(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、コンデンサレンズと、該コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に配置された部分開口を有する開口部材と、対物レンズと、前記開口部材と略共役な位置に配置された変調器とを備えた変調コントラスト顕微鏡であって、前記変調器は透過率Ｔ（％）の領域を備え、以下の条件を満たすようにしたことを特徴とする変調コントラスト顕微鏡。
1.05<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.4
8<T<25
但し、Moは前記透過率Tの領域における半径方向の長さ、Mcは前記部分開口における半径方向の長さ、fcは前記コンデンサレンズの焦点距離、frは標本面から前記変調器までの間にある光学系の焦点距離である。
【請求項２】
前記透過率Tの領域の顕微鏡光軸からの距離Dが以下の条件を満たすようにした請求項１に記載の顕微鏡。
0.2R<D<0.6R
但し、Rは変調器が配置されている面の有効半径である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に変調コントラスト顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、不妊治療の一つに顕微鏡を用いたICSI(卵細胞質内精子注入法)が盛んに行なわれているが、ICSIでは変調コントラスト法（ホフマンモジュレーションコントラスト：Modulation Optics社の登録商標）が多く使われている。この変調コントラスト法は、特開昭５１−２９１４９号公報に開示されており、公知の技術であるが、図６乃至８を用いてその原理を簡単に説明する。図中、５はコンデンサレンズ、Sは標本、７は対物レンズである。また６は開口板で、中心部から離れた位置に矩形状開口６ａを有している。また、１４は円盤状の変調器で、開口板６と略共役な位置に配置されている。この変調器１４には、開口６aの像を含み得る透過率１００％の領域１４aと、例えば透過率１５％の領域１４bと、透過率０％の領域１４cとが順に隣接して配置形成されている。
【０００３】
この光学系では、矩形状開口６aが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ5に入射した光は標本Ｓを斜め方向から照明するように射出する。このとき、透明な標本Sが図６（a）に示すように扁平であると、標本Sを透過した光束は対物レンズ７により変調器１４の領域１４b内に結像し、図７（a）に示すように領域１４b内に開口像６a'が形成される。また、標本Sの表面が図６（b）に示すように右肩上がりの斜面となっていると、標本Sを透過するとき光束は右方へ屈折して変調器１４の領域１４c内に結像し、図７（b）に示すように領域１４c内に開口像６a'が形成される。また、標本Sの表面が図６（c）に示すように左肩上がりの斜面となっていると、標本Sを透過するとき光束は左方へ屈折して変調器１４の領域１４a内に結像し、図７（c）に示すように領域１４a内に開口像６a'が形成される。
【０００４】
この説明で明らかなように、標本Sが図８（a）に示すような平坦面と斜面とを有する無色透明体である場合、その観察像は図８（b）に示すように平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒または白く見える。このように、変調コントラスト法では、変調器１４に設けた異なる透過率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透明な標本でも陰影を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
変調コントラスト法は、上述のように卵細胞に精子を注入する時に用いられるが、その場合には、卵の周縁部にある透明帯と呼ばれる部分、特に卵細胞とその外側（例えば培養液）との境界部分が良く見えることが必要である。また周縁部より内側の部分では、この部分に存在する顆粒などの微細構造も良く見えることが必要である。しかしながら、従来のホフマンモジュレーションコントラストは、卵を見たときのコントラストは適切であるが、透明帯や顆粒などの細かい部分がコントラストが高すぎて見づらいという問題点があった。
【０００６】
本発明は、従来技術の有するこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、卵細胞の透明帯やその内側の微細構造の見えが最適となる変調コントラスト顕微鏡を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の変調コントラスト顕微鏡は、光源と、コンデンサレンズと、該コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に配置された部分開口を有する開口部材と、対物レンズと、前記開口部材と略共役な位置に配置された変調器とを備えた変調コントラスト顕微鏡であって、前記変調器は透過率Ｔ（％）の領域を備え、以下の条件を満たすようにしたことを特徴としている。
1.05<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.4
8<T<25
但し、Moは前記透過率Tの領域における半径方向の長さ、Mcは前記部分開口における半径方向の長さ、fcは前記コンデンサレンズの焦点距離、frは標本面から前記変調器までの間にある光学系の焦点距離である。
本発明によれば、前記透過率Tの領域の顕微鏡光軸からの距離Dが0.2R<D<0.6Rなる条件を満たすように構成されている。但し、Rは変調器が配置されている面の有効半径である。
【０００８】
【発明に実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図示した実施例に基づき説明する。図１は本発明に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成を示す図である。図中、１は光源、２はコレクタレンズ、３は照明レンズ、４はミラー、５はコンデンサレンズ、６は開口板、７は対物レンズ、８はレボルバ、９，１０，１１，１２はリレーレンズ、１３は接眼レンズ、１４は変調器、１５は標本Sを載置するためのステージである。
開口板６はコンデンサレンズの前側焦点位置、あるいはその近傍に配置されている。そして、図２に示すように、開口板６には中心から離れた周辺部に矩形状の開口部６ａが設けられている。本実施例では、開口板６とは矩形状の開口部の大きさが異なる別の開口板６'が交換できるようになっている。開口板６と開口板６'の交換は、例えばターレット１５に開口板６と開口板６'を配置しておき、このターレット１５を回転させればよい。このようにすれば、開口板６と開口板６'のいずれか一方を光路内へ挿入することができる。また、変調器１４は対物レンズ７の後側焦点位置、あるいはその近傍に配置されている。この位置は、開口板６と開口板６'と略共役な位置である。また、変調器１４は図３に示すように透過率がＴ％の領域１６が設けられている。この、透過率がＴ％の領域１６は、矩形状の開口部６ａと同じように中心から離れた周辺部に形成されている。
【０００９】
この実施例において、Moを透過率がT％の領域１６における半径方向の長さ、Mcを矩形状の開口部６aにおける半径方向の長さ、fcをコンデンサレンズ５の焦点距離、frを標本面から前記変調器１４までの間にある光学系の焦点距離としたとき、下記の条件式を満足するように構成されている。なお、半径方向とは、図２あるいは図３に示している矢印方向である。この半径方向は、変調器１４において透過率の変化を示す境界線に対して直交する方向である。
1.05<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.4                             （１）
8<T<25                                                    （２）
【００１０】
本実施例は上記のように構成されているから、矩形状開口６a（開口６bについては後述する。）から射出した光源１からの光は、コンデンサレンズ５，標本S，対物レンズ７及び変調器１４を通過して、標本像を形成する。この標本像は従来技術で説明したように、標本の形状に応じてコントラストがついており、観察者は接眼レンズ１３を介して観察する。そして、上記条件式（１）は、半径方向に見た変調器１４の透過率Tの領域の大きさと、変調器１４が配置されている面内に投影される矩形状の開口部６aの半径方向の大きさとの比率を表しており、透過率Tの領域の大きさが上記開口像の大きさの１．０５倍から１．４倍の大きさとなっていることを示している。矩形状の開口部６aはコンデンサレンズ５の前側焦点位置近傍に配置されているため、変調器１４に投影される開口像の半径方向の大きさはMc×fr/fcとなる。
【００１１】
従来の変調コントラスト法では、透過率Ｔ％の領域の大きさと、この領域に投影された矩形状の開口部の大きさがほぼ同じであった。そのため、卵細胞のように凹凸の変化が大きい（厚みの変化が大きい）標本内を光が通過すると、この凹凸によって光が大きく屈折してしまう。そのため、変調器１４上に投影される開口は、透過率T％の領域からずれてしまう。この結果、コントラストが付き過ぎて観察像はぎらぎら輝くような像になり、細かい部分が見えなくなってしまう。これに対して、本発明では、透過率T％の領域を変調器１４上に投影される開口よりも大きくなるように選定したから、上記コントラストが抑えられて、細かい部分も良く見えるようにすることが出来る。
【００１２】
即ち、上記条件式（１）の上限を下回ると、観察像においてぎらつきが大きくなり過ぎてしまう。そのため、例えば卵細胞であれば、透明帯やその内側の細かい部分が見えない。また、この比が上限を上回ると、コントラストが弱くなり過ぎて、卵細胞全体が見難くなる。また、上記条件式（２）は、透過率T％の数値条件を示しているが、この透過率が（２）式の下限を下回ると、例えば卵細胞では、周辺部と中心部とのコントラストの差が強くなり過ぎ且つ中心部の像が暗くなり過ぎて観察し難くなる。また、この透過率が（２）式の上限を上回ると、コントラストが弱くなり過ぎて卵細胞全体が見難くなる。
【００１３】
実験の結果、|(Mo×fc)／(Mc×fr)|が下記の条件を満たすようにすれば、更にコントラストと解像バランスの良い変調コントラスト観察が可能であることが分かった。
1.15<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.3                            （３）
【００１４】
また、本実施例において、透過率T％の領域の顕微鏡光軸からの距離をD、変調器１４が配置されている面の有効半径をR(図３参照)としたとき、下記の条件式（４）を満たすことが好ましい。即ち、下記（４）式の下限を下回ると、透過率T％の領域が光軸に近くなりコントラストは向上するが、解像力が悪くなる。また、下記（４）式の上限を上回ると、解像力の点では有利であるが、コントラストが悪くなる。
0.2R<D<0.6R                                              （４）
【００１５】
また、本実施例において、NAoをNA（開口数）が最大の対物レンズのNA、NAcをコンデンサレンズ５のNAとしたとき、下記の条件式（５）を満たすことが好ましい。
0.7NAo<NAc                                               （５）
上記（５）式はコンデンサレンズのNAを規定したものであるが、この条件から外れると、コンデンサレンズのNAが小さくなり、解像力の良い変調コントラスト観察が出来なくなる。
【００１６】
以上、本実施例においては６aを矩形状の開口部として説明したが、これはリング状の開口部であっても良い。但し、コンデンサレンズ５側の矩形状の開口部６ａと光学的に共役な位置に配置されていれば良い。矩形状の開口部６aの像は、対物レンズ７内と顕微鏡本体内にできるが、対物レンズ内の方が開口像のリレー回数が少なくて開口像の収差が少ないため、変調器１４は対物レンズ７内にあった方が望ましい。
【００１７】
なお、本発明は、変調コントラスト顕微鏡を近赤外光で観察することを特徴とする。近年、人工授精の研究分野では、卵細胞に対する損傷が可視光よりも近赤外光の方が少ないと考えられており、近赤外光によるTV観察が検討されて来ている。近赤外光を用いる場合は、可視光よりも変調器１４に投影される矩形状の開口部６aの像が、色収差のためぼやける傾向にある。そこで前記（１）式のように、変調器１４上に投影される矩形状の開口部６aの像よりも透過率Tの領域を大き目に取っていれば、近赤外光によるTV観察でも矩形状の開口部６aの像が透過率Tの領域よりもはみ出ることがなく、コントラストを抑えた観察が可能となる。
【００１８】
また、本実施例では、一つの変調器１４に対して複数の開口部材を切換えて使用するように構成されている。何れの開口部材を用いる場合も前記条件式（２）を満足する変調器１４が使用される。前述のように、矩形状の開口部６aを用いた場合は、コントラストを若干落とすことによりぎらつきを抑え、細かい部分の見え方を改善している。そのため、卵細胞以外の凹凸の少ない標本を見た場合には、コントラストが低く見難く感じることがある。このような場合には、Mcの大きい開口、即ち前記矩形状の開口６bを有する開口部材６'に切換えて観察すれば、前記（１）式の下限を外れてコントラストの良い観察が可能となる。
【００１９】
図４は、本実施例に係る変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。使用された対物レンズの倍率は20X、NAは0.4、コンデンサレンズのNAは0.5、|(Mo×fc)／Mc×fr)|＝1.2、T＝11％、D／R＝0.53である。
【００２０】
図５は従来の変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。使用された対物レンズの倍率は20X、NAは0.4、コンデンサレンズのNAは0.5、|(Mo×fc)／Mc×fr)|＝1、T＝15％、D／R＝0.625である。
【００２１】
図４（ａ）と図５（ａ）において、卵細胞は中心の円形部分とその周りにある輪帯状（リング状）の部分に分かれている。このうち、輪帯状の部分が透明帯である。ここで、図４（ｂ）と図５（ｂ）を比較する。何れの図にも輪帯状の透明帯とその内側の構造が示されている。ここで、図5（ｂ）では透明帯とその内側構造の境界は白く輝いており、透明帯と外部の境界は黒くなっている。これに対して、図４（ｂ）では透明帯とその内側構造の境界も透明帯と外部の境界も灰色近い。よって、図４（ｂ）の方が透明帯の境界を良好に認識できる。また、円形部分の内部構造のうち周辺部にある微細な粒状の構造も図４（ｂ）の方が良好に観察できる。
図４（b）と図５（b）との比較から明らかなように、本発明によれば、従来の変調コントラストによる場合よりも、卵細胞の縁部分が遥かに鮮明に観察され得る。
【００２２】
以上説明したように、本発明の変調コントラスト顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した特徴の他に下記の特徴を有している。
（１）前記開口と略共役の位置に配置されていて該開口の像が投影される透過率T（％）の領域を持つ変調器を備え、以下の条件を満たす請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
1.15<|(Mo×fc)／Mc×fr)|<1.3
（２）以下の条件を満たす請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
0.7NAo<NAc
但し、NAoは変調コントラスト顕微鏡のNAが最大の対物レンズのNA、NAcはコンデンサレンズのNAである。
（３）前記開口が矩形である請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
（４）前記変調器が前記対物レンズ内に配置されている請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
（５）近赤外光を用いて観察するようにした請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
【００２３】
【発明の効果】
上述の如く本発明によれば、ICSI時に透明帯の見えが最適になる変調コントラスト顕微鏡を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成を示す図である。
【図２】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡に用いられる開口板の平面図である。
【図３】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡に用いられる変調器の平面図である。
【図４】本発明実施例に係る変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。
【図５】従来の変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。
【図６】変調コントラストの原理を説明するための図である。
【図７】開口像と変調器との位置関係を説明するための図で、(a),(b),(c)は図６の(a),(b),(c)に夫々対応している。
【図８】  (a)は標本の一形状例を、(b)はこの標本に対応して現れる濃淡をそれぞれ示した図である。
【符号の説明】
１                                    光源
２                                    コレクタレンズ
３                                    照明レンズ
４                                    ミラー
５                                    コンデンサレンズ
６                                    開口板
６a，６b                              開口
６a'，６b'                            開口像
７                                    対物レンズ
８                                    レボルバ
９，１０，１１，１２                  リレーレンズ
１３                                  接眼レンズ
１４                                  変調器
S                                     標本
【図１】
0003958554.tif 000002
【図２】
0003958554.tif 000003
【図３】
0003958554.tif 000004
【図４】
0003958554.tif 000005
【図５】
0003958554.tif 000006
【図６】
0003958554.tif 000007
【図７】
0003958554.tif 000008
【図８】
0003958554.tif 000009