(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置であって、
（１）第２２番染色体上に存在する当該疾患の責任遺伝子であって、前記疾患において特異的に欠失しているＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって定量するための配列表の配列番号１記載の順方向プライマー、配列表の配列番号２記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号３記載のＵＦＤ１Ｌプローブ、
（２）第２１番染色体上に存在する遺伝子であって、前記疾患によって含有量が変化しない遺伝子であるＳ１００β遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号４記載の順方向プライマー、配列表の配列番号５記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号６記載のＳ１００βプローブ、
（３）前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子および前記Ｓ１００β遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により定量的に増幅するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応試薬キット、
（４）前記試薬キットを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応による前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子および前記Ｓ１００β遺伝子の増幅、増幅された前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子および前記Ｓ１００β遺伝子の検出及び解析を行うための装置、により構成される２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置。
【請求項２】
ダウン症候群の診断装置であって、
（１）前記疾患において特異的に増加する第２１番染色体上に存在する遺伝子であって、前記第２１番染色体上のダウン症候群関連領域に存在するＳ１００β遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号４記載の順方向プライマー、配列表の配列番号５記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号６記載のＳ１００βプローブ、
（２）第２２番染色体上に存在する遺伝子であって、前記疾患によって含有量が変化しない遺伝子であるＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号１記載の順方向プライマー、配列表の配列番号２記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号３記載のＵＦＤ１Ｌプローブ、
（３）前記Ｓ１００β遺伝子および前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により定量的に増幅するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応試薬キット、
（４）前記試薬キットを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応による前記Ｓ１００β遺伝子および前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の増幅、増幅された前記Ｓ１００β遺伝子および前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の検出及び解析を行うための装置、により構成される２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲにより、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の量及びＳ１００β遺伝子の量を測定することを特徴とする、２２ｑ１１．２欠損症候群及びダウン症候群の新規の診断装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２２ｑ１１．２欠損症候群（ＣＡＴＣＨ２２症候群）は、第２２番染色体の短腕１１．２（２２ｑ１１．２）の約３メガベースの微小欠失による染色体異常症であり、出生４０００人あたり１人の発症頻度の、比較的頻度の高い遺伝病である。即ち、本疾患の本態は第２２番染色体の一部が欠損する部分モノソミーの染色体異常であり、ＣＡＴＣＨ２２症候群に含まれる症候群にはディジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群、円錐部動脈幹異常顔貌、Ｏｐｔｉｚ症候群、ｖｅｌｏｃａｒｄｉｆａｃｉａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅが含まれる。
【０００３】
尚、通常の個体においては各染色体を２本ずつ、計４６個の染色体を有するが、減数分裂の際に染色体の不分離が起これば染色体を１個過剰に有する配偶子と、１個不足する配偶子ができ、その各々が正常な染色体構成の配偶子と接合すると、１個過剰な染色体をもつ個体、あるいは染色体を１個欠いた個体が発生する。その様な染色体数の異常を異数性といい、染色体数が１個過剰な個体をトリソミー、染色体数が１個不足している個体をモノソミーという。ＣＡＴＣＨ２２症候群は第２２番染色体の部分モノソミーであるが、常染色体の完全モノソミーは致死的である。一方、ギャップ、切断、交換などの構造異常による染色体異常においては、減数分裂は正常であるために染色体数は正常であり異数性を伴わない。
【０００４】
臨床的に認められるＣＡＴＣＨ２２の代表的な症候としては、先天性心疾患（心奇形）、顔貌異常（円錐部動脈幹異常顔貌）、胸腺の低形成、口蓋裂、低カルシウム血症（テタニー）が挙げられる。これらの奇形の発生機序は神経堤細胞の遊走不全であると言われている。神経堤細胞は発生初期に頸の背中側に生じて、腹側へ遊走して脳神経、胸腺、副甲状腺、心臓の円錐部と動脈幹に分布して、これらの初期発生に必須の材料となる。ＣＡＴＣＨ２２症候群では神経堤細胞の機能、又は遊走が不良でこれら臓器の低形成、異常を生じる。本疾患において予後を左右する最も重要な因子は心疾患の程度であるが、ＣＡＴＣＨ２２症候群における心奇形は、Ｆａｌｌｏｔ四徴症、総動脈幹残違症、大動脈弓離断症を合併している。
【０００５】
従来、ＣＡＴＣＨ２２症候群の診断は、染色体分染法や、第２２番染色体のｑ１１．２のプローブ（Ｎ２５ＤＧＣＲプローブ）を用いた蛍光インシツハイブリダイセージョン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）により行われていた。即ち、リンパ球を遠心分離して培養し、細胞分裂のメタフェーズを調べる。上述した第２２番染色体のプローブを用いると、正常の第２２番染色体は２個の蛍光点を有するが、２２ｑ１１．２欠失の２２番染色体は１個のみ蛍光点をもつために、当該疾患を診断することができる。
【０００６】
一方、ダウン症候群は最も高頻度で認められる染色体異常症であり、出生１０００人あたり１人の頻度で発症する。ダウン症候群の本態は第２１番染色体が１個過剰であるトリソミーである（染色体数４７、２１番常染色体３個）。症状としては、知能障害及び蒙古人様の顔貌が挙げられ、先天性心疾患を有することも多い。また、本疾患の発生は母親の加齢と共にその頻度が増加すると言われている。第２１番染色体のトリソミーを証明することによりダウン症候群は診断されるが、その診断は染色体分染法により行われることが一般的である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、従来はＣＡＴＣＨ２２症候群の診断にはＦＩＳＨ法が用いられてきた。ＦＩＳＨ法は優れた診断方法であるが、細胞培養及びハイブリダイゼーションの過程を必要とするために、解析に数日が必要であった。また、過程が複雑であるために正確な結果を得るためには熟練が必要であり、費用も１検体あたり約６５００円と高価であった。そこで、迅速かつ簡便で費用も安く、ＦＩＳＨ法に替えることができるＣＡＴＣＨ２２症候群の診断装置が、求められていた。また、ダウン症候群の診断は染色体分染法により行われてきたが、より迅速かつ簡便な方法が、やはり求められており、その様な目的に使用できる新規の診断装置を開発する事が本発明の課題である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ところで、ＣＡＴＣＨ２２症候群の責任遺伝子に関する知見が近年増加してきた。ディジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）染色体領域中において、ユビキチン融合蛋白質分解（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ＵＦＤ１Ｌ）遺伝子が、ＣＡＴＣＨ２２症候群の責任遺伝子であるという知見が、近年報告された。酵母のユビキチン融合蛋白質分解酵素（ＵＦＤ１ｐ）のヒトホモログ蛋白質をコードする遺伝子がＵＦＤ１Ｌ遺伝子であり、ＵＦＤ１蛋白質はユビキチン化した蛋白質の分解に関与している。ユビキチンと結合する翻訳後修飾は、多くの蛋白質の分解における重要な初期反応である。ＵＦＤ１Ｌ遺伝子は発生の過程において高レベルで発現する様になり、外胚葉由来の組織構造の発達に関与していると言われている。ユビキチンにより仲介される機構が神経堤の発生に役割を果たしていると示唆する知見もあり、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の欠損とＣＡＴＣＨ２２症候群の病態との関連に興味がもたれている。
【０００９】
ＦＩＳＨにより２２ｑ１１．２の欠損が認められた患者の全てにおいて、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子が欠損している事が、最近報告された（Ｐｉｚｚｕｔｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）６：２５９−６５）（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８３：１１５８−６１）。上記の知見より、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の量を定量することによりＣＡＴＣＨ２２症候群を診断することが可能であると考えられる。
【００１０】
一方、Ｓ１００βは星状細胞由来の神経突起成長促進因子であり、それをコードする遺伝子は第２１番染色体上のダウン症候群関連領域に存在することが知られている。第２１染色体の異数性を定量的蛍光ＰＣＲで解析した過去の報告（Ｃｈｉａｎｇ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６）６：１０１３−２６）より、Ｓ１００β遺伝子を第２１染色体上の標的として用いることを考えた。中年以降のダウン症候群患者において、アルツハイマー病に類似した神経の病変が見られるが、ダウン症候群の患者において、星状細胞においてＳ１００βが過剰発現し、またβアミロイド前駆体蛋白質の発現が増加していることが示唆されており、Ｓ１００βが関与するその様な現象がダウン症候群の病変に関与する可能性が示されている（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ（１９９８）１９：４０１−４０５）。上記の知見より、第２１番染色体上に存在しているＳ１００β遺伝子の量を定量することにより、ダウン症候群を診断することが可能であると考えられる。
【００１１】
ＵＦＤ１Ｌ遺伝子及びＳ１００β遺伝子の量を定量する目的で、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることにより、容易、安価かつ簡便にＣＡＴＣＨ２２症候群及びダウン症候群を診断する事が可能である。その様な原理により診断を可能とするために、本発明者らはＵＦＤ１Ｌ遺伝子及びＳ１００β遺伝子を定量的ＰＣＲで増幅する事が可能なプローブとプライマーを設計し、ＰＥバイオシステムズ社によるＰＣＲ反応試薬キットとシークエンスディテクションシステムにより、定量的ＰＣＲ反応を行った後に反応産物を検出して、遺伝子量を定量的に解析することを考えた。即ち、本発明の装置は、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子及びＳ１００β遺伝子のプローブとプライマー、定量的ＰＣＲ反応の試薬キット、定量的ＰＣＲ反応を行い、反応産物を検出して解析するための装置から成ることを特徴とする、新規な診断装置である。
【００１２】
尚、ＣＡＴＣＨ２２症候群は第２２番染色体上に存在する２２ｑ１１．２が欠損している疾患であるために、ＣＡＴＣＨ２２症候群の診断において、第２１番染色体の量には変化がなく、第２１番染色体上に存在する遺伝子であるＳ１００β遺伝子量を標準として校正に使用することができる。また同様に、ダウン症候群は第２１番染色体のトリソミーの疾患であるために、第２２番染色体の量には変化がなく、ダウン症候群の診断において、第２２番染色体上に存在する遺伝子であるＵＦＤ１Ｌ遺伝子量を標準として校正に使用することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の（１）から（４）の要素から成る、２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置である。
（１）第２２番染色体上に存在するこの疾患の責任遺伝子であって、この疾患において特異的に欠失しているＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号１記載の順方向プライマー、配列表の配列番号２記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号３記載のＵＦＤ１Ｌプローブ。
（２）第２１番染色体上に存在する遺伝子であって、この疾患によって含有量が変化しない遺伝子であるＳ１００β遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号４記載の順方向プライマー、配列表の配列番号５記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号６記載のＳ１００βプローブ。
（３）ＵＦＤ１Ｌ遺伝子およびＳ１００β遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により定量的に増幅するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応試薬キット。
（４）試薬キットを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるＵＦＤ１Ｌ遺伝子およびＳ１００β遺伝子の増幅、増幅されたＵＦＤ１Ｌ遺伝子およびＳ１００β遺伝子の検出及び解析を行うための装置。
【００１４】
ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量とＳ１００β遺伝子の含有量を評価するにあたり、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた。一般的なＰＣＲ法は、目的とする微量サンプルのＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅するために、増幅後のＤＮＡ量は鋳型量を反映しておらず、定量的な方法ではない。定量的にＰＣＲ法を行うためには、プラトーの検出と各サイクルでの増幅頻度の検出が必須である。これらを検出して定量的ＰＣＲ解析を行う装置がＰＥバイオシステムズ社のシークエンスディテクションシステムである。検出の原理としては特異的プライマー間のアンプリコン上に、更にプローブを設定してＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）と５’ヌクレアーゼアッセイの２つの反応を利用する。定量的ＰＣＲ法の原理を図１に示す。図１ａと図１ｂにおいて、プライマーの伸長前及び伸長後の状態の模式図を、それぞれ示す。
【００１５】
ＦＲＥＴとは蛍光物質の共鳴を利用したエネルギー転位反応で、図１ａに示すように、蛍光プローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）間で起こる。蛍光プローブの一方の蛍光物質を励起させて（Ｘｎｍ）、発光した波長（Ｘ’ｎｍ）が他方の励起波長として吸収され、異なる波長（Ｙｎｍ）での発光が見られる。即ち、プライマーからの伸長鎖の先にＴａｑＭａｎプローブがアニーリングすると、Ｘｎｍの波長を当てたときにＹｎｍの発光が見られる。ＰＣＲ増幅を行うと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によりこの蛍光プローブは分解され、プローブ両端の蛍光物質の物理距離が生じてエネルギー転位が起こらなくなり、これによって蛍光物質本来の波長（Ｘ’ｎｍ）が現れる（図１ｂ）。ＰＣＲ産物の蓄積に従ってこのＸ’ｎｍの蛍光量の増大が示され、ＰＣＲ増幅の様子がモニタリングできる。さらに蛍光物質を用いた定量的ＰＣＲの利点は、ＲＩを用いた従来のＰＣＲ産物の検出法に比べ煩雑さがない点、ＦＲＥＴによるＰＣＲ溶液中の蛍光強度を変化させて直接的にＰＣＲ増幅の様子を測定できることである。
【００１６】
このような定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのプライマーとして、実施例において用いている以下のプライマー及びプローブを用いることができる。即ち、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の増幅のためのプライマーとして、順方向プライマーのオリゴヌクレオチドであるAGGCAGATTCGTCGCTTT（配列番号１）及び逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドであるCAGCCAACAGTCCTCACTT （配列番号２）を、プローブのオリゴヌクレオチドとしてはTCTGGAGAAGGACAGTCATTGCGTAAAA（配列番号３）を用いることができる。また、Ｓ１００β遺伝子の増幅のためのプライマーとして、順方向プライマーのオリゴヌクレオチドであるCCTCATCGACGTTTTCCAC（配列番号４） 及び逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドであるGCTCATTGTTGATGAGCTCC（配列番号５）を、プローブのオリゴヌクレオチドとしてはAGACAAGCACAAGCTGAAGAAATCCG（配列番号６）を用いることができる。使用できるプライマー及びプローブの構造はこれに限定されるものではなく、ＰＥバイオシステムズ社のプライマー設計ソフトウェアである「プライマーエキスプレス」を用いれば、プライマーとプローブの最適な組み合わせを検索することができる。
【００１７】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の増幅を行うための試薬として、ＰＥバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスのキットを用いることができる。当該キットを用いて、バッファー、塩化マグネシウム、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ａｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ等にＴａｑＭａｎプローブ、順方向プライマー、逆方向プライマーを添加した組成の反応液を調製してポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子増幅を行う事ができる。なお、ａｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧはウラシル特異的な分解をする酵素であり、キャリーオーバーにより混入したＰＣＲ産物を分解することができる。定量的ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の増幅を行うための試薬はこれに限られるものではなく、同様の遺伝子増幅を行うことが可能な他の試薬もまた、用いることができる。
【００１８】
上述したＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ反応、反応産物の検出及び解析を行うために、ＰＥバイオシステムズ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００シークエンスディテクションシステム及びソフトウェアを用いることができる。当該装置は、図１に示した様な、蛍光物質を用いてＰＣＲ増幅中の蛍光強度の変化を検出して定量的解析を行う装置であり、より現実的な定量的ＰＣＲ法を再現した、最初の検出装置である。定量的ＰＣＲ反応、反応産物の検出及び解析を行うための装置はこれに限られるものではなく、同様の反応、検出及び解析を行う事が可能な限り、他の装置もまた、用いることができる。
【００１９】
上述したように、２２ｑ１１．２欠損症候群（ＣＡＴＣＨ２２症候群）は第２２番染色体の部分モノソミーであり、当該染色中においてＵＦＤ１Ｌ遺伝子が本疾患の責任遺伝子である。よって、２２ｑ１１．２の欠損に由来するＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量の低下をＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ反応によって示すことにより、ＣＡＴＣＨ２２症候群を診断することができる。その際に、ＣＡＴＣＨ２２症候群により変化しない標準遺伝子を用いて、その様な不変な遺伝子の量により、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の量を校正する必要がある。そのために、ＣＡＴＣＨ２２症候群によっては含有量が変化しない第２１番染色体上に存在するＳ１００β遺伝子の含有量によって、校正を行うこととした。即ち、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量をＳ１００β遺伝子の含有量で割り算を行った比の値であるＲ22の値を求めることにより、２２ｑ１１．２遺伝子の欠損を証明することとした。ＣＡＴＣＨ２２症候群はＵＦＤ１Ｌ遺伝子のモノソミーであるので、Ｒ22の理論値は０．５である。
【００２０】
更に本発明は、以下の（１）から（４）の要素から成る、ダウン症候群の診断装置である。
（１）前記疾患において特異的に増加する第２１番染色体上に存在する遺伝子であって、前記第２１番染色体上のダウン症候群関連領域に存在するＳ１００β遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号４記載の順方向プライマー、配列表の配列番号５記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号６記載のＳ１００βプローブ。
（２）第２２番染色体上に存在する遺伝子であって、前記疾患によって含有量が変化しない遺伝子であるＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量を、定量的ポリメラーゼ連鎖方法によって定量するための配列表の配列番号１記載の順方向プライマー、配列表の配列番号２記載の逆方向プライマーおよび配列表の配列番号３記載のＵＦＤ１Ｌプローブ。
（３）前記Ｓ１００β遺伝子および前記ＵＦＤ１Ｌ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により定量的に増幅するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応試薬キット。
（４）試薬キットを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるＳ１００β遺伝子およびＵＦＤ１Ｌ遺伝子の増幅、増幅されたＳ１００β遺伝子およびＵＦＤ１Ｌ遺伝子の検出及び解析を行うための装置。
【００２１】
上述したＣＡＴＣＨ２２症候群の場合において、第２１番染色体上に存在するＳ１００β遺伝子の含有量を標準遺伝子として測定しているために、第２１番染色体のトリソミーであるダウン症候群の検出にも用いることができる。即ち、第２１番染色体上のダウン症候群関連領域に存在するＳ１００β遺伝子の含有量の増加を検出することにより、第２１番染色体のトリソミーを証明することが可能である。この場合にも、ダウン症候群により変化しない標準遺伝子を用いて、その様な不変な遺伝子の量により、１００β遺伝子の量を校正する必要がある。ダウン症候群においては第２２番染色体の含有量は正常であるために、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量を標準として用いる事が可能であり、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量によって校正を行うこととした。即ち、Ｓ１００β遺伝子の含有量をＵＦＤ１Ｌ遺伝子の含有量で割り算を行った比の値であるＲ21の値を求めることにより、ダウン症候群を証明することとした。ダウン症候群は第２１番染色体のトリソミーであるので、Ｒ22の理論値は１．５である。
【００２２】
【実施例】
Ｄ２２Ｓ７５ディジョージ染色体領域のプローブを用いたＦＩＳＨにより、２９人の患者をＣＡＴＣＨ２２であると診断した。円錐部動脈幹異常顔貌（ｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌ  ｆａｃｅ）は全ての患者において、先天性心臓疾患（ＣＨＤ）は２８人の患者において認められた。また、ダウン症候群の患者及び川崎病の患者についても解析を行った。Ｇ−バンディングにより、２２人の患者が２１トリソミーのダウン症候群であると診断された。４０人の子供は川崎病であったが、先天性異常を示さずに正常に発育していた。
【００２３】
ＱＩＡａｍｐ血液キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、全白血球から高分子量ＤＮＡを抽出した。正常個体由来のゲノムＤＮＡを系列希釈し、キャリブレーション曲線を作製した。ディジョージの領域中に存在する重要な標的として、ＵＦＤ１Ｌを用いた。第２１番染色体の異数性を定量的蛍光ＰＣＲで解析した過去の報告（Ｃｈｉａｎｇ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６）６：１０１３−２６）に従い、Ｓ１００β遺伝子を第２１番染色体上の標的として用いた。ＵＦＤ１ＬとＳ１００βの配列に関する知見は、過去の報告（Ｎｏｖｅｌｌｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９８）１３９６：１５８−６２）（Ａｌｌｏｒｅ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１５５３７−４３）及び遺伝子バンクデータベースの検索（アクセッション番号  Ｕ６４４４、Ｍ５９４８６）により得た。ＵＦＤ１Ｌ遺伝子及びＳ１００β遺伝子について用いるプライマー及びＴａｑＭａｎプローブは、ＵＦＤ１Ｌのエクソン１２とＳ１００βのエクソン２の間に位置する様に、コンピュタープログラムであるプライマーエクスプレス（ＰＥバイオシステムズ）を用いて設計した。表１に、用いたプライマーを示す。
【００２４】
【表１】
0003876301.tif 000002
【００２５】
ＴａｑＭａｎＰＣＲは、１６μｌの反応容量で行った。０．１ｐｍｏｌ／μｌの蛍光プローブ、０．２ｐｍｏｌ／μｌのプライマー、１ｘＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＥバイオシステムズ）及び１５−２５ｎｇのＤＮＡを含む反応溶液を用いて、反応を行った。５０℃で２分間インキュベートすることにより温度のサイクリングを開始し、次いで９５℃で１０分間最初の変性過程を行い、その後９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の２過程からなるＰＣＲを４０サイクル行った。対象サンプル及び未知のサンプルをそれぞれ、ＵＦＤ１Ｌ及びＳ１００β遺伝子解析に分割し、平行して解析した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００シークエンスディテクションシステム及びソフトウェア（ＰＥバイオシステムズ）を用いて、定量的な解析を行った。コントロールのゲノムが２倍体であるという想定してキャリブレーション曲線を作製し、それぞれの反応におけるＤＮＡコピー数を得、校正した遺伝子数（Ｒ）を得た。ＣＡＴＣＨ２２（Ｒ22＝ＵＦＤ１Ｌ／Ｓ１００β）においては、Ｓ１００βを内部コントロール遺伝子として用いた。また、２１トリソミー（Ｒ21＝Ｓ１００β／ＵＦＤ１Ｌ）の診断の内部コントロール遺伝子として、ＵＦＤ１Ｌを用いた。ＣＡＴＣＨ２２である異接合体欠損サンプルにおいてＲ22の値は０．５、正常の二倍体のサンプルにおいてＲ22とＲ21の値は１．０、そして三倍体のダウン症候群においてＲ21の値は１．５であると予測された。
【００２６】
ＣＡＴＣＨ２２症候群及びダウン症候群の患者において、ＵＦＤ１Ｌ及びＳ１００βの遺伝子量を校正した値を表２に示す。尚、表２に示した範囲は、最小値から最大値の範囲である。ＣＡＴＣＨ２２において、コントロール遺伝子量により校正したＵＦＤ１Ｌ遺伝子量（Ｒ22）の平均は０．５０７であり、平均±３ＳＤの範囲の値を検討したところ、０．３９６−０．６１８であった。正常コントロールにおけるＵＦＤ１Ｌ遺伝子の量は、０．７６１−１．２４１（平均±３ＳＤ）であり、ＣＡＴＣＨ２２と比較して明らかに区別された。
【００２７】
校正したＳ１００β遺伝子量（Ｒ21）の、平均±２ＳＤの範囲の値を検討したところ、２１トリソミーでは１．２６１−１．７７７であり、正常コントロールでは０．８３６−１．１７６であった。２１トリソミーと正常コントロールの値は、平均±２ＳＤの範囲では重複しなかったが、平均±３ＳＤの範囲ではいくらか重複した。また、特異な顔貌、低カルシウム血症及び特定の型の先天性心臓疾患という臨床的な特徴を示す患者の中で、１７人の患者は２２ｑ１１．２が欠損は認められないとＦＩＳＨにより診断されていたが、その患者群においてＵＦＤ１Ｌ遺伝子量を求めたところ、０．９７１（０．７５−１．１４の範囲内）であった。
【００２８】
【表２】
0003876301.tif 000003
【００２９】
定量的ＴａｑＭａｎＰＣＲシステムは、ＰＣＲ中における鋳型の増幅の結果としての、サイクルからサイクルの蛍光シグナルの変化を動的に解析して、標的遺伝子の最初のコピー数を決定するものである。このシステムを用いることにより、鋳型の出発コピー数における２倍の差を区別することができる。このシステムにより、Ｘ染色体のコピー数を規定することによる性の決定、結腸癌組織中における１８ｑ２１領域の欠損の検出および癌家系の個体のＤＮＡ試験等をを達成することができる。
【００３０】
本発明の方法により、２１ｑ１１．２欠損（２倍の差）が、９９．７％の統計学的信頼性でもって、ＴａｑＭａｎＰＣＲシステムにより明らかに検出された。一方、２１トリソミーの場合、平均±２ＳＤの範囲内では、校正されたＳ１００βの遺伝子量と正常のコントロールにおいて、コントロールとの１．５倍の差を区別することが可能であった。平均±３ＳＤの範囲内では２１トリソミーとコントロールの範囲と重複しており、１．５倍の差を区別することが難しい場合もあったが、本発明の方法は基本的にはダウン症候群の診断にも可能であると思われる。
【００３１】
２２ｑ１１．２欠損における内部コントロール遺伝子としてＳ１００βを用いているために、２１染色体のモノソミー又はトリソミーが存在したら、校正された遺伝子量は誤差が生じると思われる。２１トリソミーが存在している場合に２２ｑ１１．２欠損を検出する事を考えると、校正された遺伝子量は０．３であることが予想されるから、その検出は容易であると思われる。一方、２１モノソミーが存在する場合において２２ｑ１１．２欠損を検出することを考えると、校正された遺伝子量は１．０であろうと予想されるから、その場合にはＴａｑＭａｎＰＣＲシステムによって検出する事は困難であると思われる。しかし、完全な２１モノソミーは通常は致命的であり、部分的な２１モノソミーは精神運動静止及びわずかな奇形という、異なった臨床上の特徴を示す。そこで、そのような場合においてはＴａｑＭａｎＰＣＲシステムの結果をＦＩＳＨにより確認することが必要である。
【００３２】
ＦＩＳＨに対する本装置の利点として、１）迅速性：ＦＩＳＨは細胞培養及びハイブリダイゼーションを要するのに対して、ＤＮＡの抽出から４時間かかること、２）容易性：技能や習練なしで、容易に実施できること、３）低価格：本方法の価格は、１サンプルあたり約６５００円であるＦＩＳＨと比較してずっと低価であり、１サンプルあたり約１０００円以下であること、４）サンプルの量が少なくてすみ、古い材料を使用できること、などが挙げられる。
一方、ＦＩＳＨと比較しての不利益な点として、１）転座又は転位の様な、遺伝子量の異常を伴わない、構造的な染色体異常を検出することはできないこと、２）装置が高価であること、などが挙げられる。
以上より、ＴａｑＭａｎＰＣＲシステムは迅速に、そして正確に２２ｑ１１．２欠損を検出し、２２ｑ１１．２欠損症候群の診断おいて実際に有用であると考えられる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲを用いた、２２ｑ１１．２欠損症候群及びダウン症候群を診断するための、新規の装置が与えられた。本発明の装置は従来の方法と比較して、簡便、迅速かつ容易に実施できる、という特徴を有する。
【００３４】
【配列表】
＜１１０＞出願人氏名：九州大学長
＜１２０＞発明の名称：２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置、ダウン症候群の診断装置
＜１６０＞配列の数：６
＜２１０＞配列番号：１
＜２１１＞配列の長さ：１８
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
AGGCAGATTC GTCGCTTT
＜２１０＞配列番号：２
＜２１１＞配列の長さ：１９
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
CAGCCAACAG TCCTCACTT
＜２１０＞配列番号：３
＜２１１＞配列の長さ：２８
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
TCTGGAGAAG GACAGTCATT GCGTAAAA
＜２１０＞配列番号：４
＜２１１＞配列の長さ：１９
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
CCTCATCGAC GTTTTCCAC
＜２１０＞配列番号：５
＜２１１＞配列の長さ：２０
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
GCTCATTGTT GATGAGCTCC
＜２１０＞配列番号：６
＜２１１＞配列の長さ：２６
＜２１２＞配列の型：核酸
＜２１３＞起源：？
＜４００＞配列
AGACAAGCAC AAGCTGAAGA AATCCG
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＴａｑＭａｎＰＣＲの測定原理を示す、模式図である。
【図１】
0003876301.tif 000004