(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化剤としてデキストラン硫酸を含有し、さらにクエン酸塩、塩化ナトリウムおよび界面活性剤を含有するＨＧＦ凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＧＦを含有する溶液を凍結乾燥することにより得られる、ＨＧＦ凍結乾燥製剤に関する。さらに詳しくは、安定化剤、塩化ナトリウム、緩衝剤、又は界面活性剤の少なくとも一種以上を含有する、前記ＨＧＦ凍結乾燥製剤に関する。本発明により、ＨＧＦを安定化させた、長期保存の可能な製剤が提供される。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは肝実質細胞の増殖活性を有する蛋白質であり、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されており、その名称も、ＨＧＦ、ＴＣＦ、ＳＣＦ等が使用されている。本発明では、これらの公知の肝実質細胞増殖活性を有する蛋白質をＨＧＦと総称する。
ＨＧＦは様々な薬理作用を示す生理活性ペプチドであり、その薬理作用については、例えば実験医学 Vol.10, No.3 （増刊）330-339 (1992)に記載されている。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等(特開平4-18028号公報、特開平4-49246号公報、EP 492614号公報、特開平6-25010号公報、WO 93/8821公報、特開平6-172207号公報、特開平7-89869号公報、特開平6-40934号公報、WO 94/2165公報、特開平6-40935号公報、特開平6-56692号公報、特開平7-41429号公報、WO 93/3061公報、特開平5-213721号公報等)としての開発が期待されている。
【０００３】
ＨＧＦの製剤については、WO 90/10651公報及び特開平6-247872号公報に記載がある。上記WO 90/10651公報は、ＨＧＦと比較してアミノ酸５残基が欠失したデリーションタイプのＨＧＦ（ｄＬｅＨＧＦ）について開示されており、ＴＣＦIIと称している。この明細書では、アルブミン、ヒト血清、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール、キリシトール等がＨＧＦを安定化することを開示している。これらは、水溶液製剤に関するものであり、ＨＧＦを水溶液中で安定化させる。また、特開平6-247872号公報は塩基性アミノ酸等とＨＧＦ（ＴＣＦ）を共存させることにより、ＨＧＦを高濃度に含有させた製剤について開示している。
【０００４】
ところで、タンパク質は一般に凍結操作においてそれほど安定ではない（「蛋白質 核酸 酵素」 37(9), 1517 (1992))。また、水溶液中におけるタンパク質の安定化剤は、水分子とタンパク質との相互作用によって安定化させるものであり、従って、水の存在しないタンパク質の凍結乾燥品においては、水溶液におけるタンパク質の安定化剤は、多くの場合、安定化効果を示さない（「蛋白質 核酸 酵素」 37(9), 1517 (1992))。
一方、ＨＧＦの凍結乾燥製剤についてはまったく知られておらず、またＨＧＦの凍結乾燥製剤がどの程度の物理的及び生物活性的安定性を示すかは予想することができなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦの水溶液製剤自体は、低温又は室温で数日間保存すると、凝集、白濁、ゲル化が認められ、性状が変化し、類縁体・重合体が形成される等、物理的安定性が低く、また生物活性が低下する等、生物活性安定性が低く、長期間の保存に対し安定な製剤ではない。そのことは、ＨＧＦを注射用製剤等とした医薬又は動物薬としての開発に大きな障害となっていた。本発明は上記の従来の課題を解決するものである。即ち、本発明の目的は、医療用医薬品又は動物用薬として長期間の保存でも安定な製剤の提供にある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記課題を解決するためになされたものであり、その要旨は、
（１）ＨＧＦ凍結乾燥製剤、
（２）安定化剤を含有する（１）記載のＨＧＦ凍結乾燥製剤、
（３）安定化剤がグリシン、アラニン、ソルビトール、マンニトール又はデキストラン硫酸である（２）記載のＨＧＦ凍結乾燥製剤、
（４）緩衝剤を含有する（１）から（３）のいずれかに記載のＨＧＦ凍結乾燥製剤、
（５）緩衝剤がクエン酸塩である（４）記載のＨＧＦ凍結乾燥製剤、及び
（６）安定化剤、塩化ナトリウム、緩衝剤及び界面活性剤を含有するＨＧＦ凍結乾燥製剤に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で精製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの精製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 1987 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照)。
【０００８】
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる（例えば、Nature, 342, 440, 1989、WO 92/01053公報、特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００９】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【００１０】
かくして得られたＨＧＦは、肝細胞の増殖効果を有していれば、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００１１】
「ＨＧＦ凍結乾燥製剤」とは、ＨＧＦを含有する水溶液を通常の凍結乾燥方法で凍結乾燥した製剤をいう。
「安定化剤」としては、グリシン、アラニン等のアミノ酸類、ヘパリン、デキストラン硫酸等の多糖類、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。安定化剤を加えて製造したＨＧＦ凍結乾燥製剤は、さらにＨＧＦの保存安定性が増した製剤である。好ましい安定化剤は、グリシン、アラニン、ソルビトール、マンニトール、デキストラン硫酸等が挙げられる。例えば、グリシン、アラニン、ソルビトール又はマンニトールの添加量として好ましいのは、ＨＧＦの重量に対して、０．０１−１００倍の重量が挙げられ、特に好ましいのは、０．１−１０倍の重量が挙げられる。
【００１２】
「緩衝剤」としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、再溶解後の水溶液のｐＨを調整しＨＧＦの溶解性を保つ作用を有する。すなわち、例えば実施例で使用した組換ＨＧＦの場合、ｐＨによってＨＧＦの溶解度は変化し、ｐＨ７付近では０．１−５．０ｍｇ／ｍｌの溶解度を示すが、ｐＨ５付近では２０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を示すため、ｐＨを５．０−６．０にするのが好ましい。緩衝剤として好ましいものは、クエン酸バッファーが挙げられ、特に好ましくはクエン酸ナトリウムバッファーが挙げられる。このクエン酸バッファーは、再溶解後の水溶液中でのＨＧＦの安定化にも寄与する。緩衝剤の添加量として好ましい範囲は、例えば再溶解後の水量に対し、１−１００ｍＭとなる範囲が挙げられる。
【００１３】
「界面活性剤」としては、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。界面活性剤として特に好ましくは、ポリソルベート８０を挙げることができる。ＨＧＦは容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、再溶解後のＨＧＦの容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量として好ましい範囲は、例えば再溶解後の水重量に対し、０．００１−２．０％の重量の範囲が挙げられる。
【００１４】
「塩化ナトリウム」はＨＧＦの溶解性を保つ作用を有する。すなわち、例えば実施例で使用した組換ＨＧＦの場合、塩化ナトリウムの添加により溶解度が向上し、特に３００ｍＭ以上では著しく溶解性が向上する（特開平6-247872号公報）。塩化ナトリウムの添加量は浸透圧比により制限を受けるが、一般的に用いられる注射剤の浸透圧比を示す量でよい。特に医療用又は動物薬用注射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比１−２が好ましく、例えば再溶解後の水量に対し１５０−３００ｍＭとすることが好ましい。
【００１５】
ＨＧＦ凍結乾燥製剤は、ＨＧＦを含有する水溶液を通常の凍結乾燥方法で凍結乾燥することで製造できる。例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、必要に応じて、安定化剤、緩衝剤、界面活性剤、塩化ナトリウム等を加え、凍結乾燥する。本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでもよい。凍結乾燥方法としては、例えば、▲１▼常圧下で冷却凍結する凍結過程、▲２▼溶質に拘束されない自由水を減圧下で昇華乾燥する１次乾燥過程、▲３▼溶質固有の吸着水や結晶水を除去する２次乾燥過程の３つの単位操作による方法が挙げられる（Pharm. Tech. Japan, 8(1), 75-87 (1992))。
ＨＧＦは、溶液調製時、凍結乾燥時、及びその凍結乾燥製剤を再溶解した水溶液において、非常に安定である。なお、ＨＧＦ含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができる。
凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００１６】
【発明の効果】
本発明のＨＧＦ凍結乾燥製剤は、ＨＧＦを安定化させることができ、長期間の保存が可能となった。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。なお、本実施例においては、ＷＯ ９０／１０６５１公報に記載のｄＬｅＨＧＦ（５アミノ酸欠失型ＨＧＦ、別名ＴＣＦII）を用いた。
実施例１
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＨＧＦ２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、無菌的にＨＧＦ水溶液を得た。本水溶液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアルに充填し、表１に示す条件に従って凍結乾燥して、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。なお、表中の→は、温度を変化させたことを示す。
【００１８】
【表１】
0003927248.tif 000002
【００１９】
実施例２
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
実施例１において、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）の代わりに１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
実施例３
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
実施例１において、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
実施例４
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
実施例１において、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００２０】
実施例５
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）にＨＧＦ２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。続いて、グリシンを５０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、無菌的にＨＧＦ溶解液を得た。本溶解液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアルに充填し、実施例１の凍結乾燥の条件と同様の条件によりＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
実施例６
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
実施例５において、グリシンの代わりにアラニンを用いて、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００２１】
実施例７
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）にＨＧＦ２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。続いて、ソルビトールを２００ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、無菌的にＨＧＦ溶解液を得た。本溶解液のｐＨを調整した後、無菌的にバイアルに充填し、実施例１の凍結乾燥の条件と同様の条件によりＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００２２】
実施例８
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）にＨＧＦ１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。続いて、デキストラン硫酸を５０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、ｐＨを調整して、ＨＧＦ溶解液を得た。次いで、バイアル充填し、実施例１の凍結乾燥の条件と同様な条件によりＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
実施例９
ＨＧＦ凍結乾燥製剤の作製
実施例１において、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）の代わりに１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、またＨＧＦ濃度を１０ｍｇ／ｍｌとして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００２３】
試験例１
ＨＧＦの生物活性に及ぼす凍結乾燥過程の影響
凍結乾燥製過程におけるＨＧＦの生物活性の変化を確認するため、実施例１において、凍結乾燥前のＨＧＦ水溶液及び凍結乾燥後そのまま再溶解したＨＧＦ水溶液を用いてＨＧＦの生物活性を測定した（生物活性測定法は以下に示す）。その結果を表２に示す。凍結乾燥前後で比活性に変化が認められなかったことから、凍結乾燥過程及び再溶解においてＨＧＦの生物活性は失活せず、ＨＧＦを凍結乾燥製剤とすることが可能であることが示された。
【００２４】
生物活性測定方法
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを肝潅流して得られた肝細胞を精製し、細胞生存率を確認後、１×１０4／ｗｅｌｌでプレートに播種した。５％炭酸ガスインキュベータでのプレインキュベーション２０時間後、ＨＧＦサンプル及び標準品を添加した（ｎ＝３）。さらに、５％炭酸ガスインキュベータでのプレインキュベーション２４時間後、［3Ｈ−チミジン］を添加し、２時間ラベルした。細胞をセルハーベスターで回収し、細胞内に取り込まれた［3Ｈ］量を測定した。測定結果を平行線検定法にかけ、標準品に対する比活性を求めた。
【００２５】
【表２】
0003927248.tif 000003
【００２６】
試験例２
凍結乾燥製剤溶解後の性状
実施例で作製した凍結乾燥製剤を、−４０℃、２５℃、５０℃にて１ヶ月間保存後、溶解し、溶解後の性状を目視により観察した。凍結乾燥製剤の溶解は精製水で行った。その結果を表３に示す。−４０℃及び２５℃の保存において、いずれの実施例の製剤も性状に関して安定であった。また、５０℃の保存においては、実施例１の製剤は溶解直後白濁したが、実施例５、６及び７の製剤は性状に関して安定であった。
【００２７】
【表３】
0003927248.tif 000004
【００２８】
試験例３
凍結乾燥製剤における重合体含量変化
実施例１、５、６及び７で作製した凍結乾燥製剤を、−４０℃、２５℃、４０℃、５０℃にて１ヶ月間又は２ヶ月間保存し、その凍結乾燥製剤に含まれる重合体含量とＨＧＦ含量の比を測定した。測定方法は以下に示すゲルろ過法を使用した。その結果を表４及び表５に示す。いずれの温度の保存においても、いずれの実施例の製剤も重合体の生成は少なく物理的に安定であった。また、特に実施例５、６及び７の製剤は重合体の生成は極端に少なく物理的に安定であった。
【００２９】
重合体含量測定方法
ＨＧＦ濃度を２ｍｇ／ｍｌに希釈後、ゲルろ過法を用いて、下記の条件で測定した。
カラム          ： TOSOH TSK G-3000SW XL (φ0.78×30cm)
流速            ： 0.5 ml/min
検出            ： OD 280
温度            ： 25 ℃
キャリアー      ： 10mM Tris, 150mM NaCl, 0.05％ SDS, pH 7.0
アプライ        ： 20 μl
重合体の保持時間： 13.0 min
ＨＧＦの保持時間： 14.4 min
【００３０】
【表４】
0003927248.tif 000005
【００３１】
【表５】
0003927248.tif 000006
【００３２】
試験例４
重合体生成に及ぼすデキストラン硫酸の影響
実施例８で調製した凍結乾燥製剤を、５０℃にて１ヶ月保存し、その凍結乾燥製剤に含まれる重合体含量とＨＧＦ含量の比を測定した。なお、測定は試験例３と同様にして行った。また、比較例として、デキストラン硫酸を含まない点以外は同様な成分及び方法により調製されている実施例９の凍結乾燥製剤を用いて、同様な試験を行った。その結果を表６に示す。表６に示されるように、デキストラン硫酸を添加することにより、高温保存しても重合体の生成は少なく、安定性が向上することが判明した。
【００３３】
【表６】
0003927248.tif 000007
【００３４】
試験例５
凍結乾燥製剤の生物活性変化
実施例１、５、６及び７で作製した凍結乾燥製剤を、−４０℃、４０℃、５０℃、６０℃にて１ヶ月間又は２ヶ月間保存し、その凍結乾燥製剤を再溶解した水溶液の生物活性を、試験例１に示す生物活性測定方法で測定した。その結果を表７及び表８に示す。なお、実施例１、５、６及び７の製剤の再溶解後の水溶液の生物活性の初期値は、それぞれ1.01±0.25、0.91±0.18、0.88±0.05、1.03±0.04であった。６０℃の保存では、やや生物活性に低下傾向が見られるものの、５０℃以下の保存では、いずれの実施例の製剤も生物活性に殆ど変化はなく、生物活性的に安定であった。
【００３５】
【表７】
0003927248.tif 000008
【００３６】
【表８】
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