(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物。
0004008491.tif 000026
式中、ｍ＝１、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基、もしくはエーテル含有アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ4はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項２】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000027
式中、ｎ＝０〜１０、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項３】
Ｒ3が炭素数１乃至１０個のアルキル基である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3がメチル基である請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000028
式中、ｎ＝０、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ5は炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項６】
ｎが０〜３であり、Ｒ1が炭素数１乃至１０個のアルキル基であり、Ｒ3が炭素数１乃至１０個アルキル基であり、Ｒ5が炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ｎが０〜３であり、Ｒ1がメチル基であり、Ｒ3がメチル基であり、Ｒ5がメチル基である請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000029
式中、ｎ＝０、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ5は炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、Ｒ6は炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項９】
Ｒ3が炭素数１乃至１０個のアルキル基であり、Ｒ5が炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、Ｒ6が炭素数１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ3がメチル基であり、Ｒ5がメチル基であり、Ｒ6がメチル基である請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000030
式中、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項１２】
Ｘ-がハロゲン化物である請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000031
式中、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項１４】
Ｘ-がハロゲン化物である請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000032
式中、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項１６】
Ｘ-がハロゲン化物である請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000033
式中、ｎ＝０、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項１８】
Ｒ1が炭素数１乃至１０個のアルキル基であり、Ｒ3が炭素数１乃至１０個のアルキル基である請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ1がメチル基であり、Ｒ3がメチル基である請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000034
式中、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項２１】
Ｒが−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3である請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘ-がハロゲン化物である請求項２０又は２１に記載の化合物。
【請求項２３】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物。
0004008491.tif 000035
【請求項２４】
ヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２、３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウムの名称を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ4がヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキルもしくはアルケニル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ5がメチル基であり、Ｒ6がメチル基である、請求項８に記載の化合物。
【請求項２７】
ａ）生物活性種、脂質、及び請求項１乃至２６のいずれか一項に記載の化合物を含む脂質小胞を形成する工程と、
ｂ）前記脂質小胞を生物活性種と複合させる工程と、
ｃ）前記脂質小胞とトランスフェクションされるべき細胞とを接触させる工程と、
を含む、生物活性種で細胞をインビトロでトランスフェクションする方法。
【請求項２８】
ａ）生物活性種、脂質、及び請求項１乃至２６のいずれか一項に記載の化合物を含む脂質小胞を形成する工程と、
ｂ）前記脂質小胞を生物活性種と複合させる工程と、
ｃ）前記脂質小胞とトランスフェクションされるべき細胞とを接触させる工程と、
を含む、生物活性種で培養細胞をトランスフェクションさせる方法。
【請求項２９】
ａ）前記化合物が次の構造を有する請求項２７又は２８に記載の方法。
0004008491.tif 000036
式中、ｍ＝１、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基、又はエーテル含有アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ4はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項３０】
生物活性種で細胞をトランスフェクションするための薬学的に許容可能な組成物を製造するための、請求項１乃至２６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３１】
前記化合物が、次の構造を有する請求項３０に記載の使用。
0004008491.tif 000037
式中、ｍ＝１、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ4はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【請求項３２】
生物活性種で細胞をトランスフェクションするための試薬を製造するための、請求項１乃至２６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３３】
前記化合物が、次の構造を有する請求項３２に記載の使用。
0004008491.tif 000038
式中、ｍ＝１、Ｒ1はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキルもしくはアルケニル基であり、Ｒ4はアルキル基、アルケニル基、又はヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はアニオンである。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
．発明の分野
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、製薬物質及び他の生物活性種を、膜障壁を通して結合及び輸送するカチオン脂質が提供される。更に詳細には、選択された分子種と錯体をつくり、膜及び同等の境界構造内へ並びに膜及び同等の境界構造を通してこれらの選択された種が促進輸送されるのを容易にする対称性ジアミンカチオン脂質が開示される。
２．背景技術の説明
遺伝子治療及び同様の目的のために細胞のトランスフェクション方法が設計及び実行されてきたが、これらの手順の多くは組換えウイルスベクターを必要とし、これらのウイルス遺伝子転移システムでは種々の問題が存在する。大抵のヒトはベクターとして選択されているものを含むアデノウイルス血清型の多くに対して抗体を有するので、一般的に有利なアデノウイルス技法でさえも困難に遭遇する。アデノウイルスベクターで治療された患者の野性型アデノウイルス重感染は、結果的に、（稀な血清型を有するように選択されれば）意図しない多くの個体を感染させる能力を持った欠陥ウイルス粒子として組換えベクターを増殖させることになる。アデノウイルス汚染の機会はかなり低いが、あり得ないことではない。これらの遺伝物質をヒトに使用することの安全性は不明瞭であり、従って危険である。
トランスフェクション又は遺伝子治療のために安全な非ウイルス性ベクター法が不可欠である。ＤＮＡ、タンパク質及び他の化学物質を膜境界を横切って輸送するためのこのような安全な脂質輸送系は、研究グループ及び企業実体によって少しは合成されている。合成機構の大部分は比較的複雑で、限られたトランスフェクション能力だけを有する輸送体を発生する。カチオン脂質輸送体の分野では、生体高分子輸送効率の高いカチオン種が必要とされる。第４級アンモニウム誘導（カチオン）リポソームがＤＮＡと自然会合し、細胞膜と融合し、ＤＮＡを細胞質内へ輸送することはしばらくの間知られている。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）はカチオンリポソーム製剤開発の第１世代を代表する。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮは、第４級アンモニウム含有化合物ＤＯＴＭＡとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの１：１混合物を小さい単ラメラ小胞（ＳＶ）内へ水中で音波処理して構成される。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮに関する１つの問題は、非代謝性エーテル結合を含むことである。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮに関する他の問題は、タンパク質キナーゼＣ活性の抑制及び直接的な細胞毒性である。これらの問題に応えて、多数の他の関連化合物が開発された。本発明のジアミン化合物は現行のカチオン輸送体能力に改良が加えられており、生物活性化学薬品のための非常に効率的な輸送手段として役立つ。
上述のように、種々のカチオン脂質が先行の参考文献で合成されている。例えば、米国特許第４、８１２、４４９号は、影響を受けないことが所望される環境よりは目標の場所における生物活性試薬のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化合物構築を開示する。いくつかのチャージされた及びチャージされないアミン誘導体が記載される。
米国特許第５、１７１、６７８号には、真核細胞をトランスフェクションするためのリポポリアミン及びその使用が紹介されている。ポリヌクレオチドは当該リポポリアミンと混合され、処理されるべき細胞と接触される。
米国特許第５、１８６、９２３号及び同第５、２７７、８９７号は、膜内電位の低下によって親油性カチオン有機金属化合物の細胞集積を高めることに関する。テクネチウム含有化合物が開示される。
米国特許第５、２０８、０３６号では親油性カチオン化合物が提供される。不斉アミン化合物が合成され、ＤＮＡトランスフェクションのための方法で使用される。
米国特許第５、２６４、６１８号は、生物活性分子の細胞内輸送のためのカチオン脂質を開示する。膜包囲系内へ分子を輸送するために不斉アンモニウム含有カチオン脂質が提供される。
中性脂質及びカチオン脂質による核酸の動物細胞内へのトランスフェクションは米国特許第５、２７９、８３３号に示される。核酸トランスフェクション活性を有するリポソームは、中性脂質及びアンモニウム塩含有カチオン脂質から形成される。
米国特許第５、３３４、７６１号には、他のアミン含有カチオン脂質が報告される。カチオン脂質は、高分子及び他の化合物を細胞内へ輸送する集合体を形成するために利用される。
上記特許は出願人が気づいている当該技術の状態を反映するものであり、本出願の審査で関連する情報の開示において出願人に認められた正当であることの義務を果たす目的で提供される。しかしながら、これらの特許はどれも、単独又は組み合わせて考慮された場合に、出願人の請求する発明を教示又は明らかにするものでないことは慎んで具申される。
発明の概要
本発明の目的は、膜構造を通る生物活性化合物の促進輸送を非常に容易にするジアミンのカテゴリーを開示することである。
本発明のもう１つの目的は、選択された高分子及び他の物質を膜障壁内へ及び膜障壁を通過して輸送することを促進する対称性ジアミンカチオン化合物群を提供することである。
本発明の更なる目的は、対称性ポリヒドロキシル含有ジアミンコア構造へ結合された容易に可変的な脂質成分を有する生物活性分子輸送体の集合を示すことである。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド等の化合物を膜壁内へ及び膜壁を越えて輸送することを容易にする新規なジアミンカチオン輸送体分子が開示される。一般的に関連されるのは、アルキル鎖、アルケニル鎖、及びアルキル又はアルケニル含有アシル鎖より成る群から選択される少なくとも一対の同一リポイル部分を有し、ポリヒドロキシル化又は別の方法で第４級化された対称構造のカチオンジアミンである。更に詳細には、次の構造を有する化合物である。
0004008491.tif 000002
ここでｍ＝１〜１０であり、Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ4は水素、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基、もしくはエーテル含有基であり、Ｘ-はアニオンである。
特に、好ましい組成は、その結合親和性を考慮してＰｏｌｙＧｕｍ（ポリガム）の俗称が与えられるヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウム、ＰｏｌｙＧｕｍのＯ−アルキル化誘導体、ヨウ化Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウム、及びヨウ化Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウムのＯ−アルキル化誘導体である。これらは好ましい組成ではあるが、Ｒ2基の長さ及び二重結合特性（以下に詳細に述べられる）並びにＲ2基中のカルボニルの存在又は不在は可変的である。
本発明の他の目的、利点及び新規な特徴は、対応の図面と共に考慮されて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、無血清環境でＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションする場合に、ＤＮＡのみと比較して、ＤＮＡと共に使用されるＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍの５．０：５０混合物の有効性を証明するグラフである。
図２は、リポソーム構造（ＳＶ型対ＭＬＶ型）がＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション効率に影響することを説明するグラフである。
図３は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＰｏｌｙＧｕｍ（ＭＬＶ）媒介トランスフェクションに対する血清の影響を示すグラフである。
図４は、１０％の子牛血清が存在する場合及び血清が無い場合に、ホスフェチジルエタノールアミン（ＰＥ）誘導体及びＰｏｌｙＧｕｍの５０：５０混合物を用いるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションに対するホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）側鎖構造の影響を示すグラフである。
図５は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の無血清トランスフェクションにおいて、ＰｏｌｙＧｕｍ（ＳＶ）に対するＤＯＰＥのモル比の最適化を示すグラフである。
図６は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の無血清トランスフェクションにおいて、ＤＮＡに対するＰｏｌｙＧｕｍ（ＳＶ）のチャージ比の最適化を説明するグラフである。
図７は、ＤＵ−１４５細胞の無血清トランスフェクションにおいて利用されるカチオン脂質の効率比較を示すグラフである。
図８は、２％ＦＢＳの存在下でのＤＵ−１４５細胞のトランスフェクションにおいて利用されるカチオン脂質の効率比較を示すグラフである。
図９は、ＰｏｌｙＧｕｍ及びＰｏｌｙＧｕｍメトキシ誘導体の疎水性及び極性領域トランスフェクション分析を示すグラフである。
好ましい実施例の説明
以下の開示及び図１〜図９に提供されるデータをここで参照して、アルキル鎖、アルケニル鎖、及びアルキル又はアルケニル含有アシル鎖より成る群から選択される少なくとも一対の同一リポイル部分を有する対称性カチオンジアミンの好ましい実施例が説明される。
一般的に、ジアミンはポリヒドロキシル化されており、次の一般構造を有する。
0004008491.tif 000003
ここで、ｍ＝１〜１０、好ましくは１である。Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ4は水素、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基、もしくはエーテル含有基であり、Ｘ-はアニオンである。ｍが１より大きい余分のメチレン数は、記載される当該合成経路を補足する標準手順によって導入される。
更に詳細には、１つの好ましい構造は次の通りである。
0004008491.tif 000004
ここで、化合物Ａでは、ｎ＝０〜１０、通常は０〜３であり、好ましくは１である。Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、一般的に１乃至１０個の炭素を有し、好ましくは１個の炭素を有する。Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基である。Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、炭素が１乃至１０個のアルキル基であることが多く、好ましくはメチル基である。Ｘ-はアニオンであり、通常はハロゲン化物、好ましくはヨウ化物である。
第２の好ましい構造は次の通りである。
0004008491.tif 000005
ここで、化合物Ｂでは、ｎ＝０〜１０、通常は０〜３であり、好ましくは１である。Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基である。Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、炭素が１乃至１０個のアルキル基であることが多く、好ましくはメチル基である。Ｘ-はアニオンであり、通常はハロゲン化物、好ましくはヨウ化物である。
第３の好ましい構造は次の通りである。
0004008491.tif 000006
ここで、化合物Ｃでは、ｎ＝０〜１０、通常は０〜３であり、好ましくは１である。Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、一般的に１乃至１０個の炭素を有し、好ましくは１個の炭素を有する。Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基である。Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、炭素が１乃至１０個のアルキル基であることが多く、好ましくはメチル基である。Ｒ5は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｘ-はアニオンであり、通常はハロゲン化物、好ましくはヨウ化物である。
第４の好ましい構造は次の通りである。
0004008491.tif 000007
ここで、化合物Ｄでは、ｎ＝０〜１０、通常は０〜３であり、好ましくは１である。Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基である。Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、炭素が１乃至１０個のアルキル基であることが多く、好ましくはメチル基である。Ｒ5は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｒ6は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｘ-はアニオンであり、通常はハロゲン化物、好ましくはヨウ化物である。
当該化合物の議論を容易にするために、略語、俗称又は頭字語の一覧表は次の通りである。
0004008491.tif 000008
0004008491.tif 000009
当該化合物を合成する他の可能な方法もあり得るが、カチオンジアミン化合物のための好ましく且つ一般的な合成機構は次の通りである。
0004008491.tif 000010
ここで、ｎ＝１〜１０であり、Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はハロゲン化物である。
化合物Ａの一般合成機構において、第１段階は、無水エタノール中で過塩素酸リチウムの存在下、第３（ｔ−）ブチルジフェニルシリロキシ誘導物質（ヒドロキシエチル出発物質とＣｌＳｉＰｈ2 ｔＢｕの反応によって製造される）を１，３−ブタンジエポキシドと反応させることを意味する。第２段階は、ハロゲン化アルキル又はアルケニル、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシルのハロゲン化物との反応である。第３段階は、フッ化テトラブチルアンモニウム及びＴＨＦで開始される第３（ｔ−）ブチルジフェニルシリロキシ保護基の除去であり、一般的前駆体化合物を生成する。次に、一般的前駆体化合物は、選択されたアルキル、アルケニル、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニルのハロゲン化物と反応させられる。
0004008491.tif 000011
ここで、ｎ＝１〜１０であり、Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｘ-はハロゲン化物である。
化合物Ｂの一般合成機構において、第１段階は、無水エタノール中で過塩素酸リチウムの存在下、第３（ｔ−）ブチルジフェニルシリロキシ誘導物質（ジヒドロキシエチル出発物質とＣｌＳｉＰｈ2 ｔＢｕの反応によって製造される）を１，３−ブタンジエポキシドと反応させることを意味する。第２段階は、ハロゲン化アルキル又はアルケニル、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシルのハロゲン化物との反応である。第３段階は、フッ化テトラブチルアンモニウム及びＴＨＦで開始される第３（ｔ−）ブチルジフェニルシリロキシ保護基の除去であり、一般的前駆体化合物を生成する。次に、一般的前駆体化合物は、選択されたアルキル、アルケニル、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニルのハロゲン化物と反応させられる。
0004008491.tif 000012
ここで、ｎ＝１〜１０であり、Ｒ1は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基である。Ｒ5は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｘ-はハロゲン化物である。
化合物Ｃの一般合成機構において、第１段階は、無水エタノール中で過塩素酸リチウムの存在下、エーテル含有出発物質を１，３−ブタンジエポキシドと反応させることを意味する。第２段階は、ハロゲン化アルキル又はアルケニル、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシルのハロゲン化物との反応である。次に、一般的前駆体化合物は、選択されたアルキル、アルケニル、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニルのハロゲン化物と反応させられる。
0004008491.tif 000013
ここで、ｎ＝１〜１０であり、Ｒ2はアルキル基、アルケニル基、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシル基であり、Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニル基である。Ｒ5は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｒ6は炭素が１乃至１０個のアルキル又はアルケニル基であり、好ましくはメチル基である。Ｘ-はハロゲン化物である。
化合物Ｄの一般合成機構において、第１段階は、無水エタノール中で過塩素酸リチウムの存在下、ジエーテル含有出発物質を１，３−ブタンジエポキシドと反応させることを意味する。第２段階は、ハロゲン化アルキル又はアルケニル、もしくはアルキル又はアルケニル含有アシルのハロゲン化物との反応である。次に、一般的前駆体化合物は、選択されたアルキル、アルケニル、もしくはヒドロキシル化アルキル又はアルケニルのハロゲン化物と反応させられる。
好ましい当該化合物は次の構造を有する。
0004008491.tif 000014
ここで、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、好ましくは−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ3、又は−（ＣＨ2）10ＣＨ3である。Ｘ-はアニオンであり、好ましくはヨウ化物等のハロゲン化物である。
本発明の更に好ましい化合物Ａ種は、ヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウム（ＰｏｌｙＧｕｍ）の名称を有し、以下の構造を有する。
0004008491.tif 000015
好ましい化合物の合成機構は次の通りである。
0004008491.tif 000016
第２の好ましい組成は次の構造を有する。
0004008491.tif 000017
ここで、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、好ましくは−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ3、又は−（ＣＨ2）10ＣＨ3である。Ｘ-はアニオンであり、好ましくはヨウ化物等のハロゲン化物である。
特に、本発明の１つの化合物Ｂ種はヨウ化Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウムの名称を有し、以下の構造を有する。
0004008491.tif 000018
一般的に好ましい化合物Ｂ種の合成機構は次の通りである。
0004008491.tif 000019
第３の好ましい組成は次の構造を有する。
0004008491.tif 000020
ここで、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、好ましくは−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ3、又は−（ＣＨ2）10ＣＨ3である。Ｘ-はアニオンであり、好ましくはヨウ化物等のハロゲン化物である。
特に、本発明の１つの好ましい化合物Ｃ種はヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−メトキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウムの名称を有し、以下の構造を有する。
0004008491.tif 000021
一般的に好ましい化合物Ｃ種の合成機構は次の通りである。
0004008491.tif 000022
第４の好ましい組成は次の構造を有する。
0004008491.tif 000023
ここで、Ｒはアルキル又はアルケニル基であり、好ましくは−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3、−（ＣＨ2）14ＣＨ3、−（ＣＨ2）12ＣＨ3、又は−（ＣＨ2）10ＣＨ3である。Ｘ-はアニオンであり、好ましくはヨウ化物等のハロゲン化物である。
本発明の更に好ましい第４の化合物Ｄ種はヨウ化Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（２−メトキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウムの名称を有し、以下の構造を有する。
0004008491.tif 000024
一般的に好ましい化合物Ｄ種の合成機構は次の通りである。
0004008491.tif 000025
疎水性領域の変化に対する論理的説明
好ましい化合物ＰｏｌｙＧｕｍに見られるように、長い脂質テール（尾）は両方共オレオイル基であるが、他の脂質テールも容認することができ、本発明の開示の範囲内である。親水性領域（ＰｏｌｙＧｕｍに存在する極性ヘッド（頭）基成分）としてＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム基〔（ＣＨ3）2（ＨＯＣＨ2ＣＨ2−）Ｎ+−Ｒ〕を含み、疎水性領域を構成するために種々の脂肪酸の組合せを含むカチオン脂質に関する研究（バラスブラマニアム，Ｒ．Ｐ．、ベネット，Ｍ．Ｊ．、グルーナート，Ｄ．、マローン，Ｒ．Ｗ．、及びナンツ，Ｍ．Ｈ．「呼吸上皮細胞ＤＮＡトランスフェクションに対するカチオン脂質の疎水性領域の影響」原稿準備中、ここに参照によって組み込まれる）では、疎水性領域組成の微妙な変化は、哺乳動物細胞へのポリヌクレオチド輸送（トランスフェクション）の媒介物質としてのこれらの脂質の性能に影響することが示されている。しかしながら、全ての例において、カチオン脂質はポリヌクレオチドトランスフェクションのための試薬として活性を示した。従って、脂肪酸側鎖の種々の組合せはカチオン脂質の全体構造の類似の変化だけを示し、それぞれの場合に、カチオン脂質はトランスフェクション活性を証明する傾向がある。
疎水性領域の変化を含むＤＯＨＭＥ（モノアンモニウムヘッド基を含むカチオン非対称性脂質）の誘導体化は、すべての誘導体がトランスフェクション活性を示すがその量が変わるという発見を導いた。類推によると、ＰｏｌｙＧｕｍの疎水性領域の変化はトランスフェクション活性を有する新しい脂質となるであろう。更に、この予想は、一定の極性ヘッド基に対する疎水性領域の変化が様々な程度のトランスフェクション活性を示す化合物を与えることを証明する最近の文献の研究（フェルナー，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．バイオロジカルケミストリ１９９４，２６９，２５５０）によって支持される。
トランスフェクション又は膜浸透は、当該ジアミンを種々のリポソーム／ＤＮＡ複合体中へ組み込み、トランスフェクションを開始するのに所望される条件下に細胞をさらすことによって証明される。図１に示されるように、ルシフェラーゼ発光により決定される有効性（ルシフェラーゼプラスミドｐＣＭＶＬは、以下に示すように、トランスフェクションレベルを検出するために標準方法で利用された）では、無血清の５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍＳＶは、ＤＮＡのみの場合と比較して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＤＮＡトランスフェクションを非常に効率的に媒介した。
トランスフェクション小胞の構造上の特徴はトランスフェクション効率に影響を及ぼす。図２は、５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍ調合物ではＳＶが更により有能なトランスフェクションキャリヤであることを明確に示す。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＰｏｌｙＧｕｍ（ＭＬＶ）媒介トランスフェクションに対する血清の影響は図３に示される。これらのトランスフェクション条件下において、無血清条件では、１０％の子牛の血清が存在する場合よりもトランスフェクションの大幅な増大が見られる。他のトランスフェクション条件下では、血清トランスフェクションについて変化はほとんど気づかれなかった。
図４は、小胞を発生するために利用されるホスファチジルエタノールアミンの側鎖特性によって、血清のある場合とない場合とで細胞のトランスフェクションがどのように影響されるかをはっきりと証明する。無血清トランスフェクションでは５０：５０のＰｏｌｙＧｕｍ：ＤＯＰＥ混合物が優れているが、血清が加えられた場合には５０：５０のＰｏｌｙＧｕｍ：ＤＭＰＥ混合物が勝っている。
ＳＶ中のＤＯＰＥ対ＰｏｌｙＧｕｍのモル比が増大するにつれて（図５参照）、トランスフェクション効率はほぼ直線的に低下する。
ＰｏｌｙＧｕｍ含有ＳＶについて、図６はＤＮＡチャージ比の最適化データを示す。与えられた範囲では、明らかに、２：１のＰｏｌｙＧｕｍ：ＤＮＡリン酸塩の比率がトランスフェクションを最大にする。
図７及び図８に示されるように、２％ＦＢＳの存在は、無血清条件と比較して、種々の混合物のトランスフェクションレベルを変える。血清がない場合、脂質対ＤＮＡリン酸塩比が２：１では、５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍ（ＳＶ）混合物が最もトランスフェクションについて効率的である。血清のある場合では、２：１の比率において５０：５０のＤＯＰＥ：ＰＯＨＭＥ（ＭＬＶ）混合物が最も効率的であるが、５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍ種はトランスフェクション効率が２番目に高い。血清のある比率４：１では、５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍ（ＳＶ）混合物が再度最も効率的なトランスフェクション試薬であり、ＭＬＶ５０：５０のＤＯＰＥ：ＰｏｌｙＧｕｍ組成物が２番目である。明らかに、ＰｏｌｙＧｕｍ試薬は細胞をトランスフェクションさせるための有用な試薬である。
図９は、疎水性側鎖の型が変更されたメトキシＰｏｌｙＧｕｍ誘導体のための最適化データを提供する。ＤＰ−ＰＧ−Ｍｅはトランスフェクションが最も有効であり、ＤＬ−ＰＧ−Ｍｅ誘導体はトランスフェクションが最も有効でない。疎水性側鎖が適切な型である限りは、メトキシ基の付加はトランスフェクションを増大させるように見えることに気づく。ＤＭ−ＰＧ−ＯＨとＤＭ−ＰＧ−ＭＥとの比較は、同一の疎水性側鎖であれば、メトキシ形は非メトキシ形よりもトランスフェクションが効率的であることを説明する。
当該化合物の毒性は標準アラマーブル（Alamar Blue）毒性手順の適用により評価された。結果は、ＰｏｌｙＧｕｍのＭＬＶ及びＳＶ混合物の両方について、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）及び他の幾つかのアミン含有小胞よりも低い毒性を示した。
例
例１：化学薬品
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンは、アバンティポーラーリピッズ社（バーミンガム、アラバマ州）から購入された。リポフェクタミンはライフテクノロジーズから得られた。ＤＯＴＡＰを含むリポソーム製品は、べーリンガーマンハイムから得られた。コレステロールはシグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から購入された。アラマーブルーはアラマーバイオサイエンス（サクラメント、カリフォルニア州）から得られた。２−ヒドロキシエチルメチルアミン、ジ（２−ヒドロキシエチル）メチルアミン、２−メトキシエチルメチルアミン、及びジ（２−メトキシエチル）メチルアミン出発物質は、全てアルドリッチケミカル社から入手可能である。
例２：（±）−２，３−ジヒドロキシ−１，４−〔Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ｔ−ブチルジフェニルシリロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジメチル〕ブタンジアミン（上記の特定機構の化合物３を参照）の合成
（±）−１，３−ブタジエンジエポキシド（上記特定機構の化合物２を参照、アルドリッチケミカル社から入手可能）（０．９３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及び過塩素酸リチウム（５．０９ｇ、４７．８ｍｍｏｌ）の混合物の無水エタノール（５０ｍＬ）溶液に、Ｎ−メチル−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリロキシ）エチルアミン（ショーハリー，Ｓ．Ｋ．、ヘルナンデズ，Ｏ．のテトラヘドロンレターズ１９７９、９９の手順に従って調製された）（上記特定機構の化合物１を参照）（１５．０ｇ、４７．８ｍｍｏｌ）が添加された。反応混合物は６０℃に加温され、２４時間攪拌された。この時間の後、反応溶液は室温に冷却され、次に、Ｅｔ2Ｏ（７５ｍＬ）の入った分液漏斗へ移された。得られた混合物はＮａＨＣＯ3飽和水溶液で洗浄された。有機層が分離された後、Ｈ2Ｏ及び食塩水で洗浄され、次に乾燥された（Ｎａ2ＳＯ4）。乾燥剤は濾過され、濾液は回転蒸発により濃縮されて、粗生成物が黄色いオイルとして与えられた。ＳｉＯ2カラムクロマトグラフィ（ＣＨ2Ｃｌ2中３％ＭｅＯＨ）によって精製が行われ、６．９６ｇ（８１％）の化合物３（上記特定機構）がオイルとして与えられた。
Ｒｆ＝０．４４（１０：９０メタノール：ジクロロメタン）。
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６７（ｍ，８Ｈ）、７．３９（ｍ，１２Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ）、３．６４（ｍ，２Ｈ）、２．７３〜２．５８（ｍ，６Ｈ）、２．５３（ｄｄ，Ｊ＝４．１３，２Ｈ）、２．３２（ｓ，６Ｈ）、１．０４（ｓ，１８Ｈ）。
13ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１３５．３、１３３．３、１２９．６、１２７．６、６８．６、６１．５、６０．７、５９．６、４２．９、２６．７、１９．０。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４２０、２９３１、１１１２ｃｍ-1。
例３：（±）−２，３−ジオレオイロキシ−１，４−〔Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ｔ−ブチルジフェニルシリロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジメチル〕ブタンジアミン（上記の特定機構の化合物４を参照）の合成
ジアミン化合物３（４．２６ｇ、５．９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．８３ｍＬ、１３．１ｍｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（０．１４６ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）の混合物の０℃のＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）溶液に、塩化オレオイル（３．９５４ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ）が滴状に添加された。完全に添加したら、反応混合物は０℃で４時間攪拌され、ここでＣＨ2Ｃｌ2の追加部分（２０ｍＬ）が添加された。次に、反応混合物は分液漏斗へ移され、有機層はＮａＨＣＯ3飽和水溶液、Ｈ2Ｏ及び食塩水で連続的に洗浄された。有機層は乾燥され（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過され、濾液の溶媒は真空で除去された。そうして得られた粗精製物はＳｉＯ2カラムクロマトグラフィ（ＣＨ2Ｃｌ2中１％ＭｅＯＨ）により精製され、４．２１ｇ（５７％）の化合物４がオイルとして与えられた。
Ｒｆ＝０．３１（１：９９メタノール：ジクロロメタン）。
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６６（ｍ，８Ｈ）、５．３５（ｍ，４Ｈ）、５．１５（ｍ，２Ｈ）、３．６８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ）、２．５９（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ）、２．４９（ｍ，４Ｈ）、２．２７〜２．２２（ｍ，１０Ｈ）、２．０１（ｍ，８Ｈ）、１．２８（ｍ，４８Ｈ）、１．０４（ｓ，１８Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ）。
13ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７２．８、１３５．４、１３３．６、１２９．９、１２９．８、１２９．６（２）、１２９．４、１２８．５、１２７．５、７０．０、６２．２、５９．７（２）、５８．１、４３．０、３４．２、３１．８、２９．７、２９．４、２９．３、２９．２、２９．１、２９．０、２７．１（２）、２６．７、２４．９、２２．６、１９．０、１４．０。
ＩＲ（ＫＢｒ）２９２７、１７３３．２、１１１２ｃｍ-1。
例４：（±）−２，３−ジオレオイロキシ−１，４−〔Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジメチル〕ブタンジアミン（上記の特定機構の化合物５を参照）の合成
ジアミン化合物４（４．２１ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）の０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム溶液（１ＭＴＨＦ溶液を２０．４ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）が滴状に添加された。反応は０℃で１５時間攪拌され、この時点で、薄層クロマトグラフィによる分析で出発物質は全く存在しないことが明らかにされた。反応混合物はＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）で希釈され、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（５０ｍＬ）の添加により抑制された。有機層は分離され、Ｈ2Ｏ及び食塩水で連続的に洗浄され、乾燥された（Ｎａ2ＳＯ4）。濾過の後、有機層は回転蒸発により濃縮され、粗生成物が黄色いオイルとして与えられた。粗生成物は、溶離液としてＣＨ2Ｃｌ2中５％ＭｅＯＨを用いるシリカゲルの短いカラムを通過され、生成物の混合物が得られた。ＳｉＯ2カラムクロマトグラフィ（ＣＨ2Ｃｌ2中５％ＭｅＯＨ）を用いる第２のクロマトグラフィステップは、２．００ｇ（７７％）の化合物５をオイルとして与えた。
Ｒｆ＝０．４８（５：９５メタノール：ジクロロメタン）。
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ５．３３（ｍ，６Ｈ）、５．６２（ｓ，２Ｈ）、３．５５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，４Ｈ）、２．６１〜２．５０（ｍ，８Ｈ）、２．３７（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，４Ｈ）、２．２８（ｓ，６Ｈ）、１．９８（ｍ，８Ｈ）、１．６３（ｍ，４Ｈ）、１．２８（ｍ，４８Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，６Ｈ）。
13ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７３．３、１２９．９、１２９．７（３）、１２９．５、１２９．４、６９．５、６９．４、５９．７、５９．６、５９．５（２）、５８．６、５７．８、４２．３、３４．２、３４．０、３１．８、２９．６（２）、２９．４、２９．２（２）、２９．１、２９．０、２７．１、２７．０、２６．８、２４．８、２２．５、２２．４、１４．０、１３．９。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４４７、２９２５、１７３９，１５１２ｃｍ-1。
例５：ヨウ化（±）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイロキシ）−１，４−ブタンジアミニウム（上記の特定機構の化合物６、ＰｏｌｙＧｕｍを参照）
２５ｍＬの丸底フラスコにジアミノジオール化合物５（１．２６ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）及びヨウ化メチル（１６．５ｍＬ、２６５ｍｍｏｌ）が装入された。溶液は外界温度で２４時間攪拌された。この後、ヨウ化メチルは窒素ガスの定常流の援助で蒸発された（注：この操作は換気フード中で実行されなければならない）。ヨウ化メチルの除去で得られた残渣はアセトニトリルから二度再結晶され、０．４０ｇ（２３％）の化合物６を白色粉体（ｍｐ１６９〜１７１℃）として与えた。
Ｒｆ＝０．２８（５：９５メタノール：ジクロロメタン）。
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ５．６０（ｍ，２Ｈ）、５．３３（ｍ，４Ｈ）、４．５３（ｍ，８Ｈ）、３．４７（ｓ，６Ｈ）、３．４２（ｓ，６Ｈ）、２．５０（ｍ，４Ｈ）、２．００（ｍ，８Ｈ）、１．６５（ｍ，４Ｈ）、１．２９（ｍ，４４Ｈ）、０．８８（ｔ，６Ｈ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３３５５、２９０１、１７５３，１４６７ｃｍ-1。
Ｃ48Ｈ94Ｉ2Ｎ2Ｏ6に対する分析的な計算値は、Ｃ＝５４．９６、Ｈ＝９．０３及びＮ＝２．６７であり、得られた値はＣ＝５４．７８、Ｈ＝９．０４及びＮ＝２．６３であった。
例６：他の当該化合物の合成
上記例３のオレオイル誘導体のための手順と類似の手順によって、種々の疎水性側鎖誘導体は合成された。同様に、ジ（２−ヒドロキシエチル）メチルアミン、２−メトキシエチルメチルアミン、及びジ（２−メトキシエチル）メチルアミン出発物質から製造される誘導体は、２−メトキシエチルメチルアミン及びジ（２−メトキシエチル）メチルアミン誘導物質のためにはシラン保護基の導入及び除去が必要とされない（上記化合物Ｂおよびのための特定機構を参照）点を除いて、シラン保護された２−ヒドロキシエチルメチルアミンのための例１〜５に示される工程と類似の方法で合成された。
例７：組織培養及びプラスミド
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ダルベッコ（Dulbecco）変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清中で成長された。ＤＮＡプラスミドｐＣＭＶＬは標準方法で調製され、３６９ｎｇ／μｌのＴＥ溶液（ｐＨ＝７．６）として使用された。ルシフェラーゼ運搬プラスミドｐＣＭＶＬはＵＣデービスで調製され、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）にサブクローンされたＰ．ピラリスルシフェラーゼｃＤＮＡから成る。
例８：ＭＬＶ及びＳＶの形成
多重ラメラ小胞及び音波処理された単小胞は、ＤＯＰＥと共にカチオン脂質ＤＯＨＭＥ（いずれもクロロフォルム溶液）を５ｍＬのサンプルびんに添加して調製された。クロロホルムは３７℃の一定温度に設定された水浴を用いて回転蒸発器により除去された。得られた脂質薄膜は、溶媒の全ての痕跡が除去されたことを保証するために高真空下に一晩中置かれた。脂質混合物は蒸留水を用いて再懸濁され（２ｍｍｏｌ全脂質／１ｍＬ水）、渦混合されて、ＭＬＶの懸濁液が与えられた。この濁った懸濁液は、ＳＶを含む透明な懸濁液が得られるまで、音波処理浴を用いて１５分間音波処理された。
例９：リポソーム／ＤＮＡ複合体の形成
ＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清のある場合又はない場合）、ｐＣＭＶＬプラスミド（ｎ＝４．４μｇについて）、及びリポソーム調合物を２ｍＬエッペンドルフチューブに連続的に添加することによって、全体積８００μｌが与えられた。使用されるリポソーム：ｐＣＭＶＬプラスミドの相対量は、所望されるカチオン脂質：ＤＮＡリン酸塩のチャージ比によって決定された。これらの物質の混合の後、徹底的な攪拌が行われた。
例１０：ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション
通常、ウェルごとに付着ＮＩＨ３Ｔ３細胞を急速に分割する、５．０×１０4細胞／ウェルを含む２４ウェル組織培養プレートがトランスフェクションされた。成長培地は吸引により除去され、細胞はウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで一回洗浄された。リポソーム−ＤＮＡ複合体の２００μｌアリコートが各ウェルに添加され、細胞は３７℃で４時間培養された。所望されるならば、このときに、ウェル当たり１ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎児血清が添加され、細胞は更に４８時間培養され、その後、毒性及び／又は効能の分析が実行された。同等の手順はＤＵ−１４５細胞に対して利用された。
例１１：相対ルシフェラーゼ発光の決定
トランスフェクション活性はルシフェラーゼ分析を用いて測定された。ルシフェラーゼ分析は、メーカーの使用説明書に従って、モノライト２０１０ルミノメータ（アナリティカルルミネッセンスラボラトリーズ、サンジエゴ、カリフォルニア州）を用いてルシフェラーゼ分析キット（アナリティカルルミネッセンスラボラトリーズから購入される）と共に実行された。培地はトランスフェクションされた細胞から吸引によって除去された。ウェル当たり０．５ｍＬのルシフェラーゼバッファが添加され、細胞は１５分間氷上に置かれた。１００μｌのライゼートからのルシフェラーゼ発光はルミノメータを用いて測定された。
例１２：疎水性側鎖の最適化
図９には、合成された種々のＰｏｌｙＧｕｍ誘導体についての疎水性及び極性領域トランスフェクションの結果が示される。試験では、１．０×１０5個のＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞は、移入の２４時間前に塗布された。細胞ライゼートはトランスフェクション後４８時間で得られ、ルシフェラーゼ特異活性について分析された。図９に提供されるデータは、当該カチオン脂質が１マイクログラムのプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３１＋）を媒介送達する能力に対応する。
例１３：アラマーブルー毒性分析
アラマーブルー（アラマーバイオサイエンス、サクラメント、カリフォルニア州）は細胞培養地で１０％に希釈され、細胞に添加され、２時間まで培養された。還元された染料は、５３０ｎｍ励起フィルタ及び５９０ｎｍ発光フィルタと共にサイトフルオ（Cyto Fluor）２３００蛍光プレートリーダを用いて定量された。示された値は背景よりも少ない蛍光を表した。同じトランスフェクション細胞は、次に、アラマーブルー分析後の運搬タンパク質活性について分析されることができる。
本発明は今、特定の実施例を参照して説明された。他の実施例は、この明細書を再検討すれば当業者には示唆されるであろう。
上記の発明は理解を明白にするために図及び例によっていくらか詳細に説明されたが、ある変化及び変更が特許請求の範囲の範囲内で実施できることは明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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