(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＤＮＡを含有する試料を、ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも２５０ｂｐを含むＡＡＶ核酸配列の第１の領域であって、５’末端において高度に保存された配列の少なくとも１８塩基対と３’末端において高度に保存された配列の少なくとも１８塩基対が隣接する可変配列を有し，かつ、該塩基対が少なくとも２種のＡＡＶ血清型の整列に関連して高度に保存されている上記第１の領域を特異的に増幅する第１のプライマーのセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅に供する工程を含んでなり；
ここでプライマーのセットのそれぞれは５’プライマー及び３’プライマーから成り；そして
ここで増幅された配列の存在が試料中におけるＡＡＶの存在を示す、
ことを特徴とする、ＡＡＶを含有することが疑われそしてＤＮＡを含有する試料中における未知のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）配列の検出方法。
【請求項２】
（ｂ）ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に５’である配列を含む第２の領域を特異的に増幅する第２のプライマーのセットを用いるさらなる増幅に供し、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５’末端にアニーリングするＡＡＶ５’伸長配列を得る工程をさらに含んでなり、かつ、該第２の領域が少なくとも２種のＡＡＶ血清型の核酸配列の整列に基づいて予め決定されており、そして少なくとも２種の整列されたＡＡＶ血清型に関連して、該領域の配列の５’ 末端において少なくとも１８塩基対に亙って高度に保存されている核酸配列と中間の可変配列と３’末端において少なくとも１８塩基対に亙って高度に保存されている核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に３’である配列を含む第３の領域を特異的に増幅する第３のプライマーのセットを用いるさらなる増幅に供し、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の３’末端にアニーリングするＡＡＶ３’伸長配列を得る工程をさらに含んでなり、かつ、該第３の領域が少なくとも２種のＡＡＶ血清型の核酸配列の整列に基づいて予め決定されており、そして少なくとも２種の整列されたＡＡＶ血清型の配列に関連して、該領域の配列の５’末端において少なくとも１８塩基対に亙って高度に保存されている核酸配列と場合により中間の可変の配列と３’末端において少なくとも１８塩基対に亙って高度に保存されている配列を含む、ことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、工程（ｂ）及び（ｃ）を実施し、かつ、（ｄ）増幅された配列を用いて部分的及び／又は完全なＡＡＶ遺伝子を含む配列を構築し、それにより試料からＡＡＶ遺伝子配列を単離する工程をさらに含む、上記方法。
【請求項５】
第１の領域がＡＡＶ１，配列番号：６の約ｂｐ２８００−約３２００及び他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対に亙る請求項１に記載の方法。
【請求項６】
プライマーが配列番号：６のヌクレオチド１３９８−１４２３の配列を有するＡＶ１ｎｓ及び配列番号：７の配列を有するＡＶ２ｃａｓである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が全長キャプシド遺伝子を増幅する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増幅された配列がＡＡＶｃａｐ遺伝子及びＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料がプロウイルスＡＡＶ配列を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
高度に保存されている塩基対がＡＡＶ１，２，３，４，５及び６、並びにガチョウ及びアヒルから単離されたＡＡＶの整列に関連して高度に保存されている請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
可変配列が超可変配列である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１の領域が１０キロの塩基対までの長さを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第１の領域が全長ｃａｐ配列を含む３．１キロの塩基対断片を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の試料中の増幅された配列からの制限酵素消化パターンを、１つもしくはそれより多くのアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）配列の対応する領域に関する制限酵素消化パターンと比較し、それにより試料中のＡＡＶ配列を１つもしくはそれより多いＡＡＶ配列の１つからのもの又は未知の配列からのものであると同定する工程を含む、ことを特徴とする試料中のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）配列の配列を既知もしくは未知と同定する方法。
【請求項１５】
ＡＡＶの汚染が疑われる細胞のＤＮＡから試料中の未知のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在を検出するためのキットであって、（ａ）ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも２５０ｂｐを含むＡＡＶ核酸配列の第１の領域であって、５’末端において高度に保存された配列の少なくとも１８塩基対と３’末端において高度に保存された配列の少なくとも１８塩基対が隣接する可変配列を有し，かつ、該塩基対が少なくとも２種のＡＡＶ血清型の整列に関連して高度に保存されている上記第１の領域を特異的に増幅する第１のプライマーのセットを含んでなり、かつ、該第１のプライマーのセットが５’プライマー及び３’プライマーから成り、該プライマーの各々がそれの相対的に高度に保存された配列に相補的な少なくとも１５塩基対を含み、そしてそれの３’末端における少なくとも５塩基対に亙りそれの相対的に高度に保存された配列と正確に同一である、ことを特徴とする上記キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、該第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５’末端にアニーリングするＡＡＶ５’伸長配列が得られるように、該第１の領域及び該第１の領域に５’である配列を含むＡＡＶ核酸の第２の領域に特異的な第２のプライマーのセットをさらに含んでなり、かつ、該第２のプライマーのセットが５’プライマー及び３’プライマーから成り、該プライマーの各々がそれの相対的に高度に保存された配列に相補的な少なくとも１５塩基対を含み、そしてそれの３’末端における少なくとも５塩基対に亙りそれの相対的に高度に保存された配列と正確に同一である、ことを特徴とする上記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
パルボウィルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）科のメンバーであるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は４．７キロベース（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小さい非−包膜正二十面体ウィルスである。ＡＡＶはデペンドウィルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）の属に指定され、それは該ウィルスが精製されたアデノウィルス素材（ｓｔｏｃｋ）中の汚染物として発見されたからである。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが、感染の後、宿主の染色体中に部位特異的に組込まれる潜伏期及び、アデノウィルス又は単純疱疹ウィルス感染に続き、組込まれたゲノムが続いてレスキューされ（ｒｅｓｃｕｅｄ）、複製され、感染性ウィルスに詰込まれる感染期を含む。非−病原性、非−分裂細胞を含む感染力の広い宿主範囲及び部位−特異的染色体組込みの可能性は、ＡＡＶを遺伝子伝達のための魅力的な道具としている。
【０００２】
近年の研究は、ＡＡＶベクターが遺伝子治療のための好ましいベヒクルであり得ることを示唆している。今日までに、ヒト又は非−ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離された６種のＡＡＶｓの血清型があり、十分に特性化されている。それらの中でヒト血清型２は、遺伝子伝達ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり；それは種々の標的組織及び動物モデルにおいて有効な遺伝子伝達実験のために広く用いられてきた。ＡＡＶ２に基づくベクターの、いくつかのヒトの病気のモデルへの実験的適用の臨床試験は進行中であり、のう胞性線維症及び血友病Ｂのような病気が含まれる。
【０００３】
望まれているのは、遺伝子送達のためのＡＡＶに基づく構築物である。
【０００４】
［発明の概略］
１つの側面において、本発明はバイオインフォーマティクス分析（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＰＣＲに基づく遺伝子増幅及びクローニング法を用い、ヘルパーウィルス遺伝子の共感染の不在下におけるＡＡＶｓの潜伏性及び組込み性に基づき、種々のヒト及び非−ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織の細胞ＤＮＡｓからＡＡＶ配列を検出し、同定する新規な方法を提供する。
【０００５】
他の側面において、本発明は上記の本発明の方法を用いて検出される新規なＡＡＶ配列を単離する方法を提供する。本発明はさらにキャプシド遺伝子配列及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子結合の構造の利用性のみに基づく、血清学及び遺伝子伝達研究のための、これらの新規なＡＡＶ血清型に基づくベクターの形成の方法を含む。
【０００６】
さらに別の側面において、本発明はプライマー／プローブの遺伝子セット（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｅｔ）を含む本発明に従う試薬及び定量的実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いる、血清学、疫学、生物分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）及び伝達の様式の研究を行うための新規な方法を提供する。
【０００７】
さらに別の側面において、本発明はＲＡＣＥ及び他の分子的方法を用い、種々の起源の細胞ＤＮＡから新規なＡＡＶ血清型の完全且つ感染性ゲノムを単離する方法を提供する。
【０００８】
さらに別の側面において、本発明は種々の起源のアデノウィルスヘルパーを用い、ヒト及びＮＨＰ細胞系からＡＡＶゲノムの新規な血清型を取り出す方法を提供する。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明は新規なＡＡＶ血清型、それを含有するベクター及びそれらの使用法を提供する。
【００１０】
本発明のこれらの及び他の側面は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかになるであろう。
【００１１】
［発明の詳細な記述］
本発明において発明者等は、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）が核に侵入し、ヘルパーウィルス共−感染の不在下で、細胞ＤＮＡ中に組込まれ、潜在性感染を確立する能力を利用する方法を見出した。この方法はヒト及び非−ヒト霊長類起源ならびに他の源からの組織からのＤＮＡｓからＡＡＶｓの配列を検出、同定及び／又は単離するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく戦術を用いる。有利なことに、この方法は下記に記載するように、他の組込まれたウィルス及び非−ウィルス配列の検出、同定及び／又は単離にも適している。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の方法に従って同定された核酸配列を提供する。１つのそのようなアデノ随伴ウィルスは新規な血清型のものであり、本明細書で血清型７（ＡＡＶ７）と称する。本明細書で提供する他の新規なアデノ随伴ウィルス血清型にはＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２が含まれる。本発明の方法に従って同定されたさらに別の新規なＡＡＶ血清型は本明細書に示されている。引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる図及び配列表を参照されたい。
【００１３】
これらのＡＡＶ配列のフラグメントも提供する。特に望ましいＡＡＶフラグメントの中に、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３を含むｃａｐタンパク質、超可変領域、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質ならびにこれらのタンパク質をコードする配列がある。これらのフラグメントのそれぞれを多様なベクター系及び宿主細胞において容易に用いることができる。そのようなフラグメントを単独で、他のＡＡＶ配列又はフラグメントと組み合わせてあるいは他のＡＡＶもしくは非−ＡＡＶウィルス配列からの要素と組み合わせて用いることができる。１つの特に望ましい態様において、ベクターは本発明のＡＡＶｃａｐ及び／又はｒｅｐ配列を含有する。
【００１４】
本明細書に記載する通り、整列は、多様な公共的もしくは商業的に入手可能なＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ、例えばインターネット上のウェブサービスを介してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」のいずれかを用いて行われる。あるいは又、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティを用いることもできる。上記のプログラム中に含有されているものを含んで、ヌクレオチド配列同一性の測定に用いられ得る、当該技術分野で既知の複数のアルゴリズムもある。他の例として、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中のプログラムであるＦａｓｔａを用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａは疑問（ｑｕｅｒｙ）配列と検索配列の間のベストオーバーラップの領域の整列及びパーセント配列同一性を与える。例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中に与えられているそのデフォールトパラメーター（６のワードサイズ及びマトリックスを記す（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）ためのＮＯＰＡＭ因子）を有するＦａｓｔａを用い、核酸配列の間のパーセント配列同一性を決定することができる。アミノ酸配列に関し、類似のプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」プログラムが利用可能である。一般にこれらのプログラムのいずれもデフォールト設定で用いられるが、当該技術分野における熟練者は必要通りにこれらの設定を変更することができる。あるいは又、当該技術分野における熟練者は、少なくとも引用したアルゴリズム及びプログラムにより与えられるものと同じ同一性又は整列のレベルを与える他のアルゴリズム又はコンピュータープログラムを利用することができる。
【００１５】
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸又はそのフラグメントに言われる場合、適したヌクレオチド挿入又は欠失を用いて他の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させると、整列した配列の少なくとも約９５〜９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。好ましくは、相同性は全長配列又はその読み取り枠あるいは長さが少なくとも１５ヌクレオチドである他の適したフラグメント全体に及ぶ。適したフラグメントの例を本明細書に記載する。
【００１６】
「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、アミノ酸又はそのフラグメントに言われる場合、適したアミノ酸挿入又は欠失を用いて他のアミノ酸と最適に整列させると、整列した配列の少なくとも約９５〜９９％においてアミノ酸配列同一性があることを示す。好ましくは、相同性は全長配列又はそのタンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質あるいは長さが少なくとも８アミノ酸又はより望ましくは少なくとも１５アミノ酸であるそのフラグメント全体に及ぶ。適したフラグメントの例を本明細書に記載する。
【００１７】
「高度に保存された」という用語により、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性そしてより好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当該技術分野における熟練者に既知のアルゴリズム及びコンピュータープログラムに頼ることにより、当該技術分野における熟練者により容易に決定される。
【００１８】
「パーセント配列同一性」又は「同一の」という用語は、核酸配列の範囲内で、最大一致のために整列させると同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さはゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長に及ぶことができるかあるいは少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６もしくはそれより多いヌクレオチドの、もっと小さいフラグメントの中の同一性も望ましいことがあり得る。同様に、「パーセント配列同一性」をアミノ酸配列に関して、タンパク質の全長に及んで又はそのフラグメントに関して容易に決定することができる。適切には、フラグメントは長さが少なくとも約８アミノ酸であり、最高で約７００アミノ酸であることができる。適したフラグメントの例を本明細書に記載する。
【００１９】
ＡＡＶ配列及びそのフラグメントはｒＡＡＶの形成に有用であり、そしてアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター又はワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに、本発明のＡＡＶ配列を含有する核酸分子、遺伝子送達ベクター及び宿主細胞を提供する。
【００２０】
本明細書に記載する通り、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、抗体の中和が他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウィルスベクターの有効性を低下させる用途において用いるのに特に十分に適している。本発明のｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ再投薬及び繰り返し遺伝子治療において特に有利である。
【００２１】
本発明のこれらの及び他の態様及び利点を下記においてより詳細に記載する。本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびにそれらの変形は、他の成分、要素、整数、段階などを包含する。逆に、「より成る」という用語及びその変形は、他の成分、要素、整数、段階などを排除する。
Ｉ．本発明の方法
Ａ．分子クローニングを介する配列の検出
１つの側面において、本発明は試料中の標的核酸配列を検出及び／又は同定する方法を提供する。この方法は、細胞の染色体中に組込まれたウィルス配列、例えば中でもアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）及びレトロウィルスの検出に特に十分に適している。本明細書はＡＡＶに言及し、それを本明細書で例示する。しかしながらこの情報に基づき、当該技術分野における熟練者は中でもレトロウィルス［例えばネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ］ならびにレンチウィルス［例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウィルス及びスプーマウィルス）］に本発明の方法を容易に実行することができる。さらに、宿主細胞のゲノム中に組込まれていても組込まれていなくても、他のウィルス及び非−ウィルス配列の検出に発明の方法を用いることもできる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、試料は核酸を含有する源、例えば組織、組織培養、細胞、細胞培養ならびに尿及び血液を含むがこれらに限られない生物学的流体である。これらの核酸配列はプラスミドからのＤＮＡ又はＲＮＡ、バクテリア、酵母、ウィルス及び植物もしくは動物のような高等生物を含むいずれかの源からの天然のＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは当該技術分野における熟練者に既知の多様な方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記載されている方法により試料から抽出される。試料の起源及び本発明の方法の適用のために核酸を得る方法は、本発明を制限するものではない。場合により、本発明の方法をＤＮＡの源又は源から得られた（抽出された）核酸に直接実行することができる。
【００２３】
本発明の方法は、ＤＮＡを含有する試料を二本鎖核酸配列の第１の領域に関して特異的な第１のプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅に供し、それにより増幅された配列を得ることを含む。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「領域」のそれぞれは少なくとも２つの血清型（例えばＡＡＶ）又は株（例えばレンチウィルス）の核酸配列の整列に基づいてあらかじめ決定され、且つここで該領域のそれぞれは高度に保存されている５’末端、好ましくは、しかし必然的に（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ，ｂｕｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｉｌｙ）可変の中間部及び高度に保存されている３’末端を有する配列を含み、これらのそれぞれは少なくとも２つの整列したＡＡＶ血清型の配列に対して保存されているか又は可変である。好ましくは、５’及び／又は３’末端は少なくとも約９、そしてより好ましくは少なくとも１８塩基対（ｂｐ）に及んで高度に保存されている。しかしながら、５’又は３’末端における配列の一方もしくは両方が１８ｂｐより多く、２５ｂｐより多く、３０ｂｐより多く又は５’末端において５０ｂｐより多くに及んで保存されていることができる。可変領域に関して保存配列に関する要求はなく、これらの配列は比較的保存されていることができるかあるいは整列した血清型もしくは株の中で９０，８０もしくは７０％未満の同一性を有していることができる。
【００２５】
領域のそれぞれは長さが約１００ｂｐ〜約１０キロ塩基対に及ぶことができる。しかしながら、領域の１つが「特徴領域」、すなわち増幅された領域を標的源からのものであると明確に同定するのに十分にユニークな領域であることが特に望ましい。例えば１つの態様においては、第１の領域が長さにおいて約２５０ｂｐであり、且つ既知のＡＡＶ配列の中で十分にユニークであり、それは増幅された領域をＡＡＶ起源であると明確に同定する。さらにこの領域内の可変配列は十分にユニークであり、増幅された配列が由来する血清型を同定するのに用いられ得る。増幅されると（そしてそれにより検出されると）、通常の制限消化及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のいずれかにおけるこの領域又はＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２のいずれかにおけるこの領域あるいは本発明によりあらかじめ決定され且つ与えられる本発明により同定された他の新規な血清型のいずれかのこの領域に関する制限消化パターンとの比較を行うことにより、配列を同定することができる。
【００２６】
本明細書で示す指導を与えられると、当該技術分野における熟練者は他の組込まれたウィルス中でそのような領域を容易に同定することができ、これらの配列の容易な検出及び同定が可能である。その後、高度に保存された末端内に位置する遺伝子プライマー（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ）の最適セットを設計し、試料からの選ばれた領域の有効な増幅のために調べることができる。本発明のこの側面は、本明細書に記載するあるいは本明細書に記載する方法を用いて単離されたＡＡＶ血清型に関する制限パターンを含む標準を用いて、標的配列（例えばＡＡＶ）の存在を検出するため及びＡＡＶ血清型を同定するための診断キットに容易に適用される。例えばＰＣＲ産物を消化し、制限パターンを比較することにより、ＰＣＲ産物の迅速同定又は分子的血清型決定（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ）を行うことができる。
【００２７】
かくして１つの態様において、ＡＡＶに関する「特徴領域」はＡＡＶ１［配列番号：６］の約ｂｐ２８００〜約３２００ならびにＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ６中の対応する塩基対に及ぶ。さらに望ましくは、該領域はＡＡＶ１［配列番号：６］のｂｐ２８８６〜約３１４３ｂｐ内に位置する約２５０ｂｐならびにＡＡＶ２［配列番号：７］、ＡＡＶ３［配列番号：８］及び他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対である。図１を参照されたい。試料中のＡＡＶの迅速な検出を可能にするために、この特徴領域を特異的に増幅するプライマーが用いられる。しかしながら、本発明はＡＡＶ特徴領域に関して本明細書で同定される正確な配列に制限されることはなく、それは、当該技術分野における熟練者がこの特長領域のもっと短いフラグメント又はもっと大きいフラグメントを含むようにこの領域を容易に変更できるからである。
【００２８】
ＰＣＲプライマーは当該技術分野における熟練者に既知の方法を用いて形成される。ＰＣＲプライマーセットのそれぞれは５’プライマー及び３’プライマーを含む。例えば本明細書で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれると、合成の開始の点として働くオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは一本鎖である。しかしながら、二本鎖プライマーを用いる場合、伸長産物の形成に用いる前にそれを処理してその鎖を分離する。プライマーは約１５〜２５もしくはそれより多いヌクレオチドであることができ、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドである。しかしながら、ある種の用途の場合、もっと短いヌクレオチド、例えば７〜１５ヌクレオチドが用いられる。
【００２９】
プライマーは、増幅されてそれらのそれぞれの鎖とハイブリッド形成するべき各特異的配列の種々の鎖に十分に相補的であるように選ばれる。従って、プライマー配列は増幅されている領域の正確な配列を反映している必要はない。例えば非−相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に結合しており、プライマー配列の残りが鎖に完全に相補的であることができる。あるいは又、非−相補的塩基又は比較的長い配列がプライマー中に散在していることができ、但しプライマー配列は、増幅されてそれとハイブリッド形成し、他のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型を形成するべき鎖の配列と十分な相補性を有する。
【００３０】
本発明に従う特徴領域のためのＰＣＲプライマーは２つもしくはそれより多い整列した配列（例えば２つもしくはそれより多いＡＡＶ血清型）の高度に保存された配列に基づいている。プライマーは５’末端又は中間において、２つもしくはそれより多い整列したＡＡＶ血清型の中で正確に同一である程ではないことに順応できる。しかしながら、プライマーの３’末端における配列は、プライマーの３’末端における少なくとも５塩基対に及んで、好ましくは少なくとも９塩基対に及んでそしてより好ましくは少なくとも１８塩基対に及んで正確な同一性がある、２つもしくはそれより多い整列したＡＡＶ血清型の領域に対応する。かくしてプライマーの３’末端は、少なくとも５ヌクレオチドに及んで整列した配列と１００％同一性を有する配列を含む。しかしながら場合により、プライマーの３’末端において１つ、２つもしくはそれより多い縮重ヌクレオチドを用いることができる。
【００３１】
例えば、ＡＡＶの特徴領域のためのプライマーセットを以下の通りにＡＡＶキャプシド内のユニーク領域に基づいて設計した。５’プライマーはＡＡＶ2［配列番号：７］のｎｔ２８６７−２８９１、５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴ３’に基づいた。図１を参照されたい。３’プライマーはＡＡＶ２［配列番号：７］のｎｔ３０９６−３１２２，５’−ＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣ−３’に基づいて設計された。しかしながら、当該技術分野における熟練者はＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６の、あるいは本明細書に示す情報に基づいてＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又は本発明の他の新規なＡＡＶの対応する領域に基づいてプライマーセットを容易に設計できるはずである。さらに、当該技術分野における熟練者に既知の方法を用い、この特徴領域を増幅するためにさらに別のプライマーセットを容易に設計することができる。
【００３２】
Ｂ．標的配列の単離
本明細書に記載する通り、本発明は標的の検出を可能にするために、標的配列、例えばＡＡＶ血清型の特徴領域を特異的に増幅する第１のプライマーセットを提供する。さらに別の配列が望まれている状況では、例えば新規なＡＡＶ血清型を同定する場合、特徴領域を伸長することができる。かくして本発明はさらに１つもしくはそれより多い追加のプライマーセットを利用することができる。
【００３３】
適切には、これらのプライマーセットは第１のプライマーセット及び該プライマーセットにユニークである第2のプライマーの５’もしくは３’プライマーを含み、特徴領域の５’末端又は３’末端にアニーリングする、特徴領域に５’又は３’である領域をプライマーセットが増幅するように設計される。例えば第１のプライマーセットが特徴領域の増幅のための５’プライマー、Ｐ１及び３’プライマーＰ２を含む。その３’末端上の特徴領域を伸長するために、第２のプライマーセットがプライマーＰ１及び３’プライマーＰ４を含み、それは特徴領域及び特徴領域の下流の連続配列を増幅する。その５’末端上の特徴領域を伸長するために、第３のプライマーセットが５’プライマー、Ｐ５及びプライマーＰ２を含み、特徴領域及び特徴領域の上流の連続配列が増幅される。これらの伸長段階を必要ならもしくは所望なら繰り返す（あるいは同時に行う）。その後、これらの増幅段階から生ずる産物を通常の段階を用いて融合させ、所望の長さの単離配列を形成する。
【００３４】
第２及び第３のプライマーセットは、特徴領域のためのプライマーセットの場合と同様に、整列した配列の中の高度に保存された配列を有する領域を増幅するように設計される。本明細書で「第２」又は「第３」のプライマーセットという用語への言及はそれぞれの議論のためのみであり、これらのプライマーが反応混合物に加えられるか又は増幅に用いられる順序に関してではない。第２のプライマーセットにより増幅される領域は、増幅されると、それがその５’末端において特徴領域の３’末端にアニーリングするように選ばれる。同様に、第３のプライマーセットにより増幅される領域は、増幅されると、それがその３’末端において特徴領域の５’末端にアニーリングするように選ばれる。追加のプライマーセットは、それらが増幅する領域が第２又は第３のプライマーセットにより、又は続くプライマーセットにより形成される伸長産物の５’末端又は３’末端にアニーリングするように設計することができる。
【００３５】
例えば、ＡＡＶが標的配列である場合、第一のプライマーのセット（Ｐ１及びＰ２）を用いて試料からの特徴領域を増幅する。一つの望ましい態様の場合、この特徴領域はＡＡＶキャプシド内に位置している。第二のプライマーのセット（Ｐ１及びＰ４）を用いて特徴領域の３’末端を、ＡＡＶ配列内のＡＡＶ３’ＩＴＲの直前の位置まで伸長し、すなわち特徴領域をアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として用いた場合にはＡＡＶキャプシドの３’末端全体を含有する伸長産物を得る。一つの態様の場合、Ｐ４プライマーはＡＡＶ２［配列番号：７］のｎｔ４４３５−４４６２及び他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応する。これは約１．６ｋｂの領域の増幅を生じ、それは０．２５ｋｂの特徴領域を含有する。第三のプライマーのセット（Ｐ３及びＰ２）を用い、特徴領域の５’末端をＡＡＶ配列内のｒｅｐ遺伝子の３’末端内にある位置まで伸長し、すなわち特徴領域をアンカーとして用いた場合にはＡＡＶキャプシドの５’末端全体を含有する伸長産物を得る。一つの態様の場合、Ｐ３プライマーはＡＡＶ2［配列番号：７］のｎｔ１３８４−１４０９及び他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応する。これは約１．７ｋｂの領域の増幅を生じ、それは０．２５ｋｂの特徴領域を含有する。場合により、第四のプライマーのセットを用い、ＡＡＶキャプシドの５’末端全体を含有する伸長産物をｒｅｐ配列も含むようにさらに伸長することができる。一つの態様では、Ｐ５と称されるプライマーはＡＡＶ2［配列番号：７］のｎｔ１０８−１３３及び他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応し、Ｐ２プライマーと一緒に用いられる。
【００３６】
所望の数の伸長段階の完了に続き、種々の伸長産物を融合させ、完全な配列の構築のためのアンカー又はマーカーとして特徴領域を利用する。本明細書に示す実施例では、最小で、完全なＡＡＶｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶ配列が得られる。行われる伸長段階の数に依存して、もっと大きな配列を得ることができる。
【００３７】
適切には、伸長産物は、当該技術分野における熟練者に既知の方法を用いて完全なＡＡＶ配列に組み立てられる。例えば特徴領域内に位置するＤｒａＩＩＩ部位において切断するＤｒａＩＩＩを用いて伸長産物を消化し、制限フラグメントを得、それを再−連結して（最小で）完全なＡＡＶｃａｐ遺伝子を含有する産物を得る。しかしながら、伸長産物を完全な配列に組立てるための他の適した方法を用いることができる。一般的に、本明細書で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ ａｌを参照されたい。
【００３８】
上記の複数伸長段階（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐｓ）の代わりに、本発明の他の態様は、全長ｃａｐ配列の単離を可能にする３．１ｋｂフラグメントの直接増幅を提供する。ＮＨＰ組織及び血液ＤＮＡｓからの３．１ｋｂの全長ｃａｐフラグメントを直接増幅するために、２つの他の高度に保存された領域を、大きなフラグメントのＰＣＲ増幅で用いるためにＡＡＶゲノム中で同定した。全長ＡＡＶｃａｐを含むＡＡＶ配列の増幅のために、ｒｅｐ遺伝子の中間に位置する保存領域内のプライマー（ＡＶ１ｎｓ：５’ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ３’、配列番号：６のｎｔ）をＣａｐ遺伝子の下流の別の保存領域内に位置する３’プライマー（ＡＶ２ｃａｓ：５’ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ３’、配列番号：７）と組合わせて用いる。典型的には、増幅に続いて産物をクローニングし、≧９９．９％の精度で配列分析を行う。この方法を用い、発明者等は少なくとも５０個のキャプシドクローンを単離し、それを続いて特性化した。それらの中で３７個のクローンはリーサス・マカケ（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）組織から（ｒｈ．１−ｒｈ．３７）、６個のクローンはシノモロガス・マカケ（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）から（ｃｙ．１−ｃｙ．６）、２個のクローンはヒヒ（Ｂａｂｏｏｎｓ）から（ｂｂ．１及びｂｂ．２）そして５個のクローンはチンパンジー（Ｃｈｉｍｐｓ）から（ｃｈ．１−ｃｈ．５）誘導された。これらのクローンは明細書の他の箇所で、それらが同定された動物の種ならびにその動物中でこれらの新規な配列が位置していた組織と一緒に同定される。
【００３９】
Ｃ．新規なＡＡＶの単離のための代わりの方法
他の側面において、本発明は細胞から新規なＡＡＶを単離するための代わりの方法を提供する。この方法は、ＡＡＶにヘルパー機能を与えるベクターに細胞を感染させ；ＡＡＶを含有する感染性クローンを単離し；単離されたＡＡＶを配列決定し；そして単離されたＡＡＶの配列を既知のＡＡＶ血清型と比較することを含み、それにより単離されたＡＡＶと既知のＡＡＶ血清型の配列における相違が新規なＡＡＶの存在を示す。
【００４０】
一つの態様において、ヘルパー機能を与えるベクターは、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ６を含む必須のアデノウィルス機能を与える。一つの態様において、ヘルパー機能はアデノウィルスにより与えられる。アデノウィルスは野生−型アデノウィルスであることができ且つヒトもしくは非−ヒト起源、好ましくは非−ヒト霊長類（ＮＨＰ）起源のものであることができる。Ａｄ５型［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ７３２６０］を含む複数のアデノウィルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋから入手 可能である。血清型２，３，４，７，１２及び４０のような、及びさらに現在同定されているヒト型［例えば上記で引用したＨｏｒｗｉｔｚを参照されたい］のいずれをも含むいずれの既知のアデノウィルス血清型からもアデノウィルス配列を得ることができる。同様に、非−ヒト動物（例えばチンパンジー）に感染することが知られているアデノウィルスを本発明のベクター構築物中で用いることもできる。例えば米国特許第６，０８３，７１６号を参照されたい。野生−型アデノウィルスの他に、必要なヘルパー機能を保有している組換えウィルス又は非−ウィルスベクター（例えばプラスミド、エピソームなど）を用いることができる。そのような組換えウィルスは当該技術分野において既知であり且つ公開されている方法に従って調製することができる。例えば米国特許第５，８７１，９８２ｂ号及び米国特許第６，２５１，６７７ｂ号を参照されたく、それらはハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウィルスを記載している。アデノウィルス型の選択は以下の発明を制限すると思われない。多様なアデノウィルス株がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能であるか又は多様な商業的及び工業的供給源から要請により入手可能である。さらに、多くのそのような株の配列が、例えばＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを含む多様なデータベースから入手可能である。
【００４１】
他の変法において、ゲノム歩行法を用いて感染性ＡＡＶを単離することができる（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。ゲノム歩行は、本発明の方法に従って同定された新規な配列に隣接する配列を同定し、単離するために特に十分に適している。例えばこの方法は、本発明の方法を用いて同定された新規なＡＡＶキャプシド及び／又はｒｅｐ配列に基づき、新規なＡＡＶ血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を単離するために有用であり得る。この方法は、本発明に従って同定され、単離された他のＡＡＶ及び非−ＡＡＶ配列に隣接する配列の単離にも有用である。実施例３及び４を参照されたい。
【００４２】
本発明の方法を多様な疫学研究、生物分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の研究、ＡＡＶベクター及び他の組み込まれたウィルスから誘導されるベクターを介する遺伝子治療の監視に容易に用いることができる。かくして該方法は、臨床医、研究者及び易学者により用いられるための事前−包装キットにおいて用いるために十分に適している。
ＩＩ．診断キット
他の側面において、本発明は試料中の既知のもしくは未知のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。そのようなキットは、ＡＡＶ核酸配列の特徴領域に特異的な第一の５’及び３’ＰＣＲプライマーのセットを含有していることができる。あるいは又もしくはさらに、そのようなキットは本明細書において同定される全長ＡＡＶキャプシド核酸配列を含む３．１ｋｂフラグメントに特異的な第一の５’及び３’ＰＣＲプライマーのセットを含有していることができる（例えばＡＶ１ｎｓ及びＡＶ２ｃａｓプライマー）。場合により、本発明のキットはさらに、本明細書に記載する２つもしくはそれより多い追加の５’及び３’プライマーのセット及び／又はＰＣＲプローブを含有していることができる。これらのプライマー及びプローブは本発明に従い、例えば定量的ＰＣＲを用いて各ＡＡＶ血清型の特徴領域を増幅するために用いられる。
【００４３】
本発明はさらに、本発明の方法に従って検出されたＡＡＶ血清型を同定するため及び／又は既知のＡＡＶから新規なＡＡＶを区別するために有用なキットを提供する。そのようなキットは１種もしくはそれより多い制限酵素、ＡＡＶ血清型の「特徴制限酵素消化分析」を与えるＡＡＶ血清型に関する標準及び／又は検出されたＡＡＶの血清型を決定するための他の手段をさらに含んでいることができる。
【００４４】
さらに本発明のキットは指示書、負及び／又は正の標準、容器、試料のための希釈剤及び緩衝剤、特徴比較のための指示チャート（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｈａｒｔｓ）、使い捨て手袋、汚染除去指示書、アプリケータースティック又は容器及び試料調製カップならびに、培地、洗浄試薬及び濃縮試薬を含むいずれかの望まれる試薬を含むことができる。そのような試薬は本明細書に記載する試薬の中から及び通常の濃縮試薬の中から容易に選ばれ得る。一つの望ましい態様の場合、洗浄試薬は生理学的ｐＨに緩衝されている等張食塩水、例えばリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり；溶離試薬は０．４ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳならびに濃縮試薬及び装置である。例えば当該技術分野における熟練者はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＮＨ4ＳＯ4のような試薬が有用であり得ることあるいはフィルター装置のような装置が有用であり得ることがわかるであろう。例えば１００Ｋ膜を有するフィルター装置はｒＡＡＶを濃縮する。
【００４５】
本発明が与えるキットは、本明細書に記載する方法を実行するためならびに生物分布、疫学、ヒト及びＮＨＰｓにおける新規なＡＡＶ血清型の伝達の様式の研究のために有用である。
【００４６】
かくして本発明の方法及びキットは、標的ウィルス配列、特に組込まれたウィルス配列の検出、同定及び単離を可能にする。該方法及びキットは、新規なＡＡＶ血清型を含み得るＡＡＶ配列の検出、同定及び単離において用いるために特に十分に適している。
【００４７】
一つの注目に価する例では、本発明の方法が発明者等によりクローニングされたＡＡＶ配列の分析を容易にし、それは、すべて既知の６種のＡＡＶ血清型と異なり、キャプシドタンパク質の超可変領域に局在する多数の変動を有する種々の動物からクローニングされたフラグメントの間のプロウィルス配列の異質性を明らかにした。驚くべきＡＡＶ配列のダイバージェンスが、個々のアカゲザルからの、リンパ節のような一つの組織源から単離されたクローンにおいて注目された。この異質性は、部分的に、限られた数の同時感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ）腸管外ウィルスの間の広範囲の相同的組換えによる個々の動物内のＡＡＶ配列の見かけの進化により最も良く説明される。これらの研究は、自然のＡＡＶ感染の経過中に広く撒き散らされたウィルスの配列進化を示唆しており、それはおそらくキャプシド超可変領域のアレーにおいて互いに異なる準種の群の形成に導く。これは、以前にはＲＮＡウィルスに限られると考えられたやり方でのＤＮＡウィルスの急速な分子的進化の最初の例である。
【００４８】
本発明の方法により同定されたいくつかの新規なＡＡＶ血清型の配列及びこれらの血清型の特性化を示す。
ＩＩＩ．新規なＡＡＶ血清型
Ａ．核酸配列
本発明の方法により同定された新規なＡＡＶ血清型の核酸配列を示す。引用することにより本明細書の内容となる配列番号：１，９−５９及び１１７−１２０を参照されたい。図１及び配列表も参照されたい。
【００４９】
新規な血清型ＡＡＶ７に関し、ＡＡＶ５’ＩＴＲｓ、キャプシド、ｒｅｐ及びＡＡＶ３’ＩＴＲｓを含む全長配列を配列番号：１に示す。
【００５０】
本発明の他の新規なＡＡＶ血清型に関し、本発明の方法に従って単離された約３．１ｋｂフラグメントを示す。このフラグメントは全長キャプシドタンパク質をコードする配列及びｒｅｐタンパク質をコードする配列の全体もしくは一部を含有する。これらの配列は下記で同定するクローンを含む。
【００５１】
さらに別の新規なＡＡＶ血清型に関し、キャプシドタンパク質をコードする特徴領域を示す。例えば本発明のＡＡＶ１０核酸配列は、図１［２５５塩基に及ぶ配列番号：１１７を参照されたい］に示すものを含む。本発明のＡＡＶ１１核酸配列は、図１［２５８塩基に及ぶ配列番号：１１８を参照されたい］に示すＤＮＡ配列を含む。本発明のＡＡＶ１２核酸配列は、図１［２５５塩基から成る配列番号：１１９を参照されたい］に示すＤＮＡ配列を含む。上記の方法を用いてさらなるＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２配列を容易に同定し、ＡＡＶ７及び本明細書における他の新規な血清型に関して記載する目的を含む多様な目的のために用いることができる。
【００５２】
図１は本発明の非−ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＡＡＶ核酸配列を、以前に公開されたＡＡＶ血清型、ＡＡＶ１［配列番号：６］、ＡＡＶ２［配列番号：７］及びＡＡＶ３［配列番号：８］と整列させて示している。これらの新規なＮＨＰ配列は、次表Ｉ中に示すものを含み、それはクローン番号により同定される：
【００５３】
【表１】
0003958191.tif 000002
【００５４】
【表２】
0003958191.tif 000003
【００５５】
【表３】
0003958191.tif 000004
【００５６】
新規なＮＨＰクローンは、２種のチンパンジーアデノウィルスのキャプシドフラグメントをＡＡＶ2ｒｅｐ構築物中にスプライシングすることにより作られた。この新規なクローン、Ａ３．１はＣｈ．５［配列番号：２０］とも称される。さらに、本発明はＨ６［配列番号：２５］及びＨ２［配列番号：２６］と称される２つのヒトＡＡＶ配列を含む。
【００５７】
本発明のＡＡＶ核酸配列はさらに、図１及び配列表に示す配列［配列番号：１，９−５９，１１７−１２０］、核酸配列中に示される鎖に相補的な鎖ならびに図１及び配列表に示す配列［配列番号：１，９−５９，１１７−１２０］及びそれらの相補的鎖に対応するＲＮＡ及びｃＲＮＡ配列を包含する。図１及び配列表の配列［配列番号：１，９−５９，１１７−１２０］及びそれらの相補的鎖の自然の変異体及び操作された改変産物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）も本発明の核酸配列中に含まれる。そのような改変には、例えば当該技術分野において既知の標識、メチル化及び天然に存在するヌクレオチドの１つもしくはそれより多くの縮重ヌクレオチドを用いる置換が含まれる。
【００５８】
８５％より多く、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％、図１及び配列表［配列番号：１，９−５９，１１７−１２０］を含む本発明の配列と同一又は相同である核酸配列がさらに本発明に含まれる。これらの用語は本明細書で定義した通りである。
【００５９】
本明細書に記載する方法により同定された新規なＡＡＶ配列のフラグメントも本発明内に含まれる。適したフラグメントは長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、機能性フラグメント、すなわち生物学的に重要なフラグメントを含んでいる。一つの態様の場合、これらのフラグメントは図１及び配列表の新規な配列［配列番号：１，９−５９，１１７−１２０］、それらの相補的鎖、それらに相補的なｃＤＮＡ及びＲＮＡのフラグメントである。
【００６０】
適したフラグメントの例をＡＡＶ１、ＡＡＶ２又はＡＡＶ７上のこれらのフラグメントの位置に関して示す。しかしながら、本明細書に示す整列（デフォールト設定におけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて得られる）又は本発明の他の新規な血清型との整列を作るための類似の方法を用いて、当該技術分野における熟練者が所望のフラグメントに関する正確なヌクレオチド開始及び停止コドンを容易に同定することができる。
【００６１】
適したフラグメントの例には、交互スプライス変異体であるＡＡＶキャプシドの３種の可変タンパク質（ｖｐ）：ｖｐ１［例えばＡＡＶ７，配列番号：１のｎｔ８２５−３０４９］；ｖｐ２［例えばＡＡＶ７，配列番号：１のｎｔ１２３４−３０４９］；及びｖｐ３［例えばＡＡＶ７，配列番号：１のｎｔ１４３４−３０４９］
をコードする配列が含まれる。ＡＡＶ７が通常通りでないＧＴＧ開始コドンを有することは注目に価する。いくつかのハウスキーピング遺伝子を除き、そのような開始コドンはＤＮＡウィルス中で以前に報告されたことがない。他のＡＡＶ血清型に関するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３のための開始コドンは、ビリオンの有効な組立てを可能にするために、それらが存在する宿主細胞の細胞機構がｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３をそれぞれ１０％：１０％：８０％の比率で生産することを可能にするようなものであると思われてきた。しかしながら、ＡＡＶ７ビリオンはこの希少なＧＴＧ開始コドンを用いてさえも有効に組立てられることが見出された。かくして発明者等は、他のＡＡＶ血清型のｖｐ３の開始コドンをこの希少なＧＴＧ開始コドンを含むように変更し、他のＡＡＶ血清型のビリオン構造を変更及び／又はエピトープ（例えば抗体中和エピトープ（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ））の位置を変更するために、詰込み効率を向上させるのが望ましいと予測する。例えば特定部位の突然変異誘発を含む通常の方法を用いて開始コドンを変更することができる。かくして本発明は、開始コドンがＧＴＧに変更されているｖｐ３及び／又は場合により、ｖｐ１及び／又はｖｐ２を含む、いずれかの選ばれた血清型の変更されたＡＡＶビリオンを包含する。
【００６２】
ＡＡＶの他の適したフラグメントには、ＡＡＶキャプシドタンパク質のための開始コドンを含有するフラグメント［例えばＡＡＶ７，配列番号：１のｎｔ４６８−３０９０、ＡＡＶ７，配列番号：１のｎｔ７２５−３０９０及び他のＡＡＶ血清型の対応する領域］が含まれる。本明細書に記載する方法を用いて同定されたＡＡＶ７及び他の新規なＡＡＶ血清型のさらに別のフラグメントには、ｒｅｐ７８［例えばＡＡＶ７に関する図１の開始コドン３３４］、ｒｅｐ６８［例えばＡＡＶ７に関する図１の開始コドンｎｔ３３４］、ｒｅｐ５２［ＡＡＶ７に関する図１の開始コドン１００６］及びｒｅｐ４０［ＡＡＶ７に関する図１の開始コドン１００６］を含むｒｅｐタンパク質をコードするものが含まれる。他の重要なフラグメントにはＡＡＶ５’逆方向末端反復ＩＴＲｓ［ＡＡＶ７に関する図１のｎｔ１−１０７］；ＡＡＶ３’ＩＴＲｓ［ＡＡＶ７に関する図１のｎｔ４７０４−４７２１］、Ｐ１９配列、ＡＡＶＰ４０配列、ｒｅｐ結合部位ならびに末端分割部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｅ  ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）が含まれ得る。さらに別の適したフラグメントは当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。本発明の他の新規な血清型中の対応する領域は、図１を参照することにより又は本明細書に示す配列との通常の整列法を用いることにより容易に決定され得る。
【００６３】
図および配列表に与えられた核酸配列を包含することに加えて、本発明は、本発明のＡＡＶ血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するように設計されている核酸分子および配列を含む。かくして、本発明は、次の新規ＡＡＶアミノ酸配列：Ｃ１［配列番号：６０］、Ｃ２［配列番号：６１］、Ｃ５［配列番号：６２］、Ａ３−３［配列番号：６６］、Ａ３−７［配列番号：６７］、Ａ３−４［配列番号：６８］、Ａ３−５［配列番号：６９］、３．３ｂ［配列番号：６２］、２２３．４［配列番号：７３］、２２３−５［配列番号：７４］、２２３−１０［配列番号：７５］、２２３−２［配列番号：７６］、２２３−７［配列番号：７７］、２２３−６［配列番号：７８］、４４−１［配列番号：７９］、４４−５［配列番号：８０］、４４−２［配列番号：８１］、４２−１５［配列番号：８４］、４２−８［配列番号：８５］、４２−１３［配列番号：８６］、４２−３Ａ［配列番号：８７］、４２−４［配列番号：８８］、４２−５Ａ［配列番号：８９］、４２−１Ｂ［配列番号：９０］、４２−５Ｂ［配列番号：９１］、４３−１［配列番号：９２］、４３−１２［配列番号：９３］、４３−５［配列番号：９４］、４３−２１［配列番号：９６］、４３−２５［配列番号：９７］、４３−２０［配列番号：９９］、２４．１［配列番号：１０１］、４２．２［配列番号：１０２］、７．２［配列番号：１０３］、２７．３［配列番号：１０４］、１６．３［配列番号：１０５］、４２．１０［配列番号：１０６］、４２−３Ｂ［配列番号：１０７］、４２−１１［配列番号：１０８］、Ｆ１［配列番号：１０９］、Ｆ５［配列番号：１１０］、Ｆ３［配列番号：１１１］、４２−６Ｂ［配列番号：１１２］および／または４２−１２［配列番号：１１３］、そしてこれらの配列および／またはそれらのユニークフラグメントを用いて生成された人工ＡＡＶ血清型をコードしている核酸配列を含む。
【００６４】
本明細書で使用されるところの、ＡＡＶ血清型は、限定されるものではないが、非天然に存在するキャプシドタンパク質をもつＡＡＶを含む。そのような人工キャプシドは、その他のＡＡＶ血清型（既知もしくは新規の）、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分、非ＡＡＶウイルス起源、または非ウイルス起源から得られてもよい異種配列と組み合わせて本発明の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を用いて、いかなる適当な技術によって生成されてもよい。人工ＡＡＶ血清型は、限定されるものではないが、キメラＡＡＶキャプシド、組み換えＡＡＶキャプシドまたは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよい。
【００６５】
Ｂ．ＡＡＶアミノ酸配列、タンパク質およびペプチド
本発明は、例えば、ＡＡＶ７［ＡＡＶ７のｎｔ８２５〜３０４９、配列番号：１］本明細書で与えられた他の新規血清型を含む、本明細書で同定された新規ＡＡＶ血清型の核酸配列によってコードされているタンパク質およびそれらのフラグメントを提供する。かくして、Ｈ６［配列番号：２５］、Ｈ２［配列番号：２６］、４２−２［配列番号：９］、４２−８［配列番号：２７］、４２−１５［配列番号：２８］、４２−５ｂ［配列番号：２９］、４２−１ｂ［配列番号：３０］、４２−１３［配列番号：３１］、４２−３ａ［配列番号：３２］、４２−５ａ［配列番号：３４］、４２−１０［配列番号：３５］、４２−３ｂ［配列番号：３６］、４２−１１［配列番号：３７］、４２−６ｂ［配列番号：３８］、４３−１［配列番号：３９］、４３−５［配列番号：４０］、４３−１２［配列番号：４１］、４３−２０［配列番号：４２］、４３−２１［配列番号：４３］、４３−２３［配列番号：４４］、４３−２５［配列番号：４５］、４４．１［配列番号：４７］、４４．５［配列番号：４７］、２２３．１０［配列番号：４８］、２２３．２［配列番号：４９］、２２３．４［配列番号：５０］、２２３．５［配列番号：５１］、２２３．６［配列番号：５２］、２２３．７［配列番号：５３］、Ａ３．４［配列番号：５４］、Ａ３．５［配列番号：５５］、Ａ３．７［配列番号：５６］、Ａ３．３［配列番号：５７］、４２．１２［配列番号：５８］、および４４．２［配列番号：５９］：を含む、本発明の新規血清型のキャプシドタンパク質は、先に列挙したクローンについて与えられたオープンリーディングフレームから慣用の技術を用いて容易に生成することができる。
【００６６】
さらに本発明は、合成、組み換えまたは当業者に既知の他の技術を用いて生成された本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を用いて生成されるＡＡＶ血清型を包含する。本発明は、本発明の新規ＡＡＶ核酸配列から発現される新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に限定されず、そして例えば、化学合成、他の合成技術または他の方法を含む、技術上既知の他の方法によって生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。例えば、Ｃ１［配列番号：６０］、Ｃ２［配列番号：６１］、Ｃ５［配列番号：６２］、Ａ３−３［配列番号：６６］、Ａ３−７［配列番号：６７］、Ａ３−４［配列番号：６８］、Ａ３−５［配列番号：６９］、３．３ｂ［配列番号：６２］、２２３．４［配列番号：７３］、２２３−５［配列番号：７４］、２２３−１０［配列番号：７５］、２２３−２［配列番号：７６］、２２３−７［配列番号：７７］、２２３−６［配列番号：７８］、４４−１［配列番号：７９］、４４−５［配列番号：８０］、４４−２［配列番号：８１］、４２−１５［配列番号：８４］、４２−８［配列番号：８５］、４２−１３［配列番号：８６］、４２−３Ａ［配列番号：８７］、４２−４［配列番号：８８］、４２−５Ａ［配列番号：８９］、４２−１Ｂ［配列番号：９０］、４２−５Ｂ［配列番号：９１］、４３−１［配列番号：９２］、４３−１２［配列番号：９３］、４３−５［配列番号：９４］、４３−２１［配列番号：９６］、４３−２５［配列番号：９７］、４３−２０［配列番号：９９］、２４．１［配列番号：１０１］、４２．２［配列番号：１０２］、７．２［配列番号：１０３］、２７．３［配列番号：１０４］、１６．３［配列番号：１０５］、４２．１０［配列番号：１０６］、４２−３Ｂ［配列番号：１０７］、４２−１１［配列番号：１０８］、Ｆ１［配列番号：１０９］、Ｆ５［配列番号：１１０］、Ｆ３［配列番号：１１１］、４２−６Ｂ［配列番号：１１２］および／または４２−１２［配列番号：１１３］のいずれかの配列は種々の技術を用いて容易に生成される。
【００６７】
適当な作成技術は当業者には周知である。参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。あるいはまた、ペプチドは周知の固相ペプチド合成法によって合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）  ｐｐ．２７−６２）。これらおよび他の適当な作成法は、当業者の知識内にあり、そして本発明の限定とはならない。
【００６８】
特に望ましいタンパク質は、先に同定されたヌクレオチド配列によってコードされているＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。本発明の多くのキャプシドタンパク質の配列は、図２および／または配列リスト、配列番号：２および６０〜１１５の整列において与えられ、引用によって本明細書に組み入れられている。ＡＡＶキャプシドは３種のタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３からなり、これらは代替スプライス改変体である。これらの図において与えられる全長配列はｖｐ１のそれである。ＡＡＶ７キャプシド［配列番号：２］の数字に基づいて、ｖｐ２の配列はＡＡＶ７のアミノ酸１３８−７３７にわたり、そしてｖｐ３の配列はＡＡＶ７のアミノ酸２０３−７３７にわたる。この情報により、当業者は、本発明の他の新規血清型についてｖｐ２およびｖｐ３タンパク質の位置を容易に決定することができる。
【００６９】
キャプシドタンパク質の他の望ましいタンパク質およびフラグメントは、超可変領域（ＨＰＶ）間に位置する不変領域と可変領域およびＨＰＶ領域それ自体の配列を含む。ＡＡＶ２における配列相違の領域を決定するために開発されたアルゴリズムは、１２の超可変領域（ＨＶＲ）をもたらし、これらの５つは重複しているか、または４つの既に記された可変領域の一部である。［Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２：３０９−３１９］  ここに記述されるこのアルゴリズムおよび／または整列技術を用いて、新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲが決定される。例えば、ＡＡＶ２ｖｐ１［配列番号：７０］の数字に関して、ＨＶＲは次のように位置する：ＨＶＲ１、ａａ１４６−１５２；ＨＶＲ２、ａａ１８２−１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２−２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１−３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０−４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０−４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００−５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４−５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４−５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１−５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８−６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５−７１９。常法により作成された整列および本明細書で与えられる新規配列［参照、例えば図２］を利用して、本発明の新規ＡＡＶ血清型におけるＨＶＲの位置を容易に決定することができる。例えば、図２を用いて、ＡＡＶ７［配列番号：２］についてのそれを容易に決定できる。ＨＶＲ１はａａ１４６−１５２に位置し；ＨＶＲ２は１８２−１８７に位置し；ＨＶＲ３はａａ２６３−２６６に位置し；ＨＶＲ４はａａ３８３−３８５に位置し；ＨＶＲ５はａａ４５１−４７５に位置し；ＨＶＲ６はａａ４９１−４９６に位置し；ＨＶＲ７はａａ５０１−５０５に位置し；ＨＶＲ８はａａ５１３−５２１に位置し；ＨＶＲ９は５３３−５５４に位置し；ＨＶＲ１０はａａ５８３−５９６に位置し；ＨＶＲ１１はａａ６６０−６６９に位置し；ＨＶＲ１２はａａ７０７−７２１に位置する。本明細書で与えられる情報を用いて、他の本発明の新規血清型のＨＶＲが容易に決定できる。
【００７０】
さらに、キャプシド内では、同一性のあるアミノ酸カセットが同定された。これらのカセットは、例えば、選ばれた血清型のＨＶＲ１カセットをその他の血清型のＨＶＲ１カセットにより置換することによって、人工血清型を構築する際に有用であるので、それらは特に興味がもたれる。同一性のあるこれらのカセットのあるものは図２において注目される。参照、図２、これは第１残基の位置において始まる配列の下に示されるルーラー（ｒｕｌｅｒ）を有するＣｌｕｓｔａｌＸアラインメントを提供する。ルーラー上の線は保存位置を強調するために使用される。３種の記号（＊，：，．）が使用される。「＊」は、単一の完全に保存される残基を有する位置を示す。「：」は、「強い」グループが完全に保存されていることを示す。「．」は、「弱い」グループが完全に保存されていることを示す。これらは、Ｇｏｎｎｅｔ  Ｐａｍ２５０マトリックス中に生じるすべてのポジティブにスコアするグループである。強いグループは、強いスコア＞０．５として定義され、そして弱いグループは弱いスコア＜０．５として定義される。
【００７１】
さらに、ＡＡＶキャプシドの他の適当なフラグメントの例は、ＡＡＶ２［配列番号：７０］の数字に関して、ａａ２４−４２，ａａ２５−２８；ａａ８１−８５；ａａ１３３−１６５；ａａ１３４−１６５；ａａ１３７−１４３；ａａ１５４−１５６；ａａ１９４−２０８；ａａ２６１−２７４；ａａ２６２−２７４；ａａ１７１−１７３；ａａ４１３−４１７；ａａ４４９−４７８；ａａ４９４−５２５；ａａ５３４−５７１；ａａ５８１−６０１；ａａ６６０−６７１；ａａ７０９−７２３を含む。なお他の望ましいフラグメントは、例えば、ＡＡＶ７では、配列番号：２のアミノ酸１−１８４、アミノ酸１９９−２５９；アミノ酸２７４−４４６；アミノ酸６０３−６５９；アミノ酸６７０−７０６；アミノ酸７２４−７３６；ａａ１８５−１９８；ａａ２６０−２７３；ａａ４４７−４７７；ａａ４９５−６０２；ａａ６６０−６６９；およびａａ７０７−７２３を含む。なお他の望ましい領域は、ＡＡＶ７［配列番号：２］の数字に基づいて、ａａ１８５−１９８；ａａ２６０−２７３；ａａ４４７−４７７；ａａ４９５−６０２；ａａ６６０−６６９；およびａａ７０７−７２３からなる群の中から選ばれる。デフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）においてＣｌｕｓｔａｌ  Ｘプログラムを用いるか、またはデフォルトセッティングにおいて他の市販もしくは公に得られるアラインメントプログラムを用いて実施された本明細書で与えられる整列を使用して、当業者は容易に本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを決定することができる。
【００７２】
他の望ましいタンパク質は、中でも、ＡＡＶｒｅｐタンパク質［ＡＡＶ７について配列番号：３のａａ１〜６２３］および例えば配列番号：３のａａ１−１７１，ａａ１７２−３７２，ａａ３７３−４４４，ａａ４４５−６２３を含む、それらの機能性フラグメントである。適当には、そのようなフラグメントは長さ少なくとも８アミノ酸である。参照、図３。比較しうる領域は、本明細書に記述される技術および当該技術分野で既知の技術を用いて、本発明の他の新規ＡＡＶのタンパク質において同定することができる。さらに、他の所望の長さのフラグメントが容易に利用できる。そのようなフラグメントは、組み換え的に、または他の適当な手段、例えば化学合成によって作成されてもよい。
【００７３】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組み換え生産、化学合成、または他の合成手段を含むいかなる適当な手段によって作成されてもよい。そのような作成方法は当業者の知識内にあり、そして本発明の限定とはならない。
【００７４】
ＩＶ．新規ＡＡＶキャプシドによるｒＡＡＶの作成
本発明は、野生型ＡＡＶ血清型の配列が、天然において随伴されるこれらのウイルスのもつＤＮＡおよび／または細胞材料を含有しない、本発明によって同定される新規な野生型ＡＡＶ血清型を包含する。その他の態様では、本発明は、標的細胞への異種の遺伝子または他の核酸配列の送達において有用な分子の作成のための、そのフラグメントを含む本発明の新規ＡＡＶ配列を利用する分子を提供する。
【００７５】
本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を含有する本発明の分子は、そこに保持される配列を導入する宿主細胞に送達することができるすべての遺伝要素（ベクター）、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス性送達担体（例えば脂質に基づくキャリヤー）、ウイルスなどを含む。選ばれたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ−被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む、いかなる適当な方法によって送達されてもよい。本発明のすべての実施態様を構築するために使用される方法は、核酸操作において習熟した者には既知であり、そして遺伝子工学、組み換え工学および合成技術を含む。参照、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ。
【００７６】
１つの実施態様では、本発明のベクターは、本発明の新規ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ４４−２（ｒｈ．１０）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド）、またはこれらのＡＡＶキャプシドの１つ以上のフラグメントをコードしている配列を含有する。あるいはまた、ベクターはキャプシドタンパク質、またはそのフラグメント自体を含有してもよい。
【００７７】
場合によっては、本発明のベクターは、ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードしている配列を含有してもよい。そのようなｒｅｐ配列は、ｃａｐ配列を備えている同じＡＡＶ血清型由来であってもよい。あるいはまた、本発明は、ｒｅｐ配列がｃａｐ配列を備えているものとは異なるＡＡＶ血清型由来であるベクターを提供する。１つの実施態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別々の起源（例えば、別々のベクター、または宿主細胞とベクター）から発現される。その他の実施態様では、これらのｒｅｐ配列はｃａｐ配列と同じ起源から発現される。この実施態様では、ｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にフレーム内で融合されてキメラＡＡＶベクターを形成してもよい。場合によっては、本発明のベクターは、さらに、ＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲによって隣接される選ばれた導入遺伝子を含有するミニ遺伝子を含有する。
【００７８】
かくして、１つの実施態様では、本明細書に記述されるベクターは、単一のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ７もしくはその他の新規ＡＡＶ）由来でもよいインタクトのＡＡＶキャプシドをコードしている核酸配列を含有する。あるいはまた、これらのベクターは、異種のＡＡＶまたは非ＡＡＶキャプシドタンパク質（またはそのフラグメント）に融合されたＡＡＶ７（もしくはその他の新規ＡＡＶ）キャプシドの１つ以上のフラグメントを含有する人工キャプシドをコードしている配列を含有する。これらの人工キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ７（もしくはその他の新規ＡＡＶ）キャプシドの非隣接部分、または他のＡＡＶ血清型のキャプシドから選ばれる。例えば、例えば１つ以上の超可変領域（すなわちＨＰＶ１−１２）における、ＡＡＶｖｐ１、またはｖｐ２および／またはｖｐ３の１つ以上のコーディング領域を改変することが望ましいであろう。その他の例では、ｖｐ３部分の開始コドンをＧＴＧに変えることが望ましいであろう。これらの改変は、選ばれた発現系において発現、収量を増強し、そして／または精製を改良するため、あるいはその他の目的（例えば、屈性を変えるか、または中和抗体エピトープを改変するため）のために存在してもよい。
【００７９】
本明細書に記述されるベクター、例えばプラスミドは、種々の目的のために有用であるが、特に、ＡＡＶ配列またはそのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの生産における使用のために非常に適している。ｒＡＡＶを含むこれらのベクター、それらの要素、構築および使用は本明細書において詳細に記述されている。
【００８０】
１つの態様では、本発明は、ＡＡＶ血清型７（もしくはその他の新規ＡＡＶ）キャプシドまたはその部分を有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成する方法を提供する。そのような方法は、本明細書において定義されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７（もしくはその他の新規ＡＡＶ）キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードしている核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最小でも、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；ならびにＡＡＶ７（もしくはその他の新規ＡＡＶ）キャプシドタンパク質中にミニ遺伝子の充填を可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。
【００８１】
ＡＡＶキャプシド中にＡＡＶミニ遺伝子を充填するために宿主細胞において培養されるのに必要な成分は、トランスに宿主細胞に供給されてもよい。あるいはまた、要求される成分（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上が、当業者に既知の方法を用いて１つ以上の要求される成分を含有するように工作された安定な宿主細胞によって供給されてもよい。もっとも適当には、そのような安定な宿主細胞は、誘導しうるプロモーターの制御下で要求される成分を含有できる。しかしながら、要求される成分は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適当な誘導および構成プロモーターの例は、導入遺伝子による使用のために適当な調節要素の議論において本明細書で提供される。なおその他の代替法では、選ばれた安定な宿主細胞は、構成プロモーターの制御下の選ばれた成分および１つ以上の誘導プロモーターの制御下の他の選ばれた成分を含有してもよい。例えば、２９３細胞（構成プロモーターの制御下でＥＩヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する、安定な宿主細胞が生成されてもよい。なお他の安定な宿主細胞も当業者によって生成することができる。
【００８２】
本発明のｒＡＡＶを作成するために要求されるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、それに保持された配列を伝達するすべての遺伝要素の形態において充填する宿主細胞に送達されてもよい。選ばれた遺伝要素は、本明細書に記述される方法を含む、すべての適当な方法によって送達することができる。本発明のすべての実施態様を構築するのに使用される方法は、核酸操作において習熟した者には既知であり、そして遺伝子工学、組み換え工学および合成技術を含む。参照、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作成する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は本発明において限定されるものではない。参照、例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号。
【００８３】
Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は、最小でも、導入遺伝子およびその調節配列、および５’と３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）からなる。キャプシドタンパク質中に充填され、そして選ばれた宿主細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。
【００８４】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種である核酸配列であり、これはポリペプチド、タンパク質、または興味ある他の生産物をコードしている。核酸のコーディング配列は、宿主細胞において導入遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で調節成分に操作可能に結合される。
【００８５】
導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターが置かれる用途に依存するであろう。例えば、１つのタイプの導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生産するレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列は、限定されるものではなく、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、例えばＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ８を含むルシフェラーゼ結合タンパク質、インフルエンザ血球凝集タンパク質、および技術上既知の他のものをコードしているＤＮＡ配列を含み、それに対向する高親和力の抗体は、既に存在しているか、または慣用の手段によって、そして中でも血球凝集素もしくはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適当に融合された膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質によって生産することができる。
【００８６】
これらのコーディング配列は、それらの発現を進める調節要素と共同した場合、酵素的、放射能的、比色的、蛍光もしくは他の分光光度アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む蛍光活性化細胞選別アッセイおよび免疫学的アッセイ、を含む慣用の手段により検出可能なシグナルを与える。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合には、シグナルを保持しているベクターの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質もしくはルシフェラーゼである場合には、シグナルを保持するベクターは、ルミノメーターにおいて発色もしくは発光によって可視的に測定することができる。
【００８７】
しかしながら、望ましくは、導入遺伝子は、生物学および医学において有用である生産物、例えばタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素もしくは触媒性ＲＮＡをコードしている非マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒性ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の１つの例は、処置される動物において標的核酸配列の発現を失わせる配列である。
【００８８】
導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常なレベル以下でしか発現されない欠失か、または機能性遺伝子産物が発現されない欠失を含んでもよい遺伝子欠失を矯正するかまたは緩和するために使用されてもよい。導入遺伝子配列の好適なタイプは、宿主細胞において発現される治療的タンパク質もしくはポリペプチドをコードしている。さらに、本発明は、例えば、多サブユニットタンパク質によって惹起される遺伝子欠失を矯正または緩和するために、多数の導入遺伝子を使用することを含む。ある場合には、異なる導入遺伝子が、タンパク質の各サブユニットをコードするために、または種々のペプチドもしくはタンパク質をコードするために使用されてもよい。このことは、タンパク質のサブユニットをコードしているＤＮＡのサイズが、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子またはジストロフィンタンパク質に対して大きい場合には望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を生産するために、細胞は、種々のサブユニットの各々を含有する組み換えウイルスにより感染される。あるいはまた、タンパク質の種々のサブユニットが同じ導入遺伝子によってコードされてもよい。この場合には、単一の導入遺伝子は、内部リボザイムエントリー部位（ＩＲＥＳ）によって分けられる各サブユニットについてのＤＮＡとともに、サブユニットの各々をコードしているＤＮＡを含む。このことは、各サブユニットをコードしているＤＮＡのサイズが小さい場合、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードしているＤＮＡの全サイズが５キロ塩基未満である場合には望ましい。ＩＲＥＳの代わりとして、ＤＮＡは、翻訳後の出来事において自己開裂する、２Ａペプチドをコードしている配列によって分けられてもよい。参照、例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８（Ｐｔ1）：１３−２１（Ｊａｎ  １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ  ２００１）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ  ２００１）。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも有意に小さく、それは、スペースが制限因子である場合の使用には良好に適合される。しかしながら、選ばれた導入遺伝子は、いかなる生物学的に活性な生産物または他の生産物、例えば研究のために望ましい生産物をもコードすることができる。
【００８９】
適当な導入遺伝子は当業者によって容易に選択することができる。導入遺伝子の選択は本発明の限定とは考慮されない。
【００９０】
２．調節要素
ミニ遺伝子について先に同定された主要素に加えて、またベクターは、本発明によって作成されたプラスミドベクターによりトランスフェクションされるか、またはウイルスにより感染される細胞において、その転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で導入遺伝子に操作可能に結合される必要な慣用制御要素を含む。本明細書で使用されるように、「操作可能に結合された」配列は、興味ある遺伝子に隣接している発現制御配列および興味ある遺伝子を制御するためにトランスまたは一定の距離において作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわちＫｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望ならば、コードされた生産物の分泌を増強する配列を含む。本来的、構成的、誘導的および／または組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が当該技術分野において知られており、そして利用することができる。
【００９１】
構成プロモーターの例は、限定されることなく、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーとともに）［参照、例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５）］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を含む。
【００９２】
誘導プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外因的に供給される化合物、環境因子、例えば温度、または特定の生理的状態の存在、例えば急性相、細胞の特定の分化状態または複製中の細胞自体によって調節することができる。誘導プロモーターおよび誘導系は、限定されることなく、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む種々の市販の起源から得ることができる。多くの他の系が記述されており、そして当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導プロモーターの例は、亜鉛誘導性ヒツジ・メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス・乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、また参照、Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８）］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を含む。なお、本文脈上有用である他のタイプの誘導プロモーターは、特定の生理的状態、例えば温度、急性相、細胞の特定の分化状態または複製中の細胞自体によって調節されるものである。
【００９３】
その他の実施態様では、導入遺伝子のために本来のプロモーターが使用される。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が本来の発現を模倣しなければならないことが所望される場合には好適である。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的もしくは発展的、または組織特異様式でもしくは特異的転写刺激に応答して調節されねばならない場合に使用できる。さらなる実施態様では、他の本来の発現制御要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはＫｏｚａｋ共通配列がまた、本来の発現を模倣するために使用されてもよい。
【００９４】
導入遺伝子のその他の実施態様は、組織特異的プロモーターに操作可能に結合された導入遺伝子を含む。例えば、骨格筋における発現が所望される場合、筋肉中で活性のあるプロモーターが使用されねばならない。これらは、骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーターならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性をもつ合成の筋肉プロモーター（参照、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９））を含む。組織特異的であるプロモーターの例は、中でも、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、神経繊維軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））について知られている。
【００９５】
場合によってはまた、治療上有用な導入遺伝子を保持するプラスミドは、選択可能なマーカーを含んでもよく、あるいはレポーター遺伝子は、中でもゲネチシン、ハイグロマイシンもしくはプリマイシン耐性をコードしている配列を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子（好ましくは、本発明の方法によってレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）、例えばアンピシリン耐性は、細菌細胞におけるプラスミドの存在を示すために使用できる。他のプラスミド成分は複製起点を含んでもよい。これらおよび他のプラスミドおよびベクター要素の選択は慣例のとおりであり、そして多くのそのような配列が得られる［参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，およびそこに引用された参考文献］。
【００９６】
導入遺伝子、プロモーター／エンハンサーおよび５’と３’ＩＴＲの組み合わせは、本明細書での引用が容易なように「ミニ遺伝子」と呼ばれる。本発明の教示があれば、そのようなミニ遺伝子の設計は慣用の技術により作成できる。
【００９７】
３．充填する宿主細胞へのミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は、宿主細胞に送達されるすべての適当なベクター、例えばプラスミドに担持させることができる。本発明において有用なプラスミドは、それらが複製と、そして場合によっては、原核細胞、哺乳動物細胞または両者への組み込みに適当であるように工作されてもよい。これらのプラスミド（または５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを保持している他のベクター）は、真核生物および／または原核生物におけるミニ遺伝子の複製を可能にする配列ならびにこれらの系のための選択マーカーを含有する。選択マーカーもしくはレポーター遺伝子は、中でもゲネチシン、ハイグロマイシンもしくはプリマイシン耐性をコードしている配列を含んでもよい。またプラスミドは、細菌細胞におけるベクターの存在を示すために使用できるある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性を含んでもよい。他のプラスミド成分は、複製起点およびアンプリコン、例えばエプスタインバールウイルス核抗原を用いるアンプリコン系を含んでもよい。このアンプリコン系または他の類似のアンプリコン成分は、細胞において高いコピー数のエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を保持する分子は、それが一過性に存在してもよい細胞中にトランスフェクションされる。あるいはまた、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを保持している）は、染色体であってもエピソームとしても、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。ある実施態様では、ミニ遺伝子は、多コピーにおいて、場合によっては、ヘッド・トゥー・ヘッド。ヘッド・トゥー・テールもしくはテール・トゥー・テールにおいて提供されてもよい。適当なトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞にミニ遺伝子を送達するために容易に利用することができる。
【００９８】
一般に、トランスフェクションによってミニ遺伝子を含んでなるベクターを送達する場合、ベクターは、約５μｇ〜約１００μｇＤＮＡ量、好ましくは約１０〜５０μｇＤＮＡ量において、約１ｘ１０4細胞〜約１ｘ１０13細胞、好ましくは約１０5細胞に送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選ばれるベクター、送達方法および選ばれた宿主細胞のようなファクターを考慮して調節できる。
【００９９】
Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列
ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は、宿主細胞において新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ７もしくは他の新規ＡＡＶキャプシドまたはこれらのキャプシドの１つ以上のフラグメントを含んでなる人工キャプシドタンパク質）の発現を作動する配列およびミニ遺伝子に見いだされるＡＡＶ  ＩＴＲの血清型と同じ血清型のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶｃａｐおよびｒｅｐ配列は、前記ＡＡＶ起源から独立して得られてもよく、そして前記のように当該技術分野において既知のいかなる方法においても宿主細胞に導入することができる。さらに、本発明の新規ＡＡＶキャプシドを仮分類する場合、必須のｒｅｐタンパク質の各々をコードする配列は、同じＡＡＶ血清型によって供給されてもよく、あるいはｒｅｐタンパク質をコードする配列は、種々のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ＡＡＶ３，ＡＡＶ４，ＡＡＶ５，ＡＡＶ６、または本明細書で同定された新規血清型の１つ）によって供給されてもよい。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２由来であり、一方ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ１由来である。
【０１００】
１つの実施態様では、宿主細胞は、適当なプロモーター、例えば前記プロモーターの制御下でキャプシドタンパク質を安定に含有する。もっとも望ましくは、この実施態様では、キャプシドタンパク質は、誘導プロモーターの制御下で発現される。その他の実施態様では、キャプシドタンパク質はトランスにおいて宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞において選ばれたキャプシドタンパク質の直接発現に必要な配列を含有するプラスミドを介して送達されてもよい。もっとも望ましくは、トランスに宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質を保持するプラスミドは、ｒＡＡＶを充填するために要求される他の配列、例えばｒｅｐ配列をまた保持している。
【０１０１】
その他の実施態様では、宿主細胞は、適当なプロモーター、例えば前記プロモーターの制御下でｒｅｐ配列を安定に含有する。もっとも望ましくは、この実施態様では、必須のｒｅｐタンパク質は、誘導プロモーターの制御下で発現される。その他の実施態様では、ｒｅｐタンパク質はトランスにおいて宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達される場合、ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞において選ばれたｒｅｐタンパク質の直接発現に必要な配列を含有するプラスミドを介して送達されてもよい。もっとも望ましくは、トランスに宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質を保持するプラスミドは、ｒＡＡＶを充填するために要求される他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列をまた保持している。
【０１０２】
かくして、１つの実施態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、単一の核酸分子において宿主細胞にトランスフェクションされてもよく、そしてエピソームとして宿主細胞中で安定に存在する。その他の実施態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。その他の実施態様は、宿主細胞において一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位の間に入れる任意のスペーサー、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶｃａｐ遺伝子配列を含有する。
【０１０３】
場合によっては、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、宿主細胞中に導入されるべき他のＤＮＡ配列を含有しているベクターにおいて供給されてもよい。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有してもよい。ベクターは、ヘルパー機能、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１，Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６をコードしている遺伝子の１つ以上、およびＶＡＩ  ＲＮＡの遺伝子を含有してもよい。
【０１０４】
好ましくは、この構築物で使用されるプロモーターは、当業者に既知であるか、または先に議論されたような構成的、誘導的または本来のプロモーターのいずれであってもよい。１つの実施態様では、ＡＡＶ  Ｐ５プロモーター配列が使用される。これらの配列のいずれかを与えるためのＡＡＶの選択は本発明を限定するものではない。
【０１０５】
その他の好適な実施態様では、ｒｅｐについてのプロモーターは、導入遺伝子調節要素に関して先に議論されたような誘導プロモーターである。ｒｅｐ発現のための１つの好適なプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターおよびｃａｐ遺伝子によって調節されるｒｅｐ遺伝子を含んでなるベクターは、構成的でも誘導的でも、Ｔ７ポリメラーゼを発現する細胞中にトランスフェクションされるか、または形質転換される。参照、１９９８年３月１２日に公表されたＷＯ９８／１００８８。
【０１０６】
スペーサーはベクターの設計における任意の要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子ＡＴＧ開始部位との間に入れられるＤＮＡ配列である。スペーサーはすべての所望される設計を有してもよい；すなわち、それはヌクレオチドの任意の配列であってもよく、あるいはまた、それは遺伝子産物、例えばマーカー遺伝子をコードしてもよい。スペーサーは、原核生物もしくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御されないコーディング配列または転写制御されるコーディング配列であってもよい。スペーサー配列の２つの代表的起源は、λファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、これらは、例えば中でもＧｉｂｃｏもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。スペーサーは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させ、そしてｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルのままに発現させるのに十分ないかなるサイズのものであってもよい。したがって、スペーサーの長さは、約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐの範囲、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲であってもよい。組み換えの可能性を低下させるために、スペーサーは、好ましくは、長さ２ｋｂｐ以下である；しかしながら、本発明はそれに限定されるものではない。
【０１０７】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子は宿主細胞中に一過性に存在してもよい（すなわち、トランスフェクションを通じて）が、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の１つもしくは両方およびそれらの発現を制御するプロモーターが、例えばエピソームとして、または宿主細胞の染色体への組み込みによって、宿主細胞において安定に発現されることが好適である。本発明の実施態様を構築するために用いられる方法は、先の参考文献において記述されるような慣用の遺伝子工学または組み換え工学である。本明細書は、ここに与えられる情報を用いて特定の構築物の具体的な例を提供するけれども、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、および少なくとも１つの翻訳開始および終止シグナル、およびポリアデニル化部位の任意の付加を含む他の要素の選択を使用して、他の適当な構築物を選択および設計することができる。
【０１０８】
本発明のその他の実施態様では、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は宿主細胞によって安定して提供される。
【０１０９】
Ｃ．ヘルパー機能
充填をする宿主細胞は、また、本発明のｒＡＡＶを充填するためにヘルパー機能を必要とする。場合によっては、これらの機能はヘルペスウイルスによって供給されてもよい。もっとも望ましくは、必要なヘルパー機能は、ヒトまたは非ヒトの霊長類アデノウイルス起源、例えば、先に記述された起源から各々供給され、そして／またはアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（ＵＳ）を含む、種々の起源から入手できる。１つの現に好適な実施態様では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／またはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物を備えており、そして／または含有している。宿主細胞は、他のアデノウイルス遺伝子、例えばＶＡＩＲＮＡを含有してもよいが、これらの遺伝子は必要ではない。好適な実施態様では、他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は宿主細胞には存在しない。
【０１１０】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」によって、Ｅ１ａをコードしているすべてのアデノウイルス配列またはすべての機能性Ｅ１ａ部分が意味される。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡは同様に定義される。また、アデノウイルス遺伝子またはその機能性部分のすべての対立遺伝子または他の改変が含まれる。そのような改変は、ある様式でアデノウイルス機能を増強するための慣用の遺伝子工学または変異誘発技術、ならびに天然に存在する対立遺伝子改変体によって導入されてもよい。これらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためにＤＮＡを操作するそのような改変および方法はは当業者にとっては既知である。
【０１１１】
アデノウイルスＥ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにすべて他の所望のヘルパー機能は、細胞においてそれらの発現を可能にするすべての手段を用いて与えることができる。これらの生産物をコードしている各配列が別々のベクターに存在していてもよく、または１つ以上の遺伝子が同じベクターに存在していてもよい。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを含む、当該技術分野において既知かまたは先に開示されたすべてのベクターであってもよい。ベクターの宿主細胞への導入は、中でもトランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む、当該技術分野において既知かまたは先に開示されたすべての手段によって達成することができる。１つ以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、または一過性に発現されてもよい。遺伝子産物は、エピソームにおいても、または安定に組み込まれても、すべて一過性に発現されてもよいし、あるいは他は一過性に発現されながら遺伝子産物のあるものが安定に発現されてもよい。さらにまた、各々のアデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成プロモーター、誘導プロモーターまたは本来のアデノウイルスプロモーターから独立に選択することができる。プロモーターは、生物体もしくは細胞の特定の生理的状態（すなわち、分化状態または複製中または静止状態の細胞）によって、または例えば外因的に付加された因子によって調節されてもよい。
【０１１２】
Ｄ．宿主細胞および充填する細胞系
宿主細胞それ自体は、原核細胞（例えば細菌）ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含む真核細胞、を含むすべての生物学的有機体から選択することができる。特定の望ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、細胞、例えばＡ５４９，ＷＥＨＩ，３Ｔ３，１０Ｔ１／２，ＢＨＫ，ＭＤＣＫ，ＣＯＳ１，ＣＯＳ７，ＢＳＣ１，ＢＳＣ４０，ＢＭＴ１０，Ｖｅｒｏ，Ｗ１３８，ＨｅＬａ，２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１を発現する），Ｓａｏｓ，Ｃ２Ｃ１２，Ｌ細胞，ＨＴ１０８０，ＨｅｐＧ２ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳類由来の一次繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞、を含む、すべての哺乳動物種の中から選択することができる。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定するものではなく；また哺乳動物細胞の種類、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども限定するものではない。もっとも望ましい細胞は、Ｅ１，Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６以外のいずれのアデノウイルス遺伝子も保持しないか；またはそれらは、ｒＡＡＶの生産中に汚染ウイルスの相同組み換えをもたらすいかなる他のウイルス遺伝子をも含有せず；そしてそれは、感染またはＤＮＡのトランスフェクションおよびトランスフェクションされたＤＮＡの発現が可能である。好適な実施態様では、宿主細胞は、細胞中に安定にトランスフェクションされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。
【０１１３】
本発明において有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードしている配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１，Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６のＤＮＡならびに前記ミニ遺伝子を保持する構築物によりトランスフェクションされる宿主細胞である。安定なｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現細胞系、例えばＢ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）、または米国特許第５，６５８，７８５号に記述される細胞系もまた同様に使用されてもよい。その他の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ＯＲＦ６を発現するのに十分である最小のアデノウイルスＤＮＡを含有している。なお他の細胞系は、本発明の新規ＡＡＶｒｅｐおよび／または新規ＡＡＶｃａｐ配列を使用して構築することができる。
【０１１４】
本発明による宿主細胞の作成は、選ばれたＤＮＡ配列の集合のような技術を必要とする。この集合は慣用の技術を用いて実施することができる。そのような技術は、周知であり、そして先に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらにより記述されているｃＤＮＡおよびゲノムのクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて、アデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、合成法、および所望のヌクレオチド配列を与えるすべての他の適当な方法、を含む。
【０１１５】
また、宿主細胞への分子（プラスミドもしくはウイルスとして）の導入は、習熟した技術者にとって周知の。そして本明細書をとおして議論される技術を用いて達成できる。好適な実施態様では、標準トランスフェクション技術は、細胞系、例えばヒト胚性腎細胞系ＨＥＫ２９３（トランス−作用性Ｅ１タンパク質を与える機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞系）への、例えばハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによるＣａＰＯ4トランスフェクションもしくはエレクトロポレーション、および／または感染を使用する。
【０１１６】
当業者によって作成されるこれらの新規なＡＡＶに基づくベクターは、ＡＡＶ７に対する中和抗体がヒト集団では見いだされていないので、選ばれた宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達のためには有利である。さらに、初期の研究は、チノモンキー（ｃｙｎｏ  ｍｏｎｋｅｙ）およびチンパンジー集団では中和抗体を示しておらず、そしてアカゲサル、血清型が分離された種におけるＡＡＶ７の１５％以下の交差反応を示している。当業者は、当業者に既知の種々の技術を用いて本明細書に示されるＡＡＶ７キャプシドタンパク質を含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に作成することができる。同様に、ＡＡＶ７配列およびその他の血清型のＡＡＶキャプシドを含有するなお他のｒＡＡＶウイルスベクターが作成される。類似の利点が本発明の他の新規ＡＡＶに基づくベクターによって与えられる。
【０１１７】
かくして、本発明のＡＡＶ７配列が、イン・ビトロ、エクス・ビボもしくはイン・ビボの遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系における使用に容易に適合させられることを、当業者は容易に理解できる。同様に、当業者は、種々のｒＡＡＶおよび非ｒＡＡＶベクター系における使用のために新規ＡＡＶゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、例えば、なかんずくレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含んでもよい。これらのベクター系の選択は本発明を限定するものではない。
【０１１８】
かくして、さらに本発明は、本発明の新規ＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を用いて生成されるベクターを提供する。そのようなベクターは、治療分子の送達を含む種々の目的のため、そしてワクチン処方における使用のために有用である。治療分子の送達のために特に望ましいのは、本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組み換えＡＡＶである。本発明の新規ＡＡＶ配列を含有しているこれらの、または他のベクター構築物は、例えばサイトカインの同時送達、または免疫源それ自体の送達のために、ワクチン処方において使用されてもよい。
【０１１９】
Ｖ．組み換えウイルスおよびそれらの使用
本明細書に記述される技術を用いて、当業者は本発明の新規血清型のキャプシド、または本発明の方法によって同定されるＡＡＶ血清型の１つ以上の新規フラグメントを有するｒＡＡＶを作成する。１つの実施態様では、単一の血清型、例えばＡＡＶ７［配列番号：２］由来の全長キャプシドが利用できる。その他の実施態様では、その他の選ばれたＡＡＶ血清型由来の配列とともに、フレーム内に融合された本発明の新規血清型の１つ以上のフラグメントを含有する全長キャプシドが作成されてもよい。例えば、ｒＡＡＶは、本発明のＡＡＶ血清型の新規な超可変領域配列を含有してもよい。あるいはまた、本発明の独特なＡＡＶ血清型は、他のウイルスもしくは非ウイルス配列を含有する構築物において使用されてもよい。
【０１２０】
本発明のある種の血清型がある種の使用のために特に良好に適合できるという態様は当業者にとって容易に明白である。例えば、本発明のＡＡＶ７キャプシドに基づくベクターは、筋肉における使用に特によく適合され；一方、本発明のｒｈ．１０（４４−２）キャプシドに基づくベクターは、肺における使用のために特によく適合される。そのようなベクターの使用はそれに限定されず、そして当業者は、他の細胞類、組織もしくは器官への送達のためのこれらのベクターを利用できる。さらに、本発明の他のキャプシドに基づくベクターも、これらまたは他の細胞、組織もしくは器官への送達のために使用されてもよい。
【０１２１】
Ａ．導入遺伝子の送達
その他の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶの配列を用いて生成されたベクターにより選ばれた宿主細胞をトランスフェクションまたは感染することを伴う、宿主への導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は当業者には周知であり、そして本発明を限定するものではない。
【０１２２】
１つの望ましい実施態様では、本発明は、宿主への導入遺伝子のＡＡＶ仲介送達方法を提供する。この方法は、それとＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を主導する配列の制御下で、選ばれた導入遺伝子を含有する組み換えウイルスベクターにより選ばれた宿主細胞をトランスフェクションまたは感染することを伴う。
【０１２３】
場合によっては、宿主由来のサンプルは、先ず、選ばれたＡＡＶ血清型に対する抗体の存在についてアッセイされる。中和抗体を検出する種々のアッセイ形式は当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は本発明を限定するものではない。参照、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（Ｍａｒｃｈ  １９９７）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９：４７７−４８５（Ｍａｒｃｈ  １，１９９８）。このアッセイの結果は、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達のために好適であるかを、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不在によって、決定するために使用されてもよい。
【０１２４】
この方法の１つの態様では、選ばれたＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターの送達は、異なる血清型ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する遺伝子の送達に先行しても後から続いてもよい。同様に、本発明の他の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターの送達も、異なる血清型ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する遺伝子の送達に先行しても後から続いてもよい。かくして、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達は選ばれた宿主細胞への反復遺伝子送達のために使用することができる。望ましくは、続いて投与されるｒＡＡＶベクターは、最初のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を保持しているが、続いて投与されるベクターは、最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有する。例えば、最初のベクターがＡＡＶ７キャプシドタンパク質［配列番号：２］を有する場合、続いて投与されるベクターは、ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ＡＡＶ３Ａ，ＡＡＶ３Ｂ，ＡＡＶ４，ＡＡＶ６，ＡＡＶ１０，ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２、または限定されるものではなく：Ａ３．１、Ｈ２、Ｈ６、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、Ａ３−３、Ａ３−７、Ａ３−４、Ａ３−５、３．３ｂ、２２３．４、２２３−５、２２３−１０、２２３−２、２２３−７、２２３−６、４４−１、４４−５、４４−２、４２−１５、４２−８、４２−１３、４２−３Ａ、４２−４、４２−５Ａ、４２−１Ｂ、４２−５Ｂ、４３−１、４３−１２、４３−５、４３−２１、４３−２５、４３−２０、２４．１、４２．２、７．２、２７．３、１６．３、４２．１０、４２−３Ｂ、４２−１１、Ｆ１、Ｆ５、Ｆ３、４２−６Ｂおよび／または４２−１２を含む本明細書で同定される他の新規ＡＡＶキャプシドのいずれか、を含む他の血清型の中から選ばれるキャプシドタンパク質を有してもよい。
【０１２５】
前記組み換えベクターは公表されている方法にしたがって宿主細胞に送達される。ｒＡＡＶは、好ましくは生理学的に適合しうるキャリヤーに懸濁されて、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物患者に投与することができる。適当なキャリヤーは、導入ウイルスが管理される指示に関して当業者によって容易に選ぶことができる。例えば、１つの適当なキャリヤーは、種々のバッファー溶液を用いて作成されてもよい食塩水（例えばリン酸バッファー食塩水）を含む。他の代表的キャリヤーは、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油および水を含む。キャリヤーの選択は本発明を限定するものではない。
【０１２６】
場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよびキャリヤーに加えて、他の慣用の製薬成分、例えば保存剤もしくは化学安定剤を含有してもよい。適当な代表的な保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。適当な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。
【０１２７】
ウイルスベクターは、細胞にトランスフェクションし、そして医療技術に習熟した者によって決定できる、過度の悪い影響がないかまたは医薬的に許容しうる生理的効果のある治療上の利益を与えるように十分なレベルの遺伝子導入と発現を与えるのに十分な量で投与される。慣例のそして製薬的に許容しうる投与経路は、限定されるものではないが、選ばれた臓器への直接送達（例えば肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻内および気管内送達）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は、所望ならば組み合わされてもよい。
【０１２８】
ウイルスベクターの用量は、主として、治療される症状、患者の年令、体重および健康のようなファクターに依存し、したがって患者において変化する。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒトの用量は、一般に、濃度約１ｘ１０9〜１ｘ１０16ゲノムウイルスベクターを含有する液の約１ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲である。好適なヒトの用量は、約１ｘ１０13〜１ｘ１０16ＡＡＶゲノムである。用量は、すべての副作用に対して治療利益をバランスさせるように調節され、そしてそのような用量は、組み換えベクターが使用される治療上の適用に応じて変化する。導入遺伝子の発現レベルは、ミニ遺伝子を含有するウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターをもたらす用量頻度を決定するためにモニターすることができる。場合によっては、治療目的について記述されたものと類似の用量処方が、本発明の組成物を用いる免疫化のために利用されてもよい。
【０１２９】
本発明のＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療生産物および免疫誘発生産物の例は以下に与えられる。これらのベクターは、本明細書に記述されるような種々の治療またはワクチン処方のために使用されてもよい。さらに、これらのベクターは、所望の治療および／またはワクチン処方における１つ以上の他のベクターまたは有効成分と組み合わせて送達されてもよい。
【０１３０】
Ｂ  治療用導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされた有用な治療用生成物は、ホルモン及び成長因子及び分化因子を包含し、これらはインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン類（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン又は骨誘導因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＢＭＰ）ＢＭＰｓ１〜１５のいずれかを包含するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのいずれか、増殖因子のヒレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ニュー分化因子（ｎｅｕ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン、セマホリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ）／コラプシン、ネトリン−１及びネトリン−２のファミリーのいずれか、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎｓ）、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼを包含するが、これらに限定はされない。
【０１３１】
他の有用な導入遺伝子産物は、免疫系を調節するタンパク質を包含し、これらはサイトカイン及びリンホカイン、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１〜ＩＬ−２５（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８を包含する）、単球化学誘因タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを包含するが、それらに限定はされない。免疫系により産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、人体で作られた抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩＭＨＣ分子並びに工学的に製造された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子を包含するが、これらに限定はされない。有用な遺伝子産物は補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９も包含する。
【０１３２】
更に他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質のための受容体のいずれかを包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、極めて低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体及びスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節のための受容体を包含する。本発明は、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及び他の核内受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーの如き遺伝子産物も包含する。更に、有用な遺伝子産物は転写因子、例えば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウイルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ−３及びウイングドヘリックスタンパク質（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｆａｍｉｌｙ）ファミリーを包含する。
【０１３３】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイルシンテターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、シスタチオンβ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィンｃＤＮＡ配列を包含する。更に他の有用な遺伝子産物は酵素の欠損活性から生じる種々の状態において有用でありうる酵素置換治療（ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）において有用な如き酵素を包含する。例えば、マンノース−６−ホスフェートを含有する酵素をリソソーム蓄積症の治療において利用することができる（例えば、適当な遺伝子はβ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（ＧＵＳＢ）を包含する）。
【０１３４】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失又はアミノ酸置換を含む非天然的に存在するアミノ酸配列を有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドの如き非天然的に存在するポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工学的に製造された免疫グロブリンは或る種の免疫無防備状態の患者において有用でありうる。他のタイプの非天然的に存在する遺伝子配列はアンチセンス分子及び触媒核酸、例えばリボザイムを包含し、これは標的の過剰発現を減少させるのに使用することができる。
【０１３５】
遺伝子の発現の減少及び／又はモジュレーションは、がん及び乾癬の如く過増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）細胞により特徴付けられた過増殖状態の処置のために特に望ましい。標的ポリペプチドは正常細胞に比べて過増殖細胞において排他的に又はより高いレベルで産生されるこれらのポリペプチドを包含する。標的抗原は、がん遺伝子、例えば、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ及びトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦによりコードされたポリペプチドを包含する。標的抗原としてがん遺伝子産物の他に、抗がん処置及び防御治療プログラム（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ）のための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により産生された抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、これは或る態様では自己免疫のための標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチド及び及びフォレート（ｆｏｌａｔｅ）結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞において高いレベルで見いだされるポリペプチドの如き標的ポリペプチドとして使用することができる。
【０１３６】
他の適当な治療用ポリペプチド及びタンパク質は、自己指向性抗体（“ｓｅｌｆ”−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を産生する細胞受容体及び細胞を含む自己免疫と関連した標的に対する広い基礎の防御免疫応答を与えることにより自己免疫疾患及障害にかかっている個体を処置するのに有用で有り得るポリペプチド及びタンパク質を包含する。Ｔ細胞媒介自己免疫疾患は、慢性間接リューマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患の各々は内因性抗原に結合しそして自己免疫疾患と関連した炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）により特徴付けられる。
【０１３７】
Ｃ  免疫原性導入遺伝子
替わりに又は追加的に、本発明のベクターは本発明のＡＡＶ配列及び選ばれた免疫原に対する免疫応答を誘発するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする導入遺伝子を含有することができる。例えば、免疫原は種々のウイルス科から選ぶことができる。免疫応答が望ましいであろう望ましいウイルス科の例は、ピコルナウイルス科であり、ピコルナウイルス科は、風邪の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス及びヒトエンテロウイルス、例えば肝炎Ａウイルスを包含するエンテロウイルス属；及び、主として非ヒト動物における口蹄疫の原因であるアフトウイルス属を包含する。ピコルナウイルス科のウイルス内では、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４及びＶＰＧを包含する。他のウイルス科は、カリシウイルス科を包含し、カリシウイルス科は、流行胃腸炎の重要な原因物質であるノーウォークウイルス群（Ｎｏｒｗａｌｋ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ）を包含する。ヒト及び非ヒト動物において免疫応答を誘発するための標的抗原における使用に望ましい更に他のウイルス科はトガウイルス科であり、トガウイルス科は、アルファウイルス属を包含し、アルファウイルス属は、シンドビスウイルス、ロス川ウイルス及びベネズェラ東及び西ウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ，Ｅａｓｔｅｒｎ  ＆  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｅｑｕｉｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス及び風疹ウイルスを含むルビウイルスを包含する。フラビウイルス科はデング熱、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介性脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は肝炎Ｃ及びコロナウイルス科から発生させることができ、これらは、多数の非ヒトウイルス、例えば、伝染性気管支炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（家禽）、ブタ伝播性胃腸炎ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ブタ）、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）及びヒト呼吸器コロナウイルス（ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を包含し、これらは風邪及び／又は非Ａ、Ｂ又はＣ肝炎を引き起こすことがある。コロナウイルス科内では、標的抗原はＥ１（Ｍ又はマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓ又はスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎとも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥ又はヘマグルチン−エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するのではない）又はＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。更に他の抗原はラブドウイルス科に対して標的化されることができ、ラブドウイルス科はベシキュロウイルス属（例えば、水泡性口内炎ウイルス）及び狂犬病ウイルス属（例えば、狂犬病）を包含する。ラブドウイルス科内では、適当な抗原はＧタンパク質又はＮタンパク質由来のものであることができる。マールブルグウイルス及びエボラウイルスの如き出血熱ウイルスを包含するフィロウイルス科は適当な抗原のソースであることができる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ｒｕｂｕｒａｖｉｒｕｓ）（ムンプスウイルス（ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ）、モルビリウイルス、これははしか及びイヌジステンバーを包含する、及び呼吸合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）を包含するニューモウイルス、を包含する。インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科内に分類され、そして適当な抗原のソース（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）である。ブンヤウイルス科は、ブンヤウイルス属、（カリフォルニア脳炎、ラ・クロッス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン熱ウイルス（ｈｅｍａｈａｇｉｎ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）である）、ナイロウイルス（ナイロビヒツジ病）及び種々の非指定（ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ）ブンヤウイルスを包含する。アレナウイルス科はＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原のソースを与える。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス属（子供の急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属及びカルチウイルス属（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｔｉｃｋ  ｆｅｖｅｒ）、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳炎、ブルータング）を包含する。
【０１３８】
レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩの如きヒト及び獣医学的疾患を包含するオンコウイルス亜科（ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）、レンチウイルス亜科（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）及びスプマウイルス亜科（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）を包含する。ＨＩＶとＳＩＶとの間で、多くの適当な抗原が記載されておりそして容易に選ぶことができる。適当なＨＩＶ及びＳＩＶ抗原の例はｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖタンパク質並びにそれらの種々の断片を包含するが、それらに限定はされない。更に、これらの抗原に対する種々の変性が記載されている。この目的に適当な抗原は当業者には知られている。例えば、他のタンパク質から抜きん出て、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、及びＶｐｒ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖをコードしている配列を選ぶことができる。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載の変性されたｇａｇタンパク質参照。Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａｒｃｈ  ２００１）及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）に記載されたＨＩＶ及びＳＩＶタンパク質も参照。これらのタンパク質又はそのサブユニットは、別のベクターを介して又は単一のベクターから単独で又は組み合わせて送達することができる。
【０１３９】
パポバウイルス科はポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス）及びパピローマウイルス亜科（がん又は乳頭腫の悪性進行と関連した）を包含する。アデノウイルス科は呼吸疾患及び／又は腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルス科は、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス及びブタパルボウイルスを包含する。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科及び、サイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス（ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））を含むベータヘルペスウイルス亜科、及び、リンフォクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管炎、マレック病ウイルス及びラジノウイルス（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、ウサギポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含する脊椎動物ポックスウイルス亜科、及び昆虫ポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科は肝炎Ｂウイルスを包含する。適当な抗原のソースでありうる更に他の未分類ウイルスは肝炎デルタウイルスである。更に他のウイルスソースはニワトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）及びブタ呼吸及び生殖症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）を包含することができる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルス及び種々の脳炎ウイルスを包含する。
【０１４０】
本発明は、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染するバクテリア、菌・カビ類（ｆｕｎｇｉ）、寄生微生物（ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）又は多細胞寄生生物を包含する又はがん細胞もしくは腫瘍細胞からの他の病原体に対してヒト又は非ヒト動物を免疫するのに有用な免疫原も包含することができる。バクテリア病原体の例は、肺炎球菌、ブドウ球菌及び連鎖球菌を包含する病原性グラム陽性球菌を包含する。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｃｏｃｃｕｓ）、淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）を包含する。病原性腸内グラム陰性バチルス（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｉ）は、腸内細菌科；シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクテリア属（ａｃｉｎｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びエイケネラ属（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疸（ｍｅｌｉｏｉｄｏｓｉｓ）；サルモネラ属（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ属（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ属（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルジニア属（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ属（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））；ストレプトバシラス・モニリホルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）及びスピリルム属（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）を包含し、グラム陽性バチルスは、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ菌（ｃｈｏｌｅｒａ）；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ）（鼡径部肉芽腫（ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ））；及びバルトネラ症（ｂａｒｔｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）を包含する。病原性嫌気性バクテリアにより引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス中毒（ｂｏｔｕｌｉｓｍ）；他のクロストリジウム属（ｏｔｈｅｒ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；らい病；及び他のミコバクテリア（ｏｔｈｅｒ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を包含する。病原性スピロヘータ疾患は、梅毒（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）；トレポネーマ症（ｔｒｅｐｏｎｅｍａｔｏｓｅｓ）；イチゴ腫（ｙａｗｓ）；ピンタ（ｐｉｎｔａ）及び風土病梅毒（ｅｎｄｅｍｉｃ  ｓｙｐｈｉｌｉｓ）及びラプトスピラ症（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）を包含する。より高い病原バクテリア及び病原性菌・カビ類により引き起こされる他の感染症は、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコックス症；ブラストミセス症、ヒストプラスマ症及びコクシジオイデス真菌症；カンジダ症；アスペルギルス症及びムコール症（ｍｕｃｏｒｍｙｃｏｓｉｓ）；スポロトリクス症；パラコクジオイドミコーシス（ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）；ペトリエリジオシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）；トルロプシス症（ｔｏｒｕｌｏｐｓｏｓｉｓ）；菌腫（ｍｙｃｅｔｏ���ａ）及びクロモミコーシス；及び皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス熱（ｔｙｐｈｕｓ  ｆｅｖｅｒ）、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱及びリケッチア痘を包含する。マイコプラスマ及びクラミジア感染症の例は、肺炎マイコプラスマ；性病性リンパ肉芽腫；オウム病及び周生期クラミジア感染症（ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）を包含する。病原性真核生物は、病原性原生動物及び蠕虫を包含し、そしてそれにより引き起こされる感染症は、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラスマ・ゴンディー（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア鞭毛中症（ｄｉａｒｄｉａｓｉｓ）；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫感染症；吸虫類（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ  ｏｒ  ｆｌｕｋｅｓ）感染症；及び条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（ｔａｐｅｗｏｒｍ）感染症を包含する。  これらの生物及び／又はそれにより産生された毒素の多くは、生物学的アタックにおける使用の可能性を有する作用物質（ａｇｅｎｔｓ）として、疾病管理センター［（ＣＤＣ）、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ］により同定されている。例えば、これらの生物学的作用物質のいくらかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及びその毒素（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）（天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ））、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）及びウイルス出血熱（ｖｉｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）を包含し、これらのすべては現在範疇Ａ作用物質（Ｃａｔｅｇｏｒｙ  Ａ  ａｇｅｎｔｓ）として分類されており、更に、コクシエラ・バーネッティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）；ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疸）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）及びその毒素（リシン毒素）、ウエルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びその毒素（イプシロン毒素（ｅｐｓｉｌｏｎ  ｔｏｘｉｎ）、ブドウ球菌属の種及びその毒素（エンテロトキシンＢ）を包含し、これらのすべては現在範疇Ｂ作用物質として分類されており、そして更にＮｉｐａｎウイルス及びハンタウイルスを包含し、これらは現在範疇Ｃ作用物質として分類されている。更に、そのように分類され又は異なって分類される他の生物が将来においてこのような目的で同定及び／又は使用されることができる。本明細書に記載したウイルスベクター及び他の構築物はこれらの有機物、ウイルス、それらの毒素又は他の副生物からの抗原を送達するのに有用であり、これは感染又はこれらの生物学的作用物質との他の不利な反応を防止及び／又は処置するであろうということは容易に理解されるであろう。
【０１４１】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与はＣＴＬｓを含む免疫応答を誘発してＴ細胞を排除する。慢性関節炎（ＲＡ）において、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）のいくつかの特定の（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲｓはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７及びＶα−１７を包含する。かくして、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達はＲＡに関与するＴ細胞を標的する免疫応答を誘発するであろう。多発性硬化症（ＭＳ）においては、疾患に関与するＴＣＲｓのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲｓはＶ−７及びＶα−１０を包含する。かくして、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達はＭＳに関与するＴ細胞を標的する免疫応答を誘発するであろう。強皮症においては、疾患に関与するＴＣＲｓのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲｓはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４及びＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８及びＶα−１２を包含する。かくして、これらのポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達は強皮症に関与するＴ細胞を標的する免疫応答を誘発するであろう。
【０１４２】
場合により、本発明のＡＡＶ配列を含むベクターはプライム−ブースト治療プログラム（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ）を使用して送達させることができる。種々のこのような治療プログラムは当該技術分野で記載されておりそして容易に選ぶことができる。例えば、２０００年３月２日に公開されたＷＯ００／１１１４０参照。これは参照により本明細書に取り込まれる。
【０１４３】
このようなプライム−ブースト治療プログラムは、典型的には、ＤＮＡ（例えば、プラスミド）をベースとするベクターを投与して免疫系をプライミングし、そして伝統的な抗原（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、このような抗原をコードする配列を有するタンパク質又は組換えウイルスにより第２の、ブースター投与することを含む。１つの態様では、本発明は選ばれた抗原を有するプラスミドＤＮＡベクターを送達し、次いで例えば本発明のＡＡＶ配列を含むベクターでブーストすることにより、一次免疫しそして選ばれた抗原に対する免疫応答をブーストする方法を提供する。
【０１４４】
１つの態様では、プライム−ブースト治療プログラムはプライム及び／又はブーストベヒクルからの多数のタンパク質の発現を伴う。例えば、ＨＩＶ及びＳＩＶに対する免疫応答を発生させるのに有用なタンパク質サブユニットの発現のためのマルチタンパク質治療プログラム（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｆｉｍｅｎ）を記載しているＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）参照。例えば、ＤＮＡプライムは、シングル転写（ｓｉｇｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）からのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸ及びＶｐｒ及びＥｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖを送達することができる。あるいは、ＳＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＨＩＶ−ＩＥｎｖが送達される。
【０１４５】
しかしながら、プライム−ブースト治療プログラムは、ＨＩＶに対する免疫感作（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）又はこれらの抗原の送達に限定されない。例えば、プライミングは、本発明の第１チンプベクター（ｃｈｉｍｐ  ｖｅｃｔｏｒ）で送達し、次いで第２チンプベクター又はタンパク質形態の抗原自体を含有する組成物によりブーストすることを伴うことができる。１つの例では、プライム−ブースト治療プログラムは、抗原が由来しているウイルス、バクテリア又は他の生物に対する保護免疫応答を与えることができる。他の所望の態様では、プライム−ブースト治療プログラムは、治療が行われるべき状態の存在の検出のための慣用のアッセイを使用して測定することができる治療効果を与える。
【０１４６】
プライミングワクチンは、用量（ｄｏｓｅ）依存性方式で身体の種々の部位に投与することができ、これは所望の免疫応答が標的されるべき抗原に依存する。本発明は、注射の量又は部位又は製薬学的担体に限定されない。むしろ。プライミング段階は、１時間に、１日に、１週間に、又は１カ月に、又は年間に投与される単一用量又は投与量（ｄｏｓａｇｅ）を含む治療プログラムを包含する。例として、哺乳動物は、担体中のプラスミド約１０μｇ〜約５０μｇを含有する１つ又は２つのプライミング注射を受けることができる。プライミングＤＮＡワクチン組成物の望ましいプライミング量又は投与量はＤＮＡワクチン約１μｇ〜約１０，０００μｇの範囲にある。投与量は被験体の体重１ｋｇ辺り約１μｇ〜１０００μｇＤＮＡまで変わることができる。注射の量又は部位は望ましくは、ワクチンを与えられる哺乳動物の独自性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び状態に基づいて選ばれる。
【０１４７】
哺乳動物への抗原の送達に適当なＤＮＡワクチンの投与単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）は本明細書に記載されている。等張性食塩水（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ｓａｌｉｎｅ）、等張性塩溶液又はこのような投与において当業者に明らかな他の処方の如き製薬学的又は生理学的に許容しうる担体中に懸濁又は溶解させることにより、投与するためのＤＮＡワクチンが製造される。適当な担体は当業者には明らかでありそして大部分投与経路に依存するであろう。本発明の組成物は、生物分解性生物適合性ポリマーを使用する遅延放出処方において又はミセル、ゲル又はリポソームを使用する部位送達（ｏｎ−ｓｉｔｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）により、上記した経路に従って哺乳動物に投与することができる。
【０１４８】
場合により、本発明のプライミングステップは、本明細書に定義されている如き適当な量のアジュバントをプライミングＤＮＡワクチン組成物と共に投与することも含む。
【０１４９】
好ましくは、ブースチング組成物は哺乳動物被験体にプライミングＤＮＡワクチンを投与してから約２〜約２７週間後に投与される。ブースチング組成物の投与は、プライミングＤＮＡワクチンにより投与されのと同じ抗原を含有するか又は送達することができる有効量のブースチングワクチン組成物を使用して達成される。ブースチング組成物は同じウイルスソース又は他のソース由来の組換えウイルスベクターからなることができる。あるいは、「ブースチング組成物」は、プライミングＤＮＡワクチンにおいてコードされているのと同じ抗原を、しかしタンパク質又はペプチドの形態で、含有する組成物であって、宿主における免疫応答を誘発する組成物であることができる。他の態様では、ブースチングワクチン組成物は、哺乳動物細胞においてその発現を指向する調節配列の制御下に抗原をコードするＤＮＡ配列、例えば、周知のバクテリア又はウイルスベクターの如きベクター、を含有する組成物を包含する。ブースチングワクチン組成物の主たる要件は、ワクチン組成物の抗原がＤＮＡワクチンによりコードされている抗原と同じ抗原又は交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）抗原であるということである。
【０１５０】
適当には、本発明のベクターは、非ＡＡＶベクター並びにタンパク質、ペプチド及び／又は他の生物学的に有用な治療用又は免疫原性化合物を使用する治療プログラムにおける使用にも十分に適している。これらの治療プログラムは、保護免疫を誘発することを含む、治療ポーズ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｓｅｓ）のため及び免疫感作（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）のための遺伝子送達に特によく適している。このような使用は当業者には容易に明らかであろう。
【０１５１】
更に、本発明のベクターは、生物が１つ又はそれより多くのＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有する場合ですら、生体内又は生体外で選ばれた宿主細胞に選ばれた導入遺伝子を送達することができる有効な遺伝子伝達ビヒクル（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を提供する。１つの態様では、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）及び細胞を生体外で混合し、感染した細胞を慣用の方法を使用して培養し、形質導入された細胞を患者に再注入する（ｒｅ−ｉｎｆｕｓｅｄ）。更に、本発明のベクターは、試験管内での所望の遺伝子産物の産生のために使用することもできる。試験管内産生のためには、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードしている分子を含有するｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクションし、そして発現を許容する条件下に細胞培養物を培養することにより所望の培養から得ることができる。次いで発現された産物を所望に応じて精製しそして単離することができる。トランスフェクション、細胞培養、精製及び単離のための適当な技術は当業者には知られている。
【０１５２】
（実施例）
実施例１：  新規なＡＡＶ配列のＰＣＲ増幅、クローニングおよび特徴付け
公知ＡＡＶの高度に保存されている領域に対するオリゴヌクレオチドを基にしたＰＣＲ方法を用いて、非−ヒト霊長類の組織にＡＡＶ配列に関する選別を受けさせた。ＡＡＶ１の２８８６から３１４３ｂｐに渡る長さのＡＡＶ配列［配列番号：６］をＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）［この中の保存配列は公知ＡＡＶ血清型の各々にユニークなキャプシド蛋白質（Ｃａｐ）の超可変領域（本明細書では「シグニチャー領域（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」と呼ぶ）に隣接している］として選択した。後の分析で、前記シグニチャー領域は保存残基間に位置していて超可変領域３に渡ることが示された。
【０１５３】
ヒトでないいろいろな霊長類種の抹消血液を最初に試験した結果、レサス・マカク（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）、シノモロゴス・マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）、チンパンジーおよびヒヒの如き種に属するサブセットの動物にＡＡＶが検出され得ることが分かった。しかしながら、試験を受けさせた他のある種の霊長類［ニホンザル、ピッグテールドマカク（ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅｓ）およびスクイレルモンキー（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙｓ）を包含］には全くＡＡＶ配列が検出されなかった。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａおよびＴｕｌａｎｅコロニーのアカゲザルの死体解剖で回収した組織を用いてより広範なベクター分布（ｖｅｃｔｏｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）分析を実施した。それによって、幅広い範囲の組織全体に渡ってＡＡＶ配列が存在することが分かった。
Ａ．  ＡＡＶシグニチャー領域の増幅
「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」を用いて、ガチョウおよびアヒルから単離したＡＡＶおよびＡＡＶ１−６のＤＮＡ配列をデフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ）で互いに整列させた。ＡＡＶ１−６の整列（新規なＡＡＶ７の情報を包含）を図１に示す。ＡＡＶ間の配列類似性を比較した。
【０１５４】
この系列の試験で本発明者らはＡＡＶ１の２８８６ｂｐから３１４３ｂｐに渡る２５７ｂｐ領域［配列番号：６］およびＡＡＶ２−６ゲノムのゲノム内の相当する領域［図１を参照］を同定した。この領域はＡＡＶキャプシド遺伝子と一緒に位置し、これはとりわけ５’および３’末端の両方の所に高度に保存された配列を有しそして中間部に比較的変化する配列が存在する。加うるに、この領域はＤｒａＩＩＩ制限酵素部位（ＣＡＣＣＡＣＧＴＣ、配列番号：１５）を含有する。本発明者らは、前記領域は公知種類のＡＡＶのＤＮＡの各々に特異的なシグニチャーとして働くことを見いだした。言い換えれば、ＰＣＲ反応、公知血清型の各々に特異的なエンドヌクレアーゼを用いた消化そしてゲル電気泳動分析を行った後、前記領域を用いて、増幅させたＤＮＡが血清型１、２、３、４、５、６または別の血清型に属するとして明確に同定することができる。
【０１５５】
ＡＡＶ１、２および５のＤＮＡ対照を用いてプライマーを設計し、確認しそしてＰＣＲ条件を最適にした。これらのプライマーは、ＡＡＶ２：５’プライマー、１Ｓ：ＡＡＶ２（配列番号：７）のｂｐ２８６７−２８９１の配列、そして３’プライマー、１８ａｓ、ＡＡＶ２（配列番号：７）のｂｐ３０９５−３１２１の配列が基になったプライマーである。
【０１５６】
異なるアカゲザルのいろいろな組織（血液、脳、肝臓、肺、睾丸などを包含）から得た細胞のＤＮＡにこの上に記述した方策を用いた試験を受けさせた。その結果、これらのサルのいろいろな組織に由来するＤＮＡは強力なＰＣＲ増幅をもたらすことが分かった。ＰＣＲ産物にさらなる制限分析を受けさせた結果、それらは公開されている如何なるＡＡＶ配列とも異なるＡＡＶ配列から増幅されたものであることが分かった。
【０１５７】
多様なサル組織のＤＮＡから得たＰＣＲ産物（大きさが約２５５ｂｐ）をクローン化して配列決定を行った。これらの新規なＡＡＶ配列にバイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）試験を受けさせた結果、それらはキャプシド遺伝子の新規なＡＡＶ配列でありかつ互いに異なることが分かった。図１に、ＡＡＶ１０−１２の新規なＡＡＶシグニチャー領域［それぞれ配列番号：１１７、１１８および１１９］を整列させた状態で含める。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８１）プログラムを用いて多数配列整列解析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。ＡＡＶ１−７およびＡＡＶ１０−１２ゲノムのシグニチャー領域の間の配列同一性のパーセントを以下に示す。
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
選択した２５７ｂｐ領域に渡る新規なＡＡＶ血清型配列を含有するクローンを３００を超える数で単離して配列決定を行った。これらの３００＋クローンのバイオインフォマティクス分析は、この２５７ｂｐ領域は新規なＡＡＶ血清型の迅速な単離および同定を行おうとする時にそれを良好なランドマーカー（ｌａｎｄｍａｒｋｅｒ）またはシグニチャー配列として用いることができる点で重要であることを示唆している。
Ｂ．  シグニチャー領域をＰＣＲ増幅で使用
ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子の接合領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）（１３９８ｂｐ−３１４３ｂｐ、配列番号：６）を覆うゲノムの５’およびこのゲノムの３’へのＰＣＲ増幅伸長のＰＣＲアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として前記２５７ｂｐシグニチャー領域を用いることでｃａｐ遺伝子配列全体（２８６６ｂｐ−４６００ｂｐ、配列番号：６）を得た。標準的条件を用いてＰＣＲ増幅を実施したが、そのような条件に、１ｋｂ当たりに変性を９５℃で０．５−１分間行い、アニーリングを６０−６５℃で０．５−１分間行いそして伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を７２℃で１分間行うことを含め、増幅サイクルの全数を２８から４２の範囲にした。
【０１６０】
「Ａ」に記述したように整列させた配列を用いて、前記２５７ｂｐ領域に対しては５’でありそしてｒｅｐ遺伝子の３’末端に位置する配列の中そして前記２５７ｂｐフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の下流に位置するがＡＡＶの３  ＩＴＲの前に位置する配列の中に他の関係する２つの保存領域を同定した。新規なＡＡＶ血清型のキャプシド全体およびｒｅｐ配列の一部を回収する目的で２組の新規なプライマーを設計してＰＣＲ条件を最適にした。より具体的には、５’増幅の場合の５’プライマー、即ちＡＶ１ＮはＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ［ＡＡＶ１のｎｔ  １３９８−１４２３、配列番号：６］でありそして３’プライマーはこの上に示した１８ａｓであった。３’増幅の場合の５’プライマーはこの上に示した１ｓでありそして３’プライマーはＡＶ２Ｌａｓ、即ちＴＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧ［ＡＡＶ２のｎｔ  ４４３５−４４６２、配列番号：７］であった。
【０１６１】
これらのＰＣＲ増幅では、本明細書に記述するようにして得た５’および３’伸長フラグメントの増幅に続いて、シグニチャー領域内のＤｒａＩＩＩ部位の所を融合させて完全なキャプシド遺伝子を構築する目的で、前記２５７ｂｐ領域を、重なり合うフラグメントを生じさせるＰＣＲアンカーおよびランドマーカーとして用いた。より詳細には、完全なＡＡＶ７ｃａｐ遺伝子を生じさせる目的で、製造業者の指示に従って、３種類の増幅産物である（ａ）シグニチャー領域の配列、（ｂ）５’伸長部の配列および（ｃ）３’伸長部の配列をｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］プラスミドのバックボーンにクローン化した。その後、そのプラスミドをＤｒａＩＩＩで消化させた後、組み換えを行うことで完全なｃａｐ遺伝子を生じさせた。
【０１６２】
この系列の作業で、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８のキャプシド配列の約８０％を単離して分析した。また、サル＃２から別の新規な血清型であるＡＡＶ９も確認した。
【０１６３】
この上に記述したＰＣＲ条件を用いて、ＡＡＶ７のｒｅｐ遺伝子配列の残りの部分を単離した後、ＡＡＶゲノムの１０８ｂｐから１４６１ｂｐを増幅するプライマーを用いてクローン化を行った（ＡＡＶ２、配列番号：７の番号付けを基に計算）。このクローンの配列を決定して、ＩＴＲを伴わない完全なＡＡＶ７ゲノムを構築する。
Ｃ．  ３．１ｋｂのＣａｐフラグメントの直接増幅
ＮＨＰ組織および血液のＤＮＡから得た３．１ｋｂの全長Ｃａｐフラグメントの直接増幅を行う目的で、ＡＡＶゲノムの中に他の高度に保存されている２つの領域を同定して、大型フラグメントのＰＣＲ増幅で用いた。ｒｅｐ遺伝子の中間部に位置する保存領域内のプライマー（ＡＶ１ｎｓ：５’ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ  ３’、配列番号：６のｎｔ１３９８−１４２３）をＣａｐ遺伝子の下流に位置する別の保存領域内に位置する３’プライマー（ＡＶ２ｃａｓ：５’ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ  ３’；配列番号：７）と組み合わせて選択して、全長ｃａｐフラグメントを増幅させた。製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってＰＣＲ産物をＴｏｐｏクローン化（Ｔｏｐｏ−ｃｌｏｎｅｄ）した後、Ｑｉａｇｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｑｉａｇｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ、シアトル、ＷＡ）を用いて配列分析を≧９９．９％の精度で行った。全体で５０個のキャプシドクローンを単離して特徴付けを行った。これらの中の３７個のクローンはレサス・マカク組織に由来し（ｒｈ．１−ｒｈ．３７）、６個のクローンはシノモロゴス・マカクに由来し（ｃｙ．１−ｃｙ．６）、２個のクローンはヒヒに由来し（ｂｂ．１およびｂｂ．２）そして５個のクローンはチンパンジー（Ｃｈｉｍｐｓ）に由来する（ｃｈ．１−ｃｈ．５）。
【０１６４】
新規なＡＡＶ系列内の配列多様性がＰＣＲの人為産物、例えば配列が類似している異なる部分的ＤＮＡ鋳型の間の重なり合い伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によるＰＣＲ媒介遺伝子スプライシング、または細菌内の組み換え過程の結果などでない可能性を排除する目的で、細胞の全ＤＮＡを用いたＶＰ１増幅と同じ条件下で一連の実験を実施した。最初に、完全なＡＡＶ７とＡＡＶ８プラスミドを等しいモル比で混合した後、一連の希釈を行った。何らかのハイブリッドＰＣＲ産物が生じたか否かを確認するためのＤＮＡ増幅で用いたＰＣＲ条件と同じ条件および万能プライマーを用いて３．１ｋｂのＶＰ１フラグメントをＰＣＲで増幅させる時、前記一連の希釈を受けさせた混合物を鋳型として用いた。この混合物を細菌に形質転換して形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）を単離することで、細菌の細胞内で起こる組み換え過程でハイブリッドクローンが生じる可能性を探求した。異なる実験で、我々は、Ｍｓｐ  Ｉ、Ａｖａ  ＩおよびＨａｅＩ（これらは全部両方のゲノムを異なる場所で複数回切断する）を用いてＡＡＶ７およびＡＡＶ８プラスミドの特定部位を切断し、消化物をいろいろな組み合わせで混合し、そしてそれらをＶＰ１フラグメントのＰＣＲ増幅で同じ条件下で用いることで、部分的ＡＡＶ配列の重なり合い配列伸長を通して何らかのＰＣＲ産物が生じるか否かを試験した。別の実験で、ゲルで精製した５’の１．５ｋｂのＡＡＶ７  ＶＰ１フラグメントと３’の１．７ｋｂのＡＡＶ８  ＶＰ１フラグメントの混合物（シグニチャー領域が重なり合う）に一連の希釈を受けさせた後、これらをサルの細胞系から抽出した細胞のＤＮＡ（ＴａｑＭａｎ分析によりＡＡＶ配列は存在しない）を２００ｎｇ存在させた状態および存在させない状態のＰＣＲ増幅で用いた。これらの実験のいずれもゲノムＤＮＡのＣａｐ増幅の条件下ではＰＣＲ媒介で重なり合う配列の有効な産出は起こらなかったことを示している（データを示していない）。さらなる実証として、いろいろなＨＶＲに位置していてレサス・マカクＦ９５３から得たクローン４２の変形に特異的な配列である３対のプライマーをいろいろな組み合わせで設計することで、Ｆ９５３から得た腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）のＤＮＡ（これからクローン４２を単離した）からより短いフラグメントを増幅させた。それらの短いフラグメントの中に全長Ｃａｐクローンで同定した配列変形の全部が存在することを確認した（データを示していない）。
実施例２：  霊長類が自然に感染している間にアデノ随伴ウイルスが実質的な進化を起こす
選択したＡＡＶ単離物の配列分析により、キャプシド蛋白質の超可変領域の中で濃度が最も高いゲノム全体に渡って相違が存在することが分かった。疫学データにより、公知の血清型は全部が霊長類にとって地方病性であるにも拘らず臨床的単離物の単離はヒト乳児の肛門および喉のスワブ（ｓｗａｂｓ）から得たＡＡＶ２およびＡＡＶ３そしてヒトのコンジロームいぼから得たＡＡＶ５に限定されていたことが分かる。ＡＡＶ感染に関連した臨床的後遺症は全く知られていなかった。
【０１６５】
ＡＡＶの生物学の理解をより良好にする試みで、自然感染の後遺症を特徴づけるモデルとして非−ヒト霊長類を用いた。公知ＡＡＶの高度に保存されている領域に対するオリゴヌクレオチドを基にした本発明のＰＣＲ方法を用いて、非−ヒト霊長類から得た組織にＡＡＶ配列に関する選別を受けさせた（実施例１を参照）。ＡＡＶ１の２８８６から３１４３ｂｐに渡る長さのＡＡＶ配列［配列番号：６］をＰＣＲアンプリコン［この中の保存配列は公知ＡＡＶ血清型の各々にユニークな超可変領域（本明細書では「シグニチャー領域」と呼ぶ）に隣接している］として選択した。
【０１６６】
ヒトでないいろいろな霊長類種［アカゲザル、シノモロゴス・マカク、チンパンジーおよびヒヒを包含］の抹消血液を最初に試験した結果、全部の種に属するサブセットの動物にＡＡＶが検出され得ることが分かった。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａおよびＴｕｌａｎｅコロニーのアカゲザルの死体解剖で回収した組織を用いてより広範なベクター分布分析を実施した。それによって幅広い範囲の組織全体に渡ってＡＡＶ配列が存在することが分かった。
【０１６７】
増幅させたシグニチャー配列をプラスミドにサブクローン化し（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）た後、個々の形質転換体に配列分析を受けさせた。それによって、いろいろな動物から生じさせたクローンのヌクレオチド配列は実質的に異なることが分かった。また、個々の動物内で得たクローンでもシグニチャー配列が異なることが示された。ユニークなシグニチャー配列を同定した２種類の動物から収穫した組織（即ち９８Ｅ０４４の結腸および９８Ｅ０５６の心臓）にさらなる特徴付けを高度に保存されている配列に対するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって増幅させた配列を拡張（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）させることで行った。このような方法を用いて、本明細書に記述するように、両方の組織から得た完全なプロウイルス構造をウイルスのゲノムに関して再構築した。これらのプロウイルスは他の公知ＡＡＶとは異なり、最大の配列相違はＣａｐ遺伝子の領域内に存在することを注目した。
【０１６８】
非−ヒト霊長類の組織に存在するＡＡＶ配列が感染性ウイルス［放出され（ｒｅｓｃｕｅｄ）そしてビリオンを形成し得る］のプロウイルスゲノムに相当することを実証する追加的実験を実施した。動物９８Ｅ０５６の肝臓組織（これからＡＡＶ８シグニチャー配列を検出した）から得たゲノムＤＮＡを、ＡＡＶ配列内の部位を持たないエンドヌクレアーゼで消化させた後、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１欠失ゲノムをヘルパー機能源として含有するプラスミドを用いて２９３細胞の中にトランスフェクションさせた。その結果として得た溶解産物を２９３細胞の上に一度通した後、この溶解産物を回収し、そしてＣａｐ蛋白質に幅広く反応するポリクローナル抗体を用いてそれにＡＡＶ  Ｃａｐ蛋白質の存在に関する分析を受けさせ、かつＰＣＲで増幅させたＡＡＶプロウイルス（これからＡＡＶ８を得た）に由来するＤＮＡ配列の存在および富裕度に関する分析を受けさせた。エンドヌクレアーゼで特定部位を切断した心臓ＤＮＡおよびアデノウイルスのヘルパープラスミドをトランスフェクションさせると、ウエスタンブロット分析によるＣａｐ蛋白質の検出で示されるように、ＡＡＶ８ウイルスが多量に生じ、ＡＡＶ８ベクターのゲノムが２９３細胞当たり１０4個存在していた。大規模調製で溶解産物を生じさせた後、セシウムによる沈降でＡＡＶを精製した。この精製した調製物は２６ｎｍの二十面体構造を有することが示され、これはＡＡＶ血清型２のそれと同じであるように見える。アデノウイルスヘルパーを単独でトランスフェクションさせたのではＡＡＶ蛋白質もゲノムも生じず、その結果として、放出されるＡＡＶの源としての混入が排除された。
【０１６９】
ＡＡＶシグニチャー配列の動物間および動物内変異を更に特徴付ける目的で、選択した組織に伸長ＰＣＲを受けさせることでＣａｐ開放読み枠全体を増幅させた。
【０１７０】
結果として得たフラグメントを細菌のプラスミドにクローン化した後、個々の形質転換体を単離して全体の配列を決定した。この分析に、３匹のアカゲザルから得た腸間膜リンパ節（Ｔｕｌａｎｅ／Ｖ２２３−６個のクローン；Ｔｕｌａｎｅ／Ｖ６１２−７個のクローン；Ｔｕｌａｎｅ／Ｆ９５３−１４個のクローン）、２匹のアカゲザルから得た肝臓（Ｔｕｌａｎｅ／Ｖ２５１−３個のクローン；Ｐｅｎｎ／００Ｅ３３−３個のクローン）、１匹のアカゲザルから得た脾臓（Ｐｅｎｎ／９７Ｅ０４３−３個のクローン）、１匹のアカゲザルから得た心臓（ＩＨＧＴ／９８Ｅ０４６−１個のクローン）、そして１匹のチンパンジー（ＮｅｗＩｂｅｒｉａ／Ｘ１３３−５個のクローン）、６匹のシノモロゴス・マカク（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ／Ａ１３７８、Ａ３０９９、Ａ３３８８、Ａ３４４２、Ａ２８２１、Ａ３２４２−全体で６個のクローン）および１匹のヒヒ（ＳＦＲＢ／８６４４−２個のクローン）から得た抹消血液を含めた。異なる１５匹の動物から得て配列を決定した５０個のクローンの中の３０個のクローンは、少なくとも７個のアミノ酸が互いに異なることを確認したことを基にして、非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）であると見なした。非重複性ＶＰ１クローンに番号を単離した順に付け、それの接頭語は、これらを得た非−ヒト霊長類種を示している。この３０個の非重複性クローンとこの上に記述した８個のＡＡＶ血清型の間の構造関係をＳｐｌｉｔｓ  Ｔｒｅｅプログラム［Ｈｕｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｓｐｌｉｔｓ  Ｔｒｅｅ：ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４、６８−７３（１９９８）］を用いたスプリット分解（ｓｐｌｉｔ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）方法の実施で決定した。この分析により、１組の配列の間に二又状木ではなく木様網状組織の状態の同種形成性（ｈｏｍｏｐｌａｓｙ）が存在することが分かる。その利点は、収束の結果として生じる群を検出することができかつそれらが並行出来事（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｅｖｅｎｔｓ）で歪んだ時でも系統分類的関係を示す点にある。ＡＡＶの進化を明らかにするには広範な系統分類学的研究が必要であると思われるが、ここでの意図は単にいろいろなクローンをこれらの配列類似性に関して分類分けすることにある。
【０１７１】
新規なＶＰ１配列が感染性ウイルスのゲノムに由来することを立証する目的で、ウイルスのＤＮＡが非常に豊富に存在する組織から得た細胞のＤＮＡにエンドヌクレアーゼ（これはＡＡＶ内に開裂をもたらすべきでない）を用いて特定部位を切断しそして２９３細胞にトランスフェクションした後、アデノウイルスに感染させた。その結果として、異なる２匹の動物から得た組織のＤＮＡに由来するＡＡＶゲノムの放出（ｒｅｓｃｕｅ）および増幅がもたらされた（データを示していない）。
【０１７２】
新規なＡＡＶのＶＰ１配列をアミノ酸配列変異の性質および位置に関して更に特徴付けた。アミノ酸配列が互いに１％を超える度合で異なることが示された３０個のＶＰ１クローンの全部を整列させて、各々の残基の所に変異のスコアーを付けた。配列に差異が存在する領域を決定するように開発した特定の演算方式を用いて１２個の超可変領域（ＨＶＲ）を得たが、これらの中の５個は重なっているか或は以前に記述された４つの可変領域［この上で引用したＫｏｔｉｎ、この上で引用したＲｕｔｌｅｄｇｅ］の一部である。３畳基部ピーク（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｐｅａｋｓ）が変異の大部分を含有する（ＨＶＲ５−１０）。興味の持たれることに、２および５畳軸の所に位置するループも同様に強力な変異を示している。キャプシド蛋白質のＮ末端部分（これはＸ線構造に解像されない）にＨＶＲ１と２が存在し、このことは、ＶＰ１蛋白質のＮ末端がビリオンの表面に露出していることを示唆している。
【０１７３】
公知ＡＡＶのＲｅｐ（１組）およびＣａｐ（２組）の高度に保存されている領域に対するプライマーおよびプローブを用いて２１匹のアカゲザルの組織からＡＡＶ配列を量化する目的でリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを用いた。各データ点は個々の動物から得た組織のＤＮＡの分析値に相当する。それによって、ＡＡＶ配列が幅広く分布していることが実証されたが、個々の動物の間で量的分布に差があった。レサス・マカクの動物源および先行する履歴または処理がＡＡＶ配列の分布に影響を与えているようには思われなかった。ＡＡＶを量化する目的で用いた異なる３組のプライマーおよびプローブは一貫性のある結果をもたらした。陽性の１３匹の動物に関して腸間膜リンパ節に最大レベルのＡＡＶを二倍体ゲノム１個当たり平均で０．０１個のコピーの割合で一貫して確認した。また、肝臓および脾臓にもウイルスのＤＮＡが非常に豊富に含まれていた。非常に高いＡＡＶの例、例えばレサス・マカク９８Ｅ０５６の心臓、レサス・マカク９７Ｅ０４３の脾臓、レサス・マカクＲＱ４４０７の肝臓などが存在し、それぞれＡＡＶ配列のコピーが二倍体ゲノム１個当たり１．５、３および２０個存在することが示された。抹消血液の単核細胞に存在するウイルスのＤＮＡのレベルは比較的低く、このことは、組織に関するデータは内在する血液成分が理由でないことを示唆している（データを示していない）。このような方法は非−ヒト霊長類に内在するＡＡＶの必ずしも全部を捕捉する方法ではないことを注目すべきである、と言うのは、検出を行うにはオリゴヌクレオチドとリアルタイムＰＣＲプローブの両方に対して高い相同関係を示す必要があるからである。ＡＡＶのＤＮＡが豊富に存在する動物から得た組織にＤＮＡの分子状態に関するさらなる分析をＤＮＡハイブリッド化技術で受けさせかつこれの細胞分布に関するさらなる分析をインサイチューハイブリッド化で受けさせた。
【０１７４】
異なる動物および同じ動物の組織内で単離したＡＡＶプロウイルスフラグメントに見られる種類の配列変異は、数多くのＲＮＡウイルスが汎流行中または感染した個体内でさえ進化することを示す暗示である。ある状況下では、選択的圧力の存在下で起こる急速な複製および変異の結果として進化する準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）の群の存在によって野生型ウイルスの概念（ｎｏｔｉｏｎ）が置き換えられてきた。１つの例はＨＩＶによる感染であり、ＨＩＶは免疫学的および薬学的圧力に応答して進化する。そのようにＲＮＡウイルスが起こす変異の速度が速いことの起因となる機構はいくつか存在し、それには、逆転写酵素の適合度が低くかつ校正能力が不足していること、そして非同種および同種組み換えが含まれる。
【０１７５】
この試験で複数のクローン化プロウイルスフラグメントを系統的に配列決定することでＡＡＶの準種が生じる証拠が示された。実際、単離した如何なる伸長クローン内にも動物間および動物内で同じ配列を確認することはできなかった。このような配列進化の重要な機構は、より限られた数の腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ウイルス間の同種組み換えの速度が速いことによるものであると思われる。正味の結果としてＣａｐ蛋白質の超可変領域の広範な取り替えが起こることで一団のキメラが生じ、これらはいろいろな向性および血清学的特異性を持つ可能性がある（即ち、特にそれが中和抗体に関係する時には免疫学的応答から逃れる能力を有する）。同種組み換えが起こり得る機構は明らかになっていない。１つの可能性は、いろいろな一本鎖ＡＡＶゲノムの＋ストランドと−ストランドが複製中にアニーリングを起こすことにある［ＡＡＶ組み換え体による感染の高多重度（ｈｉｇｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）中に記述したように］。ＡＡＶ感染中に起こる配列進化の起因となる機構が他に存在するか否かは明らかでない。ＡＡＶ複製中に起こる変異全体の速度は相対的に遅いと思われ、かつデータも複製誤差の頻度が高いことを示唆してはいない。しかしながら、溶菌感染中にＡＡＶゲノムが実質的な再配列を起こすことで障害となる不完全な粒子の生成がもたらされると記述されて来た。僅かの例外を伴うが、配列相違をもたらす機構に関係なく、そのような準種のｖｐ１構造がフレームシフトもナンセンス変異も起こすことなく完全なままであること［このことは、適合に最も好ましい輪郭を有するウイルスが競合的に選択されることを示唆している］がポピュレーションダイナミクス（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）に貢献している。
【０１７６】
このような研究は生物学および医学のいくつかの分野に暗示を与えるものである。ウイルスの進化が速いと言った概念（以前はＲＮＡウイルスに限定された特性であると考えられていた）をＤＮＡウイルス（これは古典的に血清学アッセイで特徴づけられていた）に関しても考慮に入れるべきである。構造および生物学の複雑さを獲得するウイルス単離物を記述する新しい方法を開発するにはパルボウイルス、例えばＨＩＶ（これはＣｌａｄｅｓと呼ばれる同様な構造および機能を有する一般系列として分類分けされる）などにとって重要であろう。単離物を血清学的特異性に関して分類分けしかつ血清学的群内の変異体を記述する判断基準を開発する代替方策を継続して行うべきである。
実施例３：  いろいろな動物モデルを用いた血清学的および遺伝子伝達試験でＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子と新規なＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子を含有するキメラプラスミド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）を用いるＡＡＶ２  ＩＴＲが備わっている組み換え型ＡＡＶゲノムのベクトロロジー（ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ）
新規なＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とＡＡＶ２  ｒｅｐ配列を融合させることでキメラパッケージング構築物（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を生じさせた。このようなキメラパッケージング構築物を、最初に、Ａｄ５ヘルパープラスミドを用いた２９３細胞へのトリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によるＡＡＶ２  ＩＴＲ担持組み換え型ＡＡＶゲノムのプソイドタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）で用いる。このプソイドタイピングを受けさせたベクターを用いて、形質導入を基にした血清学的試験における性能を評価しかつ新規なＡＡＶ血清型をいろいろな動物モデル（ＮＨＰおよび齧歯類を包含）に遺伝子伝達させる時の効率を評価し、その後、この新規な血清型の完全な感染性ウイルスを単離する。
Ａ．  ｐＡＡＶ２ＧＦＰ
構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ）の制御下で発現する緑色蛍光蛋白質とＡＡＶ２  ＩＴＲを含有するＡＡＶ２プラスミド。このプラスミドは下記の要素を含有する：ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰコード化配列（ＧＦＰ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）。
Ｂ．  トランスプラスミドのクローニング
プソイドタイピングを受けた組み換え型ＡＡＶ７ベクターを産出するキメラトランスプラスミドを構築する目的で、ｐ５Ｅ１８プラスミド（Ｘｉａｏ他、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７３：３９９４−４００３）をＸｈｏ  Ｉである程度消化させることで、前記プラスミドの３１６９ｂｐの位置に存在するＸｈｏ  Ｉ部位の所のみを線形にした。次に、前記Ｘｈｏ  Ｉで切断された末端部にフィルインとリゲートバックを受けさせた（ｆｉｌｌｅｄ  ｉｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｔｅｄ  ｂａｃｋ）。このような修飾を受けさせたｐ５Ｅ１８プラスミドをＸｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで完全に消化させて特定部位を切断することでＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子配列を除去した後、それをＡＡＶ７  ｃａｐ遺伝子を含有する２２６７ｂｐのＳｐｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉフラグメント（ｐＣＲＡＡＶ７  ６−５＋１５−４プラスミドから単離した）で置換した。
【０１７７】
結果として得たプラスミドは、ＡＡＶ２  Ｐ５プロモーターの制御下にあるＲｅｐ７８／６８のＡＡＶ２  ｒｅｐ配列およびＡＡＶ２  Ｐ１９プロモーターの制御下にあるＲｅｐ５２／４０のＡＡＶ２  ｒｅｐ配列を含有する。このＡＡＶ７キャプシド配列はＡＡＶ２  Ｐ４０プロモーターの制御下にあり、これはＲｅｐ配列内に位置する。このプラスミドは更にｒｅｐ  ＯＲＦのスペーサー５’も含有する。
Ｃ．  プソイドタイピングを受けたｒＡＡＶの産出
アデノウイルス−フリー（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ）方法を用いてｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ７キャプシド中のＡＡＶ２ベクター）を生じさせた。簡単に述べると、シスプラスミド（ＡＡＶ２  ＩＴＲを含有するｐＡＡＶ２．１  ｌａｃＺプラスミド）とトランスプラスミドｐＣＲＡＡＶ７  ６−５＋１５−４（ＡＡＶ２  ｒｅｐとＡＡＶ７  ｃａｐを含有）とヘルパープラスミドのそれぞれを１：１：２の比率で燐酸カルシウム沈澱によって２９３細胞の中に同時コトランスフェクションさせた。
【０１７８】
ｐＡｄヘルパープラスミドを構築する目的でｐＢＧ１０プラスミドをＭｉｃｒｏｂｉｘ（カナダ）から購入した。Ｌ２とＬ３を含有するＲｓｒＩＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から欠失させることで１番目のヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ１３を生じさせた。ＰｍｅＩ／Ｓｇｆｌが欠失しているＡｓｐ７００／ＳａＩＩフラグメント（ｐＢＧ１０から単離）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐにクローン化することでプラスミドＡｄΔＦ１を構築した。このｐＡｄΔＦ１にはＭＬＰ、Ｌ２、Ｌ２およびＬ３が欠失していた。２．３ｋｂのＮｒｕＩフラグメントそして次に０．５ｋｂのＲｓｒＩＩ／ＮｒｕＩフラグメントを更に欠失させることでそれぞれヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ５およびｐＡｄΔＦ６を生じさせた。このヘルパープラスミド（ｐΔＦ６と呼ぶ）はＥ２ａおよびＥ４  ＯＲＦ６の本質的なヘルパー機能を示す（Ｅ１発現ヘルパー細胞は示さない）が、アデノウイルスのキャプシド蛋白質と機能性Ｅ１領域が欠失している。
【０１７９】
典型的には、５０μｇのＤＮＡ（シス：トランス：ヘルパー）を１５０ｍｍの組織培養皿の上にトランスフェクションさせた。トランスフェクション後７２時間で２９３細胞を収穫し、これに音波処理を受けさせた後、０．５％のデオキシコール酸ナトリウムを用いた処理を受けさせた（３７℃で１０分間）。次に、細胞溶解産物にＣｓＣｌ勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を２回受けさせた。ｒＡＡＶベクターを含有するピーク画分を集め、プールした後、これにＰＢＳに対する透析を受けさせた。
実施例４：  ヒトおよびＮＨＰに由来する細胞系における基本的ウイルス学を試験しそして新規なＡＡＶ血清型がＮＨＰおよび他の動物モデルで示す病原性を評価する目的で新規な完全ＡＡＶ血清型を担持する感染性クローンを作成
この目的を達成する目的で、ゲノムウォーカーシステム（ｇｅｎｏｍｅ  ｗａｌｋｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、５’および３’末端配列（ＩＴＲ）そして新規な完全ＡＡＶ血清型ゲノムを含有するクローンの完全な構築物を得る。
【０１８０】
簡単に述べると、市販のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］を用いて、ＡＡＶ７配列の存在に関して陽性であると同定したサルの組織もしくは細胞系から得たゲノムＤＮＡをＤｒａ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｐｖｕ  ＩＩおよびＳｔｕ  Ｉエンドヌクレアーゼで消化させた後、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ａｄａｐｔｏｒに結合させることで、４個の個々のＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＧＷＬ）を生じさせた。ＧＷＬから得たＤＮＡを鋳型として用いて、ＡＡＶ７および隣接するゲノム配列をアダプタープライマー１（ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ  １）（前記キットに備わっているＡＰ１）およびＡＡＶ７に特異的なプライマー１でＰＣＲ増幅させた後、アダプタープライマー２（ＡＰ２）およびＡＡＶ７に特異的な別のプライマー２［これらは両方とも１番目の組のプライマーに内在（ｉｎｔｅｒｎａｌ）］を用いたネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行う。このネステッドＰＣＲで生じた主要なＰＣＲ産物をクローン化した後、配列決定分析で特徴付ける。
【０１８１】
この実験で、遺伝子ＡＡＶゲノムの２５７ｂｐまたは他のシグニチャーフラグメントに渡るプライマーをヒトおよびＮＨＰに由来する細胞系から抽出した細胞のＤＮＡのＰＣＲ増幅で用いることで、潜伏しているＡＡＶ配列を同定して特徴付ける。異なる種および株のアデノウイルスヘルパーを用いて、その同定した潜伏しているＡＡＶゲノムを陽性の細胞系から放出させた。
【０１８２】
感染性ＡＡＶクローンをＮＨＰに由来する細胞系から単離する目的で、所望の細胞系をＡＴＣＣから入手してこれにＰＣＲによる選別を受けさせることで、２５７ｂｐのアンプリコン、即ち本発明のシグニチャー領域を同定する。この２５７ｂｐのＰＣＲ産物にクローン化および配列決定分析による血清型分類分けを受けさせる（ｓｅｒｏｔｙｐｅｄ）。この細胞系がＡＡＶ７配列を含有する場合、この細胞にＳＶ−１５、ＡＴＣＣから購入したサルのアデノウイルスまたはヒトＡｄ５を感染させるか、或はＡＡＶヘルパー機能の一因であるヒトＡｄ遺伝子を持つプラスミド構築物によるトランスフェクションを受けさせる。感染またはトランスフェクション後４８時間が経過した時点で細胞を収穫した後、Ｘｉａｏ他、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：３９９４−４００３に従い、Ｈｉｒｔ  ＤＮＡにＡＡＶ７ゲノムのクローニングのための調製を受けさせる。
実施例５−ＡＡＶベクターの産出
ＡＡＶ１／７に関して実施例３に示した方策に類似したプソイドタイピング方策を用いて、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８キャプシド蛋白質を包み込んでいるＡＡＶ２ベクターを産出させた。簡単に述べると、２９３細胞にシス−プラスミド、アデノウイルスのヘルパープラスミドおよびキメラパッケージング構築物（ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子と新規なＡＡＶ血清型のｃａｐ遺伝子が融合している）によるトリプルトランスフェクションを受けさせることで、ＡＡＶ２  ＩＴＲが備わっている組み換え型ＡＡＶゲノムを包み込ませた。前記キメラパッケージング構築物を生じさせる時、ｐ５Ｅ１８プラスミドの３１６９ｂｐの所のＸｈｏ  Ｉ部位を切除した後、このような修飾を受けさせたプラスミドをＸｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで完全に消化させて特定部位を切断させることで、ＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子を除去した後、これを２２６７ｂｐのＳｐｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉフラグメント（ＡＡＶ８  ｃａｐ遺伝子を含有）に置き換えた［Ｘｉａｏ，Ｗ．他、（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３、３９９４−４００３］。ＡＡＶ２／１とＡＡＶ２／５のキメラパッケージングプラスミドを作り出す時にも同様なクローン化方策を用いた。ＡＡＶ２／２には単一段階のヘパリンクロマトグラフィーを用いた精製を受けさせることを除き、全ての組み換え型ベクターに標準的なＣｓＣｌ2沈降方法による精製を受けさせた。
【０１８３】
以前に記述［Ｇａｏ，Ｇ．他、（２０００）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１、２０７９−９１］されたようにして、ＳＶ４０ポリＡ領域を標的にするプローブおよびプライマーを使用したＴａｑＭａｎ分析を用いて、ＡＡＶベクターのゲノムコピー（ＧＣ）タイターを測定した。
【０１８４】
血清型毎にベクターを構築していろいろなインビトロおよびインビボ試験を行った。これらのベクターに異なる８種の導入遺伝子カセット（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）を取り込ませた後、血清型毎に組み換え型ビリオンを産出させた。ゲノムのコピーを基にしたウイルスの回収率を以下の表４に要約する。血清型毎のベクターの収率は高く、血清型の間に一貫した差は存在しなかった。下記の表に示すデータは、５０枚のプレート（１５０ｍｍ）を用いた多数のトランスフェクションの産出ロットの平均ゲノムコピー収率であり、これに標準偏差（ｘ１０13）を伴わせる。
【０１８５】
【表５】
0003958191.tif 000006
【０１８６】
実施例６−プソイドタイピングを受けたベクターの血清学的分析
ＡＡＶＣＢＡ１ＡＴベクターのいろいろな血清型のベクターをＣ５７ＢＬ／６マウスの筋肉に注射（５ｘ１０11ＧＣ）した後、３４日後に血清サンプルを集めた。血清がＡＡＶの各血清型に対して示す中和および交互中和（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）活性を試験する目的で、形質導入を基にした中和抗体アッセイ［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．他、（１９９６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０、８９３４−４３］による分析を血清に受けさせた。より具体的には、血清がいろいろな血清型のレポーターウイルス（ＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ）による８４−３１細胞の形質導入を抑制する能力を評価することで中和抗体の存在を測定した。具体的には、各血清型のレポーターウイルスＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ［指標細胞（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の９０％の形質導入をもたらした複数の感染（ＭＯＩ）で］を、いろいろな血清型のＡＡＶを与えておいた動物または与えていないマウスから得て熱による不活性化を受けさせておいた血清と一緒に予備インキュベートした。インキュベーションを３７℃で１時間行った後、ウエルが９６個備わっているプレートに入れておいた８４−３１細胞にウイルスを加えてウイルスの血清型に応じて４８時間または７２時間放置した。ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてＧＦＰの発現を測定しかつＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで量化した。中和抗体タイターを形質導入が５０％未満にまで抑制された最大血清希釈度として報告した。
【０１８７】
ＧＦＰを発現するベクターを利用することができるようになったことで許容細胞系（即ち、Ａｄ５に由来するＥ４を安定に発現する２９３細胞）における形質導入の抑制を基にした中和抗体検定の開発が簡潔化された。組み換え型ウイルスを筋肉内注射することで、選択したＡＡＶ血清型に対する血清を生じさせた。抗血清の１：２０および１：８０希釈によるＡＡＶ形質導入の中和を評価した（以下の表５を参照）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８に対する抗血清は、この抗血清を生じさせた血清型の形質導入を中和する（ＡＡＶ５およびＡＡＶ８の方がＡＡＶ１およびＡＡＶ２よりも低い度合）が他の血清型の形質導入は中和しなかった（即ち、交互中和の証拠は全く存在せず、このことは、ＡＡＶ８が真にユニークな血清型であることを示している）。
【０１８８】
【表６】
0003958191.tif 000007
【０１８９】
５２人の正常な被験者から得たヒト血清を、選択した表現型に対する中和に関して選別した。ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を中和する血清サンプルは全く確認されなかったが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ血清の２０％および１０％の度合で中和された。６０，０００個の個々のサンプルの収集に相当する画分のプールしたヒトＩｇＧはＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を中和しなかったが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ１／１２８０および１／６４０に相当する血清タイターで中和された。
実施例７−いろいろな血清型のＡＡＶベクターのインビボ評価
この試験では、７種類の組み換え型ＡＡＶゲノム、即ちＡＡＶ２ＣＢｈＡｌＡＴ、ＡＡＶ２Ａ１ｂｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＣＭＶｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｃＦＩＸ、ＡＡＶ２ＣＭＶＬａｃＺおよびＡＡＶ２ＴＢＧＬａｃＺにいろいろな血清型のキャプシド蛋白質を包み込ませた。７種類の構築物全部でミニ遺伝子カセットはＡＡＶ２ＩＴＲに隣接していた。ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）のｃＤＮＡ［Ｘｉａｏ，Ｗ．他、（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３、３９９４−４００３］、アカゲザルのコリオゴナドトロピックホルモン（ｃｈｏｒｉｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＣＧ）のβ−サブユニット［Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２、６５７−９］、イヌファクターＩＸ［Ｗａｎｇ，Ｌ．他、（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、１１５６３−６］および細菌のβ−グラクトシダーゼ（β−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）（即ちＬａｃ  Ｚ）遺伝子をレポーター遺伝子として用いた。肝臓指向（ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）遺伝子伝達では、マウスアルブミン遺伝子プロモーター（Ａｌｂ）［この上で引用したＸｉａｏ，Ｗ．（１９９９）］またはヒトチロイドホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）［この上で引用したＷａｎｇ（１９９７）］のいずれかを用いてレポーター遺伝子の肝臓特異的発現を促した。筋肉指向遺伝子伝達実験では、シトメガロウイルスの初期プロモーター（ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＣＭＶ）またはニワトリのβ−アクチンプロモーターのいずれかをＣＭＶエンハンサー（ＣＢ）と一緒に用いてレポーターの発現を促した。
【０１９０】
筋肉指向遺伝子伝達では、４−６週令のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）の右脛骨腹側にベクターを注入した。肝臓指向遺伝子伝達試験では、７−９週令のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）の門脈内にベクターを注入した。ベクター投与後いろいろな時点で血清サンプルを眼窩経由で集めた。ｌａｃＺベクターを与えた動物からいろいろ時点で筋肉および肝臓の組織を収穫して、それらにクリオセクショニング（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）およびＸｇａｌ組織化学染色を受けさせた。再投与実験では、最初にＣ５６ＢＬ／６マウスの筋肉にＡＡＶ２／１、２／２、２／５、２／７および２／８ＣＢＡ１ＡＴベクターを与えた後、Ａ１ＡＴ遺伝子発現を７週間に渡って起こさせた。次に、動物の門脈にＡＡＶ２／８ＴＢＧｃＦＩＸを注入することによる処理を行った後、ｃＦＩＸ遺伝子発現に関する試験を行った。
【０１９１】
以前に記述［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．他、（１９９６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０、８９３４−４３；Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２、６５７−９；Ｗａｎｇ，Ｌ．他、Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、１１５６３−６］されたようにして、ＥＬＩＳＡを基にしたアッセイを実施することでｈＡ１ＡＴ、ｒｈＣＧおよびｃＦＩＸ蛋白質の血清レベルを量化した。動物を屠殺して筋肉および肝臓の組織を収穫した時点で実験を完了して、ＤＮＡを抽出し、そしてベクター調合物の滴定で使用した組のプライマーおよびプローブと同じ組のプライマーおよびプローブを使用したＴａｑＭａｎ［Ｚｈａｎｇ，Ｙ．他、（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３、６９７−７０７］を用いて、目標組織に存在するベクターのゲノムコピーの定量分析を行った。
【０１９２】
筋肉指向遺伝子伝達および肝臓指向遺伝子伝達のマウスモデルを用いて新規な血清型が基になったベクターの性能を評価して、公知の血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５が基になったベクターのそれと比較した。血清にＥＬＩＳＡ分析を受けさせることによっていろいろな血清型の間の相対的形質導入効率を量化する目的で、分泌される蛋白質（アルファ−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）およびコリオゴナドトロピン（ＣＧ）を発現するベクターを用いた。ｌａｃＺ発現ベクターおよびＸ−ｇａｌ組織化学を用いて目標器官内の形質導入の細胞分布を評価した。
【０１９３】
ＡＡＶベクターを脛骨腹側筋肉に直接注入した後にそれが骨格筋内で示す性能を分析した。ベクターは同じＡＡＶ２が基になったゲノムに加えてＣＭＶの即座初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）または導入遺伝子の発現を促すＣＭＶ増強β−アクチンプロモーターを含有していた。以前に行われた研究により、ヒトＡ１ＡＴ蛋白質をＡＡＶベクターから発現させた時、この蛋白質に対する限定された生物学的流体性応答を免疫応答能のあるＣ５７ＢＬ／６マウスが引き出すことが示された［Ｘｉａｏ，Ｗ．他、（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３、３９９４−４００３］。
【０１９４】
各株に関して、ＡＡＶ２／１ベクターがＡ１ＡＴを最も高いレベルで産出しそしてＡＡＶ２／２ベクターがＡ１ＡＴを最も低いレベルで産出し、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８ベクターが中間度合の発現を示した。ｎｕ／ｎｕＮＣＲマウスに注入して２８日後のＣＧのピークレベルは、ＡＡＶ２／７のレベルが最大でＡＡＶ２／２によるレベルが最低で、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／１がそれらの間であることが示された。ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／７のｌａｃＺベクターを注入すると筋肉繊維全部の注入部位の所に遺伝子の発現がもたらされたが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８ベクターを用いた時に観察されたｌａｃＺ陽性繊維の数は実質的に少なかった。これらのデータは、骨格筋におけるＡＡＶ２／７ベクターによる形質導入の効率はＡＡＶ２／１（以前に記述された血清型の中で最も高い効率を骨格筋中で示す［この上で引用したＸｉａｏ，Ｗ．（１９９９）；Ｃｈａｏ，Ｈ．他（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４、２１７−２２；Ｃｈａｏ，Ｈ．他（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２、６１９−２３］）を用いた時に得たそれに類似していることを示している。
【０１９５】
同様なマウスモデルを用いて肝臓指向遺伝子伝達の評価を行った。マウスの門脈にゲノムのコピーが基になったベクターを同じ用量で注入した後、それを導入遺伝子の発現に関して分析した。この上に記述した肝臓特異的プロモーター（即ちアルブミンもしくはチロイドホルモン結合グロブリン）［これは導入遺伝子の発現を促す］を用いて各ベクターにＡＡＶ２が基になったゲノムを含有させた。より詳細には、筋肉指向遺伝子伝達および肝臓指向遺伝子伝達のそれぞれでＣＭＶＣＧおよびＴＢＧＣＧミニ遺伝子カセットを用いた。ｒｈＣＧのレベルを相対単位（ＲＵｘ１０3）で定義した。ベクターを投与した後２８日目に集めた血清サンプルを検定することでデータを得た（１群当たり４匹の動物）。表３に示すように、ｎｕ／ｎｕおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡ１ＡＴベクターの形質導入そしてＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＧベクターの形質導入の効率に対するキャプシド蛋白質の影響に一貫性があった（表６を参照）。
【０１９６】
【表７】
0003958191.tif 000008
【０１９７】
全てのケースで、ＡＡＶ２／８ベクターが最も高いレベルの導入遺伝子発現をもたらし、このレベルは、ＡＡＶ２／２ベクターを用いた時に得たレベルよりも１６から１１０倍の範囲の度合で大きく、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／７ベクターを用いた時の発現は中間的であったが、ＡＡＶ２／７の方がＡＡＶ２／５よりも高かった。相当するｌａｃＺベクターを与えた動物の肝臓断片をＸ−Ｇａｌで染色させる分析により、形質導入を受けさせた細胞の数と導入遺伝子発現全体のレベルの間に相互関係が存在することが示された。Ａ１ＡＴベクターを与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から抽出したＤＮＡにリアルタイムＰＣＲ技術を用いた分析をベクターＤＮＡの豊富さに関して受けさせた。
【０１９８】
注入して５６日後の肝臓中で測定したベクターＤＮＡ量と導入遺伝子発現のレベルは相互に関係していた（表７を参照）。この実験では、前記ベクターのゲノムのＳＶ４０ポリＡ領域を標的にする１組のプローブとプライマーをＴａｑＭａｎ  ＰＣＲで用いた。示す値は３匹の個々の動物の平均であり、この値に標準偏差を伴わせる。これらの動物を５６日目に屠殺して肝臓組織を収穫し、それにＤＮＡ抽出を受けさせた。この試験は、ＡＡＶ８が肝臓指向遺伝子伝達で最も高い効率を示すベクターであることを示しており、これは、形質導入を受けた肝細胞の数が増大したことによる。
【０１９９】
【表８】
0003958191.tif 000009
【０２００】
この上に記述した血清学的データは、ＡＡＶ２／８ベクターは他の血清型による免疫化後にインビボで中和されないであろうことを示唆している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにいろいろな血清型のＡ１ＡＴベクターを門脈内注射で与えてから５６日後、イヌファクターＩＸを発現するＡＡＶ２／８ベクター（１０11個のゲノムコピー）を門脈内注射で与えた。それを与えなかった動物にＡＡＶ２／８を注入してから１４日後に高いレベルのファクターＩＸ発現を得た（１７±２μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）が、これは、ＡＡＶ２／１による免疫化を受けさせた動物で観察した値（３１±２３μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）、ＡＡＶ２／２による免疫化を受けさせた動物で観察した値（１６μｇ／ｍｌ、ｎ＝２）およびＡＡＶ２／７による免疫化を受けさせた動物で観察した値（１２μｇ／ｍｌ、ｎ＝２）のそれに比べて大きな差はなかった。このことは、ＡＡＶ２／８ファクターＩＸベクターを注入することでＡＡＶ２／８による免疫化を受けさせた動物で観察した値［ファクターＩＸは全く検出可能な量では観察されなかった（＜０．１μｇ／ｍｇ、ｎ＝４）］とは対照的であった。
【０２０１】
ｃａｐ遺伝子の保存領域に対するオリゴヌクレオチドは、アカゲザルから得た配列（ユニークなＡＡＶに相当する）を増幅した。少なくとも２種類の異なるコロニーに属するアカゲザルから得た複数の組織の中に同じｃａｐシグニチャー配列が存在することを確認した。単一の源から全長のｒｅｐおよびｃａｐ開放読み枠を単離して配列決定を行った。新規なＡＡＶがベクターとして働き得る可能性を評価するに必要なのはそれのｃａｐ開放読み枠のみである、と言うのは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲおよびｒｅｐを用いてＡＡＶ７またはＡＡＶ８キャプシドを有するベクターを生じさせたからである。それによってまたいろいろなベクターの比較が簡潔になった、と言うのは、実際のベクターゲノムはいろいろなベクター血清型間で同じであるからである。実際、このようなアプローチを用いて生じさせた組み換え型ベクターの収率は血清型間で差がなかった。
【０２０２】
ＡＡＶ７およびＡＡＶ８が基になったベクターは免疫学的に異なると思われる（即ち、それらは他の血清型に対して生じさせた抗体によって中和されない）。更に、ヒトから得た血清はＡＡＶ７およびＡＡＶ８ベクターによる形質導入を中和せず、このことは、現在開発下にあるヒト由来ＡＡＶ［この場合にはヒト集団が大きな比率で先在免疫（これは中和する）を有する（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｎ．他、（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６、１５７４−８３）］に比べて大きな利点である。
【０２０３】
新規なベクターの各々が有する向性はインビボ用途にとって好ましいものである。ＡＡＶ２／７ベクターは、ＡＡＶ２／１［これは今日までに試験された霊長類のＡＡＶの中で最も高いレベルの形質導入を骨格筋に与える血清型である（この上で引用したＸｉａｏ，Ｗ．；この上で引用したＣｈｏｕ（２００１）、およびこの上で引用したＣｈｏｕ（２０００）］と同じほどの効率で骨格筋に形質導入すると思われる。重要なことに、ＡＡＶ２／８は、遺伝子を肝臓に転移させる効率（今までは安定な形質導入を受けた肝細胞の数の点で相対的に失望感があった）の点で他の血清型よりも実質的に有利である。ＡＡＶ２／８は他のベクターに比較して遺伝子伝達効率の点で１０から１００倍の向上を一貫して達成した。このようにＡＡＶ２／８が向上した効率を示すことに関する基礎は明らかでないが、恐らくは、肝細胞の基底面に対して高い活性を示すいろいろなレセプタによる吸収が原因であろう。このように向上した効率は数多くの形質導入細胞が重要である肝臓指向遺伝子伝達の開発、例えば尿素サイクル疾患および家族性高コレステロール血症などにとって極めて有用であろう。
【０２０４】
従って、本発明は、ゲノム配列のＰＣＲ検索を基にして新規なＡＡＶを単離する新規なアプローチを提供するものである。増幅させた配列をベクターに組み込んで動物で試験するのは容易であった。ＡＡＶ７に対する先在免疫はなくかつそのようなベクターが筋肉に好ましい向性を示すことは、ＡＡＶ７がヒト遺伝子治療および他のインビボ用途でベクターとして用いるに適することを示している。同様に、本発明のＡＡＶ血清型に対する先在免疫はなくかつそれらは向性を有することから、それらは治療用分子および他の有用な分子の搬送で用いるに有用である。
実施例９−組織トロピズム試験
新規なＡＡＶ構築体に関する高スループット機能性スクリーニングスキームの設定では、容易に検出可能且つ定量化可能なレポーター遺伝子であるヒトα抗トリプシン遺伝子を機能させるために非組織特異的で且つ高度に活性なプロモーターであるＣＢプロモーター（ＣＭＶ促進されたニワトリβアクチンプロモーター）を選択した。それ故、３種の組織である肝臓、肺及び筋肉を標的として特定のＡＡＶ構築体の組織向性をスクリーニングするための遺伝子導入試験用には新規な各ＡＡＶクローンに関して１個だけのベクターを製造する必要がある。以下の表は組織トロピズム試験における４種の新規なＡＡＶベクター（ＡＡＶＣＢＡ１ＡＴ）から生じたデータをまとめており、そこから新規なＡＡＶキャプシドクローンである４４.２が３種全ての組織中で非常に有効な遺伝子導入ビヒクルであること、特に肺組織中の高い成果、が見いだされた。表８は試験の１４日目に得られたデータ（μｇＡＩＡＴ／ｍＬの血清）を報告している。
【０２０５】
【表９】
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【０２０６】
肺組織中のＡＡＶ４４.２の優れた局在性を確認するために一対の別の実験を次に行った。最初に、新規なＡＡＶのキャプシドで偽類型化された(pseudotyped)肺特異的発現用のＣＣ１０ｈＡＩＡＴミニ遺伝子を担持するＡＡＶベクターを免疫欠失動物（ＮＣＲヌード）に対して、等しい量（それぞれ５０μｌの未希釈のオリジナル調合物）を以下の表に提示されている通りにして気管内注射を介して与えた。表９では、１匹のマウスすなわちＮＣＲヌード当たり５０μｌの各オリジナル調合物、検出限度＞０.０３３μｇ／ｍｌ、２８日目。
【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
コンピテント動物（Ｃ５７ＢＬ／６）を表１０に示されている通りにして同一ゲノムコピー（１×１０11個のＧＣ）の中で免疫感作させるためにベクターも投与した。（１匹の動物当たり１×１０11個のＧＣ、Ｃ５７ＢＬ／６、１４日目、検出限度＞０.０３３μｇ／ｍｌ）
【０２０９】
【表１１】
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【０２１０】
二つの実験からのデータは、肺に向けられた遺伝子導入におけるクローン４４.２のすばらしい向性を確認した。
【０２１１】
興味深いことに、肝臓及び筋肉に向けられた遺伝子導入におけるクローン４４.２の性能も顕著であり、最良の肝臓形質導入剤であるＡＡＶ８及び最良の筋肉形質導入剤であるＡＡＶ１のものと互角であり、この新規なＡＡＶがある種の興味ある生物学的意義を有することを示唆している。
【０２１２】
これらの新規なＡＡＶ類の血清学的性質を試験するために、異なるキャプシド類に対する抗血清の存在下及び不存在下におけるウサギの免疫感作及び８４−３１細胞のインビトロ形質導入用に偽類型化されたＡＡＶＧＦＰベクターを作成した。データを以下にまとめる：
【０２１３】
【表１２】
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【０２１４】
【表１３】
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【０２１５】
【表１４】
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【０２１６】
実施例１０−家族性高コレステロール血症のマウスモデル
下記の実験は、家族性高コレステロール血症のマウスモデルにおいて本発明のＡＡＶ２／７構築体がＬＤＬ受容体を送達しそして血漿コレステロール及びトリグリセリド類の水準を減ずるに充分な量でＬＤＬ受容体を発現することを示す。
Ａ.ベクター構築
ＡＡＶ７又はＡＡＶ８キャプシドタンパク質が充填されたＡＡＶベクターを偽類型方式を用いて構築した［Hildinger M, et al., J. Virol 2001; 75:6199-6203］。ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する組換えＡＡＶゲノムを、シス−プラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド及びキメラ充填構築体である新規なＡＡＶ血清型のキャプシドとＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子との融合体を用いる２９３個の細胞の三重トランスフェクションにより充填した。キメラ充填プラスミドは前記の通りにして構築された［以上で引用された Hildinger, et al］。組換えベクターを標準的ＣｓＣｌ2沈降方法により精製した。収率を測定するために、タクマン(TaqMan)（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）分析をベクターのＳＶ４０ポリ（Ａ）領域を標的とするプローブ及びプライマーを用いて行った［Gao GP, et al., Hum Gene Ther. 2000 Oct 10; 11(15):2079-91］。生じたベクターはヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）の調節下で導入遺伝子を発現する。
Ｂ.動物
Ｃ５７Ｂ１／６背景上のＬＤＬ受容体欠失マウスはジャクソン・ラボラトリイ(Jackson Laboratory)（バー・ハーバー、メイン州、米国）から購入されそして飼育集団として養育されていた。マウスには無制限に水が与えられそしてベクター注入の３週間前から高脂肪ウェスタン・ダイエット(Western Diet)（高％コレステロール）が与えられた。−７日目及び０日目に、血液を後眼窩出血を介して採取しそして脂質特性を評価した。マウスを無作為に７群に分けた。ベクターをこれまでに記載されている通りにして門脈内注射により注射した［Chen SJ et al., Mol Therapy 2000; 2(3), 256-261］。簡単に述べると、マウスにケタミン及びキシラジンで麻酔をかけた。開腹手術を行いそして門脈静脈を露出した。３０ｇ針を用いて、１００μｌのＰＢＳ中に希釈された適切な投与量のベクターを門脈静脈内に直接注射した。圧力を注射部位にかけて出血の停止を確実にした。皮膚の傷を閉じ、布で覆い、そしてマウスを翌日に注意深く観察した。肝臓に向けられた遺伝子導入後１４日目から始まり毎週出血させて血液脂質を測定した。各群からの２匹の動物をベクター注射後６週及び１２種の時点で殺害してアテローム硬化症プラーク寸法ならびに受容体発現を試験した。残りのマウスは２０週目にプラーク測定及び導入遺伝子発現用に殺害した。
【０２１７】
【表１５】
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【０２１８】
Ｃ.血清リポタンパク質及び肝機能分析
血液試料を後眼窩叢から６時間の断食期間後に得た。血清を血漿から遠心により分離した。血清中の血漿リポタンパク質及び肝臓トランスミナーゼの量を自動的臨床用化学分析機（ＡＣＥ、シアパレリ・バイオシステムズ(Schiapparelli Biosystems)、アルファ・ワッセルマン）を用いて検出した。
Ｄ.導入遺伝子発現の検出
ＬＤＬ受容体発現を免疫−蛍光染色及びウェスタン・ブロッティングにより評価した。ウェスタン・ブロット用には、凍結された肝臓組織を溶解緩衝液（２０ｍＭ トリス、ｐＨ７.４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ１００）、プロテアーゼ抑制剤（完全、ＥＤＴＡを含まない、ロッシェ(Roche)、マンハイム、ドイツ）と共に均質化した。タンパク質濃度をマイクロＢＣＡタンパク質検定試薬キット(Micro BCA Protein Assay Reagent Kit)（ピアース(Pierce)、ロックフォード、イリノイ州）を用いて測定した。４０μｇのタンパク質を４−１５％トリス−ＨＣｌレディ・ゲルズ(Ready Gels)（バイオラド(Biorad)、ハーキュルズ、カリフォルニア州）上で分解しそしてニトロセルロース膜（インビトロゲン(Invitrogen)）に移した。抗ｈＬＤＬ受容体抗体を作成するために、ウサギにＡｄｈＬＤＬｒ調合物（１×１０13ＧＣ）を静脈内注射した。４週間後にウサギ血清が得られそしてウェスタン・ブロット用に使用された。血清の１：１００希釈物が一次抗体として使用され、引き続きＨＲＰと共役した抗ウサギＩｇＧ及びＥＣＬ化学蛍光検出（ＥＣＬウェスタン・ブロット検出キット(ECL Western Blot Detection Kit)、アメルシャム(Amersham)、アーリントン・ハイツ、イリノイ州）を行った。
Ｅ.免疫細胞化学
凍結された肝臓切片標本中のＬＤＬ受容体発現の測定用に、免疫細胞化学分析を行った。１０μｍのクリオスタット切片標本をアセトン中で５分間にわたり固定するか、又は固定しなかった。１０％のヤギ血清を用いる１時間のインキュベーション期間により阻止が得られた。切片標本を次に１時間にわたり一次抗体と共に室温においてインキュベーションした。ウサギのポリクローン性抗体抗ヒトＬＤＬ（バイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレーテッド(Biomedical Technologies Inc.)、スタフトン、マサチュセッツ州）を、製造業者の指示に従い希釈して使用した。切片標本をＰＢＳで洗浄し、そして１：１００に希釈したフルオレセインヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州）と共にインキュベーションした。検体を最後に蛍光顕微鏡であるニコン・マイクロフォト−ＦＸＡ(Nikon Microphot-FXA)下で試験した。全ての場合、各インキュベーション後にＰＢＳで良く洗浄した。負の対照はＰＢＳを用いるプレインキュベーション、一次抗体の省略、及びイソタイプ適合性の非免疫対照抗体による一次抗体の置換よりなっていた。３タイプの上記対照を各実験に関して同一日に行った。
Ｆ.遺伝子伝達効果
マウスを指定された時点で殺害した後に肝臓組織を得た。組織を液体窒素中で衝撃凍結させそしてその後の処理まで−８０℃において貯蔵した。ＤＮＡを肝臓組織からキアンプＤＮＡミニキット(QIAamp DNA Mini Kit)（キアゲン(QUIAGEN)ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて製造業者の処方に従い抽出した。肝臓組織中のＡＡＶベクターのゲノムコピーを以上で記載された通りにしてＳＶ４０ポリ（Ａ）テイルに対するプローブ及びプライマーを用いるタックマン分析を用いて評価した。
Ｇ.アテローム硬化症プラーク測定
マウス大動脈内のアテローム硬化症プラークの定量化のために、マウスに麻酔をかけ（１０％ケタミン及びキシラジン、腹腔内）、開胸しそして動脈系に氷冷燐酸塩緩衝食塩水を左心室を通して灌流させた。大動脈を次に注意深く回収し、腹の中央線に沿って大動脈弓から下がって大腿動脈まで切断しそしてホルマリン中で固定した。脂質に富んだアテローム硬化症プラークをスダン(Sudan)ＩＶ（シグマ、ドイツ）で染色しそして大動脈を平らに黒色ワックス表面上にピンでとめた。ソニー(Sony)ＤＸＣ−９６０ＭＤカラービデオカメラを用いて像を得た。プラークの面積ならびに全大動脈表面をフェーズ・３・イメージング・システムズ(Phase 3 Imaging Systems)（メディア・シベルネティックス(Media Cybernetics)）を用いて測定した。
Ｈ.Ｉ125ＬＤＬのクリアランス
１実験群当たり２匹の動物を試験した。Ｉ125で標識が付けられたＬＤＬ（一般的にはダン・ラダー(Dan Rader)、Ｕペン(U Penn)により供給される）を尾の静脈中に３０秒間の期間にわたりゆっくり注入した（１００μｌの殺菌性ＰＢＳ中で希釈された１,０００,０００カウントの［Ｉ125］−ＬＤＬ／動物）。注射後３分間、３０分間、１.５時間、３時間、６時間の時点で、血液試料を後眼窩叢を介して得た。血漿を全血から分離しそして１０μｌの血漿をガンマカウンター中でカウントした。最後に分別異化作用率(fractional catabolic rate)をリポタンパク質クリアランスデータから計算した。
Ｉ.肝臓脂質蓄積の評価
凍結された肝臓切片標本のオイルレッド染色を行って脂質蓄積を測定した。凍結された肝臓切片標本を蒸留水中で簡単にすすぎ、引き続き無水プロピレングリコール中で２分間にわたりインキュベーションした。切片標本を次にオイルレッド溶液（プロピレングリコール中０.５％）の中で１６時間にわたり染色し、引き続きメイヤーのヘモトキシリン溶液で３０秒間にわたり対比染色しそして暖められたグリセリンゼリー溶液の中に配置した。
【０２１９】
肝臓コレステロール及びトリグリセリド含有量の定量化のために、肝臓切片標本を均質化しそしてクロロホルム／メタノール（２：１）の中で一晩にわたりインキュベーションした。０.０５％のＨ2ＳＯ4の添加及び１０分間にわたる遠心後に、各試料の下層を集め、２個のアリコートに分割しそして窒素下で乾燥した。コレステロール測定のために、第１アリコートの乾燥脂質をクロロホルム中１％トリトンＸ−１００の中に溶解させた。溶解したら、溶液を窒素下で乾燥した。脂質をｄｄＨ2Ｏの中に溶解させそして３０分間にわたり３７℃においてインキュベーションした後に、総コレステロール濃度をトータル・コレステロール・キット(Total Cholesterol Kit)（ワコウ・ダイアグノスティックス(Wako Diagnostics)）を用いて測定した。第２アリコートに関しては、乾燥脂質をアルコール性ＫＯＨの中に溶解させそして６０℃において３０分間にわたりインキュベーションした。次に１Ｍ ＭｇＣｌ2を加え、引き続き氷上で１０分間にわたりインキュベーションしそして１４,０００ｒｐｍで３０分間にわたり遠心した。上澄み液を最後にトリグリセリド類に関して評価した（ワコウ・ダイアグノスティックス）。
【０２２０】
ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／７キャプシド中で偽類型化されたベクター類の全てが総コレステロール、ＬＤＬおよびトリグリセリド類を対照と比べて減少させた。これらの試験ベクターは投与量依存方式で高コレステロール血症の表現型も補正した。ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／７マウスに関するプラーク面積の減少が処置したマウスでは最初の試験（２カ月間）で観察され、そしてこの効果が実験期間（６カ月間）にわたり持続することが観察された。
実施例１０−血友病の機能性因子ＩＸ発現及び補正
Ａ.ノックアウトマウス
機能性イヌ因子ＩＸ（ＦＩＸ）発現をＢ型血友病のマウスで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７又はＡＡＶ８のキャプシドを有するベクター類を、ＡＡＶ２５'ＩＴＲ−肝臓特異的プロモーター［ＬＳＰ]−イヌＦＩＸ−ウッドチャック肝炎調整後要素（ＷＰＲＥ）−ＡＡＶ２３'ＩＴＲを送達するために、構築した。ベクター類を Wang et al, 2000, Molecular Therapy 2:154-158に記載された通りにして、適当なキャプシド類を用いて構築した。
【０２２１】
ノックアウトマウスは Wang et al, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11563-11566 に記載された通りにして作成した。このモデルはヒトのＢ型血友病の表現型に非常によく似ている。
【０２２２】
異なる血清型のベクター（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８）を１回の門脈内注射として成体血友病Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肝臓内に５種の血清型に関しては１×１０11個のＧＣ／マウスの投与量で送達し、そして１群はＡＡＶ８ベクターをそれより低い投与量である１×１０10個のＧＣ／マウスで受容した。対照群には１×１０11個のＧＣのＡＡＶ２／８ＴＢＧＬａｃＺ３を注射した。各群は５−１０匹の雌雄のマウスを含んでいた。マウスをベクター投与後に一週間おきに採血した。
１.エリザ(ELISA)
マウス血漿内のイヌＦＩＸ濃度を、本質的に Axelrod et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5173-5177 により記載されている通りにして変更せずに行われたイヌ因子ＩＸに特異的なエリザ検定により測定した。ヒツジ抗イヌ因子ＩＸ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ(Enzyme Research Laboratories)）が一次抗体として使用されそしてウサギ抗イヌ因子ＩＸ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ）が二次抗体として使用された。注射後２週間から始まり、ｃＦＩＸの増加した血漿水準が全ての試験ベクターに関して検出された。増加した水準は実験期間中ずっと、すなわち１２週間まで治療水準に維持された。治療水準は正常水準の５％、すなわち約２５０ｎｇ／ｍＬであると考えられる。
【０２２３】
発現の最高水準がＡＡＶ２／８（１０11）及びＡＡＶ２／７構築体に関して観察され、超生理機能性水準であるｃＦＩＸ水準（正常水準より１０倍高い）が持続した。ＡＡＶ２／８（１０11）の発現水準はＡＡＶ２／２及びＡＡＶ２／８（１０10）に関して観察されたものより約１０倍高かった。最低であるがそれでも治療範囲より上の発現水準がＡＡＶ２／５に関して観察された。
２.インビトロでの活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検定
ＦＩＸノックアウトマウスの血漿中の機能性因子ＩＸ活性をインビトロでの活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検定により測定し、マウス血液試料を後眼窩叢から１／１０容量のクエン酸塩緩衝液の中に集めた。ａＰＴＴ検定は Wang et al, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11563-11566 により記載された通りにして行った。
【０２２４】
ベクターを注射した全てのマウスの血漿試料上でのａＰＴＴによる凝固時間は注射２週間後に測定された時には正常範囲内（約６０秒間）であり、そして試験期間（１２週間）中ずっと正常又は正常範囲より短い凝固時間が持続した。
【０２２５】
ＡＡＶ２／８（１０11）及びＡＡＶ２／７を受容する動物において最低の持続凝固時間が観察された。１２週までは、ＡＡＶ２／２もＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／７に関するものと同様な凝固時間を誘発した。しかしながら、この減じられた凝固時間はＡＡＶ２／２に関しては１２週までは観察されなかったが、減じられた凝固時間（２５−４０秒間の範囲）はＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／７に関しては２週目から始まって観察された。
【０２２６】
処置したマウスの一部から回収された肝臓組織上での免疫−組織化学染色が最近行われている。ＡＡＶ２／８.ｃＦＩＸベクターを注射したマウスにおいて肝細胞の約７０−８０％がイヌＦＩＸに関して陽性に染色される。
Ｂ.Ｂ型血友病のイヌ
モデリング試験に基づくと、タンパク質を不安定にすると思われるＦＩＸ遺伝子の触媒領域において点突然変異を有するイヌはＢ型血友病に罹る［Evans et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10095-10099］。そのようなイヌの集団は２０年間以上にわたりチャペル・ヒルのノース・カロライナ大学で養育されている。これらのイヌの止血パラメーターはたくさん記載されておりそして血漿ＦＩＸ抗原の不存在、正常なイヌは６−８分間であるが６０分間を越える全血凝固時間、及び正常なイヌは１３−２８秒間であるが５０−８０秒間の長くなった活性化された部分的トロンボプラスチン時間を包含する。これらのイヌは反復的な自発性出血を経験する。典型的には、有意な出血現象は１０ｍｌ／ｋｇの正常なイヌ血漿の１回の静脈注入により成功裡に処置され、場合によっては、出血を抑制するために反復注入が必要である。
【０２２７】
４匹のイヌにＡＡＶ.ｃＦＩＸを以下のスケジュールに従い注射する。第１のイヌはＡＡＶ２／２.ｃＦＩＸを含む１回注射を３.７×１０11個のゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの投与量で受容する。第２のイヌはＡＡＶ２／２.ｃＦＩＸ（２.８×１０11個のＧＣ／ｋｇ）の第１回目の注射を、引き続きＡＡＶ２／７.ｃＦＩＸ（２.３×１０13個のＧＣ／ｋｇ）の第２回目の注射を１１８０日目に受容する。第３のイヌはＡＡＶ２／２.ｃＦＩＸを含む１回注射を４.６×１０12個のＧＣ／ｋｇの投与量で受容する。第４のイヌはＡＡＶ２／２.ｃＦＩＸを含む注射（２.８×１０12個のＧＣ／ｋｇ）及び９９５日目のＡＡＶ２／２.ｃＦＩＸを含む注射（５×１０12個のＧＣ／ｋｇ）を受容する。
【０２２８】
血友病のイヌを一般的な麻酔下で無菌的に且つ手術により開腹しそしてベクターの１回注入を門脈静脈内に投与する。動物を正常なイヌ血漿の静脈内投与により手術期間前後の出血から防護する。イヌに鎮静剤を与え、挿管して一般的な麻酔薬を導入し、そして腹を切開して準備した。開腹後に、脾臓を手術場所に移動させる。脾臓静脈を置きそして縫合糸を静脈内の小さい遠位切開部の近くにゆるめて置く。針を静脈内に急いで挿入し、次に縫合糸をゆるめそして５Ｆカニューレを門脈静脈分岐近くの静脈位置に縫合された門脈静脈近くの静脈位置に縫合する。止血が確保されそしてカテーテルバルーンが膨張された後に、ＰＢＳ中で希釈された約５.０ｍｌのベクターを門脈静脈内に５分間隔で注入する。ベクター注入後に５.０ｍｌの食塩水を注入する。バルーンを次にしぼめ、カニューレを除去しそして静脈止血を確保する。脾臓を次に交換し、出血している血管を焼灼しそして手術の傷を閉じる。手術経過を良くするように取り扱いながら動物を抜管する。血液試料を記載されている通りにして分析する［Wang et al, 2000, Molecular Therapy 2:154-158］。
【０２２９】
補正又は部分的補正を示す結果がＡＡＶ２／７に関して予期される。
【０２３０】
この明細書に引用された全ての刊行物は参照により本発明の内容となる。本発明を特に好ましい態様を以下に列挙する。
１．  （ａ）ＤＮＡを含有する試料を、ＡＡＶ核酸配列の第１の領域を特異的に増幅する第１のプライマーのセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅に供し；
（ｂ）場合により、ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に５’である配列を含む第２の領域を特異的に増幅する第２のプライマーのセットを用いるさらなる増幅に供し、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５‘末端にアニーリングするＡＡＶ５’伸長配列を得；
（ｃ）場合により、ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に３’である配列を含む第３の領域を特異的に増幅する第３のプライマーのセットを用いるさらなる増幅に供し、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の３’末端にアニーリングするＡＡＶ３’伸長配列を得る
段階を含み、
ここで該領域のそれぞれは少なくとも２つのＡＡＶ血清型の核酸配列の整列に基づいてあらかじめ決定されており、そして該領域のそれぞれは、少なくとも２つの整列したＡＡＶ血清型の配列に対して、領域の配列の５’末端における少なくとも１８塩基対に及んで高度に保存されている核酸配列、場合により中間の可変の配列及び３’末端における少なくとも１８塩基対に及んで高度に保存されている配列を含み；且つ
ここでプライマーのセットのそれぞれは５’プライマー及び３’プライマーから成り；
ここで増幅された配列の存在が試料中におけるＡＡＶの存在を示す、
試料中におけるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）配列の検出法。
２．  段階（ｂ）及び（ｃ）を行い且つさらに：
（ｄ）増幅された配列を用いて部分的及び／又は完全ＡＡＶ遺伝子を含む配列を構築し、それにより試料からＡＡＶ遺伝子配列を単離する
段階を含む上記１に従う方法。
３．  第１の領域がＡＡＶキャプシド内にあり、第2の領域がｒｅｐ遺伝子の３’末端に延び、第３の領域がＡＡＶ３’ＩＴＲの５’に延び、段階（ｄ）が完全ＡＡＶキャプシド遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子配列の構築を可能にする上記２に従う方法。
４．  さらにＤＮＡを、第３の領域の５’に延びる第４の領域を特異的に増幅する第４のプライマーのセットを用いる増幅に供する段階を含む上記２に従う方法。
５．  第４の領域がＡＡＶ５’ＩＴＲの３’に延び、段階（ｄ）が完全ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子配列の構築を可能にする上記４に従う方法。
６．  該試料が細胞又はゲノムＤＮＡを含む上記１又は上記２に従う方法。
７．  該ＤＮＡが細胞、細胞培養、組織、組織培養及び生物学的流体より成る群から抽出されている上記１又は２に従う方法。
８．  第１の領域が長さにおいて約２５０塩基対である上記１又は２に従う方法。
９．  第１の領域が領域の５’及び／又は３’末端において少なくとも約２５塩基対に及んで高度に保存されている上記１又は２に従う方法。
１０．    第１の領域が領域の５’及び／又は３’末端において少なくとも約３０塩基対に及んで高度に保存されている上記１又は２に従う方法。
１１．  第１の領域の高度に保存された配列が、整列したＡＡＶ血清型の中で領域の５‘及び／又は３’末端において少なくとも８０％の同一性を有する上記１又は２に従う方法。
１２．  第１の領域の高度に保存された配列が、整列したＡＡＶ血清型の中で領域の５‘及び／又は３’末端において少なくとも９０％の同一性を有する上記１１に従う方法。
１３．  第１の領域の中間の可変の配列が、整列したＡＡＶ血清型の中で７０％未満の同一性を有する上記１又は２に従う方法。
１４．  第１の領域がＡＡＶ１，配列番号：６の約ｂｐ２８００−約３２００及び他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対に及ぶ上記１又は２に従う方法。
１５．  第１の領域がＡＡＶ１，配列番号：６のｂｐ２８８６〜約３１４３ｂｐに及ぶ２５７ｂｐ及び他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対である上記１４に従う方法。
１６．  プライマーがＡＶ１ｎｓ及びＡＶ２ｃａｓである上記１に従う方法。
１７．  （ａ）ＡＡＶ１，配列番号：１のｂｐ２８８６−３１４３及び他のＡＡＶ血清型の対応する領域の全体もしくは一部に及ぶＡＡＶ配列を含むＤＮＡ分子を含有する試料の酵素消化分析を得；
（ｂ）試料からの酵素消化分析を、１つもしくはそれより多くのＡＡＶ血清型の対応する領域に関する酵素消化分析と比較し、それにより試料中のＡＡＶ配列を１つもしくはそれより多いＡＡＶ血清型の１つからのもの又は未知の血清型からのものであると同定する
段階を含む、試料中のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）配列の血清型を既知もしくは未知と同定する方法。
１８．  ＡＡＶ配列を上記１の方法により得た上記１７に従う方法。
１９．  （ａ）ＡＡＶ核酸配列の第１の領域を特異的に増幅する第１のプライマーのセット；
（ｂ）場合により、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５’末端にアニーリングするＡＡＶ５’伸長配列が得られるように、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に５’である配列を含むＡＡＶ核酸配列の第２の領域に特異的な第２のプライマーのセット；
（ｃ）場合により、第１の領域のためのプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の３’末端にアニーリングするＡＡＶ３’伸長配列が得られるように、ＡＡＶ配列の第１の領域及び第１の領域に３’である配列を含む第３の領域を特異的に増幅する第３のプライマーのセット
を含み、
ここで該領域のそれぞれは少なくとも２つのＡＡＶ血清型の核酸配列の整列に基づいてあらかじめ決定され、該領域のそれぞれは、少なくとも２つの整列したＡＡＶ血清型の配列に対して、領域の配列の５’末端における少なくとも１８塩基対に及んで高度に保存されている核酸配列、場合により中間の可変の配列及び３’末端における少なくとも１８塩基対に及んで高度に保存されている配列を含み；且つ  ここでプライマーのセットのそれぞれは５’プライマー及び３’プライマーから成る、
試料中の未知のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キット。
２０．  （ａ）細胞を、ＡＡＶにヘルパー機能を与えるウィルスに感染させ；（ｂ）ＡＡＶを含有する感染性クローンを単離し；（ｃ）単離されたＡＡＶを配列決定し；（ｄ）単離されたＡＡＶの配列を既知のＡＡＶ血清型と比較する段階を含み、それにより、単離されたＡＡＶの配列と既知のＡＡＶ血清型における相違が新規なＡＡＶの存在を示す、細胞から新規なアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を単離する方法。
２１．  該ウィルスがアデノウィルスである上記２０に従う方法。
２２．  該アデノウィルスがヒトまたは非−ヒト霊長類起源のものである上記２１に従う方法。
２３．  上記２又は２０に従う方法により同定される新規なアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型。
２４．  ＡＡＶ７，配列番号：２のアミノ酸１−７３７；Ｃ１，配列番号：６０；Ｃ２，配列番号：６１；Ｃ５，配列番号：６２；Ａ３−３，配列番号：６６；Ａ３−７，配列番号：６７；Ａ３−４，配列番号：６８；Ａ３−５，配列番号：６９；３．３ｂ，配列番号：６２；２２３．４，配列番号：７３；２２３−５，配列番号：７４；２２３−１０，配列番号：７５；２２３−２，配列番号：７６；２２３−７，配列番号：７７；２２３−６，配列番号：７８；４４−１，配列番号：７９；４４−５，配列番号：８０；４４−２，配列番号：８１；４２−１５，配列番号：８４；４２−８，配列番号：８５；４２−１３，配列番号：８６；４２−３Ａ，配列番号：８７；４２−４，配列番号：８８；４２−５Ａ，配列番号：８９；４２−１Ｂ，配列番号：９０；４２−５Ｂ，配列番号：９１；４３−１，配列番号：９２；４３−１２，配列番号：９３；４３−５，配列番号；９４；４３−２１，配列番号：９６；４３−２５，配列番号：９７；４３−２０，配列番号：９９；２４．１，配列番号：１０１；４２．２，配列番号：１０２；７．２，配列番号：１０３；２７．３，配列番号：１０４；１６．３，配列番号：１０５；４２．１０，配列番号：１０６；４２−３Ｂ，配列番号：１０７；４２−１１，配列番号：１０８；Ｆ１，配列番号：１０９；Ｆ５，配列番号：１１０；Ｆ３，配列番号：１１１；４２−６Ｂ，配列番号：１１２及び４２−１２，配列番号：１１３
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドを含む単離されたアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）。
２５．  ｖｐ２キャプシドタンパク質、アミノ酸（ａａ）１３８−７３７；
ｖｐ３キャプシドタンパク質、ａａ２０３−７３７；
超可変領域（ＨＶＲ）１−１２：ａａ１４６−１５２；ａａ１８２−１８７；ａａ２６２−２６４；ａａ２６３−２６６；ａａ２６３−２６６；ａａ３８１−３８３；ａａ３８３−３８５；ａａ４５０−４７４；ａａ４５１−４７５；ａａ４９０−４９５；ａａ４９１−４９６；ａａ５００−５０４；ａａ５０１−５０５；ａａ５１４−５２２；ａａ５３３−５５４；ａａ５３４−５５５；ａａ５８１−５９４；ａａ５８３−５９６；ａａ６５８−６６７；ａａ６６０−６６９；及びａａ７０５−７１９；ａａ７０７−７７２；
ａａ２４−４２，ａａ２５−２８；ａａ８１−８５；ａａ１３３−１６５；ａａ１３４−１６５；ａａ１３７−１４３；ａａ１５４−１５６；ａａ１９４−２０８；ａａ２６１−２７４；ａａ２６２−２７４；ａａ１７１−１７３；ａａ４１３−４１７；ａａ４４９−４７８；ａａ４９４−５２５；ａａ５３４−５７１；ａａ５８１−６０１；ａａ６６０−６７１；ａａ７０９−７２３；ならびに
ａａ１−１８４，ａａ１９９−２５９；ａａ２７４−４４６；ａａ６０３−６５９；ａａ６７０−７０６；ａａ７２４−７３６；ａａ１８５−１９８；ａａ２６０−２７３；ａａ４４７−４７７；ａａ４９５−６０２；ａａ６６０−６６９；及びａａ７０７−７２３
より成る群から選ばれ、
ここでアミノ酸番号はＡＡＶ７キャプシド，配列番号：２ならびにＣ１，配列番号：６０；Ｃ２，配列番号：６１；Ｃ５，配列番号：６２；Ａ３−３，配列番号：６６；Ａ３−７，配列番号：６７；Ａ３−４，配列番号：６８；Ａ３−５，配列番号：６９；３．３ｂ，配列番号：６２；２２３．４，配列番号：７３；２２３−５，配列番号：７４；２２３−１０，配列番号：７５；２２３−２，配列番号：７６；２２３−７，配列番号：７７；２２３−６，配列番号：７８；４４−１，配列番号：７９；４４−５，配列番号：８０；４４−２，配列番号：８１；４２−１５，配列番号：８４；４２−８，配列番号：８５；４２−１３，配列番号：８６；４２−３Ａ，配列番号：８７；４２−４，配列番号：８８；４２−５Ａ，配列番号：８９；４２−１Ｂ，配列番号：９０；４２−５Ｂ，配列番号：９１；４３−１，配列番号：９２；４３−１２，配列番号：９３；４３−５，配列番号；９４；４３−２１，配列番号：９６；４３−２５，配列番号：９７；４３−２０，配列番号：９９；２４．１，配列番号：１０１；４２．２，配列番号：１０２；７．２，配列番号：１０３；２７．３，配列番号：１０４；１６．３，配列番号：１０５；４２．１０，配列番号：１０６；４２−３Ｂ，配列番号：１０７；４２−１１，配列番号：１０８；Ｆ１，配列番号：１０９；Ｆ５，配列番号：１１０；Ｆ３，配列番号：１１１；４２−６Ｂ，配列番号：１１２及び４２−１２，配列番号：１１３のキャプシド中の対応する領域のものである、
ＡＡＶキャプシドタンパク質のフラグメントを含むタンパク質。
２６．  上記２５に従うタンパク質フラグメントの１つもしくはそれより多くを含む人工アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）キヤプシドタンパク質。
２７．  上記２６に従う人工キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）。
２８．  上記２５〜２６に従うタンパク質をコードする核酸配列を含む分子。
２９．  ＡＡＶ７，配列番号：２のアミノ酸１−７３７；Ｃ１，配列番号：６０；Ｃ２，配列番号：６１；Ｃ５，配列番号：６２；Ａ３−３，配列番号：６６；Ａ３−７，配列番号：６７；Ａ３−４，配列番号：６８；Ａ３−５，配列番号：６９；３．３ｂ，配列番号：６２；２２３．４，配列番号：７３；２２３−５，配列番号：７４；２２３−１０，配列番号：７５；２２３−２，配列番号：７６；２２３−７，配列番号：７７；２２３−６，配列番号：７８；４４−１，配列番号：７９；４４−５，配列番号：８０；４４−２，配列番号：８１；４２−１５，配列番号：８４；４２−８，配列番号：８５；４２−１３，配列番号：８６；４２−３Ａ，配列番号：８７；４２−４，配列番号：８８；４２−５Ａ，配列番号：８９；４２−１Ｂ，配列番号：９０；４２−５Ｂ，配列番号：９１；４３−１，配列番号：９２；４３−１２，配列番号：９３；４３−５，配列番号；９４；４３−２１，配列番号：９６；４３−２５，配列番号：９７；４３−２０，配列番号：９９；２４．１，配列番号：１０１；４２．２，配列番号：１０２；７．２，配列番号：１０３；２７．３，配列番号：１０４；１６．３，配列番号：１０５；４２．１０，配列番号：１０６；４２−３Ｂ，配列番号：１０７；４２−１１，配列番号：１０８；Ｆ１，配列番号：１０９；Ｆ５，配列番号：１１０；Ｆ３，配列番号：１１１；４２−６Ｂ，配列番号：１１２及び４２−１２，配列番号：１１３より成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する新規なアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む分子。
３０．  核酸配列が：ＡＡＶ５，配列番号：２；４２−２，配列番号：９；４２−８，配列番号：２７；４２−１５，配列番号：２８；４２−５ｂ，配列番号：２９；４２−１ｂ，配列番号：３０；４２−１３，配列番号：３１；４２−３ａ，配列番号：３２；４２−４，配列番号：３３；４２−５ａ，配列番号：３４；４２−１０，配列番号：３５；４２−３ｂ，配列番号：３６；４２−１１，配列番号：３７；４２−６ｂ，配列番号：３８；４３−１，配列番号：３９；４３−５，配列番号：４０；４３−１２，配列番号：４１；４３−２０，配列番号：４２；４３−２１，配列番号：４３；４３−２３，配列番号：４４；４３−２５，配列番号：４５；４４．１，配列番号：４７；４４．５，配列番号：４７；２２３．１０，配列番号：４８；２２３．２，配列番号：４９；２２３．４，配列番号：５０；２２３．５，配列番号：５１；２２３．６，配列番号：５２；２２３．７，配列番号：５３；Ａ３．４，配列番号：５４；Ａ３．５，配列番号：５５；Ａ３．７，配列番号：５６；Ａ３．３，配列番号：５７；４２．１２，配列番号：５８；４４．２，配列番号：５９；ＡＡＶ１０，配列番号：１１７；ＡＡＶ１１，配列番号：１１８；ＡＡＶ１２，配列番号：１１９；Ａ３．１，配列番号：１２０；及びＨ６，配列番号：２５より成る群から選ばれる、新規なアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む分子。
３１．  核酸配列が：
ｖｐ１，ｎｔ８２５−３０４９
ｖｐ２，ｎｔ１２３４−３０４９
ｖｐ３，ｎｔ１４３４−３０４９
ｎｔ４６８−３０９０及び
ｎｔ７２５−３０９０
より成る群から選ばれ、
ここでヌクレオチドの番号はＡＡＶ７，配列番号：１のものであり、４２−２，配列番号：９；４２−８，配列番号：２７；４２−１５，配列番号：２８；４２−５ｂ，配列番号：２９；４２−１ｂ，配列番号：３０；４２−１３，配列番号：３１；４２−３ａ，配列番号：３２；４２−４，配列番号：３３；４２−５ａ，配列番号：３４；４２−１０，配列番号：３５；４２−３ｂ，配列番号：３６；４２−１１，配列番号：３７；４２−６ｂ，配列番号：３８；４３−１，配列番号：３９；４３−５，配列番号：４０；４３−１２，配列番号：４１；４３−２０，配列番号：４２；４３−２１，配列番号：４３；４３−２３，配列番号：４４；４３−２５，配列番号：４５；４４．１，配列番号：４７；４４．５，配列番号：４７；２２３．１０，配列番号：４８；２２３．２，配列番号：４９；２２３．４，配列番号：５０；２２３．５，配列番号：５１；２２３．６，配列番号：５２；２２３．７，配列番号：５３；Ａ３．４，配列番号：５４；Ａ３．５，配列番号：５５；Ａ３．７，配列番号：５６；Ａ３．３，配列番号：５７；４２．１２，配列番号：５８；４４．２，配列番号：５９；ＡＡＶ１０，配列番号：１１７；ＡＡＶ１１，配列番号：１１８；ＡＡＶ１２，配列番号：１１９；Ａ３．１，配列番号：１２０；及びＨ６，配列番号：２５中の配列に対応する、
アデノ随伴ウィルスキャプシドタンパク質のフラグメントをコードする核酸配列を含む分子。
３２．  該分子がプラスミドである上記２６又は上記２８〜３１に従う分子。
３３．  該分子がさらに機能性ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む上記２６又は上記２８〜３１に従う分子。
３４．  該核酸配列がＡＡＶ７配列，配列番号：１である上記３０に従う分
子。
３５．  （ａ）アデノ随伴ウィルスキャプシドをコードする上記２６又は上記２８〜３１のいずれかに従う分子；（ｂ）機能性ｒｅｐ遺伝子；（ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）及び導入遺伝子を含むミニ遺伝子；ならびに（ｄ）ＡＡＶキャプシドタンパク質中へのミニ遺伝子の詰込みを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養する段階を含む、ＡＡＶ血清型キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を形成する方法。
３６．  上記２４に従うアデノ随伴ウィルス又は上記２６もしくは上記２８〜３１のいずれかに従う分子を用いてトランスフェクションされた宿主細胞。
３７．  上記２４又は２７に従うＡＡＶ及び生理学的に適合性の担体を含む組成物。
３８．  上記２６又は上記２８〜３１のいずれかに従う分子及び生理学的に適合性の担体を含む組成物。
３９．  細胞を上記２４又は２７に従うＡＡＶと接触させる段階を含み、ここで該ｒＡＡＶは導入遺伝子を含む、細胞に導入遺伝子を送達する方法。
４０．  異種アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型７核酸配列を含み、該配列が：
配列番号：１のヌクレオチド（ｎｔ）１−１０７；
配列番号：１のｎｔ１０７−２２１５；
配列番号：１のｎｔ３３４−２２１５；
配列番号：１のｎｔ２２２２−４４３５；
配列番号：１のｎｔ２６３３−４４３５；
配列番号：１のｎｔ２８３１−４４３５；及び
配列番号：１のｎｔ４７０４−４７２１
を含む分子。
４１．  アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型７ｒｅｐタンパク質又はそのフラグメントをコードし、該タンパク質又はフラグメントが：
配列番号：３のアミノ酸（ａａ）１−６２３、ａａ１−１７１；ａａ１７２−３７２、ａａ３７３−４４４及びａａ４４５−６２３
より成る群から選ばれる分子。
４２．  上記４０又は４１に従う分子を含有する宿主細胞。
【０２３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＡＶ血清型に関する少なくともｃａｐタンパク質をコードする核酸配列の整列を示している。ＩＴＲｓ、ｒｅｐ領域及びキャプシド領域を含む全長配列は新規なＡＡＶ血清型７［配列番号：１］に関してならびに以前に公開されたＡＡＶ１［配列番号：６］、ＡＡＶ２［配列番号：７］；及びＡＡＶ３［配列番号：８］に関して示されている。新規なＡＡＶ血清型ＡＡＶ８［配列番号：４］及びＡＡＶ９［配列番号：５］は同時申請される（ｃｏ−ｆｉｌｅｄ）出願の主題である。この整列内に示される本発明の他の新規なクローンには：４２−２［配列番号：９］，４２−８［配列番号：２７］，４２−１５［配列番号：２８］，４２−５ｂ［配列番号：２９］，４２−１ｂ［配列番号：３０］；４２−１３［配列番号：３１］，４２−３ａ［配列番号：３２］，４２−４［配列番号：３３］，４２−５ａ［配列番号：３４］，４２−１０［配列番号：３５］，４２−３ｂ［配列番号：３６］，４２−１１［配列番号：３７］，４２−６ｂ［配列番号：３８］，４３−１［配列番号：３９］，４３−５［配列番号：４０］，４３−１２［配列番号：４１］，４３−２０［配列番号：４２］，４３−２１［配列番号：４３］，４３−２３［配列番号：４４］，４３−２５［配列番号：４５］，４４．１［配列番号：４７］，４４．５［配列番号：４７］，２２３．１０［配列番号：４８］，２２３．２［配列番号：４９］，２２３．４［配列番号：５０］，２２３．５［配列番号：５１］，２２３．６［配列番号：５２］，２２３．７［配列番号：５３］，Ａ３．４［配列番号：５４］，Ａ３．５［配列番号：５５］，Ａ３．７［配列番号：５６］，Ａ３．３［配列番号：５７］，４２．１２［配列番号：５８］，４４．２［配列番号：５９］が含まれる。ＡＡＶ１０［配列番号：１１７］，ＡＡＶ１１［配列番号：１１８］及びＡＡＶ１２［配列番号：１１９］の特徴領域（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ）のヌクレオチド配列はこの図に示されている。ＡＡＶゲノムの構造における決定的指標（ｌａｎｄｍａｒｋｓ）が示されている。空所は点により示されている。ＡＡＶ１［配列番号：６］の３’ＩＴＲは公開されている配列におけると同じ配置で示されている。ＴＲＳは末端分割部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を示す。ＡＡＶ７はＶＰ３のための開始コドンとしてＧＴＧを用いる報告されている唯一のＡＡＶであることに注目されたい。
【図２】以前に公開されているＡＡＶ血清型１［配列番号：６４］、ＡＡＶ２［配列番号：７０］、ＡＡＶ３［配列番号：７１］、ＡＡＶ４［配列番号：６３］、ＡＡＶ５［配列番号：１１４］、及びＡＡＶ６［配列番号：６５］のｖｐ１キャプシドタンパク質のタンパク質のアミノ酸配列ならびに：Ｃ１［配列番号：６０］，Ｃ２［配列番号：６１］，Ｃ５［配列番号：６２］，Ａ３−３［配列番号：６６］，Ａ３−７［配列番号：６７］，Ａ３−４［配列番号：６８］，Ａ３−５［配列番号：６９］，３．３ｂ［配列番号：６２］，２２３．４［配列番号：７３］，２２３−５［配列番号：７４］，２２３−１０［配列番号：７５］，２２３−２［配列番号：７６］，２２３−７［配列番号：７７］，２２３−６［配列番号：７８］，４４−１［配列番号：７９］，４４−５［配列番号：８０］，４４−２［配列番号：８１］，４２−１５［配列番号：８４］，４２−８，配列番号：８５］，４２−１３［配列番号：８６］，４２−３Ａ［配列番号：８７］，４２−４［配列番号：８８］，４２−５Ａ［配列番号：８９］，４２−１Ｂ［配列番号：９０］，４２−５Ｂ［配列番号：９１］，４３−１［配列番号：９２］，４３−１２［配列番号：９３］，４３−５［配列番号；９４］，４３−２１［配列番号：９６］，４３−２５［配列番号：９７］，４３−２０［配列番号：９９］，２４．１［配列番号：１０１］，４２．２［配列番号：１０２］，７．２［配列番号：１０３］，２７．３［配列番号：１０４］，１６．３［配列番号：１０５］，４２．１０［配列番号：１０６］，４２−３Ｂ［配列番号：１０７］，４２−１１［配列番号：１０８］，Ｆ１［配列番号：１０９］，Ｆ５［配列番号：１１０］，Ｆ３［配列番号：１１１］，４２−６Ｂ［配列番号：１１２］，４２−１２［配列番号：１１３］を含む本発明の新規なＡＡＶ配列の整列である。新規な血清型ＡＡＶ８［配列番号：９５］及びＡＡＶ９［配列番号：１００］は同時申請される特許出願の主題である。
【図３】ＡＡＶ７ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列［配列番号：３］を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｑ】
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【図１Ｒ】
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【図１Ｓ】
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【図１Ｔ】
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【図１Ｕ】
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【図１Ｖ】
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【図１Ｗ】
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【図１Ｘ】
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【図１Ｙ】
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【図１Ｚ】
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【図１ＡＡ】
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【図１ＡＢ】
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【図１ＡＣ】
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【図１ＡＤ】
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【図１ＡＥ】
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【図１ＡＦ】
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【図１ＡＧ】
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【図１ＡＨ】
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【図１ＡＩ】
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【図１ＡＪ】
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【図１ＡＫ】
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【図１ＡＬ】
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【図１ＡＭ】
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【図１ＡＮ】
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【図１ＡＯ】
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【図１ＡＰ】
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【図１ＡＱ】
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【図１ＡＲ】
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【図１ＡＳ】
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【図１ＡＴ】
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【図１ＡＵ】
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【図１ＡＶ】
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【図１ＡＷ】
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【図１ＡＸ】
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【図１ＡＹ】
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【図１ＡＺ】
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【図１ＡＡＡ】
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【図１ＡＡＢ】
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【図１ＡＡＣ】
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【図１ＡＡＤ】
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【図１ＡＡＥ】
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【図１ＡＡＦ】
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【図１ＡＡＧ】
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【図１ＡＡＨ】
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【図１ＡＡＩ】
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【図１ＡＡＪ】
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【図１ＡＡＫ】
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【図１ＡＡＬ】
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【図１ＡＡＭ】
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【図１ＡＡＮ】
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【図１ＡＡＯ】
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【図１ＡＡＰ】
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【図１ＡＡＱ】
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【図１ＡＡＲ】
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【図１ＡＡＳ】
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【図１ＡＡＴ】
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【図１ＡＡＵ】
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【図１ＡＡＶ】
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【図１ＡＡＷ】
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【図１ＡＡＸ】
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【図１ＡＡＹ】
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【図１ＡＡＺ】
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【図１ＡＡＡＡ】
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【図１ＡＡＡＢ】
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【図１ＡＡＡＣ】
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【図１ＡＡＡＤ】
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【図１ＡＡＡＥ】
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【図１ＡＡＡＦ】
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【図１ＡＡＡＧ】
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【図１ＡＡＡＨ】
0003958191.tif 000696
【図１ＡＡＡＩ】
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【図１ＡＡＡＪ】
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【図１ＡＡＡＫ】
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【図１ＡＡＡＬ】
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【図１ＡＡＡＭ】
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【図１ＡＡＡＮ】
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【図１ＡＡＡＯ】
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【図１ＡＡＡＰ】
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【図１ＡＡＡＱ】
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【図１ＡＡＡＲ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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