(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンブおよびワカメから選ばれる褐藻類の組織の乾燥物５重量部を入れた人工海水４５０体積部に対して、マリンブロス液体培地５０体積部に細胞構造多糖のうち複数の成分に対して分解活性を有するシュードアルテロモナス属の海洋細菌を一白金耳植菌し一晩室温で培養した液体培地を５０体積部添加し、これを３日間室温で資化させ、生成した褐藻類の組織分解物を５００体積部の水で希釈調整したものを原液として５０〜４００倍に稀釈して有効濃度に調整することからなる菌根菌の生長促進剤の製造方法。
【請求項２】
シュードアルテロモナス属の海洋細菌が、シュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas  atlantica）である請求項１記載の菌根菌の生長促進剤の製造方法。
【請求項３】
シュードアルテロモナス属の細菌が、シュードアルテロモナス  ＡＲ０６（Pseudoalteromonas  sp.  ＡＲ０６）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０２４号である請求項１に記載の菌根菌の生長促進剤の製造方法。
【請求項４】
褐藻類の組織が、物理的に破砕された粉粒体状の組織である請求項１〜３のいずれかに記載の菌根菌の生長促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、植物の根に共生する有用菌類である菌根菌に対し、その生長を促進する菌根菌の生長促進剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物の菌根（マイコリーザ）は、共生菌が植物から炭水化物を吸収する代わりに土壌中から水分や養分を集めて供給するという共生関係のある菌類である。このような菌根としては、菌糸が細根の表面と細胞の外側を包む外生菌根と、菌糸が根の細胞の中まで進入する内生菌根があり、内生菌根のうち、菌糸が根の細胞に進入して袋状体（Ｖｅｓｉｃｕｌｅ）や樹枝状体（Ａｒｂｕｓｃｕｌｅ）を作る菌根菌はＶＡ菌根と呼ばれている。
【０００３】
ＶＡ菌根菌は接合菌類に属し、特にリンやカリウムの吸収に重要な働きをするものであり、ＶＡ菌根が形成された植物のリン等の吸収率が向上して植物の生長がよくなると共に、病気に対する抵抗力も高くなると考えられている。
【０００４】
一方、海藻類の褐藻類、紅藻類、緑藻類、珪藻類などには、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンなどのような植物の生理活性調節因子となる物質が含まれていることは周知である。
【０００５】
本願の出願人は、食材のコンブ類等からメタノールなどの有機溶媒抽出物を得て、これをメタノール濃度５０重量％以下でＯＤＳの様な吸着樹脂（固定化担体）を充填したカラムを通過させることにより分画して得られる海藻抽出物の製造方法と、それを用いた植物の菌根形成促進方法を特開平１０−２０１４６８号および特開平１０−２７３４１０号公報に開示した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記した従来の菌根菌の生長促進剤の製造方法では、海産藻類のアルコール粗抽出物を得るためにカラムを用いたアルコール溶媒の分取クロマトグラフィーによって分画する処理を必要とし、さらにこの分画物をシリカ系吸着樹脂充填カラムで所定溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行なって分画し、さらに所定の分画物を分取するという煩雑な工程を要しており、菌根菌の生長促進剤を低コストで大量生産するという実用性の高い技術は、未だ開発されていなかった。
【０００７】
そこで、本願の各請求項に係る発明の課題は、海産藻類を原材料とした菌根菌の生長促進剤を、抽出溶媒や分取クロマトグラフィーを用いることのない比較的容易な手法を用いて、可及的に製造効率がよく、低コストで製造できる実用性の高い製造方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、褐藻類の組織をシュードアルテロモナス属の海洋細菌に資化させ、生成した褐藻類の組織分解物を有効濃度に調整することからなる菌根菌の生長促進剤の製造方法としたのである。この製造方法に従い、例えば褐藻類の組織を含有する培地（微生物が生活、発育または増殖可能であるように栄養物を含有している液状物や半固形状または固形状物をいう。以下、同じ。）で、海藻組織分解性のあるシュードアルテロモナス属の細菌を培養（栄養条件を制御して微生物を生活、発育または増殖させること。以下、同じ。）し、生成した組織分解物含有液（培地成分を含んでいてもよい。）を真水で有効濃度に希釈することからなる菌根菌の生長促進剤の製造方法を採用できる。
【０００９】
上記の製造方法では、褐藻類の組織の一部がシュードアルテロモナス属に属する海藻組織分解性細菌で資化されるが、その際に細菌の生産する酵素で褐藻類の多糖類等が分解されていると考えられ、その作用によって組織分解物を含有する液状物が生成する。
【００１０】
そして、この液状物を真水で適当に希釈することにより、菌根菌の生長促進に好ましい影響のある菌根菌の生長促進剤を製造できることが後述する実験等で確認できる。
【００１１】
上記の発明に使用する褐藻類の葉部などの組織は、物理的に破砕された粉粒体状の組織であることが、海藻組織分解性細菌を効率よく作用させるために好ましい。
【００１２】
また、海藻組織分解性のあるシュードアルテロモナス属の細菌としては、シュードアルテロモナス属の海洋細菌は、シュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas  atrantica）、特にシュードアルテロモナス  ＡＲ０６（Pseudoalteromonas  sp．  ＡＲ０６）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０２４号を採用することが、効率よくまた確実に菌根菌の生長促進剤を製造するために好ましい。
【００１３】
また、生成した組織分解物を含有する培養液などの液状物を真水で希釈する際には、例えば５重量部のコンブ乾燥物を原料として人工海水４５０体積部、液体培地５０体積部からなる液状物を生成する条件で５０〜４００倍、好ましくは５０〜１５０倍に希釈することがより作用性の高い菌根菌の生長促進剤を得るために好ましいことである。
【００１４】
原料となる褐藻類は、その代表例としてコンブまたはワカメを採用することによって、ＶＡ菌根菌の菌糸生長率の高い菌根菌の生長促進剤を製造することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この発明に用いる褐藻類としては、マコンブ、ワカメ、アラメ、カジメ、ホンダワラ、モズク等が挙げられる。特にコンブ類は、確実に好ましい結果の得られることが判明しており、マコンブ（Laminaria japonica）その他の周知のコンブ類（コンブ属：Laminaria）についても種類を限定することなく採用できる。
【００１６】
この発明に用いるシュードアルテロモナス属に属する海藻組織分解性細菌の特徴としては、アルギン酸、セルロース、寒天、フコイダン、カラギーナン、キシラン等の海藻における細胞構造多糖のうち、一つもしくは複数の成分に対して分解活性を有する細菌が挙げられる。このような細菌は、特開平５−３０９８８号公報などに記載されたシュードアルテロモナス属に属する周知の細菌であり、前記公報に開示された採取方法および単離方法によるか、または通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている株を入手可能である。
【００１７】
すなわち、Pseudoalteromonas sp.ＡＲ０６株の単離（日水誌第59巻第11号第1865〜1871頁 (1993年) 参照）の具体的方法としては、以下のように行なえる。また、シュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas  atrantica）についても同様に行なえる。
【００１８】
天日乾燥したマコンブ(Laminaria japonica Kombu)を２００メッシュ程度に粉砕する。前記粉砕コンブ１．０％、前記海水９０％に寒天１．５％を加えてｐＨ７．６に調整し、これを上層培地とし、この下層に寒天１．５％前記海水９０％を加えた培地を置き、２０℃で８〜２０日間培養する。よく成育したコロニーあるいは透明環を有するコロニーを採取し、これをペプトン０．５％、ビーフ抽出物０．３％ 、寒天１．５％及び前記海水９０％よりなる寒天培地(NAS培地) プレートに拡げて純粋分離する。
【００１９】
鉤菌したコロニーを、乾燥コンブ片(１．５×３．６cm 、乾物重量０．４〜０．５g)２片及び９０％海水よりなる培地(ｐＨ６．９) ならびに前記乾燥コンブ片２片、ペプトン０．５％、ビーフ抽出物０．３％及び９０％海水よりなる培地(ｐＨ６．９) に接種し、２０℃で４週間振とう培養したり、コンブ片を取り出し巾１０ｍｍとし、その剪断応力を測定する。この結果から、葉体のせん断応力を２００ｇ以下に減少させた細菌株を分離能力の高い（＋＋）マコンブ葉体分解菌とする。
【００２０】
このようして選抜した細菌株について、褐藻成分であるアルギン酸、フコイダン、ラミナラン、セルロースに対する分解酵素活性を調べ、アルギン酸等に対して強い分解活性（１０units 以上）を有する細菌株を得る。
【００２１】
この菌株は、一般性状試験における菌学的性状からシュードアルテロモナス エスペジアナ（Pseudoalteromonas espejiana）であることが絵面・清水の海洋細菌の簡易同定法（技報堂出版「海洋微生物とバイオテクノロジー」第２２９−２３０頁、１９９１年）で確認でき、この菌株をPseudoalteromonas sp.ＡＲ０６株と命名した。
【００２２】
その後、ＡＲ０６株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の決定およびＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験（ハイブリ試験）により分類学的位置の検討によってシュードアルテロモナス  アトランティカ（Pseudoalteromonas  atrantica）であると同定され、この菌株は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５０２４として寄託されている。
【００２３】
海藻組織分解性細菌は、生育にＮａＣｌを要求するため、培養には海水で調製した培地を用いることが好ましい。なお、海藻組織分解性細菌を培養する時には、振とうするか、または攪拌機を用いて攪拌することが組織分解物を含有する培養液の均質な液化のために好ましく、オートクレーブ殺菌前に超音波で破砕することも充分な液化のために好ましいことである。
【００２４】
生成した組織分解物含有液を有効濃度に調整するには、組織分解物を含有する培地を希釈もしくは濃縮するか、または常法により不純物をできるだけ取り除いて組織分解物を分取してから、これを希釈もしくは濃縮する。
【００２５】
真水で希釈して有効濃度に調整する場合は、所定範囲未満で高い濃度の組織分解物含有液とすると、ＶＡ菌根菌の菌糸の生長が不良となる場合があり、また所定範囲を超えて多量の真水で希釈しても、有効成分が低濃度になってＶＡ菌根菌の菌糸の生長試験結果が不良となる場合がある。
【００２６】
【実施例および比較例】
［培地の調整］
３００ｍｌ容の三角フラスコに、マリンブロス（Difco社製：Marine Broth 2216）１８７ｍｇと人工海水５０ｍｌを添加し、オートクレーブ殺菌を行なった。これを冷却後、神奈川件横須賀市の沿岸海水から分離した前記海洋細菌Pseudoalteromonas  ＡＲ０６株を一白金耳植菌し、室温で一晩振とうしたものを液体培地とした。
［組織分解物含有液の製造］
褐藻類のマコンブの葉体を天日乾燥したものを機械的に粉砕し、粒径５０００μｍ以下の海藻粉末を得た。この海藻粉末５ｇを１リットル容ビーカに、人工海水４５０ｍｌと共に入れ、オートクレーブにより減菌処理し、室温まで冷却した。この海藻懸濁液に、前記の液体培地を５０ｍｌ添加し、室温にて３日間振とうした。
【００２７】
これをオートクレーブ殺菌し、水で５００ｍｌにメスアップしたものを組織分解物含有液（原液）とした。
【００２８】
得られた組織分解物含有液（原液）について、濃度に対するＶＡ菌根菌の菌糸の生長に及ぼす影響について、以下の方法によって調べた。すなわち、上記組織分解物含有液（原液）を蒸留水で１０倍（比較例１）、１００倍（実施例１）、５００倍（比較例２）および１０００倍（比較例３）に希釈し、希釈された各液（実施例１および比較例１〜３）毎に１．５％の素寒天培地１０ｍｌ（直径７０ｍｍのシャーレを使用）を調整し、１２１℃でオートクレーブした。その後、ＶＡ菌根菌であるギガスポーラ・ラミスポロフォーラ（Gigaspora ramisporophora）の胞子を１シャーレ当たり４個置き、３０℃の暗黒下でインキュベートした。２週間後、胞子からの菌糸の伸長をＣＣＤカメラを装備した実体顕微鏡およびパソコンによる画像処理法（石井ら、1996）によって測定し、結果を表１および図１に示した。なお、対照区として蒸留水のみを素寒天培地に加えたこと以外は、全く同様にしてギガスポーラ・ラミスポロフォーラ（Gigaspora ramisporophora）の胞子をインキュベートするブランクテストを行ない、これらの結果を表１および図１中に併記した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１および図１の結果からも明らかなように、対照区と比較して１００倍希釈区（実施例１の菌根菌の生長促進剤の施用）におけるＶＡ菌根菌の菌糸は、最も生長が促進されていることが確認された。なお、その他に追加試験を行なった結果、５０〜４００倍の希釈倍率であれば使用に耐える生長促進剤になることが確認され、さらに１００倍希釈にほぼ等しい生長促進作用のある希釈倍率が５０〜１５０倍であることを確認した。
【００３１】
次に、前記した［組織分解物含有液の製造］において、マコンブに代えてワカメを用いたこと以外は全く同様にして、組織分解物含有液（原液）を得た。
【００３２】
得られた組織分解物含有液（原液）について、濃度に対するＶＡ菌根菌の菌糸の生長に及ぼす影響について、以下の方法によって調べた。
【００３３】
すなわち、上記組織分解物含有液（原液）を蒸留水で１０倍（比較例４）、１００倍（実施例２）および１０００倍（比較例５）に希釈し、希釈された各液（実施例２および比較例４、５）毎に１．５％の素寒天培地１０ｍｌ（直径７０ｍｍのシャーレを使用）を調整し、１２１℃でオートクレーブした。その後、ＶＡ菌根菌であるギガスポーラ・ラミスポロフォーラ（Gigaspora  ramisporophora）の胞子を１シャーレ当たり４個置き、３０℃の暗黒下でインキュベートした。２週間後、胞子からの菌糸の伸長をＣＣＤカメラを装備した実体顕微鏡およびパソコンによる画像処理法（石井ら、1996）によって測定し、結果を表２および図２に示した。なお、対照区として蒸留水のみを素寒天培地に加えたこと以外は、全く同様にしてギガスポーラ・ラミスポロフォーラ（Gigaspora ramisporophora）の胞子をインキュベートするブランクテストを行ない、これらの結果を表２および図２中に併記した。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
表２および図２の結果からも明らかなように、対照区と比較して１００倍希釈区（実施例２の菌根菌の生長促進剤の施用）におけるＶＡ菌根菌の菌糸は、最も生長が促進されていることが確認された。
【００３６】
【発明の効果】
この発明は、以上説明したように、粉粒体状のコンブまたはワカメなどの褐藻類の組織を含有液にシュードアルテロモナス属に属する海藻組織分解性細菌を添加し、褐藻類の組織を資化して組織分解物含有液を真水で所定倍率に希釈して菌根菌の生長促進剤を製造するから、抽出溶媒や分取クロマトグラフィーを用いることなく、比較的容易な手法を用いて可及的に製造効率がよく、低コストで実用的に海産藻類を原材料とした菌根菌の生長促進剤を製造できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】コンブ組織分解物含有液の希釈倍率とＶＡ菌根菌の菌糸生長の関係を示す図表
【図２】ワカメ組織分解物含有液の希釈倍率とＶＡ菌根菌の菌糸生長の関係を示す図表
【図１】
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【図２】
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