(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ配列とマルチクローニングサイトとを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列とマルチクローニングサイトとを含む、マルチクローニングベクター。
【請求項５】
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるマルチクローニングベクター。
【請求項６】
請求項１のＤＮＡ配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）の形質転換用の発現ベクター。
【請求項７】
請求項６の発現ベクターを含む、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）からなる形質転換体。
【請求項８】
請求項７の形質転換体を培養し、発現された異種タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらを用いたタンパク質の生産方法に関し、特に分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼプロモータを用いることによって特定の栄養源の有無による遺伝子発現制御を行い、目的タンパク質の生産時期を制御可能とするタンパク質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）は真核生物でありながら遺伝学、分子生物学、細胞生物学分野での応用がきわめて容易な単細胞生物として広く研究されている（Nasim A. et al. eds., Molecular biology of the fission yeast, Academic Press, 1989）。その培養には炭素源としてブドウ糖（グルコース）や果糖（フルクトース）等の単糖が主に用いられる。培地中にこれら単糖が存在しない場合、ショ糖（スクロース）をブドウ糖と果糖に分解する酵素であるインベルターゼの発現が誘導され、生育に必要な炭素源を獲得することが知られている（Moreno S. et al., Arch. Microbiol. 142, 370, 1985）。
【０００３】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて、インベルターゼは細胞表層に存在しており、分子量２０５０００の高分子量糖タンパク質である。その６７％が糖鎖であり、等モルのマンノース残基とガラクトース残基から成り立っている。精製酵素のタンパク質分子量やアミノ酸組成および抗体を用いた実験から、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ由来のインベルターゼは出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のインベルターゼとタンパク質化学的にも非常に類似していることが知られている（Moreno S. et al., Biochem. J. 267,697,1990）。またグルコース濃度の低下によりインベルターゼの合成抑制が解除されることも知られている（Mitchison J. et al., Cell Sci 5,373,1969）。
【０００４】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにおいても同様に、固有のインベルターゼの誘導生産現象（脱抑制）が知られている。その発現における遺伝子レベルでの制御、生合成経路、糖鎖部分の構造解析等に関する研究はすでに詳細に行われている。すなわち、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのインベルターゼ遺伝子は染色体上に６個重複しており、ＳＵＣ１〜ＳＵＣ５およびＳＵＣ７という遺伝子によってコードされている。このうちの１つでも活性なＳＵＣ遺伝子を持てばスクロースとラフィノースの資化性を示すことがわかっている（Hohmann S. et al., Curr Genet 11, 217, 1986 ）。
【０００５】
これに対し分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは、インベルターゼタンパク質の精製については報告されているが（Moreno S. et al., 1985）、その遺伝子に関しては本発明者らのグループの研究によって最近になってようやく明らかになった。すなわち、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子は染色体上に２個重複しており、ｉｎｖ０+およびｉｎｖ１+として同定されている。このうちｉｎｖ０+はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が不完全で偽遺伝子であると推定された。よって唯一ｉｎｖ１+が分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼをコードする遺伝子である。分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベはショ糖を唯一の炭素源として生育することが知られており（橋谷義孝編、「酵母学」、岩波書店、1967）、本インベルターゼによってショ糖の資化性を示すことが推定できる。
【０００６】
単離された遺伝子のプロモーター領域の解析がなされた結果、１ｂｐから６２０ｂｐの間にある特別な配列がカタボライト抑制に関与していることが推定された。
【０００７】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエではＳＵＣ２遺伝子から転写開始点が異なる２種類のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写されることが知られている。短い方のｍＲＮＡは構成的な転写であり、細胞内インベルターゼを発現している。長い方のｍＲＮＡは分泌型インベルターゼをコードしており、その発現はカタボライト抑制を受け、その脱抑制比は２００倍以上である（Carlson M. et al. 、Mol. Cell. Biol. 3、439 、1983）。長い方のｍＲＮＡに対するプロモーター領域の解析がなされた結果、−６５０ｂｐから−４１８ｂｐの間にある特別な繰り返し配列に転写制御因子が結合していると考えられている（Salokin L et al.、Mol. Cell. Biol. 6、2314、1986）。また、−４１８位から−１４０位までの領域がグルコース抑制に必要とされる領域であることがわかっている。
【０００８】
これらの領域とｉｎｖ１+遺伝子の上流領域１位から２８０９位までの領域を比較したところ有意な相同性は認められなかった。しかしグルコース抑制解除に必要とされる領域の中には７ｂｐモチーフと呼ばれる（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＡＴの塩基配列の繰り返し配列が５箇所確認されており、７ｂｐモチーフがｉｎｖ１+遺伝子の上流領域にも多数存在していることが明らかとなった。その上グルコース抑制により制御される遺伝子（ＳＵＣ、ＭＡＬ、ＧＡＬ）の上流領域にはステム・アンド・ループ構造と類似したパリンドローム構造が同じような位置に存在していることが確認されている。シゾサッカロミセス・ポンベにおいてｉｎｖ１+遺伝子の上流領域においてもパリンドローム構造を形成する領域が認められた。これらの配列は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおけるグルコース抑制に重要な役割を果たしていると考えられた。
【０００９】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベは出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造、ゲノム複製機構、ＲＮＡスプライシング機構、転写機構、翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物のモデルとして広く用いられている（Giga-Hama and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verlag, 1997）。
【００１０】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベは異種タンパク質遺伝子発現の宿主としても広く用いられており、特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている（特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、ＷＯ９６／２３８９０）。またゴルジ体や小胞体を含む膜構造の発達が知られており、このことから膜タンパク質の発現にも用いられ、高い発現量を示している。発現ベクターとしては通常構成発現ベクター（ｐＥＶＰ１１、ｐＡＲＴ１、ｐＴＬ２Ｍ）あるいはｎｍｔ１+遺伝子のプロモータ領域を用いた誘導発現ベクター（ｐＲＥＰ１）が用いられている。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエで汎用されるＧＡＬタイプあるいはＳＵＣ２タイプのものは知られていない。
【００１１】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子を発現させた場合、宿主に依存してガラクトース残基が含まれるが、カタボライト抑制を受けずに構成的な発現がなされることが知られている（Zarate, V. et al., J Applied Bacteriology, 80,45,1996）。このことから、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベと出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとでは、インベルターゼのカタボライト抑制のメカニズムが異なっている可能性がある。このことは重大な意味を含む。すなわち、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでインベルターゼ（ＳＵＣ２）型の誘導発現ベクターを作製する場合、通常当該業者が行う方法である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのプロモータの流用は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは行うことができない。このため、長らくこのようなタイプのベクターの開発は遅れていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新たに分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子のクローニングを行い、誘導発現ベクターを構築することによって本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子中のカタボライト抑制に関与している遺伝子領域、この遺伝子領域を利用した誘導発現ベクター、これを用いた外来遺伝子発現システム等に関する、下記の発明である。
【００１４】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【００１５】
上記ＤＮＡの配列を含む組換えベクター。
【００１６】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列を含む組換えベクター。
【００１７】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列とマルチクローニングサイトとを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列とマルチクローニングサイトとを含む、マルチクローニングベクター。
【００１８】
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるマルチクローニングベクター。
【００１９】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換用の発現ベクター。
【００２０】
上記発現ベクターを含む、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベからなる形質転換体。
【００２１】
上記形質転換体を培養し、発現された異種タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明者らはまず、従来その遺伝子レベルでの実体が不明であった分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、「S. pombe」と記す）のインベルターゼ遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。遺伝子破壊法によりインベルターゼ遺伝子が１種ですべての活性を担っていることを明らかにした。さらにカタボライト抑制に関与している遺伝子領域の検討をし、この領域を用いて誘導発現ベクターを作製した。実際に緑色螢光タンパク質遺伝子を組込んだ組換えベクターを作製し、これを用いて S. pombe を形質転換した。タンパク質の発現を活性並びに免疫学的手法によって確認した。さらに培地中のグルコースによって発現が抑制され、グルコースが消費されることによって外来遺伝子の発現が脱抑制されることを見出した。
【００２３】
本発明者らは、具体的には以下に示す方法で S. pombe のインベルターゼの前駆体遺伝子を見出し、その構造を決定した。
（１）S. pombe のｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子に良く保存されたアミノ酸配列から作製したプライマーに用いてＰＣＲ反応を行う。
（２）得られたＰＣＲ産物をプローブとして S. pombe のゲノムライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法によりポジティブクローンを選別する。
（３）ポジティブクローンを制限酵素で消化して電気泳動パターンを確認する。
（４）確認されたポジティブクローンからサザンハイブリダイゼーション法を用いて特定長のフラグメントを選別し、全塩基配列を決定する。
（５）遺伝子破壊法を用いてインベルターゼ活性の有無を調べる。
（６）S. pombe のインベルターゼ遺伝子における至適ｐＨ、グルコース抑制、および脱抑制に対するグルコース濃度の影響について測定する。
（７）グルコース抑制に関与している上流領域をサブクローニングし、必要領域を決定する。
【００２４】
さらに本発明者らは、次に示す方法で、S. pombe のインベルターゼの誘導発現ベクターを作製し、具体例として緑色螢光タンパク質の誘導発現を確認した。
（１）S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号公報参照）を改変して、インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍを作製する。
（２）誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍをもとに緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを作製する。
（３）緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを用いて S. pombe 野生株を形質転換する。
（４）緑色螢光タンパク質変異体の発現を活性（螢光）並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティングを用いて確認する。
（５）培地中のグルコース濃度と発現の相関から、誘導発現の条件を決定する。
【００２５】
配列表の配列番号１はカタボライト抑制に関与している遺伝子領域を含むインベルターゼ前駆体遺伝子の塩基配列である。カタボライト抑制に関与している遺伝子領域は、塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ部分ないしその内部のＤＮＡ部分にある。すなわち、実施例６や図８の解析の結果が示すように、塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ部分中で特に重要な領域は塩基番号第１番から第６２０番までの配列部分、および第１６１０番から第２６１０番までの配列部分である（なお、図８は配列表１の第２８１０番を第１番として位置を表記）。したがって、本発明における誘導プロモータとしては、これらのカタボライト抑制に関与している遺伝子を含んで誘導プロモータとして機能する限り、塩基番号第１番〜第２８０９番の全塩基配列で表されるＤＮＡに限られるものではない。しかし、現実に S. pombe で機能していることより、誘導プロモータとしては塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡが好ましい。
【００２６】
上記のようにカタボライト抑制に関与している遺伝子を含んで誘導プロモータとして機能するＤＮＡ、特に好ましくは塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ、を以下誘導プロモータ遺伝子という。この誘導プロモータ遺伝子をベクターに組み込んでマルチクローニングベクターや発現ベクターなどの組換えベクターを構築することができる。マルチクローニングベクターはマルチクローニングサイトを有するベクターであり、マルチクローニングサイトに所望の構造遺伝子を導入することにより発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは構造遺伝子を有するベクターであり、構造遺伝子でコードされた異種タンパク質の発現用に用いられる。「異種」タンパク質とは宿主が本来有していないタンパク質であり、宿主が S. pombe の場合、S. pombe が本来有していないタンパク質（例えばヒトタンパク質）である。
【００２７】
発現ベクターにおいて、誘導プロモータ遺伝子は異種タンパク質構造遺伝子の上流部に位置しその構造遺伝子の発現を制御する。配列番号１で表される塩基配列において、誘導プロモータ遺伝子がインベルターゼ前駆体の構造遺伝子の上流部にあってその発現を制御しているように、発現ベクターにおいて誘導プロモータ遺伝子はその下流に位置する異種タンパク質構造遺伝子の発現を制御する。マルチクローニングベクターにおいても、マルチクローニングサイトに異種タンパク質構造遺伝子が導入されることより、誘導プロモータ遺伝子はマルチクローニングサイトの上流部に位置する。
【００２８】
本発明マルチクローニングベクターの例として、図９に実施例で構築したマルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍのベクター構築図を示す。またこのｐＲＩ０Ｍの全塩基配列を配列番号２に示す。Ｉｎｖ１−Ｐが上記誘導プロモータ遺伝子部分、ＭＣＳがマルチクローニングサイトである。本発明発現ベクターの１例として、図１０に実施例で構築した緑色蛍光タンパク質変異体構造遺伝子（ＥＧＦＰ−ＯＲＦ）導入した緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰのベクター構築図を示す。またこの発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの全塩基配列を配列番号１３に示す。
【００２９】
本発明における誘導プロモータ遺伝子が S. pombe が有する誘導プロモータ遺伝子であることより、本発明発現ベクターで形質転換される細胞（宿主）としては S. pombe が最適である。
【００３０】
上記本発明の発現ベクターで形質転換された S. pombe をカタボライト抑制条件下で（例えばグルコース濃度の高い培養液中で）培養することにより異種タンパク質を発現することなく（あるいは少ない発現量で）S. pombe を増殖させることができる。この過程では、異種タンパク質の発現という負荷がないことより負荷がある場合に比較して増殖の効率が高い。次に、カタボライト抑制を解除した条件下で（例えばグルコースがないあるいはグルコース濃度の低い培養液中で）S. pombe を培養することにより、カタボライト抑制条件下に比較して S. pombe の増殖量は少なくなるが、S. pombe の細胞量が多いことより多量の異種タンパク質が発現する。このように S. pombe の増殖と異種タンパク質の発現をカタボライト抑制の制御によって制御することにより、より効率的に異種タンパク質の生産を行うことができる。
【００３１】
カタボライト抑制の制御は上記のような積極的制御はもちろん、消極的な制御を行うこともできる。例えば、ある所定量のグルコースを含む培養液中で形質転換された S. pombe を培養することにより、培養初期ではグルコース量が多いことよりカタボライト抑制下で S. pombe の増殖が進行し、培養後期ではグルコースが消費されてその量が少なくなることによりカタボライト抑制が解除され異種タンパク質の産生が進行する。このように積極的にグルコース量を制御することなくしても従来に比較して効率的に異種タンパク質の生産を行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３３】
［実施例１］
S. pombe のインベルターゼ遺伝子の単離
S. pombeのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子間で良く保存された配列部分をもとに設計した配列表の配列番号３〜５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、３００ｂｐおよび４００ｂｐの近傍に増幅されたバンドが得られた。それぞれのＰＣＲ産物をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ（宝酒造（株）製）を用いて精製した。ｐＭＯＳＢｌｕｅＴベクターキット(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いて得られたＰＣＲ産物をベクターに組み込み、塩基配列の決定を行った。その結果、４００ｂｐのＰＣＲ産物をアミノ酸に変換した部分アミノ酸配列が出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子と高い相同性を示した。
【００３４】
この４００ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして S. pombe のゲノムＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法により全インベルターゼ遺伝子を含むポジティブクローンの取得を試みた。その結果、約８０００のプラークから１５個のポジティブクローンが取得された。このポジティブクローンの２次スクリーニングを行うため、再びプラークハイブリダイゼーションを行った。その結果、４個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンのファージＤＮＡを少量抽出し、種々の制限酵素で処理して切断パターンを比較したところすべて同一であった。よって、取得されたポジティブクローンは１種類であることがわかった。
【００３５】
インベルターゼ遺伝子の全長は、次の二段階の方法で取得した。ハイブリッドを形成した３．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−（東洋紡（株）製）に組み込んだ。制限酵素地図を作成したところ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限酵素部位が確認された。そこでこれらの制限酵素を用いてサブクローニングを行い、加えてディレーションを併用して塩基配列の決定を行った。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに遺伝子のＯＲＦをすべて含むことがわかった。しかし遺伝子発現に関与すると思われる上流領域は約２００ｂｐしか含まなかった。そのため新たに、ハイブリッドを形成した３．５ｋｂのＢａｍＨＩ消化フラグメントをさらにＨｉｎｄＩＩＩ消化によって２．６ｋｂのフラグメントとして単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−に組み込み、同様にサブクローニングとディレーションにより塩基配列を決定した。その結果、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントには遺伝子発現に関与する上流配列と思われる領域が含まれていることがわかった。得られた全長５．６ｋｂの遺伝子をｉｎｖ１+遺伝子と名付けた。その塩基配列およびＯＲＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。この結果、ｉｎｖ１+遺伝子にはアスパラギン結合型糖鎖付加部位が１６箇所存在していることがわかった。また、S. pombe のｉｎｖ１+遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列、シュワニオミセス・オキシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）のインベルターゼのアミノ酸配列、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列間の比較を図１に示す。アスタリスク（＊）で３種間で共通のアミノ酸を示す。図１から明らかなように、ｉｎｖ１+遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列は、他生物種起源のインベルターゼであるシュワニオミセス・オシデンタリス由来のものや出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ由来のものと高い相同性を示すことがわかった。このことから、ｉｎｖ１+遺伝子はインベルターゼをコードするものであると推定された。
【００３６】
［実施例２］
ｉｎｖ１+遺伝子配列の破壊
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−の制限酵素ＣｌａＩ認識部位に S. pombe 由来ｕｒａ４+遺伝子を組み込んだプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端平滑化の後セルフライゲーション（自己環状化）させてＨｉｎｄＩＩＩサイトを破壊した。このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｃＩＩで二重消化してｕｒａ４+フラグメントを取得した。次にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−を制限酵素ＳｐｅＩで消化して末端平滑化し、さらに制限酵素ＸｂａＩで消化したベクターに上述のｕｒａ４+フラグメントを組み込み、制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位をｕｒａ４+の両側に配置したプラスミドを作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−の制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位も上述のように制限酵素処理、末端平滑化、セルフライゲーションにより破壊し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｉｎｖ１+遺伝子のＯＲＦ領域を含む３．０ｋｂのフラグメントを組み込んだ。このプラスミドをＢａｍＨＩで消化して挿入フラグメント中の１．４ｋｂのフラグメント（ｉｎｖ１+のＯＲＦのＣ末端側領域を含む）を除き、両側にＢａｍＨＩサイトを持つｕｒａ４+遺伝子を組み込んだ。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化して両端にｉｎｖ１+遺伝子の近傍の領域を含むＤＮＡフラグメントを取得した（図２）。図２はｉｎｖ１+遺伝子の制限酵素地図を示し、ｉｎｖ１+遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印（ｉｎｖ１+ＯＲＦ）、置換したシゾサッカロミセス・ポンベｕｒａ４+遺伝子を長方形（ｕｒａ４+）で示した。ＯＲＦを含んだｉｎｖ１+の１．４Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、S. pombe ｕｒａ４+遺伝子に置き換えられていることにより、破壊株ができた。
【００３７】
このフラグメントで S. pombe の野生株ＴＰ４−１Ｄ〔ｈ-、ｌｅｕ１、ｕｒａ４、ａｄｅ６−Ｍ２１６、ｈｉｓ２、登田隆博士（Imperial Cancer Research Foundation）より供与〕を形質転換してウラシル無添加の培地に生育してきたコロニーを得た。オーバーレイアッセイによりインベルターゼ活性について検討したところ、活性の消失した株は２８株中７株存在していた。すなわち得られたｕｒａ４+コロニーの中でインベルターゼ活性の消失した株は２５％であった。
【００３８】
さらに染色体上のｉｎｖ１+遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーションによって確認した。インベルターゼ活性の消失した株からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによって二重消化し、ｉｎｖ１+遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化フラグメント（２ｋｂ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、図３に示すようにインベルターゼ活性の消失した株の染色体ＤＮＡ上のｉｎｖ１+遺伝子がｕｒａ４+遺伝子に置換されていることをＳａｌＩ消化により３ｋｂのハイブリッドが形成されたことから確認した。
【００３９】
以上の結果から、S. pombe において発現しているインベルターゼ遺伝子は、ｉｎｖ１+遺伝子唯一つであることが証明された。
【００４０】
［実施例３］
ｉｎｖ１+遺伝子によるインベルターゼ活性の回復
S. pombe 用発現ベクターｐＡＵ−ＳＫ（大阪市立大学理学部下田親博士より供与）に、インベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１+を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したＯＲＦ全長を含む３．０ｋｂの切断フラグメントを組み込み、得られた組換えベクターを用いてインベルターゼ欠損株（実施例２）を形質転換した。得られた形質転換体をＹＰスクロース培地（１０μｇ／ｍｌのアンチマイシンＡおよび２０μｇ／ｍｌのブロムクレゾールパープル添加）にストリークして、インベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイによって調べた。加えてインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１+の上流プロモータ領域を含む２．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントをインベルターゼ遺伝子のＯＲＦを含む２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントと連結させた４．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントをｐＡＵ−ＳＫに組込み、得られた組換えベクターを用いてインベルターゼ欠損株を形質転換し、同様にインベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイによって調べた。
【００４１】
その結果、いずれの形質転換株（ｉｎｖ１Δ［ｐＡＵ−ＳＫ：：iｎｖ１+］）においても、また野生株ＴＰ４−１Ｄ（ＷＴ）においても、破壊株（ｉｎｖ１Δ）にはみられない青い染色が観察され、インベルターゼを発現していることが確認された。さらに上流プロモータ領域を付加した場合、染色度がより強く、高いレベルでインベルターゼを発現していることが示唆された（図４（ａ）、（ｂ））。図４（ａ）はゲルオーバーレイアッセイ写真、図４（ｂ）は図４（ａ）の染色部分を説明する模式図を示す。
【００４２】
また、ＹＰスクロース培地（１０μｇ／ｍｌのアンチマイシン含有）における生育を調べた結果、インベルターゼ欠損株はほとんど生育を示さなかったが、野生株と形質転換株は３０℃、５日間の培養での生育を確認した（図５（ａ）、（ｂ））。図５（ａ）はコロニーの形態を示す写真、図５（ｂ）は図５（ａ）を説明する模式図を示す。
【００４３】
以上の結果よりｉｎｖ１+遺伝子がインベルターゼを発現して細胞表層にインベルターゼを生産していることが証明された。
【００４４】
［実施例４］
発現抑制培養のためのグルコース濃度の決定
インベルターゼ遺伝子のカタボライト抑制に必要なグルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれぞれグルコースを２％、４％、８％、１６％の濃度で含有する５ｍｌのＭＭ培地に植菌した後、対数増殖期中期になるまで３０℃で振盪培養した。菌体のインベルターゼの酵素活性をＧｏｌｄｓｔｅｉｎらの方法で、培養後の培地中のグルコース濃度をフェノール硫酸法によって測定した（図６）。図中、斜線を付したグラフは菌体あたりのインベルターゼ活性（Ｕ／ＯＤ）を、白抜きグラフは残存グルコース濃度を示す。同図から、インベルターゼ活性は、８％の濃度がグルコースの減少度も少なく、発現抑制培養に最も適当であることがわかった。
【００４５】
［実施例５］
誘導生産のためのグルコース濃度の決定
インベルターゼの誘導生産を行うために最も効果のあるグルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれぞれ、グルコースを０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％の濃度で含有するＭＭ培地に、対数増殖期中期になるまで２％グルコースが含まれた培地で生育させた野生株と形質転換株〔インベルターゼ欠損株（実施例３）をｉｎｖ１+遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ領域を挿入したｐＡＵ−ＳＫベクターで形質転換した株〕の前培養菌体を移し、２７℃で３時間振盪培養してインベルターゼ活性を測定した（図７）。各点における菌体のインベルターゼ活性を１８０分間、３０℃で測定した。インベルターゼの１Ｕは３０℃、ｐＨ４．０のもとに、１分間にショ糖を１ｎｍｏｌのグルコースに変化させる酵素の量を示す。
【００４６】
その結果、野生株では誘導に最適なグルコース濃度は０．１％であり、形質転換株では０．０５％であることがわかった。また野生株では、抑制解除時のインベルターゼ活性は抑制時の４０倍の値を示した。このような結果から S. pombe においてカタボライト抑制が存在していることが明示された。
【００４７】
［実施例６］
ｉｎｖ１+遺伝子のプロモータ領域の解析
S. pombe のインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１+の上流領域１位、６２０位、１１００位、１６１０位、２６１０位のそれぞれをｉｎｖ１+遺伝子のＯＲＦと連結させたフラグメントを発現ベクターｐＡＵ−ＳＫに組み込んで５種類の欠失体を作製した。上流領域１位、１６１０位、２６１０位を連結させたプラスミドは、それぞれｉｎｖ１+遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位を含んでいる。６２０位、１１００位の上流領域を含むプラスミドはｐＡＵ−ＳＫ：：ｉｎｖ１+（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ）をテンプレートとしてそれぞれ配列表の配列番号６、７に示すプライマーを用いた部位特異的変異を行ってＳｐｅＩサイトを作製した。そして、制限酵素ＳｐｅＩ処理により上流の一部を除去して６２０位、１１００位の上流領域を含むｉｎｖ１+遺伝子のプラスミドを作製した。
【００４８】
得られたそれぞれのプラスミドでインベルターゼ欠損株（実施例３）を形質転換した。得られた組換え体のそれぞれのインベルターゼ活性を測定し、酵素活性を決定した（図８）。その結果、グルコース抑制に必要な領域は１位から６２０位までと考えられた。グルコースの抑制解除に従ってインベルターゼの高い脱抑制に必要な領域は１６１０位から２６１０位までにあることが確認された。
【００４９】
［実施例７］
インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列番号８および配列番号９に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造（株）製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入フラグメントとした。
【００５０】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００５１】
これら２本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、図９ならびに配列表の配列番号２に示す誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍを保持する大腸菌をスクリーニングし、このベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００５２】
［実施例８］
緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号８および配列番号１０に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入プロモータフラグメントとした。
【００５３】
オワンクラゲの緑色螢光タンパク質変異体遺伝子を含むプラスミドｐＥＧＦＰ−１（Clonetech製）をテンプレートとして、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって緑色螢光タンパク質変異体遺伝子のＯＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約７００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメントとした。
【００５４】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００５５】
これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、図１０ならびに配列表の配列番号１３に示す緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを保持する大腸菌をスクリーニングし、この発現ベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００５６】
［実施例９］
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株の作製
緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰおよび導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe 野生株  ＡＲＣ００１〔ｌｅｕ１-３２ｈ-（ＡＴＣＣ３８３９９と同等）〕を岡崎ら（Okazaki et al., "Nucleic Acids Res.", 18, 6485-6489, 1990）の方法に従って形質転換した。
【００５７】
ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００１培養液  １ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕに植菌し、３０℃で１４時間振盪培養した。菌数１ｍｌあたり２．３×１０7個の段階で集菌し、水で洗菌後、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液１００μｌに、４μｇの誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰおよび０．５μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７をＴＥ  １５μｌに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０００を２９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌの１／２ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希釈したもの１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日間培養したところ、約３００個の互いに独立したコロニーがプレート上に出現した。
【００５８】
得られた形質転換体１０個（コロニー）を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３２℃で振盪培養した。２日目に６個のクローンが生育した。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、３日目に４個のクローンが生育した。これらを目的の形質転換体候補株、ＡＳＰ１３８株として、グリセロール凍結保存するとともに、以下の実験に使用した。
【００５９】
［実施例１０］
緑色螢光タンパク質変異体の発現解析
S. pombe 形質転換体  ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ１００培地）に植菌し、３２℃で２日間培養した。蛍光顕微鏡（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）で菌体を観察したところ、個々の菌体が緑色蛍光を発することが観察された。さらに遠心集菌した菌体に紫外線を照射したところ、やはり緑色蛍光を発することが観察された。以上のことから、目的の緑色蛍光タンパク質が活性体として発現していることがわかった。
【００６０】
ＡＳＰ１３８株（実施例９）をＹＰＤ１００培地５ｍｌに植菌し、３２℃で３日間培養した。集菌、洗菌後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁し、ミニビードビーター（バイオスペック製）を用いたガラスビーズによる破砕を行った。ガラスビーズを除いた後、ＳＤＳ（１％）存在下で８０℃、１５分間加熱し、抽出液を得た。別にｐＲＩ０Ｍを導入した形質転換体についても、同じ方法で抽出液を作製し、ネガティブコントロールとした。
【００６１】
５０μｇタンパク質相当の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した（図１１（ａ）、（ｂ））。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色したところ、ポジティブコントロールである組換え緑色蛍光タンパク質（Clonetech製）と同じ分子量２５０００付近にネガティブコントロールにない顕著なバンドが確認された。さらに５０μｇ相当のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗緑色蛍光タンパク質抗体（Clonetech製）を用いたウエスタンブロッティング法で解析した。その結果、ポジティブコントロールと同じ分子量２５０００付近にネガティブコントロールにない顕著なバンドが確認された。以上のことから、目的の緑色蛍光タンパク質が発現していることが生化学的に明らかになった。
【００６２】
［実施例１１］
培養方法の最適化（１）
S. pombe 形質転換体  ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ１００培地）に植菌し、３２℃で培養した。蛍光付属装置（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）付きマイクロプレートリーダー（コロナ電気（株）製）で培養液の発する蛍光値を測定し、緑色蛍光タンパク質の発現量を調べた（図１２（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、非誘導型のサイトメガロウイルスプロモータを用いたＡＳＰ１２２株［ｐｈＧＦＰＳ６５Ｔ（Clonetech製）をもとに特開平７−１６３３７３号公報記載の方法にしたがって作成した緑色蛍光蛋白質Ｓ６５Ｔ変異体発現組換え体］に比べ、ＡＳＰ１３８株では増殖期中期まで発現がみられず、グルコースが枯渇する増殖期後期になって初めて発現が開始することがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在下で抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６３】
［実施例１２］
ＡＳＰ１３８株の培養（２）
S. pombe 形質転換体  ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増殖期中期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換し、培養を続けた（図１３（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untreated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-changed）では培地交換によって発現が開始することが観察された。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによって高い発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６４】
［実施例１３］
ＡＳＰ１３８株の培養（３）
S. pombe 形質転換体  ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増殖期後期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換し、培養を続けた（図１４（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untreated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-changed）では培地交換によって発現が開始することが観察された。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって高濃度のグルコースを含む培地で培養を開始し、グルコースが消費される前に低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによって高い発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在下で抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６５】
［実施例１４］
リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号１４および配列番号１５に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ  ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入プロモータフラグメントとした。
【００６６】
ヒトのリポコルチンＩ遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２Ｌ（特開平７−１６３３７３号）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約１０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ  ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメントとした。
【００６７】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ  ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００６８】
これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によってリポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩを保持する大腸菌をスクリーニングし、このベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００６９】
［実施例１５］
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株の作製
リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩおよび導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe 野生株ＡＲＣ００１を前記岡崎らの方法に従って形質転換した。
【００７０】
ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００１培養液  １ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。菌数１ｍｌあたり１．０×１０7個の段階で集菌し、水で洗菌後、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液１００μｌに、２μｇの組換えベクターｐＲＩ０ＬＰＩおよび１μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７を１５μｌのＴＥに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０００を２９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌの１／２ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希釈したもの１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日間培養したところ、約３００個の互いに独立したコロニーがプレート上に出現した。
【００７１】
得られた形質転換体１０個（コロニー）を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３２℃で振盪培養した。２日目に３個のクローンが生育した。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、３日目に全てのクローンが生育した。これらを目的の形質転換体候補株、ＡＳＰ１３９株としてグリセロール凍結保存するとともに、以下の実験に使用した。
【００７２】
［実施例１６］
リポコルチンＩの発現解析
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株（実施例１５）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で定常状態にいたるまで培養して集菌し、非誘導培養菌体とした。これとは別に、同じ培地で培養を開始し、増殖期中期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換して培養を続け、定常期に集菌し、誘導培養菌体とした。両菌体を洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁し、ミニビードビーターを用いたガラスビーズによる破砕を行った。ガラスビーズを除いた後、ＳＤＳ（１％）存在下で８０℃、１５分間加熱し、抽出液を得た。
【００７３】
５０μｇタンパク質相当の両抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシーブリリアントブルーで染色した。その結果、誘導培養菌体由来の抽出物において、組換えリポコルチンＩタンパク質の配列から予想される位置と同じ分子量４５０００付近に、非誘導培養菌体由来の抽出物にない顕著なバンドが確認された。より感度の高いウエスタン法によって両者のバンドの濃さを比べたところ、誘導培養菌体抽出物に由来するバンドは非誘導培養菌体抽出物のものに比べて１０倍以上あることがわかった。以上のことから、培地を交換しないものに比べて、培地を交換したものでは培地交換によって発現が開始することが明らかになった。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによってた発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質であるリポコルチンＩの発現にも利用できることがわかった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のタンパク質生産方法を実施することによって、特定の栄養源の有無により遺伝子発現を制御し、目的タンパク質の生産時期が制御可能になる効果が認められる。ひいては、自身の生理活性のために生産量が低いタンパク質や、他の理由でこれまで生産できなかったタンパク質を生産可能とする効果が達成される。
【００７５】
【配列表】
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【００７６】
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【００７７】
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【００８９】
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【００９０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｉｎｖ１+、シュワニオミセス・オキシデンタリスのインベルターゼ遺伝子、出芽酵母のＳＵＣ２のアミノ酸配列（部分）の比較を示す図である。
【図２】ｉｎｖ１+遺伝子の制限酵素地図を示す。
【図３】ｉｎｖ１+遺伝子破壊を示す電気泳動図である。
【図４】図４（ａ）はゲルオーバーレイアッセイによるインベルターゼ活性を示すコロニーの図面代用写真（生物の形態）である。図４（ｂ）は図４（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図５】図５（ａ）はコロニーの形態を示す図面代用写真（生物の形態）である。図５（ｂ）は図５（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図６】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図７】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図８】インベルターゼプロモータの解析図である。
【図９】誘導発現ベクターｐＲＩ０Ｍの構築図である。
【図１０】緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの構築図である。
【図１１】図１１（ａ）、図１１（ｂ）は、それぞれ緑色蛍光タンパク質の発現解析図である。
【図１２】図１２（ａ）、図１２（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。
【図１３】図１３（ａ）、図１３（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４（ａ）、図１４（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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