(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母菌体に５０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸又はギ酸を１時間以下接触させることにより、菌体内の還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換した後、抽出することを特徴とする酵母中の酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの回収方法。
【請求項２】
酵母菌体が、ニコチンアミドを添加した培地で培養した、菌体内のβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量を高めた酵母菌体である請求項１記載の回収方法。
【請求項３】
酵母がキャンディダ・ウチリスである請求項１又は２に記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生化学、生理学等の研究用試薬として、また臨床診断における酵素分析の測定因子として有用な、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを工業的に製造する主な方法として、酵母菌体から抽出する方法（例えば、農芸化学会誌 38 515 1964、等）及び前駆物質から微生物により生合成する方法（例えば、 Agr.Biol.Chem. 37 1402 1973、等）が挙げられるが、後者は高価な前駆物質を使用するため、一般的には前者の方法が用いられている。
酵母菌体中のβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量は一般に低いが、ニコチン酸アミドあるいはニコチン酸を培地に添加し培養することにより、含量を増大できることが知られている（例えば、農芸化学会誌 40 283 1966、等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酵母内において、酸化型（以下、ＮＡＤと略称する。）と還元型（以下、ＮＡＤＨと略称する。）で存在しているが、ＮＡＤはアルカリ性条件下で、ＮＡＤＨは酸性条件下でそれぞれ不安定で分解するため、これらを同時に酵母菌体から抽出することはできない。通常、菌体からの抽出は中性以下のｐＨで行われており、従って、ＮＡＤだけしか回収されない。
酵母菌体中のβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の存在比は培養条件により異なるが、約１／３〜１／５と言われており（農芸化学会誌 38 515 1964）、培養条件によっては更に割合が高くなる場合もあった。これは、ニコチン酸アミドあるいはニコチン酸を添加・培養し、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの含量を増大させた場合も同様であった。
本発明は、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド中、約２〜４割程度を占めるＮＡＤＨを、工業的に有利に回収することを課題とする。
【０００４】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意研究した結果、抽出の前に酵母菌体懸濁液に酸を添加し、数分間菌体に接触させることにより、菌体内でＮＡＤＨがＮＡＤに変換すること、従ってＮＡＤＨをＮＡＤとして回収できることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、酵母菌体に５０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸又はギ酸を１時間以下接触させることにより、菌体内の還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換した後、抽出するＮＡＤの回収方法を提供するものである。
【０００５】
本発明に使用される酵母は、特に限定されるものではないが、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量の高いものが好ましく、例えばキャンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）等を挙げることができ、通常の培地成分、培養条件で培養することができる。また、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量を増大させるため、ニコチンアミドを添加することもできる。
本発明では、ＮＡＤを抽出する前に、酵母菌体に酸を接触させる。使用できる酸は、有機酸、無機酸いずれでもよいが有機酸が好ましく、中でもギ酸、酢酸が好ましい。接触させる酸濃度は、５０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭが望ましく、濃度が低い場合はＮＡＤＨがＮＡＤに十分に変換されない。酸との接触時間は１時間以下、好ましくは数分程度で十分であり、長時間接触させていると、生成したＮＡＤが再び菌体内でＮＡＤＨに還元され、回収率を低下させる。
菌体からのＮＡＤの抽出は常法により、例えば熱水等で容易に抽出することができる。
【０００６】
【実施例】
以下実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。なお、本実施例で示した含量は、以下の方法で測定した。
▲１▼抽出
ＮＡＤは、酵母菌体懸濁液をそのまま試験管にとり、沸騰水中で４分間加熱し抽出した。
ＮＡＤＨは、酵母菌体懸濁液と０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）と２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を９：１の割合で混合した溶液とを１：１の割合で混合し、沸騰水中で２分間加熱して抽出した。
▲２▼定量
ＮＡＤ、ＮＡＤＨの定量は、アルコールデヒドロゲナーゼを用い、３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定し求めた。
【０００７】
実施例１
酵母として Candida utilis IAM4264 を用い、グルコース３％、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１５％、  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５％、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ  ０．０３２％、ニコチンアミド１５０ｐｐｍの組成からなる培地（ｐＨ４．０）で時間培養し、集洗菌後に適量の蒸留水に懸濁して、乾燥菌体として２５ｍｇ／ｍｌ程度の濃度になるように酵母菌体懸濁液を調整した。
この酵母菌体懸濁液に、表１に掲げた酸をそれぞれ各種濃度になるように添加し、５分間放置した後、ＮＡＤ及びＮＡＤＨを抽出、含量を測定した。
結果を表１に示す。
この表から明かなように、酸を接触させることによりＮＡＤＨが減少し、ＮＡＤが増加する。
【０００８】
【表１】
0004021945.tif 000002
* 乾燥菌体当たりの含量
【０００９】
実施例２
実施例１と同様に培養し、酵母菌体懸濁液を得た。この懸濁液に１００ｍＭとなるように酢酸を添加し、酢酸との接触時間をそれぞれ２分間、５分間、１０分間及び１５分間とした後、ＮＡＤを抽出し、含量を測定した。
その結果、接触時間が２分間では 3.312mg/g、５分間では 3.522mg/g、１０分間では 3.450mg/g、１５分間では 3.360mg/gであった。
【００１０】
実施例３
実施例１において、ニコチン酸アミドを添加しない他は実施例１と同様に実施し、酵母菌体懸濁液を得た。
これに酢酸を１００ｍＭとなるように添加し、５分間放置後、ＮＡＤ、ＮＡＤＨを抽出し、含量を測定した。
その結果、酢酸を接触させる前は、ＮＡＤが 1.939mg/g、ＮＡＤＨが 2.909mg/gであったのに対して、接触させたものは、ＮＡＤが 2.667mg/g、ＮＡＤＨが 1.414mg/gであった。
【００１１】
実施例４
実施例１と同様に培養し、酵母菌体（乾燥菌体として）７５ｇを得た。これを水３Ｌに懸濁し、酢酸を１００ｍＭとなるように添加した。５分間放置後、熱水で抽出し、抽出液を活性炭処理した後、イオン交換樹脂に吸着後溶離し、ＮＡＤ画分を取得することにより、ＮＡＤ１５４ｍｇを得た。
なお、酢酸と接触させず抽出したものは、同様に後処理することにより得られたＮＡＤは１１６ｍｇであった。
【００１２】
【発明の効果】
以上説明してきたように、本発明によると、酵母菌体を酸と接触させ菌体内でＮＡＤＨをＮＡＤに変換することにより、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを効率よく回収することができる。