(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ０４０９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４７）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ａ）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ１５４３株（ＦＥＲＭＰ−１７０４６）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ｂ）を含有し、乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合が２１重量％を超え８０重量％以下の割合であることを特徴とする血清脂質改善効果を有する機能性飲食品。
【請求項２】
培養物（ａ）及び培養物（ｂ）が同一の培養基を培養した培養物である請求項１に記載の機能性飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清脂質改善効果を有する機能性飲食品に関するものである。本発明において、血清脂質改善とは、血清中の総コレステロールの低減とＨＤＬ一コレステロールの増加およびトリグリセライドの低減を意味する。
【０００２】
一般に血清中のコレステロールの増加は動脈硬化の原因となることが知られており、その低減物質に関しては各種の提案がなされている。例えば、特開平５−３４４８６４号公報や特開平６−１６５６５５号公報においては、乳清蛋白質（ホエイ蛋白質）やその誘導体について提案されている。また、特開昭６２−２５８３２３号公報、特開平５−６５２２９号公報、特開平７−２５０６７０号公報においては、ある種の乳酸菌の培養物または菌体について提案されている。従って、乳清蛋白質の他、効力レベルは低いものの、乳酸菌またはその培養物によっても血清中の総コレステロールを低減し得る。そして、斯かるコレステロール低減剤を飲食品に含有させた機能性飲食品も公知である。
【０００３】
ところで、例えば、乳清蛋白質を配合した飲食品によって血清中の総コレステロールの低減を図らんとする場合、多量の乳清蛋白質の配合はアレルギー反応を惹起する恐れがあるために注意を要する。また、多量に乳清蛋白質を配合した飲食品は独特の好ましくない風味を有する。従って、乳清蛋白質による血清中の総コレステロールの低減剤においては、その効果を高めるための改良が切望されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、その目的は、血清中の総コレステロールの低減とＨＤＬ−コレステロールの増加およびトリグリセライドの低減を図った機能性飲食品であって、乳清蛋白質を含有し且つ他の成分により乳清蛋白質の効果を高めることにより、乳清蛋白質の適用量を軽減し得る様に改善された上記の機能性飲食品を提供することにある。
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、次の様な新規な知見を得た。すなわち、血清中の総コレステロールの低減効果が必ずしも高くないレベルのある種の乳酸菌で乳清蛋白質を含有する培養基を培養するならば、意外にも、乳清蛋白質の総コレステロールの低減効果が顕著に高められ、しかも、ＨＤＬ−コレステロールの増加効果が発現される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の知見に基づき完成されたものであり、その要旨は、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ０４０９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４７）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ａ）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ１５４３株（ＦＥＲＭＰ−１７０４６）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ｂ）を含有し、乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合が２１重量％を超え８０重量％以下の割合であることを特徴とする血清脂質改善効果を有する機能性飲食品に存する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る機能性飲食品は、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ０４０９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４７）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ａ）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ１５４３株（ＦＥＲＭＰ−１７０４６）で乳清蛋白質を含有する培養基を培養した培養物（ｂ）を含有する。
【０００８】
乳清蛋白質としては、特にその純度は限定されず、市販品をそのまま使用することが出来る。培養基は、上記の乳酸菌による乳酸発酵で変換される物質を含有し、通常、乳清蛋白質の他、カゼイン、乳糖、飲食品の種類に応じた乳酸発酵で使用される各種の成分を含有している。
【０００９】
腸内生存性ラクトバチルス（Lactobacillus  sp．）に属する乳酸菌は、その胃酸耐性、胆汁酸耐性、腸細胞付着性により、特徴的な菌学的性質として腸内生存性を有し、例えば、ラクトバチルス・ブルガリカスの様な腸内非生存性ラクトバチルスと明確に区別される。
【００１０】
腸内生存性ラクトバチルスに属する乳酸菌としては、発癌抑制の観点から、二次胆汁酸非生産菌が好適に使用される。斯かる乳酸菌の好適な具体例としては、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei ）が拳げられ、本出願人により発見されたラクトバチルス・カゼイＴＭＣ０４０９菌株が好適に使用される。
【００１１】
上記の菌株は、本出願人により、東南アジアにて古くから知られている発酵乳から見出されて培養されてきた菌株である。そして、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第２巻（BERGEY'S  MANUAL  OF  Systematic  Bacteriology  Volume  ２，１９８６年）第１２１９頁に記載のデータと対比した結果、上記の菌株は、ラクトバチルス・カゼイであると考えられ、上記の通り、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ0409株と命名した。
【００１２】
そして、上記の菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所において、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０４７」として、平成１０年１１月６日から国内寄託され保管されている。
【００１３】
一方、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）に属する乳酸菌としては、乳清蛋白質との相乗効果を高める観点から、粘質物生産菌が好適に使用される。斯かる乳酸菌の好適な具体例としては、本出願人により発見されたストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ１５４３菌株が拳げられ、当該菌株は、高粘性の粘質物を産生する特徴を有する。
【００１４】
上記の菌株は、本出願人により、ヨーロッパにて古くから知られている発酵乳から見出されて培養されてきた菌株である。そして、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第２巻（BERGEY'S  MANUAL  OF Systematic  Bacteriology  Volume  ２，１９８６年）第１０６８頁に記載のデータと対比した結果、上記の菌株は、ストレプトコッカス・サーモフィラスであると考えられ、上記の通り、ストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ1543菌株と命名した。
【００１５】
そして、上記の菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所において、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０４６」として、平成１０年１１月６日から国内寄託され保管されている。
【００１６】
本発明において、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ０４０９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４７）で培養基を培養した培養物（ａ）及びストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ１５４３株（ＦＥＲＭＰ−１７０４６）で培養基を培養した培養物（ｂ）は、同一の培養基を培養した培養物であっても、各別に準備された培養基を培養した後に混合された培養物であってもよいが、一般的には、同一の培養基を培養した培養物、すなわち、通常の乳酸発酵による培養物である。なお、上記の培養物とは、乳酸発酵で得られたブロス（菌体と乳酸発酵生成物の全体）を意味する。
【００１７】
本発明に係る機能性飲食品の代表例としては、乳酸菌を添加して得られる液状または固形状の発酵乳が挙げられる。一般に、発酵乳は、全乳または脱脂乳に脱脂粉乳などを加えて固形分を増やし、更に、安定剤、糖類などを添加し、乳酸菌で発酵させて製造される。本発明においては、前述の腸内生存性ラクトバチルスに属する乳酸菌とストレプトコッカス・サーモフィラスに属する乳酸菌とを使用し、常法に従って発酵乳を製造する。
【００１８】
本発明の機能性飲食品において、乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は２１重量％を超える割合でなければならない。乳清蛋白質の割合が上記未満の場合は、常識的に摂取する飲食品の量では充分な血清脂質改善効果が発現されない。上記の割合以上であれば、単独で乳清蛋白質を利用した際の血清脂質改善効果がより少ない乳清蛋白質の使用量で得られる。従って、乳清蛋白質によるアレルギーの危険率を低下させることが出来、また、乳清蛋白質独特の風味を軽減させることが出来る。乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は、好ましくは３０〜８０重量％である。なお、通常、ヨーグルトにおける乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は２１重量％以下である。従って、乳清蛋白質の割合が上記の範囲となる量の例えば乳清蛋白質濃縮物を添加する必要がある。
【００１９】
本発明において、対象となる飲食品は、液状または固形状の発酵乳に限定されず、液状または固形状の発酵乳を粉末化した健康補助食品も含む。また、サワークリーム、クリームチーズ、バター等も挙げられ、これらは何れも高脂肪食品であり、その摂取により血清中の総コレステロールを増加させる傾向を有する。従って、本発明に係る血清脂質改善効果を有する機能性飲食品の対象食品として好適である。
【００２０】
次に、本発明の効果を具体的に説明する。
【００２１】
＜１．凍結乾燥乳酸菌菌体の調製＞
Lactobacilli  ＭＲＳ  broth（DIFCO）に供試乳酸菌を接種し、３７℃、１７時間培養を行った。１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの遠心分離により菌体を回収し、同様の操作で蒸留水にて菌体を２回洗浄した。洗浄後、菌体を凍結乾燥し、実験に供するまで４℃で保存した。
【００２２】
＜２．タウロコール酸減少試験＞
各乳酸菌の凍結乾燥菌体、または、１１０℃、１０分間加熱した凍結乾燥加熱菌の９０ｍｇをＰBS（ｐＨ７．２）（GibcoBRL，Grand  Island，NY，USA）２ｍｌに懸濁し、ボルテックスミキサーで均一にした後、０．０１ｇ／ｍｌのタウロコール酸ナトリウム溶液１００μｌを添加し、３７℃で６０分間振盪培養した。振盪培養後、３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により上清を得た。上清を限外ろ過（モルカットII：分画分子量５，０００）（日本ミリポア）した後、ろ液に残存するタウロコール酸ナトリウム量を表１に示す条件でHＰLＣにより測定した。胆汁酸減少率はタウロコール酸ナトリウムのみのコントロールとの比較により算出した。結果を表２に示す。
【００２３】
【表１】
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
カラム    ：Shim−pack  ＣＬＣ−Ｃ８（４．６mm×２５ｃｍ）（島津製作  所（株））
移動相    ：０．２５M  K2HＰO4−HＣｌbuffer（ｐＨ７．５）／エタノー  ル／メタノール＝５０／４０／１０
流速      ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長  ：２１０ｎｍ
【００２４】
【表２】
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【００２５】
供試した全ての乳酸菌で胆汁酸の一つであるタウロコール酸の減少が認められた。生体の血清コレステロールと生体中の胆汁酸の合成および代謝には密接な関係があることが知られている。体外への胆汁酸排泄の促進は肝臓内のコレステロールから胆汁酸の変換を高め、結果的に血清コレステロールを低下させることが知られている。一方、乳酸菌にはその菌体表面に発癌物質を吸着する性質があることが知られており、それは菌体を加熱しても同様な効果があるとする報告がある。同様に乳酸菌が胆汁酸の一つであるタウロコール酸を吸着して体外へ排泄するならば血清コレステロールを低下させることが出来ると考えられる。
【００２６】
今回の結果はタウロコール酸減少率が３８％以上の乳酸菌群と３８％未満の乳酸菌群の２群に分けることが出来た。しかしながら、減少率３８％以上の乳酸菌を予め加熱して試験に供した場合にはその減少率が低下した。３８％未満のものは変化しないか若干増加する傾向が認められた。これらのことから、タウロコール酸減少率が３８％未満のものはタウロコール酸を吸着したことが示唆され、３８％以上のものは吸着以外の要因も考えられた。そこで以下の実験を行った。
【００２７】
＜３．胆汁酸代謝確認定性試験＞
加熱することによりタウロコール酸減少率が低下したLactobacillus  reuteri
ＴＭＣ4405と加熱することによりタウロコール酸減少率が若干増加したLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409を使用して定性試験を行った。凍結乾燥菌体９０ｍｇを使用してタウロコール酸減少試験を上記と同様に実施し、その際に得られたろ液をBond  Elute（Ｃ１８，２００ｍｇ）（varian）にて前処理した後、HＰLＣ胆汁酸分析システム（日本分光）により分析した。
【００２８】
図１（ａ）〜（ｃ）にHＰLＣのクロマトグラムを示した。図１（ａ）はコントロール、図１（ｂ）はLactobacillus  reuteri  ＴＭＣ4405を使用した場合、図１（ｃ）はLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409を使用した場合であり、ピーク（１）は未知物質、ピーク（２）はタウロコール酸、ピーク（３）はコール酸である。
【００２９】
Lactobacillus  reuteri  ＴＭＣ4405を使用した場合、添加したタウロコール酸が消失し、若干のコール酸が産生されたが、大部分は溶出時間８．８分の未知の物質が産生された。このHＰLＣ胆汁酸分析システムは胆汁酸を３α−ＨＳＤ酵素反応で検出するため、ピーク（１）の未知物質は胆汁酸代謝物（二次胆汁酸）と考えることが出来る。
【００３０】
二次胆汁酸の一つであるデオキシコール酸は発癌との関係が示唆されている。従って、上記の本未知物質も注意を要する。また、若干産生されたコール酸も腸内で腸内細菌により代謝され二次胆汁酸が産生されることが知られている。一方、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409を添加した場合、タウロコール酸以外のピークは認められなかった。よって、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409は二次胆汁酸非生成であることが明らかとなった。
【００３１】
以上の結果、二次胆汁酸非生成であり且つ胆汁酸の一つであるタウロコール酸を吸着することが認められたLactobacillus  casei  TＭＣ0409が腸内で増殖すれば血清コレステロール低下効果が期待できる。
【００３２】
発酵乳製造用の乳酸菌にはLactobacillus  bulgaricusの様に胃酸耐性および胆汁酸耐性の低いものが一般に使用されており、この様な乳酸菌は腸内では増殖できない。腸内で乳酸菌が増殖するためには胃酸耐性および胆汁酸耐性があることが不可欠である。そこで、次に、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409の胃酸耐性および胆汁酸耐性を調査した。また、腸内で効果的に増殖するには乳酸菌が腸壁に付着することが望ましい。よって、腸細胞付着性も併せて調査した。
【００３３】
＜４．人工胃液および人工胆汁液の調製と耐性試験＞
乳酸菌には高梨乳業（株）商品研究所保存菌株であるLactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0330、Lactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0343、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0401、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409を使用した。人工胃液は、ＭＲＳ  brothに６Ｎ塩酸を加えてｐＨ２に調整し、１２１℃、１５分間加熱後に無菌的にペプシン（Sigma）溶液を０．００５％となる様に添加して調製した。人工胆汁液は、ＭＲＳ  brothに０．３％となる様にOxgall（Difco）を添加し、１２１℃１５分間オートクレーブ処理して調製した。
【００３４】
人工胃液耐性試験においては、１８時間培養した乳酸菌のＭＲＳ培養液を人工胃液に１%接種し、３７℃で４時間培養した後、BＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学）により生菌数の変化を測定し、耐性率を算出した。人工胆汁液耐性試験においても同様に供試乳酸菌のＭＲＳ培溶液を人工胆汁液に５%接種し、３７℃１０時間培養後、分光光度計（ＰV−５０００、島津製作所）により濁度（O．D．６６０）を測定し、胆汁酸無添加のコントロールと比較して耐性率を算出した。
【００３５】
図２に人工胃液耐性試験の結果を示した。図２中、−●−はLactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0330、−■−はLactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0343、−▲−はLactobacillus  casei  ＴＭＣ0401、−▼−はLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409を表す。
【００３６】
Lactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0330、Lactobacillus  acidophilus  ＴＭＣ0343、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0401は培養４時間で生菌数が０になったのに対してLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409は生菌数が４（log   cfu）／ｍｌであり、人工胃液耐性が認められた。
【００３７】
胆汁酸耐性試験の結果を表３に示した。いずれの菌株も人工胆汁液に対して耐性を示したが、その中でもLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409には最も高い耐性（７０．９%）が認められた。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
表３中、胆汁酸耐性は、胆汁酸含有ＭＲＳ培地（Ｘ）と胆汁酸非含有ＭＲＳ培地（Ｙ）でそれぞれ３７℃で４時間培養した際の吸光度の比較を表し、（%）は（Ｘ／Ｙ）×１００の値を意味する。
【００４０】
＜５．腸細胞付着性試験＞
（５−１．細胞培養）
腸細胞の代表例であるＣaco−２細胞は、理化学研究所・細胞開発銀行から購入した。培地には１０％非働化牛胎児血清および非必須アミノ酸２％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（５，０００ＩU／ｍｌ）（共にGibcoBRL）を添加したダルベッコの改変Eagle培地（GibcoBRL）を使用した。細胞は２５ｃｍ2培養フラスコで１０％ＣO2存在下、３７℃のインキュベーター内で培養し、継代維持した。
【００４１】
（５−２．付着性試験）
乳酸菌のＣaco−２細胞に対する付着性試験は、Darfeuille−Michaudら（Infection  and  Immunity，５８：８９３−９０２．１９９０）のE.coliのＣaco−２細胞への付着性試験を部分的に変更して実施した。すなわち、付着性試験のためにＣaco−２細胞を８−well  Lab−Tek  chamber  slide（Nunc  Inc．）に接種し（１．４×１０4cells／ｃｍ2）、１日置きに培地交換をして約１５日間培養した。細胞はＰBS（ｐＨ７．２）（GibcoBRL）で２回洗浄した後、乳酸菌懸濁液（１×１０8cells／ｍｌＰBS）を３００μｌ添加した。１０％ＣO2存在下、３７℃で２時間反応させた。反応後、細胞はＰBSで３回洗浄し、メタノールで固定した後、ギムザ液で染色した。付着性は光学顕微鏡により２０視野を観察し、１００細胞当たり付着した乳酸菌の数として表した。
【００４２】
（５−３．結果）
結果を表４に示した。Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409は他の菌と比較してＣaco−２細胞に高い付着性を示した。Ｃaco−２細胞は腸のモデル細胞として広く利用されている。Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409は、胃酸、胆汁酸に対して抵抗性を示しながら、ヒト腸上皮上に付着して顕著に増殖すると思われ、効率的なコレステロール低下効果が期待できる。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
表４中、付着性は、無作為に２０視野を観察し、１００細胞当たりに付着した乳酸菌数を顕微鏡下で計測し、（-）：菌数０〜２０、（+）：２１〜５０、（++）：５１〜１００で表した。
【００４５】
＜６．Streptococcus  thermophilus  発酵乳の粘度測定試験＞
１６株のStr．thermophilus１６株でそれぞれ発酵乳を調製してカードを破壊後、B型粘度計（東京計器（株））で粘度を測定した。結果を表５に示した。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
表５に示す様に、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳が最も高い粘度を示した。逆に、Str．thermophilus  ＴＭＣ1502発酵乳およびStr．thermophilus  ＴＭＣ1504発酵乳の粘度はその約１／２であった。また、酸脱脂乳の粘度は極めて低いものであった。
【００４８】
＜７．Streptococcus  thermophilus  発酵乳のコレステロール吸着性試験＞
粘度が最も高かったStr．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳と、粘度が低かったStr．thermophilus  ＴＭＣ1502発酵乳およびStr．thermophilus  ＴＭＣ1504発酵乳をそれぞれ凍結乾燥した。また、乳酸でｐＨ４．５に調整した酸脱脂乳も同様に凍結乾燥した。これらの凍結乾燥物をコレステロール溶液（１００μｇ／ｍｌ（６０%エタノール））に懸濁し、３７℃で１時間振盪した。遠心分離後、上清液を限外ろ過（分画分子量５０００）し、ろ液のコレステロール量を測定し比較した。
【００４９】
図３（ａ）及び（ｂ）に上記の結果を示した。図３中、（１）は酸脱脂乳、（２）はStr．thermophilus  ＴＭＣ1502発酵乳、（３）はStr．thermophilus  ＴＭＣ1504発酵乳、（４）はStr．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳の結果を表す。数値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表した。酸脱脂乳と比較して有意差がある（Ｐ＜0.05）と判断される。
【００５０】
酸脱脂乳と発酵乳の間で遠心分離後の上清中のコレステロール量に有意な差は認められなかった。しかしながら、上清液をさらに限外ろ過した場合、そのろ液中のコレステロール量に変化が認められた。その中で、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳は安定してコレステロール量を低下させており、酸脱脂乳と比較して有意差が認められた（Ｐ<０．０５）。
【００５１】
以上の結果から、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳の遠心分離した上清中に溶解する分子量５０００以上の物質がコレステロールを安定して吸着することが示唆された。従って、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543発酵乳を飲用することによりコレステロールの吸収抑制が期待される。
【００５２】
＜８．発酵乳の血清脂質改善効果に関する動物実験＞
（８−１．発酵乳の調製）
発酵乳（９０℃殺菌後、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409及び／又はStr.thermophilus  ＴＭＣ1543で発酵）の培養基の成分を表６に示した。この際のLactobacillus  casei  ＴＭＣ０409とStr．thermophilus  ＴＭＣ1543の両菌で発酵させた発酵乳の乳酸菌数は、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ０409が１．０×１０9／ｍｌ、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543が５．０×１０7／ｍｌであった。Lactobacillus  casei  ＴＭＣ０409のみで発酵させた発酵乳の乳酸菌数は、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ０409が２．０×１０9／ｍｌであった。Str．thermophilus  ＴＭＣ1543のみで発酵させた発酵乳の乳酸菌数は、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543が５．０×１０8／ｍｌであった。何れの発酵乳も乳蛋白質量は５２．６８ｇ、乳清蛋白質量は１９．９１ｇであり、乳蛋白質中に占める乳清蛋白質の割合は３７．８％であり、本請求項の範囲内であった。
【００５３】
【表６】
0003958456.tif 000006
【００５４】
（８−２．動物実験）
動物実験には、４週齢のSD系雄ラット（日本クレア（株））を使用した。市販の固形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業）を与えて１週間予備飼育し、平均体重がほぼ等しくなる様に群分けした後、直ちに表７に示したコントロール食およびカゼインの一部をWＰＣ添加発酵乳またはWＰＣ添加非発酵乳の凍結乾燥物に置換した飼料にて飼育を行った。また、５群の飼料の蛋白質含量は等しくなる様にした。水および実験食は自由摂取とした。１４日後に尾静脈より採血を行い、血清中の脂質分析を実施した。血清中の総コレステロールはコレステロールＥ―テストワコー（和光純薬工業）、トリグリセライドはトリグリセライドGテストワコー（和光純薬工業）、ＨＤＬ−コレステロールはＨＤＬ−コレステロール―テストワコー（和光純薬工業）、リン脂質はリン脂質Ｃテストワコー（和光純薬工業）を使用して測定した。なお、採血は一晩絶食させた後に実施した。
【００５５】
【表７】
0003958456.tif 000007
【００５６】
（８−３．結果）
図４に血清総コレステロールの測定結果を示した。図４中、（１）はコントロール群、（２）はWＰＣ非発酵物群、（３）は0409WＰＣ発酵乳群、（４）は1543WＰＣ発酵乳群、（５）は0409−1543WＰＣ発酵乳群の結果である。
【００５７】
総コレステロール値は、コントロール群と比較し、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409のみで発酵させた0409WＰＣ発酵乳群とStr．thermophilus  ＴＭＣ1543のみで発酵させた1543WＰＣ発酵乳群で低下する傾向が見られたものの有意差は認められなかった。
【００５８】
しかしながら、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409とStr．thermophilusＴＭＣ1543の両菌で発酵させた発酵乳（0409−1543WＰＣ発酵乳）に顕著なコレステロール低下効果が認められ、それは統計的に有意であった（Ｐ<０．０５）。このことは、コレステロール低下効果があるとされる乳清蛋白質とLactobacillus  casei  ＴＭＣ0409の発酵物（乳酸菌菌体を含む）とStr．themophilus  ＴＭＣ1543発酵物（乳酸菌菌体を含む）の相乗効果と考えられた。また、その他の血清脂質の測定結果を表８に示した。コントロール群と比較して0409−1543WＰＣ発酵乳群でＨＤＬ−コレステロールの増加とトリグリセリドの減少が観察された。
【００５９】
【表８】
0003958456.tif 000008
【００６０】
＜９．発酵乳の血清脂質改善効果に関するヒト生体試験＞
（９−１．発酵乳の調製）
発酵乳の培養基の成分を表９に示した。この際の発酵乳の乳酸菌数は、Lactobacillus  casei  ＴＭＣ0409が６．１×１０8／ｍｌ、Str．thermophilus  ＴＭＣ1543が２．６×１０7／ｍｌであった。この際の乳蛋白質量は４０．１８ｇ、乳清蛋白質量は２２．４０５ｇ、乳蛋白質中に占める乳清蛋白質の割合は５５．８％であり、本請求項の範囲内であった。
【００６１】
【表９】
0003958456.tif 000009
【００６２】
（９−２．偽薬（プラセボ）の調製）
被験者の心理的影響を考慮するため、コレステロール低下作用の有効成分と考えられる物質を含まない発酵乳類似物質である偽薬（プラセボ）を調製した。その成分を表１０に示した。
【００６３】
【表１０】
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【００６４】
（９−３．被験者）
事前の問診、既往歴などで試験参加に適当であると判断された、健康な成人男性を対象とした。そして、試験の目的、方法、予想され得る副作用などについて十分な説明を行い、試験参加に同意した者の中から、血清総コレステロール値の比較的高い人（２００ｍｇ／ｄｌ以上）を含む２０名を被験者として選出した。
【００６５】
（９−４．発酵乳の飲用）
被験者２０名を無作為に２群に分け、発酵乳飲用群（１０人）、偽薬（プラセボ）飲用群（１０人）とした。被験者にはどちらの群に属するかを知らせない様にした。飲用期間は８週間とした。飲用期間中、毎日、表９に記載の発酵乳、または、表１０に記載の偽薬（プラセボ）を１回２００ｍｌ毎で朝夕２回（１日合計４００ｍｌ）飲用させた。
【００６６】
（９−５．採血と血液分析）
採血は、試験飲料飲用直前、飲用開始４週間後、飲用開始８週間後の朝に産業医が実施した。また、同時に問診も行い、血圧も測定した。採取した血液の分析は保健科学研究所（横浜）にて実施した。
【００６７】
（９−６．結果）
図５（ａ）及び（ｂ）に総コレステロールの測定結果を示した。図５（ａ）は偽薬（プラセボ）群、図５（ｂ）は発酵乳群である。図５中、−●−は被験者全体（ｎ＝１０）、−□−は２００ｍｇ／ｄｌ以上の被験者（ｎ＝７）、−△−は２００ｍｇ／ｄｌ未満の被験者（ｎ＝３）を表す。
【００６８】
飲用開始前の測定値が２００ｍｇ／ｄｌ以上の高めの人と２００ｍｇ／ｄｌ未満の人に区分した結果も示した。偽薬（プラセボ）群の場合、被験者全体では僅かな総コレステロール値の上昇傾向を示した。２００ｍｇ／ｄｌ以上の高めの被験者は変化を示さなかった。一方、２００ｍｇ／ｄｌ未満の被験者は顕著な上昇を示した。発酵乳群では、被験者全体では総コレステロール値の低下傾向を示した。２００ｍｇ／ｄｌ以上の高めの被験者もコレステロール値の低下を示した。２００ｍｇ／ｄｌ未満の被験者は変化を示さなかった。
【００６９】
図６にＨＤＬ−コレステロールの測定結果を示した。図６中、−○−は偽薬（プラセボ）群、−●−は発酵乳群である。
【００７０】
発酵乳群は飲用開始４週間目でＨＤＬ−コレステロール値の上昇を示した（０週と比較して危険率５％で統計学的に有意差を示した）。飲用開始８週間目では発酵乳群はさらに上昇した（危険率１％で統計学的に有意差を示した）。一方、プラセボ群は４週間目では変化を示さなかった。８週間目でプラセボ群は危険率５％で有意な上昇を初めて示した。
【００７１】
図７にトリグリセライドの測定結果を示した。図７中、−○−は偽薬（プラセボ）群、−●−は発酵乳群である。
【００７２】
偽薬（プラセボ）群の場合、被験者全体では僅かなトリグリセライド値の上昇傾向を示した。発酵乳群では、トリグリセライド値の低下を示した。
【００７３】
以上の結果から、供試発酵乳の飲用により、総コレステロール値の低下、ＨＤＬ−コレステロールの上昇、トリグリセライドの低下を伴う血清脂質改善効果が人においても認められることが明らかとなった。
【００７４】
また、図８に血圧の変化の測定結果を示した。図８中、−○−は偽薬（プラセボ）群、−●−は発酵乳群である。
【００７５】
図８から発酵乳の飲用によって意外にも最高血圧が統計学的に有意に低下することが明らかである（０週と比較して危険率５％で統計学的に有意差を示した）。一方、偽薬（プラセボ）群の場合はその様な傾向は示さなかった。血清脂質の改善と血圧を低下させることは生活習慣病（成人病）予防にとって重要であり、本発明発酵乳はその予防にとって有効であることが示唆されている。
【００７６】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、「%」は「重量%」を意味する。
【００７７】
実施例１
脱脂粉乳（高梨乳業（株）、蛋白質含量３４％）６．６３ｋｇ、市販の乳清蛋白質濃縮物（AMＰＣ，Inc．U．S．A．蛋白質含量８０％）２．２１ｋｇ、市販の大豆ペプチド（不二製油（株））０．２６ｋｇ、砂糖２．６５ｋｇ、果糖２．６５ｋｇ、香料（協和香料興産（株））１００ｇを温水９０．０ｋｇに溶解し、均質化し、９０℃で瞬時殺菌し、発酵乳ミックス（培養基）を調製した。ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ0409株とストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ1543を上記発酵乳ミックス（培養基）に接種し、３４℃で２４時間発酵させ、冷却して発酵乳１００ｋｇを得た。この発酵乳の乳蛋白質量は４．０２２ｋｇ、乳清蛋白質量は２．２４１ｋｇであり、乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は５５．７％であった。
【００７８】
実施例２
実施例１で調製した発酵乳１００ｋｇを凍結真空乾燥して粉末１３ｋｇを得た。これを１００ｇずつガラス瓶に充填し、粉末食品１２５個を得た。この粉末食品は実施例１と同様で、乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は５５．７％であった。また、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ0409株とストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ1543は生菌として粉末１ｇあたり４×１０8個、４×１０7個それぞれ検出された。
【００７９】
実施例３
下記の通りにサワークリームを調製した。すなわち、生クリーム（乳脂肪４７％）８７ｋｇ、脱脂粉乳（高梨乳業（株）、蛋白質含量３４％）３．５ｋｇ、乳清蛋白質濃縮物（AMＰＣ，Inc．U．S．A．  蛋白質含量８０％）７．０ｋｇ、ヘキサメタリン酸ナトリウム（三栄源エフエフアイ（株））８０ｇ、水１０．０ｋｇを加温溶解し、均質化した。次いで、１２０℃で４秒間殺菌し、冷却した後、ラクトバチルス・カゼイＴＭＣ0409株とストレプトコッカス・サーモフィラスＴＭＣ1543を添加し、３７℃で２４時間培養した。そして、カードを破壊後、容器に充填した。このサワークリームの乳蛋白質中の乳清蛋白質の割合は７４．９％であった。
【００８０】
実施例４
下記の通りにクリームチーズ類を調製した。すなわち、クリームチーズ（（株）グローバルウォ−ク）１０ｋｇ、実施例２の粉末  １．２ｋｇの割合で良く混合し、冷却した。
【００８１】
実施例５
下記の通りにバター類を調製した。すなわち、乳脂肪７６．０％、食塩１．１％、実施例２の粉末３．２％の配合で常法により製造した。
【００８２】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、血清中の総コレステロールの低減とＨＤＬ−コレステロールの増加およびトリグリセライドの低減を図った機能性飲食品であって、乳清蛋白質を含有し且つ他の成分により乳清蛋白質の効果を高めることにより、乳清蛋白質の適用量を軽減し得る様に改善された上記の機能性飲食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】乳酸菌の胆汁酸代謝確認定性試験で得たHＰLＣのクロマトグラム
【図２】乳酸菌の人工胃液耐性試験の結果のグラフ
【図３】発酵乳のコレステロール吸着性試験の結果の説明図
【図４】発酵乳の血清脂質改善効果に関する動物実験の結果（血清総コレステロール測定結果）の説明図
【図５】発酵乳の血清脂質改善効果に関するヒト生体試験の結果（血清総コレステロール測定結果）の説明図
【図６】発酵乳の血清脂質改善効果に関するヒト生体試験の結果（ＨＤＬ−コレステロールの測定結果）の説明図
【図７】発酵乳の血清脂質改善効果に関するヒト生体試験の結果（トリグリセライドの測定結果）の説明図
【図８】発酵乳の血清脂質改善効果に関するヒト生体試験の結果（血圧の変化の測定結果）の説明図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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