(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッド・グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）であって、GAD65アイソフォームのアミノ酸90−105〜アミノ酸585を含む中央及びカルボキシ−末端成分と直接的に連結されたGAD67アイソフォームのアミノ酸１〜アミノ酸90−105を含むアミノ−末端成分を含む、前記ハイブリッドGAD。
【請求項２】
前記アミノ−末端成分が、GAD67アイソフォームのアミノ酸１〜アミノ酸95−101を含む、請求項１に記載のハイブリッドGAD。
【請求項３】
前記中央及びカルボキシ−末端成分が、GAD65アイソフォームのアミノ酸95−101〜アミノ酸585を含む、請求項１又は２に記載のハイブリッドGAD。
【請求項４】
GAD67（１−101）とGAD65（96−585）を含む、請求項１に記載のハイブリッドGAD。
【請求項５】
その１端又は両端に結合された追加の成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のハイブリッドGAD。
【請求項６】
前記追加の成分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ成分、β−ガラクトシダーゼ成分、及びヘキサ−His成分から選ばれる、請求項５に記載のハイブリッドGAD。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドGADをコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドGADをコードする核酸配列を含む単離DNA分子。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドGADをコードする核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドGADをコードする核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項１１】
真核宿主細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
酵母細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から選ばれる酵母細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
真核宿主細胞内で、請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドGADをコードする核酸配列を発現させ、そして当該発現産物を回収することを含む、ハイブリッドGADの製造方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から選ばれる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項14〜16のいずれか１項に記載の方法により製造された組換えハイブリッドGAD。
【発明の詳細な説明】
本発明の分野
本発明は、真核宿主細胞、特に酵母内での発現による組換えタンパク質としての、抗原性の（antigenically active）ハイブリッド・グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）の製造に、そしてインスリン依存性（１型）真性糖尿病（insulin-dependent（Type 1）diabetes mellitus（IDDM））の診断的及び前駆症状性の検出における上記組換えハイブリッドGADの使用に関する。本発明は、前駆症状性IDDMをもつと診断又は検出される個体におけるIDDMの発生を抑制又は防止するために上記ハイブリッドGAD分子の使用にも関する。
本発明の背景
インスリン依存性真性糖尿病（IDDM）は、膵臓島ベータ細胞の組織−特異的細胞質自己抗原の限られたセットに対す特徴的な免疫学的反応性が存在するところの自己免疫疾患である。これらの自己抗原の中の１つ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD；EC 4.1.1.15）に対する反応性は、上記疾患にとって事実上ユニークであり、稀な除外は、神経学的失調、Stiffman症候群（Solimena et al., 1990；Baekkeskov et al., 1990）、及び多腺性内分泌症候群１型及び２型である。グルタミン酸デカルボキシラーゼは、Ｌ−グルタミン酸からγ−アミノ酪酸（GABA）及び２酸化炭素（Erlander et al., 1991）への変換を触媒する。GABAは、主要な阻害性神経伝達物質であり、そしてこれ故、今日までGADに対するほとんどの研究が、神経の働きにおけるこの酵素の役割について集中的になされてきた。GADに対する抗体がIDDMにおいて蔓延しているという認識（Baekkeskov et al., 1990）をもって新たな方向が開かれた。
GADは、GAD65とGAD67と、それらの計算された分子量により名付けられた２つのアイソフォームとして存在する。これらは、それらの亜細胞位置（Erdo and Wolff, 1990；Faulkner-Jones et al., 1993）、染色体上の位置（Erlander et al. 1991；Karlsen et al., 1991；Bu et al., 1992；Michelsen et al., 1991）、アミノ酸配列（Bu et al., 1992）、及び補因子の相互作用（Erlander and Tobin, 1991）に従って相違するが、近いホモロジー、ヒトにおいて65％の同一性及び80％の類似性をもつ。上記アイソフォーム間の最大の相違（divergence）は、その最初の100アミノ酸内に生じる（Bu et al. 1992）。上記２つのGADアイソフォームをコードするcDNAクローンの入手可能性は、バクテリア（Kaufman et al., 1992）、バキュロウィルス・ベクターを使用したSf９昆虫細胞（Seissler et al., 1993；Mauch et al., 1993）、COS７サル細胞（Velloso et al., 1993）、ベビー・ハムスター腎細胞（Hagopian et al., 1993）、酵母（Powell et al., 1995）を含むさまざまな系において、及びウサギ網状赤血球溶解物（RRL）を使用したインビトロ翻訳（Petersen et al., 1994；Ujihara et al., 1994；Grubin et al., 1994）により、それらの発現を許容している。さらに、そのＮ−末端領域の疎水性アミノ酸２−45（含む）をもたない修飾GAD65が、酵母内で発現されている（Powell, et al., 1996）。
IDDMの主要な自己抗原としてのGADの同定は、リスク集団におけるIDDMの正確な診断及び予測のためのイムノアッセイにおけるこの抗原の広い使用を導いている。このような研究は、GADに対する抗体が、臨床的徴候の初期の開始の10年前まで患者において検出可能であるということが示されている（Baekkeskov et al., 1987, Atkinson et al., 1990；Rowley et al., 1992；Chen et al., 1993；Tuomilehto et al., 1994；Myers et al., 1996）。これらのアッセイは、２つの主要な源から得られた自己抗原性GADを利用している。１の源は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製され、そして放射性ヨウ素で標識された、動物材料、最も一般には、ブタの脳である。他の源は、ラジオイムノ沈降（RIP）アッセイ（Guazzaroti et al., 1995）のために好適な生合成において標識されたGADを作り出すウサギ網状赤血球溶解物（RRL）を使用した、クローン化ヒトGAD65遺伝子のインビトロ転写及び翻訳である。RRLからの発現は、ヒト血清における抗−GADについての診断アッセイにおいて広く使用されているが、上記インビトロ発現系は、GADの、ピコモルのオーダーにおける、ひじょうに少量だけが生産され、そしてその方法法がひじょうに高コストであるという点で、限界がある。バクテリア発現は、診断アッセイにおいて使用され易いGADを産生しないようであり、そして哺乳類細胞からの収率は、不適当に低い。数名の著者は、IDDM血清は、変性条件下では、ウェスタン・ブロッティングにおいてGADとの反応性を示さないが、非変性条件下では強い反応性を示すので、GADは、IDDMにおいて抗体と反応性である特定のコンホメーションにあるはずであるという証拠（Rowley et al., 1992；Tuomi et al., 1994, Myers et al., 1996）；そのように処理されているGADは反応性を喪失するので、多くのIDDM血清により認識されるGADコンホメーションは、還元剤、例えば、β−メルカプトエタノールへの暴露に対して感受性であるという（Tuomi et al., 1994）証拠を提示している。IDDMにおけるGAD65に対する抗体は、その分子の中央領域とＣ−末端領域内に横たわるその分子上特定のエピトープと反応するということも認められている。GAD65とGAD67の特定の配列をコードするcDNAsの融合物が、エピトープ認識を確立するために“キメラ”タンパク質として作製されている（Daw and Powers, 1995）。
免疫沈降及びいずれかのアフィニティー精製されたブタ脳GAD（Rowley et al., 1992）又は組換えGAD（Kaufman et al., 1992；Seissler et al., 1993；Mauch et al., 1993；Velloso et al., 1993；Hagopian et al., 1993；Petersen et al., 1994；Ujihara et al., 1994；Grubin et al., 1994）は、IDDM血清の70〜80％がGAD65に対する自己抗体を含み、一方において、ほんの８〜25％がGAD67に対する抗体を含むということを明らかにしている。スティッフマン症候群（Stiff-man syndrome）における自己抗体は、還元性条件下での免疫ブロッティングによりGADと反応し（Solimena et al., 1990）、一方、IDDMにおけるGADに対する自己抗体は、めったに反応せず（Baekkeskov et al., 1990）、そしてコンホメーションをもったエピトープを認識すると考えられている（Tuomi et al., 1994）。エピトープは、GAD65の中央及びカルボキシ末端ドメインに位置する１の主要なIDDM関連エピトープ（Kaufman et al., 1992；Richer et al., 1993；Ujihara et al., 1994）との、GAD65の短縮ポリペプチドに対するIDDM血清の免疫沈降による反応性を調べることによりマッピングされてきた。抗−GADのためのエピトープについての最新のマッピングは、２つの不連続エピトープ、アミノ酸244〜433内の１、及びアミノ酸451〜570内の他、の存在を示唆している（Daw and Powers, 1995）。興味深いことに、GAD65とGAD67の抗原性領域は高い相同性をもつので、GAD65は、それと自己抗体が優先的に反応性であるところのアイソフォームである。
IDDMについての診断アッセイのさらなる開発は、哺乳類源に関係する可能性のあるバイオハザードに無縁であるであろう、多量の組換えGADのよりアクセス可能な源からかなり利益を得るであろう。さらに、GADの疾患関連エピトープについてのサーチは、それを用いて、部位特異的突然変異誘発及び欠失試験を行うところの単純な系の入手可能性により、容易化されるであろう。GADが特定のコンホメーションにあるという要求は、多量の抗原性GADを作り出すための組換えDNA技術を使用する従来の努力を妨害してきた。E. coli発現系の使用は、酵素として活性なGADを作り出すと報告されているけれども（Kaufman et al., 1992）、イムノアッセイのためのバクテリアにより発現された抗原性GADの使用についての公表された報告は乏しく、そして上述のように、上記材料が、他の系内で発現されるGADよりも、有効ではなく、IDDM血清によるラジオイムノ沈降テストにおいて働くということが、本発明者の経験である。好ましい発現系は、多量のGADだけではなく、IDDM血清により認識される適当なコンホメーションにあるGADを生産することができなければならない。
本発明の要約
１の側面においては、本発明は、GAD65アイソフォーム由来の中央及びカルボキシ−末端成分と直接的又は間接的に連結されたGAD65アイソフォーム由来のアミノ−末端成分を含むハイブリッド・グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）を提供する。
キメラ分子ということもできる、このハイブリッド分子は、本明細書中、“ハイブリッドGAD67／65”ともいう。このハイブリッド分子の生成は、GAD65の中央及びカルボキシ−末端成分内の自己免疫エピトープの報告された位置、及びGAD67のcDNAのアミノ−末端成分が、組換えタンパク質の発現に適するベクター内への挿入に対してGAD65のcDNAよりもより扱いやすいという、本発明者らによる観察に基づく。
本明細書中に使用するとき、“アミノ−末端成分”への言及は、アミノ酸１〜アミノ酸90−105、より特にアミノ酸１〜アミノ酸95−101を含む成分をいう。同様に、本明細書中“中央及びカルボキシ−末端成分”への言及は、アミノ酸90−105〜アミノ酸585、より特にアミノ酸95−101〜アミノ酸585を含む成分をいう。本発明の特に好ましい態様においては、ハイブリッドGAD67／65分子は、GAD67（１−101）／GAD65（96−585）を含む。
好ましくは、アミノ−末端GAD67成分は、上記中央及びカルボキシ−末端GAD65成分に直接的に融合又は連結されるが、これらの成分は、場合により、１〜50の、好ましくは、１〜20の、そしてより好ましくは１〜５の、アミノ酸残基のリンカー成分を通して、間接的に連結されることができる。
本発明のハイブリッドGAD67／65分子は、その分子のいずれかの端においてそれに融合又はその他の方法で結合された他の成分、例えば、組換えタンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（又はGST）成分、β−ガラクトシダーゼ成分、又はヘキサ−His成分として製造されるとき、上記ハイブリッドGAD67／65分子の精製を支援する成分、をも含むことができる。
他の側面においては、本発明は、先に大まかに記載したようなハイブリッドGAD67／65分子をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子、好ましくはDNA分子を提供する。好ましくは、上記配列は、GAD67（１−101）とGAD65（96−585）をコードするcDNA配列の融合物を含む。
このような核酸分子は、上記ハイブリッドGAD67／65分子をコードする核酸配列を含む、組換えDNA分子、組換えDNAクローニング媒体又はベクター、又は宿主細胞、好ましくは、真核宿主細胞、を含むことができる。
本発明者らは、上記ハイブリッドGAD67／65分子が、酵素として活性なGADの良好な収率を提供するためにバクテリア（E. coli）系内で発現されることができるが、バクテリアにより発現されたハイブリッドGAD67／65の免疫反応性は理想的ではないということを発見した。従って、真核宿主細胞、特に酵母種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）内での発現が好ましい。
従って、好ましい側面においては、本発明は、真核宿主細胞、特に酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）内でのハイブリッドGAD67／65分子をコードする核酸配列の発現、及びその発現産物の回収を含む、ハイブリッドGAD67／65分子の製法を提供する。
本発明は、上記のような、宿主細胞内、特に酵母細胞又は他の真核宿主細胞内での発現により生産される組換えハイブリッドGAD67／65にも広げられる。
真核宿主細胞、特に酵母、例えばS. cerevisiaeその他真核宿主細胞内での組換えタンパク質の発現のために好適な、発現制御配列及び宿主細胞のクローニング媒体又はベクター組合せ物は、本分野において周知であり、そして例えば、Sambrook et al.（1989）中に及びSudbery（1996）により記載されている。
本発明に係る組換えハイブリッドGAD67／65は、有利には、先に記載されたアッセイ技術を使用したヒト又は非−ヒト哺乳類の診断及び前駆症状の検出における精製された生来の又は組換えGAD65の代わりに、使用されることができる。
従って、さらに他の側面においては、本発明は、先に広く記載されたようなハイブリッドGAD67／65が、患者から採取された血清又は他のサンプル中のGADに対する自己抗体を検出するために使用されるということを特徴とする、患者におけるIDDMの診断及び前駆症状の検出方法を提供する。
さらなる側面においては、本発明は、患者に先に記載したようなハイブリッドGAD67／65の有効量を投与することを含む、前駆症状性IDDMをもつ患者におけるIDDMの発生を抑制し又は防止するための処置方法を提供する。好ましくは、ハイブリッドGAD67／65は、粘膜経路により、最も好ましくは、経口投与により、投与される。
上記処置方法は、自己抗体についてのイムノアッセイ又は他の診断方法による（臨床前状態（すなわち、前駆症状性IDDM））における患者において検出されるとき、IDDMを抑制し又は防止するために使用されることができる。大まかに言えば、上記処置の目的は、正常な免疫寛容を再確立し、そしてそれによりIDDMを引き起こす自己免疫プロセスを排除することである。従って、本明細書中、“抑制する”又は“抑制”、又は“防止する”又は“防止”への言及は、膵臓島細胞の自己抗原性成分に対する免疫寛容（“寛容原性（tolerogenesis）”）の状態を再誘導するような方法で及びそのような条件下で、ハイブリッドGAD67／65の投与による患者の膵臓島細胞に影響を及ぼす自己免疫の状態の変更をいうと意図される。
本明細書の全体にわたり使用されるとき、用語“患者”は、ヒトと非ヒト哺乳類の両者を含む。好ましくは、患者はヒトである。しかしながら、本発明の診断及び治療方法は、非ヒト哺乳類、例えば、家畜、ペット（companion animals）、実験動物及び捕獲野生動物においても適用可能であると理解されるべきである。家畜は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、及びブタの如き動物を包含し、ペットは、全種のイヌ及びネコを含み、実験動物は、マウス、ラット、モルモット、及びウサギを含み、そして捕獲野生動物は、例えば、サル、カンガルー等を含むと理解されるべきである。
さらに他の側面においては、本発明は、前駆症状性IDDMをもつ患者におけるIDDMの発生を抑制し又は防止するための処置のための医薬又は獣医学組成物の製造における、先に大まかに記載したようなハイブリッドGAD67／65の使用を提供する。
本発明は、１以上の医薬として許容される担体及び／又は希釈剤と共に、先に大まかに記載したようなハイブリッドGAD67／65を含む、前駆症状性IDDMをもつ患者におけるIDDMの発生を抑制し又は防止するための処置における使用のための医薬又は獣医学組成物をも提供する。
このような医薬又は獣医学組成物の配合は、当業者に周知である。好適な医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、いずれかの及び全ての、慣用の溶媒、分散媒質、増量剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗バクテリア及び抗菌類剤、等張及び吸収遅延化剤、その他を含む。医薬活性物質のための上記媒質及び剤の使用は、本分野において周知であり、そして例えば、Remington’s Pharmacontical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA中に記載されている。いずれかの慣用の媒質又は剤がその活性成分と非適用性でない限り、本発明の組成物中でのそれらの使用も企図される。補助的な活性成分も本組成物中に取り込まれることができる。
投与を容易にするための、そして投与量を一定にするための単位投与形態において組成物を配合することが特に有利である。本明細書中に使用するとき、単位投与形態とは、処置されるべきヒト被験体のための単位投与量として好適な物理的に別個の単位であって、各単位が、要求される医薬担体及び／又は希釈剤と共に所望の治療効果を作り出すと計算された所定量の活性成分を含有するものをいう。本発明の新規単位投与形態のための指示は、（ａ）活性成分のユニークな特徴及び達成されるべき特別の治療効果、及び（ｂ）特定の処置のための上記活性成分を混合する分野に固有な限定、により指図され、そしてそれらに直接的に依存する。
さまざまな投与経路を利用することができる。選択された特定のモードは、もちろん、処置されるべき特定の条件、及び最適な治療的効果を提供するために決定される投与量に、依存するであろう。本発明の方法は、一般に、本発明の活性成分との粘膜接触を許容するいずれかのモードを意味する、医薬として許容されるさまざまな投与モードを使用して行われることができる。経口、鼻、又は腸経路を含む、粘膜投与が、好ましい。
本発明に従うハイブリッドGAD67／65の寛容原性調製物のための最適な配合物、例えば、粘膜経路により投与されるとき有効な、単なる水性又は塩溶液又は他の医薬組成物は、日常的な試験及び実験により容易に決定されることができる。好適な配合物は、GAD分子に対する天然の寛容の再確立を許容し、そしてそれにより、上記のような有害な自己免疫反応を排除する。
本明細書を通して、その文脈がその他を要求しない限り、用語“含む（comprise）”、又は変種、例えば、“comprises”又は“comprising”は、いずれかの他の完全体又は完全体群を除外することではなく、言及された完全体又は完全体群を含むことを意味すると理解されるであろう。
本発明の詳細な説明
本発明に従って、GADの新規ハイブリッド形態が、１の特定の態様においては、ヒトGAD67のアミノ酸１−101をコードするcDNAと、ヒトGAD65タンパク質のアミノ酸96−585をコードするcDNAとの間の融合物である核酸配列の発現により、作製される。このハイブリッドGAD67／65は、酵母S. cerevisiae内で高活性ホスホグリセレート・キナーゼ・プロモーター（PGK 1）の制御下で構成的に発現されてきた。従って、酵素的に活性なハイブリッドGADの実質的なレベルが、酵母、例えば、S. cerevisiae内で容易に作り出されることができることが証明されている。最も顕著には、このハイブリッドGADは、単一のアフィニティー・クロマトグラフィー工程により精製されることができるであろうし、そしてその精製されたハイブリッドGADは、そのような血清が抗−GADを含むとき、IDDMをもつ患者の血清と高く反応性である適当なコンホメーションをもっていた。小規模調製において得られた精製タンパク質の量、0.3〜0.5mg／リッターは、分子レベルにおける詳細な研究のためには十分な量なものであった。より多くの量は、醗酵容器の容量を増加させ、そして使用するアフィニティー・カラムの能力を高めることにより容易に得られることができる。なぜなら、組換え酵母を使用する資源の供給に制限がないからである。低コストにおいて多量に酵母を増殖させる能力は、他の哺乳類発現系を超える大きな利点である。真核生物であるので、酵母系は、翻訳後修飾の保持の点で、原核発現系、例えば、E. coliよりも優れている。
GAD65のＮ−末端領域は、パルミトイル化され、そしてそれ故、ひじょうに疎水性であり、そしてこれにより、その精製されたポリペプチドが、それが接するところの表面に接着するようにされるようである。これは、組換えGAD65の製造における別個の欠点である。ハイブリッドGAD67／65の場合、GAD65のＮ−末端疎水領域は、天然においてより親水性であるGAD67のＮ−末端領域により置き替えられている。このハイブリッドGADが、35Ｓ−メチオニンの存在下、ウサギ網状赤血球溶解物中でのインビトロ転写及び翻訳により合成されたとき、得られた産物は、IDDM血清を使用したラジオイムノ沈降における精製ブタGADに匹敵する反応性を含むことが示された。それ故、酵母においてハイブリッドGADを発現させる有用性は３倍である：それは酵素として高活性であり、それはIDDM血清のために免疫学的に強力であり、そしてそれは精製の間はるかに容易に回収されることができる。
本明細書中に詳細に記載するアフィニティー・クロマトグラフィー手順に加えて、本分野に周知の他の適当なタンパク質精製手順も、例えば、経口投与される医薬組成物において、診断イムノアッセイにおける使用のために、又は上記のような誘導された寛容原性によりIDDMを抑制し又は防止するための患者の処置における使用のために、好適な精製ハイブリッドGAD67／65産物を製造するために使用されることができるということが理解されるであろう。
本発明のさらなる特徴を、以下の実施例においてさらに詳しく説明する。しかしながら、この詳細な説明は、本発明を例示する目的だけをもって包含され、そして上記のように本発明の大まかな説明についての制限として、いかなる方法においても理解されてはならないということを理解すべきである。
添付図面において：
図１。精製ブタ脳GADとRRL発現されたヒト脳GAD65の間の、免疫沈降により検出されたときの、IDDM血清の反応性の相関。この相関は有意であった（ｐ＜0.005）。
図２。精製ブタ脳GADとRRL発現されたハイブリッGAD67／65の間の、免疫沈降により検出されたときの、IDDM血清の反応性の相関。この相関は高く有意であった（ｐ＜0.001）。
図３。RRL発現されたヒト脳GAD65とハイブリッドGAD67／65の間の、免疫沈降により検出された、IDDM血清の反応性の相関。この相関は有意であった（ｐ＝0.002）。
図４。（ａ）非還元条件、及び（ｂ）還元条件下で分離された、RRL発現されたハイブリッドGAD67／65によるラジオイムノアッセイ（RIA）後の、IDDMとNHSの、プロテインＡ sepharoseペレットのSDS−PAGEゲルのオートラジオグラフ。ハイブリッドGAD67／65とのRIAによる高反応性のIDDM血清のペレットは、レーン１と２内に含まれ、ハイブリッドGAD67／65との弱い反応性はレーン３内に含まれ、そして非反応性NHSはレーン４−７内に含まれる。非還元条件下、〜130と110kDaの２つのバンドは、IDDM血清により沈降され、これは、還元条件下、〜65及び45kDaの並びにより低分子量のバンドに還元された。NHSは、上記130又は65kDaバンドのいずれをも沈降させなかった。非還元条件下での、上記分子の130−110kDa形態とのGADの特定の免疫反応性は、Rowley et al.（1996）により記載されている。
図５。pMONBC 6の略図。黒い領域は、アンピシリン耐性（bla）及びバクテリア・プラスミドの複製起点（ori）を特定する配列を含む、E. coli DNA配列を表す。灰色の領域は、酵母プラスミド複製起点（２μ）、選択マーカーLEU 2、並びにPGK 1遺伝子からの転写制御配列であって、PGK 1プロモーター（PGK 1 p）及びPGK 1ターミネーター（pGK 1 t）を含むものを含む、酵母DNA配列を表す。図示されるような、GAD67のアミノ酸残基１−101が、GAD65のアミノ酸残基96−585に融合されているところの、ハイブリッドGAD67／65をコードするDNA配列を、親ベクターpAS−１のBamH I／Not Iクローニング部分（▲として示す）にクローン化して、pMONBC 6を作製した。略号：Ｂ，BamH I；Ｈ，HindIII；Bg，BglII；Ｎ，Not I。
図６。酵母溶解物から精製されたハイブリッドGAD67／65の分析。精製の間、清澄化のさまざまな段階から集めた酵母溶解物を、記載したように（方法）試験した。Ｓ１−４は、それぞれ、レーン１−３，４−６，７−９、と10に示される。レーン11−21内に示されるＦ１−11は、GAD−１アフィニティー・カラムからのハイブリッドGADの溶出の間に集められた最初の11画分（１ml容量）である。試験された溶解物を、YRD15（レーン１，４、と７）YpAS−１（レーン２，５、と８）；そしてYGAD−２（レーン３，６，９、と10）から調製した。パネルＡは、GAD−６を使用したウェスタン・ブロット分析であり、そしてパネルＢは、銀染色分析である。7.5％のアクリルアミドを、上記SDS−PAGEのために使用した。
図７Ａ。ラジオ−イムノ沈降による、酵母ハイブリッドGAD67／65と精製ブタ脳GADの比較。試験された血清は、第２回国際GAD研究会に提出されたものであった。血清を、ラジオイムノ沈降により、GADに対する抗体の存在について分析した。これらの結果を、100ユニットを含むと定義された、標準参照血清に従う、参照ユニット（Rowley et al., 1992）として表す。組換え酵母GADとブタ脳GAD免疫沈降結果の間の相関係数（ｒ）は、高く、0.94である。
Ｂ。ラジオイムノ沈降（RIP）による、−20℃で18ケ月間保持された酵母ハイブリッドGAD67／65と精製されたブタ脳GADの比較。試験された血清は、真性糖尿病をもつ患者からランダムに得られたコレクションであり、そして結果は、図７Ａ中に示されるように表す。上記の保存された組換え酵母GADとブタ脳GAD免疫沈降結果の間の相関係数は高く、0.93である。結果の比較性は、100ユニットまでの上記RIPアッセイの信頼性の範囲内で最適であり、それを超えると、血清の滴定が、正確な定量のために要求される（Chen et al., 1993）。
図８。pMONTP 1の略図。上記ベクターの構築のためのコーディン、及び使用される略号は、図５のために記載したものと同じである。６つのヒスチジン残基（ヘキサヒスチジン・タグ）をコードするヌクレオチドの、ハイブリッドGAD67／65のためのcDNAの３′末端における導入を示す。
実施例１
上記実施例は、ウサギ網状赤血球溶解物を使用したインビトロ転写及び翻訳により発現されたハイブリッドGAD67／65が、IDDMにおける血清の抗−GAD反応性を証明するためのイムノアッセイにおいて、GAD65と同様に十分に有効であるということを示す。
材料及び方法
GAD cDNAクローン
ヒト脳GAD65と脳GAD67、及びネコ（Ｆ）脳GAD67をコードする脳由来cDNAsは、Dr. A. Tobinから寄贈された。Ｈ−GAD65とＨ−GAD67は、両者、Ｔ３プロモーターの制御下、それぞれ、pBSGAD65とpBSGAD67と命名された、Bluescript−SKベクター（Stratagene, USA）内に含まれていた。GAD65の1755bpのコーディング領域は、Sac IとEcoR Iクローニング部位間の2010bp挿入物内に含まれ、そしてGAD67の1785bpコーディング領域は、EcoR Iクローニング部位内の2700bp挿入物内に含まれていた。1878bpのＦ−GAD67は、SP 6プロモーターの制御下、pGEM−Ｆ GAD67と命名された、pGEM−４ベクター（Promega, USA）のEcoR IとXba Iクローニング部位間にコードされていた。
GAD65のアミノ酸１−95をコードするcDNAの領域を、GAD67からのアミノ酸１−101をコードするcDNAの領域で置き替えることにより、GAD67（１−101）／GAD65（96−585）（ハイブリッドGAD67／65）と命名された、ヒト脳GAD65とGAD67の併合領域からなるハイブリッド分子を構築した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、GAD67のアミノ酸１−101をコードするDNA配列を選択的に増幅するために使用した。５′オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は、その５′末端にSac I制限部位を取り込んでいた５′TGGAGCTCATGGCGTCTTCGACCCCATCT３′であった。３′オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は、５′TTCGCCGGCAGATCTCTAGCAAA３′であり、それは、連結的に、Ｈ−GAD65遺伝子によりコードされたアミノ酸配列の変更を伴わずにその３′末端にBsrF I部位を取り込んでいた。pBSGAD67と共に上記２つのプライマーを使用したPCRは、303bpの産物をもたらした。上記Bluescript SKベクター、pBSGAD65内のGAD65を、まずSac Iで、そして次にBsrF Iで消化することにより、上記GAD67 PCR断片のライゲーションのために調製した。上記プラスミド内の多数のBsrF I部位の存在に因り、〜５μｇのSac I消化されたGAD65プラスミドが、0.2ＵのBsrF Iによる時間経過消化に供され、アリコートを、10，20，30，40、及び60分目に取り出し、そしてアガロース・ゲル電気泳動により調べた。上記消化産物の4.6kb DNA断片を回収し、そしてGAD67 PCR産物とライゲートした。pBSGAD67／65と命名された、GAD67／65のための得られたハイブリッドcDNAクローンを、DNA配列分析により特徴付けた。得られたハイブリッド・クローン内のGAD65とGAD67の間の融合点のDNA配列決定により、その組換え分子が正しく作られていたことが確認された。
GADの製造
GADを、ウサギ網状赤血球溶解物（RRL）系を使用したインビトロ転写及び翻訳により発現させた。転写前に、それぞれ、ヒトGAD65とハイブリッドGAD67／65をコードするプラスミドpBSGAD65とpBSGAD67／65を、EcoR Iを使用してその３′非コーディング領域で線状化し、そしてプラスミドpGEM-F-GAD67を、Xba Iを使用して線状化した。１μｇのプラスミドDNAの転写は、40mM Tris-HCl、pH7.9、６mM MgCl2、２mMスペルミジン、10mMジチオトレイトール、500μＭの各ATP，GTP，CTP、及びUTP、100μｇ／ml BSA、1000Ｕ／ml RNAsin（Promega）、並びに600Ｕ／mlのＴ３又はSP 6 RNAポリメラーゼのいずれかを含む20μｌ反応混合物中で行われた。この混合物を、38℃で60分間インキュベートした。転写を、５μｌの５mM EDTAを上記転写混合物に添加することにより停止させた。メチオニンを枯渇させた10μｌの１mMアミノ酸混合物を補った200μｌのヌクレアーゼ処理RRL、40μｌ〔35Ｓ〕−メチオニン（＞1200Ci／mmol）、及び５μｌ RNAsin（40,000Ｕ／ml）から成る翻訳カクテルを、上記転写混合物への添加前に併合した。上記翻訳反応物を30℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、この混合物を遠心分離し、そしてその上清を、50μｌアリコートとして−80℃で保存した。ラジオイムノ沈降アッセイにおける使用の前に、RRL翻訳されたGADをNAP 5カラムに通して、遊離〔35Ｓ〕−メチオニンからその翻訳産物を分離させた。
血清
試験された血清は、National Diabetes Data Groupの基準（1979）に従って診断されたIDDMをもつ50人の患者からのものであった。これらの血清を、ラジオイムノ沈降アッセイ（以下、参照）に従ってブタ脳GADに対する自己抗体について陽性であるかどうかに従って事前−選択した。対照を、50の健康な被験体からの血清のプールから得た。
ブタ脳GADを使用した抗−GADについてのラジオイムノ沈降アッセイ
GADを、差次的（differential）遠心分離、及びモノクローナル抗体、GAD 1で抱合されたアフィニティー・カラムにその上清を通過させることにより、ブタ脳から調製した。GAD65とGAD67の混合物を含む、その後の調製物を、クロラミンＴ手順を使用して125Ｉで標識付けした。これらの方法は、Rowley et al., 1992により記載されている。
RRLにおいて製造されたGADを使用したラジオイムノ沈降アッセイ
RRLを使用して得られたゲル−精製されたGAD調製物を、アッセイ前に正常なヒト血清（NHS）を用いて“事前−清澄化（pre-cleared）”した。200μｌのNHSを、200μｌの精製GADに添加し、そして４℃で60分間保持した。洗浄バッファー〔20mM Tris、150mM NaCl、0.5％（ｗ／ｖ）Triton X-100、pH7.4〕中に懸濁された50％プロテインＡ Sepharose（Pharmacia, Sweden）200μｌを次に添加し、そして４℃で60分間、上記NHSとウサギ網状赤血球溶解物発現されたGADと共に保持した。この混合物を690×ｇで２分間遠心分離し、そしてその上清を、抗原の源として使用した。免疫沈降を、50μｌの合計容量において、40,000DPMの“事前−清澄”GAD、25μｌの試験血清、及び洗浄バッファーを添加することにより行った。４℃で16時間インキュベーションした後、50μｌの50％プロテインＡ Sepharoseを添加し、そして４℃で60分間インキュベートした。１mlの洗浄バッファーを各サンプルに添加し、これらのサンプルを690×ｇで２分間遠心分離して、そのプロテインＡ Sepharoseビーズをペレット化し、そしてその上清を捨てた。これらのペレットをさらに３回洗浄し、次に１mlミンチラントと共に激しく撹乱し、そしてガンマ・カウンター内でカウントした。
ハイブリッドGAD67／65の免疫沈降された形態
IDDM血清により沈降されたハイブリッドGAD67／65の分子量を調べた。免疫沈降後、プロテインＡ Sepharoseペレットを、還元及び非還元条件下10％ゲル上のSDS−PAGEにより分離した。これらのゲルを、50％（ｖ／ｖ）メタノール、10％（ｖ／ｖ）酢酸中で60分間、そして次に30分間５％（ｖ／ｖ）メタノール、10％（ｖ／ｖ）酢酸中で固定し、そして真空下濾紙上で乾燥させる前に60分間Amplify溶液（Amersham, UK）中に浸漬した。これらのゲルを、発色させる前−80℃で２週間カセット内でFuji Medical X-Rayフィルム（Fuji, Australia）で重層した。
統計的分析
データを、Complete Statistical System（StatSoft Inc, USA）コンピュータ−・プログラムを使用して分析した。データを、算術平均と標準偏差として計算した。その有意差を、独立のサンプルについてStudent’s t−検定によりテストした。相関を、ピセソン積モーメント相関係数テストを使用して求めた。
結果
異なる起源をもつGADとのIDDM血清の反応性
ウサギ網状赤血球溶解物系内で全て発現された、組換えGAD65、組換えＦ−GAD67、及びハイブリッドGAD67／65との、NHSとIDDM血清の、RIAによる反応性の頻度を、測定し、そして表１中に示す。各抗原についての陽性反応のためのカット・オフを、NHSにより沈降された平均DPM上３標準偏差（SD）として定義した（表１）。これらの血清は、ブタ脳から精製されたGADとのRIAによる反応性について事前選択されたということに留意すべきである。陽性反応の頻度は、GAD65，Ｆ−GAD67、とハイブリッドGAD67／65について、それぞれ、90％、40％、と92％であった。Ｆ−GAD67と反応したIDDM血清の40％の中では、全てが、GAD65とハイブリッドGAD67／65とも反応した。ハイブリッドGAD67／65と反応しなかった４つのIDDM血清の中では、２つがGAD65と反応したが、Ｆ−GAD67とは反応しなかった。そして２つが完全に非反応性であった。
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相関を、異なる起源をもつGADの調製物とのIDDM血清の反応性の間について求めた。有意な相関が、精製されたブタ脳GADと組換えＨ−GAD65（ｐ＜0.001，Ｒ＝0.670）とIDDM血清の反応性について−図１参照、精製されたブタ脳GADとハイブリッドGAD67／65（ｐ＜0.001，Ｒ＝0.6722）の間について−図２参照、そして組換えＨ−GAD65とハイブリッドGAD67／65（ｐ＜0.002，Ｒ＝0.675）の間について−図３参照、見られた。相関は、ブタ脳GADと組換えＦ−GAD67、組換えGAD65と組換えＦ−GAD67、又はハイブリッドGAD67／65と組換えＦ−GAD67との、IDDM血清の反応性の間に見られた。
IDDM血清により沈降されたハイブリッドGAD67／65の形態
IDDMと正常被験体の血清と反応性であったハイブリッドGAD67／65を、還元及び非還元条件下でのSDS−PAGE及びオートラジオグラフィーにより調べた。３人のIDDM患者と４人の正常ヒト被験体からの35Ｓ−標識ハイブリッドGAD67／65による免疫沈降後に得られたプロテインＡ Sepharoseペレットは、非還元条件下、IDDM血清が、〜130と110kDaの２つのバンドを沈降させ、そして還元条件下、β−メルカプトエタノールの存在下、これらのバンドが〜65と45kDaに還元されたことを示した（図４）。
実施例２
本発明は、酵母におけるハイブリッドGAD67／65の発現についてのベクターの変化、抗体アフィニティー手順によるその発現された産物の精製、及びラジオイムノ沈降アッセイにおける放射標識された産物の使用を示す。
材料及び方法
微生物株及びベクター
Escherichia coli株DH 5α〔recA I  endA I  gyrA96 thi-l relA I  SupE44 ΔlactU169（φ80 lacZΔM15）hsdR17〕を、全てのサブ−クローニング目的のために使用した。Saccharomyces cerevisiae株YRD15（MATa ura3-2513-373, his-11, leu2-3 2-11）、Dr. R.J. Devenish（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Australia）から寄贈品を、ヒト組換えGADの発現及び精製のために使用した。ほとんどの酵母発現実験のために、プラスミドpAS−１に基づく構築物を使用したが（詳細については以下を見よ）、初期の試験においては、pYES 2（Invitrogen）に基づく構築物を使用した。
酵母発現ベクターpAS−１，pYEPLAC191の変種（Gietz and Sugino 1988）を、Dr. A. Stratton及びDr. R.J. Devenish（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Australia）から得た。それは、異種遺伝子の高レベルの構成的発現を駆動するための酵母ホスホグリセレート・キナーゼ（PGK 1）プロモーター及びターミネーター要素、高コピー数を提供するための２μｍの複製起点、及び宿主株内でプラスミドを維持するためのLEU 2選択マーカーを含む（図５参照）。
プラスミドpMALGAL67／65を、pMALのEcoR I部位内にＨ−GAD67 cDNAを含むプラスミドpMALGAD67の、Sal Iによる消化、及びNco Iによる部分消化により、pBSGAD67／65（実施例１参照）から得た。6243bp断片を、精製し、そしてSal IとNco IによるpBSGAD67／65の消化により解放された1876bp断片にライゲートした。従って、プラスミドpMALGAD67／65を、Ｈ−GAD67のアミノ酸１−101に融合されたマルトース結合性タンパク質（MBP）をコードするDNA配列を用いて得て、これを次に、Ｈ−GAD65のアミノ酸96−585に融合した（ハイブリッドGAD67／65）。
pMONBC 6、ハイブリッドGAD67／65を担持する酵母発現ベクターpAS−１の構築
酵母におけるハイブリッドGADの発現のためのベクターの構築を、２段階において達成した。第１段階においては、ハイブリッドGAD分子を、pMALGAD67／65から、誘導性プロモーター系pYES 2のEcoR I部位にサブ−クローン化して、pMONBC 3を作製した。GAL 1プロモーターを担持する上記プラスミドを、酵母YRD15内に形質転換したが、組換えハイブリッドGADの収率は低かった（データを示さず）。これ故、構成的発現を提供するPGK 1プロモーターを含むプラスミドpAS−１をテストした。ハイブリッドGAD67／65遺伝子を担持するBamH I−Not I断片を、pMONBC 3から再単離し、そしてpAS−１のBglII−Not I部位内にサブクローン化して、プラスミドpMONBC 6を作製した（図５）。
S. cerevisiaeにおける組換えハイブリッドGAD67／65の発現
YRD15株を、酢酸リチウム法（Elble, 1992）を使用してプラスミドpMONBC 6で形質転換した。形質転換体（YGAD−２）を、アミノ酸を含まない0.67％酵母ナイトロジェン・ベース、２％グルコース、20mg／Ｌウラシル、及び20mg／Ｌヒスチジンを含む、合成最小グルコース培地、SD＋ura＋his上で選択した。発現のために、一夜培養物を、振とうしながら、液体SD＋ura＋his培地中で28℃で培養し、次に１％酵母エキス、10％グルコース、20mg／Ｌウラシル、20mg／Ｌヒスチジン、0.12％（NH4）2SO4、0.1％KH2PO4、0.07％MgCl2、0.05％NaCl、0.01％CaCl2、及び0.005％FeCl3を含む選択培地（sacc）中で１：50に希釈し、そして振とうしながら28℃でさらに18−20時間培養した。高グルコース濃度を、PGK 1プロモーターの最大誘導を支持するように選んだ。培養後、それら培養物を４℃における遠心分離により収穫し、そして酵素精製のために使用した。対照として、YRD15も、上記のように親プラスミドpAS−１で形質転換させ、そして得られた形質転換体（YpAS−１）及び酵母宿主を、YGAD−２におけるハイブリッドGAD発現の試験におけるネガティブ・コントロールとして使用した。
S. cerevisiaeからの組換えハイブリッドGAD67／65の精製
上記酵母細胞の粗溶解物を、６回の30秒間パルスにおいて、パルス間氷上での30秒間を用いて、等容量のガラス・ビーズ（425−600μｍ直径）及び溶解バッファー（50mM KH2PO4、１mM EDTA、１mM臭化アミノエチルイソチオウロニウム（AET）、20μＭピリドキサル・リン酸（PLP）、10mM ２−メルカプトエタノール、0.5mMフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）及び10mMのグルタメート、pH7.2）と共に、上記細胞をボルテックスすることにより得た。この溶解物を、５分間5000ｇでの遠心分離により、上記ビーズと無傷の細胞から分離した。これらのビーズと細胞ペレットを、もう一方の容量の溶解バッファー中に再懸濁させ、上記のようにボルテックス及び遠心分離し、そして集めた溶解物を、第１の上清と併合した。このプールされた溶解物（Ｓ１）を、10分間18,500×ｇで遠心分離することにより清澄化してＳ２を調製し、これをさらに、60分間100,000×ｇでの超遠心分離により清澄化した。集めた上清を0.2μｍフィルターを通して濾過して、浮遊材料を除去し、そしてＳ３を調製した。Ｓ３中の組換えハイブリッドGADの精製を、ブタ脳GADの精製に関して（Rowley et al., 1992）、臭化シアン活性化Sepharoseに抱合されたモノクローナル抗体GAD−１（Chang and Gottlieb, 1988）を使用したアフィニティー・クロマトグラフィーにより行った。上記カラムに結合された組換えハイブリッドGADを、高pHバッファー（pH10.5）で１ml画分（Ｆ）内に溶出させ、そしてこれらを、直ちにpH７に中和した。Ｓ１−Ｓ３の一部、及びフロー−スルー（Ｓ４）並びに上記溶出画分の全てを、タンパク質推定及び酵素アッセイ、SDS−PAGE、イムノブロッティングを含む他の分析試験、並びに免疫沈降のためのヨウ素化におけるそれらの使用に先立って、30％グリセロール中−20℃で保存した。
GAD精製プロセスを通じて集められた画分の特徴付け
溶解物（Ｓ１−Ｓ４）と精製画分（Ｆ１−11）を、SDS−PAGE、及びGAD65アイソフォームと反応するモノクローナル抗体GAD−６（Chang and Gottlieb, 1988）を使用したイムノブロッティングにより組換えハイブリッドGADの存在について分析した。GAD−６についてのエピトープは、GAD65のＣ−末端領域にマッピングされており（Daw and Powers, 1995）；従って、GAD−６はハイブリッドGAD67／65と反応するであろうということが予想された。GAD酵素活性を、先に記載されたような（Rowley et al., 1992）、より酸性度の大きな3Ｈ−グルタメートから3Ｈ−GABAを分離するためのアニオン交換樹脂（Bio-Rad AG▲Ｒ▼１−Ｘ８）を使用するスピン・カラム・クロマトグラフィー手順により、測定した。タンパク質濃度を、製造者の指示に従って、Bradford染色結合手順（Bio-Rad Protein Assay）により測定した。
IDDM血清によるヨウ素化組換えハイブリッドGAD67／65の免疫沈降
IDDMと非IDDM血清による、ヨウ素化組換えハイブリッドGAD67／65の免疫沈降を、先に記載したように行った（Rowley et al., 1992）。分析された100の血清は、the Second International GAD Antibody Workshop（Paris, France, 1994）に提出されたものであった。放射性ヨウ素化された酵母ハイブリッドGAD67／65を使用して得られた結果を、実験室からのブタ脳GADの標準調製物（Rowley et al., 1992；Chen et al., 1993）を使用して得られたものと比較した。
結果
YGAD−２における組換えハイブリッドGAD67／65の発現
組換え酵母YGAD−２におけるハイブリッドGAD67／65の発現を、粗細胞溶解物Ｓ１についての酵素アッセイ及びウェスタン・ブロットにより試験した。GADタンパク質の感知されるほどの量とGAD酵素活性の程度が検出されることができた。組換え酵母YGAD−２、並びに対照YRD15とYpAS−１の全てから調製されたＳ１中のGAD酵素活性の結果を表２中に示す。高レベルのGAD酵素活性、8.4nmol／分／mgが上記組換え酵母から観察され、これは、上記酵母宿主YRD15からのもの、0.68nmol／分／mg、及び対照YpAS−１からのもの0.73nmol／分／mgよりも有意に高かった。このレベルの酵素活性は、GAD調製物のために広く使用されてきた；例えば、ヒト及びブタ脳ホモジネートについては、それぞれ、0.124と2.4nmol／分／mgと報告された（Blindermann et al., 1978；Spink et al., 1985）脳ホモジネート中のGADについて先に報告されたレベルを十分に上廻るものである。但し、上記脳ホモジネート中のGAD酵素活性は、上記材料の新鮮さに従ってかなり変化するかもしれない。上記酵母溶解物中の高レベルのGAD酵素活性、並びに上記酵母材料の品質をコントロールする能力は、酵母からのGAD精製プロセスの明らかな長所である。
0003876001.tif 000003
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ウェスタン・ブロット上のGAD65に向けられたモノクローナル抗体GAD−６の使用は、YGAD−２からの酵母溶解物中の少なくとも２つの主要なGAD産物を明らかにした。これらの１は64kDaに対応し、そして他は60kDaに対応する（図６Ａ、レーン３）。この64kDa産物は、上記ハイブリッドGAD67／65構築物の全体長によく対応し、一方、この60kDa産物は、Ｎ−末端短縮ハイブリッドGAD産物を表すであろう（以下を見よ）。上記２つのバンドの相対強度に基づき、上記全体長産物の量は、上記短縮産物の量よりも約２〜３倍、大きなものであろう。45kDaに対応する小さな産物も観察されたが、その同一性をさらに調べた。YRD15とYpAS−１株から調製された細胞溶解物についてのウェスタン・ブロット分析は、シグナルを全く示さなかった（図６Ａ、レーン１と２）。同様に、その中でYGAD−２が増殖したところの培養基については、シグナルは全く検出されなかった。
Ｓ１についてのGAD酵素活性とウェスタン・ブロットの上記結果は、組換えハイブリッドGAD67／65が、高レベルにおいて、そしてひじょうに高い酵素活性をもって発現され、そして、見たところ、酵母宿主の細胞質ゾル中で安定していたということを示した。
組換えハイブリッドGAD67／65の精製
酵母溶解物からのその調製の間にGADタンパク質の初期損失があったけれども、GADの高い酵素反応性、かつ、純粋な調製物が、モノクローナル抗体GAD−１を使用して、１段階のアフィニティー・クロマトグラフィーにより得られることができた。酵母からの組換えハイブリッドGADの精製のための手順は、ブタ脳のために記載されたもの（Rowley et al., 1992）と同じであった。ハイブリッドGADの調製物の、さまざまな段階、Ｓ１−Ｓ４、及びＦ１−Ｆ11から回収されたGADの量を、GAD酵素アッセイ、SDS−PAGE、及びウェスタン・ブロットによりモニターした。典型的な調製物からの結果を、表２、及び図６Ａ中に示す。酵素活性（表２）を考慮すると、Ｓ１とＳ２について、それぞれ、8.4〜7.5nmol／分／mgの酵素活性の僅かな低下があった。しかしながら、Ｓ３については、100,000ｇにおける超遠心分離後の、4.8nmol／分／mgへの酵素活性の実質的な減少があった。上記超遠心分離の間のハイブリッドGADの上記損失は、上記溶解物の清澄化についての妥協とみなされた。これは、カラム・クロマトグラフィーにとって本質的なものであった。それにも拘らず、Ｓ３中に残存したGAD活性の上記量は、ブタ脳からの調製物について報告されたもの、2.4nmol／分／mg（Spink et al., 1985）の未だ２倍の量であった。
表２中に示すように、上記カラム上でのGAD−１抗体とのインキュベーションの間、酵素活性は、フロー−スルーＳ４中、ごく少量、0.6nmol／分／mgになった。これは、組換え酵母ハイブリッドGADが、上記カラム中のGAD−１抗体に有効に結合したということを示している。１mlの画分を集め、そして0.5ｇのグリセロールを、Ｓ１−Ｓ４に関して、各画分に添加した。これらのサンプルを、その後の分析を行う前に、−20℃に維持した。集められた最初の11画分（Ｆ１−11）の分析の結果は、以下のようなものであった。精製された酵母の組換えハイブリッドGADを酵素として高反応性であった（表２）。なぜなら、その比GAD酵素活性は、ピーク画分（Ｆ６）中で2,916nmol／分／mgまでであったからであった。Ｆ５−10をプールすることにより、1,653nmol／分／mgの平均酵素活性をもつ、270μｇの精製されたハイブリッドGADの合計収量を得た。その正味の収量と認められるプールされたＦ５−10画分は、Ｓ１中のハイブリッドGADの22.9％の回収をもって、197倍の精製を示した。１ラン当りに精製されたハイブリッドGADの量は、例えば、使用するアフィニティー・カラムの能力を増加させることにより、さらに改良されることができたけれども、1,653nmol／分／mgは、1,000nmol／分／mgであるヒト脳から精製されたGADの活性（Blindermann et al., 1978）に比較して、ひじょうに高いものである。
酵母宿主（YRD15）と挿入物を含まないプラスミドにより形質転換された酵母宿主（YpAS−１）から調製された対照サンプル（Ｓ１−３）についての試験は、少量のGAD酵素活性を現した（表２）。
モノクローナル抗体GAD−６を使用したウェスタン・ブロット分析に基づけば、Ｓ３中の検出可能なハイブリッドGAD67／65の量は、Ｓ１とＳ２の量に比較して有意に減少した（図６Ａ、それぞれ、レーン９，３、と６）。これは、上記GAD酵素活性アッセイの結果とよく一致し、そして超遠心分離が上記溶解物からのハイブリッドGADの有意な損失を導いたことを示している。上記64kDa対上記60kDaタンパク質の比は、サンプルＳ１−３中、変更されずに残ったということに注目すべきである。図６Ａは、上記精製されたハイブリッドGAD（Ｆ１−11、レーン11−21）のウェスタン・ブロット分析の結果をも示す。組換えハイブリッドGADは、Ｆ５−Ｆ10（レーン16−20）において検出可能であり、そしてＦ６は、検出可能な最高レベルのハイブリッドGADを含んでいた（表２）。検出可能なハイブリッドGAD産物は、上述のように少なくとも２つのサイズ、64と60kDaを表す。面白いことに、上記酵母溶解物に比較して、上記精製されたサンプル中の60kDa産物は、上記64kDa産物を３〜４倍上廻って増加した（図６Ａ）。先に観察された40kDa産物は、ほとんど検出できなかった。
SDS−PAGEの銀染色の結果を図６Ｂ中に示す。ハイブリッドGAD調製物は、ひじょうに純粋であり（レーン16−20）、そしてＦ６は、最高含量のタンパク質産物をもっていた。しかしながら、分子サイズ、64，60，59.5，50、及び58.5kDaに対応する、検出可能な少なくとも５つの別個のバンドがある。上記実験室における先の試験は、ブタGAD調製物がＮ−末端短縮を受け易く、65〜55kDa産物を作り出す。（Tuomi et al., 1994）ということを証明している。それ故、上記酵母組換えハイブリッドGADは、また、免疫反応性を保持しているが僅かに低い分子量の一定レンジの産物を作り出すように短縮されたと予想された。ウェスタン・ブロット分析（図６Ａ、レーン15−20）は、全体長ハイブリッドGADの短縮がそのタンパク質のＮ−末端領域で生じていることをさらに示す。なぜなら使用したGAD−６モノクローナル抗体は、そのGAD分子のＣ−末端領域、アミノ酸529−586を認識するからである（上を見よ）。60−58.5kDaのサイズ範囲にある、４つの短縮産物の全ては、GAD−６認識ドメインを保持するであろうと予想されるが、これは、さらに、確かめられなければならない。なぜなら、強化化学発光（ECL）を使用したウェスタン・ブロット分析は、上記４つの成分を別個のバンドに分解することができないからである。重要なことには、上記精製ハイブリッドGAD成分の一部又は全部が、酵素として高反応性であり、そしてIDDM血清により免疫沈降されることができる（下を見よ）。
上記プロセスにプロテアーゼ阻害剤を含ませることにより、精製の間に生じるタンパク質分割を防止又は制限することが望ましいであろう。２つの実験が、これまで、ハイブリッドGAD67／65の上述の低分子量Ｎ−末端短縮産物がプロテアーゼ阻害剤により制限されることができるかどうかを調べるために行われた。第１の実験においては、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１mg／ml Pefabloc SC、３μｇ／ml Leupeptin、及び15μｇ／ml Pepstatin）が、上記溶解バッファー中に含まれ；第２の実験においては、上記カクテルの組成は、僅かに相違した（25μｇ／ml Aprotinin、１μｇ／ml Leupeptin、及び2.5μｇ／ml Pepstatin A）。これらは、得られたGADが、酵素活性、ウェスタン・ブロット上での免疫反応性、又はSDS−PAGEにより判断されるときのタンパク質含量に関して、未処理GADとは相違していなかったことが発見されたので、有効ではなかった。次の段階は、例えば、これらの短縮産物のＮ−末端配列決定による、関連するプロテアーゼの特定のタイプの測定であろう。
IDDM血清に対する反応性による精製された組換えハイブリッドGAD67／65の特徴付け
IDDM血清との上記酵母ハイブリッドGAD67／65の反応性を、the Second International GAD Workshop（Paris, France, 1994）から得られた100血清のパネルを用いた125Ｉ−標識されたタンパク質を使用したラジオイムノ沈降によりアッセイした。これらの血清は、ブタ脳由来のGADの調製物を使用した上記実験において先に試験されていた。図７Ａ中に示すように、酵母ハイブリッドGAD67／65とブタ脳GADを使用して得られた結果の間にひじょうに良い一致があった。ブタ脳GADを使用して抗−GADについて陽性として同定された55血清の全てが、酵母ハイブリッドGAD67／65に対しても反応性であり、そしてブタ脳GADを使用して抗−GADについて陰性と同定された45血清の全てが、酵母ハイブリッドGADを使用して非反応性であった。従って、上記実験室における標準的なラジオイムノ沈降アッセイにおいて使用されたとき、酵母ハイブリッドGAD67／65とブタGADは、IDDMの診断について同一の感度及び特異性を示した。
組換えハイブリッド酵母GAD67／65の実地試験
組換え酵母ハイブリッドGAD67／65の調製物を、対照被験体からの、そしてさまざまなタイプの真性糖尿病その他の疾患をもつ個体における、血清中の抗−GADの検出のためのラジオイムノアッセイにおける標準的な反応体として“実地試験（field-tested）”されている。全部で、5,068個体の血清アッセイが、バッチにおいて行われている。これらは、研究論文及び医療診断の目的をもったアッセイを提示し、そしてGADの他の形態を使用したアッセイとの比較により、“対照”されていない。各アッセイ・バッチには、抗−GADについての低い陽性ユニット、及び（ｃ）抗−GADについての高陽性ユニットとして反応することが知られている対照血清が含まれていた。上記試験期間を通して、上記アッセイのランは、上記対照血清を用いた結果の一貫性により、そして上記5,068試験血清を用いた異常な結果の非存在により、判断されたとき、真の性能を与えた。
実施例３
本実施例は、酵母発現系内で製造された組換えハイブリッドGAD67／65が、（ａ）放射性ヨウ素による標識付け後に、及び（ｂ）−20℃において２年間までの期間にわたる保存における保持の後に、イムノアッセイ基質として使用されるとき、安定性を保持するということを、示す。実施例２中に記載したような、酵母GAD調製物及び画分からの、GADの最高含量をもつ精製サンプルの中の２つを、−20℃で２年間保存し、放射性ヨウ素で標識付けし、そして次に放射標識されたブタ脳GADの標準的な実験室調製物を使用したラジオイムノアッセイによる免疫反応性について比較した。
材料及び方法
使用した血清は、正常被験体由来、及び放射標識された精製ブタ脳GADを使用したアッセイにより判断されるとき、既知のレンジのレベルの抗−GADが存在したところの真性糖尿病をもつ患者由来の164サンプルを含む。
保存の効果を評価するために使用した画分は、実施例２において記載したように行われた分画手順からの、Ｆ８とＦ９と命名されたものであった。これらの画分は、ハイブリッドGAD67／65について最も高く濃縮されたものであった。これらの画分を、２年間30％ｗ／ｖグリセロール中−20℃で保存した。グリセロールを、凍結を防止し、そしてその後の、使用に先立つ解凍後のGADの分解を防止するために、添加する。
保存から回収された画分を、解凍し、そして室温にもっていき、そして放射性ヨウ素で標識付けした。同時に、新たに調製されたハイブリッドGAD67／65からの精製画分をも、放射性ヨウ素で標識付けした。
結果
２セットの比較を、ハイブリッドGAD67／65の３つの調製物について示す。表３中の第１の比較は、（１）100ユニットの指定レベルの反応性をもつ標準実験室参照血清、（２）対照“高陽性”血清、（３）対照“低陽性”血清、及び（４）プールされた正常ヒト血清、を使用した結果を示す。この表は、新たに得られたハイブリッド酵母GAD67／65の調製物、−20℃で保存されたハイブリッド酵母の調製物、及びポリヒスチジン・タグをもつハイブリッド酵母GADの新鮮調製物（実施例４参照）についての、沈降した放射能のカウント、及び抗−GAD活性の得られたユニットを示す。これらの結果は、上記３つの調製物について高く比較できるほどに高く、これは、−20℃における長期保存とポリヒスチジン・タグの遺伝子操作による導入のいずれも（下を見よ）、酵母GADの免疫反応性に対して悪影響を及ぼさないということを示している。
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精製ブタ脳GADと、保存から回収され、そして放射性ヨウ素で標識された酵母GAD調製物についてのラジオイムノアッセイの結果の間で、抗−GADの変化レベルをもつ真性糖尿病をもつ患者からの164の血清を使用して、比較した。これらの結果を、スキャタープロットとして図７Ｂ中に示す。結果の一致は、0.93の相関係数により示される。放射性ヨウ素標識された酵母GAD67／65とブタ脳GADについてのイムノアッセイの結果の間の相関は、実際に、生合成により標識された（35Ｓ）酵母GADとブタ脳GADの間の図２中に示す相関よりも高い。図７Ｂから、最高レベルの抗−GADについての線形相関プロットからの逸脱が存在することは明らかである。これは、上記アッセイ（Chen et al., 1993）の知られた特徴に添うものであり、そのアッセイのためには、過剰の抗体が存在するとき、血清の滴定が、意味ある定量結果のために必要である。
実施例４
本実施例は、ハイブリッドGAD67／65は、所望により、発現された遺伝子産物が、Ｈ６タグについてのアフィニティーをもつ金属マトリックス・カラムを通して精製されることができるように、Ｃ−末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグを与えられることができること、そしてGAD67／65−Ｈ６が、抗体−アフィニティー・カラムにより精製されたハイブリッドGAD67／65と、酵素として、そして抗原として等価であるということを示す。
材料及び方法
GAD67／65−Ｈ６の構築
第２のハイブリッド分子を、Bluescript−SKベクター（Stratagene, USA）内に含まれる元のハイブリッドGAD67／65を使用して構築して、GAD67／65−Ｈ６と命名した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、ハイブリッドGAD67／65上にＣ−末端ヘキサヒスチジン・タグ配列を授けるために使用した。その５′オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は、５′CCGGAATTCACCATGGCGTCTTCGACCCC３′であり、これは、その５′末端にEcoR I部位を取り込んでいるが、GAD67／65のアミノ酸配列を変更していなかった。その３′プライマーの配列は、５′CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGATAAATCTTGTTCAAGGCGTTCTATTTCTTC３′であり、それは、上記ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグをコードする配列後のその３′末端にEcoR I部位をも取り込んでいた。GAD67／65−Ｈ６をコードする1.8kb DNA断片を回収し、そしてEcoR Iで消化し、そして上記のBluescriptベクター内にサブ−クローン化した。得られたクローンのDNA配列決定により、その組換え分子が正しく作られていたことが確認された。
pMONTP 1，GAD67／65−Ｈ６を担持する酵母発現ベクターの構築
酵母発現ベクターpAS−１を、BglIIによる消化に最初に晒し、その後、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片の使用による“ブラント末端”を作り、そして次にNot I制限酵素による消化を行った。GAD67／65−Ｈ６遺伝子を、EcoRＶ−Not I断片としてBluescriptベクターから単離し、そしてpAS−１にサブクローン化して、図８中に示すように、プラスミドpMONTP 1を作製した。
S. cerevisiaeにおけるGAD67／65−Ｈ６の発現
YRD−15株を、酢酸リチウム法（Elble, 1992）を使用してプラスミドpMONTP 1で形質転換した。形質転換体（YEAD−３）を、YGAD−２についてと同様に、GAD生産のために、選択し、そして発現させた。これは、プラスミドpMONBC 6で形質転換され、そして元の組換えハイブリッドGAD67／65を発現するYRD−15株である。
S. cerevisiaeからのGAD67／65−Ｈ６の精製
YGAD−３からの組換えGADの精製をYGAD−２についてと同様に行った。但し、溶解バッファーの組成は異っていた：これは、50mM KH2PO4、１mM EDTA、１mMアミノエチルイソチオウロニウム・ブロミドAET、20μＭピリドキサルーム−リン酸PLP、10mM ２−メルカプトエタノール、10mMグルタメート、0.12％（ｖ／ｖ）Triton X-100及び0.5mMフェニルメチルスルホニル・フルオリド（PMSF）、pH7.2であった。
結果
YGAD−３における組換えハイブリッドGAD67／65−Ｈ６の発現
組換え酵母YGAD−３におけるGAD67／65−Ｈ６の発現を、YGAD−２からのGAD67／65のためのものと酷似したやり方で行った。粗酵母細胞溶解物についてのGAD酵素アッセイの結果は、有意差を現さず、これらは、GAD67／65について4.4nmol／分／mg対GAD67／65−Ｈ６について3.6nmol／分／mgである。これらは、酵母宿主YRD−15についての酵素アッセイ結果、0.68nmol／分／mg、及び対照酵母YpAS−１についての結果、0.73nmol／分／mgよりも実質的に高かった。ウェスタン・ブロットによるGAD65上のＣ−末端成分と反応性であるモノクローナル抗体GAD−６を使用して、YGAD−３からの酵母溶解物中の２つの主要なGAD産物が、YGAD−２についてと同様に、それぞれ、64と60kDaの分子量をもって、見られた。GAD−１モノクローナル抗体アフィニティー・カラムを通した後、GAD67／65−Ｈ６を、GAD67／65についてと同様に精製した。これらの収量は、0.18mgのGAD67／65−Ｈ６であり、これは、等価な500ml酵母培養物からの、0.28mgのGAD67／65に十分に匹敵する。GAD67／65−Ｈ６についてプールされた画分中に僅かに高い酵素活性（4,654nmol／分／mg）があった。精製レベルも酷似しており、GAD67／65について197倍対GAD67／65−Ｈ６について239倍であった。
放射性ヨウ素で標識付けした後のラジオイムノ沈降による反応性
ポリヒスチジン（Ｈ６）タグの導入は、組換えハイブリッド酵母GAD67／65の反応性に影響を及ぼすことは示されなかった。上記表３は、ハイブリッドGAD67／65の新鮮調製物、ハイブリッドGAD67／65の第２調製物、及び抗体アフィニティー・カラム上での精製後のハイブリッドGAD67／65−Ｈ６の調製物についての、沈降した放射能のカウント数におけるラジオイムノ沈降による結果及びアッセイ・ユニットへの変換を示す。データは、100ユニットの活性をもつと指定される標準参照血清、高陽性抗−GAD血清、低陽性抗−GAD血清、及びプールされた正常ヒト血清について提示される。結果は上記３つの調製物について比較できるほどに大きなものであるということを示している。
実施例５
本実施例は、その中でGADが、ヒトIDDMを形作る疾患を顕出する傾向にあるマウスの株（非肥満糖尿病の、NODマウス）腸管上部にデリバリーされることができるところの媒体中での再構築のために好適な１〜２mgの量において、精製され、かつ、凍結乾燥された組換えハイブリッド酵母GAD67／65の調製物について説明する。経口寛容原性（tolerogenesis）として知られる、上記手順は、予言的イムノアッセイ、スクリーニングが、“危険にある”として定義される、すなわち、上記疾患の前駆症状的不完全段階にあると定義されるところの個体における、膵島炎（insulitis）及び糖尿病の完全な発展を防止し又は遅らせる可能性のある手段である。
背景
その初期段階における自己免疫疾患は、自己成分に対する免疫反応性を傷つける状態が、このような成分に対する正常な寛容状態に戻ることができるように、その免疫系を“配線し直す（rewire）”ことができる処置によりコントロールされることができるという可能性に、免疫学者の間で、かなりの関心がもたれている。これは、抗原を与えることによる経口投与の方法による、粘膜組織への、そしてより特に腸管上部への、抗原のデリバリーにより論証できるように達成される。これ故、経口寛容といわれる。経口寛容は、自己免疫疾患の各種実験動物モデルにおいて有効であると示されている（Weiner, 1997）。この原理は、自己抗原インスリン及びGADを使用したNODマウスにおける糖尿病の防止に適用されていた。しかしながら、これらの実験は、哺乳類の脳から精製されたGADが明らかに好適ではないであろうし、かつ、ウサギ網状赤血球溶解物又は哺乳類細胞を含む、最近使用された発現系から得られた組換えGADが、IDDMの危険にあるヒトの長期間処置のために収率においてひじょうに低いであろうところのヒト療法における使用のための、GADの最適な調製物についてのいずれの教示をも提供していない。
プロトコール
上記試験のためのプロトコールは、３群（ｎ＝10）の雌NODマウスに、30週間にわたり、週に２回、20μｇ、10μｇ、及び５μｇの量で、GADを与える。この時間にわたり、動物を、上昇した尿中グルコース排泄について毎週アッセイし、そしてこれが検出されたとき、血中グルコースを計測する。適当な対照群が含まれる。この実験は、特定の配合物を使用してGADの飼養が、それにより非処理雌の約70〜80％が上記疾患に発達するところの、NODマウスにおける糖尿病の自然な発展を遅らせるかどうかを確認する。
結果
本実験は未だ進行中である。ハイブリッド酵母GAD67／65が、凍結乾燥され、そしてマウスへの粘膜投与のために好適な水溶性調製物として再構成されることができるということは確認されている。予備的な観察は、GADを与えることはマウスに対して悪影響を及ぼさなかったということである。その上、GADの経口投与が、ヒトIDDMの特徴の多くを複製する疾患を顕出すると遺伝的に素因を与えられているNODマウスにおける膵島炎の発展を加速させるということは、全く示されていない。
含意
経口投与されたハイブリッド酵母GAD67／65が、糖尿病の傾向にあるNODマウスにおける疾患を排除することができるという証明は、ヒトIDDMの前臨床段階における介在療法にとって重要な意味をもつであろう。特に、酵母系は、哺乳類源から調製されたGADに頼らずに、ヒトの使用のために必要とされるであろう比較的多量のGADを提供するであろうし、そして、食品の一般的な構成成分としての酵母は、組換えGADの調製のための安全な媒体である。
文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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