(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒト抗原受容体を生成する方法であって、前記方法は、
（ａ）非ヒト標的抗原特異的抗体のＶ鎖と共にヒト抗原に結合するヒトＶＬ鎖又はＶＨ鎖を選択するステップと、
（ｂ）その次に、機能的に再構成された前記ＶＨ免疫グロブリン鎖とＶＬ免疫グロブリン鎖との組合せを選択するステップであり、ここで、少なくとも前記ＶＨ鎖が刺激されていない成熟したヒトＢリンパ球に由来し、前記ＶＬ鎖が天然のヒトＢ細胞レパートリーに由来し、前記ＶＨ鎖と前記ＶＬ鎖とが組換えベクターから発現し、
（ｃ）前記ヒト抗原への結合にインビトロディスプレー系を使用するステップと、
を含む、
抗ヒト抗原受容体を生成する方法。
【請求項２】
前記受容体が、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリンフラグメントが、Ｆｖフラグメントである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも前記ＶＨ免疫グロブリン鎖と、任意選択的な前記ＶＬ免疫グロブリン鎖とが、ヒトＩｇＤレパートリーに由来する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記インビトロディスプレー系が、ファージディスプレー系である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記再構成された鎖が、１つ又は複数の異なるライブラリーから発現される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト抗原が腫瘍抗原である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍抗原が、ヒト１７−１Ａ抗原である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＨ鎖が、配列表の配列番号１４３および配列表の配列番号１４５に示される２つの配列のうちの１つを含み、及び／又は、前記ＶＬ鎖が、配列表の配列番号１４１および配列表の配列番号１４７に示される２つの配列のうちの１つを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択するステップ（ｂ）が、
（ｉ）固定化された標的抗原又はそのフラグメントに、抗原受容体を発現するディスプレー媒体を結合させるステップと、
（ｉｉ）非特異的に結合する前記ディスプレー媒体を洗い流し、その後、前記固定化された標的抗原又はそのフラグメントに特異的に結合する前記ディスプレー媒体を溶離するステップとを含み、
このようにして単離された、前記抗原受容体を含む前記ディスプレー媒体が、任意選択的に複製により増加され、（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のインビトロ選択のさらなるラウンドに供せられるものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択するステップ（ｂ）が、
（ｉ）標的抗原又はそのフラグメントを発現し任意選択的に標識された細胞に、抗原受容体を発現するディスプレー媒体を結合させるステップと、
（ｉｉ）非特異的に結合する前記ディスプレー媒体を洗い流し、その後、前記任意選択的に標識された細胞に特異的に結合する前記ディスプレー媒体を溶離するステップとを含み、
このようにして単離された、前記抗原受容体を含む前記ディスプレー媒体が、任意選択的に複製により増加され、（ｉ）、及び（ｉｉ）に記載のインビトロ選択のさらなるラウンドに供せられるものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択するステップ（ｂ）が、
（ｉ）標的抗原又はそのフラグメントを発現し任意選択的に標識された細胞に、抗原受容体を発現するディスプレー媒体を結合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記標的抗原溶液又は標的抗原を発現する細胞の懸濁液から前記標的抗原が結合した前記ディスプレー媒体を積極的に濃縮するステップとを含み、
このようにして単離された、前記抗原受容体を含む前記ディスプレー媒体が、任意選択的に複製により増加され、（ｉ）、及び（ｉｉｉ）に記載のインビトロ選択のさらなるラウンドに供せられるものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択するステップ（ｂ）が、
（ｉ）可溶性であり、標識された標的抗原又はそのフラグメントに、抗原受容体を発現するディスプレー媒体を結合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記標的抗原溶液又は標的抗原を発現する細胞の懸濁液から前記標的抗原が結合した前記ディスプレー媒体を積極的に濃縮するステップとを含み、
このようにして単離された、前記抗原受容体を含むディスプレー媒体が、任意選択的に複製により増加され、（ｉ）、及び（ｉｉｉ）に記載のインビトロ選択のさらなるラウンドに供せられるものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ディスプレー媒体を結合させるステップで、前記ディスプレー媒体が標識された標的抗原又はそのフラグメントに結合される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非ヒト標的抗原特異性抗体の前記鎖が、マウスＶＨ鎖又はマウスＶＬ鎖である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
適切な組合わせの前記選択が、
（ａ）様々な異なるＶＬ鎖と組み合わせた１つの同じＶＨ鎖を、前記ヒト抗原への結合について試験するステップ、又は、
（ｂ）様々な異なるＶＨ鎖と組み合わせた１つの同じＶＬ鎖を、前記ヒト抗原への結合について試験するステップを含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
選択後に、ヒトＶＨ鎖又はヒトＶＬ鎖又はそれらに対応する核酸を得るステップと、前記ＶＨ鎖又は前記ＶＬ鎖を同じ又は他のＶＨ鎖又はＶＬ鎖にそれぞれ融合させるか、重鎖の免疫グロブリン定常領域（ＣＨ）又は軽鎖の免疫グロブリン定常領域（ＣＬ）にそれぞれ融合させるか、又は、非免疫グロブリン鎖及びそれに対応する核酸にそれぞれ融合させるステップとをさらに含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記定常領域鎖が、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３に由来する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
選択後、ヒトＶＨ鎖及びヒトＶＬ鎖を得るステップと、前記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を非タンパク質医薬品及び／又は他の生物学的に活性な分子に物理的に連結させるステップとをさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＶＨ鎖又は前記ＶＬ鎖が、刺激されていない成熟したヒトＢリンパ球に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果による核酸配列から発現される請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
天然のヒト１７−１Ａ抗原に特異的であることを特徴とするヒトの抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法で得られる請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
前記１７−１Ａ抗原の細胞外ドメインのエピトープを認識し、前記抗原は、以下のアミノ酸配列、ＮＹＫＬＡＶＮＣＦＶＮＮＮ、ＮＣＦＶＮＮＮＲＱＣＱＣＴ、ＮＮＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡ、ＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡＱＮ、ＩＴＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩ、ＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩＩＥ、ＥＩＴＴＲＹＱＬＤＰＫＦＩ、およびＲＹＱＬＤＰＫＦＩＴＳＩＬの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項２１又は２２に記載の抗体。
【請求項２４】
前記１７−１Ａ抗原は、以下のアミノ酸配列、ＮＹＫＬＡＶＮＣＦＶＮＮＮ、ＮＣＦＶＮＮＮＲＱＣＱＣＴ、ＮＮＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡ、ＮＲＱＣＱＣＴＳＶＧＡＱＮ、ＩＴＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩ、ＣＳＥＲＶＲＴＹＷＩＩＩＥ、ＥＩＴＴＲＹＱＬＤＰＫＦＩ、およびＲＹＱＬＤＰＫＦＩＴＳＩＬの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記ＶＨ鎖が、配列表の配列番号１４３のヌクレオチド９１〜１０５、ヌクレオチド１４８〜１９８、及びヌクレオチド２９２〜３５１、及び配列表の配列番号１４５のヌクレオチド９１〜１０５、ヌクレオチド１４８〜１９８、及びヌクレオチド２９２〜３０９、に示す配列のうち少なくとも１つのＣＤＲを含み、及び／又はＶＬ鎖が、配列表の配列番号１４１のヌクレオチド７０〜１０２、ヌクレオチド１４８〜１６８、及びヌクレオチド２６５〜２９４、及び配列表の配列番号１４７のヌクレオチド７０〜１０２、ヌクレオチド１４８〜１６８、及びヌクレオチド２６５〜２９４、に示す配列のうち少なくとも１つのＣＤＲを含む請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の抗体と、任意選択的な製薬上許容できるキャリヤを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトにおいて低免疫原性であるか免疫原性を有さない抗ヒト抗原受容体の生成方法であって、機能的に再構成されたＶＨ免疫グロブリン鎖とＶＬ免疫グロブリン鎖の組合せを選択するステップを含み、少なくとも前記ＶＨ鎖が本質的に刺激されていない（抗原未感作の；unprimed）成熟ヒトＢリンパ球に由来するか、または本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来し、前記ＶＬ鎖が天然のヒトＢ細胞レパートリーに由来し、前記ＶＨ鎖とＶＬ鎖とが組換えベクターから発現され、且つヒト抗原に結合させるためのin vitroディスプレー（display）系を使用する生成方法に関する。
本発明は、さらに、ヒトにおいて低免疫原性であるか免疫原性を有さず、且つヒト抗原対する受容体に関し、前述の受容体は、本発明の方法によって得られる。前述の受容体は、好ましくは、抗体またはそれらのフラグメント、あるいは前述の抗体のＶＨ／ＶＬ鎖を含む免疫複合体である。特に、本発明の受容体は、ヒト腫瘍抗原に関し、好ましくは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ−４０またはＧＡ７３３−２としても知られるヒト腫瘍抗原１７−１Ａに関する。最後に、本発明は、本発明の方法を実行するのに有用なキットに関する。
ヒト免疫系のような哺乳類免疫系は、免疫担当細胞や自己抗原特異的分子に対して選択する。この点に関する免疫系の制御異常により、慢性関節リウマチのような自己免疫疾患が生じる。したがって、一般に、自己反応性抗体またはＴ細胞に関する免疫系の監視は極めて有益である。しかし、哺乳類、特に人体で発現される抗原に向けられる自己反応性抗体を有することが有利な場合もある。このような抗原は、たとえば、腫瘍関連抗原である。たとえば、ヒト１７−１Ａ−抗原またはＥｐＣＡＭ抗原は、単純上皮細胞およびそれらに由来する悪性腫瘍によって発現される表面糖タンパク質である。この抗原は、特に、後期充実性転移を惹起する恐れがあり、したがって、患者の予後を悪化させるおそれのある播種性腫瘍細胞に罹患している極小の残存疾患を有する患者において、癌のモノクローナル抗体療法に報いる標的であることが証明されている。極小の直腸結腸癌が残存する患者では、原発性腫瘍の手術後４ヶ月以内に、ヒト１７−１Ａ抗原特異的ネズミモノクローナル抗体を５回、合計で９００ｍｇの抗体を各患者に全身投したとき、未治療患者と比較して、５年死亡率が３０％低下した（Riethmuller, Lancet 343（1994）, 1177-1183）。しかし、抗体投与の経過中に、ネズミ免疫グロブリンに対する強い抗体応答が患者に現れた。これらのヒトの抗マウス抗体（human anti-mouse antibody;ＨＡＭＡ）を使用する場合、抗体療法の連続適用が厳しく制限され、その効力は次第に低減する。さらに、前の抗体治療または別のネズミ免疫グロブリンとの接触によって誘導される予め形成されたＨＡＭＡは、後の抗体療法をひどく妨害する恐れがある。
これらの問題を予防するためには、最小限の免疫原性を有する治療用抗体が好ましいであろう。この目標を達成するために、たとえば、ヒト免疫系が寛容しうるヒトＩｇ可変領域を使用することによって、ヒト抗体イディオタイプのアミノ酸配列および免疫原性プロフィールを最小限にすることにより、治療用抗体または抗体誘導体を完全にヒト化することも考えられる。
しかし、ヒト抗原に対するヒト抗体の生成は、２つの重大な問題に直面している。
（１）ハイブリドーマまたは他の細胞の不死化技術は、ネズミハイブリドーマテクノロジーと比較して、ヒト抗体産生細胞株樹立においてかなり非能率的であった。
（２）自己反応性抗体は、自己認容を仲介する機構により天然の抗体レパートリーを欠き、比較的効率がよい。
ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス（Bruggemann, Immunol. Today 17（1996）, 391-397）、および組合せ抗体ライブラリーおよびファージディスプレー技術は、Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）のin vitro組合せ、およびそれらの抗原結合特異性のin vitro選択を可能にするため、一般に、ヒト抗体があるかに利用しやすくなる（Winter, Annu, Rev. Immunol. 12（1994）, 433-455）。
ファージディスプレー法を使用することにより、１０7〜１０9の異なるＶＬ／ＶＨ対またはＶＨ／ＶＬ対の中から１つの特異的結合実体というような希少事象を容易に分離することができる。これは、免疫された宿主由来のＢリンパ球をレパートリークローニング用の起源として使用することにより、可変領域のレパートリーに関して、特異的結合実体が濃縮されているときに特にあてはまる。しかし、多くの場合、天然の抗体レパートリーの特異的結合実体の頻度は、実質的に低下している。このことは、自己抗原に結合する抗体の場合に特にそうである。結果として従来のサイズ（１０7〜１０9個の独立クローン）の組合せ抗体ライブラリーとなる、自己寛容宿主由来のＶＬ領域とＶＨ領域の無作為組合せでは、ファージディスプレー法による自己反応性抗体のin vitro選択で成功するのに十分ではない。この問題を回避するための１つの戦術は、天然のレパートリーにおける自己反応性抗体の低頻度がライブラリーサイズによって補われる、非常に大きい組合せ抗体ライブラリーを使用することである。しかし、現在の技術では、プラスミドＤＮＡで大腸菌細胞を形質転換する効率に限界があり、１０9を超えるサイズの独立クローン組合せ抗体ライブラリーを得ることは困難である。
天然の抗体レパートリーにおける自己寛容介在性バイアスは、自己反応性抗体を過少表示し且つ自己抗原を特異的に認識する抗体を単離する機会を明らかに低減させるので、これを避けるために、半合成または完全合成のＶＬ鎖レパートリーおよび／またはＶＬ鎖レパートリーを使用したアプローチが開発されている。たとえば、in vivoにおけるＶ−Ｊ組換えまたはＶ−Ｄ−Ｊ組換えに似ている、再構成されていないヒトＶ遺伝子セグメントのほとんど全レパートリーが、ゲノムＤＮＡからクローニングされ、機能的可変領域遺伝子のin vitro組換えに使用されている（Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227（1992）, 381-388、Nissim, EMBO J. 13（1994）692-698、Griffiths, EMBO J. 13（1994）, 3245-3260）。通常、重鎖ＣＤＲ３の異常な長さおよび配列可変性の主な原因であるＶ−Ｄ−／Ｄ−Ｊ−結合およびＤセグメントの多様性、ならびに軽鎖ＣＤＲ３の配列可変性の一因であるＶ−Ｊ結合の多様性は、完全合成法および半合成法で変性オリゴヌクレオチドを使用して、ランダム配列により模造される（Hoogenboom（1994）（前出）、Nissim（前出）、Griffiths（前出）、Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 89（1992）, 4457-4461）。しかし、ヒト抗原に結合するために、ヒトＶ遺伝子配列に基づいて、このような半合成または合成のレパートリーから選択されるＶＬ／ＶＨ対またはＶＨ／ＶＬ対は、ヒトで望ましくない免疫応答応答を惹起する恐れがある、免疫原性エピトープを形成する危険性がある（Hoogenboom, TIBTECH 15（1997）, 62-70）。特に、完全に無作為化された配列レパートリーに由来するＣＤＲ３領域は、結果としてその後消失する外来抗原として認識されずにヒト免疫監視を受けなければならなかったことが未だかつて無いため、潜在的に免疫原性エピトープを形成するように運命付けられている。ネズミ免疫系では寛容されるがヒト免疫系では寛容されない３つの免疫グロブリン分子が選択されるため、これは、ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス由来のヒト抗体にも同様に該当する。
したがって、本発明の基礎をなす技術的問題は、ヒトで低免疫原性であるか免疫原性を有さない受容体の生成が可能であり、且つ人体の抗原を標的とするために使用することができる方法を提供することである。前述の技術的問題は、請求の範囲に記載の実施形態を提供することによっての解決される。
したがって、本発明は、ヒトにおいて低免疫原性であるか免疫原性を有さない抗ヒト抗原受容体の生成方法であって、機能的に再構成されたＶＨ免疫グロブリン鎖とＶＬ免疫グロブリン鎖の組合せを選択するステップを含み、少なくとも前述のＶＨ鎖が本質的に刺激されていない成熟ヒトＢリンパ球に由来するか、または本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来し、前述のＶＬ鎖が天然のヒトＢ細胞レパートリーに由来し、前述の鎖が組換えベクターから発現され、且つヒト抗原に結合させるためのin vitroディスプレー系を使用する生成方法に関する。
本発明の方法は、それ自身が全く免疫原性でないか、さほど免疫原性を有さず、ヒトの抗原を標的とするために使用することができる受容体を提供するのに極めて有利である。このような受容体は、細胞の受容体を標的とすることにより、様々な疾患、たとえば、腫瘍や自己免疫疾患、移植後の移植片拒絶、伝染病の治療に使用することができ、また、病理学的経過に関与する重要分子を標的とすることにより、アレルギー性疾患、炎症性疾患、内分泌疾患および退行性疾患の治療に使用することができる。
もちろん、当技術分野で公知の技術を使用して、本発明の受容体のＶＨ／ＶＬ免疫グロブリン鎖を、それらの核酸配列およびアミノ酸配列に関して、さらに研究することが可能であり、たとえば、Sambrook（Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY（1989））を参照されたい。いったん核酸配列またはアミノ酸配列が決定されると、その後は、本発明の受容体を他の方法、たとえば、合成または半合成の受容体を生成する合成方法または半合成方法、またはヒト免疫グロブリン受容体を発現するトランスジェニックマウスにおいて作ることができ、本明細書で上述した特徴を有し、且つこのような合成方法または半合成方法か、または前述のトランスジェニックマウスで作られる受容体も本発明の範囲内に含まれる。
本受容体をヒト抗原に結合させた後、この受容体をさらに精製することができる。たとえば、抗原特異性を持たない非結合受容体を洗浄ステップで除去することができる。結合した受容体を、ヒト抗原から溶離してさらに精製することができ、所望の受容体および／または対応する組換えベクターが純粋な形で単離されるまで、所望の受容体の発現、結合および選択をさらに何ラウンドか使用することができる。
このように、本発明の方法は、ヒト免疫系によるＩｇ可変領域の事前選択を使用する。本受容体は、本質的に刺激されていない成熟ヒトＢリンパ球によって発現される天然の抗体レパートリーから独占的にまたは優先的に作られたヒト組合せ抗体ライブラリーからin vitro選択されたレパートリーに由来するか、または本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来する。
しかし、Ｉｇ可変領域は、これらの事前選択されたＢ細胞個体群を代表する他の様々な起源に由来してもよい。
前述のＶＨ鎖またはＶＬ鎖の起源として機能するＢ細胞源に関する科学的背景を、以下のように説明することができる。
ＩｇＤおよびＩｇＭを膜抗原受容体として発現する、刺激されていない成熟Ｂリンパ球は、多価自己抗原に遭遇しない限り、二次リンパ系器官に行く間に、または二次リンパ系器官の間を往来する間に、原始濾胞に入り、結果としてクローン除去または可溶性一価自己抗原をもたらし、その結果、原始濾胞から排除することにより、それらのＢ細胞をアネルギー且つ短命にする。ＩｇＭのみを発現する未熟なＢ細胞が骨髄内で自己抗原と接触すると、抗原価によって、クローン除去またはアネルギーを招く。アネルギーＢ細胞は、表面ＩｇＤを発現するものの、この受容体を介して抗原に応答することができず、原始濾胞に接近せずに、またＴ細胞の助けがなければ、これらの細胞の半減期は短く、僅か２〜３日である。対照的に、自己抗原に遭遇していない、したがって原始濾胞に接近した、成熟した刺激されていないＢリンパ球は、数週間という長い半減期を有する。既述の自己寛容仲介機構にも拘わらず、これらの長寿の成熟した刺激されていないＢリンパ球の個体群は、潜在的自己反応性Ｂ細胞を依然として含むが、Ｔ細胞寛容による特異的Ｔ細胞の協力を見つける見込みはなく、したがって、増殖および抗体分泌をしない。低レベルで存在する多くの自己抗原に対するＢ細胞非応答性はこのタイプのものであり、ヘルパーＴ細胞に影響を及ぼすが、Ｂ細胞には影響を及ぼさないようである。本発明では、たとえば、ファージディスプレー法によってヒト抗原に対するヒト抗体を選択するのに特に適した組合せ抗体ライブラリーを構築するために、最も有望な天然のヒト抗体レパートリーとして、これらの長寿かつ非応答性、潜在的に自己反応性の成熟した刺激されていないＢリンパ球が同定された。本発明の基礎として使用される、主にin vivoでの半減期が長いＢ細胞に由来する、したがって、ヒト免疫系に長時間曝露される、この高度に選択された抗体レパートリーは、特に、ヒト免疫系に対して免疫原性を示す極めて変化しやすいＣＤＲ３領域内にエピトープを形成する抗体分子が明らかに欠けていることが予期される。したがって、この抗体レパートリーから選択されるヒト抗体は、半合成または完全合成のヒト抗体ライブラリーから選択されるものより、ヒトにおいて低い免疫原性プロフィールを有すると予期される。外来抗原との接触によって活性化される、成熟した刺激されていないＢ細胞は、ＩｇＤの発現を停止し、クローンの増殖、および可溶性免疫グロブリンを分泌するプラズマ細胞への分化を開始する。抗体応答の早期は、ＩｇＭ抗体によって支配されるが、その後は、ＩｇＧおよびＩｇＡが主なアイソタイプであり、ＩｇＥは、抗体応答の、小さいが、生物学的に重要な部分を提供する。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥを発現するＩｇＤ陰性の成熟した刺激されていないＢリンパ球と違って、ＩｇＤ陽性の成熟した刺激されていないＢ細胞は、クローン増殖を未だ経験しておらず、それ故、組合せＩｇＤライブラリーは、通常は外来抗原が決定要因となる免疫応答に現在関与している、あるいは以前に関与していた抗体特異性を過大表示せず、したがって、レパートリーの多様性が減少し、自己抗原に結合する見込みがない抗体候補用のライブラリースペースが徐々に減する。このことは、ヒ��抗原に対するヒト抗体を天然の抗体レパートリーからin vitro選択するのに、ヒトＩｇＭ組合せ抗体ライブラリーを使用することを推奨する従来技術（Hoogenboom（1997）（前出））と明らかに対照的である。
本発明の方法の好ましい実施形態で、前述の抗原受容体は免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。
免疫グロブリンのフラグメントは、当技術分野で従来知られている任意のフラグメント、たとえば、Ｆ（ａｂ）2フラグメントであってもよい。
本発明の方法の特に好ましい実施形態で、前述の免疫グロブリンフラグメントはＦｖフラグメントである。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、少なくとも前述のＶＨ免疫グロブリンフラグメント鎖および場合に応じて上述のＶＬ免疫グロブリンフラグメント鎖は、ヒトＩｇＤレパートリーに由来する。
この受容体、および好ましくは低免疫原性に合うように選択される抗体レパートリーは、ヒトＩｇＤ抗体ライブラリーで最もよく表されると結論を下されている。ＩｇＤは、多価自己抗原に遭遇しない限り、二次リンパ系器官に行く間に、または二次リンパ系器官の間を往来する間に、原始濾胞に入り、結果としてクローンの除去または可溶性一価自己抗原をもたらし、原始濾胞から排除することにより、Ｂ細胞をアネルギーでかつ短命にする成熟した刺激されていないＢリンパ球の表面上に、膜抗原受容体として、表面ＩｇＭと共に発現される。成熟した刺激されていないＢリンパ球の抗体レパートリーに加えて、ヒトＩｇＤライブラリーは、可溶性の一価抗原と接触してアネルギーにされた短命のＢ細胞の抗体レパートリーをさらに示すが、Ｂ細胞アネルギーの代わりにクローン除去を惹起する多価自己抗原に似た、ヒト細胞表面分子への特異的バインダーを提供しないようである。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述のin vitroディスプレー系はファージディスプレー系である。
このファージディスプレー系は、従来、特定の標的に結合する様々なペプチドおよびタンパク質の選択に便利に使用されてきた。この知識に基づいて、免疫グロブリンＶＨ鎖およびＶＬ鎖を、ファージディスプレー系に有用な分子も含むベクターに、便利にクローニングすることができる。このような分子およびベクターは、それぞれ、当業者に周知であり（Winter（前出）、Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Emzymology 2（1991）, 119-124）、ここでさらに詳細に説明する必要はない。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述の再構成された鎖の組合せは、１つまたは複数の異なるライブラリーから発現される。
この実施形態は、ＶＨ鎖またはＶＬ鎖が特定の標的に結合することが判っており、結合を再構成するか改良する第2のＶ鎖が選択される場合に、特に好ましい。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述のヒト抗原は腫瘍抗原である。
ヒト抗原が腫瘍抗原であれば、前述の抗原は、前述の腫瘍の表面上に発現されることが好ましい。この場合、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、有利に毒素にカップリングされる。遺伝子操作によって核酸レベルで、あるいは、たとえば化学的カップリングによってタンパク質レベルで、カップリングを実行することが可能である。
前述の腫瘍抗原が１７−１Ａ抗原であることが特に好ましい。
本発明の方法のさらなる特に好ましい実施形態で、前述のＶＨ鎖は、図７（ヌクレオチド１〜３８１）および図８（ヌクレオチド１〜３３９）に示す２つの配列の１つを含み、且つ／または前述のＶＬ鎖は、図６（ヌクレオチド１〜３２１）および図９（ヌクレオチド１〜３２１）に示す２つの配列の１つを含む。前述のＶＬ領域を両ＶＨ領域と組み合わせることができる、これらの特定のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む受容体は、ヒト１７−１Ａ抗原に特異的な第１のヒト抗体である。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述の選択ステップは、
（ｉ） （ａ）固定化された標的抗原またはそのフラグメント、又は、
（ｂ）標的抗原またはそのフラグメントを発現する選択により標識された細胞、又は、
（ｃ）可溶性の、好ましくは標識された標的抗原またはそのフラグメント、
に抗原受容体を発現するディスプレー媒体を結合させること、
（ii）非特異的に結合するディスプレー媒体（ａおよびｂ）の洗い流しにつづいて、非特異的手段（たとえば、低ｐＨ緩衝液）または特異的手段（たとえば、標的抗原特異的抗体）により、特異的に結合するディスプレー媒体の溶離すること、または
（iii）たとえば、それぞれ、標識された標的抗原または標的抗原を発現する標識された細胞に結合する磁気ビーズを使用した、標的抗原溶液または標的抗原を発現する細胞の懸濁液からディスプレー媒体（ｂおよびｃ）に結合した標的抗原の積極的に濃縮すること
を含み、このように単離された、それらの抗原受容体を含むディスプレー媒体が、選択により複製によって増加され、in vitro選択のさらなるラウンドに供せられる。
選択ステップの前に、代替Ｖ鎖と一緒に前述の抗原に結合するために、前述のＶＨ鎖または前述のＶＬ鎖のうちいずれかが選択される。異なる種に由来する標的抗原に特異的な鋳型抗体、たとえば、ヒト標的抗原に対するネズミモノクローナル抗体を使用して、この２工程手順を使用することができる。第１に、ヒトＶＬレパートリーまたはＶＨレパートリーを、たとえば、繊維状ファージ上にディスプレーされて抗原結合用にin vitro選択された、ネズミ鋳型抗体由来の１つの代替ＶＨ鎖またはＶＬ鎖と結合させる。したがって、全ライブラリーサイズをヒトＶＬレパートリーまたはＶＨレパートリーに独占的に利用でき、ヒト標的抗原の特異的結合に貢献することができるヒトＶＬ鎖またはＶＨ鎖候補を単離することができる。第２のステップで、鋳型抗体のの代替可変領域が対応するヒト可変領域レパートリーと置き換えられ、続いて第２ラウンドのin vitro選択が行われる。また、全ライブラリーサイズを１つのＶＨ領域レパートリーまたはＶＬ領域レパートリーに独占的に利用でき、したがって、限られたライブラリーサイズの条件で、２工程手順によって、１工程手順よりもはるかに多くのＶＬ領域候補およびＶＨ領域候補を、抗原結合に関してスクリーニングすることが可能になる。
ヒト１７−１Ａ抗原に特異的に結合するヒト抗体の可変領域をコードしているＤＮＡ配列をクローニングする場合、ファージディスプレー法によってヒトＩｇＤ組合せ抗体ライブラリーをスクリーニングするために、この２工程選択手順を有利に使用した。第１に、ヒト１７−１Ａ抗原に特異的に結合するネズミモノクローナル抗体Ｍ７９のＦｄ重鎖セグメント（Ｖｈ＋ＣＨ１）（Gottlinger, Int. J. Cancer 38（1986）, 47-53）を、ヒトκ軽鎖レパートリーおよびλ軽鎖レパートリーにそれぞれ結合させた。得られたライブラリーを繊維状ファージ上にディスプレーさせ、固定化した組換えヒト１７−１Ａ抗原を用いた数ラウンドの選別によってin vitro選択した。各ラウンドの選別後に幾つかのクローンから可溶性Ｆａｂフラグメントを発現させ、ＥＬＩＳＡで抗原結合についてスクリーニングした。選別中に濃縮された強力な結合実体は、配列解析で確認されたものと同じヒトκ軽鎖を含んでいた。以降、Ｋ８と呼ぶこのヒト軽鎖を、次にヒトＩｇＤ重鎖ライブラリーと結合させ、これを再度、繊維状ファージ上にディスプレーさせ、固定化した組換えヒト１７−１Ａ抗原を用いた数ラウンドの選別によってin vitro選択した。各ラウンドの選別後に幾つかのクローンから幾つかのＦａｂフラグメントを発現させ、再度、ＥＬＩＳＡで抗原結合についてスクリーニングした。選別手順中に濃縮された結合実体の配列解析で、Ｄ４．５およびＤ７．２と呼ばれる２つの異なる重鎖可変領域が明らかになり、それぞれが、Ｋ８軽鎖と結合して、ヒト１７−１Ａ抗原に対する特異性を有する異なるヒト抗原結合部位を形成する。κ軽鎖およびλ軽鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲならびにＩｇＤ重鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲを使用することにより、ヒト軽鎖レパートリーおよび重鎖レパートリーをドナー数人のヒト血液試料および骨髄試料から単離した幾つかの全ＲＮＡ調製物からクローニングした。ＲＮＡ調製物のＩｇＤ陽性Ｂ細胞を精製しなければ、in vivoでＩｇＤ重鎖と結合している軽鎖レパートリーを選択的に増幅することは不可能であるため、使用する軽鎖ライブラリーは、成熟した刺激されていないＢリンパ球またはアネルギーＢリンパ球の抗体レパートリーに限定される。しかし、抗原認識では重鎖が支配的であるため、このことによって、自己抗原に対するヒト抗体の選択に関するＩｇＤレパートリーの利点は実質的に損なわれない。さらに、最も重要なことに、ヒト免疫系に曝露されるため、このような軽鎖の選択により、ヒトにおける低免疫原性が依然として保証される。
本発明の方法のさらなる特に好ましい実施形態で、前述の代替鎖はマウスＶＨ鎖またはＶＬ鎖である。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述の適当な組合せの選択は、
（ａ）様々な異なるＶＬ鎖と組み合わせた同じ１つのＶＨ鎖を、前述のヒト抗原への結合について試験すること、または
（ｂ）様々な異なるＶＨ鎖と組み合わせた同じ１つのＶＬ鎖を、前述のヒト抗原への結合について試験すること
を含む。
この実施形態は、ＶＬ鎖またはＶＨ鎖のいずれかがヒト標的分子と特異的に相互に作用することがわかっている場合に、有利に使用される。次いで、好ましくは、標的分子への改良された結合に基づいて、適当な第２の鎖を選択することができる。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述の方法は、選択後にヒトＶＨ鎖およびＶＬ鎖、またはそれらと対応する核酸を得るステップと、前述の鎖を同じまたは他のＶＨ鎖またはＶＬ鎖、重鎖の免疫グロブリン定常領域（ＣＨ）または軽鎖の免疫グロブリン定常領域（ＣＬ）またはその一部、または他の生物学的に活性な分子、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子量有機化合物、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド模造品、ＰＮＡに融合するステップとを含む（Milner, Nature Mdicine 1（1995）, 879-880, Hupp, Cell 83（1995）, 237-245, Gibbs and Oliff, Cell 79（1994）, 193-198）。その他の機能的分子を、たとえば、化学的手段によって、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖に物理的に結合することも可能であり、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって融合することも可能である。
本発明のこの実施形態は、人体の所望の抗原を標的として使用することが可能な特定の薬剤を開発するのに特に有用である。たとえば、腫瘍抗原を標的とする場合、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を、核酸レベルまたはアミノ酸レベルで、毒素部分（結果として免疫毒素を生じる）、細胞性受容体の細胞外タンパク質または可溶性サイトカインまたはそれぞれのその一部（結果として抗腫瘍免疫応答を増強する構築物を生じる）、または抗体ＦＶフラグメント（二重特異性抗体誘導体を生じる）に融合することが可能である。
本発明の方法のさらなる特に好ましい実施形態では、前述の定常領域鎖はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来する。
標的抗原を発現する細胞を人体内で破壊しなければならない場合、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３の定常領域鎖を優先的に使用することが好ましい。これらのＩｇＧサブクラスが抗体依存性細胞障害（abtibody dependent cellular cytotoxicity:ＡＤＣＣ）を効率よく仲介し、且つこれらの抗体サブクラスによって認識されて結合された細胞の破壊に貢献することは、当技術分野で周知である。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述のＶＨおよび／またはＶＬ鎖を、好ましくは低分子量の、非タンパク質医薬品、たとえば、放射性同位元素や化学療法に使用される物質とカップリングさせ、その結果、さらに特異的な、前述の医薬品のin vivo標的を生じる。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、前述のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、本質的に刺激されていない成熟したヒトＢリンパ球または本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果である核酸配列から発現される。
いったんＶＨ鎖またはＶＬ鎖の適当な起源が同定され、単離されたら、その後は、ＶＨ鎖またはＶＬ鎖をＲＴ−ＰＣＲで一度増幅することが好ましい。これらの２つの組織区画は、ヒトのＢ細胞源に最も接近しやすいため、ヒト骨髄、または、さらに好ましくはヒト血液の、有核細胞のｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによるＶＨ鎖またはＶＬ鎖の増幅に使用することが好ましい。たとえば、ＲＮＡ調製物に先立って、磁気ビーズまたはサイトメトリーに基づいた細胞選別を使用することにより、前述組織区画の有核細胞から、アネルギーＢ細胞、またはさらに好ましい成熟した刺激されていないＢリンパ球を単離することは、さらに好ましい。この手順で、ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＶＨ鎖とＶＬ鎖の両者が、好ましいＢ細胞個体群に由来することが保証される。あるいは、前述の組織区画に由来する有核細胞の全分画のｍＲＮＡを使用してＶＨ鎖またはＶＬ鎖をＲＴ−ＰＣＲで増幅する場合、成熟した刺激されていないヒトＢリンパ球およびアネルギーヒトＢ細胞のみに発現される、ヒトＩｇＤ重鎖からＰＣＲ生成物を独占的に生成させる、たとえば、表１に記載の、ＩｇＤ特異的３′ＰＣＲプライマーを使用することによって、ヒトＩｇＤの重鎖Ｆｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１）の半分として、ＶＨ領域を増幅することが好ましい。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、ヒトで低免疫原性であるか、または免疫原性を有さない抗ヒト抗原受容体は、好ましくは本質的に刺激されていない成熟したヒトＢリンパ球または本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来し、上述した本発明による方法で得られる、機能的に再構成されたＶＨ鎖とＶＬ鎖の組合せを含む。
本発明の抗体の利点を、本明細書に略述してきた。ヒト抗原を標的とし、ヒト起源に由来する対応する抗体、したがって、ヒトで低免疫原性であるか免疫原性を有さない前述の抗体は、当技術分野で、今まで単離されていなことを強調しておかなければならない。したがって、本発明の抗体は、医学および薬学の様々な分野で使用することが可能な抗体の新たな開発全体の出発点である。
本発明の方法のさらなる好ましい実施形態で、受容体は抗体またはそのフラグメントである。
本発明の方法の別の好ましい実施形態で、受容体は、ヒト腫瘍抗原に特異的であり、最も好ましくは、ヒト１７−１Ａ抗原に特異的である。
本発明は、さらに、前述のＶＨ鎖が図７（ヌクレオチド１〜３８１）および図８（ヌクレオチド１〜３３９）に示す２つの配列の１つを含み、及び／又は前述のＶＬ鎖が、図６（ヌクレオチド１〜３２１）および図９（ヌクレオチド１〜３２１）に示す２つの配列の１つを含む受容体に関する。さらに、本発明は、本発明の受容体に含まれるＶＨ鎖またはその一部に関する。
本発明は、本発明の受容体に含まれるＶＬ鎖またはその一部にも関する。
本発明の方法のさらなる特に好ましい実施形態で、前述のＶＨ鎖の一部は、ＣＤＲ３領域である。
さらに、本発明は、機能的に再構成されたＶＨ免疫グロブリン鎖およびＶＬ免疫グロブリン鎖およびの組合せを含み、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の少なくとも１つが本質的に刺激されていない成熟したヒトＢリンパ球に由来するか本質的にアネルギーのヒトＢ細胞に由来し、前述のＶＨ鎖およびＶＬ鎖がin vitroディスプレー系の組換えベクターから発現可能であることを特徴とするキットに関する。
前述のキットは、本発明の方法を実施する際に、したがって所望の特異性を有する受容体を得る際に有利に使用される。
好ましくは、前述のキットでは、前述のin vitroディスプレー系は、ファージディスプレー系である。
さらに、本発明は、ヒト配列に由来し、ヒト１７−１Ａ抗原に特異的である点で特徴的である抗体に関する。
本発明の方法を使用して、初めに、ヒト１７−１Ａ抗原に特異的なヒト抗体が生成される。前に指摘した通り、ヒト腫瘍関連抗原に対するヒト抗体は、通常、免疫系の自己認容を仲介する機構に供され、従って、in vivoで自己反応性抗体を発現するＢリンパ球の消失を招くため、この生成は些細な仕事ではない。既知の腫瘍関連抗原１７−１Ａは、上皮性腫瘍上に発現される他にも、他の腫瘍抗原よりも広範囲の正常な上皮組織上に、はるかに遍在的に発現される。したがって、現在は、１７−１Ａ抗原は、最初に記述されたときに考えられた腫瘍抗原というよりむしろ汎上皮抗原と考えられている。比較すると、ｅｒｂ−Ｂ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、Ｍｕｃ−１（ＰＥＭ）またはThompson-Friedreich抗原のような、上皮性腫瘍上に存在するその他のいわゆる腫瘍抗原は、通常、正常な上皮組織上で、はるかに制限された発現パターンを示す。したがって、この１７−１Ａ抗原は遍在しているので、このようなＢ細胞が１７−１Ａ抗原との遭遇を長期間避けることは不可能に近いと思われるため、親和性が低くても、１７−１Ａ反応性抗体を発現するＢリンパ球に対する選択的自己認容力は、非常に高いと予期される。したがって、意外にも、１７−１Ａ特異的抗体または少なくともそれに相当する重鎖を、たとえば、成熟した刺激されていないＢリンパ球のようなヒトＢ細胞の抗体レパートリーから単離することができることが、本発明によって発見された。これらのＢ細胞は、長いin vivo半減期を有し、１７−１Ａ抗原が成熟部位に存在していても、その成熟前に欠失を首尾よく回避することが知られており、このタイプのＢ細胞寛容は可溶性自己抗原によって惹起されるに過ぎないため、１７−１Ａ抗原の場合には、Ｂ細胞アネルギーが起こらない。首尾よく生き残る長寿のＢ細胞のみは、潜在的に１７−１Ａ反応性であるにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン可変領域のレパートリーを表し、そのレパートリーは、免疫系の監視機能によって、免疫原性配列に関して既にスクリーニングされており、次に免疫原性から排除されているため、ヒトに繰り返し全身投与するためのヒト抗体および抗体誘導体の構築に使用されるとき、ヒト免疫系により十分に寛容される公算が高い。したがって、たとえば、本発明の方法によって、前述のin vivo適合性が高いヒト抗体配列が、健常なヒトのＢ細胞レパートリーにも発見されることが大いに期待されるため、本発明は、１７−１Ａ抗原に特異的であり、得られる方法に関係なく、繰り返しin vivoでの適用に適したヒト抗体にも関する。したがって、１７−１Ａ抗原をもつ腫瘍細胞のモニタリングおよび／または破壊に有利に使用することができるヒト抗体が初めて開発された。
このように、本発明の抗体は、都合よく、ヒトで低免疫原性であるか、非免疫原性である。好ましい実施形態で、上述の抗体は、本明細書に上述した方法に従って得ることができる。別の好ましい実施形態で、本発明の抗体は、好ましくは、ペプチド番号８、１１、１３、１４、５９、６０、７７および７９のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を含む１７−１Ａ抗原の細胞外領域のエピトープを認識する。好ましくは、本発明の抗体のＶＨ鎖が、図７（ヌクレオチド１〜３８１）および図８（ヌクレオチド１〜３３９）に示す２つの配列のうちの１つのＣＤＲの少なくとも一を含み、及び／又はＶＬ鎖が、図６（ヌクレオチド１〜３２１）および図９（ヌクレオチド１〜３２１）に示す２つの配列ののうちの１つのうちのＣＤＲの少なくとも一を含む。特に好ましいものは、前述のＶＨ鎖が図７（ヌクレオチド１〜３８１）および図８（ヌクレオチド１〜３３９）に示す２つの配列のうちの１つを含み、及び／又は前述のＶＬ鎖が、図６（ヌクレオチド１〜３２１）および図９（ヌクレオチド１〜３２１）に示す２つの配列のうちの１つを含む抗体である。
この受容体および好ましくは低免疫原性用に選択される抗体レパートリーは、ヒトＩｇＤ抗体ライブラリーで最もよく表されると結論を下されている。ＩｇＤは、多価自己抗原に遭遇しない限り、二次リンパ系器官に行く間に、または二次リンパ系器官の間を往来する間に、原始濾胞に入り、結果としてクローンの除去または可溶性一価自己抗原をもたらし、原始濾胞から排除することにより、Ｂ細胞をアネルギーで且つ短命にする成熟した刺激されていないＢリンパ球の表面上に、膜抗原受容体として、表面ＩｇＭと共に発現される。成熟した刺激されていないＢリンパ球を除き、ヒトＩｇＤライブラリーのみが、可溶性の一価抗原と接触してアネルギーにされた短命のＢ細胞の抗体レパートリーをさらに示すが、Ｂ細胞アネルギーの代わりににクローン除去を惹起する多価自己抗原に似た、ヒト細胞表面分子への特異的バインダーを提供しないようである。
さらに、本発明は、前述した本発明の受容体またはその一部の少なくとも１つ（単独で、または組み合わせて）と、場合に応じて製薬上許容できるキャリヤまたは賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。適当な製薬用キャリヤーの例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、油／水乳剤のような乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などがある。このようなキャリヤを含む組成物は、よく知られている従来の方法で調製することができる。
これらの医薬組成物は、適切な用量で被験者に投与することができる。適切な組成物の投与は、様々な方法、たとえば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与または皮内投与で行うことができる。
したがって、本発明は、被験者の腫瘍（好ましくは、その腫瘍は上皮に由来する）を治療、予防および／または遅延するための医薬組成物を調製するための、本発明の方法によって製造される受容体またはその一部の使用にも関する。
図面は以下の通りである。
図１．重要な制限部位を含む、ｐＣｏｍｂ３Ｈのクローニング部位を表す図である。以下の略語を使用した：Ｐ、プロモーター。ＶＬ、軽鎖可変領域。ＣＬ、軽鎖定常領域。ＶＨ、重鎖可変領域、ＣＨ１、重鎖定常領域１。Ｌ１/２、原核リーダー配列。ｐＣｏｍｂ３Ｈの遺伝子IIIと呼ばれる領域は、たとえば、ＶＣＳＭ１３のような、繊維状ファージの遺伝子III生成物の非感染部分をコードする。
図２．ｐＣｏｍｂ３Ｈプラスミドおよび完全に発現されたＭ１３ファージを表す略図である。ｐＣｏｍｂ３Ｈ上の、リーダー（Ｌ）ｏｍｐＡ、軽鎖、リーダー（Ｌ）ｐｅｌＢ、重鎖および遺伝子IIIの構成を表す。完全に発現されたＭ１３ファージは、軽鎖、および遺伝子III生成物の非感染性部分に結合した重鎖のＦｄセグメント（ＶＨ＋ＣＨ１）からなる、ある一定のＦａｂ抗体フラグメントの表現型を、その表面上に示し、且つ対応する遺伝子型を、ディスプレーさせるＦａｂフラグメントの重鎖および軽鎖をコードしている１本鎖ＤＮＡとして含む。感染性遺伝子IIIタンパク質は、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により提供される。
図３．可溶性ＦａｂフラグメントのＥＬＩＳＡを示す図である。可溶性Ｆａｂフラグメントのペリプラズム調製物は、それぞれ、クローン当たり、キメラ化Ｍ７９のＦｄセグメントおよび１本のヒトκ鎖を含む。ＥＬＩＳＡプレートを可溶性１７−１Ａ抗原と共に一晩インキュベートした。ペルオキシダーゼ−複合ポリクローナル抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いて、結合したＦａｂ抗体フラグメントを検出した。ＡＢＴＳ基質溶液（ＡＢＴＳ＝２，２  アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））を加えることによって、ＥＬＩＳＡを最終的に発色させ、基質ターンオーバーを４０５nmの波長で測定した（ｙ軸）。クローンをｘ軸に表す。最初の数字は選別のラウンドを示し、２番目の数字はクローンの番号を示す。クローン１．５〜１．９は、Ｍ７９Ｆｄセグメントとランダムκ鎖１本との組合せを有し、ネガティブコントロールを表す。
図４．可溶性ＦａｂフラグメントのＥＬＩＳＡを示す図である。可溶性Ｆａｂフラグメントののペリプラズム調製物は、それぞれ、ｋ８軽鎖およびヒトＩｇδ鎖Ｆｄ−セグメント１つを含む。ＥＬＩＳＡプレートを可溶性１７−１Ａ抗原と共に一晩インキュベートした。ビオチニル化ポリクローナル抗ヒトκ軽鎖抗体に続いてペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジンを用いて、結合したＦａｂ−抗体フラグメントを検出した。ＡＢＴＳ−基質溶液（ＡＢＴＳ＝２，２  アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））を加えることによって、ＥＬＩＳＡを最終的に現像し、基質ターンオーバーを４０５nmの波長で測定した（ｙ軸）。クローンをｘ軸に表す。最初の数字は選別のラウンドを示し、２番目の数字はクローンの番号を示す。クローン１．２−１．６は、ｋ８軽鎖とランダムＩｇδ重鎖Ｆｄセグメント１つの組合せを有し、ネガティブコントロールを表す。
図５．可溶性ＦａｂフラグメントのＥＬＩＳＡを示す図である。可溶性Ｆａｂフラグメントののペリプラズム調製物は、それぞれ、クローン当たりＤ４．５Ｆｄセグメントおよびヒトκ鎖１本を含む。ＥＬＩＳＡプレートを可溶性１７−１Ａ抗原と共に一晩インキュベートした。ビオチニル化ポリクローナル抗ヒトκ軽鎖抗体に続いてペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジンを用いて、結合したＦａｂ−抗体フラグメントを検出した。ＡＢＴＳ基質溶液（ＡＢＴＳ＝２，２  アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））を加えることによて、ＥＬＩＳＡを最終的に現像し、基質ターンオーバーを４０５nmの波長で測定した（ｙ軸）。クローンをｘ軸に表す。最初の数字は選別のラウンドを示し、２番目の数字はクローンの番号を示す。クローンＳ．１〜３は、ｋ８軽鎖とランダムＩｇδ重鎖Ｆｄセグメント１つの組合せを有し、ネガティブコントロールを表す。
図６．ヒトκ８軽鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表す図である。数字は、ヌクレオチド（ｎｔ）の位置を表し、アミノ酸を１文字コードで表す。ＣＤＲ１は、ｎｔ７０〜ｎｔ１０２を含み、ＣＤＲ２はｎｔ１４８〜ｎｔ１６８を含み、ＣＤＲ３はｎｔ２６５〜ｎｔ２９４を含む。
図７．ヒトＤ４．５重鎖可変領域のＤＮＡ配列を表す図である。数字は、ヌクレオチド（ｎｔ）の位置を表し、アミノ酸を１文字コードで表す。ＣＤＲ１は、ｎｔ９１〜ｎｔ１０５を含み、ＣＤＲ２はｎｔ１４８〜ｎｔ１９８を含み、ＣＤＲ３はｎｔ２９２〜ｎｔ３５１を含む。重鎖可変領域とＩｇδ定常領域のＣＨ１ドメインとの間の境界は、ｎｔ３８２とｎｔ３８３の間に位置し、δ定常領域タンパク質配列はｎｔ３８４で開始する。
図８．ヒトＤ７．２重鎖可変領域のＤＮＡ配列を表す図である。数字は、ヌクレオチド（ｎｔ）の位置を表し、アミノ酸を１文字コードで表す。ＣＤＲ１は、ｎｔ９１〜ｎｔ１０５を含み、ＣＤＲ２はｎｔ１４８〜ｎｔ１９８を含み、ＣＤＲ３はｎｔ２９２〜ｎｔ３０９を含む。重鎖可変領域とＩｇδ定常領域のＣＨ１ドメインとの間の境界は、ｎｔ３４０とｎｔ３３４１の間に位置し、δ定常領域タンパク質配列はｎｔ３４３で開始する。
図９．ヒトκ５．１軽鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表す図である。数字は、ヌクレオチド（ｎｔ）の位置を表し、アミノ酸を１文字コードで表す。ＣＤＲ１は、ｎｔ７０〜ｎｔ１０２を含み、ＣＤＲ２はｎｔ１４８〜ｎｔ１６８を含み、ＣＤＲ３はｎｔ２６５〜ｎｔ２９４を含む。
図１０．ｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメントを含むペリプラズム調製物の結合活性を試験するための１７−１Ａ陽性Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｆａｂ抗体フラグメントおよびコントロール抗体Ｍ７９のフローサイトメトリーを表す図である。Ｋａｔｏ細胞をＩ）関連のないペリプラズム調製物、II）１０μｇ/ｍｌキメラ（二価！）Ｍ７９、III）ｋ８−Ｄ４．５ペリプラズム調製物およびIV）ｋ８−Ｄ４．５ペリプラズム調製物の１：１０希釈液と共にインキュベートした。相対的細胞数をＹ軸に、相対的蛍光強度をｘ軸に表す。
図１１．ｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメント、ｋ５．１−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメントまたは関連のないｋ−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメントを含むペリプラズム調製物（ｐｐ）の結合活性を試験するための、それぞれ１７−１Ａ陽性Ｋａｔｏ細胞、１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびトランスフェクトしていないＣＨＯ細胞を用いた、Ｆａｂ抗体フラグメントおよび完全抗体のフローサイトメトリーを表す図である。Ｋａｔｏ細胞をＩ）関連のないｐｐ（破線）またはｋ５．１−Ｄ４．５−ｐｐ（実線）、またはII）２０μｇ/ｍｌＭ７９抗体（実線）または対応するネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）と共にインキュベートした。１７−１ＡでトランスフェクトしていないＣＨＯ細胞を、III）関連のないｐｐ（破線）またはｋ５．１−Ｄ４．５−ｐｐ（実線）、IV）関連のないｐｐ（破線）またはｋ８−Ｄ４．５−ｐｐ（実線）、またはV）２０μｇ/ｍｌＭ７９抗体（実線）または対応するネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）と共にインキュベートした。III）、IV）およびV）で、関連のあるｐｐ（それぞれｋ５．１−Ｄ４．５Ｆａｂ−ｐｐおよびｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂ−ｐｐ）およびネズミ抗体Ｍ７９のインキュベーションおよび検出も、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（点線）を用いて実施した。相対的細胞数をＹ軸に、相対的蛍光強度をｘ軸に表す。
図１２．重要な制限部位を含むｐＥＦ−ＡＤＡのクローニング部位を表す図である。以下の略語を使用した：Ｐ、プロモーター。ＶＬ、軽鎖可変ドメイン。ＣＬ、定常軽鎖ドメイン。Ｌｅｕｃ、真核リーダー配列。
図１３．重要な制限部位を含むｐＥＦ−ＤＨＦＲのクローニング部位を表す図である。以下の略語を使用した：Ｐ、プロモーター。ＶＨ、可変重鎖ドメイン。ＶＬ、軽鎖可変ドメイン。ＣＨ１／２／３、定常重鎖ドメイン。Ｌｅｕｃ、真核リーダー配列。
図１４．ヒト抗体Ｈ７９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製物。還元条件および非還元条件で、各抗体約１０μｇを１２．５％変性ポリアクリルアミドゲルで実行し、クーマシーブルーで染色した。
レーン１：マーカー（分子量［ｋＤａ］の単一バンドはゲルの左側に印をつけた）
レーン２：Ｈ７９ヒトＩｇＧ１バージョン（非還元条件）
レーン３：還元条件でのＨ７９ヒトＩｇＧ１バージョン
レーン４：Ｈ７９ネズミＩｇＧ１バージョン（非還元条件）
レーン５：還元条件でのＨ７９ネズミＩｇＧ１バージョン
図１５．ヒト抗体Ｈ７９およびＨＤ７０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製物。非還元条件（ゲル１）および還元条件（ゲル２）で、Ｈ７９  １０μｇおよびＨＤ７０  ３．５μｇを１２．５％変性ポリアクリルアミドゲルで実行し、クーマシーブルーで染色した。
ゲル１：    レーン１：マーカー（分子量［ｋＤａ］の単一バンドはゲルの左側に印をつけた）
レーン２：Ｈ７９ヒトＩｇＧ１バージョン（非還元条件）
レーン３：ＨＤ７０ヒトＩｇＧ１バージョン（非還元条件）
ゲル２：    レーン４：マーカー（ゲルの左側に印をつけた分子量［ｋＤａ］のバンド）
レーン５：還元条件でのＨ７９ヒトＩｇＧ１バージョン
レーン６：還元条件でのＨＤ７０ヒトＩｇＧ１バージョン
図１６．精製Ｈ７９ヒトＩｇＧ１ならびに精製Ｈ７９ネズミＩｇＧ１の結合活性を試験するための１７−１Ａ陽性Ｋａｔｏ細胞のフローサイトメトリー分析を表す図である。Ｋａｔｏ細胞を、ＩｇＧアイソタイプ対照（それぞれ、１０μｇ／ｍｌヒトＩｇＧ１およびネズミＩｇＧ１）、ポジティブコントロール（それぞれ、１０μｇ／ｍｌのＭ７９およびキメラ化Ｍ７４（両者とも１７−１Ａ特異的））およびＨ７９ヒトＩｇＧ１またはＨ７９ネズミＩｇＧ１（それぞれ、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。相対的細胞数をＹ軸に、相対的蛍光強度をｘ軸に表す。
図１７．精製抗体Ｈ７９ヒトＩｇＧ１、Ｈ７９ネズミＩｇＧ１、ＨＤ７０、Ｄ７．２、Ｍ７９、Ｐａｎｏｒｅｘおよびアイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１、ネズミＩｇＧ１および２ａ）を試験するための、１７−１Ａ陽性Ｋａｔｏ細胞、１７−１ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を用いた抗体（濃度：各２０μｇ／ｍｌ）のフローサイトメトリーを表す図である。１）Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｈ７９ヒトＩｇＧ１（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、II）Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｈ７９ネズミＩｇＧ１（実線）およびネズミＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、III）Ｋａｔｏ細胞を用いた、ＨＤ７０（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、IV）Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｄ７．２（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、Ｖ）Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｍ７９（実線）およびネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）、VI）Ｋａｔｏ細胞を用いた、Ｐａｎｏｒｅｘ（実線）およびネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）、VII）１７−１ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた、Ｈ７９ヒトＩｇＧ１（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、VIII）１７−１ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた、Ｈ７９ネズミＩｇＧ１（実線）およびネズミＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、IX）１７−１ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた、ＨＤ７０（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、Ｘ）１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた、Ｄ７．２（実線）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（破線）、XI）１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた、Ｍ７９（実線）およびネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）、XII）１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた、Ｐａｎｏｒｅｘ（実線）およびネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（破線）。図VII〜XIIは、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞を用いた、関連ある抗体のインキュベーションおよび検出の結果も示す。
図１８．51Ｃｒ抗体依存性細胞障害分析を表す図である。51Ｃｒ放出用に、エフェクター細胞としての、非刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、５×１０5細胞）を、標識した標的細胞（51Ｃｒで２時間標識したＫａｔｏ細胞）および異なる濃度の抗体と共に、３７℃で４〜２０時間インキュベートした。対応する非結合アイソタイプ（ｈ−ＩｇＧ＝ヒトＩｇＧ１、ｍ−ＩｇＧ２ａ＝ネズミＩｇＧ２ａ）をネガティブコントロール（Ｈ７９＝Ｈ７９ｈｕＩｇＧ１）として使用した。特異的溶解を、（（ｃｐｍ、実験的放出）−（ｃｐｍ、自然放出））／（（ｃｐｍ、最大放出）−（ｃｐｍ、自然放出））として算出した。
図１９．Ｍ７９（陽性）対照で染色した、健常なヒト結腸組織の光学顕微鏡写真。ポジティブコントロールとして、正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、ネズミＭ７９抗体（ＩｇＧ２ａ）（１０μｇ/ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２０．Ｈ７９ネズミＩｇＧ１で染色した、健常なヒト結腸組織の光学顕微鏡写真。正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、Ｈ７９抗体のネズミＩｇＧバージョン（１０μｇ/ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミＩｇＧ１抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２１．Ｍ７９（陽性）対照で染色した、結腸癌の光学顕微鏡写真。ポジティブコントロールとして、結腸癌の５ｎｍ凍結切片を、ネズミＭ７９抗体（ＩｇＧ２ａ）（１０μｇ/ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２２：Ｈ７９ネズミＩｇＧ１で染色した、結腸癌の光学顕微鏡写真。結腸癌組織の５ｎｍ凍結切片を、Ｈ７９抗体のネズミＩｇＧ１バージョン（１０μｇ/ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミＩｇＧ１抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２３．ネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で染色した、健常なヒト結腸組織の光学顕微鏡写真。ネガティブコントロールとして、正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、関連のないネズミＩｇＧ２ａ抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２４．ＩｇＧ１アイソタイプ対照で染色した、健常なヒト結腸組織の光学顕微鏡写真。ネガティブコントロールとして、正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、関連のないネズミＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２５．ネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で染色した、ヒト結腸癌組織の光学顕微鏡写真。ネガティブコントロールとして、正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、関連のないネズミＩｇＧ２ａ抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２６．ＩｇＧ１アイソタイプ対照で染色した、ヒト結腸癌組織の光学顕微鏡写真。ネガティブコントロールとして、正常な粘膜組織の５ｎｍ凍結切片を、関連のないネズミＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ペロキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したネズミ抗体を検出し、カルバゾール（褐色）で染色した。ヘマラウン（青色）で対比染色を実施した。
図２７．ネズミ抗体Ｍ７９およびヒト抗体Ｈ７９およびＨＤ７０（それぞれ、ヒト１７−１Ａ抗原特異的である）のエピトープ分析。アミノ酸１３個のポリペプチド１１９個を含み、アミノ酸２個が取り替えられ、ヒト１７−１Ａ抗原の細胞外アミノ酸配列全体を包含する、ペプチドの方眼配列と共に、抗体をインキュベートした。このペプチド類は、それらのＣ末端で、個々のスポットとして、Pep Spots Membrane（Jerini Biotools, Berlin）に共有結合されていた。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にカップリングした抗ネズミ免疫グロブリン抗体に続いて化学発光を用いて、結合したネズミＭ７９抗体をPep Spots Membrane上で直接検出した。個々のペプチドスポットについて、二次抗体のみの反応性による信号を、Pep Spots Membraneの対応する対照染色に示す。ペプチドスポット８７における主たるバックグラウンド染色を減算することにより、ペプチドスポット３８および９５はネズミ抗体Ｍ７９の特異的結合を表すことがわかる。幾つかのペプチドスポットでは二次ＨＲＰ−複合抗ヒト免疫グロブリン抗体は交差反応性がさらに高いため、結合したヒト抗体Ｈ７９およびＨＤ７０を、それぞれ、電気移動によってPep Spots Membraneからブロッティング膜に移動させ、その後、前述の抗ヒト二次抗体および化学発光で検出した。ヒト抗体Ｈ７９の特異的結合は、主としてペプチドスポット８、１１、１３、１４、５９〜６０、７７および７９で検出することができたが、ヒト抗体ＨＤ７０の場合には、結合は全く検出されなかった。
実施例を示して、本発明を説明する。
例I：組合せ抗体ライブラリーの構築およびファージディスプレー
Chomczynski, Analytical Biochemistry 162（1987）156-159に従って、それぞれ、ドナー４人、および１０人の、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）試料および骨髄試料から調製した全ＲＮＡ上のκ特異的プライマー、λ特異的プライマーおよびＦｄδ特異的プライマーセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲでヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖およびＩｇ重鎖ＦｄＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築した。標準的な方法（Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989，第２版）に従って、ｃＤＮＡを合成した。次のプライマーセットを選択し、重鎖フラグメント用５′−Ｘｈｏｌおよび３′−Ｓｐｅｌ認識部位、および軽鎖用５′−Ｓａｃｌおよび3′−Ｘｂａｌ認識部位を生成した。δＦｄ  ｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ−増幅の場合、５つの異なる５′−ＶＨ−ファミリー特異的プライマーを、それぞれ、３′−ＣＨ１δプライマー１つと組合せ、κ（Ｋ）軽鎖フラグメントのＰＣＲ増幅の場合、５つの異なる５′−ＶＫ−ファミリー特異的プライマーを、それぞれ、３′−ＣＫプライマー１つと組合せ、λ（Ｌ）軽鎖フラグメントの増幅の場合、８つの異なる５′−ＶＬ−ファミリー特異的プライマーを、それぞれ３′−ＣＬプライマー１つと組合せた。Ｆａｂ  ＤＮＡフラグメント（５′から３′）の増幅用プライマーセットを下表１に示す。次のＰＣＲプログラムを増幅に使用した。
９４℃で１５秒間変性、５２℃で５０秒間プライマーのアニーリングおよび７２℃で９０秒間プライマー伸長を４０サイクル、続いて７２℃で１０分間の最終伸長。
0003876002.tif 000002
0003876002.tif 000003
κ軽鎖フラグメント（ＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化）４５０ｎｇを、重鎖の位置が、１７−１Ａタンパク質の細胞外部分に対するキメラ化ネズミ抗体Ｍ７９のＦｄフラグメント（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１を含む）で既にされている、ｐＣｏｍｂ３（Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88（1991）7978-7982）に由来するファジミドｐＣｏｍｂ３Ｈ（ＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化、大きいＤＮＡフラグメント）１４００ｎｇと連結した（たとえば、ｐＣｏｍｂ３Ｈクローニング部位については、図１を参照）。次に、このようにして得られた組合せ抗体ＤＮＡライブラリーで、電気穿孔（２．５ｋＶ、間隙０．２ｃｍのキュベット、２５ＦＤ、２００Ω、Biorad遺伝子パルサー）で、電気的にコンピテントにしたEscherichia coli. XL1 BLue３００μｌを形質転換して、４×１０7のライブラリーサイズの独立クローンを得た。表現型が発現した１時間後に、ｐＣｏｍｂベクターによってコードされるカルベニシリン耐性について、陽性の形質転換体を選別した。この適応後、これらのクローンに、感染量である１×１０12ファージ粒子のヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させると、それぞれが、１本のヒト軽鎖およびキメラＭ７９のＦｄセグメントをコードしている１本鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＤＮＡを含み、それぞれが、対応するＦａｂフラグメントを、ファージコートタンパク質IIIの非感染性部分への翻訳融合物としてファージ画面に示す、繊維状Ｍ１３ファージが産生され、分泌された（ファージディスプレー）。図２を参照されたい。クローニングされたＦａｂレパートリーを担持するこのファージライブラリーを、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈降および遠心分離で培養上清から収穫し、ＴＢＳ／１％ＢＳＡに再溶解し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化された組織えｓ１７−１Ａと共にインキュベートした。記載（Mack, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 92（1995）7201-7025）通りに、ｓ１７−１Ａを調製した。ＴＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎを用いた１０回までの洗浄ステップで、標的抗原に特異的に結合しなかったＦａｂファージを排除した。ＨＣｌ−グリシン  ｐＨ２．２を使用してバインダーを溶離し、溶離液を２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ１２で中和した後、新しい未感染のE. coli XL1 Blue培養の感染に使用した。抗原結合ＦａｂフラグメントをコードしているｐＣｏｍｂファジミドコピーが申し分無く形質導入された細胞を、カルベニシリン耐性に関して選別し、続いて、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させて、第２ラウンドの抗体ディスプレーおよびin vitro選択を開始した。
５ラウンドの抗原結合Ｆａｂファージの産生および選別の後、選択されたＦａｂレパートリーを含むプラスミドＤＮＡを調製した。
可溶性Ｆａｂタンパク質を産生する場合、遺伝子IIIＤＮＡフラグメントをプラスミドから切り取り、このようにして、Ｆｄ重鎖セグメントと遺伝子IIIタンパク質との転写融合を破壊した。再度連結した後、このプラスミドＤＮＡのプールで、熱ショク反応性E. coli XL1 Blue１００μｌを形質転換し、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）ＬＢ寒天上にプレーティングした。１０ｍｌのＬＢＣａｒｂ培養／２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で個々のコロニーを成長させ、最終濃度１ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、６時間後にＦａｂ発現を惹起した。Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88（1991）, 10134-10137に従って、このin vitro選択ならびに可溶性Ｆａｂフラグメントの発現を実施した。２０時間後に細胞を収穫し、４ラウンドの凍結（エタノール／ドライアイス）および解凍（３７℃）によってペリプラズム調製物を作成し、ｓ１７−１ＡへのＦａｂフラグメント結合をＥＬＩＳＡで試験した。２７中２３のクローンが結合活性を示した。配列決定後、最強のシグナルを示した２つのクローン（図３参照）は、同じκ鎖を有することが判明し、これをｋ８と呼んだ。図６参照。次に、このヒトκ軽鎖ｋ８を、ヒトＩｇδ重鎖プールの結合パートナーとして使用した。ヒトδ重鎖Ｆｄ  ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏｌおよびＳｐｅｌで消化）２２５０ｎｇを、軽鎖の位置にｋ８ＤＮＡフラグメントを含むファジミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ（ＸｈｏｌおよびＳｐｅｌで消化、大きいＤＮＡフラグメント）に連結した。ｋ８軽鎖と組み合わせたとき、１７−１Ａ抗原に特異的に結合する重鎖可変領域の起源としてのヒトδ鎖レパートリーの選択が、最も適するようであった。成熟した刺激されていないＢ細胞、および増殖を経験したことがない、または増殖を経験しないであろう自己抗原特異的アネルジーＢ細胞では、δ鎖のみが産生される。したがって、他の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖レパートリーと比較して、それらの重鎖レパートリーの多様性は高く、その中の各個の特異性は低い。
５回の同じ電気穿孔（２．５ｋＶ、間隙０．２ｃｍのキュベット、２５ＦＤ、２００Ω）で、ｐＣｏｍｂ−ｋ８−δ  Ｆｄフラグメントライブラリーで合計１５００μｌのE. coli XL1 Blueを形質転換し、最終的に１．１×１０9個の独立クローンを得た。ヒト軽鎖レパートリーについて上述した通りに、この組合せ抗体ライブラリーのin vitro選択を実施した。４ラウンドの選別後、８つのクローンからＦａｂフラグメントを調製した。ペリプラズム調製物をＥＬＩＳＡで試験した。クローンの１つが強い抗原結合を示した（図４参照）。このクローンをＤ４．５と呼び、逆δＣＨ１特異的プライマーでＦｄδフラグメントのＤＮＡの配列決定をした（図７参照）。さらに何ラウンドかの選別後、７ラウンドで初めて出現した、Ｄ４．５に比べて明らかに弱いＥＬＩＳＡ信号を示す（図４参照）。別のｓ１７−１Ａ結合Ｆａｂフラグメントを単離した。このクローンをＤ７．２と呼び、δ特異的プライマーを使用してＤＮＡ配列を決定した（図８参照）。
Ｄ４．５δ重鎖Ｆｄセグメントと結合して１７−１Ａ特異的Ｆａｂフラグメントを形成する、さらなる軽鎖パートナーを同定するために、改造実験を実施した。ヒトκ軽鎖フラグメント４５０ｎｇおよびヒトλ軽鎖フラグメント４５０ｎｇ（両者ともＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化）を、それぞれ、重鎖の位置がＤ４．５Ｆｄフラグメントで既に占拠されているファジミドｐＣｏｍｂ３Ｈ（ＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化、大きいＤＮＡフラグメント）１４００ｎｇと連結した。次に、このようにして得られた組合せ抗体ライブラリー（κおよびλ）で、電気穿孔（２．５ｋＶ、間隙０．２ｃｍのキュベット、２５ＦＤ、２００Ω、Biorad遺伝子パルサー）により電気的にコンピテントにしたEscherichia coli. XL1 BLue３００μｌを形質転換して、κライブラリーは０．５×１０7のライブラリーサイズの独立クローンを、λライブラリーは１．４×１０7のライブラリーサイズの独立クローンを得た。表現型が発現した１時間後に、ｐＣｏｍｂベクターによってコードされるカルベニシリン耐性について、陽性の形質転換体を選別した。この適応後、これらのクローンに、感染量である１×１０12ファージ粒子のペルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させると、それぞれが、１本のヒト軽鎖およびｄ４．５重鎖Ｆｄセグメントをコードしている１本鎖ｐＣｏｍｂ３ＨＤＮＡを含み、対応するＦａｂフラグメントを、ファージコードタンパク質IIIの非感染性部分への翻訳融合物としてファージ表面に示す、繊維状Ｍ１３ファージが産生され、分泌された。クローニングされたＦａｂレパートリー（κおよびλ）を担持する両ファージライブラリーを、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈降および遠心分離で培養上清から収穫し、ＴＢＳ／１％ＢＳＡに再溶解し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化された組換えｓ１７−１Ａと共にインキュベートした。ＴＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎを用いた１０回までの洗浄ステップで、標的抗原に特異的に結合しなかったＦａｂファージを排除した。ＨＣｌ−グリシン  ｐＨ２．２を使用して、両ライブラリー（κおよびλ）のバインダーを溶離し、溶離液を２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ１２で中和した後、新しい未感染のE. coli XL1 Blue培養の感染に使用した（１つはκライブラリー用、１つはλライブラリー用）。抗原結合ＦａｂフラグメントをコードしているｐＣｏｍｂファジミドコピーが申し分無く形質導入された細胞を、カルベニシリン耐性に関して再度選別し、続いて、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させて、第２ラウンドの抗体ディスプレーおよびin vitro選択を開始した。５ラウンドの抗原結合Ｆａｂファージの産生および選別の後、それぞれ、選択されたＦａｂレパートリーを含むプラスミドＤＮＡを調製した。
可溶性Ｆａｂタンパク質を産生する場合、遺伝子IIIＤＮＡフラグメントをプラスミドから切り取り、このようにして、Ｆｄ重鎖セグメントと遺伝子IIIタンパク質との転写融合を破壊した。再度連結した後、このプラスミドＤＮＡのプールで、熱ショク反応性E. coli XL1 Blue１００μｌを形質転換し、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）ＬＢ寒天上にプレーティングした。１０ｍｌのＬＢ−Ｃａｒｂ培養／２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で個々のコロニーを成長させ、最終濃度１ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、６時間後にＦａｂ発現を惹起した。２０時間後に細胞を収穫し、凍結および解凍によってペリプラズム調製物を作成し、ｓ１７−１ＡへのＦａｂフラグメント結合をＥＬＩＳＡで試験した。合計で、主として第５ラウンドの選別に由来するが、ある程度は他のラウンドに由来するκライブラリー４５クローンおよびλライブラリー４５クローンを、１７−１Ａ抗原への結合について試験した。５ラウンドに出現したｋ５．１と呼ばれるクローン（κライブラリー）１つだけが結合活性を示した（図５参照）。ｋ５．１のκＶ領域のＤＮＡ配列を決定した（図９参照）。
例II：E.coli XL1 Blueにおける細菌発現
例Iに前述した通り、軽鎖１つと重鎖のＦｄセグメントとを含むｐＣｏｍｂ３Ｈで形質転換したE. coli XL1 Blueは、遺伝子IIIフラグメントを切除し、ＩＰＴＧで誘発した後、可溶性Ｆａｂを十分な量で産生する。重鎖Ｆｄセグメントおよび軽鎖がペリプラズム内に輸出され、そこで、機能的Ｆａｂフラグメントを組み立て、構成する。よりよいペリプラズム調製物を作成するために、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を加えたＳＢ培地中で細胞を増殖させ、収穫後、ＰＢＳに再溶解した。４ラウンドの−７０℃での凍結と３７℃での解凍によって、細菌の外膜が温度ショックで破壊され、Ｆａｂフラグメントを含む可溶性ペリプラズムタンパク質が上清に放出された。無傷の細胞および細胞デブリスを遠心分離で除去した後、Ｆａｂ抗体フラグメントを含む上清を回収し、さらなる試験に使用した。
第１に、ｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂペリプラズム調製物およびｋ５．１−Ｄ４．５−Ｆａｂペリプラズム調製物を、固定化ｓ１７−１Ａ抗原への結合について試験し、両者とも強いＥＬＩＳＡ信号を示した（例Ｉ参照）。セイヨウワサビ複合アビジン（１μｇ/ｍｌ  ＰＢＳ）で検出されたポリクローナルビオチン化抗ヒトκ軽鎖抗体（１μｇ/ｍｌ  ＰＢＳ）を使用して、固定化ｓ１７−１Ａ抗原に結合したｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメントおよびｋ５．１−Ｄ４．５−Ｆａｂフラグメントの検出を実施した。２，２′アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸）および過ホウ素酸ナトリウムを含む基質溶液を加えることによって信号を発色させ、４０５ｎｍの波長で検出した。
Ｋａｔｏ細胞（１７−１Ａ発現胃癌細胞株）、１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／１７−１Ａ）およびトランスフェクトしなかったＣＨＯ細胞を用いた、２つの１７−１Ａ陽性ヒトＦａｂフラグメント（ｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂおよびｋ５．１−Ｄ４．５−Ｆａｂ）の結合に関する試験を、ペリプラズム調製物で再度実施した。標準手順（Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY（1989））に従って、ＧＡ７３３−２（Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87（1990）, 3542-3546）としても知られる、１７−１Ａ抗原の全アミノ酸配列をコードしているＤＮＡフラグメントを、真核発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92（1995）7021-7025）にサブクローニングすることによって、ＣＨＯトランスフェクト細胞株を作った。結果として得られたプラスミドを、Ｎｄｅｌで直鎖状にし、安定した発現を得るために、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。その後、２０ｎＭから１００ｎＭの間の濃度間隔で、漸増する濃度のＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサート（ＭＴＸ）を最終濃度５００ｎＭまで加えることによって誘発された段階的遺伝子増幅により、膜貫通型１７−１Ａの発現が増加した（Kaufmann, Methods, Emzymol. 185（1990）, 537-566）。
細胞２００，０００個（Ｋａｔｏ細胞、ＣＨＯ／１７−１Ａ細胞またはＣＨＯ細胞）を関連Ｆａｂまたは関連のないＦａｂを含むペリプラズム調製物の１つと共にインキュベートし、続いてビオチニル化ポリクローナル抗ヒトκ軽鎖抗体（２０μｇ/ｍｌ  ＰＢＳ）およびＦＩＴＣ複合ストレプトアビジンと共にインキュベートした。次いで、標識された細胞をフローサイトメトリーで分析した。それぞれ、ｋ８−Ｄ４．５−Ｆａｂおよびｋ５．１−Ｄ４．５−Ｆａｂを含むペリプラズム調製物は、関連のないペリプラズム調製物（ネガティブコントロール）と比較して、異なる信号を示したが、トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の染色はどれも、１７−１Ａ抗原特異性を示さなかった。抗１７−１Ａ抗体Ｍ７９（Gottlinger, Int. J. Cancer 38（1986）, 47-53）を１７−１Ａ陽性細胞のポジティブコントロールとして使用し、ネズミＩｇＧ２ａ抗体をアイソタイプ対照として使用した（図１０および１１参照）。
例III：ＣＨＯ細胞における真核発現
通常、細菌は、完全な機能的免疫グロブリンを生成することができないが、機能的Ｆａｂフラグメントを発現する。完全な機能的免疫グロブリンを生成するために、哺乳類細胞を使用しなければならず、したがって、ｋ８軽鎖およびＤ４．５重鎖の可変領域を哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。
ａ）軽鎖（ｋ８およびｋ５．１）：適当な末端制限部位を作るために、ｋ８ＤＮＡフラグメントおよびｋ５．１ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで再増幅して、５′末端にＢｓｕ３６Ｉ部位を含み、３′末端にＳａｌＩ部位およびＮｏｔＩ部位を含むκフラグメントを得た。Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔＩにより、これらのフラグメント（ｋ８およびｋ５．１）プラスミドＢＳＰＯＬＬにサブクローニングし、哺乳類リーダー配列を加えて、ＰＣＲ誘発性突然変異を防止するために配列を決定した。ＥｘｏＲＩおよびＳａｌＩを使用して、ｋ８およびｋ５．１をＢＳＰＯＬＬから切除し、ネズミジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードしているｃＤＮＡ２を、ネズミアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードしているｃＤＮＡと取り替えることにより、発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Mack, Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 92（1995）7021-7025）から誘導された真核発現ベクターｐＥＦ−ＡＤＡにサブクローニングした（図１２参照）。
各軽鎖種（ｋ８およびｋ５．１）について、１０7個のＣＨＯ細胞に、それぞれ、直線化プラスミドＤＮＡ１００μｇをトランスフェクトし、続いて、発現ベクターによりコードされたアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）活性に適した条件で培養した。Ｄ４．５可変領域またはＤ７．２可変領域を担持する重鎖をさらにトランスフェクトするために、生存しているＡＤＡ陽性細胞を培養した。
ｂ）重鎖４．５可変領域：δＦｄフラグメントＤ４．５から、ＰＣＲで可変領域を再増幅し、両末端にＢｓｕ３６Ｉを作った。次いで、これらの制限部位を使用して、得られたＶ−Ｄ４．５  ＤＮＡフラグメントを、真核リーダー配列ならびにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードしているＤＮＡフラグメントを既に含んでいる真核発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングした（図１３参照）。このようにして、リーダーと重鎖定常領域との間に、Ｄ４．５重鎖可変領域を装入した。可変領域の配列を決定し、完全なクローンをＨ７９Ｖ−Ｄ４．５ｈｕＩｇＧ１と呼んだ。その後の組織染色のために、ＸｂａＩをサブクローニングに使用して、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をネズミＩｇＧ１重鎖定常領域と取り替えた。このプラスミドをＨ７９Ｖ−Ｄ４．５ＭＩｇＧ１と呼んだ。
Ｄ４．５重鎖のヒトＩｇＧ１バーションとネズミＩｇＧ１バーションの両者を、既にｋ８軽鎖を発現している１０7個のＣＨＯ細胞に、それぞれ、トランスフェクトした。ｋ５．１軽鎖を発現しているＣＨＯ細胞にも、ヒトＩｇＧ１バーションをトランスフェクトした。それぞれ、直線化プラスミドＤＮＡ  １００μｇを、重鎖トランスフェクションに使用した。ＶＤ４．５について記載した通りに、Ｄ７．２重鎖Ｆｄフラグメントの可変領域もｐＥＦ−ＤＨＦＲにサブクローニングし、プラスミドを発現しているヒトＩｇＧ１重鎖を得た。次いで、この発現プラスミドを、Ｈ７９Ｖ−Ｄ４．５ hu ＩｇＧ１について上述した通りに、ｋ８軽鎖を既に発現しているＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、記述（Kaufman, Methods, Enzymol. 185（1990）, 537-566）通りに、ＡＤＡ活性およびＤＨＦＲ活性に関する選択に供した。このようにして得られた細胞株をＨ７９−ｈｕＩｇＧ１（ＶＤ４．５ｈｕＩｇＧ１−ｋ８）、Ｈ７９−ＭＩｇＧ１（ＶＤ４．５ＭＩｇＧ１−ｋ８）、Ｄ７．２（ＶＤ７．２ｈｕＩｇＧ１−ｋ８）およびＨＤ７０（ＶＤ４．５ｈｕＩｇＧ１−ｋ５．１）と呼んだ。
それぞれ、４種の抗１７−１Ａ抗体（Ｈ７９−ｈｕＩｇＧ１、Ｈ７９−ＭＩｇＧ１、Ｄ７．２およびＨＤ７０）の１つを産生する、４つの異なる密集した細胞培養３０ｍｌの３日齢の培養上清を、固定化ｓ１７−１Ａへの結合について、ＥＬＩＳＡで試験した。弱いＥＬＩＳＡ信号を示すＤ７．２を除き、他の３種の抗体は強い信号を示し、ネズミ抗体Ｍ７９の範囲の結合親和性を表すと推定された。培地５００ｍｌを使用して、ローラーボトル内で大規模抗体産生を実施した。プロテインＡアフィニティーカラムを使用して、抗体Ｈ７９−ｈｕＩｇＧ１、Ｄ７．２およびＨＤ７０を精製した。Ｈ７９−ＭＩｇＧ１抗体は、抗マウスＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーで精製した。組換え抗体の純度および分子量を、還元条件および非還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した（図１４および１５）。標準手順に従って、タンパク質精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
例IV：Ｈ７９抗体およびＨＤ７０の機能的分析
IV.１．固定化抗原に対する試験
ヒトおよびネズミＩｇＧ１トランスフェクタントの密集した培養物３０ｍｌの３日後の培養上清ならびに対応する精製抗体調製物を、固定化ｓ１７−１Ａ抗原に対する結合について、ＥＬＩＳＡで試験し、ネズミＭ７９抗１７−１Ａ抗体と比較した。IIに記載の通りに検出を実施した。抗体Ｈ７９（ｈｕＩｇＧ１バーションおよびＭＩｇＧ１バーション）およびＨＤ７０は、ネズミＭ７９の範囲内で、よく似た結合親和性を有すると推定された。
IV．２．親和性の決定
BIACORE 2000装置（Biacore AB, Freiburg, Freiburg, Germany）を使用して、表面プラスモン共鳴測定法を実施した。BIACORE 2000の自動方法で、各フローセル内の組換え可溶性１７−１Ａ抗原の固定化および相互作用の分析を実施した。第一級アミン基を介して、抗原をセンサーチップＣＭ５に共有結合させた。４個のフローセル全部を通過する０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／０．４Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ９）８０μｌの１回注入で、ＣＭ５センサーチップのカルボキシル化デキストランマトリックスを活性化した後、ｓ１７−１Ａ抗原（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中６０μｇ/ｍｌ、ｐＨ４．７）の注入中に、フローセル１、２、３および４を流路に逐次入れた。活性化された表面に、１７−１Ａを異なる時間接触させると、約２５００の応答単位が生じた（フローセル１でＲＵ９、フローセル２で１４０００ＲＵ、フローセル３で７８０ＲＵ、フローセル４で２９０ＲＵ）。４つのフローセル全体に１Ｍエタノールアミン、ｐＨ５、８５μlを注入して、余分の活性化エステルをブロックした。２５℃、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含むｐＨ７．４の緩衝液中で、結合実験を実施した。０．５〜２μＭの範囲の濃度を抗体を注入することにより、抗体の固定化組換え１７−１Ａへの結合反応速度を決定した。各実験の間に、１００ｍＭグリシン、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ｐＨ３でセンサーチップを再生した。記述（Karlsson,（1991）J Immunol Meth 145: 229-240）通りに、Biacore ABのＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して、会合速度定数および解離速度定数、ＫonおよびＫoffを分析した。２組の親和性測定を実施した（１．セット：Ｍ７９、Ｈ７９、Ｄ７．２、Ｐａｎｏｒｅｘ、２．セット：Ｐａｎｏｒｅｘ、ＨＤ７０）。内部リファレンスとして、ネズミＰａｎｏｒｅｘもセット２に含めた。Ｄ７．２のＫDは、最小検出値である１０-4Ｍ末端であったため、表2に記載されていない。
0003876002.tif 000004
IV.３．１７−１Ａ発現真核細胞に関するフローサイトメトリー
１７−１Ａ発現Ｋａｔｏ細胞、１７−１ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびトランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞について、Ｈ７９（ヒトおよびネズミＩｇＧ１バーション）、ＨＤ７０（ヒトＩｇＧ１）およびＤ７．２（ヒトＩｇＧ１）の精製抗体調製物をＦＡＣＳ分析で試験した。２×１０5個の細胞を、それぞれ精製したＨ７９−ｈｕＩｇＧ１、Ｈ７９−ＭＩｇＧ１、ＨＤ７０およびＤ７．２、Ｍ７９、Ｐａｎｏｒｅｘ、Ｍ７４ｃｈ（＝ネズミ抗１７−１Ａ抗体Ｍ７４のヒトＣＨＩｇＧ１−ヒトκバーション（Gottlinger, Int. J. Cancer 38（1986）, 47-53））、ネズミＩｇＧ２ａ、ネズミＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ１（各２０μｇ／ｍｌ抗体）と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体（各２０μｇ／ｍｌ）を用いて、細胞結合した抗体の検出を実施した。氷上で、４５〜６０分間、インキュベーションした。Ｈ７９ヒトＩｇＧ１、Ｈ７９ネズミＩｇＧ１およびＨＤ７０は、１７−１Ａ陽性細胞ならびにＭ７９およびＰａｎｏｒｅｘに対して、異なる結合を示した。Ｄ７．２は、１７−１Ａ陽性細胞に対して弱いが有意な結合を示した。トランスフェクトしなかったＣＨＯ細胞に対して結合を示した細胞は皆無であり、ＩｇＧ対照は、Ｋａｔｏ細胞、ＣＨＯ／１７−１Ａ細胞およびトランスフェクトしなかったＣＨＯ細胞に対して陰性であった（図１６および１７参照）。
IV．４．抗体依存性細胞障害（51Ｃｒ放出）
51Ｃｒ放出用に、エフェクター細胞としてのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ドナーの新鮮なバフィーコートから単離した。フィコール密度勾配遠心分離および後続の１００×ｇ遠心分離ステップで、ＰＢＭＣを分離した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地１００μｌに懸濁した非刺激ＰＢＭＣ（５×１０5細胞）を、平底微量滴定プレートの各ウェル加え、３７℃で一晩インキュベートした。標的細胞を51Ｃｒで２時間標識した。標識された標的細胞（１００μｌ）および異なる濃度の抗体（５０μｌ）をＰＢＭＣに加え、３７℃で１８時間インキュベートした。対応する非結合アイソタイプをネガティブコントロールとして使用した。特異的溶解を、（（ｃｐｍ、実験的放出）−（ｃｐｍ、自然放出））／（（ｃｐｍ、最大放出）−（ｃｐｍ、自然放出））として算出した。この51Ｃｒ放出分析法で、ヒト抗１７−１Ａ抗体Ｈ７９およびＨＤ７０は、１７−１Ａ陽性胃癌細胞株ＫＡＴＯに対して高い細胞障害性を仲介した。ネズ高７−１Ａ抗体Ｍ７９およびＰａｎｏｒｅｘは、明らかに低レベルまで、細胞死滅を仲介した（図１８）。
IV．５．ヒト組織に対する試験
結腸癌および正常な結腸組織の凍結切片５ｎｍを、それぞれ、抗体Ｈ７９（１０μｇ/ｍｌ）のネズミＩｇＧバーションと共にインンキュベートした。この実験では、ヒト組織中にヒト免疫グロブリンが存在することに起因する非特異的染色を避けるために、Ｈ７９のネズミＩｇＧ１バーションを使用した。ペルオキシダーゼ複合ポリクローナル抗マウスＩｇ抗体を用いて、結合したＨ７９ＭＩｇＧ１を検出し、カルバゾールで染色した。ヘマラウンで対比染色を実施した。光学顕微鏡で結果を評価した。Ｈ７９ＭＩｇＧ１ならびにネズミモノクローナル抗体Ｍ７９（ポジティブコントロール）は、正常な結腸粘膜上で強い染色を示し（図１９のＭ７９、図２０のＨ７９−ＭＩｇＧ１）、結腸癌細胞上で弱い染色を示した（図２１のＭ７９、図２２のＨ７９−ＭＩｇＧ１）。対照的に、アイソタイプ対照は、結腸粘膜および結腸癌組織上で染色を示さなかった（Ｍ７９については図２３および２５、Ｈ７９−ＭＩｇＧ１については図２４および２６）。
例Ｖ：Ｈ７９およびＨＤ７０のエピトープ分析。
ヒト抗体Ｈ７９およびＨＤ７０、およびネズミ鋳型抗体Ｍ７９によって認識される１７−１Ａ−エピトープと比較するために、１７−１Ａ−抗原の細胞外部分のアミノ酸配列から誘導される１３量体のペプチドを、Pep Spots Membrane上の個々のスポットとして合成した。これらのペプチドは、隣接する各ペプチドとアミノ酸１１個のオーバーラプを有し、ペプチド１の最初のアミノ酸は１７−１Ａ抗原のＮ−末端アミノ酸と同じであり、ペプチド１１９の最後のアミノ酸は１７−１Ａ−抗原の細胞外部分のＣ末端アミノ酸と同じであることによって、１７−１Ａ−抗原の細胞外アミノ酸（Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8(1990）, 3542-3546によって規定された）全体を包含する（表３）。
0003876002.tif 000005
0003876002.tif 000006
合成されたペプチドが付いたPepSpot Membraneをメタノール中で１０分間振盪し、次いで、ＴＢＳ−緩衝液  ｐＨ８で１０分間ずつ３回洗浄した。次いで、０．０５ｇ/ｍｌスクロースを含む、カゼインを主成分とするブロック用溶液で、この膜を１時間ブロックし、ＴＢＳ  ｐＨ８／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）で一度振盪した。各抗１７−１Ａ抗体を、ブロック用溶液中（Ｉμｇ抗体／ｍｌ）、室温で３時間、膜と共にインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間ずつ３回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合二次抗体（抗マウス／抗ヒト、１μｇ／ｍｌブロック用溶液）を膜と共に、室温で２時間インキュベートした。次いで、この膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間ずつ３回洗浄した。Ｍ７９の場合、化学発光キット製造会社（Boehringer）のプロトコルに従って、結合した抗体の検出を、Pep Spots membrane上で直接実施した。現像したフィルムを図２７に示す。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７、１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む溶液中、５０℃で３０分間、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄（１０分）した後、ブロットを再生した。続いて、次の抗体のエピトープマッピングに再使用した。ＨＤ７０およびＨ７９の場合、抗ヒト免疫グロブリン二次抗体が膜上のポリペプチドスポットに非特異的に結合したため、Rudiger, EMBO 16（1997）1501-1507に従って、第２のブロット用膜に分別電気トランスファーした後、抗ヒト二次抗体を用いて検出を実施した。二次抗体とのインキュベーションおよびブロット上の抗体検出は、上述の通りに実施した。現像したフィルムを図２７に示す。この図（図２７）からわかるように、ペプチドに基づくエピトープマッピングの結果から、ネズミ鋳型抗体Ｍ７９により認識されるエピトープは、主としてペプチドスポット３８および９５に現れ、主としてペプチドスポット８、１１、１３、１４、５９〜６０、７７および７９に現れるヒト抗体Ｈ７９によって認識されるものと明らかに異なることがわかる。ヒト抗体ＨＤ７０は検出可能な結合を全く示さないため、そのエピトープもネズミ抗体Ｍ７９と異なり、且つヒト抗体Ｈ７９とＨＤ７０のエピトープも同じではないことが予想される。
ヒト抗体ＨＤ７０の場合、検出可能な結合信号が存在しないのは、構造的な、連続的なまたは非連続的なエピトープか、部分的にまたは全体に炭水化物で構成されたエピトープのいずれかを認識する可能性が原因と考えられ、いずれの場合にも、短いペプチドによるこのようなエピトープの模倣は考えられない。
0003876002.tif 000007
0003876002.tif 000008
0003876002.tif 000009
0003876002.tif 000010
0003876002.tif 000011
0003876002.tif 000012
0003876002.tif 000013
0003876002.tif 000014
0003876002.tif 000015
0003876002.tif 000016
0003876002.tif 000017
0003876002.tif 000018
0003876002.tif 000019
0003876002.tif 000020
0003876002.tif 000021
0003876002.tif 000022
0003876002.tif 000023
0003876002.tif 000024
0003876002.tif 000025
0003876002.tif 000026
0003876002.tif 000027
0003876002.tif 000028
0003876002.tif 000029
0003876002.tif 000030
0003876002.tif 000031
0003876002.tif 000032
0003876002.tif 000033
0003876002.tif 000034
0003876002.tif 000035
0003876002.tif 000036
0003876002.tif 000037
0003876002.tif 000038
0003876002.tif 000039
0003876002.tif 000040
0003876002.tif 000041
0003876002.tif 000042
0003876002.tif 000043
0003876002.tif 000044
0003876002.tif 000045
0003876002.tif 000046
0003876002.tif 000047
0003876002.tif 000048
0003876002.tif 000049
0003876002.tif 000050
0003876002.tif 000051
0003876002.tif 000052
0003876002.tif 000053
0003876002.tif 000054
0003876002.tif 000055
0003876002.tif 000056
0003876002.tif 000057
0003876002.tif 000058
0003876002.tif 000059
0003876002.tif 000060
0003876002.tif 000061
0003876002.tif 000062
0003876002.tif 000063
0003876002.tif 000064
0003876002.tif 000065
0003876002.tif 000066
0003876002.tif 000067
0003876002.tif 000068
0003876002.tif 000069
0003876002.tif 000070
0003876002.tif 000071
0003876002.tif 000072
0003876002.tif 000073
0003876002.tif 000074
0003876002.tif 000075
0003876002.tif 000076
0003876002.tif 000077
0003876002.tif 000078
0003876002.tif 000079
0003876002.tif 000080
0003876002.tif 000081
0003876002.tif 000082
0003876002.tif 000083
0003876002.tif 000084
0003876002.tif 000085
0003876002.tif 000086
0003876002.tif 000087
0003876002.tif 000088
0003876002.tif 000089
0003876002.tif 000090
0003876002.tif 000091
0003876002.tif 000092
0003876002.tif 000093
0003876002.tif 000094
0003876002.tif 000095
0003876002.tif 000096
0003876002.tif 000097
0003876002.tif 000098
0003876002.tif 000099
0003876002.tif 000100
0003876002.tif 000101
0003876002.tif 000102
0003876002.tif 000103
0003876002.tif 000104
0003876002.tif 000105
0003876002.tif 000106
0003876002.tif 000107
0003876002.tif 000108
0003876002.tif 000109
0003876002.tif 000110
0003876002.tif 000111
0003876002.tif 000112
0003876002.tif 000113
0003876002.tif 000114
0003876002.tif 000115
0003876002.tif 000116
0003876002.tif 000117
0003876002.tif 000118
0003876002.tif 000119
0003876002.tif 000120
0003876002.tif 000121
0003876002.tif 000122
【図１】
0003876002.tif 000123
【図２】
0003876002.tif 000124
【図３】
0003876002.tif 000125
【図４】
0003876002.tif 000126
【図５】
0003876002.tif 000127
【図６】
0003876002.tif 000128
【図７】
0003876002.tif 000129
【図８】
0003876002.tif 000130
【図９】
0003876002.tif 000131
【図１０】
0003876002.tif 000132
0003876002.tif 000133
【図１１】
0003876002.tif 000134
0003876002.tif 000135
【図１２】
0003876002.tif 000136
【図１３】
0003876002.tif 000137
【図１４】
0003876002.tif 000138
【図１５】
0003876002.tif 000139
【図１６】
0003876002.tif 000140
0003876002.tif 000141
0003876002.tif 000142
0003876002.tif 000143
【図１７】
0003876002.tif 000144
0003876002.tif 000145
0003876002.tif 000146
0003876002.tif 000147
【図１８】
0003876002.tif 000148
【図１９】
0003876002.tif 000149
【図２０】
0003876002.tif 000150
【図２１】
0003876002.tif 000151
【図２２】
0003876002.tif 000152
【図２３】
0003876002.tif 000153
【図２４】
0003876002.tif 000154
【図２５】
0003876002.tif 000155
【図２６】
0003876002.tif 000156
【図２７】
0003876002.tif 000157