(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（１）
【化１】
0003897807.tif 000017
（式（１）中、Ｒ1は、下記式（１−１）
式（１−１）
【化２】
0003897807.tif 000018
（式（１−１）中、Ｒ3は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、アルキル基である。）を表し、
Ｒ2は、水素原子を表す。）
【請求項２】
前記式（１）は、下記式（３）で表される、請求項１に記載のＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（３）
【化３】
0003897807.tif 000019
（式（３）中、Ｒ5は、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78を表し、Ｒ6は、水素原子を表す。）
【化４】
0003897807.tif 000020
【化５】
0003897807.tif 000021
【化６】
0003897807.tif 000022
【化７】
0003897807.tif 000023
【請求項３】
前記スフィンゴ糖脂質が、スフィンゴモナスパウシモビリスおよび／またはスフィンゴモナスヤノイクヤエから産生されたものである、請求項１または２に記載のＮＫＴ細胞活性化用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、特定の構造からなるスフィンゴ糖脂質を含むＮＫＴ細胞活性化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、スフィンゴ糖脂質は動物細胞等の表層に存在している物質であり、認識機構に関与するものと考えられている。一方、グラム陰性細菌はその細胞表層に、リポ多糖、蛋白質及びリン酸よりなる外膜を持っており、これを介して外界とのやりとりを行っている。従って、外膜の主要成分であるリポ多糖は全てのグラム陰性菌に共通に存在し、必須なものであると考えられてきた。ところが、近年になって、好気性グラム陰性菌であって、以前シュードモナス パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）と呼ばれていたスフィンゴモナス パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）は、リポ多糖を全く保有しないこと及びこの菌は菌体脂質としてスフィンゴ糖脂質を含有していることが知られてきた。
そこで、本願出願人は、上記スフィンゴモナス パウシモビリスの菌体から糖脂質を単離し、さらに、その化学構造を解析し、同定することに成功している（特許文献１）。そして、本願出願人は、上記スフィンゴ糖脂質が優れた保湿効果と肌荒れ防止効果を有しているため化粧品として広く採用しうることを開示している（特許文献２）。加えて、本願出願人は、上記スフィンゴ糖脂質が優れた乳化作用を有することも明らかにしている（特許文献３）。
加えて、本願出願人は、他のスフィンゴモナス科の菌株から得られたスフィンゴ糖脂質についても化粧組成物及び医薬組成物として優れていることを開示している（特許文献４）。
【０００３】
一方、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するＮＫＴ細胞は、Ｌａｒｇｅ Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＬＧＬ）様の形態を示すこと、ＩＬ−２Ｒ β鎖を常時表出すること、パーフォリンを有する点などでは、ＮＫ細胞と類縁の細胞であるが、ＴＣＲを有するという点でＮＫ細胞とは決定的に異なる細胞群であることが報告されている（非特許文献１）。
かかる状況のもと、非特許文献２、非特許文献３には、マウスではＩＬ−１２により活性化されたＴ細胞の中でもＮＫ１．１を発現しているＮＫＴ細胞が、腫瘍の肝臓や肺への血行性転移抑制の重要なエフェクター細胞であることが報告されている。
以上のように、このＮＫＴ細胞は、近年、新しい細胞群として非常に注目を集めている細胞群である。
さらに特許文献５は、特定の構造を有するα−グリコシルセラミドがＮＫＴ細胞活性剤として有効であると述べている。しかしながら、より効果的なＮＫＴ細胞活性化剤が求められている。
【０００４】
【特許文献１】国際公開９２／１２９８６号公報
【特許文献２】特開平１１−４３４３７号公報
【特許文献３】特開２０００−５１６７６号公報
【特許文献４】特開２００２−０１０７９７号公報
【特許文献５】国際公開９８／４４９２８号公報
【非特許文献１】J．Immunol.，155，2972（1995）
【非特許文献２】J．Immunol.，154，4333(1995)
【非特許文献３】J. Immunol.，88，82(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明の目的は、上記課題を解決することであって、より効果的なＮＫＴ細胞活性化用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題のもと、本願発明者は下記手段により上記課題を解決しうることを見出した。
（１）下記式（１）で表される構造を有するスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（１）
【化８】
0003897807.tif 000002
（式（１）中、Ｒ1は、下記式（１−１）
式（１−１）
【化９】
0003897807.tif 000003
（式（１−１）中、Ｒ3は、アルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、アルキル基である。）を表し、
Ｒ2は、水素原子を表す。）
（２）前記式（１）は、下記式（３）で表される、（１）に記載のＮＫＴ細胞活性化用組成物。
式（３）
【化１０】
0003897807.tif 000004
（式（３）中、Ｒ5は、下記Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77又はＲ78を表し、Ｒ6は、水素原子を表す。）
【化１１】
0003897807.tif 000005
【化１２】
0003897807.tif 000006
【化１３】
0003897807.tif 000007
【化１４】
0003897807.tif 000008
（３）前記スフィンゴ糖脂質が、スフィンゴモナスパウシモビリスおよび／またはスフィンゴモナスヤノイクヤエから産生されたものである、（１）または（２）に記載のＮＫＴ細胞活性化用組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明により、より効果的なＮＫＴ細胞活性化用組成物が得られた。
さらに、本願発明の組成物は、毒性が低く、エンドトキシントレランスが誘導されないため、副作用が低いという観点からも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下において、本願発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。また、本願明細書において、上記式（３）中、Ｒ51、Ｒ52、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ55、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ58、Ｒ59、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ72、Ｒ73、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ76、Ｒ77、Ｒ78を、「Ｒ51〜Ｒ78」と示すことがある。
本願発明で採用するスフィンゴ糖脂質（以下、「ＧＳＬ」と呼ぶことがある）は、上記式（１）で表される構造を有するものである。ここで、式（１）のＲ1に含まれるＲ3のアルキル基は、シクロアルキル基を有していてもよく、該シクロアルキル基は、Ｒ3のアルキル末端でもよいし、鎖の中に含まれていてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、シクロプロパン基があげられる。Ｒ3のアルキル基の炭素数としては、好ましくは１３〜２３、より好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１である。また、Ｒ3のアルキル基及びアルケニル基は、好ましくは置換または無置換の直鎖のものである。また、アルケニル基に含まれる２重結合は、いずれの位置にあってもよい。
一方、Ｒ4のアルキル基の炭素数は好ましくは１０〜２０、より好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であり、さらに好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらに、Ｒ4のアルキル基は、置換または無置換の直鎖アルキル基であることが好ましい。
【００１８】
さらに好ましくは、Ｒ1が上記Ｒ51〜Ｒ78のいずれかである。
また、式（１）のＲ1は、下記式（１−２）の立体構造をとるものが好ましい。
式（１−２）
【００１９】
【化１５】
0003897807.tif 000009
ここで、上記式（１−２）中のＲ3およびＲ4は、上記式（１−１）のＲ3およびＲ4と同義である。従って、上記Ｒ51〜Ｒ78も上記立体構造をとるものがより好ましい。
また、上記式（１）は、好ましくは、式（３）で表されるものである。
【００２０】
尚、本明細書において、式（３）において、Ｒ5が、Ｒ51〜Ｒ78のいずれかであって、Ｒ6が水素原子の場合を、構造Ａということがある。本発明では、構造Ａの中でも、Ｒ5が、Ｒ51、Ｒ52又はＲ53のものをより好ましく採用できる。
また、本明細書において、式（３）において、Ｒ5が、Ｒ51〜Ｒ78のいずれかであって、Ｒ6が下記Ｒ62の場合を、構造Ｂということがあり、Ｒ5が、Ｒ51〜Ｒ78のいずれかであって、Ｒ6が下記Ｒ63の場合を、構造Ｃということがあり、Ｒ5が、Ｒ51〜Ｒ78のいずれかであって、Ｒ6が下記Ｒ64の場合を、構造Ｄということがあり、Ｒ5が、Ｒ51〜Ｒ78のいずれかであって、Ｒ6が下記Ｒ65の場合を構造Ｅということがある。尚、本明細書における構造Ｂ〜Ｆは参考例として示される。
【化１６】
0003897807.tif 000010
【００２１】
式（４）
【化１１】
0003897807.tif 000011
式（４）中、Ｒ1は、上記式（１）のＲ1と同義である。また、Ｒ1の好ましい範囲も上記とＲ1と同義である（式（４）で表される化合物の少なくとも一種を含むものを以下、構造ＡＡと呼ぶことがある）。
式（５）
【００２２】
【化１２】
0003897807.tif 000012
式（５）中、Ｒ1は、上記式（１）のＲ1と同義である（以下、構造Ｆということがある）。また、Ｒ1の好ましい範囲も上記Ｒ1と同義である。
【００２３】
さらに、本願発明のスフィンゴ糖脂質は１種類のみを採用しても良いし、２種類以上を採用しても良い。２種以上を組み合わせて含有させる場合の各成分の比率は特に制限されない。例えば、上記構造Ａに該当する３種類の化合物のうち１種類以上を含むもの、上記構造Ｂに該当する３種類の化合物のうち１種類以上を含むもの、上記構造Ｆに該当する化合物を少なくとも１種以上含むもの等を挙げることができる。この中でも好ましくは、Ｒ1が、Ｒ51、Ｒ52又はＲ53のいずれかの場合である（以下、構造ＦＡと呼ぶことがある）。
本願発明で開示する組成物には、上記に加えて、上記式（１）において、式（１）中の式（１−１）が式（１−１−１）の立体構造で表されるものも含まれていてもよい。
式（１−１−１）
【００２４】
【化１３】
0003897807.tif 000013
式（１−１−１）中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ、上記式（１−１）と同義であり、好ましい範囲も同義である。
式（１−１−１）は、さらに好ましくは、下記式（１−１−２）で表される立体構造のものである。
式（１−１−２）
【００２５】
【化１４】
0003897807.tif 000014
式（１−１−２）中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ、上記式（１−１）と同義であり、好ましい範囲も同義である。
【００２６】
式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、スフィンゴ糖脂質を有する菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号パンフレットや特開２００２−１０７９７号公報に記載の方法を採用することができる。スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴモナス科に属する菌体中に含まれていることから、スフィンゴモナス科に属する菌のいずれかを用いて抽出すれば式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質を得ることができる。ここで、スフィンゴモナス科に属する菌とは、従来から一般的に「スフィンゴモナス属」（Sphingomonas）に属する菌と言われているものの他、該菌と実質的に同じ科に属するものとして分類される菌を含む趣旨である。本願発明で採用できる菌株としては、例えば、Microbiol. Immunol.,2000,44,563-575に示されるいずれの菌株も採用することができる。
【００２７】
式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、アセトンに対して不溶性であることから、抽出操作を行なう前に菌体をアセトンで洗浄しておくのが好ましい。式（１）のスフィンゴ糖脂質の抽出に用いる溶媒は、メタノールなどのアルコール系溶媒またはアルコール系溶媒とクロロホルムなどの極性溶媒の混合溶媒にするのが収率の点で好ましい。ただし、スフィンゴ糖脂質溶解性の溶媒であれば、これらの以外の溶媒を用いても構わない。
スフィンゴ糖脂質の混合物が得られた場合は、本技術分野で周知の方法にしたがって各成分を分離することができる。たとえば、クロマトグラフィー法によって、スフィンゴ糖脂質は完全に分離することができる。溶出液としてクロロホルム／メタノール混合溶液を用いた場合は、構造Ａ、構造Ｆ、構造Ｃ、構造Ｂあるいは構造Ｄあるいは構造Ｅの順に各スフィンゴ糖脂質が溶出し、構造Ｂ、Ｄ、Ｅは、一般的に異なる菌株が産生するため、極めて簡便に分離することができる。充填剤、溶出液、溶出速度、圧力、温度などのクロマトグラフィーの分離条件については、適宜調節することができる。また、スフィンゴ糖脂質の混合物に含まれる特定の物質のみに選択的に反応する試薬を作用させて該物質の誘導体を調製し、その誘導体の化学的性質または物理的性質を利用して分離を行なうこともできる。菌として、スフィンゴモナスパウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｂのスフィンゴ糖脂質が得られる。また、スフィンゴモナスカプスラータ（Sphingomonas capsulata）（新名：Novosphingobium capsulatum）を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｃのスフィンゴ糖脂質が得られる。さらに、スフィンゴモナスアドハエシバ(Sphingomonas adhaesiva)を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｄのスフィンゴ糖脂質が得られる。加えて、スフィンゴモナススピーシーズＭＫ３４６(Sphingomonas sp. MK346)を用いた場合には、一般に構造Ａのスフィンゴ糖脂質と構造Ｅのスフィンゴ糖脂質が得られる。また、スフィンゴモナスウィッティチアィ（Sphingomonas wittichii）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダス（Sphingomonas macrogoltabidus）（新名：Sphingopyxis macrogoltabida）、スフィンゴモナステラエ（Sphingomonas terrae）又はスフィンゴモナスヤノイクヤエ（Sphingomonas yanoikuyae）(新名：Sphingobium yanoikuyae)を用いた場合には、一般に構造ＡＡ（例えば、構造Ａ）のスフィンゴ糖脂質と構造Ｆ（例えば、構造ＦＡ）のスフィンゴ糖脂質が得られる。したがって、これらの情報に基づいて菌を選択すれば、目的とするスフィンゴ糖脂質を効率よく得ることができる。
式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、周知の合成法を組み合わせることによって合成することもできる。たとえば、糖とスフィンゴシン部分をあらかじめ合成するか、菌体から抽出しておき、アミド結合を形成することによって式（１）で表される各スフィンゴ糖脂質を調製することができる。
【００２８】
本願発明のＮＫＴ細胞とは、例えば、ヒトＶα２４+ＮＫＴ細胞及びマウスＶα１４+ＮＫＴ細胞を含む趣旨である。また、ＮＫＴ細胞活性化とは細胞傷害活性の増強、サイトカイン産生増強及びＮＫＴ細胞の増殖促進を含む意図である。さらに、本願発明のＮＫＴ細胞活性化用組成物は、結果として、ＩＬ−４の産生及びＩＦＮ−γの産生を促進する。従って、ＩＬ−４又はＩＦＮ−γによって促進される各種機能の促進用組成物としても使用することができる。ＮＫＴ細胞活性化用組成物としては、本願発明で採用するＧＳＬのうち、ガラクツロン酸型のスフィンゴ糖脂質な構造を有するものが特に好ましい。
ＩＬ−４によって促進されるものの例としては、Ｔｈ２の誘導、抗体のクラススイッチの誘導が挙げられ、ＩＦＮ−γによって促進されるものの例としては、ＩＦＮ−γによって促進されるＴｈ１の誘導、マクロファージ活性化作用が挙げられる。
ここで、サイトカインの増強として、上記のほか、各種ＩＬ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、造血因子のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン、造血因子の上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生又は活性化促進作用組成物としても利用することができる。さらに、本願発明で開示した上記スフィンゴ糖脂質は、上記以外の免疫活性化組成物や、がん細胞のアポトーシス誘導化組成物、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化促進、ＩｋａｐｐａＢの分解、ｐ３８のリン酸化、Ａｋｔのリン酸化等を目的とした、産生又は活性化促進用組成物としても利用できる。
【００３０】
また、本願発明の組成物を医薬品若しくは医薬部外品やその有効成分として利用する場合、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし崩壊補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本願発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の効能を有する成分を１種又は２種以上配合してもよい。本願発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、成人一日あたり、０．００１〜１００ｍｇ好ましくは０．０１〜１０ｍｇの範囲で用いることができる。また、投与方法も特に限定されず、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本願発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本願発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００３２】
本実施例においては、ＧＳＬとして、スフィンゴモナスパウシモビリスから産生された構造Ａのもの（ＧＳＬ−１）、スフィンゴモナスパウシモビリスから産生された構造Ｂのもの（ＧＳＬ−２）、スフィンゴモナスカプスラータから産生された構造Ｃのもの（ＧＳＬ−３）、スフィンゴモナスアドハエシバから産生された構造Ｄのもの（ＧＳＬ−４）、スフィンゴモナススピーシーズＭＫ３４６から産生された構造Ｅのもの（ＧＳＬ−５）、スフィンゴモナスヤノイクヤエから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−６）、スフィンゴモナスヤノイクヤエから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−７）、スフィンゴモナスウィッティチアィから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−８）、スフィンゴモナスウィッティチアィから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−９）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダスから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−１０）、スフィンゴモナスマクロゴルタビダスから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−１１）、スフィンゴモナステラエから産生された構造ＡＡのもの（ＧＳＬ−１２）、スフィンゴモナステラエから産生された構造Ｆのもの（ＧＳＬ−１３）を採用した。これらは、国際公開ＷＯ９２／１２９８６号公報、特開２００２−０１０７９７号公報に記載の方法に従って分離した。
【００３３】
実施例１  ＮＫＴ細胞活性化作用の測定
動物：
試験用マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎマウス（以下、正常マウスという。）及びＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒマウス（ＴＬＲ４欠損ＩＬ−１２Ｒβ２鎖変異マウス）（以下、ＴＬＲ４欠損マウスという。）（マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ市）（７週齢、雌）を使用した。ＧＳＬ−１はＴＬＲ４を介して正常マウスのマクロファージを活性化し、ＩＬ−１２産生を誘導する。ＴＬＲ４欠損マウスは、ＩＬ−１２受容体のβ鎖に変異があり、ＩＬ−１２が作用しないものである。ＩＬ−１２は免疫系を強力に活性化する物質であるが、本実施例のＴＬＲ４欠損マウスを用いると本願発明で採用するスフィンゴ糖脂質のＮＫＴ細胞に対する活性化促進をＩＬ−１２の作用を受けない状態で、より明確にすることができる。
サンプルの作成：
各ＧＳＬのいずれか１０μｇを、正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに投与した。投与は、尾静脈内投与により行った。そして、対照として生理食塩水を投与したもの（コントロール）、投与後１日経過時（１日目）及び２日経過時（２日目）の血清及び肝臓を採取した。
【００３４】
肝臓内白血球の分離：
採取した肝臓を２枚のスライドガラスを用いてつぶした。細胞浮遊液を５００ｒｐｍ、１分間遠心した。得られた上清を１２００ｒｐｍ（３００ｇ）、５分間遠心した。その沈渣を３０％のパーコール（ファルマシア社製）に懸濁し、さらに、これを、６７．５％  パーコールの上に重層して、２０℃、２０００ｒｐｍ（８００ｇ）、３０分間遠心し、３０％と６７．５％パーコールの境界に白血球を集積させ回収した。得られた細胞をハンクス液で３回洗浄して肝臓内白血球を得た。
【００３５】
フローサイトメトリー：
ＦｃＲを介した蛍光標識抗体の非特異的結合を防ぐため、抗ＦｃγＲ（２．４Ｇ２）を用いた。抗体は、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（日本ベクトン・ディッキソン（株）製、ＰＫ１３６）及びビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体（日本ベクトン・ディッキソン（株）製、Ｈ５７−５９７）を用いた。細胞に各抗体を添加した後、４℃、暗所で３０分反応させた。尚、ビオチン標識抗体を用いた細胞は、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジン（日本ベクトン・ディッキソン株式会製、５５４０６２）を４℃、暗所で３０分反応させた。上記抗体、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合ストレプトアビジンの染色及び細胞の洗浄には０．１％ＮａＮ3含有１％血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（-）で固定した。測定は HYPERLINK "http://cent-scorpio.asahikawa-med.ac.jp/central/image/biochemistry/fcm.html" 自動細胞解析分離装置（ベックマンコールター（株）、COULTER EPICS ELITE ESP)で行った。また、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ａ抗体（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製、Ｍ１７／４）に代えて同様に行った。
上記ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（又はＣＤ１１ａ）を用いた方法によって得られたフローサイトメトリーの結果を図１〜図６に示した。ここで、図１〜図４は、それぞれ、正常マウスを用いた場合で、順に、ＧＳＬ−１、６を投与した場合を、図５及び図６は、それぞれ、ＴＬＲ４欠損マウスを用いた場合で、順に、ＧＳＬ−１を投与した場合を示した。
ここで、図中に示した数字は、ＮＫ１．１（又はＣＤ１１ａ）とＴＣＲαβの両方を発現した細胞の割合（％）を示している。尚、ＮＫ１．１（又はＣＤ１１ａ）とＴＣＲαβの両方を発現したものは、ＮＫＴ細胞である。
また、日を変えて、上記と同様に、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体を用いた方法によって得られた正常マウスのフローサイトメトリーの結果（ＮＫＴ細胞の割合）を図７に示す。ここで、図中に示した数字は両方を発現した細胞の割合（％）を示し、図中の米印は、ｔ検定により統計的にコントロールと有意な差が認められたものである。
【００３６】
ＩＦＮ−γの存在の確認：
ＧＳＬ−１を添加した場合の血中のＩＦＮ−γ量について検討した。正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに、ＧＳＬ−１を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれるＩＦＮ−γを解析した。
ＩＦＮ−γは、捕捉抗体として精製抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）（日本ベクトン・ディッキソン株式会製）と、検出抗体としてビオチン結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＡＮ−１８）（日本ベクトン・ディッキソン株式会製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。ビオチン結合抗体に続く反応でアルカリ性フォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ製、４３−４８２２）を結合させ、パラニトロフェニルリン酸塩（ＳＩＧＭＡ製、Ｎ−４６４５）を基質として発色させた。マイクロプレートリーダー（日本バイオラドラボラトリーズ株式会社、Ｍｏｄｅｌ５５０）で４０５ｎｍと対照として５４０ｎｍの波長の吸光度を観察した。この結果、正常マウスにおいて、図８に示すように、ＩＦＮ−γの産生が促進されていることが認められた。尚、ＴＬＲ４欠損マウスの場合、ＩＬ−１２に反応しないため、ＧＳＬ−１を投与してもＩＦＮ−γは検出されなかった。
【００３７】
ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリー：
ＧＳＬ−１を投与した場合の正常マウスについて、上記と同様の方法でフローサイトメトリーを行い、（ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体、ビオチン標識抗ＴＣＲαβ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ抗体（日本ベクトンディッキンソン株式会社製、５５４４１０）にて染色して、ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞の割合を測定した。その結果を図９に示す。ここで、図中の数字は、ＮＫ１．１とＴＣＲαβの両方を発現した、ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞の割合に相当する。
【００３８】
ＩＬ−４の量の測定：
ＧＳＬ−１を添加した場合の血中のＩＬ−４の量が増加するかについて検討した。上記正常マウス及びＴＬＲ４欠損マウスに、ＧＳＬ−１を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれるＩＬ−４を解析した。
ＩＬ−４の測定は、マウスＩＬ−４  ＢＤ  Ｏｐｔｉ  ＥＩＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製、５５５２３２）を用いて該マニュアルに従って測定した。結果、いずれのマウスについても、ＩＬ−４の増加が認められた。特に、図１０に示すとおり、ＴＬＲ４欠損マウスにおいて、ＩＬ−４の顕著な産生促進が認められた。
ＧＳＬ−１を添加した場合、上記フローサイトメトリーにおいて、ＮＫ１．１とＴＣＲαβの両方に発現したものの割合の増加が認められたこと、及び、これらの増加が大きいものについては、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の両方が産生されていることが確認できたことから、ＧＳＬ−１がＮＫＴ細胞の活性化に有効であることが認められた。
【００７１】
実施例２
本願発明のＧＳＬ組成物についての毒性について確認した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。２０ｍｇのガラクトサミンを腹腔内投与直後に、リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と示すことがある）（Salmonella abortus equi由来、マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ市）（溶媒は生理食塩水）、または、下記表１に示したＧＳＬ（溶媒は「Ｐ＋Ｓ」）の下記表１に示した量を、マウス尾静脈から投与した。投与２４時間後、マウスの生死を観察した。その結果を表１に示した。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
ＬＰＳを添加した場合、１０ｎｇの添加でもすべてのマウスが死亡した。一方、ＧＳＬでは１００μｇ添加してもすべてのマウスが生存していた。このように本願発明の組成物はきわめて毒性が低いことが認められた。
【００７４】
実施例３
エンドトキシントレランスが誘導されるか否かについて確認した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週令、メス）を用いた。ＬＰＳ（溶媒は生理食塩水）または各ＧＳＬの下記表１６に示す量をマウス尾静脈から投与した。投与後２４時間に、ガラクトサミン（２０ｍｇ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ、溶媒は生理食塩水）を腹腔内投与し、マウスの生死を観察した。その結果を、表２に示す。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
表２から明らかなとおり、ＧＳＬ−１、ＧＳＬ−２、ＧＳＬ−６およびＧＳＬ−７を１００μｇ添加してもエンドトキシントレランスは誘導されず、すべてのマウスが死亡した。一方、ＬＰＳは１００ｎｇの添加でもエンドトキシントレランスが誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】正常マウスにＧＳＬ−１を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図２】正常マウスにＧＳＬ−６を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図３】ＴＬＲ４欠損マウスにＧＳＬ−１を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図４】ＴＬＲ４欠損マウスにＧＳＬ−２を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【図５】正常マウスに各種ＧＳＬ−１、６を投与した場合のＮＴＫ細胞の変化を示す。
【図６】正常マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２投与後のＩＦＮ−γの濃度を示す。
【図７】正常マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２を投与した場合のＩＮＦ−γ産生ＮＴＫ細胞の変化を示す。
【図８】ＴＬＲ４欠損マウスにおけるＧＳＬ−１又はＧＳＬ−２投与後のＩＬ−４の濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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