(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリの形質転換体をβ-アラニンの存在下で培養し、培養液中にD-パントテン酸又はその塩を生産させ、且つ蓄積させ、これを採取することを特徴とするD-パントテン酸又はその塩の製造方法であって、前記形質転換体が、
(a)パントテン酸生合成遺伝子とilvGM遺伝子とを有するDNAを含むプラスミド、又は、
(b)パントテン酸生合成遺伝子を有するDNAを含むプラスミドと、ilvGM遺伝子を有するDNAを含むプラスミド、
で形質転換され、その親株と比較して、パントテン酸生合成経路及びバリン生合成経路の双方の活性が増強されているものである、前記方法。
【請求項２】
(a)パントテン酸生合成遺伝子とilvGM遺伝子とを有するDNAを含むプラスミド、又は、
(b)パントテン酸生合成遺伝子を有するDNAを含むプラスミドと、ilvGM遺伝子を有するDNAを含むプラスミド、
で形質転換されたエシェリヒア・コリの形質転換体であって、その親株と比較して、パントテン酸生合成経路及びバリン生合成経路の双方の活性が増強されており、且つβ-アラニンの存在下でパントテン酸を生産することができる、前記形質転換体。
【請求項３】
エシェリヒア・コリFV5069/pFV202(FERM BP-5227)である、請求項２記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤ−パント酸および／またはＤ−パントテン酸またはそれらの塩の新規な製造法に関する。パントテン酸はビタミンとして有用な物質であり、Ｄ−パント酸はパントテン酸やＣoＡの重要な合成中間体として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−パントテン酸はビタミンとして有用な物質であるが、従来の製造法としては(１)ＤＬ−パントラクトンを光学分割してＤ−パントラクトンと、β−アラニンまたはその塩をメタノール中で化学的に縮合させる方法や、(２)微生物あるいは酵素を用いてＤ−パントテン酸エステルを加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法や、ＤＬ−パントテン酸エステルのＤ−体のみを選択的に加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法(特開平１−２２８４８７号、特開平１−２２８４８８号)、(３)微生物の休止菌体またはその酵素にＤ−パント酸カリウム塩とβ−アラニンとＡＴＰをトリス緩衝液中で接触させて得る方法[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊournal  of  Ｂiological  Ｃhemistry)、第１９８巻２３頁(１９５２)と第１７６回アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・ナショナル・ミーティング要旨集(Ａbstracts  of  Ｐapers  １７６th  Ａmerican  Ｃhemical  Ｓociety  Ｎational  Ｍeeting)、マイクロバイアル・アンド、バイオケミカル・テクノロジー部門(Ｄivision  of  Ｍicrobial  and  Ｂiochemical  Ｔechnology)、４８番(１９７８)などに記載]、(４)特定の微生物をＤＬ−パント酸とβ−アラニンの存在下で培養し、Ｄ−パント酸を特異的にβ−アラニンと縮合させることによってＤ−パントテン酸を得る方法(特開平５−２３１９１号)、(５)特定の微生物をβ−アラニンの存在下で培養し、Ｄ−パントテン酸を得る方法(特開平６−２６１７７２号)などが知られている。
【０００３】
Ｄ−パント酸および／またはＤ−パントラクトンの製造法としては、(６)化学的に合成されたＤＬ−パントラクトンをキニーネ、ブルシンなどの分割剤を使用して光学分割する方法、(７)特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンのみを分解し、Ｄ−パントラクトンのみを取得する方法、(８)特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンのみを酸化してケトパントラクトンに導き、さらにこのものを不斉還元することによってＤ−パントラクトンを得る方法、(特開昭４７−１９７４５号)、(９)化学的に合成されたケトパントラクトンを特定の微生物を用いて不斉還元し、Ｄ−パントラクトンを得る方法(特公昭６１−１４７９７号)、(１０)特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パントラクトンを得る方法(特開昭５７−１５２８９５号および特開昭６２−２９４０９２号)、(１１)特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＤ−パントラクトンを選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パント酸を得る方法(特公平３−６５１９８号)、(１２)特定の微生物を培養し、グルコースからＤ−パント酸を生合成させることによって得る方法(特開平６−２６１７７２号)などが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
工業的にＤ−パントテン酸(以下、その塩も含む)を製造するに当たり、(１)の方法は主原料となるＤＬ−パントラクトンの合成に煩雑なる工程を要するのみならず、その光学分割には煩雑かつ困難な工程を伴っている。(２)の方法はＤＬ−パントラクトンからＤ−パントテン酸エステルやＤＬ−パントテン酸エステルを製造する工程を要するという欠点がある。(３)の方法は高価なＡＴＰやトリス緩衝液を使用する点で不利であり、生成したパントテン酸の量も微量でしかも高価なＤ−パント酸を原料として用いた場合実用的でない。(４)の方法は他の方法に比べてシンプルな製造法であるが、ＤＬ−パント酸製造工程やラセミ化工程が必要である。(５)の方法は(４)の方法をさらにシンプルにしたものであるが、パントテン酸の生合成経路の上流に位置するバリン生合成経路の活性が培養後期には消失し、パントテン酸生成はバリンの枯渇に伴い止まってしまうため、蓄積量に限界がある。
【０００５】
また、Ｄ−パント酸および／またはＤ−パントラクトンの製造法のほとんどは合成に煩雑な工程を要するＤＬ−パントラクトンを出発原料としている欠点を有するのみならず、(６)の方法は高価な分割剤を使用し、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でないなどの欠点を有し、(７)の方法はＤＬ−パントラクトンの半分量が損失量となるという欠点を有している。(８)、(９)、(１０)、(１１)の方法は使用する微生物の性質上、あるいはパントラクトン(またはパント酸)の性質上、培養液中に光学純度１００％でＤ−体のみを製造するのは非常に困難である。また、(６)、(１０)、(１１)の方法は残ったＬ−体を回収、再利用することを前提としているため、さらに煩雑な工程が増えることになる。また、(１２)の方法はＤ−パントテン酸製造法での(５)と同様に、Ｄ−パント酸蓄積量はバリン生合成活性に依存している。
【０００６】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは、Ｄ−パントテン酸の工業的に有利な、より効率的な製造法につき鋭意検討した結果、微生物をβ−アラニンを添加した培地にて培養し、Ｄ−パントテン酸を蓄積させる方法において分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子の組み込まれたプラスミドを用いて形質転換せしめた菌株が培地中にＤ−パントテン酸またはＤ−パント酸(および／またはＤ−パントラクトン)を、さらに高濃度蓄積することを見出した。本プラスミド導入により、培養前半でのバリン生成活性が向上し、中後期にかけてその活性がさらに持続する。その結果パントテン酸生成もさらに長時間持続し、最終蓄積量の増大が得られた。
【０００７】
すなわち本発明は、
（Ｉ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パント酸またはその塩の製造法、
（ＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生物をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ−パントテン酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の製造法、
（ＩＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パント酸またはその塩の製造法、
（ＩＶ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)を有するプラスミドおよび分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生物をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ−パントテン酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の製造法、
（Ｖ）１）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドまたは
２）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換されたパント酸生産能またはβ−アラニン存在下でパントテン酸生産能を有する微生物、および
（ＶＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドに関する。
本発明により(５)、(１２)で問題となっていたバリン生産性が高まり、より高濃度のパントテン酸の蓄積が可能となる。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸およびβ−アラニンは、その塩であってもよく、本明細書の記載において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸およびβ−アラニンと称する場合、遊離体のみならずその塩も含む。Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸、β−アラニンの塩としてはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩が挙げられる。いずれも、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【０００９】
本発明者らは、エシェリヒア属等の微生物を用いて糖類などの炭素源から、直接発酵法により、さらに効率的かつ経済的にＤ−パント酸を製造する方法を開発すべく研究を行った結果、パントテン酸生合成経路のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路を、遺伝子組み換え技術を用いて強化した微生物の中に大量のＤ−パント酸を生産する能力を有する菌株があることを見いだし、さらにこの様な微生物を炭素源を含む培地中でβ−アラニンと接触させることによって大量のＤ−パントテン酸を蓄積せしめることが可能であることを見いだした。すなわち、本発明におけるＤ−パント酸およびＤ−パントテン酸合成法は、１)微生物の有するパント酸およびパントテン酸合成能を利用し、グルコースなどの種々の炭素源からＤ−パント酸を生合成せしめ、これを培地中に蓄積させるか、２)培地中にβ−アラニンを添加する等してβ−アラニンと微生物とを接触させることにより、β−アラニンと、生合成されたＤ−パント酸とを微生物によって縮合せしめることによりＤ−パントテン酸を蓄積させるものであり、パントテン酸生合成経路のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路を遺伝子組み換え技術を用いて強化することにより、さらに高濃度のＤ−パント酸、Ｄ−パントテン酸を蓄積させるものである。
【００１０】
本発明に用いられる微生物としては、β−アラニンの存在下でＤ−パントテン酸合成能を有する微生物や、Ｄ−パント酸合成能を有する微生物をそれぞれ用いることができる。とりわけ、実用面からエンテロバクテリアシー科の微生物が好適であり、例えば、シトロバクター属、シゲラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、サルモネラ属およびエシェリヒア属に属する菌が挙げられる。本発明に用いられるより好ましい菌株の具体例としては、エシェリヒア属菌が挙げられ、その具体例としては、エシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７など財団法人発酵研究所の「リスト・オブ・カルチャーズ(Ｌist  of  Ｃultures)、第８版、１９８８」に掲載されているようなエシェリヒア・コリの公知菌株およびこれらに由来する菌株が挙げられる。具体的には、エシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７よりサリチル酸耐性、α−ケトイソ吉草酸耐性、α−ケト酪酸耐性、β−ヒドロキシアスパラギン酸耐性、o−メチルスレオニン耐性を付与することによって得られたＦＶ５０６９株、パントテン酸生合成遺伝子領域またはその一部および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはその一部を組み込んだプラスミドpＦＶ２０２で形質転換したエシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２７）などが挙げられる。
【００１１】
分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子を含む遺伝子断片の調製法としては、例えば、エイチ・サイトーおよびケイ・ミウラ、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Ｈ．Ｓaito  and  Ｋ．Ｍiura  Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta)の方法またはそれに準ずる方法等の公知方法によりまず、供与菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いで、これを制限酵素ＨindIIIを用いて切断する方法などが挙げられる。次に、この様にして得られた染色体ＤＮＡ断片はベクターＤＮＡに挿入される。本発明に使用されるベクターＤＮＡは、受容菌で増殖しうるものの中から適宜選択しうる。受容菌で増殖可能なプラスミドとしては、例えば、pＳＣ１０１[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，Ｕ.Ｓ.Ａ.)、７０、３２４０(１９７３)]、pＵＣ１８[ジーン(Ｇene)、３３、１０３(１９８５)]などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、新たに分離されたり、合成されたりしたベクターＤＮＡであっても本発明の目的を達成しうるものであれば用いることができる。これらのプラスミド・ベクターに遺伝子断片を挿入するには、ティー・マニアティスら「モレキュラー・クローニング」(Ｔ．Ｍaniatis  et  al.，Ｍolecular  Ｃloning  Ａ  Ｌaboratory  Ｍannual，Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌaboratory、東大出版会、１９８２年)などに記載された公知の方法またはそれに準じた方法に従い行うことができる。遺伝子断片を挿入したプラスミドを受容菌へ導入する場合には例えば[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.)、５３、１５９(１９７２)]などに記載されている様な公知の形質転換法またはそれに準じた方法が使用できる。該受容菌の具体例としては、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.)、１６６(１９８３)]などの公知菌株が挙げられる。
【００１２】
形質転換株の中から分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子が挿入されているプラスミドが導入された菌株を選択するには、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ. coli）Ｋ−１２株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子の配列の一部をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションなどの方法によって選択すればよい。このようにして得られた分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡは、その保有株から抽出し、他の受容菌に導入したり、あるいは抽出されたプラスミドＤＮＡから分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製後、これを他のベクターに連結して用いることができる。
【００１３】
この様にして得られた形質転換株の例として、エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株(ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２７、ＩＦＯ  １５８５７)が挙げられる。pＦＶ２０２はエシェリヒア・コリＦＶ５２５株由来のパントテン酸生合成遺伝子およびエシェリヒア・コリＦＶ５０６９株由来の分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺伝子)を導入したプラスミドであり、エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２７）はpＦＶ２０２をエシェリヒア・コリＦＶ５０６９株に導入した株である。なお、本明細書においてＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番５号）への寄託番号を、また、ＦＥＲＭ  ＢＰ−番号はブタペスト条約の下での工業技術院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東１丁目１番３号)への寄託番号を表し、特に、エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株は、平成７年９月７日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２７で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１４】
以上の様にして得られた菌株を培養するには、通常の振とう培養法(回転振とう培養法)、静置培養法あるいは通気撹拌培養法などにより連続的あるいは間欠的に行うことができる。用いる培地は使用する微生物の生育しうる通常の組成のものでよく、炭素源には炭水化物、油脂、脂肪酸、有機酸またはアルコール類の中から資化しうるものを適宜選択し、単独または混合して使用される。また、窒素源には、例えば、ペプトン、大豆粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、尿素などの有機窒素源の他に、硫安、塩安、硝安、リン安などの無機窒素源が必要に応じて適宜混合してまたは単独で用いられる。また、リン源としてリン酸１カリウム、リン酸２カリウムを用いるのが好都合である。培地には、炭素源、窒素源、リン源の他に、生育に必要な金属塩(例、硫酸マグネシウム)、アミノ酸、ビタミンなどの生育必須因子や生育促進物質を添加しても良い。培養中のpＨの管理の目的で塩基性物質、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸カルシウムなどを適宜添加することができ、また、泡の管理のため、消泡剤の添加も有効である。これらは、培養途上に適宜添加してもよい。さらに環境を好気状態にする目的で酸素を通気するのも有効である。培養の温度は通常１５℃から４５℃、好ましくは２５℃から４０℃で培養するのが有利である。また、培養の時間はパントテン酸および／またはパント酸の蓄積量が最大になるまで行われるが、通常、６時間から１２０時間の培養で目的を達することができる。本発明によりＤ−パントテン酸を製造する際に、原料物質であるβ−アラニンを当該菌体に接触させる方法として菌株の培養開始前や培養途上の適当な時期に原料物質を添加する方法、あるいは菌体処理物に原料物質を添加する方法を用いることができる。菌体処理物とは、菌を培養して得られる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー、ポリアクリルアミドゲルまたはk−カラギーナン包括固定化菌体などをいう。原料物質は、水などの適当な溶剤の溶液または懸濁液として、あるいは粉末状として、一時的あるいは一定時間にわたり連続的にまたは間欠的に添加される。
【００１５】
添加するβ−アラニンの濃度としては、培地に添加する場合、微生物の生産能力に応じて添加するのが好ましいが、経済性を考慮すれば、通常、０.１〜６w／v％、より好ましくは０.５〜４w／v％の濃度で添加するのが良い。
上記のような培養物あるいは反応物からＤ−パントテン酸またはその塩を単離する場合の採取方法は、慣用方法に従って行うことができる。例えば、培養液から菌体を除いた後、イオン交換樹脂処理、活性炭・合成吸着剤などを用いる吸着処理、濃縮処理、晶析処理などの公知操作を単独または適宜組み合わせてＤ−パントテン酸またはその塩を単離することができる。なお、晶析方法は、特公昭４０−２３３０号に記載の方法に準ずれば、濾過が容易な結晶が高収率で得ることができ、工業的生産に有利である。この晶析方法に従えば、パントテン酸カルシウム１モルに対しメタノール４モルと水１モルを含む溶媒水和物(パントテン酸カルシウム・４メタノール・１水塩)が晶析結晶として得られ、乾燥することで結晶中のメタノールおよび水は結晶中から除去することができ、結果としてパントテン酸カルシウムが得られることが、エム・イナガキ（Ｍ．Ｉnagaki）らの報告(ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレチン(Ｃhem．Ｐharm．Ｂull.)，２４，３０９７−３１０２(１９７６))に記載されている。
【００１６】
例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウムは、以下の方法によって培養液から単離することができる。パントテン酸またはその塩を含有する培養液から菌体を除いた液を、カチオンを除去する目的でカチオン交換樹脂(例えば、ダイヤイオンＰＫ−２１６(Ｈ型)、ＰＫ−２２８(Ｈ型)(三菱化成製）)のカラムに通し、次に無機アニオンおよびパントテン酸より酸性度の強い有機酸を除去する目的でアニオン交換樹脂(例えば、ＰＡ−４１２(ＯＨ型)、ＷＡ−３０(ＯＨ型)(三菱化成製）)のカラムに通す。この遊離体のパントテン酸を含むカラム通過処理液(pＨ約２.６)に水酸化カルシウムを添加し、pＨを約５.０に調整した後、パントテン酸として約２５％(w／v)になるまで濃縮する。次に、この濃縮液に水酸化カルシウムを添加し、pＨを約７.０に調整した後、活性炭(例えば、白鷺Ａ(武田薬品製))を添加し脱色処理を行う。活性炭を濾過により除去した後、パントテン酸カルシウムとして約４５％から５５％(w／w)になるように濃縮し、次にメタノールを適当量添加し、この液の水分含有率が５％から１５％になるようにする。次にこの液を２℃付近にまで冷却し、種晶を添加し、パントテン酸カルシウムの溶媒水和物の結晶を晶出させる。この結晶を分離、乾燥することにより、高純度のＤ−パントテン酸カルシウムを高収率で得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明の内容をより具体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内容を例示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。なお、Ｄ−パントテン酸の定量は高速液体クロマトグラフィー法[カラム：島津ＳＣＲ１０１Ｈ(７.９mmＩ.Ｄ.×３０cm；移動相：０.００８Ｎ硫酸；流量：０.８ml／min.；検出：示差屈折計]および／または微生物学的定量法(Ｂioassay)[被検菌：ラクトバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus  plantarum)ＩＦＯ３０７０；培地：市販パントテン酸定量用培地(ＤＩＦＣＯ製)]で行った。さらに、培養液中のバリンの定量は高速液体クロマトグラフィー法[カラム：三菱化成ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＲＳ １０Ｗ(４.６mmＩ.Ｄ.×５cm；移動相：１mＭ−ＣuＳＯ4／ＣＨ3ＣＮ＝７／１；流量：０.７ml／min.；検出：ＵＶフォトメーター]で行った。
【００１８】
実施例１
(１)染色体ＤＮＡの調製
エシェリヒア・コリＦＶ５０６９を１リットルのＬ培地(バクトトリプトン１.０％、酵母エキス０.５％、塩化ナトリウム０.５％)に接種し、３７℃で一夜培養し、得られた菌体からフェノールを用いるサイトー等の方法(バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Ｂiochim.Ｂiophys.Ａcta.)７２,６１９(１９６３))によって最終３.３mgの染色体ＤＮＡを得た。
(２)染色体ＤＮＡのベクタープラスミドpＵＣ１８への挿入
上記(１)項で得た染色体ＤＮＡ１０μgとpＵＣ１８(ニッポンジーン製)を制限酵素ＨindIII(ニッポンジーン製)を用いてそれぞれ切断した後、両者を混合してＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ(ニッポンジーン製)によって連結させた。
(３)染色体ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの選択
上記(２)で得られた各種プラスミドの混合物をエシェリヒア・コリＪＭ１０９株にコンピテント・セル法を用いて形質転換した。次にこの形質転換株を含む懸濁液をアンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／ml、ＩＰＴＧを０.５mＭ、Ｘ−galを１００μg／ml含むＬ寒天培地の平板培地上に塗布して３７℃にて１夜培養した。得られたコロニーのうち白色のものを染色体ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの形質転換体として選択した。
【００１９】
(４)プローブの調製
ローサー等により決定されたＥ.coli  Ｋ−１２株ilvＧ遺伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩラージサブユニット遺伝子、ヌクリーク・アシッド・リサーチ（Nucleic  Ａcids  Ｒesearch）２１３７、１５(１９８７))内約６００bpの配列をＰＣＲ法を用いて増幅した。これを、ランダムプライム法を用いて32Ｐでラベルし、プローブとして用いた。
(５)アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺伝子のクローニング
アンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／mlを含んだＬ寒天平板培地上にナイロンメンブレンを置き、その上に上記(３)で得た白色コロニーをストリークし、３７℃で１夜培養した。このメンブレンをアルカリ処理した後中和し、さらに８０℃、２時間ベーキングして菌体内ＤＮＡをメンブレンに固定した。このメンブレンを(４)のプローブを用いてハイブリダイゼーション反応に供した結果、他より明らかに強力にシグナルを発するコロニーを一株得た。
【００２０】
(６)サザンハイブリダイゼーション法による確認
上記コロニーよりプラスミド１０μgを抽出し、ＨindIIIで切断後、電気泳動し、サザンハイブリダイゼーション法で挿入断片の解析を行った。その結果、この断片は４.７kbの長さを有しており(Ｋ−１２のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺伝子を含むＨindIII断片の長さも４.７kb)、また(４)で取得したプローブと強くハイブリダイズした。
(７)発現プラスミドの構築
上記４.７kb挿入断片をプラスミドベクターpＭＷ１１８のＨindIIIサイトに挿入した後、さらにＥcoＲＩサイトにエシェリヒア・コリＦＶ５２５のパントテン酸生合成遺伝子２.５kbを挿入し、pＦＶ２０２と命名した。これを用いてパントテン酸生産株ＦＶ５０６９を形質転換してＦＶ５０６９／pＦＶ２０２と命名し、本菌株とパントテン酸生合成遺伝子のみを挿入したpＦＶ３１形質転換株ＦＶ５０６９／pＦＶ３１およびプラスミドを持たない親株（宿主）であるＦＶ５０６９についてアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ活性を比較した。
【００２１】
(８)形質転換株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性の測定
被検菌を生産培地(Ａ)で約４８時間培養した菌体から超音波処理により溶菌液を調製し、これを２０,０００rpm、１時間遠心して上清を得た。この上清を粗酵素液として用い、ジャクソン等の方法(Ｍethods  Ｅnzymol.１９８８)に従い、生成アセト乳酸をアセトインに変換した後、２−ナフトールで発色させて波長５３０nmで定量した。
表１にその測定結果を示す。
表１の結果から、pＦＶ２０２に挿入された４.７kbのＨindIII断片にアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩをコードするilvＧＭ遺伝子が含まれていることが明らかである。
【００２２】
【表１】
0004020991.tif 000002
【００２３】
(９)ilvＧＭを含む４.７kb断片の制限酵素地図
pＦＶ２０２内に挿入された４.７kbのＤＮＡ断片中にはＰstＩサイト、ＳalＩサイトおよびＰvuＩＩサイトがそれぞれ１個ずつ存在する。これらの簡単な制限酵素地図を図１に示す。
【００２４】
実施例２
表２に示す組成の液体培地を、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌し、２００ml三角フラスコに２０mlずつ分注した。ここに、斜面培地から実施例１の(７)で得られたエシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２７）、ＦＶ５０６９／pＦＶ３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３９５）をそれぞれ１白金耳量接種し、３０℃で２０時間、２２０rpmで回転振とう培養した。このシード培養物１mlを表２に示す組成の培地２０mlに移植し、２００ml容ひだ付き三角フラスコ中で３８℃にて７２時間振とう培養した。培養中、表３に示す要領で各種物質を添加した。
培養終了時のパントテン酸生成量（PaA）およびバリン量（Val）を表４に示す。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
【表３】
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【００２７】
【表４】
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【００２８】
【発明の効果】
本発明のＤ−パント酸、Ｄ−パントテン酸（またはその塩）の製造法は、パント酸、パントテン酸の生合成経路の上流に位置するバリン生合成経路の活性を向上させてバリン生産性を高め、より高濃度のパント酸、パントテン酸の蓄積を可能とするため、工業的に有利で効率的な製造法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  pＦＶ２０２に挿入された４.７kbのＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図１】
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