(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱安定性DNAポリメラーゼを少なくとも0.5ユニット/μlの最終濃度で用いる、少なくとも102のダイナミックレンジを有する定量的多重PCRの方法であって、
隣接してハイブリダイズする２つのプローブが各標的核酸を検出するために用いられ、かつ各プローブは、蛍光性成分で適切に標識されており、その結果該成分が、ハイブリダイゼーションの際に蛍光共鳴エネルギー転移を可能にすることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
少なくとも１０３のダイナミックレンジを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１０４のダイナミックレンジを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中の少なくとも第1および第2の核酸をPCR手段によって定量するための方法であって、
サンプル中の第1核酸のもとの濃度が第2核酸のもとの濃度に比べて100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライマー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー対を添加すること、熱安定性DNAポリメラーゼによって２つの核酸を増幅させることを含み、
ここで、該熱安定性DNAポリメラーゼは、反応液中に少なくとも0.5ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅は、第1プライマー対の非存在下における第2プライマー対による第2核酸の増幅と比較して10％未満までは阻害されず、および
隣接してハイブリダイズする２つのプローブが各標的核酸を検出するために用いられ、かつ各プローブは、蛍光性成分で適切に標識されており、その結果該成分が、ハイブリダイゼーションの際に蛍光共鳴エネルギー転移を可能にすることを特徴とする、上記方法。
【請求項５】
サンプル中の少なくとも第1および第2の核酸を高温開始PCR手段によって定量するための方法であって、
サンプル中の第1核酸のもとの濃度が第2核酸のもとの濃度に比べて100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライマー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー対を添加すること、熱安定性DNAポリメラーゼによって２つの核酸を増幅させることを含み、
ここで、該熱安定性DNAポリメラーゼは、反応液中に少なくとも0.25ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅は、第1プライマー対の非存在下における第2プライマー対による第2核酸の増幅と比較して10％未満までは阻害されず、および
隣接してハイブリダイズする２つのプローブが各標的核酸を検出するために用いられ、かつ各プローブは、蛍光性成分で適切に標識されており、その結果該成分が、ハイブリダイゼーションの際に蛍光共鳴エネルギー転移を可能にすることを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアルタイムPCRの分野に関する。特に、本発明は特定の細胞内mRNAにおける核酸の定量の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
対象とする特定の遺伝子の発現について情報を得るために、mRNAの定量は、分子生物学の分野において未解決の課題であった。従来、これは半定量的なノーザンブロット分析または半定量的なリボヌクレアーゼプロテクションアッセイのいずれかによって行われてきた。
【０００３】
加えて、PCR技術の有用性、特に逆転写酵素PCR（RT-PCR）の有用性は、少ないサンプルから少量のmRNAのより高感度な定量的検出を可能にした。RT-PCRでは、逆転写酵素を用いて分析されるため、最初にmRNAから一本鎖cDNAが産生される。続いて、PCRを用いて、二本鎖DNA増幅産物が生成される。
【０００４】
この方法の異なる２つの改良型の間で識別がなされる。いわゆる相対的定量では、特定の標的遺伝子の発現の比率が、各々の生理的状態に関係なくすべての細胞で構成的に発現している、いわゆるハウスキーピング遺伝子のRNA量に対して相対的に決定される。ここで、該mRNAはすべての細胞内でほぼ同量存在する。この利点は、様々なサンプル材料の異なる内部特性およびRNA調製の過程が特有な結果に影響を持たないことである。しかし、絶対的定量はこの方法では不可能である。
【０００５】
代替方法として、使用されるRNAの絶対量は、既知のコピー数の標準核酸を用いて、この標準核酸の対応する希釈列を増幅させることを用いて決定することができる。内部標準を用いる場合、すなわち、1つの反応槽内で標準および標的核酸が増幅される場合、標準核酸および標的核酸の増幅間で識別が可能となるよう、分析される標的核酸と比較して異なる配列を有する標準物を用いなければならない。
【０００６】
増幅反応の動態観測を可能にし、従って、特定の標的分子のより正確な定量を可能にする、キネティックリアルタイムPCRの方法を応用することによって、更なる発展が達成され得た。
【０００７】
この場合、PCR産物の形成はPCRの各サイクルで観測される。その増幅は通常、増幅反応中の蛍光シグナルを測定するための付加的な装置を持つサーモサイクラーで測定される。この代表的な例としては、Roche Molecular Biochemicals LightCycler（カタログ番号2 0110468）が挙げられる。増幅産物は、例えば、標的核酸に結合した場合のみに蛍光シグナルを放射する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出され、または、特定の場合には二本鎖DNAに結合する蛍光色素によっても検出される。
【０００８】
分析されるすべての反応に対して明確なシグナルの閾値が決定され、標準またはハウスキーピング遺伝子などの基準核酸に対してと同様に標的核酸に対して、この閾値に達するために必要なサイクル数Cpが決定される。標的分子の絶対的または相対的コピー数は、標的核酸および基準核酸について得られたCp値に基づいて決定されうる（Gibson, U. E.,ら、Genome Res 6 (1996) 995-1001.; Bieche, I.,ら、Cancer Res 59 (1999) 2759-65.; WO 97/46707）。このような方法もまたリアルタイムPCRと呼ばれる。
【０００９】
要約すると、PCRによる核酸の定量のために記述されたすべての方法において、増幅反応中に形成されるコピー数は、常に、標準またはハウスキーピング遺伝子のRNAのいずれかである基準核酸の形成されるコピー数に関連している。
【００１０】
多くの場合、いわゆる多重アプローチにおいて、1つの反応槽内で1つ以上の標的を定量することが、大きな関心事である。これは、例えば、あるmRNAの発現レベルが一般的なハウスキーピング遺伝子の発現レベルとの比較として決定されるような、相対的定量の実施形態についての場合である（Meijerink J.,ら、J Mol Diag 3 (2001) 55-61）。また、複雑な細胞内プロセスを研究または分析するために、より複雑な発現パターンが分析される必要がある場合、異なるmRNA分子種の同時定量が関心事となるかも知れない。
【００１１】
多重PCRの有する主要な欠点は、多くの場合、第2の核酸標的分子種と比較して少量の核酸標的分子種が適切な効率で増幅され得ず、少量の核酸標的に対応する各増幅シグナルが検出されないことである（例えば、Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27 (1999) 762-770）。言い換えると、多くの場合、多重アプローチで検出されうる核酸量のダイナミックレンジは非常に限定されている。
【００１２】
この状況において、多重アプローチのダイナミックレンジは通常、検出される異なる標的核酸の絶対値に依存しないが、ほとんどもっぱら分析されるサンプル中に存在する異なる標的核酸のモル比のみに依存していることに注目することが重要である。
【００１３】
しかし意外にも、得られるダイナミックレンジはアッセイおよび標的に依存するらしく、Vet, J. A.,ら、Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 6394-9は、ダイナミックレンジが104の、Molecular Beaconを用いた4つの病原性レトロウイルスの検出のための洗練された多重アッセイを発表している。同様に、Director-Myska, A. E.,ら、Environ Mol Mutagen 37 (2001) 147-154は、蛍光発生性5'ヌクレアーゼ形式（TaqMan形式）を用いた特異的定量プラスミド混合物分析を発表し、そこでは103から104のダイナミックレンジが実現されている。
【００１４】
Tucker, R. A., et al., Mol Diagn 6 (2001) 39-47は、β-アクチンmRNAに対するHPV 16の相対的定量のためのTaqManリアルタイムPCRアッセイを発表しており、そこでは、5 x 104のアクチンコピーの増幅はHPV 16 RNAの増幅に影響を与えないが、一方、100倍以上のHPV 16 mRNA鋳型はβ-アクチンの増幅を阻害する。特にこの例から、妥当な多重PCRのダイナミックレンジを得るための問題に対する分子的基礎は、理解されるには程遠いと結論することができる。
【００１５】
適切なプライマー濃度の調整によってこの問題を克服するために、当技術分野で試みが為された。Halminen, M.,ら、Cytokine 11 (1999) 87-93は、β-アクチンの発現と比較したインターフェロン-ガンマmRNAおよびインターフェロン-4 mRNAの相対的定量を発表しており、そこでは、限定された量のβ-アクチンプライマーが使用される。同様に、Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27 (1999) 762-770は、下位に相当する標的核酸のプライマー量が増加されて含まれていること、または、代替として、このような多重反応のアニーリング温度を低くすることを推奨している。
【００１６】
しかし、当技術分野において発表されたすべての方法は、核酸濃度の適切で正確な測定の必須条件として、広範にわたるPCR条件の最適化を必要とする。従って、当技術分野には、標的の性質または使用されるプライマーの濃度について固有の最適化なしで妥当な広いダイナミックレンジを提供する、標準化された多重PCRプロトコールの必要性がある。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第5,118,801号
【００１８】
【特許文献２】
米国特許第5,677,152号
【００１９】
【特許文献３】
米国特許第5,693,502号
【００２０】
【特許文献４】
米国特許第6,174,670号
【００２１】
【特許文献５】
米国特許第6,303,305号
【００２２】
【特許文献６】
WO 97/46706
【００２３】
【特許文献７】
WO 97/46707
【００２４】
【特許文献８】
WO 97/46712
【００２５】
【非特許文献１】
Bernard, P. S.,ら、Anal Biochem 255 (1998) 101-7
【００２６】
【非特許文献２】
Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27 (1999) 762-770
【００２７】
【非特許文献３】
Bieche, I.,ら、Cancer Res 59 (1999) 2759-65
【００２８】
【非特許文献４】
Director-Myska, A. E.,ら、Environ Mol Mutagen 37 (2001) 147-54
【００２９】
【非特許文献５】
Gibson, U. E.,ら、Genome Res 6 (1996) 995-1001
【００３０】
【非特許文献６】
Halminen, M.,ら、Cytokine 11 (1999) 87-93
【００３１】
【非特許文献７】
Kainz, P.,ら、Biotechniques 28 (2000) 278-82
【００３２】
【非特許文献８】
Kellogg, D. E.,ら、Biotechniques 16 (1994) 1134-7
【００３３】
【非特許文献９】
Lin, Y. Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100-11
Meijerink, J.,ら、J Mol Diagn 3 (2001) 55-61
【００３４】
【非特許文献１０】
Moretti, T.,ら、Biotechniques 25 (1998) 716-22
【００３５】
【非特許文献１１】
Sharkey, D. J.,ら、Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506-9
【００３６】
【非特許文献１２】
Tucker, R, A.,ら、Mol Diagn 6 (2001) 39-47
【００３７】
【非特許文献１３】
Vet, J. A.,ら、Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 6394-9
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、リアルタイムPCRの分野に関する。特に、本発明は特定の細胞内mRNAにおける核酸の定量の分野に関する。
【００３９】
【課題を解決するための手段】
従って、新しい本発明は少なくとも102のダイナミックレンジを有する定量的多重PCRの方法を提供し、そこでは、少なくとも0.5ユニット/μlの最終濃度で熱安定性DNAポリメラーゼが使用される。好ましくは、少なくとも103のダイナミックレンジが、より好ましくは、少なくとも104のダイナミックレンジが得られる。
【００４０】
【発明の実施の形態】
より具体的には、本発明は、サンプル中の少なくとも第1および第2核酸を定量するためのPCRを用いた方法に関し、該方法は、サンプル中の第1核酸のもとの濃度は、第2核酸のもとの濃度と比較して100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライマー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー対を添加すること、熱安定性DNAポリメラーゼによって2つの核酸を増幅することを包含する。本発明によると、熱安定性DNAポリメラーゼは少なくとも反応液中に0.5ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅は、第1プライマー対の非存在下における第2プライマー対による第2核酸の増幅と比較して10％以下には阻害されない。
【００４１】
本発明に従ったPCRが高温開始によって行われた場合、すなわち、プライマーダイマーの形成が適切に阻害された場合、更なる利点を持つことも証明されている。この場合、本発明に従ったDNAポリメラーゼは、少なくとも0.25ユニット/μlの濃度で存在する。
【００４２】
PCR増幅がリアルタイムで観測される場合、本発明の方法は特に適用できる。好ましくは、得られる増幅産物は各々、少なくとも1つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによって検出される。
【００４３】
特殊な実施形態では、各標的核酸に対して2つの隣接するハイブリダイゼーションプローブが用いられ、各プローブはハイブリダイゼーションによって蛍光共鳴エネルギー移動を起こすことができる蛍光成分によって適切に標識されている（FRET-ハイブリダイゼーションプローブ）。
【００４４】
リアルタイム観測をも含みうる他の好ましい実施形態では、増幅反応は高速熱サイクルによって行われ、そこでは1サイクルが1分間以下である。
【００４５】
更なる態様では、本発明は、本発明の方法を実行するための試薬を含むキットを対象にする。このようなキットは、少なくとも最終濃度0.5ユニット/μlの熱安定性DNAポリメラーゼ、または少なくとも0.25ユニット/μlの熱安定性DNAポリメラーゼおよび高温開始増幅プロトコールに必要とされる付加的な化合物を提供するために、充分な濃度で熱安定性DNAポリメラーゼを含むマスター混液を含むことが好ましい。
【００４６】
発明の詳細な説明
新しい本発明は、少なくとも最終濃度0.5ユニット/μlで熱安定性DNAポリメラーゼを使用する、少なくとも102のダイナミックレンジを有する定量的多重PCRのための方法を提供する。好ましくは、少なくとも103のダイナミックレンジ、より好ましくは少なくとも104のダイナミックレンジが得られる。
【００４７】
本発明の方法が多様な異なる標的濃度に適用できることに注目することも重要である。このような背景において、少なくとも多重アッセイで増幅される標的核酸が102から108の間のコピー数で存在する場合には、本発明に従って同じダイナミックレンジが得られることも、実施例の中に示されている。
【００４８】
本発明において、1ユニットの熱安定性DNAポリメラーゼとは、標準的アッセイ条件下で、65℃、60分間で、酸沈殿性DNA内に20 nmolの全デオキシリボヌクレオシド3リン酸を取り込む酵素量として定義される。
【００４９】
これらの条件は、67 mM Tris/HCl、pH8.3/25℃、5mM MgCl2、10 mMメルカプトエタノール、0.2%ポリドカノール、0.2mg/mlゼラチン、各0.2mMのdATP、dGTP、dTTP、および0.1 mM dCTP、pH8.3/25℃である。
【００５０】
活性は、50 μlのインキュベーションバッファーで適切に希釈したTaqポリメラーゼと、M13mp9ss、M13プライマー（17mer）、および1μCi（α-32-P) dCTPを65℃、60分間で保温することによって測定することができる。取り込まれたdNTP量は、その後、トリクロロ酢酸沈殿によって決定される。
【００５１】
先行技術において開示されたものと同様に、本発明の多重PCRは、1つの反応槽内で1つ以上の核酸標的配列が、1つ以上の（少なくとも2つの）増幅プライマー対の存在下で増幅されるPCRアッセイとして定義される。
【００５２】
本発明は、明確に、PCRを用いてサンプル中の少なくとも第1および第2核酸を定量するための方法を対象にしている。多くの応用例において、分析される標的核酸は細胞の全RNAまたは全ポリA RNA（mRNA）に由来する。このようなRT-PCR分析においては、定量は、それ自体の増幅反応前にRNA依存的cDNA合成を行うことによって達成される。cDNA合成反応は特殊な逆転写酵素を用いて行われ、続いて汎用の熱安定性DNAポリメラーゼを用いた増幅が行われてもよく、あるいは、cDNA合成およびRT-PCRはRNA依存性逆転写酵素とDNA依存性DNAポリメラーゼの両方の活性を持つ熱安定性酵素を用いて行われてもよい。
【００５３】
上記に限らず、例えば遺伝子量または反復配列数の決定のために、ゲノムDNAもまた本発明の多重アプローチで分析できる。
【００５４】
本発明において、「核酸の定量」という用語は、絶対的な対照標準と比較した場合のサンプル中に存在する複数の核酸のコピー数の絶対評価、あるいは、同一サンプル中に見られる他の核酸と比較した場合の相対値の評価などの異なる可能性を含む場合がある。
【００５５】
当然、2つだけでなく多数の標的核酸が増幅される場合も、本発明の範囲内である。分析される核酸数に関して、上限はまだ実験的に決定されていない。しかし、実験を行う際、本発明の方法は、異なる増幅断片の検出に対して可能な数によってのみ限定される。
【００５６】
本発明によると、対象とする異なる標的核酸のもとの濃度は、互いに少なくとも100倍まで異なってもよい。更に、新しい方法は、異なる標的核酸の開始濃度が互いに1000倍または10000倍にまで異なるような状況に幅広く適用されることも、発明者によって証明されている。各々のデータは後述の実施例において示される。
【００５７】
本発明による典型的なアッセイは、定量される各標的核酸に対する増幅プライマー対、適切なバッファー、デオキシヌクレオシド3リン酸、および、少なくとも反応液中0.5ユニット/μlの濃度で熱安定性DNAポリメラーゼを含むであろう。定量される増幅標的の種類および数に関係なく、高濃度の酵素は、単一アプローチにおける少量の核酸標的の増幅と比較して、他の増幅される標的の存在によって、少量の標的の増幅が多くとも10％しか阻害されないことを保証するであろう。
【００５８】
一方、用いることのできるポリメラーゼの最高濃度は通常10ユニット/μlである。約5ユニット/μl、すなわち3〜7ユニット/μlの間、好ましくは約2ユニット/μl、すなわち1〜3ユニット/μlの間の濃度でも、大抵の場合、非常によく機能する。
【００５９】
更に、増幅は、増幅産物を検出するための手段を提供する物質の存在下で行われてもよい。例えば、反応槽は予め増幅産物の均質リアルタイム検出のために適切なハイブリダイゼーションプローブを含んでいてもよい。これらのプローブは蛍光成分によって適切に標識されていることが好ましい。
【００６０】
本発明に従ったPCRが高温開始によって行われた場合、すなわち、プライマーダイマーの形成が適切に阻害された場合、更なる利点を持つことも証明されている。このようなプライマーダイマーの形成は、主として、熱サイクル反応自体に先立つ室温での残存ポリメラーゼ活性に帰因している。標準的な増幅プロトコールとは対照的に、高温開始プロトコールの中では、ポリメラーゼ活性は、最初の加熱後しか活性化されず、従って、非特異的産物（例えば、プライマーダイマー）のアニーリングまたは増幅を引き起こす低温におけるいかなる活性をも排除される。この段階は、同一反応槽に更なるオリゴヌクレオチド（プライマー、蛍光プローブ、増幅産物）の添加がある場合の多重PCRにおいて、より重要であることが判明した。
【００６１】
任意に選択された高温開始技術の適用は、過剰量の熱安定性ポリメラーゼの所要量を約２分の１にまで減少させることが、発明者によって証明されている。
【００６２】
従って、本発明によると、少なくとも102のダイナミックレンジを有する信頼性のある多重PCRプロトコールは、任意の高温開始技術を併用した、少なくとも最終濃度0.25ユニット/μlのDNAポリメラーゼの使用を含む。
【００６３】
従って、本発明はまた、サンプル中の少なくとも第1および第2核酸の定量のためのPCRを用いた方法であって、サンプル中の第1核酸のもとの濃度は第2核酸のもとの濃度と比較して100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライマー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー対を添加すること、熱安定性DNAポリメラーゼによる2つの核酸を増幅させることを含む方法をも対象とする。ここでは、高温開始PCRが行われ、熱安定性DNAポリメラーゼは反応液中に少なくとも0.25ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅は第1プライマー対の非存在下で第2プライマー対を用いた第2核酸の増幅と比較して、10％未満までは阻害されない。
【００６４】
従って、プライマーダイマーの形成は、当技術分野において既知のいくつかの方法によって阻害され得る。
【００６５】
例えば、DNAポリメラーゼは化学修飾を受けて可逆的に不活性化される。より正確には、熱不安定性の阻害基がTaq DNAポリメラーゼに導入され、酵素を室温で不活性にしている。これらの阻害基はPCR前段階での高温で除去され、酵素は活性化される。このような熱不安定性の修飾は、例えば、酵素のリジン残基へのシトラコン酸無水物またはアコニット酸無水物カップリングによって得られうる（US 5,677,152）。一方、このような修飾を持つ酵素はAmplitaq Gold（Moretti, T.,ら、Biotechniques 25 (1998) 716-22、またはFastStart DNA Polymerase（Roche Molecular Biochemicals）として市販されている。
【００６６】
代替方法として、非特異的にアニーリングされたプライマーの伸長は、短い二本鎖DNA断片の添加によって阻害されることが示されている（Kainz, P.,ら、Biotechniques 28 (2000) 278-82.）。この場合、プライマーの伸長は、短い二本鎖DNA断片の融点より低い温度で阻害されるが、競合的DNA自体の配列とは無関係である。より一層特異的には、定義された二次構造をとる特異的配列を有する、オリゴヌクレオチドアプタマーが用いられてもよい。このようなアプタマーは、DNAポリメラーゼへの非常に高い親和性のために、SELEX技術を用いて選択されている（US 5,693,502）、（Lin, Y. Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100-11）。実際の熱サイクル過程自体の前に増幅混合物中のこのようなアプタマーが存在することは、再びDNAポリメラーゼに高親和性結合を生じ、その結果、その活性の熱不安定性阻害を生じる。
【００６７】
Taq DNAポリメラーゼの熱不安定性阻害を成立させるための別のアプローチは、精製酵素に対して作成されたモノクローナル抗体の添加である（Kellogg, D. E.,ら、Biotechniques 16 (1994) 1134-7; Sharkey, D. J.,ら、Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506- 9）。オリゴヌクレオチドアプタマーのように、抗体は、阻害様式において、室温で高い親和性でTaq DNAポリメラーゼに結合する。複合体は、熱サイクル過程自体の前の予熱段階で分解される。特に高速熱サイクルのためのプロトコール（WO 97/46706）を適用する場合、これは全体として増幅の実質的な時間消費の延長になる。
【００６８】
高温開始技術を適用するまたはしないに関わらず、本発明の方法は、PCR増幅がリアルタイムで観測され均質検出形式となる場合、特に適用できる。従って、得られる増幅産物は、少なくとも1つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによって検出されることが好ましい。このようなリアルタイム観測のための計測基盤は、Roche Light Cycler（Roche Molecular Biochemicals）、ABI Prism 7700（Perkin Elmer）、または、iCycler（BioRad）のような市販の機器によって提供される。
【００６９】
示されたように、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブはリアルタイム観測のために使用されうる。本発明による本発明の方法に使用されるこれらのハイブリダイゼーションプローブは、通常、増幅反応のアニーリング温度で標的核酸にハイブリダイズする、一本鎖DNAもしくはRNAなどの一本鎖核酸、またはその誘導体、或いはPNAである。これらのオリゴヌクレオチドは、通常20から100ヌクレオチドの長さを持つ。
【００７０】
標識化は、特定の検出形式に従って、オリゴヌクレオチドの任意のリボースまたはリン酸基に導入できる。核酸分子の5'および3'末端での標識が好ましい。
【００７１】
標識の種類は増幅反応のリアルタイムな様式で検出されるものでなければならない。これは蛍光標識プローブで可能であるだけでなく、NMRによって検出されうる標識を用いても可能である。しかし、増幅核酸は少なくとも1つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出される方法が特に好ましい。
【００７２】
多くの試験方法が可能である。下記の3つの検出形式は特に本発明と関連して有用であることが証明されているが、本発明の範囲を制限するものとして理解されるべきではない。
【００７３】
（i）FRETハイブリダイゼーションプローブ
この試験形式のために、増幅される標的核酸の同一鎖の隣接した部位に相補的である2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが、同時に使用される。両プローブは異なる蛍光性成分で標識される。適切な波長の光で励起した場合、蛍光共鳴エネルギー転移の原理によって、第1成分が吸収したエネルギーを第2成分へ転移させる結果、両ハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の隣接した位置に結合する場合、第2成分の蛍光放射を測定することができる。
【００７４】
本発明の範囲内で可能な全ての検出形式の中で、この「FRET-ハイブリダイゼーションプローブ」は、高感度、正確、かつ信頼性の高いものであるということが証明されている。
【００７５】
代替方法として、蛍光標識プライマーおよび1つだけの標識オリゴヌクレオチドプローブを用いることもまた可能である（Bernard, P. S.,ら、Anal Biochem 255 (1998) 101-7.）。
【００７６】
（ii）TaqManハイブリダイゼーションプローブ
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが2つの成分で標識される。第1成分が適切な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーは蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って第2成分、いわゆる消光剤に転移される。PCR反応のアニーリング段階の間に、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、続く伸長段階の間に、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光性成分および消光剤は空間的に互いから分離されるため、第1成分の蛍光放射を測定することができる。
【００７７】
（iii）分子ビーコン（Molecular Beacons）
これらのハイブリダイゼーションプローブもまた、第1成分および消光剤で標識されており、標識はプローブの両末端に位置することが好ましい。プローブの二次構造によって、両成分は溶液中で空間的に近傍にある。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両成分は互いから分離され、その結果、適切な波長の光による励起後、第1成分の蛍光放射を測定することができる（US 5,118,801）。
【００７８】
リアルタイムPCRが二本鎖核酸結合成分を用いて行われる場合、それもまた発明の範囲内である。例えば、本発明に従って、各々の増幅産物はまた、適切な波長の光による励起の後、二本鎖核酸との相互作用に対応した蛍光シグナルを放射するDNA結合蛍光色素によっても検出されることができる。SybrGreenおよびSybrGold（Molecular Probes）色素は、この応用例に特に適していることが証明されている。代替としてインターカレーション型色素も使用することができる。しかし、この形式では、異なる増幅産物を識別するために、それぞれのメルティングカーブ分析を行うことが必要である（US 6,174,670）。
【００７９】
リアルタイム観測をも含みうる別の好ましい実施形態では、増幅反応は、1サイクルが1分未満である高速熱サイクルによって行われる。このような高速熱サイクルのための計測基盤は、例えばLightCycler（Roche Molecular Biochemicals）によって提供され、WO 97/46707およびWO 97/46712で公開されている。本発明によれば、プライマーのアニーリングは、少量でしかサンプル中に存在しない標的核酸の定量的増幅の律速段階ではない。従って、少量の要素を増幅するための各々の多重熱サイクルプロトコールの時間変数は、当技術分野において既知のいかなる熱サイクルプロトコールと比較しても修正される必要はない。
【００８０】
更なる態様において、本発明は、本発明の方法を行うための試薬を含むキットを対象とする。より具体的には、このようなキットは、熱サイクル反応自体に先立って、分析されるサンプル、適切なプライマー、および反応容量を調整するための水だけを添加すればよいだけの様式で増幅に使用できる、マスター混液を含んでもよい。
【００８１】
発明によれば、マスター混液は、少なくとも0.5ユニット/μlの最終濃度の熱安定性DNAポリメラーゼを供給するために十分な濃度の熱安定性DNAポリメラーゼを含む。パラメータ特異的なキットは、更に、各々の配列を有するプライマーを含みうる。これらのオリゴヌクレオチドはマスター混液に含まれてもよい。
【００８２】
更に、このようなキットは、リアルタイムPCRによって生成される産物の均質検出に適切な試薬、例えば、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブまたは、二本鎖DNA結合体を含んでもよい。各々のプライマーのように、いくつかの場合では、それらもまたマスター混液に含まれるようになるかもしれない。
【００８３】
代替として、本発明のキットは、高温開始PCRのためのマスター混液を含み得る。このようなマスター混液は、少なくとも0.25ユニット/μlの最終濃度の熱安定性DNAポリメラーゼを供給するために十分な濃度で、熱安定性DNAポリメラーゼを含み、かつ、高温開始PCRを可能にするためのさらなる物質をみ得る。ポリメラーゼ活性を室温で不活性化し得るこのような物質は、例えば、抗ポリメラーゼ抗体、または、ポリメラーゼ結合性核酸アプタマーであってもよい。
【００８４】
更に別の実施形態では、本発明のキットは、化学的に修飾されていることによって、化学的修飾を除去するためにポリメラーゼが加熱されない限り室温で不活性な熱安定性DNAポリメラーゼを、少なくとも0.25ユニット/μlの最終濃度の熱安定性DNAポリメラーゼを供給するのに十分な濃度で含む、高温開始PCRのためのマスター混液を包含し得る。
【００８５】
そのキットが、標準曲線のために希釈系列を作成するための既知量の標準DNA、または代替として、ある特定の増幅反応の効率を決定するために使用されうる補正サンプルのいずれかを含む場合、 それもまた有利であることも証明されている。
【００８６】
以下の実施例、参照、配列表および図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の正確な範囲は添付の請求項において述べられる。本発明の精神から逸脱することなく記載した手順に改良がなされ得ることが理解される。
【００８７】
【実施例】
実施例１
CK20およびPBGDプラスミドDNAのリアルタイムPCR
本発明の有効性を実証するために、すなわち播種性腫瘍細胞の検出のために研究された遺伝子であるサイトケラチン20（CK20）、およびハウスキーピング遺伝子として一般に用いられる、ポルフォリンビリノーゲンデアミナーゼ（PBGD）を増幅標的として選択した。
【００８８】
サイトケラチン20（CK20）およびポルフォリンビリノーゲンデアミナーゼ（PBGD）遺伝子の部分的断片は、別々のpT3T7プラスミドベクター（Roche Molecular Biochemicals）にクローニングされた。直鎖状にしたプラスミドDNAのコピー数は、1モルが6 x l023コピーに等しいという仮定を用いて、分光光度法で概算された。CK20およびPBGDプラスミドDNA混合物は、10mM Tris-HCl、pH 8.5中のMS2 RNA（10ng/μl）から成る希釈液を用いた希釈によって調製された。
【００８９】
キネティックPCRはLightCycler機器（Roche Molecular Biochemicals）で行われた。標準的なPCRアッセイは、1μlのDNA、1 x 検出混合物、1 x 反応バッファー、4mMの塩化マグネシウム、および様々な量のTaqポリメラーゼから成り（すべてRoche Diagnostics, Mannheim, Germanyによる）、1つの反応キャピラリー中10μlの容量に水で調節する。
【００９０】
通常の単一および多重PCRのために、LightCycler - DNA Master Hybridisation Probes Kit (Roche Molecular Biochemical, カタログ番号2015 102）からの反応バッファーおよび修飾されていないTaqポリメラーゼを使用した。
【００９１】
CK20およびPEGDのための10 x検出混合物は、それぞれ、10mMのTris-HCl、pH 8.5バッファー中、各5μMのプライマー（フォワードおよびリバース）、各2μMの（フルオレセインおよびLC-Red640、または、フルオレセインおよびLcred705で標識された）ハイブリダイゼーションプローブ、0.05% Brij-35から成る。多重PCRのために、反応キャピラリー内には更なる1x検出混合物が含まれた。
【００９２】
以下のプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブ配列が用いられた。
【００９３】
0003909010.tif 000002
（配列番号:８）
LCRed640を用いたCK20 PCRのための、および、LCRed705を用いたPBGD PCRのためのハイブリダイゼーションプローブの標識化は、別々のチャネルでの各反応の同時観測を可能にする。チャネル2（LCRed640）および3（LCRed705）間の蛍光のクロストークは、LightCycler - Color Compensation Set（Roche Molecular Biochemicals）を用いることによって補正された。
【００９４】
通常のPCRサイクル条件は、最初に94℃1分間の保温、続いて94℃0秒間、55℃10秒間および72℃10秒間の50サイクルから成り、40℃30秒間で完了する。
【００９５】
各反応についての交差ポイント（crossing point）は、計算による基準線の設定による二次微分最大関数を用いてLightCycler分析ソフトウェアによって決定された。
【００９６】
実施例２
過剰なポリメラーゼは単一PCRアッセイの性能を増大させない
102、104および106コピーのCK 20のリアルタイムPCRは、実施例１に従って、量を増加させて0,0825 U/μl、0,165 U/μl、0,33 U/μl、または、0,66 Uμlのいずれかの量のFast Start Polymerase（Roche Molecular Biochemicals）を含む単一構成で行われた。結果は、図１に示す。そこで見られるように、同定される各コピー数に対する蛍光シグナル曲線は、用いられる酵素濃度に関係なく基本的に同一であったため、酵素濃度の増加により低いCp値を生じることはない（左：106コピー、中央：104コピー、右：102コピー）。単一PCR、すなわち1つの標的核酸だけの増幅では、標的核酸が初めに高いコピー数で存在したとしても、過剰な増幅反応はポリメラーゼによって増強されないと判断されるべきである。
【００９７】
実施例３
多重PCRアプローチでは比較的少量の標的は定量的に増幅されない
【００９８】
図２は、それぞれ実施例１に従ったCK20およびPBGDの単一PCRの代表的な結果を、0,0825 U/μlのTaqポリメラーゼを用いて実施例1に従った単一PCR中に2つの個別のPCRのプライマーセットおよびキネティックPCRのための蛍光プローブセットを単に混合することによる多重アプローチ（多重PCR）と比較して示す。
【００９９】
反応のための異なる鋳型核酸は、それぞれ102/104、104/104および106/104のCK20/PBGDコピー量を含んでいる3つのプラスミド混合物を含む。同一PCR実行中に、競合反応のない個別PCR（図２a）、および同一反応槽で起こるバックグラウンドPBGD PCRを伴った多重PCRにおける、CK20増幅の反応効率は、チャネル2で観測される（図２a）。同時に、個別および多重PCRにおけるPBGD増幅に対する反応効率は、チャネル3で観測される（図２b）。
【０１００】
その結果は、特にバックグラウンド反応のための鋳型のコピー数が標的反応のそれを100倍上回る場合、個別PCRと比較した、多重PCRにおける標的PCRの対数期曲線の勾配が有意に減少することを示す。これはすなわち、増幅されているPBGD 104コピー存在下ではCK20 102コピーの増幅、および、増幅されているCK20 106コピー存在下ではPBGD 104コピーの増幅ということである。
【０１０１】
当技術分野において既知の方法に従って得られたこれらの結果は、当技術分野において既知の標準的PCR条件下では、ダイナミックレンジが明かに100倍未満であることを示唆する。
【０１０２】
実施例４
過剰なポリメラーゼは多重PCRにおいて比較的少量の標的の増幅を増強する。
【０１０３】
実施例１に従ったアッセイをポリメラーゼ濃度を増加させて行った。PBGD 104コピーのバックグラウンドPCRを伴うCK20 102コピー（図３a）、または、CK20 106コピーのバックグラウンドPCRを伴うPBGD 104コピー（図３b）のいずれかが定量した。
【０１０４】
図に示されるように、ポリメラーゼ濃度の増加は、多重PCRのPCR対数期勾配を増加させる。これは、相当する単一構成においてすでに観察されたこと（上記の実施例２を参照）と驚くべき対照をなしている。
【０１０５】
更に、その結果は、0.33ユニット/μlのポリメラーゼ濃度が、多重PCRの対数期勾配を個別PCRのそれを同等と見なすにはまだ十分ではないことを示す。この実験では、単一対照に相当する性能をもたらすのは、0.66ユニット/μlの「過剰な」ポリメラーゼ量だけである。
【０１０６】
一般的な真正のポリメラーゼ濃度の改良に関する更なる実験は（データは示されない）、多重PCR曲線の勾配が個別PCRのそれと等しくなるために、少なくとも約0.5ユニット/μl反応容量のポリメラーゼ濃度が必要とされることを示した（データは示されない）。
【０１０７】
実施例５
通常のPCR増幅を越える高温開始プロトコールの向上した性能
【０１０８】
多重PCRと同様に単一PCRにも、LightCycler - FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit（Roche Molecular Biochemicals, カタログ番号 3 003 248）からの反応バッファーおよび修飾Taqポリメラーゼを比較のために用いた以外は実施例１に従って高温開始PCRサイクルを行った。104コピーのPBGDの増幅は、CK 20 106コピーのバックグラウンドPCRとともに、0,0825 U/μl、0,165 U/μl、0.33のU/μl、または、0.66U/μlのいずれかのポリメラーゼ酵素濃度（最終濃度）にて分析された。熱サイクルプロトコールは、最初の加熱は94℃ 10分間に、およびサイクル中の94℃は10秒間に修正した。
【０１０９】
図４は、酵素およびそれに対応しているバッファー以外同一の漸増条件下で、通常のポリメラーゼと比べた高温開始ポリメラーゼに必要な酵素量の比較を示す。ポリメラーゼ0.66ユニット/μl（反応容量）の通常のポリメラーゼが、個別のPCRに等しい多重PCRの対数期勾配を生じる一方（図４a）、高温開始ポリメラーゼの使用は、約半分にまで所要量を減少させる（図４b）。
【０１１０】
実施例６
過剰ポリメラーゼ多重PCR（高温開始）についての可能性のあるダイナミックレンジ
図5は、実施例１に従ってFastStartポリメラーゼを用いた多重実験を示す。PBGD 102コピーのPCR増幅は、それぞれ102、104、106および108コピーのCK 20バックグラウンド、および0.55ユニット/μl反応容量の過剰量のFastStartポリメラーゼを用いて行われた。図に見られるように、PBGD PCR対数期曲線勾配（図５b）と交差ポイントは、バックグラウンドCK20 PCR（図５a）に関わらず、互いに類似している。CK20 PCR増幅について、正確なPCR定量に不可欠な交差ポイントとlog濃度との間の線形関係は維持されている（R2=-1）（図５c）。
【０１１１】
従って、これらのデータは、本発明のPBGDおよびCK20の多重増幅に対して、ホットスタートの実施形態によって106のダイナミックレンジが得られることを示す。
【０１１２】
実施例７
過剰ポリメラーゼ多重PCR（高温開始）についての可能性のあるダイナミックレンジ
異なる増幅標的としてHer2/neuおよびβグロビンを用いた同様の実験において、同一の結果が得られている。増幅条件は、実施例１のそれらと基本的に同一であった。しかし、この場合には、PCRは、製造メーカーの使用説明書に従った高温開始増幅のための手段として、供給元によって示される条件下で、KlenTaq Antibody（Clontech）と併用して、1UのKlentaq Polymerase（Clontech、6Uの標準ポリメラーゼに相当する）を用いて行った。
【０１１３】
Her2/neuに対しては配列番号９-１０、およびβグロビンに対しては配列番号１１-１２に従った以下のプライマーが用いられた。
【０１１４】
0003909010.tif 000003
Her2/neuのためのハイブリダイゼーションプローブは、LC-Red 640で5'標識された配列番号１３、およびフルオレセインで3'標識された配列番号１４に従った配列を含むオリゴヌクレオチドであった。βグロビンのためのハイブリダイゼーションプローブは、LC-Red 705で5'標識された配列番号１５、およびフルオレセインで3'標識された配列番号１６に従った配列を含むオリゴヌクレオチドであった。
【０１１５】
0003909010.tif 000004
（配列番号１６）
この実験では、10コピーのHer2/neuプラスミドDNAは、βグロビンプラスミドDNAの10〜107コピーのバックグラウンドにかかわらず、106のダイナミックレンジに対応して、同一の効率で増幅され得た。
【０１１６】
実施例８
過剰ポリメラーゼの添加によって得られるダイナミックレンジの、絶対標的コピー数に対する独立性
過剰ポリメラーゼの多重高温開始PCRの許容性を評価するため、更に、絶対標的濃度からダイナミックレンジの依存の可能性を除外するために、いくつかの小さな変更を伴う基本的に実施例１で示された条件に従った実験が行われた。
【０１１７】
より正確には、102コピーのPBGDは、様々な量のFastStartポリメラーゼを用いて、102、104、106および108コピーのCK20のバックグラウンドPCRとともに増幅され、同じ条件下で分析された。
【０１１８】
PBGDの定量的増幅のための指標として、RocheLightCyclerマニュアル（Roche Molecular Biochemicals）に従い、いわゆる「二次微分アルゴリズム」（US 6,303,305）を用いて、交差ポイント（cp値）が決定された。本発明の酵素濃度が用いられた場合、二次微分データ処理アルゴリズムを用いて、予想される統計的許容誤差範囲内で、加えられた過剰なCK 20とは独立して、所与の標的濃度に対して同一のcp値が得られた。
【０１１９】
得られたPBGDに対するcp値は、以下の表に示される。
【０１２０】
【表１】
0003909010.tif 000005
これらの結果から、以下の結論を引き出すことが妥当である。
【０１２１】
第一に、本発明によって得られた酵素濃度についてのデータ（表１、右側カラム、0,3300 U/μl）は、多重アッセイ内で増幅されるべき標的核酸が102〜108の間のコピー数で存在するならば、この場合、本発明による多重PCRが、全体で106のダイナミックレンジを生じるということを実証する。
【０１２２】
第二に、同一の実験条件下で104コピーのPBGDが、102コピーのPBGDの場合と同様に、同じ増幅効率で増幅されることになったのは、些少なことである。従って、106コピーのCK20バックグラウンドで102コピーのPBGDを増幅する結果が、108コピーのCK20バックグラウンドでの104コピーの増幅と比較される場合（データは示さない）、本発明の過剰量のポリメラーゼの使用によるダイナミックレンジの増加の効果は、本来サンプル中に存在する標的DNAの絶対的なコピー数から独立しているということもまた、結論付けることができる。
【０１２３】
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US 6,303,305
WO 97/46706
WO 97/46707
WO 97/46712
【０１２４】
【配列表】
0003909010.tif 000006
0003909010.tif 000007
0003909010.tif 000008
0003909010.tif 000009
0003909010.tif 000010
0003909010.tif 000011
0003909010.tif 000012
0003909010.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、単一増幅の結果を示す。
102、104、および106コピー数のCK 20はそれぞれ、0,0825 U/μl、0,165 U/μ1、0,33 U/μl、または、0,66 Uμlのポリメラーゼのいずれかで増幅された。
【図２】図２は、0,0825 U/μl Taq DNAポリメラーゼによる、様々な比率のCK20およびPBGDの単一および多重増幅の結果を示す。
図２aは、CK20の増幅 - 単一アッセイおよび多重構成の結果である。
図２bは、PBGDの増幅 - 単一アッセイおよび多重構成の結果である。
【図３】図３は、Taqポリメラーゼの量を増加させて用いたCK20/PBGDの多重増幅の結果を示す。
図３aは、CK20についてである。
図３bは、PBGDについてである。
【図４】ポリメラーゼの量を増加させて用いた、高温開始PCRを伴う多重増幅および伴わない多重増幅の結果である。
図４aは、Taq DNAポリメラーゼである。
図４bは、FastStart DNAポリメラーゼである。
【図５】図５は、過剰な高温開始ポリメラーゼを用いて得られるダイナミックレンジの拡大を示す。
図５aは、100コピーのPBGDをバックグランドとした様々なコピー数のCK20の増幅である。
図５bは、様々なコピー数のCK20をバックグランドとした100コピーのPBGDの増幅である。
図５cは、CK20増幅の回帰分析の結果である。
【図１】
0003909010.tif 000014
【図２】
0003909010.tif 000015
【図３】
0003909010.tif 000016
【図４】
0003909010.tif 000017
【図５】
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