(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有し、最終製品のｐＨを５．３以上に維持しうるペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又はその培養液を、乳糖、キシロース、ステビオサイド、グリチルリチン、アスパルテーム、糖アルコールから選ばれるペディオコッカス・アシディラクティシによって資化されにくい１種又は２種以上の甘味料を添加した非加熱食肉に、最終製品に保有される菌数が１０４／ｇ以上となるように添加することにより、生ハムに存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させることを特徴とする最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法。
【請求項２】
ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又はその培養液を、注入法、乾塩法又は塩水法により添加することを特徴とする請求項１記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法。
【請求項３】
ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又は該菌の培養液を、ｐＨを５．３以上に調整された懸濁液又は培養液として添加することを特徴とする請求項１又は２記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法。
【請求項４】
ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）によって資化されやすい糖質甘味料を、原料非加熱食肉１００重量部当たり０．３重量部未満添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法。
【請求項５】
非加熱食肉製品の製造を２０℃以下で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られ、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有し、最終製品のｐＨを５．３以上に維持しうるペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を１０４／ｇ以上保有し、リステリア・モノサイトジェネスが最終製品あたり１０／ｇ以下であり、かつｐＨが５．３以上であることを特徴とする生ハム製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗リステリア活性を有する乳酸菌を用いて、リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）により汚染されていない、あるいは汚染が著しく減じられた、最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム等の加熱殺菌を行わない非加熱食肉製品及びその製造方法、並びにそれに用いる乳酸菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、欧米を中心にリステリア・モノサイトジェネスによる感染症が多発している。食肉においてもリステリア・モノサイトジェネスによる汚染が指摘され、原料食肉を汚染源とする食肉製品での食中毒事故も報告されている。リステリア・モノサイトジェネスには耐熱性はなく、一般的な食肉製品では適正な加熱殺菌を行うことにより、その危害は防止することができる。しかし、リステリア・モノサイトジェネスは、食塩、亜硝酸塩などに耐性をもち、低温で発育するという特性を有していることから、加熱殺菌を行わない製品、いわゆる非加熱食肉製品では、リステリア・モノサイトジェネスによる感染症発生の可能性の高いことが指摘され、非加熱食肉製品において品質に悪影響を与えずにリステリア・モノサイトジェネスによる汚染を防除する方法が求められていた。
【０００３】
これまで、食肉や食肉製品のリステリア・モノサイトジェネスによる汚染の防除を目的に、様々な物理的（加熱、超高圧、放射線、電子線など）、化学的（有機酸、抗菌物質、殺菌剤など）、あるいは生物学的（競合乳酸菌、バクテリオシンなど）方法が検討されており、原料食肉を加熱せず、加工・製品化する非加熱食肉製品においても、原料肉に由来するリステリア・モノサイトジェネスによる汚染を防除するための試みが行われている。例えば、Hugheyらは、リゾチームとＥＤＴＡをフレッシュソーセージに加えることで、リステリア・モノサイトジェネスによる危害を軽減できることを報告している（Hughey, V. L., Wilger, P. A. and Johnson, E. A. Antibacterial activity of hen egg white lyzozyme against Listeria monocytogenes Scott A in foods. Appl. Environ. Microbiol., 55, 631-638(1989)）。また、乳酸菌から得られる様々なバクテリオシンが、非加熱食肉製品中のリステリア・モノサイトジェネスの削減に効果的であることも報告されている（Ryser, E. T. and Marth, E. H. Listeria, Listeriosis and Food Safety, 2nd edition, pp.552-555, Marcel Dekker, Inc., New York(1999)）。そして、Baccus-Taylorらは、サラミソーセージにペディオコッカス・アシディラクティシをスタータとして添加し、リステリア・モノサイトジェネスを約２．６ log10cfu/g 低減しうることを報告している（Baccus-Taylor, G., Glass, K. A., Luchansky, J. B. and Maurer, A. J. Fate of Listeria monocytogenes and Pediococcal starter cultures during the manufacture of chicken summer sausage. Poultry Sci., 72, 1772-1778(1993)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述した、Hugheyらの利用したＥＤＴＡやバクテリオシンの非加熱食肉製品への適用は、現在のところ我が国では許可されていないため、商業的にこれらの物質を使用することはできない。他方、Baccus-Taylorらの方法は、糖質甘味料を資化し、ｐＨを低下させる乳酸菌の特性を利用して、独特の酸味のある発酵ソ−セージの製造に適用しようとするものであるが、この場合、ｐＨの低下によって、製品本来の風味や食感などの品質が低下するような製品には利用できないという問題があった。そのため、ｐＨを極力低下させることなく、製品本来の品質を維持することが要求されている生ハム等の非加熱食肉製品において、リステリア・モノサイトジェネスを低減する新たな方法が求められていた。すなわち、本発明の課題は、リステリア・モノサイトジェネスにより汚染されていない、あるいは汚染が著しく減じられた、製品本来の風味や食感などの品質が維持されている生ハム等の非加熱食肉製品を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意研究を重ね、以下の製品開発コンセプトを先ず策定した。
(1)現在、我が国では許可されている方法を採用すること。
(2)リステリア・モノサイトジェネスによる汚染を実質的に防除しうること。
(3)生ハム製品本来の風味や食感などの品質を維持しうること。
(4)リステリア・モノサイトジェネス以外の微生物による汚染を防除しうること。
(5)既存の設備であっても、再現性をもって対応しうること。
【０００６】
ＥＤＴＡやバクテリオシンの生ハム製品へ添加する方法ではなく、食品から分離した抗リステリア活性を有する乳酸菌を添加する方法を基本とすることにより上記コンセプト(1)を解決し、原料生肉に混入したリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有する乳酸菌をスクリーニングすることにより上記コンセプト(2)を解決し、市販の非加熱食肉製品由来の抗リステリア活性を有する乳酸菌であって、最終製品のｐＨを５．３以上に維持しうる乳酸菌をスクリーニングすることにより上記コンセプト(3)を解決し、黄色ブドウ球菌に代表される汚染微生物の増殖を抑制するために、実施されている２０℃以下での生ハム製造工程においても、抗リステリア活性を発現することができる乳酸菌をスクリーニングすることにより上記コンセプト(4)を解決し、注入法、乾塩法、塩水法等の公知方法により乳酸菌を添加した場合であっても、再現性をもってリステリア・モノサイトジェネスにより汚染されていない、あるいは汚染が著しく減じられた生ハム製品が得られる条件を確立することにより上記コンセプト(5)を解決した。
【０００７】
すなわち、市販の非加熱食肉製品由来の乳酸菌をスクリーニングした結果、その中に、２０℃以下でリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有し、最終製品のｐＨを５．３以上に維持して生ハム製品本来の風味や食感などを維持しうる乳酸菌が存在することを見い出し、かかる抗リステリア活性を有する乳酸菌を、注入法、乾塩法、塩水法等の公知方法により、最終製品に保有される乳酸菌数が１０４／ｇ以上となるように添加すると、リステリア・モノサイトジェネスにより汚染されていない、あるいは汚染が著しく減じられた、製品本来の風味や食感などの品質が維持されている生ハム等の非加熱食肉製品が得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有し、最終製品のｐＨを５．３以上に維持しうるペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又はその培養液を、乳糖、キシロース、ステビオサイド、グリチルリチン、アスパルテーム、糖アルコールから選ばれるペディオコッカス・アシディラクティシによって資化されにくい１種又は２種以上の甘味料を添加した非加熱食肉に、最終製品に保有される菌数が１０４／ｇ以上となるように添加することにより、生ハムに存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させることを特徴とする最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法（請求項１）や、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又はその培養液を、注入法、乾塩法又は塩水法により添加することを特徴とする請求項１記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法（請求項２）や、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又は該菌の培養液を、ｐＨを５．３以上に調整された懸濁液又は培養液として添加することを特徴とする請求項１又は２記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法（請求項３）や、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）によって資化されやすい糖質甘味料を、原料非加熱食肉１００重量部当たり０．３重量部未満添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法（請求項４）や、非加熱食肉製品の製造を２０℃以下で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の最終製品のｐＨが５．３以上である生ハム製品の製造方法（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られ、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる抗リステリア活性を有し、最終製品のｐＨを５．３以上に維持しうるペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を１０４／ｇ以上保有し、リステリア・モノサイトジェネスが最終製品あたり１０／ｇ以下であり、かつｐＨが５．３以上であることを特徴とする生ハム製品（請求項６）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の最終製品のｐＨが５．３以上である非加熱食肉製品の製造方法としては、抗リステリア活性を有する乳酸菌又はその培養液を非加熱食肉に添加することにより、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させる方法であれば特に制限されるものではなく、上記抗リステリア活性を有する乳酸菌としては、ペディオコッカス属に属し、２０℃以下で抗リステリア活性を有する乳酸菌、特に、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性を有する乳酸菌が好ましい。ここで、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性とは、ピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）を２０重量％となるように豚挽肉に添加し、かかるピックルを添加した豚挽肉１ｇ当たり、培養洗浄集菌した乳酸菌を１０４及びリステリア・モノサイトジェネスを１０４それぞれ添加し、均一となるまで混合した後ケーシングに充填し、次いで５℃で一晩塩漬した生ハムモデルソーセージを１８℃で５日間（水分活性０．９５未満）乾燥させた後、このソーセージ２５ｇにペプトン加生理食塩水２２５ｍｌを加え、ストマッカーで均一となるまで混合粉砕したものを試料液とし、試料液０．１ｍｌをパルカム寒天培地（Merck社）を用いて３２℃で４８時間培養後、出現したコロニーで前記リステリア・モノサイトジェネス特有の様相を示すコロニー数に希釈倍率を乗じた数が１０２以下になるような抗リステリア活性をいう。
【００１２】
また、上記抗リステリア活性を有するペディオコッカス属に属し、２０℃以下で抗リステリア活性を有する乳酸菌、特に好ましくは非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性を有する乳酸菌の中でも、最終製品のｐＨを５．３以上である非加熱食肉製品とすることができる乳酸菌がより好ましい。本発明において、最終製品のｐＨが５．３以上である非加熱食肉製品とは、非加熱食肉製品１０ｇに脱イオン水９０ｍｌを加え、ホモジナイザーで均一となるまで混合粉砕した後、５分間静置したときの上澄み液のｐＨが５．３以上であることをいう。
【００１３】
上記抗リステリア活性を有するペディオコッカス属に属し、２０℃以下で抗リステリア活性を有する乳酸菌、特に好ましくは非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性を有する乳酸菌、中でも最終製品のｐＨを５．３以上である非加熱食肉製品とすることができる乳酸菌は、食品、好ましくは市販の非加熱食肉製品から公知の乳酸菌分離用培地を用いて乳酸菌を分離し、必要に応じて公知の乳酸菌同定用培地を用いて乳酸菌であることを確認し、アガーウェル法（Schillinger, U. and Lucke, F. K. Lactic acid bacteria as protective cultures in meat products. Fleischwirtsch Int. 3-10(1991)）を改変して抗リステリア活性を有する乳酸菌をスクリーニングし、次いで、ピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）を２０重量％となるように豚挽肉に添加し、かかるピックルを添加した豚挽肉１ｇ当たり、上記スクリーニングにより得られた抗リステリア活性を有する乳酸菌１０４〜１０５程度を添加し、均一となるまで混合した後ケーシングに充填し、次いで５℃で一晩塩漬した生ハムモデルソーセージを１８℃で５日間（水分活性０．９５未満）乾燥させた後、該生ハムモデルソーセージのｐＨが５．３以上で、かつ酸味や・発酵臭のない生ハムモデルソーセージとなった乳酸菌を選択することにより得ることができる。
【００１４】
食肉に存在する乳酸菌を分離する方法としては、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）添加プレートカウント寒天培地（日水製薬社製、栄研化学社製）、又は、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）指示薬を加えたAPT agar（Difco社製）、MRS agar（Oxoid社製）などの乳酸菌の発育に適した乳酸菌分離用培地を用いて、培養条件は、２０〜３５℃で４８〜７２時間培養し、寒天培地に発生したコロニーで培地を黄変しているものを乳酸菌と判定して分離することができる。しかし、その他の菌が共存又は混入していた場合、それが糖分解能を有する菌であれば乳酸菌と同様な発育挙動を示すので、被検菌についてカタラーゼ試験を行い、気泡の発生がないカタラーゼ陰性菌株を乳酸菌と確認することができる。そして、乳酸菌と確認された単一コロニーから任意に３〜１０株を釣菌し、斜面培地で培養すると同時に、斜面培地で培養し菌株を保管しておくことが好ましい。
【００１５】
抗リステリア活性を有する乳酸菌又はその培養液を、最終製品に保有される乳酸菌数が１０４／ｇ以上、好ましくは１０５／ｇ以上、特に好ましくは１０６／ｇ以上となるように添加することが、最終製品におけるリステリア・モノサイトジェネスの生菌数を確実に低減させ得ることから好ましい。本発明において、例えば、乳酸菌を１０５／ｇ以上保有するとは、非加熱食肉製品２５ｇにペプトン加生理食塩水２２５ｍｌを加え、ストマッカーで均一となるまで混合粉砕したものを試料液とし、試料液１ｍｌをＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（日水製薬社製）を用いて３２℃で４８時間培養後、出現したコロニーで培地に黄変を示すコロニー数に希釈倍率を乗じた数が１０５以上であることをいう。
【００１６】
抗リステリア活性を有する乳酸菌又はその培養液を生ハム等の食肉原料へ添加する方法としては特に制限されないが、公知の注入法、乾塩法、塩水法等を好適に例示することができる。上記注入法としては、乳酸菌やその培養物を直接原料食肉に注入する方法であればどのような方法でもよいが、特開平１１−８９５４２号公報記載の高圧直進水流ノズルを備えた無針型ピックルインジェクターを用いて均一に分散・注入する方法が好ましい。上記乾塩法としては、食塩、亜硝酸塩、硝酸塩などの塩漬剤に乳酸菌又はその培養液を混合し、食肉表面に塗布する方法の他、解凍前の原料食肉、解凍後の原料食肉、塩漬終了後の食肉、塩漬・脱塩終了後の食肉の表面に乳酸菌又はその培養液を塗布する方法を例示することができる。また、上記塩水法としては、塩漬剤に乳酸菌又はその培養液を混合した溶液に食肉を浸漬し、食肉表面から乳酸菌を浸透させる方法の他、解凍前の原料食肉や解凍後の原料食肉の表面に乳酸菌又はその培養液を塗布した後、ピックル液に浸漬し、食肉表面から乳酸菌を浸透させる方法を例示することができる。上記乳酸菌やその培養物はそのまま使用してもよいが、凍結乾燥等の処理をしたものも使用することができる。さらに、上記抗リステリア活性を有する乳酸菌又はその培養液を、ｐＨ５．３以上に調整された乳酸菌懸濁液として添加したり、あるいは、乳酸菌の培養液のｐＨを５．３以上に調整した後添加することもできる。
【００１７】
また、抗リステリア活性を有する乳酸菌又はその培養液と、乳糖、キシロース、ステビオサイド、グリチルリチン、アスパルテーム、糖アルコールから選ばれる乳酸菌によって資化されにくい１種又は２種以上の甘味料とを、共に生ハム等の食肉原料へ添加することもできる。この場合、最終製品のｐＨを５．３以上にすることが一層確実となる他、酸味が緩和されるので風味の上からも好ましい。また、砂糖やブドウ糖等の乳酸菌によって資化されやすい糖質甘味料は、添加しなくてもよいが、最終製品の酸味の緩和や呈味の改良の目的で添加する場合は、最終製品のｐＨが５．３以上を維持することが困難になるおそれがあるので、原料非加熱食肉１００重量部当たり０．３重量部未満の割合で添加することが好ましい。
【００１８】
本発明の非加熱食肉製品としては生ハムを好適に例示することができるが、生ハム以外の非加熱食肉製品としては、冷凍・冷蔵肉塊で商取引される流通生肉等を例示することができ、最終製品のｐＨが５．３未満であるサラミソーセージ等の非加熱食肉製品は本発明の非加熱食肉製品に該当しない。また、本発明における食肉としては、豚肉、牛肉、家禽肉、馬肉、羊肉及びこれらの内臓肉、骨付き肉、皮付き肉並びに魚肉等を例示することができる。そして、これらの非加熱食肉原料を用いての最終製品のｐＨが５．３以上である非加熱食肉製品の製造に際しては、製造工程を２０℃以下で行うことが、リステリア・モノサイトジェネス以外の黄色ブドウ球菌、クロストリジウム属菌、サルモネラ菌、大腸菌等に代表される汚染微生物の増殖を抑制する上で好ましい。
【００１９】
本発明の生ハム等の非加熱食肉製品としては、ペディオコッカス属に属し、２０℃以下で抗リステリア活性を有する乳酸菌を１０４／ｇ以上保有し、かつｐＨが５．３以上である非加熱食肉製品であれば特に制限されるものではないが、２０℃以下での抗リステリア活性を有する乳酸菌が、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性を有する乳酸菌であることが好ましく、これら２０℃以下で抗リステリア活性を有する乳酸菌は、単独又は組み合わせて使用することもできる。また、本発明の生ハム等の非加熱食肉製品としては、リステリア・モノサイトジェネスが最終製品当たり１０／ｇ以下、好ましくは１／ｇ以下、より好ましくは検査試料２５ｇ中に検出されない製品が望ましい。そして、これら本発明の生ハム等の非加熱食肉製品は、前記本発明の非加熱食肉製品の製造方法により得ることができる。
【００２０】
本発明の乳酸菌としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）又はペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaseus）に属し、２０℃以下で抗リステリア活性を有するものであれば特に制限されるものではないが、非加熱食肉に存在するリステリア・モノサイトジェネスを１％以下に減少しうる活性を有する乳酸菌が好ましく、具体的にはペディオコッカス・アシディラクティシＰＳＣ−Ｙ５４０２０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２９９）を例示することができる。
【００２１】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（抗リステリア活性を有する乳酸菌のスクリーニング）
非加熱食肉製品を１３０種類用意し、各製品２５ｇにペプトン加生理食塩水２２５ｍｌを加え、ストマッカーで均一となるまで混合粉砕したものを試料液とし、試料液１ｍｌをＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（日水製薬社製）を用いて３２℃で４８時間培養後、出現したコロニーで培地に黄変を示す乳酸菌コロニー約５００個を単離し、次いで各コロニーをカタラーゼ試験により乳酸菌であることを確認した。このようにして、乳酸菌と判定された３８０株の各々につき、アガーウェル法により抗リステリア活性を調べた。なお、アガーウェル法は、リステリア・モノサイトジェネスを１０６／ｍｌ接種したトリプトソーヤ寒天培地（日水製薬社製）平板に直径５ｍｍの孔を切り、分離乳酸菌の培養液（APT broth、３２℃、２４〜４８時間）上清３０μｌを分注し、４℃で２時間浸透させた後、３２℃で２４時間培養を行い、孔の周辺に形成されるリステリア・モノサイトジェネシスの増殖阻止による透明な阻止円の直径を測定することで抗リステリア活性を確認した。各種非加熱食肉製品から分離された代表的な乳酸菌９種１１株についての結果を表１に示す。この結果、抗リステリア活性の認められたラクトバチルス（Lactbacillus）属に属する４株、ストレプトコッカス（Streptcoccus）属に属する１株、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する２株の計７株を以下の実験に供した。
【００２２】
【表１】
0003966496.tif 000002
【００２３】
実施例２（生ハム様モデルソーセージ中での抗リステリア活性と品質への影響）
実施例１で抗リステリア活性の認められた７株について、生ハム様モデルソーセージ中での抗リステリア活性と品質への影響を調べた。ピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）を２０重量％となるように豚挽肉に添加し、かかるピックルを添加した豚挽肉１ｇ当たり、培養（APT broth、３２℃、２４〜４８時間）後洗浄・集菌した乳酸菌を１０４個及びリステリア・モノサイトジェネスを１０４個それぞれ添加し、均一となるまで混合した後ケーシングに充填し、次いで５℃で一晩塩漬した生ハムモデルソーセージを１８℃で５日間（水分活性０．９５未満）乾燥させ、乳酸菌数及びリステリア菌数の測定を行った。また同時に官能評価用の生ハム様モデルソーセージも同様に製造し、風味、色調などの評価も行った。また、このソーセージ２５ｇにペプトン加生理食塩水２２５ｍｌを加え、ストマッカーで均一となるまで混合粉砕したものを試料液とし、試料液１ｍｌをＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（日水製薬社製）を用いて３２℃で４８時間培養後、出現したコロニーで培地に黄変を示すコロニー数に希釈倍率を乗じた数を乳酸菌数とし、同様に試料液０．１ｍｌをパルカム寒天培地（Merck社製）を用いて３２℃で４８時間培養後、出現したコロニーでリステリア・モノサイトジェネス特有の様相を示すコロニー数に希釈倍率を乗じた数をリステリア菌数とした。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
表２にから、乳酸菌無添加の対照区（乾燥５日目の乳酸菌数：１０３〜１０４ＣＦＵ／ｇ）ではリステリア削減効果が０．９オーダーであるのに対して、乳酸菌添加の試験区（乾燥５日目の乳酸菌数：１０７〜１０８ＣＦＵ／ｇ）では、いずれの株においても、リステリア削減効果が２．４オーダー以上であることがわかった。しかし、同時にｐＨの低下に伴う品質に悪影響があり、酸味や発酵臭を感じるものもあった。供試菌７株の中で、比較的風味への影響が少ないと評価されたのは、P.pentosaceus、P.acidilactici PSC-Y540205、L.helveticus PSC-Y512201の３株で、これら３株のうち、抗リステリア活性が比較的高かったP.acidilactici PSC-Y540205を選択し、以下の実験に供した。
【００２６】
実施例３（生ハムにおける資化されやすい糖質甘味料の影響）
実施例２で選択された乳酸菌P. acidilactici PSC-Y540205について、酸味の緩和策として資化されやすい糖質甘味料を削減し、これによる抗リステリア活性と品質への影響を実際の生ハムで調べた。また、資化されやすい糖質甘味料として砂糖、ブドウ糖を用いた。実施例２で用いたピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）の砂糖８重量％に代えて、砂糖又はブドウ糖の含量が生ハム原料肉中でそれぞれ０重量％、０．５重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％、２．５重量％（甘味料減少分は水の添加量を増やした）となるように調整したピックルを２０重量％となるように生ハム原料肉に注入添加した。これにより、生ハム原料肉１００重量部当たり、砂糖又はブドウ糖をそれぞれ０重量部、０．１重量部、０．２重量部、０．３重量部、０．４重量部、０．５重量部含んだ生ハムサンプルを調製した。また、注入添加には、前記特開平１１−８９５４２号公報記載の高圧直進水流ノズルを備えた無針型ピックルインジェクターを用い、ピックルを均一に分散・注入した。なお、リステリア・モノサイトジェネスは原料１ｇ当たり約１０４個となるように原料食肉に接種し、洗浄集菌した乳酸菌は、原料食肉１ｇあたり約１０７個となるようにピックルに配合して、注入することにより接種した。なお、乳酸菌無添加を対照区とした。
【００２７】
各塩漬肉をファイブラスケーシングに充填し、１８℃、５日間（水分活性０．９５以下）乾燥させ、経時的に乳酸菌数及びリステリア菌数の測定を行った。また同時に官能評価用の生ハムも同様に製造し、風味、色調などの評価も行った。結果を表３に示す。乳酸菌添加した試験区では、砂糖、ブドウ糖の添加、無添加に関係なく、リステリア削減効果が２．５オーダー以上あることがわかった。官能評価では、砂糖あるいはブドウ糖の添加量０．３重量％以上の試験区では弱い酸味を感じるという評価であったが、添加量０．２重量％以下であれば良好な評価が得られたことから、資化されやすい甘味料の添加量を０．３重量％未満程度にすれば、ｐＨ低下に伴う品質劣化を生じさせずにリステリア・モノサイトジェネスを減少できることがわかった。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
実施例４（生ハムにおける資化されにくい甘味料の影響）
砂糖又はブドウ糖に代えて、生ハム原料肉１００重量部当たり、乳糖、キシロース、ステビオサイド、グリチルリチン、アスパルテーム、又は糖アルコールを１重量部含んだ生ハムサンプルを用いる以外は、実施例３と同様にして、生ハムサンプルにおける乳酸菌数及びリステリア菌数の測定を経時的に行った。また同時に官能評価用の生ハムも同様に製造し、風味、色調などの評価も行った。結果を表４に示す。乳酸菌添加区では、いずれの甘味料でも抗リステリア活性が確認できた。官能評価では、砂糖を使用した対照区においてｐＨの低下による酸味が感じられたが、資化されにくい乳糖、キシロース、ステビオサイド、グリチルレチン、アスパルテーム、糖アルコールの甘味料を使用した試験区では、いずれも良好な評価が得られた。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
実施例５（生ハムの各種製法）
実施例２で選択された乳酸菌P. acidilactici PSC-Y540205を用いて、注入法、乾塩法及び塩水法の３種類の製法により生ハムを製造し、各種製法における抗リステリア活性と品質への影響を調べた。種類の製法における乳酸菌等の添加方法を以下に示す。
注入法；上記乳酸菌を添加したピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）が２０重量％となるように、あらかじめリステリア菌が原料肉１ｇ当たり約１０４個となるように塗布した生ハム原料肉に注入添加した。注入添加には、前記特開平１１−８９５４２号公報記載の高圧直進水流ノズルを備えた無針型ピックルインジェクターを用い、乳酸菌・リステリア菌含有ピックルを均一に分散・注入した。かかる乳酸菌を注入したものを試験区とし、乳酸菌を注入しなかったものを対照区とした。
乾塩法；生ハム原料肉の表面に、原料肉の１２重量％に相当する塩漬剤（精製塩１８重量部、砂糖８重量部、亜硝酸塩その他５重量部）を塗布し、４℃で１４日間塩漬した後、脱塩処理を施した。その後、リステリア菌を脱塩した肉１ｇ当たり約１０４個になるように接種し、３７℃１５分間放置することで、リステリア・モノサイトジェネスを定着させ、次いで、あらかじめ洗浄集菌した乳酸菌の懸濁液に上記脱塩した肉を浸漬させ、塩漬肉１ｇ当たり約１０７個になるように乳酸菌を接種したものを試験区とし、乳酸菌を接種しなかったものを対照区とした。
塩水法；生ハム原料肉を、原料肉の５０重量％に相当するピックル（水６９重量％、精製塩１８重量％、砂糖８重量％、亜硝酸塩その他５重量％）に浸漬し、４℃で１３日間塩漬した後、脱塩処理を施した。その後、リステリア菌を脱塩した肉１ｇ当たり約１０４個になるように接種し、３７℃１５分間放置することで、リステリア・モノサイトジェネスを定着させ、次いで、あらかじめ洗浄集菌した乳酸菌の懸濁液に上記脱塩した肉を浸漬させ、塩漬肉１ｇ当たり約１０７個になるように乳酸菌を接種したものを試験区とし、乳酸菌を接種しなかったものを対照区とした。
【００３２】
上記注入法、乾塩法及び塩水法で処理した食肉をファイブラスケーシングに充填し、燻煙を行い、１８℃、５日間（水分活性０．９５以下）乾燥させ、乳酸菌数及びリステリア菌数の測定を行った。また同時に官能評価用の生ハムも同様に製造し、風味、色調などの評価も行った。注入法、乾塩法及び塩水法でのリステリア削減効果及び官能評価の結果を表５に示す。注入後、乾塩法、塩水法のいずれの製造方法においても抗リステリア活性を有する乳酸菌を接種することで、２オーダー以上のリステリア削減効果が確認でき、さらに官能評価においても良好な結果が得られ、乳酸菌無添加区と比較して品質的に問題のないことがわかった。
【００３３】
【表５】
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【００３４】
【発明の効果】
本発明によると、リステリア・モノサイトジェネスにより汚染されていない、あるいは汚染が著しく減じられた、製品本来の風味や食感などの品質が維持されている生ハム等の非加熱食肉製品を提供することができる。