(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で示される耐熱性α−ガラクトシダーゼを用い、スクロースとガラクトース及び／又はＵＤＰ−ガラクトースを基質として、ラフィノースを製造することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列で示される耐熱性α−ガラクトシダーゼ遺伝子に対応するα−ガラクトシダーゼを用い、スクロースとガラクトース及び／又はＵＤＰ−ガラクトースを基質として、ラフィノースを製造することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項３】
アブシディア属由来の耐熱性α−ガラクトシダーゼを使用すること、を特徴とする請求項１又は２に記載のラフィノースの製造方法。
【請求項４】
アブシディア属菌が、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）であることを特徴とする請求項３に記載のラフィノースの製造方法。
【請求項５】
配列番号２の塩基配列で示される耐熱性α−ガラクトシダーゼ遺伝子のＤＮＡを含有するプラスミドで形質転換してなる形質転換体を培養し、培養物から得た耐熱性α−ガラクトシダーゼを用い、スクロースとガラクトース及び／又はＵＤＰ−ガラクトースを基質として、ラフィノースを製造することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項６】
形質転換体としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ３２Ｔｒｘ／ｇａｌα（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４０）を使用すること、を特徴とする請求項５に記載のラフィノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラフィノースの製造方法に関するものであり、更に詳細には、新規耐熱性α−ガラクトシダーゼを使用するラフィノースの新規製造方法に関するものである。
【０００２】
また、新たに解析に成功したAbsidia corymbifera IFO 8084（以下、８０８４株ということもある）のα−ガラクトシダーゼ遺伝子は新規であり、本構造遺伝子を発現プラスミドベクターに連結し、得られた組換えプラスミドを、大腸菌を宿主とする系に導入することにより、α−ガラクトシダーゼを効率的に大量発現することができ、本酵素を利用する産業分野に安価に大量供給することが可能になった。本発明に係る糸状菌アブシディア・コリンビフェラ（Absidia corymbifera）から得られた新規耐熱性α−ガラクトシダーゼ遺伝子、本構造遺伝子を発現プラスミドベクターに連結してなる組換えプラスミド、これを宿主微生物に導入してなる形質転換体は、いずれも従来未知のものである。
【０００３】
ここに、新規耐熱性α−ガラクトシダーゼの工業的製造が可能となったので、従来工業的製造が非常に困難であったラフィノースについて、スクロースとガラクトース及び／又はＵＤＰ−ガラクトースを原料としたラフィノースの工業的製造が可能となり、本発明を確立するに至ったのである。
【０００４】
【従来の技術】
近年、食生活が多様化する中で、生活習慣病などが大きく問題視され、消費者の食品および食品素材に関する意識は高まっている。そのような中、砂糖の過剰摂取も取り上げられ、低カロリーで生理機能性を有する新たな甘味料としてのオリゴ糖の開発、生産が重要視される様になり、その研究も多岐に渡っている。
【０００５】
発明者らはこのような観点から、ラフィノース（Raffinose）に着目した。ラフィノースは、スクロース分子にＤ−ガラクトースがα１−６結合した構造をもつ３糖類のオリゴ糖である。自然界では、砂糖の原料であるビート（サトウダイコン）をはじめ、大豆などの豆科植物の種子やサトウキビ、蜂蜜、キャベツ、酵母、じゃがいも、ぶどう、麦類、トウモロコシなど広くに分布している。用途として甘味料は勿論であるが、ウシ精液の冷凍貯蔵の安定剤として、さらには世界各国で使用されているヒト臓器移植用の輸送液にも配合されている。一方、ヒト腸内細菌に関する研究が進む中、腸内の有用菌であるビフィズス菌を増殖させる因子として、難消化性オリゴ糖が注目されるようになり、臨床的研究の結果、ラフィノースはビフィズス菌増殖効果に優れていることが明らかとなり、1993年には厚生省の定める特定保健用食品素材として認可されている。また、医学臨床的研究から、ラフィノース経口投与がアレルギーの病態の一つであるアトピー性皮膚炎に対しても有効なケースがあることが明らかとなってきており、この分野でも研究が進められている。
【０００６】
ラフィノースは、工業的にはビート糖製造の際に副産物として回収されている。ビート中のラフィノースは、秋の収穫前後、気温の低下とともに増加することから、凍結に対する生体保護成分として考えられている。しかし、ビート中のラフィノースの含有量は最大で根茎部重量の０．１％程度に過ぎず、生産量は砂糖の製造量に大きく関わってくるが、限界がある。今後、上記の様に、ラフィノースの生理的機能が明らかになると共に、需要の増加は必須であり、植物からの抽出製造のみでなく、安価な原料からの合成製品が求められるであろう。
【０００７】
本発明に先がけて発明者らは、製糖工程での砂糖の結晶化を妨げる成分であったラフィノースを分解する目的で、８０８４株のα−ガラクトシダーゼ活性を利用して、ラフィノースの効率的分解法を確立している。このα−ガラクトシダーゼは逆反応として、スクロースとガラクトースを原料として、ラフィノースを合成することが理論上は可能である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記したようにα−ガラクトシダーゼは、α−ガラクトシドを分解する本来の性質を利用して、砂糖の結晶化を妨害するラフィノースを分解する目的で製糖工業等において利用されるだけでなく、その逆反応にしたがい、スクロースとガラクトースを原料とするラフィノースの製造にも利用することができる。
【０００９】
製糖工業においては、ラフィノースを分解するために大量のα−ガラクトシダーゼが必要であるし、逆反応を利用するラフィノースの合成にも大量のα−ガラクトシダーゼが必要である。すなわち、本酵素によるラフィノース製造は先にも触れたように、本来の正反応ではなく、逆反応を利用するため、酵素が少量であったり、反応条件が最適でない場合、極端に効率が悪化する可能性がある。本発明では、このラフィノース製造法に十分量のα−ガラクトシダーゼを供給するため、効率の良い酵素生産を遺伝子レベルでとらえ、且つそれに成功した。遺伝子工学的な手法を導入し、酵素の大量生産を行うことを目的とし、本発明に至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の目的を達成するためになされたものであって、目的とする微生物、酵素を遺伝子工学的手法で創製することとした。
【００１１】
そこで発明者らは、８０８４株の染色体ＤＮＡからα−ガラクトシダーゼ遺伝子をクローン化し、その構造遺伝子の一次配列を解明し、これを含むＤＮＡ断片を発現プラスミドベクターに連結し、大腸菌エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（以後、大腸菌ということもある）BL21(DE3)株を形質転換し、菌体を培養し、α−ガラクトシダーゼを大量発現させた。そして、得られたα−ガラクトシダーゼが、すぐれたα−ガラクトシド分解能を有するだけでなく、その逆反応によって効率よくラフィノースを合成でき、そして更に７０℃というきわめて高い温度においても活性を有しており、耐熱性が極めて高い等の特質を有する点を確認し、本酵素を従来未知の新規酵素と同定した。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
８０８４株のα−ガラクトシダーゼ遺伝子をクローン化するために、まず酵素精製されたα−ガラクトシダーゼタンパク質の内部アミノ酸配列を決定した。８０８４株を培養し、発現されたα−ガラクトシダーゼを硫酸アンモニウム分画および各種カラムクロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一にまで精製した。この精製α−ガラクトシダーゼタンパク質をタンパク質分解酵素で切断し、得られたペプチド鎖群を分離し、それぞれのＮ−末端アミノ酸配列をペプチドシーケンサーにより解読した。
このようにして得られたアミノ酸配列を基に、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００１３】
これとは別に調製した８０８４株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、先にプライマーとして合成したオリゴＤＮＡと混合してＰＣＲ法により部分的にα−ガラクトシダーゼ遺伝子を増幅し、これをプローブとした。
【００１４】
そして、８０８４株より染色体を抽出し、得られた染色体からｃＤＮＡを合成し、合成ｃＤＮＡをプラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、このプラスミドベクター群を用いて大腸菌等の宿主を形質転換して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このようにして作製した遺伝子ライブラリーの大腸菌コロニーから、コロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングして、陽性のクローンを選別した。陽性クローン株からプラスミドＤＮＡを抽出して、目的のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる可能性のある領域のＤＮＡ塩基配列を解読した。その結果、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造遺伝子の全ＤＮＡ塩基配列を決定するに至った。この塩基配列を配列表の配列番号２に示すが（図２）、この配列は従来未知の新規遺伝子であった。また、このＤＮＡ塩基配列から、８０８４株由来のα−ガラクトシダーゼは、そのアミノ酸配列が配列番号１と類推される（図１）。
【００１５】
そして、α−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を完全に含む断片を大腸菌発現プラスミドベクター、例えばｐＥＴ３２−ＥＫ／ＬＩＣプラスミドベクター（宝酒造（株））のthioredoxin配列の下流に挿入、連結して、新たな組換えプラスミドを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に発現できるプロモーターが導入されており、この組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、誘導培養することでα−ガラクトシダーゼの大量発現を可能にした。
【００１６】
本発明に係るα−ガラクトシダーゼは、次のような理化学的性質を有し、正反応であるα−ガラクトシド分解能が高いだけでなく、逆反応としてスクロースとガラクトースからラフィノースを合成する性質を有する点、至適温度域が５０〜７０℃であって熱に対する耐性がきわめて高い等のすぐれた特徴を示すものである。このようなα−ガラクトシダーゼは過去に例がなく、従来未知の新規酵素である。
【００１７】
（１）作用
本酵素は、正反応として、α−ガラクトシダーゼの定義（糖鎖の非還元末端のα−ガラクトシド結合を切断する、エキソグリコシダーゼ活性を有する）通りの反応を全般に行い、特に（２）に記載した基質特異性を有する。
また、逆反応として、スクロースとガラクトースを基質として、ラフィノースを合成する反応を行う。基質特異性の試験法、および酵素力価の試験法は（４）に、逆反応の詳細な反応条件は後記する。
【００１８】
（２）基質特異性
表１に、本酵素のＯＮＰα−ガラクトシドに対する活性を１００％とした時の、各基質の相対活性を示した（正反応の基質特異性）。その結果、本酵素は、極めてＯＮＰα−ガラクトシドに高い基質特異性を有していた。
【００１９】
0004021123.tif 000002
【００２０】
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
図３に、本酵素のｐＨに対する影響を示した。安定性の検討は、酵素溶液を各ｐＨの緩衝液中で２４時間、４℃で保持した後、溶液をｐＨ５．５の緩衝液で置換し、基質をＯＮＰα−ガラクトシドを用いて、正反応の酵素活性を定法に従い測定した。その結果、本酵素の至適ｐＨは５．５であり、ｐＨ５．０から１１．０で安定であった。
【００２１】
（４）力価の測定法
本酵素活性は、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシド）法に従って測定した。酵素反応は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、４０℃で行った。酵素溶液０．１ｍｌに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を０．２ｍｌ加え、２０ｍＭ  ＯＮＰＧを０．２ｍｌ添加することで反応を開始し、１０分後に０．１Ｍの炭酸ナトリウム溶液を５ｍｌ添加することで反応を停止させた。生成したｏ−ニトロフェノールの量を吸光度４１５ｎｍで測定した。
ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした時も同様に試験し、生成したｏ−ニトロフェノールを定量した。
【００２２】
ラフィノース、メリビオース、スクロース、ラクトース及びマルトースを基質とした時も、反応停止を沸騰水に５分間保持することで行った以外、同様に試験した。その後、ラフィノースを基質とした時は、ガラクトースＵＶテストを用いてガラクトースを定量し、メリビオース、スクロース、ラクトース及びマルトースを基質とした時は、グルコスタット法によりグルコースを定量した。
ここで、酵素１単位は、本酵素反応条件下で、１分当たりに１μmolの反応生成物を生じる酵素量とした。
【００２３】
（５）至適温度及び安定温度範囲
図４に、本酵素の温度に対する影響を示した。安定性の検討は、酵素溶液を各温度で２０分間保持した後、素早く４℃に冷却し、基質をＯＮＰα−ガラクトシドを用いて、正反応の酵素活性を定法に従い測定した。その結果、至適温度は６０℃であり、６０℃まで安定であった。図面からも明らかなように、本酵素は非常に高い耐熱性を有する点で、きわめて特徴的である。
【００２４】
（６）ｐＨ、温度等による失活の条件
特に詳細を検討していないが、（３）及び（５）に記載のｐＨ及び温度の条件、特に安定性において、相対活性が低下している範囲以上が失活の条件であると考察される。また、酵素溶液を沸騰水中に５分間保持した後の酵素活性消失は確認している。
【００２５】
（７）精製方法
本Escherichia coli BL21(DE3)-pET32Trx/galαの発現系には、プラスミドベクターpET32-Ek/LIC由来のHis・Tag配列が含まれており、無細胞抽出液からアフィニティークロマトグラフィーにより１段階で発現α−ガラクトシダーゼを精製することができる様に工夫されている。His・Tag配列は、ヒスチジン残基を６から１０個ほど並べて配した配列で、金属イオンと結合能を有している。このため発現産物を、金属イオンと結合したHis・Tag Resinによるキレートクロマトグラフィーによって高効率に単一タンパク質が精製できる。手法については公知の事実でありNovagent社の精製マニュアルに従った。その結果、大腸菌E.coli BＬ21(DE3)-pET32Trx/galαの無細胞抽出液から回収率８０％以上の高回収率で、α−ガラクトシダーゼを単一に精製した。
【００２６】
（８）分子量及び分子量の測定方法
発現α−ガラクトシダーゼタンパク質の分子量測定は、タンパク質の精製純度検定と同時に、Laemmli(Laemmli: Nature（London）、１９７０、２２７、６８０−６８５)の方法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。ゲルの濃度は７．５％とした。タンパク質の染色はCoomassie Brilliant Blueを用いた。その結果、分子量は、およそ８２，０００Ｄａと測定された。この値は、遺伝子のＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列から算出される分子量８２，７１２Ｄａと類似しており、信頼性がある。
【００２７】
本発明に係る新規耐熱性酵素は、上記した理化学的性質を有する酵素であればすべてのものが包含され、例えば配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質もその１例として例示される。その製造方法についても、その遺伝子を含有した新規形質転換体（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４０として生命研に国際寄託されている）をＩＰＴＧで誘導培養したり、誘導によることなく通常培養することにより、本発明に係る新規耐熱性α−ガラクトシダーゼを得ることができるし、その新規アミノ酸配列の１例が明らかにされたので（配列番号１）、合成することによっても本酵素を得ることができる。
【００２８】
本酵素は、正反応であるα−ガラクトシド結合の分解を高効率で行い、例えばメリビオースやラフィノースを効率的に分解できるだけでなく、逆反応であるラフィノース合成を非常に効率的に実施することができる。ラフィノース合成は、スクロース、ガラクトース（及び／又はＵＤＰ−ガラクトース）の存在下、本発明に係る新規耐熱性α−ガラクトシダーゼを用いてインキュベートすることによって、非常に効率的に実施することができる。
【００２９】
ラフィノース合成は、例えば次のようにして実施することができる。例えば、本酵素としては、精製品のほか、粗製品も使用可能であることはもちろんのこと、形質転換体の培養物、培養液、無細胞抽出液、それらの濃縮物等の少なくともひとつが適宜使用可能である。スクロース、ガラクトースの基質濃度は高い方が良く、各２０％以上、好ましくは２５％以上とすると好適であるが、好適例として、スクロース４０〜８０％（好ましくは５０〜７０％）、ガラクトース５〜４５％（好ましくは１５〜３５％）が例示される。
【００３０】
反応ｐＨは、６．０よりも中性〜アルカリ側とするのが良く、反応温度は、正反応が生じないような高温とするのが良い。具体的には、５０〜７５℃以上、好ましくは６０〜７３℃以上、更に好ましくは、酵素の安定性はやや低下するけれども、反応温度を約７０℃に設定すればよい。
【００３１】
この場合、本酵素は卓越した耐熱性を有する特徴を有するため、ラフィノースの合成を効率的に行うことがはじめて可能となった点で画期的である。そのうえ、本酵素は高温においても活性を有しているため、反応系を高温に維持することができ、反応系が雑菌によって汚染されることがなく、工業的実施に特に好適である。また、酵素液、その他反応液を高温殺菌することも可能であって、本発明はこの点においても非常にすぐれている。
【００３２】
なお、反応条件としては、反応速度、収率等を考慮に入れないのであれば、上記した範囲から逸脱してもさしつかえなく、適宜選択することができる。
以下、試験例及び実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
【００３３】
〔試験例〕
（１）８０８４株のα−ガラクトシダーゼの酵素精製
酵素の精製操作は特に断らない限り４℃で行い、緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（以後、緩衝液とする）を用いた。
【００３４】
８０８４株を本庄らの方法（本庄ら、精糖技術研究会誌、１９８５、３５、６７〜７３）に従って培養した。培養菌体を６倍量のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．７に懸濁し、５０℃で２４時間自己消化を行った。その後、遠心分離により菌体残渣を除き、得られた上清液を粗酵素液とした。また、この様に培養した湿菌体は（３）でも使用した。
【００３５】
この粗酵素液をゆっくりと撹拌しながら５０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、１時間放置した。この操作で塩析したタンパク質を遠心分離処理で沈殿物として回収した。この沈殿物を少量の緩衝液に溶解し、同緩衝液で一晩透析した。
【００３６】
この粗酵素液を担体として緩衝液で平衡化したDEAE Sephacelを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（２．７×４５ｃｍ）に供した。吸着したタンパク質の溶出は緩衝液中に含まれる塩化ナトリウム濃度を０〜０．５Ｍまで直線的に変化させて行った。定法に従い、α−ガラクトシダーゼ活性画分を測定し、活性画分を遠心限外ろ過膜で濃縮した。
【００３７】
この粗酵素液を担体として緩衝液で平衡化したSephacryl S-300を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（２．５×５０ｃｍ）に供した。活性画分を遠心限外ろ過膜で濃縮した。
この粗酵素液を担体として緩衝液で平衡化したDEAE-Sepharoseイオン交換カラムクロマトグラフィー（１．８×１３ｃｍ）に供した。吸着したタンパク質の溶出は緩衝液中に含まれる塩化ナトリウムの濃度を０〜０．３Ｍまで直線的に変化させて行った。活性画分を遠心限外ろ過膜で濃縮した。
【００３８】
タンパク質の精製純度はLaemmli(Laemmli:Nature(London)、１９７０、２２７、６８０〜６８５）の方法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検定した。ゲルの濃度は７．５％とした。タンパク質の染色はCoomassie Briliant Blueを用いた。
以上の操作で８０８４株のα−ガラクトシダーゼタンパク質を電気泳動的に単一にまで精製できた。回収率は３６％で、比活性は２１６．２Ｕ／ｍｌであった。
【００３９】
（２）精製α−ガラクトシダーゼの内部アミノ酸配列およびオリゴヌクレオチドプライマーの合成
【００４０】
（１）で調製した精製酵素標品とリジルエンドペプチダーゼとを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で混合し、３７℃で２４時間反応させてポリペプチド鎖を分解した。反応後の分解ペプチド断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、転写されたペプチド鎖を切り出し、それぞれのＮ−末端アミノ酸配列を気相式プロテインシーケンサーに供して解読した。
その結果、４カ所の内部アミノ酸配列を解読することができた。これらの配列は、配列番号１に全て含まれることになった（図１）。
【００４１】
決定したアミノ酸配列を基に、配列番号３、４（図５、６）に示す２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。即ち、縮重の少ないアミノ酸配列を多く含む部位を選択し、すでにＤＮＡのデーターベース、DNA Information Stock Center、DISC(http://www.dna.affrc.go.jp/,National Institute of Agrobiological Resources, Tsukuba）に登録されている糸状菌アブシディア属のコドン使用頻度を考慮に入れた。また、イノシンも併用した。
【００４２】
使用したセンスプライマー、アンチセンスプライマーを配列番号３、４（図５、６）に示す。なお、配列中、ｖはＡ又はＧ、ｙはＴ又はＣ、ｎはＩ（イノシン）を示す。
【００４３】
（３）８０８４株の染色体ＤＮＡの調製
これからの実験で多用する遺伝子クローニング実験の基礎技術は、斯界において公知のものであり、特に断らない限りSambrookらの方法（Sambrook et al.：モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、１９８９年）に従って行った。
【００４４】
（１）で調製した８０８４株の湿菌体約２ｇをＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、良く洗浄した。遠心分離して菌体を回収し、同洗浄操作を３回繰り返した。その後、洗浄菌体をマイナス８０℃で冷凍してから、凍結乾燥を行った。その後、乾燥菌体を乳鉢ですりつぶし、粉末状にした。この粉末にリゾチームとＮ−アセチルムラミデイスをそれぞれ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。処理物をマイナス８０℃で１時間凍結し、ＴＥＮ緩衝液を加え３７℃に加温し、３．３％（ｗ／ｖ）となるようにＳＤＳを加えさらに３７℃で３時間インキュベートし細胞を破砕した。この溶液をフェノール処理後、エタノール沈澱し析出した核酸をガラス棒に巻き付け回収した。この核酸を７０％のエタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解しさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、フェノール−クロロフォルム処理後、エタノール沈澱し、回収し、染色体ＤＮＡとした。この操作により約１０ｍｇの染色体ＤＮＡを調製することができた。
【００４５】
（４）プローブ合成と確認
（２）で作製したプライマーと（３）で調製した染色体ＤＮＡを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＤｉｇ−１１−ｄＵＴＰの蛍光色素を用いた系でＰＣＲを行い（総液量は５０マイクロリットルで行い、サイクル数は３５回とし、１サイクルは９８℃−１分間、６８℃−３分間とした）、増幅された約１８０塩基対の蛍光ラベルＤＮＡ断片をプローブとした。
【００４６】
また、作製したプローブは、８０８４株から（５）に記した手法で抽出したｍＲＮＡを、ホルムアミド−ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に供し分離して、キャピラリー法でナイロンメンブランにブロットされ、ノーザンブロット解析して、実験に使用可能であることを確認した。プローブとのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリ溶液（６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム）、３％ブロッキング試薬、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０マイクログラム／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）中で６８℃で一晩とした。
【００４７】
（５）８０８４株のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーの構築
８０８４株を培養し、菌体から全ＲＮＡを抽出して、マイナス８０℃で保存した。
ポリＡ  ｍＲＮＡを簡易カラムを用いて精製した後、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは、ｐＳＰＯＲＴ IIプラスミドベクターのマルチクローニング部位に挿入した。このプラスミドベクター群を、大腸菌５α株にエレクトロポレーション法で形質転換してｃＤＮＡライブラリーを構築した。形質転換体は１５０マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌポリペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ７．０）に出現するコロニーをもって確認した。
【００４８】
（６）８０８４株のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の取得およびその一次配列
（５）で作製した遺伝子ライブラリーの大腸菌コロニーのＤＮＡをナイロンメンブランにブロットした。（４）にて作製したＤｉｇラベル化プローブを用いて、（４）のハイブリダイゼーションと同じ条件で陽性クローンをコロニーハイブリダイゼーションでスクリーニングした。スクリーニングは２段階選抜を行い、最終選別として大腸菌を単一コロニー化した後、プラスミドＤＮＡを抽出しフラグメントサザンハイブリダイゼーションを行って強いシグナルが確認できるものを陽性クローンとした。
【００４９】
目的遺伝子を含む可能性がある領域のＤＮＡ断片を鋭意サブクローニングし、ＤＮＡの塩基配列を決定した。一連の操作は宝酒造（株）遺伝子解析センターに依託した。
【００５０】
ＤＮＡシーケンスの解析はＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いた。ＤＮＡシーケンスに関する様々な情報はDNA Information Stock Center、ＤＩＳＣのネットワークサービスを利用した。
【００５１】
その結果、配列番号２（図２）に示す５′末端からのＤＮＡ塩基配列を有する２，１９０塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見い出されていない新規な遺伝子であった。また、このＤＮＡ塩基配列より類推される８０８４株が生産するα−ガラクトシダーゼは７２９個のアミノ酸からなり、配列番号１（図１）に示すようなＮ末端からのアミノ酸配列を有していた。
【００５２】
（７）α−グルコシダーゼ遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
クローン化されたα−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片を、構造遺伝子が完全な形で取り出せる制限酵素（ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ）で切断し、平滑末端化し、切断部位間の約２．２キロ塩基対の領域をｐＥＴ３２−ＢＫ／ＬＩＣプラスミドベクターのthioredoxin配列の下流に連結し、新たなプラスミドベクターｐＥＴ３２Ｔｒｘ／ｇａｌαを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写、翻訳できるＴ７Ｌａｃプロモーターが導入されており（８）に示す培養方法でα−ガラクトシダーゼを高効率で発現・製造させることができる。
【００５３】
この遺伝子組換えプラスミドベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＢ３）株のコンピテント細胞にヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を創製した。この微生物はEscherichia coli BL21(DE3)-pET32Trx/galαと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４０として国際寄託した。
【００５４】
（８）形質転換体の培養及びα−ガラクトシダーゼの発現
（７）で作製した大腸菌BL21(DE3)-pET32Trx/galαを１５０マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地で３７℃で対数増殖中期まで培養した。この菌液を終濃度で１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以後、ＩＰＴＧと略する）を含む１００ｍｌの同培地に接種し、３７℃で振とう培養した。培養後、大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。破砕液を遠心分離し、この上清を無細胞抽出液とした。
【００５５】
この様に調製した大腸菌BL21(DE3)-pET32Trx/galαの無細胞抽出液のα−ガラクトシダーゼ活性を定法に従い測定したところ、１８．７単位／培養液（ｍｌ）であった。８０８４株は最適条件下でも０．４４９単位／培養液（ｍｌ）のα−ガラクトシダーゼしか生産できないため、本発明により遺伝子組換え体は、元株８０８４より高い生産性を獲得した。活性の比較を表２に示した。
【００５６】
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【００５７】
また、この無細胞抽出液から発現α−ガラクトシダーゼは、プラスミドベクター由来のヒスチジンＴａｇを利用したアフィニティークロマトグラフィーで１回の操作で、電気泳動的に完全精製することができ、回収率９２％で、完全にかつ安価に発現α−ガラクトシダーゼが供給できる。
【００５８】
【実施例】
（発現α−ガラクトシダーゼを用いたラフィノースの製造）
スクロースが終濃度で６００ｇ／Ｌ、ガラクトースが終濃度で２５０ｇ／Ｌとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した液を基質溶液とした。この基質溶液と（８）で調製した精製遺伝子組換え発現α−ガラクトシダーゼ溶液（１００Ｕ分）とを混合し、７０℃で酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。この反応で合成されたラフィノースはＨＰＬＣを用いた系で測定した。カラムは、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＫＳ８０１（８．０×３００ｍｍ）、溶離液は水、検出器はＲＩを用いた。
【００５９】
その結果、表３に示すように、ラフィノースの収率は使用したガラクトースの１０％であった。つまり、０．１４モル／Ｌ（２５ｇ／Ｌ）のラフィノースが合成された。また、ガラクトースをＵＤＰ−ガラクトースに変更して基質として用いた時、ラフィノースの収率は４５％と増加した。つまり、０．６３モル／Ｌ（１１３ｇ／Ｌ）のラフィノースが合成された。
【００６０】
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【００６１】
なお、本実施例においては、上記のように新規形質転換体Escherichia coli BL21(DE-3)-pET32Trx/galαをＩＰＴＧで誘導培養し、無細胞抽出液を調製した。本培養条件で、１８．７単位／培養液ｍｌのα−ガラクトシダーゼが生産できる。本酵素をアフィニティークロマトグラフィーで精製することができるが、工業的なラフィノースの生産を考慮した場合、コスト面に関わってくるので、ラフィノースの生産効率の面で何の問題もないと思われるため、無細胞抽出液をそのまま使用する事とした。
【００６２】
反応液の全量を５００ｍｌとして、スクロースが終濃度で６００ｇ／Ｌ、ガラクトースが終濃度で２５０ｇ／Ｌとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した液を基質溶液とした。この基質溶液と調製したα−ガラクトシダーゼ溶液（１００単位分）とを混合し、７０℃で酵素反応を行った。反応終了後、沸騰水中で５分間保持することで反応を停止した。
【００６３】
本酵素の正反応での至適ｐＨは５．５であったが、逆反応のラフィノース合成反応では７．０であったため、正反応が起こりにくくするため、１０ｍＭリン酸緩衝液のｐＨを７．０と設定した。
【００６４】
また、ラフィノース合成反応は、できる限り高温で行う方が高効率なため（通常の４０℃付近の反応温度では、正反応が行われてしまう）、酵素の安定性は悪化するが、反応温度を７０℃に設定した。
【００６５】
また、スクロース、ガラクトースの基質濃度は、各２５％以上でないとラフィノース合成反応が進行しなかった。そのため、酵素の安定性は悪化するが、スクロース６０％、ガラクトース２５％と設定した。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のラフィノースの新規製造方法は、耐熱性α−ガラクトシダーゼを用いることによってはじめて可能となったものである。本酵素は、ガラクトシド結合を効率的に分解する作用を有するだけでなく、その逆反応を利用して、スクロースとガラクトースからラフィノースを大量合成することが可能となった。この逆反応は高温条件下で実施する必要があるため、反応中雑菌による汚染が防止されており、きわめて優れた工業的ラフィノースの製造方法ということができる。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】８０８４株由来の耐熱性α−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図２】８０８４株由来の耐熱性α−ガラクトシダーゼ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】発現α−ガラクトシダーゼのｐＨに対する影響を示す。
【図４】発現α−ガラクトシダーゼの温度に対する影響を示す。
【図５】センスプライマーの塩基配列を示す。
【図６】アンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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