(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の特定基質の濃度の電気化学的測定方法における電極として使用できるバイオセンサであって、
バイオセンサは、カーボン電極材料、酸化還元酵素およびメディエータ化合物としてのニッケロセンまたはニッケロセン誘導体を含んで成る混合物からできており、
バイオセンサと参照電極との間に−０．４〜＋０．２ボルトの電位差が形成されるように印加して電気化学的測定方法を実施するバイオセンサ。
【請求項２】
カーボン電極材料はカーボン粒状物である請求項１のバイオセンサ。
【請求項３】
カーボン電極材料はペースト状であり、電極は、カーボン電極材料、酸化還元酵素およびメディエータ化合物の均質混合物から形成されている請求項２のバイオセンサ。
【請求項４】
カーボン電極材料は、更に白金粒状物を含んで成る請求項２または３のバイオセンサ。
【請求項５】
白金粒状物の寸法がカーボン粒状物の寸法より小さい請求項２〜４のいずれかのバイオセンサ。
【請求項６】
白金粒状物の寸法が０．３〜２．５μｍであることを特徴とする請求項３〜５のいずれかのバイオセンサ。
【請求項７】
特定基質がグルコースであり、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１〜６のいずれかのバイオセンサ。
【請求項８】
作用電極としての請求項１〜７のいずれかのバイオセンサ、対極およびこれらの電極間に一定の電位を印加して流れる電流量を測定する装置を有して成る、液体試料中の特定基質の濃度の電気化学的方法により測定するための装置。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のバイオセンサを使用して液体試料中の特定基質の濃度の電気化学的方法により測定する方法であって、バイオセンサと参照電極との間に−０．４〜＋０．２ボルトの電位差が形成されるように印加することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所定条件下にて、液体、特に血液、尿等の体液に含まれる特定基質、例えばグルコースの濃度に対応した電気的な応答を示すバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
白金や炭素電極表面に酵素や抗体、微生物等の生物由来あるいは生物自体より成る生体機能物質を固定化したバイオセンサが種々の化学物質および生体物質の量や濃度を迅速且つ連続的に測定できることは既に知られている。
【０００３】
このバイオセンサは、その特徴を活かして様々な分野において利用されているが、特に盛んに利用されているのは臨床検査の分野においてである。このようなバイオセンサを、臨床検査の分野において最もポピュラーなバイオセンサであるグルコース測定用バイオセンサの例により、以下詳細に説明する。
【０００４】
従来のグルコース濃度測定用バイオセンサは、一般的に、平板状の白金，銀等の電極表面に酵素固定化膜を装着した構造を有している。そして、その製作法としては、別途調製した固定化酵素膜を白金または銀のような電極表面に貼り付けるという方法がしばしば用いられている。この固定化酵素膜には通常グルコースオキシダーゼが固定化されており、このグルコースオキシダーゼが血液、尿等の体液中のグルコースに特異的に働いて、
グルコース＋酸素＋水→グルコン酸＋過酸化水素
の反応を引き起こす。この反応により発生した過酸化水素の量を電気化学的方法により測定することによって体液中のグルコースの量や濃度を測定している。
【０００５】
電気化学的方法による過酸化水素の測定は、作用電極と参照電極との間に一定電位（例えば＋６００ｍＶ程度）を印加し、作用電極表面上で過酸化水素を酸化する時に流れる電流値を測定することによっている。即ち、一定電位を印加することにより次の反応を起こさせて、これらの反応時の電流値を測定しているわけである：
（陽極）    Ｈ2Ｏ2→２Ｈ+＋Ｏ2＋２ｅ-
（陰極）    １／２Ｏ2＋２Ｈ+＋２ｅ-→Ｈ2Ｏ
【０００６】
上述の反応を行うことに加えて、固定化酵素膜のもう一つの役割は、血液、尿等の体液中に存在する、電気化学的方法を妨害する物質、例えばアスコルビン酸が電極表面近くに存在しないようにすることである。ここで、電気化学的方法を妨害する物質とは、電極表面近くに存在すると、電極に過酸化水素を酸化するために一定電位を印加した時に、過酸化水素と同時に、電極表面上で酸化あるいは還元されて電極に電子を与えるか、あるいは電極から電子を奪うことにより、過酸化水素の酸化に起因する電流値に影響を与える物質のことである。
【０００７】
従来の固定化酵素膜では、代表的な電気化学的方法妨害物質であるアスコルビン酸のような大きな分子量の物質は通さないが、過酸化水素のような低分子量の物質であれば通過できるような小さな孔を固定化酵素膜に形成することによって、電極表面に電気化学的方法妨害物質が接近するのを防いでいる。
【０００８】
このように従来のバイオセンサが電気化学的方法妨害物質、特にアスコルビン酸の影響を考慮した構成を採っている理由は、過酸化水素を電極表面上で酸化するために与える電位がアスコルビン酸が電極表面上で酸化される電位よりも高いことによる。このことは、アスコルビン酸が過酸化水素と共存した場合に、測定値に正誤差をあたえることを意味している。もし、アスコルビン酸が酸化される電位（およそ＋２００ｍＶ以上）よりも低い電位を電極に印加するだけでグルコース濃度の測定が可能であれば、測定試料中のアスコルビン酸の影響は考慮しなくともよいことになる。
【０００９】
しかしながら、測定の際に電極に与える電位は、可能な限り低ければ良いというわけではない。それは、測定試料中の酸素が電極表面上で還元され得る電位がおよそ−４００ｍＶ付近以下であるからである。即ち、電極に与える電位を−４００ｍＶ以下にすると、測定試料中の酸素が電気化学的方法妨害物質となってしまうのである。
【００１０】
ここでは、試料中のグルコース濃度の測定に関して説明したが、測定試料中の他の物質、例えば乳酸、コレステロール、尿素、アルコール等を測定する場合にも同様の問題点がある。
【００１１】
従って、可能であるのならば、電気化学的方法妨害物質となり得る物質のなかでも代表的な、アスコルビン酸および酸素の双方が測定試料中に存在していても、これらの影響を受けないような電位で測定するのが望ましいが、従来技術のバイオセンサではこれは実質的に不可能であった。
【００１２】
尚、従来技術のグルコース等の測定用バイオセンサの他の形態においては、前述の様に過酸化水素の量を測定するのではなく、グルコースを酸化したグルコースオキシダーゼの活性中心から測定電極へ電子を伝達（メディエート）するメディエータ化合物を用いたものがある。メディエータ化合物としては、例えばフェリシアン化カリウム、オクタシアノタングステンイオン、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、フェロセンおよびフェロセン誘導体、キノンおよびキノン誘導体、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩等が知られている。このような方法は、例えば特開平第１−１９１０５１号、特開平第６−９０７５４号、特開昭第６０−１７３４５号および公表平第５−５０５４５９号等に開示されている。しかしながら、このようなメディエータ化合物を用いても、アスコルビン酸と酸素のどちらの影響も受けないような電位で測定することは実質的に不可能である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような従来技術のバイオセンサに鑑み、発明が解決しようとする課題は、アスコルビン酸および酸素のどちらの影響も受けないような電位で、測定試料の特定基質、特に体液中のグルコースの量（従って、濃度）を測定することができるバイオセンサおよびそのようなセンサを使用して特定基質の量を測定する方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、酵素の活性中心から測定電極へ電子を伝達するメディエータ化合物として、ニッケロセンまたはニッケロセン誘導体を用いることにより解決されることが見いだされた。
【００１５】
即ち、第１の要旨において、本発明は、カーボン電極材料、酸化還元酵素およびニッケロセンまたはニッケロセン誘導体を含んで成る、液体試料中の特定基質の濃度の電気化学的測定方法に使用できるバイオセンサとしての電極を提供する。
【００１６】
本発明において、液体試料とは、測定すべき対象である特定基質が溶解している液体であって、液体自体は、溶液であっても、エマルジョンであってもよい。具体的には、血液、血清、血漿、尿、髄液などの体液や果汁などの食品等を例示できる。
【００１７】
本発明において、メディエータ化合物（Ｍ）とは、酸化酵素の場合を例にして説明すると、酸化型酸化酵素（ＯＤ）oxと特定基質（Ｓ）との反応によって生成する生成物（Ｐ）および還元型酸化酵素（ＯＤ）reが生成する場合（式（１））、その内の、還元型酸化酵素（ＯＤ）reと反応して酸化型メディエータ（Ｍ）oxとなり（式（２））、その酸化型メディエータ（Ｍ）oxが作用電極にて電子を放出して（従って、酸化されて）還元型メディエータ（Ｍ）reに戻る（式（３））一連の反応に関与する化合物であって、実質的に電子を伝達する働きをする化合物を意味する。これは、以下の反応式で表すことができる：
（Ｓ）＋（ＯＤ）ox→（Ｐ）＋（ＯＤ）re                （１）
（ＯＤ）re＋（Ｍ）ox→（ＯＤ）ox＋（Ｍ）re            （２）
（Ｍ）re→（Ｍ）ox＋ｎｅ-  （電極にて、ｎは正の整数） （３）
換言すれば、メディエータ化合物とは、上述の酸化酵素の場合について、酸化酵素が特定基質を酸化することにより奪った電子を電極に伝達する機能を有する化合物である。
【００１８】
例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いて特定基質としてのグルコースの量を測定する場合では、上記反応は以下のようになる：
Ｃ6Ｈ12Ｏ6＋（ＧＯＤ）ox→Ｃ6Ｈ10Ｏ6＋（ＧＯＤ）re    （１）’
（ＧＯＤ）re＋（Ｍ）ox→（ＧＯＤ）ox＋（Ｍ）re        （２）’
（Ｍ）re→（Ｍ）ox＋２Ｈ+＋２ｅ-    （電極にて）      （３）’
【００１９】
還元酵素の場合は、上記反応（１）〜（３）が下記反応（４）〜（６）となる。
（Ｓ）＋（ＯＤ）re→（Ｐ）＋（ＯＤ）ox                （４）
（ＯＤ）ox＋（Ｍ）re→（ＯＤ）re＋（Ｍ）ox            （５）
（Ｍ）ox＋ｎｅ-→（Ｍ）re  （電極にて、ｎは正の整数） （６）
換言すれば、メディエータ化合物とは、上述の還元酵素の場合について、還元酵素が特定基質を還元するために電極から電子を特定基質に伝達する機能を有する化合物である。
【００２０】
本発明において、電気化学的測定方法とは、上述のような反応において生じる電流量（または電気量）を測定し、その電流量に基づいて基質の量、従って濃度を求める方法を意味する。このような方法は、当業者には古くから周知の方法であり、例えば特公昭第４５−３５３６０号公報を参照できる。
【００２１】
本発明の電極は、電気化学的測定方法において作用電極（測定電極）として使用することができ、本発明の電極に加えて、バイオセンサを用いる電気化学的測定方法において常套的に使用される、参照電極としても作用する対極ならびに極電間に所定の電位差を形成し、また、反応により生じる電流量を測定する、印加および電流測定装置を組み合わせて、測定試料中の特定基質の濃度測定方法に使用できる。場合により、参照電極を対極から独立した電極としてもよい。本発明のバイオセンサ以外の要素、例えば対極ならびに印加および電流測定装置については、当業者には周知であり、これ以上の説明は不要である。
【００２２】
本発明において、ニッケロセン誘導体とは、ニッケロセン（（Ｃ5Ｈ5）2Ｎｉ）の誘導体をも含む意味で使用する。この誘導体としては、例えば、１，１’−ジカルボキシレートニッケロセン、モノカルボキシレートニッケロセン、ジメチルアミノメチルニッケロセン、ヒドロキシメチルニッケロセンのようなものを例示できる。ニッケロセンまたはその誘導体は、単独で、または種々の混合物で使用できる。
【００２３】
ニッケロセンまたはニッケロセン誘導体を電気化学的測定方法におけるメディエータ化合物として使用する場合、約−３００ｍＶ〜＋１００ｍＶの範囲、特に約−１００ｍＶの参照電極に対する作用電極の電位にてメディエータとして最も効率的に機能する、即ち、最も多くの電子を伝達できる（従って、応答電流値（即ち、上記反応（３）または（３）’あるいは（６）により伝達される電気量）が大きい）ことが判った。この電位は、アスコルビン酸の（最低）酸化電位（約＋２００ｍＶ）より低く、かつ、酸素の（最高）還元電位（約−４００ｍＶ）より高いため、このような範囲の電位にて電気化学的方法を実施する場合、測定試料中に電気化学的測定方法妨害物質が共存する場合であっても、これらの物質は電気化学的には実質的に反応せず、従って、特定基質の濃度を測定するための電気化学的測定方法はこれらの物質の悪影響を受けない。
【００２４】
本発明のバイオセンサに使用する酸化還元酵素は、特定基質を酸化または還元できる酵素であれば、特に限定されるものではなく、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクトースデヒドロゲナーゼ、パイルベート（phyruvate）デヒドロゲナーゼ、マレイト（malate）デヒドロゲナーゼ、グルタメイト（glutamate）デヒドロゲナーゼを例示できる。
【００２５】
従って、本発明のバイオセンサを用いる電気化学的測定方法により測定できる特定基質は、上記酸化還元酵素により酸化または還元されるものであれば特に限定されるものではない。例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合には、特定基質はグルコースであり、他の組み合わせとして、コレステロールとコレステロールオキシダーゼ、尿素とウリカーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼまたはラクトースデヒドロゲナーゼ、アルコールとアルコールオキシダーゼ、ピルビン酸とパイルベートデヒドロゲナーゼ、マレイン酸とマレイトデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸とグルタメイトデヒドロゲナーゼを例示できる。
【００２６】
本発明において、カーボン電極材料とは、電極として使用できるカーボンまたはカーボンと他の材料の組み合わせ、例えば組成物である。好ましい１つの態様では、カーボン電極材料は、カーボン粒状物、例えば微粒状物である。粒状物のカーボンを使用する場合、カーボン粒状物の導電性が高い上に、他の材料、例えば粉末、粒状材料と混合して組み合わせ易いこと、成形が容易であることのような利点がある。特に平均直径が約１０μｍのものを使用するのが好ましい。
また、より好ましい態様では、カーボン粒状物は、ペースト状で使用する。ペースト状とするために、使用するペースト化剤は、特に限定されるものではないが、例えばパラフィン、ヌジョール、ワックス、エポキシ樹脂、シリコーンゴムを使用できる。カーボン粒状物をペースト状とすることにより、電極としての成形が容易になることに加えて、センサの使用時にカーボン粒状物、ニッケロセン、酸化還元酵素および場合により存在する他の物質が測定試料中に分散し易い傾向を抑制することが可能となる。
【００２７】
本発明のバイオセンサにおいて、カーボン電極材料は、白金粒状物、特に微粒状物を含むのが好ましい。この白金粒状物は、カーボンのみを電極材料として使用する場合よりも大きい応答電流を得ることができる、また、応答電流のピーク値が電位が低くなる方向にシフトするという作用を有する。このような白金粒状物は、その平均寸法が約０．３〜２．５μmであるのが好ましく、また、カーボン粒状物より小さいのが特に好ましい。このような特定の白金粒状物を用いると上述の白金粒状物の作用が一層顕著になる。
【００２８】
第２の要旨において、本発明は、液体である測定試料中に存在する特定基質の量（従って、その濃度）を電気化学的測定方法により測定するための装置であって、作用電極としての上述の本発明のバイオセンサ、対極およびこれらの電極間に所定の電位差を印加して生じる電流量を測定する装置を有して成る測定装置を提供する。
【００２９】
好ましい態様において、本発明の測定装置は、対極から独立した参照電極を更に有して成り、作用電極と参照電極との間に所定の電位差にて印加した場合に生じる電流量として、作用電極と対極との間で流れる電流量を測定する装置を提供する。このような測定装置の構成を模式的に図１に示す。
【００３０】
図１において、本発明の測定装置１０は、作用電極としての本発明のバイオセンサ１２、参照電極１４および対極１６を有して成り、これらの電極は、リード１８によりポテンショスタット２０およびレコーダ２２に接続されている。これらの電極は、所定の容器２４中に入れられた、基質濃度を測定すべき試料２６中に浸けられ、試料はスターラにより撹拌してよい。容器２４は、恒温槽２８内に配置されている。別法では、参照電極と対極とを一体としてもよい。
【００３１】
本発明の測定装置１０において、作用電極としてのバイオセンサ１２以外は、当業者には周知の構成であり、また、作用電極１２については、上述の本発明のバイオセンサの説明が当てはまる。
【００３２】
第３の要旨において、本発明は、上述の本発明の測定装置を用いて、測定電極と参照電極との間に−４００〜＋２００ｍＶ、好ましくは−３００〜＋１００ｍＶの電位差を印加して、測定試料中の特定基質の濃度を電気化学的方法により測定する方法を提供する。
【００３３】
本発明の測定方法において、バイオセンサ１２以外は、当業者には周知のものであり、また、測定方法に使用する測定装置、特に作用電極１２およびについては、上述の本発明のバイオセンサおよびそれを用いる測定装置の説明が当てはまる。本発明の測定方法においては特定基質の濃度が既知の種々の標準試料について、上述の本発明の測定装置を用いて、応答電流の基質濃度依存性を予め検量線として求めておき、その後、特定基質濃度が未知の試料について同様の測定を実施して応答電流値を得、この電流値から検量線に基づいて試料中の特定基質濃度を求める。
【００３４】
【実施例】
実施例１（バイオセンサおよび測定装置の作製）
以下の成分：
（ａ）カーボンペースト（カーボン粒状物（グラファイト）の平均粒径１０μｍ、カーボン：ナカライテスク社製、パラフィン：メルク社製）
（ｂ）グルコースオキシダーゼ
（ｃ）白金粒状物（平均粒径０．３〜２．５μｍ、田中貴金属社製、商品名：ＡＹ−１０１０）
（ｄ）ニッケロセン（東京化成社製）
を（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）＝７：１：１：１の重量比で室温にて十分混練して作用電極用ペーストを得た。
【００３５】
このペーストを成形して作用電極としての本発明のバイオセンサを作製した。作製したバイオセンサをガラス管に入れ、その端部にて電極が露出するようにした。また、電極の露出面の他方の端部は、リード線を介してポテンショスタットに接続した。
【００３６】
また、参照電極として銀／塩化銀電極、対極として白金電極を用い、これらも同様にポテンショスタットに接続して、図１に示す本発明の電気化学的測定方法に使用する測定装置１０を得た。
【００３７】
実施例２（メディエータの応答電流の測定）
実施例１にて作製した装置を使用して酸化ピークを微分ポーラログラフィで測定することにより、メディエータの応答電流特性を評価した。
【００３８】
本実施例および後述の他の実施例の全てにおいて、電気化学的測定方法は、実施例１にて作製した測定装置１０を用いて、三種の電極を用いた３電極系において行った。測定に際して、作用電極１２の参照電極１４に対する電位を一定に保ちながら、作用電極１４と対極１６との間に流れる電流量（応答電流量）を測定した。測定の対象となる液体試料は、スターラーで撹拌され、また、３０℃の恒温槽に浸けて温度を一定に保つようにした。
【００３９】
本実施例において、測定試料として１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いた。本実施例において使用した電極（電極Ａ）は、ピークを明確にするためにグルコースオキシダーゼを含まないこと、また、白金粒状物も含まないことを除いて、実施例１と同様の組成にて作製した電極と同様の電極である。
【００４０】
比較のため、ニッケロセンに代えてフェロセンを使用したこと以外は、上記のグルコースオキシダーゼおよび白金粒状物を含まない電極（電極Ｂ）、ならびにグルコースオキシダーゼ、白金粒状物およびメディエータ化合物を全く用いないで（従って、カーボンペーストのみで）作製した電極（電極Ｃ）を用いて同様の測定を実施した。
【００４１】
図２に測定結果を示す。図２において、ニッケロセンを用いた電極（電極Ａ）の測定結果をＣＰ＋Ｎｉｃにより、フェロセンを用いた電極（電極Ｂ）の測定結果をＣＰ＋Ｆｃにより、また、メディエータ化合物を使用しない電極の測定結果をＣＰ（電極Ｃ）により示している。
【００４２】
図２から、明らかなように、電極Ｂの酸化ピークは約＋３００ｍＶ付近の参照電極に対する作用電極の電位にあるのに対して、電極Ａの場合は酸化ピークは−１００ｍＶ付近にあり、しかも応答電流が大きいことが判る。また、電極Ｃでは、シャープなピークは存在せず、また、応答電流の絶対値も他の２つに比べて相当小さいことが判る。これらの結果は、ニッケロセンをメディエータ化合物として用いる場合、フェロセンと比較してはるかに低い電位でメディエータとして機能し、また、カーボンよりはるかに大きい応答電流を発生することを示している。
【００４３】
酸素の影響もアスコルビン酸の影響も受けない特定基質の測定には、従来技術の説明から明らかなように−４００〜＋２００ｍＶの電位範囲において大きい絶対値の応答電流を生じることが望ましいので、ニッケロセンがメディエータ化合物として非常に望ましく機能し得ることを示している。
【００４４】
実施例３（白金粒状物の影響の測定）
実施例１にて作製したバイオセンサ（白金粒状物含有量：電極を構成する組成物全体の重量基準で１０％）およびそれを有する図１の測定装置を用いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中にグルコースが５ｍＭ含まれるように調製した水溶液について、実施例２と同様に電位の変化に対する応答電流の変化（応答電流の電位依存性）を測定した。
また、比較のため、白金粒状物を全く含まない以外は、実施例１と同じ電極についても同様の測定を実施した。
【００４５】
これらの測定結果を図３に示す。図３から、明らかなように、白金粒状物を含有する電極を使用する場合、白金粒状物を含まない場合と比較して、全電位範囲において大きな応答電流を生じ、また、応答電流値のピークはより低い電位側にシフトすることが判る。白金粒状物を含むことによって、応答電流の絶対値が大きくなることは、測定感度が向上することを意味し、望ましい傾向である。
【００４６】
実施例４（グルコース濃度の測定）
種々のグルコース濃度の水溶液（１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を含む）を調製し、実施例１にて説明した作用電極としての本発明のバイオセンサにおいて白金粒状物の含有率を種々に変更し（電極を構成する組成物全体の重量基準で白金粒状物が０％、１％、５％、１０％、他の成分は、実質的に実施例１と同じ割合）および実施例１にて説明した測定装置を用いて、応答電流のグルコース濃度依存性を測定した。尚、印加電位は−２００ｍＶとした。
【００４７】
測定結果を図４に示す。この結果から明らかなように、いずれの白金含有率の場合であっても、電極からの応答電流は、グルコース濃度に対する明らかな依存性を示し、また、白金含有率がある程度大きい場合、大きいほど応答電流が大きくなることが判る。従って、本発明のバイオセンサは、アスコルビン酸が酸化されず、酸素が還元されないような低電位でも十分にセンサとして機能し得ること、また、基本的には白金含有率を大きくするほど、応答電流が大きくなることが判る。
【００４８】
実施例５（血清中のグルコース濃度の測定）
実施例４と同様に、本発明の電極の応答電流の血清中のグルコース濃度依存性を測定した。測定に使用した電極は、実施例１と同様の材料を使用し、カーボンペースト：グルコースオキシダーゼ：ニッケロセン：白金が７：１：１：１（重量比）の組成物を十分に混合した電極材料から形成した。尚、印加電位は−２００ｍＶとした。
【００４９】
測定結果を図５に示す。実施例４と同様に、電極の応答電流は血清中のグルコース濃度に対して明らかな依存性を示し、従って、血清を測定試料とする場合であっても、アスコルビン酸が酸化されず、酸素が還元されないような電位でも本発明の電極は、十分にセンサとして機能し得ることが判る。
【００５０】
実施例６（センサの応答時間の検討）
実施例５と同じ装置を用いて、同じ条件にて本発明のバイオセンサの応答時間について検討した。応答時間を評価するために、グルコース濃度４．６ｍＭの状態で応答電流値を安定化させた後に、濃グルコース溶液を加えて、グルコース濃度が１０．５ｍＭとなるようにし、その後、濃グルコース溶液を更に加えて、最終のグルコース濃度が１６．５ｍＭとなるようにした。
この時の、応答電流の時間的変化を図６に示す。この結果から、本発明のバイオセンサが十分短い応答時間（図示した場合では、約１０秒以下）で作動していることが判る。
【００５１】
実施例７（アスコルビン酸の影響の検討）
実施例６と同様の条件で、測定を実施した。測定試料（４．８ｍＭのグルコースを含むコントロール血清（和光純薬社製）５ｍｌについて測定を開始し、電流値が安定した後、１Ｍアスコルビン酸溶液２５μｌを追加して試料全体としてアスコルビン酸濃度が５ｍＭとなるようにし、応答電流の変化を確認した後、１Ｍグルコース溶液２５μｌを追加して試料全体としてグルコース濃度が９．８ｍＭとなるようにした。
【００５２】
図７に測定結果を示す。この結果から明らかなように、アスコルビン酸溶液を加えても、応答電流は実質的に変化しない。これは、本発明のバイオセンサは、アスコルビン酸の影響を受けないでグルコース濃度を測定できることを意味する。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のバイオセンサ、測定装置および測定方法を使用することにより、測定試料中に共存する酸素の影響もアスコルビン酸の影響も受けないような電位で溶液中の特定基質、特に体液中のグルコース濃度を測定することができる。その結果、酸素の影響やアスコルビン酸の影響を回避するために従来技術において採用さられていた構成（例えば特定の膜の使用）が不要となる。また、そのような構成の影響による測定値のばらつきをなくすことができる。このことによって、従来よりも、より正確な測定値を迅速に得られるバイオセンサを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のバイオセンサを使用した本発明の測定装置の構成を模式的に示す概略図である。
【図２】  本発明のバイオセンサの酸化ピークを微分ポーラログラフィにより測定した結果を、フェロセンを使用する場合およびメディエータを使用しない場合と比較した図である。
【図３】  本発明のバイオセンサにおいて白金粒状物を加える効果を示す図である。
【図４】  本発明のバイオセンサを使用して水溶液中のグルコース濃度を測定した結果を示す図である。
【図５】  本発明のバイオセンサを使用して血清中のグルコース濃度を測定した結果を示す図である。
【図６】  本発明のバイオセンサを使用した場合の応答時間を評価する図である。
【図７】  本発明のバイオセンサを使用した場合のアスコルビン酸の影響を示す図である。
【符号の説明】
１０…電気化学的方法による測定装置、１２…作用電極、１４…参照電極、１６…対極、１８…リード、２０…ポテンショスタット、２２…レコーダ、２４…容器、２６…測定試料、２８…恒温槽。
【図１】
0003885121.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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