(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電流を測定することによって液体サンプルの分析対象物濃度を定量するバイオセンサシステムに用いられる方法であって、測定した電流とその時間微分の比を算出し、前記測定した電流とその時間微分の比を使用して前記液体サンプルとコントロール液とを弁別することを特徴とする液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項２】
前記測定した電流とその時間微分の比を複数回算出することを特徴とする請求項１に記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項３】
前記複数回算出された比の任意の２つの差を算出することを特徴とする請求項２に記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項４】
前記算出された比を予めシステムに記憶された所定の比較値と比較し、その結果を表示することを特徴とする請求項１に記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項５】
前記複数回算出された比をそれぞれ予めシステムに記憶された所定の比較値と比較し、その結果を表示することを特徴とする請求項２に記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項６】
前記算出された複数の比の任意の２つの差を予めシステムに記憶された所定の比較値と比較し、その結果を表示することを特徴とする請求項３に記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項７】
前記液体サンプルが血液である請求項１から６のいずれかに記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【請求項８】
コントロール液によるシステムチェックの判定結果を表示することを特徴とする請求項４から７のいずれかに記載の液体サンプルとコントロール液の弁別の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体サンプルに含まれる分析対象物濃度を測定するための方法に関する。特に血液などの体液に含まれる例えばグルコース、コレステロールなどの濃度を電流測定により定量するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、液体サンプル、特に血液などの生体サンプル中の分析対象物濃度を簡便、迅速に定量するものとしてバイオセンサが知られている。
【０００３】
バイオセンサとは、電気化学測定を行うためのデバイスの１種である。電気化学測定とは、その名の通り、化学的反応を電気的な信号、例えば電流、電圧、電荷量として測定するものである。電気化学測定の弱点は、その特異性の低さにある。すなわち、化学的反応によって生成した物質が電気化学測定可能な物質であっても、測定サンプル中に電気化学測定可能な別の物質が存在すると、直ちに誤差を生じてしまうのである。バイオセンサは、この電気化学的測定の特異性の低さという弱点を補うために、分析対象物と選択的かつ特異的に反応し得る生体機能物質、例えば酵素などを利用している。バイオセンサは、少なくとも次の２つの部分を有する。１つは選択機能部として、目的物と選択的かつ特異的に反応する部分である。例えば酵素や抗体がこれに相当する。もう１つは信号変換部として、選択機能部の化学的反応を電気的な信号へと変換する部分である。主として電極に相当する。バイオセンサを用いた分析対象物の測定は、直接的に電流、電圧、電荷量などの各種電気的な量が測定対象になり得る。この中でも電流を測定対象とするバイオセンサが多く存在している。
【０００４】
バイオセンサシステムとは、バイオセンサへ電位を与えたり、バイオセンサの信号である電流を測定したりする機器と、テストセルとしてのバイオセンサを組み合わせて使用するものである。例えば、血液サンプル中の乳酸濃度を定量するためのバイオセンサシステムであれば、乳酸と特異的に反応する乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの酵素を選択機能部とするバイオセンサをテストセルとして、血液サンプルと前記酵素などとの反応が始まってからの時間を計時するタイマー機能、定められた時間経過後に定められた電位をバイオセンサに印加する機能、前記電位印加開始から定められた時間経過後に電流を測定する機能、電流と乳酸濃度との相関関係、例えば検量線を記憶する機能、前記記憶された相関関係、例えば検量線と前記測定された電流から乳酸濃度を判定する機能、前記判定した結果をディスプレイなどに表示する機能等を有する機器と組み合わせて使用することで構築することが出来る。このようなバイオセンサシステムは、血液サンプル中の乳酸濃度の定量にとどまらず、種々のものが知られている。
【０００５】
欧州特許出願公開第０２３０４７２号には、電流測定を利用して血液サンプルのグルコース濃度を測定するバイオセンサシステムが開示されている。このシステムでは、測定電極、リファレンス電極およびカウンタ電極を備えたバイオセンサがテストセルとして用いられている。前記電極は、グルコースオキシダーゼ、フェリシアン化カリウムおよびその他の成分を含有する試薬層で覆われている。血液サンプルを試薬層に接触させて入れると、サンプル中のグルコースが、グルコースオキシダーゼの作用を介してフェリシアン化カリウムと反応し、フェロシアン化カリウムを形成する。その後で電極に電圧を印加すると、逆反応が生じて、最初の反応で生じたフェロシアン化カリウムの濃度に比例した電流が流れる。この電流の測定値がサンプル中のグルコースの濃度に対応するとしている。
【０００６】
電気化学測定において、時間に対して矩形波的に電位を印加し、それに対する電流を測定する手法は、ポテンシャルステップ法として一般的に知られている。ここで言う「時間に対して矩形波的な電位印加」とは、実質的に瞬間にある一定電位を印加し、その後前記一定電位を印加し続けるという意味である。このようなポテンシャルステップ法では、電位を印加してからの時間の経過と共に減衰していく電流、減衰電流が観察される。この減衰電流は、時間に依存しているので、時間の関数として表すことが出来る。他方この減衰電流は、分析対象物濃度にも依存している。ゆえに、この減衰電流は分析対象物濃度の関数としても表すことが出来る。減衰電流は、時間と分析対象物濃度の関数として表せるわけである。従って、減衰電流に影響を与えるその他の因子として、例えばサンプルの性状、サンプル温度、電極面積、印加電位などが一定に保たれている場合には、減衰電流をＩ、時間をｔ、分析対象物濃度をＣとした時、Ｉ＝（ｔ，Ｃ）と表すことが出来る。Ｉ（ｔ，Ｃ）はＩがｔ，Ｃの関数であることを表しており、時間ｔを一定に保つことが出来れば、言い換えれば、同一のタイミングで測定された減衰電流は、分析対象物濃度のみの関数として表すことが出来る。式で表すと、Ｉ（ｔ=一定，Ｃ）＝Ｉ（Ｃ）となる。従来のバイオセンサシステムでは、この原理が用いられている。予め電流測定の時間を決めておき、その時の電流と分析対象物濃度の相関関係を示す検量線Ｉ（Ｃ）を使って、電流と分析対象物質濃度を関連づけているのである。この時、電流測定は１回のみである。
【０００７】
複数回の電流測定を行うバイオセンサシステムが、特許公報第２６５１２７８号に開示されている。この発明では、電流測定を複数回行うことで得られた情報を異常なサンプル供給状態の検知の為に活用している。分析対象物濃度以外の情報を、電流の大きさそのものではなく、異なる時刻における電流間の関係から得ようとしている。言い替えれば、電流Ｉよりは寧ろ、時間の関数Ｉ（ｔ）から情報を得ようとする試みである。このシステムでは、連続する２回の電流測定を行い、両者の測定電流の比とその測定が行われた時間の平方根の逆数の比とを比較することによって、システムが正常に働いているかどうかの指標を得ている。これは、サンプル量半無限、電極に電位を加える直前の状態で分析対象物濃度分布一様、サンプル撹拌無し、という条件下でのポテンシャルステップ法におけるＩ（ｔ、Ｃ）の理論式が時間（ｔ）の平方根の逆数に比例していることに基づく。例えば、血液サンプルが検出電極の表面全体を覆わない場合、テスト前またはテスト中に反応域が水和した場合、さらに、リークが生じて血液サンプルが反応域内の電極だけでなく反応域の外部をも覆う場合には読取り値にエラーが生じる場合には前記連続する２回の測定で得られた電流の比とその測定が行われた時間の平方根の逆数の比とを比較することで得られた指標により、エラーが生じていることを判別することができるとしている。
【０００８】
バイオセンサシステムが正常に働いているかどうかをチェックするための他の従来技術としては、コントロール液を用いる方法が知られている。この技術は、特許公報第２６５１２７８号開示の発明とはその目的が多少異なり、主にバイオセンサシステムにおける機器が正常に働いているかどうかのチェックを目的としている。以下に、血液サンプルのグルコース濃度を定量するためのバイオセンサシステムを例として、コントロール液を用いたシステムチェックの方法を説明する。
【０００９】
コントロール液は既知のグルコース濃度に調製されており、正常なシステムがどのような応答、例えばグルコース濃度表示をするのかが予め調べられている。更にコントロール液には、血液サンプルの性状に近づけるために、水溶性高分子を加えて粘性を増しているものや、色素が加えられているものもある。システム使用者は、定期的に、あるいは必要に応じて、前記コントロール液を血液サンプルを測定するときと同様の手段で測定する。そして、システムの応答が正常なものであるかを判定する。システムの応答が正常であるか否かの判定は、コントロール液の容器や添付文書などに表示された正常範囲と実際のシステム応答値を比較することに依る。例えば、正常範囲が７０〜１２０ｍｇ／ｄＬであるコントロール液を測定したとき、システムの応答値が８０ｍｇ／ｄＬ、１１０ｍｇ／ｄＬなどであればシステムは正常に働いていると判定し、システムの応答値が５０ｍｇ／ｄＬ、１４０ｍｇ／ｄＬ等であれば、システムは異常であると判定する。このようにして、バイオセンサシステムが正常に働いているかどうかを判定するわけである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記のようにコントロール液を用いたバイオセンサシステムのチェック方法では、システムチェックのためにコントロール液を測定する場合であっても、血液サンプルなどの通常サンプルの測定であっても、システムの応答としては分析対象物質濃度の表示があるだけで同一であるため、使用者がサンプルとして何を用いたか認識していなければ、コントロール液を測定した結果であるのか、血液サンプルなどの通常サンプルを測定した結果であるのかを判別できないという問題があった。このため、例えば、血液サンプルなどの通常サンプルを測定した結果であるにも関わらずコントロール液を測定した結果であると誤認識して、又はシステムが正常であるにもかかわらず異常であると判定してしまったり、又はシステムが異常であるにもかかわらず正常であると判定してしまったり、或いはコントロール液を測定した結果であるにも関わらず血液サンプルなどの通常サンプルを測定した結果であると誤認識して、医師が間違った診断を下したりしてしまう恐れがあった。特に後者のような場合では、誤った血液検査データを基に誤った診断が下される危険性を孕み、重大であった。
【００１１】
また、システムが正常であるかどうかを判定する際にも、コントロール液容器や添付文書等に表示された正常範囲とコントロール液の測定結果を比較する必要があり、作業が煩雑であった。頻回にわたってシステムチェックを行わなければならない場合、又は複数濃度のコントロール液を用いてシステムチェックを行う場合、或いは多数のバイオセンサシステムに対してシステムチェック行わなければならない場合などで特に煩雑であった。
【００１２】
本発明の目的は、使用者に負担を掛けず、コントロール液を測定した際にはシステムが自動的に、血液サンプルなどの通常サンプルではなく、コントロール液であることを弁別してこれを表示し、使用者側の誤認識を防ぐことの出来るバイオセンサシステムを構築するための方法を提供する。併せて、煩雑な作業を伴うこと無しにコントロール液によるシステムチェックの結果を知ることの出来るバイオセンサシステムを構築するための方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、電流を測定することによって液体サンプルの分析対象物濃度を定量するバイオセンサシステムに用いられる方法であって、測定した電流とその時間微分の比を算出し、これを指標として液体サンプルとコントロール液との弁別を行う方法である。前記測定した電流の時間微分は、アナログ的に連続する測定データから得られる厳密な意味での微分であって良いし、デジタル的に不連続である測定データから実質的に微分値となるように算出されたものであっても良い。例えば、比較的短い時間の間隔で電流を測定し、両者の差を持って時間微分とすることが出来る。つまり、時間微分の定義式、ｌｉｍ（Δｔ→０）＝｛Ｉ（ｔ＋Δｔ）−Ｉ（ｔ）｝／Δｔでは、Δｔは無限小でなければならないので、不連続な測定から厳密な時間微分を求めることは不可能であるが、比較的短い時間の間隔Δｔで測定した電流から近似的に時間微分を求めることは出来るということである。また、何らかの理由でΔｔをそれほど短く出来ない場合には、例えば、３点以上の測定を行い、それらの差の移動平均を取るなどして、近似的に時間微分を求めることが出来る。こうして得られた時間微分と電流の比を取って、液体サンプルとコントロール液との弁別の指標とする訳である。時間微分と電流の比は、所望により、微分／電流であっても良いし、電流／微分であっても良く、これらに四則演算的に定数を含めても良い。それらには本質的な違いはなく、後に述べる比較値の選び方が異なるだけである。時間微分は、厳密な微分（ｄＩ／ｄｔ）であっても、近似的な微分（ΔＩ／Δｔ）であっても良く、液体サンプルとコントロール液との弁別の指標を算出する際にも、電流と時間微分の比が、｛Ｉ／（ｄＩ／ｄｔ）｝又は｛Ｉ／（ΔＩ／Δｔ）｝であっても、｛（ｄＩ／ｄｔ）／Ｉ｝又は｛（ΔＩ／Δｔ）／Ｉ｝でも良いし、これらの比をα、ａ、ｂをある定数として、（ａ α±ｂ）などとして良い。何故なら、上記のどれを液体サンプルとコントロール液との弁別の指標として選んでも  本質的な違いはなく、後に述べる比較値の取り方が異なってくるだけだからである。
【００１４】
液体サンプルとコントロール液との弁別のための他の指標を得るための方法として、前記電流とその時間微分の比を複数回算出して、それらの差を取ることもできる。電流とその時間微分の比αをｎ個（ｎ回）算出したとして、そのｋ番目、１番目をαk，α1とし、これらの差をΔαとすれば、Δα（ｋ，ｌ）＝αk−α1と表すこともできる。但し、Δα（ｋ，ｌ）の括弧は、ｋ番目とｌ番目のαの差であることを表す。この場合も、液体サンプルとコントロール液との弁別の指標を得るのに符号を変更しても差し支えなく、Δα（ｋ，ｌ）＝αk−α1であっても、Δα（ｋ，ｌ）＝α1−αkであっても良い。また、四則演算的に定数を含めても良く、ｃ、ｄをある定数として、｛ｃ（Δα）±ｄ｝を液体サンプルとコントロール液との弁別のための指標としても良い。何故なら、上記のどれを液体サンプルとコントロール液との弁別の指標として選んでも本質的な違いはなく、後に述べる比較値の取り方が異なってくるだけだからである。
【００１５】
これまで説明してきたような方法で得られた指標を比較値と比較することにより、液体サンプルとコントロール液とを弁別することが出来る。前記比較値は、実験的に求められる値であるので、本法を用いて液体サンプルとコントロール液とを弁別するには、事前に液体サンプルあるいはコントロール液がどのような指標値を取るのか調べておかなければならない。例えば、指標として電流とその時間微分の比αを用いるとしてコントロール液と液体サンプルを弁別する際には、コントロール液でα0未満，サンプルでα0以上のα値が観察されるというような閾値としてα0を比較値に選んでおけば良い。このようにして決められた比較値をシステムに予め記憶させておけば、実際の測定時に観察される指標値と比較値との比較によって液体サンプルとコントロール液との弁別が可能となる。弁別が可能であれば、その結果を前記システムに表示させることは容易である。
【００１６】
本法を用いてコントロール液であることが弁別された場合には、システムチェックの判定結果をも併せて表示することが出来る。判定結果の表示は、○や×、ＯＫやＮＧなど二者択一式にしても良いし、コントロールＨｉｇｈ・２７０ｍｇ／ｄｌ・ＯＫなど具体的に表示しても良い。
【００１７】
【発明の実施の形態】
【実施例】
以下、具体的な実施例により本発明を更に詳しく説明する。バイオセンサシステムの一例として、血液サンプルのグルコース濃度を定量するグルコースセンサシステムについて説明する。グルコースセンサシステムのテストセルであるグルコースセンサは、次のような構成のものを使用した。ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）からなる絶縁性の基板上に、スクリーン印刷によって、リード（銀）と作用極、対極を含む電極系（カーボン）及び電気絶縁層が形成されている。電気絶縁層は、作用極及び対極の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的に覆っている。このようにして形成された電極部分上に、親水性高分子であるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）層が形成されている。更にこのＣＭＣ層の上に、酵素としてのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）と電子伝達体（メディエータ）としてフェリシアン化カリウムからなる、酵素及びメディエータ層が形成されている。（以下ＣＭＣ層と酵素及びメディエータ層を併せて反応層と称する。）更に、カバーとスペーサーからなるインサートが形成されており、インサートへサンプルが触れると、毛管現象によって、反応層および電極系へ一定量として約３μＬのサンプルが供給されるようになっている。一方、測定機器としては、汎用のポテンショスタット、ＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）を使用した。通常のバイオセンサシステムであれば、一つのテストセルにそれ専用の機器が組み合わされて使用されるが、本実施例では汎用の機器を使用している。しかしながら、既知技術を用いた簡易な機器であっても、本実施例の再現実施は容易である。
【００１８】
測定サンプルは、コントロール液１、コントロール液２、血液を用いた。コントロール液１は、防腐剤として安息香酸、色素として赤色二号とグルコースが添加された水溶液である。グルコース濃度は、９７ｍｇ／ｄｌと３２５ｍｇ／ｄｌの２種類を用いた。コントロール液１の性状は、水に近く、比較的粘性が低かった。コントロール液２は、水溶性高分子であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とグルコースの水溶液である。グルコース濃度は、８３ｍｇ／ｄｌと２５６ｍｇ／ｄｌの２種類を用いた。コントロール液２の性状は、比較的粘性が高かった。血液は、血球成分濃度とグルコース濃度の異なる６種類を用いた。血球成分濃度（ヘマトクリット値で示す。）とグルコース濃度は、（３０％，１０２ｍｇ／ｄｌ）、（４４％，１０１ｍｇ／ｄｌ）、（５８％，１０３ｍｇ／ｄｌ）、（２８％，２６８ｍｇ／ｄｌ）、（４５％，２６３ｍｇ／ｄｌ）、（６２％，２６６ｍｇ／ｄｌ）であった。また、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを添加した。これらの測定サンプルをテストセルの反応層および電極系へ供給して、２５秒間電位を印加せずに静置した。この間、測定サンプル中のグルコースが、グルコースオキシダーゼの作用を介して反応層のフェリシアン化カリウムと反応し、フェロシアン化カリウムを生成する。そして、２５秒後から５秒間、作用極と対極の間に５００ｍＶの一定電位を、時間に対して矩形波的に印加し、０．１秒間隔で電流を測定した。この時観察される電流は、フェロシアン化カリウムからフェリシアン化カリウムという逆反応によるものである。この電流は、最初の反応で生じたフェロシアン化カリウムの濃度に比例しているので、この電流の測定値が測定サンプルのグルコース濃度に対応する。また、この電流は、電位印加からの時間経過に伴って減衰する減衰電流である。図１に、時間と印加電位の関係を示す。また、図２に、コントロール液１のグルコース濃度９７ｍｇ／ｄｌであるものを測定した際の減衰電流を図示する。横軸の時間単位は秒で、電位が印加された瞬間を０秒としている。
【００１９】
（演算１）
以下に示す方法で、測定サンプル弁別のための演算値を得る。尚、本実施例では電圧印加からの時間が４秒後の電流を用いているが、これに限定されることはなく、測定サンプル弁別に適した時間の電流を利用することが出来る。先ず、測定した減衰電流の４秒後の値から４．１秒後の電流を減じた差を取り、４秒後電流の時間微分とした。これは、時間微分の定義式、ｌｉｍ（Δｔ→０）＝｛Ｉ（ｔ＋Δｔ）−Ｉ（ｔ）｝／Δｔにおける、無限小のΔｔに代えて、Δｔ＝０．１秒を取り、符号を入れ替えたものに相当する。こうして得られた時間微分を分母、４秒後電流を分子とした比の値を取り、これを弁別指標α4にした。α4の添え字の４は、４秒後電流から得られた指標であることを示す。表１に各測定サンプルにおける指標α4の値を示す。尚、コントロール液１およびコントロール液２のデータは、それぞれ、測定数３０の結果であり、血液のデータは、測定数９０の結果である。表１に測定サンプル別のα4値を示す。
【表１】
0003991173.tif 000002
表１からは、コントロール液１の最小値の方が血液の最大値よりも大きいため、例えば、比較値として１１０を選べば、比較値１１０よりも大きいα4値を示すものをコントロール液１、小さいものを血液として両者を弁別することが出来る。同様にして、コントロール液１とコントロール液２も弁別可能である。しかし、コントロール液２と血液では、コントロール液２の最大値が血液の最小値よりも大きいために、弁別が不能である。
【００２０】
（演算２）
次は、演算１と同様にして得られる電流とその時間微分の比αt（ｔ秒後電流から得られるαの意）を複数求め、それらの差を測定サンプル弁別のための指標値とする場合について説明する。０．５秒、２秒について、α0.5，α2を求める。式で表せば、それぞれ、α0.5＝Ｉ0.5／（Ｉ0.5−Ｉ0.6）、α2＝Ｉ2／（Ｉ2−Ｉ2.1）と表せる。これらを求めておいて、次に、これらの差を取る。本実施例では、α2からα0.5を減じた差を取った。ｔ2秒のαt2とｔ1秒のαt1の差をΔα（ｔ1，ｔ2）のように表すとして、本実施例での演算を式で表すと、Δα（０．５，２）＝α2−α0.5＝｛Ｉ2／（Ｉ2−Ｉ2.1）｝−｛Ｉ0.5／（Ｉ0.5−Ｉ0.6）｝となる。表２に各測定サンプルにおけるΔα（０．５，２）の値を示す。尚、基としたデータは、演算１に用いたものと同一で、コントロール液２のデータは、測定数３０の結果であり、血液のデータは、測定数９０の結果である。
【表２】
0003991173.tif 000003
表２からは、コントロール液２の最大値の方が血液の最小値よりも小さいため、例えば、比較値として３０を選べば、比較値３０よりも小さいΔα（０．５，２）値を示すものをコントロール液２、大きいものを血液として両者を弁別することが出来る。
【００２１】
以上の結果から、コントロール液１，コントロール液２および血液の３つの測定サンプルを弁別することが可能となる。すなわち、本実施例に於いては、Δα（０．５，２）の値が３０未満であればコントロール液２であると判定し、３０以上であれば血液あるいはコントロール１であると判定し、更にα4の値が１１０未満であれば血液で１１０以上であればコントロール液１であると判定することが出来る。これにより、コントロール液１，コントロール液２および血液の３つの測定サンプルを弁別出来たことになる。
【００２２】
これまでに述べてきた様な方法によって、コントロール液の弁別が可能となるので、弁別結果を表示することの出来るバイオセンサシステムを構築するのは容易である。また、コントロール液を用いたシステムチェックの結果表示は、本法によって測定された測定サンプルがコントロール液であることが弁別できるので、予めシステムにコントロール液の正常範囲電流値を記憶させておけば、濃度を調べるための電流測定の結果とその正常範囲電流値を比較した結果を表示することも可能になる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることによって、使用者に負担を掛けずコントロール液を測定した際には機器が自動的に血液サンプルなどの通常サンプルではなく、コントロール液であることを弁別してこれを表示し、使用者側の誤認識を防ぐことの出来るバイオセンサシステムを構築することが出来る。併せて、煩雑な作業を伴うこと無しにコントロール液によるシステムチェックの結果を知ることの出来るバイオセンサシステムを構築することが出来る。
【００２４】
【図面の簡単な説明】
【図１】時間と印加電位の関係を表すものである。
【図２】グルコース濃度９７ｍｇ／ｄｌであるものを測定した際の減衰電流を示す
【図１】
0003991173.tif 000004
【図２】
0003991173.tif 000005