(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚における線維芽細胞増殖因子の量を指標とする毛髪状態の鑑別法であって、真皮と脂肪層に於ける線維芽細胞増殖因子の量比を指標とすることを特徴とする毛髪状態の鑑別法。
【請求項２】
前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ−５であることを特徴とする請求項１に記載の毛髪状態の鑑別法。
【請求項３】
前記ＦＧＦ−５の量の検知を、樹状突起を有していないマクロファージの密度により行うことを特徴とする請求項２に記載の毛髪状態の鑑別法。
【請求項４】
皮膚における線維芽細胞増殖因子の量を指標とする毛髪状態の鑑別法であって、該線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ−５であるとともに、そのＦＧＦ−５の量の検知を、樹状突起を有していないマクロファージの密度により行うことを特徴とする毛髪状態の鑑別法。
【請求項５】
前記線維芽細胞増殖因子の量の検知にモノクロナール抗体を使用する免疫学的方法を用いることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の毛髪状態の鑑別法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛髪状態の鑑別法に関する。より詳しくは、毛髪状態に関連する因子に基づく毛髪状態の鑑別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛髪は、人間にとっては、その容姿に及ぼす影響が大きく、黒々とした美しい髪の毛を望む人が多い。それにも関わらず、現代に於いては多くのストレスのため薄毛や禿等の毛髪に関するトラブルに悩む人が少なくない。これら毛髪に関するトラブルに大きな影響を与えているものに毛周期がある。毛周期に影響を与える因子については、あまり知見が得られておらず、このため、髪の毛などのトラブルの根本的な解決が為されていないのが現状である。
【０００３】
毛周期或いは毛髪とマクロファージの関係について、何らかの関係があるのではないかという示唆をする報告はあるが、これらの因果関係について明確に説明したものはない。また、形態学的には、マクロファージには樹状突起を有するものと有さないものの２種類が存在することが知られているが、これら２種の機能的な違いは全く知られていない。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞に対して強い増殖作用を有する成長因子であり、類似蛋白を含めるとＦＧＦ１〜ＦＧＦ７等の現在１５以上のサブタイプが知られている。これら線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンとの親和性を有している、血管の新生に関与している、リウマチ性関節炎に関与している、脳の発生と機能維持に関与しているなどの生理活性が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの様な状況を踏まえて為されたものであり、毛周期に関連する因子を見いだし、この因子に基づいて毛髪の状態を鑑別する技術を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは毛髪の状態を鑑別する技術を得るべく、毛周期に関連する因子を求めて鋭意研究を重ねた結果、線維芽細胞増殖因子を保持する、樹状突起を有しないマクロファージが毛周期に深く関与し、毛髪の生成に関わっていることを見いだし発明を完成させるに至った。
【０００７】
線維芽細胞増殖因子が、樹状突起を有しないマクロファージに局在して毛周期に関与していることは知られておらず、線維芽細胞増殖因子を保持する、樹状突起を有しないマクロファージが毛周期に深く関与していることは予期せぬ知見である。
【０００８】
従って、本発明は、皮膚における線維芽細胞増殖因子の量を指標とすることを特徴とする、毛髪状態の鑑別法を提供する。
好ましくは、線維芽細胞増殖因子の量はマクロファージにおけるものである。このマクロファージ、好ましくは樹状突起を有していないものである。本発明の毛髪状態の鑑別方法に於いては、好ましくは、真皮と脂肪層に於ける線維芽細胞増殖因子の量比を指標とする。また、線維芽細胞増殖因子は、好ましくはＦＧＦ−５である。
【０００９】
線維芽細胞増殖因子の量の検知にはモノクロナール抗体を使用する免疫学的方法を用いることが好ましい。
また、本発明は、線維芽細胞増殖因子の量を指標とすることを特徴とする、樹状突起を有さないマクロファージの定量法、及び、線維芽細胞増殖因子の有無を指標とすることを特徴とするマクロファージの鑑別法を提供する。これらの方法において、線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ−５であることが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について実施の形態を中心に詳細に説明を加える。
（１）本発明の毛髪状態の鑑別法
本発明の毛髪状態の鑑別法は、皮膚における線維芽細胞増殖因子の量を指標とすることを特徴とする。線維芽細胞増殖因子の中では、ＦＧＦ−５を指標として使用するのが好ましい。以下、ＦＧＦ−５を例にとって説明するが、他の線維芽細胞増殖因子でも同様である。
【００１１】
後記実施例に示す様に、ＦＧＦ−５は樹状突起を有さないマクロファージのみに保持されている。かかるマクロファージは後記実施例に示す様に、毛周期に深く関与しているので、この動向を把握することにより毛髪の状態の鑑別を行うことができ、従って、例えば、育毛効果の確認、発毛メカニズムの解析、毛髪の不全状態の鑑別等を行うことができる。即ち、後記実施例に示す如く、毛周期との関係において、真皮ではＦＧＦ−５保持マクロファージの密度は成長期に上昇し、退行期から低下し始め、休止期には成長期の最初の密度とほぼ同等にまで低下している。又、脂肪層では成長期の間はＦＧＦ−５保持マクロファージの密度は低いまま変化せず、退行期から上昇し始め休止期には真皮の約２倍にまで増えている。このパターンが崩れていれば、毛髪の状態が異常と鑑別できる。又、この際ＦＧＦ−５を保持しているマクロファージは総て樹状突起を有さないマクロファージであることから、樹状突起を有さないマクロファージの分布を調べることでも、ＦＧＦ−５による鑑別と同様の鑑別が、感度がやや低く手間もかかるが、可能であり、かかる方法での毛髪状態の鑑別法も本発明の技術範囲に属する。
【００１２】
ＦＧＦ−５が実質的にマクロファージ内のみに認められること、及び、マクロファージ１個当たりのＦＧＦ−５量はほぼ一定であると認められることから、ＦＧＦ−５量の変化もＦＧＦ−５保持マクロファージ密度の変化と同様であると考えられる。従って、ＦＧＦ−５の量を指標として毛髪状態の鑑別をすることができるが、精度の点からは、マクロファージにおけるＦＧＦ−５の量を指標とすることが好ましく、樹状突起を有さないマクロファージにおけるＦＧＦ−５の量を指標とすることがより好ましい。また、上述の様に、表皮と脂肪層において、それぞれ特徴的な量変化を示すので、真皮と脂肪層に於けるＦＧＦ−５の量比を指標とすることも好ましい。
【００１３】
ＦＧＦ−５は、例えば、ＦＧＦ−５に対するモノクロナール抗体を作成することによって、公知の免疫学的方法に従って定性的及び定量的に検出することができる。モノクロナール抗体の作成は特願平０８−１６９８２１号報に記載の技術によって行うことができる。これは、ＦＧＦ−５の部分ペプチドでマウスなどの動物を感作し、脾臓細胞を取りだし、ミエローマ等の細胞とハイブリドーマを作成し、モノクロナール抗体を作成する方法である。
【００１４】
モノクロナール抗体としては、ＦＧＦ−５遺伝子からは、全長のＦＧＦ−５タンパク質に加えて、exon 2が欠落したｍＲＮＡのコードするＦＧＦ−５Ｓタンパク質も産生されるので、全長のＦＧＦ−５タンパク質を認識し、ＦＧＦ−５Ｓタンパク質を認識しない抗体を用いることが好ましい。
【００１５】
このようにして得られるモノクロナール抗体を標識すれば標識モノクロナール抗体が得られ、得られる標識モノクロナール抗体を測定すべき試料に結合させ、結合した標識を検出することによりＦＧＦ−５が検出できる。モノクロナール抗体の標識としては、例えば、ペルオキシダーゼや放射性同位体による標識などが例示できる。
【００１６】
又、標識ヤギ抗マウス抗体等の標識二次抗体を用いてサンドウィッチ法によって検出することも可能である。検出方法としては、標識二次抗体を用いて検出する方が、モノクロナール抗体そのものを標識するよりも、反応性を損なう懼れが少ないので好ましい。
【００１７】
試料となる皮膚は、通常、切片とされるが、抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体を用いる免疫学的方法によってＦＧＦ−５が測定可能である限り、ホモジェネートなどの別の形態であってもよい。
【００１８】
検出方法の具体例を挙げると、皮膚を公知の方法で切片とし、上記の様に作成したモノクローナル抗体を用いる免疫学的染色法により当該切片を染色し、ＦＧＦ−５、特には、ＦＧＦ−５を保持しているマクロファージを検出する方法が挙げられる。定量的に検出する場合には、顕微鏡的に計数を行ってもよいし、また、標識として、放射性同位体等で標識したモノクロナール抗体や蛍光を発する官能基を有する標識で標識したときには、放射強度や蛍光強度等の数値として定量することも可能である。
【００１９】
（２）本発明の樹状突起を有さないマクロファージの定量法
本発明の樹状突起を有さないマクロファージの定量法は、上記線維芽細胞増殖因子の量を指標に定量することを特徴とする。以下、ＦＧＦ−５を例にとって説明する。
【００２０】
上述の様に、マクロファージに於いて、ＦＧＦ−５は樹状突起を有さないマクロファージのみ保持しているので、ＦＧＦ−５の保持量を定量することにより、樹状突起を有さないマクロファージを定量できる。
【００２１】
この様なマクロファージを定量するに際しては、従来は、顕微鏡下その形状をもとに血球計数板等を用いて単位面積当たりのマクロファージを肉眼で計数するのが常法であったが、この様な作業は極めて煩雑で、観察者の負担の多いものであった。しかしながら本発明の方法のように、当該マクロファージ上のＦＧＦ−５を抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体と反応させ、このモノクロナール抗体を標識によって明らかにすることにより、細かく形態観察をするという負担が軽減され、より簡便に定量性良く定量することができる。
【００２２】
定量は、上述のような抗ＦＧＦ−５モノクローナル抗体を用いる免疫学的方法によって行うことができる。免疫学的方法における標識については、上述の様に、モノクロナール抗体そのもの自身を標識しても良いし、標識二次抗体でサンドウィッチ法によって標識しても良い。好ましい標識法は標識二次抗体を用いる方法である。この標識として、放射性同位体等で標識したモノクロナール抗体や蛍光を発する官能基を有する標識で標識した場合には、放射強度や蛍光強度等の数値として定量することも可能である。
【００２３】
（３）本発明のマクロファージの鑑別法
本発明のマクロファージの鑑別法は、線維芽細胞増殖因子を保持しているか否かによってマクロファージを鑑別するものである。ＦＧＦ−５等の線維芽細胞増殖因子はヘパリンとの親和性を有している、血管の新生に関与している、リウマチ性関節炎に関与している、脳の発生と機能維持に関与しているなどの生理活性が知られているので、線維芽細胞増殖因子を保持するマクロファージはこれらの生体反応に関与している可能性が高い。又、実施例に示す如く、かかるマクロファージが毛周期に関わっていることが本発明者らにより明らかにされた様に、本発明によれば、マクロファージの関与する反応を証明することができ、マクロファージの生体での役割を明らかにすることができる。ＦＧＦ−５等の線維芽細胞増殖因子の有無は上述の如く、モノクロナール抗体を用いれば簡便に知ることができる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明について詳細に説明するが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００２５】
【実施例１】
ラット皮膚切片の抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体による免疫染色生後２〜２６日後のウィスターラット背部より皮膚を採取し、１０％ホルマリンにて固定した。８０〜１００％のエタノール系列にて脱水後、キシレンにて透徹し、パラフィン包埋後、切片を切り出し、キシレンにて脱パラフィンし、１００〜８０％エタノール系列で水和し切片を得た。切片は組織中のペルオキシダーゼを失活させるために０．３％過酸化水素／メタノール液に１０分間浸漬した後、後続の抗体処理に於いて抗体の非特異的吸着を防ぐため３０μｌの１０％ヤギ血清をのせ１０分間放置した。このものに１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体を３０μｌのせて３０分間反応させ、洗浄後、５０倍希釈のビオチン標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコン社製）を３０μｌのせ、１０分間反応させた。洗浄後、原液の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン（ニチレイ株式会社製）を３０μｌのせ１０分間反応させた。洗浄後、切片をジアミノベンジン過酸化水素液に３分間浸し発色させた。この結果を図１に示す。図１中、ａは６日齢、ｂは１２日齢、ｃは１８日齢のラットからのサンプルである。何れのサンプルにもＦＧＦ−５が局在している丸い細胞が染色されていることが判る。
【００２６】
【実施例２】
ＦＧＦ−５を保持する細胞の同定
実施例１に於いて、ＦＧＦ−５を保持している丸い細胞が見つかったが、この細胞について同定を行い、どの様な毛周期に関与しているかを調べた。実施例１の如く調製した２μｍの１組の連続切片を、実施例１の方法に従ってＦＧＦ−５モノクロナール抗体で染色した。残る１枚の切片は抗ラットマクロファージモノクロナール抗体を一次抗体として、抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体同様に染色した。この結果を図２に示す。図２中、ａ及びｃは抗ラットマクロファージモノクローナル抗体で染色した切片、ｂ及びｄは抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体で染色した切片である（いずれも１８日齢）。これより、ＦＧＦ−５を保持している細胞が抗マクロファージ抗体にも染色していることが判り、ＦＧＦ−５を保持している丸い細胞はマクロファージであることが突き止められた。これらの形態を観察するといずれのＦＧＦ−５保持マクロファージも樹状突起を有していないことが明らかとなった。このことは、言い換えれば、樹状突起を有するマクロファージにはＦＧＦ−５が保持されていないと言うこともできる。
【００２７】
【実施例３】
真皮・脂肪層に於けるＦＧＦ−５保持マクロファージ密度の変化
実施例１で作成した標本について、光学顕微鏡下マクロファージの数を各切片ごとに、真皮、脂肪層に分けて計数した。計数値はそれぞれ観察した真皮、脂肪層の面積で除し、平方ｍｍ当たりのマクロファージの数すなわち密度として算出した。各日齢の例数は４で、結果を平均値と標準偏差のプロットとして図３に示す。図３中、縦のバーは標準偏差を示す。この結果より、真皮ではＦＧＦ−５保持マクロファージの密度は成長期に上昇し、退行期から低下し始め、休止期には成長期の最初の密度とほぼ同等にまで低下していることが判る。又、脂肪層では成長期の間はＦＧＦ−５保持マクロファージの密度は低いまま変化せず、退行期から上昇し始め休止期には真皮の約２倍にまで増えていることが判る。成長期に真皮に於いてＦＧＦ−５保持マクロファージの密度が上昇することより、この時期の特徴である毛包の成長にＦＧＦ−５保持マクロファージが関与していることが判る。更に、ＦＧＦ−５保持マクロファージの密度が、退行期から休止期にかけて真皮では低下し、脂肪層では上昇することより、ＦＧＦ−５保持マクロファージが、この時期の特徴である毛包の萎縮に関与していることが判る。
【００２８】
なお、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のメンバーは、互いに高い相同性を有するペプチドであるので、ＦＧＦ−５以外のＦＧＦも同様な挙動を示すと考えられる。また、染色がマクロファージ内のみに観察されること、及び、染色の強度からみて、マクロファージ１個当たりのＦＧＦ−５量はほぼ一定であると認められることから、ＦＧＦ−５量の変化もＦＧＦ−５保持マクロファージ密度の変化と同様であると考えられる。
【００２９】
【実施例４】
ＦＧＦ−５保持マクロファージとＦＧＦ−５不保持マクロファージの差異
実施例３のＦＧＦ−５保持マクロファージとＦＧＦ−５を保持しないマクロファージとの関係について、実施例２と同様の方法で調べた。即ち、１２日齢（成長期）、１８日齢（退行期）、２６日齢（休止期）のウィスターラットの１組の連続切片の１つを抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体で、残りの１つを抗ラットマクロファージモノクロナール抗体で染色し、それぞれのモノクロナール抗体で染色されたマクロファージの数を顕微鏡下真皮、脂肪層ごとに計数した。これらの計数値を面積で除し密度を求めた。抗ラットマクロファージ抗体染色標本の密度より抗ＦＧＦ−５抗体染色標本の密度を減じＦＧＦ−５を保持しないマクロファージの密度とした。結果を実施例３と同様のプロットとして図４に示す。図４中、縦のバーは標準偏差を示し、＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、０．０５％、０．０１％及び０．００１％以下の危険率で有意であることを示す。この結果より、ＦＧＦ−５を保持しないマクロファージは、真皮に於いては成長期、退行期、休止期と日を追うごとに上昇し、脂肪層に於いては逆に日を追うごとに低下しており、ＦＧＦ−５を保持するマクロファージの密度、毛周期とは関係していないことが判る。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、毛周期に関連する因子に基づいた、毛髪状態を鑑別する技術を提供できる。測定の容易な因子に基づく鑑別方法は容易に実施できるので、毛周期に影響を与える因子などの解明、育毛効果の確認、発毛メカニズムの解析、毛髪の不全状態の鑑別などに有利に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体での皮膚の染色結果を示す顕微鏡写真である。ａは６日齢、ｂは１２日齢、ｃは１８日齢のラットからのサンプルである。
【図２】  連続切片に於ける、抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体での皮膚の染色結果と抗ラットマクロファージモノクロナール抗体での皮膚の染色結果を示す顕微鏡写真である。ａ及びｃは抗ラットマクロファージモノクロナール抗体で染色した切片、ｂ及びｄは抗ＦＧＦ−５モノクロナール抗体で染色した切片である（いずれも１８日齢）。
【図３】  毛周期とＦＧＦ−５保持マクロファージの密度の関係を示す図である。ａは真皮、ｂは脂肪層に於ける密度を示す。
【図４】  毛周期とＦＧＦ−５保持マクロファージの密度及びＦＧＦ−５不保持マクロファージの密度との関係を示す図である。ａは真皮、ｂは脂肪層に於ける密度を示す。
【図１】
0003870250.tif 000002
【図２】
0003870250.tif 000003
【図３】
0003870250.tif 000004
【図４】
0003870250.tif 000005