(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を大量発現させた宿主を、６Ｍ濃度以上の尿素を含有する破砕溶液中で破砕した後、変性プロテアーゼを吸着する陽イオン交換クロマトグラフィーにより破砕物からプロテアーゼを除去し、次いで未分解のタンパク質を吸着する陰イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製することを特徴とするタンパク質精製方法。
【請求項２】
破砕方法が、物理的破砕であることを特徴とする請求項１のタンパク質精製方法。
【請求項３】
破砕方法が、超音波破砕であることを特徴とする請求項２のタンパク質精製方法。
【請求項４】
タンパク質大量発現用宿主が、細菌であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかのタンパク質精製方法。
【請求項５】
タンパク質大量発現用細菌が、大腸菌であることを特徴とする請求項４のタンパク質精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、プロテアーゼ除去方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、タンパク質を大量発現させた際、目的タンパク質を分解する宿主由来のプロテアーゼを除去する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
タンパク質を得る方法としては、一般的に、ヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、特定のアミノ酸配列に基づき化学合成によってぺプチドを調製する方法、あるいは特定のＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で取得する方法などが用いられる。とくに、組換えＤＮＡ技術は、均一なタンパク質を工業的に大量に合成したり、天然には存在しない融合タンパク質を合成する方法として有用であり、近年好ましく実施されている。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術では、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の宿主に、目的タンパク質を合成するＤＮＡの断片を有する発現ベクターを導入し、目的タンパク質を大量に発現させることができる。
【０００４】
しかしながら、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物や、動物細胞、植物細胞は、その細胞内に様々なタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を保有しており、組換え技術によって発現されたタンパク質を細胞破砕して抽出する際、および、抽出後には、これらのプロテアーゼが発現されたタンパク質を分解してしまうため、その活性を抑制しておく必要がある。
【０００５】
プロテアーゼ活性の抑制方法としては、様々なプロテアーゼ阻害剤を添加する方法が最も一般的である。しかし、プロテアーゼ阻害剤の種類によっては、完全にプロテアーゼの活性を抑制できないものもあり、目的タンパク質を分離精製しても、時間の経過とともにタンパク質の分解が進行してしまうことが多かったのが実状である。さらに、プロテアーゼ阻害剤の添加により、精製が困難になるという問題も指摘されていた。
【０００６】
したがって、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、目的タンパク質を分解させることなく、効果的かつ簡便に宿主のタンパク質大量発現系からプロテアーゼを除去する方法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、この出願の発明は、以下の通りの発明を提供する。
【０００８】
まず第１には、この出願の発明は、タンパク質を大量発現させた宿主を、少なくとも尿素を含有する破砕溶液中で破砕した後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とするプロテアーゼ除去方法を提供する。
【０００９】
また、この出願の発明は、第２には、破砕方法が、物理的破砕であること、第３には、該物理的破砕が、超音波破砕であること、第４には、尿素の濃度が６Ｍ以上であること、および第５には、イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換カラムと陰イオン交換カラムを組み合せて成ることを上記プロテアーゼ除去方法の態様として提供する。
【００１０】
さらに、この出願の発明は、第６には、タンパク質大量発現用宿主が、細菌であること、第７には、該細菌が大腸菌であることをその態様として提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この出願の発明のプロテアーゼ除去方法は、宿主を用いて一般的な遺伝子工学的手法により大量発現されたタンパク質の精製を行う際に、しばしば問題となる宿主由来のプロテアーゼを、効果的に、かつ簡便に除去するためのものである。
【００１２】
その手順としては、まず、目的タンパク質を大量発現させた宿主に少なくとも尿素を含有する破砕溶液を加え、その中で宿主の細胞膜を破砕した後、イオン交換クロマトグラフィーにより、目的タンパク質とそれを基質とするプロテアーゼを分離する。
【００１３】
このとき、タンパク質の大量発現系として用いる宿主は、遺伝子工学的手法において一般的に用いられる様々なものが適用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌、原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などが挙げられる。これらは、目的タンパク質の構造、性質、用途等に応じて選択される。
【００１４】
大量発現されたタンパク質を宿主から抽出させるために、遺伝子工学的手法では、通常、宿主の破砕を行う。この出願の発明のプロテアーゼ除去方法では、まず、破砕溶液の添加を行う。この破砕溶液は、少なくとも尿素を含有していればよく、その尿素濃度は、とくに限定されないが、６Ｍ以上とすることが好ましい。尿素以外の成分は特に限定されないが、目的タンパク質の性質や精製条件に応じてｐＨを調製した緩衝液としてもよい。
【００１５】
破砕の方法としては、一般的な遺伝子組換操作において用いられる様々な方法を適用することが可能である。例えばホモジナイザー、フレンチプレス、超音波などの物理的破砕方法や、界面活性剤による細胞膜の溶解などが例示される。なかでも、薬品等の添加により精製工程を複雑化する恐れがなく、簡便で効果の高い超音波破砕が好ましい。
【００１６】
菌体を破砕し、抽出した目的タンパク質は、そのままイオン交換クロマトグラフィーによって、プロテアーゼを分離、除去される。イオン交換クロマトグラフィーは、通常用いられる多種多様のものから選択されるが、とくに陽イオン交換カラムと陰イオン交換カラムを連結させて行うことが効果的で好ましい。その際、カラムの順序や種類、サイズ、能力、溶液の流量、流速等の条件は、目的タンパク質の性質とプロテアーゼの性質によって適宜変更することが可能である。好ましくは、陽イオン交換カラムを最初にし、その後陰イオン交換カラムを連結する。
【００１７】
陽イオン交換カラムには、プロテアーゼが吸着するため、抽出液を通過させれば、抽出液からプロテアーゼが除去される。一方、陰イオン交換カラムには、目的タンパク質が吸着する。陽または陰イオン交換カラムに吸着しない尿素などの不純物は流出し、除去される。
【００１８】
この出願の発明のプロテアーゼ除去方法では、最後に陰イオン交換カラムを陽イオン交換カラムから分離し、適当な溶媒によりカラムを洗浄することにより、目的タンパク質のみを回収できる。
【００１９】
以下に実施例を示し、この出願の発明をさらに詳しく説明する。もちろんこの出願の発明は、これらの例に限定されるものではなく、様々な態様が考えられることは言うまでもない。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例、比較例において、プロテアーゼＸとは、ＦｌｇＦを基質とする宿主由来のプロテアーゼを示す。
【００２１】
実施例１  プロテアーゼＸの活性に対する阻害剤と尿素の効果
サルモネラ菌べん毛タンパク質の一つであるＦｌｇＦ（Salmonella typhimurium flagellar protein）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを宿主として、通常の遺伝子工学的手法により大量発現させた。８Ｍの尿素を添加し、超音波によって大腸菌の細胞膜を破砕すると同時に、プロテアーゼを変性させた。
【００２２】
この溶液を、遠心分離にかけて可溶性画分を分離した。
【００２３】
得られた可溶性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、ＦｌｇＦの存在を確認した。
【００２４】
比較例１〜６
実施例１と同様の方法でタンパク質を大量発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭのＥＤＴＡを混合したＴＥ溶液（比較例１）、ＴＥ溶液にペプスタチンＡを２μｇ／ｍｌ添加した溶液（比較例２）、ＴＥ溶液にロイペプチンを２μｇ／ｍｌ添加した溶液（比較例３）、ＴＥ溶液に４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド・ＨＣｌ（ｐ−ＡＢＳＦ）を２ｍＭ添加した溶液（比較例４）、ＴＥ溶液にＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）を２ｍＭ添加した溶液（比較例５）、ＴＥ溶液にベーリンガーマンハイム社製のプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット１個／５０ｍｌを加えた溶液（比較例６）を用いて、実施例１同様に超音波破砕し、遠心分離を経て可溶性画分を得た。各可溶性画分の含有成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＦｌｇＦと分解されたＦｌｇＦの存在を確認した。
【００２５】
図１は、実施例１および比較例１〜６におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロファイルである。これよりプロテアーゼＸに対する阻害効果を比較できる。これによれば、比較例１〜６では、プロテアーゼ分解されたＦｌｇＦが可溶性画分中に存在していることが明らかであるが、実施例１の尿素を添加した溶液中で破砕、プロテアーゼ変性した系においては、分解されたＦｌｇＦは見られなかった。
【００２６】
これより、尿素がプロテアーゼの活性を阻害する上で効果的であることが示された。
【００２７】
実施例２、３  プロテアーゼ除去後のＦｌｇＦの安定性
実施例１と同様に、ＦｌｇＦ（Salmonella typhimurium flagellar protein）を大量発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、８Ｍの尿素溶液中で超音波によって破砕した後、遠心分離を経て可溶性画分を得た。
【００２８】
ＨｉＴｒａｐＳＰ（陽イオン交換カラム）とＨｉＴｒａｐＱ（陰イオン交換カラム）を連結したイオン交換カラムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化し、この可溶性画分を通過させた。さらにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、陽イオン交換カラムを取り外した後、陰イオン交換カラムに吸着したＦｌｇＦを溶出した。このＦｌｇＦ画分（実施例２）と、ＦｌｇＦ画分を３７℃で１時間放置した後のもの（実施例３）を、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、含有成分の分析を行なった。
【００２９】
比較例７〜８
実施例２と同様の方法で、イオン交換クロマトグラフィー前のＦｌｇＦ溶液（比較例７）、分離したＦｌｇＦに陽イオン交換カラムから溶出したプロテアーゼＸを改めて添加し、３７℃で一時間放置した溶液（比較例８）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、含有成分の分析を行なった。
【００３０】
以上より、イオン交換クロマトグラフィー直後には、可溶性画分中には、ＦｌｇＦのみが存在し、３７℃で１時間経過後もＦｌｇＦは分解せずに安定に存在することが明らかになった。一方、分離精製後のＦｌｇＦにプロテアーゼＸのみを添加した試料では、各成分由来の２つのスポットが明確に現れた。
【００３１】
これより、この出願の発明のプロテアーゼ除去方法により、目的タンパク質からプロテアーゼを完全に除去することが可能であることが示された。
【００３２】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、目的タンパク質を分解させることなく、効果的かつ簡便に宿主のタンパク質大量発現系からプロテアーゼを除去する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この出願の発明の実施例において、様々なプロテアーゼ阻害剤と尿素を添加した際の、ＦｌｇＦ溶液のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す図である。
【図２】  この出願の発明の実施例において、この出願の発明の方法でプロテアーゼを除去した後のＦｌｇＦ溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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