(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）かつ２）かつ３）を満たす蛋白工学的に改変された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
１）配列表配列番号２記載のアミノ酸配列において、そのＮ末端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列（配列表配列番号１）が、（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン）または（アルギニン−アルギニン−システイン−ロイシン−グルタミン酸−プロリン）からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して、Ｎ末端側にアスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンのいずれか１ケのアミノ酸を付加し、且つ、Ｃ末端側に２〜４ケのアミノ酸配列（但し、該Ｃ末端側に直接に付加する１ケのアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのいずれか１ケのアミノ酸であり、この１ケのアミノ酸に続くアミノ酸が、グリシン、セリンまたはトレオニンのいずれか１ケのアミノ酸であり、これら2ケのアミノ酸に続くアミノ酸がリジン、アルギニン、イソロイシンまたはセリンのいずれか１ケのアミノ酸であり、これら３ケのアミノ酸に続くアミノ酸がアラニン、セリン、またはイソロイシンのいずれか１ケのアミノ酸である配列）が付加したアミノ酸配列］に置換されている
２）安定性が野生型に比し向上している
３）ミカエリス定数が野生型に比し５分の１以下に小さくなっている
【請求項２】
配列表配列番号２記載のアミノ酸配列において、そのＮ末端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列（配列表配列番号１）が、［（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−グリシン−アルギニン−セリン）、（グルタミン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アラニン）、（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−セリン−イソロイシン−セリン）、（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−トレオニン−セリン−イソロイシン−セリン）、（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−ロイシン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アラニン）、（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン−トリプトファン−グリシン−アルギニン−セリン）または（アスパラギン酸−アルギニン−アルギニン−システイン−グリシン−グルタミン酸−プロリン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アラニン−アスパラギン酸−グルタミン酸−リジン−アラニン−プロリン−セリン−トレオニン−イソロイシン−セリン）からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列］に置換されている、蛋白工学的に改変された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ断片を含有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
エシャリヒア・コリである請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項６記載の宿主細胞を培地で培養し、培養物から変異型Ｌ−α−グリセロフォスフ
ェートオキシダーゼを採取すること特徴とする変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオ
キシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、それをコードするＤＮＡ断片及びその変異型酵素の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼは血清中の中性脂肪や羊水中のフォスファチジルグリセロールなどを測定する際に用いられる臨床検査薬用酵素である。Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを臨床検査薬に応用するに際しては、一般に水溶液中で用いるが、水溶液中でのＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの安定性は低く、そのため水溶液状の臨床検査薬には必要以上の過大な酵素量を必要とする。そこで、Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの水溶液中での安定性を改善することが強く望まれていた。
水溶液中のＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの安定性を改善するために、種々の安定化剤を添加したり、酵素を化学修飾する方法がこれまでに行われてきた（特許文献１〜４）。しかし、これらの方法においては十分な安定性の向上がなされておらず、より安定なＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが必要とされていた。
【０００３】
野生型のＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼはストレプトコッカス属、ラクトバシルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、アエロコッカス属に属する細菌に存在することが報告されており（特許文献５、６）、ストレプトコッカス属由来の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを遺伝子操作により、エシェリヒア．コリを形質転換体として製造する方法が報告されている（特許文献７、８）が、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを遺伝子操作等により蛋白質工学的に改変し、安定性を向上させたという例はなかった。
【特許文献１】特開昭５７−６８７８８号公報
【特許文献２】特開昭５９−１４７８８号公報
【特許文献３】特開昭６０−１２６０８４号公報
【特許文献４】特開平７−１６３３３９号公報
【特許文献５】特開昭５３−７２８９２号公報
【特許文献６】特開昭５５−１５７４６号公報
【特許文献７】特開平２−４５４号公報
【特許文献８】ＵＳ特許第４９６０８７７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は水溶液中において安定性が向上させ、またはミカエリス定数が小さい優れた変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、ならびにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列のうち少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入することによって、安定性が向上させ、またはミカエリス定数が小さい優れたものに改変できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列において、少なくとも１ケのアミノ酸残基が欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有する変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、及び、この変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片、そのＤＮＡ断片を含有する発現ベクター、その発現ベクターにより形質転換された宿主細胞である。
【０００６】
本発明は更に、上記の宿主細胞を培養し、培養物から変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とする、変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの製造法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば野生型のＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼよりも安定性の優れ、酵素的性能のよい変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼとしては、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列の少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入することによって改変し、Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼに少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが挙げられる。例えば、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列における１２位のアスパラギン酸をアラニンに置換（ミカエリス定数１．９ｍＭ）またはアスパラギンに置換（ミカエリス定数１．８ｍＭ）、１２のアスパラギン酸を欠損（ミカエリス定数１．４９ｍＭ）や１１位のアルギニンから１３位のグルタミン酸までを欠損（ミカエリス定数１．１８ｍＭ）が挙げられる。
【０００９】
また、少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼとして好ましくは、（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシンまたはバリンまたはロイシン−グルタミン酸またはアスパラギン酸−プロリン）で表される長さ６のアミノ酸配列またはこの配列と４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが挙げられる。この上記の長さ６のアミノ酸配列の具体例としては（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギニン−システイン−バリン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギニン−システイン−ロイシン−グルタミン酸−プロリン）、（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシン−アスパラギン酸−プロリン）を含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００１０】
さらにそのＮ末端側には少なくとも１ケのアミノ酸の付加、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸を付加することが好ましく、Ｃ末端側には少なくともフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのいずれか１ケのアミノ酸、またはこの１ケのアミノ酸に続くグリシン、セリンまたはトレオニンのいずれか１ケのアミノ酸、またはこれらの２ケのアミノ酸に続くリジン、アルギニン、イソロイシンまたはセリンのいずれか１ケのアミノ酸、またはこれら３ケのアミノ酸に続くアラニン、セリン、イソロイシンまたはアルギニンのいずれか１ケのアミノ酸の１〜４ケのアミノ酸配列、好ましくは２〜４ケのアミノ酸配列、例えばフェニルアラニン−グリシン、フェニルアラニン−セリン、フェニルアラニン−トレオニン、フェニルアラニン−グリシン−アルギニン、チロシン−グリシン−アルギニン、トリプトファン−グリシン−アルギニン、フェニルアラニン−グリシン−リジン−アラニン、フェニルアラニン−トレオニン−セリン−イソロイシン、フェニルアラニン−グリシン−アルギニン−セリンまたはフェニルアラニン−グリシン−リジン−アルギニンの配列が選択され付加されることが好ましく、さらに具体的には配列表配列番号５〜１３記載のアミノ酸配列が例示される。
【００１１】
さらに、ストレプトコッカス属由来の配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼとして配列表配列番号２記載の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが例示され、配列表配列番号２記載のアミノ酸配列においてＮ末端から３９１番目〜４１０番目の少なくとも１ケのアミノ酸残基を欠失、置換、挿入した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、特に配列表配列番号２記載のアミノ酸配列においてＮ末端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列が少なくとも（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシンまたはバリンまたはロイシン−グルタミン酸またはアスパラギン酸−プロリン）で表される長さ６のアミノ酸配列と４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列と置換された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼが挙げられ、より具体的には上記の長さ６のアミノ酸配列を含む配列表配列番号５〜１３記載のアミノ酸配列と置換された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ、更に望ましくは配列表配列番号３記載のアミノ酸配列にて表される変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（以下、変異型Ｂと記すこともある）が挙げられ、これらの変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼは野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼに比べ安定性が向上し、またはミカエリス定数が小さくなったものであって、酵素的性能が向上した変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼである。
【００１２】
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列は、例えば微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列に、一般的な部位特異変異導入技術で変異を導入することで得ることができる。例えばＫｕｎｋｅｌ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行）に従って変異を導入する場合には、ｄｕｔ−、ｕｎｇ−のエシェリヒア．コリを用いてＴｈｙｍｉｎｅの一部がｄｅｏｘｙｕｒａｃｉｌに置換された、野生型酵素の一部または全体をコードするＤＮＡ配列（センス鎖）またはそれに相補的なＤＮＡ配列（アンチセンス鎖）を含む環状一本鎖ＤＮＡを作製し、この環状一本鎖ＤＮＡに変異導入用の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により相補鎖を合成した後、ｕｎｇ＋のエシェリヒア．コリを形質転換することで変異を導入することができ、必要ならば更に遺伝子の組換えを行うことで変異型酵素のＤＮＡ配列を得ることができる。
【００１３】
用いる微生物由来の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列としては、例えば配列表配列番号２記載の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列が挙げられ、この野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＰＯＳ−５３株として得られており、それをコードするＤＮＡ配列で公知であり（特開平２−４５４号公報（ＵＳ特許第４９６０８７７号明細書））、そのＤＮＡ配列を有する発現ベクターＧＰＯＳ１を保持する形質転換体エシェリヒア．コリＤＨ１・ｐＧＰＯＳ１株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−２１３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２９として保存されており、何人も入手可能である。
【００１４】
変異導入用の合成オリゴヌクレオチドとしては、鋳型となる環状一本鎖ＤＮＡの中にＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのアンチセンス鎖の一部または全部が存在する場合は、目的とするアミノ酸変異をコードする塩基配列の５’側および３’側に８塩基以上、好ましくは１０〜３０の相補な塩基をつけたもので、例えば配列表配列番号３記載の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードする変異型ＤＮＡを配列表配列番号２記載のＤＮＡに変異を導入することで得る場合には配列表配列番号４記載の変異導入用オリゴヌクレオチドを用いればよく、（アルギニン−アルギニン−システイン−グリシンまたはバリンまたはロイシン−グルタミン酸またはアスパラギン酸−プロリン）で表される長さ６のアミノ酸配列またはこの配列と４ケ以上の相同性を有するアミノ酸配列、また好ましくはこれらのＮ末端側およびＣ末端側に前記したアミノ酸配列を付加した配列を含む変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードする変異型ＤＮＡを得る場合には該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の５’側および３’側に上記の適宜な塩基配列をつけたものを合成オリゴヌクレオチドとして用いることができ、例えば配列表配列番号５〜１３記載のアミノ酸配列を含む変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（例えば変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）をコードする変異型ＤＮＡを配列表配列番号２記載のＤＮＡに変異を導入することで得る場合には、同じく配列表配列番号１４〜２１または２２いずれかに記載の変異導入用オリゴヌクレオチドを用いればよい。また、鋳型となる環状一本鎖ＤＮＡの中にＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのセンス鎖の一部または全部が存在する場合は前記のアンチセンス鎖が存在するときに用いる変異導入用オリゴヌクレオチドに相補的になるような変異導入用オリゴヌクレオチドを用いればよい。
【００１５】
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターは、該ＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２など通常用いられるプラスミドベクターに一般的な遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ断片を連結することで作製することができ、変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを効率よく発現させるために、トリプトファンプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、フォスフォグリセロキナーゼプロモーター、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素プロモーター、ＳＥＶプロモーター等の強力なプロモーターの下流に該ＤＮＡ断片を連結した発現ベクターを作製してもよい。
【００１６】
上記発現ベクターをエレクトロポーレーション法、Ｈａｎａｈａｎ法、塩化カルシウム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行）など一般的に用いられる形質転換法によりエシェリヒア．コリ、酵母、枯草菌などの宿主細胞に導入することで形質転換体を得ることができる。
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを得るためには、上記のようにして形質転換された宿主細胞を一般的な方法で培養し、例えば、エシェリヒア属に属するエシェリヒア．コリの場合は一般にエシェリヒア．コリを培養する培地、例えばＬＢ培地にて、一般にエシェリヒア．コリを培養する方法、例えば２５〜３７℃において、好気的に培養し、目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば８〜３６時間にて、目的となる酵素を採取すればよい。
【００１７】
次いで、培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズ等によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。このようにして得られた、粗製の変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを得ることができる。例えば、アセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法等の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを得ることができ、適宜安定化剤例えば０．００１％〜０．１％程度のアミノ酸、補酵素等、５％〜５０％程度のショ糖、グリセロールなどを加えて、凍結保存、ないしは凍結乾燥保存をしてもよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
［参考例１］
Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）
１０ｍＭ    Ｄ，Ｌ−α−グリセロフォスフェート（シグマ社製、米国）
０．０３％  ４−アミノアンチピリン
０．０２％  ＴＯＯＳ
０．１％    Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（シグマ社製、米国）
（ＰＩＰＥＳ：Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））
（ＴＯＯＳ：Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ  同仁化学研究所製、日本国）
酵素希釈液
５０ｍＭ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）
０．１％    Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
測定試薬１ｍｌを試験管に入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を加えて、３７℃で５分間加温し、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ加えて反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定する。また、試薬ブランクとして酵素液の代わりに０．０２ｍｌの酵素希釈液を加えたものの吸光度（Ａｂ）も測定する。吸光度（Ａａ）が０．５以上になるときは酵素を酵素液を適宜、酵素希釈液で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位はこの条件下で１分間に１μモルの過酸化水素を生成する酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａａ−Ａｂ）ｘ１．５４ｘ酵素の希釈倍率
【００２０】
［参考例２］
野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１及び変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８の構築
野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１の構築は図１に記載の流れに沿って構築した。すなわち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＰＯＳ−５３株の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯＳ１をエシェリヒア．コリＤＨ１・ｐＧＰＯＳ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２１３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２９）からアルカリ−ＳＤＳ法により抽出した後に制限酵素ＣｌａＩで完全切断してできた野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含む約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＵＣ１２を制限酵素ＰｓｔＩで切断したのちＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造製、日本国）で末端平滑化してセルフライゲーションしてできたｐＵＣ１２ｄＰを制限酵素ＡｃｃＩで切断したものとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本国）を用いて連結することでｐＧＰＯ１００を得た。このｐＧＰＯ１００を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全切断してできる野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含む約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩとで切断してＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造製、日本国）で末端平滑化してセルフライゲーションしてできたｐＵＣ１１８ｄＥＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本国）を用いて連結することでプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１を得た。
【００２１】
変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８の構築は図２に記載の流れに沿って構築した。すなわち、上記のように作製したｐＧＰＯ１０１を制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断して得た約０．７ｋｂｐのフラグメントとファージベクターＭ１３ｍｐ１８を同じく制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断したものとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本国）を用いて連結することでｐＧＰＯｍｐ１８を得た。（配列表配列番号２記載のＤＮＡ配列においてＰｓｔＩの位置は５５１番目、ＨｉｎｃＩＩの位置は１２６６番目に存在する。）
尚、上記のプラスミドＤＮＡの制限酵素切断反応はすべてＤＮＡ約０．２μｇ、制限酵素（宝酒造製）１０Ｕ、反応液量２０μｌ、反応液組成は制限酵素製造元推奨の組成すなわち、ＣｌａＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩは１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ塩化ナトリウムで、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩは５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ塩化ナトリウムで、３７℃で９０分反応させた。
【００２２】
［実施例１］
変異型ＢをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１Ｂの構築とそれを含む形質転換体の作製
配列表配列番号３記載の変異型ＢのＤＮＡ配列は図３に示すようにｐＧＰＯｍｐ１８上の配列表配列番号２記載の野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの３９１番目〜４１０番目のアミノ酸をコードしている塩基配列に変異を導入した後、ｐＧＰＯ１０１と組み換えることで作製する。
変異導入用の合成オリゴヌクレオチドは目的とする変異をコードする塩基配列の５’側に配列表配列番号２記載のＤＮＡ配列の１１５０番目〜１１６９番目の相補鎖の塩基に対して相補的になるような塩基を、３’側には配列表配列番号２記載のＤＮＡ配列の１２３０番目〜１２５０番目の相補鎖の塩基と相補的になるような塩基をつけた配列表配列番号４で表される合成オリゴヌクレオチドを用いた。この合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌをＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造製、日本国）をその使用説明書に従って用いて５’末端をリン酸化した。
【００２３】
次にＭｕｔａｎ−Ｋ  ｋｉｔ（宝酒造製、日本国）をその使用説明書に従って用いることにより、すなわち、ｐＧＰＯｍｐ１８のｄｅｏｘｙｕｒａｃｉｌを含んだ環状一本鎖ＤＮＡをエシェリヒア．コリＣＪ２３６株（Ｆ’、ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）を用いて作製し、上記リン酸化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により相補鎖を合成してエシェリヒア．コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株（Ｆ’、ｍｕｔＳ）にトランスフェクションして変異を導入するＫｕｎｋｅｌ法により、変異が導入されたｐＧＰＯｍｐ１８Ｂを得た。
つぎに、図３のようにこのｐＧＰＯｍｐ１８Ｂを制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断して得た約０．７ｋｂｐのフラグメントとｐＧＰＯ１０１を制限酵素ＨｉｎｃＩＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断して得た約４．７ｋｂｐのフラグメントとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製、日本国）を用いて連結することで配列表配列番号３記載の変異型ＢをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１Ｂを得た。このｐＧＰＯ１０１Ｂでエシェリヒア．コリＤＨ１株をｈａｎａｈａｎ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行）に従って形質転換し、その形質転換体を以下のように命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。なお、かっこ内は国際寄託機関の寄託番号を示す。
エシェリヒア．コリＤＨ１・ｐＧＰＯ１０１Ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７３０）
【００２４】
［実施例２］
配列表配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端から３９１番目〜４１０番目のアミノ酸配列が表１および表２にて示される配列表配列番号５〜１３記載ののアミノ酸配列と置換された変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドベクター（ｐＧＰＯ１０１Ａ、ｐＧＰＯ１０１Ｃ、ｐＧＰＯ１０１Ｄ、ｐＧＰＯ１０１Ｅ、ｐＧＰＯ１０１Ｆ、ｐＧＰＯ１０１Ｇ、ｐＧＰＯ１０１Ｈ、ｐＧＰＯ１０１Ｉ、ｐＧＰＯ１０１Ｊ）の構築とそれを含む形質転換体の作製。
【００２５】
【表１】
0004020266.tif 000002
【００２６】
【表２】
0004020266.tif 000003
表１および表２に、各変異型に対応する置換配列と、その変異を導入する為の変異導入用オリゴヌクレオチドが明示されている。この変異導入用オリゴヌクレオチドを用いて実施例１と同様にして各変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクター（ｐＧＰＯ１０１Ａ、ｐＧＰＯ１０１Ｃ、ｐＧＰＯ１０１Ｄ、ｐＧＰＯ１０１Ｅ、ｐＧＰＯ１０１Ｆ、ｐＧＰＯ１０１Ｇ、ｐＧＰＯ１０１Ｈ、ｐＧＰＯ１０１Ｉ、ｐＧＰＯ１０１Ｊ）を作製した。また、これらのベクターでエシェリヒア．コリＨＢ１０１を形質転換し、その形質転換体を得た。
【００２７】
［実施例３］
変異型Ｂの製造方法
３．７％のＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製、米国）を１００ｍｌ含む５００ｍｌ容三角フラスコ２０ケを１２０℃、２０分間加熱滅菌した後、濾過滅菌したアンピシリン液を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、エシェリヒア．コリＤＨ１・ｐＧＰＯ１０１Ｂ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７３０）をコロニーより植菌し、撹拌させながら３７℃で１８時間培養し、培養力価０．２５Ｕ／ｍｌの培養液２ｌを得た。
得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）３０ｍｌを加えて懸濁して、超音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を１５０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、３７ｍｌ（酵素活性５００Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝かしたＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製、スウェーデン国）１００ｍｌ（２．６ｘ２０ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行い、酵素活性画分（４８０Ｕ）を得た。
この得られた酵素活性画分にＮａＣｌ濃度が４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、４ＭのＮａＣｌで平衡化されたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（ファルマシアバイオテク社製、スウェーデン国）２０ｍｌ（１．５ｘ１２ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行い活性画分（２９０Ｕ）を回収し、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）に対して透析した後、Ｃｅｎｔｒｉｆｌｏ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｎｅｓ  Ｔｙｐｅ  ＣＦ２５（アミコン社製、米国）で濃縮し、酵素標品を得た。この標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質であることが確認され、Ａ２８０は１０．１、２８０Ｕ／ｍｌであった。
【００２８】
［実施例４］
変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊの製造方法
３．７％のＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製、米国）を１００ｍｌ含む５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃、２０分間加熱滅菌した後、濾過滅菌したアンピシリン液を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、実施例２記載の各変異型酵素を生産する形質転換体をコロニーより植菌し、撹拌させながら３７℃で１８時間培養し、それぞれ培養液１００ｍｌを得た。
それぞれの変異型において、得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）７ｍｌを加えて懸濁して、超音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝かしたＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製、スウェーデン国）２０ｍｌ（１．５ｘ１２ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行い、酵素活性画分を得た。得られた精製酵素液のＡ２８０と活性（Ｕ／ｍｌ）と液量（ｍｌ）を表３に示した。
【００２９】
【表３】
0004020266.tif 000004
また、表３には比較のため野生型酵素においても同様の精製を行い、その結果も示した。
【００３０】
［実施例５］
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ｂ）の液状安定性およびミカエリス定数の評価
野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（実施例３と同様の方法で精製された標品）と実施例３で得られた変異型Ｂの酵素標品を用いて下記のような保存条件で残存活性を測定し、液状安定性を評価した。
保存条件
５０ｍＭ      ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）      
０．０５％    アジ化ナトリウム
１０Ｕ／ｍｌ  Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
３７℃
図４で示されるようにに野生型（□−□）に比べ、変異型Ｂ（■−■）は安定性が向上していた。
また、野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（実施例３と同様の方法で精製された標品）と実施例３で得られた変異型Ｂの酵素標品を用いてＬ−α−グリセロフォスフェートに対するミカエリス定数を活性測定法と同様の測定法でＬ−α−グリセロフォスフェート濃度を変化させて測定したところ、以下のように野生型に比べ、変異型Ｂはミカエリス定数が低下し、酵素的性能が向上していた。
野生型      ２．５ｍＭ
変異型Ｂ    ０．５ｍＭ
【００３１】
［実施例６］
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ｂ）の至適ｐＨ、至適温度
参考例１記載の活性測定法において５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）の代わりに各ｐＨの５０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ＭＥＳ：２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ， ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いて変異型Ｂの至適ｐＨを測定した。その結果を図５に示した。図中、○−○はＭＥＳ−ＮａＯＨ、●−●はＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、□−□はＴｒｉｓ−塩酸の場合を示す。
また、参考例１記載の活性測定法において５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液を用いて変異型Ｂの至適温度を測定した。その結果を図６に示した。
【００３２】
［実施例７］
変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（変異型Ａ、変異型Ｃ、変異型Ｄ、変異型Ｅ、変異型Ｆ、変異型Ｇ、変異型Ｈ、変異型Ｉ、変異型Ｊ）の液状安定性およびミカエリス定数の評価
野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（実施例４において変異型と同様に精製された標品）と実施例４で得られた各変異型の酵素標品を用いて下記のような条件で熱処理を行い、前記活性測定法に沿って残存活性を測定し、液状安定性を評価した結果を上記表３に示した。
熱処理条件
５０ｍＭ        トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
約０．５Ｕ／ｍｌ    Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ
４２℃  １０分間加温
野生型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ（実施例４で変異型と同様に精製された標品）と実施例４で得られた各変異型の酵素標品を用いて下記のような反応条件でＤ，Ｌ−α−グリセロフォスフェートの濃度を変化させ、Ｄ，Ｌ−α−グリセロフォスフェートに対するミカエリス定数を測定した結果を表４に示した。
【表４】
0004020266.tif 000005
ミカエリス定数測定法
反応液
２０ｍＭ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）
０．０６％  ４ＡＡ
０．０４％  ＴＯＯＳ
５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ
酵素希釈液
５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）
反応液０．５ｍｌに０〜１０００ｍＭのＤ，Ｌ−α−グリセロフォスフェート溶液０．０５ｍｌ加えて３７℃で５分間予備加温した後、希釈酵素液を０．０５ｍｌ加えて反応を開始し、５分後に０．５％ＳＤＳを１ｍｌ加えて反応を停止させ吸光度５５５ｎｍを測定した。          
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、水溶液中において安定性が向上させ、またはミカエリス定数が小さい優れた変異型Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを提供するので、診断薬などの分野で好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１はストレプトコッカス属由来の野生型のＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの遺伝子を含むプラスミドｐＧＰＯ１０１作製の工程を示す。
【図２】図２は変異導入用ベクターｐＧＰＯｍｐ１８作製の工程を示す。
【図３】図３は変異型Ｂをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターｐＧＰＯ１０１Ｂ作製の工程を示す。
【図４】図４は本発明の変異型酵素と野生型酵素の３７℃での保存安定性を示す。
【図５】図５は本発明の変異型Ｂの至適ｐＨ曲線を示す。
【図６】図６は本発明の変異型Ｂの至適温度曲線を示す。
【図１】
0004020266.tif 000006
【図２】
0004020266.tif 000007
【図３】
0004020266.tif 000008
【図４】
0004020266.tif 000009
【図５】
0004020266.tif 000010
【図６】
0004020266.tif 000011
【配列表】
0004020266000001.app