(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス由来のコレステロール分解性酵素であるコレステロールオキシダーゼの３７９位（プレタイプ）のアミノ酸のセリンが疎水性アミノ酸のトレオニンまたはアラニンに置換されており、コレステロールに対する酸化活性とともにプレグレノロンに対する高酸化活性を有することを特徴とする機能改変されたコレステロールオキシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、機能改変されたコレステロールオキシダーゼに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、これまで予期できなかったプレグレノロンへの高い酸化活性を有する新しいコレステロールオキシダーゼとこれを用いたプレグレノロンの合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明の課題】
従来より知られているように、コレステロール分解性の酵素であるコレステロールオキシダーゼは、次式のように、３β−ヒドロキシステロイド１分子、例えばcholesterol と酸素１分子間の反応を触媒し、最終的には３−オキソステロイド、つまり４-cholesten- ３-oneと過酸化水素１分子とを生じる酵素で、補酵素としてＦＡＤを必要としている。そして、この酵素は、従来より臨床検査試薬として血中コレステロールの定量に利用されている。特に近年、先進国ではコレステロールの過剰摂取が要因となる動脈硬化性疾患や家族性高コレステロール血しょうなどの病気が増加していることから、コレステロールの測定については、米国ではホームキットが販売されており、家庭で容易にコレステロールチェックができるようになっている。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
このような背景において、この出願の発明者らは、世界に先駆けてストレプトマイセス由来のコレステロールオキシダーゼの遺伝子をクローニングしている。また種々な宿主においてこの遺伝子の高発現にも成功し、ランダム変異によって耐熱性のかなり向上した変異酵素をも取得したり、触媒活性の分離した変異酵素の取得にも成功している。そして発明者らのストレプトマイセス由来の同酵素の推定アミノ酸配列を参考にして、英国のBlow教授らにより、ブレビバクテリウム由来の同酵素のＸ線結晶構造解析が行われ、その立体構造をもとに東海大学の平山教授らによりストレプトマイセス由来の同酵素の立体構造がホモロジーデリングされている。
【０００５】
この出願の発明者らは、以上のようにストレプトマイセス由来のコレステロールオキシダーゼに注目しているが、このストレプトマイセス由来のコレステロールオキシダーゼは、公知のブレビバクテリウム由来のコレステロールオキシダーゼと似ており、アミノ酸配列で約６０％の相同性があり、基質及びＦＡＤ周辺のアミノ酸残基もよく保存されていることから、これらの相同性が酵素学的諸性質にどの程度の相違がみられるかを、両菌株から酵素を精製して検討してみた。
【０００６】
表１は、その相違を比較したものである。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
表中のＣＨＯｓは、ストレプトマイセス由来の、ＣＨＯｂはブレビバクテリウムの酵素、コレステロールオキシダーゼの場合を示している。比活性を評価した後、種々の温度で酵素活性を測定し、アウレニウスの式よりエンタルピー変化と活性値が半減する温度を求めたところ、どちらの値においてもブレビバクテリウム由来の酵素の方が良い値を示した。つまり、熱安定性に関しては、ブレビバクテリウム由来の酵素の方が勝っていると判断される。続いて基質特異性を評価した。コレステロールを基質とした場合を１００％とした相対活性値で示している。側鎖の短い数種の基質において差が認められた。
【０００９】
そこで発明者らは、両酵素の立体構造を基に再度相違点を詳しく比較した。補酵素ＦＡＤ近傍アミノ酸残基において、基質Dehydroisandrosterone （ＡＮＤ）近傍アミノ酸残基において、基質が結合することによって立体配座が変化するアミノ酸残基において、溶媒露出表面のない４個のループ領域を対象とした。
【００１０】
以上のような経緯から、この出願の発明者は、ストレプトマイセス由来のコレステロール分解性酵素であるコレステロールオキシダーゼに注目し、その機能解明とこれに基づく改変を試みることにより、これまでに知られていない新しい特異的機能をもつコレステロールオキシダーゼを提供することを課題としてきた。特に、この出願の発明においては、コレステロール分解のための酸化活性とともに、コレステロールの分解にともなう有用物質の合成に係わる機能について着目し、その実現を課題としてきた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、ストレプトマイセス由来のコレステロール分解性酵素であるコレステロールオキシダーゼの３７９位（プレタイプ）または３３７位（成熟タイプ）のアミノ酸のセリンが疎水性アミノ酸のトレオニンまたはアラニンに置換されており、コレステロールに対する酸化活性とともにプレグレノロンに対する高酸化活性を有することを特徴とする機能改変されたコレステロールオキシダーゼを提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１５】
この出願の発明における機能改変されたコレステロールオキシダーゼにおいては、３７９位（プレタイプ）のアミノ酸のセリンが疎水性アミノ酸のトレオニンまたはアラニンに置換されている。この場合のプレタイプについて説明すると、まずストレプトマイセス由来のの酵素は生合成された直後は、５０４残基（プレタイプのコレステロールオキシダーゼ；前駆体タンパク質）のアミノ酸からなっており、その後シグナルペプチターゼによって限定分解されて（アミノ末端の４２残基が加水分解されて）、最終的には４６２残基（成熟タイプのコレステロールオキシダーゼ）のアミノ酸で構成される菌体外（分泌）タンパク質となる。一般的には成熟タンパク質におけるアミノ末端から１番と名付けるようになっていることから、本来なら３３７位のセリンを疎水性アミノ酸に置換したというべきであるが、実際には、コレステロールオキシダーゼとしてたとえば大腸菌由来の組換えタンパク質であってよいことから、プレタイプコレステロールオキシダーゼ（５０４残基）が考慮されることになる。以上のことから、この出願の発明では、３７９位（プレタイプ）が疎水性アミノ酸に置換されたものとしている。
【００１６】
たとえば以下に説明する具体例においても、大腸菌由来の組換タンパク質が対象とされ、プレタイプのコレステロールオキシダーゼの３７９位が疎水性アミノ酸によって置換されている。
【００１７】
置換することになる疎水性アミノ酸としては、たとえばより実際的に好適なものとして、トレオニン、アラニンが示される。
【００１８】
そこで、この出願の発明の機能改変されたコレステロールオキシダーゼについて、これまでの発明者による検討の過程に沿って、そしてその結果に基づいて説明すると、まず、前記のとおり、ストレプトマイセス由来のものと、ブレビバクテリウム由来のものとの比較から、両酵素間で保存されておらず、周りに影響を及ぼしそうな５つのアミノ酸残基を選択し、その役割について評価した。
【００１９】
図１は、ストレプトマイセス由来の立体構造予想図であって、置換するアミノ酸残基の位置を示している。数字はアミノ末端からの序数である。１１９Ｌと３７９Ｓは基質近傍に存在し、１４５Ｖと２８６ＱはＦＡＤ近傍に存在し、３５７Ｐは溶媒露出表面のないループ領域に存在している。置換するアミノ酸は、ブレビバクテリウムの相当するアミノ酸残基とした。つまりＬ１１９Ｆ，Ｖ１４５Ｑ，Ｑ２８６Ｒ，Ｐ３５７Ｎ，Ｓ３７９Ｔの変異遺伝子を部位特的変異方法によって構築した。
【００２０】
具体的には、次の表２のプロセスに従って部位特異的変異を行った。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
すなわち、以前より構築しておいたTac プロモーター下でコレステロールオキシダーゼ遺伝子を発現するベクターを基に、野生型及び変異型の発現ベクターを持つ大腸菌ＪＭ１０９を、アンピシリン含有ＬＢ培地で３７度培養し、対数増殖期中期に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、その後１２時間培養を続けた。集菌後、リン酸バッファーに懸濁し、超音波処理にて菌体を破砕した。残宰を再度遠心によって、取り除き上清を得た後にコレステロールアフィニティーカラムクロマトグラムに供し、活性画分を疎水性カラムクロマトグラムによって精製した。
【００２３】
精製した酵素サンプルを１０％アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００２４】
図２に例示したように、約５５Ｋの所に単一バンドとしてタンパク質がみられた。これらの酵素比活性値は、約６０−８０Ｕ／ｍｇ of protein であった。そこでこれらの精製酵素を用いて、生化学的諸性質を求めた。
【００２５】
まずはじめに、熱安定性を測定したところ、Ｌ１１９ＬとＱ２８６Ｒは熱安定性が低下したが、Ｖ１４５Ｑは向上した。Ｐ３５７ＮとＳ３７９Ｔは野生型と差がなかった。
【００２６】
続いて基質特異性を調べた。コレステロールを基質にした時の活性値を各々１００％とした相対活性で、図３にその結果を示している。この結果、多くの変異酵素と基質において変化が認められなかったが、唯一ステロイド側鎖の短いプレグレノロン：pregnenoloneが基質の場合に、Ｓ３７９Ｔ変異酵素だけがその特異性を向上した。
【００２７】
３７９番目のセリンが基質特異性に関与するアミノ酸であることがわかったので、その変異酵素の速度パラメーターを求めた。またトレニオン以外の疎水性アミノ酸ＡとＶ、酸性アミノ酸Ｄ、塩基性アミノ酸Ｒに置換した変異酵素も同様にして発現精製し、速度パラメーターを求めた。
【００２８】
アスパラギン酸とアルギニンに置換した変異酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質は確認できたものの活性が認められなかった。バリンに置換した変異酵素は、活性は認められるものの野性型との相違はあまり認められなかった。
【００２９】
図４に示したようにトレニオン（Ｓ３７９Ｔ）に置換したものは、基質に対しての親和性が良くなりkcat/Km 値が野性型に比較して向上することが確認された。
【００３０】
また、トレオニンとともに疎水性アミノ酸であるアラニン（Ｓ３７９Ａ）に置換したものにも活性の向上が認められた。その理由としては、３７９番目のセリンは基質の近くに存在し、その周辺に大きな空間が空いていることから、トレオニンに置換することによって、丁度この空間を埋める様になったので、基質に対する親和性が向上したのではないかと推定される。
【００３１】
以上のように、３７９番目のセリンが基質特異性に関与するアミノ酸残基であることが見出され、このセリンの疎水性アミノ酸による置換が、野性型に比べてコレステロールの酸化活性、そしてプレグレノロンに対する酸化活性を向上させることが判明した。特に、疎水性アミノ酸がトレニオン置換の酵素の場合には、コレステロールに対する活性が向上するだけでなく、まったく予期できなかったことであるが、プレグレノロンに対する活性が野性型の６倍にも向上することが見出された。
【００３２】
このことからこの出願の発明の機能改変されたコレステロールオキシダーゼによれば、これを酸化触媒として、一段階でのプレグレノロンの合成が可能となる。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、コレステロールオキシダーゼにおいて、コレステロールの分解のための酸化活性とともに、コレステロールの分解にともなう有用物質の合成に係わる新しい機能を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ストレプトマイセス由来のコレステロール分解性酵素の立体構造予想図である。
【図２】アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥによる処理結果を例示した図である。
【図３】コレステロールを基質とした時の活性値を相対比として例示した図である。
【図４】トレオニン置換した場合の活性について例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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