(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性菌を培養する発酵槽の菌濃度を一定に制御する培養法において、糖およびアルカリを交互にフィードするとき、アルカリ消費量を基準として糖のみならず、糖を含まない栄養成分培地も併せてフィードすることによって培養液の残糖濃度を制御するに際し、培養液ｐＨを一定に制御するために添加するアルカリの積算消費モル数に比例したモル数の糖をフィードし、残糖濃度を一定とすることを特徴とする嫌気性菌の連続培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、嫌気性菌の連続培養法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
嫌気性細菌の中には、アセトン・ブタノール菌、乳酸菌、エタノール生産細菌など、産業的に有用な細菌が多く存在するが、これら嫌気性細菌を用いた実用に耐える効率高い工業プロセスは全く知られていない。たとえばアセトン・ブタノール発酵は、近代発酵工業の祖として、先の大戦までは世界各国で盛んに実施されたが、石油化学の勃興とともに現在では完全に消滅している。また、乳酸菌は乳加工や発酵乳の製造、醸造、漬け物製造などに広く用いられている有用細菌であるが、有機酸工業としての乳酸発酵技術は、好気性細菌による近代的発酵工業であるグルタミン酸発酵に代表されるアミノ酸・核酸発酵にくらべ、ほとんどまだ未着手の状態にある。そして、嫌気性細菌によるエタノール生産は酵母に比べ生産性が高いことはわかっているが、包括固定化法による連続発酵法が検討されているものの、現在まで実用に耐えるプロセスの開発には成功していない。しかるに、最近石油資源の枯渇への懸念から要請される化石燃料依存からの脱却、炭酸ガス削減への対応、プラスチックゴミ問題など、深刻化するグローバル課題への対応技術として、嫌気性細菌活用の期待が急速に高まっている。特に、生分解性プラスチックとして市場拡大が期待されているポリ乳酸の原料供給手段としての有機酸工業としての乳酸発酵や、安全なジーゼル油添加剤として需要が拡大している発酵エタノールの生産性向上は緊急の技術開発課題となっている。だが、LactobacillusやLactococcusを用いる乳酸発酵や、Zymomonasを用いるエタノール発酵では、工業化が可能な連続発酵技術は確立していないのが実情である。従来、これら嫌気性菌の連続発酵については、学術論文による報告例は多数にのぼるが、いずれも単純なケモスタットを基本とするもので、瞬間的な生産性は必ずしも低くはないが、システム制御法が確立していないため発酵速度を長時間にわたって安定に維持することはできず、そのため基質消費速度が不安定で、その結果発酵槽内の基質濃度（残糖濃度）を制御することができていない。すなわち、実用性のほど遠いものとなっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
周知のとおり、工業用の連続発酵システムでは、定常状態を長時間維持できなければならない。すなわち、基質消費速度を一定に保ち、しかも流出液（生産物回収を目的とする）の基質濃度を極力低く一定に保ち、原料ロスを最小にしなければならない。好気性菌の連続培養法では、そのためにDO-statと呼ばれる大変優れた方法がある。
【０００４】
この方法では、基質濃度が低い限界値に達すると、代謝活性が低下して酸素消費速度が低下する結果、酸素摂取量が低下して溶存酸素濃度(DO)が上昇する。そこが基質切れのシグナルと判断して基質を追加補填してやれば、発酵は回復し継続する。
【０００５】
しかしながら、嫌気性菌の場合には、元来酸素を消費しないので、原理的にこの方法を採用することはできない。また、好気性菌の連続培養法には、DOに代わってpHの上昇を基質切れのシグナルに用いるpH-auxostatが用いられることもある。嫌気性菌でも、酸の生成に限られずにアルコール生成でも、代謝に伴いpHが低下するので、pHの反転上昇を基質切れのシグナルと見なして、これを基質フィードタイミングとすることが可能なように思える。しかし、実際にこの方法で基質フィードを行うことはできない。それは、嫌気性菌ではpHの反転上昇が起こると直ちに菌が失活し、発酵速度は不可逆的に低下してもはや快復しないからである。すなわち、図１に示すように、嫌気性菌の培養で、pHが下限界に近づいたとき（Ａ）は、残糖濃度が臨界値(critical value)に近づくが、臨界値に達した時点で直ちに糖液をフィードすれば（Ｂ）発酵は継続できるが、図２に示すように、臨界値に達しても糖液をフィードせず放置した場合は菌は失活し、発酵速度は低下して運転を継続できない。これは、嫌気性菌に共通する好気性菌とは異なる特徴である。従って、嫌気性菌では連続培養を実施するための基質フィードの適当な手段が見出されていない。
【０００６】
もう一つの嫌気性菌の特徴は、発明者がsterile cellと定義した増殖能力を失った細胞の生成である。このため、嫌気性菌の増殖は菌濃度が頭打ちとなり、回分培養では菌濃度は低くとどまる。発酵速度を上昇させるには、菌濃度の増加が有効で、cell recycling法によって培養液の濃縮が可能であるが、細胞濃度の上昇に伴い、生産物濃度が上昇して、最終生産物阻害が強くなる。このようなことから、cell recycling法による菌濃縮培養法は最終生産物阻害による菌の活性低下を招く結果、発酵は不安定となり、著しい生産性の低下をまねく。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの問題点を解消し、乳酸菌を用いて高純度L-乳酸を生産する有機酸生産プロセスや嫌気性細菌を用いる燃料用エタノール生産など、高い経済効率で運転しなければ成り立たない嫌気性菌の連続発酵プロセスの実用化に欠くことのできない新しい制御法として、残糖制御の方法と最終生産物阻害の軽減と菌の活性維持の新しい方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、嫌気性菌を培養する発酵槽の菌濃度を一定に制御する培養法において、基質およびアルカリを交互にフィードするとき、時間当たりのアルカリ消費量を基準として基質をフィードすることによって培養液の残糖濃度を制御することを特徴とする嫌気性菌の連続培養法を提供する。
【０００９】
第２には、培養液pHを一定に制御するために添加するアルカリの積算消費モル数に比例したモル数の基質をフィードし、残糖濃度を一定とする連続培養法を、第３には、アルカリの濃度を低くすることで循環培養液の希釈効果を高めて、菌の比活性を維持して高い生産性を維持することを特徴とする連続培養法を提供する。
【００１０】
以上のとおりのこの出願の発明は、発明者による以下のとおりの検討を踏まえている。
【００１１】
すなわち、まず残糖レベルを一定に制御するために、従来は培養液基質レベルの低下を直接検出してフィードバック制御を行うことを考えてきたが、対象とする培養にこの目的で使用できる信号が見あたらないことから、pH調整のためのアルカリフィード量の積算値から基質消費量を求め、この値から追加する基質量を求めて、所定量の基質を培養液に添加すれば、結果として残糖濃度を一定に保つことができることを見出した。そして、さらには、この方法を実現し、しかも大きな生産性を得るには、菌の高密度培養が必要とされ、そのような条件下では強い最終生産物阻害が発現し、菌の失活が起こる結果、菌の活性（菌体重量当たりの代謝活性＝比速度）が一定せず、結果として上記方法で残糖制御を行うことが難しくなるが、濁度制御によって菌濃度を一定に保つ培養系で、菌濃度の増加に対応して中和剤アルカリの濃度を希釈することで希釈効果を大きくすれば、生産物濃度が低下して阻害が低減する結果、安定した菌の比活性を維持できて、上記の方法による残糖制御が行えることを見出した。
【００１２】
この出願の発明は以上のような知見に基づいて完成されたものである。
【００１３】
この出願の発明によって、残糖濃度を低く制御して原料ロスを最低限に抑えることができる嫌気性菌連続発酵プロセスが可能とされ、さらには、残糖濃度を低く抑えられることから、最終製品の乳酸等の純度を飛躍的に向上することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この出願の発明では、以上のように、嫌気性菌を培養する発酵槽の菌濃度を一定に制御する培養システムにおいて、基質およびアルカリを交互に連続的にフィードするときに、時間当たりのアルカリ消費量を基準として、たとえばこれに一定の係数を乗じたモル量に等しい基質のグラム等量をフィードすることによって培養液の残糖濃度を制御する。これによって、連続発酵による基質ロスを最小限度に抑え、生産コストを引き下げるとともに、製品の品質を向上できる。
【００１５】
また、この出願の発明では、上記の培養システムにおいて、培養液を循環して培養液菌濃度を上昇させると、生産物濃度も増加するので、生産物阻害によって菌の活性が低下するが、アルカリの濃度を低くすることで希釈効果を高めて、菌の比活性を維持して高い生産性を維持することを可能とする。このことで、菌の比活性が安定して保たれ、この出願の発明の嫌気性菌の連続培養の実施が可能となる。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図を用いて説明する。
【００１７】
図３はこの出願の発明を実施するのに好適な培養システムを示したSFD(Schematic Flow Diagram)である。図中において、Ａは発酵槽、Ｂは菌濃縮用クロスフローろ過器、ＣはpH測定制御器、Ｄはアルカリ添加量積算器、Ｅはレーザー濁度測定制御器、P1，P2，P3はペリスターポンプを示している。F1はpH制御のためのアルカリフィード速度、F2はアルカリ添加量から求められる基質フィード速度、F3は濁度制御のために添加される糖を含まない栄養成分培地のフィード速度、F4はF1に等量の培養ろ液引き抜き速度（Ｃによるフィードバック制御）、F5はF2に等量の培養ろ液引き抜き速度（Ｄによるフィードバック制御）、F6はF3に等量の培養液引き抜き速度（Ｅによるフィードバック制御）を示している。なお、速度はいずれも(ml/min)とする。この制御システムでは、発酵槽Ａの液量Ｖを一定に保つために、F1=F4，F2=F5，また、Ｖ一定で発酵槽Ａ内の菌濃度を一定に保つためにF3=F6なる条件を満足させている。このシステムでは、流入量の総量はF1＋F2＋F3、流出量の総量はF4＋F5＋F6で、F1＋F2＋F3＝F4＋F5＋F6の関係にあるから、発酵槽流量をＶとすると、連続発酵の希釈率は次式（１）
【００１８】
【数１】
0003958089.tif 000002
【００１９】
で示される。また、発酵槽内の菌増殖量μＸＶと引き抜き量ＸF6は等しくなければならないから、菌の比増殖速度はＸF6＝μＸＶの関係があって、次式（２）
【００２０】
【数２】
0003958089.tif 000003
【００２１】
となって、増殖速度μが希釈率Ｄに等しい状態で定常状態が成立するとする従来の連続発酵の原則μ＝Ｄに従わない、全く新しい連続発酵であることがわかる。上記の式で、基質フィード速度はF１の関数として与えられる。またF1は低規定度にすれば大きくなるので、Ｄが大となって希釈効果が得られる。このようにして、最終生産物阻害が低減され、菌の比活性を高く維持するとともに、残糖濃度を一定に制御できる。
【００２２】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
使用菌は発明者が独自に分離したLactococcuslactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は−85℃の凍結保存菌をTGC培地(Difco)に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース３％、酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％からなる培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃５分autoclave滅菌したものに接種して８時間培養したものをシードとした。乳酸発酵に用いた培養装置のシステム構成は図３に示したものと同一である。主発酵培地はグルコース ５％、酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％で、殺菌条件は同一である。主発酵槽は全容１リッターのガラス製ジャーで、内部にマグネットスターラーのかくはん機を設置し、約400rpmの回転数でゆっくりかくはんしている。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して培養温度を37℃に制御した。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter（東亜電波製）で測定し、pH6.0（下限）でアルカリ(1N-NaOH)をフィードしてpH制御を行った。グルコースアナライザーで培地の残糖濃度を適時測定し、残糖レベルが3g/lとなった時点でアルカリフィード速度に比例して求めたグルコースフィード速度で培地の添加を行い、連続発酵を開始した。そのときのアルカリフィード速度とグルコースフィード速度との関係については、次のように考慮される。
【００２４】
すなわち、グルコース必要量（ＧQ）は次式（３）で表わされる。
【００２５】
【数３】
0003958089.tif 000004
【００２６】
（ただし、ｆは1N-NaOHの規定度factor，Ｃは残糖誤差補正項）
すなわち、ＩＮのアルカリのフィード速度F1に対応する乳酸のグラム数（乳酸の分子量は９０）が必要なグルコース量（グラム数）となるが、さらにフィードしたグルコースの５％はF2の再生に使用されるので０．９５で割る必要がある。また、実際の制御では多少off-set（制御偏差）を生じるので、その修正項Ｃを加えて補正する。
【００２７】
従って、糖濃度Ｓg/lのフィード液を用いて式（３）で得られた糖量を供給するには、培地添加速度は
【００２８】
【数４】
0003958089.tif 000005
【００２９】
（ただし、Ｓは培地（フィード液）糖濃度）
で表わされる。
【００３０】
培地フィード槽に主発酵と同一組成の培地を送り仕込んでおき、この計算によって求めた量をフィードしながら連続培養を行った。連続培養を実施するにあたり、ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、微生物の濃縮を行ったろ過膜外側からは除菌液を抜き出して、製品である乳酸液を取り出す。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDC controller(ModelLA-300 工一エスアール)に入力し、ジャーの濁度制御を行って、菌の濃縮管理を行うシステムも組み込んだ。濁度コントロールのシステムとしては、培養液( 含菌液) を抜き出し、無糖培地（酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％からなる培地）を希釈水としてフィードした。これらはペリスタリィックポンプによって同調させた。かくして連結培養では、３種類の液(F1，F2，F3)を供給し、２種類の液(F4，F5とF6)の抜き出しを行う。すなわち、pH制御のためのアルカリ液(lN-NaOH)の添加量の積算値に対応した基質の糖をフィードした。
【００３１】
回分培養で発酵を開始して約12時間後、残糖レベルが約3g/lとなったところで、連続フィードと菌のリサイクルを開始したところ、菌の濃度増加とともに基質フィード速度も徐々に増加して、菌体濃度10.5g/l(DCWとして) に達した。このとき、糖濃度は目標の2g/lより高い4.5g/lであったので、前記の残糖誤差補正項Ｃによって残糖レベルを修正したところ、約３時間で残糖２±0.5g/lに制御できた。それ以降total dilution rate 0.7 1/hで10日約250hの連続運転を行い、残糖レベルを安定して維持でき、L-乳酸濃度は平均45g/lであった。従って、このシステムの生産性は31.5g/l hであった。
【００３２】
この乳酸を濃縮し90％  Ｌ−乳酸液としたところ、混在する糖は対乳酸５％以下であり、ポリ乳酸原料として十分の品質であった。
（実施例２）
使用菌は発明者が独自に分離したLactococcuslactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は−85℃の凍結保存菌をTGC培地(Difco)に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース3%、酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％からなる培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃５分autoclave滅菌したものに接種して８時間培養したものをシードとした。用いた培養装置のシステム構成は実施例１に示したものと同一である。主発酵槽は全容１リッターのガラス製ジャーで、内部にマグネットスターラーのかくはん機を設置し約400rpmの回転数でゆっくりかくはんしている。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して培養温度を37℃に制御した。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter(東亜電波製)で測定し、pH6.0（下限）でアルカリ(1N-NaOH)をフィールしてpH制御を行った。主発酵に用いた培地は、コーンスターチ酵素糖化液（使用酵素 NOVO Thermamyl 120L, Dextrozyme 225/75L)を希釈してグルクース５％に調整し、これにコーンスティープリカー(CSL)１％を添加し、pH調整後120℃５分殺菌したものである。グルコースアナライザーで培地の残糖濃度を適時測定し、残糖レベルが1.5g/lとなった時点でアルカリフィード速度に比例して求めたグルコースフィード速度で培地の添加を行い、連続発酵を開始した。そのときのアルカリフィード速度とグルコースフィード速度との関係は実施例１において用いた式によって求めた。
【００３３】
この計算によって、コンピューターから培地フィード槽に指令を送り、糖をフィードしながら連続培養に移行した。連続培養を実施するにあたり、ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、微生物の濃縮を行ったろ過膜外側からは除菌液を抜き出して、製品である乳酸液を取り出す。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDC controller(ModelLA-300 工一エスアール)に入力し、ジャーの濁度制御を行って、菌の濃縮管理を行うシステムも組み込んだ。濁度コントロールのシステムとしては、培養液（含菌液）を抜き出し、無糖培地（CSL １％）を水に溶解し、殺菌したもの）を希釈水としてフィードした。これらはペリスタリィックポンプによって同調させた。かくして連結培養では、３種類の液(F1，F2，F3)を供給し、２種類の液(F4，F5とF6)の抜き出しを行う。すなわち、pH制御のためのアルカリ液(0.5N-NaOH)の添加量の積算値に対応した基質の糖をフィードした。
【００３４】
回分培養で発酵を開始して約18時間後、残糖レベルが約1.5g/lとなったところで、連続フィードと菌のリサイクルを開始したところ、菌の濃度増加とともに基質フィード速度も徐々に増加して、菌体濃度12.3g/l(DCWとして)に達した。このとき、糖濃度は目標の1.5g/lより低い1.0g/lであったので、補正項Ｃによって残糖レベルを修正したところ、約１時間で残糖1.5±0.2g/lに制御できた。それ以降total dilution rate 1.0 1/hで３週間約525hの連続運転を行い、残糖レベルを安定して維持でき、L-乳酸濃度平均値は40.5g/lであった。従って、このシステムの生産性は40.5g/l hであった。
【００３５】
この乳酸を濃縮し90％  L-乳酸液としたところ、混在する糖は対乳酸５％以下であり、ポリ乳酸, 原料として十分の品質であった。
（実施例３）
使用菌はZymomonas mobilis NRRLB-14023である。種菌は一85℃の凍結保存菌をYM培地に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース100g、酵母エキス10g 、KH2PO4 1g, (NH4)2SO４ 1g、Mg(SO4)・7H2O 0.5gを1Lの脱イオン水に溶解した培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃ 5分autoclave滅菌したものに接種して、約８時間培養したものをシードとした。エタノールの連続発酵に用いた培養装置のシステム構成は図３に示すものと同じである。すなわち、主発酵槽は全容約１リッターのガラス製ジャーで、内部マグネットスターラーのかくはん機を設置し約400rpmの回転数でゆっくりかくはんしている。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して温度を制御する。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter（東亜電波製）で測定し、下限の２点制御を行った。連続運転に入れば、pH上限で基質フィードを行い、pH下限(5.5)でアルカリ(0.5N-NaOH)フィードを行った。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDC contro11er(ModelLA-300 工一エスアール) に入力、ジャーの濁度制御を行うシステムを構築した。ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、菌の濃縮を行うとともに、ろ過膜外側から除菌液を抜き出してエタノールを含む液を取り出す。一方、濁度コントロールのシステムとしては、殺菌した無糖培地をフィードし、培養液（含菌液）を抜き出した。このとき、水の供給と培養液の抜き出しはペリスタリィックポンプによって同調させた。連結培養では、実施例１と同様、３種類の液を供給し、２種類の液の抜き出しを行う。すなわち、pH下限においてpH制御のためのアルカリ液(0.5N-NaOH)を添加し、実施例１に示した計算式に代わって、次式（５）
【００３６】
【数５】
0003958089.tif 000006
【００３７】
（ただし、ｆHはグルコース１モルの取り込みに要する1N-NaOH量の逆数）
によって計算した糖フィード速度で培地をフィードする。エタノール発酵は乳酸発酵とは異なりグルコースからエタノールを生成するときにＣＯ2の発生があって、収率は１００％とならず、通常は５０％である。
【００３８】
そこで、グルコースからエタノールの転換率をfHと表せば、式（１）と同様の考えによって式（５）が成立することになる。
【００３９】
フィード液とアルカリ液をジャーに供給するとき、ペリスタリィックポンプによって等量の除菌液を限外ろ過膜外側から抜き出してジャーの液量を一定に保つ。また濁度制御のために、上述したように、培養液を抜き出し、これもジャーの液量を一定に保つように無糖培地をペリスタティックポンプを用いて供給する。主発酵はシードと同一組成、すなわちグルコース 10%、酵母エキス 1%、KH2PO4 0.1%、(NH4)2SO4  0.1%、Mg(SO4)・7H2O 0.05gの培地400mlにシード20mlを植菌してスタートしアルカリフィードしながらpH5.5を維持する。
【００４０】
回分培養開始約８時間後、培地の残糖濃度が1g/lに近づいたところで、連続基質フィードと菌のリサイクルを開始した。菌の濃度増加とともに基質フィード速度も徐々に増加して、菌体濃度7.5g/l(DCWとして)に達した。このとき、残糖濃度は目標の1g/lより高い1.5g/lであったので、補正項Ｃによって残糖レベルを修正したところ、約２時間で残糖1.0±0.3g/lに制御できた。それ以降total dilution rate 0.5 1/hで７日約150hの連続運転を行い、残糖レベルを安定して維持でき、この間のエタノール濃度52g/lであった。従って、このシステムのエタノール生産性は26g/l hであった。
【００４１】
【発明の効果】
この出願の発明では、菌体を固定化しないで微生物の代謝活性を生菌体として維持し、活性の衰えた菌はwash outさせると共に、新しい菌を再生させる。このようにして、発酵システムの中は一定の代謝活性を有する菌のみで構成されるバイオリアクターが成立する。このようなリアクターでは、濁度制御によって微生物濃度を一定に維持すれば、発酵速度は一定となるので、基質を連続的にフィードして、その速度に対応した速度で生産物を引き抜く連続発酵システムとなる。このとき、希釈率は、アルカリ液をふくむフィード液の容積によって決まるので、たとえば、アルカリ濃度を下げれば、希釈率が大きくなり、最終生産物阻害を低減できる。従って、菌濃度を高くして最終生産物濃度が高くなれば、アルカリ濃度を下げて、希釈率を上げれば最終生産物阻害を低減でき、高い生産速度を維持できる。このようなバイオリアクターはいままでに全く知られていなかったバイオリアクターである。このようなリアクターは反応速度が石油化学の連続反応に近いものとなるので、従来の回分発酵に比べ数十倍の装置生産性が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】嫌気性菌の培養で、pHが下限界に近づいたとき（Ａ）は、残糖濃度が臨界値(critical value)に近づくが、臨界値に達した時点で直ちに糖液をフィードした場合（Ｂ）は発酵を継続することができることを示した模式図である。
【図２】  臨界値に達しても糖液をフィードせず放置した場合は菌は失活し、発酵は継続できないことを示した模式図である。
【図３】この発明のための装置構成を例示した概要構成図である。
【図１】
0003958089.tif 000007
【図２】
0003958089.tif 000008
【図３】
0003958089.tif 000009