(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質に補酵素を混合する混合器と、
その中空部に、酵素が担体に結合されてなる固定化酵素が充填されていて、該固定化酵素充填層に上記基質を通すことにより酵素反応を利用して上記基質から標識化合物を含む粗生成物を合成する流通式の固定化酵素カラムと、
上記固定化酵素カラムによって合成された上記粗生成物を精製して標識化合物を含む最終生成物を生成する高速液体クロマトグラフィと、
上記高速液体クロマトグラフィで生成された標識化合物を含む上記最終生成物を注射薬として適するように限外濾過して酵素、発熱物質及び細菌を除去する、予め電子線照射による滅菌処理が施されている限外濾過膜とを備えていることを特徴とする固定化酵素を用いた標識薬剤自動合成装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、放射性同位元素で標識した化合物を利用し体外より放射線を計測することにより診断を行うポジトロン断層撮影法などで使用される標識化合物を合成する標識薬剤合成装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、何らかの化合物の生体内での挙動を観測する場合、該化合物を構成する一部の元素をその放射性同位元素で置き換えることにより標識した標識化合物ないしは標識薬剤を用いて、該標識化合物から放射される放射線を生体外から計測することにより該化合物の生体内での挙動を観測するといった手法が広く用いられる。そして、かかる標識化合物を合成する標識薬剤合成装置としては、従来より、主として化学合成による装置が多く用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アミノ酸等では、Ｌ体（左旋性）のみ生理活性を有することが多く、このため合成上特別な工夫が必要であったり、最終的に光学分離等を行わなければならないなどといった問題があるので、従来の標識薬剤合成装置では、該装置への負担が大きく、安定した性能を備えるのは困難である。とくに、短寿命核種による標識化合物では、短時間内に合成を行う必要があるが、従来の標識薬剤合成装置ではかかる合成を短時間で行うことは極めて困難である。
【０００４】
また、遊離酵素を用いた標識薬剤合成装置も提案されている。しかしながら、かかる従来の標識薬剤合成装置では、酵素自体の取り扱いが煩雑であり、また最終生成物への酵素の混入があるため該酵素の分離が必要となるが、該酵素は容易には分離できないといった問題がある。さらには、滅菌、発熱物質、パイロジェン等の除去が必要であるといった問題がある。
【０００５】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされたものであって、標識化合物を短時間で合成することができ、かつ最終生成物への異物の混入を防止することができる簡素で高性能な標識薬剤合成装置を提供することを解決すべき課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべくなされた本発明にかかる標識薬剤自動合成装置は、固定化酵素カラムを用いることにより、従来の化学合成による装置ないしは方法では標識が困難であった化合物に対して、緩和な条件の下で迅速かつ選択的に標識を行うことを可能にするものである。また、本発明にかかる標識薬剤自動合成装置は、従来の遊離酵素を用いる合成装置ないしは合成方法に比較して、簡便かつ効率的な合成手法を実現するとともに、安全性の高い放射性標識薬剤を生産することを可能にするものである。
【０００７】
本発明にかかる標識薬剤自動合成装置は、その基本的な構成においては、目的物を得るために選定した酵素を固定したカラム（固定化酵素カラム）と、目的物を含む粗生成物から目的成分を分離して最終生成物とするための精製部と、最終生成物から酵素、細菌、パイロジェン等の異物を除去するための限外濾過膜とからなる。
【０００８】
具体的には、本発明にかかる標識薬剤自動合成装置は、基質に補酵素を混合する混合器と、その中空部に、酵素が担体に結合されてなる固定化酵素が充填されていて、該固定化酵素充填層に上記基質を含む原料を通すことにより酵素反応を利用して上記基質から標識化合物を含む粗生成物を合成する流通式の固定化酵素カラムと、固定化酵素カラムによって合成された上記粗生成物を精製して標識化合物を含む最終生成物を生成する高速液体クロマトグラフィと、高速液体クロマトグラフィで生成された標識化合物を含む最終生成物を注射薬として適するように限外濾過して異物（酵素、発熱物質、細菌、パイロジェン等）を除去する、予め電子線照射による滅菌処理が施されている限外濾過膜とを備えていることを特徴とするものである。
【００１１】
かくして、本発明にかかる標識薬剤自動合成装置によれば、次のような作用が得られる。
（１）酵素を固定化してカラム形状にしたことで、従来は取り扱いの難しかった酵素の簡便な取り扱いを実現するとともに、合成時間の短縮や合成収量の向上を図ることができる。
【００１２】
（２）限外濾過膜によって生成物を処理することにより、該生成物に混入している酵素、発熱物質、パイロジェン、細菌等を除去することができ、合成された標識化合物を投与するための注射液として使用することができる。なお、この場合においても、合成段階で固定化酵素カラムを使用することによって酵素のリークが殆どなくなるので、濾過速度の低下を招くことなく迅速に異物の分離操作を実行することができるといった利点がある。
【００１３】
（３）最終生成物を処理する限外濾過膜の滅菌のために、従来から多用されている蒸気滅菌あるいはＥＯＧ滅菌を施すと濾過速度が遅くなるといった問題が生じるが、本発明によれば、電子線滅菌またはガンマー線滅菌を利用することにより、濾過速度に悪影響を与えることなく滅菌を施すことができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を具体的に説明する。本発明を同位元素として“Cポジトロン核種”を用いた場合について説明するが、同位元素が13Cまたは14Cである場合にも、本発明が適用できることは明らかである。
図１は、基質である[C-11]アラニンから目的物である[3-11C]ピルビン酸を合成するための、本発明にかかる標識薬剤合成装置のシステム構成図である。
図１に示すように、本発明にかかる標識薬剤合成装置Ａは、基本的には、基質（[C-11]アラニン）及び補酵素等を後記の合成部に供給する原料供給部と、該原料供給部から供給される基質から目的物（[3-11C］ピルビン酸）を合成する合成部と、該合成部で製造された目的物を含む粗生成物を精製して最終生成物とする精製部と、該精製部で精製された最終生成物から酵素、細菌、発熱物質、パイロジェン等の異物を限外濾過により除去する濾過部とで構成されている。
【００１５】
そして、標識薬剤合成装置Ａの原料供給部には、[C-11]アラニンを所定の緩衝液に溶解させる混合器１と、[C-11]アラニンが緩衝液に溶解されてなる混合液を混合器１から受け入れる第１容器２と、該第１容器２に所定の補酵素を供給する第１バイアル３（薬瓶）と、第１容器２内の混合液を後記の固定化酵素カラム５に送液するペリスターポンプ４とが設けられている。なお、第１容器２から固定化酵素カラム５に供給される混合液（原料）の性状、流量等は、第１フォトセンサ６によって監視されるようになっている。
【００１６】
標識薬剤合成装置Ａの合成部には、その中空部に所定の固定化酵素が充填されていて、該固定化酵素充填層に上記混合液（原料）を通すことにより、[C-11]アラニン（基質）から[3-11C]ピルビン酸（目的物）を合成する流通式の固定化酵素カラム５と、該固定化酵素カラム５で製造された[3-11C]ピルビン酸を含む粗生成物を貯留する第２容器７とが設けられている。なお、第２容器７から後記のＨＰＬＣ８（高速液体クロマトグラフィ）に送液される粗生成物の性状、流量等は、第２フォトセンサ９によって監視されるようになっている。また、この合成部には、溶出液を貯留する第２バイアル１０が付設されている。ここで、固定化酵素カラム５に、１種類または２種類以上の固定化酵素が充填されている。
なお、混合器１、第１バイアル３及び固定化酵素カラム５は、酵素の種類等に応じて適温（例えば、４５°Ｃ）に維持された恒温槽Ｃ内に配置されている。
【００１７】
標識薬剤合成装置Ａの精製部には、第２容器７内に貯留された粗生成物から目的成分を分離（精製）して最終生成物（[3-11C]ピルビン酸等）を得るＨＰＬＣ８が設けられている。
また、標識薬剤合成装置Ａの濾過部には、ＨＰＬＣ８によって精製された目的成分を含む最終生成物を貯留する第３容器１１と、該第３容器１１内の最終生成物に限外濾過を施す限外濾過膜１２と、該限外濾過膜１２によって濾過され、酵素、細菌、発熱物質、パイロジェン等の異物が除去された、注射薬として適する最終生成物を貯留する第３バイアル１３とが設けられている。ここで、限外濾過膜１２は、予め、電子線照射またはガンマー線照射による滅菌処理が施されている。
【００１８】
なお、この標識薬剤合成装置Ａの管路には、種々のバルブＶ1〜Ｖ9が介設されている。これらのバルブのうち、Ｖ1、Ｖ2、Ｖ4及びＶ7は、これらが介設された管路を開閉する開閉バルブであり、Ｖ3、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ8及びＶ9は、これらが介設された管路の接続形態を切り替える三方バルブである。
【００１９】
以下、この標識薬剤合成装置Ａを用いて、［C-11］アラニンから、固定化酵素カラム５を通すことにより［3-11C］ピルビン酸を合成（製造）する具体的な方法を説明する。
この［3-11C］ピルビン酸の製造においては、まず通常用いられる合成法により、自動合成装置を使用してD,L-[3-11C]アラニンを合成する。このように合成されたD,L-[3-11C]アラニンは、１〜２mlの緩衝液（０.１ＭTris／HCl：pH８.５）に溶解した状態で第１容器２に回収される。回収されると同時に、これに、予め第１バイアル３中に入っていた、補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）とピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）とを加えて、最終濃度がTris/HCl(pH８.５)０.１Ｍ、ＦＡＤ１７μＭ、ＰＬＰ０.１ｍＭとなるように混合する。
【００２０】
この混合液を、ペリスターポンプ４を用いて流速５ml／minで、４５℃に保温された固定化酵素カラム５に送液し、次いで０.０１ｍＭのＰＬＰを含む０.１ＭのTris／HCl緩衝液を送液する。なお、ペリスターポンプ４の代わりにガス圧を用いて混合液を送液するようにしてもよい。
固定化酵素カラム５を通過した液、すなわち目的物である[3-11C]ピルビン酸を含む粗生成物を第２容器７に回収する。なお、本願発明者による分析結果によれば、このような合成手法においては、D,L-[3-11C]アラニンは完全に消費されて[3-11C]ピルビン酸に転換されていた。
この後、粗生成物をＨＰＬＣ８を用いて精製して最終生成物とし、この目的成分を含む最終生成物を第３容器１１に分取する。そして、この分取した最終生成物を限外濾過膜１２を通して濾過し、酵素、細菌、発熱物質、パイロジェン等の異物が除去された、注射液として使用しうる最終生成物を第３バイアル１３に回収する。
【００２１】
以下、固定化酵素カラム５の調製を具体的に説明する。本発明にかかる固定化酵素カラム５は、次の（１）〜（３）に示すような手順で調製される。
（１）固定化アラニンラセマーゼの調製
０.２ｇのアミノプロピル-ＣＰＧ（ポアサイズ１４００オングストローム  フナコシ（株）販売）に２.５％グルタルアルデヒド水溶液１０mlを添加し、１時間室温で反応させた後、充分に水洗いをする。これに対して、１０mgのアラニンラセマーゼを含む０.１Ｍリン酸緩衝液（pH７.５）を１０ml加え、４℃で一晩撹拌しながら反応させる。この後、未反応のアラニンラセマーゼを除去し、固定化アラニンラセマーゼを作成する。
【００２２】
（２）固定化のＤ-アミノ酸オキシダーゼ調製
０.２ｇのアミノプロピル-ＣＰＧ（ポアサイズ１４００オングストローム  フナコシ(株)販売）に２.５％グルタルアルデヒド水溶液を１０ml添加し、１時間室温で反応させた後、充分に水洗いする。これに対して、１０mgのＤ-アミノ酸オキシダーゼを含む０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）を１０ml加え、４℃で一晩撹拌しながら反応させる。この後、未反応のＤ-アミノ酸オキシダーゼを除去し、固定化Ｄ-アミノ酸オキシダーゼを作成する。
【００２３】
（３）固定化酵素カラムの調製
内径４mm、長さ６０mm（内容積：７２０μｌ）のカラム（中空部を有する円柱体）に、上記のステップ（１）で調製した固定化アラニンラセマーゼと、上記のステップ（２）で調製した固定化のＤ-アミノ酸オキシダーゼとを１：１の量比に混合したものを充填し、ピルビン酸合成用反応カラムとする。
かくして、固定化酵素カラム５が完成する。
【００２４】
以下、限外濾過膜１２による、リーク酵素、パイロジェン等の除去機能を具体的に説明する。
一般に、酵素合成法では、最終的には、最終生成物に含まれている酵素を分離する必要がある。そして、固定化酵素カラムを使用しない酵素合成法、例えば従来の遊離酵素合成法では、除去すべき酵素の量が多く限外濾過膜に対する負担が大きくなり、濾液の流速ないしは濾過速度の著しい低下が問題となる。しかしながら、本発明にかかる固定化酵素カラム５を用いた合成方法では、基本的には酵素自体が担体に結合しているため、リークする酵素の量は極少量である。このため、限外濾過膜１２に対する負担が小さくなり、目詰まり等により濾過の流速ないしは濾過速度の低下は殆どなく、迅速に酵素、パイロジェン、細菌等を同時に除去することができる。
【００２５】
また、従来より用いられている限外濾過膜（カートリッジ）は滅菌されたものが無く、このため滅菌を必要とする場合は、一般に限外濾過膜に蒸気滅菌やＥＯＧ滅菌を施すようにしている。しかしながら、限外濾過膜に蒸気滅菌あるいはＥＯＧ滅菌を施すと、限外濾過膜の特性が変化してしまい、濾過速度の低下などを招き、使用することが困難となる。そこで、本願発明者は限外濾過膜１２に対して種々の滅菌方法を試み、電子線またはガンマー線による滅菌を施した場合は、限外濾過膜１２の濾過速度の低下などといった不具合が生じないことを見いだした。そこで、本発明にかかる標識薬剤合成装置Ａでは、限外濾過膜１２に対して予め電子線またはガンマー線による滅菌を施し、濾過速度を損なうことなく限外濾過を行うことができるようにしている。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、次のような効果が得られる。
（１）標識化合物の合成装置にカラム状に充填した固定化酵素を利用することによって、簡便にかつ短時間で複雑な化合物を合成することが可能となった。したがって、本発明にかかる標識薬剤自動合成装置により、従来は困難であった生理活性物質などの短寿命核種による標識化合物を適切な酵素の選択により比較的容易に得ることができる。また、使用した酵素のリークを最小限に押さえることが可能である。
【００２７】
（２）２種類以上の固定化酵素を混合し１つのカラムに充填することにより、１段階で最終反応生成物を得ることができ、このため標識薬剤合成装置を単純化することができるため、合成時間の短縮が可能となり、短寿命核種の場合には多くの収量を得ることができる。
【００２８】
（３）最終生成物は、滅菌した限外濾過膜を通過させることにより、これまでは困難であったリーク酵素を除くとともに、発熱物質・細菌の除去を同時に実現することができ、注射薬剤として使用することができる品質のものが得られる。この場合、限外濾過膜の滅菌方法として電子線滅菌または放射線滅菌を行ったものでは、濾過特性の変化が少なく限外濾過膜を有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施の形態を示す固定化酵素カラムを用いた標識薬剤合成装置のシステム構成図である。
【符号の説明】
Ａ…標識薬剤合成装置、Ｃ…恒温槽、１…混合器、２…第１容器、３…第１バイアル、４…ペリスターポンプ、５…固定化酵素カラム、６…第１フォトセンサ、７…第２容器、８…ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、９…第２フォトセンサ、１０…第２バイアル、１１…第３容器、１２…限外濾過膜、１３…第３バイアル、Ｖ1〜Ｖ9…バルブ。
【図１】
0004022585.tif 000002