(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0003958452.tif 000009
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との複合体を含有することを特徴とする化学発光試薬。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光試薬。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される化合物である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
【請求項４】
下記一般式（１）
【化２】
0003958452.tif 000010
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を溶媒の存在下又は非存在下において、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と接触処理することを特徴とする化学発光試薬の製造方法。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項４に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項６】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される化合物である請求項４又は５に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項７】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物の混合割合が、前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類１モルに対し当モル以上である請求項４ないし６のいずれかの１項に記載の化学発光試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能であり、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬及びその製造方法に関するものであり、更に詳しくは、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性の測定が可能な化学発光試薬及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、水素受容体、例えば、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素としてグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリの存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とする化学発光分析法は、化学発光試薬の調製及び発光系の操作が煩雑であることから、ペルオキシダーゼを標識酵素に用いる化学発光分析法用の安価な化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑み、過酸化水素等の水素受容体を基質とするペルオキシダーゼを用いることができる新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と接触させることにより得られる複合体を含有する化学発光試薬が、特定アルカリ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの量に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【０００６】
即ち、本発明の第一は、
下記一般式（１）
【化３】
0003958452.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子を示し、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との複合体を含有することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００７】
また、本発明の第二は、
下記一般式（Ｉ）
【化４】
0003958452.tif 000003
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を溶媒の存在下または非存在下においてＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と接触処理することを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との複合体を含有するものである。
【０００９】
また、本発明の化学発光試薬の製造方法は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を溶媒の存在下又は非存在下においてＮ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物と接触処理することからなるものである。
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、次の一般式（１）：
【００１０】
【化５】
0003958452.tif 000004
で表され、一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、各々、互いに同一でも異なるものでもよい。
【００１１】
アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でもまたは異なるものでよい。炭化水素基の炭素数としては、例えば、１〜２０、好ましくは、１〜１４を挙げることができる。
また、上記一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具体的には硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等が挙げられる。これらのなかで、特に、硝酸イオンが好ましい。
【００１３】
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げることができ、対イオンとして上記の陰イオンが好ましいが、特に、対イオンが硝酸イオンであるＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適である。
【００１４】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるもう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が比限定的に挙げられるが、特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が好ましい。
【００１５】
これらのＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物のうち、常温で液体のものは溶媒を兼ねて大過剰に用いることもできるし、他の適当な溶媒を用いてもよい。また、室温で固体のものは加熱溶融させて用いてもよく、また、適当な溶媒を用いることもできる。このような溶媒としては、ジメチルスルホキサイド、ヘキサメチルホスホアミド等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の化学発光試薬の製造においては、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物とを接触させることにより、その接触時間により発光強度が増大し、ピークを形成して減衰していく現象が観察されることから、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物がＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と反応して活性化状態を形成した後、経時的に変化して不活性化するものと考えられる。
【００１７】
従って、本発明の化学発光試薬の製造は、基本的にはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との接触処理によるものであり、以下に述べる反応条件下において両者を混合、保持することに行なわれる。具体的には本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう際に、これらの試薬の各成分を調合して所定時間反応させてから使用する方法が採用される。
【００１８】
反応条件として、反応温度は用いられる試薬及び溶媒の種類によって異なるが、一般的に−１０〜＋２００℃、好ましくは、０〜１２０℃、特に好ましくは、２０〜６０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは、５分〜１２時間、特に好ましくは、１０分〜５時間の範囲の時間を採用することができる。また、本発明の化学発光試薬の各成分の割合は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類１モルに対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物当モルから大過剰の範囲でよい。
【００１９】
本発明の化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の水素受容体の存在下ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−プロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることができる。
上記水素受容体としては、ペルオキシダーゼの基質になり得るものであれば特に限定されるものではなく、有機過酸化物、無機過酸化物等を任意に用いることができるが、特に、過酸化水素が好ましい。
【００２０】
本発明の化学発光試薬は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは、１０-4〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは、５０〜３００μｌの範囲である。発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素等の水素受容体の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２１】
上記化学発光反応に用いられる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いることが好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２２】
本発明によれば、ペルオキシダーゼ活性測定用試薬キットとして、各々、別個の容器に充填された一般式（１）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ標識物質からなる化学発光分析用試薬キットを提供することもできる。
【００２３】
本発明の化学発光試薬は、以上説明したように、塩基性条件下に過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在で反応して発光するが、この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、さらに、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を示し本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等により限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得た。
【００２６】
ペルオキシダーゼ活性の測定
上記の如くして得られた化学発光試薬を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【００２７】
【表１】
0003958452.tif 000005
［実施例２］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で３時間静置してから純水２ｍｌを加えて混合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得た。
【００２８】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬溶液を直ちに２０μｌ採り、複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに各々西洋ワサビペルオキシダーゼの異なる複数の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【００２９】
【表２】
0003958452.tif 000006
［実施例３］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−メチル−２−ピロリドン２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で３時間静置してから純水２ｍｌを加えて混合することによりルシゲニンとＮ−メチル−２−ピロリドンとの複合体からなる化学発光試薬を得た。
【００３０】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬溶液を直ちに２０μｌ採り、複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに各々西洋ワサビペルオキシダーゼの異なる複数の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２０μｌを加え、更に、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【００３１】
【表３】
0003958452.tif 000007
［比較例１］
ルシゲニン１ｍｇを純水２ｍｌに溶解し、これを２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに各々西洋ワサビペルオキシダーゼの種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液２０μｌを加え、さらに、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を正確には測定できないことが確認された。
【００３２】
【表４】
0003958452.tif 000008
【００３３】
【発明の効果】
本発明により提供される化学発光試薬は、過酸化水素等の水素受容体とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有することを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。
さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等をウエスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。