(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５'から３'へのエキソヌクレアーゼ活性を欠き、サーマスアクアティカス、サーマスフラバスまたはサーマスサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にて単一ポリペプチドバンドを形成する、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの６６７位に均等な位置においてチロシンを有する５４０から５８２アミノ酸の酵素学上活性なＤＮＡポリメラーゼであって、但し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの６６７位に均等な位置が配列番号：１の３９６位、配列番号：２の３９７位、又は配列番号：１４の３９６位である、酵素学上活性なＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
ポリメラーゼのアミノ酸配列が上記サーマス種のＤＮＡポリメラーゼに比して３未満の保存的アミノ酸の変更を含む、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
ポリメラーゼのアミノ酸配列が上記サーマス種のＤＮＡポリメラーゼに比して３未満の保存的アミノ酸の変更をＮ末端に含む、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号：１、２及び１４からなる群から選択される、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする精製された核酸。
【請求項６】
少なくとも１つのチェーン停止剤および１つまたは複数のヌクレオチド３リン酸の存在下で、請求項１ないし４のいずれか１項記載のＤＮＡポリメラーゼを用いて配列決定されるＤＮＡ鋳型からチェーン停止断片を生成し、そして該断片のサイズからＤＮＡ配列を決定する工程からなる、ＤＮＡ配列決定法。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか１項記載のＤＮＡポリメラーゼおよびピロホスファターゼを含むＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項８】
ピロホスファターゼが熱耐性である、請求項７記載のキット。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれか１項記載のＤＮＡポリメラーゼを含む反応機およびバンド分離機を有するＤＮＡ配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、新規な熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ、それらをコードする遺伝子およびベクター並びにＤＮＡ配列決定におけるそれらの使用に関する。
米国特許第4,889,818号および第5,079,352号は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以後、Ｔａｑと呼ぶ）として知られているＤＮＡポリメラーゼの単離および発現を記載する。コーディング配列の約1/3が存在しないアミノ末端欠失が、ポリメラーゼアッセイにおいて全く活性な遺伝子産物の生成をもたらしたことを報告する。Ｔａｑは、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）において使用されるとして記載されている。
米国特許第5,075,216号はＤＮＡ配列決定におけるＴａｑの使用を記載する。
国際特許出願WO/92/06/06188は、Ｎ末端の235アミノ酸を欠く以外はＴａｑのと同一のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ並びにその配列決定における使用を記載する。このＤＮＡポリメラーゼは△Ｔａｑとして知られている。
米国特許第4,795,699号は、ＤＮＡ配列決定におけるＴ７タイプのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ７）の使用を記載する。これらはデオキシヌクレオシド３リン酸（ＮＴＰｓ）の取り込みに匹敵する効率でジデオキシヌクレオシド３リン酸（ＮＴＰｓ）を取り込むＤＮＡ配列決定において極めて有用であり、他のＤＮＡポリメラーゼは極めて効率悪いジデオキシＮＴＰｓの取り込みを示し、配列決定反応において割合大量のジデオキシＮＴＰｓを必要とする。
ＤＯＥコントラクター−グランティーワークショップ（1994年11月13-17日、サンタフェ）およびＩ．Robert Lehmanシンポジウム（1994年11月11-14日、ソノマ）において、Ｓ．Tabor教授は、より効率よくジデオキシＮＴＰｓを取り込ませるために修飾されうるＤＮＡポリメラーゼ中の部位を同定した。彼は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７およびＴａｑ上の高度に保存された位置における単一のヒドロキシ基（チロシン対フェニルアラニン）の存在または不在がジデオキシＮＴＰｓに対しての区別の能力を1000倍以上異ならせることを報告した。（公告番号0 655 506 A1として1995年５月31日公告の欧州特許出願番号94203433.1も参照されたく、該文献を引用により編入する）
発明の概要
本発明は、Ｎ末端の272アミノ酸を欠き、そして667位（天然のＴａｑの）において、フェニルアラニンに代えてチロシンを有する、Ｔａｑとは異なるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼを提供する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、１位（Ｔａｑの272位に等しい）にメチオニンを有する（以後、ＦＹ２と呼ぶ）。完全長のＤＮＡ配列は図１（配列番号：１）に示すとおりである。本発明の範囲に包含されるのは、熱耐性並びにジデオキシＮＴＰｓの効率よい取り込みを保持した上記アミノ酸配列と実質的に相同な配列を有するＤＮＡポリメラーゼである。
実質的に相同なアミノ酸配列とは、熱耐性またはヌクレオチド取り込みに実質的に影響しないＴａｑに匹敵する保存的アミノ酸の変更、即ちフェニルアラニンからチロシンへの置換以外の置換を有する、540から582アミノ酸を含む配列を意味する。そのような変更は同様な荷電を有するアミノ酸同志の置換、または小さな側鎖を有するアミノ酸から他の小さな側鎖を鎖を有するアミノ酸への置換、例えばalaからvalを包含する。より劇的な変化は、そのような変化によりほとんどまたは全くポリメラーゼ活性に影響しない重要ではない領域において導入されてよい。
本発明は、サーマスフラバス（Themus flavus）（Ｔｆ１）のＮ末端の251から293（好ましくは271または272）のアミノ酸を欠き且つ（天然Ｔｆ１の）666位にてフェニルアラニンに代えてチロシンを有するＤＮＡポリメラーゼ；およびサーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）のN末端の253から295（好ましくは274）のアミノ酸を欠き且つ（天然Ｔｔｈの）669位にてフェニルアラニンに代えてチロシンを有するＤＮＡポリメラーゼも特徴とする。
ジデオキシＮＴＰｓの効率よい取り込みとは、ｄＮＴＰｓに比した場合のｄｄＮＴＰｓの取り込みに関して、たとえあったとしてもほとんど区別できないポリメラーゼの能力を意味する。適切な効率よい区別とは、１：１０未満であり、好ましくは１：５未満である。そのような区別は、当業界において公知の方法により測定されうる。
上記配列に対する一つの好ましい実質的に相同なアミノ酸配列は、１位にメチオニンを有し且つ２位にアラニンを有する（天然Ｔａｑの271位および272位に対応する）562アミノ酸を含む配列である。完全長のＤＮＡ配列は、図２に与えられる。これは、本発明の遺伝子による発現のために好ましいＤＮＡポリメラーゼである。
精製されたＤＮＡポリメラーゼＦＹ２およびＦＹ３は共に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に単一のポリペプチドのバンドを与え、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に同様なサイズの幾つかのポリペプチドバンドを形成する667位にフェニルアラニンまたはチロシンの何れかを有する△Ｔａｑとは異なる。
第２の実質的に相同なアミノ酸配列は、１位にメチオニンを有するサーマスサーモフィルスのＮ末端のアミノ酸274を欠き、そして396位において（天然Ｔｔｈの669位に対応する）フェニルアラニンからチロシンへの変異を有する配列である（以後、ＦＹ４と呼ぶ）。完全長のＤＮＡ配列を図５に与える（配列番号：１４）。
本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子も提供する。ＤＮＡポリメラーゼ活性の発現における補助のために、修飾された遺伝子は新たなＤＮＡポリメラーゼの１位においてメチオニン残基をコードするのが好ましい。さらに、本発明の一つの好ましい態様において、修飾された遺伝子は２位において（天然Ｔａｑの272位に対応する）アラニンもコードする。
さらなる側面において、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性をコードする、例えばＮ末端の272アミノ酸を欠き且つ396位において（Ｔａｑの667位と均等）フェニルアラニンに代えてチロシンを有するような、天然Ｔａｑとは異なるアミノ酸配列をコードするかまたはそれらと実質的に相同アミノ酸配列をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
さらなる側面において、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性をコードする、例えばＮ末端の272アミノ酸を欠き且つ396位において（Ｔａｑの667位と均等）フェニルアラニンに代えてチロシンを有するような、天然Ｔａｑとは異なるアミノ酸配列をコードするかまたはそれらと実質的に相同アミノ酸配列をコードする遺伝子を含むベクターを有する、宿主細胞を提供する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、精製された形態が好ましい。精製された形態とは、通常は結合している大多数の宿主細胞蛋白質から単離されたＤＮＡポリメラーゼであって、好ましくは該ポリメラーゼが調製物の蛋白質の少なくとも１０％（w/w）であり、より好ましくは均一な調製物、例えば均一な溶液として提供される。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にて単一ポリペプチドである。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはピロホスファターゼと組み合わせて配列決定において適切に使用される。したがって、本発明は、ピロホスファターゼと組み合わせて、より好ましくは熱耐性ピロホスファターゼ例えばサーモプラズマアシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）のピロホスファターゼ（Schafer, G. and Richter, O.H．（1992）Eur. J. Biochem. 209, 351-355）と組み合わせて、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を提供する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは標準技術を用いて構築されうる。例示の目的で、変異原性ＰＣＲプライマーを用いてデザインすることにより、所望のPheからTyrへのアミノ酸の変更（ＦＹ変異）を一つのプライマーに取り込むことができる。我々の手元において、これらのプライマーは、我々により鋳型ＤＮＡとして用いられたデルタＴａｑ、pWB253のＴａｑポリメラーゼ遺伝子クローンの配列内部に見いだされる制限部位も運んだ。しかしながら、Ｔａｑの任意のクローンからのこのプライマー対またはサーマスアクアティカス（Thermus aquaticus）から直接単離したゲノミックＤＮＡを用いて同じＰＣＲ産物を生じさせることもできる。該遺伝子の部分のみをコードするＰＣＲ産物は、次に適切な制限酵素により消化されて、同じ制限酵素で消化されたデルタＴａｑのクローンのための置換配列として用いられる。我々の手元において、その結果得られたプラスミドはpWB253Yと呼んだ。該変異の存在は、該遺伝子の増幅領域のＤＮＡ配列決定により確認することができる。
Ｔａｑの対応する位置には見いだされないＮ末端のメチオニン残基をコードするさらなるプライマーを提供することができ、配列はアミノ酸残基273が続く。これらのプライマーは、適切なプラスミド、例えばpWB253YのＤＮＡを増幅のための鋳型として用いることにより使用することができ、そして増幅された遺伝子はベクター、例えばpRE2に挿入されて遺伝子、例えばポリメラーゼ（ＦＹ２）をコードするpRE273Yを創製することができる。完全な遺伝子はＤＮＡ配列決定により確認できる。
pRE2発現ベクター中における本発明のＤＮＡポリメラーゼの改良された発現は、さらなる遺伝子pRE273Ypref（ＦＹ２に相同な蛋白質をコードする）およびＦＹ３をコードするpRE273Yを創製することにより得た。変異原性ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリペプチドの配列に影響しない蛋白質のアミノ末端においてサイレントなコドンの変更（即ち、コードされたアミノ酸が変化しない）を導入した。これらの変更は、ＦＹ２ポリメラーゼの増加生成に通じた。ＦＹ３をデザインすることにより、インビボにおいて増加させた翻訳効率を促進させた。pRE273Yprefに導入されたサイレントなコドンの変更に加えて、大腸菌において強く発現される遺伝子においてしばしば生じるように、第２位置へGCTコドンを追加した（配列番号：２）。これはＦＹ２の配列にアミノ酸を付加し、そして故に該蛋白質はそれ自身の名称ＦＹ３を与えられた。両構築物はpRE273Yより多くの酵素を生成する。
例えば以下のようなサイレントなコドンの変更は大腸菌における蛋白質の生成を増加させる：
GAAに代えてコドンGAGの置換；
CGTまたはCGCに代えてコドンAGG, AGA, CGGまたはCGAの置換；
CTGに代えてコドンCTT, CTC, CTA, TTGまたはTTAの置換；
ATTまたはATCに代えてコドンATAの置換；
GGTまたはGGCに代えてコドンGGGまたはGGAの置換。
本発明は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の決定方法も提供する。該方法は、ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができるプライマー分子でアニールさせたＤＮＡ分子を提供し、そして少なくとも一つのデオキシヌクレオチド３リン酸を含む容器中においてアニールされた分子をインキュベートすること、および本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む。また、特定のヌクレオチド塩基においてＤＮＡ合成を停止させる少なくとも一つのＤＮＡ合成停止剤も提供される。該方法はさらに、サイズに応じてインキュベート反応のＤＮＡ産物を単離することを含み、それによりＤＮＡ分子の少なくとも一対のヌクレオチド塩基配列が決定できる。
好ましい態様において、配列決定は50℃、60℃または70℃以上の温度で実施する。
他の好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼのmgあたり1000, 250, 100, 50，または２ユニット以下のエキソヌクレアーゼ活性を有し（以下に記載の標準法により測定された）、そしてたった４、６または10塩基しか有差ないプライマーを利用することができ；また、インキュベート工程の開始における全４デオキシヌクレオシド３リン酸の濃度は試薬、例えばｄｄＮＴＰにより停止されるまでＤＮＡ合成を続けさせるのに十分である。
循環配列決定に関して、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、天然酵素に比して顕著に低い量のジデオキシヌクレオチドを用いることを可能にする。即ち、該方法は、循環配列決定反応において４つ全てのジデオキシヌクレオチドに対して過剰量のデオキシヌクレチシドを提供し、そして、循環配列決定を実施することを含む。
好ましくは、２、５、10または100倍以上過剰のdNTPを、対応するddNTPに対して提供する。
関連する側面において、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定のための試薬、例えばｄＩＴＰ、デアザＧＴＰ、チェーン停止試薬例えばｄｄＮＴＰ、およびマンガン含有溶液または粉末および任意にピロホスファターゼを含む、ＤＮＡ配列決定のためのキットまたは溶液を特徴とする。
他の側面において、本発明は、修飾されたＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を提供し、宿主細胞中で該核酸を発現させ、そして宿主細胞からＤＮＡポリメラーゼを精製することによる、本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供する方法を特徴とする。
他の関連する側面において、本発明は、ひとつまたは複数（好ましくは２、３または４）のデオキシリボヌクレオシド３リン酸、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および第１チェーン停止剤を必須に用いる、上記のＤＮＡ標準物の配列決定法を特徴とする。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長合成して伸長されたプライマーの長さとは異なる第１のシリーズの第１ＤＮＡ産物を形成するが、各第１ＤＮＡ産物はその伸長末端においてチェーン停止剤を有し、そして各第１ＤＮＡ産物の分子数は20塩基未満長さの異なる実質的に全てのＤＮＡ産物とほぼ同じである。該方法は、第１チェーン停止剤とは異なる濃度でハイブリダイズした混合物中に第２チェーン停止剤を提供することも特徴とし、各第２ＤＮＡ産物はその伸長末端において第２チェーン停止剤を有する。各第２ＤＮＡ産物の分子数は、互いに１から20塩基異なる実質的に全ての第２ＤＮＡ産物とほぼ同じであり、第２ＤＮＡ産物と20塩基未満異なる長さを有する全ての第１ＤＮＡ産物の分子数とは明らかに異なる。
好ましい態様において、３または４のそのようなチェーン停止剤を用いることにより異なる産物を作成し、そして配列決定反応はマグネシウムイオン、またはマンガンまたは鉄イオン（例えば、0.05から100mMの間、好ましくは１から10mMの間の濃度で）さえも含んで提供され；またＤＮＡ産物は４未満のゲルレーンにおいて分子量に従い分離される。
他の関連する側面において、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマー、配列決定される核酸、１から４のデオキシリボヌクレオチド３リン酸、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも２つの異なる量のチェーン停止剤を、配列決定される核酸に相補な核酸断片を形成するためにオリゴヌクレオチドプライマー伸長合成を提供する条件下で混合することによる、核酸配列決定法を特徴とする。例えば、チェーン停止剤はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンに関するジデオキシヌクレオチド停止剤であってよい。該方法はさらに、サイズにより核酸断片を分離して核酸の配列を決定することを含む。該試薬はプライマー伸長産物中の標識強度により互いに区別される。
ＤＮＡ配列決定反応のＤＮＡ産物を分離するためにゲル電気泳動を用いるのは普通であるが、当業者は他の方法も使用可能であることを認識するであろう。即ち、フライト質量分析計の時間、電子顕微鏡および単一分子検出法等の方法を用いて異なる断片各々を検出することが可能である。
本発明は、単一プライマーおよびＤＮＡ鎖から形成される少なくとも２シリーズのＤＮＡ産物を提供する試薬を含む反応器を有する自動化ＤＮＡ配列決定装置も特徴とする。シリーズの各ＤＮＡ産物は分子量が異なり、一方の末端にチェーン停止剤を含む。試薬は本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む。装置は一連のバンドを形成するために分離器の一つの軸に沿ってＤＮＡ産物を分離するための分離手段を含む。軸に沿った分離後に各バンドの位置および強度を測定するためのバンド解読手段、および分離手段中に存在するかもしれないあらゆる標識からの光の放射波長からではなく、軸に沿ったバンドの位置および強度のみからＤＮＡ鎖のＤＮＡ配列を決定する計算手段も含む。
本発明の他の特徴および利点は以下に記載の好ましい態様および請求の範囲から明らかになろう。
好ましい態様の記載
最初に図面を簡単に記載する。
図面
図１−４は、それぞれＦＹ２，ＦＹ３の、およびサーマスフラバス（T. flavus）およびサーマスサーモフィルス（Thermus themophilus）のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列である。図５は、ＦＹ４のＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列である。
実施例
以下の実施例は、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの配列決定における使用を例示するために提供する。
ＦＹ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＹ２およびＦＹ３）の調製
バクテリア株
大腸菌：MV1190［Δ（srl-recA）306::Tn10，Δ（lac-proAB, thi, supE, F'（traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15））；DHλ+［gyrA96, recA1, relA1, thi-1, hsdR17, supE44, λ+］；M5248［λ（bio275, cI857, CIII+, N+Δ（H1））］。
ＰＣＲ
Barnes（91 Proc. Natl. Acad. Sci. 2216-2220, 1994）の方法に基づいた反応条件は以下のとおりであった：100ml反応あたり、20mMトリシンpH8.8, 85mM KOAc, 200mM dNTPs, 10％グリセロール、５％DMSO, 0.5mM各プライマー、1.5mM MgOAc, 2.5Uホットタブ（アマーシャムライフサイエンス社）、0.025Uディープベント（ニューイングランドバイオラブズ）、1-100ng標的ＤＮＡ。循環条件は94℃30秒、68℃10分40秒を８サイクル；次に94℃30秒、68℃12分00秒を８サイクル；次に94℃30秒、68℃13分20秒を８サイクル；次に94℃30秒、68℃14分40秒を８サイクルであった。
インビトロ変異導入
制限酵素消化、プラスミドの調製、および他のインビトロＤＮＡ操作は、標準プロトコル（Sambrook et al., Molecular Cloning第２版コールドスプリングハーバー出版、1989）を用いて実施した。ＰＣＲ（上記プロトコルを参照されたい）を用いることにより、天然Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのコドン667においてPheからTyrへの変更を導入した（ＦＹ２のコドン396である）。オリゴヌクレオチドプライマー１dGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGG（配列番号：３）は、BamHI制限部位を含む配列番号：１のコーディング領域のヌクレオチド954から976にわたる。変異原オリゴプライマー２dGGGATGGCTAGCTCCTGGGAGAGGCGGTGGGCCGACATGCCGTAGAGGACCCCGTAGTTGATGG（配列番号：４）は、配列番号：１のNheI部位およびコドン396を含むヌクレオチド1178から1241にわたる。最初の235アミノ酸を欠失したexo- TaqのクローンであるデルタTaqポリメラーゼをコードするpWB253（Barnes, 112 Gene 29-35, 1992）を鋳型として用いた。サーマスアクアティカスのＴａｑポリメラーゼまたはゲノミックＤＮＡのあらゆるクローンを利用することにより、相同なＰＣＲ産物を増幅することもできた。ＰＣＲ産物はBamHIおよびNheIで消化し、そしてこの断片をBamHI/NheI消化したpWB253プラスミドに連結して対応断片を置換することにより、ポリメラーゼＦＹ１をコードするpWB253Yを創製した。大腸菌株MV1190を蛋白質発現のための形質転換および誘導のために使用したが、lacリプレッサーを有するあらゆる宿主株を置換できた。ＤＮＡ配列決定は該コーディング領域中のPheからTyrへの変更を実証した。
開始コドンにわたり且つ制限酵素部位を含むＰＣＲプライマー３dGGAATTCCATATGGACGATCTGAAGCTCTCC（配列番号：５）を、制限酵素部位を含み且つストップコドン（配列番号：１のコドン562）にわたるＰＣＲプライマー４dGGGGTACCAAGCTTCACTCCTTGGCGGAGAG（配列番号：６）と共に使用した。メチオニン開始コドンおよび制限酵素配列をＰＣＲプライマー５dGGAATTCCATATGCTGGAGAGGCTTGAGTTT（配列番号：７）に加え、上記プライマー４と共に使用した。上記プライマー対を用いてＰＣＲを実施し、そしてプラスミドpWB253Yを鋳型として用いた。ＰＣＲ産物は制限酵素NheIおよびKpnIを用いて消化して、MdeI/KpnI消化したベクターpRE2（Reddi et al., 17 Nucleic Acids Research 10, 473-10, 488, 1989）に連結して、それぞれ、ＦＹ１をコードするプラスミドpRE236YおよびＦＹ２をコードするpRE273Yを作成した。これおよびすべての続くpRE2構築物での最初の形質転換のために大腸菌株DHλ+の細胞を用い、そして蛋白質発現のために株M5248（λcI857）を用いたが、cI+およびcI857対立遺伝子を有する大腸菌株のあらゆる同等な対を利用した。別法として、ポリメラーゼを生成するために化学試薬例えばナリジキシン酸によりあらゆるrec+ cI+株を導入することができる。両遺伝子の配列を確認した。pRE273Yは、pRE253YまたはpRE236Yとは異なり、SDSポリアクリルアミドゲル上において単一ポリペプチドを生成することが見いだされた。
プライマー６dGGAATTCCATATGCTGGAACGTCTGGAGTTTGGCAGCCTCCTC（配列番号：８）およびプライマー４を用いて、ＦＹ２のコドン用法におけるサイレントな変更をＰＣＲ産物に導入した。産物はNdeI/BamHIにより消化してＦＹ２の３’末端を含むpRE2構築物に連結して、ＦＹ２のＤＮＡポリメラーゼをコードするpREFY2prefを創製した。プライマー７dGGAATTCCATATGGCTCTGGAACGTCTGGAGTTTGGCAGCCTCCTC（配列番号：９）およびプライマー４を用いることにより、高度に発現される遺伝子の第２の位置において共通に生じる付加的なアラニンコドンをＰＣＲ産物に導入した。NdeI/BamHI消化した断片を上記のとおりに用いて、ＦＹ３のＤＮＡポリメラーゼをコードするpREFY3を創製した。
ＦＹ４のＤＮＡポリメラーゼの調製
バクテリア株
大腸菌株：DH1λ+［gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44, λ+］；M5248［λ（bio275, cI857,cIII+, N+, Δ（H1））］。
ＰＣＲ
標準法によりサーマスサーモフィルスからゲノミックＤＮＡを調製した。サーマスサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は３キロベースのAlwNI断片上に存在することが知られている。幾つかのＰＣＲ反応においては、ポリメラーゼ配列を豊富にするために、ＰＣＲの前にゲノミックＤＮＡをAlwNIで消化して、約３kbの断片をアガロースゲル電気泳動により選択して鋳型ＤＮＡとして用いた。反応条件は以下のとおりであった：100μl反応あたり、10mM Tris pH8.3, 50mM KCl, 800μM dNTPs, 0.001％ゼラチン、1.0μMの各プライマー、1.5mM MgCl2、2.5U Tth, 0.025Uディープベント（ニューイングランドバイオラブス）。サイクル条件は、94℃２分、次に35サイクルの94℃30秒、55℃30秒、72℃３分、次いで72℃７分であった。
インビトロ変異導入
制限酵素消化、プラスミドの調製、および他のインビトロＤＮＡ操作は、標準プロトコル（Sambrook et al., 1989）を用いて実施した。５’末端における大腸菌内の発現のために最適化されたコドンを用いて、エキソヌクレアーゼを含まないポリメラーゼをコードするプラスミドpMR1を構築した。プライマー８（配列番号：１０）（GGAATTCCATATGCTGGAACGTCTGGAATTCGGCAGCCTC）をプライマー９（配列番号：１１）（GGGGTACCCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTC）と共に用いて、ＴｔｈゲノミックＤＮＡからＰＣＲ産物を創製して、制限酵素NdeIおよびKpnIにより消化して、同じ酵素で消化されたプラスミドpRE2（Reddi et al., 1989, Nucleic Acids Research 17, 10473-10488）に挿入した。
所望のF396Y変異を創製するために、Tth染色体ＤＮＡから２つのＰＣＲ産物を作成した。上記プライマー８をプライマー１０（配列番号：１２）（GGGATGGCTAGCTCCTGGGAGAGCCTATGGGCGGACATGCCGTAGAGGACGCCGTAGTTCACCG）と共に用いて、ＦからＹへのアミノ酸変更並びにNheI制限部位を創製するためのサイレントな変更を含む遺伝子の部分を創製した。プライマー１１（配列番号：１３）（CTAGCTAGCCATCCCCTACGAAGAAGCGGTGGCCT）を上記プライマー９と共に用いて導入されたNheI部位からコーディング配列の３’末端のストップコドンまでの遺伝子部分を創製した。プライマー８および１０のＰＣＲ産物をNdeIおよびNheIにより消化して、プライマー９および１１のＰＣＲ産物をNheIとKpnIにより消化した。これらは、MdeIおよびKpnIで消化された発現ベクターpRE2に導入されてプラスミドpMR5を生成した。所望の変更に加えて、pMR5はＰＣＲによりアミノ酸置換K234Rに通じる疑似の変更を有することが見つかった。プラスミドpMR8は、pMR5のAflII/BamHI断片によりpMR1からの対応断片を置換することにより、この置換を除去するように創製された。プラスミドpMR8（配列番号：１４）によりコードされるＦＹ４のポリメラーゼを図５に示す。
大腸菌株DH1λ+の細胞を第１の形質転換のために用い、そして株M5248（λcI857）を蛋白質の発現に用いたが、cI+およびcI857対立遺伝子を含むあらゆる相当の大腸菌株を利用することができる。別法として、化学試薬例えばナリジキシン酸によりあらゆるrec+ cI+株を誘導して該ポリメラーゼを生成することができる。
蛋白質の配列決定
アミノ末端蛋白質配列決定は、W. M. Keckファンデーション、バイオテクノロジーリソースラボラトリー、ニューヘブン、コネチカットにおいて実施した。
ポリメラーゼの精製
２×ＬＢ（２％バクト−トリプトン、１％バクト−酵母抽出物、0.5％NaCl）＋0.2％カザミノ酸＋20mM KPO4 pH7.5＋50μg/mlアンピシリンの１リットル培養物に適切な細胞株のグリセロールストックを接種して、細胞が対数期になるまで（0.7-1.0 OD590）30℃において撹拌しながら生育させた。１０リットルマイクロファーム発酵器（ニューブルンスウイックサイエンティフィック社）中で、９リットルの２×ＬＢ＋0.2％カザミノ酸＋20mM KPO4 pH7.5＋0.05％Mazu消泡剤に対数期細胞１リットルを接種した。30℃において、15psi圧力、350-450rpm撹拌および風速14,000cc/分±1000cc/分下で細胞を生育させた。OD590が1.5-2.0に到達したら、温度を40-42℃に90-120分間上昇させることにより培養物を誘導した。つっぎに、この培養物を＜20℃に冷却してソボール（Sorvall）RC-3B遠心分離機中で5000rpmにおいて４にて15-20分間遠心分離することにより細胞を回収した。
凍結細胞を小片に破壊して、予め加温した（90-95℃）溶解バッファー（20mM Tris pH8.5, １mM EDTA, 10mM MgCl2, 16mM（NH4）2SO4, 0.1％ツイーン20、0.1％ノニデットN-40，１mM PMSF）中に懸濁した。次に、懸濁した細胞を迅速に80℃に加熱して一定の撹拌と共に80℃において20分間インキュベートした。次に、懸濁液を氷上で迅速に冷却した。細胞残余物は、ソボール（Sorvall）GSAローターを用いて10,000rpmにて20分間４℃において遠心分離することにより除去した。上清のNaCl濃度を300mMに調節した。次に、バッファーＡ（20mM Tris pH8.5, １mM EDTA, 0.1％ツイーン20、0.1％ノニデットP-40、300mM NaCl, 10％グリセロール、１mM DTT）で平衡化したジエチルアミノエチルセルロース（ワットマンDE-52）カラムにサンプルを通し、そしてフロースルーしてポリメラーゼを回収した。次に、サンプルを100mM NaCl濃度に希釈してヘパリンセルロースカラムにのせた。ポリメラーゼはNaCl勾配（100-500mM NaCl）によりカラムから溶出した。次に、サンプルをバッファーＢ（20mM Tris pH8.5, １mM EDTA, 0.1％ツイーン20、0.1％ノニデットP-40、10mM KCl, 10％グリセロール、１mM DTT）に対して透析して、バッファーＢの導電率に対するサンプルの導電率を低くするのに必要とされるようにさらに希釈した。次に、サンプルをジエチルアミノエチル（ワットマンDEAE 15 HR）カラムにのせて、10-500mM KCl勾配で溶出た。次に、ポリメラーゼを等量の最終バッファー（20mM Tris pH8.5, 0.1mM EDTA, 0.5％ツイーン20、０．５％ノニデットP-40、100mM KCl, 50％グリセロール、１mM DTT）にて希釈して、最終バッファーに対して透析した。
エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ
エキソヌクレアーゼ活性は、５μl（25-150ユニット）のＤＮＡポリメラーゼを、100μlの20mM Tris-HCl pH8.5, ５mM MgCl2，10mM KCl中の５μg標識［3Ｈ］-pBR322のＰＣＲ断片（1.6×104cpm/μg ＤＮＡ）と１時間60℃においてインキュベートすることにより実施した。この時間の後、２mM EDTAを含む50μg/mlサケ精子ＤＮＡ200μlと２％ピロリン酸ナトリウムを含む20％TCAの１：１比200μlをアッセイアリコートに加え入れた。アリコートは氷上に10分間置き、次に12,000rpmにて10分間遠心分離した。200マイクロ1の上清中の酸可溶性放射活性は液体シンチレーション計数により定量した。１ユニットのエキソヌクレアーゼ活性は、30分間60℃において全ヌクレオチド１０nmolの酸可溶化を触媒した酵素量として定義された。
ＤＮＡ配列決定における利用性
実施例１： ＦＹポリメラーゼ（例えばＦＹ２およびＦＹ３）を用いたＤＮＡ配列決定
以下の成分をミクロ遠心分離チューブ（0.5ml）に加えた：0.4pmol M13 ＤＮＡ（例えば、M13mp18, 1.0μg）；２μl反応バッファー（260mM Tris-HCl, pH9.5 65mM MgCl2）；２μｌの標識ヌクレオチド混合物（各1.5μlのdGTP, dCTPおよびdTTP）；0.5μl（５μCi）の［a-33P］dATP（約2000Ci/mmol）；１μlの-40プライマー（0.5μM；0.5pmol/μl 5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）；４U/μlのＦＹポリメラーゼおよび6.6U/mlのサーモプラズマアシドフィルムの無機ピロホスファターゼ（32U/μlのポリメラーゼおよび53U/mlのピロホスファターゼを20mM Tris（pH8.5）, 100mM KCl, 0.1mM EDTA，１mM DTT, 0.5％NP-40, 0.5％ツイーン-20および50％グリセロールの、希釈バッファー（10mM Tris-HCl pH8.0，１mM 2-メルカプトエタノール、0.5％ツイーン-20、0.5％NP-40）による８倍希釈液中に含む）を含む２μlの混合物；および水を加えて全量17.5μlにした。これらの成分（標識反応物）を混合して、バイアルを定温水槽中に45℃にて５分間置いた。
４つのバイアルは標識したＡ，Ｃ，ＧおよびＴであり、対応する停止混合物：ddA停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddATP）；ddT停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddTTP）；ddC停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddCTP）；ddG停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddGTP）４μlを満たした。
標識反応物は等しく４つの停止バイアルに分割して（各停止反応バイアルに４μl）、そしてきつく栓をした。
４つのバイアルを定温水槽中に72℃において５分間置いた。次に、４μlの停止溶液（95％ホルムアミド、20mM EDTA, 0.05％ブロムフェノールブルー、0.5％キシレンシアノールFF）を各バイアルに加え、配列決定ゲル（８％アクリルアミド、8.3Ｍ尿素）にのせる直前に短時間70-80℃に加熱した。オートラジオグラムは、コダックXAR-5フィルムまたはアマーシャムハイパーフィルムMPを用いて18-36時間を必要とした。均一（uniform）なバンド強度の高質の配列決定が得られた。バンド強度は、同様なプロトコルでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは△Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた強度よりもよりはるかに均一であった。
実施例２： ＦＹポリメラーゼを用いたＤＮＡ循環配列決定
以下の成分を、温度循環機械（例えば、パーキンエルマーＤＮＡ温度循環機）に挿入するのに適切なミクロ遠心分離バイアル（0.5ml）に加えた：0.05pmolまたはそれ以上のM13 ＤＮＡ（例えば、M13mp18, 0.1μg）、または0.1μgの二本鎖プラスミドＤＮＡ（例えば、pUC19）；２μlの反応バッファー（260mM Tris-HCl, pH9.5, 65mM MgCl2）；１μlの3.0μM dGTP；１μlの3.0μM dTTP；0.5μl（５μCi）の［α-33P］dATP（約2000Ci/mmol）；１μlの-40プライマー（0.5μM；0.5pmol/μl 5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）；４U/μlのＦＹポリメラーゼおよび6.6U/mlのサーモプラズマアシドフィルムの無機ピロホスファターゼ（32U/μlのポリメラーゼおよび53U/mlのピロホスファターゼを20mM Tris（pH8.5），100mM KCl, 0.1mM EDTA，１mM DTT,0.5％NP-40, 0.5％ツイーン-20および50％グリセロールの、希釈バッファー（10mM Tris-HCl pH8.0，１mM 2-メルカプトエタノール、0.5％ツイーン-20、0.5％NP-40）による８倍希釈液中に含む）を含む２μlの混合物；および水を加えて全量17.5μlにした。
これらの成分（標識反応物）を混合して、10μlの軽いミネラルオイル（アマーシャム）を重層した。バイアルを温度循環機に入れて、45℃１分間から95℃0.5分間を30-100サイクル（60サイクル以上は不要）実施した。（必要であれば、温度は55℃-95℃で循環されうる。）プライマー／鋳型の融解温度が顕著に高いかまたは低いならば温度を調節してよいが、これらの温度はほとんどのプライマー−鋳型の組み合わせに向いている。この工程はサイクルあたり約３分間で完了することができる。
４つのバイアルは標識したＡ，Ｃ，ＧおよびＴであり、対応する停止混合物：ddA停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddATP）；ddT停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddTTP）；ddC停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddCTP）；ddG停止混合物（150μMの各dATP, dCTP, dGTP, dTTP、1.5μM ddGTP）４μlを満たした。停止バイアルにはさらに酵素を加えなかった。前の（標識）工程から含まれる酵素は十分である。
循環した標識反応物は等しく４つの停止バイアルに分割して（各停止反応バイアルに４μl）、そして軽いミネラルオイル10μlで重層した。
４つのバイアルを温度循環機中に置き、95℃15秒間、55℃30秒間、および72℃120秒間を30-120サイクル（60サイクル以上は不要である）実施した。この工程は夜通しで完了するのが便利である。他の時間および温度も効果的である。
反応混合物６μlを取り出し（オイルは避ける）、３μlの停止溶液（95％ホルムアミド、20mM EDTA, 0.05％ブロムフェノールブルー、0.5％キシレンシアノールFF）を加え、配列決定ゲル（８％アクリルアミド、8.3Ｍ尿素）にのせる直前に短時間70-80℃に加熱した。オートラジオグラムは、コダックXAR-5フィルムまたはアマーシャムハイパーフィルムMPを用いて18-36時間を必要とした。均一（uniform）なバンド強度の高質の配列決定が得られた。バンド強度は、同様なプロトコルでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは△Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた強度よりもよりはるかに均一であった。
実施例３： 圧縮人工物を排除するためのｄＧＴＰ類似体による配列決定
実施例１および２において概要を記載した配列決定法の何れかに関して、７−デアザ−２’デオキシ−ＧＴＰでｄＧＴＰを置換することができ、ｄＧＴＰと完全に同じ濃度にて標識混合物および停止混合物中において用いる。この置換を行う場合には、ゲル上の二次構造が大幅に減じられる。同様に、２’−デオキシイノシン３リン酸をdGTPに代えて用いることができるが、その濃度はｄＧＴＰの対応濃度より10倍高くなくてはならない。ｄＩＴＰによるｄＧＴＰの置換は圧縮人工物を排除するのに７−デアザ−ｄＧＴＰよりもいっそう効果的である。
実施例４： ＦＹポリメラーゼを用いた他の配列決定法
ＦＹポリメラーゼは他の多くの配列決定法においての使用に適合されてきており、ABI 373A ＤＮＡ配列決定装置を用いた配列決定のための蛍光プライマーおよび蛍光-ジデオキシ-停止剤の使用を包含する。
実施例５： ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
蛋白質サンプルを14×16mmの7.5または10％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。（ゲルは、主として14×16mmホファー（Hoefer）装置を用いた10％ポリアクリルアミドであった。他のサイズ、装置、およびパセンテージのゲルは受容可能である。同様な結果は、SDS，８−25％勾配ゲルを用いるファルマシアフェーストゲル（Phast Gel）システムを用いて得ることもできる。試薬級および超純粋級試薬を用いた。）スタッキングゲルは４％アクリルアミド（30：0.8，アクリルアミド：ビスアクリルアミド）、125mM Tris-HCl pH6.8, 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）からなった。分離ゲルは7.5または10％アクリルアミド（30：0.8，アクリルアミド：ビスアクリルアミド）、375mM Tris-HCl pH8.8, 0.1％SDSからなった。泳動バッファーは25mM Tris, 192mMグリシンおよび0.1％SDSからなった。１×サンプルバッファーは25mM Tris-HCl pH6.8, 0.25％SDS, 10％グリシン、0.1Mジチオスレイトール、0.1％ブロムフェノールブルーおよび１mM EDTAからなった。1/4体積の５×サンプルバッファーを各サンプルに加えた。泳動前に、サンプルをサンプルバッファー中で90-100℃において約５分間加熱した。1.5mm厚のゲルを50-100mA定電流にて１−３時間（ブロムフェノールブルーがへるの底に到達するまで）泳動した。ゲルは、50％メタノール、10％酢酸中の0.025％クマジーブリリアントブルーR250で染色して、５％メタノール、７％酢酸溶液で脱色した。ゲルの記録は、ゲルの写真を撮るか、セルロースフィルムシートの間でゲルを乾燥させるか、または真空下でフィルターペーパー上にてゲルを乾燥させることにより作成した。
他の態様は以下の請求の範囲の範囲である。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：アマーシャムライフサイエンス
（ii）発明の名称：熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ
（iii）配列の数：１４
（iv）対応住所：
（Ａ）居住者：Ｌｙｏｎ  ＆  Ｌｙｏｎ
（Ｂ）通り：６３３西５番街スイート４７００
（Ｃ）市：ロスアンジェルス
（Ｄ）衆：カリフォルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９００７１−２０６６
（ｖ）コンピューターの読み取り可能なフォーム
（Ａ）媒体の種類：３．５インチディスケット、１．４４Ｍｂ保存
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル
（Ｃ）操作システム：ＩＢＭ  Ｐ．Ｃ．ＤＯＳ５．０
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト５．１
（vi）現在の出願人データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）前の出願のデータ：
以下に記載の出願を含む：ひとつ
（Ａ）出願番号：ＵＳ  ０８／４５５，６８６
（Ｂ）出願日：１９９５年５月３１日
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）氏名：Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．
（Ｂ）登録番号：３２，３２７
（Ｃ）照会／ドケット番号：２１９／３０４−ＰＣＴ
（ix）電子情報
（Ａ）電話：（２１３）４８９−１６００
（Ｂ）テレファックス：（２１３）９５５−０４４０
（Ｃ）テレックス：６７−３５１０
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６８６塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／キー：ＦＹ２
（Ｂ）位置：１．．．１６８３
（xi）配列の記載：配列番号：１
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0003966555.tif 000003
0003966555.tif 000004
0003966555.tif 000005
（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６８９塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／キー：ＦＹ３
（Ｂ）位置：１．．．１６８６
（xi）配列の記載：配列番号：２
0003966555.tif 000006
0003966555.tif 000007
0003966555.tif 000008
（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３
0003966555.tif 000009
（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６４塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４
0003966555.tif 000010
（２）配列番号：５
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５
0003966555.tif 000011
（２）配列番号：６
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：６
0003966555.tif 000012
（２）配列番号：７
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：７
0003966555.tif 000013
（２）配列番号：８
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４３塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：８
0003966555.tif 000014
（２）配列番号：９
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４６塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：９
0003966555.tif 000015
（２）配列番号：１０
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１０
0003966555.tif 000016
（２）配列番号：１１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１１
0003966555.tif 000017
（２）配列番号：１２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６４塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１２
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（２）配列番号：１３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１３
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（２）配列番号：１４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６８６塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／キー：ＦＹ４
（Ｂ）位置：１．．．１６８３
（xi）配列の記載：配列番号：１４
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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