(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素である、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適した電極において、
その表面に、式（Ｉ）
【化１】
0003966591.tif 000019
〔式中、Ａは、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、インダゾール又はトリアゾールである複素環の残りの部分を表し、
Ｒ1 は、アルキルであり、
Ｚは、式（II）又は（IV）
【化２】
0003966591.tif 000020
（式中、Ｒ2 は、水素又はアルキルであり、
Ｒ3は、アルキル、シクロアルキル又はアラルキルであり、
Ｒ4は、水素、アルキル、アルコキシ、アルカノイルアミノ又はアルキルスルホニルアミノであり、
Ｒ8 は、アルキルであり、
Ｒ9 は、アルキル、ニトロ又はシアノであり、
Ｒ10は、水素又はシアノであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 は、モルホリノであってもよく、
また、Ｒ3 とＲ4 とが一緒になって、場合によってはアルキルで置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよく、
ｍは、２であり、
ｐは、１である）
のいずれかの残基であり、
Ｘ- はアニオンである〕
の媒介物として機能する物質を有することを特徴とする電極。
【請求項２】
式（Ｉ）の媒介物質において、
式中、
Ｒ1 は、非置換であるか、ヒドロキシ、Ｃ1 〜Ｃ4 アルコキシ又はシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキルであり、
Ｒ2 は、非置換であるか、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、シアノ又はＣ1 〜Ｃ4 アルコキシカルボニルによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキルであり、
Ｒ3 は、非置換であるか、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、シアノ又はＣ1 〜Ｃ4 アルコキシカルボニルによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ4 〜Ｃ7 シクロアルキル又はＣ7 〜Ｃ9 アラルキルであり、
Ｒ4 は、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ8 アルコキシ、Ｃ1 〜Ｃ8 アルカノイルアミノ又はＣ1 〜Ｃ8 アルキルスルホニルアミノであり、
Ｒ8 は、非置換であるか、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル又はシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキルであり、
Ｒ9 は、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、ニトロ又はシアノであり、
Ｒ10は、水素又はシアノであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 は、モルホリノであってもよく、
また、Ｒ3 とＲ4 とは一緒になって、非置換であるか、３個までのメチル基で置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよい、請求項１記載の電極。
【請求項３】
媒介物質が、複素環
【化４】
0003966591.tif 000021
が、
【化５】
0003966591.tif 000022
（式中、
Ｒ11は、水素であり、
Ｒ12は、水素又はＣ4 〜Ｃ7 シクロアルキルであり、
Ｒ13は、水素又はＣ1 〜Ｃ8 アルコキシであり、
Ｒ14は、水素、又は非置換であるか、ヒドロキシ若しくはシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキルであり、
Ｒ15は、非置換であるか、ヒドロキシ、シアノ又はアセチルアミノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、シクロヘキシル又はフェニルであり、
ここで、ＮＲ14Ｒ15は、ピロリジノであってもよく、
Ｘ- はアニオンであり、
ここで、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基及びアラルキル基のすべては直鎖状又は分岐状である）
である式（Ｉ）のカチオン色素である、請求項１又は２記載の電極。
【請求項４】
媒介物質が、複素環
【化１５】
0003966591.tif 000023
が、
【化６】
0003966591.tif 000024
（式中、Ｒ16 及びＲ17 は、メチルである）
で示される、請求項１又は２記載の電極。
【請求項５】
媒介物質が、式
【化６】
0003966591.tif 000025
（式中、Ｒ1 は、非置換であるか、ヒドロキシ又はシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ2 は、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ3 は、非置換であるか、シアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであるか、非置換であるか、エチルによって置換されている、フェニルであり、
Ｒ14は、水素、又は非置換であるか、ヒドロキシ若しくはシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ15は、非置換であるか、ヒドロキシ又はシアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、非置換であるか、フッ素、シアノ又はアセチルアミノによって置換されている、シクロヘキシル又はフェニルであり、
Ｒ4aは、水素又はメトキシであり、
Ｒ4bは、水素又はアセチルアミノであり、
Ｘ- はアニオンである）
で示される、請求項１記載の電極。
【請求項６】
媒介物質が、式
【化７】
0003966591.tif 000026
（式中、Ｒ1 は、非置換であるか、アルカノイルアミノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ2 及びＲ3 は、互いに独立して、非置換であるか、シアノ又はメトキシカルボニルによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであるか、非置換であるか、エトキシによって置換されている、フェニルであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 は、モルホリノであってもよく、
Ｒ4aは、水素であり、
Ｒ4bは、水素又はメチルスルホニルアミノであり、
Ｒ13は、水素又はメトキシであり、
また、Ｒ3 とＲ4a とは一緒になって、非置換であるか、３個までのメチル基で置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよい、
Ｘ- はアニオンである）
で示される、請求項１記載の電極。
【請求項７】
Ｒ1 が、メチル又はアセチルアミノであり、
Ｒ2 及びＲ3 が、互いに独立して、メチル、エチル、シアノエチル、エトキシフェニル又はエトキシカルボニルであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 は、モルホリノであってもよく、
Ｒ4aが、水素であり、
Ｒ4bが、水素又はメチルスルホニルアミノであり、
Ｒ13が、水素又はメトキシであり、
また、Ｒ3 とＲ4a とは一緒になって、非置換であるか、３個までのメチル基で置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよい、
Ｘ- がアニオンである、請求項６記載の電極。
【請求項８】
媒介物質が、式
【化８】
0003966591.tif 000027
（式中、Ｒ1 は、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ8 は、非置換であるか、シアノによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｒ9 及びＲ10は、互いに独立して、水素、メチル、シアノ又はニトロであり、
Ｒ14及びＲ15は、互いに独立して、非置換であるか、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルであり、
Ｘ- はアニオンである）
で示される、請求項１記載の電極。
【請求項９】
Ｘ- が、Ｃｌ−、ＣＨ３ＯＳＯ３−、又はＺｎＣｌ３−である、請求項１〜８のいずれか１項記載の電極。
【請求項１０】
エネルギー転移性酸化還元対としてのデヒドロゲナーゼ触媒及び補酵素とともに動作する電気化学的センサの性能を改善する方法において、請求項１〜９のいずれか記載の電極をバイオセンサの作用電極として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、流体試料中に存在する可能性のあるいくつかの成分の１種の濃度の電気化学的測定及び／又は調査に適した、酵素電極又は電気化学的バイオセンサに関する。酵素系としては一般に、すべてのジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性の系を考慮することができる。これらの系は、酵素の選択性を電流測定的検出の感度と組み合わせるものであり、診断産業にとっては非常に興味深いものである。デヒドロゲナーゼを触媒とする反応でニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）が産生されるため、これらのニコチンアミド補酵素の還元は特に重要である。反応式：
【０００２】
【数１】
0003966591.tif 000002
【０００３】
で示されるデヒドロゲナーゼを触媒とする反応は、生物細胞及び分析反応において重要な役割を演じる。種々の基質の産生物への変換に触媒として選択的に作用する数百種の様々なデヒドロゲナーゼが既知である。基質が酸化されると、補酵素ＮＡＤ+ 及びＮＡＤＰ+ がそれぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元される。これらの補酵素は、酵素と作用してエネルギー転移性酸化還元対を形成する能力のため、反応に必要な要素である。
【０００４】
このような酵素の使用により、ＮＡＤ（Ｐ）依存性オキシレダクターゼを使用する生化学分析の分野に該当する多様な反応を、少なくとも原則的には遂行させることができる〔D.W. Moss らのN.W. Tietz（Ed.), Textbook of Clinical Chemistry, Pp. 619-763, W.B. Saunders, Philadelphia, 1986を参照〕。一般に、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度の変化は、有色試料又は濁った試料を処理する場合に問題を招くおそれのある光学的方法によって測定される。代替として、電気化学的方法をバイオセンサの形態で使用することができる。
【０００５】
電極面上でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの直接酸化は非常に高い過剰電位を要し、その電位が、望ましくない現象、たとえば電極の汚損又は汚染物質による強い干渉につながるということが知られている。近年発表された多数の出版物及び特許が、一部には媒介物質分子を使用することにより、このような問題を解消しようと取り組んでいる。この物質は、まずＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されたのち、第二段階で陽極で酸化的に再生される。媒介物質の使用が、直接ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化の場合に比べて低い電気化学電位を使用しやすくする。これは以下の反応式によって示される。
【０００６】
【数２】
0003966591.tif 000003
【０００７】
しばしば、このような媒介物質の例は色素、たとえばメチレンブルー、メルドラブルー、ナイルブルー又はトルイジンブルーである〔L. Gorton, J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 82 (1986), 1245-1258 〕。しばしば、これらの化合物は、すべての関連する干渉が常に抑制されるとは限らないような高い電位で、それら自体が再酸化されるという欠点を抱えている。特に、血液又は尿中の分析対象物の測定の場合、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、アセトアミノフェン、ビリルビン及び尿酸の直接酸化を避けることが必要である。これは、０〜１５０mVの範囲の酸化電位（銀／塩化銀基準に対し）を望ましくする。さらには、十分に高い電流密度を得るためには、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと媒介物質との間及び媒介物質と陽極との間の高い化学的代謝回転速度が望ましい。この側面は特に、バイオセンサに望まれる小型化にとって重要であり、前述の媒介物質によっては包含されないか、不十分にしか包含されない。本明細書の表８のデータは、本発明の媒介物質がこの基準を満たすことを実証している。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと媒介物質との間の代謝回転速度が低い場合、基質の存在において明らかな酸化電位の上昇が見られる。さらには、従来技術の媒介物質の多くは水溶液中で十分に可溶性ではなく、それにより、有機溶剤の使用及びこれらの媒介物質を電極に被着させるための複雑なコーティング技術が必要になる。これが、特にポリマーの分野においてバイオセンサに使用可能な担体物質の数を制限する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、炭素電極上でのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気触媒酸化のための媒介物質、特に、スクリーン印刷技術によって製造されるものを提供することが望まれ、それが本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、本発明の媒介物質と、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとを有し、銀／塩化銀基準電極に対して測定したとき０〜１５０mVの範囲にある、電流飽和が起こる酸化電位を有し、５mmol/L  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈで１００μA/cm2 のオーダの電流密度を得る能力のある電極を提供することである。加えて、本発明の目的は、水性媒体に可溶性であり、酵素活性を阻害しない媒介物質を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、式（Ｉ）のジアザシアニンの使用によって満たされる。
【００１０】
【化９】
0003966591.tif 000004
【００１１】
式（Ｉ）中、Ａは、場合によってはベンゼン環に縮合していてもよい、芳香族又は準芳香族の、５員又は６員の複素環の残りの部分を表し、
Ｒ1 は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル又はアラルキルであり、
Ｚは、式（II）、（III)又は（IV）
【００１２】
【化１０】
0003966591.tif 000005
【００１３】
（式中、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ8 は、それぞれが独立して、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アラルキル、アリール又は飽和複素環式基であり、
Ｒ4 及びＲ7 は、それぞれが独立して、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アルカノイルアミノ又はアルキルスルホニルアミノであり、
Ｒ9 及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アルカノイル又はアルキルスルホニルであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 は、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ又はＮ−アルキルピペラジンもしくはＮ−アルキルピペラジノであってもよく、
また、Ｒ3 とＲ4 とが一緒になって、場合によってはアルキルで置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよく、
ｍ、ｎ及びｐは、それぞれ独立して、０、１又は２である）
のいずれかの残基であり、
Ｘ- はアニオンである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に有用であるジアザシアニンの上記式を参照すると、好適な対イオン（Ｘ-)は、電気的バイオセンサの作用電位の範囲ではそれら自体が酸化還元活性ではない、有機アニオン又は無機アニオンである。用いることができるアニオンの例は、塩化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、硫酸水素イオン、硫酸イオン、リン酸二水素イオン、リン酸水素イオン、メチル硫酸イオン、エチル硫酸イオン、酢酸イオン、フェニル酢酸イオン、安息香酸イオン、メチルスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン及びトルエンスルホン酸イオンである。使用するアニオンが多価アニオン、たとえば硫酸イオン又はリン酸水素イオンであるならば、Ｘ- は、そのような多価アニオンの１当量である。
【００１５】
本発明によると、媒介物質として使用するのに好ましいジアザシアニンは、複素環が式（Ｖ）：
【００１６】
【化１１】
0003966591.tif 000006
【００１７】
によって示され、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、ピラゾール、インダゾール、イミダゾール、ベンズミダゾール、トリアゾール、ピリジン、キノリン又はピリミジンであるか、次式のいずれかによって示されるジアザシアニンである。
【００１８】
【化１２】
0003966591.tif 000007
【００１９】
式中、Ｒ1 は、非置換であるか、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシ、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ4 アルコキシ、シアノ又はＣ1 〜Ｃ4 アルコキシカルボニルによって置換されている、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ3 〜Ｃ8 アルケニル、Ｃ3 〜Ｃ8 アルキニル、Ｃ4 〜Ｃ7 シクロアルキル又はＣ7 〜Ｃ9 アラルキルであり、
Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ8 、Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、非置換であるか、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ4 アルコキシ、シアノ、Ｃ1 〜Ｃ4 アルコキシカルボニル、Ｃ1 〜Ｃ4 アルカノイルアミノ、Ｃ1 〜Ｃ4 アルキルスルホニル又はテトラメチルスルホニルによって置換されている、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ3 〜Ｃ8 アルケニル、Ｃ4 〜Ｃ7 シクロアルキル、Ｃ7 〜Ｃ9 アラルキル又はＣ6 〜Ｃ10アリールであり、
Ｒ4 及びＲ7 は、それぞれ独立して、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ8 アルコキシ、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、Ｃ1 〜Ｃ8 アルカノイルアミノ又はＣ1 〜Ｃ8 アルキルスルホニルアミノであり、
Ｒ9 及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ8 アルコキシ、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、Ｃ1 〜Ｃ8 アルカノイル又はＣ1 〜Ｃ8 アルキルスルホニルであり、
Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ8 アルコキシ、Ｃ4 〜Ｃ7 シクロアルキル、Ｃ7 〜Ｃ9 アラルキル、Ｃ6 〜Ｃ10アリール、フルオロ、クロロ、ブロモ又はシアノであり、
Ｒ13は、水素、Ｃ1 〜Ｃ8 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ8 アルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ又はシアノであり、
ここで、ＮＲ2 Ｒ3 及びＮＲ14Ｒ15は、それぞれ独立して、ピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノであってもよく、
Ｒ3 とＲ4 とが一緒になって、非置換であるか、３個までのメチル基で置換されている、−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −橋であってもよく、
ｍ、ｎ及びｐは、それぞれ独立して、０、１又は２であり、
Ｘ- はアニオンであり、
アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基及びアラルキル基すべては直鎖状又は分岐状である。
【００２０】
【実施例】
実施例Ｉ
媒介物質の合成
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ媒介物質としての使用が本発明の最重要点であるジアザシアニンの調製は、すべての開示を本明細書に引用例として含める米国特許第５，２０８，３２５号明細書、米国特許第５，４３６，３２３号明細書、米国特許第４，２６８，４３８号明細書及び米国特許第４，５００，７１５号明細書に開示されている。合成は、米国特許第５，２０８，３２５号明細書の第５〜８欄、特に第５欄の６５行目から第６欄の２８行目に詳細に記載されている。この合成に類似した方法で、式：
【００２１】
【化１３】
0003966591.tif 000008
【００２２】
のアミノ複素環を使用し、ジアゾ化し、式：
【００２３】
【化１４】
0003966591.tif 000009
【００２４】
のアニリン類又はインドール類に対し、矢印で印される位置にカップリングしたのち、式：
Ｒ1 Ｘ
〔式中、Ｘは、式（Ｉ）のＲ1 及びＸ- が誘導される脱離基である〕
の化合物によって四級化することができる。このＲ1 Ｘは、たとえば、ヨウ化メチル、塩化ヒドロキシエチル又は硫酸ジメチルであることができる。第７及び８欄に記載されているジアゾ化及び四級化の条件を用いてもよい。
【００２５】
実施例II
媒介物質の評価
黒鉛の電極棒（直径３mm、Johnson Matthey Electronics, Ward Hill, MA）を、銀ワイヤと接触させ、鈍端を除くすべての端部を熱収縮チューブで絶縁したのち、電極の表面を細グリット紙やすりで研磨し、次いでweigh ペーパで研磨することにより、調製した。電極を、リン酸緩衝液（２５mmol/L、pH７．０）５０mlに浸漬した試験すべき媒介物質の１mmol/Lメタノール溶液に浸漬した。飽和カロメル基準電極に対して−７００mV〜＋８００mVで、１００mV／秒でサイクリックボルタンメトリーを実施した。陽極ピーク（Ｅox）及び陰極ピーク（Ｅred)を測定した。本発明の代表的化合物３８種を使用して得られた結果を表１〜６に記載する。表１〜６に記載したデータから、試験された媒介物質が、系依存性シフトのための余裕をいくらか維持しながらも、電気化学的干渉を避けるために低い酸化電位を有するという要件を満たすと判断することができる。
【００２６】
【表１】
0003966591.tif 000010
【００２７】
【表２】
0003966591.tif 000011
【００２８】
【表３】
0003966591.tif 000012
【００２９】
【表４】
0003966591.tif 000013
【００３０】
【表５】
0003966591.tif 000014
【００３１】
【表６】
0003966591.tif 000015
【００３２】
【表７】
0003966591.tif 000016
【００３３】
実施例III
媒介物質のサイクリックボルタンメトリー
酸化還元電位を測定するため、試験すべき物質を２mmol/Lの濃度で水に溶解した。スクリーン印刷した一連の炭素（黒鉛／カーボンブラック混合物）電極（Acheson 黒鉛インク、酸素プラズマ中での処理によって電極面３mm2 を活性化）それぞれに、この溶液３μL を塗布し、室温で乾燥させた。リン酸緩衝液（２５mmol/L、pH７．０）１０μL を生理緩衝液として加えたのち、飽和Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して１００mV／秒でサイクリックボルタンメトリーを実施した。表７は、得られた酸化電位及び還元電位を示す。
【００３４】
【表８】
0003966591.tif 000017
【００３５】
表７から、印刷した電極における電位が黒鉛電極棒における電位よりも高いと判断することができる。
【００３６】
実施例IV
ＮＡＤＨ酸化／滴定
サイクリックボルタンメトリー実験に関して記載したものと同様な方法で、印刷した黒鉛電極を、試験すべき特定の媒介物質化合物でコーティングした。処理した電極をポテンシオスタットに接続したのち、リン酸緩衝液（２５mmol/L、pH７．０）中で異なる濃度（０、２、５及び１０mmol/L）のＮＡＤＨ１０μL を加えた。そして、作用電位を飽和Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に印加し、５秒後に電流を計測した。電流をＮＡＤＨ濃度に対してプロットした。表８は、種々の媒介物質について種々の作用電位で測定したスロープを示す。
【００３７】
【表９】
0003966591.tif 000018
【００３８】
表８から、試験された媒介物質が高い電流密度を実証すると判断することができる（０．２μA/mMは、電極面３mm2 で１００μA/cm2 に相当する）。
【００３９】
実施例Ｖ
グルコース応答曲線（水溶液及び全血溶液）
実施例III で使用した印刷した黒鉛電極を、以下の試薬溶液３μL でコーティングした。％値はすべて重量／容量に基づく。
【００４０】
０．７％γ−グロブリン
１．０％ポリビニルピロリドン
０．１％Cremophor EL（界面活性剤）
０．８５％ＮａＣｌ
１５mmol/l  ＮＡＤ+
１２mM媒介物質（１７）
５０mM  ＰＩＰＥＳ緩衝液、pH７．０に溶解した３．３単位／μL グルコースデヒドロゲナーゼ
【００４１】
溶液が電極で乾燥したのち、電極をポテンシオスタットに接続して、異なる量のグルコース（０〜４００mg/dL)をリン酸緩衝液（２５mmol/L、pH７．０）又はヒト血液（４５％ヘマトクリット）に加えた溶液１０μL を加えた。２５％水溶液でそれをスパイクし、YSI STAT分析装置で実際の濃度を測定することにより、グルコース濃度を調節した。試料をセンサに適用した１５秒後に作用電位を印加し、５秒後に電流の読みを実施した。得られた電流をグルコース濃度に対してプロットした。図１は、緩衝液及び血液について計測された応答曲線を示す。これらの応答曲線から、本媒介物質を用いて製造された酵素電極を使用して、酵素活性を無傷のまま残しながらも、水溶液及び血液溶液中のグルコースを測定することができると判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】緩衝液及び血液について得られた電流をグルコース濃度に対してプロットした応答曲線を示すグラフである。
【図１】
0003966591.tif 000028