(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法であって、既知濃度の前記物質を含む標準検体および前記物質の濃度が未知の測定すべき検体における凝固時間並びに前記物質を含まない対照標準検体における凝固時間を測定し、前記標準検体における前記血液凝固時間に影響を与える物質の濃度の対数値と下記式[1]で表される相対凝固時間（Tr）の下記式[2]で表されるロジット(Logit)値とを変数として検量線を作成し、得られた検量線に基づいて、測定すべき検体中の前記物質の濃度を求めることを特徴とする定量方法。
[1]Tr＝(T0/T)×K
[2]Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす任意の定数、Lnは自然対数である。）
【請求項２】
前記定数Kが1.0である請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
前記検量線を作成する方法が多項式回帰法である請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項４】
前記凝固時間の測定が、前記物質を破壊しない条件下で前記の測定すべき検体及び標準検体あるいは前記の測定すべき検体のみを処理することによって内在する血液凝固因子を不活化し、次いで、該不活化後の両検体を一定量の血液凝固因子と混和し、得られた混和物の凝固時間を測定することによって行われる請求項１〜３のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項５】
血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法であって、前記物質の濃度が未知の測定すべき検体に内在する血液凝固因子を、前記物質を破壊しない条件下で不活化し、次いで、前記検体および既知濃度の前記物質を含む標準検体を一定量の血液凝固因子と混和し、得られた混和物の凝固時間を測定することを特徴とする定量方法。
【請求項６】
前記不活化が、加熱処理によるものである請求項４又は５に記載の定量方法。
【請求項７】
前記加熱処理の条件が50〜70℃である請求項６に記載の定量方法。
【請求項８】
前記血液凝固時間に影響を与える物質が糖質又は複合糖質である請求項１〜７のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項９】
前記血液凝固時間に影響を与える物質がグリコサミノグリカンまたは糖脂質である請求項５〜７に記載の定量方法。
【請求項１０】
血液凝固時間に影響を与える物質の定量装置であって、既知濃度の前
記物質を含む標準検体および前記物質の濃度が未知の測定すべき検体並びに前記物質を含まない対照標準検体の凝固時間を測定する手段、前記既知濃度の対数値と下記式[1]で表される相対凝固時間（Tr）の下記式[2]で表されるロジット(Logit)値とを変数として多項式回帰法により検量線を算出する手段、及び前記検量線に基づいて、前記測定すべき検体の凝固時間から前記物質の濃度を算出する手段を有することを特徴とする前記定量装置。[1]Tr＝(T0/T)×K
[2]Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす定数、Lnは自然対数である。）
【請求項１１】
前記定数Kが1.0である請求項１０に記載の定量装置。
【請求項１２】
前記血液凝固時間に影響を与える物質が糖質又は複合糖質である請求項１０又は１１に記載の定量装置。
【請求項１３】
前記血液凝固時間に影響を与える物質がグリコサミノグリカン又は糖脂質である請求項１０又は１１に記載の定量装置。
【請求項１４】
血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法を行うためのキットであって、既知濃度の前記物質を含む標準検体、血液凝固因子、活性化因子、並びに既知濃度の前記物質を含む標準検体及び前記物質を含まない対照標準検体における凝固時間を入力することによって、前記標準検体における前記血液凝固時間に影響を与える物質の濃度の対数値と下記式[1]で表される相対凝固時間（Tr）の下記式[2]で表されるロジット(Logit)値とを変数として検量線を算出する手順、及び前記物質の濃度が未知の測定すべき検体の凝固時間を入力することによって、測定すべき検体中の前記物質の濃度を前記検量線に基づいて算出する手順をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録した媒体を含むことを特徴とするキット。
[1]Tr＝(T0/T)×K
[2]Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす任意の定数、Lnは自然対数である。）
【請求項１５】
前記血液凝固時間に影響を与える物質が糖質又は複合糖質である請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記血液凝固時間に影響を与える物質がグリコサミノグリカン又は糖脂質である請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、プロトロンビン時間(PT)、トロンビン時間(TT)のような血液凝固時間に影響を与える薬物などの物質の濃度を短時間に、正確に、簡便に、また安価に測定する方法に関する。また同じ原理を用いて、各種検体中の当該物質を定量する装置、及びこの定量方法に使用する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンやデルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下GAGとも記述する）やアルガトロバンのように血液凝固系に影響を与える物質を測定する方法には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のように一般の測定機器を用いて該測定対象物質を直接測定するか、そうでなければヘパリン測定の際に行われるように該測定対象物質に特異的な生化学的活性を測定して間接的に測定することがなされている（血液凝固検査ハンドブック  宇宙堂八木書店発行  藤巻道男、福武勝幸編集  1992）。しかし、前者の方法では特定の測定機器が必要であり、さらにその測定装置によって測定可能な状態にするために長時間かかる簡便ではない前処理が必要とされ、検出感度が低い等の欠点が存在する。また、後者の方法においては目的とする物質に特異的活性が存在することが必須であり、その特異的活性を検出するためには多くの場合、入手困難で高価な試薬が必要とされ、また、活性を測定するため敏速な処理が必要とされ一度に多数の検体の測定を行うことが困難であり、さらに試料の長期間の保存は活性の低下を招き正確な測定を妨げる、測定可能な範囲は狭い等の問題点が存在する。特異的な抗体を用いた免疫化学的測定方法等も考え得るが、該測定対象物質が免疫原性がないあるいは低い場合には検出が不可能であるという問題点があり、汎用されるには至っていない。部分トロンボプラスチン時間(PTT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、プロトロンビン時間(PT)、トロンビン時間(TT)のような血液凝固時間を測定することにより、該測定対象物質濃度を測定する試みもあるが（In Heparin, pp.393-415, Lane, D.A. and Lindahl, U. eds, Edward Arnold, 1989）、従来行われている方法では該測定対象物質濃度と凝固時間の間に数学的相関関係がなく、凝固時間の測定値から濃度の直接の数値化が困難であること、作成される検量線から数値化が可能な濃度範囲が狭いこと、さらに検体中に含まれる多くの凝固因子を利用して凝固させるため、該測定対象物質濃度に関わらず検体差が大きいこと、などが問題点となっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
血液凝固時間に影響を与える物質の簡便でかつ精度の高い定量方法、数値化が容易な定量方法が求められている。特に、前記の従来の定量法に比べ、広い測定域で精度よく、また数値化が可能な定量法、及び検体中の測定対象物質以外の血液凝固因子等の物質の影響を受けずに該測定対象物質を特異的に高い精度で定量する方法が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究した結果、既知濃度の測定対象物質濃度と、凝固時間とから特定の様式で検量線を求めることにより、広い測定範囲で精度よく定量することができること、測定値から測定対象物質濃度を数値化できること、また、測定対象物質を含む検体を特定の条件で前処理することにより、検体中の測定対象物質以外の物質の影響を受けずに高い精度で測定対象物質を特異的に定量することができることを見いだし本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明の第１の要旨は、血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法であって、既知濃度の前記物質を含む標準検体及び前記物質の濃度が未知の測定すべき検体における凝固時間並びに前記物質を含まない対照標準検体における凝固時間を測定し、前記標準検体における前記血液凝固時間に影響を与える物質の濃度の対数値と下記式▲１▼で表される相対凝固時間（Tr）の下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)値とを変数として検量線を作成し、得られた検量線に基づいて、測定すべき検体中の前記物質の濃度を求めることを特徴とする定量方法に存する（以下本発明方法１とも表現する）。
【０００６】
▲１▼Tr＝(T0/T)×K
▲２▼Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす任意の定数（好ましくは1.0）、Lnは自然対数である。）
好ましくは、検量線を作成する方法は多項式回帰法である。
【０００７】
また、本発明の第２の要旨は、血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法であって、前記物質の濃度が未知の測定すべき検体に内在する血液凝固因子を、前記物質を破壊しない条件下で不活化し、次いで、前記検体及び標準検体を一定量の血液凝固因子と混和し、得られた混和物の凝固時間を測定することを特徴とする定量方法に存する（以下本発明方法２とも表現する、なお本発明方法１及び２をあわせて単に本発明方法と表現することもある）。
【０００８】
好ましくは、不活化は、加熱処理によるものであり、その好ましい条件は50〜70℃である。
本発明方法１に本発明方法２を組み合わせることもできる。
【０００９】
本発明方法の測定対象物質として好ましい血液凝固時間に影響を与える物質は、糖質又は複合糖質であり、さらに好ましいものは、グリコサミノグリカン又は糖脂質である。
【００１０】
さらに、また、本発明は、本発明方法を行うための装置（以下本発明装置とも表現する）及び本発明方法を行うためのキット（以下本発明キットとも表現する）を提供する。
【００１１】
すなわち、血液凝固時間に影響を与える物質の定量装置であって、既知濃度の前記物質を含む標準検体及び未知濃度の前記物質の濃度が未知の測定すべき検体並びに前記物質を含まない対照標準検体の凝固時間を測定する手段、前記既知濃度の対数値と下記式▲１▼で表される相対凝固時間（Tr）の下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)値とを変数として多項式回帰法により検量線を算出する手段、及び、前記検量線に基づいて、前記測定すべき検体の凝固時間から前記物質の濃度を算出する手段を有することを特徴とする前記定量装置が提供される。
【００１２】
▲１▼Tr＝(T0/T)×K
▲２▼Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす定数（好ましくは1.0）、Lnは自然対数である。）
また、本発明キットは血液凝固時間に影響を与える物質の定量方法を行うためのキットであって、既知濃度の前記物質を含む標準検体、前記物質を含まない対照標準検体、血液凝固因子及び活性化因子を含むことを特徴とするキットである。好ましくは、前記既知濃度の対数値と下記式▲１▼で表される相対凝固時間（Tr）の下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)値とを変数として多項式回帰法により検量線を算出する手順、及び、前記検量線に基づいて、前記測定すべき検体の凝固時間から前記物質の濃度を算出する手順をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録した媒体を更に包含するキットである。
【００１３】
▲１▼Tr＝(T0/T)×K
▲２▼Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす定数（好ましくは1.0）、Lnは自然対数である。）
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
1.本発明方法１
血液凝固時間に影響を与える測定対象物質の濃度が未知の測定すべき検体すなわち該測定対象物質の濃度を測定すべき検体（測定検体）と、当該測定対象物質を含まない対照標準検体、さらに既知濃度の測定対象物質を含む標準検体について、血液凝固時間に関する測定系によって、それぞれ凝固時間を測定する。この際、測定検体、対照標準検体、標準検体のいずれかが血液凝固因子を全く含まないか、その一部を欠くものであり、活性化因子を添加しても単独では凝固が起こらない場合は、これら全ての検体の血液凝固因子が同濃度となるように上記血液凝固因子を混和する。標準検体に含まれる当該測定対象物質濃度の対数値を取り(対数変換)、標準検体と当該測定対象物質を含まない対照標準検体の凝固時間から下記式▲１▼で表される相対凝固時間を算出し、さらに該相対凝固時間を下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)変換を行いロジット(Logit)値を算出し、当該対数値と当該Logit値を用いて検量線を作成する。通常のLogit変換は本発明方法１で使用する下記式▲２▼で示すLogit変換のように絶対値は使用しないが、本明細書中では下記式▲２▼による変換をロジット(Logit)変換と称し、該変換法による変換値をロジット(Logit)値とする。当該測定対象物質濃度を対数値に変換し、凝固時間を相対凝固時間に変換した後にLogit変換を行うことを今後Logit-log変換とも記述する。Logit変換の応用として下記式▲２▼'に示す式をLogit変換の代替として用いることも可能である。また、必要に応じ上記対数値とLogit値を回帰式に回帰して検量線を算出する。当該検量線を使用して検体の凝固時間から算出したLogit値を用いて検体中の当該測定対象物質濃度を求め、血液凝固時間に影響を与える物質の定量を行う。
▲１▼ Tr＝(T0/T)×K
▲２▼ Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
▲２▼'Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)m+Ln(n)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2の定数、Lnは自然対数、m、nは自然数であり、特にnはn＞0を満たす。Kは既知の標準検体中の当該測定対象物質濃度を検量線上で求め、誤差が生じた場合に必要に応じて検体中の当該測定対象物質濃度を算出する前に補正定数として変化させる。通常はK＝1.0で十分に対応することが可能である。また、▲２▼'の応用変換は検量線の傾き、切片を変化させる手段であり、当該応用変換を用いることによって数値の算出方法が単純になる場合は適宜利用することも可能であるが、通常は▲２▼式で表現される単なるLogit変換で十分に対応することが可能である。当該応用変換も本発明の技術範囲に包含される。）
【００１５】
以下に本発明方法１の各工程における技術について詳細に説明する。
(1)血液凝固時間に影響を与える測定対象物質の濃度を測定すべき検体（測定検体）
血液凝固時間に影響を与える測定対象物質は、正常な血液凝固系においてその存在によって血液凝固時間の延長または短縮を起こす物質であれば特に限定されないが、糖鎖構造を有することが好ましい。当該糖鎖構造を有する物質としては例えば糖質、複合糖質等があげられるが、糖質としては例えばデルマタン硫酸(DS)、コンドロイチン硫酸E(CSE)、ヘパリン(Hep)、低分子ヘパリン(LMWHep)等のグリコサミノグリカン等があげられ、また複合糖質としては、例えばスルファチド等の糖脂質等があげられる。例えばデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸E、ヘパリンあるいは低分子ヘパリンは血液凝固時間の延長を起こす物質であり、例えばスルファチドは濃度条件により血液凝固時間を延長又は短縮する物質である。検体については、上記血液凝固時間に影響を与える物質を含み得る溶液であれば本発明において検体として用いることが可能であり、特に限定はされないが、例えば臨床検査用検体、前記物質を含む医薬品のモニタリングのための体液、前記物質を製造するための工程から得られる溶液等である。具体的には例えば体液として血液、血漿、血清、リンパ液、組織液、関節液、脳脊髄液、汗、涙液、尿等があげられ、組織抽出液等や、生理食塩水、各種緩衝液、水等の水溶性溶液等も体液と同様に検体として利用することが可能である。
【００１６】
(2)対照標準検体及び標準検体
対照標準検体は、上記血液凝固時間に影響を与える物質を含まない水性の液体であれば特に限定はされないが、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、組織液、関節液、脳脊髄液、汗、涙液、尿等の体液、組織抽出液、生理食塩水、各種緩衝液、水等である。さらに、標準検体とは、当該測定対象物質を既知濃度で含む上記液体である。検体と標準検体、対照標準検体の溶媒となる液体は必ずしも同一である必要はないが、同一であることが好ましい。
【００１７】
(3)測定対象物質の濃度
本明細書中の測定対象物質の濃度は例えば（重量/容量(mg/ml、μg/ml等)で示される濃度、（活性/容量(U/ml等)）等として記述される濃度である。
【００１８】
(4)血液凝固時間に関する測定系
血液凝固時間に関する測定系は、検体の凝固を利用する方法であれば特に限定はされないが、例えば部分トロンボプラスチン時間(PTT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、プロトロンビン時間(PT)、トロンビン時間(TT)（いずれも  臨床検査マニュアル  文光堂発行  北村元仕ら編  1988）等の測定系である。
【００１９】
(5)活性化因子
本発明における活性化因子とは利用する上記測定系によって検体の凝固を開始させるための活性化因子、例えばAPTT測定におけるAPTT測定試薬、あるいはPT測定におけるPT測定試薬等である。例えば、APTT測定試薬としては、市販のトロンボチェックAPTT（（株）ミドリ十字；商品名）等に含まれる「APTT試薬」と塩化カルシウム溶液との組み合わせが好ましいが、「APTT試薬」の代替として同様の構成を有する試薬、すなわち珪藻土（例えばセライト（商品名））、カオリン鉱物等の鉱物、エラグ酸等のタンニン又は無水ケイ酸等の接触因子及び粗製のセファリン等を含有する試薬をAPTT測定用キットの説明書の記載と同様に用いて本発明方法におけるAPTT測定に適用してもよい。また、例えば、PT測定試薬とは市販のトロンボチェックPT（（株）ミドリ十字；商品名）等に含まれる「PT試薬」と塩化カルシウム溶液が好ましいが、「PT試薬」と同様の構成を有する試薬、すなわちトロンボプラスチンを「PT試薬」の代替として、PT測定用キットの説明書の記載と同様に用いて本発明方法におけるPT測定に適用してもよい。また、同様にPTT測定やTT測定も0.02M塩化カルシウム溶液とPTTやTT測定用の市販のキットと同様の試薬、すなわち例えばPTT測定ではPTT試薬の代替としての粗製のセファリン、TT測定ではTT試薬の代替としてのトロンビンを用いて測定を行うことにより測定が可能である。
【００２０】
(6)凝固時間
本発明における凝固時間とは、例えば吸光光度計による吸光度の測定値、濁度計や比濁計による濁度の測定値、あるいは粘度計による粘度の測定値などの測定値が、凝固の開始から凝固を示す一定の値に達するまでの時間を示す。
【００２１】
(7)血液凝固因子
血液凝固因子とは血液凝固系に関して健常な血漿に含まれる全ての血液凝固因子であり、その添加方法は当該血液凝固因子が活性化因子により正常な凝固を誘導するのであれば測定反応系への混和方法、試薬の形態は限定はされない。混和の際は溶液の状態が好ましいが、正確に添加することが可能な方法であればこれに限定はされず、例えば凍結乾燥品を反応液に容易に溶解するように混和することも可能である。当該血液凝固因子を検体に混和する際には好ましくは最終濃度が健常人の血漿におけるこれら因子の濃度の5〜200%となることが望ましい。また、本発明における血液凝固因子としてはコアグトロール１（（株）ミドリ十字；商品名）等の必要な血液凝固因子を含む市販の標準血漿を用いることが好ましいが、血液凝固因子としては、例えば血液にクエン酸ナトリウム等の血液凝固阻害剤を添加し、遠心分離を低回転数（例えば、150×g程度）で行って得られる血小板を多く含んだ多血小板血漿(PRP)、又は高回転数（例えば、1,000×g程度）で行って得られる貧血小板血漿(PPP)のいずれであっても用いることが可能である。さらに、正常血漿に含まれる血液凝固因子を全て含有する液体であり、上記血液凝固因子の活性化によって凝固を起こす能力が失われていなければ、例えば、未処理のままの血漿を凍結乾燥して得られた凍結乾燥品を蒸留水に再溶解した溶液等でも可能である。
【００２２】
(8)対数変換
本発明における測定対象物質濃度の対数変換とは特に限定はされず、例えば常用対数値、自然対数値等を取ることであるが、数値の算出時の簡便さを考慮すると、常用対数値を用いることが好ましい。
【００２３】
(9)回帰法
本発明における回帰法としては対数値とLogit値の関係を数式で表現するための回帰法であれば特に限定はされない。しかし、算出される数値と理論値の誤差が小さく正確性が高いことから多項式回帰法を用いて回帰式に回帰することが好ましく、実用性を考慮すると二次式又は三次式に回帰することがより好ましい。
【００２４】
また、本発明は血液凝固時間に影響を与える物質の測定方法として以下の本発明方法２も提供する。以下に本発明方法２の実施の形態について説明する。
【００２５】
2.本発明方法２
血液凝固時間に関する測定系において凝固時間を測定する際に、血液凝固時間に影響を与える物質の濃度を測定すべき検体（測定検体）が血液凝固因子をすでに含む生体由来検体である場合、当該測定対象物質を破壊しない条件下で測定検体中に内在する血液凝固因子を不活化し、次いで前記検体及び標準検体を一定量の血液凝固因子と混和してから、得られた混和物について凝固時間を測定する。測定された凝固時間から濃度をそのまま、あるいは対数による変換値と凝固時間をそのまま用いて検量線を作成する従来の方法によって測定対象物質の濃度を算出することができる。
【００２６】
以下に本発明方法２の各工程における技術について詳細に説明する。なお、測定検体、対照標準検体及び標準検体、血液凝固時間に関する測定系、測定対象物質の濃度、凝固時間、血液凝固因子等については本発明方法１について記載したものと同様である。
【００２７】
(1)測定対象物質を破壊しない条件下で血液凝固因子を不活化する処理
本発明における測定対象物質を破壊せずに検体内在性の血液凝固因子を不活化するための処理とは、例えば酵素処理、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶媒による変性処理、凍結融解の繰り返し処理等であり、その中でも加熱処理が簡便なため好ましい。加熱処理における温度は、通常には30〜100℃、好ましくは40〜80℃、さらに好ましくは50〜70℃、最も好ましくは56〜65℃である。加熱処理における時間は加熱によって測定対象物質を破壊しないならば限定はされないが、通常には数分〜数十分、好ましくは15〜25分、特に好ましくは20分程度である。酸処理、アルカリ処理による場合は、その処理の後に例えば緩衝液等によって水素イオン濃度(pH)を適宜調整する必要がある。また、有機溶媒による変性処理の場合には、当該変性処理の後に有機溶媒を除去する処理が必要である。さらに、例えばタンパク質分解酵素等を用いた酵素処理による場合には、該処理の後に当該酵素を例えば加熱処理等によって失活させる必要がある。また、酵素処理法としては、固定化酵素と接触させる方法を採用することも可能であり、この場合は必ずしも失活させる必要はない。該不活化処理においては、上記処理の単独の使用、複数の処理の組み合わせた使用は特に制限されない。
【００２８】
(2) 一定量の血液凝固因子との混和
本発明における一定量の血液凝固因子との混和とは、上記不活化処理で不活化された内在性の血液凝固因子の代わりに別途血液凝固因子を添加することを指す。添加量は当該血液凝固因子が活性化因子により正常な凝固を誘導する量であり、測定系により適宜決定される。
【００２９】
以上本発明方法１と本発明方法２をそれぞれ独立で実施した場合にも従来法と比較して広い濃度範囲で正確な測定値を得ることが可能であるが、本発明方法１と本発明方法２に記載された方法を組み合わせて検体内在性の血液凝固因子の不活化処理と測定値の数値変換を用いた場合はより広い濃度範囲で正確な測定値を得ることが可能である。
【００３０】
すなわち、当該本発明方法１について記載した測定対象物質を含む該本発明方法１と同様な測定検体及び標準検体または測定検体のみに当該測定対象物質を破壊しない処理を施し内在性の血液凝固因子を不活化し、その後、測定検体、対照標準検体、標準検体それぞれに該本発明方法１についての記載と同様に血液凝固因子を全て同濃度となるように添加して該本発明方法１について記載した活性化因子を添加して本発明方法１と同様に凝固時間を測定し、対照標準検体、標準検体における当該測定対象物質濃度あるいは活性単位と凝固時間の測定値を利用して検量線を作成し、当該検量線と測定検体における凝固時間から該検体中の当該測定対象物質濃度を求めることができる。
【００３１】
また、本発明方法１、２及びこれらを組み合わせた定量方法は、血液凝固時間に影響を与える物質が測定すべき検体中に複数含まれる場合にも測定対象物質のみを定量する事が可能である。この場合には、本発明方法１、２あるいはこれらを組み合わせた方法において、検体の凝固を開始する前に、対象とする物質以外の上記物質を血液凝固系に影響を与えない状態にする作業を行う必要がある。当該作業は、例えば酵素処理法等である。例えば、測定対象物質とヘパリンが共存する場合には、検体の凝固を開始する作業の前にヘパリナーゼ等のヘパリン分解酵素によって処理してヘパリンを分解した後に、凝固を開始させて凝固時間の測定を行う。
【００３２】
本発明は本発明方法を利用した測定機器（本発明装置）とキット（本発明キット）も提供する。以下に本発明装置と本発明キットの実施の形態について説明する。
【００３３】
3.本発明装置
本発明方法１に記載された方法で血液凝固時間に影響を与える物質濃度を測定するための装置であり、その一例を図１のブロック図を参照して説明する。この本発明装置は、測定検体、対照標準検体及び標準検体の凝固時間を測定する手段として、反応実施部1と検体測定部2とを装備し、検量線を算出する手段及び前記物質の濃度を算出する手段として、入力部3、中央処理部4、データ記憶部5、プログラム記憶部6及び出力部7を装備している。
【００３４】
以下、各構成部分毎に詳細に説明する。
(1)反応実施部
反応実施部1は、測定検体、対照標準検体及び標準検体の凝固が起こる反応器を備える。加熱による内在性の血液凝固因子の不活化処理を行うために加熱が可能なヒーターが装備されていることが好ましく、このヒーターを利用することにより本発明方法２の説明の後に記載した本発明方法１と本発明方法２を組み合わせた測定を行うことも可能である。
【００３５】
(2)検体測定部
検体測定部2は、測定検体、対照標準検体、標準検体の変化を測定することにより凝固時間を測定する。装置の単純化を考慮すると上記反応実施部1と隣接して設置することが好ましい。
【００３６】
検体測定部2が装備する凝固時間の測定手段は、上記本発明方法１の測定工程を実施することが可能であれば特に限定はされない。例えば、分光光度計を利用した吸光度の測定装置、濁度計や比濁計を用いた濁度の測定装置、粘度計を利用した粘度検出装置等であるが、装置の構造や簡便さなどから吸光度を利用する方法が好ましい。凝固の開始から測定値が凝固を示す一定の値に達するまでの時間が凝固時間として測定される。
【００３７】
(3)入力部
入力部3により、標準検体中の測定対象物質濃度と当該濃度での凝固時間の測定値、必要に応じて標準検体中の該測定対象物質の活性単位(U/mg)、検体の凝固時間の測定値及び数値変換の係数(K)を入力するとともに検量線を算出するための回帰法を選択する。必要であれば反応実施部1のヒーターの加熱温度及び加熱時間の入力も当該入力部3で行う。入力部3は、例えばキーボード、テンキー、タッチパネル等で構成されるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３８】
(4)中央処理部
以下の処理を行う。
・上記入力部3から入力された標準検体中の測定対象物質濃度あるいは活性単位及び回帰式情報（回帰式の選択情報及び係数(K)）等をデータ記憶部5に格納し、また上記検体測定部で測定された検体、対照標準検体及び標準検体の凝固時間を上記検体測定部から取得してデータ記憶部5に格納する。
・プログラム記憶部6から検量線算出手順を実行するプログラムを読み出し、該プログラムを実行して検量線を算出し、必要に応じてデータ記憶部5に格納する。
・上記入力部3において入力された情報に応じてプログラム記憶部6から未知濃度算出手順を実行するプログラムを読み出し、該プログラムを実行して、検体中の物質濃度あるいは活性単位を算出し、必要に応じてデータ記憶部5に格納する。・算出された検量線及び検体中の測定対象物質濃度、ならびに、データ記憶部5に格納されたデータを出力部7に出力する。
・必要であれば、データ記憶部5に格納されたヒーターの加熱温度及び加熱時間を読み出し、反応実施部1のヒーターを制御する。
【００３９】
中央処理部4は、例えば、マイクロプロセッサで構成される。
【００４０】
(5)データ記憶部
標準検体中の測定対象物質濃度及び回帰式情報（回帰式の選択情報及び係数(K)）、並びに、測定された測定検体、対照標準検体及び標準検体の凝固時間とを記憶する。例えば、ランダムアクセスメモリ、ハードディスク等の記憶装置で構成される。
【００４１】
(6)プログラム記憶部
検量線算出手順、未知濃度算出手順及び濃度記述の相互換算手順を中央処理部に実行させるプログラムを格納する。例えば、読み出し専用メモリで構成される。あるいは、ランダムアクセスメモリに記憶媒体からプログラムを転送して構成される。
【００４２】
検量線算出手順は、データ記憶部5から、標準検体中の測定対象物質濃度あるいは活性単位、回帰式の選択情報、並びに、測定検体、対照標準検体および標準検体の凝固時間のデータを読み出し、標準検体中の濃度の対数値と下記式▲１▼で表される相対凝固時間（Tr）の下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)値とを変数として回帰式情報に基づいて多項式回帰法により検量線を算出する手順である。
【００４３】
▲１▼Tr＝(T0/T)×K
▲２▼Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす定数（好ましくはK=1.0）、Lnは自然対数である。）
未知濃度算出手順は、算出された検量線としての回帰式に基づいて、データ記憶部5から読み出した測定検体の凝固時間から濃度を算出する手順である。
【００４４】
濃度記述の相互換算手順は、（重量／容量）で示される濃度と（活性／容量）で示される濃度の相互換算手順、すなわち、入力された活性単位（1mgあたりのユニット数）および上記未知濃度算出手順によって得られた数値を用いて（重量／容量）で示される濃度を（活性／容量）で示される濃度に、あるいはその逆の換算を行う手順である。
【００４５】
(7)出力部
算出された物質濃度、回帰式等を出力する。例えば、液晶表示パネル等の画面表示手段、プリンタ等の印刷手段によって構成される。
【００４６】
本発明装置が装備する上記各手段を行うそれぞれの装置は、必ずしも同一の筐体に包含される必要はなく、情報が適切に処理されるのであればその構成は特に限定されない。
【００４７】
4.本発明キット
本発明キットは上記本発明方法１、上記本発明方法２を単独に又は複合的に行うためのキットであり、本発明方法１について記載された標準検体、血液凝固因子及び活性化因子、さらに好ましくは測定によって得られた凝固時間の測定値を数学的に処理するためのプログラムが記録された媒体及び／又は対照標準検体を内包するキットである。
【００４８】
以下に本発明キットにおける技術について詳細に説明する。
(1)対照標準検体、標準検体、血液凝固因子及び活性化因子
対照標準検体、標準検体、血液凝固因子は本発明方法１について記載した通りである。本発明キットとしては例えばヘパリン測定用キット、デルマタン硫酸測定用キット等があげられるが、例えばヘパリン測定用キットの場合は標準検体として一定量のヘパリンを一定濃度で含有する標準ヘパリン検体を包含することが好ましい。
【００４９】
本発明キットにおける活性化因子とは、当該活性化因子を混和することにより血液凝固因子の活性化が誘導される物質であり、本発明方法１について記載したものが例示されるが、凝固を起こす因子であれば特に限定はされない。当該活性化因子は凝固時間の測定に利用する血液凝固系（APTT、PT、PTT、TT等により）で決定され、例えば本発明方法１の活性化因子の項に記載したAPTT試薬やPT試薬等とカルシウムイオンを含有する溶液の組み合わせである。
【００５０】
対照標準検体、標準検体、血液凝固因子及び活性化因子は、保存又は使用に適した形態に調製されてキットに含まれることが望ましい。
【００５１】
(2)数学的な処理を行うプログラムが記録された媒体
本発明キットにおける数学的な処理を行うプログラムが記載された媒体とは凝固時間の測定値を規定された方法で入力することにより、上記本発明方法１に記載された各種数値の変換処理を行い、また該変換値を利用して上記本発明方法１に記載された検量線の作成すなわち数値の回帰処理、検体中の測定対象物質濃度の算出、必要に応じて濃度記述の相互変換を行うプログラムが記録された記憶媒体であり、その種類は限定されず、また当該プログラムが動作する環境も特に限定はされない。
【００５２】
プログラムの一例の手順を図２のフローチャートを参照して説明する。
Ｓ１では、標準検体中に含まれる血液凝固時間に影響を与える物質の濃度及び標準検体の凝固時間並びに対照標準検体における凝固時間を入力する。また、必要に応じて係数(K)を入力する。
【００５３】
Ｓ２では、検量線を算出するために使用される回帰式を選択する。例えば、１次式、２次式及び３次式の中から選択する。
Ｓ３では、Ｓ１で入力された情報とＳ２で選択された情報に基づいて、前記標準検体における前記血液凝固時間に影響を与える物質の濃度の対数値と下記式▲１▼で表される相対凝固時間（Tr）の下記式▲２▼で表されるロジット(Logit)値とを変数として検量線を算出する。
【００５４】
▲１▼Tr＝(T0/T)×K
▲２▼Logit(Tr)＝Ln(Tr/|1-Tr|)
（式中、Trは相対凝固時間、T0は前記対照標準検体における凝固時間、Tは前記標準検体における凝固時間、Kは0.8≦K≦1.2を満たす任意の定数、Lnは自然対数である。）
【００５５】
Ｓ４では、測定すべき検体の凝固時間を入力する。
Ｓ５では、測定すべき検体中における測定対象物質の濃度（未知濃度）を前記検量線に基づいて算出する。また、必要に応じて濃度記述の相互変換を行う。
【００５６】
Ｓ６では、Ｓ５で算出された濃度とＳ３で算出された検量線としての回帰式を表示する。これらは別個に表示するようにしてもよいし、また、グラフ表示にしてもよい。
【００５７】
上記の手順の内、Ｓ１、Ｓ２及びＳ４の順序は任意でよい。Ｓ４をＳ３の前にしてもよいが、この場合Ｓ１及びＳ２はＳ３よりも前に行われなければならない。
【００５８】
Ｓ１〜Ｓ３が検量線を算出する手順に、Ｓ４〜Ｓ５が未知濃度を算出する手段にそれぞれ相当する。
【００５９】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６０】
【実施例１】
（本発明方法１による各種グリコサミノグリカンの定量）
ラット血漿中の血液凝固時間を延長する種々の物質がAPTTに与える影響、およびAPTTの数値変換値と測定対象物質である当該物質の濃度値との相関を検討した。当該測定対象物質として、グリコサミノグリカン（以下GAG）であるヘパリン（以下Hep）、低分子ヘパリン（以下LMWHep）及びデルマタン硫酸（以下DS）を用い、採取して未処理の血漿のAPTTの変化を調べた。
即ち、3.8wt%クエン酸ナトリウム水溶液を含む注射筒を用意し、該注射筒を用いて該クエン酸ナトリウム水溶液の約9倍量の血液を採血する。該混合物を4℃、1000×Gの条件で15分間遠心処理してその上清を血漿として分離した。該血漿100μlに各濃度で生理食塩水に溶解した上記の種々の測定対象物質を100μl添加して37℃に1分間放置し、その後、37℃に保温したAPTT試薬（トロンボチェックAPTT：ミドリ十字）を100μl添加して37℃に2分間放置した後、37℃に保温した0.02Ｍ塩化カルシウム溶液を100μl添加して凝固を開始させ、凝固時間をバクスター社製の血液凝固自動測定装置(AMELUNG KC10A)で測定した（表１、図３）。
【００６１】
ヘパリンでは、0.12μg/mlから、APTTは延長し、12μg/ml以上では凝固が起こらず、低分子ヘパリンでは、1.2μg/mlから、APTTは延長し、40μg/ml以上で凝固が起こらなくなった。デルマタン硫酸では、1μg/mlから、APTTは延長し、3000μg/mlでは、65.7secまで延長した。従来知られている方法(In Heparin,pp.393-415, Lane, D.A. and Lindahl, U. eds, Edward Arnold, 1989)で、測定された凝固時間と濃度をそれぞれ対数変換しプロット後、検量線を作成した（後述）。しかし、当該検量線は精度が低く、実用的に測定可能な濃度域はきわめて狭かった（比較例；図４〜６）。
【００６２】
【表１】
0003876022.tif 000002
*いずれも血液凝固時間に影響を与える物質を含んでいない血漿におけるAPTT値であるが、ヘパリン、低分子ヘパリンの実験を行った日とデルマタン硫酸の実験を行った日が異なるため、これらの値に違いがある。従って、血液凝固時間には、使用する検体（血漿等）による相違が生じる。本発明は、また、このような検体による誤差をなくす定量方法も提供する（実施例２）。
【００６３】
上記物質を用いて得たAPTT値を用いて数値の変換を行い、数値の多項式回帰法による回帰により検量線の作成を行った。即ち、下記手順に従い数値の変換(Logit-log変換)、回帰を行った。
1)被験測定対象物質濃度(x)を常用対数値に変換する。(X=Logx)
2)各被験測定対象物質濃度(x)におけるAPTT値(T)に対する、被験当該物質の未添加時(0濃度)のAPTT値(T0)の比率(Tr)を計算する(Tr=(T0/T)×K;K=1.0)。
3)Trの値をロジット(Logit)変換する。本実施例は凝固時間を延長するケースであるので1>Trとなり、Y= Ln(Tr/(1-Tr))となる。従って、本実施例の場合は、Ln(T0/T)/(1-T0/T) = Ln(T0/T-T0) = Ln((T-T0)/T0)-1 = - Ln(ΔAPTT/T0)と変換される。ただしΔAPTT= T-T0。
4)それぞれのX値と、それに対応するY値のデータを多項式回帰し、多項方程式で回帰曲線（一次式の場合は、直線）を算出する。Y=ΣCkXk、ただしK≧0、Ckは実数。
【００６４】
理論値は実際の検体中の測定対象物質濃度、計算値は回帰計算によって求めた検量線の式により該検体のAPTTの測定値から測定対象物質濃度を逆算した数値である。
【００６５】
測定によって得たAPTT値、算出された回帰曲線を示す多項式（一次、二次、三次、ただし、ヘパリンは一次、二次のみ）から得られた計算値、並びに理論値と計算値から得た真度(真度＝(計算値−理論値)/理論値×100%)の一覧を表２〜５（本発明方法）に示す。また上記の従来法で得た理論値を参考の為併記した。また、算出された回帰曲線を図７〜９（本発明方法）に示す。本実施例では、回帰式は三次式までを例示したが、四次以上の多項式での回帰曲線も用いることが可能である。
【００６６】
上記回帰曲線（検量線）を用いてAPTT値から未知当該物質濃度を求める場合は、未知濃度の当該測定対象物質を含む検体のAPTT値を測定しYを算出し、これを得られた多項式に代入しXを得、10Xを計算し、最終的に未知濃度xを得る。表２〜５の結果から明らかなように、本発明によれば、広い濃度範囲でよい真度が得られる。
【００６７】
【表２】
0003876022.tif 000003
従来法：Y=0.495X+1.311（但し、この場合のY=log（検体のAPTT値）、X=log（検体中のヘパリン濃度）（図４）
【００６８】
【表３】
0003876022.tif 000004
従来法：Y=0.303X+1.217 （但し、この場合のY=log（検体のAPTT値）、X=log（検体中の低分子ヘパリン濃度）（図５）
【００６９】
【表４】
0003876022.tif 000005
【表５】
0003876022.tif 000006
従来法：Y=0.253X+0.898 （但し、この場合のY=log（検体のAPTT値）、X=log（検体中のデルマタン硫酸濃度）（図６）
【００７０】
【実施例２】
（本発明方法によるデルマタン硫酸の定量）
血漿の加熱処理がAPTTにおよぼす影響と、ラット血漿あるいは標準血漿（コアグトロール１）を血液凝固因子供給源として使用した影響を調べた。測定対象物質としてはデルマタン硫酸を用いた。
【００７１】
血漿中の血液凝固因子量の検体差がAPTTの測定値に影響し、さらに定量値に影響することが、実施例１の表１において使用した血漿が異なる検体であったためにグリコサミノグリカンの濃度が０のときの凝固時間が相違していることからも明らかであるため（表１参照）、デルマタン硫酸を含有する検体中の血液凝固因子を失活させ、APTT測定に使用する血液凝固因子は別に添加した。血液凝固因子の失活の手法として、サンプルの加熱処理を試みた。加熱処理のAPTTに対する影響を、デルマタン硫酸濃度0及び250μg/mlにおいて検討した。その後、血液凝固因子の供給源として、コアグトロール１及びラット血漿を使用した。
【００７２】
加熱処理による影響は、ラットから実施例１の方法と同様に採取した血漿に、生理食塩水に溶解したデルマタン硫酸を最終容量の1/10添加し、この状態での最終濃度を0及び250μg/mlとし、これを検体とした。加熱処理検体は、65℃で20分間加熱し、実施例１と同様のAPTT試薬とカルシウム溶液を100μlずつ添加してそれぞれのAPTT値を実施例１と同様に血液凝固自動測定装置で測定した。非加熱処理検体のデルマタン硫酸濃度0、250μl/mlの検体において、それぞれのAPTT値は14.2秒及び38.1秒であったが、加熱処理を行った検体は、いずれのデルマタン硫酸濃度において少なくとも120秒の間で凝固は認められなかった（表６）。
【００７３】
一方、加熱処理の後に血液凝固因子を別途添加した場合のAPTT値の変化は、上記加熱検体20μlに説明書に従って調製したコアグトロール１を80μl添加し、上記方法と同様にAPTT試薬とカルシウム溶液を添加し、APTT値を実施例１と同様に血液凝固自動測定装置で測定した。その結果、加熱処理を行った場合には凝固が起こらなかった検体で、コアグトロール１の添加によって凝固活性が復活し、さらにデルマタン硫酸によるAPTT値の延長作用が観察された（表６）。
【００７４】
また、データは示さないが、実施例１と同様の方法で用意されたラット血漿を上記コアグトロール１の代替として使用した場合にも上記結果と同様に凝固活性の復活とデルマタン硫酸によるAPTTの延長作用が起こることを確認している。
【００７５】
【表６】
0003876022.tif 000007
【００７６】
【実施例３】
（本発明方法１と本発明方法２の組み合わせによるデルマタン硫酸の定量）
APTT法を用い、ラットの尿及び肝臓組織ホモジネイトを検体とした血液凝固時間を延長する物質の定量の検討を行った。測定対象物質としてデルマタン硫酸を用いた。
【００７７】
肝臓は、その一部(2.550g)に4倍量のリン酸緩衝液を添加し、氷冷下ポリトロン型ホモジナイザー(約15,000rpm)でホモジナイズし、その後、3,000rpm, 4℃の条件下において15分間遠心分離した上清を肝臓ホモジナイズサンプルとした。尿の場合は氷冷下で、ラットが一晩に排泄した尿を回収し、3,000rpm, 4℃の条件下において遠心分離した上清を尿サンプルとした。それぞれのサンプルは、-30℃で凍結保存した。
【００７８】
本発明方法２に従い不活化処理として融解後に56℃で20分間加熱処理した。生理食塩水に溶解したデルマタン硫酸をサンプルの全体量に影響を与えない少量添加し十分に攪拌して検体（肝臓ホモジネイト検体、尿検体）とした。各検体を20μl取り、コアグトロール１を80μl添加し、APTT測定に供試した。また、参考値として肝臓ホモジネイトサンプルや尿サンプルの代替として生理食塩水（生食）にデルマタン硫酸を各濃度で溶解した（対照生理食塩水検体）場合についてもAPTT測定を行い、本発明方法１に従って数値変換を行った（表７〜１０及び図１０〜１８）。
【００７９】
【表７】
0003876022.tif 000008
【００８０】
【表８】
0003876022.tif 000009
【００８１】
【表９】
0003876022.tif 000010
【００８２】
【表１０】
0003876022.tif 000011
【００８３】
【実施例４】
（本発明方法１及び本発明方法２の組み合わせによる各種GAGの定量）
実施例２及び３は測定検体の血液凝固因子を不活化し、デルマタン硫酸の量を測定したが、デルマタン硫酸以外の血液凝固時間を延長する物質が知られているので、実施例２と同様の熱処理（65℃、20分）では破壊されないと考えられるGAGであるヘパリン、低分子ヘパリン、コンドロイチン硫酸Eについても調べた。測定法は以下に記す方法で行った。
【００８４】
即ち、実施例１と同様にラット血漿を採取し、ラット血漿の全体量に影響を与えないごく少量の生理食塩水に溶解した各種GAGを各々加えた後、十分混和して検体とし、この検体を65℃で20分間加熱処理した（加熱処理検体）。加熱処理検体の20μlを80μlのコアグトロール１と混和後、実施例１と同様の方法によってそれぞれのAPTT値をデュプリケートで測定し、その平均を測定値とし、本発明方法１に従って数値変換した（表１１〜１４及び図１９〜２６）。
【００８５】
【表１１】
0003876022.tif 000012
【００８６】
【表１２】
0003876022.tif 000013
【００８７】
【表１３】
0003876022.tif 000014
【００８８】
【表１４】
0003876022.tif 000015
【００８９】
ヘパリンは活性単位で示されることが多いため、当該実施例中のヘパリンの例（表１２）について、標準検体のU/mlとして示される濃度の理論値と凝固時間の関係で示し、当該実施例中のヘパリンの例と同様に検量線の作成と曲線回帰を試みた（表１５および図２７、２８）。ただし、ヘパリンは、和光純薬工業（株）(Cat No.085-00134;182.5U/mg)を使用した。
【００９０】
【表１５】
0003876022.tif 000016
【００９１】
【実施例５】
（本発明方法１によるスルファチドの定量）
血液凝固時間（APTT）を短縮させ得る物質について検討した。硫酸化糖脂質であるスルファチドをリン酸緩衝溶液に溶解し、該物質の濃度測定を本発明方法１で試みた。
【００９２】
スルファチドをリン酸緩衝溶液に種々の濃度で溶解し検体とし、この溶液20μlと標準血漿コアトロール1を80μlを混和し、実施例１と同様にAPTTをデュプリケートで測定し、平均値を測定値とし、本発明方法１に従って数値変換した（表１６〜１８及び図２９〜３５）。
【００９３】
【表１６】
0003876022.tif 000017
【００９４】
スルファチドが0μg/mlの場合のAPTT平均値は32.3秒であった。図２９に示したように23.4μg/ml以上（区間A）では容量依存的にAPTTは延長した。一方11.7μg/ml以下、0.18μg/ml以上ではAPTTは短縮し、このうち、1.5μg/ml以下、 0.18μg/ml以上（区間B）ではこの短縮は容量逆相関性であった。そこで区間A、区間B各々についてLogit-log変換を行い、各々検量線を作成した。図３０〜３５に示した如く、延長区間のみならず、短縮区間でもこれらのデータは各々区間独立した多項式で表すことが可能である。
【００９５】
尚、本実施例ではスルファチドをリン酸緩衝溶液に溶かしたものそのままを用いているが、この物質は65℃、20分の処理や凍結融解の処理に安定である。従って、生体由来検体中のスルファチドを測定する場合、本発明方法２に従って不活化処理を行うことができる。
【００９６】
【表１７】
0003876022.tif 000018
【００９７】
【表１８】
0003876022.tif 000019
【００９８】
【実施例６】
（本発明方法１及び本発明方法２の組み合わせによるデルマタン硫酸の測定）
病態血漿中の血液凝固時間を延長する物質の濃度測定を病態血漿を用いて行った。病態モデルとして、ラット汎発性血管内凝固症候群（Disseminated Intravascular Coagulation, DIC）モデルを、測定対象物質としては、デルマタン硫酸を選び、下記の添加回収実験を行った。
【００９９】
ラットDICモデルの３匹の血漿は PCT国際公開 WO95/09188号公報の実施例４に従って調製した。すなわち、50mg リポポリサッカライド（LPS）/kg/4時間点滴静注後の病的血漿である。これらの検体及び正常ラットの血漿を実施例１と同様に採取して-20℃で保存し、融解後に実施例３と同様に少量の生食に溶解した種々の濃度のデルマタン硫酸を各々加えて測定検体とし、実施例２と同様に65℃で20分間加熱処理した（加熱処理検体）。これら加熱処理検体の各々20μlに80μlのコアグトロール１を添加し、APTT法を用いた定量を実施例３と同様に行った（表１９）。
【０１００】
【表１９】
0003876022.tif 000020
【０１０１】
上記の如く、本法で測定された値は、DICモデル血漿及び正常血漿とも、きわめて近いことが示された。正常ラットで得られた標準検体のAPTT値を基に得られた三つの検量線の回帰式の各々に上記のDICモデル血漿（測定検体）のAPTT値をそれぞれ代入して計算値及び真度を算出した（表２０）。
【０１０２】
【表２０】
0003876022.tif 000021
【０１０３】
上記に示したとおり、50〜100μg/mlの間では、測定値の信頼性がやや劣る傾向にあるが、それ以降では、実用的範囲で測定対象物質濃度が測定されていることが判明した。
【０１０４】
【実施例７】
（本発明方法１及び本発明方法２の組み合わせによる複数のGAGを含む検体の定量）
血液凝固時間に影響を与える物質が複数入った検体における定量を行った。測定対象物質の例としてデルマタン硫酸を、上記測定対象物質以外の血液凝固時間に影響を与える物質としてヘパリンを例にとり、測定対象物質の入る溶媒としては、実施例１と同様に採取したラット血漿を選び以下の実験を行った。デルマタン硫酸を0〜90mg/ml、ヘパリンを900μg/mlとなるように各々生理食塩水に溶解した。血漿2.7mlに生理食塩水0.15mlを加えたものに、0.15mlの種々の濃度のデルマタン硫酸を溶解した生理食塩水を添加したもの、及び血漿2.7mlにヘパリン、900μg/mlを含む生理食塩水0.15mlを加えたものに、0.15mlの種々の濃度のデルマタン硫酸を溶解した生理食塩水を加えたものをそれぞれ用意した（測定検体）。これらを65℃で20分間加熱処理した後、ヘパリンを加えた群には凍結乾燥された酵素（ヘパリナーゼ、0.1U 生化学工業（株）製）を加え、ヘパリンを分解した（酵素処理検体）。その後、これらの酵素処理検体を20μlとり、80μlのコアグトロール１に加え、実施例１と同様にAPTT値をデュプリケートで測定し、平均値を測定値とした（表２１）。
【０１０５】
【表２１】
0003876022.tif 000022
【０１０６】
測定対象物質(デルマタン硫酸)のみを含有する検体,及び,測定対象物質及び測定対象物質以外で凝固時間に影響を与える物質(ヘパリン)双方を含有しない溶媒である生理食塩水のAPTT値でLogit-log変換を行い回帰直線あるいは回帰曲線を作成した（表２２）。
【０１０７】
【表２２】
0003876022.tif 000023
【０１０８】
次に、測定対象物質（デルマタン硫酸）を含有し、更に血液凝固時間に影響を与える物質(ヘパリン)も含有する検体を酵素処理した後得たAPTT値を上記数式に各々代入して得た計算値と理論値を比較した（表２３）。
【０１０９】
【表２３】
0003876022.tif 000024
【０１１０】
上記の表に示したごとく、 酵素処理後のサンプルの濃度は、1500μg/ml以上の範囲で、理論値と誤差21.7%以下の精度で測定できる事が判明した。
【０１１１】
【実施例８】
（本発明方法１及び本発明方法２の組み合わせによるヘパリンの定量）
APTTと同様にPTを応用した。測定対象物質の例としては、ヘパリンを用いた。ヘパリンを生理食塩水に種々の濃度で溶解後、ラット血漿に加えた（検体）。この時、加えた容量が、全体の血漿容量に影響しないよう配慮した。検体を65℃で20分間加熱処理した（加熱処理検体）。20μlの加熱処理検体を80μlのコアグトロール１と混和後、説明書通りに調整したPT試薬（トロンボチェックPT：ミドリ十字）を用いてPTを測定し、APTTの時と同様に測定値でLogit-log変換を行い回帰直線あるいは回帰曲線を作成した（表２４）。
【０１１２】
【表２４】
0003876022.tif 000025
【０１１３】
【実施例９】
（本発明キットの構成及び使用法）
本実施例のヘパリン測定キットは次の１〜７の要素からなる。
１．標準ヘパリン生理食塩水（ヘパリン60μg/ml(10.95U/ml)、1ml）１バイアル。
２．生理食塩水（ヘパリン希釈用、1ml）１バイアル。
３．標準血漿（抗体検査の結果HIV, HCV, HBV等の病原微生物に感染が認められない健常人10人からクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採血して得た新鮮血漿を等量ずつ混和しプールしたもの、0.5ml相当の凍結乾燥品、通常は2〜8℃保存）１バイアル。
４．蒸留水（標準血漿溶解用、0.5ml）１バイアル。
５．APTT試薬（ウサギ由来セファリン0.2mg/ml、エラグ酸0.03mg/ml含有、3ml、通常は冷蔵保存）１バイアル。
６．塩化カルシウム溶液（0.02M、4ml）１バイアル。
７．測定用ソフトウェア記憶媒体
【０１１４】
使用に際しては標準血漿を室温に戻した後、蒸留水１バイアルを全量泡立てないように穏やかに加え、穏やかに均一となるように攪拌し、20〜30分間程度放置する。この溶解した標準血漿80μlに標準ヘパリン生理食塩水を生理食塩水で3〜60μg/mlの範囲で段階希釈した溶液あるいは生理食塩水を20μlずつ気泡を作らぬよう注意して均一に添加する。当該溶液を3分間、37℃に保温後、あらかじめ37℃に加熱しておいたAPTT試薬を100μlずつ添加し、更に37℃に3分間保温する。当該溶液に塩化カルシウム溶液を100μlずつ添加して凝固を開始させ、凝固が完了するまでの時間を測定する。ヘパリン濃度の理論値とそれぞれの凝固時間を測定後、当該理論値と測定値、さらに標準ヘパリン生理食塩水に含まれるヘパリンの活性単位(U/mg)と、回帰方法とを測定用ソフトウェアに入力して検量線の作成を行う。検体は56℃で20分間の加熱処理後室温に戻し、その20μlを上記手順により蒸留水に溶解した標準血漿80μlに気泡を作らぬよう均一に添加する。当該溶液を37℃で3分間保温後、あらかじめ37℃に加熱しておいたAPTT試薬を100μlずつ添加し、該溶液を37℃で3分間保温後、塩化カルシウム溶液を100μl添加して凝固を開始させる。凝固が完了するまでの時間を測定し、測定用ソフトウェアで作成した上記検量線をメモリから呼び出し、検体の凝固時間を入力し、当該測定値から検体中の測定対象物質濃度を算出する。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明によれば、血液凝固時間に影響を与える物質の精度が高く、操作が簡便であり多数の検体を処理することが可能である定量方法が提供される。
【０１１６】
すなわち、本発明の定量方法の一態様によれば、既知濃度の測定対象物質溶液（標準検体）の濃度の対数値と、対照凝固時間に対する相対凝固時間の比((T-T0)/T0)のロジット（Logit）値とを変数として検量線を求めているので、広い測定濃度範囲で精度の高い定量を行うことが可能である。
【０１１７】
また、本発明の定量方法の別の態様によれば、測定対象物質を含む検体に内在する血液凝固因子を前記測定対象物質を破壊しない条件下で不活化しているので、検体中の測定対象物質以外の物質の影響を受けずに精度の高い定量を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の定量装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図２】本発明のキットに含まれる媒体に記録されたプログラムの処理手順を示すフローチャートである。
【図３】ヘパリン、低分子ヘパリンおよびデルマタン硫酸の濃度(μg/ml)の対数値とAPTTの関係を示す。
【図４】ヘパリンの濃度(μg/ml)の対数値とAPTTの対数値の関係を示す。
【図５】低分子ヘパリン(LMWHep)の濃度(μg/ml)の対数値とAPTTの対数値の関係を示す。
【図６】デルマタン硫酸(DS)の濃度(μg/ml)の対数値とAPTTの対数値の関係を示す。
【図７】ヘパリンの濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係を示す。
【図８】低分子ヘパリン(LMWHep)の濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係を示す。
【図９】デルマタン硫酸(DS)の濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係を示す。
【図１０】生理食塩水中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図１１】生理食塩水中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図１２】生理食塩水中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図１３】肝臓ホモジネイト中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図１４】肝臓ホモジネイト中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図１５】肝臓ホモジネイト中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図１６】尿中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図１７】尿中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図１８】尿中のデルマタン硫酸(DS)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図１９】血漿中のヘパリン濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図２０】血漿中のヘパリン濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図２１】血漿中の低分子ヘパリン(LMWHep)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図２２】血漿中の低分子ヘパリン(LMWHep)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図２３】血漿中の低分子ヘパリン(LMWHep)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図２４】血漿中のコンドロイチン硫酸E(CSE)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図２５】血漿中のコンドロイチン硫酸E(CSE)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図２６】血漿中のコンドロイチン硫酸E(CSE)濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図２７】血漿中のヘパリン濃度(U/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図２８】血漿中のヘパリン濃度(U/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図２９】スルファチド濃度(μg/ml)がAPTTにおよぼす影響を示す。区間Ａおよび区間Ｂは、それぞれ、検量線の作成を行ったAPTTが延長する区間および短縮する区間である。
【図３０】  APTT延長区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図３１】  APTT延長区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図３２】  APTT延長区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図３３】  APTT短縮区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（一次式）を示す。
【図３４】  APTT短縮区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（二次式）を示す。
【図３５】  APTT短縮区間の血漿中のスルファチド濃度(μg/ml)の対数値とAPTTのロジット値の関係と検量線の回帰式（三次式）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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