(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ｇａｔｇｃａｃｃｇｃｔｔｇｃｔａｔｃａｔｃ−３’からなる遺伝子増幅プライマー及び５’−ｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｇａａｇｇａｔｔｃｃ−３’からなる遺伝子増幅プライマーからなるセット、又は５’−ｇａｔｇｃａｃｃｇｃｔｔｇｃｔａｔｃａｔｃ−３’の相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー及び５’−ｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｇａａｇｇａｔｔｃｃ−３’の相補鎖からなる遺伝子増幅プライマーからなるセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを用いるビブリオ  ブルニフイカスを検出、定量又は同定する方法。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットを含む、ビブリオ  ブルニフイカスを検出、定量又は同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、並びに臨床検査における、ビブリオ ブルニフィカス（Vibrio vulnificus）の検出・同定・計数方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビブリオ ブルニフィカスは、海水や汽水域に生息する好塩性グラム陰性細菌である。健康人への感染は稀であるが、肝硬変などの重度の基礎疾患を持つ患者には感染して重篤な感染症を起こすことがあり、死亡例を伴う感染菌として公衆衛生の立場から注目されている。本菌による感染症は1970年にRolandにより下肢壊疽から分離された（New Engl. J. Med.,、 282, 1306 、1970）のが最初の報告例であるが、当初は腸炎ビブリオの腸管外感染例とされていた。その後、この菌が大腸菌などと比較して反応が遅いが乳糖分解能をもつこと、8%食塩の存在下では増殖できないことなどが明らかになり、1979年Farmerによりビブリオブルニフィカスと命名された（Lancet, ii, 903 、1979）。
【０００３】
本菌は生物学的性状から生物型1〜3型に分類されている（Appl. Environ. Microbiol., 63, 1460-1466   1997、 Lancet, 354, 1421-1424   2000）。ヒトの感染症から分離されるのは主として1型であり、2型は主に魚の病原菌として分離される。また、3型は1996年〜1997年に起きたイスラエルでの集団感染の病原菌として分離された（Lancet, 354, 1421-1424   2000）。
本菌による感染様式には経口感染型と創傷感染型がある。経口感染は主として夏場に生の魚介類を喫食することにより感染し、24時間以内に発熱、腹痛、下痢、嘔吐などの消化器病の症状を経た後に敗血症を併発し、平均48時間で死に至る。死亡率は50〜70%と非常に高い。また、創傷感染は創傷への海水の接触により感染し、12時間の潜伏期問を経て1週間以内に発症する。致死率は経口感染よりは低く25%である。米国では1988年〜1996年までに22州で422事例の報告があり、その感染源は、米国の食習慣から生牡蠣摂取による場合が多数を占めている。一方、我が国でも関東以西の太平洋側で約90事例の報告があり、刺身、鮨など生の魚介類の喫食が感染の主な原因となっている。最近では、2001年7月に熊本で、生のシャコ、コチの喫食により4名が感染し、うち2名が死亡するなど、魚介類の生食文化を有するわが国では、ビブリオブルニフィカス感染症は警戒すべき感染症であるといえる。
【０００４】
本菌の選択的分離には、主として腸炎ビブリオ同様TCBS寒天培地が用いられてきた。ビブリオブルニフィカスは、TCBS培地上で腸炎ビブリオとよく似た緑青色のコロニーを形成し、その判別のためには種々の生化学的性状の確認を行う必要があり、煩雑である上誤判定の危険を伴っている。一方で、SPS agar (SDS-polymixin B sucrose agar)培地（FEMS Microbiol. Lett., 17, 205-209 1983）やcellobiose-collistin agar培地（Appl. Environment. Microbiol., 64, 1721-1724 1998）などの改良選択分離培地も報告されているが、生化学的性状の確認作業を行うことに変わりは無い。
【０００５】
一方、これまでに、他の食中毒菌と同様に、遺伝子工学的手法を応用したビブリオブルニフィカスの検出法が幾つか開発されている。wzaは、莢膜多糖CPS（capsular polysaccharide）をペリプラズムから外膜へ移動させるのに必要なトランスポーターをコードする遺伝子としてE.coliで見出された遺伝子である。ビブリオブルニフィカス では莢膜の無い株がマウスに対する毒性を示さないこと、および、wza欠損株がマウスに対する病原性を失うこと（Infect. Immun. 69, 6893-6901   2001）から、病原性の一つと考えられている。そこで、病原性を持つビブリオブルニフィカスを検出する手段としてwza遺伝子を標的としたプライマーがWrightらによって開発された（U.S. Patent 6183973, Feb., 6, 2001）。しかし、ビブリオブルニフィカスの病原因子はCPSに限られないため、病原性を持つビブリオブルニフィカスを全て検出できるとは限らない。また、同じくビブリオブルニフィカスの病原性因子の一つとされているヘモリシン遺伝子(vvh ：Vibrio vulnificus hemolysin)を標的としたプライマーが開発されている（Appl. Environ. Microbiol. 57, 707-711   1991）。このプライマーはvvh遺伝子がビブリオブルニフィカスに特異的な遺伝子であるものとして設計されているが、一方でV. choleraeやV. mimicusが有するヘモリシン遺伝子もvvh遺伝子と相同性を示すことが報告されており（Infect. Immun. 58, 2706-2709  1990、 Infect. Immun. 65, 1830-1835   1997）、さらにプライマーの設計にあたり、これらのヘモリシン遺伝子との比較が行われていないことから、特異性の検証が十分とは言えない。
以上のように、既存の遺伝子を用いたビブリオブルニフィカス検出方法は、特異性が十分とは言えないものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の遺伝子検査方法に共通している点は、細菌の「種」が遺伝的な多様性を内包する集団である事を無視していることである。ある細菌集団のメンバーと推測される1菌株の塩基配列を、その集団共通の、あるいは代表する配列として用いる事は、中立的変異を速やかに蓄積する遺伝子の分子進化の性質上大変危険である。即ち、本来検出されるべき菌株がプライマー領域の僅かな変異の為に増幅が阻害されて検出されなかったり、プライマーの特異性が十分でないために検出されるべきでない近縁株が検出されるといった誤判定の原因になる事が危惧される。そこで、特異性のバックグラウンドが証明されており、誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増幅効率と増幅特異性を有する、高性能なビブリオブルニフィカスの検出・同定・定量用特異遺伝子増幅プライマー及びプローブの作成が必要とされていた。
【０００７】
【発明の実施の形態】
細菌のある系統群の遺伝子を特異的に検出する方法を作成する為には、検出しようとする生物群、ならびにその系統的に近縁な生物群の塩基配列をなるべく多数収集する必要がある。また、特異検出のターゲットとする遺伝子は、最も近縁の生物とも判別可能なように、十分に異なる塩基配列を有している必要がある。この為には、十分に早い進化速度を有していなくてはならない。また、高頻度に水平伝播する遺伝子（たとえば腸炎ビブリオの毒素遺伝子）の様に、系統とは無関係に存在する遺伝子は用いる事が出来ない。本発明でターゲットとして用いたgyrB遺伝子、rpoD遺伝子及びrecA遺伝子がコードするタンパク質は、生存に必須なタンパク質である。この為、水平伝播し難く、また適度な進化速度を有しているため、細菌の系統解析に適している。発明者らは、既にgyrB遺伝子及びrpoD遺伝子のPCRダイレクトシークエンス法による簡便な塩基配列の決定方法を開発している（特開平07-213229、特開平08-256798）。
【０００８】
さらに、発明者らは、既に多数のビブリオブルニフィカスを環境より単離しており、他方に、公知のビブリオブルニフィカス保存株及び、16S rRNA配列に基づく解析により本菌に近縁であることが報告されているV.navarrensis, V.diazotrophicus, V.ordalii, Listonella anguillarum, V.metschnikovii, V.cincinnatiensis, V.mimicus, V.chorelae(International Journal of Systematic and Evolutionary  Microbiology 51, 1449-1456(2001)) について、下記表１に示される菌株のgyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の部分塩基配列を解析し、その配列に基づいた分子系統解析を行い、その系統関係を明らかとした。
【０００９】
【表１】
0004021285.tif 000002
【００１０】
即ち、上記表１に示される供試菌株を2％NaCl添加ブレインハートインフュージョン培地で増菌培養した後に、PUREGENE DNA Isolation Kit ( Gentra SYSTEMS )を用いて染色体DNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型として、gyrB増幅ユニバーサルプライマーUP-1E（5'-caggaaacagctatgaccaygsnggnggnaarttyra-3'）およびAprU(5'-tgtaaaacgacggccagtgcnggrtcyttytcytgrca-3')を用いて約900bp（大腸菌K-12株上の塩基配列上のポジション331 - 1212； アミノ酸配列ではポジション111から 404に相当する領域）のgyrB遺伝子断片をPCR増幅した。また同様にrpoD増幅ユニバーサルプライマー70F-M13(5'-caggaaacagctatgaccyatgmgngaratgggnacngt-3')および70R-M13(5'-tgtaaaacgacggccagtngcytcnaccatytcyttytt-3')を用いて約800bp（大腸菌K-12株上の塩基配列上のポジション334 - 1125； アミノ酸配列ではポジション112から 376に相当する領域）のrpoD遺伝子断片をPCR増幅した。さらに、recA遺伝子増幅ユニバーサルプライマーrecUFおよびrecUR（recUF : caggaaacagctatgaccatggaygtngaracnat,recUR:tgtaaaacgacggccagttanswrtaccangcncc )を用いて648bp（大腸菌K-12株上の塩基配列ポジション172-819；アミノ酸配列ではポジション58-273に相当する領域）のrecA遺伝子断片をPCR法により増幅した。増幅反応は、耐熱性DNAポリメラーゼ（AmpliTaqGo1：Applied Biosystems製）を用い、GENE MATEサーマルサイクラー（ISC BioExpress）を使用して行った。反応液はDNA1μg,50mMKCl,10mM Tris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2、0.01%ゼラチン、各0.2mMのdNTP,2.5UのAmpliTaq Gold、プライマー各1μMを含む溶液を50μlに調製した。反応条件は、AmpliTaq Goldの活性化(95℃・10分間)に続いて、94℃・1分間、アニール（gyrB、rpoDは56℃、recAは54℃）1分問、72℃・2分聞の反応を40サイクル行った後に、72℃・10分間の伸長反応を行った。得られたPCR産物は、1%アガロースゲル（SeaPlaque GTG agarose:BioWhittaker Molecular Applications製）で電気泳動（O.5xTAE、100V・30分間）後、臭化エチジウムで10分間染色した。紫外線照射下で増幅産物の存在を確認し、ゲルより切り出した後、Wizard PCR Preps DNA Purification System（Promega製）を用いて精製し、シーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応は、ユニバーサルプライマーに予め付加してあるM13R（5'-CAggAAACAgCTATgACC-3'）、M13-21配列(5'-TgTAAAACgACggCCAgT-3')をプライマーとして、ABI PR1SM BigDye Terminator Cycle Sequenceing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems製）を用い、GENE MATEサーマルサイクラー（ISC BioExpress）を使用して行った。反応液は、DNA20ng、プライマー3.2pmo1、BigDye Terminator Ready Reaction Mix8μlを混合し、最終体積20μlに調製した。サイクルシーケンス反応は、92℃・10分聞の加熱後、96℃・10秒、50℃・5秒、60℃・4分の反応を25サイクル行った。塩基配列の解析にはABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER（Applied Biosystems製）を用いた。得られた塩基配列を用いて分子系統解析を行うにあたり、ビブリオブルニフイカスの近縁種をより正確に把握するために、gyrB、rpoDおよびrecA遺伝子部分配列を結合させた後に解析を実施した。即ち、上記3遺伝子配列を結合した上でC1ustal Wコンピュータプログラムを用いて多重アラインメント解析を行った後、PHYLIPコンピュータプログラムパッケージを用い、木村の2パラメーターモデル（J.Mo1.Evol、(1980)Vo1.16,No.2,p.111-20）で算出した遺伝的距離に基づいて近隣結合法（Mo1.Bio1.Evo1.Vo1.4,No,4,406-425）により分子系統樹を作製した。
【００１１】
この結果、ビブリオブルニフイカスは解析に供した全ての株が、ビブリオ属菌株中で独立した単系統をなすことが明らかとなった（図1）。即ち、この系統に属する細菌群がビブリオブルニフイカスと判定されるべきことが示唆された。
【００１２】
そこで、ビブリオブルニフィカス菌群のみを検出可能な遺伝子検査法を確立するために、まず、近縁種間の塩基配列の差異を明らかとした。即ち、ビブリオブルニフィカス群内では保存され、他のビブリオ属細菌とは異なっている塩基の位置を同定した。具体的には、ビブリオブルニフィカスが属する系統群のコンセンサス配列を求めると共に、分子系統解析の結果から本系統に近縁であることが判明した図１中Ｃ1〜Ｃ3の系統のコンセンサス配列を比較し、系統特異的情報図を作成した（図2、3、4）。図2〜4より、gyrB遺伝子においては、配列表中の配列番号１の位置番号3、15、69、95、121、123、132、136、138、139、231、424、549、557、603、700、701、726、727、728、734、735、738又は804の位置、rpoD遺伝子においては配列中の配列番号2の位置番号21、33、60、120、126、235、260、312、315、340、354、396、414、459、462、570、686、689、732、750又は756の位置、さらにrecA遺伝子においては配列表中の配列番号3の位置番号9、81、138、153、172、180、208、228、237、288又は540の位置がビブリオブルニフィカスが属する系統に特異的であることが明らかとなった。これら特徴的塩基を含む本系統に特異的な配列を用いることにより、高特異性を有するプローブ及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅プライマーを設計することが可能となる。例えば、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する15塩基以上のgyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の塩基配列、好適には20塩基以上、更に好適には20塩基以上40塩基以下の連続するgyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の塩基配列を用いてプライマーを設計することが可能となる。同様に、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する15塩基以上のgyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の塩基配列、好適には20塩基以上、更に好適には20塩基以上で100塩基以下の連続するgyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の塩基配列を用いて、プローブを設計することが可能となる。さらに、当該プライマーおよびプローブの作成には、上記相違塩基を高頻度で含む領域、例えば、gyrB遺伝子においては、121、123、132、136、138、139のいずれかの位置を２以上含む領域、726、727、728、734、735、738のいずれかの位置を２以上含む領域、rpoD遺伝子においては、459、462を含む領域、732、750、756のいずれかの位置を２以上含む領域、さらにrecA遺伝子においては138、153を含む領域、228、237を含む領域が好適に使用できる。また、プライマーの場合、3末端がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることが望ましい。本件発明は、これらプライマーおよびプローブを他の試薬と組み合わせたビブリオブルニフィカスの検出、定量又は同定用のキットを包含するものである。
【００１３】
本発明のプライマーの遺伝子増幅方法は、PCR法に限定されない。プライマーの特異性に基づく特異増幅方法、あるいは増幅の特異的阻害方法に用いる事が可能である。また、同様に特異増幅プライマーと標識特異プローブの組み合わせによる定量増幅反応にも用いる事が出来る。また、本件発明のプローブは単独で用いる事も可能である。その使用方法は、固相あるいは液相に限定されない。
【００１４】
サイバーグリーンなどの増幅した二本鎖DNAを検出する試薬を用いて行なうリアルタイムPCRやFRET等を応用したリアルタイムPCRを行なう際のプライマー及びプローブとしても利用可能である。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。実施例はその一態様であり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
本発明により得られた、ビブリオブルニフィカスに特異的である領域を用いて設計した表２に示される遺伝子増幅用プライマーを用いた実施例を示す。
【００１６】
【表２】
0004021285.tif 000003
【００１７】
尚、請求項11、14、33、35、44および47に記載のプライマーはそれぞれ表２中のVF1、VR1、VrF2、VrR2、VVrecF2およびVVrecR2にあたる。
供試菌株から抽出した染色体DNAを鋳型としたPCRを行った。増幅反応は、耐熱性DNAポリメラーゼ（AmpliTaq Go1d：Applied Biosystems製）を用い、GENE MATEサーマルサイクラー（ISC BioExpress）を使用して行った。反応液はDNA 0.1μg、50mM KC1,10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、0.01% ゼラチン、各0.2mMのdNTP、2.5UのAmpliTaq Gold、プライマー（濃度は表3参照）を含む溶液を最終体積20μlに調製した。反応条件は、AmpliTaq Goldの活性化（95℃・10分間）に続いて、94℃1分、アニール（gyrB遺伝子の場合65℃、rpoD遺伝子の場合63℃、recA遺伝子の場合65℃）1分、72℃1分を35サイクル行い、最後に72℃10分の伸長反応を行った。プライマーの組み合わせと増幅反応条件を表3に示した。
【００１８】
【表３】
0004021285.tif 000004
【００１９】
増幅後の反応液５μｌを、1％アガロースゲル（アガロースＳ：（株）ニッポンジーン製）で電気泳動後（0.5xTAE、100V・30分間）、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で遺伝子の増幅の有無を確認した。gyrB遺伝子を標的としたプライマーVF1とVR1、rpoD遺伝子を標的としたVrF2とVrR2、及びrecA遺伝子を標的としたVVrecF2とVVrecR2の組み合わせを用いて、表１に示した菌株由来のDNAをPCR法によりスクリーニングした結果を表４に示す。図１においてビブリオブルニフィカスに属するとされた菌株由来のDNAのみから増幅産物が確認され、共にビブリオブルニフィカスのみを検出可能であることが判明した。
【００２０】
【表４】
0004021285.tif 000005
【００２１】
【発明の効果】
本件発明のgyrB、rpoD、及びrecA遺伝子プライマー及びプローブは、ビブリオブルニフィカスとの系統関係を把握した上で設計したものであるため、特異性を向上させる検討が行われており、検出精度という点で優れている。従って、食品、臨床検体などから菌を単離せず、近縁細菌種が夾雑している状況で直接検出する場合に有利になる。
【００２２】
【配列表】
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0004021285.tif 000009
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【００２３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４−２０は、プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  gyrB、rpoDおよびrecA遺伝子の部分配列を繋ぎ合わせた後に分子系統解析を行った結果を示した図。この図が近隣結合法による分子系統樹であり、ビブリオブルニフィカスが他のビブリオ属細菌とは異なった単一の系統に属していることを示しており図中にV.v.という標記で記した。また、ビブリオブルニフィカス以外の系統をC1〜C4に分類した。E. coli K12 及びV. cholerae N 16961株の遺伝子データはそれぞれGen BankデータベースのアクセションナンバーNC00913,NC002505を用いた。
【図２】図1で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのgyrB遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図1中のC1,2,3）のgyrB遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。D=A又はG又はT、H＝A又はC又はT、V=A又はC又はG、R＝A又はG、Y＝C又はT、K＝G又はT、M＝A又はC、S＝G又はC、W＝A又はT、N＝A又はG又はT又はCを示す。
【図３】図1で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのrpoD遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図1中のC1,2,3）のrpoD遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。D=A又はG又はT、H＝A又はC又はT、V=A又はC又はG、R＝A又はG、Y＝C又はT、K＝G又はT、M＝A又はC、S＝G又はC、W＝A又はT、N＝A又はG又はT又はCを示す。
【図４】図1で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのrecA遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図1中のC1,2,3）のrecA遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。D=A又はG又はT、H＝A又はC又はT、V=A又はC又はG、R＝A又はG、Y＝C又はT、K＝G又はT、M＝A又はC、S＝G又はC、W＝A又はT、N＝A又はG又はT又はCを示す。
【図１】
0004021285.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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