(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を加水分解してアミノ酸を製造する方法において、加水分解を３００℃〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧の圧力下、１〜４０秒の反応時間で行うことを特徴とする蛋白質からのアミノ酸の製造方法。
【請求項２】
蛋白質が食用蛋白質である請求項１記載の蛋白質からのアミノ酸の製造方法。
【請求項３】
蛋白質がトウモロコシ由来の蛋白質である請求項１又は２記載の蛋白質からのアミノ酸の製造方法。
【請求項４】
蛋白質を加水分解してペプチドを製造する方法において、加水分解を３５０℃〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧の圧力下、４〜３０分の反応時間で行うことを特徴とする蛋白質からのペプチドの製造方法。
【請求項５】
蛋白質が食用蛋白質である請求項４記載の蛋白質からのペプチドの製造方法。
【請求項６】
蛋白質がトウモロコシ由来の蛋白質である請求項４又は５記載の蛋白質からのペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質からのアミノ酸又はペプチドの製造方法に関するものであって、特に、蛋白質の分解を超臨界状態又は亜臨界状態の水で行うことにより、従来のような酸や酵素等の除去処理が不必要である蛋白質からのアミノ酸又はペプチドの製造方法及びこの蛋白質分解物を含有する食品、飼料、微生物培地並びに医薬に関する。
【０００２】
【従来技術】
蛋白質からアミノ酸を製造する方法としては、蛋白質を酸触媒又は酵素を利用することにより加水分解する方法が知られている。
【０００３】
また、酸触媒等を使用しない方法としては、蛋白質を、温度５０〜３５０℃及び圧力２５０〜５０００ｋｇ／ｃｍ2下に５〜６０分間保持することを特徴とする蛋白質低分子化物の製造法が、最近、報告されている（特公平８ー１７６８２号公報）。
【０００４】
ところで、物質には固体、液体、気体の３つの状態があることはよく知られているところであるが、液体は、ある特定の圧力と温度を越えると、気体であるのか、液体であるのか区別することが難しい状態になり、種々の物質を溶解する点では液体的な挙動を、圧縮膨張の点では圧力によりその密度を任意に変えることができる等気体的な挙動を示す。
【０００５】
超臨界水とは、水の臨界条件、すなわち、臨界温度３７４℃及び臨界圧力２２１気圧を越えた状態の水を意味する。この状態下では、これ以上いくら圧力を加えても液化することは不可能となる。物性上では、この状態の水、超臨界水は、気体や液体と呼べず、両者の中間の性質を有している。当然、気液の境はなくなり、超臨界水として単一相で存在する。
【０００６】
超臨界水は、温度、圧力に依存して密度、粘度、誘電率、イオン積、及び拡散係数等の値が連続的に変化する。反応溶媒として重要な指標である溶解度は密度の増大とともに大きくなることが知られているが、溶解性に係わるもう１つの重要な要素は誘電率である。誘電率は密度の増大とともに大きくなり、温度の上昇につれて減少する。温度が充分に高ければ誘電率は非常に小さくなり、水はイオン間の静電気力を覆うことが殆どできなくなる。この条件下では、溶解しているイオン種の多くはイオン対として存在することとなる。したがって、超臨界水はこの場合、極性物質というよりも非極性物質として振舞うのである。
【０００７】
このような状態にある流体は、液体や気体の通常の性質と異なることから、超臨界流体と称され、従来、超臨界液体クロマトグラフィ−等に利用されてきた。また、超臨界水によるフロン、ＰＣＢの加水分解なども研究されている。最近では、超臨界水によるバイオマスの分解反応についても研究され、超臨界水中でのリグニン系試料の低分子化、セルロ−スからのグルコ−スの生成等が報告されている（特開平５−３１０００）。この報告は、超臨界水が高分子化合物の分解に用いられることは示唆していると言えるかもしれないが、超臨界水を用いる反応は、高温、高圧というフロンやＰＣＢ等も分解されるという厳しい反応条件下に実施されるため、これを蛋白質の分解に利用した場合、反応が進みすぎてアミノ酸も分解されてしまう恐れが極めて大きい。
【０００８】
したがって、蛋白質を超臨界水により加水分解することによりアミノ酸等を製造した報告はない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従来のアミノ酸等の製造方法では、酸を用いる場合、中和するためのアルカリ処理が必要であったり、好ましくない有機塩等の化合物が副生したりする。また、蛋白質分解酵素を用いる方法の場合は、酸分解に比べて食品として利用するにあたっての衛生上の問題はないが、分解率を上げるために蛋白質分解酵素を多量に必要とするという課題があった。
【００１０】
本発明は、このような問題点の解決を図ったところの新規なアミノ酸やペプチドの製造方法及びこの蛋白質分解物を含有する食品、飼料、微生物培地並びに医薬を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、超臨界水の特殊な物性に着目し、これを蛋白質からのアミノ酸やペプチドの製造に利用できないかと検討を続けてきた結果、その反応条件の厳しさにも拘わらず、特定の反応条件を採用すれば、アミノ酸やペプチドの製造が可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、蛋白質からのアミノ酸又はペプチドの製造方法において、蛋白質の分解を超臨界状態又は亜臨界状態の水で行うことを特徴とする蛋白質の分解によるアミノ酸又はペプチドの製造方法及びこの蛋白質分解物を含有する食品、飼料、微生物培地並びに医薬である。
【００１３】
本発明の特徴の一つは、反応時間等により得られる生成物が異なることである
。
【００１４】
すなわち、アミノ酸を目的とする場合、超臨界状態又は亜臨界状態の水による蛋白質の分解は、３００℃〜４００℃、好ましくは３５０℃〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧、好ましくは２５０気圧〜３５０気圧の圧力下に行われるが、反応時間は極めて短く、１秒〜４０秒、好ましくは５秒〜３０秒である。
【００１５】
これに対して、ペプチドを目的とする場合、超臨界状態又は亜臨界状態の水による蛋白質の分解は、３５０℃〜４００℃、好ましくは３７４℃〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧、好ましくは２５０気圧〜３５０気圧の圧力下に行われるが、反応時間が比較的長く、４〜３０分である。
【００１６】
ところで、以下の実施例によると、実施例１では、４００℃、３００気圧、１分間以上の反応で生成アミノ酸が消滅していることが確認されているが、実施例２では、それ以上の激しい条件（４００℃、３９２.４気圧、５分以上）であるが、アミノ酸は生成されていないにもかかわらず、意外にも、ペプチドが生成している。しかも、ペプチドであるLeu-Glyのピークはむしろ５分から２０分と反応時間が長くなるほど大きくなっている。これは、超臨界条件下で安定なペプチドへの再結合が起こったものと推察される。
【００１７】
超臨界水を用いる反応は、高温、高圧というフロンやＰＣＢ等も分解されるという厳しい反応条件下に実施されるため、これを蛋白質の加水分解に利用した場合、反応が進みすぎて生成したアミノ酸も分解され、アミノ酸等は到底取得することが出来ないであろうとするのが技術常識であった。
【００１８】
このことは、蛋白質を高温、高圧下、例えば、３５０℃を超える処理を行うと、炭化されるとされていることからも窺い知れるところである（特公平８ー１７６８２号公報）。
【００１９】
したがって、本発明において、上記のような反応条件を選択することにより、アミノ酸やペプチド等を得ることが出来たということは全く予想外のことであって、このような点からみて、本発明は全く新しい技術を開発したものといえよう。
【００２０】
また、本発明においては、最初はアミノ酸が生成するが、その後、一定時間経過した後、今度は、ペプチドが生成するということが起こるが、これは、いったん生成したアミノ酸が活性化され、再結合して超臨界条件下でも安定なペプチドを形成するためと推察されるが、このようなペプチドの生成は、一旦、アミノ酸の生成が確認できない時期があるだけに、全く予想外の生成反応であることが分かる。
【００２１】
上記の本願発明の反応条件下では、水の密度は０.１〜０.８ｇ／ｃｍ3となる。
【００２２】
蛋白質としては、蛋白質を含有するものであるならばその種類を問わない。例えば、蛋白質を含有する天然資源、食用資源、廃棄物、生ゴミ等いずれでも良い。
【００２３】
加水分解反応に用いる超臨界水は、通常の水、蒸留水、超純水等である。また、反応温度、圧力は水の状態図から算出される超臨界の周辺の範囲、すなわち亜臨界であればいずれも有効である。
【００２４】
超臨界水の使用量は、蛋白質を分解するのに必要な量、すなわち、化学量論的量であれば十分であるが、通常は、溶媒を兼ねて、蛋白質１重量部に対し水３〜１００重量部、好ましくは１０〜５０重量部使用される。
【００２５】
その他、水の超臨界状態への移行を妨げない範囲での各種有機溶媒（メチルアルコ−ル、エチルアルコ−ル、アセトン等）の添加も有効である。
【００２６】
また、反応に用いる容器は、ステンレス製の他、当該反応温度と圧力に耐えられるものはいずれでも可能である。また、加熱に用いる炉は、溶融塩を含むものの他、電気的に直接加熱するものも可能である。
【００２７】
反応方式は、連続式でもバッチ式でも条件を満たせばいずれも可能である。
【００２８】
従来の酵素等による蛋白質の分解では、ペプチド結合の内一定の結合しか切れないため、生成物に偏りや限界があったが、本発明方法では、蛋白質のペプチド結合全てが加水分解されるため、蛋白質を構成する全てのアミノ酸を得ることが出来る。
【００２９】
例えば、トウモロコシ由来の蛋白質であるツェインを用いた場合、構成アミノ酸でないリジン以外のアミノ酸については、その量の多少はあるにせよ、全てを遊離回収することができる。
【００３０】
したがって、本発明の蛋白質の分解により得られた生成物は、必須アミノ酸等数多くのアミノ酸やその再結合物と認められるペプチドを含有しており、栄養学上極めて有用であるので、食品、飼料、微生物培地、医薬等への適用が期待できる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質の分解は、上記のような反応条件下で実施されるが、得られる反応生成物を食品、飼料、微生物培地、医薬等へ適用する場合、通常の配合手段を採用することにより行われる。
【００３２】
以下、本発明の詳細を実施例で説明する。
【００３３】
【実施例１】
蛋白質ツェインの加水分解によるアミノ酸の製造
ツェイン100mgを体積10.46cm3のステンレス（ステンレス316）容器に入れ、蒸留水5mlを加え、アルゴンガスで置換した後、容器を密封し、180℃〜500℃に加熱した溶融塩中に導入し、ほぼ瞬間的に超（亜）臨界温度以上に上昇させた。温度は反応管中に差し込んだハステロイ被覆の熱電対により測定した。圧力300気圧の条件下、200、250、300、350、400℃の各温度で、30秒間反応させた。また、400℃では１〜３分間の反応も行った。この反応液１０μｌを用い、日立製L8500型アミノ酸分析計によりアミノ酸を解析した。それらの結果を表１に示す。この結果、350℃でのアミノ酸の生成が最も多いことが明らかになった。
【００３４】
【表１】
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【実施例２】
蛋白質ツェインの分解によるペプチドの製造
ツェイン200mgを体積10.46cm3のステンレス（ステンレス316）容器に入れ、蒸留水5mlを加え、容器を密封し、400℃に加熱した溶融塩中に導入し、ほぼ瞬間的に臨界温度以上に上昇させた。温度は反応管中に差し込んだハステロイ被覆の熱電対により測定した。その結果、温度は400℃、圧力は392.4気圧、密度0.4777g/cm3で超臨界の条件を達成していることが明らかになった。5分後、反応管を氷水中に投入し、反応を終了させた。同様な操作を10分、20分行った。得られた透明な加水分解物から実施例１と同じ分離手段により、ペプチドを含有する反応液を得た。この反応液５μｌを用い、高速液体クロマトグラフィ−により分析した。分析条件を下記に示す。また、その結果得られたクロマトグラムを図１〜３に示す。ツェイン分解物の分画物の一部をアミノ酸配列分析したところ、Ｌeu-Ａla-Ａla （図１の３.９６２のピークのもの）や Ｌeu-Ｇly （図１の１２.７１３のピークのもの）等のペプチドが生成していた。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：ウオ−タ−ズ社製  μＢondashpre ５μ  C8-300A（3.9×150mm）
溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む1〜63％（20分）アセトニトリルの直線濃度勾配
流速  ：1ml/min
検出  ：210nmの吸収
【発明の効果】
▲１▼  従来の酵素等による蛋白質の分解では、ペプチド結合の内一定の結合しか切れないため、生成物に偏りや限界があったが、本発明方法では蛋白質を構成する全てのアミノ酸を得ることが出来る。そのため、本発明の蛋白質の分解により得られた生成物は、必須アミノ酸等数多くのアミノ酸やその再結合物と認められるペプチドを含有するので栄養学上極めて有用であり、食品、飼料、微生物培地、医薬等への適用が可能となる。
【００３５】
▲２▼  従来の酵素等による蛋白質の分解では、最終的には反応に用いた酵素や緩衝液成分等を反応生成物から完全に除去する必要があるが、本発明ではこのような反応生成物の精製が不要である。
【００３６】
▲３▼  従来の酵素等による蛋白質の分解では、有害な酸や高価な酵素等を使用する必要があったが、本発明の水は化学的に安定、無毒、安価であり、従来の他の触媒より有利である。
【００３７】
▲４▼  本発明では、蛋白質なら全ての種類のものが分解できるので、生物系天然資源、有機産業廃棄物、生ゴミ等から有用物質を得ることができる。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２の反応時間５分のペプチド生成物の高速液体クロマトグラフィーにより分析したクロマトグラムである。
【図２】実施例２の反応時間１０分のペプチド生成物の高速液体クロマトグラフィーにより分析したクロマトグラムである。
【図３】実施例２の反応時間２０分のペプチド生成物の高速液体クロマトグラフィーにより分析したクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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