(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を標識する方法であって、以下のステップ：
一般的な媒体中に、
標識分子；
特異的に結合する対（sbp）の第２のメンバーに結合することができるリガンド（“第１のマーカーリガンド”）；
上記第２のsbpメンバー；
上記標識分子の他の分子への結合を触媒することができる酵素であって、
上記第１のマーカーリガンドと会合する上記酵素；
を供し、
上記第１のマーカーリガンドの上記第２のsbpメンバーへの結合を引きおこし又はそれを許容し、
上記第２のsbpメンバーに結合した上記第１のマーカーリガンドの近くに存在する他の分子への上記標識分子の結合を引きおこし又はそれを許容し、そして
上記媒体から標識された分子を単離及び／又は精製する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記標識分子が結合する前記他の分子が、前記第２のsbpメンバーに結合するsbpメンバー（“第１のsbpメンバー”）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識分子が結合する前記他の分子が、前記第２のsbpメンバーの近くの分子に結合するsbpメンバー（“第１のsbpメンバー”）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のsbpメンバーの近くの分子が、細胞表面上にあることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のsbpメンバーの近くの分子が、上記第２のsbpメンバーと複合体を形成することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のsbpメンバーが、ウィルス粒子の表面上に提示されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーリガンドに結合することができる第２のsbpメンバーを含む前記第２のsbpメンバーの多様な集団が、前記一般的な媒体中に供されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のsbpメンバーが、ペプチドであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のsbpメンバーが、ウィルス粒子の表面上に提示されることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のsbpメンバーに結合することができる第１のsbpメンバーを含む第１のsbpメンバーの多様な集団が、前記一般的な媒体中に供されることを特徴とする、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のsbpメンバーが、抗体抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のsbpメンバーが、scFv，Fab，Fv，dAb，Fd又はディアボディー分子を含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーリガンドが、サイトライン又はケモカインを含むことを特徴とする、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーリガンドが、抗体抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーリガンドが、非ヒト抗体抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項２〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のsbpメンバーが、ヒト抗体抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識が、活性化可能な結合分子を含むことを特徴とする、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化可能な結合分子が、チラミンであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素が、水素ペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素が、前記マーカーリガンドにコンジュゲートされることを特徴とする、請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素が、ペプチジル結合により前記マーカーリガンドにコンジュゲートされることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素が、ペプチド又はポリペプチドリンカーを介して前記マーカーリガンドにコンジュゲートされることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵素が、特異的に結合する対のメンバーを介して前記マーカーリガンドにコンジュゲートされることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素が、スペーサーを介して前記マーカーリガンドにコンジュゲートされることを特徴とする、請求項20〜23のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記スペーサーが、化学的リンカー、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、又は剛性ビーズ、ファージ分子、又は他の粒子であることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のsbpメンバーに結合した前記マーカーリガンドの近くの他の分子への前記標識分子の結合の後、前記媒体から、標識された分子を単離及び／又は精製し、そして前記標識が、特異的に結合する対のメンバーであることを特徴とする、請求項１〜25のいずれか１項にの方法。
【請求項２７】
標識された分子を、相補的なsbpメンバーへの前記標識の結合により、単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識が、ビオチンであることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
ビオチン化した分子を、ビオチンのストレプトアビジンへの結合により単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法により標識された第１のsbpメンバーが、前記方法の更なる実施において第２のリガンド（“第２のマーカーリガンド”）として用いられることを特徴とする、請求項２〜29のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法の前記更なる実施によって標識された更なる第１のsbpメンバーを、前記媒体から単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記更なる第１のsbpメンバーが、前記第１のマーカーリガンドのアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のsbpメンバーに結合した前記第１のマーカーリガンドの近くの標識化の量を決定することを特徴とする、請求項１〜29のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２のsbpメンバーがウィルス粒子の表面上に提示され、そして前記マーカーリガンドの上記第２のsbpメンバーへの結合並びに上記粒子及び／又は上記提示された第２のsbpメンバーの標識化の後に、上記粒子を単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項１〜33のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のsbpメンバーがウィルス粒子の表面上に提示され、そして上記第１のsbpメンバーの前記第２のsbpメンバーへの結合並びに上記粒子及び／又は上記提示された第１のsbpメンバーの標識化の後に、上記粒子を単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項２〜34のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のsbpメンバーがウィルス粒子の表面上に提示され、そして前記第２のsbpメンバーの近くの前記分子への上記第１のsbpメンバーの結合並びに上記粒子及び／又は上記提示された第１のsbpメンバーの標識化の後、上記粒子を単離及び／又は精製することを特徴とする、請求項３〜35のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記粒子が、前記標識された粒子及び／又は提示された第１もしくは第２のsbpメンバーに結合することができる特異的に結合する対のメンバーにより、単離及び／又は精製されることを特徴とする、請求項34、35又は36に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウィルス粒子の単離及び／又は精製の後、前記粒子から核酸を得ることを特徴とする、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記粒子から得られた前記核酸の配列又は１以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失及び／又は置換により修飾された配列をもつ核酸からの発現によりコードされたペプチド又はポリペプチドを作り出すことを含む、請求項38に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、分子、例えば、特に存在するリガンドが利用できる相補的な特異的結合性対（Sbp）のメンバーに排他的でなくても、関心の相補的Sbpのメンバーに結合することができるSbpのメンバーの標識及び選択に関する。典型的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体のような抗体であり得る存在する結合する分子が既に利用できる関心の抗原に特異的な抗体又は抗体抗原結合ドメインを含むポリペプチドに関する。それは、例えばその析出を触媒する酵素に関連する（関心の抗原に特異的な）モノクローナル抗体を含む“マーカーリガンド”の近隣の分子への標識又はリポーター分子、例えばビオチン−チラミンの析出に関する。本発明により標識された分子は、その結合メンバーが反応媒体内に含まれるなら結合メンバー、例えば同じ結合標的（例えば抗原）に結合する抗体、未知の抗原標的の同定及び／又は精製を許容するマーカーリガンドが結合する標的分子、及び／又は例えば結合標的が見い出される細胞表面上で、その結合標的に結合した時にその結合標的及び／又はマーカーリガンドの近隣の他の分子、例えば新規のタンパク質−タンパク質相互作用の同定を許容する結合標的と複合化した分子を含み得る。特にその方法が標識の程度を増加させるために繰り返される場合、本発明を用いて細胞又は他の粒子を標識することは種々の利点もある。本発明の更なる態様及び実施形態は本明細書に開示される。
抗体及び抗原からなる対により要約されるような、多数の種類の特異的に結合する対が知られている。他の特異的に結合する対は以下に短く議論され、本明細書に議論される本発明の種々の態様に等しく用いることができる。しかしながら、便利さのため、本明細書の議論のほとんどは、その選択が本発明の種々の実施形態の方法を行うのに要求される（第１の）特異的に結合する対（Sbp）メンバーの型としての“抗体”、特異的に結合する分子が選択されることが要求され得る関心の相補的（第２の）Sbpメンバーとしての“抗原”及び関心の相補的Sbpメンバーに結合することができることが知られている予め存在する結合性分子としての“マーカーリガンド”を言及する。一般に、そのマーカーリガンドは関心の相補的Sbpメンバー（例えば抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを含む。他書の適切なマーカーリガンドは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、神経ペプチドケモカイン、酵素基質及びいずれかの他の特異的に結合する分子を含む。また、標識又はリポーター分子、及び近接して他の分子へのその標識の結合を触媒する酵素も存在する。
このことを心に留めると、本発明は（特定の実施形態において）、マーカーリガンドの近くに結合する抗体の回収を導くために抗原のためのマーカーリガンドを用いて、例えば細胞表面上、他の固体支持体上又は溶液中の抗原に結合する抗体について選択するための手段を同定した本発明者らにより行われた。これは、リポーター分子の転移により所定のリガンド近くに結合する分子を標識し又は結合性分子を標識するための手段を提供する。所定のリガンドは抗原上の特定のエピトープを占有し、一般に、特定のエピトープ及びそれとオーバーラップするエピトープが他の抗体を結合することからブロックする。これにより、選択された抗体は、通常、マーカーリガンドエピトープに結合しないが、近接したエピトープに結合するものである。元来のマーカーリガンドとして同じエピトープに結合する抗体は、次の回における第２のマーカーリガンドとしてその方法の１回で得られる抗体を用いる反復方法により、又は以下に議論されるような適切な条件を用いることにより得ることができる。
その選択手順を再びくり返すことによりマーカーリガンドとして同じエピトープに結合する抗体を形成するためにシグナル転移選択を用いることができる。シグナル転移選択の最初の回から選択される抗体は、もとのマーカーリガンドの欠如下で行われる次の選択の回のための新しいマーカーリガンドとして用いることができる。これは、“ステップバック”選択と言及され得、もとのリガンド結合を阻害する抗体について選択するのに用いられ得る。ステップバック選択の第２の段階がマーカーリガンド−レセプター複合体に結合するもとのマーカーリガンド抗体の欠如下で行われ、レセプターのみで行われないなら、選択することができる。このような抗体はリガンドアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。もちろん、ステップバック選択は、抗体ライブラリーからの選択に限定する必要はない；この手順においてはいずれの特異的に結合するメンバーも用いることができる。
マーカーリガンドが結合するエピトープに最も近くエピトープに結合する抗体は、標識される可能性が最も高く、標識の可能性はマーカーリガンドエピトープから離れるほど少くなる。有利には、本発明は、このような標識された分子の精製を促進し得る。
ビオチンチラミンリポーター分子の転移は、以下の実験結果によれば約25nm以内でおこり得る。もとのマーカーリガンドの結合部位からの距離は、シグナル転移過程の反復により、又は誘導分子とそのシグナル転移を触媒する酵素との間のスペーサーの添加によりその誘導分子を適合させることにより増加させることができる。このようなスペーサーは化学的リンカー、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、堅いビーズ、ファージ分子、又は他の粒子であり得る。
このようなスペーサーは、いずれかの適切な要求される長さ、例えば約10〜20nm、約20〜40nm、約40〜60nm、約60〜100nm、約100nmもしくはそれ超、例えば約500nmもしくはそれ超から約１μｍもしくはそれ超までのものであり得る。
更に、バクテリオファージ又は他の生物粒子の表面上に提示される関心の抗原に特異的な結合性分子の標識及び次の精製（例えばWO92/01047を参照のこと）は、特異的に結合する分子をコードする核酸の回収を容易にする。いわゆる“ファージディスプレイ”において、結合性分子、例えば抗体又は抗体フラグメント、ペプチド又はポリペプチド、例えば酵素は、提示される分子をコードする核酸を含むウィルス粒子の表面上に提示される。要求される結合特異性を有する分子を提示する粒子の選択の後、その核酸は、その粒子から回収されて、後に必要に応じて用いられ得る特異的結合分子又はその誘導体を発現するのに用いられ得る。
繊維状バクテリオファージ上の提示のかわりに他の提示システムを用いることができる。このようなシステムは、全体のバクテリア細胞又は修飾したバクテリア表面構造（Osuna 5, Crit. Rev. Microbiol., 1994, 20：107〜116；Luら、BioTechnology, 1995, 13：366〜372）及び真核細胞ウィルス（Boublikら、BioTechnology，1995, 13：1079〜1084；Sugiyamaら、FEBS Fett, 1995, L359：247〜250）上の提示を含む。バクテリオファージディスプレイライブラリーは、遺伝子IIIタンパク質（例えばVaughanら、Nature Biotechnology, 1996, 14：309〜314）、主要遺伝子VIIIコードタンパク質（Clackson及びWells, Trends Biotechnol., 1994, 12：173〜184）、又は遺伝子VIタンパク質（Jespersら、Biotechnology, 1995, 13：378〜382）との融合タンパク質を用いて形成することができる。
ここに、例えば細胞の表面上で発現された、所定の標的抗原に特異的に結合する抗体は、その選択を導くために要求される抗原の存在するリガンドを用いて、大きな多様なファージディスプレイライブラリーから選択することができる。要求される抗原は、存在するリガンドによって触媒される反応における抗原の化学的修飾により細胞から精製することができることも証明される。周知のリガンドが存在するいずれかの抗原に対する抗体は、抗原のみよりむしろ抗原−リガンド複合体に特異的に結合する抗体も、この方法において得ることができる。更に、未知の分子（例えば抗原）に対する存在するリガンドは、その未知の分子に対する抗体の選択又はその未知の分子自体の精製を導くためにマーカーとして用いることができる。抗原の表面アクセス可能領域は、標識にアクセス可能な手段、例えばビオチン化により同定することができる。ビオチン化された分子は、例えばそれらが天然でペプチジルであるならタンパク質分解により、開裂することができ、そしてビオチン化された画分は、例えばサイズ分画に従って、検出され得る。更に、マーカーリガンドが結合する分子の近くにおける他の分子の標識は、これら他の分子が同定され及び／又は更なる研究のために精製されるのを許容する。それは、結合する標的が現れる特定の成分、例えば異なる細胞型の複合混合物の中からの特定の抗原を提示する１の細胞型が同定され及び／又は精製されるのも許容する。マーカーリガンドが結合する分子の近くにおこる標識の程度の決定は、例えば細胞表面上の、分子の複製数を決定するのに用いることができる。
本発明による分子の選択は細胞表面上の抗原に限られない。例えば、多重ドメイン又はサブユニットを有する複合タンパク質は固体支持体上にコートされ得、そして特定のドメイン又はサブユニットに特異的なリガンドは他の近くのドメイン又はサブユニットに対する抗体の選択を導くためにマーカーリガンドとして用いることができる。ドメイン又はサブユニットは、直接的又は間接的に酵素（例えばHRP）にコンジュケートされ得、そしてドメイン−ドメイン又はサブユニット−サブユニット相互作用は選択を導くために用いられ得る。これは、“ドメイン・ウォーキング”と呼ばれ得る。タンパク質上の特定のエピトープに特異的なマーカーリガンドも、マーカーリガンドエピトープの遠くからの選択を導くため、及び標識の半径（例えばビオチニル化について約25nm）内で他のエピトープに結合する結合性分子について選択するために用いることができる。これは“エピトープ・ウォーキング”と呼ばれ得、その例は実施例８に供される。もとのマーカーリガンドとして同じ又はオーバーラップするエピトープ特異性を有するSbpメンバーを形成する“ステップ・バック”選択が（他に議論されるように）行われ得る。
“シグナル転移選択”として知られ得る分子の選択についての本発明の技術は、抗体選択に限る必要はなく；（例えばファージ上に提示される）ペプチドライブラリーからの選択は、ただ抗体／エピトープばかりでなく、いずれかの結合ドメイン又はリガンド相互作用のタイプであり得る所定のタンパク質についての特異的に結合する特徴を有するペプチドを同定するのに用いることができる。実施例14は、溶液中の（HRPに接合した）抗体のエピトープマップへのペプチドライブラリーを用いてこれを示す。ライブラリー又は抗体以外のタンパク質の多様な集団は、ファージの表面上に提示され得、マーカーリガンドの近くのタンパク質に結合する新規なタンパク質の単離を許容し得る。
シグナル転移選択は、他の細胞のバックグラウンドからのその細胞型の精製を容易にするために特定の抗原を有する特定の細胞型を化学的に修飾するのにも用いることができる。未決定の抗原を認識するMab'sは同様の結合能力を有するヒト抗体の選択のターゲッティングに用いることができので、シグナル転移選択は、存在するモノクローナル抗体の人体適応化にも適用することができる。これは、HRPのような酵素に直接的又は間接的に接合され得る、マウスモノクローナル抗体のような非ヒト抗体の結合ドメインを含むマーカーリガンドに関連し得る。シグナル転移選択は、バクテリオファージもしくはレトロウィルスのような適切なウィルス又は予め存在する非ヒト抗体と同じ抗原に結合する他の生物粒子の表面上に提示されたヒト抗体ライブラリーから抗体を得るのに用いることができる。次にその過程を行うことにおけるマーカーリガンドとしてその過程を最初に行うことにおいて得られる抗体を用いる方法（“ステップバック”）を繰り返すことは、もとの非ヒト抗体と同じエピトープに結合するヒト抗体−ヒトに適応した抗体を得るのに用いることができる。抗体のようなこの結合分子が同じエピトープに結合する能力は、もちろん適切な競合アッセイを用いて測定することができる。
シグナル転移選択は、同じ標的分子上の隣接するエピトープに結合するこの抗体又は他の結合メンバーを形成するのに用いることができる。これは、より高いアフィニティー又は個々の抗体単独では示さない他の要求される生物学的特性（例えば中和能力）を有し得る（“ディアボディー（diabodies）”のような）二特異的抗体を形成する能力を供する。シグナル転移選択は、酵素活性部位に結合し、酵素インヒビター又はアクティベーターであり得る抗体の直接的選択に、酵素基質と共に用いることもできる。基質による酵素活性部位の直接的ビオチン化、触媒に重要なアミノ酸残基をマッピングするための道具を供し得る。
過酸化水素又は他のフリーラジカルの局所的供給は、マーカーリガンドを、フリーラジカル発生酵素を作り出す酵素、例えばHRP、例えばグルコースオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ又はアジドとカップリングすることにより行われ得る。これは、フリーラジカル発生酵素の近くでのラジカル化ビオチン−チラミン又は他の標識分子の局所的発生を可能にする。フリーラジカル発生酵素の活性形態は、酵素の２つのサブユニットと一緒にして活性酵素を作り出すこと又は酵素のアクティベーターをその酵素自体と一緒にすることのような結合の出来事に応じて形成され得る。これにより、ビオチン−チラミンのようなラジカル化標識分子は、特異的細胞型、タンパク質、又は他の特異的結合メンバー間であり得る結合する出来事に応じて形成され得る。
用  語
特異的結合メンバー
これは、互いについて結合特異性を有する一対の分子のメンバーを記載する。特異的に結合する対のメンバーは、天然に得られるか又は合成的に作られ得る。その分子の対の１つのメンバーはその表面上の領域、又はそれに特異的に結合する空洞を有し、それゆえその分子の対の他のメンバーの空間的及び極性的構成に相補的である。これにより、その対のメンバーは互いに特異的に結合する特性を有する。
特異的結合対の型の例は抗原−抗体、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質である。
抗  体
これは、天然の又は部分的もしくは全体的に合成で作られたいずれかのイムノグロブリンを記載する。この用語は、抗体結合ドメインである又はそれに相同である結合ドメインを有するいずれかのポリペプチド又はタンパク質も含む。これらは天然のソースから得ることができ、又はそれらは部分的もしくは全体的に合成で作ることができる。抗体の例は、イムノグロブリンイソタイプ及びそれらの同形サブクラス；抗原結合ドメインを含むフラグメント、例えばFab，scFv，Fv，dAb，Fdi及びディアボディーである。
モノクローナル及び他の抗体をとり、組換えDNA技術を用いてもとの抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作り出すことが可能である。このような技術は、抗体のイムノグロブリン可変領域又は相補性決定領域（CDR）をコードするDNAを、異なるイムノグロブリンの定常領域又は定常領域＋骨格領域に導入することに関連し得る。例えば、EP-A-184187, GB2188638A又はEP-A-239400を参照のこと。ハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞は、産生された抗体の結合特異性を変え得る又は変え得ない遺伝子変異又は他の変換に対する対象であり得る。
抗体はいくつかの方法によって修飾することができるので、用語“抗体”は、要求される特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの特異的結合メンバー又は物質を含むとして解釈されるべきである。これにより、この用語は、天然又は全体的もしくは部分的に合成であるイムノグロブリン結合ドメインを含むいずれかのポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能的等価物及び相同体を含む。それゆえ、他のポリペプチドに融合したイムノグロブリン結合ドメイン又は等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はEP-A-0120694及びEP-A-0125023に記載される。
完全な抗体のフラグメントは抗原に結合する機能を行うことができることが示されている。結合するフラグメントの例は、（ｉ）VL, VH, CL及びCH1ドメインからなるFabフラグメント；（ii）VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；（iii）単一抗体のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（iv）VHドメインからなるdAbフラグメント（Ward, E. S. ら、Nature 341, 544〜546（1989））；（ｖ）単離されたCDR領域；（vi）２つの連結したFabフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ab'）２フラグメント；（vii）VHドメインとVLドメインとがその２つのドメインが抗原結合部位を形成するために会合するのを許容するペプチドリンカーにより連結されている一本鎖Fv分子（scFv）（Birdら、Science, 242, 423〜426, 1988；Hustonら、PNAS VSA, 85, 5879〜5883, 1988）；（viii）二特異的一本鎖Fvダイマー（PCT/US92/09965）及び（ix）遺伝子融合により作製された多価又は多特異的フラグメントである“ディアボディー”（WO94/13804；P. Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444〜6448, 1993）である。
ディアボディは、ポリペプチドの多量体であり、その各々のポリペプチドはイムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン及びイムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、その２つのドメインは（例えばペプチドリンカーにより）連結しているが抗原結合部位を形成するために互いに会合することができない：抗原結合部位はその多量体内の他のポリペプチドの第２のドメインとの、その多量体内の１のポリペプチドの第１のドメインの会合により形成される。
抗原結合ドメイン
これは、それに特異的に結合する領域を含み、抗原の一部又は全部に相補的である抗体の部分を記載する。抗原が大きい場合、抗体は、その部分がエピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合し得る。抗体抗原結合ドメインは、１又は複数の抗体可変ドメインにより供される。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）を含む。
特異性
これは、特異的結合対の一員が、その特異的に結合するパートナー以外の分子といずれの大きな結合も示さないであろう状況をいう（例えば約1000×低いアフィニティー）。その用語は、例えば抗原結合ドメインが、いくつかの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用できる。この場合、その抗原結合ドメインを有する特異的結合メンバーは、そのエピトープを有する種々の抗原と結合できるであろう。
機能的に等価な変異形態
これは、他の分子（親）と構造的な差を有するが、特定の大きな相同性を保持し、そして親分子の生物学的機能の少くともいくつか、例えば特定の抗原又はエピトープに結合する能力も保持する分子（変異体）をいう。変異体は、フラグメント、誘導体又は突然変異体の形態であり得る。変異体、誘導体又は突然変異体は、１もしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入による親分子の修飾により、又は他の分子との結合により、得ることができる。これらの変換は、ヌクレオチド又はタンパク質レベルにおいて行うことができる例えばそのコードされたポリペプチドは、後に他のソースからのFc尾に連結されるFabフラグメントであり得る。あるいは、マーカー、例えば酵素、フルオレセイン等が連結され得る。
マーカーリガンド
これは、相補的なSbpメンバーに結合することができる特異的に結合する対の一員をいう。本発明の実施形態において、それは、その特異的に結合する対の相補的な他のメンバーに結合するその部位において及びその周囲における標識又はリポーター分子析出の触媒を導くのに用いられる。
本発明の第１の態様によれば、分子を標識する方法であって、
一般的な媒体中に、
標識分子；
特異的結合対（Sbp）の第２のメンバーに結合することができるリガンド（“第１のマーカーリガンド”）；
前記第２のSbpメンバー；
前記標識分子の他の分子への結合を触媒することができる酵素であって、前記第１のマーカーリガンドと会合する酵素
を供し、
前記第１のマーカーリガンドの前記第２のSbpメンバーへの結合を引きおこし又はそれを許容し、
前記第２のSbpメンバーに結合した前記第１のマーカーリガンドの近傍における前記標識分子の他の分子への結合を引きおこし又はそれを許容する
ことを含む方法を提供する。
特異的結合対の第１のメンバー、例えば抗体が含まれ得、又は第２のSbpメンバーに結合する１又は複数のものを含む前記第１のSbpメンバーの別種の集団も含まれ得る。標識分子が結合する分子は、前記第２のSbpメンバーに結合するSbpメンバー（“第１のSbpメンバー”）を含み得る。
標識分子が結合する分子は、更に後述されるように、前記第２のSbpメンバーの近傍において分子と結合するSbpメンバー（“第１のSbpメンバー”）を含み得る。
本発明の好ましい実施形態において、第１のSbpメンバーは抗体抗原結合ドメインを含むポリペプチドであり、そして第２の相補的Sbpメンバーは抗原である。マーカーリガンドは、抗体抗原結合ドメインを含むポリペプチド、例えばモノクローナル抗体又はクローン化されたscFv，Fabもしくは他の抗体フラグメントであり得る。
本発明の好ましい実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーが含まれ、そして標識分子の結合により標識される。これは、関心の物質、例えば抗原に結合することができる抗体のような標的分子の同定及び／又は単離を許容する（用語“標的分子”は、その同定が本発明を行う当業者の目的である分子をいう）。このような単離は、標識自体が特異的結合対のメンバーであるなら、容易化され得る。本明細書に例示される好ましい標識はアビジンに特異的に結合することができるビオチン、及びストレプトアビジンである。また、標識としての光活性化可能ストレプトアビジンの使用も例示される。
ビオチンようなSbpメンバー標識の標的Sbpメンバー（例えば抗体）への結合の後、その標識のその相補的Sbpメンバー（例えばビオチン標識の場合ストレプトアビジン）への特異的結合は、標的Sbpメンバーの単離に用いることができる。例えば、ストレプトアビジンでコードされた磁気ビーズが、ストレプトアビジン−ビオチン結合がおこるのを許容する媒体又は環境に添加され、次に磁石を用いて抽出される。次にビオチンで標識されたSbpメンバーがそのビーズから回収され得る。
他の適切な標識は、光反応性化合物、例えばＮ−〔Ｎ−４−アジド−テトラフルオロベンゾイル）−ビオシチニロキシ〕−スクシニミド、又はストレプトアビジンもしくはビオチンと組み合わせた光反応性架橋剤、例えばsulfor−SANPAHもしくはSAND（スルホスクシニミジル２−〔ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド〕−エチル−１，３−ジチオプロピオネート）を含む。便利には、ビオチン又は他の標識は、そのペプチド分子への共有結合が過酸化水素の存在下で水素ペルオキシダーゼにより形成される酵素フリーラジカルにより触媒される。ビオチン−チラミンのかわりに、本発明を行うことにおける標識は、フルオレセイン化酵素又は他のフリーラジカル試薬を含む修飾チラミンの他の形態、例えばｐ−ヒドロキシフェニルプロピオニル−ビオシチン及びビオチニル−クマリンガラクトースを用いることができる。（例えばビオチン−チラミンとしての）ビオチンのような標識は、例えば取扱いの容易さのため、光反応性標識より好まれ、そのことは、以下の実施例10が、その結合が光活性化される標識、即ちストレプトアビジンに結合したSANDを用いて本発明を行うことを示す。光活性化可能標識、例えばストレプトアビジン−SANDを用いる利点は、この標識が置かれるところにわたる距離である。ストレプトアビジンとSANDとの間のリンカーは1.8nmと極めて近くであり、その範囲内でストレプトアビジンは、ビオチン−チラミンで得ることができるビオチニル化の約25nmまでの半径と比べて最大約1.8nmまでである。
標識分子の他の分子への結合を触媒する酵素は、当該技術で利用できるいずれかの適切な手段によりマーカーリガンドと会合することができる。それは、例えばペプチド結合により（この場合、マーカーリガンド及び酵素を含む融合タンパク質はコード化核酸からの発現によって形成され得る）、もしくはマーカーリガンドと酵素との化学的コンジュゲーションにより直接的に、又は間接的にコンジュゲートされ得る。酵素とマーカーリガンドとの間接的コンジュゲーションは、便利には、マーカーリガンドと特異的結合対を形成する更なる結合分子を用いて行われ得る。例えば、マーカーリガンドはマウスモノクローナル抗体であり得、又はマウス抗体配列を含み得、そしてその酵素は抗マウス抗体又は抗体抗原結合ドメインとコンジュゲートされて（例えば融合タンパク質として）供され得る。それ自体関心の抗原に結合するマウスモノクローナル抗体に対する抗マウス抗体（第２のSbpメンバー）の結合は、その酵素が前記分子（例えば標的抗体）及び／又は抗原の標識形成を触媒することを許容する抗原（例えば標的抗体）に結合することができる媒体又は環境内の抗原及びいずれかの分子の極めて近くに、そのコンジュゲートした酵素を連れていく。標識された分子は、研究及び／又は使用のために同定され及び／又は単離され得る。
既に言及したように、反応の環境内に供された場合の第１のSbpメンバーは、異なる結合特異性を有するSbpメンバーの型の種々の集団の１つであり得る。抗体抗原結合ドメインの場合、これらは、関心の抗原で免疫化された又はされていない生物（好ましはヒト）からの再配列した又は再配列されていないイムノグロブリン配列のレパートリーからの発現によって供され得る。抗体抗原結合ドメイン（VH及び／又はVL）をコードする配列のレパートリーは、Ｖ，Ｊ及びＤ遺伝子セグメントの人工的再配置、試験管内もしくは生体内での突然変異、試験管内ポリヌクレオチド合成及び／又は当該技術で利用できるいずれかの他の適切な技術のいずれかによって付加的に又はかわりとして供され得る。示唆する文献は、Vaughanら（1996）Nature Biotechnology 14：309〜314；Griffithsら（1993）EMBO J. 12：725〜734がある。
便利には、結合する分子の種々の集団は、その各々の粒子がその表面上に提示されたその結合する分子をコードする核酸を含む生物学的粒子、例えばウィルス、例えばバクテリオファージの表面上に提示されて供される。W092/01047は、ポリペプチド及びペプチド結合分子、例えばscFv，Fab及びFvフラグメントを含む抗体分子並びにモノマー及びポリマーの両方の酵素の“ファージディスプレイ”についての詳細な種々の形態を開示する。関心の相補的なSbpメンバーに結合することができる標的Sbpメンバーを提示するファージのラベリング、及び議論されるような反応媒体又は環境からのこれらの単離の後、核酸はファージ粒子から回収され得る。この拡散は必要に応じて配列決定され得る。
例えばバクテリア細胞又はレトロウィルス上の他のディスプレイシステムが、既に言及されるように適用可能である。
その粒子から取った核酸又はその核酸配列は、適切な発現システム、例えば組換え宿主生物内でのフラグメント又はその誘導体の生産のために核を供するのに用いることができる。誘導体は、それからのアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入により又はそのコードされたポリペプチドへの他の分子の連結により得られる出発ポリペプチドから異なり得る。これらの変換は、ヌクレオチド又はタンパク質レベルで行われ得る。例えば、コードされるポリペプチドは、他のソースからのFc尾に後に連結されるFabフラグメントであり得る。あるいは、酵素、フルオレセイン等のようなマーカーは、例えばFab，scFvフラグメントに連結され得る。
種々の異なる宿主細胞内でのポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムは公知である。適切な宿主細胞はバクテリア、哺乳動物細胞、イースト及びバキュロウィルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のための当該技術で利用できる哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞等を含む。一般に、好ましいバクテリア宿主は大腸菌である。
適切なベクターを選択し又は作製することができ、これには、適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切なら他の配列を含む。ベクターは、適切なら、プラスミド、ウィルス、例えばファージ又はプラスミドであり得る。更に詳しくは、例えばMolecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition, Sambrookら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導入及び遺伝子発現における核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubelら、eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。Sambrookら及びAusubelらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
発現最終産物又はその誘導体、及び必要に応じて、治療もしくは予防薬剤又は診断製品として用いられ得る１又は複数の更なる構成物、例えば医薬として許容されるビヒクル、担体又は賦形剤を含む組成物を調製するために、発現最終産物を用いることができる。
本発明の特定の実施形態において、第２のSbpメンバー（マーカーリガンドが結合するもの、例えば抗体）が標識される。これは、その標的分子が周知のマーカーリガンド（例えば抗原／レセプターのためのモノクローナル抗体又は天然のリガンド）についての未知の抗原／レセプターである場合に有用である。この場合、第１のSbpメンバーは反応媒体又は環境から除かれ得る。第２のSbpメンバーのラベリングの後、それは本明細書に開示される手順に従って同定し、単離することができる。
本発明の更なる態様によれば、本発明による方法において供されるように、
前記特異的結合対のメンバー；
標識分子；
前記Sbpメンバーに結合することができるリガンド（“マーカーリガンド”）；
前記標識分子の他の分子への結合を触媒することができる酵素であって、前記マーカーリガンドに会合する酵素
を含む反応媒体又は環境を提供する。更なるSbpメンバー（“第１”で示される）が存在することができ、この場合、マーカーリガンドは相補的“第２の”Sbpメンバーと結合することができる。
本発明の更なる態様は、開示されるように同定され及び／又は単離されたレセプター又はリガンドを含む関心の相補的Sbpメンバーと結合する能力を有するものとして同定され、及び／又は本明細書に開示されるような方法を用いて単離されるSbpメンバー、並びにこのように同定され及び／又は単離されたSbpメンバー及びその同定及び／又は単離されたSbpメンバーをコードする核酸を含む組成物を提供する。
本発明は、概括的には、“マーカーリガンド”と呼ばれ得、そして特異的結合メンバーへのリポーター分子配置の触媒を導くのに用いられる存在する所定のリガンドの極めて近く（例えば約25nm未満、そしておそらく約20nm未満、約15nm未満、約10nm未満、約５〜10nm又は約５nm）で相補的Sbpメンバーに結合するその能力によって同定されるいずれかの特異的結合メンバーを提供する。
本発明は、レセプターの直接的ラベリング、又はレセプターに対する抗体の生産、その後の免疫精製のいずれかによる、ファージディスプレイされたSbpメンバー、例えば抗体、ペプチド又はタンパク質の選択、及び周知のリガンドを用いる未知のレセプターの選択もしくは同定のための本明細書に供される方法及び手段の使用も提供する。
本発明は、反復様式、即ち次のSbpメンバーについて選択するために１サイクルで選択された１又は複数のSbpメンバーを用いるシグナル転移選択の使用も提供する。これは、選択の第１の段階で用いられるもとのマーカーリガンドに対してアンタゴニスト又はアゴニストとして機能することができるSbpメンバーを選択するのに用いることができる。
細胞表面又は他のレセプターは、キャラクタライズされていないレセプター（例えば天然のレセプター）のためのリガンドを、標識分子の結合を触媒することができる酵素とコンジュゲートすることにより、本発明による方法において同定することができる。次に、例えばそれを発現する細胞上でのレセプターへのリガンドの結合が、例えばファージ上に提示されるSbpメンバー、例えば抗体、特にSbpメンバーのライブラリー、及び標識分子の存在又は欠如下で行うことができる。天然のリガンドは、シグナル分子を直接、未知のレセプターに転移させることができる。次に、標識されたレセプターは、例えば細胞抽出液から直接精製することができ、配列決定されたタンパク質であり得る。Sbpメンバー、例えばファージ上に提示された抗体のライブラリーの存在下において、シグナル転移は、レセプターに結合することができる標識されたSbpメンバーを作り出すだろう。次にこれらは、アフィニティー精製により、精製されたレセプターを作り出すのに用いることができる。
本発明は、リガンドの直接的ラベリング、又はリガンドに対する抗体の生産及び後の免疫精製のいずれかにより、周知のレセプターのための未知のリガンドを同定するための前記方法の使用も提供する。
更に本発明は、隣接したエピトープ、ドメイン又はサブユニットを認識する存在するリガンド又は抗体による、タンパク質又は複合体の所定のエピトープ、ドメイン又はサブユニットに対する抗体の選択を導くためのシグナル転移選択の使用である。規定されるがおそらく不要なタンパク質複合体のエピトープ、サブユニット又は領域に対するSbp's（例えばモノクローナル抗体）は、標識分子の他の分子への結合を触媒することができる酵素にコンジュゲートされ得る。次にこれらのコンジュゲートされたSbp'sは、同一でなくオーバーラップもないが同じ抗原に結合し、タンパク質の隣接サブユニット上又はタンパク質複合体の隣接領域上であり得る隣接するエピトープに結合する他のSbpメンバー、例えば（例えばファージ上の）抗体への標識のシグナル転移を行うのに用いることができる。
マーカーリガンドと同じエピトープに結合する抗体又は他の結合分子を得るためにシグナル転移選択を用いることができる。例えば、多量体タンパク質にサブ飽和量のマーカーリガンドを添加することができ、そして次にそのマーカーリガンドは、近接するサブユニット上のマーカーリガンドと同じエピトープ又はその多量体のコピーを認識する結合特異性の選択を行うことができる。そのマーカーリガンドは、そのマーカーリガンドが選択される種により標的タンパク質から競合されるのと同時に、ラベリングがおこるなら、同じエピトープに結合する結合株をラベリングすることができ得る。
その方法の他の適用は、特定の細胞構造又は細胞型に結合する抗体又は他のリガンドについて選択するものである。
本発明の更なる態様は、実施例16に記載される遺伝子クローニング研究から生ずる。コード化核酸、単離されたポリペプチド、該ポリペプチドのための特異的に結合する分子及び前記ポリペプチドと相互作用する他の分子、特にその機能を調節するもの、例えばCD４+細胞の表面上でCC−CKR5の近くにおいてCC−CKR5及び／又は他のポリペプチドとのその会合を妨害するもの、前記ポリペプチドと相互作用する他の分子並びにこれらの方法及び使用は全て本発明により供される。
本発明のこの態様による核酸は、図８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれから本質的になり得る。
そのコード化配列は、図８に示されるものであり得、又はそれはその示される配列の変異体、突然変異体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。その配列はその示される配列の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の、付加、挿入、欠失及び／又は置換である変換により、示されるものとは異なり得る。ヌクレオチド配列への変換は、遺伝コードにより決められるので、タンパク質レベルにおいてアミノ酸変換を生じてもそうでなくてもよい。
これにより、本発明による核酸は図８に示される配列と異なる配合列を含み得るが、なお同じアミノ酸配列のポリペプチドをコードし得る。そのポリペプチドは図８からの約60の隣接アミノ酸、好ましくは約70の隣接アミノ酸、より好ましくは約80の隣接アミノ酸の配列を含み得る。第２の読み枠からのアミノ酸配列が好ましい。終止コドンはこのフレーム内ではヌクレオチド251でおこり、従って好ましい実施形態において、そのポリペプチドは前記終止コドンまでの図８の第２の読み枠のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の隣接配列を含む、通常、示されるアミノ酸配列にはＮ末端に付加的アミノ酸が含まれる。
他方、そのコードされたポリペプチドは、図８に示される関連するアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含み得る。図８に示される配列のアミノ酸配列突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子であるポリペプチドをコードする核酸は本発明によって更に供される。
このようなポリペプチドをコードする核酸は、図８に示される関連するコード化／アミノ酸配列と約50％超の相同性、約60％超の相同性、約70％超の相同性、約80％超の相同性、約90％超の相同性又は約95％超の相同性を、ヌクレオチド配列及び／又はコードされたアミノ酸レベルで示し得る。
十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は一般に、アミノ酸類似性又は同一に関してである。類似性は“保存性変異”、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような１の疎水性残基の他のものからの置換、１の極性残基の他のものからの置換、例えばリシンからアルギニンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸、又はアスパラギンからグルタミンへの置換を許容する。類似性は、当該技術に普通に用いられるAltschulら（1990）（J. Mol. Biol. 215：403〜10）のTBLASTNプログラムにより規定され、決定される通りであり得る。相同性は、図８の関連するアミノ酸配列の全長にわたってであり得、又はより好ましくは、図８の関連するアミノ酸と比較して、約20，25，30，40，50，60，70，80又はそれ超のアミノ酸の隣接配列にわたってであり得る。
核酸レベルにおいては、相同性はその全長にわたって、又はより好ましくは約50，60，70，80，90，100，120，150，180，210，240又はそれ超のヌクレオチドの図８の配列内の隣接ヌクレオチドコード化配列との比較によってであり得る。
一般に、本発明による核酸は、単離され及び／又は精製された形態において、又は発現のための１もしくは複数の調節配列を除いて、天然に関連する材料のないもしくはそれが実質的にない、例えばヒトゲノム内の遺伝子に隣接する核酸のないもしくはそれが実質的にない単離物として供される。核酸は全体的又は部分的に合成され得、そしてゲノムDNA，cDNA又はRNAを含み得る。本発明による核酸がRNAを含む場合、示される配列への引用は、ＴのかわりにＵを置換した、RNA均等物を引用するものとして解釈されるべきである。
その遺伝子の全てもしくは一部をコードする核酸及び／又はその調節因子は、本明細書に含まれる情報及び引用物並びに当該技術で周知である技術（例えば、Sambrook, Fritsh and Maniatis,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及びAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992を参照のこと）を用いて当業者により直ちに調製することができる。
図８に供される配列情報は全長のヒトコード化配列のクローニングを可能にする、本発明は、関心の核酸を得る方法であって、図８に示される配列もしくは相補配列又はそれらいずれかのフラグメントを有するプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。ハイブリダイゼーションの後、一般に、成功したハイブリダイゼーションの同定、及び１又は複数のPCRのステップを含み得る。プローブにハイブリダイズした核酸の単離が行われる。本明細書に供される核酸配列は、当業者が全長の配列の増幅についてPCRプライマーをデザインするのを許容する。
本発明による核酸は、コドンの利用又は統計分析に基づいて、図８に示される核酸配列の１又は複数のフラグメント、特に比較的まれな配列のフラグメントとハイブリダイズするようデザインされた１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを用いて得ることができる。図８に示される核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするようデザインされたプライマーは、標的核酸がその中でクローン化されるクローニングベクター内の配列とハイブリダイズするようデザインされた１もしくは複数のオリゴヌクレオチドと連結して、又はライブラリー内のcDNAがオリゴヌクレオチドリンカーに連結され図８に示される配列とハイブリダイズするプライマー及びオリゴヌクレオチドリンカーとハイブリダイズするプライマーを用いてPCRが行われるいわゆる“RACE”（cDNA端の迅速な増幅）において用いることができる。
このようなオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、並びに全長の配列（並びに突然変異体、対立遺伝子、変異体及び誘導体）は、診断及び／又は予後の意味で、対立遺伝子、突然変異体及び変異体の存在について核酸を含むテストサンプルをスクリーニングするのにも役立つ。
１もしくは複数の細胞（例えばヒト）から単離され及び／又は精製された核酸、又は細胞から単離及び／又は精製された核酸由来の核酸ライブラリー（例えば細胞から単離されたmRNA由来のcDNAライブラリー）は、選択的ハイブリダイゼーションのための条件下でプローブされ得、及び／又は議論されるように、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）のような特異的核酸増幅反応にかけられ得る。
クローニングの文脈において、１又は複数の遺伝子フラグメントが連結されて全長のコード化配列を形成することが必要であり得る。また、全長のコード化核酸分子が得られた場合、完全な分子の一部を示すより小さな分子を、全長のクローンを得るために用いることができる。部分的なcDNAクローンから挿入物を調製することができ、cDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。単離された全長のクローンは、発現ベクター内にサブクローンすることができ、活性は、例えばリポータープラスミドと一緒の適切な宿主細胞内への移入によってアッセイすることができる。
当業者は、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成、並びに温度等のような要因を考慮して、選択的ハイブリダイゼーションのための要求されるストリンジェンシーの適切な条件を十分に用いることができる。
アミノ酸配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、遺伝コードの縮重を考慮してデザインされ得、候補の核酸からの生物のコドン利用が導かれる。核酸増幅に用いるためのオリゴヌクレオチドは長さが約10又はそれ未満のコドン（例えば６，７又は８）、即ち約30又はそれ未満のヌクレオチド（例えば18，21又は24）を有し得る。一般に特定のプライマーは長さが14ヌクレオチドより大きいが、18〜20以下である。当業者は、PCRのような使用過程のためのプライマーのデザインにおいて十分に精通している。ホスホトリエステル及びホスホジエステル合成法を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成するための種々の技術は当該技術で公知である。
本発明の更なる態様は、特に核酸を得る及び／又はスクリーニングする方法に用いるための、図８に示されるヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドフラグメント、又は相補配列を提供する。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、図８に示される配列又は１もしくは複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入もしくは欠失により、示される配列のいずれとも異なる配列であるが好ましくは図８に示される配列の核酸と選択的にハイブリダイズする、即ち所定の配列の１つとのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの相同性の程度が十分に高い能力を欠如しない配列を有する。
本発明による核酸は、遺伝子治療の方法、例えば病気を（全体的又は部分的に）防ぎ又は治癒する目的での個体の治療において用いることができる。これは、その病気の１又は複数の症状を容易にし得る。
本発明によるポリペプチドを生産する便利な方法は、発現システムにおけるそのポリペプチドをコードする核酸の使用により、その核酸を発現することである。
従って、本発明は、（開示されるような）ポリペプチドを作る方法であって、ポリペプチドをコードする核酸（一般に本発明による核酸）からの発現を含む方法も含む。これは、便利には、ポリペプチドの発現を引きおこし又はそれを許容する適切な条件下で、上述のベクターを含む宿主細胞を培養で増殖させることにより行うことができる。ポリペプチドは、試験管内システム、例えば網状赤血球のライゼートで発現させることもできる。
種々の異なる宿主細胞内でのポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムは公知である。適切な宿主細胞は、バクテリア、真核細胞、例えば哺乳動物及びイースト、並びにバキュロウィルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のための当該技術で利用できる哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎細胞、COS細胞及び多くの他のものを含む。一般的な好ましいバクテリア宿主は大腸菌である。
核酸は宿主細胞に導入することができ、これは次に、例えばコードされたポリペプチドが産生されるような遺伝子の発現のための条件下で、（おそらくその細胞は形質転換された細胞の子孫であろうが、実際に形質転換された細胞を含み得る）宿主細胞を培養することにより、その核酸からの発現を引きおこし又は許容する。適切なシグナルリーダーペプチドに連結したポリペプチドが発現されるなら、それは細胞から培養培地に分泌され得る。発現による生産の後、場合により、ポリペプチドは宿主細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製することができ、そして次に必要に応じて、例えば１又は複数の更なる構成物を含み得る組成物、例えば１又は複数の医薬として許容される賦形剤、ビヒクル又は担体（例えば以下を参照のこと）を含む医薬組成物の調剤に用いることができる。
当業者は、医薬品として用いるため、薬剤の開発のため、及び生体内での特性及び役割についての更なる研究のために、大量のポリペプチド、又はそのフラグメントもしくは活性な部分を生産するために、本明細書に記載される技術及び当該技術で公知である他のこと（例えば本明細書に記載されるSambrook及びAusubelの文献を参照のこと）を用いることができる。
これにより、本発明の更なる態様は、議論されるような図８に示されるアミノ酸配列を含み、天然に関係する材料がない又はそれが実質的にない単離され及び／又は精製された形態、例えばポリペプチド以外の文は（例えば原核細胞内での発現により産生されるなら）ネイティブのグリコシル化を欠く、例えばグリコシル化されていない他のポリペプチド又はヒトポリペプチドであり得るポリペプチドを提供する。
アミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体又は突然変異体であるポリペプチドも、議論されるように本発明により供される。好ましいこのようなポリペプチドは機能、即ち次の特徴：その配列が図８に示されるポリペプチドと反応する抗体との免疫学的な交差反応性；（例えば２つのポリペプチド間の免疫学的交差反応性により決定されるような）そのアミノ酸配列が図８に示されるポリペプチドとエピトープを共有することのうち１又は複数を有する。
本発明は、本発明のポリペプチドの活性部分、フラグメント、誘導体及び機能的擬態物も含む。そのポリペプチドのフラグメントは、少くとも約５〜７の隣接アミノ酸、しばしば少くとも約７〜９の隣接アミノ酸、典型的には少くとも約９〜13の隣接アミノ酸、そして最も好ましくは少くとも約20〜30又はそれ超の隣接アミノ酸のアミノ酸の範囲であり得る。ポリペプチド配列抗原決定基又はエピトープのフラグメントは、そのアミノ酸配列の一部分に対する抗体を生じさせるのに役立つ。
本発明によるポリペプチド、ペプチドフラグメント、対立遺伝子、突然変異体又は変異体は、特定の抗体を得ることにおけるファージ・ディスプレイ又は（例えば免疫化に関する）他の技術に用いることができる。抗体は、ポリペプチド及びペプチドの精製及び他の操作、診断的スクリーニング並びに治療の状況に役立つ。
本新規ポリペプチドの供給は、最初に、実施例16に記載されるような抗体CD4E1の同定及び単離を導くシグナル転移選択以外の手順により、それに特異的に結合することができる抗体の生産を可能にする。従って、本発明の更なる態様は、図８に供される配列を含むポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を提供する。
このような抗体は、例えばWO92/01047のようなファージディスプレイライブラリーを用いる、図８のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質の選択により、又は動物を免疫化してモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清を得るために上述のペプチド又はタンパク質を用いることにより、得ることができる。
例えばファージディスプレイにより同定された抗体は、次に、本明細書に開示されるようなシグナル転移選択の技術を用いて、図８のアミノ酸配列を含むタンパク質と複合化され得る更なるタンパク質、例えばレセプター分子を同定するのに用いることができる。
例えばファージ上に提示されたcDNA発現ライブラリーは、図８のアミノ酸配列を含むタンパク質の近くで、レセプターのような分子に結合するリガンドを同定するためのシグナル転移選択と合わせて用いることができる。抗体は、例えばmycタグと一緒に、CD４リンパ球の表面上のタンパク質に結合することができる。ファージ−ディスプレイされたcDNA発現ライブラリーを加えることができ、次にHRPに接合した（mycタグに結合する）抗体9E10を加えることができる。次に、ビオチン−チラミンの添加は、ファージ発現性レセプターリガンドを含む、抗体の近くでの分子のラベリングを導くであろう。抗体CD4E1がこれに適するだろう。
本発明のポリペプチド、抗体、ペプチド及び核酸は、組成物において調剤することができる。このような組成物は、上述の物質の１つに加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に公知である他の材料を含み得る。このような材料は非毒性であるべきであり、活性成分の効能を妨害しないべきであろう。担体又は他の材料の正確な性質は、投与の経路、例えば経口、静脈内、皮膚、皮下、鼻内、筋肉、腹腔内の経路に依存し得る。
本発明によるポリペプチドは、例えばCD４+細胞の表面上の、他の分子、例えばCC−CKR5又は他の分子と相互作用又は会合する能力を含むその活性又は機能に影響を与え又はそれを調節する分子をスクリーニングするのに用いることができる。このような分子は、（おそらく診断的なものを含む）治療的情況に役立ち得る。
ポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法は、１又は複数のテスト物質を、適切な反応媒体内でそのポリペプチドに接触させ、その処理されたポリペプチドの活性をテストし、そしてその活性を、テスト物質で処理されていない比較反応媒体中のポリペプチドの活性と比較することを含み得る。処理されたポリペプチドと未処理のものとの間の活性の差は、関連するテスト物質の効果を調節することを示す。
組み合わせライブラリー技術は、ポリペプチドの活性を調節する能力について潜在的に莫大な数の異なる物質をテストする有効な方法を供する。このようなライブラリー及びそれらの使用は当該技術で周知である。ペプチド又はタンパク質ライブラリーの使用が好ましい。
図８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と相互作用する分子を同定するためにシグナル転移選択を用いるかわりとして、テスト物質は、例えば（ポリペプチド及びテスト物質の両方が、例えばイースト又は哺乳動物細胞のような細胞中で、コード化核酸から発現され得ることを要求する）２−ハイブリッド（two−hybrid）システムにおいて、ポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングすることができる。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質をテストする前の粗いスクリーンとして用いることができる。そのスクリーンは、例えば抗腫瘍治療のために、ポリペプチドの擬態物を見つけ出すために、特異的に結合するパートナーに結合することについてテスト物質をスクリーニングするのに用いることができる。２−ハイブリッドスクリーンは、２つのポリペプチド又はペプチド間の相互作用を調節、例えば妨害することができる物質を同定するのに用いることができる。
２−ハイブリッドスクリーンアッセイはField及びSong（1989, Nature 340；245〜246）により記載される。この型のアッセイは、哺乳動物細胞とイーストとの両方に用いることができる。DNA結合ドメイン及び転写活性化ドメインの種々の組合せが、当該技術で利用でき、例えばLexA DNA結合ドメインとVP60転写活性化ドメイン、及びGAL4 DNA結合ドメインとGAL4転写活性化ドメインが利用できる。そのアッセイシステム内での発現のために、適切な融合構成物が作られる。２つの構成物間の相互作用を調節することができる物質をスクリーニングする場合、（例えば組み合わせたペプチドライブラリー中の）テスト物質は、第３の構成物から発現され得る。
ポリペプチド活性及び／又は他の分子と相互作用もしくは会合する能力を調節し又はそれに影響を及ぼす物質の同定の後、その物質は更に研究され得る。更に、それは、薬のような組成物、医薬組成物又は薬剤の調製、即ち製造又は調剤において製造され及び／又は用いられ得る。これらは個体に投与することができる。
それゆえ、本発明は、種々の態様において、本明細書に開示されるものに従う、ポリペプチド活性の調節物として核酸分子を用いて同定された物質のみに限られず、このような物質を含む医薬組成物、薬、薬剤又は他の組成物、例えば癌の（予防的治療を含み得る）治療のための、患者に前記組成物を投与することを含む方法、例えば癌の治療のための、投与するための組成物の製造における前記物質の使用、並びに医薬として許容され賦形剤、ビヒクル又は担体、及び任意的な他の成分と、前記物質を混合することを含む医薬組成物を作る方法にも広げられる。
本発明の更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は引用により組み込まれる。本発明が十分に理解され得るように、限定する目的でなく例示する目的のみで、以下の実施例を供する。以下の図面が引用される。
図１は、本発明の一実施形態による方法の概略図を示す。関心の抗原（CEA）に結合することができる標的抗体は、それが、酵素水素ペルオキシダーゼに結合したCEAに特異的なモノクローナル抗体を含むマーカーリガンドの結合の領域において抗原に結合するので、ビオチン化により標識される。過酸化水素の存在下において、水素ペルオキシダーゼは、標的抗体を含む酵素の近くにおける分子へのビオチン−チラミンの結合を触媒する。（CEA−癌胎児性抗原；HRP−水素ペルオキシダーゼ；BT−ビオチン−チラミン。）
図２は、ファージの端における金粒子の分布を示す実施例12に記載される実験において得られた結果を示す。異なる数のファージ当りのビーズについて、その頻度をプロットする。ファージ当りの粒子の平均数は6.6であり、その検出範囲は５nm〜25nmであった。球状タンパク質の直径は４nmである。
図３は、実施例13において実験的に例示されるような“ステップ−バック”選択スキームを示す。
図３（ａ）は、HRP−マーカーリガンドコンジュゲートがビオチンチラミン（BT）のシグナル転移をリガンド周囲に結合するファージ上に導く過程を示す。次に、ビオチン化したファージは図３（ｂ）に示すようにリガンドの欠如において細胞に結合することができる。
図３（ｂ）は、もとのマーカーリガンドの欠如下におけるビオチン化されたファージの結合を示す。ストレプトアビジン−HRPを加え、次にファージライブラリーの新しいアリコートを加え（黒で示される）、それは次に、シグナル転移によりビオチン化され、選択され得る。示される実施形態において、その選択されたファージ擬態物はリガンドに擬態し、その細胞への結合を阻害する。
図４は、実施例18に記載されるフローサイトメトリー実験の結果を示す。異なるビオチンチラミン濃度（μｇ／ml）を用いて得られたピーク位置（即ち達成された蛍光の基準）をプロットする。
図５は、実施例19に記載されるような、２つのフローサイトメトリーの読みから生ずる蛍光シフトを示す。その一方は１のビオチンチラミン処理にかけられたサンプルについてのものであり、他方は反復にかけられたサンプルについてのものである。見ることができるように、ビオチンチラミン処理の繰り返しは、細胞の平均蛍光レベルの2.5倍のシフトを引きおこす（FL1LOに対してプロットしたもの）。
図６は、実施例20に記載されるフローサイトメトリー実験の結果を示す（FL1LOGに対するもの）。
図６（ａ）は、抗CD36で標識された血液からの単核細胞での結果を示す。
図６（ｂ）は、最初にCD36抗体を加えなかった対照の豊富化についての結果を示す。
図６（ｃ）は、抗CD36で標識された豊富化細胞についての結果を示す。
図７は、実施例21に記載される実験の結果を示す。回収されたファージ（×105）を、ビオチン−チラミンの種々の濃度（μｇ／ml）についてプロットする。
図８は、実施例16に記載される研究において最初に同定されたラット遺伝子CL−６のヒト同族体についてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。EcoRＩクローニング部位に下線が引かれる。
本発明の１つの特定の実施形態のために、詳説の目的のため、その手順を以下に要約する。
典型的なシステムは酵素活性の部位周辺におけるビオチン化チラミン分子の多重複製物の析出を触媒するための固定化されたリポーター酵素の使用に基づく。触媒化酵素リポーター析出（deposition）（CARD）は、免疫細胞化学、ELISA及びブロティングにおけるシグナル増幅の手段として用いられる（Bobrowら（1992）J. Immunol. Method, 125：279〜285）。ここで、本発明は、リポーター分子の析出が増幅システムとしてだけでなく標識されたリガンドの回収を許容する転移システムとしても用いることができる。
本明細書に記載される例において、ビオチン化チラミン分子析出を触媒するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）活性が用いられる。HRP活性は、要求される結合特異性を有する第１マウスMabの使用により、例えば細胞表面上の関心の特定部位に標的づけられる。ここでHRP活性は第１Mabを認識する抗マウス−HRP接合第２抗体により供される。HRP活性は、かわりに、（例えば融合タンパク質としての発現による）Mab又は酵素に対するリガンドの直接のコンジュゲーションによって供され得る。抗体抗原結合ドメインを提示するファージは、第１Mabと一緒に細胞表面上でインキュベートされ、そして第１Mabの部位周辺、従ってHRP活性の部位周辺に結合するこれらは、ビオチンチラミン分子に共有結合することとなる。この反応は、H2O2の存在下でHRPにより作り出される酵素フリーラジカルによって触媒される。
次にビオチン化ファージはストレプトアビジンコートされた磁気ビーズを用いて特異的に回収することができ、従って存在するマウスMabのすぐ近くに結合するファージは豊富化される。ビオチン−チラミンフェノールフリーラジカルの半減期は極めて短く、従って析出は活性化する酵素の極めて近くでおこる（Bobrowら、前掲）。CARDが免疫細胞化学においてシグナルを増幅するために増幅システムとして用いられるなら、像分解能の検出できる損失が明らかでないことは、析出が触媒酵素との接近した会合においておこることを示す（Adams, J. C.（1992）J. Histochem. and Cytol 40：1457〜1463）。シグナル転移がおこる領域は、反応がおこる溶液の粘度もしくは温度を改良することにより、又は過剰な非ビオチン化チラミンを加えることによって増加させ又は減少させることができる。
シグナル転移選択はタンパク質−タンパク質相互作用の同定に一般に適用され、そして特定の場合、このような相互作用の検出のための極めて強力な技術であることが判明しているイースト２−ハイブリッドシステムに類似している（Fields and Song, 1989, Nature 340, 245〜246）。両方のシステムは、未知のタンパク質のライブラリーと対になることができる標識された周知のタンパク質に関連し、ここでその未知のタンパク質のいくつかは前掲標識されたタンパク質と相互作用することができる。２−ハイブリッドシステムにおける２つのタンパク質間の相互作用は、ガラクトース利用のための酵素をコードするイーストGAL1−lacZ遺伝子の転写的活性化を引きおこし、従って、ガラクトース含有媒体上の相互作用するクローンの選択を許容する。シグナル転移システムにおける２つのタンパク質の相互作用は、未知のタンパク質、例えばファージディスプレイされた抗体、ペプチド又は他のタンパク質をラベルし、従ってその成分を回収する。ファージディスプレイされた抗体、ペプチド又は他のタンパク質が標識された（例えばビオチン化された）要素であるなら、その相互作用するタンパク質のための遺伝子の救済は容易になる。なぜなら、ファージディスプレイにおいては、各々のファージ粒子は、それが提示する抗体、ペプチド又は他のタンパク質をコードする核酸を含むからである（例えばWO92/01047を参照のこと）。シクナル転移選択はイースト内での細胞内発現に限られるので、イースト２−ハイブリッドシステムより多くの利点を有する。
実施例15及び16は、新規のタンパク質−タンパク質相互作用を発見するための道具としていかにしてシグナル転移選択を用いることができるかを示す。同定され得るタンパク質−タンパク質相互作用の型の例は、シグナルトランスダクション経路において相互作用するタンパク質、例えばＧタンパク質、キナーゼ、ホスファターゼを含む。レセプターはしばしば、その相互作用する対がリガンド結合の存在下又は欠如下のいずれかで同定され得る多重タンパク質複合体として存在する。細胞内でおこるタンパク質−タンパク質相互作用は、溶液中の又は固体支持体上に固定化された、例えば細胞抽出液、裏返しシグナル、核抽出液及び他の細胞区画からの抽出液を用いて同定することもできる。本発明は、タンパク質−DNA相互作用の同定にも適用することができる。推定される転写因子結合ドメインを組み込むDNAのセグメントは（例えばビオチン化により）標識することができ、標識のための酵素関連結合分子（例えばストレプトアビジン）に結合させることができる。DNA配列に結合するタンパク質は、シグナル転移選択によって選択することができる。
当業者に明らかであろうシグナル転移選択の多くの適用がある。その適用には、抗体の選択を目的とするために酵素コンジュゲートリガンドを用いる、リガンド−レセプター複合体を特異的に認識する抗体の単離を含む。バックグラウンド細胞型上の細胞型の特異的ラベリングを行うことができる。例えば１の特定の表面抗原を発現する細胞は、その抗原を認識し、標識をそれら細胞のみに転移させることができる酵素コンジュゲートsbpメンバーを用いて標識することができる。これは、抗原を発現せず、それゆえ標識されない（又は大きくは標識されない）細胞のバックグラウンドからの抗原発現細胞の精製を許容する。これは実施例20に例示される。
シグナル転移ラベリングは細胞表面に限る必要はない。複合体混合物中のいずれのタンパク質、ウィルス粒子又は他の種も特異的に標識することができ、未標識の集団と離れて精製することができる。
シグナル転移は、実施例18及び19に議論され、示されるように、フローサイトメトリーにおけるシグナル増強に適用できる。シグナル増強プロフィールは、例えば細胞表面上の、特定の分子のために、例えば特定の細胞又は細胞型上の、前記分子の複製数を測定するために、又は例えば同細胞上の、２もしくはそれ超の異なる標的分子の近接を測定するために用いることができ、例えば細胞表面上の、特定のタンパク質の検出のためのよりセンシティブな方法を供し得る。
他の適用は、逆薬剤スクリーニングである。この方法においては、効能があることが知られているがその細胞標的が未知である薬剤を、標識析出を導く酵素にコンジュゲートさせることができる。次に、薬剤−酵素複合体は、細胞抽出液及び添加した標識分子とインキュベートすることができる。次に薬剤−酵素コンジュゲートに結合する細胞抽出液中のタンパク質は標識され、それらの精製及びキャラクタリゼーションを許容する。
シグナル転移選択メカニズムはフリーラジカルの発生に依存するので、その使用は、新しい又は増強された触媒活性を有するタンパク質を選択するために、タンパク質又は予想される酵素によるフリーラジカルの発生で行われ得る。タンパク質、酵素、又は予想される触媒抗体のファージライブラリーを作ることができ、そして選択は、標識（例えばビオチンチラミン）を活性化してファージ提示種上にそれを析出させるフリーラジカルを発生させる能力のため、活性種を標識（例えばビオチン化）することによって行うことができる。
シグナル転移技術は、例えば腫瘍ターゲッティングにおいて、いくつかの生体内適用も有する。腫瘍型を特異的に認識する抗体−HRPコンジュゲートは、生体内で腫瘍に局在化することを許容し得る。次にビオチンチラミン又は同様の分子が注入され得、そしてHRPは腫瘍部位における特異的なビオチンチラミンの析出を触媒し得る。これは、ストレプトアビジン−コンジュゲート薬剤、又は遺伝子療法もしくは薬剤デリバリーのためのベシクルとしてのストレプトアビジン−リポソームが標的づけされ得る多量にビオチン化された腫瘍を生じるだろう。
シグナル転移は、酵素活性の焦点周辺にビオチンチラミンを連続的に作り上げる再び繰り返すことができる過程である。これは、ビオチンチラミン又は類似する分子の連続層は損傷の部位に析出して、損傷した管をブロックすることができる複合体を形成することができるので、例えば小動脈又は神経修復の状況において、生体内の適用を有し得る。
本発明によるビオチン−チラミン及び他の標識析出の繰り返し能力は、配向した表面の形成に用いることができる。タンパク質又は他の種の連続層は、その表面上に析出され得る。初めのタンパク質又は他の種は表面上に固定化され得、そしてこの初めのタンパク質に特異的な結合する分子は酵素（例えばHRP）−接合し、その表面に結合するのを許容し、次に初めの表面上に、ビオチンチラミンの層を析出するのに用いられ得る。次に、第２の、例えばストレプトアビジン結合タンパク質、又は他の種がその表面に添加され得、第２のタンパク質の層を供する。この過程は、表面上に複合体方向に向いた層を作り上げることの要求に応じて再び繰り返すことができる。
本発明の能力を例示するために、ヒト癌胎児性抗原（CEA）のための遺伝子が移入されたHeLa細胞系を利用するモデルシステムを用いた。CEAを特異的に認識するscFvは、最初の実験のために用いられ、大きなscFvファージディスプレイライブラリーは、シグナル転移選択システムを用いて更なる抗CEA特異的scFv'sを作り出すのに用いた。
培養されたヒト内皮細胞上の特定の細胞表面タンパク質を選択するために更なる実験を行った。
実施例のリスト
実施例１−マーカー抗CEAマウス抗体の存在又は欠如下におけるCEAを発現する細胞の表面からのCEA結合ファージの回収。
実施例２−ヒトscFv'sの大きなライブラリーからのヒトCEA結合性ファージの選択。
実施例３−CEAに結合するscFvフラグメントについてのＫoff測定。
実施例４−ヒトscFv'sの大きなライブラリーからのマウス抗CEA抗体に結合するファージの選択。
実施例５−CEA発現性細胞型のマーカー−リガンド依存性ビオチン化。
実施例６−CEAのマーカー−リガンド依存性ビオチン化。
実施例７−ヒトscFv'sの大きなライブラリーからのヒトＥ−選択結合性ファージの選択。
実施例８−存在する抗TGFβ１−特異的scFvを用いる新規の抗TGFβ１−結合性ファージの選択。
実施例９−選択を導くケモカインリガンドを用いる抗ケモカインレセプターファージの選択。
実施例10−光活性化ストレプトアビジン及び誘導のためのレセプターリガンドを用いる抗ケモカインレセプターファージの選択。
実施例11−選択を導くために両方に結合するビオチン化リガンドを用いる２の異なる細胞表面接着分子に対するファージ抗体の選択。
実施例12−ビオチンチラミンを用いるシグナル転移がおこり得る距離の測定。
実施例13−リガンド結合を阻害するファージ抗体を単離するためのステップ−バック選択。
実施例14−ペプチドファージライブラリーを用いる溶液中のビオチンチラミン選択。
実施例15−ウエスタン・ブロッティング及びICCによる、CD４+細胞に結合するがケモカインレセプターCC−CKR5に結合しないクローンのキャラクタリゼーション。
実施例16−新規のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するためのシグナル転移選択の使用の記載。
実施例17−ビオチン化を行うためにMIP−１αを用いる細胞表面上のCD4E1ファージのビオチン化。
実施例18−フローサイトメトリーにおけるシグナル増幅試薬としてのビオチンチラミンの使用。
実施例19−更なるシグナル増強を供するためのビオチンチラミン処理の繰り返し。
実施例20−後の精製を許容するために細胞のサブ集団を特異的にビオチン化するためのビオチンチラミン使用。
実施例21−ビオチン−チラミン調製物を確認するための溶液中のファージ粒子のビオチン化。
実施例１−マーカー抗CEAマウスMABの存在下でCEAを発現する細胞の表面からのCEA結合性ファージの回収。
ａ．CEA結合性ファージの精製
CEA6は、ヒトCEAに作用する（panning）ことにより大きなscFvファージディスプレイライブラリーから単離されたCEA特異的scFvである（Vaughanら、1996）。OPIは16残基ペプチドを認識しCEAに結合しない対照scFvである。ファージｇIIIタンパク質と共に融合タンパク質としてCEA6又はOPI−scFv'sを発現するファージミド粒子を次の通り単離した。２ｌのコニカルフラスコ中の500mlの予め温められた（37℃）２YTAG（100μｇ／mlのアンピシリン及び２％グルコースが供された２TY培地）に、CEA6−又はOPI−ファージミドのグリセロール保存液（−70℃）からの約３×1010細胞を接種した。その培養物を、600nmのODが0.8に達するまで、十分なエレーションと共に37℃で増殖させた。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene）を、その培養物に、（１の600nmのODが培養物のml当り５×108細胞に等しいことを仮定して）約10の感染の多重度（moi）まで加えた。その培養物を、15分、37℃で静止してインキュベートし、次に同じ温度でかるいエレーション（200rpm）で、45分、インキュベートした。その培養物を遠心してその上清をその細胞ペレットから吸引した。その細胞を500mlの２TYAK（100μｇ／mlのアンピシリン及び50mg／mlのカナマイシンが供された２YT培地）中に再懸濁し、そしてその培養物を十分なエレーション（300rpm）で、30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、３つのポリエチレングリコール（PEG）沈殿により濃縮し（Sambrook, J., Fritsch, E. F., 及びManiatis, T.（1990）, MolecuIar Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York）, PBS中に、1012トランスデューシング単位（tu）／mlまで再懸濁した。
ｂ．Hela−CEA細胞スライドの調製
CEA発現性HeLa細胞を、16チャンバースライド（Nunc.）上で10％胎児ウシ血清が供されたDMEM中で集密的になるまで増殖させた。その細胞を10分間、アセトンで固定化し、乾燥させて−70℃で保存した。
ｃ．チラミンのビオチン化
等モル量のチラミン（Sigma）を50mlのホウ酸緩衝液、pH8.8中のNHS−LC−ビオチンと反応させた。その反応は、回転させながら、暗所で一晩、室温で行った。ビオチン化チラミン（BT）を0.45μＭフィルターを通してろ過し、分注して−70℃で保存した。
ｄ．Mabの近くに結合するファージのビオチン化
Hela−CEAスライドも、３％のマーベルPBS（MPBS）での１：100〜１：10000の希釈の範囲において、抗（EAマウスMab（Zymed）の存在又は欠如下で100μｌのファージと共に４℃で一晩、インキュベートした。ファージ入力値はCEA精製したファージについてml当り約５×1011であった。平行して、抗CEA Mabの存在下でOPIのファージ調製物を用いて、対照インキュベーションを行った。スライドのチャンバー当り100μｌのファージを用いた。スライドチャンバーを、0.1％Tween20を含むPBS（PBST）で３回、洗浄し、次にPBSで３回、洗浄した。各々の洗浄は交換する前、２分間、行った。次に100μｌのヤギ抗マウスHRP第２抗体（Pierce）を１：2500希釈のMPBS中に加え、室温で１時間、インキュベートした。PBSのみで同じ時間、インキュベートして対照インキュベーションを行った。先の通り洗浄を行い、0.03％のH2O2を含む50mM  Tris−HCl pH7.4中のBT100μｌを、室温で10分間にわたって、各々のスライドチャンバーに加えた。BTを除いては先の通りに、対照インキュベーションを行った。チャンバーを上述のように洗い、次にファージを200μｌのトリエチルアミン（TEA）を用いて溶出した。TEAを100μｌの１Ｍ  Tris−HCl，pH7.4で中和した。この溶出されたファージ10μｌを用いて大腸菌TGIの指数増殖中の培養物に直接、感染させた。感染した細胞を２YTブイヨン中で軽いエレーション下で37℃で１時間、増殖させ、次に２TYAG培地上にプレートした。一連のバクテリアの希釈液をプレートして30℃で一晩、インキュベートした。コロニー数はファージタイターを供した。結果を表１に示す。
ｅ．ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ上のビオチン化ファージの捕獲
20μｌのストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（Dynal）を、磁石を用いて溶液からとり、３％MPBSｌmlで、回転でラットホーム上で室温で２時間、ブロックした。ビーズを磁石を用いてペレット化し、次に30μｌの15％MPBSと共に150μｌの溶出されたファージを、そのブロックされたビーズに加え、室温で15分、回転させた。ビーズをペレット化し、PBSで３回そしてPBSで３回洗浄した。そのビーズを最終容量100μｌのPBS中に再懸濁した。これの半分をとって、大腸菌TGIの指数増殖中の培養物１mlに直接感染させるのに用いた。感染した細胞を２YTブイヨン中で、軽いエレーション下で37℃で１時間、増殖させ、次に２TYAG培地上にプレートした。一連のバクテリアの希釈物をプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。コロニー数はファージタイターを供した。結果を表１に示す。
２．結果の概要−シグナル転移選択の後、ストレプトアビジン捕獲を用いるCEA結合ファージの回収の増加
CEAが移入されたHeLa細胞でコートされたスライド上のCEA6精製されたファージのインキュベーションを、特定範囲の異なる条件下で行った。ファージ入力量、第１Mabの希釈、HRP接合第２抗体の存在又は欠如及びBTの存在又は欠如を全て検査した。16残基ペプチド上で選択された非CEA特異的ファージミドOPIも含まれていた。データを表１に示す。
第１Mab、抗マウスHRP接合第２抗体及びBT中でインキュベートされたCEA6ファージは、一貫して、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ上で回収された最も多い数のファージを供した。BTを除いた場合、回収されたファージの数は16倍低下し、そして第１Mabを除いた場合ファージの回収は８倍減少した。HRP接合Mabの欠如がファージ回収を６倍減らしたことは、CEA6ファージのビオチン化がMab−HRP複合体の存在により促進されるという結論を示唆する。これは、BTの欠如下ではファージのごく一部のみがDynalビーズに非特異的に結合することも示す。ファージの特定の非部位特異的ビオチン化は、BTは存在するが第１Mabは欠如するファージの回収が、BTを除いた時の回収より大きいことからおこるに違いない。
HRP−抗体コンジュゲートの欠如は、第１Mabの欠如と比較して、回収されたファージの数に同様の効果を有する。これは、第２Mabが第１Mabに特異的に結合し、それら自体が細胞に結合する少いバックグラウンドを供することを示唆する。非CEA特異的ファージは、第１抗CEA Mabの欠如下で見られるように、ビオチン−ファージ回収の同様のレベルを供し、これは再び、非部位特異的ファージビオチン化の低レベルを示唆する。
それら全ての結果は、関心のタンパク質に対して生じた存在するMabが、そのMabと同じ近隣において関心のタンパク質に結合するファージ上へのビオチン析出の触媒を誘導するのにいかにして用いることができるを典型的に証明する。
実施例２−ヒトscFv'sの大きなライブラリーからのCEA結合性ファージの選択
抗体レパートリー
以下の抗体レパートリーを用いた：
扁桃、骨髄及び末梢血液リンパ球を含むリンパ組織由来の大きな一本鎖Fvライブラリー。
“Quickprep mRNA Kit”（Pharmacia）を用いて、43の非免疫化ドナーの種々のリンパ組織のＢ−細胞から、ポリアデニル化RNAを調製した。合成の準備をするためにランダムヘキサマーを用いる“第１鎖cDNA合成”キット（Pharmacia）を用いて、mRNAから第１鎖cDNAを合成した。以前に記載（Marksら（1991）J. Mol. Biol. 222：581〜597）されるように、VH，Ｖκ及びＶλ遺伝子のためのファミリー特異的プライマーを用いて、Ｖ−遺伝子を増幅し、次に、PCRアセンブリーにより、（Gly4，Ser）3scFvリンカーと一緒に組み換えた。VH−リンカーVL抗体構成物を、ファージミドベクターpCANTAB6のSfiＩ及びNotＩ部位にクローン化した。連結、エレクトロポレーション及び細胞のプレートを、先に記載される通りであった（Markら、前掲）。用いたベクター及び挿入物の量を多くすることにより、並びに多重エレクトロポレーションを行うことにより、以前に記載されるより約1000倍大きいライブラリーを作った。これは、BstNＩフィンガープリンティングが極めて多様であることを示す約1.3×1010の個々の組換体を有すると計算された。
ａ．ファージ抗体ライブラリーの誘導
先のファージ抗体レパートリーを、CEAに対する抗体について選択した。その“大きな”レパートリーを、ファージミド粒子を救済するために以下のように処理した。500mlの予め温められた（37℃）２ｌコニカルフラスコ中の２TYAG（100μｇ／mlのアンピシリン及び２％グルコースが供された２YT培地）に、ライブラリーのグリセロールストック（−70℃）培養物からの約３×1010細胞を接種した。その培養物を、OD600nmが0.7（約２時間）に達するまで、十分なエレーション下で37℃で増殖させた。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene）を、約10の感染の多重度（moi）（１のOD600nmが培養物のml当り５×108細胞に等しいことを仮定する）で培養物に加えた。その培養物を15分間、37℃で静止状態でインキュベートした後、同じ温度で軽くエレーション（200rpm）して45分、インキュベートした。その培養物を遠心してその細胞ペレットから上清をとった。その細胞を500mlの２TYAK（100μｇ／mlのアンピシリン及び50μｇ／mlノカナマイシンが供された２YT培地）中に再懸濁し、そしてその培養物を十分なエレーション（300rpm）下で30℃で一晩、インキュベーションした。ファージ粒子を精製し、３のポリエチレングリコール（PEG）沈殿剤によって濃縮し（Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T.（1990）. Molecular Cloning - A Caboratory Manual. Cold Spring Harbour, New York）PBS中に1012トランスデューシング単位（tu）／ml（アンピシリン耐性クローン）に再懸濁した。
ｂ．触媒による酵素リポーター析出及びその後のストレプトアビジン捕獲を用いる大きな非免疫化ファージディスプレイファージからのCEA結合性ファージの選択
ｉ．第１回目の選択
大きな非免疫化ヒトscFvライブラリーから調製されたファージを用いる２回の選択を、CEA発現性HeLa細胞のスライド上で行った。５×1011のファージを、４℃で一晩、100μｌの全量中、MPBSの１：100の希釈下で、抗CEAマウスMab（Zymed）の存在又は欠如下で細胞に結合させた。そのスライドをPBSTで３回、次にPBSで３回、洗った。次に、第１マウス抗CEA抗体を認識する第２抗マウス水素ペルオキシダーゼ接合抗体を、１時間、室温で100μｌの全量でMPBSの１：2500の希釈でそのセクション上でインキュベートした。前に洗浄を行って、そして0.03％のH2O2を含む50mMのTris−HCl pH7.4中の100μｌのビオチン化チラミンを室温で10分間、各々のスライドチャンバーに加えた。上述のようにチャンバーを洗い、200μｌのトリエチルアミン（TEA）を用いてファージを溶出した。TEAを100μｌの１Ｍ  Tris−HCl，pH7.4で中和した。
ii．Hela−CEA細胞に結合するファージの総数の測定
この溶出されたファージ10mlを用いて、１時間、37℃で２YTブイヨン中で軽いエレーション下の大腸菌TGIの指数増殖中の培養物に直接感染させた感染したTGIsを243mm×243mm 皿（Nunc.）中の２TYAG培地上にプレートした。希釈した感染したTGIsもプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。コロニー数はファージ出力タイターを供した。
iii．ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ上のビオチン化されたファージの回収
20μｌのストレプトアビジンコートされた磁気ビース（Pyna）を磁石を用いて溶液からとり、１mlの３％MPBSで、回転プラットホーム上で室温で２時間、ブロックした。ビーズをペレット化し、次に30μｌの15％MPBSと共に溶出されたファージ150μｌをそのブロックしたビーズに加え、そして室温で15分、回転させた。ビーズをペレット化し、１ml PBSTで３回、１ml PBSで３回、洗った。そのビーズを最終容量100μｌのPBS中に再懸濁した。これを50μｌとり、２TYAG培地中軽いエレーション下で１時間、37℃で大腸菌TGIの指数増殖培養物１mlに直接、感染させるのに用いた。感染したTGIsを243mm×243mm 皿（Nunc.）中の２TYAG培地上にプレートした。バクテリアの希釈物もプレートして、一晩、30℃でインキュベートした。コロニー数はファージ出力タイターを供した。
iv．第２回目の選択
その243mm×243mmプレートからコロニーをはぎとり３mlの２TYAGブイヨンに入れ、−70℃での保存のため15％（ｖ／ｖ）グリセロールを加えた。HeLa−CEA細胞上のレパートリーの第１回目の選択からのグリセロール保存液を、第２回目の選択のためのファージミド粒子を得るためにヘルパーファージを用いて救済した。ファージミド粒子を、マーカー抗CEA Mabの存在又は欠如下で行った両方の第１回目の選択から救済した。250μｌのグリセロール保存液を、50mlの２TYAGでブイヨンに接種するのに用い、OD600nMが0.7に達するまで（約２時間）、十分なエレーション下で37℃で250mlのコニカルフラスコ中でインキュベートした。M13K07ヘルパーファージ（moi＝10）をその培養物に加え、次にそれを15分37℃で、次に同じ温度で軽いエレーション（200rpm）下で45分、静止してインキュベートした。その培養物を遠心し、その細胞ペレットから上清をとった。その細胞を50mlの予め温められた２YTAK中に再懸濁し、その培養物を十分なエレーション下で30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、PEG沈殿により濃縮し（Sambrookら、1990）、PBS中に1013tu１mlに再懸濁した。
抗CEAマウスMabの存在下での選択により回収されたファージを、Mabなしか、又は１：100もしくは１：1000希釈の抗CEA Mabでの第２回目の選択にかけた。抗CEA Mabの欠如下での第１回目の選択から回収されたファージを、再び抗CEA Mabの欠如下での第２回目の選択にかけた。第１回目の選択について記載されるように、HeLa−CEA細胞上で選択を行った。溶出液中に存在し、ストレプトアビジン捕獲によって回収されたファージの総数を表２に示す。
第１回目の選択の後に磁気ビーズ上で回収されたファージの総数は、Mabの存在又は欠如下のいずれかに相当する。２回目の選択において、回収されたファージの総数は１回目からの値の約10分の１に落ちた。しかしながら、Mabの存在下での２回目の選択の後に回収されたファージの数はMabが存在しない２回目の選択後に回収されたものより約７倍高いことは注目に値する。Mabの存在下での１回目の後にMabのない１回が行われた場合、回収されたファージの数は、Mabを含む２回の選択後に見られるものの約半分であった。２回目の選択におけるMabの10倍希釈は、Dynalビーズ上に回収されたファージの数を少しだけ減少させた（12％だけ）。
ｃ．イムノアッセイのための単一選択クローンの増殖
第１回目及び第２回目の選択からの個々のコロニーを、100μｌの２YTAGを96ウェル組織培養プレート（Corning）の個々のウェルに接種した。プレートを、適度な振とう（200rpm）と共に、30℃で一晩、インキュベートした。15％までのグリセロールを各々のウェルに加え、これらのマスタープレートを、分析直前まで−70℃で保存した。
ｄ．抗CEA scFvを同定するための可溶性ELISA
マスタープレートからの細胞を、ウェル当り100μｌの２YTAGを含む新鮮な96ウェル組織培養物プレートに接種するのに用いた。これらのプレートを８時間、30℃でインキュベートし、次に10分間、2000rpmで遠心してその上清を溶出した。各々の細胞ペレットを、10mM IPTGを含む100μｌ  2YTA中に再懸濁し、30℃で一晩、インキュベートした。
各々のプレートを2000rpmで遠心し、各々のウェルからの100μｌの上清を回収し、室温で１時間、20μｌの18％M6PBS中で静止してブロックした。その間に、dH2O中0.5μｇ／mlのCEA100μｌ又は100μｌのdH2Oのみのいずれかで37℃で静止して一晩、ブロックされたフレキシブルマイクロタイタープレートをPBS中で３回、洗浄し、３MPBS中で室温で２時間、静止状態でブロックした。次にこれらのプレートをPBSで３回、洗い、50μｌの予めブロックされた可溶性scFvを、CEAコートされたプレート又はコートされていないプレートの両方の各々のウェルに加えた。そのプレートを１時間、37℃で静止状態でインキュベートし、その後scFv溶液を注いで除いた。そのプレートを、PBST中で２分、３回、次にPBSで２分、３回、全て室温でインキュベートすることにより洗浄した。
CEAコートされたプレート及び末コートのプレートの両方の各々のウェルに、３MPBS中抗mycタグネズミ抗体9E10（Munro, S. & Pelham, H. R. B.（1986）Cell 46, 291〜300）の200倍希釈液中のalを100μｌ加え、そのプレートを１時間、静止して37℃でインキュベートした。各々のプレートを上述のように洗浄し、３MPBS中の5000倍希釈ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート（Pierce）中のal 100μｌを加え、１時間、37℃で静止してインキュベートした。プレートを上述のように洗い、次に0.9％NaClで２回、そそいだ。アルカリホスファターゼ活性を、色原性基質pNPP（Sigma）を用いて視覚化した。各々のクローンにより発生した吸光度シグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて405nm（pNPP）における光学密度を測定することにより評価した。CEAコートされたプレート上に発生したELISAシグナルがコートされていないプレート上の少くとも２倍のシグナルであったなら、更なる分析のためにクローンを選択した。各々の回の選択からスクリーニングされたクローンの数及びCEA陽性の数を表３に示す。
ｅ．抗CEA scFv抗体の配列決定
抗CEA抗体のヌクレオチド配列を、各々のクローンからの挿入されたDNAを増幅するために、ベクター特異的プライマーを最初に用いることにより決定した。２YTAG寒天プレート上の個々のコロニーからの細胞を、プライマーpUC19reverse及びfdtetseqを用いる挿入されたDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅のためのテンペレートとして用いた。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分、そして72℃で２分の30サイクル、その後の72℃で10分からなる。そのPCR生成物を、PCR Clean-up Kit（Promega）を用いて、50μｌのH2Oの最終容量に精製した。各々の挿入調製物２〜５μｌを、Taq Dye−ターミネーターサイクルシーケンシングシステム（Applied Biosystem）を用いる配列決定のためのテンプレートとして用いた。プライマーmycseq 10及びPCR−Ｌ−Linkを各々のクローンの軽鎖を配列決定するのに用い、そしてPCR−Ｈ−Link及びpUC19reverseを重鎖を配列決定するのに用いた。
ｆ．最初のCEA特異的scFv抗体の配列
20の異なるCEA特異的抗体を選択により単離した。各々のクローン名及びその重鎖及び軽鎖生殖細胞系統は以下に供する。選択のシグナル転移法は、抗CEA抗体の多様なパネルを形成することができる。大きなscFvライブラリーのパンニング（panning）が精製されたCEA上で直接、行われる実験からはこれらの抗体のいずれも単離されないことは、シグナル転移選択がライブラリーからの異なる抗体特異性を評価する方法を供することを示唆する。
0003923534.tif 000002
実施例３−アシアロCEAに結合するscFvフラグメントのためのＫOFF測定
ａ．表面プラスモン共鳴によるＫOFF測定
実施例２に記載されるscFvフラグメントのCEAに結合するためのＫoffを、CM５センサーチップに結合したアシアロCEAを用いて測定した。100μｇのCEAを0.1Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0中に再懸濁して、1.375mUのシアリダーゼ（Sigma）を用いて脱シアル化した。これを、時折、振とうしながら37℃で４時間、インキュベートした。次に脱シアル化したCEAを、10mMリン酸緩衝液pH7.0中CEA500μｇ当り１unitのガラクトースオキシダーゼを用いて酸化した。これを36℃で２時間、インキュベートし、そして10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0中に脱塩した。次にCEAをアルデヒド基を用いてセンサーチップ上に固定した。15μｌのEDC/NHSカップリング剤（Pierce）を５μｌ／分の流速でそのチップ上を通過させた。次に水中５mMのヒドラジン35μｌ、次に35μｌのエタノールアミンをそのチップ上に通過させた。60μｇ／mlの処理したCEA４μｌを２μｌ／分の流速で、次に0.1Ｍ酢酸緩衝液pH4.0中0.1Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウム40μｌを５μｌ／分の流速でそのチップ上を通過させた。CEA約1500RV（共鳴単位）をこの方法を用いて結合した。5000RV及び800RV CEAチップをこの手順を用いて作った。
Ｋoffを、Bia-Evalutionソフトウェアー（Pharmacia）を用いて計算した。Ｋoffを測定する前に、各々のサンプルについて精製されたscFvでのチップの飽和を確認した。結果を表４に示す。選択された抗体のＫoffの範囲は、回収が、古典的な選択方法の場合のように、相互作用のアフィニティーよりむしろファージ抗体の結合の正確な部位に依存することを示唆する。それゆえ、シグナル転移選択は、他の選択手順によっては通常得られないであろう多様な配列及びアフィニティーの抗体の集団を得るための経路である。
実施例４−ヒトscFv'sの大きなライブラリーからのマウス抗CEA抗体に結合するファージの選択
ここで用いた抗体レパートリー及びファージ導入の方法は、実施例２に記載されるのと同じであった。アッセイされた選択は実施例２に記載されるのと同じであった。
ａ．イムノアッセイのための単一の選択されたクローンの増殖
第１回目及び第２回目の選択からの個々のコロニーを、100μｌの２YTAGを96ウェル組織培養プレート（Corning）の個々のウェルに接種した。プレートを、適度な振とう（200rpm）と共に、30℃で一晩、インキュベートした。15％までのグリセロールを各々のウェルに加え、これらのマスタープレートを、分析直前まで−70℃で保存した。
ｂ．抗scFvを同定するための可溶性ELISA
マスタープレートからの細胞を、ウェル当り100μｌの２YTAGを含む新鮮な96ウェル組織培養物プレートに接種するのに用いた。これらのプレートを８時間、30℃でインキュベートし、次に10分間、2000rpmで遠心してその上清を溶出した。各々の細胞ペレットを、10mM IPTGを含む100μｌ  ２YTA中に再懸濁し、30℃で一晩、インキュベートした。
各々のプレートを2000rpmで遠心し、各々のウェルからの100μｌの上清を回収し、室温で１時間、20μｌの18％M6PBS中で静止してブロックした。その間に、PBS中0.1μｇ／mlの抗CEAマウスMab50μｌ又は50μｌのPBSのみのいずれかで37℃で静止して一晩、インキュベートされたフレキシブルマイクロタイタープレートをPBS中で３回、洗浄し、３MPBS中で室温で２時間、静止状態でブロックした。次にこれらのプレートをPBSで３回、洗い、50μｌの予めブロックされた可溶性scFvを、抗CEAマウスMabコートされたプレート又はコートされていないプレートの両方の各々のウェルに加えた。そのプレートを１時間、37℃で静止状態でインキュベートし、その後scFv溶液を注いで除いた。そのプレートを、PBST中で２分、３回、次にPBSで２分、３回、全て室温でインキュベートすることにより洗浄した。
マウスMabコートされたプレート及び末コートのプレートの両方の各々のウェルに、３MPBS中抗mycタグネズミ抗体9E10（Munro, S. & Pelham, H. R. B.（1986）Cell 46, 291〜300）の200倍希釈液中のalを100μｌ加え、そのプレートを１時間、静止して37℃でインキュベートした。各々のプレートを上述のように洗浄した。次にプレートをdH2O中１：1000に希釈したアルカリホスファターゼストレプトアビジン複合体（DAKO）と共にインキュベートした。プレートを上述のように洗い、次に0.9％NaClで２回、そそいだ。アルカリホスファターゼ活性を、色原性基質pNPP（Sigma）を用いて視覚化した。各々のクローンにより発生した吸光度シグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて405nm（pNPP）における光学密度を測定することにより評価した。CEAコートされたプレート上に発生したELISAシグナルがコートされていないプレート上の少くとも２倍のシグナルであったなら、抗CEAマウスMabのための陽性結合体についてクローンを評価した。
種々の回の２回の選択からのクローンを、抗CEAマウスMab結合についてスクリーニングした（表５）。２回の１：100Mab選択に通したクローンの12.5％がMabに結合することが見い出された。Mabが存在しない２回の選択を通した集団においてはMab結合体は存在しなかった。この回収されたファージのいくつかが抗CEAマウスMabを認識するという証明は、抗マウスHRP第２抗体のすぐ近くに結合するいずれかのファージの一般的ビオチン化についての証拠であり、従って、相互作用の部位特異的性質の証拠である。
実施例５−CEA発現性細胞型のマーカーリガンド依存性ビオチン化
ａ．スライド上で増殖したHeLa−CEA発現性細胞のビオチンチラミンによるビオチン化
室温で10分間、PBS中で再び水和した解凍したHeLa−CEAスライドを、５μｇ／mlにおいてPBS中のストレプトアビジンと共に15分、インキュベートした。スライドをPBSで４回、洗い、次に10μｇ／mlでPBS中で15分、インキュベートした。スライドをPBSで４回、洗浄し、次に30分、10％の通常のマウス血清を含む１％BSA PBSからなるブロック中でインキュベートした。ブロックを除き、次にそのスライドを、４℃で一晩、１％PBS−BSA中ml当り約１×1010の（実施例１に記載されるような）CEA6精製されたファージと共にインキュベートした。対照スライドを、CEAを認識しない精製されたフルオレセイン結合ファージと共に、同じ条件下でインキュベートした。スライドを室温にもどして、10分間、PBST中で洗った後、１時間、１％BSA−PBS中で３μｇ／mlに希釈した9E10−ビオチンとインキュベートした。PBSTで10分、洗い、次にそのスライドを、30分、PBS中で１：100に希釈したABC−HRP（DAKO）とインキュベートした。スライドをこの時点で展開するか又はPBSTで３回洗い、次に、いずれも、10分間、0.03％H2O2を含む50mM  Tris−HCl pH7.4中のビオチン化チラミンと共にインキュベートした。３回のPBST洗浄を行い、次にそのスライドを30分、ABC−HRP複合体と共に再びインキュベートした。カルバゾールを用いてスライドを展開した。カルボゾールは、25mlのDMF当り60mgの９−アミノ−エチル−カルボゾール（Sigma）を溶かし、次にこれを100μｌ，１mlの酢酸ナトリウムpH5.2に加えることにより新しく調製した。次に５μｌの30％H2O2を加え、この混合物100μｌを各々のスライドチャンバーに加えた。20分間、展開させて、次にカルバゾールをdH2Oで洗い落とした。
CEA6ファージとインキュベートしたがビオチン−チラミン増幅ステップを行わなかったスライドは、HeLa−CEA細胞表面からブレビング（blebbing）する領域内にかすかに赤い染色を示し、他方抗フルオレセインファージで処理したスライドはこのような染色を示さなかった。CEA6ファージとインキュベートし、次に１回のビオチンチラミン処理にかけたスライドがCEAの領域のかなり強い染色を示したことは、CEA6ファージ結合の領域中に存在するタンパク質がビオチン化され、より多くのABC−HRP複合体の補充のため色反応を増幅することができることを証明する。
実施例６−CEAのマーカーリガンド依存性ビオチン化
ｉ．CEAのビオチン化
チャンバーフラスコ内で増殖したHeLa−CEA発現性細胞を、室温で２時間、MPBS中でブロックした。次に100μｌの抗CEAマウスMabを室温で１時間、MPBS中１：100に希釈してスライド上でインキュベートした。抗CEA MabなしのMPBS中で対照インキュベーションを行った。スライドをPBSTで３回、次にPBSで３回、洗った。次に、MPBSでの１：2500の希釈で、100μｌのヤギ抗マウスHRP接合第２抗体（Pierce）を加え、室温で１時間、インキュベートした。先の通り洗浄を行い、0.03％H2O2を含む50mM  Tris−HCl pH7.4中のビオチン化チラミン100μｌを、室温で、10分間、各々のスライドチャンバーに加えた。次にそのスライドから細胞をはぎとった。細胞を５分、600rpmでペレット化し、次に塩類溶液中10mMのトリエタノールアミン、１％トリトン中に再懸濁した。細胞を氷上に10分間、放置し、次に細胞核を４℃で５分、ミニフュージ内で13000rpmペレット化した。上清を還元性タンパク質充填緩衝液に加え、10〜18％SDS勾配PHASTゲル上を走らせた。タンパク質を、30分、70℃のPHASTシステムプログラムを用いて、Hybond C eytra（Amersham）メンバーに移した。メンバーをMPBS中で２時間、ブロックし、ストレプトアビジン−HRP複合体又は抗CEAマウスMabのいずれかと共に室温で１時間、インキュベートした。抗CEA mabでプローブしたブロットをPBSTで３回、PBSで３回、洗浄し、次に室温で１時間、MPBSで１：2500に希釈した抗マウス−HRP接合抗体と共にインキュベートした。先の通りプロットを洗い、ECL（Amersham）検出キットを用いて展開した。
ストレプトアビジン−HRPコンジュゲートでプローブしたウエスタンブロットは、抗CEA、抗マウス−HRP、次にビオチン化チラミンで処理したHeLa−CEA細胞において１つの主要な高分子量バンドの存在を示した。このバンドは抗CEA Mabとの反応性を示した。そのバンドは、おそらくCEAの遅いマイグレーションを生ずるCEA上の多くの炭水化物基のため、CEAのために理論的に予想されるより高い分子量であった。２つの他のビオチン化した小さなバンドが、Mab又はコンジュゲートしたMabのための予想される大きさの周辺で検出することができた。これらのバンドは潜在的に、抗CEA Mab及び抗マウスHRPコンジュゲートのビオチン化形態であり得た。そのブロットにおいて他の明らかなバンドは見ることができなかったが、抗体とBTとの両方で処理したHeLa−CEA細胞に相当するレーンにおけるECL（Amersham）フィルムへのブロットの長い露出（20分）の後の高分子量スミヤーの存在により、いくらかのより明確でないビオチン化が示され得た。BT又は抗CEA Mabでの細胞の処理を除いた対照レーンは、ビオチン化の証拠は示さなかった。これは、マーカーリガンドに近接して結合するタンパク質を選択的“タグ”してそれらの検出を許容し、それらの精製を容易にするビオチンチラミンの能力を証明する。
実施例７−大きなscFvライブラリーからのヒト抗−Ｅ−セレクチン−結合性ファージの選択
ａ．ポリクローナル抗ＥセレクチンIgGのHRPへのコンジュゲーション
ポリクローナル抗ヒト−Ｅ−セレクチンIgGを、Ｒ及びＤシステムから得た。Pierceにより供される水素ペルオキシダーゼコンジュゲーションキットを用いてコンジュゲーションを行った。１mgのマレイミド活性化HRPをSATAプロトコル（Pierce）を用いて100μｇのMabにコンジュゲートした。DMF中に作った４mg／ml SATA溶液20μｌをPBS中のポリクローナルIgG  100μｌに加えた。これを室温で30分、インキュベートし、次に100μｌの脱アセチル化溶液（Pierce）を加え、そして室温で更に２時間、インキュベーションを続けた。マレイミドコンジュゲーション緩衝液で予め平衡化した５mlのセファロース25カラム上で、脱アセチル化IgGを未反応の脱アセチル化SATAから分離した。0.5mlの画分を収集してタンパク質の主要部を画分２及び３に収集した。次に１mlの脱アセチル化IgGを１mgのマレイミド活性化HRPに加え、室温で１時間、インキュベートした。
ｂ．細胞培養物
ヒト脈管内皮細胞（HUVECs）（Clonetics）を、１％ゼラチンがコートされた24ウェルプレート（Nunc）上で継代３まで培養した。その細胞を、EGM培地（Clonetics）を用いて約80％コンフルエンスまで増殖させた。HUVEC細胞は、低い基底レベルの接着タンパク質Ｅ−セレクチンを発現する。
ｃ．選択手順
細胞をPBSで洗い、そして次にその細胞を、大きな非免疫化ヒトscFvライブラリーから調製した１×1012ファージの存在下で200μｌのPBS／１％BSA中で４℃で一晩、インキュベートした。１つの培養ウェルに、１：20希釈のHRP−コンジュゲートポリクローナル抗−ＥセレクチンIgGもファージに加えた。細胞を0.5ml PBSTで３回、PBSで３回、洗った。（実施例２パートｂｉ）のような）200μｌのビオチンチラミン混合物を各々のウェルに加え、室温で10分、放置した。先のように細胞を洗い、次に室温で10分、200mlのトリエチルアミン（TEA）中にファージを溶出した。次にTEAを100μｌのｌＭ Tris HCl pH7.4で中和した。
ｄ．ビオチン化ファージの回収
20μｌのストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（Dynal）を、磁石を用いて溶液から取り、１mlの３％MPBSで回転プラットホーム上で室温で２時間、ブロックした。ビーズをペレット化し、15％MPBS60μｌと共に、溶出したファージ300μｌをブロックされたビーズに加え、室温で15分、回転させた。ビーズをペレット化し、１mlのPBSTで３回、１mlのPBSで３回、洗った。そのビーズを最終容量100μｌのPBS中に再懸濁した。これを50μｌとり、２TYAG培地中で軽いエレーション下で１時間、37℃で、大腸菌TGIの指数増殖培養物５mlに直接感染させるのに用いた。感染したTGIsを243mm×243mm 皿（Nunc）中の２TYAG培地上にプレートした。バクテリアの希釈物もプレートし、30℃で一晩、インキュベートした。コロニー数はファージ出力タイターを供した。
選択のための出力タイター：
0003923534.tif 000003
HRP−コンジュゲートポリクローナル抗−Ｅ−セレクチンIgGの存在下でビーズ上に捕獲されたビオチン化ファージの割合は抗体の欠如下で捕獲されたその割合より約30倍高い。これは、HRP−抗−Ｅ−セレクチンポリクローナルIgGがＥ−セレクチン−特異的ファージのビオチン化を目標にすることを指唆する。
ｅ．抗−Ｅ−セレクチンscFvを同定するための可溶性ELISAのための単一選択されたクローンの増殖
単一コロニーを、実施例２パートｃに記載されるように正確に増殖させ、プレートを１μｇ／mlの組換えＥセレクチンでコートした以外はパートｄと同様に、ELISAを行った（Ｒ及びＤシステム）。
各々の回の選択からスクリーニングされた陽性の数及びＥ−セレクチン陽性クローンの数を以下に示す。
0003923534.tif 000004
ELISAの結果は、この抗体を除いた時の選択と比較した、ポリクローナル抗−ＥセレクチンHRPコンジュゲートの存在下でのそれについて選択されるＥ−セレクチン結合体の数の増加を証明する。これは、抗体−HRPコンジュゲートがその近くでのファージ結合の特異的ビオチン化の原因であることを証明する。
実施例８−存在する抗−TGFβ１−特異的scFvを用いる新規TGFβ１−結合ファージの選択
31G9は、固定化されたTGFβ１上のライブラリーの直接の選択により、大きなヒト非免疫化scFvファージディスプレイライブラリーから以前に単離された高アフィニティー（1.2×10-9Ｍ）抗−TGFβ１−特異的scFvである。その抗体はTGFβ１の中和性エピトープを認識しない。31G9のHRP−コンジュゲートが、TGFβ１の異なる潜在的に中和性のエピトープを認識するファージ抗体の新しい血統を単離するためにシグナル転移選択に用いることができるか否かを評価するために研究を行った。
ａ．HRPへの31G9 scFvのコンジュゲーション精製されたscFv 300μｇをコンジュゲーション反応に用いたことを除いて、実施例７に記載されるように31G9をマレイミド活性化HRPにコンジュゲートした。
ｂ．低密度TGFβ１Bia Coreチップの調製
50μｌのNHS/EDC調薬（Pharmacia）を、CM５チップの表面上で室温で30分、インキュベートした。HBSで５回、洗い、次に10mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH3.6の75μｌ中の75mgのTGFβ１を室温で１時間、チップ上でインキュベートした。そのチップをHBSで５回、洗い、次に10分、１ＭエタノールアミンpH８で処理した。そのチップをHBS中で４℃で保存した。TGFβ１の約40共鳴単位（RVs）をチップに結合させた。
ｃ．選択手順
ｉ）第１回目の選択
100μｌのHRP−コンジュゲート31G9（約30μｇ）を室温で１時間、TGFβ１結合Bia Coreチップ上でインキュベートした。そのチップをPBSTで３回、PBSで３回、洗い、そして次に、ヒト非免疫化ライブラリーから調製した１×1012ファージを、室温で１時間、チップ表面上でインキュベートした。そのチップを先のように洗浄し、100μｌの（実施例２パートｂｉに記載されるような）ビオチンチラミン混合物を室温で10分、チップ上でインキュベートした。そのチップを先の通り洗い、200μｌのトリエチルアミンTEAを用いてそのチップからファージを溶出した。そのTEAを100μｌの１ＭTris−HCl，pH7.4で中和した。
ii）ビオチン化ファージの回収
20μｌのストレプトアビジンコートした磁気ビーズ（Dynal）を磁石を用いて溶液からとり、１mlの３％MPBSで回転プラットホーム上で室温で２時間、ブロックした。ビーズをペレット化し、そして60μｌの15％MPBSと共に、300μｌの溶出したファージをブロックしたビーズに加え、室温で15分、回転させた。ビーズをペレット化し、１mlのPBSTで３回、１mlのPBSで３回、洗った。ビーズを最終容量100μｌのPBS中に再懸濁する。これを50μｌとり、２TYAG培地中で軽いエレーション下で１時間、37℃で大腸菌TGIの指数増殖培養物５mlに直接感染させるのに用いた。感染したTGIsを243mm×243mm 皿（Nunc）中の２TYAG培地上にプレートした。バクテリアの希釈物もプレートして30℃で一晩、インキュベートした。コロニー数はファージ出力タイターを供した。
iii）第２回目の選択
コロニーを243mm×243mmプレートから３mlの２TYブイヨンにはがしとり、−70℃での保存のため15％（ｖ／ｖ）グリセロールを加えた。TGFβ−Bia Coreチップ上のレパートリーの第１回目の選択からのグリセロール保存液を、第２回目の選択のためのファージミド粒子を得るためのヘルパーファージを用いて救済した。250μｌのグリセロール保存液を50mlの２YTAGブイヨンに接種するのに用い、OD600nMが0.7（約２時間）に達するまで、十分なエレーション下で37℃で250mlコニカルフラスコ内でインキュベートした。M13K07ヘルパーファージ（moi＝10）を培養物に加え、次にそれを37℃で15分、次に同じ温度で軽いエレーション（200rpm）下で45分、静止状態でインキュベートした。その培養物を遠心し、その上清を細胞ペレットから取る。その細胞を50mlの予め温めた２YTAK中に再び懸濁し、そしてその培養物を十分なエレーション下で30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、PEG沈殿（Sambrookら、1990）により濃縮し、PBSで1013tu１mlに再懸濁した。
第２回目の選択及びTGFβ１−Bia Coreチップ上のビオチン化ファージの捕獲を、第１回目と全く同じに行った。ファージ出力タイターを次に示す。
0003923534.tif 000005
ｄ．抗TGFβ１scFVを同定するための可溶性ELISAのための単一選択クローンの増殖
単一コロニーを実施例２パートｃに記載されるのと全く同様に増殖させ、プレートを0.2μｇ／mlの組換えTGFβ１でコートした以外はパートｄと同様にELISAを行った（Ｒ及びＤシステム）。第２回目の選択からの192のコロニーをELISAによりスクリーニングし、その26がTGFβ１陽性である（13.5％）ことが見い出された。
ｅ．抗−TGFβ１scFv抗体のスクリーニング
抗TGFβ１抗体のヌクレオチド配列を、最初に、各々のクローンからの挿入されたDNAを増幅するためにべクター特異的プライマーを用いることにより決定した。２YTAG寒天プレート上の個々のコロニーからの細胞を、プライマーpUC19reverse及びfdtetseqを用いる挿入されたDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅のためのテンプレートとして用いた。増幅条件は、94℃で１分、55℃で１分、そして72℃で２分の30サイクル、及びその後の72℃で10分からなる。そのPCR生成物を、50μｌのH2Oの最終容量においてPCR Clean−up Kit（Promega）を用いて精製した。２〜５μｌの各々の挿入調製物を、Taq Dye−ターミネーターサイクル配列決定システム（Applied Biosystems）を用いて配列決定するためのテンプレートとして用いた。プライマーmycseq 10及びPCR−Ｌ−Linkを用いて各々のクローンの軽鎖を配列決定し、そしてPCR−Ｈ−Link及びpUC19reverseを用いて重鎖を配列決定した。
配列決定は、全部で６の異なる抗−TGFβ１抗体が部位特異的ビオチン化を目標となるための31G9−HRPコンジュゲートを用いるシグナル転移選択法により単離されたことを示した。これらの６の抗体は以下に示す通り、31G9のそれから異なるVH生殖細胞系のものであった。
0003923534.tif 000006
選択された全てのクローンは、種々のVL遺伝子セグメントと対になった同じVH３ DP53生殖細胞系を有していた。ST６とST10とは同じVL生殖細胞系であるが、VL CDR２における１つのアミノ酸残基において互いに異なる。ST14とST21も同じVL生殖細胞系を有するが、VL CPR３における１つのアミノ酸残基において互いに異なる。31G9と同じVHを有する選択されたクローンはなかった。クローンST19は、VL FR２における１つのアミノ酸変換で、31G9と同じ生殖細胞系VLを有していた。
これら全ては、不要な抗原性エピトープをはずして選択し、変化した特異性を有し得るファージ抗体の新しい系統を形成するシグナル転移選択技術の能力を証明する。
実施例９−選択を導くためのケモカインリガンドを用いる抗ケモカインレセプターの選択
ケモカインレセプターCC−CKR5はCD４+リンパ球上で発現されるマクロファージ刺激性HIV−１株のためのコレセプター（co-receptor）である。cc−CKR−５は、マクロファージ炎症タンパク質（MIP）−１αを含むいくつかのケモカインに応答する。MIP−１αは、CC−CKR1及びCC−CKR4を含む他のケモカインレセプターにも結合する。MIP−１αは、ファージ抗体又はCC−CKR5レセプターに結合する他のファージディスプレイされたタンパク質のシグナル転移選択を導くのに用いることができる。
ａ．血液からのヒトCD４+細胞の調製
Ficoll−Paque（Pharmacia）密度勾配遠心（20℃で20分、600ｇ）を用いて、50mlのバッフィーコートから単核細胞を調製した。次にPBS／２％胎児ウシ血清（FCS）を全体を通して用いたが、製造元の説明に従って、Biotex CD４カラムを用いて、1.5×108の回収された細胞からCD４+細胞を単離した。溶出された細胞を５分間、ペレット化し、300μｌのPBS／２％FCS中に再懸濁した。この手順を用いて8.3×106細胞を回収した。その回収した細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、約59％の細胞がCD４+であることが見い出された。
ｂ．選択手順及びビオチン化ファージの捕獲
１×105のCD４+リンパ球を、最終濃度375nMにおいて、ビオチン化MIP−１α（Ｒ及びＤシステム）の存在又は欠如下のいずれかにおいて、1.4×1010scFvファージディスプレイライブラリーから調製した２×1012のファージと共にインキュベートした。各々の選択についての最終容量は２％のマーベルを含むPBS（MPBS）で40μｌに作った。その選択物を４℃で14時間、インキュベートした。細胞を600ｇで３分の遠心によりペレット化し、１mlのMPBSで洗った。全部で３回の洗浄を行った。100μｌのストレプトアビジン−HRPを、MPBSでの１：1000の希釈において加えた。これを２時間、インキュベートし、次に上述のように洗浄した。次に（実施例２、パートｂｉのように）ビオチンチラミンを３％H2O2を含む100μｌの150mM NaCl/50mM Tris HCl pH7.4中に加え、室温で10分、インキュベートした。細胞を洗って0.5％トリトンを含む100μｌTE中に再び懸濁した。ビオチン化ファージを10μｌのMPBS−ブロック化ストレプトアビジン−コート磁気ビーズ（Dynal）上に捕獲させた。そのビーズを１ml PBS/0.1％ Tween 20（PBST）で３回、洗い、次に100μｌのPBSに再び懸濁した。ストレプトアビジン捕獲前及び後のファージ溶出液を、１時間、37℃での大腸菌TGIの指数増殖培養物の感染により滴定した。種々の選択手順から回収されたファージの数を以下に示す。
順に、選択番号、Bio−MIP−１α Bio−チラミン、溶出したStrep−HRP、総数、捕獲されたファージ数、捕獲されたファージ割合（％）
0003923534.tif 000007
ビオチン化ファージの最も大きな回収は、ビオチン化MIP−１α及びビオチンチラミンの両方とインキュベートされたCD４+リンパ球から観察された。ビオチン化リガンド又はビオチンチラミンのいずれかの除去は、溶出液から回収されたファージの割合を約５〜６倍低下させた。これらの結果は、ビオチン化MIP−１αはファージライブラリーの存在下でCD４+細胞に結合することができ、HRP及び過酸化水素の存在下でその周囲に結合するファージのビオチン化を導くことができることを示唆する。
ｃ．CD４+細胞結合体、CC−CKR5移入細胞結合体及びCC−CKR5アミノ末端ペプチド結合体を同定するためのファージELISA
選択されたファージを、CD４+リンパ球、CC−CKR5移入された細胞系（M. Parmentier及びG. Vassart, University of Brusselsにより供されたもの）及びCC−CKR5レセプターのアミノ末端20アミノ酸（MDYQVSSPIYDINYYTSEPC）に相当するBSAコンジュゲートペプチドを認識するそれらの能力についてファージELISAによって分析した。ファージELISAは次の通り行った：個々のクローンを、100μｌの２YTAGを含む96ウェル組織培養プレートにとった。プレートを37℃で６時間、インキュベートした。M13K07ヘルパーファージを各々のウェルに10のmoiで加え、37℃で45分、静かに振とうしながらインキュベートした。そのプレートを10分、2000rpmで遠心し、上清を除いた。細胞ペレットをカナマイシン（50μｇ（ml）を含む100μｌの２TYA中に再懸濁し、30℃で一晩、インキュベートした。次に、9E10のところにヤギ抗Ｍ13抗体を１：2500の希釈で用い、次に抗ヤギアルカリホスファターゼコンジュゲートも１：2500の希釈で用いた他は、可溶性ELISA（実施例２）の通りELISAを行った。ELISAウェル当り１×105の細胞を用い、ペプチドBSAコンジュゲートは１μｇ／mlの濃度でコートした。
ビオチンチラミン及びMIP−１αの存在下で選択されたファージの30／95はCD４+を認識した。MIP−１αの欠如下で選択されたファージの11／95はCD４+リンパ球を認識した。CD４+細胞で陽性である30のクローンのうち13はCC−CKR5細胞系上で陽性であることが見い出された。MIP−１α及びビオチンチラミンの存在下で選択されたこれら２つのクローン（RK−１及びRK−２）はCC−CKR5ペプチドに特異的であることが見い出された。CC−CKR5ペプチドを認識しないクローンは、もちろん、CC−CKR5の他のエピトープ、他のMIP−１αレセプター又はMIP−１αレセプター近くの細胞表面上で見い出されるタンパク質を認識し得る。
ｄ．RK１及びRK２の配列決定
２つのペプチド結合クローンの配列決定を実施例２パートｆに記載されるように行った。クローンRK１及びRK２は同一のVL遺伝子セグメントを有していた。
0003923534.tif 000008
ｅ．RK２を用いるウエスタン・ブロット
これらのペプチド結合クローンの代表（RK−２）を、CC−CKR5移入細胞系からの抽出液でのウエスタンブロットによりテストし、CC−CKR5に相当し得る約35kDのバンドに結合することが見い出された。
この研究は、リガンド結合部位周辺の領域に結合するファージの選択を導くために、マーカーとして、周知の結合特異性（MIP−１α）のリガンドを用いて、大きなファージライブラリーから直接、要求される特異性のファージ抗体を単離するためのシグナル転移選択の使用を記載する。結果として生ずる選択された集団の割合は、リガンドのレセプター（CC−CKR5）に特異的であることを示した。この例において作られた抗体は、HIV感染における補因子として機能する７つの膜貫通タンパク質に結合し、従ってその抗体は治療的役割を有し得る。
実施例10−光活性化ストレプトアビジン及び誘導のためのレセプターリガンドを用いる抗ケモカインレセプターファージの選択
実施例９に記載されるように、MIP−１αは、そのレセプター（CC−CKR5）の少くとも１つに対する抗体の選択を導くのに用いることができる。この例は、同様のシグナル転移手順においてビオチンチラミンのかわりに用いる光活性化ストレプトアビジンの能力を証明するために同じシステムを利用する。
ａ．光活性化ストレプトアビジンの形成
SAND（スルホスクシニミジル２−〔ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド〕−スチル−１，３−ジチオプロピオネート、Pierce）は、可視帯域（300〜460nm）において活性化される光架橋剤である。SANDを、PBS中7.5mMのSANDと２mg／mlのストレプトアビジン（Pierce）を混合することによってストレプトアビジンに結合させた。これを室温で２時間、暗室でインキュベートし、次にNAPSカラム上で分離した。
ｂ．選択手順
１×105のCD４+リンパ球を実施例９パートａに記載されるように調製し、最終濃度375nMでビオチン化MIP−１α（Ｒ及びＤシステム）の存在又は欠如下のいずれかで1.4×1010scFvファージディスプレイライブラリーから調製した２×1012ファージとインキュベートした。各々の選択についての最終容量を２％マーベルを含むPBS（MPBS）で40μｌにした。４℃で14時間、選択物をインキュベートした。３分で600ｇでの遠心により細胞をペレット化し、１ml MPBSで洗った。全部で３回の洗浄を行った。次に、細胞を500mMのストレプトアビジン−コンジュゲートSANDと30分、暗所でインキュベートした。細胞を上述のように洗い、普通のフラッシュガンから５回の光のフラッシュに露出した。細胞をペレット化し、0.5％トリトンを含む100μｌのTE中に再懸濁した。
ｃ．ストレプトアビジン結合ファージの捕獲
溶出液を、１mlの100μｇ／mlビオチン化BSAでコートされた予めブロックされた免疫吸着チューブに加えた。１時間後、そのチューブを１mlのPBSで10回、洗った。ストレプトアビジンに架橋されているファージを、28mMのｂ−メルカプトエタノールを含む１ml PBS中に溶出した。全ての溶出液からのファージ及びその捕獲された集団からのファージを滴定した。種々の選択手順から回収されたファージの数を以下に示す。
順に、選択番号、Bio−MIP−１αSAND、溶出したStrep、総数、捕獲されたファージ数、捕獲されたファージ割合（％）
0003923534.tif 000009
ストレプトアビジン−SANDが選択スキームに含まれる時にはファージは最初溶出液から回収されただけであった。これの欠如下においては、バックグラウンドファージは回収されなかった。これらの結果は、MIP−１α結合の部位周辺に結合するファージへストレプトアビジンを特異的に架橋するビオチン化MIP−１α及び光活性化ストレプトアビジン分子の能力を証明する。
ｃ．CD４+細胞結合体、CC−CKR5移入細胞結合体及びCC−CKR5アミノ末端ペプチド結合体を同定するためのファージELISA
選択されたファージを、CD４+リンパ球、CC−CKR5移入細胞系（M, Parmentier and G. Vassart, University of Brusselsにより供されたもの）及びCC−CKR5レセプターのアミノ末端20アミノ酸（MDYQVSSPIYDINYYTSEPC）に相当するBSAコンジュゲートペプチドを認識する能力についてファージELISAにより分析した。ファージELISAは実施例９に記載されるように行った。
ビオチンチラミン及びMIP−１αの存在下で選択されたファージの24／54はCD４+リンパ球を認識した。CD４+細胞上で陽性である24のクローンのうち15はCC−CKR5細胞系で陽性であることも見い出された。これらの２つのクローンは、CC−CKR5ペプチドに特異的であることが見い出された。
ｄ．RK３及びRK４の配列決定
２つのペプチド結合クローンの配列決定を実施例２パートｆに記載されるように行った。
0003923534.tif 000010
誘導分子としてMIP−１αを用いるビオチンチラミンシグナル転移選択により作られたクローンであるRK１は、VL CDR３における１つのアミノ酸の差を除いてRK−３と同一であった。これは、選択手順の選択性を証明し；同じCC−CKR5領域を認識する本質的に同一のクローンは、1.4×1010の他のクローンのバックグラウンドから、ビオチンチラミン又は光活性化ストレプトアビジンシグナル転移選択のいずれかによって選択することができる。
実施例11−選択を導くための、両方に結合するビオチン化リガンドを用いる２つの異なる細胞表面接着分子に対するファージ抗体の選択
Ｅ及びＰセレクチンは、ヒト脈管内皮細胞（HUVECs）の表面上に発現される細胞接着分子である。Ｅ及びＰセレクチンは、TNFαのようなトロンボゲン又は炎症剤での刺激後に上昇制御される。これら両方のセレクチンのためのリガンドはシアリルLewis Xであることが見い出されており、このリガンドは、同じ選択におけるそのレセプター接着分子の両方に対する抗体を作るのに用いられている。
ａ．TNFαを用いるHUVEC'sの刺激
（継代５まで増殖させた）HUVEC'sを４時間、500pg／mlでTNFαで刺激し、Ｅ選択が上昇制御されるのを確実にするためにフローサイトメトリー分析を行った。刺激後、処理した細胞の43.8％は１を超える蛍光値を供し、他方刺激なしでは、細胞の2.6％のみが１を超える蛍光を供した。
ｂ．シアリルLewis Xのビオチン化
シアリルLewis X（Oxford Glycosystems）をビオチン化ジアミノピリジン（BAP）を用いてビオチン化した。１mgのBAPを50μｌのピリジン／酢酸（２：１ｖ／ｖ）に溶かした。これを乾燥炭水化物（100μｇ）に直接加え、80℃で１時間、インキュベートした。オリゴサッカリド−BAPアダクトを、50μｌのピリジン／酢酸中の2.1Ｍ／ｌボランジメチルアミンを加えることにより還元し、ボルテキシングした。次に80℃で更に１時間、インキュベーションを行った。
ｃ．ビオチン化ファージの選択及び捕獲
刺激したHUVEC'sを大きな非免疫化scFvライブラリーから救済されたファージとインキュベートした。40μｇのビオチン化シアリルLewis Xの存在又は欠如下で２回のシグナル転移選択を行った。実施例１パート（ｅ）に記載されるようにファージをストレプトアビジンコートした磁気ビーズ上に捕獲した。捕獲前及び後に存在するファージの数を滴定した。ビオチン化ファージの最も大きな回収は、ビオチン化シアリルLewis X及びビオチンチラミンステップが存在する時に刺激した細胞から観察された（1.8％回収率）。ビオチン化シアリルLewis X又はビオチンチラミンのいずれかの除去は溶出液から回収されたファージの割合（％）を約10倍低下させた。これらの結果は、（ストレプトアビジン−HRPを伴う）ビオチン化シアリルーLewis Xが、ファージライブラリーの存在下で刺激されたHUVEC'sに結合することができ、そしてリガンド結合部位周辺に結合するファージのビオチン化を導くことができることを示唆する。
ｄ．Ｅ−及びＰ−セレクチン結合体を同定するための可溶性ELISA
回収したファージを、Ｅ及びＰセレクチンに対してのそれらの結合について（実施例２パート（ｄ）に記載されるように）可溶性ELISAにより検査した。ビオチン化シアリルLewis X及びビオチンチラミンの存在下での第１回目の選択から回収されたクローンの3.6％はＥ−セレクチン陽性であった。刺激しない細胞で、又はリガンド又はビオチンチラミンの欠如下で行った選択からテストしたクローンでＥ−セレクチン陽性なものはなかった。HRP−コンジュゲート抗ＥセレクチンIgG選択はＥセレクチンに結合することが見い出されたが、HRP−コンジュゲートの欠如下においてはＥセレクチン陽性であることが見い出されたクローンはなかった。シアリルLewis X及びビオチンチラミンの存在下での第２回目の選択から、Ｅセレクチン陽性であることが見い出されたクローンの数は13.7％に増加した。
刺激した細胞上のビオチン化シアリルLewis X及びビオチンチラミンの存在下で選択されたクローンの集団上でもＰセレクチンELISAを行った。Ｅセレクチン結合体の50％がＰセレクチンを認識し、それはそのリガンドとしてシアリルLewis Xを分けあうことも見い出された。加えて、更に２％がＰセレクチン特異的であることが見い出された。
第２回目の選択がされた集団の更に21％は、可溶性ELISAにより刺激したHUVEC'sに結合することが見い出された。Ｅセレクチンに結合することが見い出されたクローンを配列決定し、Ｅセレクチン結合体の多様な集団を同定した。特定範囲の異なる生殖細胞系VHを選択した。VLはそれより多様ではなく；共通のCDR３'sを有する全部で４つの異なる生殖細胞系セグメントを選択した。
これらの選択は、細胞表面タンパク質結合クローンの選択を導く特定の細胞表面タンパク質のための天然のリガンドの能力を証明する。１超の細胞表面タンパク質を認識するリガンド（この場合Ｅ及びＰセレクチン）は、その標的タンパク質のいずれかの抗体の選択を導くのに用いることができる。
実施例12−ビオチンチラミンを用いるシグナル転移がおこり得る距離の測定
HRP及びビオチンチラミンを用いてビオチン化がおこり得る距離を測定するために以下の実験をデザインした。バクテリアファージは、そのフィラメントの一端に遺伝子３タンパク質の３のコピーを有する約１μｍ長のフィラメントである。遺伝子３タンパク質は、マウス抗遺伝子３抗体により、次に抗マウスHRPコンジュゲートによりファージの一端にHRP特異性を局在化するのに用いることができるマーカーを提供する。次にビオチンチラミン及び過酸化水素を、HRP活性の部位周辺でのファージのビオチン化を許容するためにタグされたファージに加えることができる。次に、ファージは、電子顕微鏡グリッドに移し、ビオチン化の程度を視覚化するためにストレプトアビジン−金ビーズで標識することができる。
ａ．ファージの調製
エストラジオール結合性ファージ（MT31C）を、37℃で６時間、50mlの２TY／２％グルコース／１μｇ／mlアンピシリン（２TYGA）中のバクテリアグリセロール保存液から増殖させた。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene）を、（１のOD600nmが培養物のml当り５×108細胞に等しいと仮定して）約10の感染の多重度（moi）まで加えた。その培養物を、37℃で15分、同じ温度で軽いエレーション（200rpm）下で45分、静止してインキュベートした。その培養物を遠心し、その上清をその細胞ペレットからとった。その細胞を50mlの２TYAK（100μｇ／mlアンピシリン及び50μｇ／mlのカナマイシンが供された２TY培地）中に再懸濁し、そしてその培養物を十分なエレーション（300rpm）下で30℃で一晩、インキュベートした。ファージ粒子を精製し、そして２回のホリエチレングリコール（PEG）沈殿で濃縮し（Sambrook, J., Fritsch, E. F., 及びManiatis, T.（1990）, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York）, PBSで1012のトランスデューシング単位（tu）／mlに再懸濁した。
ｂ．ファージのビオチン化
ファージを総量500μｌでml当り約２×1010の濃度に希釈した。遺伝子３タンパク質に対するマウスMab５μｌをファージに加え、室温で１時間、インキュベートした。次に５mlの抗マウス−IgG−HRPコンジュゲート（Sigma）をファージに加え、更に１時間、室温でインキュベートした。次にそのファージを、そのファージ混合物に50μｌの１Ｍ  Tris−HCl pH7.4、次に４μｌのビオチンチラミン保存液及び２μｌの過酸化水素（Sigma）をファージ混合物に加えることにより、ビオチンチラミンで処理した。その反応を室温で10分、進め、そして次にそのビオチン化ファージを４℃で一晩、保存した。
ｂ．ビオチン化ファージのストレプトアビジン−金ラベリング
EMグリッドを0.1％ゼラチンでブロックし、そして次にファージサンプルを適用した。次にそのファージをml当り約２×1011粒子の濃度でストレプトアビジン−５nmコロイド状金（Sigma）で標識した。ファージのビオチン化端のいくつかの像を形成した。抗遺伝子３抗体を除いた時にはファージ端の金標識は観察することができなかった。
ｄ．このシステムを用いてビオチン化がおこる距離の測定
電子顕微鏡においてファージの個々の端に局在化することが見い出された金粒子の数を計数し、そのデータを分布ヒストグラムを作るのに用いた（図２）。２つの別個の標識実験からのデータをヒストグラムを作るためにプールした。ファージ端に関連する金粒子の平均数は6.6であることが見い出され、7.2nmのビオチン化の平均半径を供した。この方法を用いて、観察されたビオチン化の範囲は５nm〜25nmであり、ここで５nmが本実験の分解能の限界であった。典型的な球状タンパク質は約４nmの直径を有するので、ビオチン化の範囲は１〜５タンパク質直径のオーダーである。
ｅ．ビオチン化の距離の調整
ビオチン化がおこる距離を増加させるために、種々の長さのHRP−コンジュゲート分子を用いることができる。例えば特定の結合特性を有するファージ抗体は、標識され、次にライブラリーからのファージ抗体のビオチン化を導くのに用いられるHRPであり得る。ファージ粒子は通常約１μｍ長であるので、これは、10nm〜１μｍのビオチン化の半径を供するだろう。同様に、より短い又はより長い長さの他の分子、例えばストレプトアビジン−デキストラン−HRPコンジュゲート、又は50nmの直径を有し、直接的もしくはビオチン−ストレプトアビジンを通して間接的にHRPに結合され得るMACSビーズ（Miltenyi Biotec）のような所定の大きさのビーズを用いることができる。ビオチン化がおこる領域を広げるために、ビオチンチラミン反応の繰り返しを行うことができる。実施例10は、短いスペーサーアーム（18オングストローム）を有する光活性化可能ストレプトアビジン分子を用いるシグナル転移技術に基づくバリエーションを記載する。この手順は、誘導分子にすぐ隣接して結合する分子へのシグナル転移を許容するだけであろう。
実施例13−リガンド結合を阻害するファージ抗体を単離するためのステップバック選択
この例は、最初のマーカーリガンドの細胞への結合を阻害する抗体を単離するための２段階様式のビオチンチラミンシグナル転移選択手順の使用を記載する。この手順は、いずれかのリガンド、小分子、又は抗体に対するインヒビターの形成に適用することができる。ここで例示される方法は、リガンド結合の部位周辺に結合するファージ抗体をビオチン化し、捕獲するための選択の最初の段階を含む。次に、ビオチン化ファージは、リガンドの欠如下で細胞を用いる選択の第２段階を導くために（増幅の必要なく）直接用いられる。この方法において、リガンド結合部位に結合する抗体は、シグナル転移選択手順によりビオチン化され得、次にリガンド結合の阻害について捕獲及びスクリーニングされ得る。このスキームを図３に概説する。ここに記載される例は、第２段階の選択を行うためにファージを用いるが、scFvは、抗体又はその結合フラグメントのようないずれかの他の適切な結合分子であり得るので、scFv分子の集団として、又は個々のクローン単離及び精製によるもののいずれでも用いることができる。この例で用いたシステムは実施例９に記載されるのと同じである。MIP−１αは、精製されたCD４+リンパ球上の誘導リガンドとして用いた。
ａ．第１段階選択
CD４+細胞を、実施例９パートａに記載されるように血液から精製した。次に、ファージを90μｌの予めブロックしたストレプトアビジンコートされたDynalビーズ上に捕獲した以外は実施例９パートｂ）に記載されるのと全く同様に第１選択手順を行った。洗った後、ビーズ上のファージを滴定するために、ビーズを90μｌのPBS中に再懸濁し、30μｌを除いた。残りの60μｌを磁石を用いて溶液から再びとり、37℃で10分、100μｌの100mMトリエチルアミンを用いてファージをビーズから溶出し、次に50μｌの１Ｍ  Tris−HCl pH7.4で中和した。溶出した後、ビーズを溶液からとり、そのビオチン化ファージを含む上清を、ステップ２に用いるためにとった。その残りのビーズを保持し、溶出後のビーズ上に残ったファージタイターを確認するために大腸菌TGIに感染させた。
以下のタイターを得た。
Dynalビーズ上に捕獲されたファージの総数：1.7×104
TEA溶出後のビーズ上に保持されたファージの総数：2.2×103溶出された総数：1.5×104
ｂ．第２段階選択
第１段階の選択から回収されたビオチン化ファージの集団を、MPBS中200μｌの総容量で１×106のCD４+リンパ球に直接加えた。ファージを、室温で１時間、細胞に結合させ、そして次に細胞を１ml PBS中で３回、洗った。細胞を洗浄の間、4000rpmで２分の遠心でペレット化した。次にscFvファージライブラリーの更なるアリコート（２×1012ファージ）を１ml MPBS中の細胞に加え、室温で１時間、結合させた。上述のように細胞をPBSで３回、洗い、次に２μｌのストレプトアビジン−HRP複合体（Amersham）を含む200μｌのMPBS中に再懸濁した。これを室温で30分、結合させて、次に上述のように洗った。実施例９パートｂ）に記載される通り、細胞のビオチンチラミン処理を行った。次に細胞を100μｌのPBST中に再懸濁することにより溶解し、そして30μｌの予めブロックされたストレプトアビジンコートされたDynalビーズをそのライゼートに加えた。ビーズ及びライゼートを室温で20分、回転し、次にのビーズを磁石で溶液にとる。ビーズを１mlのPBSTで３回、次に１mlのPBSで３回、洗った。洗ったビーズを大腸菌TGIの指数増殖培養物に直接感染させるのに用いた。全部で約４×103クローンをこの選択手順から回収した。
ｃ．イムノアッセイのための単一選択されたクローンの増殖
選択手順の第２ステップからの個々のコロニーを、組織培養プレートの個々のウェルに100μｌの２TYGAを接種するのに用いた。プレートを、適度に振とう（200rpm）しながら、30℃で一晩、インヒビターした。15％までのグリセロールを各々のウェルに加え、これらのマスタープレートを分析する直前まで−70℃に保存した。
ｄ．抗CD４+scFv'sを同定するためのファージELISA
マスタープレートからの細胞をウェル当り100μｌの２TYGAを含む新鮮な96ウェル組織培養プレートに接種するのに用いた。これらのプレートを、６〜８時間、37℃でインキュベートした。M13K07を各々のウェルに10のmoiまで加え、30分、静止して、次に30分、静かに振とう（100rpm）しながら、両方７℃でインキュベートした。そのプレートを2000rpmで10分、遠心し、その上清を除去した。各々の細胞ペレットを100μｌの２TYAK中に再懸濁し、30℃で一晩、インキュベートした。各々のプレートを2000rpmで10分、遠心し、そしてその上清100μｌを回収し、１時間、室温で静止状態で、20μｌの18％M6PBS（18％スキムミルク粉末、６×PBS）中でブロックした。
CD４+細胞を記載されるように（実施例９，パートａ）単離し、１×105の細胞を、室温で30分ポリ−Ｌ−リシンで予めコートされた96ウェル培養ウェル上で回転させた。細胞を37℃で２時間、100μｌのMPBS中でブロックし、PBSで１回そそいだ。次にその細胞にファージ上清を加え、室温で１時間、インキュベートし、次にPBSで３回、洗った。MPBS中１：5000倍希釈のヒツジ抗fd抗体（Pharmacia）を加え、そのプレートを１時間、室温でインキュベートした。プレートをPBSで３回洗い、そしてMPBS中のロバ抗ヒツジアルカリホスファターゼコンジュゲート（Sigma）100μｌを加え、室温で１時間、インキュベートした。プレートをPBSで３回、洗い、そしてアルカリホスファターゼ活性を、色原性基質pNPP（Sigma）を用いて視覚化した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて405nmにおける吸光度を測定した。この方法においてCD４細胞結合について45の個々のコロニーを測定し、その25が陽性であることが見い出された。このうち６つを更なる分析のためにランダムにとった。
ｅ．MIP−１αのCD４+細胞への結合を阻害するための抗CD４scFv'sの測定
６のscFv'sを、ニッケルアガロース金属アフィニティークロマトグラフィー（Quiagen）を用いて精製した。１×105のCD４細胞を、全量100μｌの0.1％BSAを含むPBS中で室温で１時間、精製したCD４+結合性scFv's又は無関係な対照scFvとプレインキュベートした。サンプル当り約５〜10μｇのscFvを用いた。細胞をミニフュージ内で4000rpmでピレット化し、１mlのPBSで１回、洗った。ビオチン化されたMIP−１α（Ｒ及びＤシステム）を、製造元の説明に従って作り、（５ngに等しい）５μｌを、100μｌのMPBS中の細胞に加え、室温で１時間、インキュベートした。細胞を上述のように洗った。MPBSで１：100に希釈した100μｌのストレプトアビジン−FITC（Sigma）を加え、室温で30分、インキュベートし、そして細胞を上述のように洗った。Coulter Epics−XLフローサイトメーターを用いて蛍光を検出した。MIP−１αは、scFvがない場合又は対照scFvを細胞に加えた場合に細胞の蛍光の大きなシフトを供した。選択されたクローンからのscFvの存在下では、細胞に結合するMIP−１αは大きく阻害された。阻害はクローン間で変化した。
実施例14−ペプチドファージライブラリーを用いる溶液中のビオチンチラミン選択
9E10は、細胞mycタンパク質の一部であるペプチドを認識する市販のマウスモノクローナル抗体である（Munro, S. 及びPelham, H. R. B（1986）, Cell 46, 291〜300）。この実験は、9E10に結合する大きなペプチドライブラリーからのペプチドについて選択するようデザインした。9E10を、溶液中でのビオチン−チラミン選択を許容するようHRPに接合した。これは、エピトープマッピング抗体又は他のタンパク質結合ドメインの新規な方法として考えることができる。
ａ．ペプチドライブラリーの作製
本実施例において、用いたペプチドライブラリーは、１×1013の独立したクローンのファージライブラリーを供するようにFischら（I. Fischら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 7761〜7766）により記載されるように作製した。
ｂ．HRPに対する抗myc抗体（9E10）のコンジュゲーション
１mlの１mg／ml 9E10 IgGを、Pierce EZ−Iinkマレイミド活性化HRPキット（cat. no. 31494）を用いてHRPに接合した。１mlの9E10を、100μｌのコンジュゲーション緩衝した中６mgの２−メルカプトエチルアミン（MEA）を含むバイアルに加えた。その溶液を室温まで冷やし、脱塩カラムを用いてMEAを還元IgGから分離した。そのカラムを、30mlのマレイミドコンジュゲーション緩衝液で洗うことにより予め平衡化し、そしてIgG/MEA溶液1.1mlをカラムに適用した。そのコンジュゲートをマレイミドコンジュゲーション緩衝液を用いて溶出した。１mlの画分を収集し、画分５及び６が主要なタンパク質を含んでいることが見い出された。画分７及び８はより少量のタンパク質を含んでおり、対照選択のために保持した。画分５及び６をプールして、１mgのマレイミド活性化HRPをIgGに加え、室温で１時間、反応させた。
ｃ．9E10−HRP及びペプチドファージディスプレイライブラリーを用いる第１回目の選択
１回の選択当り約１×1013のファージを用いた。６μｇの9E10−HRPコンジュゲートを、２％マーベルを含む総量１mlのPBS（MPBS）中のペプチドファージに加えた。６μｇのコンジュゲートしていない9E10を用いて、対照選択も行った。全ての選択を１mlで行った。ファージ及び抗体を４℃で一晩、結合させた。次に、50μｌの１ＭのTris−HCl pH7.4，４μｌのビオチンチラミン及び２μｌの過酸化水素をその選択物に加え、室温で10分、反応させた。次にMPBS中で30分、予めブロックされた100μｌのストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Dynal）をその選択物に加え、室温で30分、回転させた。次に磁気ビーズを磁石を用いて溶液にとり、0.1％ Tweenを含むPBS１mlで３回洗い、次にPBS１mlで３回、洗った。そのビーズを最終容量100μｌのPBS中に懸濁し、大腸菌TGIの指数増殖培養物５mlに直接感染させるのに用いた。37℃で30分、静止して、次に37℃でゆっくり振とう（200rpm）しながら30分、インキュベートすることにより感染を行った。ファージを、100μｇ／mlのテトラサイクリンを含む２TY培地（２TYT）上にプレートした。コロニー数はファージタイターを供した。
ｄ．9E10−HRP及びペプチドライブラリーを用いる第２回及び第３回目の選択
プレートを５mlの２TYにこすりとり、次にこのプレートスクラップを50mlの２TYTに加え、エレーション下で30℃で一晩、増殖させた。結果として生ずる細胞懸濁液１mlをミニフュージで6000rpmでペレット化し、その上清に100μｌの10×MPBSを加えた。次に、9E10−HRPコンジュゲート、コンジュゲートしていないものを、上述のパートｃに記載される第１回目と全く同様に行われた選択としてブロックしたファージに加えた。３回の選択全てが行われるように選択を繰り返した。各々の回における出力集団において回収されたファージの数は次の通りであった。
0003923534.tif 000011
ｅ．9E10に結合するための出力集団のスクリーニング
第３回目の選択からの個々のコロニーをウェル当り100μｌの２TYTを含む96ウェル組織培養プレートに接種するのに用い、クローンを十分なエレーション（300rpm）下で30℃で一晩、増殖させた。プレートを2000rpmで遠心し、各々のウェルからの上清からの100μｌを回収し、室温で１時間、静止して20μｌの18％M6PBS（18％ミルク粉末、６×PBS）中でブロックした。50μｌの10μｇ／ml 9E10又は50μｌのPBSのみで４℃で一晩、ブロックされたELISAプレートをPBSで洗い、次に３Ｍ PBSで37℃で２時間、静止してブロックした。ELISAプレートをPBSで洗い、次にブロックしたファージ上清をELISAプレートに加えた。そのプレートを室温で静止してインキュベートし、次にPBSTで３回、PBSで３回、洗った。次に、３MPBS中１：5000に希釈した抗遺伝子８−HRPコンジュゲート50μｌを各々のウェルに加え、そしてそのプレートを室温で１時間、インキュベートした。上述のようにプレートを洗い、50μｌのTMB基質で室温で１時間、ELISAを展開した。25μｌの１ＭのH2SO4を加えることにより進展を止めた。
ｆ．スクリーニングの結果
9E10−HRPコンジュゲートを用いる第３回目の選択からの95のクローン及びコンジュゲートしていない9E10選択からの95のクローンをELISAによりスクリーニングした。9E10−HRP選択からのPBSコートプレートではないが、9E10に結合するものとして３の陽性体が同定されたが、対照のコンジュゲートしていない9E10選択からは陽性体は見い出されなかった。３つの陽性クローンを、未処理のマウスモノクローナル抗体における上述のELISAにより再検査し、いずれのシグナルも供さなかったことは、それらが9E10 Mabに特異的に結合することを証明する。
ｇ．9E10結合性クローンの配列決定
9E10に結合することについて陽性であることが見い出されたクローンを、Fisch５により記載されるように、DNA配列決定により分析した。全ての３つのコロニーは同一であることが見い出された。エキソン１にペプチド挿入はなく、エキソン２には全部で10のアミノ酸のペプチド配列が挿入されており、それは以下に示すように、mycタグといくらかの相同性を有していた。
選択された配列：    ＰＭＰＨＡＥＧＫＳＴ
Mycタグ：              ＧＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＭ
要約すると、9E10特異的クローンがペプチドライブラリーから同定され、それはmycタグといくらかの相同性を有していた。これは、ビオチンチラミン選択を溶液中で上手く行うことができ、そして非抗体ライブラリー上で行うことができることを証明する。
実施例15−ウエスタン・ブロット及びICCによるCD４+細胞に結合するがケモカインレセプターCC−CKR5には結合しないクローンのキャラクタリゼーション
実施例９は、ケモカインレセプターに結合するファージ抗体の選択を記載した。ビオチン化MIP−１αを用いて、次に選択を導くためにストレプトアビジン−HRPによって、CD４+細胞上でファージ選択を行った。ビオチンチラミン及びMIP−１αの存在下で選択された30／95ファージはCD４+リンパ球を認識した。これらのクローンのうち13はMIP−１αがリガンドであるCC−CKR5ケモカインレセプターについて陽性であることが見い出され、残りの17のクローンはCD４+細胞に結合するが他の抗原に結合するかは確認しなかった（実施例９パートｃ）。これらのクローンは、通常MIP−１αレセプター近くに見い出されるか又はCC−CKR5以外のMIP−１αレセプター（CC−CKR1及びCC−CKR4は両方ともMIP−１αに結合する）である抗原を確認することができる。これらのCD４+−結合クローンに対する抗体の同定は細胞表面上のタンパク質間相互作用の検査を許容し、そして新規のタンパク質間相互作用を発見するための道具としてのビオチンチラミン選択の能力を例示する。
３つのクローン、CD4A2，CD4E1及びCD4D2を、17のCD４+結合クローンからランダムに選択し、そしてそれらの抗原パートナーを同定するために更なる分析にかけた。最初の研究は３のクローンからの精製されたscFvでのCD４+細胞から調製された膜画分のウエスタンブロットのプロービングに関連する。CD４+細胞での免疫細胞化学もscFv'sを用いて行った。
ａ．CD４+細胞膜画分の調製
実施例９パート（ａ）に記載されるように、CD４+リンパ球を調製した。次に膜調製物を次のように作った。約１×106の細胞を250mMスクロース中12mMのTris−HCl，pH7.5の１ml中に再懸濁した。細胞を３サイクルの凍結解凍により溶解し、そのライゼートをすりガラスホモジナイザー中でホモジナイズした。そのホモジネートを４℃で10分、270×ｇで遠心して透明な画分にペレット化した。次にその上清を４℃で10分、8000×ｇで遠心してミトコンドリア及びリソソーム画分にペレット化した。形質膜画分にペレット化するための最後の遠心を４℃で60分、100,000×ｇで行い、その膜画分を100μｌのPBS中に懸濁し、−70℃に保存した。
ｂ．膜画分のウエスタンブロット
４〜20％のNovex勾配を、15時間、125Ｖで非還元変性条件下で走らせ、25Ｖで1.5時間、ブロットした。Hybond−Ｃ膜（Amersham）を用いて、製造元の推奨に従って、Novex装置においてブロッティングを行った。
ｃ．ウエスタン・ブロットのプロービング
膜をMPBS中で45分、ブロックし、室温で１時間、５mlのMPBS中の50μｇの精製されたscFvでプローブした。ブロットをPBSTで３回、次にPBSで３回、洗った。次に１：100にMPBSで希釈した9E10を室温で１時間、膜上でインキュベートした。上述のように洗浄を行い、次に抗マウス−IgG−HRP抗体を、MPBSで１：5000に希釈して加えた。ECL基質（Amersham）を用いてブロットを展開し、オートラジオグラフィーフィルムに露出した。
クローンCD4E1は約29kDaの１つのバンドを供した。
クローンCD4D2は約31kDaの１つのバンドを供した。
クローンCD4A2は変性ゲル条件下で特定のバンドを供さなかった。
ｄ．CD４+細胞上のscFv'sを用いる免疫細胞化学（ICC）
約１×105のCD４+細胞をCytospin（Serotech）を用いて、ポリ−Ｌ−リシンを下塗りしたスライド上で回した。スライドを室温で２時間、MPBS中でブロックし、次にMPBS中１：10の希釈物を室温で１時間、インキュベートした。スライドをPBSで洗い、両方MPBSで希釈した9E10の１：100希釈物、次に抗マウスHRPの１：500希釈物を用いて検出を行い、インキュベーションの間にPBSで洗いながら、室温で１時間、インキュベーションした。CD4E1及びCD4D2の両方が細胞膜の透明な染色を供した。
実施例16−新規のタンパク質間相互作用を同定するためのシグナル転移選択の使用の証明
クローンCD4A2，CD4E1及びCD4D2が認識する抗原を定義的に同定するために、精製したCD４+細胞からのmRNAから、ラムダgt11 cDNA発現ライブラリーを作製し、精製したscFv'sでスクリーニングした。
ａ．メッセンジャーRNAの単離
メッセンジャーRNAをQuick Preb Micro mRNA精製キット（Pharmacia）を用いてCD４で精製された細胞の集団から精製した。mRNAを製造元の説明に従って精製した。本方法は、グアニジニウムチオシアネート及びＮ−ラウロイルサルコシンを含む緩衝水溶液中の細胞の溶解に関する。次にその抽出液を、セルロースに付着したmRNA及びオリゴ（dT）上のポリ（Ａ）域間に有効に水素結合するのを許容するのにあまり十分でないがRNAseの完全な阻害に極めて十分であるレベルまでグアニジウム濃縮物を減少させる溶出緩衝液で３倍に希釈した。その希釈ステップは、いくつかのタンパク質を沈殿させ、最初の精製を供する。その抽出液をマニフュージ内で最高速での短い遠心により透明にし、そしてその上清をオリゴ（dT）−セルロースを含むマイクロセントリフュージに移す。ポリ（Ａ）＋RNAがオリゴ（dT）セルロースに結合する間の10分の後、そのチューブを高速で10秒、遠心し、その上清をそのペレット化したオリゴ（dT）−セルロースから吸引した。ペレット化した材料を高塩緩衝液の１mlアリコートで連続的に洗った。ここでその各々の洗浄は再懸濁及び簡単な遠心の過程によって行った。最後の洗浄の後、そのペレットを50μｌの低塩緩衝液中に再懸濁して、マイクロセントリフュージ内に置いたMicro Spinカラムに移し、そしてそのカラムを0.5mlの低塩緩衝液で３回、洗った。最後に、そのポリアデニル化材料を予め温めた溶出緩衝液（10mM  Tris−HCl（pH7.5），１mM EDTA）で溶出した。グリコーゲン担体、酢酸カリウム及びエタノールの添加によりmRNAを沈殿させた。沈殿した後、遠心によりmRNAを回収し、水で処理したDEPC中に再び懸濁した。
ｂ．cDNA合成
Amersham Internationalにより供されるcDNA合成キットを用いてCD４ mRNAからcDNAを合成した。詳細なプロトマルパンフレットに従った。第１鎖合成反応は、テンプレートとしてのmRNAと共に、ヘキサマープライマー及び逆転写酵素を含んでいた。第２鎖合成はリボスクレアーゼＨ及びDNAポリメラーゼで行い、合成後、そのcDNAの端をT4 DNAポリメラーゼでの処理により平滑にした。次にそのcDNAをフェノール／クロロホルム抽出によって精製した。
ｃ．cDNAライブラリーの作製
AmershamのcDNA迅速アダプター連結モジュール（RPN 1712）及びcDNA迅速クローニングモジュール−gt11（RPN 1714）を用いて、cDNAをラムダgt11発現ベクターにクローンした。アダプターをcDNAに加えてEcoRＩ制限接着端を供し、そしてアダプターを有するcDNAを、カラムステップにより遊離したアダプターから分離した。次にその適合したDNAをラムダgt11ベクターに連結し、次に試験管内パッケージングキットを用いてパッケージした。結果として生ずる反応を、ライブラリーの大きさを評価するために滴定し、７×105であることが見い出された。
ｄ．scFvでのcDNA発現ライブラリーのスクリーニング
イムノスクリーニングのために、宿主細胞（Ｙ1090）にライブラリーからのファージを感染させ、そしてＬトップアガロース上にプレートした。42℃で3.5時間、増殖させた後、そのプレート上に、LacZ遺伝子発現のインデューサーである10mM IPTGで飽和したニトロセルロースフィルターを重層し、そして37℃で更に3.5時間、インキュベートした。この間、そのプラークを、溶解的に感染した細胞から遊離したβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質と一緒にフィルターに移す。そのフィルターを注意深く除去し、PBSで簡単に洗って、次にMPBSTでブロックした。陽性体の検出は、MPBS中10μｇ／mlの濃度での関心のscFvのインキュベーション、次に9E10（MPBS中１：100）及び次の抗マウスHRPコンジュゲート（MPBS中１：1000）でのインキュベーションによる。フィルターを３回、PBSでインキュベーションの間に洗った。Enhanced Chemiluminescentシステム（Amersham ECLキット）を用いて、シグナルを検出した。第１回目のスクリーニングで陽性であることが見い出されたプラークをとり、Ｙ1090の新鮮な培地に再び感染させ、そしてそのスクリーニング過程を繰り返した。陽性シグナルの再現性を確実にするため、及びクローンしたプラークを得るためこれを行った。
ｅ．陽性プラークからの挿入物の配列決定
単一のプラークを100μｌのSM緩衝液にとり、４℃で一晩、放置した。次に溶出したプラーク５μｌをとり、普通の50μｌのPCR反応（0.5μｌのTAQポリメラーゼ、４μｌの10mM dNTP，５μｌの10×PCR緩衝液、2.5μｌの各々のプライマー（10μＭ）、水で50μｌ）する）のためのテンプレートとして用いた。配列決定のために用いたプライマーは次の通りであった。
gt11スクリーン５        ５’GAC TCC TGG AGC CCG
gt11スクリーン３        ３’GGT AGC GAC CGG CGC
次にPCR生成物を浄化し、gt11スクリーン５及びgt11スクリーン３を配列決定プライマーとして用いた他は先に記載（実施例２パートｅ）されるように配列決定反応に用いた。次に、結果として生ずるヌクレオチド配列を、BLASTプログラムを用いてNCBIデータベースにアラインした（Altschulら、J. Mol. Biol.（1990）215, 403〜410）。
ｆ．配列アラインメントの結果
0003923534.tif 000012
これは、インスリン誘導性成長応答タンパク質であるCL−６と呼ばれるラットタンパク質に相同性を有する挿入物を含むラムダクローンを認識することが見い出された。このタンパク質は、タンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）である。PTPは、タンパク質内のチロシン残基を脱リン酸化する細胞内複合膜ホスファターゼのファミリーである。PTPは通常の新生物の成長及び増殖の制御に関係する。PTPはＴ細胞シグナル伝達経路にも関連し、ここでそれらは第２メッセンジャーイノシトールシリン酸の形成のためのレセプターにカップリングすることに関する。ここで単離されたDNAフラグメントはラットCL−６タンパク質とヌクレオチドレベルで80％の同一性を有し、従っておそらくヒトの相同体である。CL−６は約30kDaのタンパク質である。
ラット遺伝子CL−６は、インスリンの生理的濃度に応じて増殖し、肝臓を再生するいくつかの特性を保持するラットヘパトーム細胞系である肝臓及びインスリン処理Reuber Ｈ35細胞を再生することにおいて誘発される遺伝子として、R. H. Diamondら（1993, Journal of Biological Chemistry 268, 15185〜15192）によって同定された。CL−６はこの研究において同定された41の新規な成長応答遺伝子のパネルの１つであり、最も豊富なインスリン誘発遺伝子であることが見い出された。CL−６は肝細胞内の早期遺伝子として誘発され、そしてその肝臓再生の間の早期誘発は、それが早期刺激により制御され、インスリンのみによってではないことを示唆する。CL−６mRNA発現は肝臓及び腎臓において最も高いことが見い出されたが、ほとんどの組織においてはいくらか発現されるだけであった。CL−６タンパク質は高度に疎水的であると予想され、そして膜関連のタンパク質であり得る。CL−６は、再生及び胎児の発達の間の通常の肝臓構造又は代謝の維持に関する細胞増殖の組織特異的態様において役割を有するようである。
CD4A2
このクローンは、甲状腺レセプター相互作用タンパク質４（TRIP４）を認識することが見い出されている。甲状腺ホルモンレセプター（TRs）は種々の特定の標的遺伝子の発現を制御するホルモン依存性転写因子である。甲状腺相互作用タンパク質はホルモン結合へのTRの応答を媒介する役割を果たすと考えられている。
CD4D2
このクローンは、ヒト26Ｓプロテオソームのｐ31（31kDa）サブユニットを認識することが見い出された。プロテオソームはユビキチン依存性タンパク質分塊経路に及び抗原処理に関し、それらが生体内で血漿膜に近くに見い出され、又はそれに会合することの証拠がある。
ｇ．結果の概要
シグナル転移選択手順は、もとの標的抗原の近くに見い出される抗原に結合するが標的抗原自体を認識しない抗体又は他の結合種について選択するのに用いることができる。CD4A2，CD4E1及びCD4D2はこれの３つの例である。これらの３つの抗体が認識する抗原は、cDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定されている。cDNAスクリーニングにより同定された抗原は、CD4E1及びCD4D2がウエスタンブロット上で結合する抗原の予想される大きさと適合し、即ち、26Ｓプロテオソームのｐ31サブユニット（31kDa）であるCL−６（30kDa）とヒト相同性がある。抗体は、シグナル転移選択を導くのに用いられるCC−CKR5レセプターのためのリガンドであるMIP−１αと同様、ICCによりCD４+細胞膜を染色する。従って、シグナル転移選択は、CD４+細胞の表面上のMIP−１αレセプターのすぐ近く（おそらく約25nmまで）において見い出される抗原のパネルを同定するのに用いられる。これは、新規のタンパク質−タンパク質相互作用を同定する手段としての、及び新規の遺伝子を同定するためのシグナル転移選択の使用の証明である。CL−６遺伝子は以前にラットにおいて同定されているだけであり、そしてシグナル転移選択はCL−６のヒト相同体のクローニングを可能にした。
実施例17−ビオチン化を行うためのMIP−１αを用いる細胞表面上のCD4E1ファージのビオチン化
クローンCD4E1は、CD４+細胞表面上のMIP−１α結合部位近くで見い出された抗原に結合するという事実によって選択されている。それゆえ、CD4E1抗原がMIP−１αレセプターとの密接な関連において通常見い出されることを証明するために、CD４+細胞表面に結合したCD4E1ファージ上へのビオチンチラミン析出を触媒するためにストレプトアビジン−HRPに結合したビオチン化MIP−１αを用いることが可能であるはずである。これを、細胞をビオチン化MIP−１α、ストレプトアビジン−HRP及びCD4E1ファージとインキュベートし、ビオチンチラミンで処理し、そしてビオチン化したファージを回収し、そして滴定することによりテストした。このシステムを用いるファージの回収を、MIP−１α結合部位から離れたCD４+細胞表面上の部位に結合したファージをその細胞とインキュベートした場合、又はCD４+細胞表面上の他の離れた部位において結合するビオチン化リガンド（ビオチン化VCAM）をCD4E1ファージと一緒に用いた場合の回収と比較した。
ａ．細胞表面上のファージのビオチン化
CD４+細胞を実施例９に記載されるように精製した。CD4E1ファージ又はCD４+結合性クローンからのファージ（CLA4）を実施例12に記載されるように調製した。１×106の細胞を全量100μｌのPBS/BSA中５ngのビオチン化MIP−１α又は５ngのビオチン化VCAMと共に１時間、インキュベートした。次に、ストレプトアビジン−HRP（PBS/BSAで１：1000希釈）をその細胞に加え、30分、インキュベートした。細胞をPBSで洗い、そして次にPBS/BSA中1011のファージを加え、室温で１時間、細胞に結合させた。細胞をPBSで洗い、次に上述のようにビオチンチラミンで処理した。細胞をPBSで洗い、そして次に0.1％ Tweenを含むPBS中に溶かし、そしてビオチン化したファージをストレプトアビジンコート上に捕獲した。ビーズをPBSTで３回、PBSで３回、洗い、次に大腸菌TGIの指数増殖培養物に直接、感染させた。
ｂ．ファージビオチン化の結果
ビーズ上に捕獲されたファージの数を滴定により計算した。ビオチン化反応を行わなかった場合、約107のCD4E1及びCLA4ファージが細胞表面に結合することが見い出された。
0003923534.tif 000013
回収されたファージの数は、種々の対照サンプルで行われた回収より、CD4E1ファージをMIP−１αとインキュベートした場合に少くとも2.5倍高かった。これは、HRP−コンジュゲートMIP−１αが、CD4E1がMIP−１αレセプターのすぐ近く（25nm以内）に見い出される抗原を認識するので、CD4E1ファージを特異的にビオチン化することができることを示唆する。
実施例18−フローサイトメトリーにおけるシグナル増幅試薬としてのビオチンチラミンの使用
フローサイトメトリーにおいて蛍光シグナルを増強するための増幅システムとしてもシグナル転移を用いることができる。これは、HRP−コンジュゲート抗体又はリガンドを細胞に結合させることによって達成される。次に細胞は、選択手順のために記載されるように、過酸化水素及びビオチンチラミンで処理することができる。これは、抗体周辺又は細胞表面上のリガンド結合部位周辺のビオチンチラミン析出を引きおこすだろう。次に、ストレプトアビジン−フルオレセイン（FITC）を細胞に加えることができる。これは、細胞表面上に新しい析出したビオチンに結合し、FITCコンジュゲート抗体又はリガンドを用いる普通のFITC細胞ラベリングプロトコルと比べて、シグナルを増強させるであろう。これは、抗CD４+抗体、次の抗マウスFITCを用いて精製されたCD４+リンパ球上で達成されたラベリングを比較することにより、又は抗マウスHRP、次にビオチンチラミン処理、そして次にストレプトアビジン−FITCを用いることによる場合であることが示されている。
ａ．細胞ラベリング
CD４+リンパ球を実施例９に記載されるように精製した。細胞をPBS/BSAで１：1000に希釈して抗−CD４+抗体（Sigma）と共にインキュベートした。細胞をPBSで洗い、次に２つの第２抗体（抗マウス−FITC又は抗マウス−HRP）のいずれかをPBS/BSAでの１：1000の希釈でその細胞に加えた。サンプル当り１×105の細胞を用いた。PBS中で細胞を洗い、直接検出するか（抗マウスFITC）、又は先に記載されるようにビオチンチラミンで処理した。最適なシグナル増強がおこる濃度を決定するために、0.25μｇ／ml〜100μｇ／mlの濃度の範囲にわたってビオチンチラミンを加えた。ビオチンチラミン処理の後、細胞を再びPBSで洗い、次にPBSでの１：1000の希釈においてストレプトアビジン−FITCを加えた。フローサイトメトリーにより細胞を分析した。
ｂ．フローサイトメトリー結果
異なるビオチンチラミン濃度を用いて得られたピーク位置（即ち達成された蛍光の基準）をプロットした。その結果を図４に示す。図から見ることができるように、ビオチンチラミンでの最適な増強は、12.5μｇ／mlの濃度を用いて得られた。抗マウス−FITC第２抗体を用いて得られた最適なピーク位置は60蛍光単位であり、従って、ビオチンチラミンの使用はこのシグナルを５倍以上、有効に増強した（60から330蛍光単位）。
実施例19−更なるシグナル増強を供するためのビオチンチラミン処理の繰り返し
ストレプトアビジン−FITCを用いて、最終的な検出ステップの前に、ビオチンチラミン処理の繰り返しを行うことができる。最初のビオチンチラミン処理、次のストレプトアビジン−HRPの添加、その後の更なるビオチンチラミン処理により繰り返しを行った。この例は、更なるシグナル増強を供するための２回のビオチンチラミン処理の有効な使用を証明する。（単球、リンパ球及び顆粒球を含む）混合したFicoll精製された細胞調製物及び単球のマーカーである抗CD36抗体でのラベリングを、ここでモデルシステムとして用いた。
ａ．細胞ラベリング
Ficoll精製した細胞（サンプル当り１×106の細胞）を室温で30分、抗CD36抗体とインキュベートし、PBS/BSAで希釈（１：1000）した。細胞をPBS/BSAで洗い、次に室温で30分、抗マウスHRPコンジュゲート（PBS/BSA中１：1000）とインキュベートした。細胞を先の通り洗い、次に12.5μｇ／mlでビオチンチラミンで処理した。次に、ちょうど１回のビオチンチラミン処理にかけたサンプルを洗浄し、ストレプトアビジン−FITC（PBS/BSA中１：1000）と共にインキュベートした。ビオチンチラミンの更なる処理を行ったサンプルを室温で30分、ストレプトアビジン−HRP（PBS/BSA中１：1000）とインキュベートし、次に洗浄し、そして上述のようにビオチンチラミンで処理した。細胞も再び洗い、そして次に上述のようにストレプトアビジン−FITCとインキュベートした。
ｂ．結果
サンプルをフローサイトメトリーにより分析し、そして図５に示すように蛍光シフトを重ねた。図から見ることができるように、ビオチンチラミン処理の繰り返しは、細胞の平均蛍光レベルを2.5倍シフトさせた。これは、ビオチン化がHRPが局在するもとの部位から25nmまでの範囲にわたっておこり得るという予想された所定の観察結果である。最初のビオチンチラミン処理がHRPから半径25nmの球内のタンパク質をビオチン化すると仮定すると、これは、1963nm2であるπ252nm2のビオチン化の領域を供するであろう。ビオチンチラミンでの２回目の処理の場合、この領域内で析出したビオチンは、次にストレプトアビジン−HRPで飽和し、これによりいずれのストレプトアビジン−FITCの結合もブロックする。ビオチンチラミン処理を繰り返すと、ビオチン析出のもとの球の大きさの３倍の領域である5887nm2であるπ502−π252のイビオチン化の更なる領域を供する。これは、約2.5倍の実験で観察された蛍光シフトと適合する。
ビオチンチラミン処理の繰り返しの後に観察される蛍光シフトは、細胞表面タンパク質の細胞の複製数を測定するのに用いることができる。タンパク質が細胞表面上でまれであるなら、蛍光シグナルは、細胞表面が飽和するまで、ビオチンチラミン処理の連続で増加し続けるだろう。タンパク質が細胞表面上で高い複製数で発現されるなら、蛍光シグナルは、ビオチン化の球がオーバーラップするので、よりはやく飽和するだろう。
実施例20−それらの後の精製を許容するために細胞のサブ集団を特異的にビオチン化するためのビオチンチラミンの使用
この例は、複合体混合物内で細胞のサブ集団を特異的にビオチン化するため、及び次に豊富な集団を供するためにビオチン化した細胞を捕獲するためにビオチンチラミンを用いることを示す。ここで選択されるシステムは、単球細胞表面マーカーである抗CD36マウスモノクローナル抗体（Immunotech）を用いる。単球、リンパ球及び顆粒球の混合物をFicoll密度勾配により血液から精製した。リンパ球及び顆粒球はCD36を発現しないので、抗体は単球を特異的にビオチン化するはずである。その技術は、細胞表面に結合するいずれの分子にも、そしてsbpメンバー又はエピトープを提示するいずれの細胞型、ウィルス粒子、ビーズ又は他の粒子の集団に同様に適用できる。
ａ．バフィコートからの細胞の精製
Cambridge Blood Transfusion Serviceからの大人のバフィコート血液をDulbeccos PBS（組織培養グレード）で１：２に希釈し、次に1077密度Ficoll Hypaqwe（Sigma）上に充填した。次にこれをブレーキをはずして室温で30分、1500rpmで回転させた。界面にある細胞を除去し、PBSで１回、洗った。Ｒ＆Ｄシステムからの白血球赤血球溶解キット（Cat. no. WL1000）を用いることにより赤血球を除去した。細胞を５mlの溶解試薬中に再懸濁し、室温で５分、放置し、次に1000rpmで５分、回転させ、10mlの洗浄試薬で洗い、そして再び1000rpmで５分、回転させた。細胞をPBS/0.5％  BSA/２mM EDTA（PBE）中に再懸濁し、次に計数した。以下の実験の各々において、2.4×106の細胞を用いた。
ｂ．抗体インキュベーション及びビオチンチラミン処理
細胞（2.4×106）を４〜８℃で30分、マウスIgG抗ヒトCD36抗体（Immunotech 0765）（２μｇ／105細胞）とインキュベートし、PBEで洗い、そして1000rpmで５分、回転させた。ヤギ抗マウスHRP接合抗体とのインキュベーション（１：1000希釈）は抗CD36抗体についてのものと同じであった。全ての抗体をPBEで希釈した。細胞ペレットを、２μｌのビオチンチラミン（５μｇ）及び１μｌのH2O2を含む50mM Tris−HCl pH7.4の100μｌ中に再懸濁した。これを室温に10分、放置し、次に５mlのPBEで洗った。
ｃ．ビオチン化細胞の捕獲
これは、製造元の説明に従って、ストレプトアビジンMACSビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて行った。先の処理からの細胞を20μｌのMACSストレプトアビジン（Cat no. 481−01）と共に80μｌ PBE中に再懸濁した。インキュベーションを４℃で15分、行った。細胞をPBEで洗い、100μｌのPBEに再懸濁し、MACS磁石内に包まれたMACSカラム上に充填した。カラム上に細胞を走らせ、次に未結合の細胞を除去するために、そのカラムを２×ｌmlのPBEで洗った。磁石からカラムを除き、１mlのPBEを加え、そして次にカラムを通してPBEを押すためにそのプランジャーをリザーバーに押すことにより、カラムから細胞を溶出した。細胞をエッペンドルフに溶出し、そして次にマイクロフュージ内で５分、4000rpmで回転させた。細胞ペレットを80μｌのPBEに再懸濁し、20μｌの抗CD36抗体をフルオレセイン（Immunotech 0766）にコンジュゲートさせた。細胞を20分、暗所で４℃でインキュベートした。次にフローサイトメトリーによりサンプルを分析した。
ｄ．結果
抗CD36抗体、次に抗マウスHRP及びビオチンチラミン処理を、ストレプトアビジンビーズ上に後に捕獲される細胞のサブ集団をビオチン化することにおいて連続的であった。その捕獲された細胞は、CD36陽性であることが見い出され、フロー分析における前方及び側方散乱により、適切な位置において単球であることが見い出された（図９）。
実施例21−ビオチン−チラミン調製物を確認するための溶液中のファージ粒子のビオチン化
ファージ調製物を実施例12パートａ）に記載される通りに作った。ファージ粒子を１mlで１×109ファージのタイターに希釈し、遺伝子８タンパク質HRPコンジュゲートを認識する１μｌのHRPコンジュゲートマウスMab（Pharmacia）を溶液中のファージに加えた。これを室温で１時間、インキュベートし、そして次にそのファージを実施例12パートｂ）に記載されるようにビオチンチラミンで処理した。通常の保存液の１：100倍希釈から通常の濃度の100倍過剰までの範囲のビオチンチラミンの更なる希釈を一定に維持した。次にビオチン化ファージを30μｌの予めブロックしたストレプトアビジンコートビーズ上に捕獲し、そのビーズを上述のように洗った。ビーズ上に捕獲されたファージを滴定し、最大のビオチン化を供する最適なビオチンチラミン濃度を確立した。結果を図７に示す。
これは、ビオチンチラミンの調製を確認する手段を供し、そして異なるバッチ間の比較を許容する。２つの異なるビオチンチラミンの調製について最適なビオチンチラミンを評価し、それは同等であることが見い出された。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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