(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
正電荷をもつ官能基を露出させた半導体ナノ粒子からなる負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項２】
半導体ナノ粒子表面をチオール化合物で化学修飾することにより正電荷を持つ官能基を半導体ナノ粒子表面上に露出させたことを特徴とする請求項１に記載の負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項３】
半導体ナノ粒子表面を、（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウムで化学修飾することにより正電荷を持つ官能基を半導体ナノ粒子表面上に露出させたことを特徴とする請求項２に記載の負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項４】
前記半導体ナノ粒子の材質が、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅであることを特徴とする請求項1〜３のいずれかに記載の負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項５】
前記生体高分子がＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項６】
前記生体高分子がたんぱく質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の負電荷をもつ生体高分子の検出用試薬。
【請求項７】
正電荷をもつ官能基を露出させた半導体ナノ粒子を、サンプル生体高分子の持つ負電荷に静電的に結合させることにより、プローブ生体高分子との結合の有無および結合量を検出する生体高分子の検出方法。
【請求項８】
前記プローブ生体高分子との結合の有無および結合量の検出が、光学的、電気化学的、又はそれらの融合により信号を検知することを特徴とする請求項７に記載の生体高分子の検出方法。
【請求項９】
基板上に固定化されたプローブ生体高分子に結合したサンプル生体高分子の有無および結合量を検出することを特徴とする請求項７又は８に記載の生体高分子の検出方法。
【請求項１０】
光学的、電気的および磁気的に修飾されたプローブ生体高分子に結合したサンプル生体高分子の有無および結合量を検出することを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の生体高分子の検出方法。
【請求項１１】
前記プローブ生体高分子がプローブＤＮＡであり、前記サンプル生体高分子がサンプルＤＮＡであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の生体高分子の検出方法。
【請求項１２】
前記サンプル生体高分子がサンプルたんぱく質であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の生体高分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル修飾を必要としない生体高分子検出試薬及び生体高分子検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体高分子の検出においては、サンプル側の生体高分子に光学的、電気的、および磁気的な修飾を施し、それらから得られる信号を検知し、検出を行っている。光学的な方法としては、アマシャムファルマシアバイオテク社から販売されているＣｙTMｄｙｅに代表される蛍光試薬を用いた方法、および、放射性を持つ試薬を用いるラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた方法などがある。また、電気的に修飾をする方法として、ＤＮＡ二本鎖に特異的にインタカレートする試薬を用いて、あるいはルテニウム錯体等を用いた酸化・還元サイクルを利用した、電気化学的検出方法が挙げられる。また、修飾を行わない方法においては、表面プラズモン共鳴現象を利用した方法などが挙げられる。しかし、これらの方法においては、解析の信頼性、コスト等の問題が残っている。
ところで、半導体ナノ粒子は、発光特性および電気化学特性を持ち、さまざまな分野での利用が期待され、近年急速に注目されている高機能材料である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、半導体ナノ粒子の持つ物理化学的特性に注目した、生体高分子検出における新しい利用法である。本発明においては、表面を化学修飾した半導体ナノ粒子を検出試薬として用いることで、サンプルに対する修飾を必要とせず、安価で感度の高い、十分な信頼性が得られる検出を行うことを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明では、サンプル生体高分子のもつ電荷を利用し、その電荷量に応じて吸着する性質を持つ試薬を用いることで、サンプル生体高分子への修飾を必要としない生体高分子検出試薬及び生体高分子検出方法を提供する。
本発明者らは、半導体ナノ粒子の持つ物理化学的特性に注目し、表面を化学修飾した半導体ナノ粒子を検出試薬として用いることにより上記課題が解決されることを見出し本発明に至った。
即ち、本発明の生体高分子検出用試薬は、正電荷をもつ官能基を露出させた半導体ナノ粒子からなる。
【０００５】
ここで、半導体ナノ粒子に正電荷をもつ官能基を露出させる手段としては、半導体ナノ粒子表面をチオール化合物で化学修飾することが挙げられる。
前記正電荷の官能基を有するチオール化合物としては、（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウムが好ましく例示される。
【０００６】
前記半導体ナノ粒子の材質として限定されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ2、ＷＯ3、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅが好ましく例示される。
【０００７】
本発明においては、チオール化合物の−ＳＨ基が半導体ナノ粒子の表面のＳ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐ、Ａｓ、Ｎ等の原子と置換することにより半導体ナノ粒子の表面を化学修飾する。
また、本発明の生体高分子の検出方法は、正電荷をもつ官能基を露出させた半導体ナノ粒子を、サンプル生体高分子の持つ負電荷に静電的に結合させることにより、プローブ生体高分子との結合の有無および結合量を検出するものである。
【０００８】
ここで、前記プローブ生体高分子との結合の有無および結合量の検出は、光学的、電気化学的、又はそれらの融合により信号を検知することで行うことが出来る。
また、基板上に固定化されたプローブ生体高分子に結合したサンプル生体高分子の有無および結合量を検出することが出来る。
【０００９】
また、光学的、電気的および磁気的に修飾されたプローブ生体高分子に結合したサンプル生体高分子の有無および結合量を検出することが出来る。
更に、上記の生体高分子の検出試薬及び生体高分子の検出方法において、前記プローブ生体高分子がプローブＤＮＡであり、前記サンプル生体高分子がサンプルＤＮＡであるときに、前記検出を行うことが出来る。
【００１０】
図１を参照して、本発明の生体高分子を検出するメカニズムを説明する。図１において、平面又はビーズ状を形成する表面基板１が有する正電荷とプローブＤＮＡ２の燐酸側鎖の負電荷の結合により、基板１に対してプローブＤＮＡ２が固定化されている。プローブＤＮＡ２とサンプルＤＮＡ３は互いに水素結合でハイブリドする。これによりサンプルＤＮＡ３の燐酸側鎖の負電荷が上昇する。このサンプルＤＮＡ３の負電荷に正電荷を有する半導体ナノ粒子４が結合し、その結合量によりハイブリッド形成されたサンプルＤＮＡ３に関する情報を信号として提供する。
【００１１】
図１の場合は、プローブＤＮＡ２が負電荷で半導体ナノ粒子４が正電荷であった。たんぱく質等では、等電点が存在し、ＰＨの高低によってサンプルＤＮＡ３の電荷も正負に変化する。
【００１２】
本発明では公知の半導体ナノ粒子を使用することが出来る。粒径が１０ｎｍ以下の半導体ナノ粒子は、バルク半導体結晶と分子の遷移領域に存在することから、いずれとも異なった物理化学特性を示す。このような領域においては、量子サイズ効果の発現により、粒径の減少に伴ってエネルギーギャップが増大する。さらにこれに伴い、バルク半導体で見られたエネルギーバンドの縮退が解け軌道が離散化し、伝導帯下端が負側に荷電子帯上端が正側にシフトする。このような特性を利用して、近年、応用化に関する研究が急速に行われるようになった。本発明では、この特性を利用し、生体高分子検出試薬として応用化した。
【００１３】
半導体ナノ粒子の材質としては、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ2、ＷＯ3、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅ等が挙げられる。
【００１４】
【実施例】
正電荷をもつ官能基が露出した半導体ナノ粒子の製造方法を実施例として以下に説明する。なお、ここでは逆ミセル法を用いたＣｄＳナノ粒子の調整方法を説明するが、ナノ粒子の調整および修飾方法については、光エッチングを用いた作成方法等、その方法を問わない。
【００１５】
チオコリン水溶液の調製
窒素で飽和させた２ｍｏｌ・ｄｍ-3ＨＣｌ水溶液１．２ｃｍ3にヨウ化アセチルチオコリン３５０ｍｇを溶かし、１２時間室温で放置した。これに窒素雰囲気下２８％アンモニア水を０．２ｃｍ3加え中和し、弱アルカリ性の０．８６ ｍｏｌ・ｄｍ-3チオコリン（（２−メルカプトエチル）トリメチルアンモニウム）水溶液を作成した。これによってナノ粒子表面を修飾することによって、正電荷を粒子表面に有するチオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子を調整した。
【００１６】
チオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子の調整方法
ここでは、逆ミセル法による正電荷を粒子表面に有するチオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子の調整方法について説明する。逆ミセル法とは、表面活性剤に囲まれた微小な空間の中で金属イオンを還元することによって、金属ナノ粒子を合成する手法であり、金や銀などのナノ粒子の合成にはよく用いられている。
【００１７】
２００ｃｍ3のｎ−ヘプタンにスルホコハク酸ジ−２−エチルヘキシルナトリウム（ＡＯＴ）１４ｇと超純水４ｃｍ3を加え、40分間攪拌を行うことにより、ＡＯＴの逆ミセル溶液を調製した。これを１２０ｃｍ3と８０ｃｍ3の二つに分けた。前者には、１．０ ｍｏｌ・ｄｍ-3ＨＣｌ水溶液０．４８ｃｍ3を、後者には、１．０ ｍｏｌ・ｄｍ-3ＮａＳ水溶液０．３２ｃｍ3を加え、いずれも均一になるまで攪拌を行った。その後、両者を混合し、さらに１時間攪拌を行うことで、ＣｄＳナノ粒子の逆ミセルコロイド溶液を作製した。さらにこれを激しく攪拌させながら０．８６ ｍｏｌ・ｄｍ-3チオコリン水溶液０．４７ｃｍ3を添加し、さらに一晩攪拌を行うことによって、ＣｄＳナノ粒子表面をチオコリンで化学修飾した。
【００１８】
チオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子の水溶化
チオコリンで表面修飾をしたＣｄＳナノ粒子を含む逆ミセル溶液にメタノールを添加し、逆ミセルを崩壊させた後、遠心分離を行ない、表面修飾したＣｄＳナノ粒子の沈殿を得た。さらに、ヘプタンとエタノールで数回づつ洗浄した後、６．０ｍｏｌ・ｄｍ-3のテトラメチルアンモニウムクロライド水溶液あるいは飽和ＮａＣｌ水溶液を加えナノ粒子表面に存在するＡＯＴを塩化物イオンでイオン交換した。これにより、得られたＣｄＳナノ粒子は、水溶性となる。
【００１９】
チオコリン修飾ＣｄＳナノ粒子の精製
ＣｄＳナノ粒子の精製は、非水溶媒の添加による沈降分離によって行った。まず、得られた粗なＣｄＳナノ粒子水溶液にエタノールを加え、ＣｄＳナノ粒子を再沈殿させた。沈殿のみを回収し、これに超純水を加え再び水に溶かした後、エタノールで沈殿させるという操作を、さらに2回繰り返した。その後、２−プロパノールと超純水を用いて同様の操作を行ない、ＡＯＴを完全に除去した。その後、限外濾過を行ない、共存するテトラメチルアンモニウムクロライドなどの塩および粒径の小さなＣｄＳを取り除き、より単分散化したＣｄＳナノ粒子を精製した。
【００２０】
修飾方法
ここではＤＮＡマイクロアレイに適用した応用例について説明する。ＤＮＡマイクロアレイとは、基板上に化学的に固定された多数の既知のプローブＤＮＡに対し、検定を行いたいサンプルＤＮＡをプローブ上に展開させ、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡの結合の有無および結合量により、サンプルの配列特性を知る方法である。今まで、ＤＮＡの結合の有無および結合量については、サンプルに対して蛍光物質あるいは放射性物質を修飾し、それらを光学的に検出することによって、結合の有無および結合量の測定を行う方法が一般的であった。本発明によれば、前もってサンプルに対して修飾する必要がないため、ＲＮＡ逆転写反応やＰＣＲ反応によるサンプルの前処理が不要であるという特徴をもつ。
【００２１】
ＤＮＡマイクロアレイ上にサンプルＤＮＡ溶液を滴下し、カバーグラスを静置した後、ＣＨＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いて、密閉環境下で６５℃において１６時間反応させた。反応後、スライドガラスを取り出し、２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中にスライドガラスを浸漬してカバーグラスを取り除いた後、ＣｄＳ半導体ナノ粒子濃度１．２×１０17個ｍｏｌ・ｄｍ-3を含む２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中に二時間浸漬した。ＣｄＳ半導体ナノ粒子は、サンプル調製時に、サンプルＤＮＡと混合させても構わない。この場合、前記浸漬は不要となる。その後、２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて２０分間振とうし、０．２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて２０分間振とうをおこなった。さらに非特異吸着サンプルを除去するために、０．２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中で55℃にて２０分間振とうし、同様な操作を再度繰り返した。その後０．２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ溶液中で室温にて数回振とうを行ない、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣのそれぞれの溶液中で室温にて数回振とうさせた。以上の浸漬および洗浄工程は、いずれも染色壷を用いて行った。その後、スライドガラスは、蛍光顕微鏡を用いて解析を行った。
【００２２】
検出方法
検出方法については、既存の方法に準じて行うことができる。すなわち光学的検出方法、電気化学的検出方法などである。ただし、半導体ナノ微粒子は、光学的特性と電気化学的特性の両方を持っているため、電気化学的に励起し光学的に検出を行う方法、もしくは、光学的に励起し電気化学的に検出を行う方法等の融合した検出システムに適用できることが大きな特徴である。
【００２３】
以上の方法に関しては、プローブの形態は問わない。ここでは、ＤＮＡマイクロアレイについて説明をしたが、近年注目を集めているビーズを用いた方法にも利用できる。ルミネックス１００（ルミネックス社製）は、蛍光物質によって染色されたビーズにプローブを固定化し、マイクロチューブ等の溶液中にて蛍光物質等で修飾されたサンプルとの反応を行ない、ビーズの蛍光信号とサンプルの蛍光信号を対照させ、解析を行う方法である。ここでは、ＤＮＡマイクロアレイ同様、サンプルの修飾に適用することが可能である。
【００２４】
また、ＤＮＡに限らず、さまざまな生体高分子について適用可能である。例えば、タンパク解析においては、タンパクの種類により正電荷あるいは負電荷をもつため、これらの性質を利用し、本発明による方法によりナノ粒子をタンパクサンプルに結合させることにより、修飾を行うことが可能である。さらに今後、ペプチド核酸（ＰＮＡ），ロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工的に合成されたプローブを用いる場合には、さらに感度の高い検出を行うことができる。
【００２５】
【発明の効果】
正電荷をもった半導体ナノ粒子を生体高分子検出法に応用することで、従来のように、ＲＴ逆転写反応やＰＣＲ反応等のサンプル生体高分子を修飾することを必要としない反応および解析を行うことが可能となった。さらに、本発明は、今まで一般的に用いられてきた系に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＤＮＡ検出を説明する模式図
【符号の説明】
１：基板、２：プローブＤＮＡ、３：サンプルＤＮＡ、４：正電荷を持った半導体ナノ粒子。
【図１】
0003897285.tif 000002