(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
0003936401.tif 000009
（上式中、R1が、スクシニル或いはアセチル基であり、R2が、スクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるBis-Arg Helix#2を含んでなるヘパリン結合分子。
【請求項２】
上記アミノ酸が、全てＤ−アミノ酸である請求項１記載のヘパリン結合分子。
【請求項３】
下記式
0003936401.tif 000010
（上式中、Ｒ1がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ2がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ3スクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるTris-Arg Helix#3を含んでなるヘパリン結合分子。
【請求項４】
上記アミノ酸が、全てＤ−アミノ酸である請求項３記載のヘパリン結合分子。
【請求項５】
下記式
0003936401.tif 000011
（上式中、Ｒ1がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ2がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ3がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ4がスクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるTetra-Arg Helix#3を含んでなるヘパリン結合分子。
【請求項６】
上記アミノ酸が、全てＤ−アミノ酸である請求項５記載のヘパリン結合分子。
【請求項７】
下記式
0003936401.tif 000012
（上式中、R1が、スクシニル或いはアセチル基であり、R2が、スクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるBis-Arg Helix#2、下記式
0003936401.tif 000013
（上式中、Ｒ1がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ2がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ3がスクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるTris-Arg Helix#3、下記式
0003936401.tif 000014
上式中、Ｒ1がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ2がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ3がスクシニル或いはアセチル基であり、Ｒ4がスクシニル或いはアセチル基である。）
で示されるTetra-Arg Helix#3、およびこれらの混合物からなる群より選ばれたヘパリン結合ペプチドを含んでなるヘパリン結合組成物。
【請求項８】
血漿中ヘパリン含量を減少させる治療を要する非ヒト哺乳動物において、請求項７記載のヘパリン結合組成物をその非ヒト哺乳動物の血漿中ヘパリンレベルの減少に有効な量で投与することにより、血漿中ヘパリン含量を減少させる方法。
【請求項９】
ヘパリンの抗血液凝固効果を減少させる治療を要する非ヒト哺乳動物において、請求項７記載のヘパリン結合組成物をヘパリンの抗血液凝固効果の減少に有効な量で投与することにより、ヘパリンの抗血液凝固効果を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国の厚生省、公共保健サービス、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所に授与された補助金＃１Ｒ４１  ＨＬ５３００３−０１の下で政府の援助により行われた。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
発明の背景
１．発明の技術分野
本発明は、心臓血管系用ヘパリン結合ペプチドを提供する。より詳しくは、本発明は、６個の関連ペプチド配列を提供するが、これらは全てヘパリンを結合させ、安定なヘパリン／ペプチド複合体を形成し、ヘパリンの生物学的作用を拮抗する。本発明の化合物は、ヘパリンの抗血液凝固活性を拮抗または中和するために全身系に（プロタミンのように）または部分的にまたは局所的に投与される薬物として有用である。また、本発明の化合物は、糖尿病患者に投与するためのインシュリン剤製においてプロタミンの代替に有用である。
２．関連技術の説明
ヘパリンは、Ｎ−グルコサミンとウロン酸の残基が交互に結合されてなっている、多分散化、硫酸化多糖類である（１）。このヘパリンの合成は、本質的に硫酸塩残基の程度および位置においてのみならず、糖骨格の形態において多様である（イズロン酸対グルクロン酸）。薬剤用ヘパリンとしては、分子量が６，０００〜２０，０００の範囲内にある種類のみのが含まれており、このようなヘパリンの約３０重量％が、その抗血液凝固性質の役割を果たしていると推定されている。しかし、ヘパリンは、平滑筋細胞増殖を阻止し（２）、リポタンパク質リパーゼを触媒し、内皮細胞に結合し、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）と血小板との相互作用を阻止（３）する能力を始め、多数の他の生物学的性質を有する。これらの他の活性に基づいた成功している治療方法は、まだ考えられていない。その主な理由は、それらの他の生物学的作用を遂行するのに必要な投薬量が過剰の抗血液凝固につながるからである。それにもかかわらず、ヘパリンの平滑筋細胞増殖を阻止する能力が、その抗血液凝固効果とははっきり区別されることが良く証明されている（２）。
ヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）はヘパリンと似ているが、これはただ不十分に硫酸化され、抗血液凝固活性が低い。デルマタン硫酸（ｄｅｒｍａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）も、また、ヘパリンより硫酸化の程度が低く、糖類骨格にガラクトサミンを有している。これらの二つのヘパリン様物質が有する残留の抗血液凝固性質の部は、抗トロンビンIIIよりヘパリン助因子Ｈの触媒化に起因している（６）。しかし、ヘパリン抗血液凝固作用の主要経路は、その抗トロンビンIII（ＡＴIII）との相互作用により仲介される。
［タンパク質領域に結合するヘパリン］
ヘパリンとの複合体の形成により、ＡＴIII（７〜１２）、線維芽細胞増殖因子（１３、１４）、及び粘膜プロテイナーゼ素抑制因子（１５）を含む多数のタンパク質が、高次構造の変化を誘発する。ヘパリン−タンパク質の相互作用の誘導原理は、ヘパリンポリマー内の特定の化学的単位構造がタンパク質（１６〜１９）内の構造的に相補的な特定領域に固く結合することである。本発明者等は、フォンビルブラント因子またはＡＴIIIのヘパリン結合領域が合成ペプチド（１６〜２１）により完全に複製されることが出来ることを証明した。ｍａｒｇａｌｉｔら（２２）は、データベースにおいてタンパク質とペプチドのヘパリン結合領域配列に関する分子モデル分析法を使用し、それらの全てのヘパリン結合配列に存在する塩基性アミノ酸の空間分布が、二つの塩基性残基（一般的には、Ａｒｇ）がα−ヘリックスまたはβ−ストランド構造の反対方向で約２０Åの間隔をおいて分離されているモチーフと一致することを証明した。これらの２個の残基の間に他の陽イオン性残基が配置されている。ヘパリンは、ペプチド骨格のまわりを包み込むようにして結合し、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）様構造を形成することができる。そのような複合体は、タンパク質またはペプチドの高次構造の変位を容易に誘発するだろう。Ｆａｎら（２３）およびＴｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓら（２１）は、抗トロンビンIII内の特定の陽イオン性残基が高親和性部位にあるヘパリンの認識および結合に必須的であることと、これらの残基の置換または修飾によりヘパリンともはや結合しないタンパク質（またはペプチド）が生成されることとを、それぞれ変異性置換及び化学的合成法の各々により証明した。本発明者ら（２１）は、ヘパリン結合領域配列がとる高次構造に好ましくない歪を引き起こす必須のＡｒｇ残基からＧｌｎ残基への突然変異により（２４）、その担体が血栓症に対する素因を現す天然の突然変異体タンパク質であるＡＴIIIＧｅｎｅｖａが生成することを示唆した。
［ヘパリン解毒剤の必要性］
ヘパリンは、心臓切開手術、体外循環、末梢血管手術、経皮的血管形成術および多数の他の急性血管介入を行う間に、血液の凝固を阻止するために使用されている。ヘパリンによる出血性合併症は、特に、動脈の樹状構造が害されるとき、よくおこり、１０〜１５％ほどのケースで発生する。利用できる唯一のアンタゴニストであるプロタミンは、その毒性及び副作用のため、心臓切開手術及び救急処置における使用だけに主に制限されている。ヘパリンの多くのその他の急性、動脈系症状に用いるとき、数時間の内にてその坑血液凝固効果が自発的に衰える。ヘパリンにより生じる坑血液凝固を最も安全、かつ確実に調節することができれば、ヘパリンによる多数の付加的な出血性合併症を避けることができる。そして、プロタミンを代替するため、そしてプロタミンの毒性が高過ぎるようなより一般的な症状に対して使用するため、ヘパリン解毒剤が要求される。
［プロタミン及びその問題点］
プロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）は、魚（鮭）の精子から精製され、アルギニン残基に富んだ塩基性タンパク質の群である（２５）。プロタミンは、陽イオン性電荷により炭水化物を制圧することにより、ヘパリンの全ての生物学的効果を中和させる（２６〜２８）。それで、ヘパリンの中和のためのプロタミンの効率性は、部分的には、純陽イオン電荷の総量に関連しているが、不幸にも、プロタミンの毒性は、その高い電荷密度にも関係がある（２９）。ヘパリンを投与したヒトに対するプロタミンの投与により、低血圧、肺動脈高血圧症、心筋圧下、補体活性化、血小板減少症、及び白血球減少症を頻繁に誘発しうる（３０〜３６）。致死例が報告されている（３７）。
人工心肺において、ヘパリンのプロタミン反転は非常に重要であり、少量または分量の投与により副作用を回避するために、数多くの臨床療法が案じられていた。これは、本ヘパリンアンタゴニストの臨床的重要性を立証するものである。プロタミンは、毒性に対する治療の比率がよくないにもかかわらず、臨床治療に利用することが出来る唯一のヘパリンアンタゴニストとして１９３９年以来使用されてきた（３８）。
内因性及び外因性ヘパリン類は、血管の損傷部位で平滑筋細胞の増殖を抑制できるため（３９〜４１）、プロタミンがまた別の有害な副作用に関与しているのではないかと現在疑われている。Ｅｄｅｌｍａｎら（４２）は、プロタミンの注入によりヘパリンの平滑筋細胞増殖に対する有利な抑制作用が弱められ、プロタミンのみがその増殖反応を悪化させることを示した。これらの研究は、培養細胞のより行われ、動物生体による研究において確認された。各々の状況において、プロタミンがヘパリンの有利な増殖抑制活性を弱めることが見いだされた。
このようにして、プロタミンは実際に、ヘパリンまたは外因性ヘパリン様分子を結合することによって正常な血管修復を歪めることがある。このような結果があるため、プロタミンの臨床用の使用は難しい。例えば、動脈バイパスまたは血管形成術のような血管損傷または血管試術の際、プロタミンの投与は特に有害であり、動脈内膜増殖症、早期狭搾症及び血栓症に到る。従って、優れたヘパリンアンタゴニスト、即ちより選択的な生物学的作用及び改善された安全性を有するものが強く求められている。
心臓血管系手術に伴う選択的または応急的処置においてヘパリンアンタゴニストとして使用できる安全なプロタミン代替薬物への商業的関心が大きくなっている。おもに、この薬物は、傷に対する増殖性血管反応を激化させたり、有害な血行力学的副作用を誘発することなく、ヘパリンの通常の抗血液凝固性質を特異的に中和させなければならない。
今は、臨床医師が組換え型血小板因子４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ４）を潜在的なヘパリンアンタゴニストとして使用したがるかどうかが現在評価されている（４３）。不幸にも、組換え型血小板因子４は、ネズミにおいてヘパリン抗血液凝固の反転に効果があるけれども（４４）、いくつかのネズミ以外の種においては、アナフィラキシーや、急性肺血管収縮及び血圧降下を含む強い副作用を生じる。これは、おそらく、血流へのトロンボキサンの放出に関係がある（４５）。なお、血小板因子４は、ヘパリンと複合体を形成してヘパリン由来の血小板減少症を誘発する最終的な免疫原として同定されている（５４〜５６）。このようなヘパリンに対する免疫感作の症候群（ヘパリンは血小板因子４との複合体を形成する）は、大きな疾病及び死亡の原因であるとして非常に恐れられている。血小板因子４をプロタミン代替物として開発しようとする初期の努力以降にこれらの新しい発見があったものであり、その潜在的な臨床用途について深刻な疑問が生じている。
他のアプローチとして、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（４６）は、プロタミンのタンパク質分解により誘導された断片を潜在的なプロタミン代替薬物として検討している。プロタミン由来の比較的高分子量の断片が、プロタミンそのものより毒性が少ないか否か、あるいは、そのような断片を潜在的な薬剤として大量生産することができるか否か、まだ不明である。このようなプロタミン代替物において選択性または特異性を得ようとする試みはなされていない。
心臓血管系手術の後、またはその他の用途に使用するためのヘパリンアンタゴニストである、安全なプロタミン代替物の全世界的市場が存在することは明かである。
発明の概要
従って、本発明の主な目的は、心血管系用途のためのヘパリンアンタゴニスト薬物を提供することである。詳しくは、本発明のヘパリン結合化合物は、傷に対する増殖性血管反応を激化したり、有害な血行流動態的副作用を起こさず、ヘパリンの通常的な抗血液凝固性質を中和させる。より詳しくは、本発明のヘパリン結合化合物は、選択的または緊急的状況下で使用して、有害な血行流動態的副作用または傷に対する増殖性血管反応の激化を起こさず、ヘパリンの通常的な抗血液凝固性質を安全に、かつ特異的に中和できる速効性の静脈注射用薬物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２、Ｔｒｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３、およびＴｅｔｒａ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３の構造を示す。
図２は、残留因子Ｘａ酵素活性により測定されているように、ヘリックスペプチドのヘパリンとＡＴIIIの複合体形成に及ぶ阻止効果を示す。その分析は、前述のように（２０、２１）行われた。
図３は、Ｌｙｓ  Ｈｅｌｉｘ  ＃１とヘパリンの５糖類単位構造との間で形成された疑似“ドック状態（ｄｏｃｋｅｄ）”の複合体の立体図である。
図４は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２とヘパリンの５糖類単位構造との間で形成された疑似“ドック状態”の複合体の立体図である。
図５は、残留因子Ｘａ酵素活性により測定されているように、ヘリックスペプチドのヘパリンとＡＴIIIの複合体に及ぶ阻止効果を示す。
図６は、ＰＴＴ分析により判断した、血漿中のヘパリンの試験管内中和反応を示す。ヘパリンを投与したヒト血漿（０．１５μ／ｍｌ）をアンタゴニストの濃度を増加させながら中和した。
図７ＡおよびＢは、ヘパリンを投与したモルモットとヘパリンを投与しなかったモルモットにおいて放射線標識したＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２の運命を示す。
図８は、ヘパリンを投与しなかった、麻酔したモルモットにおける放射線標識したＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２の器官分布を示す。
図９は、ヘパリンを投与した、麻酔したモルモットにおける放射線標識したＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２の器官分布を示す。
図１０は、麻酔したモルモットの尿への放射線標識したＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２のクリアランスを示す。
図１１は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ  ＃２由来の放射線標識された断片の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。
図１２は、ＰＴＴ分析により判断した、血漿中のヘパリンの生体内中和反応を示す。
図１３は、試験ペプチドの大動脈平滑筋細胞の生存力に及ぶ効果を示す。
発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明者らは、合成ヘリックスヘパリン結合ペプチドの投与により、ヘパリンに効果的に結合し、ヘパリンを失活させ、体外へヘパリンを排出させうることを発見するに到った。全身系用の他に、本発明のヘパリン結合ペプチドは、例えば、出血性傷害、血管吻合術、または漏出の配合性血管グラフトにおいて、ヘパリンの作用に局部的に拮抗するための局所投与に有用である。本発明のヘパリン結合ペプチドは、他の薬剤と混合して組成物とすることもできる。例えば、本発明のペプチドは、糖尿病の治療における用途のため、プロタミンの代替物としてインシュリンとの薬剤組成物の形で混合することもできる。本発明のヘパリン結合ペプチドは、ヘパリンの活性が他の試薬の作用を妨げる場合、他の治療剤または診断用試薬と複合体を形成することもできる。例えば、本発明のヘパリン結合ペプチドは、フィブリン膠、またはヘパリンに対して感応性のある診断用血漿試験薬物と複合体を形成することができる。
本発明のヘパリン結合ペプチドは、直鎖または分岐鎖のペプチドでもよい。好ましい直鎖のヘパリン結合ペプチドは、次のようなものである。
ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃２：
スクシニル（またはアセチル）−ＡＬＡ１−ＧＬＵ２−ＡＬＡ３−ＡＲＧ４−ＡＬＡ５−ＡＲＧ６−ＡＲＧ７−ＡＬＡ８−ＡＬＡ９−ＡＬＡ１０−ＡＲＧ１１−ＡＬＡ１２−ＡＬＡ１３−ＡＲＧ１４−ＡＲＧ１５−ＡＬＡ１６−ＡＬＡ１７−ＡＲＧ１８−ＡＬＡ１９−アミド（または酸、ＣＯＯＨ）；
ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃３：
スクシニル（またはアセチル）−ＡＬＡ１−ＧＬＵ２−ＡＬＡ３−ＡＲＧ４−ＡＬＡ５−ＡＲＧ６−ＡＲＧ７−ＡＬＡ８−ＡＬＡ９−ＡＬＡ１０−ＡＲＧ１１−ＡＬＡ１２−ＡＬＡ１３−ＡＲＧ１４−ＡＲＧ１５−ＡＬＡ１６−アミド（または酸、ＣＯＯＨ）；および
ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃４：
スクシニル（またはアセチル）−ＡＬＡ１−ＧＬＵ２−ＡＬＡ３−ＡＬＡ４−ＡＬＡ５−ＡＲＧ６−ＡＲＧ７−ＡＬＡ８−ＡＬＡ９−ＡＬＡ１０−ＡＲＧ１１−ＡＬＡ１２−ＡＬＡ１３−ＡＲＧ１４−ＡＲＧ１５−ＡＬＡ１６−アミド（または酸、ＣＯＯＨ）。
好ましい分岐鎖のヘパリン結合ペプチドとしては、Ｂｉｓ−ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃２、Ｔｒｉｓ−ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃３、およびＴｅｔｒａ−ＡＲＧ  ＨＥＬＩＸ  ＃３が含まれる。これらの分岐鎖のペプチドの構造式を図１に示す。本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、またはこれらの混合体でもよいが、Ｄ−アミノ酸が好ましい。
本明細書で用いられる意味で、本発明により意図されたヘパリン結合ペプチドには、当該分野において公知であるペプチドの誘導体、特に、ヘパリンに対する結合能を除去しないか、または、あまり減少させない置換基を有する、上記のペプチドが含まれる。例えば、本発明のペプチドは、ある官能基により任意的に置換される。ヘパリンに対するペプチドの結合能を除去しないか、あまり減少させない、当該分野で認識されている官能基をどれでも使用することができる。その例としては、エステル、アミド、酸、アミン、アルコール、エーテル、チオエーテルなどが含まれるが、特にこれらに限定されることはない。溶媒化物、例えば、本発明の方法において有用であるペプチドの水和物も、本発明の範囲内に含まれる。そのような溶媒化物を生成する溶媒化法は、一般的に当該分野において知られている。
各種の経路による投与に適切なヘパリン結合ペプチドの薬学的塩は、当該分野において公知であるので、ここでは具体的に記載することは必要ではない。本発明によるペプチド及びこれらの誘導体の薬学的に許容可能な塩には、塩基塩、例えば、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、バリウム）、マグネシウム、アンモニウムのような、適切な塩基から誘導された塩、及びＮＷnＨm（ここで、ｎ及びｍが、各々０〜４であり、ｎ＋ｍが４であり、Ｗが（Ｃ1〜Ｃ18）アルキル基を現す。）塩基及び塩が含まれる。酸基またはアミノ基の薬学的に許容可能な塩としては、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イソチオン酸、ラクトビオン酸およびスクシン酸のような有機カルボキシル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トリルスルホン酸のような有機スルホン酸、および塩酸、硫酸、リン酸及びスルファミン酸のような無機酸の塩が挙げられるが、特にこれらに制限されない。ヒドロキシ基を有する化合物の薬学的に許容可能な塩としては、Ｎａ+のような、適切な陽イオンと結合する化合物の陰イオン、およびＮＷnＨm（ここで、Ｗが（Ｃ1−Ｃ18）アルキル基を現し、ｎ及びｍが０〜４で、ｎ＋ｍが４である。）が含まれるこれらに特に制限されることなく、。
また、本発明のもう一つの態様によれば、ヘパリンと結合し、その作用に対して拮抗作用を現す物質の薬剤組成物が提供される。この薬剤組成物は、少なくとも１種以上の上記のヘパリン結合ペプチド及びこれらの混合物および／またはこれらの薬剤学的塩と、これに対する薬剤学的に許容可能な担体とを含んで成る。そのような薬剤組成物は、例えば、RemingtonのPharmaceutical Sciences, seventeenth edition,ed. Alfonso R. Gennaro,Mack Publishing Company, Easton, PA（1985）に記載されているような、容認された製薬方法に従って製造される。
ヘパリン活性を阻止する方法においての治療的用途のため、ヘパリン結合ペプチドまたはその塩は、ヘパリン結合ペプチドまたはその塩と、これに対する薬剤学的に許容可能な担体とを含む薬剤組成物の形で投与することが便宜である。適切な担体は、当該分野においてよく知られているが、薬剤組成物の目的の形態および投与様態によって多様である。例えば、適切な担体には、希釈剤または賦形剤、例えば、充填剤、結合剤、水和剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤などが含まれる。代表的には、その担体は、固形、液相形、または気化性担体でもよいが、これらの複合形態でもよい。一つの好ましい態様において、その組成物は治療用組成物であり、その担体は薬剤学的に許容可能な担体である。
本発明のヘパリン結合ペプチドまたはその塩は、上記の担体とともに目的とする単位投薬量の形で製剤化することができる。代表的な単位投薬形としては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁液、乳液、粒剤、カプセル剤、座薬などが含まれるが、注射用液剤および懸濁液が特に好ましい。
各々の担体は、製剤中の他の成分との互いに影響を及ぼし合わないものでなければならないし、患者に有害ではいけないという意味で、許容可能でなければならない。その担体は、生物学的に許容可能、かつ不活性でなければならない、即ちその担体は、本発明の化合物がその阻害活性を現すことができるように、細胞にその代謝反応を行わせなければならない。
製剤の例としては、経口、直腸、鼻内、局所（頬及び舌下を含む）、膣内、及び非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内及び経皮を含む）投与に適切な形態が含まれるが、静脈内投与製剤が好ましい。
例えば、注射に適切な製剤を製造するためには、液剤および懸濁液を滅菌して、好ましくは血液と等張性になるようにする。注射用製剤の製造の際には、当該分野で通常用いられ得る担体を使用することができる。その担体としては、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトル及びソルビタン酸エステルが挙げられる。これらの場合において、塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリンのような等張性調整剤を適量添加して製剤を等張にすることができる。水性滅菌注射用液剤は、酸化防止剤、緩衝剤、制菌剤、及び非経口投与に許容可能な付加剤等をさらに含むことができる。
上記の製剤は単位投薬形をとることが便宜であり、製薬業分野において公知の方法により製剤化することができる。そのような方法には、活性成分と少なくとも１種以上の補助成分を含む担体とを合わせる段階が含まれる。一般的には、上記の製剤は、活性成分を液状担体または微粉固形担体または両方と均一に、かつ均密に混合させた後、必要に応じて、製品を成形することにより製造することができる。当該分野においてよく知られているように、各種の単位投薬形および数回投薬容器、例えば、アンプル剤およびバイアルを使用することができる。
特に上述のような成分の他に、本発明の製剤は、この類型の薬学的製剤について通常用いる他の薬物をも含むことができる。
本発明のヘパリン結合ペプチドは、担体に対して広範囲の比率で組成物中に存在することができる。例えば、そのペプチドは、０．０１〜９９．９重量％、好ましくは、約０．１〜９９重量％の量で存在することができる。より好ましくは、上記のペプチドは、組成物の約１〜７０重量％の量で存在することができる。
また、本発明の態様によれば、患者に対して、少なくとも１種以上の本発明のヘパリン結合ペプチド、その薬学的に許容可能な塩、またはこれらの混合物を、患者の血液循環系からヘパリンの除去に十分な効果量で投与することにより、患者の血行からヘパリンを除去する方法が提供される。この用途において、「患者」には、ヘパリンを投与するあらゆる哺乳動物が含まれる。
患者に投与された本発明の組成物において、ヘパリン結合ペプチド、その薬学的に許容可能な塩、またはこれらの混合物の容量は、患者の年齢、体重及び類別、患者の全般的な健康状態、症状の重症度、上記の組成物が単独に、あるいは、他の抗ウイルス剤とともに投与される場合、副作用の病発頻度などをはじめ、多数の要因によって変わるが、これらの要因に特に制限されることはない。
一般的に、ヘパリンで治療した患者に適切な適用量は、約０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／投与、好ましくは、約０．０１〜６０ｍｇ／体重ｋｇ／投与、より好ましくは、約０．１〜４０ｍｇ／体重ｋｇ／投与である。その所定量を１〜６回以上の分量で、必要に応じて、適切な間隔で投与することができる。上記の化合物は、繰り返して投与してもよいし、患者に対して徐々に、かつ定期的に注入してもよい。その投薬量を増量しても、減量してもよい。
上記の容量は、例えば、上述の多様のパラメーターを考慮して調整することができる。典型的には、本発明の組成物を約０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／１日の量で投与することができる。しかし、その容量を変更して投与してもよい。
良好な血漿濃度を得るために、活性化合物は、例えば、任意的には、塩水中、活性成分の約０．１〜１％溶液の静脈注射により投与することができる。
上記活性成分は、局所、経口、直腸、鼻内、膣内、及び非経口（服腔内、皮下、筋肉内、静脈内、皮内及び経皮を含む）経路を含んだどの経路によっても治療目的として投与することができる。好ましい経路は、患者の状態及び年齢、疾病の性質と他の治療剤をはじめ活性成分の選択によって変更可能であることが認識される。静脈内経路を利用するのが好ましい。しかし、患者の条件や治療の長期持続の程度によって、他の経路を利用することもできる。
上記の活性成分その自体を投与することも可能であるが、薬学的製剤として製剤化するのが好ましい。本発明の製剤は、上述のような活性成分の少なくとも１種を、その許容可能な担体１種以上、任意的には、他の治療剤とともに含んでいる。
上記の方法は、化合物をその自体、または、薬剤組成物に抗ウイルス性化合物及び／治療剤を含んだ他の活性成分と混合して投与することにより実施することができる。ここで使用するのに適切な他の治療剤としては、意図された目的のための同一または相違の反応メカニズムにより効果がある和合可能な薬剤、または本発明の製剤に相補的である薬剤がある。これらには、有効的なヘパリン結合剤である試薬が含まれる。その例としては、プロタミン、組換え血小板因子４などがある。
併用治療法において用いられた化合物は、独立製剤または複合製剤の形で同時に投与しても良いが、併用効果が達成できるように、本発明の化合物とは異なる時間で、例えば、順次的に投与しても良い。医師は、初期に基準投薬量を減少し、その次に得た結果の適正域値を求めることにより、投与の量及び規定食事法を調整することができる。本発明の治療方法は、医師により決められた他の治療剤と併用することができる。
以上、本発明について記載しているが、特定の実施例を参考にして本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、別に言及されていない限り、単に説明のためにあげたものであり、本発明の範囲またはその態様を限定するものではない。
実施例１：ヘパリン結合ペプチドの構造的特徴の最適化
本実施例においては、医薬として有力な候補を対象にして４個の化合物を検討した。これらの中の２個、Ｋ121−Ａ134およびＫ121−Ａ134Ｅｘｔは、高親和性ヘパリン結合部位におけるＡＴIIIの１次配列に基づいている（２０）。それ以降、これらの配列内にある陽イオン性残基は、それぞれ５糖類単位構造との製造上の静電接触のために必要であるか、構造的に好ましいヘパリン／ペプチド複合体の形成に必要であることが証明された（２１）。これらのペプチドは、両方とも特性としてβ−ストランドが優勢である（両方とも、ヘパリン結合に対するあるヘリックス特性を獲得しているが）。それゆえ、これらの２個の配列のいずれも相当な結合エネルギを潜在的に喪失せず、容易に作製することができる。これらの理由のため、本発明者らは、本発明の独特なヘパリン結合ペプチド類を開発するに到った。
タイトなヘリックスヘパリン結合ペプチドは、血小板因子IV（４７）またはタンパク質Ｃ抑制因子の意図されたヘリックス結合領域に基づいて開発されている。ヘパリンアンタゴニストの開発において先の計画が失敗してから、陽イオン性電荷の高次構造的な提示を考慮せず、総陽イオン電荷を単純に増加させることにより、最も強な化合物が生産されると信じられてきた。しかし、今では、塩基性残基の数とプロタミン類似体の毒性との間の直接的な相互関係があり（２９）、ヘパリンとタンパク質の二つの分子が適切な荷電および構造相補性を現す（１６〜２２参照）とき、ヘパリンとタンパク質との間の最大相互反応が起こるということが知られている。
これらの研究に基づいて、本発明者らは、ペプチドの陽イオン性残基が適切な間隔を置いて配置されて、それらの陽性側鎖をヘリックスの同一面の上に配向させる溶液中でヘリックス構造を取ると予想されるペプチドを考案し、合成した（１６、２２）。このペプチド、スクシニル（ｓｕｃｃ）−ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ−ＮＨ2（Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃１）は、円形２色性（ＣＤ：ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分光法により７５％のヘリックスを示し、ヘパリンとの複合体形成によりペプチドのヘリックス含量が１００％に増加した。ヘパリンも、また、このペプチドの見かけ熱安定性を約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ程度増加させる。言い換えれば、ヘパリンはペプチドの高次構造を安定化させた。
２個のヘリックスペプチドを追加合成した。Ｌｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１（ｓｕｃｃ−ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＫＫＡＡＫＫＡＡＡＫ−ＮＨ2）において、ヘリックス構造の修復のためにＥ2とイオン対を形成するのに要求される、Ｒ6を除いたすべてのＡｒｇ残基を、Ｌｙｓで置換した。また、Ａｒｇ  ｈｅｌｉｘ＃２（ｓｕｃｃ−ＡＥＡＲＡＲＲＡＡＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ−ＮＨ2）において、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃１の配列を修飾してヘリックスの一つの面に存在するＡｒｇ残基の数を最大化した。等温適定熱量測定法（１７〜２１、４７）を使用してヘパリンとの複合体形成を定量し（表１）、因子Ｘａ中和分析法（２０、２１）を使用して抗血液凝固性ヘパリンを結合する上記ヘリックスペプチドの能力を決定した。
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全ての実験は、ｐＨ７．０１の５０ｍＭリン酸塩緩衝液中で３０℃にて行われた。一般的には、３０秒間で１０μｌの注射液２０回を迅速に（４００ｒｐｍ）ペプチド溶液と混合するが、注入の間の平衡時間は２分にした。全ての実験について、指示されたペプチドを０．１０ｍＭで熱量計のキュベットに入れ、ヘパリンを０．５ｍＭの初期濃度で点滴注射器に入れた。ヘパリンを緩衝液のみ（ペプチドの不在下）に注入した後、混合及び希釈の熱についての減算によりすべての等温線を補正した。
ＩＴＣの結果に基づいて、Ｌｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１及びＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２について、ヘパリン結合に向かってＡＴIIIと競争するこれらの能力をそれぞれ検査した。図２に示したように、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、ＩＴＣによれば、ヘパリンに対して高度の親和性を有し、また、Ｌｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１よりも良好に抗血液凝固性ヘパリンに結合する。結合は、エンタルピー的に進行され、熱動力学的に好ましい。そのようなエンタルピーの大きな変化には、ほぼいつでもヘパリン糖類の並置された近接の硫酸基及び／またはカルボキシ基とアミノ酸側鎖との製造上の静電接触のような、遠距離の相互作用が伴う。
また、本発明者らは、プロタミンの結合活性とより密接に似ている合成ヘリックスペプチドを創り出した。この方法では、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の二つの複製物を、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）誘導体として合成樹脂にまず複合させたＣ末端のＬｙｓ残基のα−及びε−アミン基の上で、個別的であるが、同時に合成した。生成されたＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２ペプチドは、リジン残基を通じて
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結合された全長ヘリックス配列を２個有する。
ＣＤによれば、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、溶液（２５℃）中では４５％ヘリックスであるが、ヘパリンとの複合体形成によりヘリックス特性が約７０％に増加され、ヘパリン結合がペプチドに熱安定性を与える。適定熱量測定法により決められたヘパリンのＫDは、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のみに対して測定した値の約３倍より高い。また、因子Ｘａ中和分析法（図２）において、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、約７０μＭのＩＣ50を示すが、この値は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２よりだいたい３倍以上であり、プロタミンよりは２倍未満も劣る。
従って、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２及びＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、高陽イオン電荷密度の界面を提供するよう作製できる化合物を生成する。Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のデザインは、潜在的な結合部位の数の増加により有効因子Ｘａ中和の可能性が高くなるということで正しいようである。ヘリックスペプチドは、以前にプロタミン類似体として報告された小数の陽イオン残基によりより大きな効能を発揮する（３１）。
分子モデルを使用してＬｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１またはＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２とヘパリンの抗血液凝固性５糖類単位構造との間に形成される複合体を概念化した（参考文献２１参照）。これらの複合体をシリコングラフィクスのアイリス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｒｉｓ）ＷＤ３５ワークステーションで動くＩＮＳＩＧＨＴ（Ｂｉｏｓｙｍ）によりモデル化した。バイオポリマーモジュールを用いることにより、ペプチドをそれぞれ最初に、ＣＤの結果と一致するα−ヘリックスコンフォーマーとして作製した。ＡＴIIIに結合する抗血液凝固性５糖類単位構造の原子配置は、Ｄｒ．Ｆｅｒｒｏ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｄｅｌｌｅ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｏｌｅ  ｄｅｌ  Ｃ．Ｎ．Ｒ．，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）により提供された。これらの座標上の位置は、直接にＩＮＳＩＧＨＴへ読み取られる５糖類のタンパク質データバンク（ＰＤＫ）ファイルを作製するために使用された。全ての分子に対するフォースフィールドパラメータが、ｃｆｆ９１フォースフィールド（Ｂｉｏｓｙｍ）により付与された。フォースフィールドパラメータは、５糖類の硫酸塩（６価の硫黄および３当量の酸素）またはスルホンアミド官能基を適切に現すのに役に立たない。したがって、本発明者らは、酸素原子がそれぞれ−０．３３９の部分電荷に手動的にセットされるプロン化亜硫酸塩1として上記の基をモデル化することとした。
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最急勾配及び共役傾き法を併用してＤＩＳＣＯＶＥＲ（Ｂｉｏｓｙｍ）でエネルギ最少化を行った。ペプチドと５糖類を個別的に８０の誘電率で最少化した後、分子対間に手動的に複合体を形成した。各々の場合、ペプチドからずっと離れて配向されたＡＴIII（参考文献２１参照）に結合するに必要ではない５糖類の硫酸基を維持しようと試みながら、反対に荷電された基の最上の可能な並列を創り出すようにペプチドと５糖類を配向した。それから、複合体を３の誘電率で最少化した。
ヘパリン５糖類単位構造とＬｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１との間に形成された疑似「ドック状態」複合体の立体写真を図３に示す。その写真の低部でＡ1からＫ19に向かって上方に配向されたペプチドは、淡い青色で輪郭を描いており、アミン側鎖官能基は、すべて暗青色でハイライトを与えた。Ｒ6は、ヘリックス構造の維持に必要であるＥ2と臨界イオン対を形成すると仮定される（１６）。５糖類単位構造は、上記写真の低部でＨ単位からＤ単位（Ｌｉｎｄｈａｌらの命名、参考文献４８、及びＡｔｈａら、参考文献４９参照）に向かって上方に配向され、ＡＴIIIに対する結合に必要であると公知の硫酸基（黄色）またはカルボキシル基（赤色）が示されている。結合相互反応に関与していない単位Ｄの２−Ｎ−硫酸基と単位Ｆの６−Ｏ−硫酸塩基は、灰色で示されている。ドック状態の複合体において、ペプチドに相対的である５糖類の配向（Ｈ→ＤまたはＤ→Ｈ）にかかわらず、数多くの臨界陰イオン性基は、ペプチドアミノ酸側鎖に並列されない（Ｄ→Ｈ配向は図示していない）。
ヘパリンの５糖類単位構造とＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２との間に形成された疑似「ドック状態」複合体の立体写真はを図４に示す。ペプチドと５糖類は、図３と同じように配向される。この構造において、結合に必要であると認められた硫酸基及びカルボキシル基は、すべてペプチドのグアニド官能基に空間的に並列配置され、堅固にからみついているヘリックス複合体を形成することに注目すべきである。
モデル化複合体に基づいて、Ｌｙｓ  Ｈｅｌｉｘ＃１がヘパリン結合に乏しいペプチドであると断定することができる。なぜならば、５糖類の硫酸基およびカルボキシル基の大多数は、リジン側鎖の並列配置されたアミノ酸基と製造上の静電接触をしないからである（図３）。リジン側鎖がクーロン反発力を最少化するのに十分に寄与できないことを確かめるに至って、多量の潜在的結合エネルギーが消耗されているように見える。一方、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２と５糖類との間に形成された複合体（図４）は、アルギニン側鎖が、殆ど全て５糖類と決定的に接触していることと、その複合体がエネルギー面で安定性のある堅固なヘリックスをなすことを示す。
［ペプチド開発−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３＆４］
Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２と５糖類とのドック状態複合体に関する厳密な調査によれば、Ｒ18及びＲ5が５糖類の反対に荷電された官能基の近くに空間配置されているように見えない。また、Ｒ5が糖類と生産的な接触をしていないことは明白であるが、Ｒ5がＥ2とのイオン対によるヘリックス構造の維持に必要であることを仮定することができる。
そして、２個の誘導体化合物、即ち、Ｒ18が省略された化合物（Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３；ｓｕｃｃ−ＡＥＡＲＡＲＲＡＡＡＲＡＡＲＲＡ−ＮＨ2）、または、Ｒ5とＲ18の両方が省略された化合物（Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃４；ｓｕｃｃ−ＡＥＡＡＡＲＲＡＡＡＲＡＡＲＲＡ−ＮＨ2）が合成される。Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３がヘパリン結合能を保持していることが期待されたが、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃４があるヘリックス構造を喪失するかも知れないから、ヘパリン結合に効果的ではないだろう。
本発明者らは、ＩＴＣにより測定したように（表２）、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３がＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２またはＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２とほぼ同一の親和力をもってヘパリンを結合させたが、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃４は、ヘパリン結合性が２倍乏しくなったことがわかった。その結果から、一見したところ、モデル化よりなされた予測が確証される。しかし、因子Ｘａ中和分析（図５）において、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３がＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２（Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２より約２倍くらい効果が少ない）より約３倍くらい効果が劣る（ＩＣ50≒２００μＭ）が、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃４は、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２より１００倍以上効果がおとる（ＩＣ50≒＞１０００μＭ）。
図５は、残留因子Ｘａ酵素活性により測定されているように、ヘリックスペプチドのヘパリン／ＡＴIII複合体形成に及ぶ阻止効果を示す。ここで、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３及び＃４をはじめ、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の各種の誘導体間について阻止率を比較する。
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全ての実験は、ｐＨ７．０１の５０ｍＭリン酸塩緩衝液中で３０℃にて行われた。一般的には、３０秒で１０μｌ注入液２０回分を迅速に（４００ｒｐｍ）ペプチド溶液と混合するが、注入の間の平衡時間は２分にした。全ての実験について、指示されたペプチドを０．１０ｍＭで熱量計のキュベットに入れ、ヘパリンを０．５ｍＭの初期濃度で点滴注射器に入れた。ヘパリンを緩衝液のみ（ペプチドの不在下）に注入した後、混合及び希釈の熱についての減算によりすべての等温線を補正した。
生物学的分析により、ＩＴＣに関連した、ヘパリン結合の広い基準となるヘパリン結合事象の選択性が分かっている。。それにもかかわらず、多くの結合活性がＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３については保持されているが、ペプチド構造は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃４は破壊され過ぎており、ペプチド結合が相当に劣る結果となることが分かっている。
実施例２：ＰＴＴおよび因子Ｘａ試験管内分析におけるヘリックスペプチドの効率性
ヘリックスに基づいたペプチドの因子Ｘａ酵素活性を中和する能力は既に議論されている。プロタミンは、試験された化合物の中でもっとも効能のある化合物であるが、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２もヘパリン結合のためのＡＴIIIと有効に競争する。
ヘパリン由来の抗血液凝固作用を反転させるペプチドの能力に関するもっとより適切な測定法は、多分ヒトの混合血漿において行われた、生体外部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）分析であろう。ここで、ヘパリンの一定量を血漿の個々のサンプルに加えて凝固時間を延長した後、プロタミンまたは試験ペプチドを添加して坑血液凝固性ヘパリンと複合体を形成することにより、ヘパリン由来の抗血液凝固作用を反転させる。
そのように試験されたヘリックスペプチドの中で、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のみが、ヘパリン抗血液凝固作用の反転に効果的であった。約８０μＭで、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、ヘパリン由来の抗血液凝固作用の約８０％を反転させる反面、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は比較的に効果的である（図６）。従って、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、また、上記の分析において効果がある。これらの結果は、潜在的な複合体形成部位の数を増加することによりヘパリン結合活性を増加することができると言う前提をさらに立証する。
実施例３：麻酔したモルモットにおけるＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の薬物動力学；ヘパリンを投与したモルモットにおいてプロタミン代替物としてＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２及びＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の生体内効率に関する評価
ヘパリンを投与したモルモット及び投与しなかったモルモットを麻酔したものにおいてＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の血漿クリアランス及び組織分布について研究するために、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の放射標識されたものを合成、精製して、非標識のペプチドと同一の物理化学的性質を有することを証明した。また、その放射線標識されたペプチドは、適定熱量測定法、ＣＤ分光法、及び因子Ｘａ中和分析法によりヘパリと結合することが分かった。合成は、ＦＭＯＣ化学プロトコルに従って行われ、放射線標識されたＡｌａを３種類の異なる配列位置に入れて血漿中に形成されるＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のタンパク質分解による断片の検出を容易にした。そこで、Ａｃ−ＡＥ［Ｕ−14Ｃ］−ＡＲＡＲＲＡ［Ｕ−14Ｃ］−ＡＡＲＡＡＲＲ［Ｕ−14Ｃ］ＡＡＲＡ−ＮＨ2がペプチドｍｇ当たり２×１０6ｃｐｍ（０．５６μＣｉ／μｍｏｌ）で作製された。
ヘパリンを投与した動物または投与しなかった動物に注入するとき（図７Ａ及びＢ）、放射線標識された、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、注入してから１分以内に（１回の循環時間内）最大血漿濃度に到る。この最大血漿濃度は、注入の計算量の約２０％に相当し、動物に注入された総計算値の約２０％になる。ピークに達した後、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の濃度が、２時間にわたって連続的に減少するが、注入後、４時間経過しても、ペプチドの約２．５％が血漿中に残されている。
上記動物を屠殺した後、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、大動脈、および肺動脈を摘出して、切片についてシンチレーション分光法を行った。ペプチドの注入前、実験の間、または屠殺の直前に尿サンプルを採集して、シンチレーション分光法により放射標識のペプチドの存在について検査した後、逆相ＨＰＬＣにより広大な脱タンパク質化に引き次いでオンラインシンチレーション及びＵＶ検出器により各々のサンプルに存在する放射標識のペプチド（または断片）の性質を同定する。
動物において、小さい百分率のペプチドが検査した各種の器官に対してクリアするが（図８及び９）、多くても、腎臓と肝臓両者は注入したペプチドのほんの４％を占めに過ぎない。注入後２４０分での際、腎臓において隔絶したペプチドの最高パーセントが示されたが、器官分布は１分での場合はより相当に低い。
この事実は、回収されたペプチドの殆ど（１４％）が４時間の過程にわたって尿へだんだんクリアされる（図１０）という点から理解できる。注入されたＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２による大多数が、検査した各種器官系において説明されないのは興味深いが、プロタミン及び血小板因子４については真実である（４４）。
図８は、ヘパリンを投与しなかった、麻酔したモルモットにおける放射線標識のＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の器官分布を示す。ペプチド（3.77mg/kg）を３匹の異なる動物に注入した。指示された時間に、動物を屠殺させ、シンチレーション分光法を適用した器官の各部分の重量をはかった。その結果を器官の総重量当たり動物へ注入され局所化された総数の百分率として換算する。
図９は、ヘパリンを投与した、麻酔したモルモットにおける放射線標識のＡｒｇ Ｈｅｌｉｘ＃２の器官分布を示す。３匹の動物についてペプチド（３．７７ｍｇ／ｋｇ）の注入５分前にヘパリン投与（５０ユニット／ｋｇ）した。指示された時間に、その動物を屠殺し、器官の放射能を定量化した。その結果を器官の総重量当たり動物に注入された局所化された総数の百分率として換算する。
図１０は、麻酔したモルモットの尿への放射線標識されたＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のクリアランスを示す。麻酔した動物にペプチド（３．７ｍｇ／ｋｇ）を注入した。２時間及び４時間に、尿サンプルを得てシンチレーション分光を行った。ヘパリンを投与した動物とヘパリンを投与しなかった動物に対して、注入された総ｃｐｍの百分率を算出する。
ヘパリンを投与した動物においては、注入後４時間経過時でもペプチドは器官にほとんど存在しなく、尿中の総放射能が２〜４時間に減少する。したがって、上記の結果から、ヘパリンと複合体を形成したら、その複合体のクリアランスのメカニズムはペプチドのみのクリアランスのメカニズムとは異なっていることが証明される。
［尿中で発見されたＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２由来の放射線標識の断片についての特性化］
Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２がタンパク質分解されたか否かを決定するために、ペプチド５．７７ｍｇ／ｋｇを注入した、ヘパリンを投与しなかった動物から得た尿の分取量を、アセトニトリル（１：１）で、次に１ＮのＨＣｌの中で３分間沸騰させ、最終的には、限外ろ過（５０００ＮＭＷＣＯ）により連続処理することにより脱タンパク質化して尿の高分子量成分を除去した。その次に、濃厚なサンプルについて逆相ＨＰＬＣを行って放射線標識の成分を分解し、確認した。図示したように（図１１）、サンプルの脱タンパク質化についての広大な試みにもかかわらず、ＵＶトレース（上部パネル）はさらに、成分を吸収する多数のＵＶの存在を示す。しかし、シンチレーショントレース（下部パネル）は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２由来のただ２つの放射線標識の断片（２６分に上記勾配で溶出される）を示す。アミノ酸組成及び配列分析により両断片を特微付ける試みを行うが、製剤において関連のないタンパク質／ペプチド成分が連続的に存在することにより生成物の絶対的な同定が妨げる。
従って、このとき、完全なペプチドが尿へ排出されず、またＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２由来のタンパク質分解断片のみが腎臓を通じて濾過されることと断定しても差し支えない。放射線標識のペプチド断片をさらに分解、分離するために精製（正常相ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、強陽イオン交換クロマトグラフィ）の追加段階を後続実験に入れた後、アミノ酸分析及び／またはＥＳ／ＭＳ技法により明白に同定する。次いで、タンパク質分解的に耐性のある結合をペプチドに混入させて血漿半減期を延長することを試みる。
図１１は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２由来の放射線標識された断片の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。ヘパリンを投与しなかった動物から４時間後に収集した尿に関する分析の結果が示される（２時間後に収集した尿から得た結果とほぼ同一である）。脱タンパク質化尿に対してＣ１８カラム（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、４．５ｍｍ×２５ｃｍ；５ミクロン）上で逆相ＨＰＬＣを適用し、１０％溶媒Ａから８０％溶媒Ｂ（溶媒Ａ：水中の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロアセト酸（ＴＦＡ）；溶媒Ｂ：水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中の８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリド）の線状勾配（３５分；１ｍｌ／分）で展開させる。上部パネルは、得られたＵＶトレース（ＯＤ２２０ｍｎ）を複製する；下部パネルは、得られた連続のシンチレーション分光を示す。上記カラムの通過容量（ｂｒｅａｋ−ｄｏｗｎ）で溶出される二つの放射線標識のペプチド断片が得られる。Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２が上記の勾配において２６分で溶出される（矢印）。
実施例３：Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２が生体内ヘパリン抗血液凝固作用を効果的に反転させる。
本発明者らは、また、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２が生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）血漿ＰＴＴ分析の結果により予測されたように、ヘパリン由来の抗血液凝固作用を反転させることができるか否かについて調査した。この実験の結果は、図１２に示す。
本実施例においては、ヘパリン（３５ユニット／ｋｇ）をＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２１９．３ｍｇ／ｋｇの注入５分前に成熟のモルモットに静脈内投与する。ヘパリンは、ＰＴＴにおいて即時の持続された増加を誘発し、だんだん循環からクリアされるが、ＰＴＴは６０分後にもまだ上昇された。図示されているように、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、４２秒に凝固時間を即時に回復（１分以内）させ、モルモットはほぼ正常であった。
したがって、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、生体内ヘパリン抗血液凝固作用の反転に有効であって、プロタミン代替薬物として大きく期待できる。
実施例４：培養された大動脈平滑筋細胞におけるヘリックスペプチドの毒性効果；平滑筋細胞増殖に対するヘパリンに誘導された抑制に及ぶヘリックスペプチドの効果
平滑筋細胞が、血管平滑筋細胞の増殖抑制因子であるヘパリン様化合物を生産する。これらのヘパリン様化合物は、血管傷害部位で混乱される血管緊張の維持に制御的役割を果たす。プロタミンは、培養された平滑筋細胞の増殖を刺激し、ネズミにおいて平滑筋増殖性病変を悪化させ、ヘパリン由来の平滑筋細胞増殖抑制作用を完全に反転させることが証明された（４１、４２）。ヘリックスペプチドが培養された大動脈平滑筋細胞の毒性（溶解を誘発）となるか否か、ヘリックスペプチドがヘパリン（または１９で言及されたように製造した各種のヘパリン置換体）の有効な増殖抑制作用を拮抗するか否かを決定した。屠殺したウシからの大動脈をＰｅｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｉｎｃ．（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｒｏｃｋ，ＡＲ）から得て、一晩中特急配達によりアイス上に保管して実験室へ運送した。平滑筋細胞の初代培養物をＥｄｅｌｍａｎら（４１、４２）により記載されたように製造した。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に富んだＤＭＥＭ培地に移し、付着性細胞を平滑筋細胞として形態学的に分類して平滑筋細胞アクチン（ＲＢＨから購入できるフォトス）に対する抗体で染色した。その細胞は、ネガティブコントロールとして働くミオシンに対する抗体では染色されない。これらの基準によれば、付着性細胞は平滑筋細胞である。
図１３は、試験ペプチドの大動脈平滑筋細胞の生存力に及ぶ効果を示す。これらの分析の場合、５次継代した大動脈平滑筋細胞をトリプシン処理をし、計数し、９６ウェルミクロリットルプレートのウェル当たり約１０００個の細胞となるよう添加した。この細胞は、ペンストレプ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）及び０．４％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有のＤＭＥＭ培地中で２日間増殖を止めさせた。その欠乏性培地を除去し、その代わりに１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有し、試験ペプチド添加または無添加の培地を使用した。試験ペプチドは、プロタミン、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２及びＫ121−Ａ134ペプチドを最終濃度で５、５０、または５００μｇ／ｍｌで含んでいる。上記の細胞をもう４日間増殖させた後、酵素に基づいた分析系（ｃｙｔｏＴｏｘ９６非放射線活性細胞毒性分析キット、プロメガ社；製造業者当たり試行）を用いて溶解細胞の百分率を測定した。細胞溶解率は、３回測定の平均値±１ｓ．ｄ．として示される。
毒性試験においては、培地のみで増殖させた細胞に比べて、試験濃度毎にプロタミンは、培養された平滑筋細胞を顕著に溶解させた（図１３）。対照的に、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２、またはＫ121−Ａ134ペプチドは、中くらいの細胞溶解を誘発させるにすぎなかった。試験製剤の存在の下で培養時間を長くすればするほど（１０日以下）、プロタミンは、５０μｇ／ｍｌで６５％以上の細胞溶解を起こしたが、一方、ヘリックスペプチドは、追加の細胞溶解を起こさなかった（データは図示されてない）。従って、ヘパリン抗血液凝固作用を反転させるためにはより多量のヘリックスペプチドが要求され得るが、使用された量は血管平滑筋細胞の溶解を起こさないだろうと予想される。
ヘパリン由来の平滑筋細胞増殖抑制作用を反転させるヘリックスペプチドの能力を評価するために、先ず、平滑筋細胞増殖におけるヘパリンの効果を確定した。５次継代後、トリプシン処理により平滑筋細胞を収集し、図１２の説明文に記載したように、２日間増殖を止めさせ、ウェル当たり約１０００個の細胞をプレーティングした。次いで、細胞をヘパリンの量を増加しながら、（またはヘパリンを添加しないで）６日間増殖させた。投与量依存的に、ヘパリンは平滑筋細胞の増殖を抑制する（表３）。このような効果は、培養時間を延ばすことによりもっと著しくなるが、比較の容易のため、表３における結果は全て、ヘパリン及び／または試験ペプチドの存在の下で６日間増殖したことを現す。
次に、プロタミン、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２、＃３、＃４またはＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２が、ヘパリンを結合する固有の能力に起因してヘパリン由来の平滑筋細胞増殖抑制を反転することができたことを測定した。示されているように（表３）、試験製剤の中、プロタミンのみがヘパリン由来の細胞増殖の抑制作用を完全に反転させた。試験ヘリックスペプチドの中、いずれも５００μｇ／ｍｌ以下の濃度でヘパリン抑制に伴う細胞増殖を回復した。おもしろいことには、２個のβ−ストランドペプチド、即ちＡＴIIIの１次配列に基づいたＫ121−Ａ134（２０、２１）、及びフォンビレブラント因子の１次配列に基づいたＫ569−Ｉ580（１７、１８）は、ヘパリン由来の細胞増殖抑制作用の反転において適度に効果的である。それで、予測してみると、平滑筋細胞増殖抑制作用を中介するヘパリンの単位構造がα−ヘリックス上でよりβ−ヘリックス上で存在する陽イオン性基に対してもっと相補的である。より重要なことは、ヘリックスペプチドが、平滑筋細胞増殖抑制ヘパリン類を結合しないので、ヘパリンの上記の所望の特性をほとんど干渉しないということを結論できる。
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酵素に基づいた分析系：細胞タイター９６水性非放射活性細胞増殖分析（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて細胞増殖を測定した。代謝的に活性のある細胞に存在するデヒドロゲナーゼ酵素により、着色産物に対する外来添加の基質の転換を行う。
要約すると、上記実験により、ヘリックスに基づいたペプチドは、ヘパリンの結合及びその抗血液凝固効果の反転のためプロタミンより効果が劣る一方、平滑筋細胞に対して非毒性であり、ヘパリン由来の平滑筋細胞増殖抑制作用を拮抗しないし、ヘパリンの効果を反転させる生体内機能を発揮する。なお、ヘリックスに基づいたペプチドは、肝臓を通してクリアされる組換え血小板因子４について観察されたことと異なっているに違いないメカニズムにおいて、血漿から大部分尿へクリアされる（４４）。最終的に、ヘリックスペプチドの多数の複製物がこれらの生体内有効度を顕著に増加させることも立証された。
実施例５：生体物理学的方法（円偏光２色性分光法、等温適定熱量測定法）及び競争的結合分析により新規なアンタゴニストの効能を確定する
Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２に関してヘパリン結合能力を増加させるための一環としてＢｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２を製造した。その結果は、結合配列の多数の複製物が因子Ｘａ及びＰＴＴ分析においてヘパリン結合及び効能を向上させるという仮説を支持する。しかし、生体内製剤として、Ｂｉｓ−Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、ヘパリン由来の抗血液凝固作用の反転のためのプロタミンより効能が劣る。従って、副作用を起こさず、生体内効力を向上させようとする際、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３の３、４、５、６、または８個の複製物を融合するペプチドの生物学的効力が決定される。
［方法］
本質的に前述したように（１６−２１）、ｔＢＯＣまたはＦＭＯＣ化学反応（また、特定の場合、直交の合成計画案において両方の化学反応を使用する）を用いた自動化固相手順により全てのペプチドの合成を行う。ペプチドは、全て必要に応じて、他のクロマトグラフィーとともに調製用逆相ＨＰＬＣによりＮ−末断均質性になるよう精製する。各々のペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣ、定量的アミノ酸組成分析、自動化Ｎ−末端配列分析により、ある場合には、質量分光分析により測る。円偏光２色性分光法を日常的に使用して（１６〜１８、２１）、ペプチドを結合しながらヘパリンの複合体形成（または解離）の際に生じる２次構造要素の再分配を特定化する。短鎖のペプチド及びリガンドを伴う結合結果物を定量するため等温適定熱量測定法を使用する手順は、本実験書（１８、２０、２１、４８）に詳しく説明されており、これを成功的に応用して各種のペプチドとヘパリンとの間の結合反応を定量した（１８、２０、２１）。単一の実験から、結合定数と、複合体形成のギブス自由エネルギ（△Ｇ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対するエンタルピー（△Ｈ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びエントロピー（△Ｓ，ｅｕ）の貢献度を決定する。ペプチドの当量当たり結合されたリガンド分子（ヘパリン）の化学量論量も、１５、０００の単位ヘパリンポリマー分子量を使用して決定する（１９）。分別されなかったヘパリンに結合する天然ＡＴIIIと競争する合成ペプチドの能力を測定するために、本発明者らは、Ｔｅｉｅｎら（５１）のヘパリン分析に基づいた競争的結合分析法を開発した（２０）。この分析法は、因子Ｘ（Ｘａ）酵素活性の中和によりヘパリン−抗トロンビン複合体形成について測定する。簡略には、ヘパリン（２８ｎＭ）、精製の人体ＡＴIII（２８０ｎＭ）及び試験ペプチド（０〜１０μＭ）を共に、マイクロリットルプレートのウェルで室温にて１５分間保温させる。次に、因子Ｘａ及びこの因子Ｘａの色素代替物を順次的に添加し、因子Ｘａの残留活性を熱量測定により測る。ヘパリンの抗トロンビン領域に対するペプチドの結合は、ヘパリン−抗トロンビン複合体の形成を減少し、その結果、残留Ｘａ活性が観察される。ペプチドによる抑制度は、ペプチドの不在下、ヘパリン−抗トロンビン複合体活性の減少百分率として算出する（２１、２２）。
［作製された新規の構造物］
Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３の繰り返し単位を有する３個の構造物を作製するが、これらの構造物において、ペプチドの３、４、５、または８個の複製物が単一のＣ−末端エーテル残基へ融合される。Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃３が合成単位として選択される。その理由は、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２より鎖長が短く（それで、製造がもっと容易である）、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２の結合活性の８０％を保有するためである。上記の３個の構造物は、Ｌｙｓ−βＡｌａ−ＷＡＮＧ合成樹脂コア上に造り上げられるが、この構造物において、α−及びε−アミノ基も適切に保護されたＬｙｓ残基により置換されている。このようにして、標的ペプチドの多数の複製物が融合されることができる「アーム（Ａｒｍｓ）」が創り出される。一旦合成されたら、分解及び精製を比較的に直接進ませる。単一の合成により、典型的に、全て必須的な生体物理学的及び生物学的分析を遂行するに十分な最終生成物が４００ｍｇ得られる。ヘパリンに対する潜在的により高い親和性を有する付加的ヘリックスペプチドを創り出すが、このヘリックスの陽イオン性面上に存在するＡｒｇ残基の配列空間及び／または数が増加される。即ち、少なくとも１種以上のヘリックスを提供するためヘリックスの鎖長を実際的に増加することにより、末端の５糖類単位の硫酸塩に空間配置されたＡｒｇ残基が与えられるが、その中で少なくとも一つがＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２／糖類ドック状態構造において静電気的に接触しないように見える。従って、。Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃５（スクシニル−ＡＥＡＲＡＲＲＡＡＡＲＡＡＲＲＡＡＡＲＲＡ−ＮＨ2）が合成されるが、これは上記の硫酸基とマッチする位置で追加のＡｒｇ残基を置かなければならない。
実施例６：血漿に基づいた試験管内分析及び動的動物モデルを用いて新規なヘパリンアンタゴニストの効力及び特異性を確認する
本発明のペプチドのプロタミン代替物としての有用性をさらに評価するために、これらの生体内効能を臨床的に該当する環境で実証することができる。
［方法］
試験管内ＰＴＴ及び因子Ｘａ分析において、一定投与量のプロタミンまたはペプチドアンタゴニストをヘパリンを添加（０．２５ユニット／ｍｌ）混合人体血漿に加え、自動化フィブロメーター及びシムプラスチンII試薬を用いてＰＴＴ分析を行う。同一の分取量を取って（ＰＴＴ試薬を添加する前）、因子Ｘａ分析により残留ヘパリン活性を測定する（１９、２１、２２）。これらの二つの分析は相補的である：ＰＴＴは、ヘパリン−トロンビンの直接相互反応及びヘパリン補因子IIの効果のみではなくＡＴIIIの触媒作用を含めて、ヘパリンの抗トロンビン効果の広範な測定である。残留Ｘａ活性は、試験ペプチドによるＡＴIII複合体形成の特異的抑制を示す。生体内モデルにおいて、ヘパリンの一定量を試験アゴニストの注入５分前に頸静脈を通じて麻酔したモルモットに注射する。ヘパリンの動力学及び特性を上述のようなＰＴＴ及び因子Ｘａ活性の時間測定により決定する。
［分析／解釈］
試験管内研究の場合、投与量反応曲線を図２及び５に示したように作成し、正常値に対するＰＴＴまたはＸａ活性の９０％回復を達成するに要するペプチドの投与量を算出する。動物モデルについては、１０分に９０％の回復を与えるペプチドの投与量を算出する。生体内実験の成功的な結果は、ヘパリンの抗血液凝固効果の投与量−反応中和である。
実施例７：平滑筋増殖性モデルにおけるヘパリンの増殖抑制効果のヘパリンアンタゴニストの相対的干渉に関する決定および培養された血管平滑筋細胞に対する毒性の評価
上述のように、プロタミン処理の主な問題点は、プロタミンが全てのヘパリンと無差別に結合して、内因性または外因性ヘパリンにより提供された平滑筋細胞増殖抑制活性の有利な阻止を無効にするということである。このようにして、プロタミンは、血管傷害の部位で病変（及び再狭搾）を招く平滑筋細胞増殖を実際的に促進する。本発明のヘリックスに基づいたペプチドは、ヘパリン由来の平滑筋細胞増殖を干渉しないし（図１２）、培養された血管平滑筋細胞の増殖に対して毒性ではない（表３）。この実験は、ヘリックスペプチド及び培養された血管平滑筋細胞上の後続の誘導体の生物学的効果をさらに評価する。
［方法］
平滑筋細胞増殖に対する試験ペプチド（及びプロタミン）の効果について、ウシの大動脈より培養された血管平滑筋細胞上で測定する。簡略に言うと、ウシ胎児血清に富んだ培地を使ってＧo相から放出された培養細胞をヘパリンを添加した、または添加しなかった試験ペプチドまたはプロタミンの増加濃度に露出させる。６日間増殖した後、細胞を洗浄してトリプシン処理により回収し、非放射活性酵素分解分析（プロメガ水性非放射活性細胞増殖分析、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｒｉｖｅ  Ａｓｓａｙ）により細胞数を測定する。この分析において、ヘパリンの存在下での抑制またはウシ胎児血清を含有する培地における成長に関して試験アゴニスト（プロタミンまたはペプチド）の存在に起因する抑制の反転を計算する。
非放射活性酵素分析により平滑筋細胞生存能力についても評価する。ウシ胎児血清に富んだ培地を使用してＧo相から細胞を放出させ、濃度を増加した試験ペプチドまたはプロタミンに露出させる。４日経過後、酵素に基づいた分析系（Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ９６非放射活性細胞毒性分析キット、プロメガ社）を用いて培地のみにおける増殖に対して溶解細胞の百分率を決定する。ペプチドアゴニストの投与量をそれぞれ少なくとも３回繰り返しをする。
「分析／解釈］
ヘリックスに基づいたペプチドは、ヘパリンの抗平滑筋増殖性単位構造を認識しない。追加のデータによれば、上記単位構造が抗血液凝固性５糖類単位構造またはフォンヴィレブラント因子結合単位構造のいずれかから化学的に独特であることが示される。本発明者らにより収集されたデータは、上記の三つの単位構造（抗平滑筋細胞増殖性単位構造、ＡＴIII５糖類単位構造、及びＶＷＦ単位構造）が同一のヘパリンポリマー鎖上に存在することができるが、重複していない明瞭な部位であることを示す。したがって、ヘリックスに基づいたペプチドは、抗血液凝固性ヘパリンに対する結合能を明白に保有するが、平滑筋細胞増殖を刺激するか、ヘパリンの細胞成長の抑制制御に影響を及ぼさない。
実施例８：リードヘパリンアンタゴニストの薬物動力学を最適化するその構造工学：タンパク質分解的に感受性のある結合の代替
ヘリックスペプチドのＮ−及びＣ−末端をそれぞれ、アシル化及びアミド化して血漿産出のアミノ−またはカルボキシルペプチダーゼによる分解を防ぐ。しかし、図示されているように（図７〜１１）、放射線標識のＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２は、血漿から迅速にクリアされ、回収されたペプチドの大部分が尿で排出される。尿中で回収された放射線標識の断片の同一性がまだ決定されていないが、注入後２または４時間に尿中で完全なペプチドが発見されなかったことは明かである。したがって、そのペプチドはタンパク質分解されている。高い陽イオン性電荷密度の表面がヘパリンとペプチドとの間の結合を介しているため、全ての（Ｄ）配置のペプチド（これはその表面がペプチド骨格の反対「側」上に存在する反転ヘリックスだろう）が、全ての（Ｌ）配置のペプチドと同じ作用を有するであろう。選択的に、Ａｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２のタンパク質分解部位の決定により、ペプチド配列内のタンパク質分解的に耐性のある結合（還元された、Ψペプチド結合；Ｎ−メチルペプチド結合）の混入が行われる。
［方法］
脱タンパク質化尿サンプルから十分に純粋な放射線標識の断片を得るために追加のステップが必要になる。これらの段階には、正常の相シリカクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または強陽イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせが含まれる；その荷電されたペプチド断片は、尿の高分子量タパク質／ペプチド成分から溶解されそうである。いったん単一ピークに精製されたら（逆相ＨＰＬＣ上で）、アミノ酸、Ｎ−末端配列、及び／または質量分光分析により上記断片の同定を行う。
全ての（Ｄ）配位のペプチドの合成は、全ての（Ｌ）配位のペプチドの合成より困難ではない（もっと高価であるのみ）。Ｎ−メチルまたは環元されたΨ−ペプチド結合誘導体の作製は、本質的に、他のペプチド同族体の製造（５２）について記載したように行われる。
いったん合成経路が確定されたら、放射線標識のペプチドを製造するが、そのペプチドには、ペプチド合成中に特定鎖位置にある特別な放射線標識のアミノ酸（例えば、Ｌ−［Ｕ−14Ｃ］−Ａｌａ）が混入される。次いで、この放射線標識のペプチドを上述のように、麻酔したモルモットに投与して、時間の経過によって、血液と尿のサンプルを採集する。屠殺の際、器官サンプルを得る。各々のサンプルの分取量についてシンチレーション分光法により計数し、尿（または血漿）の追加の分取量を集中的に脱タンパク質化し、分解産物の同定（もしあれば）を上述のように確認する。
［分析／解釈］
タンパク質分解的に耐性のある結合におけるエンジニアリングにより、血漿中でリードヘリックス化合物の半減期を延ばす。多量の注入された放射線標識のＡｒｇ  Ｈｅｌｉｘ＃２について血漿中でまたは検査された組織サンプル中で計数することができない反面、放射線標識のプロタミンまたは放射線標識の組換え血小板因子４の注入について同一の作用が観察された（４４）。循環からの放射線標識のクリアランス率を定量し、循環において放射線標識のペプチドから得られた分解産物の同定を決定する。
実施例９：心臓血管系手術のイヌモデルにおけるヘパリン結合ペプチドの効力及び毒性の測定：急性毒性の定量−血行動態学及び血液細胞
プロタミンの急性心臓血管系及び血液学的毒性は、新規なヘパリンアンタゴニストの開発の原因となる推進力である。従って、リード化合物は、心臓血管系手術の既定のイヌモデルにおいて評価することができる。プロタミンと各々のリード化合物の間に血小板及び白血球細胞数における衰微と血行動態学的副作用について比較をすることができる。
［一般的方法］
Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（５３）により記載され、実証されたイヌモデルの変形方法を使用する。雌のモングレル種イヌ（１２〜１５ｋｇ）をペントバルビタルナトリウム１５ｍｇ／ｋｇにより麻酔し、挿管し、機械的に換気した後、血行動態学的及び凝血のモニターのために完全に機器化する。各々の実験には標準ヘパリン化（１００Ｕ／ｋｇ）が伴われる。安定化した後、プロタミン（１ｍｇ／ｋｇ）またはリードアンタゴニスト（試験管内作業により決められた最適投与量）を迅速に（１０秒）ボラス静脈注射して血行動態学的効果を最大にする。
［血行動態学的方法］
実時間測定は次のようである：大動脈カテーテルにより平均大動脈圧（ＭＡＰ）、心泊数（ＨＲ）、及び全身大動脈飽和度（ＳａＯ2）；スワン−ガンズ酸素濃度計カテーテルにより肺動脈収縮期及び拡張期圧力（ＰＡＳ／ＰＡＤ）および混合静脈飽和度（ＳｖＯ2）；肺動脈に対する電磁流量プローブにより心拍出量（ＣＯ）；フィック方程式［流量Ｘ  Ｈｇｂ  Ｘ１．３４（ＳａＯ2−ＳｖＯ2）］により全身酸素消耗量（ＶＯ2）。測定時間は、ヘパリン注入前、ヘパリン注入後であるが、反転の３分前、次に５分間に毎３０秒毎に、１０、１５、及び３０分にて行う。以前の研究によれば、上記の時間間隔が相当な血行動態学的変化を捕まえるに最適であることが現れる。
［血小板減少症及び白血球減少症］
コウルター計数器により血小板数及び白血球細胞数の測定のために静脈血サンプルをヘパリンの反転から−３、３、１０及び３０分に採集する。
［分析／解釈］
アンタゴニストをそれぞれ５〜７匹の異なるイヌに対して試験する。動物を回復させ、別個の週に無作為に各々の化合物について独立的に試験する。各々の動物に対して、その動物を屠殺する前にプロタミンを加えた一定の２〜３個のリード化合物（対照群）を４回試験する。毒性の総点数（ＴＴＳ−参考文献５３）は、各々のアンタゴニストの血行動態学的毒性が薬物投与後、最初５分内にＭＡＰ、Ｃｏ，ＶＯ2、及びＨＲにおける最大変化から誘導されたことを要約する。血小板及び白血球細胞における変化の場合のように、パラメーターそれぞれについての個別的比較をも行う。そのリードペプチドは、ヘパリンに比べて、相当に少ない血行動態学的血圧降下と少ない血小板減少症及び白血球減少症を現す。
実施例１０：全動物モデルにおけるヘパリンアンタゴニストの凝血効力に関する評価
本実験は、上記提示された試験管内実験の高次構造：リード化合物が心臓血管系手術の該当モデルにおいて凝血競争作用を回復する効率性の実際的な生体内における高次構造を提供する。
［方法］
上述のような同一のモデルと製剤を使用する。血行動態のモニターを行いながら、同時に凝血試験用静脈サンプルをヘパリンの反転から−３、３、１０及び３０分で分析する。この研究には、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、ＰＴＴ、血漿抗Ｘａ活性、及び出血時間が含まれる。３匹の追加の対照動物にアンタニゴストの代わりに塩水プラセボとともにヘパリンのみを与える。
また、心臓血管系組織移植止血のための手術モデルについて安楽死前の各々のイヌの最終実験を行う。試験ペプチドとプロタミンは、各々の動物に対する一連の試験中最終試験で５〜７匹の異なる動物について無作為に試験するため、手術モデルは、各々のアンタゴニストのための手術用モデルの５〜７回試験するようする。これらの実験において、全身麻酔の下で、大腿部大動脈を摘出して調整した後、ヘパリン処理する間、汚れてない、多孔性結合ダクロン組織移植片（１０×５ｍｍ）のアンレーパッチを縦動脈切開術で縫合する。パッチした体節を通す流量の回復後、ヘパリンをアンタゴニストで反転させる。経験によれば、ヘパリンの不在下で、上記ダクロンパッチが相当に出血し、その次に組織移植間隙にフィブリンを密封すると、止まる。外科手術場から吸引することにより出血液の総量を定量し、組織移植止血に対する時間も記録する。このモデルは、血補欠分子族の界面反応をはじめ、心臓血管系手術中に直面した実際の凝血挑戦者の現実的な推定である。
［分析／解釈］
ヘパリン単独、プロタミン、リード化合物の間に時間間隔をおいて凝血パラメータの比較を行う。異なるアンタゴニストの臨床的、実際的な効力を比較するために、出血の総損失から誘導された出血指数とパッチ組織移植の止血時間を使用する。個別の試験管内凝血分析が、止血の臨床モデルにおいてアンタゴニストの作用的効力を正確に反映することができないほど、上記パラメータは重要である。
実施例１１：免疫原性を含んだ急性及び反復投与毒性研究
本実験は、上薬理学的投与量の効果、及びペプチドアンタゴニストによる免疫感作の効能について評価する。
［方法］
５匹の雌雄のモルモットの群と３匹の雌雄のウサギの群（軽く麻酔して）に対して試験化合物を１回９０分静脈注入した。予知の投与量は、二つの異なる実験において化合物０（プラセボ）、１、及び１０ｍｇ／ｋｇ／分である。血圧及び脈拍、止血試験についての静脈血サンプル、血小板及び白血球細胞数、及び急性溶血現象の証拠をモニターすることにより直接効果を評価する。上記動物を注入の後１４日間観察した後、死後観察し、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、脳、及び骨格筋に対する肉眼的または組織的変化を調査する。
反復投与研究において、雌雄のモルモットとウサギを４群に分ける。１群に対してプラセボ投与し、他の群に対しては、試験化合物の投与量（ｍｇ／ｋｇ／日水準で）を増量しながら投与する。その投与量を２週間毎日繰り返しをした後、死後、上記動物に対して、組織の肉眼組織化学的または形態学的変化を調査する。その急性及び反復投与実験の後、動物から採集した血清に対して、通常の固相ＥＬＩＳＡ分析法を用いた注入ペプチドに対する抗体試験を定期的に行う。上記分析法においては、ペプチドをプレートに固定化し、２次抗体を用いて結合されたウサギまたはモルモット血清抗体を検出する。
［分析／解釈］
本発明のヘリックスに基づいてペプチドは、既に麻酔したモルモット及び培養された血管系平滑筋細胞に対して非毒性であると立証された。
種々の特定材料、手順及び実施例を参考にして本発明を詳細に説明しているが、本発明がその目的のために選択された特定の材料、材料の併用、及び手順に制限されることないと解釈すべきである。そのような詳細な説明を別に変更することができ、その変更は本分野の当業者には了解されるべきものである。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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