(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−［Ｎ−［Ｎ−（４−ピペリジン−４−イル）ブタノイル）−Ｎ−エチルグリシル］−（Ｌ）−アスパルチル］−（Ｌ）−β−シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載の非吸湿性結晶及び薬学的に許容しうるキャリヤーを含む薬学的組成物。
【請求項３】
Ｎ−［Ｎ−［Ｎ−（４−ピペリジン−４−イル）ブタノイル）−Ｎ−エチルグリシル］−（Ｌ）−アスパルチル］−（Ｌ）−β−シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶を約４０乃至１００％の相対湿度及び約２０乃至約８０℃の温度に暴露することを含むＮ−［Ｎ−［Ｎ−（４−ピペリジン−４−イル）ブタノイル）−Ｎ−エチルグリシル］−（Ｌ）−アスパルチル］−（Ｌ）−β−シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶を調製する方法。
【請求項４】
前記暴露が、約６５乃至８０％の相対湿度である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
前記暴露が、約４０乃至８０℃である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項６】
前記暴露が、静的条件下で実施される請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項７】
前記暴露が、動的条件下で実施される請求の範囲第３項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、式IのN［N［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシル-アラニンアミドの非吸湿性安定結晶形に関する。
0004008499.tif 000002
化合物は、哺乳動物における血小板凝集及び血栓形成の阻害を含む抗血栓性を有し、心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾患及び血管内凝固症候群のような疾患状態に伴う血栓症の予防及び治療に有用である。
更に、本発明は、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの結晶形、薬学的に許容しうるその組成物及びその中間体を調製する方法に関する。
血液凝固の生化学である止血は、正常な全血及び体組織が損傷した血管からの出血を自発的に止める非常に複雑な現象である。効果的な止血は、血管、血小板及び血漿因子の活性の組み合わせ並びに過剰な凝固を防ぐ制御機構を必要とする。これらの構成要素のいずれかの欠陥、欠乏、又は過剰が出血又は血栓形成の結果となりうる。
細胞外基質上での血小板粘着、拡散及び凝集が血栓形成における主要なできごとである。これらのできごとは、粘着糖タンパク質群、すなわちフィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びフォン・ウィルブランド因子により媒介される。フィブリノーゲンは血小板凝集の補助因子であり、フィブロネクチンは血小板の結合及び拡散反応を支持し、フォン・ウィルブランド因子は血小板の内皮下基質への結合及び拡散において重要である。フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びフォン・ウィルブランド因子の結合サイトは、糖タンパク質IIb/IIIaとして知られている血小板膜タンパク質錯体上に位置する。
フィブリノーゲンのような粘着糖タンパク質は、正常な休止血小板とは結合しない。しかしながら、血小板がトロンビン又はアデノシン二リン酸のような作用物質で活性化されると、血小板は、たぶんフィブリノーゲンを受け入れやすいGPIIb/IIIa結合サイトをつくってその形を変える。本発明の範囲内の化合物はフィブリノーゲン受容体を阻害するので、前述の抗血栓活性を有する。
２．報告された発展
フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びフォン・ウィルブランド因子の細胞表面受容体との相互作用にはそれらにArg-Gly-Asp（RGD）の存在が必要であることが観察された（Ruoslahti E.,Pierschbacher,Cell 1986,44,517-18）。２種類のその他のアミノ酸シークエンス、つまり、Gly-Pro-Argシークエンス、及びドデカペプチドHis-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Valシークエンスもフィブリノーゲンの血小板結合機能に参加すると思われる。RGD及びドデカペプチドを含む小さな合成ペプチドは血小板のGPIIb/IIIa受容体と結合して、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びフォン・ウィルブランド因子の結合を競争的に阻害するとともに活性化された血小板の凝集を阻害することが示された（Plow,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985,82,8057-61;Ruggeri,et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1986,5708-12;Ginsberg,et al.,J.Biol.Chem.1985,260,3931-36;Gartner,et al.,J.Biol.Chem.1987,260,11,891-94）。
グアニジノアルカノイル-及びグアニジノアルケノイル-アスパルチル部分を含むインドリル化合物が血小板凝集阻害剤であることが、Tjoengらによる米国特許第5,037,808号及び同第4,879,313号により報告されている。
１９９１年２月１２日に発行された米国特許第4,992,463号（Tjoeng,et al.）には、一般的に一連のアリール及びアラルキルグアニジノアルキルペプチド擬似化合物が血小板凝集阻害活性を示すことが開示され、特に一連のモノ-及びジメトキシフェニルペプチド擬似化合物及びビフェニルアルキルペプチド擬似化合物が開示されている。
１９８９年８月１５日に発行された米国特許第4,857,508号（Adams,et al.）には、一般的に一連の末端アラルキル置換基を有するグアニジノアルキルペプチド誘導体が血小板凝集阻害活性を示すことが開示され、特に一連の末端アミド官能基を有するO-メチルチロシン、ビフェニル、及びナフチル誘導体が開示されている。
Haverstick,D.M.et al.,Blood 66（4）,946-952（1985）には、arg-gly-asp-ser及びgly-arg-kly-asp-serを含む多くの合成ペプチドがトロンビンにより誘導された血小板凝集を阻害しうることが開示されている。
Plow,E.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,3711-3715（1982）には、テトラペプチドglycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolineがフィブリノーゲンのヒトの血小板への結合を阻害することが開示されている。
１９８６年１２月１５日に出願された仏国特許願第86/17507号には、-arg-gly-asp-シークエンスを含むテトラ-、ペンタ-及びヘキサペプチド誘導体が抗血栓剤として有用であることが開示されている。
１９８７年７月２８日に発行された米国特許第4,683,291号（Zimmerman,et al.）には、シークエンス-arg-gly-asp-を含む、６乃至４０個のアミノ酸からなる一連のペプチドが血小板結合阻害剤であることが開示されている。
１９８９年６月７日に公告された欧州特許願公告第0319506号には、一連の-arg-gly-asp-シークエンスを含むテトラ-、ペンタ-及びヘキサペプチド誘導体が血小板結合阻害剤であることが開示されている。
米国特許第5,023,233号には、Gly-Asp部分を含む環状ペプチド類似物がフィブリノーゲン受容体拮抗物質であることが開示されている。
それぞれ１９９１年３月２８日、１９９０年６月７日、及び１９９０年１月４日に出願された未決の米国特許願第07/677,006号、同第07/534,385号及び同第07/460,777号並びに米国特許第4,952,562号、及び１９９０年９月２５日に出願された国際特許願第PCT/US90/05448号（全ては本発明と同一の譲渡人に譲渡されている）には、アミノ-、グアニジノ-、イミダゾリル-、及び／又はアミジノアルカノイル、及びアルケノイル部分を含むペプチド及び擬ペプチドが抗血栓剤であることが報告されている。
１９９０年２月５日に出願された未決の米国特許願第07/475,043号、及び１９９１年４月１１日に出願され、１９９２年１０月２９日に国際特許公告第WO92/13117号として公告された国際特許願第PCT/US91/02471号（本発明と同一の譲渡人に譲渡されている）には、アミノ-及びグアニジノ-アルキル-及びアルケニル-ベンゾイル、フェニルアルカノイル、及びフェニルアルケノイル部分を含むペプチド及び擬ペプチドが抗血栓剤であることが報告されている。
１９８９年１２月１日に出願され、本発明と同一の譲渡人に譲渡され、本発明と同一の発明者集団を有する米国特許第5,053,392号には、アルカノイル及び置換アルカノイルアザシクロアルキルホルミルアスパラギン酸誘導体が血小板結合阻害剤であることが報告されている。
本発明と同一の発明者による、本発明と同一の譲渡人に譲渡された、１９９０年４月５日に出願された米国特許第5,064,814号には、N-置換アザシクロアルキルカルボニル環状アミノアシルアスパラギン酸誘導体が抗血栓剤であることが報告されている。１９８９年１０月１０日に出願され、本発明と同一の譲渡人に譲渡された米国特許第5,051,405号には、アザシクロアルキルホルミルグリシルアスパラギン酸誘導体が抗血栓剤であることが報告されている。
１９９２年４月８日に公告された欧州特許願第0479481号には、アザシクロアルキルアルカノイルグリシルアスパルチルアミノ酸がフィブリノーゲン受容体拮抗物質であることが開示されている。
１９９２年４月１日に公告された欧州特許願第0478362号には、アザシクロアルキルアルカノイルペプチジルβ-アラニンがフィブリノーゲン受容体拮抗物質であることが開示されている。
PCT特許願公告第WO95/10295号には、哺乳動物における血小板凝集及び血栓形成を阻害し、血栓症の予防及び治療に有用である式IIのアザシクロアルキル-アルカノイルペプチド及び擬ペプチド、特にN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドが開示されている。
0004008499.tif 000003
PCT特許願公告第WO95/10295号にしたがって調製されるN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドは非晶質で吸湿性であり、水分を吸収するので物理的に不安定である。PCT特許願公告第WO95/10295号には、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシル-アラニンアミドの非吸湿性で安定な結晶形は開示されていない。
PCT特許願公告第WO95/10295号にはまた、アザシクロアルキルアルカノイルペプチド及び擬ペプチドが一般的には、Aldrich又はSigmaのような化学薬品供給会社から容易に入手しうる出発物質及び／又は中間体を用いて標準固相又は溶液相ペプチド合成法により調製されることが開示されている（H.Paulsen,G.Merz,V.Weichart,“Solid-Phase Synthesis of O-Glycopeptide Sequences”,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27（1988）;H.Mergler,R.Tanner,J.Gosteli,and P.Grogg,“Peptide Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods I:A New Very Acid-Labile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments.Tetrahedron letters 29,4005（1988）;Merrifield,R.B.,“Solid Phase Peptide Synthesis after 25 Years:The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon”,Makromol.Chem.Macromol.Symp.19,31（1988））。更に、PCT特許願公告第WO95/10295号には、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非晶質で吸湿性の形がスキームＩに示すようにしてC-末端アミノ酸から逐次合成することにより調製されることが開示されている。
0004008499.tif 000004
PCT特許願公告第WO95/10295号には、中心のジ（擬ペプチド又はペプチド）のN-及びC-末端を共に擬アミノ酸及び／又はアミノ酸とカップリングさせてテトラアザシクロアルキルアルカノイルペプチド及び擬ヘプチドを形成することにより、中心のジ（擬ペプチド又はペプチド）からテトラアザシクロアルキルアルカノイルペプチド及び擬ヘプチド又は特に、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドを形成することは開示されていない。
発明の要約
本発明は、式IのN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシル-アラニンアミドの非吸湿性安定結晶形に関する。
0004008499.tif 000005
化合物は、哺乳動物における血小板凝集及び血栓形成の阻害を含む抗血栓性を有し、心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾患及び血管内凝固症候群のような疾患状態に伴う血栓症の予防及び治療に有用である。本発明はまた、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性安定結晶形の薬学的組成物及びその中間体に関する。
本発明はまた、式IIのテトラ-アザシクロアルキルアルカノイルペプチド又は擬ペプチド化合物、特にN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-βシクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性安定結晶形を調製する方法に関する。
0004008499.tif 000006
式中、
AはHであり、
Bはアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、アルキルアリール、又はアルキルアラルキルであり、
Zは
0004008499.tif 000007
であり、
E1はHであり、
E2は天然産のα-アミノ酸のα-炭素側鎖、H、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、複素環式、置換複素環式、複素環式アルキル、置換複素環式アルキルであるか、又はE1及びE2が結合して窒素及び炭素原子とともにE1及びE2が4-、5-、6-、又は7-員環のアザシクロアルカン環を形成し、
GはOR1又はNR1R2であり、
R1及びR2は独立してH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、アルキルアリール、又はアルキルアラルキルであり、
RはH、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
mは１乃至５であり、
nは０乃至６であり、かつ
pは１乃至4である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１３の方法Ａにおいて調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形の試料のＸ線粉末回折グラフを表す。
図２は、実施例１３の方法Ｂ（ａ）において調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形の試料のＸ線粉末回折グラフを表す。
図３は、実施例１３の方法Ｂ（ｂ）において調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形の試料のＸ線粉末回折グラフを表す。
図４は、実施例１４に示したようにして調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の試料のＸ線粉末回折グラフを表す。
図５は、実施例１４に示したようにして調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形の試料のＸ線粉末回折グラフを表す。
図６は、実施例１５に記載したように実施される３種類の実験に関する時間の関数としての出力の等温マイクロ熱量グラフを表す。実験は、種々の溶媒蒸気に暴露した際のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの異なる結晶形の熱的活量を追跡する。図６の（Ａ）図形は、実施例５又は１１にしたがって調製された吸湿性のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドを４０℃において３０時間以上８０％のRH（飽和KCl溶液）した際に、その暴露中に化合物の吸湿性の形が化合物の非吸湿性の形に変換され、強い発熱がおこることを示す。図６の（Ｂ）図形は、実施例５又は１１にしたがって調製された吸湿性のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドを４０℃においてメタノール（化合物が溶解する水以上の溶媒）蒸気に暴露した際に発熱的変換がおこらず、したがってメタノールが非吸湿性の形への変換のためにその形の結晶内の移動を支持しないことを示す。図６の（Ｃ）図形は、実施例１３にしたがって調製された非吸湿性のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドを４０℃において８０％のRHに暴露した際に発熱的変換がおこらず、したがってそのような条件下では化合物の非吸湿性の形が形の変換をしないこと、すなわち、安定な形であることを示す。
図７は、実施例１５に記載したように実施される３種類の実験に関する時間の関数としての出力の等温マイクロ熱量グラフを表す。実験は、４０℃、５０℃及び６０℃において８０％のRHに暴露した際のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の非吸湿性の形への変換の熱的活量を追跡する。図は、４０℃において約２４時間、５０℃において約６．５時間及び６０℃において約３時間で変換がおこることを示す。
図８は、実施例１５に記載したように実施される４種類の実験に関する時間の関数としての出力の等温マイクロ熱量グラフを表す。実験は、６０℃において６５％のRH、７５％のRH、８０％のRH及び１００％のRHに暴露した際のN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の非吸湿性の形への変換の熱的活量を追跡する。図８の顕著な特徴は、相対湿度が高いほど変換が速いということである。別の顕著な特徴は、室温における吸湿性の形におこる液化なしに、６０℃において１００％のRHで化合物の非吸湿性の形への変換がおこるということである。これらの結果から、非吸湿性の形への変換速度は、６０℃における吸湿性の形の液化の速度よりずっと速いことが期待される。
図９は、実施例１６に記載したように実施される２５℃におけるN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性（■）及び非吸湿性（●）の形に関する％重量増加対％RHの比較である。図９は、吸湿性の形のほうが非吸湿性の形よりRHの増大にしたがって重量が増加し、６０％より高い相対湿度では更に顕著であることを示す。更に、図９は、化合物の非吸湿性の形がそのもとの重量％に脱着するのに対し、化合物の吸湿性の形はそのもとの重量％に脱着しないことを示す。
本発明の詳細な説明
前述のように、そして本発明の記載中では、指示がなければ以下の用語は以下の意味を有すると理解される。
本明細書において使用される略語には、BOC（t-ブチロキシカルボニル）、CBZ（ベンジロキシカルボニル）、Gly（グリシン）、Asp（アスパラギン酸）、Obzl（ベンジロキシ）、TFA（トリフルオロ酢酸）、Cha（β-シクロヘキシル-アラニン）、EtOAc（酢酸エチル）、DMF（ジメチルホルムアミド）、DCC（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、HOBT（ヒドロキシベンゾトリアゾール）、TBTU（2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート）、DI（脱イオン水）、PNP（p-ニトロフェノール）、PFP（ペンタフルオロフェノール）、DCU（ジシクロヘキシル尿素）、NMM（N-メチルモルホリン）、MTBE（メチルt-ブチルエーテル）、RH（相対湿度）、THF（テトラヒドロフラン）、PipBu（4-ピペリジン酪酸）及びPipBuen（（4-ピペリジン）ブチリデニルカルボン酸）が含まれ、最後の化合物は下式の化合物である。
0004008499.tif 000008
“患者”には、ヒト及びその他の哺乳動物の両方が含まれる。
“薬学的に許容しうる塩”は、治療投与量で使用された場合に、式Ｉの親化合物の有益な薬学的性質がその塩の形の対イオンに起因する副作用により損なわれないような患者に比較的無害である式Ｉの親化合物の塩の形を意味する。薬学的に許容しうる塩にはまた、式Iの化合物の双性イオン又は内部塩も含まれる。
“アルキル”は、直鎖状又は分枝鎖状の、連鎖内に約１乃至約２０個の炭素原子を有する飽和脂肪族炭化水素基を意味する。分枝鎖状とは、メチル、エチル又はプロピルのような低級アルキル基が直鎖状アルキル連鎖に結合していることを意味する。好ましい直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基は、アルキル基が１乃至約１０個の炭素原子を有する“低級アルキル”基である。最も好ましい低級アルキル基は１乃至約６個の炭素原子を有する。
“シクロアルキル”は、１個以上の環を有し、約３乃至約１０個の炭素原子を有する飽和炭素環状基を意味する。好ましいシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びデカヒドロナフチルが含まれる。
“シクロアルキルアルキル”は、シクロアルキル基で置換されたアルキル基を意味する。好ましいシクロアルキルアルキル基には、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、デカヒドロナフト-1-イルメチル及びデカヒドロナフト-2-イルメチルが含まれる。
“アルキルシクロアルキル”は、アルキル基で置換されたシクロアルキル基を意味する。代表的なアルキルシクロアルキル基には、1-、2-、3-、又は4-メチル又はエチルシクロヘキシルが含まれる。
“アルキルシクロアルキルアルキル”は、アルキルシクロアルキル基で置換されたアルキル基を意味する。代表的なアルキルシクロアルキルアルキルには、1-、2-、3-、又は4-メチル又はエチルシクロヘキシルメチル又は1-、2-、3-、又は4-メチル又はエチルシクロヘキシルエチルが含まれる。
“アザシクロアルカン”は、窒素原子を含む飽和脂肪族環を意味する。好ましいアザシクロアルカンにはピロリジン及びピペリジンが含まれる。
“天然産のα-アミノ酸”は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、及びリシンを意味する。
“天然産のα-アミノ酸のα-炭素側鎖”は、天然産のα-アミノ酸のα-炭素を置換する部分を意味する。代表的な天然産のα-アミノ酸のα-炭素側鎖には、それぞれバリン、アラニン、及びアスパラギン酸のイソプロピル、メチル、及びカルボキシメチルが含まれる。
“アミン保護基”という用語は、合成手順中に望ましくない反応に対してアミノ基を保護し、選択的に除去されうる当業者に公知の容易に除去しうる基を意味する。アミン保護基の使用は、合成手順中に望ましくない反応に対してアミノ基を保護するために当業者には公知であり、多くのそのような保護基は公知である。例えば、本明細書において参考として導入されているT.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd edition,John Wiley & Sons,New York（1991）を参照されたい。好ましいアミン保護基は、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、o-ニトロフェニルアセチル、o-ニトロフェノキシアセチル、トリフルオロアセチル、アセトアセチル、4-クロロブチリル、イソブチリル、o-ニトロシンナモイル、ピコリノイル、アシルイソチオシアネート、アミノカプロイル、ベンゾイル等を含むアシル、メトキシカルボニル、9-フルオレニルメトキシカルボニル、2,2,2-トリフルオロエトキシカルボニル、2-トリメチルシリルエトキシカルボニル、ビニロキシカルボニル、アリロキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル（BOC）、1,1-ジメチルプロピニロキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル（CBZ）、p-ニトロベンジロキシカルボニル、2,4-ジクロロベンジロキシカルボニル等を含むアシロキシである。
“酸不安定性アミン保護基”という用語は、その他の試薬に対しては比較的安定であるが、酸で処理することにより容易に除去される前述のように定義したアミン保護基を意味する。好ましい酸不安定性アミン保護基はtert-ブトキシカルボニル（BOC）である。
“水素化不安定性アミン保護基”という用語は、その他の試薬に対しては比較的安定であるが、水素化により容易に除去される前述のように定義したアミン保護基を意味する。好ましい水素化不安定性アミン保護基はベンジロキシカルボニル（CBZ）である。
“酸保護基”という用語は、合成手順中に望ましくない反応に対してカルボン酸（-CO2H）基を保護し、選択的に除去されうる当業者に公知の容易に除去しうる基を意味する。カルボン酸保護基の使用は当業者には公知であり、多くのそのような保護基は公知である。例えば、本明細書において参考として導入されているT.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd edition,John Wiley & Sons,New York（1991）を参照されたい。カルボン酸保護基の例には、メトキシメチル、メチルチオメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジロキシメチル、置換及び未置換フェナシル、2,2,2-トリクロロエチル、tert-ブチル、シンナミル、置換及び未置換ベンジル、トリメチルシリル等のようなエステル、N，N-ジメチル、7-ニトロインドリル、ヒドラジド、N-フェニルヒドラジド等を含むアミド及びヒドラジドが含まれる。
“水素化不安定性酸保護基”という用語は、その他の試薬に対しては比較的安定であるが、水素化により容易に除去される前述のように定義した酸保護基を意味する。好ましい水素化不安定性酸保護基はベンジルである。
“アリール”はフェニル又はナフチル基を意味する。
“置換アリール”は、同種又は異種の１種以上のアリール基置換基により置換されたフェニル又はナフチル基を意味する。“アリール基置換基”には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリーロキシ、アラルコキシ、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル、カルボキシ、アルケノイル、アロイル、ハロ、ニトロ、トリハロメチル、シアノ、アルコキシカルボニル、アリーロキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アラルキルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アリールスルホニル、アリールスルフィニル、アラルキルスルホニル、アラルキルスルフィニル、又は-NRaRb（式中、Ra及びRbは独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。）が含まれる。
“アラルキル”は、アリール基により置換されたアルキル基を意味する。好ましいアラルキル基には、ベンジル、ナフト-1-イルメチル、ナフト-2-イルメチル、及びフェネチルが含まれる。
“置換アラルキル”は、アリール部分上において１個以上のアリール基置換基により置換されているアラルキル基を意味する。
“複素環式”は、環中の１個以上の原子が炭素以外の元素、例えば窒素、酸素、又は硫黄である約4-乃至約15-員環の単環状又は多環状の系を意味する。好ましい複素環式はピリジル、ピリミジル、及びピロリジルである。
“置換複素環式”は、１個以上のアリール基置換基により置換されている複素環式を意味する。
“複素環式アルキル”及び“置換複素環式アルキル”は、それぞれ複素環式基及び置換複素環式基により置換されているアルキル基を意味する。
“吸湿性”は、物質の物理的又は化学的性質に影響を及ぼすのに十分な量又は状態の水を獲得した収着を意味する（Eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,Vol.10,p.33）。
好ましい実施態様
本発明にしたがって調製した好ましい化合物は、E2がH、アルキル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、メルカプトメチル、2-メチルチオエチル、カルボキシメチル、2-カルボキシエチル、4-アミノブチル、3-グアニジノプロピル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、複素環式、置換複素環式、複素環式アルキル（インドール-3-イルメチル以外である）、置換複素環式アルキルであるか、又はE1及びE2が結合して窒素及び炭素原子とともにE1及びE2が4-、5-、6-、又は7-員環のアザシクロアルカン環を形成している式IIにより記載される。
本発明にしたがって調製した更に好ましい化合物は、E2がH、アルキル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、メルカプトメチル、2-メチルチオエチル、カルボキシメチル、2-カルボキシエチル、4-アミノブチル、3-グアニジノプロピル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキルであるか、又はE1及びE2が結合して窒素及び炭素原子とともにE1及びE2が4-、5-、6-、又は7-員環のアザシクロアルカン環を形成している式IIにより記載される。
本発明にしたがって調製した一層好ましい化合物は、E2がH、アルキル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、メルカプトメチル、2-メチルチオエチル、カルボキシメチル、2-カルボキシエチル、4-アミノブチル、3-グアニジノプロピル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキルであるか、又はE1及びE2が結合して窒素及び炭素原子とともにE1及びE2が4-、5-、6-、又は7-員環のアザシクロアルカン環を形成している式IIにより記載される。
本発明にしたがって調製した一層好ましい化合物は、Bがアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、又はアルキルシクロアルキルアルキルである式IIにより記載される。
本発明にしたがって調製した特定の実施態様は、式IIaにより記載される。
0004008499.tif 000009
式中、
Bはアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、アルキルアリール又はアルキルアラルキルであり、
JはH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
LはOR1又はNR1R2であり、
R1及びR2は独立してH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、アルキルアリール又はアルキルアラルキルであり、
mは１乃至５であり、
nは２乃至６であり、かつ
pは１又は２である。
本発明にしたがって調製した一層好ましい特定の実施態様は、
Bがアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル又はアルキルシクロアルキルアルキルであり、
JがH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルキルアルキルであり、
mが３であり、かつ
nが３又は4である
式IIaにより記載される。
本発明にしたがって調製した更に好ましい特定の実施態様は、
Bがアルキルであり、
Jがアルキル、シクロアルキル又は、シクロアルキルアルキルであり、
R1及びR2が独立してH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルキル又はアルキルシクロアルキルアルキルであり、
mが３であり、
nが３又は4であり、かつ
pが１である。
式IIaにより記載される。
本発明にしたがって調製した更に一層好ましい特定の実施態様は、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドである式IIaにより記載される。
本発明による別の実施態様は、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの安定な非吸湿性結晶形の形成である。本発明によれば、化合物のこの形は化合物の安定な配合物として発生しうる。N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの安定な非吸湿性結晶形はまた、融点が高く、水を吸収する傾向を示さない。安定な形はまた、輸送、投与量の形の製造、又は長期の輸送又は貯蔵時に通常遭遇する湿度及び温度より十分過剰なそれに対して類のない予期せぬ安定性を示す。安定な形への変換はまた、物質又はその純度を損失せず、その粒子の性質に悪影響を及ぼさない。
本発明は、本明細書に記載したような好ましい化合物、好ましい実施態様及び特定の実施態様のあらゆる組み合わせを含むつもりであるであることは理解されるべきである。
本発明の化合物は遊離塩基又は酸、その双性イオン塩の形又は薬学的に許容しうるその塩の形で有用である。すべての形が本発明の範囲内である。
本発明の化合物が塩基性の部分で置換されている場合には、酸付加塩が形成され、それは使用するのに更に便利な形である。実際には、塩の形の使用は本質的に遊離塩基の形の使用となる。酸付加塩の調製に使用しうる酸には、好ましくは、遊離塩基と結合したときに薬学的に許容しうる塩、すなわち、遊離塩基固有の血小板凝集及び血栓形成に有益な阻害効果がアニオンに起因する副作用により損なわれないように、そのアニオンが塩の薬学的投与量で患者に対して非毒性である塩を製造するものが含まれる。前記塩基性化合物の薬学的に許容しうる塩が好ましいけれども、例えば、塩が精製、及び確認のためにのみ形成される場合、又はイオン交換法により薬学的に許容しうる塩を調製する際に中間体として使用される場合のような、特別な塩が本質的に中間体生成物としてのみ望ましくても、全ての酸付加塩が遊離塩基の形の源として有用である。本発明の範囲内の薬学的に許容しうる塩は以下の酸から誘導されるものである。塩酸、硫酸、燐酸及びスルファミド酸のような無機酸、及び酢酸、くえん酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミド酸、キナ酸等のような有機酸。対応する酸付加塩は以下のものを含む。例えば塩酸塩及び臭化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、スルファメート、アセテート、シトレート、ラクテート、タルトレート、マロネート、オキサレート、サリチレート、プロピオネート、スクシネート、フマレート、マレエート、メチレン-ビス-β-ヒドロキシナフトエート、ゲンチセート、メシレート、イソチオシアネート及びジ-p-トルオイルタルトレート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、p-トルエンスルホネート、シクロヘキシルスルファメート及びキネート。
本発明の更なる特徴によれば、本発明の化合物の酸付加塩は、公知の方法を適用することにより遊離塩基と適する酸とを反応させることにより調製される。例えば、本発明の化合物の酸付加塩は、遊離塩基を適する酸を含む水溶液又は水−アルコール溶液又はその他の適する溶媒の溶液に溶解させて溶媒を蒸発させることにより塩を単離するか、有機溶媒中で遊離塩基と酸を反応させることにより調製する。この場合には塩は直接分離するか、溶液の濃縮により得られる。
本発明の化合物の酸付加塩は、公知の方法の適用により塩から再生しうる。例えば、本発明の親化合物は、例えば重炭酸ナトリウム水溶液又はアンモニア水溶液のようなアルカリで処理することによりその酸付加塩から再生しうる。
本発明の化合物が酸性部分で置換されている場合には、塩基付加塩が形成され、それは使用するのに一層便利な形である。実際には、塩の形の使用は本質的に遊離酸の形の使用となる。塩基付加塩の調製に使用しうる塩基には、好ましくは、遊離酸と結合したときに薬学的に許容しうる塩、すなわち、遊離酸固有の血小板凝集及び血栓形成に有益な阻害効果がカチオンに起因する副作用により損なわれないように、そのカチオンが塩の薬学的投与量で動物に対して非毒性である塩を製造するものが含まれる。例えばアルカリ及びアルカリ土類金属塩を含む、本発明の範囲内の薬学的に許容しうる塩は、以下の塩基から誘導されるものである。水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、エチレンジアミン、N-メチル-グルカミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、N，N′-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、N-ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）-アミノメタン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド等。
本発明の化合物の金属塩は、水性又は有機溶媒中で水素化物、水酸化物、カーボネート又は同様な選択された金属の反応性化合物を遊離酸の形の化合物と接触させることにより得られる。使用する水性溶媒は水でもよいし、有機溶媒、好ましくはメタノール又はエタノールのようなアルコール、アセトンのようなケトン、テトラヒドロフランのような脂肪族エーテル、又は酢酸エチルのようなエステルと水との混合物でもよい。そのような反応は通常周囲温度で実施されるが、所望であれば、加熱して実施してもよい。
本発明の化合物のアミン塩は、水性又は有機溶媒中でアミンを遊離酸の形の化合物と接触させることにより得られる。適する水性溶媒には、水及びメタノール又はエタノールのようなアルコール、テトラヒドロフランのようなエーテル、アセトニトリルのようなニトリル、又はアセトンのようなケトンと水との混合物が含まれる。アミノ酸塩は同様にして調製しうる。
本発明の化合物の塩基付加塩は、公知の方法の適用により塩から再生しうる。例えば、本発明の親化合物は、例えば塩化水素酸のような酸で処理することによりその塩基付加塩から再生しうる。
活性化合物として有用であるばかりでなく、本発明の化合物の塩は、例えば当業者に公知の技術により塩及び親化合物、副精製物及び／又は出発物質間の溶解性の差の利用による化合物の精製のために有用である。
本発明の化合物は非対称中心を含みうる。これらの非対称中心は独立してR又はS配置のいずれかである。式Iの化合物が幾何的異性を示しうることも当業者には明らかであろう。幾何的異性体にはアルケニル部分を有する本発明の化合物のcis及びtrans形が含まれる。本発明は個々の幾何的異性体及び立体異性体及びそれらの混合物を含む。
そのような異性体は、例えばクロマトグラフィー技術及び再結晶化技術のような公知の方法を適用することにより、それらの混合物から分離しうる。又は例えば本明細書に記載されている方法の適用により、中間体の適する異性体から別々に調製する。
本明細書において参考として導入されている米国特許願第08/138,820号及び同第08/476,750号には、式IIの非晶質化合物、特に式Iの非晶質化合物の調製法が記載されている。
本発明による式IIの化合物、特に式Iの結晶質化合物を調製するための本発明による新規方法はスキームIIに示される合成により記載される。
0004008499.tif 000010
式中、B、E1、E2、G、R、m、n及びpは前述の定義のとおりであり、P1はベンジルのような水素化不安定性酸保護基であり、P2はt-ブトキシカルボニル（BOC）のような酸不安定性アミン保護基であり、かつP3はベンジロキシカルボニル（CBZ）のような水素化不安定性アミン保護基である。
式IIの化合物又はその中間体の調製中にはまた、天然産のアミノ酸又は擬アミノ酸に存在するそれらの化学的に活性な置換基間の交叉反応を防ぐことが望ましいか必要でありうる。置換基は、その後に必要に応じて公知の方法により除去又は保持されて所望の生成物又は中間体としうるような標準的なブロック基で保護しうる（例えば、Green,“Protective Groups in Organic Synthesis”,Wiley,New York,1981を参照されたい。）。選択的な保護又は脱保護はまた、存在する置換基の変換又は除去を許容するために、又はその後の反応で最終的な所望の生成物を提供するために必要であるか望ましいかもしれない。
スキームIIの方法の例は式IIの化合物の調製であるが、式Iの化合物は適する出発物質を用いて調製されることは理解されるべきである。スキームIIによる式Iの化合物の調製においては、Bがエチルであり、E1がHであり、E2がシクロヘキシルメチルであり、GがNH2であり、RがHであり、mが３であり、nが３であり、pが１であり、P1がベンジルであり、P2がBOCであり、かつP3がCBZである。
式Iの化合物を調製する本発明による別の方法は、P3が前述の定義のとおりである式III
0004008499.tif 000011
の化合物を、RがHであり、mが３であり、nが３であり、pが１であり、かつP3がCBZである式IV
0004008499.tif 000012
の化合物の代わりに用いて、Bがエチルであり、E1がHであり、E2がシクロヘキシルメチルであり、GがNH2であり、pが１であり、P1がベンジルであり、かつP3がCBZである式V
0004008499.tif 000013
の中間体を生成すること以外はスキームIIと同一の方法である。
スキームIIは、最初に、B、p、P2及びP1が前述の定義のとおりである式VI
0004008499.tif 000014
の本発明による中心ジペプチド中間体を形成する、本発明による化合物の５工程調製法を示す。式Iの化合物の調製の場合には、本発明による中心ジペプチド中間体はBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHである。中心ジペプチド中間体は遊離カルボン酸部分の保護なしに調製される。
スキームIIの工程２においては、中心ジペプチドを形成するカップリングがジクロロメタン中又は酢酸エチル（補助溶媒としてのDMFの存在下又は不在下）とNMMのような有機塩基の混合物中で実施されうる。この反応はほぼ室温乃至約４０℃の温度で実施されうる。カップリングのための下式のアミノ酸又は擬アミノ酸の活性化は、p-ニトロフェノール、ペンタフルオロ-フェノール、及びN-ヒドロキシ-スクシンイミドとの非単離活性エステルを用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドの作用により実施されうる。
0004008499.tif 000015
カップリング時間は、カップリングされるアミノ酸又は擬アミノ酸、活性化剤、溶媒、及び温度に依存して約１乃至約２０時間である。工程１の中心ジペプチド生成物は単離する必要はない。工程１の反応混合物は典型的には水又は酸（例えば塩酸）の希薄水溶液で洗浄し、次いで乾燥することなしに直接工程２で使用する。フェノールを基剤とする活性エステルを使用する場合には、中心ジペプチド生成物を反応混合物からアルカリ水に抽出し、酸性水溶液から再抽出して有機溶媒に戻す。そして溶液を直接工程２として反応させる。
式VIのジペプチド中間体は、B、E、F、G、p及びP1が前述の定義のとおりであり、かつP2′がP2又はTFA・H-である式VII
0004008499.tif 000016
の本発明によるトリペプチド中間体の調製に使用される。“・”の記号は、F3CCO2-及びH+を形成するTFAの解離を表す。H+は式VIIの化合物中の末端アミンをプロトン化して、式VIIa
0004008499.tif 000017
のTFA塩を生成する。式Iの化合物の調製の場合には、本発明によるトリペプチド中間体はP2′-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2である。
工程２においては、中心ジペプチドを形成するアミノ酸又は擬アミノ酸のカップリングは、ジクロロメタン中又は酢酸エチルとDMF又はTHFの混合物中で、ほぼ室温又はそれ以下の温度で実施されうる。カップリングのための下式の中心ジペプチドの活性化は、ペンタフルオロ-フェノール又はN-ヒドロキシ-スクシンイミドの非単離活性エステルを用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドの作用により実施されうる。
0004008499.tif 000018
活性化はまた、イソプロピルクロロホルメートを用いて実施してもよい。反応時間は、カップリングされるアミノ酸又は擬アミノ酸、活性化剤、溶媒、及び温度とともに変化し、約１乃至約２０時間である。トリペプチド生成物は単離する必要はない。トリペプチド中間体を単離しない場合には、反応混合物をN-メチルモルホリン水溶液のような水性有機塩基及び塩酸水溶液のような水性酸で洗浄し、水性洗浄の後乾燥することなしに工程３の方法により“そのまま”反応させる。
スキームIIの工程３においては、工程２のトリペプチド生成物からのBOCのような保護基の除去を、トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いて、又はHBrの酢酸溶液及び酢酸エチルの混合物を用いて実施しうる。反応はほぼ室温において実施でき、約１時間（HBr法）及び約２時間（TFA法）必要とする。トリペプチドの酸塩生成物は、直接反応混合物から（HBr法）、又は蒸留により溶媒を部分的に除去してポット残留物に非極性溶媒を添加した後、濾過により結晶固体として単離される。
本発明による更なる反応は、BOC-N（Et）Gly-OHからTFA・H-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2を迅速に簡単に調製する単一の連続法として記載される。この方法は、スキームIIの最初の２つのカップリング工程及びTFAによる処理を含むワン・ポット反応である。TFA・H-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2は、直接連続反応溶液から結晶化するにしたがって単独で得られる。連続法は、スキームIIにおける対応する３つの異なる反応を回避し、製造環境中で有効である簡単で、時間及び価格が経済的な合成を確立する問題を解決する。
スキームIIは、N-保護アミノ酸から出発し、次いで従来の順序とは逆にカルボキシル末端に連続的に付加する逆の順序のポリペプチドの構築を示す。この方法では、ポリペプチドは保護されたC-末端アミノ酸のアミン末端における連続的アミド化により構築される。この本発明による逆合成法は、最初のアミノ酸のみ窒素保護を必要とし、アミン又は酸末端のいずれか（側鎖の官能基は例外）が保護されていない連続したアミノ酸の前方の点からの使用を可能にする。逆合成法はまた、通常溶液相ペプチド化学に必要とされるバッチ式とは異なるフロータイプの製造技術の使用を可能にすることにより、式IIの化合物、特に式Iの化合物の製造を合理化する。新規方法は、アミン末端において保護されたアミノ酸を購入する必要が除去されるので製造コストが削減される。特定の装置、試薬、あるいは分析方法論も必要ない。
本発明による別の方法は、スキームIIに記載されている方法及び特に言及されたそれに代わる反応工程により調製されたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶から新規固体状態変換により再現性よく得られるN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの安定な非吸湿性結晶の形成である。
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形は物理的には不安定であり、湿度及び温度の条件に暴露するとN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-βシクロヘキシルアラニンアミドの非常に安定な非吸湿性結晶形に変換される。
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形からN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非常に安定な非吸湿性結晶形へ変換するための本発明による一般的な条件は、静的及び動的条件下で達成された。
本発明による静的な方法は、バイアル又はトレイ中のような非移動容器中に入れたN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形を制御された環境の室内のある温度及び湿度条件に暴露することを含むので静的変換として記載される。この“静的”変換は約２０乃至約８０℃、更に好ましくは約４０乃至約８０℃、及び約４０乃至約１００％RH、好ましくは約６５乃至約８０％RHの温度及び相対湿度において実施される。
本発明による動的な方法は、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形を静的モデルと同様な湿度及び温度におけるインキュベーション下であるが、回転蒸発フラスコ中又はプロペラ攪拌を具備する円筒状容器（湿潤オーブン中）中におけるN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形のタンブリングを含む攪拌手段下に暴露することを含むので動的変換として記載される。
以下の実施例は本発明の例であり、範囲を限定するつもりはない。
特に指示がなければ、報告された質量スペクトルの分析データは、VG 70SEで実施されたLow Resolution Fast Atom Bombardmentであり、“計算値”は（M+H）+である。核磁気共鳴（NMR）スペクトルデータは、D2O中で、Brucker ACF 300で得られた。フラッシュクロマトグラフィーはシリカゲル上で実施される。高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）は、８乃至１５μの粒子寸法のC-18 Reverse Phase columnsで実施される。
特に指示がなければ、報告されたＸ線粉末回折グラフは、粉末試料を走査するのにCu放射線源（１．８kW、４５kV及び４０mA）を用いSiemens D5000回折計で得られる。試料は、ピーク強度に影響を及ぼす粒度を除去するために測定前に粉砕する。約６０mgの試料を、１．５×１cmの試料ホルダー上に置き、３乃至４０°の範囲で０．０４°のステップサイズで２シータ（２θ）を走査する。ステップ当たり１秒の総暴露である。
実施例１  BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHの調製
（スキームIIの工程１）
１Ｌの３口丸底フラスコに、５１ｇ（０．２５mole）のBOC-N（Et）Gly-OH、３５ｇ（０．２５mole）のPNP、４００mlのEtOAc、及び１００mlのDMFを装填する。混合物を攪拌して溶液を形成し、４乃至６℃に冷却する。約５乃至約８℃の温度に保持しながら、５１．５ｇ（０．２５mole）のDCCを１２５mlのEtOAcに溶解させた溶液１０分間にわたって滴下する。すべてのDCCを添加した後、冷却槽を除去し、混合物を室温（２０乃至２２℃）にあたためながら１．５時間攪拌する。この間に固体沈殿物であるDCUが形成する。分析的HPLCによりPNPエステルの形成の完了を決定される（BOC-N（Et）Gly-OHの消失）。反応混合物を濾過し、DCU残渣を５０mlのEtOAcで２回洗浄し、洗浄液を濾液に添加する。DCUは廃棄する。
攪拌された、濾過された溶液に、６７ｇ（０．３mole）のH2N-（L）-Asp（OBzl）-OHを１５０ml（１３８ｇ、１．３６mole）のNMM中のスラリとして添加する。混合物を３８乃至４０℃に加熱し、この温度に４１時間保持する。この時点で分析的HPLCによりBOC-N（Et）Gly-OHの完全な消費が示される。反応混合物を２５℃に冷却し、未反応H2N-（L）-Asp（OBzl）-OHを濾過により除去する。溶液を冷却して再び濾過すると、追加の１．２ｇが得られる（２１．７ｇ回収された。１１．２ｇは添加された２０％過剰量を表し、１０．５ｇ（０．０４７mole）は未反応物質を表す）。
濾過された溶液は、２ＬのSquibb漏斗中で５００mlで１回、次いで２５０mlで２回の脱イオン水で抽出する。一緒にした水溶液は、３００mlの１：１MTBE/EtOAcで３回抽出して残存するPNPを除去し（HPLC分析はごく微量の残存を示す）、次いで５℃に冷却して、１５０mlの濃厚HClの滴下により酸性化してpHを８．９から１．７９とする。酸性化した水溶液を２００mlのEtOAcで２回抽出する。水溶液のHPLC分析は残存する所望の生成物がないことを示す。EtOAc抽出物を一緒にして、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、３５℃において回転エバポレータで濃縮する。得られた淡い橙色のオイルを３５℃においてポンプで取り出し、残存溶媒を最高に除去すると、オイルとして８５．７８ｇのBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHが得られる（２１．３mmole、収率８５．５％、残存溶媒に関して未補正）。
特性決定：
NMR（250MHz）:7.3ppm（s）、5.1ppm（s）、3.3ppm（dq）、3.0ppm（dq）、1.4ppm（s）、1.1ppm（t）
MS:M=408;M+1obsvd=409
HPLC:90.79A%（3.87A%p-ニトロフェノール、ｅに関して未補正）
元素分析:C20H28N2O7:H,N;Cfd57.74,Ccal.58.81
実施例２  BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の調製
（スキームIIの工程２）
方法Ａ：  イソプロピルクロロホルメート法
１当量のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHをEtOAc（６〜８容量；１：６．５Wt:Vol）に溶解させ、−１５乃至０℃の温度に保持する。約−１５乃至約０℃の温度に保持しながらNMM（１当量）を添加する。イソプロピルクロロホルメート（１乃至１．１当量）を−１５乃至０℃の温度において保護されたジペプチド溶液に添加する。反応は、約−１５乃至約０℃の温度において２乃至５分間保持する。H2N-（L）-Cha-NH2（１当量）のTHF（１０容量；１：１０Wt:Vol）溶液を、約−１５乃至約０℃の温度に保持しながら冷却したジペプチド溶液に添加する。反応は、反応の完了を評価するために１５分、１時間、及び２時間で得られた工程内制御（HPLC）試料を用いて追跡する。（観察されたジペプチドの量がHPLC分析による面積で１０％未満となるとき反応は完了する。）
BOC-トリペプチド生成物は反応溶液から直接沈殿するので反応混合物から濾過し、EtOAc（２×、１容量；Wt:Vol）で洗浄し、真空下で乾燥させる。典型的な収率は、純度＞９０Ａ％で＞６０％であり、典型的には＜１Ａ％のアスパラギン酸−エピマージアステレオマーが観察される。
EtOAcの再スラリは、〜６０％の最終収率でBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2を提供し、ジアステレオマーは＜０．５％で純度は＞９５Ａ％に改良される。
イソプロピルクロロホルメート法の特定例として、方法Ａの一般的な手順に従い、４．５５ｇ（８．１mmole）のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHを使用すると、調製されたBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の量は、理論収率の７０％である３．２６ｇ（純度９７．９Ａ％、ジアステレオマーは０．３Ａ％）である。
方法Ｂ：  ペンタフルオロ-フェノール−DCC錯体法
ペンタフルオロ-フェノール（PFP、２．９当量）及びDCC（１当量）を室温においてEtOAc（５容量；１：５Wt:Vol）に溶解させ、−１５乃至０℃の温度に冷却する。１当量のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHをEtOAc（６容量；１：６Wt:Vol）に溶解させ、予めDMF（１０容量；１：１０Wt:Vol）に溶解させた１当量のH2N-（L）-Cha-NH2と混合する。ジペプチド/H2N-（L）-Cha-NH2溶液を、−１５乃至０℃の温度に保持しながら、PEP及びDCCの溶液に滴下する。反応は１５乃至２２℃の温度で５乃至１６時間保持し、反応の完了を評価するために１、２、３、4及び１６時間で得られた工程内制御（HPLC）試料を用いる。（観察されたジペフチドの量がHPLC分析による面積で２％未満となるとき反応は完了する。）
反応混合物を濾過し、フィルターケーク（DCC）をEtOAc（２×０．５容量；Wt:Vol）で洗浄する。濾液を水（１０容量；１：１０Wt:Vol）で処理し、水層を除去する。EtOAc層を水（１×、５容量；１：５Wt:Vol）で洗浄する。EtOAc層を冷却すると生成物が沈殿し、このものを濾過してEtOAc（２×０．４容量；１：０．４Wt:Vol）で洗浄する。単離したモル収率は、典型的な純度＞９０Ａ％で＞６０％であり、アスパラギン酸−エピマージアステレオマーは＜１〜４Ａ％である。
EtOAcの再スラリは、〜６０％の最終収率でBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2を提供し、ジアステレオマーは＜０．５％で純度は＞９９Ａ％に改良される。
ペンタフルオロ-フェノール−DCC錯体法の特定例として、方法Ｂの一般的な手順に従い、１０ｇ（２４．５mmole）のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHを使用すると、調製されたBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の量は、理論収率の５９％である８．１５ｇ（純度９９Ａ％、ジアステレオマーは０．４９Ａ％）である。
方法Ｃ：  ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）/2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート（TBTU）法
１当量のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHをDMF（９〜１０容量；１：１０Wt:Vol）に溶解させ、室温に保持する。この溶液にH2N-（L）-Cha-NH2（１当量）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT，１当量）を添加する。得られた溶液を約０乃至約１０℃に冷却し、NMR（１〜１．１当量）を添加する。カップリング試薬、TBTU（１〜１．１当量）をDMF（４〜５容量；１：５Wt:Vol）に溶解させ、約０乃至約１０℃の温度で保護されたジペプチド溶液に添加する。この溶液を、HPLC分析が反応の完了（面積で２％未満の出発物質）を示すまで、約１０乃至約２５℃で約３時間攪拌する。反応混合物を、５％の水酸化ナトリウム水溶液（約４容量対反応容量）及びEtOAc（約２容量対反応容量）の攪拌混合物に添加する。相を分離し、水性相を追加のEtOAc（約１．５容量対反応容量）で抽出する。有機相は一緒にして、０．５Ｎのくえん酸水溶液（約０．６〜０．７容量対有機相容量）、重炭酸ナトリウムの１０％水溶液（２回、各々約０．６〜０．７容量対有機相容量で）及び塩化ナトリウムの２５％水溶液（約０．３〜０．４容量対有機相容量）で順次洗浄する。得られた有機相を減圧下約３０乃至５０℃において約１／４乃至１／２の容量に濃縮し、このあたたかい溶液に等量のヘプタンを添加する。混合物を攪拌して約０乃至約２０℃に冷却すると、所望のトリペプチドが沈殿する。この固体を濾過し、EtOAc及びヘプタンの混合物で洗浄し、乾燥させる。典型的な収率は、典型的な純度＞９５．７Ａ％で＞６０％であり、アスパラギン酸−エピマージアステレオマーの量は＜２Ａ％である。
HOBT/TBTU法の特定例として、一般的な手順に従い、１０ｇ（２4．５mmole）のBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-OHを使用すると、理論収率の６７．７％である９．３ｇのBOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2が調製される（純度９６．１Ａ％、Aspにおけるジアステレオマーは１．７７Ａ％）。
質量スペクトル:Mcalc560.7;M+1obsvd561
mp 182.17（DSC）
1H NMR（δ対TMS,D6 DMSO）:0.89,m（lH）;0.94,m（1H）;1.0,dt（2H）;1.15,m（2H）;1.06-1.3,m（4H）;1.36,d（9H）;1.4-1.74,m（6H）;2.65,m（1H）;2.85,m（1H）;3.18,m（2H）;3.75,d（2H）;4.2,s（1H）;4.66,d（1H）;5.08,s（2H）;7.02,s（1H）;7.18,d（1H）;7.36,s（5H）;7.88,dd（1H）;8.24,dd（1H）。
実施例３  TFA・H-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の調製
（スキームIIの工程３）
BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2をジクロロメタン（〜１：１２wt/wt）に溶解させ、その溶液に周囲温度においてTFAを添加する。次いでHPLCが反応の完了を示すまで攪拌する（３〜５時間）。溶液を４０乃至４５℃において約１／２の容量に濃縮する。このあたたかい溶液に、＞４０℃の温度を保持しながらMTBE（〜１：１０wt/wt対BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2）を添加する。混合物を約５℃にゆっくり冷却し、完全な結晶化を確保するために１時間攪拌する。得られた固体を濾過し、冷却したMTBEで洗浄する。固体を減圧下で乾燥させ、TFA・N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の量を分析する（HPLC wt/wt分析）。収率は一般的にはほぼ定量的であり、純度は＞９５Ａ％である。
質量スペクトル:Mcalc460（遊離塩基）;M+1obsvd461
元素分析:C26H37N4O7F3:H,N,F,C 54.35,fd.,53.82
1H NMR（δ対TMS,D6 DMSO）:0.9,m（2H）;1.15,t（6H）;1.5,m（1H）;1.5-1.8,m（6H）;2.65,dd（1H）;2.9,m（3H）;3.7,s（2H）;3.9,m（2H）;4.2,m（1H）;4.75,m（1H）;5.1,s（2H）;7.0,s（1H）;7.15,s（1H）;7.2,s（5H）;8.13,d（1H）;8.7-8.8,m（3H）。
13C NMR（顕著なシグナル，δ対TMS,D6 DMSO）:10.76,25.49,25.68,25.96,31.66,33.07,33.36,36.25,38.59,41.88,47.02,49.40,50.47,65.71,127.81-128.34,135.82,165.10,169.34,173.79。
脱保護の特定例は表Ａに示す。
0004008499.tif 000019
実施例４  CBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の調製
（スキームIIの工程４）
〜等モル量のTFA・N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2、CBZ-PipBu、及びTBTUのEtOAc、DMF、及び水（１００：８：４v/v，〜１１：１総v/wt対TFA・N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2）中における懸濁液を調製する。この懸濁液を０乃至１０℃に冷却し、約３乃至４当量のNMMを添加する。混合物を室温に暖め、HPLCが反応の完了を示すまで攪拌する（１〜３時間、この時間で溶液となる）。水を添加すると（２〜３×最初の水の添加量）、相が分離する。水性相は残しておき、有機相は更に２回水で洗浄する。これらの水性洗浄液を一緒にしてEtOAcで逆抽出し、有機相を一緒にして２５％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。有機相を減圧下で〜１／２の容量に濃縮し、MTBE（〜１／２v:v対溶液の容量）を添加する。この混合物を結晶化させ（数時間）、固体を濾過により回収し、EtOAc及びMTBEの冷却した混合物で洗浄する。固体を減圧下で乾燥させる。CBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の量をHPLC wt/wt分析により分析する。収量は一般的に＞８０％であり、純度は＞９５Ａ％である。
前述の調製の特定例として、工程４の一般的な手順に従い、７．２５ｇのTFA・N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2を使用すると、理論収率の８４％である７．９ｇのCBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2が調製される（純度＞９９Ａ％、Aspにおけるジアステレオマーは０．０８Ａ％）。
元素分析:C41H57N5O8:H,N,C,65.84,fd.,65.38
質量スペクトル:Mcalc747;M+1obsvd748
mp 101.6（DSC）
1H NMR（δ対TMS,CDCl3）:0.88,m（1H）;0.98,m（1H）;1.13,（2H）;1.23,m（6H）;1.4,m（1H）;1.62-1.76,m（8H）;1.86,qd（1H）;2.35,t（1H）;2.74,dd（2H）;3.25,dd（1H）;3.47,q（2H）;3.7,d（1H）;3.84,d（1H）;4,15,ds（2H）;4.5,qd（1H）;4.68,dt（1H）;5.07,d（1H）;5.14,bd（2H）;5.16,d（1H）;7.28-7.39,m（10H）;7.57,dd（1H）。
13C NMR（δ対TMS,CDCl3）:［顕著なシグナル］66.93（ともにベンジル炭素），127.78-128.64（ともにフェニル環），155.249,170.00,170.24,171.69,174.27,175.21（すべてカルボニル炭素）。
実施例５  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の調製（スキームIIの工程５）
CBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2、蟻酸アンモニウム、及びPd/Cの１０％２０：１アルコール／水溶液（１０：１v/wt対CBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2）の混合物を調製する。混合物を４０乃至５０℃に加熱し、HPLCが反応の完了を示すまで攪拌する（１〜２時間）。混合物を室温に冷却し、触媒を除去するために濾過する。得られた溶液を４０乃至５０℃に加熱し、アセトン（〜等量対濾過された溶液）を添加し、溶液を３５乃至４０℃に冷却する。N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドのシードを混合物に添加し、室温に冷却しながらそこからN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性の形を結晶化させる（数時間）。窒素でガスシールして濾過により固体を回収し、アセトンですすぐ。固体を減圧下で乾燥させ、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の量を分析（HPLC wt/wt分析）する。収率は一般的には＞８５％で、純度は＞９５Ａ％である。
前述の調製の特定例として、工程５の一般的な手順に従い、５ｇのCBZ-PipBu-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2を使用すると、白色固体として化学量論的収率が８９．４％である３．１ｇのN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形が提供される（純度９９．６Ａ％）。
適する出発物質を用い、前述の実施例１乃至５にしたがって調製したその他の化合物には以下のものが含まれる。
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］バリン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-D-バリン、
N-［N-［N-（3-（ピペリジン-4-イル）プロパノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］バリン、
N-［N-［N-（５-（ピペリジン-4-イル）ペンタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］バリン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-α-シクロヘキシルグリシン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］ノルロイシン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-α-（2,2-ジメチル）プロプ-3-イルグリシン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-β-デカヒドロナフト-1-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-α-（2-シクロヘキシルエチル）グリシン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］フェニルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-β-ナフト-1-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-β-ナフト-2-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-β-シクロヘキシルアラニンエチルエステル、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-L-β-cis-デカヒドロナフト-2-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロヘキシル-D-アラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-デカヒドロナフト-1-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロヘキシルアラニンエチルアミド、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロオクチルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロヘキシルメチルアラニンアミド、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-アダマント-1-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-（1,2,3,4）-テトラヒドロナフト-5-イルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-（4-シクロヘキシル）シクロヘキシルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロヘプチルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロオクチルアラニンアミド、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-α-シクロヘキシルプロピルグリシン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロオクチルメチルアラニン、
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロペンチルアラニン、及び
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］アスパルチル］-β-シクロヘキシルメチルアラニンエチルエステル。
実施例６  4-N-CBZ-ピペリドンの調製
４０kgのN-ベンジロキシカルボニロキシスクシンイミド及び２６kg（１７５mole）の4-ピペリドン・HCl・H2Oを３８．８kgの水及び８８kgのTHF中に混合した混合物を、溶解が完了するまで（〜１５分）１５℃±５℃で攪拌する。２０℃以下の温度に保持しながら、NMM（２２．８kg）を攪拌混合物添加する（発熱的）。バッチを２０℃±５℃において２．５時間攪拌する。このとき、HPLCは反応の完了を示す。混合物を１１５．２kgのMTBE及び３８．８kgの水で希釈し、２０℃±５℃において５分間攪拌する。攪拌を停止して、層を分離させ、水性（下方）層を除去し、廃棄する。有機層は２×１２９．６kgの水で洗浄する（５分間攪拌し、相を分離させ、水性（下方）相を除去／廃棄する）。有機層は５．２kgのNaClを４６．８kgの水に溶解させたもので洗浄する（５分間攪拌し、相を分離させ、水性（下方）相を除去／廃棄する）。有機層を１１．５kgのMgSO4で処理し、１時間攪拌して混合物を濾過する。反応器を８kgのMTBEですすぐ（濾過して主要な濾液を一緒にする。全濾液の水含量：０．５２％）。混合物の容量を減圧下３０℃における蒸留により半分にする。真空を窒素雰囲気下で解除し、残留物を２０℃に冷却する（ポット残留物の水含量：０．４３％）。残留物を５７．６kgのMTBEで希釈し、混合物の容量を真空下３０℃における蒸留により再び半分にする。真空を窒素雰囲気下で解除し、混合物を２０℃に冷却する（ポット残留物の水含量：０．２５％）。これを更に５回繰り返す。最終的なポット残留物を２８．８kgのMTBEで希釈し、５分間混合して、水含量及び4-N-CBZ-ピペリドンの量について分析する（水：０．０５％；wt/wt 4-N-CBZ-ピペリドン：２２．６６wt%；３５．３６kg，１５５mole，化学量論的収率８８．６％）。
実施例７  PipBuの調製
N2パージ下で攪拌しながら、５３．５kgの3-カルボキシプロピルトリフェニルホスホニウムプロマイドを２３０．１kgの1,2-ジメトキシ-エタンに溶解させた溶液を調製する。２４乃至２８℃の温度に保持しながら、カリウムt-ブトキシド/THF（２０重量％、１４１．８kgの溶液）を３５分間にわたって添加する。混合物をこの温度で０．５時間攪拌する。このとき、HPLCは反応の完了を示す。攪拌した混合物を１０℃±２℃に冷却し、次いで混合物に９６．４５kg（滴定濃度（Titer）：１．１５モル当量対）の4-N-CBZ-ピペリドンをMTBEに溶解させたものを４０分間にわたって添加する。そのバッチの温度は１２℃±２℃のままである。混合物をこの温度で１０分間攪拌し、次いで２０℃±２℃に加熱してその温度で２時間攪拌する。混合物が２０℃±２℃に保持されるように、攪拌した混合物に、２２．５kgの濃厚HCl水溶液を２４５．６kgの水に溶解させた溶液を添加する。最終pHは０．５である。混合物を攪拌しながら２１４．０kgのメチルtert-ブチルエーテルで抽出する。攪拌を停止して、相を分離させ、水性層（下方）を除去し、廃棄する。有機層は１３３．７５kgの水で洗浄し（５分間攪拌し、分離させ、水性（下方）層を除去／廃棄する）、次いで１０．７kgの５０％NaOHを１２６．８kgの水に溶解させたもので洗浄する（１０分間攪拌し、層を分離させ、有機（上方）層を除去／廃棄する）。水性層を２×１２３．０５kgのEtOAcで抽出する（５分間攪拌し、層を分離させ、有機（上方）層を除去／廃棄する）。攪拌した水性層に１３．１kgの濃厚HCl水溶液を添加してpHを２．５乃至３．５（最終：２．８２）とし、次いで混合物を１２３．０５kgのEtOAcで抽出する（５分間攪拌し、層を分離させ、水性（下方）層を除去／廃棄する）。EtOAc溶液を１３３．７５kgの水で洗浄し（５分間攪拌し、層を分離させ、水性（下方）層を除去／廃棄する）、次いでCBZ-PipBuenの量を分析（wt/wt）する（総重量：１９４．８６kg：１７．０５％CBZ-PipBuen［３３．２２kg、１０８mole］、化学量論的収率８７．９％）。
CBZ-PipBuenのEtOAc溶液を６．６kgの５％Pd/C（重量で５０％の水）とともに攪拌しながらステンレス鋼圧力タンクに装填し、次いで混合物を５５℃±２℃に加熱する。反応混合物の温度が５５℃±２℃のままである（〜３０分）ように、蟻酸カリウム（３８．２kg）を６６．４kgの水に溶解させたもの添加する。混合物を５５℃±２℃で２時間攪拌する。この時間で反応は完了した（HPLC）。反応器に６．６kgのセリット及び３３．２kgの水を添加し、混合物を攪拌し、次いで濾過する。反応器を３３．２kgの水ですすぐ（濾過し、主要な濾液に添加する）。濾液を新しい容器に入れ、２０乃至２５℃に冷却し、層を分離させ、有機層を除去して廃棄する。水性層を５２．１kgの濃厚HCl水溶液で酸性としてpHを２乃至３（最終：２．８２）とし、次いで４×１２９．５kgのメチレンクロライドで抽出する（５分間攪拌し、層を分離させ、有機（下方）層を除去／廃棄する）。水性層は、攪拌しながら１７．８５kgの５０％NaOH水溶液を添加することによりpHを６．１とする。混合物を濾過すると、１７．６kg（１０３mole）の4-（3′-カルボキシプロピル）ピペリジンを含む２２４kgの溶液が得られる。
実施例８  CBZ-PipBuの調製
4-（3′-カルボキシプロピル）ピペリジンのNaOH水溶液２２４kgを５５．３kgのTHFと一緒にして、混合物を攪拌しながら８℃±２℃に冷却する。温度を＜１０℃に保持しながらNMM（２０．９kg）を添加する。添加が完了した後、温度を８℃±２℃に調整し、次いで温度を＜１５℃に保持しながら、２５．７kgの1-（ベンジロキソカルボニル）スクシンイミドを４９．８kgのTHFに溶解させたものを１時間にわたって添加する。１０乃至１５℃において３時間後反応は完了する（分析的HPLC）。濃厚HCl水溶液（２９．９kg）を添加してpHを２．５乃至３．５（最終：３．３）に調整し、次いで６１．4kgのMTBEを添加して混合物を５分間攪拌する。攪拌を停止し、層を分離させ、水性（下方）層を分離（廃棄）する。MTBE層は８３．１kgの水で洗浄する（攪拌期間、１０分、次いで５分及び５分）。各場合について、水性層を分離させ、除去（廃棄）する。８．３kgの５０％NaOH水溶液を９５．７kgの水に溶解させた溶液を攪拌しないで添加し、添加の完了時に混合物を〜５分間攪拌する。攪拌を停止し、相を分離させ、有機（上方）層を分離して廃棄する。水性層は反応器に戻し、２×３８．４kgのメチルtert-ブチルエーテルで抽出する（５分間攪拌し、層を分離させ、有機（上方）層を除去／廃棄する）。１８．５kgのメチルtert-ブチルエーテルを用い、この操作を繰り返す。反応器に戻した水性層を９．９kgの濃厚HCl水溶液で酸性とし、pHを２．５乃至３．５（最終：３．３７）とする。混合物を７６．４kgのメチルtert-ブチルエーテルで抽出する（５分間攪拌し、層を分離させ、下方〔水性〕層を除去／廃棄する）。有機層を、１．１kgのNaHCO3を１２．４kgの水に溶解させた溶液で洗浄し（５分間攪拌し、層を分離させ、水性〔下方〕層を除去／廃棄する）、次いで４１．５kgの水で洗浄する（５分間攪拌し、層を分離させ、水性〔下方〕層を除去／廃棄する）。反応器を減圧下におき、５５℃において蒸留物の流れが終わるまで揮発性溶媒を除去する。トルエン（３２．４kg）を添加し、蒸留物の流れが停止するまで混合物を大気圧下で蒸留する。バッチの温度は９０乃至９５℃に上昇する。次いで混合物を３０乃至３５℃に冷却し、ヘプタン（５６．８５kg）を反応器に装填し（二相）、混合物を９０乃至９５℃に加熱し（一相）、次いで３８乃至４２℃に再び冷却する。CBZ-PipBuのシード結晶を添加すると、生成物は１時間で混合物から結晶化する。濾過により固体を回収し、１９．３５kgの１：２トルエン／ヘプタン、次いで３３．４kgのヘプタンで洗浄する。真空下４０℃においてフィルターケークを乾燥させると（乾燥時の分析で０．１３％損失）、２２．４kg（７２．９６mole、4-ピペリドンからの化学量論的収率４２％）のCBZ-PipBuが得られる。
実施例９  CBZ-PipBuenの調製
１４℃において８２ｇの3-カルボキシプロピルトリフェニルホスホニウムブロマイドを４０７mlの1,2-ジエトキシエタンに懸濁させた液に、反応混合物の温度を２４乃至２８℃に保持しながら２００ｇのカリウムtert-ブトキシドの２０重量％テトラヒドロフラン溶液を２５分間にわたって添加する。混合物を１時間攪拌して１０℃に冷却し、次いで５２．５ｇの4-N-CBZ-ピペリドンを２４６mlのtert-ブチルメチルエーテルに溶解させた液を冷却しながら３０分間にわたって添加する。添加が完了した後、混合物を１２℃において１０分間攪拌し、次いで２０℃にあたためて更に３０分間攪拌する。反応混合物を４１０mlの１Ｎ HCl水溶液で１０分間処理し、３２８mlのtert-ブチルメチルエーテルで希釈して相を分離させる。有機相を２０５mlの水、次いで２１０mlの１Ｎ NaOH水溶液で洗浄する。生成物を含むNaOH層は別に回収し、１８９ｇの酢酸エチルで３回洗浄し、濃厚HClでpH３．４８に酸性化して、１８９mlの酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を分離し、２１１mlの水で洗浄して、１０ｇのMgSO4上で３０分間乾燥させ、濾過して真空中で濃縮する。油状残留物（５０．７ｇ）がトルエン／ヘプタンから結晶化し、合計２９．４６ｇ（収率５０．９％、純度〜９５Ａ％）のCBZ-PipBuenが得られる。
質量スペクトル:Mcalc303;M+1obsvd304
1H NMR（δ対TMS,CDCl3）:2.2,t（2H）;2.25,t（2H）;2.35,m（4H）;3.45,m（4H）;5.15,s（2H）;5.2,m（1H）;7.33,2（5H）。
13C NMR（δ対TMS,CDCl3）:22.43,28.2,34.26,35.66,44.88,45.74,67.20,122.02,127.83,127.95,128.45,128.65,128.90,136.17,136.72,155.34,178.39。
実施例１０  CBZ-PipBuen-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の調製
（スキームIIの別の工程４）
CBZ-PipBuen（７０ｇ、０．２３mole）及びDMF（２３０ml）を１Ｌのジャケット付きフラスコに入れ、０℃に冷却しながら攪拌し、次いでTBTU（７４．９ｇ、０．２３mole）を一度に添加する。温度を０℃に保持し、DIPEA（６１．９ｇ、０．６１mole）の添加を開始する。４５分後、TFA・H-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2（１３８．９ｇ、０．２４mole）をDMF（２３０ml）溶液として添加する。DIPEA（４５ml）の添加によりpHを７乃至８に調整し、混合物を室温にする。２時間後に反応が完了する（HPLC分析）。混合物を水（２．５Ｌ）中に入れて急冷し、EtOAc（１Ｌ）で抽出する。水性相をEtOAc（０．３Ｌ）で逆抽出する。有機層を一緒にして、くえん酸水溶液（５％w/w、２×１Ｌ）、NaHCO3、水溶液（５％w/w、２×１Ｌ）、及び水（２Ｌ）で洗浄する。EtOAc層を２Ｌのフラスコに移し、結晶化に影響するように攪拌しながらヘプタン（５００ml）を添加する。ブフナー漏斗で吸引しながら固体を回収し、EtOAc/ヘプタン（２：ｌv/v、１Ｌ）で洗浄して一定重量になるまで乾燥させると、CBZ-PipBuen-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2が得られる（１４３．２ｇ、０．１９mole、収率８３％）。
元素分析:C41H57N5O7:C:calc.66.02;fd.65.53,H,N。
質量スペクトル:Mcalc745.91;M+1obsvd746
1H NMR（δ対TMS,CDCl3）:0.86,qd（1H）;0.98,qd（1H）;1.16,t（2H）;1.24,dt（6H）;1.37,m（1H）;1.64-1.78,m（4H）;1.86,qd（1H）;2.2,bd（4H）;2.35,m（1H）;2.4,m（2H）;2.74,dd（1H）;3.07,m（4H）;3.52,d（1H）;3.85,d（lH）;4.12,q（1H）;4.49,qd（lH）;4.68,dt（1H）;5.07,d（1H）;5.14,s（1H）;5.16,d（1H）;5.22,t（2H）;6.45,s（1H）;7.28,d（1H）;7.26,s（5H）;7.35,s（5H）;7.56,d（1H）。
13C NMR（δ対TMS,CDCl3）:14.15,22.68,24.95,25.61,26.03,26.45,28.20,31.71,32.89,33.80,33.89,34.00,35.63,38.37,44.79,45.13,45.65,50.23,51.34,60.40,66.87,67.06,76.50,77.13,77.77,122.46,126.88,127.80-128.60,135.15,155.19,170.11,170.20,171.61,173.76,175.35。
実施例１１  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形の調製（スキームIIの別の工程５）
CBZ-PipBuen-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2（１４０ｇ、０．１９mole）、蟻酸アンモニウム（６１ｇ、０．９６mole）及び１０％Pd/C（５０％湿潤、デガッサ（degussa）タイプ、２８ｇ）を５Ｌのジャケット付きフラスコに入れる。EtOH（２００proof、１２６０ml）、iPrOH（７０ml）及び水（DI、７０ｇ）を添加する。この混合物を４０乃至５０℃に加熱し、HPLCが反応の完了を示すまで攪拌する（５時間）。混合物を室温に冷却し、触媒を除去するために濾過する。得られた溶液を４０乃至５０℃に加熱し、アセトン（〜等量対濾過された溶液）を添加し、溶液を３５乃至４０℃に冷却する。N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドのシードを混合物に添加し、室温に冷却すると（数時間）そこからN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性の形が結晶化する。窒素でガスシールしてブフナー漏斗で吸引により固体を回収し、ケークをアセトンで洗浄して一定重量になるまで空気乾燥させると、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドが得られる（８４．３ｇ、０．１６mole、収率８４．８％、純度＞９５Ａ％）。
実施例１２  TFA・H-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の連続調製
（スキームIIの工程１〜３の別法）
温度プローブを具備する５００mlのフラスコに、BOC-N（Et）-Gly（２０．３ｇ、０．１mole）、N-ヒドロキシスクシンイミド（１１．５ｇ、０．１mole）及びジクロロメタン（２００ml）を装填する。混合物を中程度の速度で攪拌し、得られた溶液にDCC（２０．６ｇ、０．１mole）を固体として一度に添加する。この溶液を１時間攪拌すると、その間にわずかな発熱が認められ（２０℃から２８℃への温度上昇）、DCUが沈殿する。得られた懸濁液を、Whatman #1濾紙を具備するブフナー漏斗で真空濾過する。ケークをジクロロメタン（２×２５ml）で洗浄する。濾液をもとの５００mlのフラスコに戻して（L）-Asp（OBzl）（２２．３ｇ、０．１mole）、NMM（３３．８ml、０．３mole）及びDMF（８０ｇ、１．０１mole）を順次添加する。室温で２時間攪拌すると、BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）の形成が完了する（HPLC追跡）。反応混合物を、氷水（１００ml）を含む抽出漏斗に注ぐ。混合物をpHが１になるまでHCl（３６％、２５ml）で酸性化する。層が分離し、ジクロロメタン層を氷水（１００ml）で洗浄すると相分離する（水性相のpH３〜４）。ジクロロメタン層をもとの５００mlのフラスコに戻し、NH2-（L）-Cha-NH2（１７ｇ、０．１mole）、N-ヒドロキシスクシンイミド（１１．５ｇ、０．１mole）及びDCC（２０．６ｇ、０．１mole）を順次各々固体として一度に添加する。室温で２時間攪拌すると、BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の形成が完了し（HPLC追跡）、Whatman #1濾紙を具備するブフナー漏斗でDCUを真空濾過する。ケークをジクロロメタン（２×２５ml）で洗浄する。濾液を抽出漏斗に移し、N-メチルモルホリン（１５ml、pH８〜９）を含む脱イオン水（２００ml）で洗浄する。相が分離し、ジクロロメタン層を再び水（DI、２×１５０ml）で洗浄する。ジクロロメタン層を１５０mlの１ＮのHCl（pH１）で洗浄する。相が分離し、ジクロロメタン層を脱イオン水（２００ml、pH３）で洗浄する。BOC-N（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2のジクロロメタン溶液をきれいな５００mlのフラスコに戻してTFA（１００ml）を装填する。室温で２時間攪拌すると、TFA・HN（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2の形成が完了する（HPLC追跡）。ジクロロメタン及び大部分のTFAを除去するために反応混合物を真空下で蒸留して、生成物の結晶化に作用させるためMTBE（５００ml）及びシードを添加する。Whatman #1濾紙を具備するブフナー漏斗で混合物を真空濾過する。ケークをMTBE（２×２５ml）で洗浄して空気乾燥させると白色固体としてTFA・HN（Et）Gly-（L）-Asp（OBzl）-（L）-Cha-NH2が得られる（４６．８ｇ、収率８１．５％、純度＞97A%、D-Aspジアステレオマー＜０．２Ａ％）。
実施例１３  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの安定非吸湿性結晶形の調製
方法Ａ．  静的変換
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形（７．４５kg）をハンマーミルで粉砕する。７．３５kgの得られた固体をステンレス鋼の乾燥器トレイ（９０×２８cm）に入れ、トレイを孔あきアルミ箔でおおう。次いでトレイを湿潤オーブン（LUNAIRE Humidity Cabinet model no.CEO 941W-3）に入れてシールする。オーブンは分析のために試料を取り出すとき以外は形の変換プロセスの間中シールしておく。オーブンを４０％RH及び６０℃に調整し、この状態に１時間保持する。次いで湿潤オーブンを８０％RH／６０℃に調整し、この状態に１２時間保持する。８０％RH／６０℃において１８時間後に試料を取り出し、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形への変換を評価するためにＸ線粉末回折分析により調べる。湿潤オーブンを再びシールして４０％RH／６０℃に調整し、この状態に２時間保持する。オーブンを再び周囲条件に調整してトレイをオーブンから取り出し、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形を得る（７．２kg、収率９６．６％）。変換の確認はＸ線粉末回折グラフ（図１）により決定される。Ｘ線粉末回折はまた、結晶の面間隔（d）（単位Å）に対応する回折角（２θ）（増大する順）、回／秒（Cps）及び相対的ピーク強度（%）の関数として表に示す（表１）。
0004008499.tif 000020
0004008499.tif 000021
方法Ｂ．  動的変換
ａ．  形の変換
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形（５０ｇ）をリングスタンド上の機械的攪拌器を具備する４００mlのメスシリンダー（台の高さ６cm）に入れる。装置を、湿度制御オーブン（LUNAIRE Humidity Cabinet model no.CEO 941W-3）に入れる。攪拌を２７５回／分に設定し、温度及びRHを３０分間にわたってそれぞれ６０℃及び４０％RHに調整する。化合物をこの状態に１時間保持し、次いで状態を４５分間にわたって８０％RH／６０℃に調整する。次いで化合物をこの状態に１６時間保持し、その後オーブンを４０％RH／６０℃に再び設定し、この状態に３．２５時間保持する。次いで化合物を周囲条件に戻し（台の高さ４cm）、次いでシリンダーから取り出して、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形を得る（収率＞９５％）。変換の確認はＸ線粉末回折グラフ（図２）により決定される。Ｘ線粉末回折はまた、結晶の面間隔（d）（単位Å）に対応する回折角（２θ）（増大する順）、回／秒（Cps）及び相対的ピーク強度（%）の関数として表に示す（表２）。
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ｂ．  形の変換
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形（３７０ｇ）を２Ｌの回転エバポレータフラスコに入れる。フラスコを回転エバポレータ（Heidolph UV 2002）上に置き、予め加熱した（５８℃）浴（Heidolph MR 2002）中に下げる。装置を、真空ポンプ（Divatrion DV1）を用いて６０mBarの真空状態にし、次いで真空を解除して、分離した、加熱された、水を含むフラスコ中に創造される湿った雰囲気を許容する制御された状態にする。湿った雰囲気は、装置（内部圧１３０〜１８０mBar）内のRHが７９％に達するように、湿度制御装置（Vausalo Humiditique and Temperature Traumettor）により制御される。次いで、加熱浴を〜６０℃に保持し、容器内のRHを７１乃至７９％に保持しながら、回転エバポレータ容器を１４５乃至１６０回／分の速度で５時間回転させる。次いで窒素雰囲気中で真空を解除し、容器及びその内容物を周囲温度に冷却し、生成物を取り出すと、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形が得られる。第２のロットの３１７ｇのN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形も同様に処理すると、N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形が得られる。変換の確認はＸ線粉末回折グラフ（図３）により決定される。２つのロットを併せて６６７ｇのN-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの非吸湿性結晶形が得られる（全収率９７％）。変換の確認はＸ線粉末回折グラフ（図３）により決定される。Ｘ線粉末回折はまた、結晶の面間隔（d）（単位Å）に対応する回折角（２θ）（増大する順）、回／秒（Cps）及び相対的ピーク強度（%）の関数として表に示す（表３）。
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実施例１４  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性結晶形試料及びその変換された非吸湿性結晶形のＸ線粉末回折グラフ
吸湿性結晶N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの試料を実施例５又は１１のようにして調製し、実施例１３の方法にしたがって対応する非吸湿性結晶形に変換する。吸湿性結晶形及び非吸湿性結晶形のＸ線粉末回折グラフをそれぞれ図４及び５に示す。吸湿性結晶形及び非吸湿性結晶形のＸ線粉末回折グラフはまた、結晶の面間隔（d）（単位Å）に対応する回折角（２θ）（増大する順）、回／秒（Cps）及び相対的ピーク強度（%）の関数としてそれぞれ表４及び表５に示す。
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実施例１５  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性及び非吸湿性結晶形に関する等温マイクロ熱量実験
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性及び非吸湿性結晶形に関する等温マイクロ熱量実験を、Thermometric（登録商標）Thermal Activity Monitor（TAM）で実施する。異なる結晶形の固体状態変換は、形を種々の温度において種々の湿度又は溶媒蒸気に暴露することにより研究する。種々の湿度を得るために使用した飽和塩溶液は、KCl（８０％RH）、NaCl（７５％RH）、及びNaBr（６５％RH）であった。約１００mg当量の形を秤量してTAMガラスアンプルに入れ、飽和塩溶液（過剰の固体を含む）又は有機溶媒を含むマイクロ恒湿器をアンプル内に置く。アンプルをシールし、実験温度に平衡させ、TAM内の測定位置に下げる。試験する形の代わりに洗浄した海砂を含む同一の系を対照側に置く。出力（μW）を時間の関数として測定する（図６〜８）。
実施例１６  N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性及び非吸湿性結晶形の水分収着等温線
N-［N-［N-（4-（ピペリジン-4-イル）ブタノイル）-N-エチルグリシル］-（L）-アスパルチル］-（L）-β-シクロヘキシルアラニンアミドの吸湿性及び非吸湿性結晶形の水分収着等温線は、VTI MB300G湿度計で得られる。実験は、約１５mgの結晶形試料に対して％RHを段階的に増減させ、（各平衡段階における）重量増加を％RHの関数として得ることにより、又は結晶形試料を一定の湿度に保持し、重量増加を時間の関数として得ることにより実施する。
式IIの化合物は有用な薬学的活性を示すので、薬学的組成物に混和してある種の病的状態の患者の治療に使用される。
本発明はまた、血小板凝集及び血液凝固に伴う活性化された血小板及びその他の粘着性糖タンパク質へのフィブリノーゲンの結合を阻害することにより、血小板凝集の阻害剤の投与により軽減又は予防しうる状態の患者を治療する方法に関する。更に、本発明はまた、ヒト及びその他の動物における心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾患及び血管内凝固症候群のようなある種の病的状態に伴う血栓症の予防又は治療法に関する。
本明細書において治療に関する言及は、予防的治療並びに認められた状態の治療を含むと理解されるべきである。
本発明はまた、薬学的に許容しうる量の１種以上の式Iの化合物を薬学的に許容しうるキャリヤー又は賦形剤とともに含む薬学的組成物をその範囲内に含む。
実際には、本発明による治療のための化合物又は組成物は、例えば、局所的には、吸入、非経口的、直腸又は経口的のような適する手段により投与しうるが、好ましくは経口的に投与される。
式IIの化合物は最も適する経路で投与しうる形で存在しうるので、本発明はまた、ヒト又は動物の医薬に使用するのに適する本発明による化合物を１種以上含む薬学的組成物に関する。これらの組成物は、１種以上の薬学的に許容しうる補助薬又は賦形剤を用いて、従来の方法に従って調製しうる。補助薬には、とりわけ、希釈剤、滅菌水性媒体及び種々の非毒性有機溶媒が含まれる。組成物は、錠剤、ピル、カプセル、顆粒、粉末、水溶液又は懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ等の形で存在でき、薬学的に許容しうる調剤を得るために甘味料、香料、着色剤、安定剤又は防腐剤からなる群から選択された１種以上の薬剤を含みうる。
ビヒクルの選択及びビヒクル中の活性物質の含量は、一般的には生成物の溶解性及び化学的性質、特に投薬の様式及び薬学的実践において観察される条件にしたがって決定される。例えば、ラクトース、くえん酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸二カルシウムのような賦形剤及び、澱粉、アルギン酸及び、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクのような滑剤と結合したある種の錯体シリカゲルのような崩壊剤が錠剤の調製に使用しうる。カプセルの調製には、ラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールを使用するのが有利である。水性懸濁液を使用する場合には、乳化剤又は懸濁を容易にする薬剤を含みうる。蔗糖、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロホルム又はその組み合わせのような希釈剤は他の物質と同様に使用しうる。
非経口的投与においては、例えばゴマ油、落花生油又はオリーブ油のような植物油、又は水及びプロピレングリコールのような水−有機溶媒中の本発明による化合物の乳濁液、懸濁液又は溶液、オレイン酸エチルのような注射用有機エステル、並びに薬学的に許容しうる塩の滅菌水溶液を使用しうる。本発明による生成物の塩の溶液もまた筋肉内又は皮下注射による投与に有用である。純粋な蒸留水中に塩の溶液を含む水溶液も、そのpHが適するように調整され、十分な量のグルコース又は塩化ナトリウムと慎重に緩衝されて等張性とされ、加熱、照射及び／又はマイクロ濾過により滅菌されているという条件で静脈内投与に使用しうる。
局所的な投与には、本発明の化合物を含むゲル（水又はアルコールを基剤とする）、クリーム又は軟膏を使用しうる。本発明の化合物はまた、皮膚を通して化合物を徐放するパッチに塗布するためのゲル又はマトリックスの基剤に混合しうる。
直腸投与のための固体組成物には、公知の方法にしたがって配合された、１種以上の式IIの化合物を含む座薬が含まれる。
本発明による組成物中の活性成分の百分率は、適する投与量の割合を構成するように変化しうる。明らかに、数単位の投与量の形がほぼ同時に投与されうる。使用される投与量は、医師又は資格のある医学の専門家により決定され、所望の治療効果、投与の経路及び治療期間、及び患者の状態に依存する。本発明の方法の実施に於ける投薬養生は、改良が得られるまで最大の治療応答を確保し、その後は軽減される最少有効量を確保するということである。一般的には、経口投与量は約０．１乃至約１００mg/kgであり、好ましくは約０．１乃至２０mg/kgであり、最も好ましくは約１乃至２０mg/kgであり、静脈内投与は約０．１乃至約１００μg/kgであり、好ましくは約０．１乃至５０μg/kgである。各特定の場合については、投与量は、年齢、体重、健康の一般状態及び本発明による化合物の有効性に影響しうるその他の特性のような治療される患者特有の因子にしたがって決定される。
更に、式IIの化合物は、所望の治療効果を得るために必要なだけしばしば投与されうる。投与量が多くても少なくても迅速に応答して、適する投与量がずっと少ない患者もいるし、各特定の患者の生理的要件にしたがって、１日に１乃至４回、好ましくは１日に１乃至２回経口的に投与して長期間治療する必要のある患者もいる。一般的には、活性物質は１日に１乃至４回経口的に投与しうる。もちろん、１日に１乃至２回以下を処方する必要がある患者もいる。
式IIの化合物は、試験結果がヒト及びその他の哺乳動物における薬学的活性と相互関係があるとされている、文献に記載されている試験による顕著な薬学的活性を示す。以下の薬学的生体外及び生体内試験の結果は式IIの化合物を特徴付けるのに代表的である。
以下の薬学的試験は、フィブリノーゲン媒介血小板凝集、フィブリノーゲンのトロンビン刺激血小板への結合、及びADP-誘導半ビボ血小板凝集の阻害に関する式IIの化合物の阻害活性を評価する。これらの試験結果は式IIの化合物の生体内阻害性と相互関係がある。
血小板凝集分析は、Blood 66（4）,946-952（1985）に記載されている分析に基づく。フィブリノーゲン結合分析は、本質的に、Ruggeri,Z.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,5708-5712（1986）及びPlow,E.F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8057-8061（1985）の分析である。ADP-誘導半ビボ血小板凝集の阻害の分析は、Zucker,“Platelet Aggregation Measured by the Photoelextric Method”,Methods in Enzymology 169,117-133（1989）の分析に基づく。
血小板凝集分析
固定された一活性化された血小板の調製
Marguerie,G.A.et al.,J.Biol.Chem.254,5357-5363（1979）及びRuggeri,Z.M.et al.,J.Clin.Invest.72,1-12（1983）に記載されているようなゲル−濾過技術を用いヒトの血小板濃縮物から血小板を単離する。血小板を、１２７mMの塩化ナトリウム、２mMの塩化マグネシウム、０．4２mMのNa2HPO4、１１．９mMのNaHCO3、２．９mMのKCl、５．５mMのグルコース、１０mMのHEPESを含み、pHが７．３５でヒト血清アルブミン（HSA）が０．３５％の変性したカルシウムを含まないTyrodeの緩衝液に２×１０8細胞/mlの濃度で懸濁させる。これらの洗浄した血小板は、ヒトa-トロンビンを２単位/mlの最終濃度で、次いでトロンビン阻害剤I-2581を４０μMの最終濃度で添加することにより活性化される。活性化された血小板にパラホルムアルデヒドを０．５０％の最終濃度で添加し、これを室温で３０分間インキュベートする。次いで、固定された、活性化された血小板を、６５０×ｇで１５分間遠心分離することにより回収する。血小板のペレットを前述のTyrodeの０．３５％HSA緩衝液で４回洗浄し、２×１０8細胞/mlの濃度で同一緩衝液に再び懸濁させる。
血小板凝集分析
固定され活性化された血小板を、選択した投与量の、血小板凝集阻害に関して試験する化合物とともに１分間インキュベートし、ヒトフィブリノーゲンを２５０μg/mlの最終濃度で添加することにより凝集を開始させる。血小板凝集の記録には、血小板凝集Profiler Model PAP-4を使用する。凝集の阻害度は、阻害剤の不在下で観察される凝集速度に対する％として表す。次いで、IC50、すなわち５０％の凝集速度に低下させるのに必要な阻害剤の量を各化合物に関して計算する（例えば、Plow,E.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8057-8061（1985）を参照されたい）。
フィブリノーゲン−結合分析
血小板は、Trapani-Lombardo,V.et al.,J.Clin Invest.76,1950-1968（1985）により修正されたWalsh,P.N.et al.,Br.J.Haematol.281-296（1977）のアルブミン密度勾配技術により、血漿成分でない状態に洗浄した。各実験混合物において、変性Tyrode緩衝液（Ruggeri,Z.M.et al.,J.Clin.Invest.72,1-12（1983））中の血小板を２２乃至２５℃において１０分間ヒトa-トロンビンで刺激する（３．１２５×１０11／Ｌの血小板及び０．１NIH単位/mlのトロンビン）。次いで、125Iで標識したフィブリノーゲン及び試験する化合物を添加する前に、２５倍過剰（単位／単位）のヒルジンを５分間で添加する。この添加の後、混合物中の血小板の最終数は１×１０11／Ｌである。２２乃至２５℃において更に３０分間インキュベートした後、３００μＬの２０％蔗糖により５０μＬの混合物を１２，０００×ｇで４分間遠心分離することにより結合及び遊離リガンドを分離する。次いで血小板ペレットを残りの混合物から分離し、血小板−結合放射能を決定する。非特異性結合は、過剰の標識のついていないリガンドを含む混合物中で測定する。Scatchard分析により結合曲線を分析すると、非特異性結合は、コンピュータで処理されるプログラムによる結合等温線からぴったり合ったパラメータとして誘導される（Munson,P.J.,Methods Enzymol.92,542-576（1983））。トロンビンで刺激された血小板へのフィブリノーゲンの結合を５０％阻害するのに必要な各化合物の濃度（IC50）を決定するためには、各化合物について、125Iで標識したフィブリノーゲンを０．１７６μmol/L（６０μg/ml）に保持して６以上の濃度で試験する。IC50は、残存するフィブリノーゲンの結合を試料化合物の濃度の対数に対してプロツトすることにより誘導される。
ADP-誘導半ビボ血小板凝集の阻害
実験記録
対照の血液試料は、１０乃至２０kgの雑種の犬に試験化合物を投与する５乃至１０分前に得る。化合物は水性栄養により胃の中に、又はゼラチンカプセルにより経口的に投与される。次いで血液試料（５ml）を、投与後３０分間隔で３時間、そして６、１２、２４時間後に得る。各血液試料は、頭部の静脈の穿刺により得る。回収して直接、３．８％のくえん酸三ナトリウム１部と血液９部を含むプラスチックシリンジに入れる。
半ビボ犬の血小板凝集
血液試料を１０００回／分で１０分間遠心分離して血小板に富む血漿（PRP）を得る。PRPの除去後、試料を更に１０分間２０００回／分で遠心分離すると血小板の不十分な血漿（PPP）が得られる。PRP内の血小板の数は、Coulter Counter（Coulter Electronics,Hialesh,FL）を用いることにより決定される。PRP内の血小板の濃度が３００，０００／μLより高い場合には、PRPをPPPで希釈して血小板の数が３００，０００／μLとなるように調整する。次いでPRPのアリコート（２５０μＬ）を珪素化ガラスキュベット（７．２５×５５mm、Bio/Data Corp.,Horsham,PA）内に置く。次いで、エピネフリン（最終濃度１μM）をPRPに添加し、このものを３７℃で１分間インキュベートする。次いで、血小板凝集の刺激剤であるADPを１０μMの最終濃度でPRPに添加する。血小板凝集は、光透過血小板凝集計（Bio/Data Platelet Aggregation Profiler,Model PAP-4,Bio/Data Corp.,Horsham,PA）を用いて分光光度分析的に追跡する。化合物の試験については、光透過の変化の割合（勾配）及び最大光透過（最大凝集）を一組として記録する。血小板凝集データは、試験化合物の投与前に得られた血液試料から調製される対照PRPから得られるデータと比較して勾配又は最大凝集凝集の％減少として（平均±SEM）報告される。
式IIの化合物は前述の試験において顕著な活性を示し、ある種の病的状態に伴う血栓症の予防及び治療に有用であると考えられる。半ビボ犬の血小板凝集分析における抗血栓活性は、ヒトにおけるそのような活性を予言する（例えば、Catalfamo,J.L.,and Dodds,W.Jean,“Isolation of Platelets from Laboratory Animals”,Methods Enzymol.169,Part A,27（1989）を参照されたい）。前述の方法による式IIの化合物の試験結果は以下の表６に示す。表には、4-4（ピペリジル）ブタノイルグリシルアスパルチルトリプトファン、すなわち欧州特許願公告第0479481号に開示されている化合物に関する比較試験の結果も示されている。
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本発明が本発明の目的を実施するのに十分適切であり、記載された目的及び利点、並びにそれらに固有のものが得られることは当業者には容易に認められるであろう。本明細書に記載されている化合物、組成物、及び方法は、好ましい実施態様の例として提供されており、例であって、本発明の範囲の限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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