(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸生産能を有するシゾキトリウム属に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸含有油脂を製造する方法において、ｐ−トルイル酸、タンニン酸およびシアノコバラミンからなる群から選択される添加剤の存在下に該微生物を培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法。
【請求項２】
ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸生産能を有する微生物が、シゾキトリウム属ＳＲ２１株(ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３４)である請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の培養によるドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸を生産する能力を有する微生物を培養してドコサヘキサエン酸含有油脂を製造する際に、該微生物が生産する油脂中に含まれるドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸またはエイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸の含有比率をコントロールする方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ドコサヘキサエン酸(以下、「ＤＨＡ」とも記載する)は、青魚に属する魚油に含まれ、特にイワシやマグロ由来の油には２０％前後含まれている。近年、魚油の中でもマグロ眼窩脂肪にはＤＨＡが高濃度で含有されることが発見された。また、脂肪酸の高度精製技術が発達したことなどから、ＤＨＡの生理活性機能に関する研究が進展し、コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、制癌作用などが明らかとなってきた。さらに、脳代謝系に関連して記憶学習能力の向上、老人性痴呆症の予防、アルツハイマー病の治療などに効果があることが明らかになっている。また、稚魚の成長必須脂肪酸であることも明らかとなっている。このようなことから、ＤＨＡは、各種食品あるいは飼料または餌料に使用されている。
【０００３】
ドコサペンタエン酸(以下、「ＤＰＡ」とも記載する)も魚油の中に含まれることが知られているが、その量はごく僅かであるにすぎない。また、ＤＰＡの生理活性機能については、未だ不明な点が多く、薬剤を脳へ運び易くする担体として機能することなどが僅かに知られているにすぎない[特開昭６１−２０４１３６号]。しかし、動物体内でのＤＨＡの不足の代償として、ＤＰＡが増加することが知られており[Hometownら、J.Neurochem., vol.51, p.45 (1988)；Hammら、Biochem.J., 245, p.907 (1987)；および、Rebhungら、Biosci.Biotech.Biochem., vol.58, p.314 (1994)]、ＤＰＡが動物体内で何らかの生理的役割を有していることが示唆される。
【０００４】
このようなＤＨＡやＤＰＡを魚油から得ようとする場合、その含有率が低い上、魚類の回遊性などの面から魚油が安定な供給源となりにくく、また、魚油特有の異臭があるなどの欠点がある。
【０００５】
魚油以外のＤＨＡやＤＰＡの供給源としては、ＤＨＡおよびＤＰＡ生産能を有する微生物の培養菌体中に蓄積した油脂(微生物オイル)が挙げられる。これらＤＨＡおよびＤＰＡ生産能を有する微生物としては、深海から分離された細菌ビブリオ・マリナス(Vibrio marinus)ＡＴＣＣ１５３８１、深海魚の腸内から分離されたビブリオ属細菌、鞭毛菌類であるスラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)ＡＴＣＣ３４３０４、スラウストキトリウム・エスピー(Thraustochytrium sp.)ＡＴＣＣ２８２１１およびＡＴＣＣ２０８９１、シゾキトリウム・エスピー(Schizochytrium sp.)ＡＴＣＣ２０８８８およびＡＴＣＣ２０８９９[米国特許Ｎo.5,340,742]、シゾキトリウム属ＳＲ２１株[Nakaharaら、J.Am.Oil Chem.Soc., Vol.73, p.1421 (1996)]、ジャポノキトリウム・エスピー(Japonochytrium sp.)ＡＴＣＣ２８２０７[特開平１−１９９５８８号公報]、微細藻類であるシクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica)、クリプテコディニウム・コーニー(Cryptocodenium cohnii)[特開平５−５０３４２５号公報]、エミリアニア[特開平５−３０８９７８号公報]などが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＨＡやＤＰＡの供給源としての前記微生物が生産する油脂には、ＤＨＡ、ＤＰＡ、エイコサペンタエン酸(以下、「ＥＰＡ」とも記載する)などの高度不飽和脂肪酸が含有されている。これら高度不飽和脂肪酸の含有比率や生産量は、微生物の種類により異なり、所望の含有比率の油脂を収率良く得ることは困難である。一方、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡなどの高度不飽和脂肪酸含有比率を変化させることができれば、天然の魚油の組成により近くなるばかりか、個々の高度不飽和脂肪酸を分離および精製する操作がより容易なものとなる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく１５５種類の化合物について検討した結果、ｐ−トルイル酸、タンニン酸またはシアノコバラミンの存在下にドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸生産能を有する微生物を培養することにより、該微生物の産生するＤＨＡ含有油脂中のＤＰＡやＥＰＡ含量を変化させることができるという知見を得、本発明を完成した。
即ち、本発明は、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸生産能を有する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸含有油脂を製造する方法において、ｐ−トルイル酸、タンニン酸およびシアノコバラミンからなる群から選択される添加剤の存在下に該微生物を培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書中に記載した「ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)」とは(ｎ−３)系のＤＨＡを、また、「ドコサペンタエン酸(ＤＰＡ)」とは(ｎ−３)系および／または(ｎ−６)系のＤＰＡを指す。また、本明細書において、「油脂」、「脂質」および「オイル」なる用語は同じ意味で使用する。
【０００９】
本発明におけるドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸生産能を有する微生物としては、例えば、シゾキトリウム属またはスラウストキトリウム属に属する微生物を挙げることができる。これらの微生物のうち最も好ましいものとしては、シゾキトリウム属ＳＲ２１株(工業技術院生命工学工業技術研究所に「海生菌ＳＲ２１菌株」の名称で平成７年３月６日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３４を取得している)を挙げることができる。
【００１０】
培地中に添加するｐ−トルイル酸、タンニン酸またはシアノコバラミンの量は、１.０ｇ／Ｌ以下であれば良く、０.０２〜０.２ｇ／Ｌの範囲が好ましい。
【００１１】
本発明において前記微生物を培養するには、その菌株を予め培養して得られた前培養液を、液体培地または固体培地に接種し、培養する。培地は、天然海水または人工海水、あるいは調製した合成培地であってもよい。
【００１２】
培地に添加する炭素源としては、グルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、フコース、グルコサミン、デキストランなどの炭水化物の他、オレイン酸、ダイズ油などの油脂類や、グルタミン酸、糖蜜、グリセロール、マンニトール、酢酸ナトリウムなどの一般的に使用されているものをいずれも使用できるが、これらに限られるものではない。
【００１３】
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカーなどの天然窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿素などの有機窒素源、または、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの無機窒素源を用いることができる。
【００１４】
この他、必要に応じてリン酸カリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化カルシウムなどの無機塩およびビタミン類も微量栄養源として使用できる。
【００１５】
これらの培地成分は、微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。一般的には、炭素源は培地１リットル当たり０.６〜６０ｇの濃度で用いてよい。窒素源は、炭素源の増加に伴って増加させるのが望ましい。
【００１６】
培養は、液体培地を用い、フラスコによる振盪培養でも、通気撹拌培養でもできる。通常の撹拌式発酵槽あるいは気泡塔型培養装置を使用することもできる。また、培養温度は２０〜４０℃の範囲であってよく、培養期間は３〜５日間であるのが望ましい。
【００１７】
培養終了後、培養液から遠心分離や濾過などの常用の固液分離手段を用いて培養菌体を得る。菌体を十分に水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥や風乾などによって行うことができる。
【００１８】
このようにして得られる培養菌体を、そのまま動物の飼料や魚類の餌料として用いることができる。また、この菌体から、次のようにしてＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡなどを含有する油脂を採取することができる。さらに、所望によりＤＨＡ、ＤＰＡまたはＥＰＡを単離することもできる。
【００１９】
油脂の採取は、乾燥菌体を、例えばダイノミルや超音波などにより破砕し、次いで、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出することによって行う。有機溶媒としては、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテルなどを用いることができる。また、メタノールと石油エーテルの交互抽出あるいはクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いる抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出液から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃度のＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡを含有する油脂が得られる。
また、上記の方法に代えて、湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合には、メタノールやエタノールなどの水と相溶性の有機溶媒と水の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
【００２０】
このようにして得られる油脂中には、ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡなどの高度不飽和脂肪酸が、中性脂質(例えば、トリグリセリド)または極性脂質(例えば、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール)の形で存在している。培養菌体から採取したＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ含有油脂からのＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ含有トリグリセリドの精製は、例えば冷却分離法またはカラムクロマトグラフィー法などにより行うことができる。
【００２１】
ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡ含有油脂からのＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの分離および精製は、油脂を加水分解し、得られる混合脂肪酸をそのままあるいは混合脂肪酸エステルとした後、常法(例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法など)により行うことができる。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１  シゾキトリウム属微生物による油脂の製造(１)
シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌの三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込み、以下の条件で撹拌培養を行った。
(１)培地組成（ｇ／Ｌ）
１）グルコース：２０
２）ポリペプトン：１０
３）酵母エキス：５
４）５０％人工海水：１Ｌ
５）ｐ−トルイル酸：０、０.０２、０.０５、０.１、０.２
(２)培養条件
１）培養温度（℃）：２８
２）撹拌数（ｒｐｍ）：１００
【００２３】
培養後、遠心分離により菌体を集め、１０５℃で３時間乾燥した。乾燥菌体１０ｍｇを１０％ＨＣlを含むメタノール溶液とジクロロメタンの等量混合液に溶解し、５０℃で３時間熱処理することにより、脂肪酸メチルエステルを調製した。これをガスクロマトグラフィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。ガスクロマトグラフィーの分離条件を下記に示す。
0003931219.tif 000002
【００２４】
この結果を以下の表１に示す。
【表１】
0003931219.tif 000003
【００２５】
実施例２  シゾキトリウム属微生物による油脂の製造(２)
シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌの三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込み、実施例１と同条件で撹拌培養を行った。
培地組成（ｇ／Ｌ）
１）グルコース：２０
２）ポリペプトン：１０
３）酵母エキス：５
４）５０％人工海水：１Ｌ
５）タンニン酸：０.０５
培養後、実施例１と同様にして脂肪酸メチルエステルを調製した。これを、実施例１と同条件でガスクロマトグラフィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。この結果を図１に示す。
結果からわかるように、タンニン酸を添加したときには、対照と比較して、ＥＰＡに相当するピークの減少が認められた。
【００２６】
実施例３  シゾキトリウム属微生物による油脂の製造(３)
シゾキトリウム属ＳＲ２１株について、容量５００ｍｌの三角フラスコに、以下の組成の培地１００ｍｌを仕込み、実施例１と同条件で撹拌培養を行った。
培地組成（ｇ／Ｌ）
１）グルコース：２０
２）ポリペプトン：１０
３）酵母エキス：５
４）５０％人工海水：１Ｌ
５）シアノコバラミン：０.０５
培養後、実施例１と同様にして脂肪酸メチルエステルを調製した。これを、実施例１と同条件でガスクロマトグラフィーにかけ、脂肪酸組成を分析した。この結果を図１に示す。
結果からわかるように、シアノコバラミンを添加したときには、対照と比較して、奇数鎖脂肪酸である１５：０および１７：０の割合が減少し、偶数鎖脂肪酸である１４：０の割合が増加した。これは、シアノコバラミンがＳＲ２１株のアミノ酸代謝に何らかの影響を与え、奇数鎖脂肪酸の前駆体が供給されなくなったためと推定される。
【００２７】
実施例４  シゾキトリウム属微生物由来の油脂のカラム精製
実施例１の方法に従い０.２ｇ／Ｌのｐ−トルイル酸を含む培地で培養して得た菌体を乾燥して乾燥菌体を得た。この乾燥菌体をクロロホルムとメタノールとの混合溶媒中でガラスビーズを用いて破砕し、濾過した後、ヘキサンで抽出することにより油脂を得た。得られた油脂を、ヘキサン中、水酸化カリウムを含むエタノールの添加によってエステル化した。常法に従って後処理することにより、脂肪酸のエステル体を含む油脂混合物を得た。この油脂混合物は、ガスクロマトグラフィーによる分析によれば、ＤＨＡエチルエステルを約５０％、ＤＰＡエチルエステルを約２.４％、ＥＰＡエチルエステルを８.５％含有していた。
【００２８】
この油脂混合物につき、下記条件での液体クロマトグラフィーによりＤＨＡエチルエステル、ＤＰＡエチルエステルおよびＥＰＡエチルエステルを分離した。即ち、粒子径５０μｍ、細孔径１２０オングストロームおよび炭素含有率１７％のオクタデシルシラン(ＯＤＳ)充填剤[YMC＊GEL ODS-AM-120-S50]を充填した内径４００ｍｍおよび長さ２０００ｍｍのカラムを用いてＨＰＬＣに付した。
上記の油脂混合物１.２ｋｇをメタノール中の１０％溶液として上記カラムに導入し、メタノールを使用して４.４リットル／分の流速で溶離し、分画を得た。各分画につき溶媒を留去し、ＤＨＡエチルエステル３３０ｇ、ＤＰＡエチルエステル２ｇ、ＥＰＡエチルエステル８２ｇを得た。
【００２９】
【発明の効果】
本発明に従えば、微生物が産生するＤＨＡ含有油脂に含まれる高度不飽和脂肪酸のうち、例えばＤＰＡやＥＰＡの含有比率を変化させることができるので、ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡの含有比率の異なる培養菌体または油脂を得ることができ、所望により魚油由来のＤＨＡ含有油脂組成物と同様の油脂組成物を得ることもできる。
また、微生物培養によって得たＤＨＡ含有油脂からＤＨＡを分離および精製するに際し、分離がより困難なＤＰＡ含量を減少させることは、ＤＨＡの分離および精製を容易にするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  培地に添加物を加えたときに微生物が産生した油脂中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで調べた結果を示すチャートである。
【図１】
0003931219.tif 000004