(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合しうるタンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、
ａ）天然のｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列のアミノ酸残基２０６〜残基４２６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ配列；
ｂ）命名されたタンパク質、５５．１、５５．３からなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、該タンパク質５５．１が天然のｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列のアミノ酸残基３２８〜残基４２６のアミノ酸配列からなり、該タンパク質５５．３が天然のｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列のアミノ酸残基２７７〜残基４２６のアミノ酸配列からなる；
よりなる群から選択されるＤＮＡ配列からなることを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
命名されたタンパク質、５５．１、５５．３からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
タンパク質５５．１をコードする、請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
タンパク質５５．３をコードする、請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項６】
請求の範囲第５項記載のベクターを含む形質転換された真核性のまたは原核性の宿主細胞。
【請求項７】
請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ分子によってコードされ、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合しうるタンパク質の製造方法であって、請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を該タンパク質の発現に適した条件下で増殖すること、該タンパク質を該形質転換細胞の培養液からまたは該形質転換細胞の細胞抽出物から抽出することを含む製造方法。
【請求項８】
前記ａ）のＤＮＡ配列がヒトｃＤＮＡライブラリーから得られるｃＤＮＡの配列であり、かつ命名されたタンパク質、５５．１、５５．３からなる群から選択されるタンパク質をコードする配列からなる、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求の範囲第８項記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載のベクターを含む形質転換された真核性のまたは原核性の宿主細胞。
【請求項１１】
請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ分子によってコードされ、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合しうるタンパク質の製造方法であって、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を該タンパク質の発現に適した条件下で増殖すること、該タンパク質を該形質転換細胞の培養液からまたは該形質転換細胞の細胞抽出物から抽出することを含む製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項記載のベクターを含む形質転換された真核性のまたは原核性の宿主細胞。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子によってコードされ、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合しうるタンパク質の製造方法であって、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を該タンパク質の発現に適した条件下で増殖すること、該タンパク質を該形質転換細胞の培養液からまたは該形質転換細胞の細胞抽出物から抽出することを含む製造方法。
【請求項１５】
ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合しうる、請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１つに記載の配列によってコードされるタンパク質。
【請求項１６】
天然のｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列のアミノ酸残基３２８〜残基４２６のアミノ酸配列をもつタンパク質５５．１である、請求の範囲第１５項記載のタンパク質。
【請求項１７】
天然のｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列のアミノ酸残基２７７〜残基４２６のアミノ酸配列をもつタンパク質５５．３である、請求の範囲第１５項記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は一般に、ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの受容体に属する受容体およびこれら受容体の生物学的機能の制御の技術分野に関する。ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの受容体としてはたとえば、ｐ５５とｐ７５の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ受容体）およびＦＡＳリガンド受容体（ＦＡＳ／ＡＰＯ１またはＦＡＳ受容体とも称呼され、以下ＦＡＳ受容体という）などの受容体がある。さらに具体的に述べると本発明は、ｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体およびＦａｓ受容体の細胞内ドメイン（ＩＣ）（これらの細胞内ドメインはそれぞれｐ５５ＩＣ、ｐ７５ＩＣおよびＦａｓＩＣと称呼する）と結合し、かつｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体およびＦａｓ受容体の機能を調節（modulating）することができる新規なタンパク質に関する。完全なｐ５５−ＴＮＦ受容体のｐ５５ＩＣと結合できるタンパク質の１つは、ｐ５５ＩＣ分子またはたとえばｐ５５ＩＣのいわゆる「死滅ドメイン（death domain）」（ＤＤ）などのその部分の形態のｐ５５ＩＣ自体である。したがって、本発明はｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）またはその部分によってリガンド（ＴＮＦ）とは独立した方式で細胞内に誘発させることができる新規なＴＮＦ関連作用に関する。また本発明は、これらの新規な、ｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体の結合タンパク質およびＦａｓ受容体結合タンパク質（本明細書ではそれぞれｐ５５ＩＣ結合タンパク質、ｐ７５ＩＣ結合タンパク質およびＦａｓＩＣ結合タンパク質という）の製造および用途に関する。
別の態様で、また本発明は、新しい可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体とオリゴマーＦＡＳ受容体、およびＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体の混合物を含有するオリゴマー受容体、その用途ならびにその製造方法に関する。
発明の背景と従来技術
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）とリンホトキシン（ＴＮＦ−β）（以下、ＴＮＦはＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者を意味する）は細胞に対して多くの作用を有する単核食細胞が主として産生する多機能のプロ炎症サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）である（イオン  グレッサー（Ion Gresser）編「インターフェロン（interferon）７」の８３〜１２２頁（アカデミック  プレス（Academic Press）社、ロンドン）に記載のワラック  ディー（Wallach D.）（１９８６年）の報告；およびビュトラー（Beutler）とセラミ（Cerami）（１９８７年））。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は特定の細胞表面受容体に結合することによって、両者の作用を開始する。これらの作用のいくつかは生物体に対して有益と考えられている。すなわちこれらの作用によってたとえば腫瘍細胞またはウィルスに感染した細胞が破壊されまた顆粒球の抗菌活性が増大される。このように、ＴＮＦは腫瘍と感染因子に対する生物体の防御に関与しかつ損傷からの回復に関与している。したがってＴＮＦは、腫瘍細胞の表面上のＴＮＦの受容体に結合して腫瘍細胞が死滅するに至る事象を開始させる用途で、抗腫瘍剤として使用することができる。ＴＮＦは抗感染症剤としても使用できる。
しかしＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者には有害な作用もある。ＴＮＦ−αが過剰に産生されると、いくつかの疾患で重大な病原として作用することは明らかである。すなわち、主に血管系に対するＴＮＦ−αの作用が、敗血症性ショックの症状の主な原因であることは公知である（トラシー（Tracey）ら（１９８６年））。いくつかの疾患で、ＴＮＦは脂肪細胞の活性を制御しかつ無食欲を起こさせて体重が過剰に失われる（悪液質）ことがあるので、ＴＮＦ−αはカケチン（cachetin）と命名された。またＴＮＦ−αは、リウマチ性疾患における組織に対する損傷のメディエーターとして（ビュトラーおよびセラミ；（１９８７年））および移植片対宿主反応に見られる損傷の主なメディエーターとして（ピクエト（Piquet）ら（１９８７年））により報告されている。さらにＴＮＦは、炎症の過程および多くの他の疾患に関与していることは公知である。
独立して発現される２種の異なる受容体であるｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者を特異的に捕捉して、ＴＮＦの前記生物学的作用を開始および／または媒介する。これら２種の受容体は構造が異なる細胞内ドメインを有し、これら受容体が異なるシグナリング（signaling）を行なっていることを示唆している（以下の諸報告参照、ホーマン（Hohmann）ら（１９８９年）、エンジェルマン（Engelmann）ら（１９９０年）、ブルックハウス（Bruckhaus）ら（１９９０年）、レオトシャー（Leotscher）ら（１９９０年）、スカール（Schall）ら（１９９０年）、ノファー（Nophar）ら（１９９０年）、スミス（Smith）ら（１９９０年）およびヘラー（Heller）ら（１９９０年））。しかしながら、その細胞機構、たとえばｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内シグナリングに関与している各種タンパク質や関与している可能性がある他の因子はこれから解明しなければならない（下記のように、まず、ｐ７５ＩＣとｐ５５ＩＣに結合できる新しいタンパク質類について述べる）。この細胞内シグナリングは、通常リガンド、すなわちＴＮＦ（αもしくはβ）がその受容体に結合したのちに起こり、最後に細胞のＴＮＦに対する応答が見られるに至る反応のカスケードの開始に関与している。
ＴＮＦの前記細胞致死作用（cytocidal effect)については、今まで研究された大部分の細胞において、この作用は主としてｐ５５ＴＮＦ受容体によって誘発される。ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン）に対する抗体類はそれ自体、細胞致死作用を誘発し（ＥＰ４１２４８６参照）、この作用は抗体による受容体の架橋（croSS-linking）の効率と相関関係があり、細胞内シグナリングのプロセス発生の第一ステップであると考えられる。さらに突然変異の研究によって（ブラッケブッシュ（Brakebusch）ら（１９９２年）；タータグリア（Tartaglia）ら（１９９３年））、ｐ５５ＴＮＦ受容体の生物学的機能がその細胞内ドメインの完全性（integrity）に依存していることが分かったので、ＴＮＦの細胞致死作用をもたらす細胞内シグナリングの開始はｐ５５ＴＮＦ受容体の２つ以上の細胞内ドメインの会合の結果起こることが示唆された。さらに、ＴＮＦ（αとβ）はホモトリマー（homotrimer）として生成するので、受容体分子に結合し架橋するその性能によってｐ５５ＴＮＦ受容体を経由して細胞内シグナリングを誘発すること、すなわち受容体凝集を起こすことを示唆している。ｐ５５ＩＣとｐ５５ＤＤがどのように自己会合して、リガンド非依存性方式で細胞内にＴＮＦ関連作用（TNF-associated effect）を誘発するかを以下に説明する。
ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの受容体のもう１つのメンバーは、Ｆａｓ抗原とも呼ばれているＦＡＳ受容体（ＦＡＳ受容体）であり、種々の組織内で発現されかつＴＮＦ受容体とＮＧＦ受容体を含むいくつかの細胞表面受容体と相同である。ＦＡＳ受容体は、アポトーシスの形態の細胞死を仲介し（イトウ（Itoh）ら（１９９１年））、そしてＴ細胞が成熟中に自己反応性Ｔ細胞の負のセレクター（Selector）として働くようである。ＦＡＳ受容体は自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシス死を仲介する。ＦＡＳ受容体遺伝子（Ｉｐｒ）に突然変異が起こると、マウスに、ヒトの自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似ているリンパ増殖障害を起こすことが発見されている（ワタナベ−フクナガ（Watanabe-Fukunaga）ら（１９９２年））。ＦＡＳ受容体に対するリガンドは、とりわけキラーＴ細胞（すなわち細胞毒性性Ｔリンパ球：ＣＴＬ）が保有している細胞表面結合分子（Cell-surface associated molecule）のようであるので、このようなＣＴＬはＦＡＳ受容体を保有する細胞に接触すると、ＦＡＳ受容体保有細胞のアポトーシス死を誘発することができる。さらに、ＦＡＳ受容体に対して特異的なモノクローナル抗体が調製されており、このモノクローナル抗体は、ヒトＦＡＳ受容体をコードするｃＤＮＡで形質転換されたマウスの細胞を含む、ＦＡＳ受容体を保有する細胞にアポトーシス細胞死を誘発することができる（イトウ（Itoh）ら（１９９１年））。
Ｔリンパ球以外の他の各種正常細胞は、それらの表面にＦＡＳ受容体を発現し、この受容体の誘発によって死滅されることが見出されている。このような死滅工程を抑制せずに誘発させると、特定の疾患における組織の損傷、たとえば急性肝炎における肝細胞の破壊の原因になると考えられる。したがって、ＦＡＳ受容体の細胞毒性活性を抑制する方法を見つければ治療に利用できるであろう。
逆に、特定の悪性細胞とＨＩＶ感染細胞はその表面にＦＡＳ受容体を保有していることが見出されたので、ＦＡＳ受容体に対する抗体すなわちＦＡＳ受容体のリガンドは、これらの細胞に、ＦＡＳ受容体仲介細胞毒性作用を誘発するために用いてそのような悪性細胞またはＨＩＶ感染細胞と戦う手段を提供することができる（イトウ（Itoh）ら（１９９１年））。したがって、ＦＡＳ受容体の細胞毒性活性を高める他の方法を見つければ治療に利用できるであろう。
たとえば前記のような病的状態でＴＮＦ（αまたはβ）とＦＡＳ受容体リガンドに対する細胞の応答を調節する方法を提供することが必要であると長らく考えられてきたが、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドが過剰に発現されたばあいは、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドが誘発する細胞致死作用を阻害することが望ましく、一方他の状態、たとえば創傷を治すばあいＴＮＦ作用を高めることが望ましく、または腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞におけるＦＡＳ受容体のばあい、ＦＡＳ受容体仲介作用を高めることが望ましい。
本発明者らは、いくつもの方法を作製して（たとえばヨーロッパ特許出願、ＥＰ１８６８３３、ＥＰ３０８３７８、ＥＰ３９８３２７およびＥＰ４１２４８６参照）、ＴＮＦがその受容体に結合するのを抗ＴＮＦ抗体を用いて阻害することによって、または可溶性ＴＮＦ受容体（とくに該受容体の可溶性細胞外ドメインである）を用いてＴＮＦが細胞表面に結合したＴＮＦ受容体に結合するのと競合させることによってＴＮＦの有害な作用を調節してきた。さらに、ＴＮＦが細胞作用を誘発するにはＴＮＦがその受容体に結合することが必要であるということにもとづいて、本発明者らは、ＴＮＦ受容体の活性を調節することによって、ＴＮＦの作用を調節する方法（たとえばＥＰＯ  ５６８９２５参照）を作製してきた。概略を述べると、ＥＰＯ  ５６８９２５は、ＴＮＦ受容体におけるシグナルの伝達および／または遮断（cleavage）を調節して、ペプチドまたは他の分子を、受容体自体または受容体と相互に作用するエフェクタータンパク質と相互に作用させる方法、すなわちＴＮＦ受容体の正常な機能を調節する方法に関する。ＥＰＯ  ５６８９２５には、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン、トランスメンブランドメインおよび細胞内ドメイン中に変異部分を有するｐ５５ＴＮＦ受容体の各種変異体の構築と特徴解析が記載されている。このように、ｐ５５ＴＮＦ受容体の前記ドメイン内の領域は、受容体が機能しすなわちリガンド（ＴＮＦ）を捕捉し、ついでシグナルが伝達され細胞内シグナリングが行なわれて最終的に細胞に観察されるＴＮＦ作用をもたらすのに不可欠であると確認された。さらにＴＮＦ受容体の前記ドメイン内の各種領域に結合でき、かつＴＮＦ受容体の活性のコントロールもしくは調節に関与しているタンパク質、ペプチドまたは他の因子を分離し同定するいくつかの方法も説明する。かようなタンパク質とペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離しクローン化する方法；これらのタンパク質とペプチドを産生するのに用いる発現ベクターの構築方法；ならびにＴＮＦ受容体またはＴＮＦ受容体の各種領域に結合する前記タンパク質およびペプチドと相互に作用する抗体もしくはその断片の製造法はいくつかＥＰＯ  ５６８９２５にも記載されている。しかしＥＰＯ  ５６８９２５には、ＴＮＦ受容体（たとえばｐ５５ＴＮＦ受容体）の細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドや、ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合するかようなタンパク質またはペプチドを単離し同定する酵母ツー・ハイブリッド法（yeast two-hybrid approach）について全く記載されていない。同様に、そののち、ＦＡＳ受容体の細胞内ドメインと結合できるタンパク質またはペプチドについて全く開示されていない。
したがって、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用を抑制したいばあいは細胞表面におけるＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の量または活性を減らすことが望ましく、一方ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用を高めたいばあいはＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の量または活性を増大することが望ましい。この目的のため、本発明者らは最近、ｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体の両者のプロモーターの配列を決定し分析し、各種の転写調節因子に特異的ないつくかの主要配列のモチーフを発見した。それゆえこれらＴＮＦ受容体の発現はそれらのプロモーターレベルで制御することができる。すなわちプロモーターにより転写を抑制して受容体の数を減らし、またプロモーターにより転写を促進して受容体の数を増大することができる（ＩＬ１０４３５５とＩＬ１０９６３３およびこれらに対応する未公開のＥＰおよびＰＣＴの出願参照）。ＦＡＳ受容体遺伝子のプロモーターのレベルでのＦＡＳ受容体の制御について対応する研究結果はいまや報告されねばならない。
さらに、つぎのことは述べておかねばならない。すなわち、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体および構造が類似している受容体のＦＡＳ受容体が、リンパ球が産生するリガンドすなわちそれ自体の消滅をもたらす破壊的活性体（destructive activities）によって刺激されると細胞内でトリガーとなることは公知であるとはいえ、このトリガリングの機序はまたほとんど判っていない。突然変異の研究結果は、ＦＡＳ受容体とｐ５５ＴＮＦ受容体（ｐ５５受容体）では、細胞毒性のシグナリングはそれらの細胞内ドメイン内の別個の領域で行なわれることを示している（ブラッケブッシ（Brakebusch）ら（１９９２年）；タータグリア（Tartaglia）ら（１９９３年）；イトウ（Itoh）およびナガタ（Nagata）（１９９３年））。これらの領域（「死滅ドメイン」）には配列類似性がある。ＦＡＳ受容体とｐ５５受容体の両者の「死滅ドメイン」は自己会合する（self associate）傾向がある。この自己会合により、シグナリングを開始するのに必要であり（ソング（Song）ら（１９９４年）；ワラック（Wallach）ら（１９９４年）；ボルディン（Boldin）ら（１９９５年）のみならず以下に説明する）かつ高レベルの受容体発現で結果としてリガンド非依存性シグナリングをトリガリングできる（ボルディン（Boldin）ら（１９９５年）を以下に述べる）該受容体の凝集が促進されることは明らかである。
したがって、本発明より以前に、ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーに属するリガンドの作用、たとえば細胞内シグナリング過程の仲介による、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの細胞に対する作用を調節することができるタンパク質は提供されていない。なお前記シグナリングはおそらく大部分が、ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの受容体に属する受容体の細胞内ドメイン（ＩＣ）たとえばＴＮＦ受容体の細胞内ドメインすなわちｐ５５ＴＮＦ受容体とｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（それぞれｐ５５ＩＣとＰ７５ＩＣ）およびＦＡＳ−ＩＣによって支配されている。
したがって本発明の１つの目的は、ＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合可能で、かつＴＮＦがその受容体に結合することまたはＦＡＳリガンドがその受容体に結合することによって開始される細胞内シグナリング過程に関与していると現在考えられているタンパク質を提供することである。
本発明の他の目的は、これらの細胞内ドメイン結合タンパク質（ＩＣ結合タンパク質）が正のシグナルエフェクター（すなわちシグナリングを誘発する）であるばあい、所望時にシグナリング過程を抑制するため、またはこれらＩＣ結合タンパク質が負のシグナルエフェクター（すなわちシグナリングを抑制する）であるばあい、所望時にシグナリング過程を促進するために用いることができる、これら細胞内ドメイン結合タンパク質に対するアンタゴニスト（たとえば抗体）を提供することである。
本発明のさらなる他の目的は、前記シグナリング過程にさらに下流で関与していると思われる別のタンパク質もしくは因子を単離し特徴解析を行なうためにこれらのＩＣ結合タンパク質を用いること、および／またはシグナリング過程のさらに上流でこれらのＩＣ結合タンパク質が結合する他の受容体（たとえば他のＴＮＦ受容体または類縁受容体）（したがってこれら受容体の機能にはＩＣ結合タンパク質が関与している）を単離し同定するのにこれらＩＣ結合タンパク質を用いることである。
さらに、本発明の目的は、前記ＩＣ結合タンパク質に対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を調製するための抗原として前記ＩＣ結合タンパク質を使用することである。一方この抗体は、異なる起源、たとえば細胞抽出物または形質転換された細胞系由来の新しいＩＣ結合タンパク質を精製するのに使用できる。
さらにこれら抗体は診断に用いることができる。たとえばＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属する受容体によって仲介される細胞作用が異常に機能することに関連する障害を確認するのに使用できる。
本発明のさらなる他の目的は、ＴＮＦまたはＦＡＳリガンドが誘発する症状の治療または予防を行なうのに用いる、前記ＩＣ結合タンパク質を含んでなる医薬組成物およびＩＣ結合タンパク質のアンタゴニストを含んでなる組成物を提供することであり、これらの組成物はたとえば、組成物に含有されているＩＣ結合タンパク質またはそのアンタゴニストの前記性質によって、ＴＮＦまたはＦＡＳリガンドの作用を高めるためまたはＴＮＦまたはＦＡＳリガンドの作用を阻害するために使用できる。
さらに本発明の他の目的は、可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体、オリゴマーＦＡＳ受容体またはＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体の混合物であるオリゴマーを使用して、内因的に生成するかまたは外因的に投与されるＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドを除去するかまたはこれらに拮抗させる（弱める）他の方法を開示することである。この点については、この方面での試みの１つが、ＴＮＦの作用に拮抗することができることが報告されたＴＢＰ−Ｉと呼ばれるＴＮＦ結合タンパク質を単離することと組換え法で製造することであったことは述べておかねばならない。この拮抗作用は、ＴＮＦの細胞毒性活性の低下を測定することおよびＴＮＦがその受容体に結合するのを阻害する程度を測定することによって測定された（ＥＰ３０３７８）。ＴＢＰ−Ｉは、１ｍｌ当り数ナノグラムの濃度で細胞をＴＮＦの毒性から保護し、かつＴＮＦ−αとＴＮＦ−βとを同時に用いると、これら両サイトカインが細胞に結合するのを阻害することが報告された。ＴＢＰ−Ｉが機能する機構をさらに試験した結果、ＴＢＰ−Ｉは標的細胞と相互に作用しないが、ＴＮＦに特異的に結合し、つまりＴＮＦに対してＴＮＦ受容体と競合することによってＴＮＦの機能を遮断することが明らかになった。
その結果、異なる精製法によって、２種の活性成分が存在することが見出された。すなわち第一のＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−IIと呼んだ第二のＴＮＦ結合タンパク質（ＥＰ３９８３２７に最初に記載された）である。これら両タンパク質は、ＴＮＦの生体外での細胞致死作用に対して防御を行ない、ＴＮＦ−αに対しＴＮＦ−βより一層有効に結合する。ＳＤＳ  ＰＡＧＥの分析結果によると、これら２種のタンパク質ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−IIは分子の大きさが非常に類似しているようであるが、これら２種のタンパク質は、免疫学的交差反応がないこと、Ｎ末端のアミノ酸配列が異なりかつアミノ酸の組成が異なることによって、互いに明確に区別することができる。
しかし前記の先に見出された可溶性のＴＮＦ結合タンパク質は単量体であり、天然リガンドのＴＮＦホモトリマーの１つのモノマーにしか結合できないので、そのＴＮＦ結合タンパク質が結合していない２つの活性モノマーを依然としてもっている該ＴＮＦによってＴＮＦ活性が保持される（すなわち不完全な中和である）。さらに、ホモトリマーであり細胞表面に結合している分子であることがわかっているＦＡＳ受容体リガンドに結合できる可溶性ＦＡＳ受容体は今まで全く開示されていない。
ｐ５５−ＩＣのいわゆる「死滅ドメイン」（タータグリア（１９９３年））はすでに開示されていたが、本発明によれば、ｐ５５−ＩＣとその「死滅ドメイン」が自己会合し、この自己会合が細胞の細胞毒性（cytotoxis）を誘発するシグナリングに主に関与していることは記載されていなかった。さらにこの刊行物には、可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体または可溶性のオリゴマーＦＡＳ受容体またはそのオリゴマーの混合物を製造する可能性については述べられておらず、またｐ５５−ＩＣもしくはその部分によって誘発される他のＴＮＦ関連の作用、たとえばＩＬ−８遺伝子発現の誘発すなわち本発明がすべて開示されていない。同様に、本発明出願日の以後に公開された他の刊行物は、ｐ５５ＩＣの凝集（すなわち自己会合）性能を開示したが、前記のように可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体またはＦａｓ受容体を製造するためｐ５５−ＩＣを使用すること、または本発明のｐ５５−ＩＣまたはその部分によりリガンドに依存しない方式で誘発される他のＴＮＦ関連作用に関するものではなかった。
発明の要約
本発明にしたがって、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体それぞれの細胞内ドメインと結合できる新規なタンパク質：ｐ５５ＩＣ結合タンパク質、ｐ７５ＩＣ結合タンパク質およびＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質を発見した。これらのｐ５５ＩＣ結合タンパク質、ｐ７５ＩＣ結合タンパク質およびＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質は、ＴＮＦがｐ５５ＴＮＦ受容体および／またはｐ７５ＴＮＦ受容体に結合したのちに、またはＦＡＳ受容体リガンドが細胞表面に結合したのちに通常起こる細胞内シグナリング過程を仲介もしくは調節することによって、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの細胞に対する作用のメディエーターまたはモジュレーターとして作用することができる。さらに、予想外の驚くべきことであるが、ｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣが自己会合することができ、かつｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣの断片も同様にｐ５５ＩＣに結合でき、とくにこれら受容体のＩＣ内のいわゆる死滅ドメイン（ＤＤ）、すなわちｐ５５ＤＤとＦＡＳ−ＤＤがｐ５５−ＩＣに結合できることが発見されたのである。したがって、ｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣおよびこれらの断片もｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣに結合できるタンパク質であるので、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの細胞に対する作用のモジュレーターである。
さらに、本発明の新規なタンパク質の１つ（本明細書では５５．１１タンパク質と命名した）の、ｐ５５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに対する結合性を一層充分説明した（実施例１参照）。
さらに、別の態様で、本発明は、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）、ｐ５５−ＩＣ中に含まれている領域のいわゆるｐ５５−ＩＣ「死滅ドメイン」と、Ｆａｓ／ＡＰＯＩ受容体の細胞内ドメイン（Ｆａｓ−ＩＣ）、およびＦａｓ−ＩＣ中に含まれている領域のいわゆるＦａｓ−ＩＣ「死滅ドメイン」は自己会合することができるという知見にもとづいた発明である。したがって、一方の末端にＴＮＦ受容体の少なくとも２つの細胞外ドメインを含有しかつ他方の末端に少なくとも２つの前記自己会合性細胞内ドメインもしくはその部分を含有する融合生成物である可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体を、標準の組換えＤＮＡ法で構築することができる。なお前記自己会合性細胞内ドメインまたはその部分は自己会合して、ともに連結した少なくとも２つの前記融合生成物を有するオリゴマーを提供する。したがってそのような可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体は、天然に存在するＴＮＦホモトリマーの２つのモノマーと結合することができるのでＴＮＦの活性を有効に中和する。ＴＮＦ活性を中和することは、ＴＮＦが内因的に過剰産生されたりまたは外因的に高い投与量で投与されて望ましくない副作用をもたらす前記のすべての状態に望ましいことである。さらに、本発明の可溶性オリゴマーの受容体によってＴＮＦが有効に捕捉されることは、ＴＮＦがその有益な作用のために投与される状態のばあい、たとえば腫瘍を治療するばあいに、外因的に加えられたＴＮＦを捕捉して望ましい緩徐な放出を行なわせるのに役立つ。同様に、標準的な組換えＤＮＡ法によって、その一方の末端にＦＡＳ受容体の少なくとも２つの細胞外ドメインを含有し、かつその他方の末端に前記自己会合性細胞内ドメインもしくはその部分を少なくとも２つ含有する融合生成物であるオリゴマーのＦＡＳ受容体を構築することもできる。なお前記自己会合性細胞内ドメインもしくはその部分は自己会合してともに連結した少なくとも２つの前記融合生成物を有するオリゴマーを提供する。したがってかようなオリゴマーＦＡＳ受容体は、天然に存在するＦＡＳ受容体リガンドのホモトリマーの２つのモノマーに結合することができるので、ＦＡＳ受容体リガンドの活性を有効に中和する。ＦＡＳ受容体リガンドの量が過剰であるために望ましくない副作用が起こる前記のすべての状態のばあい、ＦＡＳ受容体リガンドの活性を中和することが望ましい。類似の方式で、かつ起りうるＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンド間の会合により誘発される細胞に対する作用と、したがってＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドがそれらの受容体に結合する細胞表面で場所的に起りうる会合を示す最近の報告からみて、ＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの両者に対して特異性を有する混合オリゴマー受容体を標準的な組換えＤＮＡ法で構築することができる。かような混合オリゴマーは、その一方の末端に、少なくとも１つのＴＮＦ受容体の細胞外ドメインと少なくとも１つのＦＡＳ受容体の細胞外ドメインを含有し、かつその他方の末端に少なくとも２つの前記自己会合性細胞内ドメインもしくはその部分を含有する前記融合生成物の混合物である。そしてその自己会合性細胞内ドメインもしくはその部分は自己会合して、ともに連結した少なくとも２つの前記融合生成物を含有する混合オリゴマーを提供する。したがって、このような混合オリゴマーは、少なくとも１つのＴＮＦのモノマーと少なくとも１つのＦＡＳ受容体リガンドのモノマーを同時に捕捉できるので、これら２種のサイトカインの量が過剰であるために望ましくない細胞作用を起こす前記のような状態のばあいに、細胞表面でＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの活性を減らすかまたは有効に中和することができる。前記のように、ＦＡＳ受容体リガンドは通常、細胞表面で結合しまた最近の報告は細胞表面結合型のＴＮＦも報告している。したがって、これらの混合ＴＮＦ／ＦＡＳ受容体オリゴマーは、細胞表面でＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの活性を中和するのにとくに有用である。
したがって、本発明は、腫瘍壊死因子／神経成長因子（ＴＮＦ／ＮＧＦ）スーパーファミリー受容体に属する１または複数の受容体の１または複数の細胞内ドメインに結合しうるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。
詳しく述べると本発明は、
(a)天然の（native）ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質のコーディング領域由来のｃＤＮＡ配列、
(b)適度なストリンジェント条件下で(a)のＤＮＡとハイブリダイゼーションでき、かつ生物学的に活性なＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および
(c)遺伝コードの結果として(a)と(b)で定義されたＤＮＡ配列と縮重し（degenerate）、かつ生物学的に活性なＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
からなる群から選択されるＤＮＡ配列を提供するものである。
また本発明は、
(a)天然のＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質のコーディング領域由来のｃＤＮＡ配列、
(b)適度なストリンジェント条件下で(a)のｃＤＮＡとハイブリダイゼーションでき、かつ生物学的に活性なＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および
(c)遺伝コードの結果として(a)と(b)で定義されたＤＮＡ配列と縮重し、かつ生物学的に活性なＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、からなる群から選択されるＤＮＡ配列を提供するものである。
本発明の実施態様において、これらＤＮＡ配列は、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質をコードし、たとえば本明細書で命名されたタンパク質：５５．１、５５．３、５５．１１、７５．３、７５．１６、Ｆ２、Ｆ９およびＤＤ１１をコードするＤＮＡ配列である。
また本発明は、本発明の前記配列のいずれかによってコードされるタンパク質またはその類似体もしくは誘導体を提供するものであり、前記タンパク質、類似体および誘導体は、１または複数のＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の１または複数の細胞内ドメインに結合しうる。本発明のこの態様の実施態様には、本明細書で命名された諸タンパク質：５５．１、５５．３、５５．１１、７５．３、７５．１６、Ｆ２、Ｆ９およびＤＤ１１；その類似体とその誘導体が含まれる。
また本発明は、本発明の前記ＤＮＡ配列を含有し本発明の前記タンパク質をコードするベクターであって、適切な真核性もしくは原核性の宿主細胞において発現させることができるベクター；前記ベクターを含む形質転換された真核性もしくは原核性の宿主細胞；ならびに本発明のタンパク質、類似体または誘導体の発現に適した条件下で前記形質転換宿主細胞を増殖させ、前記タンパク質をうるため必要に応じて前記タンパク質の翻訳後の修飾を行ない、ついで前記発現されたタンパク質、類似体もしくは誘導体を、前記形質転換細胞の培地からまたは前記形質転換細胞の細胞抽出物から抽出することによって本発明のタンパク質類似体または誘導体を製造する方法を提供するものである。
別の態様で、本発明は、本発明のタンパク質、その類似体および誘導体に特異的な抗体またはその活性な誘導体もしくは断片を提供するものである。
本発明の他の態様で、本発明による前記ＤＮＡ配列またはこれら配列がコードするタンパク質の各種の用途が提供され、これらの用途としてはとりわけつぎのものがある。
(i)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を担う細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用の調節方法であって、本発明によるタンパク質、類似体および誘導体からなる群から選択される１または複数のタンパク質、類似体または誘導体で前記細胞を治療することからなり、そして前記タンパク質がｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ、またはその類似体もしくは誘導体であり、すべての前記タンパク質が、前記ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合してＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の活性を調節し、細胞の前記治療が、前記１または複数のタンパク質、類似体または誘導体を細胞内投与に適した形態で前記細胞中に導入すること、または前記１または複数のタンパク質、類似体または誘導体をコードするＤＮＡ配列を適切な発現ベクターの形態で前記細胞中に導入することからなる調節方法；
(ii)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を担う細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用の調節方法であって、本発明の抗体またはその活性な誘導体もしくは断片で前記細胞を治療することからなる調節方法；
(iii)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を担う細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用の調節方法であって、本発明の配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードする、またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で前記細胞を治療することからなり、前記オリゴヌクレオチド配列が、ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質の少なくとも１つの発現を遮断することができる調節方法；
(iv)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を担う細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用の調節方法であって；
(a)特異的な細胞表面受容体に結合しうるウィルス表面タンパク質をコードする配列、ならびに本発明の配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列およびｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤの配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列から選択される配列を担う組換え動物ウィルスベクターを構築し、前記オリゴヌクレオチド配列が、前記細胞に前記ウィルスによって導入されると、ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体細胞内ドメイン結合タンパク質の少なくとも１つの発現を遮断することができ；ついで
(b)前記(a)のベクターを前記細胞に感染させる；
ことからなる調節方法；
(v)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を担う細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用の調節方法であって；本発明のタンパク質、類似体または誘導体をコードするｍＲＮＡ配列、およびｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤをコードするｍＲＮＡ配列から選択される配列に対して特異的な配列を有する、リボザイムをコードする適切なベクターで前記細胞を治療することからなり、前記リボザイムの配列が前記ｍＲＮＡの配列と相互に作用することができ、かつ前記ｍＲＮＡ配列を開裂することができ、その結果本発明のタンパク質、類似体または誘導体の発現またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤの発現が阻害される調節方法；
(vi)腫瘍細胞またはＨＩＶ感染細胞または他の病的な細胞を治療する方法であって；
(a)腫瘍細胞表面受容体もしくはＨＩＶ感染細胞表面受容体に結合しうるか、または他の病的な細胞の他の細胞表面受容体に結合しうるウィルス表面タンパク質をコードする配列、ならびに本発明のタンパク質、類似体もしくは誘導体をコードする本発明の配列およびｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤまたはその生物学的に活性な類似体もしくは誘導体をコードする配列から選択される配列を担う組換え動物ウィルスベクターを構築し、本発明の前記タンパク質、その類似体もしくは誘導体、ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤ、その類似体もしくは誘導体は、前記腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞または他の病的な細胞内で発現されると前記細胞を死滅させることができ；
(b)前記(a)のベクターを、前記腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞または他の被感染細胞に感染させる；
ことからなる方法；
(vii)本発明による細胞内ドメイン結合タンパク質と結合しうるタンパク質、因子または受容体を単離し同定する方法であって；本発明の前記タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー基材に結合させ、その結合されたタンパク質を細胞抽出物と接触させ、つぎに前記結合されたタンパク質についた細胞抽出物由来のタンパク質、因子または受容体を溶離し、単離し、分析するアフィニティークロマトグラフィー法を適用することからなる方法；
(viii)本発明の細胞内ドメイン結合タンパク質と結合しうるタンパク質を単離し同定する方法であって；前記細胞内ドメイン結合タンパク質をコードする配列を第一のハイブリッドベクターに担わせ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列を第二のハイブリッドベクターに担わせ、ついでこれらベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換し、陽性の形質転換細胞を単離し、続いて前記第二のハイブリッドベクターを抽出して前記細胞内ドメイン結合タンパク質と結合するタンパク質をコードする配列をえる、酵母ツー・ハイブリッド法を適用することからなる方法；ならびに
(ix)ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインと結合しうるタンパク質を単離し同定する方法であって；本発明の配列またはその部分をプローブとして用いて、これに少なくとも部分的相同性を有する、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列を捕捉し、前記捕捉された配列をついでＰＣＲ法で増幅しクローニングして本発明の前記配列に対して少なくとも部分的相同性を有するタンパク質をコードするクローンをうる、非ストリンジェント・サザン・ハイブリダイゼーションとこれに続くＰＣＲクローニング法を適用することからなる方法
である。
また本発明は、下記のもののいずれか１つを有効成分として含有してなる、細胞へのＴＮＦまたはＦＡＳリガンド作用を調節する医薬組成物を提供するものである。すなわち(i)本発明のタンパク質、またはタンパク質ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ、その生物学的に活性な断片、類似体、誘導体もしくはそれらの混合物；(ii)ＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体を担う細胞または腫瘍細胞の特異的受容体と結合できるウィルス表面タンパク質をコードする組換え動物ウィルスベクター、および本発明のタンパク質、類似体もしくは誘導体をコードするかまたはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤをコードする配列；(iii)前記(ii)に示すようなウィルス表面タンパク質をコードする組換え動物ウィルスベクターおよびｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列；ならびに(iv)本発明のタンパク質、類似体もしくは誘導体をコードするｍＲＮＡ配列、またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤをコードするｍＲＮＡ配列と相互に作用することができるリボザイムの配列をコードするベクターである。
本発明の前記態様の具体的な実施態様はｐ５５−ＩＣまたはそれをコードするＤＮＡの使用である。この実施態様は、ｐ５５−ＩＣが、リガンド（ＴＮＦ）とは独立した方式で、細胞内で他のＴＮＦ関連作用（TNF-associated effects）を誘発するという発見にもとづいている。したがって、細胞または組織内でのＴＮＦ関連作用の誘導方法であって前記細胞を１または複数のタンパク質、その類似体もしくは誘導体で治療することからなる方法が提供される。そして前記１または複数のタンパク質は、自己会合し、リガンド（ＴＮＦ）とは独立して、細胞内で前記ＴＮＦ作用を誘導することができる、本質的にすべてがｐ５５ＴＮＦ受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の本質的にすべてまたはその部分であるタンパク質から選択され、細胞の前記治療が、前記１または複数のタンパク質、類似体もしくは誘導体を、それを細胞内に導入するのに適した形態で前記細胞内に導入すること、または前記１または複数のタンパク質、類似体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を、前記配列をもつ適切なベクターの形態で前記細胞内に導入することからなり、前記ベクターは、前記配列が前記細胞内で発現される状態で、前記配列を前記細胞内に挿入することができる。
本発明の前記方法の実施態様としては以下の方法がある。すなわち、
(i)細胞の前記治療が、組換え動物ウィルスベクターで前記細胞をトランスフェクトすることにより行なわれ、
(a)治療すべき前記細胞の表面上の特異的な細胞表面受容体と結合できるウィルス表面タンパク質（リガンド）をコードする配列と、前記細胞内で発現されると、自己会合し前記１または複数のＴＮＦ関連作用を誘導することができる、ｐ５５−ＩＣ、その部分、前記すべてのものの類似体と誘導体であるタンパク質をコードする第二の配列を担う組換え動物ウィルスベクターを構築する工程；および
(b)前記(a)のベクターを前記細胞に感染させる工程；
からなる方法；
(ii)前記細胞内で誘導される前記ＴＮＦ作用がＩＬ−８遺伝子発現の誘導であり、前記ベクターが前記ｐ５５−ＩＣの本質的にすべて、その部分、および前記のものすべての類似体および誘導体をコードする配列を担い、前記タンパク質が細胞内で発現されると自己会合し、前記ＩＬ−８遺伝子の発現を誘導するシグナリングを行なうことができる方法；
(iii)腫瘍細胞もしくはウィルス感染細胞を治療するまたは顆粒球の抗菌作用を増大する方法であって；前記ウィルスベクターが、前記腫瘍細胞、ウィルス感染細胞または顆粒球の表面の特異的な細胞表面受容体に結合しうるウィルスリガンドをコードする配列、ならびに前記ｐ５５−ＩＣ、その部分、その類似体および誘導体をコードする配列を担い、前記タンパク質が前記腫瘍細胞、ウィルス感染細胞もしくは顆粒球細胞内で発現されると、これら細胞の死をもたらすＴＮＦ関連作用を誘発する方法；
(iv)腫瘍細胞を治療する方法であって；前記ｐ５５−ＩＣ、その部分、その類似体または誘導体が、腫瘍細胞内で発現されると、顆粒球および他のリンパ球を腫瘍細胞に引きつけて腫瘍細胞の死滅をもたらすＩＬ−８の化学走化活性によって前記腫瘍細胞の死滅を導くＩＬ−８の発現を誘導する方法；
がある。
本発明のこの実施態様で、ＴＮＦ関連作用を細胞内で誘導することによって細胞を治療するのに用いる、ｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）、その部分、先に述べたものすべての類似体と誘導体が提供される。そしてその実施態様はつぎのとおりである。すなわち
(i)細胞内にＩＬ−８遺伝子の発現を誘導することによって細胞を治療するのに用いる、ｐ５５−ＩＣ、部分、類似体および誘導体；
(ii)細胞内にＩＬ−８遺伝子の発現を誘発して腫瘍細胞の死滅をもたらすことにより腫瘍細胞を治療するのに用いる、ｐ５５−ＩＣ、部分、類似体および誘導体；である。
さらに本発明のこの態様で、ｐ５５−ＩＣ、その一部分、前述のものすべての類似体および誘導体を有効成分として含有し、医薬として許容される担体を含有する、細胞内でＴＮＦ関連作用を誘導することによって細胞を治療する医薬組成物を提供するものである。その実施態様はつぎのとおりである。すなわち
(i)有効成分として、ｐ５５−ＩＣ、その部分、前述のものすべての類似体と誘導体および治療される細胞上の細胞表面タンパク質に結合できるタンパク質をコードする組換え動物ウィルスベクターを含んでなる、細胞内でＴＮＦ関連作用を発現することによって細胞を治療するのに用いる医薬組成物；
(ii)投与するとＩＬ−８の発現を誘導し腫瘍細胞を殺す、腫瘍細胞を治療するのに用いる医薬組成物；である。
さらに他の態様として、本発明は、少なくとも２つの自己会合した融合タンパク質を含んでなる可溶性のオリゴマー腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ受容体）を提供するものである。そして各融合タンパク質は、(a)その一方の末端に、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン、その類似体もしくは誘導体から選択されるＴＮＦ結合ドメインを有し、前記細胞外ドメイン、その類似体または誘導体は有害な自己会合を行なうことができず、かつＴＮＦと結合することができ、ならびに(b)その他方の末端に、(i)天然のｐ５５ＴＮＦ受容体分子（ｐ５５受容体）のアミノ酸残基約２０６からアミノ酸残基約４２６まで延びるｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の本質的にすべて；(ii)天然のｐ５５受容体のアミノ酸残基約３２８位からアミノ酸残基約４２６位まで延びるｐ５５−ＩＣの死滅ドメイン；(iii)Ｆａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメイン（Ｆａｓ−ＩＣ）の本質的にすべて；(iv)Ｆａｓ−ＩＣの死滅ドメイン；および(v)自己会合することができる(i)〜(iv)のいずれか１つの類似体、画分または誘導体から選択される自己会合性ドメインを有し；前記少なくとも２つの自己会合したタンパク質は、少なくとも２つのＴＮＦモノマーに結合できる前記末端(a)を有し、前記末端(b)でのみ自己会合し、また各末端(a)は１つのＴＮＦモノマーと結合することができる、ＴＮＦ受容体、および前記可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体の塩および機能誘導体である。
本発明のこの態様の実施態様には、前記定義の末端(a)と末端(b)の組合せがすべて含まれ、たとえば可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体は、細胞外ドメインとしてｐ５５受容体細胞外ドメインを含有し、かつ自己会合性細胞内ドメインとしてｐ５５−ＩＣを含有している。
さらに本発明は、本発明の可溶性オリゴマーＴＮＦ受容体の製造方法を提供するものである。
すなわち
(a)前記融合タンパク質のいずれか１つをコードする発現ベクターを構築し、該融合タンパク質の前記各末端のＤＮＡ配列が、ＴＮＦ受容体の前記細胞外領域のほとんどすべて、その類似体もしくは誘導体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列から、および前記ｐ５５−ＩＣのほとんどすべて、ｐ５５−ＩＣの死滅ドメイン、Ｆａｓ−ＩＣ、Ｆａｓ−ＩＣの死滅ドメイン、前記のものすべての類似体もしくは誘導体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列からえられ、前記末端が連結されて融合タンパク質の配列が形成され、ついで前記融合タンパク質の配列が、転写および翻訳の調節配列のコントロール下で前記ベクター中に挿入され；
(b)(a)のベクターを、前記融合タンパク質が発現される適切な宿主細胞中に導入し；ついで
(c)前記宿主細胞中に発現される融合タンパク質を精製し、前記融合タンパク質を、精製過程の前、該過程中または該過程に続いて自己会合させて可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体をうることからなる方法である。
さらに、本発明の前記方法に有用な前記融合タンパク質をコードするベクター；該ベクターを含有する宿主細胞；ならびに有効成分として、本発明の可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体、その塩もしくは機能誘導体および前記のもののいずれかの混合物を含有し、かつ薬学的に許容しうる担体を含有する医薬組成物が提供される。同様に、本発明の可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体、その塩、機能誘導体および前記のもののいずれかの混合物は、とくに、過剰なＴＮＦが内因的に形成されるか、もしくは外因的に投与される状態を治療するばあい、哺乳類内でＴＮＦの有害作用を弱めるのに使用するか、あるいは、ＴＮＦを外因的に投与して用いるばあい、哺乳類内でＴＮＦの有益な作用を長期間維持するのに使用される。
本発明の前記態様に関して述べる構想にそって、Ｆａｓリガンドの有害作用を弱めるのに有用な可溶性オリゴマーのＦａｓ／ＡＰＯ１受容体（Ｆａｓ受容体）を構築することが可能であることが発見されたのである。したがって別の態様で本発明は、少なくとも２つの自己会合した融合タンパク質を含有する可溶性オリゴマーのＦａｓ／ＡＰＯ１受容体（Ｆａｓ受容体）を提供するものであり、各融合タンパク質は、(a)その一方の末端に、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメイン、自己会合できず、Ｆａｓリガンドに結合できる該Ｆａｓ受容体細胞外ドメインの類似体もしくは誘導体を有し、そして(b)その他方の末端に、(i)天然のｐ５５ＴＮＦ受容体分子（ｐ５５受容体）の約２０６位のアミノ酸残基から約４２６位のアミノ酸残基まで延びる、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐｐ−ＩＣ）の本質的にすべて；(ii)天然のｐ５５受容体の約３２８位のアミノ酸残基から約４２６位のアミノ酸残基まで延びるｐ５５−ＩＣの死滅ドメイン；(iii)Ｆａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメイン（Ｆａｓ−ＩＣ）の本質的にすべて；(iv)Ｆａｓ−ＩＣの死滅ドメイン；および(v)自己会合することができる(i)〜(iv)のいずれか１つの類似体もしくは誘導体から選択される自己会合性ドメインを有し、前記少なくとも２つの自己会合するタンパク質は、少なくとも２つのＦａｓリガンドモノマーに結合できる前記末端(a)を有する前記末端(b)でしか自己会合せず、各末端(a)は、１つのＦａｓリガンドモノマーおよび前記可溶性オリゴマーのＦａｓ受容体の塩および機能誘導体に結合できる。
本発明のこの態様で、以下の工程からなる可溶性オリゴマーのＦａｓ受容体の製造方法が提供される。すなわち
(a)前記融合タンパク質のいずれか１つをコードする発現ベクターを構築し、該融合タンパク質の前記各末端のＤＮＡ配列が、Ｆａｓ受容体の前記細胞外ドメインの本質的にすべて、その類似体もしくは誘導体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列から、および前記ｐ５５−ＩＣの本質的にすべて、ｐ５５−ＩＣの死滅ドメイン、Ｆａｓ−ＩＣ、Ｆａｓ−ＩＣの死滅ドメイン、前記のものすべての類似体もしくは誘導体をコードするクローン化ＤＮＡ配列からえられ、前記末端が連結されて融合タンパク質の配列が形成され、そして前記融合タンパク質の配列が、転写および翻訳の調節配列のコントロール下で前記ベクターに挿入される工程；
(b)(a)のベクターと、前記融合タンパク質が発現される適切な宿主細胞中に導入する工程；および
(c)宿主細胞内に発現された融合タンパク質を精製し、その精製工程の前、該工程中または該工程に続いて前記融合タンパク質を自己会合させて可溶性オリゴマーＦａｓ受容体をうる工程；
からなる方法である。
さらに、本発明は、前記方法に有用な可溶性オリゴマーのＦａｓ受容体をコードする融合タンパク質配列を含有する発現ベクター；該ベクターを含有する宿主細胞；ならびに有効成分として、可溶性のオリゴマーＦａｓ受容体、その塩もしくは機能誘導体または前記のもののいずれかの混合物を含有し、かつ薬学的に許容しうる担体も含有する医薬組成物を提供するものである。同様に、可溶性のオリゴマーＦａｓ受容体、その塩もしくは機能誘導体または前記のもののいずれかの混合物が提供され、とくに、過剰のＦａｓリガンドが内因的に形成されるかまたは外因的に投与される状態を治療する際に、哺乳類内でのＦａｓリガンドの有害作用を弱めるのに用いられる。
オリゴマーＴＮＦ受容体とオリゴマーＦＡＳ受容体について先に述べたのと同じ方法で、ＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの両者に対して結合特異性を有する混合オリゴマーを製造することができる。したがって本発明は、少なくとも２つの自己会合した融合タンパク質を含んでなる混合オリゴマーＴＮＦ受容体／ＦＡＳ受容体を提供するものであり、その融合タンパク質の一方は前記ＴＮＦ特異的融合タンパク質類のいずれか１つから選択され、他方の融合タンパク質は前記ＦＡＳ受容体リガンド特異的融合タンパク質のいずれか１つから選択され、少なくとも１つのＴＮＦ受容体細胞外ドメインと少なくとも１つのＦＡＳ受容体細胞外ドメインを有し、かつこれらの各細胞外ドメインに融合された細胞内ドメインもしくはその部分の間を自己会合させることによって該細胞外ドメインを結合させてなる混合オリゴマーが提供される。これらの混合オリゴマー受容体は、前記のように、オリゴマーＴＮＦ受容体とオリゴマーＦＡＳ受容体を製造し、つぎにこれらを混合し、ついでＦＡＳ受容体リガンドとＴＮＦの両者に対して結合特異性を有するオリゴマーを標準の方法で選択することによって製造される。該混合オリゴマー受容体を製造する他の方法は、前記のようにＴＮＦ特異的融合タンパク質（可溶性ＴＮＦ受容体）のいずれかをコードしかつＦＡＳ受容体リガンド特異的融合タンパク質（可溶性ＦＡＳ受容体）のいずれかをコードするベクターで適切な宿主細胞をコトランスフェクトし、発現された融合タンパク質を精製し、精製する前、精製中または精製に続いて自己会合させてオリゴマー受容体をえ、ついでＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの両者に結合できるオリゴマー受容体を標準的な方法で選択することによる方法である。
同様に、有効成分として、前記混合オリゴマー受容体、その塩もしくは機能誘導体または前記のもののいずれかの混合物を含有するとともに薬学的に許容しうる担体を含有する医薬組成物も提供される。さらに、前記混合オリゴマー受容体、その塩もしくは誘導体または前記のもののいずれかの混合物は、とくに、過剰のＴＮＦおよびＦＡＳ受容体リガンドが内因的に形成されるかまたは外因的に投与される状態を治療するばあい、哺乳類内でのＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの両者の有害作用を弱めるのに使用され；あるいはＴＮＦおよび／ＦＡＳ受容体リガンド（可溶型）を外因的に投与して用いるばあい、哺乳類内にＴＮＦおよび／またはＦＡＳ受容体リガンドの有益な作用を長期間保持する（緩徐に行なう放出）ために用いられる。
本発明の他の態様と実施態様は、本発明の下記詳細な説明で提供される。
以下の用語：「細胞に対するＴＮＦの作用の調節」および「細胞に対するＦＡＳリガンドの作用の調節」は本明細書で使用されるばあい、生体内の治療のみならず生体外の治療も含むと解することに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
図１ａ〜１ｃは、ｐ５５ＩＣ結合タンパク質とｐ７５ＩＣ結合タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの部分および予備ヌクレオチド配列（partial and preliminary nucleotide sequence）を図式的に示し、図１（ａ）はｐ５５ＩＣ結合タンパク質５５．１１をコードするクローン５５．１１の配列を示し；図１（ｂ）はｐ７５ＩＣ結合タンパク質７５．３をコードするクローン７５．３の部分および予備配列を示し；および図１（ｃ）はｐ７５ＩＣ結合タンパク質ｐ７５．１６をコードするクローン７５．１６の部分および予備配列を示し、これらのことはすべて実施例１に記載されている。そして図１（ｄ）は図１（ａ）のヌクレオチド配列から推定したタンパク質５５．１１の推定アミノ酸配列を示し、これも実施例１に記載されている。
図２は、実施例１に記載されているように試験されたいくつかの細胞系中に存在する５５．１１特異的ｍＲＮＡを示すノーザンブロットの複写図である。
図３Ａと図３Ｂは、５５．１１ｃＤＮＡがコードするタンパク質がｐ５５−ＩＣの部分を含有するＧＳＴ融合タンパク質に生体外で結合するのを示すオートラジオグラムの複写図であり、図３Ａには全長の５５．１１タンパク質（55.11 full）が各種のＧＳＴ融合タンパク質に結合するのを示し、そして図３Ｂには、ＦＬＡＧオクタペプチドに融合された５５．１１の部分が各種のＧＳＴ融合タンパク質に結合するのを示している。これらのことはすべて実施例１に記載されている。
図４は、実施例１に記載されているように、ヒト５５．１１の推定アミノ酸配列を、下等生物由来の関連タンパク質の配列と比較した結果を図式的に示す。
図５は、ｐ５５ＩＣの自己会合を示す抗ＭＢＰポリクローナル抗血清を用いて染色したウェスタンブロットの複写図であり、このウエスタンブロットは、相互に作用する最近産生されたキメラタンパク質ｐ５５ＩＣ−ＭＢＰとｐ５５ＩＣ−ＧＳＴ（レーン１〜４）またはキメラタンパク質ｐ５５ＩＣ−ＭＢＰとＧＳＴ単独間のコントロールの相互作用（レーン５〜８）を電気泳動させたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来のブロットであり、キメラタンパク質（およびコントロール）間の相互作用は実施例２に記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける前にグルタチオン−アガロースビーズ上で行なった。
図６は、全長のｐ５５ＩＣをコードする発現ベクターでトランスフェクトされたＨＴtal細胞中の全長ｐ５５ＩＣの細胞毒性作用（右パネル）および細胞とテトラサイクリンで処理してベクターの発現を遮断したときのこの細胞毒性作用の阻害（左パネル）を示す位相差顕微鏡トランスフェクトされたＨｅＬａの細胞内での細胞到死作用のリガンドに依存しないトリガリングを示す。すなわち
(i)図７の左端に、ＨｅＬａ細胞がトランスフェクトされたベクター中に挿入された、全長ｐ５５受容体、その細胞内ドメインおよび該細胞内ドメインの部分をコードする各種ＤＮＡ分子を図式的に示す。
(ii)左と中央の棒グラフは図７の左端に示す各タイプの受容体のＨｅＬａ細胞内でのＴＮＦ受容体の発現を示し、左の棒は受容体の量（ｎｇ／細胞試料）を示し、中央の棒グラフはトランスフェクトされた細胞に結合したヨウ素で標識したＴＮＦによって、発現された受容体の量を示す。
(iii)右の棒グラフは、各種の前記受容体を発現するＨｅＬａ細胞の生存能力を示す。
そして全棒グラフ中、白抜きの棒はテトラサイクリンの存在下でトランスフェクトされた細胞を示し、塗りつぶした棒はテトラサイクリンなしでトランスフェクトされた細胞を示す。これらはすべて本明細書の実施例２に記載されている。
図８は、全長のｐ５５受容体またはその細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中でのＩＬ−８遺伝子発現のリガンド非依存性誘発を示し、パネルＡには、ＴＮＦで処理したまたは処理しなかったＨｅＬａ細胞から抽出したＲＮＡのノーザン分析結果を示すノーザンブロットの複写図（「コントロール」および「ＴＮＦ」と記入した左側の２つのレーン）およびｐ５５受容体、ｐ５５−ＩＣまたはコントロールのタンパク質のルシフェラーゼをコードするベクターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析結果を示すノーザンブロットの複写図（それぞれ「ｐ５５−ＩＣ」、「ｐ５５受容体」および「Ｌｕｃ」と記入した残りのレーン）を示し、これらの細胞は、各々のばあい毎にテトラサイクリンの存在下（＋）または非存在下（−）でトランスフェクトされた（１トランスフェクション当り２つのレーン）。またパネルＢには、パネルＡに示したＨｅＬａ細胞の各試料中の１８Ｓ  ｒＲＮＡをメチレンブルーで染色した結果を示す。これらのことはすべて実施例２に記載されている。
図９（ＡとＢ）は、ｐ５５受容体もしくはその部分またはＦＡＳ−ＩＣでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内での細胞到死作用のリガンド非依存性トリガリングをグラフで示し、図９Ａはｐ５５受容体またはその部分についての試験結果を示し、そして図９ＢはＦＡＳ−ＩＣについての試験結果を示す。図９Ａと図９Ｂの両者の左側のパネルにはトランスフェクションに使用されたｐ５５受容体の部分またはＦＡＳ−ＩＣを図式的に示し、右側のパネルには実験結果をグラフで示す。これらのことはすべて実施例２に記載されている。
図１０は、Ｆ２と呼称されているｃＤＮＡクローンの部分および予備ヌクレオチド配列を図式的に示し、このヌクレオチド配列は実施例３に記載されているようにｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣに結合することができるタンパク質をコードしている。
図１１は、Ｆ９と呼称されているｃＤＮＡクローンの部分および予備ヌクレオチド配列を図式的に示し、このヌクレオチド配列は実施例３に記載されているようにｐ５５ＩＣとＦＡＳ−ＩＣに結合することができるタンパク質をコードしている。
図１２は、ＤＤ１１と呼称されているｃＤＮＡクローンの部分および予備ヌクレオチド配列を図式的に示し、このヌクレオチド配列は実施例３に記載されているように、ｐ５５ＩＣ、とくにｐ５５ＤＤおよびＦＡＳ−ＩＣに結合できるタンパク質をコードしている。
発明の詳細な説明
本発明は１つの態様で、ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーに属する受容体、たとえばＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合することができ、したがって、たとえばＴＮＦがＴＮＦ受容体に結合し、ＦＡＳリガンドがＦＡＳ受容体に結合することによって開始されるシグナリング過程に役割をもっている、前記スーパーファミリーの受容体、たとえばＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体のメディエーターまたはモジュレーターと考えられる新規なタンパク質に関する。これらのタンパク質の例は、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）に結合するタンパク質、たとえば本明細書で５５．１、５５．３および５５．１１と命名されているタンパク質類（実施例１）とｃＤＮＡクローンＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１がコードするタンパク質（実施例３）；ｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ７５ＩＣ）に結合するタンパク質、たとえば本明細書で７５．３および７５．１６と命名されているタンパク質（実施例１）；ならびにＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）に結合するタンパク質、たとえばｃＤＮＡクローンのＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１がコードするタンパク質（実施例３）である。タンパク質５５．１と５５．３は、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）の部分または断片であることはすでに見出されていたが、その他のタンパク質である５５．１１、７５．３および７５．１６は、本発明より前には全く報告されていないタンパク質（７５．３、７５．１６）であるか、または報告されていたが（５５．１１、カーンら（１９９２年））、その機能と他の特性、とくにＴＮＦ受容体に結合する性能はまったく報告されていなかったタンパク質である（下記実施例１参照）。ｃＤＮＡクローンＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１がコードする新しいタンパク質も今までまったく報告されていないタンパク質であり、すなわちこれらの配列は、ＤＮＡまたはアミノ酸の配列の、「遺伝子バンク」または「タンパク質バンク（PROTEIN BANK）」のデータバンクにはない。
したがって本発明は、これらタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびこれら配列がコードするタンパク質に関する。
さらに、本発明はこれらタンパク質の生物学的に活性な類似体と誘導体をコードするＤＮＡ配列ならびにそのＤＮＡ配列がコードする類似体と誘導体に関する。このような類似体と誘導体は標準の方法（たとえばサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年））で製造され、その方法では、これらタンパク質をコードするＤＮＡ配列において、１または複数のコドンが欠失され、追加されまたは他のコドンで置換されて、天然のタンパク質について少なくとも１個のアミノ酸残基が変化した類似体がえられる。許容できる類似体は、ＦＡＳ受容体もしくはＴＮＦ受容体のようなＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーの細胞内ドメイン、たとえばｐ５５ＩＣ、ｐ７５ＩＣもしくはＦＡＳ−ＩＣに結合する性能を少なくとも保持する類似体；または他の結合活性もしくは酵素活性を仲介することができる類似体、たとえばｐ５５、ｐ７５ＩＣもしくはＦＡＳ−ＩＣに結合するがシグナリングを行なわない、すなわちさらに下流の受容体、タンパク質もしくは他の因子に結合せずまたはシグナル依存性反応を触媒しない類似体である。このように、いわゆる優性の負の作用（dominant-negative effect）を有する類似体すなわち、たとえばｐ５５ＩＣ、ｐ７５ＩＣまたはＦＡＳ−ＩＣに対する結合またはこの結合に続いておこるシグナリングにおいて欠陥がある類似体を製造することができる。このような類似体は、たとえば、天然のＩＣ結合性タンパク質と競合させることによってＴＮＦもしくはＦＡＳ−リガンドの作用を阻害するのに使うことができる。同様に、たとえばＴＮＦもしくはＦＡＳ−リガンドの作用を高めるのに役立ついわゆる優性の正の類似体（dominant-postive analog）も製造することができる。これら類似体は、同じかまたは一層すぐれたＩＣ結合特性および天然ＩＣ結合タンパク質と同じかまたは一層すぐれたシグナリング特性を有している。同様に、誘導体は、当該技術分野で公知であるように、前記タンパク質の１または複数のアミノ酸残基の側基を標準法で修飾するか、または前記タンパク質ともう１つの分子、たとえば抗体、酵素、受容体などに接合することによって製造することができる。
これら新しいＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合するタンパク質、たとえば５５．１、５５．３、５５．１１、７５．３、７５．１６ならびにｃＤＮＡクローンのＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１がコードするタンパク質（以下Ｆ２、Ｆ９およびＤＤ１１という）にはいくつもの有望な用途がある。たとえば以下の用途である。
(i)これらのタンパク質は、ＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドの作用が高められた方が望ましい状態、たとえばＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドが誘発する細胞毒性性が望ましい抗腫瘍、抗炎症もしくは抗ＨＩＶの用途のばあいに、ＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドの機能をまねるかまたは高めるのに使用できる。このばあい、これらタンパク質、たとえばＴＮＦ作用を高める、たとえば５．１、５５．３とＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１などの５５ＩＣに結合するタンパク質、ならびに遊離のｐ５５ＩＣ自体（下記の事項と実施例２参照）とｐ５５ＩＣの「死滅ドメイン」（ｐ５５ＤＤ）；またはＦＡＳ受容体リガンド作用すなわち細胞毒性作用を高めるタンパク質Ｆ２、Ｆ９およびＤＤ１１とＦＡＳ−ＩＣとＦＡＳ−ＤＤはそれ自体公知の標準法で細胞に導入することができる。たとえば、これらのタンパク質は細胞内タンパク質であるので、ＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドの作用が要求される細胞中にのみ導入することが望ましいから、これらタンパク質をこれら細胞に特別に導入するシステムが必要である。これを行なう一方法は、たとえばワクシニアウィルス由来の組換え動物ウィルスを創製し、このウィルスのＤＮＡに以下の２種の遺伝子を導入する方法である。その遺伝子は、細胞によって特異的に発現される細胞表面タンパク質、たとえばいくつかの細胞（ＣＤ４リンパ球と関連白血病）に特異的に結合するエイズ（ＨＩＶ）ウィルスｇｐ１２０タンパク質のようなタンパク質に結合するリガンド、または組換えウィルスベクターがＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を保有する細胞に結合できるように、ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体を保有する細胞に特異的に結合する他のリガンドをコードする遺伝子；ならびに新しい細胞内ドメイン結合タンパク質、すなわちｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤのタンパク質をコードする遺伝子である。したがって、細胞表面結合タンパク質がウィルスの表面で発現すると、そのウィルスは腫瘍細胞または他のＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体を保有する細胞を標的として特異的に指向し、続いて細胞内ドメイン結合タンパク質をコードする配列またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤをコードする配列が該ウィルスにより細胞中に導入され、細胞内で発現されると、ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用が増大して死滅したい腫瘍細胞または他のＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体を保有する細胞の死をもたらす。このような組換え動物ウィルスの構築は標準の方法で行なわれる（たとえばサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年））。別の可能性としては、細胞に吸収され細胞内で発現できるオリゴヌクレオチドの形態で、前記の新しいタンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤの配列を導入する方法がある。
(ii)これらのタンパク質は、たとえば、敗血症性ショック、移植片対宿主拒絶反応または急性肝炎における組織損傷のような症例においてＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドの作用を阻害するのに用いられる。なおこれらの症例では、ＴＮＦが誘発するＴＮＦ受容体細胞内シグナリングまたはＦＡＳ受容体リガンドが誘発するＦＡＳ受容体細胞内シグナリングを遮断することが望ましい。このばあい、たとえば、これらの新しいタンパク質に対するアンチセンスをコードする配列またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤに対するアンチセンスをコードする配列を有するオリゴヌクレオチドを標準の方法で細胞内に導入することができ、そうすると、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳が有効に遮断され、その結果、そのタンパク質の発現が遮断されてＴＮＦ受容体リガンドの作用もしくはＦＡＳ受容体リガンドの作用が阻害されるに至る。
かようなオリゴヌクレオチド類は前記の組換えウィルス法を用いて細胞に導入することができ、そのウィルスが保存する第二の配列が前記オリゴヌクレオチド配列である。他の可能性は、これらのタンパク質に対して特異的な抗体を用いてそれらの細胞内シグナリング活性を阻害することである。これらの新しいタンパク質は、細胞内ドメインのみならず細胞外ドメインを保有することが可能であり、ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の結合ドメインに結合する細胞内ドメインおよびそれらの細胞外ドメインに対して生成する抗体を用いて、それらのＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドが関連する機能を遮断することができる。
ＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドの作用を阻害するさらに他の方法は、最近開発されたリボザイム法による方法である。リボザイムはＲＮＡを特異的に開裂する触媒ＲＮＡ分子である。リボザイム類は、選択された標的ＲＮＡ、たとえば本発明の新しいタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤをコードするｍＲＮＡを開裂するよう設計することができる。このようなリボザイムは選択されたｍＲＮＡに対して特異的な配列を有し、そのｍＲＮＡと相互に作用して（相補的結合）そのｍＲＮＡを開裂し、阻害したいタンパク質の発現を減らす（あるいは完全に消失させる）ことができ、そして減少した発現のレベルは標的細胞内でのリボザイム発現のレベルによって決まる。選択された細胞（たとえばＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体を保有する細胞）の中にリボザイムを導入するためには、この目的のために通常もちいられるプラスミド、動物ウィルス（レトロウィルス）ベクターのごとき任意の適切なベクターを使用することができる（選択されたリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを第二の配列としてウィルスがもっているばあいは前記(i)参照）。さらに、たとえば本発明のタンパク質および／またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤの１または複数の発現を阻害するのに使用できる、多数の標的を有するリボザイム（多標的リボザイム）を構築することができる（リボザイムに関する総説、方法などについてはチェン（Chen）ら（１９９２年）、ゾオ（Zhao）およびピック（Pick）（１９９３年）、ショア（Shore）ら（１９９３年）、ジョゼフ（Joseph）およびバーク（Burke）（１９９３年）、シマヤマ（Shimayama）ら（１９９３年）、カンター（Cantor）ら（１９９３年）、バリナガ（Barinaga）（１９９３年）、クリセル（Crisell）ら（１９９３年）およびコイズミ（Koizumi）ら（１９９３年））。
(iii)本発明の新しいタンパク質は、それらに結合できる他のタンパク質、たとえばＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインの下流にあって細胞内シグナリング過程に関与している他のタンパク質を単離し同定しついでクローン化するのに使用できる。このばあい、これらのオプション、すなわちそれらをコードするＤＮＡ配列は酵母ツー・ハイブリッド系（後記実施例１参照）に使用することができ、そのシステムでは、これらタンパク質の配列は、これらの新しいＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合するタンパク質に結合できるタンパク質をコードする他の配列（「餌食（preys）」）を、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのライブラリーから単離し、クローニングしついで同定するための「餌（baits）」として用いる。同様に、本発明の特定のタンパク質、すなわちｐ５５ＩＣ、ｐ７５ＩＣもしくはＦＡＳ−ＩＣに結合するタンパク質が、ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの受容体のなかの他の受容体に結合できるのかどうかを決定することができる。たとえばｐ５５およびｐ７５のＴＮＦ受容体以外の他のＴＮＦ受容体が存在することが最近報告されている（シュバルブ（Schwalb）ら（１９９３年）、ビーンズ（Baens）ら（１９９３年）およびクロウ（Crowe）ら（１９９４年））。したがって、酵母ツー・ハイブリッド系を用いて、本発明の諸タンパク質がこれらの他のＴＮＦ受容体またはＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの他の受容体に特異的に結合できるかどうかを明確に試験することができる。さらに、この方法は、本発明のタンパク質類が、活性で機能の役割をもっている他の公知の受容体に結合できるかどうかを決定するのに利用できる。
(iv)本発明の新しいタンパク質は、同じクラスの他のタンパク質、すなわちＴＮＦ受容体もしくはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインまたは機能面で類縁の受容体と結合し、細胞内シグナリング過程に関与しているタンパク質を単離し、同定しついでクローン化するのに使用できる。この用途に前記の酵母ツー・ハイブリッド系を使用することができ、または非ストリンジェント・サザン・ハイブリダイゼーション（non-stringent southern hybridization）を行なってからＰＣＲクローニングを行なう最近開発されたシステム（ウイルクス（Wilks）ら（１９８９年））を使用してもよい。ウイルクスらの刊行物には、２種の推定タンパク質−チロシンキナーゼの同定法とクローニング法が記載され、この方法はキナーゼのモチーフの公知の配列、すなわち考え出されたキナーゼ配列にもとづいて非ストリンジェント・ハイブリダイゼーションを行なってからＰＣＲ法でクローニングを行なって実施される。この方法は、新しいタンパク質の配列を用い本発明にしたがって、類縁のＴＮＦ受容体、ＦＡＳ受容体または類縁の受容体（ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリー受容体）の細胞内ドメイン結合タンパク質の配列を同定しついでクローニングするのに使用できる。
(v)本発明の新しいタンパク質を利用するさらなる他の方法は、本発明の新しいタンパク質が結合できる他のタンパク質もしくは因子、たとえばＴＮＦ受容体（ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のスーパーファミリー）に関連する他の受容体または細胞内シグナリング過程に関与する他のタンパク質もしくは因子を単離し同定するため、アフィニティークロマトグラフィー法に使用する方法である。この用途で、本発明のタンパク質類は、個々にアフィニティークロマトグラフィーの基材に結合させ、つぎに、細胞内シグナリング過程に関与していると考えられる細胞抽出物または単離されたタンパク質もしくは因子に接触させる。このアフィニティークロマトグラフィー法に付したのち、本発明の新しいタンパク質に結合する他のタンパク質もしくは因子は溶出し、単離しついで特徴を解析することができる。
(vi)前記のように、本発明の新しいタンパク質類は、免疫原（抗原）として用い、それに対して特異的な抗体を産生することもできる。これらの抗体は、細胞抽出物からまたは本発明の新しいタンパク質を産生する形質転換細胞系から新しいタンパク質類を精製するために使用することもできる。さらにこれらの抗体は、ＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドの系が異常に機能すること、たとえば活性が過剰であるかもしくは低すぎるＴＮＦもしくはＦＡＳ受容体リガンドが誘発する細胞作用に関連する障害を確認する診断を行なうのに使用できる。したがって万一かような障害が、新しいタンパク質を含む機能不全の細胞内シグナリング系に関連しているばあい、かような抗体は重要な診断手段として役立つであろう。
本発明の新しいタンパク質類の単離、同定および特徴解析は公知の標準選別法のいずれかを用いて実施することができる。たとえば、これらの選別法の１つである、下記実施例（実施例１と３）に記載されている酵母ツー・ハイブリッド法を本発明の新しいタンパク質を固定するのに用いた。先に述べたまたは以下に述べるように、当該技術分野で公知のアフィニティークロマトグラフィー、ＤＮＡハイブリダイゼーション法などのような他の方法を用いて、本発明の新しいタンパク質を単離し、同定しついで特性を解析するか、または本発明の新しいタンパク質もしくはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に属する受容体に結合できる追加のタンパク質、因子、受容体などを単離し、同定しついで特性を解析することができる。
本明細書を通じてあげられている抗体について、「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、キメラ抗体、可溶型（soluble form）または結合型（bound form）で標識を付けることができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、ならびにこれらに限定されないが酵素開裂法、ペプチド合成法または組換え法などのいずれかの公知の方法で提供される前記抗体類の断片を含むものとする。
ポリクロナール抗体は、抗原で免疫化された動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に同種の集団を含有し、この集団は実質的に類似のエピトープ結合部位をもっている。ｍＡｂは当該技術分野の当業者に公知の方法によってうることができる（たとえば、コーラー（Kohler）およびミルスティン（Milstein）、ネーチャー（Nature）、２５６巻、４９５〜４９７頁、１９７５年；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；アウスベル（Ausubel）ら編、アンチボディーズ（ANTIBODIES）：ア  ラボラトリー  マニュアル（A LABORATORY MANUAL）「コールド  スプリング  ハーバー  ラボトラリー（Cold Spring Harbor Laboratory）」（１９８８年）のハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）；コリガン（Colligan）ら編、「カレント  プロトコルズ  イン  イムノロジー（Current Protocols in Immunology）」、グリーン  パブリッシング  アソク  アンド  ウィレイ  インターサイエンス（Greene publishing Assoc.and Wiley Interscience）、ニューヨーク（１９９２年、１９９５年）参照。なおこれら引用文献の内容は全体を本明細書に援用するものである）。前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含む免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスの抗体である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、生体外、原位置（in situ）または生体内で培養することができる。生体内または原位置で高力価のｍＡｂが産生されるのでこれが現在好ましい製造方法になっている。
キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、たとえばマウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの不変領域を有する分子である。キメラ抗体は主として、使用時の免疫原性を低下させ産生時の収量を増大させるために使用される。たとえばマウスｍＡｂはハイブリドーマからの収量が高いがヒトにおける免疫原性も高いばあい、ヒト／マウスのキメラｍＡｂが用いられる。キメラ抗体およびその製造方法は当該技術分野で公知である（キャビレイ（Cabilly）ら、プロク  ナツル  アカド  サイ  ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、８１巻、３２７３〜３２７７頁、１９８４年；モリソン（Morrison）ら、プロク  ナツル  アカド  サイ  ユーエスエー、８１巻、６８５１〜６８５５頁、１９８４年；ボウリアン（Boulianne）ら、ネーチャー（Nature）、３１２巻、６４３〜６４６頁、１９８４年；キャビレイ（Cabilly）ら、ヨーロッパ特許願第１２５０２３号明細書（１９８４年１１月１４日付け公開）；ヌーベルガー（Neuberger）ら、ネーチャー（Nature）、３１４巻、２６８〜２７０頁、１９８５年；タニグチ（Taniguchi）ら、ヨーロッパ特許願第１７１４９６号明細書（１９８５年２月１９日付け公開）；モリソン（Morrison）ら、ヨーロッパ特許願第１７３４９４号明細書（１９８６年３月５日公開）；ヌーベルガー（Neuberger）ら、ＰＣＴ特許願第ＷＯ８６０１５３３号パンフレット（１９８６年３月１３日付け公開）；クドウ（Kudo）ら、ヨーロッパ特許願第１８４１８７号明細書（１９８６年６月１１日付け公開）；サハガン（Sahagan）ら、ジェー  イムノル（J.Immunol.）、１３７巻、１０６６〜１０７４頁、１９８６年；ロビンソン（Robinson）ら、国際特許願第ＷＯ８７０２６７１号パンフレット（１９８７年５月７日付け公開）；リウ（Liu）ら、プロク  ナツル  アカド  サイ  ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、８４巻、３４３９〜３４４３頁、１９８７年；サン（Sun）ら、プロク  ナツル  アカド  サイ  ユーエスエー（Proc.Nacl.Acad.Sci.USA）、８４巻、２１４〜２１８頁、１９８７年；ベター（Better）ら、サイエンス（Science）、２４０巻、１０４１〜１０４３頁、１９８８年；およびハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、アンチボディーズ（ANTIBODIES）：ア  ラボラトリー  マニュアル（A LABORATORY MANUAL）（前掲））。これらの引用文献は全体を本明細書に援用するものである。
抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、ある抗体の抗原結合部位に一般に付随するユニーク決定基（unique determinant）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの起源と種および遺伝子型が同じ動物（たとえばマウス系）を、ｍＡｂに対する抗Ｉｄが調製されているそのｍＡｂで免疫化することによって調製することができる。その免疫化された動物は、免疫化する抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、これらイディオタイプ決定基を認識しこれに応答する（たとえば米国特許第４，６９９，８８０号明細書参照、なおこの文献は全体を本明細書に援用するものである）。
また前記抗Ｉｄ抗体は、「免疫原」として用いてさらに別の動物中に免疫応答を誘発し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生することができる。この抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導したオリジナルのｍＡｂとエピトープが同一である。したがってｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同じ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
したがって、本発明のＩＣ結合タンパク質類、その類似体もしくは誘導体、またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤ、その類似体、もしくは誘導体に対して生成するｍＡｂは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのような適切な動物中に抗Ｉｄ抗体を誘導するのに使用できる。かような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を用いて、抗ＩｄｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生することができる。さらにこの抗ＩｄｍＡｂは、たとえばキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合させて、追加のＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化するのに用いることができる。これらのマウス由来の血清は、前記ＩＣ−結合タンパク質、その類似体もしくは誘導体、またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ、その類似体もしくは誘導体のエピトープに対して特異的なオリジナルのｍＡｂの結合特異性をもっている抗−抗Ｉｄ抗体を含有している。
したがって前記抗ＩｄｍＡｂは、それ自身のイディオタイプエピトープまたはＧＲＢプロティン−αのような評価中のエピトープに構造が類似している「イディオトープ」をもっている。
また「抗体」という用語は、完全な分子と、抗原を捕捉できるたとえばＦａｂとＦ（ａｂ′）2のような完全分子の断片の両者を含むものとする。ＦａｂとＦ（ａｂ′）2断片は完全抗体（intact antibody）のＦｃ断片を欠いて、循環血（circulation）から一層迅速にクリアーとなり、完全抗体より非特異的組織結合性が小さい（ワール（Wahl）ら、ジェー  ヌクル  メド（J.Nucl.Med.）、２４巻、３１６〜３２５頁、１９８３年）。
本発明に有用な抗体のＦａｂとＦ（ａｂ′）2および他の断片は、完全抗体分子について本明細書で開示した方法にしたがって、ＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤを検出し定量するのに使用できる。このような断片は一般に、パパイン（Ｆａｂ断片を製造するのに使用）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）2断片を製造するのに使用する）のような酵素を用いてタンパク分解開裂法で製造される。
抗体が分子と特異的に反応してその分子をその抗体に結合させることができるばあい、その抗体はその分子に「結合できる」といわれる。「エピトープ」という用語は、抗体が認識することができて、その抗体が結合することができる分子の一部分を意味するものとする。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖の側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングで構成され、特定の三次元構造の特徴と特定の電荷特性を有している。
「抗原」は、抗体が捕捉することができて、さらに、その抗原のエピトープに結合できる抗体を動物に産生させることができる分子または分子の部分である。抗原は１つまたは複数のエピトープをもっている。前記の特異的な反応は、高度に選択的な方法で、抗原がその対応する抗体と反応し、そして他の抗原が誘発する他の多数の抗体とは反応しないことを示すものとする。
本発明に有用な抗体（抗体の断片を含む）は、試料中のＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤを定量的または定性的に検出し、または本発明のＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤであるタンパク質を発現する細胞の存在を検出するのに使用することができる。これは光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光定量法による検出を組合わせて、蛍光で標識をつけた抗体を利用する免疫蛍光法（以下参照）によって達成される。
本発明に有用な抗体（またはその断片）は、本発明のＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤの原位置検出を行なうため、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法において、組織学的に使用することができる。原位置検出は、患者から組織学的試料を採取し、本発明の標識化抗体をその試料に付与する。その抗体（または断片）は、標識化した抗体（または断片）を生物学的試料に塗布するかまたは被覆することによって付与することが好ましい。前記方法を使用することによって、ＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤの存在のみならず、被検組織上のその分布を確認することができる。本発明を使用すれば、当業者は、広範囲の組織学的方法（染色法など）を、かような原位置検出を達成するため改善できることが容易に分かるであろう。
本発明のＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤのかような検定法は、一般に、生物学的試料、たとえば生物学的流体、組織抽出物、リンパ球もしくは白血球のような新しく収穫した細胞、または組織培養で培養された細胞を、ＩＣ結合タンパク質またはｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣ、ＦＡＳ−ＤＤを同定することができる検出可能に標識した抗体の存在下でインキユベートし、ついで当該技術分野で公知のいくつかの方法で抗体を検出することからなる方法である。
生物学的試料は、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化することができるニトロセルロースまたは他の固体の支持体もしくは担体のような固相の支持体もしくは担体で処理することができる。またこの支持体もしくは担体は、適切な緩衝液で洗浄し続いて前記のように本発明にしたがって検出可能に標識された抗体で処理することができる。固相の支持体もしくは担体はついで緩衝液で２回目の洗浄を行ない、未結合抗体を除去することができる。つぎに前記支持体もしくは担体に結合した標識の量を通常の方法で検出することができる。
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」または「担体」という用語は、本明細書で用いるばあい、抗原もしくは抗体が結合できる支持体もしくは担体を意味するものとする。公知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然セルロースと改質セルロース（modified cellulose）、ポリアクリルアミド類、はんれい岩および磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であってもよく不溶性でもよい。支持体の材料は、結合された分子が抗原または抗体に結合できるかぎり事実上可能などんな構造の形態でもよい。したがって支持体または担体の形態は、ビーズのばあいのように球形であるか、または試験管の内面もしくはロッドの外表面のばあいのように円筒形でもよい。あるいは表面は、シート状テスト・ストリップ（sheet test strip）などのように平坦でもよい。好ましい支持体または担体としてはポリスチレンビーズがある。当該技術分野の当業者は、抗体もしくは抗原を結合させるのに適した他の担体を多数知っており、またはこれら担体を日常的な実験に使用して確認できるであろう。
前記のような本発明の抗体の与えられたロットの結合活性は公知の方法で測定することができる。当該技術分野の当業者は、日常的な実験法を用いて各測定の操作条件と最適検定条件を決定することができる。
洗浄、撹拌、振とう、濾過などのような他の工程は個々のばあいに対し慣例どおりに、または必要に応じて検定法に付け加えてもよい。
本発明の抗体を検出可能に標識することができる方法の１つは、抗体を酵素に連結し酵素免疫検定法（ＥＩＡ）に用いる方法である。つぎにその酵素は、そののち、適当な基質に暴露すると、たとえば分光光度法、蛍光光塵法または目視手段によって検出できる化学的部分を生成するような方式で基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素としては、これらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがある。検出は酵素に対して発色性基質を用いる比色法で達成することができる。また検出は、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と目視で比較して実施することができる。
検出は他の各種の免疫検定法を用いて達成することができる。たとえば、抗体または抗体断片を放射能で標識することによって、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を用いてＲＰＴＰアーゼを検出することができる。ＲＩＡについてのすぐれた説明は、ティーエス（Ｔ．Ｓ．）ら編、「ラボラトリー  テクニークス  アンド  バイオケミストリー  イン  モレキュラー  バイオロジー（Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology）」、ノースホーランド  パブリッシング  カンパニー（North Holland Publishing Company）、ニューヨーク、１９７８年中のとくに、チャード  ティー（Chard T.）の標題が「アン  イントロダクション  ツー  ラジオイムン  アッセイ  アンド  リレーティッド  テクニークス（An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques）」の章に見られる。なおこの文献は本明細書に援用するものである。放射能同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターを用いる方法またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
蛍光化合物を用いて本発明の抗体を標識することもできる。蛍光的に標識した抗体は適正な波長の光に暴露すると、その存在が蛍光によって検出できる。もっとも普通に用いられる蛍光標識付け化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンである。
また抗体は、ランタノド系列の152Ｅなどのような蛍光放出性金属を用いて検出可能に標識付けすることができる。これらの金属は、たとえばジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート化基を用いて抗体に結合することができる。
また抗体は、それを化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識付けすることができる。つぎに、化学発光で標識を付けた抗体の存在が化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって確認される。とくに有用な化学発光標識付け化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体に標識を付けることができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大する生物学系に見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することによって確認される。標識付けに用いる重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびアクオリン（acquorin）である。
本発明の抗体分子は「二部位（two-site）」検定法または「サンドイッチ」検定法として知られている免疫検定法で利用するのに採用することができる。代表的な免疫検定法では、所定量の未標識化抗体（または抗体の断片）を固体の支持体または担体に結合させつぎに所定量の検出可能に標識を付けた可溶性抗体と添加して、固相抗体、抗原および標識化抗体間に形成された三成分系複合体を検出および／または定量することができる。
代表的な好ましい免疫検定法としては「正規」検定法（「forward」assay）があり、この検定法ではまず、固相に結合させた抗体を被検試料と接触させ、二成分系の固相抗体抗原複合体を形成させることによって、試料から抗原を適切なインキュベーション期間ののち、固体の支持体または担体を洗浄して、もし存在しているならば未反応の抗原も含めて流体試料の残留物を除去し、ついで未知量の標識化抗体（「受容体分子」として機能する）を含有する溶液と接触させる。標識化抗体を、未標識化抗体を通じて固体の支持体または担体に結合した抗原と複合体を形成させる第二のインキュベーション期間ののち、その固体の支持体または担体の二回目の洗浄を行なって未反応の標識化抗体を除く。
他のタイプの「サンドイッチ」検定法は、本発明の抗原に対して有用であるが、この検定法ではいわゆる「同時」検定法と「逆」検定法が用いられる。同時検定法は、固体の支持体または担体に結合させた抗体と標識化抗体を両者同時に被検試料に添加する単一のインキュベーション工程である。インキュベーションを完了したのち、固体の支持体または担体を洗浄して流体試料の残留物と複合体になっていない標識化抗体を除去する。つぎに固体の支持体または担体と結合した標識化抗体の存在は、通常は「正規」サンドイッチ検定法のばあいと同様にして確認される。
「逆」検定法では、まず標識化抗体の溶液を流体試料に加えつぎに適切なインキュベーション期間ののち、固体の支持体または担体に結合させた未標識化抗体を添加する段階的添加が行われる。第二のインキュベーションののち、固相を通常の方法で洗浄して被検試料の残留物と未反応の標識化抗体の溶液を除く。つぎに固体の支持体または担体に結合した標識化抗体は、「同時」検定法および「正規」検定法のばあいと同様にして測定した。
たとえば酵母ツー・ハイブリッド法、アフィニティークロマトグラフィーおよびその他の当該技術分野で公知の方法などのいずれかの標準選別法で単離され同定され特性が解析された本発明の新しいタンパク質は、つぎに標準の組換えＤＮＡ法（たとえばサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年）参照）で製造できる。この方法では、適切な真核性または原核性の宿主細胞を、本発明のタンパク質をコードする配列を含有する適切な真核性または原核性のベクターで形質転換させる。したがって本発明は、本発明のタンパク質類を製造するのに用いるこのような発現ベクターと形質転換宿主に関する。前記のようにこれらのタンパク質にはそれらの生物学的に活性な類似体と誘導体も含まれ、したがってこれらのタンパク質をコードするベクターにはこれらタンパク質の類似体をコードするベクターも含まれており、形質転換された宿主にはこのような類似体を産生する宿主が含まれている。これらタンパク質の誘導体は、形質転換された宿主が産生したタンパク質またはその類似体を標準的な修飾法で製造した誘導体である。
他の態様で、本発明は、ｐ５５ＴＮＲ受容体の遊離細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）もしくはＦＡＳ受容体の遊離細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）またはそれらそれぞれのいわゆる「死滅ドメイン」（ｐ５５ＤＤもしくはＦＡＳ−ＤＤ）の細胞上での、もしくはそれ自体のＴＮＦ作用またはＦＡＳ受容体リガンド作用を高める薬剤としての使用に関する（実施例２参照）。ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体リガンドが誘導する細胞毒性作用を、たとえば癌細胞またはＨＩＶ感染細胞のような細胞に導入したいばあいは、ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤを、前記の（前記(i)参照）組換え動物ウィルス（たとえばワクシニアウィルス）法を用いて前記細胞中に導入すればよい。また、天然のｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣもしくはＦＡＳ−ＤＤ、生物学的に活性な類似体と誘導体もしくは断片も使用可能であり、これらはすべて前記のようにして調製することができる。
同様に本発明は、ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤの活性を遮断することによるＴＮＦ作用またはＦＡＳ受容体リガンド作用の特異的遮断法に関し、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞中に導入してｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣまたはＦＡＳ−ＤＤの発現を遮断することができる。
また本発明は、ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン結合タンパク質（ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ−ＩＣおよびＦＡＳ−ＤＤを含む）をコードする組換え動物ウィルスベクターを含んでなる医薬組成物に関する。そしてそのベクターは、特定の標的細胞（たとえば癌細胞）表面タンパク質に結合できるウィルス表面タンパク質もコードし、前記細胞中に細胞内ドメイン結合タンパク質配列を挿入する。
他の態様で、本発明はとくにｐ５５ＴＮＦ受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ、実施例２参照）の作用に関する。かような作用の例は、その受容体に結合するＴＮＦによって通常仲介される作用であり、自己会合性ｐ５５−ＩＣもしくはその部分のシグナリング活性を同様に発揮する作用であるが、ＩＬ−８をコードする遺伝子の発現を誘発する作用である。
ＩＬ−８は本来走化活性を有するケモカイン（chemokine）のサブクラスに属するサイトカインであり、顆粒球などいくつかの病的状態に関連する他のタイプの細胞の走化性に重要な役割を演じていることが報告されている（たとえばエンドウ（Endo）ら（１９９４年）、セキド（Sekido）ら（１９９３年）、ハラダ（Harada）ら（１９９３年）およびフェリック（Ferrick）ら（１９９１年））。
ＴＮＦは有益な活性を有しているので、それ自体、腫瘍細胞とウィルス感染細胞を破壊するかまたは顆粒球の抗菌活性を高める治療に用いられる。しかし前記のように、ＴＮＦは、癌の治療、抗ウィルス治療または抗菌治療に大投与量で用いられるばあいを含めて、その活性を遮断したい状態では望ましくない活性をもっている。
したがって、ＴＮＦまたはＴＮＦの有益な活性を同様に発揮することができる物質を、とくに治療したい細胞または組織に導入することが望ましい。
本発明によって、ｐ５５受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）がリガンド非依存性方式でＴＮＦのいくつかの作用を同様に発揮することができたとえばｐ５５−ＩＣの「死滅ドメイン」は細胞に対し細胞毒性作用を誘発することができ、ｐ５５−ＩＣがＩＬ−８遺伝子の発現を誘発できることが見出された。したがってｐ５５ＩＣを利用し、部位特異的方式でＴＮＦの機能を同様に発揮させること、すなわち治療したい細胞もしくは組織にのみｐ５５−ＩＣを導入することができる。
前記のような方法の一例は、腫瘍細胞もしくは悪性組織に細胞毒性作用を誘発するのみならず、ＩＬ−８を共誘発することによってこれらの作用を高めることができるｐ５５−ＩＣまたはその部分をコードするＤＮＡ分子で前記細胞もしくは組織を特異的にトランスフェクト（形質転換）する方法であり、この方法を用いれば顆粒球などのリンパ球が前記細胞もしくは組織の部位に蓄積して腫瘍性の細胞もしくは組織を破壊するのに役立つ。この方法によれば有害な副作用があるＴＮＦの大量投与を行なう必要が回避される。
通常の組換えＤＮＡ法を用いることによって、ｐ５５−ＩＣの各種の領域を調製し、各ＴＮＦ誘導作用に対しどの領域が関与しているかを確認することができる。たとえば本発明の発明者らは「死滅ドメイン」が細胞毒性に関与することを確認し、かつｐ５５−ＩＣの部分を含有する他の各種構築物をすでに調製したが、このｐ５５−ＩＣの一部分は、（死滅ドメインの部分もしくはすべてとともに）他のＴＮＦの作用に関与し、自己会合して活性がえられるリガンドとは独立した方式で使用し、これらの作用、たとえばＩＬ−８誘発作用を誘発させることができる。
他のＴＮＦ関連作用（たとえばＩＬ−８誘発作用）の誘発に関与するｐ５５−ＩＣの配列は、細胞毒性に関与する配列とは異なっていることに注目すべきであり、すなわち、「死滅ドメイン」を含んでいないかもしくはごく一部を含有し、かつその細胞内ドメインの他の領域由来の他の配列モチーフをもっているか、または同じ配列であるがその配列（同じ配列モチーフ）の異なる特徴が他の作用の誘発に関与している。
したがって、先に述べかつ以下に説明するように、これらのｐ５５−ＩＣ部分、その類似体もしくは誘導体を含有する発現ベクターは、調製し、宿主細胞内で発現させ、精製し、その活性について試験することができる。このように、１または複数のＴＮＦ関連活性を有するかようなｐ５５−ＩＣ断片のいくつかを調製し、特異的な方式で使用して、たとえばウィルス感染症、細菌感染症、腫瘍などのいくつもの疾病を治療することができる。このような状況のばあいはすべて、ＩＬ−８遺伝子発現の誘発に関与しているｐ５５−ＩＣ断片を組入れる（またはコトランスフェクション）によってその特異的な活性を高めることができ、望ましいＩＬ−８の走化活性によって破壊したい細胞もしくは組織の破壊を促進することができる。
したがって、ＴＮＦを全身的に投与することなく、治療したい細胞もしくは組織に、ｐ５５−ＩＣのすべてまたは部分を特異的に導入することによってその望ましい作用を誘発することができる。
ｐ５５−ＩＣは前記方法のいずれか１つによって、破壊したい細胞または組織に特異的に導入することができる。たとえば、これを実施する１つの方法は、たとえばワクシニアウィルス由来の組換え動物ウィルスを作製し、そのウィルスのＤＮＡに以下の２種の遺伝子を導入する方法である。その遺伝子とは、前記細胞によって特異的に発現される細胞表面タンパク質、たとえばいくつかの細胞（ＣＤ４リンパ球または類縁白血病）に特異的に結合するエイズウィルスｇｐ１２０タンパク質のようなタンパク質に結合するリガンド、または前記組換えウィルスのベクターがかようなＴＮＦ受容体保存細胞に結合できるようなＴＮＦ受容体を保有する細胞に特異的に結合する他のリガンドをコードする遺伝子；ならびにｐ５５−ＩＣまたはその部分をコードする遺伝子である。したがって細胞表面結合タンパク質を該ウィルスの表面で発現させると、ウィルスを腫瘍細胞または他のＴＮＦ受容体保有細胞に対して特異的に指向させ、ついでｐ５５−ＩＣまたはその部分をコードする配列がウィルスにより細胞内に導入される。そして細胞内で発現されると、殺したい腫瘍細胞または他のＴＮＦ受容体保有細胞の死をもたらすＴＮＦ作用または細胞の死をもたらすたとえばＩＬ−８の誘発が増大する。このような組換え動物ウィルスは標準の方法（たとえばサム−ブルック（Sam-brook）ら（１９８９年））で構築される。その外に、ｐ５５−ＩＣまたはその部分の配列を、細胞に吸収させて細胞内で発現させることができるオリゴヌクレオチドの形態で導入することも可能である。
したがって本発明はとくに、ｐ５５−ＩＣもしくはその部分をコードし、また特定の標的細胞（たとえば癌細胞）の表面タンパク質に結合できるウィルス表面タンパク質もコードし、ｐ５５−ＩＣもしくはその部分の配列を該細胞に挿入させる前記組換え動物ウィルスベクターを含んでなる医薬組成物に関する。
他の態様で、本発明は、可溶性でかつオリゴマー化してダイマーを形成することができ、さらに高度のマルチマーを形成する可能性がある新しい合成ＴＮＦ受容体に関する。ＴＮＦ受容体の分子はこれら受容体の各モノマーの部分がＴＮＦモノマーに結合できる。ＴＮＦは３個の活性ＴＮＦモノマーを含有するホモトリマーとして天然に存在し、そのモノマーは各々単一のＴＮＦ受容体分子と結合することができるが、一方ＴＮＦ受容体はモノマーとして存在し、そのモノマーは各々ＴＮＦのホモトリマー分子のモノマーの１個としか結合できない。したがってＴＮＦは、細胞表面上のＴＮＦ受容体に結合するとき３個の受容体分子に結合することができるので、ＴＮＦ受容体が密集する（clustering）。このことは、細胞に対して観察されるＴＮＦの作用を最終的にトリガーするシグナリング過程の始まりであると考えられる。
ＴＮＦは、たとえば腫瘍細胞またはウィルス感染細胞を破壊したり顆粒球の抗菌活性を増大する性能のような多くの望ましい作用をもっているとはいえ、自己免疫疾患、リウマチ様関節炎、移植片対宿主反応（移植片拒絶）、敗血症性ショックを含む多くの重篤な疾患のばあいのような多くの望ましくない作用がある。ＴＮＦは病的な組織破壊の主な原因となっている。またＴＮＦは脂肪細胞の活性を抑制することによって過剰な体重減少（悪液質）を起こす。さらに、ＴＮＦは各種の悪性疾患またはウィルス疾患を治療するばあいのようにその望ましい活性のために投与されるばあいでさえ、その使用されるＴＮＦの投与量は、望ましくないいくつもの細胞毒性副作用、たとえば健康な組織の破壊などを患者に起こすのに充分に高いことが多い。
したがって、ＴＮＦの作用が望ましくない前記のすべてのばあい、ＴＮＦの有効な阻害剤が求められてきた。ＴＮＦに結合してＴＮＦがその受容体に結合するのを阻害し、その結果ＴＮＦの細胞毒性作用を阻害できる可溶性タンパク質を含めて多数のＴＮＦ遮断剤が提案されている（ＥＰ３０８３７８、ＥＰ３９８３２７およびＥＰ５６８９２５参照）。しかしこれらのＴＮＦ結合タンパク質または可溶性ＴＮＦ受容体はモノマーなので、各々、ＴＮＦホモトリマーのＴＮＦモノマーの１つにしか結合できない。したがってＴＮＦ機能の遮断は完全ではなく、モノマーの受容体が結合した各ＴＮＦ分子は、細胞表面ＴＮＦ受容体に結合して細胞に対するＴＮＦの作用を妨害（illicit）することができる２つの自由なＴＮＦモノマーを依然としてもっている。
ＴＮＦの機能を遮断するばあいの前記欠点を克服するため、天然に存在するＴＮＦホモトリマー分子の少なくとも２つのＴＮＦモノマーに結合できる可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体を融合タンパク質として構築する方法が本発明によって開発されたのである。その結果、これら可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体は従来知られているモノマーの可溶性ＴＮＦ結合タンパク質もしくは受容体より一層強力にそのＴＮＦリガンドに結合する。たとえば、本発明の可溶性ＴＮＦ受容体がダイマーの形態のばあい、該受容体はＴＮＦトリマーの２つのＴＮＦモノマーと結合できるので、ＴＮＦの一層完全な中和が起り、またこのダイマーの可溶性受容体のＴＮＦからの解離速度（dissociation rate）が遅いので、この中和作用は写真の複写図であり、これは実施例２に記載されている。
図７は、全長のｐ５５受容体、その細胞内ドメインまたは「死滅ドメイン」を含む該細胞内ドメインの部分で一層よく持続する。さらに、かような可溶性オリゴマー受容体はそのモノマーのものより大きいため、身体からのクリアランス速度が低い可能性があるため医薬として有利である。
本発明の可溶性オリゴマーＴＮＦ受容体の開発の基礎は、ｐ５５受容体であるＴＮＦ受容体の細胞内ドメインが自己会合することができ、さらにこの細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）内にいわゆる「死滅ドメイン」という領域が存在し、この領域も自己融合することができるので、リガンドとは独立して細胞に対し細胞毒性作用を起こすことができるという発見であった（実施例２参照）。ｐ５５−ＩＣおよびその「死滅ドメイン」のこの自己会合特性を利用し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、たとえばｐ７５受容体もしくはｐ５５受容体、好ましくはｐ５５受容体などのＴＮＦ受容体の細胞外ドメインのほとんどすべてに、細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）またはｐ５５−ＩＣの死滅ドメインのほとんどすべてを融合させてなる融合タンパク質を構築することができる。このようにして、一方の末端にＴＮＦ結合ドメイン、すなわち受容体の細胞外ドメインを有し、そして他方の末端に自己会合することができる細胞内ドメインまたはその死滅ドメインを有する新しい融合生成物が製造される。したがってかような生成物は、２つの（２つを超える可能性がある）ｐ５５−ＩＣもしくはその死滅ドメイン間の自己会合によってオリゴマー化し、少なくとも２つのＴＮＦ結合ドメインを有するオリゴマー（すなわち少なくともダイマー）をうることができる。
さらに、Ｆａｓ／ＡＰＯ１受容体が、ｐ５５−ＩＣとその死滅ドメインに対して特定の相同性を有する、自己会合性「死滅ドメイン」を含む自己会合性細胞内ドメインを有していることが本発明によって発見されたのである（実施例２）。したがってＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（前記のもの）を、Ｆａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメインもしくは「死滅ドメイン」に融合させることによって、本発明の可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体を構築することができる。
前記の両者のばあい、本発明のオリゴマーＴＮＦ受容体は、ＴＮＦ受容体の可溶性細胞外ドメインと、ｐ５５ＴＮＦ受容体もしくはＦａｓ／ＡＰ０１受容体の可溶性細胞内ドメインもしくはその死滅ドメインのみを持っていることによって可溶性である。すなわち本発明のオリゴマーＴＮＦ受容体は前記両タイプの受容体のトランスメンブラン（不溶性）ドメインを含有していない。
本発明の前記オリゴマーＴＮＦ受容体の構築については後記実施例４で詳細に述べる。しかし、本発明のオリゴマーＴＮＦ受容体を構築すると、今まで報告されていないが、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインが自己会合できるという状態が起こるということに注目すべきである。この状態は、オリゴマー受容体がＴＮＦホモトリマー分子の２つ以上のＴＮＦモノマーに結合する性能を阻害するか、またはかようなＴＮＦモノマーの結合が最適ではなくなるから望ましくない。
したがって、このようなばあい、標準の組換えＤＮＡ法を用いて、たとえば自己会合性領域内に含有されている１つまたは複数のアミノ酸残基を欠失させるかまたは置換することによって、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインを修飾してかような自己会合を防止することができる。したがって、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインのかような修飾体は本発明の一部であり、本明細書ではＴＮＦ受容体の細胞外ドメインの類似体または誘導体と命名する。同様に、本発明のオリゴマーＴＮＦ受容体に使用される、ｐ５５受容体もしくはＦａｓ／ＡＰＯ１受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ＩＣ）もしくはその死滅ドメイン（ＤＤ）も、その類似体もしくは誘導体であり、すなわち、ｐ５５−ＩＣ配列もしくは死滅ドメイン（ｐ５５ＤＤ）を含むその部分の修飾体かまたはＦａｓ／ＡＰＯ１細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）配列もしくは死滅ドメイン（ＦＡＳ  ＤＤ）を含むその部分の修飾体である。ただし、これらの修飾によって自己会合性生成物がえられる。
同様に、可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体、その類似体もしくは誘導体を、製造し精製したのち、さらに標準の化学的方法によって修飾して、本発明のこれらＴＮＦ受容体を有効成分として含有する医薬組成物を製造するためのその塩と機能誘導体をうることができる。
本発明の可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体を製造するために、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列は、全ＴＮＦ受容体の既存のクローンからえられ、その細胞内ドメインもしくは死滅ドメインとＦａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメインもしくは死滅ドメインはそのままでえられる（実施例２と５参照）。このように所望の細胞外ドメインのＤＮＡ配列は、死滅ドメインを含む所望の細胞内ドメインもしくは、その部分のＤＮＡ配列に連結され、ついでこの融合生成物は、プロモーターおよび他の発現制御配列のコントロール下にある適切な発現ベクター中に挿入（および連結）される。発現ベクターが形成されると、これを適切な宿主細胞中に導入し（形質転換、トランスフェクションなど）、つぎにそのベクターを発現させて、可溶性で自己会合性のＴＮＦ受容体分子である本発明の融合生成物がえられる。つぎにこれら生成物を標準の方法で宿主細胞から精製して、可溶性のオリゴマーＴＮＦ受容体である最終製品がえられる。
細胞外ドメインと細胞内ドメインまたはその部分をコードする融合生成物の好ましい製造方法は、全ＴＮＦ受容体分子をコードするクローンからコピーされる望ましい配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法による方法である。他の方法も使用できるが、たとえば細胞外ドメインと細胞内ドメインをコードする所望の部分を制限エンドヌクレアーゼによって単離し、つぎにその制限断片の末端で修飾しまたは修飾せずに公知の方法でこれらをともにスプライスして受容体の所望の部分（細胞外ドメインと細胞内ドメインまたはその部分）の正確な融合を確実に行なう方法がある。ついでこのようにしてえられた融合生成物を選択した発現ベクター中に挿入する。
同様に、本発明は、Ｆａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞外ドメインおよびｐ５５受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）、その死滅ドメイン（ｐ５５ＤＤ）、またはＦａｓ／ＡＰＯ１受容体の自己会合性細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）、またはその死滅ドメイン（ＦＡＳＤＤ）またはその類似体もしくは誘導体（前記事項参照）を含有する可溶性のオリゴマーＦａｓ／ＡＰＯ１（ＦＡＳ）受容体に関する。これらの可溶性オリゴマーＦＡＳ受容体の構築は後記実施例５で詳細に述べるが、入手できるクローニングされた全長のＦＡＳ受容体をコードする配列を出発物質として用い、そして所望の細胞外ドメインと細胞内ドメインをＰＣＲで製造するために適当なオリゴヌクレオチドを用い、それらを連結して融合生成物をえて、つぎのその生成物を適切な発現ベクター中に挿入する。さきにおよびこの後にのべるように、原核性もしくは真核性のベクターと宿主細胞を用いて所望の可溶性オリゴマーのＦＡＳ受容体を製造し、ついで精製し有効成分として医薬組成物中に配合する。
本発明の前記可溶性オリゴマーのＦＡＳ受容体はＦａｓリガンドを有効的に遮断することを目的とするものであり、トリマーとして存在しているので（ＴＮＦと同様に、前記事項参照）、本発明の各オリゴマー受容体は、２つもしくは２つを超える可能性もあるＦａｓリガンドと結合してその活性を中和することができる。Ｆａｓリガンドは支配的に細胞表面に結合することが知られているが、可溶型で存在している。いずれにしろ、本発明のオリゴマーＦＡＳ受容体はこのリガンドの少なくとも２つのモノマーに結合することが可能なので（モノマーのＦＡＳ受容体より）、有効にＦａｓリガンドの活性を中和することができる。ＦａｓリガンドおよびこのリガンドによるＦＡＳ受容体の活性化は、いくつもの病的状態、とくに肝炎に伴う肝臓損傷を含む肝臓損傷に関連する病状（たとえば肝細胞の細胞消滅）ならびにＨＩＶに感染したヒトのリンパ球損傷（細胞消滅）を含む自己免疫症状に関与している（たとえばオガサワラ（Ogasawara）ら（１９９３年）；チェン（Cheng）ら（１９９４年））。したがって、本発明の可溶性オリゴマーのＦＡＳ受容体は、Ｆａｓリガンドの活性を遮断するのを目的として、前記のようなＦａｓリガンドが関連する病的状態を治療するのに用いる医薬組成物の有効成分として使用することができる。
同様に、本発明は、ＴＮＦとＦＡＳ受容体リガンドの両者に対し結合アフィニティを有する可溶性オリゴマーの受容体すなわちいわゆる「混合」ＴＮＦ受容体／ＦＡＳ受容体オリゴマー受容体に関する。これら混合オリゴマー受容体は、少なくとも１つのＴＮＦ受容体細胞外ドメインと少なくとも１つのＦＡＳ受容体細胞外ドメインを含有し、これら細胞外ドメインが各々、前記の自己会合性ｐ５５ＩＣ、ｐ５５ＤＤ、ＦＡＳ  ＩＣまたはＦＡＳ  ＤＤのいずれか１つに融合されることによって結合してオリゴマー受容体になっている。
これら混合オリゴマーは次のようにして製造することができる。すなわち（ａ）自己会合性細胞内領域のｐ５５ＩＣとＦＡＳ  ＩＣのいずれか１つ、または自己会合性死滅ドメインのｐ５５ＤＤとＦＡＳ  ＤＤのいずれか１つまたはその自己会合性の部分、類似体もしくは誘導体のいずれかに融合されたＴＮＦ受容体（ｐ７５ＴＮＦ受容体もしくは好ましくはｐ５５ＴＮＦ受容体）の細胞外ドメインを含有する前記融合生成物のいずれかを提供し；（ｂ）自己会合性のｐ５５ＩＣ、ＦＡＳ−ＩＣ、ｐ５５ＤＤおよびＦＡＳ  ＤＤのいずれか１つまたはその自己会合性部分、類似体もしくは誘導体のいずれかに融合されたＦＡＳ受容体の細胞外ドメインを含有する前記融合生成物のいずれかを提供し；ついで（ｃ）（ａ）のＴＮＦ特異的融合生成物のいずれかを（ｂ）のＦＡＳ受容体リガンド特異的融合生成物のいずれかと混合して、少なくともＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体の細胞外ドメインの両者を含有し、これらドメインがそれに融合されたＩＣまたはＤＤの領域の自己会合性能によって結合されてなるオリゴマー（ダイマーもしくはより高度のオリゴマー）受容体を（標準の選別・精製法に付して）提供する方法である。
前記混合オリゴマー受容体を製造できる他の方法は、前記発現ベクター類で適切な宿主細胞を同時形質転換することによる方法であり、その１つのベクターはＴＮＦ特異的ＴＮＦ受容体融合生成物をコードし、もう１つのベクターはＦＡＳ受容体リガンド特異的ＦＡＳ受容体融合生成物をコードしている。これらの異なる融合生成物を宿主細胞内で発現させたのち、標準の精製選別法によって混合オリゴマー（ＴＮＦ受容体／ＦＡＳ受容体）受容体がえられる。
これらの混合アフィニティーオリゴマー受容体が有効なのは、主としてＴＮＦおよびＦＡＳ受容体リガンドが内因的に過剰に発現されるかまたは外因的な投与によって望ましくない高レベルになっているときにこの両者を中和するばあいである。最近の証拠により、ＦＡＳ受容体リガンド（通常、細胞表面についている）とＴＮＦ−α（これも細胞表面についている）との間に機能の相乗作用が存在している可能性があることを指摘されている。したがって、ばあいによっては、これら両リガンドを細胞表面の同じ場所で中和することが望ましい。すなわちかような混合アフィニティー受容体は、ＴＮＦがその受容体に結合するのとＦＡＳ受容体リガンドがその受容体に結合するのをともに遮断することができる。したがって、これら混合アフィニティー受容体は、ＴＮＦでＦＡＳ受容体リガンド両者の作用が望ましくないような状態（前記事項参照）を治療するのに用いる医薬組成物に有効成分として使用することができる。
同様に、本発明の可溶性オリゴマーのＴＮＦ受容体とＦＡＳ受容体および混合ＴＮＦ受容体／ＦＡＳ受容体オリゴマーについて先に述べた方向に沿って、他の受容体またはその混合物、とくにＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリーの他のメンバーのいずれかの受容体に対する可溶性オリゴマー受容体を製造することができる。このばあい、各種受容体の細胞外ドメインのいずれかを、前記自己会合性細胞内領域もしくはその部分に、または自己会合を行なうことができる該スーパーファミリーのメンバーのいずれかの他の細胞内ドメインに融合させることができる。
本明細書に述べる本発明の組換えタンパク質のいずれかの発現は、適当な発現ベクターを用いて真核細胞（たとえば酵母、昆虫細胞または哺乳類の細胞）内で行なうことができる。当該技術分野で公知の方法を利用できる。
たとえば、前記方法のいずれかでえられるタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、当該技術分野で公知の方法で適当に構築した発現ベクター中に挿入することができる（サムブルック（Sambrook）ら（１９８９年））。二本鎖ｃＤＮＡは、プラスミドベクターに、ホモポリマー・テーリング法（homopolymeric tailing）または合成ＤＮＡリンカーもしくは平滑末端連結法を使用して行なう制限連結法で連結する。ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ分子を連結し、望ましくない結合はアルカリホスファターゼで処理することによって回避する。
所望のタンパク質を発現できるように、発現ベクターは、遺伝子を発現してタンパク質を産生できるような方式で所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結された、転写と翻訳を調節する情報を有する特異的ヌクレオチド配列を含有していなければならない。第一に、遺伝子は、転写されるため、ＲＮＡポリメラーゼが認識可能なプロモーターが先行していなければならず、そのプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合して転写過程が開始される。各種のプロモーターが使用されているが、異なる効率で作用する（強力なプロモーターと弱いプロモーターがある）。プロモーターは原核細胞と真核細胞とでは異なっている。
本発明に用いることができるプロモーターとしては、いずれも構成プロモーターであるが、バクテリオファージΔのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターおよびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなど、または誘導プロモーターのたとえば、バクテリオファージΔの右と左の主要プロモーター（ＰLおよびＰR）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＪ、ｏｍｐＦおよびｇａ１の諸プロモーターもしくはｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーターなどを含む原核プロモーターがある（グリック  ビーアール（Glick.B.R.）（１９８７年））。多量のｍＲＮＡを生成させるために強力なプロモーターを使用するのに加えて、原核細胞内で高レベルの遺伝子発現を達成するため、リボソーム結合部位を用いてｍＲＮＡの有効な翻訳を確実に行なう必要がある。その一例は、開始コドンから適当な位置に配置されかつ１６Ｓ  ＲＮＡの３′−末端配列に相補的なシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）である。
真核宿主のばあいは、宿主の性質によって異なる転写と翻訳の調節配列（regulatory sequewe）が用いられる。これらの調節配列は、調節シグナルが高レベルの発現を行なう特定の遺伝子と結合しているばあい、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、シミアンウィルスなどのようなウィルスの起源由来の配列である。その例は、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。転写開始調節シグナルとしては、遺伝子類の発現を調節できるように抑制と活性化を行なえるものを選択する。
本発明の融合生成物のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列は、所望の遺伝子配列を宿主細胞に組込むことができる作動可能に連結された転写および翻訳の調節シグナルを有するベクターに挿入される。導入されたＤＮＡで安定して形質転換された細胞は、発現ベクターを含有している宿主細胞を選択することができる１または複数のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、ホトトロフィー（phototrophy）のため栄養要求性宿主に、たとえば抗生物質または銅のような重金属などの生物致死剤に対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結できるか、または同じ細胞中にコントランスフェクションによって導入することができる。本発明のタンパク質を最適に合成するには追加の要素が必要である。これらの要素としては、転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルがある。このような要素が組込まれているｃＤＮＡ発現ベクターとしてはオカヤマ、エイチ（Okayama,H.）（１９８３年）の報告に記載されている。
好ましい実施態様で、導入されるＤＮＡ分子は、受容宿主内で自律複製を行なうことができるプラスミドまたはウィルスベクター中に組入れられる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択するばあいに重要な因子は、ベクターを含有する受容細胞が認識されて、そのベクターを含有していない受容細胞から選別される容易さ；特定の宿主内で要求されるベクターのコピーの数；および異なる種の宿主細胞間をベクターが「シャトル」できることが望ましいかどうかということである。
好ましい原核ベクターとしては、大腸菌中で複製できるようなプラスミドで、たとえばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４など（マニアティス（Maniatis））ら（１９８２年）およびサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年））；ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などのようなバチルスのプラスミド（グリクザン  ティン（Gryczan,T.）（１９８２年）ｐＬＩ１０１を含むストレプトミセスのプラスミド（ケンダル  ケー  ジェイ（Kendall,K.J.）ら（１９８７年））、φＣ３１のようなストレプトミセスのバクテリオファージ「シックスス  インターナショナル  シンポジウム  オン  アクチノミセタルス  バイオロジィ（Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology）」（１９８６年）中のチャター  ケー  エフ（Chater,K.F.）ら）；およびシュードモナスのプラスミド（ジョン  ジェイ  エフ（John,J.F.）ら（１９８６年）およびイザキ  ケー（Izaki,K.）（１９７８年））がある。好ましい真核プラスミドとしてはＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２ミクロン・サイクルなどまたはその誘導体がある。このようなプラスミドは当該技術分野で公知である（ボットステイム  ディー（Botsteim,D.）ら（１９８２年）；「ザ  モレキュラー  バイオロジィ  オブ  ザ  イースト  サッカロミセス：ライフ  サイクル  アンド  インヘリタンス（The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance）」（１９８１年）、ブローチ、ジェイ  アール（Broach,J.R.）；ブローチ、ジェイ  アール（Broach,J.R.）（１９８２年）；ボロン、ディーピー（Bollon,D.P.）ら（１９８０年）；「セル  バイオロジィー：ア  コンプレヘンシブ  トリーティス（Cell Biology:A Comprehensive Treatise）Vol.3ジーン  エクスプレッション（Gene Expression）」（１９８０年）、マニアティス  ティー（Maniatis,T.）；およびサムブルック（Sambrook）ら（１９８９年）。
前記構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現に用いるために調製されたならば、そのＤＮＡ構築物は、各種の適切な方法、すなわち形質転換、トランスフェクション、接合、原形質体融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、直接顕微注射法などのいずれかによって適当な宿主細胞中に導入することができる。
本発明に用いる宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい原核宿主としては、大腸菌、バシラス（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、サルモネラ（Salmonella）属、セラチア（Serratia）属などの細菌がある。最も好ましい原核宿主は大腸菌である。とくに重要な細菌宿主は、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ-、λ-、原栄養性（ＡＴＣＣ  ２７３２５））、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）もしくはセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）のような腸内細菌および各種のシュードモナス（Pseudomonaｓ）属の種の細菌である。このような条件下では、タンパク質はグリコシル化されない。原核宿主は発現プラミド中のレプリコンおよび制御配列と相容性でなければならない。
好ましい真核宿主は、哺乳類の細胞、たとえばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。なぜならばこれらの宿主は、正しい折りたたみまたは正しい部位でのグリコシル化を含めて、タンパク質分子に翻訳後の修飾を行なうからである。また酵母細胞はグリコシル化を含めて翻訳後のペプチド修飾を実施することができる。酵母中で所望のタンパク質を産生させるのに利用できる強力なプロモーター配列と高コピー数のプラスミドを用いるいくつかの組換えＤＮＡ戦略がある。酵母は、クローニングされた哺乳類の遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレ−ペプチド（pre-peptide））を分泌する。
ベクターを導入したのち、宿主細胞は、ベクターを含有する細胞を選択して増殖させる選択培地で増殖させる。クローニングされた遺伝子配列を発現させると所望のタンパク質が産生される。
組換えタンパク質の精製はこの目的のための公知の方法のいずれか１つで実施される。すなわち、抽出法、沈降法、クロマトグラフィー、電気泳動法などを含む通常の方法である。本発明のタンパク質を精製するのに優先的に用いられるその後の精製法は抗ＴＮＦ受容体モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーである。なおこの抗体はカラム内に入っているゲル基材上に生成させて固定化される。組換えタンパク質を含有する不純物含有製剤を該カラムに通過させる。該タンパク質は特異的抗体によってカラムに捕捉され、一方不純物は通過する。洗浄後、該タンパク質は、ｐＨまたはイオン強度を変化させることによってゲルから溶離させる。
「塩類」という用語は本明細書で用いるばあい（前記事項参照）、当該技術分野で公知の方法で形成される、本発明のタンパク質のカルボキシル基の塩類とアミノ基の酸付加塩類の両者を意味する。カルボギシル基の塩としては、たとえばナトリウム塩、カルシウム塩のような無機塩ならびに、トリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジンのようなアミンとで形成されるような有機塩基との塩である。酸付加塩としてはたとえば鉱酸との塩および有機酸との塩がある。
「機能誘導体」という用語は、本明細書で使用するばあい、残基またはＮ末端もしくはＣ末端の基の側鎖として存在する官能基から当該技術分野で公知の方法で製造される誘導体を含み、これら誘導体は、依然として薬学的に許容されうる、すなわちタンパク質の活性を破壊せず、かつそれを含有する組成物に毒性を付与しないかぎり本発明に含まれる。これらの誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステルもしくはアミド、ならびにアシル部分（たとえばアルカノイル基もしくは炭素環式アロイル基）で形成された、遊離ヒドロキシルのＯ−アシル誘導体の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体がある。
「画分（fraction）」という用語は本明細書で用いるばあい、受容体の一部もしくは部分（受容体の細胞内もしくは細胞外のドメイン）または受容体の細胞内ドメインに結合するタンパク質の一部もしくは部分を意味する。ただしそのタンパク質はその生物活性を保持している。
前記のように本発明は、薬学的に許容されうる担体、および各種記載した本発明の有効成分またはその塩、機能誘導体もしくはこれらのものの混合物を含んでなる各種の医薬組成物に関する。これらの組成物は本明細書に記載の状態のいずれかに使用可能であり、たとえば、敗血症性ショック、悪液質、移植片対宿主反応、リウマチ様関節炎のような自己免疫症状などの症例のような内因的ＴＮＦが過剰に産生される症例がある。投与法は、類似の薬剤に許容されている投与法のいずれかであり、治療される状態によって決まる。たとえば本発明の組成物をＴＮＦ作用を阻害するのに使うばあい、敗血症性ショックの症例には静脈注射で投与し、またはリウマチ様関節炎の症例では局所注射で（たとえばひざの中へ）投与し、または注入法などで連続的に投与される。また本発明の組成物は、たとえば、癌もしくはウィルス疾患の治療のばあいのように過剰量（過剰投与量）のＴＮＦの外因的投与で起こるＴＮＦ中毒の症例にも使用できる。
本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質またはその誘導体を、生理的に許容されうる担体、安定剤および添加剤と混合することによって投与用に製造され、そしてたとえば投与バイアルびん中で凍結乾燥することによって投与剤形で製造される。投与される有効化合物の量は、投与経路、治療する疾患および患者の症状によって決まる。たとえばリウマチ様関節炎の炎症症状の症例のばあいの局所注射は、敗血症性ショックの症例のばあいの静脈注射より、体重基準の有効成分の量を少なくする必要がある。
本発明の他の態様は以下の実施例によって明らかになるであろう。
本発明を、以下の実施例と添付図面でさらに詳細に説明するが、これら実施例と図面は本発明を限定するものではない。
実施例１
ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインに結合するタンパク質のクローニングならびに単離
ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣおよびｐ７５ＩＣ）と相互に作用（interacting）するタンパク質を単離するために、酵母のツー・ハイブリッド系（the yeast two-hybrid system）を使用した（フィールズおよびソング、１９８９年）。
簡潔に言うと、このツー・ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインという２つの別個のドメインをもつ、たとえばＧＡＬ４などの真核生物の転写活性化因子（transcriptional activator）の修復によりインビボで特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための、酵母にもとづく遺伝子分析である。前記ドメインは、発現し互いに結合して修復されたＧＡＬ４タンパク質を形成すると、上流の活性化配列と結合することができ、ついでたとえばＬａｃＺまたはＨＩＳ３などのその発現が容易に培養した細胞中で観察されるレポータ遺伝子（reporter gene）の発現をコントロールするプロモーターを活性化する。この系において、候補となる相互に作用するタンパク質の遺伝子は別々の発現ベクターでクローニングされる。一方の発現ベクターでは、１つの候補のタンパク質の配列はＧＡＬ４ＤＮＡと結合するドメインの配列と同時にクローニングされてＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとともにハイブリッドタンパク質を生成し、他方のベクターでは、２番目の候補のタンパク質の配列はＧＡＬ４活性化ドメインの配列と同時にクローニングされてＧＡＬ４活性化ドメインとともにハイブリッドタンパク質を生成する。つぎに２つのハイブリッドベクターは、上流のＧＡＬ４結合部位の制御下にあるｌａｃＺまたはＨＩＳ３レポータ遺伝子を有する酵母の宿主株へ同時形質転換される。２つのハイブリッドタンパク質が発現し、互いに相互作用できるこれらの形質転換された宿主細胞（同時形質転換体）のみが前記レポータ遺伝子を発現することができるであろう。ｌａｃＺレポータ遺伝子のばあい、この遺伝子を発現する宿主細胞はＸ−ｇａｌを培養物に添加したときに青色を呈するだろう。したがって、青色のコロニーは２つのクローニングされた候補タンパク質が互いに相互作用することができるという事実を示している。
このツー・ハイブリッド系を使用して、細胞内ドメインｐ５５ＩＣおよびｐ７５ＩＣをベクターｐＧＢＴ９（ＧＡＬ４ＤＮＡの結合配列を担持する、クローンテック（CLONTECH）社、アメリカ合衆国より入手。以下参照）に別々にクローニングし、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質を作製した（同様に、細胞内ドメインであるＦＡＳ−ＩＣおよび５５ＩＣの部分、すなわち５５ＤＤもまたｐＧＢＴ９にクローニングし、ほかのＩＣ結合タンパク質を単離するために使用した。以下の実施例３参照）。ｐ５５ＩＣおよびｐ７５ＩＣをｐＧＢＴ９にクローニングするために、ｐ５５ＴＮＦ受容体（スカール（Schall）ら、１９９０年）およびｐ７５ＴＮＦ受容体（スミス（Smith）ら、１９９０年）の全長のｃＤＮＡ配列をコードするクローンを用い、以下のようにして細胞内ドメイン（ＩＣ）を切り取った。ｐ５５ＩＣを酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて切り取り、ついでｐ５５ＩＣ配列を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を標準的な手順により単離し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いマルチクローニング部位領域（ＭＣＳ）にて開環したｐＧＢＴ９ベクターに挿入した。ｐ７５ＩＣを酵素ＢｓｐＨＩおよびＳａｌＩを用いて切り取り、ついでｐ７５ＩＣ配列を含むＢｓｐＨＩ−ＳａｌＩ断片を標準的な手順により単離し、クレノウ酵素を用いて埋め（filled-in）、ＳｍａＩおよびＳａｌＩを用いて開環したｐＧＢＴ９ベクターに挿入しうる断片を生成した。
ついで前記ハイブリッド（キメラ）ベクターを、ＧＡＬ４の活性化ドメインを有するｐＧＡＤ  ＧＨベクターにクローニングされたヒトＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーとともにＨＦ７ｃ酵母宿主株にコトランスフェクトした（別々に、一方のコトランスフェクションはｐ５５ＩＣハイブリッドベクターとともに、他方のコトランスフェクションはｐ７５ＩＣハイブリッドベクターとともに行なった）（前記のすべてのベクター、すなわちｐＧＢＴ９およびＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーを有するｐＧＡＤ  ＧＨならびに酵素株はマッチメーカーのツー・ハイブリッド・システム（MATCHMAKER Two-Hybrid System）、＃ＰＴ１２６５−Ｉの一部としてクローンテックラボラトリーズ社（Clontech Laboratories. Inc.）、アメリカ合衆国より購入した。）。コトランスフェクトした酵母をヒスチジン欠乏培地（Ｈｉｓ-培地）におけるそれらの増殖能力で選択した（増殖するコロニーは陽性の形質転換体であることを示す）。ついで選択された酵母クローンを、ｌａｃＺ遺伝子を発現するそれらの能力、すなわちそれらのＬＡＣＺ活性について試験した。この試験はｌａｃＺ遺伝子によりコードされる酵素であるβ−ガラクトシダーゼによって代謝され青色を呈する生成物を形成するＸ−ｇａｌを培養培地に添加することにより行なわれた。したがって、青色のコロニーは活性なｌａｃＺ遺伝子を示すことができる。ｌａｃＺ遺伝子の活性のためにはＧＡＬ４転写活性化因子が形質転換したクローン中に活性な形態で存在すること、すなわち一方の前記ハイブリッドベクターによりコードされるＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインが、他方のハイブリッドベクターによりコードされたＧＡＬ４活性化ドメインと適切に組み合わさることが必要である。そのような組み合わせは、それぞれのＧＡＬ４ドメインと融合した２つのタンパク質が互いに安定して相互に作用する（結合する）ことができるときのみ可能である。したがって、単離されたＨｉｓ+および青色（ＬＡＣＺ+コロニー）は、ｐ５５ＩＣをコードするベクターおよび、ｐ５５ＩＣと安定して結合することができるヒトＨｅＬａ細胞起源のタンパク質生成物をコードするベクターでコトランスフェクトされているコロニー、またはｐ７５ＩＣをコードするベクターおよびｐ７５ＩＣと安定して結合することができるヒトＨｅＬａ細胞起源のタンパク質生成物をコードするベクターでトランスフェクトされているコロニーである。
前記Ｈｉｓ+、ＬＡＣＺ+酵母コロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離し、標準的な手順により大腸菌ＨＢ１０１株へ電気穿孔法により導入し、続いてＬｅｕ+およびアンピシリン耐性形質転換体（これらの形質転換体はＡｍｐRおよびＬｅｕ2をコードする配列の両方を有するハイブリッドｐＧＡＤ  ＧＨベクターを有するものである）を選択した。それゆえそのような形質転換体は、ｐ５５ＩＣまたはｐ７５ＩＣに結合することができる新規に同定されたタンパク質をコードする配列を有するクーロンである。ついでプラスミドＤＮＡを形質転換した大腸菌から単離し、
（ａ）前記プラスミドをオリジナルの細胞内ドメインハイブリッドプラスミド（ｐ５５ＩＣまたはｐ７５ＩＣ配列のいずれか１つを有するハイブリッドｐＧＴＢ９）とともに前記した酵母ＨＦ７株に再度形質転換する。コントロールとして、関係のないタンパク質をコードする配列を有するベクター、たとえばｐＡＣＴ−ラミン（pACT-lamin）またはｐＧＢＴ９のみを、ｐ５５ＩＣ結合タンパク質またはｐ７５ＩＣ結合タンパク質をコードするプラスミドとの同時形質転換に使用する。ついで同時形質転換した酵母をＨｉｓ-培地のみまたは異なるレベルの３−アミノトリアゾールを含むＨｉｓ-培地上での増殖について試験すること、および
（ｂ）前記プラスミドＤＮＡ、オリジナルの細胞内ドメインハイブリッドプラスミドおよび（ａ）に記載したコントールのプラスミドをＳＦＹ５２６株である酵母宿主細胞に形質転換し、ＬＡＣＺ+活性（β−ｇａｌ形成の効率、すなわち青色の呈色）を測定すること
により再試験した。
前記試験の結果により、Ｈｉｓ-培地におけるコロニーの増殖パターンは、コロニーの色による評価としてのＬＡＣＺ活性のパターンと同一である、すなわちＨｉｓ+コロニーはＬＡＣＺ+でもあるということが判明した。さらに液体培養（好ましい培養条件）におけるＬＡＣＺ活性を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合および活性化ドメインハイブリッドを、ＨＦ−７酵母宿主細胞よりも高いＧＡＬ４転写活性化因子によるＬＡＣＺ誘導能を有するＳＦＹ５２６酵母宿主にトランスフェクトしたのちに評価した。
前記コトランスフェクションの結果を以下の表１に示す。前記の結果から、多くのタンパク質がｐ５５ＩＣまたはｐ７５ＩＣと結合することができること、すなわちｐ５５ＩＣと結合する５５．１１と名付けられたタンパク質、ｐ７５ＩＣと結合する７５．３および７５．１６であることを見出した。すべてのｐ５５ＩＣおよびｐ７５ＩＣ結合タンパク質は、前記酵母ツー・ハイブリッド解析系におけるプラスミドｐＧＡＤ  ＧＨのＧＡＬ４活性化ドメイン配列に融合したＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡ配列によってすべてコードされる真正のヒトタンパク質である。
興味深いことに、ｐ５５ＩＣ自身の断片、すなわち５５．１および５５．３と名付けられたタンパク質がｐ５５ＩＣと結合することができることも見出した。これらは以下の実施例２においても論じる。
0003966387.tif 000002
前記表１において、プラスミドならびにＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインおよびＧＡＬ４活性化ドメインをコードするハイブリッドは以下のとおりである。
ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド
ｐＧＢＴ９−ＩＣ５５：全長のｐ５５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）
ｐＡＣＴ−ラミン：関係のないタンパク質であるラミン
ｐＧＢＴ９：ベクター単独
ｐＧＢＴ９−ＩＣ７５：全長のｐ７５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ７５ＩＣ）
活性化ドメインハイブリッド
５５．１および５５．３はｐ５５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインの断片に対応する。
５５．１１はｐ５５−ＴＮＦ受容体と会合する新規なタンパク質である。
７５．３および７５．１６はｐ７５−ＴＮＦ受容体と会合する新規なタンパク質である。
ついで前記の新規なｐ５５ＩＣ結合タンパク質ならびにｐ７５ＩＣ結合タンパク質である５５．１１ならびに７５．３および７５．１６をコードする前記のクローニングしたｃＤＮＡについて、標準的なＤＮＡ配列決定手順を使用して配列を決定した。これらすべてのタンパク質をコードする配列の部分配列は図１ａ〜ｃに表わされ、図１（ａ）はタンパク質５５．１１をコードするｃＤＮＡの配列を示し、図１（ｂ）はタンパク質７５．３をコードするｃＤＮＡの部分配列を示し、図１（ｃ）はタンパク質７５．１６をコードするｃＤＮＡの部分配列を示している。図１（ｄ）は図１（ａ）のヌクレオチド配列から推測したタンパク質５５．１１の推測されるアミノ酸配列を示す。
しかしながら、５５．１１のタンパク質をコードするｃＤＮＡの部分配列は、カーン（Khan）ら（１９９２年）によってもヒト脳ｃＤＮＡの配列決定ならびに物理的および遺伝的なマッピングをするための新規な迅速かつ正確な方法の確立に向けられたヒト脳ｃＤＮＡの配列の研究において報告されていることに注意すべきである。しかしながら、カーンらは５５．１１のｃＤＮＡの配列にコードされるタンパク質の機能またはそのほかの特性に関する情報をまったく提供しておらず、そのような機能的またはそのほかの分析はカーンらの研究に含まれない。
５５．１１タンパク質の解析および特徴づけ
（ａ）一般的な手順および材料
(i)５５．１１のｃＤＮＡのクローニング
タンパク質５５．１１のｃＤＮＡの解析（たとえばノーザン解析、以下参照）において、ツー・ハイブリッドスクリーン手順によりクローニングした前記５５．１１のｃＤＮＡは、アミノ酸３０９〜９００（図１（ｄ）参照）をコードするヌクレオチド９２５〜２８６３（図１（ａ）参照）を有する５５．１１の部分的なｃＤＮＡのみを表わしていることが明らかになった。５５．１１のｃＤＮＡの残りの部分（アミノ酸１〜３０８（図１（ｄ））をコードするヌクレオチド１〜９２４（図１（ａ）））を標準的な手順、すなわちヒト胎児の肝臓のｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるクローニング（詳細については以下参照）によりえた。５５．１１の全長の（full）ヌクレオチド配列（図１（ａ））をジデオキシ・チェーン・ターミネーション法（dideoxy chain termination method）により両方向において決定した。
(ii)ツー・ハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ発現試験
β−ガラクトシダーゼ発現試験を、いくつかの前記試験において、ＶＰ１６の活性化ドメインを含むｐＶＰ１６ベクターをＧａｌ４活性化ドメインベクターであるｐＧＡＤ−ＧＨのかわりに使用したことを除いて、前記と同様にして行なった。ｃＤＮＡ挿入物によりコードされるタンパク質における残基の番号づけはスイス−プロット・データ・バンク（Swiss-Prot data bank）におけるものと同じである。欠失変異体をＰＣＲにより生産し、点変異をオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（oligonucleotide-directed mutagenesis）により生産した（クンケル（Kunkel），１９９４年）。
(iii)ノーザン解析
全ＲＮＡをトリ・リエージェント（TRI REAGENT）（モレキュラー  リサーチ  センター（Molecular Research Center, INC.）社、シンシナチ、オハイオ州（Oh.）、アメリカ合衆国）を用いて単離し、ホルムアルデヒド／ホルムアミド緩衝液中で変性させ、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにより電気泳動し、標準的な技術を用いて１０×ＳＳＰＥ緩衝液中のジーンスクリーン・プラス・メンブレン（Gene Screen Plus membrane）（デュポン（Dupont）社、ウィルミントン、ディーイー（De.）、アメリカ合衆国）にブロットした。ブロットを５５．１１の部分的なｃＤＮＡ（前記参照、ヌクレオチド９２５〜２８６３）とハイブリダイズさせ、ランダム−プライム・キット（random-prime kit）（ベーリンガー  マンハイム  バイオケミカ（Boehringer Mennheim Biochemica）社、マンハイム（Mennheim）、ドイツ連邦共和国）を用い放射性標識し、厳重（stringently）に洗浄した。オートラジオグラフィーを１週間かけて行なった。
(iv)ＨｅＬａ細胞における５５．１１のｃＤＮＡの発現および５５．１１タンパク質のｐ５５−ＩＣのグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質との結合
グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のｐ５５−ＩＣとの融合物（ＧＳＴ−ｐ５５ＩＣ）およびアミノ酸３４５より下流を切断（truncated）したｐ５５−ＩＣとの融合物（ＧＳＴ−ｐ５５ＩＣ３４５）を生産し、以下の実施例２に記載したようにグルタチオン−アガロース・ビーズに吸着させた（スミス（Smith）およびコルコラン（Corcoran）、１９９４年；フランギオーニ（Frangioni）およびニール（Neel）、１９９３年参照）。５５．１１のｃＤＮＡ（１〜２８６３ヌクレオチド、すなわち全長の５５．１１のｃＤＮＡ）、ＦＬＡＧ−５５．１１のｃＤＮＡおよびルシフェラーゼのｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞中で発現させた。ＦＬＡＧ−５５．１１は、５５．１１タンパク質における３０９〜９００の残基間に広がる領域（ツー・ハイブリッド・スクリーン（two hybrid screen）により独自にクローニングされた、５５．１１の部分的なｃＤＮＡ（ヌクレオチド９２５〜２８６３））であり、ＦＬＡＧオクタペプチド（イーストマン  コダック(Eastman Kodak)社、ニューヘーブン、シィーティー（Ct.）、アメリカ合衆国）にＮを介して結合している。融合タンパク質の発現は、テトラサイクリンでコントロールされるトランス作用因子（tetracycline-controlled transactivator）を発現するＨｅＬａ細胞クローン中の、テトラサイクリンでコントロールされる発現ベクター（tetracycline-controlled expression vector）（ＨｔＴＡ−１）を用いて達成した（以下の実施例２ならびにゴッセン（Gossen）およびバヤード（Bujard）、１９９２年参照）。［35Ｓ］メチオニンおよび［35Ｓ］システイン（デュポン社、ウィルミントン、ディーイー、アメリカ合衆国およびアマシャム（Amersham）社、バッキンガムシャー、英国）を用いた発現タンパク質の代謝的な標識化（metabolic labeling）、ＨｅＬａ細胞の溶解、免疫沈降および標識したタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質との結合を、細胞溶解緩衝液中に０．１％ではなく０．５％ノニデェット（Nonidet）Ｐ−４０が存在したことを除いて、以下の（実施例２）の記載と同様に行なった。５５．１１およびＦＬＡＧ−５５．１１の免疫沈降は、アミノ酸３０９〜９００のあいだに広がる５５．１１の領域を含むＧＳＴ融合タンパク質に対するウサギ抗血清（１：５００に希釈）およびＦＬＡＧオクタペプチドに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍ２、イーストマン  コダック社、細胞溶解液に５μｇ／ｍｌ）を用いて達成した。
（ｂ）形質転換した酵母内での５５．１１タンパク質のｐ５５−ＩＣとの結合
本研究においては、５５．１１およびｐ５５ＩＣのあいだの結合の特徴、とくにこの結合に関係するこれらのタンパク質双方の領域を確認することが求められていた。この目的のために、「ＤＮＡ結合ドメイン」構築物における様々な全長のｐ５５ＩＣおよびｐ５５ＩＣの欠失変異体（以下の実施例２も参照）を、ベクターＧＡＬ４ＡＤおよびＶＰ１６ＡＤ中で部分的な５５．１１の配列（残基３０９〜９００、独自に単離）が「活性化ドメイン」に融合した構築物にコードされる部分的な５５．１１タンパク質である「餌食（preys）」に結合する「餌（baits）」として用いた前記ツー・ハイブリッド手順を使用した。さらに、様々な５５．１１の欠失変異体を構築し、ＧＡＬ４ＡＤベクター中で「活性化ドメイン」と融合した（たとえば、残基３０９〜６８０および４５７〜９００のみを有する５５．１１の変異体）。様々な「結合ドメイン」構築物の様々な「活性化ドメイン」構築物との結合をトランスフェクトしたＳＦＹ５２６酵母細胞中で試験した。前記結合をツー・ハイブリッド  β−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイにより評価した。関係のないタンパク質、ＳＮＦ１およびＳＮＦ４をそれぞれ、「結合ドメイン」および「活性化ドメイン」構築物に対するポジティブ・コントロールとして使い、空（empty）のＧａｌ４（ｐＧＡＤ−ＧＨ）およびＶＰ１６（ｐＶＰ１６）ベクターを「活性化ドメイン」構築物に対するネガティブ・コントロールとして使い、空のＧａｌ４（ｐＧＢＴ９）ベクターを「結合ドメイン」構築物に対するネガティブ・コントロールとして使った。分析の結果を以下の表２に示し、表２における記号「＋＋＋」および「＋＋」はそれぞれ分析開始後２０〜６０分以内の強い発色を示し（正の結合結果）、「−」は分析開始後２４時間以内に発色がないこと（負の結果）を示す。表中の空欄は結合分析を調べていないことを示す。
0003966387.tif 000003
前記表２に示された結果より、５５．１１は、ｐ５５−ＩＣの「死滅ドメイン（death domein）」（残基３２８〜４２６）とは異なる部位でｐ５５−ＩＣと結合することが結論づけられうる。
５５．１１タンパク質は、切断されていないｐ５５−ＩＣよりも効果的に、死滅ドメインが削除されている切断されたｐ５５−ＩＣ（表２における構築物２０６〜３２８）と結合した。また、さらにＣ末端が切断された構築物（構築物２０６〜３０８）ならびに死滅ドメインおよび膜に近い部分がともに削除された構築物（構築物２４３〜３２８）とも結合した。しかしながら、５５．１１タンパク質はＮ末端からアミノ酸２６６までが切断された構築物とは結合しなかった（表２）。これらの知見により、５５．１１に対する結合部位はｐ５５−ＩＣの残基２４３〜３０８のあいだに広がる領域に位置し、この結合部位のＮ末端は残基２４３〜２６６のあいだにあることが示されている。
５５．１１のｃＤＮＡを、Ｇａｌ４活性化ドメインを含む独自にクローニングされた「餌食」構築物から、ＶＰ１６活性化ドメインを含むプレイ構築物に移すことにより、５５．１１タンパク質のｐ５５−ＩＣとの結合効率は減少しなかった（表２）。したがって、この結合に関係する１または複数の構造は５５．１１分子に属し、５５．１１の活性化ドメインとの融合部位とは関係していないと思われる。
しかしながら、５５．１１のｐ５５−ＩＣとの結合は、そのＣ末端（５５．１１構築物３０９〜６８０）またはＮ末端（５５．１１構築物４５７〜９００）のいずれかにおける限定された切断によってさえも廃止された（残基３０９は、ツー・ハイブリッド・スクリーンにおいて独自に単離された部分的なｃＤＮＡクローンによってコードされる５５．１１タンパク質における最初の残基である）。
５５．１１は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの３つの受容体（ｐ７５受容体、Ｆａｓ／ＡＰＯ１およびＣＤ４０）ならびにたとえばラミンおよびサイクリンＤ（cyclin D）（データは示していない）などのほかのタンパク質を含むほかのタンパク質に結合しなかったので、５５．１１およびｐ５５−ＩＣ間にみられた結合は特異的であるように思われる。ヒトＦＡＳ受容体（残基１７５〜３１９）、ＣＤ４０（残基２１６〜２７７）およびｐ７５−ＴＮＦ受容体（残基２８７〜４６１）といった、ここで試験したほかのＴＮＦ／ＮＧＦ受容体タンパク質の細胞内ドメインを含む部分も調べたが、５５．１１に結合したものはなかった（データは示していない）ことに注意すべきである。
（ｃ）プローブとして５５．１１のｃＤＮＡを用いたいくつかの細胞系由来のＲＮＡのノーザン解析および全長の５５．１１のｃＤＮＡのクローニング
試験した細胞系は、ヒト上皮腫（human epithelial carcinoma）由来のＨｅＬａ細胞、急性リンパ芽球Ｔ細胞性白血病（acute lymphoblastic T cell leukemia）由来のＣＥＭ細胞、急性Ｔ細胞性白血病由来のジャーカット（Jurkat）細胞および肝細胞腫（hepatocellular carcinoma）由来のＨｅｐＧ２細胞であった。独自に単離した５５．１１のｃＤＮＡ（ヌクレオチド９２５〜２８６３をプローブとして使用した。サンプルはＲＮＡ１０μｇ／レーン（lane）から構成された。ノーザン解析の結果を、ノーザンブロットの再現図である図２に示す。
したがって、図２から、プローブとして５５．１１のｃＤＮＡを使用したノーザン解析により、いくつかの細胞系において、独自に単離した５５．１１のｃＤＮＡであるｃＤＮＡ（２ｋＢ）よりも大きい、約３ｋＢの単一のハイブリダイズ転写物（single hybridizing transcript）が明示されたことは明らかである。５５．１１の配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲにより約１ｋＢの長さを有する５′にのびる配列（5′ extending sequence）をクローニングした。独自にクローニングしたｃＤＮＡの長さを有するこの５′にのびる配列の長さの合計は５５．１１の転写物の長さに近い。これらの部分をともに含む３ｋＢのｃＤＮＡは、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中で効果的に発現し（以下参照）、約８４ｋＤａのタンパク質を産生し、このことは、３ｋＢのｃＤＮＡは翻訳開始部位を含んでいることを示唆している。
（ｄ）インビトロでの５５．１１タンパク質のｐ５５−ＩＣの部分を含むＧＳＴとの融合タンパク質への結合
５５．１１が実際にｐ５５−ＩＣと結合することができることを確認し、この結合における酵母タンパク質の関係を除くために、細菌が産生したＧＳＴ  ｐ５５−ＩＣ融合タンパク質と、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞が産生した３ｋＢの５５．１１のｃＤＮＡ（５５．１１−全長）がコードするタンパク質との相互作用を研究した。この研究において、全長の５５．１１、ＦＬＡＧ−５５．１１（独自にクローニングした部分的なｃＤＮＡによりコードされる５５．１１の残基３０９〜９００であり、Ｎ末端でＦＬＡＧオクタペプチドと融合している）およびルシフェラーゼ（コントロール）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中で発現させ、［35Ｓ］メチオニンおよび［35Ｓ］システインを用いて代謝的に標識した。以下のタンパク質をＧＳＴと融合した：全長のｐ５５−ＩＣ（ＧＳＴ−ｐ５５−ＩＣ）およびＣ末端をアミノ酸３４５まで切断して「死滅ドメイン」（表２参照）の大部分を除去したｐ５５−ＩＣ（ＧＳＴ−ｐ５５−ＩＣ３４５）。ＧＳＴ単独をコントロールとして使った。トランスフェクトした細胞の溶解物を、全長の５５．１１タンパク質をＧＳＴ融合タンパク質との結合のために使用したときは５５．１１タンパク質に対する抗体を用い、またはＦＬＡＧ−５５．１１融合生成物をＧＳＴ融合タンパク質との結合に使用したときはＦＬＡＧオクタペプチドに対する抗体を用いて免疫沈降させた。前記タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１０％アクリルアミド）により分析し、続いてオートラジオグラフィーを行なった。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフィーの再現図を示す図３ＡおよびＢにおいて、図３Ａは全長の５５．１１タンパク質（５５．１１−全長）の様々なＧＳＴ融合タンパク質との結合を示し、図３ＢはＦｌａｇ−５５．１１融合生成物の様々なＧＳＴ融合タンパク質との結合を示している。図３Ａにおいて、一番右側のレーンには、全長の５５．１１のみでトランスフェクトし、抗５５．１１抗体（α５５．１１抗体）を用いて免疫沈降させた細胞の溶解物のコントロールの免疫沈降が示されている。図３Ｂにおいて、一番右側のバンドのレーンには、ＦＬＡＧ−５５．１１のみでトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ抗体（αＦＬＡＧ抗体）を用いて免疫沈降させた細胞の溶解物のコントロールの免疫沈降が示されている。
したがって、図３ＡおよびＢより、全長の５５．１１のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質はＨｅＬａ細胞中で発現することができ、全長のｐ５５−ＩＣを含む融合タンパク質（ＧＳＴ−ｐ５５ＩＣ）または死滅ドメインの大部分を欠く切断されたｐ５５−ＩＣを含む融合タンパク質と（ＧＳＴ−ｐ５５ＩＣ３４５）結合することが明らかである（図３Ａ）。全長の５５．１１タンパク質はＧＳＴ単独（コントロール）とは結合しなかった。同様に、５５．１１のはじめにクローニングされた部分的なｃＤＮＡによってコードされるＦＬＡＧオクタペプチドと融合したＨｅＬａ細胞で発現されたタンパク質（ＦＬＡＧ−５５．１１）はＧＳＴ−ｐ５５ＩＣおよびＧＳＴ−ｐ５５ＩＣ３４５とインビトロで結合したが、ＧＳＴとは結合しなかった（図３Ｂ）。それゆえ、前記結果は５５．１１は「死滅ドメイン」のｐ５５ＩＣ上流の領域、すなわちトランスメンブレンドメイン（transmembrane domain）により近いｐ５５−ＩＣの領域に結合することのさらなる証拠（前記（ｂ）参照）を提供する。
さらに、前記研究は、本発明にしたがい、５５．１１に対する抗体を首尾よく産生していることを説明している（図３Ａ）。
（ｅ）ヒト５５．１１の推定されるアミノ酸配列と下等生物に存在する関連タンパク質の推定されるアミノ酸配列との比較、および５５．１１タンパク質の配列の特徴
前記したように、本発明にしたがい、全長の５５．１１のｃＤＮＡがクローニングされ、配列が決定され（図１（ａ）のヌクレオチド配列参照）、ついで５５．１１の全長のアミノ酸配列をｃＤＮＡ配列から推定した（図１（ｄ）のアミノ酸配列参照）。データバンク（ゲンバンク（商標）／イーエムビーエル  データバンク（GenBankTM／EMBL DataBank）検索により、ヒト５５．１１のｃＤＮＡ配列の部分（受託番号Ｔ０３６５９、Ｚ１９５５９およびＦ０９１２８）およびマウスにおける相同物（homologue）（受託番号Ｘ８０４２２およびＺ３１１４７）は、ｃＤＮＡライブラリーの任意の配列決定（arbitrary sequencing）のなかで既に決定されていることが明らかになった。ヒトヘパトーマＨＣ１０細胞の培養物中に存在する５９６アミノ酸のヒトタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（受託番号Ｕ１８２４７）は５５．１１のｃＤＮＡ配列と類似している。しかしながら、このヘパトーマタンパク質は、５５．１１のＮ末端部分に相当するＮ末端部分（アミノ酸１〜２９７）を欠き、５５．１１における残基２９７〜３７７および残基６４８〜６６８に相当する領域において５５．１１とは異なる。データバンク検索により、５５．１１に対して非常に高い配列の相同性を有するタンパク質がサッカロミセス・セレブシエ（Saccharomyces cerevisiae）（酵母）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）（植物）およびカエノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）（蠕虫（worms））に存在することも明らかになった。したがって、５５．１１は進化論的に保存された機能を果たしていると思われる。酵母においては、ＤＮＡ配列が５５．１１のＤＮＡ配列に似ている２つの既知のタンパク質（塩基の読み取り枠（open reading frame）ＹＨＲ０２７ｃおよびＳＥＮ３）が存在する。両方のタンパク質の大きさは５５．１１の大きさに近い。ＹＨＲ０２７ｃはゲノムクローンの配列決定によってのみ知られており、一方ＳＥＮ３はｃＤＮＡとしてクローニングされている。５５．１１およびＹＨＲ０２７ｃ間の類似点は５５．１１およびＳＥＮ３間の類似点よりも非常に多いことが明らかであるけれども、ＳＥＮ３内の部位に類似している５５．１１内の部位は、ＹＨＲ０２７ｃに対する５５．１１の類似性の部位と相互に関係している。部分のみではあるけれども、アラビドプシス・サリアナおよびカエノルハブディティス・エレガンスのタンパク質からえられるＤＮＡ配列の情報により、酵母のＹＨＲ０２７ｃタンパク質と同様に５５．１１にこれらのタンパク質が類似していることがはっきりと示される。これら４つのタンパク質の中でこれまでに性質が明らかにされた唯一のタンパク質は、５５．１１に対する相同性が限られている酵母ＳＥＮ３である。ＳＥＮ３は、２０Ｓプロテアソーム（20S proteasome）の活性化因子のｐ１１２サブユニットの酵母における同等物として同定されている（２６Ｓプロテアソームのタンパク質分解コア（レックステイナー（Rechsteiner）ら、１９９３年およびデマルチノ（DeMartino）ら、１９９４年））（エム  アール  カルバートソン（M. R. Culbertson）およびエム  ホックストラッサー（M. Hockstrasser）、個人的な情報）。
図４には、ヒト５５．１１の推定されたアミノ酸配列と前記下等生物に存在する関連タンパク質との図式的な比較が示されている。図４において比較した配列は、５５．１１ｃＤＮＡ（図１（ｄ）参照）、サッカロミセス・セレブシエの８番目の染色体由来のコスミド内の塩基の読み取り枠（ＹＨＲ０２７ｃ）（ヌクレオチド２１２５３〜２４２３４、受託番号Ｕ１０３９９）；ＳＥＮ３、サッカロミセス・セレブシエのタンパク質のｃＤＮＡ（受託番号Ｌ０６３２１）；植物アラビドプシス・サリアナのタンパク質の部分的なｃＤＮＡ（受託番号Ｔ２１５００）および線虫カエノルハブディティス・エレガンスのタンパク質の部分的なｃＤＮＡ（受託番号Ｄ２７３９６）について予測されるアミノ酸配列である。５５．１１における「ＫＥＫＥ」配列は、実線で印をつけ、配列ＡＹＡＧＳ（ｘ）8ＬＬは破線で印をつけた。前記配列をジーシージー・パッケージ（GCG package）のパイルアップおよびプリティボックス・プログラム（PILEUP and PRETTYBOX programs）を使用して一列に配列した。直線化（alignments）を最大限にするために導入した隙間（gaps）をダッシュで示す。
ヒト５５．１１配列に存在するさまざまな配列の特徴またはモチーフ（motifs）に関して、以下のことが認められた。保存されたアミノ酸配列のモチーフは、リジン６１４およびグルタミン酸６３２のあいだに広がる反復した「ＫＥＫＥ」配列（図４における下線）を除いて、５５．１１によってコードされるタンパク質内には認められなかった。プロテアソーナル（proteasonal）なサブユニットおよびシャペロニン（chaperonins）を含む。多数のタンパク質に存在する前記「ＫＥＫＥ」配列はタンパク質複合体の会合を促進するかもしれない（リエイニ（Reaiini）ら、１９９４年）。配列ＡＹＡＧＳ（ｘ）8ＬＬは、５５．１１タンパク質において２度現れるが（部位４７９、５９０、図４参照）、この配列についての機能的な意味はまだ説明されていない。
（ｆ）５５．１１タンパク質との結合に関係するｐ５５ＩＣ領域の配列特徴
前記したように（（ｂ）および（ｄ）参照）、５５．１１タンパク質は、ｐ５５−ＩＣの残基２４３および３０８間の領域（この結合部位のＮ末端は残基２４３および２６６のあいだにある）と結合し、この領域は「死滅ドメイン」の上流でありかつｐ５５−ＴＮＦ受容体のトランスメンブレンドメインにより近い。５５．１１が結合するｐ５５−ＩＣ内のこの領域は、高い含量でプロリン、セリンおよびスレオニン残基を有している。しかしながら、この領域は、いくつかのほかのサイトカイン受容体中に存在するＲＰＭ１およびＲＰＭ２プロリンリッチモチーフ（RPM1 and RPM2 proline-rich motifs）を含んでいない（オニール（O′Neal）およびユ・リー（Yu-Lee）、１９９３年）。その欠失によりｐ５５受容体の５５．１１との結合が廃止される、残基２４３〜２６６のあいだに広がる領域（前記（ｂ）および（ｄ）ならびに表２参照）において、２つのセリンおよび２つのスレオニンのあとにプロリン残基が続き、これがこれらの残基をＭＡＰキナーゼ、ＣＤＣ２およびほかのプロリン依存キナーゼによるリン酸化の可能性のある部位にしている（セガール（Seger）およびクレブス（Krebs）、１９９５年）。受容体におけるこの部位のリン酸化が、その５５．１１タンパク質との結合に影響しているかも知れない。
タンパク質５５．１１およびそのｐ５５−ＩＣとの結合に関する前記記載すべてを考慮して、本発明にしたがい、ｐ５５−ＩＣの「死滅ドメイン」上流の異なる領域に結合する新規なタンパク質が見出されたことを結論づけることができる。そのような結合は、細胞死の誘導以外のＴＮＦが介する活性（TNF-mediated activities）に影響を及ぼすことができるかもしれない。５５．１１が結合する領域は、窒素酸化物シンターゼ（nitric oxide synthase）の誘導に関係することが既に示されており（タータグリア（Tartaglia）ら、１９９３年）、ＴＮＦによる中性スフィンゴミエリナーゼ（neutral sphingomyelinase）の活性化に関係するものと思われる（ウェイグマン（Wiegmann）ら、１９９４年）。したがって、５５．１１のｐ５５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）との会合（結合）は、(i)前記またはそのほかのＴＮＦの作用に対するシグナリング（signaling）、(ii)タンパク質の折りたたみまたはプロセッシング（processing）（５５．１１の２６Ｓプロテアソームのサブユニットに対する類似点より示唆される）もしくは(iii)ｐ５５−ＴＮＦ受容体の活性もしくは発現の調節に影響または関係する可能性がある。
実施例２
ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）の自己会合能力、細胞死を引きおこす能力、ｐ５５ＩＣのそのほかの特徴および活性、ならびに関連したＦａｓ／ＡＰＯ１受容体の細胞内ドメイン
前記実施例１に表わしたように、ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）はそれ自身に結合することができること、さらにはｐ５５ＩＣの断片、すなわちタンパク質５５．１および５５．３もｐ５５ＩＣと結合することができることがわかった。
ＴＮＦのｐ５５ＴＮＦ受容体との結合はこの受容体を有する細胞に細胞破壊作用（cytocidal effect）を導くことが知られている。さらに、この受容体の細胞外ドメインに対する抗体は、前記抗体による受容体の架橋の効果（effectivity）との相関関係において、前記抗体自身がこの効果を引きおこすことができる。
加えて、突然変異の研究（タータグリア（Tartaglia）ら、（１９９３年）、ブレークブッシュ（Brakebusch）ら、（１９９２年））により、ｐ５５受容体の機能はｐ５５受容体の細胞内ドメインの完全性（integrity）に依存していることが示された。それゆえ、ＴＮＦの細胞破壊作用に対するシグナリングの開始は、受容体の凝集によって強いられる２つまたはそれより多くのｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の会合の結果としておこることが示唆された。本発明による結果は、細胞内のｐ５５受容体の細胞内ドメインの発現は、トランスメンブレンまたは細胞内ドメインなしに、細胞死を引きおこすことを示すこの見解に対するさらなる証拠を提供する。そのような細胞内ドメインのないｐ５５受容体は、おそらくＴＮＦから独立して機能することができる能力の原因となる自己会合をすることが示される。全長のｐ５５受容体によるシグナリングはＴＮＦの刺激に依存するという事実は、この自己会合を減少または妨害する受容体のトランスメンブレンまたは細胞外ドメインの活性を反映することが示唆される。
ｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の自己会合する能力は、この受容体と相互に作用するエフェクタータンパク質をクローニングする試み（前記実施例１参照）において幸運にもに見出だされた。その目的のために、前記「ツー・ハイブリッド」技術を適用した。ｐ５５ＩＣと会合（結合）することを見出した新規タンパク質である５５．１１に加えて、ｐ５５受容体の細胞内ドメインの部分をコードするｃＤＮＡ配列を３つのほかのクローニングされたＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡが含み、ｐ５５−ＩＣが自己会合することができることを暗示していることを見出した。これらのクローンのなかの２つは同一で、アミノ酸３２８〜４２６をコードする挿入物を含んでいた（ｐ５５ＩＣのタンパク質断片５５．１をコードするクローン５５．１と名付けた）。３番目のものは、アミノ酸２７７〜４２６をコードする長い挿入物を含んでいた（ｐ５５ＩＣのタンパク質断片５５．３をコードするクローン５５．３と名付けた）。
さらに、細菌によって生産された２つのｐ５５ＩＣのキメラ、一方はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合したものと、他方はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したものとのインビトロでの相互作用を評価した。これらのキメラを標準的な方法により構築し、クローニングし、ついで発現させた。それらの発現に続いて、前記細菌により生産されたキメラタンパク質であるＧＳＴ−ＩＣ５５（Ｍｒ−５１ｋＤ）およびＭＢＰ−ＩＣ５５（Ｍｒ−６７ｋＤ）の互いの相互作用を測定することによりｐ５５受容体細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣ）の自己相互作用（self-interaction）を評価した。等量のＧＳＴ−ＩＣ５５キメラ（Ｆｉｇ．５におけるレーン１〜４のサンプル）またはＧＳＴ単独（Ｆｉｇ．５におけるレーン５〜８のサンプル）をグルタチオン−アガロースビーズ（シグマ（Sigma）社）に結合させ、ついで以下に示す緩衝溶液の１つのなかの等量のＭＢＰ−ＩＣ５５融合タンパク質とともにインキュベートした。
(i)緩衝液Ｉ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％  トライトン  Ｘ１００（Triton X100）、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、５％  グリセロール）。この緩衝液を図５のレーン１および５のサンプルに使用した。
(ii)ＭｇＣｌ2の代わりに５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液Ｉ。この緩衝液を図５のレーン２および６のサンプルに使用した。
(iii)１００ｍＭ  ＫＣｌの代わりに２５０ｍＭ  ＫＣｌを含む緩衝液Ｉ。この緩衝液を図５のレーン３および７のサンプルに使用した。
(iv)１００ｍＭ  ＫＣｌの代わりに４００ｍＭ  ＫＣｌを含む緩衝液Ｉ。この緩衝液を図５のレーン４および８のサンプルに使用した。
回転させながら４℃で２時間インキュベーションしたのち、前記ビーズを同じ緩衝液で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で煮沸し、ついでＰＡＧＥにより電気泳動を行なった。続いてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜にウエスタンブロットし、ついでＭＢＰに対するポリクローナル抗血清を用いて染色した。この染色したウエスタンブロットの複写を図５に示す。レーン１〜８のサンプルは前記の通りである。
図５より、ｐ５５ＩＣ−ＭＢＰキメラは、二価の陽イオンと無関係に、かなり高い塩濃度（０．４Ｍ  ＫＣｌ）下においてもｐ５５ＩＣ−ＧＳＴキメラ（レーン１〜４）と結合することは明らかである。したがって、ｐ５５ＩＣは積極的に（avidly）自己会合することができると結論付けられる。
ｐ５５−ＩＣの自己会合する傾向の機能的関係を評価するために、ＴＮＦの細胞破壊作用に感受性を有する細胞の細胞質内でのｐ５５−ＩＣの発現を試みた。ｐ５５−ＩＣが細胞障害性に変化するかもしれないことを考慮して、最近開発され、厳密に調節されたテトラサイクリンでコントロールされる哺乳類発現系（tetracycline-controlled mammalian expression system）を用いた誘導方法における発現を選択した（ゴッセン（Gossen）およびボヤード（Boujard）、１９９２年）。ｐ５５−ＩＣの発現は結果として大量の細胞死を引きおこした（図６、右のパネル）。死滅した細胞は、ＴＮＦによる細胞の死滅したときにみられる細胞表面のブラッビング（blabbing）を示した。伝えられるところによるとｐＨＤ１０−３の調節された構築物の発現を１０5倍まで低下させるテトラサイクリンの存在下におけるｐ５５−ＩＣ構築物の細胞へのトランスフェクションは、テトラサイクリンの非存在下においてみられたものと比べるとかなり低いけれども、結果としてある程度の細胞死を引きおこした（図６、左のパネル）。対照的に、ルシフェラーゼのｃＤＮＡを含むコントロールの構築物でトランスフェクトした細胞は死の兆候を示さなかった（結果は示していない）。
受容体のトランスメンブレンまたは細胞外ドメインなしに発現したときの、ｐ５５−ＩＣの細胞死を引きおこす能力は、シグナリングにおけるこのドメインの関係についてのさらなる証拠を提供する。さらに、受容体のほかの部分はそのようなシグナリングに直接的な役割を果たさないということを示している。本発明において研究した突然変異を含む突然変異のｐ５５−ＩＣの機能に及ぼす影響の研究により、アミノ酸残基３２６〜４０７のあいだに広がる領域がこの機能に対してもっとも重要であることが示された。この領域は、ｐ５５ＴＮＦ受容体とは進化論的に関係した２つのほかの受容体、すなわち細胞死に対しシグナリングすることができるＦａｓ受容体（イトウ(Itoh)ら、１９９１年およびオーエム(Oehm)ら、１９９２年）および細胞の増殖を高める受容体であるＣＤ４０（ステーメンコビック（Stamenkovic）ら、１９８９年）の細胞内ドメイン内の配列に対し著しい類似性（resemblance）を示し、それゆえこの配列は、シグナリングにおけるある種の一般的な役割を果たす保存されたモチーフを構成すると思われる。それは酵素活性の既知のモチーフの特徴とは類似していないので、間接的な方法、すなわちおそらくはシグナリングする酵素または前記酵素に刺激のシグナルを伝達するタンパク質に対するドッキング部位（docking site）として使うことによりシグナリングすることがもっともらしく思われる。ｐ５５−ＩＣ、Ｆａｓ受容体およびＣＤ４０はすべてそれらの細胞外ドメインに対する抗体によって刺激を受けることができる。これら刺激は、受容体を架橋する抗体の能力と関係していることが示されうる。それゆえ、シグナリングは、細胞外ドメインの凝集により強いられた２つまたはそれより多くの細胞内ドメインの相互作用の結果としてはじまるものと思われる。これらの受容体のシグナリングの開始におけるそのような相互作用の関係については、細胞内ドメインの突然変異により機能しなくなった受容体の発現は、同時に発現した正常な受容体の機能に「支配的な負の（dominant negative）」な影響を及ぼすことを示している研究（ブレークブッシュ（Brakebusch）ら、１９９２年）にも示された。ＴＮＦに応じたｐ５５受容体の凝集は、ホモトリマー（homotrimers）として生じたＴＮＦ分子の各々が２つまたは３つの受容体分子と結合することができるという事実のみにより、受動的な方法（passive manner）においておこることが示唆された。しかしながら、本発明の知見ではこのプロセスはやや異なっておこることを示唆している。
ｐ５５−ＩＣの自己会合する傾向は、このドメインがその誘導された凝集において活性化の役割を果たすことを示している。さらに、ｐ５５−ＩＣは、受容体分子の残りの部分とは無関係に発現したとき、ＴＮＦまたはあらゆるほかの外部刺激（exterior stimuli）の非存在下で細胞死を引きおこすことができるので、ｐ５５−ＩＣの活性はシグナリングの開始に充分であるように思われる。にもかかわらず、全長の受容体として発現したとき、ｐ５５−ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦより刺激を受けないかぎり、シグナリングしない。それゆえ、ｐ５５−ＴＮＦ受容体を活性化するとき、ＴＮＦは細胞内ドメインの自発的な会合を妨害するある阻害機構を抑え、この阻害はｐ５５−ＩＣの受容体分子の残りの部分への連結によると仮定されている。この阻害は、トランスメンブレンおよび細胞外ドメインによって細胞内ドメインに強いられた、いくつかのほかのタンパク質と受容体との会合に対する方向づけ（orientation）、またはおそらく単に細胞膜に位置することが許された受容体の量の制限のせいかもしれない。
細胞死をおこすためには、たとえたった１つのＴＮＦ分子の細胞との結合で充分であるという判断より、このコントロール機構はかなり効果的であることに注目すべきである。
リガンドとは無関係な自発的なシグナリングは、結果としてこの受容体によってコントロールされる過程の大規模な混乱（derangement）を引きおこすことができる。もっともよく知られた例は、成長因子受容体のデレギュレーション（deregulation）である。シグナリングを自発的に開始する突然変異、たとえば自発的に凝集させる突然変異は、腫瘍細胞のデレギュレーションされた増殖において重要な役割を果たしている。過剰に誘導されたときのＴＮＦの作用は、多数の疾病の病因となることはよく知られている。細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣｓ）のないｐ５５−ＴＮＦ受容体の、ＴＮＦとは無関係にシグナリングする能力は、そのような過度の機能の一因となっているのかもしれない。たとえば、ウイルスおよびほかの病原体（pathogens）の細胞変性作用のあるものは、直接の細胞破壊機能ではなく、ｐ５５−ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインのタンパク質分解による分離によりおこり、結果としてＴＮＦ様の細胞毒性作用をおこしている可能性があると思われる。
ｐ５５ＩＣの自己会合およびこれによるリガンドに依存しない細胞毒性の原因であるｐ５５ＩＣ内の領域をさらに明らかにし、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのほかの関連するメンバー（たとえば、ＦＡＳ受容体）が自己会合能力およびリガンドに依存しない作用をもつ細胞内ドメインを有するかどうかを決定するために、以下に述べる詳細な研究を行なった。
（ａ）一般的な手順および材料
(i)ツー・ハイブリッド・スクリーンおよびツー・ハイブリッド・β−ガラクトシダーゼ発現試験
ｐ５５−ＩＣおよびその欠失変異体、Ｆａｓ−ＩＣならびに様々なほかのタンパク質をコードするｃＤＮＡ挿入物（表３参照）を、本発明者の研究室においてすでにクローニングされている全長のｃＤＮＡまたは購入したｃＤＮＡライブラリーのいずれかからＰＣＲによりクローニングした。ｐＧＢＴ−９およびｐＧＡＤ−ＧＨベクター（それぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および活性化ドメイン（ＡＤ）構築物）中にあるｃＤＮＡで形質転換した酵母（ＳＦＹ５２６レポータ株（reporter strain）（バーテル（Bartel）ら、１９９３年）内でのβ−ガラクトシダーゼの発現を液体試験（liquid test）（ガレンテ（Guarente）、１９８３年）により評価し、さらにフィルターアッセイ（filter assay）によっても評価して、定量的に同じ結果をえた（データは示さない）。ｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）と結合するタンパク質のための、購入したＧａｌ４  ＡＤをつけたＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリー（クローンテック、パロ  アルト、シーエイ（Ca.）、アメリカ合衆国）のツー・ハイブリッド・スクリーニング（フィールズおよびソング、１９８９年）を製造者の勧めにしたがいＨＦ７ｃ酵母レポータ株を使用して行なった。単離したクローンの陽性を、（ａ）５ｍＭ  ３−アミノトリアゾールの存在下で増殖させたときの、ヒスチジンに対する形質転換した酵母のプロトトロフィー（prototrophy）により、（ｂ）β−ガラクトシダーゼの発現により、（ｃ）特異的な試験（ＳＮＦ４とＧａｌ４  ＤＢＤに融合したラミンとの相互作用）により評価した。
(ii)細菌により生産されたｐ５５−ＩＣ融合タンパク質のインビトロでの自己会合
グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ−ｐ５５−ＩＣ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｐ５５−ＩＣ）をほかの記載（フランギオーニおよびニール、１９９３年およびアウスベル（Ausubel）ら、１９９４年）により生成した。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質をｐＭａｌｃＲＩベクター（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））を使用してえ、アミロース樹脂カラムで精製した。ＧＳＴおよびＭＢＰＰ融合タンパク質の相互作用を、グルタチオン−アガロースビーズを連続的にＧＳＴおよびＭＢＰＰ融合タンパク質とインキュベートすることによって調べた（５μｇタンパク質／２０μｌビーズ、１回目のインキュベーションを１５分間、２回目を２時間、ともに４℃）。ＭＢＰ融合タンパク質とのインキュベーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ、ジチオトレイトール（dithiotreitol）、０．２％  トライトンＸ１００、０．５ｍＭ  フェニル−メチル−スルホニル−フルオリド（phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride）および５％（ｖ／ｖ）  グリセロールを含む緩衝溶液中または、示したときは、ＭｇＣｌ2の代わりに５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または０．４Ｍ  ＫＣｌを含む同じ緩衝液中で行なった。ＭＢＰ融合タンパク質の会合を、グルタチオン−アガロースビーズと会合したタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％  アクリルアミド）、続いてのウエスタンブロッティングにより評価した。ブロットをＭＢＰに対するウサギ抗血清（本発明者の研究室で生成）およびセイヨウワサビ  ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン）を用いて探った。
(iii)ｐ５５受容体およびその断片のＨｅＬａ細胞における誘導された発現
ゴッセンおよびバヤードにより開発されたテトラサイクリンでコントロールされる転写活性化因子を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｔＴＡ−１クローン（ゴッセンおよびバヤード、１９９２年））を、１０％  ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  ネオマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco′s modified Eagle′s medium）中で増殖させた。ｐ５５受容体またはその部分をコードするｃＤＮＡ挿入物を、テトラサイクリンでコントロールされる発現ベクター（ｐＵＨＤ  １０−３、エイチ  バヤード（H. Bujard）により提供）に導入した。細胞を、リン酸カルシウム沈殿法（アウスベル（Ausubel）ら、１９９４年）により、細胞を発現構築物（５μｇＤＮＡ／６ｃｍ  プレート）でトランスフェクトした。トランスフェクトしたタンパク質の一時的な発現の作用を、テトラサイクリンの存在下（１μｇ／ｍｌ）または非存在下、トランスフェクション後の示した時間に評価した。ｐＵＨＤ  １０−３ベクター中のヒトｐ５５−ＩＣのｃＤＮＡで安定してトランスフェクトした細胞のクローンは、ｃＤＮＡをＨｔＴＡ−１細胞へ、テトラサイクリンの存在下、ハイグロマイシン（hygromycin）耐性を授けたプラスミドとともにトランスフェクトすることにより確立し、ついでハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）耐性クローンの選択を行なった。ほかの方法では細胞増殖培地中で一定に維持したテトラサイクリンの除去によりｃＤＮＡの発現をえた。
(iv)ｐ５５受容体およびそれの断片の誘導された発現により引きおこされるＴＮＦ様作用の評価
受容体およびＴＮＦの誘導された発現が細胞の生存能力（viability）に及ぼす影響を、ニュートラル−レッド取り込み法（neutral-red uptake method）により評価した（ワラック（Wallach）、１９８４年）。ＩＬ−８遺伝子発現の誘導をノーザン解析により評価した。ＲＮＡを、標準的な手順を用いて、トリ・リエージェント（TRI REAGENT)（モレキュラー・リサーチ・センター社（Molecular Research Center, Inc.））を用いて単離し、ホルムアルデヒド／ホルムアミド緩衝液中で変性させ、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにより電気泳動し、１０ｘＳＳＰＥ緩衝液中でジーンスクリーン  プラス膜（GeneScreen Plus membrane）（デュポン社）にブロットした。フィルターをＩＬ−８のｃＤＮＡプローブ（マツシマ（Matsushima）ら、１９８８年、ヌクレオチド１〜３９２）を用いてハイブリダイズさせ、ランダム−プライム・キット（random-prime kit）（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Boehringer Mannheim Biochemica）社、マンハイム、ドイツ連邦共和国）を用いて放射性標識し、製造者のプロトコルにしたがい厳密に洗浄した。オートラジオグラフィーを１〜２日間かけて行なった。
(v)ＴＮＦ受容体発現の評価
１ｘ１０6の細胞サンプル中のＴＮＦ受容体の発現を既に記載されている（ホルトマン（Holtmann）およびワラック（Wallach）、１９８７年）ようなクロラミン−Ｔ法（chloramine-T method）を用い125Ｉで標識したＴＮＦの結合の測定により評価した。また、ＥＬＩＳＡも、細胞を溶解し（７０μｌ／１０6ｃｅｌｌ）、試験するサンプルを希釈するためにＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、１％、デオキシコール酸塩（deoxycholate）、０．１％  ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用したことを除いて、可溶性ＴＮＦ受容体の定量についての記載（アデルカ（Ａｄｅｒｋａ）ら、１９９１年）と同様にして行なった。尿から精製したｐ５５受容体の可溶型を標準として使った。
（ｂ）自己会合に関係するｐ５５−ＩＣの領域を決定するためのｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の突然変異解析
前記したように、ｐ５５−ＩＣは自己会合でき、細胞に細胞毒性作用を引きおこすことができ、さらに全長のｐ５５−ＩＣに結合することができるｐ５５−ＩＣ部分が存在する。とくに、ｐ５５−ＩＣの部分の１つ（前記実施例１においてタンパク質断片５５．１と名付けられた）は、全長のｐ５５−ＩＣに強く結合することができるものと同定され、さらにこの配列は配列決定され、ｐ５５−ＩＣ内にあるｐ５５−ＴＮＦ受容体のアミノ酸残基３２８〜４２６を含むことが認められた。さらに、前記部分、すなわちタンパク質断片５５．１はそれ自身自己会合でき、細胞に細胞毒性作用を引きおこすことができることを発見した（以下参照）。それゆえ、ｐ５５−ＩＣのこの部分は「死滅ドメイン」と呼ばれており、ヒトｐ５５受容体のアミノ酸残基約３２８〜４２６のあいだの領域、もっとも可能性のあるのは残基約３２８および４１４のあいだのアミノ酸残基からなる領域に存在する。
ｐ５５−ＩＣ内の「死滅ドメイン」は自己会合するという事実は思いがけない出来事により見出された。この受容体の細胞内ドメインに結合するタンパク質のための、ツー・ハイブリッド技術によるＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（前記実施例１参照）において、細胞内ドメイン−ＧＡＬ４  ＤＢＤ融合タンパク質に特異的に結合する生成物を生じるｃＤＮＡの中から、それら自体がｐ５５受容体細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ、表３において星印を付けた）の部分をコードするいくつかのクローン（たとえば、５５．１および５５．３）を検出した。
ｐ５５−ＩＣの自己会合における特異性の程度を評価することおよび関係する領域をより正確に定義するためのツー・ハイブリッド試験の適用により、以下の知見が導びかれた（表３）。（ａ）ｐ５５−ＩＣの自己会合は「死滅ドメイン」内の領域に制限される。そのＮ末端は残基３２８および３４４のあいだに位置し、そのＣ末端は残基４０４近く、このドメインの報告されたＣ末端（残基４１４）よりもやや上流に位置する。（ｂ）「死滅ドメイン」の上流のｐ５５−ＩＣの膜に近接した部分の欠失は自己会合を強化し、このことにより、この領域が会合に対する阻害効果を有することが示唆される。（ｃ）マウスｐ５５−ＩＣが自己会合し、またヒトｐ５５受容体の「死滅ドメイン」とも会合する。（ｄ）ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの３つのほかの受容体、すなわちＦａｓ／ＡＰＯ１（ＦＡＳ受容体）、ＣＤ４０（フィールズおよびソング、１９８９年）およびｐ７５ＴＮＦ受容体（スミス（Smith）ら）の細胞内ドメインの自己会合の試験により、ｐ５５受容体の「死滅ドメイン」に関係した配列モチーフによる細胞死に対してシグナリングするＦａｓ−ＩＣは自己会合し、ｐ５５−ＩＣとある程度会合することが示された。しかしながら、増殖刺激シグナル（growth stimulatory signals）を提供するＣＤ４０−ＩＣ（たとえ、「死滅ドメイン」に類似した配列を含んでいるとしても）およびｐ５５−ＩＣに類似した構造をもたないｐ７５−ＩＣは、自己会合せず、ｐ５５−ＩＣまたはＦａｓ−ＩＣとも結合しない。
0003966387.tif 000004
前記表３に以下のタンパク質を包含するＧａ１４ハイブリッド構築物の相互作用の定量的評価を示す。ヒトｐ５５受容体の細胞内ドメインおよびその様々な欠失変異体（（ロエッシャー（Loetscher）ら、１９９０）において番号づけられた残基）；マウスｐ５５受容体の細胞内ドメイン（（グッドウィン（Goodwin）ら、１９９１）において番号づけられた残基３３４〜４５４）；マウスＦａｓ／ＡＰＯ１（（ワタナベ−フカナガ（Watanabe-Fukanaga）ら、１９９２）において番号づけられたＦａｓ−ＩＣ、１６６〜３０６）；ヒトＣＤ４０（（スタメンコビック（Stamenkovic）ら、１９８９）において番号づけられたＣＤ４０−ＩＣ、２１６〜２７７）およびヒトｐ７５ＴＮＦ受容体（（スミス（Smith）、１９９０）において番号づけられたｐ７５−ＩＣ、２８７〜４６１）。ＳＮＦ１およびＳＮＦ４を会合のポジティブコントロールとして用い（フィールズ（Fields）およびソング（Song）、１９８９）、およびラミンをネガティブコントロールとして用いた（バーテル（Bartel）ら、１９９３）。Ｇａｌ４  ＤＢＤ構築物（ｐＧＰＴ９）を縦に列記し、Ｇａｌ４  ＡＤ構築物をコードするもの（ｐＧＡＤ−ＧＨ）を横に列記する。星印をつけた２つの欠失変異体を「餌」としてｐＧＢＴ９においてクローニングしたｐ５５−ＩＣを用いて、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーのツー・ハイブリッド・スクリーンにおいてクローニングした（クローンテック、パロ  アルト（Clontech, Palo Alto）、カリフォルニア、アメリカ合衆国）。前記スクリーンにおいて、調べた約４×１０6のｃＤＮＡクローンのうち４つが陽性であった。これらのクローンのうち３つがヒトｐ５５受容体のｃＤＮＡの部分に対応することがわかった（２つは同一で残基３２８〜４２６をコードし、１つは残基２７７〜４２６をコードしていた）。この４つは未知のタンパク質をコードすることがわかった。β−ガラクトシダーゼ発現のデータは２つの独立した形質転換体の分析の平均であり、β−ガラクトシダーゼ生成物の量（酵母培養のＯＤ600で割った１０3倍のＯＤ420として定義される活性単位）としてあらわす。分析の検出限界は０．０５単位であった。重複した試料間の偏差はすべてのばあいにおいて平均の２５％よりも少なかった（試験せず）。
ｐ５５−ＩＣ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の細菌融合タンパク質とｐ５５−ＩＣ−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質との相互作用のインビトロ試験によりｐ５５受容体が自己会合することを確認し、この会合において酵母タンパク質が関与していることが判明した（前記参照）。会合は高い塩濃度によってではなく、ＥＤＴＡによって影響された（前記参照）。
死滅ドメインの自己会合への機能的関わりを評価するために、ｐ５５受容体、またはその部分の誘導された発現がＴＮＦ細胞毒性に感受性のある細胞に影響を及ぼす方法を調べた。この分析の結果をｐ５５受容体、その細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）またはその部分（「死滅ドメイン」を含む）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における細胞破壊作用のリガンドと独立したトリガーリング（triggering）を示す図７に記載する。
図７に、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトしたベクターに含まれる異なる型のＴＮＦ受容体をコードする様々なＤＮＡ分子（図７の一番左端）：およびテトラサイクリンでコントロールされる発現ベクターを用いた、様々な全長のｐ５５受容体（ｐ５５受容体）、ｐ５５−ＩＣまたはｐ５５−ＩＣの部分、またはコントロールとして、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）（図７の一番左端にそれぞれを示す）を一時的に発現するＨｅＬａ細胞における発現（左および中間の棒グラフ）および生存能力（右の棒グラフ）を説明図として示す。白抜きの棒グラフ（左、中間および右）にはテトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下でトランスフェクトされた細胞を示し、前記細胞は発現を阻害し、塗りつぶした棒グラフ（左、中間および右）にはテトラサイクリンの非存在下でトランスフェクトされた細胞を示す。ＴＮＦ受容体発現を受容体の細胞外ドメインの対する抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ（図７の左側の説明図参照）および細胞への放射性標識されたＴＮＦの結合の測定の両方により、トランスフェクションの２０時間後に評価した。トランスフェクトされたタンパク質の細胞破壊作用はトランスフェクションの４８時間後について評価した。示したデータは定量的により少ない結果の３つの実験のうちの１つに由来するもので、それぞれの構築物は二重に調べた。ＮＤは測定されなかったことを示す。
したがって、図７からテトラサイクリンで調節されるトランスアクティベーター（transactivator）によりトランスフェクトされたｃＤＮＡの厳密にコントロールされた発現を許容する発現ベクターを用いることにより（ゴッセン（Gossen）およびブジャード（Bujard）、１９９２）、全長の受容体についての一時的にトランスフェクトされたｃＤＮＡの発現によるＨｅＬａ細胞におけるｐ５５受容体発現の単なる増加が非常に広範囲の細胞死を結果としてもたらすことが明らかである。ｐ５５−ＩＣのみを発現したばあいよりも大きな細胞毒性が観察された。ＨｅＬａ細胞において本質的に「死滅ドメイン」からなるｐ５５−ＩＣの部分（残基３２８〜４２６）のみを発現したばあいに有意な細胞毒性も観察された。一方、「死滅ドメイン」を欠いたまたはその部分のみを含んだｐ５５−ＩＣの部分の発現（または無関係なコントロールとして用いた、ルシフェラーゼの発現）は細胞の生存能力に対する作用をもたなかった。ｐ５５−ＩＣの細胞毒性はさらにそのｃＤＮＡで安定に形質転換された細胞を用いて確認され、これらの細胞はｐ５５−ＩＣ発現が誘導されなかったばあいは増殖し続けたが、ｐ５５−ＩＣが発現されたばあいには死滅した（前記参照）。
（ｃ）ｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインのそのほかの作用
ＴＮＦのそのほかの活性がその「死滅ドメイン」を含む細胞内ドメインの自己会合によって開始されるかどうかを調べるために、ＴＮＦにより活性化されることが知られている（マツシマ（Matsushima）ら、１９８８）、インターロイキン８（ＩＬ−８）の転写に対する、全長の受容体（ｐ５５受容体）の増大された発現の作用または受容体（ｐ５５−ＩＣ）の細胞内ドメインの発現の作用を調べた。テトラサイクリンでコントロールされる構築物を用いて、ｐ５５受容体またはｐ５５−ＩＣでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるＩＬ−８遺伝子のリガンドとは独立した誘導を示す（「ジェネラル・プロセデュワーズ・アンド・マテリアルズ（General Procedures and Materials）」および前記実施例１も参照）、図８に結果を示す。図８のパネルＡには、ＨｅＬａ（ＨＴｔａ−１）細胞から抽出されたＲＮＡ（７μｇ／レーン）、非処理細胞（コントロール）、ＴＮＦ（５００μ／ｍｌ、４時間）で処理した細胞、またはｐ５５−ＩＣ（「ｐ５５−ＩＣ」）、ｐ５５受容体（「ｐ５５−Ｒ」）、またはルシフェラーゼ（「ＬＵＣ」）ｃＤＮＡで（テトラサイクリンの存在下または非存在下で）トランスフェクションから２４時間後のＨＴｔａ−１細胞のノーザン・ブロット解析（前記「ジェネラル・プロセデュワーズ・アンド・マテリアルズ」参照）を示すノーザン・ブロットの複製図（reproduction）を示す。図８のパネルＢには、図８のパネルＡに示された各試料における１８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色を示すノーザン・ブロットの複製図を示す。
したがって、図８から明らかなように、ｐ５５受容体ｃＤＮＡをコードするテトラサイクリンでコントロールされる構築物を用いるＨｅＬａ細胞のトランスフェクションはＩＬ−８の転写を誘導した。ｐ５５−ＩＣのｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞においてより強い誘導が観察された。両方のばあいにおいて、細胞増殖培地からテトラサイクリンを除いたばあいのみ誘導が生じた。このことから前記誘導がトランスフェクトされたｐ５５受容体またはｐ５５−ＩＣの発現の結果として生じることが示される。コントロールとしての、ルシフェラーゼｃＤＮＡでのトランスフェクションはＩＬ−８の転写に対して作用をもたなかった。
したがって、前記の結果（図８）から、ｐ５５受容体発現における単なる増加、またはその細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）のみの発現でも、リガンド（ＴＮＦ）に独立した様式で、細胞毒性および、細胞内のＩＬ−８遺伝子の発現における増加の作用も含む、そのほかの作用を開始するには充分であることが明らかである。それら作用のトリガーリングはｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）の自己会合によるものであろうと考えられる。前述のように、ｐ５５−ＩＣの自己会合にあたりその「死滅ドメイン」がまず細胞内過程の誘導のシグナリングを招いて細胞内の細胞毒性のトリガーリングを導き、他方、そのほかの作用、すなわちＩＬ−８遺伝子発現の誘導を導くシグナリングはｐ５５−ＩＣのほかの領域によると思われ、さらにその自己会合が続く。したがって、ｐ５５−ＩＣのことなる領域は細胞内のことなるＴＮＦが誘導する作用（たとえば、細胞毒性、ＩＬ−８誘導）を招くことが可能であり、これらの作用はｐ５５−ＩＣの自己会合の際の細胞内のシグナリングの結果である。
ｐ５５−ＩＣがリガンド（ＴＮＦ）に独立した様式で、他の細胞内作用、たとえばＩＬ−８の誘導のトリガーリングを誘導できるという事実は、ｐ５５−ＩＣまたはその特異的な部分が、治療を望む細胞または組織をＴＮＦで治療する必要なく、そのような細胞または組織における前記の作用をもたらすための高度に特異的な道具として用いうることを意味する。多くの病理的状態（たとえば、悪性状態）において、ＴＮＦでの治療、とくに多い服用量での治療はＴＮＦ受容体への結合に続くＴＮＦによる全身性に誘導された細胞内作用の数に起因する望ましくない副作用を導きうる。ｐ５５−ＩＣが特異的なほかのＴＮＦで誘導される作用（細胞毒性に加えて）と類似することができるという本発明による発見方法により、たとえば、ＩＬ−８の誘導が細胞または組織特異的な方法でｐ５５−ＩＣまたはその特異的な部分を導入する方法を開発し、特異的な所望の細胞内作用、たとえばＩＬ−８の誘導を誘導するためのシグナリング、それによってＴＮＦによる治療中にしばしば見られる全身性の副作用を克服するであろう。
（ｄ）ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体（Ｆａｓ／ＡＰＯ１）の細胞内ドメインおよびその「死滅ドメイン」によるＨｅＬａ細胞における細胞破壊作用のリガンドとは独立したトリガーリング
ｐ５５ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５ＩＣおよびＦＡＳ−ＩＣ）の細胞毒性活性に関して、現在ではさらにｐ５５ＩＣ、その「死滅ドメイン」（ｐ５５ＤＤ）およびＦＡＳ−ＩＣの両方がＨｅＬａ細胞において細胞破壊作用のリガンドとは独立してトリガーリングできることも解明されてきている。この研究において、ＨｅＬａ細胞を、全長のｐ５５−ＴＮＦ受容体、ｐ５５ＩＣおよびｐ５５ＤＤを含むその部分またはＦＡＳ−ＩＣのいずれかの様々な構築物を含む発現ベクターでトランスフェクトした。１組の実験においてＨｅＬａ細胞をｐ５５ＴＮＦ受容体（ｐ５５−Ｒ）およびＦＡＳ−ＩＣを含む構築物でコトランスフェクトした（構築物の詳細、その生成などは前記参照）。この研究の結果を図９（ＡおよびＢ）に示す。ここで図９Ａおよび図９Ｂの両方において、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトするために用いる構築物を図式的に左側のパネルに示し；ＴＮＦまたはＦＡＳ受容体発現の結果をグラフとして２つの中間のパネルに示し（左から２番目および３番目のパネル）；およびトランスフェクトされた細胞の生存能力の結果をグラフとして右側のパネルに示す。図９Ａにおいて、すべてのばあいにおいてテトラサイクリンでコントロールされる発現ベクターを用い、全長のｐ５５受容体、ｐ５５−ＩＣまたはその部分、もしくはコントロールとしてルシフェラーゼ（ＬＵＣ）を一時的に発現するトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の結果を示す。図９Ｂにおいては、テトラサイクリンでコントロールされる発現ベクターを用い、ＦＡＳ−ＩＣ単独またはｐ５５受容体とともにＦＡＳ−ＩＣを一時的に発現するトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に関する結果を示す。図９Ａおよび図９Ｂにおける結果のグラフによる表現において、白抜きの棒が発現を阻害する、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下でトランスフェクトされた細胞をあらわし、塗りつぶした棒がテトラサイクリン非存在下でトランスフェクトされた細胞をあらわす。ＴＮＦ受容体発現は受容体の細胞外ドメインに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ（左側のパネル）と、細胞への放射性標識したＴＮＦの結合の測定（中間のパネル）の両方により、トランスフェクションから２０時間後に評価した。トランスフェクトした細胞の細胞破壊作用をトランスフェクションから４８時間後に評価した。示したデータは定量的により少ない結果の３つの実験のうちの１つに由来するもので、各構築物は二重に試験した。図９ＡおよびＢにおける「ＮＤ」の表示は測定されないことを意味する。図９ＡおよびＢに示された結果からｐ５５ＩＣのみの発現は結果としてより多くの細胞毒性をもたらすことは明らかである。その死滅ドメイン（ｐ５５ＤＤ）のみを発現するばあいにも有為な細胞毒性が生じる。対照的に、死滅ドメインを欠くまたはその部分のみを含むｐ５５ＩＣの部分の発現は細胞の生存能力に対する作用をもたなかった。ＦＡＳ−ＩＣの発現は結果として有意な細胞毒性をもたらさず、ただ同時に発現されたｐ５５受容体の細胞毒性を有意に高めたにすぎなかった。
実施例３
ｐ５５ＴＮＦ受容体またはＦＡＳ受容体の細胞内ドメインに結合できる追加のタンパク質
前記実施例１に記載したのと同様のアプローチおよび技術を用いて、さらに３つのｐ５５ＩＣまたはＦＡＳ−ＩＣと結合できるタンパク質を単離し同定した。
図１０〜１２において、それぞれＦ２、Ｆ９およびＤＤ１１と呼ぶ、ｃＤＮＡクローンの部分および予備的な（preliminary）ヌクレオチド配列を図式的に示す。
クローンＦ２およびＦ９を「餌」としてマウスＦＡＳ−ＩＣを用いたマウス胚ライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。図１０に、配列決定したＦ２のｃＤＮＡ由来の部分的なヌクレオチド配列を図式的に示す。図１１に、配列決定したＦ９のｃＤＮＡ由来の１７２４塩基の部分的なヌクレオチド配列を図式的に示す。
クローンＦ２およびＦ９によってコードされたタンパク質（それぞれＦ２およびＦ９）の結合能力の分析により、
（ａ）Ｆ２はヒトｐ５５ＩＣおよびｐ５５ＤＤと、ならびにマウスＦＡＳ−ＩＣと強力に相互作用するが、適切なタンパク質、ヒトＦＡＳ−ＩＣと同様に不適切な（コントロールの）タンパク質ＳＮＦ１およびラミンとは微弱にしか相互作用しないこと、
（ｂ）Ｆ９はヒトｐ５５−ＩＣおよびマウスＦＡＳ−ＩＣと強力に相互作用するが、ヒトＦＡＳ−ＩＣ（適切なタンパク質）および不適切なタンパク質ＳＮＦ１およびラミンとは微弱にしか相互作用しないこと、
（ｃ）Ｆ２もＦ９もヒトｐ７５ＩＣ、ｐＧＢＴ９（空の餌ベクター）、ヒトＣＤ−４０とはまったく相互作用しなかったこと
を示していた。
さらに「遺伝子バンク」および「タンパク質バンク」を検索したところＦ２およびＦ９は新規なタンパク質をあらわすことが判明した。
したがって、Ｆ２およびＦ９はＦＡＳ−ＩＣおよびｐ５５ＩＣの両方との結合特異性をもつ新規なタンパク質を意味する。
クローンＤＤ１１を「餌」としてマウスｐ５５ＤＤを用いたヒトＨｅＬａライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。図１２に、配列決定したＤＤ１１のｃＤＮＡ由来の４２５塩基の部分的なヌクレオチド配列を図式的に示す。
ＤＤ１１クローンは長さ約８００ヌクレオチドを有する。転写物の全長は約１２ｋｂであり、前記クローンを用いてプローブ化される。クローンＤＤ１１によってコードされるタンパク質の結合能力の分析により、ＤＤ１１はｐ５５ＤＤ（アミノ酸３２６〜４１４）と強力に相互作用するが（図９参照）、このドメインの欠失変異体、たとえば、アミノ酸３２６〜４０４とは相互作用しない。ＤＤ１１はまたマウスおよびヒトＦＡＳ−ＩＣとも相互作用し、ある程度まではラミンとも相互作用する。ＤＤ１１はＳＮＦ１ともｐＧＢＴ９（空の餌ベクター）ともまったく相互作用しない。ＤＤ１１もまた「遺伝子バンク」および「タンパク質バンク」のデータベースにはなかった。したがって、ＤＤ１１はｐ５５ＩＣ（ｐ５５ＤＤ）およびＦＡＳ−ＩＣの特異的結合タンパク質を表わす。
実施例４
可溶性ダイマーＴＮＦ受容体の構築
前記実施例２に記載した研究結果にもとづき、前記ｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）およびその部分（前記「死滅ドメイン」）、ならびに前記Ｆａｓ／ＡＰＯ１およびｐ５５−ＩＣ「死滅ドメイン」に類似するその部分（「死滅ドメイン」とも呼ぶ）は自己会合ができ、自己会合（凝集）ができ可溶性である新規なＴＮＦ受容体を構築することができる。このようなＴＮＦ受容体はｐ５５受容体またはＦａｓ／ＡＰＯ１の細胞内ドメインまたはその「死滅ドメイン」の本質的にすべてと融合されるｐ５５受容体の細胞外ドメインのすべてをもつ融合タンパク質になる。したがって、そのような融合構築物はｐ５５受容体（またはＦＡＳ／ＡＰＯ１）のトランスメンブレン・ドメインを欠くであろうし、したがって可溶性である。さらに、その細胞内ドメインまたは「死滅ドメイン」の自己会合能の効力によって、これらの融合構築物はｐ５５受容体の少なくともダイマーを（および可能性としてより大きなオーダーのマルチマーも）提供するオリゴマー化を可能とする。つづいて、このようなダイマーＴＮＦ受容体（ｐ５５受容体）は天然に生じるＴＮＦホモトリマーの少なくとも２つのＴＮＦモノマーと結合でき、そのリガンド（ＴＮＦホモトリマー）とより積極的に（avidly）結合する可溶性ＴＮＦ受容体を提供する。
したがって、少なくとも４つの型のｐ５５ＴＮＦ受容体融合タンパク質が構築され、それらのうちのそれぞれはオリゴマー化でき、可溶性であり、
(i)ｐ５５受容体の細胞外ドメイン（ＥＣ５５）とｐ５５受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ）との融合生成物、
(ii)ＥＣ５５とｐ５５−ＩＣの「死滅ドメイン」（ＤＤ５５）との融合生成物、
(iii)ＥＣ５５とＦａｓ／ＡＰＯ１の細胞内ドメイン（ＩＣ  ＦＡＳ）との融合生成物および
(iv)ＥＣ５５とＩＣ  ＦＡＳの「死滅ドメイン」（ＤＤ  ＦＡＳ）との融合生成物
である。
前記融合タンパク質のそれぞれにおいて、ＴＮＦモノマー結合能力はＥＣ５５部分によって提供されるが、融合タンパク質の各種類のオリゴマー化（または少なくともダイマー化）はｐ５５ＩＣ、ＤＤ５５、ＩＣ  ＦＡＳまたはＤＤ  ＦＡＳ部分のいずれかであるその「テール（tail）」領域によって提供される。
前記融合タンパク質の構築のために、組換えＤＮＡテクノロジーの標準的な技術を用いることができ、これは今や当該技術分野において充分に確立されている（たとえば、サムブルック（Sambrook）ら、（１９８９）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク）参照。簡潔にいえば、いかなる適当な細菌の、バクテリオファージの、または動物ウィルスの発現ベクター（選んだ挿入ＤＮＡの発現のために設計されたクローニング・ビヒクルまたはプラスミド）も用いることができ、その中にＥＣ５５およびｐ５５−ＩＣ、ＤＤ５５、ＩＣ  ＦＡＳまたはＤＤ  ＦＡＳである「テール」の１つをコードするＤＮＡを１または複数の段階で挿入する。前記融合タンパク質のそれぞれをコードするそのような挿入されるＤＮＡを、たとえばプロモーター、リボザイム結合部位、転写因子結合部位などのクローニング・ビヒクルまたはプラスミドの様々な発現制御配列のコントロール下におく。このような発現制御配列は選択した発現ベクターの型に依存して、したがって本発明の融合タンパク質を発現することが望まれる宿主細胞（真核性または原核性）の型に依存して選択される。好ましい宿主細胞（およびしたがって発現ベクター）は真核性細胞であり、とくに好ましくは哺乳類細胞である。
前記の融合タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡ分子は以下の手順により調製され発現ベクターに挿入される。
（ａ）まず、ＰＣＲに用いるための１組のオリゴヌクレオチド類を標準手段、
0003966387.tif 000005
であるオリゴヌクレオチド類により構築し、
（ｂ）本発明者の研究室にあるクローニングされた全長のｐ５５受容体およびＦａｓ／ＡＰＯ１受容体を含むプラスミド（同時係属中の（co-pending）ＥＰ５６８９２５および前記実施例１〜３も参照）を以下の取扱いに供して前記融合タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡ断片を生じ、ついで前記ＤＮＡ断片を選択の前記発現ベクターに連結する。
(i)４つのすべての融合タンパク質の構成要素であるＥＣ５５をコードするＤＮＡ断片を作製するために、前記オリゴヌクレオチド番号１および２（断片の大きさ６４０ｂｐ）を用いてヒトｐ５５のｃＤＮＡを担うプラスミドについてＰＣＲを行なう。
(ii)融合生成物ＥＣ５５−ＩＣ５５をえるために、オリゴヌクレオチド番号３および４を用いてヒトｐ５５のｃＤＮＡを担うプラスミドについてＰＣＲを行ない、ＩＣ５５（大きさ６７７ｂｐ）をコードするＤＮＡ断片をえ、それをついでＳａｌＩで切ったＥＣ５５と混合し、適したプロモーターのコントロール下で平滑末端連結により哺乳類細胞のための発現ベクターと連結する。前記ベクターにおける挿入されたＥＣ５５−ＩＣ５５のオリエンテーションは制限消化によりおよび配列決定により確認する。
(iii)融合生成物ＥＣ５５−ＩＣ  ＦＡＳをえるために、ＩＣ  ＦＡＳを、オリゴヌクレオチド番号５および６を用いてＦＡＳのｃＤＮＡをもつプラスミドについてのＰＣＲにより作製し、断片（大きさ４４８ｂｐ）をえ、それをついでＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩで切断したＥＣ５５と混合し、つづいて適したプロモーターのコントロール下で平滑連結により哺乳類の発現ベクターと連結する。前記ベクターにおける挿入されたＥＣ５５−ＩＣ  ＦＡＳのオリエンテーションは制限消化によりおよび配列決定により確認する。
(iv)融合生成物ＥＣ５５−ＤＤ５５をえるために、ＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチド番号７および４を用いてヒトｐ５５のｃＤＮＡについてのＰＣＲによりＤＤ５５配列を用いて作製する。大きさ３１４ｂｐの生成物を、ＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩで切断したＥＣ５５と混合し、つづいて平滑連結により哺乳類の発現ベクターと連結する。前記ベクターにおける挿入されたＥＣ５５−ＤＤ５５のオリエンテーションは制限消化によりおよび配列決定により確認する。
(v)融合生成物ＥＣ５５−ＤＤ  ＦＡＳをえるために、ＤＤ  ＦＡＳをもつＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチド番号６および８を用いてＦＡＳのｃＤＮＡについてのＰＣＲにより作製する。大きさ３３２ｂｐの生成物を、ＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩで切断したＥＣ５５と混合し、つづいて平滑連結により哺乳類の発現ベクターと連結する。ついでＥＣ５５−ＤＤ  ＦＡＳのオリエンテーションは制限消化および配列決定により確認する。
いったん前記発現ベクターが構築されれば、それらはつぎに発現を目的として適当な哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズ・ハムスターの卵巣（CHO）細胞またはサルの腎臓（COS）細胞）に標準的な方法で導入する。そのようにして発現させた融合タンパク質はついで標準的な方法で（同時係属中のＥＰ３０８３７８、ＥＰ３９８３２７およびＥＰ５６８９２５参照）精製される。精製された融合タンパク質はつぎにオリゴマー化する能力（およびその程度、すなわちそれらがダイマーまたはより大きなマルチマーを形成するかどうか）についておよびＴＮＦと結合する能力（およびその結合のアフィニティーまたは積極性）について分析する。
実施例５
可溶性ダイマーＦａｓ／ＡＰＯ１受容体の構築
前記実施例４に記載した様式と同様に、以下の４種類のＦａｓ／ＡＰＯ１融合生成物を作製することができる。それらのうちのそれぞれはオリゴマー化でき、可溶性であり、
(i)Ｆａｓ／ＡＰＯ１の細胞外ドメイン（ＥＣ  ＦＡＳ）とｐ５５−ＩＣの細胞内ドメインとの融合生成物、
(ii)ＥＣ  ＦＡＳとｐ５５−ＩＣの「死滅ドメイン」（ＤＤ５５）との融合生成物、
(iii)ＥＣ  ＦＡＳとＦａｓ／ＡＰＯ１の細胞内ドメイン（ＩＣ  ＦＡＳ）との融合生成物および
(iv)ＥＣ  ＦＡＳとＩＣ  ＦＡＳの「死滅ドメイン」（ＤＤ  ＦＡＳ）との融合生成物
である。
前記融合タンパク質のそれぞれにおいて、ＦＡＳリガンド結合能力はＥＣ  ＦＡＳ部分によって提供されるが、融合タンパク質の各種類のオリゴマー化（または少なくともダイマー化）はｐ５５−ＩＣ、ＤＤ５５、ＩＣ  ＦＡＳまたはＤＤ  ＦＡＳ部分のいずれかであるその「テール」領域によって提供される。
前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片およびそれらを含む発現ベクターの構築は、異なる適したオリゴヌクレオチド類（示さず）を前記の「テール」領域のいずれかに連結されるＥＣ  ＦＡＳ断片の調製に用いる以外は実施例４に詳細に記載されている。続いて、発現ベクターを適した宿主細胞に導入し、結果としてえられた発現された融合タンパク質は精製され、オリゴマー化するそれらの能力（およびその程度、すなわちそれらがダイマーまたはより大きなマルチマーを形成するかどうか）についておよびＦＡＳリガンドと結合する能力（およびその結合のアフィニティーまたは積極性）について分析する。
実施例６
可溶性オリゴマー「混合」ＴＮＦ／ＦＡＳ受容体の構築
「混合」アフィニティー、すなわちＴＮＦおよびＦＡＳ受容体リガンドの両方に対するアフィニティーをもつオリゴマー受容体を調製するために、前記（実施例４および５）の融合生成物を以下の手順で利用しうる。
ｉ）ｐ５５ＩＣ、ＦＡＳ−ＩＣ、ｐ５５ＤＤまたはＦＡＳ  ＤＤのいずれか１つと融合したＴＮＦ受容体（ｐ７５ＴＮＦ受容体またはｐ５５ＴＮＦ受容体）の細胞外ドメインを含む、実施例４に記載した融合生成物を提供すること、
ii）ｐ５５ＩＣ、ＦＡＳ−ＩＣ、ｐ５５ＤＤまたはＦＡＳ−ＤＤのいずれか１つと融合したＦａｓ受容体の細胞外ドメインを含む、実施例５に記載した融合生成物を提供すること、
iii）ｉ）の融合生成物のいずれか１つとii）の融合生成物のいずれか１つとを混合して、ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体の細胞外ドメインの両方をもち、それらがそれらのＩＣまたはＤＤ領域でつながれている新規なダイマー（またはより大きいオーダーのオリゴマー）受容体を提供すること。
前記手順において、ｉ）およびii）の融合タンパク質は別々に提供され、すなわち前記タンパク質を生成する形質転換細胞由来のそれらの精製物から提供され、ついでインビトロで混合して混合アフィニティー受容体をえてもよい。または、宿主細胞を両方の型の融合タンパク質をコードする配列を担うベクターでコトランスフェクトしてもよく、そのばあいにおいては、混合アフィニティー受容体はコトランスフェクトした細胞から直接えてもよい。融合タンパク質のオリゴマーへの実際のオリゴマー化は細胞内でまたは細胞において発現された融合生成物をえるための精製手順の間または前記手順ののちに行われてもよい。混合アフィニティー受容体をとくに選択するためにいかなる標準的な方法を利用してもよく、たとえば、ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体の細胞外ドメインに対する抗体を連続するクロマトグラフィー工程に用いて両方の型の細胞外ドメインをもつこれらの受容体を選択する。
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配列表
(1)一般情報
(i)出願人：
(A)名称：イエダ  リサーチ  アンド  ディベロップメント  カンパニー  リミテッド  アット  ザ  ワイズマン  インスティチュート  オブ  サイエンス
(B)街路：ピーオー  ボックス  95
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76100
(G)電話：011-972-847-0617
(H)ファクシミリ：011-972-847-0733
(A)氏名：ヘンリー  ウェインワーゼル
(B)街路：ハーツァル  ストリート  43
(C)都市：ラーナナ
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：43353
(A)氏名：デイビッド  ワラック
(B)街路：ボロチョフ  ストリート  24
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76406
(A)氏名：マーク  ボルディン
(B)街路：ツェレノグラード  927-53
(C)都市：マスコウ
(E)国：ロシア連邦
(F)郵便番号：103575
(A)氏名：アイゴア  メット
(B)街路：レビン  エプスタイン  ストリート  60
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76462
(A)氏名：ユージーン  バルフォロメーフ
(B)街路：ピーオー  ボックス  26
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76100
(ii)発明の名称：ＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリー受容体および可溶性オリゴマーＴＮＦ／ＮＧＦスーパーファミリー受容体のモジュレーター
(iii)配列の数：２５
(iv)連絡先：
(A)名宛人：ブラウディ  アンド  ニーマーク
(B)街路：エヌ  ダブリュ、セブンス  ストリート  419、スイート  300
(C)都市：ワシントン
(D)州：ディストリクト  オブ  コロンビア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：20004
(v)コンピュータ読取フォーム：
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピューター：ＩＢＭ製パーソナルコンピューターコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn Release 1.0、バージョン1.30（ヨーロッパ特許局）
(v)出願データ：
出願番号：PCT/US95/05854
(vi)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国、109,632
(B)出願日：1994年5月11日
(vii)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国、111,125
(B)出願日：1994年10月2日
(viii)代理人情報：
(A)氏名：ブラウディ、ロジャー  エル
(B)登録番号：25,618
(C)ファイル番号：WALLACH=15 PCT
(ix)連絡先情報：
(A)電話：202-628-5197
(B)ファクシミリ：202-737-3528
(C)テレックス：248633
（2）配列番号：１
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２１
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１
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（2）配列番号：２
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２
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（2）配列番号：３
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：３
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（2）配列番号：４
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：１８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４
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（2）配列番号：５
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５
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（2）配列番号：６
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：１８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６
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（2）配列番号：７
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７
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（2）配列番号：８
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８
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（2）配列番号：９
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２８６６
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９
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（2）配列番号：１０
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：６７６
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０
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（2）配列番号：１１
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：１１５３
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１
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（2）配列番号：１２
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２２０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２
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（2）配列番号：１３
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：２２０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１３
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（2）配列番号：１４
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：９００
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：１４
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（2）配列番号：１５
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：９００
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：１５
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（2）配列番号：１６
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：９９５
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：１６
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（2）配列番号：１７
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：９４５
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：１７
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（2）配列番号：１８
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：１４２
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：１８
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（2）配列番号：１９
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：９７
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
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（2）配列番号：２０
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：３９０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２０
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（2）配列番号：２１
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：３８５
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２１
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（2）配列番号：２２
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：４４４
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２２
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（2）配列番号：２３
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：８８８
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２３
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（2）配列番号：２４
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：３９２
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２４
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（2）配列番号：２５
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：４２５
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：２５
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0003966387.tif 000069
【図１０】
0003966387.tif 000070
【図１１】
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【図１２】
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