(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において神経突起の成長又は神経腫の生成の抑制が望まれる部位で神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するための薬剤の製造方法であって、神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するために効果的な量のアニオン性ポリマーを、薬学的に許容される担体又は移植片と結合させることを含み、該アニオン性ポリマーはデキストラン硫酸、アルギネート及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれ、該担体又は移植片は固形又は半固形のものである、前記製造方法。
【請求項２】
担体がゲル又はポリマー担体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
担体が天然コラーゲン、変性コラーゲン又はデキストランである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記哺乳類が、神経組織の腫瘍、神経腫又は哺乳類の神経成長促進因子の正常レベルと対比して神経成長促進因子の過剰生産を有する、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
哺乳類において不要の神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するための薬剤の製造方法であって、神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するために効果的な量のアニオン性ポリマーを変性コラーゲンと結合させることを含み、該アニオン性ポリマーはデキストラン硫酸、アルギネート及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれ、該変性コラーゲンは固形又は半固形のものである、前記製造方法。
【請求項７】
アニオン性ポリマーが、神経突起の成長又は神経腫の生成が抑制されるべき部位に該アニオン性ポリマーをつなぎ留めるために有効な接着性タンパク質と結合されたものである、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれたものである、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれ、硫黄含有量が5重量％より大である、請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
アニオン性ポリマーが10重量％より大きい硫黄含有量を有する、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸であり、該デキストラン硫酸の平均分子量が40,000〜500,000ダルトンである、請求項１から１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するために効果的な量のアニオン性ポリマーを、薬学的に許容される担体又は移植片と共に含み、該アニオン性ポリマーはデキストラン硫酸、アルギネート及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれ、該担体又は移植片は固形又は半固形のものである、神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するための組成物。
【請求項１３】
担体がゲル又はポリマー担体である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
担体が天然コラーゲン、変性コラーゲン又はデキストランである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
アニオン性ポリマーが、神経突起の成長又は神経腫の生成が抑制されるべき部位に該アニオン性ポリマーをつなぎ留めるために有効な接着性タンパク質と結合されたものである、請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれたものである、請求項１２から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するために効果的な量のアニオン性ポリマーを変性コラーゲンと共に含み、該アニオン性ポリマーはデキストラン硫酸、アルギネート及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれ、該変性コラーゲンは固形又は半固形のものである、神経突起の成長又は神経腫の生成を抑制するための組成物。
【請求項１８】
アニオン性ポリマーが、神経突起の成長又は神経腫の生成が抑制されるべき部位に該アニオン性ポリマーをつなぎ留めるために有効な接着性タンパク質と結合されたものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸及びペントサンポリ硫酸から成る群から選ばれたものである、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生体適合性アニオン性ポリマーを含む組成物及び線維過多、及び瘢痕形成及び外科的癒着の如き合併症を抑制するためにかかる組成物を使用する方法に向けられている。また、グリア細胞侵入、神経突起成長及び骨成長を抑制するための組成物及び方法も提供される。
【０００２】
【従来の技術】
外科的癒着−瘢痕組織を介しての器官又は組織相互の付着−は臨床上の問題をもたらし得る。瘢痕組織の形成は、外科手術又は他の組織傷害の正常な帰結であり、適切な傷の治癒には必要である。しかしながら、ある場合には、瘢痕組織が予定した領域を越えて成長し外科的癒着を生む。これら瘢痕組織外科的癒着は、冒された身体部分の正常な運動及び機能を制限する。末梢神経が関与する場合は、線維性接着が普通の動作の最中に激しい痛みを引き起こす。更には、瘢痕及びケロイド組織（盛り上がった瘢痕組織）は見苦しいことが多く、心理的及び情緒的問題を生む。
【０００３】
１  硬膜外線維過多
好ましくない瘢痕形成の臨床的に重要な例は硬膜外線維過多で起こる。この症状は、腰の椎弓切除及び椎間板切除後に再発  性の背中低部の痛みを招く (コウコイックス (Cauchoix) ら, 1978, Spine 3:256-259 ; ジャクソン (Jackson), 1971, J. Bone Joint Surg. 538:409-616 ; フィーサント (Pheasant), 1985, Orthop. Clin. North Am. 6:319-329 ;ヨン・ヒン(Yong-Hing) ら,1980, Spine 5:59-64)。組織瘢痕形成は神経根運動を制限し、以前にヘルニアになった椎間板と同じ分布でしばしば再発する根性痛と相互に関連付けられてきた（ベノイスト (Benoist,M.) ら, 1980, Spine 5:432-436)。
【０００４】
２  好ましくない瘢痕化の阻止
多くの研究者が好ましくない瘢痕を阻止する種々の処理の有効性を研究してきた。脂肪移植片が使用され、瘢痕形成を阻止又は改善する多少の成功を収めている（ラロッカ(Larocca) 及びマクナブ (Macnab), 1974, J. Bone Joint Surg. 56B:545-550;ランゲンスコルド(Langenskold) 及びキビルボト(Kivilvoto), 1976, Clin. Orthrop. 115:82-85; ギル (Gill) ら, 1985, Spine 10:662-667; ギルら, 1979, Spine 4:176-185; ヨン・ヒンら, 1980, Spine 5:59-64）。ゲルフォーム（変性コラーゲンゲル）及びサイラスティック膜が、接着を阻止する多少の有効性を示した（ラロッカ (La Rocca) 及びマクナブ (Macnab) ，前記文献）。しかしながら、その後の研究は、ゲルフォームは有効ではないか又は瘢痕形成を助長することを示した（ギルら, 1985, 前記文献; ギルら, 1979, 前記文献; ヨン・ヒンら, 前記文献）。ソンガー (Songer) らは、ゲルフォームでも他の脂肪移植片でもないヒアルロン酸ナトリウムが、犬をモデルにした場合に瘢痕を抑制して線維芽細胞侵入を軽減したことを報告している（1990, Spine 15:550-554）。
【０００５】
３  細胞侵入及び付着
スノー (Snow) らによる先の研究 (1990, Exp. Neurol. 309: 111-130)は、ケラタン (keratan)硫酸／コンドロイチン硫酸−プロテオグリカン（ＫＳ／ＧＳ−ＰＧ）が胚生（Ｅ−９）ヒヨコ背根神経節（ＤＲＧ）からの神経突起成長に対し抑制性であることを明らかにした。神経突起は、急に止まるか又は方向転換をしてＫＳ／ＧＳ−ＰＧストライプの縁に沿って進んだ。この現象は、プロテオグリカンの濃度に依存し、中間濃度では交差のパターンが断続した。
【０００６】
多くの研究において、細胞付着におけるプロテオグリカンの役割が考慮された。未分別の軟骨プロテオグリカン、及び精製の程度が低い軟骨成分であるコンドロイチン硫酸がコラーゲン及びフィブロネクチンへの線維芽細胞結合をin vitroで抑制することが見出された (リッチ (Rich) ら, 1981, Nature293:224-226)。デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ−ＰＧ）は、血漿フィブロネクチン被覆培養基質上で３Ｔ３線維芽細胞の付着及び拡散を抑制することが認められた（レワンドフスカ(Lewandowska) ら, 1987, J. Cell Biol.105:1443-1454; ローゼンべルグ (Rosenberg,L.C.) ら, 1986, CIBA Foundation Symposium 124:47-68)。デキストラン硫酸及び高分子量ヘパリンは、コラーゲンへのチャイニーズハムスターの卵巣及びＧ−８マウスの筋芽細胞の付着の初期速度を低下させた（クレーベ (Klebe,R.J.) 及びモック (P.J.Mock), 1982, J. Cell. Physiol. 112:5-9）。軟骨から単離した、糖タンパク質及びヒアルロン酸を含まないプロテオグリカンは、組織培養プラスチック及びコラーゲンへのヒヨコ胚生線維芽細胞を含む種々の細胞型の付着を抑制する（クノックス (Knox, P.) 及びウェルズ (P. Wells), 1979, J. Cell Sci. 40:77-88）。
【０００７】
しかしながら、グリコサミノグリカンケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸は、細胞付着の抑制を示さなかった（クノックス及びウェルズ，前記文献）。
【０００８】
主としてヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸も、フィブロネクチンへの線維芽細胞（マウス３Ｔ３細胞）付着の媒介物質として同定された（ラテラ(Laterra) ら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:6662-6666）。３次元I型コラーゲンスポンジにおけるフィブロネクチン又はヒアルロン酸、又はそれら両方の存在がin vivo で傷の治癒を促進し、そして生成するコラーゲン堆積物で線維芽細胞侵入をin vitroで支援することが見出された（ドイロン(Doillon,C.J.) ら, 1987, Biomaterials 8:195-200）。
【０００９】
２つのグリア、２つの内皮及び１つの線維芽細胞の細胞株は、コラーゲンに匹敵するか又は低下した、コラーゲン−グリコサミノグリカンへの結合を示した（レイカード−ブラウン (Reichard-Brown) 及びアケソン (Akeson),前記文献）。ヒアルロン酸は３Ｔ３線維芽細胞の凝集を抑制し（アンダーヒル(Underhill,C)及びドーフマン (Dorfman, A.), 1978, Exp. Cell. Res. 117:155-164)、そしてコンドロイチン硫酸は内皮への白血球の接着を阻止するようである（フィビ (Fibbi,G.) ら, 1983, Biochem. Biophys. Acta 762:512-518) 。
【００１０】
線維芽細胞の基質接着部位の組成の研究は、細胞表面プロテオグリカン、主としてヘパリン硫酸プロテオグリカンが閉鎖性で限局性の接触接着に重要な役割を果たしていることを示している（カルプ (Culp, L.A.) ら, 1986, CIBA Foundation Symp  osium 124:158-83 ;イザード (Izzard, C.S.) ら, 1986, Exp.Cell. Res. 165:320-336; ラーク (Lark, M.W.) ら, 1985, Fed. Proc. 44:394-403;ロリンス (Rollins,B.J.) 及びカルプ, 1979, Biochem. 18:141-148; カルプら, 1979, Supramol. Struct. 11:401-427; カルプら, 1978, J. Cell Biol. 79:788-801 ;カルプ及びベンスザン (H.Bensusan), 1978, Nature 273:680-682; コルニック (Cornic, M.) ら, 1980, Eur. J. Cell Biol. 22:262)。フィブロネクチン及びコラーゲンよりはむしろ、基質付着物質内で分泌されたグリコサミノグリカンが、骨格マウス筋芽細胞株の接着プロセスに速度制限的役割を果たしているようである（シュベルト (Schubert, D.) 及びラ・コルビエレ (La Corbiere), 1980, J. Biol. Chem. 255:11564-569) 。ラット卵黄嚢腫瘍細胞により分泌されたプロテオグリカンは、フィブロネクチン及び、IV型コラーゲンではなくI型コラーゲンへの腫瘍細胞結合を抑制した。このIV型コラーゲンはI型コラーゲンより１２倍少なくプロテオグリカンに結合した（ブレンナン (Brennan,M.J.) ら, 1983, Cancer Res. 43:4302-4307）。
【００１１】
４  接着性タンパク質
ムラサキイガイ、カキ及びフジツボの生体接着性タンパク質は、水面下で種々の表面に高い結合強度で接着する。他のＤＯＰＡ（3,４−ジヒドロキシフェニルアラニン）含有タンパク質も接着特性を示す。ブラウンは、イガイ科の貝の足糸及び肝臓吸虫類である肝てつの卵鞘を含む無脊椎動物の構成タンパク質におけるキノンなめし(tanning) の証拠を記した（1950, Nature 165:275）。ジェンセン (Jensen）及びモース(Morse) は、海洋虫(marine worm)であるフラグマトポマ・カリフォルニカ  (Phragmatopoma californica) がその保護管を作るために使用  する接着性タンパク質の特質を明らかにした（1968, J. Comp. Physiol. B 158:317-324)。イガイ科の貝の接着性タンパク質については、ＤＯＰＡがフラグマトポマ接着タンパク質の主要な構成成分である；リシン、セリン、及び水酸基含有アミノ酸も存在した（ジェンセン及びモース，1988, 前記文献）。
【００１２】
更に、フィブリン接着剤は普及しており、多く応用されている（ストラウスベルグ (Strausberg, R.L.) 及びリンク (R.P.  Link), 1990, Trends Biotech 8:53-57)。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一定の生体適合性アニオン性ポリマーが瘢痕形成、特に外科的癒着を効果的に抑制でき、及びこれらアニオン性ポリマーが線維過多を概ね抑制するという発見に関連している。本発明は、アニオン性ポリマーが好ましくない治癒プロセス、即ち、線維過多、瘢痕化に関連する細胞の侵入を効果的に抑制するという発見に基づくものである。特に、抑制性アニオン性ポリマーと呼ぶ本発明のアニオン性ポリマーは、線維芽細胞侵入を抑制し、かくして、治癒プロセスを調節して線維過多を阻止するのに有用である。本発明のアニオン性ポリマーは、グリア細胞侵入、骨成長及び神経突起成長も抑制する。本発明は、更に、細胞侵入、例えば、線維芽細胞侵入の抑制におけるアニオン性ポリマーの有効性が、該ポリマーのアニオン電荷基の数と部分的に相関関係を有しているという発見に関連している。かくして、本発明は瘢痕形成及び線維過多、特に、外科的癒着の抑制に使用する多くの物質、及びその有効アニオン電荷含量に部分的に基づく、本発明に使用するための所定の物質の適合性を確認する方法を提供する。
【００１４】
本発明で使用するアニオン性ポリマーには、デキストラン硫酸（ＤＸ）及びペントサンポリ硫酸（ＰＳ）が含まれる。従って、デルマタン硫酸（ＤＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、及びヘパリン（ＨＮ）を含む、中性のプロテオグリカン、又はプロテオグリカンのグリコサミノグリカン部分が使用できる。アルギネート（ＡＬ）も使用できる。適した濃度では、前述の分子は、ラミニンの如き適当な移動促進基質の存在下でさえも、線維芽細胞侵入又は移動を抑制できる。特定の側面においては、本発明は、線維芽細胞侵入及び線維過多を抑制、阻止又は調節するために、及び前述のものが望ましい場合は治療に、ＤＸを使用する方法、及びＤＸを含む分子及び組成物に向けられている。本発明は、更に、線維芽細胞侵入及び線維過多又は単核細胞／マクロファージ侵入を抑制するために、１又は２以上のアニオン性ポリマーを使用する方法、及び１又は２以上のアニオン性ポリマーを含む組成物及びその治療的用途に向けられている。ＫＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ、又はＨＮを含むかかる分子には、ジサッカライド、グリコサミノグリカン、及びプロテオグリカン構造体が含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様においては、本発明の線維芽細胞抑制性組成物及び方法に、ＤＸを使用してもよい。
【００１５】
本発明は、更に、瘢痕形成の阻止に使用するのに適した追加の抑制性アニオン性ポリマーを提供する。１つの態様においては、硫黄含量が約５重量％より大きい、酸性硫酸を含むアニオン性ポリマーを使用してもよい。より好ましい態様においては、硫黄含量は約１０重量％より大きい。
【００１６】
他の態様においては、本発明は、更に、線維芽細胞侵入及び線維過多を抑制するために、並びにグリア細胞侵入、神経突起成長、及び骨成長も抑制するために、接着性タンパク質と組み合わせて抑制性アニオン性ポリマー、好ましくはデキストラン硫酸又はペントサンポリ硫酸を使用する方法に向けられている。接着性タンパク質は、抑制性分子と適当な標的を架橋することができる。従って、本発明は、抑制又は調節活性が望まれる部位に抑制性アニオン性ポリマーを固定する方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様においては、接着性タンパク質を、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）残基の化学的又は酵素的酸化により活性化してキノンを形成し、ＫＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ、ＨＮ、ＤＸ、又はヒアルロン酸（ＨＡ）を含む分子と共に目的の位置に適用し、そして治癒させる。接着性タンパク質には、ムラサキイガイ、カキ、フジツボ、フラグマトポマ・カリフォルニカ、又は肝てつ、又はフィブリン、又は組み換え体で、若しくは化学合成により、若しくは天然接着性タンパク質の分解及び再重合により生成するあらゆる接着性タンパク質からの接着性タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
更なる態様においては、抑制性アニオン性ポリマーのうちの１を含む分子を、１又は２以上の他の抑制性アニオン性ポリマー及び接着性タンパク質と一緒に使用してもよい。
【００１９】
本発明は、更に、抑制性アニオン性ポリマー及び適当な製剤上の担体を含む組成物、及び一般に瘢痕形成及び線維過多を抑制するために、及び望ましくない骨成長、グリア細胞の侵入及び／又は神経突起成長を抑制するために、該組成物を投与する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、また、有効量の抑制性アニオン性ポリマー、好ましくはデキストラン硫酸又はペントサン硫酸、有効量の接着性タンパク質、及び薬学的に許容できる製剤上の担体を含む組成物を提供する。
【００２１】
１  定義
ＡＬ アルギネート
ＣＳ コンドロイチン硫酸
ＤＳ デルマタン硫酸
ＤＸ デキストラン硫酸
ＧＡＧ グリコサミノグリカン
ＨＡ ヒアルロン酸
ＨＮ ヘパリン
ＨＳ ヘパリン硫酸
ＫＳ ケラタン硫酸
ＬＮ ラミニン
ＰＧ プロテオグリカン
ＰＳ ペントサンポリ硫酸
細胞接着 細胞表面と基質の間の初期の相互作用であって付着及びそれに続く細胞拡散に帰着する
細胞移動 同一基質内での細胞運動
細胞侵入 １つの型の基質から他の型の基質への細胞運動
2. 発明の詳細な説明
本発明は、一定の生物適合性を有するアニオンポリマーが瘢痕形成、殊に外科手術の癒着を効果的に抑制しうること、及び “抑制性アニオンポリマー" と称されるこれらのアニオン性のポリマーが線維症を一般的に抑制するとの知見に関する。本発明は、アニオンポリマーが好ましくない治癒過程に関連する細胞の侵入、例えば線維症及び瘢痕形成を効果的に抑制するとの知見に基づくものである。特に、本発明のアニオンポリマーは線維芽細胞の侵入を抑制するために有用であり、その結果、治癒工程を調節し、線維症を予防する。本発明のアニオンポリマーは、また、グリア細胞の侵入、骨成長、神経突起の成長及び単核白血球(monocyte)／マクロファージの侵入を抑制することができる。本発明は、さらに、細胞、例えば線維芽細胞の侵入を抑制する際のアニオンポリマーの有効性は、一部、ポリマー上のアニオン性の荷電基の有効なものの数に相関するとの知見に関係する。このため、本発明は、瘢痕形成及び線維症を抑制し、外科手術の癒着を抑制するために使用される多数の物質を教示する。本発明で使用するための他のアニオンポリマーは、有効なアニオン性の荷電含量又は密度に基づいて確認しうる。
【００２２】
本発明で使用するための抑制性アニオンポリマーには、デキストラン硫酸（ＤＸ）及びペントサンポリスルフェート（ＰＳ）が含まれる。加えて、中性のプロテオグリカン、又はデルマタン硫酸（ＤＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）及びヘパリン（ＨＮ）を含むプロテオグリカンのグリコサミノグリカン成分が使用しうる。アニオン性のカルボハイドレートアルギネート（ＡＬ）も使用できる。適当な濃度において、上述の分子はラミニン（laminin)のような適当な移動促進物質の存在下においてさえも、線維芽細胞の侵入又は移動を抑制することができる。本発明で使用するための他のアニオンポリマーには、セルロース誘導体が含まれる。好適な態様において、本発明は、前述のものが望ましい場合には線維芽細胞の侵入及び線維症を抑制し、予防し又は調節するために、ＤＸ及びＤＸを含む分子及び組成物を使用する方法に関連する。本発明は、さらに、線維芽細胞の侵入及び線維症を抑制するために１又は２以上のアニオンポリマーを使用する方法及び１又は２以上のアニオンポリマーを含む組成物及びそれらの治療上の使用に向けられる。ＫＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ又はＨＮを含むこれらの分子は、限定されるものではないが、ジサッカライド、グリコサミノグリカン、及びプロテオグリカン構造体を含む。
【００２３】
本発明は、さらに抑制性アニオンポリマー又は抑制性アニオンポリマーと粘着性（adhesive) タンパク質、及び医薬的に許容しうる担体を含む医薬組成物、並びに一般に瘢痕形成、及び線維症を抑制し、さらにグリア細胞の望ましくない侵入、骨成長、及び神経突起の成長を抑制するためにこの組成物を投与する方法を提供する。
【００２４】
本発明の組成物及び方法は、動物、好適には哺乳類、及びより好適にはヒトを治療するために適当である。治療上の有効量の本発明のアニオンポリマーを含む組成物は、後述するいずれかの方法で動物の病変部(lesion)に投与され得る。
【００２５】
2.1. 本発明で使用するための他のアニオンポリマー
デキストラン硫酸、ペントサンポリスルフェート、グリコサミノグリカン及び本発明で使用するための他のアニオンポリマー（上述）に加えて、本発明は、一部、ポリマーの効果的なアニオン性の特性がその抑制的可能性を決定するのを助けるという知見（下記第７節参照）に基づく本発明において使用するための他の付加的なアニオンポリマーを提供する。一の態様において、使用上適当なかかるアニオンポリマーは、酸性硫酸塩を含むアニオンポリマーであり、このものにおいて硫黄含量は約５重量％よりも大きい。より好ましい態様において、硫黄含量は約10重量％よりも大きい。
【００２６】
本発明で使用するためのアニオンポリマーは、天然に、例えばプロテオグリカン中に豊富に見い出し得る。代わりに、ポリマーはアニオンポリマーを製造するために化学的に変性させることができる。例えば、ポリグルコースポリマーデキストランは、硫酸中で沸騰させ、クロロスルホン酸でエステル化することにより処理して、デキストラン硫酸を製造しうる（例えば、メルクインデックス、第10版、1983、No.2915、第427 頁を参照）。化学的に製造されるアニオンポリマーの他の例は、セルロース誘導体を含む。ポリマーの骨格は、炭水化物ポリマーに限定されない。生物適合性アニオンポリマーは商業的に入手されうる（例えば、下記第5.1.6節を参照）。本発明で使用するアニオンポリマーは、代わりに、天然源から精製でき、又は合成的に製造できる。
【００２７】
2.2. 線維症及び細胞の侵入を予防するための組成物
本発明は、線維芽細胞の侵入、グリア細胞の侵入、神経突起の成長、骨成長、及び単核白血球／マクロファージ侵入を抑制するために使用する組成物を提供する。特に、この組成物は、線維症及び瘢痕形成、例えば外科手術の癒着を予防する際に有用である。この組成物は、本発明の抑制性アニオンポリマーを含む。この組成物が治療方法又は治療において使用するために意図される場合には、これは治療上有効量のアニオンポリマー及び医薬的に許容しうる賦形剤又は担体、例えば、インビボでの使用に適するものを含む医薬組成物として調製され得る。アニオンポリマーは、好適には約１mg／ml以上の濃度で存在する。本発明の組成物は、以後、“抑制性組成物" と称される、というのはそれらは細胞の侵入に対するアニオンポリマー抑制剤を含むからである。
【００２８】
例えば、本発明の抑制性組成物において、アニオンポリマーはデキストラン硫酸（ＤＸ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパリン（ＨＮ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、アルギネート（ＡＬ）又はペントサンポリスルフェート（ＰＳ）を含みうる。好適な態様において、アニオンポリマーはデキストラン硫酸又はペントサンポリスルフェートである。より好ましい態様において、アニオンポリマーは硫黄含量が約10重量％以上のデキストラン硫酸である。より一層好ましい態様において、デキストラン硫酸の平均分子量は約40,000から500,000 ダルトンである。好ましくは、デキストラン硫酸の平均分子量は約40,000ダルトンである。デキストラン硫酸は、好適には約２〜20mg／mlの溶液濃度で存在すべきである。
【００２９】
上述のアニオンポリマーとともに使用する担体又は賦形剤は、水、食塩水、生理的緩衝塩液、デキストロース溶液のような水溶液、又は当該分野で既知のいずれかの担体を含む。アニオンポリマーと担体の混合物は、粘性の液体又はゲルを生ずるかもしれない。液体又はゲルの粘性を増大するためには、架橋したアニオンポリマーが実質的にそのアニオン性を保持すること、即ち、ポリマーの負の電荷密度が実質的に影響されないことを条件に、当該分野の専門家に既知のいずれかの架橋剤を使用してアニオンポリマーを架橋させることができる。
【００３０】
他の態様において、この発明の生物適合性アニオンポリマーは、ペースト、ゲル、フォーム又はシートのような固体又は半固体の賦形剤又は担体と組み合わせてもよい。本発明のアニオンポリマーは、コロイド状の懸濁液又は混合物にて上記の担体又は賦形剤と混合することができる；代わりに、担体又は賦形剤にアニオンポリマーを含浸させて、組成物を形成させてもよい。理解されるように、アニオンポリマーと担体又は賦形剤との結合は、共有的又は非共有的とすることができる。
【００３１】
本発明は、ＤＸ、ＤＳ、ＫＳ、ＣＳ、ＨＮ、ＨＳ、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＰＳ又はＡＬ、又は例えば上記第2.１節に参照される適当なアニオンポリマーのいずれかを上述の担体と組み合わせて、使用のために提供する。
【００３２】
好適な態様において、アニオンポリマーはデキストラン硫酸又はペントサンポリスルフェートであり得る。好適な態様において、担体又は賦形剤は、医薬的に許容しうる担体又は賦形剤、即ち、インビボにおける使用に適するものでありえる。好ましい半固体の担体には、HYSKON-70（ファルマシア）、INTERCEED（登録商標）（ジョンソン＆ジョンソン）のようなデキストランゲル、天然のコラーゲンゲル、及び GELFOAM（登録商標）（アプジョン）のような変性コラーゲンゲルが含まれる。
【００３３】
明らかのように、好ましくは、アニオンポリマー及び医薬的に許容しうる担体又は移植片を含む組成物は、一定時間、好ましくは１か月内に生物−吸収可能である。好適なアニオンポリマーはデキストラン硫酸及びペントサンポリスルフェートであり、デスキトラン硫酸がより好ましい。かかる生物−吸収可能な担体は、限定されるものではないが、上述のようにデキストラン、天然コラーゲン及び変成コラーゲンを含む。もし、コラーゲンゲルのような担体が使用されるならば、コラーゲンは好ましくは架橋されるべきではなく、その結果インビボで一層容易に吸収される。
【００３４】
ある態様において、GELFOAM（登録商標）は、カルシウム／マグネシウム不含のリン酸緩衝食塩溶液中の２〜20mg／mlのデキストラン硫酸溶液を浸漬させてもよい（下記、第3節を参照  ）。
【００３５】
明らかのように、かかる組成物において医薬的に許容しうる外科用ポリマー移植片、例えばデキストラン、天然のコラーゲン又は変成されたコラーゲンは、約５％(w/v) の組成物、好適には少なくとも約10％、及び、他の態様において約20％以上の組成物を構成する。かかる組成物は、アニオンポリマー、例えばデキストラン硫酸を含有し、下記の実施例に示されるように水性媒質も含むことができる。
【００３６】
2.2.1.接着性タンパク質と抑制性分子の組成物：抑制性−接着剤
特定の態様において、抑制性アニオンポリマーは、適当な濃度又は量の接着性タンパク質と組みあわせて使用でき、この組合せは下記の第2.３節に開示される治療機能に影響する “抑制性−接着剤"を与える。接着性タンパク質と結合した抑制性分子を使用すると、接着性タンパク質は抑制性分子を適所につなぎ留めるのに役立つので、抑制性分子が分散するのを防止する。適当濃度又は量の接着性タンパク質は接着特性を示すのに必要な濃度又は量である。
【００３７】
ここで使用されるように、“接着性タンパク質" という語は、一又は二以上の分子又は表面に非特異的に接着しうるタンパク質又はペプチドに関する。実質的な量のジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）及びヒドロキシル−含有アミノ酸残基を含有するいずれの天然、非天然又は組み換えタンパク質は、タンパク質を活性化し、硬化(cure)させるために（下記参照）、本発明で使用しうる。出願人は、機能的ペプチド並びに全タンパク質が本発明で使用しうることを想定している。機能的ペプチドは、タンパク質の接着特性を生ずるアミノ酸の最小の数を含有するものである。例えば、限定されるものではないが、接着性タンパク質はフィブリン又はTUSSUCOL（登録商標）、TISSEEL（登録商標）又はヒトIMMUNO（登録商標）のような製品に基づく商業的に入手可能なフィブリンであってもよい。代わりに、接着性タンパク質は、イガイ（mussel） のポリフェノール性接着性タンパク質、フジツボ（barnacle） のポリフェノール性接着性タンパク質又はカキのポリフェノール性接着性タンパク質であってもよい。生物接着性のタンパク質は、商業的に入手できるもの、例えば、ADHERACELL（登録商標）(Genex Corp, Gaithesburg, MD) 及びMAP (“イガイ接着性タンパク質" 、Bio-Polymers社、Farmington, CT) である。接着性タンパク質は、Phragmatopoma californica 又は Fasciola hepatica (肝のフレーク）から得られるDOPA−タンパク質を含むことができる。イガイ、フジツボ又はカキから得られるポリフェノール性粘着タンパク質は、動物のフェノール性腺から抽出し、精製でき、又は組み換え的に製造される（国際特許公開公報 WO88／03953, 1988,及び WO 88／07076, 1988; ストラスベルグら、1989,“Adhesives from Renewable Resources" 、ACS シンポジウムシリーズ 385、ヘミングウェイ及びコーナー、Eds.、第453-464頁) 。
【００３８】
抽出された天然分子を化学的に又はタンパク分解的に開裂して製造された又は組み換え的に製造された、イガイ、フジツボ又はカキからのフェノール性接着性タンパク質の断片が本発明の医薬組成物において使用しうるものと考えられる。他の態様において、接着性タンパク質は接着タンパク質から化学的に重合したペプチド、例えばMytilus edulisタンパク質の断片をタンパク分解的又は化学的に消化し、次いでグルタルアルデヒド重合させたものであってもよい（米国特許第4,585,585号明細書) 。
【００３９】
他の態様において、接着性タンパク質は組み換え的に製造された接着タンパク質の類似体であってもよい。組み換え的に製造された類似体の接着タンパク質はイガイ、フジツボ又はカキのポリフェノール性接着性タンパク質、又はいずれかの他の接着性タンパク質に由来するものであってもよい。保存性のアミノ酸代用物を組み込んだ接着タンパク質のフラグメント及び類似体は、本発明の実施において接着性タンパク質として使用できる。組み換え的に製造された類似体の接着タンパク質は、イガイ、フジツボ又はカキ、又はフラグマトポマカリフォルニカ（Phragmatopoma californica)、ファッシオラヘパチカ（Fasciola hepatica)又は他の匹敵する接着タンパク質からの１以上の接着タンパク質の部分を含んでいてもよい。もし必要ならば、接着性タンパク質は化学的に又は酵素的にヒドロキシル化してもよい。例えば、きのこのチロシナーゼ又はストレプトマイセスアンチビオチクス（streptomyces antibioticus)で処理すると、接着性タンパク質前駆体を修飾することができる。こうして、この発明の医薬組成物は天然に生ずる接着タンパク質の本質を組み込んだ、純粋に操作された接着タンパク質を含んでいてもよい。
【００４０】
ある態様において、抑制性分子及び接着性タンパク質は、接着性タンパク質の活性化及び硬化の前に非共有結合的に結合させてもよい。他の態様において、抑制性の分子は活性化及び硬化の前に接着性タンパク質へ共有結合させてもよい。
【００４１】
本発明の接着性タンパク質は所望の表面に接着可能とするように硬化されなければならない。硬化は抑制性接着性組成物、特に接着性タンパク質を活性化し、引き続いての、活性化された接着性タンパク質を所望の分子と反応させる工程を含む。酵素的又は化学的工程が硬化を開始させる。ポリフェノール性の接着タンパク質の場合には、硬化はＤＯＰＡをキノンに酸化することにより開始されうる。酸化は、空気にさらすこと、酵素、例えばカテコールオキシダーゼにより処理すること、又は市販のオキシダーゼ架橋剤、例えばＣＯＸ（バイオポリマー社）により行うことができる。上記の方法は例として提供されるものであって、決して限定されるものではない；本分野の当業者ならば、他の酸化剤又は方法を知るであろう。フィブリン硬化は、フィブリノーゲンの例えばトロンビンによる開裂により開始される。フィブリンモノマーは自発的に重合する；トランスアミナーゼによるさらなる作用は共有的な架橋を触媒する。硬化工程は、活性化されたタンパク質が周囲環境の分子又は表面に共有的に又は非共有的に結合するとき完了する。
【００４２】
こうして、抑制性−接着性組成物は病変部に適用され、硬化される。或る部位に接着性タンパク質により抑制性分子を固定することは局部の有効濃度の時間を増大させることにより抑制分子の効率を増大するであろう。そのことにより一層効果的に線維芽細胞の侵入及び線維症、グリア細胞侵入、神経突起の成長及び骨成長の発生を抑制する。抑制性分子及び接着性タンパク質が外科的切開、損傷及び一般的な外傷部位で適用されかつ硬化されるときは、有益な結果が期待されるであろう。
【００４３】
2.3. 治療方法
本発明の組成物は、線維芽細胞の侵入及び線維症、肉芽化、及び特に瘢痕形成を抑制する動物の治療方法が望まれる広範の状態を治療するために使用できる。病変部の線維症、肉芽化又は瘢痕形成を抑制する方法であって、抑制性組成物又は抑制性−接着性組成物を病変部に投与することから成る方法が提供される。治療の処置のために医薬組成物を投与する方法も提供される。
【００４４】
2.3.1. 一般的な適応症
抑制性アニオンポリマー又は抑制性−接着性組成物を含む抑制性組成物は、外傷、外科手術、感染（ウイルス又は細菌）、代謝性疾病、悪性疾患、毒性物質への暴露、及び他の過形成状況により引き起こされる細胞の移動又は侵入に対するバリヤーとして使用できる。抑制組成物はコーティング方法により前述の状態から器官又は組織を保護するために好ましい方法を提供する。例えば、後根神経節、視神経、又は視神経交差は制御できない細胞の侵入及び接着に対して保護するために抑制性組成物でコーティングされ得る。グリア細胞侵入、神経突起の成長、及び骨成長並びに線維芽細胞の侵入は本発明の方法により抑制することができる。抑制性組成物で器官又は組織をコーティングすることは防止のため又は予防的であってもよい。抑制性−接着性組成物は好ましいコーティング組成物を提供する。
【００４５】
2.3.2.  外科手術
一の態様において、硬膜外の（又は硬膜上の(peridural)）線維症は、外科的病変に本発明の組成物を適用することにより抑制できる。一の態様において、本発明のアニオンポリマーを含む溶液に浸漬したコラーゲンゲルの一部を病変部に適用し得る。他の態様において、アニオンポリマーはペースト、ゲル又はシートのような担体又は賦形剤中に添加しうる。さらに他の態様において、アニオンポリマーは生理食塩緩衝液のような担体中に溶解又は懸濁させることができ、灌注法により又はエアゾールとして適用しうる。好ましい態様において、医薬担体又は賦形剤を使用してもよい。
【００４６】
本発明は、椎弓切除の後の線維症、特に腰部椎弓切除の後の硬膜外の（硬膜上の） 線維症を抑制するための物質及び方法を提供する（第3節参照）。限定されるものではないが、一例を挙げると半固体の医薬的に許容しうる担体の一部をデキストラン硫酸、又は他の本発明のアニオンポリマーに浸漬する。浸漬した担体は予め又は外科手術の際に調製されるうる。担体は、カルシウム／マグネシウム−不含リン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）又はインビボの使用に適した溶液中にデキストラン硫酸又は他の本発明で使用するためのアニオンポリマーの溶液中に浸漬しうる。担体をアニオンポリマーで含浸させた後に、その部分を椎弓切除部位に挿入する。前述の手法を使用すると、再出術の際に、椎弓切除した部位は最小の瘢痕組織形成及び骨成長を示すであろう。そして担体は容易に除去でき、硬膜は平滑な透明の膜としてみることが可能である。好ましくない線維症、即ち神経根をつなぎとめる瘢痕及び外科手術の癒着に関連する解剖特徴は存在しないであろう。
【００４７】
本発明のアニオンポリマー、及びこれを含有する組成物は、又、骨成長の抑制が望まれる部位に治療上効果的な量のアニオンポリマーを投与することにより、望ましくない骨の成長を抑制する際に使用される（下記第3節参照）。さらに、アニオンポリマーは骨の成長の抑制が望ましい他の適応症を治療するために使用しうる。これは、クラニオステモストシス（craniostemostosis)のような、特に、子供における或る種の操作の後の骨成長の望ましくない場合が相当する。
【００４８】
他の態様において、本発明はファロピウス組織(fallopian  tisue) の線維症及び瘢痕形成を抑制するための組成物及び方法を提供する。特に、外科手術の後のファロピウス管部及びその周辺の病変部の線維症及び瘢痕形成を抑制できる。感染及び他の原因から生ずるファロピウス管の線維症は25〜30％の場合において不妊の原因となる。腰帯（pelvic) の側壁の癒着も不妊に関係する。外科手術後に瘢痕組織が形成されるので、癒着を外科手術的に除去するだけでは十分な治療ではない。このように本発明は不妊の処置において重要な適用を有する。
【００４９】
以下の実例は、外科手術後のファロピウス組織の治療における本発明の多くの用途の１つを示唆する。アニオンポリマーを含む組成物について、外傷的損傷を標定した後、ラットの子宮角（uterine horn) の線維症を抑制する能力を試験することができる。モデル動物、例えば雌ルイスラットの腹部の皮膚及び筋肉を、腹腔を開口するために切開しうる。切開は子宮角の壁においてなしうる。子宮内膜に標定された外傷的損傷をつくり、次いで適当なアニオンポリマー、例えばデキストラン硫酸に  浸漬した半固体の医薬的に許容しうる担体を病変部位に挿入しうる。
【００５０】
外科手術後のファロピウス組織の治療のための好適な方法において、アニオンポリマーを含むゲル又はペーストが挿入され、抑制性組成物は病変の治ゆに従って自然に体内に吸収されるか、又は卵管通水法(hydrotubation) により洗い流される。抑制性組成物が挿入された後で、腹部の筋肉及び筋膜が閉じられ、縫合される。皮膚切開部も閉じられる。
【００５１】
当業者ならば、以上の記載から、本発明はいずれの外科手術にも関連する好適な治療方法を提供することが理解できよう。以上の方法は、外科手術後の線維症、瘢痕形成及びケロイド形成を抑制するために使用しうる。本発明の方法は、瘢痕形成を最小にすることが望まれる場合、即ち、再生又は美容外科のような、特に形成のための外科的処置において有用であろう。他の外科的適応症は、限定されるものではないが、腹部手術、関節手術、腱手術、骨盤側壁癒着を分離する手術、腹膜手術、胸部手術、血管手術及び心臓手術、特にバイパス手術、弁置換手術、心臓血管系手術又は他の開心手術である。
【００５２】
本発明は、さらに、高張性及びケロイドの瘢痕治療を提供する。美観の損失及び運動性を限定する瘢痕が、しばしば外科的除去の後に生ずる。抑制性又は抑制性−接着性組成物の使用は、瘢痕を除去するための治療の後の高張性の瘢痕又はケロイドの形成を限定し又は予防する。
【００５３】
他の態様において、治療上効果的な量の本発明のアニオンポリマー含有する組成物を移植片に適用することを含む、移植部の周辺における線維症を抑制する方法において使用しうる。瘢痕形成及び線維症の抑制が望ましい移植片の例は、限定されるものではないが、腎フィステル形成用のチューブ、腹膜ドレナージ用のチューブ、人工股関節、人工心臓弁、末梢神経修復プロテーゼ及び他のプロテーゼ及び静脈カテーテルである。移植片は本発明により提供される組成物でコーティング又は含浸させることにより処理しうる。本発明はさらに改善された移植片を提供し、この場合、改善は移植片をコーティングすることから成り、このコーティングは適当量の抑制性−接着性組成物から成るものである。移植片はポリマー移植片であり得る。上記ポリマー移植片は種々の組成物、孔径及びジオメトリーを有することができ、かつ、これに限定されるものではないが、ニトロセルロース、ポリアンヒドライド及びアクリルポリマー製の生物適合性ポリマーを含むことができる。移植片を形成するポリマーはそれ自体アニオンポリマーであり得る。
【００５４】
2.3.3.  関節における線維症病変部の治療
本発明の抑制性組成物は、線維症関節病変部の治療において使用しうる。外傷性の傷害は、しばしば陸上競技に関連する身体的活動及び接触から起こる。転倒又は衝突のような外傷性の傷害から生ずる関節の線維症は、傷ついた関節を固め、運動に痛みが伴うようにする。外傷を負った領域における瘢痕組織は、しばしば腱の損傷の後に生ずる。側頭下顎骨の関節の機能不全において、あごの動きは限定され、かつ痛みを伴うものとなるかもしれない。
【００５５】
関節の病変部を治療する一つの方法は、関節を外科手術で切開するか、又は関節鏡検的に関節にアクセスし、癒着を除去するものである。これらの方法は、治癒過程においてさらに線維症を引き起こすという不利益を有する。本発明の抑制性のアニオンポリマーを含む組成物を投与すると、関節におけるその後の線維症及び癒着形成が抑制されるため、治療を成功させる機  会が増大するであろう。
【００５６】
本発明は、陸上競技又は事故から生ずる関節の損傷の治療における整形外科的手術のために使用されるであろう。口腔外科では、幾つかの型の側頭下顎骨の関節の機能不全を治療する際に本発明は有用であることが見い出されるであろう。治療方法において使用するためのアニオンポリマーは上記第2.及び2.1.節に記載されており、組成物は上記第2.2.及び2.2.1.節に記載されている。好ましい態様において、硫黄含有量が10重量％以上のデキストラン硫酸が使用され得る。さらに好ましい態様において、デキストラン硫酸の平均分子量は約40,000から500,000ダルトンである。
【００５７】
2.3.4.  グリア細胞の侵入の抑制
デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、アルギネート、及び高度にアニオン性の特性を有するアニオンポリマー、例えば、約10％以上の硫黄含有量を有し、硫黄が酸性スルフェートとして見い出される硫酸化されたアニオンポリマーのような、本発明のアニオンポリマーは、グリア細胞の侵入の抑制が望まれる部位に上記アニオンポリマーを投与することを含む、グリア細胞の侵入を抑制する方法において有用である。種々の態様において、グリア細胞の侵入は、外傷、手術、ウイルス感染、細菌感染、代謝病、悪性疾患、毒性物質への暴露、又は過形成状況により引き起こされる。グリア細胞は星状細胞であってもよい。
【００５８】
他の態様において、抑制性−接着性組成物は、グリア細胞の移動又は侵入に対するバリアーとして使用することができる。抑制性−接着性組成物は、コーティング方法により前述の状態から器官又は組織を保護するための好適な方法を提供する。例えば、後根神経節、視神経又は視神経交叉は、制御できない細  胞侵入及び癒着から保護するために抑制性−接着性組成物でコーティングされてもよい。線維芽細胞並びにグリア細胞の侵入は、この方法により抑制されるであろう。抑制性−接着剤で器官又は組織をコーティングすることは防止又は予防効果があり、又はすでに症状の表われた患者における治療となり得る。
【００５９】
2.3.5.  神経細胞の侵入の抑制
高度にアニオン性の特性を有するアニオンポリマー、例えば約10％以上の硫黄含有量の硫酸化された（sulfated) アニオンポリマー及びこれを含有する医薬組成物を投与することにより細胞の侵入を抑制する方法は、神経突起の成長を抑制するために使用することができる。特性の態様において、抑制性−接着性組成物を使用しうる。アニオンポリマーは神経突起の成長又はグリア細胞の侵入を抑制することが望まれる領域に投与しうる。或る態様において、抑制性組成物は神経膠腫、又は神経組織の腫瘍、即ち、神経芽腫のような悪性腫瘍を有する患者の治療に使用しうる。
【００６０】
他の態様において、抑制性組成物は神経腫（軸索が適当な目標又は神経発達のための基質経路のいずれかを見失った場合の状態に関連する方向性のない軸索の成長(undirected axon growth)を治療するために使用することができる。例えば、抑制性組成物は切断、病変又は先天的な奇形等に関連する神経腫の治療のためにも使用しうる。現在、骨の近辺にドリルで穴をあけ、その穴に軸索が置かれる。しばしば、この方法は、穴から軸索が離れて、神経腫を形成するため失敗に終わる。神経端部及び骨をコーティングするために本発明の抑制性組成物を使用すると、方向性の定まらない軸索の成長に対し環境的な抑制を与えることにより上記の現行の欠点が克服されるであろう。代わりに、この抑制性組成物は、ポリマー “キャップ（cap)" 、即ち、一端が閉じたポリマーのシリンダーとして使用しうるかもしれない。本発明のアニオンポリマーは、キャップの内側をコーティングするためにも使用可能であり、そのことにより神経突起の成長及び神経腫の形成に対して環境的に抑制作用を与える。他の態様において、ポリマーキャップはアニオンポリマーを含むことができる。
【００６１】
好適な態様において、抑制性−接着性組成物は、神経腫の治療に使用しうる。軸索及び骨をコーティングするために本発明の抑制性−接着性組成物を使用すると、
（１）軸索を骨の内部の穴に固定し、そして
（２）抑制的環境を提供するであろう。
【００６２】
代わりに、抑制性−接着性組成物は、ポリマー“キャップ" 内に神経の端部を固定するのに使用しうるかもしれない。
【００６３】
限定されるものではないが、神経成長促進因子、線毛の神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor)、脳由来の成長因子、ラミニア（laminia)、ＮＣＡＭ、Ｌ２及びＳＳＥＡ−１を含む神経成長−促進因子の過剰生産から生ずる疾患は、抑制性−接着性組成物又は抑制性組成物の投与により治療することができる。抑制性又は抑制性−接着性組成物は、中枢及び／又は末梢神経系の疾患を治療するために使用することができる。
【００６４】
2.3.6.  投与形態
本発明の抑制性アニオンポリマー又は抑制性−接着性組成物の導入方法は、当業者に既知の方法を含む。本発明の抑制性組成物又は抑制性−接着性組成物はいずれかの適切な経路により関連部位に導入することが望ましい。これらは、限定されるものではないが、例えば手術時の局所注入又は適用により、注射により、エアゾールにより、カテーテル手段により、又は移植片手段により、（但し、この移植片は多孔の、非多孔の、又はゼラチン様物質であって、サイラスティック膜又は繊維のような膜を含むものである）により達成しうるかもしれない。好適な態様において、移植片は本発明の抑制性−接着性組成物によりコーティング又は浸漬される。抑制性分子で処理された、又は、より好適には抑制性−接着剤でコーティングされたポリマー移植片は、治療が望まれる部位に適用され又は挿入されうる。かかるポリマーは、種々の組成、孔径、及びジオメトリーを有することができる。限定されないが、使用しうるポリマーには、ニトロセルロース、ポリアンヒドライド及びアクリルポリマーから製造されたものが含まれる。
【００６５】
本発明は、外科的方法による抑制性組成物又は抑制性−接着性組成物の適用を提供する。抑制性アニオンポリマー又は抑制性−接着剤は外科的な傷に適用され得る。アニオンポリマー又は抑制性−接着剤は、組織の損傷部位へ、又は全器官をコーティングするため又は外科的切開を閉じるために直接に使用しうる。適当な場合、抑制性のアニオンポリマー又は抑制性−接着性組成物の投与は、オルソロスコピックな方法（orthroscopic  procedures)でなし得るかもしれない。
【００６６】
抑制性−接着性組成物が導入された場合には、接着性タンパク質は所望の部位で硬化する機会を有し（上記第2.2.1.を参照）、抑制性の分子を最も効果的に固定するであろう。硬化は、抑制性−接着性組成物が外科的切開、外傷性損傷、又は古典的な切開手術の間に器官又は組織に適用される場合のような、空気環境下で生じうる。代わりに、硬化は弱い酸化的分子にさらすか、又は組成物の粘度が組成物を硬化が生ずる間所望の部位の近辺に保持しうるようなものである場合には、自然に、その場で（in situ)生じるかもしれない。
【００６７】
3. 実施例：硬膜外の線維症動物モデル
硬膜外の線維症は、椎弓切除処置の後に生ずる瘢痕組織に関係する。瘢痕組織は椎弓切除部位内で生じ、脊柱起立筋(erector spinae muscles)の下面を硬膜の後部（posterior)及び下部（lateral)表面及び硬膜を通して存在する神経根に結合させる。神経根への瘢痕組織の付着は、椎弓切除処置の後で長く続く、再発性の痛みの原因であると信じられている。
【００６８】
硬膜外の線維症は、ラット、ウサギ及び犬の腰部の椎弓切除の後で試験した。これらのモデルにおいて、椎弓切除を実施し、次いで試験物質を椎弓切除部位に適用した。続いて、椎弓切除部位は、大きな切開により又は組織学的な分析により、線維症を試験した。
【００６９】
これらの実施例において、硬膜外の線維症を抑制するために試験物質として使用するための組成物は、一般に40kDa の分子量のデキストラン硫酸、ゲルフォーム粉末及びリン酸緩衝食塩水を使用して製造された。これらの三成分は、静脈内の、経口の、及び非経口用のヒトの臨床的な使用にける安全性の長い歴史を有している。以下の節で議論される試験の幾つかは、500kDaの分子量を有するデキストラン硫酸を使用しており、媒体(vehicle) としてゲルフォーム粉末に代えてゲルフォームスポンジを使用した。これらの変更は、ラット、ウサギ及び犬のモデルにおける臨床的結果に対して影響を与えないことが示された。
【００７０】
下記に記載される動物モデルは、40kDa と500kDaのデキストラン硫酸物質の間では、抗線維症作用において差異を示さなかった。文献に与えられているデータは、しかしながら、より低い分子量の物質は、より高い分子量の物質に比較して低毒性でありうることを示していた（下記に記載される濃度では、毒性は観察されなかった）。この測定が一度なされたら、その後の試験は40kDa のデキストラン硫酸を使用して実施した。
【００７１】
デキストラン硫酸と使用するのに適した媒体を決定する際に、幾つかの物質−ゲルフォームスポンジ、プルロニックゲル（Pluronic gel) 、ゼラチン、コラーゲン及びゲルフォーム粉末を試験した。試験結果及び外科医の好みに基づいて、デキストラン硫酸を含有するゲルとして配合されるゲルフォーム粉末が選ばれた。以下の節で議論される多くの試験は、この粉末の代わりにゲルフォームスポンジを使用した。このスポンジ及び粉末の製造者である、アップジョン社により提供された情報によると、この粉末は実際には粉末状に加工されたスポンジ物質である。我々は、ゲルフォームスポンジ及びゲルフォーム粉末により達成された結果の間では何ら臨床的な差異を見出さなかった。
【００７２】
3.1.  ラットモデル
3.1.1.  実験計画
各動物内で自動コントロールを提供するために、（以下に記載するとおり）椎弓切除を腰椎のＬ３及びＬ５で実施した。実験用又はコントロール用の溶液に浸漬したゲルフォーム（GELFOAM)（登録商標、アップジョン社）の一部を椎弓切除部位に挿入した。浸漬したゲルフォーム片を調製し、24時間前にコードした。ゲルフォーム片は、カルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）中のデキストラン硫酸、ＣＭＦ−ＰＢＳ中のデキストラン又はＣＭＦ−ＰＢＳのみの溶液に浸漬させた。幾つかの椎弓切除部位では、ゲルフォーム片は偽装操作として使用するために省略された。続いて、大きく切開して、椎弓切除部位にいずれの溶液が配置されたかについて何らの知識もないようにして評価を実施した。このように、実験は二重盲検であった。
【００７３】
3.1.2.  椎弓切除
ルイスの同系交配したラットを４％の抱水クロラールで麻酔した（34mg／100g体重）。背部皮膚を切開し、腰椎Ｌ２からＬ６の棘状突起からパラスピナル（paraspinal) 筋を分離した。Ｌ３とＬ５の棘状突起は骨鉗子で取り除いた；次に、椎骨板（vertebral lamina) をマイクロ骨鉗子で取出し、４×２mmn の径の長方形の椎弓切除の欠損部を作った。止血はエピネフリンを浸漬した綿のペレット及び緩やかな圧力を使用して達成した。出血が停止した後、ランダムなプロトコールに従ってゲルフォーム片を椎弓切除部位に配置した。上に位置するパラスピナル筋は、再吸収可能な６−０ PDS II （エチコン）で表面上の筋膜とともに縫合することによりその部位を閉じた。皮膚の切口は傷用クリップで閉じた。
【００７４】
3.1.3.  分 析
動物は２週間保持してから、全体の評価を行った。経時的実験において、動物は４, ８, 16, 26及び36週維持した。その時点で、ラットは４％の抱水クロラールで麻酔し、傷部は皮膚を切開し、パラスピナル筋を分離することにより再び開口させた。椎弓切除部位上の瘢痕組織の量及び質、ゲルフォーム（GELFOAM 、登録商標）の外観及び新しい骨の成長の程度は、硬膜まで鋭く切開する間、視覚的かつ触覚の観察により評価した。全体観察が完了した後で、ラットは麻酔の過剰投与により安楽死させた。
【００７５】
3.1.4.  結 果
治療コードを教える前に、すべての全体評価を行ったが、その観察は治療グループごとに一覧表にして示した。硬膜外の線維症の程度の評価及び定量のための尺度は、表１に示されている。
【００７６】
【表１】
0003923290.tif 000002
すべての動物において、皮膚の切開及び下に位置する筋膜及びパラスピナル筋は良好に治癒していた。すべての椎弓切除部位において、パラスピナル筋を分離すると、瘢痕組織の層が露出した。
【００７７】
デキストラン硫酸部位では、表面の瘢痕組織は薄い層であることが見出され、それは容易に下に位置するゲルフォーム(GELFOAM、登録商標）から剥離された。ゲルフォームは椎弓切除部位から１又は２個の切片で容易にはがすことができた。ゲルフールムを除去した後で、硬膜は平滑なかつ透明な膜のように見えた。椎弓切除部位は、それ自体、大きさにおいて明らかな変化がなかった；その部位の境界は平らのようにみえた。
【００７８】
負のコントロール部位（デキストラン又はＣＭＦ−ＰＢＳ）は劇的に異なっていた。第１の差異は瘢痕組織の表面層に観察された：この層はゲルフォームに癒着していた。瘢痕組織が除去されたとき、ゲルフォーム内及びその周辺で出血が始まった（出血はデキストラン硫酸に浸漬したゲルフォームを除去したときは、生じなかった）。もう一つの差異はゲルフォームのテキスチャーであった：それは非常にもろく、それを除去するときくずれた。ゲルフォームを除去した後、椎弓切除部位の大きさは劇的に減少し、巾の狭いスリットになっていた。椎弓切除  境界のテキスチャー及び固さは、椎弓切除部位が新しい骨成長のために狭くなったことを示していた。
【００７９】
【表２】
0003923290.tif 000003
表２に示された結果は、各々の個々の尺度並びに合計点に関するデキストラン硫酸、デキストラン及びリン酸緩衝液の作用を比較したものである（低い点数は瘢痕形成の一層大きな抑制を示す）。４つの尺度のすべてにおいて、椎弓切除部位にデキストラン硫酸を移植すると、デキストラン又はリン酸緩衝液のいずれかを移植したものより有意に低い点数となる。これらの結果は、デキストラン硫酸はラットの椎弓切除モデルにおいて硬膜外の線維症を減少させるための劇的に強い薬剤であったことを示している。
【００８０】
硬膜外の線維症におけるデキストラン硫酸の異なる濃度の作用は、ラットの椎弓切除モデルで試験され、上記表１に記載されたとおりの点数をあげた。結果は表３に示されている。
【００８１】
【表３】
0003923290.tif 000004
瘢痕形成は20mg／mlの濃度のデキストラン硫酸により最も抑制された。濃度を10倍低下させて２mg／mlにすると僅かに瘢痕形成の抑制を減少させたが、抑制は依然としてコントロールよりも明らかに大きかった。0.2mg／mlの濃度では、デキストラン硫酸はコントロールとは有意差のない抑制を示した。
【００８２】
硬膜外の線維症の抑制に対するデキストラン硫酸、デキストラン及びリン酸緩衝液の作用は、移植後の時間の関数として試験され、表１に記載されたとおりの点数をあげた。
【００８３】
【表４】
0003923290.tif 000005
1 デキストラン硫酸は、それぞれの時点で対照群のスコアと有意に異なっていた（スチュ−デント tテスト; p<0.001)。
【００８４】
2 PBS のみを浸漬したスポンジまたは PBSに混入したデキストランを浸漬したスポンジあるいは未浸漬スポンジで処理したラットにより対照群を構成した。使用したどの対照群から得られた結果にも、統計的な相違が見られなかったところから、ここではスコアを総合してある。
【００８５】
表4 で明らかなように、デキストラン硫酸による瘢痕形成の抑制は、移植後4 週間目でも、移植後2 週間目と変わらず強かった（有意差が見られなかった）。処置後 4, 8, 16, 26, 36 週間後にも同様な結果が観察された（表5)。デキストランや緩衝液は、いずれの時点においても、瘢痕形成を抑制しなかった。結果は、デキストラン硫酸による瘢痕の抑制が有効であり、また持続的であることを示している。
【００８６】
椎弓切除用ラットのモデルを用い、アニオンポリマーを含む何種類かの異なった組成物を使用して、硬膜外線維症が抑制されたかどうかをテストした。ヘパリンとヒアルロン酸とはポリ硫酸化グリコサミノグリカンであり、ペントサンはポリ硫酸化キシランであり、アルギネートはカルボキシル化した炭水化物ポリマーである。それぞれの化合物について、表1 に記載したごとく、瘢痕形成に及ぼすその効果を採点した（表5）。
【００８７】
【表５】
0003923290.tif 000006
これらの化合物のうち、瘢痕形成を有効に抑制したのは、デキストラン硫酸のみであった。ヘパリンとアルギネートは緩衝液（対照）と比べてわずかな改善を示した。ヘパリンもラットでの、椎弓切除部位における出血と血腫形成との原因になったが、これは同様に用いたデキストラン硫酸には見られなかった。一方、ヒアルロン酸は瘢痕形成を抑制する能力をなんら示さなかった。
【００８８】
3.2 ウサギの椎弓切除モデル
ニュージーランド産の白ウサギでは、椎弓切除後の硬膜外線維過多の形成が、術中にデキストラン硫酸（MW =500 KDa; 400μg)を用いたことにより有意に低減していた。硬膜外線維過多の程度は、総体的な解剖により上記ラットのモデルに使用した採点方法を用いて評価した。この評価の結果は、表 6に掲げてある。
【００８９】
【表６】
0003923290.tif 000007
緩衝液で処理した部位では、両方の時間間隔において、明らかに密度の高い瘢痕が形成されていた。デキストラン硫酸で処理した部位は、実質的に、硬膜外の瘢痕形成や硬膜癒着を、明らかに実証してはいなかった。皮膚や腰背筋膜の治癒は、デキストラン硫酸による椎弓切除部位の処置により影響されなかった。これらの結果は、デキストラン硫酸がウサギでの、硬膜癒着や硬膜外線維症を予防したことを実証している。
【００９０】
3.3 イヌの椎弓切除モデル
イヌのモデルによって椎弓切除後の硬膜外線維症を評価した。硬膜は、第6、第4 ならびに第2 腰椎部位で、1 x 2 cmの椎弓切除により露出した。一番目の部位には、ゲルフォーム（Gelfoam）スポンジ中のデキストラン硫酸を、二番目の部位には、粉末状のゲルフォームで調製したゲル懸濁液中のデキストラン硫酸を使用したが、三番目の部位には、なにも使用しなかった。3 種類の腰椎部位には、これら3 種類の異なった方法による処理を無作為に行なった。硬膜外の瘢痕形成は、術後 4, 8, 16 週目に行なった（一回にイヌ4 匹の）総体的解剖評価により分析した。
【００９１】
腰弓切除部位に存在した結合組織、硬膜癒着ならびに骨の成長は、表7 に掲げた評価基準により採点したが、皮膚、腰背筋膜または錯棘状筋組織の治癒には、なんら差異が見られなかった。
【００９２】
【表７】
0003923290.tif 000008
なんの処理もしなかった部位とデキストラン硫酸で処理した部位とを、総合スコアで比較したところ、明らかに、デキストラン硫酸が硬膜外瘢痕の形成を有意に抑制していた。
【００９３】
【表８】
0003923290.tif 000009
3.3 結論
硬膜外線維症のモデルとして使用したラット、ウサギならびにイヌでは、デキストラン硫酸の存在が、明らかに、線維症や瘢痕形成を抑制したことによる実質的な治療上の恩恵を受ていた。デキストラン硫酸で処理したゲルフォ−ムＲも同様に骨の成長を抑制していた。前述の実施例では、外科的病変部を、デキストラン硫酸−ゲルフォ−ムＲで治療すると、瘢痕組織の薄層のほとんどを抑制し、硬膜はなめらかで透明のままだった。デキストラン硫酸を含浸させたゲルフォ−ムＲは一片として容易に除去でき、このことは線維症を予防したことを示す。対照的に、陰性の対照部位には、表層の瘢痕形成や厚い執着性の根深い瘢痕に加え密度の高い骨の成長が見られた。
【００９４】
ラットやウサギではいずれも、椎弓切除のモデルが、ヒトの背部外科手術の様相に類似している。瘢痕形成は、創傷部位から外科領域への線維芽細胞、上皮細胞ならびに免疫系細胞の増殖や遊走に基づいている。その後、線維結合組織や血管が外科領域に形成される。これら硬膜外線維症の特色は、ヒトやラットそれにウサギに共通して見られるものである。
【００９５】
さまざまな相違点は、大きさの違いや外科手術の細部に関連している。比較的その体が小さいラットやウサギは、高度な外科手術を余儀なくされている。ラットやウサギでは、全椎弓切除術が行なわれるが、ヒトの場合の背部手術は、通常、部分的な椎弓切除を必要とする。また、ヒトの背部外科手術の最も共通した理由の１つが椎間板切除である。小動物のモデルでは、こうした手術が不可能なところから、脊椎板を損傷する後遺症をラットやウサギのモデルでは研究し得ない。しかし、実際のヒトの外科手術に極めて類似したイヌのモデルではこれを行なうことが可能である。
【００９６】
この実施例で用いたデキストラン硫酸は高度に有効な陰イオン電荷密度を有するアニオンポリマーであり、硫黄の含有量は15.3 wt%である。デキストラン硫酸は、デキストランを硫酸と共に煮沸し、クロルスルフォン酸でエステル化して調製することができる。デキストランとデキストラン硫酸はいずれもポリグルコ−ス炭水化物の主鎖を有している。デキストラン硫酸またはデキストランを含浸したゲルフォ−ムＲの結果を比較したところ（高度に陰イオン性の）デキストラン硫酸が、（陰イオン性でない）デキストランよりも遥かに硬膜外線維症を抑制する効果があったところから、本発明では、ポリマーの陰イオン性状がその抑制効果と有用性とに影響を与えていることが明白である。
【００９７】
しかしながら、表5 に示した他の陰イオンポリマーにより得られた結果は、電荷密度のみが生体内での潜在的な抑制能力を表しているわけではないことを示している。試験管内では強力に抑制的であった天然のプロテオグリカンは（第4 節、下記参照）、生体内で最小限に活性であるか（アルギネート、ヘパリン）、不活性（ヒアルロン酸）であった。ペントサンは硬膜外線維症の予防にまずますの効果を示したが、試験管内では、細胞の侵入を抑制する上で非常に効果があった。
【００９８】
4. 実施例：  試験管内における細胞侵入の抑制
アニオンポリマーは、細胞の侵入を抑制することがわかった。（以下に記述される）ストリップ検定法は、試験管内で細  胞侵入の有無を知る上で有用なモデルになっている。抑制活性は、ラミニンのような基質分子を被覆したストリップから、基質分子と抑制分子（例えばアニオンポリマー）を被覆したストリップへの細胞の遊走度によって測定することができる。また、アニオンポリマー、特に DS や KS/CS の細胞接着を抑制する能力をも測定した。
【００９９】
4.1. 物質および方法
4.1.1. 細胞培養物
細胞系：ネズミの3T3線維芽細胞（NIH）、ラットのC6膠腫（Paganetti等、1988,J.Cell Biol. 107:2281）ならびに MCG-28の若い不死化したマウスの星状膠細胞（SV-40 で不死化したネズミの新生児星状膠細胞系）を、ダルベッコの改良イ−グル培地（DMEM）、10%ウシ胎児血清（Gibco Laboratories）およびペニシリンG/ストレプトマイシン(それぞれl00 units/ml、100 μg/ml、Gibco Laboratories)からなる培地で増殖した。ストリップ検定では、集密プレ−トを 0.05%トリプシン、0.53 mM EDTA (Gibco Laboratories)で分離し、200,000 細胞/ml (3 ml/プレート)でまいた。細胞の接着検定では、0.03% EDTAで集密培養物を分離し、ウエル当たり 20,000 個から100,000 個の細胞を96−ウェルのマイクロタイタープレ−トにまいた。好クロ−ム性細胞腫の細胞系であるPC12細胞(Green L.A. & Tischler A.S.,1976,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73:2424) を、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート(RPMI)の培地 1640 (Gibco Laboratories)、ウマの10% ウマ血清、10% ウシ胎児血清およびペニシリン G/ ストレプトマイシン（それぞれl00 units/ml、100 μg/ml、Gibco Laboratories)を含有した培地で増殖した。細胞は、0.03% EDTAで分離し、96−ウェルのマイクロタイタープレ−トに、ウエル当たり細胞 3,000個の割合でまいた。
【０１００】
一次細胞培養物：ラットの髄膜線維芽細胞(RMF) の一次培養物を、P-3 ラットの子どもより得た。組織を動物から取り出し、L-グルタミン培養液を有する Leibovitz's L-15 に移した。その後、解剖用のメスを用い、組織を細断し、Ca2+/Mg2+ を含有しないハンクスの平衡塩類溶液（CMF-HBSS, Gibco Laboratories) 中の0.25% トリプシンで37℃、20分間酵素的に解離した。細胞は、10% FCS を加えたDMEM で洗浄し、遠心分離により濃縮したのち、75cm2 のフラスコ当たり細胞数 5.0 x 106  でプレートするために、10% FCS を加えたDMEM により希釈した。成熟したラットの座骨神経線維芽細胞 (RSF)は、成熟ラット座骨神経の 1mm切片を外植することによって得た。
【０１０１】
ラット星状細胞 (RAST) の培養物は、P-1-3 ラットの脳皮質より調製した。脳皮質を、結合組織や血管から剥離し、細断し、0.5%コラゲナ−ゼ（Gibco Laboratories) により37℃で 20分間解離したのち、37℃で 0.25%トリプシンにより 15 分間、0.04 mg/ml DNAse (Sigma)および 0.52 mg/ml 大豆トリプシン  抑制剤により 5分間解離した。細胞はその後、機械的に、パストゥ−ルのピペットを用いて摩砕によって解離し、ポリ-L-リシン (PLL、Sigma)を被覆した 75 cm2 のフラスコ内で、細胞数 1.5 x 107でまいた。プレ−ティング後、フラスコを4 時間振盪し、接着性の乏しい非星状細胞の乏突起神経膠細胞およびニューロンを取り除いた。
【０１０２】
一次外植片培養物：背根神経節 (DRG)は、E8-E9 ニワトリの胚より得た。解離は CMF-HBSS で行なった。脊髄を露出し、DRG を取り出したのち、周囲の結合組織を除去した。DRG は、神経成長因子 (NGF) 50 ng/ml を含有するDMEM/F12、10％ウシ胎児血清中にまいた。また、DRG はラミニン（LN,Gibco Laboratories)
もしくはポリ−L−リシン（PLL,Sigma）で被覆した皿にまいた。
【０１０３】
4.1.2. ストリップ検定
ストリップ検定は、本質的に、Snow 等が記述した通りに行なった (1990, Exp.Neural 309:111-136)。組織培養用のペトリ皿 (Falcon,60 mm) を予めメタノール6ml に溶解した5 cm2 切片のニトロセルロース(Schleicher & Schuell, Type BA85) の混合液 0.5mlで被覆したのち、層流フ−ドで風乾した。セルロースの濾紙（Whatman #1) を McILwain の組織用チョッパー(The Mickle Laboratory Engineering Co.,Ltd.)で 12 x 0.35 mm のストリップに切断した。濾紙のストリップは、所定の濃度の DS-PG または S/CS-PG および LN 溶液20μl に浸漬し、ニトロセルロースで被覆した皿に 30 秒間ブロットしてのち除去した。試験溶液を風乾させた。このプロセスを5 、6 回繰り返して、明確に規定された、間隔が等しい、幅の均一な平行バンドをプレート上に調製した。その後、0.1 もしくは 1 mg/ml LN の薄層を、湾曲したガラス製のパストゥ−ルピペットでバンドを越え均一に伸張し、培地で被覆した（図 1) 。
【０１０４】
プレ−トに、2.0 x l05 細胞／mlの細胞懸濁液もしくは4-10 DRGの外植片をまいた。培養物は、Leitz Fluovertの顕微鏡を用い、最高7 日間にわたって、DS-PG または KS-CS-PG バンドの接着、遊走および/ もしくは侵入の度合いによって評価した  。
【０１０５】
細胞の接着、遊走および/ もしくは侵入が完全に抑制されていたバンドは、その評価結果を (-)とし、細胞の接着、遊走および/ または侵入が制限されていたものを (+/-)とし、細胞の接着、遊走および/ または侵入が許容されていたものは (+)とした。細胞の接着は、その付着や拡散の原因となる細胞の表面と下層との初期の相互作用として定義され、細胞の遊走は、操作上、同じ下層内における細胞の運動として定義され、そして、細胞の侵入は、操作上、あるタイプの下層から他のタイプの下層への、細胞運動として定義された。
【０１０６】
4.1.3. 外植片の成長検定
DRGの外植片を、LN または PLL で被覆した皿上で培養したところ、ニューロンならびに非ニューロン（線維芽細胞および Schwann細胞）成長の輪が、Leitz Fluovertの顕微鏡で 1、2、3日間にわたって観察された。処理しなかった対照群の成長に比較してその相対的な成長は、1:対照群の 0-19%; 2:対照群の 20-39%; 3: 対照群の 40-59%; 4: 対照群の 60-79%; 5: 対照群の 80-100%として評価した。
【０１０７】
4.1.4. PC12 神経突起の成長検定
PC12 細胞は、20 ng/ml NGF により8日間にわたって活性化し、PBS中の 0.03% EDTA によって収集し、ウエル当たり3,000個の細胞で予備被覆した96−ウェルのマイクロタイタ−プレ−トにまいた。マイクロタイタ−プレ−トは、予めポリ−L-リシンで被覆し、細胞の添加に先立って20分間、接着培地（PRMI 中の1% BSA）でブロックした。細胞は 20ng/ml NGFを補足した接着培地で生育させた。細胞はまた、試験化合物の添加に先立って、2時間付着させた（Akson & Warren1986, Exp. Cell Res. 162:347-362）。
【０１０８】
4.1.5. 比色定量細胞接着検定
マイクロタイタ−プレ−トは予め、ポリ−L-リシンで被覆し、細胞の添加に先立って、DMEM中の1%BSAによって20分間ブロックした。細胞を予め被覆した96−ウエルのプレート上で培養し、試験化合物を培地に添加した。加湿インキュベ−タ−内で5% CO２、36℃で 4 - 24 時間培養したのち、テトラゾリウム塩 MTT (3-(4,5- ジメチルタゾール-2- イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)を追加した。培養を2時間行なったところ、生細胞内に見られたミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナ−ゼが、MTTを、ホルマザン青色反応生成物に加水分解した。培地を吸引し、ウエルを洗って、分離した細胞をすべて取り除いた。付着した細胞内のホルマザン青色反応生成物を、イソプロパノ−ル中の、0.08 NHC1 によって可溶化し、プレ−トを 630 nm の標準フィルタ−を用い、570 nmでマイクロタイタープレートリーダー(Dynatech MR 4000)により読み取った。結果的に得られた光学密度の読み取り値は、ウエル内の生細胞数に直接関連している（Mosmann, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63)。サンプルはポイント当たり、3-6 の反応実験を行い、SDは 5% 以下であった。
【０１０９】
4.1.6. 試薬
ヘパリン、H-7005 Sigma, ブタから得たロット: 19F0268 グレード II 、ナトリウム塩；デルマタン硫酸 90%（コンドロイチン硫酸 B) C-4259 シグマ、ロット 59F0848、ナトリウム塩、ブタの皮膚；コンドロイチン硫酸 A、C-0914 シグマ、ナトリウム塩、ブタ； デキストラン硫酸、D-6001 シグマ、ロット 50HO458、MW 500 kD; デキストラン、シグマ、D-5251 シグマ、ロット 40HO4211 、MW
485 kD;ペントサンポリ硫酸、シグマ、P-8275、ロット 114F0194 。
【０１１０】
4.2 結果
4.2.1.  細胞の接着、遊走ならびに侵入に及ぼすDS-PG の影響
細胞の付着（つまり接着）、遊走ならびに侵入に及ぼすDS-PG の影響を一次培養物、線維芽細胞およびグリア細胞系により試験した。細胞浮遊液は上述したストリップ検定用に調製した組織培養プレ−ト上で培養した。培養プレ−トは、交互にDS-PG/LN (それぞれ 0.1-0.8 mg/mlおよび 20μg/ml) とLN (20μg/ml)ストリップで被覆し、細胞の接着、遊走ならびに侵入については、プレ−ティングの2日後に評価した。
【０１１１】
0.8mg/ml DS-PG ならびに20μg/ml LN の混合物を含む下層のストリップは、3T3細胞の接着に対して抑制的であった。細胞  は、DS-PG が欠如しているLNの下層領域に、選択的に付着していた。細胞の交互のバンドはDS-PG/LNおよびLNを含むストリップ間の界面に、非常に明確な境界線を形成していた( 図 2A &  2B;（- ）として評価）。0.2 mg/ml では、僅かな侵入が見られ（図 2C; （+/-)として評価) 、さらに 0.1 mg/ml では、細胞がバンド上に侵入し、遊走することが可能であった（図 2  D; (+)として評価）。細胞の接着、遊走ならびに侵入に及ぼす  DS-PG の抑制効果は、試験したすべての種類の細胞に観察され  た（表9) 。一次細胞と細胞系とは、0.8 mg/ml DS-PG で、そして一次星状細胞を除いて0.4 mg/mlで、細胞の欠如したバンドを形成した。この効果は、約 0.2 mg/ml DS-PGで抑制が低減し、0.1 mg/ml では抑制効果が無くなるという用量依存性であった。
【０１１２】
【表９】
0003923290.tif 000010
DS-PGの C6 細胞に及ぼす抑制効果の安定性は、６日目（図３）まで追跡し、3T3細胞のそれに対する安定性は７日目（表  10）まで追跡した。0.8 mg/ml のDS-PG で、細胞の密集層間に  形成された明確な交互のストリップは、少なくとも 4日間安定していた（図 3A-C）。６日目になると、僅かな数の細胞が、DS-PGのストリップに侵入し始め（図 3D）、3T3 細胞でも同様な結果が得られた（表 4）。
【０１１３】
【表１０】
0003923290.tif 000011
0.8 および 0.4 mg/mlのDS-PG による抑制効果は、少なくとも 4日間安定であり、7 日目では、わずかな侵入が明らかに認められた。同様に、0.2 mg/ml のDS-PGでのわずかな抑制が７日目までに打ち負かされた。0.1 mg/ml のS-PGでは、最初からなんら抑制効果が見られず、抑制効果の欠如は少なくとも 7日間持続した。
【０１１４】
線維芽細胞と星状細胞の一次細胞培養物に加え、DRGSの外植片培養物から遊走する線維芽細胞ならびに Schwann 細胞に及ぼす DS-PGの効果を試験した。胚生ニワトリ (E-8)のDRGを上述した交互の DS-PG/LN と LN ストリップ上で培養した。0.8 mg/ml DS-PG/20μg/ml LN では、LNの下層にわずかな DRGが付着しており、神経突起の成長や非神経細胞の遊走が制限されて  いることを実証していた（図 4A)。0.4 mg/ml のDS-PGでは、LNの下層にDRGが付着しており、神経突起の成長と非神経細胞の遊走のいずれをも明らかに示していた（図4B)。LN とDS-PG/LN ストリップ間の界面では、伸張した神経突起と遊走する非神経細胞が急激に停止したり、向きを変えたり、LNとDS-PG/LNストリップの境界に沿って移動していた。DS-PG による抑制は用量依存性であり、低い濃度(0.2 mg/ml) は制限された細胞の侵入をもたらした。一方、0.1 mg/ml のDS-PGでは、神経突起や非神経細胞の侵入が抑制されていなかった（表 6）。
【０１１５】
4.2.2.    細胞の接着、遊走ならびに侵入に及ぼすKS/CS-PGの効果
線維芽細胞やグリア細胞の一次培養物および細胞系に及ぼす KS/CS-PGの効果を試験した。試験した細胞の種類には、ラットの髄膜線維芽細胞（RMF）、成熟ラットの座骨神経線維芽細胞 (RSF)、ラットの星状細胞（RAST） 、3T3-マウス線維芽細胞系、C6-ラットのグリア細胞系および MCG-28の若い不死化した  マウスの星状細胞が含まれていた。細胞は、第4.1.2. 節で上述した通り調製された培養プレ−トにまき、細胞の接着、遊走ならびに侵入についての評価を行なった。
【０１１６】
2.7 mg/mlKS/CS-PGと20μg/ml LN の混合物を含む下層は、試験の対象としたすべての細胞型の付着と遊走を抑制した。ラット髄膜線維芽細胞、3T3 細胞、ラット星状細胞ならびにニワトリ DRG神経突起は、KS/CS-PGによる抑制を最も受けやすかった（表12）。用量と反応の関係を評価したところ、DRGニューロンが KS/CS-PG による抑制を最も受けやすく、グリア細胞系 C6 と MCG-28 が抑制を最も受けにくいことが明らかになった。C6細胞は2.7 mg/ml KS/CS-PGで付着がまず抑制され（図 5A）、その後遊走と侵入が部分的に抑制された（図 4B）が、長続きしなかった。プレーティングの48時間後までには、C6細胞はKS/CS-PGの抑制作用に打ち勝ち（図 5C）、試験を行なった細胞密度では72時間後までにバンドの形成が認められなかった。
【０１１７】
【表１１】
0003923290.tif 000012
4.2.3   DS-PG と KS/CS-PG の活性の比較
データによれば、DS-PG が KS/CS-PG よりも細胞の付着、遊走ならびに侵入を抑制する作用が強いようである（表 9対表 11）。この強さの違いは、乾燥重量/容積（mg/ml）による濃度をほぼ同じにして二つのプロテオグリカンを比較すれば明らかになる。しかし、DS-PGの推定分子量は KS/CS-PG のそれの約1/10なので、これをモル濃度で補正すると、DS-PGとKS/CS-PGの強さの違いは大幅に低減する。例えば、1.0mg/mlでのKS/CS-PG の概算モル濃度は1.25μMである。同じモル濃度の DS-PG（1.25μM 1.0 mg/ml）にはもはや抑制作用はなく、KS/CS-PGで見られた結果を反映している（表 9と表 11を比較されたい）。
【０１１８】
4.2.4   ヘパリンとデキストラン硫酸が細胞の遊走に及ぼす影響
ニワトリ DRGの外植片培養物からの細胞遊走にヘパリンとデキストラン硫酸が及ぼす影響を試験した。PLL または LN のいずれかの下層を予め塗布した培養皿にDRGをプレートし、濃度の異なるヘパリン、デキストラン硫酸もしくはデキストラン溶液を含む培地で培養した。試験化合物を用いない場合には、24 - 48時間以内に神経突起の成長の輪と非神経細胞、すなわち  線維芽細胞とシュヴァン細胞の遊走が神経節の周囲に認められた（図 6A）。DRG外植片から遊走する細胞の輪の大きさは、ヘパリン 0.4 mg/mlの存在下でその外植片を培養した場合に低減した（図 6B）。デキストラン硫酸0.2 mg/ml の存在下で外植片を培養した場合には、DRG外植片周囲の細胞の輪は大きさが劇的に低減した（図 6C）。対照的に、デキストラン 0.4 mg/mlの場合は何ら影響が見られなかった（図6D）。試験化合物の存在下で培養した DRGから発している細胞の輪の大きさを、処理を施していない対照と比較して評価し、第 4.1.3節に記載したように等級を定めた（表 12 ）。
【０１１９】
【表１２】
0003923290.tif 000013
ヘパリンとデキストラン硫酸の及ぼす影響を二つの異なる下層 LN と PLLで試験した。いずれの下層も、外植片の付着、神経突起の成長ならびに外植片からの非神経細胞の遊走を支持する。この二つの下層は、細胞が下層に付着する機序とその付着強度が異なっている。細胞の LN への付着には受容体が介在していると考えられるが、ポリカチオンポリマーである PLLはイオンの相互作用を介して付着する。細胞は LN かPLL のいずれかへの嗜好性を示す。DRGの場合、接着しやすい下層はLNである。表12に示すように、ヘパリンは PLLで培養したときにDRGからの細胞の遊走を抑制するが、LNで培養した場合には遊走を抑制しない。デキストラン硫酸は DRGを LN で培養した場合でも抑制効果があるので、これは、ヘパリンがデキストラン硫酸よりも抑制作用が弱いことを示している。PLLでは、1μg/mlにおいて、ヘパリンは抑制作用が弱かった。デキストラン硫酸は PLLでは、1μg/mlで、そして LN では、2 μg/mlで強い抑制作用があった。デキストランの場合は、DRGをPLL、LNのどちらで培養しても細胞遊走の抑制が観察されなかった。
【０１２０】
4.2.5   GAG とその他の硫酸化炭水化物による線維芽細胞付着の抑制
GAGとその他の硫酸化炭水化物は容易に組織培養プラスチックやその他の基板に吸着されないため、我々は定量法を用いて溶液中のそれらの活性を調べた。培地に試験組成物が存在する場合のPLLを塗布したマイクロタイタープレートへの線維芽細胞の付着を、第 4.1.5節に記載した MTT検定を用いて評価し、付着した細胞の数を対照に対する百分率で表した。ヘパリン、ペントサンポリ硫酸、デキストラン硫酸ならびにデキストランの存在下において4時間の培養がラット髄膜線維芽細胞（RMF）と3T3細胞のPLLへの接着に及ぼす影響を図 7に示した。
【０１２１】
ヘパリン、ペントサンポリ硫酸ならびにデキストラン硫酸は、処理を施さなかった対照と比較して、付着細胞数を低減させたが、デキストランで処理した場合は付着細胞数が僅かに増加していた。一次ラット髄膜線維芽細胞もしくは線維芽細胞系3T3のどちらで試験を行なっても、抑制度の順位は類似していた。一次線維芽細胞の付着はヘパリン、ペントサンポリ硫酸ならびにデキストラン硫酸で3T3細胞系よりも強く抑制された。処理 24 時間後にデキストランとデキストラン硫酸が付着細胞数に及ぼす影響を図8に示した。
【０１２２】
4.2.6   GAG とその他のアニオンポリマーが細胞遊走に及ぼす影響
GAG とその他のポリアニオン分子が細胞の付着と遊走に及ぼす影響を、PC12細胞の神経突起の成長の簡便かつ迅速なモデル系を使って調べた。NGF の存在下で培養した PC12細胞は神経突起を伸張した。神経突起の先端の成長円錐は付着、分離、遊走のサイクルを繰り返すことにより成長を媒介する。この過程の正味の結果は神経突起の伸長である。
【０１２３】
NGFで刺激した PC-12細胞を96−ウェルのプレートにまいた。試験液をウェルに加え、2 日後に、少なくとも細胞体の直径の二つ分の長さがある神経突起が大多数の細胞に見られる場合にはそれらの細胞を(+)として評価し、短い突起しか見られないかまたは全然見られない場合には(-)と評価した。各試験化合物に対して完全な用量反応曲線を作成し、その結果を IC100（g/ml）、すなわち、その化合物が神経突起の成長を100% 抑制した時の最低濃度として表した。試験したそれぞれの化合物に毒性がないことは、顕微鏡的には細胞死と細胞分離の証拠が認められないこと、細胞がトリパンブルーで陽性に染色されなかったこと、そして抑制効果のある化合物を培地から取り除くと神経突起が成長したことから確認した。試験の対象とした化合物は、GAG（ヘパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸 A、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸）、硫酸化炭水化物ポリマー（デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸）とその他のポリアニオンポリマー（アルギン酸など）であった。
【０１２４】
【表１３】
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化合物の試験管内における相対的な抑制度は硫黄の含有量と正の相関関係があるようである。硫黄官能基の貢献は、デキストラン硫酸とデキストランの活性を比較することにより、最も明確に実証される。硫黄は GAG中に硫酸として存在するが、陰イオンの電荷密度によって細胞の侵入に影響を及ぼす可能性が高い。この仮説を検証するため、我々は、負の電荷がカルボキシル基のみによるものであるポリアニオンポリマーのアルギン酸（アルギネート）を使用した。表 13 に示したように、アルギン酸も細胞の遊走を抑制する。この結果は、所定のポリマーの抑制作用の強い要素が陰イオン（負）の電荷密度であることを示している。
【０１２５】
4.2.7   デキストラン硫酸分子の大きさが線維芽細胞の付着に及ぼす影響
硫黄の含有量はほぼ同じであるが（15 - 16重量%）分子の大きさが異なっている硫酸化デキストランが線維芽細胞の付着に及ぼす影響を調べた。第4.1.5 節に記載した比色細胞付着定量法を用いて、5 kD、8 kD、500 kD、2,000 kDのデキストラン硫酸の存在下で 24 時間培養した 3T3細胞の用量反応曲線を作成した（図 9）。5 kD、8 kD、500 kD、2,000 kDのデキストラン硫酸で、3T3 細胞の接着に対する抑制作用が観察されたが、その強さは有意に異なっていた。デキストラン硫酸による 3T3細胞付着の抑制に対する EC50値は、5 kDでは 6 mg/ml、8 kDでは4 mg/ml 、500 kDでは 0.006 mg/ml、2,000 kDでは 20 mg/ml であった。この検定で作用が最も強かった分子は 500 kD のデキストラン硫酸である。
【０１２６】
4.3   結論
瘢痕形成と線維過多は、線維芽細胞が傷害部もしくは病変部に制御されずに侵入することから生じる。その他の有害な状態も、神経突起の成長、グリア細胞の侵入、単球/ マクロファージの侵入といった制御されない細胞の侵入によって生じる。線維芽細胞の侵入を抑制することで、瘢痕化や関連した有害作用、例えば、硬膜外線維症などの外科手術による癒着や、美容整形や再建手術につながる美容上不適当な瘢痕を防ぐこともできる。前述の結果は、グリコサミノグリカンとその他のアニオンポリマーが、線維芽細胞とグリア細胞などのその他の非神経細胞の侵入ならびに神経突起の成長を抑制して、関連する有害作用を防止することを示している。
【０１２７】
前述の結果は、抑制の程度が陰イオンの電荷密度と相関関係があり、この関係が本発明の実施に使用するためアニオンポリマーを同定、確認する上で有用となり得ることをも示している。しかしながら、in vivo での結果は、電荷密度が部分的にしか抑制効果を決定しないことを示している。
【０１２８】
本発明は、ここに記載した特定の具体例によってその範囲を限定されるものではない。実際には、先の記載した内容と添付の図面から、ここに記載したものの他に本発明の様々な改変が、当業者には明らかになるはずである。そのような改変は、本特許請求の範囲内に含まれるものである。
【０１２９】
各種の出版物を引用したが、その明細は参照によってここに完全に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラミニン（ＬＮ）とプロテオグリカン（ＰＧ）＋ＬＮの交互するバンドと、プレート全体にわたるＬＮの上張りを示すストライプ分析の概略図。
【図２】３Ｔ３細胞接着、移動及び侵入についてのＤＳ−ＰＧの投与量依存効果。4.1.2.節に記載したようにして被覆された６０ｍｍ組織培養皿の中で増殖した生きた３Ｔ３細胞の顕微鏡写真で、種々のＤＳ−ＰＧ濃度における３日間のＬＮとＤＳ−ＰＧ／ＬＮの交互するバンドを示す。（Ａ）0.８ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧ、（Ｂ）0.４ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧ、（Ｃ）0.２ｍｇ／ｍｌ  ＤＳ−ＰＧ、及び（Ｄ）0.１ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧ。（１００  ×）
【図３】Ｃ６細胞接着、移動及び侵入についてのＤＳ−ＰＧの時間依存効果。4.1.2.節に記載したようにして被覆された６０ｍｍ組織培養皿の中で増殖した生きたＣ６細胞の顕微鏡写真で、0.８ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧにおける（Ａ）２時間、（Ｂ）１日間、（Ｃ）２日間、及び（Ｄ）６日間のＬＮとＤＳ−ＰＧ／ＬＮの交互するバンドを示す。６日間までの抑制剤の安定性と６日目における制限された細胞侵入に注目のこと。（１００×）
【図４】ＤＲＧ外植片の接着及び細胞移動についてのＤＳ−ＰＧの効果。顕微鏡写真は、4.1.2.節に記載したようにして被覆された６０ｍｍ組織培養皿の中で増殖した生きたＤＲＧ外植片を示し、ＬＮとＤＳ−ＰＧ／ＬＮの交互するバンドを示す。（Ａ）0.８ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧ、及び（Ｂ）0.４ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧ。（Ａ）の外植片はＬＮだけを含有するスプライトに付着しており；ＤＳ−ＰＧを含有するスプライトに接着した外植片はない。溶解したＤＳ−ＰＧによるらしい細胞移動の劇的な抑制に注目のこと。0.４ｍｇ／ｍｌＤＳ−ＰＧの存在下では、外植片はＬＮスプライトに接着し細胞移動がその上で起こっているが、ＤＳ−ＰＧ／ＬＮバンド上では細胞接着も移動も侵入もみられない。（１００×）
【図５】Ｃ６細胞接着、移動及び侵入についてのＫＳ／ＣＳ−ＰＧの時間依存効果。4.1.2.節に記載したようにして被覆された６０ｍｍ組織培養皿の中で増殖した生きたＣ６細胞の顕微鏡写真で、２７ｍｇ／ｍｌにおける（Ａ）２時間、（Ｂ）１日間、（Ｃ）２日間、及び（Ｄ）３日間のＬＮとＫＳ／ＣＳ−ＰＧ／ＬＮの交互するバンドを示す。プレーティング後最初の２時間のＫＳ／ＣＳ−ＰＧ被覆バンドへの接着の欠如及びプレーティング後２４時間に形成されたバンドの安定性に注目のこと。ＫＳ／ＣＳ−ＰＧバンドのＣ６侵入はプレーティング後２日目で起こり、優先的な接着の証拠がないことは３日目に明らかになっている。（１００×）
【図６】ＤＲＧ外植片からの細胞移動についてのヘパリン、デキストラン硫酸及びデキストランの効果。５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中に１０％ＦＣＳを含有する培養培地内で２４時間増殖後の生きたＤＲＧ外植片の顕微鏡写真。試験溶液を該培養培地にプレーティング時に添加した。そして、神経細胞及び非神経細胞の細胞移動についての効果が示される。（Ａ）ビヒクルコントロール、（Ｂ）４００μｇ／ｍｌヘパリン、（Ｃ）２００μｇ／ｍｌデキストラン硫酸、（Ｄ）４００μｇ／ｍｌデキストラン。ヘパリンによる細胞移動の抑制及びデキストラン硫酸による劇的な抑制に注目のこと。（１００×）
【図７】線維芽細胞及び３Ｔ３細胞接着についての硫酸化された炭水化物の効果。ラット髄膜線維芽細胞（ＲＭＦ）及び３Ｔ３細胞の一次培養物を、ＰＬＬ被覆９６ウェルマイクロタイタープレート上にプレートし、試験化合物の存在下で４時間インキュベートし、4.1.5.節に記載したようにして比色細胞接着分析用に処理した。該データは、サンプル当たり６反復試験区の平均から得られた結果を表す（標準偏差は±５％を越えなかった）。該実験を２回繰り返して本質的に同じ結果を得た。
【図８】３Ｔ３細胞接着についてのデキストラン硫酸効果の投与量−応答曲線。３Ｔ３細胞をＰＬＬ被覆９６ウェルマイクロタイタープレート上にプレートし、種々の濃度のデキストラン硫酸又はデキストランの存在下で２４時間インキュベートし、4.1.5.節に記載したようにして比色細胞接着分析用に処理した。各点は３反復試験区の平均を表す。
【図９】異なる分子量のデキストラン硫酸についての投与量−応答曲線：３Ｔ３細胞接着についての効果。３Ｔ３細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウェルマイクロタイタープレート上にプレートし、種々の濃度のデキストラン硫酸の存在下で２４時間インキュベートし、4.1.5.節に記載したようにして比色細胞接着分析用に処理した。各点は３反復試験区の平均を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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