(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全体にまたは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの化学合成方法であって、ランダムな配列部分の生産が、モノヌクレオチドとジヌクレオチドとを交互に繰り返し組合せてトリヌクレオチドを形成させることからなり、
ａ）少なくとも１つのジヌクレオチドがそれぞれの支持体に添加されている少なくとも１つの支持体上での反応サイクル、
ｂ）１つのモノヌクレオチドがそれぞれの支持体に添加されているもう１つの反応サイクル、
ｃ）支持体を混合することによって得られた生産物をランダム化してもよく、および生産物を少なくとも２つの支持体間に分割してもよく、および
ｄ）工程ａ）からｃ）をランダムな配列部分が生産されるまで必要な回数繰り返してもよい、
ことからなり、
モノヌクレオチドとジヌクレオチドとの組合せは、ランダムな配列部分について、それぞれのトリヌクレオチド単位が、以下の表IIに示される有限数の利用可能なコドンから選択されるコドンを構成するように選択され：
0003986255.tif 000009
それによって、遺伝子コードの縮重を減少させる、
上記方法。
【請求項２】
全体にまたは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの化学合成方法であって、ランダムな配列部分の生産が、モノヌクレオチドとジヌクレオチドとを交互に繰り返し組合せてトリヌクレオチドを形成させることからなり、
ａ）１つのモノヌクレオチドがそれぞれの支持体に添加されている少なくとも１つの支持体上での反応サイクル、
ｂ）少なくとも１つのジヌクレオチドがそれぞれの支持体に添加されているもう１つの反応サイクル、
ｃ）支持体を混合することによって得られた生産物をランダム化してもよく、および生産物を少なくとも２つの支持体間に分割してもよく、および
ｄ）工程ａ）からｃ）をランダムな配列部分が生産されるまで必要な回数繰り返してもよい、
ことからなり、
モノヌクレオチドとジヌクレオチドとの組合せは、ランダムな配列部分について、それぞれのトリヌクレオチド単位が、以下の表IIIに示される有限数の利用可能なコドンから選択されるコドンを構成するように選択され：
0003986255.tif 000010
それによって、遺伝子コードの縮重を減少させる、
上記方法。
【請求項３】
それぞれのトリヌクレオチドが、最初にモノヌクレオチドを添加し、次いでジヌクレオチドを添加することによって合成される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
それぞれのトリヌクレオチドが、最初にジヌクレオチドを添加し、次いでモノヌクレオチドを添加することによって合成される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
合成は少なくとも２つの支持体上で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
合成は、平行して行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
４つのジヌクレオチド混合物および合成支持体が存在し、１つの支持体はそれぞれの標準のモノヌクレオチドのためである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
支持体が樹脂支持体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
カラム内で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
形成されたポリヌクレオチドは停止コドンを含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
形成されたコドンによってコードされるそれぞれのアミノ酸が唯一のコドンによってコードされ、それによって遺伝子コードの縮重を排除する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
形成されたコドンは、ポリヌクレオチドが翻訳される生物中の遺伝子発現を最大化するように選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
形成されたコドンは全ての２０アミノ酸をコードする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記の工程：
ａ）群（各群は、配列中に存在するはずのかつ第１の塩基を共有する、少なくとも１つのトリヌクレオチド単位の、第２および第３の塩基を構成する少なくとも１個のジヌクレオチドからなる）中の、ジヌクレオチドをあらかじめ選択する工程；
ｂ）活性化および保護ジヌクレオチド（該活性化および保護ジヌクレオチドは、該混合物中に分布し、さらに対応するトリヌクレオチド単位表示における均質性を得るのに適した濃度でａ）の操作によりあらかじめ選択される）を含有する混合物を調製する工程；
ｃ）容器中に含まれる固相合成のための支持体上で、既知の配列を有するポリヌクレオチドを合成する工程；
ｄ）ｂ）の活性化および保護ジヌクレオチドを含有する混合物を、合成支持体（各支持体につき１回）に加え、および活性化および保護ジヌクレオチドとｃ）の合成ポリヌクレオチドの５’末端と間で結合反応に行う工程；
ｅ）少なくとも１個の活性化および保護モノヌクレオチドを、少なくとも１個の合成支持体（各支持体につき１個のモノヌクレオチド）に加え、該活性化および保護モノヌクレオチドと工程ｄ）に従って合成したポリヌクレオチドに結合したジヌクレオチドの５’末端との間で結合反応を行う工程；
ｆ）容器を開け支持体を混合して、均質な反応混合物を得る工程；
ｇ）ある量の均質な反応混合物（各支持体につき１／ｎ画分に等しく、ここでｎは、使用される支持体の数である）を用いて合成支持体を復元する工程；
ｈ）実験計画に必要とされるだけの回数、ｄ）、ｅ）、ｆ）およびｇ）の工程を反復する工程；および
ｉ）こうして得られたポリヌクレオチドの５’末端で、既知の配列を有するポリヌクレオチドを合成する工程；
を含んでなる、請求項１および４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
下記の工程：
ａ1）群（各群は、配列中に存在するはずの、第３の塩基を共有する、少なくとも１個のトリヌクレオチド単位の、第１および第２の塩基を構成する少なくとも１個のジヌクレオチドからなる）中の、ジヌクレオチドをあらかじめ選択する工程；
ｂ1）活性化および保護ジヌクレオチド（該活性化および保護ジヌクレオチドは、該混合物中に分布し、さらに対応するトリヌクレオチド表示における均質性を得るのに適した濃度でａ1）の操作によりあらかじめ選択される）を含有する混合物を調製する工程；
ｃ1）容器中に含まれる固相合成のための合成支持体上で、既知の配列を有するポリヌクレオチドを合成する工程；
ｄ1）少なくとも１個の活性化および保護モノヌクレオチドを、少なくとも１個の合成支持体（各支持体につき１個のモノヌクレオチド）に加え、該活性化および保護モノヌクレオチドと工程ｃ1）の合成ポリヌクレオチドの５’末端との間で結合反応を行う工程；
ｅ1）ｂ1）の活性化および保護ジヌクレオチドを含有する混合物を、合成支持体（各支持体につき１回）に加え、および活性化および保護ジヌクレオチドとｃ1）の合成ポリヌクレオチドに結合したモノヌクレオチドの５’末端との間で、工程ｄ1）に従って結合反応を行う工程；
ｆ1）容器を開け支持体を混合して、均質な反応混合物を得る工程；
ｇ1）ある量の均質な反応混合物（各支持体につき１／ｎ画分に等しく、ここでｎは、使用される支持体の数である）を用いて合成支持体を復元する工程；
ｈ1）実験計画に必要とされるだけの回数、ｄ1）、ｅ1）、ｆ1）およびｇ1）の工程を反復する工程；
ｉ1）こうして得られたポリヌクレオチドの５’末端で、既知の配列を有するポリヌクレオチドを合成する工程；
を含んでなる、請求項２、３および５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
モノヌクレオチドおよびジヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ジヌクレオチドは、以下の表IVに網掛けにより強調される大腸菌（Escherichia coli）ゲノムにおける最もよくあるコドンに対応するトリヌクレオチド単位を形成するようにあらかじめ選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
0003986255.tif 000011
【請求項１８】
ジヌクレオチドは、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＧＴ、ＧＧである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ジヌクレオチドは、下記：
Ｗ＝ＴＣ；ＴＧ；ＣＣ；ＡＣ；ＡＡ；
Ｘ＝ＴＧ；ＣＧ；ＡＣ；ＡＧ；ＧＴ；
Ｙ＝ＡＡ；ＡＣ；ＣＴ；ＧＴ；ＴＴ；
Ｚ＝ＧＧ；ＡＣ；ＣＴ；ＧＴ；ＴＣ；
のとおり４個の混合物として混合される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
コドンは、下記の群：
ＡＷ1＝イソロイシン、メチオニン、トレオニン、アスパラギン、リジン；
ＣＸ1＝ロイシン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン；
ＧＹ1＝バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン；
ＴＺ1＝フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、トリプトファン；
のアミノ酸をコードするように、合成支持体上で得られる、請求項１〜１４および１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ジヌクレオチドは、下記の割合：
Ｗ2：［ＡＡ］＝［ＣＣ］＝［ＴＣ］＝［ＡＣ］＝１Ｍ、および［ＴＧ］＝１．５Ｍ；
Ｘ2：［ＴＧ］＝［ＡＣ］＝［ＧＴ］＝［ＣＧ］＝１Ｍ、および［ＡＧ］＝１．５Ｍ；
Ｙ2：［ＧＴ］＝［ＡＣ］＝［ＣＴ］＝［ＡＡ］＝１Ｍ、および［ＴＴ］＝１．５Ｍ；
Ｚ2：［ＧＧ］＝２Ｍ、［ＡＣ］＝［ＣＴ］＝［ＧＴ］＝１Ｍおよび［ＴＣ］＝１．５Ｍ
で混合される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ジヌクレオチドは、以下の表VIに網掛けにより強調される真核生物ゲノムにおける最もよくあるコドンに対応するトリヌクレオチド単位を形成するようにあらかじめ選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
0003986255.tif 000012
【請求項２３】
ジヌクレオチドは、ＴＣ、ＴＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＡＧ、ＧＣ、ＧＧである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
真核生物は酵母であって、ジヌクレオチドは、以下の表Ｖに網掛けにより強調される酵母ゲノムにおける最もよくあるコドンに対応するトリヌクレオチド単位を形成するようにあらかじめ選択される、請求項２２記載の方法。
0003986255.tif 000013
【請求項２５】
ジヌクレオチドは、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＴ、ＣＡ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＧＴ、ＧＡ、ＧＧである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
形成されるコドンが、１以上のアミノ酸を除外するように選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
形成されるコドンが、グルタミン酸およびアスパラギン酸を除外するように選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
モノヌクレオチドおよびジヌクレオチドはリボヌクレオチドである、請求項１〜１７および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
モノヌクレオチド：ジヌクレオチドの組合せが
Ｔ：ＴＴ、ＣＴ、ＡＴ、ＧＴ、ＧＧ；
Ｃ：ＴＴ、ＣＴ、ＡＴ、ＡＡ、ＧＴ；
Ａ：ＴＴ、ＴＧ、ＣＴ、ＡＴ、ＡＡ；および
Ｇ：ＴＴ、ＣＴ、ＡＴ、ＡＡ、ＧＴ
である、請求項１および４〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ジヌクレオチド：モノヌクレオチドの組合せが
ＴＴ、ＣＡ、ＡＣ、ＡＡ、ＧＡ：Ｔ；
ＴＡ、ＴＧ、ＣＣ、ＡＧ、ＧＴ：Ｃ；
ＴＴ、ＡＴ、ＡＡ、ＧＣ、ＧＡ：Ａ；および
ＴＧ、ＣＡ、ＡＴ、ＡＧ、ＧＧ：Ｇ
である、請求項２、３、５〜１３および１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の主題は、ランダムさが、３個の隣接したヌクレオチドの単位に関するものであるように、かつ該単位のそれぞれ１個が、数と配列があらかじめ決められた有限数のコドンに適合し、そして遺伝コード縮重の影響を排除するのに適切であるように、分子の多少の伸長域に沿ってランダム配列を導入しうる、ポリヌクレオチドの合成方法である。
【０００２】
上記特徴を有するポリヌクレオチド合成法の応用可能性は、疑いなく注目すべきものである。実際、近年その使用を必要とする応用は、科学研究の多くの分野においてますます重要性が増大している。これは、例えば、分子構造または機能における既知タンパク質の真の役割を立証するために、おそらく重要な位置にあるそのタンパク質をコードする遺伝子において機能する部位特異的突然変異誘発の場合である。別の例は、ランダム配列合成オリゴヌクレオチドの「ボックス」を含有するライブラリーにより提供されるが、これは、新しい生物学的機能を実行しうる分子を選択するために実現される。
【０００３】
これら全ての場合に、遺伝コード縮重の影響を排除すること以外に、所望のコドンだけが挿入されるように、配列のランダムさを、ある程度制御することが非常に重要である。同様に重要なことは、該ポリヌクレオチド合成が、単純で費用効果が高く効率的な方法で、明らかに実施されることである。
【０００４】
用語
本明細書の以下の用語を特定することが有用である：
【０００５】
支持体＝支持体という用語は、化学合成を実現するためにモノマーが結合している固相物質のことをいう；該支持体は、通常樹脂または多孔性ガラス粒からなるが、また当業者に公知の他の任意の物質から作られていてもよい。この用語は、ポリヌクレオチド合成の付加反応のための支持体に結合している１個またはそれ以上のモノマーを含むことを意味する。
【０００６】
結合または縮合：これらの用語は、モノマーを、第２のモノマーまたは固体支持体に結合させるために行われる化学反応のことをいう。これらの反応は、当業者に公知であり、そして通常、製造業者により与えられる使用説明書に従い、自動ＤＮＡ合成機において実現される。
【０００７】
モノマーまたはモノマーヌクレオチド：モノマーまたはモノマーヌクレオチドという用語は、オリゴヌクレオチドの化学合成において利用される個々のヌクレオチドのことをいう。利用することができるモノマーは、５種の標準ヌクレオチド（塩基のアデニン（それぞれＡまたはｄＡ）、グアニン（ＧまたはｄＧ）、シトシン（ＣまたはｄＣ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）から誘導される）のそれぞれのリボとデオキシリボ型の両方を含む。イノシンのような塩基誘導体または前駆体様もまたモノマーに含まれ、さらに例えばモノマーのプリンもしくはピリミジン塩基上、リボースもしくはデオキシリボース、またはヒドロキシルもしくはホスフェート基上の任意の位置に、可逆性ブロッキング基を有するような、化学修飾ヌクレオチドも含まれる。これらのブロッキング基は、例えば、ジメトキシトリチル、ベンゾイル、イソブチリル、ベータシアノエチルおよびジイソプロピルアミン基を含み、そしてヒドロキシル基、ホスフェートおよびヘキソサイクリックアミンを保護するために使用される。しかし当業者に既知の他のブロッキング剤を採用してもよい。
【０００８】
ダイマーまたはジヌクレオチド：ダイマーまたはジヌクレオチドという用語は、前述の２個のモノマーまたはモノヌクレオチドの縮合により誘導される分子単位のことをいう。
【０００９】
合成モノマー単位：この用語は、合成方法において必須の要素として利用される単位を示す。本発明の方法主題において、これらはモノマーまたはダイマーからなっていてよい；これらはまた、当該分野において既知の他の方法ではトリヌクレオチド単位から構成されていてもよい。
【００１０】
コドンまたはトリプレット：コドンまたはトリプレットという用語は、ポリペプチド生合成において利用される２０個の天然アミノ酸の１個を特定する、３個の隣接したデスオキシリボヌクレオチドモノマーの配列のことをいう。この用語はまた、どのアミノ酸もコードしないコドンであるナンセンスコドンも含む。
【００１１】
コドンまたはランダム化トリプレット：これらの用語は、同じ配列位置が、あるポリヌクレオチドセット中の２個以上のコドンに対応する場合のことをいう。異なるコドンの数は、各特定の位置について２〜６４個に変化しうる。
【００１２】
アンチコドン：アンチコドンという用語は、プリンおよびピリミジン塩基結合の既知の規則により対応するコドンを特定する、３個の隣接したリボヌクレオチドモノマーの配列のことをいう。
【００１３】
ポリヌクレオチドまたはランダム化オリゴヌクレオチド：この用語は、１個またはそれ以上の位置にランダム化コドンを有する、１セットのオリゴヌクレオチドのことをいう。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドが、６個の長さのヌクレオチド（すなわち、２個のコドン）からなり、そして配列の第１および第２位の両方が、２０個のアミノ酸の全てをコードするようにランダム化されているならば、ランダム化オリゴヌクレオチドの集団は、第１および第２位に２０個のトリプレットの可能な全組合せを有するオリゴヌクレオチドセットを含む。従ってこの場合に、可能なコドンの組合せの数は、４００である。同様に、全位置でランダム化されるような方法で、１５個のヌクレオチド長のランダム化オリゴヌクレオチドが合成されるならば、２０個のアミノ酸のそれぞれをコードする全てのトリプレットが、全位置に見い出されるであろう。この場合に、ランダム化オリゴヌクレオチド集団は、２０5個の異なる可能なオリゴヌクレオチド種を含有する。
【００１４】
明瞭に定義されないとき、本説明中に使用される他の用語は、本発明の当業者に公知であることを意味する。
【００１５】
分子生物学手法については、サムブルーク（Sambrook）らのマニュアル（サムブルーク（Sambrook）ら、１９８９年）を参照されたい。明瞭に定義されない化学的性質の本質に関する他の用語は、本発明の当業者に知られていることを意味し、そしていずれにせよこれらの定義は、エム・ジェイ・ゲイト（Gait, M.J.）ら、１９８４年のようなマニュアルに見いだすことができる。
【００１６】
技術の現状
一般に、合成オリゴヌクレオチドを利用する応用は、２種類ある：既知配列のオリゴヌクレオチドの使用を必要とするもの、および少なくとも部分的に縮重した配列またはランダム配列を有するオリゴヌクレオチドの使用を必要とするもの。
【００１７】
第１グループの応用に関して、通常の合成法は、ポリヌクレオチドの構築の原理に基づき、１回に１個モノヌクレオチドを縮合し、初めに３’末端から出発し、そして全反応サイクルについて各モノヌクレオチドを選択することにより、所望の明白な配列を有するポリヌクレオチドを合成する。
【００１８】
第２グループの応用に関して、合成は、同じ様式に従うが、可変基を挿入する必要のある配列に沿う位置では、合成サイクルは、２個またはそれ以上の異なるモノマーの混合物を使用して進行する。どのサイクルでも、５’末端に付加されるモノマーにおいて異なるオリゴヌクレオチド混合物は、こうして作成される。例えば、あるサイクルで４種の異なるモノヌクレオチドがモノマーとして利用されるならば、挿入される最後のヌクレオチドだけが異なる４種の異なるポリヌクレオチドを含有する混合物が得られる。同じ種類の合成サイクルが反復されるならば、最後の２個の挿入されるヌクレオチドが異なる１６種のポリヌクレオチドの混合物が得られる、等々。
【００１９】
一般に、合成ポリヌクレオチドを利用する応用は、遺伝物質への該ポリヌクレオチドの直接的または間接的挿入を提供し、これはある種の生体中のポリペプチドへと翻訳される（インビトロの翻訳はめったに起こらない）。知られているように、ＤＮＡを翻訳する遺伝子コードは、部分的に縮重している［すなわち、３個のヌクレオチドコードのグループにより形成される６４個の可能なコドンは２０個のアミノ酸だけ（加えて３個の終止または停止コドン）だけをコードするため、２個以上のコドンが単一のアミノ酸をコードする］。
【００２０】
少なくとも１個の前述の部分的にランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ここで、ランダム配列に関してポリヌクレオチドは、異なる配列を有するポリヌクレオチドの多少複雑な混合物を意味する）は、ランダム配列のペプチドをコードする（すなわち、ペプチドの混合物に関して、各ペプチドは１個またはそれ以上のポリヌクレオチドによりコードされる）。
【００２１】
実際、遺伝子コード縮重は、ランダムポリペプチドの誘導体化のために使用されるランダム配列のオリゴヌクレオチドにおいて３つの重要な結果を内包する：
【００２２】
ａ）少なくとも部分的にランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドの任意の混合物は、はるかに単純なポリペプチド混合物をコードする。例えば、６個の位置が４種の天然ヌクレオチドの１個によりランダムに充填されるオリゴヌクレオチドの混合物は、４０９６個の異なる分子（単一のヌクレオチドが考慮されるならば４6個、コドンが考慮されるならば６４2個）から作られるが、まさにコード縮重により、これらは、わずか４００個（すなわち２０2個）の異なるポリペプチドをコードする。
【００２３】
もしポリペプチドをコードする異なるポリヌクレオチドが、同じ物理的および化学的特徴を有するならば、この現象はそれ自体は無関係であろうが、異なる配列は、例えば、溶解度、安定性および異なる条件での静電荷、濾過手段による吸着などに関する、異なる性質を付与しうる。
【００２４】
ｂ）ランダム配列ポリヌクレオチド翻訳により生じるポリペプチドの混合物において、ある百分率の末端切断型配列のペプチドが存在するであろう。実際、コドンのランダムな組み込み中には停止シグナルを示すコドンも必然的に挿入され、従って末端切断型配列のポリペプチド形成は避けがたい。
【００２５】
上記の例において、４０９６個のオリゴヌクレオチドのうち、３７５個（９％）は、第１または第２位で切断されているポリペプチドをコードする（すなわち、第２位の６４個の可能なコドンのそれぞれについて第１位の３個の可能な終止コドン、および第１位の６１個の可能なコドンのそれぞれについて第２位の３個の可能な停止コドン）。従って、４００個の可能なポリペプチドと一緒に、２１個の末端切断型ポリペプチドが見い出されよう（第１位の１個と第２位の２０個）。この現象は、長めのランダム配列を有するポリペプチドのライブラリーが作られるときには、特別な重要性を有する。例えば、２７個のヌクレオチドのライブラリー（多くの応用において記載されているように、ノナペプチドライブラリーをコードする）では、３５％ものポリヌクレオチドが停止コドンを含む（すなわち、［６４9−６１9］／６４9）。長い配列ほど、ポリペプチド鎖の早期の終止をコードする分子を含む割合が高い。
【００２６】
ｃ）異なる生物で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの同様でない翻訳効率の存在は、出発ポリヌクレオチド混合物とは異なる複雑さを有するポリペプチド混合物の誘導体化において明らかになる。遺伝子コードは、本質的にユニークであるが、実際、同じアミノ酸をコードする異なるコドンが翻訳される効率において、種々の生物で差がある。例えば、大腸菌（E. coli）のセリンは、コドンＵＣＡによるよりも１８倍多くコドンＵＣＵによりコードされる。このため、初期混合物に加えた等モル濃度の２種の異なるポリヌクレオチドは、異なる効率で翻訳され、そして生じるポリペプチド混合物は異なるモル比の２種の分子種を含有することになる。従って選択された細胞系の効率を最大化するためには、コード配列が、その細胞系自体により主として利用される、まさしくそのコドンを含有することが、非常に適切なことである。
【００２７】
これらの要因の３つ全ては、１つの位置だけにランダム化を提供する応用と、ランダム化が長い配列に関する応用との両方において、ランダム配列ポリヌクレオチドを利用する系の効率に、大きな影響を及ぼす。しかしこの影響は、採用されるランダム配列の長さと複雑さに正比例する。
【００２８】
この事実は、特に、均等に複雑かつ均質なポリペプチド混合物の調製のために仕上げた、ランダム配列ポリヌクレオチドの完全に均質な混合物（すなわち、同じ濃度の可能な全分子種を含有するもの）の調製を妨げる。実際に、この方向のあらゆる努力は、まさにこれら３つの要因の組合せのため、ポリペプチド分子にポリヌクレオチドを翻訳するときに部分的に邪魔され、そしてこれが、恐らくかなりの多くの応用に影響する。
【００２９】
これは、例えば、ポリヌクレオチドのこのような均質な混合物により作成される発現ライブラリーの効率の場合である。
【００３０】
これら全ての問題に関して、これらの克服、およびランダム配列ポリペプチドを利用する種々の系の効率の改善を狙った合成方法が、長期間かけて開発された。
【００３１】
第１の解決策（理論的な観点から恐らく最も明らかである）は、個々のモノヌクレオチドの代わりに、あらかじめ形成したトリヌクレオチド（コドンに対応する）のモノマー単位としての利用を提供するポリヌクレオチド合成である（ビー・ビルケナス（Virkenas, B.）ら、１９９４年；エム・ユー・リトル（Lyttle, M.U.）ら、１９９５年；エイ・オノ（Ono, A.）ら、１９９４年）。すなわち所望のコドンに対応する２０個のトリマーを最初に合成して、少し遅れて、モノマーの代わりにトリマーから作られたモノマー単位を、各合成サイクルで縮合することによりポリヌクレオチド合成を行うことができる。この解決策は、一見単純かつ有効であるが、実際には後述の利用により、複雑で費用が高く非効率的な方法を必要とする：
【００３２】
１．初めのトリヌクレオチド合成は、標準的なポリヌクレオチド合成方法（従って比較的単純かつ効率的な方法）に従って行われる、３個のブロック化ヌクレオチドの縮合により容易に達成可能であるが、合成マトリックスからの新しく形成されたトリヌクレオチドの分離に厳密に固有の多くの問題が存在する。
【００３３】
実際、通常の方法でこの操作は、種々の塩基を保護する全ての基の分解を伴うが、この場合には、次にポリヌクレオチド合成において使用するという観点から、ヌクレオチドと側鎖保護基の間の結合をそのまま残す必要があり、側鎖保護基との結合が関与せずに、支持体マトリックスとの３’−５’結合を分解させることが試みられた。
【００３４】
このことから、普通でない保護基を使用し、かつ１つのコドンから別のものに変化する製造収率を考慮に入れる必要性は、ほとんど再現性がなく、いずれの場合にも低い。
【００３５】
樹脂上でなく溶液中で合成が行われるときにも、完全に類似の困難が生じる。この場合も同様に、個々のトリヌクレオチドは、専ら３’位で使用前に選択的にブロックをはずす（これらを反応性にするために）必要があり、一方他の全ての官能基はブロックしたまま残す必要がある。
【００３６】
２．モノヌクレオチドの使用に基づく、ランダム配列ポリヌクレオチドの通常の合成では、各合成サイクルで、少なくとも２種のヌクレオチドからなる混合物が使用される。この最も困難な化学的条件で、可能な４種全てのヌクレオチドが使用されるが、これらのそれぞれの反応性が他のものとのわずかに差があっても、これらは４成分しかなく、ポリヌクレオチド鎖の形成に各ヌクレオチドの等モルの組み込みを促進する最適なモル比条件を見つけることは困難ではない。
【００３７】
はるかに重要なことは、２０種もの異なるトリヌクレオチドを等モル量で組み込む必要があるときの困難さである。最初に、全ての可能なトリヌクレオチドには、相対的な化学反応性において４種の単純なモノヌクレオチドに比べて顕著に大きな差が存在するという事実を考慮に入れなければならない。
【００３８】
さらに、純粋な形で、かつ制御され再現可能な反応性を有するヌクレオチドは容易に利用可能であるが、トリヌクレオチドは、上述の困難のため、その定性的および定量的含量を容易には立証できない溶液として利用されよう。最後に、等モル組み込みを与えるのに充分な、合成混合物を形成する２０成分の正しいモル比を見い出すことは明らかに困難であろう。当然ながらこれら全ての困難は、複雑さの少ない混合物の採用により最小化される。
【００３９】
化学合成の観点からはるかに単純な第２のアプローチは、多くのコドンが１種のアミノ酸だけをコードするとき、最初の２個のコドン塩基はしばしば一定であり、３番目のコドン塩基だけが異なるという事実に基づく。
【００４０】
従って各トリヌクレオチド単位の合成中、第１サイクル（これは、３’末端ヌクレオチド、すなわちコドンの３番目を与える）において、グアニンとチミン（またはウラシル）の混合物から誘導されるヌクレオチドを使用し、一方以後の２回の縮合サイクルでは４種のモノヌクレオチドの混合物を使用するならば、ポリヌクレオチドで示されるコドン中の違いを減少させることができる。すなわち、ポリヌクレオチドは、６４種の可能なコドンを含まないが、ＮＮＫ（ここで、Ｎは、４種のヌクレオシドの任意の１種であり、そしてＫは、グアノシンまたはチミジンである）という種類の縮重した３２種だけを含むように、合成される。２０種のコードされるアミノ酸のうち、１２種は、１個のコドンだけによりコードされ、５種は、２個の可能なコドンによりコードされ、そして３種は、３個の可能なコドンによりコードされる。最後に、３２種のうち１個のコドンだけが、停止シグナルをコードする。
【００４１】
この方法は、通常の合成法に比較するならば、全く変更を必要としないという顕著な利点を有するが、上述の問題をたとえ部分的ではないとしても解決しない。具体的には、通常の方法に比較してこれは部分的な解決を与えるが、停止コドン導入、および末端切断型ポリペプチドの形成の問題を解決しない（ダブリュー・ヒュアン（Huang, W.）とディー・ブイ・サンティ（Santi, D.V.）、１９９４年）。
【００４２】
当該分野において報告された別の方法は、合成支持体を、オリゴヌクレオチドの所定の位置に挿入される異なるコドンと同じ数の合成容器（通常カラム）に細分する原理に基づく。次に単一のコドンを全支持体上で合成し、次いでランダム化ポリヌクレオチド混合物を得るために、種々の支持体を混合する（米国特許第５，５２３，３８８号）。例えば、４種のアミノ酸をコードする４種のコドンを所定の位置に挿入する必要があるならば、合成樹脂は、４つの部分に細分して、第１のコドンは第１の樹脂で、第２のコドンは第２の樹脂でというように合成する。一旦合成が終了したら、４個の支持体を混合することにより、その５’末端コドンが４種のコドンについてランダム化されている結合ポリヌクレオチドを有する支持体樹脂が得られる。
【００４３】
この方法は、所定の位置に挿入する必要のあるコドンの正確な選択を可能にするという利点を有する。この主な限界は、所望のコドンと同じだけ多くの部分に合成樹脂を再分割する必要があることである。それでコドンの数が少ないならば、合成は比較的単純になるが、コドンの数が多いならば（ランダム化を意図する全位置について２０個までの異なる合成支持体を用意する必要があるとき）、合成は極めて複雑になる。製造コストを抑えるために比較的少量の樹脂を扱うことが必要であるため、樹脂を１０個またはそれ以上の異なる量に細分することは、極めて厄介で、全合成サイクルにおいて必要とされる化学反応および洗浄の複雑な操作において取り扱いが困難なものになる。さらに、結合反応の効率を大きく低下させずに、合成規模を数マイクロモルより大きく増大させることができないということに注目する必要がある。
【００４４】
（発明の要約）
本発明は、合成における顕著な簡便さと費用効果の高さを同時に確保する方法により、上述の困難を克服することを目的とする。本発明は、コドンを含む全トリヌクレオチドが、１個のモノヌクレオチドと、これに続くか、または配列中で最初にくる１個のジヌクレオチドから構成されるという考えに基づく。
【００４５】
このアプローチの顕著な特徴は、通常法（表Ｉ）に示されるコドンと、モノヌクレオチド−ジヌクレオチド（表II）およびジヌクレオチド−モノヌクレオチド（表III）の組合せを示すことが示されるコドンとの単純な比較により証明することができる。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
表IIにおいて具体的に、各コドンは、第１のヌクレオチド＋１個のジヌクレオチド（本明細書では以後Ｂ＋Ｄと予備、Ｂは単一のヌクレオチドを意味し、そしてＤはジヌクレオチドを意味する）の組合せから生じるものとして示され、一方表III（これもＩに由来する）は、今度は第１と第２のコドン塩基に対応するジヌクレオチド＋第３の塩基に対応する単一のヌクレオチド（本明細書では以後、前述の用語によるＤ＋Ｂとも呼ばれる）に由来するものとしてのコドンを表す。
【００５０】
遺伝子コードのこれら代替表示の完全な調査によって、発明者らは、他のアプローチとの比較において、全てのアミノ酸をコードするのに必要な最少数のモノマー単位（ジヌクレオチドにより構成される）を確実に減少させられると考えることが可能になった。実際、表示Ｄ＋Ｂにより、１３個のジヌクレオチドに等しく（表IIIにおいて、網掛けにより強調した）、Ｂ＋Ｄコード表示によるなら、さらに小さい７個という非常に小さい数になる（表IIにおいて、これも網掛けにより強調した）。従ってＢ＋Ｄの組合せは、最も好ましいものと考えなければならない。
【００５１】
さらに、表IIおよびIIIから他の組合せを得ることができるが、これらは、異なる生物における遺伝子発現において好ましいコドンの配列中に導入されるという利点にもかかわらず、存在する必要なジヌクレオチドの数が少ないために、総合的にはＤ＋Ｂの組合せよりも好ましくはない。各合成混合物形成に必要なダイマーの数の最小に維持し続ける、大腸菌（E. coli）、酵母および真核生物細胞における種々のコドンの示差的使用に関する知識に基づき（本発明の詳細な説明については以下を参照のこと）、表IIから、それぞれ表IV、ＶおよびVIを誘導することが可能である（表中、単一コドンの使用頻度が示され、一方最も便利な選択は、網掛けにより強調される）。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
従って化学合成方法は、選択された組合せへと組織化される。選択されるアプローチの特徴により、好適なものとして提案される方法は、本明細書に後述の表IIに示されるヌクレオチド−ジヌクレオチドの組合せ（すなわち、Ｂ＋Ｄの組合せ）に基づくものである。
【００５６】
本方法は、４種のヌクレオチド、すなわち、Ｔ（またはポリリボヌクレオチドを合成する場合はＵ）、Ｃ、Ａ、Ｇの名称で印をつけた、この目的のために使用される通常の樹脂を含有する、４個の同一の合成カラムの調製を提供する。次に適宜選択されるジヌクレオチドの混合物を、自動合成機の内側の樹脂上で縮合させる。第１のカラム（Ｔ）では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド（ＴＴ；ＣＴ；ＡＴ；ＧＴ；ＧＧ）により構成される。第２のカラム（Ｃ）では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド（ＴＴ；ＣＴ；ＡＴ；ＡＡ；ＧＴ）により構成される。第３のカラム（Ａ）では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド（ＴＴ；ＴＧ；ＣＴ；ＡＴ；ＡＡ）により構成される。第４（Ｇ）では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド（ＴＴ；ＣＴ；ＡＴ；ＡＡ；ＧＴ）により構成される。この合成サイクルに、第２のサイクルが続き、ここで単一のヌクレオチド（そして具体的には、カラムの記号で示されるもの、すなわち、第１ではＴ、第２ではＣ、第３ではＡそして第４ではＧ）が各カラムに添加される。第２サイクルの最後に、あらかじめ選択された２０種全てのコドンが４個のカラムの樹脂に挿入されているが、各カラムには表IIに網掛けされているコドンだけが存在する。配列をさらにランダム化するために、次にカラムを開いて、合成樹脂を回収し、４種の樹脂を注意深く混合する。
【００５７】
混合した樹脂は、４個のカラムに再分配し、カラムを合成装置に再接続して、前述のように２つの合成サイクルを反復する。実際には、あらゆる二重合成サイクルにおいて、あらかじめ選択されたコドンだけを形成するために、しかし全体としてはランダムな仕方で、すなわち選択されたコドンに無関係に、３つの新しい単位が形成ポリヌクレオチド鎖に加えられる。
【００５８】
この合成方法は、本明細書で以後に要約されるように、技術の現状において報告されているものに比較して顕著な利点を提供する。
【００５９】
◆ジヌクレオチド合成は、文献に充分に報告されている方法により、従って廉価な市販の試薬を溶液中で使用することにより行われ、生成物の収率は８５〜９０％である（ジー・クマール（Kumar, G.）、１９８４年）。
【００６０】
◆多くの場合に、異なるジヌクレオチドの反応性の差は、トリヌクレオチドに特有な反応性の差よりも小さいことが期待される。主な結果は、合成混合物中に存在する全ての分子種の形成ポリヌクレオチド鎖への均質な組み込みが、容易に得られるということである。試薬の純度は、本反応のこの側面には決定因子である。
【００６１】
◆全ての可能な組合せをカバーするのに必要なジヌクレオチドの総数は、極めて小さい。実際にこれは、最少７から最大２０に変化し、通常の場合には、本明細書に記載される限りでは、１１個のダイマーで充分である。
【００６２】
◆使用されるジヌクレオチドの選択は、合成混合物を形成する分子種の数を最少化するように行うことができる。一例として、各合成混合物が、わずか５個のジヌクレオチドを含有するように選択された、表IIに示されるものがある。これによって、全ての成分の均質な組み込みを最適化するための、適切な反応条件および試薬の相対モル濃度の探索が非常に容易になる。
【００６３】
◆このアプローチにより行われる合成によって、形成鎖に完全なコドンを組み込むことができる。実際、ジヌクレオチドとモノヌクレオシドの注意深い選択によって、停止コドンのような望ましくないコドンを除外するように、合成を方向づけることができる。停止コドンだけを特異的に排除する組合せは、例えば、表IIに示される組合せであるが、最終配列の１個またはそれ以上の位置において、任意の望ましくないコドンを除外するように、組合せを修飾することも可能である。
【００６４】
ポリペプチド鎖のある位置から例えば数個のアミノ酸（例えば、酸性のアミノ酸である、グルタミン酸、ＧｌｕまたはＥ、とアスパラギン酸、ＡｓｐまたはＤ）を除外するなら、所望の位置に対応する合成サイクルでカラムＧに適応される混合物からダイマーＡＴとＡＡを除外すれば充分であろう。しかし同じ原理に従って、他の無数の組合せが可能である。
【００６５】
◆各アミノ酸合成に関して、多くの可能なコドンから適切なコドンを選択することができれば、選択された微生物のタンパク質合成において優先的に使用されるコドンだけの挿入が可能になる。従って、ランダム配列オリゴヌクレオチド混合物から、低い効率でこの系で翻訳されたものを除外することにより、遺伝子発現を最大化し、こうしてオリゴヌクレオチドの均質性と生じるオリゴペプチド混合物の均質性との間の良好な対応を得ることができる。
【００６６】
これら全ての考察は、このようなアプローチに由来する顕著な利点を強調する。実際これらは、専らＢ＋Ｄの組合せに基づく方法のみに関係するのではなく、一般的なアプローチに由来するあらゆる種類の方法に当てはまり、従って上述のものから推測可能である。
【００６７】
実際、例えば表IIIに示される組合せに基づき、２つの合成サイクルの順序を逆転させる必要があるという側面だけ、前述の方法とは異なる合成方法を推測することができる：先ず最初に単一モノヌクレオチドを合成樹脂上で縮合させ、第２ラウンドでジヌクレオチド混合物だけを縮合させる。
【００６８】
この第２の方法は、さらに別の可能な組合せに由来する他の方法と同様に、本発明者らが企図するものであるが、前述の第１の方法から本質的に推測可能であるため、さらに具体的には記さない。
【００６９】
（発明の詳細な説明）
全体にまたは部分的にランダム化されたヌクレオチド配列を含有する、オリゴヌクレオチド混合物の合成のための方法であって、以下の特徴：
◆各混合物成分は、異なるポリペプチドをコードする。同じポリペプチドをコードする異なるオリゴヌクレオチドは、混合物中に存在しない；
◆各混合物成分に挿入されたランダム配列部分は、配列のランダムさが、単一のヌクレオチドの代わりに３個の隣接したヌクレオチドの単位（通常コドンに対応する）に当てはまるように構成される；
を有する上記方法が記載される。
【００７０】
各混合物成分に挿入されたランダム配列部分は実際、３個の隣接したヌクレオチド単位を考慮して、各単位が、所定のリストに定義されかつ４種の天然モノヌクレオチドの組合せにより形成される２〜６４個の可能なトリヌクレオチドを含有する、有限数のトリヌクレオチドの配列を採用するように、構成される。
【００７１】
これらの特徴は、合成方法の直接の結果である。その好適な形態において、これは以下の操作に基づく：
【００７２】
ａ）群（各群は、第１の塩基を共有する配列において所望の少なくとも１個のコドンの、第２および第３の塩基を構成するジヌクレオチドにある）中の、ジヌクレオチドをあらかじめ選択；
【００７３】
ｂ）活性化ジヌクレオチド（該ジヌクレオチドは、該混合物中に再分布し、さらに対応するトリプレット表示における均質性を得るために、適切な濃度でａ）の操作により分類される）を含有する混合物の調製；
【００７４】
ｃ）最終配列の３’末端に生じる既知配列の固相合成のための支持体を保持する１個またはそれ以上の反応容器上で、並行してまたは並行せずに行うことができる合成；
【００７５】
ｄ）ｂ）の活性化ジヌクレオチド混合物の、合成容器（各容器につき１回）への添加、およびそこに含まれる活性化ジヌクレオチドとｃ）の合成配列の５’末端との、続いて起こる結合反応；
【００７６】
ｅ）少なくとも１個のモノヌクレオチドの、少なくとも１個の合成容器（各容器につき１個のモノヌクレオチド）への添加、および該ジヌクレオチドの５’末端での、続いて起こる結合反応；
【００７７】
ｆ）容器の開口、および均質な反応混合物を得るための支持体の混合；
【００７８】
ｇ）ある量の均質な混合物［前工程ｇ）において各容器につき１／ｎ画分に等しい量（ここで、ｎは、使用される容器の数である）］による合成容器の復元；
【００７９】
ｈ）応用目的に必要とされるだけの回数の、ｄ）、ｅ）、ｆ）およびｇ）の連続操作の反復；
【００８０】
ｉ）最終ポリヌクレオチド産物の５’末端に生じる既知配列の、並行したまたは並行しない、容器上での合成。
【００８１】
前述の種々の操作を実施する方法を例証するために、以下に方法を要約するが、そのため各工程は、実験室の習慣に普通に採用される応用基準に基づき修正（または必要であれば断片化）してもよい。
【００８２】
従って本方法は、以下のように実現することができる：
【００８３】
α．それぞれ４個の可能なヌクレオチドと、それぞれ１６個の可能なジヌクレオチドとの組合せを考慮して得られる、６４個のトリヌクレオチドの表（例えば表IIのような）。
【００８４】
β．表に列挙される各トリヌクレオチドの次に、合成されるポリヌクレオチドの使用において考慮すべき特徴が記される。その最も普通の（ユニークではない）形態において、これらの特徴は、天然の遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、および合成すべきポリヌクレオチドを最終的に発現する生物の天然ポリヌクレオチド配列において比較的多量にあるトリヌクレオチドである（表IV；ＶおよびVIのように）。トリヌクレオチドに固有の他の特徴を確立することは可能であると立証されるなら、これらは、合成方策の選択に関して考慮に入れることができよう。
【００８５】
γ．次に、その合成に必要なジヌクレオチドの数をただ最小に保持しようとして、そして表の４つのカラムにできるだけ均一に分配されるように（表II、III、IV、ＶおよびVIの網掛けにより例示されるように）、所望のトリヌクレオチドの選択が行われる。
【００８６】
δ．活性化型および保護型の選択されたダイマーの調製。好適な実施態様において、本発明は、ジー・クマール（Kumar, G.）とプーニアン（Poonian）により報告された（ジー・クマール（Kumar, G.）とエム・エス・プーニアン（Poonian, M.S.）、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-4912）ように必要なジヌクレオチドの調製法を提供する。こうして得られるダイマーは、その５’末端をジメトキシ−トリチル基により保護され、一方ダイマーの３’末端は、シアノエチルホスホルアミジトにより誘導体化される。塩基は、当該分野において報告され、ホスホルアミジト法によるオリゴヌクレオチド合成において使用されている保護基により保護される（特に問わないが図１に示される例のように）。ダイマー純度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびリン31を用いる核磁気共鳴（３１Ｐ−ＮＭＲ）によって測定すると、８５〜９０％である。本発明の範囲を明確にするために、種々のダイマーの合成方法は、これらがポリヌクレオチド合成に利用される固体マトリックス上の縮合方法と矛盾のないものである限り、重要ではない。
【００８７】
ε．好適な実施態様において、ポリヌクレオチド合成は、支持体として樹脂を含有する固相合成のための４個のクロマトグラフィー用カラムを合成容器として利用して、使用する装置の製造業者の通常のプロトコールを採用して、並行して行われる。いずれにしても本特許において、一例としてパーキンエルマー（Perkin Elmer）社の方法を記載するが、他の任意のセット、または同じかもしくは充分類似の化学反応に基づく固相合成法を利用することも同様に可能である。
【００８８】
次に４個の合成カラムをこのセットに連結して、通常は（しかし必ずではない）単一かつ所定の配列を有する３’末端部分の並行合成に利用する。ここには、しばしば制限酵素のための切断部位、またはクローニングもしくはポリヌクレオチドの他の任意の望ましい応用のために有用な他の任意の配列を含んでいる。
【００８９】
ζ．次にカラム１、２、３および４（後で加えられるモノヌクレオチドにより、Ｔ、Ｃ、ＡおよびＧとも呼ぶ）上に、それぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧに対応するジヌクレオチド混合物を、選択される参照用の表（例えば、本項のα、βおよびγに前述されるように作成した、表II、IV、Ｖ、VIまたは他のものの１つ）に特定されるコドンの明確化のために加えられる。Ｔに対応するジヌクレオチドを含有する混合物は、混合物Ｔと命名され、Ａに対応するものは混合物Ａと命名され、ほかも同様である。
【００９０】
種々の混合物のモル組成および結合時間は、状況により最適化する必要がある。
【００９１】
通常の実施では、結合時間は、２０秒〜８分の範囲で選択されるが、一方混合物中に存在する単一のジヌクレオチドの相対モル濃度は、単一のジヌクレオチドの純度とその反応性を考慮に入れて、等モル濃度から逸脱してもよい。単一のジヌクレオチドの反応性の指標は、ヴィルネカス（Virnekas）ら（ヴィルネカス（Virnekas）ら、１９９４年）；オノ（Ono）ら（オノ（Ono）ら、１９９４年）；カグシン（Kagushin）ら（カグシン（Kagushin）ら、１９９４年）に考察されたように、同じ３’末端ジヌクレオチドを有するトリヌクレオチドの反応性から推測することができる。
【００９２】
ダイマー縮合反応は、トリチル放出により測定すると、一般に９０〜９５％の収率で起こる。
【００９３】
η．次の合成工程は、対応するカラムへの各モノマーの結合、および本明細書に後述の混合である：
カラム１（混合物Ｔ）５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、チミジン、３’−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジト
カラム２（混合物Ｃ）５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、デオキシシチジン  Ｎ４−ベンゾイル  ３’−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジト
カラム３（混合物Ａ）５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、デオキシアデノシン  Ｎ６−ベンゾイル  ３’−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジト
カラム４（混合物Ｇ）５’−Ｏ−ジメトキシトリチルモノマー、デオキシグアノシン  Ｎ２−イソブチリル  ３’−Ｏ−シアノエチルホスホルアミジト。
【００９４】
反応しなかった配列の通常のアセチル化、およびヌクレオチド間リン架橋の酸化（古典的合成工程による）後、合成は停止する。
【００９５】
θ．４個の合成カラムを開けて、均質な混合物を得るためにその樹脂を混合する。
【００９６】
ι．４個の合成カラムは、１カラム当たり等量の樹脂で復元して、カラムを合成機に再接続する。
【００９７】
κ．ζからιの方法を、ポリヌクレオチドに挿入されるランダム型トリヌクレオチドの数に必要とされるだけの回数反復する。
【００９８】
λ．合成は、４個のカラム上で並行して、εに考察された３’末端配列と類似した官能基を有する、所定配列のポリヌクレオチドの５’末端テールを合成して通常終了する。
従って、開示された全事項を考慮に入れて、本発明の主題は、全体にまたは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの化学合成方法であり、そのためランダム配列では、コドンに対応する各トリヌクレオチド単位は、有限数のあらかじめ決められた配列をとりうる。この方法は、ランダム配列部分合成のモノマー単位としてあらかじめ合成したモノヌクレオチドとジヌクレオチドを利用するという事実、および該合成は、多数の支持体上で行われるという事実を特徴とし、そのため該支持体のそれぞれの上には、該ジヌクレオチドの混合物が結合している少なくとも１個の反応サイクルが、少なくとも１個のモノヌクレオチドが結合している反応サイクルと互い違いになっている。好適な実施態様において、１個のコドン合成に必要なｎ回の反応サイクルの最後に、支持体が、混合され、次に２個またはそれ以上の反応容器に再分割される。
【００９９】
詳細には、考えられるケースは、それぞれ第１または第３の塩基を共有するコドンの、第２および第３塩基、または第１および第２塩基を作るジヌクレオチドのケースである。
【０１００】
さらに、考えられるケースは、このようなポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドから構成されるケース、さらにこれらがリボヌクレオチドから作られるケースである。
【０１０１】
第１塩基を共有するコドンの第２および第３塩基に対応するジヌクレオチド（好適な実施態様に見られるように、Ｂ＋Ｄ構造に相当する）が利用されるとき、本方法は、ａ）〜ｉ）の操作において上記で詳細に説明したものである。
【０１０２】
第３塩基を共有するコドンの第１および第２塩基に対応するジヌクレオチドが利用される類似したケース（Ｄ＋Ｂスキームに対応する）では、方法は、ｄ）とｅ）においてその操作を逆転させるほかは、ほぼ完全に同じである。
【０１０３】
該合成が並行して行われるとき特定のケースが起こり、そして混合物が４という数であるとき、支持体は樹脂から構成され、そして容器はカラムから構成される。
【０１０４】
本発明の主題はまた、大腸菌（E. coli）、真核生物および酵母ゲノムにおいて最もよくあるコドンに対応するトリヌクレオチド単位の形成を決定するジヌクレオチド、そして具体的にはそれぞれジヌクレオチドのＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＧＴ、ＧＧ、ジヌクレオチドＴＣ、ＴＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＡＧ、ＧＣ、ＧＧおよびジヌクレオチドＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＴ、ＣＡ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＧＴ、ＧＡ、ＧＧを利用する方法である。
【０１０５】
第１シリーズのジヌクレオチドに関して、以下のような４種の混合物：Ｗ＝ＴＣ；ＴＧ；ＣＣ；ＡＣ；ＡＡ；Ｘ＝ＴＧ；ＣＧ；ＡＣ；ＡＧ；ＧＴ；Ｙ＝ＴＴ；ＣＴ；ＡＣ；ＡＡ；ＧＴ；Ｚ＝ＴＣ；ＣＴ；ＡＣ；ＧＴ；ＧＧ；として混合されるケースが特に考えられ、およびコドンが以下のグループ分け：
ＡＷ1＝イソロイシン、メチオニン、トレオニン、アスパラギン、リジン；
ＣＸ1＝ロイシン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン；
ＧＹ1＝バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン；
ＴＺ1＝フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、トリプトファン；によって４種の樹脂カラム上で得られるケースが考えられる。
【０１０６】
最後に、ジヌクレオチドが以下のモル比：Ｗ2：［ＡＡ］＝［ＣＣ］＝［ＴＧ］＝［ＡＣ］＝１Ｍ、［ＴＣ］＝１．５Ｍ；Ｘ2：［ＴＧ］＝［ＡＣ］＝［ＧＴ］＝［ＣＧ］＝１Ｍ、［ＡＧ］＝１．５mM；Ｙ2：［ＧＴ］＝［ＡＣ］＝［ＣＴ］＝［ＡＡ］＝１Ｍ、および［ＴＴ］＝１．５Ｍ；Ｚ2：［ＧＧ］＝２Ｍ、［ＡＣ］＝［ＣＴ］＝［ＧＴ］＝１Ｍおよび［ＴＣ］＝１．５Ｍ；でこれらの中で混合されるケースを同じ関連で考えられる。
【０１０７】
これまで本発明を一般的に説明した。以下の例を参照して、本発明の目的、特徴、利点および操作の様式をより理解できるように、その具体的実施態様をさらに詳細に説明する。これらの例は、例示のためだけであって、添付される請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する目的であるのではない。
【０１０８】
例１
図１に記載される式による１１個の保護ジヌクレオチドの合成。
表IVの試験からの、部分的にランダム化された（しかし大腸菌（E. coli）における良好な転写のために制御されている）配列を有するポリヌクレオチドの合成に必要なダイマーを調製するために、ジー・クマール（Kumar, G.）とプーニアン（Poonian）が報告した方法（ジー・クマール（Kumar, G.）とエム・エス・プーニアン（Poonian, M.S.）、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-4912）により、表中で網掛けされて示す１１個のジヌクレオチドを調製することを決定した。こうして得られたダイマーは、その５’末端でジメトキシトリチル基により保護され、一方ダイマーの３’部分は、シアノエチルホスホルアミジトにより誘導体化される。塩基は、クーマール（Koomar）とプーニアン（Poonian）により報告され図１で特定される、ホスホルアミジト法によりオリゴヌクレオチドの合成において使用される保護基で保護される。
【０１０９】
ＴＬＣと３１Ｐ−ＮＭＲで測定されるダイマー純度は、分析データの以下のリストから推測した：
【０１１０】
全てのダイマーに共通の１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：
δ  １．１５−１．２５（１２Ｈ，ｍ，イソプロピル）、２．１５−２．５０（４×２’−Ｈ）、２．８０−２．９０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ2ＣＮおよび２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2  シアノエチル）、３．７０−３．９０（１３Ｈ，ｍ，５’ヌクレオシドの２×５’−Ｈ，ＤＭＴｒの２×ＯＣＨ3，ＰＯＣＨ3および２Ｈ，ｍ，−ＣＨ−イソプロピル）、４．００−４．５０（４Ｈ，３’ヌクレオシドの２×５’−Ｈおよび２×４’−Ｈ）、５．００−５．３５（２Ｈ，ｍ，３’−Ｈ）、６．２０−６．５０（２Ｈ，ｍ，１’Ｈ）、６．８０−６．９５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＤＭＴｒの３，３’，５，５’−Ｈ）、７．１５−７．３０（ＤＭＴｒの９Ｈ）
【０１１１】
ＤＭＴｒ  Ｔ／Ｔ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．９０−１．９５（６Ｈ，ｍ，チミンのＣＨ3）、７．２０−７．２５（２Ｈ，ｍ，チミンの６−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −１．４１、−２．２６（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．００、１４８．６０（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １０８５．０３（Ｍ＋Ｎａ+）；Ｒｆ：０．４４（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１２】
ＤＭＴｒ  Ａ／Ａ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  ７．２０−８．０５（１０Ｈ，ｍ，ｂｚ）、８．１０−８．８０（４Ｈ，ｍ，アデニンの２−Ｈおよび８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −１．６９、−１．９１（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４８．１０、１４８．６０（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２８９．５（Ｍ＋Ｎａ+）、Ｒｆ：０．４７（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１３】
ＤＭＴｒ  Ｃ／Ｃ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  ７．２５−７．４０（４Ｈ，ｍ，シトシンの２×５，６−Ｈ）、７．５０−８．２０（１０Ｈ，ｍ，ｂｚ．）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −１．１９、−１．９４（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．８８、１４９．０７（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２４２．５（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．４８（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１４】
ＤＭＴｒ  Ｇ／Ｇ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．２０−１．４０（１２Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ3）、２．４０−２．５５（２Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ）、７．５０−７．６０（２Ｈ，ｍ，グアニンの８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −２．１９、−１．５１（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．６９、１４８．１９（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２５３．２（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．３７（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１５】
ＤＭＴｒ  Ｔ／Ｃ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．２０−１．４０（３Ｈ，ｍ，チミンのＣＨ3）、７．３０−７．４０（３Ｈ，ｍ，シトシンの５，６およびチミンの６−Ｈ）、７．４５−８．２０（５Ｈ，ｍ，ｂｚ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．００、−１．９８（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．８、１４８．４（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １１５２．４（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．４１（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１６】
ＤＭＴｒ  Ｔ／Ｇ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．０５−１．１５（６Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ3）、１．２０−１．３０（３Ｈ，ｍ，チミンのＣＨ3）、２．３０−２．４５（１Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ）、７．２０−７．２５（１Ｈ，ｍ，チミンの６−Ｈ）、７．４０−７．７０（１Ｈ，ｍ，グアニンの８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −２．２０、−３．００（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．２０、１４８．２０（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １１５８．４（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．３７（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１７】
ＤＭＴｒ  Ａ／Ｇ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．０５−１．１５（６Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ3）、２．３０−２．５０（１Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ）、７．４５−８．７０（８Ｈ，ｍ，２，３，４，５，６−Ｈ  ジｂｚ，グアニンの８−Ｈおよびアデニンの２，８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −１．６３、−２．２０（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．０６、１４８．５４（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２７１．４（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．３８（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１８】
ＤＭＴｒ  Ａ／Ｃ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  ７．０５−７．１５（２Ｈ，ｍ，シトシンの５，６−Ｈ）、７．５０−８．７０（１２Ｈ，ｍ，ｂｚの２×（２，３，４，５，６−Ｈ）およびアデニンの２，８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −０．１９、０．２９（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．６６、１４８．６６、１４８．５５（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２６６．１（Ｍ＋Ｈ+）；Ｒｆ：０．４４（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１１９】
ＤＭＴｒ  Ｃ／Ｔ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．４０（３Ｈ，ｓ，チミンの３Ｈ）、７．２０−７．４０（３Ｈ，ｍ，シトシンの５，６−Ｈおよびチミンの６−Ｈ）、７．５０−８．０５（５Ｈ，ｍ，ｂｚ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −１．５３、−１．９８（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４８．２０、１４８．４５（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １１７５（Ｍ＋Ｎａ+）；１１９１（Ｍ＋Ｋ+）；Ｒｆ：０．４２（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１２０】
ＤＭＴｒ  Ｇ／Ｔ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．１−１．２５（６Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ3）、１．３０−１．３５（３Ｈ，ｍ，チミンのＣＨ3）、２．２５−２．５０（１Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ）、７．１５−７．２０（１Ｈ，ｍ，チミンの６−Ｈ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，グアニンの８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −０．４０、−１．００（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４８．００、１４８．８０（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １１５８．５（Ｍ＋Ｈ+）；１１８１（Ｍ＋Ｎａ+）；１１９６．４（Ｍ＋Ｋ+）；０．４１（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１２１】
ＤＭＴｒ  Ｃ／Ｇ  Ｐｈｏｓ
1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  １．３０（６Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ3）、２．２０−２．２５（１Ｈ，ｍ，イソブチリルのＣＨ）、７．１５−７．２５（２Ｈ，ｍ，シトシンの５，６−Ｈ）、７．４５−８．３０（６Ｈ，ｍ，５Ｈ  Ｂｚおよびグアニンの８−Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3）：δ  −２．４７、−２．６９（２×Ｐ（Ｖ）ジアステレオマー）；１４７．７５、１４８．１６（２×Ｐ（III）ジアステレオマー）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２４６（Ｍ＋Ｈ+）；０．４４（５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）
【０１２２】
このデータから、合成されたダイマーの純度は、８５〜９０％の間であると推測することができる。
【０１２３】
例２
下記式の２０種のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの合成：
5’-A GTC GCG [P' P] TCG ACC T-3’
（ここで、Ｐ’およびＰは、微生物の大腸菌（E. coli）の既知の使用頻度を反映するように選択された、２０種の天然アミノ酸の任意のものをコードしうるトリヌクレオチドを意味する）。
【０１２４】
この合成から生じる混合物は、実際には総数４００種の異なるポリヌクレオチドから構成されるであろう。
【０１２５】
例１に関して調製された１１種のジヌクレオチドは、次に以下の方法で調製される：
【０１２６】
混合物Ｚ
ダイマー  ＴＣ      ０．０２２５mmol
ＣＴ      ０．０１５mmol
ＡＣ      ０．０１５mmol
ＧＴ      ０．０１５mmol
ＧＧ      ０．０３mmol
【０１２７】
秤量した量を次に１mlアセトニトリルに溶解して、０．０９７５mmol/ml（すなわち、０．０９７５Ｍ）の最終濃度を得る。
【０１２８】
混合物Ｘ
ダイマー  ＴＧ      ０．０１５mmol
ＣＧ      ０．０１５mmol
ＡＣ      ０．０１５mmol
ＡＧ      ０．０２２５mmol
ＧＴ      ０．０１５mmol
【０１２９】
秤量した量を１mlアセトニトリルに溶解して、０．０８２５mmol/ml（すなわち、０．０８２５Ｍ）の最終濃度を得る。
【０１３０】
混合物Ｗ
ダイマー  ＴＣ      ０．０２２５mmol
ＴＧ      ０．０１５mmol
ＣＣ      ０．０１５mmol
ＡＣ      ０．０１５mmol
ＡＡ      ０．０１５mmol
【０１３１】
秤量した量を１mlアセトニトリルに溶解して、０．０８２５mmol/ml（すなわち、０．０８２５Ｍ）の最終濃度を得る。
【０１３２】
混合物Ｙ
ダイマー  ＴＴ      ０．０２２５mmol
ＣＴ      ０．０１５mmol
ＡＣ      ０．０１５mmol
ＡＡ      ０．０１５mmol
ＧＴ      ０．０１５mmol
【０１３３】
秤量した量を１mlアセトニトリルに溶解して、０．０８２５mmol/ml（すなわち、０．０８２５Ｍ）の最終濃度を得る。
【０１３４】
４種の混合物（Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ）は、３０ppm未満の水を含有するアセトニトリルにアルゴン下で可溶化して、ＤＮＡアプライド・バイオシステム（DNA APPLIED BIOSYSTEM）３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機に、それぞれ機械の５，６，７，８の位置に載せる。全ての試薬（溶媒、アクチベーター、および４０nmol規模の合成カラム）はパーキンエルマー（PERKIN ELMER）から購入して、製造業者の指示書により使用した。
【０１３５】
合成は、オリゴヌクレオチド：
カラム１      ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
の３’部分の４個のカラム上で並行する合成から開始する。
【０１３６】
次にオリゴヌクレオチドの縮重部分を前述のように合成する：
【０１３７】
カラム１、２、３および４上に、前述の濃度のダイマー混合物Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺを加え、３分の結合時間で反応を行う。ダイマーの縮合反応は、トリチル放出により測定して、通常９０〜９５％の収率で行われる。カラム上で以下のオリゴヌクレオチドが合成される：
カラム１      Ｗ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      Ｘ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      Ｙ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      Ｚ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
【０１３８】
次に反応カラム１、２、３および４上への、それぞれ塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの添加が続く：
カラム１      ＡＷ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      ＣＸ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      ＧＹ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      ＴＺ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
【０１３９】
通常の（古典的な合成方法による）アセチル化および酸化反応後、合成は停止される。カラムを分解し、開き、そして４個の合成カラムの樹脂をひとつにして（全体で４０mg）、均質に混合する。
【０１４０】
次に混合物を４等分（４×１０mg）に再分割し、次いで４個の新しい合成カラムにまた再分割する：
カラム１      Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
（ここで、Ｐ＝（ＡＷ＋ＣＸ＋ＧＹ＋ＴＺ）である）。
【０１４１】
この方法は、第２の縮重位置：Ｐ’について反復する。
【０１４２】
混合物Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは、それぞれカラム１、２、３および４に加える：
カラム１      Ｗ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      Ｘ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      Ｙ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      Ｚ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
【０１４３】
次にそれぞれのカラムへの第３コドンの添加が続く：
カラム１      ＡＷ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      ＣＸ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      ＧＹ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      ＴＺ  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
【０１４４】
次に４個のカラムの樹脂を均質に混合して、４個の新しい合成カラムに再分割する。この時点で、第２の縮重コドンＰ’を合成したため、カラムは以下を含有する：
カラム１      Ｐ’  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム２      Ｐ’  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム３      Ｐ’  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
カラム４      Ｐ’  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ      −３’
（ここで、Ｐ’＝Ｐ＝（ＡＷ、ＣＸ、ＧＹ、ＴＺ）である）。
【０１４５】
第２のトリヌクレオチドＰ’（塩基＋ダイマー混合物）の合成後、５’領域に側面を接するオリゴヌクレオチド［ＡＧＴ  ＣＧＣ  Ｇ］を４個のカラム上に並行して合成し、従って配列オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＧＴ  ＣＧＣ  Ｇ  Ｐ’  Ｐ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ−３’
［ここで、コドン：ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＣＧ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＧＴ、ＧＴＴ、ＧＣＴ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＧＴ、ＴＴＣ、ＴＣＴ、ＴＡＣ、ＴＧＴおよびＴＧＧに対応する、Ｐ’＝Ｐ＝（ＡＷ、ＣＸ、ＧＹ、ＴＺ）である］を構成する。
【０１４６】
合成が終了したら、合成用に使用された樹脂に固定されていたオリゴマーを除外して、Ｏ−メチルホスホルアミジトの化学を使用して、合成オリゴヌクレオチドの作成に採用された古典的方法により脱保護する（７）。
【０１４７】
例３
下記配列：
５’−Ａ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ［Ｐ’  Ｐ］  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ−３’
［ここで、コドン：ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＣＧ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＧＴ、ＧＴＴ、ＧＣＴ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＧＴ、ＴＴＣ、ＴＣＴ、ＴＡＣ、ＴＧＴおよびＴＧＧに対応する、Ｐ’＝Ｐ＝（ＡＷ、ＣＸ、ＧＹ、ＴＺ）である］を有する、例２において合成されたポリヌクレオチドの機能性および遺伝子解析
例２において合成された縮重ポリヌクレオチドは、４００個のポリヌクレオチドの混合物から作られる。本例において、この混合物は便宜上「ポリヌクレオチドＢ」と呼んだ。その真の組成を分析し、合成に期待される４００の分子種全てが混合物中に存在することを実際に確認するために、以下の工程を行った：
【０１４８】
→従来法により以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
オリゴヌクレオチドＡ
１４種のヌクレオチド
配列：５’ＣＧＣＧＡＣＴ  ＡＧＧＴＣＧＡ３’
【０１４９】
このオリゴヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチドＢの３’末端部分とその３’末端部分（７種のヌクレオチド）、およびオリゴヌクレオチドＢの５’末端部分とその５’末端部分（７種のヌクレオチド）の両方において相補的になるよう設計した。
配列（Ａ）＝5'CGCGACTA AGG TCG A  3'
配列（Ｂ）＝5'         TCC AGC T[P P'] GCGCTG A 3'
配列（Ａ）＝5'                         CGCGAC T AGGTCGA  3'
【０１５０】
→両方のオリゴヌクレオチドは、５’末端で酵素的にリン酸化し、等モル量で混合し、９５℃で変性して、次にゆっくり温度を１５℃にしてアニーリングと重合を行った。
【０１５１】
→次に混合物は、酵素で連結させ、次いでクレノウ（Klenow）ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより反応を完了させた。連結反応は、２つの結合したオリゴヌクレオチドＡおよびＢにより構成されたＤＮＡ単位の連続「ヘッド−テール」反復を含有する、二重らせんＤＮＡ断片の形成を伴う。
【０１５２】
→平滑末端を持って生じる生成した断片は、次にｐＢＳｋｓ＋プラスミドのＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。次に連結混合物は、ＥｃｏＲＶ消化により組換えクローンを濃縮して、コンピテントＸＬ−１ブルー細菌細胞を形質転換するのに使用した。
【０１５３】
→組換えクローンは、ＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｘｇａ１／ＩＰＴＧプレート上で比色定量的選択により同定した。
【０１５４】
→２０個のランダムに選択したクローンを拡張し、そこに含まれる全組換え配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅およびクローン化した。
【０１５５】
→アガロースゲル上の電気泳動による分析により、各クローン挿入配列の長さを測定した。
【０１５６】
→２０個のクローンの挿入配列を配列決定して、それによってオリゴヌクレオチドＢに含まれる１７０個の可変部分が決定された。
【０１５７】
表VIIIは、本実験計画により準備された２０個のトリヌクレオチドのそれぞれについて観察された頻度を示す。表VIIIから、本実験計画（表IVに従う）において期待された全てのトリヌクレオチドが存在し、その頻度は、均一な分布から有意には突出しないことが判る。
【０１５８】
表VII：本発明の方法で合成した、縮重オリゴヌクレオチドのライブラリーにおいてランダムに選択された２０個のクローンのＤＮＡの縮重部分に存在する１７０個のコドンの配列決定から観察されたトリプレットの頻度。
【表７】
0003986255.tif 000008
【０１５９】
引用文献
●エム・ジェイ・ゲイト（Gait, M.J.）、オリゴヌクレオチド合成「実際のアプローチシリーズ」 (1984) ＩＲＬプレス・オックスフォード・ワシントンＤＣ
●ダブリュー・ファン（Huang, W）とディー・ブイ・サンティ（Santi, D.V.）、(1994) Anal. Biochem. 218, p.454-457
●エイ・エル・カユシン（Kayushin, A.L.）、エム・ディー・コロステレヴァ（Korosteleva, M.D.）、エイ・アイ・ミロシュニコフ（Miroshnikov, A.I.）、ダブリュー・コッシュ（Kosch, W.）、ディー・ズボフ（Zubov, D.）およびエヌ・ピール（Piel, N.）、(1996) Nucleic Acid Research vol.24, No.19
●ジー・クマール（Kumar, G.）とエム・エス・プーニアン（Poonian, M.S.） 、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-4912
●エム・エイチ・リトル（Lyttle, M.H.）、イー・ダブリュー・ナポリターノ（Nabolitano, E.W.）、ビー・エル・カリオ（Calio, B.L.）およびエル・エム・カウヴァー（Kauvar, L.M.）、Biotechniques (1995), Vol.19, N 2, p.274-280
●エイ・オノ（Ono, A.）、エイ・マツダ（Matsuda, A.）、ジェイ・ザオー（Zhao, J.）およびディー・ブイ・サンティ（Santi, D.V.）、Nucleic Acids Research (1994), Vol.22; N25, p.5600-5607
●ジェイ・サムブルーク（Sambrook, J.）、イー・エフ・フリッシュ（Fritsch, E.F.）およびティー・マニアティス（Maniatis, T.） (1989) 「分子クローニング。実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州
●ビー・ビルネカス（Virnekas, B.）、エル・ゲー（Ge, L.）、エイ・プルックスタン（Plucksthun, A.）、ケイ・シー・シュナイダー（Schneider, K.C.）、ジー・ウェルンホッファー（Wellnhofer, G.）およびエス・イー・モロニー（Moroney, S.E.）、Nucleic Acids Research (1994),  Vol.22; N25, p.5600-5607
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図１によりさらに明らかになろう。
【図１】  最終配列コドンの合成において、モノマー単位として利用されるダイマーの化学構造を示す。各ダイマーは、各ダイマーについて特定されるように、Ｂ２位の基および次にＢ１位の基を置換することにより得られる。
【図１】
0003986255.tif 000014