(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0003932926.tif 000005
（式中、Ｒは、Ｃ1-6アルキル基を意味する。）で表される化合物に、ピキア（Pichia）属、クライシア（Kuraishia）属、オガタエア（Ogataea）属（但し、オガタエア  ミヌタ変種ノンファーメンタスIFO1473を除く）、サッカロマイセス（Saccharomyces）属又はヤマダザイマ（Yamadazyma）属の各属に属する微生物またはオガタエア ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）の菌体及び／又は菌体処理物を作用させることを特徴とする式（２）
【化２】
0003932926.tif 000006
（式中、Ｒは、前記と同じ意味を表す。）で表される光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項２】
微生物がピキア（Pichia）属に属する請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項３】
微生物がクライシア（Kuraishia）属に属する請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項４】
微生物がオガタエア（Ogataea）属に属する請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項５】
微生物がサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項６】
微生物がヤマダザイマ（Yamadazyma）属に属する請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項７】
微生物がピキア アノマラ（Pichia anomala）、ピキア アングスタ（Pichia angusta）、ピキア ナガニシイ（Pichia naganishii）、クライシア カプシュラタ（Kuraishia capsulata）、オガタエア ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）、サッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）又はヤマダザイマ ファリノサ（Yamadazyma farinosa）である請求項１記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【請求項８】
微生物がピキア アノマラ（Pichia anomala）IFO 0569株、ピキア アングスタ（Pichia angusta）ATCC 26012株、ピキア ナガニシイ（Pichia naganishii）IFO 1670株、クライシア カプシュラタ（Kuraishia capsulata）IFO 0974株、オガタエア ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）IFO 1706株、サッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）TPU 1924株又はヤマダザイマ ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IAM 4682株である請求項７記載の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法に関する。
さらに詳しくは、コレステロール低下剤であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の合成中間体として有用な、（３Ｒ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）キノリン−３−イル］−３−ヒドロキシ−５−オキシ−６−ヘプテン酸エステルを容易に、効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
特開平１−２７９８６６号公報及び特開平８−１２７５８５号公報には、光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法が記載されている。
しかし、これらの製造法は、多工程を必要とすること等の理由から、より効率的な製造法が望まれていた。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、効率的な光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法を見出すために鋭意検討した結果、特定の微生物を用いることにより、短工程で目的の光学活性ヒドロキシケトエステルが製造されることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、  式（１）
【０００４】
【化３】
0003932926.tif 000002
【０００５】
（式中、Ｒは、Ｃ1-6アルキル基を意味する。）で表される化合物に、ピキア（Pichia）属、クライシア（Kuraishia）属、オガタエア（Ogataea）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属又はヤマダザイマ（Yamadazyma）属の各属に属する微生物の菌体及び／又は菌体処理物を作用させることを特徴とする式（２）
【０００６】
【化４】
0003932926.tif 000003
【０００７】
（式中、Ｒは、前記と同じ意味を表す。）で表される光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
まず、置換基における語句について説明する。
【０００９】
尚、本明細書中「ｎ」はノルマルを、「ｉ」はイソを、「ｓ」はセカンダリーを、「ｔ」はターシャリーを、「ｃ」はシクロを意味する。
【００１０】
Ｃ1-6アルキル基としては、直鎖、分枝及び環状のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｃ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基及びｃ−ヘキシル基等が挙げられる。
【００１１】
式（１）で表される化合物は、特開平６−３２９６７９号公報記載の方法により製造することができる。
【００１２】
本発明に用いられる微生物としては、ピキア（Pichia）属、クライシア（Kuraishia）属、オガタエア（Ogataea）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属及びヤマダザイマ（Yamadazyma）属の各属に属する微生物が挙げられる。
【００１３】
ピキア（Pichia）属に属する微生物の具体例としては、ピキア  アノマラ（Pichia anomala）IFO 0963株、ATCC 20144株、IFO 0120株、IFO 0146株、IFO 0145株、IFO 0118株、IFO 0149株、IFO 0569株、ピキア  ペテルソニ（Pichia petersonii）IFO 1372株、ピキア  シルビコラ（Pichia silvicola）IFO 0807株、ピキア  カナデンシス（Pichia canadensis）IFO 0976株、ピキア  アングスタ（Pichia angusta）ATCC 26012株、ピキア  ナガニシイ（Pichia naganishii）IFO 1670株、ピキア  ピペリ（Pichia pijperi）IFO 1290株及びピキア  トレハロフィラ（Pichia trehalophila）IFO 1683株等が挙げられ、好ましくは、ピキア  アノマラ（Pichia anomala）IFO 0569株、ピキア  アングスタ（Pichia angusta）ATCC 26012株及びピキア  ナガニシイ（Pichia naganishii）IFO 1670株等が挙げられる。
【００１４】
クライシア（Kuraishia）属に属する微生物の具体例としては、クライシア  カプシュラタ（Kuraishia capsulata）IFO 0974株及びIFO 0721株等が挙げられ、好ましくは、クライシア  カプシュラタ（Kuraishia capsulata）IFO 0974株等が挙げられる。
【００１５】
オガタエア（Ogataea）属に属する微生物の具体例としては、オガタエア  ミヌタ（Ogataea minuta）IFO 0975株、IFO 1473株、オガタエア  グルコザイマ（Ogataea glucozyma）IFO 1472株、オガタエア  ヘンリッシ（Ogataea henricii）IFO 1477株、オガタエア  ポリモルファ（Ogataea polymorpha）IFO 1475株及びオガタエア  ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）IFO 1706株等が挙げられ、好ましくは、オガタエア  ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）IFO 1706株等が挙げられる。
【００１６】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する微生物の具体例としては、サッカロマイセス  セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）JCM 1818株、IFO 565株、IFO 305株及びTPU 1924株等が挙げられ、好ましくは、TPU 1924株等が挙げられる。
【００１７】
ヤマダザイマ（Yamadazyma）属に属する微生物の具体例としては、ヤマダザイマ  ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IAM 4682株等が挙げられる。
【００１８】
上記の菌株のうちサッカロマイセス  セレビジエ（Saccharomyces serevisiae） TPU 1924株以外の菌株は全て公知の菌株であり、それぞれ、(財)発酵研究所(IFO)、東京大学分子細胞生物学研究所(IAM)、理化学研究所  微生物系統保存施設（JCM）及びアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から容易に入手することができる。
【００１９】
以下に、TPU 1924株の菌学的性質を示す。
形態学的性状
増殖法          ：  多極出芽
栄養細胞の形    ：  タマゴ型、楕円、球
栄養細胞の大きさ：  （４．０〜６．０）×（４．０〜８．０）μｍ
子嚢胞子の形成  ：  有
子嚢胞子の形    ：  球
子嚢の形成様式  ：  栄養細胞が直接子嚢になる
子嚢胞子の数    ：  認められない
ピンクのコロニー  −      出芽細砲    ＋
レモン型細胞      −      有柄出芽    −      分裂胞子          −
菌糸状態          −      仮性菌糸体  −      菌子体隔壁        −
分節型分生子      −      射出分生子  −      対称型射出分生子  −
生理・生化学的性状
糖類発酵性試験
D-グルコース    ＋      マルトース  ＋      ラクトース    nd
D-ガラクトース  ＋      スクロース  ＋      ラフィノース  ＋
炭素化合物資化性試験
D-グルコース    ＋    マルトース    ＋    グリセロール        w
D-ガラクトース  ＋    α,α-トレハロース  −    meso-エリスリトール  −
L-ソルボース    −    メチルα-D-グルコシド  −    D-ソルビトール  −
D-グルコサミン  −    セロビオース  −    D-マンニトール      −
D-リボース      −    メリビオース  −    myo-イノシトール    −
D-キシロース    −    ラクトース    −    2-ケト-D-グルコン酸  −
L-アラビノース  −    ラフィノース  ＋    D-グルコン酸        −
L-ラムノース    −    メレチトース  −    D-グルクロン酸      −
スクロース      ＋    DL-乳酸      ＋
窒素化合物資化性試験
硝酸        −    エチルアミン    −    L-リジン          −
カタベリン  −    D-グルコサミン  −    D-トリプトファン  −
生育試験
0.01％シクロヘキシミド  −    酸生成  −
37℃  ＋
糖の発酵性
D-グルコース    ＋    マルトース  ＋    ラクトース    −
D-ガラクトース  ＋    スクロース  ＋    ラフィノース  ＋
炭素化合物の資化性
D-グルコース    ＋    ラフィノース    ＋    リビトール      −
D-ガラクトース  ＋    可溶性デンプン  −    D-マンニトール  −
スクロース      ＋    D-キシロース    −    コハク酸ソーダ  −
マルトース      ＋    L-アラビノース  −    クエン酸ソーダ  −
セルビオース    −    D-リボース      −    イノシトール    −
トレハロース    −    L-ラムノース    −
ラクトース      −    エリスリトール  −
窒素化合物資化試験
硝酸塩の資化性                                −
エチルアミン・塩酸塩の資化性                  −
カダベリン・2塩酸塩の資化性                  −
ビタミン欠培地での生育                        −
37℃での生育                                  ＋
サイクロヘキシミド100ｐｐｍ含有培地での生育  −
TPU 1924株は多極出芽で増殖し、栄養細胞が直接子嚢になり、ブドウ糖を強く醗酵、硝酸塩を資化しないことより、 [Kurzman, C.P. and Fell. J.W.： The Yeasts，a Taxonomic Study 4th Ed. Elsevier，1055 (1998)]ではサッカロマイセス属に属する。さらに、エチルアミン、カダベリンを資化しないこと、サイクロヘキシミドに感受性であることから、サッカロマイセス・セレビシエ メイエン エックス ハンゼン (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex．Hansen )と同定した。本菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにFERM P-18689として寄託されている。
【００２０】
本発明に用いられる微生物としては、更に、上記の微生物の菌株に変異を生じさせて一層生産性を向上させた菌株等の変異株、また、菌株の細胞中に存在する、本反応に関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクタ−例えばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当な異種宿主もしくは同種宿主を形質転換することによる菌株等も含まれる。
【００２１】
菌体及び／又は該菌体処理物の様態としては、特に制限はないが、細胞を含有する培養液、培養上清液、培養上清液又は、培養液から分離した菌体の処理物、これから得た酵素、さらに、これらの酵素又は、酵素含有物を常法によって、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等、が挙げられる。
【００２２】
前記の微生物を培養して本発明の光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法に用いる事が可能な菌株を製造しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば硫安、硝酸アンモニウム、ＮＺアミン、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆抽出物等の１種類又は複数種類を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源として、麦芽エキス、グルコ−ス、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン、マニトール等を加えることができる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることもでき、更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミド、及びその他のビタミン類を必要に応じて添加することができる。
【００２３】
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよく、振盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を行うのが好ましい。培養温度は菌が生育する温度範囲内であればいずれの温度でもよいが、好ましくは４〜５０℃である。ｐＨは３〜１１の範囲である。培養時間は、１〜１００時間である。
【００２４】
培養された微生物は、遠心分離等により分離した菌体をそのまま、又は、菌体処理物として本発明の製造法に用いることができる。
【００２５】
次に、式（１）で表される化合物に微生物の菌体及び／又は菌体処理物を作用させることによる式（２）で表される光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法について説明する。
【００２６】
本発明の製造法は、上記の培養方法により培養された微生物の菌体及び／又は菌体処理物と、式（１）で表される化合物と、反応媒体とを含む溶液を攪拌することにより達成される。
【００２７】
反応媒体としては、水、又は、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等を含む水性液、例えば、水性緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等を使用することができる。また、ケトン、エーテル、炭化水素、芳香族オレフィン、ハロゲン化炭化水素、有機酸エステル、アルコール、ニトリル等水と混合しない有機溶媒をも用いることもできる。例えば、メチルブチルケトン、イソプロピルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロフォルム、二塩化メチレン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール等を使用することができる。また、それらの有機溶媒の混合物を使うこともできるし、水を飽和させた有機溶媒、水性緩衝液との二層系あるいは、ミセル、逆ミセル、エマルジョンとして反応させることもできる。
【００２８】
式（１）で表される化合物の反応系中における濃度としては、反応を阻害しない程度であれば、反応液中の菌体の濃度等により異なり特に限定されないが、反応液に対して通常０．０００１〜１０質量％の範囲、好ましくは０．００１〜５質量％の範囲である。
【００２９】
反応のｐＨとしては、２〜９、好ましくは４〜８の範囲である。
【００３０】
反応の温度は、通常は４〜７０℃、好ましくは１５〜５０℃である。
【００３１】
反応時間は、反応温度により変化するため、特定する事はできないが、例えば反応温度が３０℃の場合は、１〜１００時間の範囲である。
【００３２】
上記反応を促進するために、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素やグルコース、フルクトース、サッカロース、グリセリン、マンニトール等の炭素源を反応系に加えることもできる。
【００３３】
補酵素としてＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等を用いる際の使用量としては、式（１）で表される化合物に対して、１００万分の１当量〜１０当量、好ましくは１万分の１当量〜２当量の範囲である。
【００３４】
反応で得られた光学活性ヒドロキシケトエステルの採取方法としては、反応液を、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、カラムクロマトグラフィー、蒸留、ＨＰＬＣなどの分離精製手段に供することにより光学活性体を得ることができるが、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わせて利用できる。
【００３５】
又、必要に応じて、遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離操作による微生物などの固形分の除去操作を行ってもよい。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、式（１）で表される化合物（Ｒ＝エチル）は、特開平６−３２９６７９号公報記載の方法に従って製造した。
【００３７】
実施例１
ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％、寒天１．５％の組成からなるｐＨが６．０である培地２．０ｍＬに、各種の菌株を接種し、好気的条件下、３０℃で２４〜４８時間振とう培養した。
得られた培養液を遠心（3000rpm 5min 4℃）した後、０．５ｍＬの生理食塩水で洗浄し、再度遠心（3000rpm 5min 4℃）し、菌体を収集した。
得られた菌体に式（１）で表される化合物（Ｒ＝エチル）の１０ｇ／Ｌのジメチルスルホキシド溶液０．０２ｍＬ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍＬ及び精製水０．８８ｍＬを加え、好気的条件下、３０℃で２４時間激しく攪拌した。
０．５ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、溶媒を留去し、残査をＨＰＬＣを用いて分析し、式（２）で表される光学活性ヒドロキシケトエステル（Ｒ＝エチル、３Ｒ体）の収率を決定した。
【００３８】
ＨＰＬＣの分析条件を以下に示した。
カラム：キラルパック（CHIRALPAK）ＡＤ  内径４．６ｍｍ  長さ２５ｃｍ（ダイセル化学工業（株））、溶離液：n-ヘキサン／エタノール＝９５／５（ｖ／ｖ）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、検出器：紫外吸光光度計（測定波長２５４ｎｍ）
（式（２）で表される光学活性ヒドロキシケトエステル（Ｒ＝エチル、３Ｒ体）のカラム温度３０℃における保持時間は、２１．３分）
尚、以下に示す収率は、事前に作成した、式（２）で表される光学活性ヒドロキシケトエステル（Ｒ＝エチル、３Ｒ体）の検量線との比較から算出し、抽出ロスによる補正を行った値で示した。（抽出効率が５０％であったため、２倍とした。）
結果を表１に示した。
【００３９】
尚、表中の記号は、以下に示した微生物を意味する。
Ａ：クライシア  カプシュラタ（Kuraishia capsulata）IFO 0974株
Ｂ：オガタエア  ウィッケルハミ（Ogataea wickerhamii）IFO 1706株
Ｃ：ピキア  アノマラ（Pichia anomala）IFO 0569株
Ｄ：ピキア  アングスタ（Pichia angusta）ATCC 26012株
Ｅ：ピキア  ナガニシイ（Pichia naganishii）IFO 1670株
Ｆ：サッカロマイセス  セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）TPU 1924株
Ｇ：ヤマダザイマ  ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IAM 4682株
【００４０】
【表１】
0003932926.tif 000004
【００４１】
実施例２
ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％の組成からなるｐＨが６．０であるYM培地２．０ｍＬに、サッカロマイセス  セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）TPU１９２４菌株を接種し、好気的条件下、３０℃で２４時間振とう培養した。
得られた培養液を遠心（3000rpm 10min 4℃）した後、０．５ｍＬの生理食塩水で洗浄し、再度遠心（3000rpm 10min 4℃）し、菌体を収集した。
2リッターの坂口フラスコで400ｍｌの培地から、遠心により5gの湿菌体を得て、5mM-2メルカプトエタノールを含む25ｍｌの0.1Mリン酸緩衝液に懸濁し、超音波処理を15分間行い、３５００回転で１０分遠心後20ｍｌの無細胞抽出液を得た。
得られた無細胞抽出液50μｌ（1  ｍｌの培養液に相当）に式（１）で表された化合物（Ｒ＝エチル）の１０ｇ／Ｌのジメチルスルホキシド溶液０．０２ｍＬ、23mgのグルコース、0.62 mgのNADP、0.59mgのNAD、 2.4 mg（１７７Unit）のグルコース脱水素酵素、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍＬ及び精製水０．８８ｍＬを加え、好気的条件下、３０℃で２４時間激しく攪拌した。
０．５ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、溶媒を留去し（エバポレーターによって乾固し、200μｌの酢酸エチルに溶解した）、残査をＨＰＬＣを用いて分析し、式（２）で表される光学活性ヒドロキシケトエステル（Ｒ＝エチル、３Ｒ体）の収率を決定した。
収率20%で、5-ケト体が生成していた。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、光学活性ヒドロキシケトエステルを効率よく製造することができる。