(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ストレプトコッカル  ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae；S. pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化された多糖と、（ｂ）組み換え的に発現されるストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)のニューモリシンタンパク質であって、前記酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化されておらず、もしくは部位特異的突然変異誘発により産生されていないニューモリシンタンパク質とを含んで成る、多糖とタンパク質の免疫原性結合体。
【請求項２】
ストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖がタイプ１４もしくはタイプ１８Ｃ由来である請求項１記載の結合体。
【請求項３】
組み換え的に発現されるニューモリシンが大腸菌(E. coli)において発現される請求項１記載の結合体。
【請求項４】
組み換え的に発現されるニューモリシンが、大腸菌のＳＣＳ１株であって、ｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃと命名されるプラスミド（ＡＴＣＣ  ６９６５４）およびｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ／２０と命名されるプラスミド（ＡＴＣＣ  ６９６５５）よりなる群から選択されるプラスミドを宿すＳＣＳ１株において発現される請求項３記載の結合体。
【請求項５】
組み換え的に発現されるニューモリシンが、ストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化された多糖との結合に先立ち、まずあるスペーサーに連結されている請求項１記載の結合体。
【請求項６】
スペーサーがアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）および６−アミノヘキサン酸よりなる群から選択される、請求項５記載の結合体。
【請求項７】
請求項１記載の免疫原性結合体を含むワクチン。
【請求項８】
免疫学的に許容され得る希釈剤、担体もしくは補助剤の一種以上をさらに含む請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
ストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)の多糖とストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)のニューモリシンタンパク質の免疫原性結合体の少なくとも２種の混合物を含むワクチンであって、当該各多糖が異なるタイプのストレプトコッカル  ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化された多糖であることを特徴とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、ストレプトコッカル  ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae）の莢膜多糖由来のある酸化された多糖および組み換え的に発現されるＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)のニューモリシンタンパク質を含む、免疫原性の多糖−タンパク質の結合体に関する。ここで、前述のニューモリシンは、前述の酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化されず、もしくは部位特異的突然変異誘発により産生されていない。
発明の背景
ストレプトコッカル  ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae；S. pneumoniae)）は細菌性肺炎の最も普遍的な病因であり、かつまた細菌性の中耳炎（中耳の感染症）、髄膜炎および菌血症の主要原因のひとつでもある。少なくとも83タイプの肺炎双球菌生物体があり、それぞれが莢膜多糖の異なる化学構造をもつ。莢膜多糖は肺炎双球菌の重要な毒性因子であり、また成人において抗体応答を誘導する。現在、23価の多糖ワクチン（ニューイミューン〔PnuImune〕（商標）など、アメリカン  シアナミド  カンパニー(American Cyanamid Company)、ウェイン(Wayne)、ニュージャージー州(NJ)）が、成人および２歳以上の小児に対して利用し得る。この精製された肺炎双球菌多糖ワクチンの調製法は、米国特許第4,242,501号、同4,221,906号および同4,686,102号（引用文献番号１、２、３）に開示される。しかしながら、２歳未満の幼児はこのタイプのワクチンに対する良好な免疫応答を誘導しない。
免疫学的特徴を修飾しかつ２歳未満の幼児において当該多糖の免疫原性を強化するために、当該多糖は、多糖−タンパク質に結合体を形成するためにあるタンパク質担体に共有結合的に結合されている。この多糖−タンパク質結合体ワクチンの調製法は米国特許第6,473,574号（４）に開示される。当該特許は、還元性基（一種もしくは複数）含有するＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)もしくはヘモフィラス  インフルエンザ(Haemophilus influenzae)タイプｂの莢膜ポリマー由来のある多糖断片およびタンパク質担体としてのある細菌性毒素もしくはトキソイド、とりわけ非毒性のジフテリアトキシン（ＣＲＭ197など）を含む免疫原性結合体類の調製に関する。
ある多糖の免疫原性を強化するための一つの試みが報告されており、そこでは部位特異的突然変異誘発がＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)の毒性タンパク質、ニューモリシンの非毒性トキソイド類を創製するために使用された。得られる変異ニューモリシントキソイド類は、リンカーもしくはスペーサー、６−アミノヘキサン酸の使用によりタイプ１９Ｆ肺炎双球菌莢膜多糖に結合された。当該結合体は、結合されない多糖の免疫原性に比較してタイプ１９Ｆ多糖部分の免疫原性を強化した（５、６）。ある追跡調査は、トキソイド化されない天然のニューモリシンはその毒性のためにワクチン中へ含めるのに適さないことを指摘した（７）。
しかしながら、これらおよび他の試みにもかかわらず、２歳未満の幼児のためのＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)に対する効率的なワクチンはない。したがって、かかるワクチンに対するニーズがある。
発明の要約
Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖由来のある酸化された多糖、およびタンパク質担体すなわち組み換え的に発現されるＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)のニューモリシンタンパク質を含む、免疫原性の多糖−タンパク質結合体類を提供することがこの発明のひとつの目的である。ここで、前述のニューモリシンは、前述の酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化されず、もしくは部位特異的突然変異誘発により産生されない。当該ニューモリシンはトキソイド化されないが、それにもかかわらず得られる結合体は大きく低減された毒性を有する。
この発明のひとつの態様においては、その酸化された多糖はニューモリシンタンパク質に直接結合される。この発明の他の態様においては、当該ニューモリシンタンパク質はまずあるスペーサーに連結され、そしてその後この酸化された多糖に結合される。
これらの結合体類をワクチンとして使用することがこの発明のさらなる目的である。これらのワクチンは温血動物においてＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖に対する抗体応答を導き出すのに有用である。
これらのワクチンを筋肉内もしくは皮下注入により免疫原性の量において投与することにより、温血動物においてＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)が原因の疾患に対して免疫化するためにこれらのワクチンを使用することが、この発明のさらにもうひとつの目的である。
この発明の付加的な態様においては、当該ワクチンは異なるタイプのＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化された多糖との免疫原性結合体に最低２個の混合物を含む。
この発明のさらなる局面においては、Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)のタイプ１８Ｃ多糖は、組み換えニューモリシン（「ｒＰＬ」）との結合がうまく実施されることができるようにするために、酸化に先立ち弱酸で処理され、当該多糖が部分的に解重合される。
この発明の結合体ワクチン類は温血動物において高度に免疫原性である。当該ワクチン類は、当該多糖および当該タンパク質すなわち組み換えニューモリシンの双方に対する抗体を導き出す。
この発明の結合体類は先に記述されたそれらに優る特徴的な利点を有する。当該結合体類においてはタンパク質担体はニューモリシン由来であり、ニューモリシンは肺炎双球菌感染症における１種の毒性因子であると報告されている（８）。この発明の結合体ワクチン類は、当該多糖および当該ニューモリシンの双方（これらの双方とも毒性因子である）に対する抗体を導き出し、そしてＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)により引き起こされる疾患に対する免疫を賦与する。当該結合体類は、先に記述されたあるスペーサーもしくはあるリンカー（５、６）が使用されることができるとはいえ、こうしたスペーサー類に対する要求なしに当該毒素の溶血性および細胞毒性の活性を中和することができる、ニューモリシンに対する抗体を誘導する。当該組み換えニューモリシンは非毒性にされているがその立体配座を保持する。
当該ワクチン類が２歳未満の幼児において免疫を賦与することを許容するのに加え、当該担体タンパク質、ｒＰＬはそれ自身免疫を賦与することができ、かつ、単に酸化された多糖のための担体として作用しない。最後に、当該結合体ワクチン類は完全なＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)生物体の使用を包含しないため、当該ワクチン類の投与はＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)が原因の疾患を誘発しない。
【図面の簡単な説明】
第１図はＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)タイプ１８Ｃおよび２０からのニューモリシン遺伝子（ｐｌｙ）を包含するクローン類の物理的地図を図示する。制限酵素切断部位は以下のように略記される。すなわち、Ｂｓ＝BstYI、Ｓｌ＝SalI、Ｈｄ＝HindIII、ＥＶ＝EcoRV。
第２図はｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ−３１を創製するための、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ中へのＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)タイプ１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子のサブクローニングのための計画を図示する。制限酵素切断部位は以下のように略記される。すなわち、ＥＩ＝EcoRI、Ｂｓ＝BstYI、Ｈｄ＝HindIII、ＥＶ＝EcoRV、ＢＨ＝BamHI。
第３図は組み換え的に発現されるｒＰＬを精製するために使用される方法を図示する。
第４Ａ図は精製の各段階におけるｒＰＬ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルーで染色された８〜16％のアクリルアミド）を図示する。レーンは以下のようである。すなわち、１．ＩＰＴＧ誘導前のＥ．コリ(E. coli)細胞、２．ＩＰＴＧ誘導45分後のＥ．コリ(E. coli)細胞、３．ＩＰＴＧ誘導２時間後のＥ．コリ(E. coli)細胞、４．誘導されたＥ．コリ(E. coli)細胞ライセート全体、５．アフィニティーゲルカラム（ＧＳＴ−ｒＰＬがカラムに結合する）により結合されないＥ．コリ(E. coli)タンパク質類、６．溶出後の精製された融合タンパク質ＧＳＴ−ｒＰＬ、７．融合タンパク質のトロンビン切断後のＧＳＴおよびｒＰＬの混合物、８．精製されたｒＰＬ（ＧＳＴおよびトロンビンを含まない）、９．以下のような分子量マーカー類（それぞれkDで表す）：97.4−ホスホリラーゼＢ、66−ウシ血清アルブミン、45−卵白アルブミン、31−炭酸デヒドラーゼ、21.5−トリプシンインヒビター、14.5−リゾチーム。
第４Ｂ図は精製の各段階におけるｒＰＬ調製物のイムノブロットを図示する。天然のニューモリシンに対するウサギ抗血清がイムノブロットにおいて使用される。レーン１〜８は第４Ａ図のレーン１〜８に対応する。
発明の詳細な記述
長さが471残基でスルフヒドリル基が活性化された溶血性毒素ニューモリシンは、Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)のあらゆるタイプにより産生され、かつ、肺炎双球菌感染症における推定の毒性因子と考えられる。この毒素はおよそ53,000ダルトン（53kD）の分子量を有する。不活性化されたニューモリシンを注入されたマウスおよびラットは、Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)生菌で攻撃される場合に強化された生存を表す（９、１０）。従って、ニューモリシンは潜在的なワクチン候補のひとつであり、また、この発明において示されるように、ある結合体ワクチンの調製のための有用なタンパク質担体のひとつである。天然のニューモリシンはＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)において低濃度で産生されるため、ｒＰＬを過発現する組み換えＥ．コリ(E. coli)の構築が企てられる。ニューモリシン遺伝子は、すでにＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)タイプ１（１１）、２（１２）および１９Ｆ（１３）からクローニングされ、配列が決定され、そしてＥ．コリ(E. coli)においてならびにバチルス  スブチリス(Bacillus subtilis)（１３Ａ）において発現されている。ニューモリシンはＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)細菌により分泌されないが、見たところシグナル配列の欠如のためであるらしい（１２）。
この発明の局面のうち、以下に例示されるのは、Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)からのニューモリシン遺伝子のクローニングおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システムを使用する融合タンパク質としてのＥ．コリ(E. coli)におけるニューモリシンの数倍の過発現、ならびに、グルタチオン−アガロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィー、および部位特異的タンパク質分解酵素トロンビンを使用することによるＧＳＴ−ｒＰＬを含有する当該融合タンパク質におけるＧＳＴの切断、を使用する53キロダルトン（kD）のｒＰＬの精製、を包含する工程である。当該ｒＰＬのアミノ酸組成、末端アミノ酸配列および免疫学的反応性が決定される。この様式において得られるｒＰＬは、融合タンパク質のＧＳＴが切断分離された後にｒＰＬのアミノ末端に２個の付加的なアミノ酸が存在することを除いては、天然のタンパク質と同様である。
以下の実施例１において詳述されるように、タイプ１８Ｃからのニューモリシン遺伝子もしくはタイプ１８Ｃおよびタイプ２０からの当該遺伝子の一部の融合からの１個のハイブリッドニューモリシン遺伝子を含有する発現ベクター類が調製され、そしてＥ．コリ(E. coli)宿主内に挿入される。他のタイプのＳ．ニューモニエ(S. pneumoniae)もまたニューモリシン遺伝子の適切な供給源である。他の従来からの宿主細胞が当該ｒＰＬの発現に適する。
組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃを有するＥ．コリ(E. coli)株ＳＣＳ１の試料は、出願人によりアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション(American Type Culture Collection)、12301  パークローン  ドライヴ(Parklawn Drive)、ロックヴィル(Rockville)、メリーランド(Maryland)  20852、ＵＳＡに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６９６５４を指定されている。
組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ／２０を有するＥ．コリ(E. coli)株ＳＣＳ１の試料は、出願人によりアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、12301  パークローン  ドライヴ、ロックヴィル、メリーランド  20852、ＵＳＡに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６９６５５を指定されている。
ＡＴＣＣに寄託された材料はまた、従来からの遺伝子工学技術とともに天然のニューモリシンタンパク質を創製するために使用されることもできる。天然のニューモリシンタンパク質は、トロンビン切断後にＮ末端に残存する付加的なグリシンおよびセリン残基を欠く。
この発明において使用される様々な肺炎双球菌のタイプの莢膜多糖類は、共通に譲渡された米国特許第4,242,501号および4,686,102号（１、３）において記述されており、これらは引用することにより組み込まれられる。このように得られる精製された肺炎双球菌多糖類は相対的に大きな分子サイズを有し、50％以上がセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  ＬＫＢ  バイオテクノロジー(PharmaciaLKBBiotechnology)、ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャージー州(NJ)）のカラム上で0.3未満の溶出係数（Ｋav）値をもつ。この値は６×105ダルトンより大きな分子量に対応する。
その天然の形態においては、肺炎双球菌生物体からの多糖類は反応性の還元性基を含有しない。還元性基を含有するそれぞれの反応性の多糖を創出するために、当該多糖は調節された量の過ヨウ素酸ナトリウムで部分的に加水分解され、過ヨウ素酸塩で酸化することによる当該多糖のcis-ビシナルのヒドロキシル基の切断により還元性基が生成し、パリク(Parihk)ら（１４）の工程に従いアルデヒド官能基が創製される。精製された肺炎双球菌多糖類は、４℃もしくは室温にて、様々な時間、暗黒下に0.2〜50mMの過ヨウ素酸ナトリウムで処理される。好ましい態様においては、当該多糖はpH4.0〜5.0で処理される。過ヨウ素酸ナトリウムの使用が好ましい。
この発明のもうひとつの局面は、過ヨウ素酸塩を使用する弱酸のもしくは酸化的な切断により酸化されたタイプ６Ｂ、１４および１８Ｃのような肺炎双球菌多糖（［Ｏ］６Ｂ、［Ｏ］１４および［Ｏ］１８Ｃ）の反応性の基を創出する、当該多糖類の調製のための工程である。
酸化の後、この酸化された多糖（「［Ｏ］ＰＳ」）を、それから発熱物質を含まない水に対して広範囲に(extensively)透析し、低分子サイズの素材を除去する。あるいは、セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのようなゲル濾過カラムが当該［Ｏ］ＰＳの精製のために使用されることができる。ゲル濾過カラムが使用される場合は、そのフラクションを、精製された対応する多糖を標準品として使用するフェノール硫酸比色法（１５）により［Ｏ］ＰＳの存在についてアッセイする。精製された生成物はその後、濃縮および凍結乾燥することにより回収される。得られる［Ｏ］ＰＳは約15〜800モノマー単位の鎖長を有する。
ある新規の方法がタイプ１８Ｃにおいて反応性の基を創出するために使用される。すなわち、当該多糖を部分的に解重合し、中間の大きさの分子を産生するよう切断し、そしてその後酸化する。
この酸化が部分的解重合の非存在下に実施される場合は使用できないゲル様素材が得られる。この問題を克服するため、当該タイプ１８Ｃ多糖をまず、酢酸処理のような弱酸により部分的に解重合し、多糖をおよそ10,000〜600,000の分子サイズ（セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂカラム上で0.3〜0.7のＫav）に縮小する。その後にのみ、当該タイプ１８Ｃ多糖は上述されるような過ヨウ素酸酸化を受け、機能を有する還元性基を創出する。以下に記述されるようにｒＰＬに結合される場合、当該生成物はワクチンの使用に適する形態にある。
当該［Ｏ］ＰＳは直接的もしくは間接的のいずれかの結合を使用してタンパク質担体としてのｒＰＬに結合される。直接的結合のためには、当該［Ｏ］ＰＳは、従来の手段による還元的アミノ化のためにシアノトリヒドロホウ酸塩を使用して当該ｒＰＬに結合される。
当該［Ｏ］ＰＳ中の機能を有するアルデヒド基類はｒＰＬと反応される。このｒＰＬはシッフ塩基を形成するアミノ基類（とりわけリジン基）を含有する。あるシアノトリヒドロホウ酸塩のような穏やかな選択的還元剤の存在下においては、安定な、共有結合的に結合される結合体が形成される。当該反応は好ましくはpH５ないし９で実施される。ヒドロホウ酸塩を使用するタンパク質への［Ｏ］ＰＳの結合についての方法論はパリクら（１４）およびシュヴァルツ(Schwarz)とグレイ(Gray)（１６）により記述されている。
肺炎双球菌タイプ６Ｂ、１４もしくは１８Ｃの［Ｏ］ＰＳ（濃度１〜10mg/ml）を、室温もしくは37℃にて、0.2Mリン酸カリウム緩衝液もしくはリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0〜8.0）中のｒＰＬ（濃度１〜10mg/ml）と混合する。
穏やかに混合しながらの30分のインキュベーションの後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム0.1〜2.0mMを添加する。この混合物を25〜37℃にて穏やかに混合しながら１〜８日間インキュベートし、［Ｏ］ＰＳ−ｒＰＬ結合体を形成する。当該結合体をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのようなゲル濾過カラム上で精製する。フラクションを、ウシ血清アルブミンを標準品として使用するバイオラド(Bio-Rad)タンパク質アッセイ試薬でのブラッドフォード(Bradford)法（１７）によりタンパク質についてアッセイし、かつ、先に記述されたように［Ｏ］ＰＳについてアッセイする（１５）。当該結合体を含有するフラクションを合わせ、透析しそして透析濾過および／もしくは凍結乾燥する。
あるいは、当該ｒＰＬを、当該［Ｏ］ＰＳとの結合に先立ちまずあるスペーサーに連結する。こうしたスペーサーの例はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）および６−アミノヘキサン酸である。ＡＤＨは好ましいスペーサーである。
この発明に従い処理された結合体類は、Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)が引き起こす疾患に対する温血動物の保護を賦与するワクチン類の調製において好ましく使用される。当該ｒＰＬの溶血活性（毒性）は、それが［Ｏ］ＰＳに結合される場合（単独でもしくはスペーサーとともに）には、単独で投与されるニューモリシンに比較して大きく低減される。
当該結合体類は、従来からの様式で免疫学的に許容しうる希釈剤もしくは担体に添加され、注入可能な液体の溶液もしくは懸濁液を調製することができる。加えて、当該結合体類は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（alum）、もしくは、ＱＳ−２１（１８）、モノホスホルリピドＡおよび３−Ｏ−デアクリルモノホスホルリピドＡ（３ＤＭＰＬ）のような製薬学的に許容しうる他の補助剤に結合されることができる。
例えば、［Ｏ］ＰＳおよびｒＰＬを含有するある結合体ワクチン、もしくは、それぞれがｒＰＬおよび異なるタイプの１個の［Ｏ］ＰＳを含有するいくつかの結合体の混合物を含有するあるワクチンを調製するためには、当該結合体調製物（一種もしくは複数）が、１mlあたりの多糖が１〜100μgの濃度でリン酸ナトリウムで緩衝化された生理的食塩水（「ＰＢＳ」）（pH7.0〜8.0）に懸濁される。
この発明の結合体ワクチン類は、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入のような従来からの様式における温血動物体内への注入により投与され、病原体Ｓ．ニューモニエ(S. pneumoniae)により引き起こされる全身性感染症に対する保護のための活性の免疫応答を誘導する。投与されるべき投与量は当業者に既知の手段により決定される。保護はワクチンの一回用量により賦与されることができるか、もしくは数回の追加抗原刺激用量の投与を必要とすることがある。
ｒＰＬはそれ自身保護的ではないとはいえ、ｒＰＬを単独で投与される(receiving)マウスは［Ｏ］１８Ｃ多糖を単独で投与されるマウスより長期間生存することは注目すべきである。かように、当該結合体の保護効果は、［Ｏ］ＰＳのための担体として作用するｒＰＬおよびｒＰＬそれ自身の機能としてのｒＰＬの双方のためであるようにみえる。
この発明がよりよく理解されるために以下の実施例が述べられる。当該実施例は具体的な説明の目的のためのみであり、かつ、本発明の範囲を制限するように解釈されるものではない。
実施例
実施例１
ｒＰＬ遺伝子のクローニングおよび発現
１個のタイプ１８Ｃ／２０ｒＰＬハイブリッド遺伝子を含有する発現ベクターの構築
ある融合ｐｌｙ遺伝子がタイプ１８Ｃおよび２０から構築され、適切な発現ベクター中にサブクローニングされ、そしてハイブリッドｒＰＬが発現される。当該遺伝子の３’末端はタイプ２０から得られ、一方、当該遺伝子の５’末端はタイプ１８Ｃから得られる。
タイプ２０のｐｌｙ遺伝子のクローニングのための適切な制限酵素切断部位を決定するために、３’末端をラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＬ２０と命名される）を使用するサザンブロット法を実施する。このプローブは、スルフヒドリル基が活性化されたヘモリシン類中の高度に保存された領域（第1484−1503ヌクレオチド；１２）とハイブリッド形成する。当該プローブはビオチンもしくはジゴキシゲニンのいずれかでラベルされる。1.3kbのSalI−EcoRV断片が、当該遺伝子の５’末端を除いてｐｌｙ遺伝子の大部分を含むと同定される。この1.3kbの断片を、ｐＢＲ３２２（ベーリンガー  マンハイム  カンパニー(Boehringer Mannheim Co.)、インジアナポリス(Indianapolis)、インジアナ州(IN)）中のSalIおよびEcoRV切断部位に挿入する。Ｅ．コリ(E. coli)株ＳＣＳ１（ストラタジーン(Stratagene)、ラホヤ(La Jolla)、カリフォルニア州(CA)）のコンピテント細胞を宿主として使用する。アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性の形質転換細胞をＰＬ２０プローブを使用するコロニーハイブリッド形成法によりスクリーニングする。ｐＳＥ２−２、３および２８と命名される３個の同一の組み換え体が単離される（第１図）。
ｐＳＥ２のSalI-EcoRV断片を取り出し、そしてｐＵＣ１９（ニューイングランド  バイオラブス(New England Biolabs)、ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州(MA)）のSalIおよびSmaI切断部位に挿入する。アンピシリン耐性でラクトース陰性（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）により誘導される場合にＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有するプレート上で無色のコロニー）の形質転換細胞を制限酵素分析によりスクリーニングする。陽性の組み換え体のひとつがｐＳＥ３−５と命名される。
タイプ２０からのｐｌｙ遺伝子の５’末端のクローニングに適した制限酵素切断部位がないため、サザンブロット法をタイプ１８ＣからのゲノムＤＮＡで実行する。混合プライマーラベル法によりラベルされるｐＳＥ２−２からの1.3kbのSalI-EcoRV断片をプローブとして使用する。2.8kbのBstYI断片が５’および３’のフランキング領域と一緒に完全なｐｌｙ遺伝子を含有すると同定される。このBstYI断片をHindIIIで切断し、そしてプロモーター選択ベクター、ｐＫＫ２３２−８（１９；ファルマシア）のBamHIおよびHindIII切断部位に挿入する。Ｅ．コリ(E. coli)株ＳＣＳ１を宿主として使用する。
ｐｌｙ遺伝子のプロモーターを含有する形質転換細胞を選択するために、アンピシリン耐性（100μg/ml）かつクロラムフェニコール耐性（５μg/ml）の形質転換細胞を制限酵素分析およびサザンブロット法によりスクリーニングする。ｐＢＨ１−３２、３５、３６、３７、３８および３９と命名される６個の同一の組み換え体が、タイプ１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子の５’上流の非翻訳領域および５’領域にわたる１kbのBstYI-HindIII断片を含有することが見出される（第１図）。
その後、機能を有する組み換えタンパク質を産生するために、上述されるタイプ１８Ｃおよび２０からクローニングされた肺炎双球菌のＤＮＡ断片を融合し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質システム（２０）を使用してプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア）中にハイブリッドｐｌｙ遺伝子を構築する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を当該遺伝子の５’末端のサブクローニングを容易にするために実行する。２種のプライマーが合成される。すなわち、クローニングを容易にするよう開始コドンのすぐ上流に導入されたBamHI切断部位をもつコード配列のはじめのセンスプライマー（第208-231ヌクレオチド；１２）、および当該遺伝子中の唯一のEcoRI切断部位を包含する領域とハイブリッド形成するアンチセンスプライマー（第709−733ヌクレオチド；１２）である。ｐＢＨ１−３７（タイプ１８Ｃ）からの0.7kbのBstYI-EcoRI断片がベント〔Vent〕ＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ニュー  イングランド  バイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ州）により増幅されるべき鋳型としてはたらき、それにより0.5kbの断片を創製する。
ＰＣＲ実験は以下のように実行される。すなわち、ベント〔Vent〕（商標）ＤＮＡポリメラーゼの添加に先立ちＤＮＡを95℃にて５分間変性し、そして30サイクルの変性（95℃にて30秒間）、アニーリング（50℃にて30秒間）および複製（72℃にて1.5分間）を実施する。
増幅されたＤＮＡ断片をBamHIおよびEcoRIで切断し、そしてその後ｐＧＥＸ−２Ｔ中のBamHIおよびEcoRI切断部位に挿入する。ランダムに拾い上げたアンピシリン耐性の形質転換細胞を制限酵素分析により望まれる挿入物の存在について試験する。ｐＢＥ０．５１４と命名される１個の組み換え体が陽性と同定される（第２図）。次に、ｐＳＥ３−５（タイプ２０）からの1.0kbのEcoRI（当該遺伝子内の唯一の切断部位）-EcoRI（ｐＵＣ１９ベクター（ニュー  イングランド  バイオラブス）由来）断片を、ｐＢＥ０．５１４中の増幅されたＤＮＡの下流に挿入する。
陽性の組み換え体をウサギ赤血球オーバーレイ（overlay）法（１２）により同定する。これは以下のように遂行する。ＬＢアガープレート上のアンピシリン耐性の形質転換細胞上に2.5％ウサギ血球（１mMＩＰＴＧおよび１mMＤＴＴを含有するＰＢＳ中の0.7％溶融アガー中）５mlを広げ、そして37℃にて３時間インキュベートする。組み換えプラスミドを有するコロニーは溶血の円形の帯を示す。
４個の個々のコロニー（ｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ／２０−１、２、３および１１）が溶血の円形の帯を示す。制限酵素分析がｇｓｔ遺伝子の３’末端に融合される完全なｐｌｙ遺伝子の存在を確かにする。
１個のタイプ１８ＣｒＰＬ遺伝子を含有する発現ベクターの構築
上述されるように、タイプ１８Ｃの染色体ＤＮＡの2.8kbのBstYI断片のHindIIIでの切断は、タイプ１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子の５’上流の非翻訳領域および５’領域にわたる１kbの断片を産生する。この切断はまた、コロニーハイブリッド形成法により同定されるように、ｐｌｙ遺伝子の３’領域および３’非翻訳領域にわたる1.8kbの断片も産生する（第１図）。アンピシリン耐性かつクロラムフェニコール感受性の形質転換細胞のスクリーニングが、ｐＨＢ２−１、２６および３２と命名される３個の同一の組み換え体を同定する。
ｐＧＥＸ−２Ｔにおけるタイプ１８Ｃからの完全なｐｌｙ遺伝子の構築は３個の断片の連結を必要とする。サブクローニングにおいて用いられるべき制限酵素部位の不足のため、一連のクローニング段階が実行される。
最初に、ｐＨＢ２−３２をHindIIIおよびEcoRVで切断し0.7kbの断片を産生する。この断片をｐＵＣ１９中に挿入し、ｐＨＶ３−２、４および６と命名される３個の組み換え体を創製する。二番目に、ｐＢＨ１−３５をEcoRIで切断して0.5kbの断片を産生し、この断片をｐＵＣ１９中に挿入してｐＩＩ３−１、２、３、４および５と命名される５個の組み換え体を創製する。三番目に、ｐＩＩ３−１およびｐＨＶ３−２もしくは６のいずれかをHindIIIで切断する。四番目に、ｐＩＩ３−１からの0.3kbのHindIII断片のｐＨＶ３−２もしくは６のいずれかのHindIII切断部位へのクローニングを実施し、ｐＨＨＶ３−３１、５４および５５と命名される３個の組み換え体を創製する。五番目に、ｐＨＨＶ３−３１およびＰＢＥ０．５１４をEcoRIで切断する。最後、六番目に、ｐＨＨＶ３−３１からの1.0kbのEcoRI断片をｐＢＥ０．５１４のEcoRI切断部位に挿入する。ｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ−３１ないし３９と命名される９個の同一の組み換え体がウサギ赤血球オーバーレイ法により単離される。
さらに特定しては、上述されるＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）タイプ１８Ｃからの染色体ＤＮＡの2.8kbのBstYI断片をHindIIIで切断し、そして記述されるように（２１）ｐＫＫ２３２−８（１９）のBamHIおよびHindIII切断部位に連結する（第２図はHindIII切断部位を指す）。Ｅ．コリ（E. coli）ＸＬ１−ブルー（Blue）（２２）のコンピテント細胞（ストラタジーン  クローニング  システムズ（Stratagene Cloning Systems）、ラホヤ、カリフォルニア州）を形質転換し、そして、クロラムフェニコール（10μg/ml）の存在もしくは非存在下にアンピシリン（50μg/ml）を含有するルリア・ベルタニ（Luria-Bertani）（ＬＢ）アガープレート（２１）上に植え付ける。アンピシリン耐性の形質転換細胞をクロラムフェニコール耐性、およびプローブすなわち0.9kbのEcoRI-EcoRV断片でのコロニーハイブリッド形成（２１）によりスクリーニングする。この断片はタイプ２０のｐｌｙ遺伝子（２３）由来である。正しい断片を含有することが同定されるいくつかの組み換え体のうち、ｐＢＨ１−３５およびｐＨＢ２−３２と命名される２個がサブクローニングのために使用されるべきものとして選択される。
完全なｐｌｙ遺伝子をその後、従来からのクローニング法（２１）およびベント〔Vent〕（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー  イングランド  バイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ州）でのポリメラーゼ連鎖反応により、ｐＧＥＸ−２Ｔ（２０；ファルマシア  ＬＫＢ  バイオテクノロジー、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、から入手できる）中、ｇｓｔ遺伝子の３’末端に同じ読み枠で構築する。Ｅ．コリ（E. coli）ＳＣＳ１（２４）のコンピテント細胞（ストラタジーン）を使用する。アンピシリン耐性の形質転換細胞をウサギ赤血球オーバーレイ法（２１）によりスクリーニングする。すなわち、組み換えプラスミドを有するコロニーは溶血の円形の帯を示す。ｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ−３１と命名される、類似の性質の９個の単離物のうちのひとつがさらなる特徴づけのために選択される（第２図）。
ｒＰＬの発現、精製および特徴づけ
タイプ１８Ｃ／２０もしくは１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子をクローニングし、そしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（２０）としてＥ．コリ（E. coli）において過発現する。得られる融合タンパク質は水性溶液に可溶であり、かつ、非変性条件下で粗細菌ライセートから精製される。これらの条件は精製後のｒＰＬの抗原性を保存する。当該ＧＳＴ−ｒＰＬ融合タンパク質はアフィニティクロマトグラフィーのような簡単な手段により精製されることができる。
ｒＰＬの十分量を精製するために、以下のアフィニティクロマトグラフィー処置を実施する。ｒＰＬの精製のための作業工程図を第３図に示す。アンピシリン（100μg/ml）を含有する50mlの１×ルリア培地もしくは１×テリフィック（Terrific）培地（２５）中のｐＧＥＸ−ＰＬ  １８ＣもしくはｐＧＥＸ−ＰＬ  １８Ｃ／２０のいずれかを含有するＥ．コリ（E. coli）ＳＣＳ１の一夜培養系を同培地１lに添加する。組み換えＥ．コリ（E. coli）をその後、活発に振盪しながら、600nmでの１の吸収に到達するまで37℃にて増殖させる。ＩＰＴＧを誘導物質として培養系に添加（１mMの濃度まで）し、そしてＥ．コリ（E. coli）細胞を継続して２時間増殖させる。非常に少量の当該ＧＳＴ−ｒＰＬ融合タンパク質が誘導前に産生されるが（第４Ｂ図のレーン１を参照）、ＩＰＴＧは短時間のうちに（30分ないし２時間）大量での融合タンパク質の発現を誘導する。当該融合タンパク質、ＧＳＴ−ｒＰＬは過発現され、かつ、クマシーブルーで染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の総細菌性タンパク質の10％以上を構成する（第４図）。
細胞を４℃にて10,000×ｇで５もしくは10分間遠心分離し、リン酸ナトリウムで緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ：150mM塩化ナトリウム、16mMリン酸二水素カリウム、４mMリン酸水素二カリウム、pH7.3）で１回洗浄し、そして1/50体積量のＰＢＳに再懸濁する。トリトンＸ−１００を１％の最終濃度まで添加し、そして細胞を穏やかな音波処理もしくはフレンチプレス（12,000ポンド）の２回通過により溶解する。当該ライセートを４℃にて10,000×ｇで10分間遠心分離し、そして細胞破片をＴＰＢＳ（ＰＢＳ中１％トリトンＸ−１００）で１回洗浄する。上清を合わせ、そして透明な細胞ライセート200mlをＴＰＢＳで平衡化した10もしくは50mlのグルタチオン−アガロースゲル（シグマ  ケミカル  カンパニー（Sigma Chemical Co.）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ州（MO））カラムに負荷する（apply）。当該カラムをカラム床体積の５倍量のＴＰＢＳ、カラム床体積の２倍量のＰＢＳおよびカラム床体積の１倍量の50mMトリス塩酸、pH8.0で洗浄し、不必要な素材を除去する。当該融合タンパク質、ＧＳＴ−ｒＰＬを５もしくは10mMグルタチオン／50mMトリス塩酸、pH8.0で溶出する。溶血性アッセイおよびタンパク質アッセイにより示されるような溶血活性を示すフラクションを合わせる。フラクションは溶血性であることを以下のように同定する。すなわち、各フラクション１μlを10mMＤＴＴ／ＰＢＳ50μlに添加し、そしてその後マイクロタイタープレート上で５％ウサギ赤血球25μlと混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。溶血は目視により同定する。Ｇ−ＳＴ−ｒＰＬをその後タンパク質分解酵素トロンビンにより切断する。トロンビンはＧＳＴとｒＰＬの間に唯一の認識部位を有する（２０）。
当該融合タンパク質をウシ血漿トロンビン（シグマ）（タンパク質１mgあたり５単位）と混合し、そしてその後トロンビン切断緩衝液（50mMトリス塩酸、pH8.3、150mM塩化ナトリウム、2.5mM塩化カルシウム）に対し室温にて一夜透析する（分子量カットオフ：12,000〜14,000）。ＧＳＴ、ｒＰＬおよび若干量の未切断のＧＳＴ−ｒＰＬの混合物を、アミコン（Amicon）セントリプレップ〔Centriprep〕（商標）−１０（ビバリー、マサチューセッツ州）（分子量カットオフ：10,000）を使用して20℃にて3,000×ｇで遠心分離して濃縮し、そして緩衝液をＰＢＳに交換し、そしてその後グルタチオン−アガロースカラム上に負荷する（apply）。ＧＳＴおよびいかなる未切断のＧＳＴ−ｒＰＬも特異的に当該カラムに結合するため、ｒＰＬは自由に当該カラムを通過しそしてＰＢＳ溶出液中に収集される。ｒＰＬを含有する溶血性フラクションを合わせる。緩衝液をセントリプレップ〔Centriprep〕（商標）−１０を使用して10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に交換する。トロンビンを、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化した１mlのヘパリン−セファロース〔Sepharose〕（商標）ゲル（ファルマシア）のカラムを通過することによりｒＰＬから除去する（２６）。精製されたｒＰＬを４℃にて保存する。この精製からの収量は培養液１lあたりおよそ６〜10mgである。
精製されたｒｐＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブルー染色により示されるように、ゲル上に53,000ダルトンの分子量の単一のバンドを表す。当該ゲルのデンシトメトリーのスキャンはｒＰＬの純度が95％より高いことを明らかにする。
上述される方法は95％より高い純度のｒＰＬを産生するとはいえ、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの最終段階を添加することにより、より高い純度さえ得られることができる。この段階はＨＡ−ファスト  フロー（Fast Flow）の1.6×8.0mmのカラム（カルバイオケム  コーポレーション（Calbiochem. Corp.）、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して実行される。当該カラムを10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で平衡化する。ｒＰＬの10ml（およそ10mg）の部分をＨＡカラムに添加し、そして、タンパク質を10mMないし200mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）の直線濃度勾配100mlで溶出する。カラム溶出液はおよそ1.5ml/minの流速にて2.0mlのフラクションずつ収集する。フラクションは先に記述されたように（１１）アッセイする。ｒＰＬを含有するフラクションを合わせ、そしてタンパク質濃度、溶血活性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度について分析する。当該ｒＰＬはおよそ85〜115mMのリン酸緩衝液で単一ピークとして溶出される。溶出されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるようにほぼ均一であり、また、実際上は汚染するリポ多糖（エンドトキシン）を含まない。
ｒＰＬの分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス補助（matrix assisted）ＵＶ−レーザーディソープション／イオン化質量分析計により決定されるように、53,000ダルトンである。
精製されたｒＰＬはウサギ赤血球に対しタンパク質１mgあたり３×105溶血単位の特異的活性を有する（２７）。これは天然のＰＬ１mgあたりおよそ106溶血単位に匹敵する（９、２７）。当該特異的溶血活性はペイトン（Paton）ら（９）の方法のわずかな修飾により測定される。試料は1.7％ウサギ赤血球と混合する前に10mMＤＴＴで活性化する。上清の吸光度は550nmで測定する。
化学ルミネセンス検出のためのルミフォス〔Lumi-Phos〕（商標）５３０（べーリンガー  マンハイム  カンパニー、インジアナポリス、インジアナ州）を使用するイムノブロットにおいて、ＧＳＴ−ｒＰＬ融合タンパク質およびｒＰＬの双方が天然のＰＬに対する抗体を含有する抗血清と反応する（第４Ｂ図）。見たところ、より分子量の大きい融合タンパク質は、ｒＰＬおよび当該抗体によりなお認識されることができる分解生成物に比較して、ナイトラン（Nytran）メンブレン（シュライヒャー  アンド  シュエル  インク（Schleicher & Schuell Inc.）、キーン（Keene）、ニューハンプシャー州（NH））に非効率的に転写されるようである。オクタロニー免疫拡散法は、ｒＰＬが抗ＰＬ抗体および抗ｒｐＬ抗体と全く同じに反応することを明らかにする。このことは、ｒＰＬが天然のＰＬと同じ抗原決定基を有することを示唆する。アミノ酸分析およびＮ末端配列の決定（40残基まで）が精製されたｒＰＬで実行される。ｒＰＬのＮ末端配列は、２個の付加的残基（グリシンおよびセリン）を除いては、天然のＰＬのそれ、およびタイプ２のｐｌｙ遺伝子のヌクレオチド配列から推論される予想配列（１１、１２）と同一である。この付加的残基はトロンビン切断後にｒＰＬ上のＮ末端に残存する（２０）。ｒＰＬのアミノ酸組成はタイプ２のｐｌｙ遺伝子のヌクレオチド配列から推論されるそれとよく一致する（１２）。
実施例２
Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）莢膜多糖の調製
この発明において使用される様々な肺炎双球菌のタイプの莢膜多糖は共通に譲渡された米国特許第4,242,501号（１）および第4,686,102号（３）において記述されている。これらは引用することにより組み込まれられる。こうして得られる精製された肺炎双球菌多糖類は比較的大きな分子サイズを有し、50％以上がセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  ＬＫＢ  バイオテクノロジー、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のカラム上で0.3未満の溶出係数（Ｋav）値を有する。この値は６×105ダルトンより大きな分子量に対応する。
実施例３
還元性基を含有する反応性の酸化されたタイプ１４多糖の調製
肺炎双球菌タイプ１４多糖の100mgの試料を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）20mlに溶解する。過ヨウ素酸ナトリウムの４mgの部分（１mMの最終濃度まで）を暗黒下に添加し、そして当該混合物をアルミ箔で包んだふたをした三角フラスコ中で室温にて10分間穏やかに攪拌する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムは0.5Mエチレングリコール１mlとの室温での10分間の反応により破壊する。得られる酸化されたタイプ１４（「［Ｏ］１４」）多糖を含有する反応混合物を、室温にて、3,500ダルトンのカットオフのメンブランのアミコン（ビバリー、マサチューセッツ州）濃縮器で広範囲にわたって（extensively）透析濾過しそして濃縮する。透析濾過された［Ｏ］１４多糖を凍結乾燥し、そして使用するまで−20℃にて保存する。
実施例４
還元性基を含有する反応性の酸化されたタイプ１８Ｃ多糖の調製
実施例３において記述されるタイプ１４多糖を酸化するための処置を、過ヨウ素酸酸化に先立ち当該タイプ１８Ｃ多糖を１M酢酸により部分的に解重合してｒＰＬに結合される場合に当該多糖のゲル化することを防ぐことを除き、タイプ１８Ｃについて繰り返す。タイプ１８Ｃ多糖の500mgの試料を50mlの酢酸（最終のpH2.5）に懸濁し、そして60℃にて40時間インキュベートする。その後、２M酢酸ナトリウム６mlを添加する（最終のpH4.0）。当該混合物をアミコン攪拌セル（ＹＭ10）を使用しておよそ12mlまで濃縮する。当該濃縮物を、セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂカラム上におきかつ10mMＰＢＳおよび0.01％アジ化ナトリウムで溶出することによるカラムクロマトグラフィーにかける。４mlずつフラクションを収集し、そしてＫdが0.3〜0.7（10〜60kD）のフラクションを合わせる。当該フラクションを、12〜14kDの分子量カットオフで水に対して透析し、水は毎日変える。過ヨウ素酸酸化の段階をその後実行し、酸化されたタイプ１８Ｃ（「［Ｏ］１８Ｃ」）多糖を生成する。実施例５
［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結合体の調製
実施例３において作成される［Ｏ］１４多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）に溶解する。実施例１に従い作成されるｒＰＬ（Ｅ．コリ（E. coli）においてＡＴＣＣ  ６９６５４もしくはＡＴＣＣ  ６９６５５のいずれかから発現される）もまた、別個の容器中において約２mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。［Ｏ］１４多糖溶液（0.5ml）およびｒＰＬ溶液（0.5ml）を室温にて混合する。30分後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（2.5mg）を添加し、そして反応混合物を室温にて５日間インキュベートする。当該混合物をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。このカラムは最初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化される。当該結合体材料を濃度勾配なしに同緩衝液で溶出する。当該結合体を含有するピークのフラクションを多糖およびタンパク質についてアッセイする（１５、１７）。当該結合体を含有するフラクションを合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製のために使用する。当該［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結合体は、約７：１の炭水化物／タンパク質の重量／重量比を有する。当該結合体ワクチン調製物は使用するまで４℃にて保存する。
実施例６
スペーサーアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を含む［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結合体の調製
ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の調製
実施例１に従い作成されるｒＰＬ（タイプ１８Ｃもしくはタイプ１８Ｃ／２０のいずれか）の３ml（９mg）を0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH5.5）中におく。緩衝液で処理したｒＰＬをＡＤＨ（20mg）およびカルボジイミド（20mg）と混合し、そして室温にて３時間インキュベートする。反応混合物を、3,500ダルトンのカットオフのメンブランを用いスペクトラポール（Spectorapor）メンブランチュービング（tubing）中で４℃にて0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に対して透析することにより、pHを7.0に変える。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体を含有する透析された材料をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でのクロマトグラフィーにより特徴づけする。タンパク質の含有量をブラッドフォード法（１７）によりアッセイし、また、ＡＤＨを、標準品としてＡＤＨを用いる２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の反応（２８）により測定する。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体（液体）は使用するまで４℃にて保存する。
［Ｏ］１４多糖−ＡＤＨ−ｒＰＬ結合体の調製
実施例３に従い作成される［Ｏ］１４多糖を６mg/mlの濃度で0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）に溶解し、そして当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体もまた別個の容器中において３mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。当該［Ｏ］１４多糖の2.5mlの試料および当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の2.5mlの試料を室温にて混合する。２時間後、水中のシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（12.5mg）を添加し、そして反応混合物を37℃にて穏やかに混合しながら４日間インキュベートする。当該混合物をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。このカラムは最初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化される。当該結合体材料を同緩衝液で溶出する。当該結合体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定し、そしてその後合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製に使用する。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が当該結合体中に存在することを示す。プール１と命名される合わせたフラクションの最初のグループ（セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂから）の結合体は0.08〜0.20のＫavを有する。一方、プール２と命名される合わせたフラクションの二番目のグループは0.21〜0.34のＫavの素材を含有する。結合体プール１の炭水化物：タンパク質の比率は11：１であり、結合体プール２の比率は13：１である。当該結合体調製物類はワクチン類の調製のために使用される。当該結合体調製物類は４℃にて保存する。
実施例７
［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体の調製
結合体の使用に適したこの多糖の中間的長さを調製するために、実施例４の方法の小さな修飾が使用される。タイプ１８Ｃ多糖の500mg分を１M酢酸（pH2.3）50mlに溶解しそして60℃にて40時間インキュベートする。処理された多糖を２M酢酸ナトリウムでpH4.5に調整する。当該試料をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上で分子量で分類する。0.3ないし0.7のＫavで溶出する多糖（分子量15,000〜600,000）を合わせる。合わせたフラクションを４℃にて発熱物質を含まない水に対して広範囲に（extensively）透析し、そしてその後凍結乾燥する。当該材料は［Ｏ］１８Ｃ多糖の調製のための使用まで−20℃にて保存する。タイプ１８Ｃ多糖の中間的サイズの50mg分を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）10mlに溶解し、そして、暗黒下、室温にて10分間、過ヨウ素酸ナトリウム４mg（最終濃度２mM）で酸化する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムは0.5Mエチレングリコール50μl（最終濃度25mM）との10分間の反応により破壊する。［Ｏ］１８Ｃ多糖を含有する反応混合物を広範囲に（extensively）透析し、そしてその後凍結乾燥する。当該材料を−20℃にて保存し、そしてｒＰＬとの結合体の調製のために使用する。
当該［Ｏ］１８Ｃ多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）に溶解する。実施例１に従い作成されるｒＰＬ（Ｅ．コリ（E. coli）においてＡＴＣＣ  ６９６５４もしくはＡＴＣＣ  ６９６５５のいずれかから発現される）もまた、別個の容器中において３mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。［Ｏ］１８Ｃ多糖溶液１mlおよび当該ｒＰＬ溶液0.5mlを室温にて混合する。１時間後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（３mg）を添加し、そして反応混合物を37℃にて８日間インキュべートする。当該混合物をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。このカラムは最初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化され、そしてその後同緩衝液で溶出される。当該結合体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定し、合わせそして特徴づけを行う。当該［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体は、約0.76：１の炭水化物／タンパク質比を有する。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が存在することを示す。当該結合体はワクチンの調製のために使用するまで４℃にて保存する。
実施例８
スペーサーＡＤＨを含む［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体の調製［Ｏ］１８Ｃ多糖の調製
当該［Ｏ］１８Ｃ多糖は実施例７に従い調製し、−20℃にて保存しそしてｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体との結合体の調製のために使用する。
ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の調製
実施例１に従い作成されるｒＰＬ（タイプ１８Ｃもしくはタイプ１８Ｃ／２０のいずれか）の10ml分（12mg）を0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH5.4）中におく。緩衝液で処理したｒＰＬを0.3mlのＡＤＨ（30mg）およびカルボジイミド0.1ml（30mg）と混合し、そして穏やかに混合しながら室温にて３時間インキュベートする。反応混合物を、3,500ダルトンのカットオフのメンブランを用いスペクトラポール  メンブランチュービング中で４℃にて２日間0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に対して透析することにより、pHを7.0に変える。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体を含有する透析された材料を、アミコン  セントリプレップ〔Centriprep〕（商標）（10,000ダルトンのカットオフ）で約４mlにまで濃縮し、そしてセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。タンパク質およびＡＤＨの含有量を先に記述されたようにアッセイする。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体は使用するまで４℃にて保存する。
［Ｏ］１８Ｃ多糖−ＡＤＨ−ｒＰＬ結合体の調製
当該［Ｏ］１８Ｃ多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）に溶解し、また、ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体もまた別個の容器中において約2.7mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。［Ｏ］１８Ｃ多糖の2.5ml部分および当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の2.5mlを室温にて混合する。２時間後、水中のシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（12.5mg）を添加し、そして反応混合物を37℃にて穏やかに混合しながら４日間インキュべートする。当該混合物を最初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化されるセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。当該結合体材料を同緩衝液で溶出する。当該結合体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定し、合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製のために使用する。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が結合体中に存在することを明らかにする。当該結合体におけるｒＰＬに対する当該［Ｏ］１８Ｃ多糖の比は約1.8：１である。当該結合体材料は４℃にて保存する。
実施例９
当該結合体ワクチン類に対する抗体応答
上記の実施例の処置により調製される結合体類はアメリカ食品医薬品局（21  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  610.11；1993年４月１日）により要求されるマウスおよびモルモットにおける一般安全性試験に合格する。当該結合体類はその後、マウスにおいて抗体を生じるその能力について試験される。当該結合体類を、0.2mlの用量が多糖１もしくは５μｇを含有するように0.01％チメロサールを含有する無菌のＰＢＳ（pH7.0）で希釈する。当該結合ワクチン類を0.2μのゲルマン（Gelman）フィルターでのメンブレン濾過により滅菌する。当該無菌ワクチンは使用するまで４℃にて保存する。
ＣＤ−１（スイス（Swiss））マウス（８週齢）に、補助剤としてのリン酸アルミニウム上に吸収させた（１mg/ml）ワクチン0.2ml（１回用量当たり１〜５μg）を復腔内に注入する。２週間の間隔で、マウスに当該ワクチンの２回の付加的注入を与える。血液試料を各注入後２週間に眼窩静脈穿刺により収集する。７匹のマウスをＥＬＩＳＡ法により当該多糖およびｒＰＬに対する抗体価についてアッセイする。アッセイの結果は第１表（［Ｏ］１４／ｒＰＬ結合体について）ならびに第２表および第３表（［Ｏ］１８Ｃ／ｒＰＬ結合体に対する２個の別個の実験）に示される。
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実施例１０
中和抗体に対する溶血性アッセイ
中和抗体に対する溶血性アッセイは以下のように遂行する（９、１２、２９）。すなわち、96穴（Ｕ型）マイクロタイタープレート中で、ｒＰＬに対する抗体を含有する動物（マウスもしくはウサギ）からの血清の希釈物をｒＰＬ１μgと混合する。37℃にて15分間インキュベートした後、10mMジチオスレイトールを添加する。37℃にて15分間インキュベートした後、ウサギ赤血球（1.7％の最終濃度）を添加し、そして同じ様式でさらに30分間インキュベートする。150×ｇで５分間遠心分離した後、ペレットの有無に注意する。赤血球の50％溶解を表す希釈物を視覚的に決定する。中和抗体が存在する場合はペレットが見られるが、抗体が存在しない場合には赤血球が溶解される。２回の溶血性アッセイの結果が第４表および第５表に示される。
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実施例１１
内皮細胞の細胞毒性のアッセイ
内皮細胞の細胞毒性のアッセイはルビンスら（３０）の方法に従い実行する。無傷の細胞を放射性ラベルするために、細胞が集密状態に到達した後培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮な培養培地で２回洗浄し、200μlのＰＢＳおよび300μlの51Ｃｒ（300μCi）に再懸濁し、そして37℃、５％ＣＯ２にて90分間インキュベートする。細胞を５％ＢＳＡおよび２％Ｄ−グルコースを含有するＰＢＳで２回洗浄し、そして0.5％ＢＳＡおよび0.2％Ｄ−グルコースを含有するＰＢＳに再懸濁する。細胞を１mlあたり２×105個に調整する。96穴（Ｕ型）マイクロタイタープレート中で、ｒＰＬに対する抗体を含有する動物（マウスもしくはウサギ）からの血清の希釈物をｒＰＬ５ngと混合する。37℃、５％ＣＯ2にて15分間インキュベートした後、10mMジチオスレイトールを添加する。37℃、５％ＣＯ2にて30分間インキュベートした後、細胞（２×104個）を添加し、そして同じ様式でさらに２時間インキュベートする。150×ｇで３分間遠心分離した後、上清のアリコート中の放射活性を液体シンチレーション法によりカウントし遊離された51Ｃｒのパーセントを測定する。残存する細胞性の51Ｃｒを測定するため、１N水酸化ナトリウムを添加し、当該溶液を混合し、そしてアリコート中の放射活性をカウントする。遊離された51Ｃｒのパーセントは、溶媒中の１分あたりの総カウントを溶媒および細胞層中の１分あたりの総カウントで割ったパーセントとして決定される。当該アッセイの結果は第６表に表される。ここでは値は１穴あたり２×104個の細胞の３穴の51Ｃｒ細胞培養系（24,000cpm／200μl）由来の平均値および標準偏差を指す。当該細胞は10mMジチオスレイトール存在下に、示されるような物質の存在または非存在下で37℃にて２時間インキュベートする。遊離の51Ｃｒのパーセント＝100×（２Ａ／（Ａ＋Ｂ））；ここでＡ＝上清100μl中のcpm、Ｂ＝100μlの水酸化ナトリウムが添加されるペレット100μl中のcpm。
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実施例１２
ｒＰＬもしくは結合されたワクチン類でワクチン接種したマウスにおけるＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）生菌での攻撃に対する保護
10匹のグループの雌性の８週齢ＣＤ−１マウスに２週間隔で様々なワクチン0.2mlを復腔内に注入する。これらのワクチン類はｒＰＬ、［Ｏ］１８Ｃ−ｒＰＬおよび［Ｏ］１８Ｃ−ＡＤＨ−ｒＰＬを包含する。コントロールのワクチン、［Ｏ］１８Ｃはこれらのマウスにおいて抗体応答を誘導しない。各マウスに、多糖１μg、もしくはｒＰＬのみを含有するワクチンの場合にはタンパク質１μgを含有するワクチン１回用量を注入する。すべてのワクチン類はまた１mg/mlのリン酸アルミニウムも含有する。代表するマウスからの血清を、最初のワクチン接種に先立ち、ならびに最初のワクチン接種の２および４週間後に収集する。全マウスからの血清は最後のワクチン接種の11日後に収集する。当該血清はｒＰＬおよび［Ｏ］１８Ｃに対する抗体を測定するために使用する。最後のワクチン接種の２週間後に、マウスに異なる用量のタイプ１８ＣのＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）（ＡＴＣＣ  ６３１８）を注入する。当該細菌は５％ヒツジ血小板を含むトリプティケース〔Trypticase〕（商標）大豆アガー（ＢＢＬ、コッキースヴィル（Cockeysville）、メリーランド州（MD）；ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー（Becton, Dickinson and Co.）の登録商標）上で37℃にて一夜培養し、その後、５％脱線維ヒツジ血および１％グルコースを含有するトリプティケース〔Tripticase〕（商標）大豆培地（ＴＳＢ）（ＢＢＬ；ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニーの登録商標）に接種し、そして振盪せずに37℃にて６時間インキュベートする。生育物をＴＳＢで適切に希釈する。１mlあたりのＣＦＵ数はプレートのカウントにより測定する。復腔内に注入される細菌の用量はおよそ０、５、25、125および625×ＬＤ50となるように計算する。ここでＬＤ50は１回用量あたり３ＣＦＵより少ないかもしくは等しい。従って、細菌の用量は１回用量あたり０、23、115、575および2875ＣＦＵである。動物は１日に２回チェックしそしていかなる死亡も記録する。
当該結果は第７表に示される。ＴＳＢのみで細菌を投与されない、ネガティヴコントロールとしてはたらくすべてのマウスは、14日後も健在である。抗体応答を誘導しないポジティヴコントロールの［Ｏ］１８Ｃでワクチン接種されたすべてのマウスは、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）の４種の用量のいずれかでの攻撃後４日以内に死亡する。ｒＰＬに対しかなりの抗体応答を誘導する、ｒＰＬワクチンを単独で投与されるマウスは、ポジティヴコントロールよりもより長期間生存する。［Ｏ］１８ＣおよびスペーサーとともにもしくはスペーサーなしかのいずれかのｒＰＬを含有するこの発明の結合体ワクチン類は、細菌の攻撃前に与えられる場合には、タイプ１８Ｃ肺炎双球菌による致死的感染症に対し、2.9×103ＣＦＵ（625×ＬＤ50）の最も大きい攻撃用量であっても、マウスを保護することにおいて最も有効である。
これらの結合体ワクチン類はまた、タイプ１８Ｃ多糖およびｒＰＬの双方に対しかなりの抗体応答も導き出す（第２表および第３表を参照）。
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実施例１３
各種のアジュバンドを含む結合体ワクチン類に対する抗体応答
実施例９のアッセイが、アジュバンドとして（１）リン酸アルミニウム200μg（１mg/ml）、（２）３ＤＭＰＬ25μg、（３）３ＤＭＰＬ100μg、もしくは（４）リン酸アルミニウム200μgと３ＤＭＰＬ２５μgの配合剤、のいずれかを使用して繰り返された。アッセイの結果は第８表に示される。
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引用文献
１．  米国特許第４，２４２，５０１号
２．  米国特許第４，２２１，９０６号
３．  米国特許第４，６８６，１０２号
４．  米国特許第４，６７３，５７４号
５．  国際公開第ＷＯ  ９０／０６９５１号
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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