(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の細胞毒性形態のイソ−好酸球カチオン性タンパク質(ＥＣＰ)のレベルを選択的に測定することを特徴とする、
（ａ）個体から得た試料中のＥＣＰの少なくとも１種の細胞毒性イソ形態のレベルを特異的に測定し、
（ｂ）該少なくとも１種の細胞毒性イソ形態の実測ＥＣＰレベルと標準ＥＣＰレベルとを比較する
各段階を含む、ＥＣＰレベルを測定する方法。
【請求項２】
該少なくとも１種の細胞毒性形態のイソ−ＥＣＰのレベルを免疫アッセイによって測定する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも１種の細胞毒性形態のイソ−ＥＣＰに特異的な抗細胞毒性形態イソ−ＥＣＰ抗体を該少なくとも１種の細胞毒性形態のイソ−ＥＣＰの測定のために使用する、請求の範囲第１〜２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
非細胞毒性形態のイソ−ＥＣＰへの結合と比較して、細胞毒性形態のイソ−ＥＣＰの方に優先的に結合する能力を有するものである、抗ＥＣＰ抗体ｍＡｂ６５２。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、好酸球カチオン性タンパク質(ＥＣＰ)の測定を含む新規診断法およびその方法において採用できる新規抗体に関する。
背景技術
好酸球顆粒タンパク質は、標的細胞に近接すると自らの細胞毒性を媒介することが示唆されている(Hamman et al., J. Immunol. 144(1990)3166-3173; Capton et al., Eosinophils in Asthma. London, New York, Tokyo: Academic Press(1989)49-60; Robert et al., J. Allergy Clin. Immunol.(1991)1105-1115)。ＥＣＰは、Shistosoma Mansoniの幼虫にとって強力な毒素であり(McLaren et al., Parasitol. 88(1984)491-503)、モルモットの脳またはウサギの脳脊髄液に注射した場合は強力な神経毒素である(Fredens et al., J. Allergy Clin. Immunol. 70(1982)361-366)。ＥＣＰは膜活性剤であり、膜損傷を引き起こすこともある。これによって、孔形成により人工二重層のイオン通過を誘導する(Yong et al., Nature321(1985)613-616)。
多くの研究者ら(Olsson et al., Blood 44(1974)235-246; Olsson et al., Blood 67(1986)498-503;およびGleich et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83(1986)3146-3150)は、精製ＥＣＰがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより数種の分子量形態（１８から２１ｋＤaの範囲）に分離されることを示した。Peterson等(Eur. J. Haematol. 40(1988)415-423)は、健常ドナーから精製したＥＣＰがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより少なくとも３種の分子量形態に分離されたこと、および電荷および分子量における相違はこのタンパク質に結合した炭水化物量の相違を表すと推論されたことを示した。これらの多種のＥＣＰ分子形態（イソ−ＥＣＰ類）の生物学的活性については何ら知られていない。
好酸球がアレルギー疾患を含む様々な炎症疾患に関連することは昔から知られていた。このような疾患では、好酸球およびその有毒産物が炎症病巣、例えば喘息の組織標本中に見られる(Arm et al., Acv. Immunol. 51(1992)323-382)。この細胞およびその顆粒産物は、組織破壊、例えば、気道における上皮細胞の落屑(shedding)の主たる原因とみられている(Filly et al., Lancet 3(July, 1982)11-16; Venge et al., Am. Rev. Resp. Dis. 138(1988)54-57;およびBousquet et al., N. Engl. J. Med 323(1990)1033-1039)。喘息の肺でみられる病態生理学的変化は、活動亢進状態を導く。低度の炎症でも、患者はアレルゲン暴露(Bisgaard et al., J. Allergy Clin. Immunol. 85(1990)891-895)や運動(Venge et al., J. Allergy Clin. Immunol. 88(1991)699-704)を含む様々な攻撃を受けやすくなるようである。これらの症状は、様々な生物体液における活性化好酸球およびそれらの産物ＥＣＰの監視により確定できる。
急性喘息などの炎症症状は、抗炎症剤で処理される(Sheffer, J. Allergy Clin. Immunol. 88(Suppl)(1991)425-534)。血清や血漿などの血液試料中のＥＣＰレベルにより表される炎症の低下は、治療効果を監視する際に重要であり得る。
ＥＣＰレベルは、この他にもアトピー性皮膚炎(Kapp et al., J. Am. Acad. Dermatol. 24(1991)555-558)、ある種の感染(Paganelli et al., J. Allergy Clin. Immunol. 88(1991)416-418）、
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および寄生虫性疾患(Venge et al., In. Eosinophil cationic proteins(ECP and EPX)in health and disease. Eds Yoshida et al., Immunobiology of the eosinophil. New York: Elsevier Biomedical(1983)163-179)などの活性化好酸球関連の臨床症状では高いことが分かっている。
発明の開示および発明の目的
本発明は、ＥＣＰのイソ形態（イソ−ＥＣＰ）が、異なる生物学的効果を生むいう、例えば、ＥＣＰの細胞毒性は各イソ形態間で変わるという我々の発見に基づくものである。このことから、発明者らは、生物体液においてイソ−ＥＣＰを測定することによりヒト診断法の改良が可能になることが分かった。
結果として、本発明の目的は、イソ−ＥＣＰ測定に基づく新規および改良ヒト診断法およびこれらの方法において採用される試薬を提供するものである。
本発明
Ａ．具体的な方法
本発明の一態様は：
（ａ）診断対象の個体から得た試料中のＥＣＰレベルを特異的に測定し、
（ｂ）実測ＥＣＰレベルと標準ＥＣＰレベルとを比較する
各段階を含む、診断法である。
本発明のこの態様の特徴は、少なくとも１種のイソ−ＥＣＰのレベルを選択的に測定し、同じイソ−ＥＣＰの基準レベルと比較することである。この態様では、全イソ−ＥＣＰの総量（レベル）測定は無視している。
この基準レベルは、明らかに健常な個体での実測レベルまたは同じ個体で以前に得られたレベルであり得る。実測レベルが健常個体の正常レベルから離れていれば、その個体が何らかの異常状態、例えば、上記のような状態を被っていることを示す（レベル増大）。実測レベルが、同じ個体で以前に得られたレベルとは異なっている場合、その偏差は症状が変わったことを示している（異常状態からの回復または異常状態の悪化）。後者の場合、イソ−ＥＣＰ測定によって上記のような医学的処理の監視が可能になる。正常レベルと比べて低いレベルならば、抗炎症剤による過剰処理および／または好酸球欠乏を示している。
測定される好ましいイソ−ＥＣＰは細胞毒性のもの、例えば、実施例のところで定義した細胞毒性変種である。
“少なくとも１種のイソ−ＥＣＰを選択的に測定する”という表現は、様々なＥＣＰのイソ形態の総数も含むが、ＥＣＰの総量は含まないことを意味する。
測定レベルは、絶対濃度(例えば、μg/lまたはnmol/l)または他の試料構成物に対する値、例えば、ＥＣＰの総量に対する値、ある種のイソ−ＥＣＰ混合物またはその他の試料構成物に対する値として表す。
試料は、診断対象のヒト個体から得られ、好酸球および/またはＥＣＰを含有する。好酸球は全身に存在するため、試料として考えられるのは、気管支肺胞洗浄液、血液(血清および血漿試料を含む)、尿、脳脊髄液、痰、糞便、涙液および鼻汁である。血液試料、例えば全血、血清および血漿試料は、優先日時点で好ましい試料であった。
イソ−ＥＣＰの測定は、原則として、１種以上のイソ−ＥＣＰを他のＥＣＰと識別でき、十分な感度、精度、および特異性などを提供できる方法ならどれによっても実施できる。しかしながら、実施例に示したように、免疫アッセイが好ましいと考えられる。
本発明の免疫アッセイは、基準からはずれたレベルのイソ−ＥＣＰを含有する疑いのある試料をアッセイ培地中、ＥＣＰと抗ＥＣＰ抗体との免疫複合体を形成させる条件下で抗ＥＣＰ抗体と接触させるというものである。次いで、測定対象のイソ−ＥＣＰ含有複合体を、その試料中レベルを定量または定性測定できるそれ自身知られている方法にて測定する。この種のアッセイでは、複合体は、それ自体を測定してもよく、また分析的に検出可能な物質(標識)で標識した生物特異的親和性反応体の補助により測定することもでき、該反応体(およびそのラベル)は、複合体中に特異的に組み込まれる能力がある。標識でき、かつ採用できる適切な生物特異的親和性反応体は、抗ＥＣＰ抗体、好ましくは、測定対象の１種以上のイソ−ＥＣＰと特異的に反応するもの、形成された複合体中に存在する抗ＥＣＰ抗体の定常領域と対向する抗−抗体、プロテインＡおよびＧ等である。使用できる検出可能な物質(標識)の例は、発光体、発色団、蛍光体、酵素、酵素基質、補因子、補酵素、放射性アイソトープ、粒子(金属または非金属)、ビオチン(アビジン／ストレプトアビジンとの反応により検出される)等である。標識の中には免疫複合体中に組み込まれるとそのシグナルが変わるものもあり、そうでないものもある。前者のタイプの標識は、複合体の中に組み込まれた標識と組み込まれなかった標識とを分離する必要のない均一系免疫アッセイを提供する。後者のタイプの標識は、例えば、標識が組み込まれている複合体を不溶性化することにより、分離を行う必要がある（非均一系アッセイ）。標識を含有する不溶性化複合体を得るために、ポリエチレングリコールなどの沈殿化剤および複合体に結合する不溶性化した、および不溶性化可能な生物特異的親和性反応体を使用できる。この後者のタイプの試薬は、標識化生物特異的親和性反応体自身を不溶性化してはいけない。採用される免疫アッセイは、競合的または非競合的であってよい。後者のタイプは、抗原(本件ではＥＣＰ)に同時に結合できる２つの抗体を利用するので、サンドイッチアッセイと呼ばれることが多い。
知られている原理を応用して、適切な免疫アッセイプロトコール、例えば、均一系または非均一系の変形法、添加順序および様式、インキュベーション行程等を選択する。主要点は、複合体中に組み込まれるまたは組み込まれない標識の量が試料中の測定対象イソ−ＥＣＰのレベルを表すような量で反応体を添加しなければならないことである。
通常のアッセイ条件は、水混和性共溶媒を含むかまたは含まない水性培地、０−４０℃の範囲の温度および４−１０の範囲のｐＨ値である。
抗ＥＣＰ抗体(抗イソ−ＥＣＰ抗体を含む)という用語は、目的のイソ−ＥＣＰと特異的に反応する抗体調製物を意味する。本発明の診断法で使用される抗ＥＣＰ抗体は、試料またはアッセイ培地中に存在し得る他の成分と実質的に反応しない。“実質的に反応しない”という用語は、抗体が意図する目的を損なう、本件では、使用した免疫アッセイの結果を無効にするような反応を持たないことを意味する。
特記しない限り、上記の抗体概念、特に、抗ＥＣＰ／抗イソ−ＥＣＰ抗体概念は、Ｆab、Ｆ(ab)2、Ｆv、一本鎖抗体等を含む抗体活性フラグメントおよび誘導体や、ＥＣＰまたは選択されたイソ−ＥＣＰに特異的に結合するその他の生物特異的親和性反応体も含む。
好ましい免疫アッセイ変形法では、抗ＥＣＰ抗体は測定対象のイソ−ＥＣＰに対してのみ、更に好ましくはモノクローナル抗体調製物に対してのみ特異的である。
全てのイソＥＣＰと反応する抗ＥＣＰ抗体を使用する場合、サンドイッチアッセイにおいて、測定対象のイソ−ＥＣＰに対して特異的な抗イソ−ＥＣＰ抗体と組合せるのが好ましい。その他の場合では、関連するイソ−ＥＣＰ複合体の測定は、形成された複合体中に保持される分子イソ−ＥＣＰの相違に基づくものでなければならない。EP-A-535,162(Axis)に示されたアッセイ変形法を比較。
優先日時点で、非均一系変形法に重点を置くサンドイッチ形式が好まれていた。よって、この好ましいアッセイ変形法は、二種の抗ＥＣＰ抗体を使うものであり、少なくともその１つは、測定対象のイソ−ＥＣＰと他のイソ−ＥＣＰとを識別できる。非均一系アッセイ変形法では、抗ＥＣＰ抗体の１種は、アッセイ中、使用したアッセイ培地において不溶性の固相(支持体)に結合するようになる。
本発明の優れた抗イソ−ＥＣＰ抗体
本発明の第二の態様は、ＥＣＰの細胞毒性イソ形態の天然形態に特有のエピトープに特異的に結合する抗イソ−ＥＣＰ抗体である。よって、ＥＣＰに結合する本発明の抗体は、少なくとも１種の細胞毒性イソ−ＥＣＰ形態と他のイソ−ＥＣＰとを識別でき、および／または抗体が結合するイソ−ＥＣＰの細胞毒性活性を少なくとも部分的に阻害できる。実施例参照。優先日時点で、好ましい抗体調製物は、赤白血病Ｋ５６２細胞系列に対して細胞毒性を発揮できるイソ−ＥＣＰに関するものであった。
本発明の抗イソ−ＥＣＰ抗体は、他の抗体についてよく知られた標準技術により調製でき、上記と同じ一般型の抗体変種を含む。実施例参照。
実施例１−イソ−ＥＣＰおよびモノクローナル抗体の単離および特性化
方法
顆粒の単離
顆粒は、Peterson et al(Eur. J. Haematl. 40(1988)415-423)に記載されている方法の変法を用いて健常血液ドナーから得られた軟膜の顆粒球から調製した。軟膜およそ４Ｌをメスシリンダー中で等用量のＮaＣl／ＰＢＳ(ホスフェート緩衝化塩水)中２％デキストランＴ−５００と混合した。白血球豊富血漿を収集する前に赤血球を室温で１時間沈殿させた。白血球をＰＢＳ中で２回、０.３４Ｍショ糖で１回、４００×gで１０分間遠心することにより洗浄した。洗浄後、白血球ペレットを５容量の０.３４Ｍショ糖に懸濁した。等容量の０.３４Ｍショ糖と混合した細胞懸濁液３００mlを窒素ボンベ(Parr Instrument Company, Moline, IL, U.S.A.)中一定撹拌しながら＋４℃、７５０psiで３０分間Ｎ2加圧した(Klemper et al., J. Cell. Biol. 86(1986)21-28; and Borregard et al., J. Cell. Biol. 97(1983)52-61)。次いで、気泡を等容量の０.３４Ｍショ糖、０.３４ＭＮaＣl中に集め、４℃、４５０×gで２０分間遠心した。上清を４℃、１０，０００×gで２０分間遠心して、顆粒を沈殿させた。−７０℃での凍結および解凍を一巡した後、顆粒ペレットを５０mＭ酢酸５容量で１時間４℃で抽出した。等容量の０.４Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４を加え、抽出操作を４℃で４時間磁気撹拌しながら続けた。次いで、顆粒抽出物を、ＹＭ−３フィルター(Amicon Corporation, Lexington, U.S.A.)を用いておよそ５mlまで濃縮した。
クロマトグラフィー法
ゲルろ過クロマトグラフィーは、セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５スーパーファインカラム(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)にて実施した。カラムを０.２ＭＮaＡc、ｐＨ４.５で平衡化した。試料容量はおよそ５mlであり、３mlのフラクションを流速７ml/hで集めた。タンパク質は２８０nmでのその吸光度により測定した。
イオン交換クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣおよび強カチオン性交換Ｍono−Ｓプレパックカラム(Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。カラムを、５０mＭ ＭＥＳ(２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸)ベタイン２％０.１ＭＬiＣl、ｐＨ６.０(出発緩衝液)で平衡化した。出発緩衝液中の試料(プール８(図１参照)の２ml)をカラムにのせ、０.１Ｍから１.０ＭＬiＣl、ｐＨ６.０の直線勾配を用いて溶出した。
過ヨウ素酸塩処理
セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５でのゲルクロマトグラフィー後のＥＣＰ調製物プール８(図１参照)を０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４.５中メタ過ヨウ素酸ナトリウム(Peterson et al., Eur. J. Haematol. 40(1988)415-423; and Stewart et al., proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74(1977)4200-4204)と共にモル比率１：１６００で＋４℃で１７時間インキュベーションした。
タンパク質測定およびタンパク質溶液の濃縮
クロマトグラム中のタンパク質を２８０nmでのその吸光度により測定した。特定のタンパク質はラジオイムノアッセイ(下記参照)で測定した。プールしたフラクションをＹＭ−２フィルター(Amicon Corporation, Lexington, U.S.A.)にて超ろ過した。緩衝液交換は、ＰＤ−１０カラム(Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。タンパク質プールを０.２Ｍ酢酸ナトリウム中、ｐＨ５.５、−７０℃で貯蔵した。
電気泳動法
不連続ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)は、PhastSystem(Pharmacia Biotech AB)、PhastGel勾配１０−１５％を用いて実施した。分子量マーカーはホスホリラーゼｂ(９４ｋＤa)、アルブミン（６７ｋＤa)、オバルブミン（４３ｋＤa)、トリプシン阻害剤(２０ｋＤa)およびラクトアルブミン(１４.４ｋＤa)である。電気泳動後、PhastSystemを用いてゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
顆粒タンパク質のイムノブロッティングは、PhastTransferSemi-ドライ電気泳動転写システム(dry Electrophoretic Transfer System)(Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、２０Ｖおよび２５mＡで３０分間、タンパク質をニトロセルロース紙へ電気泳動的に転写した。転写緩衝液は、２５mＭトリス、０.１９２Ｍグリシン、２０％メタノールであった。転写したタンパク質は、１：２，０００希釈した精製顆粒タンパク質に対するマウス抗体と共にインキュベーションし、次いで、免疫複合体を、マウスＩgＧに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート化抗体(Sigma Immunochemicals, CO, U.S.A.)により同定し、α−ナフチルホスフェート２５mgにより染色した。ｏ−ジアニシジン２５mg、テトラゾタイズド(tetrazotized)(Sigma)は０.０６Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９.７、５０mlに希釈した。
ＥＣＰおよびＥＰＯに対する抗体
ＥＣＰおよびＥＰＯに対するモノクローナル抗体(mＡｂ)は、ハイブリドーマ技術を用いて作った。要約すると、Ｂalb/cマウスをアジュバント中精製抗原５０μgで免疫化し、次いで、３日続けて抗原２５μgで追加免疫した。脾臓細胞とＳp２/０骨髄腫細胞とを融合させた後、ＥＬＩＳＡ分析により、ＥＣＰおよびＥＰＯそれぞれに対する抗体について上清をスクリーニングした。ＥＣＰに対するモノクローナル抗体を更にＢＩＡコア▲Ｒ▼(Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)によりそのエピトープ特異性について特性化した。ＥＣＰに対する多様なエピトープ特異性の４つのクローンとＥＰＯに対して反応性の１つのクローンを、展開(expansion)および精製のために選定した。抗体は全てＩgＧ１サブタイプのものであった。
ＥＣＰのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
個々のカラムフラクション中のＥＣＰ濃度は、Pharmacia ＥＣＰ ＲＩＡ(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)の使用により測定した。
細胞毒性および毒性アッセイの阻害
ＦＭＣＡ法。Larsonら(Int. J. Cancer 50(1992)177-185)によって報告された蛍光測定ミクロ培養細胞毒性アッセイ(ＦＭＣＡ)の変法を使用した。赤白血病Ｋ５６２細胞系列を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、ペニシリン５，０００Ｕ／mlおよびストレプトマイシン５，０００g/mlを補足したＲＰＭＩ１６４０にて培養した。アッセイ日までに、ペニシリン５，０００Ｕ/mlおよびストレプトマイシン５，０００g/mlは補足したがＦＣＳは含まないＲＰＭＩ１６４０中で細胞を３回洗浄した。Ｋ５６２細胞、２０，０００細胞/ウェルをＶ型９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)の各ウェルに接種し、同じものを３通り用意し、最終濃度２０μg/ml/ウェルで０.２Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ５.５中ＥＣＰ１０μlを加えた。対照として、細胞と緩衝液のウェルを用意した。次いで、９５％空気および５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気下で７２時間、培養プレートを３７℃でインキュベーションし、続いて遠心した(２００×g、７分)。培地を除去し、ＰＢＳ２００μl/ウェルで１回洗浄後、ＦＤＡ(１０μg/ml；二酢酸フルオレセイン(Sigma, St Louis, Mo. U.S.A.))含有ＰＢＳ１００μl/ウェルを加えた。続いて、プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、その後４８５nm(Fluorescan 2, Labsystems Oy, Helsinki, Finland)での蛍光を読み取った。この蛍光測定では、ＦＤＡ染料を含有するが細胞は含まないＰＢＳ含有ウェルをブランクとした。この蛍光データを、マイクロソフト社のExcelおよびマッキントッシュ社のＳＥ/３０パーソナルコンピューターを用いる自動データ計算用のカスタムメードソフトウェアに移した。指示剤ＦＤＡにより得られた結果は、対照ウェルパーセントにおける試験ウェルの蛍光として定義した生存指標(ＳＩ)として表す。個々のカラムフラクションをＫ５６２細胞に対する細胞毒性について試験した。
ＤiＳＣ法。短期間色素排除試験と平行して、分染細胞毒性(ＤiＳＣ)アッセイ(Weisenthal et al., Cancer Res. 43(1983)749-757; and Nygren et al., Leukemia 11(1992)1121-1128)を実施した。蛍光測定後直ちに、選定したウェルをファーストグリーン（１％、Sigma)、ニグロシン(０.５％、Sigma)および２５，０００ホルムアルデヒド−固定化ニワトリ赤血球／ウェルの混合物に室温で１０分間暴露した。ウェルの細胞内容物を続いてスライド上で細胞遠心し、メイ−グルンワルト−ギームザ染色で対比染色した。細胞生存は、光学顕微鏡で評価した。生存可能細胞は正常なギームザ形態に染まるのに対し、死滅細胞およびニワトリ赤血球は、緑がかった黒色に染まる。この変形ＤiＳＣ法(Nygren et al., Leukemia 11(1992)1121-1128)を用いる腫瘍細胞生存は、実験ウェルでは固定化ニワトリ赤血球に対する生存可能Ｋ５６２細胞の比率として、対照ウェルでは得られた比率のパーセンテージとして生存指標(ＳＩ)を表すことにより、算出した。
阻害Ｋ５６２細胞は、上記のように１８０μl/ウェル調製した。ＥＣＰに対する抗体１０μlを最終濃度１００μg/ml/ウェルで加え、ＥＣＰ１０μlを最終濃度２０μg/mlで加えた。
統計
各グループ間の差異の統計学的評価については、一対の試料に対してマン−ホワイトニー(Mann-Whitney)Ｕ−試験とウィルソン(Wilcxon)試験を用いた。統計学的パッケージStatistica/W(StatSoft, Tulsa, OK, U.S.A.)を用いてパーソナルコンピューターにより算出した。
結果
セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５でのゲルクロマトグラフィーから得たプールの分子特性および細胞毒性活性
健常血液ドナーから抽出した顆粒の上清をセファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５カラムでのゲルろ過にかけ(図１)、０.２ＭＮaＡc、ｐＨ４.５で溶出した。各フラクション中のＥＣＰは、特定のＲＩＡ(Peterson C.G.B. et al., Clin. Exp. Allergy 21(1991)561-566)により測定した。各フラクションを指示通りにプールし、プール７および８中のＥＣＰを超ろ過により濃縮した。図１中の挿入図は、プール７およびプール８中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。プール７では、分子量およそ２１および２４ｋＤaの２つのバンドが見られた。還元後、２つのバンドは分子量２０および２２ｋＤa辺りであった。プール８では、１つの主要バンドが２２ｋＤaで見られた。還元後、分子量１８および１５ｋＤaの２つのバンドが見られた。バンドは全て、還元前、ＥＣＰに対する多種のモノクローナル抗体を用いてウェスタン・イロノブロットによりＥＣＰとして同定したものであった。
図２には、ゲルろ過後のプール７(ｎ＝１０)およびプール８(ｎ＝１２)の細胞毒性活性を示す。ＥＣＰの細胞毒性活性は、プール８(ｐ＜０.０１)の方が顕著に高く、プール７では弱い活性があるのみであった。
Ｍono−ＳカラムでのＦＰＬＣクロマトグラフィーから得たプールの分子特性および細胞毒性活性
上記ゲルろ過から得たプール８中のタンパク質(分子量２０ｋＤa)は、Ｍono−Ｓカラムで分離した(図３)。指示通り各フラクションをプールして濃縮し、各プール中のＥＣＰの量は、図に示したように測定した。３つの主要なＥＣＰ含有プール、プールＶ、ＶIおよびＶIIが得られた。これらのプール中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元せずとも、プールＶにおいてそれぞれ分子量２０および２２ｋＤaの二重バンドを示した。プールＶIでは、単一だが、非常に幅広の分子量１９−２１ｋＤaのバンドが見られた。プールＶIIは分子量２０ｋＤaの単一バンド１本を含有した。還元後、同様のパターンが得られたが、全てのバンドがより低い分子量へと僅かにシフト(１−２ｋＤa)し、更に約１５ｋＤaの低分子量タンパク質があった(図４)。これら３つのプールの還元前(図５ａ)のタンパク質がＥＣＰであるかどうかの同定は、ウェスタン・イムノブロットにより確立されており、図５ｂに示している。ＥＣＰに対してｍＡｂ６１４を用いた場合の結果が示されており、同一の結果がｍＡｂ６１１およびｍＡｂ６１２でも得られた(図示せず)。よって、上記のバンドは全てＥＣＰであると同定された。更に、高分子量タンパク質、約３０ｋＤaもまた同定された(図５ｂ)が、これはゲルのタンパク質染色では見えなかった。ｍＡｂ６５２では、分子量１９−２２ｋＤaの範囲のバンドのみが同定された(図５ｃ)。
Ｋ６５２に対する細胞毒性は、プールＶにおいて、細胞毒性活性をもつ他のプールの調製物の１つのみで主に見出された。
細胞毒性活性の抗体阻害
セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５でのゲルろ過後の多種の抗体によるプール８の細胞毒性活性の阻害が、図７に示されている。ポリクローナルウサギＥＣＰ−抗体、但し、ＥＰＯ−抗体ではない、は約９８％まで細胞毒性活性を中和した。ＥＣＰに対するｍＡｂ６１１、ｍＡｂ６１２、ｍＡｂ６１４およびｍＡｂ６５２の阻害作用を試験すると、ｍＡｂ６５２は９０−９８％の阻害を引き起こしたのに対し、他のモノクローナル抗体は阻害作用を持たなかった。ＥＣＰに対する市販のモノクローナル抗体、即ち、ＥＧ１およびＥＧ２もまた、ＥＣＰの細胞毒性活性を阻害できなかった。一実験では、Ｍono−ＳでのＦＰＬＣクロマトグラフィーから得られたプールＶの細胞毒性活性もまた、ｍＡｂ６５２により中和されるが、他のｍＡｂでは中和されない(図示せず)。
タンパク質脱グリコシル化
ゲルろ過により得られた細胞毒性ＥＣＰ(プール８)を、Ｍono−Ｓカラムで分離する前にモル比率１：１６００で過ヨウ素酸ナトリウムと共にインキュベーションした(図８ａ)。指示通りフラクションをプールし、濃縮して、各プール中のＥＣＰ量を図８ａに示すように測定した。３つの主たるＥＣＰ含有ピークの電荷は、過ヨウ素酸酸化後、より塩基性の分子へと変わった。しかしながら、タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(図８ｂ)は、実質的に変わらない分子サイズを示した。一単一個体からのＥＣＰの調製
ＥＣＰもまた過剰好酸球増加症の一単一個体から調製した。また、この単一個体では、ある程度の分子不均一性が見られたが、Ｍono−Ｓで精製したＥＣＰの細胞毒性活性は見られなかった。上記と同じイオン強度で溶出したＭono−ＳプールのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＥＣＰのバンドが２０ｋＤaで現れたが、２２ｋＤaのタンパク質バンドはなかった(図９)。
プロテアーゼ阻害剤での処理
サイズに関する不均一性は、ＥＣＰ精製中のプロテアーゼによる分解に起因することもあるため、全行程において、精製はプロテアーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)、濃度１００μg/mlの存在下で実施した。この操作は、ＥＣＰの分子不均一性を変化させず、またＥＣＰの細胞毒性活性にも影響を与えなかった。
考察
提示したデータは、好酸球カチオン性タンパク質(ＥＣＰ)には生物学的活性の異なる数種の分子変種(イソ形態)が存在することを示す。これらのデータはまた、分子不均一性がグリコシル化の相違に部分的に依存するが、細胞毒性活性を持つ分子変種は他の変種とは共有しない独特な構造を持つことも示唆している。更に、この分子変種の細胞毒性活性を特異的に中和するモノクローナル抗体を製造することが可能である。
ＥＣＰの精製は、ゲルろ過とＭono−Ｓでのカチオン交換クロマトグラフィーの二段階であった。ゲルろ過では、ＥＣＰは不規則なピークで溶出し、既にこの段階で不均一性を示した。このように大まかに分離した後、細胞毒性活性はより低分子量のＥＣＰ種と関連することが明らかになった。そこで、この低分子量領域の細胞毒性分子の解明にこの研究の焦点をしぼった。Ｍono−Ｓで更に精製すると、ＥＣＰを含有する３つのピークが基本的に見つかり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致するパターンを示した。よって、塩基性最大のＥＣＰ種がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分子量およそ２０ｋＤaの単一バンドとして現れたのに対し、塩基性最少のＥＣＰ種は、一貫して、それぞれ分子量およそ２２および２０ｋＤaの別個の二重バンドとして現れた。真中のＥＣＰ分子種は、常に、同じ分子量領域に幅広のバンドとして現れた。還元によりピークＶおよびＶIにおいて１５ｋＤaバンドが出現したのに対し、過ヨウ素酸酸化により脱グリコシル化してもゲル上の様相は有意には変わらなかった。しかしながら、全ての変種の電荷は、過ヨウ素酸酸化後、より塩基性の分子へと変化した。これらの結果は、これら３種のＭono−Ｓピーク由来のＥＣＰの不均一性がグリコシル化の主たる相違によっては説明できないこと、および第四級構造を決定し得る−Ｓ−Ｓ−架橋が分子中に存在することを示す。ＥＣＰに対する全てのモノクローナル抗体は、イムノブロットでは、還元前の異なるバンドがエピトープを共有したことを示し、このことは、これらが全てＥＣＰ分子であったことを確認するものである。しかしながら、モノクローナル抗体、ｍＡｂ６１１、６１２および６１４はまた、６５２を除き、特に、ピークＶIおよびＶIIの調製物、即ち、最も塩基性かつ非細胞毒性の２種のＥＣＰ変種において、分子量およそ３０ｋＤaでタンパク質染色後に僅かに目に見える１つのバンドを同定した。これらのデータは、ＥＣＰの細胞毒性変種は幾つかの独特な分子特性を持ち、これがその細胞毒性を決定することを示している。この細胞毒性調製物において見出された両方の分子種が細胞毒性活性にとって必要であるという仮定は、現在のところ知られていないが、好酸球増加症の一患者由来の調製物中に高分子量バンドがなければ、このＥＣＰ調製物は非細胞毒性になるという事実は、この２２ｋＤa種が必須部分であることを示唆している。
この研究では、一貫して、５〜６種のＥＣＰ変種の存在を示してきたが、問題は、これらの変種が精製操作の結果であるのか、または遺伝的に決定されているのかということである。前者の原因は、不均一性がプロテアーゼ阻害剤の存在下ではＥＣＰ調製物と相違なかったことから非常に考えにくい。また、これらの変種は、殆どの調製物中に非常に一貫してみられる。しかしながら、後者の問いは、別の可能性であり、これを除外することはできない。従って、我々は、ＥＣＰ調製物の出発物質として常に正常白血球のプールを使用した。これらのプールは、一般に、無作為に選択した、それぞれ別個のＥＣＰ変種を持ち得るおよそ１００人の血液ドナーから入手した。これは、好酸球が得られた患者の一人については少なくとも真実であった。なぜなら、この患者から得られたＥＣＰの不均一性はかなり低かったからである。その他の可能性は、もちろん、これらの変種が、そのグリコシル化度の相違に起因する分子の翻訳後変化を部分的に表すことやこれらの変化が非遺伝的決定要因によることである。
ＥＣＰの細胞毒性活性を独特に中和するｍＡｂ６５２により全てのＥＣＰ種においてその細胞毒性活性にかかわりなくエピトープが同定されたという事実は、細胞毒性エピトープが全てのＥＣＰ変種中に存在することを示す。そのため、ＥＣＰにおける細胞毒性部位は、その分子の幾つかの独特な構造的特性に関連し得る。しかしながら、ｍＡｂ６５２が３０ｋＤａバンドを同定しなかったことは興味深く、これは僅かに細胞毒性ＥＣＰの調製物で見られた。これらの結果に基づき、本願発明者らは、ＥＣＰの細胞毒性能がＭono−Ｓで分離後にピークＶに見られた２２ｋＤａ変種に関連することを提唱する。この分子は、ある程度のグリコシル化度と内部Ｓ−Ｓ架橋を持つ。この分子はまた、ＥＣＰの一部が１５および７ｋＤaバンドに還元されるため、不安定なタンパク質分解部位を含有することもある。この１５ｋＤa鎖は、３０ｋＤaタンパク質から二量体化によりイムノブロット上で明らかにすることもできる。この３０ｋＤaタンパク質は、ｍＡｂ６５２と反応しないが、他のモノクローナル抗体とは反応するので、ＥＣＰの細胞毒性部位を損失することもあり、従って、７ｋＤａ鎖に関連している。これらの分子変種の頂部で、グリコシル化度の相違によりその他多くの変種が形成される。これらの結果から、１種以上のＥＣＰ産物が存在し得ることも推論される。
初期の研究で、本願発明者らは、２種のモノクローナル抗体、ＥＧ１およびＥＧ２がそれぞれ非活性化好酸球および活性化好酸球中のＥＣＰに結合することを示した。この相違は、イロノブロットにおいてＥＧ２のみが低分子量で脱グリコシル化されたＥＣＰを検出したことから、異なるグリコシル化度での抗体のＥＣＰ認識能に関連することを示していた。しかしながら、今回の結果は、これらのモノクローナル抗体はどれもＥＣＰの細胞毒性活性を中和できないことを示し、これは、細胞毒性部位が、提案されたＥＣＰのマトリクス結合部位とは異なること、およびその細胞毒性は脱グルコシル化ＥＣＰ分子に単純に関連しているのではないことを意味する。
実施例II−臨床物質におけるイソ−ＥＣＰアッセイ
試験キット
アッセイは、ＥＣＰ抗原が固相抗ＥＣＰ抗体と標識化抗ＥＣＰ抗体との間で複合体形成するサンドイッチＥＣＰアッセイにより様々な臨床物質にて実施した。確立された方法Pharmacia CAP System ECP FEIA(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)と、固相結合抗体およびｍａｂ６１４とｍａｂ６５２それぞれで置換した標識化抗体を用いる以外は同じキットとで比較を行った。
結果：図面の説明参照
図面の説明
図１〜９は実施例Ｉに相当し、図１０〜１３は実施例IIに相当する。
図１
健常血液ドナーから得られた顆粒抽出物のセファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５でのゲルろ過クロマトグラフィー。ＥＣＰのラジオイムノアッセイは、クロマトグラム中に含まれる。クロマトグラムの底部に示したとおりピークでのタンパク質をプールした。挿入図は、クロマトグラム由来のプール７および８(還元済みおよび未還元)のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。Ｒ＝分子量マーカーは、ホスホリラーゼｂ(９４ｋＤa)、アルブミン(６７ｋＤa)、オバルブミン(４３ｋＤa)、無水カルボン酸(３０ｋＤa)、トリプシン阻害剤(２０.１ｋＤa)およびα−ラトクアルブミン(１４.４ｋＤa)であった。試料は、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
図２
セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５ゲルろ過後のプール７および８における細胞毒性活性。細胞系列Ｋ５６２由来の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに２０，０００/ウェルずつ接種した。別の調製物由来のＥＣＰは、最終濃度２０μg/ml/ウェルで使用し、続いて、インキュベーションし、材料および方法のところで記載したＦＭＣＡ法により蛍光測定した。生存指標(ＳＩ)とＰ値の計算については、上記参照。
図３
セファデックス▲Ｒ▼Ｇ−７５ゲルろ過由来のプール８のＭono−Ｓカラムでのイオン交換クロマトグラフィー。試料(２mlのプール８)を出発緩衝液に充填し、材料および方法のところ示したようにして溶出した。クロマトグラムの底部に示したとおりにフラクションをプールした(１〜７)。棒グラフはＲＩＡにより測定した各プール中のＥＣＰ量を示す。
図４
図３(Ｍono−Ｓカラム)のプールＶ、ＶIおよびＶII由来のタンパク質の還元。分子量マーカーは、レーンＲに見られる。＋は、還元されたタンパク質を示し、−は、未還元タンパク質を示す。
図５ａ−ｃ
図３(Ｍono−Ｓカラム)のプールＶ、ＶIおよびＶIIを(ａ)ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび(ｂ、ｃ)イムノブロットにて同定した。(ａ)レーンＲが分子量マーカー。レーンＶ、ＶIおよびＶII(未還元)は、図３のそれぞれのプールから精製したＥＣＰに相当する。(ｂ)ｍＡｂ６１４により同定されたタンパク質。(ｃ)ｍＡｂ６５２により同定されたタンパク質。未還元試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース紙に移した。
図７
細胞毒性活性の抗体阻害。黒点は、３回繰り返し測定した平均を示す。棒グラフは、その３回の測定の中央値である。
図８ａ−ｂ
ａ．タンパク質の過ヨウ素酸酸化前後のＭono−Ｓカラムでのプール８(図１に示した)分離についてのクロマトグラム。実線は過ヨウ素酸処理物のクロマトグラフィーを示し、点線は非処理物のクロマトグラフィーを示す。棒グラフは、過ヨウ素酸処理後にＲＩＡで測定したＥＣＰ濃度を示す。破線はＬiＣl勾配を示す。
ｂ．過ヨウ素酸酸化前後の図８ａにおけるクロマトグラム由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーはレーンＲに示し、レーンＶ、ＶIおよびＶIIは図８ａに示したそれぞれのプールから精製したＥＣＰに相当する。＋＝過ヨウ素酸処理物。−＝非処理物。
図９
Ｍono−Ｓカラムでのクロマトグラフィーにより精製した、過剰好酸球増加症の一個体由来のＥＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーはレーンＲに示し、レーンＶ、ＶIおよびＶIIの試料は図３に示した正常好酸球のプールＶ、ＶI、ＶIIに相当する。
図１０および１１
これらは、確立された方法と本発明のイソＥＣＰ検出法により測定したＥＣＰの血清レベルを示す。
ｒ＝参考グループ。健常非アレルギー性被験者９９人。
aa＝急性喘息、一部は処理し、一部は処理しない。ｎ＝１７。
ka＝除感作後３年のネコアレルギー幼児。ｎ＝２４。
ｅ＝喘息およびアレルギーに対するヨーロッパ人の研究。処理および非処理患者混合。ｎ＝４２。
sj＝シェーグレン症候群の患者。ほとんど非処理。ｎ＝９。
bl＝病院にアレルギーおよび喘息の病気について問い合わせた患者の混合グループ。
ｉ＝急性ウイルス性および細菌性疾患の患者グループ。ｎ＝１１３。
ｐ＝花粉の季節の前およびその最中のアレルギー患者。ｎ＝５７。
ｇ＝慢性喘息の患者。非処理。ｎ＝１５。
図１２は、それぞれの患者グループと参考グループとのＥＣＰ平均レベルの比率を示す。
図１３は、健常参考グループにおけるＥＣＰの血清レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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