(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにて目的とする遺伝子を標的細胞に形質導入するためのウイルスベクター複合体であって、
ａ．１）標的細胞中で活性のあるプロモーターに操作できるように連結した、目的とする遺伝子、及び
２）ウイルスエンベロープタンパク質、
を有するレトロウイルス粒子、並びに
ｂ．  以下の（ａ１）又は（ａ２）：
（ａ１）ウイルスのエンベロープタンパク質と共有結合で付着しているビオチン分子、及びビオチン結合部位と天然のアクセプターに対する結合部位とを持つリンキング分子、を含むアダプター
（ａ２）ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも２５個の連続する残基と置換して融合タンパク質を形成する結合ポリペプチドを含み、並びに、該結合ポリペプチドに対する結合部位を含むビオチン分子を含むリガンド部分と天然のアクセプターに対する結合部位とを含むリンキング分子を含む、アダプター、
を含む、前記ウイルスベクター複合体。
【請求項２】
（ａ１）において、アクセプター結合部位が、エリスロポエチン、インターロイキン、インターフェロン、繊維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子及び上皮増殖因子からなる群から選択された可溶性サイトカインの断片である、請求項１に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項３】
アダプターが、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６９７２９として寄託されているプラスミドｐＴＳＡＬＡによってコードされた融合タンパク質を含む、請求項２に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項４】
（ａ１）において、リスキング分子がプロテインＡ／ストレプトアビジン融合タンパク質及び天然のアクセプターに結合する抗体分子を含む、請求項１に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項５】
天然のアクセプターが、クラスＩ  ＭＨＣ抗原、クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原、インターナライズしている細胞表面レセプター、及びウイルスレセプターからなる群から選択されたものであり、アクセプター結合部位が、天然のアクセプターのタンパク質部分に対する結合部位である、請求項４に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項６】
（ａ２）において、アクセプター結合部分が抗体である請求項１に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項７】
天然のアクセプターが、クラスＩ  ＭＨＣ抗原、クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原、インターナライズしている細胞表面レセプター、及びウイルスレセプターからなる群から選択されたものである、請求項６に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項８】
（ａ２）において、融合タンパク質が、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６９７３０として寄託されたベクターｐＳＴ−ｅｎｖによってコードされている、請求項１に記載のウイルスベクター複合体。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにて目的とする遺伝子を標的細胞に形質導入するためのウイルスベクター複合体を作製する方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）と（ｉｉ）を非共有結合の形成に適した条件下で接触させる工程：
（ｉ）標的細胞中で活性のあるプロモーターに操作できるように連結した目的とする遺伝子、及びウイルスエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子、
（ｉｉ）（ａ１）ウイルスのエンベロープタンパク質と共有結合で付着しているビオチン分子、及びビオチン結合部位と天然のアクセプターに対する結合部位とを持つリンキング分子、を含むアダプター、
（ｂ）上記ウイルスエンベロープタンパク質と非共有結合する二機能性アダプターを有するウイルスベクター複合体を回収する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
目的とする遺伝子を標的細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現させる方法であって、標的細胞と請求項１に記載のウイルスベクター複合体とを接触させる工程を含み、該ウイルス粒子が該細胞中にインターナライズされることにより、該細胞に目的遺伝子が形質導入されて該細胞が目的遺伝子を発現するものである、前記方法。
【請求項１１】
標的細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで培養された標的細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞が哺乳動物由来の細胞である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
１．発明の分野
本発明は標的細胞に形質導入するために、すなわち遺伝物質を細胞中に導入するために用いうるウイルスベクターを含む。目的とする標的は真核細胞、とりわけヒト細胞である。形質導入はin vivo又はin vitroで行うことができる。より特定すれば、本発明はウイルスベクターに関するもので、多数のタイプの細胞の中から標的細胞の表面に露出している特定のアクセプター分子を有する細胞に形質導入しうる。
２．発明の背景
目的とする遺伝子を標的となる真核細胞中に輸送し発現させるために、種々のウイルスをベースとしたベクターが用いられてきた。ウイルスの遺伝子の内の一つ又はそれ以上を、標的細胞中で機能を有するプロモーターと連結しうる、目的の遺伝子と置き換えるためには、組換えＤＮＡ技術が用いられている。その構築物はウイルスベクターと名付けられており、ウイルスの生理学的な感染「機構」（machinery）を用いて標的細胞に感染し、ウイルスの遺伝子のかわりに目的とする遺伝子を発現させるものである。そのベクター中にウイルスの全ての遺伝子が含まれているわけではないので、そのベクターが標的細胞に感染してもウイルス粒子は産生されない。ヒト又は哺乳類の標的細胞に感染するウイルスとしてはヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び白血病型レトロウイルスの誘導体が用いられている。ヒト由来の細胞の形質導入において特に興味深いレトロウイルスの一つはアンホトロピックレトロウイルスをベースとした構築物である。
２．１  アンホトロピックレトロウイルスベクターの使用
レトロウイルスは真核細胞の形質導入に特に適している。このタイプのウイルスをベースとしたベクターの利点としては、標的細胞のゲノムにインテグレートし形質導入された細胞の後世代が目的とする遺伝子を発現するようになるという点がある。第二には、感染性はあるが形質導入された標的細胞中でウイルス粒子の産生を起こさないベクター粒子のストックを作製するための、よく開発された技法があることである。最後に、ベクター粒子のストックで106TCIU/mlの感染価を持つものの作製及び精製を行いうることである。
レトロウイルスベクターの一つの欠点としては、目的とする特定の組織又は細胞のタイプを特異的に形質導入し得るような一般的に用いうる方法が現在のところはないことである。この目的のためにこれまでに行われてきたこととしては、ウイルスベクター粒子の物理的な分布を特定の器官に限定するための外科的手法がある（Ferry, N. ら，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8377）。また別の方法として、C型レトロウイルスが分裂期の細胞にのみ感染するという利点が実際に利用されている。この場合は細胞群、例えば骨髄細胞を患者から取り出し、その特定の標的細胞に対して特異的な成長因子の存在下でex vivo（生体外）で培養し、培養液中の大多数が分裂期の細胞となるようにした。例えばWilson, J.M. ら，1990, Proc. Natl. Acad. Sci.87:439-47; Ohashi, T. ら，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11332-36を参照されたい。形質導入後、分裂期の細胞を回収し、さまざまな目的のために患者に再移植しなければならない。ex vivoの培養技術の技術的困難さと、ある種の細胞に特異的な成長因子が使用できないこととが、この方法の応用性を制限している。
レトロウイルスをベースとしたベクターの使用にあたっての第二の困難は、レトロウイルス粒子はそのゲノムを２コピーもっていることである。ウイルス粒子の対立遺伝子間で遺伝子組換えが起こる可能性はゼロとはいえない。このような組換えによって、標的細胞での感染性をもつ粒子の産生を引き起こす可能性のある複製コンピテントウイルスが生じる可能性がある。ヘルペスウイルス感染やアデノウイルス感染とは異なりレトロウイルス感染は必ずしも自己制限されるとはいえない。
これらの困難があるとはいえ、ヒト細胞への感染性のあるアンホトロピックマウス白血病レトロウイルスをベースに作製されたレトロウイルスベクターは、ある種の疾患、例えばアデノシンデアミナーゼ及び低比重リポタンパク質レセプター欠乏症及びゴーシェ病などの、ヒト遺伝子治療への使用が認められている。例えば、Miller, A.D., 1992, Nature 357:455; Anderson, W.F., 1992, Science 256:808を参照されたい。
両栄養性レトロウイルスベクターをヒト細胞に使用する際の制限を克服する方法の一つは、ウイルス表面にありウイルスの感染の特異性を決定しているタンパク質であるgp70タンパク質をコードする遺伝子を突然変異させることであった。組換えＤＮＡ技術を用いて、あらかじめ決定された配列をgp70配列中の小領域と置き換えた「変異体」ウイルスが構築された。この方法の限界は、目的とする標的の感染を可能とする配列についての知識が必要なことである。しかし、この知識が既にある場合には、予測通りのウイルスの特異性の変化が認められている（Valsesia-Wittmann, S., 1994, J. Virol. 68:4609-19）。
２．２  標的細胞に形質導入するためのウイルスベクター複合体の使用
gp70タンパク質自体の結合特異性を変えること以外の方法は、ウイルス粒子と標的細胞の双方に結合する又は結合している第二の新規の構造体を用いることである。このような新規の独立して機能する分子は、ウイルス粒子と共にベクター複合体を形成する分子アダプターと考えうるものである。この方法の一例として、ラクトース分子は非特異的反応によって、共有結合で通常はヒト細胞には感染しないエコトロピックレトロウイルスのエンベロープタンパク質に結合された。ヒト肝細胞癌はラクトース含有タンパク質に対するレセプターを持つことが知られているが、形質導入された目的の遺伝子が標的細胞の染色体中にインテグレートされたか否かを直接的に示すことはできなかったとはいえ、この癌細胞にベクター複合体による形質導入が起こることが見いだされた（Neda, H. ら，1991, J. Biol. Chem. 266:14143）。ラクトース特異的レセプターを欠く肝細胞癌では発現の証拠となるものは見られなかった。Nedaの方法によれば、標的細胞上に露出しているアクセプターに対しての結合部位がいくつもあり、それらの部位は誘導体化又は結合したエンベロープタンパク質に付着しているが、もちろん標的細胞がラクトースレセプターを有している場合に限られる。
アダプター分子の使用についての別の方法として、ベクターと共有結合していないアダプターがある。このタイプのアダプターの使用はRoux及び彼の共同研究者たちによって試みられ、彼らはこの方策に関する報告をいくつか発表している（Piecheczykのフランス国特許公報2,649,119, 1991年１月４日；Roux, P. ら，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9079-83; Etienne-Julan, M. ら，1992, J. Gen. Virol. 73:3251-55）。Rouxとその共同研究者らは２種類のタンパク質からアダプターを構築したが、それらはいずれも典型的な抗体であり、そのタンパク質をビオチン化し、アビジン又はストレプトアビジン４量体、これは４つのビオチン分子と結合するタンパク質であるが、これらを用いてビオチン化したタンパク質の４個までの凝集体を形成した。第一のタイプのタンパク質は抗gp70抗体で、ウイルス粒子と結合する。第二のタイプのタンパク質は標的細胞と特異的に結合するさまざまなタンパク質の内の一つで、抗体又はその他のタンパク質であろう。Rouxのアダプターはストレプトアビジン４量体及び他の４種のタンパク質分子を含んでいる。各アダプターは１個のストレプトアビジン４量体を含むが、凝集体はランダムな、すなわち他の二つのタイプのタンパク質の考えうる全ての組み合わせが可能であり、その中には抗gp70のみ、及び標的細胞特異的タンパク質のみしか含まない凝集体をも含まれる。
ランダムに凝集したタンパク質の混合物の使用に伴う困難を避けるために、Rouxはあらかじめ調製したアダプターは用いず、in situつまり標的細胞の表面で標的細胞特異的タンパク質、ストレプトアビジン、抗gp70及び最後にウイルスベクター自体を順次細胞に暴露することによってアダプターを構築した。in situで構築した場合においてもRouxのアダプター分子はランダムな混合物からなっており、ウイルス又は標的細胞との結合部位は定まった数とはならなかった。
この多段階のプロセスを完了させるためには、何らかの方法でそのプロセスの完了前に凝集体の構成成分が標的細胞のインターナリゼーションを防がなければならない。Rouxが採用した方法は培養時の温度を下げることであった。このように、Rouxの行った方法はin vivoでは全く用い得ないシステムであった。ex vivoにおいてもアダプター及びベクターの複合体は、標的細胞の代謝が阻害されている状態で、多段階プロセスで構築されねばならない。
３．本発明の概略
本発明はウイルスベクターの使用に関する。該ウイルスベクターはそのウイルス粒子の表面にタンパク質を持ち（そのタンパク質は以後エンベロープタンパク質と呼ぶ）、そのウイルス粒子は目的とする標的細胞に結合しない。本発明は新たなタイプのアダプターを含み、そのアダプターはあらかじめ定めた変動しない数の結合価、すなわち一定数の結合部位を提供する。その結合部位は、そのようなアダプターを有するエンベロープタンパク質分子上にあり、標的細胞上に露出しているアクセプター分子に特異的である。アダプターのウイルス粒子との結合部位は標的細胞との結合部位とは異なっているため、本発明のアダプターは標的細胞がない状態でも構築しうる。あらかじめ形成しておいた、アダプターとウイルス粒子の複合体は目的とする遺伝子を標的細胞中に形質導入しうる。
ある態様においては、本発明はウイルスベクターと非共有結合性２機能性分子、すなわち少なくとも１カ所のウイルスとリンクする部位を持ち、あらかじめ定めた数の目的の標的細胞特異的な結合部位を持つ。このタイプの特別な態様においては、二機能性の分子は１カ所のウイルス結合部位と１カ所の標的細胞結合部位を持つ。
本発明はウイルスのエンベロープタンパク質分子のいくつか又は全てが新たな共有結合の形成によって改変させられたウイルスベクターから成る複合体をも含む。本発明のこの形態のものについては３つの異なる態様がある。
第一は、ウイルスのエンベロープタンパク質の内の少なくとも約２５個のアミノ酸と置換した結合ポリペプチドでありうるアダプター分子で、それにより融合タンパク質が形成される。そのような融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を用いて、エンベロープタンパク質の断片をコードする遺伝子の断片と親タンパク質、それは結合ポリペプチドと同様の望ましい結合特異性を持っているが、そのタンパク質をコードする遺伝子の断片とをリンクすることにより作製しうる。ここに用いているとおり、融合タンパク質は少なくとも二つの近接した配列のブロックを有し約10アミノ酸又はそれ以上の長さで、二つの異なる親タンパク質に由来する。好ましい実施態様においては、ウイルス粒子は正常のエンベロープタンパク質及び融合タンパク質の混合物を含有している。
第二にアダプターはリンキング分子及び上述のエンベロープタンパク質/ポリペプチド融合タンパク質のポリペプチドから構成しうる。融合タンパク質の非エンベロープポリペプチドはリンキング分子に相補的であるので、リンキングポリペプチドと名付けた。本実施態様においては、リンキング分子はベクターとは共有結合はしていない。むしろ、リンキング分子自体が二機能性である。リンキング分子はリガンド機能部分を有し、その機能部分はリンキングポリペプチドに相補的で、ウイルス表面に付着し、あらかじめ定められた数の標的細胞表面の露出しているアクセプターに対してのアクセプター結合部分を有する。
第三の実施態様では、上記のように、リンキング分子を用いるが、エンベロープタンパク質/リンキングポリペプチド融合タンパク質は用いない。この実施態様では、ベクター粒子を構築した後にリンキング部位は共有結合でエンベロープタンパク質に付着された。
本発明はさらに、当業者であれば、標的細胞特異的タンパク質としての使用にある特定の抗体が適しているかを決定しうる方法を提供し、あらかじめ作製したウイルスベクター複合体の使用方法をも包含する。
４．図の簡単な説明
図１．  SupTlのβ-ガラクトシダーゼ依存性蛍光染色のFACSヒストグラム；A:非形質導入；（B,C）：ψ-2BAG / SA-PA / 抗CD4ベクター複合体で２回の別々の実験で形質導入
図２．  in vivoで形質導入したマウスから回収したCD4+細胞（斑点）及びB220+細胞（斜線）のβ-gal蛍光染色の平均値：A:ψ-2BAG / SA-PA / 抗CD4ベクター複合体；B:ψ-2BAG / SA-PAのみ；C:ψ-2BAG；D:ウイルス粒子なし。２匹の実験動物の結果を示す。
図３．ベクター複合体のインターナライゼーションの時間経過。Daudi，抗HLA-DR抗体のみ（-○-）；SupTl，抗CD4抗体のみ（-■-）；Daudi，ベクター複合体（-▲-）；SupTl，ベクター複合体（-□-）
図４．ストレプトアビジン/env融合タンパク質をコードする遺伝子及びpST-env中に見いだされる、機能できるようにリンクさせたサイトメガロウイルスプロモーター（CMV-pro）を模式図としたもの
図５．形質導入されたDaudi細胞のβ-gal蛍光染色のFACSヒストグラム。図５A：ψ-2BAG（陰性対照）図５B：pST-env-ψ-2BAG / ビオチン化抗HLA-DRベクター複合体。図５Bのみ100以上のチャンネルに細胞が存在していることに注意せよ。
５．発明の詳細な説明
本発明は真核細胞、例えば哺乳類の細胞又は鳥類の細胞、及び、より特定すれば医学用途にはヒトの細胞の、及び農業及び娯楽用の獣医学用途には家畜の細胞のゲノムを改変する方法を提供する。本発明はウイルスベクター複合体による遺伝物質の細胞内への導入と発現を提供している。ウイルスベクター内ではウイルス遺伝子のいくらかあるいは全てが、標的真核細胞内で発現されるべき遺伝子と置換されている。ベクターから除去された本質的に重要なウイルス遺伝子は、通常はウイルス粒子のストックを産生するために用いられる細胞系のゲノムに挿入される。産生細胞系はこのようにウイルスベクター内にある欠陥補完する。いくつかの実施態様においては、ベクターのゲノム内に含まれているウイルスの遺伝子だけが、ベクターゲノムをウイルス粒子にパッケージングする際に必要な遺伝子である。
特定のウイルスに感染する細胞中の遺伝子の一般的な発現に適したウイルスベースのベクターの構築は下記の特許公報に記載されている：レトロウイルスベクターに関してはWO 89/05345, Milligan, R.C. ら、WO 92/07943, Guild, B.C.ら、ヘルペスベクターに関してはWO 90/09441及びWO92/07945, Geller, A.I.ら、アデノウイルスベクターに関してはWO 94/08026, Kahn, A.ら、WO 94/10322, Herz, J.ら、アデノ関連ウイルスに関しては米国特許第5,354,678号，Lebkowski、及び第5,139,941号，Muzcyzka。レトロウイルスベクター産生用のパッケージングシステムについては次の文献に述べられている：Danos, O. とMulligan, R.C., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.85:6460-64、及びLandau, N.R. & Litmann, D.R., 1992, J.Virol. 66:5110-13。
本発明はウイルスベクター技術の改善である。本発明はウイルスベクターを、２つの部分、すなわちウイルス部分とアダプターと名付けられた標的細胞特異的な部分から成るベクター複合体と置き換えるものである。アダプターはベクターが標的細胞と結合することに役立ち、その過程においてベクターは標的細胞内へインターナライズされる。この機能は感染及び目的とする遺伝子の発現に必要である。理論に限定されることなく、本発明はアダプター部分を提供することによって２つの改善を成し遂げている。第一に、アダプターの使用によって、アダプターなしでは標的細胞又は同一種からのいかなる細胞にも感染できないようにベクターを構築できるようになった。本発明のいくつかの特定の実施態様においては、ベクターは、通常はその標的種に感染できず、そのベクター中の遺伝子によってアダプターがコードされていないウイルスをベースにしている。感染はアダプターが存在しているときのみに起こるのであるから、不注意による医原性の感染を起こす組換えウイルスは事実上不可能である。
第二に、アダプターは種々の特異性を有して提供しうる。本出願は、ベクター複合体が結合した後に標的細胞中にアクセプターとベクター複合体が内部化されるようなものである限り、標的細胞上のアクセプターに対して特異的な抗体又はその抗体の抗原結合断片を含むアダプターを構築する方法を開示している。アクセプターとして適した細胞表面抗原は多数あり、それらに対する抗体も既に利用可能である。それらの構造としては、クラスＩ及びクラスIIの組織適合性抗原；各種サイトカインに対するレセプターと細胞型特異的成長ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、線維芽細胞増殖因子、エリスロポイエチン、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子及び上皮増殖因子；細胞接着分子；アミノ酸のような代謝物の輸送分子；B及びTリンパ球の抗原レセプター；並びにリポタンパク質のレセプターなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明はウイルスベクター複合体のアクセプターとして判別抗原を用いることによって細胞タイプ特異的な感染を可能とした。
本発明は目的とする遺伝子を標的細胞に形質導入することに用いる。本発明の好ましい実施態様の実施において、ウイルスベクターとアダプターとの複合体は、そのアダプター又はアダプターの一部が標的細胞のアクセプターと相互作用する以前に作製される。
本発明は標的細胞をex vivoで培養することによって実施し得る。培養細胞は引き続き培養液内にあり、形質導入された遺伝子によってコードされた産物を産生する。あるいは、別に培養細胞を採取した患者を宿主として、ex vivoで形質導入した細胞をその患者に埋め込むこともできる。
さらに別の実施態様においては、ウイルスベクター複合体は患者に直接投与することができ、それによってex vivoでの細胞培養が不要となる。患者への投与経路としては、ベクター複合体と標的細胞との接触が起こるような経路であればいかなる経路も可能である。例えば静脈内投与は肝臓、脾臓、腎臓、心臓、及び、循環系又は造血系にある標的細胞に適した経路である。また、ベクター複合体は標的器官に繋がる動脈又は静脈のカテーテルによっても投与でき、それによってその複合体の局所投与が可能となる。標的細胞が呼吸器系にある場合には複合体は吸入によっても投与しうる。
本発明を実施することによって形質導入される遺伝子としては真核細胞系で発現されるいかなる遺伝子も含まれる。本発明を使用することで発現され得る遺伝子の例を挙げれば、グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、及び第VIII因子及び第IX因子などの血液凝固因子がある。
ベクター複合体のウイルス部分は、ウイルス粒子が標的細胞と同じ種の細胞に結合できないか、あるいは結合できないように改変されているいかなるウイルスも用いうる。この第一のタイプのウイルスの非限定的な例としてはマウスエコトロピック白血病レトロウイルス、例えばMoloney Leukemia Virus（モロニー白血病ウイルス）やAKVがある。また別に、化学的に改変したウイルス粒子も使いうる。非限定的例として、ウイルス粒子は何らかの方法でビオチン化することができ、その結果ビオチン分子がウイルスのエンベロープタンパク質と広範囲に共有結合することとなる。このような広範囲のビオチン化はエンベロープタンパク質の機能をブロックし、それによってそのウイルスはアダプター（そのアダプターはウイルス粒子のリンキング部位を相補的なリガンド部分を有している）なしでは非感染性となる。この実施態様ではビオチンそれ自体がリンキング部位を提供する。エコトロピックなレトロウイルスに加え、本発明のこの実施態様に従ってベクターを構築するために使用できるウイルスとしてはアンホトロピックレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスがある。
本発明の実施態様をより詳細に下記に述べる。
５．１  非改変ウイルス粒子とアダプターとの複合体
ある実施態様においてはベクター複合体は、ウイルス粒子の表面タンパク質又は親ウイルスのタンパク質と本質的に同一な１種あるいはそれ以上のエンベロープタンパク質を有しているベクターから成っている。ここで用いるとき、特に断らない限り、ウイルスのエンベロープタンパク質とは、巨大分子が接近可能な、ウイルス粒子の任意のタンパク質、すなわち露出した表面タンパク質を意味している。ウイルスのエンベロープタンパク質とはウイルスの非人工的な構成成分であり、例えばエコトロピックレトロウイルスのenv遺伝子の産物である。
アダプターは、ウイルスベクター粒子と非共有結合で結合される二つの機能性部分をもつ分子である。第一の機能性部分は粒子のエンベロープタンパク質と特異的かつ安定に結合する確定した数の部位から成る。アダプターのこの機能性部分はペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体又は抗体の抗原結合性断片、又はウイルスの天然レセプター又は天然レセプターの相同体のエンベロープ結合ドメインに由来するポリペプチドでありうる。第二の機能性部分は標的細胞表面に露出しているアクセプター分子と特異的かつ安定に結合する確定した数の結合部位から成る。好ましい実施態様において、この二つの機能性部分は単一のポリマーの別個の部分として合成される。この機能性部分がポリペプチドである場合にはアダプターは融合タンパク質となる。
本発明の特定の実施態様の説明は同時係属中の共通に譲渡された米国特許出願番号第08/132,990号（1993年10月７日出願）に提示されており、それをここに参考として組り入れる。この実施態様において、エンベロープ結合機能はマウスエコトロピックウイルスレセプターのヒト相同体であるタンパク質の断片、それはさらにエコトロピックウイルスのgp70と結合するように改変されているが、その断片によって促進される。標的細胞結合機能は、ヒト粘液癌の炭水化物部分と結合するモノクローナル抗体B3由来の抗原結合断片によって促進される（Pastan, I. ら，1991, Cancer Research 51:3781）。
５．２  改変ウイルスベクターとアダプターとの複合体
５．２．１  エンベロープタンパク質の改変
ウイルスベクターの改変は産生細胞系を確立する前、または後のいずれでも行うことができる。産生細胞系の確立後に改変を行う場合には、産生細胞系の上清を濃縮し、ウイルス粒子を当業者には公知の技術に従って、さらにゲルろ過又はショ糖密度勾配遠心で精製する。精製後、ウイルス粒子は、変性を起こさないように、またはエンベロープのあるウイルスの場合にはその脂質膜を分断しないように、タンパク質中に共有結合を形成させる何らかの化学的手法で改変しうる。好ましい実施態様においては化学的改変はウイルスとビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド（ビオチン-NHS）との反応によって行われる。この反応によりウイルスはアダプターが無く非感染性となるとはいえ、このようなウイルス調製物は本発明の実施に適したものである。
本発明の実施に用いうるウイルスのその他の化学的改変法としては、光活性化試薬例えばN-（4'-アジド-ニトロフェニルアミノ）基をビオチンにリンクさせたもの（PHOTOBIOTIN）、及び活性化ジスルフィドすなわちジチオ-2-ピリジル含有化合物を、ウイルス粒子のエンベロープタンパク質を改変することが挙げられる。
別の実施態様では、本発明はウイルスのエンベロープタンパク質の改変により実施することができ、例えば、それに限定されないが、マウスエコトロピックレトロウイルスのenv遺伝子を産生細胞系でのウイルス粒子の産生前に改変することが挙げられる。本発明のこの実施態様によると、融合タンパク質が組換えＤＮＡ技術で構築される。融合タンパク質をコードする組換え遺伝子は次いで産生細胞系へトランスフェクトされる。ある実施態様においてはベクターのエンベロープタンパク質は標的細胞種の細胞に結合せず、正常なエンベロープタンパク質とエンベロープタンパク質の断片を含有する融合タンパク質の両方をコードする遺伝子が産生細胞系中に存在しうる。ベクターの完全なエンベロープタンパク質がそのような細胞と結合する別の実施態様においては、エンベロープタンパク質遺伝子はエンベロープタンパク質/結合ペプチド融合タンパク質遺伝子に置き換えられている。
包膜（エンベロープで覆われた）ウイルス粒子の脂質膜に、又はカプシドで包まれたウイルスのカプシドの外表面に融合タンパク質が組み込まれるように、融合タンパク質のエンベロープタンパク質部分を選択される。結合ポリペプチドはリンキング分子と結合するように、すなわち「リンキング部位」を提供するように選択される。候補融合タンパク質の安定性及び適合性はそれをコードする遺伝子が構築されれば容易に測定し得る。候補融合タンパク質をコードする遺伝子は適当な細胞系例えばNIH 3T3細胞にトランスフェクトでき、トランスフェクトされた細胞表面上での機能性融合タンパク質の発現は、蛍光性タグのようなリポーター分子と複合体化させたリンキング分子の相補的リガンド部分に対して暴露することによって測定できる。非限定的な例として、結合ポリペプチドはストレプトアビジンタンパク質の残基16-133をコードするストレプトアビジンの断片で、タンパク質の残りの部分はAKRウイルスのenv遺伝子から由来するものである。本実施例ではエンベロープタンパク質をコードする遺伝子の２つの断片を用いている：507塩基対の断片はU5領域からのびており、Met-49残基からPro-1残基におよぶenvタンパク質リーダーを含み、1323塩基対の断片はenvタンパク質のGly223残基からカルボキシ末端のGlu638残基までをコードする。配列の番号付けはLenz, J.ら，1982, J. Virol. 42:519を用い、この文献を参考としてここに組み入れる。結果として得られるウイルスベクターはビオチン分子の相補的なリンキング部位を有している。
５．２．２．リンキング分子
リンキング分子は、第一にはベクター粒子のエンベロープタンパク質上にあるリンキング部位と、第二には標的細胞上の露出されたアクセプターと特異的かつ安定的に結合する機能性部分を有するいかなる分子であってもよい。今後はそれらの機能性部位をそれぞれ「リガンド部分」又は「リガンド」と呼び、標的細胞を「アクセプター結合部分」又は「アクセプター結合体」と呼ぶこととする。これらの機能性部分が異なっていること、すなわちリガンド部分がアクセプターと安定な複合体を形成せず、またアクセプター結合体もリンキング部位と安定な複合体を形成しないことが、本発明には必要である。これら２つのタイプの機能性部分が定まった数存在するときには複合体をあらかじめ形成させておくことは容易に行える。アクセプターと結合する機能性部分のあらかじめ定められた部位の数は本発明にとって決定的に重要なものではない。数は１又は１以上としうる。in vivoでの使用のためには各リンキング分子上のアクセプター結合機能性部位の数は少ない方が好ましく、１から４の間が最も好ましい。各リンキング分子上のリガンド部分の機能性部分の数についてはあまり重要ではなく、その数をあらかじめ決めておく必要はなく、リンキング分子間で変動してもよい。
リンキング分子の例を、それに限定するものではないが、下記に示す。
リンキング部位がビオチン結合性の機性能部分である場合はリガンド部分はビオチンとすることができる。リンキング分子はビオチン化抗体、ビオチン化サイトカイン、又は成長因子又はそれに類するものとしうる。アクセプター結合機能部分が阻害されない限りはビオチン化の度合いは重要でない。効果的なベクター複合体を形成するために必要とされるビオチン分子の数は重要ではない。アクセプター結合体のビオチン化に用いられる反応時間及び試薬の濃度を変えて、リンキング分子あたりの最適なビオチンの数を決定することができ、それによってベクター複合体の形成が都合のよい時間でかつ実際的に到達可能なウイルス粒子の濃度で起こるようになる。
また別に、ウイルス粒子中に導入されたリンキング部位がビオチンであることもできる。この実施態様においてはリンキング分子のリガンド部分はストレプトアビジン又はストレプトアビジン断片から成ることができる。リンキング分子のアクセプター結合部分が抗体から成っているときは、リンキング分子はストレプトアビジン/プロテインＡ融合タンパク質から（この例の米国特許第5,328,985号に開示され、特許請求されている）、及び適当な露出された標的細胞のアクセプターに対する抗体から成ることができる。
６．実施例
６．１  実施例１：非改変のウイルスと共に作用することを意図したアダプター
非改変エコトロピックレトロウイルスベクターのための可溶性アダプターとして作用する融合タンパク質の一例は融合タンパク質B3（Fv）-Ex3mH13によって提供される。この融合タンパク質は、抗原結合性断片B3（Fv）とエキソトキシン断片との融合タンパク質であるB3（Fv）-PE40融合タンパク質に基づくものである。B3モノクローナル抗体は粘液性アデノカルシノーマ上に存在する炭水化物抗原に特異的であり、抗原結合断片も同様な結合特異性を有している。PE40断片は第三の外部ドメイン（ヒトタンパク質H13の210-249残基）、それはマウスエコトロピックレトロウイルスレセプターのヒト相同体であるが、その断片によって置換されたものである。EX3mH13ではH13タンパク質の239,240,242,244の位置のアミノ酸を、マウスエコトロピックレトロウイルスレセプターの相同の位置のアミノ酸と置換することにより、ウイルスのgp70エンベロープタンパク質と相互作用することによってEx3mH13がウイルス粒子に非共有結合で付着するようにしうる。
大腸菌中でのB3（Fv）-Ex3mH13融合タンパク質の発現に用いうる発現ベクターpBH3の構築は、同時係属中の米国特許申請Serial No.08/132,990（1993年10月７日申請）の実施例XIに詳細に述べられており、それはここに参照として組み込んでおり、公開特許WO 93/25682, Meruelo and Yoshimoto（1993年12月23日公開）でも述べられている。pBH3プラスミドはB3（Fv）-Ex3mH13融合タンパク質を発現させるために用いる。TGFαの1-50残基及び上記のEX3mH13ドメインから成る融合タンパク質を発現させるために用いるプラスミドpTGFA/H13をATCCへ1994年12月22日付でATCC No. 69728として寄託した。
６．２  実施例２：改変したエンベロープタンパク質、リンキング分子及び抗MHC抗体から成るアダプター
６．２．１．材料と方法
ウイルスと細胞系
この実験に用いる細胞は、SupTlをDr. J. Sodroski（Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA）の好意により提供を受けた他は全てATCCから入手し、NYU Medical Centerの我々の研究室で維持したものである。産生細胞系ψ-2BAG（ATCC No. CRL 9560）及びNIH 3T3, Daudi及びSupTl細胞はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）又はRPMI-1640に10%の加熱不活化ウシ胎児血清（FBS）及び100Uペニシリン及び1%ファンギゾンを最終濃度として含む1%の抗生物質/抗真菌剤溶液を添加した培地で維持した。継代培養は培地を除去し、新鮮なトリプシン（0.25%）溶液で2-3分処理し、トリプシンを洗って除去して行った。次いで細胞が解離するまでインキュベートした後、新鮮な培地を添加した。細胞を吸引し新しいフラスコに1:4から1:20の比となるように分注した。細胞は培地中で標準加湿インキュベーター内で37℃で5%COβ/95%空気の雰囲気中で定常的に増殖させた。Falcon（Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA）プラスチック組織培養皿をFisher Scientific（Springfield, NJ, USA）より入手した。ウイルスについては定期的に不適当な宿主範囲を組換えで獲得していないか調べた。
ウイルスの精製と濃縮
産生細胞系から得たベクター上清はMillipore Pellicon接線フローろ過システム（Millipore, Bedford, MA, USA）でPLMK000C5カセット（5平方フィート，300,000 NMWL）を用いて濃縮した。膜に加える圧を５psiと低圧にするため、ポンプを用いた。濃縮は30分以内に完了した。濃縮後、濃縮物を20mlサンプルに分割し、-70℃で使用するまで凍結保存した。精製には20mlの濃縮液をSepharose 4BCL（Pharmacia）カラムに通すかあるいはショ糖密度勾配でバンドに分けるかのいずれかで行った。カラムでの精製にあたってはSepharose 4BCLカラムをリン酸緩衝液加生理食塩液（PBS）で前もって平衡化する。濃縮液をロードした後PBSで溶出させ、フラクションの260 nmの吸光度を測定した。吸光度の最も高いフラクションをウエスタンブロット法によりヤギ抗gp70抗体及びウサギ抗ヤギアルカリホスファターゼを用いてウイルスを調べた。ショ糖密度勾配による精製は既報のとおり行った（Bach, R. & Meruelo, D. 1984, J. Exp. Med. 160:270）。
細菌株とプラスミド
クローニングには大腸菌HMS171株（Campbell, J.L.ら，1978, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75:2276-2280）及びDH5a株（Sambrook, J. ら，1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA）を用いた。発現には溶原菌BL21（DE3）（Studier, F.W. & Moffat, B.A, 1986, J. Mol. Biol.189:113-130; Studier, F.W.ら，1990, Methods Enzymol. 185:60-89）を用いた。この溶原菌はクローン化されたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を染色体内のlacUV5プロモーターの下流に持っている。pTSA-18Fはストレプトアビジン含有キメラタンパク質用の発現ベクターである（Sano, T. & Cantor, C.R. 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 176:571-577）。このプラスミドは、T7プロモーターφ10の下に成熟したストレプトアビジンの16-133残基のアミノ酸のＤＮＡ配列を持っており、その後ろにポリリンカー領域がある。
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はシグナルペプチド（S領域）及び５個のIgG結合ドメイン（領域E,D,A,B,及びC）に対応するプロテインＡ遺伝子（Uhlen, M. ら，1984, J.Biol. Chem. 259: 1695-1702）を持ちその後には細胞壁接着ドメイン（X領域）の配列の中にポリリンカーがおかれている。pLySはクローン化されたＴ７リゾチーム遺伝子を持っており、宿主細胞中でのT7 RNAポリメラーゼ活性の基礎レベルを下げるために用いた（Studier, F.W. & Moffat, B.A, 1986, J. Mol. Biol. 189:113-130; Studier, F.W.ら，1990, Methods Enzymol. 185:60-89）。
発現ベクターの構築
pTSAPA-2はDr.Takeshi SanoとDr.Charles Cantorの好意により提供を受けた。pTSAPA-2の構築と使用は米国特許No. 5,328,985に記載されている。SanoとCantorは、pTSAPA-2ベクターを、プロテインＡ遺伝子の一部をストレプトアビジン含有キメラタンパク質pTSA-18Fの中へ挿入することによって構築した。pTSAPA-2は、２つのIgG結合ドメイン（E及びD領域）をコードするpRlT11（ＤＮＡポリメラーゼI大断片を用いて塞いだ）の490塩基対のRsa I-HindIII断片を、pTSA-18FのSma I及びBamH I（塞がれた）部位に挿入することによって構築した。
ストレプトアビジン-プロテインＡキメラタンパク質の発現
ストレプトアビジンとプロテインＡの遺伝子融合体の発現は本質的には既報の方法に従って行った（Sano, T. & Cantor, C.R, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:142-146; Sano. T. & Cantor, C.R, 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 176:571-577）。溶原菌BL21（DE3）（pLysS）はNovagenから入手した。その溶原菌は発現ベクターで形質転換し、LB培地に１mM MgSO44 0.2％ブドウ糖，1.5μMチアミン，0.5%カザミノ酸（Difco Laboratories），２μg/mlビオチン，150μg/mlアンピシリン，及び34μg/mlクロラムフェニコールを加え、37℃で振盪しつつ増殖させた。培養液の595nmにおける吸光度が0.6に達してから、lacUV5プロモーターの下に位置するT7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を誘導するために、水に溶解した100mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを添加し最終濃度を0.5mMとした。誘導後、細胞を37℃で振盪しつつインキュベートした。最小培地中での発現には発現したキメラタンパク質の蛋白分解が著しく低減されるという利点がある。
ストレプトアビジン-プロテインＡキメラタンパク質の精製
発現したストレプトアビジン-プロテインＡキメラタンパク質の精製は特に断らない限りは4℃又は氷上で行った。誘導後2時間インキュベートしたBL21（DE3）（LysS）（pTSAPA-2）培養液（100ml）を2,900 x g，15分間遠心分離にかけた。細胞を溶解させるために細胞のペレットを10mlの２mM EDTA, 30mM Tris-Cl（pH8.0）, 0.1% Triton X-100, 0.5mM PMSFで懸濁し、溶解物は-70℃で使用するまで凍結保存した。凍結溶解した細胞溶解物にPMSF，ロイペプチン，及びペプスタチンＡを添加して最終濃度をそれぞれ0.5mM, １μM，及び１μMとした。蛋白分解酵素阻害剤を精製の初期に添加するとキメラタンパク質の分解を低減させた。溶解物を次いで10μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼI及び10μg/mlのリボヌクレアーゼＡにて12mM MgSO4の存在下で室温（〜20℃）で20分間処理した。混合液を39,000 x gで15分間遠心分離し、沈殿を約100mlの７Mグアニジン塩酸塩で溶解した。溶液を150mM NaCl, 50mM Tris-Cl（pH7.5）, 0.05% Tween 20, 0.1mM PMSF, １μMロイペプチン，１μMペプスタチンＡ，0.02% NaN3に対して透析した。グアニジン塩酸塩を緩徐に除去するため、タンパク溶液を入れた透析バッグを透析液（〜1,000ml）の中で攪拌せずに一晩放置し、その後透析外液を数回交換し攪拌しつつ透析した。透析した液を39,000 x gで15分間遠心分離し、上清をあらかじめ150mM NaCl, 50mM Tris-Cl（pH7.5）, 0.05% Tween 20で平衡化したIgG Sepharose 6 Fast Flowカラム（1.2 x 1.1cm）にかけた。未吸着のタンパク質は同じ液でカラムを洗って除去し、カラムを2.5mlの５mM酢酸アンモニウム（pH5.0）で洗った。結合したタンパク質はpHを酢酸アンモニウムで3.4に調整した
0.5M酢酸で溶出し、1.0M NaCl, 50mM炭酸ナトリウム（pH11.0）に対して透析した。透析物は39,000 x g、15分間遠心分離して清澄化した。各フラクションはELISAで活性を調べた。活性は溶出されたフラクション（各１ml）の１から５に認められ、それらのフラクションをプールし、あらかじめベッド容量の10倍量の１M NaCl, 50mM NaCHO3（pH11.0）で平衡化した２−イミノビオチンアガロース（24）カラム（1.2 x 1.2cm）にかけた。未結合のタンパク質を１M NaCl, 50mM NaCHO3（PH11.0）で除去した後、結合したタンパク質を６M尿素，50mM酢酸アンモニウム（pH4.0）で溶出させた。溶出したタンパク質は0.02% NaN3を含むTris緩衝液加生理食塩液（TBS; 150mM NaCl, 20mM Tris-Cl（pH7.5））に対して３回透析し、透析した液を0.22μmのフィルター（Millex-GV, Millipore）に通した後4℃で保存した。各フラクションの活性を再度ELISAで調べた。
ウイルス感染性アッセイと感染価の決定
第１日目にNIH3T3細胞を6ウエルの組織培養プレート（Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ,USA）に1 x 105個/ウエル播き、37℃にて5% CO2中でインキュベートした。第２日目に、ベクター検体を8μg/ml Polybreneを含有する培地中で10倍段階希釈した液を標的細胞に添加し37℃でさらに4時間インキュベートし、その後培地を除去し、２μg/ml Polybreneを含む通常の培地と置き換えた。48時間後に細胞のX-gal活性をアッセイした。ベクターの感染価は１mlあたりのコロニー形成単位（cfu）数として計算した。天然状態の細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）活性の５-ブロモ-４-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシダーゼ（Sigma）（X-gal）視覚化のため、0.5%グルタールアルデヒドで15分間固定した後、Dannenberg and Sugaの方法（METHODS FOR STUDYING MONONUCLEAR PHAGOCYTES, Adams, D.O.ら編，Academic Press, New York, pp.375-396, 1981）を用いた。
タンパク質の濃度の測定
タンパク質濃度を測定するためにBio-Radの推奨する標準及びマイクロアッセイ法を用いた。標準法としては、タンパク質標準品（供給品）を0.2から約1.4mg/m1含有する数種の希釈液を調製した。次いで0.1mlの標準品と適度に希釈したサンプルをきれいな乾燥した試験管に取った。ブランクの試験管にサンプル緩衝液を0.1m1取った。5.Omlの希釈染色試薬（供給品）を添加し、ヴォルテックスし、５分から1時間後にOD595を、試薬をブランクとして測定した。OD595値は標準品の濃度に対してプロットし標準曲線から未知濃度値を求めた。マイクロアッセイ法としては、1から25μg/mlのタンパク質標準品を用い、適度に希釈したサンプル0.8mlを0.2mlの染色試薬濃縮液と共に用いた。２つの方法はその他の点では同一である。
ウイルスのビオチン化
ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン-NHS）（biotin-X-NHS, Calbiochem, Catalog No.203187）をエンベロープタンパク質をビオチン化するために用いた。ビオチン-X-NHSはビオチンと標的リガンドとの間にスペーサーを導入し、ストレプトアビジン結合の効率を減弱させる立体障害を減らす。この目的のために、１mgのウイルスを0.9mlの滅菌蒸留水に溶解した。10Xの緩衝液（NaHCO3）を0.1ml添加し、ヴォルテックスした。新たに調製したビオチン（11mgのビオチン-X-NHSエステルを0.25mlのジメチルホルムアルデヒド中に含む）を0.1Mの濃度で用いた。平衡化したタンパク溶液にビオチン溶液を加え、室温で１時間、緩徐にロッカーを用いて攪拌しながらインキュベートした。その時間の終了時に、未反応のビオチン-X-NHSエステルを除去するためにタンパク質-ビオチン溶液を数回0.01M PBS pH7.3に対して透析した。ビオチンで標識したタンパク質溶液は使用するまで4℃で保管した。
フルオレポーターlacZフローサイトメトリー
我々は単一細胞中のlacZ-β-ガラクトシダーゼの検出のためにMolecular Probes, Inc.（Eugene, Oregon, USA）が開発したフルオレポーター”IacZ”フローサイトメトリーを選択した。
色素産生性のβ-ガラクトシダーゼの基質、例えばo-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（ONPG）及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル  ガラクトシド（X-gal）はlacZ遺伝子の発現の結果生ずるβ-ガラクトシダーゼ活性をモニターするために広く用いられている。しかし、色素産生性のlacZアッセイは比較的感度が低く、細胞抽出液を多量に必要とする。最近になって、フルオレセインジ-β-ガラクトピラノシド（FDG）の酵素的解裂によって生ずる蛍光の測定が、蛍光活性化セルソーティング分析に基づくlacZアッセイ法、これは色素法よりも少なくとも８桁鋭敏であるが、このアッセイ法を開発することに利用されている。この方法のもう一つの利点はFACSアナライザーを使用することにより細胞集団の中の個々の細胞の分析が可能となったことである。
試薬類は全てこのアッセイの製造者から入手し、製造者の推奨するとおりに使用した。本質的にはこの方法においては細胞懸濁液は指数的に増殖している細胞から調製され、基質となるFDGは37℃で細胞中に低張性ショックによってロードされる。ローディング過程は、細胞を氷冷した等張培地中に希釈することにより終了させる。この低温条件下では、細胞膜は基質に対する透過性が比較的低く、加水分解が起こる。基質と産物が各細胞の内側に閉じこめられたいるので基質のフルオレセインへの加水分解速度は各細胞中のβ-ガラクトシダーゼの濃度に単調に相関している。反応は競合阻害剤であるフェニルエチルβ-D-チオガラクトピラノシド（PETG）を添加することによって停止でき、反応のタイミングをより都合のよいものとすることができる。ヨウ化プロピジウム染色は溶解した細胞（死細胞）を検出するために用いられる。阻害剤であるクロロキンはリソソームのpHレベルを下げ、非特異的なリソソームによる加水分解を防止するために用いうる。
FACS分析
細胞を1% BSAと場合によっては0.1%のアジ化ナトリウムを含むPBS 10mlに最懸濁する。細胞数を数え、生存率を記録する。細胞濃度はl x 106個/mlに調整する。１mlずつを各試験管に入れ、細胞を遠沈させた。細胞は適当に希釈した抗体（50μl中）とともに4℃又は室温で30分間インキュベートする。次いで細胞を遠沈させ、１%BSA及び0.1%アジ化ナトリウムを含む１mlのPBSで２回洗う。最後の洗浄のペレットをもしそれが適当と考えられるならば二次試薬とインキュベートし、さらに4℃又は室温で30分間インキュベートする。次いで細胞を遠沈させ、１%BSA及び0.1%アジ化ナトリウムを含む１mlのPBSで２回洗う。最後の洗浄後、FACScan, Beckton Dickinson, Lincoln Park, NJ. USAを用いるFACS分析の前に、細胞を１%BSA及び0.1%アジ化ナトリウムを含む300μlのPBSで再懸濁し、300μlの2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。
複合体の調製と非接着細胞の形質導入
ウイルスベクター複合体は各10μlのビオチン化ウイルス粒子、抗体及びSA-PA融合タンパク質（その各々は約0.3mg/mlのタンパク質を含んでいる）をマイクロ遠心管中で混合することによって調製した。混合液は22℃で10分間インキュベートした。その後、2 x 106個の細胞を１mlの新鮮な完全培地に懸濁しCO2インキュベーターで37℃で4時間インキュベートした。細胞にさらに4mlの培地を追加し、形質導入48時間後のFACS分析まで培養した。
６．２．２．  ex vivoでのβgalを有する標的細胞への形質導入
エコトロピックウイルスによる感染を検出するために、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を用いる48時間アッセイを用いた。このアッセイでは選択過程は不要であり、lacZがコードするβ-ガラクトシダーゼの検出を単一細胞中で行うフルオレポーターlacZフローサイトメトリーアッセイによって良い定量性が得られる（Fiering, S.N.ら，1991, Cytometry 12:291-301; Nolan, G.P.ら，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607; Molecular Probes, Inc.）。
このアッセイでは、あらかじめ定めたレベルより強い蛍光を持つ細胞のみが感染しているとみなされる。あらかじめ定めるレベルは細胞のタイプによって異なる。未感染の細胞群の内の少数の細胞は選択した蛍光のレベルを上回り、それらはこのアッセイのバックグラウンドレベルを表している。
ψ-2BAGはマウスエコトロピックウイルスであるが、ヒトBリンパ芽球細胞系であるDaudiに感染することができない。しかし、このウイルスをビオチン化し、ストレプトアビジン/プロテインＡ（SA-PA）融合タンパク質及びこれらの細胞上で露出しているアクセプター（抗HLA-DR及び抗CALLAモノクローナル抗体）に特異的な２つのモノクローナル抗体の内のどちらかとともに用いた場合には、Daudi細胞の感染は下記に示すとおり容易に起こる。
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Daudi細胞に結合しないモノクローナル抗体（抗CD4）を用いている場合にはDaudi細胞は形質導入されない。Daudi細胞はψ-2BAGによって形質導入されないため、これらの結果は、lacZ遺伝子を目的の遺伝子として有するマウスエコトロピックウイルス及び、ビオチン、SA-PA融合タンパク質、及び標的細胞のレセプターに特異的なモノクローナル抗体から成るアダプターから成るベクター複合体の使用によって、マウスエコトロピックレトロウイルスによる特異的なヒト細胞の感染が起こることを示している。
特異的モノクローナル抗体及びSA-PA融合タンパク質によって標的とし、ビオチン化したψ-2BAGを用いて種々の細胞系を調べた結果を下記の表IIに示す。試験に供した４種の細胞系の内、SupTが最も高い感染率を示した。これらのデータは本発明が種々の細胞系にうまく利用しうることを示している。ここに示すとおり、CD4又はCD3分子のどちらを標的としようともJURKAT細胞はFPをベースとするアプローチによって感染し、CCL119はCD4，CD3，又はCD10を標的とすることによって感染した。
図１は形質導入のない場合及び上述のウイルスベクター複合体で形質導入後のSupTの蛍光の強度のヒストグラムである。
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６．２．３．  in vivoの標的のベクター複合体による形質導入
本発明のin vivoでの操作性を示すためにヌードマウスにヒトDaudi細胞を投与し、腫瘍細胞を約４週間増殖させた。この時点で抗HLA-DR-PASAをリンクさせたβ-galを含むビオチニルエコトロピックレトロウイルス粒子から成るベクター複合体をマウスの腹腔内及び腫瘍内部に投与した。２日後に腫瘍細胞を取り出し二重蛍光によってβ-ガラクトシダーゼ活性及びHLA-DR決定因子の存在を調べた。理論的にはエコトロピックウイルスは宿主細胞（マウス）に感染性であったのであろうが、前記の実験ではビオチン化したウイルス粒子はアダプターが存在しなければ感染しないことを示していた。この実験結果では回収した細胞の77.3％はHLA-DR陽性、10.2%はβ-ガラクトシダーゼ陽性、8.6%はHLA-DR，β-galとも陽性であった。このようにβ-gal陽性細胞の大部分はHLA-DR陽性であった（83%）。
下記の実験はアダプターのない条件ではビオチン化したベクターはマウス細胞に感染能がないことから説明される。CD4マウス細胞を標的とし、エコトロピックウイルス粒子のエンベロープタンパク質上のビオチンからなるアダプターを有するウイルス複合体を種々の濃度でマウスに静脈内投与した。対照のマウスはその複合体の個々の構成要素のみで感染させた。融合タンパク質投与の数日後、供試動物を屠殺し、各器官（すなわち胸腺、脾臓、及び腸管膜リンパ節）のT及びB細胞群の蛍光の強度を測定した。抗CD4-FP-V複合体を投与されたマウスの器官のCD4細胞群に比較的高いβ-ガラクトシダーゼ活性が認められた。代表的な結果を図２に示す。この図は対照マウスから得た器官では二重陽性の細胞群（CD4/β-gal）での蛍光強度の平均値は138.22から163.94の範囲にあることを示している。しかし、完全なベクター複合体の投与を受けた動物から採取したリンパ球ではCD4/β-gal陽性細胞の蛍光強度の平均値は326.50から452.17の範囲へと増加した。これに対して標的とならなかったB細胞（B220陽性）は全ての動物においてβ-galの蛍光強度の平均値の増加は見られなかった。B220/β-gal二重陽性では蛍光強度の平均値は対照マウスで117.31から138.96の範囲であり、複合体投与を受けた動物では131と137.04の間であった。
６．２．４．  非抗体アクセプター結合体を有するリンキング分子
ストレプトアビジンの16-133残基及びTGFαの1-50残基を含む断片からなるアダプターを構築した。この融合タンパク質は、上述したSA-PA融合タンパク質についての発現方法を用いて発現させた。TGFα-SA融合タンパク質発現に用いうるプラスミドpTSALAを1994年12月22日にATCC No. 69729として寄託した。
６．３    標的細胞のアクセプターの選択
本発明の好ましい実施態様においては、標的細胞上のアクセプター分子へのベクター複合体の結合にすぐ引き続いてその複合体が細胞内部入ることが好ましい。その複合体の取り込みの速度を観察することによってある特定の判別抗原が適しているか決めることができる。取り込み速度は、蛍光標識した、アダプターの構成要素に特異的な抗体、典型的には抗免疫グロブリン抗体を用いて染色して測定する。ビオチン化ウイルス粒子、SA-PA融合タンパク質、及びモノクローナル抗体の複合体の取り込みの時間経過は、SupTl上の抗CD4及びDaudi細胞上の抗HLA-DRからなる複合体で観察した。結果を図３に示す。
我々は、ウイルスの融合誘発性とベクター複合体の形質導入の相関関係についても調べた。デキストラン硫酸はウイルスが媒介する融合を阻害することが示されている。デキストラン硫酸（DS）は、抗HLA-DRモノクローナル抗体含有ベクター複合体によって媒介される、β-galを含むDaudi細胞の形質導入を阻害する；対照21%β-gal陽性；２μg DS/ml 10%陽性；６μg DS/m1 6%陽性。この観察結果から、FP複合体によって媒介されるレトロウイルス粒子が細胞内へ入っていく機聯ウイルスの融合誘発性が重要な役割を果たすという結論が得られる。
６．４  エンベロープ/ストレプトアビジン融合タンパク質からなるアダプター
６．４．１．  pST-envピラスミドの構築
pST-envプラスミドは次のとおり構築した。エコトロピックAKVマウスレトロウイルスのクローン分離株で感染させたNIH3T3細胞系から、全AKV ＲＮＡを分離した。全ウイルスＲＮＡはゲノム全体を含む転写物及びenv遺伝子のみを含むスプライスされた転写物からなっている。転写物をSuperscript RNase H-逆転写酵素（Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD, USA）及びランダムな6量体プライマー（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）で逆転写した。マウスレトロウイルスAKVの公表されている遺伝子配列に基づき、プライマーをUniqueな５'領域（FP1:5'-GGACTAGT TCC GAA TCG TGG TCT CGC TGA-3'）、及びenv遺伝子のシグナルペプチドのカルボキシ末端（RP1:5'-GGG AAT TCCATATG GGG GTT GAC CCC TCC GAG-3'）となるようにデザインした。それぞれプライマーFP1及びRPIに組み込まれるSpeI及びNdeIの制限酵素配列は下線を付してあり、不規則にまとまっている。
env遺伝子の507塩基対部分（U5及びエンベロープタンパク質のシグナルペプチドを含む）はPCR（Perkin-Cetus Corpn. Norwald, CT, USA）でFP1とRP1をプライマーとして増幅した。この増幅された断片はTAクローニングベクターPCR II（Invitrogen Corp. San Diego, CA, USA）中の２個のEcoRIサイトの間に直接クローン化し、制限酵素消化及び配列によってチェックした。正しく挿入されたPCR IIベクターをNdeI及びKpnIで消化し、約4.4Kb長のNdeI-KpnI断片を作製した。プラスミドpTSAPA-2（第6.2.1.節で得た、ストレプトアビジン-プロテインＡキメラタンパク質をコードする挿入物を含むもの）を酵素NdeI及びKpnIで消化した。結果として得られた360塩基対の、切り取られたストレプトアビジンを含む断片は、U5+リーダーペプチドを含むPCR Eカットベクター中に連結された。862塩基対の正しい挿入物を持つクローンの一つであるPCRII-10b4STを、目的とする断片を遊離させるためにSpeI及びEcoRIで消化した。
AKV env遺伝子（pBKCMVベクターのSmaIサイトにクローン化した）（Lenz, S.ら，1982, J. Virol. 49:471-8）をBamI-H及びHindIIIで消化した。この結果完全長のp15Eを含みAKV gp70のプロリンリッチな領域をコードする1322塩基対の断片が得られた。BamHI-HindIII断片をSpeI-EcoR1断片と、末端に適合性がある２つのリンカーEB1（5'-AAT TCG GGA GGC GGT GGA TCA GGT GGA GGC GGT TCA GG-3'）、及びEB2（5'-GAT CCC TGA ACC GCC TCC ACC TGA TCC ACC GCC TCC CG-3'）を用いて連結した。
ストレプトアビジンをコードする挿入物及びAKVのenvBamHI-HindIII断片を、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子を持つpCEP4真核細胞発現ベクター中にクローン化し、キメラエンベロープ構築物pST-envを得た。図４にその構築物を図解してある。
AKV env遺伝子（nts 539-2191）のNspI-HindIII断片（これはgp70及びp15Eの可変部Ａ（vrA）をコードする）、又はenv遺伝子（nts. 871-2191）のEsp3I-KpnI断片（p15Eのみをコードする）のいずれかを有するストレプトアビジンを含む融合タンパク質を作製した。これらの融合タンパク質はパッケージング細胞系中で発現され、enｖ由来の融合タンパク質の一部分は、トランスフェクトされたパッケージング細胞系によって作られたウイルス粒子中への融合タンパク質のアセンブルを指示するためには十分である。プラスミドpST-envは1994年12月22日付でATCC No. 69730として寄託した。
６．４．２．パッケージング細胞系のトランスフェクション
pST-envをψ-2BAGαエコトロピックMLVパッケージング細胞系にCaPO4及びリポフェクチン法でトランスフェクトした。最初に、細胞表面でのストレプトアビジン発現をビオチン化IgG及び125Ｉ-プロテインＡでトランスフェクションの３日後に調べた。pST-envをトランスフェクトされたψ-2BAGα細胞はAKV envでトランフェクトされた対照より高いビオチン結合活性を示した。ヒグロマイシンで選択した後トランスフェクトされたクローンのいくつかを取り、ストレプトアビジン発現を、FITC-biotin Xを用いてFACS分析で調べた。クローンのいくつかは蛍光の単相性シフトを示し、これは細胞表面でのストレプトアビジン発現を示していた。
サブクローンからウイルス含有上清を採取し、無血清非選択培地で一晩インキュベートしコンフルエントとなるまで増殖させた。ウイルス上清をビオチン化抗HLA-DRモノクローナル抗体と室温で30分間インキュベートし、次いでバーキットリンパ種Daudi細胞に添加し37℃で4時間インキュベートした。感染３日後、lacZ染色フローサイトメトリー（Molecular Probe, Inc.）で感染細胞を調べた。陰性対照感染はψ-2BAGα細胞から同様に採取したウイルスを用いて行った。図5Aと5Bの比較に示すとおり、pST-envでトランスフェクトされた細胞系の上清で形質導入したDaudi細胞の20%はβ-gal関連染色があり、非改変ψ-2BAGα上清で形質導入した対照のDaudi細胞では2.7%のβ-gal関連染色が見られたのみであった。この結果はストレプトアビジン-env融合タンパク質アダプターを含むエコトロピックMLVの産生を示している。
本発明はここに記述した特定の実施態様、それらは本発明の個々の態様の一つの説明を意図したものであるが、それらの範囲に限定されるものではなく、機能的に同等な方法及び構成要素は本発明の範囲内にある。事実、ここに記述した事柄に加えて本発明に種々の改変を加えることは当業者にとっては前述の説明及び図から自明なことであろう。そのような改変は本発明の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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