(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性ホスファターゼの酵素反応を使用して、試料中のアルカリ性ホスファターゼを測定する測定方法であって、（ａ）ｐＨが５以上及び８．５未満であり、かつｐ−ニトロフェニルリン酸を含有する第１試薬と試料を混合して混合液を調製し、（ｂ）ｐＨが９．５以上である第２試薬を、段階（ａ）の混合液に混合して、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨ域であるｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５に入るｐＨを有する反応混合液を調製し、及び（ｃ）段階（ｂ）の反応混合液の調製によりアルカリ性ホスファターゼの酵素反応を開始させる段階を含むことを特徴とする、試料中のアルカリ性ホスファターゼの測定方法。
【請求項２】
アルカリ性ホスファターゼの酵素反応を使用する、試料中のアルカリ性ホスファターゼの測定試薬であって、（１）ｐＨが５以上及び８．５未満であり、かつｐ−ニトロフェニルリン酸を含有する第１試薬、及び（２）ｐＨが９．５以上である第２試薬を含むことを特徴とする、試料中のアルカリ性ホスファターゼの測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応を使用する試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬に関するものであって、第１試薬と試料の混合液に第２試薬又は第３試薬以上の試薬を混合することにより、酵素反応を進めさせるものである。
本発明により測定試薬中の測定に使用する成分の安定化を図ることができる。本発明は、特に、化学分野、医療分野及び臨床検査分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、試料中の被検物質の測定において、酵素反応を使用する測定方法、測定試薬が繁用されている。
酵素はその基質特異性により基質にのみ特異的に作用し、妨害物質の影響を受けにくいため、酵素反応を使用することにより目的の被検物質だけを正確に測定することができる。
また、酵素反応は室温下等温和な条件下で反応が進むので、設備が整っていない施設においても簡便に測定を行うことができる。
【０００３】
この酵素反応を使用する試料中の被検物質の測定方法は主に次の２つに分けることができる。
▲１▼被検物質が酵素の場合には、その被検物質自身の酵素反応を使用して、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、測定を行う。
▲２▼被検物質が酵素以外の物質の場合には、被検物質を基質とする酵素の酵素反応を使用して、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、測定を行う。
なお、前記▲１▼及び▲２▼のいずれの場合においても、酵素反応により生成した生成物（補酵素を含む）を基質とする別の酵素（共役酵素）による酵素反応を連続させて、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、測定を行うことも広く行われている。
【０００４】
前記▲１▼の被検物質が酵素の場合について、アルカリ性ホスファターゼを例に挙げて以下説明を行う。
肝疾患のマーカーとなるヒト血清（血漿）試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性値の測定は、次のようにして行う。
アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨ域であるｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５で、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として、試料中のアルカリ性ホスファターゼと混合し、これによりｐ−ニトロフェノールとリン酸を生成させる。
ｐ−ニトロフェノールは４０５ｎｍ付近に吸収極大を持つので、この吸光度の増加速度を測定することによりアルカリホスファターゼ活性値を測定する。
【０００５】
【化１】
0004022588.tif 000002
【０００６】
前記▲２▼の被検物質が酵素以外の物質の場合について、ピルビン酸を例に挙げて以下説明を行う。
糖尿病等のマーカーとなるヒト血清（血漿）試料中のピルビン酸濃度の測定は、次のようにして行う。
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の至適ｐＨ域であるｐＨ６〜ｐＨ８で、試料中のピルビン酸とＬＤＨ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド〔還元型〕（ＮＡＤＨ）を混合し、乳酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド〔酸化型〕（ＮＡＤ+ ）を生成させる。
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少を測定することによりピルビン酸濃度を測定する。
【０００７】
【化２】
0004022588.tif 000003
【０００８】
酵素反応を使用する試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬では、測定に使用する成分を２つ又は３つ以上に分けて、第１試薬及び第２試薬、又は第３試薬以上の試薬として、測定に用いることが多用されてきている。
このように測定に使用する成分を分けた複数の試薬を用い、多段階のステップによって試料中の被検物質の測定を行うことにより、測定に使用する成分を安定化することができ、また試料中に含まれる妨害物質の影響を受けにくくなるので好ましい。
測定を第１試薬及び第２試薬の２試薬を用いて行う２ステップ法では、酵素反応に適した環境を整える成分及びｐＨを有する第１試薬と試料を混合し、その後、被検物質が酵素の場合にはその基質を、被検物質が酵素以外の物質の場合には被検物質を基質とする酵素を含む第２試薬を混合することにより、酵素反応を進めさせて、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、試料中の被検物質の測定を行っていた。
被検物質が酵素の場合に、試料に基質を含む試薬を混合して酵素反応を開始させて測定を行う方法を、「基質スタート法」と呼んでいた。
【０００９】
酵素反応を使用する試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬において、測定に使用する基質、酵素、又は補酵素等の成分は不安定なものが多く、保存時に失活又は分解してしまい、長期間の保存が難しいため、凍結乾燥品の形態での供給が一般的であった。
しかし、近年、測定者の作業性を向上させるために、液状形態での測定試薬の供給が求められ、測定に使用する成分の更なる安定化、及び長期間安定な測定試薬が求められてきた。
【００１０】
ところで、前記のように従来は第２試薬又は第３試薬以上の試薬に、基質、酵素又は補酵素等の測定に使用する成分を含有させることが多かったが、この第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域のｐＨに設定されており、基質、酵素又は補酵素等の測定に使用する成分が安定なｐＨに設定されているわけではなかった。
このため、測定試薬の保存中に測定に使用する成分が失活又は分解してしまい、正確な測定が行えなくなったり、またはこれを防ぐため、測定に使用する成分の失活又は分解量を見込んで、予め多量に測定試薬に含有させたりしていた。
【００１１】
例えば、アルカリ性ホスファターゼ活性の測定において、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨ域はｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５であることから、測定試薬のｐＨはｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５にある必要があり、２ステップ法における第２試薬のｐＨはｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５設定にされていた。
しかし、第２試薬中に含有させられた基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）は中性付近で安定なため、第２試薬中においては徐々に分解してしまっていた。
【００１２】
また、各種疾病診断で重要な指標とされる、ＬＤＨ、ピルビン酸、コリンエステラーゼ、尿素窒素等を測定する測定試薬には、一般的に補酵素であるＮＡＤＨ又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸〔還元型〕（ＮＡＤＰＨ）が含まれている。
これらの測定試薬においては、これらのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを液体状態で長期間安定化する必要がある。
一般的に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、アルカリ性域で安定性がよい。
しかしながら、やはり測定試薬のｐＨは酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域のｐＨ、又は他の成分の保存安定ｐＨ域のｐＨに設定されており、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの保存に適したアルカリ性域に設定されているわけではなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の酵素反応を使用する測定方法及び測定試薬では、測定に使用する成分である基質、酵素、又は補酵素等は、第２試薬又は第３試薬以上の試薬に含有させられていた。しかし、この第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域のｐＨに設定されており、基質、酵素又は補酵素等の測定に使用する成分が安定なｐＨに設定されてはいなかった。
このため、測定試薬の保存中に測定に使用する成分が失活又は分解してしまい、正確な測定が行えなくなったり、またはこれを防ぐため、測定に使用する成分を失活又は分解量を見込んで、予め多量に測定試薬に含有させたりしていた。
【００１４】
本発明者らは、この従来の酵素反応を使用する測定方法及び測定試薬が有する問題点の解消を目指して鋭意検討を行った結果、測定に使用する成分である基質、又は酵素を、酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域から外れるようなｐＨを有する第１試薬に含有させることにより、測定に使用する成分である基質、又は酵素をその安定なｐＨ域にて保存、使用することができ、酵素反応及び被検物質の測定値に影響を及ぼすことなく、測定に使用する成分を長期間安定に保つことができる測定方法及び測定試薬を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被検物質が酵素の場合にはその酵素反応を使用して、また被検物質が酵素以外の物質の場合は被検物質を基質とする酵素の酵素反応を使用して、試料中の被検物質を測定する測定方法であって、
（ａ）前記酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域から外れるようなｐＨを有し、かつ被検物質が酵素の場合にはその基質を、又は被検物質が酵素以外の物質の場合には被検物質を基質とする酵素若しくはこの酵素の酵素反応を始めとする連続する酵素反応の生成物を基質とする酵素を含有する第１試薬と試料を混合して混合液を調製し、
（ｂ）段階（ａ）の混合液と混合することによりその反応混合液のｐＨが前記酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有する第２試薬又は第３試薬以上の試薬を、段階（ａ）の混合液に混合して、前記酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有する反応混合液を調製し、及び
（ｃ）段階（ｂ）の反応混合液の調製により前記酵素反応を進めさせる
段階を含むことを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法である。
【００１６】
また、本発明の測定方法においては、前記第１試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を下回る場合は、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを超えるものであり、前記第１試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を超える場合は、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを下回るものであることが好適である。
【００１７】
そして、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域にあることが好適である。
【００１８】
更に、本発明は、前記段階（ｂ）の反応混合液の調製により前記酵素反応を開始させることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の測定方法においては、前記第１試薬がｐ−ニトロフェニルリン酸を含有し、かつｐＨが８．５未満であり、前記第２試薬のｐＨが９．５以上であり、前記試料中の被検物質がアルカリ性ホスファターゼであることが好適である。
【００２０】
なお、本明細書におけるｐＨの値は、特に言及していない限り２０℃における値である。
【００２１】
本発明はまた、被検物質が酵素の場合にはその酵素反応を使用し、また被検物質が酵素以外の物質の場合は被検物質を基質とする酵素の酵素反応を使用する、試料中の被検物質の測定試薬であって、
（１）前記酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域から外れるようなｐＨを有し、かつ被検物質が酵素の場合にはその基質を、又は被検物質が酵素以外の物質の場合には被検物質を基質とする酵素若しくはこの酵素の酵素反応を始めとする連続する酵素反応の生成物を基質とする酵素を含有する第１試薬、及び
（２）第１試薬と試料の混合液と混合することによりその反応混合液のｐＨが前記酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有する第２試薬又は第３試薬以上の試薬
を含むことを特徴とする、試料中の被検物質の測定試薬である。
【００２２】
また、本発明の測定試薬においては、前記第１試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を下回る場合は、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを超えるものであり、前記第１試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を超える場合は、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを下回るものであることが好適である。
【００２３】
そして、前記第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨが酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域にあることが好適である。
【００２４】
更に、本発明の測定試薬においては、第１試薬がｐ−ニトロフェニルリン酸を含有し、かつｐＨが８．５未満であり、第２試薬のｐＨが９．５以上であり、試料中の被検物質がアルカリ性ホスファターゼであることが好適である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
１．本発明の測定方法及び測定試薬
本発明の試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬は、▲１▼被検物質が酵素の場合には、その被検物質自身の酵素反応を使用して、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、測定を行うものであり、▲２▼被検物質が酵素以外の物質の場合には、被検物質を基質とする酵素の酵素反応を使用して、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質の生成に導き、測定を行うものである。
【００２６】
２．第１試薬
第１試薬は、測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域から外れるようなｐＨを有し、かつ被検物質が酵素の場合にはその基質を、又は被検物質が酵素以外の物質の場合には被検物質を基質とする酵素若しくはこの酵素の酵素反応を始めとする連続する酵素反応の生成物を基質とする酵素を含有するものである。
【００２７】
なお、被検物質が酵素以外の物質の場合の被検物質を基質とする酵素の酵素反応を始めとする連続する酵素反応とは、被検物質を基質とする酵素の酵素反応により生成した生成物（補酵素を含む）を基質とする別の酵素（共役酵素）による酵素反応、更にこの別の酵素の酵素反応により生成した生成物（補酵素を含む）を基質とする次の別の酵素（共役酵素）による酵素反応、というように酵素反応による生成物（補酵素を含む）が次の酵素反応の基質となるような酵素反応の連続をいう。
【００２８】
また、測定に使用する酵素反応に補酵素が関与し、その補酵素の安定ｐＨ域が測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域と異なる場合には、その補酵素を第１試薬に含有させることが好ましい。
【００２９】
測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域は『丸尾、田宮監修，「酵素ハンドブック」，１９８２年，朝倉書店発行』等の文献により公知となっている。
【００３０】
よって、測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を適宜調べたうえで、この至適ｐＨ域から外れるようなｐＨであって、含有させる基質、酵素、又は酵素反応の補酵素等の測定に使用する成分が安定であるようなｐＨを第１試薬のｐＨに選択すればよい。
【００３１】
補酵素等の測定に使用する成分が安定であるようなｐＨ域についても、『日本生化学会編，「生化学実験講座５  酵素研究法（下）」，６８１〜６９０頁，１９７５年，東京化学同人発行』等の文献に記載されている。
【００３２】
なお、酵素の至適ｐＨ域を表１及び表２に、基質が安定なｐＨ域を表３に、そして補酵素が安定なｐＨ域を表４に示した。
【００３３】
【表１】
0004022588.tif 000004
【００３４】
【表２】
0004022588.tif 000005
【００３５】
【表３】
0004022588.tif 000006
【００３６】
【表４】
0004022588.tif 000007
【００３７】
被検物質が酵素の場合にはその基質を第１試薬に含有させるが、その基質、そして共役酵素、補酵素の例を表５に示した。
【００３８】
【表５】
0004022588.tif 000008
【００３９】
また、被検物質が酵素以外の物質の場合には被検物質を基質とする酵素を、場合によっては更に酵素反応の補酵素を第１試薬に含有させるが、その酵素又は補酵素の例を表６に示した。
【００４０】
【表６】
0004022588.tif 000009
【００４１】
なお、これらの基質、酵素、又は補酵素を第１試薬に含有させる濃度は、測定に使用する酵素反応に応じて適宜選択して用いればよい。
【００４２】
また、第１試薬には、緩衝剤、発色剤（色原体）、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を適宜必要に応じて含有させることができる。
【００４３】
但し、第１試薬の緩衝能は強くないことが好ましく、緩衝剤を含有させないか、緩衝能の弱い緩衝剤を含有させるか、又は含有させる緩衝剤の濃度を低濃度とすることが好ましい。
【００４４】
２．第２試薬又は第３試薬以上の試薬
本発明において、測定に使用する成分は２以上に分ければよく、その分ける上限は特にない。つまり、本発明では、測定に使用する成分を分けた第１試薬及び第２試薬、そして場合によっては更に第３試薬以上の試薬を用いて測定を行う。
【００４５】
この第２試薬又は第３試薬以上の試薬は、これを第１試薬と試料の混合液と混合することによりその反応混合液のｐＨが測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有するものである。
【００４６】
例えば、第１試薬のｐＨが測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を下回る場合は、第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを超えるものであればよい。
また、第１試薬のｐＨが測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域を超える場合は、第２試薬又は第３試薬以上の試薬のｐＨは前記酵素の至適ｐＨ域にあるか又はこれを下回るものであればよい。
【００４７】
なお、酵素の至適ｐＨ域については、前記第１試薬の項で述べたとおりである。
第２試薬又は第３試薬以上の試薬の緩衝能は強いことが好ましく、緩衝能の強い緩衝剤を含有させるか、又は含有させる緩衝剤の濃度を高濃度とすることが好ましい。
【００４８】
４．試料
本発明において試料とは、被検物質が存在する可能性があり、かつその被検物質の存在の有無の確認又は定量を行おうとするものをいう。
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト又は動物の肝臓、胃、脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液等が挙げられる。
【００４９】
５．被検物質
本発明において測定を行う被検物質としては、酵素又は酵素の基質となる物質であればいずれのものでもよい。つまり、酵素反応に関与する物質であればよい。
【００５０】
具体的には、酵素としては、リパーゼ、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＬＤＨアイソザイム、α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤＨ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＡＬＰアイソザイム、酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、α−アミラーゼ、α−アミラーゼアイソザイム、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ、γ−ＧＴ）、γ−ＧＴＰアイソザイム、クレアチンキナーゼ（ＣＫ、ＣＰＫ）、ＣＫアイソザイム、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、ＧＯＴ）、ＡＳＴアイソザイム、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、ＧＰＴ）、ＡＬＴアイソザイム、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、コリンエステラーゼ（Ｃｈ−Ｅ）、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、グアナーゼ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リゾチーム、アルドラーゼ、Ｌ−ＣＡＴ、ドーパミン−β−水酸化酵素、トランスケトラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼＡ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、アリルスルファターゼＡ、ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼｂキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、カルニチンパルミチル転換酵素、中性マルターゼ、酸性マルターゼ、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、及び第ＸＩＩＩ因子等を例示することができる。
【００５１】
また、酵素以外の物質としては、総コレステロール、遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、レムナント様リポタンパク−コレステロール、β−リポタンパク質、トリグリセライド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ、ＦＦＡ）、グルコース、乳酸、ピルビン酸、ガラクトース、２・３−ＤＰＧ、シアル酸、クエン酸、フルクトサミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グリコーゲン、フコース、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビン、アンモニア、尿素窒素（ＢＵＮ、ＵＮ）、クレアチニン、クレアチン、尿酸（ＵＡ）、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン、マグネシウム、胆汁酸、ケトン体、アセト酢酸、３−ヒドロキシ酪酸、δ−アミノレブリン酸、総カルニチン、遊離カルニチン、分岐鎖アミノ酸、チロシン、総ハイドロキシプロリン、遊離ハイドロキシプロリン、ポリアミン、エンドトキシン、Ｄ−アラビニトール、β−Ｄ−グルカン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンチプラスミン（α2 プラスミンインヒビター）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、Ｃ１インアクチベーター活性（Ｃ１エステラーゼインヒビター活性）、ヘパリン、プロテインＣ、プロテインＳ、高分子キニノーゲン、プレカリクレイン、及びループスアンチコアグラント等を例示することができる。
【００５２】
６．測定
本発明による試料中の被検物質の測定は、以下のようにして行うことができる。
（ａ）  まず、第１試薬と試料を混合して混合液を調製する。
混合する第１試薬及び試料の量は、測定系のボリューム、試料中に含まれる被検物質の濃度、又は発色物質若しくは紫外部吸収物質などの信号物質の感度等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、試料は０．５〜５０μＬ、第１試薬は２０〜６００μＬの範囲で使用すればよい。
【００５３】
この混合液の調製後、直ちに次の段階に移ってもよいし、又はこのままインキュベートしてもよい。
インキュベートする場合の時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内である。
また、インキュベートする場合の温度は、混合液が凍結する温度より上であればよく、かつ酵素反応に関与する酵素が変性、失活する温度未満であればよい。通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましい。なお、酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でもよい。
【００５４】
（ｂ）  次に、段階（ａ）で調製した第１試薬と試料の混合液に、第２試薬又は第３試薬以上の試薬を混合して、測定に使用する酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有する反応混合液を調製する。
【００５５】
混合する第２試薬又は第３試薬以上の試薬の量は、測定系のボリューム、試料中に含まれる被検物質の濃度、又は発色物質若しくは紫外部吸収物質などの信号物質の感度等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、第２試薬又は第３試薬以上の試薬は１０〜４００μＬの範囲で使用すればよい。
【００５６】
（ｃ）  段階（ｂ）における酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域に入るようなｐＨを有する反応混合液の調製により、測定に使用する酵素反応が反応混合液において進む。
【００５７】
そして、この酵素反応、又はこの酵素反応により生成した生成物（補酵素を含む）を基質とする別の酵素（共役酵素）による酵素反応の連続により、発色物質又は紫外部吸収物質等の信号物質を生成させ、この信号物質の吸光度、又は蛍光強度等を測定する。
この測定した信号物質の吸光度、又は蛍光強度等より、試料中の被検物質の活性、又は濃度を算出する。
【００５８】
この反応混合液の酵素反応を進めさせる時間は、１〜２０分間が好ましく、３〜１０分間が特に好ましい。
【００５９】
また、酵素反応を進めさせる時の温度は、混合液が凍結する温度より上であればよく、かつ酵素反応に関与する酵素が変性、失活する温度未満であればよい。通常は、２〜７０℃であるが、、２０〜３７℃が好ましい。なお、酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でもよい。
【００６０】
信号物質の測定は、酵素反応中に吸光度、若しくは蛍光強度等の増減、つまり酵素反応の速度を測定する反応速度法（レート法）により行ってもよいし、又は酵素反応を停止させた後に吸光度、若しくは蛍光強度等の増減を測定する終点法（エンドポイント法）により行ってもよい。
【００６１】
また、測定した信号物質の吸光度、又は蛍光強度等より、試料中の被検物質の活性、又は濃度を算出する方法は、信号物質のモル吸光係数を基に算出する方法、又は活性若しくは濃度が分かっている標準物質の吸光度、又は蛍光強度等と比較して算出する方法のいずれの方法でもよい。
【００６２】
なお、本発明における、（ａ）混合液の調製の段階、（ｂ）反応混合液の調製の段階、（ｃ）酵素反応を進めさせる段階、信号物質の測定の段階、試料中の被検物質の活性、又は濃度の算出の段階は、測定者自身が行ってもよいし、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
【００６３】
本発明においては、段階（ａ）の混合液の調製により連続する酵素反応の一部を行わせておき、その後段階（ｂ）の反応混合液の調製により残りの酵素反応を進めさせてもよい。
また、段階（ｂ）の反応混合液の調製により、始めて酵素反応を開始させてもよい。
【００６４】
７．測定試薬の例
▲１▼  アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬
ｉ）第１試薬
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、第１試薬を調製した。なお、この第１試薬のｐＨは、ｐＨ８．０（２０℃）であった。
0004022588.tif 000010
【００６５】
ｉｉ）第２試薬
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、６Ｎ塩酸でｐＨを１０．３（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000011
【００６６】
試料と第１試薬、及び第２試薬を混合して調製した反応混合液のｐＨは、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨ域（ｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５）に入るｐＨ１０．０（２０℃）となる。
基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸の安定ｐＨ域は、ｐＨ５〜ｐＨ９であるので、ｐ−ニトロフェニルリン酸をｐＨが８．０である第１試薬に含有させることにより、長期間安定に保存させることが出来るようになる。
【００６７】
▲２▼  ピルビン酸測定試薬
ｉ）第１試薬
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．５（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
0004022588.tif 000012
【００６８】
ｉｉ）第２試薬
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000013
【００６９】
試料と第１試薬、及び第２試薬を混合して調製した反応混合液のｐＨは、ＬＤＨのピルビン酸から乳酸への反応の至適ｐＨ域（ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５）に入るｐＨ８．０（２０℃）となる。
補酵素であるＮＡＤＨの安定ｐＨ域は、ｐＨ８．５〜ｐＨ１１であるので、ＮＡＤＨをｐＨが９．５である第１試薬に含有させることにより、長期間安定に保存させることが出来るようになる。
【００７０】
【実施例】
本発明の測定方法及び測定試薬は、酵素の至適ｐＨに注目した新しい測定方法及び測定試薬であり、不安定な基質、酵素、又は補酵素を長期間にわたって安定化することが可能となるものである。
特に、本発明を好適に適用することができる測定方法及び測定試薬の具体例を以下に記載するが、本発明はこれらの記載によってなんら限定されるものではない。
【００７１】
〔実施例１〕
（アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の安定性の検討）
本発明による日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を調製し、その安定性を検討した。
なお、アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法の日本臨床化学会勧告法は、反応混合液の緩衝剤及びその濃度を１．０Ｍ２−エチルアミノエタノール、ｐＨをｐＨ９．９０（３０℃）と規定しているものである。
【００７２】
（１）試薬の調製
▲１▼本発明第１試薬の調製
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、本発明の第１試薬を調製した。なお、この本発明第１試薬のｐＨは、ｐＨ８．０（２０℃）であった。
0004022588.tif 000014
【００７３】
▲２▼本発明第２試薬の調製
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、６Ｎ塩酸でｐＨを１０．３（２０℃）に調整して、本発明の第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000015
【００７４】
▲３▼対照第１試薬の調製
対照として、下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、従来の日本臨床化学会勧告法準拠試薬の第１試薬である対照第１試薬を調製した。
0004022588.tif 000016
【００７５】
▲４▼対照第２試薬の調製
対照として、下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、従来の日本臨床化学会勧告法準拠試薬の第２試薬である対照第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000017
【００７６】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した本発明第１試薬、本発明第２試薬、対照第１試薬及び対照第２試薬を、外形が７９ｍｍ（奥行き、Ｌ）×８８ｍｍ（高さ、Ｈ）×１０〜２４．５ｍｍ（幅、Ｗ）であり上面に１２．５ｍｍ径の口を有する容量が８０ｍＬの長方形のポリエチレン製の容器（日立７１５０形自動分析装置専用容器）の中にそれぞれ６０ｍＬずつ注入し、蓋を閉めた後、これらを温度が２〜８℃に保たれた冷温庫内にて保存した。
【００７７】
（３）保存した試薬の安定性の測定
保存開始時及び保存１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後、並びに１２カ月後に、上記（２）で冷温保存した本発明第１試薬及び本発明第２試薬について、また対照としての対照第１試薬及び対照第２試薬について、４０５ｎｍにおける試薬自身の吸光度を測定することにより、ｐ−ニトロフェニルリン酸の分解物であるｐ−ニトロフェノールの生成率を求めて、試薬の安定性を確認した。
【００７８】
試薬自身の吸光度の測定は、本発明第１試薬２ｍＬと本発明第２試薬０．５ｍＬを混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、日立製作所社製３２００形分光光度計で４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、４０５ｎｍに吸収極大を持つｐ−ニトロフェノールの生成率を求めた。
【００７９】
また、同様にして、対照第１試薬と対照第２試薬を混合して、試薬自身の吸光度の測定を行い、ｐ−ニトロフェノールの生成率を求めた。
【００８０】
（４）測定結果
本発明試薬及び対照試薬のｐ−ニトロフェノールの生成率を表７に示した。
なお、この表における数値は、保存開始時の試薬の４０５ｎｍにおける吸光度を１００％とした時の各吸光度の相対値を表す。
【００８１】
【表７】
0004022588.tif 000018
【００８２】
この表より、本発明第１試薬及び本発明第２試薬よりなる本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、対照第１試薬及び対照第２試薬よりなる従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬に比べて、ｐ−ニトロフェニルリン酸の分解が著しく抑制されていることが分かる。
【００８３】
このことより、本発明によるアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は、長期間試薬を保存しても測定に使用する成分の失活、分解を防止することができ、長期間正確な測定値を示すことができて効力の低下を起こさない、安定な測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。
【００８４】
〔実施例２〕
（従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬との相関）
本発明による日本臨床化学会勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬、及び従来の日本臨床化学会勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を調製し、ヒト血清試料によりその相関を検討した。
【００８５】
（１）試薬の調製
前記実施例１の（１）と同様にして、本発明第１試薬、本発明第２試薬、対照第１試薬及び対照第２試薬を調製した。
【００８６】
（２）相関の測定
本発明試薬及び対照試薬にて、６２検体のヒト血清試料のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。
【００８７】
ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５μＬに第１試薬として本発明第１試薬を３００μＬ混合し混合液を調製して、３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として本発明第２試薬７５μＬを混合して反応混合液を調製し、３７℃で反応を行わせ、第２試薬混合１分３８秒目（３３ポイント）から５分目（５０ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリ性ホスファターゼ活性値の算出を行った。
【００８８】
また、同様にして、対照第１試薬を第１試薬とし、そして対照第２試薬を第２試薬として、ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定を行った。
【００８９】
なお、純水を試料とした時の吸光度の増加速度を試薬盲検値として、測定値より試薬盲検値を差し引いてアルカリ性ホスファターゼ活性値を算出した。
【００９０】
（３）測定結果
本発明試薬及び対照試薬を用いてヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した時の相関の測定結果を図１に示した。この図において、横軸は従来の測定試薬（対照試薬）による測定値を表し、縦軸は本発明の測定試薬による測定値を表す。
【００９１】
【図１】
【００９２】
この図より、本発明試薬（ｙ）と従来試薬（ｘ）との回帰式がｙ＝１．００６ｘ−０．３であり、相関係数がｒ＝１．０００であって、良好な相関を示していることが分かる。
このことより、本発明によるアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は、従来のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定法と測定値が同一であり、正確なアルカリ性ホスファターゼ活性を示すことが確かめられた。
【００９３】
〔実施例３〕
（ピルビン酸測定試薬の安定性の検討）
本発明によるピルビン酸測定試薬を調製し、その安定性を検討した。
【００９４】
（１）試薬の調製
▲１▼本発明第１試薬の調製
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを９．５（２０℃）に調整して、本発明の第１試薬を調製した。
0004022588.tif 000019
【００９５】
▲２▼本発明第２試薬の調製
下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを８．０（２０℃）に調整して、本発明の第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000020
【００９６】
▲３▼対照第１試薬の調製
対照として、下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを８．０（２０℃）に調整して、対照第１試薬を調製した。
0004022588.tif 000021
【００９７】
▲４▼対照第２試薬の調製
対照として、下記の測定使用成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを８．０（２０℃）に調整して、対照第２試薬を調製した。
0004022588.tif 000022
【００９８】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した本発明第１試薬、本発明第２試薬、対照第１試薬及び対照第２試薬を、外形が７９ｍｍ（奥行き、Ｌ）×８８ｍｍ（高さ、Ｈ）×１０〜２４．５ｍｍ（幅、Ｗ）であり上面に１２．５ｍｍ径の口を有する容量が８０ｍＬの長方形のポリエチレン製の容器（日立７１５０形自動分析装置専用容器）の中にそれぞれ６０ｍＬずつ注入し、蓋をした後、これらをま温度が２５℃に保たれた保温庫内にて保存した。
【００９９】
（３）保存した試薬の安定性の測定
保存開始時及び保存７日後、１３日後、２３日後、４３日後、６２日後、並びに１０２日後に、上記（２）で２５℃にて保存した本発明第１試薬及び本発明第２試薬について、また対照としての対照第１試薬及び対照第２試薬について、３４０ｎｍにおける試薬自身の吸光度を測定することにより、ＮＡＤＨの残存率を求めて、試薬の安定性を確認した。
【０１００】
試薬自身の吸光度の測定は、本発明第１試薬２ｍＬと本発明第２試薬０．５ｍＬを混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、日立製作所社製３２００形分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度を測定して、３４０ｎｍに吸収極大を持つＮＡＤＨの残存率を求めた。
【０１０１】
また、同様にして、対照第１試薬と対照第２試薬を混合して、試薬自身の吸光度の測定を行い、ＮＡＤＨの残存率を求めた。
【０１０２】
（４）測定結果
本発明試薬及び対照試薬のＮＡＤＨの残存率を表８に示した。
なお、この表における数値は、保存開始時の試薬の３４０ｎｍにおける吸光度を１００％とした時の各吸光度の相対値を表す。
【０１０３】
【表８】
0004022588.tif 000023
【０１０４】
この表より、本発明第１試薬及び本発明第２試薬よりなる本発明のピルビン酸測定試薬は、対照第１試薬及び対照第２試薬よりなる従来のピルビン酸測定試薬に比べて、ＮＡＤＨの分解が著しく抑制されていることが分かる。
【０１０５】
このことより、本発明によるピルビン酸の測定は、長期間試薬を保存しても測定に使用する成分の失活、分解を防止することができ、長期間正確な測定値を示すことができて効力の低下を起こさない、安定な測定方法及び測定試薬であることが確かめられた。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明の試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬は、測定に使用する成分である基質、酵素、又は補酵素等を、酵素反応に関与する酵素の至適ｐＨ域から外れるようなｐＨを有する第１試薬に含有させることにより、測定に使用する成分である基質、酵素、又は補酵素等をその安定なｐＨ域にて保存、使用することができ、酵素反応及び被検物質の測定値に影響を及ぼすことなく、測定に使用する成分を長期間安定に保つことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】日本臨床化学会勧告法に準拠した本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬と従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の相関を示したグラフである。
【図１】
0004022588.tif 000024