(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスの産生に用いられるヒト胎児腎細胞由来の２９３細胞であって、
（１）ＥＦ１αプロモーターの下流にレトロウイルスの構造タンパク質ｇａｇ及びｐｏｌをコードするＤＮＡが機能的に結合した発現構築物；及び
（２）ＥＦ１αプロモーターの下流にレトロウイルスの構造タンパク質ｅｎｖをコードするＤＮＡが機能的に結合した発現構築物、
を有する細胞。
【請求項２】
ｅｎｖがエコトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖまたはアンフォトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
発現構築物中のレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始コドンの上流に、Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列が配置されている、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
レトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡがＩＲＥＳ配列を介して選択マーカーをコードするＤＮＡと結合している、請求項１から３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
レトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のコード領域以外のウイルスゲノム由来ＤＮＡを実質的に有さない、請求項１から４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
２９３細胞が、２９３Ｔ細胞である、請求項１から５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７３７または寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７７で特定される細胞。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の細胞に、少なくとも１つの構造タンパク質をコードする遺伝子を欠損しているレトロウイルスベクターＤＮＡを導入する工程を含む、レトロウイルスの産生方法。
【請求項９】
レトロウイルスベクターＤＮＡが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードする遺伝子をすべて欠損している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
レトロウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子が含まれている、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高力価ウイルスを生産する能力を安定に保持するウイルス生産細胞（パッケージング細胞）およびウイルス生産のための該細胞の利用に関する。
背景技術
レトロウイルスベクターは、宿主細胞に対し高い効率で、しかも安定に遺伝子を導入できることから、細胞への遺伝子導入法として医療分野を含む広い分野で用いられている。レトロウイルスベクターの作製は、レトロウイルスの遺伝子構造、生活環のメカニズムに基づき開発されてきた。その基本原理は、パッケージングシグナルは有するが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの各構造遺伝子を欠如するレトロウイルスベクターに目的の遺伝子を導入し、当該レトロウイルスベクターを、パッケージングシグナルを欠くが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの各構造遺伝子を有するパッケージング細胞に導入し、レトロウイルスベクターＲＮＡを含むウイルス粒子を形成（パッケージング）させ、その培養上清にレトロウイルスを産生するものである（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６７，３５１−３５９，１９９８）。この様にして産生されたレトロウイルスは、目的とする遺伝子を効率よく細胞に導入することができる。一方、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの各構造遺伝子を欠如する為、パッケージング細胞の中でのみ複製でき、通常の細胞においては複製できない。従って、作製した感染細胞から再度レトロウイルスが産化されることがない。
このような特徴を有するパッケージング細胞の作製は、国際公開番号ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９４／１９４７８、ＷＯ９６／３４０９８等で示されているが、感染効率、長期安定性の点で満足できるものではなかった。また、ウイルスの力価を高めるために大量のウイルス構造タンパク質をパッケージング細胞中で発現させる必要がある。大量のウイルス構造タンパク質を発現し、継代によっても生産されるウイルスの力価の低下が起こりにくいパッケージング細胞が求められていた。
発明の開示
本発明は、高力価の感染性ウイルスを産生する能力を保持するウイルス産生細胞を提供することを課題とする。該細胞の好ましい態様において、長期安定性や安全性が高められたウイルス産生細胞を提供する。また、本発明は、該ウイルス産生細胞を用いる、高力価の感染性ウイルスの生産方法を提供することをも課題としている。
本発明者は、上記課題を解決するために、まず、２９３Ｔ細胞において、高い活性を有するプロモーターの探索を行った。本発明者は、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＴＫプロモーター、ＭｕＬＶ  ＬＴＲ、ＣＭＶ  ＬＴＲの転写活性の強さを調べたところ、ＥＦ１αプロモーターが、他のプロモーターに比較して顕著に高い活性を示すことを見出した。そこで、次に、ＥＦ１αプロモーターを用いた高性能パッケージング細胞の樹立を試みた。
具体的には、本発明者は、パッケージング細胞において、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の発現効率を高めるために、ウイルス構造タンパク質をコードするｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子をＥＦ１αの制御下に組み込んだ。さらに、転写されたｍＲＮＡからのウイルス構造タンパク質の翻訳効率を高めるため、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）を該遺伝子の翻訳開始コドンの上流に配した。さらに、該遺伝子の下流にＩＲＥＳ配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：内部リボソーム侵入部位）を介して選択マーカー耐性遺伝子をつなげることで、１本のｍＲＮＡからＩＲＥＳ前後にある遺伝子が翻訳され、構築物が導入され発現している細胞を選択マーカーにより確実に選択することを可能にした。すなわち、選択マーカー耐性遺伝子を有する構築物と、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する構築物を別々に導入して作製されていた従来のパッケージング細胞よりも、長期安定性に優れた細胞を作製した。
また、構築物上に、ウイルス構造タンパク質のコード領域のみをＰＣＲによって増幅した遺伝子としてｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を挿入することにより、パッケージング細胞から組み換えによる野生型ウイルスが産生される可能性をなくし、安全性を向上させた。
本発明者は、このようにして作製されたパッケージング細胞の性能につき検討を行なった結果、該パッケージング細胞は、高力価のレトロウイルスを産生し、４ヶ月の長期継代後でも、それ以前と同等の力価のレトロウイルスを産生する能力を保持していた。本発明のパッケージング細胞は生体内への遺伝子導入のためのベクターの作製に有用であり、特に遺伝子治療などに用いられる高力価レトロウイルスベクターの製造等に好適に利用しうる。
即ち、本発明は、長期間継代しても高力価の感染性ウイルスを産生する能力を保持し、安全性にも優れたウイルス産生細胞、および該ウイルス産生細胞を用いる高力価の感染性ウイルスの産生方法に関し、より具体的には、
（１）  レトロウイルスの産生に用いられる細胞であって、ＥＦ１αプロモーターの下流にレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合した発現構築物を有する細胞、
（２）  レトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖからなる群より選択される１または複数のタンパク質をコードするＤＮＡである、（１）に記載の細胞、
（３）  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖのすべてを発現する、（２）に記載の細胞、
（４）  ｇａｇおよびｐｏｌを発現する発現構築物とｅｎｖを発現する発現構築物とを有する、（３）に記載の細胞、
（５）  ｅｎｖがエコトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖまたはアンフォトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖである、（３）または（４）に記載の細胞、
（６）  発現構築物中のレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始コドンの上流に、Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列が配置されている、（１）から（５）のいずれかに記載の細胞、
（７）  レトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡがＩＲＥＳ配列を介して選択マーカーをコードするＤＮＡと結合している、（１）から（６）のいずれかに記載の細胞、
（８）  レトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のコード領域以外のウイルスゲノム由来ＤＮＡを実質的に有さない、（１）から（７）のいずれかに記載の細胞、
（９）  細胞が２９３細胞由来である、（１）から（８）のいずれかに記載の細胞、
（１０）  細胞が２９３Ｔ細胞由来である、（９）に記載の細胞、
（１１）  寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７３７または寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７７で特定される細胞、
（１２）  （１）から（１１）のいずれかに記載の細胞に、少なくとも１つの構造タンパク質をコードする遺伝子を欠損しているレトロウイルスベクターＤＮＡを導入する工程を含む、レトロウイルスの産生方法、
（１３）  レトロウイルスベクターＤＮＡが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードする遺伝子をすべて欠損している、（１２）に記載の方法、
（１４）  レトロウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子が含まれている、（１２）または（１３）に記載の方法、
（１５）  （１２）から（１４）のいずれかに記載の方法により生産されたレトロウイルス、を提供するものである。
本発明のパッケージング細胞は、レトロウイルスの構造タンパク質を発現させるために、ＥＦ１αプロモーターを用いることを特徴としている。本発明者等は、パッケージング細胞内で高い活性を示すプロモーターの探索を行なった結果、活性を検出したプロモーターの中で特にＥＦ１αプロモーターが強力な活性を有することを見出した。本発明のパッケージング細胞は、ＥＦ１αプロモーターを用いることにより、レトロウイルスの構造タンパク質を高発現させ、力価の高いウイルス粒子の生産を行なうことを可能としている。
パッケージング細胞において、ＥＦ１αプロモーターの制御下でレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるためには、ＥＦ１αプロモーターの下流にレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合した発現構築物を作製し、これを細胞に導入すればよい。ここで「機能的に結合」とは、ＥＦ１αプロモーターがその活性化によって下流のレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡの発現を保証するように該ＤＮＡに結合していることを指す。
細胞において発現されるレトロウイルスの構造タンパク質としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖが挙げられる。論理的にはパッケージング細胞においてこれらすべてのタンパク質を発現させる必要はなく、レトロウイルスベクターＤＮＡにこのうちのいくつかのタンパク質をコードする遺伝子をのせておくことも可能である。例えば、パッケージング細胞にｇａｇ、ｐｏｌを発現させて、ｅｎｖ遺伝子はレトロウイルスベクターＤＮＡにのせておくようなことも可能であるが、この場合にはｅｎｖの発現量が必要量まで達しない可能性がある。従って、パッケージング細胞においては、ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖの全てが発現していることが望ましい。
発現構築物としては、ｇａｇおよびｐｏｌを発現する構築物とｅｎｖを発現する構築物を分けて細胞に導入することが好ましい。これにより、レトロウイルスベクターとパッケージング細胞内に存在するｐｏｌ，ｇａｇ，ｅｎｖとの間で組換えが生じて、自己複製可能なウイルスが産生される可能性を低下させることができる。このことは、例えば、該細胞により生産されるウイルスを遺伝子治療に用いる際の安全性の点から重要である。ｇａｇおよびｐｏｌについては同じ構築物にｇａｇ−ｐｏｌとしてコードされていることが好ましい。仮に別々の発現構築物とした場合、ｐｏｌのみが多量に発現してしまうと細胞に対して毒性が生じることが知られており、また、ｐｏｌとｇａｇの発現比率が高力価ウイルスの産生に重要であるからである。
ｅｎｖとしては、所望によりエコトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖ（ｅｃｏｅｎｖと称する）やアンフォトロピックレトロウイルス由来のｅｎｖ（ａｍｐｈｏｅｎｖと称する）を用いてパッケージング細胞を作製することができる。ｅｃｏｅｎｖを有するパッケージング細胞からはエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスが産生される。また、ａｍｐｈｏｅｎｖを有するパッケージング細胞からは、アンフォトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスが産生される。エコトロピックレトロウイルスは、ラットおよびマウスの細胞表面にのみに存在するエコトロピック受容体に結合する糖タンパク質を有することから、ラットあるいはマウス細胞にのみ感染する。一方、アンフォトロピックレトロウイルスは、より広範な種に対して感染可能であり、例えば、ラット、マウス、ヒト、ニワトリ、イヌ、ネコ等に感染できる。例えば、遺伝子治療に用いるレトロウイルスとしては、ヒトに感染可能なａｍｐｈｏｅｎｖが用いられる。また、実験室で新規遺伝子のクローニング等に用いる場合には、ヒトに感染できないｅｃｏｅｎｖを有するパッケージング細胞から作製されたレトロウイルスを用いることが安全である。
また、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のｅｎｖなど種々のレトロウイルスｅｎｖが使用されうる（Ｌａｎｄａｕ  Ｎ．Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｔｔｍａｎ  Ｄ．Ｒ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５１１０−５１１３））。さらに、レトロウイルス以外のエンベロープタンパク質を使用してもよい。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を用いることができる（Ｏｒｙ  Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１４００−１１４０６）。
本発明のパッケージング細胞においては、好ましい態様として、レトロウイルスの構造タンパク質を発現させるための発現構築物から転写されたこれらタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳効率を高めるため、該発現構築物中のレトロウイルスの構造タンパク質遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＫｏｚａｋ配列のコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）を配することができる（Ｋｏｚａｋの法則とは、翻訳開始点ＡＴＧの前の配列にＧＣＣＡＣＣが存在する確率が高いことを明らかにしたものである）。
本発明のパッケージング細胞の他の好ましい態様として、ウイルス構造タンパク質および選択マーカーをコードするＤＮＡがＩＲＥＳを介して機能的に結合し、ウイルス構造タンパク質と選択マーカーとが同時に発現する発現構築物を有するパッケージング細胞が提供される。該発現構築物においては、ＥＦ１α活性化により転写された単一分子内にウイルス構造タンパク質および選択マーカーがコードされており、該ＲＮＡ分子からは、一方のタンパク質が翻訳されるのみならず、ＩＲＥＳの働きにより選択マーカーも翻訳される。このため該発現構築物が導入されレトロウイルス構造タンパク質を発現している細胞を、該選択マーカーにより確実に選択することが可能となった。従来は、選択マーカー耐性遺伝子を有する発現構築物と、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する発現構築物を別々に細胞に導入してパッケージング細胞を作製していたため、選択マーカー耐性遺伝子を有する細胞とウイルス構造蛋白質遺伝子を有する細胞とが必ずしも一致せず、該細胞の安定性に問題が生じていたが、ＩＲＥＳ配列の利用により長期安定性に優れたパッケージング細胞の調製が可能となった。
選択マーカーとしては、実施例に記載したブラスチシジンやピューロマイシンの他に、例えばハイグロマイシン、ジフテリアトキシン、ネオマイシンなどを使うことができる。しかしながら、ブラスチシジンやピューロマイシンは、他の薬剤に比べて即効性で細胞の選択に必要な時間が短くてすむという点で好ましい。ジフテリアトキシンおよびハイグロマイシンの耐性遺伝子はそれぞれ「Ｂｉｓｈａｉ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１５５４−１５６３（１９８７）」および「ハイグロマイシン：Ｙｉｎ，Ｄ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４９２２−４９２８（１９９５）」に記載されている。
本発明のパッケージング細胞のさらなる好ましい態様として、ＥＦ１α制御下のレトロウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のコード領域以外のＤＮＡを実質的に有さない発現構築物を有する細胞が提供される。本発明のパッケージング細胞においては、構造タンパク質の発現に必須ではないウイルスゲノム由来配列はできる限り除去されていることが好ましい。これにより、上記発現構築物を有するパッケージング細胞にレトロウイルスベクターＤＮＡを導入した際に、該発現構築物中のウイルスゲノム由来ＤＮＡとレトロウイルスＤＮＡの間の組換えの可能性を低下させ、複製能を有するレトロウイルス（ＲＣＲ）が出現するリスクを最小限に抑制することができる。従って、これによりパッケージング細胞から産生されるウイルス粒子の安全性を向上させることができる。
このようなレトロウイルスの構造タンパク質のコード領域以外のＤＮＡを実質的に有さないＤＮＡは、例えば、実施例に記載されたようにウイルスゲノムＤＮＡを鋳型に、ウイルス構造タンパク質のコード領域に対応するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により得ることができる。ここでコード領域以外のＤＮＡを「実質的に有さない」とは、ウイルスゲノム由来のタンパク質コード領域以外のＤＮＡが、３０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、さらに好ましくは５塩基以下、最も好ましくは０塩基であることをいう。
パッケージング細胞を作成するための宿主細胞としては、トランスフェクションによる遺伝子導入効率が高い細胞であれば制限はなく、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）や２９３（ヒト胎児腎細胞）（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６，５９−７２（１９７７））などを用いることができる。
発現構築物の細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、あるいはリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、フュージン（Ｆｕｇｅｎｅ，Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等による一般的な遺伝子導入方法を用いることができる。選択方法としては薬剤選択を用いることができ、薬剤選択に用いる薬剤としては薬剤耐性遺伝子が明らかになっているものであれは制限はなく、例えば、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジフテリアトキシン、ネオマイシンなどを用いることができる。
得られたパッケージング細胞は、限界希釈し、各クローンにレトロウイルスベクターＤＮＡを導入し、産生されるウイルスの力価を測定して、最も高い力価のウイルスを産生する細胞を選択しクローン化することが好ましい。
パッケージング細胞に導入されるレトロウイルスベクターＤＮＡとしては特に制限はない。パッケージング細胞が２９３Ｔ細胞のようにＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞に由来する場合は、ＳＶ４０の複製開始点と結合された該ベクターＤＮＡを用いれば、パッケージング細胞内でのコピー数を増加させることができ、力価の上昇を期待することができる。
レトロウイルスベクターＤＮＡの細胞への導入は、上記ウイルス構造タンパク質発現構築物の細胞への導入と同様にして行うことができる。レトロウイルスベクターを導入後、パッケージング細胞の培養上清中に放出されるレトロウイルス粒子を回収することにより、目的のレトロウイルスベクターを調製することができる。
本発明のパッケージング細胞により生産されたレトロウイルスベクターは、広範囲の研究・医療分野に有用に用いられる。例えば、遺伝子治療やモデル動物の作製において目的の遺伝子をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるためのベクターとして用いられる。また、抗原タンパク質や免疫機能を高めるタンパク質を発現させるためのワクチンとしても有用である。また、遺伝子機能を解析するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入ベクターとしても有用である。また、該ベクターを、目的のタンパク質を製造するために用いることもできる。また、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのように、不特定のｃＤＮＡ分子種を発現するライブラリーの作製用ベクターとしても有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ＦＡＣＳ−ＧＡＬ解析
２９３細胞、２９３Ｔ細胞においてプロモーター活性を比較し、最も高い活性を示すプロモーターを用いるため、ＦＡＣＳ−ＧＡＬ解析（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｎ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１２，２９１−３０１，１９９１）を行った。これはそれぞれのプロモーターの下流にｌａｃＺ遺伝子をつなぎ、細胞内にトランスフェクションしてその細胞内でのｌａｃＺの発現分布を調べるものである。
トランスフェクションする１６〜２４時間前に２９３細胞、２９３Ｔ細胞を６ｃｍ組織／培養皿に２×１０６まいた。それぞれのプロモーターの下流にｌａｃＺをつないだプラスミド３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）９μｌを２００μｌの胎児ウシ血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分おいた。その後、２９３細胞、２９３Ｔ細胞を播いた６ｃｍ皿にゆっくり加えた。２４時間後細胞をはがし、５０μｌのＰＢＳに懸濁した後、３７℃で５分間置いた。ＦＤＧ（フルオレセイン  ジ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド，モレキュラープローブ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，カタログ番号Ｆ１１７９：２ｍＭ  ｉｎ  ９８％蒸留水）をあらかじめ３７℃で温めておき、５０μｌを加えた。３７℃で１分間インキュベートしたあと、ＰＢＳを１ｍｌ加え、氷上で２時間おく。２時間後反応を止めるためＰＥＴＧ（フェニルエチル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド，Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ４９０２）を２０μｌ加え、ＦＡＣＳにて細胞内のｌａｃＺの発現分布を調べた。その結果、２９３Ｔ細胞内において、ＥＦ１αのプロモーター活性が一番高かった。レトロウイルスのプロモーターであるＬＴＲと比較した場合、ＥＦ１αのプロモーター活性は約１００倍高く、その他のプロモーターに対しても数十倍高い活性を示した。
［実施例２］  選択マーカー遺伝子の増幅
選択マーカーとしてブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を用いるため、それぞれの抵抗性遺伝子（ｂｓｒ：Ｋａｍａｋｕｒａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３１６５−３１６８，１９８７．ｐｕｒｏｒ：Ｂｕｃｈｈｏｌｚ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３１１８−３１１９，１９９６）を鋳型として、以下のＰＣＲの条件で、反応を行った。
反応組成は鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、１０×ＫＯＤ  バッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、１０μＭプライマーそれぞれ２．５μｌ（プライマーの塩基配列は以下に示す）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、２．５Ｕ／ｍｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）１μｌである。
プライマーは、ブラスチシジン抵抗性遺伝子（ｂｓｒ）については５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）および５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＴＣＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号：２）を、また、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（ｐｕｒｏｒ）については５’−ＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：３）および５’−ＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号：４）を用いた。温度条件は９４℃３０秒、９４℃３０秒・５４℃３０秒・７２℃２分を２５サイクル、７２℃１０分である。ブラスチシジン抵抗性遺伝子（ｂｓｒ）はＳａｌＩで、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（ｐｕｒｏｒ）はＢｇｌＩＩで制限酵素処理した後、電気泳動し、ゲルからの抽出を行った。抽出にはＱｉａｅｘＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
［実施例３］  ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの調製
ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：内部リボソーム侵入部位）配列とは、ウイルスのｍＲＮＡの５’非翻訳領域に存在する配列であり、特徴的な二次構造をとると考えられている。本配列をリボソームが認識して翻訳が開始し、宿主の蛋白翻訳が抑えられ、ウイルス蛋白の翻訳を優位にすることができることになる。そのＩＲＥＳの後ろに選択マーカー抵抗性遺伝子をつなげるため、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｎｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，４７５４−４７６５，１９９９）をＮｃｏＩで制限酵素処理した。その後エタノール沈殿を行い、クレノウ反応により平滑末端化した。フェノール／クロロホルム処理のあと、エタノール沈殿を行い、ｂｓｒを入れる場合にはＳａｌＩ、ｐｕｒｏｒを入れる場合にはＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、それぞれライゲーションした。このようにしてＩＲＥＳの後ろに選択マーカー抵抗性遺伝子が位置することになる。ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒはＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）とＳａｌＩで、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒはＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ＩＲＥＳ−ｂｓｒ、ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒの断片を切り出した。
［実施例４］  ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖの増幅
ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖのＰＣＲを以下の条件で行った。
反応組成は鋳型ＤＮＡ（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ．，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２９３，５４３，１９８１）１０ｎｇ、１０×ＬＡ  Ｔａｑバッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８μｌ、１０μＭプライマーそれぞれ１μｌ（塩基配列は以下に示す）、５Ｕ／ｍｌ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．５μｌである。
プライマーは、ｇａｇ−ｐｏｌの増幅は５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＡ−３’（配列番号：５）および５’−ＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：６）、また、エコトロピックｅｎｖ増幅は５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：８）を用いた。
温度条件はｇａｇ−ｐｏｌの場合、９８℃２分、９８℃２０秒・６８℃３分を２０サイクル、６８℃８分である。エコトロピックｅｎｖの場合、９８℃２分、９８℃２０秒・６８℃２分を３０サイクル、６８℃７分である。
ＰＣＲ産物を電気泳動で流したのち、ＱｉａｅｘＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりゲルからＤＮＡ抽出を行った。これをＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＴＡベクターにサブクローニングし、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）処理した。
［実施例５］  ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖ発現ベクターの構築
ＥＦ１αのコントロール下でｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ、ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒを発現させるために、以下のようにｐＣＨＯ（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，３５６，２４４−２４８（１９９４）；Ｏｋａｙａｍａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８３８−４５（１９９６）；ｐＣＨＯはｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ．Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３３２，１９９０）に由来する）に挿入した。
［ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）］
ｐＣＨＯをＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ）により制限酵素処理した後、クレノウ反応により平滑末端化した。そこへＳａｌＩリンカーｄ（ＣＧＧＴＣＧＡＣＣＧ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）（配列番号：９）をつけた後、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で制限酵素処理した。ここへ実施例２，３で作製したｇａｇ−ｐｏｌ、ＩＲＥＳ−ｂｓｒ断片をいれ、ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）を作製した。
［ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）］
ｐＣＨＯをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）で制限酵素処理し、ここへ実施例２，３で作製したエコトロピックｅｎｖ、ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒを挿入し、ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）を作製した。
［実施例６］  アンフォトロピックｅｎｖ発現ベクターの構築
エコトロピックｅｎｖは同種由来の細胞にのみ感染可能であるのに対し、アンフォトロピックｅｎｖは幅広い細胞に感染可能である。このアンフォトロピックｅｎｖを用いて、実施例４および５と同様にｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒの発現ベクターの構築を行った。反応組成はアンフォトロピックｅｎｖ遺伝子（４０７０Ａ）（Ｏｔｔ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４．７５７−７６６．，１９９０）の挿入されているプラスミド１０ｎｇ、１０×ＫＯＤバッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、１０μＭプライマー（塩基配列は以下に示す）それぞれ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、２．５Ｕ／ｍｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌである。プライマーは、５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号：１０）および５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：１１）を用いた。温度条件は９８℃３分、９８℃１５秒・６５℃２秒・７２℃３０秒を２５サイクル、７２℃１０分である。
実施例５で作製したｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで制限酵素処理し、クレノウ処理によって、平滑末端化した。ここへ上記アンフォトロピックｅｎｖをライゲーションし、ｐＣＨＯ（ａｍｐｈｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）を作製した。
［実施例７］  パッケージング細胞の樹立
ヒト中腎由来細胞２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，３７９−３８７．１９８７）に、作製したコンストラクトをトランスフェクションした。トランスフェクションする１６〜２４時間前に２９３Ｔ細胞を６ｃｍ組織／培養皿に２×１０６まいた。ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）９μｌを２００μｌのウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分静置した。その後、２９３Ｔ細胞をまいた６ｃｍ  ｄｉｓｈにゆっくり加えた。４８時間後細胞をはがし、１０ｃｍ皿にまき、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ブラスチシジン８μｇ／ｍｌ）を加えた。
約１０日後、ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）、またはｐＣＨＯ（ａｍｐｈｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）それぞれを同様にトランスフェクションし、ピューロマイシン（０．８μｇ／ｍｌおよびブラスチシジン（８μｇ／ｍｌ）の両方が入った培地で培養した。細胞が増殖してきたところで限界希釈し、単一のクローンにすることで目的とするパッケージング細胞を樹立した。
ｅｃｏｅｎｖ発現ベクターが導入された当該パッケージング細胞を「Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞（ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）」と名付けた。該細胞は、「Ｐｔ−Ｅ」として下記の通り寄託機関に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）  平成１１年５月３１日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６７３７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７３７）
一方、ａｍｐｈｏｅｎｖ発現ベクターが導入された当該パッケージング細胞を「Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ細胞（ＰＬＡＴ−Ａ細胞）」と名付けた。該細胞は、「Ｐｌａｔ−Ａ」として下記の通り寄託機関に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）  平成１１年１２月２２日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６９７７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７７）
［実施例８］  レトロウイルスの産生
パッケージング細胞により得られたウイルス液の感染効率を調べるため、以下の方法で感染実験を行った。トランスフェクションする１６〜２４時間前に、パッケージング細胞（ｅｃｏｅｎｖ導入ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）を６ｃｍ組織／培養皿に２×１０６まいた。ＭｏＬｕＬＶを基本骨格としたレトロウイルスベクターで、ＧＦＰが組み込まれているベクターＤＮＡ（ｐＭＸ−ＧＦＰ：Ｏｎｉｓｈｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４，３２４−３２９，１９９６）３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ  ９μｌを２００μｌの血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分おいた。その後、これをパッケージング細胞をまいた６ｃｍ皿にゆっくり加えた。
４８時間後に上清（ウイルス液）を回収し、３０００ｒｐｍで５分間遠心した。このうち、５００μｌに１ｍｇ／ｍｌポリブレン（ｓｉｇｍａ社）を５μｌ、×１０００  ＩＬ３（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ）を１μｌ加え、１×１０５のＢａＦ／３細胞に５時間感染させた。５時間後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＩＬ３含有）を５００μｌ加えた。感染した細胞内においてＧＦＰが発現され、３９５ｎｍ波長の光で励起し、５０９ｎｍの波長の光を放出することを利用し、ＦＡＣＳｃａｎ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて発光する（感染発現している）細胞の割合を感染効率として、２４時間後に測定した。ＢａＦ／３細胞に対する感染効率はウイルス液を濃縮することなく用いても９５％に達した。
液体窒素から同時期に起こしたＰＬＡＴ−Ｅ（ｅｃｏｅｎｖ導入ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）とＢＯＳＣ２３より得られたウイルス液の感染効率をＢａＦ／３細胞を用いて測定したところ、継代を開始して７日目では、いずれのパッケージング細胞を用いた場合でも９０％以上の感染効率が確認されたが、継代２ヶ月後には、ＢＯＳＣ２３を用いた場合の感染効率が２３％にまで低下したのに対し、ＰＬＡＴ−Ｅを用いた場合では、７日目の感染効率と同程度の感染効率が、継代２ヶ月後および４ヶ月後においても保持されていることが確認された（継代を開始してから４ヶ月後において、Ｂａ／Ｆ３細胞に対し７０％以上の感染効率が保持されていた）。すなわち、約４ヶ月の間、約１ｘ１０７／ｍｌの力価のレトロウイルスを産生することができた。
Ｐｌａｔ−Ａ細胞より得られたウイルス液の感染効率をＢａＦ／３細胞を用いて測定したところ、継代開始して７日目に３０％の感染効率が確認された（およそ１ｘ１０６／ｍｌの力価）。
［実施例９］  Ｐｌａｔ−Ｅの安全性の検討
パッケージング細胞にレトロウイルスベクターを導入した際、組み換えにより複製能を有するレトロウイルス（ＲＣＲ；ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）が出現していないかを検討した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞５ｘ１０４を６ｃｍ組織／培養皿にまいた１６時間後、ｐＭＸ−ｎｅｏをパッケージング細胞に導入して産生されたウイルス液１ｍｌに１ｍｇ／ｍｌのポリブレン１０μｌを加え、ウイルスを感染させた。４時間後、１０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭ  ３ｍｌを加え、コンフルエントになるまで培養した。１回継代後、終濃度２μｇ／ｍｌポリブレンの添加されたＤＭＥＭで５０％コンフルエントになるまで培養した後、培地を交換し、２ｍｌのＤＭＥＭで２〜３日培養した。この上清を０．４５μｍフィルターに通し、新たにＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させ、Ｇ４１８（ｎｅｏ）の入ったＤＭＥＭで選択培養した。もし複製能を有するレトロウイルスが産生されているならば、Ｇ４１８耐性コロニーが出現するはずである。しかしながら、このようなコロニーは検出されなかった。
［実施例１０］  Ｂｏｓｃ２３細胞及びＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞と比較したＰｌａｔ−Ｅ細胞の安定性の検討
本発明者等は、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞がその初期経過において、一過性のトランスフェクションにより長期間安定して高い力価のレトロウィルスを産生することができるか否かにつき、Ｂｏｓｃ２３細胞及びＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞の場合と比較した。この３つのパッケージング細胞系列の培養条件を以下に示す。Ｂｏｓｃ２３細胞は製造業者の指示に従い、ＧＰＴ選抜試薬を含む、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭにて増殖させた（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）。Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞は、ＣＤ８の発現を指標にＦＡＣＳにより分類し、ハイグロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）及びジフテリア毒素（１μｇ／ｍｌ）を含む、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で１週間培養した後、ハイグロマイシン及びジフテリア毒素を含まない、１０％牛胎児血清を添加したＤＥＭＥ中に移植した。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞は、常に、ブラスチジン（１０μｇ／ｍｌ）およびプロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含む、１０％牛胎児血清を添加したＤＥＭＥ中にて維持した。Ｂｏｓｃ２３から産生されたレトロウイルスの感染効率は３ヶ月以内に減少し、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞から産生されたレトロウイルスの感染効率も同時に減少した。一方、Ｐｌａｔ−Ｅは薬剤選抜圧がかけられた状況下において少なくとも４ヶ月間、一過性の遺伝子導入で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して平均約１×１０７／ｍｌの力価をもち、ＢａＦ／３細胞に対して７５％以上（最高９９％）の感染効率を持つレトロウイルスを産生した。
Ｐｌａｔ−Ｅ、Ｂｏｓｃ２３、及びＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅパッケージング細胞系列におけるＧａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ  ｍＲＮＡの発現レベルを比較するために、３週間培養した細胞を用いてノーザンブロット解析を行なった。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞におけるＧａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ  ｍＲＮＡの発現レベルは、他の細胞系と比較して、それぞれ４倍と１０倍であった。
細胞溶解物におけるＲＴ活性の解析も行なった。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞では、Ｂｏｓｃ２３及びＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞と比較して、少なくとも２倍のＲＴ活性が検出された。さらに、ｅｎｖ蛋白質の発現レベルは、ｅｎｖ遺伝子産物に対する抗体染色によって評価した場合、Ｂｏｓｃ２３及びＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞よりもかなり高かった。
以上から、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞が高力価のレトロウイルスを長期間安定的に生産することができることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、長期間継代しても高力価の感染性ウイルスを産生する能力を保持するウイルス産生細胞が提供された。また、該ウイルス産生細胞を用いる、高力価の感染性ウイルスの産生方法が提供された。本発明のレトロウイルスパッケージング細胞を用いれば、高力価のレトロウイルスを安定に供給することが可能となる。また、パッケージング細胞に含まれるウイルスゲノムを最小限にすることにより、複製能を有するレトロウイルス（ＲＣＲ）等の望ましくない組換え体ウイルスの生成の可能性をより低くすることに成功した。従って、本発明のレトロウイルスパッケージング細胞は、生物学、医学研究分野において、レトロウイルスベクター作製のための強力なツールとなる他、遺伝子治療における遺伝子導入ベクターの作製にも有用である。
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