(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
0004028386.tif 000011
［式中、
ｍおよびｎは同一または異なって０または１であり、
ＸはＯまたはＮＨであり、
Ｒ１は水素、炭素数６〜２１のアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシルアミノ、アリール、置換アリール、複素環もしくは置換複素環であり、
（ただし、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、もしくは置換複素環は、水酸基、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のアルコキシ、炭素数２〜８のアルケニル、炭素数２〜８のアシル、炭素数２〜８のアシルオキシ、炭素数６〜１４のアリール、炭素数６〜１４のアリールオキシ、もしくは炭素数１〜８の複素環の少なくとも一つで置換されたものである）、
ＡＡ１〜ＡＡ６はα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ７は側鎖にＨＯ−を有するＤ型のα−アミノ酸であり、
ＡＡ８はα−またはβ−アミノ酸である］
で表わされる環状ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２】
上記一般式（１）において、
ＡＡ１は疎水性のα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ２は側鎖にアミノ基を有するα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ３はβ−アラニン、グリシン、または側鎖にＨＯ−、ＨＯＯＣ−、Ｈ２ＮＯＣ−を有するα−もしくはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ４は側鎖にＨＯ−を有するα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ５は側鎖にＨＯ−を有するα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ６は側鎖にＨ２ＮＯＣ−を有するα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ７は側鎖にＨＯ−を有するＤ型のα−アミノ酸であり、
ＡＡ８はグリシン、または側鎖にＨＯ−を有するα−もしくはβ−アミノ酸である、請求項１記載の環状ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩。
【請求項３】
上記一般式（１）において
ＡＡ１はアラニン、バリン、ロイシンであり、
ＡＡ２はリジン、オルニチンであり、
ＡＡ３はβ−アラニン、グリシン、または側鎖にＨＯ−、ＨＯＯＣ−、Ｈ２ＮＯＣ−を有するα−もしくはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ４は側鎖にＨＯ−を有するα−アミノ酸であり、
ＡＡ５は側鎖にＨＯ−を有するα−アミノ酸であり、
ＡＡ６はアスパラギン、グルタミンであり、
ＡＡ７は側鎖にＨＯ−を有するＤ型のα−アミノ酸であり、
ＡＡ８はグリシン、または側鎖にＨＯ−を有するα−アミノ酸である、請求項１記載の環状ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
請求項１記載の環状ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有する抗真菌医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は抗真菌活性を有する新規環状ペプチド及びその薬理学的に許容される塩ならびにそれらを含有する抗真菌医薬組成物に関する。
背景技術
真菌は、ヒト、動物、植物等に感染して種々の疾病を引き起こすことが知られている。このうち、ヒトに感染して、全身性真菌症を起こす原因真菌の主なものとしては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する真菌等が知られている。
真菌による感染症に対する治療、防御の目的に使用可能である抗真菌剤は、現在のところ、非常に少数のものが知られているにすぎず、上記のヒトをはじめとする動物の全身性真菌症の原因菌に対する薬としては、アンホテリシンＢ、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾール等を挙げる事ができる。しかし、これらの薬剤は、効力、毒性、抗菌スペクトル等の点で問題があり、治療剤としては充分なものではなかった。
詳細には、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等のヒト全身性真菌症を起こす原因真菌のうち特にアスペルギルス属に属する真菌に対して有効な薬剤は少なく、上記の既存薬の欠点を補える治療剤が待望されていた。
発明の目的
本発明の目的は、化学合成的に得られる、Ｄ−ａｌｌｏ−トレオニンもしくは種々のβ−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸を有する環状リポペプチド類の中から、優れた抗真菌活性を有する新規環状ペプチドを提供することにある。
発明の概要
本発明を概説すれば、下記一般式（１）：
0004028386.tif 000002
［式中、
ｍおよびｎは同一または異なって０または１であり、
ＸはＯまたはＮＨであり、
Ｒ１は水素、炭素数６〜２１のアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシルアミノ、アリール、置換アリール、複素環もしくは置換複素環であり、
（ただし、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、もしくは置換複素環は、水酸基、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のアルコキシ、炭素数２〜８のアルケニル、炭素数２〜８のアシル、炭素数２〜８のアシルオキシ、炭素数６〜１４のアリール、炭素数６〜１４のアリールオキシ、もしくは炭素数１〜８の複素環の少なくとも一つで置換されたものである）、
ＡＡ１〜ＡＡ６はα−またはβ−アミノ酸であり、
ＡＡ７は側鎖にＨＯ−を有するＤ型のα−アミノ酸であり、
ＡＡ８はα−またはβ−アミノ酸である］
で表わされる環状ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩に関する。
本発明者らは、化学合成的手法により調製した新規環状リポペプチドの中に、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタス等のヒト全身性真菌症を起こす原因真菌に対して強い活性を有する化合物を探索した結果、意外にも８残基のα−またはβ−アミノ酸と１残基のα−またはβ−位にヒドロキシ基もしくはアミノ基を有する脂肪酸よりなる環状リポペプチドにおいて、少なくとも１残基のβ−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸、好ましくはエリトロ形β−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸もしくはＤ−ａｌｌｏトレオニンを含有する環状リポペプチド化合物が、これまでに有効な薬剤の少ないアスペルギルス・フミガタスを含めた上記ヒト全身性真菌症を起こす原因真菌に対して強い活性を示すことを見い出し本発明を完成した。
発明の詳細な説明
上記式（１）で表わされる化合物は、リピド部分としてＲ１を有するヒドロキシ酸若しくはアミノ酸１残基、ＡＡ１〜ＡＡ８の８残基のα−またはβ−アミノ酸よりなる環状リポペプチドである。ｍおよびｎは同一または異なって０または１であり、ＸはＯまたはＮＨである。
Ｒ１は水素、炭素数６〜２１のアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシルアミノ、アリール、置換アリール、複素環もしくは置換複素環である。
ただし、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、もしくは置換複素環は、水酸基、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のアルコキシ、炭素数２〜８のアルケニル、炭素数２〜８のアシル、炭素数２〜８のアシルオキシ、炭素数６〜１４のアリール、炭素数６〜１４のアリールオキシ、もしくは炭素数１〜８の複素環の少なくとも一つで置換されたものである。
Ｒ１として好適なアルキルには、炭素数６〜２１の直鎖状または分枝状アルキル、例えばＣＨ３（ＣＨ２）５−、ｃｙｃｌｏＣ６Ｈ１１ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）６−、ＣＨ３（ＣＨ２）７−、ＣＨ３（ＣＨ２）８−、ＣＨ３（ＣＨ２）９−、ＣＨ３（ＣＨ２）１０−、ＣＨ３（ＣＨ２）１１−、ＣＨ３（ＣＨ２）１２−、ＣＨ３（ＣＨ２）１３−、ＣＨ３（ＣＨ２）１１ＣＨ（ＣＨ３）−、ＣＨ３（ＣＨ２）１４−、ＣＨ３（ＣＨ２）１５−、ＣＨ３（ＣＨ２）１６−、ＣＨ３（ＣＨ２）１７−、ＣＨ３（ＣＨ２）１８−、ＣＨ３（ＣＨ２）１９−、ＣＨ３（ＣＨ２）２０−などが挙げられる。
好ましくはＣＨ３（ＣＨ２）１２−、ＣＨ３（ＣＨ２）１１ＣＨ（ＣＨ３）−であり、これらを有するヒドロキシ酸は、それぞれ、３−ヒドロキシ−ヘキサデカン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル−ヘキサデカン酸である（このときｍは０であり、ｎは１である）。
Ｒ１として好適なアルケニルには、炭素数６〜２１の直鎖状または分枝状アルケニル、例えばＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−、ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３−などが挙げられる。
Ｒ１として好適なアシルアミノのアシル部分には、炭素数６〜２１の直鎖状または分枝状の脂肪族アシルもしくは芳香族アシル、例えばＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＯ−、ｃｙｃｌｏＣ６Ｈ１１ＣＨ２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）９ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１１ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１３ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１５ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１７ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１８ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）１９ＣＯ−、Ｃ６Ｈ５ＣＯ−、Ｃ６Ｈ５−Ｃ６Ｈ４ＣＯ−、Ｃ１２Ｈ７ＣＯ−などが挙げられる。
Ｒ１として好適なアリールには、例えばフェニル、メシチル、トリル、ナフチル、アントリルなどが挙げられる。
Ｒ１として好適な複素環には、例えばフリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソオキサゾリルなどの基が挙げられる。
上記置換基として水酸基を有するものには、例えばＣＨ３（ＣＨ２）１１Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−があり、これを有するヒドロキシ酸は、３，４−ジヒドロキシ−４−メチル−ヘキサデカン酸である（このときｍは０であり、ｎは１である）。
上記置換基として好適なアルキルおよびアルコキシのアルキル部分には、炭素数１〜８の直鎖状または分枝状アルキル、例えばＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）２−、ＣＨ３（ＣＨ２）３−、ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）４−、ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２）２−、ＣＨ３（ＣＨ２）５−、ｃｙｃｌｏＣ６Ｈ１１ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）６−、ＣＨ３（ＣＨ２）７−などが挙げられる。
上記置換基として好適なアルケニルには、炭素数２〜８の直鎖状または分枝状アルケニル、例えばＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−、ＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ２）３−、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−などが挙げられる。
上記置換基として好適なアリールおよびアリールオキシのアリール部分には、炭素数６〜１４のアリール、例えばフェニル、メシチル、トリル、ナフチル、アントリルなどが挙げられる。これらは炭素数１〜８の直鎖状または分枝状アルキル、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、ヒドロキシ、もしくは上記アリールなどの基を少なくとも一つ有していてもよい。
上記置換基として好適なアシルおよびアシルオキシのアシル部分には、炭素数２〜８の直鎖状または分枝状脂肪族アシルもしくは芳香族アシル、例えばＣＨ３ＣＯ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨＣＨ２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＯ−、ｃｙｃｌｏＣ６Ｈ１１ＣＨ２ＣＯ−、Ｃ６Ｈ５ＣＯ−、Ｃ６Ｈ５−Ｃ６Ｈ４ＣＯ−、Ｃ１２Ｈ７ＣＯ−などが挙げられる。
上記置換基として好適な複素環には、炭素数１〜８の複素環、例えばフリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソオキサゾリルなどの基が挙げられる。
上記ＡＡ１は、側鎖として炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するα−またはβ−アミノ酸であり、好ましくはＣＨ３−を有するアラニンである。
上記ＡＡ２は、アミノ基で置換された炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するα−またはβ−アミノ酸であり、好ましくはＨ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−を有するオルニチン、リジンである。
上記ＡＡ３は、水素もしくは炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するアミノ酸、もしくはＨＯ−、ＨＯＯＣ−、Ｈ２ＮＯＣ−を有する炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基もしくはＨ−を有するアミノ酸であり、好ましくはＨ−、ＣＨ３−、ＨＯ−ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−、ＨＯＯＣ−ＣＨ２−、Ｈ２ＮＯＣ−（ＣＨ２）２−、Ｈ２ＮＯＣ−ＣＨ２−を有するグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギンである。あるいはＡＡ３はβ−アラニンである。
上記ＡＡ４は、水酸基で置換された炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するアミノ酸であり、好ましくはＨＯ−ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−を有するセリン、トレオニンである。
上記ＡＡ５は、水酸基で置換された炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するアミノ酸であり、好ましくはＨＯ−ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−を有するセリン、トレオニンである。
上記ＡＡ６は、Ｈ２ＮＯＣ−を有する炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するアミノ酸であり、好ましくはＨ２ＮＯＣ−（ＣＨ２）２−、Ｈ２ＮＯＣ−ＣＨ２−を有するグルタミン、アスパラギンである。
上記ＡＡ７は、水酸基で置換された炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するＤ型のアミノ酸であり、好ましくはＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−、ＣＨ３（ＣＨ３）Ｃ（ＯＨ）−を有するＤ−ａｌｌｏ−トレオニン、Ｄ−β−ヒドロキシバリンである。
上記ＡＡ８は、水素もしくは炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するα−またはβ−アミノ酸、もしくは水酸基で置換された炭素数１〜７の直鎖状または分枝状アルキル基を有するアミノ酸であり、好ましくはＨ−、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−を有するグリシン、アラニン、トレオニンである。
本発明の下記式（１’）で表わされる新規環状ペプチドの代表例として、表１に示した化合物が挙げられる。
式（１’）：
0004028386.tif 000003
0004028386.tif 000004
β−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸残基を本発明の化合物に導入する方法としては、あらかじめアミノ酸の段階で導入し、これを原料として用いる方法とβ−ヒドロキシの導入可能な環状ペプチドを合成した後に導入する方法により行うことができるが、いずれの場合も例えば種々のアルデヒドおよびケトンとグリシン残基等との間でのアルドール縮合反応によって目的化合物を調製することができる。
アミノ酸の段階でβ−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸を調製する場合、原料として、例えばＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌもしくはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌを用いることができ、これらと反応させる求電子試薬として、アセトアルデヒド、アセトン等の種々のアルデヒドもしくはケトンを用いることができる。例えば、ＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌを塩化リチウム等の金属塩の存在下、強塩基であるリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）と反応させ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌをリチウムエノラート体とする方法や、塩化トリメチルシランによりＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌをシリルエノールエーテル体とした後、求電子剤として過剰量のアルデヒドもしくはケトンを加え、低温で数時間攪拌することによってβ−ヒドロキシを有するＤ型のα−アミノ酸の調製を行うことができる。また、グリシンまたはβ−アラニン残基等を有し構成アミノ酸の側鎖官能基を保護した環状ペプチドを調製し、上記と同様の反応によって目的のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸残基へ変換することができるが、好ましくはＬＤＡ等の強塩基を用いてリチウムエノラート体とした後、アルデヒドおよびケトンと反応を行うことができる。
非プロトン性溶媒としては、ＴＨＦの他にジクロロメタンやエチルエーテル等を用いることができる。また、金属塩としては塩化リチウムの他に塩化マグネシウム、塩化セシウム、塩化チタン、塩化アルミニウム、ホウ素化合物等を用いることができる。これらを適当に選択することによって不斉中心の立体化学を制御して、反応生成物に新たに生じる不斉炭素に由来するジアステレオマーを適当な比率に混合物として得たり、目的のジアステレオマーのみを収率よく得ることができる。金属エノラートを生成させるために用いられる強塩基としては、ＬＤＡの他にメチルリチウム、（ｎ−Ｂｕ）２ＢＯＳＯ２ＣＦ３等を用いることができる。さらに、立体化学的に純粋な目的物を得るためには反応温度の制御は重要であり、通常−８０℃〜−２０℃の低温で実施される。
反応混合物は逆相高速液体クロマトグラフィー等によって精製して目的の化合物を単一の光学活性体もしくはジアステレオマーの混合物として得ることができる。さらにこれらの化合物は、公知のまたはそれを応用した方法に従い、構成アミノ酸の側鎖官能基及び原料として用いたアルデヒドもしくはケトン中の官能基に使用した保護基を除去して目的の化合物を得ることができる。
本発明の化合物の製造は、液相合成法もしくは固相合成法を用いた全合成法により行なうことができる。
いずれの方法を用いる場合も、例えば下記の一般式（２）で表わされる直鎖状ペプチドを環化する方法が好適に利用される。液相合成法を用いた全合成法により、この直鎖状ペプチドを調製するためには、２、３個のペプチド断片を合成後、それらを縮合する方法が望ましい。固相合成法を用いた全合成法によっても簡便に各種直鎖状ペプチドを調製することができる。
式（２）：
0004028386.tif 000005
上記の固相合成法を用いた全合成法について、一般式（１）において、ｍ＝０、ｎ＝１であり、Ｒ１が、ＣＨ３（ＣＨ２）１２−であり、ＡＡ１が、Ｌ−Ａｌａであり、ＡＡ２が、Ｌ−Ｏｒｎであり、ＡＡ３が、β−Ａｌａであり、ＡＡ４が、Ｌ−Ｓｅｒであり、ＡＡ５が、Ｌ−Ｓｅｒであり、ＡＡ６が、Ｄ−Ａｓｎであり、ＡＡ７が、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒであり、ＡＡ８が、Ｇｌｙである下記式（３）で表わされる化合物１を例として説明する。
式（３）（化合物１）：
0004028386.tif 000006
［式中、（±）−Ｈｈｄは（±）−３−ヒドロキシヘキサデカン酸を示す。Ｌ−ＯｒｎはＬ−オルニチンを示す］。
固相合成用として一般に用いられている樹脂ビーズに、あらかじめ調製したエステル結合を含むフラグメントＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｈｈｄ−ＯＨを公知の方法で固定化した後、通常の全自動ペプチド合成機を用いて、下記式（４）で表わされる直鎖状保護ペプチドを樹脂ビーズ等の固相担体上に合成する。
式（４）：
0004028386.tif 000007
この直鎖状保護ペプチドを適当な公知の脱離試薬を用いて樹脂から脱離させた後、環化反応を行ない、下記式（５）で表わされる環状保護ペプチドを得る。最終的にこの環状保護ペプチドに含まれるアミノ酸側鎖保護基を適当な公知の脱離試薬を用いて脱保護して式（３）で表わされる目的の化合物１を得る。
式（５）：
0004028386.tif 000008
一般式（２）で表わされる直鎖状ペプチドを合成するために用いられる固相合成用樹脂としてはペプチド合成及びコンビナトリアル合成に用いられるいずれの市販の樹脂を用いることができるが、好ましくは、Ｂａｒｌｏｓら（テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３０巻、３９４７頁、１９８９年）が考案した２−クロロトリチル−クロリド（Ｃｌ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ、１００〜２００メッシュ、１％ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）架橋）樹脂が用いられる。
Ｇｌｙ９と（±）−Ｈｈｄ１との間のエステル結合の形成には、例えばＰｙＢｒｏＰ、ＨＡＴＵ等の縮合剤を用いる方法が挙げられるが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をジメチルアミノピリジンや４−ピロリジノピリジン等の触媒とともに用いる方法である。
上記のように合成したＧｌｙ９と（±）−Ｈｈｄ１との間のエステル結合を含むフラグメントとして、例えばＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨを２−クロロトリチル−クロリド（Ｃｌ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ）樹脂上に固定化する反応は、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等の有機溶媒中、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン等の塩基存在下０℃から５０℃の温度条件下、行われる。好ましくは、ジクロロメタン中、ジイソプロピルエチルアミンを塩基として用いて行われる。反応に用いる溶媒の選択は固定化の収率に大きく影響し、樹脂の膨潤率の大きい溶媒であるジクロロメタンが好適に選択される。
樹脂上でのペプチド鎖の伸長はＦｍｏｃ法もしくはＢｏｃ法により実施することができ、それぞれマニュアル（手動）法もしくは自動合成機によって実施される。好ましくは、自動合成機を用いてＦｍｏｃ法により行われる。自動ペプチド合成機を用いたＦｍｏｃ法でのペプチド合成プロトコールの一例を図１に示した。
アミノ酸の縮合方法としては、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ；ＥＤＣ）−ＨＯＢｔ法、ＰｙＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＡＴＵ法等をジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の塩基存在下、用いることができるが、好ましくは、Ｎ−メチルモルホリンを塩基として用い、ＰｙＢＯＰ−ＨＯＢｔ法により実施される。
Ｎ−Ｆｍｏｃ基の選択的脱保護反応は、広く塩基により進行するが、１０〜１００％ピペリジン、好ましくは３０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液により行われる。
Ｆｍｏｃ法による自動合成機での合成プロトコール終了後、合成されたペプチドを樹脂から脱離させる反応は、通常、トリフルオロ酢酸、塩酸、トロフルオロメタンスルホン酸等にスカベンジャーとしてアニソール、チオアニソール、エタンジチオール等を添加した溶液を用いて実施され、一般に、この時、同時にアミノ酸側鎖保護基も脱離されるが、アミノ酸側鎖保護ペプチドとして脱離させる場合、好ましくは酢酸−トリフルオロエタノール−塩化メチレンの混合溶液を用いて実施される。
樹脂から脱離した目的のアミノ酸側鎖保護ペプチドのＮ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基はいずれも遊離の基であり、これを用いた環化反応は、Ｃ末端としてカルボキシル活性基を有するペプチドに変換し、その後、塩基の存在下に反応させることにより実施することができる。上記環化反応の反応温度の設定は、選択したカルボキシル活性基により異なるが、一般には、−３０〜６０℃の範囲に設定され、好ましくは、−１０〜３０℃である。上記環化反応の反応時間は、数分間〜数日間であり、好ましくは３０分間〜４時間である。
上記環化反応において、Ｃ末端カルボキシル基の活性化は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ）とする方法、ＰｙＢｒｏＰ、ＨＡＴＵ、もしくはＤＣＣ−ＨＯＡｔにより活性化する方法等を用いることができる。また、塩基としては、ＤＩＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン等を用いることができる。さらに、環化反応溶媒としては、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等を用いることができ、式（４）で示される直鎖ペプチドの環化反応では、ジメチルスルホキシドが好適に用いられる。
Ｃ末端カルボキシル基をＨＡＴＵにより活性化する場合、Ｃ末端カルボキシル活性体は、式（４）で表わされるペプチドすなわちＮ末端が遊離または塩形態のアミノ基で、Ｃ末端が遊離カルボキシル基であるものを、塩基存在下、例えばジメチルスルホキシド等の溶媒中、−１０〜３０℃の温度で、ＨＡＴＵと反応させて得ることができる。この場合、上記反応は、同時に環化を伴って進行する。反応系における各反応成分の濃度及び反応温度の精密制御、溶媒の選択等によりさらにその環化収率を増大させることができる。
本発明の化合物は、アミノ酸側鎖保護ペプチドを樹脂から脱離させ、環化反応を実施した後、上記の酸及びスカベンジャーの混合液を用いてアミノ酸側鎖保護基を脱離することによって調製される。
このようにして、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対する最小生育阻害濃度（ＭＩＣ、μｇ／ｍｌ）が低く、毒性のない新規環状ペプチドを得ることができる。
医薬として有用な塩の形態に関する説明
本発明の環状ペプチドは、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、りん酸、ふっ化水素酸、臭化水素酸等の鉱酸の塩；ぎ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマール酸、マレイン酸、こはく酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸の塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属等の塩等を挙げることができる。
本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、そのまま、又は、医薬的に許容される無毒かつ不活性の担体中に、例えば、０．１〜９９．５％、好ましくは０．５〜９０％含有する医薬組成物として、ヒトを含む動物に投与される。
上記担体としては、例えば、固形、半固形若しくは液状の希釈剤、充填剤又はその他の処方用の助剤等を挙げることができ、これらは、１種以上を用いることができる。
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。
本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、抗真菌剤としての用量は、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質および程度等を考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、１０〜２０００ｍｇの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。
上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型等により行うことができる。
上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤等の皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体等の注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。
上記局所投与（経皮投与等）は、例えば、液、クリーム、粉末、ペースト、ゲル、軟膏剤等の外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤等のうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。
上記経直腸的投与は、本発明の環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル等の高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物等の低融点の固体に混入した座剤等を用いて行うことができる。
本発明における代表的化合物の理化学的性質及び生物学的性質は次の通りである。
（１）理化学的性質
既述の表１に示した本発明における代表的化合物１〜７の理化学的性質を下記表２に示す。
0004028386.tif 000009
（２）生物学的性質
本発明の環状ペプチドは、抗真菌活性の判定に使用される代表的真菌であるカンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対し高い抗真菌活性を示す。例えば、上記の化合物１はカンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンスの生育をすべて１２．５μｇ／ｍｌ以下の濃度で阻止することができる。
また、化合物を各々１００ｍｇ／ｋｇずつマウスに腹腔内投与したが、何ら毒性を示さなかった。
実施例
次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物１）の合成
１）（±）−３−ヒドロキシヘキサデカン酸フェナシル（（±）−Ｈｈｄ−ＯＰａｃ）（Ｐａｃ：フェナシル）
（±）−３−ヒドロキシヘキサデカン酸  ５００ｍｇ（１．８４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（３．６ｍｌ）に懸濁し、臭化フェナシル  ４２１ｍｇ（２．１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン  ２９４ｍｇ（２．１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾去し、ろ液を減圧濃縮して標記化合物  ６７８ｍｇを淡黄固体として得た。
２）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＰａｃ
上記１）で調製した（±）−Ｈｈｄ−ＯＰａｃ  ３００ｍｇ（０．７７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍｌ）に懸濁し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ  ２７４ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン  ２８．２ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド  １９０ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、これを１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で洗浄した後、シリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（４０ｇ、ＣＨＣｌ３で溶出）で精製し、標記化合物  ５６３ｍｇを無色固体として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ６７０［ＭＨ］＋。
３）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨ
上記２）で調製したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＰａｃ  ５００ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を９０％酢酸／水（３７．５ｍｌ）に溶解し、亜鉛末を加え、室温で１．５時間攪拌した。析出物をろ去し、ろ液に酢酸エチルを加え、１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で洗浄し標記化合物３７０ｍｇを得た。
４）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−Ｔｒｉｔｙｌ（２−Ｃｌ）−樹脂
上記３）で調製したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨ  １６．５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．５ｍｌ）に溶解し、２−クロロトリチルクロリド−樹脂（１００〜２００メッシュ、渡辺化学工業社製）５０ｍｇ及びジイソプロピルエチルアミン  １７．４μｌ（０．０９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間放置した。反応液にメタノール（４０μｌ）を加えた後、樹脂をろ収し、これを塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、イソ−プロピルアルコール、メタノール、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥した。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨの固定化量の算出：上記４）で調製した樹脂  １０ｍｇに５０％ピペリジン／塩化メチレン溶液（１ｍｌ）を加え、室温で３０分間穏やかに攪拌した。反応液をろ過し、ろ液と樹脂の洗浄液（塩化メチレン）を合わせて減圧濃縮した。残さを塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解し、さらにこれを塩化メチレンで２５倍希釈した。この溶液のＡ２６７及びＡ３０１の吸光度を測定しそれぞれ０．１６７及び０．０７９の値を得た。換算式より、それぞれ０．４８ｍｍｏｌ／ｇ樹脂及び０．５１ｍｍｏｌ／ｇ樹脂の固定化量であった。
５）  Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−Ｔｒｔｙｌ（２−Ｃｌ）−樹脂
上記４）で調製した樹脂  ５０ｍｇ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（各Ｆｍｏｃ−アミノ酸はＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨの固定化量の１０倍量を使用。）を用い、ペプチド自動合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を用いて、ＰｙＢＯＰ−ＨＯＢｔ法による通常の自動合成プロトコールに従って合成した。合成プロトコール終了を確認後、樹脂をイソプロピルアルコール及びメタノールで洗浄し、減圧乾燥した。
６）Ｈ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨ
上記５）で得られた樹脂を酢酸−トリフルオロエタノール−塩化メチレン（１：１：８）の混合液０．８ｍｌに懸濁し、室温で１時間放置した。樹脂をろ去し、ろ液をアルゴン気流下濃縮した後、ジエチルエーテルを加えた。析出した結晶を遠心（１００００ｒｐｍ、５分間）で回収し、標記化合物  １９．５ｍｇを得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １４２９［ＭＨ］＋。
７）Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）
上記６）で得られたＨ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−ＯＨ  １５ｍｇ（１０．５μｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（５．２５ｍｌ）をＨＡＴＵ  ２７．９ｍｇ（７３．５μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン  １２．８μｌ（７３．５μｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（５．２５ｍｌ）に５時間かけて加え、さらに、室温で２時間攪拌した後、そのまま凍結乾燥した。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １４１１［ＭＨ］＋、１４３３［ＭＮａ］＋。
８）Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）
上記７）で得られたＣｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）を含む残さにトリフルオロ酢酸−アニソール−エタンジチオール（９４：５：１）の混合液（１ｍｌ）を加え、室温で２時間放置した。反応液をアルゴン気流下濃縮し、エチルエーテルを加えた。析出した結晶を遠心（１００００ｒｐｍ、５分間）で回収し、これをジメチルスルホキシドに再溶解して凍結乾燥して標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９５７［ＭＨ］＋．
元素分析：理論値（Ｃ４３Ｈ７６Ｎ１０Ｏ１４・２Ｈ２Ｏとして）Ｃ：５２．００％、Ｈ：８．１２％、Ｎ：１４．１３％、分析値Ｃ：５１．９６％、Ｈ：８．１５％、Ｎ：１４．１０％。
実施例２：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物２）の合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨを用いることにより標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９５７［ＭＨ］＋。
実施例３：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｌ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物３）の合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＨを用いることにより標記化合物  ４．８ｍｇを得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １０００［ＭＨ］＋。
実施例４：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物４）の合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−ＯＨを用いることにより標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １００１［ＭＨ］＋。
実施例５：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物５）の合成
実施例１の５）から８）と同様の、方法ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＨを用いることにより標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １０１５［ＭＨ］＋。
実施例６：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物６）の合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いることにより標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９４３［ＭＨ］＋。
実施例７：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）（化合物７）の合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨを用いることにより標記化合物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９７３［ＭＨ］＋。
実施例８：抗真菌活性の確認
液体培地希釈法により、実施例１、３〜７で合成された各化合物の抗真菌活性を測定した。
段階希釈された上記の化合物を含有する培地にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＴＩＭＭ０１３６）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＴＩＭＭ０３５４）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＴＩＭＭ１７７６）をそれぞれ接種し、３０℃、２日間培養を行った。各真菌の増殖をほぼ完全に阻止した濃度を最小生育阻害濃度（ＭＩＣ、μｇ／ｍｌ）として求めた。測定培地は、カンジダ・アルビカンス及びクリプトコッカス・ネオホルマンスではイーストナイトロジェンベース（ディフコ社製）０．６７％、グルコース１．０％を含有する培地（ＹＮＢＧ培地）を用い、アスペルギルス・フミガタスではブレインハートインフュージョンブイヨン（日水製薬社製）０．５％を含有する培地（ＢＨＩ培地）を用いた。測定の結果を表３に示す。
表３に示すように、化合物１、３、４、５、６、及び７はカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ．）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃ．ｎ．）、及びアスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆ．）に対し高い抗真菌活性を示すことが明らかとなった。
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実施例９：化合物１ＡＡ７（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ）のＬ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ置換アナログ：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−ＡＡ７−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）の合成及びそれらの抗真菌活性の比較
１）ＡＡ７：Ｌ−Ｔｈｒ置換アナログの合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いることにより、化合物１ＡＡ７がＬ−Ｔｈｒに置換された化合物（ＡＡ７：Ｌ−Ｔｈｒ置換アナログ）を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９５７［ＭＨ］＋。
２）ＡＡ７：Ｄ−Ｔｈｒ置換アナログの合成
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨを用いることにより、化合物１ＡＡ７がＤ−Ｔｈｒに置換された化合物（ＡＡ７：Ｄ−Ｔｈｒ置換アナログ）を得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ９５７［ＭＨ］＋。
３）抗真菌活性の比較
ＡＡ７：Ｌ−Ｔｈｒ置換アナログおよびＡＡ７：Ｄ−Ｔｈｒ置換アナログのカンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対する抗真菌活性を、実施例８に記載の方法により測定した。ＡＡ７が置換されていないＤ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ体は表３に示すように、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対してそれぞれＭＩＣ  ６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌの濃度で抗真菌活性を示したが、ＡＡ７：Ｌ−Ｔｈｒ置換アナログおよびＡＡ７：Ｄ−Ｔｈｒ置換アナログはいずれの菌に対しても活性を示さなかった（ＭＩＣ＞２００μｇ／ｍｌ）。
実施例１０：ＡＡ４置換アナログ混合物：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−ＡＡ４−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）の調製
化合物１のＡＡ４の位置にＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｙｒ、およびＬ−Ｖａｌのいずれかを有する２０種類の標記環状ペプチドの混合物を調製した。
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、ＡＡ４のアミノ酸の導入のために使用するＦｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨのかわりに、その１／２０量（モル数）のＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨの混合物を用いて合成プロトコールを実施した。最終的に得られた残さのＦＡＢ−ＭＳスペクトルを測定し、２０種類の標記環状ペプチドを含むことを確認した。
実施例１１：ＡＡ５のアミノ酸置換アナログ混合物：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−ＡＡ５−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）の調製
化合物１のＡＡ４の位置にＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｙｒ、およびＬ−Ｖａｌのいずれかを有する２０種類の標記環状ペプチドの混合物を調製した。
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、ＡＡ５のアミノ酸の導入のために使用するＦｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨのかわりに、その１／２０量（モル数）のＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨの混合物を用いて合成プロトコールを実施した。最終的に得られた残さのＦＡＢ−ＭＳスペクトルを測定し、２０種類の標記環状ペプチドを含むことを確認した。
実施例１２：ＡＡ６のアミノ酸置換アナログ混合物：Ｃｙｃｌｏ（−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｏｒｎ−β−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｓｅｒ−ＡＡ６−Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（±）−Ｈｈｄ−）の調製
化合物１のＡＡ６の位置にＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、およびＤ−Ｖａｌのいずれかを有する１３種類の標記環状ペプチドの混合物を合成した。
実施例１の５）から８）と同様の方法、ただし５）において、ＡＡ６のアミノ酸の導入のために使用するＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのかわりに、その１／１３量（モル数）のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨの混合物を用いて合成プロトコールを実施した。最終的に得られた残さのＦＡＢ−ＭＳスペクトルを測定し、１３種類の標記環状ペプチドを含むことを確認した。
実施例１３：ＡＡ４、ＡＡ５およびＡＡ６のアミノ酸置換アナログ混合物の抗真菌活性測定
実施例１０、１１および１２で得たＡＡ４、ＡＡ５およびＡＡ６の各位置でのアミノ酸置換アナログの各混合物のカンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対する抗真菌活性を、実施例８に記載の方法により調べた。ＡＡ４のアミノ酸置換アナログ混合物はクリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対してそれぞれＭＩＣ  １００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度で活性を示し、ＡＡ５のアミノ酸置換アナログ混合物は、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、アスペルギルス・フミガタスに対してそれぞれＭＩＣ  ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＡ６のアミノ酸置換アナログ混合物は同様に、ＭＩＣ  ５０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌの濃度で抗真菌活性を示した。
【図面の簡単な説明】
図１：本発明で実施した一般的な固相合成プロトコールを示す図である。
【図１】
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