(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮成長因子及び繊維芽細胞成長因子の組み合わせを含む、神経的な疾病、障害または損傷を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
更に、成長、増殖、分化、栄養、調節効果またはこれらの組み合わせ効果がある他の分子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該分子が、アクチビン、アンフィレグリン、Ｂｃｌ−２遺伝子産物、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ−２）、脳由来向神経因子（ＢＤＮＦ）、繊毛向神経因子（ＣＮＴＦ）、ＥＧＦ様リガンド、グリア由来向神経因子（ＧＤＮＦ）、ヘパリン様分子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-1）、インターロイキン、マクロファージ炎症タンパク（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レチノイン酸、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）からなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
更にヘパラン硫酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
更に神経前駆細胞を遺伝修飾するための遺伝物質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該遺伝物質がウイルス構築物中に含まれる、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
該ウイルス構築物がレトロウイルス構築物である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
該遺伝物質が、成長因子、成長因子レセプター、神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、神経ペプチド、成長因子合成酵素及び神経伝達物質合成酵素からなる群より選ばれた神経物質をコードする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
投与が必要な患者の中枢神経系の脳室への投与に適する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該投与が浸透ポンプにより行われる、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該医薬組成物が投与が必要な患者の中枢神経系の脳室への送達に適した浸透ポンプ内に含有されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該脳室が前脳の側脳室であるか、または患者の脊髄における中心管であるか、または静止状態の幹細胞を含むCNS脳室組織であるか、またはこれらの組み合わせである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該患者が霊長類である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該神経障害が、卒中、頭部損傷、及び脳性麻痺からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該神経障害が、うつ病、てんかん及び精神分裂病からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該神経障害が、神経変性疾患、脱髄性疾患及び低髄性疾患からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症またはこれらの組み合わせである、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該脱髄性疾患が、多発性硬化症を含む、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該繊維芽細胞成長因子が酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）または塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）またはこれらの組み合わせである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）における内在性前駆細胞の遺伝子又は後成的発現手段による原位置（生体内）修飾及び操作並びにＣＮＳ前駆細胞の原位置修飾及び操作を誘導するための組成物に関する。更に詳細には、本発明は、ＣＮＳに物質を送達する伝達体として使用するために原位置（生体内）の内在性前駆細胞を直接操作するか又はそれらを誘導して分裂、分化及び移動して機能障害細胞又は損傷もしくは疾患のために消失した細胞を置き換えるために操作する方法に関する。
発明の背景
哺乳動物神経系の発達は、胎児発生の早い段階で始まり、生後の初期まで続く。哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）は３種類の細胞：ニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞から構成される。ニューロンは主に胎児期間に発生するが、希突起膠細胞及びアストログリア細胞は生後の初期に発生する。生後の後期までに、ＣＮＳは完全な神経細胞になる。
種々の組織に見られる多くの他の細胞と異なり、成体哺乳動物ＣＮＳの分化した細胞は分裂周期に入る能力及び新しい神経細胞を発生させる能力をほとんど又は全くもたない。アストログリア細胞の限られた及び緩慢な代謝回転があり［Korrら,J.Comp.Neurol 150:169,(1971)］、希突起膠細胞の前駆細胞［Wolsqijk & Noble,Development 105:386,(1989)］が存在することは考えられているが、新しいニューロンの発生は生じない。わずかな哺乳動物種（例えば、ラット）は歯状回及び嗅神経球のような成体脳制限領域に新しいニューロンを発生させる限られた能力を示す［Kaplan,J.Comp.Neurol.195:323,(1981);Bayer,N.Y.Acad.Sci.457:163,(1985)］、これは全ての哺乳動物に当てはまらず；更に、成体霊長類においては新しいＣＮＳ細胞の発生は生じない［Rakic,Science 227:1054,(1985)］。このほとんどの哺乳動物（特に霊長類）において新しい神経細胞を作ることができないことは、長期記憶保持には有利なことであるが、損傷又は疾患のために消失したニューロン細胞を置き換えることが求められる場合には欠点であることは明らかである。
ＣＮＳ障害は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば、卒中、頭部損傷、脳性麻痺）及び多数の機能障害（例えば、うつ病、てんかん及び精神分裂病）のような多くの罹患を包含する。近年、これらの障害のために非常に危険な状態の初老人口が広がっているために神経変性疾患が重要な関心事になってきた。アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の場所の神経細胞の変性に関連しており、これらの細胞又は脳領域がその意図した機能を行うことができなくなる。神経変性疾患のほかに、急性脳損傷はたいてい神経細胞の消失、罹患した脳領域の不適切な機能化及び引き続き行動異常を引き起こす。おそらくＣＮＳ機能障害の最大面積は、神経細胞の消失によって確認されないでむしろ現在の神経細胞の異常機能化によって確認される。これは、ニューロンの不適切な点火又は神経伝達物質の異常合成、放出及び処理によるものである。これらの機能障害はうつ病及びてんかんのような十分に研究及び確認されたものもあれば、神経症及び精神病のような理解の少ない疾患もある。
現在まで、ＣＮＳ障害の治療は、主に医薬化合物の投与によるものであった。残念ながら、このタイプの治療は血液脳関門をこえて薬剤を輸送する限られた能力及びこれらの薬剤を長期間投与する患者によって獲得される薬剤耐性を含む多くのやっかいな問題を伴った。例えば、パーキンソン病患者におけるドーパミン作動性の部分的回復は血液脳関門をこえることができるドーパミン前駆体である左旋性ドーパで得られた。しかしながら、患者は左旋性ドーパの効果に耐性になり、その効果を維持するためにますます用量の増加が必要である。更に、増加した及び制御できない運動のような左旋性ドーパに伴う多数の副作用がある。
最近、神経組織移植の概念がパーキンソン病のような神経変性疾患の治療に適用された。
神経障害を治療するために出現するテクノロジーは、宿主神経細胞の消失又は異常機能化を置き換えるか又は打ち消すためにＣＮＳに細胞を移植することを必要としている。胎児性ＣＮＳ細胞はヒト試験に良好な結果を与え［Winderら,New Eng.J.Med.327:1556,(1992)］かつ好ましい供与組織であるが、これらの細胞の使用を制限する倫理的及び政治的問題のために他の種類の供与組織が開発されている。これらは、遺伝的に修飾した神経細胞系［Renfranzら,Cell 66:173,(1991);Synderら,Cell 68:1,(1992)］、線維芽細胞［Kawajaら,J.Neurosci,12:2849,(1992)］、筋細胞［Jiaoら,Nature 363:456,(1993)］、グリア、前駆細胞［Grovesら,Nature 362:453,(1993)］及び莢膜性細胞［Hoffmanら,Exp.Neurol.132:100,(1993)］が含まれる。
移植方法は神経障害に現在用いうる治療より著しい改良を表すが、多数の重要な欠点をもっている。例えば、移植の際にある種類の細胞は宿主組織を組込まない。他の欠点は、供与体と宿主間の免疫不適合が移植細胞の拒絶を生じることである。また、移植した細胞が腫瘍形成を引き起し、供与組織から宿主へ感染物質を移すこともできる可能性がある。移植方法の別の重要な欠点は、主な神経外科手術に関係した危険を伴うその方法の侵入力のために、健康な脳組織に対する損傷が生じることである。
Leblond［NCI Monograph,14:19,(1963)］は、成体哺乳動物組織を集団内の細胞代謝回転率に基づいて３つのカテゴリーに分類した。
１．神経系のような静的集団、分裂がほとんど又は全くなく、発達中に形成された細胞は動物の生存の間存続する。
２．肝臓のような条件により更新する細胞集団を有する組織、正常な条件下でほとんど細胞分裂がないが、適切な刺激に応答して新しい細胞が発生することができる。
３．血液及び扁平上皮のような連続的に更新する集団、分化した細胞は寿命が短く、幹細胞と呼ばれる細胞の亜集団によって連続的に置き換えられる。
幹細胞の同定する決定的な特徴は、自己更新を示すか又は多くのそれ自体を発生する能力である。幹細胞の最も簡単な定義は、自己維持能を有する細胞であろう。幹細胞の説得力のある定義（なお過度に単純化した）はPotten & Loefflerによって提供され［Development 110:1001,(1990)］、幹細胞を“ａ）増殖、ｂ）自己維持、ｃ）多数の分化した機能後代、ｄ）損傷後の組織の再生、及びｅ）これらの選択の使用における可変性の可能な分化しない細胞”として定義した。
幹細胞の役割は、正常細胞の死滅、損傷又は疾患によって消失した細胞を置き換えることである。具体的な種類の組織内に幹細胞が存在すると、通常、細胞の代謝回転の高い組織と相互関係がある。しかしながら、この関係は、幹細胞が細胞の代謝回転の高くない組織内に存在すると考えられるので常に保持されるものではない［例えば、肝臓；Travis,Science,259:1829,(1993)］。
哺乳動物ＣＮＳにおける細胞の低代謝回転により、成体哺乳動物ＣＮＳが細胞の損傷又は疾患後の細胞の消失に応答して新しい細胞を発生させることができないことと共に成体哺乳動物ＣＮＳが幹細胞を含有しないという仮定が導かれた。しかしながら、最近生体外で幹細胞の特性を示す細胞がＣＮＳから単離された。この細胞は、胚内に［Reynoldsら,J.Neurosci.12:4565,(1992)］成体まで［Reynolds & Weiss,Science 255:1707,(1992)］存在し、成体ＣＮＳは損傷又は疾患に応答して新しい細胞を発生させないが、新しい細胞の発生能及び増殖による修復能並びに造血系と同様の方法で幹細胞及びそれらの子孫の分化を有する。
ＣＮＳ障害を治療するための療法について従来技術に付随した制限及び欠陥を考慮すると、当該技術において損傷又は疾患のために消失した細胞を置き換えることを含むＣＮＳ障害の治療方法が求められているが、侵入的な移植方法及びその方法に付随した欠点を含まないことは明らかである。更に、医薬化合物に伴う課題のために、化合物をＣＮＳに他のＣＮＳ細胞によって直接送達し、もって、注入ポンプの使用と血液脳関門を克服することを含むＣＮＳ障害の治療方法が当該技術において求められている。
発明の要約
本発明の目的は、内在性前駆細胞をＣＮＳ内で増殖／分化及び／又は移動することを誘導することにより損傷、疾患又は機能障害のために消失した細胞を置き換える方法を提供することである。
また、本発明の目的は、内在性前駆細胞の遺伝的又は後成的操作によって物質をＣＮＳに送達する方法を提供することである。
更に、本発明の目的は、原位置の内在性ＣＮＳ前駆細胞を増殖、分化及び／又は移動を誘導するために及び／又はＣＮＳ前駆細胞を遺伝的に修飾するために用いられる組成物を提供することである。
また更に、本発明の目的は、内在性前駆細胞の後成的操作によって幹細胞の生体外収量を増大させる方法を提供することである。
これらの目的は、以下に開示される方法によって行われる。本発明の他の目的及び特徴は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から図面と共に用いると当業者に明らかになるであろう。
神経前駆細胞の原位置増殖の方法であって、１種以上の成長因子が中枢神経系の脳室に投与して前駆細胞の増殖を誘導する方法が記載される。
神経前駆細胞の原位置遺伝子修飾方法であって、遺伝物質をＣＮＳ脳室に投与して前駆細胞を感染させる方法が記載される。遺伝物質は、成長因子、成長因子レセプター、神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、神経ペプチド、成長因子合成酵素及び神経伝達物質合成酵素からなる群より選ばれた神経物質をコードする。
また、前駆細胞の生体外増殖方法であって、１種以上の成長因子を生きている哺乳動物のＣＮＳ脳室に投与する工程、そのＣＮＳ脳室の内層の組織を切除する工程、その組織を解離して前駆細胞を分離する工程、及びその前駆細胞をその細胞の増殖を誘導する成長因子を含有する培地に曝す工程を含む方法が記載される。
また、消失又は損傷した神経細胞に起因する神経障害に罹患している哺乳動物の治療方法であって、その消失又は損傷した神経細胞を置き換えるために１種以上の成長因子を哺乳動物のＣＮＳ脳室に投与してその脳室の内層の前駆細胞の原位置増殖、移動及び分化を誘導する方法が記載される。
図面の説明
図１ａ−１ｃは、成体脊髄円錐から単離した幹細胞から発生した分化した細胞を示す図である。脊髄円錐を含む組織は、成体マウスから解剖した。幹細胞を単離し、２０ng/mlのＥＧＦとｂＦＧＦの共存下に培養した。ＭＡＰ−２（図１Ａ）、ＧＦＡＰ（図１Ｂ）及びＯ４（図１Ｃ）の各々に対する抗血清による三重標識間接免疫細胞化学によって示されるようにニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞を生じた。
図２は、種々のチミジン死滅処理の後の脳室上衣下で増殖する細胞数を示す図である。対照マウスはトリチウム化チミジン（３Ｈ−チミジン）投与せず、１００％の増殖脳室上衣下細胞集団を有するとみなした。細胞の構成的に増殖する集団を死滅するために０日目に一連の注射を投与したマウスは、８日目に対照値の８５％を有した。０日及び２日目に一連の３Ｈ−チミジンを注射したマウスは、最後の注射の８日後（１０日目）に対照値の４５％を有した。０日及び４日目に一連の３Ｈ−チミジンを注射したマウスは、１２日目に対照値の８５％を有した。これは、幹細胞が最初の死滅の２日後に増殖機序を回復すること及びほとんどが４日目までに再び静止状態になったことを示す。
図３は、生体内で種々の３Ｈ−チミジン処理を受けたマウスから生体外で生じた神経小球数を示す図である。マウスに、図２に示された同じ一連の注射を投与した。対照マウスに食塩水を注射した。マウスを最後の３Ｈ−チミジン注射の１６〜２０時間後に犠牲にし、脳を切除し、各チミジン死滅処理後に生じた神経小球数を算定するために培養した。０日目に３Ｈ−チミジンを投与した（本来増殖する脳室上衣下細胞を死滅する）マウスは、対照動物として同じ小球数を生じ、構成的に増殖する脳室上衣下細胞が生体外で単離した幹細胞源でないことが示される。２日目に第２の一連の注射を投与したマウスは、対照値に相対して４５％の神経小球を生じた。４日目に第２の一連の注射を投与したマウスは、対照値とほぼ同程度の多数の神経小球を生じ、表皮成長因子のような成長因子の存在下に生体外で単離される神経小球形成多分化能性幹細胞が生体内の脳室上衣下内で相対的に静止状態の幹細胞に由来することが示される。
図４ａ及び図４ｂは、側脳室に生体内ＥＧＥ注入に応答した脳室上衣下のレトロウイルス標識前駆細胞の増殖及び移動を示す図である。図４ａ及び図４ｂのマウスは、前脳の側脳室に注入したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するコンピテントでない複製レトロウイルスを有した。更に、図４ｂのマウスは、注射と同じ部位に移植した３３μg/mlＥＧＦを充填した浸透ミニポンプを有した。６日後に双方のマウスの脳を固定し、β−ｇａｌ組織化学処理した。対照マウスでは（図４ａ）、レトロウイルス標識細胞（白い矢印）は側脳室壁に近接して残った。ＥＧＦ注入を投与したマウスは、多数の標識細胞を有した。更に、ＥＧＦ注入マウスの増殖した細胞は、側脳室壁から離れて移動した（棒は２００μmを表す）。
図５は、側脳室への生体内ＥＧＦ注入が生体外で生じた神経小球数を劇的に増大させることを示す図である。マウスを犠牲にする６日前に、３３μg/mlＥＧＦ充填注入ポンプで処理した。引き続き、２０ng/mlＥＧＦの存在下に側脳室壁を培養すると、生体外で９日後に生じた神経小球数が同じ６日間食塩水を注入した対照マウスに比べて４倍の増加をもたらした。
図６ａ及び図６ｂは、１回の一連の３Ｈ−チミジン注射後（図６ａ）及び第１の注射の２日後に投与した第２の一連の３Ｈ−チミジン注射後（図６ｂ）の脳室上衣下の増殖する細胞数を再構成するためにかかる時間を示す図である。図６ａに示されるように、１回の一連の注射の１日後に脳室上衣下細胞が対照値（３Ｈ−チミジン注射なし）に相対して１０％だけ増殖していた。時間が経つにつれて増殖する細胞数が連続的に増加し、８日までに増殖する脳室上衣下の細胞数が対照値に戻った。第２の一連の注射を第１の注射の２日後に投与すると、図６ｂに示されるように（白い丸）、幹細胞数が使い尽くされ、増殖する集団が対照値の５０％まで減少した。第２の一連の注射を第１の注射の４日後に投与すると（白い四角）、脳室上衣下を再び占めるように回復する幹細胞数は細胞サイクルから出てもはや増殖しなかった。従って、４日目の第２の一連の注射によって死滅した。この場合には、増殖する脳室上衣下の細胞数は、第２の一連の注射の８日後に対照値の８５％に戻った。
図７は、成長因子の投与の１日及び２１日後のＣＤ1マウスの処理及び未処理脳室下帯（ＳＶＺ）及び黒質部（ＳＮ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ｍＲＮＡの相対量を示す図である。ＣＭＦ＝ラットＢ４９グリア細胞系からの順化培地＋ＦＧＦ（２５μg/ml）＋ヘパラン硫酸（１０IU/ml）。Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳ＝ＥＧＦ（２５μg/ml）＋ｂＦＧＦ（２５μg/ml）＋ヘパラン硫酸（１０IU/ml）＋２５％ウシ胎児血清。ＳＡＬ＝食塩水。ＮＣＳＶＺ＝カニューレ挿入していない脳室下帯。
発明の詳細な説明
定義
“幹細胞”とは、増殖することができかつ分化した又は分化可能な娘細胞も生じることができる多数の前駆細胞の発生能を有する多くの幹細胞を生じる相対的に静止状態の未分化の細胞を意味する。
“神経幹細胞”とは、ニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞に分化することができる子孫を生じることができる多分化能性幹細胞を意味する。
“前駆細胞”とは、ＣＮＳ幹細胞に由来する未分化の細胞を意味する。前駆細胞は、増殖能が限られかつ自己更新することができない。特定の分化経路に委ねられ、適切な条件下で最後にはニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞に分化する。
“希突起膠細胞”とは、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索の周囲のミエリンを形成する分化したグリア細胞を意味する。希突起膠細胞は、表現型ガラクトセレブロシド（＋）、ミエリン塩基性タンパク（＋）及びグリア原線維酸性タンパク（−）［ＧａｌＣ（＋）、ＭＢＰ（＋）、ＧＦＡＰ（−）］を有する。
“ニューロン”とは、表現型ニューロン特異的エノラーゼ（＋）、神経フィラメント（＋）、微小管会合タンパク（＋）又はＴａｕ−１（＋）［ＮＳＥ（＋）、ＮＦ（＋）、ＭＡＰ−２（＋）又はＴａｕ−１（＋）］を有する分化したニューロン細胞を意味する。
“アストログリア細胞”とは、ＧＦＡＰ（＋）、ＧａｌＣ（−）、ＭＢＰ（−）である分化したグリア細胞を意味する。
“神経小球”とは、神経幹細胞に由来しかつ生体外で培養した細胞クラスターを意味する。細胞は少なくともネスチン（＋）表現型を有するものがある。クラスターは、幹細胞及び／又は前駆細胞から構成され、分化した細胞を含んでも含まなくてもよい。
“前駆細胞”とは、生体内又は生体外で神経幹細胞に由来する本発明の方法によって修飾又は操作した生細胞を意味し、前駆細胞と幹細胞の双方を含む。生体外で、前駆細胞は典型的には神経小球の形で生育するが、培養条件下によって種々の成長パターンを示すことがある。前駆細胞は、脳室上衣下に見られるが、このＣＮＳ領域に限定されない。
“成長因子”とは、タンパク質、ペプチド又は前駆細胞に成長、増殖、分化、栄養又は調節効果がある他の分子（単独で或いは他の成長因子と組合わせて）のような生物因子を意味する。成長因子の例としては、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、アクチビン、アンフィレグリン、Ｂｃｌ−２遺伝子産物、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ−２）、脳由来向神経因子（ＢＤＮＦ）、繊毛向神経因子（ＣＮＴＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ様リガンド、グリア由来向神経因子（ＧＤＮＦ）、ヘパリン硫酸のようなヘパリン様分子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-1）、インターロイキン、マクロファージ炎症タンパク（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レチン酸、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）等が挙げられる。
“神経物質”とは、ＣＮＳ細胞の機能化に有効な生物活性物質を意味する。例えば、神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、成長因子、成長因子レセプター等及びこれらの物質の合成に用いられる酵素を包含する。
“脳室”とは、脳脊髄液が流動する中枢神経系内の腔又は通路を意味する。即ち、側脳室、第三脳室及び第四脳室を包含するだけでなく、中央管及び中脳水道を包含する。
“脳室組織”とは、ＣＮＳ脳室の内層の組織を意味し、ＣＮＳ幹細胞及び前駆細胞を含む未分化の細胞の集合を含む脳室上衣下を含む。
“構成的に増殖する集団”とは、成体哺乳動物前脳の側脳室の脳室上衣下内に位置した分裂する細胞の集団を意味し［Smart;J.Comp.Neurol.116:325,(1961)に略述されている］、脳室上衣下のある領域で細胞の約３３％をつくる［Morshead & van der Kooy,J.Neurosci.12:249,(1992)］。
“遺伝物質”とは、成長因子、成長因子レセプター、神経伝達物質、神経伝達物質レセプター、神経ペプチド、成長因子合成酵素及び神経伝達物質合成酵素からなる群より選ばれた神経物質をコードするＲＮＡ及びＤＮＡを意味する。遺伝物質は、当該技術において既知の遺伝子修飾法を用いて生体外又は生体内で前駆細胞を感染させるために用いられる。
好適実施態様の説明
成体哺乳動物ＣＮＳからの幹細胞の生体外単離及び確認
ＣＮＳ幹細胞は報告されており、それらの潜在的使用は記載されている［Reynolds & Weiss,Science 255:1707(1992);Reynoldsら,J.Neurosci 12:4565(1992);Reynolds & Weiss,Restorative Neurology and Neuroscience 4:208(1993)］。更に、これらの細胞の有用性は公開されたＰＣＴ出願の国際出願第93/01275号、同第94/16718号、同第94/10292号及び同第94/09119号に記載されている。他の哺乳動物組織に見られた幹細胞のように、ＣＮＳ幹細胞は自己維持及び多数の子孫--これらはニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞が含まれる--を発生することが可能である。
ＣＮＳ前駆細胞は、成体哺乳動物ＣＮＳから下記実施例２並びに上記で言及したReynolds & Weissの発表及びＰＣＴ出願に記載される方法によって単離及び培養することができる。要するに、表皮成長因子（ＥＧＦ）応答幹細胞は、少なくとも１種の成長因子の存在下に培地中で生育される。培地は、無血清規定培地であることが好ましい。増殖を誘導するために用いられる成長因子としては、前駆細胞を増殖する栄養因子が含まれ、細胞の表面上のレセプターに結合して細胞に栄養又は成長誘導効果を示す。増殖効果を有する好ましい成長因子としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ及びＴＧＦαが含まれる。成長因子の種々の組も用いることができる。好ましい組合わせは、ＥＧＦとａＦＧＦ又はｂＦＧＦである。
ある種の成長因子は、前駆細胞の増殖に調節作用を有する。これらの成長因子は、上述の増殖誘導成長因子と組合わせて用いて、例えば、増殖を高めるかもしくは遅らせるか又は前駆細胞の子孫の表現型を変えることにより調節することができる。増殖に調節効果を示す成長因子としては、ヘパラン硫酸、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、アクチビン、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ−２）、繊毛向神経因子（ＣＮＴＦ）、レチン酸、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、マクロファージ炎症タンパク（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン及びＢｃｌ−２遺伝子産物が挙げられる。
成長因子又は成長因子の組合わせを誘導する増殖は、未分化の前駆細胞のクラスターを生じるように分裂するＣＮＳ幹細胞の増殖を誘導する。細胞のクラスターは、ＧＦＡＰ、神経フィラメント（ＮＦ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）又はＭＢＰに免疫反応性でない。しかしながら、クラスター内の前駆細胞はネスチン、未分化のＣＮＳ細胞に見られる中間フィラメントタンパクに免疫反応性である。ネスチンマーカーは、Lehndahlら［Cell 60:585-595(1990)］によって確認された。前駆細胞の子孫から分化される４種類の細胞に伴う成熟表現型は、ネスチン表現型に主に陰性である。
ＥＧＦ等のマイトジェンの継続して存在するときには、神経小球内の前駆細胞は分裂し続けて神経小球のサイズ及び未分化の細胞数の増加がもたらされる［ネスチン（＋）、ＧＦＡＰ（−）、ＮＦ（−）、ＮＳＥ（−）、ＭＢＰ（−）］。この段階で、細胞は非接着性であり、神経小球の自由浮動クラスター特性を形成する傾向がある。しかしながら、培養条件は、前駆細胞がネスチン表現型をなお発現するが、特有の神経小球を形成しないようにように変動させてもよい。マイトジェンを除去した後、細胞は基質（ポリオルニチン処理プラスチック又はガラス）に付着し、平らになり、ニューロン及びグリア細胞に分化し始める。この段階で、培地は０．５〜１．０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清を含んでもよい。２〜３日以内に、ほとんどの又は全ての前駆細胞がネスチンに対する免疫反応性を失い始め、各々ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰ及びＧａｌＣに対する免疫反応性によって示されるようにニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞に特異的な抗原を発現し始める。
ニューロンの同定は、また、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、神経フィラメント及びニューロン特異的タンパクｔａｕ−１に対する免疫反応性を用いて行われる。これらのマーカーは非常に信頼できるので、ニューロンの同定に主として有効であることは続くが、ニューロンを特異的神経伝達物質表現型に基づいて同定することもできる。
二重標識免疫蛍光及び免疫ペルオキシダーゼ法を用いて、分化した神経小球クラスターについて神経伝達物質の発現、ある場合には神経伝達物質合成に関与する酵素を分析することができる。また、原位置ハイブリッド形成組織化学は、ペプチド神経伝達物質に特異的なｃＤＮＡ又はＲＮＡ又は神経伝達物質合成酵素ｍＲＮＡを用いて行われる。これらの手法は、免疫細胞化学法と組合わせて特定の表現型の同定を高めることができる。必要な場合には、上記で論じた抗体及び分子プローブをウエスタン及びノーザンブロット法に各々適用して細胞同定を援助することができる。
ニューロン或いはアストログリア細胞に特異的な中間フィラメントを発現しない細胞は、正しい一時的な方法で希突起膠細胞に特異的なマーカーを発現し始める。即ち、細胞はまずＯ４（細胞表面抗原）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ、ミエリン糖脂質）、最後にミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）に免疫反応性になる。これらの細胞は、また、特有の希突起膠細胞形態学を有する。
ＣＮＳ幹細胞は、脊髄円錐（図１ａ〜図１ｃ参照）、頸及び胸脊髄、脳幹及び視床下部を含む種々の成体ＣＮＳ領域から単離された。これらの例の各々において、単離したＣＮＳ幹細胞は自己維持を示しかつニューロン、アストログリア細胞及び希突起膠細胞を含む多数の子孫を生じる。即ち、幹細胞は成体哺乳動物ＣＮＳの多数の領域に存在する。
生体内の成体哺乳動物ＣＮＳからの幹細胞の確認及び操作
ＣＮＳ幹細胞を生体外で単離、増殖及び分化する上記に記載される手法は、下記の生体内手法に適応して同様の結果を得ることができる。これらの細胞のその生体内操作及び修飾は、損傷又は疾患のために消失した細胞を内在的に置き換え、もって、異種細胞を患者に移植する必要を不要にする。更に、細胞を生体内で修飾又は遺伝子操作することができるので神経障害の治療に有効な種々の生物学的物質を発現する。
通常、成体哺乳動物ＣＮＳは、前脳の側脳室の内層の脳室上衣下部を除いて成体内で分裂的に静止状態である。この領域は、構成的に増殖する細胞の亜集団を細胞周期時間１２．７時間で含有する。ＢｒｄＵ及び増殖する細胞のレトロウイルス標識から、新たに生じた細胞のいずれも成熟ニューロン又はグリアに分化せず他のＣＮＳ領域に移動しないことが明らかである。
脳室上衣下内の一定数の細胞の連続的増殖及び維持は、２つの機序により説明される。各々の分裂後の娘細胞の１つの死滅は、増殖する集団を一定数に維持する。構成的に分裂する集団は最後には死滅し、脳室上衣下内の相対的に静止状態の細胞の亜集団は構成的に分裂する集団を再び占めることができる。増殖脳室上衣下集団を維持するというこの幹細胞様機序は、細胞の寿命が短くかつ幹細胞と呼ばれる相対的に静止状態の細胞の亜集団によって再び占められる他の組織に類似している。
実施例１に詳述されるように、生体内のこれらの増殖する細胞のレトロウイルス感染、引き続き非希釈マーカーとしてβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）リポーター遺伝子発現を使用する実験から、成体マウス生存時間が増加するにつれて（レトロウイルス感染後の２８日まで）β−ｇａｌ陽性脳室上衣下細胞が進行的に消失する。生存マウス１日に相対して、レトロウイルス注射６日後にβ−ｇａｌ陽性細胞の４５％が消失し、レトロウイルス感染２８日後に９７％が消失する。レトロウイルスＤＮＡを含有する単細胞を同定するために繰り込まれたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、β−ｇａｌ発現細胞の消失が細胞死までのレトロウイルス的に感染した細胞の消失によるものであり、β−ｇａｌ発現を止めるためでないことが求められた。
ＢｒｄＵ（分裂する細胞のＤＮＡに組込まれるチミジン類縁体）を腹腔内注射すると、脳室上衣下のある領域内の細胞の３３％が本来分裂する集団をつくることが明らかである（下記実施例９参照）。ＢｒｄＵ標識細胞数は、時間が経つにつれて減少する。ＢｒｄＵ標識の３０日後までに、分裂する細胞のわずか３％がなお標識されている。ＢｒｄＵ注射の３０日後の少数の細胞の重い標識により、標識細胞が注射時に分裂していたことが証明されかつ３０日間相対的に静止状態であったことが示される。これは、これらの細胞が構成的に増殖する集団の細胞より幹細胞であることを意味する。
上記の２つの例は、成体寿命を通して見られた増殖する脳室上衣下細胞の一定数の維持には構成的に増殖する集団を補充しかつ自己更新するために散発的に増殖する相対的に静止状態の細胞の存在を必要とするという仮定を支持している。
実施例５に詳述されるように、構成的に分裂する脳室上衣下細胞はＳ相期間より少ない間隔で細胞周期の期間放射性チミジンの高い用量を注射することにより死滅させることができる。死滅１日後に増殖する集団は対照の１０％であり、８日までに増殖する集団は対照レベルに戻る。補充した集団が本来静止状態の細胞を増殖機序へ回復することによる場合には、幹細胞が脳室上衣下を占めるように子孫を生じる時間の第２の死滅が構成的に増殖する集団内の細胞数を変えなければならない。最初の死滅の２日後に第２の死滅が行われる場合、８日後に構成的に増殖する集団は対照値（チミジン死滅処理しないマウス）又は０日の１回のみ死滅のマウスの４５％だけである（図６ｂ参照）。脳室上衣下の増殖する細胞数の減少は、第２死滅の３１日後でさえ６３％に維持される。第２死滅が４日目に行われる場合、増殖する集団は８日後に対照値の８５％に戻る。これらの結果から、本来静止状態の幹細胞が最初の死滅後の最初の２日以内に増殖機序に回復すること及び４日までに幹細胞が脳室上衣下を占めるようにもはや回復する必要がないことが示される（図２参照）。
下記の実施例６に詳述されるように、実験は生体外の幹細胞が構成的に増殖する集団に由来するか静止状態の集団に由来するかを求めるために行った。マウスを次の方法の１つで処理した。
グループ１．  対照
高用量の放射性チミジンを投与した。
グループ２．  ０日目
グループ３．  ０日と２日目
グループ４．  ０日と４日目
最後の注射の後に、マウスを犠牲にし、下記実施例２に記載される方法により線条体（脳室上衣下部を含む）から幹細胞を単離した。
グループ２〜４の構成的に増殖する集団が死滅した。グループ３の細胞周期に回復して増殖する脳室上衣下細胞を占める幹細胞も死滅した。
生体外で生じた神経小球数
グループ１．  １００％（対照）
グループ２．  １００％
グループ３．  ４５％
グループ４．  ８５％
これらの結果から、脳室上衣下の構成的に増殖する細胞のほぼ全てが排除されると、生体外で単離及び増殖することができる幹細胞数に影響しないことが証明される（グループ１対グループ２及び４）。しかしながら、本来静止状態の細胞が死滅し脳室上衣下を占めるように回復すると（グループ３のように）、生体外で単離することができる幹細胞数は顕著に減少する（グループ３対グループ１及び２）。最初の死滅の４日後までにほとんどの幹細胞がもはや代謝回転しなくなり、結果として第２の一連のトリチウム化チミジン注射によって死滅しない（従って、５５％減少［グループ３］に比べて１５％だけ減少［グループ４］）。
上記の結果から、生体外の幹細胞が生体内の脳室上衣下細胞の静止状態の集団に由来することが証明される（図３参照）。これにより、なぜ幹細胞が構成的に増殖する細胞の亜集団をもたない前脳以外のＣＮＳ脳室領域に由来することができるかも説明される。即ち、脳室上衣下細胞の構成的に増殖する集団と側脳室の相対的に静止状態の幹細胞間の関係を求めたので、生体内でより効果的に操作するためにこれらの細胞集団の特性を利用することができる。この手法は、種々の神経障害の治療に内在性細胞の使用及び操作を可能にする。生体外の細胞の増殖及び分化に影響するいくつかの因子もまた生体内で同じ効果を得る。即ち、例えば、細胞は生体外実験で求めた指定された成果をもたらす成長因子及び成長因子の組合わせを投与することにより原位置で操作することができる。例えば、細胞が具体的な分化経路を辿るように誘導される国際出願第94/10292号に開示された生体外分化法は本明細書に記載された方法を用いて修飾して生体内で同様の結果が得られる。成長因子は、定位脳注入、浸透ポンプの移植又は他の適切な方法によって脳室に投与される。
静止状態の神経幹細胞は、脳室領域近傍のＣＮＳにわたって位置する。前脳内に側（第一及び第二）脳室がある。第三脳室は、前脳の下部の腔である。中脳の腔は、環状の中脳水道であり、第三脳室と後脳内の腔、第四脳室と連結する。中心管は、脊髄内の脊髄液の通路である。
ＣＮＳ幹細胞が脳室の内層の組織に位置するという事実は、原位置のこれらの細胞の修飾及び操作並びにＣＮＳの種々の領域に罹患する種々の神経疾患、障害及び損傷の最後の治療にいくつかの利点を与える。これらの治療法は、それに応じて合わせることができるので、罹患した領域近傍の脳室の周囲の幹細胞が本明細書に記載される方法を用いて原位置で操作又は修飾される。脳室系はほぼ全ての脳領域に見られ、罹患面に容易に接近することが可能である。成長因子又はウイルスベクターを含む組成物に曝すことにより幹細胞を修飾したい場合には、組成物を脳室に投与する装置を移植することが比較的簡単である。例えば、浸透ポンプに取り付けたカニューレを用いて組成物が送達される。また、組成物は脳室に直接注入される。これにより、損傷又は疾患の結果として損傷した領域へＣＮＳ幹細胞子孫を移動させることができる。更に、多くの脳領域に対して極めて近接した脳室が幹細胞又はその子孫により分泌した神経物質の拡散を可能にする。
ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び主に前脳に罹患する他の神経障害の治療の場合、成長因子又は他の神経物質が前脳の脳室に送達されて幹細胞の原位置修飾又は操作に影響する。例えば、パーキンソン病は、脳、特に線条体における低レベルのドーパミンの結果である。患者自身の静止状態の幹細胞を誘導して生体内で分裂し始めること及びこれらの細胞の子孫を誘導して線条体の罹患領域内のドーパミン作動性細胞に分化し、ドーパミンのレベルを局所的に高めることが有利である。本来、ドーパミン作動性ニューロンの細胞体は、黒質及び中脳の隣接領域に線条体に突出している軸索と共に位置する。脳内のドーパミン作動性ニューロンの誘導に関する従来技術は、中脳組織の操作に集中している。パーキンソン病を治療するための従来の方法は、通常、薬剤のＬ−ドーパの使用を含み、線条体内のドーパミンレベルを高めるものである。しかしながら、薬剤耐性及び副作用を含むこの治療に関しては欠点がある。また、ドーパミンを生じる胎児性組織はかなりの成功でヒトパーキンソン患者の線条体に移植された。しかしながら、論争の的になる治療方法であるほかに、組織拒絶及び感染を含む異種組織の移植に伴う危険がある。
本発明の方法及び組成物は、パーキンソン病の治療に薬剤の使用及び論争の的になる使用の代替を提供するものである。線条体内のドーパミン細胞のレベルは、成長因子を含む組成物を側脳室に投与することにより高められる。特に好ましい組成物は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及び硫酸ヘパリンを含む。組成物は、また、血清を含むことが好ましい。この組成物を投与した後、線条体の脳室下領域、本来ドーパミン作動性細胞体を含まない領域においてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（ドーパミン細胞のマーカー）に対するメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の転写が顕著に増大する。これらの方法及び結果は、実施例１１に詳細に記載される。実施例１２に詳述されるように、ＢｒｄＵ＋及びＴＨ＋細胞の分布を示す二重標識組織は、成長因子の生体内投与に応答してＴＨ＋細胞体が線条体組織に生じることを示している。これらの新たに生じたＴＨ＋細胞もＢｒｄＵ＋である。
多発性硬化症及び他の脱髄性又は低髄性疾患の治療及び筋萎縮性側索硬化症又は他の運動ニューロン疾患の治療の場合、成長因子又は他の神経物質は中心管に送達される。本発明の方法によって治療される他の疾患及び障害は、ＰＣＴ出願の国際出願第93/01275号に開示されている。
脳室のすぐ周囲のＣＮＳ組織を治療するほかに、ウイルスベクター、ＤＮＡ、成長因子又は他の神経物質をＣＮＳ中に循環するために腰椎槽に容易に投与することができる。
正常な条件下脳室上衣下前駆細胞は分化又は移動せず、むしろそれらの最期はまだはっきりしない数の細胞分裂後の細胞死であると考えられる（前記Morshead & Van der Kooy）。この説明は、上記のようにＰＣＲの証拠によっても支持される。成長因子を側脳室に注入するとこの最期が変わる。下記実施例１に詳細に記載されるように、レトロウイルスを引き続き６日間側脳室に注入した。ＥＧＦ充填浸透ポンプに取り付けたカニューレを側脳室にレトロウイルス注入（１又は６日後）と同じ日に移植すると、６日後にＲＶ−β−ｇａｌ標識細胞の全体数が増加する（平均２０細胞／脳から１５０細胞／脳に）。
レトロウイルス注入後６日間発現しないレトロウイルスＤＮＡを含む細胞が存在しないことは、上記ＰＣＲ実験から既知である。即ち、これらの結果は、β−ｇａｌ陽性細胞数のＥＧＦ誘導増加がレトロウイルス的に標識した構成的に増殖する集団のクローンサイズの増大によるものであることを示している。また、この増加の一部は、相対的に静止状態の幹細胞のＥＧＦによる活性化によることも可能である。
おもしろいことに、β−ｇａｌ標識細胞数のこの増大は、これらの細胞が内側に及び外側に（おそらく吻側に及び尾側に）脳室上衣下から離れて約４００μmの距離まで（図４参照）移動し、引き続き分化することを伴う。即ち、ＥＧＦ又は類似の成長因子の注入は、生体内の神経幹細胞及び前駆細胞の増殖、移動及び分化を誘導し、損傷又は疾患のために消失した神経細胞を置き換えるために治療上使用することができる。好適実施態様においては、ＥＧＦとＦＧＦが一緒に又は連続して投与される。
構成的に増殖する細胞集団の正常な最期（即ち、細胞死）は、Ｂｃｌ−２を投与するか又はｂｃｌ−２遺伝子で細胞を遺伝的に修飾することにより変えることができる。遺伝子産物は、様々な種類の細胞においてプログラムされた細胞死（アポトーシス）を防止することが既知である。ＥＧＦ実験と同様に、構成的に増殖する細胞集団のクローンの増大が得られる。
本明細書に記載される生体内手法は、ＣＮＳ幹細胞及び前駆細胞を遺伝的に修飾するために用いられる。細胞の有効な遺伝子修飾は本発明の範囲内である。例えば、細胞は神経伝達物質、成長因子等の神経物質を生産するか又はその生産を増加するために修飾される。遺伝子修飾は、ＣＮＳ脳室領域の内層の細胞に組換え体レトロウイルスを感染させるか或いは当該技術において既知の方法を用いてトランスフェクトすることにより行われる［Maniatisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N,Y.(1982)参照］。現在既知の又は後に開発される遺伝子修飾の方法を用いることができる。直接ＤＮＡトランスフェクションに関しては、細胞は粒子衝撃、レセプター仲介送達及びカチオンリポソームにより修飾される。キメラ遺伝子構築物が用いられる場合、通常、ウイルス、例えば、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；所望のタンパクをコードする構造遺伝子の発現に対する哺乳動物細胞特異的プロモーター、例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、神経フィラメント（ＮＦ）タンパク（ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈ等）が含まれる。
レトロウイルス構築物を本来静止状態の幹細胞を遺伝的に修飾するために用いるべきである場合には、本明細書に記載される方法を用いてこれらの細胞の増殖を誘導することが好ましい。例えば、レトロウイルスを感染する数日前に、浸透注入ポンプを用いて成長因子を中心管に送達することができる。これにより、レトロウイルスの感染を受けやすい活性的に分裂する神経幹細胞があることが確かめられる。
遺伝子修飾が生物活性物質の生産のためであると、その物質は、通常、或るＣＮＳ障害の治療に有効であるものとなる。例えば、ある種の成長因子産物を分泌するように細胞を遺伝的に修飾することが所望される。ＣＮＳ障害の治療に有効な成長因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来向神経因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ−３、ＮＴ−４／ＮＴ−５）、繊毛向神経因子（ＣＮＴＦ）及び他のサイトカイン、アンフィレグリン、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞は、また、ある種の成長因子レセプターを発現するために生体内で修飾される。その成長因子レセプターとしては、ｐ７５低親和性ＮＧＦｒ、ＣＮＴＦｒ、ニューロトロフィンレセプターのｔｒｋファミリー（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ）、ＥＧＦｒ、ＦＧＦｒ及びアンフィレグリンレセプターが挙げられるがこれらに限定されない。
細胞は、セロトニン、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルエピネフィリン、エピネフィリン、タキキニン、サブスタンスＰ、エンドルフィン、エンケファリン、ヒスタミン、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）、グリシン、グルタミン酸塩、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アセチルコリン等の種々の神経伝達物質又はそのレセプターを生じるように操作される。有効な神経伝達物質合成遺伝子としては、ＴＨ、ドーパ、脱炭酸酵素（ＤＤＣ）、ＤＢＨ、ＰＮＭＴ、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、トリプトファン水酸化酵素、ＣｈＡＴ及びヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられる。ＣＮＳ障害の治療に有効である種々の神経ペプチドをコードする遺伝子としては、サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ（ＮＰ−Ｙ）、エンケファリン、バソプレシン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）、グルカゴン、ボンベシン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）等が挙げられる。
ＣＮＳ幹細胞の生体外増殖技術の改良
哺乳動物ＣＮＳから生体外で単離した前駆細胞数の絶対収量は、成長因子又は成長因子の組合わせ、例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ又はＥＧＦとＦＧＦ共にを上記のように原位置の脳室に注入することにより劇的に増加することができる。下記実施例１０に詳述されるように、ＥＧＦをマウス前脳の側脳室に注入した６日後に、脳室の壁を切除し、幹細胞を採取した。ＥＧＦを側脳室に注入すると、神経小球を生じるように増殖する幹細胞の収量の効率が高まった。
ＣＮＳ幹細胞の増殖のための生体外テクノロジーのこの技術的改良は、幹細胞が後に患者に移植するために採取される場合に貴重であり、もって、最初の手術を１）少ない組織が切除されるために小さな外傷にし、２）１回の手術につき幹細胞の高い収量が生体外で増殖するために効率がよい。更に、生体外で増殖すれば、患者の幹細胞はＰＣＴ出願の国際出願第94/16718号に記載されている技術を用いて生体外で遺伝的に修飾することもできる。生体外遺伝子修飾は、遺伝物質を感染させるにつれて制御が必要である場合の原位置技術よりある種の環境では望ましいことがある。
本明細書に記載される本発明が更に完全に理解されるように、下記の実施例を示す。これらの実施例は具体的に説明するためのものであり、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでないことは理解されねばならない。
実施例１
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するコンピテントでない複製レトロウイルス［Walsh & Cepko,Science 241:1342,(1988)に記載されている］をＣＤ１成体雄マウス（２５〜３０ｇCharles River）の前脳側脳室に注入した。注入したレトロウイルスをWalsh & Cepkoの方法（前記）に従ってＢＡＧ細胞系（ATCC CRL-9560）から採取した。マウスを６５mg/kgi.p.ナトリウム−ペントバルビタールを用いて麻酔した。０．２〜１．０μlのレトロウイルスの一側性定位脳注入を１μlのハミルトン注射器を用いて側脳室に注入した。注入座標は、ＡＰ＋４.２mmラムダの前方、Ｌ±０.７mm及びＤＶ−２．３mm硬膜の下であり、口のバーは耳のラインの下−２mmであった。
レトロウイルス注入の１日又は６日後と同じ日に３．３〜３３０μg/mlのＥＧＦで充填した０．５μl／時間ALZET浸透ミニポンプに取り付けた注入カニューレを側脳室に上述のように同じ定位脳座標で外科的に移植した。この注入カニューレキットはALZAから入手した。注入カニューレはペデスタルの２．７mm下で切断した。ポンプは、アクリルセメント及び注入部位に対側及び尾側の頭骨ねじを用いてマウス頭骨に固定した。浸透ミニポンプは、左前足の腋窩の下及び後ろの皮下に位置し、ポリエチレン管によって注入カニューレに接続した。
ＥＧＦ注入開始の６日後に、マウスをナトリウム−ペントバルビタールを過剰投与して犠牲にした。マウスを２％緩衝化パラホルムアルデヒドで経心臓的に潅流し、脳を切除し、２％緩衝化パラホルムアルデヒド中２０％スクロースで一晩後固定した。冠状切片を３０μmの切片にする−２０℃で調製した。切片をMorshead & Van der Kooy（前記）によりβ−ｇａｌ組織化学に対して展開した。
これらの条件下、レトロウイルス注入後の日にちに無関係にＥＧＦを注入すると、平均２０細胞／脳から平均１５０細胞／脳までβ−ｇａｌ標識細胞の集団の増大及び側脳室の内層から離れたこれらの細胞の移動がもたらされた（図４参照）。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、３３μg/mlを注入すると、β−ｇａｌ標識細胞数の増加がもたれされるが、この増加は移動を伴わなかった。ＥＧＦとＦＧＦを共に注入すると、２０細胞／脳から平均３５０細胞／脳にβ−ｇａｌ標識細胞の集団の更に大きな増大がもたらされた。
これらの結果は、ＦＧＦが脳室上衣下層において相対的に静止状態の幹細胞の生存因子であるが、ＥＧＦが構成的に増殖する集団の本来死滅している子孫の生存因子として作用するものであることを意味する。ＥＧＦとＦＧＦが共に注入されるとβ−ガラクトシダーゼ細胞数の相乗増加が、相対的に静止状態の幹細胞と構成的に増殖する前駆細胞間の直接会合に反映する。
実施例２
病原体を含まない雌のＣＤ１白マウス［生後３〜１８ヵ月；Charles River（ＣＦ１及びＣＦ２株は同じ結果を生じた）］の脳室上衣下部を含む線条体を解剖し、１mmの冠状切片に鋏を用いて手で切断し、室温において９５％Ｏ2−５％ＣＯ2で通気した１２４mMＮａＣｌ、５mMＣＫｌ、１．３mMＭｇＣｌ2、２mMＣａＣｌ2、２６mMＮａＨＣＯ3及び１０mMＤ−グルコース（ｐＨ７．３５、約１８０ミリオスモル）を含有する合成脳脊髄液（ａＣＳＦ）に移した。１５分後、組織切片を１．３３mg/mlのトリプシン（９０００ＢＡＥＥ単位／mg）、０．６７mg／mlのヒアルロニダーゼ（２０００単位／mg）及び０．２mg/mlのキヌレン酸を含有する３２〜３５℃において９５％Ｏ2−５％ＣＯ2で通気した１２４mMＮａＣｌ、５mMＣＫｌ、３．２mMＭｇＣｌ2、０．１mMＣａＣｌ2、２６mMＮａＨＣＯ3及び１０mMＤ−グルコース（ｐＨ７．３５、約１８０ミリオスモル）を含有する低Ｃａ2+ａＣＳＦで充填した磁気スターラーを備えた攪拌フラスコ（Bellco Glass）に移した。９０分後、組織切片を摩砕５分前に標準ａＣＳＦに移した。組織を０．７mg/mlオボムコイド（Sigma）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ａ：１、Gibco）培地に移し、焼いて細くしたパスツールピペットで機械的に摩砕した。細胞を無血清培地［これは規定ホルモンミックス及びインスリン（２５μg/ml）、トランスフェリン（１００μg/ml）、プロゲステロン（２０nM）、プトレッシン（６０μM）及び塩化セレン（３０nM）を含む塩混合物；グルコース（０．６％）；グルタミン（２mM）；重炭酸ナトリウム（３mM）；及びＨＥＰＥＳバッファー（５mM）を含んだ］及びＥＧＦ［２０ng/ml、マウス下顎腺（Collaborative Research）から精製］又はヒト組換え体（Gibco／ＢＲＬ）を含有する非被覆３５mm培養皿（Costar）に播種した（１０００生存できる細胞／プレート）。細胞を３〜１０分間沈降させ、その後に培地を吸引し、新しいＤＭＥＭ／Ｅ−１２／ホルモンミックス／ＥＧＦを加えた。５〜１０日後、生体外の小球（神経小球）数を各３５mm皿で計数した。
実施例３
ヒトｂｃｌ−２遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物を成体マウス側脳室に微小注入する。対照マウスにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のみ含有するレトロウイルス構築物を注入する。成体側脳室の構成的に増殖する脳室上衣下細胞の各々の２子孫の１つが分裂後数時間で死滅する。ｂｃｌ−２遺伝子産物は、他の数組織においてプログラムされた細胞死を防止する。成体脳室上衣下において、β−ガラクトシダーゼとｂｃｌ−２遺伝子を共に感染させた単細胞を両方のこれらの遺伝子産物の発現によってマークされる。これらの細胞は、脳組織切片中でβ−ガラクトシダーゼとヒトＢｃｌ−２に特異的な抗体で同定される。そのように感染した増殖する感染脳室上衣下細胞は、対照に相対して多数の細胞／クローンを生じる。即ち、Ｂｃｌ−２は、構成的に増殖する成体脳室上衣下細胞の各分裂の１つの本来死滅する子孫の生存を誘導する。更に、ｂｃｌ−２感染した子孫は、線条体及び中隔組織に移動して新しいニューロンとグリアを生じる。これは、ＥＧＦ及びＢｃｌ−２が構成的に増殖する成体脳室上衣下細胞の本来死滅する子孫の生存因子として作用し、生体内で新しいニューロンとグリアを生じることを意味する。
実施例４
神経成長因子遺伝子を含むレトロウイルス構築物を微小注入して（実施例１の構築物のように）側脳室の構成的に増殖する成体脳室上衣下細胞に感染させる。即ち、これらの細胞を用いて成体脳内に内在性成長因子を与える。トランスフェクトされた細胞によって生じた神経成長因子のレベルは、ラジオイムノアッセイ及び（直接機能分析から）Gage & collaboratorsによって開発されたモデルの軸索損傷後の生体内の基底前脳コリン作動性ニューロンの救助によって直接測定される（P.N.A.S.83:9231,1986）。
実施例５
構成的に増殖する脳室上衣下細胞を死滅させるために、成体雄ＣＤ１マウスに３Ｈ−チミジンの一連の腹腔内注射（０．８ml／注射、比活性４５〜５５mCi/ミリモル、ICN Biomedical）を０日目（３回注射、４時間毎に１回）に投与した。０．５、１、２、４、６、８又は１２日目に、マウスにＢｒｄＵ注射を２回１時間離して投与し（実施例９参照）、最後の注射の０．５時間後に犠牲にした。
死滅後１日目に細胞の１０％が増殖し、８日までに増殖する細胞数が８５％に達し（図６ａ参照）、対照値と統計的にあまり変わらなかった。マウスを犠牲にし、脳を切除し、実施例９に記載されるように処理した。
第２グループのマウスにおいて、３Ｈ−チミジン注射を０日目に投与した（３回注射、４時間毎に１回）後に、２又は４日目に同じ一連の注射を投与した。マウスを８日間生存させた後に、第２の一連の注射を投与し（各々９、１０及び１２日目に）、その時にＢｒｄＵを２回注射し、０．５時間後に犠牲にした。マウスを犠牲にし、脳を切除し、実施例９に記載されるように処理した。
２日目の第２の一連の注射後、対照値に相対して増殖する集団の４５％だけ戻った。これは、増殖機序に回復するにつれて２日目に投与した第２の一連の注射が幹細胞を死滅させたことを意味する（図６ｂ参照）。４日目に投与した第２の一連の注射は８日目までに対照値に戻り、このときまでには、幹細胞はもはや増殖しなくなり、４日目の一連の注射によって死滅しなかった（図６ｂ）。
実施例６
成体雄ＣＤ１マウスを４つのグループに分けた。グループＡのマウスに０日目に一連の３Ｈ−チミジンを注射した（３回注射、４時間毎に１回）。グループＢ及びＣのマウスに一連の３Ｈ−チミジンを０日目に注射した後、第２の一連の注射を２又は４日目に投与した。グループＤのマウスには、グループＡと同じ時間の経過で３Ｈ−チミジンの代わりに生理食塩水を注射した。全てのグループからのマウスを最後の一連の注射の１６〜２０時間後に頸部脱臼により犠牲にした。脳を切除し、前脳の側脳室の周囲の脳室上衣下を解剖し、注射パラダイムの各々に従って生じた小球数を評価するために実施例２に記載されたように培養した。各脳からの細胞を２つの３５mmウェルに播種した。生体外で６及び８日目に全小球数を３５mmウェルの各々にて計数した（図３参照）。
一連の食塩水を注射した対照マウスは、３Ｈ−チミジンを０日目に投与したマウスと同数の小球を生じた（本来増殖する脳室上衣下細胞を死滅させる）。これは、構成的に増殖する脳室上衣下細胞が生体外で単離した幹細胞源でないことを意味する。第２の一連の注射を２日目に投与したマウスは、４５％の小球数を生じた（生体内に認められた増殖する脳室上衣下細胞数と同様）。第２の一連の注射を４日目に行うと、生体外で生じた小球数は対照値とあまり変わらず、生体内知見と相互関係があった。一緒にすると、このデータは、ＥＧＦの存在下に生体外で単離される多分化能小球が生体内の脳室上衣下内の相対的に静止状態の幹細胞から生じることを意味する。
実施例７
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウイルス構築物を間脳の第三脳室、脳幹の第四脳室及び脊髄の中心管に微小注入する（実施例１のように）。次に、ＥＧＦ及びＦＧＦを含むミニポンプを用いてレトロウイルス構築物が投与された脳室系の同じ部分に成長因子を６日間連続投与する（実施例１のように）。これにより、生存しかつ新しいニューロン及びグリアを生じる第三脳室、第四脳室及び脊髄の中心管近傍の組織に移動するβ−ガラクトシダーゼ産生細胞数の増加が生じる。
実施例８
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウイルス構築物を実施例１のように成体側脳室に微小注入する。次に、ＥＧＦ、ＦＧＦ又はＥＧＦとＦＧＦを共に含むミニポンプを用いて実施例１のように６日間側脳室に成長因子を連続投与する。感染した脳室上衣下細胞が線条体に移動するにつれて、抗体との免疫蛍光及び（直接機能分析から）一側性６−ヒドロキシドーパミン障害によって生じた旋回傾向の克服能によって直接測定されるようにドーパミンを生じるニューロン細胞に分化する。
実施例９
前脳内の側脳室の内層の脳室上衣下における構成的に増殖する細胞の全てを標識するために、成体雄ＤＣ１マウス（２５〜３０ｇ、Charles River）にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Sigma、６５mg/kg）を全５回の注射に対して２時間毎に腹腔内（i.p.）に注射した。１ヵ月後、マウスにペントバルビタールを過剰投与して犠牲にし、４％パラホルムアルデヒドを用いて経心臓潅流した。脳を切除し、２０％スクロースを含む４％パラホルムアルデヒドに一晩後固定した。脳切片をクリオスタット（３０μm）で切断し、洗浄バッファー［０．１M リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２と１％正常ウマ血清及び０．３％トリトンX-100］に集めた。切片を１M ＨＣｌ中で６０℃において０．５時間インキュベートし、次に洗浄バッファーで３回（各々１０分）洗浄した。最後の洗浄後、切片を抗ＢｒｄＵ（Becton Dickinson、１：２５）中４℃で４５時間インキュベートした。一次抗体中でインキュベートした後、切片を３回洗浄し、ビオチニル化ウマ抗マウス二次抗体（Dimension Lab、１：５０）中室温で１時間インキュベートし、次に３回洗浄した。次に、切片をアビジン結合ＦＩＴＣ（Dimension Lab、１：５０）中室温で１時間インキュベートし、最後に３回洗浄した。切片をゼラチン被覆スライドに載せ、風乾し、フルオロマウントでカバースリップした。ニコン蛍光顕微鏡を用いてスライドのＢｒｄＵ陽性細胞を調べた。吻側の脳梁の閉鎖と尾側の前交連の交差間の切片の８試料において側脳室の周囲の脳室上衣下内のＢｒｄＵ陽性細胞を計数した。一連のＢｒｄＵ注入の３１日後に、脳室上衣下細胞の３％がなお一連の注入の直後に犠牲にした対照マウス（対照１００％）に比べて標識された。
実施例１０
ＥＧＦポンプを実施例１に記載されているように移植した。ポンプを移植した６日後にマウスを頸部脱臼により犠牲にした。脳を切除し、幹細胞を単離し、実施例２に記載されているように計数した。
図５に示されているように、犠牲にする６日前にマウスの側脳室にＥＧＦを注入し、脳培養は同じ６日間食塩水ポンプを与えた対照マウスに比べて生体外で９日後に生じる小球の４倍もあった。即ち、前駆細胞を切除する前に生体内で側脳室にＥＧＦを注入すると、生体外で増殖及び神経小球を生じる幹細胞の収量が著しく増大する。
実施例１１
成体雄ＣＤ1マウスを麻酔し、定位脳装置に入れた。ALZETミニポンプに取り付けたカニューレを各マウスの側脳室に移植した。ミニポンプを皮下に移植し、これを用いて（ａ）順化培地（ラットＢ４９グリア細胞系から、D Schubert,Salk Instituteから入手）＋ｂＦＧＦ（R&D Systems、２５μg/ml）＋ヘパラン硫酸（Sigma、１０IU/ml）（ＣＭＦ）又は（ｂ）ＥＧＦ（Chiron、２５μg/ml）＋ｂＦＧＦ（２５μg/ml）＋ヘパラン硫酸（１０IU/ml）＋２５％ウシ胎児血清（Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳ）又は（ｃ）対照として滅菌食塩水（ＳＡＬ）を側脳室に送達した。マウスの一群をデリバリー用法の完了１日後に犠牲にし、その他は２０日後に犠牲にした。これらのマウスの脳室下帯（ＳＶＺ）を解剖し、カニューレを挿入し処理した側をカニューレを挿入しない対照側から分離した。これらのマウスの黒質（ＳＮ）部も回収した。グアニジウムチオシアネート酸フェノール法を用いてこれらの組織から全ＲＮＡを抽出した［Chomzynski & Sacchi,Annal.Biochem.162:156,(1987)］。次に、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製した。これらのｃＤＮＡをチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の２５４ヌクレオチド領域をひとまとめに扱うように設計されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルによる電気泳動にかけ、次に正に荷電したナイロン膜に毛管ブロットした。ＴＨに対する放射性標識ｃＤＮＡプローブをろ紙ハイブリッド形成し、オートラジオグラフィーで検出した。オートラジグラフをデンシトメトリーで走査及び分析してカニューレを挿入しない対照ＳＶＺ及びＳＮにおける処理に応答したカニューレ挿入側のＳＶＺにおけるＴＨｍＲＮＡの相対レベルを得た。結果は、図７の棒グラフに示されている。処理１日後に分析したマウスでは、Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳを投与すると、ＣＭＳに応答して観察されたものに比べてＳＶＺにおけるＴＨｍＲＮＡのレベルが１１倍増加した。処理２１日後、Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳによる処理に応答して検出されたＴＨｍＲＮＡの量は１日後に検出されたものとほぼ同じであったが、ＳＡＬ処理ＳＶＺは検出できる限界より低くカニューレを挿入しないＳＶＺ対照と区別できないＴＨｍＲＮＡレベルであった。全ての処理によって、ＳＮは測定できる量のＴＨｍＲＮＡを有した。
実施例１２
分裂活性細胞を標識するために、雄ＣＤ1マウス（Charles River、生後約４〜６週）に２時間おきに２４時間かけてＢｒｄＵ（Sigma、１２０mg/kg）を腹腔内注射した。次に、実施例１１に記載された組成物ａ〜ｃ（ＣＭＦ、Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳ又は滅菌食塩水）を送達するためにALZETミニポンプに取り付けたカニューレを各マウスの側脳室の片側に移植した。
成長因子を投与した２４時間後にペントバルビタール麻酔剤の致死量を用いてマウスを犠牲にした。次に、マウスに１０mlの氷冷４％パラホルムアルデヒド溶液を心臓を介して潅流した。脳を切除し、線条体を含む嗅球から第３脳室まで伸びる領域の組織を解剖し、３０％スクロース／４％パラホルムアルデヒド溶液中４℃で一晩貯蔵した。次に、組織をドライアイスで凍結し、処理するまで−７０℃に保った。３０μmの冠状切片をクリオスタットを用いて切断し、その切片を４００μlのＰＢＳを加えておいた１２ウェル磁器製皿に入れた。切片を新しいＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１０％正常ヤギ血清／０．３トリトンX-100中で調製した次の一次抗体：抗ＴＨ（ウサギポリクローナル、１：１０００、Eugene Tech International Inc.；又は１：１００、Pel-freeze）及びマウス抗ＢｒｄＵ（１：５５、Amersham）と一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ヤギ抗ウサギローダミンとヤギ抗マウスフルオレセイン（Jackson）をＰＢＳ中で室温において５０分間用いた。次に、切片をＰＢＳで３回（各々１０分）洗浄し、ガラススライドに載せ、乾燥し、次にFluosave（Calbiochem #345789）を用いてカバースリップした。
脳室に関するＴＨ免疫反応性（ＴＨ＋）細胞又はＴＨ＋及びＢｒｄＵ＋細胞の位置のマッピングにより、ドーパミン作動性ニューロンの位置を求めた。側脳室に注入された食塩水に応答して、ＴＨ＋線維の正常集団が線条体に検出されたがＴＨ＋細胞体はこの領域に検出されなかった。ＣＭＦ処理により、線条体及び第三脳室の領域にＴＨ＋線維の正常集団のほかにＴＨ＋細胞体の検出が得られた。Ｅ＋Ｆ＋ＦＢＳ処理は、最大量のＴＨ＋細胞体の検出を生じる最も意味深い効果があった。ＴＨ＋細胞体のいくつかは、ＢｒｄＵも陽性であった。
実施例１３
パーキンソン病の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）障害ラットモデルを用いて側脳室に対する種々の組合わせの成長因子を投与することの影響を測定する。一側性６−ＯＨＤＡ障害をラットモデルで行い、旋回挙動が認められる。ミニポンプを、実施例１１に記載されたようにラットの皮下に移植する。ＥＧＦ（Chiron、２５μg/ml）＋ｂＦＧＦ（２５μg/ml）＋ヘパリン硫酸（１０IU/ml）＋２５％ウシ胎児血清を側脳室に連続的に投与する。対照ラットに食塩水を投与する。一側性６−ＯＨＤＡ障害によって生じた旋回傾向の克服能が認められた。
実施例１４
Charles Riverからの成体雄ＣＤ1白マウス（３０〜３５ｇ）をナトリウム−ペントバルビタール（０．４０mlの１０％溶液）で麻酔し、定位脳装置に入れた。頭蓋の背側部を縦に切開した。第四脳室（定位脳座標Ａ／Ｐ−７．０、Ｌ±０．３Ｄ／Ｖ−５．８）、中脳水道（Ａ／Ｐ−４．８、Ｌ±Ｄ／Ｖ−２．６）又は中心管（Ｄ／Ｖ−１．５）にカニューレを挿入した。このカニューレを、皮下に配置した２５μg/mlＥＧＦ（Becton 40001）及び／又は２５μg/mlｂＦＧＦ（R&D Systems 233-FB）を含有するALZET浸透ミニポンプに滅菌管で取り付けた。滅菌食塩水+０．１％マウスアルブミン（Sigma A3134）を含むポンプを対照として用いた。歯科用セメントで切開を閉じた。
手術の６日後、マウスに０．１５mlＢｒｄＵ（Sigma B5002）；０．００７％ＮａＯＨ／０．１M ＰＢＳ中１８mg/ml）を２時間毎に８時間注入した。最後の注入の０．５時間後に麻酔剤を過剰投与して犠牲にし、１０mlの氷冷滅菌食塩水、次に１０mlの氷冷ブーアン固定液（５％氷酢酸、９％ホルムアルデヒド、７０％ピクリン酸）を経心臓潅流した。頸脊髄部を解剖し、ブーアン後固定液（９％ホルムアルデヒド、７０％ピクリン酸）中４℃で一晩後固定した。翌日、この組織を１０％スクロース中で２時間、２０％スクロース中で２時間及び３０％スクロース中で一晩浸漬することにより凍結保護した。組織を粉末上ドライアイスで凍結し、−１８℃のTissue-Tek（Miles 4583）に取り付け、３０μmの縦の連続的切片をゲル抑制ガラススライドに載せた。各スライドは、同じマウスの脳からの側脳室の中の１以上の３０μmの冠状切片を含み正の対照として働く。スライドを処理するまで−８０℃に保った。免疫組織化学：スライドを０．１M ＰＢＳ中室温で３×１５分間ＰＢＳで洗浄し、１N ＨＣｌで３７℃で６０分間加水分解し、０．１M ＰＢＳ中室温で３×１５分間洗浄し、メタノール中６％Ｈ2Ｏ2に室温で３０分間入れ、０．１M ＰＢＳ中室温で３×１５分間洗浄し、０．１M ＰＢＳ中１０％正常ウマ血清（Sigma H-0146）中室温で２０分間インキュベートした。スライドを、１．５％正常ウマ血清及び０．３％トリトンを含有する０．１M ＰＢＳ中１：５０に希釈した抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Becton 7580）中室温で一晩インキュベートした。翌日、スライドを０．１M ＰＢＳ中室温で３×１０分ＰＢＳで洗浄し、ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター BA-2000）と室温で２時間インキュベートし、０．１M ＰＢＳ中室温で３×１５分間洗浄し、ＡＢＣ試薬（ベクター PK-2000）中室温で２時間インキュベートし、０．１M ＰＢＳ中室温で３×１５分間洗浄し、ＤＡＢ試薬で２〜４分間展開した。スライドをアクアポリマウント（Polysciences 18606）でカバースリップした。ＢｒｄＵ＋細胞数を頸脊髄切片に対して計数した。ＢｒｄＵ標識細胞が食塩水対照切片中にいくつか見られた。ＥＧＦ或いはｂＦＧＦで処理すると、対照と比べて見たＢｒｄＵ標識細胞数に顕著な増加が得られた。ＥＧＦ＋ｂＦＧＦの組合わせは、更に多量のＢｒｄＵ＋細胞／切片を生じた。
実施例１５
ＥＧＦとＦＧＦを側脳室（実施例１参照）（又は静止状態の幹細胞を含む他のＣＮＳ脳室領域）に注入する。次に、ＣＮＳ幹細胞を単離し、実施例２に記載されたような増殖法を用いて生体外で増殖した。この方法により、生じる幹細胞数の増加及び神経小球数の増加が得られる（図５参照）。この方法で生じた神経小球は、後にヒト成人ＣＮＳの変性した領域に移植するための供与細胞源として用いる。神経小球は、また、患者自身のＣＮＳ幹細胞からそれに応じて増殖し、患者に移植して戻すこともできる。
本明細書中に言及した文献は全て参考として引用する。