(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２が３’末端側）を有する被検体を検出する、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにおいて、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共鳴エネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(2)  前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であり、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少し、
(4)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特徴とする、検出プローブ。
【請求項２】
第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２が３’末端側）を有する被検体を検出する、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにおいて、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共鳴エネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であり、
(2)  前記第２プローブが、前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少し、
(4)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特徴とする、検出プローブ。
【請求項３】
第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２が３’末端側）を有する被検体を、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブを用いて検出する方法において、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共鳴エネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(2)  前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であり、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への蛍光エネルギー移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少し、
(4)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特徴とする、検出方法。
【請求項４】
第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２が３’末端側）を有する被検体を、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブを用いて検出する方法であって、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共鳴エネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であり、
(2)  前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への蛍光エネルギー移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少し、
(4)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（以下ＦＲＥＴとする）を利用した標的核酸検出プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の研究の進展により、種々の生物情報が遺伝子の配列から得ることが出来るようになった。それに伴い当該遺伝子を検出（標的核酸中の特定のポリヌクレオチド配列に対応する）することにより、医療分野においては疾病の存在、薬物に対する感受性、臓器移植の適合性などを診断することが、食品分野においては食中毒の原因になる様々な病原体を検出したり同定することが可能になった。
【０００３】
このような特定のポリヌクレオチド配列を検出するために、検出しようとする配列と相補的な塩基配列からなるプローブを用いたハイブリダイゼーション法が知られている。
【０００４】
このハイブリダイゼーション法において使用される検出手段の１つとしては、蛍光色素でラベル化したプローブを用いて非放射性エネルギー転移（蛍光エネルギー転移又は蛍光共鳴エネルギー移動（以下ＦＲＥＴとする））現象を利用する方法が知られている。係るＦＲＥＴ現象についてはFeorster等によりその理論的取扱を含めてよく知られているものである（Foerster、Discuss.Faraday Soc.,27,7-17(1959)）。実際、エネルギー供与体と受容体をそれぞれ連結したオリゴペプチド類（Stryer等、Proc.Natl.Acad.Sci.,58,719-726(1967)）や、オリゴヌクレオチオド（特公平7-63400）を用いた例が知られている。
【０００５】
一方、係るＦＲＥＴ現象を、特定のポリヌクレオチド塩基配列を高感度かつ高認識で検出する目的に使用するためには、該ＦＲＥＴに基づく現象（例えばエネルギー転移効率）が検出用プローブの構造から定量的に解析可能なものである必要がある。例えば、特定の検出用プローブを使用して特定のオリゴヌクレオチド塩基配列とハイブリダイズさせた際、観測されるＦＲＥＴのエネルギー転移効率から該プローブ近傍の塩基配列情報（例えば該プローブ間にいくつの塩基が介在しているか）を定量的に推定可能とするものである。
【０００６】
実際上記のオリゴペプチド類について、エネルギー供与体及び受容体としての２種類の蛍光色素を用いた場合、該色素間の間隔（距離）と、観測されるエネルギー転移効率の間には、Foerster等による理論式によく一致することが知られている（Stryer等、Proc.Natl.Acad.Sci.,58,719-726(1967)）。しかしながら、上記のオリゴヌクレオチド（１本の標的核酸に対して２本のプローブを用い、その間隔を開けるようなハイブリダイゼーションの方法においては）については、該色素間の間隔（距離）と、観測されるエネルギー転移効率の間には、Foerster等による理論式には一致しない（特公平7-63400）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は上記従来技術に係る問題点、すなわち、オリゴヌクレオチドについて見られる、該色素間の間隔（距離）と観測されるエネルギー転移効率間の、Foerster等による理論式との不一致の原因を鋭意解析し、その結果、特定の構造を有する検出プローブを用いることにより、前記色素間の間隔（距離、又は介在する塩基数）と観測されるエネルギー転移効率の関係において、Foerster等による理論式とよく一致することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係る検出プローブは、特定のオリゴヌクレオチド塩基配列とハイブリダイズした際においても、該プローブの色素間の間隔（距離、又は塩基数に換算）と観測されるエネルギー転移効率の間に、Foerster等による理論式とのよい一致を与えるものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、
第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２が３’末端側、以下同じ）を有する被検体を検出する、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにおいて、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(2)  前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストローム以上であり、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素へのの蛍光エネルギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に従い単調に減少すること、
を特徴とする検出プローブを提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、上記プローブの構成において、エネルギーアクセプター及びエネルギードナー性蛍光色素の結合一のみ異なる構成を有するプローブである、第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２を有する被検体を検出する、第１のプローブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにおいて、
(1)  前記第１プローブが、
前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端にエネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ
(a)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ
(b)  前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であり、
(2)  前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、
(3)  前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素へのの蛍光エネルギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少することを特徴とする、検出プローブを提供するものである。
【００１１】
さらに、上記前記エネルギーアクセプター性蛍光色素の最大径を直径とする球とした際の、前記直径においてより好ましい範囲として１２〜１００オングストローム以上のものが含まれる。
【００１２】
また、本発明は、前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン、パイセン、ペンタフェン、ペンタセン、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ルビセン、コロネン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピランスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフェニルナフタレン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビアントラニル、9,10-ジナフチルアントラセン、ルブレン、1,3,6,8-テトラフェニルピレン、ビピレニル、o-フェニレンピレン、アンサンスレン、3,3'-ビフルオロアンセニル、デカサイクレンからなる群から選択される基を有するものであることを特徴からなる群から選択される基を有するものであることを特徴とする検出プローブを提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特徴とする検出プローブを提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、上記本発明に係るプローブを用いて被検体を検出する方法を提供するものである。
【００１５】
本明細書において使用される、「エネルギードナー性蛍光色素」、又は「エネルギーアクセプター性蛍光色素」とは、それぞれ「蛍光共鳴エネルギー移動ドナー性蛍光色素」、又は「蛍光共鳴エネルギー移動アクセプター性蛍光色素」を意味するものとする。
【００１６】
以下、本発明を、実施の形態に即してより詳しく説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
特定のオリゴヌクレオチド配列を有する標的核酸
本発明においては標的核酸の種類については、特に制限はされず、各種の核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド等）に適用可能である。また標的核酸の長さにおいても特に制限はなく目的に応じて、適当な処理により適当な長さに調製したものにも使用可能である。
【００１８】
本発明は図１にその概念が示されるように、被検体（又は標的核酸、又はターゲット）中の特定のポリヌクレオチド塩基配列（図１では連続するＡ１ＩNＡ２）を検出する方法であって、この特定のポリヌクレオチド塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を有する２種類のプローブ（プローブ１と２）を用いるものである（図１では、塩基配列Ｂ１、Ｂ２とする）。従って、この特定のポリヌクレオチド配列はあらかじめ知られている必要があるが、その数については特に制限はない。充分な認識を可能とするためには、少なくとも２０塩基数あればよい。さらに好ましくは３０塩基以上である。またその特定のポリヌクレオチドの標的核酸中での位置についても特に制限はない。末端付近でも中間部分でもよい。
【００１９】
さらに、本発明に係る方法を使用する際には、ハイブリダイズさせるために少なくとも上記特定のポリヌクレオチド配列部分は１本鎖である必要があるが、標的核酸が２本鎖である場合には、通常の、熱またはアルカリ変性等の方法により容易に１本鎖とすることが可能である。
【００２０】
また、本発明において、特定のポリヌクレオチド塩基配列を検出するとは、図１に示されるように、被検体中の特定の塩基配列が、中間のいくつかの不特定の塩基で離されて存在する場合（図１中ＩNで表されている）において、その中間に存在する塩基の数（図中Ｎで表され、Ｎが０、すなわち係るＩN配列が存在しない場合も含むものである）を正確に測定することも意味するものである。
【００２１】
検出プローブ
本発明に係る検出プローブは、その１つの態様が図１に示されるように、１組２種類のオリゴヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１およびプローブ２）である。被検体中の特定のオリゴヌクレオチド塩基配列とハイブリダイズし認識するためのオリゴヌクレオチド塩基配列（Ｂ１、Ｂ２）を有し、かつ蛍光検出のためにそれぞれ蛍光色素でラベル化されているものである。図１では、一例としてプローブ１にエネルギードナー性蛍光色素（Ｄ）が結合し、またプローブ２にエネルギーアクセプター性蛍光色素（Ａ）が結合しているものを示した。当然、本発明においては、上記（Ｄ）及び（Ａ）が相違するプローブに結合したプローブも含まれる。
【００２２】
（塩基配列）
さらに、図１に示すように、プローブ１は標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列部分Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、また、プローブ２は標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列部分Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有することから、これら２種類のプローブは上記の特定のポリヌクレオチド配列部分Ａ１、Ａ２と連続して、又は中間塩基部分（ＩN）を介してハイブリダイゼーションし、ハイブリッド体を形成するものである。
【００２３】
それぞれのプローブの塩基配列の数には特に制限はない。本発明においては、塩基配列数は約１０以上あればよく、好ましくは１５以上である。塩基数が少ない場合は充分な特異的認識作用がなく、またあまりに多いと取扱性、保存性などに問題を生じるからである。
【００２４】
なお、ここではプローブ１及びプローブ２はそれぞれ別々のものとして説明したが、プローブ１の３’末端とプローブ２の５’末端が適当なリンカーで結合した１つのプローブであってもよい（図示せず）。
【００２５】
また、中間塩基部分ＩNについてもその数Ｎについては特に制限はない。その最小値は０の場合であり、これはプローブ１および２の間に介在する塩基配列がない場合の被検体をも含むことを意味する。被検体の存在を検出する目的で使用する場合は、図４に示されるように、蛍光エネルギー移動効率が最大となるＮが０または１のプローブが好ましいプローブの構成となる。
【００２６】
また使用可能なＮの最大値は、使用する蛍光色素の組合せによる。具体的には、実施例で示すような方法で、種々のＮ値において蛍光エネルギー移動（転移）効率の測定を行い、その結果該効率が有意の値を示す場合の最大のＮの値を求めることが可能となる。以下で説明する実施例の場合はその値（Ｎ）は１０である。
【００２７】
また、図４に示されるように、一連のＮ値を有するプローブを用いてエネルギー転移効率とＮ値の間の関係を確立した後は、Ｎ値が未知の被検体の測定においても測定された転移効率から、Ｎ値が推定可能となる。
【００２８】
（蛍光色素）
本発明に係るプローブ１はその５’末端にエネルギードナー性の蛍光色素を結合し、またプローブ２はその３’末端にエネルギーアクセプター性の蛍光色素を結合するものである（具体的一例が図１に示される）。なお、プローブ１にその５’末端にエネルギーアクセプター性の蛍光色素を結合し、またプローブ２はその３’末端にエネルギードナー性の蛍光色素を結合するものも可能であるが、以下、プローブ１にその５’末端にエネルギードナー性の蛍光色素を結合し、またプローブ２にその３’末端にエネルギーアクセプター性の蛍光色素を結合したもので説明する。
【００２９】
係るエネルギードナー性、及びエネルギーアクセプター性色素は、該エネルギードナー蛍光色素の励起に基づきＦＲＥＴ現象によりエネルギーアクセプター性蛍光色素から蛍光を発生可能とするものである。係る蛍光色素は、主として、大きなストークスシフト、高い量子収率、高い消衰係数、及び放射光波長、励起波長等を考慮して適時選択可能である。
【００３０】
上記エネルギードナー性蛍光色素としては、特に制限はなく、下記エネルギーアクセプター性色素の蛍光帯とほぼ一致する吸収帯を有する色素であればよい。具体的には、エネルギードナー性蛍光色素／エネルギーアクセプター性色素の好ましい組合せとして、ピレン(Pyrene)／アンスアンスラセン(anthanthrene)、ペリレン(Perylene)／ルブレン(rubrene)、３−フェニルフルオランテン(3-phenylfluoranthene)／ルブレン(rubrene)等が挙げられる。本発明においては、特にピレンが好ましい。
【００３１】
また、本発明においては以下の条件を満たすエネルギーアクセプター性色素が好ましく使用できる。すなわち、
(i)  色素が非イオン性の縮合多環式炭化水素系であること。
【００３２】
(ii)  色素の分子サイズが、被検体と、プローブ１及びプローブ２により形成されるハイブリッドの２本鎖内の疎水性領域（グルーブ）よりも十分大きく、該色素分子が該ハイブリッド２本鎖の外側に向いていること。
【００３３】
係る条件を満たす蛍光色素分子としては、少なくとも５個以上のベンゼン環、又はベンゼン環と同等の芳香族環を有する縮合多環式炭化水素が挙げられる。具体的には、ペリレン、パイセン、ペンタフェン、ペンタセン、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ルビセン、コロネン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピランスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフェニルナフタレン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビアントラニル（例えば9,9'-ビアントラニル）、9,10-ジナフチルアントラセン、ルブレン、1,3,6,8-テトラフェニルピレン、ビピレニル、o-フェニレンピレン、アンサンスレン、3,3'-ビフルオロアンセニル、デカサイクレンが好ましく、より好ましくはペリレンが挙げられる。ここで、ベンゼン環と同等の芳香族環とは、炭素数６のベンゼン環のみならず、炭素数６〜８個の芳香族環をも含むものである。また、炭素以外のヘテロ原子（Ｓ、Ｎ、Ｏ等）を含む芳香族環をも含むものである。
【００３４】
さらに、上記のエネルギードナー性蛍光色素との組合せにおいては、大きなストークスシフト、高い量子収率、高い消衰係数を有する組合せ、及び放射光波長、励起波長等を考慮して適時選択可能である。
【００３５】
係るエネルギーアクセプター蛍光色素を選択した場合、以下に説明するように、ＦＲＥＴ現象のエネルギー転移効率が、蛍光色素環の距離に従い減少し、Foersterの理論式に一致するものとなる。
【００３６】
すなわち、該色素が非イオン性であることは、ハイブリダイズ条件が種々のpHで行われても係るpHの変化に影響されにくいこととなる。実際、通常の蛍光色素ラベル化基がイオン解離基を有しているものが多く、pHの変化に大きく影響されることと比較して本発明に係るプローブが高感度、高認識の検出に適しているものである。
【００３７】
また、本発明に係るエネルギーアクセプター性色素の特徴としては、その分子の大きさが、被検体と、プローブ１及びプローブ２により形成されるハイブリッドの２本鎖内に形成されるいわゆる疎水性領域（グルーブ）よりも十分大きいものであり、従って該色素分子が該ハイブリッド２本鎖の該疎水性領域とは相互作用できず、外側に向いていることである。
【００３８】
従って疎水領域以上の分子サイズを有する蛍光色素はその疎水性領域とは相互作用しにくいことになる。その結果、エネルギードナー蛍光色素からの蛍光エネルギー移動がfoersterの理論が予想するように生じることとなるものである。
【００３９】
その結果、Foersterの理論式が適用可能となり、前記Ｎが０の場合に最もエネルギー転移効率が高く、Ｎが増加するにともないエネルギー転移効率が減少することなる。
【００４０】
係る色素を選択する場合においては、色素分子の大きさを、例えば、エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させたとした場合を、通常公知の分子模型、分子計算等を用いて見積り、その直径が１２オングストローム以上、好ましくは１５オングストローム以上のものである。また、あまりに大きい場合は溶解性、取扱性等が困難となることから、約１００オングストローム以下であることが好ましい。
【００４１】
さらに、色素が非イオン性の縮合多環式炭化水素系であり、他の置換基がない場合、またはアルキル基等の置換基のみの場合には、該色素分子の大きさはその色素基の計算上の分子量を用いても推定可能である。具体的には、ペリレン（C20H12）が２５２であり、少なくともこの値以上であることが好ましい。
【００４２】
（リンカー）
本発明において上記２種類の蛍光色素は、各プローブに適当な長さのリンカーを介して結合してもよい。ここでリンカーの種類、形状等には特に制限はない。プローブと標的核酸をハイブリダイズする条件、及び蛍光測定条件等において充分強固な結合性を有していればよい。
【００４３】
具体的には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合等の通常の化学結合を利用したものが好ましいが、特に限定されるものではない。
【００４４】
（プローブ間の距離）
本発明に係る２種類のプローブは、標的核酸たる被検体上で特定の位置を有するようにハイブリダイズするものであるが、必ずしも連続してハイブリダイズする必要はない。すなわち、標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列Ａ１とＡ２と連続してハイブリダイズする場合と、上記塩基配列Ａ１とＡ２間にさらにいくつかの不特定の塩基配列ＩNを介してハイブリダイズする場合とが可能である。
【００４５】
この場合、２種類の蛍光色素間の距離（又はＮ値）と、エネルギー転移効率にはFoersterの理論式が適当可能となるため、その転移効率の測定から、Ｎ値すなわち色素間の塩基数（距離）が推定可能となるものである。
【００４６】
（ハイブリダイズの条件）
本発明において、本発明に係る１組のプローブと標的核酸とのハイブリダイズ条件は特に制限なく通常の条件を使用可能である。例えば、「分子生物学実験マニュアル」（川上正也監修；講談社）１７２ページに記載の方法に準じて、または修正して使用できる。
【００４７】
（検出方法）
本発明に係る標的核酸の検出方法は、図１に模式的に示されるように、本発明に係る検出プローブを用いるものであって、前記１組のプローブが標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列Ａ１とＡ２にハイブリダイズさせ（連続して、又は適当な不特定塩基配列を介して）、得られるハイブリダイズ体の蛍光スペクトルを測定するものである。
【００４８】
すなわち、エネルギードナー性蛍光色素を光励起する条件にて、上記ハイブリダイズ体（ハイブリッド体）の蛍光スペクトルを測定するものである。
【００４９】
ここで、あらかじめ測定して作成した、蛍光色素間の距離と、蛍光色素間のエネルギー転移効率との検量線に基づき、(1)特定の塩基配列Ａ１Ａ２が存在するかどうか、また(2)Ａ１とＡ２間にいくつの塩基配列が存在するかが解析可能となる。具体的には、以下の実施例で使用したプローブにおいては、色素間に塩基数が０個から少なくとも１０個存在することが解析可能となる。
【００５０】
また、標的核酸の存在を検出する目的においては、該蛍光色素間のエネルギー移動が生じていることを判別すればよく、この目的においては、色素間の塩基数が少ない程エネルギー転移効率がよく従って、塩基数が０又は１のプローブが好ましい。
【００５１】
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
【実施例】
(1)  以下のオリゴヌクレオチドの合成は、一般的に、ホスホロアミダイト固相合成法による自動核酸合成機にて合成し、イオン交換ＨＰＬＣにて精製（純度９９％以上）した。
【００５３】
0004008996.tif 000002
上記２つのプローブの末端へ以下の色素を結合した。
【００５４】
P3の3'末端へは1-pyrenebutanoic acidを、carbonyldiimidazole法(CDI法）により導入した（Gottikh等、Tetrahedron 26,4419-4433)。得られた色素導入プローブをPBuA-P3とする。
【００５５】
さらに、P5の5'末端にはN-(1-perylenemethyl)-iodoacetamideを導入した（Czworkwski等、Biochemistry 30,4821-4830,1991）。得られた色素導入プローブをPEMIA-P5とする。
【００５６】
(2)  標準ハイブリダイゼーション溶液（10 mM phosphate buffer(pH7.0)、0.2 M NaCl, 20%(v/v)dimethylformamide(DMF)、以下STDsolnとする）を調製し、100 nMのPEMIA-P5、PBuA-P3  および100 nMのTarを溶解し、得られた溶液の蛍光スペクトルを測定した。結果を図２、３に示す。ペリレンの蛍光ピーク(488 nm)でモニターした図２の励起スペクトルから明らかなように、Tarが存在する（すなわち、ハイブリッド形成したことを意味する）場合にのみ認められる300から360 nmにかけての励起帯が存在する。この励起帯は、ピレン残基の蛍光ピーク(368 nm)でモニターした場合の励起スペクトル（図３）と同一であり、PBuA-P3の吸収スペクトルとの一致する。この結果は、ハイブリダイゼーションによってピレン残基とペリレン残基が接近した場合にのみ認められる励起帯で、ピレンからペリレンへの蛍光エネルギー移動に起因している。
【００５７】
(3)  Tar 32-merの中央部分に余分の挿入配列（thymine oligodeoxyribonucleotides)を導入したターゲットとプローブとのハイブリッド形成における励起スペクトルを測定した（図示せず）。挿入配列のない場合の励起ピーク（347 nm)の強度とTarを添加しない場合の347 nmにおける強度の比はPBuA-P3とPEMIA-P5との347 nmでの分子吸光係数の比がほぼ一致していた。この結果は、２つの蛍光色素が最接近した場合に、エネルギー転移効率が100%であり、Tarのない場合には、転移効率が0%となることを意味する（Stryer等、Proc.Natl.Acad.Sci.,58,719-726(1967)）。そこでTarに対する挿入配列の数と励起ピーク(347 nm)でのエネルギー転移効率の関係図示すると図４となる。すなわち、挿入配列の数が増加し、２つの蛍光色素間の距離が増加すると転移効率が減少する。
【００５８】
さらに、係る結果を解析するために、次式からフェルスター距離を求めた。
【００５９】
R06＝(8.79x105)・κ2・η4・ΦDxJ  （オングストローム）
ここで、Roはフェルスター距離、κは配向因子でdonor双極子とacceptor双極子の転移効率における配向に依存する定数を示す。また、ηは溶媒の屈折率で、本実験では1.36である（Abbe屈折計で測定）。ΦDはdonor蛍光の量子収率であり、本実験では、0.0201であった。Jはdonorの蛍光スペクトルとacceptorの励起スペクトルとの重なり部分の積分値である。
【００６０】
J＝｛∫fD(λ)・εA(λ)・λ4・dλ｝／｛∫fD(λ)dλ｝  (2)
ここで、λはcm単位で表した場合の波長を表す。εA(λ)はacceptorの分子吸光係数(M-1・cm-1)を表す。fD(λ)は単位波長あたりのdonorの補正蛍光スペクトルの量子収率（全面積を１に規格化）を表す。実験により各パラメータを求めて、配向因子についてはランダム配向を仮定すると、R0は20.9オングストロームであった。
【００６１】
ここで塩基間隔が塩基数に比例すると仮定すると、
R＝a＋bN                                      (3)
となる。
【００６２】
ここでRは色素間の距離（オングストローム）で、aとbは比例定数である。Nは挿入した塩基の数を示す。転移効率とR0の関係式は、
E＝R06／（R06＋R6）                            (4)
となる。
【００６３】
式(3)を式(4)に代入し、NとEの関係を示した結果（図４）のカーブフィットを行った。実験結果とカーブフィットデータがよく一致することが示された。
【００６４】
この場合、定数aは10.5オングストロームで、bは1.89オングストロームであった。  また、分子モデル（ＣＰＫモデル）から、両色素分子の距離は約5オングストローム程度と予想できるが、定数aの値はそれとよく一致する。また、b-typeの２重らせんの塩基間隔は約3.5オングストロームと予想されるが、ここではＤＮＡは単鎖であり、水溶液中ではbendingしており、この値よりも小さくなると予想される。このことからもbの値は一致する。これらの結果から、本実験例での蛍光エネルギー移動はフェルスターの理論とよく一致する系であることが明らかである。
【００６５】
【配列表】
0004008996.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るプローブ、およびそれを用いた被検体の検出を模式的に示す図である。
【図２】  PEMIA-P5、PBuA-P3及びTar間のハイブリッド体の励起スペクトルを示す図である。
【図３】  PEMIA-P5、PBuA-P3及びTar間の標準ハイブリダイーゼション条件下でのハイブリッド体の蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】中間塩基配列ＩNのＮ値と、得られる蛍光エネルギー移動効率の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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