(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面を形成する構成物に組み合わせられたスルホリピド多糖を含んでなるワクチンのためのアジュバントであって、
スルホリピド多糖がシクロデキストリン、マルトデキストリン、イヌリンおよびプルランから成る群から選択される疎水性多糖に由来することを特徴とするアジュバント。
【請求項２】
スルホリピド多糖がシクロデキストリンに由来することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
スルホリピド多糖がα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンからなる群より選ばれる多糖に由来することを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項４】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.01個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項５】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.12個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項４に記載のアジュバント。
【請求項６】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.0個を超えない硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項７】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり0.23個を超えない疏酸基を含有することを特徴とする、請求項６に記載のアジュバント。
【請求項８】
スルホリピド多糖がマルトデキストリンに由来し、かつ、それがその疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり0.23個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項９】
スルホリピド多糖がシクロデキストリンに由来し、かつ、それがその疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり0.20個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１０】
スルホリピド多糖がイヌリンに由来し、かつ、それがその疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり0.19個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１１】
スルホリピド多糖がプルランに由来し、かつ、それがその疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり0.16個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１２】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.01個のリピド基を含有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１３】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低1.05個のリピド基を含有することを特徴とする、請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１４】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり2.0個を超えるリピド基を含有しないことを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１５】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.29個を超えるリピド基を含有しないことを特徴とする、請求項１４に記載のアジュバント。
【請求項１６】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.29個のリピド基を含有するマルトデキストリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１７】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.05個のリピド基を含有するシクロデキストリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１８】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.24個のリピド基を含有するイヌリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項１９】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり1.24個のリピド基を含有するプルランの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２０】
リピド基が４−22個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２１】
硫酸基とリピド基の比が、その化合物の疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基0.01−２であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２２】
硫酸基とリピド基の比が、その化合物の疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基0.10−0.19であることを特徴とする、請求項２１に記載のアジュバント。
【請求項２３】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基およそ0.18の硫酸基と脂質基の比を含有するマルトデキストリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２４】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基およそ0.19の硫酸基とリピド基の比を含有するシクロデキストリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２５】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基およそ0.15の硫酸基とリピド基の比を含有するイヌリンの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２６】
スルホリピド多糖が、その疎水性の特性を維持しながら、リピド基あたり硫酸基およそ0.13の硫酸基とリピド基の比を含有するプルランの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２７】
界面を形成する構成物が、水と混和できない液体および水相に不溶である固体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２８】
水と混和できない液体が、スクアラン、ダイズ油、鉱物油およびヘキサデカンから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項２９】
スルホリピド多糖の濃度が０．１−１００ｍｇ／ｍＬである請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３０】
スルホリピド多糖の濃度が２−２０ｍｇ／ｍＬである請求項２９に記載のアジュバント。
【請求項３１】
抗原の水溶液、請求項１に記載のスルホリピド多糖および界面を形成する構成物、ならびに乳化剤を乳化することを特徴とするエマルシヨンの状態にあるワクチンの調製方法。
【請求項３２】
抗原と請求項１に記載のスルホリピド多糖および界面を形成する構成物を含むアジュバントとを含んでなるワクチン。
【請求項３３】
シクロデキストリン、マルトデキストリン、イヌリンおよびプルランからなる群より選ばれる多糖のスルホリピド多糖を加えることを特徴とする水中油または油中水ワクチンの毒性の低下方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は新規のワクチンのアジュバントに関する。
抗原は、例えば非経口に投与される場合に免疫応答、例えば抗体の形成を誘導する、所定の生物体に対しての外来物質として定義される。
抗体は血液および他の体液中、ならびに組織中に含有される物質であり、また、抗原と結合してそれを無毒にする物質である。抗体は身体の生来の防御メカニズムのひとつを構成する。それらは高度に特異的であり、また、それらの形成を誘導した抗原を殺し得、それらに結合し得、もしくは無毒にし得る。
抗原は、免疫系に接触することで複雑な一連の細胞の相互作用を活性化し、抗原を排除しそして／もしくは先にある平衡を再度確立する。
抗原の特徴的特色のうちの２つは、それらの免疫原性、すなわちインビボで免疫応答を誘導するそれらの能力（特異的抗体の形成を包含する）、および、それらの抗原性、すなわちその起源がその抗原である抗体により選択的に認識されるそれらの能力である。
ワクチンにより特異的抗原を投与することにより免疫応答を故意に刺激する方法は既知である。当該処置は、当該抗原とのその後の接触の間のその生物体のより迅速かつより効果的な応答を可能にする、その生物体での免疫応答の状態の獲得を可能にする。
しかしながら、若干の抗原は弱い免疫原性のみを有し、かつ、それらはその生物体の有効な保護を獲得するのに不十分な免疫応答を誘導する。
抗原の免疫原性はアジュバントと呼ばれる物質との混合物でそれを投与することにより増強され得る。アジュバントは、免疫系に直接作用することによるか、もしくは当該抗原の薬物動態的特徴を修飾することによるかのいずれかで、および、かように後者と免疫系との間の相互作用時間を増加させることにより、当該抗原に対する応答を増強する。
この時点で、多数の獣医学のワクチンは、鉱物油中水型（Ｗ／Ｏ）もしくは水中鉱物油型（Ｏ／Ｗ）のアジュバントのような、鉱物油の標準的乳剤をなお含むアジュバントを使用する。何年かの間、低減された毒性で類似の有効性を有する代替物を見出すために研究が実施されてきた。鉱物油に基づくこれらの標準的アジュバントの注入は、その重篤度が乳剤のタイプおよび使用される油の性質に大部分依存する局所反応をしばしば伴う。鉱物油に基づくアジュバントの使用は結果として家畜（ブタ、ニワトリ、反芻動物、など）および実験動物に限られる。
より以前、水中スクアラン（Ｓ）（Ｓ／Ｗ）乳剤に組み込まれた、硫酸基および脂質基をもつ、ポリスクロースおよびエピクロリドリン（原文ママ；エピクロロヒドリン）の合成コポリマー（フィコール）（ＳＬ−フィコール）が、いくつかの重要なウイルス抗原を包含する異なるタイプの抗原に対し、異なる動物種（ブタを含む）に対する高いアジュバント効果を有したことが示されている（ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.653-660（1994）およびワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.661-665（1994）、欧州特許第EPO 0,549,074号）。フィコールに基づくアジュバントのこれらの処方は、種々の豚のワクチンで使用される水中鉱物油の標準的処方に置き換わるのに十分に有効である。
しかしながら、局所毒性、すなわちブタおよびマウスでのフィコールに基づくこれらの処方の反応生成性は、Ｏ／Ｗ型の鉱物油の標準的処方のそれより弱いことが判明しなかった。
加えて、フィコールに基づく処方に関しては、温度がその乳剤の安定性に対し著しい効果を有する。これらの乳剤のいくつかは４℃で数年間安定であったが、しかし、水相および油相は37℃で数日以内に、また60℃でおよそ10分以内に分離した。
本発明の目的は、高温で増大した安定性を有しかつより低い局所毒性を呈する、ワクチンのための有効なアジュバントを提案することである。
この目的は、界面を形成する構成物と組み合わされたスルホリピド多糖を含む、ワクチンのためのアジュバントにより達成される（例えば、油／水型（Ｏ／Ｗ）の乳剤）。
本発明によるアジュバントの利点のひとつは、それがフィコールに基づくアジュバントより高温でより安定であることである。
この目的は、界面を形成する構成物と組み合わせられたスルホリピド多糖を含む、ワクチンのためのアジュバントにより達成される。
「多糖」という表現は、互いに共有結合された最低３個の反復する糖単位を有する化合物を意味する。
「スルホリピド多糖」という表現は、互いに共有結合された最低３個の反復する糖単位、最低１個の硫酸基、および最低１個の脂質基を有する化合物を意味する。
好ましくは、スルホリピド多糖は疎水性多糖である。
「疎水性多糖」という表現は、無極性有機相よりも水相でより小さく可溶性である多糖を意味する。
最初の有利な態様により、スルホリピド多糖はシクロデキストリン、マルトデキストリン、イヌリン、フィコールおよびプルランから成る群から選択される。
好ましくは、スルホリピド多糖はシクロデキストリン、マルトデキストリンおよびイヌリンから成る群から選択される。
好ましいスルホリピド多糖はシクロデキストリンである。
当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.01個の硫酸基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.12個の硫酸基を含有する。
当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり1.0個を超えない硫酸基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり0.23個を超えない硫酸基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.23個の硫酸基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.20個の硫酸基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.19個の硫酸基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.16個の硫酸基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.12個の硫酸基を含有する。
平均で、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、単糖あたり最低0.01個の脂質基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり最低1.05個の脂質基を含有する。
平均で、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、単糖あたり2.0個を超えない脂質基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり1.29個を超えない脂質基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.29個の脂質基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.05個の脂質基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.24個の脂質基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.24個の脂質基を含有する。
好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、それはその疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.22個の脂質基を含有する。
当該脂質基は好ましくは４−22個の炭素原子を含有する。
硫酸基と脂質基の比は、有利には脂質基あたり硫酸基0.01−２個である。好ましくは、硫酸基と脂質基の比は、その化合物の疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基0.10−0.19個である。
好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、硫酸基と脂質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.18個である。
好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、硫酸基と脂質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.19個である。
好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、硫酸基と脂質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.15個である。
好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、硫酸基と脂質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.13個である。
好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、硫酸基と脂質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.10個である。
「界面を形成する構成物」（すなわち「ＩＦＣ」）という表現は、水性媒体中で物質と水相との間に物理的界面を形成する物質を意味する。
界面を形成する構成物は、水と混合できない液体（例えば、スクアラン、ダイズ油、鉱物油、ヘキサデカン）もしくは水相に不溶である固形物から成る群から選択される。
本発明の水相に不溶な固形物は、不溶性塩（例えば、Ａｌ（ＯＨ）3、ＡｌＰＯ4、ミョウバン、オキザロ酢酸カルシウム）、微粒子、ナノ微粒子、ひとつもしくはそれ以上のポリマー、コポリマー（例えば、ポリアクリル酸エステル、ポリメチルメタクリル酸エステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアクチド、ポリグリコリド）のミクロスフェアおよびナノスフェア、あるいは脂質二重相もしくは脂溶性作用物質（例えばリン脂質）または界面活性剤のミセルを含む。
好ましくは、「ＩＦＣ」成分は水と混合できない液体である。
有利には、界面を形成する構成物は、ダイズ油、スクアランおよびヘキサデカンから成る群から選択される。
ワクチンのための安定なアジュバントは、スルホリピド多糖の（疎水性の）誘導体、界面を形成する構成物、および乳化剤を含むそれらである。
加えて、本発明によるアジュバントの有効性は、標準的アジュバントのそれに匹敵するかもしくはより大きくさえある。局所毒性、すなわち本発明によるアジュバントの反応生成性は、一般に標準的アジュバントのそれより小さく、また、フィコールに基づくアジュバントのそれより小さい。
比較的より低い分子量のスルホリピド多糖が低減された局所毒性を有するようである。
本発明の別の局面により、スルホリピド多糖をワクチンのアジュバントとして使用することが提案される。
本発明のさらに別の態様により、乳剤中のワクチンを調製する方法が提案される。これは抗原の水溶液がスルホリピド多糖、乳化剤および界面を形成する構成物の存在下に乳化されることを特徴とする。
本発明の別の局面により、免疫原性の量の抗原（免疫原）および本発明によるアジュバントを含むワクチンが提案される。
好ましくは、アジュバントの濃度は0.1−100mg/mL、好ましくは２−20mg/mLである。
当該ワクチンは、アジュバントの他に、例えば不活性化されたウイルス、生存ウイルス、細菌、サブユニット、タンパク質、ペプチドならびに不活性化ＭＲＣ−11株インフルエンザウイルス、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、不活性化Ａ／Swine株インフルエンザウイルス、および／もしくは不活性化偽狂犬病ウイルス（ｉＰＲＶ）の抗原を含む。
測定される抗体力価は商業的製品で使用される水中鉱物油の乳剤により得られるそれらより高かった。ＳＬ−フィコールと当該乳剤との間に強い相乗活性が存在することが見出されており、これはマウスでよりブタでより著しい（ヒルガース（Hilgers）ら、ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.661-664、1994）。マウスでの抗体応答は有意に増大した（ヒルガース（Hilgers）ら、ワクチン（Vaccine）、Vo1.12、pp.653-660、1994）。
反応生成性は処方中に包含される多糖および油のタイプに依存し、また、多糖の分子量が重要な因子のうちのひとつであるという結論が引き出される。
シクロデキストリンおよびそれらの誘導体は、例えば製薬学的目的の物質のような他の物質を、それらの環状構造により形成されるくぼみに封入する封入複合体を形成するそれらの能力についてよく知られている。
これらの封入複合体により提供される利点は、溶解性、バイオアベイラビリティーおよび／もしくは化学的安定性の改善、半減期の長さの増大、二次的効果の低下、ならびに、液体製剤の開始点として使用されるべき乾燥粉末のより容易な獲得のような産生の間のある利点を包含する。
シクロデキストリンに基づくスルホリピド多糖（ＳＬＰ）はかように上に記述されるアジュバントとしてのそれらの使用に加えて興味深い応用を有し得る。
実際、ＳＬ−シクロデキストリンは、これらの分子中の陰イオン基（硫酸基）および疎水性基（脂肪鎖）の同時の存在により界面活性剤である。この特性は、水相でのミセルもしくは他の界面活性剤の存在下での混合ミセルの形成、ならびに水と混合できない液体の乳剤、不溶の粒子の水相中の懸濁剤の形成、または水相と液体もしくは固形の不溶物質との間の界面の形成の発端である。
かように、ＳＬ−シクロデキストリンは封入複合体の形成が可能であることおよび界面活性剤であることの二重の利点を呈する。
それらは、かように、製薬学的分野での独創的応用にそれら自身を与える新規の特性を呈する生成物の一族を形成すると考えられ得る。
多数の異なるＳＬ−シクロデキストリンが得られており、それらは、シクロデキストリンのタイプ（例えば、α、β、γ）、硫酸基の含量ならびに脂質基の含量および性質から生じるそれらの物理化学的特性において異なる。
実施例１
異なる多糖が、合成に使用される有機溶媒でのそれらの溶解性を決定するため試験されており、そして不十分な溶解性をもつそれらは断念された。マルトデキストリン（マルトデキストリン15；アミルム（Amylum）、ベルギー）4.5g、β-シクロデキストリン（アクロス（ACROS））4.5g、イヌリン（ダリアの塊茎、シグマ（Sigma）、ＵＳＡ）4.5gおよびプルラン（林原株式会社）4.5gを、無水ジメチルホルムアミドおよび無水ピリジン（体積比１：１）の混合物（100mL）に別個に溶解した。短時間（48時間）、これらの多糖の溶液を分子メッシュ（サイズ２Ａ）（メルク（Merck）、ダルムシュタット、ドイツ）により乾燥した。塩化ラウロイル（メルク、ドイツ）6.6gを添加し、そして当該混合物を60℃で６時間さらに室温（およそ15−22℃）で18時間インキュベーションした。その後、無水ジメチルホルムアミドおよび無水ピリジンの混合物（10mL）中のクロロスルホン酸（メルク、ドイツ）0.6gを添加し、そして室温でのインキュベーション処置を繰り返した。溶媒を60℃で１−２時間の減圧（200mb）での蒸発により除去し、そして、10,000Ｄのカットオフ閾値を有する再生セルロース膜（スペクトラ（SPECTRA）／ＰＯＲ）を使用し、等張のリン酸緩衝液処理生理的食塩水溶液（この生理的食塩水ＰＢＳ溶液は、7.3のｐＨを有し、水１リットルあたり、塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム0.2gおよびリン酸水素二ナトリウム1.15gを含む）を使用し、さらにその後超純水を使用して、濾液中に溶媒の痕跡が検出されなくなるまで透析した。透析溶液（ＰＢＳ生理的食塩水溶液もしくは超純水）と透析の間に使用される残渣との間の体積比は10：１（体積／体積）より上に維持する。透析は最低10日間実行し、透析溶液は最低１日１回交換する。このように得られたスルホリピド多糖（ＳＬＰ）を、0.1mbより小さな内圧かつ−25℃より低い温度のコールドトラップで、室温で凍結乾燥した。
ＳＬＰの組成を、上に記述されるように（ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.653-660）、多糖、結合された硫酸基、総脂質含量および結合された脂質含量をアッセイすることにより測定した。
２体積／体積（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のトウィーン（Tween）80を含有するリン酸緩衝液処理生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中の１重量／体積（ｗｔ／ｖｏｌ）％のＳＬＰの溶液は、まず、ＳＬＰを最小体積（20mL）のメチルブチルエーテル（メルク）中に溶解することにより、ＳＬＰ１グラムあたり２mLのトウィーン80（メルク）を添加することにより、そして、トウィーン80中のＳＬＰの粘稠な溶液が得られるまで高温（±60℃）でおよび減圧（50mb）でメチルブチルエーテルを蒸発させることにより、調製した。ＳＬＰ１グラムあたり10mLの水をゆっくりと添加し、そしてその後、適切な量のＰＢＳおよび油を添加した。この混合物をミクロ流動化装置（マイクロフルイディクス
コープ（Microfluidics Corp.）、ニュートン、ＵＳＡ）を使用し、顕微鏡下（倍率1000×）で２もしくは３μmより大きな油滴が見えなくなるまで乳化した。この乳剤は、使用するまで４℃で保存した。
ワクチンは、１体積の抗原を１体積のアジュバントと混合することにより調製した。抗原は上に記述されるように（ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.653-660およびワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.661-665）調製した。異なる抗原の２個の溶液を使用した。すなわち、溶液IIは、１mLあたり、不活性化インフルエンザウイルスＭＲＣ−11株（ソルヴェイ  ダファー（SOLVAY DUPHAR））10μg＋1000μgＯＶＡ（シグマ）を含み、また、溶液Iは、１mLあたり、不活性化インフルエンザウイルスＡ／Swine株（ソルヴェイ  ダファー）4.4μg/mL、ＭＲＣ−11株の不活性化インフルエンザウイルス（ソルヴェイ  ダファー）4.0μg、Ｘ−79株の不活性化インフルエンザウイルス（ソルヴェイ  ダファー）2.0μgおよび108  ＴＣＩＤ50の不活性化偽狂犬病ウイルス（ｉＰＥＶ）（ソルヴェイ  ダファー）を含む。
８−10週齢（およそ20g）の雌性ＮＭＲＩマウス（チャールズ  リヴァー（Charles River）、ドイツ）を、ワクチン0.025mLを足に注入することにより免疫し、そして抗体力価を３週間後に測定した。
抗体力価は幾何平均（2log＋ＳＥＭ）として表した。抗体力価の分析を標準化された検定により実施した。また、妥当性の基準は以前に記述されている（ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.653-660）。
ステューデント（Student）のｔ検定を実施して結果の統計学的有意を分析し、また、ｐ＜0.05は有意であると考えた。
アジュバントの処方をマウスでの２回の独立した実験で試験した。
0003927235.tif 000002
0003927235.tif 000003
全てのＳＬＰ／油／水乳剤はＭＲＣ−11株のインフルエンザウイルスに対するおよびＯＶＡに対する体液性応答を増大させた。アジュバント効果に関する限り、異なる処方間に差異が存在することが示されており、また、いくつかはＳＬ−フィコール／Ｓ／Ｗ（の活性）と同等の活性を引き起こした。ＳＬＰのタイプによるはっきりした効果は観察され得なかった。使用された油のタイプに関しては、スクアラン（Ｓ）を含む乳剤はヘキサデカンを含有する乳剤より有意に高い応答を生み出したが、一方、ダイズ油は最小に高い応答を引き起こした。
実施例２
８−10週齢のブタを、問題のウイルス抗原に対する抗体のいかなる存在も検出するために試験し、そして検出可能な抗体力価をもつ動物を排除した。
スヴァキシン（SUVAXYN）Ｏ／Ｗ乳剤（ソルヴェイ  ダファー）の名称で販売される水中鉱物油乳剤、および水中スクアラン乳剤中のＳＬＰの処方を、実施例１に記述される方法に従って調製した。
アジュバントを含む処方を含有するワクチンを実施例１に記述される方法に従って調製した。
ＳＬＰ／スクアラン／水の処方を、抗体としてｉＰＲＶならびに不活性化インフルエンザウイルス（ＭＲＣ−11株およびＡ／Swine株）とともに、ブタに対するそれらのアジュバント効果を測定するために試験した（第２表）。動物を２回（第０および第３週）免疫しそして抗体力価を２回目の注入３週後（第６週）に測定した。
ＰＲＶに対する抗体（抗ＰＲＶ）の力価は、ＳＬ−フィコール／スクアラン／水、ＳＬ−マルトデキストリン15／スクアラン／水、ＳＬ−イヌリン／スクアラン／水およびＳＬ−シクロデキストリン／スクアラン／水の乳剤により増大した。測定された抗体力価は商業的製品で使用される水中鉱物油の乳剤により得られるそれらに匹敵するかもしくはより高かった。Ａ／Swineに対する抗体応答もまた、異なるＳＬＰ／スクアラン／水の処方により増大したが、しかし、ある応答は標準的な油／水乳剤により得られるそれらと同じくらい高かった。ＭＲＣ−11に対する抗体の力価は異なる処方により増大し、また、いくつかのＳＬＰ／スクアラン／水の乳剤は鉱物油／水乳剤で得られるそれらに匹敵するもしくはより高い力価を生み出した。
これらの分析の結果は第２表に列挙される。
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２種の動物種に対するアジュバント効果を同時に試験する先行する実験から、ＳＬ−フィコールと当該乳剤との間に強い相乗効果が存在すること、および、その相乗効果はマウスでよりもブタでより著しいことが示されている（ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.653-660、1994；ワクチン（Vaccine）、Vol.12、pp.661-664、1994）。マウスでの抗体応答は有意に増大し、また、使用される油のタイプの著しい効果が存在するがしかし多糖のタイプの効果は存在しないことが示されている。
抗原を受けなかった動物と比較した増大の係数はマウスで１もしくは２2log単位に限られた。ブタでは、このアジュバント効果はより著しく、それは主としてアジュバントなしの抗原に対する応答が非常に低いためであった。抗ｉＰＲＶならびに抗Ａ／Swineおよび抗ＭＲＣ−11の抗体力価は、６2log単位を越えて増加した。
鉱物油に基づくアジュバントは抗体応答を有意に増大させるが、しかし、異なる新規のアジュバントの処方はより高い力価さえ引き起こした。上に提示されるＳＬ−フィコール／Ｓ／Ｗアジュバント（ワクチン（Vaccine)、Vo1.12、pp.653-660およびワクチン（Vaccine)、Vo1.12、pp.661-665）は鉱物油よりも有効であることが示されたが、一方、いくつかの新規のＳＬＰはＳＬ−フィコールと同等もしくはより大きな活性を発揮している。
実施例３
アジュバント効果以外に、他の特性もワクチンの評価で重要なことである。それらは重要な局面である局所反応を包含するが、とは言え注入部位でのあるレベルの反応はある動物種により一般に許容される。局所毒性を、ワクチン注入後のマウスの足の腫脹をモニターすることによりインビボで試験した。この方法は非常に感受性が高いことが示されている。
水中スクアラン、水中ダイズ油、水中鉱物油およびヘキサデカン、の乳剤中のＳＬＰの処方、ならびにアジュバントなしの対照を、実施例１に記述される方法に従って調製した。
アジュバントを含む処方を含有するワクチンを実施例１に記述される方法に従って調製した。
６匹のマウスの群を、後左足底での皮下注入によりワクチン25μLで処理した。このワクチンは、ＰＢＳ１mLあたり10μgのＭＲＣ−11および１mgの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有する抗原溶液ならびにアジュバント１体積を含んだ。
足の太さは、注入の１日前および注入後いくつかの間隔で、オランダのユトレヒト州立大学によりこの目的のために特別に開発された半電子的装置を使用して測定した。この装置の精度はおよそ0.02mmある。
腫脹を、処理後の足の太さから処理前の足に太さを差し引くことにより算出し、そしてそれを0.01mm表す。
これらの実験の結果は第３表に列挙される。
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処方は注入部位で異なる程度の腫脹を引き起こし、また、この腫脹は、初期の数日間、若干の例で非常に強かったが、ゆっくりと消失した（第３表）。ヘキサデカンを含む乳剤は一般にダイズ油を含有するそれらより強い反応を引き起こした。ＳＬＰに関しては、ＳＬ−フィコールを含むスクアランの乳剤はより強い腫脹を引き起こし、これは３週間を超えて維持された。ＳＬ−マルトデキストリン15、ＳＬ−イヌリンもしくはＳＬ−プルランを含有する乳剤はかなりの腫脹反応を引き起こしたが、しかしながら、これはＳＬ−フィコールにより引き起こされたそれらより迅速に消失し、また、それらは１ないし２週間のみ存続した。
異なる油中に包含されるＳＬ−シクロデキストリンの反応生成性は非常に弱いかもしくは非存在ですらあった。スクアランもしくはヘキサデカン中にＳＬ−シクロデキストリンを含有する乳剤は注入後１もしくは２日間、若干の腫脹を引き起こし、一方、ダイズ油中のＳＬ−シクロデキストリンは目に見える応答を引き起こさなかった。
マウスで試験された反応生成性すなわち局所毒性は、油のタイプおよび多糖のタイプの機能としての著しい効果を示した。一般に、ＳＬ−フィコールは試験された他のＳＬＰより強い反応を引き起こした。スクアランもしくは鉱物油のいずれかと組み合わせられたＳＬ−フィコールは非常に強くかつ持続する局所反応を引き起こしたが、一方、ヘキサデカンおよびダイズ油と組み合わせられたＳＬ−フィコールはそれぞれ中程度もしくはより弱い反応のみを生み出した（第２表）。スクアランに基づく乳剤はヘキサデカンを含むそれらより有意に強い反応を引き起こした。ダイズ油は非常に弱い反応のみを引き起こした。
これらの油の疎水性の特徴は異なる。スクアラン、鉱物油およびヘキサデカンは強く疎水性の炭化水素であり、一方、異なる物質の混合物であるダイズ油はより小さく疎水性である。異なる油の疎水性の特徴は、安定な水中乳剤を得るのに必要とされる界面活性剤のＨＬＢ値により例証される。
ＳＬ−プルランは他の３種のＳＬＰよりも強い局所毒性を引き起こした。ＳＬ−イヌリンおよびＳＬ−マルトデキストリン15はかなりの局所腫脹を引き起こしたが、一方、ＳＬ−シクロデキストリンは１もしくは２日間のみ顕著な反応を引き起こした。
他の特徴のうち、ＳＬＰはそれらの分子量で異なり、それらはＳＬ−プルランのそれに等しいＳＬ−フィコールから＞ＳＬ−イヌリン＞ＳＬ−マルトデキストリン15＞ＳＬ−シクロデキストリンと減少する。反応生成性と分子量との間の並行が観察され得るが、しかし、直接の関連を確立する他の研究が行われる必要がある。
上から、反応生成性はその処方に包含される多糖および油のタイプに依存すること、および、多糖の分子量が重要な因子であることが結論された。
実施例４
マルトデキストリン15、イヌリン、シクロデキストリンおよびプルランのスルホリピド誘導体を合成し、そしてスクアラン、鉱物油、ヘキサデカンおよびダイズ油に基づく水中油乳剤中に取り込み、さらにその安定性をインビトロで検討した。
本発明のＳＬＰを実施例１に記述される方法に従って合成し、そしてスクアラン、ヘキサデカンおよびダイズ油の水中油乳剤中に混合し、そしてそれらの乳剤の安定性をインビトロで検討した。
水中スクアラン、水中ダイズ油および水中ヘキサデカンの乳剤中のＳＬＰの処方を、実施例１に記述される方法に従って調製した。
乳剤の安定性を、当該処方を一定時間高温に曝すことにより試験した。一般に、乳剤は高温でより小さく安定であり、また、より高温での試験はより低温での長期間の挙動に対する指摘を与えると考えられた。
乳剤の安定性を37℃で測定した。乳剤の無菌のアリコート５mLを37℃でインキュベーションし、そして油滴の形成、油相の外観および他の変化を、各日、肉眼での乳剤の点検で確かめた。
およそ0.1／1.0のＳ／Ｌ比のＳＬＰが、スクアラン、ヘキサデカンおよびダイズ油に基づく水中油型の乳剤中に取り込まれた。
チメロサール（シグマ）0.01％（重量／体積）を含む無菌のアリコートを37℃でインキュベーションし、そして乳剤の状態を肉眼での異なる時間間隔の点検で確証した。
これらの実験の結果は第４表に列挙される。
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スクアラン油、ヘキサデカンもしくはダイズ油のこれらの乳剤中に取り込まれた新規のＳＬＰ（ＳＬ−プルラン、ＳＬ−イヌリン、ＳＬ−マルトデキストリン15およびＳＬ−シクロデキストリン）は注目すべき安定性を有する。スクアラン中のＳＬ−イヌリン、ＳＬ−シクロデキストリンおよびＳＬ−マルトデキストリン15の乳剤は37℃で53日間以上安定のままである。これはＳＬ−フィコール／スクアラン／水の乳剤と比較して大きな改善であると考えられる。37℃での安定性試験の制限された予言的価値にもかかわらず、それは不安定化因子に対する増大した抵抗性を示す。
ＳＬ−プルラン／スクアラン／水を除いた全ての乳剤は37℃で最低53日間安定のままであった。115日後、ＳＬ−マルトデキストリン15、ＳＬ−シクロデキストリンおよびＳＬ−イヌリンを含む乳剤のほとんどは安定のままであるが、とは言えスクアランおよびヘキサデカンを含む乳剤は乳剤上に数個の油滴を示した。