(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＡＬＳＶＤ(Ｘ)Ｙ(Ｘ)ＡＶＡＳ
（式中、（Ｘ）はいずれかのアミノ酸を示す）
で特定されるアミノ酸配列を含有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有するエンドセリン活性抑制剤。
【請求項２】
式：
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項３】
式：
ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項４】
式：
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項５】
式：
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＧＳＲＶＩ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項６】
式：
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＧＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項７】
式：
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＧＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項８】
式：
ＶＬＮＬＧＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項９】
式：
ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１０】
式：
0003923515.tif 000018
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１１】
式：
ＶＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＮＨ2
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有する第１項記載のエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１２】
式：
ＱＧＩＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有するエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１３】
式：
ＩＡＤＮＡＥＲＹＳＡＮＬＳＳＨＶ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有するエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１４】
式：
ＦＬＧＴＴＬＲＰＰＮＬＡＬＰ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有するエンドセリン活性抑制剤。
【請求項１５】
式：
ＬＮＲＲＮＧＳＬＲＩＡＬＳＥＨＬＫＮＲＲＥＶＡ
で特定されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドと高分子もしくは高分子蛋白との結合物を含有するエンドセリン活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はエンドセリンに高い親和性を示すペプチドに関する。
背景技術
エンドセリンは、最初ブタ大動脈内皮細胞の培養上清から単離されたペプチドである。前駆体から酵素で切断されて成熟ペプチドに変換されると強力な血管収縮作用を獲得する。これは既存の物質中最も強力な血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつである。
エンドセリンは３種のイソペプチド、エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３からなるファミリーを形成する。いずれのイソペプチドも２１残基のアミノ酸からなるペプチドである。エンドセリン−１（ＥＴ−１）のｃＤＮＡをクローニングすることにより、その塩基配列からエンドセリンの前駆体の構造が明らかにされている。（Nature,332、411-415(1988)参照）。
一方、エンドセリンレセプターとしてはエンドセリン−１に特異的なＡ型受容体とエンドセリンの３種のイソペプチドに対して非特異的なＢ型受容体の２種類が知られており、ｃＤＮＡのクローニングによりそのアミノ酸配列も推定されている（Biochem.Biophys.Res.Commun., 180,1265-1272(1991)、Biochem.Biophys.Res.Commun., 177, 34-39(1991)参照）。しかし、エンドセリンが結合する部位や立体構造は不明である。
エンドセリンは血管内皮細胞のみならず、神経細胞や尿細管上皮細胞など多くの細胞で合成されることが知られている。また高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の患者では血中エンドセリン濃度の上昇が報告されている。
エンドセリンに特異的に結合し、その活性を抑制する物質の研究はエンドセリンの病態生理的役割の解明の一助となるばかりでなく、上記疾患の診断および治療薬の開発にもつながることが期待される。
エンドセリンに特異的な親和性を有し、その活性を直接抑制する物質として、抗ＥＴ−１抗体が知られている。エンドセリンの測定はこの抗体を用いたＲＩＡ法やＥＩＡ法によって行われている。また、当該抗体を用いて多くの臓器におけるＥＴ−１の生理活性を直接的に修飾あるいは抑制させることが報告されている（特開平２−２３８８９４号公報）。しかし、抗ＥＴ−１抗体以外には、エンドセリンに特異的な親和性を有する物質として満足のゆくものが未だ得られていない。
あるペプチド(ペプチドＩ)をコードするＤＮＡ鎖あるいはｍＲＮＡ鎖に対する相補的なＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖を構成する遺伝コドンによって規定されるアミノ酸を当該遺伝コドンの配列順に従って配列することにより得られたペプチドIIが元のペプチドIに対して親和性を有することがアンジオテンシン(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2518-2522(1988))、黄体形成ホルモン放出ホルモン(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,9714-9718(1986))、副腎皮質刺激ホルモン(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1372-1375(1985))等で報告されている。この知見に基づき、あるペプチドに対して親和性を有するペプチドの分子設計法として、ＤＮＡの非解読鎖あるいは相補ＲＮＡ鎖配列により規定される相補的ペプチドを得る方法がブラロックにより特表昭６２−５０２５１３号に開示されている。
従来技術の問題点
抗体分子は生体由来の生合成蛋白であるため、保存安定性上の問題や、抗体取得時の精製の煩雑さによるコスト高の問題、抗体を産生する生物個体あるいは継代細胞が変わり、抗体の分子種が変化することによる安定供給性の問題等がある。また抗体を生体に投与する場合には、免疫原性の問題や、消化酵素による分解のための活性低下の問題もある。
エンドセリンと高い親和性を有する低分子物質の開発が望まれており、その検索が盛んに行われているが、候補物質としての主流は土壌細菌等の培養液を用いるという、偶然性に頼ったものがほとんどである。
一方、ペプチドをコードするｃＤＮＡやｍＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖を解読してそのアミノ酸配列により相補的な配列から得られるペプチドも、目的とする親和性を必ずしも示すとは限らない（Biochem.J.,261,310-311(1989)参照）。
本発明はエンドセリンと高い親和性を有し、その活性を抑制する低分子のペプチドを提供することを目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するため、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列およびエンドセリンのレセプターのアミノ酸配列両方の情報をもとに、より高い親和性を有するペプチドをより高い確率で得るための分子設計を行い、エンドセリンの活性を抑制するペプチド群を得た。
すなわち本発明は、ヒトのエンドセリン前駆体のｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列とヒトのエンドセリンレセプターのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列とを比較し、アミノ酸レベルで少なくとも８０％相補的な関係になっている部分のヒトエンドセリンレセプターのアミノ酸配列を含有するペプチドおよびその高分子または高分子蛋白との結合物に関する。
相補的なペプチドとは、一般には図１に示すごとく生理活性を有するペプチド（センスペプチド）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの対合鎖によってコードされるアミノ酸配列を有するペプチド（アンチセンスペプチド）をいう。本明細書においては、相補的な関係をアミノ酸レベルで検索するため、例えばアミノ酸Ａをコードするコドンが複数個ある場合、各コドンに対するアンチコドンがコードするアミノ酸すべてをアミノ酸Ａと「相補的な関係にある」アミノ酸とする。各アミノ酸に対する相補的なアミノ酸を表１に示す。なお、本明細書においてアミノ酸残基は通常当分野で用いられる一文字表記にて記載した。アミノ酸は特に断らない限り、Ｌ−アミノ酸を示す。
アミノ酸レベルで相補的なアミノ酸
0003923515.tif 000002
ヒトエンドセリン前駆体は、エンドセリン−１のｃＤＮＡのクローニングにより、そのアミノ酸配列が知られている（Nature、332、411-415(1988)）。一方、ヒトエンドセリンレセプターはＡ型受容体およびＢ型受容体の２種類あることが知られており、そのｃＤＮＡもクローニングされているが、活性部位や立体構造等は不明である。本発明のペプチドの分子設計においては、エンドセリン−１に特異的なＡ型受容体をコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列（Biochem. Biophys. Res. Commun., 180,1265-1272(1991)参照）を用いた。
本発明においては、ヒトエンドセリン前駆体のアミノ酸配列とヒトエンドセリンレセプターのアミノ酸配列を以下の手法で比較して、両者がアミノ酸レベルで少なくとも８０％相補的な関係になっている部分のヒトエンドセリンレセプターのアミノ酸配列を得る。まず、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列のＮ末端から１０残基、すなわち１番から１０番までのアミノ酸配列からなるフレームを上記のエンドセリンレセプターの全アミノ酸配列と比較し、８個以上が表１に示す相補的な関係にある部分をエンドセリンレセプターのアミノ酸配列上から選択する（図２参照）。次に、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列上のフレームを１残基Ｃ末端側へ移動し、次の１０残基、すなわち２番から１１番までのアミノ酸配列をフレームとして、エンドセリンレセプターの全アミノ酸配列と比較し、８個以上が表１に示す相補的な関係にある部分をエンドセリンレセプターのアミノ酸配列上から選択する。同じ操作を、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列上のフレームの位置を１残基ずつずらして繰り返し、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列に対して、８０％以上のアミノ酸が表１に示す相補的な関係にある部分をエンドセリンレセプターのアミノ酸配列上から選択する。
本発明において、アミノ酸レベルで少なくとも８０％が相補的な関係になっている部分とは、エンドセリン前駆体のアミノ酸配列の１個のフレームに対してのみ相補的な関係にある部分と、図３のごとく複数のフレームに対して相補的な関係にある部分がオーバーラップしている部分の両方が含まれる。このようなアミノ酸配列を有するペプチドはエンドセリンに対して高い親和性を有することが期待される。
上記の方法で得られた好ましいアミノ酸配列を以下に示す。なお、番号はそれぞれ配列表の番号を示す。
Ｃ１：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ
Ｃ２：ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ
Ｃ３：ＱＧＩＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ
Ｃ４：ＩＡＤＮＡＥＲＹＳＡＮＬＳＳＨＶ
Ｃ５：ＦＬＧＴＴＬＲＰＰＮＬＡＬＰ
Ｃ６：ＬＮＲＲＮＧＳＬＲＩＡＬＳＥＨＬＫＮＲＲＥＶＡ
本発明のペプチドには上述のＣ１ペプチドの類縁体も含まれる。すなわち、以下の配列：
ＡＬＳＶＤ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）ＡＶＡＳＷ
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）
を含有するペプチドである。かかるペプチドもまた、エンドセリンの活性を抑制する効果を示す。
好ましいペプチドとしては、Ｃ１ペプチドの末端をアミド体としたもの、および当該末端アミド体の配列中、特定のアミノ酸のいずれか１つをグリシンで置換したものが挙げられる。具体的には以下の配列が好ましい：
Ｃ１１：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
Ｃ１２：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＧＳＲＶＩ−ＮＨ2
Ｃ１３：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＧＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
Ｃ１４：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＧＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
Ｃ１５：ＶＬＮＬＧＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2
上記式および以下の式において、「−ＮＨ2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化された化合物を示す。
また、Ｃ１ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸を除去したペプチド、およびその配列中のアミノ酸の一部を置換したものも好適に用いられる。具体的には以下に示す配列が好ましい。
0003923515.tif 000003
【図面の簡単な説明】
図１：相補的なペプチドを示す概念図である。
図２：本発明のペプチドのアミノ酸配列の検索方法を示す概念図である。
図３：エンドセリンレセプター上のエンドセリン前駆体との相補的な関係を有する部位を示す概念図である。
図４：エンドセリン−１の添加による細胞内カルシウム濃度の変化を示すグラフである。
図５：本発明のペプチドＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５の、エンドセリン−１による細胞内カルシウム濃度上昇の抑制作用を示すグラフである。
図６：本発明のペプチドＣ３−ＭＡＰ、Ｃ４−ＭＡＰ、Ｃ６−ＭＡＰの、エンドセリン−１による細胞内カルシウム濃度上昇の抑制作用を示すグラフである。
図７：本発明のペプチドＣ１の、エンドセリン−１による細胞内カルシウム濃度上昇の抑制作用を示すグラフである。
図８：本発明のペプチドＣ１−ＭＡＰの、エンドセリン−１による細胞内カルシウム濃度上昇の抑制作用を示すグラフである。
図９：本発明のペプチドＣ３−ＭＡＰの、エンドセリン−１による細胞内カルシウム濃度上昇の抑制作用を示すグラフである。
図１０：本発明のペプチドＣ１〜Ｃ６の、エンドセリン−１による血管平滑筋収縮の抑制作用を示すグラフである。
図１１：本発明のペプチドＣ１−ＭＡＰ〜Ｃ６−ＭＡＰの、エンドセリン−１による血管平滑筋収縮の抑制作用を示すグラフである。
図１２：本発明のペプチドＣ１１〜Ｃ１８の、エンドセリン−１による血管平滑筋収縮の抑制作用を示すグラフである。
符号の説明
１：ヒトエンドセリンレセプターのアミノ酸配列、２：エンドセリンレセプターとアミノ酸レベルで８０％以上相補的な関係にあるヒトエンドセリン前駆体のアミノ酸配列のフレーム、３：本発明のペプチドに含有されるアミノ酸配列
発明を実施するための形態
本発明のエンドセリン活性抑制剤は、好ましくは少なくとも上記Ｃ１〜Ｃ６およびＣ１１〜Ｃ１８のいずれかのアミノ酸配列を含有する。本発明のペプチドは上記のアミノ酸配列単独からなるものであっても、このアミノ酸配列の繰り返し部分を有するポリペプチドであってもよい。
本発明のペプチドを医薬あるいは診断薬として用いる場合、治療上あるいは診断上担体に結合させることによりその効果および性能を向上させるため、上記ペプチドにさらに高分子または高分子蛋白と結合させた結合物として用いてもよい。高分子としてはラテックス粒子、アガロース樹脂、アクリルアミド樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ−Ｌ−リジン等が例示される。高分子蛋白としてはヒトアルブミン、牛血清アルブミン、カサ貝ヘモシアニン、牛サイログロブリン等が例示される。
本発明のペプチドの合成は常法に基づいて行えばよい。ペプチドの合成方法としては、例えば固相法および液相法による化学合成が挙げられる。また、当該ペプチドを暗号化したＤＮＡ鎖を含むＤＮＡベクターを作成し、これによって培養細胞や細菌等を形質転換し、該形質転換体によりペプチドを生産させてもよい。
実施例
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
ペプチド合成
以下に示すペプチドＣ１〜Ｃ６およびＣ１１〜Ｃ１８を合成した：
0003923515.tif 000004
ペプチドＣ１〜Ｃ１８の合成はペプチドシンセサイザー（ＰＥＰＴＩＣＯＵＰＬＥＲ  ２２００：ベガ社製）を用い、固相法により行った。カルボキシ末端を有するぺプチドについては、ＰＡＭ樹脂を、アミド化された末端を有するペプチドについてはＭＢＨＡ樹脂を用いて合成した。得られたペプチド樹脂を無水フッ化水素により処理して樹脂からペプチドの切り出しおよび脱保護を行った後、酢酸−アセトニトリル−水（１：２：２）で抽出、高速液体クロマトグラフィーによる精製を行った。得られたペプチドは最終的にアミノ酸分析により確認した。
Ｃ末端にポリ−Ｌ−リジンを有するポリペプチドの合成
以下に示すペプチドＣ１−ＭＡＰ〜Ｃ６−ＭＡＰを合成した。
Ｃ１−ＭＡＰ：(ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
Ｃ２−ＭＡＰ：(ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
Ｃ３−ＭＡＰ：(ＱＧＩＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
Ｃ４−ＭＡＰ：(ＩＡＤＮＡＥＲＹＳＡＮＬＳＳＨＶ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
Ｃ５−ＭＡＰ：(ＦＬＧＴＴＬＲＰＰＮＬＡＬＰ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
Ｃ６−ＭＡＰ：(ＬＮＲＲＮＧＳＬＲＩＡＬＳＥＨＬＫＮＲＲＥＶＡ)8Ｋ4Ｋ2Ｋ−β−Ａｌａ−ＯＨ
合成はペプチドシンセサイザー（ＰＥＰＴＩＣＯＵＰＬＥＲ  ２２００）を用い、固相法により行った。得られたペプチド樹脂は無水フッ化水素処理により樹脂からの切り出しおよび脱保護を行い、８Ｍの尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて抽出後、透析により精製した。得られたポリペプチドはアミノ酸分析により確認した。
エンドセリンによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇の抑制
エンドセリンを培養細胞に添加すると、細胞内Ｃａ2+レベルが上昇することが知られている。マウス３Ｔ３細胞を用い、細胞内カルシウムイオン濃度の変化をエンドセリンの活性の指標として、本発明のペプチドによるエンドセリン活性の抑制作用を調べた。
１.細胞内カルシウムイオン濃度の測定
市販の３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ.ＣＣＬ９２）を常法に従ってフラスコ培養したものを用いた。フラスコ内壁に培養した培養細胞をトリプシン処理により集めたのち、Ｃａ2+を含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、Ｃａ2+フリーのＰＢＳ２００μｌに懸濁させ、最終濃度が１μＭとなるようにＣａ2+の蛍光指示薬であるＦＬＵＯ−３ＡＭ（和光純薬：１ｍＭのＤＭＳＯ溶液）を添加した。３７℃で１０分間インキュベートして細胞内に蛍光指示薬を取り込ませた。その後Ｃａ2+フリーのＰＢＳで３回洗浄し、緩衝液Ａ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ  ＭｇＣl2、１.２５ｍＭ  ＣａＣl2、１１ｍＭ  グルコース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）に０.２％牛血清アルブミンを添加したもの）にて懸濁し、約１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製した。
Ｃａ2+の流入による相対蛍光強度の増加はベクトンディッキンソン社製のＦＡＣＳｃａｎにて測定した。測定は約２０秒間ベースラインを測定した後に試験物質（エンドセリン等）を添加し、約８０秒間相対蛍光強度の時間変化を追跡して行った。
２.エンドセリン添加による細胞内カルシウムイオン濃度の増加
上記細胞懸濁液中に、エンドセリン−１を最終濃度が０.０１〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、相対蛍光強度の変化を観察した。図４に示した如く、エンドセリンの添加量が多いほど立ち上がり、すなわち反応が速く、エンドセリン濃度依存的に細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することが認められた。
３.本発明のペプチドによる細胞内カルシウムイオン濃度増加の抑制Ｉ
本発明のペプチドを蛍光試薬を取り込ませた細胞の懸濁液にそれぞれ２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、２０分間２５℃でプレインキュベートした。ここへ上記と同様にしてエンドセリン−１を１０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加し、８０秒間相対蛍光強度の変化を調べた。結果を図５および図６に示す。
図５〜６より、ペプチドＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ３−ＭＡＰ、Ｃ４−ＭＡＰおよびＣ６−ＭＡＰがそれぞれエンドセリン−１による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を抑制することが示される。
４.本発明のペプチドによる細胞内カルシウムイオン濃度増加の抑制II
エンドセリン−１のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（１０μｇ／ｍｌ）に各ペプチドをそれぞれ濃度が２００、４０、８、１.６、０.３μｇ／ｍｌとなるように添加し、２５℃で２０分間プレインキュベートした。
このエンドセリン−ペプチド混合溶液を細胞懸濁液にエンドセリン濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、８０秒間の相対蛍光強度の変化を調べた。結果を図７〜９に示す。
図より、ペプチドＣ１，Ｃ１−ＭＡＰ，Ｃ３−ＭＡＰがそれぞれエンドセリン−１による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を抑制することが示される。
エンドセリンによる血管収縮に対する本発明のペプチドの効果
エンドセリンには血管平滑筋を収縮させる作用があることが知られている。ラットの大腿動脈の血管平滑筋標本を用い、本発明のペプチドのエンドセリンの血管平滑筋収縮作用に対する効果を調べた。
オスWistarラット(２２０〜３５０ｇ、７〜９週齢)の大腿動脈を採取し、螺旋状に切り取って長さ２０ｍｍ、幅１.４ｍｍの標本を作成した。得られた標本を張力測定器にセットし、Krebs-Henseleit Bicarbonate（ＫＨＢ）緩衝液ＮａＣｌ  １１５.０ｍＭ；ＫＣｌ  ４.７ｍＭ；ＣａＣｌ2  ２.５ｍＭ；ＭｇＣl2  １.２ｍＭ；ＮａＨＣＯ3  ２５.０ｍＭ；ＫＨ2ＰＯ4  １.２ｍＭ；デキストロース  １０.０ｍＭ、ｐＨ７.５、３７℃、９５％Ｏ2  ５％ＣＯ2ガスでバブリング）２０ｍｌ中に浸漬した。静止張力として５００ｍｇを負荷した。標本の収縮能を、終濃度が４０ｍＭになるようＫＣｌを緩衝液に添加して確認し、緩衝液で標本を洗浄した後、以下の試験に供した。
まずエンドセリン−１を最終濃度が１０-9Ｍとなるように緩衝液へ添加した。収縮が一定となったところで本発明のペプチドを累積的に添加し、血管の弛緩を調べた。最終的に平滑筋弛緩剤であるパパベリンを、濃度が１０-4Ｍとなるよう添加して組織を完全に弛緩させ、これを弛緩率１００％として各濃度のペプチドの弛緩率を求めた。
結果を図１０〜１２に示す。本発明のペプチドはエンドセリンにより誘起された血管平滑筋収縮に対し、強い弛緩作用を示すことがわかる。
産業上の利用可能性
本発明のペプチドは化学合成することができるため抗体に比べて安価で供給でき、コストが抑えられ、安定した品質のエンドセリン抑制剤を供給することができる。また、本発明のエンドセリン抑制剤は比較的低分子のペプチドであるため、エンドセリンの検出試薬のみならず、エンドセリンの関与する種々の疾患の有用な治療薬となり得る。
配列表
配列番号：Ｃ１
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000005
配列番号：Ｃ２
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000006
配列番号：Ｃ３
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000007
配列番号：Ｃ４
配列の長さ：１６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000008
配列番号：Ｃ５
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000009
配列番号：Ｃ６
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000010
配列番号：Ｃ１２
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000011
配列番号：Ｃ１３
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000012
配列番号：Ｃ１４
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000013
配列番号：Ｃ１５
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000014
配列番号：Ｃ１６
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
0003923515.tif 000015
配列番号：Ｃ１７
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bond s
存在位置：1..15
配列
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配列番号：Ｃ１８
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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