(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L−アミノ酸を生産する能力を有し、該L−アミノ酸を唯一の窒素源として３ｍｇ／ｍｌ含有する合成培地では生育できないエシェリヒア・コリH−9244 THN−１株（FERM BP-5985）。
【請求項２】
L―アミノ酸を生産する能力を有し、該L―アミノ酸を唯一の窒素源として３ｍｇ／ｍｌ含有する合成培地では生育のできないエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にL―アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物より該L―アミノ酸を採取することを特徴とするL―アミノ酸の製造法。
【請求項３】
L―アミノ酸がL―スレオニンである、請求項２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、医薬品、食品および飼料添加物などに用いられている。
【０００２】
【従来の技術】
糖から直接Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させる直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アースロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変異株を用いる方法が知られている。例えばＬ−アミノ酸生産性変異株としては、アミノ酸等の栄養要求性を有した菌株（特公昭５６-１００３７）、アミノ酸のアナログやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特開昭５６-１３４９９３、特開昭６２-４４１９３）、栄養要求性変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特開昭５０-３１０９３、特開昭５６-１３４９９３）、分解能の低下した菌株（特開昭６３-２７３４８７、特公昭５２-４８１９５）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株（特開平４-３３０２７５）等が知られている。さらにアミノ酸の生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された菌株（特開昭５８-８９３、特開昭６０-１２９９５、特開昭６０-３０６９３、特開昭６１-１９５６９５、特開平２-４５８、特開平２-４２９８８）も知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、Ｌ−アミノ酸の医薬、食品、飼料等への需要の増大によって、益々その製造法の改善が望まれている。従って、本発明の目的は、医薬品、食品および飼料添加物等として有用なＬ−アミノ酸の工業的に効率のよい製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微生物、および該微生物を栄養培地に培養し、培養物中に該Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法を提供することができる。
【０００５】
一般に微生物は、Ｌ−アミノ酸からアンモニアを遊離させる酵素としてＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドラターゼ等を、またＬ−アミノ酸からアンモニアを転移させる酵素としてＬ−アミノ酸トランスアミナーゼ等を有しているため、Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として含む合成培地で生育可能であり、５ｍｇ／ｍｌ以下の低濃度の窒素源でも生育することができる。
【０００６】
本発明の微生物として、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微生物であればいずれも用いることができ、例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属およびアースロバクター属から選ばれる属に属する微生物であり、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微生物をあげることができる。具体的には、エシェリヒア・コリH-9244 THN-1株をあげることができる。
【０００７】
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物に通常の変異処理、あるいは細胞融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法を施し、５ｍｇ／ｍｌ以下の少量のＬ−アミノ酸を唯一の窒素源とする合成培地では生育できない微生物を選択することにより取得することができる。
本発明の微生物は、さらに、Ｌ−アミノ酸生産性を向上させる他の性質（例えば、栄養要求性変異、薬剤耐性、薬剤感受性等）を合わせ持っていても良い。
【０００８】
合成培地として、本発明の微生物が栄養要求性を持たない場合には最少培地を、栄養要求性を持つ場合には該最少培地に栄養要求物質を添加した培地を合成培地として用いることができる。
本発明の微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産は、通常の細菌培養法にて実施することができる。
【０００９】
Ｌ−アミノ酸の生産に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなどのアルコールなどが用いられる。
【００１０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられる。
【００１１】
培養は、振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨはｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中にＬ−アミノ酸が生成蓄積する。
【００１２】
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例】
【００１４】
実施例１  Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微生物の取得
ジアミノピメリン酸に対する栄養要求性を有するエシェリヒア・コリＨ−４５８１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４１１）より誘導したジアミノピメリン酸非要求株Ｈ−７７００に、常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる変異処理（０．２ｍｇ／ｍｌ、３０℃、３０分間）を施した後、合成寒天平板培地〔グルコース ０．５％、リン酸一カリウム ０．３％、リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸マグネシウム ０．０１％、塩化アンモニウム ０．２％、塩化カルシウム ２０ｍｇ／ｌ、栄養要求物質（ＤＬ−メチオニン）２０ｍｇ／ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２〕に塗布した。
【００１５】
３０℃で２〜６日間培養し、生育してきたコロニー約１０4個を釣菌分離し、上記合成培地中の塩化アンモニウムの代わりにＬ−スレオニンを唯一の窒素源として１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した合成寒天培地上にそれぞれレプリカした。
３０℃で２日培養し、前者の培地上では生育できないが後者の培地上では生育する株を約３０株取得した。
【００１６】
これら菌株について、実施例３と同様な方法によりＬ−スレオニンの生産試験を行った。
特にＬ−スレオニンの生産性の向上した株をエシェリヒア・コリH-9244 THN-1と命名した。
該H-9244 THN-1株はブダペスト条約に基づいて平成９年６月１９日付けで、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９８５として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１７】
実施例２  Ｌ−スレオニンを唯一の窒素源とする合成寒天平板培地での生育比較試験
実施例１で取得した変異株H-9244 THN-1について、Ｌ−スレオニンを唯一の窒素源とする合成寒天平板培地での生育度を親株Ｈ−７７００と比較した。
窒素源としてＬ−スレオニンを１〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、かつ要求アミノ酸であるＤＬ−メチオニンを２０ｍｇ／ｌ添加した合成寒天平板培地上に、天然培地で２４時間培養した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2になるように塗布し、３３℃、４日間培養した。
【００１８】
該培養により培地上に出現したコロニーの大きさを第１表に示した。
Ｈ−７７００株は窒素源が存在するいずれの培地上で生育可能であったが、H-9244 THN-1株はＬ−スレオニンを唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度を含む合成寒天培地上では全く生育できなかった。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
実施例３  Ｌ−スレオニンの製造
実施例１で取得した変異株H-9244 THN-1または親株Ｈ−７７００を用いたＬ−スレオニンの製造を以下の方法で行った。
H-9244 THN-1またはＨ−７７００株をそれぞれ６ｍｌの種培地（グルコース ２％、ペプトン １％、酵母エキス １％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＤＬ−メチオニン １３０ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で１６時間振盪培養した。
【００２１】
得られた種培養液０．１ｍｌを、それぞれ５ｍｌの生産培地（グルコース ６％、コーンスチープリカー ０．２％、硫酸アンモニウム １．６％、リン酸一カリウム ０．１％、ＤＬ−メチオニン １００ｍｇ／ｌ、リン酸マグネシウム ４％、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００２２】
培養後、培養液中のＬ−スレオニンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
結果を第２表に示した。
親株Ｈ−７７００に比べ、H-9244 THN-1株のＬ−スレオニン生産性は著しく向上していた。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させることができ、これによりＬ−アミノ酸を工業的に効率よく製造できる。