(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地。
【請求項２】
酵母用栄養培地に７．５％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み食塩を含まない、請求項１記載のエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地。
【請求項３】
酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地。
【請求項４】
酵母用栄養培地に４．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を含み食塩を含まない、請求項３記載のエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地。
【請求項５】
被検菌を、請求項１及び／又は請求項３に記載の培地に接種し、培地上で生育が観察されたコロニーから目的とする株を分離することを特徴とするエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同培地を用いるエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法並びに同培地により分離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を用いる、醤油及び味噌などの含塩醗酵食品の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
醤油は大豆及び小麦蛋白質を麹菌酵素により加水分解して得られる調味料であると同時に、耐塩性の醤油酵母及び醤油乳酸菌の醗酵作用による発酵調味料でもあり、醤油醸造において、それらの微生物管理は品質のよい醤油を製造するための重要な因子である。
【０００３】
醤油醸造に関わる耐塩性の醤油酵母には、分類学的にはチゴサッカロマイセスルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）の１属１種に属し、１０〜２０％の塩化ナトリウムの存在下でもグルコースをもとに旺盛なエタノール醗酵を行なう能力を有することから、主に醤油諸味のエタノール醗酵に寄与する醤油主発酵酵母と、この醤油主発酵酵母によるエタノール発酵が終了した頃から活躍し始めて、主として醤油特有の香気の生成に関与する、かつては後熟酵母群とも呼ばれていた、耐塩性キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母ないしは耐塩性トルロープシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属酵母とがある（栃倉辰六郎編著、醤油の科学と技術、日本醸造協会、１６３〜１７０  （１９８８））。
【０００４】
この醤油主醗酵酵母と後熟酵母群とを分離識別する方法としては、下記のものが既に報告されている。
（１）醤油主醗酵酵母は高濃度の塩化ナトリウム存在下でもマルトースを資化できるが、後熟酵母群（例えば耐塩性トルロープシス属酵母）は資化できないので、この高塩下におけるマルトース資化性の差を利用して、マルトースを唯一の炭素源とする加塩寒天栄養平板培地上での生育の有無に基づいて、これらの酵母を分離識別する（茂木恵太郎ら、農化、４２、４６６  （１９６８））。
（２）後熟酵母群は、１８％の塩化ナトリウム存在下、かつｐＨ４．５以上の条件下において、亜鉛イオンに対する耐性を示すが、醤油主醗酵酵母はその耐性を持たないことを利用して、１８％塩化ナトリウム及び特定濃度の亜鉛イオン（塩化亜鉛）ないしはリチウムイオン（リチウムイオン）を含有することを特徴とする寒天栄養平板培地上での生育の有無に基づいて、これらの酵母を分離識別する（馬場林留ら、農化、５１、２６１  （１９７７））。以下、これらの培地をそれぞれ「Ｚ培地」及び「Ｌ培地」と略す。
（３）醤油主醗酵酵母はオルソバニリンにより生育が阻害されないが、後熟酵母群（例えば耐塩性トルロープシス属酵母）は生育が阻害されることを利用して、オルソバニリン加寒天栄養平板培地上での生育の有無に基づいて、これらの酵母を分離識別する（奥沢洋平ら、醤研、６、１３８（１９８０））。この培地を「ＯＶ培地」と略す。
【０００５】
（４）しかしながら、一概に醤油主醗酵酵母と言っても、株によってその性質は異なっており、醤油諸味中での増殖能やエタノール醗酵能にも大きな違いがある。そのために、実際の醤油醸造工程の諸味中には、多数の醤油主醗酵酵母株が混在して、醤油主醗酵酵母叢を形成しているが、これらの醤油主醗酵酵母株のすべてが醤油諸味のエタノール醗酵に同等に関与しているわけではなく、主にエタノール醗酵を担っている株はほんのごく少数に過ぎないことを、醤油主醗酵酵母叢のフローラ解析を通じて確認した。
【０００６】
このような、醤油諸味のエタノール醗酵を担っている主要株の性質としては、（１）諸味中での増殖が良好であり、それゆえにエタノール醗酵過程における諸味中での醤油主醗酵酵母叢に占めるその株の占有率が高く、（２）しかも株そのもののエタノール生産性が高いことが必要であろうと推察される。
【０００７】
醤油主醗酵酵母株のエタノール生産性を評価する従来の方法としては、１０〜２０％塩化ナトリウムを含む酵母用栄養培地（以下、「Ｃ培地」と略す）か、あるいはオルソバニリン及び１０〜１８％塩化ナトリウムを含む酵母用栄養培地「ＯＶ培地」に適当量の被検菌を塗抹して、３０℃条件下で３〜１０日間培養し、寒天培地上に形成された醤油主醗酵酵母株のコロニーについて、あるいは更に１８％塩化ナトリウムを含む酵母用栄養培地「Ｌ」培地上で生育が阻害される事を調べた上で、これらのコロニーを無作為ないしは全数釣菌して、醤油諸味又は諸味液汁に個別接種して、更に３０℃条件下で所定時間培養して、それぞれのエタノール生産量ないしは炭酸ガス生産量をガスクロマトグラフィー法などによりいちいち計測し、それぞれの株の乾燥ないしは湿菌体重量当たり、時間当たりのエタノール生産量ないしは炭酸ガス生産量を算出して、この値を株間で比較することを通して評価する方法しかなく、多大な時間と労力を要する面倒な作業である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、醤油諸味中での被検菌の増殖能検査や諸味又はその液汁での培養評価試験を行うことなく、醤油主発酵酵母のエタノール醗酵能を非常に簡単に、正確かつ迅速に評価できる培地を得ること、また同培地を用いてエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を確実に分離すること、またさらに分離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を醤油製造などに用いて、エタノール発酵の適正化と迅速化を図り、優れた風味を有する醤油及び味噌などの含塩醗酵食品を得ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の目的を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、醤油諸味中に混在する多数の醤油酵母の中から、まず従来公知の醤油主醗酵酵母と後熟酵母群とを分離識別する方法、例えばＯＶ培地及びＬ培地を利用して醤油諸味、或いは発酵熟成中の味噌から醤油主醗酵酵母株のみを分離した。そして得られた醤油主醗酵酵母株の集団を「特定濃度のグルコース及び硫酸銅を含む寒天培地」及び／又は「特定濃度のグルコース及び塩化マンガンを含む寒天培地」に接種し、生育が観察されたコロニーから高頻度にエタノール高生産性株のみを簡便かつ迅速に分離できること、またこの培地を用いて分離した醤油主醗酵酵母株が醤油諸味中で、或いは味噌の発酵熟成中に比較的高いエタノール生産性を示すという新事実を発見した。
以下、この点について詳述する。
（１）本発明者は、醤油主発酵酵母株の集団を、１〜３％（Ｗ／Ｖ（＝５５〜１６０ｍＭ））グルコースを加えた醤油主醗酵酵母用の無塩栄養培地に、更に０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを添加含有させた培地に接種培養すると、ほとんどすべての醤油主醗酵酵母株の生育が阻害され、培地上に集落が形成されない。しかし、グルコース濃度を３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）に高めてやると、０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンが加えられた無塩培地であっても、醤油主醗酵酵母株の中でも一部の株については生育が認められる（加糖によるマンガン耐性能の獲得）ようになることを知った。
そして、添加するグルコース濃度を、この濃度範囲内でより低く制限した場合に生育してくる株のエタノール生産性を調べてみると、いずれの株もが高いエタノール生産性を示すことを知った。
なお、無塩培地における「無塩」とは、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないことを意味する。
（２）また１〜３％（Ｗ／Ｖ（＝５５〜１６０ｍＭ））グルコースを加えた醤油主醗酵酵母用の無塩栄養培地に更に０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を加えると、ほとんどすべての醤油主醗酵酵母株の生育が阻害され、培地上に集落が形成されない。
しかし、グルコース濃度を３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）以上に高めてやると、０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅が加えられた無塩培地であっても、醤油主醗酵酵母株の中でも一部の株については生育が認められる（加糖による銅耐性能の獲得）ようになることを知った。
そして添加するグルコース濃度を、この濃度範囲内でより低く制限した場合に生育してくる株のエタノール生産性能を調べてみると、いずれの株もが高いエタノール生産性を示すことを知った。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものであって、すなわち本発明は、
（１）酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地である。
（２）また本発明は、酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地である。
（３）また本発明は、被検菌を、上記（１）及び／又は（２）に記載の培地に接種し、培地上で生育が観察されたコロニーから目的とする株を分離することを特徴とするエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明を実施するには、まず通常の醤油主発酵酵母株を分離法に従い、既知の寒天培地(Ｃ培地)、奥沢らの方法による寒天培地（ＯＶ培地）及び馬場らの方法による寒天培地（Ｌ培地）を利用して醤油諸味中に混在する多数の醤油酵母の中から醤油主醗酵酵母株のみを分離する。これら３種類の培地組成及びその調製法の詳細を以下に示す。
【００１３】
Ｃ培地の培地組成：３．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．５％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ製］、０．５％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ）、１０〜２０％塩化ナトリウム、２．２％寒天（ｐＨ４．８〜５．２）  調製法：培地成分を蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．８〜５．２に調整してから、更に蒸留水を加えて容量を整え、加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。殺菌した培地は、無菌条件下でその１０ｍｌずつを無菌のシャーレに分注し、冷却して固め、Ｃ培地とした。
【００１４】
ＯＶ培地の基本培地組成：３％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．４％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸［ＤＩＦＣＯ製］、０．２％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ製］、０．１％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ）、０．０１％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、１８％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、２．２％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ４．９）。
【００１５】
ＯＶ培地の調製法：基本培地成分を蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．９に調整してから、更に蒸留水を加えて容量を整え、加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。殺菌した培地１００ｍｌは、４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下で８ｍｇ／ｍｌのオルソバリニンを含む９９．５％エタノール溶液１ｍｌを加えてよくかき混ぜ、その１０ｍｌずつを無菌のシャーレに分注し、冷却して固め、ＯＶ培地とした。
【００１６】
Ｌ培地の組成：３％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．４％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸［ＤＩＦＣＯ製］、０．２％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ製］、０．１％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ）、０．０１％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、０．４２％（Ｗ／Ｖ）塩化リチウム、１８％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、２．２％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ４．９）。
【００１７】
Ｌ培地の調製法：培地成分を蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．９に調整してから、更に蒸留水を加えて容量を整え、加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。この培地１０ｍｌずつを無菌条件下でシャーレに分注し、冷却して固め、Ｌ培地とした。
【００１８】
次に本発明は、この得られた醤油主醗酵酵母株の集団、すなわち被検菌を、「酵母の生育可能な酵母用栄養培地であって、特定濃度のグルコース及び硫酸銅を含む寒天培地(以下、Ｍｎ培地という)」及び／又は「酵母の生育可能な酵母用栄養培地であって、特定濃度のグルコース及び塩化マンガンを含む寒天培地(以下、Ｃｕ培地という)」に対して、接種培養し、培地上で生育が観察されたコロニーを釣菌してエタノール高生産性株を得ることができる。
【００１９】
上記、酵母用栄養培地としては、適当なＮ源、Ｃ源、及びこれらに必要により各種ビタミン、無機塩類（ミネラル）などを含有させた、酵母が旺盛に生育可能な任意の培地（ｐＨ４．８〜５．４）が挙げられ、例えばイーストカーボンベース及び硫酸アンモニウムから構成される培地（ｐＨ４．８〜５．４）、あるいはグルコース、酵母エキス、各種無機塩類及びこれらに必要によりカザミノ酸を加えた構成からなる培地（ｐＨ４．８〜５．４）などが挙げられる。
【００２０】
以下にＭｎ培地とＣｕ培地の組成及び調製法の詳細を示す。
Ｍｎ培地の培地組成としては、上記に挙げた培地が挙げられるが、特に、酵母用栄養培地に７．５（Ｗ／Ｖ）グルコース及び１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み食塩を含まない培地が好ましい。
すなわち、５．８５％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、５．８５％のうち５％はグルコースが占める］、２．５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム、１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガン、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）が好ましい。
【００２１】
Ｍｎ培地の調製法：５．８５ｇイースト・カーボン・ベース、０．７ｇ、硫酸アンモニウムを蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以下、これを「Ａ液」と略す）。
これとは別に、１．０ｇ塩化マンガンを蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「Ｂ液」と略す）、また２．５ｇグルコース及び２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「Ｃ液」と略す）。
Ｂ液及びＣ液は加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またＡ液は無菌条件下でワットマン製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。
加熱殺菌の済んだＢ液及びＣ液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でＡ液２５ｍｌ、Ｂ液２５ｍｌ、Ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し込んで固め、Ｍｎ培地とする（Ａ液、Ｂ液、Ｃ液を混合すると、Ｂ液中の塩化マンガンが不溶化して、培地が白濁するので、すばやく混合してシャーレに分注しないと、シャーレ一枚一枚ごとに培地に含まれる塩化マンガンの濃度に誤差を生ずることになるので注意する）。
【００２２】
Ｃｕ培地の培地組成としては、上記に挙げた培地が用いられるが、特に酵母用栄養培地に４．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を含み食塩を含まない培地が好ましい。
すなわち、４．６８％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、４．６８％のうち４％はグルコースが占める］、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム、０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）が好ましい。
【００２３】
Ｃｕ培地の調製法：４．６８ｇイースト・カーボン・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以下、これを「ａ液」と略す）。
これとは別に、０．２ｇ硫酸銅を蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「ｂ液」と略す）、また２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「ｃ液」と略す）。
ｂ液及びｃ液は加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またａ液は無菌条件下でワットマン製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。
加熱殺菌の済んだｂ液及びｃ液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でａ液２５ｍｌ、ｂ液２５ｍｌ、ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し込んで固め、Ｃｕ培地とする。
【００２４】
次に、こうして得られた醤油主醗酵酵母株は、生醤油液体培地などによりエタノール生産性を調べ、評価した後本発明のに用いるエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株として醤油或いは味噌など含塩発酵食品に利用される。
【００２５】
生醤油液体培地の調製法を以下に示す。
生醤油液体培地の調製法：仕込み後３５日目の醤油諸味（ｐＨ５．１〜５．３）を濾紙（東洋濾紙社製、ＡＤＶＡＮＴＥＣ−ＴＯＹＯ．Ｎｏ．２）して得られる濾液を、無菌条件下でワットマン社製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化して調製する。
【００２６】
【実施例】
実施例１
Ｍｎ培地の培地の調製例
（Ｍｎ培地の培地組成）：
５．８５％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ  ＣａｒｂｏｎＢａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、５．８５％のうち５．０％はグルコースが占める］、２．５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム、１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガン、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）
（Ｍｎ培地の調製法）：
５．８５ｇイースト・カーボン・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以下、これを「Ａ液」と略す）。
これとは別に、１．０ｇ塩化マンガンを蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「Ｂ液」と略す）、また２．５ｇグルコース及び２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「Ｃ液」と略す）。
Ｂ液及びＣ液は加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またＡ液は無菌条件下でワットマン社製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。加熱殺菌の済んだＢ液及びＣ液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でＡ液２５ｍｌ、Ｂ液２５ｍｌ、Ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し込んで固め、Ｍｎ培地とする（Ａ液、Ｂ液、Ｃ液を混合すると、Ｂ液中の塩化マンガンが不溶化して、培地が白濁するので、すばやく混合してシャーレに分注しないと、シャーレ一枚一枚ごとに培地に含まれる塩化マンガンの濃度に誤差を生ずることになるので注意する）。
【００２７】
実施例２
Ｃｕ培地の培地の調製例
（Ｃｕ培地の培地組成）：
４．６８％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、４．６８％のうち４．０％はグルコースが占める］、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム、０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）
（Ｃｕ培地の調製法）：
４．６８ｇイースト・カーボン・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以下、これを「ａ液」と略す）。
これとは別に、０．２ｇ硫酸銅を蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「ｂ液」と略す）、また２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「ｃ液」と略す）。ｂ液及びｃ液は加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またａ液は無菌条件下でワットマン製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。
加熱殺菌の済んだｂ液及びｃ液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でａ液２５ｍｌ、ｂ液２５ｍｌ、ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し込んで固め、Ｃｕ培地とする。
【００２８】
実施例３
（エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法）
試料として醤油諸味５ｇを採取し、通常の方法でホモジナイズした後、殺菌した１０％塩化ナトリウム水溶液４５ｍｌに懸濁した。
この懸濁液を２〜３分静置して固形物を沈殿させた後、その上清液０．１ｍｌを、殺菌した１０％塩化ナトリウム水溶液９．９ｍｌで希釈した。
上記のＣ培地及びＯＶ培地に、この希釈液０．１ｍｌを各々塗抹した。
これらの培地を３０℃の培養器に入れ、７日間放置した。
その結果、培地１枚当たり平均１６０個のコロニーが出現した。
Ｃ培地上に出現したコロニーの中から１０個、ＯＶ培地上に出現したコロニーを更にＬ培地に植え継ぎ、Ｌ培地上では生育が観察されなかったコロニーの中から１０個をそれぞれ無作為に釣菌し、前者のコロニーをＣ−１〜１０株、後者をＯＶ−１〜１０株と命名した（図１：酵母株の分離手順参照）。
また、これとは別に、ＯＶ培地上ではコロニーを形成したが、Ｌ培地上では生育が観察されなかったコロニーすべてを釣菌してＭｎ培地及びＣｕ培地に植え継ぎ、３０℃で３〜７日間培養した後、このＭｎ培地及びＣｕ培地上で生育が観察されたコロニーの中からそれぞれ１０個を無作為に釣菌して、これらのコロニーをＭｎ−１〜１０株及びＣｕ−１〜１０株と命名した（図１参照）。
更にＭｎ培地上で生育が観察されたコロニーすべてを釣菌してＣｕ培地に植え継ぎ、３０℃で３〜７日間培養した後、このＣｕ培地上で生育が観察されたコロニーの中から１０個を無作為に釣菌して、これらのコロニーをＣｕＭｎ−１〜１０株と命名した（図１参照）。
これらのＣ−１〜１０株、ＯＶ−１〜１０株、Ｍｎ−１〜１０株、Ｃｕ−１〜１０株、ＣｕＭｎ−１〜１０株の計５０株を、それぞれ１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、７％グルコース（Ｗ／Ｖ）、８．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌから構成される生醤油液体培地（ｐＨ５．２）中で３０℃、７２時間振とう培養（１４０ｒｐｍ）した種培養液を得た。
次いで、上記微生物をそれぞれ５０本の前記生醤油液体培地１０ｍｌに対して１×１０7個／ｍｌずつ接種し、３０℃で２４時間培養した後、培養液中に生産されたエタノールの量をガスクロマトグラフィー法にて測定し、これを「エタノール生産性値」とした。
測定結果を表１〜表５に示す。
【００２９】
【表１】
0003904187.tif 000002
【００３０】
【表２】
0003904187.tif 000003
【００３１】
【表３】
0003904187.tif 000004
【００３２】
【表４】
0003904187.tif 000005
【００３３】
【表５】
0003904187.tif 000006
【００３４】
表１に示す通り、Ｃ培地で分離した酵母株（Ｃ−１〜１０株）のエタノール生産性は０．１１〜１．３１％(平均０．６４９％)を示し、一方表２に示す通り、ＯＶ培地及びＬ培地で分離した酵母株(ＯＶ−１〜１０株)のそれは０．８３〜１．５８％(平均１．１４１％)を示し、いずれも低濃度のエタノール生産性を示すことが判る。
これに対し、表３に示す通り、Ｍｎ培地で分離した酵母株（Ｍｎ−１〜１０株）のそれは１．３１〜１．６９％（平均１．５３３％）を示し、また表４に示す通りＣｕ培地で分離した酵母株（Ｃｕ−１〜１０株）のそれは１．４８〜１．７２％(平均１．５９５)を示し、更にまた表５に示す通りＭｎ培地及びＣｕ培地で分離した酵母株（ＣｕＭｎ−１〜１０株）のそれは１．５６〜１．７６％(平均１．６３７)を示すことが判る。
これらの結果から、本発明によれば、従来法で得られるエタノール生産性醤油主発酵酵母（ＯＶ−１〜１０株）（エタノール生産性：平均１．１４１％）に比べて、３４〜４３％も高いエタノール生産性を有する醤油主発酵酵母株のみを、高頻度で分離できることが判る。
【００３５】
先にも記した通り、醤油諸味中に存在する酵母には、主として醤油諸味エタノール醗酵に寄与する醤油主醗酵酵母の他にも、エタノール醗酵は微弱で醤油独特の香り成分の生産に関与する、キャンディダ  バーサティルス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）などに代表される後熟酵母群があるが、ＯＶ培地にはこの後者、後熟酵母群の生育を抑える働きがあるために、培地上に形成されたコロニーは主としてエタノール醗酵に寄与する醤油主醗酵酵母の株のみであり、Ｌ培地には逆に醤油主醗酵酵母の株のみの生育を阻害する働きがあるために、ＯＶ培地ではコロニーを形成するものの、Ｌ培地では生育できない株は醤油主醗酵酵母の株に限定されるのに対して、Ｃ培地にはそのような選抜効果がないために、醤油諸味のエタノール醗酵にあまり寄与しない後熟酵母群の株のコロニーも混在しているために、ＯＶ−１〜１０株に較べてＣ培地から釣菌された１０株、すなわちＣ−１〜１０株によるエタノール生産性はより低くなった。
また、Ｍｎ培地及びＣｕ培地の両方を用いて分離した株１０株（ＣｕＭｎ−１〜１０株）のエタノール生産性は、１．５６〜１．７６％と更に高い値を示し、Ｍｎ培地及びＣｕ培地を併用することにより、より効率的にエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を分離することができることが確認された。
このことから、本発明は、エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の迅速かつ効率的で簡便な分離識別法として有効である。
【００３６】
実施例４
実施例３にて分離したＣｕＭｎ−８株を用いた小規模の醤油醸造試験
本発明の方法にしたがって醤油諸味から分離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株ＣｕＭｎ−８株について、小規模の醤油醸造試験を行い、そのエタノール生産性を試験した。
実際の醤油醸造工程における諸味仕込み工程は、通常、完全な無菌状態ではないために、半年から長い場合には一年以上の時間を要して醸造される醤油諸味に野生酵母株が混入するのはごく当たり前のことであり、醤油の品質向上や生産性の効率化の目的のために選抜したある種の醤油主醗酵酵母株を醤油諸味中に添加したとしても、醸造中に混入した野生酵母株の諸味中における生存性の方が強く、添加酵母株が駆逐されてしまい、結果的に選抜株の添加効果を生み出さず、緩慢なエタノール生産を引き起こす場合も少なくない。
そこで、本発明において分離されたＣｕＭｎ−８株を種酵母とした小規模の醤油醸造試験を行い、醤油諸味のエタノール醗酵を観察するとともに、本株の諸味中における生存性、すなわち諸味中に含まれる醤油主醗酵酵母群に占めるＣｕＭｎ−８株の比率を調べた。
【００３７】
諸味の調製は、関根らの方法（醤研、１３、１４９  （１９８７））に従った。また、諸味に添加するＣｕＭｎ−８株の種酵母液は、７．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、８．５％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムから構成されるｐＨ５．２の液体培地で、３０℃、３日間振盪培養したものを用い、諸味への添加（接種）時期は諸味のｐＨが５．３を示した時点とし、添加量は添加後の諸味中の菌数が１０5ｃｆｕ／ｇとなるように調節した。
種酵母液を添加して撹拌してやると、醤油諸味は直ちにエタノール醗酵を開始するため、添加後毎日諸味を採取して、その諸味を適宜希釈してＣ培地及びＯＶ培地に塗抹し、３０℃条件下で、Ｃ培地は３日間、ＯＶ培地は７日間培養した後、ＯＶ培地上に形成されたすべてのコロニーを釣菌してＬ培地上及びＣ培地上に接種し、Ｌ培地上で生育が観察されなかったコロニーの数を計測するとともに、このＬ培地上で生育しなかったコロニーに相当するＣ培地上のコロニーすべてを釣菌して、まずＭｎ培地に接種し、本培地上で生育してコロニーを形成した株のみを更にＣｕ培地に植え継いで、本培地上でも生育してコロニーを形成した株の数を計測した。そして、Ｃ培地上に形成されたコロニーの数を諸味中に存在する醤油酵母の数、ＯＶ培地ではコロニーを形成したが、Ｌ培地では生育しなかったコロニーの数を醤油主醤油酵母の数、Ｍｎ培地及びＣｕ培地上でも生育性を示したコロニーの数を添加したＣｕＭｎ−８株と見做し、醤油酵母ないしは醤油主醗酵酵母に占めるＣｕＭｎ−８株の比率を算出した。
以上、小規模の醤油醸造試験における、醤油諸味中における醤油酵母数及び醤油主発酵酵母数の変化とこれらに占めるＣｕＭｎ−８株の比率の変化を調べた結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
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【００３９】
表６の結果から、添加したＣｕＭｎ−８株は諸味中に混在する野生酵母群の中においても良好で旺盛な増殖を示し、諸味中エタノール濃度の迅速な上昇に伴い、その醤油酵母群ないしは醤油主醗酵酵母群に占める割合も高まり、醤油酵母群に占める割合に換算した場合には最大８０．０％、醤油主醗酵酵母群に占める割合に換算した場合には最大９２．９％にまで到達した。
本試験を通じて、本発明の方法にしたがって分離したＣｕＭｎ−８株は、醤油諸味中に添加した場合に、混在する野生酵母群を越える増殖を示して、その醤油酵母群に占める割合を高め、きわめて迅速かつ安定的なエタノール生産を成就したことが確認された。
【００４０】
実施例５
実施例３にて分離されたＣｕＭｎ−８株及びＯＶ−２株の同種２株混合培養系における、培養経過に伴うＣｕＭｎ−８株及びＯＶ−２株の増殖と、酵母群全体に占める比率の変化試験例
上記２の試験において確認された、他の醤油酵母株の混在条件下におけるＣｕＭｎ−８株の旺盛な増殖をより厳密に確認する目的で、７．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、８．５％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムから構成される、ｐＨ５．２に調整された液体培地で３０℃、２〜３日間培養して、生育活性を安定化させたＣｕＭｎ−８株、実施例１にて分離された、Ｃｕ培地及びＭｎ培地上で生育しないＯＶ−２株を同一の同組成の液体培地中に、１０5ｃｆｕ／ｍｌずつ接種して、３０℃条件下で２日間混合培養した。
培養の終了した培養液を殺菌済みの１０％塩化ナトリウム水溶液で適宜希釈した後、Ｃ培地及びＣｕ培地上に塗抹して、３０℃条件下で、Ｃ培地は３日間培養し、培地上に形成されたコロニーの数を計測してから、このコロニーすべてをＣｕ培地及びＭｎ培地に植え継ぎ、両培地上でも生育してコロニーを形成する株の数を計測、Ｃ培地上のコロニー数を全酵母数、Ｃｕ培地及びＭｎ培地上でコロニー数をＣｕＭｎ−８株、両培地上で生育しない株の数をＯＶ−２株と見做し、全酵母数に占めるＣｕＭｎ−８株及びＯＶ−２株の比率を調べた。
結果（液体培地中での同種酵母２株混合培養系における培養前後の総酵母数に占める各株の比率の変化）を図２に示す。
【００４１】
図２に示す通り、ＣｕＭｎ−８株はＯＶ−２株との混在下においても高い増殖性を示してＯＶ−２株を駆逐し、培養終了後には全酵母数１．６×１０8ｃｆｕ／ｍｌ中の８８．７％をＣｕＭｎ−８株が占める形に変化することが確認された。この試験からも、本発明の方法を用いて分離した株の良好な増殖性が確認された。
【００４２】
実施例６
実験室株を供試株とした高エタノール生産性株の選択試験例
種々の研究機関において保管されているチゴサッカロマイセス  ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）には、分離源が醤油や味噌に限らず、蜂蜜やジャム、シロップなどから分離された株も存在する。
そして、経験的に、これらの醤油や味噌以外の分離源から分離された株は、分類学的には同属同種のチゴサッカロマイセス  ルーキシーであっても、醤油諸味や味噌に人為的に接種した場合にも、エタノール生産性は低く、あるいは生育自体が不良な場合が多い。
同属同種のチゴサッカロマイセス  ルーキシーであっても、醤油や味噌以外の分離源から分離された株の中は、グルコースとフラクトースとが等量ずつ含まれるような培養条件下で培養した際に、まずフラクトースの方から選択的に消費し始めるという、醤油や味噌から分離された株では決して観察されない特異な性質を示す株が存在するといった森治彦の報告（醸協、９６（７）、４７５〜４８２（２００１））などからも、両者の生理学的な違いに関する若干の報告もあるが、現在のところ、分類学的にはこれらの株は一括してチゴサッカロマイセス  ルーキシーと見なされている。
そこで、このようなさまざまな分離源から分離されたチゴサッカロマイセス  ルーキシーの実験室株計２７株について、Ｍｎ培地及びＣｕ培地上での生育の有無と生醤油液体培地中での増殖及びそれに伴うエタノール生産性との関係を調べてみた。
すなわち、醤油諸味液汁培地(ｐＨ５．３)におけるチゴサッカロマイセス  ルーキシーのさまざまな株のエタノール生産量を調べた結果を図３に示す。
また実験室株のエタノール生産性と本発明培地での生育を調べた結果を表７に示す。
【００４３】
【表７】
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【００４４】
図３に示す通り、３０℃、７２時間の振盪培養条件（１４０ｒｐｍ．）及び１４０時間の静置培養下における実験株のエタノール生産性は株によって大きく異なっており、表７に示す通り、醤油や味噌から分離された株のうち、比較的高いエタノール生産性を示した株については、Ｍｎ培地及びＣｕ培地の両方の培地上で良好な生育を示したのに対して、フランスのビターオレンジシロップから分離されたＩＦＯ０４８７株、カナダのハチミツから分離されたＩＦＯ０６８６株、イタリアの濃縮黒ブドウ粕から分離されたＩＦＯ１１３０株などの、すなわち醤油や味噌以外の分離源から分離された株を含むエタノール生産性の低い株はいずれもＣｕ培地ないしは、Ｃｕ培地及びＭｎ培地の両方の培地上で生育を示さず、Ｍｎ培地及びＣｕ培地をもって前者の高エタノール生産性株と明確に区別された。この事からも本発明の培地は高エタノール生産性株の分離、選択に有効である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、醤油諸味中での被検菌の増殖能検査、醤油諸味又はその液汁での培養評価試験を行うことなく、醤油主発酵酵母のエタノール醗酵能を非常に簡単に、正確かつ迅速に評価できる培地を得ることができる。
また同培地を用いてエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を確実に分離することができる。
また分離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を醤油製造などに用いて、エタノール発酵の適正化と迅速化を図り、優れた風味を有する醤油及び味噌などの含塩醗酵食品を得ることができる。
さらにまた本発明によれば、３．５〜３．８％（Ｗ／Ｖ）のエタノールを含有する醤油諸味液汁（生醤油）及び芳醇な風味を有する熟成味噌を、確実にしかも容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のエタノール高生産性醤油主発酵酵母株の分離手順を示す。
【図２】液体培地中での同種酵母２株混合培養系における培養前後の総酵母数に占める各株の比率の変化を示す。
【図３】醤油諸味液汁培地(ｐＨ５．３)におけるチゴサッカロマイセス  ルーキシーのさまざまな株のエタノール生産量を調べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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