(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロメラニンの製造方法であって、フェノール性化合物を、その１又はそれ以上のヒドロキシル基において酸化すること、及び／またはプロトンを除去することによってフェノール性化合物を酸化し、異なる分子間に炭素−炭素結合の形成を誘導することを含んでなり、該フェノール性化合物が、下記式（１）で表される一以上の化合物から選択され、当該酸化が単離されたペルオキシダーゼの存在下での生変換によって提供され、前記ペルオキシダーゼが過酸化物に受容体として作用し、及び過酸化物が生反応中に存在し、式（１）が、
0004021485.tif 000010
（ここで、Ｒ1は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ2は、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3であり、Ｒ3は、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ1からＲ3の少なくとも１つはＯＨであり、Ｒ4は、Ｈ、Ｒ、−ＣＯＯＸ及びＲ7−ＣＯＯＸから選択され、但し、Ｒは、１から１２の炭素原子を持つアルキル基であり、Ｒ7は、１から１２の炭素原子を持つアルキレン基であり、Ｘは、Ｈ及び脂肪族及び芳香族基から選択され、そして、Ｒ5及びＲ6は、各々独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＣＨ3、ＣＯＯＨ及び８までの炭素原子を持つアルキル基から選択される）である方法。
【請求項２】
式（１）の化合物が、４−ヒドロキシケイヒ酸及びその酸部分における置換によって形成されたそのエステル、カフェー酸及びその酸部分における置換によって形成されたそのエステル、及び、フェルラ酸及びその酸部分における置換によって形成されたそのエステルから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ4が、ＣＯＯＸまたはＲ7−ＣＯＯＸであって、Ｘが、請求項１に記載したＲと同じ群から選択されるか、またはＲ8−Ｏ−Ｒ9であり、Ｒ8がＲ7と同じ群から選択され、Ｒ9が、Ｒと同じ群から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｘが、直鎖または分枝鎖の１から１２の炭素原子を持つアルキル基、または、合計で１２までの炭素原子を持つエステル基−Ｒ8−Ｏ−Ｒ9である請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｘが、ＣＨ2ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）Ｃ4Ｈ9あるいはＣ2Ｈ4−Ｏ−Ｃ2Ｈ5のいずれかである請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｘが、１から１２の炭素原子を持つ環状アルキル基である請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
Ｘが、キナ酸またはそのエステルである請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｘが、クロロゲン酸またはそのエステルである請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｘが、４−ヒドロキシケイヒ酸またはそのエステルである請求項１または２記載の方法。
【請求項１０】
式（１）の化合物が、下記式：
0004021485.tif 000011
（ここで、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3から選択され、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、各々独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＣＨ3、ＣＯＯＨ及びＣ1からＣ8のアルキル基から選択され、ＱはＨまたはＣＯＯＹであって、Ｙは請求項１に定義したＸと同じ群から選択される）のエステルである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｙが請求項１で定義したＲと同じ群から選択され、かつ、Ｙが６から１０の炭素原子を持つ請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｙが、２−エチルヘキシルである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｙが、請求項４で定義したＲ8−Ｏ−Ｒ9と同じである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
Ｙが、−Ｃ2Ｈ4−Ｏ−Ｃ2Ｈ5である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
式（２）の化合物が、下記式：
0004021485.tif 000012
（ここで、ＲAは２−エチルヘキシルである）で表される請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
式（２）の化合物が、下記式：
0004021485.tif 000013
（ここで、ＲAは−Ｃ2Ｈ4−Ｏ−Ｃ2Ｈ5である）で表される請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
式（２）の化合物が、下記式：
0004021485.tif 000014
で表される請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
式（２）の化合物が、下記式：
0004021485.tif 000015
で表される請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
ペルオキシダーゼ反応によって生成されるアロメラニン生成物が、蒸発によって濃縮される請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
カフェー酸またはそのエステル、及び／またはフェルラ酸またはそのエステル、及び／または４−ヒドロキシケイヒ酸またはそのエステルが、共に生変換される請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
カフェー酸またはそのエステル、及び／またはフェルラ酸またはそのエステルが、植物材料の酵素処理から得られる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法で得ることができるアロメラニン。
【請求項２３】
請求項２２記載のアロメラニンの混合物を含有する着色用組成物。
【請求項２４】
請求項２２記載のアロメラニンまたは請求項２３記載の組成物を含有する化粧品組成物。
【請求項２５】
水中及び／または化粧用溶媒に向上した溶解性、及び／または低い着色性を示し、及び／またはＵＶＡ及びＵＶＢ領域で良好な吸収性を維持し、及び／または良好な耐酸化活性を示す請求項２２記載のアロメラニン。
【発明の詳細な説明】
本発明はメラニンに関する。
メラニンは、ヒト及び動物の毛髪、目及び皮膚に天然に存在する色素の一種である。これらは、種々の理由で非常に興味を起こさせる。メラニンは、フェノール性モノマー類から誘導されるポリマーである。これらの高度に着色された材料は、化学的及び物理的に良く特性化されていないが、それにもかかわらず、その社会的（social）、化粧品的及び保護的な関係から相当な商業的興味を生ずる。
現在、天然のメラニンは、毛髪やイカ墨等の生物学的源から抽出される。また、酸化酵素や遺伝子操作を用いたこれらの材料の工業的合成方法も存在する。例えば、アミノ酸チロシンとＤＯＰＡとから得られるメラニンは、この方法で製造される。このような材料は、従来技術において、染毛剤の製造のために、スキンクリームの酸化防止剤として、そして他の化粧品製剤において用いられている。
従来技術で製造されたメラニンに伴う重要な問題がある。化粧品に混合されたときに灰色がかった色合いを付与するが、暗い着色は望ましくないことがある。また、工業的に製造されたメラニンは比較的不溶性であるので、有用な製品の調製には不適切である場合もある。
従来技術で製造されるメラニンは黒色であり、それは化学的に漂白されて許容可能な茶色にされる。しかし、このような漂白工程は、コスト高であり、異なる性質の制御を必要とし、さらに望ましくない過酷な化学品を使用するので好ましくなく、得られる暗茶色の材料は色がまだ濃すぎる。
本発明の目的は、一の形態において、従来技術で工業的に製造されるものより色が薄く、従って、好ましくない漂白工程の使用を回避して製造することができるメラニンであって、そのようなメラニンを含有する化粧品製剤で用いられる他の成分に、例えば、溶解性が高いといった融和性のあるメラニンを提供することである。
本発明の第１の態様によれば、メラニンの製造方法が提供され、この方法は、フェノール性化合物を、その１又はそれ以上のヒドロキシル基において酸化することを含んでなり、該フェノール性化合物が、及び、下記式（１）で表される化合物から選択され、当該酸化が酸化還元酵素の存在下での生変換によって提供される。式（１）は、
0004021485.tif 000002
（ここで、
Ｒ1は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ2は、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3であり、
Ｒ3は、Ｈ又はＯＨであり、
Ｒ1からＲ3の少なくとも１つはＯＨであり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｒ、−ＣＯＯＸ及びＲ7−ＣＯＯＸから選択され、但し、Ｒは、任意に置換されていてもよい飽和または不飽和の１から１２の炭素原子を持つアルキル基であり、Ｒ7は、任意に置換されていてもよい飽和または不飽和の１から１２の炭素原子を持つアルキレン基であり、Ｘは、Ｈ及び脂肪族及び芳香族エステル形成基であり、そして、
Ｒ5及びＲ6は、各々独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＣＨ3、ＣＨ3、ＳＨ、ＮＨＣＯ2、ＮＨＣＨ3、ＣＯＯＨ及び飽和または不飽和の８までの炭素原子を持つアルキル基を示す）である。
式（１）の化合物は、４−ヒドロキシケイヒ酸及びその酸部分における置換によって形成されたそのエステル、カフェー酸及びその酸部分に
おける置換によって形成されたそのエステル、及び、フェルラ酸及びその酸部分における置換によって形成されたそのエステルから選択されるのが都合がよい。
式（１）において、Ｒ4が、ＣＯＯＸまたはＲ7−ＣＯＯＸである場合、Ｘは、上で定義したＲと同じ群から選択されるか、またはＲ8−Ｏ−Ｒ9であり、Ｒ8は、Ｒ7と同じ群から選択され、Ｒ9は、Ｒと同じ群から選択されるのがよい。
式（１）において、Ｒ4が、ＣＯＯＸまたはＲ7−ＣＯＯＸである場合、Ｘは、任意に１又はそれ以上の置換基、特にヒドロキシ基を含んでいてもよい環状アルキル基であってもよい。キナ酸またはその誘導体、例えば、クロロゲン酸及びそのエステルが、この形態で特に好ましい例である。
式（１）において、Ｒ4が、ＣＯＯＸまたはＲ7−ＣＯＯＸである場合、Ｘは、（環に隣接する）ヒドロキシ基で置換された４−ヒドロキシケイヒ酸から誘導された基（または、その環置換誘導体）であってもよい。
即ち、式（１）の化合物は、下記式：
0004021485.tif 000003
（ここで、Ｒ10は、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ3から選択され、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、各々独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＣＨ3、ＣＨ3、ＳＨ、ＮＨＣＯ2、ＮＨＣＨ3、ＣＯＯＨ及びＣ1からＣ8の飽和又は不飽和のアルキル基から選択され、ＱはＨまたはＣＯＯＹであって、Ｙは請求項１に定義したＸと同じ群から選択される）のエステルであることができる。
好ましくは、Ｒ4またはＸまたはＹはＲであり、Ｒは６から１０の炭素原子を持つ。Ｒの特に好ましい例は、オクチル、中でも、２−エチルヘキシルである。
好ましくは、ＸまたはＹがＲ8−Ｏ−Ｒ9であり、Ｒ8基とＲ9基の炭素原子は合計で２から６である。特に好ましいＲ8−Ｏ−Ｒ9の例は、Ｃ2Ｈ4−Ｏ−Ｃ2Ｈ5である。
Ｒ4がＲ7−ＣＯＯＸ基を含む場合、またはＱ基がＲ14−ＣＯＯＹ基を含む場合は、Ｒ7及びＲ14は、好ましくは１から４の炭素原子を持つ。Ｒ7及びＲ14の特に好ましい例は、−ＣＨ2−、−Ｃ2Ｈ4−及び−ＣＨ＝ＣＨ−である。
特に、下記式で表されるエステルである。
0004021485.tif 000004
及び、
0004021485.tif 000005
及び、
0004021485.tif 000006
及び、
0004021485.tif 000007
但し、ＲAは２−エチルヘキシルを表し、RAは−Ｃ2Ｈ4−Ｏ−Ｃ2Ｈ5であるのが特に好ましい。
この第１の態様で用いられる酵素は、酸素に受容体として作用する酸化還元酵素の周知の群から選択することができる。例えば、この酵素は、チロシナーゼ（０−時フェノールオキシダーゼ、ＥＣ１．１０．３．１；ＥＣ１．１４．１８．１）またはラッカーゼ（ｐ−時フェロキシダーゼＥＣ１．１．２）を含んでいてもよい。この場合、生反応の間に酸素が必要とされる。
あるいは、またはそれに加えて、酵素は、過酸化物に受容体として作用する酸化還元酵素の周知の群から選択することもできる。例えば、酵素は、ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１、１．１１．２等として設計された群）を含んでもよい。この場合、生反応の間に過酸化物、例えば過酸化水素の存在が必要とされる。ペルオキシダーゼは、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ又は微生物ペルオキシダーゼであってよい。
異なる酵素系（チロシナーゼ、ラッカーゼ及びペルオキシダーゼ）は、それらの基質と反応して、異なる化学構造を有する中間体及び最終生成物を生成する。チロシナーゼ及びラッカーゼ酵素は、フェノールを酸化して反応性の高いキノンを生成する。ペルオキシダーゼ酵素は、プロトンを除去することによって基質を酸化し、異なる基質分子間に炭素−炭素結合を誘導する。
本発明の第２の態様によると、前記第１の態様に従う方法で製造されたメラニンが提供される。
我々は、驚くべきことにかつ有利なことに、本発明によって製造されたメラニンが耐酸化性（特に、フリーラジカル消滅活性）を有し、以下に例示するようなＵＶ吸収性を発揮することを見出した。また、５−ヒドロキシインドール及びその誘導体から製造したメラニンは、用いる酵素によって緑色から茶色に着色できる。さらに、本発明に従ってカフェー酸及びその誘導体から製造したメラニンは薄茶色であり、従来技術のような漂白を必要としない。また、フェルラ酸及びその誘導体から製造したメラニンは黄色、即ち、カフェー酸及びその誘導体から製造したものよりも薄い。さらに、４−ヒドロキシケイヒ酸及びその誘導体から製造したメラニンは、用いる酵素によって、黄色から赤／茶色まで変化させることができる。カフェー酸、フェルラ酸及びその誘導体から誘導されるメラニンは、イオウ又は窒素を含まないアロメラニンとして知られる種類のものである。
５−ヒドロキシインドール及びその誘導体、カフェー酸及びその誘導体、フェルラ酸及びその誘導体、及び４−ヒドロキシケイヒ酸及びその誘導体の２又はそれ以上から製造されたメラニンは、有利に共に混合されて色素製剤を提供し、その色素の着色の暗さ（または明るさ）は、異なるタイプのメラニンの相対量によって選択することができる。
あるいは、メラニンは、例えば上記の酵素の１つ又はそれ以上を用いて、カフェー酸及び／またはフェルラ酸及び／または４−ヒドロキシケイヒ酸またはその誘導体、例えばそのエステル、及び／または５−ヒドロキシインドールまたはその誘導体の混合物を含むモノマーから生化学的に製造してもよく、その混合物の組成は、メラニン生成物に求められる色素着色に従って選択される。
また、我々は、本発明に従って製造されたメラニンが、一般的に、従来技術で工業的に製造されたメラニンに比較して、化粧品又は他の応用のための製剤の調製で従来から用いられる他の成分に溶解性が高いことも見出した。
さらに、本発明の第２の態様に従うメラニンは、天然起源の原材料と酵素を用いて温和な条件下で調製することができる。
例えば、メラニンの合成は、酵素、特に食用植物起源の酵素、及び、天然の原材料、特に食用作物又は植物起源から誘導される酵素の使用を含む天然過程によってなしうる。
式（１）の化合物は、例えば、植物材料中に天然に生成し、それからの抽出物として得ることができ、あるいは、天然起源の材料、例えば植物抽出物の酵素処理によって得ることができる。
例えば、フェルラ酸化合物、即ち、フェルラ酸及びその誘導体は、植物細胞に存在する１又はそれ以上の化合物の直接的な酵素変換によって調製することができる。例えば、水に添加した小麦胚芽を、酵素Celluzyme（商品名）（本出願人による係属中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１３４５に記載されている）またはBiofeed（商品名）といったフェルラ酸エステラーゼを含む酵素製剤を生成するHumicola insolens等の微生物株から誘導した酵素製剤で処理して、フェルラ酸を直接製造することができる。あるいは、フェルラ酸化合物は、植物細胞に存在する１またはそれ以上の化合物を酵素変換してカフェー酸又はその誘導体のような中間体を生成し、次いでこの中間体を更に処理して求められるフェルラ酸を生成してもよい。植物細胞及び組織に存在するクロロゲン酸等の化合物の酵素処理によるカフェー酸化合物の調製は、我々の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９５／０１３２４に記載され、さらに係属中の本出願人による同日の英国特許出願にも記載されている。このように調製されたカフェー酸化合物は、このカフェー酸化合物のヒドロキシ基の１つのｏ−メチル化によって、求められるフェルラ酸に変換することができる。この変換過程は、化学的に行い得るが、好ましくは生化学的に行われる。例えば、我々は、カフェー酸化合物への微生物Streptmyces griseus NRRL 8090の添加により、必要とする選択的変換が提供されることを見出した。
カフェー酸、フェルラ酸又は４−ヒドロキシケイヒ酸分子の１つまたはそれ以上がその誘導体に変換される場合、それは１またはそれ以上の環置換を含んでいてもよい。この置換基は、フェルラ酸分子の環に、その生成後に導入してもよい。あるいは、置換されたフェルラ酸化合物がカフェー酸等の前駆体から誘導される場合、前記体分子は、置換されたフェルラ酸化合物への変換に先立って置換してもよい。
カフェー酸またはフェルラ酸又は４−ヒドロキシケイヒ酸は、適宜に、電子供与性基を分子の核構造のベンゼン環の１またはそれ以上のオルト及び／またはメタ位への置換によって加工してもよい。電子供与性基の例は、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＣＨ3、ＣＨ3、ＳＨ、ＮＨＣＯ2、ＯＣＯＨ、または、Ｃ1からＣ8の飽和または不飽和アルキル基である。そのような誘導体を製造するために、必要とされるオルト位は、例えば、Ellis及びArheinn, Phytochemistry, 10, 3069-3072（1971）またはGastetner及びConnee, Arch. Biochem. Biophys., 163, 617-627（1974）の方法等の周知の方法でヒドロキシル化してもよい。このヒドロキシ基は、次いで、Vogels' Textbook of Practical Organic Chemistry, A. Vogel（Longman）またはAdvanced Organic Chemistry Reaction Mechanisms and Structure, 4th Edition, J. March（John Wiley & Sons）に記載されたような周知の方法で他の電子供与性基に置換される。あるいは、周知の方法によって直接環置換を行ってもよい。
カフェー酸又はフェルラ酸の製造方法において、酵素変換により処理される材料は、好ましくは植物材料であり、水に添加されてスラリー又は半固体塊または湿ったケーキを形成したものである。水は、酵素の添加の前に植物材料に添加してもよい。あるいは、酵素と植物材料とが互いに添加されるときに、酵素が水中に存在していてもよい。例えば、植物材料は、乾燥粉末の形態またはペレットの形態であってよく、酵素の水溶液に添加されてもよい。
酵素変換は、好ましくはバイオリアクター内で行われる。植物材料と酵素の水性混合物のｐＨは監視され、ｐＨ７近傍、例えばｐＨ５からｐＨ９の範囲に保持されるのが好ましい。加熱を施して、例えば３５℃から５５℃の範囲の高温で生反応を行うようにしてもよい。
生反応が完了した後、形成された生成物は、任意に水、ｎ−ブタノール、エタノール、ヘキサノール、クロロホルム／メタノールなどを添加した酢酸エチル、イソプロピルアルコール等の単純な有機溶媒に抽出され、その後、例えば、硫酸ナトリウム等の乾燥剤での乾燥及び／または加熱などの周知の方法で溶媒から分離されるが、好ましくは真空で溶媒を蒸発させる。
任意に置換されていてもよいカフェー酸、フェルラ酸及び４−ヒドロキシケイヒ酸のエステルである式（１）の化合物は、これらの酸から周知の方法で形成される。例えば、エステル化反応は、生化学的に、例えばエステラーゼ／リパーゼ酵素を用いて行われる。あるいは、当業者には周知の経路による化学的変換、例えば、共沸脱水による脱水、物理的又は化学的脱水、または、酸ハロゲン化物または活性化アステルなどの活性化中間体を通した縮合も用いられる。
第１の態様に従う方法の特別な形態では、この方法は、成分の組み合わせを、例えば、化粧品製剤の各々の成分の一部として、ヒト又は動物の身体、例えば皮膚又は毛髪に適用することによって行われ、それにより、フェルラ酸またはその誘導体及び／またはカフェー酸又はその誘導体及び／または４−ヒドロキシケイヒ酸、５−ヒドロキシインドールまたはその誘導体が、製剤成分の一部として添加された必要とする酵素と接触し、身体上のその部分においてメラニンを形成する。
セイヨウワサビペルオキシダーゼ及び／またはチロシナーゼなどの適当な酵素を用いたこの方法による５−ヒドロキシインドールまたは式（１）の化合物の１つ又はそれ以上の生変換は、形成されるメラニンが、用いる特定の酵素又は酵素の組み合わせに応じて好ましい色を有し、従来技術より少ない工程で調製できるので、特に染毛剤での使用に適している。
第１の態様に従う方法によるメラニンの製造において、我々は、特にペルオキシダーゼ反応からの周知の方法、例えばロータリーエバポレーション、フォーロングフィルムエバポレーション（falling film evaporation）等での蒸発濃縮（後で例示する）によるメラニン生成物の回収を選択する。
第１の態様に従う方法によるメラニンの製造において、出発材料、例えばカフェー酸等の消費が反応完了まで監視され、その後に周知の方法で停止される。析出したメラニンは、適当な分離技術、例えば遠心分離によって回収される。
本発明の第２の態様に従うメラニンが化粧品成分として用いられる場合、それらは、化粧品及びパーソナルケア製品分野で知られた他の成分を用いて、周知の方法で化粧品製剤中に入れられる。例えば、製剤は、クリーム、軟膏、ローション、エマルション、粘着膏材として製造される。製剤の他の成分は、動物油、植物油、鉱油、エステル油、ワックス、高級アルコール、脂肪酸、シリコーン油、界面活性剤、リン脂質、アルコール、多価アルコール、水溶性ポリマー、クレー及び他の無機顔料粒子及び水から選択される成分を含んでいてもよい。他の周知の添加剤は、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、キレート剤、防腐剤、殺虫剤、着色剤、香料、血流促進剤、消毒剤、抗炎症剤、細胞活性化剤、ビタミン、アミノ酸、保湿剤及び角質溶解剤を含む。
本発明の実施態様を、ここに、以下の実施例を参照することによるのみで例示する（これらは如何なる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない）。
実施例１：
カフェー酸誘導メラニンのチロシナーゼによる製造
カフェー酸（5g）をリン酸バッファー（2l, 100mM, pH6.8）に溶解した。チロシナーゼ（32mg,2400単位/mg,Sigma）を添加し、溶液を２つの5lのエルレンマイヤーフラスコに等量に分けた。反応物を、30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。カフェー酸の消費（utilisation）はＨＰＬＣ（C18カラム+酢酸（1%）, 290nm）で監視した。反応は濃塩酸（500ml）を溶液に加えて氷冷することにより停止させた。赤色／茶色メラニン析出物を、遠心分離で回収した（4000rpm, 15分）赤色／茶色ペーストを空気乾燥させた。収率：3.35g（65%）。
実施例２：
カフェー酸／フェルラ酸メラニンのチロシナーゼによる製造
カフェー酸（500mg）及びフェルラ酸（500mg）を、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で、エタノール（20ml）を加えたリン酸バッファー（200ml, 100mM, pH6.8）に溶解した。チロシナーゼ（5mg, 3900単位/mg,Sigma）を添加し、反応物を、30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。カフェー酸及びフェルラ酸の消費はＨＰＬＣ（C18カラム，2ml/分，水：アセトニトリル（80:20）+酢酸（1%）, 290nm）で監視した。反応は濃塩酸（10ml）を溶液に加えて氷冷することにより停止させた。赤色／茶色メラニン析出物を、遠心分離で回収した（4000rpm, 15分）。赤色／茶色ペーストを乾燥させた。収率：85.8mg（8.58%）。
実施例３：
フェルラ酸のセイヨウワサビペルオキシダーゼ及び過酸化水素との反応
フェルラ酸（5g）を、1lのエルレンマイヤーフラスコ中でエタノールを加えたクエン酸バッファー（500ml,100mM, pH5.5）に溶解した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（4mg, Sigma）及び過酸化水素（22ml, 27.5%）を添加し、30℃で4時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。反応物は、即座に鮮やかな黄色となり、濃塩酸（20ml, 1.0M）の添加により停止させた。生成した黄色メラニン析出物を、濾過で回収して空気乾燥させた。収率：1.18g（38%）。
実施例４：
カフェー酸／フェルラ酸メラニンのセイヨウワサビペルオキシダーゼと過酸化水素とによる製造
カフェー酸（500mg）及びフェルラ酸（500mg）を、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で、エタノール（20ml）を加えたクエン酸バッファー（100ml, 100mM, pH5.5）に溶解した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（500単位，Sigma）及び過酸化水素（5ml, 27.5%）を添加し、溶液を、30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。カフェー酸及びフェルラ酸の消費はＨＰＬＣ（C18カラム，2ml/分，水：アセトニトリル（80:20）+酢酸（1%）, 290nm）で監視した。反応は濃塩酸（10ml）を溶液に加えて氷冷することにより停止させた。赤色／茶色メラニン析出物を、遠心分離で回収した（4000rpm, 15分）。赤色／茶色ペーストを空気乾燥させた。収率：126.3mg（12.63%）。
実施例５：
５−ヒドロキシインドール誘導メラニンのチロシナーゼによる製造
カフェー酸（80mg）をメタノール（0.25ml）に溶解し、水（4ml, pH6.0）を添加した。チロシナーゼ（5mg, 2400単位/mg, Sigma）を添加し、反応物を37℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。反応は即座に明るい赤色を形成し、次いで、黒色の析出物を良好な収率で生成した。
実施例６：
５−ヒドロキシインドール誘導メラニンのセイヨウワサビペルオキシダーゼと過酸化水素とによる製造
５−ヒドロキシインドール（65mg）をメタノール（0.15ml）に溶解し、クエン酸バッファー（5.0ml, ph5.0, 100mM）及び過酸化水素を添加した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（0.1mg, Sigma）を添加し、溶液を、37℃で、200rpmで振とうしながらインキュベートした。反応は即座に明るい緑色を形成し、次いで、緑色の析出物を良好な収率で生成した。
実施例７：
クロロゲン酸誘導メラニンのチロシナーゼによる製造
クロロゲン酸（1g）をリン酸バッファー（400ml, 100mM, pH6.8）に溶解し、チロシナーゼ（6.4mg, 2400単位/mg, Sigma）を添加した。反応物を、30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。クロロゲン酸の消費はＨＰＬＣ（C18カラム，2ml/分，水：アセトニトリル（80:20）+酢酸（1%）, 290nm）で監視した。反応は濃塩酸（20ml）を溶液に加えて氷冷することにより停止させ、2時間後に水酸化ナトリウム水溶液（10.0M）で中和した。生成物は、減圧下、50℃で蒸発させて回収し、赤色／茶色固体を良好な収率で収集した。
実施例８：
４−ヒドロキシケイヒ酸誘導メラニンのチロシナーゼによる製造
４−ヒドロキシケイヒ酸（2mg）をエタノール（150μl）に溶解し、リン酸バッファー（2ml, 100mM, pH6.8）に添加し、チロシナーゼ（5μlリン酸バッファー（100mM, pH6.8）中に0.1mg, 3900単位/mg, Sigma）を添加した。反応物を30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。インキュベーション時間中に、反応混合物の、無色から赤色／茶色への色の変化が観察され、酵素によるメラニンの生成を示した。
実施例９：
４−ヒドロキシケイヒ酸誘導メラニンのペルオキシダーゼと過酸化水素とによる製造
エタノール（150μl）中の４−ヒドロキシケイヒ酸（2mg）を、リン酸バッファー（2ml, 100mM, pH6.8）に添加した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（100μl, 100単位/ml溶液, Sigma）及び過酸化水素（100μl, 27.5%）を添加し、反応物を、30℃で2時間、200rpmで振とうしながらインキュベートした。インキュベーション時間中に、反応混合物の、無色から黄色への色の変化が観察され、酵素によるメラニン生成を示した。
実施例１０：
カフェー酸と過酸化水素との反応に対するセイヨウワサビ、ダイズ及び微生物ペルオキシダーゼの比較
以下のペルオキシダーゼの能力を、2.5mg/mlのカフェー酸を含むクエン酸バッファー（pH5.5）溶液を用いて評価した：
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（sigma, Ltd., UK, P6782）1200単位；
ダイズペルオキシダーゼ（Enzymol Ltd., USA）68単位；
微生物ペルオキシダーゼ（Noveozym 502, Novo Nordisk Ltd., Denmark）200μl；
反応は、過酸化水素（100μl, 27.5%）の添加によって開始した。３つ全ての場合において、反応は同様であると観察された、即ち、無色から赤色／茶色に即座に変化し、検出可能な相違は見られなかった。
実施例１１：
カフェー酸誘導アロメラニンの蒸発を用いたチロシナーゼによる製造
カフェー酸（5g）を水（2l）に溶解し、水酸化ナトリウム（5N）を用いてpH7.0に調整した。チロシナーゼ（17mg, 4400単位/mg, Sigma）を添加し、溶液を２つの5lのエルレンマイヤーフラスコに等量に分けた。反応物を、30℃で、200rpmで振とうしながら終夜インキュベートした。生成物は、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下で蒸発させて回収し、50℃でオーブン乾燥して茶色の粉末を収集した。収率：5.5g（100%）。
実施例１２：
カフェー酸誘導アロメラニンのセイヨウワサビペルオキシダーゼと過酸化水素とによる製造
カフェー酸（10g）を1lのエルレンマイヤーフラスコ中で水（500ml）に溶解し、水酸化ナトリウム（5N）を用いてpH6.5に調整した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（8mg, 2400単位/mg, Sigma）及び過酸化水素（44ml, 27.5%）を添加し、反応物を、30℃で、200rpmで振とうしながら終夜インキュベートした。ｐＨをpH6.5に維持し、カタラーゼ（4mg, Sigma）を添加して過剰の過酸化水素を取り除き、反応物を室温で終夜インキュベートした。生成物は、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下で蒸発させて回収し、50℃でオーブン乾燥して茶色の粉末を収集した。収率：12.4g（100%）。
実施例１３：
メラニン生成物の耐酸化活性の評価
メラニン生成物の耐酸化活性を、Brand-Williams等，Lebensm-Weiss. u.Technol., 28, 25-30（1995）に記載されたようなＤＰＰＨフリーラジカル法を用いて試験した。結果を以下の表１に示す。
0004021485.tif 000008
ここで、ＥＣ50（mg/L）：定義された実験条件下で、ＤＰＰＨの濃度を50%まで低減させるのに必要な濃度。
速度×１０6（mol DPPH/分/mg aox）：酸化防止剤1mg当たりの試験におけるＤＰＰＨの消費速度。
実施例１４：
メラニン生成物の吸収スペクトル
メラニン生成物の0.005%（w/v）溶液を用いて吸収スペクトル（200nmから500nm）を測定した。溶液は、水溶液（ペルオキシダーゼを用いたカフェー酸誘導メラニン、及び、ペルオキシダーゼを用いたカフェー酸＋フェルラ酸誘導メラニン）またはエタノール溶液（チロシナーゼを用いたカフェー酸誘導メラニン）のいずれかである。全ての場合において、吸収は、メラニン生成物を示す完全な範囲、即ち200nmから500nmを走査して検出された。最大吸収を以下の表２に示す。
0004021485.tif 000009