(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿沈渣中のインテグリンβ3を測定することを特徴とする腎疾患の検知法。
【請求項２】
尿沈渣中のインテグリンβ3を、インテグリンβ3に対する抗体を用いた抗原抗体反応によって測定することを特徴とする請求項１記載の腎疾患の検知法。
【請求項３】
可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜にインテグリンβ3に対する抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ3を測定することを特徴とする請求項２記載の腎疾患の検知法。
【請求項４】
可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ3と、インテグリンβ3に対する抗体とを反応させ、抗体−インテグリンβ3−抗体の複合体の形成を検出することによりインテグリンβ3を測定することを特徴とする、請求項２記載の腎疾患の検知法。
【請求項５】
インテグリンβ3に対する抗体を含み、尿沈渣中のインテグリンβ3を測定して腎疾患を検知するための診断薬であることを特徴とする腎疾患診断薬。
【請求項６】
インテグリンβ3に対する抗体を固着させた固相体と、標識物質で標識された、又は標識されうる該抗体とを含む腎疾患診断用キット。
【請求項７】
構成試薬として尿沈渣の可溶化剤をさらに含む請求項６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腎疾患の検知法、診断薬及び診断用キットに関し、詳しくは、体液中のインテグリンβ3を測定することにより腎疾患を検知する方法に関するものである。
背景技術
腎疾患の検査法として、尿沈渣、尿蛋白等により血液成分（赤血球、白血球などの細胞および血漿蛋白）の尿への漏出の検査を基に診断がなされてきた。また、尿中のβ2-ミクログロブリン（microglobulin）とＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の濃度は、尿細管の傷害の程度を示すとされている。
さらに、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や膜性腎症においては、活性化された補体系が糸球体の上皮細胞に沈着し、糸球体を損傷すると考えられているので、尿中の補体成分の検出、あるいはその活性測定が参考とされてきた。活性化された補体系は、これを不活性化する血漿蛋白であるビトロネクチン（ＶＮ）と結合し、ＶＮ／Ｃｂ5-9複合体を形成して尿中に排出されることから、尿中のビトロネクチンを測定することも腎疾患の診断の１つの方法とされてきた。
また、ホモジナイズしたヒト正常腎組織を免疫原として作製した、尿細管内腔壁または糸球体および尿細管基底膜に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用して、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）用プレートに検体尿を加え、ついで該抗体を加えることで尿中の正常腎組織抗原を測定し、腎傷害を診断する方法が知られている（特開昭63-112994）。
ところで、インテグリンはαサブユニットとβサブユニットとが１対１で複合体を形成する細胞膜表面の接着分子であり、異なるαサブユニットとβサブユニットとの組み合わせから多種の分子が知られている。例えば、β3サブユニットに対するαサブユニットとしては、αvとαIIbの２種類が知られている。αIIbβ3複合体は、血小板に存在する主要なインテグリンであることが知られ、αvβ3複合体はビトロネクチンの受容体であることが知られ、また免疫染色によって糸球体等の組織にαvβ3複合体が多く見られることが報告されている（Nephron, 68（1994）p.87-96）。なお、腎疾患患者の尿に血小板の排出や糸球体細胞など腎由来の細胞の排出がみられることは知られているが、腎疾患患者の体液、具体的には、尿にインテグリンβ3が存在すること、および体液、具体的には、尿中のインテグリンβ3と腎疾患との関連については検討されていない。
従来の、ビトロネクチンや補体成分のような血液成分の尿中での測定は、腎全体の傷害もしくは免疫反応の関与を示唆するものであるが、腎組織内の傷害部位を同定することは困難であった。また上記の正常腎組織抗原を測定する方法では、抗体を作製する際にヒト正常腎組織を使用するため、抗原の入手が極めて困難であること、およびＥＩＡ用プレートに固着される尿中の抗原量が一定でなく、測定結果が不正確である等の欠点を有していた。さらに従来知られる方法や臨床検査では、腎疾患を詳細に確定するには不十分で、糸球体損傷あるいは腎組織損傷の確定診断を行うには腎の生検を行う必要があり、患者に苦痛を与えるものであった。
発明の開示
本発明は、上記観点からなされたものであり、腎疾患、特に糸球体の傷害の有無あるいは腎組織損傷の程度を簡便に検知することができる方法、診断薬および診断キットを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、腎疾患患者の体液、具体的には尿、より具体的には尿沈渣中にインテグリンβ3が存在することを発見し、このインテグリンβ3を簡便かつ正確に測定する方法を見いだし、本発明に至った。
すなわち本発明は、
１）体液中、好ましくは尿中、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ3を測定することを特徴とする腎疾患の検知法、
２）インテグリンβ3に対する抗体を含み、体液中、好ましくは尿中、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ3を測定して腎疾患を検知するための診断薬であることを特徴とする腎疾患診断薬、及び
３）インテグリンβ3に対する抗体を固着させた固相体と、標識物質で標識された、又は標識されうる該抗体とを含む腎疾患診断用キット、
である。
前記腎疾患の検知法において、体液中のインテグリンβ3の測定法としては、インテグリンβ3に対する抗体（インテグリンβ3と特異的に反応する抗体、以下、「抗インテグリンβ3抗体」という）を用いた抗原抗体反応によって行う方法が挙げられる。
抗原抗体反応によってインテグリンβ3を測定する具体的方法としては、例えば可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜に抗インテグリンβ3抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ3を測定する方法や、可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ3と、抗インテグリンβ3抗体とを反応させ、抗体−インテグリンβ3−抗体の複合体の形成を検出することによりインテグリンβ3を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明において腎疾患とは、腎炎や腎症（ネフローゼ）など、腎臓の糸球体等の傷害を伴う疾患をいう。このような腎疾患としては、免疫複合体などの結合や沈着によるものなど種々の原因による疾患が知られているが、具体的には、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、高血圧性腎硬化症、膜性増殖性腎炎、急性糸球体腎炎、単状糸球体硬化症、紫斑病性腎炎などが挙げられる。
なお本発明におけるインテグリンβ3という用語には、インテグリンのうちβサブユニットとしてβ3サブユニットを有する分子（αvβ3複合体、αIIbβ3複合体等）、β3サブユニット自体、およびこれらの断片等を包含する。インテグリンβ3は、腎疾患患者の尿中に排出されるが、尿蛋白の如く可溶性の形態で尿中に存在するのではなく、尿中に排出される糸球体や腎由来の細胞または細胞断片等に結合した形態で存在するものと考えられる。すなわち、腎臓の糸球体等の傷害により尿中に排出されるインテグリンβ3を、腎臓組織の傷害マーカーとして測定することにより、腎疾患を検知することができる。この腎疾患の検知には、腎疾患の有無や程度の判定の他、治療効果の評価等、予後の判定も含まれる。
本発明に使用される抗インテグリンβ3抗体としては、β3サブユニット、β3サブユニットを含むインテグリン分子（αvβ3複合体やαIIbβ3複合体等）またはこれらの断片などを認識する抗体等を挙げることができる。
なお、αvβ3複合体（糸球体由来）のβ3サブユニットとαIIbβ3複合体（血小板由来）のβ3サブユニットとを区別して測定したい場合は次の通り行えばよい。すなわちαIIbβ3複合体（血小板由来）のαIIbサブユニットに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた抗原抗体反応によってαIIbサブユニット量を測定し、血小板由来のβ3サブユニット量を求める。次いで全β3サブユニット量から血小板由来のβ3サブユニット量を差し引くことで、糸球体由来のインテグリンβ3量を求めることができる。
また、同様にαvβ3複合体を認識する抗体を用いて糸球体由来のインテグリンβ3量を測定し、次いで全β3サブユニット量から糸球体由来のインテグリンβ3量を差し引くことで、血小板由来のインテグリンβ3量を求めることができる。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の腎疾患の検知法は、体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣または可溶化した尿沈渣（以下、特に指定しないかぎり両者を合わせて「尿沈渣」という）を検体とし、検体中のインテグリンβ3を測定することにより行われる。尿沈渣中のインテグリンβ3を測定する方法としては、抗インテグリンβ3抗体を用いた抗原抗体反応によって行う方法が挙げられる。
本発明に用いる抗インテグリンβ3抗体としては、未変性もしくは可溶化によって変性したβ3サブユニット、αvβ3複合体またはαiibβ3複合体と反応性が高い抗体が好ましい。抗インテグリンβ3抗体として、例えば市販のウエスタンブロッティング用の抗インテグリンβ3抗体、例えばAnti-Human Integrin β3（クローン番号VNR3、VNR5、宝酒造（株）製）等を用いることができるが、本発明者らの作製したモノクローナル抗体（２Ｊ４０抗体、実施例参照）は、未変性のβ3サブユニットにも、またドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性されたβ3サブユニットにも反応性が高いので特に好ましい。２Ｊ４０抗体を産生するハイブリドーマ株RINSHOKEN-2J40は、平成７年８月２９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１５１３９の受託番号で寄託され、平成８年８月７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１９の受託番号で寄託されている。
また、抗インテグリンβ3抗体は、常法に従って例えば以下のように作製することも可能である。
抗原として用いる精製されたβ3サブユニットは、公知の方法で得ることができる。例えば、正常ヒト血小板を可溶化して、これをArg-Gly-Aspのアミノ酸配列を有するペプチドまたはGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド等をリガンドとするアフィニティー クロマトグラフィーによりαIIbβ3複合体を精製し、ついでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、β3サブユニットを分離精製する方法等が挙げられる。
ポリクローナル抗インテグリンβ3抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記の抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。
モノクローナル抗インテグリンβ3抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠（footpad）に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから上記抗原に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗インテグリンβ3抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗インテグリンβ3抗体を大量に製造することができる。
細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈澱およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過法および超遠心法等を挙げることができる。
なお、抗インテグリンβ3抗体は、そのまま使用することもできるが、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理して得られるＦａｂを含むフラグメントを使用することもできる。また、抗インテグリンβ3抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（例えば抗インテグリンβ3抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も本発明において用いることができる。
なお、これら抗インテグリンβ3抗体のＦａｂ部分を含むフラグメントやキメラ抗体も、本発明における「抗インテグリンβ3抗体」という用語に包含される。
上記のような抗インテグリンβ3抗体を用いた抗原抗体反応の形態は特に制限されず、通常のイムノアッセイ（免疫測定法）に用いられる測定系は種類に関わらず本発明に適用できる。測定系として具体的には、イムノブロッティング法（例えば、ウエスタンブロッティング法等）、標識化免疫測定法（例えば、ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法等）、フローサイトメトリーによる方法などが挙げられる。これらの測定法は、公知の方法［入江  實編、「続ラジオイムノアッセイ」、（株）講談社、１９７９年５月１日発行、石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」、第２版、（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行、Method in Enzymology, Vol.92（1983）, Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods,アカデミックプレス社発行  参照］に準じて実施することができる。
イムノブロッティング法、例えばウエスタンブロティング法は、体液、好ましくは尿、より好ましくは可溶化した尿沈渣を検体として電気泳動を行い、次いで電気泳動後の検体を膜に転写し、この膜に抗インテグリンβ3抗体を加え、抗原抗体反応によってインテグリンβ3を測定することによって行うことができる。電気泳動は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行うことが好ましい。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の条件および膜への転写の条件は、公知のウエスタンブロッティング法に用いられる条件に準じて当業者が適宜決定することができる。例えば、膜としてはポリビニリデンジフルオリド（polyvinylidene difluoride：ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜あるいはナイロン膜等が挙げられる。ウエスタンブロッティング法における抗原抗体反応の測定は、抗インテグリンβ3抗体を予め標識物質で標識しておき、膜とこの標識抗体をインキュベートし、膜上のインテグリンβ3に結合した標識抗体の標識物質を、該標識物質に適した方法で検出することによって行うことができる。また、未標識の抗インテグリンβ3抗体を膜とインキュベートし、インテグリンβ3と抗インテグリンβ3抗体の結合体を形成させた後に、抗インテグリンβ3抗体の調製に用いた被免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体（二次抗体）を標識物質で標識した標識化二次抗体を前記結合体に結合させ、結合体に結合した二次抗体中の標識物質を検出することによっても、抗原抗体反応を測定することができる。抗インテグリンβ3抗体としては、変性剤（例えばＳＤＳ等）で変性されたβ3サブユニットに対して反応性が高い抗体が好ましい。
標識化免疫測定法、例えばサンドイッチＥＩＡ法は、体液、好ましくは泥、より好ましくは可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ3と、抗インテグリンβ3抗体とを反応させ、サンドイッチ状複合体、すなわち抗インテグリンβ3抗体−インテグリンβ3−抗インテグリンβ3抗体の複合体の形成を検出することにより行うことができる。この複合体の形成は、複合体を形成する抗体の一方に標識抗体を用い、他方に固相体に結合もしくは結合しうる抗体を用いて、複合体中の標識物質を該標識物質に適した方法で検出することにより、検出することができる。また、複合体を形成させた後に、標識化二次抗体を複合体に結合させ、複合体に結合した標識化二次抗体の標識物質を測定することによっても、複合体の形成を検出することができる。さらに具体的にサンドイッチＥＩＡ法としては、例えば次のような方法が挙げられるが、これに限定されない。
（１）インテグリンβ3を含む可溶化した尿沈渣、標識された抗インテグリンβ3抗体、および固相体に結合しているかあるいは結合しうる抗インテグリンβ3抗体を同時に混合して反応させて、インテグリンβ3を該抗体と標識された該抗体とで挟んだサンドイッチ状複合体を形成させるか、
（２）インテグリンβ3を含む可溶化した尿沈渣と標識された抗インテグリンβ3抗体とを混合し、インテグリンβ3と標識された該抗体との結合体を形成させた後、この結合体と、抗インテグリンβ3抗体を固着した固相体とを混合して、該結合体のインテグリンβ3をさらに該固相体に固着した該抗体に結合させて、インテグリンβ3を、固相体に固着した該抗体と標識された該抗体とで挟んだサンドイッチ状複合体を形成させるか、または
（３）固相体に固着された抗インテグリンβ3抗体と、インテグリンβ3を含む可溶化した尿沈渣とを混合して、該抗体とインテグリンβ3とを結合させ、必要に応じて固相を洗浄し、さらに予め標識物質で標識された抗インテグリンβ3抗体と混合して、インテグリンβ3を、該抗体と標識された該抗体とで挟み、サンドイッチ状複合体を形成させるかした後、
固相に結合したサンドイッチ状複合体と結合しなかった該標識された抗インテグリンβ3抗体とを分離し、固相と液相のいずれかの相の標識物質を該標識物質に応じた方法（例えば酵素の場合、酵素反応による基質の変化を測定する等）で測定する方法を挙げることができる。
サンドイッチ法において抗インテグリンβ3抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、エピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体を用いるか、あるいはサンドイッチ状複合体を形成する抗体の一方にポリクローナル抗体を用いることが好ましい。
固相体としては、マイクロタイタープレート（イムノプレート）のウェル、ポリスチレンなどのボール、ラテックス粒子、試験管壁、金属コロイドなどが挙げられる。これらの固相体に抗体を固着する方法としては、物理的吸着法、共有結合法等が挙げられ、さらには包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することもできる。特に物理的吸着法は簡便であり、また抗体を固相体に固着する方法として広く用いられていることから好ましい。なお、抗体が結合していない部分は、血清アルブミン、ゼラチン、乳タンパクなどによってブロッキングしてもよい。
また、上記のサンドイッチ状複合体を固相に固着させた後、固相と液相とを分離し、液相の標識物質を測定することによっても検体試料中のインテグリンβ3を測定することができる。
また、標識物質で標識化したインテグリンβ3を、検体試料とともに固相に固着した抗インテグリンβ3抗体と混合し、固相化抗体に結合した標識物質の量を測定する、いわゆる競合法によっても、検体試料中のインテグリンβ3を測定することができる。
本発明の腎疾患の検知法においては、抗原抗体反応は上記のような固相法に限らず、固相化抗体を使用しない、いわゆる液相法で行ってもよい。すなわち、抗インテグリンβ3抗体と検体試料を混合し、さらに標識化二次抗体を加えてインテグリンβ3−抗インテグリンβ3抗体−標識化二次抗体の複合体を沈殿させ、沈殿に含まれる標識を検出する方法である。
抗体の標識に用いる標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、放射性同位元素（125Ｉ、131Ｉ、3Ｈなど）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸など）、化学発光物質（ルミノールなど）、または他の物質（ビオチン、アビジンなど）等が挙げられる。尚、固相体として金属コロイド等を用いた場合は、標識は必ずしも必要ではない。
抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法など、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座５  免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年発行参照）から適宜選択できる。
さらに、本発明の別の測定法として、可溶化していない尿沈渣に緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））等を加え浮遊液を調製し、抗インテグリンβ3抗体あるいは標識された該抗体を用いてフローサイトメトリーにより尿中のインテグリンβ3を測定する方法を挙げることができる。
一方、検体試料として尿沈渣を用いる場合、尿沈渣は、尿中に含まれる不溶物であれば特に限定されず、例えば尿中の不溶性蛋白、細胞、細胞断片等を遠心分離または限外濾過膜等によって濃縮したものが挙げられる。濃縮法としては、遠心分離が簡便であるので好ましい。遠心分離の条件としては、例えば４００×ｇ以上で５分間以上遠心する条件が例示される。
ウエスタンブロッティング法においては、通常、電気泳動に先だって、尿沈渣に界面活性剤、塩酸グアニジン、尿素等の蛋白の変性を起こす変性剤（可溶化剤）を加えて可溶化する。変性剤（可溶化剤）としては、好ましくは界面活性剤であり、さらに好ましくはイオン性界面活性剤である。イオン性界面活性剤のうちドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアルキル硫酸塩を使用する場合、その濃度としては尿沈渣に対して０．１〜５％程度が例示される。
また、標識化免疫測定法においても、尿沈渣に界面活性剤等を加えて可溶化したものが検体試料として通常用いられる。界面活性剤の種類や濃度は、抗原抗体反応に影響を与えない範囲で適宜選択することができる。界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類（Triton系界面活性剤）（トライトン（Triton）Ｘ−１００等）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類（Tween系界面活性剤）などの非イオン性界面活性剤等が例示される。
体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣中のインテグリンβ3量の定量は、既知量のインテグリンβ3を標準物質として用い、標準物質濃度と検出される標識量との関係について検量線を作成しておき、この検量線と比較することにより行うことができる。また、競合法においては、抗原抗体反応系に一定量の標準物質とともに既知量の未標識インテグリンβ3を加え、標準物質濃度と検出される標識量との関係について検量線を作成しておけばよい。
上記のようにして、抗インテグリンβ3抗体を用いて体液中のインテグリンβ3を測定することにより、腎疾患の検知を行うことができる。すなわち、抗インテグリンβ3抗体は、腎疾患の診断薬として用いることができる。また、抗インテグリンβ3抗体の他に、固相体、標識抗体、必要に応じて標識化二次抗体、標識物質を検知するための試薬、緩衝液、標識物質、インテグリンβ3標準物質、抗原抗体反応に影響を与えない可溶化剤（変性剤）などを加えて診断用キットとしてもよい。固相体は、予め抗インテグリンβ3抗体を固着させておいてもよく、かつ好ましい。このようなキットを用いると、インテグリンβ3の測定を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、調製例に記載の方法で製造した抗インテグリンβ3抗体をコーティングしたイムノプレートを用いて、各種濃度のインテグリンβ3標準液を測定した時の標準曲線を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げるが、本発明は何等これに限定されるものではない。
調製例  抗インテグリンβ3抗体の作製
モノクローナル抗インテグリンβ3抗体の作製を、Koehler.G.らの方法（Nature, 256（1975）p.495）に準じて行った。
使用可能期限をすぎた濃縮ヒト血小板浮遊液から白血球成分を除き、血小板をＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液（HEPES-Tyrode buffer）で洗浄後、２ｍＭ  Ｃａ2+、Ｍｇ2+を含む５０ｍＭ  β−オクチルグルコシドで可溶化した。超遠心後、２ｍＭ Ｍｎ2+を添加し、はじめにセファロース（Sepharose）４Ｂカラム（ファルマシア社製）でゲルろ過後、続いてアフィニティークロマトグラフィーを行なった。アフィニティーカラムには、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys（配列番号１）ペプチドをリガンドとし、このペプチドを常法によって結合させたＣＮＢｒ活性化セファロース（CNBr activated Sepharose（ファルマシア社製））を充填したカラムを用いた。
３０ｍＭ  β−オクチルグルコシドと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む溶液で十分洗浄後、１ｍＭ  Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（配列番号２）ペプチドでαIIbβ3複合体画分を溶出した。さらにこのαIIbβ3複合体画分を、セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過し、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（配列番号２）ペプチドとＭｎ2+を除き、精製されたαIIbβ3複合体を得た。なお、この複合体はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で２本のバンドとして確認された。
得られたαIIbβ3複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、αIIbサブユニットとβ3サブユニットとに分離分画し、β3サブユニットを単離した。
このβ3サブユニットを精製抗原として、アジュバントと処理した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの両後肢の足蹠に、１足当たり１００μｌを４〜５日ごとに免疫した。免疫開始３週間後、精製抗原のみを同じ部位に注射し、その３日後に膝窩リンパ節より、リンパ球を調製し、以下常法に従って、ＰＡＩ細胞（ジャパニーズ・キャンサー・リサーチ・リソース・バンクの登録番号：ＪＣＲＢ−０１１３）とポリエチレングリコールを用いて融合し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）で選択後、増殖したハイブリドーマの上清を用いてスクリーニングを行った。
ヒト血小板、およびＣ３２メラノーマ細胞（大日本製薬（株）販売；αvβ3を発現してαIIbβ3は発現していない細胞株）の浮遊液にそれぞれ最終濃度２％ＳＤＳを加えて可溶化したものを抗原するイムノブロット法によって、得られたハイブリドーマの中から、該抗原に反応性の高い抗体を産生するハイブリドーマ株を選択した。このハイブリドーマ株 RINSHOKEN-2J40は、平成７年８月２９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１５１３９の受託番号で寄託され、平成８年８月７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６１９の受託番号で寄託されている。この株が産生するモノクローナル抗インテグリンβ3抗体を２Ｊ４０抗体と命名した。このハイブリドーマ株の培養液から常法に従ってモノクローナル抗体を精製した。該抗体は、変性していないβ3サブユニットよりもＳＤＳで変性されたβ3サブユニットに対して反応が高かった。
実施例１
健常者および腎疾患患者の随時尿１０ｍｌをそれぞれ４００×ｇ（１，５００回転／分、ＫＵＢＯＴＡ製遠心機  ＫＮ−７０）で、５分間遠心し、上澄を除いた。５００μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を加えて懸濁し、１５，０００×ｇ（１５，０００回転／分、トミー精工（株）製遠心機 ＭＲＸ−１５０）で、１５分間遠心し、上澄を除去した。沈渣に４％ＳＤＳを含む可溶化溶液（トリス１．３９３ｇ、２０％ ＳＤＳ ２０ｍｌ、グリセロール２０ｍｌ、ＥＤＴＡ ０．０７４ｇを水に溶解し、１００ｍｌとした後、塩酸でｐＨ６．８に調整し、ブロモフェノールブルーを加えた溶液：以下、「可溶化溶液」と略す）４００μｌを加えて溶解（可溶化）し１００℃で５分間加熱した。得られた尿沈渣試料は測定まで−２０℃で保存し、測定時に溶解して使用した。
１レーン当たり尿沈渣試料２０μｌづつをのせ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動は、Ｒｅｓｅｐ  Ｇｅｌ（５−２０％グラジエント）（和科盛（株）製）を用い、３０ｍＡで約１時間、ブロモフェノールブルーがゲルの先端に達するまで行った。ついで、イモビロンTM（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いて、常法に従って泳動後のゲルからタンパク質を転写した。転写後の該膜にモノクローナル抗体２Ｊ４０(１：４００希釈）を加え、室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５分間、２回ついで１０分間、２回洗浄をおこなった。
この膜に、ＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）標識抗マウス抗体（１：２００希釈）を加え、室温で４５分間インキュベートし、次いで上記と同じ洗浄を行った。ＥＣＬTM試薬（アマシャム社製）を加え、２分間インキュベートした後、Ｘ線フィルム（アマシャム社製）に２分間暴露した。デンシトメータで染色された部分の黒化度を測定した。
可溶化溶液で可溶化した洗浄された血小板１０3個を試料としたときのインテグリンβ3量を、尿沈渣のインテグリンβ3の１ユニットとした。既知量の、可溶化した洗浄された血小板を用いて、デンシトメータで測定される黒化度とインテグリンβ3量との関係について調べ、０．４〜６３．０ユニットの範囲で直線に回帰された検量線を作成した。なお、インテグリンβ3量は、尿中のクレアチニン量で補正して算出した。
上記の健常者および腎疾患患者は、健常者２３例と各種腎疾患患者４８例であり、疾患の内訳は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）１９例（活動性（急性）６例、非活動性（慢性）１３例）、ＩｇＡ腎症１０例、糖尿病性腎症（ＤＭ）６例、微小変化腎症６例、膜性腎症（ＭＮ）４例、膜性増殖性腎炎（ＭＰＧＮ）１例、高血圧性腎硬化症（ＨＴＮ）２例であった。健常者は男性１３例、女性１０例で年齢は２２歳〜５９歳であった。また、各種腎疾患患者は、男性２０例、女性２８例で、年齢は２３〜６８歳であった。
結果を表１に示す。
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測定の結果、インテグリンβ3と、尿蛋白、血尿の程度、尿中β2−ミクログロブリン、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）との相関は認められなかった。
また本測定により、インテグリンβ3は健常者では尿中にはほとんど排出されないことがわかった。さらにインテグリンβ3の定量的な測定の結果では、その排出量は腎臓疾患の種類によって変動し、かつまた同一腎臓疾患群においてもその活動性によって変動が見られた。すなわち、ＳＬＥにおいて非活動性ＳＬＥに比べ活動性ＳＬＥのほうが尿中インテグリンβ3量が極めて多かった。また組織病理的に糸球体の傷害を認めなかった微小変化腎症では、尿沈渣由来のインテグリンβ3は検出されなかった。
以上のように、尿中インテグリンβ3を測定することによって、糸球体の傷害の有無およびその程度を含めて腎疾患の検出ならびにその予後を簡便に判定することが可能である。
実施例２
活動性ＳＬＥ患者の２４時間畜尿１，０００ｍｌを４００×ｇで５分間遠心し上澄を除いた。沈澱をＰＢＳ ２０ｍｌで２回洗浄し、ＰＢＳ ３ｍｌを加えて浮遊液を調製した。これに２Ｊ４０抗体、ＬＭ６０９抗体（αvβ3複合体に対するモノクローナル抗体、ケミコン（CHEMICON）社製、商品番号［ＭＡＢ１９７６］）、比較例としてＰ２抗体（αIIbβ3複合体に対するモノクローナル抗体、コスモバイオ社製）を各々加え、さらにＦＩＴＣ標識二次抗体を加え、以下常法にしたがってＦＡＣＳｃａｎ（BECTON DICKINSON社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。この結果、２Ｊ４０抗体およびＬＭ６０９抗体に対しては尿沈渣の細胞等は陽性に染色され、インテグリンβ3が検出されたが、Ｐ２抗体には陰性であり、血小板由来のαIIbβ3複合体は検出されなかった。
実施例３
調製例に記載された方法で作製した抗インテグリンβ3抗体（２Ｊ４０抗体）をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、二価イオン不含）（以下、ＰＢＳ（−）と略す）で20mg/mlに希釈し、この溶液の50μｌ（1μg／ウエル）ずつをイムノプレート（商品名マキシソープ、ヌンク社製）の各ウエルに加え、４℃で１６時間保存することにより、均一にコーティングした。
次いで、このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウエルの抗インテグリンβ3抗体が被覆されていない部分を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。
次いで、このプレートを洗浄液（0.05％トゥイーン20を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄し、抗インテグリンβ3抗体が固着されたイムノプレートを作製した。
抗インテグリンβ3抗体が固着されたイムノプレートに、各濃度のインテグリンβ3標準液（0.4、0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50および100ng/ml）をそれぞれ50μlずつ添加し、３７℃で１時間静置して反応させた。なお、インテグリンβ3標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）（以下、「反応希釈液」という）を用いた。
この後、このプレートを前記洗浄液にて３回洗浄し、１ウエルあたり、0.7μg/mlのビオチン標識抗インテグリンβ3抗体25μl及び5000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（生化学工業株式会社販売）25μlを添加し、３７℃で１時間静置して反応させた。更に、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（モス社製、以下ＴＭＢと略す）を50μl加え、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。
発色後、プレートに１ＭのＨＣｌを50μl加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長４５０ｎｍの吸光度（対照波長６３０ｎｍ）をウェルリーダー（生化学工業株式会社販売）にて測定した。得られた結果を図１に示す。
この結果から、抗インテグリンβ3抗体を固着させた固相体（ここではマイクロタイタープレートを用いているが、これに限定されるものではない）を用いたELISA法によっても尿中のインテグリンβ3の定量が可能であることが示唆された。またこの結果から、ELISA法による尿中のインテグリンβ3定量時の検量線の作成が可能であることが示された。
同様の方法で、体液、好ましくは尿、より好ましくは尿沈渣、極めて好ましくは可溶化剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ系やＴｗｅｅｎ系界面活性剤）により可溶化した尿沈渣中のインテグリンβ3を測定することにより、腎疾患の検知をすることができる。
産業上の利用性
本発明の診断薬、診断キットおよび測定法によれば、腎疾患、特に糸球体の傷害の有無および程度を簡便に検出することができる。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：
(ii)発明の名称：
(iii)配列数：
(iv)連絡先：
(A)宛名：
(B)番地：
(C)市  ：
(D)州  ：
(E)国  ：
(F)ZIP：
(v)コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PC 互換
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
(vi)現行出現データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人／事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミリ番号：
(2)配列番号１の配列の情報:
(i)配列の性質:
(A)配列の長さ:７ amino acids
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列: SEQ ID No:1:
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(2)配列番号２の配列の情報:
(i)配列の性質:
(A)配列の長さ:６ amino acids
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列: SEQ ID No:2:
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【図１】
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