(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
0003876341.tif 000007
式中、Ｘ１は、カルボニルまたはスルホニル基を意味し；Ｙは、水素、Ｙ’またはＸ１Ｙ’を意味し、ここにおいてＸ１は前記の意味を有し、Ｙ’はヒドロキシル基、アミノ基またはアルコキシル基を意味し；Ｒは、一般式
【化２】
0003876341.tif 000008
式中、Ｘ２は、ジスルフィドまたはメチレン基を意味し；Ｒ１は、アミノ基（−ＮＨ−Ｒ２）を意味し、ここにおいてＲ２は水素または誘導されたカルボキシアルカノイル基を意味し；Ｒ１はまた、イソシアネート、イソチオシアネート、ビニルスルホンアミド（−ＮＨ−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、マレイミド、ハロ−置換トリアジノアミノ、ピリミジンアミノもしくはピリジンアミノ化合物等のアミノ基の反応の結果生じる反応性基、２−ハロカルボキサミド、ジカルボン酸ジハライド由来のモノアミド、エピクロロヒドリン（−ＮＨ−ＣＨ２−オキシラン）の反応によるエポキシド、キノンへのミカエル付加によるシクロヘキセンジオン誘導体（−ＮＨ−シクロヘキセンジオン）を意味し；Ｒ１は更に、カルボキシル誘導体（ＣＯ−Ｒ３）を意味し、ここにおいてＣＯ−Ｒ３は、酸ハライド、イミダゾリド、ヒドラジド、アンハイドライド、ジチオピリジル基（−ＮＨ−（−ＣＨ２）ｎ”’−Ｓ−Ｓ−ピリジル）を用いて誘導されるカルボキシル基またはヒドロキシスクシンイミド、イソウレア、ヒドロキシスクシンイミド−スルホン酸の反応性エステルを意味し；但しＸ２がメチレン基を意味する場合には、Ｒ１はＣＯＲ３またはアミノ基（−ＮＨ−Ｒ２）（ここでＲ２は誘導されたカルボキシアルカノイル基（−ＣＯ−（−ＣＨ２）ｎＣＯ−Ｒ３、ｎ＝１−６））であって、Ｒ３はジスルフィド基を含まなければならず；ｎ’、ｎ”、ｎ”'は、１−６の整数を示す；また、一般式Ｉにおいて、Ｘ１がＮ３基に対してパラ位にあるカルボニル基、Ｙが水素原子、Ｒが一般式IIを示し、一般式IIにおいて、ｎ' 、ｎ”がそれぞれ２を示し、Ｘ２がジスルフィド基を示し、Ｒ１がアミノ基（−ＮＨ−Ｒ２）を示す場合、Ｒ２は水素原子ではない、
を有する異種３官能性化合物。
【請求項２】
基Ｙ’が、基−ＮＨ−Ｙ”または−ＯＹ”であり、ここにおいてＹ”は、水素または−（ＣＨ２）ｎＡ型の基を意味し、Ａは、グリコールまたはオリゴエチレングリコール置換基、ピリジル、ジアルキルアミノまたはＮ−アルキルピリジニウム、トリアルキルアンモニウム等の三級または四級アミノ基を意味し；ｎは１−６の整数を意味する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
光親和性標識方法に用いるための請求項１に記載の一般式Ｉの化合物。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
【０００１】
本発明は、新規な異種３官能性化合物、および生体分子の設計された化学的官能性化のためのそれらの使用に関するもので、これによって、これらの新規化合物は、慣用の光親和性標識方法においても有利の使用されうる。
【０００２】
この光親和性標識は、当然であるが、標識されるべき生体分子が変性しない水性媒体中にて行われる。従って、光親和性標識に使用される試薬には、水への適切な可溶性が要求される。従来官能化のために使用されてきた物質のうちの多くは、水への中程度の可溶性を有するのみであって、従って、それらを生体分子の水溶液に対して、有機溶媒を用いて導入することが必要であった。更に、これらの試薬の水可溶性部分は、標識工程の間に切断除去される。水可溶性部分の切断の結果として、高度に標識された標識されるべき生体分子が、水−不溶性となる危険が存在する。更に、水不溶性の標識は、それら自体が標識分子の疎水性領域に積もる傾向を示し、従って引き続く反応のために接近することが困難になる。
【０００３】
【従来の技術】
文献中に記述される方法は、均質相中で行われる［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，１９，２１９６−２２０３；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９８３，７６１，１５２−１６２］。従って、親和性複合体のパートナーの一つ（例えば、抗体標識のおける抗原、またはレセプタ標識におけるリガンド）は、異種３官能性試薬の化学的反応性基と最初に反応させられる。大型の結合パートナー（例えば、蛋白質−蛋白質親和性複合体）の場合には、この親和性複合体のパートナーは、有効な親和性標識を達成するために数個の異種３官能性分子と反応させられなければならなかった。この結合パートナーの一方の化学修飾の後に、第２のパートナーの添加によって、親和性複合体が、形成される。光活性化可能な基の光分解的活性化によって、この複合体は、共有結合により安定化される。活性化形態のこれらの基は、高度に反応性の基であって、それらのもっとも近接するものと直ちに再反応するため、この形成は、親和性複合体の２個のパートナーの接触部位（またはこれらの接触部位の近傍）にて独占的に起こる。引き続いて、この親和性複合体は、第３の官能基−ジスルフィド基−の還元による切断によって再溶解されうる。還元の後、２個のパートナーは、適切にｐＨ値またはイオン強度を変化させることによって遊離され、これによって両者は遊離のチオール基を介して配置され；パートナーの一方の場合にはこれらは表面にわたって任意に分布し、他方のパートナーの場合には、それらは親和性複合体の結合部位領域内またはその近傍に局在化する。２種のパートナーは、次いで引き続く既知のクロマトグラフィ技術による分離工程にて分離されなければならない。
【０００４】
アルキルチオ基は、一方においてこの方法にて修飾された生体分子の対応する官能化表面への固定化を可能とし、他方において蛍光性基等の付加的な基の連結を可能とし、これによってチオール基の親電子的特性のみならず、チオール置換もこのような反応のために使用され得る。該チオールのアルキル残基は、スペーサの機能を有する。
【０００５】
本発明の目的は、生体分子の標識の前後において水可溶性基を有し、従って標識生体分子が水可溶性を維持し、かつ標識分子が生体分子表面に固定化された後に溶液中に自由に突出するようにした生体分子の親和性標識用化合物を提供することである。
本発明の更なる目的は、既知の方法において必要とされているクロマトグラフィ的分離を回避することである。
【０００６】
この目的は、一般式Ｉの化合物によって、および生体分子の設計された標識のために選択される親和性複合体のパートナーを固体表面に共有結合的に固定化し、しかして高価なクロマトグラフィ的方法を回避することを含む新規方法によって達成される。
【０００７】
本発明による新規異種３官能性化合物は、一般式：
【化３】
0003876341.tif 000002
【０００８】
式中、Ｘ1 は、カルボニル（＞Ｃ＝Ｏ）またはスルホニル（＞ＳＯ2 ）基を意味し；Ｙ＝Ｈ、Ｙ’またはＸ1 −Ｙ’であり、ここにおいてＹ’はヒドロキシル基またはアルコキシル基（−Ｏ−Ｙ”）またはアミノ基（−ＮＨ−Ｙ”）であり、ここにおいてＹ”はＨまたは（ＣＨ2 ）n Ａ型の水可溶性基である。ｎ＝１−６である。
【０００９】
Ａは、グリコールまたはオリゴエチレングリコール置換基、あるいはピリジル、ジアルキルアミノ、Ｎ−アルキルピリジニウム、またはトリアルキルアンモニウム等の三級または四級アミノ基である。アルキルは、およそＣ１−Ｃ４の低級アルキル残基を示す。
【００１０】
Ｒは、一般式：
【化４】
0003876341.tif 000003
【００１１】
式中、Ｘ2 は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）またはメチレン基（−ＣＨ2 −）である、
を有する官能基である。
【００１２】
Ｒ1 は、アミノ基（−ＮＨ−Ｒ2 ）またはカルボキシル誘導体（−ＣＯ−Ｒ3 ）を意味する。Ｒ2 、は水素または誘導されたカルボキシアルカノイル基（−ＣＯ−（−ＣＨ2 ）n ＣＯ−Ｒ3 ）である。
【００１３】
ＣＯ−Ｒ3 は、酸ハライド、イミダゾリド、ヒドラジド、アンハイドライド、ジチオピリジル基（−ＮＨ−（−ＣＨ2 ）n"' −Ｓ−Ｓ−ピリジル）を用いて誘導されるカルボキシル基またはヒドロキシスクシンイミド、イソウレア、もしくはヒドロキシスクシンイミド−スルホン酸の反応性エステル等の活性化カルボキシル基である。
【００１４】
ｎ' 、ｎ" 、ｎ"'は、１−６の整数を示す。
【００１５】
Ｘ２がメチレン基を意味する場合には、Ｒ１はＣＯＲ３またはアミノ基（−ＮＨ−Ｒ２）（ここでＲ２は誘導されたカルボキシアルカノイル基（−ＣＯ−（−ＣＨ２）ｎＣＯ−Ｒ３、ｎ＝１−６））であって、Ｒ３はジスルフィド基を含まなければならず、従ってＲ３は、例えば、Ｒ２が前記の意味を有し、Ｒ２に含まれるＲ３がジスルフィド基を含まない、シスタミン誘導体−ＮＨ−(ＣＨ２）２−Ｓ−Ｓ−(ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｒ２を示す。
【００１６】
Ｙ＝Ｈの場合、Ｘ1 −Ｒ（Ｒ3 を含まない）は、親水性基（例えば、Ｘ1 ＝−ＳＯ2 −またはＲ1 ＝三級または四級アミノ基）である。
【００１７】
親水性基Ｘ1 −Ｒ（Ｒ3 を含まない）について、Ｙは場合によりＸ1 −Ｒ（二重固定）であり得る。
【００１８】
アミノ基Ｒ1 はまた、イソシアネート、イソチオシアネート、ビニルスルホンアミド（−ＮＨ−ＳＯ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、マレイミド、ハロ−置換トリアジノアミノ、ピリミジンアミノもしくはピリジンアミノ化合物（例えばジクロロトリアジン）、２−ハロカルボン酸誘導体（２−ハロ酢酸ハライド、２−ハロプロピオン酸ハライド等）、ジカルボン酸ハライド由来のモノアミド、例えばエピクロロヒドリンによるエポキシド、またはキノンへのミカエル付加によるシクロヘキセンジオン誘導体等、他の反応性基の変換されうる。
【００１９】
0003876341.tif 000004
【００２０】
0003876341.tif 000005
【００２１】
Ｘ2 ＝−ＣＨ2 −、
Ｒ1 ＝ＣＯＲ3 ＝ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）2 −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2 ）2 −ＮＨ−Ｒ2 （Ｒ2 ＝Ｈ、ＣＯ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−Ｒ3 ）、ここにおいてＲ3 はジスルフィド化合物を除いて上記３列目に定義されたものと同様である。
【００２２】
Ｒ1 ＝ピリジニウム（Ｎ−ＣＨ2 −ＣＯ−Ｒ3 ）
0003876341.tif 000006
【００２３】
これらの新規化合物は、化学反応性基Ｒ、光化学的反応性基Ａｒ−Ｎ3 、および還元的切断可能な−ＳＳ−（Ｘ2 ）基を含むことから、異種３官能性である。化学的反応性基および光化学的反応性基は、切断可能な−ＳＳ−基を含むスペーサ基によって、互いに分離されている。水可溶性基は、例えばカルボン酸またはスルホン酸あるいはそれらの誘導体であって、芳香族環、または芳香族環と切断可能な−ＳＳ−基との間のスペーサ基のいずれかに対して結合される。この位置づけは、水可溶性基が、標識されるべき生体分子中に標識と共に取り込まれることを保証する。
【００２４】
固体上にて行われるアルキルチオ基の生体分子の設計された導入のための新規方法は、標識されるべき生体分子の固相表面に対する外方に向けた固定化を中間段階に使用する。該表面は、中間的固定化が標識されるべき分子の部分を介して起こるように修飾される。このことは、例えば、この表面に標識されるべき分子の領域を認識する親和性複合体のパートナー（例えば、抗体分子のＦｃ部分の標識のために蛋白質Ａ、抗体または受容体の抗原結合またはリガンド結合領域の標識のために抗原またはリガンド、およびその逆、あるいはＤＮＡ結合蛋白質のＤＮＡ結合領域の標識のためにｓＤＮＡおよびＤＮＡ等）を固定化することによって達成され得、異種３官能性試薬は、親和性複合体の固定化されたパートナーに化学的反応性基の手段により結合される。この表面への標識される分子の外方へ向けた固定化の後、これらの分子は光誘導反応（光反応性基の活性化）によって表面に結合される。従って、前述の水可溶性異種３官能性試薬が、表面への固定化のために特に好ましいことが明らかであろう。水可溶性基の特別な配置（フェニル環上またはフェニル環と−ＳＳ−官能基との間のスペーサ基上）によって、分子の光化学的活性化領域は、表面への固定化後に水性層に向けて突出する、すなわち光反応性基が標識されるべき分子の近傍に配置され、これによってカップリングの可能性が著しく増大する。この結合は、好ましくは標識されるべき化合物の表面に近接する構造部分を介して、あるいは親和性複合体形成に寄与している領域を介して行われる。ジスルフィド結合の、例えばジチオスレイトール等による還元の後、該標識分子は、固相の表面から適当なｐＨ値、またはイオン強度または洗浄剤の添加によって洗浄除去される。
【００２５】
本発明に従うと、固相表面に固定化された親和性複合体のパートナーを光活性化可能な試薬と反応させることは、必ずしも必要ではない。この反応性基を、固定化されるべき親和性複合体のパートナーより先行するかまたはそれと同時に表面に固定される第３の分子を介して表面に結合させることも可能である。このような標識された第３の分子の取り込みの優位点は、これによって共有結合的に固定化される親和性複合体のパートナーが、標識される必要がないこと、およびこのパートナーの活性の損失が起こらないことにある。この標識方法においては、親和性複合体の形成に寄与する標識されるべき分子の領域が標識されるのみならず、配向の利点によって表面近傍にある分子のすべてに領域が標識される。
【００２６】
更に本発明によれば、この方法は、標識されるべき生体分子の配向のために表面上で操作する場合に、親和性複合体のパートナーを使用する必要がないという優位点をも有する。従って、ある型の生体分子の配向のために、固相の表面を、標識されるべき所定の分子が特定の領域について表面に吸着されるように化学的に調製することができ、従ってこの領域が親和性複合体のパートナーを使用することなく標識される（例えば、膜蛋白質の膜内外部分または膜内外部分近傍の領域の標識のために膜類似性表面、あるいは、蛋白質を所定のアミノ酸配列の近傍において標識するために、この所定の配列によって飽和される不飽和配位領域を持った表面上の金属錯体等）。この配向機能に加え、該表面は異種３官能性化合物との反応に付される。これらの化合物の光反応性領域は、それらの水可溶性のために水性層に向けて突出し、活性化後に好ましくは標識されるべき分子の表面近接領域において反応する。
【００２７】
【実施例】
以下の例は、異種３官能性化合物の製造を例示するものである。
【００２８】
４１ｍｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを、１ｍｌの塩化チオニル中で５時間撹拌し、次いで水流ポンプで減圧濃縮した。粗製の酸塩化物を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、１ｍｌのピリジン中の溶液として１４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて処理した。該混合物を２時間撹拌し、引き続いて高真空下で濃縮した。６８ｍｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）Ｎ’−（３−スクシンイミジルオキシカルボキシプロピオニル）シスタミンを、ピリジニウム塩として得た。
【００２９】
使用した出発原料を次のように調製した。
２．２ｇのシスタミンジヒドロクロライドを２０ｍｌの水に溶解し、ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調整した。この溶液中に、２．１ｇのｐ−アジドベンゼンスルホニルクロライドを懸濁し、この懸濁物を室温にて５時間撹拌した。沈殿したＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）シスタミンを、２ｇの無水コハク酸と反応させ、一夜撹拌した。得られた溶液をＨＣｌにて酸性化し、次いでろ過し水にて洗浄した。残渣を室温にて高真空下で乾燥させ、１．５３ｇのＮ−（ｐ−アジドベンゼンスルホニル）Ｎ’−（３−カルボキシプロピオニル）シスタミンを得た。ＩＲは、３２８３（アミドＮＨ）、２１３４（アジド）、１７１４（酸カルボニル）、１６５０（アミド）、１５８９＋１５４７（芳香族）、１２８４（ＣＯＯＨ）、１３２８＋１１８０（アリールスルホニル）、８３９（ｐ−ジ置換ベンゼン）においてバンドを示した。ＴＬＣ（シリカゲル−ＮＨ3 濃度／ＥｔＯＨ＝１％）、Ｒｆ＝０．７、ｍ. ｐ.:１６３℃にて分解。