(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を形成させた後、化学発光性試薬として下記一般式（１）
【化１】
0004028645.tif 000004
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、フェニル基及びハロゲン化フェニル基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、いずれも水素原子であり、Ｘn-は硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン又はスルホン酸イオンである。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物とからなる複合体を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原量又は抗体量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項４】
前記水素受容体が、過酸化水素である請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項５】
化学発光反応を行なう際に、発光増強剤を更に含有させてなる請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項６】
前記発光増強剤が、フェノール性化合物である請求項５に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項７】
前記フェノール性化合物が、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項６に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光酵素免疫測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的に測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性同位元素を使用しない、良好な測定環境を保持することが可能な、人体に対して危険性の少ない免疫測定方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。この酵素免疫測定方法において使用される酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等の様々な酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵素標識抗体又は抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホスフェート、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化学分析においてはその測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又はその経過観察等に用いられることが多く、そのために、より高感度及び高精度な測定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に満足させるのは難しい。そこで、この要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェニル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在するため前記の要求を満たすには充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キセノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうので、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法及び蛍光法を上回る高感度な酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）が開発され、注目されている。
【０００３】
ＣＬＥＩＡは、酵素の触媒活性によって化学発光物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法であり、化学反応により化学発光物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。ＣＬＥＩＡに用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でペルオキシダーゼが好適に用いられ、化学発光物質にルミノールを用い、発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発され、種々の物質が化学発光方法により免疫学的に高感度で定量することが可能になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡにおいては、測定対象物質の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡの更なる高感度化が望まれていた。本発明は、前記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な化学発光方法による新規な免疫測定系を利用した化学発光酵素免疫測定方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物とからなる複合体を用い、そして発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光物質にルミノールを用いる系より高感度に測定対象物質を免疫学的に定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【０００６】
従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体を不溶性担体に固定化した抗体又は抗原と反応させて該不溶性担体上に捕捉した後、化学発光物質として
下記一般式（１）
【０００７】
【化２】
0004028645.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物とからなる複合体を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原量又は抗体量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との複合体を含有する化学発光試薬を用いることができるものであれば、いずれの方法も採用することができる。
【０００９】
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法。
▲３▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、
▲５▼不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗体を作用させる抗体検出法、更に、
▲６▼ビチオン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジンを反応させるビチオン−アビジン法等
を非限定的に用いることができる。
【００１０】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状のほか、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。更に、これらの不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等のいずれも用いることができる。
【００１１】
尚、本発明の化学発光酵素免疫測定方法において用いられる抗体類はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、形態は全抗体でもＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来するものが好適に用いられる。
【００１２】
更に、本発明の化学発光酵素免疫測定方法の後段を構成する化学発光反応は、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類−Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物複合体を用い、そして発光増強剤の存在下において水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方法は任意であるが、一般に、化学発光物質及び発光増強剤を含有する測定試薬を、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体（過酸化水素水溶液）を添加して化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１３】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられる化学発光試薬であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物とからなる複合体は、
下記一般式（１）
【００１４】
【化３】
0004028645.tif 000003
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と接触させることにより容易に製造することができる。
【００１５】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１６】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらのうち炭化水素基の炭素数としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１４のものを挙げることができる。
【００１７】
また、一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具体的には、硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１８】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との反応条件として、反応温度は用いられる試薬及び溶媒の種類によって異なるが、一般的に−１０〜＋２００℃、好ましくは、０〜１２０℃、特に好ましくは、２０〜６０℃の範囲であり、反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは５分〜１２時間、特に好ましくは、１０分〜５時間の範囲の時間を採用することができる。また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類１モルに対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を当モルから大過剰の範囲で用いることができる。
【００１９】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等が挙げられる。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）を好適に用いることができるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００２０】
また、化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられるが、特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が好ましい。
【００２１】
これらのＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物のうち、室温で液体のものは溶媒を兼ねて大過剰に用いることもでき、必要に応じ、適当な溶媒を用いることができる。また、室温で固体のものは加熱溶融させて用いてもよく適当な溶媒を用いることもできる。このような溶媒としては、ジメチルスルホキサイド、ヘキサメチルホスホアミド等を挙げることができる。
【００２２】
上記の化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。水素受容体としては、過酸化水素、過ホウ酸、有機ヒドロペルオキシド等が挙げられるが、過酸化水素が好適に用いられる。また、この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強されることが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−プロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２３】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法において、化学発光試薬は１０-6〜１Ｍ、好ましくは、１０-4〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、特に、５０〜３００μｌの範囲が好ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは、０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲が好ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは、１０〜１０００倍モルの範囲である。また、ペルオキシダーゼを標識物質として利用し、抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いることが好ましい。
【００２４】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００２５】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法において、化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定されるが、その測定の開始点及び積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択するのが好ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは、０〜３０分、特に好ましくは、０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは、１〜３０秒、特に好ましくは、１〜１０秒である。
【００２６】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定されるものではない。
尚、参考例及び実施例等の％は重量％を意味する。
【００２７】
［参考例１］
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との複合体の製造
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することによりルシゲニン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド複合体からなる化学発光試薬を得た。
【００２８】
［参考例２］
不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造
抗原に対し特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ7.4 ）（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００２９】
［参考例３］
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有するマウス等由来のモノクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ7.4 ）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００３０】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
【００３１】
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得る。
【００３２】
［実施例１］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルシゲニン−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド複合体を４．０×１０-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）２５０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．５ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３３】
［実施例２」
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（ＰＲＬ）の測定
兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルシゲニン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド複合体を４．０×１０-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）２５０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示される濃度依存性の良好な検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを１．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３４】
［実施例３］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定
兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。
【００３５】
次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルシゲニン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド複合体を４．０×１０-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）２５０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを１．０ｍＩＵ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３６】
［比較例１］
ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルミノールを５．６×１０-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）１００μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であったにすぎなかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、入手が容易であり、取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光試薬として、極めて製造が容易であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’ビスアクリジニウム塩類−Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物複合体からなる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により測定対象物質である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量線である。
【図２】  実施例２記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定用の検量線である。
【図３】  実施例３記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線である。
【図４】  比較例１記載の反応系（ルミノールを使用。）を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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