(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列認識番号２により表されるp53タンパク質の残基360〜386にマップされる負の調節領域に由来する４〜26の連続アミノ酸からなるペプチドであって、
（a）p53 DNA結合検定において、野生型p53またはp53突然変異体のDNA結合を活性化し、該突然変異体がp53-ser239、p53-his273、p53-gln248、p53-trp282およびp53-cys273からなる群より選択され；
（b）ヒトp53の部分断片ではない、
ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列認識番号２により表されるヒトp53の残基363-373、368-380、373-383、371-383、363-382、378-382、367-386、363-386、362-386または360-386を含有する請求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列認識番号２により表されるヒトp53の残基363-370、368-373、368-372、369-373、370-375または370-374を含有する請求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項４】
前記の４〜26のアミノ酸の少なくとも一つが非ヒトp53配列の対応する残基で置換されている請求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項５】
野生型p53のDNA結合を活性化するペプチド模倣物を同定する方法であって、前記方法が、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペプチドと類似する構造を有する非ペプチド化合物を選択し、p53 DNA結合検定において前記化合物のDNA結合刺激能力を決定することを具備した方法。
【請求項６】
野生型p53のDNA結合を活性化するペプチド模倣物を同定する方法であって、前記方法が、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペプチドの一部を、類似の構造を有する非ペプチド部分で置換した化合物を選択し、p53 DNA結合検定において前記化合物のDNA結合刺激能力を決定することを具備する方法。
【請求項７】
請求の範囲第５項に従って同定されるペプチド模倣物であって、前記ペプチド模倣物が、配列認識番号２により表されるp53の残基361-383にマップされる負の調節領域に由来する４〜26の連続アミノ酸からなるペプチドの生物活性を有するペプチド模倣物。
【請求項８】
請求の範囲第６項に従って同定されるペプチド模倣物であって、前記ペプチド模倣物が、配列認識番号２により表されるp53の残基361-383にマップされる負の調節領域に由来する４〜26の連続アミノ酸酸からなるペプチドの生物活性を有するペプチド模倣物。
【請求項９】
配列認識番号２により表されるp53の残基360-386にマップされる負の調節領域に由来する４〜26の連続アミノ酸からなるペプチド模倣物であって、前記４〜26の連続アミノ酸が、ヒトp53のアミノ酸残基363-370、363-373、368-372、368-373、368-380、369-373、370-374、370-375、373-383、371-383、363-382、378-382、367-386、363-386、362-386または360-386からなる群より選択され、前記ペプチド模倣物が請求の範囲第１項記載のペプチドの生物活性を有するペプチド模倣物。
【請求項１０】
請求の範囲第１〜４項または第９項のペプチドまたはペプチド模倣物によってそのDNA結合能力が活性化されうるp53突然変異体を同定する方法であって、
p53突然変異蛋白質の試料を請求の範囲第１〜４項または第９項のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド模倣物と混合すること；および
その混合物を、p53またはその突然変異体のDNA結合を測定するDNA結合検定（但し、前記p53突然変異体のDNA結合は、前記ペプチドまたはペプチド模倣物によって、前記ペプチドまたはペプチド模倣物の非存在下におけるDNA結合よりも活性化される。）にかけることを具備する方法。
【請求項１１】
該DNA結合検定が、5'-TGGCATGTCATGGCATGTCA-3'を含む二本鎖DNA分子に対する結合を測定する検定である請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ損傷因子への暴露、乾癬、アテローム性動脈硬化症、癌および動脈再狭窄症に特有の異常な細胞増殖、移植物の拒絶および自己免疫疾患からなる群より選択される症状を治療するための薬学的組成物であって、薬学的に許容しうる担体中に、請求の範囲第１〜４項または第９項のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物を含む薬学的組成物。
【請求項１３】
p53突然変異体を発現する腫瘍を有する患者を治療するための薬学的組成物であって、ここで前記p53突然変異体は、配列認識番号２により表されるp53の残基360〜386にマップされる負の調節領域の全部または一部に対応するペプチド、修飾ペプチド、またはペプチド模倣物により活性化され得るものであり、
前記方法が、請求の範囲第１２項に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを具備する薬学的組成物。
【請求項１４】
前記p53突然変異体が、p53-ser239、p53-his273、p53-gln248、p53-trp282およびp53-cys273からなる群より選択される、請求の範囲第１３項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
請求の範囲第１３項に記載の薬学的組成物であって、DNAを結合する前記能力が、
前記患者の腫瘍に由来する試料を、前記負の調節領域の全部または一部に対応するペプチド、修飾ペプチド、またはペプチド模倣物と混合すること；および
p53 DNA結合検定において前記混合物のDNAを結合する能力を測定することにより決定される、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、腫瘍サプレッサー蛋白質に由来するペプチド、並びにそれらの治療および薬物設計における使用の分野に関する。
発明の背景
野生型（wt）p53は、ヒトおよび他の哺乳動物に認められる配列特異的なDNA結合性蛋白質であり、腫瘍サプレッサー機能を有する［Harris（1993）Science, 262:1980-1981］。p53をコードする遺伝子は全てのヒト腫瘍の半数以上で突然変異しており、このことは腫瘍発生にとってp53蛋白質の機能の不活化が重要であることを示唆している。
ヒトp53遺伝子のヌクレオチド配列と、コードされたp53蛋白質のアミノ酸配列は既に報告されている［Zakut-Houriら（1985）EMBO J. 4:1251-1255: GeneBank Code Hsp53］。本明細書には、以下に、これらの配列をそれぞれ配列認識番号1および2として記載する。p53のアミノ酸配列は進化の過程で保存されているので［Soussiら（1990）Oncogene, 5:945-952］、その機能も保存されていることが示唆される。
p53蛋白質は、細胞増殖と細胞死（アポトーシスとしても知られる）を調節する機能を有する。また、DNA損傷因子に対する細胞の応答にも関与する［Harris（1993）上記］。これらの機能の発現には、p53がDNAを配列特異的に結合し、それに続いて転写を活性化することが必要である［Pietenpolら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:1998-2002］。本明細書においてp53のDNA結合活性に言及する場合は、特に示さない限り、この配列特異的結合に関するものとする。
p53をコードする遺伝子は、全てのヒト腫瘍の半数以上で突然変異している［Harris（1993）上記］。したがって、それがコードする突然変異p53蛋白質はDNAを結合することができず［Bargonettiら（1992）Genes Dev. 6:1886-1898］、またその腫瘍抑制機能を発揮することができない。p53機能の喪失は腫瘍発生にとって極めて重要である。野生型p53を腫瘍細胞中に導入すると、細胞増殖の停止または細胞死が起こる［Finlayら（1989）Cell, 57:1083-1093；Eliyahuら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8763-8767；Bakerら（1990）Science, 249:912-915；Mercerら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6166-6170；Dillerら（1990）Mol. Cell. Biol., 10:5772-5781；Isaacsら（1991）Cancer Res., 51:4716-4720；Yonish-Rouachら（1993）Mol. Cell Biol., 13:1415-1423；Loweら（1993）Cell, 74:957-967；Fujiwaraら（1993）Cancer Res., 53:4129-4133；Fujiwaraら（1994）Cancer Res., 54:2287-2291］。したがって、もし腫瘍に由来するp53突然変異蛋白質のDNA結合を活性化することが可能なら、腫瘍成長は抑止されるだろう。また野生型p53を発現する腫瘍についても、そのDNA結合活性を活性化すれば、内因性p53蛋白質の機能が増強されて、腫瘍成長が抑止されるかもしれない。
p53のN末端［GenBank Code Hsp53として保存されている野生型p53配列（本明細書では配列認識番号2）の残基1-90；本明細書で使用する残基番号はすべてこの配列に対応する］は、その転写活性化ドメイン（トランス活性化（trans-activation）ドメインとしても知られる）をコードしている［Fieldsら（1990）Science, 249:1046-1049］。配列特異的DNA結合ドメインは、その位置が野生型p53のアミノ酸残基90-289に特定されている［HalazonetisおよびKandil（1993）EMBO J., 12:5057-5064；Pavletichら（1993）Genes Dev., 7:2556-2564；Wangら（1993）Genes Dev., 7:2575-2586］。p53は、そのDNA結合ドメインよりC末端側に、四量化ドメインを含有している。このドメインはp53の残基322-355にマップされる［Wangら（1994）Mol. Cell. Biol., 14:5182-5191］。このドメインの作用によって、p53はホモ四量体を形成し、DNAに結合したときにもその四量体化学量論を維持する［Kraissら（1988）J. Virol., 62:4737-4744；Stengetら（1992）Mol. Carcinog., 5:102-105；Stuzbecherら（1992）Oncogene, 7:1513-1523；Friedmanら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3319-3323；HalazonetisおよびKandil（1993）EMBO J., 12:5057-5064；Hainautら（1994）Oncogene, 9:299-303］。
四量化ドメインのC末端側（すなわちヒトp53のC-末端から残基355まで）には、DNA結合を負に調節する領域が存在する。ヒトp53の残基364-393か、マウスp53の対応する残基（配列認識番号3に示すマウスp53配列の残基361-390）を欠失させると、この領域の機能は失われる［Huppら（1992）Cell, 71:875-886；Halazonetisら（1993）EMBO J., 12:1021-1028；HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。
したがって、この負調節領域の欠失はp53のDNA結合を活性化する［HalazonetisおよびKandil（1992）上記；Huppら（1992）上記］。また、p53のアミノ酸373-381を認識する抗体PAb421と共にp53をインキュベートすると、やはりDNA結合が活性化される。これはおそらく、この抗体がこの負調節領域を遮蔽し、不活化することによるものと思われる［Huppら（1992）上記；Halazonetisら（1993）上記］。本明細書では以下、この負調節領域をNRR1と呼ぶ（本発明者らは今回、p53が他にも負調節領域を含有することを示す実験的証拠を得た；実施例3参照）。
Huppら［（1992）上記］は、NRR1が野生型p53の四量体−二量体間のオリゴマー化状態に影響を与えるのだと提唱している。これに対し、本発明者らは、NRR1が四量化ドメインの近位にあるにもかかわらず、NRR1はp53オリゴマー化に影響を与えるのではなく、p53のコンフォメーションを制御するのだと提案していた［Halazonetisら（1993）上記］。本発明者らのモデルを決定的に裏付けるために、本発明者らは、NRR1を欠くp53の活性型が、完全長p53と同様に四量体であることを立証した［HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。したがって、p53は2つのコンフォメーション状態（どちらも四量体で、DNAに対して高い親和性をもつR状態と、DNAに対して親和性を持たないか、あるいはその親和性が低いT状態）間で転換する［HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。
NRR1がp53 DNA結合を制御する機構がどうであれ、この領域を不活化し、p53 DNA結合を上方調節する薬物を開発することはできる。このような薬物は、癌の治療に有用であろう。というのは、p53機能の増進は細胞増殖の抑止または細胞死をもたらすからである［Finlayら（1989）Cell, 57:1083-1093；Eliyahuら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8763-8767；Bakerら（1990）Science, 249:912-915；Mercerら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6166-6170；Dillerら（1990）Mol. Cell Biol., 10:5772-5781；Isaacsら（1991）Cancer Res,, 51:4716-4720；Yonish-Rouachら（1993）Mol. Cell. Biol., 13:1415-1423；Loweら（1993）Cell, 74:957-967；Fujiwaraら（1993）Cancer Res., 53:4129-4133；Fujiwaraら（1994）Cancer Res., 54:2287-2291］。
抗体PAb421はp53のDNA結合を試験管内で活性化するので、LaneとHuppは、この抗体を癌の治療に使用することができると提唱している（国際特許出願WO94/12202）。しかし、この目的で患者に抗体PAb421を投与してもおそらく無駄であろう。というのは、抗体が細胞膜を通過してp53のような細胞内蛋白質に到達することは容易でないからである。LaneとHuppはさらに、ヒトp53のC末端の30アミノ酸に結合するリガンド（小分子リガンドを含む）は、そのDNA結合活性を活性化するだろうとも主張している（国際特許出願WO94/12202）。しかし、彼らが記述する唯一のリガンド（すなわち抗体PAb421）は、細胞を通過することがわかっている薬学的化合物より少なくとも100倍はサイズが大きいのである。さらに、ヒトp53のC末端の30アミノ酸（配列認識番号2の残基364-393）とNRR1は（重複するものの）一致していないので、彼らの権利主張には説得力がない。
したがって、NRR1がp53のDNA結合活性に影響を与える機構を特徴づける必要がある。具体的に述べると、DNAのp53結合を上方調節できる小分子を同定する必要がある。また、野生型p53のDNA結合活性を上方調節する小分子によってそのDNA結合活性が上方調節されうるp53突然変異体を発現する腫瘍を同定する方法も必要である。さらに、低p53活性を反映する疾患状態を示す細胞に、そのような上方調節分子を投与することに基づく、治療法も必要である。
発明の概要
本発明の目的は、DNAに結合するp53を上方調節できる小分子を提供することである。そのような小分子はNRR1の機能を妨害できるが、必ずしもそれに結合する必要はない。
本発明のもう1つの目的は、p53のC末端に含まれる負の調節領域（NRR1）の機能を妨害することによって、好ましくはモノクローナル抗体PAb421と実質上同じ程度に、p53によるDNA結合を上方調節する小分子を提供することである。
本発明のさらなる目的は、本発明の範囲に包含される小分子を同定し、および/または、その活性を定量する検定法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、本発明の小分子によって刺激されうるDNA結合活性を示す突然変異型p53を同定する方法を提供することである。
本発明にさらなる目的は、p53または突然変異型p53のDNA結合活性を刺激する方法であって、該刺激の必要のある患者内の細胞、特に、本発明の小分子によって刺激されうるDNA結合活性を有するp53の突然変異型を発現する腫瘍細胞において刺激する方法を提供することである。
これらの目的および他の目的は本明細書に開示する本発明によって達成される。
ヒトp53のDNA結合を活性化する薬物に関する上述の必要性から、本発明者らは、ヒトp53の調節をさらに研究することにした。本発明者らはNRR1の位置をヒトp53の残基361-383に特定した（実施例3を参照）。我々のマッピングと合致して、p53の残基373-381（ヒトp53のC末端30アミノ酸内）に結合する抗体PAb421［Wade-EvansおよびJenkins（1985）EMBO J., 4:699-706］はDNA結合を活性化するが［Huppら（1992）上記；Halazonetisら（1993）上記］、p53の残基382-392（やはりヒトp53の30 C-末端アミノ酸内）に結合する抗体ICA-9はDNA結合を活性化しない［HuppおよびLane（1994）Current Biology 4:865-875］。これらの研究は、ヒトp53のDNA結合を活性化し、かつ、p53の不十分な生体内機能に起因する癌並びに他の疾患および障害の治療法および/または予防法の開発に有用な、低分子量化合物の同定につながった。これらの低分子量化合物としては、p53のNRR1に由来するアミノ酸配列を有するペプチド断片および非天然ペプチド、それらペプチドの修飾物並びに所望の活性を有するペプチド模倣物が挙げられる。
したがって、本発明は、そのアミノ酸配列がp53から由来するペプチド、およびそのようなペプチドの構造に基づくペプチド模倣物、並びにある種の細胞および組織の過剰増殖を特徴とする癌および他の障害の治療におけるこれらペプチドおよびペプチド模倣物の使用法を提供する。ヒトp53の一次配列または非ヒトp53の対応する配列に由来するアミノ酸配列をもつが、p53の部分断片（subfragment）ではないペプチドが、本発明の好ましい態様の一つである。特に、好適な非ヒトp53供給源としては、マウス、ニワトリ、ツメガエルおよびマスが挙げられる。
1つの側面として、本発明は、野生型p53腫瘍サプレッサーのDNA結合活性と、ある種のヒト腫瘍に関係する突然変異型p53のDNA結合活性とを活性化できるペプチドを提供する。そのようなペプチドとしては、p53のアミノ酸残基（aa）363-373、368-380、373-383、371-383、363-382、367-386、363-386、362-386および360-386に対応するアミノ酸配列を含有するペプチドが挙げられる。
もう1つの側面として、本発明は、p53のアミノ酸残基（aa）363-373、368-380、373-383、371-383、363-382、367-386、363-386、362-386および360-386に対応する配列をヒトp53とは逆の方向に有するD-アミノ酸ペプチド（逆Dペプチド）を提供する。これらのペプチドは、野生型p53腫瘍サプレッサーのDNA結合活性と、ある種のヒト腫瘍に関連する突然変異型p53のDNA結合活性とを活性化できる。
さらなる側面として、本発明は、上述のペプチド（上述のペプチドまたはその類縁体および断片を含有する類縁体と、非ヒトp53由来の対応する配列を含有する類縁体の両方を含む）の修飾された変異体を提供する。本発明のペプチドは全て、ヒトp53のDNA結合活性を活性化する能力を有する。
他の側面として、本発明は、本発明のペプチドと同じ三次元構造を有する非ペプチド化合物若しくは本発明のペプチドの一部が同じ三次元構造を有する非ペプチド部分で置換されている化合物である、ペプチド模倣化合物を提供する。本発明はそのようなペプチド模倣化合物を選択する方法をも提供する。
本発明のさらに他の側面として、上述のペプチドまたはペプチド模倣物の1または組み合わせを薬学的に許容できる担体内に含有する薬学的組成物を提供する。
本発明のさらなる側面は、ヒト対象内のp53機能を活性化するために本発明の薬学的組成物を使用する方法に関する。このような活性化は、１）DNA損傷因子に対する細胞応答を誘導することによって、日光、放射線などのDNA損傷因子に対する健康な対象内の耐性を増大させ、DNA損傷因子を使用する癌療法などの療法の毒性を軽減し、２）リンパ球のアポトーシスを誘導することによって、自己免疫疾患やアレルギーを有する患者あるいは移植物受容者に免疫耐性を付与し、また、３）癌や乾癬などに関係する細胞のような異常に増殖する細胞のp53機能を増大させ、これにより、そのような細胞のアポトーシスまたは成長抑止による治療につながる。
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、p53には2つの負調節領域、すなわちヒトp53の残基300-321の配列（NRR2）と、ヒトp53のほぼ残基361-383内にある既に認識されている調節領域（NRR1）とが存在するという本発明者ら自身の発見に基づいて、完全なp53配列から本発明のペプチドを選択した。本発明者らは、これら2つの配列が互いに、若しくはp53中の第3の領域と相互作用することによって、p53が、DNAに対して低い親和性を有するコンフォメーションに変換するという仮説を立てた。これら2つの負調節領域の相互作用が（上記2領域のうちの1領域内の欠失か、適当な抗体によって）破壊されると、p53がDNAに対して高い親和性を有するコンフォメーションに変換する。
小分子は、これらの領域に対する結合に関して内因性p53負調節領域と競争することによって、p53の分子内調節相互作用を破壊することができる。本発明者らは、これらの負調節領域の一つに対応するペプチドを設計し、本発明のペプチドがヒトp53のDNA結合を活性化することを観測した。
本発明の他の側面および利点については、さらに、以下の好ましい態様の詳細な説明で記述する。
発明の詳細な説明
本発明によると、野生型p53腫瘍サプレッサーのDNA結合活性と、ある種の腫瘍に由来するp53突然変異体のDNA結合活性とを活性化するペプチドが提供される。そのようにして活性化されうる突然変異体は、ヒトの腫瘍にとって最も重要なものに属する。本発明のペプチドによって活性化されうる突然変異体としては、p53の配列中の次の位置で単一のアミノ酸残基の修飾（置換）を有することを特徴とするものが挙げられる:（a）残基239のSer；（b）残基273のHis；（c）残基248のGln；（d）残基282のTrp；（e）残基273のCys。一方、本発明のペプチドは、175位のHis、248位のTrp、249位のSerおよび237位のIleに唯一の置換を有するp53突然変異体を活性化しない。
本発明の小分子としては、ペプチドの有効配列を保持し、p53 DNA結合検定で（例えば実施例2の検定法で測定した時に）効力を示すペプチド誘導体が挙げられる。本発明は、p53のNRR1に由来するアミノ酸配列を含有するペプチド、そのペプチドの修飾された形態（該ペプチドの活性を保持するもの）またはペプチド模倣物（該ペプチドの本質的な三次元構造と化学反応性を保持し、それゆえに該ペプチドの生物活性を保持するもの）である小分子を提供する。本発明の小分子は、通常は2000ダルトン（Da）未満、好ましくは1500Da未満、より好ましくは1000Da未満、最も好ましくは500Da未満の分子量を持ち、これらの小分子は0.2mM以下の濃度で、p53の残基363-373、368-380、373-383、371-383、363-382、367-386、363-386、362-386または360-386で構成されるペプチドと同じ効力をもって、野生型p53のDNA結合を活性化する。
I.  本発明のペプチド
本発明のペプチドは、p53のNRR1（ヒトp53の残基361-383）の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を含有する。これらのペプチドには、次に挙げるものが含まれる。
0003980055.tif 000002
当業者は上記ペプチドのさらに小さい他の断片を選択することができ、それらのペプチドもまた、同じ生物活性を有するだろうことは、当業者には明らかであろう。例えば、長さが26アミノ酸から約5アミノ酸までのペプチドp53p360-386［配列認識番号12］の断片は本発明に包含される。一般に、本発明のペプチドは少なくとも4アミノ酸、好ましくは少なくとも5アミノ酸、より好ましくは少なくとも6アミノ酸を有する。
本発明のペプチドには、NRR1領域に対応する非ヒトp53断片の配列を有するペプチドも含まれる。p53のアミノ酸配列は種間で保存されている［Soussiら（1990）Oncogene, 5:945-952；参考文献として本明細書の一部を構成する］ので、機能もまた保存されていると思われる。実際、ツメガエルのp53蛋白質とヒトのp53蛋白質を分析すると、機能的な相違は認められなかった［Coxら（1994）Oncogene, 9:2951-2959］。したがって、本発明ペプチドのヒトp53配列を相同な非ヒトp53配列で置換することができる。Soussiら［（1990）上記］は、ヒトp53蛋白質と選択した非ヒトp53蛋白質の配列を対比している。この対比を使って種間で相同な領域を同定することができる。Soussiら［（1990）上記］が掲載していないp53種については、公知で市販のコンピュータープログラム（例えばウィスコンシン大学のBSETFIT GCGパッケージ）によって、ヒトp53配列との対比を行なうことができる。上記の全ペプチド配列を対応する非ヒト配列で置換するか、あるいは上記ペプチド配列の断片を対応する非ヒト配列で置換することができる。
上述のペプチドは、野生型p53のDNA結合を試験管内で活性化する効力を有するが、その生体内効力はプロテアーゼの存在によって損なわれるかもしれない。血清プロテアーゼは極めて特異的な基質要求性を有する。基質はL-アミノ酸とペプチド結合の両方を持たなければ切断されない。さらに、血清中のプロテアーゼ活性のうち最も顕著な成分であるエキソペプチダーゼは、通常、ペプチドの第1ペプチド結合に作用し、遊離のN末端を必要とする［Powerら（1993）Pharmaceutical Res., 10:1268-1273］。これらの考察に基づくと、上述のペプチドの修飾された形態を使用する方が有利である。修飾された形態のペプチドは、p53に生物活性を付与する元のL-アミノ酸ペプチドの構造上の特徴を保持するが、修飾されているために、プロテアーゼおよび/またはエキソペプチダーゼによって容易には切断されにくい。
本発明に関して、「ペプチド」という用語は、その修飾が基本的な配列を変えず、特定のDNA配列に結合するp53（すなわち配列特異的DNA結合活性）を活性化する能力をその修飾型ペプチドが保持するかぎり、修飾型のペプチドをも包含する。そのような修飾としては、N末端アセチル化、グリコシル化、ビオチニル化などが挙げられる。p53 NRR1（ヒトp53の残基361-383）のアミノ酸配列に対応するL-アミノ酸ペプチドの修飾された変異体の具体例を次に説明する。これらは本発明のペプチドとみなされる。
A.  N末端D-アミノ酸を有するペプチド
N-末端D-アミノ酸が存在すると、それ以外はL-アミノ酸を含有するペプチドの血清安定性が増大する。N-末端残基に作用するエキソペプチダーゼはD-アミノ酸を基質として利用できないからである［Powellら（1993）上記］。したがって、N-末端D-アミノ酸を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常、N-末端残基がD-アミノ酸である点以外は、上述のL-アミノ酸ペプチドの配列［例えば配列認識番号4〜12］と同一である。
B.  C-末端D-アミノ酸を有するペプチド
C-末端D-アミノ酸の存在も、それ以外はL-アミノ酸を含有するペプチドを安定化する。C-末端残基に作用するエキソペプチダーゼは、D-アミノ酸を基質として利用できないからである［Powellら（1993）上記］。したがって、これらのペプチドのアミノ酸配列は、C-末端残基がD-アミノ酸である点以外は、通常、上述のL-アミノ酸ペプチドの配列［例えば配列認識番号4〜12］と同一である。
C.  環状ペプチド
環状ペプチドは遊離のN-末端またはC-末端を持たない。したがってこれらは、ペプチド末端を切断しないエンドペプチダーゼの影響は当然受けやすいものの、エキソペプチダーゼによっては蛋白質分解されにくい。環状ペプチドのアミノ酸配列は、形状が直鎖状ではなく環状である点以外は、上述のL-アミノ酸ペプチドの配列［例えば配列認識番号4〜12］と同一であってもよい。
D.  天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換したペプチド
p53のNRR1の配列内で天然アミノ酸を非天然アミノ酸に置換すると、やはり蛋白質分解に対する耐性が付与される。このような置換は、例えばN-末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与できる。ヒトp53のNRR1（ヒトp53の残基361-383）に由来するアミノ酸配列を有するペプチドのいくつかは、N-末端残基としてセリンを有する（例えば配列認識番号7、9および11を参照のこと）。このセリン残基をβ-アミノ酸イソセリンで置換できる。このような置換は既に記述されており［Collerら（1993）J. Biol. Chem., 268:20741-20743；これは参考文献として本明細書の一部を構成する］、これらの置換は生物活性に影響しない。また、非天然アミノ酸を有するペプチドの合成は当該技術分野では日常的で公知である（例えばCollerら（1993）上記を参照のこと）。
E.  N-末端またはC-末端化学基を有するペプチド
ペプチドのN-末端またはC-末端残基に作用するペプチダーゼに対する耐性を付与する有効な一方法は、修飾されたペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではなくなるように、ペプチド末端に化学基を付加することである。そのような化学修飾の一つはペプチドの両末端をグリコシル化することである。ある種の化学修飾、特にN-末端グリコシル化は、ヒト血清中でのペプチドの安定性を増大させることが示されている［Powellら（1993）Pharma. Res., 10:1268-1273］。血清安定性を増大させる他の化学修飾としては、1〜20炭素の低級アルキルからなるN-末端アルキル基（例えばアセチル基）の付加および/またはC-末端アミドまたは置換アミド基の付加が挙げられるが、これらに限られるわけではない。特に、本発明は、N-末端アセチル基とC-末端アミド基とを有する、ヒトp53の残基363-373、368-380、373-383、371-383、363-382、367-386、363-386、362-386または360-386からなる修飾ペプチドを包含する。
F.  追加のアミノ酸を有するペプチド
上述のペプチドをその配列内に含む修飾ペプチドも、本発明に包含される。アミノ酸残基を追加することによって長くなったこれらのペプチド配列は、上述のペプチドと同じ生物活性を有する（すなわちp53のDNA結合を活性化する）ので、これらも本発明に包含される。
ヒトp53のアミノ酸残基360-386に対応するペプチドの変種の特殊な一例として、二量体を形成する能力をペプチドに与えるN-末端システインの付加が挙げられる：
0003980055.tif 000003
かなりの数の追加アミノ酸を有するペプチドも排除されるわけではないが、大きなポリペプチドのいくつかは有効配列を遮蔽する配置をとり、それがp53に対する結合を妨害することは理解されるだろう。また、結合はするものの、あまりに嵩高いので、ペプチドとp53との錯体がもはやDNAに結合しないというポリペプチドもあるだろう。これらの誘導体はp53作用を促進せず、それゆえに本発明から排除される。
G.  アミノ酸が欠失したペプチド
本発明のペプチドは、p53のNRR1内に含まれるアミノ酸配列を有する。NRR1の一区分の配列を含有するペプチドが所望の生物活性を有するならば、2種類のそのような区分の配列を含有するペプチドは、たとえそれらの区分がp53 NRR1内で連続していないとしても、所望の生物活性を有することになる。このようなペプチドは、内部欠失を有するp53 NRR1に対応する配列を有すると説明されうる。
内部欠失を有するペプチドがp53のDNA結合を活性化できるということは、ペプチドp53pC360-386［配列認識番号22］の合成がグリシンまたはフェニルアラニン若しくはその組み合わせを欠くペプチド（例えば下記のペプチド）をも生成したという観察によって、初めて認識された。
0003980055.tif 000004
上記のペプチドがp53のDNA結合を活性化する能力を有することから、本発明者らは、さらに、単一のアミノ酸の欠失もしくはそれ以上の欠失を有するペプチドを設計することにした。
単一のアミノ酸欠失を含有する修飾ペプチドには、次のペプチドも含まれる。
0003980055.tif 000005
より長い欠失を有する本発明の修飾ペプチドとしては、次のペプチドが挙げられる。
0003980055.tif 000006
H.  逆Dペプチド
本発明ペプチドのもう1つの態様は、p53 NRR1（ヒトp53の残基361-386）のアミノ酸配列に対応する逆Dペプチド（reverse-D peptide）である。「逆Dペプチド」という用語は、L-アミノ酸を含有するペプチドとは逆の順序で並んだD-アミノ酸を含有するペプチドを意味する。したがって、例えばL-アミノ酸ペプチドのC-末端残基は、D-アミノ酸ペプチドではN-末端になる。例えば、ペプチドp53p363-373［配列認識番号4］に対応する逆Dペプチドの配列は次の通りである。
0003980055.tif 000007
配列認識番号5〜11のペプチドの逆D配列を配列認識番号13〜21に示す。逆DペプチドはL-アミノ酸ペプチドと同じ三次元コンフォメーションを持ち、それゆえに同じ活性を有するが、試験管内および生体内での酵素分解に対して元のペプチドより安定であり、したがってより強い治療効果を有する［BradyおよびDodson（1994）Nature, 368:692-693；Jamesonら（1994）Nature, 368:744-746］。
本発明のペプチドは、類縁体および他の修飾型変種を含めて、一般に次の公知技術で製造できる。本発明ペプチドの合成生産は、固相合成法で行なうことが好ましい。例えば、固相合成はその種々の改良法と同様に、より理解されており、一般的なペプチドの製造法である［Merrifield（1964）J. Am. Chem. Soc., 85:2149；StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis（Pierce Chemical Company；イリノイ州ロックフォード）；BodanskyおよびBodansky（1984）The Practice of Peptide Synthesis（Springer-Verlag；ニューヨーク）；AthertonおよびSheppard（1989）Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach（IRL Press；ニューヨーク）］。下記実施例1に記載の方法も参照のこと。
別法として、本発明のペプチドを、そのペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、組換え系で製造することもできる。本発明のペプチドは同じペプチド内に上述の修飾の2以上を含有してもよいと解される。また、本発明ペプチドの薬学的に許容できる塩錯体も本発明に包含される。
II.  ペプチド模倣物
ペプチド模倣物とは、あるペプチドの生物活性を模倣するが、化学的性質がもはやペプチドでない分子をいう。厳密な定義では、ペプチド模倣物とは、もはや何らのペプチド結合（すなわちアミノ酸間のアミド結合）をも含有しない分子をいう。しかし、ペプチド模倣物という用語は、擬ペプチド、半ペプチドおよびペプトイドのように、もはや完全にはペプチド性でない分子をいうために使用されることもある。広義のペプチド模倣物（ペプチドの一部がペプチド結合を欠く構造で置換されているもの）の例をいくつか後述する。完全な非ペプチドであるか、部分的な非ペプチドであるかにかかわらず、本発明のペプチド模倣物は、そのペプチド模倣物の基礎となるペプチド中の活性基の三次元配置に極めて類似する、反応性化学部分の空間配置を提供する。この類似の活性部位構造の結果として、ペプチド模倣物は、生物系に対して、そのペプチドの生物活性と類似の効果を有する。
本発明は、本発明の生物活性ペプチドの活性を模倣する類縁体であるペプチド模倣組成物を包含する。すなわち、本発明のペプチド模倣物はp53のDNA結合活性を活性化できる。本発明のペプチド模倣物は、三次元形状と生物活性が共に、上述のペプチドと実質上類似することが好ましい。実質上類似するとは、p53と反応するそのペプチド中の基の幾何学的関係が保存されていると同時に、そのペプチド模倣物が野生型p53と上記p53突然変異体の1以上のDNA結合活性を刺激し、その刺激が本発明ペプチドの少なくとも１つが示す刺激の2倍（a factor of two）以内にあることを意味する。
ペプチドは一般に2つの望ましくない一性質［即ち（1）生物学的利用能が低く、（2）作用の持続時間が短い］を示すので、あるペプチドの模倣物を使用することには、そのペプチド自体を使用するより明らかな利点がある。ペプチド模倣物は十分に小さく、経口的に活性で、長時間持続する作用を持ちうるから、この分子は、上記2つの主要な障害を迂回する明瞭な方法を提示する。また、ペプチドの非経口投与に対してペプチド模倣物は経口的に投与することができるので、ペプチド模倣物に関する患者のコンプライアンスが改善され、かなりのコスト削減にもなる。さらに、ペプチド模倣物はペプチドよりはるかに安く生産できる。最後に、ペプチドには安定性、貯蔵および免疫反応性に関連する問題があるが、ペプチド模倣物にはそのような問題がない。
したがって上述のペプチドは、類似の生物活性を持ちそれゆえに類似の治療実効を有する小さい化学化合物の開発に有効である。ペプチド模倣物を開発する技術は従来技術である。したがって、ペプチド模倣物が元のペプチドと類似の構造をとることによって類似の生物活性を有することを可能にするような非ペプチド結合で、ペプチド結合を置換することができる。類似の構造を有する他の化学基でアミノ酸の化学基を置換することによってさらに修飾してもよい。ペプチド模倣物の開発は、遊離またはp53に結合した状態の元のペプチドの三次元構造を、ＮＭＲ分光法、結晶学および/またはコンピューターによる分子モデリングで決定することによって促進できる。これらの技術は元のペプチドより高い効力および/または高い生物学的利用能および/または高い安定性を有する新規組成物の開発の助けになる［Dean（1994）BioEssays, 16:683-687；CohenおよびShatzmiller（1993）J. Mol. Graph., 11:166-173；WilleyおよびRich（1993）Med. Res. Rev., 13:327-384；Moore（1994）Trends Pharmacol. Sci., 15:124-129；Hruby（1993）Biopolymers, 33:1073-1082；Buggら（1993）Sci. Am., 269:92-98；全て参考文献として本明細書の一部を構成する］。ペプチド模倣化合物候補が同定されたら、それを合成し、本明細書に記載のDNA結合検定法や適当な腫瘍サプレッサー検定法［Finlayら（1983）Cell, 57:1083-1093およびFujiwaraら（1993）Cancer Res., 53:4129-4133を参照のこと；共に参考文献として本明細書の一部を構成する］を用いて、その活性を評価することができる。
したがって、上述の方法を使用することによって、本発明は、上述のペプチドより高い治療活性を示す化合物を提供する。上に指定したペプチドの生物活性および類似の三次元構造を持ち、上述の方法で得られるペプチド模倣化合物は、本発明に包含される。上述した修飾ペプチドのいずれか、若しくは上述した修飾の2以上を保持するペプチドからペプチド模倣物を作成できることは、当業者には明らかだろう。また、本発明のペプチド模倣物が、その治療用化合物としての有用性に加えて、さらに強力な非ペプチド化合物の開発にも使用できることは明らかだろう。
先のセクションで説明したペプチドに由来するペプチド模倣物の例を次に示す。これらの例は例示に過ぎず、他の修飾または追加の修飾を制限するものではない。
A.  還元同配体擬ペプチド結合［ψ（ＣＨ2ＮＨ）］を有するペプチド
プロテアーゼはペプチド結合に作用する。したがって、ペプチド結合を擬ペプチド結合で置換すると蛋白質分解に対する耐性が付与されることになる。いくつかの擬ペプチド結合が記述されており、それらは一般にペプチド構造と生物活性に影響を与えない。還元同配体（reduced isostere）擬ペプチド結合は、生物活性を全く若しくはほとんど失うことなく酵素切断に対する安定性を増大させることが知られている好適な擬ペプチド結合である［Couderら（1993）Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184；参考文献として本明細書の一部を構成する］。したがって、これらのペプチドのアミノ酸配列は、1以上のペプチド結合が同配体擬ペプチド結合で置換されている点以外は、上述のL-アミノ酸ペプチドの配列［例えば配列認識番号4〜12］と同一でありうる。好ましくは、最もN-末端側のペプチド結合を置換する。というのは、このような置換はN-末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与するからである。1以上の還元同配体擬ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該分野で公知である［Couderら（1993）上記］。
B.  レトロ-インバーソ擬ペプチド結合［ψ（ＮＨＣＯ）］を有するペプチド蛋白質分解に対する耐性を付与するには、ペプチド結合をレトロ-インバーソ（retro-inverso）擬ペプチド結合で置換してもよい［Dalpozzoら（1993）Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566；これは参考文献として本明細書の一部を構成する］。この修飾法によると、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド結合の1以上がレトロ-インバーソ擬ペプチド結合で置換されている点以外は、上述のL-アミノ酸ペプチドの配列［例えば配列認識番号4〜12］と同一でありうる。好ましくは、最もN-末端側のペプチド結合を置換する。というのは、このような置換はN-末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与するからである。1以上の還元レトロ-インバーソ（reduced retro-inverso）擬ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該技術分野公知である［Dalpozzoら（1993）上記］。
C.  ペプトイド誘導体
ペプチドのペプトイド誘導体は、生物活性にとって重要な構造決定因子を保持すると共に、ペプチド結合の排除によって蛋白質分解に対する耐性を付与する修飾ペプチドのもう1つの形態である［Simonら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371；これは参考文献として本明細書の一部を構成する］。ペプトイドはN-置換グリシンのオリゴマーである。それぞれ天然アミノ酸の側鎖に対応するいくつかのN-アルキル基が記述されている［Simonら（1992）上記；これらは参考文献として本明細書の一部を構成する］。したがって、p53p363-373［配列認識番号4］に対応するペプトイドのN-アルキル基の配列は、
Narg Nala Nhhis Nhser Nhser Nhhis Nleu Naeg Nhser Naeg Naeg
となる。但し、天然アミノ酸に対するペプトイドのN-アルキル基の対応は、Narg→Arg、Nala→Ala、Nhhis→His、Nhser→Ser、Naeg→Lsyである。ペプトイドN-アルキル基の命名はSimonら［（1992）上記］に従う。
上記の例はペプチドの全てのアミノ酸を対応するN-置換グリシンで置き換えたものであるが、全てのアミノ酸を置換する必要がないことは明らかである。例えば、N-末端残基だけを対応するN-置換グリシンで置換したり、あるいは数個のアミノ酸を置換してもよい。
III.  薬学的組成物
本発明の上記ペプチドと組成物はp53のDNA結合活性を活性化することができ、したがって上述のp53の細胞機能を活性化することができるので、これらを種々の治療法で薬学的組成物として使用することができる。したがって本発明は、新規治療用薬学的組成物およびそのような組成物でヒトまたは動物を治療するための方法を包含する。本明細書における「薬学的」という用語は、本発明の獣医学的応用をも含む。
本発明の薬学的組成物を製造するには、従来の薬学的調合技術に従って、少なくとも1つの本発明ペプチド（またはペプチド模倣物）若しくは本発明ペプチド（またはペプチド模倣物）の混合物を活性成分として、選択した薬学的担体と十分に混合し、化合する。この担体は、投与法（例えば経口、舌下、直腸、鼻孔内、非経口投与など）に適した剤形として、様々な形態を取りうる。
組成物を増強または安定化するため、若しくは組成物の調製を容易にするために添加しうる薬学的に許容できる固体または液体の担体または成分としては、とりわけ次のものを挙げることができる（ただしこれらに限られるわけではない）：シロップ、水、等張塩水、水、緩衝酢酸ナトリウム溶液または緩衝酢酸アンモニウム溶液中の5%デキストロース溶液、油、グリセリン、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤、澱粉、糖、希釈剤、粒化剤、潤滑剤および結合剤。また、グリセリルモノステアリン酸やグリセリルジステアリン酸（単独若しくはワックスと組み合わせて）などの徐放性材料も担体に含まれる。固形担体の量は変動するが、好ましくは投与量単位あたり約20mg〜約1gである。
したがって、本発明のペプチドまたはその誘導体の薬学的組成物は、非経口投与用の凍結乾燥粉末の溶液として製剤化することができる。現在のところ好ましい方法は静脈内投与法である。
本発明の薬学的組成物には、局所作用を発揮すべき部分に適用するための、適当な基剤またはビヒクル（vehicle）に組込まれた局部製剤も含まれる。したがって、そのような局部組成物としては、処置すべき皮膚表面と直接接触させる外用製剤が挙げられる。この目的に合った従来の製剤としは、クリーム剤、軟膏、ローション、ゲル剤、ペースト剤、粉末剤および油性吸収性基剤、水溶性基剤および乳剤型基剤を有する製剤が挙げられる（ただしこれらに限られるわけではない）。
さらに、本発明の組成物をリポソームに封入して投与してもよい。これらの組成物は、その溶解性によって、水層にも、油相にも存在でき、また総称してリポソーム懸濁液と呼ばれる形で存在することもできる。疎水相は一般に（ただし必ずしもそうではないが）レシチンやスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、多少の界面活性剤（ジアセチルリン酸、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸など）および/または疎水性を有する他の物質を含む。
所望であれば、組成物に活性な薬学的成分を補足してもよい。任意に、抗菌剤、防腐剤および抗酸化剤を組成物中に含めて、それぞれの通常の機能を発揮させてもよい。
本発明のペプチドまたはペプチド模倣化合物を含有するこのような薬学的組成物の投与量単位は、約1mg〜5mgのペプチド若しくはその塩を含むことが好ましい。
本明細書における「適当量」または「治療有効量」という用語は、後述する症状を治療するのに有効な量を意味する。本発明のペプチドまたはペプチド模倣物は、約1mg/kg-体重〜約30mg/kg以上の量で非経口投与すると概して有効である。
IV.  治療/使用法
p53のDNA結合活性を活性化する能力を有する上述の薬学的組成物は、p53の細胞機能を活用する治療法において有用である。
一例として、本発明の薬学的組成物を、DNA損傷因子（例えば癌治療に使用される化学療法剤、放射線およびUV照射など）に対する細胞応答を誘導するために使用することができる。本発明組成物の適当量を投与することにより、患者はより高い投与量の該DNA損傷因子に耐えることができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、局部的に投与される日焼け止め剤その他の太陽光線保護組成物の形態をとることができる。別法として、本発明の組成物を、DNA損傷因子を使用する従来の癌療法（放射線療法や化学療法）を受けている患者に、補助的薬剤として非経口（例えば静脈内）投与してもよい。他の投与法も適宜使用できる。
本発明の組成物を、癌患者に唯一の治療として使用することによって、腫瘍細胞中に存在するp53（野生型であるか、突然変異体であるかにかかわらない）の腫瘍サプレッサー機能を増強してもよい。したがって本組成物を癌患者に投与すると、腫瘍細胞の増殖または成長の阻止若しくは腫瘍細胞のアポトーシス（細胞死）を起こすことができる。望ましくは、適当量の本発明組成物を全身投与するか、若しくは腫瘍の部位に局所投与する。
加えて、異常な細胞増殖を特徴とする癌以外の疾患における細胞増殖を抑制する方法として、本発明組成物を投与することもできる。そのような疾患としては、乾癬、アテローム性動脈硬化症および動脈再狭窄症が挙げられる。この方法は、適当量の選択した組成物を患者に局所投与、局部投与もしくは全身投与することによって行われる。
本発明組成物の他の治療用途は、特定の細胞（例えば増殖しつつあるリンパ球）のアポトーシスを誘導する際の使用である。この使用法では、免疫耐性の発達を促進するために、本発明組成物の適当量を対象に投与する。この方法では、生体内投与法と生体外投与法の両方を使用できる。好ましいことに、この治療法は、移植物拒絶を予防したり、あるいは自己免疫疾患（例えば全身性紅斑性狼瘡、慢性リウマチ関節炎など）を治療するための唯一の治療または補助的治療として有用である。
本発明のペプチドおよびペプチド模倣物は、疾患の進行、特に本発明による治療を受けている患者における疾患の進行を監視する方法や、またはどの患者がこの治療法に適しているかを決定するための方法にも使用できる。そのような方法では、腫瘍生検を患者から得て、抽出物を調製し［Halazonetisら（1993）上記］、次いで（例えば下記実施例2に記述するように）、本発明のペプチドまたはペプチド模倣物の存在下または非在下に、この抽出物を、p53依存性DNA結合について調べる。そのペプチドがDNA結合を増大させるなら、本発明組成物の治療的使用の必要性が示され、治療の成果が改善される。
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい組成物と方法を例示するものである。この開示を考慮すれば、本明細書に記載のペプチドの他の有用な断片や類縁体が容易に同定され、それらが本発明に包含されることは、当業者には明らかであろう。下記実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例1：ペプチドの合成
ヒトp53の負調節領域1（NRR1）残基361-383に対応するペプチドを合成した。ペプチドは、標準的なFmoc法を用い、Milligen9050自動合成装置で組み立てた［FieldsおよびNoble（1990）Int. J. Pept. Protein Res., 35:161-214］。切断後、C18カラムと0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配とを用いる逆相HPLCで、ペプチドを精製した。合成の効率と正確さは、アミノ酸組成分析および/または質量分光法でモニターした。本発明は、本発明のペプチドを製造するために使用する特定の化学または合成装置によって限定されるものではない。また、そのような因子は本発明ペプチドの活性にとって重要でない。
次に挙げるペプチドを合成した。
0003980055.tif 000008
全てのペプチドは、そのN-末端がアセチル化されており、C-末端に結合したアミド化学基を含む。
アミノ酸組成分析と質量分光法によって、ペプチドp53pC360-386が実際にはペプチドの混合物からなることがわかった。その混合物は、予期したペプチドに加えて、グリシン、フェニルアラニン若しくはその組み合わせを欠くペプチドを含有していた［配列認識番号23、24および25］。後者のペプチドは予期したペプチドとはその末端のみが異なるので、これらのペプチドはすべて生物学的に活性であると予想される。このことは、p53pC360-386の中心領域に対応する種々のペプチドが生物活性を有するという下記の証拠によって支持される。
各ペプチドを従来の緩衝液（例えば10または100mM Tris-Cl緩衝液pH8）に10mg/mlの濃度で溶解した。ペプチドが溶け、後述のDNA結合検定法に適合する緩衝液なら何でも使用できる。溶解させた後、ペプチドを−70℃で保存した。
実施例2：DNA結合検定
本発明ペプチドの、ヒトp53のDNA結合を活性化する能力を、p53に関する標準的なDNA結合検定法を用いて検定した［Halazonetisら（1993）上記；HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。この検定法では、試験管内で翻訳したヒト野生型p53または腫瘍由来のp53突然変異体と、p53結合部位を含む特殊なオリゴヌクレオチドとを使用する。これらの試薬とそれらを調製する方法を次に記述する。
ヒトp53は、完全長p53コード配列を含有するプラスミドを用いて、試験管内翻訳によって生産した。これらのプラスミドの調製には、標準的なクローニング法［Ausubelら（1994）「Current Protocols in Molecular Biology」Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, ニューヨーク；Innisら（1990）PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, サンディエゴ］を使用した。
試薬
プラスミドpGEMhump53wtは、完全長ヒト野生型p53をコードする。このプラスミドは、当業者が容易に入手できるヒトp53 cDNAを用いて、PCR［Innisら（1990）上記］で調製した。このPCR法は、ユニークな制限部位、即ちコドン218のKpnI、コドン299のSstI、コドン333のSstII、コドン338のBstBI、終止コドン直後のSalIを、ヒトp53内に組込むように設計されている。コドン138のMscI部位を除去した。これらの変化はコードされるp53のアミノ酸配列を変えず、ヒト癌に関連する点変異を保持する突然変異蛋白質の構築をはかどらせるためにのみ行なった。ヒトp53 cDNAのPCR産物をNcoIおよびSalIで消化し、EcoRIとSalIで直鎖化したベクターpGEM4［Promega, ウィスコンシン州マディソン］にクローニングした。合成オリゴヌクレオチドを用いて、ベクターのEcoRI部位とp53の開始コドンにあるNcoI部位とをつないだ。プラスミドpGEMhump53wt中のEcoRI-SalIヒトp53挿入物の全ヌクレオチド配列を配列認識番号26に示す。後述する全p53突然変異体の作成と、試験管内翻訳による野生型p53の発現には、プラスミドpGEMhump53wtを用いた。
プラスミドpGEMhump53wtを用いて、ヒト癌にしばしば関連する突然変異p53蛋白質をコードするプラスミドを作成した。導入した突然変異は、ヒト癌に最も頻繁に付随するものである［Caron de Fromentelら（1992）Gene Chrom. Cancer, 4:1-15］。具体的には、次に挙げる突然変異体（全て単一アミノ酸置換突然変異体）を作成した：His175, p53の175位にヒスチジンを有する；Gln248, p53の248位にグルタミンを有する；Trp248, p53の248位にトリプトファンを有する；Ser249, p53の249位にセリンを有する；His273, p53の273位にヒスチジンを有する；Cys273, p53の273位にシステインを有する；Trp282, p53の282位にトリプトファンを有する；Ser239, p53の239位にセリンを有する；Ile237, p53の237位にイソロイシンを有する。p53突然変異体は全て、PCRを用いて作成した［Innisら（1990）上記］。所望の突然変異を有するDNA断片を、最も便利な制限部位を用いてpGEMhump53wtにクローニングし、配列決定によってそれを確認した。得られたプラスミドは、pGEMhump53His175などと命名する。
プラスミドpGEMhump53D300-308、pGEMhump53D300-317、pGEMhump53D300-321、pGEMhump53D356-393、pGEMhump53D364-393、pGEMhump53D379-393、pGEMhump53D384-393およびpGEMhump53D388-393は、ヒト野生型p53内に欠失を含む蛋白質をコードする。これらの欠失は、それぞれp53［配列認識番号2］の残基300-308、300-317、300-321、356-393、364-393、379-393、384-393および388-393が関与する欠失である。これらの欠失は、標準的な組換え技術［Ausubelら（1994）上記；Innisら（1990）上記］を用いて作成した。
検定手順
pGEMhump53系のプラスミドを用い、標準的な方法に従って、試験管内で転写されたmRNAを生産し、次いで試験管内で翻訳された蛋白質を生産した［Halazonetisら（1988）Cell, 55:917-924］。試験管内で翻訳した蛋白質を、既に記述されているように［Halazonetisら（1993）上記；これは参考文献として本明細書の一部を構成する］、DNA結合について検定した。簡単に述べると、試験管内で翻訳した蛋白質を、非特異的競争剤DNAの存在下に、p53結合部位を含有する放射活性標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする。その反応混合物を室温で20分間インキュベートし、非変性5%ポリアクリルアミド電気泳動ゲルに直接充填した。このタイプのDNA結合検定法では、遊離のDNAはゲルの底部まで移動するが、p53/DNA錯体はもっとゆっくりと移動する。したがって、ゆっくり移動するDNAの存在（これはオートラジオグラフィーで検出できる）は、p53DNA結合の存在を表す［Halazonetis（1993）上記；HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。
本発明者らは、非特異的競争剤DNAとして、１反応につき0.1μgの一本鎖オリゴヌクレオチドMI7［GAGAGCCCCAGTTACCATAACTACTCT；配列認識番号27］と0.05μgの二本鎖オリゴヌクレオチドTF3［ATCACGTGATATCACGTGATATCACGTGAT；配列認識番号28］を使用した。
これらの実験のために、p53結合部位を含有するいくつかの二本鎖オリゴヌクレオチドを放射活性で標識した。これらには、Ewarf1、BC.V4AおよびBCが含まれる。オリゴヌクレオチドBC.V4AとBCは、p53によって認識される人工部位を有する。これら3つの部位を次に挙げるが、その際、p53が認識する特殊な5ヌクレオチド反復をハイフンで区切ることにする。オリゴヌクレオチドEwaf1（上鎖）の配列は、CCC-GAACA-TGTCC-CAACA-TGTTG-GGG［配列認識番号29］である。このオリゴヌクレオチドは、waf1遺伝子のp53依存性転写を制御するエンハンサーに対応する［Ei-Deiryら（1993）Cell, 75:817-825］。オリゴヌクレオチドBC.V4A（上鎖）の配列は、TC-GAGCA-TGTTC-GAGCA-TGTTC-GAGCATGT［配列認識番号30］である。オリゴヌクレオチドBC（上鎖）の配列は、CC-GGGCA-TGTCC-GGGCA-TGTCC-GGGCATGT［配列認識番号31］である。これらのDNAを、32P-標識ヌクレオチドを用いて、放射活性に標識した［Halazonetisら（1988）上記］。
この検定法を用いた結果を、下記実施例3〜5に記載する。
実施例3：野生型p53内の負調節領域のマッピング
上記実施例2に記述したように、p53 DNA結合検定では、試験管内で翻訳したp53を、p53結合部位を含む放射活性標識DNAと共にインキュベートする。これらの研究では、インキュベーションをオリゴヌクレオチドBC.V4Aと共に行なった。野生型p53は、このオリゴヌクレオチドに結合する。しかし、そのDNA結合活性は、p53のC-末端にマップされる負調節領域1（NRR1）による下方調節にさらされる。したがって、ヒトp53の残基364-393を欠失させると、DNA結合が活性化される［Huppら（1992）上記；HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。本発明者らは、オリゴヌクレオチドBC.V4AとプラスミドpGEMhump53D364-393を用いて、この結果を再現した。しかし、残基353-360を欠く欠失突然変異体のDNA結合は、活性化されなかった（表1参照）。
NRR1の位置をより精密に特定し、p53のC-末端に存在するかもしれない他のNRRを同定するために、本発明者らは、上記実施例2に記載のp53欠失突然変異体のDNA結合活性を調べた。表1に示すように、突然変異体p53D356-393、p53D364-393、p53D379-393は、オリゴヌクレオチドBC.V4Aに対する結合に関して活性化された。これに対し、突然変異体p53D384-393とp53D388-393は活性化されなかった。これらの結果から、NRR1のC-末端限界は、p53の残基383であると特定される。NRR1のN-末端限界はp53の残基355よりC-末端側であるに違いない。というのは、p53の残基322-355は、p53四量化ドメインを形成するからである［Wangら（1994）上記］。残基353-360を欠く欠失突然変異体のDNA結合活性を分析したところ、それが機能的なNRR1を含むことがわかった（表1）。このことは、NRR1のN-末端限界が残基360にあることを示す。したがって、NRR1はp53の残基361-383内にある。
突然変異体p53D300-308、p53D300-317およびp53D300-321を調べたところ、予想外にも第2の負調節領域（NRR2）の存在が明らかになった。これら3種類の欠失突然変異体は、オリゴヌクレオチドBC.V4Aに対する結合が活性化していたからである。NRR2とNRR1は、p53四量化ドメイン（p53の残基322-355［Wangら（1994）上記］）によって分離されているから、これら2つのNRRは重複していない。
0003980055.tif 000009
実施例4：抗体PAb421によるp53DNA結合の活性化
p53 DNA結合検定では、試験管内で翻訳したp53を、p53結合部位を含む放射活性標識DNA（BC、BC.V4AおよびEwaf1など）と共にインキュベートする［上記実施例2を参照のこと］。0.1μgの抗p53抗体PAb421［Oncogene Science（ニューヨーク州ユニオンデール）から入手できる］の存在下または不在下でインキュベーションした場合の、p53 DNA結合に対する効果を表2に示す。野生型p53がオリゴヌクレオチドBC、BC.V4AおよびEwaf1に結合することは、ゆっくりと移動する32P-標識種（これはp53/DNA錯体を表す）によって立証される。抗体PAb421の存在下では、このゆっくりと移動する32P-標識種がさらにゆっくりと移動し、それがより大きいサイズであることを示す。この場合は、抗体PAb421をも含有するからである。さらに、PAb421の存在下では、ゆっくりと移動する32P-標識種が発する放射活性の強度が強くなる。このことは、抗体PAb421が野生型p53のDNA結合を活性化するという観察と合致する［Huppら（1992）上記；Halazonetisら（1993）上記；HalazonetisおよびKandil（1993）上記］。野生型p53はオリゴヌクレオチドBCに極めて効率よく結合するので、抗体PAb421の野生型p53 DNA結合を活性する能力は、オリゴヌクレオチドBC.V4AとEwaf1を用いた方がよりはっきりする。抗体PAb421は、p53 C-末端にある負調節領域（NRR1）を不活化することによって、野生型p53のDNA結合を活性化する（「発明の背景」参照）。
オリゴヌクレオチドBCを用いて、ヒト腫瘍に頻繁に関連するp53突然変異体のいくつか（上記実施例2参照）を、DNA結合について調べた（表2参照）。これらはいずれも、野生型p53の場合と比較して、有意なDNA結合活性を示さず、この点は過去の報告［Bargonettiら（1992）上記］と合致した。しかし、抗体PAb421の存在下に、突然変異体Gln248、His273、Cys273、Trp282およびSer239は有意なDNA結合活性を示し（表2参照）、これら数種類の突然変異体に関する活性は、野生型p53の活性に等しかった。
0003980055.tif 000010
これらの実験は、PAb421によるNRR1の不活化が、ヒト癌にしばしば関連するいくつかのp53突然変異体に対するDNA結合活性を、修復できることを示唆している。次の研究で示すように、本発明のペプチドもNRR1の機能を不活化する（ただしその機構はPAb421とは異なる）。したがって、本発明のペプチドを用いる治療的介入に応答しうるp53突然変異体の範囲（スペクトル）は、そのDNA結合活性がPAb421による刺激に対して感受性を有するp53突然変異体を同定することによって決定できる。
実施例5：本発明のペプチドによるp53 DNA結合の活性化
ヒトp53のNRR1の断片に対応するペプチドの存在下または非在下で、DNA結合検定を上述（実施例2）のように行なった。試験したペプチドは実施例1に記述したものであり、これらを0.02〜0.4mMの濃度範囲で試験した。その結果を表３にまとめた。
本発明者らは、まず、オリゴヌクレオチドBC.V4Aに対する野生型p53の結合を活性化するペプチドp53pC360-386の能力について調べた。このペプチドの非在下で、野生型p53はこのDNAに弱く結合する。しかし、0.02〜0.2mMのペプチドp53pC360-386の存在下では、野生型p53のDNA結合が活性化される。0.02mMのペプチドp53pC360-386で達成された活性化のレベルは、0.1μgの抗体PAb421で達成されるレベルと同等である。野生型p53のDNA結合を活性化するペプチドp53pC360-386の能力は、オリゴヌクレオチドBC.V4Aに限られるわけではない。オリゴヌクレオチドEwaf1に対するDNA結合も活性化された（表3参照）。
ペプチドp53pC360-386が野生型p53のDNA結合を活性化したので、本発明者らは次いで、このペプチドのN-末端またはC-末端を削除しても活性化が維持されるかどうかを調べた。ペプチドp53p362-386、p53p363-386、p53p363-382およびp53p367-386を、オリゴヌクレオチドEwaf1を用いるDNA結合検定法で調べた。そのデータを表3にまとめた。0.2〜0.3mMのペプチド濃度で、全てのペプチドが野生型p53のDNA結合を活性化した。さらに小さいペプチドp53p371-383を、オリゴヌクレオチドBC.V4Aを用いて調べた。0.2〜0.4mMのペプチド濃度で、ペプチドp53p371-383は野生型p53のDNA結合を活性化した。
次に本発明者らは、ペプチドp53p363-373、p53p368-380およびp53p373-383の、野生型ヒトp53のDNA結合を活性化する能力について調べた。これらのペプチドは、p53NRR1の連続的な部分的に重複する領域（それぞれヒトp53の残基363-373、368-380および373-383）に対応する。0.4mM濃度で試験すると、3種類のペプチドすべてが、オリゴヌクレオチドEwaf1に対する野生型p53の結合を活性化した。ペプチドp53p363-373とp53p368-380は、DNA結合の活性化に関して、p53p373-383よりいくらか強力であった。いずれにせよ、これらの結果は、p53NRR1の小領域に対応するペプチドがp53 DNA結合を活性化する効力を持ちうることを示唆している。さらに、ペプチドp53p363-373とp53p373-383は実質的に重複していないので、刺激ペプチドがp53 NRR1の特定の最小断片を含有する必要はない。
本発明のペプチドがp53突然変異体のDNA結合をも活性化するかどうかを調べるために、NRR1の不活化によってそのDNA結合を活性化することのできるタイプの突然変異体の代表例として、His273 p53突然変異体を使用した（上記実施例4参照）。p53His273突然変異体は、本明細書に記載のDNA結合検定法を用いると、オリゴヌクレオチドBCに結合できない。しかし、それぞれ0.2mMおよび0.4mM濃度のペプチドp53pC360-386またはp53p371-383と共にインキュベートすると、p53His273はDNA結合活性を発揮した。
本発明者らは、本発明のペプチドが野生型p53のDNA結合と、選択したp53突然変異体のDNA結合とを、抗体PAb421と同じぐらい効率よく活性化すると結論する。本発明のペプチドと抗体PAb421は共にp53のNRR1を不活化するが、その作用機構は異なる。つまり、抗体PAb421はNRR1を結合し、それを遮蔽することによってNRR1を不活化する。これに対し、本発明のペプチドは、第2の負調節領域（おそらくNRR2）への結合に関して、p53の内因性NRR1と競争する。したがって、これらはNRR1の競争剤であって、遮蔽剤ではない。
0003980055.tif 000011
実施例6：本発明の環状ヘキサペプチドによるp53 DNA結合の活性化
下記の修飾ペプチドは、ヒトp53の残基378-382に対応する環状ペプチドである。その配列は、Ser-Arg-His-Lys-Lysである。このペプチドを環状にするため、そのC末端にD-アラニンを導入した。このペプチドをc［SRHKKa］と命名し、その化学構造を次に示す。
0003980055.tif 000012
ペプチドc［SRHKKa］を実施例2に記載のp53 DNA結合検定法で調べた。このペプチドは、0.1mMの濃度で、0.05mMのペプチドp53p363-373［配列認識番号4］より約2倍効率よく、p53 DNA結合を活性化した。この実施例は、1）活性を付与するにはp53配列の5アミノ酸で足りることと、2）N-末端またはC-末端ペプチダーゼの影響を受けにくい環状ペプチドが（我々の元の出願で権利主張されているように）活性を有すること、を例証している。
明解な理解を期すため、特定の態様に関して例示と説明のために上述の発明をいくらか詳細に説明したが、本発明が関係する分野の技術者には、他の側面、利点および変更も明らかだろう。上の説明と実例は例示のためであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。医学、免疫学、ハイブリドーマ技術、薬学および/または関連分野の技術者にとって明らかな、本発明の上記実施態様の変更は、添付の請求の範囲のみによって制限される本発明の範囲に包含されるものとする。
本明細書で言及したすべての刊行物と特許出願は、本発明が属する分野の技術者の技術水準の指標となる。全ての刊行物と特許出願は、それぞれの刊行物または特許出願について、参考文献として本明細書の一部を構成するものと、明瞭かつ個別に明言した場合と同じ程度に、参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。
上記明細書には本発明の数多くの変更と改良が含まれ、それらは当業者にとって明白であると予想される。本発明の組成物と方法に対するそのような改良や変更は、添付の請求の範囲に包含されるものと考える。
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：ジ  ウィスター  インスティテュート
ベイヤー  コーポレーション
（ii）発明の名称：ｐ５３機能を活性化するヒトｐ５３との構造類似性を有するペプチド及びペプチド模倣物
（iii）配列の数：３５
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：バナー  アンド  アレグレッティ  Ｌｔｄ．
（B）通り：１００１  Ｇストリート  Ｎ．Ｗ．
（C）市：ワシントン  Ｄ．Ｃ．
（D）州：コロンビア特別区
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：：２０００１
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：Patent In リリース#1.0、バージョン#1.25
（vi）現在の出願データ：ＰＣＴ
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先の出願データ：ＵＳＡ
（A）出願番号：０８／３９２，５４２
（B）出願日：1995年2月16日
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：ホスシェイト，デイル  Ｈ．
（B）登録番号：１９，０９０
（C）参照／ドケット番号：０４８６．５３８８０
（ix）電信情報：
（A）電話：２０２  ５０８−９１００
（B）テレファックス：２０２  ５０８−９２９９
（２）配列認識番号：１のための情報:
（i）配列特性：
（A）長さ：１３１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：１
0003980055.tif 000013
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：２
0003980055.tif 000014
0003980055.tif 000015
0003980055.tif 000016
（２）列認識番号：３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（vi）起源：
（A）生物名：ムス  スプレタス（Mus spretus）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３
0003980055.tif 000017
0003980055.tif 000018
（２）配列認識番号：４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：４
0003980055.tif 000019
（２）配列認識番号：５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：５
0003980055.tif 000020
（２）配列認識番号：６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：６
0003980055.tif 000021
（２）配列認識番号：７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：７
0003980055.tif 000022
（２）配列認識番号：８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：８
0003980055.tif 000023
（２）配列認識番号：９のための情報：
（i）配列特性：
（A)長さ：２０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：９
0003980055.tif 000024
（２）列認識番号：１０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ２４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１０
0003980055.tif 000025
（２）配列認識番号：１１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１１
0003980055.tif 000026
（２）配列認識番号：１２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１２
0003980055.tif 000027
（２）配列認識番号：１３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１３
0003980055.tif 000028
（２）配列認識番号：１４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１４
0003980055.tif 000029
（２）配列認識番号：１５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１５
0003980055.tif 000030
（２）配列認識番号：１６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１６
0003980055.tif 000031
（２）列認識番号：１７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１７
0003980055.tif 000032
（２）配列認識番号：１８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１８
0003980055.tif 000033
（２）配列認識番号：１９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：１９
0003980055.tif 000034
（２）配列認識番号：２０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２０
0003980055.tif 000035
（２）配列認識番号：２１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２１
0003980055.tif 000036
（２）配列認識番号：２２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２２
0003980055.tif 000037
（２）配列認識番号：２３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２３
0003980055.tif 000038
（２）列認識番号：２４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２４
0003980055.tif 000039
（２）配列認識番号：２５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：２５
0003980055.tif 000040
（２）配列認識番号：２６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：２６
0003980055.tif 000041
（２）配列認識番号：２７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：２７
0003980055.tif 000042
（２）配列認識番号：２８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：２８
0003980055.tif 000043
（２）配列認識番号：２９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：２９
0003980055.tif 000044
（２）配列認識番号：３０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：３０
0003980055.tif 000045
（２）配列認識番号：３１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：３１
0003980055.tif 000046
（２）配列認識番号：３２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：３２
0003980055.tif 000047
（２）配列認識番号：３３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：３３
0003980055.tif 000048
（２）配列認識番号：３４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：３４
0003980055.tif 000049
（２）配列認識番号：３５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス
（xi）配列の記載：配列認識番号：３５
0003980055.tif 000050