(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：4のアミノ酸配列を含む、セリン、トレオニン、およびチロシンキナーゼ活性を有し、ヒトマイトジェン活性化プロテイン（MAP）キナーゼp38をリン酸化する、実質的に純粋なヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ6（MKK6）のポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドであって、セリン、トレオニン、およびチロシンキナーゼ活性を有し、ヒトマイトジェン活性化プロテイン（MAP）キナーゼp38をリン酸化する、実質的に純粋なヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ6（MKK6）のポリペプチド。
（ａ）配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド配列
（ｂ）厳密なハイブリダイゼーション条件下において配列番号：3の塩基配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列
【請求項３】
請求項1又は2記載のポリペプチドをコードする、単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：3の配列を含む、単離および精製された請求項3記載のポリヌクレオチド、または配列番号：3の配列に対して完全に相補的なポリヌクレオチド。
【請求項５】
厳密なハイブリダイゼーション条件下において配列番号：3の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む、単離および精製された請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項3から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項3から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項８】
生物学的被験試料におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MKK）の活性を測定する方法であって、
a)該被験試料を、請求項1又は2記載のMKKポリペプチドのMKKの基質および標識されたリン酸と共に、該基質がリン酸化されるために十分な条件下でインキュベートする段階、および
b)MKK活性の指標となる、該基質への標識されたリン酸の取り込み速度を決定する段階を含む方法。
【請求項９】
MKKの基質が、p38およびJNK MAPキナーゼ、活性化転写因子-2（ATF2）、ATFa、cAMP応答因子結合蛋白質（CRE-BPa）、ならびにc-Junからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生物学的被験試料が、哺乳動物から採取された体液、細胞、または組織である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
被験試料におけるMKKの発現のレベルを測定するための方法であって、
a)被験試料からポリアデニル化されたRNAを単離する段階、
b)ポリアデニル化されたRNAを、請求項３記載のポリヌクレオチドに特異的なポリヌクレオチドプローブと共にインキュベートする段階、
c)MKKの発現のレベルが、該RNAとハイブリダイズしたMKKプローブの量と直接的に関係するような、該ポリアデニル化RNAとハイブリダイズした該プローブの量を決定する段階を含む方法。
【請求項１２】
MKKの検出に有用なキットであって、緩衝液と、請求項３記載のポリヌクレオチドに結合する試薬とを含み、検査される試料が該緩衝液および該試薬と混合され、該試薬が標識される、キット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、プロテインキナーゼに関する。
マイトジェン活性化プロテイン（MAP）キナーゼは、細胞表面から核へのシグナル伝達に重要なメディエーターである。酵母では、SMK1、HOG1、NPK1、FUS3、およびKSS1を含む、数多くのMAPキナーゼが報告されている。哺乳動物で同定されているMAPキナーゼには、細胞外シグナル制御MAPキナーゼ（ERK）、c-Junアミノ末端キナーゼ（JNK）、およびp38キナーゼがある（Davis（1994）Trends Biochem. Sci. 19:470）。これらのMAPキナーゼのアイソフォームは、トレオニンおよびチロシン残基の2カ所がリン酸化されることによって活性化される。
転写因子-2（ATF2）、ATFa、およびcAMP応答配列結合蛋白質（CRE-BPa）は、これに関連した転写因子であり、多くの遺伝子のプロモーターに位置する同様の配列と結合する（Ziff（1990）Trends in Genet. 6:69）。これらの転写因子の結合は転写活性の上昇をもたらす。ATF2は、腫瘍性蛋白質E1a（LiuおよびGreen（1994）Nature 368:520）、B型肝炎ウイルスX蛋白質（Maquireら（1991）Science 252:842）、および1型ヒトT細胞白血病ウイルスtax蛋白質（WagnerおよびGreen（1993）Science 262:395）を含む、いくつかのウイルス蛋白質と結合する。また、ATF2は、腫瘍抑制遺伝子産物Rb（Kimら（1992）Nature 358:331）、高速移動群蛋白質HMG（I）Y（Duら（1993）Cell 74:887）、ならびに転写因子である核内NF-κB（Duら（1993）Cell 74:887）およびc-Jun（BenbrookおよびJones（1990）Oncog ene 5:295）とも相互作用する。
発明の概要
本発明者らは、ヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MKK）の新たな群を同定し、単離した。本明細書に記載したMKKのアイソフォームであるMKK3、MKK6、およびMKK4（MKK4-α、-β、および-γを含む）は、セリン、トレオニンおよびチロシンキナーゼ活性を有し、ヒトMAPキナーゼp38をThr180およびTyr182の部位で特異的にリン酸化する。また、MKK4アイソフォームも、ヒトMAPキナーゼJNK（JNK1およびJNK2を含む）をThr183およびTyr185でリン酸化する。
したがって、本発明は、ヒトp381MAPキナーゼを特異的にリン酸化するセリン、トレオニンおよびチロシンキナーゼ活性を有する、実質的に純粋なヒトMKKポリペプチドを特徴とする。MKK3は、配列番号：2のアミノ酸配列を有する。さらに、本発明には、配列番号：4のアミノ酸配列を有し、ヒトp38MAPキナーゼを特異的にリン酸化するセリン、トレオニンおよびチロシンキナーゼ活性を有するMKK6も含まれる。
本発明はさらに、ヒトp38MAPキナーゼおよびJNKを特異的にリン酸化するセリン、トレオニンおよびチロシンキナーゼ活性を有する、実質的に純粋なヒトMKKポリペプチドを特徴とする。MKK4のアイソフォームであるMKK4-αは、配列番号：6のアミノ酸配列を有する。MKK4のアイソフォームであるMKK4-βは、配列番号：8のアミノ酸配列を有する。MKK4のアイソフォームであるMKK4-γは、配列番号：10のアミノ酸配列を有する。
本明細書で用いる「マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ」または「MKK」とは、ヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼをリン酸化し、活性化する特徴的な活性を有するプロテインキナーゼを意味する。MKKの例には、p38MAPキナーゼをThr180およびTyr182の部位で特異的にリン酸化し、活性化するMKK3およびMKK6、ならびにp38MAPキナーゼをThr180およびTyr182の部位で、またJNKをThr183およびTyr185の部位で特異的にリン酸化し、活性化するMKK4アイソフォームが含まれる。
本発明には、開示の対象である特異的p38MKKのほかに、本発明のMKKについて開示されたポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対して調製されたプローブまたは抗体を用いて同定および単離される、それと密接に関連したMKKが含まれる。これは、例えば開示したMKKの核酸配列の全体または一部を有するプローブを用いて、ゲノム、cDNA、または組合せ(combinatorial)化合物のライブラリーをスクリーニングすることなどの標準的技法を使用することによって実施可能である。本発明はさらに、本明細書に記載したMKKのアミノ酸配列の全体または一部を有する合成ポリヌクレオチドを含む。
「ポリペプチド」とは、その長さまたは転写後修飾の有無（例えば、グリコシル化またはリン酸化）とは無関係に、任意のアミノ酸の連鎖を意味し、天然の蛋白質のほかにも合成または組換えによるポリペプチドおよびペプチドを含む。
ポリペプチドに関して用いる「実質的に純粋な」という用語は、天然の状態で付随する蛋白質および天然有機分子を除いた部分が、重量にして少なくとも60％であるポリペプチドを意味する。実質的に純粋なヒトMKKポリペプチドは、重量にして少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％が、ヒトMKKポリペプチドである。実質的に純粋なヒトMKKは、例えば、天然の供給源からの抽出、ヒトMKKポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または蛋白質の化学合成によって得ることができる。純度の測定は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などの任意の適切な方法を用いて行うことができる。
1つの面において、本発明は、本発明のMKKをコードする、単離および精製されたポリペプチドを特徴とする。1つの態様において、このポリペプチドは配列番号：1のヌクレオチド配列である。その他の態様において、このポリペプチドは、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、または配列番号：9のいずれかのヌクレオチドである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」とは、より大きな構築物の分離した断片または構成要素の形態をとる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。本発明のポリペプチドの一部または全体をコードするDNAは、組換え転写単位において発現させることができる合成遺伝子を提供する、複数のcDNA断片またはオリゴヌクレオチドから構築されたものでもよい。本発明のポリペプチド配列には、DNA、RNAおよびcDNAの配列が含まれ、その由来は、天然の供給源または当業者に周知の方法によって合成された合成配列のいずれであってもよい。
本明細書で用いる「単離された」ポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノムにおいて直接隣接する（すなわち、5'端に位置するもの、および3'端に位置するもの）コード配列のいずれの側とも直接には隣接（すなわち共有結合）していないポリヌクレオチドのことである。したがって、この用語には、例えば、ベクター、自律複製性のプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えポリヌクレオチド、またはその他の配列とは独立した分離分子として存在する組換えポリヌクレオチドが含まれる。また、これには、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部として存在する組換えDNAも含まれる。
また、本発明の単離および精製されたポリヌクレオチド配列には、厳密な条件下において、本明細書で特定するポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列も含まれる。「厳密な条件」とは、本明細書に記載したようなハイブリダイズされるポリヌクレオチド同士の間に特異性が確実に得られるハイブリダイゼーション条件、またはそれよりも厳密な条件を意味する。当業者は、非特異的ハイブリッド体の数を減らし、高度に相補的な配列のみが同定されるように、温度および塩濃度を含むハイブリダイゼーション後の洗浄条件を選択することができる（Sambrookら（1989）分子クローニング（Molecular Cloning）、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
また、本発明の単離および精製されたポリヌクレオチド配列には、MKKをコードするポリヌクレオチドに対して相補的な配列（アンチセンス配列）も含まれる。アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に対して相補的なDNAまたはRNA分子である（Weintraub（1990）Scientific American 262:40）。本発明には、MKKポリペプチドの産生を抑制する能力を有するすべてのアンチセンス・ポリヌクレオチドが含まれる。アンチセンス核酸は、細胞内において対応するmRNAとハイブリダイズして2本鎖分子を形成する。合成および標的となるMKK産生細胞への導入が容易であることから、アンチセンス・オリゴマーは約15ヌクレオチドを含むものが好ましい。遺伝子の翻訳を抑制するためにアンチセンス法を用いることは、当業者には周知であり、例えば、「マーカス-サクラ（Marcus-Sakura）Anal. Biochem., 172:289（1989）」に記載されている。
さらに、本発明には、MKKに対するリボザイムヌクレオチド配列も含まれる。リボザイムは、DNA制限酵素と類似した様式で、他の1本鎖RNAを特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列に改変を加えることによって、この分子をRNA分子中に存在する特異的な配列を認識し、切断するように操作することができる（Cech（1988）J. Amer. Med. Assn. 260:3030）。この手法の主要な利点は、それらが配列特異的であるため、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。
リボザイムには2つの基本的な型、すなわち、テトラヒメナ型（Hasselhorf（1988）Nature 334:585）および「ハンマーヘッド」型がある。テトラヒメナ型リボザイムは4塩基長の配列を認識するが、一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは11〜18塩基長の塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、標的となるmRNA種にその配列が独占的に生じる可能性は高くなる。その結果、特定のmRNA種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、18塩基の認識配列の方がそれより短い認識配列よりも好ましい。
また、MKKポリペプチドを、免疫反応性であるか、またはMKKポリペプチドのエピトープと結合する抗体を産生するために用いることもできる。したがって、本発明の1つの面は、本発明のMKKポリペプチドに対する抗体を特徴とする。本発明の抗体には、明確なモノクローナル抗体の調製物のほかに、異なるエピトープ特異性を有する貯蔵モノクローナル抗体によって構成されるポリクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、MKKポリペプチドの抗原を含む断片から、当業者に周知の方法によって作製される（例えば、Kohlerら（1975）Nature 256:495を参照）。
本明細書で用いる「抗体」という用語は、完全分子のほか、Fa、F（ab'）2、およびFvなどのエピトープ決定基との結合能を有するその断片も含む。MKKポリペプチドと結合する抗体は、完全なポリペプチド、または対象となる短いペプチドを免疫化用抗原として含む断片を用いて調製することができる。動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはペプチドは、cDNAを翻訳したもの、または化学合成したもののいずれに由来してもよく、必要に応じて、担体蛋白質と結合させたものでもよい。ペプチドと化学的に結合させるために一般的に用いられる担体には、牛血清アルブミンおよびチログロブリンが含まれる。続いて、結合したペプチドを用いて動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫化する。
本発明はまた、MKKシグナル伝達経路の活性化を測定することによって、MKKを介した障害の危険性を有する対象を同定する方法も特徴とする。MKKシグナル伝達経路の活性化は、MKKの合成、MKKアイソフォームの活性化、MKKの基質であるp38またはJNKアイソフォームの活性化、またはATF2、ATFa、CRE-BPa、およびc-Junなどのp38もしくはJNKの基質の活性化を測定することによって判定することができる。「JNK」または「JNKアイソフォーム」という用語は、JNK1およびJNK2の両方を含む。本明細書で用いる「MKKの基質」という用語は、MKKの基質のほかに、p38、JNK、ATF2、およびc-JunなどのMKKの基質の基質も含む。
1つの態様において、MKKシグナル伝達経路の活性化は、MKKシグナル伝達経路の基質であるp38、JNKアイソフォーム、ATF2、またはc-Junなどの活性化を測定することによって判定される。MKKの活性は、[32]Pの取り込み速度を定量的に測定することによって判定される基質のリン酸化の速度によって測定することができる。MKKの基質のリン酸化の特異性は、p38およびJNKの活性化の測定、またはMKKリン酸化部位を欠失した変異型のp38およびJNK分子を用いることによって検討することができる。対照値と比べて基質のリン酸化に変化がある場合は、MKKシグナル伝達経路に変化があること、およびその対象がMKKを介した障害を有する危険性が高いことを示す。MKKによるP38およびJNKの活性化は、MKKシグナル伝達系の基質であるATF2、またはATFaおよびCRE-BPaなどの関連化合物を用いた共役解析を行って検出することができる。また、この活性化は、基質であるc-Junを用いて検出することもできる。この解析にATF2が含まれる場合には、それは完全な蛋白質、または例えば活性化ドメイン（第1〜109残基、またはその一部）などの、完全な蛋白質の断片として存在する。ATF2のリン酸化が十分に起こる条件下において、ATF2を、MKK活性の測定対象である被験試料、および[γ-32P]ATPとともにインキュベートする。続いて、ATF2を単離し、リン酸化量を定量的に測定する。特殊な態様において、ATF2は免疫沈降法によって単離され、SDS-PAGEによって分離されて、オートラジオグラフィによって検出される。
もう1つの態様において、MKKシグナル伝達経路の活性化は、被験試料におけるMKKの発現レベルを測定することによって判定される。特殊な態様においては、MKKの発現レベルをウェスタンブロット分析によって測定する。試料中に存在する蛋白質をゲル電気泳動によって分画化し、膜に移行させた後、MKKに対する標識化抗体を用いて検出する。もう1つの特殊な態様では、MKKの発現レベルをノーザンブロット分析によって測定する。ポリアデニル化された[ポリ（A）+]mRNAを被験試料から単離する。このmRNAを電気泳動によって分画化し、膜に移行させる。標識化したMKKのcDNAを用いて、この膜を検出する。もう1つの態様では、発現したmRNAに対して定量的PCR法を適用することによって、MKKの発現を測定する。
本発明のMKKは、MKKの活性を調節する試薬をスクリーニングするために有用である。MKKはリン酸化によって活性化される。したがって、1つの面において、本発明は、MKKを被験試薬とともにインキュベートし、MKKの合成、リン酸化、機能、または活性に対する被験試薬の効果を測定することによって、MKKの活性を調節する試薬を同定するための方法を特徴とする。1つの態様では、被験試薬を、MKKおよび[32]P-ATPとともにインキュベートし、上記の方法に従って、MKKのリン酸化の速度を測定する。もう1つの態様では、被験試薬を、MKKポリヌクレオチドの発現ベクターを用いて遺伝子導入した細胞とともにインキュベートし、上記の方法に従って、MKKの転写に対する被験試薬の効果をノーザンブロット分析によって測定する。さらに別の態様では、MKKの合成に対する被験試薬の効果を、MKKに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析によって測定する。さらにもう1つの態様では、MKKの活性に対する被験試薬の効果を、MKKと被験試薬、[32]P-ATP、ならびにp38、JNK、およびATF2のうち1つまたはそれ以上を含む、MKKシグナル伝達経路の基質とともにインキュベートすることによって測定する。基質のリン酸化の速度は上記の方法に従って測定する。
「MKK活性の調節」という用語は、抑制性または刺激性の効果のいずれをも含む。本発明は、MKK活性を抑制する試薬のスクリーニングに特に有用である。このような試薬は、例えば炎症および酸化性損傷などの、MKKを介した障害の治療または予防に有用である。
本発明はさらに、それを必要とする対象に対してMKKの活性を抑制する効果的な用量の治療的試薬を投与することによって、MKKを介した障害を治療する方法を特徴とする。
「MKKを介した障害」という用語は、少なくとも一部は、MKKシグナル伝達経路の過剰な活性化によって生じている病的状態を意味する。MKKシグナル伝達経路は、炎症およびストレスを含むいくつかの因子によって活性化される。MKKを介した障害には、例えば、虚血性心疾患、熱または放射線照射（UV、X線、γ線、β線など）に起因する熱傷、腎不全、酸化性ストレスまたはアルコールに起因する肝損傷、呼吸窮迫症候群、敗血性ショック、慢性関節リウマチ、自己免疫障害、およびその他の型の炎症性疾患が含まれる。
本明細書で用いる「治療的試薬」とは、それを必要とする対象に対して投与した場合にMKKを介した障害に対して望ましい効果を及ぼす、あらゆる化合物または分子を意味する。
さらに、MKKを介した障害には、増殖性障害、特にストレスに関連した障害が含まれる。ストレスに関連したMKKを介した増殖性障害の例には、乾癬、後天性免疫不全症候群、皮膚、骨、骨髄、肺、肝臓、乳房、胃腸系、および尿生殖路の悪性腫瘍を含む身体のさまざまな組織の悪性腫瘍がある。好ましくは、MKKの活性または発現を抑制する治療的試薬は、細胞増殖を抑制するか、またはアポトーシスを引き起こす。
「MKKの活性を抑制する」治療的試薬は、MKKを介したシグナル伝達経路に障害をもたらす。例えば、ある治療的試薬は、MKKのプロテインキナーゼ活性を変化させたり、例えばMKKのmRNAと結合できるアンチセンス・ポリヌクレオチドのようにMKKの転写もしくは翻訳レベルを低下させたり、またはMKKによるp38、JNKもしくはATF2のリン酸化を抑制することができ、それによってMKKを介したシグナル伝達経路を分断する。このような試薬の例には、MKKポリペプチドと特異的に結合する抗体、およびMKKポリペプチドの活性を競合的に阻害するMKKポリペプチドの断片が含まれる。
「MKK活性を高める」治療的試薬とは、MKKを介したシグナル伝達経路を補強するものである。このような試薬の例には、MKKポリペプチドの発現不足によってMKKを介した障害が引き起こされた場合に投与することができるMKKポリペプチドそれ自体が含まれる。さらに、MKKポリペプチドをコードするDNAの一部を、MKKポリペプチドの発現が不足している細胞に導入することもできる。
「治療的有効量」とは、MKKを介した障害に伴う症状の低減または予防のために十分な試薬の量のことである。
本発明の方法によって同定される、MKKを介した障害を治療するための治療的試薬は、注射、点滴、持続注射または徐放性インプラント、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または経皮的投与などの非経口的な方法を含む、当業者に周知の多くの方法によって対象に投与される。表皮性障害および上皮組織の障害は、試薬の局所適用によって治療される。試薬の安定性および輸送効率を改善するためには、試薬を他の化合物と混合する（例えば、リポソーム、防腐剤、またはジメチルスルホキシド（DMSO））。アンチセンス配列を含むポリヌクレオチド配列は、MKKを介した障害に冒された対象の細胞内への導入をもたらす、当技術分野において周知の技法によって治療的に投与することができる。このような方法には、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルス）、コロイド分散系、およびリポソームの使用が含まれる。
本発明の材料は、MKKのレベルまたは活性を検出するためのキットを作製するためには理想的に適している。したがって、本発明は、MKKと結合する抗体またはMKKポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸プローブ、および適切な緩衝液とを含むキットを特徴とする。プローブまたはモノクローナル抗体は、MKKのポリヌクレオチドまたは蛋白質との結合を検出するために標識化することができる。好ましい態様において、このキットはMKKに対する標識抗体を特徴とする。
別途定義しない限り、本明細書で用いる技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検討のために、本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。なお、この材料、方法、および実施例は例示のためのものであり、限定するためのものではない。
本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明および請求の範囲から明らかになると思われる。
詳細な説明
まず図面について説明する。
図面
図1は、MKK3（配列番号：2）、MKK4-α（配列番号：6）、ヒトMAPキナーゼキナーゼであるMEK1（配列番号：11）およびMEK2（配列番号：12）、ならびに酵母HOG1 MAPキナーゼキナーゼPBS2（配列番号：13）のアミノ酸配列を比較したものである。MKK3およびMKK4の配列は、PILE-UPプログラム（バージョン7.2；Wisconsin Genetics Computer Group）を用いて比較した。蛋白質の配列は、1文字コードによって表示した（A、Ala；C、Cys；D、Asp；E、Glu；F、Phe；G、Gly；H、His；I、Ile；K、Lys；L、Leu；M、Met；N、Asn；P、Pro；Q、Gln；R、Arg；S、Ser；T、Thr；V、Val；W、Trp；およびY、Tyr）。PBS2の配列は、NH2-端（＜）およびCOOH-端（＞）の双方で切断されている。一連の配列を至適化するために配列に導入した間隙はダッシュ記号で図示した。同一の残基はピリオド記号で示した。MEKにおけるリン酸化を活性化する部位は星印で示した。
図2は、ヒトおよび酵母のMAPキナーゼキナーゼ同士の関係を示す樹状図である。この樹状図は、算術平均を用いる非荷重ペア・グループ法（unweighed pair-group method）によって作成した（PILE-UPプログラム）。ヒト（hu）MAPキナーゼキナーゼであるMEK1、MEK2、MKK3、およびMKK4、パン酵母（Saccharomyces cere visiae；sc）のMAPキナーゼキナーゼであるPBS2、MKK1、およびSTE7、ならびに分裂酵母（Saccharomyces pombe；sp）のMAPキナーゼキナーゼであるWIS1およびBYR1を提示した。
図3は、ERK、p38、およびJNKのシグナル伝達経路を図示したものである。MEK1およびMEK2は、ERKサブグループに属するMAPキナーゼの活性化因子である。MKK3およびMKK4は、p38MAPキナーゼの活性化因子である。MKK4は、MAPキナーゼのp38およびJNKサブグループの双方に対する活性化因子であることが判明している。
図4は、MKK3の核酸配列（配列番号：1）およびアミノ酸配列（配列番号：2）を示したものである。
図5は、MKK6の核酸配列（配列番号：3）およびアミノ酸配列（配列番号：4）を示したものである。
図6は、MKK4αの核酸配列（配列番号：5）およびアミノ酸配列（配列番号：6）を示したものである。
図7は、MKK4βの核酸配列（配列番号：7）およびアミノ酸配列（配列番号：8）を示したものである。
図8は、MKK4γの核酸配列（配列番号：9）およびアミノ酸配列（配列番号：10）を示したものである。
ヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ
本明細書に記載したヒトMAPキナーゼキナーゼMKK3およびMKK4（MKK3／4）、ならびにMKK6は、特定の経路に沿った、細胞表面から核への特定のシグナルの伝達を媒介する。これらのシグナル伝達経路は、サイトカイン、紫外線照射、浸透圧性ショック、および酸化性ストレスなどの因子によって開始される。MKK3／4の活性化は、MAPキナーゼp38（MKK3／4の場合）およびJNK（MKK4の場合）の活性化をもたらす。これに続いて、p38およびJNKは、ATF2、ATFa、およびCre-BPaなどの関連した一群の転写因子を活性化する。続いて、これらの転写因子は、特定の遺伝子の発現を活性化する。例えば、ATF2はヒトT細胞白血病ウイルス1型（WagnerおよびGreen（1993）Science 262:395）、トランスフォーミング成長因子-b2（Kimら（1992）前記）、インターフェロン-β（Duら（1993）Cell 74:887）、およびE-セレクチン（DeLucaら（1994）J. Biol. Chem. 269:19193）の発現を活性化することが知られている。さらに、ATF2は、T細胞特異的エンハンサーの機能にも関係している（Georgopoulosら（1992）Mol. Cell. Biol. 12:747）。
ヒトMKKの単離は、実施例1、およびデリジャール（Derijard）ら（1995）Science 267:682〜685に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用のプライマーの設計には、酵母PBS2の配列中の特有な領域を使用した。これらのプライマーを用いてヒト脳mRNAを増幅したところ、特定の産物が産生され、続いてそれをプラスミドベクター中にクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ヒトプロテインキナーゼをコードする2種類の異なる相補的なDNA（cDNA）が同定された。その1つは36kDの蛋白質（MKK3）をコードしており、もう1つは44kDの蛋白質（MKK4）をコードしていた。MKK4は、NH2-端がわずかに異なる3種のアイソフォームを含んでおり、それぞれα、β、γと同定された。MKK3（配列番号：2）、MKK4-α（配列番号：6）、MKK4-β（配列番号：8）、およびMKK4-γ（配列番号：10）のアミノ酸配列を図1に示した。また、MKK3（図5）、MKK6（図6）、MKK4α（図7）、MKK4β（図8）、およびMKK4γ（図9）の核酸配列およびアミノ酸配列も提示した。MKK6は、MKK3との交差ハイブリダイゼーションによってヒト骨格筋ライブラリーから単離した。N端に差異があることを除いて、MKK6はMKK3と相同である。ヒトMKK3およびMKK4に関して存在するその他のアイソフォームは、実施例1において説明した方法によって同定することができる。
これらのヒトMKKアイソフォームの発現を、8種のヒト成人組織から単離したmRNAのノーザン（RNA）ブロット分析によって検討した（実施例2）。いずれのプロテインキナーゼとも、ヒト組織では広範に発現しており、骨格筋組織で最も発現の程度が高いことが明らかになった。
MKK3の基質特異性は、組換えエピトープを付加したMAPキナーゼ（JNK1、p38、およびERK2）を基質として用いるインビトロリン酸化アッセイにおいて調べた（実施例3）。MKK3およびMKK6は、p38をリン酸化したが、JNK1およびERK2をリン酸化しなかった。ｐ38のホスホアミノ酸分析（phosphoaminoacid analysis）によって、ホスホトレオニンおよびホスホチロシンが存在することが示された。p38の変異分析により、リン酸化部位であるThr180およびTyr182をそれぞれAlaおよびPheに置換することによって、p38のリン酸化が阻害されることが示された。これらの結果から、MKK3がインビトロでp38 MAPキナーゼキナーゼとして働くことが立証された。MKK6の基質特異性はMKK3のそれと同様であったが、MKK6の比活性はMKK3のそれのほぼ300倍であった。
MKK4のインビトロでの基質特異性を検討した結果を実施例4に記載した。MKK4を[γ-32P]ATP、およびJNK1、p38またはERK2とともにインキュベートすることにより、p38およびJNK1はいずれもリン酸化されることが明らかになっている。MKK4によるJNKおよびp38の活性化は、MKK4を野生型または変異型のJNK1またはp38とともにインキュベートすることによっても検討されている。いずれの解析でも、p38の基質にはATF2が含まれている。MKK4は、MKK3よりも自己リン酸化を生じにくいことが明らかになっている。また、MKK4は、活性化されたMAPキナーゼの基質でもあることが判明している。MKK3およびMKK6とは異なり、MKK4はJNK1を活性化することもわかっている。MKK4を野生型のJNK1とともにインキュベートするとATF2のリン酸化の度合いが増すが、変異型のJNK1ではこれは生じない。これらの結果から、MKK4が、JNKサブグループに属するMAPキナーゼをもリン酸化するp38MAPキナーゼキナーゼであることが実証される。
実施例5には、紫外線による刺激を受けたMKK3によるインビボでのp38の活性化について記載した。MKK3を発現している細胞を、紫外線の存在下または非存在下に曝露した。MKK3を免疫沈降法によって単離し、基質p38またはJNKを用いてプロテインキナーゼ解析を行った。解析の一部では、p38またはJNKの基質としてATF2も含めた。活性化されていない培養COS細胞から得たMKK3によるp38 MAPキナーゼのリン酸化の程度はわずかであり、これはMKK3の基礎的活性によるものであった。紫外線照射を受けた細胞から得たMKK3は、p38 MAPキナーゼのリン酸化の増加をもたらしたが、JNK1のリン酸化についてはこれはみられなかった。p38活性の上昇は、ATF2を基質として含めた解析でも検出された。これらの結果は、MKK3が紫外線照射によって活性化されることを実証するものである。
p38の活性に対するMKK3およびMKK4の発現の影響を、COS-1細胞で検討した（実施例6）。p38およびMEK1、MKK3またはMKK4をコードするベクターを用いて細胞に遺伝子導入を行った。細胞の一部は、EGFまたは紫外線照射のいずれか一方にも曝露させた。p38を免疫沈降法によって単離し、[γ-32P]ATPおよびATF2を用いて活性を解析した。ERK活性化因子であるMEK1の発現により、p38によるATF2のリン酸化は変化しなかった。これに対して、MKK3またはMKK4の発現によって、p38 MAPキナーゼの活性は上昇した。MKK3およびMKK4によるp38の活性化は、紫外線照射を受けた細胞で認められたものと同様であり、EGFを投与された細胞で検出されたものよりもはるかに大きかった。これらのインビトロでの結果は、MKK3およびMKK4が、インビボでp38を活性化するとの証拠を提供するものである。
JNK1によってATF2が調節されている可能性を検討するために、一連の実験を実施した。これらの実験は、「グプタ（Gupta）ら（1995）Science 267:389〜393」に記載されている。ATF2のリン酸化に対する紫外線照射の影響を、エピトープを付加した、または付加していないJNK1による遺伝子導入を行ったCOS-1細胞で調べた（実施例7）。細胞に紫外線を照射し、基質としてATF2を用いるゲル中プロテインキナーゼ解析によって、JNK1およびJNK2を可視化した。JNK1およびJNK2は、紫外線照射を受けた遺伝子導入細胞および遺伝子導入を受けていない細胞のいずれにおいても検出されたが、JNK1のレベルは遺伝子導入細胞の方が高かった。これらの結果は、ATF2がJNK1およびJNK2プロテインキナーゼの基質であり、これらのプロテインキナーゼが紫外光を照射された細胞内で活性化されることを示している。
JNK1によるATF2のリン酸化部位を、欠失分析（deletion analysis）によって検討した（実施例8）。NH2-端ドメインに段階的な欠失を有するGST-ATF2融合蛋白質を作製し、紫外線照射を受けた細胞から単離したJNK1によるリン酸化について検討した。その結果、JNK1がATF2のNH2-端ドメインをリン酸化するためには、ATF2の第1〜60残基の存在が必要であることが示された。
JNK1との結合に必要なATF2の残基についても同様に検討した。JNK1を、固定したATF2とともにインキュベートし、十分に洗浄して非結合型のJNK1を除去した後に、[γ-32P]ATPとともにインキュベートすることによって結合型のJNK1を検出した。その結果、JNK1による結合およびリン酸化にはATF2の第20〜60残基が必要であることが示された。ATF2と55kDのJNK2プロテインキナーゼとの間にも、結合に関して同様の相互作用が認められた。
JNK1によるリン酸化を受けると、ATF2の電気泳動移動度が低下することが示された（実施例9）。全長ATF2分子（第1〜505残基）のホスホアミノ酸分析により、JNKがThrおよびSer残基の双方をリン酸化することが示された。ThrおよびSerのリン酸化が起こる主要な部位は、それぞれNH2端およびCOOH端のドメインに位置していた。ホスホペプチドマッピングおよび変異分析によって、NH2-端のリン酸化部位はThr69およびThr71であることが同定された。これらのThrのリン酸化部位は、JNKとの結合に必要なサブドメイン（第20〜60残基）とは異なるATF2の領域に位置していた。
ATF2がリン酸化を受けた際に認められた電気泳動移動度の低下について、さらに検討した（実施例10）。JNK1を発現しているCHO細胞において、紫外線照射、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン-1、または血清の投与によってJNK1を活性化させた。JNK1によって活性化されたATF2の電気泳動移動度の低下は、紫外線照射およびIL-1によって処置した細胞で認められた。細胞に血清を投与した後に認められた影響はそれよりも小さかった。これらの結果は、ATF2がJNK1のインビボでの基質であることを示している。
野生型（Thr69、71）およびリン酸化能を欠く（Ala69、71）ATF2分子の性質に対する紫外線照射の影響を調べた（実施例11）。紫外線の照射によって、内因性および過剰に発現した野生型のATF2はいずれも電気泳動移動度の低下を生じた。電気泳動移動度のこの変化は、ATF2のリン酸化の増加を伴っていた。電気泳動度の変化およびリン酸化の増加は、ATF2のThr69およびThr71をAlaに置換することによっていずれも阻害された。また、この変異によって、ATF2のThr残基のインビボでのリン酸化も阻害された。
GAL4のDNA結合ドメインと野生型または変異型のATF2を含む融合蛋白質の転写活性を検討した（実施例12）。ATF2のThr69および／またはThr71での点変異によって、ATF2の転写活性は野生型分子に比べて有意に低下したが、このことはこれらの部位におけるリン酸化が活性と生理的に関連することを示している。
JNK1がATF2のNH2-端活性化ドメイン（実施例8に記載）と結合したことは、触媒的に不活性なJNK1分子が、野生型JNK1分子の有力な抑制因子として働くことを示唆する。ATF2の機能に対する触媒的に不活性なJNK1分子の影響を調べることによって、この仮説を検討した（実施例13）。リン酸化活性化部位Thr183およびTyr185を、それぞれAlaおよびPhe（Ala183、Phe185、「ドミナントネガティブ」と呼ぶ）と置換することにより、触媒的に不活性なJNK1の変異体を構築した。野生型のJNK1の発現によって、血清による刺激を受けたATF2の転写活性はわずかに上昇した。これに対して、ドミナントネガティブのJNK1は、対照、および血清による刺激を受けたATF2の活性をいずれも抑制した。この抑制効果は、JNK1変異体とATF2の活性化ドメインとの結合が非生産的であり、ATF2のリン酸化を効果的に阻害することに起因する。
腫瘍抑制遺伝子Rbは、ATF2と結合して、ATF2誘発性の遺伝子発現を増強させる（Kimら（1992）Nature 358:331）。同様に、アデノウイルスの腫瘍性蛋白質E1Aは、ATF2のDNA結合ドメインと会合して、ATF2のNH2-端活性化ドメインを必要とする機構により、ATF2誘発性の遺伝子発現を増強させる（LiuおよびGreen（1994）Nature 368:520）。対照条件、Rb処置、およびE1A処置を施した、野生型または変異型のATF2分子を発現している細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子系を用いて、ATF2の転写活性を調べた（実施例14）。RbおよびE1Aは、野生型および変異型のATF2のいずれについても、ATF2によって誘発される遺伝子発現を増強させることが示された。しかし、変異型のATF2によって生じたレポーター遺伝子の発現のレベルは、野生型のATF2によるものよりも低かった。以上を総合すると、これらの結果は、最大の転写活性が得られるためには、（Thr69およびThr71での）ATF2のリン酸化に加えて、RbまたはE1Aのいずれかが必要であることを示している。したがって、RbおよびE1Aは、ATF2のリン酸化との共同作用によって転写活性を制御する。
p38の活性化による作用を検討し、p38 MAPキナーゼ経路のERKおよびJNKシグナル伝達経路との関係を立証するために、一連の実験を実施した（Raingeaudら（1995）J. Biol. Chem. 270:7420）。まず、ERKおよび／またはJNK群のMAPキナーゼの基質であることが示されている蛋白質とともにp38をインキュベートすることによって、p38の基質特異性を調べた（実施例15）。本発明者らは、MBP（Ericksonら（1990）J. Biol. Chem. 265:19728）、EGF-R（Northwoodら（1991）J. Biol. Chem. 266:15266）、細胞質ホスホリパーゼA2（cPLA2）（Linら（1993）Cell 72:269）、c-Myc（Alvarezら（1991）J. Biol. Chem. 266:15277）、IκB、c-Jun、および野生型（Thr69、71）もしくは変異型（Ala69、71）のATF2のリン酸化について検討した。p38はMBPおよびEGF-Rをリン酸化し、それよりも程度は低いがIκBもリン酸化したが、その他のERKの基質はリン酸化せず、このことから、p38の基質特異性がERKおよびJNK群のMAPキナーゼのいずれとも異なることが示された。野生型のATF2はp38の優れた基質であるが、変異型のATF2（Ala69、71）はそうではないことが明らかになった。
p38によるATF2のリン酸化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるATF2の電気泳動移動度の変化を伴っていた。本発明者らは、Thr69およびThr71をAlaと置換する（Ala69、71）ことによって、p38がリン酸化するATF2の部位がJNK1と同じであるとの仮説を検証した。その結果、p38は変異型のATF2をリン酸化しないことが明らかになり、このことから、p38はATF2のNH2-端活性化ドメイン内にあるThr69およびThr71をリン酸化することが示された。
JNK1またはp38を発現している細胞の抽出物を、エピトープ単独（GST）またはGST-ATF2（活性化ドメインを含む第1〜109残基）とともにインキュベートすることによって、JNKおよびp38のATF2との結合を比較した（実施例16）。ウェスタンブロット分析によって、結合したプロテインキナーゼを検出した。その結果、p38およびJNKは両方ともATF2の活性化ドメインと結合することが示された。
EGFおよびホルボールエステルは、ERKシグナル伝達経路の強力な活性化因子であり（EganおよびWeinberg（1993）Nature 365:781）、ERKサブグループに属するMAPキナーゼを最大限に活性化させる。しかし、これらの処置によってもたらされるJNKプロテインキナーゼ活性の上昇はごくわずかである（Derijardら（1994）前記；Hibiら（1993）前記）。p38の活性に対する、紫外線照射、浸透圧性ショック、インターロイキン-1、腫瘍壊死因子、およびLPSのほか、EGFまたはホルボールエステルの影響もすべて検討した（実施例17）。意義深いことに、EGFまたはホルボールエステルによるp38プロテインキナーゼ活性の上昇はごく軽度であったが、環境ストレス（紫外線照射および浸透圧性ショック）は、p38およびJNKのいずれの活性も著しく上昇させた。炎症誘発性サイトカイン（TNFおよびIL-1）または内毒素LPSを投与した細胞において、p38およびJNKはいずれも活性化された。以上を総合すると、これらの結果は、p38がJNKと同じく、ストレスによって誘発されるシグナル伝達経路によって活性化されることを示している。
ERKおよびJNKは、それぞれThr-Glu-TyrおよびThr-Pro-Tyrのモチーフ内の2カ所がリン酸化されることによって活性化される。これに対して、p38はこれと関連した配列であるThr-Gly-Tyrを含む。このモチーフがp38の活性化に関連するか否かを検証するため、Thr-Gly-TyrをAla-Gly-Pheに置換することによる影響を検討した（実施例18）。野生型（Thr180、Tyr182）または変異型（Ala180、Phe182）のp38を発現している細胞に対する紫外線照射の影響を調査した。抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロット分析により、紫外線照射によってp38のTyrのリン酸化が増加したことが示された。Tyrのリン酸化の増加は、[γ-32P]リン酸標識細胞から単離したp38のホスホアミノ酸分析によって裏づけられた。また、この分析からは、紫外線照射がp38のThrのリン酸化の増加を引き起こすことも示された。意義深いことに、Thr180およびTyr182でのリン酸化の増加は、Ala180／Phe182変異によって阻害された。この結果は、紫外線照射が2リン酸化（dual phosphorylation）によってp38の活性化の増強を引き起こしたことを示している。
最近、ERKの活性は、マイトジェンによって誘発される二重特異性ホスファターゼ（dual specificity phosphatase）MKP1およびPAC1によって調節されることが示されている（Wardら（1994）Nature 367:651）。2リン酸化によってp38が活性化されたこと（実施例18）からみて、p38も二重特異性ホスファターゼによって調節されている可能性が高い。本発明者らは、p38 MAPキナーゼの活性化に対するMKP1およびPAC1の影響を検討した（実施例19）。ヒトMKP1およびPAC1を発現している細胞に、紫外線照射または非照射のいずれかの処理を行ってp38の活性を測定した。その結果、PAC1またはMKP1の発現によってp38の活性が抑制されることが明らかになった。MKP1の抑制効果は、PAC1のそれよりも大きかった。これに対して、触媒的に不活性な変異型のホスファターゼ（変異型PAC1 Cys257／Ser）を遺伝子導入した細胞ではp38 MAPキナーゼの抑制は起こらなかった。これらの結果は、p38が二重特異性ホスファターゼPAC1およびMKP1によって調節されうることを示している。
p38 MAPキナーゼの細胞内分布を、間接蛍光顕微鏡によって検討した（実施例20）。M2モノクローナル抗体を用いて、エピトープを付加したp38 MAPキナーゼを検出した。エピトープ付加p38 MAPキナーゼを遺伝子導入した細胞では、細胞表面、細胞質、および核内に特異的染色が認められた。紫外線照射後は、細胞表面および核のp38 MAPキナーゼには顕著な変化は認められなかったが、細胞質のp38 MAPキナーゼについては核周囲領域への局在化の増加が検出された。
高浸透圧性培地によるJNKの活性化を調査するために、一連の実験を実施した（実施例21）。これらの実験は、「ガルシェバ・ガルゴバ（Galcheva-Gargova）ら（1994）Science 265:806」によって報告されている。エピトープを付加したJNK1を発現しているCHO細胞を、0〜1000mMのソルビトールとともにインキュベートし、c-Junを基質として用いる免疫複合体キナーゼ解析においてJNK1の活性を測定した。100mMのソルビトールとともに1時間インキュベートした細胞ではJNK1活性の上昇を認めた。300mMのソルビトールに5分以内曝露させた場合もJNK1活性の上昇が認められた。最大の活性は、浸透圧性ショックを与えて15〜30分後に認められ、その後のJNK1の活性は徐々に低下した。野生型（Thr183、Tyr185）または変異型（Ala183、Phe185）のJNK1を発現している細胞における、浸透圧性ショックによるJNKの活性化を調査した。300mMソルビトールの存在下または非存在下において15分間インキュベートした後にJNK1の活性を測定した。野生型のJNK1を発現している細胞はJNK1活性の上昇を示したが、変異型のJNK1を発現している細胞ではこれはみられなかった。これらの結果は、高浸透圧性培地に曝露された培養哺乳動物細胞においてJNKシグナル伝達経路が活性化されることを示している。
上記の実験の結果を図3に示したが、ここにはERK、p38、およびJNK MAPキナーゼに関するシグナル伝達経路も図示した。ERKは、細胞にEGFまたはホルボールエステルを投与することによって強く活性化される。これに対して、p38はこれらの条件下ではわずかに活性化されるのみである（実施例15）。しかし、紫外線照射、浸透圧性ストレス、および炎症性サイトカインは、p38の活性の著明な上昇を引き起こす。ERKおよびp38の活性化パターンにみられるこの差異は、これらのMAPキナーゼが異なるシグナル伝達経路によって調節されていることを示唆する。これらのシグナル伝達経路が別個の実体を有することの分子的基盤は、ERK（MEK1およびMEK2）およびp38（MKK3、MKK6、およびMKK4）を活性化するMAPキナーゼキナーゼが異なっていることが証明されたことによって立証される。
MKKのアイソフォームは、MKKの活性を調節する試薬のスクリーニングに有用である。実施例の後に続く「用途」の項には、MKKの活性を抑制または活性化する能力を有する試薬を同定するための方法を記載した。
ヒトMKKアイソフォーム、およびMKKを介したシグナル伝達経路の発見は、MKKを介した障害を治療するために臨床的に有意義である。MKKアイソフォームの用途の一つは、MKK-MAPキナーゼ-ATF2経路の活性化を抑制または防止する能力を有する試薬をスクリーニングするための方法における使用である。
以下の実施例は、説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
実施例1．MKKプロテインキナーゼ
ヒト胎児脳ライブラリーから単離したcDNAクローンの配列から、MKK3およびMKK4の一次配列を導出した。
PBS2の配列に基づいて、プライマーTTYTAYGGNGCNTTYTTYATHGA（配列番号：14）およびATBCTYTCNGGNGCCATKTA（配列番号：15）を設計した（Brewsterら（1993）Science 259:1760；Maedaら（1994）Nature 369:242）。これらのプライマーを、ヒト脳mRNAをテンプレートとして用いるPCR反応に用いた。PBS2に関連したプロテインキナーゼの断片をコードする2つの配列を同定した。ヒト胎児脳ライブラリーのスクリーニングによって、全長のヒトcDNAクローンを単離した（Derijardら（1994）前記）。アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）のモデル373Aマシンを用いたシークエンシングによって、このcDNAクローンを検討した。MKK3（2030塩基対（bp））およびMKK4（3576bp）に関して得た最長のクローンは、これらのプロテインキナーゼのコード領域の全体を含んでいた。
MKK3（配列番号：2）およびMKK4α（配列番号：6）の一次構造を図1に示した。インフレーム終止コドンは、MKK3のcDNAの5'非翻訳領域に位置するが、MKK4のcDNAの5'領域には存在しなかった。提示したMKK4蛋白質の配列は、第2のインフレーム開始コドンから始まっている。
これらの配列を、ヒトMAPキナーゼキナーゼMEK1（配列番号：11）およびMEK2（配列番号：12）（ZhengおよびGuan（1993）J. Biol. Chem. 268:11435）、ならびに酵母MAPキナーゼキナーゼPBS2（配列番号：13）（BoguslawaskiおよびPolazzi（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5848）のそれと比較した（図1）。これらのキナーゼのヒトMKK3（サブドメインIとXIとの間）との同一性および類似度を、BESTFITプログラム（バージョン7.2；Wisconsin Genetics Computer Group）を用いて算出した（同一性、次いで類似度）:MEK1 41％／63％、MEK2 41％／62％、MKK4α 52％／73％、およびPBS2 40％／59％であった）。これらのキナーゼのヒトMKK4αとの同一性および類似度を算出した結果は以下の通りであった（同一性、次いで類似度）:MEK1 44％／63％、MEK2 45％／61％、MKK3 52％／73％、およびPBS2 44％／58％。
MKK3およびMKK4γのcDNA配列は、それぞれ寄託番号L36719およびL36870としてジェンバンク（GenBank）に寄託した。MKK4γのcDNA配列は、インビボで交代性のスプライス部位から産生されるMKK4αおよびMKK4βのcDNA配列の両方を含む。当業者は、寄託されたcDNA配列から、MKK3およびMKK4アイソフォームのアミノ酸配列を直ちに決定することができる。
MKK3プローブを用いた厳密性の低い条件でのスクリーニングによって、骨格筋からヒトMKK6 cDNAクローンを単離した。pCDNA3（Invitrogen Inc.）のHindIIIおよびXbaI部位へのMKK6 cDNAのサブクローニングによって、哺乳動物のMKK6発現ベクターを構築した。すべてのプラスミドの配列を、アプライド・バイオシステムズ社のモデル373Aマシンを用いた自動シークエンシングによって確認した。
実施例2．ヒト成人組織におけるMKK3およびMKK4のmRNAの発現
ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓、および膵臓の組織から単離したポリアデニル化[poly(A)+]mRNA（2μg）を用いてノーザンブロット分析を実施した。変性アガロースゲル電気泳動によってmRNAを分画化し、ナイロン膜に移行させた。このブロットを[α-32P]ATP（デオキシアデノシン三リン酸）（Amersham International PLC）を用いるランダムプライミングによって標識したMKK3およびMKK4のcDNAを用いて検出した。検討したすべての組織においてMKK3およびMKK4は発現していたが、MKK3およびMKK4の最も強い発現が認められたのは骨格筋組織であった。
ヒトおよび酵母のMAPキナーゼキナーゼ群のメンバー間の関係を、樹状図として提示した（図2）。MKK3／4はヒトMAPキナーゼキナーゼの独立したサブグループを形成する。
実施例3．MKK3によるp38 MAPキナーゼのインビトロでのリン酸化
GST-JNK1、およびGST-ERK2はすでに記載されている（Derijardら（1994）前記；Guptaら（1995）Science 267:389；WartmannおよびDavis（1994）J. Biol. Chem. 269:6695）。発現ベクターpGSTag（Dressierら（1992）Biotechniques 13:866）、およびp38 MAPキナーゼのcDNAのコード領域を含むPCR断片から、GST-p38 MAPキナーゼを調製した。pGEX3X（Pharmacia-LKB Biotechnology）ならびにMKK3およびMKK4のcDNAのコード領域を含むPCR断片を用いて、GST-MKK3およびMKK4を調製した。これらのGST融合蛋白質を、GSH-アガロース（SmithおよびJohnson（1988）Gene 67:31）を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。発現ベクターpCMV-Flag-JNK1およびpCMV-MEK1はすでに記載されている（Derijardら（1994）前記；WartmannおよびDavis（1994）前記）。発現ベクターpCMV5（Anderssonら（1989）J. Biol. Chem. 264:8222）およびp38 MAPキナーゼcDNAを用いて、プラスミドpCMV-Flag-p38 MAPキナーゼを調製した。MKK3およびMKK4のための発現ベクターは、pCDNA3（Invitrogen）のポリリンカー内にcDNAをサブクローニングすることによって調製した。挿入オーバーラッピングPCR法（insertional overlapping PCR）（Hoら（1989）Gene 77:51）によって、各キナーゼの第1コドンと第2コドンとの間にFlagエピトープ（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（配列番号：16）；Immunex、Seattle、WA）を挿入した。
キナーゼ緩衝液（25mM 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸、pH7.4、25mMβグリセロリン酸、25mM MgCl2、2mMジチオスレイトール、および0.1mMオルソバナジン酸）中にてプロテインキナーゼ解析を実施した。組換えGST-MKK3を、[γ-32P]ATPおよび緩衝液、GST-JNK1、GST-p38 MAPキナーゼ、またはGST-ERK2とともにインキュベートした。解析は、基質蛋白質1μgおよび50μMの[γ-32P]ATP（10Ci／mmol）を、最終容量が25μlとなるように添加することによって開始した。25℃で30分経過した後に、レムリ試料緩衝液（Laemmli sample buffer）を添加して反応を停止させた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った後、オートラジオグラフィーによって基質蛋白質のリン酸化を検討した。部分的酸加水分解および薄層クロマトグラフィーによって、ホスホアミノ酸分析を実施した（Derijardら（1994）前記；Alvarezら（1991）J. Biol. Chem. 266:15277）。MKK3の自己リン酸化は、すべての群において認められた。MKK3は、p38 MAPキナーゼをリン酸化したが、JNK1およびERK2をいずれもリン酸化しなかった。
p38のThr180およびTyr182をそれぞれAlaおよびPheに置換するために、同様の挿入オーバーラッピングPCR手順を用いた。すべてのプラスミドの配列を、アプライド・バイオシステムズ社のモデル373Aマシンでの自動シークエンシングによって確認した。GST-MKK3を、[γ-32P]ATPおよび緩衝液のほか、野生型のGST-p38 MAPキナーゼ（TGY）または変異型のGST-p38 MAPキナーゼ（AGF）とともにインキュベートした。リン酸化された蛋白質をSDS-PAGEによって分離し、オートラジオグラフィーによって検出した。その結果、野生型のp38のリン酸化のみが認められた。
MKK6についても同様の検査を行ったところ、p38 MAPキナーゼをThr180およびTyr182の部位でリン酸化するが、JNK1およびERK2はリン酸化しないことが示された。MKK6の比活性は、MKK3のそれよりもほぼ300倍高かった。
実施例4．MKK4による、JNKおよびp38 MAPキナーゼのインビトロでのリン酸化および活性化
実施例3に記載した方法でプロテインキナーゼ解析を実施した。組換えGST-MKK4を、[γ-32P]ATPおよび緩衝液のほか、GST-JNK1、GST-p38 MAPキナーゼ、またはGST-ERK2とともにインキュベートした。MKK4をJNK1およびp38とともにインキュベートした際と同じく、JNK1およびp38はリン酸化されていた。
GST-MKK4を、[γ-32P]ATPおよび緩衝液のほか、野生型のJNK1（Thr183、Tyr185）、または変異型のGST-JNK1（Ala183、Phe185）とともにインキュベートした。それぞれのインキュベーションには、JNK1の基質であるATF2（Guptaら（1995）前記）も含めた。ATF2はMKK4および野生型JNK1の存在下ではリン酸化された。これらの結果は、MKK4がp38およびJNK1の双方をリン酸化および活性化することを立証するものである。
実施例5．紫外線によって刺激されたMKK3による、p38 MAPキナーゼのリン酸化および活性化
エピトープを付加したMKK3を、牛胎児血清（5％）を添加したダルベッコ（Dulbecco）改変イーグル（Eagle）培地（Gibco-BRL）中に維持されているCOS-1細胞で発現させた。リポフェクタミン（lipofectamine）試薬を用い、製造者（Gibco-BRL）の推奨に従ってこの細胞に遺伝子導入を施し、記載された内容（Derijardら（1994）前記）の通りに紫外線照射またはEGFによって処置した。
この細胞をUV-C（40J／m2）の存在下または非存在下に曝露させた。溶解緩衝液（20mM tris、pH7.4、1％Triton X-100、10％グリセロール、137mM NaCl、2mM EDTA、25mMβ-グリセロリン酸、1mMオルソバナジン酸ナトリウム、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、およびロイペプチン（10μg／ml））に細胞を溶解し、100,000×gの遠心処理を4℃で15分間行った。MKK3を免疫沈降法によって単離した。エピトープを付加したプロテインキナーゼを、プロテインG-セファロース（Pharmacia-LKB Biotechnology）に結合させたFlagエピトープ（IBI-Kodak）に対するM2抗体とともに4℃で1時間インキュベートした。免疫沈降物を溶解緩衝液によって2回、キナーゼ緩衝液によって2回洗浄した。
プロテインキナーゼ解析は、基質としてGST-p38 MAPキナーゼまたはJNK1を用いて実施した。解析の一部にはATF2を含めた。まず、MKK3によるp38 MAPキナーゼのリン酸化の基礎レベルを観察した。紫外線照射によってp38 MAPキナーゼのリン酸化は増加したが、JNK1のそれは増加しなかった。p38 MAPキナーゼの活性の上昇のためにATF2のリン酸化は増加した。
実施例6．MKK3およびMKK4を発現している細胞におけるp38 MAPキナーゼの活性化
エピトープを付加したp38 MAPキナーゼを、空の発現ベクター、またはMEK1、MKK3もしくはMKK4αをコードする発現ベクターとともにCOS-1細胞に遺伝子導入した。培養物の一部には、紫外線（40J／m2）の照射または10nM EGFの投与を行った。M2モノクローナル抗体を用いる免疫沈降法によってp38 MAPキナーゼを単離し、[γ-32P]ATPおよびATF2を基質として含む免疫複合体中にてプロテインキナーゼ活性を測定した。SDS-PAGEの後に、リン酸化反応の産物をオートラジオグラフィーによって可視化した。ATF2は、対照MEK1またはEGF投与群ではリン酸化されなかったが、MKK3、MKK4、および紫外線照射群ではリン酸化された。MKK3およびMKK4によるATF2のリン酸化は、紫外線を照射した細胞から単離したp38 MAPキナーゼで認められたものと同様であった。
実施例7．JNK1およびJNK2によるATF2のリン酸化
牛胎児血清（5％）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco-BRL）中でCOS-1細胞を維持した。この細胞を、[32P]オルソリン酸（2mCi／ml）（Dupont-NEN）を添加した無リン酸改変イーグル培地（Flow Laboratories Inc.）中にて3時間インキュベートすることにより、[32]Pによる代謝標識を実施した。エピトープを付加したJNK1の非存在下（Mock）または存在下（JNK1）において、COS-1細胞に遺伝子導入を施した。JNK1のcDNAをコードするプラスミド発現ベクターは以前に記載されている（Derijardら（1994）Cell 76:1025）。リポフェクタミン法（Gibco-BRL）によって、プラスミドDNAをCOS-1細胞に遺伝子導入した。48時間のインキュベーションの後、培養物の一部には40J／m2の紫外線を照射し、37℃で1時間インキュベートした。
細胞を、20mM Tris、pH7.5、25mMβ-グリセロリン酸、10％グリセロール、1％Triton X-100、0.5％（w／v）デオキシコール酸、0.1％（w／v）SDS、0.137M NaCl、2mMピロリン酸、1mMオルソバナジン酸、2mM EDTA、10μg／mlロイペプチン、1mM PMSF中に溶解させた。微量遠心管に入れ、4℃で20分間の遠心処理を行って可溶性抽出物を調製した。また、組換えJNK1を抗原として調製したウサギ抗血清と反応させることによって、JNK1の免疫沈降物も調製した。
SDS-PAGEの後に、プロテインキナーゼの再生、ゲル中での基質（GST-ATF2、第1〜505残基）の重合化、および[γ-32P]ATPとのインキュベーション（Derijardら（1994）前記）により、細胞溶解物およびJNK1の免疫沈降物を用いたゲル中プロテインキナーゼ解析を実施した。オートラジオグラフィーによって[32P]リン酸の取り込みを可視化し、ホスホイメージャー（Phosphorimager）およびイメージクアント（ImageQuant）ソフトウェア（Molecular Dynamics Inc.、Sunnyvale、CA）を用いて定量的に分析した。細胞溶解物には、紫外線を照射された細胞から調製した抽出物中のATF2をリン酸化する、46kDおよび55kDのプロテインキナーゼが存在することが示された。この46kDおよび55kDのプロテインキナーゼはそれぞれJNK1およびJNK2であることが同定された。
実施例8．JNK1のATF2との結合、およびNH2-端活性化ドメインのリン酸化
ATF2のNH2-端ドメインに段階的な欠失を作成することにより、JNK1によるATF2のリン酸化の部位を調べた。ATF2をコードするプラスミド発現ベクター（pECE-ATF2）（LiuおよびGreen（1994）ならびに（1990））は、すでに記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって得たATF2のcDNA断片をpGEX-3X（Phamacia-LKB Biotechnology Inc.）にサブクローニングすることにより、GST-ATF2融合蛋白質に関する細菌発現ベクターを構築した。構築したすべてのプラスミドの配列は、アプライド・バイオシステムズ社のモデル373Aマシンによる自動シークエンシングによって確認した。記載されている内容（SmithおよびJohnson（1988）Gene 67:31）に従ってGST-ATF2蛋白質を精製し、SDS-PAGEによって分離した後にクーマシーブルー染色を施した。GST-ATF2融合蛋白質は、第1〜505、1〜349、350〜505、1〜109、20〜109、40〜109、および60〜109の各残基を含んでいた。
紫外線を照射した細胞から単離したJNK1によるGST-ATF2融合蛋白質のリン酸化を、免疫複合体キナーゼ解析において検討した。免疫複合体キナーゼ解析は、「デリジャール（Derijard）ら（1994）前記」に記載されている方法で、Flagエピトープを付加したJNK1、およびモノクローナル抗体M2（IBI-Kodak）を用いて実施した。また、組換えJNK1を抗原として調製したウサギ抗血清を用いる免疫複合体プロテインキナーゼ解析も実施した。細胞を、20mM Tris、pH7.5、10％グリセロール、1％Triton X-100、0.137M NaCl、25mMβ-グリセロリン酸、2mM EDTA、1mMオルソバナジン酸、2mMピロリン酸、10μg／mlロイペプチン、および1mM PMSF中に溶解させた。JNKに対するウサギポリクローナル抗体またはFlagエピトープに対するM2モノクローナル抗体を結合させたプロテインG-セファロースによってJNK1を免疫沈降させた。このビーズを溶解緩衝液で3回、キナーゼ緩衝液（20mM HEPES、pH7.6、20mM MgCl2、25mMβグリセロリン酸、100μMオルソバナジン酸ナトリウム、2mMジチオスレイトール）で1回洗浄した。基質1μg、20μMアデノリン三リン酸、および10μCiの[γ-32P]ATPを含むキナーゼ緩衝液30μlにおいて、25℃、10分間のキナーゼ解析を実施した。レムリ試料緩衝液の添加によって反応を停止させ、SDS-PAGE（10％ゲル）によって産物を分離した。JNK1は、第1〜505、1〜349、1〜109、20〜109、および40〜109の各残基を含むGST-ATF2融合蛋白質をリン酸化したが、第60〜109を含むそれはリン酸化しなかった。これらの結果は、JNKによるリン酸化にはATF2の第1〜60残基の存在が必要であることを示している。
固定したGST-ATF2融合蛋白質の結合性を、「ヒビ（Hibi）ら（1993）Genes Dev. 7:2135」によって記載された、固相キナーゼ解析において検討した。紫外線照射を受けた細胞から得たJNK1を、GSH-アガロースに結合させたGST-ATF2とともにインキュベートした。結合していないJNK1を除去するために、このアガロースビーズを十分に洗浄した。結合型のJNK1プロテインキナーゼによるGST-ATF2融合蛋白質のリン酸化を、[γ-32P]ATPを添加することによって検討した。JNK1が結合したGST-ATF2融合蛋白質には、第1〜505、1〜349、1〜109、20〜109、および40〜109の各残基が含まれており、このことから、JNK1のATF2との結合には第20〜60残基の存在が必要であることが示された。
実施例9．JNK1による、ATF2のThr69およびThr71でのNH2-端活性化ドメインのリン酸化
野生型（Thr69、71）、およびリン酸化能を欠く（Ala69、71）ATF2分子の性質に対する紫外線照射の影響を検討した。Mock遺伝子導入およびJNK1の遺伝子導入を行ったCOS細胞を40J／m2の紫外線照射の非存在下または存在下において処置した。M2モノクローナル抗体による免疫沈降法によって、エピトープを付加したJNK1を単離した。上記の免疫複合体キナーゼ解析において、GST-ATF2（第1〜109残基）のリン酸化を検討した。SDS-PAGEによってGST-ATF2を他の蛋白質から分離し、クーマシーブルー染色を施した。オートラジオグラフィーによってGST-ATF2のリン酸化を検出した。その結果、JNK1を遺伝子導入した細胞はATF2をリン酸化したが、偽遺伝子導入細胞ではリン酸化は起こらなかった。JNK1によるATF2のリン酸化の程度は、紫外線照射を受けた細胞の方が大きかった。JNK1によるATF2のリン酸化は、電気泳動移動度の低下を伴っていた。
別の実験では、全長のATF2（第1〜505残基）、NH2-端断片（第1〜109残基）、およびCOOH-端断片（第95〜505残基）を含むGST融合蛋白質をJNK1でリン酸化し、ホスホアミノ酸分析によってリン酸化部位を分析した。ホスホペプチドマッピングおよびホスホアミノ酸分析のために用いた方法は記載されている（Alvarez（1991）J. Biol. Chem. 266:15277）。ペプチドマップの水平軸は電気泳動であり、垂直軸はクロマトグラフィーである。ホスホペプチドマッピングおよび変異分析によって、NH2端でのリン酸化の部位はThr69およびThr71であると同定された。上記の通りに、Thr69およびThr71をAlaに置換する位置指定変異誘発を実施した。変異型のATF2ではリン酸化は認められなかった。
実施例10．JNKによって活性化されたATF2の電気泳動移動度の低下
5％牛血清アルブミン（Gibco-BRL）を添加したハム（Ham）F12培地中で、CHO細胞を維持した。細胞の標識およびJNK1の遺伝子導入は上記の通りに行った。CHO細胞に対して、UV-C（40J／m2）、IL-1α（10ng／ml）（Genzyme）、または牛胎児血清（20％）（Gibco-BRL）による処置を行った。細胞を採取する前に、37℃で30分間インキュベートした。SDS-PAGEの後、蛋白質免疫ブロット分析によってATF2の電気泳動度を検討した。紫外線、IL-1、および血清による処置を受けた細胞では、ATF2の電気泳動度の変化が認められた。これらの結果は、JNK1の活性化にはATF2の電気泳動移動度の変化が伴うことを示しており、さらに、ATF2がJNK1のインビボでの基質であることを示唆する。
実施例11．JNKの活性化によるATF2のリン酸化の増加
上記の方法（Haiら（1989）前記）により、COS-1細胞に対して、ATF2発現ベクターの非存在下（対照）または存在下（ATF2）で遺伝子導入を施した。細胞に対する40J／m2のUV-Cの照射の影響を検討した。照射の後、細胞を37℃で0もしくは30分間（対照）、または0、15、30、および45分間（ATF2）インキュベートし、その後で採取した。上記の蛋白質免疫ブロット分析により、SDS-PAGE中のATF2の電気泳動度を検討した。ATF2を遺伝子導入した細胞では2種類の電気泳動度を示すATF2の形態が認められたが、対照細胞ではこれは認められなかった。
[32]Pによって標識し、40J／m2のUV-C処置の存在下および非存在下に置き、続いて37℃で30分間インキュベートした細胞において、野生型（Thr69、71）のATF2および変異型（Ala69、71）のATF2のリン酸化の状態を検討した（Haiら（1989）前記）。ATF2蛋白質を免疫沈降によって単離し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。上記のホスホアミノ酸分析によって、リン酸化されたATF2蛋白質を検討した。ATF2の2種類の形態はいずれもホスホセリンを含んでいたが、ホスホトレオニンを含んでいたのは野生型のATF2のみであった。
インビトロでJNK1によりリン酸化されたATF2と、COS-1細胞内でリン酸化されたATF2との比較には、トリプシン消化ホスホペプチドマッピングを用いた。インビボおよびインビトロでリン酸化されたATF2を等量含む資料（Mix）によるマップも調製した。ATF2のThr69およびThr71での変異によって、紫外線照射を受けた細胞から単離したATF2のマップにみられた2種類のトリプシン消化ホスホペプチドが消失した。これらのホスホペプチドは、Thr69およびThr71を含む一リン酸化ペプチドおよび二リン酸化ペプチドに対応する。これらのホスホペプチドはいずれも、インビトロでJNK1によってリン酸化されたATF2のマップでは認められた。
実施例12．リン酸化部位Thr69およびThr71の変異による、ATF2誘発性遺伝子発現の抑制
ATF2およびGAL4 DNA結合ドメインを含む融合蛋白質を、上記の方法で、CHO細胞中にて発現させた。レポータープラスミドpG5E1bLuc（Sethら（1992）J. Biol. Chem. 267:24796）を用いる同時遺伝子導入解析によって、GAL4-ATF2融合蛋白質の活性を測定した。このレポータープラスミドは、最小プロモーター要素およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に、5つのGAL4部位を含む。β-ガラクトシダーゼを発現する対照プラスミド（pCH110；Pharmacia-LKB Biotechnology）を用いてトランスフェクション効率を観測した。細胞抽出物に検出されるルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を測定し、3回の実験での平均活性比率を得た（Guptaら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3216）。表1に示したこの結果は、Thr69およびThr71でのリン酸化が転写活性にとって重要であることを示している。
0003948571.tif 000002
実施例13．ATF2の機能に対する、ドミナントネガティブJNK1変異体の影響
野生型（Thr183、Thr185）または変異型（Ala183、Phe185）のJNK1による遺伝子導入を施した、血清を投与したCHO細胞における、ATF2のリン酸化部位Thr69およびThr71での点変異の影響を明らかにするために、ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いた。偽遺伝子導入細胞を用いる対照実験も行った。CHO細胞を18時間、血清欠乏状態に置き、続いて、血清の存在下または非存在下で4時間インキュベートした。野生型のATF2を発現させた場合には、血清誘発性ATF2転写活性のわずかな増加が生じた。これに対して、変異型のJNK1は、対照および血清誘発性のATF2活性をいずれも抑制した。
実施例14．ATF2誘発性遺伝子発現に対する、腫瘍抑制遺伝子産物Rbおよびアデノウイルス腫瘍性蛋白質E1Aの影響
上記のルシフェラーゼレポータープラスミドGAL4-ATF2（第1〜505残基）を用いて、ATF2の転写活性に対する、Rb腫瘍抑制遺伝子産物およびアデノウイルス腫瘍性蛋白質E1Aの発現の影響を調べた。細胞に対して、野生型（Thr69、71）または変異型（Ala69、71）のATF2による遺伝子導入を施した。GAL4-ATF2の非存在下では、ルシフェラーゼ活性に対するRbおよびE1Aの影響は全く検出されなかった。野生型および変異型のATF2はいずれもATF2誘発性の遺伝子発現を増強させることが示された。しかし、変異型のATF2によって生じたレポーター遺伝子の発現は野生型のATF2の場合よりも低いレベルであった。これらの結果は、最大の転写活性が得られるためには、ATF2の（Thr69およびThr71での）リン酸化に加えて、RbまたはE1Aのいずれかが必要であることを示している。
実施例15．p38 MAPキナーゼの基質特異性
細菌性に発現するp38 MAPキナーゼを、IκB、cMyc、EGF-R、細胞質ホスホリパーゼA2（cPLA2）、c-Jun、ならびに変異型ATF2（Thr69、71）およびATP[γ-32P]とともにインキュベートすることによって、p38 MAPキナーゼによる基質のリン酸化を検討した（Raingeaudら（1995）J. Biol. Chem. 270:7420）。GST-IκBは、バルチモア博士（Dr. D. Baltimore）（Massachusetts Institute of Technology）によって提供された。GST-cMyc（Alvarezら（1991）J. Biol. Chem. 266:15277）、GST-EGF-R（第647〜688残基）（Kolandら（1990）Biochem. Biophys. Res. Commun. 166:90）、およびGST-c-Jun（Derijardら（1994）前記）は記載されている。30分後にレムリ試料緩衝液を添加してリン酸化反応を停止させた。リン酸化された蛋白質をSDS-PAGEによって分離し、オートラジオグラフィーによって検出した。ホスホイメージャー（Molecular Dynamics Inc.）を用いた分析によって、基質蛋白質のリン酸化の速度を定量的に分析した。ATF2、MBP、EGF-RおよびIκBの相対的リン酸化は、それぞれ1.0、0.23、0.04、0.001であった。
実施例16．p38 MAPキナーゼのATF2との結合
エピトープを付加したJNK1およびp38 MAPキナーゼを発現している細胞抽出物を、GSH-アガロース上に固定した、ATF2の活性化ドメイン（第1〜109残基）を含むGST融合蛋白質とともにインキュベートした。上清を除去し、アガロースを十分に洗浄した。上清およびアガロース結合分画に対するウェスタンブロット分析を以下の通りに実施した：蛋白質をSDS-PAGEによって分画化し、電気泳動によってイモビロン-P（Immobilon-P）膜に移行させ、ホスホチロシンおよびFlagエピトープに対するモノクローナル抗体（それぞれPY20およびM2）を用いて検出した。免疫複合体は、強化ケミルミネッセンス系（enhanced chemiluminescence）（Amersham International PLC）を用いて検出した。固定したGSTを用いる対照実験も実施した。
実施例17．炎症誘発性サイトカインおよび環境ストレスによる、p38 MAPキナーゼおよびJNK1の活性化
ATP[γ-32P]およびATF2を基質として用いる免疫複合体プロテインキナーゼ解析において、p38 MAPキナーゼおよびJNK1の活性に対する、ホルボールエステル、EGF、紫外線照射、浸透圧性ストレス、IL-1、腫瘍壊死因子（TNF）、およびLPSの影響を測定した。TNFαおよびIL-1αはジェンザイム社（Genzyme Corp）から入手した。リポ多糖（LPS）は、記載された方法（Mathisonら（1988）J. Clin. Invest. 81:1925）で、凍結乾燥したサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minesota）Re595菌から単離した。酢酸ホルボールミリスチン酸はシグマ社（Sigma）から入手した。EGFはマウス唾液腺から精製した（Davis（1988）J. Biol. Chem. 263:9462）。キナーゼ解析はp38およびJNKの免疫沈降物を用いて実施した。免疫複合体をキナーゼ緩衝液で2回洗浄し（上記の通りに）、1μgのATF2および50μM[γ-32P]ATP（10Ci／mmol）を最終容量が25μlになるように添加することによって解析を開始した。30℃で30分経過させた後に、レムリ試料緩衝液を添加して反応を停止させた。SDS-PAGEの後、オートラジオグラフィーによってATF2のリン酸化を検討し、ホスホイメージャーを用いた分析によってATF2のリン酸化速度を定量的に分析した。
結果は表2に示した。ヒーラ（Hela）細胞に対して10nMの酢酸ホルボールミリスチン酸を曝露させると、p38およびJNK1は極めてわずかに活性化された。同様に、10nMのEGFによる処置を行った場合のp38およびJNK1の活性化もごくわずかであった。これに対して、40J／m2のUV-C、300mMのソルビトール、10ng／mlのインターロイキン-1、および10ng／mlのTNFαによる処置を行った場合は、p38およびJNK1は著しく活性化された。ヒトCD14を発現するCHO細胞を用いて、p38の活性に対するLPSの影響を検討した。CHO細胞に対する10ng／mlのLPSの曝露による、p38およびJNK1の活性の上昇はごく軽度であった。
0003948571.tif 000003
実施例18．TyrおよびThrでの2リン酸化によるp38 MAPキナーゼの活性化
野生型（Thr180、Tyr182）または変異型（Ala180、Phe182）のp38 MAPキナーゼを発現しているCOS-1細胞に対して、UV-C（40J／m2）の非存在下または存在下での処置を行った。紫外線の照射または非照射の30分後に細胞を採取した。偽遺伝子導入細胞を用いた対照実験も実施した。エピトープを付加したp38 MAPキナーゼの発現レベル、およびp38 MAPキナーゼのTyrリン酸化の状態を、M2モノクローナル抗体およびホスホチロシンに対するモノクローナル抗体PY20を用いたウェスタンブロット分析によって検討した。免疫複合体は、増強ケミルミネッセンス系によって検出した。
野生型および変異型のp38の発現のレベルは同様であった。ウェスタンブロット分析では、紫外線照射によってp38のTyrリン酸化に増加が生じたことが示された。Tyrリン酸化の増加は、[32P]リン酸によって標識した細胞から単離されたp38のホスホアミノ酸分析によっても裏づけられた。この結果から、紫外線照射によってp38のThrリン酸化も増加したことが示された。TyrおよびThrのリン酸化の増加は、変異型のp38によって阻害された。免疫沈降法によって、COS-1細胞から野生型および変異型のp38を単離した。[γ-32P]ATPおよびGST-ATF2を基質として用いる免疫複合体においてプロテインキナーゼ活性を測定した。SDS-PAGEの後、リン酸化されたGST-ATF2をオートラジオグラフィーによって検出した。紫外線照射によって、野生型p38の活性は著しく上昇したが、変異型のp38は触媒的に不活性であることが明らかになった。これらの結果は、Thr-Gly-Tyrモチーフ内部における2リン酸化によってp38が活性化されることを示している。
実施例19．MAPキナーゼホスファターゼはp38 MAPキナーゼの活性化を抑制する
細胞に対して、40J／m2のUV-Cの非存在下または存在下での処置を施した。偽遺伝子導入細胞（対照）、ならびに触媒的に非活性な変異型のホスファターゼmPAC1（Cys257／Ser）およびヒトMKP1による遺伝子導入を施した細胞を用いての対照実験も実施した。[γ-32P]ATPおよびGST-ATF2を基質として用いる免疫複合体プロテインキナーゼ解析によって、p38 MAPキナーゼの活性を測定した。その結果、PAC1またはMKP1の発現によってp38のリン酸化が抑制されることが明らかになり、p38が二重特異性ホスファターゼPAC1およびMKP1によって調節されうることが示された。
実施例20．p38 MAPキナーゼの細胞内分布
エピトープを付加したp38 MAPキナーゼをCOS細胞で発現させた。細胞に対して、40J／m2の紫外線照射の非存在下または存在下での処置を施し、続いて37℃で60分間インキュベートした。p38 MAPキナーゼは、M2モノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光法によって検出した。画像をデジタル画像顕微鏡によって入手し、画像再生のための処理を行った。
免疫細胞化学．カバーグラス（22mm×22mm No.1；Gold Seal Cover Glass；Becton-Dickinson）を0.1N HCl中で10分間煮沸し、蒸留水ですすいだ後に、オートクレーブ処理および0.01％ポリ-L-リジン（Sigma；St. Louis MO）による被覆を施すことによって、前処理を行った。このカバーグラスを径35mmのマルチウェル組織培養プレート（Becton Dickinson、UK）の底に配置した。遺伝子導入を施したCOS-1細胞を直接カバーグラス上に播いて、牛胎児血清（5％）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco-BRL）中に一晩置いて付着させた。遺伝子導入から24時間後に細胞を1回すすぎ、25mM Hepes、pH7.4、137mM NaCl、6mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、10mMグルコース中にて37℃で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を1回すすぎ、組織培養皿からカバーグラスを取り出した。4％パラホルムアルデヒドを含む、新たに調製した22℃のリン酸緩衝生理食塩水中に15分間置くことによって細胞を固定した。続いて0.25％Triton X-100を含むリン酸緩衝生理食塩水中に5分間置くことによって細胞に透過化処理を施し、DWB溶液（150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0、2％馬血清、1％（w／v）牛血清アルブミン、0.05％Triton X-100）で5分間にわたり3回洗浄した。一次抗体（M2抗FLAGモノクローナル抗体、Eastman-Kodak Co.、New Haven、CT）をDWBによって1：250に希釈し、22℃の加湿環境において細胞に1時間適用した。再び、上記の通りに細胞を3回洗浄し、1：250に希釈したフルオレセイン・イソチオシアネートを共役させたヤギ抗マウスIg二次抗体（Kirkegaad & Perry Laboratories Inc. Gaithersburg、MD）を22℃の湿潤環境において1時間適用した。続いて細胞をDWB液で3回洗浄し、その後に、免疫蛍光分析のためにゲル・マウント（Gel-Mount）（Biomeda Corp. Foster City、CA）を用いてスライドガラスに載せた。観察された免疫蛍光の特異性を評価するための対照実験も実施した。M2一次モノクローナル抗体の非存在下において遺伝子導入細胞を染色した場合、および偽遺伝子導入細胞では、蛍光は全く検出されなかった。
デジタル画像顕微鏡および画像再生
以前に記載された通り（Carringtonら（1990）:Non-invasive Techniques in Cell Biology（細胞生物学における非侵襲的技術）（Fosbett & Grinstein編）、Wiley-Liss、NY、pp.53〜72；Fayら（1989）J. Microsci. 153:133〜149）に、エピ蛍光装置を装備したツァイス（Zeiss）IM-35顕微鏡に装着したニコン（Nikon）60倍プラナポ（Planapo）対物レンズ（開口数＝1.4）を用いて、単一細胞における蛍光分布を示すデジタル画像を得た。コンピュータ制御された焦点機構および熱電的に冷却された電荷結合素子カメラ（model 220；Photometrics Ltd.、Tucson、AZ）により、さまざまな焦平面での画像が得られた。励起源に対する試料の露出は、コンピュータ制御されたシャッターおよび波長選択装置系（MVI、Avon、MA）によって決定した。電荷結合素子カメラおよび顕微鏡の機能はマイクロコンピュータによって制御し、カメラから得たデータは、画像処理のためにシリコングラフィックス社（Silicon Graphics）のモデル4D／GTXワークステーション（Mountainview、CA）に転送した。画像には感度の不均一性および電荷結合素子検出器の暗電流に関する補正を施した。顕微鏡の焦点のぼけに関する較正は、直径0.3μmの蛍光標識ラテックスビーズ（Molecular Probe Inc.）の連続光学切片を0.125μmの間隔で撮影した際の、装置の点拡がり関数（point spread function）を測定することによって決定した。使用した画像再生アルゴリズムは、イル・ポーズド問題理論（theory of ill-posed problems）に基づいており、非処理画像のそれよりも実質的に正確な、細胞内部の定量的な色素密度値が得られた（Carringtonら（1990）前記；Fayら（1989）前記）。画像処理を行った後、細胞の個々の光学切片を検査し、シリコングラフィックス社のワークステーション上でコンピュータグラフィック用ソフトウェアを用いて分析した。p38 MAPキナーゼは細胞表面、細胞質、および核内に認められた。照射後には、細胞質のp38の核周囲領域への局在化の増加が検出された。
実施例21．浸透圧性ショックによる、MKKシグナル伝達経路の活性化
CHO細胞に対して、プラスミドpCMV-Flag-Jnk1およびpRSV-Neo（Derijardら（1994）前記）による同時遺伝子導入を施した。ジェネテシン（Geneticin）（Gibco-BRL）による選別によって、エピトープを付加したJnk1（Flag；Immunex Corp.）を発現している安定な細胞系列を単離した。細胞を、0、100、150、300、600、または1000mMのソルビトールとともに37℃で1時間インキュベートした。細胞を溶解緩衝液（20mM tris、pH7.4、1％Triton X-100、2mM EDTA、137mM NaCl、25mMβ-グリセロリン酸、1mMオルソバナジン酸、2mMピロリン酸、10％グリセロール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、10μg／mlロイペプチン）中に溶解し、100,000×g、4℃の遠心処理を30分間行って可溶性抽出物を採取した。モノクローナル抗体M2（Immunex Corp.）を用いた免疫沈降法により、エピトープを付加したJNK1を単離した。免疫沈降物を溶解緩衝液で十分に洗浄した。25μlの25mM HEPES、pH7.4、25mM MgCl2、25mMβグリセロリン酸、2mMジチオスレイトール、100μMオルソバナジン酸、および50μM ATP[γ-32P]（10Ci／mmole）に、細菌性に発現するc-Jun（第1〜79残基）とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合体2.5μgを基質として加えたものの中で、免疫複合体キナーゼ解析を行った。SDS-PAGEの後、オートラジオグラフィーおよびホスホイメージャー（Molecular Dynamics Inc.）分析によって、c-Junのリン酸化を検討した。ソルビトール曝露を行ったすべての濃度でJNK1の活性化が認められた。
上記の通りに300mMのソルビトールを添加した培地中でインキュベートした細胞での、JNK1プロテインキナーゼの活性化の経時的推移を測定した。ソルビトールへの曝露から5分以内にJNK1活性の上昇が認められ、15〜30分後に最大活性が得られた。
JNK1のリン酸化部位Thr183およびTyr185の部位での変異により、浸透圧性ショックによるJNK1蛋白質のキナーゼ活性の活性化は阻害された。CHO細胞に対して、ベクター、野生型のJNK1（Thr183、Tyr185）および変異型のJNK1（Ala183、Phe185）による遺伝子導入を施した。上記の通りにJNK1プロテインキナーゼの活性を測定する前に、300mMソルビトールを添加しないか、または添加した培地中で細胞を15分間インキュベートした。JNK1の活性化は、野生型のJNK1では認められたが、変異型のJNK1では認められなかった。
用途
本発明のMKKポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、MKKシグナル伝達経路を調節する試薬を同定するために有用である。MKKシグナル伝達経路を調節する試薬は、MKKの合成、MKKのリン酸化、またはMKKの活性に対するそれらの影響によって同定することができる。例えば、MKKの活性に対する試薬の影響は、上記のインビトロでのキナーゼ解析によって測定することができる。各要素が反応するために十分な条件下において、MKKを被験試薬の非存在下（対照）および存在下にてインキュベートし、引き続いて、キナーゼ活性に対する被験試薬の影響を測定する。MKKシグナル伝達経路を抑制する試薬は、MKKを介した障害の治療に用いることができる。MKKシグナル伝達経路を刺激する試薬は、組織におけるプログラム細胞死（アポトーシス）の誘導を含む多くの方法で用いることができる。例えば、紫外線によって障害を受けた細胞の除去を、癌の予防のために用いることができる。
一般に、MKKシグナル伝達経路を抑制する試薬を同定するには、例えば1.0mM〜100mMなどの一定範囲の濃度の試薬、MKKの基質、および[γ-32P]ATPなどの放射性マーカーを用いてキナーゼ解析を実施する。これに適した基質分子には、p38、JNK1、JNK2、またはATF2が含まれる。基質への[32]Pの取り込みを測定し、被験試薬について得られた結果を対照値と比較する。特に関心が持たれるのは、[32]P取り込みの約80％またはそれ以上の抑制をもたらす試薬である。
MKKの合成に対する試薬の影響を検証するための解析を、MKKシグナル伝達経路を抑制する化合物を同定するために用いることもできる。MKKの発現に対する被験試薬の影響は、例えば、MKKに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析によって評価することができる。抗体の結合はオートラジオグラフィーまたはケミルミネッセンスによって可視化し、定量的に分析することができる。MKK mRNAの発現に対する被験試薬の影響は、例えば、ポリヌクレオチドプローブを用いるノーザンブロット分析、またはポリメラーゼ連鎖反応によって検討することができる。
MKKシグナル伝達経路を抑制することが判明している試薬を、MKKを介した障害を治療するための治療的薬剤として使用することができる。このような試薬は、薬剤設計において、MKKシグナル伝達経路を抑制するために必要な特定の分子の特徴を解明する上でも有用である。
さらに、本発明は、MKKを介した、ストレス関連性および炎症性の障害を治療するための方法を提供する。この方法は、MKKの機能を抑制する有効量の治療的試薬の投与を含む。適した試薬は、MKKの活性または発現のいずれかを抑制する。投与する試薬の濃度は、至適用量、投与経路、および投与対象となる特定の異常を含む、多くの因子に基づいて決定される。試薬の至適用量は、個々の患者および治療対象となる特定のMKKを介した障害に必要な用量を最適化するための慣習的な実験を含む、当業者に周知の方法によって決定される。投与に適した特定の治療的有効量の決定は、当業者は容易である（例えば、レミントンの製薬科学（Reminton's Pharmaceutical Sciences.）、第18版、ジェナロ（Gennaro）編、Mack Publishing Company、Easton、PA、1990）。
本発明は、ストレス関連性および炎症性の障害の、急性期および予防的治療の双方のための方法を提供する。例えば、虚血性心疾患は、再潅流後の虚血性および酸化性ストレスのエピソード過程において治療しうると考えられている。さらに、虚血の危険性がある患者を、虚血エピソードが起こる前に治療することもできる。
もう1つの例では、TNFおよびIL-1を含む炎症性サイトカインの分泌を抑制することによって炎症反応を制御するために、MKKの機能または活性を抑制する治療的試薬を投与する。
本発明の方法により、MKKの機能または活性を抑制する治療的試薬を投与することによって、ストレスに関連した増殖性障害を治療することもできる。このような治療的試薬は単独でも、または例えば悪性腫瘍の治療における化学療法剤などのその他の治療的薬剤と併用して用いることもできる。実際に、本発明によって提供される治療的試薬による、ストレスによって活性化されるMKKの制御によって、ストレスを誘発するその他の治療的戦略によって引き起こされる症状を調節することができる。
採用される治療的試薬は、本発明および当業者に周知の技法に従って作製される、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどのその他の分子を含む、MKKの機能または活性を抑制する化合物である。MKKのエピトープと結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体（その断片または誘導物を含む）も、治療的試薬として採用することができる。プロテインキナーゼ活性を低下させるために、MKKを効果的に転位させる、または基質の結合および／もしくはリン酸化をMKKと競合するドミナントネガティブな形態のMKKを用いることもできる。ドミナントネガティブな形態を、上記の通りに、プロテインキナーゼの触媒ドメイン内部の変異によって作製することもできる。
例えばアポトーシスの誘導などの一部の場合では、MKKの活性を増強することが望ましい。本発明の方法は、MKKの機能または活性を高める能力を有する試薬を同定するために用いることができる。また、MKKの過剰発現によって活性の増加を実現することもできる。MKKを介した障害がMKKの発現不足、または変異型のMKKポリペプチドの発現を伴う場合には、センスポリヌクレオチド配列（DNAコード鎖）またはMKKポリペプチドを細胞に導入することができる。
本発明の抗体は、注射または時間をかけた段階的な注入によって非経口的に投与することができる。本発明のモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、または経皮的に投与することができる。
本発明のポリペプチドまたは抗体の非経口的投与のための製剤は、滅菌した水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。水性担体には、水、アルコール性／水性の溶液、懸濁液または乳濁液などがあり、生理食塩水および緩衝溶媒が含まれる。非経口性担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル（Ringer）デキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内担体には、液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルデキストロース液に基づくものなど）などが含まれる。防腐剤、ならびに例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの添加物を加えることもできる。
また、当業者に周知のさまざまな技法によって、アンチセンス配列を含むポリヌクレオチド配列を治療的に投与することができる。このような治療法は、MKKを介した障害を有する哺乳動物の細胞内にMKKポリヌクレオチドを導入することによって治療的効果を達成すると考えられる。MKKポリヌクレオチドを輸送することは、遊離ポリヌクレオチド、もしくはキメラ型ウイルスなどの組換え発現ベクター、またはコロイド分散系を用いることによって達成することができる。ヌクレオチド配列の治療的輸送のために特に好ましいのは、標的を定めたリポソームの使用である。
輸送の効率を高めるためには、特定の組織に対する治療的試薬のターゲティングが望ましい。ターゲティングは、投与経路を介した受動的機序によって達成することができる。特定の組織に対する能動的なターゲティングを利用することもできる。リポソーム、コロイド懸濁液、およびウイルスベクターを使用すると、例えば、標的組織の要素に対する受容体として作用する分子を含めることなどによって、治療的試薬を含む製剤の組成を変えることにより、特定の組織に対するターゲティングが可能となる。その例には、糖、糖脂質、ポリヌクレオチドまたは蛋白質が含まれる。これらの分子を治療的試薬とともに含めることができる。また、例えば、その分子をコードするポリヌクレオチドを含めること、またはターゲティング分子を提供するパッケージ系を用いることなどの間接的な方法によって、これらの分子を含めることもできる。当業者は、本明細書で提供される開示から、本発明の分子および手法が治療的試薬を特定の組織へ輸送するのに有用であることを理解または確認することができると思われる。
その他の態様
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、本明細書に記載した内容は例示を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲により定義されることを理解すべきである。その他の局面、利点、および改変も、以下の請求の範囲に含まれる。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：Davis, Roger J.
Raingeaud, Joel
Gupta, Shashi
Derijard, Benoit
（ii）発明の名称：サイトカイン、ストレス、および腫瘍性蛋白質によって活性化されるヒトプロテインキナーゼキナーゼ
（iii）配列数：16
（iv）文書通信情報：
（A）宛名：Fish & Richardson P.C.
（B）街路名：225 Franklin Street
（C）市名：Boston
（D）州名：MA
（E）国名：USA
（F）郵便番号：02110-2804
（V）コンピューター読み取りフォーム：
（A）メディア形式：Floppy disk
（B）コンピューター：IBM PC compatible
（C）運転システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）親出願データ：
（A）出願番号：US 08/530,950
（B）出願日：19-SEP-1995
（C）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（A）氏名：Fasse, J. Peter
（B）登録番号：32,983
（C）参照／明細書番号：07917/010001
（ix）電気通信情報：
（A）電話：617/542-5070
（B）ファックス：617/542-8906
（C）テレックス：200154
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2030塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0003948571.tif 000004
0003948571.tif 000005
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：318アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003948571.tif 000006
0003948571.tif 000007
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1602塩基対
（B）配列の型：核酸
（c）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0003948571.tif 000008
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：334アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0003948571.tif 000009
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（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3497塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５：
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（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：363アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：６：
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（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3553塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：７：
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（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：393アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：８：
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（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：3576塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：９：
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（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：399アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
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（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：393アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
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（2）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：400アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
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（2）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：668アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
0003948571.tif 000033
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（2）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
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（2）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
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（2）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：17塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0003948571.tif 000050
0003948571.tif 000051
0003948571.tif 000052
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【図７】
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0003948571.tif 000057
0003948571.tif 000058
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【図８】
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