(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）〜（e）の中から選択されるカチオン性基に結合したステロール由来の親油基を含む両親媒性化合物のワクチン組成物製造における使用：
（a）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（b）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレナミン
（c）コレステリル-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（d）3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロール、
（e）3β-［N-（ポリエチレナミン）カルバモイル］コレステロール。
【請求項２】
上記両親媒性化合物が3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロールである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記両親媒性化合物を中性脂質と組み合わせる請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
組み合わせる中性脂質の割合を少なくとも20％にする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記中性脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）またはジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）である請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
上記両親媒性化合物をリポソーム形で水性環境中に懸濁させる請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
下記（a）〜（e）の中から選択されるカチオン性基に結合したステロール由来の親油基を含む両親媒性化合物のワクチン（ヒト用を除く）投与用アジュバントとしての使用：
（a）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（b）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレナミン
（c）コレステリル-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（d）3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロール、
（e）3β-［N-（ポリエチレナミン）カルバモイル］コレステロール。
【請求項８】
上記両親媒性化合物が3β-［Ｎ-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロールである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
上記両親媒性化合物を中性脂質と組み合わせる請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
少なくとも一種の抗原を含むワクチン組成物において、下記（a）〜（e）の中から選択されるカチオン性基に結合したステロール由来の親油性基を有する少なくとも一種の両親媒性化合物をさらに含むことを特徴とするワクチン組成物：
（a）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（b）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレナミン
（c）コレステリル-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（d)3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロール、
（e）3β-［N-（ポリエチレナミン）カルバモイル］コレステロール。
【請求項１１】
上記親油性基がコレステロール誘導体である請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
上記両親媒性化合物が3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロールである請求項１０または１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
上記両親媒性化合物が少なくとも一種の抗原を含むリポソームの形の請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
上記両親媒性化合物を中性脂質と組み合わせる請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
少なくとも一種のインフルエンザウィルス抗原を含む請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
下記（a）〜（e）の中から選択されるカチオン性基に結合したステロール由来の親油性基を有する少なくとも一種類の両親媒性化合物と、少なくとも一種の抗原とをワクチン処置において同時、別々または時間をあけて使用する組合せ物：
（a）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（b）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレナミン
（c）コレステリル-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（d）3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロール
【発明の詳細な説明】
本発明はワクチン組成物に関するものであり、特にワクチン組成物の免疫原性を高めるアジュバントに関するものである。
動物に注射された時に特異的な抗体を生成する抗原は多数存在する。ワクチン投与の原理はヒトや動物に所定の抗原を投与して体内での抗体の生成を刺激することにある。こうして生成された抗体を用いて生物組織はその後の感染に対して自己防御することが可能になる。しかし、いくつかの抗原はそれを単独で投与しても免疫系を十分に刺激することができない。そのため、アジュバントを添加して生物組織の免疫応答性を高め、それによって十分な量の抗体を生成させる必要がある。
公知アジュバントの中でヒト用ワクチンに一般的に用いられるものは水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムである。しかしこれらの化合物は全ての抗原に対してアジュバント特性を有するものではなく、特にインフルエンザワクチンの免疫原性を高めることができない。
従って、ワクチン組成物において、投与した抗原の免疫原性を高める、毒性のないアジュバントが要求されている。
また、IgAのように分泌性抗体を生成する免疫応答を誘導するアジュバントも重要である。
この目的のために、本発明はワクチン組成物の製造においてカチオン性基に結合したステロール（sterol）に由来する親油性（lipophile）基を有する両親媒性（amphipathique）化合物を用いることを提案する。
本発明の対象は上記両親媒性化合物のワクチン投与でのアジュバントとしての使用にある。
本発明の他の対象は、少なくとも一種の抗原を含むワクチン組成物であって、さらに、カチオン性基に結合したステロール由来の親油性基を有する少なくとも一種類の両親媒性化合物を含むことを特徴とするワクチン組成物を対象とする。
本発明のさらに他の対象はワクチン投与と同時、別々または時間をあけて使用される製品としての、少なくとも一種の抗原と、カチオン性基に結合したステロールに由来する親油性基を含む少なくとも一種の両親媒性化合物とを含む製品にある。
本発明のさらに他の対象は、哺乳動物に少なくとも一種の抗原を投与する哺乳動物の免疫応答の誘導方法において、抗原の他にカチオン性基に結合したステロール由来の親油性基を含む少なくとも一種の両親媒性化合物を投与することを特徴とする方法にある。
両親媒性（amphipathique）という用語は疎水性部と親水性部との両方を有する化合物を意味する。
本発明化合物を生成可能なステロール誘導体としてはコレステロール、フィトステロールおよびエルゴステロールを挙げることができ、コレステロール誘導体が特に好ましい。
本発明の両親媒性化合物のカチオン性基は第４級アンモニウムまたはプロトン化可能なアミンで構成することができる。
親油性基は細胞中で加水分解可能なエステル、エーテル、アミドまたはカルバモイル結合によってカチオン性基に結合されている。
２つの官能基間は１〜20個の炭素原子を含む分岐鎖を有するまたは有しないアルキル鎖から成るスペーサーアームを会して結合されているのが好ましい。
本発明の目的に適した化合物としては米国特許第5,283,185号に記載の特に下記（a）〜（e）を挙げることができる：
（a）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（b）コレステリル-3β-カルボキサミドエチレンアミン
（c）コレステリル-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムアイオダイド
（d）3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロール、
（e）3β-［N-（ポリエチレナミン）カルバモイル］コレステロール
これらの中でも3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル］-コレステロールが特に有利である。
本発明の両親媒性化合物は“Advanced Organic Chemistry”Part B:Reactions and Synthesis（F.A.Carey and R.J.Sundberg-Plenum Publishing Corp.）に記載の方法で、カチオン性基を有する化合物とステロール誘導体との縮合によって得られる。本発明の化合物のいくつかは米国特許第5,283,185号に記載の方法で調製することができる。
アルコール性溶液中で得られた両親媒性化合物を水または水性緩衝液に懸濁してミセルまたはリポソームの懸濁液にする。本発明の両親媒性化合物はリン脂質等の中性脂質、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）またはジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）と組み合わせるのが有利である。この組み合わせにすることによって本発明の両親媒性化合物は水性環境中に懸濁した時にミセルよりもむしろリポソームを構成する。両親媒性化合物と組み合わせる中性脂質のモル比は20％以上にするのが好ましい。
本発明で得られる生成物はネズミに接種した場合に全く急性毒性反応を起こさなかった。
防御的免疫応答を誘導するために用いられる抗原は、ワクチン組成物で通常用いられている任意の抗原単独か、それに他の抗原を組み合わせたもので構成することができる。
本発明の両親媒性化合物は、インフルエンザウィルスのエンベロープ表面にあるヘマグルチニンであるHA蛋白質、ウィルスＲＮＡに結合したキャプシド核蛋白質であるNP蛋白質およびエンベロープのＭ蛋白質または『マトリクス』蛋白質を含むインフルエンザウィルスワクチンと組み合わせた時に優れた免疫アジュバントになることが分かっている。
免疫原性を増加させようとする抗原と両親媒性化合物のミセルまたはリポソーム懸濁液とは各成分を混合した時の疎水性相互作用および静電相互作用によって自発的に結合する。
本発明で得られたワクチン組成物は優れた安定性を有する。ミセル懸濁液よりもリポソーム懸濁液の方がより好ましいと思われる。リポソーム懸濁液は濾過および凍結乾燥によって安定化することができる。
本発明で得られたワクチン組成物に、従来ワクチンに用いられている成分、例えば水、生理食塩水または緩衝液を添加することができることは明らかである。
本発明で得られるワクチン組成物はワクチン投与で通常用いられる任意の経路で投与でき、特に皮下または鼻腔経路で投与することができる。一次免疫とブースター免疫とを別々の経路で行うことも可能である。
抗原を含む組成物と本発明の両親媒性化合物を含む組成物とを別々に投与することもできるが、本発明の両親媒性化合物を抗原とリポソーム組成物とを組み合わせて投与することによって体液性（humorale）免疫応答を増加させることができるだけでなく、特異的な細胞障害Ｔリンパ球を誘導することもできる。
以下、図面を参照して本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
図１はDC cholを合成するための反応スキーム。
図２〜６は実施例８に記載の各マウス群について行った細胞障害Ｔリンパ球誘導試験の結果を示す図。
図７は実施例11に記載の結果を示す図。
図８、９は実施例12に記載の結果を示す図。
図10、11は実施例13に記載の結果を示す図。
図12、13は実施例14に記載の結果を示す図。
図14、15は実施例15に記載の結果を示す図。
図16は実施例16に記載の結果を示す図。
実施例１
3β-［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC chol）の合成
DC cholは、X.GaoとL.Huangの文献（BBRC 179（1）:280-285）に報告の方法で合成される。図１はコレステリルクロロホルメートとN,N-ジメチルエチレンジアミンとの反応スキームである。
過剰量のN,N-ジメチルエチレンジアミン溶液（２ml、18.2mmolを3mlの乾燥クロロホルムに添加したもの）に、温度０℃でコレステリルクロロホルメート溶液（2.25ｇ、５mmolを５mlの乾燥クロロホルムに添加したもの）を一滴ずつ添加する。蒸発によって溶媒を除去した後、残留物を４℃の無水エタノール中で２回再結晶化して精製し、減圧乾燥すると、白色粉末状のDC chol、0.545ｇが得られる。ＮＭＲと質量分析によって化合物の構造を確認した。得られた結果は上記文献に記載のデータと一致した。
実施例２
DC chol 2.3mgのミセル懸濁液を用いたインフルエンザウィルスに対するワクチン組成物の調製
実施例１で得られたDC cholの30mgを100μｌのエタノールに溶解して得られる溶液７５μｌをハミルトンシリンジを用いて45℃の水３mlに攪拌しながら添加する。温度45℃でさらに５分間攪拌した後、得られたミセル懸濁液を抗原としてヘマグルチニンHA、核蛋白質NPおよびM蛋白質を含むインフルエンザウィルス（Ａ／シンガポール株）に対する一価のワクチン200μｌと混合する。
得られた混合物を１回分の投与量である0.3mlに分ける。１回分の投与量には５μｇのHAと、2.3mgのDC chol含む。
実施例３
DC chol0.45mgのミセル懸濁液を用いたインフルエンザウィルスに対するワクチン組成物の調製
実施例１で得られたDC chol ６mgを用いて実施例２と同様にした。
実施例４
DC cholとジオレオイルホスファチジルェタノールアミン（DOPE）とを組み合わせたリポソーム懸濁液の調製
実施例１で得られたDC chol 4.5mgを３mlのクロロホルムに溶解したものと、18mgのジオレオイルホスパチジルエタノールアミン（DOPE）とを混合する。
減圧下にクロホルムを留去して脂質膜を形成し、デシケータを用いて減圧乾燥してから３mlの水に再度懸濁する。
４℃で24時間水和化した後、分散物を超音波槽（laboratory Supplies-Hicksville-N.Y.）を用いて５〜10分間超音波処理してリポソームを形成する。
懸濁液は４℃で少なくとも６ヶ月間安定であった。
実施例５
DC cholとジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）とを組み合わせたリポソーム懸濁液の調製
18mgのDOPEの代わりに18mgのジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）を用いて、実施例４と同様な操作を行った。
４℃で少なくとも６ヶ月間安定なリポソーム懸濁液が得られた。
実施例６
DC chol／DOPEリポソーム懸濁液を用いたインフルエンザウィルスに対するワクチン組成物の調製
実施例４で得られたリポソーム懸濁液３mlを、Ａ／シンガポール株に対する一価のインフルエンザワクチン0.2mlと混合する。このワクチンはヘマグルチニンHAより成る抗原を50μｇ当量含有している。
得られた混合物を１回分の投与量を0.3ml（５μｇのHAと、0.45mlのDC cholとを含む）として10回分に分けた。
実施例７
DC chol／DOPCリポソーム懸濁液を用いたインフルエンザウィルスに対するワクチン組成物の調製
実施例５で得られたリポソーム懸濁液３mlを、0.2mlのＡ／シンガポール株に対する一価のインフルエンザワクチンに混合する。
得られた混合物を１回分の投与量を0.3ml（５μｇのHAと、0.45mlのDC cholとを含む）として１０回分に分けた。
実施例８
免疫処置
４匹のBalb/cマウスで構成される５つのグループに対して異なる日：D０、D21およびD36に下記ワクチン組成物を皮下注射して免疫処置した：
Ａ群：Ａ／シンガポール株に対する希釈された一価のインフルエンザワクチン0.3ml（0.3mlのPBS中に５μｇのHAを含む）
Ｂ群：実施例２で得られたワクチン組成物0.3ml
Ｃ群：実施例３で得られたワクチン組成物0.3ml
Ｄ群：実施例６で得られたワクチン組成物0.3ml
Ｅ群：実施例７で得られたワクチン組成物0.3ml
実施例９
抗HA抗体の投与
中和抗体を定量するために異なる日：Ｄ21、Ｄ36およびＤ51にマウスの血清を採取し、インフルエンザウィルスによって誘導された赤血球凝集阻害法を用いて抗HA抗体を滴定した。
下記表１は１回注射後に各マウス群について得られる結果を示し、表２は２回注射後の結果を示す。
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マウス血清中の中和抗体の力価は赤血球凝集阻害を誘導した最大希釈度のlog2で表される。
以上の結果はDC cholの果たすアジュバントとしての役割を明確に示している。すなわち、抗HA抗体のレベルはアジュバント無しのワクチンを接種したマウス（Ａ群）よりもDC cholを接種したマウスで顕著に高くなる。
Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群およびＥ群の中和抗体レベルは各ワクチン組成物を１回注射した場合でもＡ群の中和抗体レベルよりも高いことは重要である。各力価は２回目の注射後にわずかに上昇して安定化する。３回目の注射後に得られる結果（図示せず）は２回目の注射について得られる結果とほぼ同じである。
Ａ／テキサス株、Ｂ／パナマ株およびＡ／ペキン株を含む３価のインフルエンザワクチンを用いて試験を行った場合も、DC cholのアジュバントとしての効果を示した。
実施例10
細胞障害Ｔ細胞の誘導
実施例８に記載の各群のマウスからＤ51に脾臓細胞を取り出す。これらのエフェクター細胞を、被験ワクチンに対応するＡ／シンガポール株ウィルスに感染した同系刺激細胞用いてインビトロで再度刺激する。刺激された細胞が特異的細胞障害機能を示すことは、赤血球凝集素のＣＴＬエピトープであるペプチド（HAに対する特異的応答）またはウィルスの核蛋白質のＣＴＬエピトープであるペプチド（NPに対する特異的応答）と一緒に培養することによって感作されたＰ815肥満細胞系を標的細胞として使用することによって示される。非特異的溶解（バックグラウンド）は感作されていないＰ815細胞か、HIVウィルス（V3MN）のＣＴＬエピトープであるペプチドを用いた感作されたＰ815細胞で測定した。
標的細胞の溶解は、標的細胞にCr-15を導入して細胞溶解時にこの放射性元素が放出されることを利用した放射化法で測定した。
図２〜図６に示した結果は、試験した各マウス群についてエフェクター細胞と標的細胞との比（Ｅ／Ｔ比）について見た細胞障害％を具体的に示すものであり、DC cholを中性脂質と組み合わせたリポソーム組成物を使用することが特に有利であることを示している。これは、この組成物によってDC cholのアジュバント作用の結果として得られる体液性免疫応答の他に特異的細胞障害Ｔリンパ球の誘導が可能になるためである。
実施例11
DC cholの使用量を変えた時の免疫応答に関する研究
それぞれＡ／シンガポール株に対する一価のインフルエンザワクチンと15μｇまたは５μｇのHAとを含み、これに各種濃度のDC chol／DOPCリポソームを組み合わせた300μｌのワクチン組成物を調製した。リポソーム懸濁液の調製は実施例４と同様な方法で行うが、18mgのジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）の代わりに13.5ｇのジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）を用い、所望のDC chol濃度に応じて量を変えた水に脂質膜を懸濁させた。
得られたワクチン組成物を８〜10週齢のメスのBalb/cマウス５匹で構成される群にＤ０およびＤ28に注射した。Ｄ42に血清を採取して凝集阻害（HAI）法によって抗HA抗体を定量した。
この方法で下記組成物を試験した：
15μｇHA＋０μｇDC chol
15μｇHA＋400μｇDC chol
５μｇHA＋０μｇDC chol
５μｇHA＋25μｇDC chol
５μｇHA＋50μｇDC chol
５μｇHA＋100μｇDC chol
５μｇHA＋200μｇDC chol
５μｇHA＋300μｇDC chol
５μｇHA＋400μｇDC chol
赤血球凝集阻害を誘導した最大希釈度の対数（log2）で表される結果を図７に示す。この結果は１回分の投与量あたり100μｇ以上のDC cholを使用した場合にのみDC cholのアジュバント効果を最大限利用できるということを示している。
実施例12
各種抗体アイソタイプの誘導に関する実験
８〜10週齢の成長したメスのBALB/cマウス５匹で構成される３つの群にＤ０とＤ28に２回下記組成物を皮下注射して、誘導される抗体について比較試験を行った。
第１群：0.3mlの希釈されたＡ／シンガポール株に対する一価のインフルエンザワクチン（0.3mlのPBS中に５μｇのHAを含む）
第２群：0.3mlの希釈されたＡ／シンガポール株に対する一価のインフルエンザワクチン（アジュバントとしての水酸化アルミニウム0.1mgと５μｇのHAを含む）
第３群：実施例11で得られたワクチン組成物0.3ml（DOPCと組み合わせて５μｇのHAと400μｇのDC cholとを含む）
Ｄ28とＤ42にマウス血清を採取し、生成したIgG1およびIgG2をELISA法で定量した。
一次応答で得られた結果を図８に示し、二次応答で得られた結果を図９に示す。
これらの結果は従来のアジュバントである水酸化アンモニムに比較して、一次応答および二次応答のいずれでもDC cholのアジュバント効果を具体的に示している。また、生成IgG2aは大幅に増加し、DC cholがTH1型リンパ球の発達を促進する作用を有することを示している。
実施例13
老齢のマウスにおけるDC cholの作用
実施例12と同様な実験を行うが、この場合は刺激がより困難な20〜22週齢のマウスを試験した。
一次応答で見られた結果を図10に、二次応答の結果を図11に示す。
この場合も、DC cholは一次応答および二次応答の両方にお一いて、特にIgG2a抗体の誘導に関してアジュバント効果を有する。
実施例14
成長マウスと老齢マウスにおけるHAIレベル
実施例12、13で行った試験で免疫処置したマウスを用いて赤血球凝集阻害（HAI）試験で中和抗体を測定した。
一次応答で得られた結果を図12に示し、二次応答の結果を図13に示す。得られた力価は赤血球凝集を阻害する最大希釈度の対数（log 2 HAl力価）の形で表す。明らかに、成長マウスと老齢マウスの両方におけるDC chol/DOPCリポソームのアジュバント効果を示している。
実施例15
鼻腔経路による免疫処置
実施例11と同じ方法で、５μｇのHA（Ａ／シンガポール株に対する一価インフルエンザウィルスの状態で）をDC chol/DOPC（質量比１：４）の状態で存在する200μｇのDC cholと組み合わせて含有するワクチン組成物を調製した。
４匹のBALB/cマウスより成る２つの群に４週間の間隔を開けて２回、鼻腔投与で免疫処置した。
第１群のマウス（G1）には200μｇのDC cholを含むワクチン組成物50μｌを投与し、第２群のマウス（G2）にはアジュバントを含まない同じ一価のインフルエンザウィルスを50μｌ投与した。ブースタ免疫の３週間後に採取した血清についてELISA試験を行い、各群の免疫応答を分析した。
ELISA力価の底10に対する対数（log base 10）で表した結果を、血清IgGについては図14に、血清IgAについては図15に示す。
従って、厳密な粘膜投与プロトコルでは、DC chol/DOPCリポソームによって局所的または全体的免疫応答が少なくともファクター２の分だけ増加することがわかる。
ELISA法でIgGおよびIgAの力価を測定する代わりにHAIによって抗HA抗体の力価を測定した場合も、全体的な免疫応答におけるDC chol/DOPCが果たすアジュバントの役割が示される。局所免疫応答の増加は免疫処置したマウスの肺のIgAを分泌する細胞の数とIgGを分泌する細胞の数とをELISPOTによってカウントすることによっても示され、さらに、免疫処置したマウスの鼻咽頭洗浄液を用いてELISA法によって測定された全IgGレベル（またはIgAレベル）に対する特異的IgGレベル（またはIgAレベル）の比を決定することによっても示される。
実施例16
皮下投与と鼻腔投与の組み合わせによる免疫処置
各４匹のBALB/cマウスより成る２つの群に対し、４週間の間隔を開けて２回ずつ下記組成物を用いて免疫処置した：
第３群（G3）：
（1）４μｇのHA（Ａ／シンガポール株の一価インフルエンザワクチンの状態で）を６μｇのDC chol（DC chol/DOPCリポソームの状態で）と組み合わせて含有するワクチン組成物300μｌを皮下注射で投与し、
（2）0.25μｇのHA（Ａ／シンガポール株の一価インフルエンザワクチンの状態で）を６μｇのDC chol（DC chol/DOPCリポソームの状態で）と組み合わせて含有するワクチン組成物50μｌを鼻腔投与で投与した。
第４群（G4）：
（1）４μｇのHAを200μｇのDC cholと組み合わせて含有するワクチン組成物300μｌを皮下注射によって投与し、
（2）0.25μｇのHAを200μｇのDC cholと組み合わせて含有するワクチン組成物50μｌを鼻腔投与した。
ブースター投与の３週間後に免疫処置したマウスの血清を採取し、中和抗体レベルをHAI赤血球凝集阻害法で測定した。
得られた結果を、力価の底２に対する対数（log base2）で表したものを図16に示す。この結果は皮下経路と鼻腔経路とを組み合わせた混合投与のプロトコルではDC cholがアジュバント効果を有することが示され、DC cholの投与量を６から200μｇに増加することによって免疫応答が増加することを示している。
HAI法によって抗HA抗体レベルを測定する代わりにELISA法によって血清IgGを測定した場合、免疫処置したマウスの肺についてIgAを分泌する細胞の数とIgGを分泌する細胞の数とを測定した場合（ELISPOT法により）または免疫処置したマウスの鼻咽頭洗浄液について全IgGレベル（またはIgAレベル）に対する特異的IgGレベル（またはIgAレベル）の比を決定した場合も、投与量に関して同じ効果が見られた。
DOPCをDOPEで置き換えた場合やDC cholと組み合わせる中性脂質のモル比を20％以上に保った状態でDC chol/中性脂質の比を変化させた場合も実施例11〜16と類似の結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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