(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列の３’末端から０．０７ｋｂの塩基長〜３’末端から５’末端までの塩基長のＤＮＡからなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列の３’末端から０．０７ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．９ｋｂの塩基長のＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の塩基配列を有するＤＮＡに関し、より詳細にはブタ補体インヒビターのプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臓器移植は各国で広く行われており、特に優れた免疫抑制剤（シクロスポリン、ＦＫ５０６など）の開発により、ヒトからヒトへの臓器移植の拒絶反応は解決された。しかし、臓器提供者（ドナー）の不足が深刻な問題となっている。このような問題から、動物臓器のヒトへの移植、即ち異種移植が研究されている。例えば、欧米では年間約３５００例の心臓移植が行われているものの、この例数は心臓移植を必要としている患者の約２〜３割にしか満たないのが現状である。ドナー動物として、ヒトの近縁種（例えば、ヒヒ、チンパンジーなどの霊長類）を用いることは、ドナー動物数が少ないことや知能の高いことによる倫理的な点から問題が多い。それに対して、家畜をドナー動物とする場合には問題が少ない。特に、ブタは大量に飼育されており供給が容易であること、ブタの臓器の大きさはヒトの臓器に近いこと、系統の保存などの基盤が確立されていることなどの利点を有し、ブタの臓器をヒトに移植する研究が行われている。
【０００３】
ブタの臓器をヒトに移植した場合に生じる拒絶反応のうち、ＭＨＣの関与する細胞性免疫による急性の拒絶反応(Acute rejection)は、ブタとヒトでは遠縁種の関係にあり、ＭＨＣの類似性がないので、起こり難いと予測されている。また、万一、このような拒絶反応が生じた場合でも、上述の優れた免疫抑制剤の使用により、回避できると考えられている。
しかし、ヒトの血中にはブタに対する抗体が既に存在する（自然抗体と称される）。その結果、ブタの組織がヒトに移植されると、ヒト血中の自然抗体がブタの組織（抗原）を認識し、抗原・抗体複合体が形成され、この抗原・抗体複合体がヒトの補体を活性化し、活性化されたヒトの補体が移植されたブタの組織を壊死させる（拒絶）。このような現象は、移植後速やかに（１時間以内）に起こるので、超急性拒絶(Hyperacute rejection)と呼ばれている。
【０００４】
補体の活性化による超急性拒絶を抑制する薬剤は開発されていない。ヒトの組織はヒトの補体による損傷を受けない。これは、ヒトの組織には補体の活性化反応を抑制する因子が発現しているからであり、この因子は補体インヒビター（又は補体制御因子）と称されている。補体インヒビターとしては、ＤＡＦ(Decay accelating factor, CD55)、ＭＣＰ(Membrane cofactor protein, CD46)、ＣＤ５９の３つが重要である。なお、ＤＡＦ及びＭＣＰはＣ３ｂ及びＣ３／Ｃ５転換酵素の崩壊亢進により、ＣＤ５９はＣ９ステップの阻害により補体の活性化を阻止すると考えられている。
補体インヒビターは種による特異性があり、ブタ補体インヒビターはブタの補体活性を阻止することはできても、ヒトの補体活性を阻止することはできない。そのため、ブタの組織がヒトに移植されてヒトの補体系が活性化されたとき、ブタの補体インヒビターではそれを抑制することはできない。その結果、ヒトに移植されたブタ組織は壊死することになる。
また、ブタの組織がヒトに移植されると超急性拒絶が起こるが、この際、トロンビンの形成や血小板の凝集も起こり、血液凝固反応も活性化され、血管系及び移植臓器中では、血栓が形成される。また、血液凝固反応に関連する成分、例えばトロンビン、フィブリン及びフィブリンの分解産物は臓器の損傷、炎症を増悪させ、移植臓器を壊死させるという問題点があった(Xenotransplantation, vol.
3(1). 24-34, 1996)。
【０００５】
前記のような、ブタの臓器をヒトに移植する際の問題点を解決するには、遺伝子工学的方法により、ブタの臓器にヒトの補体インヒビター及び／又はトロンボモジュリン等の血栓形成阻害因子（以下、これらを総称して補体インヒビターという）を予め発現させておけばよい。ブタの心臓を移植する場合には、ブタの血管内皮細胞にヒトの補体インヒビターを予め発現させておけばよい。
このような観点から、ヒトの補体インヒビター遺伝子を組み込んだ遺伝子組換ブタ（トランスジェニックブタ）の研究が盛んに行われている。
一方、血液凝固系の反応を制御し得る因子（例えば、トロンボモジュリン， Proceedings of the XVth World Congress of the Transplantation Society, pp. 77-79, 1995)をブタの臓器に単独又はヒトの補体インヒビターとともに予め遺伝子工学的方法を活用して発現させておくことも有用であると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ヒト補体インヒビターを組み込んだトランスジェニックブタを用いて、異種移植を行うことが研究されている。現在のところ、このトランスジェニックブタ作製に使用されているプロモーターはヒト補体インヒビター由来のもの又はウイルス由来のものが用いられている。しかし、補体インヒビターのブタでの発現には、ブタ由来の補体インヒビターのプロモーターがより有効であると考えられる。上記のプロモーターを獲得するためには、まず、ブタ補体インヒビターのｃＤＮＡを得る必要がある。そこで、本発明者等はブタ補体インヒビター（以下、ｐＭＣＰという）のｃＤＮＡの単離・精製を検討し、当該ｃＤＮＡを単離すると共にその塩基配列を決定した（特願平７−１７８２５４号参照）。
本発明者等は、更に研究を進め、上記のｐＭＣＰのｃＤＮＡをプローブとして、ブタゲノムライブラリーからｐＭＣＰのゲノムＤＮＡを取得し、そのゲノムＤＮＡからｐＭＣＰのプロモーター領域の特定及びその塩基配列の決定に成功した。
上記のように、本発明のｐＭＣＰのプロモーターはｐＭＣＰゲノムＤＮＡに由来し、ｐＭＣＰゲノムＤＮＡはｐＭＣＰのｃＤＮＡを用いて選択された。ｐＭＣＰのｃＤＮＡはブタ血管内皮細胞内のＲＮＡに由来する。すなわち、本発明のｐＭＣＰのプロモーターはｐＭＣＰをブタ血管内皮細胞に発現させる際の調節遺伝子として機能している。これらのことから、本発明のｐＭＣＰのプロモーターを用いれば、ヒトの補体インヒビター遺伝子、トロンボモジュリン等の血栓形成阻害因子の遺伝子や種々の構造遺伝子をブタの臓器、特にブタの血管内皮細胞に発現させることが可能となる。しかも、本発明のｐＭＣＰのプロモーターを用いれば、種々の構造遺伝子をブタの臓器、特にブタの血管内皮細胞に、効率的、選択的かつ特異的に発現させることが可能となる。
一方、従来の研究において採用されているヒト補体インヒビター又はウイルスに由来するプロモーターを用いて、ブタの臓器にヒト補体インヒビターを発現させる場合には、その発現は非選択的、非特異的、非効率的であった。
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明はｐＭＣＰのプロモーター活性を有するＤＮＡを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼配列番号１で示される塩基配列もしくは当該塩基配列の一部からなるＤＮＡ又は当該塩基配列を含むＤＮＡ；
▲２▼配列番号１で示される塩基配列の３’末端から約４．１ｋｂ、２．４ｋｂ、１．７ｋｂ、０．９ｋｂ、０．５ｋｂ、０．０７ｋｂ又は０．０５ｋｂの塩基長のＤＮＡである上記▲１▼記載のＤＮＡ；
▲３▼配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡである上記▲１▼記載のＤＮＡ；であり、かかるＤＮＡはｐＭＣＰのプロモーター活性を有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明にかかる配列番号１に示される塩基配列は、ｐＭＣＰのプロモーター活性を有するＤＮＡである。当該ＤＮＡは、例えば、市販のブタゲノムライブラリーからｐＭＣＰ構造遺伝子のゲノムＤＮＡを取得し、当該ゲノムＤＮＡの上流に存在するプロモーター領域を特定し、適当な制限酵素で切り出すことにより得ることができる。
上記において、ｐＭＣＰ構造遺伝子のゲノムＤＮＡの取得は、ｐＭＣＰｃＤＮＡ又はその一部をプローブとして用い、ブタゲノムライブラリーから、慣用のプラーク ハイブリダイゼーション法、コロニー ハイブリダイゼーション法などによりクローニングすることにより行うことができる。例えば、プラーク ハイブリダイゼーション法による場合、▲１▼ブタゲノムファージライブラリーを用いて、ファージクローンと大腸菌を寒天平板上で培養してプラークを形成させ；▲２▼プラークをニトロセルロースフィルターにレプリカして、プラーク中のファージＤＮＡをフィルター上に固定し；▲３▼ラジオアイソトープなどで標識された前述のｐＭＣＰｃＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行い、フィルターのオートラジオグラフィーを取ることにより、目的とするｐＭＣＰゲノムＤＮＡを含むファージのプラークを検出する。この操作を繰り返すことにより、ｐＭＣＰのゲノムＤＮＡを含むファージをクローン化することができる。
得られたクローンの内、プロモーター領域を有するゲノムＤＮＡを含むファージクローンの選別は、プロモーター領域は第一エクソンを持つものと考えられることから、既に知られているヒトｐＭＣＰｃＤＮＡの第一エクソンに相当すると考えられる領域をｐＭＣＰｃＤＮＡから切り出し、これをプローブとして用いて、前述と同様にしてプラーク ハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを選別することにより行うことができる。
かくして選別されたクローンのファージＤＮＡより、プロモーター領域を含むｐＭＣＰのゲノムＤＮＡを得ることができる。
【０００９】
ｐＭＣＰのプロモーター領域のＤＮＡは、上記で得られたｐＭＣＰのゲノムＤＮＡの上流領域を適当な制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片のプロモーター活性を試験し、活性のある断片を採取することにより得ることができる。
プロモーター活性の試験は慣用の方法に準じて行うことができる。例えば、制限酵素で切断した断片を、ルシフェラーゼ活性測定用ベクターに組み込み、このベクターを適当な細胞に導入し、細胞を所定時間培養した後、細胞を溶解し、細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を蛍光測定することにより、プロモーター活性を試験することができる。
【００１０】
上述の方法にて、ブタゲノムライブラリーからｐＭＣＰのゲノム遺伝子のプロモーター領域を取得したところ、後記の実施例に示されるように、約５４００ｂｐからなるプロモーター領域が得られた。この領域の塩基配列のシーケンスを常法に準じて決定したところ、配列番号１に示される塩基配列（５４１８塩基）を有することが明らかになった。
更に、このプロモーター領域を適当な制限酵素で切断し、前述の試験方法でプロモーター活性を試験したところ、約１７００ｂｐ上流までに強いプロモーター活性が認められた。そこで、この約１７００ｂｐの塩基配列のシーケンスを常法に準じて決定したところ、配列番号２に示される塩基配列（１６２２塩基）を有することが明らかになった。
なお、後記実施例に示されるように、配列番号２に示されるプロモーター領域よりも短い領域にもプロモーター活性が認められ、またそれよりも長い領域もプロモーター活性を有する。従って、本発明のＤＮＡは、ｐＭＣＰのプロモーター活性を有する限り、配列番号１に示される塩基配列の一部であってもよく、また配列番号１に示される塩基配列を含むもであってもよい。
更に、本発明のＤＮＡはｐＭＣＰのプロモーターに限らず、種々の構造遺伝子の発現のプロモターとしても利用でき、その際には、発現させようとする構造遺伝子、細胞種、動物種などにより、プロモター活性の良好な物を全長のシーケンスから適宜選択することができる。
【００１１】
かくして得られた本発明のＤＮＡはｐＭＣＰ等の構造遺伝子に対してプロモーター活性を有し、種々の用途に利用することができる。好適には、前述のように、ヒト補体インヒビターを組み込んだトランスジェニックブタを作製する際に、ヒト補体インヒビターの上流に組み込んで用いられ、ヒト補体インヒビターを効果的に発現させることが可能となる。特に、補体インヒビターをブタの血管内皮細胞に発現させることが可能となる。更に、本発明のＤＮＡは、ｐＭＣＰ以外の種々の構造遺伝子の発現のプロモターとしても利用できる。
なお、本発明のＤＮＡは上記の例で得られたものに限定されるものではなく、他の方法で得られたものも包含される。また、本発明のＤＮＡは、プロモター活性を有する限り、当該塩基配列の一部の塩基が置換や欠失されていてもよく、更に１又は２以上の塩基が挿入されていてもよい。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ａ．ｐＭＣＰのプロモーター領域の獲得
▲１▼ハイブリダイゼーションによるファージクローンのクローニング
ｐＭＣＰのゲノムの獲得は、ゲノムのライブラリーとしてλＦＩＸＩＩブタゲノムファージライブラリー（Stratagene社製）を用い、プローブとして発現クローニングにより得たｐＭＣＰｃＤＮＡ全長（発現ベクターよりＸｈｏＩ，ＮｏｔＩで切り出したもの）を用い、プラークハイブリダイゼーションで行った。以下にその方法の概要を示す。
【００１３】
まず、上記ファージクローンを大腸菌液とともに２万クローンずつ５０枚のプレートにまく（合計１００万クローン）。３７℃で一晩培養しファージクローンによりプラークを出現させる。この各プレート上に、ハイブリダイゼーション用のニトロセルロースフィルターを一枚ずつ１分ほど置き、各プラーク中のファージをフィルターに吸着させる。
この後、吸着面の逆側から液が浸透するようにアルカリ変性液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に２０秒浸してファージの核を分解し、さらに、中和液［ｘ２ ＳＳＣ、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］に２０秒浸した後、風乾する。次いで、GS GENE LINKER（BIO RAD社製）を用いてＵＶクロスリンクさせる。
次に、このフィルターをプレハイブリダイゼーション用バッファー[50％ deionized Formamide, x4 SSC, 50mM HEPES(pH7), x10 Denhardt溶液, 100mg/ml変性サケ精子ＤＮＡ]を用い、３７℃４時間インキュベーションしてブロックする。
【００１４】
一方、プローブは上記プラスミドをラジオアイソトープである［α-32Ｐ］ＡＴＰ存在下においてｄＮＴＰとＫｌｅｎｏｗ（DNA polymerase Ｉ）で反応させラベルを行う。この反応により、ｃＤＮＡを鋳型にして、ラジオアイソトープを取り込んだｃＤＮＡの逆鎖ができ、この逆鎖は鋳型と同じＤＮＡ配列を持つファージクローンと結合できる。
その後、ラベルしたプローブをゲル濾過スピンカラムに通し、未反応のラジオアイソトープ標識ヌクレオチドを取り除き、９０℃３分のインキュベーションの後、氷冷してＤＮＡを一本鎖にした状態でハイブリダイゼーションに用いる。
【００１５】
プレハイブリダイゼーションが終わった前記のフィルターは、上記プローブを添加したプレハイブリダイゼーションバッファーを収容したハイブリパックに入れて、３７℃で一晩反応させてハイブリダイゼーションする。
ついで、このフィルターは適当な濃度のＳＳＣ、ＳＤＳ溶液で２回洗浄した後、イメージアナライザ用プレートと２時間室温で反応させた後、イメージアナライザ（FUJI FILM社製）で解析する。
以上の結果、３０クローンの陽性クローンを得た。この陽性クローンに相当するプラークのゲルをパスツールピペットで吸い取りＳＭバッファーで希釈してクローン液を得た。
【００１６】
▲２▼２次スクリーニング及びそれ以降のスクリーニング
上記のクローン液を、各クローン１プレートで（合計３０プレート）、十分に各プラークが分かれて出現するように希釈し、再度ハイブリダイゼーションを行った。その結果、２０プレートにおいて陽性プラークが多数出現した。こうして２０個の陽性クローンを得た。
同様のことをさらに３回繰返し、プレートに出ている全てのクローンが陽性になるようにしてクローン化した。
【００１７】
▲３▼クローンの制限酵素切断パターンによる分類
上記の２０個のクローンに重複するものがあるかどうかを調べるために、各クローンを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、ゲルに流した。
同じクローンであれば同様な切断パターンを示すので、この切断パターンの違いにより分類分けし、１０種類のクローンを得た。
【００１８】
▲４▼プロモーター領域を含むファージクローンのｃＤＮＡの先頭領域を用いての選別
このうち、プロモーター領域を含むクローンは第一エクソンを持つものと考えられるので、ｐＭＣＰｃＤＮＡのヒトＭＣＰｃＤＮＡの第一エクソンに相当すると思われる領域を切り出し（ＳａｌＩ−ＳｐｈＩ）、これをプローブにしてハイブリダイゼーションしたところ、４種のクローンが陽性となった。
【００１９】
▲５▼プロモーター領域を含むファージクローンの出現頻度の低い制限酵素サイトを用いての選別
さらに、ｐＭＣＰｃＤＮＡの第一エクソン中に存在している出願頻度の低い制限酵素サイトＦｓｐＩで、上記の４種のクローンを切断したところ、１種のみがこの酵素で切断できた。
このことより、これがプロモーター領域を含むクローンである可能性が強いことが明らかになった。
【００２０】
▲６▼プロモーター領域のシーケンスによる確認
第一エクソン中に存在しているこのＦｓｐＩが端にくるようにＦｓｐＩと別の酵素（ＥｃｏＲＩ）の組合せで切り出し、シーケンス用ベクターであるｐＢＳＩＩＫＳ+（Stratagene社製）に組み込み、シーケンスを行った(373 DNA シーケンサー、Applied Biosystems社製)。
その結果、本クローンは確かに第一エクソンのシーケンスを含んでいた。
これより、本ファージクローンは、ファージクローンの制限酵素の切断パターンより考え、全長としてｐＭＣＰのプロモーター領域と考えられる上流域のゲノム配列を約１３ｋｂｐ含んでいることがわかった。
【００２１】
Ｂ．ｐＭＣＰプロモーター領域の活性測定
▲１▼プロモーター活性測定用コンストラクトの作成
プロモーター領域の活性の検討は、酵素ルシフェラーゼの遺伝子を利用したシステムを用いて行った。
ｐＭＣＰの約５．４ｋｂｐのプロモーター領域（ファージクローンに含まれている１３ｋｂｐは大きすぎてコンストラクト作製には使いにくいので、途中のＥｃｏＲＩサイトで切断したものを使用した）は、その上流にシーケンス用のＴ７プライマー認識配列を含む領域を、制限酵素ＢｓｔＥＩＩ−ＢｓｓＨＩＩで上記のシーケンスで用いたプラスミドより切り出した。上記の約５．４ｋｂｐのプロモーター領域の塩基配列のシーケンスを常法に準じて決定したところ、配列番号１に示される塩基配列（５４１８塩基）を有することが明らかになった。
そして、上記のプロモーター領域をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、ルシフェラーゼ活性測定用ベクターであるｐＧＬ−３ベーシックベクター（Promega社製）のＳｍａＩサイトにサブクローニングした。なお、上記のルシフェラーゼ活性測定用ベクターは、プロモーター領域を持たず、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にプロモーター活性を測定したいプロモーターを組み込み、ルシフェラーゼ酵素の活性でプロモーター領域の働きの強さをみるものである。このルシフェラーゼ酵素の活性は、細胞を溶解し、この酵素を含む細胞溶解液を得、この液と酵素の基質を反応させて生じる蛍光の強度を測定することにより求められる。
【００２２】
▲２▼デリーションミュータントの作成
さらに、種々の長さのプロモーター領域を得るために、キロシークエンスキット（TAKARA社製）を用いてデリーションミュータントを作成した。
これにより、約４．１、２．４、１．７、０．９、０．５、０．０７及び０．０５ｋｂの長さのプロモーター領域を持つｐＧＬ−３ベクターを作製した。
また、対照として、ＳＶ４０プロモーターを用い、同様にしてＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ−３ベクターを得た。
更に、比較例として、前記の約５．４ｋｂのプロモーター領域をベクターに逆向きに結合したもの、ヒトＤＡＦ（ｈＤＡＦ）のプロモーター（約４ｋｂ）をベクターに結合したものを作製した。
【００２３】
▲３▼ブタ血管内皮細胞へのエレクトロポレーション
ルシフェラーゼ活性の測定は豚血管内皮細胞由来初代培養細胞株を用いて行った。
培養した豚細胞株をトリプシン／ＥＤＴＡではがし、洗浄した後に、ＨｅＢＳバッファーに３×１０6個／８００μｌになるように懸濁させた。
ついで、この懸濁液８００μｌずつと上記のプラスミド１５μｇ分を電極間距離０．４ｃｍのキュベット（細胞エレクトロポレーション用）に移し、Gene pulser(登録商標、Bio Rad社製）を用いて、５００μＦ、３００Ｖ条件でエレクトロポレーションし、プラスミドを細胞内に取り込ませた。
【００２４】
▲４▼ルシフェラーゼ活性の測定
上記の細胞を培養し、４８時間後に回収し、よくＰＢＳで洗浄した後、細胞溶解液を加えて室温で１０分反応させた。得られた細胞溶解液のうちの１０μｌとルシフェラーゼの基質溶液５０μｌを混ぜてLuminescense Reader(ALOKA社製）を用いて溶液の蛍光を測定した。
その結果を図１に示す。なお、数値は生存細胞１×１０5個当りに換算して補正した。また、対照であるＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ−３ベクターの活性を１００とする相対活性で示した。図１において、−５．４ｋｂは約５．４ｋｂのプロモーター領域をベクターに逆向きに結合させたもの、ｈＤＡＦはｈＤＡＦのプロモーターをベクターに結合させたものを意味する。
図１に示されるように、ルシフェラーゼの発現を指標とするときには、プロモーター活性は、約０．０７〜１．７ｋｂの長さのプロモーター領域で陽性対照以上の活性が認められ、この活性はｈＤＡＦのプロモーターよりも強かった。また、約５．４ｋｂ、４．１ｋｂ、２．４ｋｂ及び０．０５ｋｂの長さでもプロモーター活性が認められた。しかし、ベクターに逆向きにつなげたものについては活性が見られなかったことから、上記の領域は確かにプロモーター活性を有していることが分かった。
【００２５】
実施例２
プロモーター領域のシーケンス
図１で強い活性の認められた約１．７ｋｂのプロモーター領域について、その塩基配列を明らかにするためにシーケンスを行った。
シーケンスはデリーションミュータントで作成したそれぞれの長さのプロモーター領域の上流にあるＴ７プライマー認識配列を利用し、ダイプライマー法を用いて行った。各シーケンスは２回ずつ行い、読みにくい部分についてはｐＢＳＩＩＫＳ+にサブクローニングし、Ｔ３プライマー認識配列も利用した。
その結果、上記の約１．７ｋｂのプロモーター領域は、配列番号２に示される塩基配列（１６２２塩基）を有することが判明した。
【００２６】
実施例３
プロモター活性の測定（ヒト補体インヒビターの発現）
▲１▼トランスフェクション
ｐＭＣＰプロモーターの５．４ｋｂ(配列番号１）、１．７ｋｂ（配列番号２）と０．９ｋｂ、ｈＤＡＦプロモーターとプロモーターなしのそれぞれをｈＤＡＦｃＤＮＡに連結した。トランスフェクションは３×１０6個の豚細胞株に、直鎖状にした前述の遺伝子と、セレクションマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を加え、５００μＦ、３００Ｖの条件で、Gene pulser（登録商標、Bio Rad製）を用いてエレクトロポレーションして行った。
細胞は、２５０μｇ／ｍｌのネオマイシン硫酸塩（Gibco製）を含む培養液中で培養し、コロニーを形成した細胞を集めた。細胞表面のｈＤＡＦの発現をビオチン化抗ｈＤＡＦモノクローナル抗体(IA10, IIH6及びVIIIA7; Kinoshita, T., et al. (1985) J. Exp. Med. 162: 75)とストレプトアビジン−ＰＥ（Biomeda製）で染色後、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson製）により測定した。
【００２７】
▲２▼補体抵抗性試験
前述の方法で得たクローンをいくつか選び、それぞれ１．５×１０4個ずつを用い、９６穴のプレート中で抗体と補体に反応させた。抗体源としてそれぞれのウエルに非働化したヒト血清を１００μｌ加え、４℃で３０分おいた。ＰＢＳで洗浄後、各濃度の正常ヒト血清を含む培養液を補体源として加え、３７℃で３時間インキュベートした。細胞の生存率はＷＳＴ−１（ベーリンガーマンハイム製）を用いて判定した。
【００２８】
▲３▼結果
１．プロモーターの違いによる発現量の比較：
各プロモーターとｈＤＡＦ発現量の比較試験結果の一部を図２に示してある。図２の横軸のＦＬ２−ＨはｈＤＡＦ発現量を表し、右にシフトするほど高発現を意味する。図２の縦軸のカウントは細胞数を表し、上部にシフトするほど細胞数の多いことを意味する。個々のグラフはそれぞれ下部に示したプロモーターについてのグラフで、黒塗のピークは抗体と反応させなかった細胞のＦＡＣＳｃａｎへの応答を示し、白抜きのピークはｈＤＡＦ抗体で反応させた細胞のＦＡＣＳｃａｎへの応答を示す。その結果、プロモーターなしではｈＤＡＦの発現が見られなかった。ｐＭＣＰのプロモーターは何れも、ｈＤＡＦのプロモーターと比べると、２０倍以上の発現が見られた。即ち、特異的抗体との反応により、約５．４ｋｂ、１．７ｋｂ及び０．９ｋｂのプロモターが豚血管内皮細胞株にヒトの補体インヒビターを有効に発現させていることが確認された。
２．プロモーターの違いによる補体抵抗性の比較：
補体に対しては、ｈＤＡＦのプロモーターを用いてｈＤＡＦを発現させた場合には、ヒト血清５０％中でほとんど抵抗性を示さなかった。一方、ｐＭＣＰのプロモーターを用いてｈＤＡＦを発現させた場合にはヒト血清１００％中でも８０％以上の抵抗性を示した。即ち、ｐＭＣＰのプロモターにより豚血管内皮細胞に発現されたヒトの補体インヒビターは、ヒトの補体に抵抗するという本来の機能を保持していることが確認された。
【００２９】
【配列表】
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【００３０】
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【００３１】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡはｐＭＣＰのプロモーターであり、ヒト補体インヒビターを組み込んだトランスジェニックブタを作製する際に、ヒト補体インヒビターの上流に組み込むことにより、ヒト補体インヒビターを効果的に発現させることができる。従って、ブタの組織・臓器をヒトに移植した際に生じる超急性拒絶を防止することができるので、ブタの組織・臓器をヒトに移植する異種移植が可能となり、臓器移植のドナー不足の問題を解消できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】各プロモーター領域のプロモーター活性を示す図である。
【図２】本発明のプロモターとｈＤＡＦプロモターのプロモター活性の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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