(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、およびヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株に粘着することができる、腫瘍マーカーの欠如したヒト不死化大腸上皮細胞株。
【請求項２】
非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカーとして、サイトケラチン、細胞間の結合組織、アルカリ性ホスファターゼ、サイトクロームＰ４５０、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼ、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼから形成される群から選択される少なくとも２つのマーカーを発現する、請求項１に記載の不死化細胞株。
【請求項３】
代謝分化マーカーとして、表面絨毛組織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮細胞に特異的なＭＨＣクラスII抗原、およびジペプチジルペプチダーゼIVから形成される群から選択される少なくとも２つのマーカーを発現する、請求項１に記載の不死化細胞株。
【請求項４】
ヒトガンマ−インターフェロンの存在下で、ＭＨＣクラスII抗原のＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬＡ−ＤＰ抗原を発現するが、該ＭＨＣクラスII抗原のＨＬＡ−ＤＱ抗原を発現しない、請求項３に記載の不死化細胞株。
【請求項５】
１００個の大腸上皮細胞当たり少なくとも８０個の細菌の割合で、インビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株に粘着することができる、請求項１に記載の不死化細胞株。
【請求項６】
寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８を有する、請求項１に記載の不死化細胞株。
【請求項７】
無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ＢＳＡ、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、ビタミン、およびホルモンからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の不死化細胞株の培養に適応させた無血清培地であって、培地は、微量元素、ビタミンＣとレチノイン酸からなるビタミン、ならびにトリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびトランスフェリンからなるホルモンを含んでなることを特徴とする、上記培地。
【請求項８】
培地は、１〜１００nMの微量元素、１０〜１０００nMのレチノイン酸、１０〜１０００nMのトリヨードチロニン、０．１〜５０nMのデキサメタゾン、１〜１００nMのハイドロコーチゾン、１〜１００μg/mlのビタミンＣ、１〜１００μg/mlのウシ下垂体抽出物、０．１〜５０μg/mlのインスリン、０．１〜５０ng/mlのＥＧＦおよび０．１〜１００μg/mlのトランスフェリンを含んでなることを特徴とする、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
請求項７に記載の培地であって、無機塩は、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウム、塩素酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸マグネシウム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛から形成される群から選択されることを特徴とする、上記培地。
【請求項１０】
ビタミンは、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩素酸コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビオチンおよびシアノコバラミンから形成される群から選択される、請求項７に記載の培地。
【請求項１１】
培地は、８０μＭ未満のカルシウムを含むことを特徴とする、請求項７に記載の培地。
【請求項１２】
培地は、下記の組成：

無機塩
ＮａＣｌ                                     6.400 g/l
ＫＣｌ                                       0.400 g/l
ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ                           0.200 g/l
ＣａＣｌ2                                    0.200 g/l
ＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ                            0.13 g/l
ＮａＨＣＯ3                                    3.7 g/l
Ｆｅ（ＮＯ3）2−９Ｈ2Ｏ                      0.0001 g/l
他の成分
グルコース                                    4.50 g/l
ヘペス                                           20 mM
フェノールレッド                             0.010 g/l
ピルビン酸ナトリウム                         0.110 g/l
ＢＳＡ                                           0.3 %
ＰＥ                                            0.5μM
アミノ酸
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ                      0.0840 g/l
Ｌ−シスチン                                0.0480 g/l
Ｌ−グルタミン                                    2 mM
グリシン                                    0.0300 g/l
Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ               0.0420 g/l
Ｌ−イソロイシン                            0.1048 g/l
Ｌ−ロイシン                                0.1048 g/l
Ｌ−リジン−ＨＣｌ                          0.1462 g/l
Ｌ−メチオニン                              0.0300 g/l
Ｌ−フェニルアラニン                        0.0660 g/l
Ｌ−セリン                                  0.0420 g/l
Ｌ−スレオニン                              0.0952 g/l
Ｌ−トリプトファン                          0.0160 g/l
Ｌ−チロシン                                0.0720 g/l
Ｌ−バリン                                  0.0936 g/l
ビタミン
Ｄ−カルシウム−パントテン酸                 0.004 g/l
塩化コリン                                   0.004 g/l
葉酸                                         0.004 g/l
イノシトール                                 0.008 g/l
ニコチンアミド                               0.004 g/l
ピリドキシン−ＨＣｌ                         0.004 g/l
リボフラビン                                0.0004 g/l
チアミン−ＨＣｌ                             0.004 g/l
ビタミンＣ                                   0.030 g/l
レチノイン酸                                    100 nM
微量元素                                         10 nM
ホルモン
インスリン                                   0.005 g/l
ＥＧＦ                                         1 ng/ml
トランスフェリン                             0.005 g/l
Ｔ３                                            100 nM
デキサメタゾン                                    1 nM
ハイドロコーチゾン                               10 nM
ウシ下垂体抽出物                             0.038 g/l
抗菌剤
ファンジゾン（Fungizone）                  0.25μg/ml
ペニシリン                                    2.5 U/ml
ストレプトマイシン                            5 μg/ml
ゲンタマイシン                               10 μg/ml
（ＰＥ：ホスホリルエタノールアミンとエタノールアミンの混合物）
を有することを特徴とする、請求項７に記載の培地。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の不死化細胞株の調製方法であって、ヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、培養物を組換えウイルスで感染させて不死化細胞とし、その不死化細胞を請求項７〜１２までのいずれか１項に記載の無血清培地で培養する、上記方法。
【請求項１４】
初代上皮細胞を、請求項７〜１２までのいずれか１項に記載の無血清培地で培養する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養物を、ＭｕＬＶレトロウイルスの一部を含有するＳＶ４０  Ｔ−Ａｇ組換えウイルスで感染させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性を確認する方法であって、（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、請求項１〜６までのいずれか１項に記載の細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして（２）該細胞株に対するこの物質の作用を定量または測定する、上記方法。
【請求項１７】
請求項１〜６までのいずれか１項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞、請求項７〜１２までのいずれか１項に記載の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質に対する該細胞の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キット。
【請求項１８】
請求項１〜６までのいずれか１項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞を使用することからなる、腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法。
【請求項１９】
請求項１〜６までのいずれか１項に記載のヒト大腸の不死化上皮細胞からなる、薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の目的は、新規なヒト上皮大腸不死化細胞株、この細胞株を得るための方法、および、特に腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法におけるこの細胞株の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長年の間、例えば感染症、炎症または癌のようなヒトの疾患の研究に適したヒト細胞株の開発が試みられてきた。疾患の発生にしばしば関係する細胞には、上皮細胞、特に人体の環境に対して、および特に食事の条件に対して感受性のある腸管の上皮細胞がある。
【０００３】
上皮細胞は、人体の他の細胞とは、例えば、サイトケラチン（モル（Moll）ら、Ｃｅｌｌ，３１，１１−２４，１９８２）、細胞間の結合組織（グンビネル（Gumbiner）ら、Ｃｅｌｌ，６９，３８５−３８７，１９９２）、小腸に特異的なアルカリ性ホスファターゼ（ヅデジャ（Dudeja）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１０５、３５７−３６６、１９９３）、サイトクロームＰ４５０（メルキュリオ（Mercurio）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２１０，Ｎｏ．２，３５０−３５５，１９９５；マキノン（McKinnon）ら、Ｇｕｔ，３６，２５９−２６７，１９９５）、細胞酸化防御に関与する酵素（Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼ；アルベース（Albers）ら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１０９，５０７−５１３，１９９１）、および／または親電子物質の無毒化（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびキノンリダクターゼ；チェネビックス−トレンチ（Chenevix-Trench ）ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，Ｎｏ．７，１６５５−１６５７，１９９５）、およびビメンチン（リチャード（Richard ）ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，２８２，５１２−５１５，１９９０）のような、主に上皮細胞中に存在する化合物または構造の発現において異なる。
【０００４】
さらに、ヒト腸管の上皮細胞はインビトロで乳酸菌に粘着することができる（バーネット（Bernet）ら、Ｇｕｔ，３５，４８３−４８９，１９９４；ＵＳ  ５，０３２，３９９）。
【０００５】
最後に、ヒト大腸の上皮細胞はまた、例えば、表面絨毛組織（フリードリッヒ（Friedrich ）ら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１２，Ｎｏ．９，４０３−４０８，１９９０）、ショ糖イソマルターゼ（ギブソン（Gibson）ら、Ｇｕｔ，３５，７９１−７９７，１９９４；ポール（Paul）ら、Ａｍ．Ｐｙｓｉｏ．Ｓｏｃ．，Ｃ２６６−Ｃ２７８，１９９３）、いくつかのクラスII主要組織適合抗原（ＭＨＣクラスII抗原）（メイアー（Mayer ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１００，３−１２，１９９１）、およびジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰIV；ハウリ（Hauri ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１，８３６−８５１，１９８５）のような、ヒト腸管の上皮細胞に主に存在する化合物または構造の発現において、他のヒト上皮細胞とは異なる。
【０００６】
ヒト大腸の上皮細胞株の調製は、ヒト腫瘍細胞の選択により行われる。例えば、スタウファー（Stauffer）らは、ｐ５３突然変異を有し、特に腫瘍抗原ＣＥＡを発現する２つの株ＮＣＭ３５６とＮＣＭ４２５の選択を記載している（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ，１６９，１９０−１９６（１９９５））。これらの細胞は、腫瘍化（tumorigenic transformation）段階であり、上皮細胞の腫瘍化の発生の研究にとって興味深い。
【０００７】
ヒト大腸癌から単離される他のヒト大腸上皮細胞株も公知であり、例えば、ＣａＣＯ−２株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３７；フォー（Fogh）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，５８，２０９−２１４，１９７７）およびＨＴ２９株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３８；フォー（Fogh）ら、Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１４５−１５９，１９７５）がある。
【０００８】
正常細胞を不死化すること、すなわち無限に増殖できるようにすることもできる。正常細胞は、１０継代以上は生存しない。そのため、細胞のトランスフェクション法では、特別に適応させたベクター、例えばラージＴ抗原（アール・ディー・ベリー（R.D. Berry）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７，２８７−２８９，１９８８）の配列よりなるＳＶ４０ベクター、またはヒトパピローマウイルス（ＵＳ  ５，３７６，５４２）のＤＮＡ配列よりなるベクターの助けを借りる方法が一般的に使用される。
【０００９】
サンダーソン（Sanderson ）らは、胎児の小腸の正常細胞を不死化した（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７，３９６−３９７，１９９５）。しかし、これらの細胞はまだ、生理学的に正常の成人細胞とは異なる。
【００１０】
現在まで、成人大腸の正常上皮細胞の不死化は報告されていない。不死化技術は知られていても、ヒト細胞を不死化して、腫瘍化の兆候を示さずに元々の性質を保存する最適条件を見つけることは非常に困難である。
【００１１】
不死化細胞を増殖させる条件の１つは、特定の培地でのそれらの増殖である。文献に記載されている培地は、それぞれのタイプの細胞に特異的であり、他のタイプの細胞には簡単に応用できない。例えば、ギブソン（Gibson）ら（Ｇｕｔ，３５，７９１−７９７，１９９１）、ファイファー（Pfeifer ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５１２３−５１２７，１９９３）、およびクルカニ（Kulkani ）ら（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，Ｎｏ．１０，２５１５−２５２１，１９９５）に記載された無血清培地を挙げることができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒト大腸の正常上皮細胞に遺伝的かつ生理学的に関連する新規のヒト大腸上皮細胞株を、両者を区別することが困難な程度まで、提供することである。特にこれらの細胞株は、腫瘍マーカーを発現しない。これらの細胞株はさらに、ヒト大腸の正常の上皮細胞に存在する多くの特異的なマーカーを発現する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、腫瘍マーカーを発現せず、非不死化ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、およびヒトの大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーを発現し、インビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株に粘着することができる、ヒト上皮大腸不死化細胞株に関する。
【００１４】
本発明の目的はまた、例えばヒト大腸の上皮細胞の培養物と不死化に適応させた無血清培地である。この培地は、例えば無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ＢＳＡ、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、ビタミン、およびホルモンのような、動物細胞の培養に使用される無血清培地に通常見いだされる成分を含む。この培地は、さらに微量元素、ビタミンＣとレチノイン酸よりなるビタミン、トリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびトランスフェリンよりなるホルモンのいくつかの新規の組合せを含む。
【００１５】
本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の新規な不死化方法であって、ヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、培養物を組換えウイルスで感染させ、不死化細胞を前記した無血清培地で培養する上記方法に関する。
【００１６】
本発明の別の面は、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性を確認する方法であって、（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、前記細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして（２）該細胞株に対するこの物質の作用を定量または測定する上記方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、前記のヒト大腸の不死化上皮細胞、前記の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットに関する。
【００１８】
最後に本発明の目的はまた、腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有する物質の同定方法における、前記細胞株の使用、および活性薬剤としてのその細胞株の使用である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明において、「正常細胞」、「初代細胞」または「非不死化細胞」という表現は、有害な生理学的または遺伝学的欠陥のない健常成人の大腸から集めることができ、かつ元々の分化特性を失わず限定された時間培養することができる、ヒト大腸の上皮細胞を意味する。
【００２０】
一方、「不死化細胞」という表現は、無限に（例えば、６０継代以上）増殖することができるように、ＤＮＡ構築体により遺伝子操作を受けた細胞を意味する。すなわち、スタウファー（Stauffer）らにより選択された腫瘍細胞、またはＣａＣＯ−２株およびＨＴ２９株は、本発明により不死化された細胞と考えられる。
【００２１】
同様に、「継代」という用語は、細胞株のコンフルエントな培養物の一定分割量を取り、新鮮な培地に接種し、そしてコンフルエンスすなわち飽和が得られるまで、その細胞株を培養することよりなる方法を意味する。すなわち、細胞株は伝統的に、新鮮な培地中で連続的に継代して培養される。数回継代すると元々の分化特性を失うこともあることに注意すべきである。従って、何回継代しても（好ましくは少なくとも６０継代）その特性を保存している細胞株を得ることは非常に有益である。
【００２２】
最後に、「元々の分化特性」という表現は、ヒト上皮細胞上に特異的に見いだされるマーカー、およびヒト大腸上皮細胞上に特異的に見いだされる分化マーカーの両方を意味する。
【００２３】
本発明のヒト上皮大腸不死化細胞株は腫瘍マーカーを発現せず、すなわち発癌性突然変異を有さないかもしくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を発現せず、または癌細胞への細胞の形質転換に特徴的な分化した細胞構造および／もしくはタンパク質を有さない。これらのマーカーの存在は、例えば放射標識プローブを用いるハイブリダイゼーションまたはｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより検出される。細胞中のマーカーの存在は、その細胞が、免疫防御のないマウスに対して、数ヶ月後癌を引き起こすことができることを意味せず、それらの元々の細胞と比較した細胞の腫瘍化を反映している。
【００２４】
好ましくは本発明の細胞株は、ｐ５３突然変異（ラビガー（Lavigeur）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，３９８２−３９９１，１９８９；ドネハウアー（Donehower ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６，２１５−２２１，１９９２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ；スタウファー（Stauffer）ら）、および／またはＡＰＣ遺伝子の突然変異（腺腫様結腸ポリープ症；ハーゲスト（Hargest ）ら、Ｇｕｔ，３７，８２６−８２９，１９９５）を有さない。
【００２５】
一方本発明の上皮細胞株は、正常ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカーを発現する。これらのマーカーは、例えば皮膚、目、腸管、または肝臓から得ることができるヒト上皮細胞の大部分にのみ一般的に見いだされる、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、および／または分化した細胞構造でもよい。従って本発明のヒト上皮細胞は、異なる型の上皮細胞に見いだされる少なくとも２つのマーカーを発現する。好ましくは本発明の細胞は、少なくともサイトケラチン、細胞間の結合組織（タイトジャンクション（"tight junctions" ）とも呼ぶ）、小腸アルカリ性ホスファターゼ、サイトクロームＰ４５０、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キノンリダクターゼ（ＱＲ）、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰ）およびカタラーゼ（ＣＡ）から形成される群から選択される上記マーカーを発現する。
【００２６】
従って本発明の細胞株は、細胞酸化に関与する酵素（ＳＯＤ、ＧＰおよびＣＡ）、および／または親電子物質の無毒化に関与する酵素（ＧＳＴおよびＱＲ）を発現する。従ってこれらの細胞株は、ヒト大腸の粘膜の炎症または過敏性の現象の研究に特に適している。
【００２７】
本発明の細胞株はまた、ヒト大腸の非不死化上皮細胞に特異的な代謝分化マーカーも発現する。これらのマーカーは、大腸の上皮細胞にのみ見いだされるｍＲＮＡ、タンパク質または分化した細胞構造でもよい。好ましくは本発明の細胞株は、代謝分化マーカーとして、表面絨毛組織、ショ糖イソマルターゼ、大腸上皮細胞に特異的なＭＨＣクラスII抗原、およびジペプチジルペプチダーゼIVから形成される群から選択される少なくとも２つのマーカーを発現する。
【００２８】
同様に、本発明の細胞株は好ましくは、ヒトガンマ−インターフェロンの存在下で、ＭＨＣクラスII抗原のＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ抗原を発現するが、ＨＬＡ−ＤＱ抗原を発現しない（ＨＬＡ−ＤＱの発現は腫瘍形成性と関連付けられている）。
【００２９】
本発明の細胞株はまた、インビトロでラクトバシラス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株に粘着することができる。このために、乳酸菌の培養物は、本発明の細胞株のコンフルエントな培養物上に広げ、コンフルエントな培養物を洗浄し、次にこの細胞株の絨毛組織に粘着している細菌の数を数えなければならない。好ましくは本発明の細胞株は、本発明の１００個の大腸細胞当たり少なくとも８０個の細菌の割合でインビトロで乳酸菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株に粘着することができる（特に８０〜２００）。
【００３０】
本発明の細胞株はまた、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile ）にインビトロで粘着し、および／または他の粘着性乳酸菌、例えばビフィドバクテリア（bifidobacteria）、特にパスツール研究所（Pasteur Institute ）（パリ、フランス）に寄託され、それぞれ寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２６、ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２７、およびＣＮＣＭ  Ｉ−１２２８を受けている、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．，５９，４１２１−４１２８，１９９３およびＥＰ５７７９０４（ネッスル（Nestle））に記載のビフィドバクテリア（bifidobacteria）に粘着することができる。
【００３１】
本発明の細胞株はまた、炎症物質に接触した後、多くのサイトカイン（例えば、サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８）を発現することができる。
【００３２】
本発明はまた、特に１９９６年４月１６日にドイツ微生物および培養物寄託機関（Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen）（マシェローダー・ヴェーグ（Mascheroder Weg ）１ｂ、Ｄ−３８１２４、ブラウンシュバイク（Braunschweig）、ドイツ）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８を受けている本発明の不死化細胞株に関する。
【００３３】
本発明のヒト大腸上皮細胞株は、繰り返し（特に、少なくとも４０〜８０回）継代した後も元々の分化特性を有効に保存している。しかし、４０回継代した後は、またはそれ以前でも、染色体の断片の喪失のために細胞株の核型が変化することがあることに注意すべきである。しかし、これらの細胞株は一般的に、同じ完全なセットの各染色体対を保存し、これにより元々の分化特性の発現が保存される。
【００３４】
本発明の別の面は、本発明のヒト大腸の上皮細胞の培養物および不死化に適応させた無血清培地に関する。培地は特に、繰り返し継代しても無限に本発明の元々の分化特性を維持するように適応される。他の培地を使用すると、本発明の細胞株は、数回の連続した継代（例えば、５〜１０回の継代）後にその元々の分化特性を喪失するかも知れない。この培地はまた、本発明の細胞株を継続して不死化するのに必須である。従ってその特徴的構成成分の１つが抑制されると、一般的に本発明の大腸の上皮細胞の不死化が失われる。
【００３５】
この培地は、通常無血清の動物細胞培養培地に存在する成分、すなわち無機塩、グルコース、緩衝液（ヘペス、例えば：バイオフルーイッズ（Biofluids ））、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ＢＳＡ、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、ビタミン、およびホルモンを含有してもよい。ＤＭＥＭ培地（バイオフルーイッズ社（Biofluids Inc.）、米国）のような市販の培地は、この培地の調製のためのベースにすることができる。
【００３６】
本発明の培地の新規性は、その成分のいくつかの新しい組合せであり、通常必要とされる他の化合物は当業者に公知の範囲内で変化し得る。これらの必須成分は、微量元素、ビタミンＣとレチノイン酸よりなるビタミン、ならびにトリヨードチロニン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、ウシ下垂体抽出物、インスリン、ＥＧＦおよびトランスフェリンよりなるホルモンである。
【００３７】
すなわちこの培地は、１〜１００nMの微量元素、１０〜１０００nMのレチノイン酸、１０〜１０００nMのトリヨードチロニン（Ｔ３）、０．１〜５０nMのデキサメタゾン、１〜１００nMのハイドロコーチゾン、１〜１００μg/mlのビタミンＣ、１〜１００μg/mlのウシ下垂体抽出物、０．１〜５０μg/mlのインスリン、０．１〜５０ng/ml のＥＧＦおよび０．１〜１００μg/mlのトランスフェリンを含んでよい。
【００３８】
微量元素は、例えばセレン、マンガン、ケイ酸塩、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、およびこれらの塩により形成される群から選択される化合物が選択される。
【００３９】
培地に通常含有される無機塩のうち、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、硫酸カリウム、塩素酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウム、亜硝酸第二鉄、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸第二銅、塩素酸マグネシウム、塩素酸マンガン、硫酸ニッケル、酢酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩素酸スズ、および硫酸亜鉛から形成される群からの塩が選択される。
【００４０】
特に培地は、混入する繊維芽細胞の成長を阻害するために８０μＭ未満のカルシウムを含有するように注意すべきである。しかし、カルシウム濃度は１mMまで上げることができ、これはいくつかの実験では必要であった（ジャンクションタンパク質の分極と発現）。数回の継代後は、それ以上繊維芽細胞を増殖させる危険はなく、これは初代細胞の処理による初期混入物質であるかも知れない。
【００４１】
同様に、培地に通常含有される他のビタミンは、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩素酸コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビオチンおよびシアノコバラミンから形成される群から選択される他のビタミンが選択される。
【００４２】
最後に、本発明の細胞株を継続して得ることを可能にする培地は、好ましくは下記の表１に記載の組成物Ｂ５０を有する。
【００４３】
本発明の別の面は、ヒト大腸の上皮細胞の不死化方法であり、ここでヒト大腸から得られる初代上皮細胞の培養物を調製し、その培養物を組換えウイルスで感染させ、不死化細胞を前記の無血清培地中で培養する。
【００４４】
その前に、好ましくは以下の工程が使用される：
（１）ヒト大腸の上皮組織の試料を得る；
（２）この試料を、インビトロで培養するために調製する；
（３）上皮細胞を無血清培地に接種し、細胞の付着とその増殖を促進するコーティングを有する培養プレートに接種する；
（４）コンフルエントな増殖を最適化するために、培地を必要に応じてできるだけ頻繁に交換する；
（５）細胞に組換えウイルスを感染させる；
（６）そして、不死化細胞を、前記の無血清培地で培養する。
【００４５】
さらに詳細には、工程１）は、腸管の手術時の健常人からの大腸細胞試料の入手に関する。工程２）において、試料を培地で洗浄し、小片に切り、物理的および／または化学的手段により上皮部分を他の組織から分離する。例えば、組織の小片を、０．５％トリプシンと０．１％ＥＤＴＡを含有する溶液に、細胞の分離を達成するのに充分な時間入れ、次にトリプシンインヒビターを数分間加え、最後に培地（好ましくは、前記の培地）を加える。
【００４６】
工程３）では、上皮細胞を、プレートの無血清培地、好ましくは前記の無血清培地に接種する。培養プレートは好ましくは、フィブロネクチン、ＢＳＡおよびＩ型コラーゲン（レクナー（Lechner ）ら、Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９，４３−４８，１９８５）よりなるコーティングを有する。
【００４７】
工程４）では、上皮細胞を含有する培地を、コンフルエントな増殖を最適化するために必要に応じてできるだけ頻繁に交換する。好ましくは培地を１日置きに交換する。利用可能な表面積の９０％のオーダーのコンフルエンスに達した後（これは、通常接種後１０日目に起きる）、細胞をトリプシンとＥＤＴＡの溶液で処理して分離する。
【００４８】
分離した細胞を工程５）で、好ましくは前記のコーティングを有する培養プレートの、例えば前記の感染培地に移す。次に細胞を組換えウイルスを用いて従来法に従って感染させる。当業者は非常に多くのトランスフェクション法を利用できる。例えば、ＷＯ９６／０７７５０、クラウディア・チェン（Claudia Chen）ら（Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５−２７５２，１９８７）、またはウィルソン（Wilson）ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２６，２１２−２２０，１９９５）に記載の方法がある。
【００４９】
好ましくは、Ｔ抗原（Ｔ−Ａｇ）、不活性化ウイルス複製開始点（ＭｕＬＶレトロウイルス）、および選択可能な遺伝子を含有する組換えＳＶ４０ウイルスが使用される。例えば、図１に記載の構築体が使用され、その配列はジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できる（受け入れ番号Ｍ６４７５３号；ストックシュレーダー（Stockshlaeder ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２，３３−３９，１９９１）。他の適当なベクターは、例えば、Ｔ−Ａｇをコードする遺伝子、選択可能な遺伝子および／またはヒト複製開始点を含む市販のベクターから、当業者は容易に作製可能であろう。例えば、Ｔ−Ａｇをコードする遺伝子を含有するプラスミドＡＴＣＣ３７４６０およびＡＴＣＣ３７６４０がある。
【００５０】
工程６）では、上皮細胞を好ましくは前記のコーティングを含む培養プレートの新鮮な増殖培地に移す。
【００５１】
本発明の上皮細胞株の元々の性質を知ると、免疫学的、薬学的および毒性研究において、その応用が予想できる。
【００５２】
すなわち、本発明の細胞株は、例えば（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性、毒性または有効性を有することが疑われる物質を、本発明の細胞株を有する培養物と反応、培養または接触させ、そして（２）細胞株に対する物質の作用を定量または測定する方法における、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性をスクリーニングするのに特に適している。
【００５３】
従って、本発明の上皮細胞、本発明の培地、および突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットの調製も予想される。
【００５４】
本発明の細胞株はまた、組換えタンパク質の発現に適する。外来ＤＮＡのトランスフェクション法は、現在当業者に公知である（例えば、ＷＯ９４／０５４７２を参照）。
【００５５】
本発明の細胞株はまた、体外（ex vivo ）での遺伝子治療に有用な可能性がある。これらの細胞株は、治療的応用を目的とする遺伝子を発現する組換え細胞の成長のための適切な手段である。本発明の細胞株により提供される１つの利点は、これらは動物の血清に接触されないため、ウイルスまたは他の病原体により汚染される危険性を大きく低下させる。
【００５６】
本発明の細胞株の調製の実施例に関して、以下の追加の記載により、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、まず使用される培地を記載し、次に比較例を示す。しかしこれらの例は例示目的であって、本発明を限定するものではない。細胞株、ＳＶ４０の調製、トランスフェクションおよびマーカーの発現の解析は、他に特に記載しない場合は、サムブルーク（Sambrook）らのマニュアル（分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、米国、１９８９）に従って行われる。記載したパーセントは、他に特に記載しない場合は、重量％である。
【００５７】
【表１】
培地：                            表１
─────────────────────────────────
成分                                培地Ａ５０        培地Ｂ５０
─────────────────────────────────
無機塩
ＮａＣｌ                            6.400 g/l         6.400 g/l
ＫＣｌ                              0.400 g/l         0.400 g/l
ＭｇＳＯ4 −７Ｈ2 Ｏ                0.200 g/l         0.200 g/l
ＣａＣｌ2                           0.200 g/l         0.200 g/l
ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｈ2 Ｏ              0.13  g/l         0.13  g/l
ＮａＨＣＯ3                         3.7   g/l         3.7   g/l
Ｆｅ（ＮＯ3 ）2 −９Ｈ2 Ｏ          0.0001g/l         0.0001g/l
他の成分
グルコース                          4.50  g/l         4.50  g/l
ヘペス                              20 mM             20 mM
フェノールレッド                    0.010 g/l         0.010 g/l
ピルビン酸ナトリウム                0.110 g/l         0.110 g/l
ＢＳＡ                              0.3 %              0.3 %
ＰＥ                                0.5 μM            0.5μM
アミノ酸
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ              0.0840g/l         0.0840g/l
Ｌ−シスチン                        0.0480g/l         0.0480g/l
Ｌ−グルタミン                         ---            2 mM
グリシン                            0.0300g/l         0.0300g/l
Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2 Ｏ      0.0420g/l         0.0420g/l
Ｌ−イソロイシン                    0.1048g/l         0.1048g/l
Ｌ−ロイシン                        0.1048g/l         0.1048g/l
Ｌ−リジン−ＨＣｌ                  0.1462g/l         0.1462g/l
Ｌ−メチオニン                      0.0300g/l         0.0300g/l
Ｌ−フェニルアラニン                0.0660g/l         0.0660g/l
Ｌ−セリン                          0.0420g/l         0.0420g/l
Ｌ−スレオニン                      0.0952g/l         0.0952g/l
Ｌ−トリプトファン                  0.0160g/l         0.0160g/l
Ｌ−チロシン                        0.0720g/l         0.0720g/l
Ｌ−バリン                          0.0936g/l         0.0936g/l
ビタミン
Ｄ−カルシウム−パントテン酸        0.004 g/l         0.004 g/l
塩化コリン                          0.004 g/l         0.004 g/l
葉酸                                0.004 g/l         0.004 g/l
イノシトール                        0.008 g/l         0.008 g/l
ニコチンアミド                      0.004 g/l         0.004 g/l
ピリドキシン−ＨＣｌ                0.004 g/l         0.004 g/l
リボフラビン                        0.0004g/l         0.0004g/l
チアミン−ＨＣｌ                    0.004 g/l         0.004 g/l
ビタミンＣ                            ---             0.030 g/l
レチノイン酸                        10 nM             100 nM
微量元素                              ---             10 nM
ホルモン
インスリン                          0.005 g/l         0.005 g/l
ＥＧＦ                              1 ng/ml           1 ng/ml
トランスフェリン                    0.005 g/l         0.005 g/l
Ｔ３                                  ---             100 nM
デキサメタゾン                        ---             1 nM
ハイドロコーチゾン                    ---             10 nM
ウシ下垂体抽出物                      ---             0.038 g/l
抗菌剤
ファンジゾン（Fungizone ）          0.25  μg/ml      0.25  μg/ml
ペニシリン                          2.5 U/ml          2.5 U/ml
ストレプトマイシン                  5 μg/ml          5 μg/ml
ゲンタマイシン                      10μg/ml          10μg/ml
───────────────────────────────────
（ＰＥ：ホスホリルエタノールアミンとエタノールアミンの混合物）
【００５８】
比較例
ストックシュレーダー（Stockshlaeder ）らにより記載され、Ｔ抗原をコードする遺伝子、プサイ遺伝子、選択マーカーヒスチジノール脱水素酵素（ＨＳＤ）、およびＬＴＲプロモーターを含んでなる、ベクターｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０＋（ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）、受け入れ番号Ｍ６４７５３号；ストックシュレーダー（Stockshlaeder ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２，３３−３９）（図１に示す）を使用する。
【００５９】
ＳＶ４０ウイルスは、リンチとミラー（Lynch and Miller）の方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３８８７−３８９０，１９９１）に従って調製した。このために、外生（ecotropic ）細胞株Ｐｓｉ２（マン（Mann）ら、Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９，１９８３）、および両性栄養性細胞株ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９０７８）を、１０％胎児牛血清含有ＤＭＥＭ培地（ダルベッコー（Dulbecco）、米国）中で、３７℃で５％ＣＯ2 含有空気中で培養した。これらの細胞株は、２５０mMのＣａＣｌ2 と１０μｇのベクターｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０＋を用いて常法に従って別々にトランスフェクションし、４８時間インキュベート後トリプシンで処理し、等量混合し、そして全体を３７℃で５％ＣＯ2 含有空気中でインキュベートした。７０％のコンフルエンスになるまで増殖させた後、ウイルスをＰＣ−１（ベントレックス（Ventrex ）、米国）で集めた。ろ過後（０．４５μｍ、ミクロポア（Micropore ））、ウイルスの量をＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）で測定した。
【００６０】
Ｓ状結腸憩室の出現のため、６９才の高齢女性から生検により大腸の初代細胞を得た。試料をＤＭＥＭ培地で洗浄し、小片に切り、上皮部分を他の組織から分離し、プレート上の上皮細胞をＤＭＥＭ培地に接種した。培養プレートを、５mgのヒトフィブロネクチン（シグマ（Sigma ））、５mlのビトロゲン（Vitrogen）１００（コラーゲン社（Collagen Corp.）、パロアルト（Palo Alto ）、カリホルニア州、米国）、５０mlの０．１％ＢＳＡ（バイオフルーイッズ（Biofluids ））、および残りのＤＭＥＭ培地を含有する５００mlの溶液でプレインキュベートした。コンフルエントな増殖を最適化するために、上皮細胞を含有する培地を必要に応じて頻回に交換した。
【００６１】
１週間の培養後９０％のオーダーのコンフルエンスに達した後、細胞を常法によりトリプシンとＥＤＴＡの溶液で処理して分離する。分離した細胞を、前記のコーティングを有する培養プレートに移し、前記のＡ５０培地に移した。
【００６２】
次に培養物を、前述のように調製したＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）を含有する８μg/mlのポリブレン（polybrene ）と高力価のＳＶ４０ウイルス（１０5 〜１０7 ＣＦＵ）の存在下で感染させた。２時間インキュベートした後、培養物をＰＢＳで洗浄し、Ａ５０新鮮培地を加えた。
【００６３】
残念ながら細胞は以後、増殖がゆっくりし過ぎて、ヒト大腸の上皮細胞に匹敵する増殖を示すクローンを選択することができなかった。
【００６４】
実施例１
Ａ５０培地の代わりに表１に示したＢ５０培地を使用した以外はまったく同様にして、ヒト大腸の上皮細胞を、前記比較例に示したように感染させた。
【００６５】
ウイルスで２時間インキュベートした後、培地をＰＢＳで洗浄し、新鮮なＢ５０培地を加え、各継代でヘペス緩衝液（バイオフルーイッズ（Biofluids ））中の０．０２％トリプシン、１％ポリビニルピロリドンおよび０．０２％エチレングリコール溶液中で処理して細胞を分離するように注意して、新鮮なＢ５０培地で連続的に継代して培養した。
【００６６】
培養プレート上で成長する細胞コロニーのサイズを観察することにより、成長の早いものを選択した。こうして、６つのヒト上皮大腸不死化細胞株を選択することができ、このうち１つを１９９６年４月１６日にドイツ微生物および培養物寄託機関（Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen）（ＤＳＭ）（マシェローダー・ヴェーグ（Mascheroder Weg ）１ｂ、Ｄ−３８１２４、ブラウンシュバイク（Braunschweig）、ドイツ）に寄託し、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８を受けた。
【００６７】
１．ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の核型の解析
４０継代目に採取したＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の４つの核型を調製する（マニュアル「ヒトの細胞遺伝学、ルーニイ，ディー・イー（Rooney DE ）、チェプルコウスキー，ビー・エィチ（Czepulkowski BH ）編、アイラールエルプレス（IRL Press ）、オックスフォード、１９８６」に記載の方法、参考のため本明細書に引用される）。結果は、６つの異なる染色体が失われたかまたは傷害を受けたことを示す。従ってこの細胞株は、各対の染色体の１つの染色体をそのゲノム中に完全に保存する。細胞株の性はＸＯ／ＸＸである。１セットの染色体の喪失は、この細胞株の腫瘍化を示すものではないことに注意すべきである。
【００６８】
２．ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の腫瘍形成性
４６継代目に採取した１０7 個のＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株を、スタウファー（Stauffer）ら（前述）の記載した方法に従って、免疫防御能力のない（「ヌード」）マウスに注入する。８ヶ月以上たっても腫瘍の形成は見られない。この細胞株の非腫瘍形成性は、この細胞株の非腫瘍化を示すものではない。例えば、スタウファー（Stauffer）らが記載したＮＭＣ４５６株は、ヌードマウス中で腫瘍を誘導しないが、腫瘍化に特徴的な腫瘍マーカーを発現する。
【００６９】
３．ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株での腫瘍マーカーの発現
スタウファー（Stauffer）らの方法に従って、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株が以下の腫瘍マーカーを発現するか否かを測定する：ｐ−５３突然変異、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および腺腫様結腸ポリープ症（ＡＰＣ）遺伝子。
【００７０】
結果はすべてのこれらのマーカーについて陰性であり、これはこの細胞株の非腫瘍化の状態を示す。
【００７１】
４．ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株のウイルス汚染
ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）により汚染されているか否かを測定する。
【００７２】
ＨＢＶの解析のために、フェノールとクロロホルム溶液で処理して、次にエタノールで沈殿させて、約２×１０6 個の細胞からＤＮＡを抽出する。次にＤＮＡ試料について、ウイルスのプレ−コア領域（リンチ（Lynch ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３８８７−３８９０）に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、１０〜１０5 個のＨＢＶ（アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・６・プロダクト（Anawa Biomedical Services 6 Product ）、米国）を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【００７３】
ＨＩＶ−１の解析のために、前述のＤＮＡ試料について、ウイルスのＧＡＧ領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増殖を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、１０〜１０5 個のＨＩＶ−１（アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・６・プロダクト（Anawa Biomedical Services 6 Product ）、米国）を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【００７４】
ＨＣＶの解析のために、コムクジンスキー（Chomczynski ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）の方法により、約２×１０6 個の細胞からＲＮＡを抽出する。常法に従って逆転写を行い、得られた相補的ＤＮＡについて、ウイルスの非コード５’領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増殖を行う。次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。比較のために、１０〜１０5 個のＨＣＶ（アナワ・バイオメディカル・サービシーズ・６・プロダクト（Anawa Biomedical Services 6 Product ）、米国）を含有する血清の希釈物を、平行して同じ方法で解析する。
【００７５】
結果は３つのウイルスの存在は陰性である。
【００７６】
５．ヒト上皮細胞に特異的なマーカーの発現
【００７７】
５．ａ．サイトケラチン：ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の培養物の細胞を、１００％冷メタノール溶液によりガラスプレートに付着させ、次にプレートを、０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．６）、１．８％ＮａＣｌおよび０．２％ポリエチレングリコール２０００を含有する緩衝液（ＴＮＰ緩衝液）で洗浄する。次に細胞を、サイトケラチンに特異的なマウス抗体（抗−ＣＨペプチド４、７、８、１３、１４、１７、１８、１９、２０、シグマ（Sigma ）、米国）の存在下で３０分インキュベートする。０．５％ＢＳＡ含有ＴＮＰ緩衝液で３回洗浄した後、免疫蛍光化合物を含むヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（１：３００、ＦＩＴＣヤギ抗−マウスＩｇＧ；ビオシス（Biosys））でプレートを３０分インキュベートする。前記緩衝液で３回洗浄した後、プレートを固定し、蛍光顕微鏡で解析する。すべての細胞はサイトケラチン７、８、および１７について陽性である。
【００７８】
５．ｂ．ビメンチン：サイトケラチンの解析と同じ方法で、前記の固定細胞について、マウス抗−ビメンチン抗体（ダコ（ＤＡＫＯ）、米国）に反応させ、次に前記ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させる。蛍光顕微鏡により、すべての細胞はビメンチンについて陽性である。
【００７９】
５．ｃ．細胞間の結合組織（タイトジャンクション）：ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞をコンフルエンスになるまでガラスプレートで培養し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中２．５％のグルタルアルデヒド溶液で室温で１時間処理して固定する。同じリン酸緩衝液で２回洗浄後、細胞を再び同じ緩衝液中２％のＯｓＯ4 溶液で固定する。次に細胞を、３０、５０、７０、９０および１００％のエタノール（ポラロン・エクイップメント社（Polaron Equipment Ltd.）、ワットフォード（Watford ）、英国）で連続的に脱水し、次に細胞を細かい金の層から回収する（ＳＥＭコーティングユニットＥ５１００、ポラロン（Polaron ））。次に細胞を電子顕微鏡（フィリップス５０５ＳＥＭ）により観察する。この解析は、細胞が上皮細胞に特徴的な細胞間結合組織を有することを示す。
【００８０】
５．ｄ．アルカリ性ホスファターゼ：ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性を、ダールキスト（Dahlquist ）ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，９９−１０７，１９６８）の方法を再現するシグマ（Sigma ）の市販キットを用いて測定する。図２に示す結果は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞（Ｏｃ１１、Ｏｃ１２、Ｏｃ１４）は、ヒト大腸上皮癌細胞ＣａＣＯ−２に匹敵するホスファターゼ活性を示すが、ヒト大腸上皮癌細胞ＨＴ−２９より高い活性を示すことを示した。結果Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｐは、実施例２に示す他のヒト大腸上皮細胞株に関連する。
【００８１】
５．ｅ．サイトクロームＰ４５０：ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞によるサイトクロームの発現を、異なるサイトクロームＰ４５０に特異的なＤＮＡプライマーを用いて公知のＲＴ−ＰＣＲ法により解析する。これらのプライマーは、ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できる、異なるサイトクロームのＤＮＡ配列から調製することが便利である（ＣＹＰ１Ａ１：受け入れ番号Ｘ０２６１２；ＣＹＰ２Ｃ：受け入れ番号Ｍ６１８５５またはＭ６１８５８またはＭ６１８５６またはＭ６１８５４；ＣＹＰ２Ｄ６：受け入れ番号Ｍ３３３８８；ＣＹＰ２Ｅ１：受け入れ番号Ｊ０２８４３；ＣＹＰ３Ａ５：受け入れ番号Ｊ０４８１３；ＣＹＰ１Ａ２：受け入れ番号Ｚ０００３６；ＣＹＰ２Ａ６：受け入れ番号Ｍ３３３１８；ＣＹＰ２Ｂ６：受け入れ番号Ｍ２９８７４）。
【００８２】
このために細胞をコンフルエンスになるまで、３５mmプレート（コスター（Costar））で培養し、ＲＮＡイージー（RNAeasy ）キット（キアゲン（Qiagen））を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写を行い（ＲＴ−ＰＣＲ用の１本鎖ｃＤＮＡ合成キット（1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR）、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim ））、得られた相補的ＤＮＡを異なるサイトクロームＰ４５０に特異的なＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、次に増幅生成物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムの存在下で紫外線で可視化する。
【００８３】
結果は、細胞がサイトクロームＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ５を発現することを示す。一方、細胞は、サイトクロームＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６およびＣＹＰ２Ｂ６について陰性である。サイトクロームＣＹＰ３Ａ５の発現はまた、抗−ＣＹＰ３Ａ５ポリクローナル抗体（オキシゲン（Oxygene ）、米国）を用いて、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット解析により確認される。
【００８４】
５．ｆ．細胞性酸化と親電子物質の無毒化に関与する酵素：ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞を培養し、コムクジンスキー（Chomczynski ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）の方法により、ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡプローブを、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰ）、カタラーゼ（ＣＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびキノンリダクターゼ（ＱＲ）のＤＮＡ配列（これらはジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できる）から、ＤＮＡプローブを調製し（ＧＳＴ：受け入れ番号Ｘ０８０５８；ＧＰ：受け入れ番号Ｍ２１３０４；ＣＡ：受け入れ番号Ｍ８１５７８；ＳＯＤ：受け入れ番号７２９３３６；ＱＲ：受け入れ番号Ｍ８１５９６＿６００）、次にこれらのプローブでＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行い、これらの酵素の転写を確認する。
【００８５】
結果は、すべての細胞が、ＳＯＤ、ＧＰ、ＣＡ、ＧＳＴおよびＱＲ活性をコードする遺伝子の転写を発現することを示す。従ってＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株は、細胞の酸化と親電子物質の無毒化に関与する酵素を発現する。
【００８６】
６．ヒト大腸の上皮細胞に特異的なマーカーの発現
【００８７】
６．ａ．表面絨毛組織：前記５．ｃ．に記載のように、電子顕微鏡による細胞の解析は、支持体に粘着するものとは反対の極に短い絨毛組織が存在することを明瞭に示す。
【００８８】
６．ｂ．ショ糖イソマルトース：ショ糖イソマルトースは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。ショ糖イソマルトースの存在は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞のコンフルエントな培養物を１ng/ml のヒト組換えＴＧＦ−β（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））に４８時間接触させた後、前記５．ｅ．項で記載したようにＲＴ−ＰＣＲ法によるメッセンジャーＲＮＡのレベルで証明することができる。ＤＮＡプライマーは、常法に従いジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できるショ糖イソマルトース遺伝子のＤＮＡ配列（受け入れ番号Ｘ６３５９７  Ｓ４１８３３  Ｓ４１８３６）から調製される。
【００８９】
６．ｃ．ジペプチジルペプチダーゼIV：ＤＰＰIVは、ヒト大腸の上皮細胞に特異的である。その存在は、前記５．ｅ．項で記載したようにＲＴ−ＰＣＲ法によるメッセンジャーＲＮＡのレベルで証明することができる。ＤＮＡプライマーは、常法に従いジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースから入手できるＤＰＰIV遺伝子のＤＮＡ配列（受け入れ番号Ｕ１３７１０−３５）から調製される。
【００９０】
６．ｄ．ＭＨＣクラスII抗原：大腸の上皮細胞は、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の存在下で、ＭＨＣクラスII抗原（ＨＬＡ抗原）を発現することができる。このために、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞を、Ｂ５０培地中で、１００U/mlの組換えγ−ＩＦＮ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim ））の存在下で、１２、２４、３６、および４８時間培養する。細胞を、０．０２５％トリプシンとＥＤＴＡ（ギブコ・ライフ・テクノロジー（Gibco Life Technologie）、米国）を含む溶液により分離し、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ抗原に特異的な抗体（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、米国）の存在下でインキュベートし、フローサイトメーター（ファクスキャン（FACScan ）、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））を用いて分離する。
【００９１】
図３に示す結果は、１２時間の培養物からのＨＬＡ−ＤＰ抗原の発現を示し、２４時間と４８時間で濃度が上昇することを示す。２４時間の培養後にＨＬＡ−ＤＲの発現が観察され、３６時間と４８時間に最大濃度に達する。一方、ＨＬＡ−ＤＱ抗原は誘導されず、これは大腸の初代上皮細胞での観察結果（メイアー（Mayer ）ら）を確認している。
【００９２】
７．微生物への粘着
【００９３】
７．ａ．細菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株への粘着：ヒトの小腸には無数の非病原性細菌が住み着いており、その中に乳酸菌およびビフィドバクテリア（bifidobacteria）があり、そのいくつかは小腸粘膜の絨毛組織に粘着している。小腸管の上皮細胞に強く粘着することが知られているラクトバシラス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）株ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５（ＥＰ５７７９０４；バーネット（Bernet）ら）を、酸素の非存在下で、１００μＣの3Ｈアデニン（adenine）含有ＭＲＳ培地（マン、ロゴサおよびシャープ（Man, Rogosaand Sharpe）、バイオカー（Biokar））中で１２時間培養する。
【００９４】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞をコンフルエンスになるまで、２週間培養し、次に前記１２時間ＭＲＳ培地、新鮮なＭＲＳ培地、または前記１２時間ＭＲＳ培養物から得られた４×１０8 細胞/ml を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で、３７℃で１時間インキュベートする。ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で溶解し、次に細胞から放出される放射能強度を、シンチレーションカウンターで測定する。
【００９５】
比較のために、ＣａＣＯ−２株を前記方法と同じ方法で培養し、ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５株でインキュベートし、細胞から放出される放射能強度を測定する。
【００９６】
下記の表２に示す結果は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８細胞は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５細菌ならびにＣａＣＯ−２細胞に粘着することができることを示す。また１２時間のＬＡ−１株の培養物は、細菌の粘着を促進する因子を明らかに含有することがわかる。細菌を加えた新鮮なＭＲＳ培地は、低いレベルの粘着を示す。さらに、インビボで小腸管で見いだされるものと類似のｐＨであるｐＨ６．５は、ｐＨが５のオーダーより低い新鮮なＭＲＳ培地で得られる粘着レベルと比較すると、細菌の粘着を促進することがわかる。
【００９７】
【表２】
0003931212.tif 000002
【００９８】
細菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５を保持するＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の能力はまた、バーネット（Bernet）らの方法（Ｇｕｔ，３５，４８３−４８９，１９９４）により測定される。簡単に説明すると、１００個の大腸細胞に粘着する細菌の数を肉眼で測定する。このために、１２時間ＭＲＳ培地、または１２時間ＭＲＳ培養物から得られた４×１０8 細胞/ml を含む新鮮なＭＲＳ培地を使用する。さらに、３つの調製物について解析を行い、各調製物について２０枚の顕微鏡写真をランダムに使用する。
【００９９】
比較のために、細菌ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５を保持するＣａＣＯ−２細胞株の能力を、同じ方法で測定する。
【０１００】
下記の表に示す結果は、この細胞株は多くの細菌を保持することができることを示す。また、１２時間ＬＡ−１株の培養物は、細菌の粘着を促進する因子を明らかに含有することを注意すべきである。細菌を加えた新鮮なＭＲＳ培地では、このような高い粘着レベルを得ることはできない。
【０１０１】
【表３】
0003931212.tif 000003
【０１０２】
７．ｂ．クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile ）および／または粘着性ビフィドバクテリア（bafidobacteria）への粘着：
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｖｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，５９，４１２１−４１２８，１９９３およびＥＰ５７７９０４（ネッスル（Nestle））に記載の細菌クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile ）および粘着性ビフィドバクテリア（bafidobacteria）を保持するＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の能力も、測定する。結果は、この細胞株は多くの数の各細菌を保持することができることを示す。
【０１０３】
８．サイトキニン発現：炎症物質の存在下または非存在下で、ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株の細胞によるサイトキニンの発現を、異なるサイトキニンに特異的なＤＮＡプライマーを用いて公知のＲＴ−ＰＣＲ法により測定する。これらのプライマーは常法に従い、ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースの異なるサイトキニンのＤＮＡ配列（受け入れ番号：ＴＮＦα：Ｘ０２９１０；ＩＬ−１β：Ｍ１５８４０；ＩＬ−６：Ｍ１４５８４；ＩＬ−８：Ｍ２８１３０；ＩＬ−ｒａ：Ｍ９７７４８）から調製される。炎症の誘導は、１mMのヒスタミンまたは２０ng/ml のＴＰＡとともに細胞株を２４時間インキュベートすることにより行なった。
【０１０４】
比較のために、正常の大腸組織、ＨＴ−２９およびＣａＣＯ−２腫瘍形成性細胞株を用いて同じ解析を行なった。結果を下記の表４に示す。
【０１０５】
【表４】
0003931212.tif 000004
【０１０６】
実施例２
実施例１で成長させた他のヒト上皮大腸不死化細胞株は、前記ＤＳＭ  ＡＣＣ２２５８株と類似の特徴を示す。例えば、他の５つの株（Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｐ）のアルカリ性ホスファターゼ活性を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト大腸の上皮細胞の不死化に使用されるベクターｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０＋。
【図２】ヒト大腸の上皮細胞から得られる異なる細胞株による小腸アルカリ性ホスファターゼ活性の発現を示すグラフ。
【図３】時間の関数としての、ガンマ−インターフェロンの存在下でＭＨＣクラスII（ＨＬＡ）抗原を発現する本発明の不死化上皮細胞の割合を示すグラフ。
【図１】
0003931212.tif 000005
【図２】
0003931212.tif 000006
【図３】
0003931212.tif 000007