(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌培養液中に存在するビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを、培養液のｐＨを６．０以下に調整するか、または培養液に塩類を添加して、水不溶性化した後、培養液から水不溶物を分離、回収することを特徴とするビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項２】
ビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化する方法が、培養液のｐＨをｐＨ１．０〜５．５に調整することである請求項１記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項３】
ビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化する方法が、培養液に硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムを添加することである請求項１記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項４】
水不溶物を分離する手段が、遠心分離である請求項１ないし３のいずれか１項記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項５】
水不溶物を分離する手段が、膜濃縮である請求項１ないし３のいずれか１項記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項６】
枯草菌が納豆菌である請求項１記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【請求項７】
枯草菌が納豆菌で、培養液が大豆煮汁である請求項１記載のビタミンＫ2 濃縮物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、枯草菌培養液から、ビタミンＫを効率的に回収することを目的としたビタミンＫ濃縮物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＫは、血液凝固に必要な因子として作用する他、骨代謝にも関わりのある脂溶性のビタミンである。ビタミンＫは、植物によって合成されるビタミンＫ1 と細菌によって作られるビタミンＫ2 がある。ビタミンＫ2 は側鎖の長さの異なるメナキノン−１〜１４の同族体が存在する。従来より、ビタミンＫ2 の発酵生産が種々試みられてきたが、その多くは可食でない菌から作られており、常に安全性に不安が生じるものであった。近年、可食である納豆菌など枯草菌からのビタミンＫの利用が試みられている。
【０００３】
一般に、微生物の菌体中に蓄積される成分であれば、培養液から適当な方法によって集菌すれば、目的成分を培養液から回収できる。例えば、ロドシュードモナス属に属するメナキノン−７生産菌では、メナキノン−７が菌体中に蓄積されるため集菌しメナキノン−７を回収している（特開昭５７−２０２２９５号公報）。こうして得られた菌体から有機溶媒を使ってメナキノン−７を抽出することが可能である。
【０００４】
枯草菌(Bacillus subtilis) はビタミンＫ2 を生産し、その主成分はメナキノン−７であり、それ以外にマイナーな成分としてメナキノン−６を、さらに微量成分としてメナキノン−４，５，８などを生産する。菌体そのものが可食であることから安全なビタミンＫ2 供給源として期待されている。ビタミンＫは脂溶性であり、多くの微生物では細胞膜や細胞内に含まれ、通常の培養液中には溶解することはない。ところが、枯草菌は容易に溶菌するため、ビタミンＫ2 は菌体内にとどまる以外に、多くのビタミンＫ2 が壊れた細胞膜成分とともに水溶性ミセルとなって菌体外に存在する。水溶性ミセル中に含まれるビタミンＫ2 は、全ビタミンＫ2 量の３０〜７０％に達する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ビタミンＫの発酵生産が種々行われているが、例えば、上記ロドシュードモナス属に属する菌株は食経験がなく安全性に問題があり、食品としての安全性を考えると可食である納豆菌など枯草菌の利用が望まれる。しかし、上述した様に枯草菌の作るビタミンＫ2 のかなりの量が、菌体外の水溶性ミセルに含まれるため、公知の方法により菌体を回収したとしても、効率的にビタミンＫ2 を集めることができない。
このため、枯草菌培養液中に含まれるビタミンＫ含有水溶性ミセルを効率的に回収する技術の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
我々は、上記課題を鋭意検討した結果、枯草菌培養液中に存在するビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを種々の手段により不溶性化させると、ビタミンＫ2 の回収率が飛躍的に向上することを見出して本発明を完成した。
すなわち本発明は、枯草菌培養液中に存在するビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化した後、生成された水不溶物を分離、回収することを特徴とするビタミンＫ2 濃縮物の製造法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、枯草菌培養液中に存在するビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化させるには、１）枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整する、２）培養液中に塩を添加する、の２種の手段がある。
【０００８】
上記２種の手段により、水溶性ミセルが不溶性化する機構についてはいまだ定かではないが、それぞれ、１）枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整すると、水溶性ミセルに含まれる蛋白質や酸性リン脂質など荷電を持つ成分の荷電状態が変化し、ミセルの凝集が惹き起こされることにより不溶性化する、２）塩を添加した場合は、ビタミンＫ2 含有水溶性ミセルと結合している水分子が、塩によって影響をうけ、ミセルの水親和性が低下するために、不溶性化することによりミセルの溶解度が低下する結果不溶化するものと推定される。
【０００９】
枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整して該培養液中のビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化させる場合、ｐＨ調整に使用する酸については特に制限はなく、例えば、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸、硝酸、トリクロロ酢酸などの無機酸や、乳酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、酪酸、脂肪酸などのカルボン酸、その他、アスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸などが使用できる。更に、リン酸２水素ナトリウムやリン酸２水素カリウム、またクエン酸カリウムやクエン酸ナトリウムなど酸の塩類を添加しても良いし、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンや重フタル酸など緩衝液に用いられる薬剤を使用してもかまわない。さらには、硫化水素や炭酸ガスなど気体を溶存させ、酸を発生させることによりｐＨを低下させることも可能である。また、酢酸菌、乳酸菌、酵母などの、培養が進行するにつれてｐＨを低下させる微生物を使用して、納豆菌培養液にこれらの微生物を繁殖させてｐＨを調整することもできる。さらには、工業的に使用されている潜伏性のｐＨ降下剤を使用してもかまわない。
【００１０】
本発明において、枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整した後、該培養液を遠心分離処理すれば、沈殿物中にビタミンＫ2 を効率的に回収することができるが、回収効率の点からは、より好ましくは、ｐＨを１．０〜ｐＨ５．５に、さらに好ましくは、ｐＨ２．０〜４．５に調整するとよい。
【００１１】
本発明において、ビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化するために枯草菌培養液中に添加する塩類としては、前記塩類のほか、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等があり、これらは１種単独又は２種以上を組合わせて使用できる。
その際には、水溶性ミセルの沈殿を形成させるためには、１０％飽和以上で効果が現れるが、好ましくは３０％飽和以上、より好ましくは４５％飽和以上添加すると良い。
【００１２】
なお、枯草菌培養液中のビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶性化するための上記２種の方法については、単独のみならず、２種の方法を組合わせても良く、特に、塩を添加する方法は、枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整する方法と併用すれば、ごく微量の添加でも沈殿効率を上げることができる。
更には、アニオン性あるいはカチオン性の凝集促進剤を併用することもできる。
本発明において、ビタミンＫ2 濃縮物を製造する際には、枯草菌培養液に直接、上記２種のビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを不溶化する手段を適用してもよいし、あるいは当該培養液に遠心分離等の前処理を施してから不溶化手段を適用してもよい。
【００１３】
枯草菌培養液のｐＨを６．０以下に調整した後、あるいは、塩を添加した後、生成する不溶性物質を分離する方法としては、遠心分離、膜分離、デカンテーションなどがある。なかでも、遠心分離がコストや効率の面で有利である。遠心分離に使用する遠心分離器の種類、構造にはなんら制限がなく、バッチ式、連続式の遠心分離器が利用できる。遠心分離にかかる重力加速度（ｇ）は、１００ｇ以上でも充分に効果があるが、好ましくは、１０００ｇ以上、より好ましくは５０００ｇ以上が効率的である。また遠心にかかる時間は特に限定されないが、例えば５０００ｇ以上であれば１分以上、１０００ｇであれば５分以上、１００ｇであれば１０分以上の遠心時間があればよい。
【００１４】
本発明に用いる培養液を製造するために使われる菌株は枯草菌(Bacillus subtilis) に属する菌種であればよく、汎用性という観点からは納豆の製造に使われる納豆菌が好ましい。また、枯草菌や納豆菌を変異処理などにより育種あるいは選抜した株により製造した培養液についても使用でき、発酵条件や培地条件などに制限はない。その中でも枯草菌培養液を得るために使用される培地としては、大豆粉、大豆煮汁、コーンスチープリカー、廃糖蜜、グルコース、シュークロースなど一般的に発酵工業で使用されている培地が良い。また、脱脂大豆、挽き割り大豆あるいは丸大豆など固形の培地を使って枯草菌を培養後、水や塩溶液などと混合して培養液を得ることもできる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例を示しながら、本発明を説明するが、実施例によって、本発明は何ら制限されない。なお、枯草菌のビタミンＫ2 の分析は、高速液体クロマトグラフィーで行い、メナキノン−６とメナキノン−７の量の和をビタミンＫ2 量とした。
【００１６】
実施例１                                                                  Brix１０％の大豆煮汁に、市販の宮城野納豆菌を植え、３７℃で７日間通気攪拌培養し、３Ｌの納豆菌培養液を得た。この発酵液中のビタミンＫ2 濃度は、２０．３ｍｇ／Ｌであった。本培養液を、１６，２５０ｇで１０分間遠心分離したところ、上清中には１２．４ｍｇ／ＬのビタミンＫ2 が含まれ、これらは水溶性ミセル中に含まれており、沈殿中に回収できなかった。そこで、この上清液のｐＨ（ｐＨ７．３）を、塩酸、酢酸、乳酸を用いてｐＨを１．０〜６．０に調整した。同時に比較例としてｐＨを塩酸、水酸化ナトリウム、アンモニアによりｐＨ６．５〜１１．０に調整した。一部の条件下においては、沈殿を促進するためにメタノールあるいは硫酸アンモニウムを添加した。これらの試験溶液を１６，２５０ｇで１０分間遠心分離し、得られた沈殿物中のビタミンＫ2 を分析した。結果を表１に示す。
【００１７】
表１の実施例の欄に示す通り、培養液をｐＨ６．０以下に調整することにより、ビタミンＫ2 を含む水溶性ミセルは不溶化が起こり、遠心分離によりビタミンＫ2 を沈殿物中に回収することができた。ところが、納豆菌培養液のｐＨを調整しない条件１５（ｐＨ７．３）を含めて、ｐＨ６．５以上の場合には、水溶性ミセルを不溶性化することはできなかった。一方で、条件５と条件６を比較すると、メタノールを添加することにより、ビタミンＫ2 の沈殿が促進された。また、条件８と９から、硫酸アンモニウムの微量添加によっても、沈殿が促進された。なお、一般に、タンパク質は等電点沈殿することが知られているが、タンパク質には固有の等電点があり、沈殿を起こすｐＨの範囲は狭いものである。ここで得られた結果では、沈殿の形成するｐＨの範囲が１．０〜６．０と広く、単純にタンパク質の等電点沈殿とは異なることがわかる。
【００１８】
【表１】
0003876395.tif 000002
【００１９】
実施例２
培地［コーンスチープリカー７％、シュクロース３％、グリセロール８％、燐酸水素２カリウム０．１％、ｐＨ７．３］１Ｌを５Ｌ容量の三角フラスコに入れ、オートクレーブにて滅菌後、枯草菌(Bacillus subtilis, Marburg 株，ATCC6051) を植えて、３５℃で８日間振とう培養を行った。得られた枯草菌培養液中のビタミンＫ2 総量は、２８．５ｍｇ／Ｌ、培養後のｐＨは７．１であった。この培養液を１０，０００ｇにて３０分間遠心分離を行ったところ、上清中のビタミンＫ2 濃度は１５．３ｍｇ／Ｌであった。この上清液に対して、１０、３０、４５、６０％飽和となるように硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウムを加えた。生じた沈殿物を１０，０００ｇにて３０分間遠心して分離し、沈殿物中へのビタミンＫ2 の回収率を調べた。
すると、表２に示す通り、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムを１０％飽和以上添加することにより、上清中のビタミンＫが沈殿物中に回収されることがわかった。特に、硫酸アンモニウムの場合では、４５％飽和以上の濃度でビタミンＫの回収率が高くなった。
【００２０】
【表２】
0003876395.tif 000003
【００２１】
実施例３
実施例１で得られた納豆菌培養液の上清液を、ｐＨ３．０とｐＨ７．０に調整した。得られた溶液を、ポアサイズ３００Ｋの膜（膜面積０．０４ｍ２）を使って濃縮を試みた。膜濃縮装置は、ユアサ商事製のＵＦ−２を使用した。すると、液量を２倍に濃縮したとき、ｐＨ７．０では約２０％のビタミンＫが膜から外へ漏れ出したが、ｐＨ３．０に調整した培養液では、ビタミンＫ2 が膜を通過せず、９９．９％以上のビタミンＫ2 が沈殿物とともに濃縮液中に濃縮された。
【００２２】
【発明の効果】
本発明において、枯草菌培養液中に存在するビタミンＫ2 含有水溶性ミセルを、１）培養液のｐＨを６．０以下に調整する、２）培養液中に塩を添加する２種の手段により不溶性化した後、該水不溶物を分離、回収すると、著しく効率的にビタミンＫ2 を取り出すことができる。