(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺乳動物の免疫応答を引き起こすことにより、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する哺乳動物の癌を予防又は治療するための医薬であって；該免疫応答が癌細胞に対するαフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球の活性化を含み；αフェトプロテイン分子の一部が、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基３２５−３３４及び前記の組み合わせからなる群から選択される医薬。
【請求項２】
αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球が細胞障害性Ｔリンパ球である請求項１の医薬。
【請求項３】
αフェトプロテイン分子が配列番号：２である請求項１又は２の医薬。
【請求項４】
哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４及び前記の組み合わせからなる群から選択されるペプチドを、哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起こすのに十分な量で含む医薬。
【請求項５】
更にアジュバントを含む請求項４の医薬。
【請求項６】
哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む医薬。
【請求項７】
哺乳動物の癌の予防又は治療のための医薬であって、配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択されるαフェトプロテインの一部をコードする組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む医薬。
【請求項８】
癌が肝細胞癌である請求項１ないし７の何れか１項に記載の医薬。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである請求項１ないし８の何れか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
配列番号：２の残基１３７−１４５、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府委託研究又は開発に関する説明）
本発明は、助成金番号NIH/NCI ROI CA 77623でのアメリカ合衆国政府の支援下でなされた。アメリカ合衆国政府はこの発明に一定の権利を有している。
【０００２】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本出願は、2000年2月10日に出願され、肝細胞癌を予防及び治療するための方法及び組成物と題される米国特許出願第60/181,966号の優先権を主張し；及び本出願は、2000年9月12日に出願され、置換されたαフェトプロテインを用いた肝細胞癌治療と題される米国特許出願第09/660,252号の一部継続出願であり；及び2000年9月14日に出願され、αフェトプロテインｃＤＮＡを用いた肝細胞癌治療と題される米国特許出願第09/662,505号の一部継続出願であり；出典明示により内容の全体をここに取り込む。
【０００３】
（背景）
原発性肝癌は、世界中の癌による死の主要な原因である。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、全世界で一年に約１２０万の症例の発生数を有する、最も一般的な型の原発性肝癌である。世界のいくつかの地域、例えば、東南アジア及びサブサハラアフリカでは、肝細胞癌は、最も一般的な型の悪性疾患の１つである。この疾患の高い頻度は、これらの地域における肝炎の高い発生数に関連するようである。
肝細胞癌の治癒的治療は、現在非転移性疾患を有する個体に制限されており、肝移植を伴うか又は伴わない、腫瘍の外科的切除を含む。しかしながら、外科的切除及び移植でさえも、切除後の再発のために、大部分の腫瘍が治癒しない。治療に対する化学療法剤のアプローチは、たいてい無効であった。
従って、依然として肝細胞癌の有効な治療についての必要性がある。治療は、理想的には、この疾患の最高発生数を有する非先進国における使用に適切であるべきである。さらに、治療は、切除不可能な腫瘍及び転移性疾患を有する個体における使用に適切であるべきである。
【０００４】
（概要）
一実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、哺乳動物の癌の予防又は治療のための方法である。その方法は、αフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺乳動物の免疫応答を引き起こす工程を含み、該免疫応答は癌細胞に対するαフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球の活性化を含む。一実施態様では、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球は、細胞障害性Ｔリンパ球である。好ましい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号：２である。特に好ましい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される。一実施態様では、癌は肝細胞癌である。他の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
好ましい実施態様において、免疫応答を引き起こす工程はαフェトプロテインアミノ酸配列の少なくとも一部を含んでなるペプチドを含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。特に好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される。他の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号：２の残基１−９、配列番号：２の残基１７８−１８６、配列番号：２の残基２１８−２２６、配列番号：２の残基２３５−２４３、配列番号：２の残基３０６−３１５、配列番号：２の残基４８５−４９３、配列番号：２の残基４９２−５００、配列番号：２の残基５０７−５１６、配列番号：２の残基５４７−５５６及び配列番号：２の残基５５５−５６３からなる群から選択される。
【０００５】
他の好ましい実施態様では、免疫応答を引き起こす工程は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。更に他の好ましい実施態様では、免疫応答を引き起こす工程は、αフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療する方法であって、該方法は配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
【０００６】
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２の残基１−９、配列番号：２の残基１７８−１８６、配列番号：２の残基２１８−２２６、配列番号：２の残基２３５−２４３、配列番号：２の残基３０６−３１５、配列番号：２の残基４８５−４９３、配列番号：２の残基４９２−５００、配列番号：２の残基５０７−５１６、配列番号：２の残基５４７−５５６及び配列番号：２の残基５５５−５６３からなる群から選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。一又は複数のペプチドは、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞から選択される。
【０００７】
他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、該方法は、αフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルスベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好ましい実施態様では、本発明は、哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起こすのに十分な量の配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、及び配列番号：２の残基３２５−３３４からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物である。該組成物は更にアジュバントを含むことができる。他の実施態様では、本発明はこれらのペプチドの１つ又はこれらの組成物の１つをヒトに投与する工程を含むヒトの癌を予防又は治療する方法である。
【０００８】
本発明はまた、配列番号：２の残基１３７−１４５、配列番号：２の残基１５８−１６６、配列番号：２の残基３２５−３３４及び配列番号：２の残基５４２−５５０からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌を予防又は治療するための手段を包含する。
他の実施態様では、本発明は配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有する、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好ましい実施態様では、本発明は配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有するペプチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物である。組成物は更にアジュバントを含有することができる。他の実施態様では、本発明はこれらのペプチド又はこれらの組成物の１つをヒトに投与する工程を含む、ヒトの癌の予防又は治療方法である。
本発明はまた、配列番号：２の残基５４２−５５０に従う配列を有するペプチドを含む、癌の予防又は治療の手段を包含する。
【０００９】
（説明）
一実施態様では、本発明は、単独で又は組み合わせて肝細胞癌の治療に使用されうるペプチド群である。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数のペプチドを単独で又は組み合わせて、あるいは本発明の一又は複数のペプチドを含む組成物を投与することにより肝細胞癌を予防又は治療するための方法である。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数のペプチドをパルスした、あるいはαフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルス（ＡｄＶ）ベクターを導入した樹状細胞を投与することにより、肝細胞癌を予防又は治療するための方法である。
肝細胞癌の約８０％がαフェトプロテイン発現を再活性化する。マウス及びヒトの両方のＴ細胞レパートリーが、ＭＨＣクラスＩによってＡＦＰ誘導ペプチドエピトープを認識することができる。従って、胚発生の間、高い血漿レベルのこの癌胎児性タンパク質に暴露されるにもかかわらず、免疫系の個体発生の間にＡＦＰ特異的Ｔ細胞の全てが消失するわけではない。
【００１０】
本発明は、ＨＬＡ-Ａ*０２０１で提示される場合に、ヒトＴ細胞レパートリーにより認識されるヒトαフェトプロテイン、配列番号：２から誘導されるペプチドの同一性の決定を包含する。以下の表１にまとめられているように、４つのＡＦＰ誘導ペプチドを同定し、「ドミナントな」ペプチドが示された。それらはＰＬＦＱＶＰＥＰＶ、ｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ、ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ＧＬＳＰＮＬＮＲＦＬ、ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びＧＶＡＬＱＴＭＫＱ、ｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０である。それぞれ、１つ又は２つのアンカー残基を有する。
ドミナントなペプチドのそれぞれが、濃度依存性クラスＩ結合アッセイでＴ２細胞上にＨＬＡ-Ａ*０２０１を安定化した。ペプチドをオフ速度論アッセイで２〜６時間安定化した。更に、各ドミナントペプチドは、いくつかの通常ＨＬＡ-Ａ*０２０１ドナーからインビトロにおいてペプチド特異的Ｔ細胞を誘導した。重要なことには、これらのｈＡＦＰペプチド特異的Ｔ細胞はまた、細胞毒性アッセイ及びＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの両方でＨＬＡ-Ａ*０２０１＋／ＡＦＰポジティブ腫瘍細胞を認識することができる。この情報をまとめた。
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【００１１】
本発明で示されるように、これらのＴ細胞の活性化は、免疫賦活した状態でこれらのドミナントなペプチドを存在させることにより行うことができ、プロフェッショナル抗原提示樹状細胞による提示を含む。αフェトプロテインｃＤＮＡ、配列番号：１をコードする組み換えアデノウィルス（ＡｄＶ）ベクターを導入した樹状細胞は、ＭＨＣによって４つのドミナントなペプチドエピトープを処理及び提示し、またＡＦＰ特異的Ｔ細胞の活性化を誘導しうる。同様に免疫化したＨＬＡ-Ａ*０２０１／Ｋｂマウスもまた、サイトカイン放出アッセイでＡＦＰペプチドをパルスした細胞を認識する。更にＡＦＰペプチドで刺激したヒト及びＨＬＡ-Ａ*０２０１／ＫｂマウスＴ細胞は、認識したｈＡＦＰ操作標的に応答し、より低い程度で天然ＡＦＰ発現ヒト肝細胞癌細胞に応答する。最後に、質量分析を用いて、ＨＬＡ-Ａ*０２０１＋ＨＣＣ細胞から溶出したペプチドの複合混合物からの少なくとも３つのＡＦＰエピトープを同定した。従って、実証された複数のラインは、これら４つのドミナントなペプチドのそれぞれが免疫原性を有し、ＨＬＡ-Ａ*０２０１により自然に処理及び提示されることを示す。
「サブドミナント」ペプチドと称される他の１０のペプチドは、弱い又は低い再現性のある応答を有するが、１以上のタイプのアッセイでポジティブであった。これら１０のペプチドは、ＭＫＷＶＥＳＩＦＬ、配列番号：２の残基１−９；ＩＬＬＷＡＡＲＹＤ、配列番号：２の残基１７８−１８６；ＬＬＮＱＨＡＣＡＶ、配列番号：２の残基２１８−２２６；ＦＱＡＩＴＶＴＫＬ、配列番号：２の残基２３５−２４３；ＴＴＬＥＲＧＱＣＩＩ、配列番号：２の残基３０６−３１５；ＣＩＲＨＥＭＴＰＶ、配列番号：２の残基４８５−４９３；ＰＶＮＰＧＶＧＱＣ、配列番号：２の残基４９２−５００；ＮＲＲＰＣＦＳＳＬＶ、配列番号：２の残基５０７−５１６；ＴＭＫＱＥＦＬＩＮＬ、配列番号：２の残基５４７−５５６；及びＮＬＶＫＱＫＰＱＩ、配列番号：２の残基５５５−５６３である。
【００１２】
本発明の組成物及び方法は、主に一又は複数のドミナントペプチド、ｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０の使用により開示されるが、所定位置にある、あるいは一又は複数の４つのドミナントペプチドと連結している１０のサブドミナントペプチドの一又は複数を使用することも本発明の範囲内である。
ドミナントペプチド及びサブドミナントペプチドの同定は、ここに詳細に議論されるであろう。第１に、ｈＡＦＰ由来のペプチド配列、配列番号：２（Genbank受託番号：J00077、J00076及びV01514）は、ＨＬＡ-Ａ*０２０１に潜在的に結合するものであろうことが同定された。これらのペプチドは９又は１０のアミノ酸長の間に、２位にアミノ酸イソロイシン、ロイシン及びメチオニン有し、又はペプチドの長さによるがペプチド位置９又は１０にアミノ酸イソロイシン、ロイシン及びバリンを有することもあり、あるいはその両方を有する。７４のこのようなペプチドをWisconsin大学のGenetics Computer Groupプログラム「find patterns」を用いて同定し、ｈＡＦＰ配列、配列番号：２をスクリーニングした。７４の各ペプチドは標準的な技術を用いて合成した。
７４ペプチド候補のそれぞれを、ＨＬＡ-Ａ*０２０１安定化アッセイのＴ２細胞に対する濃度による結合を試験した。細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を増加させるために前の晩に室温でインキュベートしておいたＴ２（ＴＡＰ欠損）細胞を、次いでペプチド濃度0.1mM-100mMの範囲にわたって各ペプチドと共に一晩インキュベートした。抗ＨＬＡ-Ａ２抗体（ＢＢ７．２）とヤギ抗マウスＦＩＴＣで細胞を染色した後に、ＨＬＡ-Ａ*０２０１の安定性をフローサイトメトリーによってアッセイした。
【００１３】
次に、ＭＨＣ-ペプチド複合安定性をオフ速度論アッセイを用いて決定した。ＨＬＡ-Ａ*０２０１ＬＣＬを、穏やかなｐＨ３．２のクエン酸-リン酸酸性緩衝液で剥離した。各ペプチドを、3μg/mlのｂ２ミクログロブリンの存在下、室温で１時間、200mMで細胞上に直接パルスした。過剰なペプチドを洗浄除去し、細胞を３７℃で０、２、４及び６時間インキュベートした。細胞を各時点の終わりに洗浄し、細胞表面ＨＬＡ-Ａ２発現について染色し、次いで、フローサイトメトリーで分析した。ペプチドＭＨＣクラスＩ複合体は、剥離はされたがペプチドをパルスされなかった細胞から少なくとも１．５倍増加した平均蛍光強度である場合を、安定であると判断した。４つのドミナントペプチドの全てが、オフ速度論アッセイで２〜６時間、安定であった。
次いで４つのドミナントペプチドについて、更なる免疫学的及び物理化学的研究を実施した。これらの研究は（１）ペプチドを使用して、ペプチド特異的で天然ＡＦＰ発現細胞を認識するＡＦＰペプチド特異的ヒトＴ細胞培地を作成する；（２）ＡｄＶｈＡＦＰ-導入樹状細胞を使用して、ＡＦＰポジティブ細胞、並びにドミナントペプチドをパルスしたＡＦＰネガティブ細胞を認識するＡＦＰ特異的ヒトＴ細胞を作成する；インビトロ研究、及び（１）ペプチドで免疫化したトランスジェニックマウスが、ペプチド及びＡＦＰポジティブ細胞を認識する脾細胞を有する；及び（２）ＡｄＶｈＡＦＰ／ＤＣ免疫化マウスがＡＦＰポジティブ細胞、並びにドミナントペプチドをパルスしたＡＦＰネガティブ細胞を認識する、インビボ研究を含んでいた。これらの研究は、ドミナントペプチドが免疫原性を有し、ＡＦＰ自体が免疫原性を有し、ドミナントペプチドがＡＦＰポジティブ細胞の表面上で自然に処理及び提示され、さらにＡＦＰ／ＤＣ又はドミナントペプチドの両方がサイトカインの生成及びＡＦＰポジティブ細胞の殺傷を行うＡＦＰ特異的Ｔ細胞を生成するのに利用できることを示した。更に、質量分析はＡＦＰポジティブ肝細胞癌細胞の表面由来のＡＦＰペプチドを物理的に同定するのに使用された。
【００１４】
第１に、未処置のＨＬＡ-Ａ*０２０１ヒトＴ細胞培地の反復ペプチド刺激を行い、ヒトＴ細胞レパートリーにおけるペプチド免疫原性と、ＡＦＰトランスフェクト標的を認識するペプチド特異的Ｔ細胞の能力を提示した。バルクＴ細胞培地を、各ドミナントＡＦＰ由来ペプチドをパルスしたＰＢＭＣから生成し（ＫＬＨ、ＩＬ-７及びＩＬ-２を補った）、増殖の３〜７週、ペプチドをパルスした標的とＡＦＰを発現する標的の両方を認識する能力を試験した。これらの培地はペプチド特異的Ｔ細胞を増殖させ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてコントロールＭＡＲＴ-１２７-３５をパルスルＪＹは認識せず、特異的ペプチドをパルスしたＪＹ細胞を認識することによってＩＦＮｇを分泌する能力により明らかになった。ＡＦＰペプチド特異的バルクＴ細胞はまた、ＩＮＦｇ産生ＡＦＰ特異的Ｔ細胞の増加した頻度により示されるような修飾していない又は空のＡｄＶＲＲ５導入親細胞に比べ、安定にトランスフェクトしたＡＦＰネガティブ及びＡｄＶｈＡＦＰを導入したＨＬＡ-Ａ*０２０１メラノーマ細胞（Ｍ２０２）の両方を認識した。ＨＬＡ-Ａ*０２０１＋、天然ＡＦＰ発現肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を（ＨＬＡ-Ａ２-/ＡＦＰポジティブＨＣＣ株Ｈｅｐ３Ｂと比較して）認識する能力を評価するために、細胞障害性とＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。
【００１５】
更に、ＣＴＬをＡｄＶ導入樹状細胞から生成した。簡単に言うと、ＧＭ-ＣＳＦとＩＬ-４と共にインキュベートしたＰＢＭＣから作成した樹状細胞に、２時間１０００の感染効率（ｍｏｉ）でＡｄＶｈＡＦＰ又はＡｄＶＭＡＲＴ１を導入した。導入した樹状細胞を洗浄し、照射し、１-２×１０５細胞/mlで撒いて、ＣＴＬ生成のための刺激剤とした。自己非接着細胞は、磁気ビーズ枯渇によって、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６＋細胞を枯渇し、ＣＤ８＋強化キラー細胞（一般に８０％ＣＤ８＋の濃度、示さない）を作成した。ＣＤ８＋細胞を、10-25ng/mlのＩＬ-７を添加した５％自己培地に２×１０６細胞/mlで導入樹状細胞と共に撒いた。培地には、３-４日毎に10U/mlでＩＬ-２を補った。ＣＤ８＋ＣＴＬは、１０-２０のＣＤ８＋ＣＴＬに１樹状細胞の率で新しい自己ＡｄＶ導入樹状細胞により毎週再刺激された。多くの培地は、一週ベースでＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞表現型であった。各ドミナントペプチドは、いくつかの通常ＨＬＡ-Ａ*０２０１ドナーからインビトロでペプチド特異的Ｔ細胞を誘導した。
【００１６】
ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣインビトロ刺激ヒトＴ細胞は、ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイの両方でｈＡＦＰトランスフェクト標的を特異的に認識したので、次に４つのドミナントペプチドは、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ刺激Ｔ細胞により特異的に認識されるかどうかを決定するための研究がなされた。培養の７〜２１日後、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣで毎週刺激したＣＤ８強化Ｔ細胞を、細胞障害性及びｈＡＦＰペプチド特異的ＩＦＮｇサイトカイン産生細胞の頻度を試験した。ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ Ｔ細胞培地は、４つのＡＦＰペプチドのそれぞれをパルスしたＪＹ細胞に細胞障害性があり、これらのペプチドに対するＣＴＬは通常のドナーの末梢血から広がりうることが示唆される。自己ペプチドパルスＬＣＬ又はＪＹ細胞を再刺激した後、これらのバルク培地はまた、ＭＡＲＴ-１２７−３５に比較して非常に高い頻度のＡＦＰペプチドに特異的なＩＦＮｇ分泌細胞を含んでおり、ｈＡＦＰ５４２−５５０に加えて、３つの他のドミナントペプチドもまた、ＡｄＶｈＡＦＰ-導入樹状細胞により自然に処理及び提示されることが示唆された。
ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ刺激Ｔ細胞培地はまた、Ａ*０２０１＋/ＡＦＰポジティブ肝細胞癌株ＨｅｐＧ２を認識するが、Ａ*０２０１−/ＡＦＰポジティブＨＣＣ株Ｈｅｐ３Ｂは認識しない低頻度のサイトカイン産生細胞を有していた。Ｔｈ１サイトカインＩＦＮｇ及びＴＮＦａを合成するＴリンパ球は検出されたが、Ｔｈ２サイトカインＩＬ-４は検出されなかった。また、ＩＬ-１０は肝細胞癌株がＴ細胞無しに撒かれたときに検出されたが、このサイトカインの産生は腫瘍細胞を誘導することが示唆される。
【００１７】
ＨＬＡ-Ａ*０２０１/Ｋｂトランスジェニックマウスを７４ペプチドのスクリーニングに使用して、これらのペプチドの何れが免疫原性が有り、次のようなＨＬＡ-Ａ*０２０１で自然に処理及び提示されるのかを決定した。ＨＬＡ-Ａ*０２０１/ＫｂトランスジェニックメスマウスはもともとHarlan-Sprague Dawley（Indianapolis, IN US）から購入し、現在カリフォルニア大学、ロサンゼルスの放射腺腫瘍学部の動物施設で育てられている。
ペプチドの免疫化のために、マウスに、完全フロインドアジュバント中１：１でエマルジョン化した１００μｇのＡＦＰ又はコントロールペプチドを皮下注した。完全フロインドアジュバンド中にエマルジョン化した各ペプチドで免疫化した後、流入領域リンパ節細胞は、ｈＡＦＰを安定にトランスフェクトした細胞の認識によりＩＦＮｇを産生した。更に、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔ細胞は、ＡＦＰ発現アデノウィルス（ＡｄＶｈＡＦＰ）を導入した樹状細胞で免疫化したマウスの脾臓で同定することができた。従って、４つのドミナントペプチドはクラスＩで自然に処理及び提示され、免疫原性を有する。
【００１８】
次に、これら４つのドミナントペプチドのインビボ免疫原性を確認した。ＨＬＡ-Ａ*０２０１/Ｋｂマウスを、同系の樹状細胞上にパルスした各ドミナントペプチドで免疫化した。ＩＦＮｇ特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、免疫化ドミナントペプチド（又はＭＡＲＴ-１ペプチド）又はジャーカット/ＡＦＰ又はジャーカット/ＭＡＲＴトランスフェクト細胞株のいずれかでインビトロで再刺激した脾細胞で実施した。各ｈＡＦＰペプチドでの免疫化とそれに続く何れかのペプチド又はジャーカット/ＡＦＰでの再刺激は、多くのＡＦＰ特異的ＩＦＮｇ産生細胞を誘導した。ＰＢＳ注入マウス由来のリンパ球は、再刺激に関係なく細胞障害性もＩＦＮｇ産生も示さなかった。ＭＡＲＴ-１２７−３５ペプチドで免疫化したマウスは、ＭＡＲＴ-１特異的応答を生成したが、ＡＦＰペプチド応答は生成しなかった。
次いで、ＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４の分化により骨髄前駆体から樹状細胞を作成し、ｈＡＦＰｃＤＮＡ、配列番号：１を誘導する組み換えＡｄＶベクター（ＡｄＶｈＡＦＰ）を導入した。インビボ培養した樹状細胞を１００の感染効率でＲＰＭＩ/２％ＦＣＳに導入した。導入は、３７℃で２時間実施した。次いで樹状細胞を洗浄し、注入のための動物につき0.2mlＰＢＳ当たり樹状細胞５×１０５で再懸濁した。全ての場合において実行可能性が９５％を超えた。免疫化の２週間後、マウスからの脾細胞をｈＡＦＰ（ジャーカット/ＡＦＰ）又はＭＡＲＴ-１（ジャーカット/ＭＡＲＴ）を安定にトランスフェクトしたジャーカット細胞で再刺激した。ＭＡＲＴ特異的に対するＡＦＰ特異的ＩＦＮｇ放出の頻度を、３つの独立した実験（ここでｐ＜０．０２）を平均化するＥＬＩＳＰＯＴにより決定した。細胞障害性を、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイでジャーカット/ＡＦＰ及びジャーカット/ＭＡＲＴに対してアッセイした。
【００１９】
次に、ＨＬＡ-Ａ*０２０１ヒト肝細胞癌株から抽出したドミナントペプチドについてＨＰＬＣ及び質量分析同定を実施した。これらの分析の結果の概要は、以下の表２に示される。
ペプチドを抽出するために、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、5mlのｐＨ３．２のクエン酸-リン酸緩衝液で１分間インキュベートした。懸濁液を遠心分離（８００ｘｇで５分間）し、全体で500mlの細胞無しの上清を各細胞株から回収した。その物質を凍結乾燥して−２０℃で保存した。
凍結乾燥した物質を30mlの水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸（Ｗ/Ａ/ＴＦＡ、全て容量で９５/５/０．１）に再溶解した。この溶液を、Ｗ/Ａ/ＴＦＡで平衡にした分析逆相ＨＰＬＣカラム（Keystone Scientific C18 Betasil、250mm x 2mm、5mm粒径、100Å孔径）に0.2ml/分の流速で投入した。カラムは、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの増加直線勾配を用いて溶出させた（時間/％アセトニトリル＝０/５、５/５、５５/１００、６０/１００）。カラム溶出液の吸光度を２１５と２８０ｎｍで測定し、１分間分で回収された。免疫賦活ペプチドに相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドの保持時間は分離カラムの同一の分離勾配を用いて得られた。
ＡＦＰ産生肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＬＡ-Ａ２＋）及びＨｅｐ３Ｂ（ＨＬＡ-Ａ２−）由来のＨＰＬＣ画分ペプチド酸溶出物を分析するために、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析を実施した。ボイジャーのREACTION PRODUCTS（PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-Of-Flight（MALDI-TOF）の器具を使用して、質量スペクトルを得た。器具はサンプルが沈着乾燥したステンレススチール標的を使用する。全てのスペクトルをインシュリンで外面的に較正し、典型的な±０．１％内の質量精度となった。凍結乾燥したＨＰＬＣ分画を０．１％ＴＦＡを含む１０μｌの７０％アセトニトリルに再懸濁した。この物質の１μｌを、１μｌの基質ａ-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸（Sigma、70%ACN/0.1%TFAに10mg/ml）と共にスポットした。スペクトルをｍ／ｚ５００−７０００のスキャンニングで得た。
【００２０】
ＨＰＬＣ分画のＭＡＬＤＩ分析は、殆ど全ての分画が質量範囲７００〜１５００Ｄａの２０の異なるペプチドを含むが、しばしば小数のドミナントペプチドを有することを明らかにした。この複合混合物以外に、ピークは、ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０、ＨｅｐＧ２細胞から抽出したペプチドプールのｈＡＦＰ１５８−１６６及びｈＡＦＰ３２５−３３４の算出されるモノ等方性プロトン化分子（(Ｍ＋Ｈ)＋）に相当するｍ／ｚ値と同一であった。ｍ／ｚ９７５．６のペプチドをＨｅｐＧ２ペプチドプール由来の１つのＨＰＬＣ分画で同定した。ｈＡＦＰ５４２−５５０の算出された(Ｍ＋Ｈ)＋は９７５．５であり、ｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０に相当するアミノ酸を有する合成ペプチドの反応時間は２１．２分であった。更に、マトリックスのみを有するサンプル中で、及びＨｅｐ３Ｂ抽出物由来のＨＰＬＣ分画１８〜２２で９７５．５±１のｍ／ｚでのシグナルは得られなかった。同様に、ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６及びｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４の算出された(Ｍ＋Ｈ)＋に相当するｍ／ｚを有するピークはまた、標準ペプチドの作用から予測されるＨｅｐＧ２から誘導される適切な分画に見られる。これらのピークはＨｅｐ３Ｂから抽出されたペプチドプールの分画にはなかった。１１５２．２ｍ／ｚのピークは１つの分画で見られ、ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４のナトリウム付加物の存在を示唆する。
【００２１】
従って、ポテンシャル質量補体は、ＨＬＡ-Ａ*０２０１ネガティブＨｅｐ３Ｂ細胞の由来以外の、ＨＬＡ-Ａ*０２０１ポジティブＨｅｐＧ２細胞から抽出されたＨＰＬＣ分画化ペプチドプールの４つのペプチドの３つを同定した。同定された３つのペプチドでは、スポットしたサンプルの繰り返しスキャンでピークが見られた。この物理化学分析で許容される誤差の限界を超えたＨｅｐＧ２ペプチドプール由来の１つの分画において、ｍ／ｚ１０２０．９で広範なピークが見られた。従って、ＨｅｐＧ２細胞の表面上のｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５の存在を立証することができなかった。
これらの分画のドミナントペプチドの存在を免疫学的に確認するために、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐ３Ｂからの1mlの各ＨＰＬＣ分画を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣ免疫化マウス脾細胞を再刺激した。ドミナントペプチドを含む分画から２００-２５０スポット/１０６細胞が観察され、他の分画から１００-１３０スポット/１０６細胞が観察され、Ｈｅｐ３Ｂ分画から最大５０スポット/１０６細胞が観察された。これは更に、ドミナントペプチドの質量分析測定を裏付けする。
【００２２】
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脚注  １．ペプチド識別。２．コントロール合成ペプチドの典型的なＨＰＬＣ保持時間。３．予測される質量/電荷測定値。４．ＨｅｐＧ２由来の酸抽出ペプチドの観察された質量/電荷測定値。５．Ｈｅｐ３Ｂ由来の酸抽出ペプチドの観察された質量/電荷測定値。６．ＨｅｐＧ２由来の酸抽出ペプチドの観察されたｈＡＦＰペプチド質量の分画（分）/電荷測定値。７．ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴによりＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣで初回刺激した脾細胞を再刺激することができるペプチドを含む分画。
【００２３】
実施例１
ペプチドの投与による肝細胞癌を予防又は治療する方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ*０２０１＋患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発明のペプチドを投与する。ペプチドは十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
好ましい実施態様では、ペプチドは、ｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせであり、一又は複数のペプチドを２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、ペプチドを３回投与する。他の好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを２週間間隔で３回投与する。
【００２４】
好ましい実施態様では、ペプチドは直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。
好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドのそれぞれは、0.5mlのMontanide ISA-51にエマルジョン化して投与され、４つのペプチドの組み合わせの場合には、全体で2mlのMontanide ISA-51にエマルジョン化して投与する。エマルジョン化ペプチドは４等分され、各分量を離れた部位に投与する。好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約50μg〜2000μgの用量で投与する。好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約100μg〜1000μgの用量で投与する。特に好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを約500μｇの用量で投与する。
本発明の方法及び組成物を使用してＡＦＰポジティブ/Ａ２．１＋肝細胞癌を有する数人の患者を治療した。各患者は、本方法に従って４つのペプチド、ｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０で免疫化した。ペプチドを0.5mlのMontanide ISA-51でエマルジョン化して、全体で2mlになるように組み合わせた。エマルジョン化したペプチドを４等分して、各分量を離れた部位に投与した。末梢Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ及び４量体アッセイで測定した。これらの試験は、４つのＡＦＰ誘導ペプチドがインビボで検疫原性を有し、さらに患者の血清のＡＦＰのレベルが免疫化前に非常に高かったことを示す。
【００２５】
ＡＦＰ-Ａ１とした第１の患者は、再発性の切除不可能なＡＦＰポジティブ/Ａ２．１＋肝細胞癌を有していた。彼に、２週間隔でMontanide ISA中の４つのペプチドの各100μgを３回免疫化投与した。平行なインビトロＰＭＢＣ培地をまた、免疫化前に第１の患者の血液から確立し、各ペプチドを繰り返しパルスした。ＥＬＩＳＰＯＴにより試験した２８日目の培地の全てのペプチド、及び４量体による３つのうち２つのｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６以外のｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；及びｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４のインビトロ認識を明確化する。ＡＦＰ５４２ペプチドテトラマーがこれらの試薬を調製する装置にホールドできなかったので、ＡＦＰ５４２特異的Ｔ細胞の存在は、テトラマーにより評価することができなかった。インビボ反応は、第２及び第３の免疫化の後にｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０の明確な認識；及びｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４の認識の傾向を示した。
【００２６】
ＡＦＰ-Ａ２とした第２の患者は、エタノール誘発性肝硬変の病歴を有し、Ｂ型及びＣ型肝炎の両方に陰性である７０歳のコーカサス人男性であった。彼は、腫れを伴っており、肝臓の左葉に8cmマス有していることが分かった。彼のＡＦＰ提示レベルは10,400ng/mlであった。肝臓バイオプシーは硬変肝臓のよく分化した肝細胞癌を示した。彼に対し、抗真菌剤ＦＶ-４６２実験を開始したが、病気の進行と聴器毒性があった。提示の数ヶ月後、次に彼は、本発明に従うプロトコールを用いた４つのペプチドｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせで開始した。彼は、２週間隔で２回の免疫化を受けた。２回の免疫化に続く４量体及びＥＬＩＳＰＯＴデータは４つ全てのＡＦＰペプチドエピトープを検出した。
従って、これらの結果は、本方法が進行型の肝細胞癌を有する患者のＡＦＰ特異的Ｔ細胞により検出可能な免疫応答を引き起こすことを示す。
【００２７】
実施例２
本発明のペプチドをパルスした樹状細胞の投与による肝細胞癌のための、又はその予防の方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ*０２０１＋患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発明のペプチドをパルスした樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
好ましい実施態様では、樹状細胞は、ｈＡＦＰ１３７−１４５、配列番号：２の残基１３７−１４５；ｈＡＦＰ１５８−１６６、配列番号：２の残基１５８−１６６；ｈＡＦＰ３２５−３３４、配列番号：２の残基３２５−３３４；及びｈＡＦＰ５４２−５５０、配列番号：２の残基５４２−５５０の組み合わせがパルスされる。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、樹状細胞を３回投与する。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２週間隔で３回投与する。
【００２８】
好ましい実施態様では、樹状細胞は直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。一実施態様では、樹状細胞は約１×１０５〜１×１０８の用量で投与される。他の好ましい実施態様では、樹状細胞は約１×１０６〜１×１０７の用量で投与される。特に好ましい実施態様では、樹状細胞は約５×１０６の用量で投与される。
樹状細胞は、当業者に既知の技術に従って、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ-４）に組織培地に１週間さらした付着性の自己末梢血単核細胞から調製される。Ficoll-Hypaqueによる単一の白血球アフェレーシス（Leukapheresis）から得られた細胞由来の単核細胞を単離し、樹状細胞の生成に使用されるまで液体窒素で凍結して保存する。解凍した単核細胞を生理食塩水で１回洗浄し、２-４×１０７細胞/25cm2Costerフラスコで、２．５-５×１０６生細胞/ml（ＲＰＭＩ１６４０＋５％熱失活自己血清＋ゲンタマイシン）の濃度に撒く。３７度で２時間付着させた後、付着しなかった細胞を生理食塩水で洗浄して取り除く。付着細胞をｒｈＧＭ-ＣＳＦ（800U/ml）及びｒｈＩＬ-４（500U/ml）の存在下で７日間、完全培地で培養する。臨床グレードのＧＭ-ＣＳＦはImmunexにより及びＩＬ-４はSchering-Ploughにより提供された。
【００２９】
患者に単一の白血球アフェレーシスを行い、少なくとも２×１０９ＰＢＬを得て、７０％のＲＰＭＩ１６４０、２０％の自己血清及び１０％のＤＭＳＯ中に低温保存する。等分したものを研究の−７、７及び２１日目に解凍する。自己血清の血液（60ml）は白血球アフェレーシスの時と第１の免疫化の日に、全ての細胞培養に十分であるように採られる。本発明のＡＦＰ誘導免疫優性ペプチドを調製し、当業者に既知の技術で精製する。
続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水溶液で１回洗浄して、適切な濃度、例えば1mLの無血清ＲＰＭＩ１６４０に１０６及び４つの免疫優性ペプチドそれぞれについて50mg/mlで再懸濁する。インキュベーションの最低１時間後にＡＦＰペプチド/ＤＣをペレット化し、無菌生理食塩水で３回洗浄する。細胞をトリパンブルーで数え、皮内注射のために0.1mlの無菌食塩水に再懸濁する。
全量を投与する前に、被験者は0.1mlの生理食塩水中に１/１００の分量で皮膚テストを受けうる。３０分の観察期間の後、腋下、又は鼠径部下又は上付近に、0.1mlの生理食塩水中の皮内注射されるＡＦＰペプチドをパルスした樹状細胞の全量を接種されうる。免疫化後２時間、患者を監視する。好ましくは、患者は、50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも経口的に前処置される。
【００３０】
実施例３
ヒトＡＦＰアデノウィルス導入樹状細胞の投与による肝細胞癌のための、又はその予防の方法
本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提供することがある。本方法は、適した患者、例えばＡＦＰポジティブ肝細胞癌を有するＨＬＡ-Ａ*０２０１＋患者の選択を含む。次に、患者にヒトＡＦＰアデノウィルス導入樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され、好ましくは、投与は複数回繰り返して、ＡＦＰに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。
他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２回〜５回投与する。特に好ましい実施態様では、樹状細胞を３回投与する。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を２週間隔で３回投与する。
好ましい実施態様では、樹状細胞は腋下あるいは鼠径部付近に直接投与されるが、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。一実施態様では、樹状細胞は約１×１０５〜１×１０８の用量で投与される。他の好ましい実施態様では、樹状細胞は約１×１０６〜１×１０７の用量で投与される。特に好ましい実施態様では、樹状細胞は約５×１０６の用量で投与される。
【００３１】
Ficoll-Hypaqueによる単一の白血球アフェレーシスから単核細胞を単離し、１０％のＤＭＳＯ/２０％の自己血清で保存する。ＤＣワクチン接種の１週間前に細胞を解凍し、ＰＢＳで１回洗浄し、２-４×１０７細胞/25cm2Costerフラスコで、２．５-５×１０６生細胞/ml（ＲＰＭＩ１６４０＋５％熱欠活自己血清）の濃度に撒く。３７度で２時間付着させた後、付着しなかった細胞をＰＢＳで洗浄して穏やかに取り除く。付着細胞をｒｈＧＭ-ＣＳＦ（800U/ml）及びｒｈＩＬ-４（500U/ml）の存在下で７日間、完全培地で培養する。臨床グレードのＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４はSchering-Ploughによりの提供される。
ＡｄＶｈＡＦＰは、ヒトＡＦＰ ｃＤＮＡがＣＭＶエンハンサー/プロモーターにより制御されるＥ１-欠損非増殖型５アデノウィルスベクターである。それぞれの最終ウィルス生産ロットのウィルス価は、ゲノムＤＮＡ定量と感染価の両方に基づいて得られる。ウィルス粒子と生物活性ウィルスの生成率が１００：１未満のとき、条件を満たしていると判断する。
続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水溶液で１回洗浄して、1mLの２％自己血清ＲＰＭＩ１６４０に１０６-１０７の濃度及び１０９−１０１０pfu/mlのＡｄＶｈＡＦＰ（感染効率＝１０００：１）で再懸濁する。３７℃でのインキュベーションの２時間後に、ＡｄＶｈＡＦＰ/ＤＣをＲＰＭＩ-１６４０＋５％自己血清に再懸濁して吸収されなかったアデノウィルスベクターを不活性化し、次いでペレット化し、無菌生理食塩水で３回洗浄する。細胞をトリパンブルーで数え、適した数（患者のグループに応じて１×１０５〜１×１０８）を皮内注射のために無菌食塩水に再懸濁する。
患者は腋又は鼠径部の下付近に、0.1mlの標準生理食塩水中の皮内注射されるＡｄＶｈＡＦＰ導入ＤＣを投与される。免疫化後２時間、患者を監視する。好ましくは、患者は、50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも経口的に前処置される。
本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に議論したが、他の実施態様も可能である。従って、添付の請求の範囲の範囲は、本明細書中に含まれる好ましい実施態様の記載に制限されるべきではない。
【配列表】
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