(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テープストリッピング法によって生体組織中の特定物質を回収する工程と、
有機溶媒を含む溶液にテープを浸漬させて、前記特定物質を該溶液中に溶出させる工程と、
前記溶液から前記有機溶媒を除去して測定検体を調製する工程と、
前記測定検体中の特定物質を定量する工程と、を含む生体組織中の特定物質の定量方法。
【請求項２】
生体組織が皮膚または粘膜であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
皮膚が皮膚角質層であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
特定物質が含窒素化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
含窒素化合物が尿素であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
定量法が比色法であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
比色法がウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生体に吸収された物質の定量方法に関する。さらに詳しくは、皮膚に塗布した組成物中に含有される物質が皮膚角質内に吸収された量を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿素には皮膚角質の保湿作用や角質溶解作用があるため、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症等の皮膚疾患の治療や、乾燥肌や肌のかゆみ、あかぎれ等を改善するために、皮膚化粧料や医薬品・部外品の外用剤の成分として汎用されている。しかし、皮膚に塗布した外用剤中の尿素は、皮膚上で析出したり、基剤中に貯留し移行しなかったりする場合があり、塗布された尿素の全てが角質層にまで浸透するわけではない。尿素の皮膚への移行性は製剤によってさまざまであり、角質層にどの程度の尿素が浸透したか把握できれば、製剤設計上、有用な指標とすることができる。
【０００３】
特定の物質の定量には、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用するのが簡単であり、また実際に広く行われている方法である。しかし、角質層から採取したサンプル中には、生体が分泌する種々雑多な成分が混入しているため、そのままＨＰＬＣにサンプルを注入しても、多数の妨害ピークが現れ測定は不可能である。したがって、妨害ピークを除去するための操作や成分としてほぼ目的の物質のみが含まれる状態にまで精製するなどの煩雑な操作が必要となり、上記の様な角質層中の尿素の定量には不向きな方法である。
【０００４】
そこで従来より、角質層中の尿素の定量方法としては、放射性炭素（14Ｃ）によって標識した尿素を使用するラベル化方法が行われているが、放射性物質を扱うことのできる特別な実験施設中で煩雑な操作を実施しなければならず、高額な経費を要したり、放射性物質の暴露を受けたりする危険がある等の問題点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述の様に放射性炭素を使用した尿素の定量方法には、様々な問題点があるため、より簡便で安全な定量方法の開発が求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者はこの様な現状に鑑み鋭意検討を行った結果、下記の方法で簡単かつ正確に、皮膚角質層中の尿素を定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、テープストリッピング法によって生体組織中の特定物質を回収し、テープから該特定物質を回収して測定検体を調製し、測定検体中の特定物質を定量することからなる生体組織中の特定物質の定量方法である。
【０００８】
本発明は上記生体組織が皮膚、皮膚角質層または粘膜であることを特徴とする上記定量方法である。また、本発明は特定物質が含窒素化合物、特に尿素である前記定量方法である。
【０００９】
さらに本発明は、定量法が比色法、特にウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法である前記定量方法である。
【００１０】
また、本発明は上記方法により、生体組織中の特定物質を定量するために使用するキットまたはテープである。
さらに本発明には、テープストリッピング法によって回収した生体組織中の特定物質を定量するために使用するキットまたはテープも含まれる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においてテープストリッピング法とは、シート状物質を生体に貼付した後、剥がして生体の表層を回収する方法である。適用部位は髪、皮毛、粘膜、皮膚等、特に限定されないが、好ましくは皮膚である。皮膚である場合には、貼付して剥がすという１回の操作で、通常は第１層の角質層を採取することができる。すなわち10枚のシートを使用してこの操作を繰り返すことで、表面から10層分の角質層が採取される。
【００１２】
本発明においては、上記シート状物質をテープと称する。シート状物質の種類は、皮膚に密着させることができるものであればよく、特に限定されないが、紙や布、ビニルテープ、薄いアクリル板のように形状を変化させられるものであることが好ましい。また、粘着性を有するように加工し、皮膚に一定時間、付着・保持できるようにしたものが好ましい。
【００１３】
このシートを裁断、ホモジナイズまたはそのままの状態で、回収しようとする目的物質に適する溶媒に浸漬し、必要に応じて加熱したり試薬を加えたりして、目的物質を溶媒中に回収する。
【００１４】
シートを皮膚に貼付して角質層を採取した場合には、例えばアルコール等の有機溶媒を使用して溶媒中に目的物質を溶出させることができる。
【００１５】
この溶媒に加水混濁、有機溶媒の除去など、必要な処理を施して、目的物質を含んだ測定用検体を調製する。
そして、この検体をケルダール(Kjeldahl)法(ネスラー試薬発色法、滴定法、インドフェノール反応法等との組み合わせ法)やウレアーゼ法(インドフェノール反応法、グルタミン酸脱水素酵素による紫外部測定法、ロイシン脱水素酵素による紫外部測定法、アンモニア電極法等との組み合わせ法)等、適切な方法によって目的物質の定量を行うことができる。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００１７】
実施例１  塗布製剤の作製
表１に示す処方で、尿素の20％製剤（処方１）および10％製剤（処方２）を調製した。
【００１８】
0003986319.tif 000002
【００１９】
実施例２  尿素製剤の経皮投与および皮膚角質層の採取
一群６例の雄のヘアレスラット（HWY/Slc系、日本エスエルシー生産、実験時９週齢、体重220〜260g）の左側の腹部から背部にかけての皮膚、50cm2（5×10cm）に実施例１で作製した処方１または処方２の製剤を1400mg塗布した。その５時間後に塗布部を洗浄し、皮膚を拭いて残留製剤を除去した。その後、市販のビニルテープ（約5×10cm）を使用して、テープストリッピングを皮膚１カ所あたり10回行い、皮膚角質層を採取した。なお、右側の皮膚は無塗布対照として、同様の処置を行った。
【００２０】
実施例３  尿素量の定量
上記のビニルテープを約5×2cmに切断し、15mlのエタノールに浸漬させて、一夜、密栓放置した。エタノール液を約30分間攪拌した後、ビニルテープを除去し、そのうち10mlを分取して、窒素ガスを使ってエタノールを除去した。エタノール除去後、1mlの注射用蒸留水を加え、混和後、遠心操作を行い、上清を除去し、残液中の尿素測定用の検体とした。
検体中の尿素窒素を自動分析装置（商品名：AU400、オリンパス光学(株)製）を使用して、比色法（ウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法）で測定し、常法にしたがって尿素濃度に換算した(表２)。また、皮膚の単位面積あたりの吸収尿素量を算出した(表３)。
【００２１】
ウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法の測定原理：
尿素＋H2O（ウレアーゼ存在下）→2NH3＋CO2
NH3＋α-ケトグルタル酸（GLDH存在下）＋NADH→グルタミン酸＋H2O＋NAD+
【００２２】
0003986319.tif 000003
【００２３】
0003986319.tif 000004
【００２４】
【発明の効果】
上記結果から明らかなように、皮膚角質中への尿素吸収量は、処方製剤中の尿素濃度に依存して増加した。また、無塗布対照部位では、尿素は検出されなかった。
したがって、本発明方法によって、簡便でかつ短時間で皮膚角質中の尿素測定が可能になった。また、従来法のように放射性炭素（14Ｃ）を使用しないため、放射線の暴露の心配がなく安全で、かつ経費の節減にもなる。