(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼランガムを培地担体とし、活性炭及び血清アルブミンを含まないことを特徴とするレジオネラ属菌培養鑑別用透明培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レジオネラ属菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）の培養に有用な透明培地に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
レジオネラ属菌は、土壌や水などの環境や臨床材料中に存在するグラム陰性桿菌であり、近年、クーリングタワー等の空気調和設備の環境水中で発育し、肺炎をひき起こすことから問題とされている菌である。
【０００３】
しかしながら、レジオネラ属菌の発育条件は、他の細菌の発育条件と異なり、非常に厳しいため、この菌は、限られた培地でしか発育させることができない。このような培地としては、次のものが開発されている。
最初に発育が確認され、培養に用いられた培地は１％イソバイタルＸ（ＢＢＬ社）と１％ヘモグロビンを添加したミューラーヒントン（ＭＨ−ＩＨ）培地（１９７８）である。次に開発されたのはフィーリイ−ゴーマン（Ｆ−Ｇ）培地（１９７８）で、カゼインペプトンやデンプンなど基礎培地にＬ−システインとピロリン酸鉄を添加した透明培地である。しかしながら、これらの培地はレジオネラ属菌の発育の点で必ずしも満足し得るものではなかった。
【０００４】
その後、最もレジオネラ属菌の発育を支持する培地としてＢＣＹＥα培地（１９７９）が考案された。ＢＣＹＥα寒天培地は、寒天、ＡＣＥＳ緩衝剤〔Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸〕、ＫＯＨ、酵母エキス、システイン、ピロリン酸鉄、α−ケトグルタル酸に活性炭末を加えた組成からなる黒色培地で、選択剤を添加したレジオネラ属菌分離用培地（例えばＣＣＶＣ培地、ＷＹＯ培地）とともにレジオネラ属菌用培地として最も一般的に使用されるに至っている（田村ら、新細菌培地学講座・下II、第二版、２０９−２１４、１９９０；奥田ら、感染症学雑誌、第５８巻、１０号、１０７３−１０８２、１９８４）。
【０００５】
しかしながら、ＢＣＹＥα寒天培地は、寒天中に菌の発育阻害物質である不飽和脂肪酸を含むため、活性炭を添加してこれを無害とすることが必要である。しかし、活性炭は不溶性であるため、培地に均一に分散させるのは難しく、特に大量に培地を製造する場合には、煩雑で特殊な技術を必要とするという欠点があった。また、この培地は、活性炭のために培地色が黒色となり、レジオネラ属菌の鑑別目的としたpH指示薬、発色基質、蛍光基質の添加や混釈培養法へ適用が困難であると共に、活性炭が薬剤を吸着するため、薬剤量を増加しなければならないという問題があった。
【０００６】
ＢＣＹＥα寒天培地のこのような問題点を解決するものとしてＬＴ培地（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｒｍｏｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（１９９０）６５−７１）が開発されている。しかし、この培地は特殊な組成であり、活性炭の代りに血清アルブミン等の高価な薬剤を必要とするため、極めてコストがかかり一般的でない。
【０００７】
参考のため、上記の培地の組成を次の表１及び表２に示す。
【０００８】
【表１】
0004021969.tif 000002
【０００９】
【表２】
0004021969.tif 000003
【００１０】
従って本発明の目的は、活性炭や高価な薬剤を必要とせず透明で、かつ安価に製造し得るレジオネラ属菌培養用培地を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、従来、培地担体として用いられていた寒天に代えて、微生物産生粘質物たるゼランガムを培地担体として用いれば、活性炭や血清アルブミン等を添加する必要がなく、発育性に優れた透明なレジオネラ属菌培養用培地が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、ゼランガムを培地担体とし、活性炭及び血清アルブミンを含まないことを特徴とするレジオネラ属菌培養鑑別用透明培地を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるゼランガムは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａが菌体外に産出する多糖類を分離・精製したもので、次の式
【００１４】
【化１】
0004021969.tif 000004
【００１５】
で表わされるように、グルコース−グルクロン酸−グルコース−ラムノースの４つの糖分子の繰り返し単位よりなる多糖類であり、すでに植物組織培養用の培地固化剤として、ジェランガム又はＧｅｌｌａｎ  Ｇｕｍの製品名で市販されているものである。しかし、レジオネラ属菌のような特殊な菌の培地に用いられた例はない。
【００１６】
ゼランガムは、培地中に０．５〜１．５ｗ／ｖ％、特に０．８〜１ｗ／ｖ％配合するのが好ましい。
【００１７】
また、培地には、ゼランガムのゲル化を促進するためのＮａ+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+等の１価及び／又は２価の金属塩が添加される。斯かる金属塩としては微量でゲル化せしめる２価の金属塩が望ましく、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2ＯやＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ等を挙げることができ、その添加量は、０．０００５〜０．０５Ｗ／Ｖ％が好ましい。ここで金属塩は１種でも２種以上を混合して用いてもよい。
【００１８】
本発明の培地には、更にレジオネラ属菌が発育するために必要な栄養分やその他の成分が添加される。このような成分としては、従来のレジオネラ菌の培地に用いられている栄養分やその他の成分、例えばＢＣＹＥα培地に用いられているＡＣＥＳ、酵母エキス、α−ケトグルタル酸、Ｌ−システイン、ピロリン酸鉄、水酸化カリウム等、ＭＨ−ＩＨ培地又はＦ−Ｇ培地に用いられるカザミノ酸、ビーフエキストラクト、Ｌ−システイン、ヘモグロビン末、ピロリン酸鉄等が例示される。これら成分の使用量は、それぞれ従来の培地で定められた量比、すなわち前記表１又は表２に示す量比とすることが好ましい。また、必要により、レジオネラ属菌以外の細菌や真菌の発育抑制又は抗菌効果を有する薬剤を添加し選択培地としてもよい。
【００１９】
本発明の培地を調製するには、まずＬ−システインとピロリン酸鉄等の変質し易い成分を除いた各培地成分を精製水に溶解し、pHを６．９に調整した後、高圧蒸気滅菌等で滅菌し、６０℃程度の恒温槽に保持する。次にＬ−システインとピロリン酸鉄等の変質し易い成分をそれぞれ別々の精製水に溶解し、濾過滅菌等を行った後、前記恒温槽中に添加する。これを滅菌シャーレ等に分注し、放冷固化すれば、本発明の培地が得られる。
【００２０】
なお、本発明の培地のゲル強度は、ゼランガムの濃度等により決定されるが、平板培地の場合、２００〜１２００ｇ／cm2程度が好ましく、特に４００〜８５０ｇ／cm2とすることが好ましい。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のレジオネラ属菌培養用培地は、従来の寒天培地中に含まれる発育阻害物質が存在しないため、これを吸収するための活性炭や高価な薬剤を必要とせず調製も容易である。また、本発明培地は透明であるため、培地にブロムチモールブルーやブロムクレゾールパープルなどの色素を添加することで菌種に特異的な色調を呈する。これは、ＢＣＹＥα寒天培地に添加した場合に比べより明瞭となるため、レジオネラ属菌の鑑別が容易となる。更にまた、培地にレジオネラ属菌が産生する酵素の活性の指標となる発色基質や蛍光基質を添加し、レジオネラ属菌を鑑別することができる。
【００２２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  本発明培地とＢＣＹＥα培地とのレジオネラ属菌の発育性能の比較：
イ）培地調製法
Ｌ−システインとピロリン酸鉄を除く表３及び表４に示す各培地成分を精製水９００mlに溶解し、pH６．９に調整する。それらに対し高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）を施し、滅菌後は６０℃の恒温槽に保持する。Ｌ−システインとピロリン酸鉄を各々別に５０mlの精製水に溶解し、濾過滅菌（孔径０．２２μｍ）を施し、恒温槽中の培地に添加する。
これらの培地を滅菌シャーレに２０mlずつ分注し、放冷固化させる。
【００２４】
【表３】
0004021969.tif 000005
【００２５】
【表４】
0004021969.tif 000006
【００２６】
ロ）評価法
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ７５７１を供試菌株とし、ＢＣＹＥα培地上に発育した同株を滅菌精製水に懸濁（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．３程度）し、それを１０-7まで同液で希釈し、１０-4〜１０-7までの菌液から各々５０μｌ採取し、各培地に摂取した。
発育程度は３７℃好気下で５日間培養し、培地上に発育したコロニー数から比較した。
結果を表５に示す。表中の数字はコロニー数を示し、＋は十分発育したことを示し、ＮＧは全く発育しなかったことを示す。
【００２７】
【表５】
0004021969.tif 000007
【００２８】
ハ）結果
表５からゼランガム培地はＢＣＹＥα培地と同等の発育を示すこと、ＢＣＹＥα培地から活性炭だけを除いた培地では全く発育しないことが分かった。このことから、レジオネラ属菌の培養用培地のゲル化物質としてゼランガムを用いることで、活性炭などのこれまで発育阻害物質吸着剤として不可欠な成分が不要となり、安価に調製でき、かつ付加価値の高い透明培地が調製できることを確認した。