(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺組織と、LARのホスファターゼサブユニットの細胞内ドメインに対して特異的な免疫反応性を有し、且つCD45に対する免疫反応性を有しない抗体との特異的免疫反応性を評価することにより甲状腺組織試料中の甲状腺癌細胞を検出する方法。
【請求項２】
前記甲状腺組織試料が穿刺吸引細胞診により採取される試料であり、イムノアッセイによって免疫反応性が評価される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記甲状腺組織試料が甲状腺組織切片であり、組織染色によって免疫反応性が評価される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
甲状腺癌の組織診断用組成物であって、LARのホスファターゼサブユニットの細胞内ドメインに対して特異的な免疫反応性を有し、且つCD45に対する免疫反応性を有しない抗体を含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、LAR（白血球共通抗原類似分子）においてホスファターゼ活性を担うP-サブユニット（ホスファターゼサブユニット）に対して特異性を有する抗体、特にLARの細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体およびその調製方法に関し、さらに詳細には、プロテインチロシンホスファターゼの解析および定量、LAR関連分子の同定および取得、ならびにインスリン抵抗性に関わる症状の治療、予防、緩和等のための処置や診断に適用可能な医薬の開発などに有用な抗体に関する。また本発明は、甲状腺癌の診断、治療等に有用な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、動脈硬化発症メカニズムが徐々に明らかにされ、その危険因子が同定されつつある。特に高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病および喫煙が動脈硬化の４大危険因子と認定され、その治療が積極的に行われている。これらの病態として臨床的に共通しているのが、インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性とは細胞におけるインスリン感受性の低下とほぼ同義語であり、細胞での糖の取り込みにおけるインスリン作用が低下していることを指す。その原因としてはインスリン分泌自体の異常、標的細胞におけるインスリン受容体の異常、細胞内情報伝達系の異常および血行力学的に末梢循環障害に基づく糖の組織への供給減等がある。Reavenは 1988年、このインスリン抵抗性を基盤として多くの病態が引き起こされることを報告し、また、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高インスリン血症、高トリグリセライド血症、低 HDLコレステロール血症、高血圧をマルチプルに持つ病態をシンドローム Xと名付け、動脈硬化発症に深く関わっていることを提唱した（Reaven, G. M. et al.; Diabetes, 37, 1595-1607, 1988)。
【０００３】
また、一般的にインスリン抵抗性により細胞への糖の供給は低下し、膵臓におけるインスリン分泌を亢進させ、高インスリン血症を引き起こすことが知られており、臨床の場においてもインスリン抵抗性の問題が種々浮上している。例えば、インスリン抵抗性・高インスリン血症が糖尿病性腎症を促進し（Niskanen, L. et al. ; Diabetes, 41, 736-741, 1993)、糖尿病性網膜症の頻度が高くなる（Yip, J. et al. ; Lancet,341, 369-370, 1993)という報告がある。さらに、インスリン抵抗性によってプラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1（PAI-1)の活性が上昇し、血液線溶系機能を低下させたり（Potter van Loon BJ et al. ; Metab.Clin. Exp., 42, 945-954, 1993)、粥状動脈硬化の引き金になる（Sato, Y. et al. ; Diabetes, 38, 91-96, 1989)という文献等も報告されている。
【０００４】
糖尿病は有病率が全人口の 5％を占め、日本人の約 600万人が罹患している。糖尿病にはインスリン依存性糖尿病（IDDM）とインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）がある。IDDMは糖尿病全体に対して約 7％、NIDDMは約90％といわれ、特に、糖尿病の大多数を占めるNIDDMの発症は、インスリン抵抗性が重要な成因と考えられている。
【０００５】
現在までに、インスリンのシグナル伝達には細胞内蛋白質のチロシンリン酸化が重要な役割を演じていることが明らかとされている。インスリンレセプターは分子量約 135 kDaのαサブユニットと 95 kDaのβサブユニットの 2つの糖タンパクサブユニットがジスルフィド結合によりヘテロテトラマーを形成し、α2β2構造をとる。αサブユニットはインスリン結合活性を有し、βサブユニットは自己リン酸化により活性化するプロテインチロシンキナーゼ（Protein Tyrosine Kinase : PTK)ドメインを有する。すなわち、インスリンがインスリンレセプターのα鎖に結合すると、インスリンレセプターβ鎖に存在するいくつかの特定のチロシン残基がレセプターのチロシンキナーゼ活性により自己リン酸化される。インスリンレセプターチロシンキナーゼは自己チロシンリン酸化によってそのチロシンキナーゼ活性がさらに上昇する。このようにして活性化されたインスリンレセプターチロシンキナーゼは、細胞内に存在するその基質である IRS（insulin receptor substrate）をチロシンリン酸化し、このチロシンリン酸化 IRS-1を Ash/Grb2やPI-3 キナーゼが認識して結合することによりシグナルが伝達され、最終的にグルコースの取り込み、糖代謝や細胞増殖といったインスリンによる生物活性が発現することが明らかとされている（第９図参照、Goldstein, B.J. et al.; Receptor, 3, 1-15, 1993,  Kanai, F. et al. ; Biochemical and Biophysical Research Communications, 195(2), 762-768, 1993)。しかし、このインスリンのシグナル伝達において、活性化されたインスリンレセプターを不活化する酵素、すなわちチロシン脱リン酸化酵素であるプロテインチロシンホスファターゼ（Protein Tyrosine Phosphatase、以下、PTPと称する)の研究はほとんど進展していない。
【０００６】
PTPに関する研究が本格的に始まったのは、1988年にFischerのグループによりヒト胎盤由来細胞質型のPTPであるPTP1Bの遺伝子がクローニングされ、そのヌクレオチド配列が解明されてからである（Tonks, N. K. et al. ; J. Biol. Chem., 263, 6722-6730, 1988,  Charbonneau, H. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182-7186, 1988)。その結果、PTP1Bと相同性を示したのは既知のセリン／スレオニンホスファターゼではなく、造血系の膜貫通分子であるCD45の細胞質内領域の2カ所であった。さらに、CD45がPTP活性を有していることも明らかにされた（Tonks, N. K. et al. ; Biochemistry, 27, 8695-8701, 1988, Charbonneau, H. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182-7186, 1988)。
【０００７】
現在までに多くのPTPがcDNA配列の相同性に基づいてクローニングされ今なお次々と新しいPTPが報告されている（Streuli, M. et al. ; J. Exp. Med., 168, 1523-1530, 1988,  Krueger, N. X. et al.; EMBO J., 9, 3241-3252, 1990,  Trowbridge, I. S. et al. ; Biochim. Biophys. Acta, 1095, 46-56, 1991)。PTPは、(1)細胞膜貫通部分を持つ膜型PTP（LCA（白血球共通抗原（Leukocyte Common Antigen））すなわちCD45、LARならびにPTPα、β、γ、δ、εおよびζ)と、(2)細胞膜貫通部分を持たない細胞質型PTP（PTP1B、TC-PTP、PTP-MEG、PTPH1、STEPおよびPTP1C)とに大別される。
【０００８】
膜型PTPの多くは、細胞内に2つのPTP相同部分（ドメイン 1およびドメイン 2、第１図(a)および(b)参照）を持っている。現在までに報告されているPTPには、Ile/Val-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Xaa-Arg-Ser/Thr-Gly（配列番号：２）というシステインを含む配列（signature motif)がホスファターゼドメイン内に保存されている。PTP1Bのクリスタログラフィーによる研究から、この部位はPTP分子表面の小さな窪みを形成しており、システインは窪みの底に位置しリン酸との結合に直接関与していることが明らかにされた（Barford, D. et al. ; Science, 263, 1397-1404, 1994)。また、PTP1Bの酵素活性の中心の窪みにはセリンやスレオニンに結合しているリン酸は到達できないことから、窪みの深さがPTPとセリン／スレオニンホスファターゼの特異性を決定していることも示された。さらに、前記signature motifの酵素活性発現における重要性は、変異実験から明らかにされている（Streuli, M. et al. ; EMBO J., 9, 2399-2407, 1990)。これらのことから、ドメイン 1の保存されたCysが酵素活性発現に重要であり、またドメイン2は酵素の基質特異性を決めていると考えられている。
【０００９】
PTP酵素群のうち、ヒト由来の LARは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（PTP）であるCD45のホスファターゼドメインをプローブとしてヒト胎盤ゲノムライブラリーによりクローニングされた、受容体型プロテインチロシンホスファターゼである（Streuli M. et al. ; J. Exp. Med., 168, 1553-1562, 1988）。CD45が血球系の細胞に特異的に発現しているのに対して、LARは血球系以外の細胞、特に肝臓や骨格筋などのインスリン感受性組織に発現している（Goldstein B. J.; Receptor, 3, 1-15, 1993）。多くの受容体型PTPの中でLARはその細胞外ドメインが細胞接着分子と類似しているため、特に興味深い。その全構造は、Ig様ドメインとフィブロネクチンIII型ドメインよりなる 150 kDaの細胞外E-サブユニットと、膜貫通領域および、2つのホスファターゼドメインを持つ細胞内ドメインを含む 85 kDaの P-サブユニット（配列番号：１に示される）とが細胞膜のすぐ外側で非共有結合していることが明らかとなっている（第１図参照)（Streuli M. et al. ; EMBO J., 11, 897-907, 1992）。
【００１０】
現在までにLARの機能的な役割が数多く報告されている。例えば、LARが欠損した神経細胞ではニューロトロフィンへの反応性が減少し(Yang, T. et al.; 27th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans, Louisiana, USA, October 25-30, 1997,  Society for Neuroscience Abstracts, 23, 1-2, 1997)、LAR活性の抑制によりアポリポプロテイン Bの分泌が減少すること（Phung, T. L. et al. ; Biochemical and Biophysical Research Communications, 237(2), 367-371, 1997)、また、LARの発現が欠損することにより前脳基底部のコリン作動性神経細胞のサイズが小さくなり、海馬歯状回でのコリン作動性神経支配が減少する（Yeo, T. T. et al.; J. Neurosci. Res., 47(3), 348-360, 1997)ことが報告されている。このように、LARは生体内で様々な役割を担っていることが徐々に明らかになってきているが、現在最も注目が集められている研究として、LARとインスリン受容体との関係がある（Hashimoto, N. et al. ; J. Biol. Chem., 267(20), 13811-13814, 1992)。
【００１１】
1995年、肥満者の脂肪組織において LARのチロシンホスファターゼ活性が異常に上昇しており、これがインスリン抵抗性の発症原因として、また、心臓血管疾患の危険因子として考えられ、注目されるべきであるとの発表が行われた（Ahmad, F. et al. ; J. Clin. Invest.,95(6), 2806-2812, 1995）。以後、LARがインスリン受容体と密接に関与しているという報告が次々になされている（Mooney, R. A. et al. ; Biochemical and Biophysical Research Communications, 235(3), 709-712, 1997,  Orr, S. R. et al ; Biochemical Society Transaction, 25(3), 452S, 1997,  Ahmad, F. et al. ; J. Clin. Investigation,  100(2), 449-458, 1997, Ahmad, F. et al. ; J. Biol. Chem., 272(1), 448-457, 1997, Norris, K. et al. ; Febs Letters, 415(3), 243-248, 1997,  Li, P. M. et al. ; Cellular Signalling, 8(7), 467-473, 1996）。そして、これらの情報に基づき、最近Ahmad, F. らのグループはLARおよびPTP1Bがインスリン抵抗性の治療ターゲットとなり得るかもしれないと報告している（Ahmad, F. et al. ; Metabolism, Clinical and Experimental, 46(10), 1140-1145, 1997）。
【００１２】
現在までのLARおよびCD45等のPTPに関する研究より、細胞内情報伝達系においてPTPがPTKと共役して極めて重要な役割を担っていることが明らかにされつつある。
【００１３】
1992年にStreuliらのグループによって、LARのE-サブユニットとP-サブユニットの結合が非共有結合のため解離し、E-サブユニットが細胞膜表面から外れることが明らかにされた（Streuli, M. et al.; EMBO J., 11, 3, 897-907, 1992)。しかしながら、多くの研究者は、LARの細胞外ドメインであるE-サブユニットに対するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を使用して様々な研究を行ってきたため、単独でもホスファターゼ活性を有するP-サブユニットは全く無視されていた。例えば、LARのホスファターゼ活性測定を意図したLAR抗体の使用において、P-サブユニットに対する抗体を用いなければ全体としてのホスファターゼ活性が測定できない。本発明者らは、これらの状況に鑑み、LARのP-サブユニット、特に細胞内ドメインに特異性を有し、且つCD45に対して特異性を有しない抗体の作製に着手した。
【００１４】
なお、既知のプロテインチロシンホスファターゼに対する抗体としては、CD45の膜貫通領域からホスファターゼドメイン１の一部に至る196アミノ酸残基のペプチドを抗原として調製された抗体（Transduction Laboratories社製）およびPTPαのホスファターゼドメイン１（260アミノ酸残基）に対する抗体（Transduction Laboratories社製）が知られている。しかしながら、これらの抗体がLARや、その他プロテインチロシンホスファターゼのホスファターゼドメインに対して如何なる免疫特異性を有するか否かは不明である。ゆえに、CD45に特異性を有さず、LARの細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体を作製する必要もあった。
【００１５】
結節性甲状腺種には、甲状腺腫瘍と過形成である腺腫様甲状腺種がある。腺腫様甲状腺種は多発結節性であるが、その一部に癌を併発していることが少なくない。結節性甲状腺種の診断では癌を見逃さないことが重要である。現在、臨床においての甲状腺癌の診断は主に触診、超音波診断、穿刺吸引細胞診および組織切片による診断が行われている。甲状腺腫は良性結節、乳頭癌、濾胞癌、未分化癌、髄様癌および悪性リンパ腫等に分類され、また甲状腺癌を大きく分類すると分化型甲状腺癌（乳頭癌および濾胞癌）と未分化型甲状腺癌に分類することができる。大半は良性結節でありごくありふれたものであるが、はるかに数が多い良性結節の中から少数の悪性病変を確定的に診断するのは極めて困難である。分化型甲状腺癌は手術中疑わしい部位があると切除し顕微鏡下で観察した後、癌であれば甲状腺全部を切除する。また、最初に血液検査、画像診断を行っても的確な診断ができないため、結局のところ組織切除に陥るのが常である。穿刺吸引細胞診も行われるが、組織切片による形態学的観察に比較して、細胞と細胞の結合が破壊されるために確定的な診断が下せない。さらに、ヨードシンチやテクネチウムシンチも確定的な判断材料とならない。癌細胞は正常甲状腺細胞に比べてヨードを取り込みにくい。多くの良性結節は放射性ヨードを取り込むが、放射性ヨードを取り込まずにコールドを示す良性結節も多く存在する。また、ホットを示す結節であっても癌である可能性も存在する。この様に、最終的には組織切片による形態学的診断に委ねられるが、この方法は正常と思われる部位であっても疑わしい場合には組織を切除される場合が存在し、また甲状腺摘出時に声帯を動かす反回神経を傷つける可能性が増大する。ゆえに、臨床医あるいは病理医からは組織を切除する以前に正常と癌との区別ができる確定的な診断方法が切に望まれていた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、LARのホスファターゼサブユニット、特に細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体を提供することを目的とする。さらに、本発明によって、LARのホスファターゼサブユニットの細胞内ドメインに対して特異性を有、且つ他のプロテインホスファターゼには特異性を有しない抗体が提供される。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記抗体は、配列番号：１で示される塩基配列によってコードされるLARの細胞内ドメインに相当するポリペプチドまたはその断片を抗原として調製されるものが好ましく、また免疫特異性の点からモノクローナル抗体であるとよい。
【００１８】
そして、係る抗体は、LARホスファターゼドメインとその他のタンパク質またはポリペプチド断片とを含む融合タンパク質を免疫原として用いることによって調製することができる。係る融合タンパク質を構成する、その他のタンパク質またはポリペプチド断片として、特にGST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）が好適であるが、他にも、ポリヒスチジン（好ましくは６個のヒスチジン）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、プロテインA等を用いてもよい。
【００１９】
尚、ポリヒスチジンを用いた場合、遺伝子組換え法にて発現させた融合タンパク質を単離精製するためには、ニッケルキレーティング樹脂への吸着を利用することができ、pH変動の他、EDTAまたはイミダゾール物質を添加することによって当該樹脂から解離することができる。CBPを用いた場合、発現させた融合タンパク質はカルモジュリンアフィニティー樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後EGTAを加えることにより当該樹脂から解離することができる。また、プロテインAを用いた場合、発現させた融合タンパク質はIgGセファロース（例えば、IgGセファロース6FF）カラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後pH変動によって当該樹脂から解離することができる。
【００２０】
さらに前記融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリペプチド断片の別の例として、Xpress、Thioredoxin、c-myc、V5およびHA/c-myc等を挙げることができ、これらをエピトープとして認識することができる抗体を用いて、目的とするLARホスファターゼドメインとの融合タンパク質を発現した後に抗原−抗体アフィニティーカラムにより単離・精製することができる。
【００２１】
前記した、好ましい免疫原であるGSTとLARホスファターゼドメインとを含む融合タンパク質は、GST遺伝子のコード領域およびLAR遺伝子のホスファターゼドメインのコード領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌を、２０〜３０℃にて１６〜２４時間、特に好ましくは、２３〜２５℃にて１８時間培養し、その培養液および／または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製造することができる。さらにこうして得られた融合タンパク質は、グルタチオンを有する担体、例えば、グルタチオンセファロースビーズへのアフィニティーによって精製されたものであるとよく、当該グルタチオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出は、界面活性剤の存在下に煮沸することによって実施すればよい。この界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS（硫酸-3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン）、デオキシコール酸、 ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド（1-O-n-ドデシル-β-D-グルコピラノシル(1-4)α-D-グルコピラノシド）、ノニデット（商品名）P40（エチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)n）、ｎ−オクチルグルコシド（1-O-n-オクチル-β-D-グルコピラノシド）、モノラウリル酸シュクロース、テシット（商品名、ドデシルポリ（エリレングリコールエーテル）n）、トリトン（商品名）Ｘ−１００（オクチルフェノールポリ(エチレン-グリコールエーテル)n）、ツィーン（商品名）２０（ポリ(オキシエチレン)n-ソルビタン-モノラウレートレート）、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート［以上、いずれもｎは１以上の整数を表す］等が挙げられる。融合タンパク質を溶出させる場合に、これらの界面活性剤を動物に投与しても問題にならない濃度、好ましくは、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム存在下、１００℃にて５〜１０分間煮沸する。こうして、目的の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を、得ることができる。
【００２２】
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を取得する場合、抗体のスクリーニングにはLARのホスファターゼサブユニットを用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体として、例えばマウス／マウスのハイブリドーマにより産生される、約150 kDaの分子量を有する抗体を含むモノクローナル抗体が挙げられる。かかる抗体は、インスリンのシグナル伝達機構のさらなる解明のためのツールとして、またインスリン抵抗性および NIDDMに有用な診断方法を開発し、さらにインスリン抵抗性を基盤とするシンドロームXの種々の病態の予防、治療、診断等に応用できる。そして、LAR関連分子、例えば、モジュレーター、結合タンパク質などの同定や取得にも本発明の抗体が有用である。
【００２４】
本発明によってさらに、前記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が提供される。このハイブリドーマ細胞系として、本発明者によって１９９８年５月７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された、受託番号がFERM BP−6343であるマウス／マウスハイブリドーマ細胞系YU1が挙げられる。
【００２５】
本発明の抗体は、天然産物由来または全体もしくは部分合成（化学合成、遺伝子組換えによる合成等）された、LARタンパク質ならびに少なくともLARの細胞内ドメインを含む断片およびポリペプチド（以下、この断片およびポリペプチドを総称して「LAR由来分子」と称する）に対して特異的な免疫反応性を有する。
【００２６】
さらに本発明は、LARのホスファターゼサブユニットに対して特異性を  有する抗体の調製方法であって、免疫原として前記したようなLARホスファターゼドメインとその他のタンパク質またはポリペプチド断片とを含む融合タンパク質、好ましくはGST-LARホスファターゼドメイン融合タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供するものである。ここで、GST以外に使用可能な、融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリペプチド断片、その融合タンパク質の精製方法は、前記したとおりである。
【００２７】
また、好ましい免疫原であるGSTとLARホスファターゼドメインとを含む融合タンパク質は、GST遺伝子のコード領域およびLAR遺伝子のホスファターゼドメインのコード領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌を、２０〜３０℃にて１６〜２４時間、特に好ましくは、２３〜２５℃にて１８時間培養し、その培養液および／または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製造することができる。さらにこうして得られた融合タンパク質は、グルタチオンを有する担体、例えば、グルタチオンセファロースビーズへのアフィニティーによって精製されたものであるとよく、当該グルタチオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出は、界面活性剤の存在下に煮沸することによって実施すればよいことも前述のとおりであり、融合タンパク質を溶出させる場合に、これらの界面活性剤を動物に投与しても問題にならない濃度、好ましくは、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム存在下、１００℃にて５〜１０分間煮沸する。こうして、目的の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を、得ることができる。
【００２８】
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を調製する方法において、抗体のスクリーニングにはLARのホスファターゼサブユニットを用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
【００２９】
本発明によって、LARおよび／またはLAR由来分子の定量方法が提供される。この方法は、如上の抗体を使用して、被検試料中に含まれるLARのタンパク質、および／または少なくともLARの細胞内ドメインを含む断片もしくはポリペプチドの量を測定する工程を含むことを特徴とする。この方法においてLARまたはLAR由来分子の量を測定するために、前記抗体が、好ましくはイムノブロッティング、免疫沈降またはELISAのいずれかにおいて使用される。
【００３０】
本発明のさらなる特徴において、如上の抗体を用いて被検試料よりLARおよび／またはLAR由来分子を単離し、単離されたLARおよび／またはLAR由来分子の活性を測定する工程を含む定量方法が提供される。かかる方法において、LARおよび／またはLAR由来分子を単離するために、前記抗体を結合させた担体によるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が好適に用いられる。すなわち、前記抗体を結合させた担体に被検試料を接触させて抗原（LAR／LAR由来分子）−抗体間の特異的な相互作用を許容し、次いで担体を洗浄した後、結合されたLAR／LAR由来分子を溶出する工程を含む、カラム法、バッチ法等によるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が実施されるとよい。
【００３１】
本発明の別の特徴において、如上の抗体を用いてLARおよび／またはLAR由来分子を単離する工程を含む、LARおよび／またはLAR由来分子を生産するための方法が提供される。この生産方法における目的物の単離は、上記LARおよび／またはLAR由来分子の活性を定量するための方法におけると同様に、前記抗体を結合させた担体によるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が好適に用いられる。
【００３２】
また、本発明でさらに企図されるのは、LARおよび／またはLAR由来分子の組織内における存在を確認するための方法であり、この方法において、如上の抗体を用いて免疫組織学的検査が行われる。免疫組織学的検査とは、例えば、標識抗体を用いたin situ免疫組織染色などの技術が採用され、LARのタンパク質、および／または少なくともLARの細胞内ドメインを含む断片もしくはポリペプチドを検出するものである。
【００３３】
本発明はさらに、甲状腺癌細胞に対する特異的免疫反応性を有する抗LAR抗体を企図する。この抗体は、LAR分子のみならず、その断片例えば 、ホスファターゼドメイン、細胞外ドメイン等を抗原とした抗体であってよく、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ペプチド抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、CDR−移植抗体などが含まれうる。特に、如上のLARのホスファターゼサブユニットに対する抗体で、甲状腺癌細胞との免疫反応性を有するものが本発明によって提供される。甲状腺癌細胞に対して特異的免疫反応を有するとは、正常の甲状腺細胞や良性腫瘍の甲状腺細胞には殆ど反応せず（正常細胞の約１０％以下）、甲状腺癌細胞によく反応する（癌細胞の約２０％以上）ことを意味する。
【００３４】
従って、この抗体を利用して、甲状腺癌を診断することが可能になり、本発明において甲状腺癌の組織診断方法を企図するものである。この診断方法は、甲状腺癌への罹患の疑いがある被験者から甲状腺組織試料を採取し、前記抗体と当該組織試料との免疫反応性を評価することによって甲状腺癌の診断を行うことを特徴とする。この場合、甲状腺組織試料は、被験者より注射針等を用いた穿刺吸引細胞診により採取した試料でも、また甲状腺の一部を切除、摘出して調製した甲状腺組織切片等のいかなる試料でもよい。穿刺吸引細胞診により採取した試料を用いる診断方法は、被験者に対する侵襲性が低いという点でより好ましい。これは、組織形態学的検査に基づく甲状腺癌診断法では、侵襲性の高い切開法を余儀なくされていたことに鑑みて本発明により提供される重要な利点である。なお、組織切片を用いた診断においても、従来の方法よりも格段に診断の信頼性が高いので有用である。
【００３５】
前記診断方法において、穿刺吸引細胞診により得られた試料は、本発明の抗体を用いて例えばイムノブロッティング、免疫沈降またはELISA等の、汎用されているin vitroのイムノアッセイによって免疫反応性が評価される。そして、組織切片を試料とした場合、従来の免疫反応を利用した組織染色によって免疫反応性が判定される。
【００３６】
さらに本発明は、甲状腺癌の組織診断用組成物であって、上記抗体を含むことを特徴とする組成物を提供する。この組成物を用いて、前記したとおり信頼性の高い甲状腺癌の診断方法を実施することができる。組成物には、本発明の抗体の他に、適宜の賦形剤、担体、緩衝液、抗体を安定化するための薬剤等を配合するとよい。
【００３７】
このように、本発明によって、LARが甲状腺癌細胞に特異的に高発現することが判明した。また、実施例に示すように本発明のモノクローナル抗体が甲状腺癌の診断に有用であることも証明された。さらに、本発明のモノクローナル抗体が組織切片を用いた甲状腺癌の診断に有用であり（実施例５、６参照）、また組織をホモジナイズした方法による診断にも有用である（実施例７参照）ことが判明した。以上の結果より、当業者であれば本発明のモノクローナル抗体は種々の細胞診あるいはバイオプシーに有用であることが理解できる。さらに、本発明のモノクローナル抗体のみならず、LAR細胞外ドメインを認識することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／またはペプチド抗体をも利用することができる。この場合であっても本発明のモノクローナル抗体と同様に実施できるが、細胞外ドメインの解離による影響を考慮するのが好ましい。
【００３８】
本発明によりLARに対する抗体は、甲状腺癌に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能であることが判明した。これらの抗体を用いて 、LARまたはその断片との免疫学的な結合に基づき、LARまたはその断片を測定することができる。具体的には、これらの抗体を用いてLARまたはその断片を測定する方法としては、例えば、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりLARまたはその断片を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識化LARと検体中のLARまたはその断片を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のLARまたはその断片を測定する競合法を利用して検体中のLARまたはその断片を測定する方法が挙げられる。
【００３９】
サンドイッチ法によるLARまたはその断片の測定においては、まず、固定化抗体とLARまたはその断片とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体−LARもしくはLAR標識化抗体を形成させる２ステップ法もしくは固定化抗体、標識化抗体およびLARまたはその断片を同時に混合する１ステップ法などを用いることができる。
【００４０】
測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。
【００４１】
抗体の固層化には、公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ−スクシニイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートおよびＮ−スクシニイミジル−２−マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸などを用いるカルボジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。
【００４２】
抗体を標識する物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質および金属キレート等を使用するのが好ましい。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド等が挙げられ、発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン等が挙げられ、放射性物質としては125Ｉ、127Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ等が挙げられるが、これらに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。さらに、抗体にビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサールまたはフルオレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。好ましくは西洋わさびペルオキシダーゼを標識化酵素として用いる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができる。
【００４３】
標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤を用いる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質溶液としてＨ2Ｏ2を用い、発色剤として２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を使用することができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてオルトニトロフェニルフォスフェート、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができ、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明には、また、前述のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および試薬類をキット化したのものも含まれる。
【００４４】
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−オルトフェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，４’−ジチオピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。また、抗体としては、場合によっては、そのフラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体をアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、あるいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。
【００４５】
本発明はまた、前記の甲状腺癌細胞に対する特異的免疫反応性を有する抗体を用いて、甲状腺癌細胞に対して標的化（ターゲッテング）されたことを特徴とするDDS製剤を提供する。
【００４６】
甲状腺癌に関与する遺伝子はこれまでに種々明らかにされてきている。乳頭癌患者の一部でRetやTRK遺伝子のチロシンキナーゼドメインの変異が認められた（Fusco, A. et al. ; Nature, 328, 170-2, 1987）。またRetの変異は過去に放射線被曝の既往のない乳頭癌患者の3-30%に見られ（Santoro, M. et al. ; J. Clin. Invest., 89, 1517-22, 1992、Bongdrzone, I. et al. ; J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006-9, 1996、Zou, M. et al. ; Cancer, 73, 176-80, 1994）、チェルノブイリ原発事故の際、被曝した子どもおよび小児時代に放射線の外照射を受けた既往のある患者から診断される乳頭癌では、Retの変異は60-80%と高率に見出され（Fugazzola, L. et al. ; Cancer Res., 55, 5617-20, 1995、Klugbauer, S. et al. ; Oncogene, l l, 2459-67, 1995、Nikiforov, Y. E. et al. ; Cancer Res., et al. ; 57, 1690-4, 1997、Bounacer, A. et al. ; Oncogene, 15, 1263-73, 1997）、TRK遺伝子変異の頻度は極めて低い（Bongdrzone, I. et al. ; J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006-9, 1996）。Ras遺伝子の点変異は甲状腺腺腫と甲状腺濾胞癌において高頻度に見られる。これはRas遺伝子の点変異は腫瘍発生初期の段階であると考えられている（Fagin, J. A. ; Molecular pathogcnesis. In: Braverman LE, Utiger RD, cds. Werner and Ingbar's the thyroid: a fundamental and clinical text. 7th ed.  Philadelphia: Lippincott-Raven, 909-16, 1996、Challeton, C. et al. ; Oncogene, 11, 601-3, 1995）。TSHや刺激性G蛋白をコードしている遺伝子の活動性変異が一部の甲状腺濾胞癌において報告されている（Challeton, C. et al. ; Oncogene, 11, 601-3, 1995、Russo, D. et al. ; Oncogene, 11, 1907- 11, 1995）。さらに癌抑制遺伝子であるp53の変異は分化型甲状腺癌では希であるが、未分化癌では高頻度に認められることも報告されている（Fagin, J. A. et al. ; J. Clin. Invest., 91, 179-84, 1993、 Ito, T. et al. ; Cancer Res.,     52, 1369-71, 1992）。
【００４７】
これら公知の情報から、甲状腺癌の治療または診断を目的とした核酸を、LARに対する抗体によりターゲッティングされたDDS製剤中に含有させることができる。
【００４８】
また、甲状腺腫瘍細胞の増殖は甲状腺刺激ホルモン(TSH)によって調節されており、甲状腺ホルモン剤投与による甲状腺刺激ホルモン(TSH)分泌の抑制は、再発や生存率を改善することも知られている。ゆえに、TSHの作用を阻害するようなタンパク質、核酸あるいは化合物もDDS製剤中に含有させることができる。
【００４９】
一方、前記の甲状腺癌細胞に対する特異的免疫反応性を有する抗体を用いて、甲状腺癌細胞に対して標的化されたことを特徴とする本発明のDDS製剤中に、核酸、ヨード、放射性ヨード、テクネチウムおよびタンパク質よりなる群から選択される１以上の物質を含んでいてもよく、かような物質を製剤中に配合することによって、甲状腺癌細胞への標的化能を高めたり、甲状腺癌の治療または診断に用いることが可能となる。
【００５０】
ここで云う核酸としては、宿主細胞において発現可能な蛋白質をコードする核酸、細胞由来遺伝子のアンチセンス核酸、細胞由来転写調節因子の結合蛋白質をコードする遺伝子あるいは転写調節因子の結合部位の配列または類似の配列を有するデコイをコードする核酸、各細胞由来のmRNAを切断するリボザイム、自殺遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
アンチセンス核酸とは、複製、転写、翻訳等の遺伝子発現のある段階において、将来発現されうる核酸配列に対して特異的に結合する核酸もしくは核酸配列を示し、結果として将来発現されうる核酸配列の発現を阻害するものである。アンチセンス核酸には三重鎖によるアンチジーン核酸も含まれる。デコイをコードする核酸とは、細胞由来転写調節因子の結合蛋白質をコードする核酸あるいは転写調節因子の結合部位の配列または類似の配列を有する核酸を示し、これらを、囮として細胞内に導入することで、転写調節因子の結合部位への結合を阻害し、転写調節因子の作用を抑制し、最終的には活性化される遺伝子群を抑制することができる可能性がある。本明細書で言うリボザイムとは特定の蛋白質のmRNAを切断するものをいい、これら特定の蛋白質の翻訳を阻害するものを言う。リボザイムは特定の蛋白質をコードする遺伝子配列より設計可能であり、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピンリボザイム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定の蛋白質のmRNAを切断するもので、これら特定の蛋白質の翻訳を阻害するものであれば本明細書で言うリボザイムに含まれる。本明細書で言う自殺遺伝子とは、プログラム細胞死誘発遺伝子、アポトーシス誘発遺伝子、ネクローシス誘発遺伝子等を含有し、結果的に細胞を死に導く遺伝子を言う。
【００５２】
これら核酸は当業者により適宜選択することができ、該核酸をDDS製剤 に含有させることにより、甲状腺癌細胞特異的に細胞を死滅させることができる。
【００５３】
放射性ヨード(131-I)を添加することによって、正常甲状腺細胞が破壊さ  れ、従って、全身放射性ヨードシンチ検査での癌転移が検出しやすくなる。また、血中サイログロブリン値を測定することにより、癌の取り残しや再発が確認できる。さらに、放射性ヨード治療は潜在性の癌を破壊することにより再発を防止することができ、治療のために大量の放射性ヨードを使用することで、全身放射性ヨードシンチ検査を可能にする。この検査は癌の取り残しを見つけるのに大変感度がよい。ゆえに、本発明の抗体またはヨード標識あるいは放射性ヨード標識された抗体を用いることによりさらに診断・治療における有用性が高まる。
【００５４】
また、タンパク質としては、抗体、TSH（甲状腺刺激ホルモン）および甲状腺ホルモン等が挙げられる。
【００５５】
上記したとおりの構成成分を含む前記DDS製剤は、甲状腺癌の診断用医薬組成物や、甲状腺癌の治療用医薬組成物として有用である。
【００５６】
さらに、本発明の医薬組成物は、甲状腺癌を化学療法剤を用いて治療することが意図される場合に、化学療法剤とLARに対する抗体を組合せ、この抗体が特異的免疫反応性に基づき甲状腺癌に結合することを利用して病変部位へ薬物を濃縮させ、副作用の少ない有効な化学療法を実施することを可能とするものである。
【００５７】
ここで甲状腺癌治療に有効な化学療法剤として、シクロフォスファミド、アドリアマイシン、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル、ダカルバジンおよびビンクリスチン等の抗癌剤を用いることができる。
【００５８】
前記医薬組成物の投与方法は、全身投与あるいは局所投与のいずれでもよい。全身投与として、経口投与、静脈内投与、皮下、筋肉注射および直腸投与等があり、局所投与として、甲状腺組織内への直接投与もしくは甲状腺組織に連絡している血管内に投与することが好ましい。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与量は、薬物の公知の有効血中濃度に依存し、当業者が適宜選択するところである。また、以下に示すリポソーム製剤の場合、抗体の量はリポソームが形成するのを妨げない量を用いることが重要である。
【００６０】
なお、DDS製剤に含有せしめられる抗体は、特にヒトに投与する場合、前記示したヒト化抗体もしくはキメラ抗体等のヒトに対して免疫原性を有さないあるいは極力抑えた抗体を用いるのが好ましい。マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、ヒトにとっては異種タンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。そこで、ヒトモノクローナル抗体が望ましいが、融合効率が悪くまた抗体産生が安定なハイブリドーマを得ることは難しかった。しかし、現在技術は進歩しヒトモノクローナル抗体またはキメラ抗体を作製することが可能となっている。
【００６１】
キメラ抗体とはマウス抗体とヒト抗体のキメラ分子をいう。ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。ゆえに、マウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（V領域）を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体定常部（C領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる。公知のキメラ抗体の関連技術として、特開平０５−３０４９８９号、特開平０４−３３０２９５号、WO9106649、特開昭６３−０３６７８６号、特公平０６−９８０２１号等がある。
【００６２】
しかし、最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発された。ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位（CDR：Complementary determining reagion、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体遺伝子に移植（CDRグラフティング）し、抗体分子のCDRを除いた全分子をヒト化した抗体である。本抗体はヒト・マウス・キメラ抗体より、マウスの抗体部分が少ないため、抗原性が少なく安全性が高いと言われている。我が国では現在、成人性T細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。ヒト化抗体の製造方法およびその関連技術については、米国Genentech社（WO9222653、WO9845332、WO9404679、WO9837200、WO9404679、）および英国Celltech社（WO9429451、による WO9429351、WO9413805、WO9306231、WO9201059、WO9116927、WO9116928、WO9109967、WO8901974、WO8901783）等の特許出願がある。
【００６３】
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウィルス（EBV）で形質転換する方法、さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、遺伝子工学を利用しキメラ抗体、ヒト化抗体を作製する方法などがある。キメラ抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された抗体であり、ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を改変して、H鎖とL鎖の相補性決定部（CDR）以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造に置換し他抗体をいう。ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、ヒト／マウスのヘテロミエローマであるSHM-D 33株（ATCC CRL 1668）またはRF-S1株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融合効率が得られる。これらの親細胞を用いて得られたハイブリドーマはフィーダー細胞なしでクローニングが可能であり、IgGタイプの抗体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。親細胞の培養には、15%FCSを加えたERDF培地を用い、その他の操作はマウスの場合と同様である。また、IgGタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用いるのが好ましい。充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合にはin vitroで抗原感作を行うこともできる。
【００６４】
上記示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
【００６５】
また、そのような抗体をヨードで放射標識するあるいは抗体でターゲティングさせた医薬組成物中に放射性ヨードを含有させることにより、診断・治療薬として有用性が増す場合がある。
【００６６】
乳頭癌や濾胞癌が一度血流に乗って周囲の組織、または離れた部位(特に肺と骨)に転移した場合、腫瘍を破壊するために放射性ヨード(131-I)を投与するのが一般的な治療となっている。正常甲状腺細胞は血液からヨードを取り込み濃縮する。そしてこの過程は下垂体からのTSH(甲状腺刺激ホルモン)により刺激される。その後ヨードは甲状腺ホルモン(サイロ       キシンT4)を作るのに使われる。上記述べたように、甲状腺癌または甲状腺癌が転移した部位は、正常な場合はごくわずかの量のヨード(または放射性ヨード)しか取り込まない。しかし、大量のTSHの影響下にある時は、甲状腺癌、またはその転移した部位の一部は刺激を受けて、相当量のヨードを取り込むようになる。これにより、周囲の組織を損なうことなく、癌に直接大量の放射線が照射されることになる  。甲状腺が存在しており、正常な量の甲状腺ホルモンを産生している場合は、下垂体のTSHの産生量は比較的低いままに留まっているが、甲状腺全体が取り除かれたり、破壊されたりして甲状腺ホルモンのレベルが下がると下垂体はTSHの分泌を急激に増加する。このTSHが甲状腺癌を刺激し、放射性ヨードを取り込むようにする。進行した甲状腺癌に対し、放射性ヨード療法を行なう場合は、甲状腺全体を手術でほぼ完全に取り除き、残留した組  織を放射性ヨードを使って破壊する必要がある。一度これを行なったら、頚部に腫瘍が残っているか、離れた場所に転移があることがわかっている患者には、TSHのレベルが十分に高ければ、試験量の放射性ヨード(通常は約２から10ミリキュリー)を使ってスキャンを行う。もし、相当量のヨードが甲状腺癌の領域に集まっていれば、さらに大量の治療量の放射性ヨード(通常100-200ミリキュリー：3700から7400MBq)を与え、腫瘍の破壊を試みる。より浸潤性の強い甲状腺癌のある患者に対しても、放射性ヨードが安全で有効であるため、多くの医師がそれ程浸潤性の強くない乳頭癌や濾胞癌にも、放射性ヨードを日常的に使うようになっている。
【００６７】
ゆえに、LARに結合する抗体をヨード標識する、あるいは抗体でターゲティングさせた医薬組成物中に放射性ヨードを含有させることにより、さらに甲状腺癌細胞への特異性を増強し、治療または診断に用いることができる。
【００６８】
この様に甲状腺癌細胞を特異的に認識する抗LAR抗体はドラッグデリバリーシステム(Drug Delivery System: DDS)においても有用である。ドラッグデリバリーシステム(橋田充；ドラッグデリバリーシステム  創薬と治療への新たなる挑戦 , 化学同人(1995))は、薬物の投与方法や形態を工夫し、体内での薬物動態を制御することにより薬物を標的部位に選択的に送り込み、結果として最適の治療効果を得、さらに薬物による副作用を最小限にとどめることを目的とした薬物投与に関する新しい技術である。現在までに様々な DDS製剤が開発されているが、なかでもリポソーム製剤(寺田弘 , 吉村哲朗編；ライフサイエンスにおけるリポソーム実験マニュアルシュプリンガー・フェアラーク東京(1992))は欠損酵素の 補充、制癌剤および抗生物質の投与、さらには遺伝子治療の分野においても脚光を浴びている。
【００６９】
リポソームは生体膜を構成しているリン脂質を基本とする脂質二重層からなる閉鎖型小胞体であり、安全性が高く、脂質膜と水層の部分から構成されているため、脂溶性・水溶性を問わず様々な薬物を内包することができるという、優れた薬物キャリアーとしての機能を有している事が知られている。
【００７０】
さらに、リポソームの表面に抗体やペプチド等を結合することでターゲッティング能を付与できることは公知の事実である(Kazuo Maruyama, Tomoko Takizawa, Motoharu Iwatsuru et al.；Biochimica et Biophysica Acta 1234, 74 (1995))(Jlbao Zhao, Shunsaku Kimura, Yukio Imanishi；Biochimica et Biophysica Acts 1283, 37 (1996))。すなわち、抗LAR抗体は様々なリポソーム製剤における甲状腺癌細胞への特異性を高める目的で使用され得る。さらに脂質の種類を変化させたり、ポリエチレングリコール等で修飾することにより、温度感受性リポソーム(Sakae Unezaki, Kazuo Maruyama, Motoharu Iwatsuru et al.；Pharmaceutical Research 11, 1180 (1994))、血中安定性リポソーム(Kazuo Maruyama, Tsutomu Yuda, Motoharu Iwatsuru et al.； Biochimica et Biophysica Acta 1128, 44 (1992))、プラスミド導入ベクターとしてのカチオニックリポソーム(Xlang Gao, Daniel Jaffurs, Leaf Huang et al.；Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1201 (1994))等、種々の性質の異なるキャリア（ベクター）を作製できるという特性を有している。
【００７１】
しかしながら、通常、リポソームはエンドサイトーシス経路により細胞内に取り込まれ、細胞膜近傍の初期エンドソーム内に取り込まれる。その後、細胞深部の後期エンドソームに送られ、そして最終的にはライソゾームへと運ばれる。ライソゾームへ運ばれたリポソームは加水分解酵素の作用により分解され、同時にリポソーム内に封入された薬物等も代謝されるため、薬物などが未変化体の状態で細胞質内に到達する割合が極端に低下するという問題があった。
【００７２】
現在では細胞のバリアーである細胞膜に障害を与えることなく細胞質に直接薬物等を導入する方法が検討されている。例えば、リポソームが膜融合能を獲得すればライソゾームを経由することなく、直接薬物等を細胞質ゾルまで送達することが可能となる。これまでに、リポソームを細胞へ融合させる方法として pH感受性リポソーム(Kenji Kono, Kenichi Zenitani, Toru Takabishi；Biochimica et Biophysica Acta 1193, 1(1994))およびウィルスのエンベロープ蛋白質をリポソームに組み込んだ再構成リポソーム(Sangeeta Bagai, Debi P. Sarkar；The Journal of Biological Chemistry 269, 1966(1994))で検討されている。
【００７３】
最近、センダイウィルス(sendai virus : hemagglutinating virus           of japan)(Yoshio Okada;Currenttopics in Membranes and Transport 32, 297 (1988))の膜融合能をリポソームに付与した膜融合リポソーム (fusogenic liposome : HVJ-liposome)が報告されている。センダイウィルス(HVJ)は細胞間融合現象(Y. Maeda, J. Kim, Y. Okada et al；Experimental Cell Research 108, 108 (1977))が認められたことから、動物細胞を用いた遺伝学の先駆けになったウィルスである。さらに、HVJはリポソームとも融合することができ(Mahito Nakanishi,Tsuyoshi Uchida, Yoshio Okada et al.；Experimental Cell Research 159, 399 (1985))、その融合体(HVJ-リポソーム)はさらに細胞膜と融合する。つまり、リポソームと HVJを直接反応させて作製した HVJ-リポソー                 ムはいわゆるハイブリッドベクターであり、内部にリポソーム由来の空洞を有し、外側はウィルスエンベロープと同じスパイク構造を有している。HVJ-リポソームは蛋白質、化学物質および遺伝子等、リポソーム内に封入できるものであればあらゆる物質をセンダイウイルスと同等の高い効率で細胞内に導入することができる。(Tetsuhiko Nakagawa, Hiriyuki Mizuguchi, Tadanori Mayumi；Drug Delivery System 11,  411 (1996))。また、例えば HVJ-リポソームの改良型として、DNA結合能を有する核蛋白質である HMG-1(Non-histone chromosomal protein, High Mobility Group-1)を DNAと共導入することにより、さらに導入効率が向上するという報告もある(Yasufumi Kaneda et al.；J.Molec. Medicine 73, 289 (1995))。
【００７４】
膜融合リポソームの別の例として、VSV(Vesicular Stomatitis Virus：水疱性口内炎ウィルス)(永井美之 , 石浜明監；ウィルス実験プロトコール, Medical View(1995))を利用したリポソーム製剤も利用できる（J. Virol., 72(7), 6159-63, 1998、Exp. Cell. Res., 200(2), 333-8, 1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(7), 2448-51, 1990、Biochim. Biophys. Acta, 987(1), 15-20, 1989）。VSVはラブドウィルスのベシクロウィルス属に属する(−)単鎖 RNA型ウィルスで、膜表面にエンベロープ蛋白質である G蛋白質を有している(Akihiko Kawai；Journal of Virology 24, 826 (1977))。VSVの細胞への感染機構はリポソームと同様、エンドサイトーシス経路により行われる。しかし、VSVはリポソームとは異なり、エンドソーム膜と融合する特性を有しているため、ライソゾーム内の加水分解酵素による分解を受けることなく、自身の遺伝子を細胞質内に導入している。これまでに、VSVが膜融合能を有し、ヒト赤血球に対して溶血作用を示さないことが知られている(Carole A. Bailey, Douglas K. Miller, John Lenard；Virology 133, 111(1984))。また、VSVは多くの組織細胞に普遍的に存在するフォスファチジルセリンを受容体とするため、宿主域が広く(Michael J. Clague, Christian Schoch, Robert Blumenthal；Biochemistry 29, 1303 (1990))、さらにウィルス増殖が速いことから大量のウィルスが採取できるという特徴を有している。一方、VSVとリポソームが融合することが報告されている(Satoshi Yamada, Shunichi Ohnishi； Biochemistry 25, 3703 (1986))。
【００７５】
この様に、抗LAR抗体は膜融合リポソーム、pH感受性リポソーム、再構成リポソーム、カチオニックリポソーム等またはこれらを修飾したあらゆるリポソーム製剤のターゲッティング能を高める目的で利用することができる。
【００７６】
その他、モノクローナル抗体を用いてターゲッティング能を高める方法およびその有用性が多数報告されており（Hum. Antibodies, 9(1), 61-5, 1999、J. Clin. Pharm. Ther., 22(1), 7-19,1997、J. Int. Med. Res., 25(1), 14-23, 1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (24), 14164-9, 1996、Hepatology,22(5), 1482-7, 1995、Hepatology, 22(5), 1527-37, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(15), 6986-90, 1995、Immunomethods, 4(3), 259-72,1994、J. Drug Target, 2(4), 323-31, 1994、Cancer Res., 57(10), 1922-8, 1997、Crit.Rev. Biotechnol., 17(2), 149-69, 1997、Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 16(7), 505-12, 1994、Trends Biotechnol., 12(6), 234-9, 1994、Bioconjug. Chem., 4(1), 94-102, 1993 ）、甲状腺癌の治療において前記記載した文献あるいは公知の技術に準じてLARに対するモノクローナル抗体が利用できる。
【００７７】
その他、ウイルスベクターによる遺伝子治療や、ポリ酸・グリコール酸マイクロスフェアー、リピッドマイクロスフェアー、ポリエチレングリコール修飾酵素等を用いたDDS製剤においても本発明の抗LAR抗体を利用し、甲状腺癌への標的化を図ることができる。
【００７８】
さらに別の実施態様として、甲状腺癌細胞においてLARが高発現していると言うことは、LAR分子をコードする核酸配列から高率にmRNAへの  転写が行われ、翻訳されているものと理解できる。ゆえに、当業者であればmRNAに対するプローブを用いることによりLAR mRNAの発現量を測定することにより癌の診断を行うことは容易である。
【００７９】
また、本発明の結果、甲状腺癌細胞において該転写を促進させる転写 因子、プロモーター、エンハンサー等の分子生物学的研究に多大な貢献をすることができる。
【００８０】
【発明の実施の形態】
［実験例１］LAR変異体によるインスリンレセプターのチロシンリン酸化ならびにLARとインスリンレセプターとの会合に関する検討
先ず、LARによるインスリンのシグナル伝達制御メカニズムを明らかにするために、LARのPTPドメインの触媒活性中心に存在するシステインをセリンに変換することにより作製した、変異型 LARを用いるというストラテジーにより解析を進めた。
ａ．LAR、およびインスリンレセプターの発現ベクター
LAR発現ベクターとして、(a)LAR WT：ヒト野生型LAR（配列番号：３）、(b)LAR C/S：LAR-PTPドメイン 1の活性中心にあるシステイン（配列番号：３のアミノ酸第1522位）を、配列番号：３のヌクレオチド第4983位のGをCに置換することによりセリンへと変換したもの 、ならびに(c) LAR DC/S：LAR C/Sにおける変異に加えて、さらにLAR-PTPドメイン 2のシステイン（配列番号：３のアミノ酸第1813位）を、配列番号：３のヌクレオチド第5856位のGをCに置換することによりセリンへと変換したものの３種（第１図(b)参照）を、pMT発現ベクターに組み込んだもの（Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897-907, 1992およびStreuli M. et al.,EMBO J., 9, 2399-2407, 1990を参照）を用いた。
【００８１】
一方、インスリンレセプターの発現ベクターは、(a)IR WT：野生型、および(b)IR K1018M：野生型のインスリンレセプターのATP結合部位の、第1018位のリジンをメチオニンに変換してチロシンキナーゼ活性を欠失させたインスリンレセプター変異型の2種類の cDNAを、SRαプロモーターの下流に組み込んだもの（Kanai F. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 195, 762-768, 1993を参照）を用いた。
ｂ．COS-7細胞へのトランスフェクション
COS-7細胞を 1.0×106 細胞数/8 mL/90φディッシュとなるように10％牛胎児血清添加 RPMI 1640培地（日水製薬株式会社）に播種して 16時間培養を行った後、LAR C/Sと IR WTの発現ベクターを DEAE-デキストラン法を用いて COS-7細胞にコトランスフェクションした。用いたLAR C/Sは前記a.(b)に記載のとおりに変異させることにより、In vitroでチロシンホスファターゼ活性が完全に欠失していることが明らかにされている（Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399-2407, 1990）ものである。
【００８２】
コトランスフェクションは、以下の手順に従って行った。先ず 2％ FCS を含有する RPMI 1640 培養液（グルタミン0.3 gおよびカナマイシン0.1 gを含む、RPMI 1640培地（日水製薬株式会社） 10.2 g／L、10％ NaHCO3でpH 7.4に調整）4 ml に、 40μlの10 mM クロロキンを加えた。
【００８３】
この溶液 2 ml に、LAR 発現ベクター5μgおよび IR 発現ベクター1μgを加え、残りの溶液 2 ml には16μl の100 mg/ml DEAE-デキストランを加えた。次いで双方の溶液をよく撹拌混合した。こうして調製した発現ベクター溶液 3.75 ml を、1.0×106 細胞数/8 ml/ディッシュ となるように播種し、37 ℃、5％CO2インキュベーター内で 16 時間前培養しておいた COS-7細胞に加えた。前培養と同様の条件で4 時間培養した後に10％ DMSO溶液で 2 分間処理し、PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4・12H2O、1.4 mM KH2PO4）で洗浄後、10％ FCS を含有する RPMI 1640 を8 ml 加え、37 ℃、5％ CO2 に調整したインキュベーター内で48時間培養した。
ｃ．インスリン刺激と細胞溶解液調製
トランスフェクション終了後のCOS-7細胞を血清無添加RPMI 1640 培養液中で16時間培養し、10-7 Mインスリン（生化学工業社製）で一定時間すなわち、0、1、5、15および 30分間の刺激を行った。但し 0分刺激とは、インスリン刺激を行ったが、氷上に放置し、37℃でインキュベートしなかったものである。インシュリン刺激開始より各時間経過後に、培養液をすべて吸い取り、直ちに PBS w/Inh.（チロシンホスファターゼインヒビター含有PBS：1 mM バナジウム酸ナトリウム、5 mM フッ化ナトリウム、5 mM ピロリン酸ナトリウム、5 mM EDTA・2Na、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4・12H2O、1.4 mM KH2PO4）を5 ml 加えた。
【００８４】
PBS w/Inh.で細胞全体を洗浄してから液体を吸引除去し、細胞に溶解用バッファー（1％ Nonidet P-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl （pH7.4)、5 mM EDTA、10 mM ヨードアセタミド、10 mMフッ化ナトリウム、10 mM ピロリン酸ナトリウム、0.4 mM バナジウム酸ナトリウム、0.1 mM 酸化フェニルアルシン、1 mM ベンズアミジン、1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル）を1ml 加え、セルスクレイパーを用いて細胞を集めた。この細胞懸濁液を 1.5 mlチューブに移し 4 ℃で 30 分間インキュベートすることにより、細胞を完全に溶解させた。インキュベート後の液体を12,000 rpm、4 ℃にて10 分間遠心分離して得られた上清を、細胞溶解液として以下の実験に用いた。
ｄ．免疫沈降
ｃ．で得られた細胞溶解液につき、抗 LAR E-サブユニット抗体（7.5μgの11.1Aと7.5μgの753.Aとの混合物（Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897-907, 1992参照）を用いた免疫沈降を行った。前記細胞溶解液 1 ml に対してモックとしてMOPC 21（マウスIgG1κ：Sigma社製）を15μg加え、4 ℃で1 時間インキュベート後、γ-bind（GammaBind Plus Sepharose：Pharmacia Biotech社製） 20μlを加え、さらに 4 ℃で 1 時間インキュベートすることにより前吸収を行った。4 ℃、12,000 rpm にて10 分間遠心分離を行い、上清 950 μlを別のチューブに移した。抗LAR E-サブユニット抗体を15μg 加え、4 ℃で1 時間インキュベート後、γ-bind を20μl加え、さらに 4 ℃で1 時間インキュベートした。
【００８５】
12,000 rpm、4 ℃にて10 分間遠心分離後、沈査を 1 ml 溶解用バッファーで2回、PBS w/Inh.で1 回洗浄し、20μl のSDSサンプルバッファーに懸濁した。これを沸騰水中で 5分加熱し、電気泳動用の検体とした。
ｅ．イムノブロッティング
上記検体を 7.5％ SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、トランスファー装置を用いて400 mAで4 時間ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell）に転写した。この膜を3％ ウシ血清アルブミン溶液中において室温で 30 分間以上インキュベートすることによりブロッキングを行った。充分量の TBS-T（Tween 20含有TBS：10 mM Tris-HCl （pH7.4)、150 mM NaCl、0.1％ Tween 20）で10 分間、2 回以上洗浄後、TBS-T で50,000倍に希釈した抗リン酸化チロシン抗体 （4G10、UBI社）、抗LAR E-サブユニット抗体または抗インスリンレセプターβ鎖抗体（UBI社）を加え、室温において1 時間振盪した。充分量の TBS-Tで 5 分間、3 回以上洗浄後、HRP標識抗マウスIgG抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス IgG：Santa Cruz Biotechnology社製） 1.5ml を含むTBS-T溶液を15 ml 加え、室温において1 時間振盪した。充分量の TBS-T で5 分間、3 回以上洗浄後、発光試薬セット（和光純薬工業株式会社製）を用いてケミルミネッセンス法により、各抗体と結合する蛋白質のバンドを検出した。
ｆ．結果
このように、LAR C/SとIR WTをCOS-7細胞にコトランスフェクションしインスリンで一定時間刺激した後に作製した細胞溶解液を抗 LAR E-サブユニット抗体で免疫沈降後、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行ったところ、インスリン刺激 1分でインスリンレセプターβ鎖のチロシンリン酸化および 85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化が認められた。これらのチロシンリン酸化は、インスリン刺激後 30分においても持続して認められた（第２図Ａ参照）。
【００８６】
また、抗 LAR E-サブユニット抗体（第２図Ｂ）、抗インスリンレセプターβ鎖抗体（第２図Ｃ）および抗リン酸化チロシン抗体（第２図Ａ）を用いたイムノブロッティングの結果、LARとインスリンレセプターがインスリンレセプターのチロシンリン酸化の有無により会合することも明らかとなった。
［実験例２］種々のLARによるインスリンレセプターのチロシン脱リン酸化の検討（１）
次に、LAR WT、LAR C/SおよびLAR DC/Sと IR WTを用いて同様に COS-7細胞にコトランスフェクションし、インスリンで 5分間刺激後、抗LAR E-サブユニット抗体で免疫沈降し、沈降物について各種抗体を用いたイムノブロッティングを行った。その結果、インスリンレセプターとLAR WTをコトランスフェクションしたものは LAR C/SやLAR DC/Sをコトランスフェクションしたものと比べると、インスリンレセプターβ鎖や85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化はほとんど検出されなかった（第３図Ａ参照）。
【００８７】
また、この実験において LAR（第３図Ｃ）やインスリンレセプター（第３図Ｄ）の発現量は、それぞれのトランスフェクタントにおいてほぼ同一であったことより、LAR WTはインスリンレセプターβ鎖や85 kDa蛋白質のリン酸化チロシンを脱リン酸化することが示された。
【００８８】
また、抗 LAR E-サブユニット抗体による免疫沈降物を抗インスリンレセプターβ鎖抗体でイムノブロッティングしたところ、LAR DC/Sをコトランスフェクションしたものでは LAR WTや LAR C/Sをコトランスフェクションしたものに比較すると、インスリンレセプターβ鎖のバンドが明らかに弱かった（第３図Ｂ）。
【００８９】
この結果は、LAR WTや LAR C/Sに比べて、LAR DC/Sとインスリンレセプターの会合が弱いことを示すものである。LAR C/Sと LAR DC/Sの違いは、ホスファターゼドメイン 2の1813番目のアミノ酸のみであることから、チロシンホスファターゼ活性を示さず基質との結合に関与すると推測されてきたこのドメイン 2が、LARとインスリンレセプターとの結合に機能していることが明らかとなった。
［実験例３］種々のLARによるインスリンレセプターのチロシン脱リン酸化の検討（２）
さらに、インスリンレセプターのチロシン脱リン酸化がLARに結合したもののみであるのか、またはインスリンレセプター全てで確認されるのかを検討するために、このコトランスフェクタントの細胞溶解液を電気泳動後、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行った。その結果、LAR WTを導入したもののみ、インスリンレセプターのチロシン脱リン酸化が顕著に認められた（第４図参照）。
［実験例４］LAR C/S存在下でのインスリンレセプターのチロシンリン酸化の検討
次に、85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化がインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性によるものであるかを明らかにするため、LAR C/SとIR WTまたはインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を欠失させたIR K1018M（IR MT）を COS-7細胞にコトランスフェクションした。5分間インスリン刺激を行った後、抗 LAR E-サブユニット抗体で免疫沈降し、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行った（第５図参照）。その結果、IR WTとコトランスフェクションしたものではインスリン刺激によりインスリンレセプターβ鎖および 85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化が認められたが、IR K1018Mとコトランスフェクションしたものではこれらのリン酸化が全く認められなかった。
【００９０】
以上の結果より、インスリンがインスリンレセプターに結合するとインスリンレセプターのβ鎖の速やかなチロシンリン酸化が起こり、さらにインスリンレセプターチロシンキナーゼが 85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化を引き起こすことが明らかとなった。
【００９１】
従って、この 85 kDa蛋白質は、インスリンレセプターと結合していることが確認された LARの P-サブユニットである可能性が考えられた。
【００９２】
【実施例１】
LARのP-サブユニットの細胞内ドメインに対する抗体の作製
以下の手順に従って、LARの細胞内ドメインに対する抗体を作製した。
ａ．免疫原の調製
免疫原として、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-LAR融合蛋白質（GST-LAR）を用いることとした。LAR P-サブユニットの 細胞膜貫通部分の終点より細胞質側すべてにあたる 607 アミノ酸 に相当するcDNA（配列番号：１、3467塩基対）をpGEX-2T ベクター（Pharmacia Biotech社製）のBamHI/EcoRIサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて常法に従い E.coli AD202 を形質転換した。この大腸菌を LB （Amp.+)寒天培地（アガー7.5 gを含む後述のLB （Amp.+) 培地）で一晩培養した後、シングルコロニーをLB （Amp.+) 培地（トリプトン10 g/L、酵母エキス 5 g/L、NaCl 5 g/L、5 N NaOH 0.2 ml/L、アンピシリンを 50 μg / ml含有） 50 ml に接種し、さらに一晩培養した。これをLB(Amp.+) 培地 500 mlに接種し、37℃ で 600 nm における吸光度が約 1.0 になるまで培養し、1 M IPTG（イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製） 50μl を加え、25℃ で一晩培養した。この培養物を 3,000 rpm、4℃ で15 分間遠心分離し、沈澱した菌体を NETN（0.5 ％ Nonidet P-40 、1 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl） 50 ml に懸濁させた。その後、1 分間 超音波処理、氷上 1 分間の操作を 2 回繰り返し、14,000 rpm、4℃ で20 分間遠心分離して上清を得た。この大腸菌溶解液 10 ml に グルタチオンセファロースビーズ懸濁液（Glutathione Sepharose 4B（Pharmacia Biotech社製) をNETNで３回洗浄し、50％NETN懸濁液として調製）を 100 μl 加え、室温で 30 分間インキュベートした。得られた懸濁液を3,000 rpm、4℃ で5分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿したグルタチオンセファロースビーズをNETNで 2 回、PBSで 1 回 洗浄し、SDS sampleバッファー（125 mM Tris-HCl pH 6.8、0.1％ ドデシル硫酸ナトリウム、5％ 2-メルカプトエタノール）を100 μl 加え、沸騰水中で10 分間加熱してGST-LAR融合蛋白質を溶出した。ビーズを除いた溶出液を、Centricon-10（アミコン社製）に移し、3,000 rpm、45分間、4℃ で遠心濃縮した。
【００９３】
緩衝化を目的として1 ml のPBSを加え、ふたたび 3,000 rpm、45分間、4℃で遠心濃縮した。この緩衝化の操作をさらに 2 回繰り返して得られたものを、免疫用の抗原溶液とした。抗原蛋白質の精製および濃縮は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。
【００９４】
一方、最終免疫では静脈内投与を行うため、上記とは異なる方法で抗原溶液を調製した。GST-LAR融合蛋白質を発現している前記大腸菌溶解液とグルタチオンセファロースビーズをインキュベートし、遠心分離後、沈殿したビーズを NETNで2回、PBSで3回洗浄した。次いで GSH 溶出バッファー（20 mM グルタチオン、1M Tris-HCl、pH 9.6）を100μl加え、10分間室温で軽く撹拌して GST-LARを溶出させた。3,000 rpm、4℃ で5分間遠心分離して上清を回収する操作を計 3 回行い、全溶出液を生理食塩水中 4℃ で2日間透析したものを、静脈内投与用抗原溶液とした。
ｂ．免疫処置
6週齢の雌性 Balb/c マウス 8 匹に対し、プリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン、Sigma社製)を 0.5 ml/匹で腹腔内投与した。２週間後、腹腔内免疫用抗原溶液をフロイント完全アジュバント（GIBCO社製）と１：１で混和しエマルジョン化したものを、GST-LAR融合蛋白質が約10 μg/匹となるよう腹腔内投与した。以後、ほぼ２週間ごとに４回、腹腔内免疫用抗原溶液とフロイント不完全アジュバント（GIBCO社製）との１：１混和物をGST-LAR が約 30〜70 μg/匹となるよう調製し 、腹腔内投与した。4 回目の免疫の４日後に眼底静脈より採血し、血清中の抗体価をELISA法により測定した。
ｃ．ELISA
静脈内免疫用抗原と同様の方法で調製した GST-LAR および GSTのみの蛋白質溶液を、それぞれ精製水に対して 4℃ で一晩透析した。これを、PBS で 0.5 μg / ml に調製し、50 μl／ウェルで ELISAプレート（Falcon 3911 MicroTest ・TM Flexible Assay Plate） に1時間吸着させた。洗浄用バッファー（0.05％ Tween20 を含む PBS）で５回洗浄後、5％スキムミルク（2.5 gのスキムミルクを 50 ml の PBS に溶解して調製）でブロッキングを行った。これを洗浄後、ｂで得られた血清を血清希釈用バッファー（0.25％ BSA を含む PBS）で16,000倍に希釈し、50μl／ウェルずつ加え、湿箱中1時間インキュベートした。プレートを洗浄後、1000 倍希釈 HRP標識抗マウスIgG抗体を50 μl／ウェルずつ加え 1 時間インキュベートした。洗浄用バッファーで 4 回、PBS で１回洗浄後、o-フェニレンジアミン（和光純薬工業社製）をクエン酸緩衝液（5.6325 g クエン酸一水和物、18.35 g  Na2HPO4-12H2Oを精製水に溶解し、500 mlとして調製）に 1 mg /mlの濃度で溶解させた基質溶液を 50μl／ウェルとなるように加え、30 分間反応させた後、50 μl の 10％ H2SO4 を加え反応を停止した。このうち 50 μl を測定用 96ウェルプレート（住友ベークライト社製）に移して450 nm の吸光度を測定した。
ｄ．細胞融合
上記ELISAの結果よりGST-LARに対する抗体価の上昇が認められたマウス2匹に静脈内投与により最終免疫を行い、その3日後に脾臓を摘出して常法により脾細胞を調製した。
【００９５】
細胞融合のためのparent cellは、事前に 20 μg / mlの 8-アザグアニンを含む培地で選択し、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT)欠損株であることを確認したBalb/c マウス由来ミエローマ細胞株 NS1 を用いた。 NS1細胞 2 ×107 細胞数と 脾細胞 1 ×108 細胞数に対し、 ClonaCell（商標名）- HY Hybridoma Cloning Kit ( StemCell Technologies Inc. ) を用いて細胞融合、HAT選択およびクローニングを行った。
【００９６】
クローニングされたハイブリドーマ培養上清のスクリーニングは、静脈内免疫用抗原と同様の方法で調製したGST、GST-LARまたは GST-CD45（Furukawa, T. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,10928-10932,1994)）の蛋白質溶液0.5μg/mlを結合させたプレートにて、ハイブリドーマ培養上清50μlについて前記ｃにおける ELISA法に準じて行った。このELISA法において、GSTまたはGST-CD45を結合させたウェルには免疫反応を示さず、GST-LARを結合させたウェルのみに免疫反応を示すハイブリドーマを選択した。なお、クローニングされたハイブリドーマの継代培養は、10％ ウシ胎児血清 (GIBCO社製)を含有するRPMI 1640 培養液（日水製薬社製）で行った。
【００９７】
このように、HAT選択されたハイブリドーマの培養上清を ELISA法によりスクリーニングすることによって、抗体産生能、増殖能とも安定し、LARの細胞内ドメインに特異性を有するクローンYU1が得られた。
【００９８】
このハイブリドーマ細胞YU1は、１９９８年５月７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、その受託番号は、FERM BP−6343である。
ｅ．モノクローナル抗体のタイピング
上記ｄで得られたハイブリドーマ細胞YU1の培養上清 0.5 ml を 4.5 ml の TBS-T で希釈し、希釈液のうち 3 mlについてMouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham International plc.製) を用いて、アイソタイプを調べた。その結果、抗体のアイソタイプは、IgG2bκであった。
ｆ．モノクローナル抗体の調製と精製
6 週齢の雌性 Balb/c マウスに対し、0.5 ml / 匹のプリスタンを腹腔内投与し、その10 日後に、上記ｄのクローニングで得られたハイブリドーマ細胞YU1を、1 匹あたり 2.5×106〜 1.3×107 細胞数／0.5 ml / 匹で腹腔内へ注入した。10日後ごろから、マウスの腹部肥大を認めたため20ゲージの注射針を用いて数回にわたり腹水を採取した。採取した腹水は、1,000 rpm、4 ℃にて5 分間遠心分離し、上清と沈殿物とに分けた。
【００９９】
上清は、37 ℃で30 分間処理した後、4 ℃に一晩静置した。12,000 rpm、4℃にて10 分間遠心分離し、得られた上清 1.5 ml よりアフィニティーカラムHiTrap ProteinG（Pharmacia Biotech社製）を用いてモノクローナル抗体YU1を精製した。得られた抗体溶液の280 nm における吸光度を測定し、マウスIgG の分子吸光係数より抗体濃度を算出した。
【０１００】
さらに、このモノクローナル抗体YU1につき、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動上の移動度から見かけの分子量を明らかにした。この結果を第６図に示す。第６図に明らかなように、モノクローナル抗体YU1は、約50 kDのＨ鎖と、約25 kDのＬ鎖を含み、約150 kDの分子量を有していた。
【０１０１】
【実施例２】
モノクローナル抗体の特異性の検討
実験例１、ａおよびｂに記載した手順に従って、LAR WTの発現ベクターをCOS-7細胞にトランスフェクションした。その細胞溶解液について、実施例１で得られた精製モノクローナル抗体を用いて免疫沈降後、イムノブロッティングを行った。免疫沈降での対照として、IgG1サブクラスに属する抗体 (抗LAR E-サブユニット抗体（前記）および抗CD45抗体（Santa Cruz Biotechnology社製、35-Z6））に対してはMOPC 21を、モノクローナル抗体YU1に対しては マウスIgG2bκ（MOPC 195、CAPPEL社製）を用いた。
【０１０２】
係るCOS-7細胞へのLAR強制発現系を用いた解析により、抗 LAR E-サブユニット抗体で免疫沈降後、モノクローナル抗体YU1は、LAR P-サブユニットに相当する 85 kDaとプレカーサーに相当する約 200 kDaの蛋白質を認識した（第７図Ｂ参照）。
【０１０３】
さらに、LARをトランスフェクションした COS-7細胞の細胞抽出液をこれらの抗体（IgG1、IgG2b、またはYU1）により免疫沈降後、LAR E-サブユニットを認識する抗体でイムノブロッティングを行ったところ、抗体と、プレカーサーに相当する約 200 kDaの蛋白質が検出された（第７図Ａ）。
【０１０４】
以上の結果より、モノクローナル抗体YU1は、LARのP-サブユニットの免疫沈降およびイムノブロッティングに利用可能であることが明らかとなった。
【０１０５】
【実施例３】
インスリンレセプターチロシンキナーゼによる LARのリン酸化
実験例４によって、インスリンレセプターとLARのコトランスフェクションにより検出されるチロシンリン酸化された 85 kDaのバンドが LARの P-サブユニットである可能性が考えられた。
【０１０６】
そこで実施例１にて作製したモノクローナル抗体YU1を用いて、インスリンレセプターチロシンキナーゼによりチロシンリン酸化された85 kDaの蛋白質が LAR P-サブユニットであるかの検討を、実験例１に記載したと同様の手技に基づいて行った。
【０１０７】
LAR WTまたはLAR C/Sと IRをコトランスフェクション後、インスリンで1分間刺激したCOS-7細胞溶解液を抗 LAR E-サブユニット抗体で免疫沈降した後、抗 LAR E-サブユニット抗体と抗体YU1との混合物でイムノブロッティングすると、LARのプレカーサーと各サブユニットが検出された。
【０１０８】
このブロットをさらに抗リン酸化チロシン抗体でリプローブしたところ、85 kDaのチロシンリン酸化バンドが LAR P-サブユニットのバンドと一致した（第８図参照）。これらの結果は、LARがインスリンレセプターの基質の一つであることを示すものである。
【０１０９】
さらに、この LAR P-サブユニットのチロシンリン酸化は LAR WTとのコトランスフェクタントで検出されなかったことから、LARは自己脱リン酸化すると考えられた（第３図参照）。
【０１１０】
第９図に示すように、インスリンがインスリンレセプターα鎖に結合すると、インスリンレセプターのβ鎖が自己リン酸化されチロシンキナーゼ活性が上昇する。このチロシンキナーゼの働きにより、最終的にグルコースの取り込み、糖代謝や細胞増殖といったインスリン作用が発現する。この活性化されたインスリンレセプターは、LARによってチロシン脱リン酸化を受けて不活性化状態に戻ることが示された。
【０１１１】
また、インスリンレセプターチロシンキナーゼは LARの細胞内ドメインをチロシンリン酸化することが明らかとなり、このリン酸化が LARの基質特異性の決定か、ホスファターゼ活性の上昇に関与していることが推測された。そしてLARは、このリン酸化チロシンを自己脱リン酸化することによりその酵素活性を制御していると考えられる。
【０１１２】
以上の結果より、LARの酵素活性の促進がインスリン抵抗性の原因となる可能性を分子レベルで示すことができた。
【０１１３】
【実施例４】
マウスでのLARの組織分布
7週齢雄性C57BL/6マウスから摘出した各臓器1gに対し、冷細胞溶解用バッファー（実験例１、ｃ欄に記載したものに同じ） 3 ml を加え、氷上でホモジナイズした後、氷上で30分間インキュベートした。4℃、15,000g、20分間遠心後、上清を回収し、同じ条件で再度遠心して得た上清をそれぞれの組織試料として用いた。タンパク定量はDC Protein Assay（バイオラッド）のマニュアルに従って行った。
【０１１４】
得られた各上清 （タンパク質0.2 mgに相当）を電気泳動後、YU1を用い、実験例１、ｅ欄に記載した方法に従って、イムノブロットを行った。
【０１１５】
得られた結果を図１４に示す。YU1はマウスのLARも認識することができ、胸腺および脳でのLARの発現を確認することができた。腎臓および肝臓でも若干の発現が認められた。
【０１１６】
【実施例５】
YU1による甲状腺癌組織切片の免疫染色
甲状腺の組織を10％中性燐酸緩衝ホルマリン溶液で固定後パラフィンブロックを作製し、スライド標本を作製した。以下にその詳細な手順を示す。
【０１１７】
1.脱パラフィン操作
固定したパラフィンブロックを100％キシレンに５分間×２回浸し、その後100％エタノール、90％エタノール、70％エタノールにそれぞれ３分間浸した。最後に10ｍMクエン酸緩衝液（ｐH6.0）に浸した。この状態で抗原決定基を露出させるために、100℃、５分間オートクレーブにかけた。
【０１１８】
2.免疫染色
0.15M NaClを含む 50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）（トリス液）で洗浄し、さらにこのトリス液に浸した。その後、内因性ペルオキシダーゼの除去を目的に、液をスライドガラスから拭い取り3％過酸化水素水を組織の上に滴下し、３分間放置した。
【０１１９】
ブロッキングは、水で十分に洗浄後、さらにトリス液で十分に洗浄し余分な液を拭い取った後、キャリヤータンパク（2％BSA）と0.015Mアジ化ナトリウムおよび0.15M NaClを含んだ50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）液で組織を覆い１５分間放置することにより行った。
【０１２０】
次いで、洗浄しないで余分な液を拭い取り、一次抗体YU1（原液を1000倍希釈）を滴下後、そのまま湿潤箱の中で９０分間放置した。
【０１２１】
次に、0.15M NaClを含む50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）で十分に洗浄した後、二次抗体（ビオチン化抗マウスイムノグロブリン）を滴下し４５分放置した。
【０１２２】
その後、0.15M NaClを含む50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）で十分に 洗浄し、ストレプトアビジン接合セイヨウワサビペルオキシダーゼを滴下後、２５分放置した。
【０１２３】
次に、0.15M NaClを含む50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）で十分に洗 浄後、0.02% 過酸化水素および0.15M NaCl を含む0.05％DAB (3,3'-ジミノベンチジン四塩酸)の50ｍM  Tris-HCl緩衝液（ｐH7.6）を滴下し、顕微鏡下で発色を確認し、水の中にスライドガラスを浸すことによって反応を停止させた。
【０１２４】
反応停止後、マイヤーのヘマトキシリンに5-10秒間浸し、後染色を行った。その後、水洗し、100％エタノールに１分間×２回、100％キシレンに1分間×２回浸した後、マリノールで封入し、観察した。
【０１２５】
尚、ブロッキング、二次抗体、ストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ溶液はDAKO Japan Co. Ltd., (Kyoto)のLSAB キットを用い、DABはDojindo(Kumamoto)の試薬を、MalinolはMuto Pure Chemicals Ltd.,  (Tokyo)を、マイヤーのヘマトキシリンは自作のものを使用した。
【０１２６】
こうして得られた甲状腺癌細胞の免疫染色の結果を図１１〜１３に示す。これらの図から、癌化した甲状腺組織細胞にYU1抗体が選択的に結合し（褐色染色部）、正常の濾胞細胞および腫瘍組織の間質には結合しない（青色染色部）ことが判る。
【０１２７】
従って、この抗体を用いて甲状腺癌の組織切片染色による診断が可能であること、さらにはこの抗体が抗癌剤（化学療法剤）を含むDDSシステムにおいて有用であることも明らかになった。
【０１２８】
【実施例６】
他の良性腫瘍細胞および癌細胞組織の免疫染色
実施例５に記載したと同様の手順により、以下の表１に示す種々の良性腫瘍細胞および癌化細胞組織（ヒト由来）の免疫染色を実施した。
【０１２９】
YU1抗体との結合性に基づく染色が認められたものを陽性として、その割合を以下の表１に示す。
表１
┏━━━━━━━━┳━━━┯━━━━━┯━━━━┓
┃ 腫 瘍          ┃症例  │陽性例数  │陽性率  ┃
┣━┯━━━━━━╋━━━┿━━━━━┿━━━━┫
┃良│ 髄膜腫     ┃ 10   │    0     │   0    ┃
┃  │ グリオーマ ┃ 13   │    1     │   7.7  ┃
┃性│ 甲状腺腺腫 ┃ 10   │    0     │   0    ┃
┠─┼──────╂───┼─────┼────┨
┃  │ 甲状腺癌   ┃ 21   │   21     │ 100    ┃
┃悪│ 胃癌       ┃ 16   │    1     │   6.3  ┃
┃  │ 大腸癌     ┃ 26   │   13     │  50    ┃
┃  │ 肺癌       ┃ 20   │    2     │  10    ┃
┃性│ 乳癌       ┃ 20   │    3     │  15    ┃
┃  │ 肝癌       ┃  8   │    0     │   0    ┃
┃  │ 腎癌       ┃ 21   │    0     │   0    ┃
┃  │ 前立腺癌   ┃ 32   │    2     │   6.3  ┃
┗━┷━━━━━━┻━━━┷━━━━━┷━━━━┛
この結果、甲状腺癌での陽性率は１００％であり、良性腫瘍やその他の臓器の癌では陽性率が低いか、または完全に陰性であることが明らかになった。大腸癌で比較的高い陽性率が示されているがここで認められた陽性染色像は、甲状腺癌におけるものと随分異なっており、顕著な染色が認められた甲状腺癌細胞に対するYU1の特異的免疫反応性が示唆された。
【０１３０】
【実施例７】
YU1による甲状腺癌の特異的免疫反応：イムノアッセイ利用可能性の検討
実施例５で使用したヒト甲状腺癌組織および正常組織各1gに対し、冷細胞溶解用バッファー（同上） 3ml を加え，氷上でポリトロンを用いてホモジナイズした後、氷上で30分間インキュベートした。4℃、15,000g、20分間遠心後、上清を回収し，同じ条件で再度遠心して得た上清を用いた。タンパク定量はDC Protein Assay（バイオラッド）のマニュアルに従って行った。
【０１３１】
得られた上清（タンパク質1 mgに相当）、あるいは 陽性対照として、COS-7細胞にヒトLARをトランスフェクトし、抗LAR抗体を用いて免疫沈降したもの（実験例１ａ〜ｃに記載の手順に従って、調製）を電気泳動後、実験例１、ｅ欄に記載した方法に従ってYU1を用いてイムノブロットを行った。検出にはImmunoStar Reagents（和光純薬工業）を用いた。
【０１３２】
こうして得られた結果を図１０に示す。図１０に示されるとおり、YU1は正常の甲状腺細胞と異なり、癌化した甲状腺組織を特異的に認識す  ることが明らかになった。従って、甲状腺の穿刺吸引細胞診によって  得られる組織試料を甲状腺癌の診断に利用できることが判った。
【０１３３】
【発明の効果】
本発明によって提供される、LARのホスファターゼサブユニットに対する抗体は、ホスファターゼ活性を有するLARの細胞内ドメインを特異的に認識することができる。従って、この抗体は、インスリンのシグナル伝達機構を解明したり、LARのモジュレーターや結合タンパク質等を同定、取得するために極めて有用なツールになり得る。また、インスリン抵抗性および NIDDMに有用な診断方法を開発し、さらにはインスリン抵抗性を基盤とするシンドロームXの種々の病態の予防および診断ならびに動脈硬化および心疾患発症の予防および診断に応用できる。
【０１３４】
さらに本発明の抗体は、甲状腺癌に対する特異的免疫反応性を有するので、吸引穿刺吸引細胞診織切片を用いた甲状腺癌の診断、甲状腺癌治療のためのDDSを利用した医薬組成物などに有用であり、また、甲状腺癌細胞におけるLAR分子の転写、翻訳レベルでの発現調節因子の分子生物学的研究にも貢献することができる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD.
<120> Antibody Specific for Phosphatase Subunit of LAR
<130> 99P133WO
<160> 3
<210> 1
<211> 3467
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (6)..(1826)
<220>
<221> misc#feature
<222> (213)..(953)
<223> Phosphatase Domain 1
<220>
<221> misc#feature
<222> (1080)..(1826)
<223> Phosphatase Domain 2
<300>
<308> DDBJ/EMBL/GenBank Accession No.Y00815
<309> 1995-09-19
<400>  1
gatcc gga ctg aag gac tcc ttg ctg gcc cac tcc tct gac cct gtg gag    50
Gly Leu Lys Asp Ser Leu Leu Ala His Ser Ser Asp Pro Val Glu
1               5                  10                  15
atg cgg agg ctc aac tac cag acc cca ggt atg cga gac cac cca ccc      98
Met Arg Arg Leu Asn Tyr Gln Thr Pro Gly Met Arg Asp His Pro Pro
20                  25                  30
atc ccc atc acc gac ctg gcg gac aac atc gag cgc ctc aaa gcc aac     146
Ile Pro Ile Thr Asp Leu Ala Asp Asn Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn
35                  40                  45
gat ggc ctc aag ttc tcc cag gag tat gag tcc atc gac cct gga cag     194
Asp Gly Leu Lys Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile Asp Pro Gly Gln
50                  55                  60
cag ttc acg tgg gag aat tca aac ctg gag gtg aac aag ccc aag aac     242
Gln Phe Thr Trp Glu Asn Ser Asn Leu Glu Val Asn Lys Pro Lys Asn
65                  70                  75
cgc tat gcg aat gtc atc gcc tac gac cac tct cga gtc atc ctt acc     290
Arg Tyr Ala Asn Val Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Ile Leu Thr
80                  85                  90                  95
tct atc gat ggc gtc ccc ggg agt gac tac atc aat gcc aac tac atc     338
Ser Ile Asp Gly Val Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile
100                 105                 110
gat ggc tac cgc aag cag aat gcc tac atc gcc acg cag ggc ccc ctg     386
Asp Gly Tyr Arg Lys Gln Asn Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu
115                 120                 125
ccc gag acc atg ggc gat ttc tgg aga atg gtg tgg gaa cag cgc acg     434
Pro Glu Thr Met Gly Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Gln Arg Thr
130                 135                 140
gcc act gtg gtc atg atg aca cgg ctg gag gag aag tcc cgg gta aaa     482
Ala Thr Val Val Met Met Thr Arg Leu Glu Glu Lys Ser Arg Val Lys
145                 150                 155
tgt gat cag tac tgg cca gcc cgt ggc acc gag acc tgt ggc ctt att     530
Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Ala Arg Gly Thr Glu Thr Cys Gly Leu Ile
160                 165                 170                 175
cag gtg acc ctg ttg gac aca gtg gag ctg gcc aca tac act gtg cgc     578
Gln Val Thr Leu Leu Asp Thr Val Glu Leu Ala Thr Tyr Thr Val Arg
180                 185                 190
acc ttc gca ctc cac aag agt ggc tcc agt gag aag cgt gag ctg cgt     626
Thr Phe Ala Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg
195                 200                 205
cag ttt cag ttc atg gcc tgg cca gac cat gga gtt cct gag tac cca     674
Gln Phe Gln Phe Met Ala Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Tyr Pro
210                 215                 220
act ccc atc ctg gcc ttc cta cga cgg gtc aag gcc tgc aac ccc cta     722
Thr Pro Ile Leu Ala Phe Leu Arg Arg Val Lys Ala Cys Asn Pro Leu
225                 230                 235
gac gca ggg ccc atg gtg gtg cac tgc agc gcg ggc gtg ggc cgc acc     770
Asp Ala Gly Pro Met Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr
240                 245                 250                 255
ggc tgc ttc atc gtg att gat gcc atg ttg gag cgg atg aag cac gag     818
Gly Cys Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Leu Glu Arg Met Lys His Glu
260                 265                 270
aag acg gtg gac atc tat ggc cac gtg acc tgc atg cga tca cag agg     866
Lys Thr Val Asp Ile Tyr Gly His Val Thr Cys Met Arg Ser Gln Arg
275                 280                 285
aac tac atg gtg cag acg gag gac cag tac gtg ttc atc cat gag gcg     914
Asn Tyr Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Ile His Glu Ala
290                 295                 300
ctg ctg gag gct gcc acg tgc ggc cac aca gag gtg cct gcc cgc aac     962
Leu Leu Glu Ala Ala Thr Cys Gly His Thr Glu Val Pro Ala Arg Asn
305                 310                 315
ctg tat gcc cac atc cag aag ctg ggc caa gtg cct cca ggg gag agt    1010
Leu Tyr Ala His Ile Gln Lys Leu Gly Gln Val Pro Pro Gly Glu Ser
320                 325                 330                 335
gtg acc gcc atg gag ctc gag ttc aag ttg ctg gcc agc tcc aag gcc    1058
Val Thr Ala Met Glu Leu Glu Phe Lys Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ala
340                 345                 350
cac acg tcc cgc ttc atc agc gcc aac ctg ccc tgc aac aag ttc aag    1106
His Thr Ser Arg Phe Ile Ser Ala Asn Leu Pro Cys Asn Lys Phe Lys
355                 360                 365
aac cgg ctg gtg aac atc atg ccc tac gaa ttg acc cgt gtg tgt ctg    1154
Asn Arg Leu Val Asn Ile Met Pro Tyr Glu Leu Thr Arg Val Cys Leu
370                 375                 380
cag ccc atc cgt ggt gtg gag ggc tct gac tac atc aat gcc agc ttc    1202
Gln Pro Ile Arg Gly Val Glu Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Phe
385                 390                 395
ctg gat ggt tat aga cag cag aag gcc tac ata gct aca cag ggg cct    1250
Leu Asp Gly Tyr Arg Gln Gln Lys Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro
400                 405                 410                 415
ctg gca gag agc acc gag gac ttc tgg cgc atg cta tgg gag cac aat    1298
Leu Ala Glu Ser Thr Glu Asp Phe Trp Arg Met Leu Trp Glu His Asn
420                 425                 430
tcc acc atc atc gtc atg ctg acc aag ctt cgg gag atg ggc agg gag    1346
Ser Thr Ile Ile Val Met Leu Thr Lys Leu Arg Glu Met Gly Arg Glu
435                 440                 445
aaa tgc cac cag tac tgg cca gca gag cgc tct gct cgc tac cag tac    1394
Lys Cys His Gln Tyr Trp Pro Ala Glu Arg Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr
450                 455                 460
ttt gtt gtt gac ccg atg gct gag tac aac atg ccc cag tat atc ctg    1442
Phe Val Val Asp Pro Met Ala Glu Tyr Asn Met Pro Gln Tyr Ile Leu
465                 470                 475
cgt gag ttc aag gtc acg gat gcc cgg gat ggg cag tca agg aca atc    1490
Arg Glu Phe Lys Val Thr Asp Ala Arg Asp Gly Gln Ser Arg Thr Ile
480                 485                 490                 495
cgg cag ttc cag ttc aca gac tgg cca gag cag ggc gtg ccc aag aca    1538
Arg Gln Phe Gln Phe Thr Asp Trp Pro Glu Gln Gly Val Pro Lys Thr
500                 505                 510
ggc gag gga ttc att gac ttc atc ggg cag gtg cat aag acc aag gag    1586
Gly Glu Gly Phe Ile Asp Phe Ile Gly Gln Val His Lys Thr Lys Glu
515                 520                 525
cag ttt gga cag gat ggg cct atc acg gtg cac tgc agt gct ggc gtg    1634
Gln Phe Gly Gln Asp Gly Pro Ile Thr Val His Cys Ser Ala Gly Val
530                 535                 540
ggc cgc acc ggg gtg ttc atc act ctg agc atc gtc ctg gag cgc atg    1682
Gly Arg Thr Gly Val Phe Ile Thr Leu Ser Ile Val Leu Glu Arg Met
545                 550                 555
cgc tat gag ggc gtg gtc gac atg ttt cag acc gtg aag acc ctg cgt    1730
Arg Tyr Glu Gly Val Val Asp Met Phe Gln Thr Val Lys Thr Leu Arg
560                 565                 570                 575
aca cag cgt cct gcc atg gtg cag aca gag gac cag tat cag ctg tgc    1778
Thr Gln Arg Pro Ala Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Gln Leu Cys
580                 585                 590
tac cgt gcg gcc ctg gag tac ctc ggc agc ttt gac cac tat gca acg    1826
Tyr Arg Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Gly Ser Phe Asp His Tyr Ala Thr
595                 600                 605
taactaccgc tcccctctcc tccgccaccc ccgccgtggg gctccggagg ggacccagct  1886
cctctgagcc ataccgacca tcgtccagcc ctcctacgca gatgctgtca ctggcagagc  1946
acagcccacg gggatcacag cgtttcagga acgttgccac accaatcaga gagcctagaa  2006
catccctggg caagtggatg gcccagcagg caggcactgt ggcccttctg tccaccagac  2066
ccacctggag cccgcttcaa gctctctgtt gcgctcccgc atttctcatg cttcttctca  2126
tggggtgggg ttggggcaaa gcctcctttt taatacatta agtggggtag actgagggat  2186
tttagcctct tccctctgat ttttcctttc gcgaatccgt atctgcagaa tgggccactg  2246
taggggttgg ggtttatttt gttttgtttt tttttttttt ttgtatgact tctgctgaag  2306
gacagaacat tgccttcctc gtgcagagct ggggctgcca gcctgagcgg aggctcggcc  2366
gtgggccggg aggcagtgct gatccggctg ctcctccagc ccttcagacg agatcctgtt  2426
tcagctaaat gcagggaaac tcaatgtttt tttaagtttt gttttccctt taaagccttt  2486
ttttaggcca cattgacagt ggtgggcggg gagaagatag ggaacactca tccctggtcg  2546
tctatcccag tgtgtgttta acattcacag cccagaacca cagatgtgtc tgggagagcc  2606
tggcaaggca ttcctcatca ccatcgtgtt tgcaaaggtt aaaacaaaaa caaaaaacca  2666
caaaaataaa aaacaaaaaa aacaaaaaac ccaaaaaaaa aaaaaaaaag agtcagccct  2726
tggcttctgc ttcaaaccct caagagggga agcaactccg tgtgcctggg gttcccgagg  2786
gagctgctgg ctgacctggg cccacagagc ctggctttgg tccccagcat tgcagtatgg  2846
tgtggtgttt gtaggctgtg gggtctggct gtgtggccaa ggtgaatagc acaggttagg  2906
gtgtgtgcca caccccatgc acctcagggc caagcggggg cgtggctggc ctttcaggtc  2966
caggccagtg ggcctggtag cacatgtctg tcctcagagc aggggccaga tgattttcct  3026
ccctggtttg cagctgtttt caaagccccc gataatcgct cttttccact ccaagatgcc  3086
ctcataaacc aatgtggcaa gactactgga cttctatcaa tggtactcta atcagtcctt  3146
attatcccag cttgctgagg ggcagggaga gcgcctcttc ctctgggcag cgctatctag  3206
ataggtaagt gggggcgggg aagggtgcat agctgtttta gctgagggac gtggtgccga  3266
cgtccccaaa cctagctagg ctaagtcaag atcaacattc cagggttggt aatgttggat  3326
gatgaaacat tcatttttac cttgtggatg ctagtgctgt agagttcact gttgtacaca  3386
gtctgttttc tatttgttaa gaaaaactac agcatcattg cataattctt gatggtaata  3446
aatttgaata atcagatttc t                                            3467
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Signature Motif Conserved in Phosphatase Domain of Known
PTPs.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)
<223> "Xaa"="Ile" or "Val".
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)
<223> "Xaa"="Ser" or "Thr".
<400> 2
Xaa His Cys Xaa Ala Gly Xaa Xaa Arg Xaa Gly
1               5                  10
<210> 3
<211> 7702
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (371)..(6064)
<220>
<221> sig#peptide
<222> (371)..(418)
<220>
<221> mat#peptide
<222> (419)..(6061)
<220>
<221> misc#feature
<222> (419)..(4120)
<223> Extracellular Domain
<220>
<221> misc#feature
<222> (4121)..(4192)
<223> Transmembrane Domain
<220>
<221> misc#feature
<222> (4193)..(6061)
<223> Cytoplasmic Domain
<300>
<308> DDBJ/EMBL/GenBank Accession No.Y00815
<309> 1995-09-19
<400>  3
cgggagcggc gggagcggtg gcggcggcag aggcggcggc tccagcttcg gctccggctc   60
gggctcgggc tccggctccg gctccggctc cggctccagc tcgggtggcg gtggcgggag  120
cgggaccagg tggaggcggc ggcggcagag gagtgggagc agcggcccta gcggcttgcg  180
gggggacatg cggaccgacg gcccctggat aggcggaagg agtggaggcc ctggtgcccg  240
gcccttggtg ctgagtatcc agcaagagtg accggggtga agaagcaaag actcggttga  300
ttgtcctggg ctgtggctgg ctgtggagct agagccctgg atggcccctg agccagcccc  360
agggaggacg atg gtg ccc ctt gtg cct gca ctg gtg atg ctt ggt ttg     409
Met Val Pro Leu Val Pro Ala Leu Val Met Leu Gly Leu
-15                 -10                  -5
gtg gca ggc gcc cat ggt gac agc aaa cct gtc ttc att aaa gtc cct    457
Val Ala Gly Ala His Gly Asp Ser Lys Pro Val Phe Ile Lys Val Pro
1               5                  10
gag gac cag act ggg ctg tca gga ggg gta gcc tcc ttc gtg tgc caa    505
Glu Asp Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gly Val Ala Ser Phe Val Cys Gln
15                  20                  25
gct aca gga gaa ccc aag ccg cgc atc aca tgg atg aag aag ggg aag    553
Ala Thr Gly Glu Pro Lys Pro Arg Ile Thr Trp Met Lys Lys Gly Lys
30                  35                  40                  45
aaa gtc agc tcc cag cgc ttc gag gtc att gag ttt gat gat ggg gca    601
Lys Val Ser Ser Gln Arg Phe Glu Val Ile Glu Phe Asp Asp Gly Ala
50                  55                  60
ggg tca gtg ctt cgg atc cag cca ttg cgg gtg cag cga gat gaa gcc    649
Gly Ser Val Leu Arg Ile Gln Pro Leu Arg Val Gln Arg Asp Glu Ala
65                  70                  75
atc tat gag tgt aca gct act aac agc ctg ggt gag atc aac act agt    697
Ile Tyr Glu Cys Thr Ala Thr Asn Ser Leu Gly Glu Ile Asn Thr Ser
80                  85                  90
gcc aag ctc tca gtg ctc gaa gag gaa cag ctg ccc cct ggg ttc cct    745
Ala Lys Leu Ser Val Leu Glu Glu Glu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Pro
95                 100                 105
tcc atc gac atg ggg cct cag ctg aag gtg gtg gag aag gca cgc aca    793
Ser Ile Asp Met Gly Pro Gln Leu Lys Val Val Glu Lys Ala Arg Thr
110                 115                 120                 125
gcc acc atg cta tgt gcc gca ggc gga aat cca gac cct gag att tct    841
Ala Thr Met Leu Cys Ala Ala Gly Gly Asn Pro Asp Pro Glu Ile Ser
130                 135                 140
tgg ttc aag gac ttc ctt cct gta gac cct gcc acg agc aac ggc cgc    889
Trp Phe Lys Asp Phe Leu Pro Val Asp Pro Ala Thr Ser Asn Gly Arg
145                 150                 155
atc aag cag ctg cgt tca ggt gcc ttg cag ata gag agc agt gag gaa    937
Ile Lys Gln Leu Arg Ser Gly Ala Leu Gln Ile Glu Ser Ser Glu Glu
160                 165                 170
tcc gac caa ggc aag tac gag tgt gtg gcg acc aac tcg gca ggc aca    985
Ser Asp Gln Gly Lys Tyr Glu Cys Val Ala Thr Asn Ser Ala Gly Thr
175                 180                 185
cgt tac tca gcc cct gcg aac ctg tat gtg cga gtg cgc cgc gtg gct   1033
Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Asn Leu Tyr Val Arg Val Arg Arg Val Ala
190                 195                 200                 205
cct cgt ttc tcc atc cct ccc agc agc cag gag gtg atg cca ggc ggc   1081
Pro Arg Phe Ser Ile Pro Pro Ser Ser Gln Glu Val Met Pro Gly Gly
210                 215                 220
agc gtg aac ctg aca tgc gtg gca gtg ggt gca ccc atg ccc tac gtg   1129
Ser Val Asn Leu Thr Cys Val Ala Val Gly Ala Pro Met Pro Tyr Val
225                 230                 235
aag tgg atg atg ggg gcc gag gag ctc acc aag gag gat gag atg cca   1177
Lys Trp Met Met Gly Ala Glu Glu Leu Thr Lys Glu Asp Glu Met Pro
240                 245                 250
gtt ggc cgc aac gtc ctg gag ctc agc aat gtc gta cgc tct gcc aac   1225
Val Gly Arg Asn Val Leu Glu Leu Ser Asn Val Val Arg Ser Ala Asn
255                 260                 265
tac acc tgt gtg gcc atc tcc tcg ctg ggc atg atc gag gcc aca gcc   1273
Tyr Thr Cys Val Ala Ile Ser Ser Leu Gly Met Ile Glu Ala Thr Ala
270                 275                 280                 285
cag gtc aca gtg aaa gct ctt cca aag cct ccg att gat ctt gtg gtg   1321
Gln Val Thr Val Lys Ala Leu Pro Lys Pro Pro Ile Asp Leu Val Val
290                 295                 300
aca gag aca act gcc acc agt gtc acc ctc acc tgg gac tct ggg aac   1369
Thr Glu Thr Thr Ala Thr Ser Val Thr Leu Thr Trp Asp Ser Gly Asn
305                 310                 315
tcg gag cct gta acc tac tat ggc atc cag tac cgc gca gcg ggc acg   1417
Ser Glu Pro Val Thr Tyr Tyr Gly Ile Gln Tyr Arg Ala Ala Gly Thr
320                 325                 330
gag ggc ccc ttt cag gag gtg gat ggt gtg gcc acc acc cgc tac agc   1465
Glu Gly Pro Phe Gln Glu Val Asp Gly Val Ala Thr Thr Arg Tyr Ser
335                 340                 345
att ggc ggc ctc agc cct ttc tcg gaa tat gcc ttc cgc gtg ctg gcg   1513
Ile Gly Gly Leu Ser Pro Phe Ser Glu Tyr Ala Phe Arg Val Leu Ala
350                 355                 360                 365
gtg aac agc atc ggg cga ggg ccg ccc agc gag gca gtg cgg gca cgc   1561
Val Asn Ser Ile Gly Arg Gly Pro Pro Ser Glu Ala Val Arg Ala Arg
370                 375                 380
acg gga gaa cag gcg ccc tcc agc cca ccg cgc cgc gtg cag gca cgc   1609
Thr Gly Glu Gln Ala Pro Ser Ser Pro Pro Arg Arg Val Gln Ala Arg
385                 390                 395
atg ctg agc gcc agc acc atg ctg gtg cag tgg gag cct ccc gag gag   1657
Met Leu Ser Ala Ser Thr Met Leu Val Gln Trp Glu Pro Pro Glu Glu
400                 405                 410
ccc aac ggc ctg gtg cgg gga tac cgc gtc tac tat act ccg gac tcc   1705
Pro Asn Gly Leu Val Arg Gly Tyr Arg Val Tyr Tyr Thr Pro Asp Ser
415                 420                 425
cgc cgc ccc ccg aac gcc tgg cac aag cac aac acc gac gcg ggg ctc   1753
Arg Arg Pro Pro Asn Ala Trp His Lys His Asn Thr Asp Ala Gly Leu
430                 435                 440                 445
ctc acg acc gtg ggc agc ctg ctg cct ggc atc acc tac agc ctg cgc   1801
Leu Thr Thr Val Gly Ser Leu Leu Pro Gly Ile Thr Tyr Ser Leu Arg
450                 455                 460
gtg ctt gcc ttc acc gcc gtg ggc gat ggc cct ccc agc ccc acc atc   1849
Val Leu Ala Phe Thr Ala Val Gly Asp Gly Pro Pro Ser Pro Thr Ile
465                 470                 475
cag gtc aag acg cag cag gga gtg cct gcc cag ccc gcg gac ttc cag   1897
Gln Val Lys Thr Gln Gln Gly Val Pro Ala Gln Pro Ala Asp Phe Gln
480                 485                 490
gcc gag gtg gag tcg gac acc agg atc cag ctc tcg tgg ctg ctg ccc   1945
Ala Glu Val Glu Ser Asp Thr Arg Ile Gln Leu Ser Trp Leu Leu Pro
495                 500                 505
cct cag gag cgg atc atc atg tat gaa ctg gtg tac tgg gcg gca gag   1993
Pro Gln Glu Arg Ile Ile Met Tyr Glu Leu Val Tyr Trp Ala Ala Glu
510                 515                 520                 525
gac gaa gac caa cag cac aag gtc acc ttc gac cca acc tcc tcc tac   2041
Asp Glu Asp Gln Gln His Lys Val Thr Phe Asp Pro Thr Ser Ser Tyr
530                 535                 540
aca cta gag gac ctg aag cct gac aca ctc tac cgc ttc cag ctg gct   2089
Thr Leu Glu Asp Leu Lys Pro Asp Thr Leu Tyr Arg Phe Gln Leu Ala
545                 550                 555
gca cgc tcg gat atg ggg gtg ggc gtc ttc acc ccc acc att gag gcc   2137
Ala Arg Ser Asp Met Gly Val Gly Val Phe Thr Pro Thr Ile Glu Ala
560                 565                 570
cgc aca gcc cag tcc acc ccc tcc gcc cct ccc cag aag gtg atg tgt   2185
Arg Thr Ala Gln Ser Thr Pro Ser Ala Pro Pro Gln Lys Val Met Cys
575                 580                 585
gtg agc atg ggc tcc acc acg gtc cgg gta agt tgg gtc ccg ccg cct   2233
Val Ser Met Gly Ser Thr Thr Val Arg Val Ser Trp Val Pro Pro Pro
590                 595                 600                 605
gcc gac agc cgc aac ggc gtt atc acc cag tac tcc gtg gcc cac gag   2281
Ala Asp Ser Arg Asn Gly Val Ile Thr Gln Tyr Ser Val Ala His Glu
610                 615                 620
gcg gtg gac ggc gag gac cgc ggg cgg cat gtg gtg gat ggc atc agc   2329
Ala Val Asp Gly Glu Asp Arg Gly Arg His Val Val Asp Gly Ile Ser
625                 630                 635
cgt gag cac tcc agc tgg gac ctg gtg ggc ctg gag aag tgg acg gag   2377
Arg Glu His Ser Ser Trp Asp Leu Val Gly Leu Glu Lys Trp Thr Glu
640                 645                 650
tac cgg gtg tgg gtg cgg gca cac aca gac gtg ggc ccc ggc ccc gag   2425
Tyr Arg Val Trp Val Arg Ala His Thr Asp Val Gly Pro Gly Pro Glu
655                 660                 665
agc agc ccg gtg ctg gtg cgc acc gat gag gac gtg ccc agc ggg cct   2473
Ser Ser Pro Val Leu Val Arg Thr Asp Glu Asp Val Pro Ser Gly Pro
670                 675                 680                 685
ccg cgg aag gtg gag gtg gag cca ctg aac tcc act gct gtg cat gtc   2521
Pro Arg Lys Val Glu Val Glu Pro Leu Asn Ser Thr Ala Val His Val
690                 695                 700
tac tgg aag ctg cct gtc ccc agc aag cag cat ggc cag atc cgc ggc   2569
Tyr Trp Lys Leu Pro Val Pro Ser Lys Gln His Gly Gln Ile Arg Gly
705                 710                 715
tac cag gtc acc tac gtg cgg ctg gag aat ggc gag ccc cgt gga ctc   2617
Tyr Gln Val Thr Tyr Val Arg Leu Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Leu
720                 725                 730
ccc atc atc caa gac gtc atg cta gcc gag gcc cag tgg cgg cca gag   2665
Pro Ile Ile Gln Asp Val Met Leu Ala Glu Ala Gln Trp Arg Pro Glu
735                 740                 745
gag tcc gag gac tat gaa acc act atc agc ggc ctg acc ccg gag acc   2713
Glu Ser Glu Asp Tyr Glu Thr Thr Ile Ser Gly Leu Thr Pro Glu Thr
750                 755                 760                 765
acc tac tcc gtt act gtt gct gcc tat acc acc aag ggg gat ggt gcc   2761
Thr Tyr Ser Val Thr Val Ala Ala Tyr Thr Thr Lys Gly Asp Gly Ala
770                 775                 780
cgc agc aag ccc aaa att gtc act aca aca ggt gca gtc cca ggc cgg   2809
Arg Ser Lys Pro Lys Ile Val Thr Thr Thr Gly Ala Val Pro Gly Arg
785                 790                 795
ccc acc atg atg atc agc acc acg gcc atg aac act gcg ctg ctc cag   2857
Pro Thr Met Met Ile Ser Thr Thr Ala Met Asn Thr Ala Leu Leu Gln
800                 805                 810
tgg cac cca ccc aag gaa ctg cct ggc gag ctg ctg ggc tac cgg ctg   2905
Trp His Pro Pro Lys Glu Leu Pro Gly Glu Leu Leu Gly Tyr Arg Leu
815                 820                 825
cag tac tgc cgg gcc gac gag gcg cgg ccc aac acc ata gat ttc ggc   2953
Gln Tyr Cys Arg Ala Asp Glu Ala Arg Pro Asn Thr Ile Asp Phe Gly
830                 835                 840                 845
aag gat gac cag cac ttc aca gtc acc ggc ctg cac aag ggg acc acc   3001
Lys Asp Asp Gln His Phe Thr Val Thr Gly Leu His Lys Gly Thr Thr
850                 855                 860
tac atc ttc cgg ctt gct gcc aag aac cgg gct ggc ttg ggt gag gag   3049
Tyr Ile Phe Arg Leu Ala Ala Lys Asn Arg Ala Gly Leu Gly Glu Glu
865                 870                 875
ttc gag aag gag atc agg acc ccc gag gac ctg ccc agc ggc ttc ccc   3097
Phe Glu Lys Glu Ile Arg Thr Pro Glu Asp Leu Pro Ser Gly Phe Pro
880                 885                 890
caa aac ctg cat gtg aca gga ctg acc acg tct acc aca gaa ctg gcc   3145
Gln Asn Leu His Val Thr Gly Leu Thr Thr Ser Thr Thr Glu Leu Ala
895                 900                 905
tgg gac ccg cca gtg ctg gcg gag agg aac ggg cgc atc atc agc tac   3193
Trp Asp Pro Pro Val Leu Ala Glu Arg Asn Gly Arg Ile Ile Ser Tyr
910                 915                 920                 925
acc gtg gtg ttc cga gac atc aac agc caa cag gag ctg cag aac atc   3241
Thr Val Val Phe Arg Asp Ile Asn Ser Gln Gln Glu Leu Gln Asn Ile
930                 935                 940
acg aca gac acc cgc ttt acc ctt act ggc ctc aag cca gac acc act   3289
Thr Thr Asp Thr Arg Phe Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr
945                 950                 955
tac gac atc aag gtc cgc gca tgg acc agc aaa ggc tct ggc cca ctc   3337
Tyr Asp Ile Lys Val Arg Ala Trp Thr Ser Lys Gly Ser Gly Pro Leu
960                 965                 970
agc ccc agc atc cag tcc cgg acc atg ccg gtg gag caa gtg ttt gcc   3385
Ser Pro Ser Ile Gln Ser Arg Thr Met Pro Val Glu Gln Val Phe Ala
975                 980                 985
aag aac ttc cgg gtg gcg gct gca atg aag acg tct gtg ctg ctc agc   3433
Lys Asn Phe Arg Val Ala Ala Ala Met Lys Thr Ser Val Leu Leu Ser
990                 995                1000                1005
tgg gag gtt ccc gac tcc tat aag tca gct gtg ccc ttt aag att ctg   3481
Trp Glu Val Pro Asp Ser Tyr Lys Ser Ala Val Pro Phe Lys Ile Leu
1010                1015                1020
tac aat ggg cag agt gtg gag gtg gac ggg cac tcg atg cgg aag ctg   3529
Tyr Asn Gly Gln Ser Val Glu Val Asp Gly His Ser Met Arg Lys Leu
1025                1030                1035
atc gca gac ctg cag ccc aac aca gag tac tcg ttt gtg ctg atg aac   3577
Ile Ala Asp Leu Gln Pro Asn Thr Glu Tyr Ser Phe Val Leu Met Asn
1040                1045                1050
cgt ggc agc agc gca ggg ggc ctg cag cac ctg gtg tcc atc cgc aca   3625
Arg Gly Ser Ser Ala Gly Gly Leu Gln His Leu Val Ser Ile Arg Thr
1055                1060                1065
gcc ccc gac ctc ctg cct cac aag ccg ctg cct gcc tct gcc tac ata   3673
Ala Pro Asp Leu Leu Pro His Lys Pro Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ile
1070                1075                1080                1085
gag gac ggc cgc ttc gat ctc tcc atg ccc cat gtg caa gac ccc tcg   3721
Glu Asp Gly Arg Phe Asp Leu Ser Met Pro His Val Gln Asp Pro Ser
1090                1095                1100
ctt gtc agg tgg ttc tac att gtt gtg gta ccc att gac cgt gtg ggc   3769
Leu Val Arg Trp Phe Tyr Ile Val Val Val Pro Ile Asp Arg Val Gly
1105                1110                1115
ggg agc atg ctg acg cca agg tgg agc aca ccc gag gaa ctg gag ctg   3817
Gly Ser Met Leu Thr Pro Arg Trp Ser Thr Pro Glu Glu Leu Glu Leu
1120                1125                1130
gac gag ctt cta gaa gcc atc gag caa ggc gga gag gag cag cgg cgg   3865
Asp Glu Leu Leu Glu Ala Ile Glu Gln Gly Gly Glu Glu Gln Arg Arg
1135                1140                1145
cgg cgg cgg cag gca gaa cgt ctg aag cca tat gtg gct gct caa ctg   3913
Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Leu Lys Pro Tyr Val Ala Ala Gln Leu
1150                1155                1160                1165
gat gtg ctc ccg gag acc ttt acc ttg ggg gac aag aag aac tac cgg   3961
Asp Val Leu Pro Glu Thr Phe Thr Leu Gly Asp Lys Lys Asn Tyr Arg
1170                1175                1180
ggc ttc tac aac cgg ccc ctg tct ccg gac ttg agc tac cag tgc ttt   4009
Gly Phe Tyr Asn Arg Pro Leu Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Gln Cys Phe
1185                1190                1195
gtg ctt gcc tcc ttg aag gaa ccc atg gac cag aag cgc tat gcc tcc   4057
Val Leu Ala Ser Leu Lys Glu Pro Met Asp Gln Lys Arg Tyr Ala Ser
1200                1205                1210
agc ccc tac tcg gat gag atc gtg gtc cag gtg aca cca gcc cag cag   4105
Ser Pro Tyr Ser Asp Glu Ile Val Val Gln Val Thr Pro Ala Gln Gln
1215                1220                1225
cag gag gag ccg gag atg ctg tgg gtg acg ggt ccc gtg ctg gca gtc   4153
Gln Glu Glu Pro Glu Met Leu Trp Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Val
1230                1235                1240                1245
atc ctc atc atc ctc att gtc atc gcc atc ctc ttg ttc aaa agg aaa   4201
Ile Leu Ile Ile Leu Ile Val Ile Ala Ile Leu Leu Phe Lys Arg Lys
1250                1255                1260
agg acc cac tct ccg tcc tct aag gat gag cag tcg atc gga ctg aag   4249
Arg Thr His Ser Pro Ser Ser Lys Asp Glu Gln Ser Ile Gly Leu Lys
1265                1270                1275
gac tcc ttg ctg gcc cac tcc tct gac cct gtg gag atg cgg agg ctc   4297
Asp Ser Leu Leu Ala His Ser Ser Asp Pro Val Glu Met Arg Arg Leu
1280                1285                1290
aac tac cag acc cca ggt atg cga gac cac cca ccc atc ccc atc acc   4345
Asn Tyr Gln Thr Pro Gly Met Arg Asp His Pro Pro Ile Pro Ile Thr
1295                1300                1305
gac ctg gcg gac aac atc gag cgc ctc aaa gcc aac gat ggc ctc aag   4393
Asp Leu Ala Asp Asn Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Gly Leu Lys
1310                1315                1320                1325
ttc tcc cag gag tat gag tcc atc gac cct gga cag cag ttc acg tgg   4441
Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile Asp Pro Gly Gln Gln Phe Thr Trp
1330                1335                1340
gag aat tca aac ctg gag gtg aac aag ccc aag aac cgc tat gcg aat   4489
Glu Asn Ser Asn Leu Glu Val Asn Lys Pro Lys Asn Arg Tyr Ala Asn
1345                1350                1355
gtc atc gcc tac gac cac tct cga gtc atc ctt acc tct atc gat ggc   4537
Val Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Ile Leu Thr Ser Ile Asp Gly
1360                1365                1370
gtc ccc ggg agt gac tac atc aat gcc aac tac atc gat ggc tac cgc   4585
Val Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr Arg
1375                1380                1385
aag cag aat gcc tac atc gcc acg cag ggc ccc ctg ccc gag acc atg   4633
Lys Gln Asn Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Glu Thr Met
1390                1395                1400                1405
ggc gat ttc tgg aga atg gtg tgg gaa cag cgc acg gcc act gtg gtc   4681
Gly Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Val Val
1410                1415                1420
atg atg aca cgg ctg gag gag aag tcc cgg gta aaa tgt gat cag tac   4729
Met Met Thr Arg Leu Glu Glu Lys Ser Arg Val Lys Cys Asp Gln Tyr
1425                1430                1435
tgg cca gcc cgt ggc acc gag acc tgt ggc ctt att cag gtg acc ctg   4777
Trp Pro Ala Arg Gly Thr Glu Thr Cys Gly Leu Ile Gln Val Thr Leu
1440                1445                1450
ttg gac aca gtg gag ctg gcc aca tac act gtg cgc acc ttc gca ctc   4825
Leu Asp Thr Val Glu Leu Ala Thr Tyr Thr Val Arg Thr Phe Ala Leu
1455                1460                1465
cac aag agt ggc tcc agt gag aag cgt gag ctg cgt cag ttt cag ttc   4873
His Lys Ser Gly Ser Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg Gln Phe Gln Phe
1470                1475                1480                1485
atg gcc tgg cca gac cat gga gtt cct gag tac cca act ccc atc ctg   4921
Met Ala Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Tyr Pro Thr Pro Ile Leu
1490                1495                1500
gcc ttc cta cga cgg gtc aag gcc tgc aac ccc cta gac gca ggg ccc   4969
Ala Phe Leu Arg Arg Val Lys Ala Cys Asn Pro Leu Asp Ala Gly Pro
1505                1510                1515
atg gtg gtg cac tgc agc gcg ggc gtg ggc cgc acc ggc tgc ttc atc   5017
Met Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile
1520                1525                1530
gtg att gat gcc atg ttg gag cgg atg aag cac gag aag acg gtg gac   5065
Val Ile Asp Ala Met Leu Glu Arg Met Lys His Glu Lys Thr Val Asp
1535                1540                1545
atc tat ggc cac gtg acc tgc atg cga tca cag agg aac tac atg gtg   5113
Ile Tyr Gly His Val Thr Cys Met Arg Ser Gln Arg Asn Tyr Met Val
1550                1555                1560                1565
cag acg gag gac cag tac gtg ttc atc cat gag gcg ctg ctg gag gct   5161
Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Ile His Glu Ala Leu Leu Glu Ala
1570                1575                1580
gcc acg tgc ggc cac aca gag gtg cct gcc cgc aac ctg tat gcc cac   5209
Ala Thr Cys Gly His Thr Glu Val Pro Ala Arg Asn Leu Tyr Ala His
1585                1590                1595
atc cag aag ctg ggc caa gtg cct cca ggg gag agt gtg acc gcc atg   5257
Ile Gln Lys Leu Gly Gln Val Pro Pro Gly Glu Ser Val Thr Ala Met
1600                1605                1610
gag ctc gag ttc aag ttg ctg gcc agc tcc aag gcc cac acg tcc cgc   5305
Glu Leu Glu Phe Lys Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ala His Thr Ser Arg
1615                1620                1625
ttc atc agc gcc aac ctg ccc tgc aac aag ttc aag aac cgg ctg gtg   5353
Phe Ile Ser Ala Asn Leu Pro Cys Asn Lys Phe Lys Asn Arg Leu Val
1630                1635                1640                1645
aac atc atg ccc tac gaa ttg acc cgt gtg tgt ctg cag ccc atc cgt   5401
Asn Ile Met Pro Tyr Glu Leu Thr Arg Val Cys Leu Gln Pro Ile Arg
1650                1655                1660
ggt gtg gag ggc tct gac tac atc aat gcc agc ttc ctg gat ggt tat   5449
Gly Val Glu Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Leu Asp Gly Tyr
1665                1670                1675
aga cag cag aag gcc tac ata gct aca cag ggg cct ctg gca gag agc   5497
Arg Gln Gln Lys Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ala Glu Ser
1680                1685                1690
acc gag gac ttc tgg cgc atg cta tgg gag cac aat tcc acc atc atc   5545
Thr Glu Asp Phe Trp Arg Met Leu Trp Glu His Asn Ser Thr Ile Ile
1695                1700                1705
gtc atg ctg acc aag ctt cgg gag atg ggc agg gag aaa tgc cac cag   5593
Val Met Leu Thr Lys Leu Arg Glu Met Gly Arg Glu Lys Cys His Gln
1710                1715                1720                1725
tac tgg cca gca gag cgc tct gct cgc tac cag tac ttt gtt gtt gac   5641
Tyr Trp Pro Ala Glu Arg Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Phe Val Val Asp
1730                1735                1740
ccg atg gct gag tac aac atg ccc cag tat atc ctg cgt gag ttc aag   5689
Pro Met Ala Glu Tyr Asn Met Pro Gln Tyr Ile Leu Arg Glu Phe Lys
1745                1750                1755
gtc acg gat gcc cgg gat ggg cag tca agg aca atc cgg cag ttc cag   5737
Val Thr Asp Ala Arg Asp Gly Gln Ser Arg Thr Ile Arg Gln Phe Gln
1760                1765                1770
ttc aca gac tgg cca gag cag ggc gtg ccc aag aca ggc gag gga ttc   5785
Phe Thr Asp Trp Pro Glu Gln Gly Val Pro Lys Thr Gly Glu Gly Phe
1775                1780                1785
att gac ttc atc ggg cag gtg cat aag acc aag gag cag ttt gga cag   5833
Ile Asp Phe Ile Gly Gln Val His Lys Thr Lys Glu Gln Phe Gly Gln
1790                1795                1800                1805
gat ggg cct atc acg gtg cac tgc agt gct ggc gtg ggc cgc acc ggg   5881
Asp Gly Pro Ile Thr Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly
1810                1815                1820
gtg ttc atc act ctg agc atc gtc ctg gag cgc atg cgc tat gag ggc   5929
Val Phe Ile Thr Leu Ser Ile Val Leu Glu Arg Met Arg Tyr Glu Gly
1825                1830                1835
gtg gtc gac atg ttt cag acc gtg aag acc ctg cgt aca cag cgt cct   5977
Val Val Asp Met Phe Gln Thr Val Lys Thr Leu Arg Thr Gln Arg Pro
1840                1845                1850
gcc atg gtg cag aca gag gac cag tat cag ctg tgc tac cgt gcg gcc   6025
Ala Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Gln Leu Cys Tyr Arg Ala Ala
1855                1860                1865
ctg gag tac ctc ggc agc ttt gac cac tat gca acg taactaccgc        6071
Leu Glu Tyr Leu Gly Ser Phe Asp His Tyr Ala Thr                   1881
1870                1875                1880
tcccctctcc tccgccaccc ccgccgtggg gctccggagg ggacccagct cctctgagcc 6131
ataccgacca tcgtccagcc ctcctacgca gatgctgtca ctggcagagc acagcccacg 6191
gggatcacag cgtttcagga acgttgccac accaatcaga gagcctagaa catccctggg 6251
caagtggatg gcccagcagg caggcactgt ggcccttctg tccaccagac ccacctggag 6311
cccgcttcaa gctctctgtt gcgctcccgc atttctcatg cttcttctca tggggtgggg 6371
ttggggcaaa gcctcctttt taatacatta agtggggtag actgagggat tttagcctct 6431
tccctctgat ttttcctttc gcgaatccgt atctgcagaa tgggccactg taggggttgg 6491
ggtttatttt gttttgtttt tttttttttt ttgtatgact tctgctgaag gacagaacat 6551
tgccttcctc gtgcagagct ggggctgcca gcctgagcgg aggctcggcc gtgggccggg 6611
aggcagtgct gatccggctg ctcctccagc ccttcagacg agatcctgtt tcagctaaat 6671
gcagggaaac tcaatgtttt tttaagtttt gttttccctt taaagccttt ttttaggcca 6731
cattgacagt ggtgggcggg gagaagatag ggaacactca tccctggtcg tctatcccag 6791
tgtgtgttta acattcacag cccagaacca cagatgtgtc tgggagagcc tggcaaggca 6851
ttcctcatca ccatcgtgtt tgcaaaggtt aaaacaaaaa caaaaaacca caaaaataaa 6911
aaacaaaaaa aacaaaaaac ccaaaaaaaa aaaaaaaaag agtcagccct tggcttctgc 6971
ttcaaaccct caagagggga agcaactccg tgtgcctggg gttcccgagg gagctgctgg 7031
ctgacctggg cccacagagc ctggctttgg tccccagcat tgcagtatgg tgtggtgttt 7091
gtaggctgtg gggtctggct gtgtggccaa ggtgaatagc acaggttagg gtgtgtgcca 7151
caccccatgc acctcagggc caagcggggg cgtggctggc ctttcaggtc caggccagtg 7211
ggcctggtag cacatgtctg tcctcagagc aggggccaga tgattttcct ccctggtttg 7271
cagctgtttt caaagccccc gataatcgct cttttccact ccaagatgcc ctcataaacc 7331
aatgtggcaa gactactgga cttctatcaa tggtactcta atcagtcctt attatcccag 7391
cttgctgagg ggcagggaga gcgcctcttc ctctgggcag cgctatctag ataggtaagt 7451
gggggcgggg aagggtgcat agctgtttta gctgagggac gtggtgccga cgtccccaaa 7511
cctagctagg ctaagtcaag atcaacattc cagggttggt aatgttggat gatgaaacat 7571
tcatttttac cttgtggatg ctagtgctgt agagttcact gttgtacaca gtctgttttc 7631
tatttgttaa gaaaaactac agcatcattg cataattctt gatggtaata aatttgaata 7691
atcagatttc t                                                      7702
【図面の簡単な説明】
【図１】  第１図は、LARのサブユニット構造を示す模式図(a)、および実験例にて調製したLARの膜内ホスファターゼドメイン構造の変異体を示す模式図(b)である。
【図２】  第２図は、LAR C/Sとインスリンレセプターの野生型とをコトランスフェクトしたCOS細胞において、インスリン刺激により誘導されるチロシンリン酸化の時間経過を示すイムノブロットの写真である。
【図３】  第３図は、LARの野生型または変異体とインスリンレセプターの野生型とをコトランスフェクトしたCOS細胞における、リン酸化−脱リン酸化を示すイムノブロットの写真である。
【図４】  第４図は、LARの野生型または変異体によるインスリンレセプターβ鎖の脱リン酸化を示すイムノブロットの写真である。
【図５】  第５図は、インスリンレセプターの野生型または変異型とLAR C/SとをコトランスフェクトしたCOS細胞におけるチロシンリン酸化を示すイムノブロットの写真である。
【図６】  第６図は、本発明の抗体YU1の分子量を示す、SDS−ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図７】  第７図は、本発明の抗体YU1のLARに対する免疫特異性を示すイムノブロットの写真である。
【図８】  第８図は、インスリンレセプターチロシンキナーゼによるLARのリン酸化を示すイムノブロットの写真である。
【図９】  第９図は、インスリンレセプターおよびLARが関与する、リン酸化および脱リン酸化によって制御されるインスリンのシグナル伝達のカスケードを示す模式図である。
【図１０】  第１０図は、本発明の抗体YU1のヒト甲状腺癌組織に対する特異的免疫反応性を調べた、正常および癌化甲状腺組織のイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図１１】  第１１図は、本発明の抗体YU1を用いたヒト甲状腺癌組織切片の免疫染色における、癌細胞の陽性染色結果を示す図である。
【図１２】  第１２図は、本発明の抗体YU1を用いたヒト甲状腺癌組織切片の免疫染色における、癌細胞の陽性染色結果を示す図である。
【図１３】  第１３図は、本発明の抗体YU1を用いたヒト甲状腺癌組織切片の免疫染色における、癌細胞の陽性染色結果を示す図である。
【図１４】  第１４図は、本発明の抗体YU1を用いてマウスにおけるLARの組織分布を調べたイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図１】
0003991327.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003991327.tif 000008
【図８】
0003991327.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0003991327.tif 000011
【図１３】
0003991327.tif 000012
【図１４】
0003991327.tif 000013
【図１１】
0003991327.tif 000014
【図１２】
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