(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法において、ヒトＩｇＭのＨ鎖に対する抗体の存在下において該担体と該試料とを接触させることを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法。
【請求項２】
ヒトＩｇＭのＨ鎖に対する抗体と試料とを反応させた後、これと抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を接触させることを特徴とする請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
粒子状担体の粒径が０．０５〜１０μｍであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の測定法。
【請求項４】
担体が磁性担体であることを特徴とする請求項１から３の何れかに記載の測定法。
【請求項５】
担体が高分子担体であることを特徴とする請求項１から４の何れかに記載の測定法。
【請求項６】
抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていることを特徴とする請求項１から５の何れかに記載の測定法。
【請求項７】
免疫学的測定法が、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体、及び該抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を用いるサンドイッチ法であることを特徴とする請求項１から６の何れかに記載の測定法。
【請求項８】
第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体および／又は第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていることを特徴とする、請求項７に記載の測定法。
【請求項９】
第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が担体に担持されていることを特徴とする請求項７又は８に記載の測定法。
【請求項１０】
担体が標識されていることを特徴とする請求項９に記載の測定法。
【請求項１１】
（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体と試料とを接触させて抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と試料中のＰＩＶＫＡ−IIとを反応させる工程；及び
（２）粒子状担体の凝集の度合いを測定することにより、該試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIの量を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１から１０の何れかに記載の測定法。
【請求項１２】
少なくとも、（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）ヒトＩｇＭのＨ鎖に対する抗体を含む試薬を含むことを特徴とするＰＩＶＫＡ−II測定用キット。
【請求項１３】
前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含有する試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）ヒトＩｇＭのＨ鎖に対する抗体を含む試薬が、同一の懸濁液に含有されていることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法、ＰＩＶＫＡ−II測定用試薬、並びにＰＩＶＫＡ−II測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＩＶＫＡ−II（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  II）は、ビタミンＫ依存性血漿蛋白質の一つであるプロトロンビンの前駆物質で、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基についてのγ−カルボキシル化の程度が不完全なものを指して言う。一方、カルボキシル化の程度が完全なものを正常プロトロンビンと言い、ＰＩＶＫＡ−IIは正常プロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基についての脱カルボキシル化体であるとも言えることから、ＰＩＶＫＡ−IIという名称以外に異常プロトロンビン（Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）と呼ばれることもある。通常、１０個のグルタミン酸残基中いくつがγ−カルボキシル化を受けるかにより数種類のＰＩＶＫＡ−IIが混在した状態で存在している。
【０００３】
ＰＩＶＫＡ−II測定の臨床的な有用性としては、ビタミンＫの不足状態あるいは抑制状態において当該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果ＰＩＶＫＡ−IIが血液中に出現するので、ビタミンＫの不足状態あるいは抑制状態のマーカーとなることが知られている。また最近では、肝細胞腫瘍にともなって血中にＰＩＶＫＡ−IIが出現することが明らかにされ、従来肝細胞腫瘍の良いマーカーとされてきたα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が陰性を示す肝細胞腫瘍患者においてもＰＩＶＫＡ−IIが高濃度に出現することがあることから、ＡＦＰと並び肝細胞腫瘍を検出するマーカーとしても広く用いられている。
【０００４】
現在用いられているＰＩＶＫＡ−IIの測定方法としては、特異的モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を吸着させたプラスチックプレート等の固相担体と、血清や血漿等の生物学的試料との一次反応を行った後に、反応結合物と未反応物の分離（以下、Ｂ／Ｆ分離とも称する）を行い、蛍光物質、酵素、放射性同位元素等で標識したヒトプロトロンビンに特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体との二次反応を行って、反応により形成された免疫複合体の蛍光、発光量、酵素活性、放射能等を測定する免疫学的測定法が最も一般的である。
【０００５】
一般に、このような免疫学的測定法において、Ｂ／Ｆ分離の操作は、測定を煩雑にし、時間のかかるものにしている主な原因の一つとなっている。Ｂ／Ｆ分離は、通常、チューブ、マイクロタイターウェル等の反応管から未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗浄液の供給、インキュベーション、洗浄液の廃棄という洗浄操作を数回繰り返すことにより行われるが、これらの煩雑な操作を迅速簡便に行うために様々な技術が開発されている。例えば、一次抗体を担持させた担体（一次担体）としてラテックス等の不溶性粒子を利用した測定法は、フィルターにより迅速簡便にＢ／Ｆ分離が実施できることから自動化しやすいという特徴があり、広く用いられている。また、担体として磁性粒子を用いた測定法は、磁力を利用して更に簡便にＢ／Ｆ分離を行うことができる方法として知られている。
【０００６】
従って、臨床的に有用なＰＩＶＫＡ−IIについても、このような技術を応用して迅速簡便に測定を行う方法の開発が望まれていた。
また、特にこのような粒子を担体として利用した測定法においては、測定条件によって溶液中の粒子が不安定になり凝集しやすくなったり、または、用いる試料や測定対象によっては担体に担持された抗体と非特異的に反応する因子が存在し、該因子が担体を凝集させることにより二次反応が阻害されて負の測定誤差を生じるという問題点があることが解ってきた。このような問題点はＰＩＶＫＡ−IIの測定においても生じることが明らかになり、測定の精度や安定性が損なわれ、全自動化を困難にしていた。従って、これらの問題点を解決し、臨床的に非常に有用なＰＩＶＫＡ−IIの測定を、精度良く簡便に行う方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、精度が良く安定的で、かつ簡便なＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はまた、精度が良く安定的で、かつ簡便なＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定を可能にするＰＩＶＫＡ−II測定用試薬およびＰＩＶＫＡ−II測定用キットを提供することを解決すべき課題とする。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用いるＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法において、該担体の凝集を阻害する物質の存在下において該担体と該試料とを接触させることにより、該担体の凝集を阻害することができ、その結果、測定誤差を回避できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法において、該担体の凝集を阻害する物質の存在下において該担体と該試料とを接触させることを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法が提供される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、
担体の凝集を阻害する物質が、試料中に存在する担体を凝集させる因子に対する抗体であることを特徴とする測定法；
担体の凝集を阻害する物質が、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖、または、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体であることを特徴とする測定法；
担体の凝集を阻害する物質が、ヒトＩｇＭのＨ鎖に対する抗体であることを特徴とする測定法；
担体の凝集を阻害する物質と試料とを反応させた後、これと抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を接触させることを特徴とする測定法；
粒子状担体の粒径が０．０５〜１０μｍであることを特徴とする測定法；
担体が磁性担体であることを特徴とする測定法；
担体が高分子担体であることを特徴とする測定法；
抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていることを特徴とする測定法；
免疫学的測定法が、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体、及び該抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を用いるサンドイッチ法であることを特徴とする測定法；
第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体および／又は第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていることを特徴とする測定法；
第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が状担体に担持されていることを特徴とする測定法；
担体が標識されていることを特徴とする測定法；並びに、
（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体と試料とを接触させて抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と試料中のＰＩＶＫＡ−IIとを反応させる工程、及び（２）粒子状担体の凝集の度合いを測定することにより、該試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIの量を測定する工程を含むことを特徴とする測定法：
が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体の凝集を阻害する物質を含有することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−II測定用試薬が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、少なくとも、（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬を含むことを特徴とするＰＩＶＫＡ−II測定用キットが提供される。
本発明の好ましい態様によれば、
前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含有する試薬をさらに含むことを特徴とするキット；並びに、
（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬が、同一の懸濁液に含有されていることを特徴とする、キットが提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体および該抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を用いてＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法において、該担体の粒径が０．０５〜４μｍであることを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明においてＰＩＶＫＡ−II（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  II）とは、ビタミンＫ依存性血漿蛋白質の一つであるプロトロンビンの前駆物質で、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基についてのγ−カルボキシル化の程度が不完全なものを指して言う。この蛋白質には、通常、１０個のグルタミン酸残基が存在しており、その中のいくつかがγ−カルボキシル化を受けているかにより数種類のＰＩＶＫＡ−IIが混在した状態で存在している。
【００１５】
本発明の免疫学的測定法は、試料中のＰＩＶＫＡ−IIの測定を目的としており、本発明においてＰＩＶＫＡ−IIとは、特に断らない限り、数種類のＰＩＶＫＡ−IIが混在しているものを意味する。本発明で用いる試料の種類は特に限定されないが、好ましくは生物学的試料であり、例えば、被験者の血液、血清、血漿、尿、唾液等の体液、種々の細胞、組織やそれらの抽出液等が挙げられる。
【００１６】
本発明のＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法は、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法である。
【００１７】
本発明において粒子状担体に担持される抗ＰＩＶＫＡ−II抗体は、抗原抗体反応によりＰＩＶＫＡ−IIと特異的に結合する抗体であればいかなるものでもよいが、ＰＩＶＫＡ−IIがプロトロンビンの前駆物質で、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化の程度が不完全なものであることから、ＰＩＶＫＡ−IIと反応するがプロトロンビンとは反応しない抗体を用いることが好ましい。このような抗体としては、例えば、１０個のグルタミン酸残基を含むアミノ末端領域に対する抗体が挙げられる。
【００１８】
本発明で用いる抗ＰＩＶＫＡ−II抗体としてはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。なお、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体は公知であり、例えば、特開昭６０−６０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報、及び特開平７−３１３１８６号公報（これら公開特許公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする）に記載の方法、又は当業者に公知の通常の抗体取得方法により取得することができる。
【００１９】
抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体の作成方法の一例を以下に示す。先ず、ワーファリン服用者血漿よりＢａＳＯ4 、ＢａＣＯ3処理してヒトプロトロンビンを吸着除去し、次にＤＥ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅによるイオン交換をおこない、最後にＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロトロンビンと反応する抗プロトロンビン抗体を用いたアフィニティーカラムに吸着せしめ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出し、透析し、濃縮して精製ＰＩＶＫＡ−IIを得る。次にこの精製ＰＩＶＫＡ−IIをマウスに免疫してその脾臓細胞を採取し、Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｇ．等の方法（ＫｏｅｈｌｅｒＧ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；６：５１１−９）によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合し、限界希釈法により３回クローニングを行うことにより、正常プロトロンビンとは反応せずにＰＩＶＫＡ−IIとのみ反応する抗体産生セルラインとして確立される細胞が分泌するモノクローナル抗体を抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体として取得することができる。
【００２０】
抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させる粒子状担体としては、測定に用いられる種々の溶液に実質的に不溶性のものであれば特に限定されないが、磁性粒子、ポリスチレン等の高分子またはそのラテックス、ゼラチン、リポソーム、赤血球などの生体成分等を用いるのが好ましい。中でも、迅速簡便なＢ／Ｆ分離を実現する観点においては磁性粒子が特に好ましく、具体的には、例えば、四酸化三鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三酸化二鉄（Ｆｅ2Ｏ3）、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好ましく用いられる。また、これらの磁性粒子を、ポリスチレン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム、赤血球などの生体成分等の内部に含まれる形で調製したり、表面に固定化したものを好ましく用いることができる。
【００２１】
このような粒子状担体を用いた免疫学的測定におけるＢ／Ｆ分離は、フィルター法、二抗体法、沈降法等により行うことができるが、磁性粒子の場合には磁力を利用して迅速簡便に行うことができる。これらの担体の粒径は、精度良くＢ／Ｆ分離を行うことができればいかなる大きさでもよいが、粒径が小さすぎると分離の効率が悪く、凝集し易くなり、大きすぎると沈殿し易くなる。従って、粒径の下限は、０．０５μｍ、好ましくは０．１μｍ、上限は１０μｍ、好ましくは４μｍ、より好ましくは２μｍが適当であり、粒径の範囲はこれら上限と下限の組み合わせから選ばれる。担体の粒径の具体的範囲としては、通常、０．０５〜１０μｍ、好ましくは０．０５〜４μｍ、より好ましくは０．１〜２μｍが適当である。
【００２２】
上記したような担体に抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させる方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法により行うことができる。具体的には、例えば、化学結合法、物理吸着法等が挙げられ、中でも化学結合法が好ましく用いられる。物理的に吸着させる方法としては、不溶性磁性粒子に、抗体または抗原を直接固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定化する方法が挙げられる。化学的に担持させる方法としては、磁性粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することにより抗体または抗原分子と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子と抗体または抗原分子の間にスペーサー分子を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に抗体または抗原を化学結合させた後、そのタンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。その他、固定化したい抗体または抗原と特異的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡなど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、目的の抗体または抗原を結合させることにより粒子表面に固定化する方法も挙げられる。これらの方法の詳細については、特開平６−１６０３８７号公報等にも開示されている。
【００２３】
本発明の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた担体を用いるＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法の一例としては、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と試料中のＰＩＶＫＡ−IIとを反応させた後に、担体の凝集の度合いを測定することにより、該試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIの量を測定する方法が挙げられる。
【００２４】
具体的には、例えば、ラテックス凝集反応、赤血球凝集反応、ゼラチン凝集反応、金属コロイド凝集反応等の、担体の凝集の度合いがすなわち反応の強度として得られる測定法が挙げられる。これらの凝集反応は、比濁法、沈降法、粒子を直接計数する方法等によってその凝集度合いを測定することができる。例えば、ラテックス凝集反応を用いた測定法の場合は、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させたポリスチレン等のラテックスを試料と接触させた後、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIによって生じた担体の凝集度合いを吸光度や散乱光測定法等の光学的方法により測定すればよい。
【００２５】
しかしここで、試料中に上記担体を凝集させる因子が存在すると、ＰＩＶＫＡ−IIに由来しない非特異的な凝集が生じるために測定値に誤差を生じる可能性がある。試料中に上記担体を凝集させる因子が存在する可能性がある場合は、該因子の活性を阻害する物質の存在下で試料と担体とを接触させることによって、精度良く安定的な測定を行うことができる。また、溶液中における担体の分散状態が不安定になるために凝集が生じる場合には、溶液中での担体の安定性を増すことによって該担体の凝集を阻害する物質を添加することにより、安定的な測定を行うことができる。すなわち、本発明の好ましい態様によれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法において、該担体の凝集を阻害する物質の存在下において該担体と該試料とを接触させることを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの測定方法が提供される。
【００２６】
上記発明における免疫学的測定法として、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光法、電気化学発光法、放射免疫測定法等の標識化免疫測定法を好ましく用いることができる。
【００２７】
これらの方法を用いる場合、より精度の高い測定のためには、担体に担持された抗ＰＩＶＫＡ−II抗体（第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体）と、該抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とを用いるサンドイッチ法による測定が特に好ましい。ここで第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体としては、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識してＰＩＶＫＡ−IIと特異的に結合する抗体であればいかなるものでもよいが、例えば、抗プロトロンビン抗体（ＰＩＶＫＡ−IIとプロトロンビンの共通抗原に対する抗体）や、１０個のグルタミン酸残基を含むアミノ末端領域中に存在する、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識する抗体等が挙げられる。これらの中で、抗プロトロンビン抗体が好ましく用いられる。
【００２８】
本発明で用いることができる抗プロトロンビン抗体は、好ましくは、トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体である。このような抗プロトロンビン抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、新鮮ヒト血漿よりＳｈａｐｉｒｏ等（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｐｈ．，１９６６；１６：４６９−９０）の方法により精製ヒトプロトロンビンを得る。次にこのヒトプロトロンビンでウサギを免疫し、採血して抗血清を得る。抗血清に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、透析後、ＤＥ−５２Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅでイオン交換する。これを、ヒトプロトロンビンアフィニティ カラムにかけ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出して抗ヒトプロトロンビンウサギＩｇＧ抗体を得る。透析して塩酸グアニジンを除去後トロンビンアフィニティカラムにかけて、素通り分画を採取し、トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体とする。また上記のポリクローナル抗体の他に、精製ヒトプロトロンビンをマウスに免疫してその脾臓細胞を採取し、上記したＫｏｅｈｌｅｒ Ｇ．等の方法によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合し、限界希釈法により３回クローニングをおこない、トロンビンと反応せずにＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロトロンビンと反応する抗プロトロンビン抗体産生セルラインとして確立される細胞が分泌するモノクローナル抗体をトロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体として使用することもできる。
【００２９】
第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体は、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と同様に担体に担持させてもよい。該担体としては、前記の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体の担持に用いるものと同様に適宜選択して用いればよい。この場合、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を磁性粒子に担持させた場合は、簡便にＢ／Ｆ分離を行うために、磁性を有さない粒子が好ましく用いられる。このような担体としては、前記したポリスチレン等の高分子またはそのラテックス、ゼラチン、リポソーム、赤血球のような生体成分等が挙げられる。
【００３０】
サンドイッチ法を用いて測定を行う場合には、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体または第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を、用いる測定法に応じて標識する。標識物質としては、例えば、酵素免疫測定法ではＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ等の酵素が挙げられ、蛍光免疫測定法ではＥｕ（ユーロピウム）等の蛍光物質が、放射免疫測定法では125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ等の放射性同位元素が挙げられる。また、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体または第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を標識するのではなく、いずれかの担体を標識する方法が、本発明において好ましく用いられる。該担体を標識する物質も、用いる測定法に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光免疫測定法により測定を行う場合には蛍光物質であればいずれも使用できるが、Ｅｕ（ユーロピウム）、Ｔｂ（テルビウム）、Ｓｍ（サマリウム）等の希土類キレートが特に好ましく用いられる。
【００３１】
具体的には、例えば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体（一次抗体）を担持させた担体と試料とを接触（一次反応）させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い、標識化担体に担持された抗プロトロンビン抗体（二次抗体）または標識化抗プロトロンビン抗体との二次反応を行って、反応により形成された免疫複合体の蛍光、発光、酵素活性、放射能等の標識物質のシグナルを測定する。この場合、試料中に該担体を凝集させる因子が存在すると非特異的な凝集が生じてしまい、二次抗体の反応を妨げたり、蛍光や化学発光の検出を妨害する等により測定値に誤差を生じる。しかし、本発明の方法を用いて、該因子の活性を阻害する物質の存在下で接触させることによって、このような測定誤差を回避し、精度良く安定的な測定を簡便に行うことができる。また、溶液中において担体の分散状態が不安定になるために凝集が生じてしまう場合には、溶液中での担体の安定性を増すことによって該担体の凝集を阻害する物質を添加することにより、安定的な測定を行うことができる。本発明の方法は、一次抗体および二次抗体の両方が担体に担持されている場合に、特に好適である。
【００３２】
本発明で用いることができる担体の凝集を阻害する物質としては、試料中に存在する担体を凝集させる因子を認識してこの活性（即ち、担体を凝集させる活性）を阻害するものであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、該因子に対する抗体が挙げられる。このような抗体としては、例えば、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖、または、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体が挙げられる。ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖に対する抗体としては、例えば、Ｈ鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）、Ｌ鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）、Ｊ鎖（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｃｈａｉｎ）等に対する抗体が挙げられ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント、ｐＦｃ’フラグメント等に対する抗体が挙げられる。中でも、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法においては、ＩｇＭのＨ鎖に対する抗体である抗μ抗体が特に好ましく用いられる。これらの抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いても良いし、取得に用いる動物種も限定されるものではない。また、これらの抗体はそれ自体既知の通常用いられる方法により取得して用いてもよいし、市販のものを任意に選択して用いることもできるが、目的の抗体以外の抗体や他の物質をできるだけ排除するために、アフィニティカラム等を用いて十分に精製してから用いることが好ましい。また、溶液中において粒子状担体の分散状態が不安定になるために凝集が生じてしまう場合には、溶液中において該担体の分散状態の安定性を増す効果を有する物質を、本発明の担体の凝集を阻害する物質として添加してもよい。そのような物質としては、例えば、種々の界面活性剤、蛋白質等が挙げられる。
【００３３】
免疫測定系中の担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質の添加濃度としては、ＰＩＶＫＡ−IIの測定精度に問題がない程度に該因子の活性を阻害しうる濃度であれば特に限定されず、用いる該物質の種類・力価等によって最適な濃度を決めることができる。具体的な添加濃度は、後記する方法によりその効果を測定して決めればよい。具体的には、抗体の添加濃度としては、例えば、抗μ抗体の場合には、下限が０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ、上限が２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ、濃度範囲としては、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ程度が適当である。
【００３４】
また、上記したような担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質の添加方法としては、試料にあらかじめ添加することにより該試料中に存在する担体を凝集させる因子の活性を阻害し、その後に上記担体と接触させてもよいし、該担体を含む溶液等にあらかじめ添加して調製し、この溶液を試料に接触させることによって該因子の活性を阻害してもよい。
【００３５】
このような担体の凝集を阻害する物質の添加の効果は、抗原の添加回収率を測定する方法、担体の凝集度合いを測定する方法等によって判定することができる。ここで、抗原の添加回収率とは、測定された抗原の量を添加した抗原の量で除して１００を乗じた値（％）である。すなわち、実験的に目的の抗原を添加することにより存在する抗原量が既知である測定系を用いて、上記した物質を添加した場合と添加しない場合の測定値を得て、抗原の添加回収率を求めることにより、該物質の添加効果を判定することができる。
【００３６】
一方、担体の凝集度合いを測定することにより該物質の添加効果を判定する方法としては、例えば、該物質を添加した場合と添加しない場合の担体の凝集度合いを比較してもよいし、サンドイッチ法を用いた場合には、一次反応時と二次反応時の凝集の度合いを比較してもよい。具体的には、例えば、蛍光免疫測定法を用いてサンドイッチ法によりＰＩＶＫＡ−IIの測定を行う場合には、測定と平行して任意の波長における反応液の吸光度(Ａ)の測定を行い、得られた値を用いて、以下の式から凝集度合いを求めることができる。
【００３７】
凝集度合い（％）＝（（一次反応時の反応液のＡ−二次反応時の反応液のＡ）／一次反応時の反応液のＡ）×１００
【００３８】
測定を行う吸光度の波長としては、吸収曲線が最大値を示す波長において測定を行うのが好ましいが、担体の粒径によって吸収曲線が変化するので、用いた担体の粒径に基づいて任意に決定すればよい。
【００３９】
定量を行う場合は、予め既知の濃度のＰＩＶＫＡ−IIを試料として測定を行い、得られた定量値を試料のＰＩＶＫＡ−II濃度に対して図示することにより検量線が得られるので、濃度未知の試料の反応定量値からＰＩＶＫＡ−IIの濃度を求めることができる。
【００４０】
本発明の試薬は、少なくとも、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体の凝集を阻害する物質を含有し、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定に用いられるものである。例えば、該物質として抗μ抗体を用いる場合には、該抗体を０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度含有する溶液等の形態で調製することができる。このような試薬を用いれば、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定を精度良く安定的に、かつ簡便に行うことができる。
【００４１】
本発明のキットは、少なくとも、（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬を含み、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定に用いられるものである。また、前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含有する試薬をさらに含んでいてもよい。抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬は、同一の懸濁液に含有されていてもよい。上記試薬の形態は特に限定されず、液体でも固体でもよく、液体の形態も懸濁液又は溶液など任意の形態とすることができる。
【００４２】
本発明のキットは、本発明の免疫学的測定法を行うことができるものであればいかなる構成のものでもよく、例えば、前記した懸濁液の他に、反応希釈液、基質溶液、基質溶解液、洗浄液、反応停止液等を含んでいてもよい。このようなキットを用いることにより、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定を迅速簡便に、かつ、精度良く安定的に行うことができる。
以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
なお、本実施例において用いた抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体、抗プロトロンビン抗体、ＰＩＶＫＡ−II抗原はいずれも特開昭６０−６０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報に記載の方法により調製したものである。
【００４４】
実施例１：試薬類の調製
標識物質としてＥｕ（ユーロピウム）を用いた蛍光免疫測定法により、ＰＩＶＫＡ−IIの測定を行うこととした。まず、試薬類の調製を行った。
（１）溶液の調製
（ａ）反応溶液：０．１５Ｍトリス緩衝液(ｐＨ８．０)、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％  ＮａＮ3、０．１％  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、０．５％  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ
（ｂ）洗浄液：ＬＰＩＡ−Ａ７００用ＢＦ液（三菱化学社製）
（ｃ）アルカリ液：ＬＰＩＡ−Ａ７００用アルカリ液（三菱化学社製）
【００４５】
（２）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させたＭｇラテックス試薬の調製
平均粒径１．０９μｍの磁性体含有ポリスチレンラテックス（ローヌプーラン社製；以下、これを「Ｍｇラテックス」と称する）に、抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体（特開昭６０−６０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報に記載の方法により調製）を、カルボジイミドを用いて化学結合法により固定化した。その後、ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液に０．１％の濃度で懸濁させて、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させたＭｇラテックス試薬とした。
【００４６】
（３）抗プロトロンビン抗体を担持させたＥｕラテックス試薬の調製
Ｅｕキレート化合物であるＥｕＮＴＡ（ユーロピウム−ナフトイルトリフルオロアセトン）化合物１×１０-4モルと、ＴＯＰＯ（トリオクチルホスホスフィンオキシド）２×１０-4モルをアセトン４０ｇに溶解した後、平均粒径０．２１μｌのポリスチレンラテックス（セラダイン社製）３ｇを水４０ｍｌに懸濁させたものと混合した。混合物中のアセトンをエバポレーターにより除去して、ラテックス粒子にＥｕＮＴＡをＴＯＰＯと協同抽出させ、Ｅｕキレートで標識されたラテックス（以下、Ｅｕラテックスと称する。）を調製した。ＴＯＰＯとの協同抽出によりＥｕキレート化合物をラテックス内部に閉じこめる方法は、特開昭５４−１０１４３９号公報等に記載の方法に従って行った。
【００４７】
ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様に化学結合法で抗プロトロンビン抗体（特開昭６０−６０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報に記載の方法により調製）を固定化し、ＢＳＡで処理した後、０．００３％の濃度で緩衝液に懸濁して抗プロトロンビン抗体を担持させたＥｕラテックス試薬を調製した。
【００４８】
実施例２：ＬＰＩＡ−Ａ７００による蛍光免疫測定
後述する（１）〜（５）については、すべて以下に示す方法に従い、全自動分析装置ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学社製）を用いて測定を行った。標識物質として用いたＥｕ（ユーロピウム）は励起されてから蛍光を発するまでにタイムラグを有するので、ＬＰＩＡ−Ａ７００を用いた時間分解蛍光免疫測定を行った。
【００４９】
まず、反応溶液１００μｌ、脱イオン水１２４μｌ、サンプル２６μｌ、Ｍｇラテックス試薬５０μｌをキュベット中にて混合し、３７℃で４分３０秒間反応（一次反応）させたのち、Ｍｇラテックスを磁石でトラップしながらＢＦ液で洗浄することにより、Ｂ／Ｆ分離を行った。キュベット中のＭｇラテックスに反応溶液１００μｌ、脱イオン水１００μｌ、Ｅｕラテックス試薬１００μｌを加えて混合し、３７℃で１２分反応（二次反応）させた。反応後、一次反応と同様にＭｇラテックスを磁石でトラップしながらＢＦ液で洗浄した。キュベット中のＭｇラテックスにアルカリ液４００μｌを添加して処理し、ＥｕラテックスとＭｇラテックスとの結合をはずした。処理後、磁石によりＭｇラテックスをトラップしてアルカリ液を分取し、ＬＰＩＡ−Ａ７００を用いてアルカリ液中に残存したＥｕラテックスに由来する遅延蛍光の量を測定して、検体中のＰＩＶＫＡ−II量を求めた。
【００５０】
また、反応と平行してＬＰＩＡ−Ａ７００により波長５４０ｎｍにおける反応液の吸光度(Ａ540)を測定し、得られた値を用いて、以下の式からＭｇラテックスの凝集度合いを求めた。
【００５１】
凝集度合い（％）＝（（一次反応時の反応液のＡ540−二次反応時の反応液のＡ540）／一次反応時の反応液のＡ540）×１００
【００５２】
（１）担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質の添加効果
９例の正常人ヒト血清にＰＩＶＫＡ−II抗原（エーザイ社製）を４００ｍＡＵ／ｍｌとなるように添加して、測定用サンプルとした。反応溶液には、担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質としてヤギ抗μ抗体（ＩＩＣ社製）を３ｍｇ／ｍｌを加え、ヤギ抗μ抗体無添加の対象と抗原の添加回収率を比較した。抗原の添加回収率は、測定された抗原の量を、添加した抗原の量で除して１００を乗じた値（％）である。
その結果、ヤギ抗μ抗体を添加した系ではＭｇラテックスの凝集が抑制されており、添加回収率が安定していることが解った。ヤギ抗μ抗体無添加の場合の結果を図１に、ヤギ抗μ抗体を添加した場合の結果を図２に示した。
【００５３】
（２）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と他の抗体における、担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質の添加効果の比較
担体を凝集させる因子を含むことをあらかじめ確認したヒト血清をサンプルとして用いた。反応溶液にヤギ抗μ抗体を３ｍｇ／ｍｌ加え、ヤギ抗μ抗体無添加の対象とＭｇラテックスの凝集度合いを比較した。Ｍｇラテックスとしては、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させたＭｇラテックス試薬の他に、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と同様の方法で抗ＨＢｓＡｇ抗体（３Ａ１０Ｆ３、１５Ａ３、８Ｈ５の３クローン）または抗Ｔ３抗体（Ｅ２０４２５の１クローン）を担持させたＭｇラテックス、及び、抗体を担持していないＭｇラテックス（抗体なし）を使用した。抗ＨＢｓＡｇ抗体は、公知の方法に従って組換えＨＢｓＡｇ蛋白質およびモノクローナル抗体の調製を行い、得られたクローンの中から特異性や感度等に優れたクローンとして上記３クローンを選択して用いた。抗Ｔ３抗体は、バイオデザイン社製のものを用いた。
【００５４】
その結果、上記サンプルを用いると抗ＰＩＶＫＡ−IIを担持させたＭｇラテックスは強く凝集するが、反応溶液にヤギ抗μ抗体を３ｍｇ／ｍｌ添加することにより凝集を顕著に抑制できることが示された。また、他の４種の抗体では凝集は起こらず、ヤギ抗μ抗体の添加による影響もないことが確認できた。これにより、本発明がＰＩＶＫＡ−IIの測定に非常に有効であることが示された。結果を図３に示した。
【００５５】
（３）試作キットを用いた測定１（検量線の作成）
担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質として１５ｍｇ／ｍｌの抗μ抗体を含むキットの試作品を作製し、これを用いてＬＰＩＡ−Ａ７００による全自動測定を行った。
ＰＩＶＫＡ−II抗原をそれぞれ０、２０、４０、１００、１０００、１００００、３００００、５００００ｍＡＵ／ｍｌとなるように調製した緩衝液をサンプルとした。その結果、３００００ｍＡＵ／ｍｌまでは十分に定量的な測定濃度領域が得られることが確認された。結果を図４に示す。
【００５６】
（４）試作キットを用いた測定２（感度の検討）
上記（３）と同じ試作キットを用いて、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った。
ＰＩＶＫＡ−II抗原をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０ｍＡＵ／ｍｌとなるように調製した緩衝液をサンプルとし、Ｎ＝１０で測定した（Ｎはサンプル数）。得られた値を±２ＳＤ法により解析した結果、感度、すなわち定量的測定が可能な抗原の最低濃度は１０ｍＡＵ／ｍｌと求められた。これは、全自動の蛍光免疫測定法においては十分に高い感度であった。結果を図５に示す。
【００５７】
（５）試作キットを用いた測定３（従来技術との比較）
上記（３）および（４）と同じ試作キットを用いて、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った。
サンプルとしては、３００人より採取した血清検体を用いることとし、対照として、電気化学発光免疫測定法を用いた分析装置であるピコルミ８２２０（エーザイ社製）による測定を行った。測定後、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定値と、ピコルミ８２２０による測定値との相関性をプロットして解析したところ、図６に示したように相関計数は０．９９と高い値を示した。
【００５８】
一般にピコルミ８２２０で用いられている電気化学発光免疫測定法は、ＬＰＩＡ−Ａ７００で用いられている蛍光免疫測定法に比して感度が高く、高い精度を得られることが知られている。しかし、上記の結果より、本発明の方法および該方法を行うキットを用いれば、蛍光免疫測定法を用いた全自動分析装置であるＬＰＩＡ−Ａ７００を用いても、ピコルミ８２２０と同等の精度で安定的にＰＩＶＫＡ−IIの測定が行えることが示された。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の方法を用いれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた担体の凝集を回避し、精度良く安定的にＰＩＶＫＡ−IIの測定を行うことができる。また、本発明の方法を行うキットを用いれば、蛍光免疫測定法を用いる全自動測定においても、高い感度で精度良く測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２の（１）において、各サンプルに対してヤギ抗μ抗体を添加しなかった場合の凝集率および添加回収率を示した図である。
【図２】実施例２の（１）において、各サンプルに対してヤギ抗μ抗体を添加した場合の凝集率および添加回収率を示した図である。
【図３】本発明の方法が、他の抗原の測定に比べて、ＰＩＶＫＡ−IIの測定において特に有効であることを示した図である。
【図４】本発明のキットの試作品を用いて、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った場合の検量線の図である。
【図５】本発明のキットの試作品を用いて、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った場合の感度の図である。
【図６】本発明のキットの試作品を用いてＬＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った場合の測定値と、エーザイ社製ピコルミ８２２０による測定値の相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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