(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノフルオロクエン酸に対して感受性を示し、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸よりなる群から選択される有機酸のうちの１種以上の有機酸を親株よりも高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２２−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６５）。
【請求項２】
クエン酸に対して耐性を示し、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸よりなる群から選択される有機酸のうちの１種以上の有機酸を親株よりも高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ５７−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６６）。
【請求項３】
シス−アコニット酸に対して感受性を示し、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸よりなる群から選択される有機酸のうちの１種以上の有機酸を親株よりも高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３４−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６７）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸よりなる群から選択される有機酸のうちの１種以上の有機酸を高生産する新規酵母及び該酵母を用いた爽快な酸味が向上した酒類、食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機酸を高生産する変異酵母を用いた清酒製造法については、既にリンゴ酸を高生産するコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサクシネートの感受性変異酵母（特開平３−１７５９７５号）、リンゴ酸を高生産する泡なし変異酵母（特開平５−３１７０３６号）、リンゴ酸を高生産するコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイルトリフルオロアセトン又はオキシカルボキシンの耐性変異酵母（特開平６−１２１６７０号）を用いる方法がある。また、リンゴ酸及び／又はコハク酸を高生産し吟醸香の高い変異酵母（特開平７−２０３９５１号）を用いる方法も開示されているが、該酵母はメタ重亜硫酸カリウムを用いて耐性の酵母を選択したものであり、特定の酵素に対する阻害剤を用いて選択されたものではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在、前記のような有機酸高生産酵母が知られているが、これら酵母の選択方法は、ＴＣＡサイクルに関与する酵素の中では、コハク酸デヒドロゲナーゼをターゲットとしたものに限られていた。
本発明の目的は、ＴＣＡサイクルに関与する酵素のうちコハク酸デヒドロゲナーゼとは異なる特定の酸に対する感受性株及び／又は耐性株を選択し、更にその中より有機酸を高生産する酵母変異株を選択することにより得られる新規酵母及び該有機酸高生産酵母を用いる爽快な口当りの良い酸味が向上した酒類、食品の製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、新規酵母に関する発明であって、モノフルオロクエン酸に対して感受性、あるいはクエン酸に対して耐性、あるいはシス−アコニット酸に対して感受性を示し、リンゴ酸、コハク及び乳酸よりなる群から選択される有機酸のうちの１種以上の有機酸を親株よりも高生産するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する新規酵母、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６６、及びＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６７に関し、第２の発明は、該有機酸を高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母を用いることを特徴とする爽快な口当りの良い酸味が向上した酒類、食品の製造方法に関する。
【０００５】
モノフルオロクエン酸は、ＴＣＡサイクルに関与する酵素であるアコニット酸ヒドラターゼの阻害剤であり〔今堀和友、山川民夫監修、生化学辞典（第１版）、第１０９２頁、１９８４年４月１０日、（株）東京化学同人発行〕、クエン酸及びシス−アコニット酸はアコニット酸ヒドラターゼの基質である〔今堀和友、山川民夫監修、生化学辞典（第１版）、第３４５頁、１９８４年４月１０日、（株）東京化学同人発行〕。
本発明者らは、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性より選択される形質を一つ以上有する酵母は、ＴＣＡサイクルによる有機酸生合成のバランスが変化し、有機酸を高生産するのではないかと考えた。
本発明者らは、清酒用泡なし酵母である日本醸造協会７０１号（以下、Ｋ−７０１と略記する）株の変異処理株を最少培地プレートで生育させ、そのプレートをモノフルオロクエン酸、クエン酸又はシス−アコニット酸を含む最少培地プレートにレプリカし、生育してこない感受性株を元の最少培地プレートより分離し、又はＫ−７０１株の変異処理株でクエン酸を高濃度含む最少培地プレートに生育してくる耐性株を分離し、麹汁培養試験及び清酒小仕込試験を実施し、成分分析、清酒の官能試験により有機酸の高生産株が選択できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における有機酸高生産株とは、リンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する株であることを特徴としている。
【０００７】
選択される酵母の母集団は、変異処理株のほかに野生株、馴養株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株をも含む。
【０００８】
本発明における変異処理方法としては、酵母に公知の変異誘導方法、例えば、紫外線、放射線等を照射させる方法、又はＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等の薬剤を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。有効な変異処理としてはエチルメタンスルホネート処理が好ましい。
【０００９】
ここに得られるアコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性より選択される形質を一つ以上有する酵母は、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、アルコール酵母又はパン酵母等のいずれを親株にしても、リンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産するので、これらの新規酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビール又はウイスキー等の酒類、又はパン等の食品を製造すれば、爽快な口当りの良い酸味が向上した製品を製造することができる。
また、本発明の酵母は、モノフルオロクエン酸感受性、シス−アコニット酸感受性、クエン酸感受性又はクエン酸耐性の一つ以上の形質を有していればよい。
【００１０】
清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー又はパン等の製造方法は特に限定するものではなく、一般的な方法に従って製造することができる。
【００１１】
以下に本発明の酵母の取得方法の１例を示す。
（酵母の変異処理方法）
Ｋ−７０１株の有機酸高生産株を取得するために、以下の工程で変異処理を行った。Ｋ−７０１株をＳＤ液体培地〔イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％〕５ｍｌで３０℃にて一夜振とう培養した。遠心分離で菌体を集菌した後、滅菌水で洗浄した。洗浄菌体を４．３５ｍｌの０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）で懸濁し、２０ｗ／ｖ％グルコース溶液を０．５ｍｌ添加してよくかくはんした後、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を０．１５ｍｌ添加し、３０℃にて１時間穏やかに振とうした。その０．２ｍｌを９．８ｍｌの６ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液に加えて、室温で１０〜１５分放置し、そのうちの０．２ｍｌを１９．８ｍｌの滅菌水に添加し、０．１ｍｌずつ１００枚のＳＤ培地〔イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％〕の平板寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。１枚の平板寒天培地に約２００個のコロニーを形成させたもの合計１００枚を得た。
【００１２】
（モノフルオロクエン酸感受性株の選択方法）
ＳＤ培地の平板寒天培地に約２００個のコロニーを形成させたものについて、１ｍＭモノフルオロクエン酸を含むＳＤ培地（選択培地）の平板寒天培地にレプリカし、３０℃で５日間培養した。選択培地に生育できない変異株１２株をモノフルオロクエン酸感受性株として選択した。
【００１３】
（クエン酸感受性株の選択方法）
ＳＤ培地の平板寒天培地に約２００個のコロニーを形成させたものについて、２５ｍＭクエン酸を含むＳＤ培地（選択培地）の平板寒天培地にレプリカし、３０℃で５日間培養した。選択培地に生育できない変異株７株をクエン酸感受性株として選択した。
【００１４】
（シス−アコニット酸感受性株の選択方法）
ＳＤ培地の平板寒天培地に約２００個のコロニーを形成させたものについて、１０ｍＭシス−アコニット酸を含むＳＤ培地（選択培地）の平板寒天培地にレプリカし、３０℃で５日間培養した。選択培地に生育できない変異株５株をシス−アコニット酸感受性株として選択した。
【００１５】
（クエン酸耐性株の選択方法）
上記の方法で、ＥＭＳ変異処理した酵母細胞懸濁液を０．１ｍｌずつ７５ｍＭクエン酸を含むＳＤ培地（選択培地）に塗布し、３０℃で７日間培養した。選択培地に生育してきた変異株１３株をクエン酸耐性株として選択した。
【００１６】
次に、上記で選択したモノフルオロクエン酸感受性株１２株、クエン酸感受性株７株、シス−アコニット酸感受性株５株及びクエン酸耐性株１３株につき麹汁培養試験を行った。麹抽出液を麹汁培地として、３０ｍｌずつ試験管に分注して、オートクレーブ処理した後、試験培地として使用した。各株の酵母は１ｍｌ中に６×１０8 個含むものを添加した。発酵温度は１５℃一定で行った。対照株として親株のＫ−７０１株を用いた。
【００１７】
その上槽液を試料とし、一般分析及び高速液体クロマトグラフィーによる有機酸組成分析を行った。その結果、モノフルオロクエン酸感受性株１株（２２−１）、クエン酸感受性株２株（２８−１、３１−１）、シス−アコニット酸感受性株１株（３４−１）、クエン酸耐性株１株（５７−１）は、親株Ｋ−７０１株に比べ、有機酸成分の中で、リンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸が高生産されていた。その分析結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0004008539.tif 000002
【００１９】
詳細には、２２−１株は、リンゴ酸を親株の約１．７倍生産した。２８−１株は、リンゴ酸を親株の約２．１倍及びコハク酸を約１．２倍生産した。また、３１−１株は、リンゴ酸を親株の約３．３倍及びコハク酸を約１．７倍生産した。３４−１は、リンゴ酸を親株の約１．４倍生産した。５７−１は、リンゴ酸を親株の約１．５倍、コハク酸を約１．３倍及び乳酸を約２．４倍生産した。２２−１株、２８−１株、３１−１株、３４−１株及び５７−１株は、嗜好的に好ましいリンゴ酸、コハク酸及び乳酸の総生産量は親株より多く、嗜好的に好ましくない酢酸の生産量は親株より少なかった。
【００２０】
本発明で取得した有機酸高生産株で清酒を製造したところ、従来の清酒に比べ、有機酸組成のバランスに優れた、爽快な口当りの良い酸味が向上した清酒の得られることがわかった。また、クエン酸耐性株１株（５７−１）は清酒中に、酢酸イソアミル等の香気エステルを高生産しており、その清酒は芳香性に富んだ酒質であることがわかった。
【００２１】
上記のように、本発明による菌株〔変異株：２２−１、２８−１、３１−１、３４−１、５７−１〕は、Ｋ−７０１株の変異株であるが、それらの菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．５μｍ
２．胞子形成：有り
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％及び寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養した後、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して、当該５菌株を接種し、３０℃で７日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース  （−）                  メリビオース  （−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により、３０℃、１４日間後の生育を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
５．高泡の形成
清酒の小仕込みを行ったところ、いずれの変異株も高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母５菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、及び清酒の小仕込試験において、高泡の形成も認められないことから、当該５菌株はＫ−７０１株の変異株であることを示すものである。
【００２２】
６．薬剤に対する感受性
ジメチルサクシネート（１．５ｖ／ｖ％）を含むＳＤ培地を用いて、３０℃で３日間培養した。親株（Ｋ−７０１）と同様に生育してきた株を＋で表した。その結果を表２に示す。いずれの変異株も生育し、感受性を示さなかった。
７．薬剤に対する耐性
テノイルトリフルオロアセトン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、５０％オキシカルボキシンを含有する農薬プラントバックス〔３．２ｍｇ／ｍｌ：日本曹達（株）製〕又はメタ重亜硫酸カリウム（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含むＳＤ培地を用いて、３０℃で７日間培養した。親株（Ｋ−７０１）と同様に生育してこなかった株を−で表した。その結果を表３に示す。いずれの変異株も各々の培地で生育せず、耐性を示さなかった。
【００２３】
【表２】
0004008539.tif 000003
【００２４】
【表３】
0004008539.tif 000004
【００２５】
かくして、本発明により、Ｋ−７０１株を変異させた後、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性より選択される形質を一つ以上有する酵母を選択することによって、有機酸を高生産する、詳細にはリンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する酵母が提供された。
【００２６】
提供された新規酵母５株の中でモノフルオロクエン酸感受性株１株（２２−１）は、リンゴ酸を親株より高生産する特徴を有する。クエン酸感受性株２株（２８−１、３１−１）は、リンゴ酸及びコハク酸を親株より高生産する特徴を有する。シス−アコニット酸感受性株１株（３４−１）は、リンゴ酸を親株より高生産する特徴を有する。クエン酸耐性株１株（５７−１）は、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸を親株より高生産し並びに酢酸イソアミル等の香気エステルを高生産する特徴を有する。以上のリンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する特徴を有する５株より、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性株としてモノフルオロクエン酸感受性株１株（２２−１）を、アコニット酸ヒドラターゼの基質感受性株としてシス−アコニット酸感受性株１株（３４−１）を、アコニット酸ヒドラターゼの基質耐性株としてクエン酸耐性株１株（５７−１）を有機酸高生産株の代表的菌株として寄託した。
【００２７】
本発明の代表的菌株である２２−１株、３４−１株及び５７−１株は、それぞれ Saccharomyces cerevisiae ２２−１、 Saccharomyces cerevisiae ３４−１及び Saccharomyces cerevisiae ５７−１と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、各々ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６６及びＦＥＲＭ  Ｐ−１６２６７として寄託されている。
【００２８】
本発明の酒類、食品の製造方法は、これらのアコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性より選択される形質を一つ以上有する酵母を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
リンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する３株（２２−１、３４−１、５７−１）について、表４に示す仕込配合で総米５００ｇの清酒小仕込試験を行った。
【００３１】
【表４】
0004008539.tif 000005
【００３２】
掛米は精米歩合７８ｗ／ｗ％の白米を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を用いて製造した。酵母は１２．５ｍｌ中に２．５×１０9 個含むものを添加した。発酵温度は最高品温１５℃とした。対照株として親株のＫ−７０１株を用いた。上槽液の分析結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
0004008539.tif 000006
【００３４】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
【００３５】
この結果、２２−１株は、清酒の有機酸成分の中で、爽快な酸味を有するリンゴ酸を親株の約１．６倍生産し、官能的にも爽やかな口当りの良い酸味が認められた。
３４−１株は、清酒の有機酸成分の中で、爽快な酸味を有するリンゴ酸を親株の約１．７倍及び旨味を有するコハク酸を親株の約１．６倍生産し、官能的にも味に幅があり、爽やかな口当りの良い酸味が認められた。
５７−１株は、清酒の有機酸成分の中で、爽快な酸味を有するリンゴ酸を親株の約１．３倍、旨味を有するコハク酸を親株の約１．２倍及び爽やかな酸味を有する乳酸を約１．２倍生産し、官能的にも爽快な口当りの良い酸味が認められ並びに香気成分の中で、特に吟醸香に大きく寄与するとされている酢酸イソアミルを親株の約２．９倍生産し、官能的にもバナナ様のフルーティーな香りが認められた。
２２−１株、３４−１株及び５７−１株は、嗜好的に好ましいリンゴ酸、コハク酸及び乳酸の総生産量は親株より多く、３４−１株及び５７−１株は嗜好的に好ましくない酢酸の生産量は親株より少なかった。
【００３６】
以上の結果は、２２−１株、３４−１株又は５７−１株が、親株Ｋ−７０１株にない性質を有し、有機酸、詳細にはリンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する新規な酵母であることを示すものである。また、５７−１株は、上記有機酸だけでなく酢酸イソアミル等の香気エステルも高生産する新規な酵母であることを示すものである。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、リンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸を高生産する新規酵母を取得することができ、これらの酵母を使用することにより、従来の酒類、食品に比べ、嗜好的に好ましいリンゴ酸、コハク酸又は乳酸の１種以上の有機酸含有量が増加し、嗜好的に好ましくない酢酸含有量が減少した爽快な口当りの良い酸味が向上した酒類、食品を製造でき、また、例えば、割水しても味が薄くならず、幅のある爽やかな酸味を有する低アルコール酒類等の製造への応用も可能となる。