(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシのClaudin-16欠損症タイプ２を診断するための遺伝子診断法であって、
前記ウシのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号1に示される第651位に相当する配列番号3の第15811位から5’側に56kbが欠失した、ウシのClaudin-16欠損症タイプ２の欠失変異の有無を調べる工程を含むことを特徴とする遺伝子診断法。
【請求項２】
工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程と、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、配列番号1に示される第651位に相当する配列番号3の第15811位から5’側に56kbが欠失した、ウシのClaudin-16欠損症タイプ２の欠失変異を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程と、
工程（ｃ）：工程（ｂ）にて得られた核酸断片について前記領域の欠失変異の有無を調べる工程と、
を含むウシのClaudin-16欠損症タイプ２の遺伝子診断法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅反応がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって行なわれることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子診断法。
【請求項４】
ウシのClaudin-16欠損症タイプ２の欠失変異を検出するためのキットであって、
配列番号1に示される第651位に相当する配列番号3の第15811位から5’側に56kbが欠失した、ウシのClaudin-16欠損症タイプ２の欠失変異を含む領域を、遺伝子増幅反応により増幅させるためのプライマーを含むキット。
【請求項５】
前記プライマーは、配列番号４又は配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法（又は検出方法）、そのための装置またはキット、もしくはそれらの構成要素（例えば遺伝子診断試薬、プロ−ブ、プライマー、ヌクレオチド配列など）、に関する。
【０００２】
【発明に関わる語句の定義】
本明細書において、「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６」はＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子が転写され翻訳されて生成したタンパク質を意味し、「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子」はＣｌａｕｄｉｎ−１６をコードしている翻訳領域のエクソン部分、隣接している非翻訳領域のエクソン部分、それらのイントロン部分、該遺伝子の発現の制御に関わる領域に加え、本疾患に関連する変異部分が含まれるＤＮＡの領域を意味する。「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１」とは、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症というべき遺伝病のうち、特開２０００−２７０８８０（特願平１１−０８４３７３）「ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法」なる日本の特許出願公開文献（公開日：平成１２年１０月３日）にて公知とされた遺伝子診断技術によりそのキャリアではないことの判定を直接可能にされたタイプのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症を指す。一方、「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２」とは、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症というべき遺伝病でありながら、かかる「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１」用の遺伝子診断技術（結果論的に言えば、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の、例えば１〜６２９位までの領域しか調べないものや、例えば１〜６５０位までの領域しか調べないもの）では正常と判定されるのに、タイプ１キャリア牛と交配すると、劣性遺伝であるＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症を発症してしまうものであり、従ってタイプ１とは異なる特定の変異をＣｌａｕｄｉｎ−１６に有するはずのものである（但し誤解のないように言えば、ここで述べた「６５０」という数値は、特にこれが公知技術で特定されていたというわけではなく、本発明の結果から逆に特定されたというべきである）。そして、現実にこの「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２」は、「Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１」と同様な先天性腎尿細管形成不全を主徴とする常染色体性劣性遺伝病であるばかりでなく、臨床的には発育不良、背湾姿勢、過長蹄などを呈し、生化学的特徴として血液中のＢＵＮ（尿素態窒素）値及びクレアチニン値の高い疾患である。
【０００３】
【従来の技術】
１９９８年以降、和牛において、上記Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１の遺伝子診断法（特願平１１−０８４３７３）によりキャリアではなく正常と判定されたウシとタイプ１キャリア牛との交配による発症が本発明者らによって初めて見出された。すなわち、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１に認められた欠失の変異とは異なるＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子のここでいうタイプ２の変異の存在を本発明者らは予想した。
このＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２キャリアのウシは、すでに確立されているＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１の遺伝子診断では検出できないため、間違って正常と診断され、和牛集団中にタイプ２の変異が広がる可能性がある。したがってＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１の遺伝子診断だけでは本疾患の発生を未然に防ぐ上では問題を有している。しかしながら、これまで即ち本発明がなされるまで、上記Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の診断を遺伝子レベルで合理的に行うための技術は知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】
したがって、本発明の主な目的は、上述した従来技術の問題点を解消するため、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法（遺伝子検出法）や、そのための新規且つ有効な各種手段またはその構成要素を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を予防する手段の１つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避けるという方法が考えられる。そのためにはウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけだす必要がある。異常を持つウシの疾患遺伝子が正常なものに比べてどのように変異しているかを明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立することができる。その効果としては、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２のキャリアーをスクリーニングすることによって今後の本疾患の発生を未然に防ぐことができる。
本発明者らの研究成果を本発明との関連で概して言えば、それは、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子内の約５６ｋｂに及ぶ新規なタイプ２というＤＮＡ欠損を見出し、この欠損によりＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１と同様にＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子が発現していないことが本疾患即ち欠損症タイプ２の原因であることを見出し特定したことと、かかるタイプ２というＤＮＡ欠損を効率的にスクリーニングするための方法の確立、及び、そのための各種キットや、その構成要素としてのヌクレオチド配列といったツールの提案にあると言えよう。より具体的に言えば、まず、タイプ２のＤＮＡ欠損では、タイプ１におけるＤＮＡ欠損の領域と比べてさらにセントロメア側に１８．５ｋｂ、テロメア側４８０ｂｐまで欠損領域が計１９ｋｂ拡大しており、この拡大した欠損領域内にタイプ１診断用に設定されたオリゴヌクレオチドプライマー配列が含まれていた。したがって、タイプ１の診断とは別に、タイプ２の変異を検出するための該遺伝子上に設定した特定のオリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、かかる変異が検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
結果として、本発明として把握できる態様としては、例えば以下の（１）〜（１８）のいずれかのように記載できる。
態様（１）：  工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程と、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程と、
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
とを含むウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法であって、前記領域が、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の１〜６５１位を含む領域である、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法。
態様（２）：  遺伝子増幅反応が、ＰＣＲ法によって行われるものである、前記態様（１）に記載の遺伝子診断法。
態様（３）：  変異の存在をＰＣＲ増幅により調べることを特徴とする前記態様（１）〜（２）のいずれかに記載の遺伝子診断法。
態様（４）：  核酸試料がゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む試料である前記態様（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子診断法。
【０００７】
態様（５）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
態様（６）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、１０〜５０個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
態様（７）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、該オリゴヌクレオチドプライマーが、（一）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（二）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであって、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーは、１０〜５０個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
態様（８）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
態様（９）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、該オリゴヌクレオチドプライマーが、（一）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（二）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであって、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜３５個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
態様（１０）：  ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキットであって、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の配列番号４〜６に示されたものからなる群から選ばれたものであることを特徴とする、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するためのキット。
【０００８】
態様（１１）：  ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子及びウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子に対応するヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部であって、
（ａ）配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、
（ｂ）前記配列（ａ）とハイブリッド形成し、ＰＣＲによりウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できる一切の配列、
（ｃ）遺伝子コードの縮退のために前記配列（ａ）及び（ｂ）から派生した配列からなる群から選ばれたものであることを特徴とする配列。
態様（１２）：  配列表の配列番号：１で示されたヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
態様（１３）：  ゲノミックＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれたものであることを特徴とする上記態様（１１）〜（１２）のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【０００９】
態様（１４）：  上記態様（１１）〜（１２）のいずれか一記載の配列又は対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成できることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
態様（１５）：  ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を検出するため、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離するための用途の、上記態様（１４）記載のヌクレオチドプローブ。
態様（１６）：  上記態様（１４）に記載のヌクレオチドプローブを用いてウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離する工程を有することを特徴とする、ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の検出方法。
態様（１７）：  上記態様（５）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
態様（１８）：  上記態様（１７）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とするウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２用遺伝子診断試薬。
【００１０】
以下の「発明の実施の形態」の欄における記載及び、更に具体的な実施例・実験例の記載、並びに同時に提出される図面・配列表データ等は、本発明の好ましい態様の詳細部分や変更態様が示されているか、及び／または比較上の対照のために従来技術が示されているものであることが理解されるべきである。当業者であれば、上述した及び以下の記載を参酌すれば、本願特許請求の範囲の欄の記載に基づく技術範囲内で、その様々な構成技術につき、容易に個別の事情に即し、実施のための更なる具体化等及びその改良・変更等を行えるような、そのような理解に達することができるはずである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法（検出方法）の確立：
後述のように、ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の原因となる遺伝子上の変異が解明され（図１）、この変異を利用して該疾患の検出を行うことができる。具体的なウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法（検出方法）としては、次のような工程を含む様態が例示される。すなわち、
工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び
工程（ｃ）：行程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
である。
【００１２】
第１に、工程（ａ）について述べる。本発明に用いられるウシの核酸試料としては、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６をコードするヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定されるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸（全ゲノムＤＮＡ及び細胞の全ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを包含する）、例えば、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９））に記載の方法により行うことができる。
【００１３】
第２に、工程（ｂ）について述べる。工程（ａ）で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用いて、ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子に存在しうる変位部位を含む領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、ＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもＰＣＲ法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、変異部位を含む領域としては、ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の塩基配列のうち、ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の中の１〜６５１位を含む領域が挙げられる。
【００１４】
本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、一般的に、米国特許第４６８３１９５号明細書に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増殖されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用され得る。
【００１５】
ＰＣＲ法は、Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｅｌｆａｕｄ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｓｎｉｎｄｋｙ，  ＆  Ｔ．  Ｊ．  Ｗｈｉｔｅ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ＆  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）；  Ｒ．  Ｋ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９，  ４８７−４９１  （１９８８）；  Ｍ．  Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ８９９８−９００２  （１９８８）などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコールに従って実施することもできる。
【００１６】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  Ｖｏｌ．  ２８，  ｐ．７１６−７３４  （１９８９）に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよい。
【００１７】
ＰＣＲ法で用いるプライマーとしては、上記の変異部位を含むＤＮＡ断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。代表的には、プライマーは（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、より好ましくは（一）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（二）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、３〜１００個、好ましくは１０〜５０個、さらに好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、ＰＣＲ条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択することができる。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜３５回、より好ましくは２５〜３０回繰り返して行われる。
【００１８】
第３に、工程（ｃ）について述べる。本工程において、工程（ｂ）で得られる核酸断片について変異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片長を調べることにより検出される。ＤＮＡ断片長を調べる方法は特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル上の電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、例えば、既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度に対してのそれの移動度に基づいて、目的のＤＮＡ断片を同定する方法が好まれる。
【００１９】
上記以外の検出法としては、前記に例示された態様の工程（ｃ）をその他の変異検出方法に変更した方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なＤＮＡ断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法のような公知の変異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたＤＮＡを適当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を容易にするためのラベル成分により標識されていることができる。該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであることができる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Ｐなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
【００２１】
本発明のウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法（検出方法）により、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２を発病しているウシのみならず、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２のキャリアーのウシについても検出し、診断することができる。従って、本発明でいうウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２とは、遺伝子的に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、またキャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【００２２】
正常ウシ及びＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２発症ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の解析：
遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず正常なウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列を知る必要があるが、本発明者らはすでに、ポジショナルクローニング法と云われる手法を用いてウシＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子を単離し、その配列を明らかにしている（Ｔ．  Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０，  ６５９−６６３  （２０００）。
【００２３】
次に、得られた正常ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６をコードするｃＤＮＡの全塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。ＤＮＡ断片の塩基配列の決定（シークエンシング）は、化学分解法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ法）、チェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒジデオキシ法）などにより行うことができる。
【００２４】
Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の原因となる遺伝子上の変異は、正常ウシ及び発症ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の塩基配列を比較することによって明らかにすることができる。すなわち、前記の正常ウシの場合と同様に発症ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の塩基配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子と比較することにより、該疾患の原因である変異を確認することができる。
【００２５】
本発明では、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子上では、配列表の配列番号：１に示される正常ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子上のＣｌａｕｄｉｎ−１６をコードする翻訳領域の塩基配列のうち、１〜６５１位の部分が欠損する変異を見出した（図１）。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例、実験例をもってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものでばない。以下の記載では、特に説明がない場合には、Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ＆  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  （Ｅｄ．），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １，  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９５）；  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．Ｍ．  Ｇｅｌｆａｕｄ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｓｎｉｎｄｋｙ  ＆  Ｔ．  Ｊ．  Ｗｈｉｔｅ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）；  Ｍ．  Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ＆  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ（Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）に記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行われている。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行ってある。
【００２７】
［実験例１］
１−（一）ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２変異とタイプ１変異とのＤＮＡマーカーの型判定による比較
ウシＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１における変異は、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子のエクソン１から４までを含む約３７ｋｂの欠損である（実は、特願平１１−０８４３７３及びその公開公報には約３０ｋｂと表現してある）（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０，６５９−６６３  （２０００））。図１に示すように、この欠損領域にＤＮＡマーカーＢＭＳ４００９、ＤＩＫ１３０、ＤＩＫ１２９は含まれるが、ＤＩＫ１３１、ＢＭ９０１９、ＤＩＫ１３２は外側に位置する。
タイプ２変異である欠損部位を推定するため、タイプ２変異をヘテロでもつウシのゲノミックＤＮＡを用いて、３７７蛍光ＤＮＡシークエンサー（ＰＥバイオシステムズ社製）によるマーカー型判定を行ったところ、タイプ２の変異ではこれらＤＮＡマーカーＢＭＳ４００９、ＤＩＫ１３０、ＤＩＫ１２９に加えてＢＭ９０１９が欠損していた。しかしながら、ＤＩＫ１３１およびＤＩＫ１３２はヘテロ接合体であったことから、これら２種のマーカーは欠損していないことがわかった。したがって、タイプ２における欠損領域は、タイプ１よりも広く、ＤＩＫ１３１とＤＩＫ１３２間の約６３ｋｂ以内の範囲に存在することが示唆された。
【００２８】
１−（二）  Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の変異である欠損部位の決定発明者らはすでにＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子周辺のゲノミックＤＮＡ塩基配列約５５ｋｂ（配列番号：２）及び約３９ｋｂ（配列番号：３）を解読し、タイプ１の欠損領域を同定している。この配列の情報を用いて、ＤＩＫ１３１からテロメア方向の１８．５ｋｂにＰＣＲ用センスプライマーを５００ｂｐ間隔で４０種類調製した。一方、ＤＩＫ１３２からセントロメア方向の８００ｂｐにＰＣＲ用アンチセンスプライマーを３種類調製した。これらのＰＣＲプライマーを組み合わせてＰＣＲを行ったところ、ＤＩＫ１３１から１３番目と１４番目のセンスプライマーとＤＩＫ１３２に最も近いアンチセンスプライマーの組み合わせでそれぞれ約１ｋｂおよび約０．６ｋｂのＰＣＲ生成物が得られた。これらのＰＣＲ生成物の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を前記の正常ウシについて決定されたものと比較した結果、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子では、配列表の配列番号：１に示された塩基配列中、１〜６５１位を含む約５６ｋｂの欠損（タイプ１の変異では１〜６２９位を含む約３７ｋｂの欠損）が認められ、エクソン１から４およびエクソン５の一部が欠失していた。このため、該疾患牛ではＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の発現が見られないと考えられる。
【００２９】
［実験例２］
ウシのゲノミツクＤＮＡ上のＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の変異が無いことの確認：
すでに発明者らは、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１ウシに認められた欠損部位を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーＤＮ−Ｆ１、ＤＮ−Ｆ２、ＤＮ−Ｒを合成しており（特願平１１−０８４３７３）、これらのプライマーはタイプ２の変異の無いことの確認に適用できる。
【００３０】
ＤＮ−Ｆ１：  ｔａｔｇｃｔｇｔｔｇ  ａｔｇｔｔｔａｔｇｔ  ａｇ
ＤＮ−Ｆ２：  ｔａｔｇｔａｇａａｃ  ｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔ  ｇ
ＤＮ−Ｒ：  ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇ  ｃｃｔｔｔｔｔｃ
【００３１】
正常ウシ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１変異とタイプ２変異をヘテロにもつウシ、及びその母牛の血液（抗擬固剤としてＥＤＴＡ、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置ＮＡ−１０００（クラボウ社製）を用いてゲノミックＤＮＡを調製した。これらのゲノミックＤＮＡを鋳型とし、プライマーＤＮ−Ｆ１とＤＮ−Ｒ、及び／又はＤＮ−Ｆ２とＤＮ−Ｒを用いたＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑを使用、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとした４０サイクル反応）を行い、反応液を１．５％ゲル（０．５ｘ  ＴＢＥ）を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅ＤＮＡ断片を確認した。正常ウシとＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２ウシの母牛のゲノミックＤＮＡを鋳型とした場合、図２ａに示すように、３７５ｂｐ及び／又は３６０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が見られた。しかし、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ１変異とタイプ２変異をヘテロにもつウシのゲノミックＤＮＡを鋳型にした場合は増幅が認められなかった。
【００３２】
［実験例３］
ウシのゲノミツクＤＮＡ上のＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子のタイプ２の変異が有ることの確認：
Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の変異をもつウシのゲノミックＤＮＡにおいてのみＤＮＡ断片を増幅するため、実験例１−（二）記載の約５６ｋｂの欠損部分を決定するために用いた１３番目と１４番目のセンスプライマーＤＡ２−Ｆ１、ＤＡ２−Ｆ２、およびアンチセンスプライマーＤＡ２−Ｒを合成した。配列表の配列番号：４、５、６にぞれぞれプライマーＤＡ２−Ｆ１、ＤＡ２−Ｆ２、ＤＡ２−Ｒの塩基配列を示す。
【００３３】
ＤＡ２−Ｆ１：  ａａｔｇｃａｃｔｃａ  ｔｔｔｃｔｃｃａｇｔ  ｔｃａｇｃ
［配列番号：４］
ＤＡ２−Ｆ２：  ｇｔｃａｔｔｃｔｔｇ  ｇａａａｇｇｃｔｔｃ  ａｇｔａｇ
［配列番号：５］
ＤＡ２−Ｒ：  ｇｔｃｇａｃａｇｃａ  ｔａｃａｔｔｔｔｇｇ  ｃａｇｔｃ
［配列番号：６］
【００３４】
正常ウシ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の変異をもつウシ、及びその母牛のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、プライマーＤＡ２−Ｆ１とＤＡ２−Ｒ、及び／又はＤＡ２−Ｆ２とＤＡ２−Ｒを用いたＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑを使用、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとした４０サイクル反応）を行い、反応液を１．５％ゲル（０．５  ｘ  ＴＢＥ）を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅ＤＮＡ断片を確認した。Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の変異をもつウシ、及びその母牛のゲノミックＤＮＡを鋳型とした場合、図２ｂに示すように、１，０２７ｂｐ及び／又は５６６ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が見られたが、正常ウシでは認められなかった。
【００３５】
これらの結果より、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の翻訳領域の１〜６５１位を含む約５６ｋｂの欠損について、発症ウシの母牛はこの変異に関してへテロ接合体であり、Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子のタイプ２の変異が染色体性劣性遺伝をする遺伝性疾患であるＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の原因となることが確認された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によりウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２およびそのキヤリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能となる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）Ｃｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２ウシ由来のウシＣｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子の欠損部分を示す図である。（ｂ）欠損部分を検出するためのＰＣＲプライマーの位置。
【図２】Ｃｌａｕｄｉｎ−１６遺伝子のタイプ２の変異の有るゲノミックＤＮＡを鋳型とすれば、ＰＣＲで増幅することを示す電気泳動パターン図である。
【図１】
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【図２】
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