(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫に対する毒素活性を有する蛋白質をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件の下で、配列番号：11，32，36，38，41及び43からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補体とハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項３】
昆虫に対する毒素活性を有し、かつ配列番号：11，32，36，38，41及び43からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有する、単離された蛋白質。
【請求項４】
NRRL B-21553と同一の特徴を有するPS149B1；およびNRRL B-21554と同一の特徴を有するPS167H2からなる群より選択されるバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株、ならびに殺虫活性を保持しているそれらの変異株の、生物学的に純粋な培養株。
【請求項５】
核酸配列が、配列番号：44及び45からなる群より選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：32，36及び41からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補体とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質と昆虫とを接触させる段階を含む、昆虫を制御するための方法。
【請求項７】
配列番号：11，38及び43からなる群より選択される第２のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２のポリヌクレオチドによってコードされる第２の蛋白質と昆虫とを接触させる段階をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のポリヌクレオチドを含む、微生物細胞または植物細胞。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は、１９９６年４月１９日に提出された出願第08/633,993号の一部係属出願である。
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)(B.t.)は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子型(parasporal)の結晶蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で観察することができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離されて配列が決定されており、組換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である(ガートナー(Gaertner), F.H., L.キム(Kim)[1988]TIBTECH 6:S4〜S7)。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。
10年前まで、B.t農薬の商業的な利用は、鱗翅目(毛虫)の害虫に対してだけという、狭い範囲に非常に制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ変異株(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目(毛虫)用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変異株(B.thuringiensis var. kurstaki HD-1)は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示す結晶性δ内毒素を産生する。
しかし、近年になって、研究者らは、はるかに広範囲の害虫に特異性を有するB.t農薬を発見した。例えば、別のB.t.株、すなわちイスラエレンシス株(israelensis)およびテネブリオニス株(tenebrionis)(B.t. M-7、B.t.サンディエゴ(san diego)としても知られている)が、それぞれ、双翅目および鞘翅目の昆虫を抑制するために商業的に用いられている(ガートナー,F.H.(Gaertner)[1989],作物保護因子の制御輸送(Controlled Delivery of Crop Protection Agents)における「殺虫性蛋白質の細胞内輸送システム：生微生物および死微生物(Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms)」, R.M. Wilkins編、TaylorおよびFrancis、New York and London, 1990, 245〜255頁)。また、カウチ(Couch, T.L.)(1980)「バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス変種の蚊に対する病原性(Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis)」Developments in Industrial Microbiology 22:61〜76；およびビーグル(Beegle C.C.)(1978)「農業生態系における昆虫産生性細菌の使用(Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems)」Developments in Industrial Microbiology 20:97〜104を参照のこと。クリーグ(Krieg A.)、ヒューガー(Huger, G.A.)、ランゲンブルーフ(Langenbruch, W.)、シュネッター(Schunetter)(1983)は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変異株(Bacillus thuringiensis var. tenebrionis)が鞘翅目の２種の甲虫に対して有効であると記述している(Z. ang. Ent. 96:500〜508)。これらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ(Leptinotarsa decemlineata)および甲虫アゲラスチカ・アルニ(Agelastica alni)である。
最近、B.t.の新しい亜種が同定され、活性δ内毒素蛋白質をコードする遺伝子が単離された(ヘフテ(Hofte H.)およびウィトリー(H.R. Whiteley)[1989]Microbiological Reviews 52(2):242〜255)。ヘフテ(Hofte)およびウィトリー(Whiteley)は、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI(鱗翅目特異的)、CryII(鱗翅目および双翅目特異的)、CryIII(鞘翅目特異的)、およびCryIV(双翅目特異的)である。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている(フェイテルソン(Feitelson J.S.)、ペイネ(J. Payne)、キム(L. Kim)[1992]Bio/Technology 10:271〜275)。
B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている(シュネフ(Schnepf H.E.)およびウィトリー(H.R.Whiteley)[1981]Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893〜2897)。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現について開示している。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号には、さまざまな環境で鞘翅目害虫を抑制するために用いることができるB.チューリンギエンシス(B. thuringiensis)のテネブリオニス株(tenebrionis)(M-7、B.t.サンディエゴ(san diego)としても知られている)が開示されている。米国特許第4,918,006号には、双翅目害虫に対して活性を有するB.t.毒素が開示されている。米国特許第4,849,217号には、アルファルファ・ゾウムシ(alfalfa weevil)に対して活性を有するB.t.菌株が開示されている。米国特許第5,208,077号には鞘翅目に活性なバチルス・チューリンギエンシス株が開示されている。米国特許第5,151,363号および米国特許第4,948,734号には、線虫に対する活性を有するある種のB.t.菌株が開示されている。多くの研究および資源の投入の結果、新しいB.t.菌株およびB.t.菌株の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB.t.菌株の発見および既知のB.t.菌株の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術のままである。
鞘翅目は、毎年非常に大規模な損害をもたらす農業害虫の重要な群である。鞘翅目害虫の例として、アルファルファ・ゾウムシおよびトウモロコシ・ルートワームが含まれる。
アルファルファゾウムシ、ヒペラ・ポステイカ(Hypera postica)と、その近縁種であるエジプトアルファルファゾウムシ、ヒペラ・ブルネイペニス(Hyperabrunneipennis)は、米国で栽培されているアルファルファの最も重要な昆虫害虫であり、1984年には290万エーカーが食害された。エジプトアルファルファゾウムシは、米国南西部において優勢な種で、暑い夏期には何カ月間か夏眠する(つまり、休眠状態になる)。これ以外の点ではすべて、米国の残りの地域で優性なアルファルファゾウムシと同じである。
ゾウムシの生活環の中では、幼虫期が最も有害である。幼虫は、アルファルファの成長している葉先を食害して、葉を穴だらけにして成長を阻害し、植物体が大きくなるのを阻害するため、最終的には、収量を低下させる。ひどく蔓延すると、干し草の刈り取りが全くなくなってしまう。成虫も葉を食害するため、被害を大きくはするが、それほど重要ではない。
およそ930万エーカーにわたる米国のトウモロコシが、毎年、トウモロコシのルートワーム(根を食べる昆虫)の複合種による食害を受けている。トウモロコシのルートワーム複合種には、北部トウモロコシルートワーム、ディアブロティカ・バルベリ(Diabrotica barberi)、南部トウモロコシルートワーム、D.ウンデシンプンクタータ・ホワルデイ(D. undecimpunctata howardi)、および西部トウモロコシルートワーム、D. ビルギフェラ・ビルギフェラ(D. virgifera virgifera)が含まれる。これらのディアブロティカ(Diabrotica)属の種に属する土壌棲息幼虫は、トウモロコシの根を食害するため、倒伏の原因となる。倒伏は、結果的には、トウモロコシの収量を減らし、しばしば、植物体の枯死をもたらす。トウモロコシの毛を餌にすることで、成虫の甲虫は、受粉を減らすため、植物体当りのトウモロコシの収量に有害な効果を与える。さらに、ディアブロティカ属の成虫と幼虫は、商業的な、ウリ科(キュウリ、メロン、カボチャ、その他)作物、多くの野菜作物、および農業作物、また、家庭菜園で生育している作物を攻撃する。
トウモロコシルートワームの防除は、一部、作物の輪作、および、高い窒素レベルを施用して不定根系の成長を促すなどという、栽培法によって行われている。しかし、化学殺虫剤が、最も確実に、望ましい制御レベルを保証するものとして信頼されている。殺虫剤は、土の上に帯状に撒くか、土の中に混ぜ込む。化学殺虫剤の使用に伴う主要な問題は、殺虫剤処理した昆虫集団の中に抵抗性が生じるということである。
発明の概要
本発明は、哺乳動物でない病害生物を防除するための、新しい材料および方法に関する。好ましい態様において、本発明は、鞘翅目の病害生物を防除するための材料および方法に関する。特異的な態様において、本明細書において説明されている材料および方法は、アルファルファゾウムシ、および/またはトウモロコシルートワームを防除するために用いられる。
本発明は、対応する新しい種類の殺虫性蛋白質をコードする、2つの新しい種類のポリヌクレオチド配列を、有利性をもって提供する。本明細書において説明されている新しい種類のポリヌクレオチド配列の一つは、全長の分子量が40〜50kDaである毒素をコードしている。特異的な態様において、これらの毒素は、約43〜47kDaである。第二の種類のポリヌクレオチドは、約10〜15kDaの殺虫性蛋白質をコードしているが、これも、本発明によって提供されている。特異的な態様において、これらの毒素は、約13〜14kDaの分子量をもつ。本発明は、40〜50kDa、および10〜15kDaの毒素をコードするポリヌクレオチド、この全長毒素の殺虫性断片をコードするポリヌクレオチド、および、例えば、プロ毒素領域を含む、これらの毒素のより長い形態をコードするポリヌクレオチド配列に関する。好ましい態様において、これらの毒素は、その断片も含めて、鞘翅目の害虫に対して活性をもつ。
本発明によって有用になる、特異的なB.t.毒素には、PS80JJ1、PS149B1、およびPS167H2と名付けられたB.t.菌株から得た毒素が含まれる。これらのうち、PS149B1とPS167H2は、新規の菌株である。また、本発明には、特異的に例示されたB.t.菌株および毒素と実質的に同一の鞘翅目作用性特性をもつ、例示されたB.t.菌株および毒素の変異体を使用することも含まれる。このような変異菌株には、例えば、突然変異体が含まれる。突然変異体を作出する方法は、微生物学的技術分野において周知である。紫外線、および、ニトロソグアニジンなどの化学的変異原が、この目的のために広く用いられている。
本発明の態様の一つにおいて、本発明のポリヌクレオチド配列が、43〜47kDaの毒素をコードするために用いられる。そして、これらの毒素を用いて、鞘翅目害虫を防除する。特に好ましい態様において、鞘翅目害虫は、トウモロコシルートワームである。43〜47kDaの毒素をコードする遺伝子は、例えば、PS80JJ1、PS149B1、およびPS167H2から得ることができる。第二の態様において、約13〜14kDaの毒素を用いて、鞘翅目害虫を防除する。約13〜14kDaの毒素、および、これらの毒素をコードする遺伝子も、PS80JJ1、PS149B1、およびPS167H2から得ることができる。特に好ましい態様において、43〜47kDaの毒素の活性は、約13〜14kDaの毒素を標的害虫に接触させることで、増強、および/または促進される。
好ましい態様において、本発明は、形質転換された植物細胞が、標的害虫によって摂食される組織で殺虫性毒素を発現させるよう、本発明のポリヌクレオチド配列の少なくとも一つによって形質転換された植物細胞に関する。
または、本発明のB.t.菌株、本明細書において説明されている毒素を発現する組換え微生物を用いて、害虫を防除することもできる。この点に関して、本発明は、実質的に未処理のB.t.菌株、および/または、発現させた本発明の毒素を含む組換え細胞を、実質的に未処理の細胞を標的害虫のいる環境に施用した際に殺虫活性が持続するように処理することを含む。処理された細胞は、殺虫性毒素に対する保護コートとして作用する。この毒素は、標的害虫に摂食されることにより作用する。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の3つの特異的な43〜47kDaの殺虫性毒素と、これらの殺虫性毒素に関する保存配列を示している。
図2は、PS80JJ1の、14kDaの配列と45kDaの配列(配列番号：31および10)との関係を示している。
配列の簡単な説明
配列番号：1は、80JJ1の約45kDaの毒素の、N末端側にある5アミノ酸の配列である。
配列番号：2は、80JJ1の約45kDaの毒素の、N末端側にある25アミノ酸の配列である。
配列番号：3は、80JJ1の約14kDaの毒素の、N末端側にある24アミノ酸の配列である。
配列番号：4は、149B1に由来する約47kDaの毒素のN末端側の配列である。
配列番号：5は、PS149B1に由来する約14kDaの精製蛋白質の、N末端側50アミノ酸の配列である。
配列番号：6は、167H2に由来する約47kDaの毒素のN末端側の配列である。
配列番号：7は、PS167H2に由来する約14kDaの精製蛋白質の、N末端側25アミノ酸の配列である。
配列番号：8は、PS80JJ1の44.3kDaの毒素をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブで、本発明によって用いられるPS149B1とPS167H2に対する前側プライマーである。
配列番号：9は、本発明によって用いられるPS149B1とPS167H2に対する逆側プライマーである。
配列番号：10は、約45kDaのPS80JJ1毒素をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号：11は、約45kDaのPS80JJ1毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：12は、約44kDaのPS149B1毒素をコードする遺伝子の部分的な塩基配列である。
配列番号：13は、約44kDaのPS149B1毒素の部分的なアミノ酸配列である。
配列番号：14は、約44kDaのPS267H2毒素をコードする遺伝子の部分的な塩基配列である。
配列番号：15は、約44kDaのPS149B1毒素の部分的なアミノ酸配列である。
配列番号：16は、本発明によるプライマー設計で用いられたペプチド配列である。
配列番号：17は、本発明によるプライマー設計で用いられたペプチド配列である。
配列番号：18は、本発明によるプライマー設計で用いられたペプチド配列である。
配列番号：19は、本発明によるプライマー設計で用いられたペプチド配列である。
配列番号：20は、配列番号：16のペプチドに相当する塩基配列である。
配列番号：21は、配列番号：17のペプチドに相当する塩基配列である。
配列番号：22は、配列番号：18のペプチドに相当する塩基配列である。
配列番号：23は、配列番号：19のペプチドに相当する塩基配列である。
配列番号：24は、配列番号：22の逆向きの相補性に基づいた逆側プライマーである。
配列番号：25は、配列番号：23の逆向きの相補性に基づいた逆側プライマーである。
配列番号：26は、PS80JJ1の44.3kDaの毒素に基づいた前側プライマーである。
配列番号：27は、PS80JJ1の44.3kDaの毒素に基づいた逆側プライマーである。
配列番号：28は、本発明による、新しい種類の毒素を表す一般的な配列である。
配列番号：29は、本発明にしたがって用いられるオリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号：30は、14および45kDaの両方のPS80JJ1毒素の読み枠と、隣接する塩基配列を含む遺伝子座全体の塩基配列である。
配列番号：31は、PS80JJ1の14kDaの毒素の読み枠の塩基配列である。
配列番号：32は、PS80JJ1の14kDaの毒素の推定アミノ酸配列である。
配列番号：33は、本発明によって用いられる逆側のオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：34は、14および44kDaの両方のPS167H2毒素の読み枠と、隣接する塩基配列を含む遺伝子座全体の塩基配列である。
配列番号：35は、約14kDaのPS167H2毒素をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号：36は、約14kDaのPS167H2毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：37は、約44kDaのPS167H2毒素をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号：38は、約44kDaのPS167H2毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：39は、14および44kDaの両方のPS149B1毒素の読み枠と、隣接する塩基配列を含む遺伝子座全体の塩基配列である。
配列番号：40は、約14kDaのPS149B1毒素をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号：41は、約14kDaのPS149B1毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：42は、約44kDaのPS149B1毒素をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号：43は、約44kDaのPS149B1毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：44は、PS80JJ1の約14kDaの毒素をコードする、トウモロコシ用に最適化された遺伝子の塩基配列である。
配列番号：45は、PS80JJ1の約44kDaの毒素をコードする、トウモロコシ用に最適化された遺伝子の塩基配列である。
発明の詳細な開示
本発明は、新しい殺虫性毒素をコードする、2種類の新しいポリヌクレオチド配列に関する。一つの態様において、毒素は、約40〜50kDaの全長分子量をもつ。本明細書において例示されている特異的な態様において、これらの毒素は、約43〜47kDaの分子量をもつ。第二の態様において、殺虫性毒素は、約10〜15kDaの分子量をもつ。本明細書において例示されている特異的な態様において、これらの毒素は、約13〜14kDaの分子量をもつ。ある特別な毒素が、本明細書において例示されている。既知のアミノ酸配列をもつ毒素については、分子量も知られている。当業者は、ゲル電気泳動によって判定された、蛋白質の外見上の分子量が、本当の分子量とは異なることがあることを認識しているであろう。したがって、本明細書において、例えば、45kDaの蛋白質、または14kDaの蛋白質というのは、本当の分子量が多少異なっていても、おおよそ、その大きさの蛋白質を意味するものと考えられる。
本発明は、これらの種類の毒素をコードするポリヌクレオチド配列に関するだけでなく、毒素を発現させる組換え宿主を作出するために、これらのポリヌクレオチドを使用することに関する。さらなる局面において、本発明は、トウモロコシルートワームなどの鞘翅目を含む病害生物を非常に有効に防除するために、本発明の約40〜50kDaの毒素を、本発明の約10〜15kDaの毒素と一緒に組み合わせて使用することに関する。
本発明のさらなる局面は、2つの新規の菌株、および、これらの菌株から得ることのできる毒素ならびに遺伝子に関する。本発明の新規のB.t.菌株は、PS149B1およびPS167H2と名付けられている。
本明細書において提供されている新しい種類の毒素およびポリヌクレオチドの配列は、いくつかのパラメータにしたがって定義される。本明細書において説明されている毒素の重要な特徴の一つが、殺虫活性である。特異的な態様において、これらの毒素は、鞘翅目の害虫に対する活性を持つ。本発明の毒素と遺伝子は、さらに、それらのアミノ酸配列と塩基配列によって定義される。それぞれの新しい種類に含まれる分子の配列は、一定の例示された配列との相同性によって、また、一定の例示されたプローブ、およびプライマーにハイブリダイズする能力、または、それらによって増幅されうることによって、本明細書において定義されうる。本明細書において提供される毒素の種類を、一定の抗体との免疫反応性に基づいて、また、一般的な化学式との一致に基づいて同定することもできる。
本発明に係る3つの約45kDaの毒素の配列が、配列番号：11、43、および38として提供されている。本発明の好ましい態様において、この新しい種類の毒素は、配列番号：28として示されている一般的な配列と同じ配列をもつ。特異的な態様において、この種類の毒素は、図1に示されている保存配列と同じであろう。
好ましい態様において、本発明の毒素は、次の特徴の少なくとも一つを有する：
(a)該毒素が、ストリンジェントな条件下で、配列番号：2をコードするDNA、配列番号：４をコードするDNA、配列番号：6をコードするDNA、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：11をコードするDNA、配列番号：12、配列番号：13をコードするDNA、配列番号：14、配列番号：15をコードするDNA、配列番号：16をコードするDNA、配列番号：17をコードするDNA、配列番号：18をコードするDNA、配列番号：19をコードするDNA、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28の殺虫性部位をコードするDNA、配列番号：37、配列番号：38をコードするDNA、配列番号：42、および配列番号：43をコードするDNAからなる群より選択される塩基配列にハイブリダイズする塩基配列によってコードされている；
(b)該毒素が、NRRL B-18679と同一の特徴をもつPS80JJ1、NRRL B-21553と同一の特徴をもつPS149B1、およびNRRL B-21554と同一の特徴をもつPS167H2からなる群より選択されるバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株に由来する、約40〜50kDaの殺虫性毒素、または、その断片に対する抗体と免疫反応する；
(c)該毒素が、約495bpの断片を産生するためには、配列番号：20および24、約594bpの断片を産生するためには、配列番号：20および25、約471bpの断片を産生するためには、配列番号：21および24、および、約580bpの断片を産生するためには、配列番号：21および25からなる群より選択されるプライマー対を用いたPCRによって、その塩基配列の一部が増幅されうる塩基配列によってコードされている；
(d)該毒素が、配列番号：28に示されているアミノ酸配列の殺虫性部位を含んでいる；
(e)該毒素が、配列番号：11、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：38、および配列番号：43からなる群より選択される、アミノ酸配列の殺虫性部位と、少なくとも約60％の相同性をもつアミノ酸配列を含んでいる；
(f)該毒素が、ストリンジェントな条件下で、配列番号：3をコードするDNA、配列番号：5をコードするDNA、配列番号：7をコードするDNA、配列番号：32をコードするDNA、配列番号：36をコードするDNA、および配列番号：41をコードするDNAからなる群より選択される塩基配列にハイブリダイズする塩基配列によってコードされている；
(g)該毒素が、NRRL B-18679と同一の特徴をもつPS80JJ1、NRRL B-21553と同一の特徴をもつPS149B1、およびNRRL B-21554と同一の特徴をもつPS167H2からなる群より選択されるバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株に由来する、約10〜15kDaの殺虫性毒素、または、その断片に対する抗体と免疫反応する；
(h)該毒素が、配列番号：29と配列番号：33のプライマー対を用いたPCRによって、その塩基配列の一部が増幅されうる塩基配列によってコードされている；また、
(i)該毒素が、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：32の殺虫性部位、配列番号：36の殺虫性部位、および配列番号：41の殺虫性部位からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約60％の相同性をもつアミノ酸配列を含んでいる。
本明細書で用いられるハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな」条件とは、本出願人らによって用いられた条件と、同一か、ほぼ同一のハイブリダイゼーション特異性をもたらす条件を意味する。特に、32P標識した遺伝子特異的プライマーによる、サザンブロット上に固定されたDNAへのハイブリダイゼーションを、標準的な方法で行った(Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook[1982]
分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。一般的に、PS80JJ1毒素遺伝子に相同性をもつ標的配列の検出を可能にするストリンジェンシー条件の下で、ハイブリダイゼーションと、その後の洗浄を行った。二本鎖DNA遺伝子プローブについては、6×SSPE、5×デンハルトの溶液、0.1％SDS、0.1mg/mlの変性DNAにおいて、DNAハイブリッドの融解温度(Tm)よりも20〜25℃低い温度で、一晩、ハイブリダイゼーションを行った。融点は、以下の式によって説明される(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, およびF.C. Kafatos[1983]酵素学の方法(Methods of Enzymology), R. Wu, L. GrossmanおよびK. Moldave[編],Academic Press, New York 100:266-285)。
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%ホルムアミド)-600/二本鎖の塩基長。
洗浄は、典型的には、以下のようにして行った。
(1)1×SSPE、0.1％SDS中、室温で15分間を2回(ストリンジェンシーの低い洗浄)。
(2)0.2×SSPE、0.1％SDS中、Tm-20℃で15分間を1回(ストリンジェンシーの緩い洗浄）。
オリゴヌクレオチドプローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶液、0.1％SDS、0.1mg/mlの変性DNA中で、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも10〜20℃低い温度で、一晩、ハイブリダイゼーションを行った。オリゴヌクレオチドプに関する融点は、以下の式によって決定された：
Tm(℃)＝2(T/A塩基対の数)+4(G/C塩基対の数)
(Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, およびR.B. Wallace[1981]ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes(精製した遺伝子を用いた発生生物学ICN-UCLAシンポジウム), D.D. Brown[編], Academic Press, New York, 23:683-693)。
洗浄は、典型的には、以下のようにして行った。
(1)1×SSPE、0.1％SDS中、室温で15分間を2回(ストリンジェンシーの低い洗浄)。
(2)0.2×SSPE、0.1％SDS中、ハイブリダイゼーション温度で15分間を1回(ストリンジェンシーの緩い洗浄)。
本明細書で提供される開示から、当業者は、本明細書において説明されている、新規分類のさまざまな毒素およびポリヌクレオチド配列を作出し、用いることができると考えられる。
本発明に係る有用な微生物は、米国イリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許培養株コレクション(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(NRRL)の永久コレクションに寄託されている。寄託菌株の培養株寄託番号は、以下の通りである：
0003948682.tif 000002
PS80JJ1菌株は、米国特許第5,151,363号の発布によって、一般に入手可能になる。
B.t.単離株PS149B1およびPS167H2は、特許庁長官によって、37 CFR 1.14および35 U.S.C. 122により権利付与されるべきと決定された者に対して、この特許申請が係属する期間、培養菌の入手が可能なことが保証されている条件の下で寄託されている。本特許申請に相当する申請あるいはその継続申請が提出されている外国の特許法で要求されているところにしたがい、寄託菌を入手することが可能である。しかし、寄託菌を入手できることが、行政行為によって付与された特許権を逸脱して、本発明を実施する許可を与えるものではないことを理解さるべきである。
さらに、本寄託培養物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項、すなわち、寄託された試料の供給の請求が最後になされてから5年間以上、またいずれの場合も寄託された日付から30年間以上、あるいは、培養物の開示を行いうる特許の実施期間中は、汚染されることなく生存を図るために必要な注意をできる限り払って貯蔵されるべきであるという条項に従って、貯蔵され、一般に入手可能な状態に置かれる。寄託者は、寄託物の条件が原因で、請求があっても受託者が試料を供給できないときには、寄託物を交換する義務があることを承認している。本寄託培養物を一般的に利用することに対するあらゆる制約は、それらを開示する特許の認可によって、取り消されることなく解除される。
次の表は、本発明に係る有用なあるB.t.菌株の特徴を示したものである。
0003948682.tif 000003
遺伝子および毒素
本発明に係る有用な遺伝子および毒素には、開示された全長配列だけでなく、本明細書で特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持している、これらの配列の断片、変種、変異体および融合蛋白質も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異体」または「変異」という用語は、同じ毒素をコードする、または同様の殺虫活性を有する同等の毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように、「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じか、本質的に同じ生物学的活性をもつ毒素を意味する。
いくつかの方法を用いて、活性毒素をコードする遺伝子を同定し得ることができることは、当業者には明らかであると思われる。本発明に係る有用な特定の遺伝子は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている菌株から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、Bal31のような酵素や部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すことができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。
等価的毒素、および/または、これらの等価的毒素をコードする遺伝子は、B.t.菌株および/またはDNAライブラリーから、本明細書によって提供される指示に従って得ることができる。本発明の殺虫毒素を得るために、多くの方法がある。例えば、本明細書において開示され、請求されている殺虫毒素に対する抗体を用いて、蛋白質の混合物の中から別の毒素を同定、分離することができる。特に、最も定常的で、他のB.t.毒素から最も異なった毒素部位に対して抗体を作製することができよう。そして、これらの抗体を用いて、免疫沈殿や酵素結合免疫測定法(ELISA)、あるいは、ウエスタン・ブロッティングによって、特徴的な活性をもつ等価的毒素を特異的に同定することができる。本明細書において開示される毒素、あるいは、等価的毒素、あるいは、これらの毒素の断片に対する抗体は、当業における標準的な手法を用いて容易に調製することができる。そして、これらの毒素をコードする遺伝子を微生物から得ることができる。
例示された毒素の殺虫効果を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまに異なったDNA配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有し、殺虫活性に実質的に影響しない配列を意味する。殺虫活性を保持する断片もまた、この定義に含まれる。
本発明の毒素および遺伝子を同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによる。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適正な標識によって検出することができるか、または、国際公開公報第93/16094号で説明されているような、生得的に蛍光発光するようになっているかもしれない。当技術分野において周知のように、プローブ分子と核酸標品とが、2つ分子の間で強い結合を形成してハイブリダイズすれば、このプローブと標品の間には実質的な相同性があると、合理性をもって推定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G.H., M.M. Manak(1987)DNA Probes(DNAプローブ),Stockton Press, New York, NY., 169.170頁で説明されているような、当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件下で行われる。プローブの検出により、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法が提供される。このようなプローブ解析は、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド部分は、標準的な方法により、DNA合成機を用いて合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。
本発明における一定の毒素が、本明細書において特に例示されてきた。これらの毒素は、本発明の毒素を例示したものにすぎないので、本発明には、例示されている毒素の殺虫活性と同じかまたは同様の活性を有する変異体毒素または等価的毒素(および等価的毒素をコードするヌクレオチド配列)が含まれることは明白であろう。等価的毒素は、例示されている毒素とアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、典型的には60％よりも高く、好ましくは75％よりも高く、より好ましくは80％よりも高く、さらに好ましくは90％よりも高く、95％より高くてもよい。生物学的活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性に関係する三次元構造の決定に関与する一定の重要な毒素領域では、アミノ酸の相同性が最も高い。この点に関し、活性に対して重要ではない領域に起きた置換であるか、分子の三次元構造に影響しないような保存的アミノ酸の置換である場合には、一定のアミノ酸置換は認められ、予想されうる。例えば、アミノ酸は、次のように分類できよう。すなわち、非極性、非荷電性、塩基性、および酸性。同じ分類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換によって化合物の生物学的活性が実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。表２に、それぞれの分類に属するアミノ酸の例を列挙する。
0003948682.tif 000004
場合によっては、非保存的な置換が行われることもある。重要な要素は、これらの置換によって、毒素の生物学的活性が有意に損なわれてはならないということである。
本発明の毒素は、また、上述したような毒素封入体の形状や局在位置によって特徴づけることもできる。
組換え宿主
本発明の菌株がもつ毒素をコードする遺伝子を、広範囲の微生物宿主や植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、殺虫因子が直接的または間接的に細胞内で産生され、維持される。例えば、シュードモナスなどの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に散布し、そこで増殖させ、摂取させることができる。その結果、害虫を制御できる。あるいは、毒素遺伝子をもつ微生物を、毒素活性を持続させ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理した細胞は、毒素活性を維持しているため、標的害虫の周囲に散布することができる。
B.t.毒素遺伝子を適当なベクターによって微生物宿主に導入し、該宿主を生きたままの状態で周囲に散布するには、特定の宿主微生物を用いることが必須である。微生物宿主は、関心のある一つまたは複数の作物の「植物の領域(phytosphere)」(葉緑素の平面(phylloplane)、葉緑素の領域(phyllosphere)、根の領域(rhizosphere)、および／または根の平面(rhizoplane))を占拠することが知られているものから選択される。これらの微生物は、特定の環境(作物および他の昆虫の生息地)において、野生型の微生物とうまく競合でき、ポリペプチド殺虫因子を発現する遺伝子の安定した維持と発現を提供し、そして、望ましくは、周囲の環境の作用による分解および不活化から殺虫因子をよりよく保護できるように選択される。
多数の微生物が、植物の平面(植物の葉の表面)および／または根の領域(植物の根の周りの土壌)に生息していることが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および菌類が含まれる。特に興味深い微生物は、例えば、シュードモナス(Pseudomomas)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、キサントモナス(Xanthomonas)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、メチロフィリウス(Methylophilius)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アセトバクター(Acetobacter)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、およびアルカリジェネス(Alcaligenes)属の細菌、また、例えば、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、スポロボロミセス(Sporobolomyces)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、およびオウレオバシディウム(Aureobasidium)属の菌類、特に酵母である。特に興味深い細菌の種は、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas Syringae)、シュードモナス・フローレセンス(Pseudomonas Fluorescens)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、ロドシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アルカリジェネス・エントロファス(Alcaligenes entrophus)、およびアゾトバクター・ビンランディ(Azotobacter vinlandii)であり、植物に生息する(phytosphere)酵母の種は、ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R. glutinis)、R.マリナ(R. marina)、R.アウランチアカ(R. aurantiaca)、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、C.ディフルエンス(C. diffluens)、C.ラウレンティ(C. laurentii)、サッカロミセス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、S.プレトリエンシス(S. pretoriensis)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス・ロセウス(Sporobolomyces roseus)、S.オドラス(S. odorus)、クルイベロミセス・ベロネ(Kluyveromyces veronae)、およびアウレオバシディウム・ポルランス(Aureobasidium pollulans)である。特に重要なのは、色素性細菌である。
遺伝子の維持と発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。
当業者に既知のさまざまな方法によって、本発明の菌株、毒素、および遺伝子を用いて、トウモロコシ・ルートワームを含む鞘翅目昆虫の制御を行うことができる。これらの方法には、例えば、B.t.菌株を害虫(またはそれらの棲息場所)に施用すること、組換え微生物を害虫(またはそれらの棲息場所)に施用すること、および本発明の殺虫性毒素をコードする遺伝子によって植物を形質転換することが含まれる。組換え微生物は、例えば、B.t.、大腸菌、またはシュードモナス菌でありうる。形質転換は、当業者であれば標準的な技術を用いて行うことができる。これらの形質転換に必要な材料は、本明細書に開示されているか、または当業者には容易に入手できるものである。
本発明の毒素と機能的に同等の合成遺伝子を用いて宿主を形質転換することもできる。合成遺伝子の作成法は、例えば、米国特許第5,380,831号に記載されている。
標準的な技術を、本明細書において提供されている教示と組み合わせて用いれば、鱗翅目や、その他の昆虫、線虫、およびダニのような、その他の病害生物の防除も行うことができる。
細胞の処理
上述したように、毒素活性の持続期間を延ばし、細胞を安定化させるために、B.t.あるいはB.t.毒素を発現する組換え細胞を処理することができる。生成される殺虫因子の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素を含む。細胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の周囲に散布されたとき毒素を保護する。適当な宿主細胞には原核生物も真核生物も含まれるが、通常、哺乳類などの高等生物に毒性がある物質を産生しない細胞に制限される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または適用されるレベルが非常に低いため哺乳類宿主に対して毒性をもつ可能性がない場合には、高等生物に毒性がある物質を産生する生物が用いられることもある。宿主として、特に重要なのは原核生物、および菌類のような下等真核生物である。
処理を行うとき、場合によっては胞子が用いられることもあるが、細胞は通常、完全な状態の、胞子状態ではなく実質的に増殖形態にある細胞である。
例えば、B.t.毒素遺伝子を含む微生物などの微生物細胞の処理は、毒素の性質を損なうような効果を与えたり、毒素を保護する細胞の能力を失わせたりしない限り、化学的方法、物理的方法、または、化学的および/または物理的方法を組み合わせた方法により行うことができる。化学薬品の例はハロゲン化試薬で、特に原子番号17〜80のハロゲンである。より特定すると、ヨウ素を用いると、穏やかな条件の下で十分な時間をかければ、所期の結果を得ることができる。他の適当な技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、塩化ゼフィラン、塩化セルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール類、ルゴールヨウ素、ブワン固定液、さまざまな酸、ヘリー固定液(Helly's fixatives)などの様々な組織固定剤(Humason, Gretchen L.、Animal Tissue Techniques,W.H. Freeman and Company, 1967)、または細胞が宿主動物に投与されたとき細胞で産生される毒素の活性を保護し活性を引き延ばす、物理的(熱による)薬剤と化学薬剤との組み合わせなどがある。物理的方法の例としては、ガンマ線照射およびX線照射などの短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理に関する方法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは本明細書に参照として包含される。
一般的に、細胞は、環境条件に対する抵抗性を強めるように、構造的な安定性を強化できる。殺虫因子は前駆体で存在しているため、処理方法は、標的病原害虫によって前駆体がプロセシングされて、成熟した殺虫因子の形態になるのを阻害しないようなものを選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、蛋白質を架橋してしまうために、ポリペプチド殺虫因子前駆体のプロセシングを阻害する可能性がある。細胞の処理方法は、少なくとも毒素の生物学的利用能または生物活性の実質的な部位を保持するものでなければならない。
宿主細胞を作出するという目的で宿主を選択するに当たって、特に重要な特性には、宿主へのB.t.遺伝子導入の容易性、発現系の利用可能性、発現効率、宿主中での殺虫因子の安定性、および補助的な遺伝的因子の存在が含まれる。殺虫用微小カプセルとして用いられるための重要な特性には、厚い細胞壁、色素形成、細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫因子を保護する特質、水中環境でも生存すること、哺乳類に対する毒性がないこと、害虫が摂食に誘引されること、毒素を損なうことなく殺しやすく固定しやすいことなどが含まれる。他の考慮すべき事項には、処方および取り扱いの容易性、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
細胞の増殖
実質的にすべて、あるいは、すべての細胞がB.t.遺伝子を持つように選択する培地に備えて、B.t.殺虫因子遺伝子をもつ細胞宿主は、DNA構築物が選択上の利点をもつ、いかなる都合の良い栄養培地で増殖させてもよい。次に、これらの細胞を従来の方法に従って回収する。または、回収前に細胞を処理してもよい。
本発明のB.t.細胞は、標準的な人工培地と発酵技術を用いて培養することができる。発酵過程が終了したら、当業において周知の方法によって、まず発酵用培地からB.t.胞子と結晶を分離して回収することができる。回収されたB.t.胞子と結晶は、取り扱いやすく、また、特定の標的害虫に対して施用しやすくするために、界面活性剤や分散剤、不活性担体、あるいは、他の成分を加えて、可溶性の粉末、濃縮液、顆粒、あるいは、他の処方剤に処方することができる。これらの製剤および施用手順は、当技術分野において周知である。
処方剤  誘引剤、およびB.t.菌株の胞子ならびに結晶を含むか、または、本明細書において開示されているB.t.菌株から得ることができる遺伝子を含む微生物を含む、処方された餌用顆粒を土壌に施用することができる。種子コートもしくは根の処理剤、または、作物周期のもっと後の段階で、全植物体の処理剤として処方された産物を施用することもできる。B.t.細胞の植物および土壌処理剤は、無機物(フィロケイ酸(pyllosilicates)、炭酸、硫酸、リン酸など)、または、植物性物質(粉末化したトウモロコシの穂軸、イネの籾殻、クルミの殻など)のさまざまな不活性物質と混合することによって、可溶性粉末、顆粒、または粉剤として使用することができる。処方剤には、展着補助剤、安定化剤、その他の殺虫添加剤、または界面剤が含まれる。液体処方剤は、水性でも非水性でもよく、泡沫、ゲル、懸濁液、乳化可能な濃縮液などとして用いることができる。成分として、流動剤、界面剤、乳化剤、拡散剤、またはポリマーを含むことができる。
当業者にはよく認識されているように、殺虫効果がある濃度は、それぞれの処方の性質によって大きく異なり、特に、濃縮して用いるか、直接用いるかによって異なる。殺虫因子は、重量にして1％以上であるが、重量にして100％のこともある。乾燥処方剤では、殺虫因子が重量にして約1〜95％あるが、液体処方剤では、一般的に、水相中の固体の重量で1〜60％である。処方剤は、一般的に、約102から約104細胞数/mgである。これらの処方剤を、１ヘクタール当たり約50mg(液体か乾燥重で)から1kg以上散布する。
処方剤は、害虫の環境、例えば、土壌および葉に噴霧、空中散布、液体散布などによって適用することができる。
変異体  当業において周知の方法によって、本発明における菌株から変異体を作成できる。例えば、ある菌株をエチルメタンスルホン酸(EMS)突然変異誘発させることによって、胞子を形成しない変異体を得ることができる。当業において周知の方法によって、紫外光やニトロソグアニジンを用いて変異体を作出できる。
胞子無形成変異体の一部は、発酵期間を延長してもそのままで、溶菌しないため、これらの菌を非溶菌(-)と命名した。非溶菌系統は、振とうフラスコ培地で胞子無形成変異体をスクリーニングし、発酵が終わっても、そのままで、毒素結晶を含む変異体を選抜して同定することができる。非溶菌系は、保護された被包性毒素蛋白質を取り出すための細胞処理を行うのに適している。
この胞子無形成変異体のファージ抵抗性変異体を調製するために、等量のファージ溶解液を栄養寒天培地に塗布して乾かす。そして、ファージ感受性菌系を、このファージ溶解液を乾燥させた培地に直接塗布して乾燥させる。このプレートを30℃でインキュベートする。プレートを2日間インキュベートすると、多くのコロニーが寒天培地上で増殖しているのが見える。これらのコロニーのいくつかを選んで、栄養寒天培地上で継代培養する。これら外見上の抵抗性培養菌を、ファージ溶解液と交互に塗布して、抵抗性を検査する。ファージ溶解液を培地上に一直線に塗布して乾かす。そして、抵抗性培養菌をファージの線に交差するように塗布する。抵抗性の培養菌は、30℃で一晩インキュベートした後もファージの線を交差したいずれの部分でも溶菌を示さない。さらに、栄養寒天培地上に抵抗性の培養菌を一面に撒いて、ファージ抵抗性を再確認する。感受性系統も同じように撒菌して、ポジティブ・コントロールとして用いる。乾かした後、プレートの中央にファージ溶液を一滴撒いて乾かす。抵抗性培養菌は、30℃で24時間インキュベートした後も、ファージ溶解液を撒いたところで溶菌を示さない。
以下は、本発明を実施するための実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。
実施例１−本発明のB.t.菌株の培養
B.t.菌株またはその変異体の二次培養は以下の培地、ペプトン、グルコース、塩からなる培地に植えついで行うことができる。
0003948682.tif 000005
塩溶液およびCaCl2溶液は濾過滅菌し、接種する際にオートクレーブし調製した培地に加える。フラスコは30℃、200rpmの回転振とう機で64時間培養する。
上記の手順は当技術分野において周知の手順により、大きな発酵槽へ容易に拡大することができる。
上記発酵槽で得られたB.t.胞子および／または結晶は、当技術分野において周知の手順により単離することができる。一つのよく用いられる手順は、回収した発酵槽の培地を遠心分離などの分離技術に供するものである。
実施例２−45kDaの80JJ1蛋白質に関する蛋白質精製
80JJ1の凍結乾燥粉末1グラムを、80mMのTris-Cl pH8.5、5mMのEDTA、100μMのPMSF、0.5μg/mlのロイペプチン、0.7μg/mlのペプスタチン、および40μg/mlのベスタチンを含む40mlの緩衝液に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、その結果できた上清を捨てた。各洗浄毎に35〜40mlの上記の緩衝液を用いて、ペレットを5回洗浄した。洗浄したペレットを、10mlの40％NaBr、5mMのEDTA、100μMのPMSF、0.5μg/mlのロイペプチン、0.7μg/mlのペプスタチン、および40μg/mlのベスタチンに再懸濁して、振とう台の上に75分間置いた。NaBr懸濁液を遠心分離して、上清を採って、上記の40％NaBr、5mMのEDTA、100μMのPMSF、0.5μg/mlのロイペプチン、0.7μg/mlのペプスタチン、および40μg/mlのベスタチンで、ペレットを二度目に処理をした。上清(40％NaBr可溶性)をまとめて、10mMのCAPS pH10.0、1mMのEDTAに対し、4℃で透析した。透析した抽出液を遠心分離して、その結果できた上清を取り除いた。ペレット(40％NaBr透析ペレット)を、5mlのH2Oに懸濁して遠心分離した。この結果できた上清を取り除いた。洗浄したペレットを、上記のようにして、10mlのH2Oに懸濁し、遠心分離して、2回目に洗浄した。洗浄したペレットを1.5mlのH2Oに懸濁して、SDS-PAGEを用いて解析すると、主に、約47kDa、45kDa、および15kDaの分子量をもつ3つのペプチドを含んでいた。精製のこの段階では、懸濁された40％NaBr透析ペレットは、ローリー・アッセイ法によると、約21mg/mlの蛋白質を含んでいた。
15％アクリルアミドゲル中のSDS-PAGE(Laemlli, U.K.[1970]Nature 227:680)を用いて、ペレット懸濁液中のペプチドを分離した。次に、分離した蛋白質を、10Vの定常電圧で、10mMのCAPS pH11.0、10％MeOH中で電気泳動して、PVDF膜(ミリポア社(Millipore Corp.))にプロットした1時間後、PVDF膜を、簡単に水で濯いでから、0.25％クーマシーブルーR-250、50％メタノール、5％酢酸の中に3分間置いた。染色した膜を、40％MeOH、5％酢酸で脱染した。脱染した膜を室温で風乾した(LeGendreら、[1989]微量配列決定のための蛋白質精製への実用的な手引き、P. Matsudaira編、Academic Press, New York, NY)。自動気相エドマン分解を用いて、この膜をシークエンシングした(Hunkapillar, M.W., R.M. Hewick, W.L. Dreyer, L.E.Hood[1983]Meth. Enzymol. 91:399)。
アミノ酸配列解析によって、45kDaのバンドのN末端側配列が以下のようであることが明らかになった：
0003948682.tif 000006
47kDaのバンドも解析して、N末端側アミノ酸配列が、配列番号：1と同じ5アミノ酸配列であることを決定した。このように、47kDaのペプチドと45kDaのペプチドのN末端側アミノ酸配列は同一であった。
このアミノ酸配列は、また、別の精製プロトコールを用いて、PS80JJ1の胞子/結晶粉末から得られた45kDaのペプチドから得られたアミノ酸配列にも一致しており、以下のN末端配列をもっている：
0003948682.tif 000007
実施例3-14kDaのPS80JJ1ペプチドの精製
47kDa、45kDa、および15kDaのペプチドを含む、白い透析懸濁液0.8ml(およそ21mg/ml)を、40％NaBrに溶解させて、さらに、0.5mlの100mM EDTAを加えた。約18時間後(一晩置いて)、白濁した懸濁液が得られた。これを遠心分離して、集めて捨てた。この上清を、セントリコン(Centricon)-30(アミコン社(Amicon Corporation))中で濃縮し、最終容量を約15mlとした。濾過した容量を、フィルター透析によって水で洗浄し、氷上でインキュベートすると、最後に乳白色の懸濁液になる。この懸濁液を遠心分離して、ペレットと上清を別々に保存した。そして、ペレットを1.0mlの水(約6mg/ml)に懸濁させた。このペレットは、SDS-PAGEによって解析すると、実質的に純粋な15kDaの蛋白質を含んでいた。
N末端側のアミノ酸配列を決定したところ、以下のとおりであった：
0003948682.tif 000008
実施例4-PS149B1の45kDaの蛋白質の蛋白質精製および特徴分析
P1ペレットを、湿重量あたり2倍量の脱イオン水に再懸濁し、これに、9倍容量の40％(w/w)臭化ナトリウム溶液を加えた。この操作、および、この後のすべての操作は、氷上、または4〜6℃で行った。30分後、この懸濁液を36倍量の冷水で希釈して、25,000×gで、30分間で遠心分離して、ペレットと上清にした。
この結果できたペレットを、1〜2倍容量の水に再懸濁し、20〜40％(w/w)臭化ナトリウム勾配に載せて、8,000×gで10分間で遠心分離した。約32％(w/w)臭化ナトリウムのところで層になったバンド(「含有物」またはINC)を回収して、6〜8kDaMWをカットオフする透析膜を用いて、水に対して一晩透析した。25,000×gで遠心分離して粒状の物質を回収し、水に再懸濁し、等分してから、ローリー法とSDS-PAGEによって、蛋白質に関するアッセイ法を行った。
生じた上清は、セントリコン(Centricon)-10濃縮装置を用いて、3倍から4倍に濃縮してから、6〜8kDa MWをカットオフする透析膜を用いて、水に対して一晩透析した。25,000×gで遠心分離して粒状の物質を回収し、水に再懸濁し、等分してから、ローリー法とSDS-PAGEによって、蛋白質に関するアッセイ法を行った。この分画をP1.P2と名付けた。
15％アクリルアミドゲル中のSDS-PAGE(Laem11i, U.K.、前記)を用いて、ペレット懸濁液中のペプチドを分離した。次に、分離した蛋白質を、100Vの定常電圧で、10mMのCAPS pH11.0、10％MeOH中で電気泳動して、PVDF膜(ミリポア社(Millipore Corp.))にブロットした。1時間後、PVDF膜を、簡単に水で濯いでから、0.25％クーマシーブルーR-250、50％メタノール、5％酢酸の中に3分間置いた。染色した膜を、40％MeOH、5％酢酸で脱染した。脱染した膜を室温で風乾した(LeGendreら、前記)。自動気相エドマン分解を用いて、この膜をシークエンシングした(Hunkapillarら、前記)。
蛋白質解析によって、47kDaと14kDaという分子量をもつ、2つの主要なポリペプチドがあることが示された。分子量は、既知の分子量をもつ標準ポリペプチドと対照して測定したものである。この処理法は、本当の分量を見積もったものに過ぎない。PS149B1からの47kDaのバンドは、PS80JJ1からの47kDaの蛋白質と区別できない状態で、SDS-PAGE上を移動した。同様に、PS149B1からの14kDaのバンドは、PS167H2およびPS80JJ1からの14kDaの蛋白質と区別できない状態で、SDS-PAGE上を移動した。クーマシー染色された物質のそれぞれ、25〜35％(47kDa)と35〜55％(15kDa)を占めると評価された、これら2つのポリペプチドとは別に、MWが、46kDa、130kDa、および70kDaと評価されたバンドを含む、微量のバンドがあるかもしれない。
蛋白質の解析によって、INC画分が、47kDaの分子量の単一のポリペプチドを含いでいることが示され、また、P1.P2画分が、14kDaの分子量の単一のポリペプチドを含んでいることが示された。これらのポリペプチドは、P1からの50％よりも多い収量で回収された。
PS149B1から精製した47kDaの蛋白質に関するN末端側のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000009
PS149B1から精製した14kDaの蛋白質に関するN末端側のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000010
実施例5-PS167H2の45kDaと14kDaの毒素に関するアミノ酸配列
PS167H2から精製した45kDaの蛋白質に関するN末端側のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000011
PS167H2から精製した14kDaの蛋白質に関するN末端側のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000012
これらのアミノ酸配列を、PS80JJ1の胞子/結晶粉末から得られた47kDaのペプチドに関して得られた、N末端配列(配列番号：1)をもつアミノ酸配列と比較することができ、また、N末端配列(配列番号：3)をもつアミノ酸配列と比較することができる。
明らかに、45〜47kDaの蛋白質は、非常によく相関しており、一つの遺伝子ファミリーを表しているのかもしれない。また、14kDaの蛋白質も、非常によく相関しており、別の遺伝子ファミリーを表しているのかもしれない。
実施例6−バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株PS80JJ1に由来する、新規のδ-内毒素遺伝子の分子クローニング、発現、およびDNA配列解析
600nmでの光学密度が1.0になるまで増殖させたバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)(B.t.)の細胞から、全細胞DNAを調製した。遠心分離によって細胞を沈殿させ、プロトプラスト緩衝液(0.3Mスクロース中20mg/mlのリゾチーム、25mM Tris-Cl[pH8.0]、25mM EDTA)に懸濁した。37℃で1時間インキュベートした後、凍結融解を2回繰り返してプロトプラストを破砕した。完全に破砕した液に、9倍容量の0.1M MaCl、0.1％SDS、0.1M Tris-Cl溶液を加えた。澄んだ破砕液を、フェノール：クロロフォルム(1:1)で2回抽出した。2倍容量のエタノールで核酸を沈殿させ、遠心分離によってペレット化した。このペレットをTE緩衝液に懸濁して、最終濃度が50μg/mlになるようRNaseを加えた。
37℃で1時間インキュベートした後、この溶液を、フェノール：クロロフォルム(1:1)とTE飽和クロロフォルムで1回ずつ抽出した。10分の1容量の3M NaOAcと2倍容量のエタノールを加えて、水相からDNAを沈殿させた。遠心分離によってDNAをペレット化し、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、TE緩衝液に再懸濁した。
N末端ペプチド配列データから、PS80JJ1の47kDaの毒素をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブを設計した。29塩基のオリゴヌクレオチドプローブの配列は、5'-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3'(配列番号：8)である。このオリゴヌクレオチドを、示された4つの位置で混合した。このプローブを32Pで放射性標識して、PS80JJ1の全細胞DNAをさまざまな制限酵素で消化したもののサザンブロットの、標準的条件下でのハイブリダイゼーションに用いた。配列番号：8の44.3kDaの毒素のオリゴヌクレオチドプローブに相同な配列を含むDNA制限酵素断片のサイズを示す、これらの実験からの代表的なオートラジオグラフィーのデータを表3に示す。
0003948682.tif 000013
これらの解析で同定されたDNA断片は、PS80JJ1の45kDaの毒素遺伝子の全部、または一部を含んでいる。表3のハイブリダイズするDNA断片のおおよそのサイズは、予想された通り、別の実験で用いられた、PS80JJ1の45kDaの毒素のサブ遺伝子プローブとハイブリダイズするPS80JJ1の断片の部分集合のサイズとよく一致する(表4を参照、下記)。
Sau3A1で部分消化したPS80JJ1のDNAから、遺伝子ライブラリーを構築した。部分制限酵素消化物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。サイズが9.3から23kbaのDNA断片を、ゲルから切り出し、ゲル切片から電気溶出し、エルチップ(Elutip)-Dイオン交換カラム(シュライヒャー・アンド・シュネル社Schleicher and Shuell,ニューハンプシャー州キーン)で精製し、エタノール沈殿によって回収した。Sau3A1挿入断片を、BamHIで消化したLambdaGem-11(プロメガ社(Promega)、ウィスコンシン州マディソン)の中にライゲーションした。組換えファージをパッケージして、大腸菌KW251細胞で培養した。上記のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションして、プラークをスクリーニングした。ハイブリダイズしたファージをプラーク精製し、これを用いて、標準的な手順(Maniatisら、前記)によってDNAを単離するために、大腸菌KW251細胞の液体培養に感染させた。
サザンブロット解析によって、組換えファージ菌株の一つが、PS80JJ1毒素遺伝子プローブにハイブリダイズする約4.8kbpのXbaI-SacIバンドを含むことが明らかになった。PS80JJ1毒素遺伝子に隣接するSacI部位は、ファージベクターのクローニング部位であるが、隣接するXbaI部位は、PS80JJ1挿入DNAの中に存在する。配列解析を行うために、このDNA制限酵素断片を、標準的な方法によって、pBluescript S/K(ストラタジーン社(Stratagene)、カリフォルニア州サンディエゴ)の中にサブクローニングした。この結果得られたプラスミドをpMYC2421と名付けた。このDNA挿入断片を、pHTBlueII(pBluescript S/K[ストラタジーン社(Stratagene)、カリフォルニア州ラホヤ]と、固有のB.t.プラスミドに由来する複製開始点[D.Lereclusら、(1989)FEMS Microbiology Letter 60:211〜218]を含む大腸菌/B.チューリンギエンシス(B. thuringiensis)のシャトルベクター)にもサブクローニングして、pMYC2420を得た。
PS80JJ1の14kDaの毒素をコードする遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブを、N末端側ペプチド配列データから設計した。28塩基のオリゴヌクレオチドプローブの配列は、5'-GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT AC-3'(配列番号：29)であった。このオリゴヌクレオチドを、示されたように4つの位置で混合した。このプローブを32Pで放射性標識して、PS80JJ1の全細胞DNAとpMYC2421DNAを、さまざまな制限酵素で消化したもののサザンブロットの、標準的条件下でのハイブリダイゼーションに用いた。これらのRFLPマッピング実験によって、14kDaの毒素をコードする遺伝子が、44.3kDaの毒素に対するN末端コーディング配列を含む、ゲノムの同一のEcoRI断片上に位置していることが示された。
B.t.におけるPS80JJ1毒素遺伝子の発現を調べるために、pMYC2420で、非結晶性(Cry-)B.t.宿主であるCryB(A.Aronson, Purdue University, インディアナ州ウエストラファイエット)をエレクトロポレーションによって形質転換した。pMYC2420によってコードされている、約14kDaと44.3kDaのPS80JJ1毒素の両方の発現が、SDS-PAGE解析によって明らかにされた。組換えCryB[pMYC2420]菌株であるMR536から得た毒素結晶調製物を測定して、ウエスタントウモロコシルートワームに対して活性のあることが分かった。
ABI373自動配列決定装置と、それに付随するソフトウエアを用いて、pMYC2421にコードされているPS80JJ1毒素遺伝子の配列を決定した。両方の読み枠と、それに隣接する配列とを含む、遺伝子座全体の配列が配列番号：30に示されている。14kDaの毒素遺伝子の終止コドンは、44.3kDaの毒素遺伝子の開始コドンから121塩基対上流(5'側)にある(図2)。殺虫性蛋白質をコードしている他の毒素遺伝子と比較すると、PS80JJ1の14kDaの毒素の読み枠の塩基配列(配列番号：31)、44.3kDaの毒素の読み枠の塩基配列(配列番号：10)、および、それぞれの推定アミノ酸配列(配列番号：32および配列番号：11)は新規である。
したがって、PS80JJ1の14kDaの毒素をコードする塩基配列が配列番号：31に示されている。PS80JJ1の14kDaの毒素の推定アミノ酸配列が配列番号：32に示されている。PS80JJ1の14kDaおよび45kDaの毒素を両方をコードしている塩基配列、およびその隣接配列が、配列番号：30に示されている。これらの配列の関係は、図2に示されている。
プラスミドpMYC2421をもつ大腸菌NM522の継代培養株を、1996年3月28日に、米国イリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許培養株コレクション(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(NRRL)の永久コレクションに寄託した。寄託番号は、NRRL B-21555である。
実施例7−バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株PS149B1とPS167H2に由来する、さらに新規のδ-内毒素遺伝子のRFLPおよびPCR解析
トウモロコシルートワームに対して活性のある、さらに2つの菌株、PS149B1とPS167H2も、サイズ約14kDaおよび45kDaのポリペプチドを一部含むパラ胞子(parasporal)蛋白質の結晶を産生する。サザンハイブリダイゼーション、および部分的DNA配列解析を用いて、これらの毒素と80JJ1毒素との関係を調べた。上記のようにして、これらのB.t.菌株からDNAを抽出し、14kDa毒素のオリゴヌクレオチドプローブ(配列番号：29)と、PS80JJ1の44.3kDa毒素遺伝子をコードする配列の約800bpのPCR断片とを用いて、標準的なサザンハイブリダイゼーションを行った。44.3kDaの毒素に相同な配列を含むDNA制限酵素断片のサイズを示す、これらの実験から得られた代表的なRFLPデータが表4に示されている。約14kDaの毒素に相同な配列を含むDNA制限酵素断片のサイズを示す、これらの実験から得られた代表的なRFLPデータが表5に示されている。
0003948682.tif 000014
3つの菌株は、それぞれ固有のRFLPパターンを示した。PS149B1またはPS167H2からのハイブリダイズするDNA断片は、PS80JJ1の44.3kDa毒素に相同な配列をもつ、毒素遺伝子の全部または一部を含んでいる。
0003948682.tif 000015
3つの菌株は、それぞれ固有のRFLPパターンを示した。PS149B1またはPS167H2からのハイブリダイズするDNA断片は、PS80JJ1の14kDa毒素に相同な配列をもつ、毒素遺伝子の全部または一部を含んでいる。
PS149B1またはPS167H2における毒素遺伝子部位を、PS80JJ1の44.3kDa毒素遺伝子配列に基づいて設計した順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー対を用いたPCRによって増幅した。PS149B1用には、以下のプライマー対を用いた：
0003948682.tif 000016
PS167H2用にも、同じプライマー対を用いた。ABI373自動配列決定装置と、それに付随するソフトウエアを用いて、これらのPCR由来の断片の配列を決定した。得られた部分的な遺伝子配列とペプチド配列は、配列番号：12〜15に示されている。これらの配列は、B.t.菌株PS149B1またはPS167H2の中にある、トウモロコシルートワーム活性のある新規の毒素に対するコーディング塩基配列、およびペプチド配列の部分を含む。
実施例8−バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)菌株PS149B1とPS167H2に由来する、新規のδ-内毒素遺伝子の分子クローニングとDNA配列解析
PS80JJ1に関して説明したようにして、PS149B1菌株、およびPS167H2菌株から全細胞DNAを抽出した。サイズ分画されたSau3A部分制限酵素断片の遺伝子ライブラリーを、前記した各菌株毎に、LambdaGem-11の中に構築した。組換えファージをパッケージして、大腸菌KW251細胞で培養した。44kDa毒素遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせて、プラークをスクリーニングした。ハイブリダイズしたファージをプラーク精製し、これを用いて、標準的な手順(Maniatisら、前記)によってDNAを単離するために、大腸菌KW251細胞の液体培養に感染させた。
PS167H2については、単離された組換えファージの一つが、PS80JJ1の44kDaの毒素遺伝子の5'側オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号：8)にハイブリダイズする、約4.0から4.4kbpのHindIIIバンドを含んでいることが、サザンブロット解析によって明らかになった。このDNA制限酵素断片を、標準的な方法によって、pBluescript S/K(ストラタジーン社(Stratagene)、カリフォルニア州サンディエゴ)にサブクローニングした。また、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)における発現解析を行う(下記参照)ために、この断片を、コピー数が多いシャトルベクターであるpHT370(Arantes, O., D. Lereclus、[1991]Gene 108:115〜119)にもサブクローニングした。この結果得られた組換え体で、高コピー数の双機能プラスミドをpMYC2427と名付けた。
ABI373自動配列決定装置と、それに付随するソフトウエアを用いて、pMYC2427にコードされているPS167H2毒素遺伝子の配列を決定した。両方の読み枠と、それに隣接する配列とを含む、遺伝子座全体の配列を、配列番号：34に示す。14kDa毒素遺伝子の終止コドンは、44kDaの毒素遺伝子の開始コドンから107塩基対上流(5'側)にある。殺虫性蛋白質をコードしている、他の既知の毒素遺伝子と比較すると、PS167H2の14kDaの毒素をコードする配列(配列番号：35)、44kDaの毒素をコードする配列(配列番号：37)、および、それぞれの推定アミノ酸配列である、配列番号：36および配列番号：38は新規のものである。この毒素遺伝子は、PS80JJ1の14kDaおよび44kDaの毒素と同じ状態で並んでおり、また、それらにいくらかの相同性をもっている。
プラスミドpMYC2427をもつ大腸菌NM522の継代培養株を、1997年3月26日に、米国イリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許培養株永久コレクション(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(NRRL)に寄託した。寄託番号は、NRRL B-21672である。
PS149B1については、PS80JJ1の44kDaの5'側オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号：8)を用いたサザンブロット解析によって、約5.9kbpのClaI DNA断片とハイブリダイズすることが明らかになった。ClaIで完全に消化した、PS149B1のゲノムDNAを、アガロースゲルでサイズ分画して、pHTBlueIIにクローニングした。また、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)における発現解析を行う(下記参照)ために、この断片を、コピー数の多いシャトルベクターであるpHT370(Arantes, O., D. Lereclus、[1991]Gene 108:115〜119)にもサブクローニングした。この結果得られた組換え体で、高コピー数の双機能プラスミドをpMYC2429と名付けた。
ABI自動配列決定装置と、それに付随するソフトウエアを用いて、pMYC2429にコードされているPS149B1の毒素遺伝子の配列を決定した。両方の読み枠と、隣接する塩基配列とを含む、遺伝子座全体の配列が配列番号：39に示されている。14kDa毒素遺伝子の終止コドンが、44kDaの毒素遺伝子の開始コドンから108塩基対上流(5'側)にある。殺虫性蛋白質をコードしている、他の既知の毒素遺伝子と比較すると、PS149B1の14kDaの毒素をコードする配列(配列番号：40)、44kDaの毒素をコードする配列(配列番号：42)、および、それぞれの推定アミノ酸配列である、配列番号：41および配列番号：43は新規のものである。この毒素遺伝子は、PS80JJ1およびPS167H2の14kDaおよび44kDaの毒素と同じ状態に並んでおり、また、それらにいくらかの相同性をもっている。まとめると、これら3つの毒素オペロンには、殺虫性毒素の新しいファミリーが含まれている。
プラスミドpMYC2429を含む大腸菌NM522の継代培養株を、1997年3月26日に、米国イリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許培養株コレクション(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(NRRL)の永久コレクションに寄託した。寄託番号は、NRRL B-21673である。
実施例9−新規のトウモロコシルートワーム活性毒素を同定しクローニングするためのPCR増幅
PS80JJ1、PS149B1、およびPS167H2(配列番号：12〜15)に由来する新規の3つの約45kDaのトウモロコシルートワーム活性毒素のDNAおよびペプチド配列を、ジェネティクス・コンピュータグループ(Genentics Computer Group)の配列解析プログラムであるパイルアップ(Pileup)によって、ギャップの重みを3.00、また、ギャップの長さの重みを0.10としてアラインメントをとった。この配列アラインメントは、この新規の毒素の仲間をコードする遺伝子にハイブリダイズする可能性が高いオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、保存されたペプチド配列を同定するために用いられた。このようなプライマーをPCRで用いて、これらの毒素、および関連する毒素があるかを見るためのDNA断片を増幅することができる。さまざまな配列に対して、数多くのプライマーを設計することが可能であるが、それらのうち4つが、実施例を提供するために、本明細書において示されている。これらのペプチド配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000017
これに対応する塩基配列は、以下のとおりである：
0003948682.tif 000018
周期的加熱(サーマルサイクル)反応におけるポリメラーゼ増幅のための順方向プライマーを、配列番号：20および21の塩基配列を基にして設計した。
逆方向プライマーは、配列番号：22および23の逆方向の相補鎖に基づいて設計された：
0003948682.tif 000019
これらのプライマーを組み合わせて、新規のトウモロコシルートワーム毒素をコードする遺伝子を同定する、以下のサイズのDNA断片(表6)を増幅するために用いることができる。
0003948682.tif 000020
同様に、読み枠に隣接するDNA配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、周期的加熱(サーマルサイクル)反応におけるポリメラーゼ増幅によって、新規のトウモロコシルートワーム活性毒素をコードする、完全長の遺伝子を単離することができる。PS80JJ1の約44.3kDaの毒素用に、このようなプライマー対を設計し合成して、完全長の毒素をコードする配列を含む、検出用の1613bpのDNA断片を増幅することができる。これらのプライマーは、以下のとおりである：
0003948682.tif 000021
PS80JJ1の約14kDaのPCR増幅するために、N末端側ペプチド配列(配列番号：29)をコードするオリゴヌクレオチドを、PS80JJ1の毒素遺伝子座の中の配列に基づく、さまざまな逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて用いることができる。このような逆方向プライマーの一つは、次のような配列を持っている：
0003948682.tif 000022
標準的なPCR反応で用いたところ、このプライマー対は、完全長の14kDaの毒素をコードする配列、121塩基長の遺伝子間のスペーサに相当する3'側隣接配列、および44.3kDaの毒素遺伝子部分を含む1390bpの検出用DNA断片を増幅した。14kDaの順方向プライマーと組み合わせて用いたところ、PCRによって、322塩基対のDNA断片が生成された。
実施例10−蛋白質のバイオアッセイ法
PS80JJ1の透析されたNaBr抽出物から得られた不溶性画分の調製物で、47kDa、45kDa、および15kDaのペプチドを含むもので、西部トウモロコシルートワームに対してバイオアッセイを行ったところ、有意な毒素活性を示すことが分かった。
実施例11−蛋白質のバイオアッセイ法
PS149B1から得た精製蛋白質画分で、西部トウモロコシルートワームに対してバイオアッセイを行ったところ、組合されると有意な毒素活性を示すことが分かった。実際、この組合せによって、本来の調製物(P1)で示された活性が回復された。以下のバイオアッセイデータ群は、致死率を示しており、この効果を明らかにしている。
0003948682.tif 000023
実施例12−クローンの用量応答バイオアッセイ法
PS149B1およびPS167H2からクローニングした組換え毒素と、生物的活性を直接比較するために、PS80JJ1の毒素オペロンも、pMYC2421からpHT370にサブクローニングした。この結果できた組換え体である、高コピー数の双機能性プラスミドをpMYC2426と名付けた。
pMYC2426を含む大腸菌NM522の継代培養株を、1997年3月26日に、米国イリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター、農業研究用特許培養株コレクション(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(NRRL)の永久コレクションに寄託した。寄託番号は、NRRL B-21671である。
B.t.におけるPS80JJ1、PS149B1およびPS167H2の毒素遺伝子の発現を調べるために、pMYC2426、pMYC2427、およびpMYC2429で、別々に、非結晶性(Cry-)B.t.宿主であるCryB(A. Aronson, Purdue University, インディアナ州ウエストラファイエット)をエレクトロポレーションによって形質転換した。組換え菌株には、それぞれ、MR543(CryB[pMYC2426])、MR544(CryB[pMYC2427])、およびMR546(CryB[pMYC2429])と名付けた。各組換え菌株に関するSDS-PAGE解析によって、約14kDaと44kDaの毒素の発現が示された。
組換え菌株からの毒素の結晶調製物で、西部トウモロコシルートワームに対するアッセイを行った。食餌を、ソルビン酸とSIGMAペン-ストレップ-アンフォ-B(pen-strep-ampho-B)で修正した。この材料を、食餌の表面領域1cm2当り50μlの懸濁液という割合で表面に載せた。約25℃で4日目の西部トウモロコシルートワームの新生幼虫を用いて、バイオアッセイを行った。各クローン(ペレット)に関する致死率と表面に載せたLC50評定値が表8に示されている。
0003948682.tif 000024
実施例13−毒素遺伝子の植物への挿入および発現
本発明の一つの局面は、殺虫性毒素をコードしている遺伝子で、植物を形質転換させることである。形質転換された植物は、標的害虫による攻撃に対して抵抗性を有する。
別の生物において発現させるために、本明細書で説明されている新規のトウモロコシルートワーム活性遺伝子を最適化することができる。14kDaと44kDaのPS80JJ1の毒素をコードする、トウモロコシに最適な遺伝子配列が、それぞれ、配列番号：44と配列番号：45で開示されている。
本明細書で開示されている、殺虫性毒素をコードする遺伝子を、当技術分野においてよく知られている、さまざまな技術を用いて、植物細胞の中に挿入することができる。例えば、高等植物に外来遺伝子を挿入するよう調製するために、大腸菌における複製システムと、形質転換された細胞の選抜を可能にするマーカーとを含む非常に多数のクローニングベクターを利用することができる。このベクターには、例えば、pBR322、一連のpUC、一連のM13mp、pACYC184などが含まれる。したがって、B.t.毒素をコードする配列を、適当な制限酵素部位で、ベクターの中に挿入することができる。その結果できるプラスミドを、大腸菌の中に形質転換することができる。大腸菌細胞は、適当な栄養培地中で培養してから、回収して破砕する。プラスミドを回収する。解析方法としては、一般的に、配列解析、制限酵素解析、電気泳動、および、その他の生化学-分子生物学的方法が行われる。それぞれの操作の後で、用いられたDNA配列を切断して、次のDNA配列につなげることができる。各プラスミドの配列は、同じか、または別のプラスミドにクローニングすることができる。所期の遺伝子を植物の中に挿入する方法によっては、別のDNA配列が必要になるかもしれない。例えば、もし、TiまたはRiプラスミドが、植物細胞の形質転換に用いられていたら、少なくとも、TiまたはRiプラスミドのT-DNAの右側境界配列、大抵は、左右の境界配列を、挿入されるべき遺伝子の隣接領域に結合させなければならない。
植物宿主細胞の形質転換にT-DNAを用いることが、広範に研究されてきており、欧州特許第120 516号；Hoekema(1985)、植物バイナリベクターシステム、Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 第5章より；Fraleyら、Crit. Rev. Plant Sci. 4:1〜46；および、Anら、(1985)EMBO J. 4:277〜287で充分に説明されている。
挿入されたDNAは、ゲノムに組み込まれると、そこで比較的安定し、原則としては、再び出てくることはない。このDNAは、普通、形質転換された植物細胞に、とりわけ、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールなどの殺菌剤ないし抗生物質に対する抵抗性を付与する選抜マーカーを含む。したがって、個別の場合に用いられるマーカーは、挿入されたDNAを含まない細胞を選抜するのではなく、形質転換された細胞の選抜を可能にするものでなければならない。
植物細胞の中にDNAを挿入するには、多くの方法が利用可能である。それらの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を形質転換因子として用いたT-DNAによる形質転換、融合、インジェクション、バイオリスティクス(微小粒子ガン)、またはエレクトロポレーションが含まれ、また、その他の方法も可能である。形質転換にアグロバクテリウムを用いるときには、挿入すべきDNAを特別のプラスミド、すなわち、中間ベクター、またはバイナリベクターの中にクローニングしなければならない。中間ベクターは、T-DNA中の配列に相同的な配列による相同的な組換えによって、TiまたはRiプラスミドの中に組み込まれることができる。TiまたはRiプラスミドは、T-DNAを導入するのに必要なvir領域も含んでいる。中間ベクターは、それ自体では、アグロバクテリウムの中で複製することができない。ヘルパープラスミドを手段とすること(接合)によって、中間ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に移行させることができる。バイナリベクターは、大腸菌の中でも、アグロバクテリウムの中でも自己複製することができる。それらは、T-DNAの左右の境界配列という枠組みをもった、選抜マーカー、および、リンカーまたはポリリンカーを含む。これらは、直接的にアグロバクテリウムに形質転換することができる(Holstersら、[1978]Mol. Gen. Genet. 163:181-187)。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、vir領域をもつプラスミドを含んでいることになっている。植物細胞の中にT-DNAを導入するには、vir領域が必要である。付加的なT-DNAをを含んでいてもよい。こうして形質転換された細菌を、植物細胞を形質転換するために用いることができる。DNAを植物細胞に導入するためには、植物の外植片を、都合よく、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)と一緒に培養することができる。そして、選抜のために、抗生物質または殺菌剤を含む適当な培地の中で、感染させた植物材料(例えば、葉片、茎の分節、根、また、プロトプラストまたは懸濁培養細胞)から、全植物体を再生させることができる。そして、挿入DNAが存在するかを見るために、このようにして得られた植物体を調べることができる。インジェクションとエレクトロポレーションの場合には、プラスミドに特別必要とされるものはない。例えば、pUCから派生したプラスミドなどの、通常のプラスミドを使用することができる。
形質転換された細胞は、通常の態様で、植物の内部で増殖する。これらは、生殖細胞を形成することができ、形質転換された形質を後代植物に伝達することができる。このような植物体は、普通の方法で生育させることができ、同一の形質転換された遺伝因子をもつ植物体、または別の遺伝因子をもつ植物体と交配することができる。こうしてできた雑種個体は、相当する表現形質をもつ。
本発明の好ましい態様において、コドン使用が植物で最適になる遺伝子によって、植物体を形質転換する。例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,380,831号を参照のこと。また、末端部分を欠失した毒素をコードする植物が、都合よく用いられる。末端部分を欠失した毒素は、典型的には、全長毒素の約55％から約80％をコードしている。植物で用いるために、合成B.t.遺伝子を作出するための方法は、当技術分野において既知である。
実施例14−B.t.遺伝子の昆虫ウイルスへのクローニング
数多くのウイルスが、昆虫に感染することが知られている。これらのウイルスには、例えば、バキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスがある。本発明の一つの態様において、本明細書において説明されているような、殺虫性毒素をコードする遺伝子を、昆虫ウイルスのゲノムの中に入れて、ウイルスの病原性を促進させることができる。B.t.毒素遺伝子を含む昆虫ウイルスを構築するための方法は周知であり、当業者によって容易に実施することができる。それらの手順は、例えば、メリーウェザー(Merryweather)ら(Merryweather,A.T., U.Weyer, M.P.G.Harris, M.Hirst, T.Booth, R.D.Possee(1990)J. Gen. Virol. 71:1535〜1544)、およびマルテン(Marten)ら(Martens,J.W.M., G.Honee, D.Zuidema, J.W.M. van Lent, B.Visser, J.M.Vlak(1990)Appl. Environmental Microbiol. 56(9):2764〜2770)において説明されている。
本明細書に記載した実施例および様態は例示のみを目的とするものであり、その内容から様々な改変または変更が当業者には示唆されるが、それらは本出願の精神および権限ならびに添付の請求の範囲に含まれるものであることを理解されるべきである。
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人：
名称：MYCOGEN CORPORATION
街路名：5501 Oberlin Drive
市名：San Diego
州名：California
国名：US
郵便番号：92121
電話：(619)453-8030
ファックス：(619)453-6991
(ii)発明の名称：殺虫性毒素
(iii)配列数：45
(iv)文書通信情報：
(A)宛名：Saliwanchik, Lloyd & Saliwanchik
(B)街路名：2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
(C)市名：Gainesville
(D)州名：FL
(E)国名：USA
(F)郵便番号：32606-6669
(v)コンピューター読み取りフォーム：
(A)メディア形式：Floppy disk
(B)コンピューター：IBM PC compatible
(C)運転システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi)現出願データ：
(A)出願番号：US
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)親出願データ：
(A)出願番号：US 08/633,993
(B)出願日：19-APR-1996
(C)分類：
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)氏名：Sanders, Jay M.
(B)登録番号：39,355
(C)参照／明細書番号：MA-703C1
(ix)電気通信情報：
(A)電話：352-375-8100
(B)ファックス：352-372-5800
(2)配列番号：1の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：5アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：1：
0003948682.tif 000025
(2)配列番号：2の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：25アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：2：
0003948682.tif 000026
(2)配列番号：3の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：3：
0003948682.tif 000027
(2)配列番号：4の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：25アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：3：
0003948682.tif 000028
(2)配列番号：5の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：50アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：5：
0003948682.tif 000029
(2)配列番号：6の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：25アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：6：
0003948682.tif 000030
(2)配列番号：7の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：25アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：7：
0003948682.tif 000031
(2)配列番号：8の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：8：
0003948682.tif 000032
(2)配列番号：9の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：26塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：9：
0003948682.tif 000033
(2)配列番号：10の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1158塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：10：
0003948682.tif 000034
(2)配列番号：11の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：385アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：11：
0003948682.tif 000035
0003948682.tif 000036
0003948682.tif 000037
(2)配列番号：12の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：834塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：12：
0003948682.tif 000038
(2)配列番号：13の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：278アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：13：
0003948682.tif 000039
0003948682.tif 000040
(2)配列番号：14の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：829塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：14：
0003948682.tif 000041
(2)配列番号：15の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：276アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：15：
0003948682.tif 000042
0003948682.tif 000043
(2)配列番号：16の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：7アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：16：
0003948682.tif 000044
(2)配列番号：17の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：7アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：17：
0003948682.tif 000045
(2)配列番号：18の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：8アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：18：
0003948682.tif 000046
(2)配列番号：19の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：6アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：19：
0003948682.tif 000047
(2)配列番号：20の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：20：
0003948682.tif 000048
(2)配列番号：21の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：21：
0003948682.tif 000049
(2)配列番号：22の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：22：
0003948682.tif 000050
(2)配列番号：23の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：23：
0003948682.tif 000051
(2)配列番号：24の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：24：
0003948682.tif 000052
(2)配列番号：25の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：25：
0003948682.tif 000053
(2)配列番号：26の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：26：
0003948682.tif 000054
(2)配列番号：27の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：27：
0003948682.tif 000055
(2)配列番号：28の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：386アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：28：
0003948682.tif 000056
0003948682.tif 000057
0003948682.tif 000058
(2)配列番号：29の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：28塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：29：
0003948682.tif 000059
(2)配列番号：30の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：2015塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：30：
0003948682.tif 000060
0003948682.tif 000061
(2)配列番号：31の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：360塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：31：
0003948682.tif 000062
(2)配列番号：32の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：119アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：32：
0003948682.tif 000063
(2)配列番号：33の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(synthetic)
(xi)配列の記載：配列番号：33：
0003948682.tif 000064
(2)配列番号：34の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：2230塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：34：
0003948682.tif 000065
0003948682.tif 000066
(2)配列番号：35の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：372塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：35：
0003948682.tif 000067
(2)配列番号：36の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：123アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：36：
0003948682.tif 000068
(2)配列番号：37の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1152塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：37：
0003948682.tif 000069
(2)配列番号：38の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：383アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：38：
0003948682.tif 000070
0003948682.tif 000071
(2)配列番号：39の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：2132塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：39：
0003948682.tif 000072
0003948682.tif 000073
(2)配列番号：40の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：372塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：40：
0003948682.tif 000074
(2)配列番号：41の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：123アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：41：
0003948682.tif 000075
(2)配列番号：42の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1152塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：42：
0003948682.tif 000076
(2)配列番号：43の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：383アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号：43：
0003948682.tif 000077
0003948682.tif 000078
(2)配列番号：44の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：360塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：44：
0003948682.tif 000079
(2)配列番号：45の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1158塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列の記載：配列番号：45：
0003948682.tif 000080
【図１】
0003948682.tif 000081
【図２】
0003948682.tif 000082