(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸を多糖分解酵素により加水分解してオリゴ糖を製造するに当り、ヒアルロン酸分子にキトオリゴ糖を作用させてキトオリゴ糖分子により糖鎖の一部がブロックされた複合体を形成させたのち、この複合体に多糖分解酵素を作用させて、キトオリゴ糖分子によりブロックされていない位置においてヒアルロン酸を分解して、キトオリゴ糖に対応する分子鎖長をもつオリゴ糖を生成させ、次いでこの生成物からキトオリゴ糖を脱離することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素を用いてヒアルロン酸から所定の分子鎖をもつオリゴ糖を選択的に製造するための新規な方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キチンオリゴ糖やオリゴガラクツロン酸などのオリゴ糖類は、抗腫瘍性、抗菌性、エリシター活性などの生理活性を有し、種々の医薬品、農薬、健康食品などに利用されている。また、この生理活性には重合度依存性があることが知られており、製品の有効性をより高め、製造コストを低減するために、特定の重合度を有するオリゴ糖類を効率よく得る方法の開発が求められている。
【０００３】
現在、特定の重合度を有するオリゴ糖類を得る方法としては、単糖類又は二糖類などから合成する方法と多糖類を分解する方法に大別される。
前者の合成法は、組成が複雑な糖鎖などを得るときには有効な方法であるが、分子構造が比較的単純なオリゴ糖類を得るときには、グリコシド結合などを特異的に起こさせるために、保護基を結合する工程、脱離させる工程などに複雑な処理を用いなければならない上に、出発原料を得るために多糖類を分解する必要があり、この際のエネルギーのロスが大きいことなどを考慮すると、工業的に適した方法とは言い難い。
【０００４】
一方、後者の分解法は、糖の分子構造が比較的単純なオリゴ糖類を得るときには有効であり、この方法には、主に酸・塩基により、あるいは酵素により分解する方法があるが、いずれの方法も特定の重合度を有するオリゴ糖類のみを得るには、煩雑な分離、精製の工程を必要とするため、効率的に問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素を用いて多糖の１種であるヒアルロン酸から特定の重合度のオリゴ糖類を高収率で、かつ、簡便に得ることを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酵素を用いて多糖からオリゴ糖を製造する方法について種々研究を重ねた結果、ヒアルロン酸に所定の分子鎖長を有するキトオリゴ糖分子を反応させて、ヒアルロン酸分子の分子鎖の一部が所定の分子鎖長をもつキトオリゴ糖でブロックされた複合体を形成させたのち、分子鎖のブロックされていない個所に酵素を作用させれば、所定の分子鎖長をもつオリゴ糖が選択的に生成することを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸を多糖分解酵素により加水分解してオリゴ糖を製造するに当り、ヒアルロン酸分子にキトオリゴ糖を作用させてキトオリゴ糖分子により糖鎖の一部がブロックされた複合体を形成させたのち、この複合体に多糖分解酵素を作用させて、キトオリゴ糖分子によりブロックされていない位置においてヒアルロン酸を分解して、キトオリゴ糖に対応する分子鎖長をもつオリゴ糖を生成させ、次いでこの生成物からキトオリゴ糖を脱離することを特徴とするオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法においては、まず溶液中、多糖の１種であるヒアルロン酸分子とキトオリゴ糖分子間に、静電引力、水素結合力、疎水結合力などの力で相互作用を引き起こさせ、結合割合を調整することにより、ヒアルロン酸分子中にキトオリゴ糖分子でブロックされている部分とブロックされていないスペースを有する複合体を形成させる。
【０００９】
次に、使用したヒアルロン酸を分解する能力のある酵素をその複合体のスペースに選択的に作用させて分解し、キトオリゴ糖分子の分子鎖に対応した長さをもつオリゴ糖複合体を生成させたのち、この複合体からキトオリゴ糖を脱離除去し、ヒアルロン酸由来のオリゴ糖類を得る。
この際、ヒアルロン酸分子とキトオリゴ糖分子間に静電気力を生じ、両者の結合が促進される。
【００１０】
本発明においては、まずヒアルロン酸分子とキトオリゴ糖分子との複合体を形成させることが必要である。
【００１１】
【００１２】
この複合体を形成させるためには、まずヒアルロン酸分子とキトオリゴ糖分子の組合せを決める。次に、それぞれを同一の溶液に溶かし、ｐＨを調整する。設定するｐＨは、両方の溶液のｐＫａのほぼ中間の値で、緩衝溶液を利用するのが好ましい。
【００１３】
次に、２０〜４０℃に保ちながら撹拌又は振とう中のヒアルロン酸溶液にキトオリゴ糖溶液を滴下し、必要な組成比の溶液を調製する。所望ならば、これとは逆の順番で滴下することもできる。この際、自動滴下装置を用い、一定速度でキトオリゴ糖を滴下させると、より望ましい複合体を得ることができる。
滴下終了後、２０〜６０℃で複合体の形成が安定するまで撹拌又は振とうを継続する。このようにして形成された複合体は、例えば赤外吸収スペクトル解析により同定することができる。このようにして得られる複合体は、文献未載の新規物質である。
【００１４】
このようにして得られた複合体に、次に溶液又は懸濁液中でヒアルロン酸のβ‐Ｄ‐１，４結合などグリコシド結合を特異的に分解する酵素を作用させる。この酵素としては、ヒアルロニダーゼのようにキトオリゴ糖よりはヒアルロン酸を優先的に分解する能力のある酵素が好ましい。この酵素を添加する場合は、酵素の至適ｐＨ、至適温度などに留意し、反応条件を設定する。この際、複合体を形成させる条件も考慮する必要があるが、一般に反応温度は２０〜６０℃、ｐＨは中性付近に設定するのが好ましい。
【００１５】
生成物の精製は、例えば、キトオリゴ糖分子を脱離除去できる陽イオン交換樹脂又は陰イオン交換樹脂を使用して、バッチ法、若しくはカラム法により行う。精製物の各オリゴ糖類の成分分析及び分離回収は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、若しくはカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。
【００１６】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】
実施例
ヒアルロン酸［グルクロン酸（ＧｌｃＵ）とアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が交互に結合、ヒト臍帯由来、Ｍｖ＝８００，０００−１，２００，０００、ｐＫａ＝２．７７−２．９７］のグルクロン酸単位濃度換算１５ｍＭと、キトヘキサオース［（ＧｌｃＮ）6、ｐＫａ＝６．６］のグルコサミン単位濃度換算１５ｍＭとをそれぞれ５０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ５．５）に溶解させた。ヒアルロン酸溶液に組成比（［ＧｌｃＮ］／［ＧｌｃＵ］）が２になるように、キトヘキサオース溶液を滴下した。この際、全量（３ｃｃ）が一定、最終的なヒアルロン酸濃度が５ｍＭになるように調整した。
また、比較のためにヒアルロン酸単独（［ＧｌｃＮ］／［ＧｌｃＵ］＝０）の溶液も調製した。
このようにして得た混合溶液を３５℃中、２４時間振とうすることにより、複合体を形成させた。
【００１８】
次に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かした１５０μｌヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来、１５ＴＲＵ）を両方の混合溶液に添加し、３５℃中、７時間反応させた。
【００１９】
高速液体クロマトグラフィーにより、反応溶液２００μｌに内部標準物質として１ｍｇ／ｍｌ安息香酸を１０μｌ添加したものを分析した。この際、分析カラムとして、Ｃ１８カラムを、移動相として０．０１Ｍテトラブチルアンモニウム溶液とアセトニトリルの混合溶液（８３：１７，ｖ/ｖ）のｐＨを７．３５に調整したものを、検出器として紫外可視多波長分析装置（主には２３２ｎｍの吸光度）をそれぞれ用いた。図１に［ＧｌｃＮ］／［ＧｌｃＵ］＝２の時のヒアルロニダーゼによる分解パターンを、表１に［ＧｌｃＮ］／［ＧｌｃＵ］＝２及び［ＧｌｃＮ］／［ＧｌｃＵ］＝０の時の生成したオリゴヒアルロン酸の割合を示した。
【００２０】
表１から明らかなように、ヒアルロン酸単独に酵素が作用した時と複合体に酵素が作用した時とで分解挙動に差が認められた。キトヘキサオースの長さに相当する６糖からなるオリゴヒアルロン酸｛△ＧｌｃＵ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＵ（β１−３）］2ＧｌｃＮＡｃ｝の生成割合が向上していた。
【００２１】
【表１】
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注）［１］：△ＧｌｃＵ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＵ
（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ
［２］：△ＧｌｃＵ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＵ
（β１−３）］2ＧｌｃＮＡｃ
ＢＡ  ：安息香酸（内部標準物質）
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、ヒアルロン酸と相互作用する異なった分子鎖のキトオリゴ糖分子を適宜選択することにより、キトオリゴ糖分子の長さに応じたヒアルロン酸由来のオリゴ糖類を収率よく生成させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例の酵素による高分子複合体の分解パターン
【図１】
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