(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物Ｐ５２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５１）。
【請求項２】
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物Ｓ８７７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５２）。
【請求項３】
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物Ｓ１００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５３）。
【請求項４】
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物Ｓ１０１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５４）。
【請求項５】
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物Ｓ１０２３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５５）。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を好適な培地に培養し、該培地中にキシリトールまたはＤ−キシルロースを蓄積させ、該培地からキシリトールまたはＤ−キシルロースを採取することを特徴とするキシリトールまたはＤ−キシルロースの製造法。
【請求項７】
微生物Ｐ５２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７５１）をグルコースを含む培地に培養し、該培地中にエタノールを蓄積させ、該培地からエタノールを採取することを特徴とするエタノールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシリトールまたはＤ−キシルロース生産能を有する新規微生物およびキシリトールまたはＤ−キシルロース生産能を有する微生物を用いてキシリトールまたはＤ−キシルロースを製造する方法に関する。Ｄ−キシルロースはキシリトール製造の原料として、キシリトールは甘味料として食品分野等で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールの需要は今後増加することが予想される。キシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低く、蔗糖に匹敵する甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料として利用されている。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。そのためキシリトールの需要は今後増加することが予想される。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第4,008,285号に記載されるようなＤ−キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
しかし、植物材料を加水分解して得られるＤ−キシロースは価格が高いという問題点がある。これは、生産コストが高いことによる。例えば、植物材料の加水分解処理の収率が低いため、生成するＤ−キシリトールの純度は低くなる。このため、加水分解処理後に、イオン交換処理をして加水分解に用いた酸および色素を除去する。さらに、Ｄ−キシロースを結晶化して他のヘミセルロース性糖類を除去する。食品に適するＤ−キシロースを得るためにはさらなる精製が必要となる。これらイオン交換処理および結晶化処理が生産コストの上昇につながる。
【０００５】
そこで、出発材料が容易に手に入り、かつ生じる廃棄物の量が少ないキシリトールの製造法がいくつか開発されている。例えば、他のペンチオールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチオールのひとつがＤ−アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて製造することができる（Can.J.Microbiol.,31,1985,467-471、J.Gen.Microbiol.,139,1993,1047-54）。Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法としてはApplied Microbiology., 18, 1969, 1031-1035に、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC20121を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダンス（Acetobacter suboxydance）を用いてＤ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Candida guilliermondii var. soya）をＤ−キシルロースに作用させてキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００６】
また、ヨーロッパ特許出願公開第403392号および同第421882号には、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター(Acetobacter)属細菌、グルコノバクター(Gluconobacter)属細菌またはクレブジエラ(Klebsiella)属細菌を用いてＤ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次いでＤ−キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびＤ−キシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／Ｄ−キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。また、同キシロース／Ｄ−キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００７】
しかし、上記のキシリトール生産法は、発酵で生産したＤ−アラビトールを原料として、さらに多段階のステップにより変換する方法であるため、プロセスが煩雑になり、経済的にも抽出法に比べると満足のいくものではなかった。
【０００８】
そのため、グルコースを原料として、他の糖や糖アルコールのようにキシリトール又はＤ−キシルロースを一段階で発酵生産する能力を有する微生物が望まれていたが、これまでキシリトール又はＤ−キシルロースを生産する能力を有する菌の存在は報告されていない。
【０００９】
一方、遺伝子操作技術によりキシリトール発酵菌の育種が試みられている。クレブジエラ属細菌由来のアラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびピヒア（Pichia）属由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、アラビトール発酵菌（キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属またはチゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属に属する酵母）に導入した遺伝子組換え菌を用いて、グルコースからキシリトールの発酵生産が試みられている（WO94/10325号国際公開パンフレット）。しかし、上記の組換え菌では、グルコース400g/Lよりキシリトール15g/Lの生成が報告されているが、実用的な量の蓄積には至っていない。また、前記組換え菌は、他種の微生物由来の遺伝子を導入した組換え菌であり、安全性に関する情報は十分であるとはいえない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、グルコースからキシリトール又はＤ−キシルロースを発酵生産する能力を有する微生物、及び該微生物を用いたキシリトール又はＤ−キシルロースの製造法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、グルコースからキシリトール及びＤ−キシルロースを発酵生産する能力を有する微生物の検索を行った。酵母等の微生物による糖アルコール類の直接発酵の例としては、先述のアラビトール発酵の他にも、チゴサッカロマイセス・アシディファシエンス（Zygosaccharomyces acidifaciens）によるグリセロール生産（Arch. Biochem., 7, 257-271(1945)）、トリコスポロノイデス属酵母（Trychosporonoides sp.）によるエリスリトール生産（Biotechnology Letters, 15, 240-246(1964)）等の報告がある。これらの糖アルコール生産能を持った酵母は、いずれも浸透圧の高い培地で生育が良い好浸透圧性を示す。好浸透圧性の酵母のうち、キシリトール生産能を持った菌はこれまで知られていないが、本発明者らは、好浸透圧菌の中にキシリトール生産能を持つ新規微生物が存在すると考え、好浸透圧菌を広く検索した。そして、その好浸透圧菌の中から、グルコースからキシリトール及びＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物を見いだした。そして、それらの微生物は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分類系統学上、新規な細菌であると推定された。本発明は、上記知見に基づいてなされたものである。
【００１２】
すなわち本発明は、アセトバクテラシア科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）に属し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列、又はこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物、及び
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列、又はこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物である。
上記微生物として具体的には、アサイア（Ａｓａｉａ）属又はツカリバクター（Ｚｕｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が、より具体的にはアサイア・エタノリファシエンス（Ａｓａｉａ  ｅｔｈａｎｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）又はツカリバクター・フロリコラ（Ｚｕｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ）に属する微生物が挙げられる。アサイア・エタノリファシエンスは、本発明者により暫定的に命名された新種（sp. nov.）である。また、ツカリバクター属及びツカリバクター・フロリコラは、それぞれ本発明者により暫定的に命名された新属（gen. nov.）及び新種である。
【００１３】
上記微生物としてさらに具体的には、Ｐ５２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５１）、Ｓ８７７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５２）、Ｓ１００９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５３）、Ｓ１０１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５４）、及びＳ１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５５）が挙げられる。
Ｐ５２８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は配列番号１に示す塩基配列を、Ｓ８７７株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は配列番号２に示す塩基配列を、それぞれ含む。また、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株及びＳ１０２３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を、それぞれ配列番号３〜５に示す。これらの塩基配列は、配列番号２に示す塩基配列と、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等である。
【００１４】
本発明はまた、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物を、好適な培地に培養し、該培地中にキシリトールまたはＤ−キシルロースを蓄積させ、該培地からキシリトールまたはＤ−キシルロースを採取することを特徴とするキシリトールまたはＤ−キシルロースの製造法を提供する。
【００１５】
上記方法に用いる微生物としては、アセトバクテラシア科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）に属し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列、又はこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物、及びアセトバクテラシア科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）に属し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列、又はこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物が挙げられる。具体的には、アサイア属又はツカリバクター属に属する微生物が、より具体的にはアサイア・エタノリファシエンス又はツカリバクター・フロリコラに属する微生物が挙げられる。さらに具体的には、Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株が挙げられる。
【００１６】
本発明はさらに、微生物Ｐ５２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５１）をグルコースを含む培地に培養し、該培地中にエタノールを蓄積させ、該培地からエタノールを採取することを特徴とするエタノールの製造法を提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
＜１＞本発明の微生物
本発明者らは、後記実施例に詳細に示すように、好浸透圧菌を広く検索した結果、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する新規な微生物を見出し、それらの微生物をＰ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株と命名した。
【００１９】
以下に、上記の各微生物の菌学的性質を示す。
【００２０】
〔１〕形態的・培養的性質
上記菌株について、Ｄ−グルコース11%(w/v)を添加したYM培地（1%グルコース、0.5%ペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%マルトエキストラクト、pH6.0）で30℃、３日間培養した後、顕微鏡で観察した所見を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
〔２〕培養的性質
（１）寒天平板培養
Ｄ−グルコース11%(w/v)を添加したYM平板培地で30℃、３日間培養したときの所見を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
（２）液体培養
Ｄ−グルコース11%(w/v)を添加したYM培地で30℃、３日間培養したときの所見を表３に示す。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
〔３〕生理学的性質
（１）以下の生理学的試験の結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
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（２）最適生育条件
Ｄ−グルコース11%(w/v)を添加したYM培地で培養したときの最適生育温度及び最適生育ｐＨを表５に示す。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
（３）生育条件
Ｄ−グルコース11%(w/v)を添加したYM培地で培養した場合に生育可能な条件を、表６に示す。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
（４）
シュークロースを添加したYM培地で培養した場合に最適なシュークロース濃度を表７に示す。
【００３２】
【表７】
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【００３３】
（５）
Ｄ−グルコース20%(w/v)、尿素0.1%、酵母エキス0.5%を含む培地で30℃、５日間培養した後に、培地中に検出された糖の種類を表８に示す。
【００３４】
【表８】
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【００３５】
上記菌株のうち、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株およびＳ１０２３株の４株は、培地に高濃度の糖を添加しないと生育できない絶対好浸透圧性を示す。
これら５株の微生物の大きな特徴は、いずれもグルコースよりキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産することにある。これまでグルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する微生物の報告は全くないため、上記のような菌学的性質を有する菌株は新規な微生物であると判断した。
【００３６】
〔４〕分子系統学的考察
Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株の分類学上の位置を調べるために、これらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を調べ、それらの塩基配列と最も近い菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とともに分子系統樹（molecular phylogenetic tree）を作成した（図１）。その結果、Ｐ５２８株は、アセトバクテラシア科（Acetobacteracea）に属し、アセトバクター属に属する新種又はアセトバクター属に類縁の新規な属に属する微生物である可能性が示唆された。一方、Ｓ８７７株は、アセトバクテラシア科（Acetobacteracea）に属し、グルコノバクター（Acetobacter）属又はアセトバクター（Gluconobacter）属に類縁の新規な属に属する微生物である可能性が示唆された。また、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株およびＳ１０２３株の３株は、Ｓ８７７株と同一種であると考えられた。
【００３７】
分子系統樹にもとづいて生物や遺伝子の進化を研究する手法は、分子系統学（molecular taxonomy）として確立されている（例えば、木村資生編分子進化学入門（培風館）第164〜184頁、「７分子系統樹の作り方とその評価」参照）。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹は、対象の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、菌学的性質から同微生物と同種又は類縁と推定される公知の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とともに、多重アラインメント及び進化距離の計算を行い、得られた値に基づいて系統樹を作成することにより、得ることができる。分子系統樹の作成に用いる公知の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、既存のデータベースの相同性検索によっても、取得することができる。ここで、進化距離とは、ある遺伝子間の座位（配列の長さ）あたりの変異の総数をいう。
【００３８】
多重アラインメント及び進化距離は、例えば、市販のソフトウエア（CLUSTALW；プログラム集「Phylogeny Programs」（http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.htmlから入手可能）に含まれている。Thompson, D. J., et al., Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680 (1994)参照）を用いて計算することができる。また、系統樹も、一般に入手可能なソフトウエア（TreeView（Tree drawing software for Apple Machintosh: by Roderic D., Page 1995, Institute of Biomedical and Life sciences, University of Glasgow, UK）、上記Phylogeny Programsに含まれている）で作成することができる。具体的には、CLUSTALWで計算された結果をPHLYPフォーマットデータで出力し、これをTreeViewで読み込ませればよい。PHLYP（Felsenstein J. (1995) Phylogenetic inference package, version 3.5.7., Department of Genetics, University of Washington, Seatle WA, USA）も、上記Phylogeny Programsに含まれている。
【００３９】
〔５〕他の生化学的および生理学的特徴
（１）キノンタイプ及びＤＮＡのＧＣ含量
Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株のキノンタイプはいずれもユビキノン−１０であり、ＤＮＡのＧＣ含量は、それぞれ順に５６．５％、５２．３％、５２．３％、５１．９％、５２．９％である。
（２）酸の生成
種々の炭素源からの酸の生成は、表１１に示したとおりである。
（３）生育に対するNaCl添加の影響
各種濃度のNaClを含む培地で培養したときの各菌株の生育を、図４に示す。Ｐ５２８株は、NaClに対して少なくとも２％まで耐性を示した。
（４）酢酸及び乳酸の消費
各菌株を酢酸又は乳酸を添加したグルコースを炭素源とする培地で培養したとき、いずれの株も乳酸の分解能が見られたが、酢酸の分解能は微弱であるか、又はほとんど見られなかった。
（５）生育に対する酢酸又はエタノール添加の影響
いずれの株も、酢酸１％又はエタノール３％まで添加した培地で旺盛な生育を示した。酢酸４％以上又はエタノール５％以上添加した培地では、いずれの菌株も生育しなかった。
（６）酢酸の生成及びエタノールの消費
エタノールを添加したグルコースを炭素源とする培地で培養したとき、酢酸生成能は微弱であった。また、エタノールの顕著な消費は見られず、Ｐ５２８株ではエタノールの生成が認められた。
【００４０】
〔６〕本発明の微生物と他の酢酸菌との表現形質の比較
P528株、S877株、S1009株、S1019株、及びS1023株と、報告されている公知の酢酸菌（アサイア・ボゴレンシス(Asaia bogorensis)、アセトバクター・アセティ(Acetobacter aceti)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコンアセトバクター・リケファシアンス(Gluconacetobacter liquefaciens)、アシドモナス・メタノリカ(Acidomonas methanolica)）の表現形質（１９９９年度日本農芸化学会大会講演要旨集第    頁及び第６６頁）を比較した結果を、表９に示す。尚、アサイア・ボゴレンシスは、前記大会で山田等により発表された新属（gen. nov.）、新種（sp. nov.）に属する微生物である。P528株、S877株、S1009株、S1019株、及びS1023株については、酢酸の生成及びエタノールの生成、DNA塩基組成、及び主要キノンは、実施例５及び実施例６に示すようにして測定した。他の諸性質は、Asaiらの方法（Asai, T. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 10 (2), p.95, 1964）により測定した。
【００４１】
【表９】
0003948164.tif 000010
【００４２】
表９に示したように、P528株はアサイア・ボゴレンシスに類似するが、エタノールからの酢酸の生成が微弱ではあるが認められる点、及び、DNA塩基組成におけるGC含量が56.5であり、アサイア・ボゴレンシスの値（59〜61）と比べて有意に低い点でアサイア・ボゴレンシスとは異なる。また、S877株、S1009株、S1019株、及びS1023株は、エタノールからの酢酸の生成が微弱であること、30%グルコース存在下で生育可能なこと、及びエタノールからの酸の生成が認められない点で、他の酢酸菌と異なる。
【００４３】
上記の結果から、P528株はアサイア属に属する新種と同定され、アサイア・エタノリファシエンス（Asaia ethanolifaciens sp. nov.）と暫定的に命名された。また、S877株、S1009株、S1019株、及びS1023株は、いずれも新属、新種に属する微生物であると同定され、ツカリバクター・フロリコラ（Zucharibacter floricola  gen. nov., sp. nov.）と暫定的に命名された。
【００４４】
＜２＞キシリトールおよびＤ−キシルロースの製造法
グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物を好適な培地に培養し、該培地中にキシリトールもしくはＤ−キシルロース、またはこれらの両方を蓄積させ、該培地からキシリトールおよび／またはＤ−キシルロースを採取することにより、キシリトールおよび／またはＤ−キシルロースを製造することができる。
【００４５】
前記微生物としては、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する限り、特に制限されないが、具体的には前記Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株およびＳ１０２３株が挙げられる。また、これらの微生物と同種もしくは同属に属し、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物も、本発明に用いることができる。そのような微生物としては、アセトバクテラシア科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）に属し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列もしくはこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、又は、配列番号２に示す塩基配列もしくはこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物が挙げられる。具体的には、アサイア属又はツカリバクター属に属する微生物が、より具体的にはアサイア・エタノリファシエンス又はツカリバクター・フロリコラに属する微生物が挙げられる。
本発明の方法により製造される目的物は、キシリトールまたはＤ−キシルロースの一方であってもよく、これらの両方であってもよい。
【００４６】
本発明においては、グルコースからキシリトールまたはＤ−キシルロースを生産する能力を有する微生物菌株から、UV照射、N−メチル-N'-ニトロ-N−ニトロソグアニジン（NTG）処理、エチルメタンスルホネート（EMS）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等により得られる変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組換え株など、いずれの株であっても使用することができる。
【００４７】
これらの微生物を培養する培地は、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む通常の培地を用いることができる。本発明の微生物は高浸透圧条件で生育するが、通常の浸透圧条件でも生育できる場合がある。例えばＰ５２８は通常の浸透圧条件で生育する。
【００４８】
炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。公知のキシリトールの製造法、例えばＤ−キシロース又はＤ−アラビトール等のペンチオールからキシリトールを製造する方法等に対する優位性の点からは、主炭素原は、グルコース、フルクトース等の六炭糖、シュークロース、ラクトース等の二糖類、澱粉等の多糖類が好ましい。これら主炭素源の培地中における量的割合としては、10〜60％、好ましくは20〜50％の範囲で使用される。これらの炭素源は、一括して培地に添加してもよく、分割して経時的に添加してもよい。
【００４９】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。
【００５０】
培養条件にも格別の制限はないが、通常、ｐＨ５〜８及び温度２５〜４０℃の範囲内でｐＨ及び温度を適当に制限しつつ培養を行なえばよい。培養は通気撹拌、振とうなどによる好気的条件下で行う。培養時間は主炭素源が消費されるまで行われるのが望ましく、通常は３〜８日の間で行われる。
【００５１】
このようにして培養液中に生成したキシリトールおよび／またはＤ−キシルロースは、常法に従って、培養物より分離、採取される。具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その溶液から結晶化する方法などが採用できる。培養物からのキシリトールおよび／またはＤ−キシルロースの分離、採取は、植物材料の加水分解物に比べて不純物が少ないために、処理が容易である。
【００５２】
生成したＤ−キシルロースは、従来公知の方法によって水素添加することによって、キシリトールに変換することができる。
【００５３】
＜３＞エタノールの製造法
微生物Ｐ５２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５１）をグルコースを含む培地に培養し、該培地中にエタノールを蓄積させ、該培地からエタノールを採取することにより、エタノールを製造することができる。また、Ｐ５２８株以外にも、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列、又はこの塩基配列と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含み、かつ、グルコースからエタノールを生産する能力を有する微生物、あるいはこれらの変異株も、同様にエタノールの製造に用いることができる。
培地及び培養条件は、上記のキシリトールおよびＤ−キシルロースの製造法と同様の培地及び培養条件を採用することができる。また、培地中に生成したエタノールは、通常のエタノール発酵と同様にして濃縮、精製すればよい。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
なお、本実施例において、生成したキシリトールおよびＤ−キシルロースは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
カラム：Shodex SC1211（昭和電工社製品）
移動層：50％アセトニトリル／50％ 50ppm Ca-EDTA水溶液
流  速：0.8ml/分
温  度：60℃
検  出：RI検出器
【００５６】
【実施例１】
キシリトール又はＤ−キシルロースを産生する微生物の単離
初めに、自然界より集積培養により好浸透圧性の微生物の分離を行った。Ｄ−グルコース20%、酵母エキス（Difco社）1%、尿素0.1%を含む培地4mlを試験管に入れ、120℃、20分間滅菌した。この培地に各地より採種した土壌サンプルを添加し、30℃で４日から７日間振盪培養した。菌が生育した時点で、培養液を同じ組成の寒天平板培地にプレーティングし、30℃で１日から３日間培養し、生育したコロニーを釣菌した。
【００５７】
次に、上記のようにして分離した約3000株の好浸透圧菌を、Ｄ−グルコース20%(w/v)、尿素0.1%、酵母エキス0.5%を含む培地で30℃、５日間培養した後、培養液をＨＰＬＣで分析し、キシリトール又はＤ−キシルロース生産能を有する菌株を検索した。その結果、神奈川県川崎市多摩川の土手の土壌より採取した土壌から分離した菌５株に、グルコースからのキシリトール生産能があることを見いだした。これらの株をそれぞれ、Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株と命名した。これら５株は、それぞれ順に、プライベートナンバーＡＪ１４７５７、ＡＪ１４７５８、ＡＪ１４７５９、ＡＪ１４７６０、ＡＪ１４７６１が付され、１９９８年６月１８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、順にＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８４９、ＦＥＲＭＰ−１６８５０、Ｐ−１６８５１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８５２の受託番号で寄託され、１９９９年６月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５５が付与されている。
【００５８】
【実施例２】
グルコースからキシリトール及びＤ−キシルロースの生産
酵母エキス（Difco社）0.5％、尿素0.1％を含む培地（pH 6.0）50mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別に滅菌したグルコースを20％ (w/v)となるように添加した。この培地に、P528株、S877株、S1009株、S1019株及びS1023株をそれぞれ接種し、30℃で５日間振とう培養した。遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて培地中に生成したキシリトール及びＤ−キシルロースを定量した。この結果を表１０に示した。
【００５９】
【表１０】
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【００６０】
【実施例３】
Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株の分子系統学的考察
Ｐ５２８株およびＳ８７７株について、通常の方法により１６ＳｒＲＮＡの塩基配列解析による分子系統学的考察を行った。
上記菌株の菌体懸濁液を、60℃で20分間プロテアーゼ処理した後、沸騰水中で５分間加熱し、遠心分離により得られた上清を直接ＰＣＲのテンプレートとして使用した。
【００６１】
大腸菌の１６ＳｒＲＮＡのポジション8〜27及び1492〜1510に相当するユニバーサルプライマー（配列番号６及び７）を用いて、定法通り30サイクルのＰＣＲを行い、産物をＰＥＧ沈殿法により回収した。蛍光サイクル法でＰＣＲ産物を直接シークエンシングし、ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）で反応物を解析した。決定された塩基配列を、配列番号１（Ｐ５２８株）及び配列番号２（Ｓ８７７株）に示す。これらの塩基配列と一致する配列は、データベース上で見出されなかった。それぞれに最も近い塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を持つ菌群は、グルコノバクター属及びアセトバクター属に属する細菌であった。
【００６２】
得られた塩基配列データをGENETYX（ソフトウェア開発株式会社（東京））で編集し、データベースから入手可能な他の類似の塩基配列（酢酸菌の中で現在有効（valid name）とされている１３種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列）とともにCLUSTAL Wで多重アラインメントと進化距離の計算を行った。得られたPHYLIPフォーマットデータをTree Viewで読み込み、系統樹を作成した。結果を図１に示す。また、キシリトール生産菌の１６ＳｒＲＮＡのアラインメントを図２、３に示す。上記１３種の酢酸菌は、以下のとおりである。
【００６３】
グルコノバクター・アサイイ
グルコノバクター・セリヌス
グルコノバクター・フラツーリイ
グルコノバクター・オキシダンス  サブスピーシーズ  オキシダンス
アセトバクター・アセティ
アセトバクター・パスツーリアヌス
アセトバクター・メタノリカス
グルコノバクター・ユーロペウス
グルコノバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス
グルコノバクター・インターメディカス
グルコノバクター・ハンゼニイ
グルコノバクター・リケファシエンス
グルコノバクター・ジアゾトロフィカス
ロドフィラ・グロビフォルミス
【００６４】
その結果、Ｐ５２８株と進化距離の近い公知の微生物は、グルコノバクター・インターメディカス、グルコノバクター・リケファシエンス、アセトバクター・アセティ、アセトバクター・メタノリカス及びアセトバクター・パスツーリアヌスであり、進化距離はそれぞれ0.0345、0.0359、0.0403、0.0419及び0.0499であり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性は96.5％、96.3％、96.0％、95.9％、及び95.1％であった。また、Ｓ８７７株と進化距離の近い公知の微生物は、グルコノバクター・セリヌス及びグルコノバクター・オキシダンスであり、進化距離はそれぞれ0.0622及び0.0629であり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性は94.0％及び93.9％であった。Ｐ５２８株はアセトバクター属のクラスターに含まれるが、既知種３株と大きく離れており、Ｐ５２８株は新種と考えれられる。また、アセトバクター・メタノリカスは別の属（アシドモナス(Acidomonas)）に属するともいわれており、別の属とした場合は、Ｐ５２８株は、アセトバクター属のクラスターの外側に位置するため、新たな属に属する可能性もある。
【００６５】
一方、Ｓ８７７株は、グルコノバクター属のクラスターの外側に位置し、かつグルコノバクターに属する既知種のいずれとも遠く離れている。Ｓ８７７株と最も近い株（グルコノバクター・セリヌス）との進化距離は、0.066であるが、この値はグルコノバクター属とアセトバクター属との距離（0.044）よりも有意に大きく、新属と考えるのが妥当である。
【００６６】
Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株及びＳ１０２３株については、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の―部を決定したところ（それぞれ配列番号３、４及び５）、Ｓ８７７株とほば同一配列であり、同一種であることが見出された。
以上の分子系統学的考察及び前記表９に示した表現形質から、Ｐ５２８株はアサイア属に属する新種と同定され、アサイア・エタノリファシエンス（Asaia ethanolifaciens sp. nov.）と暫定的に命名された。また、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株及びＳ１０２３株は、いずれも新属、新種に属する微生物であると同定され、ツカリバクター・フロリコラ（Zucharibacter floricola  gen. nov., sp. nov.）と暫定的に命名された。
【００６７】
【実施例４】
グルコースからのキシリトール及びＤ−キシルロースの生産
酢酸アンモニウム0.2％、リン酸２水素カリウム0.3％、硫酸マグネシウム７水和物0.05％、酵母エキス（Difco社）0.5％、炭酸カルシウム４％を含む培地50mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別に滅菌したグルコースを20％ (w/v)となるように添加した。この培地に、Ｐ５２８株を接種し、30℃で４日間振とう培養した。遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて培地中に生成したキシリトール及びＤ−キシルロースを定量した。その結果、6.4g/Lのキシリトールと、17.5g/LのＤ−キシルロースが生成された。
【００６８】
【実施例５】
Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株の生化学的および生理学的特徴
（１）キノン、及びＤＮＡのＧＣ含量の分析
上記菌株について、通常の方法（細菌学技術叢書８「新しい分類学に伴走する細菌同定法」菜根出版p61〜73、p88〜97参照）で、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、キノン及びＤＮＡのＧＣ含量の分析を行った。この結果を表１１に示す。
【００６９】
【表１１】
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【００７０】
（２）種々の炭素源からの酸生成
上記菌株を各種炭素源（１％）を含む培地で培養し、生成される酸の有無を調べた。上記菌株をＹＰＧ培地で28℃で１日間前培養し、各菌体を酵母エキス 0.5％溶液で洗浄した後、ＹＰＣ培地に植菌し、28℃で４〜７日間振とう培養し、酸の生成を培地中のｐＨ指示薬の色の変化（赤紫→黄）で判定した。
【００７１】
ＹＰＧ培地は以下のように調製した。酵母エキス（Difco社）１％、ペプトン１％を含む培地を120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別に滅菌したＤ−グルコースを７％となるように添加した。
ＹＰＣ培地は以下のように調製した。酵母エキス（Difco社）0.5％、ブロモクレゾールパープル 0.012％、及び各種炭素源各１％を含む培地を120℃、20分間加熱滅菌した。
この結果を表１２に示す。
【００７２】
【表１２】
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【００７３】
（３）生育に対するNaCl添加の影響
上記菌株の生育に対するNaCl添加の影響を、ＹＰＭ培地で培養して調べた。上記菌株、及び対照としてアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）NCIB 8621株を前出のＹＰＧ培地で28℃で１日間前培養し、各菌体をＤ−グルコース無添加のＹＰＧ培地で洗浄した後、Ｄ−グルコース無添加のＹＰＧ培地に懸濁した。得られた菌体懸濁液を、種々の濃度のNaClを添加したＹＰＭ培地に接種し（1.6％、v／v）、28℃で２日間振とう培養した。培養液の濁度を東京光電ANA-75A分光光度計（OD660nm）で測定し、生育量を測定した。
【００７４】
ＹＰＭ培地は以下のように調製した。酵母エキス（Difco社）１％、ペプトン１％、マンニトール１％を含む培地を120℃、20分間加熱滅菌した。
この結果を図４に示した。Ｐ５２８株は、NaClを２％まで添加した培地で旺盛な生育を示し、食塩耐性が見られた。
【００７５】
（４）酢酸及び乳酸の消費
上記菌株を、酢酸又は乳酸を添加したＹＧ培地で培養して、酢酸及び乳酸の消費を調べた。
上記菌株、及び対象としてアセトバクター・アセチ NCIB 8621株を、前出のＹＰＧ培地で28℃で１日間振とう培養した前培養液を、酢酸又は乳酸１％を添加したＹＧ培地に接種し（1.6%、v／v）、28℃で７日間振とう培養し、経時的にサンプリングを行い、酢酸及び乳酸の消費を調べた。酢酸及び乳酸の測定は、HPLCにより、以下の条件にて測定した。
【００７６】
カラム：ULTTRON PS-80（信和化学工業社製品）
移動層：過塩素酸溶液（pH2.1）
流  速：0.9ml／分
温  度：60℃
検  出：UV検出器（210nm）
【００７７】
酢酸又は乳酸を添加したＹＧ培地は以下のように調製した。酵母エキス（Difco社）１％、酢酸又は乳酸１％を含む培地をpH6.0に調整し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別に滅菌したＤ−グルコースを７％となるように添加した。
この結果を表１３に示した（消費した量（％）で示した）。Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株共に乳酸の分解能が見られたが、酢酸の分解能は微弱、又はほとんど見られなかった。
【００７８】
【表１３】
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【００７９】
（５）生育に対する酢酸又はエタノール添加の影響
上記菌株の生育に対する酢酸添加の影響を、酢酸を添加したＹＧ培地で調べた。また、上記菌株の生育に対するエタノール添加の影響を、エタノールを添加したＹＰＧ培地で培養して調べた。
上記菌株を前出のＹＰＧ培地で28℃で１日間前培養し、各培養液を種々の濃度の酢酸を添加したＹＧ培地、及びエタノールを添加したＹＰＧ培地に接種し（1.6%、v／v）、28℃で10日間振とう培養した。培養液の濁度を東京光電ANA-75A分光光度計（OD660nm）で測定し、生育量を測定した。
【００８０】
Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株共に、酢酸１％又はエタノール３％まで添加した培地で旺盛な生育を示した。酢酸４％以上又はエタノール５％以上添加した培地では、いずれの菌株も生育しなかった。
【００８１】
（６）酢酸の生成及びエタノールの消費
上記菌株をエタノールを添加したＹＰＧ培地で培養し、酢酸の生成及びエタノールの消費を調べた。上記菌株、及び対照としてアセトバクター・アセチ NCIB 8621株を、前出のＹＰＧ培地で28℃で２日間前培養し、各培養液をエタノール１％を添加したＹＰＧ培地に接種し（1%、v／v）、28℃で培養し、経時的にサンプリングを行い、培地中の酢酸及びエタノールの濃度を調べた。酢酸及びエタノールの濃度の測定は、Ｆ−キット（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いた。
【００８２】
この結果を図５及び６に示した。対照菌であるアセトバクター・アセチ NCIB 8621株に比べ、Ｐ５２８株、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株は、いずれも酢酸生成能が微弱であった（図にはＰ５２８株及びＳ８７７株のみ示した）。また、対照菌であるアセトバクター・アセチ NCIB 8621株に比べ、Ｓ８７７株、Ｓ１００９株、Ｓ１０１９株、及びＳ１０２３株共にエタノールの消費は見られなかった。Ｐ５２８株は、逆にエタノール量の増加が見られた。
【００８３】
【実施例６】
Ｐ５２８株によるエタノール生産
Ｐ５２８株を、ＹＰＧ培地を用いて前述と同様に培養し、経時的に培地中のエタノールの濃度を調べた。この結果を図７に示す。Ｐ５２８株にはエタノールを生成する能力が認められた。
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、グルコース等の安価な原料から、効率よくキシリトール又はＤ−キシルロースを製造することができる。
また、Ｐ５２８株を用いることによりエタノールを製造することができる。
【００８５】
【配列表】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の微生物及び類縁菌の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統樹である。
【図２】  キシリトール生産菌の１６ＳｒＲＮＡの部分配列のアラインメント。配列番号１及び配列番号２の塩基番号１〜６９１の塩基配列、及び配列番号３〜５に示す塩基配列との比較を示す。点（「・」）は、共通する塩基を示す。
【図３】  図２の続き。
【図４】  本発明の微生物の生育に対するＮａＣｌ添加の影響を示す図。
【図５】  Ｐ５２８株及びＳ８７７株をエタノール添加培地で培養したときの酢酸の生成を示す図。
【図６】  Ｐ５２８株及びＳ８７７株をエタノール添加培地で培養したときのエタノールの消費又は生成を示す図。
【図７】  Ｐ５２８株によるエタノール生成を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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