(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる新規なヘキソキナーゼ。
【請求項２】
下記理化学的性質を有する請求項１に記載の新規なヘキソキナーゼ。
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
クレアチンキナーゼ測定溶液中の安定性：少なくとも６０％（４０℃にて、１週間保存）
至適温度：約４５〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
分子量：５３，９９８（アミノ酸組成から求めた値）
５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．０、３０分間）
ｐＨ安定性：約５．５〜７．５（２５℃、２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：約０．２１ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：約０．０７４ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する。
【請求項３】
サッカロミセス・パスツリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）  ＡＴＣＣ２３６６が産生する酵素である請求項１または２に記載の新規なヘキソキナーゼ。
【請求項４】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるヘキソキナーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヘキソキナーゼをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
【請求項６】
請求項４または５記載のヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、ヘキソキナーゼを生成させ、該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法。
【請求項９】
サッカロミセス・パスツリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）  ＡＴＣＣ２３６６を培養し、ヘキソキナーゼを生成させ、該ヘキソキナーゼを採取することを特徴とする請求項８記載のヘキソキナーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載されるヘキソキナーゼ、緩衝液、グルコース、マグネシウム、ＡＤＰ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液を含むクレアチンキナーゼ測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチンキナーゼ、グルコース等の測定に用いることのできるヘキソキナーゼ活性を有する新規な酵素、および該酵素をコードする遺伝子、および遺伝子工学的技術による該酵素の製造法ならびにクレアチンキナーゼ測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ヘキソキナーゼ（EC 2.7.1.1）は臨床的に、筋疾患、神経疾患、心筋梗塞等の診断の指標となっている、体液中のクレアチンキナーゼの測定、あるいは高血糖、低血糖を引き起こす様々な疾患や病態の診断として、グルコースの測定などに、グルコース−６−リン酸脱水素酵素と共に使用されている。
このようなヘキソキナーゼは、高等動物から微生物まで普遍的に存在する酵素であるが、臨床検査用途としてはヘキソキナーゼと同じ反応を触媒するグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)も含めて、サッカロミセス属、バチルス属細菌（特公昭63-26991号公報）、サーマス属細菌（特公昭63-26990号公報）由来のもの等が報告されている。
【０００３】
また、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)が産生するヘキソキナーゼは、そのコードする遺伝子がクローン化されており、アミノ酸配列が報告されている(Nucleic Acid Research, vol.14 No.2, 1986)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のヘキソキナーゼはその安定性において十分とはいえず、特にクレアチンキナーゼ測定溶液において、長期保存した場合の残存活性が低い。したがって、長期保存した場合、安定性に優れたヘキソキナーゼが望まれている。本発明の目的は、クレアチンキナーゼ測定溶液中での安定性が優れた新規なヘキソキナーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６の産生するヘキソキナーゼが、クレアチンキナーゼ測定溶液中で安定であることを見いだし、さらに、該菌体より抽出した染色体ＤＮＡからヘキソキナーゼをコードする遺伝子を分離し、該遺伝子より該酵素を大量生産させることに成功し、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規なヘキソキナーゼである。
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
クレアチンキナーゼ測定溶液中の安定性：少なくとも６０％（４０℃にて、１週間保存）
【０００７】
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である新規なヘキソキナーゼである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるヘキソキナーゼをコードする遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
本発明は以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるヘキソキナーゼをコードする遺伝子である。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
（ｅ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡ
【００１０】
本発明は、上記ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００１１】
本発明は、上記組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体である。
【００１２】
本発明は、上記形質転換体を培養し、ヘキソキナーゼを生成させ、該ヘキソキンーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法である。
【００１３】
本発明は、サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６を培養し、ヘキソキナーゼを生成させ、該ヘキソキンーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法である。
【００１４】
また、本発明は上記ヘキソキナーゼ、緩衝液、グルコース、マグネシウム、ＡＤＰ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液を含むクレアチンキナーゼ測定用試薬である。
【００１５】
【発明の実施態様】
本発明のヘキソキナーゼは、ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する酵素である。Ｄ−ヘキソースとしてはＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースなどが挙げられる。
【００１６】
また、本発明の酵素は、クレアチンキナーゼ測定溶液中で４０℃にて、１週間保存したところ、少なくとも６０％の残存活性を有することが特徴である。
ここで、クレアチンキナーゼ測定溶液とは、試料中のクレアチンキナーゼをＡＤＰの存在下にクレアチンに作用させ、生成されるＡＴＰとグルコースをマグネシウムイオンの存在下にヘキソキナーゼを作用させて、ＡＤＰおよびグルコース−６−リン酸を生成させ、次いでグルコース−６−リン酸とＮＡＤにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変化を吸光度測定することにより、クレアチンキナーゼ活性を測定する溶液であり、少なくともｐＨ緩衝剤、ＡＤＰ、Ｄ−グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、マグネシウムイオン、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼを成分として含み、３０℃でのｐＨが約６．６である溶液である。
【００１７】
また、さらに具体的には、少なくともイミダゾール酢酸緩衝液、酢酸マグネシウム、ＡＤＰ、Ｄ−グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼを成分として含み、３０℃でのｐＨが約６．６である溶液である。
【００１８】
該溶液は日本臨床化学会勧告法（臨床化学  第１９巻、第２号、第１８５頁、１９９０年６月）により、その望ましい試薬組成が定められている。
【００１９】
クレアチンキナーゼ測定溶液中の安定性とは、該酵素の保存前の酵素活性に対する、下記溶液に酵素を溶解して、４０℃、１週間保存した後の酵素活性の割合を示す。本発明では、安定性が少なくとも６０％、好ましくは７０％である。従来のサッカロマイセス・セレビシエ、バチルス・スレアロサーモフィラス由来の酵素は約５０％程度である（図６参照）。
【００２０】
本発明の一実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なヘキソキナーゼである。
0004022784.tif 000002
【００２１】
別な実施態様は、さらに、下記理化学的性質を有する。
熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．０、３０分間）
ｐＨ安定性：約５．５〜７．５（２５℃、２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：約０．２１ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：約０．０７４ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する。
【００２２】
本発明の一実施態様はサッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６が産生する酵素である。
【００２３】
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるヘキソキナーゼである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質。
【００２４】
本発明の一実施態様は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するヘキソキナーゼである。
【００２５】
本発明のヘキソキナーゼは、ヘキソキナーゼ生産微生物、例えばサッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６を培養し、該培養物から採取し得る。培養条件は、菌体の栄養生理的性質を考慮して、選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得る。好ましくは約２５〜３０℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって、適当時期に培養を終了すればよく、通常は約２４〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくは約ｐＨ５．５である。
【００２６】
培養物中のヘキソキナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま、採取し利用することもできるが、一般には常法に従って、ヘキソキナーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、ヘキソキナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ヘキソキナーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤をヘキソキナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２７】
このようにして得られたヘキソキナーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミドヒドロラーゼを得ることができる。例えば、セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）を添加して、フェニルセファロースＣＬ６−Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。  この精製酵素標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００２８】
本発明では、ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を分離し、これを適当なベクターを用いて他の宿主細胞を形質転換して、これより発現されるヘキソキナーゼを単離することにより、該酵素を簡便、かつ効率的に入手することができる。
【００２９】
本発明のヘキソキナーゼをコードする遺伝子としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるヘキソキナーゼをコードする遺伝子がある。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質。
アミノ酸の欠失、置換もしくは付加の方法としては、該アミノ酸をコードする遺伝子を変異する方法、例えば、通常のヌクレアーゼを用いる方法、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法、市販の変異導入キットを用いることができる。その欠失、置換もしくは付加の程度は、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものである。
【００３０】
本発明のヘキソキナーゼをコードする遺伝子としては、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるヘキソキナーゼをコードする遺伝子がある。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつヘキソキナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
ＤＮＡの欠失、置換もしくは付加の方法としては、例えば、通常のヌクレアーゼを用いる方法、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法、市販の変異導入キットを用いることができる。その欠失、置換もしくは付加の程度は、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものである。
（ｅ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキソキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする○○由来のＤＮＡ
ここでストリンジェントな条件とは、例えば×２ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、６５℃、１６時間である。
【００３１】
本発明のヘキソキナーゼをコードする遺伝子は、例えばサッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus）ＡＴＣＣ２３６６から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）の利用により、ヘキソキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
本発明の該遺伝子を得る方法としては、例えばサッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６の染色体ＤＮＡを分離精製し、サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６と類縁種であり、遺伝子の相同性が高いと予想されるサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のヘキソキナーゼをコードする塩基配列を基に、サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６のヘキソキナーゼをコードする遺伝子が増幅されるようなプライマーを作成し、調製した染色体ＤＮＡを鋳型をして、ＰＣＲ反応を行う。
【００３２】
得られたＰＣＲ増幅断片は、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端において、ＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからヘキソキナーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００３３】
すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりヘキソキナーゼ遺伝子の含有する溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（SDS)等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００３４】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜、組み合わせることにより行うことができる。
【００３５】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 ，Lambda-gt11などが使用できる。また、プラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、pBluescript 、ｐＬＥＤ−Ｍ１（Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993)）などが使用できる。
【００３６】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110 ，エシェリヒア・コリーC600，エシェリヒア・コリーHB101 ，エシェリヒア・コリーJM109 などを用いることができる。
【００３７】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。
こうして得られた形質転換体である微生物は栄養培地で培養されることにより、多量のヘキソキナーゼを安定に生産し得ることを見いだした。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとヘキソキナーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつヘキソキナーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００３８】
上記の方法により得られたヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Science, Vol.214, 1205-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読し、また、ヘキソキナーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定する。このようにして一度選択されたヘキソキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、ヘキソキナーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲによりヘキソキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３９】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常、用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒアコリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって、適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００４０】
培養物中のヘキソキナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま、採取し利用することもできるが、一般には常法に従って、ヘキソキナーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、ヘキソキナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ヘキソキナーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤をヘキソキナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００４１】
このようにして得られたヘキソキナーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱させればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミドヒドロラーゼを得ることができる。
例えば、セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）を添加して、フェニルセファロースＣＬ６−Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００４２】
本発明のヘキソキナーゼは、クレアチンキナーゼ測定試薬として利用される。クレアチンキナーゼ測定試薬とは、ヘキソキナーゼ、緩衝液、マグネシウムイオン、グルコース、ＡＤＰ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液を含むものである。本発明のヘキソキナーゼはクレアチンキナーゼ測定溶液中で、少なくとも６０％（４０℃にて、１週間保存）との高い安定性を有するから、該測定試薬は過剰にヘキソキナーゼを添加する必要がなく、安価で、精度の高いクレアチンキナーゼの測定が可能となる。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例中、ヘキソキナーゼ活性測定は以下の試薬および測定条件で行った。＜試薬＞
試薬Ａ      50mM  Tis-HCl 緩衝液、pH8.0 （13mM MgCl2を含む）
試薬Ｂ     0.67M  グルコース溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｃ    16.5mM  ATP 溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｄ     6.8mM  NAD 溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｅ    グルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼ溶液（300U/ml に試薬Ａで溶解）
＜測定条件＞
まず試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄおよび試薬Ｅを２．２８：０．５：０．１：０．１：０．０１の割合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌを３０℃で約５分予備加温後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え、３０℃で反応を開始し、４分間反応させた後、３４０ｍｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００４４】
実施例１  サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６からのヘキソキナーゼの採取
サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６を１００ｍｌのＹＰＤ培地(1％ポリペトン、１％酵母エキス、１％Ｄ−グルコース（ｐＨ５．３））で３０℃一晩振盪培養した後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝液、５ｍＭグルコース、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ６．３に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ファルマシア  バイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロース（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。
【００４５】
該方法により得られた標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は、約８００Ｕ／ｍｇタンパクであった。
なお、酵素活性は上記条件および操作により測定した。
精製された酵素の理化学的性質を測定した結果を下記に示す。
作用：ＡＤＰの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
至適温度：４５〜５０℃（図１参照）
至適ｐＨ：８．０〜９．０（図２参照）
熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．０にて３０分間保存、図３参照）
ｐＨ安定性：約５．５〜７．５（２５℃にて、２５時間保存、図４参照）
グルコースに対するＫｍ値：約０．２１ｍＭ
分子量：５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００４６】
【表１】
0004022784.tif 000003
【００４７】
実施例２  染色体ＤＮＡの分離
サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６の染色体ＤＮＡは、該菌株を１００ｍｌのＹＰＤ培地(1％ポリペトン、１％酵母エキス、１％Ｄ−グルコース（ｐＨ５．３））で３０℃一晩振盪培養した後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌し、該菌体より、Herefordらの方法（Cell 18:1261-1271 ）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４８】
実施例３  ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得た染色体ＤＮＡを鋳型として、遺伝子の塩基配列が公知であるサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のヘキソキナーゼをコードする塩基配列を基に、サッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６のヘキソキナーゼをコードする遺伝子が増幅されるような２種のプライマー（配列表の配列番号３、４に記載）を作成し、ＰＣＲ法によりサッカロミセス・パスツリアヌス(Saccharomyces pastorianus) ＡＴＣＣ２３６６のヘキソキナーゼをコードする遺伝子断片を増幅した。
なお、プライマーは増幅断片の両端に別々の制限酵素による切断部位（Ｎ末端にNdeI、Ｃ末端にBamHI ）が創出されるように設計した。
ＰＣＲは以下に示す反応液組成および増幅条件にて行った。
＜反応液組成＞
TaqPlus DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン製）        5 U/100 μl
10倍濃度TaqPlus DNA ポリメラーゼ用バッファー       10 μl/100μl
染色体ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）                       0.01 μg/100μl
dATP, dTTP, dGTP, dCTP                          各0.2 mM
プライマー                                      各１μM
（配列表の配列番号３、４に記載）
＜増幅条件＞
(1) ９４℃、２分間（変性）
(2) ９４℃、４５秒間（変性）
(3) ５５℃、３０秒間（アニーリング）
(4) ７４℃、２分間（反応）
（上記(1) 〜(4) のサイクルを計３０サイクル実施）
【００４９】
増幅ＤＮＡ断片約１．５ｋｂｐを Cloning Kit(Invitrogen 製）を用いて、ｐＣＲＴＭIIベクターとＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１単位で、１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、選択用ＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ  Ｘ−ｇａｌ（ｐＨ７．２）)に塗布し、３７℃、２０時間培養し、生育したコロニーの中から白色のものについてＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＨ７．２））で３７℃、１６時間培養した。培養菌体より常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した後、制限酵素 NdeI とBamHI （東洋紡製）にて処理し、約１．５ｋｂｐ断片が生成するプラスミドＤＮＡを選抜した。
【００５０】
また、pBluescript KS(+) を用いて、該ベクター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子の開始コドンの位置に制限酵素 NdeI による切断配列が創出されるようなプライマー（配列表の配列番号５に記載）と市販の変異導入キット(Transformer TM ; Clontech製）により、β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子の開始コドンの位置に制限酵素 NdeI による切断配列が導入されたプラスミドＤＮＡを作成した。次にこのプラスミドＤＮＡを NdeI とBamHI により処理したものと、前記の選抜したＰＣＲ増幅断片を保持するプラスミドＤＮＡの同制限酵素処理による生成ＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、ＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、（ｐＨ７．２））に塗布し、３７℃、２０時間培養した。得られたコロニーはＴＢ培地（1.2%ポリペプトン、2.4%酵母エキス、0.4%グリセロール、1.25% Ｋ2 ＨＰＯ4 、0.23% ＫＨ2 ＰＯ4 、100 μg/mlアンピシリン）で３０℃、２４時間培養し、これらをスクリーニングした結果、顕著なヘキソキナーゼ活性を示す株を得ることができた。この株の保持するプラスミドＤＮＡ約１．５ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＨＸＫ１０とした。ｐＨＸＫ１０の制限酵素地図を図５に示す。
【００５１】
実施例３  塩基配列の決定
ｐＨＸＫ１０の約１．５ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡製）を用いて、常法に従って塩基配列を決定した。決定した塩基配列およびアミノ酸配列を配列表に示す。
アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量は５３，９９８であった。
また、ｐＨＸＫ１０挿入ＤＮＡ断片はヘキソキナーゼ遺伝子以外の部分を含まない。すなわち、挿入ＤＮＡ断片の両端には NdeI と BamHI制限酵素切断部位がそれぞれ存在し、NdeIはヘキソキナーゼ遺伝子の開始コドン（ATG)と重なり、BamHI はヘキソキナーゼ遺伝子の終止コドン（TGA)の直後に位置している。
【００５２】
実施例４  形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡製）をｐＨＸＫ１０で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＨＸＫ１０）を得た。
【００５３】
実施例５  エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＨＫＸ１０））からのヘキソキナーゼの製造
ＴＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌ添加した。この培地に１％グルコースを含むＬＢ培地であらかじめ３０℃、１６時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＨＸＫ１０）の培養液５ｍｌを接種し、３０で２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のヘキソキナーゼ活性は約３０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離にて集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝液、５ｍＭグルコース、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ６．３に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ファルマシア  バイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロース（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。該方法により得られた標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は、約８００Ｕ／ｍｇタンパクであった。
【００５４】
上記方法で得られたヘキソキナーゼを用いて、下記クレアチンキナーゼ測定溶液を作成して、その４０℃での保存安定性を市販のヘキソキナーゼ(Saccharomyces属由来、東洋紡績製、市販品Ａ) およびヘキソキナーゼと同じ用途で用いられるグルコキナーゼ(Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ製、市販品Ｂ) と比較した結果を図６に示す。なお、クレアチンキナーゼ測定試薬は日本臨床化学会勧告法（臨床化学、第１９巻第２号１９９０年６月）に従って作成した。
図６から、本発明のヘキソキナーゼがクレアチンキナーゼ測定溶液中で優れた安定性を示すことが確認された。
【００５５】
ｐＨ（３０℃）                                     6.60
イミダゾール酢酸緩衝液                             115 mM
ＥＤＴＡ                                            2.3mM
酢酸マグネシウム                                   11.3mM
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン                        23 mM
ＡＤＰ                                              2.3mM
ＡＭＰ                                              5.8mM
Ｐ',５5−ジアデノミン−５'-ペンタリン酸           11.5μM
Ｄ−グルコース                                      23 mM
ＮＡＤＰ                                            2.3mM
ヘキソキナーゼ                                    3450 U/l，30℃
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ            1725 U/l，30℃
【００５６】
【発明の効果】
本発明によりクレアチンキナーゼ測定溶液中で安定性に優れた新規なヘキソキーゼが単離され、遺伝子工学的技術による該酵素の製造法が確立され、高純度かつクレアチンキナーゼ測定溶液中で安定な該酵素の大量供給とクレアチニンの定量への利用が可能となった。
【００５７】
【配列表】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヘキソキナーゼの至適温度を示す図である。
【図２】本発明のヘキソキナーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明のヘキソキナーゼの熱安定性を示す図である。
【図４】本発明のヘキソキナーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】プラスミド、ｐＨＸＫ１０の制限酵素地図を示す図である。
【図６】本発明のヘキソキナーゼおよび市販のヘキソキナーゼ（グリコキナーゼ）をクレアチニンキナーゼ測定試薬中でのｐＨ６．６、４０℃、０〜１４日間保存時の残存活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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