(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類から抽出したフィコビリ蛋白質からなる血清脂質低下剤。
【請求項２】
藻類がスピルリナ属の藍藻類である請求項１に記載の血清脂質低下剤。
【請求項３】
フィコビリ蛋白質がフィコシアニンである請求項１に記載の血清脂質低下剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、藻類から抽出したフィコビリ蛋白質、スピルリナ属の藻類から抽出したフィコビリ蛋白質、またはフィコシアニンを有効成分とする副作用の少ない天然物由来の血清脂質低下剤とフィコシアニンを有効成分とする健康食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活の欧米化は日本人の身体の向上や栄養の改善をもたらしたが、一方で生活習慣病の増加の原因ともなっている。肥満、高脂血症、高コレステロール血症は、動脈硬化症、脳血栓症、虚血性心疾患等の疾病を引き起こす。これらの生活習慣病による死亡率は常に上位を占めており、その治療には薬剤療法が実施されている。しかし、薬剤治療は効果が高いものの、副作用による障害を発生する危険性があり、これら生活習慣病を日常生活で普通に摂取する食品成分により改善する試みが行われている。
【０００３】
例えば、大豆蛋白質（ＳＢＰ）は、大豆蛋白質を構成するアミノ酸の内、リジン(Lys)／アルギニン(Arg)比が低いこと（１．０以下）、含硫アミノ酸（Met、Cys）含量が高いことから、食事に含まれる中性ステロイドや腸管内へ分泌された胆汁酸の体外排泄を促進して血清コレステロール値を低下させる作用を有することが報告されており、既に厚生労働省が特定保健用食品素材として認知している（厚生労働省生活衛生局食品保健課新開発食品保健対策室監修「コレステロールが高めの方の食品」）。
【０００４】
これらの日常生活で普通に摂取する食品成分により生活習慣病を予防あるいは治療する試みを、さらに進めたものに健康食品がある。健康食品は薬剤療法ほど顕著でないが、食品成分による生活習慣病の予防あるいは治療効果をさらに高め、かつ薬剤治療ほど副作用が鋭敏でない特徴を有し、現代社会において、健康食品は既に大きな市場を形成している。
【０００５】
このような状況で、優れた高脂血症や高コレステロール血症の予防または治療効果を有する、副作用の少ない天然物由来の血清脂質低下剤および健康食品が嘱望されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、優れた血清脂質改善作用を有する、副作用の少ない天然物由来の血清脂質低下剤および健康食品を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各種の天然物由来の成分について検討を行い、食用藻類が副作用がなく優れた血清脂質改善作用を有すること、特に食用藻類の中でも藍藻および紅藻に血清脂質改善作用が高いこと、さらにこれら藻類に含まれる多種多様な成分の中でもフィコビリ蛋白質、とりわけ藍藻類スピルリナから抽出されるフィコシアニンが大豆蛋白質よりも高い血清脂質改善作用を有することを見出して本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は藻類から抽出したフィコビリ蛋白質を有効成分とする血清脂質低下剤、およびフィコシアニンを有効成分とする血清脂質低下剤を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる藻類から抽出したフィコビリ蛋白質は、藻類である藍藻、紅藻、クリプト藻に含まれている。フィコビリ蛋白質の一つであるフィコシアニンは、とりわけ藍藻類に多く含まれる。藍藻類としては、スピルリナ（Spirulina）属、フィッシェレラ(Fischerella)属、ネンジュモ(Nostoc)属、シネコキスチス(Cynechocystis)属、シネココッカス(Cynechococcus)属、トリポスリクス（Tolypothrix）属等が挙げられるが、食用に供され、安全性が確認されているスピルリナ属が特に好ましい。また、健康食品としては、藻体そのものを用いても良いが、藻体中のフィコシアニンを抽出し、精製して不純物が少ない状態で用いることが効果の点からより好ましい。
【０００９】
本発明で用いるフィコシアニンは、上述の藻類から水や緩衝液で抽出し、遠心分離して不溶解分を除き、水溶液に硫酸アンモニウムを添加・遠心分離し、透析処理後、DEAEセルロースにより精製することにより得られる。フィコエリスリンあるいはアロフィコシアニンについても、紅藻あるいは藍藻を用いて同様の精製操作を用いて得ることができる。
【００１０】
これらの中でも工業的規模で生産され、その安全性が確認されて食用に供されている藻類である藍藻類のスピルリナから得られ、食用色素として用いられているフィコシアニンが最も好ましい。
【００１１】
フィコシアニンの安全性に関しては、既に多くの報告がある。例えば、急性毒性試験は、マウス、経口、ＬＤ５０で３０ｇ／ｋｇ以上である（社団法人  日本科学飼料協会）、慢性毒性試験（ＳＤ系ラット、フィコシアニン組成物１％配合飼料、１２ヵ月間経口投与では、慢性毒性因子無しの判定結果（埼玉医科大学、竹本教授）。
【００１２】
突然変異誘起性試験（ヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium ＴＡ９７,ＴＡ９８, ＴＡ１００, ＴＡ１０２株、０．１〜１０ｍｇ／plateの濃度でＳ９（代謝活性化促進剤の存在の有無に関わらず、４株において復帰変異コロニー数の増加は認められず、変異原性は陰性（東京都立衛生研究所研究年報47別冊、1996年）。また五島らはヒト試験において、スピルリナには副作用が無いことを報告している（NUT. REP. INTERNATIONAL、37巻、第6、1988年、1329〜1337頁）。
【００１３】
これらの安全性試験に供されたフィコシアニンの純度は後述する６２０ｎｍの吸光度と２８０ｎｍの吸光度の比から算出する分析方法で６０％のものである。その他の混在成分は、フィコシアニン以外のフィコビリ蛋白質や蛋白質であると考えられているが、この程度の純度でも十分な安全性を有している。
【００１４】
本発明のフィコビリ蛋白質、特にフィコシアニンを有効成分とする血清脂質低下剤は、経口投与が好ましい。かかる製剤は、その用途に応じて錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、トローチ剤、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の製剤形態に調製することができる。フィコビリ蛋白質、例えば、フィコシアニンは水溶性の蛋白質で吸湿性が有り、容易に水に溶解し鮮やかな青色を呈すること、光に対する安定性が低いことなどから、投与剤形は遮光性のあるカプセル剤や糖衣錠が特に好ましい。健康食品の形状も投与法も血清脂質低下剤に準じた形状と投与法であれば良い。
【００１５】
これらの調製に際しては、例えばこの種の薬剤に通常使用されている無毒の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、酸化防止剤、等張化剤、緩衝剤、コーティング剤、矯味剤、溶解補助剤、基材、分散剤、安定化剤、着色剤等の添加物を使用して公知の方法により製剤化することができる。また、かかる製剤中における本発明有効成分であるフィコビリ蛋白質、例えばフィコシアニンの含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に１〜１００質量％の濃度で含有していることが望ましく、また、フィコシアニンの純度は６２０ｎｍの吸光度と２８０ｎｍの吸光度の比から算出する分析方法で８０％以上であることが望ましい。健康食品の場合には、フィコシアニンの純度は６０％以上であれば良い。
【００１６】
本発明の血清脂質低下剤または健康食品の投与量は、症状の軽重、医師の判断等により広範囲に変えることができるが、一般に有効成分として、経口投与で、体重１ｋｇあたり１日に例えばフィコシアニン０．５〜５０ｍｇ、好ましくは、０．５〜２０ｍｇ投与することが好ましい。また、上記投与量は１日１回または数回に分けて投与することができる。これらは患者の症状の軽重、医師の診断に応じて適宜変えることができる。
【００１７】
本発明のフィコビリ蛋白質、特にフィコシアニンを有効成分とする血清脂質低下剤または健康食品は、腸管からのコレステロールの吸収を抑制すると共に、排出を促進させ、血清脂質を改善することにより、高脂血症および動脈硬化症、虚血性心疾患や脳卒中の予防および治療に有効である。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明は元より以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（フィコシアニンの製造例）
スピルリナ粉末５００ｇを７５００ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し１時間攪拌後、３０℃のインキュベーターにて１６時間抽出した。抽出物を２回遠心分離し、上清を回収した。さらに上清を２０％の硫酸アンモニウム溶液にて塩析させ、遠心分離後、上清を更に５０％硫酸アンモニウム溶液で一夜塩析した。この液を遠心分離して青色の沈殿物を得た。該沈殿物をイオン交換水にて透析し、再度蒸留水にて透析した後、凍結乾燥し、粗フィコシアニン８０ｇを得た。
【００２０】
次に、粗フィコシアニン１６ｇ当たり２００ｇの予め５０0ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化させたDEAE陰イオン交換セルロースを用いて粗フィコシアニンを精製し、フィコシアニン３．８２ｇを得た。フィコシアニン１００ｍｇをｐＨ６．６のリン酸緩衝液に溶解し、１００ｍｌとした後、該溶液を１０倍希釈した溶液を用いて、６２０ｎｍ（フィコシアニンの吸収最大波長）および２８０ｎｍ（蛋白質由来の吸収波長）における吸光度の比を測定したところ、Ａ６２０／Ａ２８０＝３．６で、純度８０％であった。
【００２１】
フィコシアニンのＡ６２０／Ａ２８０は４．５であるので、フィコシアニンの純度は以下の式により算出される。（西澤一俊ら、４９７頁、藻類研究法、昭和５４年、共立出版社）
フィコシアニン純度（％）＝３．６／４．５×１００＝８０％
【００２２】
（実施例１）Ｃａｃｏ−２培養細胞のコレステロール吸収に対する影響
［４−１４Ｃ］−コレステロール０．１μＣｉ／ｍｌ、コレステロール０．１ｍＭ、オレイン酸１ｍＭ、モノオレイン０．５ｍＭ、Ｌ−α−フォスファチジルコリン０．６ｍＭ、タウロコール酸６．６ｍＭを含むエマルジョンを調製し、これを溶液１として、コレステロール吸収を測定した。４８ウエルプレートに培養した腸由来Ｃａｃｏ−２細胞から培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を吸引除去した。
【００２３】
ここに前記で調製した溶液１を１ウェルあたり０．２ｍｌ分注し、これに、試験区としてフィコシアニン粗抽出物およびフィコシアニン、対照区としてカゼイントリプシン加水分解物（ネガティブコントロール）と大豆タンパク質ペプシン加水分解物（ポジティブコントロール）各０．２ｍｇを添加し、５%ＣＯ２、３７℃にて２０分間インキュベートした。
【００２４】
その後、溶液１を吸引除去し、０．５ｍｌのDMEMで２回洗浄した。０．１%ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ／ウエル加えて細胞を剥離させ、バイアルに移した。ここにAquasol−２を７．５ｍｌ加え液体シンチレーションカウンターを用いて吸収された［４−１４Ｃ］−コレステロールを測定した。その結果を表１に示した。
【００２５】
【表１】
0003904107.tif 000002
（注）異符号間で有意差あり（p＜０．０５）
【００２６】
表１の結果より、フィコシアニン粗抽出物およびフィコシアニンはいずれもカゼイントリプシン加水分解物に比較してCaco-2細胞におけるコレステロール吸収を有意に抑制し、その抑制効果は大豆蛋白質ペプシン加水分解物と同等もしくはそれ以上であった。
【００２７】
（実施例２）In vitroでのコレステロールミセル溶解性に対する影響
［４−１４Ｃ］−コレステロール０．１μＣｉ／ｍｌ、コレステロール０．１ｍＭ、オレイン酸１ｍＭ、モノオレイン０．５ｍＭ、L−α−フォスファチジルコリン０．６ｍＭ、タウロコール酸６．６ｍＭを含むエマルジョンを調製し、エマルジョン安定性を測定した。
【００２８】
上記の溶液に、試験区としてフィコシアニン粗抽出物およびフィコシアニン精製物、対照区としてカゼイントリプシン加水分解物（ネガティブコントロール）と大豆タンパク質ペプシン加水分解物（ポジティブコントロール）を添加し、ボルテックスミキサーにて攪拌し、その後、超音波処理した。３７℃、２４時間振とうインキュベートし、ミセル溶液とした。この溶液から、５０μｌをバイアルにとり、乳化シンチレーターを１０ｍｌ加えて放射活性を測定し、ミセル溶解性を測定した。その結果を表２に示した。無添加系を１００％とした。
【００２９】
【表２】
0003904107.tif 000003
（注）異符号間で有意差あり（p＜０．０５）
【００３０】
表２の結果よりフィコシアニン粗抽出物およびフィコシアニンはいずれもカゼイントリプシン加水分解物と比較してin vitroにおけるコレステロールミセル溶解性を有意に抑制した。
【００３１】
（実施例３）フィコシアニンの血清コレステロール低下作用（動物実験）
ウィスター系雄性ラット（体重９０〜１１０g）を繁殖用基礎飼料にて５日間飼育し１日絶食後、基本食（カゼイン２３．２５％、ラード５％、コーン油１％、セルロース５％、ミネラル３．５％、ビタミン１％、砂糖２０．１％、澱粉４０．２％、コレステロール０．５％、コール酸ナトリウム０．２５％、塩化コリン０．２％）を与えた群をコントロール群とし、この基本食にスピルリナを３％添加して与えた群（３％Ｓｐ群）、フィコシアニンを３％添加した群（３％ＰＣ群）、フィコシアニン抽出残査を３％添加した群（３％Ｒｅ群）を設定して、１群６匹で４日間飼育した（なお、添加試料中成分は砂糖と澱粉で調整した）。
【００３２】
その後、血清脂質（総コレステロール値、HDL−コレステロール値、LDL+VLDL−コレステロール値）を分析し、動脈硬化指数（Atherogenic Index）はHDL−c／血清TCの式で算出した。その結果を表３に示した。表中の数字の単位はｍｇ／ｄｌ、異符号間で有意差あり（*ｐ＜0.05, **p＜0.01, ***ｐ＜0.001）を示す。表中の血清TCは血清総コレステロール値、HDL−cはＨＤＬ（高密度リポ蛋白質）中のコレステロール値、LDL+VLDL−cはLDL（低密度リポ蛋白質）とVLDL（超低密度リポ蛋白質）のコレステロールの和の値を表す。
【００３３】
（比較例）大豆蛋白質（SBP）のコレステロール低下作用
コレステロール低下作用が確認されている大豆蛋白質について、同様の試験を実施し、結果を併せて表３に示した。
【００３４】
【表３】
0003904107.tif 000004
【００３５】
表３の結果より、血清総コレステロール値の上昇抑制効果はフィコシアニン群で最も効果的（p＜0.01）であること、悪玉コレステロールと言われるLDL+VLDL-コレステロール値もフィコシアニン群で最も低値（p＜0.01）を示したことから、フィコシアニンに血清脂質低下作用のあることが明らかである。更に、フィコシアニン群では動脈硬化指数も有意に改善され（p＜0.001）、動脈硬化予防効果のあることが推定された。
【００３６】
大豆蛋白質（SBP）を用いた比較例は、実施例に比して被験試料の飼料中混合量がPC（フィコシアニン）群より多いにも関わらず、血清総コレステロール低下率がPC群より低く、HDL-cがPC群では上昇傾向を示したのに対しSBP群では減少傾向を示した。その結果として動脈硬化指数はPC群では有意な増加（p＜0.001）を示したのに対しSBP群では増加傾向を示したに過ぎず、有意差が見られなかった。これらの結果から、フィコシアニン（PC）の方が大豆蛋白質（SBP）よりも血清中コレステロールの上昇抑制効果が大であり、動脈硬化予防効果が優れていることが明かである。
【００３７】
【発明の効果】
本発明は、優れた血清脂質改善作用を有する、副作用の少ない天然物由来の血清脂質低下剤および健康食品を提供する。