(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
評価すべき化学物質の存在下で酵母を培養し、該酵母細胞の複数の遺伝子の発現状態を同時に観察する方法であって、該遺伝子が表９に記載された全ての遺伝子であることを特徴とする化学物質の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質の毒性評価法及び同定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、化学物質のデーターベース Chemical abstractには約１７００万件の化学物質が登録されている。そのうち、１万種類以上の合成化学物質が環境中に蓄積しているものと推定され、その数は年々増加している。合成物質の中には、直    接又は環境中で形を変えた後に生態や人体に悪影響を与える物質も含まれている。そのため、それぞれの化学物質について、生態や人体に与える影響を迅速に評価する必要がある。また、環境汚染問題が国民の不安をあおるような社会問題となっている状況の下、種々の高度な測定システムで、環境中に存在する化学物質を同定しようとする試みがなされている。
【０００３】
さらに、多くの機関でバイオアッセイを用いた簡易毒性評価試験による毒性の指標化がなされている。これは、動植物細胞や微生物を用いて「化学物質による生物的応答の変化」を測定し、「毒性」を評価するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、どのような高度な技術を用いても、現状では約１０％の化学物質を同定できるにすぎないと言われている。従って、環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が要望されていた。
さらに、従来のバイオアッセイは主として細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としておりその情報量が限られている。このようなバイオアッセイ系では、    環境中の化学物質による毒性の有無は評価できるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因する毒性であるかを判断するための情報がまったく得られない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
以上のような現状に鑑み本発明者は鋭意研究の結果本発明を完成させたものであり、その特徴とするところは、化学物質の毒性評価法においては、評価すべき化学物質の存在下で細胞を培養し、該細胞の複数の遺伝子の発現状態を同時に観察、評価する点にあり、化学物質の同定方法にあっては、既知の化学物質の存在下で細胞を培養し、該細胞の遺伝子の発現状態を標準パターンとして記憶し、被測定液の存在下で同様の細胞を培養し、そのときの遺伝子の発現状態を標準パターンと比較することによって、被測定液中の物質を同定する点にある。
【０００６】
化学物質は、それぞれ固有の毒性を有しており、生物に影響を与える。影響を受けた生物はその毒性に応じて修復又は解毒機構を働かせる。その例として、ストレス応答と呼ばれるものがある。微生物から高等生物まですべての生物細胞は、環境ストレス（高温、低温、高圧、乾燥、紫外線、薬物暴露等）に曝されると、瞬時にストレス応答タンパク（ＨＳＰ）を合成し、これらの環境に耐える体制を整える。これをストレス応答という。即ち、ストレス応答タンパク産生遺伝子は、生体が環境の影響を受けたときのみ、しかもストレスの種類に応じたタンパクを、受けたストレスの程度に応じて産生する。還元すれば、生体はストレスの種類と程度に応じてストレス応答タンパク産生遺伝子を発現している事となる。即ち、生体が化学物質から受けた毒性の影響からの修復機構や解毒機構の誘導によってもたらされる特定の遺伝子の発現を検出することによって、その化学物質の毒性を評価することが可能になるのである。
【０００７】
化学物質の影響は単に１つの遺伝子の発現をもたらすものではなく、常に複数の遺伝子が毒性に応答して発現する。また、発現する遺伝子の種類、発現パターンは化学物質によって異なる。本発明はこのことを利用して未知化学物質の種類と毒性の程度を同定することができる。即ち、該未知化学物質が特徴的に誘導する遺伝子群と、既知の化学物質を用いて誘導される遺伝子群のスペクトル（パターン）を比較することで、その化学物質を推定することができる。また、その誘導される遺伝子群から未知化学物質がどの程度の危険性があるかを推定することができる。
【０００８】
評価すべき化学物質とは、被検液に含まれる化学物質であり、それが何か分かっている必要はなく、また単数か複数かもわかっていなくともよい。よって、ここでいう評価すべき化学物質の存在下というのは、その化学物質が含まれている被検液の存在下という意味である。
【０００９】
ここでいう化学物質とは、硫酸銅、塩化水銀、重クロム酸カリウム、塩化鉛、塩化ニッケル、塩化カドミウムなどの無機金属化合物、塩化トリブチル錫、メチル水銀、四メチル鉛などの有機金属化合物、ジクロロエタン、ダイオキシン類などの有機塩素化合物、ビスフェノールＡ、フタル酸ジメチルなどの有機化合物、スルファニルウレア、有機リン化合物、カーバメート剤などの農薬、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの界面活性剤、メタノールなどのアルコール類などがあげられるが、これらに限定するものではなく少なくとも生理活性を持つ化学物質であればよい。
【００１０】
また、本発明は新規化学物質の毒性も評価できる。新規化学物質について誘導される遺伝子群を測定しその発現パターンを記憶しておけば、未知試料中の当該化学物質の存在が確認できる。このとき化学物質の組成や構造が分かっている必要はない。また、その発現遺伝子を詳細に検討することで、その毒性を評価することができ。例えば、実施例１で示すように、カドミウムで誘導される遺伝子群からは、少なくともグルタチオン、システイン、メチオニンの欠乏が起こることが推定できるが、新規化学物質においてこれらの遺伝子が発現していれば、その物質がカドミウム類似の毒性を持つことが評価できる。
【００１１】
細胞としては、ヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他の細胞でもよい。更に、培養が容易であること、遺伝子の機能がよく研究されていることから細胞として微生物を用いることも好適である。また、微生物の中でも酵母が好適であった。これは、取り扱いが容易であるうえ、ヒト進化の過程にある生物と考えられ、ヒトに対する毒性等と同じように機能する遺伝子が多いと考えられているためである。
【００１２】
培養方法は、用いる細胞の通常の培養方法でよく特別な方法である必要はない。ＹＰＤ培地やその他の培地でよい。
【００１３】
遺伝子の発現状態を観察、評価する手段としては、ノーザンブロットやＲＴＰＣＲを複数行う等、遺伝子の発現量が測定できる方法であればどのような方法でもよい。しかし、ＤＮＡマイクロアレイ又はマクロアレイを用いる方法が好適である。ＤＮＡマイクロアレイとは、スライドガラスのような小さなチップ上（２５ｍｍ×７５ｍｍ程度）に数１０から数千個程度、或いは数万個のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を貼りつけたものである。これに対してマクロアレイとは、比較的大きな濾紙状の担体（１０ｃｍ×１０ｃｍ程度）に、同様に数十から数千個程度のｃＤＮＡを貼りつけたものである。
【００１４】
試料から発現しているＤＮＡ或いはＲＮＡを取りだし、必要によりＰＣＲなどを用いて適当に増幅し、アレイに添加（適用）する。温度を適当に調整することで、試料中のＤＮＡとアレイ上のｃＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたＤＮＡの検出は通常蛍光色素などのマーカーを用いて検出するが、マーカーを用いず、表面プラズモン共鳴や、偏光解消或いはエバネッセント光などを用いた検出法を用いることもできる。
【００１５】
上記の観察方法では、試料を単独で検出しているが、化学物質（これを含む試料液）を添加しないこと以外は試料と同じ条件で培養した対照区（ブランク検体）も作成し、それと試料検体とを一緒にＤＮＡアレイに適用し、ハイブリダイゼイションを競争的に起こさせ、同一遺伝子における試料とブランク検体のハイブリダイズ量の違いを観察してもよい。
【００１６】
アレイに添着しておくＤＮＡは目的とする化学物質を識別するのに必要なだけでよい。例えば、酵母ではおよそ６０００個の遺伝子があると言われるが、化学物質に応答して特異的に発現量が変化する遺伝子は高々５００個程度であると推定される。表９に毒物に応答して発現する遺伝子の一部を列挙した。これらの遺伝子だけで、少なくとも実施例に示した８種類の化合物の判定が可能であるが、化合物はこれらに限定されるものではない。
【表９】
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【００１７】
これらの８種のように特定の化学物質を選択しそれらによって発現する遺伝子の発現量の上位所定数の遺伝子のみ測定して評価してもよい。例えば、上位５０個の遺伝子のみ測定する等である。このようにすると、測定が簡単になる。
【００１８】
次に本発明の化学物質同定法について説明する。
まず、既知の化学物質（単一が好ましい）を含有する試料を培養し、発現した遺伝子名と発現強度をその化合物の標準として記録しておく。このときこれらをグラフ化してパターンとして記憶しておくと視覚的にも判断できる。勿論、コンピューターに記録しそこで判定してもよい。
【００１９】
このとき、被検液中に複数の化学物質が含まれている場合、遺伝子の発現パターンはその含まれている化学物質のそれぞれの発現パターンの単純合計になることがわかった。よって、特徴的な遺伝子の発現量から容易にその複数の化学物質を推定することができる。勿論、この場合には未知化学物質は同定できない。よって、いかに多くの既知化学物質の発現パターンを記録、保存しておくかが同定できる化学物質の多さを決めることとなる。しかし、その遺伝子自体の意味や機能がわかっている必要はない。
【００２０】
【実施例】
以下実施例に沿って具体的に発明を詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
実施例１
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）を用いて酵母を培養した。対数増加期に化学物質として塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２、０．３３ｍＭ）を添加し２時間培養した。これとまったく同じ条件で化学物質を添加せず培養したものを対照区とした。
この試料及び対照区を同量ＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で、１晩又は１２時間以上ハイブリダイズさせた。ＤＮＡチップをスキャナー（ＳＣＡＮ・ＡＲＲＡＹ４０００：ＧＳＩルミコス）により発現遺伝子と発現量を測定した。それを表１０に示す。全ての遺伝子について、記述することも可能であるが、ここでは化学物質の毒性によって応答した遺伝子を対象としているため、それぞれのモデル化学物質について発現量の多い上位５０の遺伝子だけを機械的に選択して示した。ここでの数値は、対照区に対する相対量で示している。即ち、数値が１の場合には、試料と対照区が同量であり、化学物質によって特別に発現していないということである。この比較の方法は異なる色に発色（蛍光）するようにしておき、その色を測定して行ってもよい。
【００２１】
勿論、同一のＤＮＡチップに適用して競争させず、別のＤＮＡチップに適用してその差を測定してもよい。
【００２２】
この表１０及び１１は、塩化カドミウムによって誘導される遺伝子の役割（機能）も記述した。誘導される遺伝子群の特徴として、硫黄の代謝系酵素群を挙げることができる。このことは、カドミウムの添加により、酵母の細胞内で硫黄代謝の異常が生じたことを示している。また、アミノ酸細胞内取りこみ関連の遺伝子が誘導されている。硫黄代謝の最終生産物が、グルタチオン、システイン、メチオニンであることを考えると、酵母細胞内で起こった異常は、これら含硫アミノ酸の欠乏であると結論することができる。
【表１０】
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【表１１】
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【００２３】
次に種々の化学物質に対して、同様の実験を行った。その遺伝子名と発現量を表に示す。化学物質としては、メチル水銀（ＣＨ３ＨｇＣｌ）、塩化水銀（ＨｇＣｌ２）、トリブチルチンクロライド（（Ｃ４Ｈ９）３ＳｎＣｌ）、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化鉛（ＰｂＣｌ２）である。これらの物質に加えて、前記塩化カドミウムも含めて表１〜８に示す。誘導される遺伝子（上位５０に限り）全てをアルファベット順に示した。表１〜８に示された遺伝子は４００種類であるが、重複する遺伝子があるため、合計３３１種類であり、これを表９に羅列した。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００２４】
また、表１〜８の数値をパターン化したグラフを図１〜図８に示す。縦軸には表９で示した遺伝子をその順に並べており、直線はそれぞれの遺伝子の発現量に対応している。８種類の化学物質を比較すれば明らかなように、誘導される遺伝子の発現パターンはまったく異なることがわかる。誘導される遺伝子のパターンは化学物質の毒性の違いを反映したものであると結論づけることができる。
【００２５】
【発明の効果】
以上詳細に説明した本発明によれば、どのような化学物質が含まれているか分からない液体であっても、その毒性が簡単に推定でき、またどの遺伝子からのデータであるかもわかる。これは、まったく未知の新規物質であっても可能である。
【００２６】
さらに、記憶している発現パターンと比較することによって、毒性とは別にその化学物質を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図２】メチル水銀（ＣＨ３ＨｇＣｌ）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図３】塩化水銀（ＨｇＣｌ２）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図４】トリブチルチンクロライド（（Ｃ４Ｈ９）３ＳｎＣｌ）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図５】重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図６】塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図７】硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図８】塩化鉛（ＰｂＣｌ２）を添加したときの遺伝子の発現パターンを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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