(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ及びプロタミンからなる医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＧＦを含有する医薬製剤に関する。より詳細には、ＨＧＦの生体内における薬効を増強できる医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは肝実質細胞の増殖活性を有する蛋白質であり、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されており、その名称も、ＨＧＦ、ＴＣＦ、ＳＦ等が使用されている。本発明では、これらの公知の肝実質細胞増殖活性を有する蛋白質をＨＧＦと総称する。
ＨＧＦは様々な薬理作用を示す生理活性ペプチドであり、その薬理作用については、例えば実験医学 Vol.10, No.3 （増刊）330-339 (1992)に記載されている。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等(特開平4-18028号公報、特開平4-49246号公報、EP 492614号公報、特開平6-25010号公報、WO 93/8821公報、特開平6-172207号公報、特開平7-89869号公報、特開平6-40934号公報、WO 94/2165公報、特開平6-40935号公報、特開平6-56692号公報、特開平7-41429号公報、WO 93/3061公報、特開平5-213721号公報等)としての開発が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦを医薬として利用する際の問題点の一つとして、生体内クリアランスが速いという点が挙げられる。例えば、ＨＧＦが静注された場合、速やかに血漿中から消失し、本発明者等の解析によれば初期相半減期は約４分である。従って、in vivoで薬効を得るためには極めて高投与量（数十μｇ／ｋｇから数ｍｇ／ｋｇ）を必要とするのが現状である。このことは、予期せぬ副作用をもたらすおそれがあり、またＨＧＦを用いた治療方法の治療費が高くなる問題がある。そのため、ＨＧＦを臨床応用させる場合には、何らかのDrug delivery system（ＤＤＳ）を構築し、肝再生効果などのＨＧＦの薬効をより低投与量で得られるように工夫する必要がある。
【０００４】
ところで、本発明者らはＨＧＦのクリアランスメカニズムを研究してきたが、ＨＧＦのクリアランス臓器は主に肝臓等であり、細胞表面のＨＧＦレセプターを介する受容体介在細胞内取り込み(receptor-mediated endocytosis)及びヘパリン様物質(マトリックス)を介する非特異的な消失が主たるメカニズムであると考えられる。
そこで、本発明者らは、後者のメカニズムによる消失を回避させ得ればＨＧＦのクリアランスを遅延でき、投与量を低減できるのではないかと考え、細胞表面のヘパリン様物質を予め当該物質と結合性を有する物質でブロックさせる方法を検討した。その結果、当該方法を採用することにより、ＨＧＦの効果を増強できることが判明した。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は生体内におけるＨＧＦの効果を増強できるＨＧＦ含有製剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記課題を解決するためになされたものであり、その要旨は、
▲１▼ＨＧＦ及び肝細胞表面のヘパリン様物質と結合性を有する物質からなる医薬製剤；
▲２▼肝細胞表面のヘパリン様物質と結合性を有する物質が塩基性タンパクである上記▲１▼記載の医薬製剤；
▲３▼肝細胞表面のヘパリン様物質と結合性を有する物質がプロタミンである上記▲１▼記載の医薬製剤；
▲４▼ＨＧＦに対する肝細胞表面のヘパリン様物質と結合性を有する物質の配合比が、０．５〜５０重量倍である上記▲１▼〜▲３▼の何れかに記載の医薬製剤；
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照)。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、カイコ、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００７】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００８】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【０００９】
本発明において使用される肝細胞表面のヘパリン様物質と結合性を有する物質（以下、単に「結合性物質」と称する）としては、当該ヘパリン様物質と結合性を有する物質であれば何れの物質も使用することができ、例えば、塩基性タンパクなどが例示される。塩基性タンパクとは等電点がアルカリ側にあるタンパクを意味し、例えば、ヒストン、プロタミンなどが例示され、特にプロタミンが好適に使用される。
【００１０】
本発明の製剤において、ＨＧＦと結合性物質との配合比は特に限定されず、ＨＧＦの適用疾患、結合性物質の種類などに応じて適宜調整される。例えば、結合性物質がプロタミンである場合は、ＨＧＦに対するプロタミンの好適な配合比の範囲は０．５〜５０重量倍程度であり、更に好ましくは１〜２０重量倍程度、特に好ましくは１．３〜１０重量倍程度である。
【００１１】
本発明の製剤は上記のＨＧＦと結合性物質を少なくとも含有し、後記実施例に示されるように、結合性物質は生体内におけるＨＧＦの効果を増強することができるので、ＨＧＦの用量を低減することができる。
本発明の製剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）において、ＨＧＦが作用し得る種々の疾患の治療・予防に適用される。
【００１２】
本発明の製剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦと結合性物質のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされ、注射剤が好適である。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦ及び結合性物質を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜３(W/V%)程度、好ましくは0.001〜２(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１３】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、アラニン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１４】
本発明の製剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の疾患、症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、例えば、成人に対し、通常ＨＧＦとして0.01mg〜500mg、好ましくは0.05mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の医薬製剤によれば、生体内におけるＨＧＦの効果を増強することができる。従って、ＨＧＦの投与量を低減することができるので、副作用の防止が図れると共にＨＧＦを用いた治療法のコストを低下させることができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ＨＧＦとしては、特開平５−１１１３８３号公報に記載のｄＬｅＨＧＦ（５アミノ酸欠失型ＨＧＦ）を用いた。また、肝疾患モデル動物としては、雄性ＷｉｓｔａｒラットにＡＮＩＴ（α−ナフチルイソチオシアネート）処理若しくは３０％肝部分切除(partial hepatectomy)を施し実験に供した。ＨＧＦの投与スケジュールは、図中（又は本文）に示される投与量をＡＮＩＴ投与前３０分、以降８、２２、３２、４６、５６、７０、８０、９４時間後に１回ずつ静注で投与した。プロタミンは図中（又は本文）に示す投与量をＨＧＦを投与する１０分前に予め瞬時静注している。なお、本実施例と異なり、ＨＧＦとプロタミンを同時に投与することもできる。
【００１７】
実施例１
ＨＧＦの肝修復作用に及ぼすプロタミンの効果(in vivo)
ＡＮＩＴ処理ラットにＨＧＦ及び／又はプロタミンを投与し、ラベリング インデックスにて肝再生の程度を調べた。その結果を図１（Ａ）に示す。なお、図中、Ｐｒｏはプロタミンを表す（以下の図においても同様）。
図１（Ａ）に示すように、ＡＮＩＴ処理ラットにＨＧＦ（３００μｇ／ｋｇ）を投与したところ肝細胞のラベリング インデックスはＨＧＦを投与しないＡＮＩＴ処理ラット(Control(+))と比較して約２倍強の上昇であった（なお、図中のControl(-)とは、ＡＮＩＴ、ＨＧＦともに処理をしていないラットを表す）。ここで、予めＨＧＦ投与１０分前にプロタミンを投与すると、ラベリング インデックスはプロタミンの投与量依存的に上昇し、その効果は１．６ｍｇ／ｋｇで最大であった。この時のラベリング インデックスはＨＧＦのみよりも実に５倍以上のものであった。
このようなプロタミンによるＨＧＦ活性の増強がＡＮＩＴ処理という肝障害モデルに特異的ではないことを示すため、同様の検討を３０％肝部分切除ラットを用いて行った。その結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）に示されるように、結果はおおむねＡＮＩＴ処理の場合と同様であった。なお、いずれの肝障害モデルでもプロタミンのみでは効果がなかった。
【００１８】
実施例２
肝細胞のマーカー酵素等の血清中レベルの測定
実施例１のＡＮＩＴ処理ラットにおいて、肝細胞の修復作用に対してもプロタミンがＨＧＦの効果を増強させることを確かめるため、肝細胞のマーカー酵素等の血清中レベルを検討した。肝細胞のマーカー酵素等の測定は常法に準じて行った。その結果を図２（ＢＩＬ、ＧＰＴ、ＬＡＰ）及び図３（ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ）に示す。
図２及び３に示されるように、ＢＩＬ（ビリルビン）、ＧＰＴ、ＬＡＰ、ＡＬＰ、γ−ＧＴＰの血清中レベルは、ＨＧＦ（３００μｇ／ｋｇ）単独投与でほぼ無処理ラット(Control(-))のレベルにまで減少していた。従ってプロタミン処理によるさらなる肝修復作用の増強は観察しにくい系ではあったが、γ−ＧＴＰについてはＨＧＦ単独よりも更に強い効果が観察された。なお、これらマーカー酵素等のレベルについてもプロタミン単独では有意な効果が観察されなかった。
以上のことより、プロタミンはＨＧＦによる肝再生促進作用、肝障害修復作用を増強することが証明された。
【００１９】
実施例３
ＡＮＩＴ処理後のラベリング インデックスの時間推移
プロタミンのみ（１．６ｍｇ／ｋｇ）、ＨＧＦのみ（３００μｇ／ｋｇ）又はプロタミン（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋ＨＧＦ（３００μｇ／ｋｇ）を投与したＡＮＩＴ処理ラットについて、ＡＮＩＴ処理後のラベリング インデックスの時間推移を観察した。その結果を図４に示す。
図４に示すように、プロタミン＋ＨＧＦでは、４８時間後に明確な肝増殖のピークが観察されるのに対して、ＨＧＦ単独ではそれほど顕著な効果は観察されなかった。即ち、プロタミンは肝障害発生後いずれの時間においても、ＨＧＦの肝増殖作用を上昇させることが明らかとなった。
【００２０】
実施例４
ＨＧＦのクリアランスに及ぼすプロタミンの効果(in vivo)
前述のＨＧＦクリアランス機構に基づけば、プロタミン投与によりＨＧＦの血漿中からの消失は遅延することが予想される。そこで、無処理若しくはプロタミン前処理後の静脈内瞬時投与後ＨＧＦの血漿中濃度推移を測定した。その結果を図５に示す。図５に示されるように、ＨＧＦの消失はプロタミン投与により若干遅延することが示された。なお、ここで用いたラットはすべてＡＮＩＴ処理２４時間後のものである。
図５の血漿中濃度推移を速度論解析することにより速度論パラメータを得た。その結果を表１に示す。表１に示されるように、全身クリアランス(CL total)はプロタミン投与により約４０％にまで減少していた。また、分布容積（Ｖ１，セントラルコンパートメントの分布容積；Ｖｄｓｓ，定常状態分布容積）も同様に低下していた。これらの結果はプロタミンが細胞表面のヘパリン様物質をブロックするために、ＨＧＦのそこへの分布やそこでのクリアランスを阻害するためであると考えれば説明可能である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
上述のように、プロタミンは確かにＨＧＦのクリアランスを減少させるが、その減少の度合いはせいぜい半分強であり、ＨＧＦ単独と比べて５倍以上のラベリング インデックスの増強（図１参照）はとても説明できるレベルではない。そこで、ＨＧＦの投与量を増やし、ＨＧＦ（３００μｇ／ｋｇ）＋プロタミン（１．６ｍｇ／ｋｇ）投与の際と同程度のＡＵＣ（血漿中濃度下面積）が得られる５００μｇ／ｋｇのＨＧＦを単独で投与した際のラベリング インデックスを測定した。その結果を図６に示す。図６に示されるように、得られたラベリング インデックスは３００μｇ／ｋｇの投与とさほど変化がなかった。従って、プロタミンによるＨＧＦ効果の増強は、ＨＧＦの血中滞留性の上昇以外の作用も関与していることが示唆された。
【００２３】
製剤例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、プロタミン６ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００２４】
実施例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、プロタミン５ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】肝疾患ラットにおいて、ＨＧＦの肝修復作用に及ぼすプロタミンの効果を示す図である。図の（Ａ）はＡＮＩＴ処理ラット、（Ｂ）は３０％肝部分切除ラットの場合である。
【図２】プロタミン及びＨＧＦを投与したＡＮＩＴ処理ラットにおける肝細胞のマーカー酵素等（ＢＩＬ、ＧＰＴ、ＬＡＰ）の血清中レベルを示す図である。
【図３】プロタミン及びＨＧＦを投与したＡＮＩＴ処理ラットにおける肝細胞のマーカー酵素等（ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ）の血清中レベルを示す図である。
【図４】プロタミンのみ、ＨＧＦのみ又はプロタミン＋ＨＧＦを投与したＡＮＩＴ処理ラットについて、ＡＮＩＴ処理後のラベリング インデックスの時間推移を示す図である。
【図５】無処理若しくはプロタミン前処理後の静脈内瞬時投与後ＨＧＦの血漿中濃度推移を示す図である。
【図６】ＨＧＦの投与量を増やした際のラベリング インデックスの変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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