(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実用清酒酵母を親株とし、親株からエチオニン感受性及びβ−アラニン培地における３５℃での生育能を有する株を取得することにより胞子形成率の高い変異株を選択すること、を特徴とする実用清酒酵母１倍体株の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母１倍体株の製造方法に関し、より詳細には、酵母の胞子形成率および胞子の生存率を高くさせるための変異処理及び変異株の選択方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
実用酵母（二倍体）の中には、胞子形成率が低くまた形成された子のう胞子の生存率が低い株が多いことが知られている。このような胞子形成に問題を持つ株から１倍体株を作成するためには、一般にはランダム胞子分離法と呼ばれる手法が用いられる。この手法は、胞子形成させた酵母の子のうを細胞壁溶解酵素で処理し、子のう壁のみを溶解させ、得られた胞子懸濁液を熱処理することにより、未溶解の二倍体株を死滅させるか胞子のみを分別した後に分散させ、次いで例えばＹＰＤの様な培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）に塗布し、生育したコロニーより１倍体株を分離する手法である。
【０００３】
１倍体株の見分け方としては、生育の早さ、ＴＴＣ染色性、色素培地での染色性（永井ら  酵母研究における方法論ｐ７１−ｐ７６）がある。二倍体株の選択的死滅方法としては熱処理の他に、エーテル処理、アルコール処理（黒瀬ら  特開平５−３１７０３５）や、高圧処理法（中富ら  特開平５−２３６９４８）があり、胞子の分別方法としてはミネラルオイル法やポリエチレングリコール法がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、実用酵母の中で例えば清酒酵母等は前述のように胞子形成率が低く、さらに胞子の生存率が低い特徴を有している。黒瀬らの手法（特開平５−３１７０３５）により胞子形成率は数倍に上昇し、１倍体株の取得頻度も数％と有為に改善されてはいるものの、単胞子分離可能な通常の実験室酵母と比較すると、極めて頻度が低く多大の時間を要する。したがって、本発明の目的は、清酒酵母等の実用酵母の１倍体株をより容易に、実験室酵母並に簡便に製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、胞子形成に問題を持つ一般の清酒酵母等の実用酵母の性質について研究を重ねた結果、これら実用酵母の持つ特徴的な性質と胞子形成率および胞子の生存率の間に関連があることを見いだした。
【０００６】
通常用いられる清酒酵母等の実用酵母は以下の性質のいずれかあるいは複数を有していることが知られている。（Ａ）メチオニンのアナログであるエチオニンに対する耐性、（Ｂ）メチオニンの代謝産物であるＳ−アデノシルメチニオンの細胞内含量が高いこと、（Ｃ）構成型酸性ホスファターゼ活性が検出されないこと、（Ｄ）清酒酵母の中でも協会７号あるいは協会７号由来の酵母はβ−アラニン寒天培地上３５℃で生育出来ないこと。これらの清酒酵母の性質については、酵母の清酒醸造特性に関連する知見は得られておらず、専ら清酒醪の純度検定の指標として用いられていた。
【０００７】
本発明者らは、胞子形成率および胞子生存率の高い株がこれら清酒酵母にみられる性質を有していないことから、まず胞子形成率および胞子生存率の高い株より突然変異処理によってエチニオン耐性変異株を作製した。その結果、エチオニン耐性変異株のうちの数株が他の（Ｂ）〜（Ｄ）の性質を同時に有することを明らかにした。次に、（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有している清酒酵母よりエチオニン感受性変異株を選択したところ、これらの性質を失った変異株は胞子形成率および胞子の生存率が極めて上昇することを見いだした。即ち、これらの性質を指標として酵母を選択することにより、胞子形成の良好な酵母が得られることが実証され、本発明を完成した。本発明におけるエチオニン感受性の範囲は少なくとも０．１ｍＭから１０ｍＭのエチオニンを含むＳＤ培地に生育できないことを意味している。
【０００８】
本発明における酵母とは、上記の（Ａ）〜（Ｄ）の性質の何れかを有している酵母であればワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母など実用酵母の種類を問わないが、これらの性質をもつ酵母として、清酒酵母協会７号株、清酒酵母協会９号株、清酒酵母協会１０号或はこれらの株の泡無し変異株協会７０１号株・協会９０１号株・協会１００１号株或は清酒酵母協会１１号株等が好適である。
【０００９】
本発明において、変異処理は常法が適宜使用され、例えば、Ｘ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、ＥＭＳ等の変異処理が適宜使用される。また、天然変異株についても、本法はもちろん適用することが可能である。
以下に、本発明に係る実用酵母１倍体の製造法について、詳細に説明する。
【００１０】
（１）酵母の胞子形成率・四胞子形成率と胞子生存率の測定法
酵母の前培養にはＹＰＤ寒天培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）を用い、３０℃で１８時間〜２４時間培養した後に適量をかきとり、胞子形成培地（２％酢酸カリウム、０．０５％酵母エキス、０．０２％ブドウ糖、２％寒天）に塗布し３０℃で３日培養する。胞子形成率は血球計算盤を用いて計数した酵母菌数あたりの子のうの数をパーセントで表した。また、四胞子形成率は計数された子のう数あたりの四胞子を形成した子のうの数をパーセントで表した。得られた子のうは滅菌水に懸濁しザイモリアーゼ等の細胞壁溶解酵素で処理して子のう壁を溶解した後に、マイクロマニピュレーターを用いてＹＰＤ寒天培地上にて単胞子分離を行い、３０℃で３日間培養し単胞子由来の一体酵母を得た。胞子の生存率は単胞子分離した胞子数あたりの生育した一倍体酵母の数をパーセントで表した。また、得られた一倍体株のメーティングタイプ（ａあるいはα）の決定は、既知の標準一倍体株との交配により行った。
【００１１】
（２）酵母の性質の測定法
【００１２】
（２）−（ｉ）エチオニン耐性の測定法
酵母の前培養にはＹＰＤ寒天培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）を用い、３０℃で１８時間〜２４時間培養した後に適量をかきとり、０．１〜１ｍＭエチオニンを含むＳＤ培地（２％ブドウ糖、０．６７％ Yeast Nitrogen Base“Difco社製”、２％寒天）に接種し、３０℃で３日間培養した後にコロニー形成を判定し、コロニーを形成する株を耐性、形成しない株を感受性とした。
【００１３】
（２）−（ii）酵母Ｓ−アデノシルメチオニンの測定法
ＹＰＤ寒天培地で前培養した酵母を５ｍｌのＹＰＤ液体培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）に１白金耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。次いで培養液を３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して得た酵母菌体を蒸留水で２回洗浄した。得られた洗浄酵母菌体に０．５ｍｌ  １０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加、攪拌後３０℃で１時間保温しＳ−アデノシルメチオニンを抽出した。Ｓ−アデノシルメチオニンの定量はAsahipakGS-320カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで行い、移動相としては０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１０）を用い、波長２５４ｎｍの吸収を測定してＳ−アデノシルメチオニン標準溶液と比較して定量した。
【００１４】
（２）−（iii）構成型酸性ホスファターゼ活性の検定
酵母の前培養にはＹＰＤ寒天培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）を用い、３０℃で１８時間〜２４時間培養した後に適量をかきとり、Burkholderの最小培地（２％ブドウ糖、０．２％アスパラギン、０．１５％リン酸１カリウム、０．０３３％塩化カルシウム、０．０５％硫酸マグネシウム、６０μｇ／ｍｌほう酸、３０μｇ／ｍｌ硫酸マンガン、３００μｇ／ｍｌ硫酸亜鉛、４０μｇ／ｍｌ硫酸銅、２５０μｇ／ｍｌ塩化第１鉄、２５μｇ／ｍｌモリブデン酸ナトリウム、２００μｇ／ｌチアミン、２００μｇ／ｌピリドキシン、２００μｇ／ｌニコチン酸、２００μｇ／ｌパントテン酸、２μｇ／ｌビオチン、１０ｍｇ／ｌイノシトール、２％寒天、ｐＨ５．０）に接種し、３０℃で２日培養した。次に、加熱溶解した３％寒天５ｍｌと、染色液（α−ナフチルリン酸ナトリウム０．０５％、Fast Blue B Salt 0.05％を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）５ｍｌを混和し、コロニー形成した培地上に重層する。３０℃で３０分〜１時間保温し、コロニーが赤色に染まる株を陽性、白いままの株を陰性とした。
【００１５】
（２）−（iv）β−アラニン培地における３５℃での生育の判定
酵母の前培養にはＹＰＤ寒天培地（２％ブドウ糖、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）を用い、３０℃で１８時間〜２４時間培養した後に適量をかきとり、β−アラニン培地（２％ブドウ糖、０．０５％硫酸アンモニウム、０．１５％リン酸１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、２００μｇ／ｍｌチアミン、２００μｇ／ｌピリドキシン、２００μｇ／ｌニコチン酸、０．２μｇ／ｌビオチン、１０００μｇ／ｌイノシトール、２００μｇ／ｌ  ｐ−アミノ安息香酸、４０μｇ／ｌ  β−アラニン、２％寒天、ｐＨ５．０）に接種し、３５℃で２日培養した。培養後生育の判定を行い、生育してきた株を陽性、生育しない株を陰性とした。
【００１６】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１７】
【実施例１】
清酒酵母協会７号のエチオニン感受性変異株
【００１８】
清酒酵母協会７号をＹＰＤ培地にて一夜前培養し、集菌・洗浄後１ｍＭのＥＭＳを含む５ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液で、３０℃、１時間振とう条件下にて変異誘起処理した。次に、酵母を滅菌水にて４回洗浄した後に、１ｍＭエチオニンを含むＳＤ培地に懸濁し、３０℃で５時間培養した後に、終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにナイスタチンを添加し、さらに培養を続け、エチオニンに耐性を示す酵母を選択的に死滅させた。生存した酵母は、適宜希釈した後、ＹＰＤ寒天培地にて培養してコロニーを形成させ、生育してきた各株について胞子形成試験を行い、胞子形成率の良好な３株、７ＥＴＳ１、７ＥＴＳ２、７ＥＴＳ３を得た。
【００１９】
これらの変異株と親株の性質を酵母の性質の測定法に基づき測定したところ、下記表１に示したように、変異株に於て胞子形成率の改善、四胞子形成頻度の上昇、酵母の性質の変化が認められた。また、変異株の胞子は、明らかに胞子生存率が上昇していた。
【００２０】
【表１】
0003923102.tif 000002
【００２１】
【実施例２】
β−アラニン培地で３５℃で生育できる清酒酵母協会７号変異株
【００２２】
実施例１と同様にＥＭＳ処理した清酒酵母協会７号をβ−アラニン培地に塗布し、３５℃で培養した。３日後に形成したコロニーについて胞子形成試験を行い、胞子形成良好な３株、７β−１、７β−２、７β−３を得た。
【００２３】
これらの変異株と親株の性質を酵母の性質の測定法に基づき測定したところ、下記表２に示したように、変異株に於て胞子形成率の改善、四胞子形成頻度の上昇、酵母の性質の変化が認められた。また、変異株の胞子は明らかに胞子生存率が上昇していた。
【００２４】
【表２】
0003923102.tif 000003
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、酵母に高い胞子形成能と胞子の生存率を付与する目的で開発された為に、従来１倍体の取得法のように多数の栄養細胞が混在する実験系を用いることなく、容易に１倍体株を単離できる。またその結果、これまで困難であった実用清酒酵母の遺伝解析が容易になり、醸造酵母としての有用形質の解析や、優良酵母の育種の原株として高い利用価値を持つ。