(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結水性担体媒体中に固定された気体の泡の凍結サスペンションであって、気体の泡及び単分子または多分子膜層の形のラメラリン脂質を含んで成る添加剤を含んでなる該担体媒体は生理的に許容し得る担体であり、該固定された気体の泡は、当該添加剤により安定化された一時的な外被によって境界をつけられた微小泡であり、該サスペンションは、液体状態にある時、注射可能であり、生き物の血液だまり及び組織の超音波画像化におけるコントラスト剤として有用であることを特徴とするサスペンション。
【請求項２】
該凍結水性担体媒体の温度が−１℃〜−196℃である、請求項１に記載のサスペンション。
【請求項３】
該凍結水性担体媒体の温度が−10℃〜−76℃である、請求項２に記載のサスペンション。
【請求項４】
大部分の微小泡のサイズが50μｍより小さい、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項５】
大部分の微小泡のサイズが10μｍより小さい、請求項４に記載のサスペンション。
【請求項６】
該微小泡のサイズが２μｍ〜９μｍである、請求項４または５に記載のサスペンション。
【請求項７】
該微小泡のサイズが３μｍ〜５μｍである、請求項６に記載のサスペンション。
【請求項８】
該ラメラリン脂質が、単ラメラまたは多ラメラリポソームの形をとる、請求項１に記載のサスペンション。
【請求項９】
該ラメラリン脂質が飽和リン脂質である、請求項１に記載のサスペンション。
【請求項１０】
該リン脂質がさらに、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン及びスフィンゴミエリンまたはそれらの混合物から選択される、請求項８または９に記載のサスペンション。
【請求項１１】
該添加剤がさらに、リン酸ジセチル、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビン及びブチル化ヒドロキシトルエンから選択された物質を包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項１２】
該添加剤がさらにソルビトールまたは非イオン界面活性剤を包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項１３】
該添加剤が界面活性剤に対する１：５〜100：１を含む重量比の線状及び架橋結合した多糖類及び少糖類、糖類、親水性ポリマー及びヨウソ化された化合物から選択される、請求項１〜12のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項１４】
該添加剤がさらに50重量％までの、脂肪酸、脂肪酸のエステル及びエーテル並びにポリオールを含むアルコールを含んでなる、請求項１〜13のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項１５】
該ポリオールがポリアルキレングリコール、ポリアルキレン化糖類及び他の炭水化物並びにポリアルキレン化グリセロールである、請求項14に記載のサスペンション。
【請求項１６】
107〜108微小泡／ml、108〜109微小泡／mlまたは109〜1010微小泡／mlを含有してなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサスペンション。
【請求項１７】
該気体が、ハロゲンを含有する気体、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される、請求項１に記載のサスペンション。
【請求項１８】
該ハロゲンを含有する気体が、SF6，CH4，C2F6，C2F8，C3F6，C3F8，C4F6，C4F8，C4F10，C5F10，C5F12及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項17に記載のサスペンション。
【請求項１９】
請求項１〜18のいずれか１項に記載の微小泡を貯蔵する方法であって、
ａ）該液体サスペンションを冷却装置に入れる段階、
ｂ）該サスペンションの凝固点をより低い温度に冷却することにより、該微小泡を固定する段階、
ｃ）該凍結条件を長時間維持する段階、
を特徴とする、前記方法。
【請求項２０】
該凍結されたサスペンションが、微小泡中にカプセル化されている少くとも１種の不活性気体または気体の混合物の雰囲気中に保持される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
該微小泡が−18℃より低い沸点を有する少くとも１種の気体または気体の混合物を含有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
該サスペンションの使用の前に解凍され、室温でしばらく維持される、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
器官及び組織の超音波画像化に用いるための請求項１〜18のいずれか１項に記載の注射し得るサスペンション。
【請求項２４】
超音波撮影のコントラスト剤の製造のための請求項１〜18のいずれか１項に記載の注射し得るサスペンションの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、凍結水性担体媒体中に固定された気体泡のサスペンションに関する。本発明は、気体泡サスペンションの冷蔵法及びそれらの人体及び動物体の超音波画像化のためのコントラスト剤としての使用にも関する。
技術の背景
近年、超音波コントラスト剤の急速な発達は、人体または動物体の器官及び組織の超音波画像化に有用である多くの異なる製剤を生成した。これらの剤は、当初、医療の音響撮影機器の使用に関連して静脈または動脈内に注射可能なものとして用いられるように設計された。これらの器具は代表的には、Ｂ−モード画像生成（後方散乱組織特性の空間的分布に基づく）及びドップラー信号処理（血液または液体流動パラメーターを決定するのに超音波エコーの連続波またはパルスのドップラー処理に基づく）に分類される。他の超音波画像化法も、たとえば超音波コンピューター断層撮影（伝導の減衰を測定する）または回折コンピューター断層撮影（角反射における散乱及び減衰パラメーターを測定する）においても、将来、これらの剤から利益を得るだろう。水性液体担体中の気体微小泡（microbubble）のサスペンションに基づき、これらの注射し得る製剤は基本的に二つのカテゴリーに分割し得る；すなわち、気体の微小泡が気体から液体への境界面でゆるく結合した液体分子と界面活性剤分子を包含する、気体／液体境界面または一時的な外被で境界をつけられた、水性サスペンション及び微小泡が天然または合成ポリマーにより形成された実体的な外被を有しているサスペンションである。後者の場合微小泡は微小気球（microballoon）である。また、他の種類の超音波コントラスト剤がある；すなわちポリマーの多孔質微粒子または微粒子の孔の中に取り込んだ気体の微小泡を担持する他の固体のサスペンションである。これらのコントラスト剤はここでは微小気球の種類の変形と考えられる。物理的には異なるが、両種類の気体微小泡はサスペンションである時に超音波コントラスト剤として有用である。これらの異った製剤についてはさらに、EP-A-0077752（シェリング），EP-A-0123235（シェリング），EP-A-0324938（ウイダー他），EP-A-0474833（シュナイダー他），EP-A-0458745（ビション他），US-A-4,900,540（ライアン），US-A-5230882（ウンガー）等に見い出されるだろう。
上述のコントラスト剤のあるものは開発されて商業的に入手し得るのに対し、他のものは臨床実験の異なった段階にある。しかしながら、商業的に入手し得るか、または臨床テスト中であるにかかわらず、これらの生成物はすべて貯蔵に関連した問題をこうむる。貯蔵の問題はサスペンションに固有であり、まさにそれらの本質により、相分離、気泡凝集、気体拡散及び長時間後ですら、種々の添加剤の沈降が進行する。気体の微小泡または微小気球の分離は、サスペンションが典型的には約１μｍから約50μｍにサイズが変化する、サイズの調整されていない微小泡から作られるという事実から生じる。既知のサスペンション中の気泡の大多数は１μｍ及び約10μｍの間であることが分かる。微小泡のサイズ分布により、貯蔵の間に、これらのサスペンションにおいては大きな微小泡が頂部に移動し、それに対して小さいものは底部に集まるという、分離が進行し、しばしば完全な相分離をもたらす。粘度増加剤の使用によりこの問題を解決する試みは、分離の速度は減少するものの除去できないことを示した。
気体の微小泡の集合は、大きな泡が小さな泡を吸収ししたがってサイズが大きくなる間の過程である。相分離とともに、この過程は加速し、平均サイズがたとえば２μｍ〜８μｍの微小泡を含むサスペンションは、しばらくして、たとえば５μｍ〜12μｍまたはそれよりも大きいサイズの微小泡を含むサスペンションに徐々に発展する。これは、サイズ調整された微小泡のサスペンション及び左心臓の不透明化を意図するサスペンションに関する場合特に望ましくない。サイズの変化は単にコントラスト剤の音響特性を変えるだけでなく、肺を経由する微小泡の通過に基づくもののような特定の用途には、コントラスト剤を適用できないようにもする。10μｍを超えるサイズの微小泡は肺の毛細管を通過しそうもないし、したがって、危険な状態をもたらすことに加え、このようなサスペンションは左心臓の画像化に適切でない。
気体サスペンション及びそれらの貯蔵に伴う他の問題は、比較的に低速で起こる気体の拡散から生じるが、気体の拡散は相分離とともに加速する。微小泡サスペンションからの気体の避けられない漏れは、したがって、さらに悪化し、極端な場合には媒体の気体を完全になくしてしまう。このゆえに、気体サスペンションの破壊の種々のメカニズムの結合した効果が非常に急速なコントラスト剤の分解をもたらす。
いくつかの超音波画像化のアプローチでは、これらのコントラスト剤の好ましい面の一つは、微小泡または基体含有粒子について厳しいサイズの窓の内に分布しているということである。その理由をこの後に示す。医療用の超音波撮影機器により生産された画像のコントラストを増加させる、これらのコントラスト剤の効果は、主として、入ってくる超音波エネルギーの非常に増大した散乱及びこれらの剤を含有する組織の変更された減衰特性に基づく。コントラストは、コントラスト剤を受け入れていない領域から得られたシグナル振幅と比較した、コントラスト剤を灌流された領域からえられた相対的シグナル振幅の測定値を意味する。増大は、投与の前に観察されたコントラストに比較した、コントラスト剤の投与に続いて観察されたコントラスト値の増加を意図する。先に述べたように、これらの剤から最も直接的に利益を受ける画像機器の型は、音響撮影機器（Ｂ−モードまたはドップラー）の群である。コントラスト剤を含有しないものに比較して、コントラスト剤を含有する組織の異なる減衰特性も、画像化手順の診断値を改善するのに利用することができる。さらに、コントラスト剤の散乱及び減衰特性の両方の超音波−振動数依存性は、空間的な組織差別化をさらに増加するのに利用することができる。これらの場合、この振動数依存性を支配する物理的法則は、微小泡のサイズまたは粒子のサイズに規則正しく依存する。したがって、用いられるアルゴリズムは、厳しいサイズ分布の微小泡または粒子から起こるエコーに作用するときより効率的である。例として、このような一つのアプローチは、基礎的な刺激振動数の第２高調波でのエコー振動数成分を検出するのに非線状振幅を利用する。コントラスト剤を含有していない組織は、微小泡と同じ非線状行動を示さないので、この方法はコントラスト剤を含有していない領域と含有している領域の間のコントラストを著るしく増加することができる。サイズが狭く分散している時に、与えられた単位容積当りの粒子数について、この増大がより言明された。しかしながら、このような狭いサイズ分布を伴う生成物の調製は時間がかかる；これらのサイズの調整されたサスペンションの迅速な供給ができれば、この技術のさらなる発展と使用を大いに容易にするであろう。このようなサイズ分布の変化を伴なわない調製物の信頼できる貯蔵も、このように、非常に興味深い。
水性気体サスペンションの貯蔵に伴うさらなる困難は、気体微小泡の安定剤としてリン脂質を含有する超音波コントラスト剤で経験する。リン脂質の加水分解により、貯蔵の間に、安定剤（界面活性剤）の濃度は、絶えず減少し、微小泡の量の低下及びサスペンションの音響特性の低下を引き起こす。したがって、これまで、気体微小泡サスペンションを含む。超音波コントラスト剤の貯蔵の問題は解決がつかない問題のままである。
凍結による水性気体サスペンションの冷蔵は、食品産業において、非常に長い間知られている。たとえば、米国特許第4,347,707号（ゼネラル  フード  コーポレーション）は、液体中に懸濁された気体水和物を形成し、温度及び圧力を制御可能に低下して、たとえばCO2／ｇの85〜110mlの炭酸塩化氷を生産するような、圧力と温度の下で水性液体と水和物−形成性気体とを接触させることにより、気化された氷が調製される方法による、高気体含量及び良好な貯蔵安定性を備えた気化させた氷の貯蔵を開示している。該文献によると、高気体含量で、長い貯蔵安定性の気化された氷は、凍結状態での商業的な流通に適切であって、水中に入れたとき激しい発泡をもたらす。
気体サスペンションを長時間貯蔵するためにそれを凍結させること及び必要時の保存されたサスペンションの再使用は、超音波コントラスト剤には、懸濁された気体は解凍の間に担体媒体から逃げる傾向があるという理由で、適当でないだろうということになる。微小泡の凍結された気体のサスペンションに伴う、さらなる困難性は、凍結の間の担体媒体の膨張が内部力を産み、それが事実上微小泡の外被を破壊または押しつぶし、内部に取り込んだ気体を遊離させ、貯蔵の間または、その後のサスペンションの解凍のいずれかの間に該気体を逃がすという事実にある。この問題は特に物質または実体的な外被を有する微小泡のサスペンションについて厳しい。
発明の概要
簡単に要約すると、本発明は、通常の添加剤を含む、気体の泡を含む担体媒体が生理的に許容し得る担体である、凍結された水性担体媒体内に固定された、気体の泡の凍結されたサスペンションに関する。固定化された気体の泡は、一時的は外被または実体的な膜により境界をつけられた微小泡であり、サスペンションは、液体状のとき、生き物に注射でき、人または動物の患者の血液だまり（pool）及び組織の超音波画像化のためのコントラスト剤として有用である。
本発明によると、凍結されたサスペンションの温度は−１℃〜−196℃、好ましくは、−10℃〜−76℃の間であり、気体の微小泡のサイズは50μｍより小さく、好ましくは10μｍより小さい。特に有用なサスペンションでは、微小泡のサイズは２μｍ〜９μｍの間であり、３μｍ〜５μｍの間のサイズの微小泡のサスペンションはより一層有用である。
膜が合成もしくは天然のポリマーまたはタンパク質から作られている実体的な外被の気体の微小泡または微小気球を含むサスペンションと一時的な外被の気体の微小泡を含むサスペンションとの間の生分解性の差を考慮すると、後者の凍結されたサスペンションは、特に単分子または多分子膜層の形のラメラリン脂質が用いられた時により有利である。
本発明は、微小泡サスペンションの貯蔵法にも関し、該微小泡は冷却機器中に入れ、微小泡はサスペンションの氷点より低く、好ましくは−１℃〜−196℃の間、より好ましくは−10℃〜−76℃の間の温度に冷却することにより、担体媒体内に固定化されており、該凍結条件が長時間維持されるものである。任意に、凍結されたサスペンションは少くとも１種は微小泡内にカプセル化された気体である、不活性気体または気体混合物の雰囲気に保たれていてもよい。気体は好ましくは、ハロゲン含有気体、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。
器官及び組織の超音波音響撮影画像化のための本発明の注射し得るサスペンションの使用及び超音波コントラスト剤の製造も開示されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、貯蔵温度の関数としての、解凍された水性担体媒体中のSF6及び５％のC5F12を含有する空気の微小泡のサスペンション中の泡濃度（総数）の変化のプロットである。
図２は、貯蔵温度の関数としての、解凍された、水性担体媒体中のSF6及び５％のC5F12を含有する空気の微小泡の総気体容積の変化のプロットである。
図３は、適用された外圧及び貯蔵温度の関数としての、解凍された微小泡サスペンションの吸光度の変化のグラフ表示である。図４は、異なった温度での貯蔵後の、解凍されたサスペンションに適用された外圧の関数としての相対吸光度の変化を示すダイアグラムである。
図５は、平均サイズ３μｍ、４μｍ及び６μｍのサイズ調整された微小泡の数（図５Ａ）及び気体容積（図５Ｂ）での微小泡のサイズ分布を示すダイアグラムである。
図６は、サイズ調整されていない微小泡の試料のための数（図６Ａ）及び気体容積での微小泡のサイズ分布を示すダイアグラムである。
発明の詳細な説明
本発明は、微小泡に追加して通常の添加剤を包含する、凍結された水性担体媒体内に、微小泡が固定化されている、気体の微小泡の凍結されたサスペンションを提供する。水性担体は生理的に許容性であり、該サスペンションは、液体状態の時、生き物に注射でき、人及び動物の患者の血液だまり及び組織の画像化のための超音波コントラスト剤として有用である。一時的な外被または実体的な膜により境界をつけられた、固定化された気体の微小泡は、温度が−１℃〜−196℃、好ましくは−10℃〜−76℃の間である凍結された担体媒体の分子の間に取り込まれている。用いられる正確な温度範囲は微小泡の気体の選択に依存するが、用いられる添加剤の種類及び温度にも依存する。したがって、たとえば、空気または窒素の場合、温度は−１℃〜−196℃の間のいずれでもよいが、C4H8の場合、温度は−１℃〜−５℃の間であろう。ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンポリマーまたはポリエチレングリコールが添加剤として用いられる時、サスペンション中に依存する総量に依存し、最高の許容し得る温度は、−１℃の代りに−５℃であるか、−10℃ですらあり得る。
サスペンション中のほとんどの微小泡のサイズは一般に50μｍより小さいが、静脈に注射し得るコントラスト剤としては微小泡のサイズは好ましくは10μｍより小さいだろう。
ほとんどの用途には、２μｍ〜９μｍの間のサイズ分布を有する微小泡を含むサスペンションが要求を満たすであろうが、サイズ調整された微小泡のサスペンションを取り扱う時、サイズは、その範囲内のいずれであってもよい。たとえば、２〜４μｍ、３〜５μｍ、５〜７μｍ、６〜８μｍ、７〜９μｍ、しかしながらサイズ範囲が３μｍ〜５μｍの間の微小泡が好ましい。
したがって、本発明は非常に狭いサイズ分布の微小泡の凍結されたサスペンションも提供する。典型的なサイズ調整された微小泡のサイズ分布のサスペンションは図５に図解されているようなもので、該分布は微小泡の数の分布（Coulter計算機で決定した）図５Ａに関して、微小泡の容積分布（Coulter計算機で決定した）図５Ｂに関して示されている。サイズ調整された微小泡を含有するサスペンションに対比して、サイズ調整されていない気体の泡を含有するサスペンションは、一般的に数及び容積サイズ分布型が図６Ａ及び６Ｂに示されたものと同様であろう。これらの図から、サイズ調整された気体の微小泡から作られた音響撮影応答サスペンションは、サイズ調整されていないサスペンションよりも、散乱が少く、その結果としてより鋭い影像をもたらすであろうことがすぐに分かる。前述のように、これらのサイズ調整されたサスペンションは非常に望ましいが、それらの使用はこれまで非常に限定されていた。したがって、これらの望ましいサスペンションは、低温で長時間その初期の音響特性の過度の低下なしに貯蔵し得る、凍結されたサスペンションの単純な転換により、今やすぐに利用し得る。
さらなる本発明の利点は基礎的な周波数の２倍でエコーシグナル成分を生成するために、第２高調波画像化はコントラスト剤の非−線状振幅を必要とするという事実から生じる。このような性質は、超音波刺激レベルを組織中の特定の深さで、特定の音響上のしきい値を超えるように強いる。非−線状の振幅の間、周波数の転換が起こり、音響エネルギーの基礎的な刺激周波数からその第２高調波への転換を起こす。したがって、この型の画像化の間、微小泡に伝播される著じるしいエネルギーは、これらの条件で残存するのに十分に耐えられる微小泡を要する。本発明は、今や、あらかじめ調整し、貯蔵し、必要時に用いることができるので、圧力変化に十分に耐えられるサスペンションへの容易で便利な入手方法を提供する。
前述のように、気体の微小泡に追加して、本発明の凍結されたサスペンションは、種々の界面活性剤、粘度増加剤、安定剤等を包含する添加剤を含有する。フィルム形成性及び非−フィルム形成性界面活性剤であってもよい、界面活性剤は、一時的な気体／液体外被の微小泡を安定することが知られているラメラまたは薄層型のリン脂質を包含する。ラメラリン脂質は単分子もしくは多分子膜層またはリポソームの形であってよい。
微小泡の型、たとえば一時的は外被または実体的な膜を持つかに依存して、担体媒体は添加剤として、水和剤及び／または親水性安定剤化合物、たとえば、ポリエチレングリコール、炭水化物、たとえばガラクトース、ラクトースもしくはスクロース、デキストラン、澱粉及び他の多糖類または他の慣用の添加剤、たとえばポリオキシプロピレングリコール及びポリオキシエチレングリコール並びにそれらのコポリマー；脂肪族アルコールとポリオキシアルキレングリコールとのエーテル；脂肪酸とポリオキシアルキル化ソルビタンとのエステル、石けん、グリセロール−ポリオキシアルキレン−ステアレート；グリセロール−ポリオキシエチレン−リシノレート；ポリアルキレングリコールのホモまたはコポリマー；ポリエトキシ化大豆油及びひまし油並びにそれらの水素添加誘導体、脂肪酸、脂肪族アルコールとスクロースもしくは他の炭水化物とのエーテル及びエステル（これらは任意にポリオキシアルキル化される）を含む。飽和もしくは不飽和脂肪酸のモノ−、ジ及びトリグリセリド；大豆油及びスクロールのグリセリドも用い得る。界面活性剤はフィルム形成性でも、非−フィルム形成性でもよく、リノレイル−レシチンまたはドデカノン酸ポリエチレンの型の重合性両親媒性化合物を含んでよい。好ましくは、界面活性剤はフィルム形成性で、より好ましくは、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン及びそれらの混合物から選択されるリン脂質である。上述のフィルム形成性界面活性剤に加えて、サスペンションは、さらに、脂肪酸、脂肪酸のエステル及びエーテル並びにポリオールを含むアルコール、たとえばポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキレン化糖類及び炭水化物並びにポリオキシアルキレン化グリセロールから選択される、非−層状界面活性剤の50重量％までを含有し得る。特に適切な物質はリン酸ジセチル、コレステロール、エルゴステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル及びブチル化ヒドロキシトルエンを含む。
本発明は一時的な外被を含む気体の微小泡のサスペンションのみに限定されないことが理解される。気体で満たされた任意の適切な粒子、たとえば、多孔質粒子、リポソームまたはリン脂質、合成もしくは天然ポリマー、またはタンパク質から製造された外被を有する微小気球が都合良く用いられる。したがって、アルブミンで製造された微小気球またはリポソームは、凍結乾燥で長期間首尾よく貯蔵できることが立証された。これらの微小気球を含有する解凍されたサスペンションは、相対的に小さい微小泡の喪失を示す満足な音響特性を示した。微小泡がソルビトールまたは非イオン界面活性剤、たとえばポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマー（Pluronic（商標）として商業上知られている）で安定化されているサスペンションは同様に貯蔵後良い画像化能力を示した。
本発明のサスペンションに用いられる添加剤は、さらに線状及び架橋結合した多糖類及び少糖類、糖類、親水性ポリマー並びにヨウソ化化合物から選択された粘度増加剤及び／または安定剤を含み得る。このような場合、これらの化合物対界面活性剤の重量比は約１：５〜100：１の間である。
本発明による異なる気体または気体混合物で調製されたサスペンションは、通常、107〜108微小泡／ml、108〜109微小泡／mlまたは109〜1010微小泡／mlを含有する。これらの濃度は長期の保存、すなわち、数ヶ月後、実質上同じままであり、サスペンションがSF6，C3F8もしくはそれらの混合物、またはSF6もしくはC5F12と空気との混合物を用いて作られるなら、くり返しの凍結−融解サイクル後ですら変化しない。
サスペンション中の微小泡が実体的な膜を有するとき、膜は合成もしくは天然ポリマーまたはタンパク質から作られる。注射し得る微小気球の外被または境界を構成するポリマーはほとんどの親水性、生分解性生理的に適合性のポリマーから選択し得る。このようなポリマーの内、低水溶解度の多糖類、ポリラクチド並びにポリグリコリド及びそれらのコポリマー、ラクチドとラクトン、たとえば、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトンとのコポリマー並びにポリペプチドをあげることができる。合成ポリマーの選択の非常な多様性は、アレルギー患者へのように、天然のタンパク質（アルブミン、ゼラチン）から作られた微小気球を用いないことを望むかもしれないので、この発明の利点である。他の適当なポリマーは、ポリ−（オルト）エステル、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（DL−ラクチド−コ−δ−カプロラクトン）、ポリ（DL−ラクチド−コ−δ−バレロラクトン）、ポリ（DL−ラクチド−コ−ｇ−ブチロラクトン）、ポリアルキル−シアノアクリレート、ポリオレフィン、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、非−加水分解性ポリエステル、ポリウレタン及びポリ尿素；ポリアミド、ポリヒドロキシブチレート；ポリジオキサノン；ポリ−β−アミノケトン、ポリホスファゼン並びにポリ無水物を含む。ポリアミノ酸、たとえば、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸、並びにその誘導体、すなわち、低級アルコールもしくはグリコールとの部分エステルも用い得る。上記ポリマーの有用な１例はポリ（ｔ−ブチルグルタミン酸）である。
膜がタンパク質から作られる時、タンパク質はアルブミンである。
適切な界面活性剤及び安定剤といっしょに、ハロゲンを含有する気体、空気、酸素、窒素または二酸化炭素を単独で用い得るけれども、最近、ハロゲンを含有する気体と空気、酸素、窒素及び二酸化炭素の混合物を用いることも提案された。ハロゲンを含有する気体は６弗化硫黄、テトラフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタンまたはそれらの混合物から、そして好ましくは、六弗化硫黄、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタンから選択される。
本発明は微小泡サスペンションの貯蔵法にも関し、該方法においては、サスペンションを、冷蔵庫のような冷却機器中に置き、サスペンションの凝固点より低く、好ましくは−１℃〜−196℃の間、更に好ましくは−10℃〜−76℃の間の温度まで冷却することによって、微小泡を担体媒体中に固定化し、該凍結状態を長時間維持する。任意に、凍結されたサスペンションを、微小泡中にカプセル化された気体の少くとも１種である不活性気体または気体の混合物雰囲気中に保つ。気体は好ましくは、ハロゲンを含有する気体、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。
本発明の凍結されたサスペンションに用いられる気体または気体混合物は、沸点が−18℃以下であるべきであることが立証された。これはC4F8及びC5F10のみのようなハロゲン化気体を用いて作られたサスペンションは非常に貯蔵安定性が悪く、実際上凍結後にすべての音響特性を失うことを意味する。他のすべてのハロゲン化気体は凍結−融解の数サイクルを音響特性の著るしい変化なしに存続するという、非常に安定な凍結されたサスペンションを製造するので、これは特に驚くべきことである。これらの気体に少量の他のハロゲン化気体、またはC5F12のように室温で液体であるハロゲン化物質の蒸気を「ドーピング」するだけで、凍結貯蔵することができない混合物を製造した。他方、これらの気体に特定量の空気を混合することにより、凍結／融解の数サイクル後、非常に良い貯蔵安定性及び非常に良い音響特性を有するサスペンションを製造した。
上述のように液体である時、本発明の注射し得るサスペンションは、器官または組織の超音波画像化のコントラスト剤として有用である。明らかに、使用の前にサスペンションを解凍し、任意にしばらく室温に維持し、次いで患者に投与する。次いで患者を超音波プローブで走査し、走査された領域の画像が作成される。
本発明の凍結された注射可能なサスペンションからの超音波音響画像コントラスト剤の製造方法も本発明の範囲内である。製造は、サイズ調整されたまたはサイズ調整されないかなり濃縮されたサスペンション（たとえば1010〜1011微小泡／mlまたはそれよりも多い）が、しばらく凍結状態で貯蔵され、必要な時に解凍されたサスペンションが、任意に、同じまたは異なった生理的に許容し得る液体担体の添加によって所望の濃度に希釈されることを意味する。この時点でさらに添加剤または調節剤を加え得ることも考えられる。
本発明をさらに次の実施例により説明する。
例  １
58mgのジアラキドイルホスファチジルコリン（DAPC）、2.4mgのジパルミトイルホスファチジル酸（DPPA）（両方共Avanti Polar Lipids（米国）から）、及び3.94ｇのポリエチレングリコール（SiegfriedからのPEG 4000）を丸底ガラス容器中のｔ−ブタノール中に60℃で溶解した。透明な溶液を−45℃で急速に冷却し、凍結乾燥した。得られた白い塊のアリコート（25mg）を10mlのガラスびんに加えた。ガラスびんをゴム栓で閉じ、真空にし、選択された気体または気体混合物で満たした（表１参照）。次いで食塩水（0.9％NaCl）を該栓を経由して注入し（ガラスびん当り５ml）、凍結乾燥物を激しい振とうにより溶解した。
微小泡サスペンションを冷蔵室（−18℃）に入れた。３日後、それらを室温（23℃）で融解し、泡濃度（Coulter Multisezerにより）及び１／50希釈の700nmでの吸光度について分析した。700nmでの吸光度は泡サスペンションの全濁の測定値である。
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表１に示された結果は、沸点に依存する凍結安定性及び気体の水溶解度を示す。沸点が−18℃より高い気体の場合回収される泡は少ない。沸点が−18℃より低い気体に関して、水中への溶解度が低いほど泡の回収は高い。ドデカフルオロペンタン（C5F12）のような低水溶性の高分子量の気体の添加は、低沸点の気体の場合に融解後の泡の回収を改善するが、−18℃より高い沸点の気体について改善しない。最後に、C4F8及びC4F10を単独でまたは少量のドデカフルオロペンタンとの混合物として、充填した微小泡は、凍結／融解に対して非常に安定性が悪い。しかしながら、これらの気体を空気と混合して用いた時、混合物を含有する微小泡のサスペンションは、空気微小泡を含有するサスペンションより音響特性または微小泡の喪失に関して良い結果を示す。
例  ２
例１に記載されたように調製されたSF6微小泡のサスペンションをゆっくりと（約30分）−18℃に、または急速に（１分以内）に−45℃に凍結した。SF6微小泡の他のサスペンションを凍結前にすべての泡が表面に上がるまで最初に室温に保持した。他のものは、泡が均質に溶液中に分散している間に凍結した。凍結されたサスペンションを−18℃及び−45℃で１ヶ月間貯蔵し、次いで解凍した。
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表２の結果は、凍結速度は最終結果に対して、相対的に小さな影響を有することを示す。回収は均質なサスペンションの場合に、デカントされた微小泡のサスペンションの場合よりもよい。
例  ３
クロロホルム−メタノール（２／１）中に4.5ｇの水素添加大豆ホスファチジルコリン（NattermannからのHSPC）及び0.5ｇのリン酸ジセチル（Fluka，スイス）を溶解し、丸底フラスコ中で回転蒸発器を用いて溶液を乾燥まで蒸発させることにより、多ラメラ  リポソームを調製した。残存脂質フィルムを真空デシケーター中で乾燥した。100mlの蒸留水を添加後、サスペンションを撹拌下、30分70℃でインキュベートした。蒸留水を添加して、リポソームサスペンションを最終脂質濃度25mg／mlに調整した。
リポソームサスペンションのアリコートを、高速機械乳化機（Polytron）を備えた気体の漏れないガラス反応器中に入れた。反応器中の気相は５％のC5F12を含有する空気であった（密度測定で決定）。均質化後（10,000rpm、１分）、得られた乳白色のサスペンションをデカンテーションろう斗に加えた。６時間後、泡の白い層を溶液の頂部に見ることができた。低い（リポソームを含有する）相を取り去り、小量の新鮮な水を加え、微小泡層を再均質化した。手順（デカンテーション）を繰り返し、異なった微小泡サイズの４つの試料を調製した（WO 94／09829号参照）。試料を−18℃で凍結し、24時間後室温に融解した。
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得られた結果（表３）から、凍結／融解処理は平均泡直径に影響を持たないことが分る。実験から、大きい直径の微小泡（＞2.5μｍ）は、小さい微小泡よりも凍結／融解処理に耐えるように見える。特定の場合には融解速度は試料に存在する微小泡の最終濃度に影響し得ることが観察された。正確な関係はまだはっきりしないが、微小泡の喪失は、解凍速度に逆比例する兆しがある。加速された解凍、すなわち、25℃の水浴中で解凍を実施する方が試料が５℃または20℃でより徐々に解凍させたときよりも、サスペンション中の微小泡濃度（計数）及び気体の総容積に関し、良い結果が得られることを予備的な結果が示している。気体容積のもっとも大きい低下は５℃で解凍された試料に認められた。
例  ４
例３に記載した実験をMLVsの代りに界面剤の混合物を用いて繰り返した。界面活性剤混合物を、蒸留水（80ml）中に１ｇのジパルミトイルホスファチジルグリセロール（Avanti Polar Lipids（米国）からのDPPG Na）及び３ｇのPluronic（商標）F68（分子量8400のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンのコポリマー）を溶解することにより得た。約70℃で加熱後、透明な溶液が得られた。この溶液を室温で冷却し、容積をグリセロールを用いて100mlにした。界面活性剤溶液をPolytron乳化機を備えたガラス製の気体の漏れない反応器に加えた。均質化後（10,000rpm、１分）、あぶくの層を頂部に含む、乳白色のサスペンションが得られた。あぶくを捨てて、109微小泡／mlを含有する低い相を回収した。この相を白い微小泡層を収集する前に数時間置いた。収集された微小泡を蒸留水中で再均質化し、二度デカントし、先に記載したように凍結／融解した。凍結の前後での泡の特徴を比較する総泡濃度（前1.3×108泡／ml、後1.25×108泡／ml）または平均直径Dn（前4.0μｍ、後3.9μｍ）に大きな変化はなかった。
例  ５
例１に記載したように、SF6泡を調製し、例３に記載したようにデカントした。下方の水相の除去の間に、ろう斗に等容積のSF6気体を加えた。泡層を蒸留水、0.9％NaCl、３％水性グリセロール溶液及び100mg／mlのトレハロース溶液に再懸濁した。泡濃度及び700nmでの吸光度（希釈後）を凍結−融解処理の前と後に測定した。
表４の結果は、サスペンション媒体とは無関係に泡のすばらしい回収を示した。ここの微小泡の回収は66〜96％であって、表１及び２に報告した前の結果と正反対であるようであることを記すことは重要である。しかしながら、この場合、第１に微小泡は調整されており、すなわち、調整されていないものより安定であり、第２にここに用いられた泡のサイズは４μｍより大きい。
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例  ６
例５に記載されたように、デカントされたSF6微小泡を得た。微小泡層を0.9％のNaCl中に異なった泡濃度で懸濁し、次いで−18℃で凍結し、４ヶ月貯蔵し、室温で融解した。
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表５に集めた結果は耐−凍結／融解について泡濃度は大した影響がないことを示す。貯蔵後に実施した第２凍結／融解処理ですら最終濃度に影響を与えず、これらのサスペンションは貯蔵後ですら、凍結及び融解サイクルの繰り返しに対し、泡の数に大きな低下も、試料の音響特性に損失もなしに、耐えることができる。
例  ７
EP-A-0324928号（Widder）に記載された方法を用いて、超音波処理したアルブミンのマイロスフェアーを調製した。簡単に言うと、５mlの殺菌した５％ヒト  アルブミン溶液（スイス赤十字の血液輸血サービス、スイス国，ベルンから）を10mlのサイズ調整された注射器に入れた。超音波処理機のプローブ（Branson Ullrasonic Corp.（米国）からのModel 250）を溶液中に４mlのマークまで低下させた。超音波処理をエネルギーを７にセットして30秒行った。次いで超音波処理機のプローブを６mlのマークまで（すなわち、溶液レベルの上）上げて、超音波処理を40秒間、パルスモード（0.3秒／サイクル）で続行した。あぶく層の除去後、平均直径3.6μｍで1.5×108泡／mlを含有するアルブミンマイクロスフェアーのサスペンションを得た。このサスペンションを−18℃で凍結し、この温度で一晩置いた。１日後、サスペンションを室温で融解した。凍結／融解の前、後に分析されたサスペンションは次の性質を有していた。
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表６の結果は凍結と解凍のサイクルによって空気を含有する微小泡のある程度の破壊を示す。純粋な空気の代りに、５容積％のC5F12またはC3F8を含有する空気の混合物で、アルブミン微小泡を調製する時、泡の数の凍結／融解減少に対するマイクロスフェアーの安定性は大きく改善された（表７参照）。アルブミンのマイクロスフェアーで得られた結果から、空気の微小泡の場合には、凍結／融解サイクルは微小泡集団のサイズが小さい方の末端に有害であること、すなわち、約５μｍまたはそれより大きい平均サイズの微小泡はそれより小さい微小泡よりも、より耐性であって、残存する機会を有することも分かる。
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例  ８
３mgの糖類の微粒子SHU-454である商業的な音響コントラスト剤（Echovist（商標），Scheringドイツ国）を製造者により推奨されたようにガラクトース溶液（8.5ml、200mg／ml）中に再構成し、凍結／融解処理を受けさせた時、融解後に溶液中にいくつかの泡が存在しているだけであった。10mg／mlのジパルミトイルホスファチジルグリセロールとPluronic（商標）F68の混合物（１：５、重量：重量）を、糖類の微粒子の添加の前にガラストース溶液に加えると、安定な微小泡が、濃度2.5×108泡／mlで得られるだろう。凍結及び融解後、泡濃度は約３オーダーの大きさで、2.3×105／mlに落ち、処理の間に、微小泡はかなりの減少を示した。しかしながら、再構成の前に、気相中の空気を10％のC5F12を含有する空気の混合物で置換したら、泡はより安定で、凍結／融解処理に対してもより耐性であった。後者の場合、濃度は3.9×108から1.6×108泡／mlに落ちたので微小泡の減少はほんの2.3×108泡／mlであった。
例  ９
例４に記載されたEP-A-0458745（Bracco International）の技術を用いて、ポリマーの微小気球を製造した。この製造において用いられたポリマーは、米国特許第4,888,398号に記載されたポリ−POMEGであった。微小気球を濃度1.8×108粒子／mlで、蒸留水、0.9％NaCl、５％デキストロース及び３％グリセロール中に懸濁した。これらのサスペンションの各々を凍結し、次いで融解した。融解後に、総粒子濃度にも平均粒子直径にも何等の検出可能な変化を認めなかった。
例  10
200mlの丸底フラスコ中の９mlのジエチルエーテルに126mgの卵レシチン及び27mgのコレステロールを溶解した。該溶液に３mlの0.2モルの重炭酸ナトリウムの水溶液とイオノフォアA23187を加え、生じた二相系を均質となるまで超音波処理した。混合物をRotavapor上で乾燥するまで蒸発させ、３mlの0.2モル重炭酸塩水溶液を、脂質析出物を含有しているフラスコに加えた。
しばらく置いた後、生じたリポソームサスペンションを取り込まれていない重炭酸塩を除去するために食塩水に対して透析し、酸性化した。しばらく後、それを蒸留水で洗浄し、次いで炭酸塩のフィルターのカスケードを数回通過させた。サイズが50μｍより小さいリポソームのサスペンションのアリコートを、次いで−18℃に凍結し、この温度で貯蔵した。２週間後、サスペンションを室温で融解させた。凍結／融解の前、後に分析されたサスペンションは許容し得る低音響特性の低下及び微小泡数を示した。
例  11
気相としてSF6及び５％C5F12を含有する空気を用いて、例３の手順を繰り返し、生じたサスペンションの試料を、−18℃、−45℃、−76℃及び−196℃で凍結させた。対応する冷却温度での貯蔵の３日後、試料を解凍し、サスペンションを分析した。得られた結果を表８に提示する。凍結前の微小泡の濃度はSF6について11.6×107／mlで、空気と５％のC5F12の混合物について9.8×107／mlであったのに対し、貯蔵前の試料中の気体のそれぞれの容積は2.9μｌ／ml及び5.9μｌ／mlであった。２気体についての平均微小泡直径は2.3μｍ及び4.2μｍであった。
その結果から貯蔵温度が低い程、微小泡濃度及び解凍により回収される気体の総量における低下が大きいということになる。その結果はさらに、SF6を用いたサスペンションの解凍された試料について、平均直径は最初は増加し、次いで温度が低下するにつれて、急激に減少することを示す。空気と５％のC5F12の混合物について、微小泡直径に相対的に小さい変化がある。結果は平均微小泡直径は貯蔵温度の低下とともに減少することも示している。図１に示すように、SF6及び空気／C5F12混合物を含むサスペンションについては、−196℃の貯蔵後に51.7％及び52％の初期の微小泡集団のみが回収される。しかしながら、図２から分かるように、SF6について貯蔵後回収された総気体容積は初期容積の21.1％であるのに対し、空気／C5F12混合物について、回収された容積は46.5％である。これは、SF6で製造されたサスペンションの場合、微小泡のサイズは変化したこと、すなわち、回収された微小泡の直径が減少したことを示す。
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図３及び図４は、空気と５％のC5F12の混合物を含有する微小泡のサスペンションの圧力変化に対する、凍結または貯蔵温度の影響を説明する。図３のダイアグラムでは、吸光度（700nmで測定された）は、異った温度で３日間貯蔵後、サスペンションに適用された圧力の関数として提示される。このダイアグラムから、−18℃〜−76℃の温度で貯蔵されたサスペンションの性質の変化は著るしいのに対し、−76℃〜−196℃で貯蔵された試料についての変化は相対的に小さいというように、貯蔵温度の低下はサスペンションの性質に影響を有することになる。したがって、−76℃より下の貯蔵温度を維持することはさらなる利益を提供しないようである。必要とするコストの点からみても、−76℃より低い温度を選択することは、例外的な場合にのみ正しいかもしれない。
図４は他方で、空気と５％のC5F12の混合物を含有する微小泡のサスペンションが低温で３日間貯蔵されるなら、圧力変化への耐性は相対的に変化しないままであるのに対し、同じサスペンションを同じ期間25℃に保持すると、圧力変化への初期の耐性の約10％を失うことを示す。
正確な手順及び臨界圧の重要性及び吸光度の測定は既にEP-A-0554213号で説明され、引用により本明細書に組み入れられる。
例  12
例１，３及び７の調製物を含むACUSON 128XP 5装置（Acuson Corp.米国）を用いて実験用ミニブタに0.04ml／体重kgの末梢血管注射をして、二次元心エコー図を実施した。凍結／融解しない場合と、凍結／融解の場合とで、左心室のエコーコントラストの増大を評価した。たとえばアルブミンマイクロスフェアーについての例７に記載されたような試料の場合ですら、著るしい差は認められなかったことは、残りの泡は強く長く続くエコー増大を生産するのに主として十分であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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