(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の生長を阻害するある種のアミドを使用する、真核細胞、細胞抽出物およびチューブリン調製物中のチューブリン含量を監視かつ測定し、抗チューブリン活性、抵抗性の化合物をスクリーニングするために有用なバインディングアッセイの実施方法であって、前記アミドは、次の構造式（Ｉ）を有している前記方法：
【化１】
0003980727.tif 000026
〔式中、
Ａは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾフラニルまたはベンジル；または、それぞれ独立して、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13から選ばれた４個またはそれより少ない置換基で置換された、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾフラニル、またはベンジルであり；またはＡが不飽和環であり、かつ互いに隣接している２個またはそれより多くの置換基で置換されているときは、前記置換基の２個は、酸素、窒素、硫黄およびリンから選ばれた２個までのヘテロ原子を含有する５、６、または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルまたはハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただし、Ｒ1およびＲ2の両方が水素原子ではなく；
Ｒ6およびＲ7は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルカルボニルであり；
Ｒ8は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり；
Ｒ9は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルカルボニルであり；
Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり；そしてＸ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つは水素原子でない〕または、それらの光学的対掌体。
【請求項２】
構造式（ＩＩ）：
【化２】
0003980727.tif 000027
〔式中、
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただし、Ｒ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；またはＲ4およびＲ5は、いっしょになって、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰから成る群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６、または７員の縮合環を形成しており；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するアミド；または、それらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、−ＮＲ6Ｒ7、シアノ、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＯＲ13または（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳類の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、エチルであり；
Ｒ3は、ハロまたはシアノであり；
Ｒ4およびＲ5は、アミノまたは−ＣＨ＝ＮＯＣＨ3であり、ただし、Ｒ4およびＲ5は同じでない；
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
菌が子のう菌類、不完全菌類または担子菌類に属する菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3は、−ＣＨ＝ＮＯＣＨ3であり；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、アミノ、シアノまたはメチルであり；
Ｒ5は、ハロ、メチル、ニトロ、またはシアノであり、
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
菌が卵菌類に属する菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、エチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、−ＮＲ6Ｒ7、シアノ、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＯＲ13または（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり；
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
植物の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロまたはシアノであり、ただしＲ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子であり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
構造式（ＩＩＩ）：
【化３】
0003980727.tif 000028
〔式中、
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
構造式（ＩＶ）：
【化４】
0003980727.tif 000029
〔式中、
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
またはＲ3およびＲ4はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
構造式（ＩＶ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、メチル、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ4の両方が水素原子ではない；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
構造式（Ｖ）：
【化５】
0003980727.tif 000030
〔式中、
Ｄは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
またはＲ3およびＲ4はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフリルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
構造式（ＶＩ）：
【化６】
0003980727.tif 000031
〔式中、
Ｄは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノおよび（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシから選ばれ、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフリルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
微小管は全ての真核細胞中に存在している細胞内の繊維状構造物である。分裂紡錘体、中心小体、基底小体、繊毛、鞭毛、軸足（ａｘｏｐｏｄｉａ）および細胞骨格のような異なった細胞小器官の成分として、微小管は、有糸分裂中の染色体運動、細胞運動性、細胞小器官移送、細胞質分裂、細胞板形成、細胞の形状の維持、植物細胞壁の発生における細胞ミクロフィブリル沈着物（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）の配向を包含する多くの細胞機能に関与する。微小管の主成分は、チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）であり、それはアルファおよびベータと称される２つのサブユニットから構成されるタンパク質である。細胞中のチューブリンの重要な性質は、適当な条件下で重合をして微小管を形成する能力または解重合をする能力があることである。また、このプロセスは、単離されたチューブリンを使用して生体外で出現させることができる。
【０００２】
微小管は、２つの娘核の間で正確に分裂細胞内に染色体を分布させることに関与する細胞小器官である分裂紡錘体の成分として細胞分裂において重要な役割を演じる。種々の薬剤および有害生物防除剤は、チューブリンまたは微小管に結合することによって細胞分裂を防止する。このメカニズムによって作用する制がん性薬剤には、アルカロイドのビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）およびビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、およびタクサン−ベース（ｔａｘａｎｅ−ｂａｓｅｄ）化合物であるパクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびドセタクセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）｛例えば、Ｅ．Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，５２，３５−８４（１９９１）、参照｝が包含される。哺乳類の細胞に対して活性の他の抗チュ−ブリン化合物（ａｎｔｉｔｕｂｕｌｉｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）には、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）のようなベンゾイミダゾールおよびコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）およびコンブレタスタチンス（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎｓ）のような天然物が包含される。また、チューブリンに結合するベンゾイミダゾールは広く使用されている駆虫薬である｛ＭｃＫｅｌｌａｒ，Ｑ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｅ．Ｗ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３，２２３−２４７（１９９０）、参照｝。抗チューブリン除草剤は、Ｊ．Ｒ．Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｋ．ＷｒｉｇｈｔおよびＡ．Ｃ．Ｂａｉｌｌｉｅによる“Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”，ｐｐ．２０２−２２３に記載されており、そしてトリフルラリン（ｔｒｉｆｌｕｒａｌｉｎ）のようなジニトロアニリン、クロルプロファム（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐｈａｍ）のようなＮ−フェニルカルバメート、アミプロフォス−メチル（ａｍｉｐｒｏｐｈｏｓ−ｍｅｔｈｙｌ）、およびプロナミド（ｐｒｏｎａｍｉｄｅ）が包含される。チューブリンに結合することによって作用すると考えられる殺菌剤には、ザリルアミド（ｚａｒｉｌａｍｉｄｅ）｛Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ  Ｒｅｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｈ．ＬｙｒおよびＣ．Ｐｏｌｔｅｒによって編集されたＲｅｉｎｈａｒｄｓｂｒｕｎｎ，３８１−３８５，（１９９３）｝、ベンゾイミダゾールベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）およびカルベンダジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ）、およびＮ−フェニルカルバメートジエトフェンカルブ（ｄｉｅｔｈｏｆｅｎｃａｒｂ）｛Ｈ．Ｌｙｒによって編集された“Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ”中のＤａｖｉｄｓｅ，Ｌ．ＣおよびＩｓｈｉ，Ｈ．３０５−３２２（１９９５）｝が包含される。
【０００３】
薬剤および有害生物防除剤のための生化学的目標としてのチューブリンの成功のために、チューブリンに結合する新規な化合物を見出すことにかなりの関心がある。種々な無細胞法（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）はそのような化合物を見つけるのに利用できる。普通の方法には、生体外において、単離されたチューブリンが重合して微小管になるのを阻害する試験化合物の能力を測定することが含まれる｛例えば、Ｅ．Ｈａｍｅｌ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，２０７−２３１（１９９６）、参照｝。第２の方法においては、試験用化合物と単離されたチューブリンとの相互作用により、プローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用された第２のチューブリン−バインディングリガンド（ｔｕｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）の結合に影響を与える試験化合物の能力を測定することによって、バインダーをアッセイすることができる。典型的には、プローブは、結合を測定するのを可能にするためにラジオラベル（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ）される。チューブリンに結合する試験化合物は、チューブリンタンパク質上でプローブと同じ部位に結合することによって、プローブの結合に影響を与えることができ、それゆえ、結合するプローブの量を減少させる。別法として、結合は試験用化合物がプローブの結合部位とは異なる部位に結合し、チューブリンタンパク質の高次構造の変化を誘発し、プローブの結合部位に影響を及ぼす「アロステリック（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ）」相互作用の手段により影響される。そのようなアロステリック相互作用は、プローブの結合を増加させるかまたは減少させる。第３の方法としては、チューブリンと会合させたグアノシントリホスファターゼ活性についての試験用化合物の影響を測定することがある｛Ｄｕａｎｍｕ，Ｃ．，Ｓｈａｈｒｉｋ，Ｌ．Ｋ．，Ｈｏ，Ｈ．Ｈ．およびＨａｍｅｌ，Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９，１３４４−１３４８（１９８９）｝。
【０００４】
これらの方法のいずれかによって多数の化合物をスクリーニングすることは、現在においては、哺乳類の脳の組織からのチューブリンを使用する場合にのみ実現可能である。なぜなら、それは、他のソースから純粋なチューブリンを充分多量に単離することが可能でなかったからである。多くの抗チューブリン化合物が異なったソースからの微小管に対して、その効果の点で大きな特異性を示すので、これらの方法の有効性が制限されていた。例えば、除草剤であるオリザリン（ｏｒｙｚａｌｉｎ）およびアミプロホスメチル（ａｍｉｐｒｏｐｈｏｓｍｅｔｙｌ）は、植物チューブリンの重合を阻害するが、脳チューブリンの重合を阻害しない。ところが、コルヒチンは、植物チューブリンの重合の阻害剤としてよりも脳チューブリンの重合の阻害剤として１００倍以上より多く有効である｛Ｊ．Ｗ．Ｓｈａｙ，によって編集された“Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ”の中のＭｏｒｅｊｏｈｎ，Ｌ．Ｃ．およびＦｏｓｋｅｔ，Ｄ．Ｅ．，“Ｔｕｂｕｌｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｆｕｎｇｉ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｉｓｔｓ”２５７−３２９（１９８６）｝。
【０００５】
本発明は、菌細胞および植物細胞を包含する真核細胞の生長を阻害することが知られている既知のある種のアミド誘導体の、抗チューブリン活性のための化合物をスクリーニングするバインディングアッセイにおけるプローブとしての使用に関する｛例えば、米国特許第３，６６１，９９１号、同第４，８６３，９４０号および同第５，２５４，５８４号、参照｝。ラジオラベルした、コルヒチン｛例えば、Ｍ．Ｈ．ＺｗｅｉｇおよびＣ．Ｆ．Ｃｈｉｇｎｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２２，２１４１−２１５０（１９７３）、参照｝およびビンブラスチン｛例えば、Ｒ．Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５，１７１４１（１９９０）｝のようなラジオラベルしたプローブは、単離されたチューブリンを使用するバインディングアッセイに広く使用されているが、これらの化合物は、チューブリンに非共有結合的に結合している。拮抗的なバインディングアッセイにおいて現存の抗チューブリン化合物を越える本発明のアミド誘導体の１つの利点は、チューブリンに、特にチューブリンのベータ−サブユニットに、高度に特別な仕方において共有結合的に結合する本発明のアミド誘導体の独特な能力から生じる。バインディングアッセイにおいては、チューブリンに結合するプローブの量を測定することが必要であり、これには、一般的に、未結合のプローブからチューブリンに結合したプローブを分離することが含まれる。アミドの場合においては、結合が共有結合であるので、チューブリンに結合したプローブは化学的に安定であり、濾過または遠心分離のような方法によって未結合のプローブから容易に分離することができる。これは、単離されたチューブリンを使用するアッセイにアミドを使用することを可能にするだけでなく、全細胞、クルード細胞抽出物、および部分的に精製されたチューブリン調製物を使用するアッセイにおいてアミドを使用することを可能にする。それ故、単離されたチューブリンの必要性を解消し、チューブリン−バインディングアッセイを、多くの異なったタイプの細胞または細胞抽出物について行うことを可能にする。例えば、植物または菌のチューブリンに結合する試験化合物は、植物または菌の細胞または細胞抽出物およびアミドプローブを使用するアッセイにおいて見つけることができ、多数の化合物をスクリーニングするための適当なアッセイを提供する。また、アミドプローブは、哺乳類の細胞中のチューブリンに結合する化合物を探査するために使用することができ、脳以外のソースからの哺乳類のチューブリンについての試験用化合物の効果を研究する手段を提供する。典型的には、アミドプローブの結合の初期速度（ｉｎｉｔｉａｌ  ｒａｔｅ）についての試験用化合物の効果が測定される。単離されたチューブリンを使用する無細胞アッセイに勝る全細胞アッセイの利点は、生物的な活性に影響を及ぼす重要な因子である細胞の代謝の活性化または不活性化の可能性のアッセイとともに、細胞中に試験化合物の蓄積を可能にすることである。
【０００６】
本発明の第２の態様は、チューブリンに結合することによって作用する有害生物防除剤または薬剤に対する真核細胞の感受性を評価するための、バインディングアッセイにおけるアミドプローブの使用に関する。抗チューブリンのための有害生物防除剤または薬剤のある期間にわたる使用は、その結果として、抗チューブリン化合物に対して減少した感受性（抵抗性）を示す細胞が出現する。抵抗性はチューブリンの変化に起因するか、または抗チューブリン化合物の捕捉（ｕｐｔａｋｅ）または代謝における変化のような他のメカニズムに関係するかもしれない。チューブリンの変化に起因する抗チューブリン化合物に対する抵抗性は、菌病原体類｛Ｈ．Ｌｙｒによって編集された“Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ”中のＤａｖｉｄｅｓ，Ｌ．Ｃ．およびＩｓｈｉ，Ｈ，３０５−３２２（１９９５）｝、藻類｛Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０６，２０９−２１８（１９９３）｝およびぜん虫類（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）｛Ｂｅｅｃｈ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３８，１０３−１１０（１９９４）｝においても発生した。変化したチューブリンを含有する抵抗性細胞は、アミドに対する結合親和力において差異を示し、バインディングアッセイに使用されるアミドプローブがそのような変異体を検出するのを可能にする。そのようなアッセイは、抗チューブリン有害生物防除剤または薬剤に予め暴露された細胞または細胞抽出物に対するアミドプローブの結合の速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）と、未処理の対照細胞または細胞抽出物に対する結合の速度とを比較することによって行うことができる。
【０００７】
例えば、ベンゾイミダゾール殺菌剤およびチオファネート殺菌剤、例えばベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）（メチル  １−（ブチルカルバモイル）ベンゾイミダゾール−２−イルカルバメート）、フベリダゾール（ｆｕｂｅｒｉｄａｚｏｌｅ）（２−（２’−フリル）ベンゾイミダゾール）、チアベンダゾール（ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ）（２−（４−チアゾリル）ベンゾイミダゾール）、カルベンダジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ）（メチル  ベンゾイミダゾール−２−イルカルバメート）、チオファネート−メチル（ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ）（１，２−ビス（３−メトキシカルボニル−２−チオウレイド）ベンゼン、およびチオファネート（ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅ）（１，２−ビス（３−エトキシカルボニル−２−チオウレイド）ベンゼンは、植物病原菌に対する使用のために当業界において知られている。しかし、ベンゾイミダゾール殺菌剤およびチオファネート殺菌剤をある期間にわたって使用すると、その結果としてこれらの殺菌剤に対して減少した感受性を有する菌株が出現し、それにより、殺菌剤は、ある種の菌による疾病を防除する有効性が極めて少なくなる。典型的には、純粋な培養物として単離したときのそのような“抵抗性”菌は、これらの殺菌剤にさらされなかった場所からの菌よりも、ベンゾイミダゾールおよびチオファネートに対して１０倍ないし１０００倍以上も感受性が小さい。更に、１種のベンゾイミダゾール殺菌剤またはチオファネート殺菌剤に対して減少した感受性を発現させた菌は、また、しばしば、他のベンゾイミダゾール殺菌剤またはチオファネート殺菌剤に対しても減少した感受性を示す。Ｎ−フェニルカルバメート殺菌剤であるジエトフェンカルブ（ｄｉｅｔｈｏｆｅｎｃａｒｂ）は、商業的に、ボトリティス  シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）のようなベンゾイミダゾール−抵抗性菌を防除するのに使用される。しかし、その使用は、ベンゾイミダゾールおよびジエトフェンカルブの両方に抵抗性のある菌株へ導いた。ベンゾイミダゾール、チオファネートまたはジエトフェンカルブに抵抗性の菌株を見つける現在の方法は、労働集約的でありかつ時間を消費する。ある種の方法には、純粋な試験培養物の単離、次いで殺菌剤で修正（ａｍｅｎｄ）した寒天プレートを使用する菌糸体の生長による生体外アッセイ、または殺菌剤で処理された葉を使用する生体内アッセイが包含される。別法として、胞子のスライド発芽試験（ｓｌｉｄｅ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｅｔｓ）を殺菌剤の存在下において行ってもよい。ジエトフェンカルブおよび／またはベンゾイミダゾールおよびチオファネートに抵抗性である菌株は、典型的には、変化したチューブリンタンパク質を含んでいる。｛例えば、Ｋｏｅｎｒａａｄｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８２，１３４８−１３５４（１９９２）およびＹａｒｄｅｎ，Ｏ．およびＫａｔｅｎ，Ｔ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８３，１４７８−１４８３（１９９３）、参照｝。ベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカルブ感受性の菌株は、典型的には、本発明のアミド誘導体に対して増加した感受性を示すが、ベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカルブ抵抗性の菌株���、典型的には、減少した感受性を示す。理論によってしばられることは欲しないが、アミドプローブは、抵抗性でない菌株から、全細胞または細胞抽出物を使用するアッセイにおいてアミドプローブと結合する増加した能力を示すベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカルブ感受性の菌株、またはアミドプローブと結合する減少した能力を示すベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカルブ抵抗性の菌株を識別するために、バインディングアッセイに使用することができると考えられる。そのようなアッセイは、労働集約もより少なく、かつ時間の消費もより少なく、また抵抗性のメカニズムがチューブリンの変化を含んでいるかどうかに関する情報も提供する。抵抗性のメカニズムについての情報は、抵抗性を管理する方策を設計するのに有用である。
【０００８】
本発明の第３の態様は、細胞または細胞抽出物中のチューブリンを検出しそして定量するために、バインディングアッセイにおいてアミドプローブを使用することが含まれる。チューブリンは、薬剤および有害生物防除剤のための目標としての成功のために、またチューブリンの重要な細胞機能のために、研究対象とされている。そのような研究においては、細胞または細胞抽出物中のチューブリンを検出し定量することがしばしば望ましい。現在においては、これは、種々なイムノアッセイ法｛Ｄ．Ｔｈｒｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．１２９−１４５（１９９３）、｝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動｛Ｂ．Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．５８７−６００（１９９７）｝、ＤＥＡＥ−セルロースへの結合｛Ｊ．Ｃ．Ｂｕｌｉｎｓｋｉｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１０４，４３２−４３９（１９８０）｝により、またはコルヒチン−結合活性を測定することにより｛Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ，９，ｐｐ．４９９９−５００７（１９７０）｝達成されている。アミドプローブにより、アミド−結合活性の測定に基づいてチューブリンを検出し定量するための別の方法が提供される。アミドプローブを使用することにより、チューブリンに対する抗体の必要性が解消され、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＤＥＡＥ−セルロースへの結合法のいずれよりもより簡単かつより迅速な方法が提供され、そしてコルヒチンに感受性のない植物細胞また菌細胞のようないろいろな細胞中のチューブリンのレベルを測定するのに適用できる。
【０００９】
当業者に知られている種々な方法を使用して全細胞、クルード細胞抽出物、部分的に精製したチューブリン調製物または単離されたチューブリンを使用するアッセイにおけるアミドプローブのチューブリンに対する結合を検出することができる。これには、例えば、ラジオラベルしたアミドプローブまたは蛍光アミドプローブを使用することが含まれる。典型的には、プローブは、細胞、細胞抽出物またはチューブリン調製物とともにインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）され、そして種々な分離技術またはそのような技術の組み合わせにより未結合のプローブから結合したプローブを分離後、結合したプローブの量が決定される。分離技術には、遠心分離、クロマトグラフィー、相分離、結合したプローブまたは未結合プローブのいずれかの沈殿、または結合したプローブまたは未結合のプローブの固体基体に対する接着が包含されるが、これらに限定されない。シンチレーションプロキシミティアッセイ技術（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（米国特許第４，５６８，６４９号）は、チューブリンに対するプローブの結合を測定するための潜在的な方法を提供する。更に他の方法にはアミド結合チューブリンの検出、または化学処理または酵素処理により、質量分光分析技術により、チューブリンから解離されたアミド結合ペプチドを検出することが含まれている。
【００１０】
本発明は、真核細胞の生長を阻害するある種のアミドを使用する、真核細胞、細胞抽出物およびチューブリン調製物中のチューブリン含量を監視かつ測定し、抗チューブリン活性、抵抗性の化合物をスクリーニングするために有用なバインディングアッセイの実施方法であって、前記アミドは、次の構造式（Ｉ）を有している前記方法：
【００１１】
【化７】
0003980727.tif 000002
【００１２】
〔式中、
Ａは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾフラニルまたはベンジル；または、それぞれ独立して、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13から選ばれた４個またはそれより少ない置換基で置換された、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾフラニル、またはベンジルであり；またはＡが不飽和環であり、かつ互いに隣接している２個またはそれより多くの置換基で置換されているときは、前記置換基の２個は、酸素、窒素、硫黄およびリンから選ばれた２個までのヘテロ原子を含有する５、６、または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、ハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルまたはハロ（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただし、Ｒ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ6およびＲ7は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルカルボニルであり；
Ｒ8は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり；
Ｒ9は、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルカルボニルであり；
Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり；そしてＸ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つは水素原子でない〕または、それらの光学的対掌体を提供する。
【００１３】
本明細書に使用されている用語「ハロ」には、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードが包含される。
【００１４】
用語「アルキル」には、１個の基につき１−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびへキシルが包含される。
【００１５】
用語「アルケニル」には、１個の基につき少なくとも１個の二重結合および２−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基、例えばビニル、２−プロペニル、２−ブテニルおよび２−メチル−２−プロペニルが包含される。
【００１６】
用語「アルキニル」には、１個の基につき少なくとも１個の三重結合および２−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基、例えばエチニル、２−プロピニル、および２−ブチニルが包含される。
【００１７】
用語「アルコキシ」には、１個の基につき１−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルコキシ、例えばメトキシ、プロポキシ、ｎ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシが包含される。
【００１８】
用語「アルキルチオ」には、１つの基につき１−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルキルチオ基、例えばメチルチオおよびプロピルチオが包含される。
【００１９】
用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」、「ハロアルキニル」、「ハロアルコキシ」、および「ハロアルキルチオ」の基は、それぞれ、１−５個のハロ置換基を有する、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アルコキシ」、および「アルキルチオ」の基である。
【００２０】
用語「シクロアルキル」には、３−７個の炭素原子の環、例えばシクロプロピル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが包含される。
【００２１】
用語「アルキルカルボニル」には、カルボニル基に結合しており、１個の基につき１−６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、例えばメチルカルボニルおよびブチルカルボニルが包含される。
【００２２】
用語「アルキルスルホニルオキシ」には、スルホニルオキシ基に結合しており、１個の基につき１−６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、例えばメチルスルホニルオキシおよびプロピルスルホニルオキシが包含される。
【００２３】
本発明の好ましい方法は、構造式（ＩＩ）：
【００２４】
【化８】
0003980727.tif 000003
【００２５】
〔式中、
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただし、Ｒ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；またはＲ4およびＲ5は、いっしょになって、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰから成る群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６、または７員の縮合環を形成しており；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するアミド；または、それらの光学的対掌体を使用する。
【００２６】
本発明の更に好ましい方法は、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、−ＮＲ6Ｒ7、シアノ、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＯＲ13または（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００２７】
哺乳類の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、本発明のさらに好ましい方法は、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、エチルであり；
Ｒ3は、ハロまたはシアノであり；
Ｒ4およびＲ5は、アミノまたは−ＣＨ＝ＮＯＣＨ3であり、ただし、Ｒ4およびＲ5は同じでない；
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００２８】
菌が子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）、不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅ）または担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）に属する菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3は、−ＣＨ＝ＮＯＣＨ3であり；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、アミノ、シアノまたはメチルであり；
Ｒ5は、ハロ、メチル、ニトロ、またはシアノであり、
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００２９】
菌が卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ）に属する菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいては、本発明のさらに好ましい方法は、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、エチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子、ハロ、−ＮＲ6Ｒ7、シアノ、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＯＲ13または（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり；
Ｘは、クロロであり、そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００３０】
植物の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッセイにおいては、本発明のさらに好ましい方法は、構造式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、ニトロまたはシアノであり、ただしＲ3およびＲ5の両方が水素原子ではない；
Ｒ4は、水素原子であり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００３１】
本発明の他の好ましい方法は、構造式（ＩＩＩ）：
【００３２】
【化９】
0003980727.tif 000004
【００３３】
〔式中、
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサミド（ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ）；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００３４】
本発明の更に他の好ましい方法は、構造式（ＩＶ）：
【００３５】
【化１０】
0003980727.tif 000005
【００３６】
〔式中、
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
またはＲ3およびＲ4はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００３７】
本発明の他の更に好ましい方法は、構造式（ＩＶ）：
〔式中、
Ｒ1は、メチルであり；
Ｒ2は、メチルまたはエチルであり；
Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、メチル、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9または−ＮＨＣＯＯＲ10であり、ただし、Ｒ3およびＲ4の両方が水素原子ではない；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｘは、クロロであり；そして
Ｙは、水素原子である〕を有するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００３８】
本発明の更に他の好ましい方法は、構造式（Ｖ）：
【００３９】
【化１１】
0003980727.tif 000006
【００４０】
〔式中、
Ｄは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
またはＲ3およびＲ4はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよく；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり、そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフリルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００４１】
本発明の更に他の好ましい方法は、構造式（ＶＩ）：
【００４２】
【化１２】
0003980727.tif 000007
【００４３】
〔式中、
Ｄは、ＯまたはＳであり；
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルまたは（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルであり、ただしＲ1およびＲ2の両方が水素原子ではない；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、（Ｃ2−Ｃ6）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ6）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ハロ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ6Ｒ7、−ＣＲ8＝ＮＯＲ9、−ＮＨＣＯＯＲ10、−ＣＯＮＲ11Ｒ12または−ＣＯＯＲ13であり；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
そして
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノおよび（Ｃ1−Ｃ6）アルキルスルホニルオキシから選ばれ、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフリルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。
【００４４】
Ｒ1およびＲ2が異なっているときは、Ｒ1およびＲ2を連結する不整炭素原子の存在のために、本発明の化合物の光学的対掌体が存在することが可能である。そのようなケースにおいては、両方の対掌体が本発明の範囲内である。多くの生物学的に活性な化合物は光学的対掌体を有し、それらの１方は、他方のものよりも特定のタンパク質により有効に結合することは知られている。同様に、本発明の方法に使用される化合物については、１つの対掌体が他の対掌体よりもチュービリンに対しより有効に結合する。例えば、化合物１、２および３の「Ｓ対掌体」は、相応する「Ｒ対掌体」よりもチューブリンに対してより有効に結合する。用語「Ｓ対掌体」は、Ｒ1およびＲ2が結合している炭素上の４つの基は、カーン−インゴールド−プレログシステム（Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ  ｓｙｓｔｅｍ）｛Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５，３８５−４１５（１９６６）｝の一連のシーケンスルールに従ってランクをつけたときに、炭素がＳ配置を有するとして定義されることを意味する。用語「Ｒ対掌体」は、４つの基がＲ配置を形成していることを意味する。
【００４５】
本発明の方法において造られ、また有用である、具体的な化合物には、表１−６に列挙された化合物が包含されているが、これらに限定されない。
【００４６】
【表１】
0003980727.tif 000008
0003980727.tif 000009
【００４７】
【表２】
0003980727.tif 000010
【００４８】
【表３】
0003980727.tif 000011
【００４９】
【表４】
0003980727.tif 000012
【００５０】
【表５】
0003980727.tif 000013
【００５１】
【表６】
0003980727.tif 000014
【００５２】
＊：左手原子（ｌｅｆｔ  ｈａｎｄ  ａｔｏｍ）の多くは安息香酸アミド環の４位置に結合しており、そして右手原子の多くは安息香酸アミド環の５位置に結合している。
【００５３】
次の方法および実施例において本発明の利用を更に例示する。
【００５４】
表１−６に列挙された化合物を製造するのに使用された方法
【００５５】
表１中の化合物１、６、８、９、１０、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９：
表１中の化合物１、６、８、９、１０、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９は、米国特許第４，８２２，９０２号、５−８欄および１１−１７欄に記載された合成方法によって造った。
【００５６】
表１中の化合物７および１６：
表１中の化合物および１６は、米国特許第５，２５４，５８４号、７欄および８欄（化合物１６）および１０−１４欄（化合物７）に記載された合成方法により造った。
【００５７】
表１中の化合物３、１４および２１：
化合物３、１４および２１は、米国特許第５，３０４，５７２号、４−８欄に記載された合成方法によって造った。
【００５８】
表１中の化合物５および１２：
化合物５および１２は、例えば米国特許第４，８６３，９４０号、５−７欄に記載されているような公知の合成技術を使用して、適当な安息香酸または塩化ベンゾイルから造った。化合物５および１２は、それぞれ、４−アミノ−３，５−ジクロロベンゾイルクロライドおよび４−アミノ−３，５−ジブロモベンゾイルクロライドを使用して造った。
【００５９】
表１中の化合物２：
化合物２は、経路図Ａに示されているように、塩化ベンゾイルＶＩＩ（式中Ｒ3はＣｌであり、Ｒ4はＮＨ2であり、そしてＲ5は−ＣＨ＝ＮＯＣＨ3である）と、α−アミノ−α’−クロロケトン誘導体ＶＩＩＩ（式中、Ｒ1はメチルであり、そしてＲ2はエチルである）との反応により造った：
【００６０】
経路図Ａ
【化１３】
0003980727.tif 000015
【００６１】
化合物２を造るのに使用した塩化ベンゾイルは、次の経路図Ｂに指示されているようにして造った。
【００６２】
経路図Ｂ
【化１４】
0003980727.tif 000016
【００６３】
化合物ＶＩＩＩは、アセチレン性アミン（Ｘ）を、塩化メチレン、クロロホルム、エチルエーテル、または水のような溶媒およびトリエチルアミン、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムのような塩基の存在下において、無水トリフルオロ酢酸と反応させてアセチレン性アミドＸＩを生成させることにより造った。
【００６４】
【化１５】
0003980727.tif 000017
【００６５】
アセチレン性アミド（ＸＩ）を、塩化メチレンまたはクロロホルムのような溶媒の存在下において、−７８℃〜０℃の温度において、塩素または塩素源で処理することにより中間体オキサゾリン（ＸＩＩ）を生成した。オキサゾリン（ＸＩＩ）は、塩酸または硫酸のような酸を使用する酸性条件下で、４０℃〜６０℃の温度において、メタノールまたはテトラヒドロフランのような溶媒を使用して容易に加水分解され、α−アミノ−α’，α’−ジクロロケトン（ＸＩＩＩ）を生成した。
【００６６】
【化１６】
0003980727.tif 000018
【００６７】
ＸＩＩＩの選択的接触脱ハロゲン化により、対応するα−アミノ−α’−クロロケトン誘導体ＶＩＩＩを生成した：
【００６８】
【化１７】
0003980727.tif 000019
【００６９】
（ａ）メチル  ３−メチル−４−ニトロベンゾエートの製造
還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機およびガス導入口を備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、３−メチル−４−ニトロ安息香酸の３００ｇおよびメタノールの３Ｌを入れた。その結果得られたよく撹拌された溶液に、塩化水素の２０．８ｇをバブリングして入れ、得られた混合物を３時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、一夜静置した。所期のメチル  ３−メチル−４−ニトロベンゾエートは淡黄色結晶として沈殿した。それを吸引濾過により集め、乾燥後２５９．３ｇを得た。この固体はそのまま次の工程において使用した。
【００７０】
（ｂ）メチル  ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエートの製造
還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機、添加用漏斗および窒素導入口を備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、メチル  ３−メチル−４−ニトロベンゾエートの２２０ｇ、無水四塩化炭素の２Ｌおよび過酸化ベンゾイルの４ｇを入れた。得られた溶液に、２７５ワットのＵＶ光線を照射し、還流させながら、臭素の１９８ｇを２時間かけて加えた。添加完了後、反応混合物をさらに６０時間還流した。反応混合物を室温に冷却した。生成した固体を吸引濾過により分離した。この固体（１５９．１ｇ）は、所期のメチル  ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエートと少量の出発物資から成っていた。母液を他のメチル  ３−メチル−４−ニトロベンゾエート２２０ｇおよび過酸化ベンゾイルの４ｇと共にフラスコに返し、前述の方法で臭素１９８ｇで処理した。添加完了後、反応混合物をさらに９６時間還流し、室温に冷却し、そして得られた固体を濾過により分離し、メチル  ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエートをさらに２５２ｇ得た。これらの固体をいっしょにすると、少量の出発物質のメチル  ３−メチル−４−ニトロベンゾエート、および少量のメチル  ３−ジブロモメチル−４−ニトロベンゾエートを含むメチル  ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエート、４１１．１ｇを得た。この固体はそのまま次の工程において使用した。
【００７１】
（ｃ）メチル  ３−アセトキシメチル−４−ニトロベンゾエートの製造
還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機および窒素導入口を備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル  ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエートの４１１ｇ、無水酢酸カリウムの４４１ｇおよび氷酢酸の２Ｌを入れた。得られた混合物を４時間還流し、室温に冷却しそして一夜撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られた淡黄色固体を酢酸エチルの２Ｌおよび水の１Ｌの混合液で処理した。有機相を分離し、水（３×４００ｍＬ）、ブライン（１×４００ｍＬ）で洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。粗反応混合物をヘキサンでトリチュレート（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）し、濾過して所期のメチル  ３−アセトキシメチル−４−ニトロベンゾエート３１８ｇを得た。この化合物はそのまま次の工程において使用した。
【００７２】
（ｄ）メチル  ３−ヒドロキシメチル−４−ニトロベンゾエートの製造
還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機および窒素導入口を備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル  ３−アセトキシメチル−４−ニトロベンゾエートの３１８ｇおよび無水メタノールの３．２Ｌを入れた。得られた溶液に、塩化水素の４０ｇをバブリングし、得られた混合物を３時間還流した。室温に冷却後、溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、微量のメタノールを含有する黄色固体として、メチル  ３−ヒドロキシメチル−４−ニトロベンゾエートの２７３ｇを得た。これはそのまま次の工程において使用した。
【００７３】
（ｅ）メチル  ３−ホルミル−４−ニトロベンゾエートの製造
５Ｌの４っ口丸底フラスコの中で、塩化メチレンの１．５Ｌを−７８℃に冷却した。塩化オキサリル（１６４ｇ、１．２９モル）をゆっくり加え、次いで、温度を−７０℃以下に保持しながら、塩化メチレンの１２５ｍＬ中の乾燥ジメチルスルホキシドの２０２ｇ（２．５９モル）を滴下して加えた。添加完了後、反応混合物を−７８℃において３０分間撹拌し、塩化メチレンの２５０ｍＬに溶解されたメチル  ３−ヒドロキシメチル−４−ニトロベンゾエートの２７３ｇ（１．２９モル）を滴下して加えた。反応混合物をさらに３０分間撹拌した。塩化メチレンの１２５ｍＬ中のトリエチルアミン（３９２ｇ、３．８８モル）を、温度を−６５℃以下に保持しながら滴下して加えた。反応混合物を室温にゆっくり温め、一夜撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、得られた固体を、酢酸エチルの２Ｌおよび水の１Ｌの混合液で処理した。有機相を分離し、珪藻土を通して濾過し、そして希塩酸（２×２５０ｍＬ）、水（２×２５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×２５０ｍＬ）、水（２×２００ｍＬ）、ブライン（１×２００ｍＬ）で続いて洗い、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒はロータリーエバポレーターを使用して除去した。粗反応混合物をヘキサンでトリチュレートし、濾過し、黄色固体として、所期のメチル  ３−ホルミル−４−ニトロベンゾエート２３４．１ｇを得た。この化合物はそのまま次の工程において使用した。
【００７４】
（ｆ）メチル  ３−メトキシイミノメチル−４−ニトロベンゾエートの製造
メチル  ３−ホルミル−４−ニトロベンゾエートの１９５ｇ、塩化メチレンの１Ｌおよび水の３７０ｍＬのよく撹拌された混合物に、メトキシアミン塩酸塩の７７．６ｇ、酢酸ナトリウムの７６．２ｇおよびテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム水素スルフェートの６．８ｇを続けて加えた。得られた混合物を室温において一夜撹拌し、次いでエチルエーテルの２Ｌで希釈した。有機相を分離し、そして水（１×５００ｍＬ）、２％塩酸水溶液（２×５００ｍＬ）、水（２×２５０ｍＬ）、およびブライン（１×２５０ｍＬ）で続けて洗い、次いで無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、赤みを帯びた油として、所期のメチル  ３−メトキシイミノメチル−４−ニトロベンゾエートの２１８．６ｇを得た。これは静置すると固化した。また、これはそのまま次の工程において使用した。
【００７５】
（ｇ）メチル  ４−アミノ−３−メトキシイミノメチルベンゾエートの製造
５Ｌの３っ口丸底フラスコに、５％酢酸水溶液の０．９Ｌおよび鉄の１５７ｇ（２．８モル）を入れた。得られたよく撹拌された混合液に、酢酸エチルの０．９Ｌに溶解した前に造ったメチル  ３−メトキシイミノメチル−４−ニトロベンゾエートの１６６．６ｇ（０．７モル）を加え、次いで温度を３５℃以下に保持しながら酢酸の０．９Ｌを滴下して加えた。得られた混合物を３５℃において３０分間撹拌し、そして珪藻土を通して濾過した。濾液を水の５Ｌ中に注ぎ入れた。水性層を分離し、エチルエーテル（２×５００ｍＬ）で洗った。いっしょにした有機相を、水（４×５００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×５００ｍＬ）、水（２×５００ｍＬ）、およびブライン（１×４００ｍＬ）で続けて洗った。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、所期のメチル  ４−アミノ−３−メトキシイミノメチルベンゾエート１３０ｇを得た。
【００７６】
（ｈ）メチル  ４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾエートの製造
２Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造った４−アミノ−３−メトキシイミノメチルベンゾエートの１０６ｇ（０．５１モル）およびアセトニトリルの５００ｍＬを入れた。得られた混合物を７０℃に加熱し、温度を８０℃以下に保持しながらＮ−クロロスクシンイミドの７５．２ｇ（０．５６モル）を分割して加えた。添加完了後、反応混合物を１時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去した。粗生成物を酢酸エチルの５Ｌに溶解した。有機溶液を水（３×５００ｍＬ）、次いでブレインで洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮してスラリーにし、ヘキサンでトリチュレートし、そして濾過し、黄色固体として所期のメチル  ４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾエートを得た。この反応を同じ量を使用して繰り返し、メチル  ４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾエートを全部で２１０．５ｇ得た。これはそのまま次の工程において使用した。
【００７７】
（ｉ）４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチル安息香酸の製造
５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル  ４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾエートの２１０ｇ（０．８６モル）、メタノールの１．７Ｌおよび１５％水酸化ナトリウム水溶液の４６２ｇ（１．７３モル）を入れた。得られた混合物を３時間還流し、その後、反応混合物を室温において一夜撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。粗反応混合物を水の２Ｌに溶解した。得られた水性溶液を酢酸エチルの５００ｍＬで１回洗い、氷浴中で冷却し、そして濃塩酸でｐＨ＝２の酸性にした。所期の４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチル安息香酸は淡黄色として沈殿した。これを吸引濾過により分離した。フィルターケーキをエチルエーテル：ヘキサンの１：２混合液で洗い、乾燥後、１８５．２ｇ（収率９４％）を得た。
【００７８】
（ｊ）４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾイルクロライドの製造
５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造った４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチル安息香酸の１８０ｇ、トルエンの２Ｌ、ジメチルホルムアミドの３ｍＬおよび塩化チオニルの１０４ｇ（６４ｍＬ）を入れた。得られた混合物を７０℃において２時間加熱し、熱い間に濾過し、そして溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、所期の４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾイルクロライド１７８．１ｇを得た。
【００７９】
（ｋ）３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩（化合物ＶＩＩＩ（式中、Ｒ1はメチルであり、そしてＲ2はエチルである）の製造
（ｉ）Ｎ−〔３−（３−メチル−１−ペンチニル）〕トリフルオロアセトアミドの製造〕
機械式撹拌機、窒素導入口および温度計を備えた３Ｌの４っ口丸底フラスコに、３−アミノ−３−メチル−１−ペンチン塩酸塩の２３４ｇ（１．７５モル）および塩化メチレンの１，０００ｍＬを入れた。得られたよく撹拌された混合物に、温度を３０℃以下に保持しながら、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の３５４ｇ（３．５１モル）を滴下しながらゆっくり加えた。添加完了後、反応混合物を１２０分間撹拌し、次いで塩化メチレンの５００ｍＬに溶解した無水トリフルオロ酢酸の３３４．５ｇ（１．５９モル）を、反応温度を０℃に維持するような速さで、滴下しながら加えた。添加完了後、反応混合物を室温において一夜撹拌し、そして真空下で濃縮した。得られたスラリーをエチルエーテルで洗った。エチルエーテル層を、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで続けて洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、活性チャコールで処理し、そしてセライト〔Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）〕を通して濾過した。溶媒は減圧下で除去した。得られた粗生成物を冷ペンタンで処理し、濾過し、そして乾燥し、白色固体として所期のＮ−〔３−（３−メチル−１−ペンチニル）〕トリフルオロアセトアミド、２５５．５ｇ（８３％）を得た。
【００８０】
（ｉｉ）５−クロロ−５−（ジクロロメチル）−４−エチル−４−メチル−２−トリフルオロメチルオキサゾリン塩酸塩の製造
機械式撹拌機、温度計、およびガス導入口を備えた５Ｌの４っ口丸底フラスコの中において、Ｎ−〔３−（３−メチル−１−ペンチニル）〕トリフルオロアセトアミドの２５５．５ｇ（１．３２モル）を塩化メチレンの４，０００ｍＬに溶解した。得られた混合物を−３０℃に冷却し。塩素の２３５ｇを２時間かけてバブリングさせた。添加完了後、反応混合物を−３０℃において３０分間撹拌し、そして室温に温めた。粗反応混合物をロータリーエバポレーターで蒸発させ、所期の５−クロロ−５−（ジクロロメチル）−４−エチル−４−メチル−２−トリフルオロメチルオキサゾリン塩酸塩を得た。これはそのまま次の工程において使用した。
【００８１】
（ｉｉｉ）３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩前記工程において造った５−クロロ−５−（ジクロロメチル）−４−エチル−４−メチル−２−トリフルオロメチルオキサゾリン塩酸塩を、メタノールの１８００ｍＬ、水の７２ｍＬ、および濃酸塩の１９０ｍＬに溶解し、５０℃に温め、そしてその温度において一夜撹拌した。粗反応混合物を冷却し、そして氷／水／エチルエーテル混合物の中に注ぎ入れた。これらの相を分離し、エーテル相を水で１回抽出した。このエーテルは有機物Ｉとして保存した。いっしょにした水性相をエチルエーテルで１回洗い、そしてこの有機相を有機物Ｉといっしょにした（有機物ＩＩ）。水性相を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和し、エチルエーテルで２回抽出した。いっしょにしたエーテル相を水、ブラインで洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、活性チャコールで処理し、そしてセライトを通して濾過した。得られた無色溶液に、温度を２０℃以下に維持しながら無水塩化水素をバブリングさせた。得られた白色固体を濾過し、乾燥し、白色固体として所期の３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の１２４．８ｇを得た。エチルエーテル濾液を有機物ＩＩといっしょにし、真空下で濃縮した。得られた残留物（１５０ｇ）をメタノール／水／濃塩酸の混合液中に入れ、週末の間、５０℃で加熱した。３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩５１ｇを得た。従って、得られた全量は１７５．８ｇ（収率６１％）であった。
【００８２】
（ｉｖ）３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の製造
２Ｌのパー瓶〔Ｐａｒｒ（登録商標）ｂｏｔｔｌｅ〕に、３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の４１ｇ、チャコール上の１０％パラジウムの０．８ｇ、およびエタノールの４００ｍＬを入れた。得られた混合物を、パー装置〔Ｐａｒｒ（登録商標）ａｐｐａｒａｔｕｓ〕で５０ｐｓｉにおいて３時間振とうした。粗反応混合物をセライトを通して濾過し、真空下で蒸発させ、粘稠な油を得た。それを酢酸エチルの３００−４００ｍＬ中に入れ、室温において数時間撹拌した。所期の３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩が白色固体として結晶化した。ヘキサンの３００ｍＬを得られた懸濁液に加え、濾過し、所期の３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の３４ｇ（９８％）を得た。この反応を、３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の４１ｇ；４１ｇ；および５１ｇを使用して繰り返し、全部で３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−１−ペンタノン塩酸塩１３２．１ｇ（全体の収率９０％）を得た。
【００８３】
（ｌ）４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチル−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドの製造（化合物２）
５Ｌの３っ口丸底フラスコに、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の９３ｇおよび水の８８５ｍＬを入れた。得られた溶液に、重炭酸ナトリウムの１３８．６ｇを加え、次いで酢酸エチルの５００ｍＬを加えた。得られたよく撹拌された混合物に、酢酸エチルの１０００ｍＬに溶解した４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾイルクロライドの１２３．５ｇを、室温において５０分間かけて加えた。添加完了後、反応混合物を室温において１時間撹拌した。２つの相を分離し、有機相を水（２×５００ｍＬ）、ブライン（１×１５０ｍＬ）で洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして溶剤をロータリーエバポレーターで除去し、褐色の油として粗生成物を得た。この油を、溶離用溶媒として塩化メチレンを使用して短いシリカゲルカラムを通した。溶媒を蒸発させ、オフホワイトの固体として所期の４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチル−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミド（ｍｐ１４０−１４１℃）、１３３．３ｇを得た。
【００８４】
表１中の化合物４および３０：
化合物３０は次の手順によって造った。
３−ニトロ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドを（前述の）経路図Ａのようにして３−ニトロベンゾイルクロライドとＶＩＩＩとの反応により造り、次いで触媒としてパラジウムを使用する接触水素添加により、３−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドに転化した。
【００８５】
機械式撹拌機、温度計および添加用漏斗を備えた３００ｍＬの４っ口丸底フラスコの中において、３．５ｇの３−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドをジクロロメタンの１００ｍＬ中に懸濁させた。この混合物を氷浴中において０−５℃に冷却し、次いでトリエチルアミンの１．８ｍＬを加え、そしてその混合物を数分間撹拌した。クロロギ酸メチル（１．１ｍＬ）を、温度を５℃以下に維持しながらゆっくり滴下して加え、そして混合物を２０分間撹拌した。氷浴を取り除き、反応混合物を室温に温めた。反応混合物を水の５０ｍＬで２回洗い、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製し、化合物３０を２３０ｍｇ得た。
【００８６】
化合物４は、化合物３０と同じ手順により造ったが、出発物質として４−ニトロベンゾイルクロライドを使用した。
【００８７】
表２、３、４および５中の化合物：
表２、３、４および５中の化合物は、米国特許第４，８６３，９４０号に記載された合成方法により造った。
【００８８】
表６中の化合物４０、４１、４２、４３および４４：
化合物４０、４１、４３、および４４は、前述の経路図Ａに例示されているように、相応する芳香族誘導体（ＶＩＩ）（ただし、Ｒ4およびＲ5は、いっしょになって縮合環を形成する）と、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩｛化合物ＶＩＩＩ（ただしＲ1はメチルであり、そしてＲ2はエチルである）｝との反応によって造った。
【００８９】
化合物４２を造るためには、まず最初に、６−カルボキシ−１，３−ベンゾチアゾール（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．から販売されている）を、塩化チオニルで処理して酸塩化物を造った。この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在下において３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４２を得た。
【００９０】
化合物４１の芳香族部分を造るためには、５−カルボキシベンゾオキサゾール誘導体ＸＩＶを、相応する２−アミノフェノール誘導体から、当業界における既知の手順によって、例えばＥ．Ｃ．Ｔａｙｌｏｒ編集のＴｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｖｏｌ．４７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７、Ｇ．Ｐ．Ｅｌｌｉｓによって編集された“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ”；ｐ．５０，ｐａｒｔ  Ｉ  ａｎｄ  ｐｐ．７１３−７１４，ｐａｒｔ  ＩＩに記載されている手順によって、造った。この手順を次に示す：
【００９１】
【化１８】
0003980727.tif 000020
【００９２】
次いで、ＸＩＶを、トリエチルアミンの存在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４１を得た。
【００９３】
化合物４０、４３および４４の芳香族部分を造るためには、６−カルボキシベンゾオキサゾール誘導体（ＸＶ）を、後述する手順によって、相応する２−アミノフェノール誘導体から造った：
【００９４】
【化１９】
0003980727.tif 000021
【００９５】
（式中Ｒ14は、ＨまたはＣＨ3である）
【００９６】
化合物４０を造るためには、６−カルボキシ−１，３−ベンゾオキサゾールを４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸から、オルトギ酸トリメチルで処理することにより造った。最初に、６−カルボキシ−１，３−ベンゾオキサゾールを塩化チオニルで処理して酸塩化物を造った。この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４０を得た。
【００９７】
化合物４３を造るためには、６−カルボキシ−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを、４−アミノ−５−クロロ−３−ヒドロキシ安息香酸から、オルトギ酸トリメチルで処理することにより造った。最初に、６−カルボキシ−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを塩化チオニルで処理して酸塩化物を造った。この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４３を得た。
【００９８】
化合物４４を造るためには、６−カルボキシ−２−メチル−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを、４−アミノ−５−クロロ−３−ヒドロキシ安息香酸から、オルト酢酸トリメチルで処理することにより造った。最初に、６−カルボキシ−２−メチル−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを塩化チオニルで処理して酸塩化物を得た。この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４４を得た。
【００９９】
次の実施例は、本発明の方法を例示するために提供された。
【０１００】
実施例１
卵菌類菌、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉに適用したときの、ベータ−チューブリンに共有結合する化合物３の能力をこの実施例において示した。
【０１０１】
Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ（ＡＴＣＣ１５３９９）を、１Ｌにつき２００ｍＬのＶ−８ジュース、４ｇのＣａＣＯ3、および２０ｇの寒天を含有するＶ−８寒天培地、ｐＨ７．０の上に維持した。Ｅｒｗｉｎ，Ｄ．Ｃ．およびＫａｔｚｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．，１９７１，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，ｐ．１５−２５（１９７１）に記載されているアスパラギン−スクロース培地の２０ｍＬを含有するエルレンマイヤーフラスコに、Ｖ−８寒天上で生長したＰ．ｃａｐｓｉｃｉの培養物の生長端から切り取った菌糸体プラグ（ｍｙｃｅｌｉａｌ  ｐｌｕｇ）（直径７ｍｍ）を接種した。このフラスコを、２６℃においてジャイロタリーシェーカー（ｇｙｒｏｔａｒｙ  ｓｈａｋｅｒ）上で１２０ｒｐｍにおいて振とうしながら７２時間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、次いで０．８ｍＭの14Ｃ−ラベルされた（ｌａｂｅｌｅｄ）化合物３の５０μＬを加えた。１時間更にインキュベーションした後、菌糸体を濾過により集め、水１００ｍＬで洗った。菌糸体を液体窒素で凍結し、微粉末に粉砕した。タンパク質を、非共有結合のリガンドの解離を生じると考えられる変性条件（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下（３％ドデシル硫酸ナトリウム、５％メルカプトエタノールおよび１０％グリセロールを含有する６２ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中において、１００℃で５分間加熱）で抽出した。抽出したタンパク質のアリコート（ａｌｌｉｑｕｏｔｓ）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），ｖｏｌ．２７７，ｐｐ．６８０−６８５，１９７０にしたがって、２つ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の７．５％ポリアクリルアミドゲルにタンパク質を分離した。１つのゲルはコオマスイ  ブリリアント  ブルー  Ｒ２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ２５０）でタンパク質を染色した。第２のゲルからのタンパク質は、電気泳動でニトロセルロース膜に移した。この膜に、ＥＮ3ＨＡＮＣＥ（登録商標）スプレー（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を噴霧し、ラジオラベルしたタンパク質の場所を、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムを使用して、３週間露光で、オートラジオグラフィー（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。ニトロセルロース上のベータ−チューブリンの場所は、ベータ−チューブリンに対するモノクローナル抗体でイムノラベリング（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）することにより測定した。それらの結果を図１に示した。点線は、コオマスイで着色したゲルの濃度分布（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｎ）を表し、タンパク質の分布を示している。連続線は、オートラジオグラフィーでの濃度分布を表し、単一の14Ｃ−ラベルバンドを示している。イムノラベリングにより測定したようなベータ−チューブリンの場所は、矢印によって示され、そして14Ｃ−ラベルされたタンパク質バンドと一致した。
【０１０２】
実施例２
懸濁培養したタバコ細胞に適用したときのベータ−チューブリンに共有結合する化合物１の能力をこの実施例において示した。
【０１０３】
懸濁培養したタバコ細胞を、Ｎａｇａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．１６１−１６５（１９８１）により調製した生長培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）の中で、２７℃において２００ｒｐｍのジヤイロタリーシェーカー上で生長させた。細胞を、１０μＭの濃度において14Ｃでラベルされた化合物１で１時間処理し、次いで濾過により集めた。これらの細胞を液体窒素で凍結し、微粉末に粉砕し、次いで実施例１に記載されているように、タンパク質を抽出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つのゲルに分離した。実施例１に記載されているように、１つのゲルではタンパク質を染色し、そして第２のゲルは、オートラジオグラフィーおよびイムノラベリングにより分析した。それらの結果を図２に示した。点線は、コオマスイで染色したゲルの濃度分布を表し、タンパク質の分布を示している。連続線は、オートラジオグラフィーによる濃度分布を表し、単一の14Ｃラベルバンドを示している。イムノラベリングにより測定したベータ−チューブリンの場所は矢印によって指示され、そして14Ｃでラベルされたタンパク質のバンドと一致していた。
【０１０４】
実施例３
単離したウシ（ｂｏｖｉｎｅ）のチューブリンのベータ−サブユニットに共有結合する化合物１の能力をこの実施例において示した。
【０１０５】
チューブリンを、ウシの脳から、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌ．１３４，ｐｐ．８９−１０４（１９８６）中のＶａｌｌｅｅ，Ｒ．Ｂ．によって記載されている方法によって単離した。１ｍＭのＭｇＣｌ2を含有するｐＨ６．６の、１．０Ｍグルタミン酸ナトリウム中のチューブリン（１０μＭ）を、３７℃において、２５μＭの14Ｃ−ラベルされた化合物１で４時間インキュベートした。試料を氷浴に３分間移し、２０％トリクロロ酢酸を添加してチューブリンを沈殿させ、氷上で更に２０分間インキュベートした。１２，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した後、チューブリンペレットを８０％の氷冷アセトンで１回洗い、そして室温において３％ドデシル硫酸ナトリウム、５％メルカプトエタノールおよび１０％グリセロールを含有する、ｐＨ６．８の６２ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。試料を１００℃において２分間加熱し、次いで、実施例１に記載したように、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、２つのゲルに分離した。実施例１に記載したように、１つのゲルではタンパク質を染色し、そして第２のゲルはオートラジオグラフィーおよびイムノラベリングにより分析した。イムノラベリングは、ベータ−チューブリンおよびアルファ−チューブリンの両方に対するモノクローナル抗体を使用して行った。それらの結果を図３に示した。イムノラベリングにより測定されたアルファ−チューブリンおよびベータ−チューブリンの場所は、矢印によって示されている。点線は、コオマスイで染色したゲルの濃度分布を表し、タンパク質の分布を示しており、アルファ−チューブリンおよびベータ−チューブリンに対応する２つの主なタンパク質バンドを有している。連続線は、オートラジオグラフィーでの濃度分布を表し、主にベータ−チューブリンサブユニットのラベリングを示している。
【０１０６】
実施例４
タバコを懸濁培養した細胞中のチューブリンへの化合物１の結合に対する異なった種類の化学薬剤である種々の抗チューブリン化合物の効果をこの実施例に示した。
【０１０７】
実施例２に記載したように生長させた懸濁培養したタバコの細胞のアリコート（２ｍＬ）を２５ｍＬ容量のガラス製バイアル（ｖｉａｌｓ）に加えた。次いで、各バイアルに、ＤＭＳＯ（対照）の５μＬまたはＤＭＳＯに溶解した抗チューブリン化合物の５μＬを入れた。これらバイアルを、２７℃において振とうしながら２時間インキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かしたトリチウム−ラベルされた化合物１の１００μＭ溶液の５μＬを加えた。バイアルを２７℃において振とうしながら２０分間インキュベートし、次いで、ラジオリガンド（ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ）の結合をラベルをしていない４０ｍＭの化合物１の５μＬを加えることによって停止した。試料を２７℃において振とうしながら更に２０分間インキュベートし、次いで氷浴中の１５ｍＬ容量のポリプロピレン遠心分離用管に移した。各バイアルを（実施例２に記載した）２ｍＬの氷冷生長培地ですすぎ、次いですすいだ溶液を試料の残部に加えた。４℃において３分間２，５００ｒｐｍにおいて遠心分離後、上澄み液を捨て、そしてペレットになった細胞を氷冷した１０％トリクロロ酢酸の４ｍＬ中に再懸濁した。試料を氷浴中で１時間保持し、再び遠心分離し、そして細胞を氷冷エタノールの４ｍＬ中に再懸濁した。氷浴中で更に１時間インキュベートした後、細胞を濾過によりガラス繊維フィルター上に集め、氷冷エタノールの１０ｍＬで２回洗った。洗った細胞を有するフィルターをシンチレーションバイアルに移し、ハイドロフルオー〔Ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒ（登録商標）〕シンチレーション流体（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）の１０ｍＬを各バイアルに加え、そして試料をシンチレーションカウンターでカウントし、結合した放射能の量を測定した。ラジオリガンドの結合に対する異なった抗チューブリン化合物の効果を表７に示した。各抗チューブリン化合物の存在下における結合したラジオリガンドの量は、ＤＭＳＯ対照における結合したラジオリガンドの量に対する百分率として表した。パクリタクセルおよび抗チューブリン除草剤プロナミドおよびクロルプロファムは、ラジオリガンドの結合を減少させたが、抗チューブリン除草剤トリフルラリンはラジオリガンドの結合を増加させた。
【０１０８】
【表７】
0003980727.tif 000022
【０１０９】
実施例５
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ中のチューブリンへの化合物１の結合に対するパクリタクセルの効果をこの実施例において示した。
【０１１０】
アスパラギン−スクロース培地中のＰ．ｃａｐｓｉｃｉの液体菌糸体振とう培養物を使用して、バインディングアッセイ用の菌物質の均質懸濁液を造った。アスパラギン−スクロース培地（１００ｍＬ）に、Ｖ−８寒天培地上で生長した培養物から切り取った菌糸体プラグを接種し、２６℃において、ジャイロタリーシェーカー上で４８時間インキュベートした。培養物をブレンダー（ｂｌｅｎｄｅｒ）中において均質化し、均質物の３０ｍＬを新しい培地の１００ｍＬの中で二次培養し、次いで２６℃において、ジャイロタリーシェーカー上で１７時間インキュベートした。得られた菌糸体を遠心分離により培地から回収し、新しい、培地の１１７０ｍＬ中に再懸濁した。この懸濁液のアリコート（２ｍＬ）を２５ｍＬ容量のガラス製バイアルに入れた。それぞれのバイアルにＤＭＳＯ（対照）の５μＬまたはＤＭＳＯに溶解したパクリタクセルの５μＬを入れた。これらバイアルを、２６℃において振とうしながら１時間インキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かしたトリチウム−ラベルされた化合物１の１００μＭ溶液の５μＬを加えた。これらバイアルを、２６℃において振とうしながら２０分間インキュベートし、次いで、ラジオリガンドの結合をラベルしていない４０ｍＭの化合物１の５μＬを加えることによって停止した。試料を２７℃において振とうしながら更に２０分間インキュベートし、次いで氷浴中の１５ｍＬ容量の遠心分離用管に移した。各バイアルを２ｍＬの氷冷培地ですすぎ、次いでそれを試料の残部に加えた。４℃において５分間３，４００ｒｐｍにおいて遠心分離後、上澄み液を捨て、そしてペレットになった細胞を氷冷の１０％トリクロロ酢酸の４ｍＬ中に再懸濁した。試料を氷浴中で１時間保持し、再び遠心分離し、そして細胞を氷冷エタノールの４ｍＬ中に再懸濁した。氷浴中で更に２時間インキュベートした後、細胞を濾過によりガラス繊維フィルター上に集め、氷冷エタノールで２回洗った。洗った細胞を有するフィルターをシンチレーションバイアルに移し、ハイドロフルオーシンチレーション流体の１０ｍＬを加え、そして試料をシンチレーションカウンチーでカウントし、結合した放射能の量を測定した。ラジオリガンドの結合に対する種々の濃度におけるパクリタクセルの効果を表８に示した。パクリタクセルの存在下における結合したラジオリガンドの量は、ＤＭＳＯ対照中における結合したラジオリガンドの量に対する百分率として表した。
【０１１１】
【表８】
0003980727.tif 000023
【０１１２】
実施例６
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ中のチューブリンに対する化合物１の結合によるザリルアミド（ｚａｉｌａｍｉｄｅ）および表１に記載された化合物７、８、１６、１９、２３および２７の効果をこの実施例において示した。
【０１１３】
Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉの遊走子（ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ）を次のように造った。Ｖ−８寒天培地の１５ｍＬを含有する直径９ｃｍのペトリ皿に、Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉの菌糸体プラグを接種し、暗所において２５℃で４日間インキュベートし、次いで連続蛍光線灯（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌｉｇｈｔ）下に３日間放置して胞子形成を誘発した。遊走子リリース（ｚｏｏｓｐｏｒｅｒｅｌｅａｓｅ）を誘発するために、滅菌した水１５ｍＬを各皿に加えた。これらの皿を室温において１０分間インキュベートし、次いで４℃において２０分間インキュベートし、最後に室温に１５分間もどした。次いで、遊走子含有流体を各皿から除き、１ｍＬにつき５×１０5遊走子の密度に調節した。発芽した遊走子シスト（ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ  ｓｙｓｔｓ）を含有するアッセイ用管を、１６×１．２５ｃｍのポリプロピレン管中のアスパラギン−スクロース培地の４００μＬに遊走子懸濁液の１００μＬを加えることにより造り、次いでゆるくふたをし、そして１２０ｒｐｍのジャイロタリーシェーカー上で２６℃において２４時間インキュベートした。
【０１１４】
次いで、発芽した遊走子シストを含有する管に、ＤＭＳＯ（対照）の２．５μＬまたはＤＭＳＯに溶解した試験化合物の２．５μＬを入れた。各化合物を一連の濃度において試験した。これら管を２６℃において振とうしながら１時間インキュベートし、次いでＤＭＳＯ中のトリチウム−ラベルされた化合物１の４０μＭ溶液の２．５μＬを加えた。バイアルを２６℃において振とうしながら２０分間インキュベートし、次いで、ラジオリガンドの結合を氷冷したラベルしていない１３３μＭの化合物１の１．５ｍＬを加えることによって停止し、そして管を氷浴に移した。３，４００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離後、上澄み液を捨て、そしてペレットになった細胞を氷冷の１０％トリクロロ酢酸の２ｍＬ中に再懸濁した。試料を氷浴中で１時間保持し、再び遠心分離し、そして細胞を氷冷エタノールの２ｍＬ中に再懸濁した。氷浴中で更に１時間インキュベートした後、氷冷エタノールをさらに４ｍＬ、それぞれの管に加え、そして細胞を濾過によりＢｒａｎｄｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）中のガラス繊維フィルター上に集め、氷冷エタノールの４ｍＬで２回洗った。洗った細胞を有するフィルターをシンチレーションバイアルに移し、そして水の０．１ｍＬを加え、次いで１ｍＬのプロトソル〔Ｐｒｏｔｏｓｏｌ（登録商標）〕（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加えた。バイアルを６０℃において３０分間インキュベートし、そして室温に冷却した。エコノフルオー〔Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ（登録商標）〕シンチレーション流体（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の１０ｍＬを加え、試料をシンチレーションカウンターでカウントし、結合した放射能の量を測定した。各試験化合物のためのＩＣ５０値（試験化合物を含まない対照に比較してラジオリガンドの結合を５０％阻害するのに要する濃度として定義した）は、用量−応答曲線（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅ）から決定し、表９に示した。
【０１１５】
【表９】
0003980727.tif 000024
【０１１６】
実施例７
本実施例は、単離したウシ（ｂｏｖｉｎｅ）のチューブリンにおける抗チューブリン化合物の効果を検出するためのプローブとしての化合物１の利用について示す。
【０１１７】
アッセイ混合物は、０．５ｍＬのポリプロピレン管の中に、１．０Ｍのグルタミン酸ナトリウム中の１０μＭの単離したチューブリンを含有し、ｐＨ６．６であり、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２５μＬのＤＭＳＯ（対照）またはＤＭＳＯに溶解した試験化合物の２．５μＬを含有していた。この混合物を３７℃において３０分間インキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かしたトリチウム−ラベルされた化合物１の６４０μＭ溶液の２．５μＬを加えた。３７℃において１２０分間更にインキュベートした後、アッセイ混合物のアリコート（８０μＬ）を、直径２．３ｃｍのワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭ濾紙ディスク（ｄｉｓｋｓ）に適用し、暖かい空気下で１５秒間乾燥し、氷冷した１０％トリクロロ酢酸の３ｍＬに浸漬し、そして４℃において一夜放置した。これらディスクを５％トリクロロ酢酸中に３０分間移し、５％トリクロロ酢酸で更に２回洗い、３７℃において、エタノール／エーテル（１：１、ｖ／ｖ）で３０分間洗い、次いで室温において、エタノール／エーテル（１：１、ｖ／ｖ）で１５分間洗い、最後に、室温において、エーテル中でそれぞれ１５分間２回続けて洗った。ディスクを乾燥し、ハイドロフルオーの１０ｍＬを含有するシンチレーションバイアルに移し、そしてシンチレーションカウンターでカウントした。ラジオリガンドの結合に対する１００μＭの最終濃度における抗チューブリン化合物の効果を表１０に示した。各抗チューブリン化合物の存在下における結合したラジオリガンドの量は、ＤＭＳＯ対照において結合したラジオリガンドの量に対する百分率として表した。
【０１１８】
【表１０】
0003980727.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉを14Ｃラベルされた化合物３で処理した後の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによるラジオラベルされたタンパク質の分析を示している。
【図２】図２は、懸濁培養したタバコ細胞を14Ｃラベルされた化合物１で処理した後の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによるラジオラベルされたタンパク質の分析を示している。
【図３】図３は、単離したウシのチューブリンを14Ｃラベルされた化合物１で処理した後の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによるラジオラベルされたタンパク質の分析を示している。
【図１】
0003980727.tif 000032
【図２】
0003980727.tif 000033
【図３】
0003980727.tif 000034