(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）サンプル受取口；濾過サンプル出口；及びそれらの間に取り付けられたサンプル分離フィルターを有する容器であって、当該サンプル分離フィルターがサンプル受取面及びこれと反対の面を有し、当該サンプル分離フィルターがサンプルの通過流阻止に有効であるが、当該サンプル分離フィルターの当該反対の面を液体媒体に接触させた場合に自発可動精子の通過を許容する、上記容器、並びに
（ii）当該フィルターの当該反対の面に液体を供給する手段を含む、液体サンプル中において非自発可動精子から自発可動精子を分離するための装置。
【請求項２】
当該サンプル分離フィルターがゲル構造又は泡構造のものである、請求項１記載の装置。
【請求項３】
当該フィルターが繊維質である、請求項１記載の装置。
【請求項４】
当該繊維質フィルターがガラスウール又はポリプロピレン製である、請求項３記載の装置。
【請求項５】
サンプル分離フィルターの出口側で、当該分離フィルターから空間を隔てて精子検出手段を含む、前請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
当該検出手段が当該装置の構造の一部を構成する、請求項５記載の装置。
【請求項７】
当該検出手段が、当該サンプル分離フィルターを液状媒体に接触させて置く前、置いている間又は置いた後に、当該装置に挿入するための当該装置の分離可能な構成部品である、請求項５記載の装置。
【請求項８】
当該フィルターが100-2000 μmの厚さを有する、前記請求項いずれかに記載の装置。
【請求項９】
当該フィルターが200-1000 μmの厚さ、好ましくは400-800 μmの厚さ、さらに好ましくは600 μmの厚さを有する、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
当該フィルターが５-100 μm、好ましくは８-60 μm、より好ましくは10-40 μmの最小粒子保持サイズを有する前記請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
当該フィルターが、当該フィルターを下支えする格子構造を有する、請求項２又は請求項５〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
精子と相互作用して目に見える信号を直接又は間接的に発生させ得る試薬又は複数の試薬の組合せを、当該精子検出手段の中に置く、請求項５−11のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
当該試薬又は複数の試薬の組合せが、精子上に存在する抗原を検出して精子に結合し得るような抗体を含む、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
精子が、当該抗体により不可動化された場合、精子に結合する目視検出可能な試薬を使用して目視検出できる、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
精子の化学走性誘因物質が当該精子検出手段の中に存在する、請求項５−14のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
当該精子化学走性誘因物質が、当該サンプル分離フィルターから離れた当該精子検出手段の一部分に位置する、請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
ピックアップ域が当該サンプル分離フィルターの中か又は当該精子検出手段の中に存在し、当該ピックアップ域が、精子に結合し、当該精子検出手段の検出域に共に輸送され得る試薬又は複数の試薬の組合せを含む、請求項５−17のいずれかに記載された装置。
【請求項１８】
ピックアップ域における当該試薬又は複数の試薬の組合せが精子上に存在する抗原を検出する抗体を含む、請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
精子上に存在する抗原を検出する当該抗体を、検出可能な程度に標識化する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
精子上に存在する抗原を検出する当該抗体を、検出可能な程度に金の粒子で標識化する、請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
当該精子検出手段の検出域中に存在する当該抗体が、ピックアップ域に存在する抗体と比較してこれと異なる精子抗原を認識する、請求項１８、請求項１９、または請求項２０記載の装置。
【請求項２２】
精子検出手段の検出域中に存在する抗体が、ピックアップ域中に存在する抗体と同じ精子抗原を認識する、請求項１８、請求項１９又は請求項２０記載の装置。
【請求項２３】
当該精子検出手段が精子先体溶解試薬及びpH変動検出手段を含む、請求項５−22記載のいずれかの装置。
【請求項２４】
当該精子先体溶解試薬が溶解緩衝液である、請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
当該溶解緩衝液が、プロテイナーゼＫ又はカルシウムイオノホアA24297を含む、請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
当該pH変動検出手段がpH感受性プローブである、請求項２３、請求項２４又は請求項２５記載の装置。
【請求項２７】
当該pH変動検出手段が、pH変動を目視検出できるようなpH指示薬である、請求項２３、請求項２４又は請求項２５記載の装置。
【請求項２８】
当該pH指示薬がブロムクレゾール パープルである、請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
当該サンプル分離フィルターのサンプル受取表面が酵素液化剤を含む、前記請求項のいずれかに記載された装置。
【請求項３０】
（ａ）第一及び第二の表面を有するフィルターであって、第二の表面に液体を適用すると、当該フィルターがそれを通過する自発可動精子の移動を許容し、該フィルターが請求項１−29のいずれかの装置に含まれるフィルターである、上記フィルターの提供；
（ｂ）サンプルの第一の表面への適用；
（ｃ）液体の当該第二の表面への適用；
（ｄ）当該フィルターを通して移行した精子の検出
を含む、サンプル中の自発可動精子の存在を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は精子の分離及び検出に関する。本発明は、サンプル中の自発可動精子の分離及び／又は検出のための方法及びキットを提供し、これらは、男性の授精能診断及び治療を含む多くの用途にこれを使用することができる。
【０００２】
（背景技術）
妊娠を試みる全ての夫婦の中、約14−16%が困難を経験しているものと推定されており、これらの夫婦は授精能セラピストにより授精不能（ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ）と定義付けられている。これらのケースの中、その40%が男性側に原因による。これらの中、かなりの部分において、受精不能の原因となる症状を改善し、又はこれを軽減する治療が存在する。
【０００３】
生育し得る精子がサンプル中に存在するか否かを試験することが望ましいような症状が、その他にも存在する。例えば、産児制限の方法として、今や精管切除が頻繁に行われるようになったが、当該手術後の一定期間中に、射出精液中に生育可能な精子が存在しないことを確認して、精管切除の有効性を検証してみることも必要である。
【０００４】
サンプル中の精子の自発可動性及びその数を評価する方法は数多く存在する。このような方法の一つが、顕微鏡分析法であり、通常病院又は商業的試験室で実施されている。しかし、さらに最近になり、精子の検出を単純化することを目的とする、従って男性の授精不能診断に有用な試験用キットに関して、多くの提案がなされている。例えばWO97/40386では、34kDヒト精巣上体の精子タンパク質（P34H）の検出に基づくキットを開示している。このタンパク質は精子−透明帯間の相互作用に関与するものと考えられている。WO97/40386で開示された試験用キットは、P34H又はこれに関連する抗原に対して育成された抗体、及びP34Hに結合する抗体を検出する試薬を使用している。WO97/40386に開示されているように、試験サンプル中の精子をダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水中で３回遠心分離して洗浄する。次に当該サンプルを95 ℃で熱変性し、14000gで遠心分離し、次にその上澄液を分析に使用する。
【０００５】
EP-A-0387873でも、男性の授精能を評価するためのキットを開示している。このキットは、ヒト精子先体上の抗原サイトに対して特異的な抗体を結合させた固体ビーズを使用して作成されている。このようなビーズを試験サンプルと混合し、10−30分間インキュベートする。次に当該試験ビーズを当該懸濁液から分離し、洗浄し、好ましくは顕微鏡の助けを借りてこれを検査することにより、当該固体ビーズに結合した精子の数を測定する。
【０００６】
サンプル中の精子を検出するためのキットは、WO95/29188でも開示されている。この場合、当該試験はヒト精子のSP-10抗原などの抗原に対する抗体に基づく。
【０００７】
上記従来技術において開示された試験キットの著しく不利な点は、これらのキットが自発可動精子と非自発可動精子を区別していない点である。男性の授精不能検出において、自発可動精子数の評価能力は、男性の授精不能を予見するための最良指標となる。さらに、従来技術による試験用キットの多くは、遠心分離又は顕微鏡検査などの手順を含んでいるので、家庭でこれを使用することができず、熟練した試験実施者の実施も必要となる。
【０００８】
従って、それだけで完備した、又は複数の構成部品を備えた装置、及び非自発可動精子から自発可動精子を分離し、自発可動精子を回収し且つその存在を検出する方法の提供が望まれるところである。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、
（ｉ）サンプル受取口；濾過サンプル出口；及びそれらの間に取り付けられたサンプル分離フィルターを有する容器であって、当該サンプル分離フィルターがサンプル受取面及びこれと反対の面を有し、当該サンプル分離フィルターがサンプルの通過流阻止に実質的に有効であるが、当該サンプル分離フィルターの当該反対の面を液体媒体に接触させた場合に自発可動精子の通過を許容する、上記容器、並びに
（ii）当該フィルターの当該反対の面に液体を供給する手段を含む、液体サンプル中において非自発可動精子から自発可動精子を分離するための装置を提供するものである。
当該サンプルは、自発可動精子、非自発可動精子及び／又は低自発可動性精子を含む。
【００１０】
分離した自発可動精子の検出を行うために、当該サンプル分離フィルターのサンプル出口側に例えば精子検出フィルターなどの精子検出手段を、これから離して備えることができる。当該検出手段を、当該装置の一部として組み入れるか、又は、フィルターを当該液体媒体に接触させて設置する前、設置している最中又は設置した後で装置に挿入する別部品として提供することもできる。当該精子検出フィルターには、当該サンプル分離フィルターと同様の特性を持たせることができる。
【００１１】
当該フィルターの厚さは100−2000 μm、好ましくは200−1000 μmであり、さらに好ましくは400−800 μmである。例えば、当該フィルターの厚さは約600 μmである。当該フィルターの最小粒子保持サイズは５−100 μm、好ましくは８−60 μm、さらに好ましくは10−40 μmである。当該フィルターは繊維質、例えばガラスウール又はポリプロピレン製であっても良く、或いはゲル構造又は泡構造を有していてもよい。自己支持能力の無いゲル構造又は泡構造である場合には、下支え用の格子又はその他支持体をこれに備えることもできる。特に好ましいフィルターは、ガラス繊維のフィルターであり、その中にアクリル酸エステルなどのバインダーを含むことができる。ゲルを当該フィルターとして使用することにより、その反対の面に液体を供給する必要が無くなり、これは、当該ゲル自体がその役目を果たすからであることが理解できよう。ヒアルロン酸及びメチルセルロースをゲルとして使用することが好ましい。
【００１２】
精子と相互作用して目視信号を直接又は間接的に発生させ得るような試薬又は複数の試薬の組合せを、当該精子検出手段の中に置くことができる。これらの試薬又は複数の試薬の組合せとして、精子上に存在する抗原を検出し、且つ／又は精子に結合し得る抗体を含み得る。精子は、このような抗体により不可動化させると、精子に結合する目視検出可能な試薬を用いて目視により検出することができるようになる。CD59に対する抗体は、WO99/66331（その完全開示内容は引用により本明細書に取り込まれる）に議論されている通り、この目的に適した試薬であることが判明した。
【００１３】
WO99/66331で特定されている卵胞液（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）などの精子の化学走性誘因物質を当該精子検出手段の中に置くことができる。このような精子化学走性誘因物質は、当該精子検出手段のサンプル分離フィルターから離れた一部分中に置くことが好ましい。
【００１４】
精子に結合して当該フィルター（単数又は複数）を通して当該精子検出手段の検出域まで輸送される能力のあるような試薬又は複数試薬の組合せを含むピックアップ域は、サンプル分離フィルター中又は精子検出手段中にこれを置いても良い。当該ピックアップ域の当該試薬又は複数試薬の組合せは、精子上に存在する抗原を検出するような抗体を含むことができる。これらの抗体を検出可能にするために、例えば金の粒子等で標識化することができる。
【００１５】
当該精子検出手段の検出域内に置く抗体は、当該ピックアップ域に存在するものと同一か又は異なる精子の抗原を認識することができる。
【００１６】
当該精子検出手段は、精子先体溶解試薬及びpH変動検出手段を含むことができる。当該精子先体溶解試薬は、通常溶解緩衝液であり、プロテイナーゼＫ又はカルシウムイオノホアA24297を含有することができる。pH変動検出手段はpH変動の目視検出能力を有するpH感受性プローブ又はpH指示薬、例えばブロモクレゾール パープルとすることができる。
【００１７】
当該サンプル分離フィルターのサンプル受取表面は、精液を液化する能力を有するキモトリピシンなどの酵素液化剤を含むことができる。
【００１８】
本発明は、上記装置を含む男性の授精能試験キットであって、当該キットがさらに液体放出機構を含み、当該液体放出機構を活性化することにより液体供給源からの液体が当該サンプル分離フィルターの当該反対の面に適用され、精子検出手段と液体連通を提供するような上記キットをも提供するものである。
【００１９】
当該精子検出手段は当該装置と一体化されたものであっても良く、或いは別個又は分離可能なキット部品として提供されるものであっても良い。
【００２０】
当該キットは、これを一体化液体供給源を含んでもよく、又は外部液体供給源を使用することもできる。当該液体は、当該精子検出手段へ移行するのに充分な時間だけ自発可動精子がその中で自発可動性を維持できるようなものでなければならない、即ち、当該液体は精子にとって一般に無毒なものでなければならないことは理解されよう。しかし、当該液体は、十分な精子が当該検出手段に到達するのに成功できる程度に十分に低い毒性を有するものであっても良い。当該液体は、WO99/66331に述べられているような燐酸塩緩衝食塩水（PBS）又はアール平衡塩溶液（EBSS）などの緩衝液であることが好ましい。
【００２１】
ゲルベースのフィルターを使用する場合、当該ゲルがそれ自体の液体供給源として作用し得ることは理解されよう。しかし、例えば当該フィルターを通じた分離後に、サンプルを希釈するため等に、ゲルベースのフィルターの反対の面に液体を供給することが望ましい。
【００２２】
当該キットは、２個又はそれ以上の分離可能な構成部品、例えば装置及びこれと組み合わせる基礎単位を含むことができる。当該装置を当該基礎単位に適用することにより、当該液体放出機構の活性化を適合させ、これにより当該精子検出フルター及びサンプル分離手段を濡らすことができる。これに代わる方法として、ボタン式液体放出機構を備えることもできる。当該精子検出フィルターを濡らすことにより、当該精子検出手段に適用される検出剤を活性化することができる。
【００２３】
当該液体放出機構の活性化後に、装置に適用される液体の過剰分を捕捉するためのオーバーフロー容器を提供することができる。
【００２４】
当該液体供給源は、壊れ易い区画又は部分であって、当該液体放出機構が当該区画を破壊してその中に含まれる液体を放出させるものを含んでいてもよい。その際放出される当該液体は、次に当該装置と当該キットの基礎部分の間に形成された窪みに向けて、傾斜路により伝わることができる。当該区画は、例えば、停止装置により保持される、貫通機構の形態の液体放出機構により、貫通することができ、当該停止装置は当該貫通装置が当該区画を貫通するのをユーザーが活性化させるまで阻止する。
【００２５】
本発明は、第一及び第二の表面を有するフィルターであって、；液体を第二面に適用した場合に自発可動精子がこれを通して移行することを可能にする上記フィルターを提供する段階、サンプルを当該フィルターの第一面に適用する段階、第二面に液体を適用する段階、及び；当該フィルターを通して移行した精子を検出する段階を含む、サンプル中の自発可動精子の存在を検出する方法を提供するものでもある。当該サンプルとして、自発可動精子及び非自発可動精子を含む混合物であってよい。当該フィルターは、上記の装置内又はキット内に組み込むまれたフィルターでよい。
【００２６】
（本発明の実施方法）
図１及び２に、男性の授精能を試験するキット10を示す。当該キットは、容器12、基礎単位14、液体18が入った液体供給源16、及び２個のフィルター20、22を包む。
【００２７】
第一のフィルター20は、その組成及び構造により精子の移行に対する妨害を形成するようなサンプル分離フィルター20である。例えば、当該フィルターはそのサンプル受入面上に、フィルター上に置いたサンプル中に存在する精液及び非自発可動精子を実質的に保持することができる。これは、例えば当該フィルターの孔サイズにより、行うことができる。非自発可動精子は当該フィルターを通過しない。しかし、当該精子が自発可動精子である場合には、これらの精子は「泳いで」当該フィルターを通過することができる。
【００２８】
ヒト精子の頭の直径は、通常３−５ μmであり、尾の長さは約50−60 μmである。当該フィルターは、当該液体を当該反対の面に適用した場合、これらの精子が当該フィルターを通過できるようなものであるべきである。適したフィルター材料は、一連の簡単な実験を行うことにより、同定することができる。
【００２９】
実験１：精子毒性の評価
精液サンプルから泳ぎ着いた精子を調製し（「実地試験室における男性病学」−David Mortimer, P. 272）、得られた自発可動精子をフィルターの精子毒性評価に用いる。2 cm x 2 cm角のフィルターを2 mm x 1 cmの帯状試片へと切り出した。新しく調製した自発可動サンプル3 x 1 mlのアリコートを重複サンプルＡ、重複サンプルＢ及び対照サンプルＣと書いた丸底試験管（例えばファルコン #2001又は2037）に添加した。フィルターの薄片10個を重複サンプルＡ及びＢの各々に入れる。次にＡ、Ｂ及びＣを37 ℃で１時間、頻繁に攪拌しながらインキュベートした。次に重複サンプル及び比較対照サンプルの両方について、精子の可動性及び／又は活力を評価した（自発可動性については「実地試験室における男性病学」のP. 49-50を、また活力についてはP.66-69を参照のこと）。精子の自発可動性及び活力には、サンプル含有フィルターと比較対照フィルターの間で著しい差異が認められ、このことは、当該フィルターが精子に対して毒性を有することを示している。
【００３０】
実験２：精子のフィルター通過ウィック量（ｗｉｃｋｉｎｇ，吸上げ）の評価
液状化精液200 μlを丸底試験管中に入れる。次に、フィルターの0.5 cm x 4 cm帯状試片を、当該フィルター下部の１−２ mm だけが直接に精液サンプルに接触するように精液サンプル中に入れる。フィルターによっては、当該精液サンプルが自発可動精子及び非自発可動精子を伴って毛管現象によりフィルター中を移動又はウィックアップ（ｗｉｃｋ  ｕｐ）し、当該分離を無効にしてしまう場合もある。与えられた時間枠（例えば15分）内におけるウィッキングの程度は、当該フィルターを精液サンプルから取り出し、当該フィルターの２ mm切片について、精子の存在を光学顕微鏡で解析することによりこれを定量することができる。自発可動精子と非自発可動精子の混合物からの自発可動精子の有効なセパレーターであるためには、当該フィルター中で（当該サンプルが、濾過された自発可動精子の検出前又は回収前に、フィルターに適用されたままの状態で残される時間枠内において）ウィッキングを起こす程度は、当該フィルターの厚さ未満であることが望ましい。
【００３１】
実験３：フィルターの死滅精子又は非自発可動精子の通過を防止する効力
死滅精子又は非自発可動精子のサンプルは、精液のサンプルを水浴中95 ℃で加熱するか又は10%シアン化物溶液を添加することによりこれを得ることができる。200 μlの死滅又は不可動化精液サンプルを当該フィルターの上面に適用し、当該フィルターの下面は直接１ mlのEBSSと直接連通した状態に置く。５、10、15及び30分の間隔を置いた後、当該濾過液10 μlのアリコートを取り出し、その中に精子が存在するかどうかを光学顕微鏡下で検査する。有効なフィルターであれば、当該精液サンプルが当該フィルターの上面と接触を保つ必要がある間は、死滅精子又は非可動精子の通過を阻止する。
【００３２】
実験４：フィルターの自発可動精子の通過についての選択的許容効力
精液サンプルの湿潤調製物の評価を実施し（「実地試験室における男性病学」, p. 49-50）、その特徴を記録した。当該精液サンプル250 μlを当該フィルターの上面に適用し、当該フィルターの下面は１ mlのEBSSと直接連通した状態に保った。５、10、15及び30分の間隔を置いた後、当該濾過液の10 μlのアリコートを取り出し、当該濾液の中に自発可動精子の存在及びその中の自発可動精子の非自発可動精子に対する比率に関して光学顕微鏡下で検査し、元のサンプルに関する結果とこれを比較する。有効なフィルターであれば、自発可動精子の通過を許容する。例えば、元の精液サンプルの自発可動率が40%（即ち、60%の精子は非自発可動性）の場合、当該濾液は少なくとも90%の自発可動率を持ち、非自発可動精子の割合は10%未満であるべきである。
【００３３】
当該キットにおける第二のフィルター22は、精子検出用フィルター22である。当該精子検出用フィルター22は、当該サンプル分離用フィルター20を通して移行できる精子の検出域26を形成する。当該検出域26は、当該精子検出フィルター22の中に備わっており、精子と相互作用を起こすと信号を発信する能力を有する試薬を含む。しかし、二個のフィルター20及び22の間には間隙24が形成され、これにより、輸送媒体（例えば液体供給源16中の液体18）が供給されて当該間隙24が満たされて当該精子が検出域26へ移行できるようになるまで、当該キットの活性化が阻止される。このようにして、当該キットを使用することにより、当該授精能試験を実施することができる。
【００３４】
適切なフィルター20、22及び検出域26の組成及び構造は、すでに本明細書の中で説明したようなものであっても、従来の文献で詳細に説明されたようなものであっても良い。しかし、WO99/66331（当該文献の完全開示内容については、本明細書の中に引用により組み込まれる）の中で述べられている組成及び構造であることが好ましい。特に好ましいフィルター材料は、フィルター4622として同定され、Ahlstrom Filtration, Inc.（122 W. Butler Street, PO Box A, Mt. Holly Springs, PA 17065-0238, USA）により市販されている。これは、ミクロ ガラス繊維とアクリルバインダーとを含む。当該アクリル ラテックスはアクリル酸型ポリマー及び共重合体のアニオン性分散液である。これらのポリマーは、アクリル酸エステルをベースとする。その孔サイズは20 μmであり、厚さは580 μmである。
【００３５】
容器12の断面は丸く、側壁28、開放頂部30、環状基礎部分32及び環状基礎部分32上に形成された開放ノズル34を有している。当該精子検出用フィルター22は、ノズル34の中に提供される。開放頂部30上には容器12中の滅菌環境を維持するためにキャップ（図には示されていない）を被せることができる。容器12の中へサンプルを適用するときは、当該開放頂部30上のキャップを外すことが必要であろう。
【００３６】
基礎単位14は液体供給源16、液体放出機構36及びくぼみ38を含む。窪み38はノズル34を受けるために適合させた孔40を含む。孔40は、キット10を活性化した後に検出域26を検査するために窓（図には示されていない）を有していてもよい。基礎単位14はさらに液体18を液体供給源16から窪み38の中へ伝えるための傾斜路42及び液体供給源16から窪み38の中へ提供される過剰液体18を捕捉するためのオーバーフロー44を含む。
【００３７】
液体放出機構36は、容器12を基礎単位14の上に嵌合することにより活性化するよう適合された貫入部材37の形態である。貫入部材37が活性化される前においては、貫入部材37は停止装置48により保持されている。容器12が嵌合されるとこれが停止装置48を越えて貫入部材37を引っ張る。液体供給源16には貫入部材37が停止装置48を通過して引っ張られると穴が空くような壊れやすい部分が設けられている。この壊れやすい部分は、錫箔の壁部分を含む。
【００３８】
実験５：ゲル状フィルターによる自発可動精子の分離
精子の分離には、種々のゲル状フィルターを使用することができる。当該ゲル媒体は、Sigma-Aldrich社又はPharmacia-Upjohn社からこれを入手し、EBSS（Gibco-BRL社）の中に再懸濁させた。４種類の異なるヒアルロン酸ゲル及び１種類のメチルセルロース ゲルを試験した。
【００３９】
平らなガラス製毛細試験管（Camlab社；大きさは1.2 x 4.8 mm；内径目視経路は0.4 mm）に当該再懸濁媒体を満たし、一端をシールした。当該試験管の開放端を、100 μl又は200 μlの液化精液の入った1.5 mlのミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）試験管の中に挿入した。室温で30分かけて精液を当該ゲル中へ移行させ、当該試験管を拭い、顕微鏡下で観察した。
【００４０】
当該試験管の開放端から１ cm 離れた位置での精子の数を記録し、種々のゲル中の透過及び移行を評価した。10倍又は20倍の対物レンズ及び10倍の対眼レンズを使用して最終倍率100倍又は200倍として、オリンパスBH-2顕微鏡により一視野当たりの精子数を数えた。倍率100倍における観察面積は0.785 mm2、倍率200倍における観察面積は0.196 mm2であった。
【００４１】
４種類のヒアルロン酸製品に関する結果は、下記の通りであった。
0003980271.tif 000002
【００４２】
メチルセルロース（粘度：15 cp）に関する結果は、下記の通りであった。
0003980271.tif 000003
【００４３】
メチルセルローズ（粘度：4000 cp）に関する結果は、下記の通りであった。
0003980271.tif 000004
【００４４】
従って、精子含有サンプルから自発可動精子を分離するフィルターとしてゲルを使用し得ることは、明らかである。
【００４５】
次に上記キットを使用して、男性の授精能を試験するプロセスについて説明する。
【００４６】
精液のサンプル46又は射精液を、未使用又は再使用容器12の中、開放頂部30を通してサンプル分離フィルター20の上にこれを加える。当該サンプルは、例えばユーザーが直接塗布することにより、又は射出精液サンプルをピペット添加により置かれる。次にこのようにして準備した容器12を新鮮な液体供給源16を有する未使用又は再使用の基礎単位14に、容器12のノズル34が基礎単位14の孔40の中へ挿入されるように、嵌合する。容器12の基礎単位14への嵌合の間に、容器12の側壁28が貫入部材37を活性化し、図２に示すように液体供給源16に穴を空けるが、図２では、貫入部材37が液体供給源16の壊れやすい部分を貫入している。これに代わる方法として、液体供給源16に貫入させるために、貫入ボタン50（図３参照）を設けることも可能である。
【００４７】
液体供給源16に貫入すると、液体供給源16の中に入っている液体18が傾斜路42を伝って窪み38へ流下し、孔40及び窪み38を液体18で満たす。液体18は、基礎単位14の孔40の中に位置する容器12のノズル34を通して流入することもできる。これにより、当該液体は精子検出フィルター22を通過して、２個のフィルター20、22の間の間隙24を液体18で満たす。過剰液体18が窪み38を溢れ、オーバーフロー44により回収される。
【００４８】
液体18はサンプル分離用フィルター20を通して移行した精子の輸送媒体として作用し、精子がサンプル分離用フィルター20を越え、精子検出用フィルター22に向けてさらに移行し、その結果、精子が精子検出用フィルター22中の検出域26で検出されることを可能にする。精子が検出域26で検出されると、其処に提供されている試薬により信号が発生し、自発可動精子の存在を知らせる。当該サンプル中に自発可動精子が存在しない場合、非自発可動精子又は低自発可動精子がサンプル分離用フィルター20を通過することができないために、精子は検出域26に到達しない。
【００４９】
図３のキット10は、本発明の代替態様である。このキットは開放頂部30を有し、これにより上記のサンプル分離フィルター20が、暴露されている。この図には、サンプル46がサンプル分離用フィルター20のサンプル受取面上に溜まっている様子が示されている。
【００５０】
キット10の側壁28により、窪み38が形成されている。液体供給源16はキット10と一体化し、窪み38に隣接しており、当該液体供給源16の中には液体18が入っており、キット10の活性化前に液体供給源16を窪み38から分離しているその外面に壊れやすい部分60が存在する。精子検出用フィルター22は窪み38中の精子の検出を行うため、スライド可能でキット10に接触させ得るスライド部材56上に設けられるか、又はそれは、側壁28中のシール可能な開口58を通して挿入できるようなキットの別構成部品として提供し得る。
【００５１】
液体放出機構は、貫入ボタン50及び貫入部材37を含む。貫入ボタン50は、バネ52により非貫入位置へ傾斜挿入されている。貫入ボタンを押すことにより、貫入部材37が液体供給源の壊れやすい部分60を通して駆動され、液体供給源16の中に入っている液体18を窪み38の中へ流入させる。
【００５２】
これに代わる方法として、例えば、スライド部材56の上に液体供給源16の壊れやすい部分60に貫入するような貫入部材を設ける等して、スライド部材56を、それを挿入することにより液体供給源16中の液体18を窪み38の中へ自動的に放出するよう適合し得る。
【００５３】
窪み38の側壁28に透明窓54を設け、ここから精子検出用フィルターの中に存在する検出域26の検査を行えるようにすることもできる。しかし側壁28を透明材料で造れば、窓54の必要性は避けられる。
【００５４】
図３に示したキット10の使用原理は、図１及び２に示した態様の使用原理に類似している。しかし、液体18を、精子検出用フィルターを当該窪みに挿入する前、挿入している最中又は挿入した後に、窪みに放出することもできる。
【００５５】
本発明、特に上記キット及びその使用方法は、純粋に例示目的でこれを説明したものであることは勿論である。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、修飾を加えることは可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  容器を基礎単位に嵌合する前の本発明に準拠するキットを示す。
【図２】  容器を基礎単位に嵌合した後の、オーバーフローを付けた図１のキットを示す。
【図３】  検出手段がキットの分離可能な構成部品である代替態様を示す。
【図１】
0003980271.tif 000005
【図２】
0003980271.tif 000006
【図３】
0003980271.tif 000007