(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導可能な異種プロモーターに作動可能に連結されたアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細胞株であって、該ｒｅｐ遺伝子が細胞のゲノム中に安定に組み込まれており、機能的なＲｅｐタンパク質を発現しうる、細胞株。
【請求項２】
前記株が、ヒト２９３細胞由来である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
前記プロモーターが、マウスメタロチオネインＩ遺伝子プロモーターである、請求項１または２に記載の細胞株。
【請求項４】
前記プロモーターが、マウスメタロチオネインＩ遺伝子の転写開始部位の−６５０ｂｐから該部位の６９ｂｐ下流までの該遺伝子のフラグメントからなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項５】
ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １１４８４として寄託された細胞系ｎｅｏ６。
【請求項６】
ＡＡＶｒｅｐおよびキャプシド遺伝子を発現させる条件下で請求項１ないし５のいずれか１項に記載の細胞系を培養することを包含する、野生型ＡＡＶを生じさせることなく組み換え型ＡＡＶベクターをパッケージングする方法であって、該細胞系がヘルパーウイルスに感染させられ、該組み換え型ＡＡＶベクターが該細胞系に導入されるものであり、該ＡＡＶベクターが該細胞系中のＡＡＶ配列と重複する相同性を欠き、機能的なＡＡＶキャプシド遺伝子を有するかあるいは機能的なＡＡＶキャプシド遺伝子を有する第２のベクターで相補されるものであり、そのことにより該組み換え型ＡＡＶベクターがパッケージングされるものである、方法。
【請求項７】
該組み換え型ＡＡＶベクターの導入が、該組み換え型ＡＡＶベクターを含むプラスミドでのトランスフェクションによるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該組み換え型ＡＡＶベクターの導入が、該組み換え型ＡＡＶベクターを含むＡＡＶ粒子での感染によるものである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
組み換え型ＡＡＶ粒子を細胞系に感染させる方法であって、下記工程：
（ａ）ヘルパーウイルスに感染された請求項１ないし５のいずれか１項に記載の細胞系を組み換えＡＡＶ粒子に感染させること、ここに該粒子は、機能的なＡＡＶキャプシド遺伝子を有するか、機能的なＡＡＶキャプシド遺伝子を有する第２のベクターで相補されるかのいずれかのベクターを含有するものである；次いで
（ｂ）該感染された細胞を、該ＡＡＶｒｅｐおよびキャプシド遺伝子の発現を可能にする条件下で培養すること
を包含する方法。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の細胞系を製造する方法であって、下記工程：
（ａ）ＡＡＶに感染しうる哺乳動物細胞系を、異種の誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有するＡＡＶベクターでトランスフェクションすること；
（ｂ）トランスフェクションされた細胞を、ｒｅｐ遺伝子の発現を可能にする条件下で培養すること；
（ｃ）Ｒｅｐタンパク質を安定に産生する細胞を選択すること、ここにｒｅｐ遺伝子は細胞のゲノム中に安定に組み込まれているものであり；次いで
（ｄ）該細胞を増殖させて細胞系を得ること
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
支援の認知
本発明は以下の支援によって成された：（ｉ）国立衛生研究所よりR29 CA 58743に基づく米国政府；（ii）1-FY92-0527に基づくMarch of Dimes Birth Defects Foundation;および（iii）Ohio Cancer Research Associates。以上３つの機関は、本発明において所定の権利を有する。
技術分野
本発明は遺伝子治療に関し、そしてより詳細には安定な細胞株で、野生型AAVを産生せずに組換えアデノ関連２型ウイルス（AAV）ベクターをパッケージングするのに有用な細胞株に関する。
背景
AAVベクターは、少数の組換えウイルスベクター系の１つで、インビボでの遺伝子導入因子として有用性を有することが示されており（Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539; Muzcyzka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129）、それ故、ヒトの遺伝子治療に極めて重要である可能性がある。AAVベクターは、高頻度の安定なDNA組み込みおよび種々の細胞における発現が可能であり、このような細胞には、嚢胞性線維症（CF）の気管支上皮細胞および鼻上皮細胞（Flotteら、1992a, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356; Eganら、1992, Nature, 358:581-584; Flotteら、1993a, J. Biol. Chem. 268:3781-3790; Flotteら、1993b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA、印刷中）、ヒト骨髄由来赤白血病細胞（Walshら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261）、およびその他いくつかの細胞が含まれる。AAVは、安定な発現のために活発な細胞分裂を必要とするわけではない。このことは、特にヒト気道上皮のような組織であって、殆どの細胞が最終的に分化し、そして分裂しない組織において、レトロウイルスより明らかに有利である。
AAVは、欠損型パルボウイルスであり、所定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ増殖する。AAVに関する一般的見解は、Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses、第１巻、169-228頁、Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses、第１巻、169-228頁、Berns, 1990, Virology、 1743-1764頁、Raven Press, New Yorkに見い出され得る。AAVの増殖および複製に対してヘルパー機能を提供する同時感染ウイルスの例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびいくつかの場合、ワクシニアウイルスのような天然痘ウイルスがある。ヘルパー機能の性質は知られていないが、細胞にAAV複製をさせるようなヘルパーウイルスのある程度の間接的効果であるようである。この概念は、細胞が遺伝障害性であるかまたは細胞周期を破壊するかのいずれかの因子で処理される場合、所定の場合において、AAVの複製は、ヘルパーウイルス同時感染の非存在下において低い効率で生じ得るという観察によって支持される。
AAVは、かなり幅広い宿主範囲を有し、明らかな種または組織特異性を伴わず、そして適当なヘルパーが存在する限り事実上ヒト、サル、または齧歯類起源のいずれの細胞株においても複製する。AAVは偏在性であり、そして殆どの哺乳動物およびいくつかのトリ種を含む幅広い動物種から単離されている。
AAVはどの疾患の原因としても同定されていない。AAVは形質転換ウイルスまたはガンウイルスではない。AAVのヒト細胞株染色体への組み込みによって、細胞の増殖特性または形態的特徴におけるいずれの有意な変化も生じない。これらのAAVの特性から、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクターとしてAAVが勧められる。何故なら、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または天然痘ウイルスのようなこの適用に対して提案される他の殆どのウイルス系は、疾患を引き起こすウイルスであるからである。
AAVゲノムは、各末端上の１コピーの145ヌクレオチド長のITR（逆方向末端反復）および4470ヌクレオチド長の非反復配列領域（Srivastavaら、1983, J. Virol., 45:555-564）を有し、repおよびcap遺伝子に対する２つの主なオープンリーディングフレームを含む（Hermonatら、J. Virol., 51:329-339; Tratschinら、1984a, J. Virol., 51:611-619）。この非反復領域は、３つの転写プロモーターｐ5、ｐ19、およびｐ40を含み（Laughlinら、1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5567-5571）、これらは、repおよびcap遺伝子を発現するために用いられる。ITR配列はシス型で要求され、そして機能的な複製起点（ori）を提供するのに十分であり、また、細胞ゲノムへの組み込みならびに宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよびレスキューに必要なシグナルを提供するのに十分である。さらに、ITRは、AAVベクターの転写プロモーターとして直接機能し得ることが示されている（Flotteら、1993、上記を参照のこと）。
repおよびcap遺伝子はトランス型で要求されて、それぞれウイルスゲノムの複製および包膜化機能を提供する。rep遺伝子は２つのプロモーター、ｐ5およびｐ19から発現される。ｐ5からの転写により、スプライシングされていない4.2kb mRNA（タンパク質、Rep78をコードする）およびスプライシングされた3.9kb mRNA（タンパク質、Rep68をコードする）が生成される。ｐ19からの転写により、スプライシングされていないmRNA（Rep52をコードする）およびスプライシングされた3.3kb mRNA（Rep40をコードする）が生成される。それ故、４つのRepタンパク質は全て共通の内部領域配列を含むが、アミノおよびカルボキシル末端領域が異なる。Rep78およびRep68のみがAAV二本鎖DNAの複製に要求されるが、Rep52およびRep40は、子孫、一本鎖DNA蓄積に必要であるようである。Rep78およびRep68の変異は、表現型がRep-であるが、Rep52およびRep40のみに影響する変異は、Rep+であるがSsd-である。Rep68およびRep78は、AAV ITRのヘアピン構造に特異的に結合し、そしてAAVの末端で複製を決定するのに必要ないくらかの酵素活性を有する。Rep52およびRep40にはこれらの特性はない。
Repタンパク質、主にRep78およびRep68は、AAV遺伝子のポジティブおよびネガティブ調節ならびにいくつかの異種プロモーターからの発現を含むいくらかの多面的調節活性、および細胞増殖に対する阻害効果を示す（Tratschinら、1986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894; Labowら、1987, Mol. Cell. Biol., 7:1320-1325;Khleifら、Virology, 181:738-741）。AAV ｐ5プロモーターは、Rep78およびRep68によってネガティブに自己調節される（Tratschinら、1986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894）。
AAVベクター構築物の一般的な原理は、最近考察されたように定義された（Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539; Muzyczka, 1992, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129）。AAVベクターは、AAV組換えプラスミド内でAAVをコードする配列部分を外来性DNAに置き換えてベクタープラスミドを作製することによって、構築される。ベクタープラスミドにおいて、AAV配列の末端（ITR）部分は完全に保持されていなければならない。何故なら、これらの領域は、いくつかの機能について、シス型で要求されるからであり、これらの機能には、トランスフェクション後のプラスミドの切り出し、ベクターゲノムの複製、ならびに宿主細胞ゲノムからの組み込みおよびレスキューが含まれる。次にベクターはAAV粒子内にパッケージングされ得、ベクタープラスミドの細胞へのトランスフェクションにより、AAV導入ウイスルを生成する。ここで細胞は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような適切なヘルパーウイルスに感染されている。ベクターゲノムの複製およびAAV粒子への包膜化を達成するために、ベクタープラスミドは、トランス型で要求されるいずれのAAV機能、すなわち、repおよびcapについても相補的でなければならない。このような機能は、ベクタープラスミドの構築において欠失した。
記載のように、AAVベクターは、遺伝子治療によるヒト疾患の処置のための潜在的な有用性を有する。AAV遺伝子治療に関する制限的要因の１つは、使用されているベクターパッケージング系の相対的非効率性である。repおよびcapのようなAAVのトランス相補機能を発現する細胞株がないために、AAVベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドとベクタープラスミドとの同時トランスフェクションにより、アデノウイルス感染細胞で達成されている。この処理の効率は各プラスミド構築物のトランスフェクション効率および現在までに記載されているパッケージングプラスミド由来のRepタンパク質の発現レベルによって、制限され得る。これらの問題のそれぞれは、AAV Repタンパク質の生物学的活性に関するようである。さらに、そして上記のように、上記の全てのパッケージング系は、複製により野生型AAVを産生する能力を有する。
機能的Repを安定に発現する細胞株がないことは、Repのneo-耐性コロニー形成による阻害により示されるように、Repの細胞傷害性または静細胞性機能を反映する（Labowら、1987; Trempeら、1991）。これはまた、Repが培養細胞の不死化された表現型を復帰させる傾向に関するようである。このような傾向は、機能的なRepを安定に発現する細胞株の産生を極めて困難にしている。Repを発現する細胞株を作製するためのいくつかの試みが行われている。Mendelsonら（1988, Virology, 166:154-165）は、AAV rep遺伝子を含むプラスミドでのHeLaまたは293細胞の安定なトランスフェクション後、非常に低いレベルの発現の所定のAAV Repタンパク質が得られるが、このレベルは、ベクターの産生に不十分であったことを報告した。Vincentら（1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press、353-359頁）は、通常のAAVプロモーターから発現されるAAV repおよびcap遺伝子を含む細胞株を作製することを試みたが、ベクターに100倍過剰の野生型AAV粒子が混入したか、またはベクターが４×103未満の非常に低い力価でしか産生されないかのいずれかにより、これらの試みは成功しなかった。別のアプローチにおいて、Lebkowskiら（米国特許第5,173,414号、1992年12月22日発行）は、エピソームプラスミド中にAAVベクターを含有する細胞株を構築した。次にこれらの細胞株は、アデノウイルスに感染され得、そしてトランス相補AAV機能、repおよびcapでトラスフェクトして、AAVベクターの調製物を作製した。これにより、より高い力価のAAVストックが産生され得ることが主張される。しかし、示した例において、力価に関する唯一の情報は、１つのヒト細胞株、K562が、僅か１%またはそれ未満の効率で形質導入され得たことであり、このことは、AAVベクターの高力価の産生を示さない。この系において、ベクターは、エピソーム（非組み込み構築物）として保持されており、そしてベクターの組み込まれたコピーは好ましくないことが示されている。
Lebkowskiら、1992により記載のAAVベクターのパッケージングに対するアプローチは、いくつかの所望しない局面を有する。第１に、非組み込みとしてベクターを維持するので、細胞株中の高いコピー数のエピソームプラスミドは望ましくない。何故なら、細胞当たりのコピー数は厳密に制御され得ないからである。そしてエピソームDNAは、より再配列を受け易く、欠損ベクターの産生を招く。第２に、この系において、ベクターはなお、アデノウイルスで細胞株を感染し、AAV repおよびcap遺伝子を含むプラスミドを導入することによりパッケージングされなければならない。Lebkowskiら、1992が使用したプラスミドはまた、pBa1であった。pBa1は上記のように、ベクターITRの配列と重複相同性を有し、そして野生型AAVの生成を生じる。第３に、Lebkowskiら、1988, 1992が使用したpBa1パッケージングプラスミドにおいて、rep遺伝子は、その相同なｐ5プロモーターが働かない状態で発現され、それ故に、ネガティブに自己調節され、従って、rep発現は制限されるようである。
プラスミドトランスフェクション後のrepの発現が次善のレベルであるという問題は、これらのタンパク質の別の生物学的活性に関し得る。AAV-Repタンパク質がAAV-ｐ5プロモーターからの自身の発現をダウンレギュレートするという証拠（Tratschinら、1986, Mol. Cen. Biol. 6:2884-2894）があるが、このようなプロモーターは、pAAV/Ad（Samulskiら、1989）またはpBa1（Lebkowskiら、1988, 1992）のような既に記載の全てのパッケージング構築物において用いられている。
本発明は、比較的、高いレベルのRep78が可能でかつ野生型AAVを産生せずにAAVベクターをパッケージングするのに有能な、安定な細胞株を提供する。
発明の開示
本発明の１つの局面は、異種プロモーターまたはRep78非感受性転写プロモーターに作動可能に連結されたrep遺伝子を有するAAVベクターを有する安定な細胞株であって、該細胞株が機能的Rep78を産生可能である、細胞株である。
本発明の別の局面は、野生型AAVを産生せずに組換えAAVベクターをパッケージングする方法であって、ヘルパーウイルスに感染した上記細胞株を組換えAAVベクターでトランスフェクトする工程であって、ここで該AAVベクターは、AAV cap遺伝子を発現可能であるか、またはAAV cap遺伝子を発現可能な第２のベクターと相補的であるが上記細胞株中のAAV配列との重複相同性のない、工程、およびトランスフェクトされた細胞をrepおよびcap遺伝子の発現を可能にするような条件下で培養する工程を包含する、方法である。
本発明のさらなる別の局面は、上記細胞株を産生する方法であって、異種プロモーターまたはRep78非感受性転写プロモーターに作動可能に連結されたrep遺伝子AAVベクターで、AAVによる感染が可能な哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程、トラスフェクトされた細胞をrepおよびcap遺伝子の発現を可能にするような条件下で培養する工程、培養物から安定にRep78を産生する細胞を選択する工程、および該細胞を増殖させて細胞株を産生する工程を包含する、方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、pMtrepプラスミドの図である。
図２は、重金属誘導非存在下（-）または存在下（+）で培養した種々のネオマイシン耐性クローンまたはpMtrepのpAW2でトランスフェクトされた293細胞由来のRepタンパク質のウエスタンブロット分析の網版複製図である。レーンE.coliは、原核細胞発現ベクター由来のRepタンパク質を含む。
図３は、neo6細胞から産生されたRep78を用いるAAV末端反復結合アッセイの網版複製図である。DNA結合反応は、抽出物なし（レーンなし）、あるいはpCDM8（レーンpCDM8）またはpCDMrep（レーンpCDMrep）でトランスフェクトされた293細胞あるいは誘導（+）または非誘導（-）のneo5またはneo6細胞由来の１μlの核抽出物を含んだ。
図４は、誘導の存在下（+）または非存在下（-）におけるrep遺伝子変異のAAVゲノムについてのパッケージングアッセイのサザンハイブリダイゼーション分析の網版複製図である。
図５は、コロニー形成効率（CFE）アッセイからのプレートの網版写真である。
図６は、MTT増殖アッセイの結果を示すグラフである。重金属誘導の存在下（+）または非存在下（-）における細胞増殖曲線は、４つの実験に由来する。結果を、光学密度（O.D.）対プレーティング後の時間（日）として表す。
発明を実施するための態様
本発明の実施には、他に示さない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を用いるが、これらは当該分野の範囲内にある。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（1989）、Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait編、1984）、Animal Cell Culture（R.I. Freshney編、1987）、双書Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）; Gene Trasfer Vectors for Mammalian Cells（J.M. MillerおよびM.P. Calos編1987）、Handbook of Experimental Immunology、（D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編）、Current Protocols in Molecular Biology（F.M. Ausubel、R. Brent、R.E. Kingston、D.D. Moore、J.G. Siedman、J.A. Smith、およびK. Struhl編、1987）、およびCurrent Protocols in Immunology（J.E. Coligan、A.M. Kruisbeek、D.H. Margulies、E.M. Shevach、およびW. Strober編、1991）を参照のこと。本明細書中に記載の全ての特許、特許出願、および刊行物は、上記および下記ともに、本明細書中に参考として援用されている。
本発明の細胞株は、AAV感染を受け易いいずれの哺乳動物の親細胞株にも由来し得る。既に示されるように、AAVは、非常に幅広い宿主の範囲を有し、そしてサル、ヒト、および齧歯類細胞を含む種々の哺乳動物細胞型から単離されている。遺伝子治療のために、適切なヘルパー機能が発現され得るヒト細胞株が使用される。本発明の細胞株が誘導され得るこのようなヒト細胞株の例には、293、HeLa、A549、KB、Detroit、およびWI38がある。293細胞は特に好ましい。
本発明の細胞株は、親細胞株を異種プロモーターまたはAAV Rep78非感受性プロモーターに作動可能に連結されたAAV rep遺伝子を有するプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を選択培地中で培養し、生存細胞をAAV rep遺伝子の発現を促進する条件下で培養し、Rep78を産生する細胞を選択し、そしてRep78産生細胞を培養することによって、産生される。
親細胞をトランスフェクトするために使用されるrep遺伝子を含むプラスミドは、細胞に安定に組み込まれ得なければならず、そしてトランスフェクトされた細胞のヘルパーウイルスによる感染によってレスキューされてはならない。これは、異種の転写プロモーターに作動可能に連結されたAAV rep遺伝子を包含する。このプロモーターは、相同であり得るが、少なくとも発現されたRep78タンパク質によって完全にダウンレギュレートされない程度に、Rep78非感受性でなければならない。許容可能なプロモーターは、rep遺伝子発現によって、ある程度ダウンレギュレートされ得るが、あまり強力ではない。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、以下のものが挙げられる：メタロチオネインプロモーターのような重金属誘導性プロモーター；MMTVプロモーターまたは成長ホルモンプロモーターのようなステロイドホルモン誘導性プロモーター；アデノウイルスE1Aタンパク質によって誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター、またはアデノウイルス主要後期プロモーターのようなヘルパーウイルスによって誘導可能なプロモーター；VP16またはICP4のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導可能なヘルペスプロモーター；ワクシニアウイルスまたは天然痘ウイルス誘導性プロモーターまたは天然痘ウイルスRNAポリメラーゼによって誘導可能なプロモーター；天然痘ウイルスRNAポリメラーゼによって誘導可能なT7ファージ由来のプロモーターのような細菌プロモーター；またはT7 RNAポリメラーゼ由来のプロモーターのような細菌プロモーター。rep発現のための異種プロモーターとしての使用に適切な強力な構成プロモーターには、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス即時型プロモーター、βアクチンプロモーター、またはβグロビンプロモーターが含まれる。RNAポリメラーゼIIIに活性化されたプロモーターもまた、使用され得る。
以下に示すような実施例において、親細胞をneo遺伝子含有ベクターで同時トランスフェクトし、そしてジェネテシン（geneticin）含有培地中で培養することによって初期選択を実施した。もちろん、他の選択マーカーも使用され得ることは明らかである。初期選択後、生存細胞を単離し、rep遺伝子の発現が可能な条件（例えば、誘導性プロモーターの場合、培地中に誘導剤を含有させる）下で培養し、回収し、そしてRep78産生についてアッセイした。ウエスタンブロッティングまたは他の適切なアッセイが使用され得る。Rep78を産生するクローンを拡大させて、本発明の細胞株を産生する（用語「細胞株」は、原株の子孫（サブクローン）を包含することを意図する）。安定性は、少なくとも12か月および約50継代以上にわたってRep78を産生する能力によって明示される。細胞によるRep78タンパク質産生のレベルは、細胞を用いて組換えAAVベクターをパッケージングし得るのに十分である。本発明の方法に従って、パッケージングされたベクターは、１ミリリットル当たり2.8×107〜1.4×108ウイルス粒子の範囲の力価で上清中で測定されている。一般に、先行技術は濃縮手順後のレベルを報告しているにも関わらず、これらの上清中力価は、先行技術に非常によく類似する。
本発明のパッケージング細胞株を使用して、組換えAAVベクターを以下のようにしてパッケージングする。
組換えAAVベクターは、AAV ITR領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結された転写プロモーターから構成される。標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結された転写プロモーターは、転写物の形成を可能にし、そして、例えば、非AAVプロモーターならびにｐ5、ｐ19、ｐ40、およびAAV ITRプロモーターのようなAAVプロモーターを包含する。標的ポリヌクレオチドの転写産物および/または翻訳産物は、好ましくは遺伝子治療において有用であり得る。従って、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子治療のために送達される遺伝子、例えば、ヘモグロビンのサブユニット鎖、酵素、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（CFTR）のようなタンパク質などをコードする遺伝子を含む。標的ポリヌクレオチドはまた、転写時にアンチセンス分子、転写因子または翻訳因子に結合するデコイ、リボザイムなどとして、活性を有するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドはまた、サイトカインおよび主要組織適合性遺伝子のような免疫応答モジュレーターをコードする遺伝子を包含する。遺伝子治療に使用され得るポリヌクレオチドのもう１つのクラスは、レシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子およびメトトレキセート耐性のミュータン（mutane）ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のような特定の薬物に対して感受性にする遺伝子である。別の標的ポリヌクレオチドは、肺ガン、乳ガン、およびその他のガンのタイプに関連する消失または損傷p53遺伝子の代償療法のための野生型p53腫瘍サプレッサーcDNAである。
細胞は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスに感染され、そして次いでベクターによりトランスフェクトされる。ベクターを導入する他の手段、例えば、エレクトロポーレーションも使用され得る。相補AAVキャプシド機能は、細胞をAAV cap遺伝子を発現し得るベクターで同時トランスフェクションすることによって提供される。相補ベクターは、ｐ40プロモーターのような相同AAVプロモーターまたは異種プロモーターのいずれかからcap遺伝子を発現し得る。あるいは、AAV cap遺伝子は、第１ベクター（primary vector）に含まれ得、それ故、相補ベクターの必要性を除く。野生型AAVの発達を避けるために、トランスフェクションAAVベクターは、既にヘルパーウイルスで感染された細胞中のAAV配列との重複相同性を有するべきではない。
トランスフェクション後、細胞はrepおよびcap遺伝子の発現ならびにAAVの複製を可能にするような条件下で培養される。rep遺伝子が誘導性プロモーターに作動可能に連結される場合、適切な誘導剤が培地に含まれる。細胞は、典型的には２〜５日間増殖され、溶解物が調製され、そして組換えAAVベクター粒子が、当該分野で既知の技術によって精製される。
以下の実施例は本発明をさらに説明する。これらはいかなる様式においても本発明を制限することを意図しない。
下記のneo6細胞株は、1993年11月９日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）、12301 Parklawn Dr.,Rockville, Maryland 20852に寄託され、そして受諾番号CRL 11484で登録されている。この寄託はブダペスト条約の条項に基づいて行われた。米国特許としての本出願の特許査定および発行において、寄託の利用性におけるあらゆる制限は不変的に除去される；そして米国特許法施行規則§1.14および米国成文法§1.22に基づき権利を与えられた特許局長により決定された者に対する上記特許の係属期間の間、登録された寄託の利用が可能である。さらに、登録された寄託は寄託の日付から30年の期間、または寄託に対する新規の要請後５年間；または本米国特許の実施期間のいずれかのうち、長い方の期間だけ維持される。本明細書に記載の寄託物は、便宜上のみのために意図され、本明細書中の説明に関して本発明を実施するために必要とされるわけではなく、さらにこれらの物質は、本明細書中において参考として援用される。
実施例
実施例１
プラスミドの産生
プラスミド構築、成育、および精製について、標準的な手順に従った（Ausubelら、（編）1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.）。２型アデノウイルスを感染多重度（MOI）５で使用した。プラスミドpMtrep（図１）は、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子の1.9kbpのDNAフラグメントに作動可能に連結されたAAVゲノムのデオキシリボヌクレオチド263〜2233の野生型rep遺伝子を含有する。このメタロチオネインＩ遺伝子のDNAフラグメントは、重金属誘導性の転写プロモーターを含有する（HamerおよびWalling. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1:273-288.; Yangら、1992. J. Virol. 66:6058-6069）。プラスミドpCDMrepは、pCDM8ベクター（Invitrogen Corp.）に挿入された同一のrep遺伝子配列を含む（YangおよびTrempe. 1993. J. Virol. 67:4442-4447）。
プラスミドpΔMtrepを、pMtrepの部分的KpnI消化の実施、ならびに転写の開始部位から−650bpのKpnI部位から開始部位の69bp下流までのマウスメタロチオネインＩプロモーター、約18bpのpGEM3Zポリリンカー配列（HindIIIからXhoI部位まで）、AAVゲノムの263-2233のAvaI制限エンドヌクレアーゼフラグメントを含むAAVのrep遺伝子配列、および約21bpのpGEM3Zポリリンカー配列（XhoIからKpnI部位まで）を含有する2725bpのフラグメントの単離により構築した。2725bpのKpnIフラグメントをプラスミドpAW1のKpnI部位に挿入し、p△Mtrepを作製した。プラスミドpAW1を、336bpのKpnI〜SnaBIフラグメント（pAV2由来のAAVポリアデニレーションシグナルを含有している）を、EcoRI部位をE.coliのDNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントにより平滑末端に変換したpGEM3ZのEcoRI〜KpnI部位に挿入することにより作製した。従って、pΔMtrepはマウスメタロチオネインのmRNAの69bpのリーダー配列および重金属誘導が可能なすぐ上流の調節因子を含むが、pΔMtrepはプロモーターから上流のエンハンサー因子を欠失している。
プラスミドpJDT279は完全なAAV2ゲノムを含むが、これはヌクレオチド814位のSstI部位のrep遺伝子内にフレームシフト変異を有する（Tratschinら、1984. J. Virol. 51:611-619）。プラスミドpSV2neoは以前に記載されている（SourthernおよびBerg. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341）。
実施例２
Repタンパク質を発現する誘導性細胞株の産生
ヒト293細胞（Grahamら、1977. J.Gen. Virol. 36:59-72）を抗生物質および10％ウシ胎児血清を補充したEagle最小必須培地（MEM）内で成育させた。全てのDNAトランスフェクションは50〜70％密集度の培養物上でリン酸カルシウム法を用いて、培養シャーレ上に細胞をプレートした１日後に実施した（Ausubelら、（編）1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.）。
AAVのrep遺伝子により仲介される細胞増殖の阻害は、十分なレベルのRepタンパク質を発現する細胞株の発達を妨げた。これらの抗増殖効果を回避するために、rep遺伝子を誘導性のマウスメタロチオネインＩ（Mt）転写プロモーターに、作動可能に連結した（Yangら、1992. J. Virol. 66:6058-6069）。pΔMtrepの構築に用いたMtプロモーターフラグメントは、メタロチオネイン遺伝子の第一エキソンの64bpからプロモーターの−650までを含む。このプロモーターは基底レベルの発現を縮小するが、その重金属誘導性を保持する（KARIN）。pΔMtrepおよびpSV2neoを293細胞に同時トランスフェクトし、そしてneo遺伝子を獲得し、発現する細胞を選択するためにジェネテシンを用いた。誘導におけるRepタンパク質の産生のためにジェネテシン耐性クローンをスクリーニングした。35mmシャーレ上の２×105ヒト293細胞を2μgのpSV2neoおよび6μgのp△Mtrepで同時トランスフェクトした。誘導性細胞株を10％の透析FBSおよび1mg/mlのジェネテシン（Sigma Chem. Co.）（600μg/ml活性成分）を含むMEM培地内で成育させた。全ての細胞を37℃、5.0％ CO2大気中で単層培養として維持した。２日後、細胞をトリプシン処理し、希釈し、そして100mmシャーレにプレートし、単一細胞クローンを増殖させた。48時間後にMEM内に0.6mg/mlのジェネテシン（Sigma Chemical Corp.）の活性成分を含む選択培地に細胞を曝した。
培養物を選択培地内で10〜14日間成育させた後、生存するコロニーを単離し、培養し、そしてRepタンパク質の発現について分析した。Repタンパク質の発現を誘導するために、培養物を回収し、Repタンパク質の発現について分析する16〜24時間前に、細胞培養培地を２μm CdSO4および100μm ZnCl2に調整した。Repの発現を検出するウエスタンブロット分析をRep特異的抗血清（Trempeら、1987. Virology 161:18-28）を用いて以下に記載のように実施した。１個のクローン（Neo6）は、抗Rep抗血清を用いたウエスタンブロットアッセイによる測定により、十分な量のRep78を発現していることが見出された（図２）。他のジェネテシン耐性クローン（neo5）は、誘導において検出可能なRepタンパク質を全く発現しなかった。Neo6細胞の間接免疫蛍光は、30〜70％の間の細胞がRepタンパク質発現にポジティブであることを示した（YangおよびTrempe、未発表のデータ）。
Repポジティブ細胞のより高度のパーセンテージを得るために、Neo6細胞を限界希釈によりサブクローン化した。Neo6のサブクローニングは、Neo34、Neo36、Neo39、およびNeo40のクローンを産生し、それら全ては、誘導されると十分なレベルのRep78を産生する（図２）。クローンNeo34はこのウエスタンブロット上には示されていないが、これはNeo6のレベルに匹敵するレベルのRep78を産生した（YangおよびTrempe、同書）。サブクローン間のRepタンパク質を発現する細胞の比率は、親のNeo6細胞の比率に匹敵する（約60％）ことが免疫蛍光から判断された。そして染色はまた、核に制限されていた（YangおよびTrempe、同書）。
タンパク質抽出および分析。35mmシャーレ中の３×105のジェネテシン耐性細胞を誘導し、Repタンパク質を発現させた。細胞株またはトランスフェクトした細胞由来のRepタンパク質を核から200mM NaCl含有STM-NP緩衝液で、既出記載（Yang、同書）のように抽出した。タンパク質抽出物をドデシル硫酸ナトリウム12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、既出記載（Yangら、1992. J. Virol. 66:6058-6069）のようにウエスタンイムノブロッティングにより分析するか、あるいはゲル移動度シフトアッセイに用いた。
ゲル移動度シフトアッセイ。Rep78は、ヘアピン構造中に存在するAAVの末端反復配列に結合することによりAAVのDNA複製を仲介し、この特性はインビトロで再現され得る（AsktorabおよびSrivastave. 1989. J. Virol. 63:3034-3039;ImおよびMuzyczka. 1989. J. Virol. 63:3095-3104）。以下のヘアピン結合アッセイを実施し、Neo6細胞由来のRep78が機能性であることを確立した。5,000cpm放射性標識したAAVヘアピンをそれぞれの反応に用いた。図３は、Neo5、Neo6、および野生型rep遺伝子プラスミドでトランスフェクトした細胞由来の核抽出物を用いた、AAVヘアピン結合アッセイを示す。誘導されたNeo6細胞から産生されたRep78タンパク質は、放射性標識したヘアピンに効率的に結合した；ところが、非誘導Neo6細胞由来の核抽出物を用いた場合には、移動度シフトは観測されなかった。これは、誘導の非存在下でRep78が検出されない場合のNeo6細胞のウエスタンブロッティング分析と一致する（図２）。シフトしたバンドは、非標識のAAVヘアピンの過度の添加により見えなくなり得、あるいはRepタンパク質に対する抗体によりスーパーシフトし得た（YangおよびTrempe、未発表のデータ）。
これらの移動度シフトアッセイのポジティブコントロールとして、pCDMrepをトランスフェクトした293細胞から核抽出物を調製した。この細胞はAAV末端反復配列に効率的に結合するRep78を含むことが公知である（YangおよびTrempe. 1993. J. Viol. 67:4442-4447）。プラスミドpCDM8をトランスフェクトした293細胞またはコントロールクローンNeo5由来の核抽出物はヘアピン構造をシフトさせなかった。放射性標識AAVヘアピンDNAへのRep78タンパク質の結合は、既出記載（YangおよびTrempe、同書）のようにして実施した。これらの細胞株から産生されたRep78は、pMtrepでトランスフェクトしたヒト293細胞由来のRep78が結合した後と同様の移動度を有し、他者に観測された（ImおよびMuzyczka. 1992. J. Virol. 66:1119-1128）ように、結合したタンパク質は二量体として現れる。
これらの細胞で発現されるRepタンパク質の優勢な形態はRep78である。これは、順にRep68合成を制限し得る効率的なAAVのmRNAスプライシングを可能にするヘルパーウイルスの感染の非存在に起因し得る（TrempeおよびCarter. 1988. J. Virol. 62:3356-3363）。Rep52の発現の欠如はまたp19の発現を増加させることが示されたアデノウイルスの感染（Tratschinら、1984. Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081）の非存在、または同様にｐ19の発現に刺激効果を有するAAV末端反復（Beatonら、1989. J. Virol. 63:4450-4454）の欠如に起因し得る。
AAVのDNA複製およびパッケージングアッセイ。AAVのDNA複製の測定のために、2μgのpJDT279を２型アデノウイルスの同時感染（MOI=5）の存在下で、指示した細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、Hirt上澄みDNAを調製した（Hirt. 1967. J. Mol. Biol. 26:365-369）。次いで標準的な技術を用いて、DNAをDpnIで消化し、アガロース電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターペーパーにトランスファーし、放射性標識したAAVのcap遺伝子のプローブとハイブリダイズさせ、そしてオートラジオグラフィーにより処理した（Ausubelら、（編）1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates、Brooklyn、N.Y.）。ハイブリダイゼーションプローブは、AAVゲノムの2397〜3981の配列を含むpJDT279由来のHincII制限エンドヌクレーゼフラグメントであった。
実施例３
組換えAAVベクターのパッケージング
感染性の変異AAV粒子を産生させる現在の方法は、ウイルス性の複製起点を含むAAVベクタープラスミド、ならびにAAVのrepおよびcap遺伝子を含むプラスミドの同時トランスフェクションを利用する。この方法の制限は、任意の相同的な配列が２つの同時トランスフェクトされるプラスミド間で共有されている場合、実質的な組換えが起こり、野生型のAAVの産生が生じることである。従って、２つのトランスフェクトプラスミド間で重複相同性を避けるように注意が払われなければならない。
pYT45はAAV末端反復配列を含み、細菌のcat遺伝子は、AAV p5転写プロモーターおよびAAVポリアデニレーションシグナルにより駆動される（Khliefら、1991. Virology 181:738-741）。感染性ビリオンへのpYT45のパッケージングのために、p1097capを用いて、AAVビリオンのアセンブリのためのキャプシドタンパク質を提供するcap遺伝子配列を提供した。p1097capは、いかなるRepタンパク質も産生しない。これは、p5転写プロモーター、およびAAVのrep遺伝子配列のヌクレオチド1097に挿入された12bpのXhoIオリゴヌクレオチドリンカーの欠如によるものである。p1097capは、pGEM3Zプラスミド（Promega Corp.）に挿入されたヌクレオチド263〜4493のAAV配列を含む。
pYT45配列のパッケージングのために、10μgのp1097capおよび5μgのpYT45を、アデノウイルスに感染させたそれぞれの細胞株の５×105細胞に同時トランスフェクトし、そしてカドミウムおよび亜鉛塩により誘導した。トランスフェクション２日後、培養物を重金属で誘導し、アデノウイルスに感染させた後に、パッケージされたpYT45であるvYT45を上記のようにして回収し、それらが由来する同じ細胞株の新しい培養物（５×105細胞）に感染させるために用いた。感染２日後、培養物を回収し、抽出物を調製し、そして５×105細胞由来の抽出物の半分をCat酵素アッセイに用いた（Ausube1ら、（編）1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.）。クロラムフェニコールのアセチル化のパーセンテージは、薄層クロマトグラフィープレートのシンチレーション計数により測定した。
rep遺伝子変異AAVをパッケージするために、10μgのpJDT279を重金属により誘導された５×105のアデノウイルス感染Rep産生細胞にトランスフェクトした。２日後、５mM MgCl2含有リン酸緩衝溶液（PBS）に細胞をかきおとすことにより培養物を回収し、３回凍結融解し、60℃、30分間の加熱処理によりアデノウイルスを不活化し、次いで30分間37℃で、100U/mlの膵臓DNaseI（Sigma Chemical Corp.）により処理した。この抽出物を10,000×gで20分間、40℃にて遠心分離し、そして上清をその後の感染に用いた。培養物を上記のようにカドミウムおよび亜鉛塩で誘導し、アデノウイルスに感染させた後に、この抽出物を用いて、それらが由来する同じ細胞株の新しい培養物（５×105細胞）を感染させた。２日後、培養物を回収し、Hirt DNA調製を実施し、アガロースゲル電気泳動、およびDNA複製アッセイのために用いた同一の放射性標識したcap遺伝子プローブを用いるサザンハイブリダイゼーションにより分析した。
Rep誘導性細胞株がrep遺伝子変異を生じさせる感染性子孫を産生し得るのかを決定するために、プラスミドpJDT279をアデノウイルスに感染させた重金属誘導性細胞株にトランスフェクトした。２日後、培養物を回収し、粗細胞抽出物を上記のように調製した。次いで抽出物を用いて、重金属により誘導し、そしてアデノウイルスに感染させた新しい培養物を感染させた。２日後、培養物を回収し、Hirt DNA調製を実施し、アガロースゲル電気泳動、および放射性標識したcap遺伝子プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより分析した。図４では、pMtrepレーンは、アデノウイルス感染293細胞へのpMtrepおよびpJDT279の同時トランスフェクションにより産生されたvJDT279に感染させた293細胞由来のDNAを含む。pJDT279レーンは、線状化プラスミドおよび単量体の長さのDNAを産生するプラスミドの部分的BglII消化を含む。二量体（Ｄ）および単量体（Ｍ）の複製型および一本鎖（SS）DNAの位置が示される。図４から、全てのRep産生細胞株が、変異rep遺伝子を含む感染性AAVのアセンブリーを指向することが明らかである。（複製型（RF）単量体DNAは、オートラジオグラムのより長い曝露によりNeo40レーンに観測され得た。）
感染性のウイルスは誘導の非存在下では増幅されなかった。これは、初期のトランスフェクションの間に産生される野生型ウイルスの検出可能な産生がないことを示した。予期されるように、Neo5細胞は、誘導または非誘導条件のどちらにおいても感染性ウイルスを全く生じなかった。これらの実験のコントロールとして、pMtrepをpJDT279とともにアデノウイルス感染293細胞に同時トランスフェクトし、子孫ウイルスを回収した。アデノウイルス感染293細胞の次の感染の後、野生型AAVが、pJDT279およびpMtrepの初期の同時トランスフェクションから生じたことが明らかである。十分な量のRF DNAが観測され、これはpMtrepとpJDT279との間の共通のrep遺伝子配列間の組換えを示す。これらの実験は、Rep産生細胞株が、組換えから野生型AAVを産生することなしに、感染性rep遺伝子変異ウイスルを生成するための改善された方法を提供することを示す。
MTT増殖アッセイ。
MTT増殖阻害アッセイを用いて、neo5、neo6、およびneo40細胞についての誘導および非誘導条件下での増殖速度の比較を行った。
１×103のNeo5、Neo6、またはNeo40細胞を24ウェルシャーレのそれぞれのウェルに播種した。プレートしてから24時間後に、培養物の半分の培地を交換し、カドミウムおよび亜鉛塩を含ませた。プレートしてから２、４、８、および12日後に、培地を、0.05mg/ml MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-２-イル）2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；Sigma Chemical Co.）を含有する無血清無フェノールレッドMEMに交換した。次いで、培養物を加湿した5.0％ CO2大気下でさらに４時間37℃でインキュベートした。次いで、培地を吸引により除去し、培養物を200μlの停止液（0.04N HCl含有イソプロパノール）で処理した。このプレートを活発に１時間撹拌し、ホルマザン結晶を溶解した。停止液の（595nmでの）吸光度を測定した。原液MTT溶液を、第一にPBS（pH7.5）にMTTを5mg/mlの濃度で溶かすことにより調製した。この溶液を0.45μシリンジフィルターで濾過し、全ての非溶解結晶を除去した。
rep遺伝子発現の誘導において、neo6およびneo40の両細胞は非誘導培養物よりも非常にゆっくりと増殖した（図６）。対照的に、コントロールneo5細胞は、重金属誘導により阻害されなかった。８日目と12日目との間で、neo6およびneo40の両細胞は、再び増殖を始めたように見えた。これはRepタンパク質の発現の欠如またはRepタンパク質の存在に対する細胞の順化に起因し得る。誘導後14日間までの誘導培養物の抗Rep抗体を用いた免疫蛍光染色は、細胞の50〜60％が依然としてRepタンパク質を含んでいることを明らかにした（YangおよびTrempe、未発表データ）。このパーセンテージは、２日間の誘導後のneo6またはneo40細胞のパーセンテージと同様である。
実施例４
安定な細胞株の産生
Neo6およびNeo40細胞株は、10ヶ月より長くそして50世代より多く培養されている。これらの細胞株がRepタンパク質を誘導により産生する能力は、この期間中減衰していない。両細胞株は誘導性を保持し、そしてRepタンパク質産生により測定したところ重金属誘導に応答する細胞の集団に変化はなかった（YangおよびTrempe、未発表データ）。細胞株の発達に重要な期間は継代10〜15で観察され、この間誘導性細胞株の細胞はトリプシン処理および低密度（１より多く３倍までの希釈）での再プレーティングをされ得ない。この転換期の後、サブクローンNeo34を除いて（このクローンは20継代を超えて培養され得ない）、クローンは樹立細胞株として維持され得る。クローンNeo34は検出可能な量のRepタンパク質を発現し、機能性アッセイにおいて他のクローンと同様に挙動した（YangおよびTrempe、未発表データ）。
コロニー形成効率（CFE）アッセイ。
AAV DNA配列の存在は、感染細胞の改変された増殖特性を生じさせ、そしていくつかの場合において細胞増殖を停止させる。Repタンパク質の細胞株への効果を測定するために、neo5、neo6、およびneo40細胞株の増殖速度およびコロニー形成効率を測定した。Rep誘導性細胞の倍加時間は、（トリパンブルー排除により測定したところ）neo5については約35時間、neo6については43時間、およびneo40については50時間と、これらの細胞がneo5細胞より遅く増殖することを示した（YangおよびTrempe、未発表データ）。
１×103のNeo5、Neo6、およびNeo40細胞を薄く６cmシャーレに３点平行でプレーティングし、Repタンパク質発現の存在下および非存在下でのそれらのクローニング効率を試験した。各々のセットにおける３つの培養物中２つは、培地中にカドミウム塩および亜鉛塩を含有し、第三の培養物は正常な培地を含んだ。14日のインキュベーションの後、各々のセット由来の非誘導培養物および１つの誘導培養物を、既出記載のようにPBS中の18％ホルムアルデヒド中で固定し、そしてクリスタルバイオレットを用いて染色した（Yangら、1992. J. Virol. 66:6058-6069）。各々のセットにおける第三の培養物の重金属含有培地を正常な培地に置き換え、そしてそれらの培養物をさらに14日間インキュベートした。次にこれらの28日培養物を固定して染色し、そしてフォーカスの数を計数した。２mmより大きいフォーカスを計数した。
重金属誘導（Rep合成に伴われる）は、neo5細胞のCFEに対して穏やかな阻害効果を有した（図５）。インキュベーションの２週間後、誘導プレート（Ｂ、Ｄ、Ｇ）および非誘導プレート（Ａ、Ｃ、Ｆ）を染色した。残りのプレート（Ｅ、Ｈ）を正常な培地中でさらに２週間再培養し、次いで染色した。しかし、Rep78-発現細胞の増殖は、誘導の存在下で激しく減少した。neo6およびneo40細胞の両方について、Rep78の存在下で90％より大きなCFEの減少があった。Rep78が発現された場合、neo6およびneo40由来のコロニーは、拡大なしで可視であるフォーカスをほとんど形成しなかった。
染色前のプレートの顕微鏡検査は、増殖してクラスターにならなかった細胞が形態的に正常であることを示した（YangおよびTrempe、未発表データ）。誘導neo6細胞由来の大きなフォーカスのいくつかを、再培養し（誘導して）、Rep特異的抗体を用いて間接免疫蛍光法によりアッセイして、それらがRepタンパク質を発現する能力を保持しているかを測定した。試験したすべてのクローンは、２日間誘導したneo6細胞と同様の免疫蛍光のレベルを示した（YangおよびTrempe、未発表データ）。
フローサイトメトリー分析。
AAV Rep78タンパク質は、293細胞およびCOS-1細胞におけるSV40 DNAの複製ならびにNIH3T3細胞における細胞DNAの合成を阻害する（Yangら、J. Virol.に投稿中）。阻害は、Repタンパク質による細胞DNA複製の直接的な干渉、または細胞周期進行の阻害のいずれかに起因し得る。これら２つの可能性を検討するために、フローサイトメトリーを誘導細胞株について以下のように実施した。Neo6、neo40、およびコントロールのneo5細胞の２×106細胞を、15cmシャーレ中に重金属の存在下または非存在下でプレーティングした。72時間のインキュベーションの後、細胞をPBSでリンスし、そして５%DMSOを含有するクエン酸塩緩衝液（250mMスクロースおよび40mMクエン酸ナトリウム）中で、５×106細胞/mlの濃度で液体窒素中に貯蔵した。ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）染色を記載のとおり実施した（Vindelovら、1983.Cytometry 3:323-327）。フローサイトメトリーをColterフローサイトメーターで実施した。細胞周期の異なる段階にある細胞の集団を、２次多項適合法（second order polynomial fit）で、Peter S. Rabinovitchにより記載されたMulticycleソフトウェア（Phoenix Flow System）を用いて算定した。
表１に結果を要約する。重金属はneo5細胞における細胞周期進行に効果を有さない。このことは細胞周期のG1、G2、およびＳ期にある細胞の同様な百分率により表される（表１）。しかし、クローンneo40は、Repタンパク質が誘導されたときにＳ期にある細胞の数の顕著な増加を示した。Neo6細胞も、誘導によりＳ期にある細胞の穏やかな増加を示した。誘導なしでは、neo5細胞はneo40またはneo6よりもより少ないＳ期にある細胞を有した。この効果は、非誘導状態では検出され得ないままであるRepタンパク質の低いレベルに起因し得る。そうであれば、誘導されないメタロチオネインプロモーターから発現される低レベルRepタンパク質は、阻害効果を発揮し得る。シャープなピークはＳ期のいかなる点においても観察されなかった。それどころか、増加はDNA合成の全プロセスを通して分布しており、このことはRep78が周期遮断を導入するのではなく、むしろDNA合成期を通る細胞の進行を遅らせることを示す。これらの結果はRepタンパク質の抗増殖効果が、G1、G2、またはＭ期において細胞周期遮断を導入するのではなく、DNA合成の阻害または遅延におそらく由来することを示唆する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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