(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
ガングリオシドが、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３よりなる群から選択される少なくとも１種以上の物質を含むものである請求項１記載の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガングリオシドを有効成分とする抗酸化剤に関する。また、本発明は、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した飲食品、医薬、化粧品及び飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガングリオシドは、シアル酸を含有する糖脂質の総称で、生体では脳や赤血球中に多く含まれていることが知られている。また、種々の食品中にも含まれており、特に牛乳の中に多く含まれていることが知られている。そして、このガングリオシドの生理作用に関しても、非常に多くの報告がなされている。例えば、種々のウイルスや毒性細菌に対する阻害活性、脳虚血障害やパーキンソン病による脳障害に対する治療効果、単球やマクロファージ系細胞の分化促進作用、上皮成長因子レセプターの機能調節作用等である。
一方、ヒトをはじめとする好気性生物にとって酸素は不可欠なものであるが、活性酸素と呼ばれる酸素分子由来のフリーラジカルは、生体に種々の障害をもたらすことが知られている。そして、このような活性酸素による細胞や遺伝子の障害が、ガンや糖尿病等の生活習慣病の発生や進行に関係があり、老化の原因になるともいわれている。
ところで、生体内には、脂質の過酸化により生じた種々の酸化障害に対し、スーパーオキシドジスムターゼやカタラーゼ等の抗酸化酵素が過酸化物質を分解して安定化する機構が存在する。そして、これらの抗酸化酵素による生体防御機構と共に、生体内抗酸化物質が抗酸化的防御機構において重要な役割を果たしているものと推定されている。例えば、脂溶性のビタミンＥは、生体膜を物理的に安定化したり、脂質の過酸化過程におけるフリーラジカルの連鎖反応を停止する作用を有する等の報告がなされている。
【０００３】
また、最近では、食品成分として摂取可能な天然抗酸化物質に関する研究も行われており、ゴマ種子由来のセサモリノールやセサミノール、茶カテキンに含まれるエピガロカテキンガレート等、植物由来の抗酸化物質が見出されている。そして、哺乳動物の乳汁中に含まれている種々の微量な蛋白質成分においても、それらの生理学的な抗酸化作用が次第に明らかにされてきている。例えば、乳清蛋白質の一種であり、種々の生理作用を有することが知られているラクトフェリンにおいては、鉄依存性の過酸化脂質生成を抑制する作用を有することが知られている。しかしながら、カゼインや乳清蛋白質といった乳蛋白質以外の低分子成分の抗酸化作用については、十分な検討がなされていない状況にある。なお、これらの低分子成分を利用した抗酸化剤としては、脱脂した哺乳動物の乳から得られる糖成分含量が５重量％未満でゲル濾過法による分子量が 1,700±500 ダルトンであるラジカルスカベンジャー作用を有する乳画分を有効成分とするものが提案されている (特開平6-306099号公報) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ガングリオシドの生理作用に注目し、種々の研究を進めていたところ、ガングリオシドが抗酸化作用を有することを見出した。そして、ガングリオシドを抗酸化剤の有効成分として利用することができること、並びにガングリオシドを配合することで、飲食品、医薬、化粧品、飼料等に抗酸化作用を賦与することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、ガングリオシドを有効成分とする抗酸化剤を提供することを課題とする。
また、本発明は、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した飲食品、医薬、化粧品又は飼料を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明では、抗酸化剤の有効成分として、ガングリオシドを使用する。
また、本発明では、飲食品、医薬、化粧品又は飼料に配合して抗酸化作用を賦与するために、ガングリオシドを使用する。
本発明で使用するガングリオシドは、哺乳動物の脳等から分離したものでも良いが、工業的な規模で調製する方法が知られている哺乳動物の乳から分離したものが特に好ましい。
なお、哺乳動物の乳から工業的な規模でガングリオシドを調製する方法としては、以下のような方法が知られている (特開昭 63-369992号公報) 。すなわち、牛乳、バターミルク、ホエー、脱脂乳等のガングリオシドを含む乳質原料に、塩酸や乳酸等の酸を作用させるか、あるいは、トリプシンやペプシン等の蛋白質分解酵素を作用させて蛋白質を分解した後、限外濾過、ゲル濾過、透析等の処理を行うことにより、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシドを得ることができる。そして、本発明では、このガングリオシドを使用することができる。
【０００６】
また、上記のガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシドを陰イオン交換樹脂等の陰イオン交換体に吸着させた後、例えば0.1M酢酸ナトリウムを含むメタノール等の溶出液で溶出することにより、さらに濃縮されたガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシドを得ることができる。そして、本発明では、このガングリオシドも使用することができる。
さらに、上記のガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含む濃縮されたガングリオシドをシリカゲルに吸着させた後、例えばクロロホルム−メタノールの混合比率を８：２から２：８まで変えた溶出液で溶出することにより、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を順次得ることができる。そして、本発明では、これらのガングリオシドを単独で、あるいは、２種以上の組み合わせで、使用することができる。
次に、参考例としてガングリオシドの製造例を示すと共に、ガングリオシドの抗酸化作用を確認した試験例を示す。
【０００７】
【参考例１】
脱脂粉乳 100kgを脱イオン水 900 lに溶解した後、蛋白質分解酵素のトリプシンを添加し、40℃、15時間の酵素反応により還元脱脂乳中の蛋白質を加水分解した。次に、この反応液を分画分子量10,000の膜で透析することによりペプチドを除去してガングリオシドを濃縮し、凍結乾燥した後、クロロホルム−メタノール溶液 (混合比率 1:1) ３Ｌに溶解し、陰イオン交換樹脂 (DEAE-Sephadex;ファルマシア社製）を充填したカラム(100cm×5cm)に通液して、ガングリオシドを陰イオン交換樹脂に吸着させた。このカラムをクロロホルム−メタノール溶液（混合比率 1:1) 15Ｌで洗浄した後、0.1M酢酸ナトリウムを含むメタノール 15 Ｌをカラムに通液してガングリオシドを溶出し、減圧乾固した。そして、減圧乾固したガングリオシドを透析して脱塩し、凍結乾燥することにより、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシド粉末4.4gを得た。
なお、このガングリオシド粉末について、薄層クロマトグラフィー（レゾルシノール法）で検出したところ、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３の組成比は10:100:1であった。
【０００８】
【参考例２】
参考例１で得られたガングリオシド粉末4.4gをクロロホルム−メタノール溶液 (混合比率 8:2) 100ml に溶解し、シリカゲル (イアトロビーズ;Iatron Laboratory社製）を充填したカラム(100cm×5cm)に通液して、ガングリオシドをシリカゲルに吸着させた。このカラムをクロロホルム−メタノール溶液（混合比率 8:2) 6 l で洗浄した後、クロロホルム−メタノール溶液 (混合比率 8:2) ６Ｌからクロロホルム−メタノール溶液 (混合比率 2:8) ６Ｌまで、クロロホルム−メタノール溶液の混合比率を変化させて、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を順次溶出した。そして、これらの溶出液を減圧乾固することにより、ガングリオシドＧＭ３ 0.3g 、ガングリオシドＧＤ３ 3.0g 及びガングリオシドＧＴ３ 0.03gを得た。
なお、これらのガングリオシドについて、薄層クロマトグラフィー（レゾルシノール法）で検出したところ、それぞれのガングリオシドの純度は95％以上であった。
【０００９】
【試験例１】
参考例１で得られたガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシド、並びに、参考例２で得られたガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＴ３の抗酸化活性について、大澤らの方法(J. Agric. Food Chem., vol.35, pp.809-812,1987) により測定した。
すなわち、ウサギ保存血液に等量の等張液 (10mMリン酸緩衝液/152mM塩化ナトリウム、pH7.4)を混和し、４℃、 1,500×g (3,500rpm)、20分間遠心分離した。この操作を３回繰り返して洗浄した血球に等量の低張液 (10mMリン酸緩衝液、pH7.4)を混和し、４℃、20,000×g(11,000rpm)、40分間遠心分離した。そして、この操作を４回繰り返して得られた緩い沈澱部分（赤血球膜ゴースト) を用いて抗酸化活性を調べた。
それぞれのガングリオシドを各初発濃度(0mM, 0.01mM, 0.1mM, 1mM, 10mM) となるよう調整した後、赤血球膜ゴーストを混和し、さらに酸化剤を添加し酸化反応を行った。次いで、ＴＢＡ反応を行った後、 532nmで吸光度を測定して酸化生成物を定量した。そして、抗酸化活性は、ガングリオシド無添加の場合の吸光度を 100％とし、それぞれのガングリオシドを添加した場合の吸光度から算出した。
なお、吸光度が低い程、赤血球膜ゴーストの酸化が抑制されたことを示し、したがって添加したガングリオシドの抗酸化活性が高いことを示す。
その結果を表１に示す。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
【試験例２】
参考例１で得られたガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３及びガングリオシドＧＴ３を含むガングリオシド、並びに参考例２で得られたガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＴ３の抗酸化活性について、中山らの方法(Mutation Research, vol.281, pp.77-80, 1992)により測定した。
すなわち、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞のＶ79株を、10％牛胎児血清を含むＭＥＭ培地(Flow Labolatories社製) で、シャーレ当たり 200個の細胞数となるよう播種し、５％二酸化炭素存在下、37℃で５日間培養して試験用培養細胞とした。そして、それぞれのガングリオシドの抗酸化活性については、過酸化水素によるコロニー形成率の低下を毒性の指標とし、ガングリオシドを試験用培養細胞に添加することにより、コロニー形成率の低下がどの程度回復するかということで判定した。
【００１２】
上記の試験用培養細胞をプレート上に播種し、２時間前培養 (細胞接着) した後、各初発濃度(0mM, 0.01mM, 0.1mM, 1mM, 10mM) となるよう調整したそれぞれのガングリオシドを添加し、４時間インキュベートして過酸化水素より先にガングリオシドを細胞に取り込ませた。次に、過酸化水素を添加し、30分間反応させて細胞に障害を与えた。そして、反応後、血清入り培地で５日間培養を行った。なお、過酸化水素の濃度は、コロニー形成率が数％〜40％位に低下する60μM に設定した。
また、それぞれのガングリオシドについても、それ自身の毒性を予め調べておき、それ自身の毒性でコロニー形成率が低下しないことを確認しておいた。
抗酸化活性の評価は、５日間の培養後、コロニー形成を確認してギムザ染色を行って全コロニー数を計測し、対照である無処置群の過酸化水素無添加の場合の細胞生存率を 100％としたときのそれぞれの細胞生存率（％）で表した。
なお、無処置群に比べて細胞生存率が高い程、添加したガングリオシドの抗酸化活性が高いことを示す。
その結果を表２に示す。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、ガングリオシドを有効成分とする抗酸化剤である。この抗酸化剤の有効成分であるガングリオシドとしては、哺乳動物の脳や乳等から得られるガングリオシドをそのまま使用しても良いし、このガングリオシド中に含まれるガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＴ３を分離し精製して使用しても良い。
また、本発明は、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した飲食品、医薬、化粧品及び飼料である。この飲食品、医薬、化粧品及び飼料に配合するガングリオシドとしては、哺乳動物の脳や乳等から得られるガングリオシドをそのまま使用しても良いし、このガングリオシド中に含まれるガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＴ３を分離し精製して使用しても良い。具体的には、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品とすることができ、また、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した、錠剤、粉末等の医薬や乳液等の化粧品とすることができ、さらに、ガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した、ドッグフード等の飼料とすることができる。
なお、本発明の抗酸化剤、あるいは本発明の抗酸化作用を賦与した飲食品、医薬、化粧品及び飼料を使用するに際しては、成人の場合、好ましくは一日当たり 100μg 〜 2,000mgのガングリオシドを一回又は数回に分けて摂取することができるように、使用量や配合量を決定すれば良い。
次に、本発明の実施例を示す。
【００１５】
【実施例１】
表３に示した配合により原料を混合し、加圧成型して、抗酸化作用を賦与した錠剤を製造した。
【００１６】
【表３】
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【００１７】
【実施例２】
表４に示した配合により原料を混合し、容器に充填後、加熱滅菌して、抗酸化作用を賦与した飲料を製造した。
【００１８】
【表４】
0004028062.tif 000005
【００１９】
【実施例３】
表５に示した配合により原料を混合し、ドウを作成して成型後、焙焼して、抗酸化作用を賦与したビスケットを製造した。
【表５】
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【００２０】
【実施例４】
表６に示した配合により原料を混合し、容器に充填後、加熱滅菌して、抗酸化作用を賦与したゼリーを製造した。
【００２１】
【表６】
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【００２２】
【実施例５】
表７に示した配合により原料を混合し、85℃で乳化して、抗酸化作用を賦与したプロセスチーズを製造した。
【００２３】
【表７】
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【００２４】
【実施例６】
固形率12重量％となるように調製した還元脱脂乳を90℃で20分間加熱殺菌後、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)及びストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus) をそれぞれ接種して得られた２種類のスターターカルチャーを等量混合した。そして、表８に示した配合により原料を混合し、発酵させて、抗酸化作用を賦与したヨーグルトを製造した。
【００２５】
【表８】
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【００２６】
【実施例７】
表９に示した配合により原料を混合し、成型して、抗酸化作用を賦与したタブレットを製造した。
【００２７】
【表９】
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【００２８】
【実施例８】
表１０に示した配合により原料を混合し、抗酸化作用を賦与した乳液を製造した。
【００２９】
【表１０】
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【００３０】
【実施例９】
表１１に示した配合により原料を混合し、抗酸化作用を賦与したイヌ飼育用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００３１】
【表１１】
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【００３２】
【発明の効果】
本発明のガングリオシドを有効成分とする抗酸化剤は、抗酸化作用を有するので、活性酸素や過酸化脂質等による酸化的細胞障害の予防や改善に有用である。また、本発明のガングリオシドを配合することにより抗酸化作用を賦与した飲食品、医薬、化粧品及び飼料は、抗酸化作用を有するので、継続的に摂取し、使用することにより、炎症、循環器系疾患、糖尿病合併症、ガン、老化等の各種疾患の予防や改善効果を発揮する。