(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも平均粒子径２．０μｍ以上３．０μｍ以下で粒子径の変動係数が１５％以下の蛍光染色された粒子を、高分子量物質を添加して粘度１．２ｍＰａ・ｓ以上３０ｍＰａ・ｓ以下とした比重が粒子比重の０．７０倍以上１．３０倍以下の分散媒に分散させた疑似血の所定量を、所定の落差で性能評価の対象となる血球分離フィルターの導入口より流入させた後、該血球分離フィルターの導出口から流出する疑似血液を回収し、少なくとも所定量の疑似血液を流すのに要した処理時間ならびに流入前の疑似血液中の粒子数および回収された疑似血液中の粒子数を分光光度計で測定することによって血球分離フィルターの白血球除去能と流れ性を評価することを特徴とする血球分離フィルターの性能評価方法。
【請求項２】
少なくとも平均粒子径２．０μｍ以上３．０μｍ以下で粒子径の変動係数が１５％以下の蛍光染色された粒子を、高分子量物質を添加して粘度１．２ｍＰａ・ｓ以上３０ｍＰａ・ｓ以下とした比重が粒子比重の０．７０倍以上１．３０倍以下の分散媒に分散させた疑似血の所定量を、所定の流量で性能評価の対象となる血球分離フィルターの導入口より流入させた後、該血球分離フィルターの導出口から流出する疑似血液を回収し、少なくとも所定量の疑似血液を流している間の該血球分離フィルターの圧力損失ならびに流入前の擬似血液中の粒子数および分光光度計で回収された疑似血液中の粒子数を分光光度計で測定することによって血球分離フィルターの白血球除去能と流れ性を評価することを特徴とする血球分離フィルターの性能評価方法。
【請求項３】
フィルター表面に存在する荷電性官能基とは反対の荷電性官能基を有する色素を含む疑似血液を用い、流入前ならびに回収された疑似血液中の色素濃度を測定する請求項１または２記載の血球分離フィルターの性能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィルター、特に血液濾過に用いられる血球分離フィルターの濾過性能を評価するための疑似血液、及びその疑似血液を用いた血球分離フィルターの性能評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、輸血分野において、輸血後副作用防止のために、血液製剤中から不織布や多孔質体を内蔵してなる血球分離フィルターを用いて白血球を除去することが一般的になっており、白血球除去性能や血液の流れ性と言ったフィルターの性能が高く安定していることが強く望まれている。
このような血球分離フィルターの基本的な性能である白血球除去性能や血液の流れ性は、実際に血液製剤を用いて評価する、いわゆる血液評価によって行われるのが一般的であるが、以下のような問題がある。第一は、医療に不可欠な血液製剤を一度に多く入手することが困難なため、評価数を稼ぎ、フィルターの性能を充分に評価するには時間がかかることである。第二は、血液製剤は含有成分量や保存日数等が必ずしも同じではないため、血液製剤の個体差が大きく、この個体差がフィルターの性能を変動させうることである。また、国、施設によっては血液製剤の作成方法が異なることも血液製剤の個体差の一因となりうるものである。第三には、血液製剤を取り扱うことにより、感染の危険性がある等の問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液評価の問題点である(1) 評価数を稼ぐのに時間がかかる(2) 血液の個体差が大きい、(3) 感染の危険性がある等を解決し、低コストで測定者間の差が非常に小さい、血液に替わる疑似血液、及びその疑似血液を用いた血球分離フィルターの性能評価方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成する新規な疑似血液及びその疑似血液を用いた評価方法を開発すべく鋭意検討を行った。その結果、特定の粒子径範囲の粒子を特定の粘度範囲の分散媒に分散させた疑似血液の所定量を血球分離フィルターの導入口より所定の落差または所定の流量で流入させた後、血球分離フィルターの導出口から流出する疑似血液を回収し、所定量の疑似血液を流すのに要した処理時間または血球分離フィルターの圧力損失と流入前ならびに回収された疑似血液中の粒子数とを測定すると、フィルターの基本性能である血液の白血球除去性能と疑似血液の粒子除去性能が、血液の処理時間と疑似血液の処理時間または血球分離フィルターの圧力損失が非常に良く相関することを見いだした。更に、疑似血液による試験結果の再現性が良く、バラツキが少ないことを確認し、本発明をなすに至った。
特に本発明の疑似血液は、血球分離フィルターの性能評価用として特に好適に用いられる。
【０００５】
すなわち本発明は、少なくとも平均粒子径２．０μｍ以上３．０μｍ以下で粒子径の変動係数が１５％以下の蛍光染色された粒子を、高分子量物質を添加して粘度１．２ｍＰａ・ｓ以上３０ｍＰａ・ｓ以下で比重が粒子比重の０．７０倍以上１．３０倍以下の分散媒に分散させた疑似血の所定量を、所定の落差で性能評価の対象となる血球分離フィルターの導入口より流入させた後、該血球分離フィルターの導出口から流出する疑似血液を回収し、少なくとも所定量の疑似血液を流すのに要した処理時間及び流入前の粒子数ならびに分光光度計で回収された疑似血液中の粒子数を測定することによって血球分離フィルターの白血球除去能と流れ性を評価することを特徴とする血球分離フィルターの性能評価方法である。また、本発明は、少なくとも平均粒子径２．０μｍ以上３．０μｍ以下で粒子径の変動係数が１５％以下の蛍光染色された粒子を、高分子量物質を添加して粘度１．２ｍＰａ・ｓ以上３０ｍＰａ・ｓ以下で比重が粒子比重の０．７０倍以上１．３０倍以下の分散媒に分散させた疑似血の所定量を、所定の流量で性能評価の対象となる血球分離フィルターの導入口より流入させた後、該血球分離フィルターの導出口から流出する疑似血液を回収し、少なくとも所定量の疑似血液を流している間の該血球分離フィルターの圧力損失及び流入前の粒子数ならびに分光光度計で回収された疑似血液中の粒子数を測定することによって血球分離フィルターの白血球除去能と流れ性を評価することを特徴とする血球分離フィルターの性能評価方法である。
【０００６】
本発明では、所定量の疑似血液を流すのに要した処理時間あるいは血球分離フィルターの圧力損失を測定することによって血球分離フィルターの流れ性を評価することができる。また、疑似血液の血球分離フィルターに流入前の粒子数及び回収された後の粒子数を測定し、その粒子の除去能を求めることによって血球分離フィルターの白血球除去能を評価することができる。
本発明で言う粒子とは、血液製剤中の白血球に対応するものであり詳細には以下の粒子を言う。
その平均粒子径は 1.0μm 以上、 5.0μm 以下の範囲にあることが必要である。平均粒子径が 5.0μm を越えると、粒子はフィルターの細孔を閉塞させつつ除去される、いわゆるふるい効果にて除去され易くなり、粒子の除去能が高く成りすぎてフィルターの異常を検出する感度が低下する等の問題が発生する。また、平均粒子径が 1.0μm 未満の場合、疑似血液中の異物との判別が困難になり、測定誤差が大きくなる等の問題がある。より好ましい平均粒径は、1.5 μm 以上、 4.0μm 以下であり、さらに好ましくは 2.0μm 以上、 3.0μm 以下である。
【０００７】
本発明で言う平均粒子径は、電子顕微鏡や光学顕微鏡を用いて測定する方法、細孔を粒子が通過する時の電気抵抗や静電容量の変化を検出して測定する方法、沈降法で測定する方法等の測定方法により測定できる。特に粒子が球体である場合は粒子を電子顕微鏡を用いて少なくとも50個以上、好ましくは 400個以上の粒子を写真撮影し粒子直径を測定して、その平均値を算出して、平均粒子径とする方法が良い。粒子径を測定する際、粒子に比べて明らかに小さな微粒子は測定しないようにする。また、粒子が非球体である場合は粒子測定装置、例えばコールターカウンターR  (コールター社製）を用い、数平均粒子径を平均粒子径とする方法が良い。
【０００８】
本発明で用いる粒子径の変動係数は５０％以下であることがが特に好ましい。ここで言う変動係数とは以下に示す式１にて求めることができる。
変動係数（％）＝（粒子径の標準偏差／平均粒子径）×100   （式１）
変動係数が50％を越えると、粒子はフィルターの細孔を閉塞しつつ除去されたり、本来除去される部位以外に捕捉されたりして、除去性能の再現性が悪くなる等の問題が発生し易くなったり、粒子製造ロット毎に除去性能に違いが発生する傾向であるため好ましくない。より好ましい変動係数は25％以下、更に好ましくは15％以下である．
【０００９】
本発明の疑似血液中の粒子濃度は、１×102 個／μ1 以上、１×105 個／μ1 以下の範囲であることが好ましい。粒子濃度が１×105 個／μ1 を越えるとフィルター表面が粒子によって被われ疑似血液が流れなくなったり、さらには、粒子同士の凝集塊が発生し易くなりフィルターの異常を検出する感度が鈍くなる傾向にあるため好ましくない。一方、粒子濃度が１×102 個／μ1 未満では、フィルターで濾過した疑似血液中の粒子の検出が難くなるため好ましくない。さらに、低濃度粒子の疑似血液を大量に濾過する方法もあるが、これは長時間を要し、コストも高くなり余り好ましくない。より好ましい粒子の濃度範囲は５×102 個／μ1 以上、５×104 個／μ1 以下であり更に好ましくは１×103 個／μ1 以上、１×104 個／μ1 以下である。
【００１０】
上記粒子濃度の測定装置としては、例えばコールターカウンターR （コールター社製）、ハイアックR （ハイアック／ロイコ社製）、電子顕微鏡、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、濁度計等が挙げられるが特に限定するものではない。
【００１１】
本発明で言う粒子を分散させる分散媒については、特に限定するものではないが、粒子を分散させるには以下の２点が大切である。まず第一の点は粒子の比重と分散媒との比重の関係である。この分散媒の比重は、粒子比重の0.70〜1.30倍であることが好ましい。粒子比重の0.70倍未満の分散媒を用いた場合は、疑似血液中の下層部に粒子が貯まり易くなり、また1.30倍を越える分散媒を用いた場合、疑似血液中の上層部に粒子が貯まり易くなり、均一に粒子が分散した疑似血液となり難くなる。このような状態では、粒子同士が接しあい、場合によっては接着して大きな凝集塊が生じやすくなるため、フィルターで濾過した時、粒子の目詰まりが急激に起こりやすくなり、処理時間や除去性能に影響を及ぼす問題が発生しがちである。また、第二の点は粒子の材質と分散媒の極性との関係である。粒子が親水性の性質を示すものであれば分散媒としては極性溶媒が好ましく、粒子が疎水性の性質をしめすものであれば分散媒としては非極性溶媒が好ましい。これは、親水性を示す粒子を非極性溶媒に、疎水性を示す粒子を極性溶媒に添加した場合にも、粒子同士が凝集し易くなりフィルターで濾過した場合処理時間や除去性能に影響を及ぼす恐れが発生しがちである。上記に示す極性溶媒としは例えば水、アルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン等が挙げられ、非極性溶媒としては例えばベンゼン、ヘキサン、クロロホルム等が挙げられるが特にこれらの例示に限定されるものでは無い。
【００１２】
本発明で言う疑似血液中の粒子の分散とは、粒子が以下の状態にあることを言う。まず、特定の粘度に調整した分散媒に粒子を添加し良く攪拌後10分間静置する。その後疑似血液中から任意に５箇所以上好ましくは10箇所以上サンプリングし、各サンプルに含まれる粒子濃度を測定し、最大粒子濃度、最小粒子濃度、平均粒子濃度を求める。さらに、以下の式２で求めた値が30％以下の状態であれば粒子は分散しているものとする。実際、疑似血液を用いて血球分離フィルターの評価を行うのに必要な時間は数十分あれば十分だからである。
〔（最大粒子濃度−最小粒子濃度）／平均粒子濃度〕×100   （式２）
【００１３】
本発明の粒子の比重測定方法については、公知の方法を用いれば良く、例えば、水中置換法、ピクノメーター法、浮沈法、密度勾配管法、重量法等が挙げられるが、特に限定するものでは無い。また、本発明の分散媒の比重測定方法については、一定の体積中の重量を測定する方法が容易で好ましい。具体的には、ホールピペットで 1ml正確に量りとり、0.1mg まで測定可能な化学天秤を用い重量を測定し 0.1mgを四捨五入し、1mg 以上の重量値を 1mlで除し密度を求める方法であり、３回繰り返した平均値を分散媒の比重とするものである。ここで言う比重を測定する分散媒とは、粒子を添加する直前の溶媒のことであり、溶媒自身、或いは溶媒に何らかの物質を溶解している溶液を示すものである。
【００１４】
本発明の粒子の材質については、合成高分子の粒子、例えばポリスチレン、ポリビニルトルエン、スチレン／ブタジエン共重合体、ビニルトルエン／ターシャリーブチルスチレン共重合体、セルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられるが、白血球除去能と対応するものであれば特に限定されるものでは無い。
本発明の粒子の製造方法として、乳化重合、懸濁重合等が挙げられるが、上記の粒子が合成されればよく、特に限定するものではない。
【００１５】
血球分離フィルターの基本性能の一つに血液の処理時間がある。本発明者らは血液の処理時間が血液成分よりもむしろ血液そのものの粘度に強く関係しており、疑似血液に高分子量物質を添加し、血液と同等の粘度に調整することにより、血液評価と疑似血液評価が良く相関することを見いだした。本発明に用いられる分散媒の粘度は、20℃〜25℃において1.2mPa・s 以上、30 mPa・s 以下の範囲であることが必要である。より詳細には、濃厚赤血球製剤を濾過するフィルターの評価を行う場合は、10 mPa・s 以上、30 mPa・s 以下であり、全血製剤を用いるフィルターに使用する場合は、2mPa・s 以上、10 mPa・s 以下であり、濃厚血小板製剤を用いるフィルターの評価を行う場合は、1.2mPa・s 以上、2.5mPa・s 以下である。
【００１６】
本発明に用いられる分散媒の粘度を調整する高分子量物質としては、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン等の多糖類及びその誘導体等が挙げられるが、上記の粘度が容易に調整されればよく、特に限定するものでは無い。
本発明に用いられる分散媒の粘度を調整する高分子量物質の分子量としては、１×103 以上、１×106 以下の範囲が好ましい。より好ましくは、５×103 以上、５×105 以下の範囲である。これは、分子量が１×103 未満では、粘度調整に多量の高分子量物質が必要となり、高コストとなるため好ましくない。一方、分子量が１×106 以上では、溶解性が悪くなる傾向があるため好ましくない。
【００１７】
本発明の粒子は、蛍光染色されていることが好ましい。本発明者らの検討では、濁度計、コールターカウンターR （コールター社製）による粒子の検出限界は５個／μl 程度のものであった。ところが、蛍光染色された粒子を用い、分光蛍光光度計にて測定を行うことにより0.05個／μl まで検出感度を上げることが可能になった。蛍光染料については、特に限定は無く、公知の染料で良い。例えば、黄色酸性染料、塩基性染料、キサンテン染料、スチルベン染料等が例示できる。
【００１８】
染色方法については、粒子を膨潤剤で膨潤させて染料を保持させる方法が一般的であるが、コーティング、イオン結合、化学的固定等何れの方法を用いても良い。蛍光強度については、蛍光染色された粒子を 500個／μl の濃度となるように調整した液を、分光蛍光光度計を用い、染色した蛍光のピーク波長にて、蛍光強度が10以上、更に好ましくは50以上、より好ましくは 100以上が良い。蛍光強度が９以下の場合は、粒子の検出感度が低下し易いため好ましくない。
【００１９】
血小板製剤用に用いられる血小板を通過させ、選択的に白血球を除去するフィルターでは、フィルター材の表面が改質されている場合が多い。表面改質によりフィルター基材表面に荷電を持つ官能基を持たせているのが一般的である。この様なフィルターに於いては、フィルター材の表面がムラ無く改質されていることが重要であり、フィルター材の表面改質剤の度合いを定量する必要がある。本発明者らは、鋭意検討した結果、本発明の疑似血液中に、フィルター材表面に存在する荷電性官能基とは反対の荷電性官能基を有する色素を添加し、この疑似血液をフィルターで濾過することにより、フィルター材表面の改質度合いを定量できることも見いだした。即ち、本発明に言う血液分離フィルターの性能評価には、そのようなフィルターの表面改質の度合いの定量も含まれる。
【００２０】
本発明の疑似血液中の色素は、荷電性官能基を有すれば、特に限定は無い。
荷電性官能基を例示すると、アニオン性官能基として、硫酸基、カルボキシル基、燐酸基等、カチオン性官能基として、アミノ基等が挙げられ、基材表面の官能基によって選択すれば良い。より具体的には例えばスルホン酸基を有するトリパンブルー、アミノ基を有するサフラニンＯ等の色素が挙げられる。
本発明の疑似血液中の色素濃度は、0.0001wt％以上、1.0wt ％以下が良い。色素濃度が、0.0001wt％未満では、この疑似血液をフィルターで濾過した場合、フィルターを通過した疑似血液中の色素の検出が困難になるため好ましくない。一方、1.0wt ％越えると、この疑似血液をフィルターで濾過した場合、フィルター表面が色素で被われても高濃度の色素が通過し、表面改質剤の定量の感度が鈍くなる傾向にあるため好ましくない。
【００２１】
本発明の疑似血液中の色素については、血球分離フィルターの導入口より流入させる前の色素濃度Ａとフィルターを経た回収液中の色素濃度Ｂを測定することにより色素通過率を以下の式３にて求めることができる。
色素通過率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００  （式３）
色素濃度測定方法としては、分光光度計による吸光度，透過率等の一般的に測定できる装置を用いれば良い。
【００２２】
荷電性官能基を有する色素を含んだ疑似血液のｐＨは、2.0 〜11.0の範囲が好ましい。より好ましくは 2.5〜10.5であり、さらに好ましくは、 3.0〜10.0の範囲である。ｐＨの調整については、緩衝液を用いても良い。上記ｐＨ範囲外では、色素の静電気的吸着が大きく影響し制御が難しく、更には、操作の安全性にも問題が発生し好ましくない。
【００２３】
本発明の疑似血液の所定量とは、特に限定は無いが、血球分離フィルターの処理時間の異常を検出する場合、一定量の疑似血液を流すことが必要である。また、極端な少量の疑似血液を血球分離フィルターで濾過した場合は、回収バッグの疑似血液中の粒子が測定限界以下になる恐れがあるため、予め疑似血液評価を行う前に適当な一定量を定めておくことが好ましい。
【００２４】
本発明の疑似血液を血球分離フィルターへ流入する方法として、落差による方法及び定流量による方法がある。ここで言う落差とは、疑似血液入り血液バッグと回収バッグとの間に血液回路等で血球分離フィルターを接続した濾過システムの中の、血液バッグと回収バッグの距離である。このような濾過方法は血液試験では一般的であり、本発明の疑似血液評価法に於いても好ましい方法であるが、落差が血球分離フィルターヘ流入する速度に変化を与え、更には血球分離フィルターの性能へ影響を及ぼす傾向があるため、一定の落差条件にすることが好ましい。
【００２５】
定流量による方法については、血球分離フィルターの導入口側に例えばポンプ等の装置を組み込んで血球分離フィルターへ流入させる方法である。この場合、疑似血液を血球分離フィルターへ定流量で流入するため処理時間の変化が無く、このため血球分離フィルターの圧力損失を測定することが好ましい。例えば、血球分離フィルターの導入口と導出口に圧力モニターを設け血液バッグの疑似血液を一定流量で流し、血球分離フィルターの導入口の圧力が安定した時の圧力損失を測定する濾過方法等が挙げられるが、上記例示に限定されるものではない。上記両者の方法の濾過速度については、500ml/min 以下が好ましく、更に好ましくは250ml/min 以下である。
【００２６】
本発明の疑似血液を用いた血球分離フィルターの評価方法に於いての処理時間は、基本的には血液バッグ中の所定量の疑似血液を血球分離フィルターにて濾過を開始した時から濾過を終了した時の時間を言う。血液バッグ中の疑似血液が少量になった時点で開始するのは余り好ましくない。これは、徐々に濾過流速が低下する異常フィルターの場合検出感度が鈍くなるためである。また血球分離フィルター間の比較においては、開始時点と終了時点を決めておくことが好ましい。例えば、血球分離フィルターの導出口より疑似血液が流出した時点から血液バッグ中の疑似血液が無くなった時点等任意に設定すれば良い。
【００２７】
本発明の血球分離フィルターとは、例えば濃厚赤血球製剤用として Sepacell R RZ、SepacellR RS-200、全血製剤用として Sepacell R R-2000、SepacellR RS-2000 、濃厚血小板製剤用として Sepacell R PLS 、SepacellR PLX （以上旭メディカル社製）等が掲げられるが、血球分離できるフィルターであれば特に限定するものでは無い。
【００２８】
【発明の実施の形態】
ここで本発明の疑似血液を用いた血球分離フィルターの評価方法のより具体的な手順の一例を詳細に説明する。まず、平均粒子径が 1.0μm 以上、 5.0μm 以下の粒子を、高分子量物質により粘度1.2mPa・s 以上、5.0mPa・s 以下の分散媒に、濃度１×102 個／μl 以上、１×105 個／μl 以下になるように加え、分散させた疑似血液を作成する。この疑似血液の所定量を入口と出口を有する血液バッグに入口より注入する。所定量の疑似血液入り血液バッグの入口を閉鎖し、血液バッグの出口を導入口と導出口を有する血球分離フィルターの導入口に血液回路で接続し、さらに血球分離フィルターの導出口と回収バッグを血液回路で接続し、所定の落差または流量で血液バッグ中の疑似血液を血球分離フィルターへ流入させ、導出口から流出する疑似血液を回収する。この時、疑似血液を血球分離フィルターへ満たし導出口より流出し始めた時から血液バッグ中の疑似血液を流し終えるのに要した時間即ち処理時間を測定し、また回収された疑似血液中の粒子数を測定し、血球分離フィルター濾過前の疑似血液の粒子数で除し、血球分離フィルターの粒子除去能を計算する。回収液中の粒子数の測定装置としては、顕微鏡、コールターカウンターR （コールター社製）、ハイアックR （ハイアック／ロイコ社製）、濁度計、電子顕微鏡、蛍光分光光度計等が挙げられるが、粒子数の測定できる装置であれば特に限定するものではない。しかしながら回収液中の粒子濃度が50個／μl 以下と高除去能の血球分離フィルターを評価する場合は、蛍光染色されている粒子を用いて蛍光光度計で測定する方法が感度が良く好ましく、更に回収液中の粒子を遠心濃縮しても良い。
【００２９】
本発明の疑似血液を用いた血球分離フィルターの評価方法を用いて得られた処理時間や圧力損失、除去能、必要に応じて色素の通過率の結果については、例えば統計的手法の活用として、血球分離フィルターのロット毎による有意差検定、管理図等を用い、異常ロットフィルターの検出、製造工程管理等に用いることができる。
【００３０】
以下に実施例を示し、発明を詳細に説明する。
【実施例１】
図１に示すような疑似血液用バッグ１、導入口４、血球分離フィルター２、導出口５、回収バッグ３を有する装置を用いて、粒子除去能、処理時間を測定した。本発明の疑似血液に、使用した粒子は、MICROSPHER（乳化重合で作成された、ポリスチレン／ジビニルベンゼンの仕込み重量比が 99.5/0.05の共重合品、ＭＡＧ社製、Yellow Fluorescent PS Microsphere)で、予め、黄色の蛍光色素(Coumarin系）で染色されている粒子を用いた。この粒子を電子顕微鏡（日立社製、S-2460Ｎ形）により、3000倍の倍率で 400個を測定し、平均粒径、変動係数を求めた。その結果、平均粒径は 2.5μm 、変動係数は3.09％であった。比重は、ピクノメーター法により測定した。ピクノメーター JIS R3053 (化学分析用ガラス器具）に規定されたゲーリュサック温度計付比重瓶を用いた。結果、粒子の比重は、1.05であった。
【００３１】
疑似血液の分散媒については、濃厚赤血球製剤を対象として粘度を調整した。調整方法は、ポリビニルピロリドン（分子量36万、和光製薬製）を市販の注射用蒸留水に４重量％の濃度になるように溶解した。上記粘度が調整された分散媒の比重を測定した。測定方法は、１mlのホールピペットで計量し、化学天秤 (METTLER AT201 シイベル機械製）で測定し、比重を質量／体積にて計算した。その結果、分散媒の比重は 1.065であった。分散媒の比重を粒子の比重で除した値は 1.014となった。粘度は粘度測定機(R-100RE型  東機産業社製）にて測定したところ、25.490 mPa・s であった。この分散媒に前記粒子を添加し粒子濃度を光学顕微鏡で測定した。結果、5750個／μｌであった。
【００３２】
この蛍光染色された粒子のピーク波長は、蛍光分光光度計（Ｒ−5000型、島津社製）を用いて求めた。その結果、蛍光波長 432.0nm、励起波長 491.0nmであった。この波長で測定した結果、2224の蛍光強度であった。疑似血液のｐＨをｐＨメーター（F-22型、堀場製作所製）にて測定しところ、pH4.5 であった。上記疑似血液を血液バック１に325gになるように入れた。血球分離フィルター２として、以下の３種類を作成した。フィルターＡ）として、有効濾過面積67mm×67mmの容器に、平均繊維直径1.2 μm 、厚み0.2mm のシート状ポリエステル不織布１０枚を充填したフィルターを作成した。フィルターＢ）として、同じ不織布２２枚を充填した以外はフィルターＡ）と同じフィルターを作成した。フィルターＣ）として、同じ不織布２８枚を充填した以外は、フィルターＡ）と同じフィルターを作成した。上記フィルターについては、すべて充填密度を0.2g/cm3とするため容器の導入口側にポリエステルメッシュ（200 メッシュ，ＮＢＣ工業製，商品名T-N0200T) を挿入し調製した。フィルターの模式図を図２に示す。図２で密度調整用ポリエステルメッシュは８で、白血球除去用ポリエステル不織布を７で示す。
【００３３】
疑似血液が入っている血液バッグ１を上記血球分離フィルター２の導入口４に接続し、導出口５と回収バッグ３と接続し、疑似血液を濾過した。濾過する際、疑似血液が入ってる血液バッグを手で掴んで加圧し強制的にフィルター内に疑似血液を満たした。かくして血球分離フィルター内に疑似血液が満たされた後、落差1.2mで疑似血液を流し、血液バッグ内に疑似血液がなくなるまで濾過を行った。この時の処理時間は、血液分離フィルターの導出口より疑似血液が流出し始めた時から血液バッグ内に疑似血液が無くなるまでとした。回収バッグ中の粒子濃度は、先に求めた蛍光分光光度計を用いた蛍光波長、励起波長で測定した。粒子除去能については、血液バッグ中及び回収バッグ中の疑似血液の蛍光強度と、疑似血液の処理量及び回収量より以下の式４に従って求めた。
除去能＝−log ［（回収バッグ中の疑似血液の蛍光強度×回収量）／（血液バッグ中の疑似血液の蛍光強度×処理量）］  （式４）
【００３４】
不織布枚数が22枚と28枚のフィルターについては、回収液中の粒子濃度が元バッグ中の粒子濃度に対して1/1000以下になるため、遠心機(SCR7BHITACHI 製）を用い、3500rpm ×30min で 100倍濃縮を行った後に測定した。
次に、疑似血液を 400mlの血液に抗凝固剤として56mlのＣＰＤ液（組成：クエン酸ナトリウム 26.3g/L、クエン酸 3.27g/L、グルコース 23.2g/L、リン酸二水素ナトリウム二水和物 2.5g/L)を加えて調整した全血から、遠心分離によって多血小板血漿を除去して得られる濃厚赤血球製剤（保存日数は７〜14日以内）に変えた以外は同じフィルター、方法で濾過を行った。血液バッグ中の濃厚赤血球製剤の白血球濃度は、チュルク液で白血球を染色し、光学顕微鏡を用いて測定した。一方、回収バッグ中の白血球が除去された濃厚赤血球製剤の白血球濃度は、ナジェットチャンバーを用いて求めた。このようにして測定した白血球濃度を用い次の式５に従って除去能を求めた。
除去能＝−log ［（回収バッグ中の濃厚赤血球製剤の白血球濃度×回収量）／（血液バッグ中濃厚赤血球製剤の白血球濃度×処理量）］  （式５）
【００３５】
白血球除去能、処理時間の結果を表１及び表２に示す。更に疑似血液を用いた粒子除去能と血液を用いた白血球除去能の関係、疑似血液を用いた処理時間と血液を用いた処理時間の関係を図３及び図４に示した。この結果より、除去能の相関係数ｒ2 ＝0.995 、処理時間の相関係数ｒ2 ＝0.968 と非常に強い相関が認められた。
【００３６】
次に、不織布枚数22枚のフィルターのみを、上記と同じ方法で作成をした疑似血液とＣＰＤを添加した濃厚赤血球製剤（保存日数は７〜14日以内）を夫々５個のフィルターで濾過した。除去能、処理時間の結果を表３及び表４に示した。この結果より、除去能のバラツキ（標準偏差）は、疑似血液評価が0.04、濃厚赤血球製剤評価が0.34、濾過時間のバラツキ（標準偏差）は、疑似血液が0.24分、濃厚赤血球製剤が1.83分であり、疑似血液が格段にバラツキが小さく優れていることが認められた。
【００３７】
【比較例１】
平均粒子径が 7.3μm 、変動係数が 9.8％の粒子に変更した以外は、実施例１と同じ粒子を使用した。この粒子を用いて、実施例１と同様な疑似血液作成を行った。疑似血液中の粒子数濃度は5886個／μｌであり、蛍光強度は2437であった。分散媒の比重を粒子の比重で除した値は1.009 倍であった。分散媒の粘度、疑似血液のｐＨは実施例１と同じになるよう調整し、この疑似血液を用いて、実施例１と同様なフィルター、方法で濾過した。粒子除去能の結果を表１に示す。その結果、フィルターの不織布枚数の増加に伴い、粒子除去能が検出限界以下（これは、血液バッグ中の粒子濃度に対し回収液中の粒子濃度が 1/1000000以下となったことを意味する）となり回収バッグ中に粒子は見られなかった。これは、フィルターの不織布の上層部にふるい効果により粒子が除去されたためと考えられ、評価不能であった。
【００３８】
【比較例２】
平均粒径が0.12μm 、変動係数が2.3 ％の粒子に変更した以外は、実施例１と同じ粒子を使用した。この粒子を用いて、実施例１と同様な疑似血液作成を行った。疑似血液中の粒子数濃度は、5502個／μl であり、蛍光強度は、2035であった。分散媒の比重を粒子の比重で除した値は1.019 倍であった。分散媒の粘度、疑似血液のpHは実施例１と同じになる様調整し、この疑似血液を用いて、実施例１と同様なフィルター、方法で処理した粒子除去能の結果を表１に示す。その結果、フィルターの不織布枚数が増加しても、除去能の向上は余り観られず感度が鈍かった。これは、粒径が 0.12 μm とかなり小さいため血液分離フィター上で除去されずに回収バッグに多く流出してくるためと考えられた。
【００３９】
【比較例３】
実施例１と同じ粒子を用い、濃厚赤血球製剤を対象として分散媒の粘度を 1.0 mPa・s に調整した疑似血液を作成した。この時粒子濃度は5760個／μl であった。pHは、4.9 であり、分散媒の比重を粒子の比重で除した値は 0.965倍であった。この疑似血液を用いて、実施例１と同様なフィルター、方法で濾過し、処理時間を求めた。結果を、表２に示す。フィルターの不織布枚数を増やしても、処理時間は余り変化無く、血液と対応が取れなかった。
【００４０】
【比較例４】
実施例１と同じ粒子を用い、濃厚赤血球製剤を対象として分散媒の粘度を50.0 mPa・s に調整した疑似血液を作成した。この時の疑似血液中の粒子濃度は、5894個／μl 、pHは、4.9 であり、分散媒の比重を粒子の比重で除した値は 1.095倍であった。この疑似血液を用いて、実施例１と同様なフィルター、方法で濾過し、処理時間を求めた。結果は表２に示す。フィルターの不織布枚数を増やすと、処理時間も延長し血液と対応は取れるものの、一方で、処理時間が非常に長く、本発明の効果である評価数を稼げると言う点でかなり逸脱しており、更に、粘度調整用の合成高分子を多量に使うため、コスト等が掛かり好ましくないものと考えられた。
【００４１】
【実施例２】
図５に示すような、疑似血液バッグ 1' と血球分離フィルター 2' の導入口４’との間に定流量ポンプＰ（アトー株社製、ペリスタポンプ）を設け、その定流量ポンプＰと導入口 4' の間、導出口 5' と回収バッグ 3' との間にそれぞれ圧力モニター9', 10'(コパル電子株社製  PRESSURE GAUGE PG-200)を組み込んだ装置を用い、血球分離フィルター２’の圧力損失を測定した。使用した疑似血液については実施例１と同じものを用い、疑似血液バッグ 1' に15ml入れた。血球分離フィルター 2' として、以下の３種類を作成した。フィルターＤ）として、市販フィルターホルダー (NUCLEPORE 社製、直径25mm) に、実施例１と同様なポリエステル不織布５枚を充填したフィルターを作成した。フィルターＥ）として、同じ不織布10枚を充填した以外はフィルターＥ）と同じフィルターを作成した。フィルターＦ）として、同じ不織布13枚を充填した以外はフィルターＥ）と同じフィルターを作成した。フィルターの模式図を図６に示す。
【００４２】
疑似血液が入っている疑似血液バッグ１’を定流量ポンプＰを介して上記血球分離フィルター 2' の導入口に接続し、導出口 5' と回収バッグ 3' と接続し、定流量ポンプＰとフィルター 2' の導入口の間に、導出口 5' と回収バッグ 3' との間に各々圧力モニター9',10'を接続し、この時点で圧力モニター9', 10' を０調整し、疑似血液を濾過した。疑似血液の濾過速度は、定流量ポンプＰで2.7ml/min になるよう調整し、血液バッグ１’内に疑似血液が無くなるまで濾過を行った。この時の血球分離フィルター２’圧力損失は、回収バッグ 3' 中に疑似血液が５ml濾過した時の各圧力モニター9', 10' の値を読み下記式６から血球分離フィルター2'圧力損失を求めた。
0003966431.tif 000002
また、実施例１と同じ方法で式４に従い粒子の除去能を求めた。血球分離フィルター２’の圧力損失、粒子除去能の結果を表５に示す。血球分離フィルター２’の不織布枚数を増加すると圧力損失も増加し、除去能も向上することが認められ、上記方法で血球分離フィルターの性能を十分に評価できることが認められた。
【００４３】
【実施例３】
実施例１と同様な濾過装置を用いて、血球分離フィルター材の表面改質剤の度合いを定量する色素吸着率を測定した。疑似血液の分散媒については、濃厚血小板製剤を対象として粘度を調整した。調整方法は、実施例１で用いたポリビニルピロリドンを市販の注射用蒸留水に0.275 重量％の濃度になるように溶解した。その結果分散媒の比重は1.022 であり、粘度は1.543mPa・s であった。この分散媒に、実施例１と同じ粒子を添加し粒子濃度を光学顕微鏡で測定した。その結果5980個／μl となり、蛍光強度は2035であった。また、分散媒の比重を粒子比重で除した値は0.973 となった。上記液に色素としてトリパンブルー（ナカライテスク株社製）を0.001 重量％になるように添加した。この色素トリパンブルーのピーク波長は、紫外可視分光光度計（日本分光製、Ｖ-560型）を用いて求めた。その結果、波長578nm であった。この波長で測定した結果、吸光度は0.997 であった。疑似血液のｐＨを測定したところ、pH5.1 であった。上記疑似血液を血液バッグに 200g になるようにいれた。
【００４４】
血球分離フィルター２として、実施例１と同様な方法でフィルターを作成し、何も表面改質されていない血球分離フィルターと、その後表面改質剤にてフィルター材の表面を改質した血球分離フィルターの２種類を作成した。先ず有効濾過面積30mm×30mmの容器に、実施例１で用いたポリエステル不織布16枚を充填した血球分離フィルターを作成した。また、充填密度を0.2g/cm3とするため容器の導入側に実施例１と同じメッシュを挿入し調整した。このようにした表面改質されていない血球分離フィルターを作成した。更に、上記作成したフィルターを以下の表面改質剤を用いて表面改質を行った。先ず、表面改質剤については、特級エタノール中に、ジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、ＤＭと言う）を 0.05mol/L、2-ヒドロキシエチルメタクリレート（以下、ＨＥＭＡと言う）を0.75mol/L の濃度になるように加え、全量を 250mlとした。重合開始剤としてＶ-65(和光純薬製）を0.01mol/L の濃度になるように加え、窒素雰囲気下50℃にて4.5 時間重合させた後、蒸留水に滴下して析出した物質を集め凍結乾燥し、ＤＭとＨＥＭＡとのコポリマー（以下、ＨＤ-5ポリマーと言う）を得た。このＨＤ-5ポリマーを特級エタノールに 0.7重量％濃度になるよう調整した液を上記作成した血球分離フィルターに充填し、一分間静置した。その後窒素ガスによって充填したＨＤ-5をポリマー液を吹き出した後、45℃で16時間真空乾燥させ、ポリエステル不織布にＨＤ-5ポリマーにて表面改質された血球分離フィルターを得た。
【００４５】
疑似血液が入ってる血液バッグを上記血球分離フィルターの導入口４と接続し、導出口５と回収バッグ３に接続し、疑似血液を濾過した。濾過する際、血球分離フィルターを反転させ疑似血液を満たした後、元に戻し、落差1.0m、流速 5g/min にローラークランプにて調整し、血液バッグ１内に疑似血液がなくなるまで濾過を行った。回収バッグ３中の色素トリパンブルーは、先に求めた紫外可視分光光度計を用いた波長で測定し、色素トリパンブルーの通過率を式３に従い求めた。また、実施例１と同じ方法で式４に従い粒子の除去性能を求めた。色素トリパンブルー通過率、粒子の除去能の結果を表６に示す。ここで用いた血球分離フィルター表面の改質剤は、カチオン性官能基を有する改質剤を用いたため、色素としては反対の硫酸基を有するトリバンブルーを選択し疑似血液評価を行った。結果、色素トリパンブルーの通過率は、表面改質されてない血球分離フィルターは95％と高く、表面改質された血球分離フィルターは25％と低く、これは、血球分離フィルター材表面の正荷電量を反映しているものであり、即ち血球分離フィルター材表面の表面改質剤の度合いを定量できることが認められた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の疑似血液及び疑似血液を用いた血球分離フィルターの性能評価方法を用いることにより、従来の血液を用いた評価法の欠点であった(1) 評価数を稼ぐのに時間がかかる(2) 血液個体差が大きい(3) 感染の危険性がある等を解決でき、低コストで測定者間の差が非常に小さい血液に替わる血球分離フィルターの性能評価方法を提供できるようになった。
以上より、従来の血液試験に対して、試験数を稼げ統計的手法を用いることが可能になり、フィルターの品質管理レベルを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、比較例１〜４の疑似血液を用いた血球分離フィルターの評価に用いる装置の一例を示す模式図面。
【図２】実施例１、比較例１〜４にて評価される血球分離フィルターの一例を示す断面模式図。
【図３】血液試験除去能と疑似血液評価除去能との相関を示すグラフ。
【図４】血液試験処理時間と疑似血液評価処理時間との相関を示すグラフ。
【図５】実施例２の疑似血液を用いた血球分離フィルターの評価に用いる装置の一例を示す模式図。
【図６】実施例２にて評価された血球分離フィルターの一例を示す断面模式図。
【符号の説明】
１，１’  血液バッグ
２，２’  血球分離フィルター
３，３’  回収バッグ
４，４’  導入口
５，５’  導出口
６，６’  容器
７，７’  粒子、白血球除去用ポリエステル不織布
８，      密度調製用ポリエステルメッシュ
９’  導入口側圧力モニター
１０’  導出口側圧力モニター
１１’  25mmカラムホルダー上部
１２’  25mmカラムホルダー下部
Ｐ    定流量ポンプ
【表１】0003966431.tif 000003
【表２】0003966431.tif 000004
【表３】0003966431.tif 000005
【表４】0003966431.tif 000006
【表５】0003966431.tif 000007
【表６】0003966431.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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