(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来の組織切片からなるタンパク質群を含む標的構造物試料における特定のタンパク質に対する抗体のスクリーニング方法であって、以下の工程(ａ)〜(ｃ)を備えることを特徴とする高効率抗体スクリーニング方法。
(ａ) タンパク質群を含む標的構造物試料又は該標的構造物試料における標的タンパク質を含む標的微細構造物部分とファージ抗体ライブラリーとを反応させる工程
(ｂ) 標的微細構造物部分から標的タンパク質に結合したファージ抗体を回収する工程
(ｃ) 回収したファージ抗体を複製し、該複製したファージ抗体を前記標的タンパク質と反応させる操作を１又は２回以上行う工程
【請求項２】
標的微細構造物部分が、標的構造物試料から分画処理された微細構造物部分であることを特徴とする請求項１記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項３】
分画処理が、標的微細構造物部分の周囲を除去する分画処理であることを特徴とする請求項２記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項４】
分画処理が、標的構造物試料を包埋材により包埋処理し、該包埋処理された標的構造物試料に微細穿孔処理を施し、標的微細構造物部分を露出させる分画処理であることを特徴とする請求項２記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項５】
微細穿孔処理が、レーザー又は電子ビームによる微細穿孔処理であることを特徴とする請求項４記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項６】
タンパク質群を含む標的構造物試料として、抗原の賦活化処理が施された試料を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項７】
ファージ抗体ライブラリーとして、ファージミド抗体ライブラリーを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項８】
ファージミド抗体ライブラリーと反応させた標的微細構造物部分を分離回収した後、標的タンパク質に結合したファージミド抗体を回収することを特徴とする請求項７記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項９】
標的タンパク質に結合したファージミド抗体を宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製することを特徴とする請求項８記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【請求項１０】
標的タンパク質に結合したファージミド抗体のＣＤＲ領域を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅された領域を組み込んだファージミドベクターを宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製することを特徴とする請求項８記載の高効率抗体スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高効率抗体スクリーニング方法、より詳しくは、生体組織切片等に包埋材による包埋処理を施した後、レーザー等により微細な孔を穿ち、露出した標的タンパク質に抗体ライブラリーを作用させ、標的タンパク質に結合したファージミド抗体を複製することにより、生体組織から標的タンパク質に対する特異抗体を直接的に高効率でスクリーニングする高効率抗体スクリーニング方法（組織ファージパニング法）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ゲノム構造解析プロジェクトは塩基配列決定技術の急速な進歩により、多くの微生物において全ゲノム配列決定に至り、ヒトにおいても来世紀初頭には終了すると言われている。しかし、塩基配列が決定されても遺伝子発現産物のうちデータベースを利用した相同タンパク質の検索などにより、機能が推定できる遺伝子は極めて少なく、また、実際に細胞内において発現、機能しているタンパク質の多くは細胞の状態によって、その発現量の変化や翻訳後修飾によって様々に変動する。このように生命活動のある瞬間に存在するタンパク質のセットはプロテオームという、PROTEin と genOMEを組み合わせた造語で表現される新たな概念として提唱されており(Kahn, P. Science 270, 369-70(1995))、プロテオームの全体像を把握し、別の瞬間の全体像と比較することでその変動を解析することが行われている。こうしたプロテオームの動態を大規模に解析することで生命現象を解析する試みがプロテオミクスと呼ばれるもので、ポストゲノムプロジェクトとして注目を集めている。そのための手法としては、二次元電気泳動法とアミノ酸配列解析・質量分析法とを組み合わせた方法が一般的に用いられている。
【０００３】
他方、生体組織を顕微鏡で観察して疾病の種類を診断する病理組織診断には、組織プレパラート等の病理組織標本が通常用いられている。かかる組織プレパラートには、さまざまな正常あるいは異常な構造物が見い出されており、異常な微細構造物の例として、プリオン病や神経変性疾患において病理組織上に現われる種々の封入体（プリオン斑、Ｐｉｃｋ小体、Ｌｅｗｙ小体、Ｂｕｎｉｎａ小体、その他）が知られている。これら微細異常構造物等を構成する未知の超微量成分を明らかにすることは、疾患の分子病理メカニズムを明らかにする上で極めて意義深いとされている。
【０００４】
また、目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとすることができ、この方法によるとヒトの抗原に対する抗体の作製も可能である。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング方法についても既に数多く報告されている (Scott, J. M. and Smith, G. P., Science, 249, 386-390 (1990); Smith, G. P. and Scott, J. K., Methodｓin Enzymology, 217, 228-257 (1993))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、ポストゲノムプロジェクトとして注目を集めているプロテオミクスには、二次元電気泳動法とアミノ酸配列解析・質量分析法とを組み合わせた手法が多用されているが、かかる手法にはいくつかの問題点があることが指摘されている。また、かかる方法では、生体組織切片等の病理組織標本を用いての微細異常構造物等を構成する未知の超微量成分を直接サンプルとすることはできない上に、生命活動のある瞬間に特定の組織に存在するタンパク質のセットを精確に把握することは困難である。本発明の課題は、顕微鏡下においてのみ認められる微細構造物等を構成する未知の超微量成分を、顕微鏡下で観察しうる極く微量の試料のみで決定することを可能にする、生命活動のある瞬間に特定の組織に存在する標的タンパク質に対する特異抗体を、直接的に高効率でスクリーニングする高効率抗体スクリーニング方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、１０9の多様性をもったライブラリーがすでに作製されており、理論上すぺての種類のタンパク質をカバーすることができるファージ抗体ライブラリーに着目し、このファージ抗体ライブラリーを用いるファージパニング法を超微量の組織試料に適用することにより、スライドグラス上で未知の配列情報を決定していくことが可能となり、かかる組織チップを用いたイン サイチュウ組織ファージパニング法が新しいプロテオーム解析法となり得るとの知見を得た。具体的には、生体組織切片等にレーザー等を用いて分画処理を施し、分画処理された標的タンパク質を含む標的微細構造物部分にファージ抗体ライブラリーを作用させ、標的タンパク質に結合したファージミド抗体を複製することにより、生体組織から標的タンパク質に対する特異抗体を直接的に高効率でスクリーニングすることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、生体由来の組織切片からなるタンパク質群を含む標的構造物試料における特定のタンパク質に対する抗体のスクリーニング方法であって、以下の工程(ａ)〜(ｃ)を備えることを特徴とする高効率抗体スクリーニング方法
(ａ) タンパク質群を含む標的構造物試料又は該標的構造物試料における標的タンパク質を含む標的微細構造物部分とファージ抗体ライブラリーとを反応させる工程
(ｂ) 標的微細構造物部分から標的タンパク質に結合したファージ抗体を回収する工程
(ｃ) 回収したファージ抗体を複製し、該複製したファージ抗体を前記標的タンパク質と反応させる操作を１又は２回以上行う工程
（請求項１）や、標的微細構造物部分が、標的構造物試料から分画処理された微細構造物部分であることを特徴とする請求項１記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項２）や、分画処理が、標的微細構造物部分の周囲を除去する分画処理であることを特徴とする請求項２記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項３）や、分画処理が、標的構造物試料を包埋材により包埋処理し、該包埋処理された標的構造物試料に微細穿孔処理を施し、標的微細構造物部分を露出させる分画処理であることを特徴とする請求項２記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項４）や、微細穿孔処理が、レーザー又は電子ビームによる微細穿孔処理であることを特徴とする請求項４記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項５）や、タンパク質群を含む標的構造物試料として、抗原の賦活化処理が施された試料を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項６）や、ファージ抗体ライブラリーとして、ファージミド抗体ライブラリーを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項７）や、ファージミド抗体ライブラリーと反応させた標的微細構造物部分を分離回収した後、標的タンパク質に結合したファージミド抗体を回収することを特徴とする請求項７記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項８）や、標的タンパク質に結合したファージミド抗体を宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製することを特徴とする請求項８記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項９）や、標的タンパク質に結合したファージミド抗体のＣＤＲ領域を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅された領域を組み込んだファージミドベクターを宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製することを特徴とする請求項８記載の高効率抗体スクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の高効率抗体スクリーニング方法としては、(ａ)タンパク質群を含む標的構造物試料又は該標的構造物試料における標的タンパク質を含む標的微細構造物部分と抗体ライブラリーとを反応させる工程、(ｂ)標的微細構造物部分から標的タンパク質に結合した抗体を回収する工程、(ｃ)標的タンパク質に結合した抗体を複製し、該複製した抗体を前記標的タンパク質と反応させる操作を１又は２回以上行う工程を備える、生体由来の組織切片からなるタンパク質群を含む標的構造物試料における特定のタンパク質に対する抗体のスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、また上記抗体には、イムノグロブリン、一本鎖抗体、抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントが含まれる。抗体フラグメントとしては、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ(ａｂ′)2、Ｆ(ａｂ′)2を還元して得られるＦａｂ′、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂなどを例示することができる。
【０００９】
上記生体由来の組織切片からなるタンパク質群を含む標的構造物試料としては、複数種のタンパク質を含む構造物試料であればどのようなものでもよく、剖検や生検用の病理標本等の生体由来の組織切片を具体的に例示することができる。かかる組織切片の作製方法は特に制限されるものではないが、本発明の高効率抗体スクリーニング方法は基本的に抗原抗体反応に立脚しているため、用いる臓器等の固定条件、保存条件等によって組織抗原性が低下している場合には、抗原性を賦活化する処理をあらかじめ施しておくことが好ましい。抗原の賦活化処理としては、公知の抗原の賦活化処理であればそれらのいずれも採用することができ、例えばハイドロリティック オートクレービング（Hydrolytic autoclaving）法、アルカリ処理法などを挙げることができる。なお、凍結保存された組織・器官等、比較的抗原性が保たれている組織試料等については抗原の賦活化処理を省略することができる。
【００１０】
本発明の高効率抗体スクリーニング方法においては、対象とする標的構造物が極めて微細かつ微量であることを特徴としている。このことからして、目的とする標的微細構造物部分以外の抗原性を遮蔽して、目的とする標的抗体以外の好ましくない抗体の混入を防止することはスクリーニング効率を高める上で極めて重要である。そのために、組織切片等のタンパク質群を含む標的構造物試料には、標的タンパク質を含む標的微細構造物部分を他の部分から分画するための分画処理を施すことが好ましい。かかる分画処理としては、紫外レーザー等を用いて、標的構造物試料における前記標的微細構造物部分の周囲を除去して標的微細構造物部分を孤立させる分画処理や、標的構造物試料を包埋材により包埋処理し、該包埋処理された標的構造物試料に赤外レーザー等を用いて微細穿孔処理を施し、標的微細構造物部分を露出させる分画処理を好適に例示することができる。上記、標的微細構造物部分の周囲を除去する分画処理としては、標的とする微細構造物部分の周囲の組織を、例えば、紫外レーザーを用いたレーザーマイクロダイセクターを用いて、約２０乃至５０μｍ幅にわたり除去する分画処理を挙げることができ、この分画処理により、標的タンパク質をより特異的に認識する抗体を効率よく得ることができる。
【００１１】
また、上記標的微細構造物部分を露出させる分画処理としては、標的微細構造物部分を覆う包埋材にレーザー光線や電子ビームを用いる微細穿孔処理を施し、標的タンパク質を含む標的微細構造物部分を露出させる分画処理を例示することができ、かかる分画処理により、包埋処理された組織切片等の標的構造物試料の標的とする微細構造物部分のみの抗原性を提示させることができ、標的タンパク質をより特異的に認識する抗体を効率よく得ることができる。上記微細穿孔処理としては特に制限されないが、例えば、標的微細構造物部分を覆う包埋材を赤外レーザー等の照射により融解して除去する処理を挙げることができ、この場合の微細穿孔の大きさは適宜選定しうるが、特異抗体を効率よくスクリーニングする上では一般的に小さい方が好ましい。赤外レーザーでの現時点での照射穿孔最小径は直径７．５μｍ程度であるが、赤外レーザーを用いる場合、理論的には直径２〜３μｍまで絞ることも可能である。また、電子ビームを用いる場合には、ナノメートルのオーダーまで絞ることも可能である。この微細穿孔処理により、標的タンパク質を含む目的とする微細構造物部分のみが包埋材から露出されるため、標的微細構造物部分以外に反応する多種多様な好ましくない抗体の混入を抑制しつつ、標的微細構造物部分の抗原性のみを提示させることが可能となる。また、包埋材としては、パラフィン、ポリアクリル酸ポリマー・ポリスチレン・エポキシ樹脂等の有機高分子樹脂、アルギン酸・寒天等の天然多糖類等を例示することができる。これらの中でも実質的に抗原性を提示しないパラフィン等の包埋材を用いることが好ましいが、抗原性を有する包埋材を使用する場合には、包埋材に対する好ましくない抗体を抗体ライブラリーの中からあらかじめ除去しておくことが好ましい。また包埋に際しては、前記賦活化した抗原性を損なわない包埋条件を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明において用いられる抗体ライブラリーとしては、多数の抗体を含むライブラリーであれば特に制限されるものではないが、理論的にはあらゆるタンパク質上の抗原エピトープに対応しうる、１０9程度の多種多様なファージミド抗体からなるファージミド抗体ライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）を用いることが好ましい。かかるファージミド抗体ライブラリーとしては、市販のものを含め、通常のファージディスプレイ法において用いられる公知のファージライブラリーであればどのようなライブラリーでもよく、例えばファージディスプレイヒト抗体ライブラリーは、ヒトＢ細胞から、抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶH、ＶL）をコードする遺伝子断片をＰＣＲで増幅し、この増幅した遺伝子が、そのコートタンパクｐIII遺伝子の枠内に挿入されたＭ１３ファージ等の繊維状ファージ（ファージミドベクター）を大腸菌に導入し、この大腸菌にＶＣＳ−１３等のヘルパーファージを感染させることにより、ＳｃＦＶ抗体ライブラリーとして構築することができる（H.R.Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20(1998)）。かかるは、免疫グロブリン遺伝子のＶH遺伝子とＶL遺伝子をヒンジ部を介して融合させて一本鎖で発現させたタンパク質で、通常の抗体分子に準ずる抗原との反応性を有する。この場合、ＳｃＦＶを発現しているＭ１３は、ファージ粒子内にＳｃＦＶの遺伝子を、ファージミドの形で持っている偽ウイルス粒子となっている。
【００１３】
また、ファージ抗体ライブラリーとして、本発明者により作製され、シークエンス−アレイ・ライブラリー（Sequence-arrayed library (ＳＡＬ)）と名づけられたライブラリーを有利に用いることができる。以下、ＳＡＬについて説明する。ファージ抗体ライブラリーにおいて抗原を特異的に認識するファージ抗体には、優先的に用いられているＦａｂ構造があり、ＶＨ鎖はＤＰ４７、ＶＬ鎖はＤＰＫ２２であることが知られている。またこれらの鎖のＣＤＲ領域において、特にＣＤＲ３領域のある限られた部位（ＶＨ鎖：９５、９６、９７、９８残基目のアミノ酸／ＶＬ鎖：９１、９３、９４、９６残基目のアミノ酸）が抗原との結合に深く関与していることも知られている。そこで、それらの領域において使われているアミノ酸の使用頻度を調べてみたところ、使用頻度に差があることを見い出した。また、それらのアミノ酸を性質ごとに分類すると７種類のアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｙ、Ｐ）に限定することができた。これらのアミノ酸をＣＤＲ３領域の抗原結合部位にランダムに配置すると、５．８×１０6の多様性をもったライブラリーを作製することができ、これにより１種類のファージ抗体の量をこれまでの１０4から１０6−１０7まで増加することができることがわかった。
【００１４】
そこで、これらの多様性をカバーし、しかも効率の良いプライマーの設計法を検討したところ、上記７種類のアミノ酸を３種類のコドンで代用できることを見い出した。３種類のコドンを抗原結合部位に配置すると、ＤＰ４７用の８１種類のプライマー（配列番号１〜８１）、ＤＰＫ２２用の８１種類のプライマー（配列番号８２〜１６２）ですべての多様性をカバーすることができる。さらにこれらのプライマーにおいて、使用するアミノ酸の数を減らしたり、それぞれのプライマーで合成したＤＰ４７とＤＰＫ２２を組み合わせてサブライブラリーを作製することによって１種類のファージ抗体の量を１０6以上にすることも可能となる。したがって、このＳＡＬは超微量な抗原に対するファージ抗体のスクリーニングだけではなく、パニングを必要としないファージ抗体のスクリーニングの可能を有している。また、このＳＡＬを用いて、特異性が低くても抗原をクローニングしてくることができれば、アフィニティーマチュレーションによって特異性を強めていくことができる。
【００１５】
前記微細穿孔処理により露出した標的タンパク質を含む標的微細構造物部分とファージミド抗体ライブラリーとの反応は、例えば約５×１０12ｃｆｕ／ｍＬのファージ抗体を用いて常法により行うことができる。ファージミド抗体ライブラリーとの反応後の微細構造物部分を組織切片から分離回収し、その後目的とする各標的タンパク質に付着したファージミド抗体のみを回収することが好ましい。かかる微細構造物部分の分離回収方法としては特に制限されるものではないが、例えば、マイクロマニピュレーターに装着したマイクロピペットを用いて吸引回収する方法や、紫外レーザーを用いたレーザーマイクロダイセクター等を用いて分離回収する方法が好ましい。レーザーマイクロダイセクター等を用いる場合、紫外レーザーにより１μｍ径程度までの切断は十分に可能であるが、電子ビーム照射によりさらに微細な切断も可能である。
【００１６】
上記回収された各標的タンパク質に付着したファージミド抗体を大腸菌に感染させることにより、各標的タンパク質に反応するファージミド抗体を大量に複製することができる。ファージミド抗体は、その抗体部分のＤＮＡ配列情報がファージミド内に組み込まれているため、大腸菌感染によりファージミドが複製される際に、その表面に発現している抗体も同時に複製されることから、各標的タンパク質と反応する抗体を大量に、かつ容易に複製することができる。実際には、一回の反応で陽性抗体を同定できることは稀であり、この操作を数回繰り返すことで、目的とする各標的タンパク質に対応する抗体を得ることができる。この繰り返しのサイクルはパニングと呼ばれ、通常このパニング操作は数回、好ましくは２〜５回程度繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するファージ抗体を濃縮し、スクリーニングすることができる。
【００１７】
上記パニングの別法として、ファージミドを直接大腸菌に感染させる方法に代えて、各標的タンパク質に結合しているファージミド抗体のＣＤＲ領域（主にＣＤＲ３）を標的にＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅された領域を組み込んだファージミドベクターを宿主細胞に感染させ、ファージミド抗体を複製する方法を挙げることができる。この方法の利点は、標的とするＣＤＲ領域のサイズがほぼ一定であること、及びＰＣＲに用いるプライマーの配列は共通であることから、通常ＰＣＲによる複製を行う際の大きな問題である、ＰＣＲによる増幅の不均一化が最小限に抑制できることにある。実際にこの方法を用いることで、ファージミドを直接大腸菌に感染させる方法に比べて、約１０倍の効率を達成することができる。
【００１８】
また、標的タンパク質とファージミド抗体ライブラリーとの反応により、陽性抗体を同定するに際し、好ましくない包埋材等に対する抗体を除去するための方法としては、先に述べた如く標的微細構造物部分のみを分離回収する方法以外に、パニング毎に異なる種類の包埋材（パラフィンと有機高分子樹脂など）を交代に用いる方法（Alternative membrane method）や、ファージミド抗体ライブラリーをあらかじめ包埋材等と反応させておき、これらに対する抗体を除去する方法や、これらを組み合わせた方法などを挙げることができる。
【００１９】
上記スクリーニングにより得られた各標的タンパク質に対する陽性抗体を用いて組織切片上で免疫染色を行い、それぞれの抗体と目的とする各標的タンパク質との反応性、特異性を確認することが好ましい。標識化抗体を用いる免疫反応により組織・細胞等を顕微鏡等で観察することができるように染色する組織免疫染色法の一つである蛍光抗体法（免疫蛍光法）は、組織における標的タンパク質の局在を蛍光顕微鏡下に検出する方法であり、かかる蛍光抗体法としては、組織において局所発現した標的タンパク質に蛍光標識した抗体を用いる直接蛍光抗体法や、組織において局所発現した標的タンパク質に未標識の抗体（一次抗体）を結合させた後に蛍光標識した二次抗体（抗Ｉｇ抗体）を結合させる間接蛍光抗体法があり、抗体の蛍光標識には、緑色系のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、Ｃｙ３（シアニン−３）等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。また、上記蛍光物質の他、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素を例示することができ、これら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法 27 ) 」 (第1 版、石川栄治著、学会出版センター、1991年)などに記載されている方法で標識することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ等のラジオアイソトープを用いることもできる。その他、各抗体のＤＮＡのフットプリントと抗体価の相関性を調べることで、抗体のモノクローナル化が可能である。
【００２０】
また、スクリーニングにより得られた陽性抗体を大腸菌に感染させることで、極めて容易に均質なファージミド抗体を大量に調製することができる。またその際、大腸菌ＨＢ２１５１株などの特定の大腸菌株に感染させると、これらのファージミド抗体を大腸菌から遊離させて、抗体断片として溶液中に可溶化することもできる。このような可溶化型抗体断片を調製する場合、ｃ−ＭｙｃやＨｉｓ−ｔａｇと呼ばれるシークエンスタッグ等を有する融合ペプチドとしておくことが、かかる可溶化型抗体断片を精製する場合に有利である上に、このタッグを特異的に認識する物質をあらかじめチップ上に固定しておき、次に可溶化された各可溶化型抗体断片を反応させることにより、これらの抗体断片をチップ上に容易に固定することができ、チップ表面を細かく分画しそれぞれの分画にそれぞれ異なるファージミド抗体を固定させることにより抗体チップとすることもできる。
【００２１】
このようにして同定された陽性抗体を用いて、タンパク質の発現ライブラリーを用いたスクリーニングを行い、陽性抗体と反応する発現ライブラリー上の陽性クローンを検出することができる。この陽性クローンの塩基配列及び翻訳されたアミノ酸配列は、組織切片等の微細構造物部分に発現している各標的のタンパク質の配列と相同であることから、標的とした各タンパク質の塩基配列情報やアミノ酸配列情報を得ることができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１［組織切片の調製］
組織切片としてヒト筋肉凍結切片を以下のように調製した。ヒトの大腿部の筋肉組織の凍結物（インフォームドコンセントの元に診断・研究用に採取されたもの）をクリオスタット（LEICA社製「CM1850」）を用いて、マイナス２５℃に保持した状態で、厚さ２μｍの組織切片に削り取り、この削り取った薄片を、シランコートスライドグラス（DAKO社製  Code NoS3003)に付着させ、ヒト筋肉凍結組織プレパラートを調製した。このプレパラートを室温にて５分間風乾した。次いで、レーザーマイクロダイセクター（オリンパス、HOYA共同製作試作品「LR-2100 OL」）を用いて、標的微細構造物部分（４０μｍ×４０μｍ）の周囲の組織を紫外レーザーにて照射し、２０μｍ幅の縁取りをするように孔を穿ち、標的微細構成物部分を周囲から孤立させ、分画した。このような標的微細構造物部分（４０μｍ×４０μｍ）を同一プレパラート上に３ヶ所作製した。
【００２３】
実施例２［標的タンパク質を認識するファージ抗体の選択］
実施例１で調製した標的タンパク質を含む標的微細構成物部分を分画した組織プレパラートを４℃のアセトンに５分間浸漬し、組織のアセトン固定を行った。これを風乾の後、プレパラート用疎水性ペン（DAIDO 産業、「PAP PEN」）にてプレパラートの組織部分を含む直径２ｃｍの円を描き、反応液槽としての上記２０μｍ幅の縁取りをした孔の周囲に印を付けた。以下の各反応液を、この反応液槽に満たすことにより、組織と反応させた。まず、１００μＬの１０％スキムミルク／トリス緩衝食塩水（以下TBSと略、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）にて２時間、室温、湿潤箱中で穏やかに振盪（blocking）した。次にこの液を除いた後、波長２６０ｎｍの吸光度が５である濃度（およそ５×１０12ｃｆｕ／ｍＬに相当）のファージ抗体ライブラリーを含む１０％のスキムミルク／ＴＢＳ  １００μＬを組織プレパラートに重層し、室温にて一晩、湿潤箱中で振盪しつつ反応させた（パニング１ラウンド目）。反応終了後、反応液を除き、プレパラートをＴＢＳでフラッシングすることにより洗浄した。さらに、プレパラートをガラス製染色壷に移し、１５０ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ中にて、３０分間４回振盪（１００回／分）洗浄し、非特異反応性ファージを除去した。上記パニング１ラウンド目のファージ抗体ライブラリーには、１０9種以上の多様性をもつファージミド系抗体ライブラリーであるヒト合成Ｆｖライブラリー“Ｇｒｉｆｆｉｎ．１”（英国ＭＲＣのG. Winter博士より供与）を使用した。
【００２４】
実施例３［標的タンパク質を認識するファージ抗体の複製］
サッター社の肉薄ガラスキャピラリー（芯なし、「Ｂ−１００−７５−１０」）より、標的微細構造物部分（４０μｍ×４０μｍ）の２〜５割増し程度の、先端内径を持つようなマイクロピペットを作製し、マイクロマニピュレーターに装着した。実施例２の処理を行ったプレパラート上に、２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳを重層し、マイクロピペットによってこの液を若干量吸引しながら３箇所の標的微細構造物部分を吸引し、３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳを入れた１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに回収した。これを１５，０００ｒｐｍ３０秒間遠心して回収構造物を沈殿させ、上清を除去することにより洗浄した。再び３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳを加えて遠心することによる洗浄を２回行なった後、上清を除去した。この標的微細構造物に１０μＬの超純水を加え、９５℃５分間加熱することにより、特異的に結合したファージ中に含まれるファージミドを溶出した。このファージミドのＳｃＦＶ遺伝子部分を挟む位置の特異的なプライマー［センスプライマー５′−CGGATAACAATTTCACACAGGAAAC−３′（Ｍ１３−ＢＡＣＫ；配列番号１７８）、アンチセンスプライマー５′−CTATGCGGCCCCATTCAGATC−３′（ＨＥＮ−ＳＥＱ１；配列番号１７９）］を用いてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９８℃で１分間変性させ、その後９５℃で２０秒間熱変性させ、６０℃で２０秒間アニーリングさせ、７２℃で１分間伸張させるというサイクルを３８回繰り返し、最後に７２℃で３分間伸張を行った。その後、このＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＮｏｔＩとＮｃｏＩで消化し、３％アガロースゲル電気泳動にて展開し、目的のＰＣＲ増幅産物を切り出して抽出した。これを、ＮｏｔＩとＮｃｏＩで消化したファージミドベクターｐＨＥＮ２に組み込んだ。このファージミドベクターを、大腸菌ＴＧ１株にエレクトロポーレーション法によってトランスフォームし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１％のグルコースを含むＬＢプレート（１Ｌ中に１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ、１５ｇのアガーを含む）（ＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート）にプレーティングし、３０℃にて一晩培養しコロニーを形成させた。
【００２５】
実施例４［ファージ抗体の調製］
実施例３による、ＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート上の大腸菌ＴＧ１株コロニー全体をかき取り、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１％のグルコースを含む２×ＴＹ（１Ｌ中に１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌを含む）（２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃ）２５ｍＬに波長６００ｎｍの吸光度が１．０程度以下になるように懸濁し、３７℃にて１時間攪拌培養した。このうち３ｍＬを２．４×１０10ｐｆｕのヘルパーファージＶＣＳ−Ｍ１３（Stratagene社製）の入ったチューブに移し、３７℃に３０分間静置した後、３２５０×ｇで１０分間遠心分離して上清を除いた。沈殿した大腸菌は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１２．５ｍＬの２×ＴＹ（２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｋａｎ）に懸濁し、３０℃で一晩振盪培養した。この培養液を４℃、１０７５０×ｇで１０分間遠心分離して沈殿を除去した後、培養上清にその１／５容のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％のポリエチレングリコールと２．５ＭのＮａＣｌを含む）を加え混合し、４℃に３０分以上放置した。その後４℃、１０７５０×ｇで１０分間遠心分離し上清をデカンテーションで除いた後、さらに１０７５０×ｇで遠心し上清を完全に吸引して取り除いた。沈殿したファージは０．５ｍＬのＰＢＳに溶解し、これを１１６００×ｇで１０分間遠心分離して不溶物を沈殿させ、上清を他のチューブに移してＳｃＦＶファージ抗体溶液を得た。このようにして得られたＳｃＦＶファージ抗体溶液は、波長２６０ｎｍにおける吸光度がおよそ１０から１５程度になる濃度であった。このＳｃＦＶ抗体を用いて１ラウンド目と同様に２ラウンド目のパニングを行い、パニング２ラウンド目で３８ｋＤａの筋細胞中の抗原に特異的に反応するＳｃＦＶ抗体ファージを得た。
【００２６】
実施例５［モノクローナルファージ抗体の調製］
実施例４によるポリクローナルファージ抗体からモノクローナルファージ抗体を調製することもできる。パニング後のＬＢ／Ａｍｐ・Ｇｌｃプレート上のシングルコロニーをポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイタープレート中の１００μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃに接種し、３７℃で一晩振盪培養した。次にこのうち２μＬをポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイタープレート中の２００μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃに接種し、３７℃にて２時間振盪培養後これに２×１０9ｐｆｕのＶＣＳ−Ｍ１３を含む５０μＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃを加え３７℃に３０分間静置した。これを室温で２３８０×ｇ、１５分間遠心分離し上清を除き、菌体をＦａｌｃｏｎ１４ｍＬラウンドチューブ中１．８ｍＬの２×ＴＹ／Ａｍｐに懸濁し、３０℃にて一晩培養した。このうち上清１．５ｍＬを用い実施例５と同様にファージ抗体溶液（１００から２００μＬ）を得た。
【００２７】
実施例６［蛍光染色による特異性の確認］
実施例５によるモノクローナルファージ抗体あるいは実施例４によるポリクローナルファージ抗体を用いて、蛍光染色によりその特異性を確認した。すなわち実施例１で調製した標的タンパク質を含む標的微細構成物部分が露出した組織切片を室温で２０分間乾燥させた後、ＴＢＳ中で室温にて５分間洗浄し、−２０℃のメタノールに浸漬し、再度ＴＢＳで洗浄した後、２％のＢＳＡを含むＨＡＮＫＳ（Ｃａ2+，Ｍｇ2+を含まない）中で室温にて１０分間ブロッキングし、実施例５によるモノクローナルファージ抗体あるいは実施例４によるポリクローナルファージ抗体を２％のＢＳＡを含むＨＣＭＦＳで希釈して調製した溶液を上記ブロッキングした切片にのせ、室温で６０分間反応させた。これら反応させた切片をＴＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、２％のＢＳＡを含むＴＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇＧ抗体を用いて室温にて３０分間染色した。これら染色物を遮光したままＴＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、グリセリンで封入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、局所的に蛍光が認められた。これによりパニング操作を通じて選択されたポリクローナルおよびモノクローナルファージ抗体は、スクリーニングに用いた標的タンパク質に高い特異性をもって反応していることを確認した。
【００２８】
参考例［抗アクチンＳｃＦＶ抗体と筋肉微小切片との反応］
ＳｃＦＶ抗体ファージライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｎライブラリー、上述）より、通常のパニング法によって、抗αアクチン抗体を得た（抗アクチンファージ＃８９）。このファージを至適条件下でヒト筋肉凍結切片と反応させ、筋の微小領域（４０μｍ×４０μｍ）に結合しているファージを回収してくると、反応時のファージ濃度とファージ回収量は直線関係にあった。反応時ファージ濃度１０9ｃｆｕ／ｍｌのとき、回収される抗アクチンファージは約１．５ｃｆｕ／筋４０μｍ2であった。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法が有効であることが示された。
【００２９】
実施例７［可溶化型抗体断片の調製］
実施例６で特異性を確認したファージ抗体クローンを、１ｍＬの２×ＴＹ／Ｇｌｃ（１％）中に波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５から１．０になるまで培養した大腸菌ＨＢ２１５１株の培養液に加え、３７℃に３０分間静置した。これにアンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍＬになるように加え３７℃で一晩振盪培養した。このうち０．５ｍＬをあらかじめ３７℃に保温しておいた５０ｍＬの２×ＴＹ／Ａｍｐ・Ｇｌｃ（０．１％）に接種し、３７℃にて対数増殖期終期に至るまで振盪培養したのち、これにＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加えて発現を誘導し、３０℃にて一晩振盪培養して培地中に可溶化型抗体断片を分泌させた。これを１０７５０×ｇで１０分間遠心分離して菌体を除き、可溶化型抗体断片を含む培地上清を得た。この可溶化型抗体断片はそのカルボキシ末端にヒスチジン６残基からなるタグを有するため、これを利用した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより必要に応じてこの分子を精製した。すなわち中性条件において可溶化型抗体断片を含む培地上清をＴＡＬＯＮ樹脂（CLONTECH社製）を充填したカラムに通した後、Ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム・ｐＨ７．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールを含む）で洗浄後、吸着した抗体断片をＥｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム・ｐＨ７．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾールを含む）で溶出させ、精製標品を得た。
【００３０】
実施例８［ＶＨ鎖ＤＰ４７およびVＬ鎖ＤＰＫ２２のクローニング］
ＳＡＬファージ抗体ライブラリーを作製するために、その出発材料となるＶＨ鎖ＤＰ４７クローンおよびVＬ鎖ＤＰＫ２２クローン（ＤＰ４７−ＤＰＫ２２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号１６３）のクローニングを前記ヒト合成Ｆｖライブラリー“Ｇｒｉｆｆｉｎ．１”を基に行った（図１参照）。ファージミドベクターおよびプライマー［ＤＰ４７（配列番号１６４）はＤＰ４７−Ｎ／Ｎｃｏ（配列番号１６５）とＤＰ４７−Ｃ（配列番号１６６）、ＤＰＫ２２（配列番号１６７）はＤＰＫ２２−Ｎ／Ａｐａ（配列番号１６８）とＤＰＫ２２−Ｃ（配列番号１６９）］を用いてＰＣＲを行い、ＶＨ鎖ＤＰ４７およびＶＬ鎖ＤＰＫ２２を増幅し、ＴＡ−クローニングベクターを使ってクローニングした後、ファージミドを回収し、シーケンスを行った（ＤＰ４７−４（配列番号１７０）およびＤＰＫ２２）。ＶＨ鎖ＤＰ４７クローンについては、期待された配列が得られなかったために、新たに変異を入れるためのプライマー［ＤＰ４７−５′−１（配列番号１７１）、−３′−１（配列番号１７２）、−５′−２（配列番号１７３）、−３′−２（配列番号１７４）］を合成し、Stratagene社のQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitを使ってＰＣＲ法でポイントミューテーションを導入し、再度シーケンスを行い、変異を確認した（Mutated ＤＰ４７）。これにより、Mutated ＤＰ４７（配列番号１７５）はＤＰ４７と塩基配列は異なるが、期待されたアミノ酸配列と相同のクローンが得られた。これらのクローンをもとに、抗原抗体反応において重要な８ヶ所（ＶＨ鎖Mutated ＤＰ４７及びＶＬ鎖ＤＰＫ２２各々４ヶ所ずつ）のアミノ酸に実施例９に示すようにアミノ酸変異を導入し、ＳＡＬファージ抗体ライブラリーを作製した。
【００３１】
実施例９［ファージ抗体ライブラリーＳＡＬの作製］
ＶＨ鎖ＤＰ４７用プライマーとして、配列番号１〜８１で示される塩基配列からなる８１種類のプライマーと、VＬ鎖ＤＰＫ２２用プライマーとして、配列番号８２〜１６２で示される塩基配列からなる８１種類のプライマーを常法により合成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、（１）ランダム領域（抗原抗体反応において重要な８ヶ所における）の作製［ＤＰ４７−Ｎ／ＮｃｏとＤＰ４７−Ｃ／ｒａｎｄｏｍ（配列番号１〜８１）、およびＤＰＫ２２−Ｎ／ＡｐａとＤＰＫ２２−Ｃ／ｒａｎｄｏｍ（配列番号８２〜１６２）］と、（２）ファージミドへの組み込みに必要な制限酵素部位の付加［ＤＰ４７−Ｎ／ＮｃｏとＤＰ４７−Ｃ／Ｘｈｏ（配列番号１７６）、およびＤＰＫ２２−Ｎ／ＡｐａとＤＰＫ２２−Ｃ／Ｎｏｔ（配列番号１７７）］を行った。これらのプライマーによって、図１に「ＮＮＮ」で示されるＶＨ鎖ＤＰ４７の９５、９６、９７、９８残基、およびVＬ鎖ＤＰＫ２２の９１、９３、９４、９６残基に7種類のアミノ酸（G、S、D、N、R、Y、P）のいずれかがランダムに配置される。これらのプライマーを用いてＰＣＲ法でＶＨ鎖ＤＰ４７とVＬ鎖ＤＰＫを合成し、これらの増幅断片を制限酵素で切断した後に、常法に準じてファージディスプレイライブラリーを作製した。これにより１０6の多様性の一本鎖抗体断片を繊維状ファージ表面に提示しているシーケンス−アレイド・ライブラリーを得た。なお、図１のＤＰ４７−Ｃ／ｒａｎｄｏｍプライマーおよびＤＰＫ２２−Ｃ／ｒａｎｄｏｍプライマーにおける「ＮＮＮ」にはＡＴＨ（ＨはＣ，Ｔ又はＡ；ＡＴＣ＝Ａｓｐ，ＡＴＴ＝Ａｓｎ，ＡＴＡ＝Ｔｙｒ）、ＡＣＢ（ＢはＴ，Ｇ又はＣ；ＡＣＴ＝Ｓｅｒ，ＡＣＧ＝Ａｒｇ，ＡＣＣ＝Ｇｌｙ）、ＣＧＧ（Ｐｒｏ）のいずれかから選択されるが、上記実施例により作製したライブラリーはＡＴＨとＡＣＢとの組合せのみを用いたので、各プライマーで３×３×３×３＝８１種類の合成プライマーを使用することになる。また、ＡＴＨとＡＣＢとの組合せは、ＤＰ４７及びＤＰＫ２２のそれぞれにおいて１６通りあることから、このライブラリーの多様性は全部で（８１×１６）×（８１×１６）＝１．７×１０6となる。
【００３２】
【発明の効果】
個々のタンパク質についてその局在や詳細な機能、他分子や細胞にもたらす相互作用を解析するにあたっては、その特異抗体が不可欠である。本発明によると、試料中の標的タンパク質に対する抗体を高効率でスクリーニングすることができ、得られた抗体を用いて、標的タンパク質の同定のみならず、得られた特異抗体を用いての対象タンパク質分子の活性阻害や細胞への刺激導入などの検討を行うことができ、今後のプロテオミクス研究を推進する上できわめて有用である。また、スクリーニングにより得られた抗体を用いて、タンパク質のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、タンパク質を効率よく同定することができる。また本発明によると、スクリーニングにより得られた抗体を用いて、タンパク質のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができるので、標的タンパク質が断片化したタンパク質の一部であっても、全長配列を確定することも可能となる。
【００３３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＰ−４７とＤＰＫ−２２の配列情報を示す図である。
【図１】
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