(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１塩基置換の検出方法であって、
１）１塩基置換部位を含む検体ＤＮＡと、
前記検体ＤＮＡに含まれる配列に相補的な配列を有し、且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基の種類毎に異なる波長を生ずる標識物質が付された複数種類のＤＮＡプローブと、
をハイブリダイズすることと；
２）１）で得られた一部が二重鎖であるＤＮＡ鎖に校正機能を有する核酸合成酵素を反応することと；および
３）２）の反応において、複数の経過時点での前記標識物質の微小運動を光学的に測定することと；
を具備する検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記微小運動が共焦点顕微鏡の共焦点領域に出入りする微小運動である検出方法。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記標識物質が発光性物質および蛍光性物質からなる群より選択される物質である検出方法。
【請求項４】
請求項２に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記標識物質の微小運動を光学的に測定する手段が、該蛍光標識物質分子のブラウン運動を蛍光相関分光法により測定すること手段である検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単一塩基多型(即ち、ＳＮＰｓ)の検出方法に関し、詳しくは、ＤＮＡにおける１塩基置換を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単一塩基多型(Single Nucleotide Polymorpism：以下、ＳＮＰｓと称する)は、塩基配列中の１塩基が置換されていることにより多型性を示す現象を示す。近年、このような１塩基置換の検出が、疾患関連遺伝子の探索や病気の遺伝子診断において重要な意味を有することが明らかになってきた。
【０００３】
現在では、１塩基置換を検出する方法として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＰおよびＰＣＲ−ＳＳＯ等が主に使用されている。これらの方法は、生じたＰＣＲ産物を電気泳動によって検出するか、または、９６ウェルプレート上に固相したプローブ配列とのハイブリダイゼーション反応を実施することにより検出を行なう方法である。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、夫々、多型的部位を特異的に増幅するプライマー(sequence-specific-primer)試薬を用いて行なう方法である。この方法は、ＳＮＰｓの判定に頻繁に用いられているが、増幅後、電気泳動で増副産物の存在を確認する必要がある。
【０００４】
また、所謂、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイ等を応用したＶＤＡ(High-Density variant detection arrays)技術によるＳＮＰｓの検出も試みられている(Science vol280,15,May 1998)。例えば、ＤＮＡアレイの応用技術である、ＶＤＡ技術では、多数のプローブＤＮＡを高密度に固相基板上に配列し、検体ＤＮＡと固相表面でハイブリダイズする方法である。この方法は、固相表面と検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションであるため効率が悪く、長い反応時間を必要とする。更に、一塩基置換ではそのＴｍ値が殆ど変化しないため、高感度にミスマッチを検出することは不可能である。
【０００５】
以上のように、従来使用される何れの方法も煩雑であり、且つ多量のサンプルを必要とするものであり、その実施には長時間を必要とするものである。また更に、従来の方法により得られる検出結果の精度は、実際に臨床的に用いるには不十分である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、高感度且つ高精度な１塩基置換の検出を簡便に行なうことのできる１塩基置換検出方法を提供することである。また、Ｂ／Ｆ分離、ＰＣＲおよび電気泳動等を必要としない、簡便な１塩基置換検出方法を提供することである。更に、本発明の目的は、少量の検体および試薬を用い、所望に応じて複数の多型部位を同時に検出することが可能な１塩基置換検出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１塩基置換検出方法であって、
１）１塩基置換部位を含む検体ＤＮＡ断片と、
前記検体ＤＮＡ断片に含まれると予期される配列に相補的な配列を有し、且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基に標識物質が付された少なくとも１種類のＤＮＡプローブと、
をハイブリダイズすることと；および
２）前記ハイブリダイズの進行中において、複数の経過時点で前記標識物質の位置変化を光学的に測定することと；
を具備する検出方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡにおける１塩基置換を検出するための方法である。本発明の方法は、大きく分けて２工程、即ち、反応工程と測定工程とからなる。
【０００９】
前記反応工程は、以下に詳述する通り、検体ＤＮＡと、標識したＤＮＡプローブとをハイブリダイゼーションすることと、得られた二重鎖を校正機能を有する酵素で処理することとを具備する工程である。
【００１０】
一方、前記測定工程は、以下に上述する通り、前記反応工程の反応系で生じた分子の自由な微小運動を測定する工程である。
【００１１】
１．反応工程
以下、本発明の反応工程を図１から３を用いて説明する。しかしながら、これは例示であり、本発明を何ら制限するものではない。
【００１２】
（１）検体ＤＮＡ
図１に、本発明の検体ＤＮＡの１例を模式的に示した。ここでは、検体ＤＮＡが、２つの多型、即ち、多型Ｉと多型ＩＩで存在する場合を例に説明する。多型Ｉと多型ＩＩは、１塩基置換部位を除く他の部分の塩基配列は相同である。また、多型Ｉの１塩基置換部位は、アデニン［以下、塩基（Ａ）またはＡと称し、図中ではＡと示す］であり、多型ＩＩの１塩基置換部位は、グアニン［以下、塩基（Ｇ）またはＧと称し、図中ではＧと示す］とする。
【００１３】
（２）標識ＤＮＡプローブ
次に、図１に示した１塩基置換部位を検出するためのプローブを図２に示す。プローブＩは、多型Ｉの３’末端から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からなり、且つプローブＩの３’末端の塩基（即ち、１塩基置換部位の塩基と対をなす塩基）には、標識物質が付与されている。この例では、プローブＩの３’末端は標識されたチミン［以下、塩基（Ｔ）またはＴと称し、図中ではＴと示す］である。
【００１４】
同様に、プローブＩＩは多型ＩＩの３’末端から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からなり、且つプローブＩＩの３’末端の塩基には標識物質が付与されている。この例では、プローブＩＩの３’末端は標識されたシトシン［以下、塩基（Ｃ）またはＣと称し、図中ではＣと示す］である。
【００１５】
（３）反応工程
本発明の最も簡単な例である第１の態様として、試料中に含まれる検体ＤＮＡが、多型Ｉであるのか、または多型ＩＩであるのかを検出する例を、図３および４に例示し、シュミレートする。また、ここでは試料中に多型Ｉが含まれているとする。
【００１６】
夫々のプローブを２つの容器に添加して試料と反応させる。図３は、容器Ｉで進行する反応を示す。即ち、図３の容器Ｉでは、多型ＩとプローブＩを適切な条件下でハイブリダイズする。それにより、多型ＩとプローブＩは完全マッチする。一方、図４は、容器ＩＩにおいて進行する反応を示す。即ち、図４の容器ＩＩでは、多型ＩとプローブＩＩを適切な条件下でハイブリダイズする。それにより、１塩基置換部位でミスマッチが生じる。
【００１７】
続いて、前記完全マッチの二重鎖とミスマッチの二重鎖に対して、夫々、校正機能を有したＤＮＡポリメラーゼを添加する（図３および４）。その結果、完全マッチの二重鎖に対し、前記ポリメラーゼは活性（即ち、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性）を示さない（図３）。それに対して、前記ポリメラーゼは、多型ＩとプローブＩＩからなる二重鎖の３’末のミスマッチを認識し、ミスマッチの塩基を削除する（図４）。このような酵素活性により、多型ＩにミスマッチしたプローブＩＩの３’末の標識された塩基（Ｃ）が遊離する（図４）。
【００１８】
上述のような反応により得られる標識された分子の自由な微小運動を、後述する測定工程手段により測定する。標識分子の自由な微小運動は、該標識分子の大きさに依存して変化する。従って、標識物質を使用にし、該分子の微小運動を測定することにより標識分子についての情報を得ることが可能である。
【００１９】
（４）用語
ここで使用する「１塩基置換部位」の語は、単一塩基多型間で存在する異なる１塩基の存在する部位または塩基自身を示す。本発明の検出方法では、１つの検体ＤＮＡの配列中に、１塩基置換部位が１つ存在しても、また、それ以上で存在しても測定することが可能である。複数の１塩基置換部位を検出する場合には、複数種類の標識物質を使用することが有利である。
【００２０】
ここで使用する「校正機能を有する核酸合成酵素」の語は、一部分が二重鎖になった塩基配列の３’末のミスマッチを認識し、その塩基を削除し、且つ適切な条件下で核酸を合成して二重鎖を合成する活性を有する酵素をいう。本発明の方法で使用可能な酵素の例は、校正機能を有する核酸合成酵素であり、好ましい酵素の例は、宝酒造により販売されるＥｘ・ＴａｑまたはＬＡ・Ｔａｑ等であるが、これに限られるものではない。
【００２１】
ここで使用する「標識物質」の語は、異なる測定時点において、略一定の出力を維持するような標識材料を示す。例えば、発光性物質、蛍光物質、磁性物質および放射性物質等である。なお、該標識物質は、後述する測定工程で使用する手段に適切な標識物質を選択するべきである。
【００２２】
ここで使用する「自由な微小運動」または「微小運動」とは、ブラウン運動等をいう。
【００２３】
（５）反応工程の他の態様
本発明の検出方法に具備される反応工程の最も簡単な１例は、上述した通りであるが、種々の変更および修飾を行なうことが可能である。例えば、複数の標識物質を用いてもよい。また、標識物質によるプローブの標識は、プローブの３’末だけではなく５’末に対して行なってもよい。また、複数のプローブを１つの容器内で試料に混合して反応を行なうことも可能である。
【００２４】
また、校正機能を有する核酸合成酵素によるミスマッチの認識および切断の後で、該切断部から３’末端方向に塩基配列を延伸することも可能である。その場合、適切な条件を設定し、且つ更に必要な基質および試薬等を更に供給してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する）等によって行なってもよい。しかしながら、該延伸を必ずしも行なう必要はない。
【００２５】
また、上述した反応を行なう前に、ＰＣＲで試料に含有される多型を増幅することも可能である。
【００２６】
２．測定工程
（１）測定原理
上述の反応工程で得られた標識分子の検出は、後述する工程により実施する。本発明の検出方法に具備される測定工程は、前記標識分子を微小視野において顕微鏡的に測定することと、複数の測定データを時間変化のばらつきに応じた統計学的データに変換することと、統計学的データに基づいてハイブリダイゼーション反応の反応曲線を得ることとを具備する。ここで、反応曲線の立ち上がりの高さが核酸分子の個数を表している。
【００２７】
本発明の測定工程が、３次元の微小視野内において実行されることにより、標的分子の試料含有液の中における自由な微小運動を高精度に測定できる。ここで、この測定工程を２次元的な視野内で測定することにより実施した場合、ブラウン運動のように、標識分子の３次元的に自由な移動を漏れなく捕えることができないため測定精度が低くなり、好ましくない。
【００２８】
測定工程の微小視野が共焦点光学系により形成されることにより、被写界深度の深い測定データが得られるので、個々の任意の標識分子が視野内で常に合焦して、正確な位置および出力データを測定手段に供給することができる。
【００２９】
微小視野が、焦点付近の回折限定領域であることにより、個々の標識分子を高いＳ／Ｎ比で測定できる。
【００３０】
回折限定が平均直径１５±５μｍのピンホールにより形成されることにより、少数の選ばれた標識分子からの測定データを高率良く得ることができる。
【００３１】
微小領域が平均半径２００±５０ｎｍおよび光軸上の平均長さ２０００±５００ｎｍの略円柱状領域であることにより、測定視野内に照準された標識分子に関する自由な微小運動を効率良く取得することができる。
【００３２】
本発明の測定工程では、微小の測定視野内を出入りする標識分子の運動速度を、所定空間内において１以上の個々の標識分子から測定される出力強度の増減または消出を指標として測定している。従って、プローブを標識する標識分子の種類は、複数の測定時点において、略一定の出力を維持するような標識材料であるのが好ましい。このような標識分子の材料としては、発光性物質、蛍光性物質、磁性物質および放射性物質等が挙げられる。特に、発光性物質と蛍光物質は、長時間、発光または蛍光を発するような色素を選ぶことが好ましい。標識分子として、発光色素や蛍光色素を有するものを使用すれば、光学的に容易な構成で分子レベルの測定を実施できる。蛍光色素の中では、特に、核酸分子同士の相補的な結合の際に、その相補的結合部分にインターカレートすることによって遊離時とは蛍光特性が変化するものも使用することが可能である。インターカレートに伴ない蛍光特性が変化する蛍光色素としては、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等がある。
【００３３】
測定工程が、蛍光分子の位置変化を測定する場合には、フォトマルチプライヤやフォトダイオード等の蛍光測定手段により蛍光データを受光することができる。蛍光測定手段は、単一フォトンを計測し得るような測定モードを備えている方が、蛍光分子に関する個別の測定を実施するのに有利である。
【００３４】
本測定工程では、標識分子の液対中の揺らぎ運動を測定することにより、標的分子の微小運動を正確に測定することができる。揺らぎ運動の測定を行なうに当たっては、自己相関関数（Autocorrelation function）を用いて演算することが好ましい。特に、標識分子として、蛍光を用いる場合には、自己相関蛍光分光法（Fluoresence Correlation Spectroscopy、以下、ＦＣＳと略する）を採用することが好ましい。
【００３５】
ＦＣＳを用いた生物学的材料に関する測定データの演算手法は、標識された核酸プローブと標的核酸分子とのハイブリダイゼーション反応においてＦＣＳを利用した報告（Dinji,M.,Rigler,R.,Nucleic Acids Research,23,1795-1799,1995 ）を参照することができる。自己相関蛍光分光法および測定データの演算については、更に後段で記述する。
【００３６】
ＦＣＳを用いた測定では、非常に小さな試料体積に含まれる蛍光粒子の数や拡散定数を、略実時間で、分離過程を経ずに求めることが可能である。即ち、Ｂ／Ｆ分離が不要であり、測定に係る時間を短縮することが可能である。また、溶液系で測定することが可能であるため、測定時間を短縮することが可能である。更に、生体分子を自然な状態で測定することが可能である。
【００３７】
（２）測定装置
以下、図５を用いて、ＦＣＳを用いた測定に使用する測定装置について説明する。図５に示したＦＣＳ装置は、共焦点光学系を用いた倒立型の蛍光顕微鏡１と試料からの蛍光を測定するためのフォトマルチプライヤ２と測定データを受信して自己相関関数による演算を行なって数値化またはグラフ化を行なうデータ処理装置３と、演算結果を画面上に表示する表示装置４とを備えている。
【００３８】
試料含有液１１は、図５に示す通り、試料台１２に載せたスライドガラス１３上に点着させることで簡単にセットできる。この装置では、特に、微量の試料含有液１１を用いるため、水分の蒸発を防止するための蓋１４をスライドガラス１３上にかぶせてある。この蓋１４は、好ましくは光透過性が低いものを用いる。これにより気密性と遮光性を同時に得られる。但し、蓋の内面は、励起光線の反射を防止するように、できるだけ光射性の低いものを使用することが好ましい。試料含有液１１が位置するスライドガラス１３部分の真下には、試料含有液１１中で焦点を結ぶように設定した対物レンズ１５が配置される。なお、蛍光顕微鏡１は落射型でもよい。落射型においては、対物レンズ１５のレンズ下面に直接的に試料含有液１１を点着してもよい。また、蛍光顕微鏡１の光源であるレーザ発生装置１６は、図５では、アルゴン（Ａｒ）イオンレーザを使用しているが、蛍光の種類に応じて、クリプトンアルゴン（Ｋｒ−Ａｒ）イオンレーザ、ヘリウムネオン（Ｈｅ−Ｎｅ）レーザ、ヘリウムカドニウム（Ｈｅ−Ｃｄ）レーザ等に種々変更してもよい。また、蛍光顕微鏡１におけるスライドガラス１３の搬入や搬出、スライドガラス１３等への試料含有液の点着、蓋１４の開閉等の各種動作は、必要に応じて適宜自動化してもよい。
【００３９】
図６は、図５の蛍光顕微鏡１の測定部分を示す拡大図である。図６（Ａ）において、スライドガラス１３と所定の開口数（図ではＦＡ＝１．２）の対物レンズ１５との位置関係により、微小視野領域２０が形成される。この微小視野領域２０は、図６（Ｂ）に示すように、実際には、ボリュームを持ったレーザ光線の焦点（図では、中間のくびれた部分）から上下に伸びた略円柱状の視野を有している。この視野領域２０は、焦点を基準位置として、光軸上の長さＺと平均半径Ｙにより規定される。このような、微小領域２０における蛍光測定は、蛍光分子の微小運動を追跡し得る最小の領域にまで小さくすることにより、試料含有液１１の中の焦点付近以外の蛍光分子に由来するノイズを有効に除去し、１個ずつの蛍光分子を正確に測定することを可能にする。
【００４０】
図６に示す通りの長さＬおよび幅Ｗの共焦点顕微鏡の共焦点領域に出入りする蛍光分子の蛍光強度を１分子レベルで捕えると、蛍光強度に揺らぎが検出される。この蛍光強度の揺らぎのデータを自己相関関数で変換し、統計学的データを得ることにより、蛍光分子の分子数および大きさが、分子を分離することなく検出することが可能となる。上述の装置により測定したデータをグラフとして図７に示した。図７のグラフは、縦軸に蛍光強度Ｉ(t)を、横軸は時間(t)を示す。このデータを以下のような自己相関関数で変換すると図８のグラフが得られる。
【００４１】
自己相関関数は、
Ｇ（τ）：Ｇ（τ）＝〈Ｉ（ｔ）Ｉ（ｔ＋τ）〉であり、
これを平均強度〈Ｉ〉の２乗で規格化し展開すると、
【００４２】
【化１】
0003910000.tif 000002
【００４３】
と近似できる。このとき、τ＝０のときＣ（０）＝１＋１／Ｎ、Ｄ＝拡散定数、Ｎ＝溶液中の分子数である。
【００４４】
３．他の好ましい実施の態様
上述した第１の実施の態様と同様に、しかし、プローブの３’末の塩基分子に付与する標識物質として、プローブの種類毎に、各々蛍光波長の異なる標識物質を付加する。このようなプローブを検体ＤＮＡと混合し、第１の実施の形態と同様にハイブリダイズをし、該酵素により、ミスマッチを起こした塩基の削除を行なう。続いて実施するＦＣＳによる検出の際に、異なる波長により、それぞれ解析を行なえば、どのプローブが完全マッチであるかが明確に分り、それと同時にその３’末の塩基の種別が識別され、何れの多型であるかが分る。その結果、より確実に１塩基置換を検出できる。また、異種蛍光を利用する場合には、励起光の波長を変えることにより、または検出部にフィルターを用いることにより検出光の波長を変えることが可能である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の１塩基置換検出方法は、簡便且つ短時間で実施することが可能である。この効果は、本発明の独創的な原理に基づく。即ち、本発明は、目的とする検出を、夫々の多型性に特異的なプローブに標識を付して使用して検体ＤＮＡと反応することによって、この反応を分子レベルで捉える。このとき、複数の経過時点で標識物質を測定し、その時間的な位置変化を検出することによって、分子の大きさに依存して変化する位置変化を定量的に検出することが可能になる。従って、従来方法に必要であったＢ／Ｆ分離等の工程や、酵素標識試薬の場合の基質反応等、およびＲＩ標識試薬を用いた場合の放射性感応フィルムへの暴露、並びにＰＣＲおよび電気泳動工程等が不要である。
【００４６】
具体的には、従来の方法では、ＰＣＲが必須であり、また、電気泳動を行なった際に明確な結果を得るためには、その伸長する長さも２００から３００ｂまで行なうことが好ましいとされている。しかしながら、本発明では、電気泳動を必要としないのでＰＣＲを行なう必要はない。しかしながら、より確実性を求めて、ＰＣＲを行なう場合であっても、１０から３０ｂの伸長によって充分に確実なデータを得ることが可能である。
【００４７】
本発明の検出方法は、検体量および試薬量とも非常に少量のみを用いて実施することが可能である。具体的には、検体として用いる試料はフェムトリットル（ｆＬ）レベルで充分である。即ち、これは、上述した通り、本発明の方法における、発光信号の検出領域が、半径２００ｎｍおよび軸長２０００ｎｍの微量領域であるためである。これにより、本検出は、極小型の容器で多数の検体を同時に測定することが可能であり、検査に要する検体量および酵素試薬等の検出に必要な試薬を低減することが可能である。
【００４８】
また、本発明の方法は、同一容器内で異なる多型部位に特異性を有する複数の試薬を混合し、同時に検体に対して処理することが可能である。従って、検体ＤＮＡの必要量の低減、および反応容器数の低減が可能である。また、多型遺伝子検査の検査工程の簡便化が可能である。更に、本検出方法は、少なくともＤＮＡ検体と試薬の混合のみで実施することが可能であるため、全自動のシステム化も可能である。
【００４９】
本発明の検出方法は、高感度に１塩基置換を検出することが可能である。また本方法は、バッググラウンドの影響が少ないホモジニアス系であるため、判定精度が高い。これは本発明の検出原理に基づくものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法で検出する検体ＤＮＡの１例を模式的に示す図。
【図２】本発明の方法で使用するプローブの好ましい１例を模式的に示す図。
【図３】本発明の検出方法を示すスキーム図。
【図４】本発明の検出方法を示すスキーム図。
【図５】本発明の検出方法に用いる装置の好ましい態様を示す図。
【図６】本発明の検出方法に用いる蛍光顕微鏡の測定部分を示す図。
【図７】本発明の検出方法で得られる蛍光強度の時間的変化のデータを示すグラフ。
【図８】図７のデータを自己相関関数で変換した統計学的データを示すグラフ。
【符号の説明】
１．蛍光顕微鏡    ２．フォトマルチプライヤ    ３．データ処理装置
４．表示装置    １１．試料含有液    １２．試料台    １３．スライドガラス１４．蓋    １５．対物レンズ    １６．レーザ発生装置
【図１】
0003910000.tif 000003
【図２】
0003910000.tif 000004
【図３】
0003910000.tif 000005
【図４】
0003910000.tif 000006
【図５】
0003910000.tif 000007
【図６】
0003910000.tif 000008
【図７】
0003910000.tif 000009
【図８】
0003910000.tif 000010