(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを有効成分とする、関節内に投与するための医薬であって、軟骨傷害を治療するための医薬。
【請求項２】
関節内に導入された場合に、プロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を促進する、請求項１の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療などに用いられる医薬に関する。さらに、詳しくはＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）遺伝子からなる医薬、及びＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは様々な薬理作用を示す生理活性ペプチドであり、その薬理作用については、例えば実験医学 Vol.10, No.3（増刊）330-339（1992）に記載されている。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺繊維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等（特開平 4-18028号公報、特開平 4-49246号公報、EP 492614号公報、特開平 6-25010号公報、WO 93/8821、特開平 6-172207、特開平 7-89869号公報、特開平 6-40934号公報、WO 94/2165、特開平 6-40935号公報、特開平 6-56692号公報、特開平 7-41429号公報、WO 93/3061、特開平 5-213721等）として有用である。
【０００３】
遺伝子治療に関しては、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、ＡＩＤＳ遺伝子治療、癌遺伝子治療、嚢胞性繊維症性遺伝子治療、血友病遺伝子治療等について現在活発な開発研究が国際的になされている。
しかし、ＨＧＦ遺伝子を用いた遺伝子治療についてはまだ知られておらず、また遺伝子治療が可能であるかについても不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦは血中半減期の短い薬物の１つである。従って、局所における持続的な投与が望まれていた。
また、ＨＧＦは多種多様の薬理作用を有することから、種々の治療剤としての開発が期待されている反面、その多種多様の薬理作用から全身的な投与では副作用が問題となることもありうる。また、ＨＧＦそのものを静脈内に投与すれば、かなりのＨＧＦが肝臓に滞留するため、治療目的の臓器に到達する量が少なくなるという欠点がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記課題を解決するためになされたものであり、その要旨は、
（１）ＨＧＦ遺伝子からなる医薬、
（２）ＨＧＦ遺伝子を含有するリポソーム、
（３）センダイウイルスと融合させた膜融合リポソームである上記（２）記載のリポソーム、
（４）上記（２）又は（３）記載のリポソームからなる医薬、
（５）動脈疾患治療剤である（１）又は（４）記載の医薬、及び
（６）軟骨傷害治療剤である（１）又は（４）記載の医薬に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦを発現し得る遺伝子をいい、当該遺伝子には、発現されるポリペプチドがＨＧＦと実質的に同効である限り、その遺伝子配列の一部が欠失又は他の塩基により置換されていたり、他の塩基配列が一部挿入されていたり、５′末端及び／又は３′末端に塩基が結合したような遺伝子も包含される。かかるＨＧＦ遺伝子としては、例えば、Nature, 342, 440 (1989) 、特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989) などに記載のＨＧＦ遺伝子が例示され、これらの遺伝子を本発明で使用することができる。
ＨＧＦ遺伝子は、適当なベクターに組み込んだものを使用する。例えば、後に挙げるウイルスの遺伝子にＨＧＦ遺伝子を組み込んだウイルスベクター、又はＨＧＦ遺伝子を組み込んだ適当な発現ベクターとして使用する。
【０００７】
本発明における「医薬」とは、ＨＧＦの有する薬理作用に基づいたヒトの疾患の治療剤又は予防剤をいい、例えば上記の治療剤又は予防剤が挙げられる。本発明によってＨＧＦ遺伝子が細胞に導入された後、該細胞でＨＧＦが発現され、そのＨＧＦが薬理作用を示す。従って、本発明の医薬は、ＨＧＦの対象疾患と同様の対象疾患に有効である。
例えば、ＨＧＦ遺伝子を細胞内に導入した場合、実施例に記載の様に、血管内皮細胞の増殖は促進されるが、血管平滑筋細胞の増殖は促進されない。さらに、実施例に記載のように、ラットを用いた動物実験において、生体内心臓にＨＧＦ遺伝子を導入した場合、血管新生が見られる。従って、ＨＧＦ遺伝子は動脈疾患、特に血管平滑筋細胞の異常な増殖を主体とする障害に起因する各種疾患（例えば、血管拡張術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄、動脈硬化症、抹梢循環不全等）の治療・予防、心筋梗塞、心筋症、末梢性血管閉塞症、心不全などの疾患の予防・治療に有用である。なお、ＨＧＦ自体も、血管内皮細胞の増殖は促進するが、血管平滑筋細胞の増殖を促進せず、同様の治療剤・予防剤として有用であり、ＨＧＦ遺伝子による効果は、ＨＧＦ自体の効果に基づくものである。
また、実施例に記載の様に、関節内にＨＧＦ遺伝子を導入すると、関節軟骨細胞の修復が促進され、プロテオグリカンを合成する細胞の増殖が促進される。従って、ＨＧＦ遺伝子は種々の軟骨傷害、例えば骨形成異常症、変形性関節症、変形性椎間板症、骨折の修復・治癒不全、スポーツによる外傷、キーパンチャー病などの疾患の予防、治療に有効である。ＨＧＦ自体も軟骨細胞の修復・増殖を促進し、同様の治療剤・予防剤として有用であり、ＨＧＦ遺伝子による効果は、ＨＧＦ自体の効果に基づくものである。
【０００８】
「リポソーム」とは、内部に水層を有する脂質二重層でできた閉鎖小胞体であり、その脂質２分子膜構造は生体膜に極めて近似していることが知られている。本発明のリポソームを製造する際に使用するリン脂質としては、例えばレシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル酸等の酸性リン脂質、又はこれらのアシル基をラウロイル基、ミリストイル基、オレオイル基等に置換したリン脂質、ホスファチジル・エタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等などがある。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、例えば通常の細胞膜中に存在する脂質など天然の材料から通常知られた方法で製造することができる。本発明のＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームは、例えば精製したリン脂質の薄膜をＨＧＦ遺伝子を含有する溶液に懸濁し、超音波処理等を施して製造することができる。
【０００９】
また、本発明のＨＧＦ遺伝子を含有するリポソームは、適宜ウイルス等と融合させて膜融合リポソームとしてもよい。その場合、ウイルスを、例えば、紫外線等で不活性化することが好ましい。特に好ましい膜融合リポソームとして、センダウイルス（Hemagglutinating virus of Japan：ＨＶＪ）と融合させた膜融合リポソームが挙げられる。この膜融合リポソームは、日経サイエンス、1944年４月号、32-38頁、J. Biol Chem., 266(6), 3361-3364 (1991) 等記載の方法で製造することができ、例えば、紫外線照射等で不活性化した精製ＨＶＪとＨＧＦ遺伝子ベクターを含有するリポソーム懸濁液とを混合し、緩やかに撹拌した後、結合しなかったＨＶＪをショ糖密度勾配遠心法で除去することにより、ＨＶＪ融合リポソーム（ＨＶＪ−リポソーム）を調製することができる。また、リポソームに、標的細胞に親和性を有するものを結合させて細胞への遺伝子導入効率を上げることができる。標的細胞に親和性を有するものとしては、例えば、抗体、レセプター等のリガンド等が挙げられる。
【００１０】
ＨＧＦ遺伝子の細胞内への導入方法としては、ウイルスベクターによるもの、及びその他のものに大別される（日経サイエンス、1994年４月号、20-45頁、月刊薬事、36(1),23-48 (1994) 、及びこれらの引用文献等）。本発明の医薬においてはいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビス他のＲＮＡウイルス等にＨＧＦ遺伝子を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の導入方法としては、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、リポソーム法が特に好ましい。
【００１１】
また、ＨＧＦ遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＨＧＦ遺伝子を直接体内に導入するIn Vivo法、及びヒトからある種の細胞を採取し体外でＨＧＦ遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すEx Vivo法がある（日経サイエンス, 1994年４月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48 (1994) 、及びこれらの引用文献等）。本発明の医薬においては治療目的の疾患、標的臓器等に応じて、適宜いずれかの方法を選択して適用することができる。
In Vivo法は、Ex Vivo法に比べて費用と手間が少なく、また簡便である。Ex Vivo法は、ＨＧＦ遺伝子の細胞内導入の効率がよい。
【００１２】
本発明の医薬において、In Vivo 法により投与する場合は治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直接投与すれば、臓器選択的に治療することができる。例えば、「ＰＴＣＡ後の再狭窄」に対する遺伝子を用いる治療では、動脈内に投与することで実施でき（実験医学、12 (15増刊), 1298-1933 (1994)）、好ましくはＰＴＣＡにおけるバルーンの先に本発明の医薬をつけて、血管にこすりつければそのまま血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞に導入することも可能である。
【００１３】
また、Ex Vivo法による場合には、常法に準じ、ヒトの細胞（例えば、リンパ球、造血幹細胞等）を採取し、それに本発明の医薬を感作させて遺伝子導入を行った後、ＨＧＦ産生細胞をヒトへ戻すことが行われる。
In Vivo法により投与する場合は、種々の製剤形態（例えば、液剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦ遺伝子を含有する注射剤等とされる。また、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。当該注射剤等は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦ遺伝子を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができ、またＨＧＦ遺伝子に代え、ＨＧＦ遺伝子を組み込んだウイルスベクターを製剤化してもよい。さらに、ＨＧＦ遺伝子を包埋したリポソーム（又はＨＪＶ−リポソーム）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中のＨＧＦ遺伝子の含量は、治療目的の疾患、標的臓器、患者の年齢、体重などにより適宜調製することができるが、通常ＨＧＦ遺伝子として0.0001mg〜 100mg、好ましくは0.001mg〜１０mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが適当である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。なお、使用した実験材料及び方法の概要は以下のとおりである。
【００１５】
実験材料及び方法
(1) ＨＧＦ発現ベクター
ＨＧＦ発現ベクターの調製は、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクター（FEBS, 333, 61-66 (1993)）のＥｃｏ  ＲＩとＮｏｔ  Ｉサイトの間にヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡ（2.2kb ：Biochem. Biophys. Res. Commun.,172, 321-327 (1990)；日本特許公開平5-111383）を挿入することにより行なった。このプラスミドベクターにおいて、ＨＧＦ  ｃＤＮＡの転写はＳＲαプロモーターにより制御される（Nature 342, 440-443 (1989)）。
【００１６】
(2) 細胞培養
ラットの冠動脈内皮細胞は、８週令のスプラギュードウリィ（ＳＤ）ラットの心臓を酵素的に消化したものから密度勾配遠心法により単離した（Transplantation 57, 1653-1660 (1994)）。ラットの大動脈平滑筋細胞（以下、ＶＳＭＣという）は、１２週令ＳＤラットから酵素処理により得た（J. Clin. Invest., 93, 355-360 (1994)）。これらの細胞は、１０％（vol/vol）ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を含有するＤＭＥＭ培地で維持した。細胞は、３７℃、９５％空気−５％ＣＯ2の加湿雰囲気中、２日ごとに培地を交換してインキュベートした。これらの細胞は、免疫組織学的及び形態的観察により、それぞれ内皮細胞及び平滑筋細胞であることが示された。
ヒト大動脈内皮細胞（５代継代）及びヒトＶＳＭＣ（５代継代）は、クラボ社より入手したものを用い、上記と同様な方法で、５％ウシ胎児血清、上皮成長因子（１０ng／ml）、塩基性繊維芽細胞成長因子（２ng／ml）及びデキサメサゾン（１μM）を含有するＭＣＤＢ１３１培地で培養した。
なお、静止期の内皮細胞は、J. Clin. Invest. 86, 1690-1697 (1990) ; ibid. 94, 824-829 (1994) に従って調製した。
【００１７】
(3) ＨＶＪ−リポソームのIn Vitro遺伝子導入
感作される内皮細胞又はＶＳＭＣは、１０8個を６ウエルプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞は、２mM塩化カルシウムを含む平衡塩類溶液（１３７mM NaCl, 5.4mM KCl, １０mM Tris-HCl, pH7.6、以下「ＢＳＳ」という）で３回洗浄し、実施例１で得たＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（2.5 mgの脂質及び１０μｇの包埋ＤＮＡ含有）の溶液１ml又は比較例１で得たＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの溶液１mlを加え、４℃で５分間、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は洗浄し、１０％ウシ血清を含む新鮮培地中、ＣＯ2インキュベーターで維持した。
【００１８】
(4) 内皮細胞及びＶＳＭＣＨ中のＨＧＦ濃度の測定
感作される内皮細胞及びＶＳＭＣが産生するＨＧＦ濃度の測定はＥＬＩＳＡ法で行なった。即ち、ラット又はヒトの内皮細胞又はＶＳＭＣは６ウエルプレート（コーニング社製）に５×１０4細胞／cm2の細胞密度で播種し、２４時間培養した。感作後２４時間して、培地を交換し更に４８時間培養した。ＨＧＦの放出を検討するため、感作された細胞（感作４８時間後）は洗浄し、インスリン（５×１０-7M）、トランスフェリン（５μg／ml）及びアスコルベート（0.2mM）を含有する無血清培地１mlに加えた。２４時間後、培養培地を集め、６００ｇで１０分間遠心し、−２０℃で保存した。
培地中のＨＧＦ濃度は、抗ラットＨＧＦ抗体又は抗ヒトＨＧＦ抗体を用いた酵素免疫法で測定した（Exp. Cell Res. 210, 326-335 (1994) ; Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)）。ウサギ抗ラット又は抗ヒトＨＧＦ  ＩｇＧを、９６ウエルプレート（コーニング社製）に４℃で１５時間コートした。３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）でブロッキングした後、培養培地を各ウエルに加え、２５℃で２時間インキュベートした。ウエルは、0.025％トゥイーンを含むＰＢＳ（PBS-トゥイーン）で３回洗浄後、ビオチン化ウサギ抗ラットＨＧＦ  ＩｇＧ又は抗ヒトＨＧＦ  ＩｇＧを添加し、２５℃で２時間インキュベートした。PBS-トゥイーンで洗浄後、ウエルは西洋ワサビ  パーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン−ビオチン複合体（PBS-トゥイーン溶液）とインキュベートした。酵素反応は、基質溶液（2.5mM O-フェニレンジアミン、１００mM  リン酸ナトリウム、５０mM  クエン酸、0.015％過酸化水素含有）を添加することにより開始した。酵素反応は、１Ｍ硫酸を添加することにより停止し、４９０nmの吸光度を測定した。なお、抗ヒトＨＧＦ抗体はヒトＨＧＦとのみ交差反応し、ラットＨＧＦとは反応せず、また抗ラットＨＧＦ抗体はラットＨＧＦとのみ交差反応し、ヒトＨＧＦとは反応しない。
【００１９】
(5) ＨＧＦ
使用したヒト及びラット組換ＨＧＦは、ヒト又はラットＨＧＦ  ｃＤＮＡを含む発現プラスミドで感作されたＣＨＯ細胞又はＣ−１２７細胞の培養液から精製したものを使用した（Cell, 77, 261-271 (1994) ; J. Clin. Invest. 93, 355-360 (1994)）。
【００２０】
(6) 統計的解析
全ての実験は少なくとも３回行い、測定値は平均値±標準誤差で示した。測定値の統計的解析は、ダンカン法（Duncan's test）で行った。
【００２１】
(7) ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、アザン（Ａｚａｎ）染色
ＨＧＦ遺伝子を導入したラットを遺伝子導入後１０日に、ヘバリンを加えた生理食塩水を潅流して屠殺し、引き続きＰＢＳで調製した４％パラホルムアルデヒドによる固定を一晩行った。固定後にパラフィン包埋を行って切片を作製し、通常の方法によりＨＥ染色、Ａｚａｎ染色を行った。顕微鏡下にて微小血管数を数えた。
【００２２】
実施例１
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製
テトラヒドロフランに、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びコレステロールを重量比で１：4.8 ：２で混合した。テトラヒドロフランをロータリーエバポレーターで留去することで、この脂質の混合物（１０mg）を容器壁に析出させた。ウシ胸腺から精製したＨＭＧ  １  核蛋白（high mobility group 1 nuclear protein）９６μｇとプラスミドＤＮＡ（３００μｇ）のＢＳＳ（２００μｌ）溶液と２０℃で１時間混合し、次いで上記の脂質に添加した。リポソーム−ＤＮＡ−ＨＭＧ  １複合体懸濁液はボルテックスで混合し、３秒間超音波処理をし、３０分間撹拌した。
精製したＨＶＪ（Ｚ株）は、使用直前に３分間紫外線照射 (１１０erg/mm2 sec)で不活性化した。上記で得られたリポソーム懸濁液（0.5 ml, 脂質１０mgを含有）とＨＶＪ（20,000 hemagglutinating units）を全液量が４mlとなる様にＢＳＳを加えて、混合した。この混合物を４℃で１０分間インキュペートし、さらに３７℃で３０分間ゆっくりと撹拌した。融合していないＨＶＪは、ショ糖密度勾配遠心法で、ＨＶＪ−リポソームから除去した。すなわち、ショ糖密度勾配における上層を集めることで、ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソーム（１０μｇ／mlのＨＧＦ発現ベクターを含有する）を得た。以下、ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡと称する。
【００２３】
実施例２
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームのラットへの投与
ＨＧＦ発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製は、ＨＭＧ  １  核蛋白を６４μｇ、プラスミドＤＮＡを２００μｇ用いて、実施例に記載の方法に従って行った。また、リポソーム懸濁液（0.5 ml, 脂質１０mgを含有）とＨＶＪ（35,000 hemagglutinating units）を全液量が２mlとなる様にＢＳＳを加えて混合した。
ＳＤラット（４００−５００ｇ；日本チャールズリバー社より購入）に対しベントバルビタール・ナトリウム塩（0.1ml／１００mg）を腹腔内投与して麻酔し、保温して自動呼吸器により呼吸を確保した。ラットに左側開胸術を施し、ＨＶＪ−リポソームＤＮＡ又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ（２０μｌ）を３０Ｇの注射針を用いて、心尖に直接、慎重に注入した。
【００２４】
比較例１
ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームの製造
ＨＧＦ遺伝子を含まないベクターに、実施例１記載の方法と同様の操作を行って、ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームの製造した。以下、ＨＧＦ発現ベクターを含有しないＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔと称する。
【００２５】
比較例２
ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームの調製
ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを用いて、実施例１と同様にしてヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを調製した。
ここで、ヒトＴＧＦ−β発現ベクターとしては、文献？に従って調製されたベクターを用いた。
以下、ヒトＴＧＦ−β発現ベクターを含有するＨＶＪ−リポソームを、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）と称する。
【００２６】
試験例１
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞のＨＧＦの発現
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（リポソーム中のＨＧＦ発現ベクター濃度：１０μｇ／ml）を、ラット冠動脈内皮細胞（細胞数：１０8個）に感作し、ＨＧＦの産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを用いて、上記と同様な試験を行った。更に、非感作ラット冠動脈内皮細胞についてもＨＧＦ産生量を測定した（無処置群）。その結果を図１に示す（ｎ＝６）。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞群である。
図１に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞は高いレベルでＨＧＦを産生し、分泌した。それに対して、無処置群及びＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したラット冠動脈内皮細胞群には、実質上、ＨＧＦ産生は認められなかった。
細胞数で測ってみると、ＨＧＦ発現群では有意に高い細胞数であった。
【００２７】
試験例２
内皮細胞の増殖に対する感作されたＨＧＦの発現ベクターの効果
ヒト内皮細胞にＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作し、外因的に添加した組換ヒトＨＧＦの存在下（１、１０及び１００ｎｇ／ml）又は非存在下に培養し、細胞数の増加率（％）を測定した。その結果を図２（折線グラフ）に示す（ｎ＝６）。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦは所定濃度の組換ヒトＨＧＦの存在下に培養した群を示す（＊：Ｐ＜0.05, ＊＊：Ｐ＜0.01対ＤＳＦ）。
図２の折線グラフに示されるように、外因的に添加したＨＧＦにより内皮細胞の増殖は促進されることが明らかになった。
一方、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（濃度：１０μｇ／ml）を感作した内皮細胞を培養し、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞を培養し、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。その結果を図２（棒グラフ）に示す（ｎ＝６）。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦベクターはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞群を示す（＊＊；Ｐ＜0.01対ＤＳＦ、＃：Ｐ＜0.05対ＨＧＦ  100ng/ml）。
図２の棒グラフに示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の増加率は対照に比べて著しく高く、また外因的に添加したＨＧＦの効果に対しても有意に高いことが明らかになった。
【００２８】
更に、上記のＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の培養をウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下又は非存在下に行ない、細胞数の増加を測定し、増加率（％）を求めた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞を培養し、同様に細胞数の増加率（％）を求めた。なお、ウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体は文献（Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)）に記載の方法により精製し、この抗体は１０μｇ／mlの濃度において１０ｎｇ／mlの生物活性を中和することができる。更に、抗ヒトＨＧＦ抗体はヒトＨＧＦとのみ交差反応し、ラットＨＧＦとは反応せず、抗ラットＨＧＦ抗体はラットＨＧＦとのみ交差反応し、ヒトＨＧＦとは反応しない。また、正常ウサギ血清ＩｇＧ（１０μｇ／ml）をコントロールとして用いた。
その結果を図３に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ感作内皮細胞群；ＨＧＦはＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群；ＨＧＦａｂはウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群を示す。なお、増加率（％）は、対照の増加率を１００とした相対％で示した（＊：Ｐ＜0.01対対照、＃：Ｐ＜0.05対ＨＧＦ）。
図３に示されるように、抗ヒトＨＧＦ抗体の存在により、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞の増殖は抑制され、対照と同程度の細胞増加率であった。このことより、ＨＧＦは、内皮細胞の増殖因子であることが明らかになった。
【００２９】
試験例３
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を、静止期にあるラット冠動脈内皮細胞培養系（細胞数：１０5個）に加え、３日間培養し、当該内皮細胞数の増加を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を用いて、同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図４に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群である。
図４に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群においては、内皮細胞数の有意な増加がみられた。
【００３０】
上記のＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦ抗体及び抗ラットＨＧＦ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。また、非感作のＶＳＭＣの培養上清中のＨＧＦ濃度も測定した（無処置群）。
抗ヒトＨＧＦ抗体を用いた測定結果を図５に、抗ラットＨＧＦ抗体を用いた結果を図６に示す（いずれもｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
図５に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清にはＨＧＦが検出され、その値は対照に対して有意に高かった。
また、図６に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清にはラットＨＧＦも検出され、その値は対照に対して有意に高かった。
なお、図５及び図６に示されるように、無処理群及び対照群では培養上清中にＥＬＩＳＡ法で測定できる程度の量のＨＧＦは存在しなかった。
【００３１】
試験例４
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を静止期のラット冠動脈内皮細胞培養系（細胞数：１０5個）に加え、３日間培養し、当該内皮細胞数の増加を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を用いて、同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図７に示す。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群（ｎ＝８）；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群（ｎ＝８）；Ｃは無処置群（ｎ＝１５）である。
図７に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群においては、内皮細胞数の有意な増加がみられたのに対し、対照群では細胞数は無処置群と同程度であった。（対照群：0.117 ±0.002 , Ａ群：0.148 ±0.03  Ｐ＜0.01）。
【００３２】
次に、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を加え、上記と同様にして内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図８に示す（ｎ＝８）。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＣはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を添加した群；ＤはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清にコントロール抗体を添加した群である。
図８のＡ及びＣに示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清の細胞増殖促進活性は、抗ＨＧＦ抗体を添加により完全に消失した。このことより、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清の細胞増殖促進活性はＨＧＦに起因することが明らかになった。
【００３３】
試験例５
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したヒトＶＳＭＣのヒト内皮細胞への効果
ヒトＶＳＭＣ細胞培養インサート（コースター社製、孔径0.45μｍ）に播種し、１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。一方、ヒト内皮細胞は、６ウエルプレートに播種し、１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地で維持した。ＶＳＭＣが８０％コンフルエントになったときに、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（リポソームの中のＤＮＡ含量：１０μｇ）又はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔと４℃で５分間、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。感作した後、感作ＶＳＭＣを含むインサートを静止期のヒト内皮細胞を含むウエルに加えた。ＶＳＭＣと内皮細胞とを、0.5％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地中で３日間共培養し、ＷＳＴ−細胞数測定キット（ワコー社製）を用いて細胞数の測定を行なった。その結果を図９に示す（ｎ＝６）。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
図９に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したヒトＶＳＭＣは、静止期にある非感作ヒト内皮細胞の増殖を有意に増加させることが明らかになった。
【００３４】
試験例６
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣのラット冠動脈内皮細胞への効果
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣ（細胞数：１０8個）と静止期にあるラット冠動脈内皮細胞（細胞数：１０5個）とを、３日間共培養し、当該冠動脈内皮細胞の増加数を調べた。また、対照として、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣを用いて、同様に共培養して内皮細胞数の増加を調べた。その結果を図１０に示す（ｎ＝６）。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣ群、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣ群である。
図１０に示される様に、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣより放出されたＨＧＦにより内皮細胞の増殖が刺激され、細胞数の増加が認められた（対照群：0.126 ±0.006、ＨＧＦ群：0.156 ±0.01  Ｐ＜0.05）。
【００３５】
試験例７
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの増殖
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣとＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣをそれぞれ個別に培養し、細胞数の増加を比較検討したが、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作は細胞増殖になんら影響は与えなかった。このことから、ＨＧＦにはＶＳＭＣに対する細胞増殖促進活性はないことが判明した。
【００３６】
試験例８
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋における新生血管増生
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋及び無処置のラット心筋をＨＥ染色、Ａｚａｎ染色し、検鏡して微小血管数を数えた。その結果を図１１に示す。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋の微小血管数である。
図１１で示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを注入したラット心筋では、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを注入したラット心筋及び無処置のラット心筋と比較して、有意に微小血管数が増加した。このことは、内皮細胞増殖作用を持つＨＧＦが生体において血管新生作用を持つことを示している。
【００３７】
試験例９
ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを関節内に直接導入することによる関節軟骨の修復
１０週齢のフィッシャーラットの大腿骨顆間部に直径１．８ｍｍのキルシュナー鋼線を用い軟骨下骨を貫く損傷を作製した。術後１週の時点で、実施例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（１００μｌ／膝）を直接的に関節内へ導入した。コントロールとして、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔおよび比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）を同量関節内に投与した。これらの遺伝子等の導入後１、３、４週でラットを屠殺し、組織学的に修復部位を観察した。
その結果、図１２に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後３週で修復組織に一部にトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を認めることができた。また、図１３に示されるように、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後４週ではさらにプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現範囲が広がる傾向を認めた。
図１４に示されるように、比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）の関節内への投与の場合には、投与後４週でこの様な軟骨様細胞の出現は認められなかった。また、図１５に示されるように、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの関節内への投与の場合には、投与後４週でこの様な軟骨様細胞の出現は認められなかった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の医薬は、ＨＧＦそのものの投与に比べ治療効果が持続的であり、また局所選択的に作用させることができるため、ＨＧＦの副作用を低減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試験例１における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞でのＨＧＦの発現を示す図である。
【図２】図２の折線グラフは、試験例２における、ＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞のＨＧＦ存在下又は非存在下における細胞増加率を示す図である。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦは所定濃度の組換ヒトＨＧＦの存在下に培養した群を示す。図２の棒グラフは、試験例２における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の細胞増加率を示す図である。図中、ＤＳＦはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作した内皮細胞群、ＨＧＦベクターはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞群を示す。
【図３】図３は、試験例２における、抗ＨＧＦ抗体の存在下又は非存在下におけるＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作した内皮細胞の細胞増加率を示す図である。図中、対照はＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔ感作内皮細胞群；ＨＧＦはＩｇＧコントロールの存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群；ＨＧＦａｂはウサギ抗ヒトＨＧＦ抗体の存在下に培養したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ感作内皮細胞群を示す。なお、増加率（％）は、対照の増加率を１００とした相対％で示した。
【図４】図４は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清を添加した群である。
【図５】図５は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦ抗体を用いて測定した結果を示す図である。図中、無処置は非感作ＶＳＭＣの培養上清群；対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
【図６】図６は、試験例３における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清のＨＧＦ濃度を、抗ラットＨＧＦ抗体を用いて測定した結果を示す図である。図中、無処置は非感作ＶＳＭＣの培養上清群；対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣの培養上清群である。
【図７】図７は、試験例４における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；Ｃは無処置群である。
【図８】図８は、試験例４における、抗ＨＧＦ抗体の存在下での、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清のラット冠動脈内皮細胞に対する細胞増殖効果を示す図である。図中、ＡはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット感動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＢはＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清を添加した群；ＣはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清に抗ＨＧＦ抗体を添加した群；ＤはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラット冠動脈内皮細胞の培養上清にコントロール抗体を添加した群である。
【図９】図９は、試験例５における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したヒトＶＳＭＣと非感作ヒト内皮細胞を共培養したときの内皮細胞の細胞増加を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
【図１０】図１０は、試験例６における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを感作したラットＶＳＭＣと非感作ラット冠動脈内皮細胞を共培養したときの内皮細胞の細胞増加を示す図である。図中、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔで感作したＶＳＭＣとの共培養群；ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡで感作したＶＳＭＣの培養上清群である。
【図１１】図１１は、試験例８における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数の増加を示す図である。図中、ＨＧＦはＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡを直接注入したラット心筋の微小血管数、対照はＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔを直接注入したラット心筋の微小血管数である。
【図１２】図１２は、試験例９における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後３週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を示す図である。
【図１３】図１３は、試験例９における、ＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡの関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を示す図である。
【図１４】図１４は、試験例９における、比較例２で作製したＨＶＪ−リポソーム−ＤＮＡ（ＴＧＦ−β）の関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞が認められないことを示す図である。
【図１５】図１５は、試験例９における、比較例１で作製したＨＶＪ−リポソーム−ｃｏｎｔの関節内への投与後４週でのトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞が認められないことを示す図である。
【図１】
0004021286.tif 000002
【図２】
0004021286.tif 000003
【図３】
0004021286.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004021286.tif 000008
【図８】
0004021286.tif 000009
【図９】
0004021286.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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