(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー属植物の切断組織片をアグロバクテリウム細菌に感染させて外来遺伝子を導入することにより形質転換コーヒーを得るに当たり、アグロバクテリウム細菌感染の前に、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することを特徴とするコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項２】
フェニルウレアタイプのサイトカイニンが４−ＣＰＰＵ（Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレア）またはＴＤＺ（チジアズロン）である請求項１記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項３】
コーヒー属植物がコーヒー・アラビカ種（Coffea arabica）、コーヒー・カネフォラ種（Coffea canephora）、コーヒー・リベリカ種（Coffea liberica）またはコーヒー・デウェブレイ種（Coffea dewevrei）である請求項１または２記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項４】
切断組織片が葉の切断組織片である請求項１〜３のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項５】
培地がＭＳ培地、Ｂ５培地またはそれらの改変培地である請求項１〜４のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項６】
培地中のフェニルウレアタイプのサイトカイニンの濃度が０．１〜４０μＭである請求項１〜５のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項７】
前培養を５〜３０日行う請求項１〜６のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項８】
さらに、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地、または、フェニルウレアタイプのサイトカイニンおよびオーキシンを加えた培地に切断組織片を移植して培養する請求項１〜７のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コーヒー形質転換方法に関し、より詳しくはコーヒー属植物の形質転換不定胚を効率的に誘導し増殖させて、形質転換コーヒー属植物を大量に創出する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
コーヒーに含まれるプリンアルカロイドの一種であるカフェインは、覚醒作用や心機能の増進といった効果を有する一方で、不眠・動機・めまいなどをきたす副作用を有する。そのため、カフェインレスコーヒーの需要が高く、従来は主に有機溶媒抽出など物理化学的な分離手法によりこれを生産していた。しかし、この方法では生産コストがかかる上に、コーヒー本来の味・香りが損なわれてしまう難点があり、新しいカフェインレスコーヒーの創出技術開発が望まれている。また、商業用コーヒー品種の多くは選抜された優良形質個体のモノカルチャーであり、高品質品種の需要は高い。さらに、病虫害や除草剤に高い抵抗性を示す新品種の創出も望まれている。
【０００３】
【従来の技術】
コーヒー属植物の育種は、元来、交配による優良品種の選抜、種子繁殖あるいは接木による増殖を主流としている。しかし交配選抜による育種は長い年月を要し、コーヒー種子は貯蔵条件により急激に発芽率低下をきたす。接木による増殖は優良形質品種のクローン増殖に有効であるが、広い育種場の確保や台木の更新などが必要となる。
【０００４】
その後、選抜・交配育種に替わるコーヒー属植物の育種技術として組織培養技術が開発されてきた（Staritsky, Acta Bot Neerl, 19: 509-514, 1970; Berthouly and Etienne, Somatic Embryogenesis in Woody Plants, Vol. 5, Kluwer: 259-288, 1999）。この技術によれば、栄養成分や植物ホルモンなど植物の成長を制御する物質を組み合わせた至適な培地中でコーヒー属植物の一部組織（例えば葉の切断組織片）を培養することにより、多数の植物体を得ることができる。近年、遺伝子組換え技術により形質転換植物を創出することが可能になり、コーヒー属植物においても形質転換例が幾つか報告されている（Spiral et al., Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.44, Transgenic Trees, Springer-Verlag: 55-76, 1999）。これによると、コーヒー属植物の形質転換法は、主に、最初に▲１▼カルス、▲２▼不定胚形成細胞（不定胚を形成する能力のある細胞であって、通常はエンブリオジェニックカルス、あるいはエンブリオジェニックセルなどと定義される）、あるいは▲３▼不定胚と呼ばれる培養細胞塊（▲１▼から▲３▼を総称する用語として定義される）を誘導し、次にこれを充分量増殖させ、その後アグロバクテリウム法により形質転換を行い、形質転換細胞を選抜した後に、形質転換植物を得る。この方法は、植物体分化能力の高い培養細胞塊誘導・増殖の難易、すなわち材料によって誘導・増殖率がばらつくこと(Berthouly and Michaux-Ferriere, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 169-176, 1996)や、培養細胞塊の誘導・増殖に時間がかかること、さらに形質転換効率に左右されること等のため、必ずしも実用的な方法とは言えない。
【０００５】
【発明の課題】
上述のような状況下において、実用レベルのコーヒー分子育種を進めるためには、さらに汎用性の高く簡便な形質転換技術開発が望まれる。
【０００６】
本発明は、組織培養および形質転換の技術を応用した新しいコーヒー属植物の育種技術を提供すること、より詳しくは、コーヒー属植物の形質転換不定胚を効率的に誘導し増殖させて、形質転換コーヒー属植物を大量に創出するコーヒー属植物の形質転換法を提供することを目的とし、ひいてはコーヒーよりカフェイン合成酵素関連遺伝子の発現を抑制することによりカフェイン含量の少ないコーヒー属植物を創出することを企図とするものである。
【０００７】
【課題の解決手段】
本発明によるコーヒー属植物の形質転換法は、コーヒー属植物の切断組織片をアグロバクテリウム細菌に感染させて外来遺伝子を導入することにより形質転換コーヒーを得るに当たり、アグロバクテリウム細菌感染の前に、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することを特徴とする。
【０００８】
植物ホルモンであるフェニルウレアタイプのサイトカイニンとしては、４−ＣＰＰＵ（Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレア）またはＴＤＺ（チジアズロン）が好ましい。
【０００９】
本発明による形質転換法が適用できるコーヒー属植物は、世界のマーケットで需要の高いコーヒー種であるコーヒー・アラビカ種（Coffea arabica）およびコーヒー・カネフォラ種（Coffea canephora）の外、コーヒー・リベリカ種（Coffea liberica）およびコーヒー・デウェブレイ種（Coffea dewevrei）であってもよい。
【００１０】
コーヒー属植物の切断組織片は、好ましくは新葉、特に好ましくは枝先端の第一展開葉の切断葉組織片である。
【００１１】
好ましい培地は、ＭＳ培地、Ｂ５培地またはそれらの改変培地である。培地中のフェニルウレアタイプのサイトカイニンの濃度は、好ましくは０．１〜４０μＭ、より好ましくは０．５〜２０μＭ、最も好ましくは１〜１０μＭである。
【００１２】
前培養の期間は好ましくは５〜３０日、より好ましくは７〜１４日である。
【００１３】
フェニルウレアタイプサイトカイニン含有培地での培養の後、さらに、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地、または、フェニルウレアタイプのサイトカイニンおよびオーキシンを加えた培地に切断組織片を移植して培養することが好ましい。
【００１４】
本発明方法により、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することによって、切断面の細胞分裂を促進することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明方法を詳しく説明する。
【００１６】
(1) コーヒー属植物組織、好ましくは新葉、特に好ましくは枝先端の第一展開葉を採取後、滅菌処理し（例えば、採取物を７０％エタノール中に１分間、次いで２％次亜塩素酸水溶液中に１０分間浸漬する。この浸漬により滅菌はほぼ１００％達成される）、滅菌組織を例えば２〜２０ｍｍ角に切断する。
【００１７】
(2) 各種栄養成分を含む液体あるいは固体培地、例えばＭＳ培地（Murashige, Physiol. Plant 15: 473-497, 1962 ）やＢ５培地（Gamborg, Exp. Cell. Res. 50: 151-158, 1968）、あるいはそれらの改変培地に、植物ホルモンとして、フェニルウレアタイプのサイトカイニン（４−ＣＰＰＵ：Ｎ−２−クロロ−４−ピリジル−Ｎ−フェニルウレアまたはＴＤＺ:チジアズロン）を添加する。改変培地は、例えば、無機塩類のみを通常の濃度から１／２に低下させた改良ＭＳ培地（modified 1/2 MS：以下ｍ１／２ＭＳと略記する）である。植物ホルモンの濃度は、好ましくは０．１〜４０μＭ、より好ましくは０．５〜２０μＭ、最も好ましくは１〜１０μＭである。この培地にショ糖を好ましくは１０〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは２０〜５０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを至適値例えば５．６〜５．８に調節した後、培地固化剤を加える（以下、固体培地とはゲランガムで固化した培地をいう。また培地とは、特にことわりの無い限りは固体培地をいう。）。培地固化剤としてはゲランガムが好ましく、その添加量は２〜４ｇ／ｌである。その後、この培地を高圧高温条件下で滅菌する。この滅菌条件は、好ましくは温度１１５〜１２５℃、１０〜２０分、具体的には温度１２１℃、期間１５分である。
【００１８】
次いで、この滅菌培地に葉切断組織片を植え付け、培養する。
【００１９】
培養条件は、従来のコーヒー属植物組織培養（例えばBerthouly and Michaux-Ferriere, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 169-176, 1996) で用いられている条件と同じであってよく、例えば温度２５〜２８℃、期間３０日である。この培養は好ましくは暗所で行う。この培養は、巨視的に細胞分裂の促進、すなわち培養細胞塊の誘導が確認できる程度の期間（約５から３０日間）、継続して行うことが望ましい。
【００２０】
(3) その後、好ましくは、上記と同じ組成のｍ１／２ＭＳ培地、または、上記と同じ組成にオーキシンの１種である２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を０．１μＭ添加したｍ１／２ＭＳ培地（すなわち［４−ＣＰＰＵ］＋［２，４−Ｄ］の組み合わせ）に、もしくは、前者の培地ついで後者の培地に、上記組織片を移植して培養する。この追加培養の培養条件も、従来のコーヒー属植物組織培養の条件と同じであってよく、例えば温度２５〜２８℃、期間３０日である。この培養も好ましくは暗所で行う。
【００２１】
こうして、コーヒー属植物の切断組織片をフェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で前培養することによって、組織片の切断部で細胞分裂が大幅に促進され、多量の不定胚形成組織、カルス、培養細胞塊が形成される。
【００２２】
(4) こうして得られた前培養物をアグロバクテリウム法による遺伝子導入操作に供する。アグロバクテリウム法による遺伝子導入は常法によって行ってよい。植物組織への外来遺伝子導入はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法により行うことができる。アグロバクテリウム細菌およびベクターには多くの種類があり、それらを適宜用いることができるが、コーヒー属植物の形質転換に有効なアグロバクテリウム細菌として用いられている（Hatanaka et al., Plant Cell Rep. 19: 106-110, 1999）アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) の１種であるＥＨＡ１０１（Hood et al., J. Bacteriol 168: 1291-1301, 1986）が好ましい。遺伝子導入用のベクターとしてｐＩＧ１２１−Ｈｍ（＝ｐＢＩＨ１−ＩＧ）（Ohta et al., Plant Cell Physiol. 31: 805-831, 1990）およびその改良ベクターであるｐＢＩＨ１−ＧＦＰが好ましい。ｐＩＧ１２１−ＨｍはＮＯＳプロモータによって制御されるカナマイシン耐性遺伝子、植物において強力な転写活性を示すプロモーターであるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）によって制御されるイントロンを含むＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。したがって、これら３つの遺伝子が植物に組み込まれる。この場合ターミネーターとしてはＮＯＳターミネーターが好ましい。改良ベクターｐＢＩＨ１−ＧＦＰは、イントロンを含むＧＵＳ遺伝子を制限酵素で切断した後、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein:グリーンフルオレセントプロテイン）遺伝子を新たに組み込んだベクターである。コーヒー属植物への遺伝子導入に先立ち、ベクター：ｐＩＧ１２１−ＨｍおよびｐＢＩＨ１−ＧＦＰをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウム細菌：ＥＨＡ１０１に組み込む。ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質であるカナマイシンおよびハイグロマイシンを加えた培地で増殖させ、アグロバクテリウム懸濁液を調製する。
【００２３】
この懸濁液に上記前培養葉切断組織を浸漬し、アグロバクテリウム細菌に感染させる。浸漬時間は好ましくは１５〜３０分である。水分除去後、アセトシリンゴン（遺伝子発現誘導剤）を加えた固体ｍ１／２ＭＳ培地（４−ＣＰＰＵを好ましくは約１μＭおよび２，４−Ｄを好ましくは約０．１Ｍμ含有）で上記葉切断組織を培養することが好ましい。
【００２４】
(5) アセトシリンゴン含有培地で培養後の葉切断組織を、アグロバクテリウム細菌の除菌剤としてセフォタキシンを添加した液体ｍ１／２ＭＳ培地で洗浄し、セフォタキシンと抗生物質としてハイグロマイシンを加えた固体ｍ１／２ＭＳ培地（４−ＣＰＰＵを好ましくは約１μＭおよび２，４−Ｄを好ましくは約０．１Ｍμ含有）で培養する。次いでセフォタキシンを除き、抗生物質を添加した培地で培養する。以後、これを同一組成の培地（抗生物質濃度やホルモン条件は適宜改良する必要があるので、改変培地を用いてもよい）に移植する。こうして、順次形質転換体を得る。
【００２５】
【実施例】
本発明を下記の実施例により具体的に説明する。
【００２６】
実施例１
(1) 温室内で栽培しているコーヒー属植物（カネフォラ種）の鉢植え個体から、新葉を採取し、滅菌処理し、クリーンベンチ内で約７ｍｍ角に切断し、３０個の葉切断組織片を得た。滅菌操作では、採取葉を７０％エタノール中に１分間、次いで２％次亜塩素酸水溶液中に１０分間浸漬した。
【００２７】
(2) ｍ１／２ＭＳ培地にフェニルウレアタイプのサイトカイニンの１種である４−ＣＰＰＵ（１μＭ）を添加し、さらにショ糖を３０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを５．７に調節した後、培地固化剤としてゲランガムを３ｇ／ｌ加えた。この培地を１２１℃で２０分間高圧高温条件下で滅菌した。
【００２８】
この滅菌ｍ１／２ＭＳ培地に上記葉切断組織片を植え付け、その後１０日間、２５℃で暗黒条件下に培養した。この培養により、全ての葉切断組織片において、巨視的に細胞分裂の促進、すなわち培養細胞塊の誘導を確認した。
【００２９】
(3) こうして得られた前培養物を、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法による植物組織への外来遺伝子導入操作に供した。アグロバクテリウム細菌としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) の１種であるＥＨＡ１０１を用い、ベクターとして改良ベクターｐＢＩＨ１−ＧＦＰを用いた（前培養物３０個のうち１５個）。このベクターをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウム細菌ＥＨＡ１０１に組み込んだ。
【００３０】
ベクターを組み込んだアグロバクテリウム細菌を抗生物質であるカナマイシンおよびハイグロマイシンを１００ｍｇ／ｌの濃度で含む培地で増殖させ、６００ｎｍにおける吸光度約０．５のアグロバクテリウム懸濁液を調製した。
【００３１】
この懸濁液に上記前培養葉切断組織を３０分間浸漬し、アグロバクテリウム細菌に感染させた。次いで滅菌したろ紙上で葉切断組織から水分を除した後、アセトシリンゴン（遺伝子発現誘導剤）５０ｍｇ／ｌを含む固体ｍ１／２ＭＳ培地（４−ＣＰＰＵを１μＭおよび２，４−Ｄを０．１Ｍμ含有）で上記葉切断組織を１日培養した。
【００３２】
(4) アセトシリンゴン含有培地で培養後の葉切断組織を、アグロバクテリウム細菌の除菌剤としてセフォタキシン３００ｍｇ／ｌを添加した液体ｍ１／２ＭＳ培地で洗浄した後、セフォタキシン３００ｍｇ／ｌと抗生物質としてハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で加えた固体ｍ１／２ＭＳ培地（４−ＣＰＰＵを１μＭおよび２，４−Ｄを０．１Ｍμ含有）で培養した。次いでセフォタキシンを除き、抗生物質を１００ｍｇ／ｌの濃度で添加した培地で約２ヶ月間培養した。以降はこれを３週間毎に同一組成の培地に移植した。こうして、順次抗生物質耐性を示す形質転換体が得られた。
【００３３】
このように不定胚形成細胞が抗生物質耐性を示すことにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入され発現したことが確認された。また、図２に示すように、ＧＦＰ遺伝子を導入した形質転換不定胚形成細胞を蛍光照射の顕微鏡下で観察すると、緑色の蛍光を発しており、この点からもＧＦＰ遺伝子が発現していることことが確認された。
【００３４】
実施例２
実施例１の工程(2) の後に、上記組織片を移植して２０日間、２５℃で暗黒条件下に追加培養した。こうして得られた前培養物を実施例１の工程(4) に供した。上記の点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００３５】
実施例３
植物ホルモンとして、フェニルウレアタイプのサイトカイニンの１種であるＴＤＺ（ジアズロン）を用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００３６】
実施例４
前培養物３０個のうち残りの１５個について、ベクターとして、ｐＢＩＨ１−ＧＦＰの代わりにｐＩＧ１２１−Ｈｍを用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００３７】
実施例５
コーヒー属植物として、カネフォラ種の代わりにアラビカ種のものを用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００３８】
比較例１
植物ホルモンとして、アデニンタイプのサイトカイニンの１種である２ｉｐ（２−イソペンテニルアデニン）を用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００３９】
比較例２
植物ホルモンとして、アデニンタイプのサイトカイニンの１種であるＢＡ（Ｎ６  −ベンジルアデニン）を用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００４０】
比較例３
植物ホルモンを添加してない培地において前培養を行った点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００４１】
比較例４
対照条件として、実施例１の工程(1) で得られた葉切断組織片を前培養せずにそのまま実施例１の工程(4) に供した点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００４２】
評価試験
ａ）細胞分裂促進効果
培養細胞塊の誘導に要する期間を比較した。この結果を表２に示す。表２から分かるように、２ｉｐを用いた場合には培養細胞塊を巨視的に確認するまでに概ね２〜３ヶ月を要するのに対して、４−ＣＰＰＵによって１０日から３０日以内にほぼ全ての葉切断組織片より培養細胞塊が誘導された。
【００４３】
ｂ）実施例および比較例における前培養の前後の葉切断組織片の生重量を、表１にまとめて示す。また、前培養を行う前の葉切断組織片の平均生重量を１００とした時の、前培養後の葉切断組織片の生重量の比を図１に示す。表１および図１中、「無添加前培養」は植物ホルモンを添加してない培地において前培養を行った例を示す。「２ｉｐ  １／２，４−Ｄ  ０」は、２ｉｐを濃度１μＭ含む培地で３０日間培養を行った例を示し、「２ｉｐ  １／２，４−Ｄ  １」は、２ｉｐを濃度１μＭ含む培地で１０日間培養を行い、その後２ｉｐ  を１μＭと２，４−Ｄを濃度１μＭ含む培地で２０日間培養を行った例を示す。４−ＣＰＰＵおよびＴＤＺについても同じである。
【００４４】
表１および図１から分かるように、従来用いられていた２ｉｐに比べて４−ＣＰＰＵおよびＴＤＺは格段に生重量を増加させた。すなわちコーヒー属植物の切断組織片をフェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で前培養することによって、組織片の切断部で細胞分裂が大幅に促進され、多量の不定胚形成組織、カルス、培養細胞塊が形成された。
【００４５】
ｃ）抗生物質耐性を示す形質転換体の獲得サンプル数を、４−ＣＰＰＵを含む培地での前処理の前後について比較した。その結果を表３に示す。表３から分かるように、サイトカイニンのうち４−ＣＰＰＵを含む培地で前処理を行った場合に、格段に高い頻度で抗生物質耐性を示す形質転換体が得られた。
【００４６】
【表１】
0004016075.tif 000002
【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は前培養条件と生重量増加比の関係を示すグラフである。
【図２】  図２(a) はＧＦＰ遺伝子を導入した形質転換不定胚形成細胞を白色光で顕微鏡下で観察した時の写真（倍率：２００倍）、図２(b) は同形質転換不定胚形成細胞を蛍光照射の顕微鏡下で観察した時の写真（倍率：２００倍）である。
【図１】
0004016075.tif 000005
【図２】
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