(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003980683.tif 000005
［式中、ｍは、０を表し、ｎは、２〜３の数を表す。
Ｚは、インドレニン環状構造を表す。
Ｒ１は、炭素数１〜５のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素または式：ＮＲ４Ｒ５で表される置換アミノ基を表す。ここで、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基を表す。
Ｘは、アニオンを表す。］
で示されるスチリル色素の少なくとも１種と、メルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、ジアホラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の電子伝達体を含んでなる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの測定用試薬。
【請求項２】
電子伝達体としてジアホラーゼを用いることを特徴とする請求項１に記載の測定用試薬。
【請求項３】
電子伝達体の存在下、請求項１に記載の式（Ｉ）で示されるスチリル色素を、液体試料に含まれる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートと反応させて該スチリル色素を発色させ、可視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの測定方法。
【請求項４】
液体試料が、血液、尿、髄液または唾液である請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
電子伝達体としてジアホラーゼを用いることを特徴とする請求項３に記載の測定方法。
【請求項６】
請求項１に記載の試薬を含む分析用試薬を吸収可能な担体に含浸する、もしくは担体に塗布、印刷または噴霧することからなる試験片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型ニコチンアミド補酵素、すなわち還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）の測定用試薬および測定方法に関し、更に詳しくは、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを含む液体試料にスチリル色素を反応させて、可視部の吸光度の変化を測定することを特徴とするＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ並びにこれらに関連する酵素や基質の測定方法およびこの測定方法に用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定方法としては、以下のような方法が知られている：
(１)ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収または蛍光を直接測定する方法、
(２)触媒の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィンの蛍光を測定する方法、
(３)電子伝達体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとＮＴＢやＭＴＴなどのテトラゾリウム塩とを反応させてホルマザン色素を生成し、その可視部の吸収を測定する方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記測定方法の内、紫外部の吸収及び蛍光を測定する方法(１)は、尿などを測定対象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍光を有する共存物質、たとえば、リボフラビンなどのビタミンＢ2剤、フルオレッセインナトリウムなどの蛍光造影剤によって妨害を受けるという欠点を有している。
また、上記テトラゾリウム塩を発色剤として用いる方法は、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質の影響で、不所望のブランク発色を生じるという欠点を有している。
【０００４】
また、ＮＡＤＨを用いずに生体試料中の成分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法があるが、テトラゾリウム塩を用いる方法と同様に、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けて発色が阻害されるという欠点を有している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記課題を解決すべく鋭意研究に取り組んだ結果、ある種のスチリル色素を電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと作用させると、アスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けずに、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを、高い選択性で測定できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、式：
【化２】
0003980683.tif 000002
【０００７】
［式中、ｍは、０を表し、ｎは、２〜３の数を表す。
Ｚは、インドレニン環状構造を表す。
Ｒ１は、炭素数１〜５のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に水素または式：ＮＲ４Ｒ５で表される置換アミノ基を表す。ここで、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基を表す。
Ｘは、アニオンを表す。］
で示されるスチリル色素の少なくとも１種と、メルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、ジアホラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の電子伝達体を含んでなる、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの測定用試薬、並びに
電子伝達体の存在下、上記スチリル色素を、液体試料中のＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと反応させ、可視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの測定方法
を提供する。
【０００８】
スチリル色素を示す上記式（Ｉ）において、Ｚによって形成されるインドレニン環の具体例としては、３,３−ジメチルインドレニン、５−クロロ−３,３−ジメチルインドレニン、５−カルボキシ−３,３−ジメチルインドレニン、５−スルホキシ−３,３−ジメチルインドレニン、３−シクロヘキシルインドレニン、５−メチルスルホニル−３,３−ジメチルインドレニンなどが挙げられる。
【０００９】
Ｒ１の具体例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基などのアルキル基、およびこれらに対応するヒドロキシアルキル基が挙げられる。
【００１１】
Ｘの具体例としては、塩素イオン、臭素イオン、フッ素イオン及びヨウ素イオンなどのハロゲンイオン；メタンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオンなどのスルホン酸イオン；メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオンなどの硫酸イオンが挙げられ、その他、過塩素酸イオン、硝酸イオンなどのイオンも例示できる。
【００１３】
電子伝達体は、メルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート(１−ｍＰＭＳ)、ジアホラーゼなどがあげられるが、ジアホラーゼが好ましい。
【００１４】
スチリル色素は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ１モルに対して
好ましくは０．１〜１０．０モル、より好ましくは、０．５〜２．０モル用いればよい。電子伝達体、たとえばジアホラーゼは、触媒として作用するので、その量は触媒量でよい。たとえば、０．１〜１．０mＫat／lのような割合で用いるとよい。
また、色素の選択、例えば式（Ｉ）中のｎの選択により測定波長を４００〜９００nmまで任意に選択することが可能である。
その他の測定パラメーターは、主として電子伝達体によって制約を受けるので、例えば電子伝達体がジアホラーゼの場合、測定可能なｐＨ域は５〜９（好ましくは７〜８）、温度は２０〜４０℃（好ましくは３０〜３７℃）、測定時間は１〜３０分の間で選択が可能である。
【００１５】
本発明の測定方法が対象とする液体試料は、典型的には体液、たとえば血液またはその成分（血漿、血清など）、尿、髄液などであるが、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを含む液体試料ならいずれも本発明の測定方法の対象となる。
【００１６】
これらの試料中に含まれる酵素または酵素の基質などの成分を測定しようとする場合、その酵素と基質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチンアミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。これにより、液体試料中の成分の量、濃度を測定することが出来る。
【００１７】
また、これらの試薬を吸収可能な担体に含浸する、または担体に塗布、印刷、噴霧することにより試験片を作製し、試料中に含まれる酵素又は酵素の基質などの成分を測定することもできる。担体としては、濾紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ポリスチレンフィルム、ガラス、セラミックなどがあげられるが、吸収可能な担体としては、濾紙が好適であり、一般的な担体としては、ポリエチレンテレフタレートフイルムが好適である。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の測定方法を用いれば、試料中に共存する目的物以外の還元性物質による不所望のブランク値の発生を防止することが可能となり、試料中の測定対象成分の測定の選択性を向上させることができる。
【００１９】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【００２０】
実施例１および比較例１〜２
以下の組成の試薬を調製した：
色素：                  ０.０５ mmol／l
ジアホラーゼ            ０.８３ mkat／l
トリス-ＨＣl(pＨ８.０)：０.２０ mol／l
色素として、実施例１では、Ｚ＝３,３'−ジメチル−５−カルボキシ−インドレニン、Ｒ１＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｒ２＝Ｎ(ＣＨ３)２、Ｒ３＝Ｈ、Ｘ＝Ｂr−である上記式で示されるスチリル色素を使用し、比較例１では、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ:２−(４−インドフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド)を使用し、比較例２では、シアニン色素(９−エチル−５,５'−ジメトキシ−３,３'−ジスルホプロピル−２,２'−チアカルボシアニンヒドロキシドトリエチルアミン塩を使用した。
【００２１】
検体
測定用検体として、以下の４種を用いた：
(１)蒸留水
(２)β−ＮＡＤＨ(２５ μmol／l)［蒸留水中]
(３)アスコルビン酸(０．５g／l)
(４)β−ＮＡＤＨ(２５μmol／l)＋アスコルビン酸(０．５g／l)
測定手順
以上の試薬と検体を用い、以下の手順で、測定を行った：
(１)反応セルにトリス−ＨＣl(pＨ８.０)を２．６５ml量りとる。
(２)色素液０．１０ml、ジアホラーゼ０．１５mlを反応セルに加え撹拌した後３０℃で５分間インキュベートする。
(３)検体を０．１０ml反応セルに加え３０℃でインキュベートしながら、２分後及び５分後の吸光度を測定する。
【００２２】
結果
試薬液と検体(１)〜(４)それぞれとの反応について得られた吸光極大波長での吸光度値を表１に示す。
【００２３】
【表１】
0003980683.tif 000003
【００２４】
試薬液と蒸留水を混合して得られた液の吸光極大波長における吸光度値をあらかじめ測定し、この値と、試薬液と上記検体(２)〜(４)を混合して得られた液の同波長での吸光度値との差(△ＯＤ)を求めた。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0003980683.tif 000004
表１および表２の結果から、本発明による測定法はアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けること無く基質の濃度に比例して特異的に吸光度の変化を示し、その値から基質の濃度を定量的に求めることができることが分かる。