(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む植物プロモーター。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１記載の植物プロモーターをベクターに導入した植物発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞。
【請求項４】
請求項３の形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体。
【請求項５】
請求項４の形質転換植物体より得られた植物種子。
【請求項６】
請求項１記載の植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体より植物種子を得、該種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法。
【請求項７】
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む植物プロモーターを挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を得、該形質転換細胞から形質転換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体よりワタ植物種子を創成し、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物においてプロモーター機能を有する植物プロモーターに関するものである。さらに、詳しくはワタ繊維などの発現の調節を行う植物プロモーターに関する。該植物プロモーター機能を有する塩基配列は、真核生物または原核生物においても外来遺伝子の発現を調節することが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
プロモーターとは、ＤＮＡを鋳型にｍＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ上のシグナルであり、特徴的な塩基の共通配列を有する。特に、真核生物においては転写開始点の２０塩基前後上流に、ＴＡＴＡボックスと呼ばれる共通配列があり、この部位が転写開始に必要な部位であると考えられている。目的の蛋白質を大量に産生させるためには、より強力なプロモーターを用いることが有利であると考えられている。一般に、植物ではその活性が強いということから、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターがよく利用されている。実際に、除草剤耐性植物の作出やウイルス抵抗性植物の作出に用いられている。しかし、３５Ｓプロモーターには組織特異性がなく、目的によっては組織特異性が要求されることがある。植物組織特異性をもつプロモーターとしては、シス因子、トランス因子の研究が行われている。植物組織特異性をもつプロモーターを用いると、所望の器官において、導入した遺伝子の発現を調節できる形質転換植物体を作出することができる。
【０００３】
現在、ワタ繊維はゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ植物を栽培し、得られたさく果（コットンボール）から採取することにより生産されている。ワタ繊維において、繊維特性を示す特性値は種々あるが、特に重要なものとして、繊維長、繊度、強度などがあげられる。従来から、ワタ繊維の特性を改善するために多大な努力がなされてきた。今日、遺伝子工学の発展により、ワタ植物を形質転換して、その繊維特性を変えることが可能となってきている。その際に、目的遺伝子を所望の時期および組織において発現させることは非常に重要なことである。しかし、ワタ繊維の形成および伸長機構については十分に解明されておらず、関与する遺伝子やプロモーターも十分に分かっていないのが現状である。目的の遺伝子を目的の組織または時期に発現させるには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのように常に発現しているものではなく、より特異的なプロモーターを用いる必要がある。特にワタ繊維の改良にはこうしたプロモーターが欠かせない。
【０００４】
ワタ繊維は胚珠の表皮細胞の１つ１つが伸長したものであり、１本の繊維は１つの細胞よりできている。繊維はイニシエーション、エロンゲーション、二次壁沈着、マチュレーションの段階を経て形成される。これまでにいくつかのワタ由来のプロモーターが発見され、繊維特異性を改善するのに有用であると報告されており（WO 94/12014)、Ｅ６またはＢ８プロモーターが開示されている。特に、Ｅ６について詳しく研究されており、Ｅ６ｍＲＮＡは開花後、１５日以降で繊維に強く発現していることが示されている。また、ノザンブロティングをロングエクスポーズすると花や胚珠、葉に弱いシグナルが得られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5769-5773, 1992)。さらにＦｂＬ２Ａプロモーターは綿繊維で開花後２５日から３０日に強く発現することが示されている(Plant Physiol.(1996)112:1331-1341) 。
また、プロモーターの強さ、働く時期などはそれぞれのプロモーターによって、様々に異なっていることが知られている。しかし、開花１５日以降はワタの繊維形成において、エロンゲーションの後半以降にあたり、繊維特性の改善には、これらのプロモーターだけでは十分ではなく、開花直後から１５日迄に発現するプロモーターも必要である。しかしながら、このようなプロモーターは未だ発見されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の１つは、ワタ繊維の繊維特性を改善するために有用なプロモーターを提供することにある。さらには、他の植物においても、目的の遺伝子を所望の組織または器官で発現させる新規な形質転換植物体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでに、ワタ繊維の繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるために鋭意研究して、ワタ繊維よりいくつかのｃＤＮＡを単離した（特願平8-31987 号) 。これらの単離したｃＤＮＡの時期および組織特異的な発現を調べ、さらに、これらの遺伝子の１つ、ｐＫＣ２２の上流配列をクローニングし、解析した結果、ワタ繊維の繊維特性を改善あるいは生産性を向上させる植物プロモーターを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む植物プロモーターである。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ
【０００８】
また、本発明は上記植物プロモーターをベクターに導入した植物発現ベクターである。
【０００９】
さらに、本発明は上記植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞である。
【００１０】
また、本発明は上記形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。
【００１１】
本発明は上記形質転換植物体より得られた植物種子である。
【００１２】
本発明は上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体より植物種子を得、該種子から植物体を生産することを特徴とする植物体の製造法である。
【００１３】
【発明の実施態様】本発明の「植物プロモーター」とは、植物において、プロモーターとして作用する能力（プロモーター機能）を有するＤＮＡである。「プロモーター」とは、ＤＮＡを鋳型にｍＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列を意味し、塩基の共通配列を持ち、これを認識してｍＲＮＡを合成する酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）がｍＲＮＡを合成する。本発明において、「プロモーター機能」とは、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ上の特異的な領域に結合し、転写開始する作用をいう。本発明の植物プロモーターは、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ。
【００１４】
本発明の植物プロモーターを得るために、本発明者らはノザンブロッティングで開花後１０日の胚珠で強いシグナルが得られた遺伝子、ｐＫＣ２２（特願平 8-31987号) の上流領域をクローニングした。これまでにノザンブロッティングにより、ｐＫＣ２２は開花１０日目の胚珠に最も強いシグナルが表れ、胚珠が成熟するに従ってシグナルが弱くなっていること、わずかなシグナルが幼植物体でみとめられ、完熟種子、葉でシグナルが見られないことより、ｐＫＣ２２の上流領域には繊維伸長時に働くプロモーターが存在すると予測できる。したがって、本発明の植物プロモーターは、その塩基配列（配列番号１）が、ワタ(Gossypium属）由来のヌクレオチド配列である。さらに、配列番号１記載の塩基配列は、ワタ繊維伸長前期に、ワタ繊維組織において発現するｐＫＣ２２の上流に位置する塩基配列である。
【００１５】
本発明の植物プロモーターは、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡである。本発明の植物プロモーターには、配列番号１記載の塩基配列の５’末端をプロモーター活性が有るかぎり、欠失したものが含まれる。
【００１７】
本発明の「植物発現ベクター」とは、上記植物プロモーターをベクターに導入したものであり、ベクターとしては、大腸菌由来のベクター、例えば、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、ｐＢＩ１０１−Ｈｍ２、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが挙げられる。また、植物ウイルス、例えばカルフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。ベクターはそれぞれの宿主細胞に応じて選択する。
植物プロモーターをベクターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入する方法に従う。
【００１８】
本発明の「形質転換植物細胞」とは、上記植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞である。宿主植物細胞としては、シロイヌナズナWassilewskija株、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられる。
植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法  、ポリエチレングリコール法あるいはパーティクルガン法などを挙げることができる。
【００１９】
本発明の「形質転換植物体」とは、上記形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法がある。使用する培地としては、ワタではＭＳＩＣ培地（MS塩、0.75% MgCl2, 1.9g/l KNO3, 30g/l グルコース、2.0g/l  ジェランガム、 pH5.8) 、ニンジンでは Kamada & Harada培地などが例示される。
【００２０】
本発明の「植物体を製造する方法」は、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して植物細胞を得、該植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体より植物種子を創成し、該種子から植物体を生産する工程を含む。
形質転換植物体から植物種子を創成する工程とは、形質転換植物体を発根培地より取り出し、水を含んだ土を入れたポットに植え、一定温度下で生育させる。生育が続き、花を形成し、最終的に種子が形成される工程という。また、種子から植物体を生産する工程とは、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
【００２１】
本発明の具体的な工程例としては、下記工程が例示される。
(1) ワタ繊維組織特異的遺伝子、ｐＫＣ２２の上流領域のクローニング
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
(4) 無菌シロイヌナズナの栽培
(5) アグロバクテリウムの感染
(6) 除菌
(7) 形質転換植物の選択
(8) 形質転換植物の再生
(9) 抗生物質耐性株の取得
(10) GUS活性の測定
【００２２】
〈１〉ワタ繊維形成および伸長に関与する遺伝子のプロモーター領域の単離
ワタ繊維から得られた組織特異的遺伝子、ｐＫＣ２２（特願平8-31987 号) の塩基配列より、合成オリゴヌクレオチドを作製し、インバースＰＣＲ法を行う。ワタ繊維よりゲノムＤＮＡを抽出した後、制限酵素、EcoRIで切断し、セルフライゲーションさせた後、ＰＣＲの鋳型として使用する。第１プライマー群を用いて、ＰＣＲを行った後、反応産物をさらに第２プライマー群を用いてＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。
アガロースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、ＴＡクローニングベクターにサブクローニングして、オートシークエンサーを用いて配列決定を行う。得られたＰＣＲ断片の配列の一部がｐＫＣ２２の配列と完全に一致したことから、ｐＫＣ２２の上流（植物プロモーター）と判断する。
【００２３】
〈２〉ワタ繊維形成および伸長に関する遺伝子のプロモーター領域の利用
上記方法により得た植物プロモーターを、ワタ植物またはワタ以外の植物において、キメラ遺伝子コントラクトをつくり、繊維形成および伸長に関与するタンパクの発現制御に利用することができる。さらに、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とも組み合わせると、細胞壁での各種タンパクの発現による細胞壁成分の改変が可能となり、耐病性等を付与した新規植物の育種にも応用できる。
【００２４】
例えば、繊維形成および伸長に関与する遺伝子を本発明の植物プロモーターに接続して、ワタ植物または他の植物に導入すると、目的タンパクの含量を増大させることができる。これに対し、マイナス鎖（コード配列に相補的な配列）の少なくとも一部を逆向きにプロモーターに接続したものを植物に導入し、いわゆるアンチセンスＲＮＡを発現させると、目的タンパク含量を低下させることができる。
【００２５】
〈３〉植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物細胞の形質転換
植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等とプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法等の方法を挙げることができる。
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、該目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いることができる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを一旦、大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Hohn）ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント・チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumors)、アカデミック・プレス、ニューヨーク（Academic Press、New York）、第 549〜560 頁(1982)、米国特許第 4,407,956号〕。
【００２６】
さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドを利用する方法がある、アグロバクテリウム属に属する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導入することもできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) は植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引き起こすが、これらは感染の際にＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドと呼ばれる、それぞれの細菌中に存在するプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA）と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプラスミド上にはＴ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれるために必須であるｖｉｒ領域と言われる領域がある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行されることはなく、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域が存在するのと異なったプラスミド上にあっても機能しうる〔Nature, 303, 179, (1983)〕。
【００２７】
ＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことができる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られたものをベクターとして使用することもできる。本発明においてはこのような種々のベクターを用いることができる。
例えば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢＩ１０１（クロンテック社）等のベクターに、本発明のプロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子をセンスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入して、これらを植物細胞に導入することができる。なお、これらのベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有している必要がある。
【００２８】
また、これらのベクターはアグロバクテリウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅することができるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができる。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌または植物細胞等を形質転換する際に、形質転換体を容易に選別することができる。また、これらのベクターにはカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベクターに挿入された遺伝子を植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させることが可能となる。
【００２９】
〈４〉形質転換植物細胞から植物体の再生
以下に、シロイヌナズナにおける、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換細胞の植物体への再生法を詳述する。
シロイヌナズナの種子を常法に従って、ＧＭプレートに播種し、無菌的に栽培する。発根した胚軸の切片を用いてＣＩＭプレート上でカルス培養を行う。本発明の植物プロモーターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した胚軸の切片を浸し、数日間、ＣＩＭプレート上で共存培養する。アグロバクテリウムが肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行ない、ＳＩＭプレート上で数日間、培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭプレート上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｍｍ程度の大きさになり、シュートを形成するまで培養する。完全なシュートの形状を示すようになったら、シュートの根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレートに移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつながっていないことが多い。発根後、無機塩類培地〔5mM  KNO3, 2.5mM K- リン酸緩衝液(pH5.5), 2mM MgSO4, 2mM Ca(NO3)2, 50μM Fe-EDTA, 1000 ×微量要素(70mM H3BO3, 14mM MnCl2, 0.5mM CuSO4, 1mM ZnSO4, 0.2mM NaMoO4, 10mM NaCl, 0.01mM CoCl2) １ml／リットル〕に浸したロックウール上に定植する。
【００３０】
発根した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、ＧＭ培地に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、形質転換の有無を確認することができる。
【００３１】
また、形質転換体や非形質転換体より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノザンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明では、レポーター遺伝子として広く植物で使われているＧＵＳ遺伝子を本発明のプロモーターの３’末端に連結して使用すると、ＧＵＳ活性を調べることで簡単にプロモーターの強さを評価できる。レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子に限らず、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインも使用することができる。
繊維形成および伸長に関与する遺伝子は、ワタ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で発現し繊維伸長に関与するため、この塩基配列の上流領域などを用いることで、ワタ繊維の伸長に関与する転写因子などが同定される可能性がある。従って、本発明の植物プロモーターは、ワタ繊維形成および伸長に関与するプロモーターであり、繊維形成および伸長を誘導する技術の確立、繊維伸長に関与するシス因子やトランス因子の単離、繊維形成および伸長のメカニズムの解明またはそれを調節する遺伝子の単離に利用することができ、細胞形成及び伸長の技術分野においてもきわめて有用である。
【００３３】
さらに、繊維形成および伸長に関与するタンパクをコードしている塩基配列と、本発明の植物プロモーターを結合したキメラ遺伝子を作製して、特定の組織の植物細胞壁の構造を変化させることができ、工業分野で用いられる植物原料の加工に有用である。また、一般にカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを用いることによって、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことができる。光、熱、傷害などの調節性のプロモーターを用いれば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体を作製することができる。また、器官または組織に特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官または組織だけに形態変化を生じさせることができる。つまり、本発明のプロモーターは器官特異的なものであるから、本発明のプロモーターを用いることによって、例えば繊維の形成を制御し繊維特性の変化をもたらすことができる。
【００３４】
本発明の植物プロモーターを用いることにより、特定の植物組織に特異的に目的遺伝子を発現させることができる。特にシロイヌナズナの維管束系やワタ繊維の伸長時に目的遺伝子を発現させることができる。さらに、本発明の植物プロモーターを用い、特定の遺伝子をワタ繊維に発現させることにより、ワタ繊維の特性（繊維長、繊度、強度等）の改善および収量の向上を行うことが可能となる。さらに、本発明の植物プロモーターを利用することにより、より優れた繊維特性を有し、かつ、生産性の高い新規なワタ品種を作出することができる。
【００３５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
(1) ワタ繊維組織由来の遺伝子、ｐＫＣ２２の上流領域 (GKC22)のクローニングワタ植物(Gossypium属）の播種後、１８日の幼植物体を用いて、Murray and Thompson の改良法でゲノムＤＮＡを抽出し、インバース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを行った。
すなわち、制限酵素HindIII で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ｔ４ライゲースでセルフライゲーションさせた。ライゲーションしたＤＮＡ 500μｇを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造）を用いて、ｐＫＣ２２の上流域（以下、ＧＫＣ２２と略す）を増幅させた。該反応は、配列番号２および３に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号４および５に示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤＮ断片をベクター、ｐＴ７ＢｌｕｅＴに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、クローニングした。その後、シーケネースシークエンスキット（アマシャム社）を用いて、ＧＫＣ２２の塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であることが確認できた。この塩基配列を配列番号１に示す。
【００３６】
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、ｐＢＩ１０１−Ｈｍ２（奈良先端大学、新名淳彦教授から入手）を制限酵素、HindIII およびSacIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミド、ｐＵＣ１９の制限酵素、HindIII およびSacIサイトに挿入して、プラスミド、ｐＧＵＳを得た。
次にプラスミド、ｐＧＫＣ２２を制限酵素、HindIII およびSacIで切断し、平滑末端化してから、上記プラスミド、ｐＧＵＳの制限酵素、SmaIサイトに挿入した。挿入されたEcoRI-SacI断片の塩基配列から正しく挿入されたか否かを確認して、正しく挿入されたプラスミドをｐＧＫＣ２２：ＧＵＳと命名した。さらに、このプラスミド、ｐＧＫＣ２２：ＧＵＳを制限酵素、HindIII およびSacIで切断し、電気泳動後、HindIII-SacI断片を上記プラスミド、ｐＢＩ１０１−Ｈｍ２の制限酵素、HindIII およびSacIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ２２：ＧＵＳを得た。次いで、該プラスミド、ｐＢＩ２２：ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia coli JM109/pBI22:GUSを得た。この工程を図１に示す。
【００３７】
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（2)で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI101-22:GUSおよびヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３をもつ大腸菌を、それぞれ５９ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養した。別途、アグロバクテリウムEHA101株（奈良先端大学、新名教授から入手）を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で２晩培養した。
各培養液を１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り、集菌した後にＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達させた。１〜２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシンおよび２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体を EHA101/pBI22:GUS と命名した。
【００３８】
(4) 無菌シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の栽培
シロイヌナズナWassilewskija 株（以下、ＷＳ株と称す）の種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＧＭプレート(1リットルあたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖10g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム5g、pH5.7)に置床した。このプレートを４℃に２日間放置して、低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サンヨー製、MLR-350HT)中に22℃、弱光下にて、７日間培養した。
【００３９】
(5) アグロバクテリウムの感染
前記(4) で７日間培養したＷＳ株の胚軸を数株ずつそろえて、メスで約１．０ｃｍ程度に切りそろえ、ＣＩＭプレート(1リットルあたりガンボーグB5ソルト3.9g、グルコース20g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム5g、2,4 −ジクロロフェノキシ酢酸を0.5 μg 、カイネチンを0.05μg となるように加えたもので、pH5.7)に置き並べた。光強度３０００ルクス、２４時間明期で２日間培養し、上記(3) にて得た形質転換体、EHA101/pBI22：GUS を１日間、２８℃で培養した菌液をＭＳ希釈液 (ムラシゲ−スクーグ無機塩類6.4g/l、pH6.3)で３倍に希釈したものをそれぞれ１ｍｌずつチューブに分注し、この中にカルス化した胚軸（ＣＩＭ培地で２日間培養したもの）を１０分間浸した。２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々２０本ほどを置き並べた。同条件にて２日間共存培養した。
【００４０】
(6) 除菌
各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えたもの) に移し、ゆっくり振蘯させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、ＳＩＭプレート（１リットルあたりガンボーグB5ソルト3.9g、グルコース20g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム5g、カナマイシン50mg、ハイグロマイシンＢ20mg、クラフォラン0.2g、ヴァンコマイシン0.5g、2iP5mg、IAA を終濃度0.15mg、となるように加えたもので、pH5.7)に置き並べ、光強度４０００ルクスで２日間培養した。
【００４１】
(7) 形質転換植物の選択
前記で２日間培養した切片をＳＩＭプレートに移植し、光強度４０００ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＳＩＭプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑色を呈し、約１カ月後、シュートが形成された。
【００４２】
(8) 形質転換植物の再生
シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレート(1リットルあたりＭＳソルト4.3g、シュクロース10g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム3.5g、インドールブチリックアシッド0.02mg、pH5.7)に軽く乗せるように挿した。約１カ月後、１〜２cm程度の根が数本形成したものをピンセットでとりだし、パーライトとバーミキュライト(TES社製) を１：１に混合し、無機塩類混合培地に浸した土に植え換えた。約１カ月後、１株につき数百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ１種子と称す。
【００４３】
(9) 抗生物質耐性株の取得
Ｔ１種子約１００粒を前記(4) と同様の方法で滅菌し、ＧＭプレート (カナマイシン50mg、ハイグロマイシンＢ20mg入り）に播種した。ほぼ３：１の割合でカナマイシンおよびハイグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
【００４４】
(10) GUS活性の測定
得られたホモ接合体である形質転換シロイヌナズナを栽培し、組織をメスで切り取り、切片を数mlの固定液(0.03％ホルマリン、10mM MES (pH5.6)、0.3M  マンニトール) に室温で45分間浸す。つぎに５０ｍＭリン酸バッファー(pH7.0) で数回洗った。切片をＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc）に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートした。クロロフィルを除くため、５％ホルマリンに１０分間浸した後、５％酢酸に１０分間、５０％エタノールに１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。青く染まった組織を顕微鏡で観察したところ、シロイヌナズナでもプロモーター活性は認められた。特に幼植物体の維管束系に強い発現が見られた (図２、図３、図４）。また花の雌しべの頂点や雄しべの先に発現が認められた（図５）。さらに９週間目のさやの基部と頂点にも発現が認められた（図６）。これらの結果より、本発明のＤＮＡはワタ以外の植物であるシロイヌナズナでも組織特異性をもったプロモーターとして働くことがわかった。
【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】形質転換体、Escherichia coli JM109/pBI22:GUSの構築を示す図である。
【図２】形質転換シロイヌナズナ（暗所生育、１週間目のシロイヌナズナ）のＧＵＳ染色を示す図である。
【図３】形質転換シロイヌナズナ（３週間目のシロイヌナズナ）のＧＵＳ染色を示す図である。
【図４】形質転換シロイヌナズナ（3週間目のシロイヌナズナの葉柄の切片）のＧＵＳ染色を示す図である。
【図５】形質転換シロイヌナズナ（７週間目のシロイヌナズナの花）のＧＵＳ染色を示す図である。
【図６】形質転換シロイヌナズナ（９週間目のさやの根元）のＧＵＳ染色を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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