(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体を含む食用植物組織、又は哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体の部分的に精製された調製物を含む食用植物組織抽出物であって、
哺乳動物が摂取したとき効果的であり前記移植抗原又は自己抗原に対する前記哺乳動物の免疫応答を抑制又は減少させ、前記哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体を発現するトランスジェニック植物を提供することによって得られることを特徴とする、食用植物組織又は食用植物抽出物。
【請求項２】
哺乳動物の抗原が、自己抗原である請求項１に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項３】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である請求項２に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項４】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）が、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼである請求項３に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項５】
哺乳動物の抗原が、移植抗原である請求項１に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項６】
移植抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質である請求項５に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項７】
ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）が、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなる群から選択される請求項６に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項８】
食用植物が、ジャガイモ、トマト、アルファルファ及びキャノーラ（ｃａｎｏｌａ）からなる群から選択される請求項１〜７のいずれか１項に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項９】
移植抗原又は自己抗原に対する免疫応答の抑制又は減少のために使用するための、哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体を含む食用植物組織、又は哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体の部分的に精製された調製物を含む食用植物組織抽出物であって、
前記哺乳動物の移植抗原若しくは自己抗原、又はその免疫抑制性の断片若しくは誘導体を発現するトランスジェニック植物を提供することによって得られることを特徴とする食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１０】
哺乳動物の抗原が、自己抗原である請求項９に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１１】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である請求項１０に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１２】
自己抗原が、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼである請求項１１に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１３】
哺乳動物の抗原が、移植抗原である請求項９に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１４】
移植抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質である請求項１３に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１５】
ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）が、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなる群から選択される請求項１４に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１６】
食用植物が、ジャガイモ、トマト、アルファルファ及びキャノーラ（ｃａｎｏｌａ）からなる群から選択される請求項９〜１５のいずれか１項に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１７】
植物の部分、全植物タンパク質の抽出物及び部分的に精製された植物タンパク質調製物からなる群から選択される請求項９〜１５のいずれか１項に記載された食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１８】
レシピエント哺乳動物による移植されたドナー組織の拒絶を抑制するための請求項５〜７のいずれか１項に記載された食用植物組織又は植物組織抽出物。
【請求項１９】
効果的な免疫抑制量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の食用植物組織又は植物組織抽出物と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
（ａ）哺乳動物の移植抗原又は自己抗原をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合された植物プロモーターを有するＤＮＡ構築物を構築するステップと、
（ｂ）前記構築物により植物細胞を形質転換するステップと、
（ｃ）形質転換された植物細胞から、前記抗原を発現するトランスジェニック植物を再生し、免疫抑制性の植物組織を生じるステップと
を含む免疫抑制性の食用植物組織を製造する方法。
【請求項２１】
哺乳動物抗原が、移植抗原である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
移植抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）が、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物の移植抗原が、自己抗原である請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
自己抗原が、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換え哺乳動物移植抗原を発現する細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項２７】
前記移植抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質である請求項２６記載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】
前記ＭＨＣタンパク質が、ＭＨＣクラス1タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなる群から選択される請求項２７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２９】
組換え哺乳動物自己抗原を発現する細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３０】
前記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）である請求項２９記載のトランスジェニック植物。
【請求項３１】
前記植物が、食用植物である請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３２】
前記植物が、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、キャノーラからなる群から選択される請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗原として機能する哺乳類のタンパク質を発現しているトランスジェニック（遺伝子導入）植物の製造に関する。
さらに、本発明は抗原として機能する哺乳類のタンパク質を発現している植物もしくは、その植物の一部又は誘導体を経口投与して、哺乳類の抗原に対する免疫応答を抑制、又は減少させるための方法に関する。
発明の背景
自己免疫疾患及び移植における全身性の免疫抑制治療は、感染、悪性腫瘍、多くの副作用の割合が増加することが伴う。それゆえ、薬剤を使わずに抗原特異的に正常以下の反応性（hyporesponsiveness）を誘導することが望まれる。経口投与したタンパク質に対する免疫応答は、内在的に調節され、経口的寛容性（oral tolerance）と名付けられた全身性の正常以下の反応性を有する状態を誘導する（Kay et al.,（1989）,Immunology, vol.66, pp. 416-421；Peng et al.,（1990）,Clin. exp. Immunol., vol. 81, pp. 510-515；Lamont et al.,（1989）, Immunology, vol. 66, pp. 595-599）。可溶性の媒体やサプレッサーＴ細胞を含む多くの因子がこの現象に関係しているが、この効果に対し、粘液組織による抗原のプロセッシングが重要であることは明らかである。
経口的寛容性を誘導し、自己免疫疾患を防ぐ、又は軽減するために、自己免疫疾患に関係があると考えられる抗原の経口投与についての様々な実験が報告されている。
自己抗原に対する経口的寛容性は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（experimental induced allergic encephalitis；EAE）、アジュバント関節炎（adjuvant arthritis；AA）、コラーゲン誘導性関節炎（collagen-induced arthritis；CIA）、実験的自己免疫性関節炎（expirimental autoimmune uveoarthritis；EAU）を軽減することが示されている（Thompson et al.,（1990）, Immunology Today, vol. 11, pp. 396-399を参照）。EAE疾患の間に、ミエリン塩基性タンパク（myelinbasic protein、MBP）を摂取すると、その疾病の病状が変わる。複数の神経組織が硬化した患者に対する最近の臨床的な試みでは、MBPを投与された患者が、研究期間で臨床的な悪化がより軽減し、末梢血液のMBP反応性Ｔ細胞の数が減少した（Weiner et al.,（1993）, Science, vol. 259, pp. 1321-1324）。
国際特許出願公開番号WO 92/07581及びWeiner et al.（1992）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 7762-7766では、Weinerらは、組織供与体からの脾臓細胞又は脾臓細胞調製物の経口投与、又は、クラスII主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質のフラグメントと一致する短い合成ペプチドの経口投与によって、同種移植片に対する哺乳類の反応が抑制されることについて述べている。
しかしながら、この方法には、いくつかの問題がある。第一に、移植では外来ペプチドの提示が複雑であり、寛容性の誘導に適したペプチド配列のスクリーニングを困難なものにしている。
第二に、抗原に対する経口的寛容性の誘導が投与量依存的であり、不十分な量の経口抗原は腸のリンパ球を刺激し、期待とは逆に、望ましくない感作効果を引き起こす。それゆえ、大量の抗原を入手できることが必要である。
第三に、ペプチド自体の性質が免疫応答性の減少を起こすより、免疫応答性の増加を起こすことがある。
経口的寛容性を誘導するために抗原タンパク質全体を使う場合、免疫系に提示された潜在的な寛容性誘導ペプチドの配列がより多くなる。しかしながら、もし、MHCタンパク質や他の移植抗原のような複雑な抗原を無処理のタンパク質として使った場合、in vitroでの合成によって、充分な量のそのタンパク質を入手するのが困難である。
これらの問題を打破するための本願発明の方法は、先に述べた引例のどれにも示唆されていないものであり、例えば、移植抗原や自己抗原などの適当な哺乳類抗原を植物において発現すること、及び、哺乳類における同種移植片の拒絶反応や自己免疫応答を制御又は抑制するために、発現した哺乳類抗原に対する経口的寛容性を生じるべく、その植物あるいはその植物に由来する植物性物質を哺乳類に投与するものである。
トランスジェニック植物は、様々な一本鎖異種ポリペプチドを発現するために使われ、かなり好結果を生んできた（Trudel et al.,（1992）, Plant Science, vol. 87, pp. 55-67）。抗体のようなより複雑な複数鎖のタンパク質は、発現されるが、一定した結果が生じない（Swain, W. F.（1991）, Tibtech, vol. 9, p. 107）。
「食用のワクチン（edible vaccine）」を提供するために、植物体内でウイルス性の抗原を発現させることが提案されている。ウイルス性抗原を含む植物をヒトが摂取すると、免疫応答が刺激されて増加し、ウイルスに対する免疫化が与えられる。
以上に示した参照文献は、適当な哺乳類抗原を発現する植物や植物性物質を哺乳類に投与することによって、哺乳類が免疫応答を減少又は抑制することを提案するものではない。
発明の要旨
本発明のある実施様態では、移植抗原や自己抗原のような哺乳類の抗原をコードするＤＮＡ配列を適当な植物に導入するために、新規のプラスミドが構成される。
本発明の他の実施様態では、移植抗原や自己抗原のような哺乳類の抗原をコードするＤＮＡ配列がゲノムに挿入された、新規のトランスジェニック植物が提供される。その植物は、挿入されたＤＮＡ配列を発現でき、その配列がコードしている抗原を産生できる。
本発明のさらに他の実施様態では、抗原に対する哺乳類の免疫応答を抑制又は減少する方法が提供される。その方法は、哺乳類に効果的な量の抗原を含有する効果的な量の植物組織を、経口的又は腸から投与することを含む。植物組織は、発現可能な異種抗原の遺伝子をゲノム中に持つトランスジェニック植物から得られる。
本発明の好適な実施様態では、自己抗原に対する哺乳類の自己免疫応答を制御又は抑制する方法が提供される。その方法は、自己抗原を発現している効果的な量の植物組織を経口的又は腸から哺乳類に投与して、自己免疫応答を制御又は抑制することを含む。
図面の説明
付随する図面を参照することによって、本発明のある実施態様を詳細に説明する。
図１は、天然のマウスMHCクラスIIα又はβｃＤＮＡの一般的な模式図を示す。
図２は、植物発現ベクターにおける本発明のあるMHCクラスIIα又はβ遺伝子の構成物の模式的な図を示す。
SSは、マウスのシグナル配列、
TMは、膜貫通配列、
CYTOは、細胞質尾部、
SSは、大麦のα−アミラーゼシグナル配列である。
図３は、プラスミドpSM150の構成を模式的に示す。このプラスミドは、線状に示されている。
図４は、プラスミドpSM151の構成を模式的に示す。
図５は、プラスミドpSMA311とその誘導体を模式的に示す。
図６は、マウスMHCα鎖の導入遺伝子を担持する植物から得たＤＮＡフラグメントのサザン・ブロットを示す。
レーン４は、コントロール（対照）であり、プラスミドpSM151から得られた、EcoR1/HindIII末端を持つ1.8kbのＤＮＡフラグメントである。
レーン１〜３は、形質転換された３つの代表的なタバコから得られたα鎖ＤＮＡである。
図７は、マウスMHCβ鎖導入遺伝子を担持する植物から得たＤＮＡフラグメントのサザン・ブロットを示す。
レーン６は、コントロール（対照）であり、プラスミドpSM152から得られた、EcoR1/HindIII末端を持つ1.8kbのＤＮＡフラグメントである。
レーン１〜４は、形質転換された４つの代表的なタバコから得られたβ鎖ＤＮＡである。
レーン５は、不完全な消化のために生じやすい、より大きいサイズのＤＮＡフラグメントである。
図８は、α鎖遺伝子による形質転換体のノザン・ブロット解析を示す。
レーンＣは、マウスの脾臓細胞のポジティブコントロールＲＮＡ。
レーン１〜１４は、α鎖プラスミドで形質転換された各々のトランスジェニック系列である。矢印は、1.25kbのキメラα遺伝子転写物を示す。
図９は、β鎖遺伝子による形質転換体のノザン・ブロット解析を示す。
レーンＣは、マウスの脾臓細胞のポジティブコントロールＲＮＡである。Ｃは、マウスの脾臓細胞から抽出されたＲＮＡ。
レーン１〜１６は、β鎖プラスミドで形質転換された各々のトランスジェニック系列である。矢印は、1.4kbのキメラβ遺伝子転写産物を示す。
図１０は、α鎖遺伝子による形質転換体のウエスタン・ブロットを示す。
レーンＣは、形質転換していないコントロール（対照）植物である。
レーン１〜５は、各々のトランスジェニック系列から得られた抽出物である。矢印は、38kDaのα鎖ポリペプチドの期待される大きさを示す。他のバンドは、非特異的なものである。
図１１は、β鎖遺伝子による形質転換体のウエスタン・ブロットを示す。
レーンＣは、形質転換していないコントロール（対照）植物を示す。
レーン１〜５は、各々のトランスジェニック系列から得られた抽出物である。矢印は、28kDaのβ鎖ポリペプチドの期待される大きさを示す。他のバンドは、非特異的なものである。
図１２は、プラスミドpSM215の構成を模式的に示す。
パネルＡは、マウスGAC65 ｃＤＮＡの地図を示す。
パネルＢは、発現ベクターpSM215の地図を示す。
図１３は、トランスジェニックタバコにおけるマウスのGADの発現についてのノザン・ブロット解析を示す。全ＲＮＡは、トランスジェニック（遺伝子導入）した葉から抽出され、その25μｇがゲルにロードされた。ブロッティングの後、膜は、32Ｐで標識されたGAD ｃＤＮＡとハイブリッド形成された。
レーンＣは、形質転換していないコントロール（対照）植物である。
レーンP1〜P12は、pSM215による形質転換の後に選ばれた各々のトランスジェニック系列である。矢印は、2.0kbのキメラGAD ｍＲＮＡの転写産物の大きさを示す。
図１４は、形質転換体におけるマウスGADの発現のウエスタン・ブロットを示す。
レーンＣは、形質転換していないコントロール（対照）植物である。
レーンＰは、精製したマウスGAD（100ng）である。
レーン１は、トランスジェニック系列P1からの抽出物である。
レーン２は、トランスジェニック系列２からの抽出物である。
レーン３は、トランスジェニック系列４からの抽出物である。
レーン４は、トランスジェニック系列７からの抽出物である。
レーン５は、トランスジェニック系列９からの抽出物である。
レーン６は、トランスジェニック系列１２からの抽出物である。
タンパク質の大きさの基準を、図の左側に示す。
図１５は、抗GAD抗体及び化学蛍光二次抗体で調べられた葉を示す。Ａはトランスジェニックしたタバコの葉であり、Ｂはコントロール（対照）の形質転換していない葉である。
発明の詳細な説明
本願発明は、植物を形質転換し、所望のタンパク質やポリペプチド、又は、免疫抑制的で寛容性を誘導するフラグメント、又は、これらのタンパク質やペプチドの誘導体を生じることによって、ヒトを含む哺乳類における経口的寛容性の誘導に適した量の、免疫応答を誘発するタンパク質又はポリペプチドの生産方法を提供する。
そのような免疫応答誘発タンパク質の例としては、移植された組織に対する反応を誘発し、移植片の拒絶反応を引き起こす移植抗原、又は、哺乳類自身の組織に対する免疫応答を誘発し、自己免疫疾患を引き起こす自己抗原を含む。
本発明は、選ばれた免疫応答誘発性タンパク質やポリペプチド、又は、免疫抑制的フラグメントやその誘導体を組織中で発現するように形質転換された植物に由来する植物性物質を、経口的に、又は腸から哺乳類に投与することによって、哺乳類における選ばれた免疫応答誘発タンパク質又はポリペプチドに対する寛容性を誘導する新規の方法を提供する。
本発明の経口的、又は腸からの投与のための植物性物質は、所望のタンパク質を含む植物組織、又は、例えば葉、根茎など植物の一部、その植物由来のタンパク質の調整物や抽出物を含む。植物の部分は、生、又は最小限の台所の調理の後、消費してよい。植物の調製物又は抽出物は、全植物タンパク質を含んでもよいし、興味あるトランスジェニックタンパク質の精製、又は部分精製した調製物を含んでもよい。
免疫応答誘発タンパク質又はポリペプチドの「免疫抑制的フラグメント」とは、そのタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の部分を意味し、哺乳類に経口的もしくは腸から投与したとき、その哺乳類にそのタンパク質又はポリペプチドに対する免疫応答の寛容又は抑制を誘導できる。
免疫応答誘発タンパク質又はポリペプチドの「免疫抑制的誘導体」とは、哺乳類に経口的又は腸から投与したとき、そのタンパク質又はポリペプチドに対する哺乳類の免疫応答の寛容又は抑制を誘導する能力を保持する類似物を意味する。
外来の抗原は、特異的な抗原提示細胞（APC）によって、小さいフラグメントに消化され、そのフラグメントと主要組織適合性複合体（MHC）分子が細胞内で結合し、細胞表面で提示された後に、哺乳類のＴ細胞によって認識される。（Hamilos, D. L.,（1989）, Cell. Immunol., 8, 98-117；Schwartz, R. H.,（1990）, Science，248, 1349-1356）。APC表面におけるこの二分子複合体（抗原−MHC）の認識は、Ｔ細胞の活性化を起こす。CD4とＴ細胞によるクラスII MHC分子の認識は、結果として増殖となり、逆に、CD8とＴ細胞は、抗原−クラスI複合体を担持した細胞に出会ったとき、標的細胞の死を起こす。この相互作用の選択性は、MHC分子の特異的領域をかみ合わせるCD4とCD8のアクセサリー分子により決定される（Robey, E. et al.,（1991）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 608-612）。
主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属するMHCの多型性の遺伝子にコードされ、絶対に必要な膜貫通タンパク質である。それらは、２本の鎖、すなわち、α（34〜38kDa）とβ（26〜28kDa）からなり、それぞれ、膜貫通領域と短い細胞内尾部によって細胞表面に固定されている２つの外側のドメインからなる（Germain, R. N. et al.,（1986）, Ann. Rev. Immunol., 4, 281-315）。ヒト及びマウスではともに、α鎖は、実質的に、非多型性であり、α鎖間で配列の変化がほとんどない（Estess, P. et al.,（1986）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3594-3598）。一方、β鎖は大いに多型性に富み、関連のあるヘテロダイマーの同一性を決定する。
同系移植片の拒絶の抗原の特異性は、完全に理解されてはいないが、免疫応答に媒介されるほとんどの細胞におけるMHCクラスII分子の関係は明らかであり、モノクローナル抗体によるクラスII分子のターゲッティングによって、移植片の拒絶が弱まることがわかっている。
ヒトを含む哺乳類における移植片の拒絶の制御及び抑制のために、MHCクラスI又はクラスIIタンパク質のような移植抗原が経口的寛容性の誘導に適切な因子である。
本発明の方法は、それぞれ異なるヒトのMHCタンパク質又はサブユニット鎖を発現することのできる形質転換植物のバンクを進めることも含めている。例えば、クラスIIのヒトMHCタンパク質のDR、DQ、DP領域のために、約２０〜３０タイプのトランスジェニック植物の集合が作られる。そのような植物性物質の集合から、寛容性を誘導したい抗原に対する所望の移植抗原を選ぶ。
クラスIのヒトMHCタンパク質には、より大きい形質転換体の集合、おそらく６０〜７０タイプの集合が必要である。一方、抽出物のような植物性物質を、調製し、貯蔵することもできる。
寛容性を誘導するある方法は、移植された患者に自己MHCタンパク質又は免疫抑制フラグメント又はその誘導体を投与することである。
一方、移植された患者は、MHCタンパク質、もしくは、供与組織と一致するタイプの免疫抑制フラグメント又は誘導体を投与される。
トランスジェニック植物性物質の選択は、供与組織のMHC発現に関係し、移植の前に組織のタイプ分けが確立される。
効果的な量の所望の移植抗原を含む、適当に形質転換された植物から得られる植物性物質又は精製されたタンパク質、もしくはその抗原の免疫抑制フラグメント又はその誘導体が、移植又は植皮の前に移植又は移植皮を受ける患者に経口的又は腸から投与され、その後も毎日投与が続けられる。
多くの疾病の原因が自己免疫であると考えられ、疑わしい自己抗原が多くの場合同定されている。自己抗原が明らかになっていない場合でさえ、自己免疫疾患の免疫応答におけるMHCクラスII分子が関与しているので、これらの分子がこの疾患を良好にするために寛容性を誘導するための候補者となる。
それゆえ、自己免疫疾患は、本発明で適当に形質転換された植物から得られる植物性物質を投与することによる、MHCクラスIIタンパク質に対する寛容性の誘導によって、制御又は抑制される。
一方、自己免疫応答に関与する自己抗原が同定されている場合、植物は本発明の方法によって形質転換され、自己抗原もしくはその免疫抑制フラグメント又は誘導体を発現する。自己免疫疾患は、寛容性を誘導するための形質転換体から得られる植物性物質の経口的又は腸からの投与によって治療される。例えば、ミエリン塩基性タンパク質は、多発性硬化症（multiple sclerosis）の治療に使われ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）又はインスリン細胞特異的抗原は、糖尿病の治療に使われ、チログロブリンは甲状腺炎の治療に使われ、コラーゲンはリューマチ性関節炎の治療に使われる。
自己免疫疾患又はその前臨床期が診断されてからすぐに、治療が開始される。
特別の自己抗原に関する自己抗原が同定された時、適切な植物の形質転換体が本発明の方法で調製され、治療用の投与のために準備された植物又は植物性物質が維持される。
インスリン細胞抗原（ICA）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）（GAD）、インスリン、熱ショックタンパク質、インスリン細胞顆粒関連抗原など、いくつかの推定インスリン細胞「自己」抗原が同定されている（Harrison, L. C.（1992）, Immunol. Today, 13：348）。GAD65は、ヌードマウスにおける免疫応答を誘発する最も初期の抗原であると示唆されている（Tisch, R., X.-D. Yang, S. M. Singer, R. S. Liblau, L. Fugger and H. O. McDevitt,（1993）, Nature, 366：72）。また、明らかなインスリン炎は、GAD、インシュリン、インシュリン細胞由来グリコプロテイン（p69）のようないくつかのβ細胞タンパク質に対する自己抗体の出現より先に現れる。このことから、GADは、糖尿病に関係のある自己抗原である可能性が示唆される。
発明者らは、植物細胞宿主における所望の抗原をコードする哺乳類遺伝子の導入用及び発現用の新規の組換えベクターを作り出した。
本発明のある実施様態では、選ばれた哺乳類抗原をコードしているｃＤＮＡ配列は、植物細胞においてプロモーター機能（本明細書中では、他に記載のない限り、「植物プロモーター」とする）が制御された条件下で、転写終了配列の機能と合う読み枠に適切に合うように、ＤＮＡ構成物に挿入され、植物細胞内で哺乳類ＤＮＡを発現する。
当業者に容易に理解されるように、植物由来のプロモーター及び植物ウイルス由来のプロモーターを含む様々な植物プロモーターが、植物において哺乳類遺伝子を発現するように使われる。
哺乳類の転写終了配列が植物において機能し、使われうるにもかかわらず、哺乳類の３’非翻訳配列を取り除き、植物遺伝子の転写終了配列、植物ウイルス遺伝子の転写終了配列、又は、アグロバクテリウムの転写終了配列と置き換えることが望ましい。
本発明の好ましい実施態様では、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター及びノパリン（nopaline）シンターゼ・ポリアデニル化終了配列の制御下で、選ばれた哺乳類抗原をコードするｃＤＮＡ配列が挿入される組換えベクターが提供される。
本発明の他の実施態様では、35Sプロモーターの制御下のｃＤＮＡ配列がMHCα鎖又はMHCβ鎖のどちらかをコードするｃＤＮＡ配列であるベクターが提供される。
本発明の他の実施態様では、例２に示されるように、哺乳類のシグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、哺乳類の抗原のＤＮＡから取り除かれ、植物のシグナル配列と置き換えられる。その場合、大麦αアミラーゼシグナル・ペプチドをコードする配列が適している。他の適したシグナル・ペプチドをコードするＤＮＡは、例えばタバコの病原体耐性タンパク質（PRタンパク質）シグナル・ペプチドなど、当業者にとってよく知られている。
本発明の他の実施態様では、例３のように哺乳類のＣ末端細胞質ドメインをコードしているＤＮＡ配列が、プラスミドにｃＤＮＡを挿入する前に、取り除かれる。
同様な手段によって、自己抗原又は移植抗原のような選ばれたヒト抗原をコードする遺伝子又はｃＤＮＡ配列は、その抗原を発現するトランスジェニック植物を調製するために、本発明の組換えベクターに導入される。
本発明の新規のベクターは、当業者に公知である各種の方法によって、選ばれた植物を形質転換するのに使われる。
本発明の好適な実施態様では、所望の抗原をコードするＤＮＡを担持するプラスミドは、Zambryski（1988）, Ann. Rec. Genet., vol.22, p. 1に述べられたように、アグロバクテリウムを介した遺伝子移入によって、植物にトランスフェクトされ、植物ゲノムの中に組み込まれる。
タバコを用いたモデルシステムでは、本発明のプラスミドは、Horsch et al.,（1985）, Science, vol. 227, pp. 1229-1231のリーフディスク（leaf disk）形質転換法によって導入される。
トランスフェクションに用いられたプラスミドに適当なマーカー遺伝子を一緒に入れることは、当業者にとって公知であり、本明細書の例に示されるように、トランスジェニック植物の選択に差し支えない。
アグロバクテリウムを介した遺伝子移入が好ましいが、哺乳類の抗原ＤＮＡを適切な植物に導入する他の適当な方法は、当業者にとって公知である。そのような方法は、ポリエチレングリコール（PEG）を介する遺伝子移入、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、リポゾーム融合、マイクロインジェクション、及びパーティクルガン法を含む（37，38）。
発明者は、例６に示すように、マウスのMHCIIα及びβ鎖タンパク質の遺伝子をタバコのゲノムＤＮＡにうまく導入した。
タバコは、ニコチンやアルカロイドのような物質があるため、食べるには適した植物ではないが、このシステムは、MHCタンパク質のような哺乳類の抗原が植物組織に導入でき、適当なトランスジェニック植物又はそのような植物由来の植物性物質を経口的又は腸から投与して、所望の抗原に対する経口的寛容性を起こす手段を与えた。当業者にとってよく知られるように、哺乳類の所望の抗原を生産するトランスジェニック食用植物を製造するために、同様な方法を使うことができる。そのような植物は、例えば、トマト、アルファルファ、及びジャガイモ（potato）などや、あるいは毒性のない、低アルカロイド株のタバコなどを含む。例で述べるように、哺乳類のGADの遺伝子を担持するベクターは、ジャガイモにトランスフェクトされ、形質転換体が得られる。
本発明の他の実施様態では、例７に示すように、植物プロモーターの制御下で、マウスのMHCをコードするｃＤＮＡ配列が発現ベクターに挿入され、アグロバクテリウムを介したトランスフェクションによって、タバコを形質転換するために使われる。
ウエスタン・ブロットによるトランスフェクトされたタバコの葉組織から得られた全タンパク質の抽出物の実験では、抗GAD抗体プローブとハイブリッド形成するタンパク質のバンドが示され、そのバンドの分子量はコントロールの精製マウスGADと一致した。図１５に示すように、形質転換された葉全体の組織プリントは、異種哺乳類タンパク質が葉の組織にほぼ均一に広く分布することを示した。
得られたウエスタン・ブロットのバンドと精製マウスGADの既知の量、又は、形質転換した葉の抽出物からのマウスGADの量の走査型デンシトメトリーにより比較して、形質転換した植物における哺乳類のタンパク質の産生量が計算された。マウスのGADタンパク質は、葉の全溶性タンパク質のうち約0.4％であると計算された。
この印象的な発現量は、約30ｇｍの葉を摂食することによって、抗原の寛容性を生じる投与量をヒトの患者に投与できることを示している。
形質転換体から得られた発現しているMHCクラスIIα鎖及びβ鎖のウエスタン・ブロットの視覚的な解析によって、トランスジェニックタンパク質が同じ量だけ産生されていることが示めされた。
本発明の他の実施態様では、例８に示すように、ヒトのGADをコードするｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、アグロバクテリウムを介したトランスフェクションによってトランスジェニックトマトを作り出すのに使われる。
トランスジェニックした澱粉性根茎は、異種タンパク質を製造するために、あまり費用がかからないバイオマスの供給源を提供する。
本発明の実施態様にさらに示されるように、所望の抗原を発現するトランスジェニック植物は、ウエスタン・ブロッティングによって植物抽出物を調べて同定され、簡便な技術によって、適当な抗体を用いて発現した抗原が検出される。
ヒト又はマウスMHCIIタンパク質のように寛容性が望まれる抗原がヘテロダイマー構造を取る場合、例６に示すように、それぞれのタンパク質鎖をコードするＤＮＡを担持し、異なるマーカー遺伝子で選択する二つのベクターによって、植物組織を引き続き形質転換し、その植物に成熟型抗原を産生させてもよい。あるいは、各鎖のＤＮＡを別々の植物に導入し、標準的な技術によって、「一本鎖を持つ」植物を雑種交配して（cross-pollination）、成熟型タンパク質を製造する雑種つくってもよい。
患者に特定の哺乳類の抗原に対する経口的寛容性を起こすために、発現した抗原を含むトランスジェニック植物組織を、患者に効果的な量だけ経口的又は腸から投与する。
一方、食用とならないトランスジェニック植物が哺乳類の抗原の製造に使われるなら、経口的又は腸からの投与の前に、標準的な方法によって所望のように抗原を植物組織から抽出し、精製する。
例１
植物へMHC遺伝子を導入するために新規なプラスミドが作られた。作られたベクターは全て、35S-35Sプロモーター、マルチクローニングサイト、及びノパリン（nopaline）シンターゼアデニル化終止配列を共に有している。２個の独立した選択可能なマーカー、カナマイシン（kanamycin）とハイグロマイシン（hygromycin）が使用された。
pSM150の作成：Plant Biotechnology Institute, NRC Canada, SaskatoonのDr. R. S. Datlaが、pBI4104プラスミドに由来する650bpのHindIIIとBamHI断片を提供してくれた（Datla et al.,（1991）, Gene, v. 101, pp. 239-246；Hobbs et al.,（1990）, Plant Cell Reports, v. 9, pp. 17-20）。この断片は、二重エンハンサー配列を有するカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35Sプロモーターと、それに続く5'非翻訳アルファルファ・モザイク・ウイルス（AlMV）RNA4リーダー配列とを有しており、pUC19のポリリンカー内へとクローニングされた。
完全な発現カセットを作るため、ノパリンシンターゼのポリアデニル化シグナルを表す260bpのSstIとEcoRIの断片をも、pUC19のポリリンカーに結合させた。35S二重エンハンサーと3'-nosがついたクローニングに適した残りの制限部位には、BamHIや，SmaI，AvaI，KpnI，SacIを含む。pSM150は、最初の植物発現ベクターとして、キメラ・マウスのクラスII MHC I-Aα及びβ遺伝子の作成に用いた。プラスミドの作成の概略を図３に示す。
pSM151の作成：マウスのクラスII MHC I-Aα遺伝子サブユニットのためのcDNA配列の全長は、the Harvard School of Public HealthのDr. Laurie Glimcherから得た。このcDNAは、1-Aαkハプロタイプの分子をコードする。
このcDNAは、図１に概略を示した様に、非損傷リーダーペプチド、膜内外スパニング部分、及び細胞質テールを有する成熟タンパク質をコードする。α鎖において、リーダーペプチドは、69個の塩基対によりコードされている。全長cDNA配列は、約1.1kbの大きさの単一のEcoRI断片として、単離された。DNAポリメラーゼIのクレノウ（klenow）酵素によるギャップを埋めるための処理の後に、pSM150のBamHI部位へと平滑末端でライゲーションした。完全な遺伝子カセットが、EcoRIとHindIIIにより単一断片として切り出され、バイナリー・シャトルベクターpBIN19の同じEcoRIとHindIIIの部位へと結合された。カナマイシン・マーカー遺伝子を有しているこの新たなプラスミドは、pSM151と命名され、図４に示されている。
pSM152の作成：マウスのクラスII MHC I-Aβ遺伝子サブユニットの全長cDNA配列は、Dr. Laurie Glimcherから得ることができた。約900bpsの単一のEcoRI断片として残った。I-Aβ遺伝子をpSM150に挿入するためには、このEcoRI断片をゲルにより精製し、クレノウ（klenow）断片で満たし、平滑末端でラィゲーションした。完全な遺伝子カセットは、EcoRI及びHindIIIにより単一の断片として切り出され、pSM151の場合と同様、PBIN19へと再クローニングして、pSM152を得た（図２）。
全ての構成物について、配列を調べることにより、処理後のMHCの一体性を確認した。
例２
マウスのMHC IIα鎖及びβ鎖のcDNAを、天然のリーダーペプチド配列を除去し、図１に示されるような植物特異的なシグナル・ペプチド配列により置き換えた。オオムギ（barley）αアミラーゼのシグナル・ペプチドをコードするDNA配列は、Washington UniversityのDepartment of BiologyのDr. John C. Rogersから得た。
pSM155の作成：
シグナル配列を、オオムギαアミラーゼcDNAクローンから、２個の合成プライマーを用いて、PCR構成物として単離した。前進プライマー（5'-CGGATCCGGCGCGCGCCATGGGGAAG-3'）は、クローニングのために5'末端に付加されたBamHI部位を有しており、逆プライマー（5'-GGAATTCCCGGGCGCCGGACGCCAAACCCGGCGAG-3'）は、２個の工学的に操作された制限部位、EcoRI及びNarIを有している。EcoRIは、サブクローニングにおける便宜のために用いられ、他方、NarIは、融合のための部位として用いられる。PCR構成物を単離し、BamHIとEcoRIにより消化し、pBluscriptII（Stratagene, NarI部位を全く持たない大腸菌プラスミド・ベクター）へとクローニングして、中間体プラスミドpBluscriptII-10を形成した。
マウスのIIα鎖の成熟したペプチド配列（天然のタンパク質からシグナル・ペプチドをとったもの）をコードするDNA断片を、PCRにより、次の２個の合成プライマーを用いて作成した。すなわち、その5'に適合性のNarI部位を含む5'GGGCGCCGAAGACGACATTGAGGCCGAC-3'（前進反応）と、5'末端に結合したEcoRI部位を有していた5'-CGAATTCTCATAAAGGCCCTGGGTGTCT-3'（逆反応）である。PCR生成物は、EcoRIとNarIの断片として、レスキュー（そのまま回収）された。
このレスキューされたEcoRIとNarIの断片を、EcoRIとNarIにより消化することにより予め線状にしたpBluscriptII-10へと結びつけた。キメラα遺伝子配列を含んでいるこのcDNA断片を、BamHI及びEcoRVにより切り出し、BamHI及びSmaI部位でpSM150へとサブクローニングした。完全な発現カセットを、HindIII及びEcoRIによる消化に続いて放出させ、pBIN19へと再クローニングし、pSM155（図２）を得た。
pSM156の作成：
I-Aβ遺伝子の天然シグナル配列をオオムギαアミラーゼのシグナル配列（図２）により置き換えることにより作成した。方法としては、pSM155の作成の場合と、ほぼ同じであった。２個のプライマーを成熟したβ遺伝子コード配列の単離のために使用した。すなわち、5'-GGGCGCCGAAGACGACATTGAGGCCGAC-3'（前進プライマー）と5'CGAATTCTCATAAAGGCCCTGGGTGTCT-3'（逆プライマー）である。
例３
pSM151-delの作成：pSM151-delは、図１にあるように、ｃ末端細胞質領域を決定するDNA配列が欠失いるI-Aα遺伝子の切り詰められた形のものを含んでいる。これは、1.1kbのEcoRI断片をpUC19にクローニングした後、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅によって得られた。M13/PUCユニバーサル・プライマー（5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'）を、前進プライマーとして用いた。ヌクレオチド715と732間のI-Aαコード化配列に対応する逆プライマー（5'-CGAATTCTCACAGGCCTTGAATGATGAAGAT-3'）は、その後にEcoRIクローニング部位が続く、733位のヌクレオチドで始まる終止コドンTGAを導入する。切り詰められた遺伝子を、２５サイクルの加熱（94℃、１分）と、アニーリング（55℃、1.5分）と、エクステンション（72℃、2分）とにより、増幅した。この反応生成物を作成し、EcoRIにより消化し、クレノウ断片により端部を平滑化し、まずpSM150に挿入し、そして、発現カセット全体を、EcoRI及びHindIIIの断片として、再度単離し、pBIM19へとサブクローニングし、pSM151-delを得た（図２）。
pSM152-delの作成：pSM152-delは、除去されたｃ末端細胞質ドメインを決定するDNA配列を有している切り詰められたI-Aβ遺伝子を含んでいる（図２）。これは、pSM151-delを作成するのに用いたのとほぼ同じやり方で達成できた。前進プライマーとして、M13/pUCユニバーサルプライマーを用いた。715と735の位置でのI-Aβ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な逆プライマー（5'-CGAATTCTCAGATGAAAAGGCCAAGCCCGAG-3'）により、同じEcoRIクローニング部位に続いて、ヌクレオチド715の後にTGA終止コドンを導入した。
例４
pSMA331の作成：pSMA331は、Agrobacterium tumefaciensのバイナリー・プラスミドベクターpBI4104から得た。完全なNPTII-GUS遺伝子発現カセットを除去し、M13 tq131からの62kbのポリリンカーにより置き換えた。その結果得られるプラスミドを、pSMA315として消化した。35S二重エンハンサープロモーター及び3'-NOSターミネーターを含む発現カセットを、pSMA315のEcoRI-HindIII部位へとクローニングして、pSMA325を形成した。ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（hpt）を有する2.2kbのBamHI断片を、pGL2から単離し（Zyprian et al., Plant Mol. Biol.（1990）15：245）、DNAポリメラーゼIのクレノウ酵素により満たし、pSMA325のBamHI部位内へと平滑末端でライゲーションした。利用できるユニークなクローニング部位としては、BamHI，SamI，XmaI，及びKpnIが含まれる。pSMA331においては、ハイグロマイシン遺伝子を、植物形質転換体の選択のためのマーカー遺伝子として使用する。pSMA331は、RK2複製の原点と伝達可能な（mobilization）ヘルパーの機能を含んでいる。pSMA331の作成を、図５に示す。
マウスのクラスII MHC I-Aα遺伝子サブユニットのDNA配列（例１におけるような）、キメラα遺伝子配列（例２におけるような）、及び、切り詰められた遺伝子配列（例３におけるような）をpSMA331へと挿入して、図５に示すような、pSMA331-1、pSMA331-1-del、pSMA331-155をそれぞれ得た。
例５
α鎖：異なる形態のMHC IIα鎖を含むpSM151や、pSM151-del、pSM155のプラスミドを、Agrobacterium tumefaciens株LBA4404へと、三元プラスミド・トランスファー法（triparental plasmid transfer method）（Ditta et al.,（1980）, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 77, pp. 7347-7351）により、個別に伝達し、そのプラスミド受容体（exconjugant）を、葉ディスク法（leaf disk method）（Horsch et al.,（1985）, Science, vol. 227, pp. 1229-1231）によりタバコNicotiana tabacumの栽培品種SR1の形質転換のために用いた。転換された葉ディスクの新たな植物への再生を、Horschらに準じて行った。
形質転換体の一次スクリーニングを、カナマイシンを加えたMSO培地上でのカルス形成により行った。
β鎖：MHC IIβ鎖遺伝子の異なる形態を含んでいるpSM152や、pSM152-del、pSM156のプラスミドのAgrobacteriumへの伝達及びタバコSR1の形質転換を、α鎖について説明したように行った。
植物としてのタバコを、α鎖遺伝子とハイグロマイシンマーカー遺伝子、そして、β鎖遺伝子とカナマイシンマーカー遺伝子をそれぞれ含む２つのAgrobacterium tumefaciens株により連続して形質転換した。使用されたプラスミドのペアは次のようなものである。すなわち、pSM152β鎖とpSMA331-1（pSMA331でクローニングした全長Aαk遺伝子）、pSM152-delとpSMA331-1-del（使用したベクター以外はpSM151と同じ）、及び、pSM156β鎖キメラ遺伝子とpSMA331-155（使用したベクター以外はpSM155と同じ）である。形質転換体の一次スクリーニングは、カナマイシンとハイグロマイシンの両方を加えたMSO培地上のカルス形成に基づいて行った。
マウスのMHCクラスIIタンパク質のα鎖遺伝子とβ鎖遺伝子の両方を含んだベクターが作成された。ここで、各遺伝子は、Ehn-35SプロモーターとNOS-ter終止配列との間に挿入され、２個のカセットはプラスミド中で連続していた。このベクターは、タバコに上記のように導入され、遺伝子導入植物が得られた。
例６
全長α鎖又は全長β鎖により形質転換され（Ehn-35Sプロモーターのコントロールのもとで、そしてNOS-ter終止配列により）、再生された植物としてのタバコを、MHC IIα又はβ鎖遺伝子の非損傷のコピーがあるかないか、サザン・ブロット法により調べた。Draperらにより記載された（Draper et al.（1998）,”Plant Genetic Transformation and Gene Expression：A laboratory manual”, Blackwell, Oxford）標準的な方法により2.0〜2.5グラムの葉組織から、全植物ゲノムDNAを抽出した。DNA断片を、EcoRI又はEcoRIとHindIIIのいずれかにより消化後、アガロースゲルの上で分離し、ナイロン膜へと移し、Sambrook et al.,（1989）,”Molecular Cloning：A laboratory manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbour Lab. Press, N. Y.に記載されているサザン・ブロット法により、α鎖遺伝子又はβ鎖遺伝子のいずれかに特異性のある32Pで標識したDNAプローブによりプローブした。
全長α鎖遺伝子により形質転換された植物において、EcoRI及びHindIIIにより消化されたとき、単一のハイブリダイゼーションバンドが、予想された1.8kbの大きさに見いだされた。このことは、α鎖遺伝子が植物の核ゲノムに非損傷DNA配列として組み込まれていることを示す（図６）。対照の非遺伝子導入植物は、ハイブリダイゼーションのシグナルを示さなかった。形質転換した植物をEcoRIのみにより消化した場合、約4.5から5.0kbにおいて単一のバンドがみられた。このことは、これらのDNAの単一コピーが組み込まれていることを示している（データは図示しない）。同様の結果が、β鎖遺伝子導入植物（図７）からも得られ、単一コピー挿入をやはり示した。
上記のSambrookの文献に記載されたようにして、ノーザンブロット分析を、遺伝子導入植物の葉組織の全RNA抽出物に対して行い、α鎖（図８）とβ鎖（図９）の遺伝子導入mRNA転写物の安定な蓄積が示された。
上記のSambrookの文献に記載されたようにして、ウエスタンブロット分析をも行った。タンパク質を、従来からある方法により、全長α鎖又は全長β鎖形質転換体から得た2.0から2.5グラムの葉組織から抽出した。タンパク質30μgを、12%SDS-PAGEゲル上において分離し、ゲルをα鎖又はβ鎖ポリペプチドに対する抗体によりプローブした。その結果、適切な期待された大きさのユニークなタンパク質バンドの存在が、図１１及び図１２にそれぞれ示すように、明らかになった。
例７  タバコ中のGAD
University of Western OntarioのDr. B. SinghからマウスのGAD65をコードする全長cDNAを得た。プラスミド発現ベクターpSM215を、図１２に示すように作成した。図のＡに示したNcoI制限部位を部位指向性の突然変異誘発により作成し、翻訳開始部位の一部として用いた。部位指向性の突然変異誘発は、ファルマシア社から購入した反応キットを製造者の指示に従って用いて行った。使用したプライマーは、新たなNcoI制限部位を含む5'-GACCACCGAGCCATGGCATCTTC-3'であった。修飾したマウスDNAを、pSM150プラスミドへとクローニングした。翻訳開始部位（ATG）と翻訳停止部位（TGA）が示されている。このGAD cDNAを、カリフラワー・モザイク・ウイルス35SプロモーターであるEhn 35Sと、ノパリン（nopaline）・シンターゼのトランスクリプション（転写）終止配列（NOS-ter）との間に挿入した。
例４及び例５に記載したアグロバクテリウムによる形質転換により、ベクターをタバコにトランスファーした。カナマイシンを用いたスクリーニングにより、形質転換された植物が選ばれた。
形質転換体の葉組織からRNAを抽出して、ノーザンブロット分析を行った（1レーンあたり25μgのRNA、32P-GAD cDNAでプローブした）。多くの形質転換体について、図１３に示すように、GAD65のmRNAに予想される2kbの大きさに強いバンドがみられた。
形質転換した植物の葉組織からの全タンパク質の抽出物を、抗マウスGAD抗体をプローブとして用いて、ウエスタンブロット分析（1レーンあたり30μg）により調べた。図１４に示されているように、精製されたマウスGAD（レーンP：100ngタンパク質）を用いて得られた対照バンドと大きさは同一である、約64kDaのユニークなポリペプチドが、多くの形質転換体についてみられた。非形質転換の対照植物（レーンC）においては、同様のバンドはみられなかった。
非損傷遺伝子導入タバコ葉における発現されたGADタンパク質の組織捺染局在化（tissue printing localization）を、CassabとVarner（1987）J. Cell Biol., 105, p.2581の方法により行った。遺伝子導入したものと形質転換してないものの両方のタバコの葉を、膜の上へと表面ブロットした。捺染物をマウスの抗マウスGAD抗体と反応させて、その後ホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼにカップルしたウサギの抗マウスGAD抗体を反応させた。反応シグナルをベーリンガー・マンハイム社のECL（化学発光）キットにより検出した。図１５に示したように、植物により生成された哺乳類タンパク質GAD65は、遺伝子導入植物の葉組織全体に概して均等に分布していた。形質転換された葉抽出物のウエスタン・ブロット上で得られたGADバンドの走査型デンシトメトリーを用いて、既知量のマウスGADからなる標準と比較して、形質転換されたタバコ葉におけるマウスGADタンパク質の生成は、形質転換葉組織中の可溶タンパク質総量の0.4%であると見積もられた。
例８  ジャガイモ（potatoes）におけるヒトGADの発現
5'配列又は3'配列のいずれかを示すよう、ヒトGADの部分をコードする２つのcDNAクローンを用いた。この２つのクローンは、70nt以下のオーバーラップ配列を有していた。完全なヒトGAD配列を、一連のDNA操作により作成した。ヒトGADのN末端を、翻訳開始部位の一部としてNcoI（CCATGC）制限部位の取り込みを含むように、PCRにより修飾した。ポリAテール（poly A tail）を含む天然の3'非翻訳配列を完全に除去した。修飾したヒトGAD配列をプラスミドベクターpTRL-GUSへとクローニングして、GUS遺伝子を置き換えた。プラスミドpTRL GU3は、5'非翻訳TEVリーダー配列、GUS遺伝子、及びNOSターミネーターに結合した二重エンハンサー配列（Ehn-35S）を有するCaMV 35Sプロモーターからなる。5'-Ehn35S-TEV5'非翻訳ヒトGAD-NOSターミネーターからなる新たな発現カセットを、HindIIIにより切り出し、バイナリー・ベクターpBIN19へと挿入した。pSM215と名付けられた最終生成物をアグロバクテリウムにトランスファーし、例５においてタバコ形質転換に関して記載した葉ディスク法により、ジャガイモ形質転換を行った。
本発明は、ここに記載した実施例の特徴に限定されるものではなく、請求の範囲内でのすべての変更や改変を含むものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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