(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される組換えＤＮＡ及び／又は発現ベクターを保持してなる形質転換細胞を培養する工程：
（ａ）配列表の配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列を有するＤＮＡであって、かつ枯草菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡと、タンパク質をコードする外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下、ハイブリダイズ可能であって、かつ枯草菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡと、タンパク質をコードする外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡ；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の組換えＤＮＡを含む発現ベクター、並びに
（２）得られた培養物から、定常期特異的に発現された外来遺伝子によってコードされるタンパク質を採取する工程
を包含することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項２】
組換えＤＮＡが、配列表の配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列を有するＤＮＡと、外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡである、請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、目的遺伝子の産物を簡便に、かつ安価に高発現させうる、新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いたタンパク質の製造方法に関する。
背景技術
有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、目的に応じて、培養手法が確立された大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などを宿主として用い、かかる宿主に適したプロモーターを利用した発現系が利用されている。なかでも、大腸菌を宿主とし、ｌａｃプロモーターやその誘導体等を用いた発現系は、その操作の容易性の観点から、よく使用されている系の１種である。
しかしながら、ｌａｃプロモーターやその誘導体を用いた発現系には、遺伝子産物の発現の際に、遺伝子発現の誘導を行なう必要があるため、工業的に不利であるという欠点を有する。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどは、遺伝子発現の誘導に高価なＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を必要とするため、工業規模での実施には不利であるという欠点を有する。
同様に、キシロースオペロンに由来するプロモーターを利用し、バチルス属細菌を宿主とする発現系が利用されているが、その発現誘導にもキシロースの添加を必要としているため工業規模での実施には不利である。
一方、ファージλプロモーターの温度誘導を用いる発現ベクターも、一般的に使用されている。
しかしながら、組換遺伝子産物の温度誘導された過剰発現は、
（ａ）迅速な温度シフトアップを達成することの困難性、
（ｂ）より高い培養温度での不溶性インクルージョンボディーを形成する可能性の増大、および
（ｃ）熱ショック時の大腸菌におけるいくつかのプロテアーゼの誘導、
などの点で不利な場合がある。
枯草菌は定常期特異的反応として、アミラーゼ、プロテアーゼなど多くの分解酵素を生産、分泌することが知られている。この定常期特異的な発現機構を利用して宿主が十分生育した後、定常期でのみ遺伝子を発現することができれば宿主に対する負担を軽減し、外来遺伝子の発現を効率良く行なうことができる。しかしながら、そのような機構を利用した遺伝子発現の手法は、いまだ確立されていない。
従って、遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、効率のよい発現が可能な手法が望まれている。
発明の目的
本発明は、遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、該遺伝子を高レベルで定常期特異的に発現することができるプロモーター、組換えＤＮＡ、遺伝子発現用ベクター、発現ベクター、及び形質転換細胞、並びに操作が簡便であり、かつ安価に行ないうる、タンパク質の製造方法及びそのキットを提供することを目的とする。
発明の概要
本発明の要旨は、
〔１〕  以下からなる群より選択される単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列を有するＤＮＡ若しくはその断片であって、かつグラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡ；及び
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ若しくはその断片にストリンジェントな条件下、ハイブリダイズ可能であって、かつグラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡ、
〔２〕  外来遺伝子の上流に配置された場合、誘導物質の非存在下に該遺伝子を定常期特異的に発現しうる、前記〔１〕記載の単離されたＤＮＡ、
〔３〕  前記〔１〕記載のＤＮＡと外来遺伝子とが、該外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡ、
〔４〕  外来遺伝子が、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸からなる群より選択された核酸である、前記〔３〕記載の組換えＤＮＡ、
〔５〕  前記〔１〕記載のＤＮＡを含有してなる遺伝子発現用ベクター、
〔６〕  ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択された１種である、前記〔５〕記載の遺伝子発現用ベクター、
〔７〕  前記〔３〕記載の組換えＤＮＡを含有してなる発現ベクター、
〔８〕  ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択された１種である、前記〔７〕記載の発現ベクター、
〔９〕  前記〔３〕記載の組換えＤＮＡ、又は前記〔７〕記載の発現ベクターを保持してなる形質転換細胞、
〔１０〕  前記〔９〕記載の形質転換細胞を培養する工程、及び得られた培養物からタンパク質を採取する工程を包含することを特徴とする、タンパク質の製造方法、並びに
〔１１〕  前記〔１〕記載のＤＮＡ、又は前記〔５〕記載の遺伝子発現用ベクターを含有してなる、タンパク質製造用キット、
に関する。
発明の詳細な説明
本発明のＤＮＡとしては、枯草菌のバチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１０４株〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第８３巻、第２１５〜２３３頁（１９８９）〕由来の定常期特異的に発現する遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に局在し、かつプロモーター活性を呈するエレメントを含むＤＮＡを使用することができる。本発明は、前記ＤＮＡの下流に外来遺伝子（目的遺伝子ともいう）を配置した場合、発現誘導物質の非存在下で、目的遺伝子産物を培地１リットル当たり１００〜５００ｍｇの高レベルで発現することができるという、本発明者らの驚くべき知見に基づく。
本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。より好ましくは、グラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡ、さらに好ましくは、後述のように、バチルス属細菌又は大腸菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡである。
本明細書において、「プロモーター」とは、転写開始点（＋１）から約１０〜３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているプリブナウボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ  ｂｏｘ）、ＴＡＴＡボックス又はＴＡＴＡボックス類似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に限定されるものではなく、この領域以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。また、本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、かかる用語は、本明細書におけるプロモーターを含む領域のことをいう。
本明細書において、「プロモーター活性」とは、プロモーターの下流に発現可能な状態で遺伝子を配置し、得られた構築物を宿主に導入した際、宿主内または宿主外において該遺伝子の発現産物を生産する能力および機能を有することを示す。
一般的に、前記「プロモーター活性」は、下記：
▲１▼  定量または確認が容易なタンパク質をコードした遺伝子（以下、レポーター遺伝子ともいう）の上流に測定対象のＤＮＡを連結するステップ、
▲２▼  得られた構築物を宿主に導入するステップ、
▲３▼  得られた形質転換細胞を培養して、該タンパク質を発現させるステップ、及び
▲４▼  該タンパク質の発現量を測定するステップ
のプロセスにより、測定することができる。また、「プロモーター活性」の有無は、例えば、プロモーター配列を有すると思われる配列をレポーター遺伝子の上流に連結し、宿主に導入した際、宿主内または宿主外において該遺伝子の遺伝子産物の発現を確認することにより実施でき、ここで、発現が認められた場合、そのプロモーターは導入した宿主においてプロモーター活性を有することの指標となる。
本明細書において、「定常期特異的プロモーター」とは、対数増殖期を経た後、定常期においてのみ転写を行なうプロモーターをいう。すなわち、「定常期特異的プロモーター」は、ＩＰＴＧなどに代表される誘導物質を用いて誘導することなく、該プロモーターの下流に配置された遺伝子を定常期でのみ発現させうる。
本発明のＤＮＡには、定常期特異的にプロモーター活性が認められるものであれば、前記配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列を有する単離されたＤＮＡの断片も含まれる。ここで、「断片」は、定常期特異的にプロモーター活性が認められる範囲内で適宜選択することができる。かかる断片は、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより選択することができる。
本発明のＤＮＡには、さらに、配列番号１〜６のいずれかに示された塩基配列において、少なくとも１塩基、具体的には、１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加を有する塩基配列を有し、かつ定常期特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡも含まれる。一般的に、短い配列を有するＤＮＡにおいて、少なくとも１塩基に変異（置換、欠失、挿入、又は付加）を有するＤＮＡは、その活性が変化することもあるが、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより定常期特異的にプロモーター活性が認められた「変異を有するＤＮＡ」は、本発明に包含される。かかる変異は、天然由来の変異及び人為的に導入された変異のいずれであってもよい。
人為的な変異の導入方法としては、慣用の部位特異的変異導入法などにより行なうことができる。部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド  デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）〕、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）遺伝子を欠損した宿主を利用する方法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）〕、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開第９８／０２５３５号パンフレット）等を用いることができる。
また、本発明のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ、又は本発明のＤＮＡを基に、例えば、常法により設計し化学的に合成したオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマーを用いて得られたＤＮＡであって、かつ定常期特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡ、好ましくは、グラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡも本発明に包含される。
かかるＤＮＡは、例えば、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより定常期特異的にプロモーター活性が認められたものを選択すればよい。該オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列には特に限定はないが、前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズするものであればよい。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版〔サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、用いるプローブのＴｍ−２５℃の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。
また、プライマーの塩基配列にも特に限定はなく、通常のＰＣＲの反応条件において、前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を開始できるものであればよい。
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーのＴｍは、例えば、下記式：
0004028388.tif 000002
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
また、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えばＡ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
前記オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーション及び非特異的なアニーリングを防止する観点から、好ましくは６塩基以上、更に好ましくは１０塩基以上であることが望ましい。また、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００塩基以下であり、更に好ましくは３０塩基以下であることが望ましい。
オリゴヌクレオチドの設計は当業者に公知であり、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ、第１３〜１６頁、１９９６年宝酒造社発行を参考に設計することができる。また市販のソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用することができる。
また、前記オリゴヌクレオチドの合成は、公知の方法を用いて合成することが可能である。例えば、ＤＮＡシンセサイザー３９４型〔アプライド  バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製〕を用いて、ホスホアミダイト法による合成ができる。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等を用いて合成することができる。
本発明のＤＮＡにより、さらに、前記ＤＮＡと外来遺伝子とが、該外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡが提供される。かかる組換えＤＮＡも本発明に含まれる。
外来遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類又は抗体等）をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸などが挙げられる。かかる外来遺伝子の起源は、特に限定されないが、例えば、細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物；植物；昆虫；動物等が挙げられ、更に目的に応じ、人工的に合成した遺伝子も挙げられる。
より具体的には、例えば、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）１〜１２遺伝子、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＩＦＮ）α、β若しくはγ遺伝子、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）遺伝子、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）遺伝子、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）遺伝子、形質転換増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）−β遺伝子、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｔ−ＰＡ）遺伝子、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）遺伝子、西洋ホタルルシフェラーゼ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書でいう「リボザイム」とは、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードした遺伝子の配列より設計可能である。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムは、フェブス  レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）、第２２８巻、第２２８〜２３０頁（１９８８）に記載の方法を用いて作製されうる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば、本明細書におけるリボザイムに含まれる。
本発明のＤＮＡは、遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、該遺伝子を高レベルで発現することができるプロモーター活性を呈するため、特にタンパク質をコードする核酸である外来遺伝子の発現に好適である。
また、本発明のＤＮＡにより、当該ＤＮＡを含有してなる遺伝子発現用ベクターが提供される。かかる遺伝子発現用ベクターも本発明に含まれる。
本発明の遺伝子発現用ベクターによれば、本発明のＤＮＡを含有しているため、目的遺伝子産物を、例えばタンパク質の場合、培地１リットル当たり１００〜５００ｍｇのレベルで発現することができ、かつ目的遺伝子産物をその使用目的などに応じて容易に発現させることが可能になる。
本発明の遺伝子発現用ベクターにおいて、ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターおよび該ベクターの一部から成るベクター断片が挙げられる。前記ベクター、ベクター断片は、宿主として用いられる細胞により適宜選択することができる。
宿主として用いられうる細胞としては、特に限定はないが、グラム陽性菌が挙げられる。グラム陽性菌の例として、形質転換系が確立されているバチルス属細菌が挙げられる。具体的には、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス  リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス  スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらバチルス属細菌に変異処理などを行い、得られたものも宿主として用いることができる。また宿主として大腸菌も使用できる。大腸菌は形質転換系が確立されており、また様々な遺伝子型の大腸菌が作製され、そのいずれもが入手容易であることから形質転換用宿主として広く用いられている。具体的には、大腸菌  Ｋ−１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＤＨ１０Ｂ株、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’株、ＴＯＰ１０Ｆ株などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これら大腸菌に変異処理などを行い、得られたものも宿主として用いることができる。
前記ベクターとしては、例えば、宿主がバチルス属細菌である場合、プラスミドベクターとして、ｐＨＹ、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４などが、ファージベクターとして、φ１０５、ＳＰβなどが挙げられる。また、宿主が大腸菌である場合、プラスミドベクターとして、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴなどが、ファージベクターとして、λｇｔ１０、λｇｔ１１などのラムダファージベクターなど挙げられる。これらベクターを適宜選択し、本発明のＤＮＡを含めることにより、定常期特異的に外来遺伝子を発現させることが可能な、本発明の遺伝子発現用ベクターを構築することができる。
本発明の遺伝子発現用ベクターの構築には、前記モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版などに記載の手法を利用することができる。また、例えば、後述の実施例に記載の構築に従って作製することができる。
本発明の遺伝子発現用ベクターは、ｒｒｎＢＴ１Ｔ等のターミネーター、選択可能なマーカー遺伝子などを含んでもよい。
選択可能なマーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。
また、本発明の遺伝子発現用ベクターは、目的遺伝子産物の使用目的に応じて、例えば、目的遺伝子の産物の単離操作の簡便化をはかるために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの異種タンパク質との融合タンパク質として発現できるような配列、あるいはヒスチジンタグなどが付加されたタンパク質として発現できるようなタグ配列を含有してもよい。
さらに、本発明により、前記組換えＤＮＡを含有した発現ベクターが提供される。かかる発現ベクターも本発明に含まれる。また、本発明の発現ベクターには、前記遺伝子発現用ベクターに目的遺伝子を組み込むことにより得られた構築物をも含まれる。
また、本発明の発現ベクターには、前記遺伝子発現用ベクターで挙げられたベクターと同様のベクターを使用できる。
本発明の発現ベクターは、（ａ）前記組換えＤＮＡを適当なベクターに組み込むこと、（ｂ）前記遺伝子発現用ベクターに目的遺伝子を組み込むこと、あるいは（ｃ）前記遺伝子発現用ベクター断片に目的遺伝子を連結すること、により作製することができる。
また、本発明の組換えＤＮＡ及び発現ベクターにより、さらに、前記組換えＤＮＡを保持してなる形質転換細胞、あるいは前記発現ベクターを保持してなる形質転換細胞も提供することができる。
宿主としては、前出「宿主として用いられうる細胞」と同様な細胞が挙げられる。
組換えＤＮＡの宿主への導入は、例えば、遺伝子工学実験、第１２頁〜第２３頁、（社）日本アイソトープ協会編、平成３年発行；ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第５２巻、第４５６頁（１９７３）；モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第７巻、第２７４５頁（１９８７）；ジャーナル  オブ  ザ  ナショナル  キャンサー  インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、第４１巻、第３５１頁（１９６８）；エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第１巻、第８４１頁（１９８２）等に記載の方法により行なうことができる。
発現ベクターの宿主への導入は、例えば、ｓｐｏｎｔｅｎｅｏｕｓ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ法〔遺伝子工学実験、第１２〜２３頁、（社）日本アイソトープ協会編、平成３年発行〕、リン酸カルシウム法〔モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１９８７）〕、電気穿孔法〔プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８１巻、第７１６１頁（１９８４）〕、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔メソッズ  イン  ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２８３頁、カラムら編、１９９１年ＣＲＣプレス社発行〕、リポソーム法〔バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第６巻、第６８２頁（１９８９）〕等により行なうことができる。
さらに、本発明の形質転換細胞によれば、形質転換細胞を培養して、得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法が提供される。かかる「タンパク質の製造方法」も本発明に含まれる。
より具体的には、
（Ｉ）ａ）本発明のＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸が発現可能に配置された組換えＤＮＡ、又は
ｂ）該組換えＤＮＡを含有したベクター
を用いて、宿主細胞を形質転換する工程、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られた形質転換細胞を培養して、得られた培養物から該タンパク質を採取する工程、
により、タンパク質を製造することができる。
形質転換細胞の培養は、宿主として用いられた細胞、発現対象のタンパク質の性質などにより適宜選択することができる。
得られたタンパク質は、慣用のタンパク質の精製手段により精製することができる。かかる精製手段としては、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。
また、本発明のタンパク質の製造方法には、本発明のＤＮＡ又は本発明の遺伝子発現用ベクターを含有した、タンパク質の製造用キットを構築し、使用することができる。かかるキットにより、より簡便にタンパク質の製造を行なうことができる。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
ここで、本発明において用いられるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ各株の関係および特徴について以下に示す。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  １６８株：組換えＤＮＡ実験における、枯草菌宿主として汎用されている菌株の親株。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ１０４株：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  １６８株の誘導体の１つであり、ヒスチジン要求株である。栄養要求性以外の変異（ｎｐｒＲ２、ｎｐｒＥ１８、ａｐｒＥＤ３）はＵＯＴ１２８５株と同一である。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＵＯＴ１２８５株：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  １６８株の誘導体の１つであり、トリプトファンおよびリジン要求株である。栄養要求性以外の変異（ｎｐｒＲ２、ｎｐｒＥ１８、ａｐｒＥＤ３）はＤＢ１０４株と同一である。
実施例１  枯草菌ＤＮＡチップを用いた定常期特異的発現遺伝子の探索
枯草菌ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）のＤＮＡ配列情報を用い、枯草菌の全ＯＲＦについて各々のほぼ全長を増幅できるようなＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  １６８株〔モレキュラー  アンド  ジェネラル  ジェネティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１５２巻、第６５〜６９頁（１９７７）〕のゲノムＤＮＡに対して９６ウェルプレート中でＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ又はＴａＫａＲａ  Ｚ−Ｔａｑ（共に宝酒造社製）を用いて、ＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物を精製し、アガロースゲル電気泳動で純度及びサイズを確認した後、吸光度測定によりＤＮＡ濃度を算出した。
得られたＤＮＡ断片溶液をイソプロパノール沈澱によって濃縮し、１．０μｇ／ｍｌのＤＮＡ断片を、国際公開第００／２６４０４号パンフレットに記載の方法に準じてスライドグラス上に固定化し、ＤＮＡチップを作製した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＵＯＴ１２８５株〔ジャーナル  オブ  ジェネラル  マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１３５巻、第１３３５〜１３４５頁（１９８９）〕を５０ｍｌの２×ＳＧ〔１．６％  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００１ｍＭ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％  グルコース〕中、３７℃で培養し、培養開始３、４、５時間後にそれぞれ培養液の一部を取り、遠心分離により集菌した。得られた菌体をＴＲＩＺＯＬ試薬〔ギブコ  ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕に懸濁し、ガラスビーズを加えてＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ〔バイオスペック  プロダクツ（ＢＩＯＳＰＥＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）社製〕で菌体を破砕後、ＴＲＩＺＯＬ試薬のプロトコールに従って、クロロホルム抽出、イソプロパノール沈澱によりＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡはＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（宝酒造社製）で処理した後、フェノール／クロロホルム抽出、次いでエタノール沈澱で回収した結果、約９０〜１００μｇ得られた。これをテンプレート用ＲＮＡとした。
上記で調製したテンプレート用ＲＮＡ  １５μｇを用い、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ〔アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕を用いて逆転写酵素反応を行い、Ｃｙ３で標識されたｃＤＮＡプローブを調製した。
次に、上記で作製したＤＮＡチップをプレハイブリダイゼーション液（４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、１ｍｇ／ｍｌ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）中、室温で２時間のプレハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ次いで０．２×ＳＳＣで洗浄し、乾燥させた。続いて、ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ濃度を０．１ｍｇ／ｍｌとしたほかは、プレハイブリダイゼーション液と同じ組成のハイブリダイゼーション液中で、上記で調製したＣｙ３標識ｃＤＮＡプローブを用いて、６５℃、一晩、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、０．２％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ中、５５℃で３０分２回、６５℃で５分、更に０．０５×ＳＳＣ中、室温で５分間洗浄し、乾燥した。
このハイブリダイゼーションしたＤＮＡチップについてＤＮＡチップ解析装置Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１８  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ〔アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製〕で蛍光検出した。この蛍光検出では、画像上、シグナル強度は青＜緑＜黄＜橙＜赤＜白の連続した色段階で表現される。
得られた画像データについて、発現データ解析ソフトウェアＩｍａＧｅｎｅ〔バイオディスカバリー（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）社製〕を用いて、該ソフトウェアに添付の説明書に従い、シグナル強度の測定及び解析を行った。尚、数値化されたＣｙ３のシグナル強度を、ｒＲＮＡのシグナルを内部標準として調整した値で比較し、枯草菌の生育ステージ毎の遺伝子の発現シグナルを計測した。その結果、培養３時間後での発現シグナルが強い遺伝子や、培養５時間後に発現シグナルが強い遺伝子が認められ、ＯＲＦによって発現パターンが明らかに異なっていることが分かった。
これらの発現シグナルの違いを更に詳細に検討するため、培養３時間後の発現シグナルを分母として４時間後、５時間後の相対的な発現量比を算出し、発現量の生育ステージ特異性を観た。主な遺伝子の結果を表１に示す。
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表１から明らかなように、定常期である培養５時間後での発現量が著しく増大している遺伝子が認められた。
実施例２  枯草菌マクロメンブレンを用いた定常期特異的発現遺伝子の探索
実施例１で調製したテンプレート用ＲＮＡ  １５μｇを用い、ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ〔ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製〕を用いて逆転写酵素反応を行い、ジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）で標識されたｃＤＮＡプローブを調製した。
次に、このＤＩＧ標識ｃＤＮＡプローブを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙ〔ユーロゲンティック（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ）社製、以下マクロメンブレンと記す、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  １６８株由来推定ＯＲＦｓ〕に対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ（ロシュ  ダイアグノスティックス社製）の溶液中で、４２℃、３０分間、プレハイブリダイゼーション後、更に４２℃、一晩、ハイブリダイゼーションを行った。次いで、ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（共にロシュ  ダイアグノスティックス社製）を用いて検出した。検出結果は、感光フィルムに現像されるが、これを画像解析装置  Ｍｏｄｅｌ  ＧＳ−７００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ〔バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製〕で、画像解析ソフト  Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ〔アドビ（Ａｄｏｂｅ）社製〕による画像取り込みを行い、画像解析ソフト  ＭｕｌｔｉＡｎａｌｙｓｔ（バイオラッド社製）を用いて、該ソフトウェアに添付の説明書に従い、シグナル強度を測定及び解析を行った。尚、数値化されたＤＩＧのシグナル強度により、枯草菌の生育ステージ毎の遺伝子の発現シグナルを計測した。その結果、培養３時間後での発現シグナルが強い遺伝子や、培養５時間後に発現シグナルが強い遺伝子が認められ、ＯＲＦによって発現パターンが明らかに異なっていることが分かった。
これらの発現シグナルの違いを更に詳細に検討するため、培養３時間後の発現シグナルを分母として４時間後、５時間後の相対的な発現量比を算出し、発現量の生育ステージ特異性を観た。主な遺伝子の結果を表２に示す。
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表２から明らかなように、定常期である５時間後での発現量が著しく増大している遺伝子が認められた。
実施例３  定常期特異的プロモーターのスクリーニング
定常期特異的プロモーターのスクリーニングには、実施例１及び実施例２での探索をそれぞれ２回ずつ行い、得られた結果から、定常期である５時間後での発現量が著しく増大していた遺伝子を総合的に判断し、２３種の遺伝子（ａｃｏＡ、ａｃｏＬ、ｉｏｌＪ、ｓｉｇＦ、ｓｉｐＷ、ｓｐｏＩＩＢ、ｓｐｏＩＩＩＡＨ、ｓｐｏＩＶＡ、ｙａｂＳ、ｙｂｃＯ、ｙｂｃＰ、ｙｂｃＱ、ｙｂｃＳ、ｙｂｃＴ、ｙｂｄＡ、ｙｂｄＤ、ｙｆｉＡ、ｙｇａＢ、ｙｊｄＢ、ｙｎｇＪ、ｙｏｂＨ、ｙｑｘＡ、ｙｒｚＥ）を選出し、以下の実験に使用した。
定常期特異的プロモーターのスクリーニングは、定常期特異的発現遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられる上記２３種類の遺伝子のＤＮＡ断片を外来遺伝子に連結し、遺伝子発現用ベクターをそれぞれ構築することにより行った。
遺伝子発現用ベクターの構築は、市販のゲル精製及びプラスミド精製用の酵素、ゲル精製用キット及びプラスミド精製用キットを用いた。また、特に明記しないかぎり、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版（サンブルークら、１９８９年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス社発行）に記載の方法で行った。
まず、上記２３種類の遺伝子の定常期特異的発現遺伝子のＳＤ配列よりさらに上流域に存在するプロモーターを含むと考えられる約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するために、実施例１に記載の枯草菌ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）の配列を基にして、２３種類の遺伝子のそれぞれの上流領域を増幅するためのプライマーを設計した（計４６種類のプライマー）。また、増幅後の操作を簡便にするため、設計したプライマーの両サイドにそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩサイトとＥｃｏＲＩサイトを導入した。
尚、ａｃｏＡ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は、配列表の配列番号７（プライマーａＡＦ１）及び配列番号８（プライマーａＡＲ１）に、ｓｐｏＩＩＢ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号９（プライマーｓｐＢＦ１）及び配列番号１０（プライマーｓｐＢＲ１）に、ｙｂｃＯ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号１１（プライマーｙｂＯＦ１）及び配列番号１２（プライマーｙｂＯＲ１）に、ｙｊｄＢ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号１３（プライマーｙｊＢＦ１）及び配列番号１４（プライマーｐｊＢＲ１）に、ｙｎｇＪ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号１５（プライマーｙｎＪＦ１）及び配列番号１６（プライマーｙｎＪＲ１）に、ｙｒｚＥ遺伝子のプロモーター領域と考えられるＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号１７（プライマーｙｒＥＦ１）及び配列番号１８（プライマーｙｒＥＲ１）に示す。
次に、ＩＳＯＰＬＡＮＴ  ｋｉｔ〔ニッポンジーン（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）社製〕を用いて、該キットに添付の説明書に従って、バチルス  サブチリス  ＤＢ１０４株〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第８３巻、第２１５〜２３３頁（１９８９）〕よりゲノムＤＮＡを調製した。
得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、上記設計したプライマーを用い、ＰＣＲ反応を、９４℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとして、２０サイクル行なった。
こうして増幅されたプロモーターを含むと考えられる２３種類のＤＮＡ断片を、以下に用いた。
定常期特異的プロモーターをスクリーニングするための外来遺伝子として、国際公開第９８／５６９２６号パンフレットに記載のピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ遺伝子を用いた。
国際公開第９８／５６９２６号パンフレットに記載の超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＰＯ１２４ΔＣを保有する菌株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ１０４／ｐＳＰＯ１２４ΔＣ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２９４）を、１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ培地  ５ｍｌ中、３７℃で一晩培養した後、集めた菌体よりＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて、該キットに添付の説明書に従い、プラスミドｐＳＰＯ１２４ΔＣを調製した。その際、４ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを添加したｋｉｔに添付されているｂｕｆｆｅｒ  Ｐ１に懸濁した菌体は、３７℃で３０分間処理を行った。
得られたプラスミドｐＳＰＯ１２４ΔＣを鋳型として、バチルス  サブチリス由来のズブチリシンＥをコードするａｐｒＥ遺伝子のＳＤ配列、分泌シグナル、超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ構造遺伝子を含む５４４８ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーＰＬＦ１（配列番号１９）及びプライマーＰＬＲ１（配列番号２０）を用いたＰＣＲにより増幅した。これをベクター断片とし、以下に用いた。
以下、ｙｎｇＪ遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を例として示す。
上記で増幅されたｙｎｇＪ遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられるＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩとで消化したベクター断片と混合してライゲーション行い、この反応液を用い、バチルス  サブチリス  ＤＢ１０４株を形質転換した。これを、１％スキムミルク及び１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有のＬＢプレートにまき、３７℃、１６時間、静置培養を行った。
得られたカナマイシン耐性の形質転換体について、上記１８０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択するため、上記プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅できるプライマーＵＢＦ１（配列番号２１）及びプライマーＳＢＰＲ１（配列番号２２）を設計した。この２つのプライマーの組合わせで、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する反応液中、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ反応を、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとして、２０サイクル行った。
こうして１８０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたクローンを選択した。選択した形質転換体よりプラスミドを調製し、これをｐＮＤ２０と命名した。
また、他の２２種類のＤＮＡ断片についても同様の操作を行い、形質転換体が得られたクローンの中からプロモーター配列がｐＮＤ２０とは異なる１８種類のクローンを得た。この形質転換体よりプラスミドを調製した（合計１９種類）。
実施例４  定常期特異的発現ベクターによる超耐熱性プロテアーゼの生産
（１）超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ遺伝子を含有するプラスミドで形質転換したバチルス  サブチリスの培養と粗酵素液の調製
実施例３で作製した、超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＮＤ２０を導入したバチルス  サブチリス  ＤＢ１０４株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ１０４／ｐＮＤ２０）を、１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＴＫＲＢＳ１培地（２０ｍｇ／ｍｌ  ポリペプトン、２ｍｇ／ｍｌ  酵母エキス、１０ｍｇ／ｍｌ  肉エキス、４０ｍｇ／ｍｌ  グルコース、２０μｇ／ｍｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０μｇ／ｍｌ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２μｇ／ｍｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）１ｍｌ中、３７℃で培養した。培養開始後、４、７、１０、１３日後にそれぞれ１００μｌの培養液を採取し、９５℃で３０分間熱処理後、遠心分離により上清を集め、粗酵素液とした。
また、他の１８種類のプラスミドをそれぞれ１種類ずつ導入したバチルス  サブチリス  ＤＢ１０４株についても、同様に、粗酵素液を調製した。
（２）超耐熱性プロテアーゼ生産能の比較
超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳの活性測定はＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ＮＡ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を基質とし、酵素による加水分解反応によって生成するｐ−ニトロアニリンを分光学的に測定することによって行なった。
すなわち、酵素活性を測定しようとする酵素標品を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適度に希釈し、その試料溶液  ５０μｌに１ｍＭ  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ＮＡ溶液〔１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて調製〕５０μｌを加え、９５℃で３０分間反応させた。その後、氷冷して反応を停止した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。
酵素１単位は、９５℃において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量とした。
更に、得られた酵素活性をもとに発現された酵素タンパク質量を、超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳのタンパク質重量当たりの比活性を９．５単位（ｕｎｉｔ）／ｍｇとして算出した。
実施例４−（１）で調製した各粗酵素液を酵素標品とし、超耐熱性プロテアーゼ活性を測定した。その結果、６種類のプラスミド（ｐＮＤ１、ｐＮＤ６、ｐＮＤ１０、ｐＮＤ１９、ｐＮＤ２０、ｐＮＤ２３）で超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳの発現が認められた。この６種類のプラスミドに組込まれたプロモーター領域の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜６に示す。更に、これら発現が認められた６種類のプラスミドについて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ１０４／ｐＳＰＯ１２４ΔＣでの発現量を１とした場合の相対値を表３に示す。
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表３から明らかなように、ｐＳＰＯ１２４ΔＣと比較して、ｐＮＤ６で約１．２倍、ｐＮＤ１０で約１．５倍以上、ｐＮＤ２０では約２倍以上に超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳ発現量が増加した。ｐＮＤ６では培養初期の４日目では、超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳの発現がほとんど認められず、培養後期の１０日目ではｐＳＰＯ１２４ΔＣよりも発現量は大となった。
超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳの発現が認められたプラスミドについて、超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳの発現量が最大となった培養日数と生産量を、プロモーターの起源となる遺伝子名とともに表４に示す。表中の生産量は培養液１リットル当たりのｍｇ数で示す。
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表４から明らかなように、ｐＳＰＯ１２４ΔＣと比較してｐＮＤ６、ｐＮＤ１０、ｐＮＤ２０では、より短期間の培養日数で、より多くの超耐熱性プロテアーゼＰＦＵＳが生産された。
実施例５  定常期特異的発現ベクターによる、アルカリプロテアーゼ、ニトロフェニルホスファターゼ、ピロリドンカルボキシルペプチダーゼおよびメチオニルアミノペプチダーゼの生産
（１）ベクターの調製
前述の実施例３において構築されたプラスミドのうち、ｐＮＤ１、ｐＮＤ６、ｐＮＤ１０、ｐＮＤ１９およびｐＮＤ２３、ならびにコントロールとしてｐＳＰＯ１２４ΔＣをそれぞれ鋳型として、リポーター遺伝子であるプロテアーゼＰＦＵＳ遺伝子を除いた領域、すなわち、プロモーター領域、ＳＤ配列、分泌シグナル、ベクターを含む領域を、プライマーＮＤＦ１（配列番号２３）およびプライマーＮＤＲ１（配列番号２４）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。これをベクター断片とし、以下に用いた。
（２）リポーター遺伝子の調製および発現ベクターの構築
（ｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）より、超好熱菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株由来アルカリプロテアーゼ遺伝子を保有するプラスミドＡ２ＧＲ７３１０を譲受した。これを鋳型として、アルカリプロテアーゼをコードする領域を、プライマーＡＰ１Ｆ１（配列番号２５）およびプライマーＡＰ１Ｒ１（配列番号２６）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。これをリポーター遺伝子断片とし、以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いたＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来アルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号３３に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、ｐＮＤ６、ｐＮＤ１０およびｐＳＰＯ１２４ΔＣ由来のベクター断片とそれぞれライゲーションし、得られた組換えプラスミド（発現ベクター）をそれぞれｐＮＤ６Ａ１、ｐＮＤ１０Ａ１およびｐＳＰＯＡ１と命名した。
（ｉｉ）ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子
独立行政法人  製品評価技術基盤機構より、超好熱菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株由来ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子を保有するプラスミドＡ２ＧＲ００３０を譲受した。これを鋳型として、ニトロフェニルホスファターゼをコードする領域を、プライマーＡＰ７Ｆ１（配列番号２７）およびプライマーＡＰ７Ｒ１（配列番号２８）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。これをリポーター遺伝子断片とし、以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いたＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号３４に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、ｐＮＤ１０、ｐＮＤ２３およびｐＳＰＯ１２４ΔＣ由来のベクター断片とそれぞれライゲーションし、得られた組換えプラスミド（発現ベクター）をそれぞれｐＮＤ１０Ａ７、ｐＮＤ２３Ａ７およびｐＳＰＯＡ７と命名した。
（ｉｉｉ）ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ遺伝子
独立行政法人  製品評価技術基盤機構より、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３株由来ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ遺伝子を保有するプラスミド２７０８を譲受した。これを鋳型として、ピロリドンカルボキシルペプチダーゼをコードする領域を、プライマーＰＨ１Ｆ１（配列番号２９）およびプライマーＰＨ１Ｒ１（配列番号３０）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。これをリポーター遺伝子断片とし、以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いたＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号３５に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、ｐＮＤ１０、ｐＮＤ１９およびｐＳＰＯ１２４ΔＣ由来のベクター断片とそれぞれライゲーションし、得られた組換えプラスミド（発現ベクター）をそれぞれｐＮＤ１０Ｐ１、ｐＮＤ１９Ｐ１およびｐＳＰＯＰ１と命名した。
（ｉｖ）メチオニルアミノペプチダーゼ遺伝子
独立行政法人  製品評価技術基盤機構より、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３株由来メチオニルアミノペプチダーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅断片ＰＨ０６２８ＰＣＲを譲受した。これを鋳型として、メチオニルアミノペプチダーゼをコードする領域を、プライマーＰＨ２Ｆ１（配列番号３１）およびプライマーＰＨ２Ｒ１（配列番号３２）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られた増幅断片を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ（共に宝酒造社製）とで消化し、精製した。これをリポーター遺伝子断片とし、以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いたＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来メチオニルアミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号３６に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、ｐＮＤ１、ｐＮＤ１９およびｐＳＰＯ１２４ΔＣ由来のベクター断片とそれぞれライゲーションし、得られた組換えプラスミド（発現ベクター）をそれぞれｐＮＤ１Ｐ２、ｐＮＤ１９Ｐ２およびｐＳＰＯＰ２と命名した。
（３）形質転換体の作製およびリポーター遺伝子の発現
上記実施例５−（２）において作製した、それぞれの発現ベクターを用い、バチルス  サブチリス  ＤＢ１０４株をそれぞれ形質転換した。これを、１％スキムミルクおよび１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートにまき、３７℃、１６時間、静置培養を行った。
得られたカナマイシン耐性形質転換体より、上記酵素をコードする遺伝子が挿入されているクローンを選択し、１ｍｌの１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＴＫＲＢＳ１培地中、３７℃で培養した。培養１０日後（アルカリプロテアーゼのみ７日後）の培養液を９５℃、３０分間熱処理後、遠心分離により上清を回収し、粗酵素液（酵素標品）とした。
（４）活性測定
（ｉ）アルカリプロテアーゼ
アルカリプロテアーゼの活性測定は、ゼラチン〔ナカライテスク（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）社製〕を基質として、以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて適度に希釈し、これとＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーとを混合し、室温で３０分以上放置した。これを、０．０５％ゼラチンを含むＳＤＳ含有１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動を行った。泳動後、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄した。洗浄したゲルを、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、９５℃で３時間保温した。その後、氷冷して反応を停止した後、クマシーブルー染色し、画像解析ソフト  Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビ社製）にてゲル像を画像ファイル化し、ＮＩＨイメージソフトにて活性シグナルを数値化した。
（ｉｉ）ニトロフェニルホスファターゼ
ニトロフェニルホスファターゼの活性測定は、ｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社製）を基質として、以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を、１ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて適度に希釈し、その試料溶液５０μｌに２ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液〔１ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて調製〕５０μｌを加え、９５℃で１０分間反応させた。その後、氷冷して反応を停止し、Ｐｉｐｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ〔モレキュラー  プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）社製〕を用いて、５４４ｎｍの励起光による５９０ｎｍにおける蛍光発光を測定し、遊離リン酸の生成量を求めた。
（ｉｉｉ）ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ
ピロリドンカルボキシルペプチダーゼの活性測定は、ピログルタミン酸−４−メチル−クマリル−７−アミド（以下、Ｐｙｒ−ＭＣＡと略す）〔ペプチド研究所（ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ）製〕を基質として、以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて適度に希釈し、その試料溶液  ５０μｌに０．２ｍＭ  Ｐｙｒ−ＭＣＡ溶液〔１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて調製〕５０μｌを加え、９５℃で３０分間反応させた。その後、氷冷して反応を停止し、３５５ｎｍの励起光による４６０ｎｍにおける蛍光発光を測定し、ＭＣＡの生成量を求めた。
酵素１単位は、９５℃において１分間に１μｍｏｌのＭＣＡを生成する酵素量とした。
（ｉｖ）メチオニルアミノペプチダーゼ
メチオニルアミノペプチダーゼの活性測定は、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ〔バッヘム（ＢＡＣＨＥＭ）社製〕を基質として、以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を、０．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて適度に希釈し、その試料溶液５μｌに１ｍＭ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ〔０．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝（ｐＨ７．５）にて調製〕４５μｌを加え、７５℃で５分間反応させた。その後、氷冷し、１０μｌの１００ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止した後、５０μｌの混合溶液Ａ〔０．１８ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、５０μｇ／ｍｌ  ペルオキシダーゼおよび０．１８ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ジアニシジンを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝（ｐＨ７．５）〕を加え、３７℃で１０分間反応させた。その後、氷冷して反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（５）産生能の比較
上記実施例５−（４）で測定した各酵素標品の酵素活性より、培養液中の総酵素活性を算出した。
ａｐｒＥ遺伝子のプロモーターを有する発現ベクター（ｐＳＰＯＡ１、ｐＳＰＯＡ７、ｐＳＰＯＰ１およびｐＳＰＯＰ２）による発現量ををそれぞれ１とした、各発現ベクターでの相対発現量を、以下の表５に示す。
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産業上の利用の可能性
本発明により、遺伝子発現を誘導しなくても、該遺伝子を高レベルで定常期特異的に発現することができるプロモーターが提供される。
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【配列表】
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