(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FAS-Rの細胞内ドメインに結合するタンパク質であるMORT-1、またはp55-TNF-Rの細胞内ドメインに結合するTRADDに結合するタンパク質であるMORT-1に結合する配列番号５の１〜182残基を含む配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載のDNA配列を含むベクター。
【請求項３】
真核宿主細胞で発現することができる請求の範囲第２項記載のベクター。
【請求項４】
原核宿主細胞で発現することができる請求の範囲第２項記載のベクター。
【請求項５】
請求の範囲第２項記載のベクターを含む形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞。
【請求項６】
MORT-1に結合するポリペプチドの製造法であって、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求の範囲第５項記載の形質転換された宿主細胞を増殖すること、および発現したポリペプチドを単離することからなる製造法。
【請求項７】
請求の範囲第１項記載のポリペプチドが、MORT-1に結合する未変性のタンパク質である請求の範囲第１項記載のDNA配列。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載のDNA配列が、MORT-1に結合する未変性のタンパク質をコードする請求の範囲第１項記載のDNA配列。
【請求項９】
前記請求の範囲第１項記載のポリペプチドが、MACHα1、MACHα2、MACHβ1、MACHβ3およびMACHβ4より選ばれたMACHのアイソフォームであるポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載のDNA配列。
【請求項１０】
MACHアイソフォームが、配列番号７、配列番号５および配列番号８のアミノ酸配列をそれぞれ有するMACHα1、MACHβ1およびMACHβ3である請求の範囲第９項記載のDNA配列。
【請求項１１】
MACHアイソフォームが、配列番号７のアミノ酸配列を有するMACHα1である請求の範囲第９項記載のDNA配列。
【請求項１２】
MACHアイソフォームが、配列番号５のアミノ酸配列を有するMACHβ1である請求の範囲第９項記載のDNA配列。
【請求項１３】
MACHアイソフォームが、配列番号８のアミノ酸配列を有するMACHβ3である請求の範囲第９項記載のDNA配列。
【請求項１４】
FAS-Rの細胞内ドメインに結合するタンパク質であるMORT-1、またはp55-TNF-Rの細胞内ドメインに結合するTRADDに結合するタンパク質であるMORT-1に結合する配列番号７の１〜182および221〜479残基を含む配列を有するポリペプチドであって、FASリガンドがその受容体に結合することまたはTNFがp55-TNF-Rに結合することにより開始される細胞内シグナリングプロセスに影響を与える該ポリペプチドをコードするDNA配列。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項記載のポリペプチドが、MORT-1に結合する未変性のタンパク質であり、かつFASリガンドがその受容体に結合することまたはTNFがp55-TNF-Rに結合することにより開始される細胞内シグナリングプロセスに影響を与える未変性のタンパク質である請求の範囲第１４項記載のDNA配列。
【請求項１６】
請求の範囲第１４項記載のポリペプチドが、MACHα1およびMACHα2、より選ばれたMACHのアイソフォームである請求の範囲第１４項記載のDNA配列。
【請求項１７】
前記請求の範囲第１４項記載のDNA配列が、MORT-1に結合する未変性のタンパク質をコードしており、かつFASリガンドがその受容体に結合することまたはTNFがp55-TNF-Rに結合することにより開始される細胞内シグナリングプロセスに影響を与える請求の範囲第１４項記載のDNA配列。
【請求項１８】
請求の範囲第１７項記載のDNA配列が、MACHα1およびMACHα2、より選ばれたMACHのアイソフォームをコードする請求の範囲第１７項記載のDNA配列。
【請求項１９】
MORT-1タンパク質に結合する単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号５の１〜182残基を含む配列を有するポリペプチド。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項記載の配列が、MACHα1、MACHα2、MACHβ1、MACHβ3およびMACHβ4より選ばれたMACHのアイソフォームである請求の範囲第１９項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
請求の範囲第１９項記載の配列が、MACHα1、MACHβ1またはMACHβ3である請求の範囲第１９項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
請求の範囲第１９項記載の配列が、MACHα1である請求の範囲第１９項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求の範囲第１９項記載の配列が、MACHβ1である請求の範囲第１９項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求の範囲第１９項記載の配列が、MACHβ3である請求の範囲第１９項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
請求の範囲第１９項記載の配列を有する単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、TNF／NGF受容体スーパーファミリーに属する受容体およびそれらの生物学的機能を制御する分野に一般的に関する。TNF／NGF受容体スーパーファミリーは、p55腫瘍壊死因子受容体およびp75腫瘍壊死因子受容体（TNF-Rs、以下p55-Rおよびp75-Rという）、FASリガンド受容体（FAS／APO1またはFAS-Rともいわれ、以下FAS-Rという）ならびにそのほかのものなどの受容体を含む。詳しくは、本発明は、タンパク質MORT-1（またはFADD）に結合する新規なタンパク質類に関し、さらに詳しくは、前記MORT-1結合タンパク質類のうちの１種であり、本明細書でMACHと命名したタンパク質に関する。
したがって、本発明は一般に、MORT-1またはMORT-1に直接または間接的に結合する、ほかのタンパク質の機能をモジュレートまたは媒介することができる新しいタンパク質に関する。とくに、本発明は、MACH、その製造およびその使用ならびにMACHの各種の新規なアイソフォーム、その製造および使用に関する。
背景技術
腫瘍壊死因子（TNF-α）およびリンホトキシン（TNF-β）（以下、TNFはTNF-αおよびTNF-βの両者を意味する）は、単核食細胞によっておもに形成される多機能な前炎症性（pro-inflammatory）サイトカイン類であり、細胞に多大な影響を及ぼす（Wallach,D.（1986）In:Interferon7（Ion Gresser, ed.）, pp.83-122, Academic Press, London;and Beutler and Cerami（1987））。TNF-αとTNF-βの両者は、特定の細胞表面受容体に結合することによってそれらの効果を開始する。その効果のうちのいくつかは生物にとって利益になるようである。たとえば、それらは腫瘍細胞またはウイルス感染した細胞を破壊することができ、顆粒球の抗菌活性を増大させることができる。このように、腫瘍や感染源に対する生物の防御にTNFは寄与し、かつ損傷からの回復に寄与する。TNFは抗腫瘍剤として用いることができ、その適用の際にはTNFが腫瘍細胞の表面のその受容体に結合し、それによって腫瘍細胞を死へと導く出来事が始まる。TNFは抗感染薬としても用いることができる。
しかしながら、TNF-αとTNF-βの両者は有害な効果も有する。過剰に産生されたTNF-αは数種の疾患において主たる病原の役割をすることがありうる、という証拠がある。たとえば、TNF-αの効果、主として血管系に対する効果は敗血症性ショック症状の主たる原因である、と現在のところ知られている（Tracey et al., 1986）。いくつかの疾患では、TNFは脂肪細胞の活性を抑制することおよび食欲不振を引き起こすことにより体重の過剰損欠（悪液質）を引き起こす可能性があり、そのためにTNF-αはカケクチンと呼ばれていた。TNFはリウマチ様疾患においては組織に対する損傷のメディエータとして（Beutler and Cerami, 1987）、移植片対宿主反応においては観察される損傷の主たるメディエーターとして（Piquet et al., 1987）も記載されていた。さらに、TNFは炎症の過程およびほかの多くの疾患と関係することが知られている。
２種の明らかに独立して発現される受容体、p55およびp75TNF-Rsは、TNF-αとTNF-βの両者に特異的に結合し、前述のTNFの生物学的効果を開始および／または媒介する。これらの２種の受容体は構造的に似ていない細胞内ドメインを有するが、それはそれらが異なるシグナリングをすることを示唆している（Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et al., 1990参照）。しかしながら、細胞のメカニズム、たとえばp55およびp75TNF-Rsの細胞内シグナリングに関係する様々なタンパク質やおそらくはほかの因子類は、まだ今のところ解明されていない。リガンド、すなわちTNF（αまたはβ）が受容体に結合したのちに通常生じることがこの細胞内シグナリングである。それは反応のカスケードの開始に関与し、その結果TNFに対して観察される細胞の応答が生ずる。
前述のTNFの細胞致死性効果に関しては、これまでに研究されたたいていの細胞ではこの効果はp55TNF-Rによっておもに引き起こされる。p55TNF-Rの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン）に対する抗体は、それら自身が細胞致死性効果を引き起こすことができ（EP 412486参照）、その効果はこれらの抗体による受容体の架橋の有効性と相互関係を示すが、細胞内シグナリングプロセスの発生の第１段階であると信じられている。さらに、突然変異の研究（Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993）によれば、p55TNF-Rの生物学的機能はその細胞内ドメインの完全さに依存することが示されており、したがって、TNFの細胞致死性効果を導く細胞内シグナリングの開始は、p55TNF-Rの２またはそれより多くの細胞内ドメインの会合の結果として生ずる、ということが示唆されている。さらには、TNF（αおよびβ）はホモトリマーとして存在し、かつそれだけで、受容体分子に対するその結合能および架橋能、すなわち受容体の凝集を生じさせる能力によって、p55TNF-Rを介する細胞内シグナリングを誘導すると示唆されている。
TNF／NGF受容体スーパーファミリーのほかのメンバーは、Fas抗原とも言われ、様々な組織に発現される細胞表面タンパク質であり、そしてTNF-RおよびNGF-Rを含む多数の細胞表面受容体と相同性を共有するFAS受容体（FAS-R）である。FAS-Rはアポトーシスの形態での細胞死を媒介し（Itoh et al., 1991）、自己反応性Ｔ細胞のネガティブセレクターとして働く、すなわちＴ細胞の成熟の間にFAS-Rは自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシスによる死（apoptopic death）を媒介するようである。また、FAS-R遺伝子（1pr）の突然変異により、ヒト自己免疫疾患全身性エリテマトーデス（SLE）に似ているマウスのリンパ球分裂疾患が生ずるということも見出されている（Watanabe-Fukunaga et al., 1992）。FAS-Rのリガンドは数ある中でもキラーＴ細胞（または細胞傷害性Ｔリンパ球−CTLs）によって担持される細胞表面関連分子であると考えられており、したがって、前記CTLsがFAS-Rを担持する細胞に接触すると、それらはFAS-Rを担持する細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することができる。さらに、FAS-Rに特異的なモノクローナル抗体が作製されたが、このモノクローナル抗体は、ヒトFAS-RをコードするcDNAによって形質転換されたマウス細胞を含む、FAS-R担持細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することが可能である（Itoh et al., 1991）。
リンパ球のいくつかの細胞傷害効果は、リンパ球産生リガンドと広く存在している細胞表面受容体FAS-R（CD95）（細胞死をトリガーする性能を有する）との相互効果によって媒介されるが、Ｔリンパ球を除くほかの各種正常細胞がその表面にFAS-Rを発現し、この受容体のトリガリングによって殺されうることも見出されている。このようなキリング・プロセス（killing process）が制御されずに誘導されることは、特定の疾患における組織の破壊、たとえば急性肝炎における肝細胞の破壊の原因になっていると推定される。したがって、FAS-Rの細胞傷害活性を抑制する方法を見出すことにより、治療効果をえることができるであろう。
反対に、ある悪性細胞およびHIV感染細胞がそれらの表面にFAS-Rを担持することも見出されているので、FAS-Rを介する細胞傷害性効果をこれらに引き起こすためにFAS-Rに対する抗体またはFAS-Rリガンドが用いられてもよく、それによってそのような悪性細胞やHIV感染細胞と戦う手段が提供されてもよい（Itoh et al., 1991参照）。したがって、FAS-Rの細胞傷害性活性を増大するためのほかの方法を見出すことにより、さらに治療が可能になるかもしれない。
TNF（αまたはβ）およびFAS-Rリガンドに対する細胞の応答、たとえば前述の病理学的な状態における細胞の応答をモジュレートする方法を提供することは長い間必要であると考えられている。TNFまたはFAS-Rリガンドが過剰に発現されているばあいは、TNFまたはFAS-Rリガンドによって誘導される細胞致死性効果を抑制することが望まれ、一方ほかの状態、たとえば創傷を治癒させたいばあいは、TNF効果を増大することが望ましく、腫瘍細胞またはHIV感染細胞におけるFAS-Rのばあいは、FAS-Rが媒介する効果を増大することが望ましい。
細胞表面に結合しているTNF-RsへのTNFの結合を競合させるために、抗TNF抗体または可溶性TNF受容体（本質的には受容体の可溶性細胞外ドメインである）を用いてTNFのその受容体に対する結合を抑制し、TNFの有害な効果を調節するよう、多くのアプローチが本件出願人らの研究所で行なわれている（たとえば、European Application Nos. EP 186833、EP 308378、EP 398327およびEP 412486参照）。さらに、TNFによって誘導される細胞の効果のためにはTNFがその受容体に結合することが必要であるということにもとづいて、本件出願人らの研究所によるアプローチ（たとえばEPO 568925参照）は、TNF-Rsの活性をモジュレートすることによりTNF効果をモジュレートするよう行なわれている。
要するに、EPO 568925はTNF-Rｓにおけるシグナル伝達および／または切断（cleavage）をモジュレートする方法に関し、その方法によればペプチドまたはほかの分子が受容体それ自身またはその受容体と相互に作用するエフェクタータンパク質のいずれかと相互に作用してTNF-Rsの正常な機能をモジュレートする。EPO 568925にはp55TNF-Rの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに変異を有する様々なp55TNF-Rsの変異体の構築および特徴付けが記載されている。ここではp55TNF-Rの前記ドメンイン内の領域が受容体を機能させること、すなわちリガンド（TNF）の結合およびそれに引き続くシグナル伝達ならびに細胞内シグナリング（これにより最終的に細胞にTNF効果が観察されることになる）、に不可欠であるとして同定された。さらに、TNF-Rの前記ドメインの様々な領域に結合することのできるタンパク質、ペプチドまたはほかの因子（そのタンパク質、ペプチドおよびほかの因子はTNF-Rの活性の調節またはモジュレートに関係してもよい）を単離し、同定するための多くのアプローチも記載されている。そのようなタンパク質およびペプチドをコードするDNA配列を単離し、クローニングするための多くのアプローチ、これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構築するための多くのアプローチそしてTNF-RとまたはTNF-Rの様々の領域に結合する前記タンパク質およびペプチドと相互に作用する抗体またはそれらのフラグメントを作製するための多くのアプローチもまたEPO 568925に記載されている。しかしながら、EPO 568925はTNF-Rs（たとえばp55TNF-R）の細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドを特定しておらず、TNF-Rsの細胞内ドメインに結合するそのようなタンパク質またはペプチドを単離し、同定するための酵母ツーハイブリッドアプローチも記載されていない。同様に、FAS-R細胞内ドメインに結合することができるタンパク質またはペプチドについてはこれまでのところ開示されていない。
このように、TNFの効果またはFAS-Rリガンドの効果を阻害することが望まれているばあいは、細胞表面でのTNF-RsかFAS-Rの量または活性を低下させることが望ましく、増大されたTNFまたはFAS-Rリガンドの効果が求められるばあいは、TNF-RsまたはFAS-Rの量または活性を増大することが望ましい。これまでのところ、p55TNF-Rおよびp75TNF-Rの両者のプロモーターが配列決定され、分析されて、様々な転写調節因子に特定のキー配列（key sequence）モチーフが多数わかっている。そして、これらのTNF-Rsの発現自体はそれらのプロモーターレベルで調節されることができる。すなわち受容体の数を減少させるためにはプロモーターからの転写を抑制し、受容体の数を増加させるためにはプロモーターからの転写を増大する（EP 606869およびWO 9531206参照）。これに対応する、FAS-R遺伝子のプロモーターレベルでのFAS-Rの調節に関する研究は、これまでのところ報告されていない。
腫瘍壊死因子（TNF）受容体およびその構造的に関連する受容体FAS-Rは、リンパ球が産生するリガンド類によって刺激されると、それら自身の活動停止を導く分解活性を細胞に引き起こすということは既知であるが、このトリガーのメカニズムは依然理解されていない。突然変異の研究によれば、FAS-Rおよびp55TNF受容体（p55-R）において細胞傷害性のためのシグナリングは、それらの細胞内ドメイン内の別々の領域に関係するということが示されている（Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993）。これらの領域（「デス・ドメイン」）には配列に類似性がある。FAS-Rおよびp55-Rの両者の「デス・ドメイン」は自己会合をする傾向がある。それらの自己会合は、シグナリングの開始に必要な受容体の凝集を明らかに促進し（Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995参照）、受容体の発現レベルが高いとリガンド−非依存性シグナリングを引き起こすことにもなりうる（Boldin et al., 1995）。
このように、WO 9531544および本発明以前には、TNFまたはFAS-Rリガンドの細胞に対する効果のようなTNF／NGFスーパーファミリーに属するリガンドの効果を、細胞内シグナリングプロセス（そのシグナリングはTNF／NGF受容体スーパーファミリーに属する受容体類の細胞内ドメイン類（ICs）、たとえばFAS-ICやTNF-Rsの細胞内ドメイン類、すなわちp55TNF-R細胞内ドメインおよびp75TNF-R細胞内ドメイン（それぞれp55ICおよびp75IC）などによって大きく支配されていると考えられている）を介して調節するであろうタンパク質は提供されていなかった。
リンパ球の細胞傷害効果のいくつかは、リンパ球が産生するリガンドと細胞死をトリガーする性能を有し広く存在する細胞表面受容体であるFAS-R（CD-95）との相互効果によって媒介される（Nagata and Golstein, 1995参照）。単核食細胞による細胞キリング（killing）には、リガンド−受容体のカップル、すなわちTNFとその受容体p55-R（CD120）のカップルが関与し、このカップルはFAS-Rとそのリガンドのカップルと構造が類似している（Vandenabeele et al., 1995参照）。受容体で誘導されるほかの効果と同様に、TNF受容体やFAS-Rによる細胞死の誘導は、一連のタンパク質−タンパク質の相互作用を介して起こり、その相互作用によって、リガンドと受容体が結合して最終的に酵素のエフェクター機能が活性化され、これらの特定の受容体の場合は細胞死に至る。以前の研究によって、細胞死のシグナリングを開始する非酵素的なタンパク質−タンパク質の相互作用が解明されている。すなわち、三量体のTNFまたはFAS-Rリガンド分子と受容体とが結合し、それら受容体の細胞内ドメイン間に起こる相互作用（Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993）がデス・ドメインのモチーフが自己結合する傾向によって増大し（Boldin et al., 1995a）、そして２種の細胞質タンパク質（これらのタンパク質は互いに結合することもできる）の受容体細胞内ドメインとの結合、すなわちMORT-1（またはFADD）とFAS-Rとの結合（Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995）およびTRADDとp55-Rとの結合（Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996）が誘導される。
相同な領域の異種会合（hetero-association）を通じて行われる受容体による細胞死誘導に関与している「デス・ドメイン」領域でFAS-Rとp55-Rの細胞内ドメインに結合し、かつ独立して細胞死もトリガーできる３種のタンパク質が、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法（yeast two-hybrid screening procedure）によって確認された。これらのタンパク質のうちの１つがFADD（Chinnaiyan et al., 1995）としても知られているMORT-1（Boldin et al., 1995b）であり、FAS-Rと特異的に結合する。２つ目のタンパク質TRADD（Hsu et al., 1995, 1996も参照）はp55-Rと結合し、そして３つ目のタンパク質RIP（Stanger et al., 1995も参照）はFAS-Rとp55-Rの両者と結合する。これらタンパク質は、FAS-Rやp55-Rに結合する以外に、互いに結合することができ、FAS-RとP55-Rの間に機能的な「クロストーク」を提供する。これらの結合は保存配列のモチーフ（受容体とそれらに関連するタンパク質に共通する「デス・ドメイン・モジュール」）を通じて起こる。さらに、酵母ツーハイブリッド試験ではMORT-1はFAS-Rと自然発生的に結合することが分かったが、哺乳動物細胞では、この結合は受容体の刺激の後でしか起こらない。このことは、MORT-1がFAS-Rのシグナリングを開始する事象に関与していることを示唆している。MORT-1は、酵素活性の特徴である配列モチーフを全く含有していていないので、細胞死をトリガーするその能力は、MORT-1自体の固有の活性を必要とせず、むしろMORT-1に結合してシグナリングカスケードの下流にさらに働くある種のほかのタンパク質の活性化が必要のようである。MORT-1分子のＮ末端部分を欠いているMORT-1変異体が細胞で発現されると、FAS/APO1（FAS-R）またはp55-Rによる細胞傷害性の誘導が阻止されることが報告されており（Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996）、このことは、タンパク質−タンパク質相互作用による両受容体の細胞致死性効果のシグナリングをこのＮ末端領域が伝達することを示している。
最近の研究は、細胞質チオールプロテアーゼ類のグループが、セノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）プロテアーゼCED3および各種の生理学的細胞死のプロセスの開始時の哺乳動物インターロイキン−１β変換酵素（ICE）に構造が類似していることを示している（Kumar, 1995およびHenkart, 1996の総説）。また、このファミリーのプロテアーゼ（類）が、FAS-RとTNF-Rが誘導する細胞の細胞傷害性に関与しているかもしれないということを示すいくつかの徴候がある。これらプロテアーゼの特異的ペプチドインヒビターおよびこれらプロテアーゼの機能を阻止する、ウイルスにコードされた２種のタンパク質、牛痘タンパク質crmAとバキュロウィルスp35タンパク質、は前述の細胞の細胞傷害性に対して細胞を保護することが見出された（Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995）。CED/ICEファミリーのプロテアーゼ（類）によって見かけ上媒介されるある特定の細胞タンパク質の迅速な切断が、FAS-RまたはTNF-Rの刺激の後すぐに細胞内で観察された。関連する特定のCED3/ICE類縁プロテーゼ（類）の本質、または、前記受容体類によるこれらプロテアーゼの活性化の機構についての情報はこれまで全く提供されていない。
発明の要約
本発明の目的は、FAS-Rの細胞内ドメインにそれ自体が結合するMORT-1に結合することができ、FASリガンドがその受容体に結合することによって開始される細胞内シグナリングプロセスに影響を及ぼす新規なタンパク質を、そのすべてのアイソフォーム、類似体、フラグメントまたは誘導体を含めて提供することである。
本発明のほかの目的は、前記新規なタンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体に対するアンタゴニスト（たとえば、抗体、ペプチド、有機化合物またはさらなるいくつかのアイソフォーム）であり、前記シグナリングプロセス、さらに詳しくは細胞の細胞傷害性を、所望に応じて阻害するために使用できるアンタゴニストを提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記新規なタンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体を用いて、受容体の活性をモジュレートすることに関与している可能性のあるさらなるタンパク質または因子、たとえば前記新規なタンパク質を切断してそれらを生物学的に活性にするほかのプロテアーゼ類を単離して特徴付けすること、および／またはこれら新規なタンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体が結合して機能にも関与している、前記シグナリングプロセスのさらに上流のほかの受容体（たとえば、ほかのFAS-Rsまたは類縁の受容体）を単離し同定することである。
本発明のさらにほかの目的は、細胞内に導入されてMACHプロテアーゼに結合するかまたはMACHプロテアーゼと相互作用し、これらプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害することができるインヒビターを提供することである。
さらに、本発明の目的は、前記新規なタンパク質ならびにその類似体、フラグメントおよび誘導体を、それらに対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を製造するための抗原として使用することである。ついで、これらの抗体は、たとえば、細胞抽出物または形質転換された細胞系のような異なるソースから新しいタンパク質を精製するために使用することができる。
さらに、これらの抗体は、たとえば、FAS-Rまたはほかの類縁受容体によって媒介され、異常に機能する細胞の効果に関連する疾患を同定するなどの診断の目的に使用できる。
本発明のさらなる目的は、前記新規なタンパク質、またはその類似体、フラグメントもしくは類似体を含有してなる薬学的組成物、ならびに前記抗体もしくはほかのアンタゴニストを含有してなる薬学的組成物を提供することである。
本発明によって、FAS-Rの細胞内ドメインにそれ自体結合するMORT-1に結合できるかまたはそのMORT-1と相互作用できる新規なタンパク質MACHが発見された。MACHは、FASリガンドが細胞表面でFAS-Rに結合することによって開始される細胞死の経路のエフェクター成分としておそらく機能し、このことは、MACHのアイソフォームの少なくともいくつかが活性な細胞内プロテアーゼであると考えられることからいえる。CED3/ICEファミリーのプロテアーゼ類は、FAS-Rがトリガーするアポプトーシスプロセスに関与していた。MORT-1（またはFADD）は、受容体のFAS-Rが活性化されると、FAS-Rの細胞内ドメインに結合し、ついで本発明の新規なMACHタンパク質がMORT-1に結合する。本発明にしたがってクローン化されて特徴付けされたMACHタンパク質には、実際には多数のアイソフォームが存在し、それらアイソフォームのうちのいくつかは、タンパク質分解活性を有し（タンパク質分解ドメイン）かつ細胞内で発現されると細胞死を起こすCED3/ICE相同性領域を有している。したがって、この新規なCED3/ICＥ相同体（すなわち、タンパク質分解ドメインを有する各種のMACHアイソフォーム）をFAS-Rで活性化すると（MORT-1の相互作用を介して）、FAS-Rが媒介する細胞死経路のエフェクター成分が構成されるようである。
さらに、MACHは、細胞表面でTNFがp55-Rに結合することによって開始される細胞死経路のエフェクター成分としても機能するようであり、これは、MORT-1がTRADD（p55-Rの細胞内ドメインに結合するタンパク質Hsu et al., 1995））に結合し、続いてまたは同時にMACHがMORT-1に結合してMACHが活性化して細胞死の実施に関与する活性プロテアーゼになるという間接的な機構を介して行われるようである。
MACH、とくにMACHα1アイソフォームは、CED3/ICEプロテアーゼの機能に重要な配列の特徴のすべてを示すが、ユニークでおそらく組織／細胞に特異的な作用様式をMACHに付与するMACH自体に特有の配列の特徴をいくつか有していることにも注目すべきである。
MORT-1（「メディエーター・オブ・レセプター・トキシシティ（Mediator of Receptor Toxicity）」の略語、Boldin et al., 1995b、従来HF1と称されていた）は、FAS-Rの細胞内ドメインと結合することができる。このFAS-IC結合タンパク質は、細胞表面でのFAS-Rリガンドの結合に続いて通常起こる細胞内シグナリングプロセスを媒介またはモジュレートすることによって、細胞に対するFAS-Rリガンド効果のメディエーターまたはモジュレーターとして作用するようである。そのFAS-IC結合特異性に加えて、MORT-1はほかの特性をもっていることが分かった（実施例１参照）。たとえば、MORT-1はp55-TNF-RおよびFAS-Rの「デス・ドメイン」（DD）領域（p55-DDおよびFAS-DD）に相同な領域を有するので、自己会合することもできる。また、MORT-1はそれ自体に細胞の細胞傷害性、すなわちその自己会合特性におそらく関連する活性を活性化することができる。また、「デス・ドメイン」相同性配列を含有するMORT-1（HF1）のその領域（MORT-DD; MORT-1のＣ末端部分に存在している）が同時に発現すると、FAS-ICの「デス・ドメイン」に結合するその特性から予想されるように、FASが誘導する細胞死を強く阻害することが今ではわかっている。さらに同一の実験条件では、MORT-DD領域を含有しないMORT-1の部分（MORT-1のＮ末端部分、アミノ酸１〜117、「MORT-1ヘッド」）が同時に発現すると、FASが誘導する細胞死の阻害が起こらず、起こるにしても、FASが誘導する細胞の細胞傷害性をいくぶん高める程度であることがわかった。
したがって、MOＲT-1は細胞内シグナリングプロセスに関与するほかのタンパク質にも結合するようである。それゆえに、これらのMORT-1結合タンパク質は、MORT-1の活性を媒介またはモジュレートすることによって、細胞に対するFAS-Rリガンドの効果の間接的なメディエーターまたはモジュレーターとしても作用する；または、これらのMORT-1結合タンパク質は、前述のように、細胞の細胞傷害性を活性化する見かけ上独立した能力を有するMORT-1の活性を媒介またはモジュレートすることによって、MORT-1に関連する細胞内シグナリングプロセスのメディエーターまたはモジュレーターとして直接作用する。また、これらのMORT-1結合タンパク質は、MORT-1に関連するかもしくはFAS-Rに関連するシグナリングプロセスに関与しているか、またはほかの細胞内シグナリングプロセスの要素であるさらなるタンパク質、ペプチド、因子、抗体などを単離し、同定しついで特性付けを行う標準的なスクリーニング法のいずれかに使用することができる。このようなMORT-1結合タンパク質が単離され、本明細書に記載されている（実施例２と実施例３参照）。これらMORT-1結合タンパク質のうちの１つ、本明細書ではMACHと称する、が最初にクローン化され、配列決定され、ついで部分的に特徴付けされたところ、つぎの特性を有することが分かった。すなわち、MACHcDNAはORF-Bオープンリーディングフレームをコードする；MACHは非常に強くかつ特異的にMORT-1に結合する；MORT-1のMACH結合部位はMORT-1「デス・ドメイン」モチーフの上流に位置している；MACHのORF-B領域はそのMORT-1相互作用部分である；そしてMACHは自己会合することができかつそれ自体に細胞の細胞傷害性を誘導することができる。
MACHが実際には多数のアイソフォームで存在していることは、前述のように、本発明によって明らかになったことである。さらに、前記MACH ORF-Bは、事実、本明細書でMACHβ1と称するMACHアイソフォームの１つである（以下参照）。
したがって、本発明は、MORT-1に結合できるかまたはMORT-1と相互作用することができ、かつFAS-Rもしくはp55-TNF-Rによって媒介される細胞内効果を媒介できるタンパク質、その類似体もしくはフラグメントをコードするDNA配列を提供するものである。
とくに本発明は、
（a）未変性MORT-1結合タンパク質のコーディング領域由来のcDNA配列、
（b）中程度のストリンジェント条件下で（a）の配列とのハイブリダイゼーションが可能であり、かつ生物学的に活性なMORT-1結合タンパク質をコードするDNA配列、および
（c）前記（a）と（b）に定義されたDNA配列に対する遺伝暗号の結果として縮重し、かつ生物学的に活性なMORT-1結合タンパク質をコードするDNA配列
からなる群より選ばれたDNA配列を提供するものである。
本発明の前記DNA配列のほかの特定の実施態様は、本明細書で命名したMACHのアイソフォームであるMACHα1、MACHα2、MACHα3、MACHβ2、MACHβ1、MACHβ3、MACHβ4およびMACHβ5から選ばれたMACHタンパク質の少なくとも１つのアイソフォームをコードする配列の少なくとも一部分を含んでなるDNA配列である。
前述の本発明のDNA配列のほかの特定の実施態様は、
（a）配列番号７、５および８で示す各アミノ酸配列を有するMACHα1、MACHβ1およびMACHβ3ならびにそのいずれか１つの類似体とフラグメントから選ばれたMACHアイソフォーム、
（b）配列番号７で示すアミノ酸配列を有するMACHα1ならびにその類似体およびフラグメント、
（c）配列番号５で示すアミノ酸配列を有するMACHβ1ならびにその類似体およびフラグメント、
（d）配列番号８で示すアミノ酸配列を有するMACHβ3ならびにその類似体およびフラグメント、
をコードするDNA配列である。
本発明は、本発明の前記配列のいずれかによってコードされ、かつMORT-1に結合できるかまたはMORT-1と相互作用できて、FAS-Rまたはp55TNF-Rによって媒介される細胞内効果を媒介できるMORT-1結合タンパク質ならびにその類似体、フラグメントおよび誘導体を提供するものである。
本発明の特定の実施態様は、MACHα1、MACHα2、MACHα3、MACHβ1、MACHβ2、MACHβ3、MACHβ4およびMACHβ5からなる群のMACHの少なくとも１つのアイソフォームから選ばれ、そしてそのアミノ酸配列の少なくとも一部分を有するMORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体である。
また、本発明は、本発明の前記MORT-1結合タンパク質またはその類似体、フラグメントもしくは誘導体をコードし、本発明の前記DNA配列を含有し、適切な真核宿主細胞もしくは原核宿主細胞で発現することができるベクター；前記ベクターを含有する形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞；および本発明のMORT-1結合タンパク質、またはその類似体、フラグメントもしくは誘導体を発現させるのに適切な条件下で前記形質転換された宿主細胞を増殖させ、前記タンパク質をえるため必要に応じて前記タンパク質の翻訳後の修飾を行い、ついで前記形質転換細胞の培養培地または前記形質転換細胞の細胞抽出物から、前記発現されたタンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を抽出することによって本発明のMORT-1結合タンパク質またはその類似体、フラグメントもしくは誘導体を製造する方法を提供するものである。前記定義には、MACHタンパク質のすべてのアイソフォームを含むものとする。
ほかの観点において、本発明は、本発明のMORT-1結合タンパク質ならびにその類似体、フラグメントおよび誘導体に対して特異的な抗体またはその活性な誘導体もしくはフラグメントも提供するものである。
本発明は、ほかの観点に関していえば、本発明の前記DNA配列またはそのDNA配列がコードするタンパク質の各種用途を提供するものであり、それらの用途としてとりわけ下記の用途がある。
（i）FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞に対するFAS-RリガンドまたはTNFの効果をモジュレートする方法であって、FAS-Rの細胞内ドメインに結合するMORT-1に結合できるか、またはp55-Rの細胞内ドメインに結合するTRADDに結合するMORT-1に結合でき、その結果、前記FAS-Rまたはp55-TNF-Rの活性をモジュレート／媒介できる本発明の１またはそれより多くのMORT-1結合タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体で、前記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が、前記１またはそれより多くのタンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をそれを細胞内に導入するのに適切な形態で前記細胞中に導入すること、または前記１またはそれより多くのタンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするDNA配列を、この配列を担持する適切なベクターの形態で前記細胞中に導入することからなり、前記ベクターが、前記配列を前記細胞で発現する方法で前記配列を前記細胞に挿入することに効果を奏するモジュレート方法。
（ii）前記（i）にしたがってFAS-RリガンドまたはTNFの細胞に対する効果をモジュレートする方法であって、細胞の前記処理が、前記MORT-1結合タンパク質またはその類似体、フラグメントもしくは誘導体を細胞内に導入するのに適した形態で前記細胞中に導入するか、または前記MORT-1結合タンパク質またはその類似体、フラグメントもしくは誘導体をコードするDNA配列を、この配列を担持する適切なベクターの形態で前記細胞中に導入することからなり、前記ベクターが、前記配列を前記細胞で発現する方法で前記配列を前記細胞に挿入することに効果を奏するモジュレート方法。
（iii）前記細胞の前記処理法が前記細胞を組換え動物ウイルスベクターでトランスフェクトすることによる、前記（ii）に記載の方法であって、
（a）FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合できるウイルス表面タンパク質（リガンド）をコードする配列、および前記細胞で発現されると前記FAS-Rまたはp55-Rの活性をモジュレート／媒介することができる、MORT-1結合タンパク質ならびにその類似体、フラグメントおよび誘導体から選択されるタンパク質をコードする第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築するステップ、および
（b）前記細胞に前記（a）のベクターを感染させるステップ
からなる方法。
（iv）FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞に対するFAS-RリガンドまたはTNFの効果をモジュレートする方法であって、本発明の抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体で前記細胞を処理することからなり、前記処理が、前記抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体を含有する適切な組成物を前記細胞に適用する処理であり、前記細胞のMORT-1結合タンパク質またはその一部分が細胞外表面で露出される場合には、前記組成物は細胞外適用のために製剤化され、そして前記MORT-1結合タンパク質類が細胞内に存在する場合には、前記組成物が細胞内適用のために製剤化されるモジュレート方法。
（v）FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞に対するFAS-RリガンドまたはTNFの効果をモジュレートする方法であって、本発明のMORT-1結合タンパク質の配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で前記細胞を処理することからなり、前記オリゴヌクレオチド配列がMORT-1結合タンパク質の発現をブロックすることができるモジュレート方法。
（vi）腫瘍細胞またはHIV感染細胞またはほかの疾患の細胞を処理する前記（ii）に記載の方法であって、
（a）特定の腫瘍細胞の表面受容体またはHIV感染細胞の表面受容体またはほかの疾患の細胞が担持する受容体に結合できるウイルス表面タンパク質をコードする配列、および前記腫瘍細胞、HIV感染細胞またはほかの疾患の細胞で発現されると前記細胞を殺すことができる、本発明のMORT-1結合タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選択されるタンパク質をコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築すること、および
（b）前記腫瘍細胞またはHIV感染細胞またはほかの疾患の細胞に、前記（a）のベクターを感染させることからなる方法。
（vii）FAS-RリガンドまたはTNFの細胞に対する効果をモジュレートする方法であって、本発明のMORT-1結合タンパク質をコードする細胞mRNA配列と相互作用できるリボザイム配列をコードするベクターを、前記リボザイム配列が前記細胞で発現できる形態で前記細胞内に導入し、前記リボザイム配列が前記細胞で発現されると前記細胞mRNA配列と相互作用して前記mRNA配列を切断し、前記MORT-1結合タンパク質が前記細胞で発現するのを阻害するリボザイム法を適用することからなる方法。
（viii）配列をコードする前記MORT-1結合タンパク質が、MORT-1に特異的に結合して、つぎにFAS-ICに特異的に結合できるか、またはMORT-1に結合し、つぎにTRADDに結合し、さらにp55-ICに結合できる本発明のMACHアイソフォーム、そのいずれかの類似体、フラグメントおよび誘導体の少なくとも一つを含有してなる、本発明の方法から選択される方法。
（ix）MORT-1タンパク質に結合できる本発明のタンパク質類を単離し、同定する方法であって、前記MORT-1タンパク質をコードする配列が１つのハイブリッドベクターに担持され、そしてcDNAまたはゲノムDNAライブラリー由来の配列が第２のハイブリッドベクターに担持され、ついでこれらベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換し、陽性の形質転換細胞を単離し、続いて前記第２のハイブリッドベクターを抽出して前記MORT-1タンパク質に結合するタンパク質、すなわちMORT-1結合タンパク質をコードする配列をえる酵母ツーハイブリッド法を適用することからなる方法。
（x）前記MORT-1結合タンパク質が、本明細書でMACHα1と命名されたMACHアイソフォーム、その類似体、フラグメントおよび誘導体である前記（i）〜（ix）のいずれかに記載の方法。
（xi）前記MORT-1結合タンパク質が、本明細書でMACHβ1と命名されたMACHアイソフォーム、その類似体、フラグメントおよび誘導体である前記（i）〜（ix）のいずれかに記載の方法。
（xii）前記MORT-1結合タンパク質が、本明細書でMACHβ3と命名されたMACHアイソフォーム、その類似体、フラグメントおよび誘導である前記（i）〜（ix）のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、有効成分としてつぎのいずれか１つを含有する、FAS-RリガンドまたはTNFの細胞に対する効果をモジュレートする薬学的組成物を提供するものである。
（i）本発明のMORT-1結合タンパク質、ならびにその生物学的に活性なフラグメント、類似体、誘導体もしくは混合物、
（ii）細胞表面受容体に結合できるタンパク質をコードし、かつ本発明のMORT-1結合タンパク質または生物学的に活性なフラグメントもしくは類似体をコードする組換え動物ウイルスベクター、
（iii）本発明のMORT-1結合タンパク質の配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列であって、そのオリゴヌクレオチドが前記（ii）の組換え動物ウイルスベクターの第２の配列であるオリゴヌクレオチド配列。
また、本発明はつぎの諸方法を提供するものである。
Ｉ．細胞に対するMORT-1が誘導する効果またはMORT-1結合タンパク質が誘導する効果をモジュレートする方法であって、前記細胞を、前記（i）〜（xi）のいずれかの方法にしたがって、MORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントもしくは誘導体、またはMORT-1結合タンパク質、その類似体もしくはフラグメントをコードする配列で処理することからなり、前記処理によって、前記MORT-1が媒介する効果が増強または阻害され、その結果、FAS-RまたはP55-Rが媒介する効果も増強または阻害される方法。
II．前記MORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントもしくは誘導体が、MORT-1への結合に特異的に関与するMORT-1結合タンパク質の一部分もしくはMORT-1結合タンパク質自体であるか、または前記MORT-1結合タンパク質の配列が、MORT-1への結合に特異的に関与するMORT-1結合タンパク質の一部分もしくはMORT-1結合タンパク質自体をコードする前記方法。
III．前記MORT-1結合タンパク質がMACHα1、MACHβ1およびMACHβ3から選ばれたMACHアイソフォームのいずれかであり、前記MACHアイソフォームが、細胞に対するMORT-1関連効果を増強し、その結果、細胞に対するFAS-Rまたはp55-R−関連効果も増強することができる前記方法。
前記すべての説明およびつぎの詳細な説明から明らかなように、MACHは、MORT-1とは独立して細胞または組織を処理するのに使用することができる。MORT-1結合タンパク質の単離、それらの同定と特徴付けは、タンパク質類を単離し同定するのに使用される標準のスクリーニング法のいずれか、たとえば酵母ツーハイブリッド法、アフィニティークロマトグラフィー法、およびこの目的のため使用されるほかの公知の方法のいずれかによって実施することができる。
本発明のほかの観点および実施態様は以下の本発明の詳細な記載からも与えられる。
至る所で用いられるつぎの用語「FAS−リガンドまたはTNFの細胞への効果のモジュレーション」および「MORT-1またはMORT-1結合タンパク質の細胞への効果のモジュレーション」は、in vitroのみならずin vivoでの処理も包含するものであると理解される、ということを記載しておくべきである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験法で評価した、形質転換した酵母内でのMORT-1とFAS-ICとの相互作用およびMORT-1の自己会合を示す。
図２は、MORT-1（HF1）の予備ヌクレオチド（preliminary nucleotide）（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を図式的に示すものであり、翻訳開始部位の可能性がある部位、すなわち49位の下線を施したメチオニン残基（ボールド体の下線をつけたＭ）が存在するとして、「デス・ドメイン」に下線が施されている。アステリスクは翻訳終結コドン（ヌクレオチド769〜771）を示す。各行の初めと中央に、その配列の開始部位（５′末端）に対する配列のヌクレオチドとアミノ酸の相対位置を示す２種の番号が付されてあり、１番目の番号はヌクレオチドを示し、２番目の番号はアミノ酸を示す。
図３は、cDNAクローンからえたMORT-1結合タンパク質をコードする予備部分ヌクレオチド配列である。
図４Ａ〜４Ｃは、MACHcDNAおよびこれがコードするタンパク質を図式的に示す。図４Ａは２つのオープンリーディングフレーム（ORF-AとORF-B）をコードするMACHcDNAの構造を示し、ORF-Bのハッチング部分はMORT-1タンパク質と相同性を有する領域を示す。図４Ｂは、MACHのORF-B領域の推定アミノ酸配列（配列番号５）を示し、その下線を施したアミノ酸残基はMORT-1と相同性を有する領域である（図４Ａのハッチング領域に相当する）。図４Ｃは、全MACHcDNA分子（MACHβ1と称する）のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
図５は、トランスフェクトされた酵母細胞内でのMORT-1とMACHとの相互作用を例証する試験結果を示す。
図６は、MACHをコードし、テトラサイクリンで制御される発現ベクターでトランスフェクトされたHeLa細胞の細胞致死効果をリガンドに依存せずにトリガーすることを、ルシフェラーゼ（luc、ネガティブコントロール）、FAS-OC、MORT-1などのほかのタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされたHeLa細胞、およびMORT-1とMACHをコードするベクターで同時にトランスフェクトされた細胞における前記効果と比較してグラフで示す。
図７Ａと７Ｂは、MACHβ1（図７Ａ）のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。図７Ｂは、MACHβ1、MORT-1およびPEA-15におけるMORTモジュールの配列の相同性を示す（配列番号６）。
図８は、Fas/APO1およびp55による細胞死の誘導に関与している受容体と標的の相互作用を示す線図であり、デス・ドメインのモジュールはストライプで示し、MORTモジュールは灰色で示し、そしてCED3/ICE領域は黒色で示してある。
図９Ａ〜９Ｃは、MACHβ1およびその欠失変異体とMORT-1とのインビトロでの相互作用を例証する試験結果を示す。図９Ａは、抗FLAG抗体を用いて細胞溶解物から免疫沈降させることによって、タンパク質の発現とその分子の大きさを評価した結果を示す。図９Ｂは、グルタチオン−アガロース・ビーズに吸着されるGST-MORT-1（またはコントロールとして、GSTまたはFas-APO1の細胞内ドメインに融合されたGST）に結合するタンパク質類のアフィニティーを示す。図９Ｃは、各種の特異的抗体を用いて各種のMORT-1とMACH融合構築物を免疫沈降させた試験結果を示す。
図10は、各種のMACHアイソフォームを示す線図である。
図11は、MACHアイソフォーム類である、MACHα1（配列番号７）、MACHβ1（配列番号５）およびMACHβ3（配列番号８）、ならびにCED3/ICEプロテアーゼファミリーの各種公知のメンバーである、CED-3（配列番号９）、Ich-11／Nedd2（配列番号10）、ICErelIII（配列番号11）、Tx/Ich2/ICErelII（配列番号12）、ICE（配列番号13）、CPP-32（配列番号30）、Mcn2α（配列番号31）のアミノ酸配列を一列に並べた図である。アミノ酸残基は、各配列の左と右の両方に番号を付してある。点線は配列を最適な一直線とするための空白である。CED3/ICEプロテアーゼファミリーのメンバーのうち少なくとも３つにおいて同一のアミノ酸を四角で囲んで示す。CED3/ICE相同性領域の上流のMORTモジュールを四角で囲んで示ず。この試験で採用したＣ末端欠失部位は破線で示す。各種のMACHアイソフォーム間で変化する、MORTモジュール領域の下流の４つのアミノ酸ブロック（ブロック１〜４）は、上に括弧をつけて示す。CED3/ICE相同性領域内で、Ｘ線結晶解析により触媒活性に関与していることが分かったICE内の残基と一直線上に並んでいるアミノ酸は次のように示す。IEC内のHis237、Gly238およびCys285に相当する、触媒効果に関与していると推定される残基は、その列の下側に黒丸印（●）を付す。Arg179に相当し、ICE中のArg179、Gln283、Arg341およびSer347に相当する、P1 Aspのカルボキシレート側鎖に対する結合ポケットを構成する残基は、列の下側の白丸の印（○）を付す。ICEのCys285に相当する残基の上流のAla残基およびこのCysの下流のArg残基とGly残基は、CED3/ICEファミリーの先に述べたすべてのプロテアーゼ中に保存されている。基質のP1-P4残基に対し近位の残基には列の下側に三角印（△）を付す。MACHにおいて同様の位置に見出された、公知の先に想定されたAsp-X切断部位と切断の可能性のある部位を四角で囲む。矢印は、ICEのp20とp10のサブユニットおよびCPP32のp17とp12サブユニットのＮ末端とＣ末端を示す。これらタンパク質のＣ末端はアステリスク（＊）で示す。
図に12Ａ〜12Ｆはそれぞれ、15分（図12Ａ）、30分（図12Ｂ）、60分（図12Ｃ）、90分（図12Ｄ）、180分（図12Ｅ）の時点におけるMACHα1のプロテアーゼ活性を例証する試験結果を示す。図12Ｆは、特定濃度の基質における経時的なタンパク質分解活性を示す。
図13Ａと13ＢはMACHαのCED3/ICE相同性領域のプロテアーゼ活性を示す。Ａ．MACHα1のCED3/ICE相同性領域のGST−融合タンパク質を発現する大腸菌（E. coli）の抽出物によるPARP−配列由来の蛍光原基質：Ac-DEVD-AMC（50μＭ）の切断のカイネティクス（kinetics）（全長のMACHα1のGST−融合産物（○）もしくはCys360をSerで置換したCED3/ICE相同性領域（▽）を発現する細菌の抽出物；またはCED3/ICE相同性領域の２つの潜在タンパク質分解産物（Ser217〜Asp373（△）とSer375〜Asp479、タンパク質のＣ末端（▲））のいずれかのGST−融合産物を発現する抽出物による切断の欠除と比較したタンパク質のSer217〜Ｃ末端（■））。Ｂ．Ac−DEVD-AMCの切断の基質濃度依存性。MACHα1のCED3/ICE相同性領域のGST−融合産物を発現する細菌の抽出物と基質とを180分間インキュベートした（■）。抽出物によるこの基質の切断はヨード酢酸の存在下で阻害された（５ｍＭ、□）。IL-1β前駆体におけるICE切断部位に対応する蛍光原基質のAc-YVAD-AMCは切断されなかった（●）。
図14Ａ〜14ＤはMACHα1とMACHα2で媒介される細胞死を示す。
図15は、MACHα1とMACHα2によって媒介される細胞死をグラフで示す。
図16Ａ〜16Ｄは、細胞死が誘導されたかまたはブロックされた細胞の形態を示す。
図17は、非機能的CED3/ICE領域を含有するMACHα分子が、p55-Rによる細胞死の誘導をブロックすることをグラフで示す。
図18は、非機能的CED3/ICE領域を含有するMACHα分子が、FAS/APO1による細胞死の誘導をブロックすることをグラフで示す。
図１９は、FAS/APO1を一時的に発現するHeLa細胞の死を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、１つの観点において、MORT-1と結合できるかもしくはMORT-1と相互作用して、MORT-1が結合するFAS-R受容体の細胞内ドメインに結合できるか、またはMORT-1が結合するタンパク質TRADD（実施例２および前述を参照）が結合するp55TNF-Rの細胞内ドメインに結合できる新規なMORT-1結合タンパク質に関する。したがって、本発明のMORT-1結合タンパク質は、FAS-Rのメディエーターまたはモジュレーターと考えられ、たとえばFASリガンドがFAS-Rに結合することによって開始されるシグナリングプロセスに働き、同様に、TNFがP55-Rに結合することによって開始されるシグナリングプロセスにも働く。本発明のMORT-1結合タンパク質には、新しく発見されたMACHアイソフォームが含まれ、そのアミノ酸配列およびDNA配列は、「GENBANK」もしくは「PROTEINBANK」といったDNA配列またはアミノ酸配列のデータバンクには見られない新しいものである。
さらに詳しく述べると、本発明は、線虫のプロテアーゼであるCED3の各種哺乳動物の相同体を開示する。これらはMACHアイソフォーム（MACHαおよびMACHβアイソフォーム）と命名され、密接な類縁関係を有するが、構造と基質特異性にいくつもの差異を示し、哺乳動物細胞ではいくぶん異なって機能する。実際に、前記プロテアーゼでは２つの異なる活性が知られている。ICEの主な役割はIL-1β前駆体のプロセシングのようであるが、CED3がプログラムされた細胞死のエフェクターとして働くことは明確に分かっている。また、この後者の役割は、哺乳動物での相同体（いくつかのMACHアイソフォーム）の少なくともいくつかの役割のようでもある。MACHα1のアミノ酸配列は、CED3に最も類似しているといわれている哺乳動物の相同体、CPP32に最もよく類似している。また、MACHの基質特異性は、CPP32の基質特異性よりもさらに限定された基質特異性を有することを除けば、CPP32に類似している。CPP32はポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）の切断部位に対応する基質ペプチドを優先的に切断するが、IL-1β前駆体のICE切断部位に対応するペプチドに対するタンパク質分解活性もいくらか有している。しかし、MACHα1は単独でPARP由来の配列を切断できるようである。MACHα1のCPP32およびCED3とのこれらの関係とMACHα1がICEとは類似していないことは、MACHα1がCED3と同様に細胞死のレギュレーターとして働くという考えと一致している。しかし、MACHα1は、CED3およびCPP32ならびにCED3/ICEファミリーのほかのすべてのメンバーと区別する、配列の特徴を数点有している。MACHα1のCED3/ICE相同性領域の上流のＣ末端部分は、ほかのあらゆる相同体の上流領域と全く似ていない。また、前記タンパク質のCED3/ICE相同性領域には、いくつもの独特の配列の特徴がある。これらの差異は、MACHα1が別個に進化したファミリーに属し、かつその細胞死に対する寄与は、先に述べたCED3/ICE相同体とはいくぶん異なっていることを示唆している。
１つの重要な差異は、プロテアーゼの機能が調節される様式に関する可能性がある。CED3/ICEファミリーのプロテアーゼによるタンパク質の切断は、発生に関連する細胞死のプロセスおよび受容体が誘導する免疫細胞溶解に関与しているので、細胞内で形成されるシグナルおよび細胞表面受容体から発するシグナルの両者によって調節されるべきである。発生に関連する細胞死のプロセスにおいて、これらプロテアーゼの活性化は、遺伝子の発現に影響してプロテアーゼ類の合成が促進され、かつそれらのアポトーシス効果に拮抗するBCL-2のようなタンパク質の合成が減少する機構に関与しているようである。しかし、このことは、FAS-RまたはTNF受容体によってトリガーされる細胞傷害性には明らかに当てはまらない。細胞は、TNFやFAS-Rリガンドのタンパク質合成活性が充分にブロックされ（そのとき細胞は、事実、より有効に殺される）、これらの条件下で刺激依存性の状態であるときでさえ、TNFまたはFAS-Rリガンドによって殺されうる。このように、TNF受容体とFAS-RによるCED3/ICEファミリーのプロテアーゼ類の活性化は、タンパク質の合成には依存しない機構で起こることができる。MACHα1は、その独特の配列特性によってかような機構に関与することができる。
出願人が知っている限り、細胞表面受容体の細胞内ドメインと、直接またはアダプタータンパク質を通じて会合するプロテアーゼは、ほかに今まで発見されていない。ほかの酵素活性を有する受容体関連タンパク質の作用の方式から推定して、MACHα1がMORT-1に結合すると、FAS-Rのトリガリングに対するMACHα1プロテアーゼ活性を刺激できる、と考えることがもっともらしいようである。また、p55-Rへ結合するTRADDにMORT1が結合することを介して、p55-Rによるプロテアーゼの活性も可能となるであろう。
CED3/ICEファミリーのほかのメンバーは、それらの自己切断またはこのファミリーのほかのプロテアーゼの効果によって起こる、タンパク質分解プロセシングの後のみに充分な活性を示すことが発見された（Kumar, 1995; Henkart, 1996に総説されている）。全長のCED3/ICE相同性領域を発現する細胞が細胞傷害性を欠いているのと対照的に、MACHα1の自己切断による可能性がある２つの主な産物の同時発現から細胞傷害効果がもたらされることは、MACHα1がそのプロセシングの後でしか充分に活性をえることができないのではないか、ということと矛盾しない。全長領域を発現する細菌の溶解物に見られる酵素活性は、見かけ上、これら条件下で産生されるタンパク質の自己プロセシングまたはいくつかの細菌プロテアーゼによるプロセシングを反映している。このプロセシングが、哺乳動物の細胞内でどのような様式で起こるのか、そしてFAS-Rとp55-Rをトリガーすることによってどのように起こすことができるかについては分かっておらず、また、MACHα1のプロテアーゼ活性がFAS-RおよびTNFで誘導される細胞傷害性に対してどのように相対的に寄与するのかも明らかになっていない。この寄与の評価は、CED3/ICE相同性領域を欠いているMACHβ1が発現しても著しい細胞傷害性がもたらされるということによって複雑になる。この細胞傷害性は、おそらく、MACHβ1がMACHα1に結合できることを反映しているのであろう。この性能のため、トランスフェクトされたMACH分子は、凝集すると、トランスフェクトされた細胞に内因性であるMACHα1分子にコンホメーションの変化を与えるであろう。このような機構は、MACHの上流に作用する分子（MORT1、TRADDまたはp55-RもしくはFAS-Rのデス・ドメイン）が細胞内で過剰発現されるときにみられる細胞傷害性を充分に説明することもできる。しかし、現在は、MACHまたはMACHの上流で作用する分子の発現が誘導されると観察される細胞傷害性は、MACHにおけるCED3/ICE相同性領域のタンパク質分解活性のほかは、FAS-Rとp55-Rの細胞傷害効果に関与していると考えられるほかのいくつかの機構の活性化（たとえば、中性または酸性のスフィンゴミエリナーゼの活性化）も反映していることは無視できない。また、CED3/ICE相同性領域のタンパク質分解活性は、細胞傷害性の誘導のほかにほかの機能を果たすことも無視できない。MACHα1の機能は、MACHα1が活性化されると切断される内因性基質タンパク質を同定することによって一層明らかに理解できるはずである。MACHα1の活性を随意に除去する方法を、たとえば阻害分子を発現させることによって見つければ、このタンパク質の機能を理解するのに貢献しかつ所望のときにその活性を調節する方法として利用できる。
MACHα1を発現する細胞内には、このタンパク質を取り囲む、プロテアーゼの天然のインヒビターがおそらく存在している。CED3/ICEファミリーのほかのメンバーのいくつかに対して、選択してスプライスされるアイソフォームが存在し、これらプロテアーゼの機能を生理的に制限する様式を形成していることが示されている。これらのほかのプロテアーゼのアイソフォームのいくつかは、全長のアイソフォームと見かけ上、不活性のヘテロダイマーを形成することによって、全長のアイソフォームの天然のインヒビターとして作用すると報告された。このことは、MACHのいくつかのアイソフォーム、たとえばＮ末端切断部位の可能性がある部位が欠除しているMACHα3およびCED3/ICE相同性領域が欠失しているMACHα1変異体、によく当てはまる。このような阻害性アイソフォームの発現によって、FAS-RとTNFの細胞傷害性に対する細胞の自己防御の機構が形成されるであろう。MACHアイソフォームの広範囲の異種性（CED3/ICEファミリーのほかのプロテアーゼに見られる異種性をはるかに超えている）によって、このタンパク質の活性型の機能のとくに精巧な調節を行うことができる。MACHのアイソフォームのいくかは、ほかの機能を提供することもできるようである。MACHβ1がMORT1およびMACHα1の両者に結合できることによって、これらのアイソフォームのいくつか（およびおそらくほかのMACHアイソフォームも）は、酵素的に活性なアイソフォームの機能を阻害するのではなくてむしろ高める効果を有する可能性が高くなることも可能なようである。また、いくつかのアイソフォームは、細胞傷害性に関連する役割を果たさずに、むしろFAS-RとTNFのほかの非細胞傷害性効果に関与する分子のドッキング部位として作用する可能性があるようである。
FAS-RおよびTNF受容体の細胞死を起こす独特の能力、かつTNF受容体のほかの組織を損傷する各種活性をトリガーする能力のために、これら受容体の機能の異常は、生物に対してとくに有害である。実際にこれら受容体の機能が過剰な場合と欠失している場合は両者とも、各種疾患の病理学的発現に寄与していると報告されている。これら受容体のシグナリング活性に関与している分子を同定し、これら分子の機能をモジュレートする法を見つければ、これら疾患に対する新しい治療法の可能性がある手がかりになる。FAS-RおよびTNFの毒性におけるMACHα1の考えられる中心的な役割からみて、CED3/ICEファミリーのいくつかのほかのメンバーになされてきたように、この分子のタンパク質分解機能を阻止できる医薬を設計することがとくに重要のようである。MACHα1分子に含まれるCED3/ICE相同体の独特な配列の特徴によって、生理的細胞死プロセス（CED3/ICEファミリーのほかのメンバーが関与している）を阻害することなく、過剰の免疫媒介細胞傷害性に対してそれを防御できる医薬を設計することができる。
このように、本発明はMORT-1結合タンパク質をコードするDNA配列およびそのDNA配列によりコードされるMORT-1結合タンパク質にも関する。
さらに、本発明はMORT-1結合タンパク質の生物学的に活性な類似体、フラグメントおよび誘導体をコードするDNA配列ならびにそれらによってコードされる類似体、フラグメントおよび誘導体にも関する。前記類似体、フラグメントおよび誘導体の製造は通常の方法によって行われる（たとえばSambrook et al., 1989参照）。その方法ではMORT-1結合タンパク質をコードするDNA配列において１またはそれより多くのコドンが欠失、付加またはほかのものによって置換されていてもよく、未変性のタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸残基の変化を有する類似体がえられる。
MORT-1結合タンパク質に「実質的に相当する」ポリペプチドまたはタンパク質としては、MORT-1結合タンパク質のみならず、MORT-1結合タンパク質の類似体であるポリペプチドまたはタンパク質があげられる。
MORT-1結合タンパク質に実質的に相当する類似体は、MORT-1結合タンパク質のアミノ酸配列の１またはそれより多くのアミノ酸が、ほかのアミノ酸で置換されているか、欠失しているおよび／または挿入されている（ただし、えられたタンパク質が相当するMORT-1結合タンパク質と実質的に同じかまたは高い生物学的活性を示す）場合のポリペプチドである。
MORT-1結合タンパク質に実質的に相当するための、MORT-1結合タンパク質類、たとえばMACHアイソフォーム類、の配列の変化は一般的に比較的小さい。変化の数は10を超えてもよいが、10以下が好ましく、５以下がさらに好ましく３以下が最も好ましい。任意の方法を用いて、MORT-1結合タンパク質に実質的に相当する生物学的活性をおそらく有するタンパク質を見つけることができるが、このような方法の１つとしては、タンパク質をコードするDNAに対して従来の突然変異誘発法を使用していくつかの修飾を行う方法があげられる。次に、かようなクローンによって発現されるタンパク質は、MORT-1結合活性および／またはFAS-Rおよびp55-Rが媒介する活性スクリーニングすることができる。
「保存的（conservative）」変化とは、タンパク質の活性を変えないと考えられる変化であり、これらの変化は、タンパク質の大きさ、電荷または立体配置を実質的に変えないと考えられ、したがってそのタンパク質の生物学的特性を変えないと考えられるので、通常、最初に選別される。
MORT-1結合タンパク質の保存的置換体としては、そのポリペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。
アミノ酸で保存的に置換された類似体があげられる。このような置換体は、表ＩＡに示される下記リストにしたがって製造することが好ましく、日常的な試験で測定して、MORT-1結合タンパク質の特徴的な生物学的活性を維持しながら、合成ポリペプチド分子の構造および機能の特性を改変することができる。
0003980641.tif 000002
あるいは、MORT-1結合タンパク質のほかのグループの置換体としては、そのポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を取り出してその位置に異なる残基を下記表ＩＢにしたがって挿入した置換体があげられる。そのポリペプチドで製造される置換体の種類は、たとえばSchulz et al., G.E., “Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, New York, NY, 1798の表１〜２およびCreighton, T.E., “Proteinｓ: Structure and Molecular Properties”, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, CA, 1983の図３〜９に示されているような異なる種の相同性タンパク質問のアミノ酸の変化の頻度の分析結果に基づいている。このような分析結果に基づいて、本明細書では、選択される保存的置換体は、つぎの５グループのうちの１つの範囲内で交換がなされた置換体と定義する。
0003980641.tif 000003
前記括弧内の３種のアミノ酸残基は、タンパク質の構造に特別の役割を有する。Glyは側鎖がない唯一の残基でありしたがってその連鎖に適応性を付与する。しかし、このことは、αヘリックス以外の二次構造の形成を促進する傾向がある。Proは幾何学的形が変わっているので連鎖をしっかり束縛して一般にβ−ターン様構造を促進する傾向があるが、場合によってはCysが、タンパク質の折りたたみに重要なジスルフィド結合の生成に関わることができる。前述のSchulz et al.,に前記グループ１と２が挙げられていることに留意のこと。また、Tyrは水素結合を有しているので、SerおよびThrなどと著しく類似していることに留意。
たとえば前記のような本発明の保存的アミノ酸置換体は当該技術分野で公知であり、アミノ酸が置換された後は、そのポリペプチドの生物学的特性と構造上の特性を維持すると考えられる。本発明の欠失体と置換体の大部分は、そのタンパク質またはポリペプチドの分子の特徴が極端に変わらないものである。「特徴」という用語は、二次構造、たとえばα−ヘリックスまたはβ−シート、の変化ならびに生物学的活性、たとえばMORT-1の結合またはFAS-RリガンドもしくはTNFの細胞に対する効果の変化の両者を定義するように包括的に定義する。
本発明に用いるMORT-1結合タンパク質の類似体をえるため使用できるタンパク質のアミノ酸置換体の製造例には公知の方法のステップが含まれ、たとえば以下の諸特許、すなわち、Markらの米国再発行特許第33,653号、同第4,959,314号、同第4,588,585号および同第4,737,462号；Kothsらの米国特許第5,116,943号；Namenらの米国特許第4,965,195号；Chongらの米国特許第4,879,111号；およびLeeらの米国特許第5,017,691号に提供されている。そしてリシンで置換されたタンパク質はShawらの米国特許第4,904,584号に提示されている。
MORT-1結合タンパク質の活性を大きく変化させない前記保存的置換体のほかに、MORT-1結合タンパク質の類似体の生物学的活性を増大させる保存的置換体または保存的ではなくよりランダムな変化は、本発明の範囲内にあるものとする。
置換または欠失の正確な効果を確認したいとき、当該技術分野の当業者には、置換、欠失などの効果を、日常的な結合検定法および細胞死検出法で評価することはよく分かっている。このような標準の試験法を用いるスクリーニングでは、過度の試験を含まない。
容認できる類似体は、少なくともMORT-1に結合する可能性を保持し、その結果、前記のように、FAS-Rとp55-Rの活性を媒介する（たとえば少なくともいくつかのMACHアイソフォームのプロテアーゼ活性による）類似体である。このようにして、いわゆるドミナントネガティブ効果（dominant negative effect）を有する類似体、すなわちMORT-1との結合またはこの結合の後のシグナリングまたはプロテアーゼ活性に欠陥がある類似体を製造することができる。このような類似体は、たとえば、天然のMORT-1結合タンパク質と競合させることによってFAS-リガンド効果を阻害するのに使用できる。たとえば、MACHアイソフォームのMACHα2とMACHα3は、これらMACHアイソフォームの活性化には不可欠と考えられる、活性（プロテアーゼ）MACHアイソフォームのMORT-1との結合を競合してMACHの活性を阻害する働きをする「天然」の類似体のようである。活性MACHアイソフォームがMORT-1に結合できないと、FAS-Rとp55-Rによって媒介ざれる細胞内シグナリング経路も阻害される。同様に、FAS−リガンドまたはTNFの効果を高めるのに役立ついわゆるドミナントポジティブ類似体を製造することができる。これらの類似体は、天然のMORT-1結合タンパク質と同じかまたはこのタンパク質より優れたMORT-1結合特性およびシグナリング特性を有している。
遺伝子レベルでは、一般的にこれらの類似体は、MORT-1結合タンパク質をコードするDNAのヌクレオチドの位置指定突然変異誘発を行って類似体をコードするDNAを製造し、ついでそのDNAを合成し次に組換え細胞培養物中にポリペプチドを発現させることによって製造される。これら類似体は一般に、天然に存在するタンパク質と同じかまたは増大した定性的生物学的活性を示す（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。
このようにして行うMORT-1タンパク質の製造、または遺伝コードの公知の縮重によって変えることができるため同じポリペプチドをコードするが天然の配列と異なる別のヌクレオチド配列によるMORT-1結合タンパク質の製造は、先に製造した類似体またはMORT-1結合のタンパク質の未変性体をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発によって達成することができる。部位特異的突然変異誘発法によれば、所望の突然変異体のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列；およびトラバースされる欠失ジャンクションの両側に安定な二重らせんを形成するのに充分な大きさと配列のコンプレキシティーを有するプライマー配列を提供するのに充分な数の隣接ヌクレオチドによって類似体を製造することができる。一般に長さが約20〜25個のヌクレオチドのプライマーが好ましく、変更される配列の各側に約５〜10個の相補ヌクレオチドを有している。一般に、部位特異的突然変異誘発法は当該技術分野で公知であり、Adelmanら、DNA、２巻183頁、1983年などの刊行物に例示されている。なおこれら刊行物の開示事項は本明細書に包含されるものである。
部位特異的突然変異誘発法では、一般に、一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するファージベクターが用いられることが分かるであろう。部位特異的突然変異誘発法で有用な代表的なベクターとしては、たとえば、A. Walton編で、アムステルダムのElsevier社が1981年に発行した“Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA”にMessingらが開示しているようなＭ13ファージなどのベクターがある。なおこの刊行物の開示事項は本明細書に包含されるものである。これらのファージは容易に市場から入手可能であり、その使用は当該技術分野の当業者にとって一般に公知である。あるいは、一本鎖のファージの複製起点を含有するプラスミドベクター（Veiraら、Meth. Enzymol., 153巻、３頁、1987年）を用いて一本鎖DNAをえることができる。
一般に前記の部位特異的突然変異誘発法は、まず、関連ポリペプチドをコードするDNA配列をその配列内に含有する一本鎖ベクターをえることによって行われる。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを自動DNA／オリゴヌクレオチド合成法で合成する。次にこのプライマーを、一本鎖のタンパク質の配列を含有するベクターを用いてアニーリングし、つぎに大腸菌（E. coli）ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなDNA重合酵素で処理して、突然変異担持ストランドの合成を完了させる。したがって突然変異配列と第２のストランドは所望の突然変異を有している。つぎにこのヘテロ二本鎖ベクターを用いて適当な細胞、たとえば大腸菌JM101細胞を形質転換し、突然変異配列が配置されている組換えベクターを含有するクローンを選択する。
このようなクローンを選択した後、突然変異MORT-1結合タンパク質を取り出し、適当なベクター、一般に、適当な宿主をトランスフェクトするのに用いられるタイプのトランスファーベクター（transfer vector）または発現ベクター中に配置する。
したがって、MORT-1結合のタンパク質をコードする遺伝子または核酸は、公知のDNAまたはRNAの増幅法、たとえばPCR法および化学的オリゴヌクレオチド合成法を用いて、in vitro、in situおよび／またはin vivoで検出し、入手し、および／または修飾することができる。PCR法は、DNAポリメラーゼの反応を繰り返すことによって、特定のDNA配列の増幅（数の増大）を行うことができる。この反応はクローン化の代わりに使用することができるが、必要なことは核酸配列の知識だけである。PCRを実施するため、対象の配列に相補的なプライマーを設計する。つぎにそのプライマーを自動DNA合成法で製造する。プライマーは遺伝子のあらゆる部分とハイブリッドを形成するように設計できるので、相補的塩基対のミスマッチを許容できるように条件を作ることができる。これらミスマッチ領域の増幅によって、突然変異産物が合成されて新しい特性を有するペプチドが生成する（すなわち位置指定突然変異誘発）（たとえばAusubelの前掲文献の16章参照）。また逆転写酵素を用いて、相補的DNA（cDNA）合成法をPCRと組み合わせることによって、クローン化を行わずにプロラクチン受容体の細胞外領域を合成するのにRNAを出発物質として使用できる。
さらに、PCRプライマーは、増幅される遺伝子セグメントの両末端に、新しい制限部位または終結コドンのようなほかの特性を組み込むように設計できる。増幅される遺伝子配列の５′末端と３′末端に前記のように制限部位を配置すると、MORT-1結合タンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子セグメントを、ベクター中のほかの配列および／またはクローン化部位とライゲーションするように、特別に設計することができる。
RNAおよび／またはDNAを増幅するPCRなどの方法は当該技術分野で公知であり、本明細書の教示と指針に基づいて過度の実験を行わずに本発明にしたがって使用できる。DNAまたはRNAを増幅する公知の方法としては、制限はないが、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）と関連する増幅法（たとえばMullisらの米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号および同第4,965,188号；Taborらの米国特許第4,795,699号および同第4,921,794号；Innisの米国特許第5,142,033号；Wilsonらの米国特許第5,122,464号；Innisの米国特許第5,091,310号；Gyllenstenらの米国特許第5,066,584号；Gelfandらの米国特許第4,889,818号；Silverらの米国特許第4,994,370号；Biswasの米国特許第4,766,067号；Ringoldの米国特許第4,656,134号；およびInnisら編“PCR Protocols: A Guide to Method and Applications参照）”；二本鎖DNAを合成するための鋳型として標的配列に対するアンチセンスRNAを使用するRNA媒介増幅法（Malekらの米国特許第5,130,238号、商品名NASBA）；ならびに抗体標識化をDNA増幅と組み合わせて用いる免疫PCR法（Ruzickaら、Science、260巻、487頁、1993年；Sanoら、Science、258巻、120頁、1992年；Sanoら、Biotechniques、９巻、1378頁、1991年）がある。なお前記文献の内容は全て本明細書に包含されるものである。
MORT-1結合タンパク質の生物学的に活性なフラグメント（たとえばMACHアイソフォームのいずれかのフラグメント）は、類似の方法で、MORT-1結合タンパク質の類似体について先に述べたようにして製造できる。MORT-1結合タンパク質の適切なフラグメントは、MORT-1結合性能を保持し、かつ前記のようにFAS-Rとp55-Rの生物学的活性を媒介できるフラグメントである。したがって、類似体に対して前記のようなドミナントネガティブなまたはドミナントポジティブな効果を有するMORT-1結合タンパク質のフラグメントを製造することができる。これらのフラグメントは本発明の類似体の特別のクラスを示す、すなわち、これらのフラグメントは、全MORT-1結合タンパク質配列由来のMORT-1結合タンパク質（たとえばMACHアイソフォームのいずれか１つの由来の）の所定の部分であり、フラグメントのこれらの部分は各々、前記の望ましい活性のいずれかをもっていることに留意すべきである。この様なフラグメントはたとえばペプチドである。
同様に、誘導体は、MORT-1結合タンパク質、その類似体またはフラグメントの１またはそれより多くのアミノ酸残基の側基を標準法で修飾するか、またはMORT-1結合タンパク質、その類似体または類似体を、ほかの分子、たとえば抗体、酵素、受容体などに複合することによって製造することができる。なおこれらのことは当該技術分野で公知である。したがって、用語「誘導体」は、本明細書で使用する場合、残基の側鎖として存在する官能基またはＮ−もしくはＣ−の末端基から、当該技術分野で公知の方法によって製造される誘導体を包含し、かつ本発明に含まれる。誘導体は、MORT-1結合タンパク質と同じかまたはこのタンパク質より高い生物学的活性を有しているかぎり、炭水化物もしくはリン酸の残基のような化学分子を有してもよい。
たとえば、誘導体としては、カルボキシル基の脂肪酸エステル類；アンモニアまたは第一級もしくは第二級のアミンとの反応によるカルボキシル基のアミド類；アシル残基（たとえばアルカノイル基もしくは炭素環式アロイル基）で形成される、アミノ酸残基の遊離基のＮ−アシル誘導体；またはアシル残基で形成される、遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリルもしくはトレオニル残基の誘導体）がある。
用語「誘導体」は、１つのアミノ酸を、２０種の共通して存在している天然アミノ酸のうちのほかのアミノ酸に変更していない誘導体だけを含むものとする。
MORT−結合タンパク質はタンパク質またはポリペプチドであるが、アミノ酸残基の配列である。MORT-1結合タンパク質の全配列を含有するより大きな配列からなるポリペプチドは、本明細書の定義にしたがって、付加物が本発明の基本的な新規の特徴に影響しない限り、すなわち、付加物が、MORT-1結合タンパク質の生物学的活性を保持もしくは増大するかまたは切断してMORT-1結合タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドを残すことができるならば、前記ポリペプチドの範囲内に含まれるものとする。したがって、たとえば、本発明は、MORT-1結合タンパク質とほかのアミノ酸またはペプチドの融合タンパク質を含むものとする。
新規なMORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体は多くのことに使用できる可能性を有する。たとえば、
（i）FAS-RリガンドまたはTNFにより誘導される細胞傷害性が望まれる、抗腫瘍、抗炎症または抗HIV感染などFAS-RリガンドまたはTNF効果の増大が望まれる状況において、MORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体はMORT-1ならびにFAS-RリガンドまたはTNFの機能を模擬するかまたは増大させるために使用してよい。このばあいには、FAS-RリガンドまたはTNF効果、すなわち細胞傷害効果を増大させるMORT-1結合タンパク質、その類似体、そのフラグメントまたは誘導体は、それ自体が既知の標準的な操作によって細胞に導入されてよい。たとえば、MORT-1結合タンパク質は細胞内に存在し、FAS-RリガンドまたはTNF効果が望まれる細胞にのみそれを導入すべきなので、細胞にこのタンパク質を特別に導入するためのシステムが必要である。これを行なう方法の１つはつぎのようである。組換え動物ウイルス、たとえばワクシニア（Vaccinia）由来の１つを作製し、そのDNAに対してつぎの２種の遺伝子を導入する：細胞に特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合するリガンド、たとえばいくつかの細胞（CD4リンパ球、および関連する白血球）に特異的に結合するエイズ（HIV）ウイルスgp120タンパク質など、または組換えウイルスベクターがFAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞に結合できるように、FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞に特異的に結合するそのほかのリガンドをコードする遺伝子；およびMORT-1結合タンパク質をコードする遺伝子。こうしてウイルスの表面に細胞表面結合タンパク質が発現すると、ウイルスは腫瘍細胞またはほかのFAS-Rもしくはp55-Rを担持する細胞を標的とし、続いて配列をコードするMORT-1結合タンパク質がウイルスを介して細胞内に導入されるであろう。細胞で一度発現するとFAS-RリガンドまたはTNF効果が増大され、殺されることが望まれる腫瘍細胞またはほかのFAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞の死が導かれるであろう。前記組換え動物ウイルスの構築は標準的な操作により行なわれる（たとえばSambrook et al., 1989参照）。ほかの可能性としては、MORT-1結合タンパク質（たとえば、MACHアイソフォームのいずれか１つ）の配列を、細胞に吸収され、そこで発現されることのできるオリゴヌクレオチドの形態で導入することがある。
（ii）それらはFAS-RリガンドまたはTNF効果を阻害するために使用してもよい。たとえば、敗血症性ショック、移植片対宿主拒絶または急性肝炎における組織の傷害のようなばあいでは、FAS-RリガンドまたはTNFで誘導されるFAS-Rまたはp55-R細胞内シグナリングをブロックすることが望まれている。このような状況では、たとえば、標準的な方法によってMORT-1結合タンパク質のための配列をコードするアンチセンスを有するオリゴヌクレオチドを細胞へ導入することが可能であり、それによりMORT-1タンパク質またはMORT-1結合タンパク質をコードするmRNAの翻訳が効果的にブロックされ、MORT-1タンパク質またはMORT-1結合タンパク質の発現がブロックされてFAS-RリガンドまたはTNF効果の阻害が導かれるであろう。前記オリゴヌクレオチドは、ウイルスによって担持される第２の配列をオリゴヌクレオ配列にした前記組換えウイルスアプローチを用いて細胞内に導入されてもよい。
ほかの可能性としてはMORT-1結合タンパク質に特異的な抗体を使用してその細胞内シグナリング活性を阻害することがある。
さらに、FAS-RリガンドまたはTNF効果を阻害するほかの方法は、最近開発されたリボザイムアプローチによるものである。リボザイムはRNAを特異的に切断する触媒RNA分子である。リボザイムは選ばれた標的RNA、たとえば本発明のMORT-1結合タンパク質をコードするmRNAを切断するために創作されてもよい。そのようなリボザイムはMORT-1結合タンパク質mRNAに特異的な配列を有し、それと相互作用する（相補的に結合する）ことができ、続いてmRNAを切断してMORT-1結合タンパク質の発現を減少させ（または完全に消失させ）るであろう。その減少した発現のレベルは標的細胞でのリボザイム発現のレベルに依存する。リボザイムを選ばれた細胞（たとえば、FAS-Rまたはp55-Rを担持する細胞）に導入するために、任意の適切なベクター、たとえば通常この目的のために用いられるプラスミド、動物のウイルス（レトロウイルス）ベクターを使用してもよい（ウイルスが第２の配列として選ばれたリボザイム配列をコードするcDNAを有する、前記（ｉ）も参照）。（リボザイムに関する総説、方法などについては、Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993; Shore et al, 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993参照）。
（iii）MORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は同じクラスのほかのタンパク質、すなわちFAS-R細胞内ドメインもしくは機能的に関連する受容体に結合、またはMORT-1およびFAS-Rおよびp55-Rといった機能的に関連する受容体に結合し、かつ細胞内シグナリングプロセスに関係するものを単離し、同定し、クローン化するために使用されてもよい。この適用では前述の酵母ツーハイブリッドシステムを用いてもよく、またストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションに続いてPCRクローニングを行なう、最近開発されたシステム（Wilks et al., 1989）を用いてもよい。Wilksらの刊行物には、キナーゼモチーフの既知の配列、創作されたキナーゼ配列にもとづいてストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションを適用し、そののちにPCRによってクローニングをすることによる、２種の推定のタンパク質−チロシンキナーゼの同定およびクローニングが記載されている。このアプローチは、本発明にしたがってMORT-1結合タンパク質（たとえば、MACHアイソフォームのいずれか）の配列を用い、MORT-1結合タンパク質に関係するものを同定してクローン化するために用いてもよい。
（iv）さらに、本発明のMORT-1結合タンパク質、またはその類似体、フラグメントもしくはそれらの誘導体を利用するほかのアプローチは、アフィニティークロマトグラフィーの方法にそれらを用いてそれらが結合することのできるほかのタンパク質または因子たとえば、MORT-1または細胞内シグナリングプロセスに関係するほかのタンパク質もしくは因子を単離し、同定することである。この適用では本発明のMORT-1結合タンパク質、その類似体、フラグメントまたはそれらの誘導体を個別にアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに付着させ、細胞抽出物と接触させるかまたは細胞内シグナリングプロセスに関係があると疑われるタンパク質または因子を単離してもよい。アフィニティークロマトグラフィー操作に続き、本発明のMORT-1結合タンパク質、またはその類似体、フラグメントもしくはそれらの誘導体と結合するほかのタンパク質または因子を溶出し、単離して特徴付けることが可能である。
（v）前述のように、本発明のMORT-1結合タンパク質、またはその類似体、フラグメントもしくはそれらの誘導体は、免疫原（抗原）として使用してそれに特異的な抗体を産生してもよい。これらの抗体は細胞抽出物からかまたはMORT-1結合タンパク質、もしくはその類似体もしくはフラグメントを産生する形質転換された細胞系からのいずれかからMORT-1結合タンパク質（たとえば、MACHアイソフォーム）を精製する目的で使用されてもよい。さらに、これらの抗体は、FAS-RリガンドまたはTNFシステムが異常に機能すること、たとえば過剰に活性化されるかまたは不充分な活性しかないFAS-RリガンドまたはTNFで誘導される細胞の効果に関する疾患を同定する目的の診断に使用されてもよい。このように、そのような疾患がMORT-1タンパク質またはMORT-1結合タンパク質に関係する多機能な細胞内シグナリングシステムに関連するのなら、前記抗体は重要な診断具として役立つであろう。
本発明のMORT-1結合タンパク質（たとえば、MACHアイソフォーム）の単離、同定および特徴付けは、よく知られている標準的なスクリーニング操作のいずれかを用いて行われてもよい、ということも述べておくべきである。たとえば、これらのスクリーニング操作のうちの１つとして、ここで（実施例１）述べられているように酵母ツーハイブリッド操作が本発明のMORT-1タンパク質およびそれに続くMORT-1結合タンパク質（実施例２〜３）を同定するために用いられた。同様に、前述および以下にも述べるように、当該分野でよく知られているアフィニティークロマトグラフィー、DNAハイブリダイゼーション操作などのほかの操作を用いて本発明のMORT-1結合タンパク質を単離、同定および特徴付けするかまたは本発明のMORT-1タンパク質またはMORT-1結合タンパク質に結合することのできるさらなるタンパク質、因子、受容体などを単離、同定および特徴付けしてもよい。
前記のように、MORT−結合タンパク質を使用して、MORT-1結合タンパク質、たとえばMACHアイソフォームに対して特異的な抗体を製造することができる。これらの抗体またはそのフラグメントは、以下に詳細に述べるように使用することができるが、ここでは抗体またはそのフラグメントとはMORT-1結合タンパク質に特異的なものであると理解する。
MACHアイソフォームの少なくともいくつか（前記事項と後記実施例３参照）が、プロテアーゼのCED3/ICEファミリーのプロテアーゼに類縁のプロテアーゼであるという本発明による発見に基づいて、これらMACHアイソフォームに対して以下の特定の医療用途が予想される。すなわち、ほかのCED3/ICEプロテアーゼ類の特異的なインヒビター（そのいくつかは細胞透過性である）がすでに存在し、プログラムされた細胞死プロセスを有効にブロックできることが発見されたのである。したがって、FAS-RリガンドまたはTNFが誘導する細胞死、すなわちMACHプロテアーゼアイソフォームが関与する経路を阻害できるインヒビターを本発明にしたがって設計することができる。さらに、これらの新しいMACHプロテアーゼの独特の配列の特性からみて、TNFおよびFAS-Rリガンドが誘導する効果に対し高度に特異的なインヒビターを設計することができるようである。また、本発明のこれらの発見によって、FAS-RリガンドとTNFに応答して「キリングプロテアーゼ（killing protease）」が活性化される機構を研究する方法が提供され、これによって、つぎに、この活性化の程度を制御できる医薬を開発することができる。このような医薬が大きく役立つ疾患が多数ある。とりわけ、肝臓の急性損傷がFAS-Rリガンドが媒介する肝細胞の死を反映しているようである急性肝炎；糖尿病をもたらす、脾臓のβランゲルハンス細胞の死のような自己免疫を誘導する細胞死；移植片拒絶の場合の細胞死（たとえば腎臓、心臓および肝臓）；多発性硬化症における脳の希突起神経膠細胞の死；およびエイズウイルスを増殖させてエイズ疾患を起こす、エイズによるＴ細胞自殺の阻害がある。
前記および下記のように、２種のMACHアイソフォームすなわちMACHα2とMACHα3は、MACHプロテアーゼアイソフォームの「天然の」インヒビターとして働くようであり、これらのMACHプロテアーゼの前記の特異的インヒビターとして利用することができる。同様に、ペプチド、有機化合物、抗体などのようなほかの物質をスクリーニングして、MACHプロテアーゼを阻害できる特定の医薬をえることもできる。
MACHプロテアーゼのペプチドインヒビターを設計しスクリーニングする方法の非限定実施例は、ICEまたはICE様プロテアーゼのペプチドインヒビター、ICEの基質特異性、およびペプチド合成を利用するエピトープ分析の戦略についての以前の研究結果に基づいている。ペプチドがICEで有効に切断されるのに必要な最小の要件は、切断部位の左側に、Ｐ1位置にアスパラギン酸に対する強い選択性（preference）を有する（Ｐ1位置の右側にはメチルアミンが充分である）４つのアミノ酸を含有することであることが見出された（Sleath et al., 1990の報告；Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992）。さらに、蛍光原基質ペプチド（テトラペプチド）のアセチル-Asp-Glu-Val-Asp-a-（４−メチル−クマリル−７−アミド）（Ac-DEVD-AMCと略す）は、FAS-Rの刺激およびほかのアポトーシスプロセスの後、すぐに細胞内で切断されることが見出されているポリ（ADP−リボース）ポリメラーゼ（PARP）の配列に相当し（Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994）、そしてCPP32（CED3/ICEプロテアーゼファミリーのメンバー）およびMACHプロテアーゼによって有効に切断される。
基質のＰ1位置のAspが重要のようなので、４番目のアミノ酸残基としてAspを有し、かつ最初の３つの残基の位置にアミノ酸の各種組み合わせを有するテトラペプチドは、たとえばGeysenが開発した方法（Geysen, 1985、Geysen et al., 1987）（固体支持体上の多数のペプチドと抗体との特異的相互作用についてスクリーニングする方法）を用いて、MACHプロテアーゼの活性部位への結合について迅速にスクリーニングすることができる。MACHプロテアーゼの特定のペプチドへの結合は、当該技術分野の当業者の技量の範囲内の公知の各種検出法、たとえばMACHプロテアーゼの放射線標識化法などで検出することができる。このGeysen法は、各試験日ごとに少なくとも4000種のペプチドを試験できると報告された。
CED3/ICEファミリーのプロテアーゼのほかのメンバーが関与する生理的細胞死のプロセスを阻害することなく、MACHプロテアーゼを選択的に阻害するペプチドインヒビターを設計することが有利であるので、さらに、前記のような検定時にMACHプロテアーゼと結合するペプチドのプールを、蛍光原基質のペプチドとして合成して、ほかのCED3/ICEプロテアーゼによって切断されることなしにMACHプロテアーゼによる選択的切断について試験することができる。MACHプロテアーゼによって選択的に切断されることが確認されたペプチドは次に、修飾して、細胞透過性を高めかつMACHの細胞死活性を可逆的にまたは不可逆的に阻害させることができる。Thornberryらは（1994）、テトラペプチドの（アシルオキシ）メチルケトンAc-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC（O）-［2,6-（CF3）2］PhがICEの強力な不活性化剤であることを報告した。同様に、Milliganらは（1995）、クロロメチルケトン基（不可逆的）またはアルデヒド基（可逆的）を有するテトラペプチドのインヒビターがICEを阻害すると報告した。さらに、ベンジルオキシカルボキシル−Asp-CH2OC（O）-2，6-ジクロロベンゼン（DCB）がICEを阻害することが報告された（Mashima et al., 1995）。したがって、MACHプロテアーゼに選択的に結合するテトラペプチドは、たとえば、アルデヒド基、クロロメチルケトン基、（アシルオキシ）メチルケトンまたはCH2OC（O）-DCB基で修飾して、MACHプロテアーゼの活性のペプチドインヒビターを創製することができる。
ほかのCED3/ICEプロテアーゼのいくつかの特定のインヒビターは細胞透過性があるが、ペプチドインヒビターの細胞透過性は増強する必要がある。たとえば、ペプチド類は、化学的に修飾するかまたは誘導体化して、細胞膜を横切るその透過性を増強しかようなペプチドを膜を通過させて細胞質中に輸送しやすくすることができる。Muranishiら（1991）は、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンをラウリン酸で誘導体化して、細胞膜を横切る透過性が優れた親油性のラウロイル誘導体を製造したと報告した。また、Zachariaら（1991）は、メチオニンを酸化してスルホキシドとし、そのペプチド結合をそのケトメチレンイソエステル（COCH2）で置換して、ペプチドを細胞膜を通過させて輸送しやすくなったと報告した。これらは、当該技術分野の当業者の技量の範囲内にある公知の修飾体と誘導体のほんの一部に過ぎない。
さらに、MACHα1とMACHα2の細胞死活性を阻害できる医薬またはペプチドインヒビターは、細胞内に入り易くする分子と接合または複合することができる。
米国特許第5,149,782号には、細胞膜を横切って輸送される分子に、膜混合剤（membrane blending agent）、たとえば融合誘導ポリペプチド、イオンチャネル形成ポリペプチド、ほかの膜ポリペプチド、および長鎖脂肪酸、たとえばミリスチン酸、パルミチン酸などを接合することが開示されている。これらの膜混合剤は、分子接合体とを細胞膜の脂質二重層中に挿入して、それら接合体を細胞質中に入り易くする。
Lowらの米国特許第5,108,921号には、制限はないが、受容体を介するエンドサイトーシス活性の機構によってタンパク質や核酸などの分子を膜を通して輸送する利用可能な方法が概説されている。これらの受容体系としては、ガラクトース、マンノース、マンノース６−ホスフェート、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、トランスコバラミン（ビタミンＢ12）、α−２マクログロブリン類、インスリンおよび上皮増殖因子（EGF）のようなほかのペプチド成長因子類を認識する受容体がある。Lowらは、ビオチンおよび葉酸塩に対する受容体のような栄養素受容体が、大部分の細胞の膜の表面上のビオチンと葉酸塩の受容体の位置と多様性および関連受容体媒介トランスメンブラン輸送プロセスによって、細胞膜を横切る輸送を増強するのに有利に使用できることを教示している。したがって、細胞質中に送られる化合物とビオチンもしくは葉酸塩などのリガンドとの間に形成される複合体が、ビオチンまたは葉酸塩の受容体を担持する細胞膜と接触して、受容体を介するトランスメンブラン輸送機構が開始され、その結果、所望の化合物が細胞中に入ることができる。
ICEは、Ｐ2の位置の自由な置換を許容する性能を持っていることが知られ、この自由な置換の許容は、ビオチンのタグを含有する強力かつ高度に選択性のあるアフィニティーラベルを開発するのに利用された（Thornberry et al., 1994）。その結果、テトラペプチドインヒビターのＰ2位置およびおそらくはＮ末端は、たとえばビオチン分子を付加することによって修飾または誘導体化して、これらペプチドインヒビターが細胞膜を横切って透過する性能を増強することができる。
さらに、所望のペプチド配列を、リーダー／シグナルのペプチド配列と融合させて「キメラペプチド」を創製すると、このような「キメラペプチド」を細胞膜を横切らせて細胞質中に輸送できることは当該技術分野で公知である。
ペプチドの技術分野の当業者であれば分かるように、本発明のMACHのタンパク質分解活性のペプチドインヒビターには、MACHプロテアーゼに対する結合について迅速にスクリーニングして恐らくより安定なインヒビターを設計できるペプチド様（peptidomimetic）の医薬またはインヒビターが含まれるものとする。
細胞膜を横切らせて行うペプチドインヒビターの輸送を容易にするかまたは増強するため先に考案したのと同じ方法を、MACHアイソフォーム自体およびその効果を細胞内で発揮するほかのペプチドとタンパク質にも適用できることが分かるであろう。
ここで記載される抗体に関しては、用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、キメラ抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（anti-Id）抗体を意味し、酵素的切断に限らず、ペプチド合成法または組換え法のような既知の技法のうちのいずれかにより提供されるそのフラグメントと同様に、可溶性の形態または結合した形態で標識されうる。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子の群である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均一な群を含み、その群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は当業者に知られている方法でえられればよい。たとえば、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497（1975）;U.S.Patent No.4,376,.110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）;およびColligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y.,（1992−1996）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、「参考文献」により本明細書に完全に包含されている。前記抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、GILDを含むイムノグロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはin vitro、in situまたはin vivoで培養されてもよい。in vivoまたはin situにおける高力価のモノクローナル抗体の産生は近年好まれている産生方法である。
キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、たとえばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する。キメラ抗体は適用の際の免疫原性を減少させるためにおもに用いられ、作製の際の収率を高めるために用いられる。たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマからの高収率を有するが、ヒトにおいては高い免疫原性を有するばあいに、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの製造法は当該分野で既知である（Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277（1984）; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855（1984）; Boulianne et al., Nature 312: 643−646（1984）; Cabilly et al., European Patent Application 125023（published November 14, 1984）; Neuberger et al., Nature 314: 268−270（1985）; Taniguchi et al., European Patent Application 171496（published February 19, 1985）; Morrison et al., European Patent Application 173494（published March 5, 1986）; Neuberger et al., PCT Application WO 8601533,（published March 13, 1986）; Kudo et al., European Patent Application 184187（published June 11, 1986）; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066−1074（1986）; Robinson et al., International Patent Application No.WO8702671（published May 7, 1987）; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439−3443（1987）; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214−218（1987）; Better et al., Science 240: 1041-1043（1988）; and Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.）。これらの参考文献は「参考文献」の欄により本明細書に完全に包含されている。
抗イディオタイプ（anti-Id）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ抗体は、それに対して抗イディオタイプが作製される、を用いて、モノクローナル抗体のソースと同一の種および遺伝型を有する動物（たとえば、マウスの株）を免疫することにより作製することができる。免疫された動物は免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−イディオタイプ抗体）を産生することにより免疫する抗体のイディオタイプ決定基に対する応答をするであろう。たとえばU.S.Patent No.4,699,880を参照のこと。これは「参考文献」の欄により本明細書に完全に包含されている。
抗イディオタイプ抗体は、さらなるほかの動物に免疫応答を誘導するための「免疫原」（いわゆる抗抗イディオタイプ抗体を産生する）として用いられてもよい。抗抗イディオタイプは抗イディオタイプを誘導するオリジナルのモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であってもよい。このようにモノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
したがって、本発明のMORT-1結合タンパク質、類似体、フラグメントまたはその誘導体に対して産生されるモノクローナル抗体は、適切な動物、たとえばBALB／ｃマウス、において抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いてもよい。前記免疫されたマウスからの脾細胞は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いられる。さらに、抗イディオタイプモノクローナル抗体はキーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）のようなキャリアーと結合することができ、さらなるBALB／ｃマウスに免疫するために用いられることができる。これらのマウスからの血清は、前記MORT-1結合タンパク質、または類似体、フラグメントおよびその誘導体のエピトープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗イディオタイプ抗体を含むであろう。
こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それら自身のイディオタイプエピトープ、または評価されるエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」、たとえばGRBプロテイン−α、を有する。
用語「抗体」は、完全な分子とそれらのフラグメントたとえば、抗原に結合できるFabとF（ab′）２の両者を含むものも意味する。FabおよびF（ab′）２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントがなく、循環からより急速に取り除かれ、完全な抗体よりも組織結合特異性が少なくてもよい（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316−325（1983））。
本発明に有用な抗体のFab、F（ab′）２およびほかのフラグメントが、完全な抗体分子のためにここに記載されている方法にしたがって、MORT-1結合タンパク質の検出および定量のために使用されてもよい。前記フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを産生するため）またはペプシン（F（ab′）２フラグメントを産生するため）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典型的に産生される。
抗体がある分子と特異的に反応してその分子と抗体とが結合できるばあいは、抗体は分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体に結合されるいずれかの分子の一部分であって、その抗体に認識されうる部分を含むことを意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は、アミノ酸や糖の側鎖などの化学的に活性な表面分子基から通常なり、特定の三次元構造特性のみならず特定の電荷特性も有する。
「抗原」は、抗体に結合されることのできる分子またはその分子の一部分であり、抗原のエピトープに結合できる抗体を動物にさらに産生させることができる。抗原は１またはそれより多くのあるエピトープを有していてもよい。前述の特異的な反応は、抗原が高度な選択性様式で相当する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引きおこされてもよいほかの多数の抗体とは反応しないことを示すよう意図されている。
本発明で有用な抗体のフラグメントを含む抗体は、サンプル中のMORT-1結合タンパク質の定量的または定性的検出または本発明のMORT-1結合タンパク質を発現する細胞の存在を検出するために用いてよい。これは、光学顕微鏡的、フローサイトメトリック的または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光的に標識された抗体を用いる免疫蛍光法（以下参照）によって確立されうる。
本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は、本発明のMORT-1結合タンパク質のin situでの検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のように、組織学的に使用されてもよい。In situ検出は患者から組織学的な試料を採取し、その試料に標識された本発明の抗体を提供することによって完成する。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに適用するかまたは上にかぶせることにより提供される。このような操作を用いると、MORT-1結合タンパク質の存在のみならず、検査される組織でのその分布も測定されうる。本発明を用いると、広く様々な組織学的な方法（染色操作など）のいずれもが、そのin situ検出を達成するために修飾されうる、ということを当業者であれば容易に認めるであろう。
本発明のMORT-1結合タンパク質のためのアッセイは典型的には、生物学的サンプル、たとえば生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球などの新鮮にえられた細胞または組織培地でインキュベートされた細胞など、をMORT-1結合タンパク質を同定することのできる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートし、当該分野でよく知られている多くの技法のうちのいずれかによりその抗体を検出することからなる。
生物学的サンプルはニトロセルロースのような固相支持体もしくは固相キャリヤー、または細胞、細胞の粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することのできるほかの固体支持体もしくは固体キャリヤーで処理されてもよい。支持体またはキャリヤーは適切な緩衝液で洗浄され、前記のように本発明の検出可能な標識抗体で処理してもよい。そののち、固相支持体またはキャリヤーを緩衝液で２度洗浄して結合していない抗体を除去してもよい。この固相支持体またはキャリヤーに結合した標識の量は従来の手段により検出すればよい。
「固相支持体」、「固相キャリヤー」「固体支持体」、「固体キャリヤー」、「支持体」または「キャリヤー」は、抗原や抗体を結合することのできるいかなる支持体またはキャリヤーをも意味するものである。よく知られている支持体またはキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性セルロースおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイガン（gabbros）およびマグネタイトがあげられる。キャリヤーの特性は、本発明の目的のためにはある程度まで可溶性であるかまたは不溶性であることができる。支持体の材料は事実上、結合される分子が抗原か抗体に結合できる限り、いかなる構造のコンフィグレーションであってもよい。このように、支持体またはキャリヤーのコンフィグレーションは、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。また、表面はシート、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体またはキャリヤーはポリスチレンビーズを含む。抗体または抗原を結合するためのほかの適するキャリヤーについては、当業者であればわかり、ルーチンの実験を用いることにより同一のものを確認できるであろう。
前述のようにして本発明でえられた多数の抗体の結合活性は、よく知られている方法により測定すればよい。当業者であればルーチンの実験を用いることにより各測定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかのステップは、通常のようにまたは特定の条件に対しては必要に応じてアッセイ追加してもよい。
本発明の抗体を検出可能となるように標識することのできる方法のうちの１つは、抗体に酵素を結合させ、酵素免疫測定法（EIA）を用いることである。この酵素は、のちに適切な基質にさらされると検出可能な、たとえば分光光度的、蛍光定量的または可視的手段により、化学的分子を産生するように基質と反応するであろう。抗体を検出可能にするために標識する際に用いることのできる酵素は、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられる。検出は酵素用の色素基質を用いる色素法により行なうことができる。検出は、同様にして調製されたスタンダードと比較した基質に対する酵素反応の程度を視覚的に比較することにより行なってもよい。
検出は様々なほかの免疫測定法を用いて行なってもよい。たとえば、放射能で標識された抗体または抗体のフラグメントにより、ラジオイムノアッセイ（RIA）を用いてR-PTPアーゼを検出することができる。RIAについての好ましい記載は、Work, T.S.らによるLaboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY（1978）に見られ、とくにChard, T.による“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques”というタイトルの章に言及されている。これは「参考文献」の欄によりここに取り入れられている。放射性アイソトープも、ｇカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオートラジオグラフィーを用いて検出することができる。
本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光により検出することができる。通常最もよく用いられている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体は、152Ｅまたはランタニド系のほかのものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ETPA）などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
抗体は、化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することもできる。化学発光が付された抗体の存在は、化学反応の過程の間に生ずる発光体の存在を検出することにより測定される。とくに有用な化学発行標識化合物の具体例は、ルミノール、イソルミノール、サーマティック  アクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。
同様に、バイオ発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。バイオ発光体は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的なシステムに見出されるタイプの化学発光体である。バイオ発光タンパク質の存在は、発光体の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要なバイオ発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
本発明の抗体分子は「ツーサイト」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても知られている、免疫的定量アッセイに利用するために適応させてもよい。典型的な免疫的定量アッセイでは、一定量の未標識抗体（または抗体のフラグメント）を固体支持体またはキャリヤーに結合させ、検出可能に標識した一定量の可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分の複合体を検出および／または定量する。
典型的で好まれる免疫定量アッセイは「フォーワード（forward）」アッセイであり、そこでは固相に結合した抗体がまず試験されるサンプルに接触し、２成分の固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出する。適切なインキュベーション期間ののち、固相支持体またはキャリヤーを洗浄して未反応の抗原を含む残った液体サンプルを除去し、未知の量の標識抗体（「レポーター分子」として働く）を含む溶液を接触させる。未標識抗体を介して固体支持体またはキャリヤーに結合した抗原と標識抗体とを複合体とするために２回目のインキュベーションをしたのち、固体の支持体またはキャリヤーを２回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原を用いると有用なアッセイでもあるほかのタイプの「サンドイッチ」アッセイ、いわゆる「同時に（simultaneous）」および「リバース（reverse）」のアッセイ、が用いられる。同時のアッセイは、固体支持体またはキャリヤーに結合した抗体および標識抗体が試験されるサンプルに同時に加えられるので、１つのインキュベーションステップからなる。インキュベーションが完了すると、固体支持体またはキャリヤーを洗浄して残った液体サンプルおよび複合化されなかった標識抗体を除去する。固体支持体またはキャリヤーに結合した標識抗体の存在は、通常の「フォーワード」サンドイッチアッセイのようにして測定される。
「リバース」アッセイでは、標識抗体の溶液をまず液体サンプルに段階的に加え、つづいて固体支持体またはキャリヤーに結合する未標識の抗体を、適切なインキュベーションを行なったのちに加える。２回目のインキュベーションののちに、固相を通常の様式で洗浄し、試験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りからそれを解放する。固体支持体またはキャリヤーに連結した標識抗体は、「同時に」および「フォーワード」アッセイで行なうようにして測定される。
本発明のMORT-1結合タンパク質は標準的な組換えDNA操作（たとえば、Sambrook, et al., 1989およびAnsabel et al., 1987−1995参照）により産生されてもよい。その操作では、タンパク質をコードする配列を含む適切な真核生物または原核生物のベクターにより、当技術において知られる適切な真核生物または原核生物の宿主細胞が形質転換される。したがって、本発明は本発明のタンパク質を産生するためのそのような発現ベクターおよび形質転換された宿主にも関する。前述のように、これらのタンパク質はそれらの生物学的活性を有する類似体、フラグメントおよび誘導体を含み、したがってそれらをコードするベクターもこれらのタンパク質の類似体およびフラグメントをコードするベクターを含み、形質転換された宿主は前記類似体およびフラグメントを産生する宿主を含む。形質転換された宿主が産生するこれらのタンパク質の誘導体は、これらのタンパク質またはその類似体もしくはフラグメントを標準の修飾法で製造した誘導体である。
また本発明は、MORT-1結合タンパク質をコードする組換え動物ウイルスベクターであって、特定の標的細胞（たとえば癌細胞）の表面タンパク質と結合してMORT-1結合タンパク質の配列を標的細胞中に挿入することができるウイルス表面タンパク質をコードするベクターを含有してなる薬学的組成物に関する。さらに、本発明の薬学的組成物は、有効成分として、（a）MORT-1結合タンパク質の配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、または（b）MACHアイソフォームのタンパク質分解活性をブロックする医薬を含有する。
本発明の薬学的組成物は、その目的を達成するのに充分な量の有効成分を含有している。さらに、本発明の薬学的組成物は、有効化合物を薬学的に使用できる製剤に加工し易くし、かつ当該技術分野の当業者にとって公知のように、投与を必要とする患者に投与する前記製剤を安定化することができる、賦形剤と補助剤を初めとする適切な薬学的に許容できる担体を含有している。
MORT-1結合タンパク質MACHは、異なる組織中に著しく異なるレベルでそして見かけ上異なるパターンのアイソタイプで発現される。これらの差異は、おそらく、Fas/APO1リガンドとTNFに対する応答の組織特異的特性の一因になっている。ほかのCED3/ICE相同体の場合のように（Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995）、不完全なCED3/ICE領域を含有するMACHアイソフォーム（たとえばMACHα3）は、同時に発現されるMACHα1またはMACHα2の分子の活性に対する阻害効果を有していることが見出されており、またこれらアイソフォームはFas/APO1とP55-Rによる細胞死の誘導をブロックすることも見出されている。細胞内でこのような阻害性アイソフォームが発現することが、Fas/APO1およびTNFが媒介する細胞傷害性に対する細胞の自己防衛の機構になっている。MACHアイソフォームの広い異種性（heterogeneity）は、CED3/ICEファミリーのほかのプロテアーゼに見られる異種性を大きく超えているので、活性のMACHアイソフォームの機能をとくにうまく調整することができるのであろう。
これらMACHアイソフォームのいくつかはほかの機能を提供することができる。MACHβ1がMORT-1とMACHα1の両者と結合できることは、このアイソフォームが、酵素的に活性なアイソフォームの活性を実際に増大できることを示唆している。このアイソフォームでトランスフェクトされた293-EBNAとMCF7の培養物に見られる軽度の細胞傷害性およびこのアイソフォームがHeLa細胞内で示すむしろ大きい細胞傷害効果は、トランスフェクトされたMACHβ1分子に結合すると、内因的に発現されるMACHα分子が活性化されることを示しているようである。おそらくMACHアイソフォームのいくつかはFas/APO1とTNFの受容体のほかの非細胞傷害効果に関与している分子のドッキング部位として作用できると考えられる。
Fas/APO1とTNFの受容体が細胞死を起こす独特の性能を有し、かつTNF受容体が組織損傷活性をトリガーする性能を有しているため、これらレセプターの機能の異常は生体にとってとくに有害である。実際に、これら受容体が過剰に機能したり不完全に機能すると各種疾患の病理学的発現の原因になることが報告されている（Vassalli, 1992; Nagata and Golstein, 1995）。これら受容体のシグナリング活性に寄与している分子を同定し、そしてこれら分子の活性をモジュレートする方法を見つければ新しい治療法がえられる。Fas/APO1およびTNFが媒介する細胞傷害性におけるMACHαの考えられる中心的な役割から見て、CED3/ICEファミリーのほかのいくつかのタンパク質についてなされたように、MACHαのタンパク質分解機能をブロックできる医薬を設計することがとくに重要のようである（Thornberry et al., 1994; Miller et al., 1995; Mashima et al., 1995; Milligan et al., 1995; Enari et al., 1995; Los et al., 1995）。MACHα分子内にはCED3/ICE相同体の独特の配列の特性があるので、その活性に特異的に作用する医薬を設計することができる。かような医薬は、CED3/ICEファミリーのほかのメンバーが関与する生理的細胞死プロセスを阻害することなく、MACHαが関与する過剰な免疫媒介細胞傷害性に対して防御する。
本発明のほかの観点は以下の実施例から明らかになるであろう。
以下に本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および図面に限定されるものではない。
MORT-1とMORT-1結合タンパク質について下記の実施例１（Bolding et al., 1995bも参照）と実施例２で述べているように、（i）ツーハイブリッドスクリーンとツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験；（ii）タンパク質類の誘導される発現、代謝ラベリングおよび免疫沈降；（iii）in vitro結合；（iv）細胞傷害性の評価；ならびに（v）ノーザン分析と配列分析の手順は、MACHとそのアイソフォームについて対応する単離、クローン化および特性付けを行うのに等しく（いくらか修正して）適用できることに注目すべきである。したがって、これらの手順は、以下の実施例３に詳細に記載されているように、本発明のMACHを単離し、クローン化し、ついで特徴づけるのに用いる同じ手順を全て開示していると解すべきである。
実施例１：FAS-Rの細胞内ドメインに結合するMORT-1タンパク質のクローニングおよび単離
（i）ツーハイブリッド  スクリーンおよびツーハイブリッド  β−ガラクトシダーゼ発現試験
FAS-Rの細胞内ドメインと相互作用するタンパク質を単離するために、酵母ツーハイブリッドシステムを用いた（Fields and Song, 1989）。要約すると、このツーハイブリッドシステムは、２つの別のドメイン、DNA結合ドメインおよび活性化ドメインを有するGAL4のような真核転写アクチベーターの回復を利用して、in vivoでの特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母を用いる遺伝子アッセイである。それらドメインが発現し、結合して回復したGAL4タンパク質を形成すると、ドメインは上流の活性化配列に結合することができ、lacZまたはHIS3などのレポーター遺伝子の発現を制御するプロモーターを順に活性化する。レポーター遺伝子の発現は培養された細胞中に容易に観察される。このシステムでは、タンパク質と相互作用する候補の遺伝子は別々の発現ベクターへクローン化される。一方の発現ベクターでは、GAL4DNA−結合ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、ある候補タンパク質の配列がGAL4DNA−結合ドメインの配列と同位相で（in phase with）クローン化され、他方のベクターでは、GAL4−活性化ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、第２候補タンパク質の配列がGAL4−活性化ドメインの配列と同位相でクローン化される。つぎに２つのハイブリッドベクターは、上流のGAL4結合部位が制御されているlacZまたはHIS3レポーター遺伝子を有する酵母宿主株中へ同時に形質転換される。２つのハイブリッドタンパク質が発現しかつそれらのタンパク質が互いに相互作用しうる、形質転換されたそれらの宿主細胞（同時形質転換体）のみが、レポーター遺伝子を発現することができるであろう。lacZレポーター遺伝子のばあい、X-galが培地に加えられると、この遺伝子を発現している宿主細胞は色が青くなるであろう。したがって、青いコロニーは２つのクローン化された候補タンパク質が互いに相互作用することができるという事実を示す。
このツーハイブリッドシステムを用いて、細胞内ドメイン、FAS-IC、を単独でベクターpGBT9（GAL4DNA−結合配列を担持する、CLONTECH、米国より入手、以下参照）へ、GAL4DNA−結合ドメインとの融合タンパク質を作製するために、クローン化した。pGBT9へのFAS-Rのクローニングには、FAS-Rの全長cDNA配列（WO 9531544）をコードするクローンが用いられ、そこから種々の制限酵素を用いる標準的な操作により細胞内ドメイン（IC）を切断し、つぎに標準的操作により単離し、その多くのクローニング部位領域（MCS）に、対応する適切な制限酵素を用いて、開裂したpGBT9ベクターへ挿入した。FAS-ICは完全なFAS-Rのアミノ酸残基175〜319から延長（extend）しているが、残基175〜319を含むこの部分はpGBT9ベクターへ挿入されたFAS-ICであるということを記載すべきである。
つぎに前記ハイブリッド（キメラの）ベクターを、GAL4活性化ドメインを有する、pGAD GHベクターへクローン化されたヒトHeLa細胞由来cDNAライブラリーとともに、HF7c酵母宿主株へ、同時トランスフェクトした（全ての前記ベクター、pGBT9およびHeLa細胞cDNAライブラリーを担持するpGAD GH、ならびに酵母株は、MATCHMAKERツーハイブリッドシステム#PT1265-1の一部として、Clontech Laboratories, Inc.,米国より購入した）。同時トランスフェクトされた酵母をヒスチジン欠損培地（His-培地）中でのそれらの増殖能により選択した。増殖しているコロニーは陽性の形質転換体であることを示す。選択した酵母クローンは、つぎにそのlacZ遺伝子発現能、すなわちそのLACZ活性について試験した。これは、lacZ遺伝子によりコードされる酵素、β−ガラクトシダーゼにより異化され、青く着色した生産物を形成するX-galを培地に加えることにより行なった。このように、青いコロニーは活性lacZ遺伝子を示す。lacZ遺伝子の活性には、GAL4転写アクチベーターが形質転換されたクローンにおいて活性型で存在すること、すなわち前記ハイブリッドベクターによりコードされるGAL4DNA−結合ドメインが他方のハイブリッドベクターによりコードされるGAL4活性化ドメインと正確に結合することが必要である。このような組み合わせは、GAL4ドメインのそれぞれに融合した２つのタンパク質が互いに安定に相互作用（結合）するばあいに限り可能である。このように、単離されたHis+および青い（LACZ+）コロニーは、FAS-ICをコードするベクターおよびFAS-ICに安定に結合しうるヒトHeLa細胞起源のタンパク質産物をコードするベクターとともに同時トランスフェクトされたコロニーである。
前記His+、LACZ+酵母コロニー由来のプフスミドDNAを単離し、標準的操作で大腸菌株HB101へ電気穿孔し、つづいてLeu+およびアンピシリン耐性形質転換体を選択をした。これらの形質転換体はAmpRおよびLeu2の両コード配列を有するハイブリッドpGAD GHベクターを担持するものである。したがって、このような形質転換体は、FAS-ICに結合しうる新たに同定されたタンパク質をコードする配列を担持するクローン類である。つぎにプラスミドDNAをこれらの形質転換した大腸菌から単離し、
（a）前述のように、それらをオリジナルのFAS-R細胞内ドメインハイブリッドプラスミド（FAS-ICを担持するハイブリッドpGTB9）とともに酵母株HF7へ再形質転換すること。コントロール群として、たとえばpACT−ラミンまたはpGBT9単独の配列をコードする無関係なタンパク質を担持するベクターを、FAS-IC−結合タンパク質（すなわちMORT-1）をコードするプラスミドとともに同時形質転換のために用いた。つぎに同時形質転換した酵母はHis-培地単独、または３−アミノトリアゾールの異なる濃度を含む培地で増殖について試験した、および
（b）プラスミドDNAおよびオリジナルのFAS-ICハイブリッドプラスミドおよび（a）に記載のコントロールプラスミドを酵母宿主細胞株SFY526に再形質転換することおよびLACZ+活性（β-gal形成の有効性、すなわち青色形成）を決定すること
により再試験した。
前記試験の結果は、コロニーの色で評価すると、His-培地におけるコロニーの増殖のパターンはLAC Ｚ活性のパターンに一致した、すなわちHis+コロニーはLACZ+でもあったことを示した。さらに、GAL4DNA−結合ハイブリッドおよび活性化−ドメインハイブリッドを、HF-7酵母宿主細胞よりGAL4転写アクチベーターによる良好なLACZ誘導能を有するSFY526酵母宿主へトランスフェクションしたのちに、液体培地（好ましい培地条件）におけるLAC Ｚ活性を評価した。
前記操作を用いて、先に記載した、「受容体により誘導される毒性のメディエーター（Mediator of Receptor-induced Toxicity）」のため今やMORT-1と称するタンパク質が同定され、単離されおよび特徴づけられた。
さらに、多数の前記ツーハイブリッド  β−ガラクトシダーゼ発現試験において、β−ガラクトシダーゼの発現は好ましいフィルターアッセイによっても評価されたことも記載すべきである。スクリーニングでは、約３×106cDNAのうちの５つがMORT-1挿入物を含むことがわかった。つぎにいわゆるクローン化したMORT-1cDNA挿入物を標準的なDNA配列決定操作を用いて配列決定した。MORT-1のアミノ酸配列（配列番号２）をDNA配列から推定した。cDNA挿入物によりコードされるタンパク質における残基の番号付けはSwiss-Prot data bankにならう。欠失突然変異株をＰＣＲにより、および点突然変異株をオリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（oligonucleotide-directed mutagenesis）（Current Protocols in Molec. Biol.,（1994））により生産した。
（ii）タンパク質の誘導された発現、代謝的標識および免疫沈降法
FLAGオクタペプチドにＮ末端結合したMORT-1（FLAG-MORT-1、Eastman Kodak、New Haven, Ct., 米国）、Fas-IC、FAS-R、p55-R、FAS-Rの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（アミノ酸153〜319）に融合したp55-Rの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜168）からなるキメラ、およびコントロールとして働くルシフェラーゼcDNAをHeLa細胞で発現させた。発現はテトラサイクリン−制御発現ベクターを用い、テトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを発現するHeLa細胞のクローン（HtTA-1）（GossenおよびBujard（1992）、Boldinら（1995）も参照）において行なった。［35Ｓ］メチオニンおよび［35Ｓ］システイン（DUPONT、Wilmington, De.,米国およびAmersham、Buckinghamshire、英国）での代謝的標識はトランスフェクションの１８時間のち、さらにメチオニンおよびシステイン欠損であるが２％透析ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改良イーグル培地で４時間インキュベーションを行なった。つぎに細胞をRIPA緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、１％NP-40、１％デオキシコーレート、0.1％SDSおよび１mM EDTA）に溶解し、溶解物を無関係なウサギ抗血清（３μl／ml）およびプロテインＧセファロースビーズ（Pharmacia、Uppsala、スウェーデン国、60μl／ml）とのインキュベーションにより前清浄した。免疫沈降法は、FLAGオクトペプチド（Ｍ２、Eastman Kodak）、p55-R（＃18および＃20、（Engelmann et al., 1990））、またはFAS-R（ZB4、Kamiya Southand Oaks、Ca., 米国）に対するマウスモノクローナル抗体（５μｌ／アリコート）と、もしくはコントロールとしてアイソタイプ適合マウス抗体とともに溶解物の0.3mlアリコートを４℃で１時間インキュベーションし、さらにプロテインＧセファロースビーズ（30μ；／アリコート）と１時間インキュベートすることにより行なった。
（iii）In vitro結合
野生型FAS-ICまたは突然変異したFAS-ICとのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）融合体を生産し、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた（Boldin et al.,（1995）、Current Protocols in Molecular biology（1994）、Frangioni and Neel（1993）も参照）。代謝的に標識したFLAG-MORT-1融合タンパク質のＧＳＴ−Fas-ICへの結合は、代謝的に［35Ｓ］メチオニン（60μＣi／ml）で標識した、FLAG-MORT-1を発現するHeLa細胞の抽出物と４℃で２時間ビーズをインキュベーションすることにより評価した。抽出物は、50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.1％NP-40、１mMジチオトレイトール、１mM EDTA、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、20μｇ／mlアプロトニン、２０μｇ／mlロイペプチン、10mMフッ化ナトリウムおよび0.1mMバナジン酸ナトリウム（１ml／５×105細胞）を含む緩衝液において調製した。
（iv）誘導されたＭＯＲＴ−１の発現によりトリガーされた細胞傷害性の評価
MORT-1、Fas-IC、p55-ICおよびルシフェラーゼcDNAをテトラサイクリン−制御発現ベクターへ挿入し、分泌型胎盤アルカリホスファターゼcDNAとともにHtTA-1細胞（HeLa細胞系）にトランスフェクトし（Gossen and Bujard（1992））、SV40プロモーター（pSBC-2-ベクター、Dirks et al.,（1993））の制御下においた。細胞死を中性レッドの取り込みアッセイ（Wallach（1984））または、トランスフェクトされたcDNAを発現するそれらの細胞における死を特異的に評価するために、インキュベーションの最後の５時間に増殖培地に分泌される胎盤アルカリホスファターゼの量を決定すること（Berger et al., （1988））により、トランスフェクションの40時間のちに評価した。
FAS-ICへの結合と関係するMORT-1タンパク質の領域を分析するための実験のもう一方のセットでは、テトラサイクリン−制御発現ベクター（pUHD10-3）を用いて、以下のタンパク質、ヒトFAS-R単独、ヒトFAS-RだけでなくMORT-1のＮ末端部分（アミノ酸１〜117、「MORT-1ヘッド」）、ヒトFAS-RだけでなくMORT-1のＣ末端部分、これはその「デス・ドメイン」相同性領域（アミノ酸130〜245、「MORT-1 DD」）を含む、FLAG-55.11（Ｎ末端でＦＬＡＧオクタペプチドに融合したタンパク質55.11のアミノ酸309〜900、タンパク質55.11はp55-IC−特異的結合タンパク質である）がテトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを含むHeLa細胞（HtTA-1）で一時的に発現された。トランスフェクションの12時間後、細胞をトリプシン処理し、30,000細胞／ウェルの濃度で再びまいた。さらなるインキュベーションの24時間のち、細胞を、10ｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下、種々の濃度（0.001〜10μｇ／ｍｌモノクローナル抗体）でFAS-Rの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体CH-11、Oncor、Gaithersburg、MD、米国）を用いて６時間処理した。つぎに細胞生存率を中性レッド取り込みアッセイにより決定し、結果はシクロヘキシミド単独（抗−FAS-Rモノクローナル抗体CH-11がない）とインキュベーションした細胞と比較して生存可能な細胞の％で表わした。
（v）ノーザン分析および配列分析
ポリＡ+RNAをHeLa細胞の全RNAから単離した（Oligotex-dT mRNA kit. QIAGEN、Hiden、独国）。プローブとしてMORT-1 cDNAを用いるノーザン分析を通常の方法（Boldin et al.,（1995）参照）により行なった。MORT-1のヌクレオチド配列をジデオキシチェーンターミネーション法により両方向で決定した。
ツーハイブリッド操作によりクローン化されたMORT-1 cDNAの配列分析はそれが新規タンパク質をコードすることを示した。このタンパク質（「受容体−誘導毒性のメディエーター」のためMORT-1）のFas-ICへの結合の特異性をさらに評価するために、およびそれが結合するFas-ICの特定の領域を定義するために、ツーハイブリッド試験を適用し、以下の発見に導いた（図１）。（a）MORT-1タンパク質はヒトおよびマウスFas-ICの両方に結合するが、TNF／NGF受容体ファミリーの３種の受容体（p55およびp75TNF受容体ならびにCD40）を含む、数種のほかの試験したタンパク質類には結合しない。（b）in vitroおよびin vivoの両方においてシグナリングを消滅させることが示される（lprcg突然変異（Watanabe-Fukunaga et al.,（1992）、Itoh and Nagata（1993））、FAS-Rの「デス・ドメイン」における225位（Ile）の置換突然変異もまたFAS-ICへのMORT-1の結合を阻止する。
（c）FAS-RにおけるMORT-1結合部位はこの受容体の「デス・ドメイン」内に存在する、および（d）MORT-1はそれ自体に結合する。この自己結合、およびFAS-RへのMORT-1の結合はタンパク質の異なる領域に関係する。残基１〜117に対応するMORT-1のフラグメントは全長MORT-1に結合するが、それ自体にもFAS-ICにも結合しない。逆に、残基130〜245に対応するフラグメントはFAS-Rに結合するが、MORT-1には以前結合しない（図１）。さらに、図１の結果から、FAS-Rの「デス・ドメイン」領域はFAS-IC自己会合に決定的であることが、p55-ICの自己会合のためのp55-Rの「デス・ドメイン」領域のように、明らかである。これらの「デス・ドメイン」の両端における欠失はその自己会合能に影響を及ぼさないが、一方でこれらの「デス・ドメイン」内での欠失は自己会合に影響を及ぼす。MORT-1のばあいでは、MORT-1のFAS-ICに対する結合もまたFAS-Rの完全（全長）な「デス・ドメイン」に依存するが、一方でFAS−IC結合のためのFAS-R「デス・ドメイン」領域の領域外は依存しない。
β−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイにより評価したようにトランスフェクトされたSFY526酵母内でのGal4DNA結合ドメインおよび活性化−ドメイン構築物（pGBT9およびpGAD-GH）によりコードされるタンパク質の相互作用を図１に表わす。DNA−結合ドメイン構築物は、ヒトFas-ICの４種の構築物、225位にIleからLeuまたはIleからAlaへの置換突然変異を有する２種の全長構築物（各々、I225NおよびI225A）を含むマウスFas-ICの４種の構築物、および３種のMORT-1構築物を含み、その全てを図式的に図１の左手側に示す。活性化−ドメイン構築物は、３種のMORT-1構築物類、そのMORT-1部分はDNA−結合−ドメイン構築物におけるのと同様である、および全長ヒトFas-IC構築物、Fas-IC部分は前記DNA−結合ドメイン構築物におけるのと同じである、を含んでいた。ヒトp55TNF受容体の細胞内ドメイン（p55-IC残基206〜426）、ヒトCD40の細胞内ドメイン類（CD40-IC、残基216〜277）およびヒトp75TNF受容体の細胞内ドメイン（p75-IC、残基287〜461）だけでなく、ラミン、サイクリンＤおよび「空の（empty）」Gal4（pGBT9）ベクター類をDNA−結合ドメイン構築物の形態で陰性コントロール群として供した。SNF-1およびSNF4をDNA−結合ドメイン（SNF）構築物および活性化−ドメイン（SNF4）構築物の形態で陽性のコントロール群として供した。「空の」Gal4ベクター（pGAD-GH）もまた活性ドメイン構築物の形態で陰性コントロール群として供した。記号「＋＋」および「＋」は、各々、アッセイの30および90分間内での強い発色を意味し、ならびに「−」は24時間内に発色がないことを意味する。スコアがない組み合わせは試験しなかったことを与える。
FLAGオクタペプチドとそのＮ末端で融合したMORT-1分子（FLAG-MORT-1）の発現は４種の異なるサイズ、約27、28、32および34kDのタンパク質類をHeLa細胞内で産生した。in vitroでのFas-ICとのMORT-1の相互作用はFLAG-MORT-1融合タンパク質でまたはコントロールとしてのルシフェラーゼcDNAでトランスフェクトされたHeLa細胞の抽出物からタンパク質を免疫沈降することにより観察され、免疫沈降は抗−FLAG抗体（αFLAG）を用いて行なわれた。in vitroでの相互作用はまたMORT-1とFAS-ICの間でも行なった。そこではMORT-1は、トランスフェクトされたHeLaの細胞の抽出よりえられた、［35Ｓ］メチオニン−代謝的標識FLAG-MORT-1融合タンパク質の形態であり、またFAS-ICは、FAS-ICの225位に置換突然変異を有するものを含むヒトおよびマウスGST-FAS-IC融合タンパク質の形態であり、そのGST-FAS-IC融合タンパク質の全てが大腸菌において生産された。GST−融合タンパク質は、MORT-1-FLAG融合タンパク質を含む抽出物との相互作用させる前にグルタチオンビーズに付着され、この相互作用に続いてSDS-PAGEが行なわれた。このようにin vitroでの相互作用を、SDS-PAGEにつづくオートラジオグラフィーにより、GST、ヒトまたはマウスFas-ICとのGST融合（GST-huFas-IC、GST-mFas-IC）に対するまたは225位でのIleからAlaへの置換突然変異を含むFas-ICとのGST融合に対する、FLAGオクタペプチドとの融合（FLAG-MORT-1）としてトランスフェクトされたHeLa細胞内で生産され、［35Ｓ］で代謝的に標識されたMORT-1の結合を評価することにより見きわめた。全４種のFLAG-MORT-1タンパク質はGST-Fas-IC融合タンパク質とのインキュベーションでFas-ICへの結合能を示すことを示した。酵母ツーハイブリッド試験（図１）におけるように、MORT-1はlprcg突然変異部位での置換（I225A）を有するGST-Fas-IC融合タンパク質には結合しない。
FLAG-MORT-1 cDNAによりコードされるタンパク質もまたFAS-Rの細胞内ドメインに対してだけでなくその細胞外ドメインがp55Rのそれと置換されたFAS-Rキメラ（p55-FAS)の細胞内ドメインに対して、HeLa細胞においてこれらの受容体で同時発現させると、結合能を示した。このばあい、トランスフェクトされたHeLa細胞内での、すなわちin vivoでのFAS-ICとのMORT-1の相互作用は種々のトランスフェクトされたHeLa細胞類の免疫沈降物で観察されるようにin vivo相互作用およびこれらのタンパク質をコードする構築物で同時トランスフェクトされた細胞内でのMORT-1とFAS-ICのあいだの相互作用の特異性を実証した。このように、FLAG-MORT-1融合タンパク質は単独で、またはヒトFAS-R、FAS-Rの細胞外ドメインがヒトp55-Rにおける対応する領域と置換されたFAS-Rキメラ（p55-FAS）と一緒に、または陰性コントロールとして、ヒトp55-Rと一緒に、HeLa細胞内で発現し、［35Ｓ］システイン（20μCi／ml）および［35Ｓ］メチオニン（40μCi／ml）で代謝的に標識された。同時発現された受容体とのMORT-1の交差免疫沈降は種々の特異的な抗体類を用いて行なった。その結果は、FLAG-MORT-1はFAS-Rの細胞内ドメインに対してだけでなくp55-Rの細胞外ドメインおよびFAS-Rの細胞内ドメインを有するFAS-R-p55-Rキメラの細胞内ドメインに対しても、HeLa細胞内でこれらの受容体類が同時発現されると、結合しうることを示した。さらに、トランスフェクトされた細胞の抽出物からのFLAG-MORT-1の免疫沈降もまた同時発現されたFAS-Rまたは同時発現されたp55-FASキメラの沈降という結果になった。逆に、これらの受容体類の免疫沈降はFLAG-MORT-1の共沈降という結果になった。
プローブとしてMORT-1 cDNAを用いるノーザン分析はHeLa細胞において単一のハイブリダイゼーションした転写産物を表わした。ノーザンブロットでは、トランスフェクトされた細胞由来のポリＡ+RNA（0.3μｇ）がMORT-1 cDNAとハイブリダイズし、RNA転写産物のサイズ（約1.8kb）はMORT-1 cDNAのサイズ（約1702ヌクレオチド）に近いことがわかった。
配列分析では、cDNAは約250アミノ酸のオープンリーディングフレームを含むことが判った。図２は「デス・ドメイン」モチーフに下線を引き、可能性のある開始Met残基（49位、ボールド、下線を引いたＭ）および翻訳終結コドン（769〜771位のコドンの下の星印）も同様にし、MORT-1の予備の（preliminary）ヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を表わす。この「デス・ドメイン」モチーフは既知のp55-RおよびFAS-R「デス・ドメイン」モチーフ類（p55DDおよびFAS-DD）と相同性を共有する。MORT-1の正確なＣ末端を決定するためおよびMORT-1の正確なＮ末端（開始Met残基）に関する証拠をうるために、追加の実験を以下のように行なった。
前記方法を用いて、FLAGオクタペプチドとそのＮ末端で融合したMORT-1分子（FLAG-MORT-1）をコードする多数の構築物を構築し、35Ｓ−システインおよび35Ｓ−メチオニンを用いて発現されたタンパク質の代謝的標識とともにHeLa細胞で発現させた。MORT-1-FLAG分子はMORT-1コード配列の異なる部分を含む以下のcDNAによりコードされた。
i）配列番号１のヌクレオチド１〜145（図２参照）を欠失させたMORT-1 cDNAの５′末端に結合したFLAGオクタペプチドcDNA、
ii）MORT-1全長cDNAの５′末端に結合したFLAGオクタペプチドcDNA、
iii）配列番号１のヌクレオチド１〜145に加えてヌクレオチド832〜1701を欠失させ（図２）、142〜144位のコドンＧＣＣをこの部位での翻訳開始を阻止するためにTCCに突然変異させたMORT-1 cDNAの５′末端に結合したFLAGオクタペプチドcDNA。
前記FLAG-MORT-1融合生産物の発現につづき、抗−FLAGモノクローナル抗体（Ｍ２）またはコントロールとして、抗−p75TNF-R抗体（＃９）を用い、前記のように免疫沈降を行ない、つづいてSDS-PAGE（10％アクリルアミド）およびオートラジオグラフィーを行なった。前記FLAG-MORT-1融合生産物での分析の結果はMORT-1の（認められていた）Ｃ末端を確認し、またMORT-1のＮ末端は図２における配列の49位であろうという証拠を提供した。
実に、その５′末端に融合したFLAGオクタペプチドがないMORT-1の追加の発現実験により、Met49は翻訳開始の有効部位として働くこどが示された。
「Gene Bank」および「Protein Bank」データベースで処理された調査は前記単離されたMORT-1の配列に対応する配列はないことを示した。このように、MORT-1は新規FAS-IC−特異的結合タンパク質を表わす。
p55-ICの高い発現は細胞傷害効果（Boldin et al.,（1995））を引き起こす。HeLa細胞でのFas-ICの発現もまた、低い程度ではあるが、感度のよいアッセイを使用するばあいにのみ検出される、そのような効果を有する。MORT-1、加えてヒトp55-ICおよびFAS-ICでトランスフェクトされた細胞における細胞傷害効果のリガンド非依存的な惹起はこのように分析された。HeLa細胞の生存率に対する、MORT-1、ヒトFas-IC、ヒトp55-IC、またはコントロールとして働くルシフェラーゼの一過性発現の効果をテトラサイクリン−制御発現ベクターを用いて評価した。細胞生存率は、分泌型胎盤アルカリホスファターゼをコードするcDNAとともに、テトラサイクリン（１μｇ／ml、発現を阻止するため）の存在下または不在下でこれらのcDNA類をトランスフェクションした40分後に評価した。細胞の生存率は、トランスフェクトされたDNAを発現するそれらの特定の細胞の生存率を特異的に決定するために、中性レッドの取り込みアッセイによりまたは、増殖培地に分泌される胎盤アルカリホスファターゼの量を測定することにより決定した。
前記分析は、HeLa細胞におけるMORT-1の発現により、FAS-IC発現によってひきおこされるよりも重大な細胞死に至るということを表わした。p55-IC、FAS-ICおよびMORT-1の全てのこれらの細胞傷害性効果は、「デス・ドメイン」領域に関し、これらのタンパク質類の全てに存在し、その「デス・ドメイン」が自己会合する傾向を有し、およびそれゆえに細胞傷害性効果を促進しうると思われる。
MORT-1の前記特徴、すなわち、細胞死誘導に関係するFAS-Rの特定の領域とのMORT-1の特異的会合、およびシグナリングを妨げるその領域における構造のわずかな変化でさえ、MORT-1の結合を消滅させる（lprcg突然変異）という事実、の観点ではこのタンパク質が細胞死のシグナリングまたはトリガーの役割をになうことを示す。この考えは、それ自身が細胞傷害性効果を誘発するMORT-1の能力が観察された、ということによりさらに支持される。このように、MORT-1は（i）FAS-Rのみならずそれ自身に対しても結合するそれ自身の能力によるFAS-Rの自己会合のモジュレーターとして機能し、または（ii）FAS-Rシグナリングに関係する追加のタンパク質のためのドッキング部位として働く、すなわちMORT-1は「ドッキング」タンパク質でありそれゆえFAS-Rに加えてほかの受容体に結合するであろう、または（iii）FAS-Rシグナリングとの相互作用を有する異なるシグナリングシステムの部分を構築するのであろう。
FAS-IC結合およびFAS-Rを介する細胞の効果（細胞傷害性）のモジュレーションに関係するMORT-1の領域をさらに分析するために、MORT-1の部分（「MORT-1ヘッド」、アミノ酸１〜117および「MORT-1dd」、アミノ酸130〜245）（別々に）をコードするベクター類を用いて、HeLa細胞の同時トランスフェクションのためのヒトFAS-Rをコードするベクターとともに、前記実験を行なった。これらの実験では種々のタンパク質およびタンパク質の組み合わせを、タンパク質をコードする配列をテトラサイクリン−制御発現ベクターpUHD10-3に挿入することによりテトラサイクリン−制御トランスアクチベーター（HtTA-1）を含むHeLa細胞で一時的に発現させた。コントロールトランスフェクション群はFAS-RのみをコードするベクターおよびFLAG-55.11融合タンパク質（55.11タンパク質は、アミノ酸309〜900を含む部分がFLAGオクタペプチドに（そのＮ末端で）融合したp55-IC−特異的結合タンパク質である）をコードするベクターを用いた。
トランスフェクションおよびインキュベーション期間につづき、トランスフェクトされた細胞を、細胞により発現されたFAS-Rの細胞外ドメインに特異的に結合する種々の濃度の抗−FAS-Rモノクローナル抗体（CH-11）で処理した。抗FAS-R抗体のこの結合は細胞表面でFAS-Rの凝集を誘導し（FAS-Rリガンドのようである）、FAS-ICを介する細胞内シグナリング経路を誘導し、最後には、細胞死（FAS-Rを介する細胞傷害性）という結果になる。用いられる抗−FAS-Rモノクローナル抗体（CH-11）の濃度は0.01〜10μｇ／mlの範囲であり、通常0.005、0.05、0.5および５μｇ／mlのような濃度であった。細胞は10μｇ／mlシクロヘキシミドの存在下抗−FAS抗体で処理した。
前記分析結果は、トランスフェクトされた細胞におけるFAS-Rの発現は抗−FAS-R抗体の細胞傷害性効果に対して感受性（「fas」と「55.11」とを比較）が増大されることを示す。さらに、「デス・ドメイン」相同性領域を含むMORT-1における領域およびFAS-Rの同時発現（fas＋MORT-1 dd）は、FAS-R「デス・ドメイン」（FAS-DD）に結合するMORT-1「デス・ドメイン」（DD）領域の能力から予期されるように、FASで誘導される（すなわち、FAS-Rを介する）細胞死を強く妨害する。さらに、MORT-1のＮ末端部分およびFAS-Rの同時発現（fas+mort1he」）はFAS-Rを介する細胞死を妨害せず、かりにするとしても、いくらか細胞傷害性を高める（すなわち、わずかに細胞死が増加する）程度である。
このように、前記結果は明らかに、MORT-1タンパク質はFAS-ICへの結合にかぎり２つの異なる領域を有することおよびFAS-ICの細胞−細胞傷害性活性の介在が関与することを示す。
したがってこれらの結果は異なる薬学的適用のためにはMORT-1タンパク質の異なる部分（すなわち、活性フラグメント類またはアナログ類）を使用するということの根拠をも提供する。たとえば、その「デス・ドメイン」領域を含むMORT-1のＣ末端部分のみを本質的に含むMORT-1タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはその誘導体は、FAS-Rを含む細胞または組織におけるFAS-Rの介する細胞傷害性効果を阻害するために用いられてもよく、それゆえたとえば、急性肝炎のようなばあいに、FAS-Rリガンドの有害な効果からこれらの細胞または組織を保護するであろう。また、腫瘍細胞および自己反応性ＴおよびＢ細胞のようなばあいに望まれれば、MORT-1のＮ末端部分のみを本質的に含むMORT-1タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはその誘導体を、FAS-Rを含む細胞および組織におけるFAS-Rの介する細胞傷害性効果を高めるために用いてこれらの細胞または組織を破壊に導いてもよい。ここで詳述したように、MORT-1の異なる領域の前記使用は、処理が望まれる特定の細胞または組織中へMORT-1領域コード配列を挿入するために種々の組み換えウイルス（たとえば、ワクシニア）を用いて行なわれてもよい。
さらに、これらのMORT-1領域を介する同様の所望の効果を達成するために、前記MORT-1領域に対応する配列または分子構造を有する抗体、ペプチドおよび有機分子のような種々のほかの分子を製造し、用いることも可能である。
さらに、MORT-1は、MORT-1に結合できるほかのタンパク質（すなわちMORT-1結合タンパク質類）を特異的に同定し単離しついで特徴付けるのに利用できる（実施例２と３参照）。
実施例２：MORT-1結合タンパク質の単離
（i）ツーハイブリッドスクリーンとツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験
実施例１に記載の方法に類似の方法で、p55TNF-Rの細胞内ドメイン（p55-IC）とMORT-1をベイトとして用い、そしてヒトＢ細胞ライブラリーをスクリーニングして、MORT-1とp-55-ICの両者に結合できるタンパク質産物をコードする２種のcDNAクローンをえた。両者のクローンは、図３に示すように、５′末端のヌクレオチド配列が同一であった（配列番号３）。
（ii）新たにクローン化されたcDNAの、ツーハイブリッドスクリーンにおける結合特性
前記の酵母ツーハイブリッド法を用いて、新しいMORT-1結合タンパク質のcDNAを含有する構築物を「プレイ」として用い、このプレイに、いくつかの「ベイト」の構築物を別個の反応で付加させて、このcDNAがコードするMORT-1結合タンパク質の結合特異性を測定した。これら「ベイト」は、MORT-1；MORT-1の部分（MORTの「ヘッド」：アミノ酸１〜117、MORTの「テール」：アミノ酸130〜245］；p55IC（p55の206〜426位）；またはp55ICの部分（「デス・ドメイン」：p55の326〜426位；および前記「デス・ドメイン」の上流の残りの部分、すなわち206〜326位）をコードする構築物を含有していた。これらの試験結果を表２に示す。
0003980641.tif 000004
大きなパネルのベイトに対する前記クローンの結合に関するツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験の前記結果から、このクローンがコードするタンパク質が、p55TNF-RとMORT-1の両者のデス・ドメインに特異的に結合することが確認された。
一般に、MORT-1結合タンパク質は、細胞に対するMORT-1関連効果を直接、モジュレートもしくは媒介し、またはこの効果がMORT-1によってモジュレートもしくは媒介される場合、細胞に対するFAS-Rリガンドの効果を間接的にモジュレートもしくは媒介するのに利用できる。同様のことが、本明細書でp55TNF-Rについて具体的に例示しているように、ほかの細胞内タンパク質またはトランスメンブランタンパク質の細胞内ドメインにも当てはまる。
MORT-1結合タンパク質としては、完全なMORT-1タンパク質に特異的に結合するものまたはMORT-1タンパク質の異なる領域（たとえばMORT-1の前記Ｎ末端領域とＣ末端領域）に結合するものがある。これら領域に特異的に結合するMORT-1タンパク質を使用して、これら領域の活性をモジュレートすることができるので、これら領域によって決定されるMORT-1の特異的な活性をモジュレートできる。
実施例３：MACHタンパク質、ほかのMORT-1結合タンパク質の単離と特徴付け
（i）ツーハイブリッドスクリーン、ツーハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ試験、配列決定および配列の分析
前記実施例１と２に記載の方法を用い、ヒトMORT-1タンパク質をコードする全長の構築物を、酵母ツーハイブリッドシステムの「ベイト」として採用して、追加の新しいMORT-1結合タンパク質をコードする。cDNAクローンを単離した。この新しいタンパク質は、最初、MORT-2と命名されたが、現在は、以下に詳細に説明するその特徴に基づいて改名してMACH（MORT-1 associated CED3 homologの略語）と称されている。
前記実施例１と２に記載の標準法によって、前記のcDNAのクローンを配列決定した。標準法とコンピュータプログラムによって配列分析を行った結果（実施例１と２参照）、このcDNAは新規の配列を有しかつ新規のタンパク質をコードすることが明らかになった（そのDNAとアミノ酸の配列はGENBANKまたはPROTEIN BANKの配列データベース中には見つからなかった）。さらに、MACHをコードするcDNAには、前記領域（５’上流）すなわちMORT-1タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに対し強い相同性を有するORF-Bリーディングフレームがあることが明らかになった（実施例１参照）。図４Ａ〜４Ｃに、ORF-B（235個のAA残基、図４Ａ）を含有するMACH cDNAクローンの一部分の構造；MACH ORF-Bの推定されるアミノ酸配列（配列番号５）（図４Ｂ）；およびMACH cDNA分子（図４Ｃ）のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。図４Ａにおいて、ORF-Bのハッチングをした領域は、MORT-1の「デス・ドメイン」モチーフの上流のMORT-1の領域と高い相同性を共有する領域であり、そしてこのMACH ORF-Bの相同性領域は、図４Ｂにおいて下線を付したアミノ酸残基で構成されている。
さらに、酵母ツーハイブリッド試験を利用して、MACHがMORT-1に結合する特異性を評価し、とくに、MACHが結合するMORT-1の領域を定義しかつどちらのMACH ORFがMORT-1と相互に作用するか決定した。なおその手順は本明細書の前記実験例１と２に記載されている。要約すると、β−ガラクトシダーゼ発現フィルター検定法で評価されるように、Gal4DNA結合ドメインによってコードされているタンパク質とトランスフェクトされたSFY526酵母内の活性化ドメイン構築物との相互作用を試験するために各種のMORT-1とMACHの構築物を製造した。そのDNA結合ドメイン構築物はpGBT9ベクターに調製し、そして活性化ドメイン構築物はpGAD-GMベクターに調整した。活性化ドメイン構築物の場合、ORF-B（MACH B）領域だけをコードする構築物であるように全長のMACH cDNAを使用した（MACH）。コントロールの活性化ドメイン構築物は、全長のMORT-1をコードする配列を含有する構築物（MORT1、ポジティブコントロール）および挿入フラグメントなしの構築物、すなわち「空の（empty）」ベクター（pGAD-GM）であった。DNA結合ドメイン構築物の場合、MORT-1の上流の領域（MORT-1DD、アミノ酸130〜245）だけをコードする構築物であるように、全長MORT-1 cDNA（MORT1）を用いた。MACH結合の特異性を決定するため構築したコントロールのDNA結合ドメイン構築物としては、ラミンをコードする構築物（ラミン）、ヒトp75TNF-Rの細胞内ドメイン（ヒトp75 IC）の残基287〜461；サイクリックＤ（cycD）；SNF1；ヒトp55TNF-Rの細胞内ドメイン（ヒトp55 IC）の残基206〜426；ヒトFas-Rの細胞内ドメインの「デス・ドメイン」領域（ヒトFas DD）；ヒトCD40の細胞内ドメイン（ヒトCD40 IC）の残基216〜277；挿入断片なしのベクターすなわち「空の」pGBT9ベクター（pGBT9、ネガティブコントロール）；およびMACHのORF-B領域（MACH B）をコードする構築物を用いた。この検定法では、呈色を測定した。この場合、呈色が著しいほどDNA結合ドメインと活性化ドメインがコードする構築物間の相互作用が大きい。呈色度は記号で示した。すなわち“＋＋＋”と“＋”はそれぞれ30分と90分内にそのアッセイで強い呈色があったことを示し、そして“−−−”はそのアッセイの24時間内で呈色がなかったことを示す。相互作用を試験しなかった場合は、記号を記載しなかった。前記の場合の各種相互作用の試験結果を表３に示し、一方、MACHアイソフォームの各種相互作用の試験結果は図５に示す。
0003980641.tif 000005
したがって前記表３に示す試験結果から以下のことが明らかである。
（a）MACHはMORT-1と非常に強くかつ特異的に結合する；
（b）MORT-1におけるMACH結合部位は、MORT-1の「デス・ドメイン」モチーフの前（上流）に存在する。すなわちこの部位は、MORT-1のアミノ酸１〜117で定義されるMORT-1の領域内にある；
（c）MACHのORF-B領域はMACHタンパク質のMORT-1と相互に作用する領域である；そして
（d）MACH ORF-B領域は自己会合することができる。
（ii）MACHタンパク質の自己会合性によって媒介される細胞の細胞傷害効果
MACHが自己会合することができ、とくにMACHのORF-B領域が自己会合するという観察結果、ならびにp55TNF-RとFAS-Rの細胞内ドメインとMORT-1（実施例１参照）について観察された自己会合と細胞傷害性の先に述べた関連は、MACHの自己会合も細胞の細胞傷害性に関与していることを示唆している。
この可能性を試験するため、MACHをコードする構築物をテトラサイクリンで制御される発現ベクターで調製した（詳細については実施例１参照）。これらの構築物はHeLa細胞をトランスフェクトするのに使用したが、この場合、前記ベクターは一過的に発現された。MACHの構築物以外に、ほかのコントロール構築物を使用し、MACH構築物の効果を比較できるHeLa細胞生存率に対する一過性発現の効果を評価した。これらほかの構築物としてはMORT-1、ヒトFAS-ICおよびルシフェラーゼ（Luc）を含めた。さらにHeLa細胞の同時トランスフェクションも、MORT-1とMACHの構築物を使用して試験して、これらタンパク質間の相互作用がどんな効果を生じるか確認した。トランスフェクションを行った後、HeLa細胞をインキュベートし、テトラサイクリン（１μｇ/ml）の存在下かまたは非存在下でトランスフェクトして発現をブロックしてから48時間後に細胞生存率を評価した。細胞生存率は中性レッドの取り込みアッセイによって測定した。
結果を図６に示す。図６は、MACHでトランスフェクトされた細胞においてリガンドに依存してトリガーされる細胞致死性効果を、ほかのタンパク質をコードする構築物でトランスフェクトされた細胞および同時にトランスフェクトされた細胞（MORT1+MACH）のばあいと比較してグラフで示す。その試験結果は、各構築物について、540nmにおけるOD単位での細胞生存率として示す。なお各構築物について、ハッチングをほどこしたバーは、テトラサイクリンなしでトランスフェクトした後、細胞をインキュベートしたことを示し、黒色バーはテトラサイクリンの存在下でトランスフェクトされた細胞をインキュベートしたことを示す。
図６に示す結果から、MACHがHeLa細胞において劇的な細胞傷害効果を誘導することは明らかであり、すなわち、HeLa細胞でMACH cDNAの過剰発現が誘導されると、劇的な細胞傷害効果がもたらされる。この細胞傷害効果は、MACHの自己会合性に関連しているようである。
（iii）ノーザン分析
公知の方法を利用して（実施例１参照）、プローブとしてMACH cDNAを使用していくつもの細胞系のノーザン分析を実施した。この分析結果は多数の細胞系、とくにCEM、Raji、Daudi、HeLa、Alexander、JuskatおよびA673の細胞系に、大きさが約3.2kbの２種のハイブリッド形成転写物が存在していることを示している。
前記のことからみて、MACHタンパク質、とくにMACHβ1タンパク質（MACHのORF-B）は、細胞に対するMORT-1関連の効果を直接、モジュレートもしくは媒介するため、またはFAS-Rリガンドの効果がMORT-1によってモジュレートされる場合、細胞に対するこの効果を間接的にモジュレートもしくは媒介するために利用できる。MACHがMORT-1の上流領域に特異的に結合しかつMORT-1と相同性を共有していることは、MACHまたはMACH ORF-Bを使用してMORT-1のこの特定の領域をモジュレートし、この上流領域で決定されるMORT-1の特定の活性をモジュレートできる特定の方法を提供する。さらに、MACHまたはMACH ORF-Bは、MACHが自己会合してそれ自体に細胞の細胞傷害性を誘導する性能によって、MORT-1自体に対し、類似の様式の細胞内効果のモジュレーターまたはメディエーターとして使用できる（前記事項参照）。
さらに、MACHタンパク質とこれをコードするDNA配列の分析を以下に記載したように実施した。さらに、MACHのORF-Bは、いくつかのMACHアイソフォームのうち１種だけを示すことが明らかになった。その結果、MACHタンパク質とこれをコードするDNA配列は本明細書では改名したが、それは以下の説明から明らかになる。
（a）MORT-1に結合するタンパク質のツーハイブリッドスクリーンにより、配列モチーフをMORT-1と共有する新規なタンパク質が明らかになる：
前記のように、MORT-1による細胞死の誘導に関与するタンパク質を同定するため、ツーハイブリッド法を使用して、MORT-1に結合するタンパク質用のcDNAライブラリーをスクリーニングした。MORT-1 cDNAをベイトとして用いてヒトＢ細胞ライブラリー（Durfee et al., 1993）のツーハイブリッドスクリーンを行ってMORT-1自体のcDNAクローンをえた。これはこのタンパク質が自己会合する性能とMORT-1が有効に結合するTRADDのクローンを反映している（実施例２参照）。また、このスクリーンによって、その産物がMORT-1に特異的に結合する新規な配列のcDNAクローンがえられた。最初MACHと称されたそのタンパク質は、後に、多数のアイソフォームで存在していることが見出された後（下記参照）MACHβ1と改名された。また、ツーハイブリッド試験でそれ自体に結合できることを示したがFAS-Rには結合できなかった。
図５に、トランスフェクトされた酵母細胞内でのMORT-1とMACHの相互作用の結果を示す。要約すると、MORT-1とMACHβ1およびそれらの欠失構築物、ならびにMACHα1、触媒的システインCys360がSerに置換されたMACHα1変異体（MACHα1（C360S））およびヒトFas-Rの細胞内ドメイン（Fas-IC）が、トランスフェクトされたSFY526酵母内でGal4DNA結合ドメインと活性化ドメインの構築物（pGBT9とpGAD-GH）中に発現された。それらの相互作用を、Boldinら（1995b）の報告中に記載されたβ−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイで評価した。結果は、強い呈色に必要な時間で示す。NDはアッセイを実施しなかったことを示す。試験した挿入断片は、ヒトp55TNF受容体の細胞内ドメイン、p75TNF受容体の細胞内ドメインおよびCD40の細胞内ドメインならびにラミン、サイクリンＤおよび「空の」Gal4のベクターを含む多数の試験されたネガティブコントロールと相互に作用しなかった。MACHβ1は、HF7C酵母のリポーター株を用いて、MORT-1に結合するタンパク質のGal4AD標識化ヒトＢ細胞ライブラリー（Durfee et al., 1993）のツーハイブリッドスクリーンを行うことによってクローン化した。とくにことわらない限り、提供された知見をえるために用いた実験手順はすべて前記のとおりである（Bolding et al., 1995も参照）。欠失分析によって、MACHβ1が、細胞死の誘導に関与する、MORT-1のＮ末端部分に結合することが分かった（Chinnaiyan et al., 1995）。またMACHβ1もトランスフェクトされた酵母内で自己会合した。しかし、MACHβ1は、いくつものコントロールのタンパク質と結合せず、かつMORT-1と異なり、FAS-Rと結合できなかった（図５）。哺乳動物の細胞でMACHβ1分子が発現されると、それと同時に発現される、MORT-1分子に結合する34kDaのタンパク質がえられた。またそのタンパク質はin vitroでGST-MORT-1融合タンパク質にも結合できた。
MACHβ1とMORT-1のアミノ酸配列を比較したところ、MORT-1のFAS-Rへの結合を介するデス・モチーフとは異なる、前記２種のタンパク質中の共有配列モチーフ（「Mortモジュール」と称する）が明らかになった。このモチーフは、MORT-1に１回、およびMACHβ1中に２回存在している。また、同じモチーフが、PEA-15すなわち機能が未知の神経膠星状細胞のリンタンパク質中にも見られる。予備データは、MORTモチーフが、MACHβ1（およびほかのMACHアイソフォーム）のMORT-1との結合に関与していることを示唆している。
図７ＡはMACHβ1の推定されるアミノ酸配列（配列番号５）を示す。２つのMORTモジュールが箱形マークで囲まれ、利用される２種のMACHβ1欠失変異体のＣ末端（図７）はアステリスクで示されている。図７Ｂは、MACHβ1内のモジュール（図７ＢではMACHと呼ばれている）、MORT-1およびPEA-15遺伝子（受託番号：X86809）の配列相同性を示す。同一および類似の残基をそれぞれ箱型マークで囲んだ領域と陰影をつけた領域で示す。
図８は、デス・ドメインおよびMORTモジュール、ならびにFas/APO1、MACHβ1およびMACHα1におけるCED3/ICE相同性領域の線図である。
この「MORTモジュール」を含有するMORT-1の領域は、このタンパク質による細胞死の誘導に関与するしていることが分かった（前記実施例１参照）。またこの領域は、MORT-1の自己会合に関与しているが、その自己会合は充分でないことが分かった（実施例１参照）。図５に示すように、トランスフェクトされた酵母におけるMACHβ1の欠失構築物の結合特性を分析した結果、MORTモジュールが、MACHβ1の自己会合とMACHβ1のMORT-1との結合に、同様に関与していることが明らかになった。すなわち、MORTモジュールの下方（下流）領域が欠失している欠失構築物は、互いに結合できないが、全長のMORT-1および全長のMACHβ1に結合する性能を維持していた。MORTモジュールの配列の一部分がさらに欠失して欠除しているとそのタンパク質の結合性能が失われた。これら相互作用に対するMORTモジュールの関与をさらに評価するため、FLAGオクタペプチドと融合させたMACHβ1の欠失変異体（FLAG-MACHβ1）をHeLaの細胞内で発現させて、細菌が産生するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-MORT-1融合タンパク質（GST-MORT-1）に対するin vitroでの結合性を評価した。図9A〜9Cに示すように、酵母ツーハイブリッド試験で観察された結合性と同様に、このin vitroでの結合はMACHβ1モジュール内の領域の相互作用に依存していることが見出された。図9Aと9Bは、MACHβ1とその欠失変異体のMORT-1とのin vitroでの相互作用の結果（オートラジオグラム）を示す。要約すると、35［S］を用いて代謝的に標識化したMACHβ1、そのＮ末端にFLAGオクタペプチドを融合させたMACHβ1（FLAG-MACHβ1）、FLAG-MACHβ1のＣ−末端切除変異体、およびコントロールとしてのルシフェラーゼを、トランスフェクトされたHeLa細胞内で産生させた。テトラサイクリンで制御される発現ベクターを用い、テトラサイクリンで制御されるトランスアクチベーターを発現するHeLa細胞クローン（HtTA-1）中で発現させた。
図９Ａは、これらタンパク質の発現および抗FLAG抗体を用いる細胞溶解物からの免疫沈降によるこれら分子の大きさの評価結果を示す。使用した抗体は次の通りである。すなわちウサギ抗MACHβ1抗血清とウサギ抗MORT-1抗血清を、GST-MACHβ1融合タンパク質とGST-MORT1融合タンパク質に対して産生した。FLAGオクタペプチドに対するマウスモノクローナル抗体（M2）とFAS/APO1に対するマウスモノクローナル抗体（CH11、Yonehara et al., 1989）はそれぞれEastman Kodak社とOncor社（米国メリーランド州、ゲイナーズベルグ所在）から購入した。マウスモノクローナル抗ＨＡエピトープ抗体（12CA5、Field et al., 1988）および抗ＴＮＦ抗体は、当該技術分野で公知の通常の方法に従って本発明の発明者らの実験室で製造した。図9Bは、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させたGST-MORT-1（または、コントロールとして、GSTもしくはFAS/APO1の細胞内領域に融合させたGST）に対するタンパク質のアフィニティー結合性を示す。図9Cは、各種のMORT-1とMACHの融合構築物の、各種の特異的抗体を用いて行った免疫沈降試験の結果を示す。
（b）MACHは多数のアイソフォームで存在している：
MACHβ1 cDNAをプローブとして使用するノーザン分析の結果、大きさが約３kbで低量の転写物がいくつもの異なる細胞系内に存在していることが明らかになった。要約すると、いくつもの細胞系由来の全RNA（14μg／レーン）またはポリＡ+RNA（２μg）のノーザンブロット分析を、プローブとしてMACHβ1 cDNAを用いて実施した。試験した細胞系：T47D、CEM、Raji、Daudi、HeLa、Alexander、JurkatおよびA673はすべてヒト由来のものであり、それぞれ、乳腺管癌、急性リンパ芽球Ｔ細胞白血病、バーキットリンパ腫、バーキットリンパ腫、上皮癌、ヒト肝細胞癌、急性Ｔ細胞白血病および横紋筋肉腫由来の細胞系であった。ノーザンブロットのハイブリッド形成バンドがかなり拡散した形態であることにより、これら転写物が、2.85〜3.5kbの範囲内の不均一な大きさである、ということが示唆される。転写物の量と大きさは異なるヒトの組織間で変化し、MORT1（Chinnaiyan et al., 1995）またはFAS/APO1（Watanabe et al., 1992）の発現とは相関関係がなかった。cDNAのプローブは、ランダム−プライムキット（Boehringer Mannhim社）を用いて放射線標識化し、製造者の指示にしたがって、ヒト多重組織ブロット（human multiple tissue blots）（Clontech社）の分析に利用した。睾丸と骨格筋では、たとえば、MACH転写物は、これら組織がかなりの量のMORT1を発現しても、ほとんど検出できなかった。逆に、MORT1の発現が非常に低い、静止している抹消血の単核白血球は、局レベルのレクチンが活性化すると、MORT-1の誘導とともにMACH転写物のサイズパターンが著しく変化する。
このサイズの不均一な性質を調べるため、cDNAライブラリーを、MACHβ1 cDNAのプローブとハイブリッドを形成する転写物についてスクリーニングした。MACHα1とMACHα2を、ヒト胸腺のmRNA由来のCharon BS cDNAライブラリーからクローン化した。そのライブラリーを、MACHβ1 cDNAのプローブを用いてストリンジェントな条件下でスクリーニングし、ランダムープライミングキット（Boehringer Mannheim社）を用いて標識化した。ほかのMACHアイソフォームは、Rajiヒトリンパ芽球細胞（MACHα1、α2、α3、β3、β4およびβ5）およびDaudiヒトリンパ芽球細胞（MACHα2、β2、β3、β4およびβ5）由来の全RNA上で、RT-PCRによってクローン化を実施した。逆転写酵素反応は、製造者の指示にしたがって、オリゴーdTアダプタープライマー（5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC（T）17-3'（配列番号26））とSuperScript II逆転写酵素（GIBCO-BRL社）を用いて行った。PCRの第１ラウンドは、センスプライマー（MACHβ1 cDNAのヌクレチオド530〜551に相当する5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3'（配列番号４））およびアンチセンスプライマー（5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'（配列番号27））を用いてExpand Long Template PCR System（Boehringer Mannheim社）で実施した。第２ラウンドは、センスネステッドプライマー（sense nested primers）（5'GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3'）（配列番号28））とアンチセンスネステッドプライマー（MACHβ1 cDNAの5'-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3'（配列番号４のヌクレオチド962〜939に相当））を用いてVentポリメラーゼ（NEB）で実施した。MACHβ3とMACHβ4が開始コドンを有していることを確認するため、Raji細胞のRNA由来のこれらアイソフォームの5'-側の配列（a more 5' sequence）をクローン化した。前記のようにオリゴ−dTアダプタープライマーを用いて実施したRT-PCR反応は、センスオリゴヌクレオチド：5'-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3'（配列番号29））とアンチセンスオリゴヌクレオチド：MACHβ1の5'-ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3'（配列番号４のヌクレオチド946〜923に相当）を用いるPCR（Ventポリメラーゼ（NEB社）による）を２ラウンド続けた。後者のオリゴヌクレオチドはβ−アイソフォームに対して特異的である。このようにしてえたクローンの中で、「ブロック２」のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含有していることが見出されたクローン（その存在は、以下に考察するように、MACHβ3とMACHβ4をMACHβ1とMACHβ2から区別する）の全配列を決定した。クローン化されたアイソフォーム全部のヌクレオチド配列は、ジデオキシ−チェーンターミネーション法によって、両方向で測定した。MACHα3とMACHβ2の部分cDNAクローンだけがえられた。このスクリーニングによって、MACHの多数のアイソフォームが存在することが明らかになった。３種類のこれらアイソフォームのアミノ酸配列を詳細に研究した。結果を図12に図表で示し、図13に、３種のアイソフォームのアミノ酸配列と公知の相同体とを比較して例示した。
図10は、各種のMACHアイソフォームの線図である。コーディング領域は四角で囲んだ領域として示す。これらコーディング領域内の各種ドメインは以下のように異なる影で示す。MORTモジュール
0003980641.tif 000006
；アイソフォームの異なる組み合わせで存在する３種のアミノ酸配列のブロック。そのＸ線結晶構造に基づいてICEの触媒活性に関与していることを示しているCED3/ICE相同性領域中の残基の位置を示す。触媒的システイン残基は星印（★）で示す。ほかのアイソフォームの配列には欠けているMACHα1のヌクレオチド配列の部分は、ほかのアイソフォームの線図中にＶ型の接続線で示す。これらのcDNA領域の長さは、おそらく明確なエキソンに対応しているが、MACHα1の線図の下側に示す。MACHα1中、「ブロック２」をコードする65個のヌクレオチドが欠けるとMACHβ1とMACHβ2の「ブロック３」をコードするヌクレオチドのリーディングフレームに変化が起こる。したがって、これらのアイソフォームでは、これらのヌクレオチドは、それらアイソフォームの独特のＣ末端領域をともに形成するほかのアミノ酸をコードしている。一方、MACHβ3とMACHβ4では、ブロック３のリーディングフレームは維持されているが、CED3/ICE領域をコードするヌクレオチドがないので、3'非コーディング領域の部分は、さらに下流のヌクレオチドのリーディングフレームが変化する。この変化のため、この下流の非コーディング領域の最も5'側の部分は10個のアミノ酸をコードし、これらアミノ酸は、これら２種のアイソフォームに独特のＣ末端領域（ハッチングが施されている）を構成している。図に示すように、MACHα3とMACHβ2のごく一部分のcDNAクローンがえられた。
これらアイソフォームは、ヒトＢ細胞cDNAライブラリー（MACHβ1）、ヒト胸腺cDNAライブラリー（MACHα1とα2）ならびにヒトリンパ芽球細胞のRaji（MACH2α1、α2、α3、β3、β4およびβ5）およびDaudi（MACHα2、β2、β3、β4、およびβ5）のmRNAからクローン化した。Raji細胞とDaudi細胞のmRNAからのクローン化は、3'の非コーディング領域およびMACHβ1中の第２のMORTモジュール内の配列に相当するオリゴヌクレオチドを用いてRT-PCRで行った。したがってこのようにして単離されたクローンの出発コドンは、第２のMORTモジュール内に位置している。MACHアイソフォームのcDNA配列とアミノ酸配列は、配列表に示しかつ表４に下記のように関係している。
0003980641.tif 000007
異なるアイソフォームの配列は下記のように互いに関連している。（a）すべてのMACHアイソフォームは、MORTモジュールを含有する共通の182個のアミノ酸からなるＮ末端領域を共有しているが、これらモジュールに対しカルボキシ末端側（3'下流）およびそれらの非コーディング領域において変化している。（b）それらのＣ末端の配列に基づいて、これらアイソフォームは２つのサブグループに分けられる。すなわち、サブグループβと定義された４種のアイソフォームは、リーディングフレームが変化しているのでＣ末端が異なっている。そのうち２種（MACHβ1とMACHβ2）は、ツーハイブリッドスクリーンで最初にクローン化されたアイソフォームに見られたＣ末端を共有し、ほかの２種（MACHβ3とMACHβ4）は異なるＣ末端を共有している。サブグループαと定義された３種のアイソフォームは、CED3/ICEファミリーのプロテアーゼによく似ている非常に長いＣ末端領域を有している（下記事項参照）；（C）これらサブグループを定義する、MORT、モジュール領域とＣ末端領域の間に延びる領域は、１種のアイソフォームからほかのアイソフォームへ変化する。しかし綿密な試験の結果、これらの中間領域は、同じ３種のアミノ酸配列のブロック（ブロック１、２および３）の異なる組合せで構成されている。異なるクローン間のアミノ酸醐の変化は、ヌクレオチド配列中の２種の変化を反映している。選択的スプライングで最もよく起こる変化は、（a）２種のヌクレオチド配列すなわち45個のヌクレオチドからなる一方の配列と65ヌクレオチドからなる他方の配列のいずれか一方、また両者が、Lys184をコードするヌクレオチドの下流に挿入されているか存在しない変化、（b）MACHβ1中の3'非コーディング部分を構成する領域内に追加の挿入部分がある変化である。これらの変化は、タンパク質のリーディングフレームと長さの両者に影響する。
MACHアイソフォームの一部分は、CED3/ICE相同体を含有している。データバンクを調査した結果、ブロック３を含有するMACHαアイソフォームのＣ末端領域とその下流に延びる配列がCED3/ICEファミリーのプロテアーゼに非常によく似ていることが明らかになった。図11は、MACHおよびこのファミリーの各種の公知のヒトのメンバーとケノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）ced3タンパク質中のこの領域の配列を比較して示す。CED3（Ellis and Horvitz, 1986; Yuan et al., 1993）；およびCED3/ICEプロテアーゼファミリーの公知のヒトプロテアーゼ類、すなわち、CPP32（Fernandes-Alnemri et al., 1994）（アポパイン（apopain）（Nicholson et al., 1995）およびヤマ（Yama）（Tewari et al., 1995b）とも称されている）；Mch2α（Fernandes-Alnemri et al., 1995）；Ich-1（Wang et al., 1994; マウスNedd2タンパク質に対するヒトの相同体、Kumar et al., 1994）；ICErelII（Munday et al., 1995）；ICErelII（Munday et al., 1995）（TXおよびIch2とも称される（Faucheu et al., 1995; kamens et al., 1995））；ならびにICE（Thornberry et al., 1992; Cerreti et al., 1992）。図11は、MACHのアイソフォームと、CED/ICEプロテアーゼファミリーの各種公知のメンバーのアミノ酸配列を図式で示す共通線平面図である。MACHα1、MACHβ1、MACHβ3、ケノルハブディティス・エレガンスのプロテアーゼCED3およびCED3/ICEプロテアーゼのファミリーの公知のヒトプロテアーゼのアミノ酸配列を示す。
MACHの前記Ｃ末端領域は、CPP32（同一性41％および相同性56％）およびCED3（同一性34％および相同性56％）と最もよく類似している。また前記の末端領域は、ICE（同一性28％および相同性50％）および密接な類縁関係にある相同性ICErelII（TXおよびIch2とも呼ばれる）とICErelIIIに対しかなり低い類似性を示している。前記類似性は、ブロック３内のTyr226から出発してMACHαのアイソフォームのＣ末端までのほとんど全領域を通じて観察された。
２つの類似点にとくに注目すべきである。
（a）CED3/ICEファミリーの公知のすべてのプロテアーゼは、P1位置にAspが存在しP1'に小さい疎水性アミノ酸残基が存在すると定義された部位でタンパク質を切断する。しかし、これらプロテアーゼの特異性は、P2〜P4の位置の残基の性質を含めて基質のほかの構造上の特徴に対して異なっている。したがって、触媒効果に関与する活性部位残基（ICE中のHis237、Gly238およびCys285に相当）およびP1のAspのカルボキシレート側鎖に対する結合ポケットに関与する活性部位（Arg179、Gln283、Arg341およびおそらくSer347も関与している）はこれらのプロテアーゼ間で保存されている。図11に示すように、これらの残基（残基のシェーディングおよび配列の下側の黒点と白点で示す）はMACHα1中にも保存されている。しかし例外が一つある。すなわちICEのSer347に対応する部位でのSerからThrへの保存的変化（conservative change）である。ほかのわずかであるが潜在的に重要な、MACHαアイソフォームと前記プロテアーゼファミリーのメンバーとの配列の差は、ICEのArg286に相当する残基のArgからGlnへの置換である。推定される触媒性システイン残基に隣接している前記残基は、ほかのCED3/ICEファミリーのメンバーの中に充分保存されている。基質のP2〜P4の残基に隣接している部位（図11の配列の下側に△印を施してある）の残基の部分も、MACHαのアイソフォームの場合、ほかのCED3/ICEファミリーのメンバーにみられるものと異なっている。
（b）CED3/ICEファミリーのプロテアーゼは、自己切断の部位をもっている。いくつものプロテアーゼが実際に自己プロセシングを行い、最高の触媒活性を示す場合、このプロセシングに依存している。これらプロテアーゼの充分に生物学的活性を有する形態は、２つの非共有結合で結合した切断産物で構成されており、これら産物は大きさが異なっている（ICEにおけるp20とp17、CPP32におけるp17とp12、図11に矢印で示す）。このファミリーのほかのメンバーの中に自己切断の潜在部位があると、それらは類似のプロセシングを受け、かつ同様に最高の活性を示す場合、このプロセシングに依存している。自己切断のかような潜在部位は、MACHα1中、CPP32中とほとんど同じ位置に存在している（図11中のシェードを付けた箱形部分参照）。CPP32のp17サブユニットのＮ末端に対応する部位は、CED3/ICE相同性領域のＮ末端から数個のアミノ酸だけ上流（Asp216の下流）の位置の第２のアミノ酸保存ブロックの内に位置している。CPP32の２種のサブユニット間の切断点に相当する部位は、切断することが知られているCED3/ICEファミリーのほかのすべてのメンバー同様に、触媒的システイン残基から数個のアミノ酸だけ下流（Asp374の下流）の位置に位置している。この保存は、mACHα1中のCED3/ICE相同性領域がタンパク質分解のプロセシングを受けていることを示唆している。この切断で予想される２つの産物の大きさはプロセシングを受けたCPP32分子の２つのサブユニットの大きさに非常に近い。
（c）MACH中のCED3/ICE相同性領域はタンパク質分解活性を有する
MACHα中のCED3/ICE相同性領域がタンパク質分解活性をもっているかどうかを明らかにするため、出願人らは、この領域の上流の潜在的切断部位（Asp216とSer217の間）から細菌中のタンパク質（GST融合タンパク質のような）のＣ末端まで延びる領域を発現させた。その際細菌の溶解物を、蛍光原ペプチド基質を切断する性能について試験した。なお、基質はほかのCED3/ICE相同体によって切断されることはすでに述べた。２種の基質のペプチドを使用した。第１の基質のアセチル-Asp-Glu-Val-Asp-a-（4-メチル-クマリル-アミド）（AC-DEVD-AMC）は、FAS-Rの刺激の後すぐに細胞内で切断され（Tewari et al., 1995b）かつほかのアポトーシスプロセスで切断され（Kaufmann et al., 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994）されることが見出されている核タンパク質であるポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）中の配列に相当している。この蛍光原基質はCPP32によって効果的に切断される。第２の蛍光原基質のアセチル-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC（Ac-YVAD-AMC）はIL-1β前駆体中のICEの基質部位に相当する。この蛍光原基質はICEによって切断される。図12A〜12Fと13A〜13Bに示すように、MACHα1のCED3/ICE相同性領域を発現する細菌の溶解物はPARP配列由来の蛍光原基質を効果的に切断した。しかし、前記溶解物はIL-1β前駆体中のICE切断部位であるIL-1β前駆体配列由来の蛍光原基質（コントロール）：Ac-YVAD-AMCに対し測定可能なほどのタンパク質分解活性をもっていなかった（Thornberry et al., 1992）。そのタンパク質分解活性はヨード酢酸（5mM）でブロックされたが、このことはこの活性がチオールプロテアーゼによって媒介されていること裏付けている。触媒的システイン残基Cys360がSerで置換されたGST融合MACHC  3/ICE相同性領域を含有する溶解物の場合、切断は観察されなかった。また、GST融合タンパク質として全長のMACHα1タンパク質を発現した細菌由来の溶解物はAc-DEVD-AMCを切断しなかった。これはおそらく、全長分子のプロセシングを行うことができる細菌酵素が存在していなかったためであろう。またCED3/ICE相同性領域の２種の潜在切断産物のいずれかを含有する溶解物も切断を起こさなかった。
図12A〜12Fと13Aは、MACHα1のCED3/ICE相同性領域のGST-融合タンパク質（そのタンパク質のＣ末端を通じてSer217）を発現する大腸菌の抽出物による、PARP配列由来の蛍光原基質：Ac-DEVD-AMC（50μM）の切断のカイネティックス（kinetics）を、全長のMACHα1分子のGST融合タンパク質を発現する細菌の抽出物またはCED3/ICE相同性領域の２種の潜在タンパク質分解産物のいずれか一方（Asp374までSer217および該タンパク質のＣ末端を通じてAsp374）を含有する細菌抽出物では切断が起こらないことを比較して示す。
GSTと融合させたMACHα1のCED3/ICE相同性領域を発現する細菌の抽出物とともに180分間インキュベートしたAc-DEVD-AMCの切断の基質濃度依存性を示す（図13B参照）。ヨード酢酸（5mM）が存在すると切断はみとめられなかった。前記抽出物には、IL-1β前駆体中のICEの基質部位に相当する蛍光原基質：Ac-YVAD-AMCに対する活性は全くみられなかった。
要約すると、pGEX3発現ベクターを用いて、XL1-ブルー細菌中に、前記GST融合タンパク質を産生させた。これらの細菌は、25mMのHEPES（pH7.5）、0.1％の3-［3-コラミドプロピル）ジメチルアミノ］-1-プロパンスルホネート、5mMのEDTAおよび2mMのDDTを含有する緩衝液中で超音波処理することによって溶解させ、次に16,000Xgで10分間遠心分離し、ついでSDS-PAGEで分析して各種の融合タンパク質が溶解物中に類似のレベルで存在していることを確認した（図示せず）。これら抽出物（全タンパク質4mg/ml）50μlずつを、全容積500μlの反応液中、指定濃度の蛍光原基質とともに、室温で指定の期間インキュベートした。AMCの放出は、励起波長380nmおよび発光波長460nmで分光光度法によって測定した。ANCの濃度は標準曲線から求めた。両方の蛍光原基質のペプチドはPeptide Institute Inc.（日本国、大阪）から入手した。ほかのCED3/ICEプロテアーゼは、自己切断またはほかのプロテアーゼによるその切断によって起こるタンパク質分解プロセシング（Kumar, 1995; Henkart, 1996に総説が記載されている）の後にしか全活性を示さないことが分かった。CED3/ICE相同性領域を発現する細菌の溶解物に活性が見られるのと対照的に、GST-MACHα1分子を発現する細菌の溶解物には酵素活性がないという出願人らの観察結果は、プロセシングがMACHαの活性にも必要であることを示唆している。MACHαのプロセシングが哺乳動物の細胞内で起こる様式およびこのプロセシングがFAS-Rまたはp55-Rのトリガリングで起こる様式は分かっていない。MORT-1は、細胞内で、いくつかのほかのタンパク質とともに活性化されたFAS-Rに結合することが報告されている（Kischkel et al., 1995）。これらのタンパク質は、MACHα1およびほかのMACHアイソフォームを含有しているようである。MACHαと会合しているMORT-1がFAS-Rと結合するといくつものMACH分子を集めるかまたはそれらの高次構造を変化させ、これらの変化によって、MACHαの自己分解プロセシングがトリガーされるかまたはMACHαがほかのプロテアーゼで切断され易くなるようである。p55-Rの刺激によって、いくつものTRADD分子を集めるかまたはそれらに高次構造の変化を誘導する（その結果、MORT-1とその会合MACH分子のボルメーション（voｒmation）もしくは状態を変化させる）、類似のあまり直接的でない方法で、MACHαの自己プロセシングがトリガーされる。
MACHα基質特異性は、むしろ「デス・指向（death oriented）」のようである。MACHαは、デス基質PARP（Ac-DEVD−AMC）中の切断部位に相当する基質ペプチドを切断できるが、IL-1β前駆体のICEによるプロセシングの部位に相当するペプチド（Ac-YVAD-AMC）に対してタンパク質分解活性を示さなかった。MACHαによって切断される基質として使用できる細胞タンパク質が同定されれば、このプロテアーゼによる、死の誘導のさらに後の事象が解明されるであろう。恐らく、MACHαによって切断される基質は、CPP32およびICEのようなCED3/ICEファミリーのほかのメンバーである。これらのプロテアーゼのうちいくつかは、実際に、FAS-RまたTNFの受容体のトリガリングの後にプロセシングを受ける（Miura et al., 1995年；Schlegel et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996）。CED3/ICEファミリーに属していないプロテアーゼは、おそらく、MACHαによって、直接にまたはほかのCED3/ICEプロテアーゼの効果を通じて活性化される。細胞死のプロセスに多数のプロテアーゼが関与していることは、FAS-RとTNF受容体で誘導される毒性から細胞を防御するための、セリンプロテアーゼのインヒビターおよびICE切断とアンチセンスICE cDNAのインヒビターを含む各種プロテアーゼのインヒビターの報告された性能と矛盾していない。（Weitzen and Granger, 1980; Ruggiero et al., 1987; Enari et al., 1995; Los et al., 1995）。
ホスホリパーゼ類、スフィンゴミエリナーゼ類およびタンパク質キナーゼ類を含むほかの各種酵素類は、TNF受容体類およびFAS-Rによる細胞死誘導に参与している（Eischen et al., 1994; Vandenabeele et al., 1995; Cifone et al., 1995とその中の引用文献参照）。これら酵素のうちいくつかは、MACHαによって開始されるタンパク質分解切断によって活性化される。しかし、これらのほかの死に関連する活性の少なくとも一部は、MACHαの刺激から独立して、異なるシグナリング経路で刺激されるようである。細胞死の誘導に１以上のシグナリングカスケードが関与していて、いくつかがp55-RとFas/APO1に共通でかついくつかがそれらの内の一つだけで誘導されることは、２つの受容体が誘導する細胞死のプロセスの共有されかつ異なる特徴に関する報告と一致している（Grell et al., 1994; Schulze-Osthoff et al., 1994; Wong and Goeddel, 1994; Clement aand Stamenkovic, 1994）。
（d）MACHα1はMACHβ1のみならずMORT1に結合する
MACHα1が、MACHβ1と同様に、MORT1に結合できるかどうかを調べるため、トランスフェクトされた酵母内でのこれらのタンパク質の相互作用を最初に試験した。MACHα1は酵母に対し著しい細胞傷害効果を有することを示した。この効果は、活性化ドメイン（AD）ベクター中にそのタンパク質を発現した酵母のコロニーの収量が著しく減少したことで示された（なお前記活性化ドメインベクターでの発現レベルはDNA結合ドメイン（DBD）ベクターの場合より高い）。一方、触媒的システイン残基Cys360がSerで置換されたMACHβ1（MACHα1（C360S））は哺乳動物の細胞（下記事項参照）または酵母に対し細胞傷害性がなかった。MACHβ1と同様に、MACHα1（C360S）は、トランスフェクトされた酵母内で、MORT-1に結合し、かつそれ自体にも結合した。またMACHα1（C360S）はMACHβ1に結合した。またMORT-1またはMACHβ1とともに野生型MACHα1を発現する酵母は、トランスフェクトされたタンパク質の相互作用を示した。しかし、lacZ産物の色の強度は、酵母のコロニー間で変化した。ADベクターとDBDベクターの両者の中のMACHα1でトランスフェクトされた酵母に、呈色産物はみとめられなかった。これはおそらく野生型MACHα1の細胞傷害効果のためであろう。やはりこの変化にもかかわらず、MORT1と組み合わせてまたはMACHβ1と組み合わせてMACHα1を発現する酵母は、トランスフェクトされたタンパク質の相互作用について明らかに陽性であった。MACHβ1と異なり、MACHα1は、ツーハイブリッド試験で自己相互作用を示さなかった（図５）。
MACHα1（C360S）とMACHβ1の両者が、ヒト胎児腎臓293-EBNA細胞の溶解物からMORT-1によって同時に免疫沈降した。これは、両者が哺乳動物の細胞内でもMORT-1に結合することを示している。MACHα1が哺乳動物の細胞中でもMORT-1に結合できるかどうかをさらに試験するため、FLAGオクタペプチドと融合させたMACHα1またはMACHβ1を、HAエピトープで標識化したMORT1分子とともに発現させた。35［S］で代謝的に標識化したMACHα1とMACHβ1をそれらのＮ末端でFLAGオクタペプチドに融合させ（FLAG-MACHα1およびβ1）、次にMORT1をそのＮ末端でHAエピトープに融合させて（Field et al., 1988）、HeLa細胞中で発現させた。前記FLAGオクタペプチドに対するマウスモノクローナル抗体（M2；Eastman Kodak社）、HAエピトープ（12CA5；Field et al., 1988）またはコントロールとしてp75TNF受容体（#9、Bigda et al., 1994）を用いて、前記細胞の溶解物からタンパク質類を免疫沈降させた。前記タンパク質類を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（12％アクリルアミド）、ついでオートラジオグラフィーで分析した。前記細胞の溶解物からMACHα1とMACHβ1の両者が、MORT1によって同時に免疫沈降したが、これは両者がMORT1に融合することを示している。MACHα1とMORT1の相互作用の有効性は、MACHβ1の場合より明らかに低かった。
（e）CED3/ICE相同性領域を含有するMACH分子は細胞死を媒介することができる：
MACHが細胞死の誘導に関与していることを調べるため、細胞生存率に対する各種MACHアイソフォームの過剰発現の効果を試験した。MACH発現ベクターをβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターとともに、トランスフェクションマーカーとして、ヒト胎芽腎臓293-EBNA細胞および乳癌MCF7細胞中にトランスフェクトすることによって試験を実施した。
要約すると。293-EBNA細胞、MCF7ヒト乳癌細胞およびHeLa HtTA-1細胞を、10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸類、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンで補充したダルベッコの改変イーグル最少必須培地で増殖させた。細胞組織培養皿（5×155個の293-EBNA細胞、3×105個のMCF7細胞または3×105個のHeLa細胞、6cmの皿中）を、リン酸カルシウム沈降法を用い、β−ガラクトシダーゼ発現ベクターとともに指定のタンパク質のcDNAで一過的にトランスフェクトした。図14A〜14Dと図15に示した実験では、各皿を、指定のMACH構築物3.5μgおよびpSV-β-gal 1.5μgでトランスフェクトした。図16A〜16Dと図17〜19に示した実験では、各皿を、指定のMACHまたはMORT-1の構築物2.5μg（またはコントロールとして空のベクター）およびpSV-β-gal 1.5μgでトランスフェクトした。各細胞は、トランスフェクトを行った後、６〜10時間すすぎを行った。293-EBNAとMCF7の細胞は、追加の処理を行わずにさらに18時間インキュベートした。HeLa細胞は、トランスフェクションを行った後、26時間インキュベートし、ついでシクロヘキシミド（10μg/ml）とともに、抗Fas/APO1抗体（CH11、0.5μg／ml）またはTNF（100ng/ml）の存在下で５時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後における細胞死の程度を、Kumar et al., 1994年の報告に記載されているようにしてβ-ガラクトシダーゼ発現を測定することによって評価した。
MACHα1またはMACHα2の発現ベクターでトランフェクトされた培養物は著しい細胞死を示した。これは細胞が丸くなり、泡状突起がでて、収縮し、最終的に細胞は皿からはがれることによって明示された（図14B）。トランスフェクトを行った後、20時間で、β-ガラクトシダーゼによる染色（X-gal）によって確認された、トランスフェクトされた細胞の上部分は、アポートシスの典型的な萎縮した形態を示した（図14B）。対照的に空のベクターを発現する細胞は生存したままであった。
とくに、図14A〜14Dは、指定のMACHアイソフォームの一過性発現を行うヒト胎芽腎臓293-EBNA細胞の形態を示す。矢印（図14B）はアポトーシスの細胞を示す。これらの写真はトランスフェクションを行ってから26時間後に撮ったものである。図15は、指定の構築物をトランスフェクトしてから20時間後にアポトーシスの形態を示すβ-ガラクトシダーゼ発現細胞の部分を測定することによって、293-EBNA（縞をつけた四角）とMCF7（黒の四角）のMACHが誘導する死を定量化した結果を示す。データは、293-EBNA細胞の場合３回の独立した実験結果からえたものであり、MCF7細胞の場合２回の独立した実験結果からえた。データは、計数した青色細胞の全数（１試料当たり約500個の細胞）の分数としてアポトーシスの徴候を示す青色細胞の平均百分率として示した。
MACHαアイソフォーム中のCED3/ICE相同性領域がそのアポトーシス効果に関与していることを試験するため、細胞を以下の発現ベクターでトランスフェクトした。すなわちCED3/ICE相同性領域を欠いている、MACHβ1アイソフォームの発現ベクター；前記領域のＮ末端部分を欠いている、MACHα3の発現ベクター；MACHα1（C360S）の発現ベクター；およびCED3/ICEプロテアーゼの機能にとって重要であると考えられる残基（ICE中のSer347に相当する）のうち１つを欠いた、MACHα1のＣ末端を切り取った変異体（MACHα1（１〜415））の発現ベクターでトランスフェクトした。空の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞に見られるわずかな量の細胞死を超える細胞死は、MACHα3、MACHα1（１〜415）またはMACHα1（C360S）の発現ベクターでトランスフェクトされた293-EBNA細胞またはMCF7細胞には生じなかった。さらに、これらのベクターとともにMACHα1でトランスフェクトされた細胞も、ごくわずか細胞死しか示さなかったが、このことは、不完全なCED3/ICE領域を含有するMACH分子が野生型分子の活性に対してネガティブドミナント効果を有していることを示す。CED3/ICE領域を全く含有していないMACHβ1を発現する培養物は、ごくわずかな細胞死しか示さなかった（図15）。MACHβ1のこの効果は、おそらく、内因性MACHα1分子の活性化が原因であるが、トランスフェクトされたHeLa細胞内ではある理由で一層顕著であった。さらに、HeLa細胞中では、MACHα3、MACHα1（１〜415）およびMACHα1（C360S）もいくぶん細胞傷害性であった（図19）。
図８は、FAS/APO1（FAS-R）とp55-Rによる細胞死の誘導に寄与するリポーターと標的タンパク質の相互作用をグラフで示す。MACHα活性は、FAS/APO1とp55-Rの細胞致死性とシグナリングするカスケードの最も上流側の酵素ステップに明らかに寄与している。MACHβ1がMORT-1とMACHα1の両方に結合できるということは、このアイソフォームが酵素として活性なアイソフォームの活性を増強することを示唆している。
これらMACHアイソフォームのうちいくつかは追加の機能を提供することができる。MACHβ1がMORT-1とMACHα1の両者に結合できるということは、このアイソフォームが酵素として活性なアイソフォームの活性を増大することを示唆している。このアイソフォームでトランスフェクトされた293-EBNAとMCF7の培養物に見られる細胞傷害性は小さいが、HeLa細胞内でこのアイソフォームが発揮する細胞傷害効果がかなり高いことは、おそらく、トランスフェクトされたMACHβ1分子に結合すると内因的に発現されるMACHα分子が活性化されることを反映している。また、MACHアイソフォームのいくつかは、Fas/APO1およびTNFの受容体のほかの非細胞傷害効果に関与する分子のドッキング部位としても作動できる。
（f）MACHαの機能をブロックすると、Fas/APO1とp55-Rによる細胞死の誘導を阻害する
Fas/APO1（FAS-R）とp55-Rによる細胞傷害性に対するMACHαの寄与を評価するため、MACHα3、無機能のMACHα1変異体のMACHα1（１〜415）およびMACHα（C360S）を、誘導してこの細胞傷害性を示す細胞内で発現させた。p55-Rで誘導される細胞傷害性は、この受容体の一過性の過剰発現によって293-EBNA細胞内でトリガーされ（Boldin et al., 1995a）、そしてFas/APO1の細胞傷害性は、p55-Rの細胞外ドメインおよびFas/APO1のトランスメンブランと細胞内ドメインで構成されたキメラ分子の過剰発現によってトリガーされた。ある理由で、このキメラは、細胞傷害効果が、通常のFAS/APO1よりはるかに大きかった。また、HeLa細胞内の細胞傷害効果は、タンパク質合成の阻害剤であるシクロヘキシミドの存在下、TNFまたは抗Fas/APO1抗体でこの細胞を処理することによって誘導された。HeLa細胞は、この受容体の一過性発現によって、Fas/APO1に対し応答性になった。試験を行ったすべての系で、MACHα3と無機能のMACHα1変異体は、Fas/APO1またはp55-Rのトリガリングで誘導される細胞傷害性に対して有効な防御を行った（図16〜19）。このような防御は、すでに報告されているように（Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996）、MACH結合領域を欠いているMORT1  Ｎ末端欠失変異体「MORT1（92〜208）」でトランスフェクトされた細胞内でもみとめられた。これらの防御効果は、MACHαが、Fas/APO1およびp55-Rが誘導する、細胞死のシグナリングカスケードの必要な要素であることを示している。
とくに図16A〜16Dは、トランスメンブランに融合させたp55-Rの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜168）およびFas/APO1の細胞内ドメイン（アミノ酸153〜319）で構成されたキメラ（p55-Fasキメラ）の一過性発現によって（図16Aと16B）、またはp55-Rの発現によって（図16Cと16D）、細胞死が誘導されたときの293-EBNA細胞の形態；ならびにMACHα1（C360S）でそれらが同時にトランスフェクトされたことによってこれらの細胞傷害効果から防御された細胞の形態（図16Bと16D）を示す。写真はトランスフェクションを行ってから26時間後に撮った。図17は、p55-Fasキメラまたはp55-Rと、空のベクター、MACH結合領域を欠いているMORT1欠失変異体（MORT1（92〜208））または無機能のCED3/ICE領域を含有するMACHα分子とでトランスフェクトすることによって293-EBNA細胞内で誘導された細胞死を定量化した結果を示す。図18は、抗Fas/APO1抗体（aFas）およびシクロヘキシミド（CHI）による処理によって誘導される、Fas/APO1の一過性発現を行うHeLa細胞の死、ならびにMORT1DD（92〜208）、MACHα（C360S）またはMACHα3の同時トランスフェクションによるその防御を示す。図19は、TNFおよびシクロヘキシミド（CHI）を適用することによって誘導されるHeLa細胞の死、および図18の場合と同じその防御を示す。データは、少なくとも二つの独立した試験からえたものであり、図14A〜14Fと図15の場合と同様にして示した。
MACHは、異なる組織内で、著しく異なるレベルで、かつ明らかに異なるアイソフォームのパターンで発現される。これらの差は、おそらく、Fas/APO1リガンドとTNFに対する応答の組織特異的特性に寄与する。ほかのCED3/ICE相同体の場合（Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995）と同様に、不完全なCED3/ICE領域を含有するMACHアイソフォーム（たとえばMACHα3）は、同時に発現されたMACHα1とMACHα2の分子の活性を阻害することが発見され、またFas/APO1とp55-Rによる細胞死の誘導を阻害することも発見されている。このような阻害性アイソフォームの細胞内での発現は、Fas/APO1およびTNFで媒介される細胞傷害性に対する細胞の自己防御の機序を構成している。MACHアイソフォームの不均一質性はCED3/ICEファミリーのほかのどのプロテアーゼに見られる不均一質性より広いので、活性の諸MACHアイソフォームの機能をとくにうまく調整することができる。
本発明について充分に説明してきたので、本発明が、広範囲の等価のパラメータ、濃度および条件で、本発明の思想と範囲を逸脱することなくかつ過度の実験を行わずに実施できることは、当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。
本発明は、その具体的実施態様によって説明してきたが、さらに変形できると解される。このことは、一般に本発明の原理に従い、そして本発明が関連している技術分野で公知または通例の慣行になっていてかつ本明細書の特許請求の範囲の範囲内で先に述べた必須の特徴に加えることができる、本明細書の開示事項からの発展を含めて、本発明の変形、使用または適用を含むものとする。
刊行された定期刊行物もしくは要約、米国もしくはその外の国の特許出願、米国もしくはその外の国の発行された特許、またほかのあらゆる文献を含む本明細書に挙げたすべての引用文献は、それらに提供されたすべてのデータ、表、図および本文を含めて本明細書に援用するものである。
公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法または従来の方法に言及しているのは、いずれにしろ、本発明の態様、記載または実施態様が関連する技術分野で開示され、教示されまたは示唆されていると自白しているのではない。
具体的実施態様の前記説明によって、本発明の一般的な性質が充分明らかになるので、第三者は、当該技術分野の技量の範囲内の知識を（本明細書に挙げた引用文献の内容を含めて）利用することによって、過度の実験を行わずに本発明の一般的内容から逸脱することなく、前記具体的実施態様を、容易に改変および／または各種用途に適応させることができる。したがって、このような適応と改変は、本明細書に提供した教示と案内に基づいて、開示された実施態様の均等物の意味と範囲に含まれているものとする。本明細書の表現法または用語は、説明を目的とするもので限定を目的とするものではなく、当業者が、当該技術分野の通常の技量の知識とあいまって、本明細書に提供した教示と案内に照らして、理解できると解すべきである。
0003980641.tif 000008
0003980641.tif 000009
0003980641.tif 000010
0003980641.tif 000011
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：イエダ  リサーチ  アンド  ディベロップメント
カンパニー  リミテッド
（B）街路：ピーオー  ボックス  95
（C）都市：レホボト
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：76100
（G）電話：011-972-847-0617
（H）ファクシミリ：011-972-847-0733
（A）氏名：ワラック、デイビッド
（B）街路：ボロチョフ  ストリート  24
（C）都市：レホボト
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：76406
（G）電話：011-972-8946-3302
（A）氏名：ボルディン、マーク  ピー
（B）街路：ワイズマン  インスティチュート  オブ  サイエンス、
ベイト  クロレ  303
（C）都市：レホボト
（D）州：
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：76000
（A）氏名：ゴンチャロフ、タンヤ  エム
（B）街路：デレクフ  ヤフネ  17-15
（C）都市：レホボト
（D）州：
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：76000
（A）氏名：ゴルトセフ、ユリー  ブイ
（B）街路：ワイズマン  インスティチュート  オブ  サイエンス、
ベイト  クロレ  ４０２
（C）都市：レホボト
（D）州：
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：76000
（A）氏名：ヴァインヴルツェル、ヘンリー
（B）街路：ヘルツル  ストリート  43
（C）都市：ラーナナ
（E）国：イスラエル国
（F）郵便番号（ZIP）：43353
（ii）発明の名称：ＦＡＳ受容体およびほかのタンパク質の機能のモジュレーター
（iii）配列の数：３４
（iv）機械読取り可能形式：
（A）媒体の形式：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ製パーソナルコンピュータ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン#1.30（EPO）
（vi）優先権データ：
（A）出願番号：イスラエル国114,615
（B）出願日：1995年７月16日
（vi）優先権データ：
（A）出願番号：イスラエル国114,986
（B）出願日：1995年８月17日
（vi）優先権データ：
（A）出願番号：イスラエル国115,319
（B）出願日：1995年９月14日
（vi）優先権データ：
（A）出願番号：イスラエル国116,588
（B）出願日：1995年12月27日
（vi）優先権データ：
（A）出願番号：イスラエル国117,932
（B）出願日：1996年４月16日
（2）配列番号１に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1701
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：1..768
（xi）配列：配列番号１
0003980641.tif 000012
0003980641.tif 000013
（2）配列番号２に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：256
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２
0003980641.tif 000014
（2）配列番号３に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：200
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号３
0003980641.tif 000015
（2）配列番号４に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1036
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号４
0003980641.tif 000016
（2）配列番号５に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：235
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号５
0003980641.tif 000017
（2）配列番号６に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：78
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６
0003980641.tif 000018
（2）配列番号７に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：479
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号７
0003980641.tif 000019
0003980641.tif 000020
（2）配列番号８に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：277
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号８
0003980641.tif 000021
（2）配列番号９に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：489
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号９
0003980641.tif 000022
0003980641.tif 000023
（2）配列番号10に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：421
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号10
0003980641.tif 000024
0003980641.tif 000025
（2）配列番号11に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：376
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号11
0003980641.tif 000026
0003980641.tif 000027
（2）配列番号12に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：377
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号12
0003980641.tif 000028
0003980641.tif 000029
（2）配列番号13に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：404
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号13
0003980641.tif 000030
0003980641.tif 000031
（2）配列番号14に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2887
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号14
0003980641.tif 000032
0003980641.tif 000033
（2）配列番号15に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1323
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号15
0003980641.tif 000034
（2）配列番号16に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：335
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号16
0003980641.tif 000035
（2）配列番号17に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2619
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号17
0003980641.tif 000036
0003980641.tif 000037
（2）配列番号18に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：464
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号18
0003980641.tif 000038
0003980641.tif 000039
（2）配列番号19に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1301
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
0003980641.tif 000040
（2）配列番号20に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：266
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号20
0003980641.tif 000041
（2）配列番号21に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：334
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号21
0003980641.tif 000042
（2）配列番号22に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：91
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号22
0003980641.tif 000043
（2）配列番号23に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：829
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
0003980641.tif 000044
（2）配列番号24に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：784
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号24
0003980641.tif 000045
（2）配列番号25に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：261
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号25
0003980641.tif 000046
（2）配列番号26に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：37
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（xi）配列：配列番号26
0003980641.tif 000047
（2）配列番号27に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（xi）配列：配列番号27
0003980641.tif 000048
（2）配列番号28に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：31
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（xi）配列：配列番号28
0003980641.tif 000049
（2）配列番号29に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：31
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（xi）配列：配列番号29
0003980641.tif 000050
（2）配列番号30に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：277
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
0003980641.tif 000051
（2）配列番号31に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：293
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号31
0003980641.tif 000052
（2）配列番号32に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：398
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号32
0003980641.tif 000053
（2）配列番号33に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1443
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号33
0003980641.tif 000054
（2）配列番号34に関する情報
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：91
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号34
0003980641.tif 000055
【図１】
0003980641.tif 000056
【図２】
0003980641.tif 000057
【図３】
0003980641.tif 000058
【図４Ａ】
0003980641.tif 000059
【図４Ｂ】
0003980641.tif 000060
【図４Ｃ】
0003980641.tif 000061
【図５】
0003980641.tif 000062
【図６】
0003980641.tif 000063
【図７Ａ】
0003980641.tif 000064
【図７Ｂ】
0003980641.tif 000065
【図８】
0003980641.tif 000066
【図９】
0003980641.tif 000067
【図１０】
0003980641.tif 000068
【図１１Ａ】
0003980641.tif 000069
【図１１Ｂ】
0003980641.tif 000070
【図１２Ａ】
0003980641.tif 000071
【図１２Ｂ】
0003980641.tif 000072
【図１２Ｃ】
0003980641.tif 000073
【図１２Ｄ】
0003980641.tif 000074
【図１２Ｅ】
0003980641.tif 000075
【図１２Ｆ】
0003980641.tif 000076
【図１３Ａ】
0003980641.tif 000077
【図１３Ｂ】
0003980641.tif 000078
【図１４Ａ】
0003980641.tif 000079
【図１４Ｂ】
0003980641.tif 000080
【図１４Ｃ】
0003980641.tif 000081
【図１４Ｄ】
0003980641.tif 000082
【図１５】
0003980641.tif 000083
【図１６Ａ】
0003980641.tif 000084
【図１６Ｂ】
0003980641.tif 000085
【図１６Ｃ】
0003980641.tif 000086
【図１６Ｄ】
0003980641.tif 000087
【図１７】
0003980641.tif 000088
【図１８】
0003980641.tif 000089
【図１９】
0003980641.tif 000090