(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性担体と結合した抗体又はレセプター（不溶性成分）と検出可能な標識物質と結合した抗体又はレセプター（標識成分）であって、互いに特異的な反応性を有しないものを用い、単一容器中で抗原抗体反応又はリガンドレセプター反応を利用して測定されるべき物質を含む複合体を一段階反応で形成させるワンステップサンドイッチ測定を実施するための試薬の製造方法において、まず不溶性成分又は標識成分のいずれか一方を該容器に分注し、他方成分の不存在下で凍結させ、次に該成分の凍結状態を保ったまま他方成分を該容器に分注し、凍結させ、その後凍結乾燥することからなる、両成分を接触させることなく凍結乾燥した前記試薬の製造方法。
【請求項２】
標識物質が酵素、蛍光物質又はラジオアイソトープのいずれかである請求項１の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術の分野】
本発明は、不溶性担体と結合した抗体又はレセプターと検出可能な標識物質と結合した抗体又はレセプターを用い、単一容器中で抗原抗体反応又はリガンドレセプター反応を利用して測定されるべき物質を含む複合体を一段階反応で形成させるワンステップサンドイッチ測定を実施するための試薬の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
サンドイッチ測定は、不溶性担体と結合した抗体又はレセプター（以下、単に不溶性成分という）と標識物質と結合した抗体又はレセプター（以下、単に標識成分という）を測定されるべき物質と結合させてこれら３物質で複合体を形成させ、不溶性担体上に結合している複合体中の標識物質を測定する方法である。不溶性成分と標識成分は測定されるべき物質が存在しない場合、特異的な反応性を示さないため、理論上は単一容器中に不溶性成分及び標識成分を分注しておけば、後は測定されるべき物質を含む（と予想される）試料を投入するだけで測定を開始することが可能である。このような測定をを実施するための試薬は、両成分が特定的な反応を生じないことから、従来は不溶性成分及び標識成分を分注し、両者を接触状態にあるなかで凍結後、乾燥することが行われている。
【０００３】
なお、いわゆる競合測定用の試薬や一部の医薬品では２以上の成分を分離して凍結し乾燥することが知られているが、これら試薬や医薬品では、２以上の成分が特異的な反応性を有するために両者を接触させることができず、又は、両者が接触するといずれか又は両成分の失活等が生じる場合に限られ、本発明が目的とするサンドイッチ測定用試薬についての報告はない（例えば特開平５−１９４１９４号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、サンドイッチ測定に用いる不溶性成分と標識成分は特異的な反応性を有しないものの、時に非特異的な反応を生じ、これらを接触状態で凍結乾燥すると測定されるべき物質が介在しないにもかからず、不溶性担体上に標識物質を含む複合体が形成され、結果としてバックグランド信号が増加して測定試薬の感度が低下する可能性のあることを知見した。
【０００５】
そこで本発明の目的は、かかる非特異的な反応を防止し、これによりバックグランド信号を減少して結果的に測定感度を向上し得るサンドイッチ測定用試薬の製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために採用された本発明の構成は、不溶性担体と結合した抗体又はレセプター（不溶性成分）と検出可能な標識物質と結合した抗体又レセプター（標識成分）を用い、単一容器中で抗原抗体反応又はリガンドレセプター反応を利用して測定されるべき物質を含む複合体を一段階反応で形成させるワンステップサンドイッチ測定を実施するための試薬の製造方法において、まず不溶性成分又は標識成分のいずれか一方を該容器に分注し、他方成分の不存在下で凍結させ、次に該成分の凍結状態を保ったまま他方成分を該容器に分注し、凍結させ、その後凍結乾燥することからなる、両成分を接触させることなく凍結乾燥した前記試薬の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
サンドイッチ測定では、測定されるべき物質に対して特異的反応性を有する一組の抗体又は一組のレセプターを用いる。ここで一組とは、測定されるべき物質と同時に結合し得る２種類を意味し、例えばモノクローナル抗体であれば測定されるべき物質上の認識部位が異なる２種類のモノクローナル抗体を用いることが例示できる。
【０００８】
本発明における不溶性成分は、抗体又はレセプターを水不溶性担体と結合したものである。担体は、測定されるべき成分を含む複合体を形成した後、該複合体に含まれる標識成分と含まれていない標識成分の分離を容易に実施するためのものであり、例えば球状、フィルム状等の形状で、大きさが数μｍ程度のものから数ｍｍ程度のものまで、特に制限はない。担体に抗体又はレセプターを結合させるためには、例えば担体と抗体等の間の吸着を利用したり、又は抗体等の分子中に存在するアミノ基等の活性な基を利用してこれを担体の活性基と化学反応させることが例示できる。なお担体が活性基を有していない場合には、例えば通常のカップリング剤等を用いることもできる。また担体は、内部に磁石を含むもの等であっても良い。
【０００９】
検出可能な標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質又はラジオアイソトープを例示できる。これらを抗体やレセプターと結合するには、各物質中の活性基を利用して化学的に反応させる等すれば良い。むろん、カップリング剤などを利用することもできる。また更には、ビオチンとアビジン等の反応を利用して標識物質を抗体等に結合させることもできる。なお、標識物質と抗体等を予め結合しておくのではなく、ビオチンとアビジン等の反応を利用してサンドイッチ測定の最中に両者結合させる場合には、標識物質と抗体等を標識成分として一緒に取り扱えば良い。
【００１０】
不溶性成分及び標識成分は、液体状態で容器に分注する。不溶性成分を含む液体及び標識成分を含む液体は、各成分以外に例えば糖等の凍結時、乾燥時そして実際のサンドイッチ測定での使用における凍結乾燥状態から液体状態への復帰時に安定化作用を発揮する物質やｐＨを調整するための緩衝剤等を含んでいても良い。なお不溶性成分については、液体状態、即ち液体に懸濁した状態で分注する以外に、湿った状態で分注することも可能である。この場合には安定化剤等を含む溶液に一端浸した後、該溶液を水切りして分注するなどすれば良い。
【００１１】
本発明では、まず不溶性成分又は標識成分のいずれかを容器に分注し、凍結する。次に、分注した成分の凍結状態を保ったまま、他方成分を分注して凍結する。容器は十分に冷却しておき、分注と同時に容器内壁に接触した部分から分注された成分が凍結されるように−２０℃程度まで冷却しておくことが好ましい。分注等の各操作は、−２０〜−４０℃条件下で実施することが、分注した各成分の溶解を防止するうえで好ましい。
【００１２】
他方成分の分注は、凍結された成分の上に多層に凍結させることが例示できる。しかしながら、凍結された状態でも両者が分離されていることが特に好ましい。このためには、いずれかの成分を容器に部分的に分注し、凍結することが好ましい。ここで部分的にとは、容器の内壁全面に該成分が広がらないように分注することを意味する。即ち、後の段階で他方成分を分注する際、他方成分が当該成分と接触することなく分注し得るように、例えば容器底面の一部分に分注して凍結するのである。不溶性成分は担体を含み容器中で広がり難いため部分的な分注が容易である。従ってこの場合には、不溶性成分をまず分注することが好ましい。特に、不溶性成分を前記したような溶液から一端分離して十分に水切りした後に分注することが好ましい。
【００１３】
このように、両成分を凍結した状態でも分離された状態とするためには、引き続き他方成分を容器の異なる部分に分注し、凍結させる。例えば前記成分を容器底面の一部分に分注、凍結した場合、他方成分を凍結された成分と接触しないように容器底面の異なる部分に分注し、凍結することが例示できる。また例えば、前記成分を容器底面全面に渡って凍結し、容器を横に向けた状態で他方成分を分注して側壁に沿って凍結したり、又は、前記成分を含まず、安定化剤や緩衝剤のみからなる液体を先に分注して凍結された前記成分を覆っておき、この上に他方成分を分注し凍結することも例示できる。
【００１４】
以上のようにして各成分を接触することなく凍結した後、凍結状態にて乾燥操作を行う。この操作は通常の凍結乾燥操作で良く、具体的な条件としては、例えば真空度１００ｍＴｏａｒ以下、−２０℃条件下に２時間おいた後２５℃条件下に５時間おくことが例示できる。乾燥操作を終了した後は、酸化による各成分の劣化等を防止する目的で不活性ガス等を注入して密閉し、保管することが好ましい。
【００１５】
以上のようにして製造されたサンドイッチ測定用試薬は、不溶性成分と標識成分が乾燥状態で単一容器に入れられていることから、測定されるべき物質を含む（と予想される）試料を投入するだけでサンドイッチ測定を開始することができる。即ち、試料を投入後、一定時間インキュベーションし、免疫反応やリガンドレセプター反応を生じさせ、担体を液体と分離し、担体上に形成された複合体中に含まれる標識物質に対して蛍光測定等の検出操作を行えば良い。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
なお以下の実施例では、市販の測定装置（ＡＩＡ  ２１、商品名、東ソー（株）製）を用いてサンドイッチ測定を行った。より具体的には、以下のようにして製造した不溶性成分（モノクローナル抗体と結合した直径約１．２ｍｍの、磁性粒子を含む、球状の樹脂製担体）と標識成分（モノクローナル抗体と結合したアルカリ性フォスファターゼ）を含む容器に測定されるべき抗原性物質を含むヒト血清を添加し、３７℃にて４０分間攪拌保温し、その後容器中の液体を除去するＢ／Ｆ分離操作（バウンド／フリー分離操作）を行い、アルカリ性フォスファターゼの蛍光基質である４メチルウンベリフェリルりん酸塩を添加し、単位時間当たりの４メチルウンベリフェロンの生成量（ｎＭ／秒）を蛍光測定した。
【００１８】
実施例１
抗体としてヒトインスリンに対する抗ヒトインスリンマウスモノクローナル抗体を用い、試薬を製造した。まず、標識成分を含まない以外は標識成分溶液と同様の組成の液体（ゼラチン及びマンニトールを含む）と不溶性成分を混合して容器の一部分に分注し、凍結後、標識成分を分注し、凍結された不溶性成分の上に重ねて凍結し、約４６ｍＴｏａｒ、−２０℃に２時間おいた後２５℃に５時間おく乾燥操作を行って測定試薬（試薬Ａ）を製造した。
【００１９】
比較のため、不溶性成分と標識成分を混合後、容器に分注して凍結した以外は同様の条件で製造した測定試薬（Ｂ）を用いた。
【００２０】
これら試薬を用いてヒトインスリンを含まない標準血清（血清１）及び３５１μＵ／ｍｌのヒトインスリンを含む標準血清（血清２）を測定した。測定は５回行い、変動計数（ＣＶ％）を算出した。結果を表１に示す。なお単位はｎＭ／秒である。
【００２１】
【表１】
0004022680.tif 000002
【００２２】
表１から明らかなように、両試薬とも血清２の測定値はほぼ同程度の値を示したが、本発明の製造方法で製造した試薬（試薬Ａ）では血清１（ゼロ濃度）の標準で比較のための試薬（試薬Ｂ）の値の約2 ／３と、非特異的な反応に由来するバックグラウンドが低減されていることが分かる。
【００２３】
実施例２
実施例１で製造した試薬を用い、０〜３５１μＵ／ｍｌのヒトインスリン濃度範囲から６点の濃度について測定を行い、いわゆる６点検量線を作成し、ゼロ濃度の測定値に２倍標準偏差を加算した際の濃度換算値より最小検出感度の計算を行った。その結果、比較のための試薬（試薬Ｂ）では最小検出感度が０．１３２μＵ／ｍｌであったのに対し、本発明の製造法で製造された試薬（試薬Ａ）では０．０８２μＵ／ｍｌであった。このことは、本発明の製造方法で製造した試薬では、従来の方法で製造した試薬に比較して高感度化されていることを示す。
【００２４】
実施例３
抗体としてヒトミオグロンビンに対する抗ヒトミオグロビンマウスモノクローナルを使用した以外は実施例１と同様の操作を行い、測定試薬（Ｃ）を製造した。また比較のため、前記抗体を用いて実施例１における試薬Ｂの製造と同様の操作を行って測定試薬（Ｄ）を製造した。
【００２５】
これら試薬を用いてヒトミオグロビンを含まない標準血清（血清１）及び１０００ｎｇ／ｍｌのヒトミオグロビンを含む標準血清（血清２）を測定した。測定は５回行い、変動計数（ＣＶ％）を算出した。結果を表２に示す。なお単位はｎＭ／秒である。
【００２６】
【表２】
0004022680.tif 000003
【００２７】
表２から明らかなように、両試薬も血清２の測定値はほぼ同程度の値を示したが、本発明の製造方法で製造した試薬（試薬Ｃ）では血清１（ゼロ濃度）の標準では比較のための試薬（試薬Ｄ）の値の約１／３と、非特異的な反応に由来するバックグラウンドが低減されていることが分かる。
【００２８】
実施例４
実施例３で製造した試薬を用い、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのヒトミオグロビン濃度範囲から６点の濃度について測定を行い、いわゆる６点検量線を作成し、ゼロ濃度の測定値に２倍標準偏差を加算した際の濃度換算値より最小検出感度の計算を行った。その結果、比較のための試薬（試薬Ｄ）では最小検出感度が０．１９４ｎｇ／ｍｌであったのに対し、本発明の製造法で製造された試薬（試薬Ｃ）では０．０５５ｎｇ／ｍｌであった。このことは、本発明の製造方法で製造した試薬では、従来の方法で製造した試薬に比較して高感度化されていることを示す。  実施例５
実施例３で製造した試薬と実施例４で作成した６点検量線を用い、未知濃度のミオグロビンを含む３０のヒト血清試料について測定を行った。
【００２９】
この結果、試薬Ｃ及びＤの相関はＹ＝０．９８５４Ｘ＋１０．２５で、相関係数Ｒ＝０．９９８であった。
【００３０】
このように、本発明の製造方法で製造したサンドイッチ測定用試薬を用いれば、不溶性成分と標識成分の非特異的な反応の抑制によりバックグランドを低減でき、結果として最小検出感度を約４倍上昇させる事が可能な反面、通常の測定値に変動は認められない。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、測定時に検出されるバッググランドが低減され、結果として検出感度が高感度化されたサンドイッチ測定用試薬を製造することが可能となる。