(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｅ）前記シグナル閾値を超えるサイクル数の関数として、増幅に使用された標的核酸のコピー数の対数の非線形連続微分可能関数を決定する工程、ならびに
ｆ）工程ｅ）で決定した関数から増幅効率Ｅを計算する工程、
を含む、標的核酸の増幅効率の決定方法。
【請求項２】
ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｅ）増幅に使用された標的核酸のコピー数の対数の関数として、工程ｄ）で決定したサイクル数の非線形連続微分可能関数を決定する工程、ならびに
ｆ）工程ｅ）で決定した関数から増幅効率Ｅを計算する工程、
を含む、標的核酸の増幅効率の決定方法。
【請求項３】
増幅効率Ｅを工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数の負の局所１次導関数として決定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
増幅効率Ｅを工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数の局所１次導関数の逆数として決定する請求項２記載の方法。
【請求項５】
工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数を３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットを用いて決定する請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
増幅された核酸を少なくとも１つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出する請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
増幅された核酸をＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブを用いて検出する請求項６記載の方法。
【請求項８】
増幅された核酸をＤＮＡ結合性色素を用いて検出する請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項９】
ａ）予め選択した増幅条件下での標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率をそれぞれの初期量の関数として、シグナル閾値を超える時のサイクル数の関数としての、増幅に使用した標的核酸コピー数の対数の非線形連続微分可能関数、またはそれぞれの場合に使用した標的核酸コピー数の対数の関数としての、決定されたサイクル数の非線形連続微分可能関数から決定する工程、
ｂ）工程ａ）と同じ反応条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、ならびに
ｄ）工程ｃ）で得られたコピー数を、工程ａ）で決定した増幅効率を用いて補正することにより、試料中の初期コピー数を計算する工程、
を含む、試料中の標的核酸の絶対定量方法。
【請求項１０】
ａ）予め選択した増幅条件下における標的核酸の増幅効率および参照核酸の増幅効率をそれぞれの初期量の関数として、シグナル閾値を超える時のサイクル数の関数としての、増幅に使用した標的核酸コピー数の対数の非線形連続微分可能関数、またはそれぞれの場合に使用した標的核酸コピー数の対数の関数としての、決定されたサイクル数の非線形連続微分可能関数から決定する工程、
ｂ）工程ａ）と同じ増幅条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および試料に含まれる参照核酸の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸の増幅および参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得た比を、工程ａ）で決定した増幅効率を用いて補正することにより、試料中の標的核酸と参照核酸との初期比を計算する工程、
を含む、参照核酸と比較した試料中の標的核酸の定量方法。
【請求項１１】
ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて規定した前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）使用した標的核酸量の対数の関数として、工程ｄ）で決定したＣｐ値の非線形連続微分可能関数を決定し、かつ使用した参照核酸量の対数の関数として、決定したＣｐ値の非線形連続微分可能関数を決定する工程、
ｆ）解析対象の試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸のＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を、工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を決定する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た２つの商の比を、試料に含まれる標的核酸の初期量に関する尺度として決定する工程、
を含む、較正試料を用いて標準化する、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法。
【請求項１２】
ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて規定した前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で決定したＣｐ値の関数として、使用した標的核酸量の対数の非線形連続微分可能関数を決定し、かつ決定したＣｐ値の関数として、使用した参照核酸量の対数の非線形連続微分可能関数を決定する工程、
ｆ）解析対象である試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸のＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を計算する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た２つの商の比を、試料中に含まれる標的核酸の初期量に関する尺度として決定する工程、
を含む、較正試料を用いて標準化する、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法。
【請求項１３】
工程ｅ）で得た連続微分可能関数を３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットを用いて決定する請求項１１〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
増幅された核酸を少なくとも１つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出する請求項９〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１５】
増幅された核酸をＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブを用いて検出する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
増幅された核酸をＤＮＡ結合性色素を用いて検出する請求項９〜１２いずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、定量的リアルタイムＰＣＲ法による核酸定量の分野に関する。詳しくは、核酸増幅効率の決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸定量方法は分子生物学の多くの領域で、また特に分子診断にとって重要である。これらの方法は例えばゲノム内で増幅される遺伝子配列のコピー数をＤＮＡレベルで決定するために使用される。しかし、核酸定量方法はとりわけｍＲＮＡ量の決定との関連で使用される。なぜなら、通常これが各コード遺伝子の発現の尺度だからである。
【０００３】
十分量の試料を利用できる場合は、ノーザンブロット解析やＲＮアーゼプロテクションアッセイなどの従来の方法によって特定のｍＲＮＡを定量できる。しかし、これらの方法の感度は少量しか利用できない試料や極めて弱く発現する遺伝子には十分でない。
【０００４】
いわゆるＲＴ−ＰＣＲは、はるかに感度の高い方法である。この方法ではまず、解析対象であるｍＲＮＡから逆転写酵素を使って一本鎖ｃＤＮＡが作成される。次に、ＰＣＲを使って二本鎖ＤＮＡ増幅産物が作成される。
【０００５】
この方法では次の２種類の変法が区別される：
（１）いわゆる相対定量方法では、いわゆるハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ量に対して、ある標的ＲＮＡの発現量の比が決定される。ハウスキーピング遺伝子は個々の生理状態とは無関係に全ての細胞で構成的に発現されると考えられ、したがって、そのｍＲＮＡは全ての細胞にほぼ同じ量で存在する。
【０００６】
この方法の利点は、様々な試料の初期品質の相違およびＲＮＡ調製の方法がその特定の結果に影響を及ぼさないということである。しかし、この方法では絶対定量は不可能である。
【０００７】
（２）一方、既知コピー数の標準核酸と、この標準核酸の対応する希釈系列の増幅とを使って、使用するＲＮＡの絶対量を決定することができる。これには次の２つの選択肢がある：
【０００８】
外部標準を使用する場合は、標準核酸と標的核酸とを別個の反応容器で増幅する。この場合は、標的核酸と同一の配列を持つ標準核酸を使用することができる。しかし、このタイプの定量方法では、解析対象であるＲＮＡ調製物がその後のＰＣＲ反応の効率を損ねる阻害成分を含有すると、系統誤差が生じうる。そのような誤差は内部標準を使用することによって、すなわち標準核酸と標的核酸とを１つの反応容器中で増幅することによって排除できる。しかし、この方法の短所は、標準核酸の増幅と標的核酸の増幅とを識別できるように、解析対象である標的核酸と比較して異なる配列を持つ標準核酸を使用する必要があるということである。これも定量における系統誤差につながりうる。なぜなら、配列が異なる場合はＰＣＲ増幅効率の相違を排除することができないからである。
【０００９】
ＰＣＲ産物は根本的に異なる次の２つの方法によって定量できる：
ａ）増幅反応のプラトー期でのＰＣＲ産物生成量の終点決定
この場合、反応終点での核酸の増幅はもはや指数的ではなく飽和に達しているので、ＰＣＲ産物の生成量は初期コピー数の量とは相関しない。その結果、異なる初期コピー数でも同じＰＣＲ産物生成量を示す。したがって、通常この方法では競争的ＰＣＲ法または競争的ＲＴ−ＰＣＲ法が使用される。これらの方法では特異的標的配列が既知コピー数の内部標準の希釈系列と共に同時増幅される。標的配列の初期コピー数は同じＰＣＲ産物量の標準および標的配列を含有する混合物から外挿される（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＭａｎｎｈａｌｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１：２８０−２７９、１９９６）。この方法の短所も測定が増幅反応の飽和領域で行なわれることである。
【００１０】
ｂ）ＰＣＲの指数期での速度論的リアルタイム定量
この場合、ＰＣＲ産物の生成はＰＣＲの各サイクル毎にモニターされる。増幅は通常、増幅反応中に蛍光シグナルを測定するための追加装置を備えたサーマルサイクラー中で測定される。この装置の代表例はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（カタログ番号２  ０１１０４６８）である。増幅産物は、例えば標的核酸に結合した場合にのみ蛍光シグナルを発する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを使って、またある場合には二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を使って検出される。解析対象である全ての反応について所定のシグナル閾値を決定し、この閾値に達するのに必要なサイクル数Ｃｐを標的核酸および参照核酸（標準遺伝子またはハウスキーピング遺伝子など）について決定する。標的分子の絶対的または相対的コピー数は標的核酸および参照核酸について得られたＣｐ値に基づいて決定できる（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１；Ｂｉｅｃｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：２７５９−２７６５、１９９９；国際公開第９７／４６７０７号パンフレット；国際公開第９７／４６７１２号パンフレット；国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。このような方法はリアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。
【００１１】
要約すると、上述したＰＣＲによる核酸定量方法では、どの方法でも、増幅反応中に形成されるコピー数が常に標準またはハウスキーピング遺伝子のＲＮＡである参照核酸の生成コピー数に関係づけられる。これに関連して、標的核酸と参照核酸のＰＣＲ効率は相違しないと仮定されている。
【００１２】
通常は１ＰＣＲサイクルにつきコピー数の倍増に相当する２．００のＰＣＲ効率が仮定される（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  ２  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９９７）。
【００１３】
しかし、ＰＣＲ効率はプライマーの結合、ＰＣＲ産物の長さ、増幅対象の核酸のＧ／Ｃ含量および二次構造ならびに試料調製の結果として反応混合物中に存在しうる阻害因子などといった様々な要因による影響を受けるので、真のＰＣＲ効率は２．００とは相違しうることが判明した。このことは、例えばハウスキーピング遺伝子の発現量との比較による相対定量に際して非相同参照核酸を使用する場合に、とりわけ問題になる。さらにまた、検出対象の標的核酸の初期濃度が増幅反応の効率に有意な影響を及ぼすかどうかまたはどの程度の影響を及ぼすかもわかっていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、核酸増幅の効率を可能な限り正確に決定する方法と、核酸の最も正確であろう定量方法におけるその使用とを提供することであった。すなわち、本発明は、標的核酸の増幅効率の決定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、増幅反応の効率を前記方法により決定し、定量に考慮する試料中の標的核酸の定量方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば上記の目的は、
ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、標的核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｅ）標的核酸の初期（original）量の関数として増幅効率を決定する工程、
を含む標的核酸の増幅効率の決定方法によって達成される。
【００１６】
なお、本発明の方法において、核酸の増幅条件は、用いる核酸に応じて任意に選択することができる。
【００１７】
したがって増幅効率は、シグナル閾値を超えるサイクル数の関数として、増幅に使用した標的核酸コピー数の対数の非線形連続微分可能関数を作成することによって決定することができ、増幅効率Ｅはこの関数から標的核酸量の関数として計算される。この態様では、ある量の標的核酸の増幅効率Ｅは、工程ｅ）で得られる連続微分可能関数の負の局所一次導関数として決定されることが好ましい。
【００１８】
あるいは、増幅に使用した標的核酸のコピー数の対数の関数として、決定されたサイクル数の非線形連続微分可能関数を作成し、決定された関数から増幅効率Ｅを計算することによって、増幅効率を決定することもできる。この場合、ある量の標的核酸の増幅効率Ｅは、工程ｅ）で得られる連続微分可能関数の負の局所一次導関数の逆数として決定されることが好ましい。
【００１９】
多項式フィットを使って非線形連続微分可能関数を決定し、増幅効率が標的核酸濃度の対数の関数として決定される方法またはその逆の方法は、特に有益であることが明らかになった。これは３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットであってよく、４次の多項式フィットが好ましい。
【００２０】
したがって、本発明の一態様である試料中の標的核酸を定量するための方法は以下の工程からなる：
ａ）予め選択した条件下における標的核酸の増幅効率を本発明に従って決定する工程、
ｂ）上と同じ反応条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅を行なう工程、
ｃ）上記の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた量を、決定した増幅効率を使って補正することにより、試料中の標的核酸の初期量を定量する工程。
【００２１】
これらの方法は絶対定量だけでなく、ハウスキーピング遺伝子の発現量との比較による相対定量にも使用できる。
【００２２】
本発明によれば試料中の標的核酸の絶対定量方法は以下の工程からなる：
ａ）予め選択した増幅条件下における標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率を本発明に従って決定する工程、
ｂ）上と同じ反応条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたコピー数を、工程ａ）で決定した増幅効率を使って補正することにより、試料中の初期コピー数を計算する工程。
【００２３】
これに対し、参照核酸と比較した試料中の標的核酸の定量方法は以下の工程からなる：
ａ）予め選択した増幅条件下における標的核酸の増幅効率および参照核酸の増幅効率を本発明に従って決定する工程、
ｂ）上と同じ増幅条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および試料に含まれる参照核酸の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸の増幅および参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得た比を、工程ａ）で決定した増幅効率を使って補正することにより、試料中の標的核酸と参照核酸との初期比を計算する工程。
【００２４】
また本発明は、増幅効率の決定が、定量結果に、特に初期濃度に依存する定量結果に、間接的にのみ使用される全ての方法に関する。この意味で本発明は特に、較正試料を基準として標準化される、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法であって、以下の工程からなる方法に関する：
ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で決定したＣｐ値の関数として、使用した標的核酸量の対数の連続微分可能関数を決定し、かつ決定したＣｐ値の関数として、使用した参照核酸量の対数の連続微分可能関数を決定する工程、
ｆ）解析対象である試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸のＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を、工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を決定する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た商の比を、試料に含まれる標的ＤＮＡの初期量に関する尺度として決定する工程。
【００２５】
すなわち、本発明は、
〔１〕  ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ならびに
ｅ）標的核酸の初期量の関数として増幅効率を決定する工程、
を含む、標的核酸の増幅効率の決定方法、
〔２〕  ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｅ）前記シグナル閾値を超えるサイクル数の関数として、増幅に使用された標的核酸のコピー数の対数の非線形連続微分可能関数を決定する工程、ならびに
ｆ）工程ｅ）で決定した関数から増幅効率Ｅを計算する工程、
を含む、標的核酸の増幅効率の決定方法、
〔３〕  ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）標的核酸を予め選択した反応条件下で増幅する工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｅ）増幅に使用された標的核酸のコピー数の対数の関数として、工程ｄ）で決定したサイクル数の非線形連続微分可能関数を決定する工程、ならびに
ｆ）工程ｅ）で決定した関数から増幅効率Ｅを計算する工程、
を含む、標的核酸の増幅効率の決定方法、
〔４〕  増幅効率Ｅを工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数の負の局所１次導関数として決定する前記〔２〕記載の方法、
〔５〕  増幅効率Ｅを工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数の局所１次導関数の逆数として決定する前記〔３〕記載の方法、
〔６〕  工程ｅ）で得た非線形連続微分可能関数を３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットを用いて決定する前記〔２〕〜〔５〕いずれか記載の方法、
〔７〕  ａ）予め選択した増幅条件下での標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率を決定する工程、
ｂ）工程ａ）と同じ反応条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、ならびに
ｄ）工程ｃ）で得られたコピー数を、工程ａ）で決定した増幅効率を用いて補正することにより、試料中の初期コピー数を計算する工程、
を含む、試料中の標的核酸の絶対定量方法、
〔８〕  ａ）予め選択した増幅条件下における標的核酸の増幅効率および参照核酸の増幅効率を決定する工程、
ｂ）工程ａ）と同じ増幅条件下で試料に含まれる標的核酸の増幅および試料に含まれる参照核酸の増幅を行なう工程、
ｃ）標的核酸の増幅および参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得た比を、工程ａ）で決定した増幅効率を用いて補正することにより、試料中の標的核酸と参照核酸との初期比を計算する工程、
を含む、参照核酸と比較した試料中の標的核酸の定量方法、
〔９〕  ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて規定した前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）使用した標的核酸量の対数の関数として、工程ｄ）で決定したＣｐ値の連続微分可能関数を決定し、かつ使用した参照核酸量の対数の関数として、決定したＣｐ値の連続微分可能関数を決定する工程、
ｆ）解析対象の試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸のＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を、工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を決定する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た２つの商の比を、試料に含まれる標的核酸の初期量に関する尺度として決定する工程、
を含む、較正試料を用いて標準化する、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法、
〔１０〕  ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて規定した前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で決定したＣｐ値の関数として、使用した標的核酸量の対数の連続微分可能関数を決定し、かつ決定したＣｐ値の関数として、使用した参照核酸量の対数の連続微分可能関数を決定する工程、
ｆ）解析対象である試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸のＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を計算する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た２つの商の比を、試料中に含まれる標的核酸の初期量に関する尺度として決定する工程、
を含む、較正試料を用いて標準化する、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法、
〔１１〕  工程ｅ）で得た連続微分可能関数を３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットを用いて決定する前記〔９〕〜〔１０〕いずれか記載の方法、
〔１２〕  増幅された核酸を少なくとも１つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出する前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、
〔１３〕  増幅された核酸をＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブを用いて検出する前記〔１２〕記載の方法、ならびに
〔１４〕  増幅された核酸をＤＮＡ結合性色素を用いて検出する前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、
に関する。
【００２６】
【発明の実施の形態】
Ａ）標的依存性効率補正の要件
定量的核酸増幅方法にとって効率補正が重要であることを誤差の計算によって例証する。表１は、各サイクル数に関して増幅効率が２．００でない場合に、決定されるコピー数の平均誤差率の理論的計算値を表す。誤差は次式に従って計算される：
【００２７】
【数１】
0004022600.tif 000002
【００２８】
【表１】
0004022600.tif 000003
【００２９】
ＰＣＲ反応の増幅効率は様々な方法によって決定できる。
【００３０】
例えばＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングの場合、これは、各増幅サイクルで増幅される標的核酸の量を決定し、得られた値から増幅反応の効率を決定することによって達成できる。
【００３１】
あるいは、特定の標的の増幅反応の効率は、その標的核酸の様々な希釈物をまず増幅し、各希釈物について予め確定しておいたシグナル閾値を超えるサイクル数を決定することにより、予め選択した条件下におけるリアルタイムＰＣＲ法で決定することができる。
【００３２】
次に、各コピー数について決定されたサイクル数に対する使用コピー数の対数の関数の傾きから、効率が決定される。この方法の利点は、標的核酸の指数的増幅がもはや起こっていないＰＣＲ反応の局面（プラトー期）での増幅効率を決定することに起因する系統誤差が起こりえないことである。
【００３３】
しかし意外なことに一定の状況では増幅効率が標的核酸の初期量にも依存しうることが明らかになった。増幅効率の明らかな変化は、対応する実験調製物において、特に低濃度で認められる。その結果、上記の効率決定方法では線形関数が得られないので、その場合は例えば上述した回帰直線の傾きの決定では、決定される増幅効率の値が、特に低濃度の標的核酸では低すぎることになるだろう。
【００３４】
増幅効率は標的核酸の濃度に依存するので、増幅反応の初期サイクル中はまだ指数期にあるが、それでも既に増幅効率の変化を除外することは不可能である。しかしこの現象は検出感度の不足が理由で直接実験的に解析することはできないので、以下の説明では濃度依存性増幅効率とは各検出時点での経過サイクル数によって決定される増幅効率と理解される。
【００３５】
Ｂ）絶対定量と相対定量
したがって本発明は、核酸の効率補正定量方法であって、増幅効率が、
ａ）標的核酸の希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸を増幅する工程、ここで、標的核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）シグナル閾値を設定する工程、
ｄ）各希釈物について前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを決定する工程、ならびに
ｅ）増幅効率を標的核酸量の関数として決定する工程、
から決定される方法に関する。
【００３６】
特に増幅効率は、
（１）シグナル閾値を超える時のサイクル数の関数としての、増幅に使用した標的核酸コピー数の対数の非線形連続微分可能関数、またはそれぞれの場合に使用した標的核酸コピー数の対数の関数としての、決定されたサイクル数の非線形連続微分可能関数と、
（２）決定された関数から増幅効率Ｅを計算することにより、
標的核酸の初期量の関数として決定することができる。個々の増幅効率は、本発明により各々の場合に使用される標的核酸の量の関数として決定される。
【００３７】
連続関数は適切な数学的方法とアルゴリズムによって決定される。例えば関数は高次の多項式フィットによって記述することができる。関数を計算するには３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットが適しており、４次の多項式フィットが好ましいことが明らかになった。
【００３８】
標的量に依存する効率は、初期コピー数の対数の関数としてのＣｐ値の連続微分可能関数Ｆ（Ｃｐ）の導関数またはその逆によって決定できる。
【００３９】
その場合、増幅効率は次式に従って決定できる：
【００４０】
【数２】
0004022600.tif 000004
【００４１】
したがってこの態様では、ある初期量の標的核酸の増幅効率Ｅが、先に決定した連続微分可能関数の負の局所一次導関数として決定される。
【００４２】
あるいは、増幅効率Ｅを次式に従って決定することもできる：
【００４３】
【数３】
0004022600.tif 000005
【００４４】
したがってこの態様では、ある初期量の標的核酸の増幅効率Ｅは、先に決定した連続微分可能関数の負の局所一次導関数の逆数として決定される。
【００４５】
標的核酸量の関数としての核酸の効率補正定量は原則として絶対定量方法にも相対定量方法にも使用できる。さらにこのような効率補正は、標的核酸と参照核酸に関する検出感度の相違の影響を排除するために、いわゆる較正試料に基づいて相対定量が標準化される方法でも特に有益である（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【００４６】
試料中の検出対象の標的核酸の絶対量を決定しようとする場合、本発明による試料中の標的核酸定量方法は、以下の工程からなる：
ａ）標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率を、それぞれの初期濃度の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を、上と同じ反応条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたコピー数を、工程ａ）で決定した増幅効率を使って補正することにより、試料中の初期コピー数を計算する工程。
【００４７】
標的核酸の配列と標準核酸の配列は実質的に同一であることが有利である。しかし内部標準の配列を選択する場合、利用可能な検出系が標準と標的核酸とを識別できることを考慮しなければならない。例えばこれは、標的核酸と内部標準の検出に異なる標識を持つハイブリダイゼーションプローブを使用することによって達成できる。これには、点突然変異などの最低限の配列相違を識別するために使用できるオリゴヌクレオチドを検出プローブとして使用することが理想的である。
【００４８】
内部標準を使用することの利点は、試料中に存在する阻害因子が標準の増幅にも影響することである。したがって増幅効率の相違を最小にすることができる。
【００４９】
これに対して外部標準の使用には、標的核酸と標準の増幅反応がその効率に関して互いに競争的に干渉し合うことがあり得ないという利点がある。さらにまた、標準の増幅生成物と標的核酸の増幅生成物を並行反応混合物中で、同じ検出系を使って、例えば同じハイブリダイゼーションプローブを使って検出することができる。短所は、試料中の阻害因子によるＰＣＲ効率の相違が考えられることである。しかしこれによって起こる定量誤差は本発明の効率補正によって排除することができる。
【００５０】
相対定量に関する本発明の主題は、参照核酸と比較した試料中の標的核酸の定量方法であって、以下の工程を含む方法である：
ａ）標的核酸の増幅効率と参照核酸の増幅効率を、それぞれの初期濃度の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅と試料に含まれる参照核酸の増幅とを、上と同じ増幅条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸の増幅と参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた比を、工程ａ）で決定した増幅効率を使って補正することにより、試料中の標的核酸と参照核酸の初期比を計算する工程。
【００５１】
このような本発明の方法は、一方では被験試料中に存在するかもしれない阻害因子の影響を排除し、他方では標的核酸と参照核酸とで増幅効率が異なる結果として起こるかもしれない誤差を補正するものである。
【００５２】
本発明のこの相対定量方法に欠かすことのできない要件は、標的核酸の増幅効率と参照核酸の増幅効率とが、最初に存在した標的核酸量および参照核酸量の関数として決定されることである。これらの決定はどちらも、上述の方法により、一定のシグナル閾値を超えるサイクル数を決定することによって行なわれることが好ましい。
【００５３】
相対定量の好ましい一態様として、試料を２等分し、標的核酸および参照核酸の増幅のリアルタイム測定を別個の反応容器で行なう。これにより、標的核酸の増幅反応と参照核酸の増幅反応とが、例えばデオキシヌクレオチドまたはＴａｑポリメラーゼに関する競争などによってその効率に関して干渉し合うことが防止される。さらに標的核酸と参照核酸とを同じ検出系を使って、例えば同じＤＮＡ結合性色素を使って検出することができる。
【００５４】
もう一つの選択肢として、標的核酸および参照核酸の増幅のリアルタイム測定を、異なる標識がなされたハイブリダイゼーションプローブを使って、同じ反応容器中で１つの試料から行なうこともできる。こうすることで必要なＰＣＲ反応の数を半分にすることができるので、これは少量の試料しか利用できない場合は特に有利である。
【００５５】
工程ｂ）〜ｄ）はいわゆる較正試料を含有する並行混合物で行なうことが有利である。較正試料は、各測定で一定である、所定の比率の標的核酸と参照核酸を含有する試料である。次に、試料と較正試料についてそれぞれ決定された商の比を、試料中の標的核酸の初期量の尺度として決定する。これには、さらに標的核酸と参照核酸との検出感度の相違による他の系統誤差も排除されるという利点がある。このような系統誤差は例えばハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーション特性の相違、また蛍光標識プローブの場合は、励起効率、量子収率またはプローブへの色素のカップリング効率の相違の結果などとして起こりうる。したがって、試験対象の試料と較正試料とは、各実験毎に同じ検出試薬を使って、すなわち同じバッチの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを使って解析しなければならない。
【００５６】
また本発明は特に、検出可能な成分を使って多くの異なる方法で標識することができるハイブリダイゼーションプローブによって増幅産物が検出される、上記効率補正核酸定量方法の態様に関する。
【００５７】
標的核酸の初期量の効率補正決定および増幅効率自体の決定に欠くことのできない条件は、シグナル閾値を設定し、次に各増幅反応について、あるシグナル閾値に達するサイクル数を決定することである。シグナル閾値は先行技術に従って様々な方法で決定できる。
【００５８】
先行技術によればシグナル閾値は例えばバックグラウンドシグナルの統計的分散の一定倍に相当するシグナルとすることができる（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【００５９】
もう一つの選択肢として、シグナル閾値を超えるサイクル数を、いわゆる「フィットポイントアバーブスレショルド（ｆｉｔ  ｐｏｉｎｔ  ａｂｏｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」法（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂ５９−Ｂ６８、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１９９９）に従って決定することもできる。
【００６０】
さらなる一態様として、シグナルの絶対値とは無関係に増幅反応の経過がサイクル数の関数として決定され、次いでｎ次導関数が計算される場合は、閾値を絶対値ではなく相対値として決定することもできる。この場合は、一定の極値の超過を、あるシグナル閾値の超過と定義することができる（欧州特許出願番号００１０６５２３．４）。したがって、この閾値決定方法は例えば蛍光シグナルなどの絶対シグナル強度とは無関係である。したがってこれは、標的核酸と参照核酸とが同じ反応容器中で増幅され異なる蛍光標識を使って検出される態様に特に適している。二次導関数の極大をシグナル閾値の尺度として決定する方法が、ＰＣＲ産物の効率補正定量には特に適していることが明らかになった。
【００６１】
本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーションプローブは通常、増幅反応のアニーリング温度で標的核酸にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡなどの一本鎖核酸もしくはその誘導体またはＰＮＡである。これらのオリゴヌクレオチドは通常２０〜１００ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６２】
標識はその検出形式に応じてオリゴヌクレオチドの任意のリボース基またはリン酸基に導入できる。核酸分子の５’および３’末端の標識が好ましい。
【００６３】
この種類の標識はリアルタイム型の増幅反応で検出されなければならない。これは例えばＮＭＲによって検出できる標識を使って行なうことも原則として可能である（ただしこれに限るわけではない）。
【００６４】
増幅された核酸が少なくとも１つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを使って検出される方法が特に好ましい。
【００６５】
多くの試験法が可能である。以下の３種類の検出形式は本発明との関連で特に適していることが明らかになった：
【００６６】
（ｉ）ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ
この試験形式の場合、増幅された標的核酸の同じ鎖の隣り合った部位に相補的な２本の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを同時に使用する。双方のプローブは異なる蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起すると、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第一成分が吸収されたエネルギーを第二成分に伝達するので、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出対象の標的分子の隣り合った位置に結合すると、第二成分の蛍光放射を測定できる。
【００６７】
もう一つの選択肢として、蛍光標識プライマーと１本の標識オリゴヌクレオチドプローブだけを使用することも可能である（Ｂｅｒｎａｒｄら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３５、１００１−１０７頁（１９９８））。
【００６８】
（ｉｉ）ＴａｑＭａｎハイブリダイゼーションプローブ
１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを２つの成分で標識する。第一成分を適切な波長の光で励起すると、吸収されたエネルギーが蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従っていわゆる消光成分である第二成分に移動する。このハイブリダイゼーションプローブはＰＣＲ反応のアニーリング工程で標的ＤＮＡに結合し、それに続く伸長期にＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光成分と消光成分は空間的に互いに分離されるので、第一成分の蛍光放射を測定することができる。
【００６９】
（ｉｉｉ）分子ビーコン
これらのハイブリダイゼーションプローブも第一成分および消光成分で標識され、これらの標識はそのプローブの両端に位置することが好ましい。プローブの二次構造の結果、両成分は溶液状態では空間的に近傍にある。標的核酸へのハイブリダイゼーション後は、両成分が互いに分離されるので、適切な波長の光による励起後に、第一成分の蛍光放射を測定することができる（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国出願第５，１１８，８０１号）。
【００７０】
標的核酸だけまたは参照核酸もしくは外部標準だけがそれぞれ１つの反応容器で増幅される上記の態様では、二本鎖核酸と相互作用すると適切な波長の光での励起後に対応する蛍光シグナルを放射するＤＮＡ結合性色素によって、各増幅産物を本発明に従って検出することもできる。色素ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（好ましくは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ）およびＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）はこの用途に特に適していることがわかった。これに代えて挿入性色素を使用することもできる。
【００７１】
Ｃ）増幅効率の直接決定による効率補正
絶対定量
試料中の標的核酸の絶対定量に関する好ましい一態様として、本発明の方法は以下の工程からなる：
ａ）標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率を、各初期量の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を上と同じ反応条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）シグナル閾値を決定する工程、
ｅ）標的核酸および標準の増幅中にそれぞれシグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｆ）試料中の標的核酸の初期コピー数Ｎ（Ｔ）0 を次式に従って決定する工程：
【００７２】
【数４】
0004022600.tif 000006
【００７３】
これらの状況では、Ｎ（Ｔ）0 の計算により、
【００７４】
【数５】
0004022600.tif 000007
【００７５】
が得られる。
【００７６】
標的核酸と標準核酸に同じシグナル閾値を設定したので、これは次式にほぼ等しくなる。
【００７７】
【数６】
0004022600.tif 000008
【００７８】
したがって、試料中に存在する標的核酸の初期コピー数は次式に従って計算される。
【００７９】
【数７】
0004022600.tif 000009
【００８０】
これに代わる試料中の標的核酸の絶対定量の一態様として、本発明の方法は以下の工程からなる：
ａ）標的核酸の増幅効率および内部または外部標準の増幅効率を、各初期量の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅および内部または外部標準の増幅を上と同じ反応条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸および標準の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）シグナル閾値を決定する工程、
ｅ）標的核酸および標準の増幅中にそれぞれシグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｆ）試料中の標的核酸の初期コピー数Ｎ（Ｔ）0 を次式に従って決定する工程：
【００８１】
【数８】
0004022600.tif 000010
【００８２】
この場合、標的核酸の増幅効率と内部標準の増幅効率は、一定のシグナル閾値を超えるサイクル数を決定することにより、上記のように決定されることが好ましい。
【００８３】
Ｎ（Ｔ）0 は本発明に従って次のように計算される：
【００８４】
【数９】
0004022600.tif 000011
【００８５】
標的核酸と標準核酸に同じシグナル閾値を設定したので、これは次式にほぼ等しくなる：
【００８６】
【数１０】
0004022600.tif 000012
【００８７】
したがって、試料中に存在する標的核酸の初期コピー数は次式に従って計算される。
【００８８】
【数１１】
0004022600.tif 000013
【００８９】
この方法の短所は、増幅された核酸の量が先行技術で利用できるどの検出系の検出限界よりもさらに低いために、各増幅反応の初期サイクルの効率を決定できないことである。
【００９０】
しかし、ある初期サイクルの効率は、その後のサイクルについて決定される全ての効率の相乗平均Πとして近似することができる。あるいは、ある初期サイクルの決定不可能な効率は、増幅産物が検出可能になった最初のサイクルについて決定される効率に等しいと考えることもできる。
【００９１】
相対定量
本発明による相対定量の特別な一態様は、以下の工程からなる、参照核酸と比較した試料中の標的核酸の定量方法である：
ａ）標的核酸の増幅効率および参照核酸の増幅効率を、各初期量の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅と試料に含まれる参照核酸の増幅を上と同じ増幅条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸および参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）シグナル閾値を決定する工程、
ｅ）標的核酸および参照核酸の増幅の際にそれぞれシグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｆ）試料中の標的核酸および参照核酸の初期比を次式に従って計算する工程：
【００９２】
【数１２】
0004022600.tif 000014
【００９３】
これらの状況では、Ｎ（Ｔ）0 の計算により、
【００９４】
【数１３】
0004022600.tif 000015
【００９５】
が得られる。
【００９６】
標的核酸と標準核酸に同じシグナル閾値を設定したので、これは次式にほぼ等しくなる：
【００９７】
【数１４】
0004022600.tif 000016
【００９８】
したがって、試料中に存在する標的核酸の初期コピー数は次式に従って計算される。
【００９９】
【数１５】
0004022600.tif 000017
【０１００】
これに代わる試料中の標的核酸の相対定量の一態様として、本発明の方法は以下の工程からなる：
ａ）標的核酸の増幅効率および参照核酸の増幅効率を、初期量の関数として、予め選択した増幅条件下で決定する工程、
ｂ）試料に含まれる標的核酸の増幅と試料に含まれる参照核酸の増幅を上と同じ増幅条件下で行なう工程、
ｃ）標的核酸および参照核酸の増幅をリアルタイムで測定する工程、
ｄ）シグナル閾値を決定する工程、
ｅ）標的核酸および参照核酸の増幅の際にそれぞれシグナル閾値を超えるサイクル数を決定する工程、
ｆ）試料中の標的核酸と参照核酸の初期比を次式に従って決定する工程：
【０１０１】
【数１６】
0004022600.tif 000018
【０１０２】
工程ｆ）での比は本発明に従って次のように決定される：
【０１０３】
【数１７】
0004022600.tif 000019
【０１０４】
（１）および（２）から、
【０１０５】
【数１８】
0004022600.tif 000020
【０１０６】
ということになる。すなわち、
【０１０７】
【数１９】
0004022600.tif 000021
【０１０８】
となる。
【０１０９】
標的核酸と参照核酸について同じシグナル閾値を設定するので、近似的に
【０１１０】
【数２０】
0004022600.tif 000022
【０１１１】
と考えることができる。
【０１１２】
この条件の下で標的核酸と参照核酸の初期比に関する式（４）から出発すると、これは次式を与える。
【０１１３】
【数２１】
0004022600.tif 000023
【０１１４】
絶対定量の場合と同様に、決定することができない初期の一サイクルの効率は、その後のサイクルに関して決定されるすべての効率の相乗平均Πと考えることができる。あるいは、初期の一サイクルの効率は増幅産物が検出可能になった最初のサイクルについて決定された効率に等しいと考えることもできる。
【０１１５】
相対定量および較正試料の参照による標準化
しかし、Ｎ（Ｔ）n ＝Ｎ（Ｒ）n という近似は標的核酸と参照核酸が異なる感度で検出される場合にしか当てはまらない。
【０１１６】
この態様での増幅産物の検出ゆえに、系統誤差を排除するには、上述した方法の工程ｂ）、ｃ）、ｅ）およびｆ）をさらに較正試料を使って行ない、次いで試料について決定した商と較正試料について決定した商の比を、試料中の標的核酸の初期量の尺度として決定することが有利である。
【０１１７】
したがって本発明では、較正試料を並行反応混合物で測定し、試料中の標的核酸の初期量の尺度として、試料と較正試料に関して商Ｎ（Ｔ）0 ／Ｎ（Ｒ）0 の比を決定する。
【０１１８】
これにより、解析対象である試料に「A 」、較正試料に「K 」という添字を用いて式（４）から次の式が得られる。
【０１１９】
【数２２】
0004022600.tif 000024
【０１２０】
分析対象である試料と較正試料には同じシグナル閾値を定めたことならびに試料中および較正試料中の標識アンプリコンと参照アンプリコンの検出には同じ薬剤を使用することから、試料と較正試料に関して決定される商の比は次の通りである：
【０１２１】
【数２３】
0004022600.tif 000025
【０１２２】
したがって、解析対象である試料と較正試料の商の比は、
【０１２３】
【数２４】
0004022600.tif 000026
【０１２４】
である。
【０１２５】
その結果、試料中の標的核酸の初期コピー数に関して、増幅効率の相違および検出感度の相違による系統誤差が排除された相対値を得ることができる。決定される値が正確であるための唯一の必要条件は、完全に同一な緩衝液条件の下では増幅効率および検出効率も様々な反応容器で同一であるという妥当な仮定である。
【０１２６】
Ｄ）較正試料を使用する場合の間接的効率補正
さらに本発明による濃度依存性効率補正は、増幅効率が直接的に決定されるのではなく定量結果に間接的に組み込まれる定量方法にも適している。
【０１２７】
例えば標的核酸と参照核酸の検出感度の相違の影響を排除するために較正試料に基づいて結果が標準化される相対定量方法などが、これに当てはまりうる。
【０１２８】
したがって本発明は、較正試料に基づいて標準化される、参照核酸に対する標的核酸の相対定量方法であって、以下の工程からなる方法をも包含する：
ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の様々な希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で決定したＣｐ値の連続微分可能関数を、使用した標的核酸量の対数の関数として決定し、決定したＣｐ値の連続微分可能関数を、使用した参照核酸量の対数の関数として決定する工程、
ｆ）解析対象である試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸についてＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を計算する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た商の比を、試料中に最初に存在した標的ＤＮＡ量に関する尺度として決定する工程。
【０１２９】
もう一つの選択肢として、このような本発明の方法は、較正試料に基づいて標準化される、参照核酸に対する標的核酸の、以下の工程からなる相対定量にも使用できる：
ａ）標的核酸および参照核酸の共通する１つの希釈系列または独立した２つの希釈系列を調製する工程、
ｂ）予め選択した反応条件下で標的核酸および参照核酸の様々な希釈物の増幅を行なう工程、ここで、前記核酸の増幅をリアルタイムで測定する、
ｃ）標的核酸および参照核酸についてシグナル閾値を設定する工程、
ｄ）標的核酸および参照核酸ついて前記シグナル閾値を超えるサイクル数Ｃｐを各希釈物で決定する工程、
ｅ）使用した参照核酸量の対数の連続微分可能関数を、工程ｄ）で決定したＣｐ値の関数として決定し、使用した参照核酸量の対数の連続微分可能関数を、決定したＣｐ値の関数として決定する工程、
ｆ）解析対象である試料中および較正試料中の標的核酸および参照核酸についてＣｐ値を決定する工程、
ｇ）工程ｆ）で測定したＣｐ値を工程ｅ）で決定した関数の特定の関数値に割り当てる工程、
ｈ）解析対象である試料および較正試料に関して、標的核酸と参照核酸の工程ｇ）で得た関数値の商を計算する工程、
ｉ）工程ｈ）で得た商の比を、試料中に最初に存在した標的ＤＮＡ量に関する尺度として決定する工程。
【０１３０】
本発明によれば、線形または非線形関数でありうる工程ｅ）の連続微分関数は、好ましくは３次、４次、５次、６次または７次の多項式フィットを使って決定される。
【０１３１】
上記連続微分可能関数が線形または非線形である程度は、希釈系列中の標的核酸および参照核酸の初期濃度に依存する。低い初期濃度では、各濃度の対数と各濃度で測定されるＣｐ値の間に線形関係はないと仮定できるだろう。これとは別に、上記の関数の形状は各実験条件および各標的配列にも依存し、したがってこれらの関数は実験的に決定する必要があり、理論的考察に基づいて引き出すことはできない。
【０１３２】
較正試料を使った上記の標準化法は、特に増幅効率が解析対象である標的核酸または参照核酸の初期量と関係して変化する場合にも使用できる。その結果、標的核酸および参照核酸の各初期コピー数に対する増幅効率の依存性が間接的に考慮される。したがって本発明の定量方法により、決定すべき標的核酸の初期濃度が低くても、それを高い正確度で決定することができる。
【０１３３】
このような定量の妥当性は以下の考察から得られる：
【０１３４】
上記の方法の工程ａ）〜ｅ）では、希釈系列について測定されるサイクル数（Ｃｐ値）に基づいて、関数（以下、これを較正曲線という）が作成される。この較正曲線は個々の測定値から数学的方法を使って（例えば多項式フィットを使って）計算される。標的核酸の初期濃度が異なっても効率が一定のままであるなら、較正曲線は線形関数である。
【０１３５】
そのような較正曲線の一例を図１に図示する。所定のシグナル閾値を超えるサイクル数をグラフの横軸にプロットする。ある相対濃度の対数をグラフの縦軸にプロットする（対数の底数は、各実験反応内で変えない限り、無作為に選択できる）。ちなみに相対濃度とは、各検出効率に依存するが実際に使用された標的核酸および参照核酸の量に比例する、単位を持たない次元であると理解される。（図１の例では、参照核酸の増幅効率は様々な希釈物で一定のままである。しかし、これに比して、標的核酸の増幅効率は低濃度では増加している。）
【０１３６】
上記の方法の後続の工程ｆ）およびｇ）では、確定したシグナル閾値を越えるサイクル数（Ｃｐ値）が標的核酸と参照核酸に関して決定される（それぞれＣｐ(TAR) およびＣｐ(REF) ）。先に決定した較正曲線に基づいて、関数値ｌｏｇ（Ｒｃｏｎｃ（Ｔａｒ））およびｌｏｇ（Ｒｃｏｎｃ（Ｒｅｆ））が、試料に関して決定されたサイクル数Ｃｐ(TAR) およびＣｐ(REF) に割り当てられる。
【０１３７】
相対定量の場合はさらに標的核酸と参照核酸に関する検出効率の相違の影響を排除することが有利である。これはいわゆる較正試料を使って達成することができる。したがって標的核酸と参照核酸に関するＣｐ値は較正試料についても解析対象である試料と同じ方法で決定され、やはり対応する関数値に割り当てられる。
【０１３８】
しかし以下の説明では、ある実験中は検出効率が一定のままである、すなわち実験的に決定される相対濃度は各試料中に実際に存在する標的および参照核酸のコピー数に比例すると考える。したがって、まず以下の式が較正試料を含む任意の試料に当てはまる：
【０１３９】
【数２５】
0004022600.tif 000027
【０１４０】
定数ＫTar およびＫRef はその絶対値が各検出効率に依存する量である。言い換えると、これらの定数は蛍光標識の量子収率の相違またはハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーション速度の相違などといった因子を考慮するものであり、したがって通常は同一ではない。
【０１４１】
上述した方法の工程ｈ）に従って次の商を形成させる。
【０１４２】
【数２６】
0004022600.tif 000028
【０１４３】
（１）と（２）から、
【０１４４】
【数２７】
0004022600.tif 000029
【０１４５】
が得られる。
【０１４６】
解析対象である試料と較正試料には同じ検出試薬を使用するので、この等式はどちらの試料にも等しく当てはまる。
【０１４７】
【数２８】
0004022600.tif 000030
【０１４８】
次に、上述した方法の工程ｉ）に従って、決定した２つの商の比を決定する：
【０１４９】
【数２９】
0004022600.tif 000031
【０１５０】
その結果、各検出効率に依存する定数を排除することができる：
【０１５１】
【数３０】
0004022600.tif 000032
【０１５２】
参照核酸に対する標的核酸の決定された相対濃度の比を、較正試料における参照核酸に対する標的核酸の相対濃度の比に基づいて標準化したものは、解析対象である個々の試料中の標的核酸と参照核酸の絶対コピー数の比に等しいことになる。
【０１５３】
したがって本発明による方法は、
（１）一方で、ＰＣＲ反応の効率の相違が、その効率を直接決定する必要なく考慮され、ならびに
（２）他方では、制御できない様々な因子に依存する検出効率の影響が較正試料を使用することで排除される、
という、核酸の正確な相対定量方法である。
【０１５４】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【０１５５】
実施例１：シクロフィリンＡ（ＣｙｃＡ）とポルホビリノゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）ｃＤＮＡの増幅
ＨｅＬａ細胞株、副腎組織および脳組織から単離された３種類の市販（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の全ＲＮＡから、以下の条件で、逆転写酵素反応を使ってｃＤＮＡを合成した：
１μｇ  全ＲＮＡ
１×ＡＭＶ反応緩衝液
５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 
１ｍＭ  デオキシヌクレオチド混合物
０．０６２５ｍＭ  無作為化ヘキサマー
５０ユニット  ＲＮアーゼ
１０ユニット  ＡＭＶ逆転写酵素
Ｈ2 Ｏで２０μｌ
【０１５６】
ｃＤＮＡ合成のために全ての混合物を２５℃で１０分間、４２℃で６０分間および９５℃で５分間インキュベートした。次に、それらを４℃に冷却した。
【０１５７】
その後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ社製）で増幅反応を行ない、その増幅反応をＦＲＥＴ  ＨｙｂＰｒｏｂｅ形式にてリアルタイムで測定した。各混合物を次の条件で増幅した：
１×ＬＣ−ファーストスタートＤＮＡ−マスターハイブリダイゼーションプローブズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）
３ｍＭ  ＭｇＣｌ2 
０．５ｍＭの各プライマー
０．２μＭ  フルオレセインプローブ
０．２μＭ  ＬＣ−ＲＥＤ６４０プローブ
Ｈ2 Ｏで２０μｌ
【０１５８】
ＣｙｃＡ配列（シクロフィリンＡ）の増幅には配列番号：１および配列番号：２のプライマーを使用した。ＣｙｃＡ産物を配列番号：３のフルオレセイン標識プローブと配列番号：４のＬＣ−ＲＥＤ６４０標識プローブとを使って検出した。ＰＢＧＤ配列（ポルホビリノゲンデアミナーゼ）の増幅には配列番号：５および配列番号：６のプライマーを使用した。ＰＢＧＤ産物は配列番号：７のフルオレセイン標識プローブと配列番号：８のＬＣ−ＲＥＤ６４０標識プローブとを使って検出した。
【０１５９】
調製物をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて次のＰＣＲ条件で増幅した：
0004022600.tif 000033
【０１６０】
５５℃での各インキュベーション後に、製造者の使用説明書に従って蛍光測定を行なった。シグナル閾値（Ｃｐ値）をサイクル数の関数としての増幅反応の２次導関数の最大値として決定した。
【０１６１】
実施例２：ＣｙｓＡおよびＰＢＧＤの増幅効率の決定
ＣｙｃＡおよびＰＢＧＤの増幅効率を決定するために、ＨｅＬａ全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを１：５倍段階希釈（合計５希釈段階）した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｅｒで各希釈段階についてシグナル閾値（Ｃｐ値）の三重決定を行なった。これをＣｙｃＡとＰＢＧＤの両方について行なった。
【０１６２】
フィット係数を決定するために、サイクル数Ｃｐが各濃度について使用したｃＤＮＡ濃度の常用対数の関数として決定される２つの異なる関数を作成した。
【０１６３】
ａ）線形関数の作成
様々な核酸初期濃度について効率は同一であると仮定して、標的核酸と参照核酸に関する２つの各増幅効率を次式に従って決定した。
【０１６４】
【数３１】
0004022600.tif 000034
【０１６５】
この場合、ｆ’（ｌｏｇ（ｃｏｎｃ））は図２および３に示す関数の回帰直線の傾きとして決定した。このようにして標的核酸ＣｙｓＡについては効率Ｅ＝２．６２が決定され、参照核酸ＰＢＧＤについては効率Ｅ＝１．９７が決定された。
【０１６６】
ｂ）本発明に従った４次の多項式フィットを使った非線形関数の作成
同じ測定値を使って、４次の多項式フィットを計算することにより、決定された相対濃度の対数−対−測定されたＣｐ値の標的核酸関数および参照核酸関数を作成した。これらの関数を図４（標的核酸）および５（参照核酸）に示す。
【０１６７】
標的核酸（ＣｙｃＡ）に関して決定されたフィットパラメーターは：
Ａ（オフセット）＝１１．３９７４９４６
Ｂ（一次）＝−０．１
Ｃ（二次）＝−０．０７２１３４９
Ｄ＝０．００４４５１６
Ｅ＝−８．２１４Ｅ−０５
であった。
【０１６８】
参照核酸に関して決定されたフィットパラメーターは：
Ａ（オフセット）＝９．９８３４７０２４
Ｂ（一次）＝−０．２９３５９０１１
Ｃ＝０
Ｄ＝０
Ｅ＝０
であった。
【０１６９】
図および決定されたフィットパラメーターからわかるように、これは参照核酸に関してほとんど線形の関数をもたらす。その結果、測定した濃度範囲での参照核酸の増幅はほとんど一定の効率で起こる。
【０１７０】
これに対し標的核酸ＣｙｃＡについて得たＣｐ値では非線形関数が決定された。したがって測定したＣｙｃＡ濃度範囲での増幅反応の効率は試料中に存在する初期コピー数に有意に依存する。
【０１７１】
実施例３：増幅効率の間接的補正ありおよび増幅効率の間接的補正なしの較正試
料で標準化した標的核酸と参照核酸の初期比の決定
実施例１に記載の条件では、決定されるＣｙｃＡとＰＢＧＤの初期量の比は使用する試料の各増幅量とは無関係であるべきである。したがって様々な量の試料ＲＮＡの比の決定を使用して、得られる測定値に基づいて、効率補正の効果を調べた。
【０１７２】
副腎ＲＮＡおよび脳ＲＮＡにおける標的核酸（ＣｙｃＡ）と参照核酸（ＰＢＧＤ）の初期比を、それぞれのｃＤＮＡについて３つの希釈段階を使用して決定した（各希釈段階について二重決定を行なった）。測定データから解析試料と較正試料の間でＣｙｃＡとＰＢＧＤの相対濃度の比の商を決定した。ＨｅＬａ細胞から得られた全ＲＮＡを較正試料として使用した。この決定は、一方ではＣｙｃＡとＰＢＧＤについて２．００の増幅効率を仮定して、また他方では実施例２で決定した線形および非線形関数を使って行なった。
【０１７３】
表２に較正試料で標準化した標的／参照核酸の比を示す。
【０１７４】
【表２】
0004022600.tif 000035
【０１７５】
表２に示すように、２つの試料ＲＮＡ（副腎組織および脳組織）について本発明の非線形効率補正後に決定された値は、効率補正なしの同じ値と比較して約１／３の変動係数を持ち、線形効率補正を行なった同じ値と比較して約１／２の変動係数を持つ。また、初期濃度の関数としての較正試料標準化標的／参照比の最大誤差率も、２つの標的ＲＮＡに関する本発明の非線形効率補正により、線形効率補正と比較してまたは効率補正なしの方法と比較して有意に減少する。これらの結果は、本発明の方法が、較正試料を使って標準化が行なわれる方法で特に有利であることを示している。
【０１７６】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ＣｙｃＡの塩基配列に基づいて設計されたプライマーである。
【０１７７】
配列番号：２は、ＣｙｃＡの塩基配列に基づいて設計されたプライマーである。
【０１７８】
配列番号：３は、ＣｙｃＡの塩基配列に基づいて設計されたプローブである。
【０１７９】
配列番号：４は、ＣｙｃＡの塩基配列に基づいて設計されたプローブである。
【０１８０】
配列番号：５は、ＰＢＧＤの塩基配列に基づいて設計されたプライマーである。
【０１８１】
配列番号：６は、ＰＢＧＤの塩基配列に基づいて設計されたプライマーである。
【０１８２】
配列番号：７は、ＰＢＧＤの塩基配列に基づいて設計されたプローブである。
【０１８３】
配列番号：８は、ＰＢＧＤの塩基配列に基づいて設計されたプローブである。
【０１８４】
【発明の効果】
本発明によれば、核酸増幅の効率を可能な限り正確に決定する方法と、核酸の最も正確であろう定量方法におけるその使用とが提供される。
【０１８５】
【配列表】
0004022600.tif 000036
【０１８６】
0004022600.tif 000037
【０１８７】
0004022600.tif 000038
【０１８９】
0004022600.tif 000039
【０１９１】
0004022600.tif 000040
【０１９２】
0004022600.tif 000041
【０１９３】
0004022600.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、決定されたサイクル数に対して相対濃度の対数を決定するための較正曲線の例示である。
【図２】図２は、回帰直線の決定によるＣｙｃＡの増幅効率の決定を示す図である。
【図３】図３は、回帰直線の決定によるＰＢＧＤの増幅効率の決定を示す図である。
【図４】図４は、４次の多項式フィットを使ったＣｙｃＡの増幅に関する効率補正を示す図である。
【図５】図５は、４次の多項式フィットを使ったＰＢＧＤの増幅に関する効率補正を示す図である。
【図１】
0004022600.tif 000043
【図２】
0004022600.tif 000044
【図３】
0004022600.tif 000045
【図４】
0004022600.tif 000046
【図５】
0004022600.tif 000047