(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化すべき物質を含む液体を表面張力により上方に膨出した状態としておき、該膨出した液体に対して測定チップの表面を密着させて所定時間放置した後、測定チップを液体から分離することを特徴とする測定チップ表面への物質固定化方法。
【請求項２】
固定化すべき物質が生理活性物質であり、測定チップが透光性基板と、該透光性基板の一面上に形成される生理活性物質を固定化する固定化膜とを有する光学的分析装置用測定チップであることを特徴とする請求項１記載の測定チップ表面への物質固定化方法。
【請求項３】
固定化すべき物質を含む液体を表面張力により上方に膨出した状態で保持しておくことのできる液体ホルダーと、測定チップの表面を下方に向けた姿勢で測定チップを保持することのできる測定チップホルダーと、前記液体ホルダーの先端に向けて前記測定チップホルダーを接近させまた離間させるように作動する移動機構とを少なくとも有することを特徴とする測定チップ表面への物質固定化装置。
【請求項４】
前記液体ホルダーは管路を介して固定化すべき物質を含む液体を収容した容器に接続しており、さらに、該容器内の溶液を前記管路を介して液体ホルダーに供給する液体供給手段をさらに有することを特徴とする請求項３記載の測定チップ表面への物質固定化装置。
【請求項５】
前記液体ホルダー内に固定化すべき物質を含む液体を滴下するためのマイクロディスペンサーをさらに有することを特徴とする請求項３記載の測定チップ表面への物質固定化装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定チップの表面へ例えば生理活性物質のような物質を固定化する方法及びそのための装置測に関する。
【０００２】
【従来の技術】
測定チップの表面に試料液などを滴下し、該試料液などを適宜の測定手段により観察し分析することは通常行われている。例えば、透光性の基板上に試料液を配置して光を照射し、反射光や透過光の屈折率や吸収率などの変量に基づき試料を分析することは行われており、具体例として、臨床検査などでの免疫反応を利用した各種検査法において、生理活性物質の変化を高感度に検出することのできる光学的分析方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した光学的分析方法などが挙げられる。
【０００３】
前記した表面プラズモン共鳴を利用した光学的分析方法の場合、光学的分析装置に用いられる測定チップは、一般的には、下から透光性基板、金属薄膜及び分析対象物に応じた生理活性物質を固定化した固定化膜とからなり、このような構成を有する測定チップが、光学的分析装置のプリズム上に透光性基板側が面するようにしてセットされる。試料液は、給液ポンプを利用して生理活性物質を固定化した固定化膜面に連続して送り込まれるか、試料液を収容したセルの液体面が固定化膜に接触するようにされ、生理活性物質と分析対象物の相互作用を生じさせる（例えば、特公平５−２１８１号公報、特開平６３−７５５４２号公報など参照）。また、固定化膜に生理活性物質を固定化するには、固定化層を設けた基板を生理活性物質の濃厚溶液に浸漬するか、マイクロディスペンサーにより滴下する方法が取られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、表面プラズモン共鳴を利用した光学的分析方法の場合には、透光性基板の裏面に照射する入射光と該金属薄膜からの反射光の光学的分析から必要な情報を得るものであり、測定チップを構成する透光性基板表面の金属膜上の生理活性物質はごく小面積であって良く、また、固定化膜上に固定化された生理活性物質上には極少量の試料液が存在すれば十分に目的が達せられる。しかし、固定化層を設けた基板を生理活性物質の濃厚溶液に浸漬する方法によって生理活性物質を固定化する方法は、大量の濃厚溶液を必要とする。また、前記公報に記載されるような方法により、生理活性物質と分析対象物の相互作用を生じさせる場合にも、大量の試料液の調製を必要とし、試料調製のために、時間的かつコスト的にロスが存在する。
【０００５】
本発明者らは、微量の生理活性物質の濃厚溶液あるいは試料液を測定チップ表面、すなわち透光性基板表面の固定化膜上に供与する手段として、従来知られたマイクロディスペンサーを用いて測定チップ表面に液滴を滴下することを試みた。しかし、測定チップ表面の親疎水性及び滴下する溶液の性質により、例えば、図７ａ〜図７ｃに示すように、マイクロディスペンサー１０のニードル１１先端から落下する液滴Ｐは、ニードル１１先端の下方位置である基板２０上の所定位置に留まらず、位置ずれを起こしてしまい、固定化あるいは反応に必要とされる時間、所定の場所に液滴を保持しておくことが困難であることを経験した。特に、測定チップの表面が疎水表面を有し、そこに蛋白質溶液を滴下すると上記現象は起こりやすかった。多少位置ずれを起こしても所望の部位を覆うことができる量を滴下すれば、所要の分析を行うことは可能であるが、一般に蛋白質溶液は高価なものであり、量産レベルでは、大量滴下は可能な限り避けなければならない。
【０００６】
対応策として、図８に示すように、液滴Ｐをマイクロディスペンサー１０のニードル１１の先端に形成しておき（図８ａ）、基板表面に溶液が接触しても尚溶液を射出して、所定量射出した後（図８ｂ）に、ニードル１１を引き上げる（図８ｃ）方法を試みた。この手法により、滴下位置は比較的安定し、所要時間にわたり所定位置で液滴を保持することができ、微量での分析が可能となったが、マイクロディスペンサー側の制御が容易でなく、量産レベルの手法としては有効とはいえない。
【０００７】
本発明の目的は、測定チップの表面へ例えば生理活性物質のような物質を固定化する際に生じている上記のような不都合を解消することにあり、固定化すべき物質を含む液体を測定チップの表面に確実に固定化することを可能とする測定チップ表面への物質固定化方法及び装置を提供することにある。
なお、測定チップの表面への物質の固定化態様としては、チップ表面に形成した固定化膜に対して生理活性物質のような物質を固定化する態様と、そのようにして固定化された物質に対して試料液中の分析対象物を相互作用させる態様の二つの態様が存在するが、本発明における「固定化方法」及び「固定化装置」は双方の態様を含むものとして用いている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための本出願の発明による測定チップ表面への物質固定化方法は、固定化すべき物質を含む液体を表面張力により上方に膨出した状態としておき、該膨出した液体に対して測定チップの表面を密着させて所定時間放置した後、測定チップを液体から分離することを特徴とする。
【０００９】
上記発明において、固定化すべき物質を含む液体の自由移動は規制を受けており、当該物質を固定化すべき測定チップの所望の表面部位に、所定の時間、すなわち、液体中に含まれる物質と測定チップ表面物質との反応が進行して固定化するまでの時間、該液体を確実に保持しておくことが可能となる。そのために、少ない液量で所要物質を確実に固定化することができる。
本発明による固定化方法は、固定化すべき物質が生理活性物質であり、測定チップが透光性基板と、該透光性基板の一面上に形成される生理活性物質を固定化する疎水性の固定化膜とを有する光学的分析装置用測定チップである場合に、特に有効に機能する。
【００１０】
本発明は、また、前記の方法を実施する装置として、固定化すべき物質を含む液体を表面張力により上方に膨出した状態で保持しておくことのできる液体ホルダーと、測定チップの表面を下方に向けた姿勢で測定チップを保持することのできる測定チップホルダーと、前記液体ホルダーの先端に向けて前記測定チップホルダーを接近させまた離間させるように作動する移動機構とを少なくとも有することを特徴とする測定チップ表面への物質固定化装置をも開示する。
前記液体ホルダーを管路を介して固定化すべき物質を含む液体を収容した容器に接続し、該容器内の溶液を前記管路を介して液体ホルダーに供給するようにしてもよく、また、前記液体ホルダー内にマイクロディスペンサーを用いて固定化すべき物質を含む液体を滴下するようにしてもよい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面を参照しながら、好ましい実施の形態に基づき本発明を詳細に説明する。なお、以下の説明は、光学的分析装置としての表面プラズモン共鳴を利用した免疫センサーに用いるのに好適な測定チップの表面に生理活性物質を固定化する場合を例として説明するが、測定チップは、これに限らず、他の任意の分析装置に用いる測定チップをも包含する。
【００１２】
表面プラズモン共鳴現象とは、ガラスなどの光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。その分析装置に用いる測定チップは、基本的に、透光性基板と、この基板の一面に形成された金属薄膜と、この金属薄膜の上に形成された生理活性物質を固定化する固定化膜とから構成される。
図１はその測定チップを説明するものであり、透光性基板１の上に金属薄膜２が配置され、その上に、生理活性物質４を固定化する固定化膜３が形成される。透光性基板１は、一般的にはガラスや、レーザー光に対して透明な材料からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度である。
【００１３】
金属薄膜２は、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであればよく、金属の種類としては、金、銀、白金、銅、アルミニウムなどが挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、前記透光性基板１への付着性を考慮して、透光性基板１と金、銀などからなる層との間にクロムなどからなる介在層が設けられる場合もある。金属薄膜２の膜厚は、１００〜２０００Åであるのが好ましく、通常、１００〜５００Å程度である。
【００１４】
生理活性物質４は、分析対象物（例えば、抗原など）と相互作用し得るものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、細菌などが挙げられる。免疫蛋白質としては、例えば分析対象物を抗原とする抗体を使用することができる。抗体としても特に限定されることなく、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、分析対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラックなどを抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体などの抗体を使用することができる。
【００１５】
酵素としては、分析対象物又は分析対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素などを使用することができる。具体的には、分析対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、分析対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラックなどを分析対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼなどの酵素を使用することができる。
【００１６】
微生物、細菌としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物、細菌を使用することができる。また、生理活性物質４はＤＮＡ塩基鎖であってもよく、相補的な塩基鎖を特異的に結合させることができる。
前記生理活性物質４を固定化する固定化膜３は、該生理活性物質４が担持又は固定化される層であればよく、例えば、多孔質材料として、合成繊維、天然繊維、無機繊維などからなる織物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが使用される（特開平３−１６４１９５号公報参照）。さらに、化学あるいは生化学反応に基づいたある特定の官能基を有する材料からなる薄膜のようなものであってもよい。
【００１７】
このような固定化膜３へ生理活性物質４を固定化するのには、何らかの手段により、所定量の生理活性物質４を固定化膜３に所定時間接触させておく必要がある。本発明による測定チップ表面への物質固定化方法及び装置は、このような場合の物質の固定化に用いるのにきわめて有効である。以下に、本発明による方法と装置を用いて、光学的分析装置としての表面プラズモン共鳴を利用した免疫センサーに用いるのに好適な測定チップの表面に形成した固定化膜３に生理活性物質４を固定化する例を具体的に説明する。
【００１８】
なお、本出願人は先の出願である特願平９−２４１２７６号において、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される例えば有機ケイ素膜のような疎水結合又は静電結合した膜、及び該膜上に配置される生理活性物質を備えなる、表面プラズモン共鳴を利用した免疫センサーに用いるのに好適な測定チップを提案しているが、このような疎水結合した膜に対して生理活性物質を固定化するような場合に、本発明による固定化方法及び装置は特に効果的である。
【００１９】
図２は測定チップの一例であり、この光学的分析装置用測定チップＡおいて、前記した透光性基板１は、１辺が１８ｍｍ程度、厚みが０．１〜０．５ｍｍ程度のガラス板である。基板１の素材としては、他に、無延伸ポリエチレンテレフタレート、無延伸ポリカーボネート、トリアセテートなどのように、透光性があり、偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性に優れた物性を持つ樹脂材料も有効に用いることができる。透光性基板１の一面中央部には、前記した金属薄膜２と固定膜３とが積層された分析領域５が形成されている。
【００２０】
具体例として、例えば、透光性基板１として１３ｍｍ×１８ｍｍ、厚さ０．３ｍｍの青板ガラスの上に、スパッタリングによりクロムからなる層、ついで金からなる層を形成し分析領域５とした。スパッタリングは、クロムについては１００Ｗ、３０秒間、金については１００Ｗ、１５０秒間で行った。得られたクロム層の厚さは３２．２Åであり、金層の厚さは４７４Åであった。上記の金属層を有する透光性基板を、ウンデカンチオール１ｍＭエタノール溶液に２４時間浸漬し、図１の固定膜３に相当する有機薄膜層（有機ケイ素膜のような疎水結合した膜）を形成した。
【００２３】
上記のとおりであり、本発明によれば、少量の生理活性物質の濃厚溶液Ｓを確実に測定チップＡの分析領域５の部分に密着させることが可能であり、生理活性化物質が所要位置に確実に固定化された光学的分析装置用測定チップＡを容易に調製することができる。そのために、高価な生理活性物質の濃厚溶液のムダをなくすことができ、低コストでの光学的分析作業が確立される。
【００２４】
図３は、本発明による測定チップ表面への物質固定化方法を実施するための装置の一例であり、この例では、複数個の測定チップＡ・・に対して同時に生理活性物質を固定化できるようにしている。装置４０は、固定化すべき物質を含む溶液Ｓを表面張力により上方に膨出した状態で保持しておくことのできる液体ホルダー４１と、測定チップＡの表面（反応領域５の面）を下方に向けた姿勢で測定チップＡを保持することのできる測定チップホルダー４５とから構成される。液体ホルダー４１は垂直状に立設する複数本の筒状体４２と、各筒状体４２の下端部をそれぞれ連通させるための第１の管路４３とを有し、該第１の管路４３は、第２の管路４４及び液供給ポンプＰａを介して、溶液Ｓが収容された容器６０内に接続している。
【００２５】
さらに装置４０は、前記液体ホルダー４１の筒状体４２の先端に向けて前記測定チップホルダー４５を接近させまた離間させるように作動するネジ機構などから成る適宜の移動機構を備えいている。
固定化に際しては、適宜の制御機構により液供給ポンプＰａを作動して、容器６０内の生理活性物質の濃厚溶液Ｓを液体ホルダー４１に向けて送り出し、濃厚溶液Ｓの一部がその表面張力により筒状体４２の先端から膨出した状態とする。その状態で、測定チップホルダー４５を下降させて、濃厚溶液Ｓの該膨出部と測定チップＡの固定膜３（反応領域５）とを密着させ、所定時間放置する。その間に、固定膜３と生理活性物質４との反応が進行し、液体ホルダー４１と測定チップホルダー４５とを分離することにより、図１に模式的に示したような光学的分析装置用測定チップＡを多数個（図示のものでは２５個）、同時に得ることができる。
【００２６】
図４，図５は、本発明による測定チップ表面への物質固定化方法を実施するための他の装置の例であり、この装置５０は、固定化すべき物質を含む溶液Ｓを表面張力により上方に膨出した状態で保持しておくことのできる多数の有底孔５２・・を持つ液体ホルダー５１と、測定チップＡの表面（反応領域５の面）を下方に向けた姿勢で多数の測定チップＡを保持することのできる測定チップホルダー５５（図５）とを備え、さらに、前記液体ホルダー５１の有底孔５２・・の先端に向けて前記測定チップホルダー５５を接近させまた離間させるように機能する適宜の移動機構を備えている。この例では、該移動機構は図５に示すように液体ホルダー５１の四隅に形成した垂直孔５３と、測定チップホルダー５５の四隅に形成した貫通孔５６と、該垂直孔５３と貫通孔５６とに挿通するピン５４とから構成されている。
【００２７】
固定化に際しては、図４に示すように、液体ホルダー５１のみを３軸方向（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に制御されるマイクロディスペンサー１０の下方位置におき、図示しない制御装置を介してマイクロディスペンサー１０を操作し、生理活性物質４の濃厚溶液Ｓを各測定チップＡの前記有底孔５１に滴下する。その際に、滴下した濃厚溶液Ｓの一部がその表面張力により前記有底孔５１の上端面よりも上方に膨出した状態となるように滴下量を制御する。
【００２８】
すべてのあるいは必要とされる有底孔５１へ濃厚溶液Ｓを滴下した後、液体ホルダー５１を側方に移動し、前記垂直孔５３にピン５４を立てる。次に、測定チップホルダー５５を各測定チップＡの表面（反応領域５の面）を下方に向けた姿勢しと、四隅に形成した貫通孔５６に前記ピン５４を通過させた姿勢で、次第に下降させる。それにより、液体ホルダー５１と測定チップホルダー５５とは次第に接近していき、濃厚溶液Ｓの該膨出部と測定チップＡの固定膜３（反応領と域５）とが密着した状態となる。その状態で所定時間放置して、固定膜３と生理活性物質４との反応を進行させた後、液体ホルダー５１と測定チップホルダー５５とを分離することにより、図１に模式的に示したような光学的分析装置用測定チップＡを多数個（図示のものでは１６個）、同時に得ることができる。
【００２９】
上記のようにして調製された光学的分析装置用測定チップＡを用いて、例えば、前記した表面プラズモン共鳴を利用した光学的分析により所要の分析を行うに際しては、図６に示すように、当該光学的分析装置のプリズム７０上に透光性基板１側が面するようにしてセットされる。分析しようとする試料液は、給液ポンプを利用して生理活性物質４を固定した固定膜面３に連続して送り込まれるか、試料液を収容したセルの液体面が固定膜に接触するようにされ、生理活性物質と分析対象物の相互作用を生じさせる。しかし、このような方法では多量の試料液を必要とする。少量の試料液で分析を行うことを望む場合には、本発明による測定チップ表面への物質固定化方法及び装置を用いて、試料液を固定化された生理活性化物質４を持つ分析領域５に密着させればよい。所定時間その位置で試料液を保持して所望の反応を行わせた後、そのようにして調製した分析対象物を表面に持つ測定チップＡを光学的分析にセットすればよい。
【００３０】
なお、上記では、本発明による測定チップ表面への物質固定化方法及び装置を表面プラズモン共鳴を利用した光学的分析装置の測定チップへ適用する場合について説明したが、本発明は、これに限らず、例えば、酵素の呈色反応を検出する光学的分析のように、反射光でなく試料液を透過した光を変量として用いて分析するような場合における測定チップの調製など、種々の分野で利用することが可能である。また、液体ホルダーに向けて測定チップホルダーを接近させまた離間させるように作動する移動機構として、図５に示したものは単なる例示であり、ネジによる駆動機構、サーボモータなどの電気的な移動手段による駆動機構など、従来知られたものを適宜用いることができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明による測定チップ表面への物質固定化方法及び装置を用いることにより、少量の液量で所要の物質を確実に測定チップの表面に固定化することが可能となり、所要の分析を低コストでかつ高い効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  表面プラズモン共鳴を利用した光学的分析装置に用いるのに好適な測定チップにおける要部を説明する断面模式図。
【図２】  光学的分析装置用測定チップの一例を説明する斜視図。
【図３】  本発明による測定チップ表面への物質固定化方法を実施するための装置の一例を説明する図。
【図４】  本発明による測定チップ表面への物質固定化方法を実施するための装置の他の例を説明する図。
【図５】  図４に示す装置の使用状態を説明する図。
【図６】  光学的分析装置用測定チップを光学的分析装置にセットして用いる場合の一例を説明する図。
【図７】  滴下した液滴の挙動を説明する図。
【図８】  滴下した液滴の挙動を説明する図。
【符号の説明】
Ａ…光学的分析装置用測定チップ、１…透光性基板、２…金属薄膜、３…固定化膜、４…生理活性物質、５…分析領域、１０…マイクロディスペンサー、３０，３５…筒状容器、４０，５０…測定チップ表面への物質固定化装置、４１，５１…液体ホルダー、４２…筒状体、４３…管路、４５，５５…測定チップホルダー、Ｓ…液体（生理活性物質の濃厚溶液）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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