(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
0004022360.tif 000003
【請求項２】
モルティエレラ・アルピナ・エムイーアール・エフ2368(Mortierella alpina. Mer-f2368, FERM P-17653)を栄養培地中で培養し、その培養液から請求項１に記載の化合物を採取する事を特徴とする、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は真菌の付着を阻害し、真菌が病原性を発揮することを阻害する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高度な化学療法等による免疫機能の低下した患者や高齢者の増加により日和見感染に対する対策は益々重要性を増してきている。カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス等による内臓真菌感染症はこうした日和見感染症の一部を占め、発症率は年々増加しており、しかも直接の死因となるにもかかわらず、有効な治療薬が少ない。
これまでの真菌感染症治療剤は既知の骨格に化学修飾し新規化合物を開発するストラテジーが中心であったが、耐性菌の問題もあり新規メカニズムに基づく新薬の開発が切望されている。
ひとつの有力なアプローチとして、病原体の宿主への付着を阻害することにより病原性を発揮させないという試みが注目されている。最近の研究においても、付着と感染の関係が複数報告されている（Janet F et al., Science, 283: 1535-1538 (1999)、Ed T. Buurman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 7670-7675 (1998)、Cheryl A. Gale et al., Science, 279: 1355-1358 (1998)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は真菌の細胞への付着を阻害し、真菌の病原性発揮を阻害する新規物質を単離し、真菌感染症治療剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記現状に鑑み、本発明者らは微生物培養液を原料として、真菌の細胞への付着を阻害する物質の探索スクリーニングを行った。その結果、モルティエレラ属に属する微生物の培養液中に真菌の細胞への付着を阻害する物質が産生されることを見出した。この活性物質を単離・構造決定したところ新規活性物質であることが判明した。
すなわち本発明は、
(1). 式（Ｉ）で表される化合物。
【化２】
0004022360.tif 000002
(2). モルティエレラ・アルピナ・エムイーアール・エフ2368(Mortierella alpina Mer-f2368, FERM P-17653)を栄養培地中で培養し、その培養液から(1)に記載の化合物を採取する事を特徴とする、(1)に記載の化合物の製造方法、
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明について、１．生産菌のスクリーニング法、２．分離された生産菌の性状、３．生産菌の培養法、４．活性物質の精製法、５．活性物質の抗真菌剤としての利用法の順に詳細に説明する。
【０００６】
１．生産菌のスクリーニング法
哺乳類細胞、好ましくは真菌が接着する細胞である腸管上皮細胞を培養し、適当な方法、例えばエタノールにより固定する。そこへ被検サンプルと、適当な時間インキュベートしたカンジダ・アルビカンスを接種し、一定時間培養後バッファーで洗浄して、寒天培地、例えばサブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を重層する。30℃一晩培養後、CFUをカウントし、付着率を計算する。
【０００７】
２．分離された生産菌の性状
本発明化合物の精製原料として、モルティエレラ属の菌種いずれも使用可能であると期待されるが、本発明の代表的な菌株として、神奈川県で採取された土壌より分離された菌株で、本発明者らがエムイーアール・エフ2368(Mer-f2368)と番号を付した菌株が挙げられる。このエムイーアール・エフ2368菌株の菌学的性状は次の通りであった。
培養は25℃で行った。培地はポテトデキストロース寒天培地を用いた。
本菌株の栄養菌糸はよく発達し、気生菌糸を形成した。気生菌糸より生じる胞子嚢柄は分枝せず、長さ80μmほどで、先端に向け細くなる傾向があった。胞子嚢は直径15μmの亜球形を成し、胞子嚢膜は平滑で溶菌により胞子を放出した。
胞子は無色の単細胞で平滑を呈し、楕円形から腎臓型を示し、大きさは2.5〜4×1.5〜2μmであった。
以上の形態的特性より本菌はモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)種であると同定した。本発明者らは、本菌をモルティエレラ・アルピナ・エムイーアール・エフ2368(Mortierella alpina Mer-f2368)として工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM P-17653の番号で寄託している。
【０００８】
３．生産菌の培養法
上記微生物の培養方法は、通常は液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法などの好気的条件下で行なうのが好適である。
培養に用いられる培地としては、モルティエレラ属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・スティープ・リカー、有機酸などを単独または組み合わせて用い得る。窒素源としてはファーマメデイァ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独または組み合わせて用い得る。
ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、燐酸塩、その他の重金属塩なども必要に応じて添加使用され得る。なお、培養中発泡の著しいときは公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできるが、その添加は目的物質の生産に悪影響をあたえないものとする必要がある。
培地のpHは微生物の至適pH範囲、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常20〜40℃、特に好ましくは25℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、1〜14日間程度とされる。
上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調節される。
【０００９】
４．活性物質の精製法
培養終了後、培養液から化合物EM-f2368を採取するためには、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム等を用いた有機溶媒抽出、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるのもではない。
これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、化合物EM-f2368を単離、そして採取することができる。
【００１０】
５．活性物質の抗真菌剤としての利用法
単離した化合物は真菌の付着阻害活性を有していた。従って該化合物は、第一に真菌感染症のリスクファクターの高い患者さんへの予防投与、第二に難治性真菌感染症に対して既存の抗真菌剤との併用使用が想定される。
該化合物を各種疾患治療・予防剤として投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約 1mg〜100mg を１日１〜数回にわけて投与する。
製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し支えない。
注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。
【００１１】
【発明の効果】
本発明により、真菌の付着を抑制し病原性を減弱させることが可能となった。
【００１２】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
［実施例１］精製方法
モルティエレラ・アルピナ・エムイーアール・エフ2368(Mortierella alpina Mer-f2368)株の斜面培地（ポテト・デキストロース寒天培地）から１白金耳を20 mlの種培地（馬鈴薯デンプン2％、グルコース1％、大豆粉2％、リン酸第一カリウム0.1％、硫酸マグネシウム７水和物0.05％、pH 無調整）を入れた250ml容の三角フラスコに接種し、25℃で３日間回転攪拌機上で培養して種培養液を得た。
この種培養液1mlを上記と同じ組成の培地60mlを含む500ml容の三角フラスコに接種して、25℃で96時間回転攪拌機上で培養を行なった。
培養終了後、得られた培養液3Lを3Lのn-ブタノールで抽出した。得られたn-ブタノール抽出物を、減圧下で濃縮し粗抽出物3.0gを得た。
この粗抽出物を少量のジメチルスルホキシドに溶解し、ODSカラムクロマトグラフィー（YMC-GEL ODS-AM 120-S50（ワイエムシィ社製)、内径50mm、長さ500mm）に付した。30％アセトニトリルで洗浄し、続いて、50％アセトニトリルで溶出した。溶出液は高速液体クロマトグラフで分析し、 EM-f2368（カラム：J’sphere ODS-H80、内径4.6mm、長さ75mm、ワイエムシィ社製、移動層：アセトニトリル−0.01％TFA＝30:70、流速：1ml/min、検出：210nmにおける紫外吸収、保持時間；7.6 min）を含む溶出液を集め、 減圧下濃縮乾固してEM-f2368粗抽出物を得た。
得られた粗抽出物を少量のジメチルスルホキシドに溶解し、分取高速液体クロマトグラフィー（カラム：J’sphere ODS-H80、内径20mm、長さ250mm、ワイエムシィ社製、移動層：アセトニトリル−0.01％TFA＝30:70、流速：10ml/min、検出：210nmにおける紫外吸収、保持時間；30.0min）に付した。この分取をくりかえし、 EM-f2368を含む溶出液をそれぞれ併せ、減圧下濃縮乾固してEM-f2368の純粋な白色粉末を10.0mg得た。
【００１４】
［実施例２］EM-f2368の理化学的性質
１．色および性状：白色粉末
２．分子式：C43H60N10O8
３．分子量：844
４．紫外部吸収スペクトル：
λmax(MeOH, nm(ε))：280 (1400)
５．赤外部吸収スペクトル：
（KBr, cm-1）3260, 1680, 1540, 1440, 1400, 1210, 1140, 840, 800, 730
６．1H核磁気共鳴スペクトル
（600MHz, DMSO-d6）, δppm:
10.73(1H,bs),9.11(1H,s),8.43(1H,bs),7.97(1H,d,7.4),7.91(1H,bs),7.86(1H,d,8.5),7.72(1H,bs),7.52(1H,d,7.4),7.30(1H,d,8.2),7.26(2H,dd,7.4,6.6),7.23(2H,d,7.4),7.18(1H,dd,6.6,6.6),7.13(1H,bs),7.03(1H,dd,8.2,7.4),6.94(1H,dd,7.4,7.4),6.54(1H,bs),6.43(1H,bs),4.62(1H,m),4.34(1H,bs),4.24(1H,m),4.20(1H,m),4.11(1H,m),3.21(1H,dd,15.2,5.0),3.15(1H,m),3.04(1H,m),2.99(1H,m),2.77(1H,m),1.91(1H,m),1.84(3H,s),1.64(1H,m),1.53(3H,d,6.9),1.50(1H,m),1.40(2H,m),1.22(1H,m),1.14(2H,m),0.81(3H,d,6.5),0.80(3H,d,6.5),0.73(3H,d,6.3),0.70(3H,d,6.3)
７．溶解性：
可溶： ジメチルスルホキシド
不溶：ヘキサン、酢酸エチル
８．高速液体クロマトグラフィー分析条件：
カラム：J’sphere ODS-H80、内径4.6mm、長さ75mm（ワイエムシィ社製）
溶媒：アセトニトリル−0.01％TFA＝30:70
流速：1ml/min
検出：210nmにおける紫外部吸収
保持時間：7.6min
【００１５】
［実施例３］f2368の真菌付着阻害活性
6穴マルチウェルプレートの各穴に10％牛胎児血清および2mMグルタミンを含むD-MEM培地（日水製薬）で1×105個/mlに調整したIEC-18細胞を3mlずつ分注した。該プレートを炭酸ガスインキュベータ内で37℃、3日間培養後、培養上清を除去し、エタノール固定した。各濃度のf2368含有サブロー・デキストロース液体培地で30℃、48時間培養したカンジダ・アルビカンスを4×102個/mlに調整し、該プレートの各穴に1ml接種した。30℃、1時間培養後、培養上清を除去し、PBSで洗浄後、サブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を2ml重層した。30℃、一夜培養後、CFUをカウントし、付着率を算出した。その結果を図１に示す。
f2368は、カンジダ・アルビカンスのIEC-18細胞への付着を阻害する活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  f2368の濃度とカンジダ付着率との関係を示す図である。
【図１】
0004022360.tif 000004