(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  第一の標的結合配列に対して５'に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む第一の増幅プライマーを、ＲＮＡ標的配列の３'末端でハイブリッド形成させ、第一のバンパープライマーを該第一の増幅プライマーに対して５'でハイブリッド形成させる段階と、
ｂ）  デオキシヌクレオシド三リン酸と少なくとも１種類の修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、且つ鎖置換活性を持つ逆転写酵素を用いて、該第一の増幅プライマーと該第一のバンパープライマーを伸長し、これによって、該ＲＮＡ標的配列と相補的なＤＮＡ標的配列を含む一本鎖の第一の増幅プライマー伸長生成物を生成する段階と、
ｃ）  該第一の増幅プライマー伸長生成物のＤＮＡ標的配列の３'末端で、第二の標的結合配列に対して５'に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、第二の増幅プライマーを、ハイブリッド形成させ、第二のバンパープライマーを該第二の増幅プライマーに対して５'でハイブリッド形成させる段階と、
ｄ）  デオキシヌクレオシド三リン酸と修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、該第二の増幅プライマーと該第二のバンパープライマーを伸長し、これによって、ＤＮＡ標的配列を含む一本鎖の第二の増幅プライマー伸長生成物を生成する段階と、
ｅ）  該第一の増幅プライマーのハイブリッド形成および伸長によって、該第二の増幅プライマー伸長生成物を二本鎖にし、これによって、上記二本鎖の第二の増幅プライマー伸長生成物中に、二本鎖の半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生成する段階と、
ｆ）  ｉ）  上記二本鎖の第二の増幅プライマー伸長生成物における二本鎖の半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、制限エンドヌクレアーゼによってニッキングし、
ｉｉ）  ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、且つ鎖置換活性を持つ熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ニックから伸長させ、それによって、該標的配列の一本鎖コピーを分離し、
ｉｉｉ）  該標的配列が増幅されるように、ニッキング、伸長、分離段階を繰り返すことによって標的配列を増幅する段階と
を含む標的配列の増幅方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ- Ｂｃａおよびｅｘｏ- Ｂｓｔから成るグループから選択され、且つ、上記逆転写酵素がSuperscript IITM、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素から成るグループから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記第二の増幅プライマーが、逆転写酵素により伸長される請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記第二の増幅プライマーが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される請求項１記載の方法。
【請求項５】
ａ）  逆転写プライマーをＲＮＡ標的配列の３'末端でハイブリッド形成させ、且つ、第一のバンパープライマーを該逆転写プライマーに対して５'でハイブリッド形成させる段階と、
ｂ）  デオキシヌクレオシド三リン酸と少なくとも１種類の修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており且つ鎖置換活性を持つ逆転写酵素を用いて、該逆転写プライマーと該第一のバンパープライマーを伸長し、これによって、該ＲＮＡ標的配列と相補的なＤＮＡ標的配列を含む一本鎖逆転写プライマー伸長生成物を生成する段階と、
ｃ）  該ＤＮＡ標的配列の３'末端で、標的結合配列に対して５'に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む第一の増幅プライマーを、ハイブリッド形成させ、且つ、第二のバンパープライマーを該第一の増幅プライマーに対して５'でハイブリッド形成させる段階と、
ｄ）  デオキシヌクレオシド三リン酸と修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、上記第一の増幅プライマーと上記第二のバンパープライマーを伸長し、これによって、ＤＮＡ標的配列を含む一本鎖の第一の増幅プライマー伸長生成物を生成する段階と、
ｅ）  第二の標的結合配列に対して５'に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む第二の増幅プライマーのハイブリッド形成および伸長によって、上記第一の増幅プライマー伸長生成物を二本鎖にし、これによって、上記二本鎖の第一の増幅プライマー伸長生成物中に、二本鎖の半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生成する段階と、
ｆ）  ｉ）  上記二本鎖の第一の増幅プライマー伸長生成物における二本鎖の半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、制限エンドヌクレアーゼによってニッキングし、
ｉｉ）  ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、鎖置換活性を持つ熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ニックから伸長し、それによって、該標的配列の一本鎖コピーを分離し、
ｉｉｉ）該標的配列が増幅されるように、ニッキング、伸長、分離段階をくり返すことによって標的配列を増幅する段階と
を含む、標的配列の増幅方法。
【請求項６】
上記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ- Ｂｃａおよびｅｘｏ- Ｂｓｔから成るグループから選択され、且つ、上記逆転写酵素がSuperscript IITM、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素から成るグループから選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記第一の増幅プライマーが、逆転写酵素により伸長される請求項５記載の方法。
【請求項８】
上記第一の増幅プライマーが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸標的配列の増幅、特にＲＮＡ標的配列の増幅に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸増幅技術は、少量の核酸を検出および分析するための優れた手段を提供している。このような方法は、鋭敏度が極めて高いため、感染症および遺伝病の早期診断や、分析のための遺伝子の分離や、法医学における特定の核酸の検出のために、それらの方法を開発する試みがなされている。核酸増幅技術は、その技術における温度の必要条件によって分類できる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。これに対して、鎖置換増幅（ＳＤＡ；strand displacement amplification ）、自家継続配列複製（３ＳＲ；self-sustained sequence replication ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based amplification ）、ＱＢレプリカーゼ系は、一定温度で実施できる等温反応である。
【０００３】
上記ＰＣＲでは、プライマーが伸長した後に反応温度を上げて、新しく合成された鎖を鋳型から分離する。次に、プライマーをリアニーリング(reanneal)し、伸長工程を繰り返すために、反応温度を下げる。従って、温度によって反応が制約されるため、ＰＣＲ反応の工程は不連続な相またはサイクルで起こる。これに対して、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびその他の等温増幅反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物の分離や、伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、反応混合物中で同時に起こる。従来のＳＤＡ（通常、約３５−４５℃の低温で実施される。）は、G.T. Walker, et al. （1992a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 および1992b. Nuc. Acids Res. 20, 1691-1696, 米国特許）により説明されている。好熱性ＳＤＡ反応（ｔＳＤＡ）が最近開発されており、それによると、熱安定性のポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを用いて、より高温だが、一定温度で実施することができる。ｔＳＤＡは、特異性がより高く、反応がより迅速であるという利点を有する。その反応は、熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性制限エンドヌクレアーゼの置換を伴って、従来のＳＤＡと本質的に同様に実施される。反応温度は、選択された好熱性酵素に適したより高温（典型的には、約４５℃〜６０℃の間）に調節され、従来の制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択された熱安定性エンドヌクレアーゼに対し、適切な制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位によって置き換えられる。また、従来のＳＤＡと異なり、酵素がその温度で十分安定であるならば、実施者は、酵素を最初の熱変性段階の前に、反応混合物の中に含めてもよい。
【０００４】
ＳＤＡによる増幅の標的は、ＳＤＡ反応に使用されるエンドヌクレアーゼを用いて、より大きな核酸をフラグメント化することにより調製できる。しかし、標的がフラグメント化のために必要な制限エンドヌクレアーゼ認識部位に挟まれていない場合には、ＳＤＡ反応におけるニッキングに適した制限エンドヌクレアーゼ認識部位を持つ標的核酸を、Walker, et al.（上記１９９２ｂおよび米国特許第５，２７０，１８４号）により説明されている方法により生成できる。ＳＤＡの場合と同様に、標的生成反応の個々の段階は、同時に連続的に起こり、ＳＤＡにおける制限酵素によるニッキングに必要な末端認識配列を持つ標的を生成する。ＳＤＡ反応の成分全てが、標的生成反応中に存在しているため、生成された標的は、自動的かつ連続的にＳＤＡサイクルに入り、増幅される。
【０００５】
発現される遺伝子のｍＲＮＡ転写物は、一般に、遺伝子そのものよりも多数のコピー数が細胞内に存在しているので、ＲＮＡ標的単独またはＲＮＡ標的とＤＮＡ標的の両者の検出により、幾つかの増幅反応において鋭敏度が不十分であるという問題を克服する事ができる。ＲＮＡおよびＤＮＡ標的の増幅は、検体あたりの増幅可能な標的数を最大にし、その結果、診断の鋭敏度を最大にすることができるため、増幅技術の診断応用にしばしば望ましい。ＲＮＡ標的の増幅は、特定のウイルス血症、癌遺伝子のアップレギュレーション等のＲＮＡ関連疾患の診断モニタリングにも有用である。ＲＮＡ標的の増幅は、「逆転写増幅」と呼ばれ、最もよく知られた方法は、逆転写ＰＣＲ（rtPCR, J.W. Larrick. 1992. Trends Biotechnology 10, 146-152 ）である。ｒｔＰＣＲは、しばしば連続工程で実施され、最初の工程は、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡ標的配列のｃＤＮＡコピーを産生する反応である。次に、逆転写酵素が不活化され、第二の工程で、ＤＮＡポリメラーゼが加えられ、ｃＤＮＡが従来のＰＣＲ反応で増幅される。この方式は、ＰＣＲ反応そのものと一致しており、不連続な温度周期相で起こる。最近、逆転写とＤＮＡポリマー形成の両者に対して１種類のポリメラーゼを用いて、ｒｔＰＣＲが実施された（ＥＰ  ０  ６３２  １３４  Ａ２）。ＴａｑおよびＴｔｈ等の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、逆転写に適した反応条件下で評価したところ、顕著な逆転写活性を有することが報告されている（米国特許第５，３２２，７７０号）。これらのアッセイでは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを分離したり、あるいはＲＮＡ鋳型を用いて修飾されたｄＮＴＰを組み入れたりする必要はない。
【０００６】
逆転写酵素（典型的には、ウイルス酵素）は、複製の鋳型としてＲＮＡを用いてｃＤＮＡを産生する事に関して、非常に高い活性を有する。他の逆転写酵素がこの能力を有するかどうかは以前は不明であったが、ＡＭＶ逆転写酵素も、チオール化されたｄＮＴＰ  をｃＤＮＡの中に組み入れることが明らかにされている（P.A. Bartlett and F. Eckstein. 1982. J. Biol. Chem. 257, 8879-8884）。幾つかの逆転写酵素に関して、鎖置換活性も報告されている。しかし、これらの酵素が、ＳＤＡで必要とされているように、ＲＮＡ鋳型から修飾されたヌクレオチドを含むｃＤＮＡを鎖置換するのかどうかは、以前は不明であった。
【０００７】
以下の用語は、ここでは下記の様に定義される。
増幅プライマーとは、プライマーのハイブリッド形成と伸長によって標的配列を増幅するプライマーである。ＳＤＡに関しては、増幅プライマーの３’末端は、標的配列の３’末端でハイブリッド形成する標的結合配列である。増幅プライマーは更に、標的結合配列に対して５’末端に、一般的にはその５’末端付近に、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。上記Walker, et al.（１９９２ａ）に記載されているように、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、認識部位が半修飾されている場合、制限エンドヌクレアーゼに対して二本鎖認識部位をニッキングする制限エンドヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列である。半修飾された認識部位は、制限エンドヌクレアーゼに対する二本鎖認識部位であり、この場合、一つの鎖は、制限エンドヌクレアーゼによる二本鎖の内の１本の切断を防止する少なくとも１つの誘導されたヌクレオチドを含む。「ニッキング(nicking) 」とは、この修飾された活性を意味し、この場合、典型的な二本鎖の切断に対し、二本鎖の片方の鎖だけが、制限エンドヌクレアーゼにより切断される。制限エンドヌクレアーゼによりニッキングできる半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位は全て、ＳＤＡで使用するのに適している。ＳＤＡのための増幅プライマーは、上記Walker, et al.（１９９２ｂ）により、Ｓ1 およびＳ2 と命名されている。α−チオ修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、「ｄＮＴＰαＳ」、「ｄＡＴＰαＳ」、「ｄＣＴＰαＳ」、その他と略される。
【０００８】
ＳＤＡ以外の増幅反応に使用するために適応させた増幅プライマーの構造は、本技術において公知である。例えば、ＰＣＲは、増幅を維持するための特殊な構造または配列を要さないので、ＰＣＲ増幅プライマーは、典型的には、標的結合配列(target binding sequence) だけを含む。しかし、３ＳＲおよびＮＡＳＢＡの増幅プライマーは、増幅反応を維持するために転写工程が必要なため、標的結合配列に加えてＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む。
【０００９】
「バンパー」またはエクスターナルプライマーは、エクスターナルプライマーの伸長により下流のプライマーが分離され、その伸長生成物、すなわち制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む標的配列のコピーが分離されるように、増幅プライマーの上流（すなわち５’）の標的配列とアニーリングするプライマーである。従って、バンパープライマーは、標的結合配列のみから成り、増幅プライマーの上流とアニーリングし、伸長されるとそれらを分離するようにデザインされている。エクスターナルプライマーは、上記Walker, et al.（１９９２ｂ）により、Ｂ1 およびＢ2 と名付けられている。エクスターナルプライマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を分離するための一方法であって、場合によっては加熱が適切な場合もある。
【００１０】
逆転写プライマーも標的結合配列のみを含む。これはＲＮＡ標的配列の３’末端でハイブリッド形成され、標的の逆転写を引き起こす。逆転写プライマーの伸長により、ＲＮＡ標的と、逆転写により産生されるＲＮＡ標的のｃＤＮＡコピーとからなるヘテロ二本鎖が作製される。ｃＤＮＡは、一本鎖にして、増幅に利用できるように、（例えば、加熱、リボヌクレアーゼ、または鎖置換によって）ＲＮＡ鎖から分離される。任意で、第二の逆転写プライマーを、ｃＤＮＡ中の標的配列の３’末端でハイブリッド形成させ、増幅前に第二の鎖合成を引き起こしてもよい。
【００１１】
標的または標的配列という言葉は、増幅、複製または検出される核酸配列（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を示す。これらには、増幅されるべき元の核酸配列とその相補的第二の鎖と、標的配列の増幅または複製によって作製される元の標的配列のコピーの両方の鎖が含まれる。
増幅生成物、伸長生成物またはアンプリコン(amplicon)は、標的配列の増幅または複製中に産生される標的配列のコピーを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびその他の酵素に関する熱安定性(thermostable)または好熱性(thermophilic)という言葉は、ＤＮＡポリメラーゼまたはその他の酵素の酵素活性が、ｔＳＤＡの温度範囲内、典型的には、約４５℃〜６０℃で安定であることを示す。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＲＮＡ標的配列の増幅方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
鎖置換増幅を、ＲＮＡ標的の逆転写増幅に適合させた。本発明の方法は、逆転写ＳＤＡ（ｒｔＳＤＡ）と呼ばれ、２段階の工程、あるいはＲＮＡのｃＤＮＡコピーが同時に産生及び増幅される１段階の工程で実施される。好熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、逆転写活性が報告されている。しかし、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）での使用に好ましいＤＮＡポリメラーゼは、典型的なＳＤＡ反応条件下で、検出可能な量のｃＤＮＡを産生しないことが見いだされた。これは、１種類のＤＮＡポリメラーゼが、逆転写の工程とＤＮＡ増幅の工程の両方を共に実施することができないことから、１段階工程としてのｒｔＳＤＡを不可能にするように最初思われた。現在、この問題は、従来の逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、１回の反応でｃＤＮＡを産生し、それを増幅するように作用するように、ＳＤＡ反応条件を調整することによって解決されている。
【００１４】
典型的なＳＤＡ反応条件下でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのみを使用するｒｔＳＤＡが実現しないのは、このポリメラーゼがＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを鎖置換できないことに少なくとも一部は起因していることが、更に発見された。別の態様において、この問題は、ＲＮＡの加熱または酵素消化等により、ＲＮＡから分離することによって、ｃＤＮＡを一本鎖にする、逆転写と増幅の間の工程の導入によって克服された。
【００１５】
【発明の実施の形態】
熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、それらのｒｔＳＤＡにおける利用可能性に関する逆転写（ＲＴ）プライマー伸長アッセイで評価した。ＲＴプライマー伸長アッセイにおいて、Ｔ７プロモーターの制御下に、ＨＩＶｇａｇ遺伝子のクローン化断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ＲＮＡ標的を産生した。ＲＮＡの標的領域にハイブリッド形成する逆転写プライマーを合成した。ＲＮＡ標的（１０10個の分子）と１６０ｎＭキナーゼ化プライマーを、リン酸反応緩衝液（３５ｍＭのＫＰＯ4 、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１５％のグリセロール、０〜４ｍＭのＭｇＣｌ2 、０〜４ｍＭのＭｎＳＯ4 ）またはトリス反応緩衝液（１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１５％のグリセロール、０〜４ｍＭのＭｇＣｌ2 またはＭｎＳＯ4 ）のいずれかにおいて変性させ、５３℃に平衡化した。逆転写反応は、１１Ｕのｅｘｏ- Ｂｃａを加えることによって開始され、２５分間インキュベートされた。その反応条件でプライマーが伸長されたかどうかを決定するために、予想される大きさの伸長生成物（２３８ヌクレオチド）を用いて、反応生成物をポリアクリルアミドゲルで分析した。プライマーを伸長させることができなかったということは、ポリメラーゼが逆転写酵素活性を殆ど、あるいは全く持っていなかったことを示す。
【００１６】
ＲＴアッセイのプライマー伸長生成物のＰＣＲ増幅は、標的の量が多い場合（１０10コピー）には、外因性マグネシウムもマンガンも逆転写に不要であることを示す。標的量が少ない場合（≦１０4 コピー）には、どちらの緩衝液でも逆転写にマンガンを添加する必要があった。トリス緩衝液ではマンガンを必要としたが、リン酸緩衝液では明らかに必要でなかった。しかし、リン酸緩衝液系には、別の試薬の成分としてマンガンが存在していた可能性があるため、マンガンの必要性を確定的に除外することはできない。
【００１７】
ｅｘｏ- Ｂｓｔ、ｅｘｏ- ＢｃａおよびＴｔｈは、ＲＴプライマー伸長アッセイにおいて完全な長さのｃＤＮＡを産生したが、Ｔａｑは産生しなかった。ｅｘｏ- Ｂｓｔおよびｅｘｏ- Ｂｃａポリメラーゼは、一般に好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）に使用される。一般に、ｅｘｏ- Ｂｃａは、従来の逆転写酵素と比較して、やや低い逆転写酵素活性を示したが、ｅｘｏ- Ｂｓｔよりも１００ないし１０００倍優れた逆転写酵素活性を示した。これに対して、ＲＮＡ鋳型上でＤＮＡプライマーを伸長するには、従来の逆転写酵素（Superscript IITM）と比較して、少なくとも５０倍の量のｅｘｏ- Ｂｓｔが必要であった。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、従来の逆転写酵素よりも逆転写酵素としての活性は低いが、ｒｔＳＤＡでの使用には十分であろうと予想された。しかし、典型的なＳＤＡ反応条件下で、逆転写酵素活性をテストすると、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写を殆ど支持しないことが見いだされた。ＰＣＲによる逆転写生成物の増幅により、ｅｘｏ- Ｂｓｔおよびｅｘｏ- Ｂｃａに関する検出鋭敏度は、それぞれ分子数１０9 個、および１０6 個であることが実証された。これに対して、その後のＰＣＲ増幅によりＡＭＶ逆転写酵素を使用する逆転写では、検出鋭敏度は、分子数１００〜１０００個を示した。鋭敏度が低いのは、ＲＴアッセイと比較して、ＳＤＡにおけるポリメラーゼの量が少ないことと、ＳＤＡ反応のその他の成分（修飾ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、プライマー、その他）の阻害作用が存在する可能性によるものと思われる。
【００１８】
検出レベルは臨床診断分析には十分に鋭敏ではなかったが、これらの実験により、特定の条件下での低レベルの逆転写が証明された。増幅前に加熱しないと、逆転写生成物の増幅が検出されないことも認められ、これは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ鎖を分離しなかったことを示している。標的ＲＮＡの濃度が低いと、鎖置換は殆ど全く観察されず、標的濃度が高いと、最小限の鎖置換が検出されたに過ぎなかった。これらの研究から、ｅｘｏ- Ｂｃａおよびｅｘｏ- Ｂｓｔを、臨床的に有用な標的濃度でＲＮＡ鋳型から伸長生成物を分離することは、実質的に不可能であるとの結論に達した。
【００１９】
典型的なＳＤＡプライマーと試薬を含む完全にｉｎ ｖｉｔｒｏのｒｔＳＤＡ反応では、唯一のポリメラーゼとしてｅｘｏ- Ｂｓｔまたはｅｘｏ- Ｂｃａを使用して、ＲＮＡ標的の増幅を実証することはできなかった。これに対して、ｅｘｏ- Ｂｃａまたはｅｘｏ- Ｂｓｔに、Superscript IITM逆転写酵素を添加すると、ＳＤＡ反応によってＲＮＡ標的の十分な増幅が可能となった。更なる研究により、（ニッキング可能な制限部位を含む）ＳＤＡ増幅プライマーは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写を阻害することが示唆された。逆転写の効率が低い状態（特に、ＳＤＡ反応におけるポリメラーゼ濃度が比較的低い状態）で結合されたＳＤＡプライマーの存在は、逆転写段階と増幅段階の間に二本鎖分子を変性するために反応を加熱するか否かにかかわらず、検出可能な増幅を引き起こさなかった。ＳＤＡに必要な特別な増幅プライマーをＰＣＲ様またはバンパー様の逆転写プライマーに置き換え、逆転写とｃＤＮＡの増幅の間にヘテロ二本鎖逆転写生成物を加熱することによって、典型的なＳＤＡ反応条件下で、検出可能量のＲＮＡ標的の増幅が達成されることが、引き続き発見された。
【００２０】
これらの実験は、ＳＤＡの増幅プライマーが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写を阻害する可能性があり、また、殆どの臨床検体に見いだされる比較的低い標的ＲＮＡ濃度において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを分離することは、実質的に不可能であることを示した。非常に高い標的濃度（ＲＮＡのコピー数約１０10個）では、非常に低レベルの鎖置換が起こったが、このように高い標的濃度は、臨床検体では稀であろう。鎖置換は、従来のＳＤＡ反応の必須の特徴である。従って、ｒｔＳＤＡのために１種類のポリメラーゼ系を使用してＲＮＡ標的の十分な増幅を達成するには、２段階に分けて反応を実施するのが好ましい。反応の第一の逆転写の段階において、１種類のバンパー様のプライマー（逆転写プライマー）だけが存在する。次に、第二の増幅段階の前に、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡが分離される。第一段階において、逆転写は、逆転写プライマーの存在下に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより実施される。逆転写プライマーは、ＳＤＡに必要な特殊化された配列を含まない。すなわち、標的結合配列だけを含み、構造的にはＰＣＲ増幅プライマーまたはＳＤＡのバンパープライマーと類似する。逆転写（即ち、逆転写プライマーの伸長）後、反応を加熱し、二本鎖ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性するか、あるいは酵素で処理し、ＲＮＡを消化する。次に、ＳＤＡプライマーを加え、同じＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの存在下に増幅反応を進行させる。逆転写と増幅反応が別々の不連続な段階で起こるため、この態様は、ｒｔＳＤＡの「１ポリメラーゼ／２段階」法と呼ばれる。ＲＮＡ標的の増幅は、一般に１ポリメラーゼ／２段階法で検出可能であるが、ポリメラーゼ濃度が低いと、鋭敏度が低いという欠点がある。しかし、ポリメラーゼの濃度を高くすれば、約１００〜１０００個のＲＮＡ標識を検出する鋭敏度が達成される。
【００２１】
１ポリメラーゼ／２段階ｒｔＳＤＡ反応の逆転写段階において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ標的の逆転写は、ＳＤＡ増幅プライマーが逆転写を阻害する可能性があるので、標的結合配列だけを含む逆転写プライマーのハイブリッド形成(hybridization) と伸長により引き起こされる。逆転写プライマーは、増幅される標的の上流にハイブリッド形成し、任意で、第二の増幅段階で使用されるバンパープライマーの１つであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼが十分な効率でＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを分離しないので、次に、得られたｃＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖のｃＤＮＡを、加熱または酵素（例えば、リボヌクレアーゼＨ）処理により一本鎖にする。このようにして生成されたｃＤＮＡは、ＳＤＡに必要な末端配列を付帯していないが、その後の増幅段階に存在していれば、増幅およびバンパープライマーが、これらの配列を、Walker, et al.（上記１９９２ｂおよび米国特許第５，２７０，１８４号）に記載されている標的産生経路に従って、付加する。ＤＮＡ増幅段階で、バンパーおよび増幅プライマーを用いてｃＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼ認識部位を付加することが、一般に好ましい。しかし、任意で、一本鎖ｃＤＮＡに、第二の逆転写プライマーのハイブリッド形成と伸長によって、ＳＤＡの前に第二の鎖合成を実施することも可能である。増幅プライマーの標的結合配列が、逆転写プライマーの標的結合配列に対応するのであれば、このように（典型的には、加熱により）生成された２つのＤＮＡ標的鎖の分離後、ＳＤＡのための増幅プライマーだけ（すなわち、バンパープライマーを含まない。）が、ＤＮＡ増幅段階に必要である。この態様において、標的生成および／または増幅は、ＳＤＡ段階で起こり、逆転写段階は、ＲＮＡ標的配列のｃＤＮＡコピーを単に提供する。２つの反応段階は、ｃＤＮＡを一本鎖にする介在する段階によって分離される。これは、ＤＮＡポリメラーゼが逆転写と増幅段階の両者を実施するが、鎖置換は不可能であるため、必要である。
【００２２】
ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、Superscript IITM、ＨＩＶ−ＩおよびRetrothermTMは、従来の逆転写酵素であり、ｄＮＴＰαＳの取り込みや鎖置換活性等のＳＤＡ関連機能に関して評価された。このアッセイにおいて、ＨＩＶｇａｇ転写物にハイブリッド形成させたＳＤＡのための増幅およびバンパープライマーが、デザインされ、合成された。ＲＮＡ標的および過剰量のキナーゼ化増幅およびバンパープライマーを、選択された逆転写酵素と共に使用するための製造者により推奨された緩衝液中で変性させ、試料を所望の反応温度に平衡化した後、逆転写酵素を添加した。少なくとも１種類はｄＮＴＰαＳであるｄＮＴＰの存在下に、プライマーをハイブリッド形成させ、伸長させる。予想される大きさの伸長生成物を使用して、反応生成物をポリアクリルアミドゲルで分析し、この反応条件下で伸長したものがあれば、どのプライマーが伸長したかを測定した。完全に伸長されたプライマー伸長生成物の予想される大きさは、次の通りである。Ｓ1ext−２００ヌクレオチド、Ｂ1ext−２３８ヌクレオチド、Ｂ2ext−１５０ヌクレオチド、Ｂ2ext−１９０ヌクレオチド。最初にＲＮＡとハイブリッド形成したバンパープライマーが伸長しないということは、酵素が下流にハイブリッド形成したプライマーを分離する事ができないか、あるいはｄＮＴＰαＳを取り込めないことを示した。第一の増幅プライマー（最初のバンパープライマーのＲＮＡ下流にハイブリッド形成した。）が伸長しないということは、ポリメラーゼが逆転写酵素活性を持っていないか、あるいはｄＮＴＰαＳを取り込めないことを示した。このｃＤＮＡ（即ち、伸長された一本鎖の最初の増幅プライマー伸長生成物）にハイブリッド形成した第二の増幅プライマーが伸長しないということは、ポリメラーゼが鋳型としてｃＤＮＡを使用して第二の鎖を合成できないか、あるいはｄＮＴＰαＳを取り込めないことを示す。
【００２３】
ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、Superscript IITM、ＨＩＶ−ＩおよびRetrothermTMが、逆転写酵素アッセイにおいてテストされた。これらの中で、ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、Superscript IITMは、ｄＮＴＰαＳをｃＤＮＡに取り込んだ。Superscript IITMは、一般に、最も活性が高いことが見いだされた。ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素を用いて、完全な長さのプライマー伸長生成物は検出できなかったので、更なる研究により、この酵素の評価を行うことはしなかった。ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、Superscript IITMは、ほぼ等量のＳ1 およびＢ1 伸長生成物（Ｓ1extおよびＢ1ext）の両方によって証明されたように、鎖置換活性(strand displacing activity)を示した。RetrothermTMに関しては鎖置換活性は検出されなかった。その理由は、おそらく、この酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のためであろう。しかし、エキソヌクレアーゼを欠失させれば、鎖置換活性が観察されるであろう。第二の鎖合成（逆転写により生成されたｃＤＮＡでの重合開始能）が、ＡＭＶに関して、放射能標識されたｄＮＴＰと末端標識されたＳ2 プライマーの両者を用いて、証明された。テストされた逆転写酵素の全てに関して、第二の鎖合成は、実験的には証明されなかったが、全てがこの活性を持つと報告されている。更に、既知のリボヌクレアーゼＨ活性を有する逆転写酵素は、Ｂ1 伸長生成物と、第二の鎖合成に利用可能な分離されたＳ1 伸長生成物の両者を作製するはずである。仮に、逆転写酵素が内因性リボヌクレアーゼＨ活性を持たなければ、第二の鎖合成が望まれる場合には、リボヌクレアーゼＨをＲＴ反応に加える事ができる。しかし、第二の鎖は、ｒｔＳＤＡにおいてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより合成できるため、第二の鎖合成は必須の特徴ではない。
【００２４】
診断用ｒｔＳＤＡの効率を改善するため、従来の逆転写酵素の高い逆転写酵素活性と鎖置換能、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ増幅における高い効率を利用する事を試みて、ＳＤＡ反応混合物の組成が研究された。このような反応により、両ポリメラーゼが存在して、それぞれの機能を「２ポリメラーゼ／１段階」反応で同時に実施できることが好ましい。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを鎖置換できないように思われたので、逆転写酵素がこの機能を実施できるＤＮＡ増幅に適合する反応条件を検討した。好ましくは、反応のＤＮＡ増幅部分に使用されるのと同じＳＤＡ増幅およびバンパープライマーを使用して、逆転写酵素が、逆転写とｃＤＮＡの鎖置換を行う。これらの同じＳＤＡ増幅プライマーを使用して、次に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ｃＤＮＡが生成されるにつれ、分離されたｃＤＮＡを増幅する。この際、逆転写と増幅反応の間に変性段階を導入する必要はない。即ち、逆転写とｃＤＮＡ増幅反応は、単一の反応混合物中で同時に起こる。
【００２５】
２ポリメラーゼ／１段階ｒｔＳＤＡ反応を図１に図解する。反応の逆転写部分において、ＳＤＡのための増幅プライマーは、ＲＮＡ標的配列にハイブリッド形成され、バンパープライマーの伸長によって、伸長された増幅プライマー（増幅プライマー伸長生成物）が分離されるように、バンパープライマーは、増幅プライマーの上流にハイブリッド形成される。この工程は、増幅可能な標的が、プライマーの伸長と鎖置換に逆転写酵素を使用して、ＲＮＡ鋳型から生成されることを除いて、米国特許第５，２７０，１８４号に記載されているＳＤＡのための標的産生反応に類似している。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡから鎖置換できないため、２ポリメラーゼ／１段階ｒｔＳＤＡ反応のこの部分に関与することができない。ＲＮＡは一本鎖なので、１つのＳＤＡ増幅プライマーと１つのバンパープライマーだけがハイブリッド形成し、元のＲＮＡ標的上で伸長される。反対のＳＤＡ増幅プライマーとバンパープライマーが、逆転写により生成されたｃＤＮＡにハイブリッド形成され、その上で伸長される。要するに、ＳＤＡのための増幅プライマー（例えば、Ｓ1 ）は、ＲＮＡ標的配列の３’末端でハイブリッド形成する。バンパープライマー（すなわち、Ｂ1 ）は、Ｓ1 の標的配列５’（すなわち上流）にハイブリッド形成する。逆転写酵素は、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下に、両プライマーを同時に伸長し、デオキシヌクレオチド三リン酸の内の少なくとも１つは、修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり、例えば、チオール化されたｄＡＴＰ（ｄＡＴＰαＳ）またはチオール化されたｄＣＴＰ（ｄＣＴＰαＳ）である。その方法により、Ｓ1 （Ｓ1ext）のｃＤＮＡ伸長生成物は、Ｂ1 が伸長されるにつれて、逆転写酵素によりＲＮＡ鋳型から分離される。この分離された一本鎖ｃＤＮＡは、この段階では５’末端に制限エンドヌクレアーゼが付加されており、ｃＤＮＡ中の標的配列の３’末端で、反対側のＳＤＡ増幅プライマー（Ｓ2 ）のハイブリッド形成のための鋳型として作用する。第二のバンパープライマー（Ｂ2 ）は、Ｓ2 増幅プライマーの５’にハイブリッド形成する（すなわち、Ｓ1extは、Ｓ2 およびＢ2 と結合する。）。これは、逆転写酵素またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質となり得る。逆転写酵素またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ標的上のＳ2 およびＢ2 の伸長（一般に、「第二の鎖合成」と呼ばれる。）によって、元のＲＮＡ標的配列に対応しているが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が両端に付加されている、一本鎖ＤＮＡ伸長生成物の置換が引き起こされる。この伸長生成物は、Ｓ1 のハイブリッド形成および伸長によって、二本鎖にされる。重合は、少なくとも１つの修飾ｄＮＴＰ  の存在下で起こるため、両端の二本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、この工程で半修飾される。従って、二本鎖ＤＮＡ構造は、ＳＤＡによる増幅に対する適切な基質である。一段階の反応における理想的な条件において、全てのＲＮＡ標的が逆転写されるまで、逆転写、標的生成、増幅の個々の段階が、同時にかつ連続的に起こり、次いで、反応が停止されるまで、ｃＤＮＡの増幅が続く。それらが生成されるにつれて、両端に認識／切断配列を��つ二本鎖ＤＮＡ標的は、自動的にＳＤＡサイクルに入り、増幅される。
【００２６】
ＳＤＡ反応媒体（特に、ＳＤＡに使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの濃度）は、ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写を効果的に阻害する。これは、ＤＮＡポリメラーゼにより開始される逆転写がアッセイの鋭敏度を低くし、鎖置換がないために、その後の増幅が不可能なｃＤＮＡを生成するため、望ましい。これに対して、逆転写酵素は、効率的にＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを逆転写し、鎖置換する。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写によりそれらが生成されると、従来のｔＳＤＡ反応においてこれらのＤＮＡ標的を効率的に増幅する。「１段階」という言葉は、この態様において逆転写段階と増幅段階が同時に発生する性質を示す。ＭＭＬＶとSuperscript IITMの両逆転写酵素は、ｅｘｏ- ＢｃａまたはクレノウＤＮＡポリメラーゼ(klenow DNA polymerase) と組み合わせると、効率的な増幅を引き起こした。ｅｘｏ- Ｂｃａ、Superscript IITM、ＢｓｏＢＩを使用すると、ｒｔＳＤＡは、ｇａｇＲＮＡ転写物の約１００個ほどのコピーを検出することが可能となった。ｅｘｏ- ＢｓｔとＢｓｏＢＩを有するＡＭＶ逆転写酵素は、また、約１００個ほどのｇａｇＲＮＡ転写物を検出した。反応に更なるルーチンの至適化を行うと、鋭敏度は上昇するはずである。逆転写酵素またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを除外すると、ＲＮＡ増幅は検出されなかったことから、これらの反応条件下で１段階反応方式で、完全なｒｔＳＤＡ反応（逆転写およびＤＮＡ増幅）を単独で実施できるポリメラーゼはないことが確認された。
【００２７】
２ポリメラーゼ／１段階ｒｔＳＤＡ反応の前記説明は、説明のための具体例として、ＳＤＡ増幅プライマーとバンパープライマーを使用している。しかし、逆転写酵素は、ＳＤＡプライマーか逆転写プライマーのどちらかを用いて、鎖置換を実施できるので、逆転写プライマーは、反応の逆転写部分において逆転写酵素により利用されるために更に存在しているのであろう。下流の逆転写プライマーは、逆転写プライマーとして作用し、上流の逆転写プライマーは、ＳＤＡバンパープライマーと類似している。なぜならば、その伸長が下流の逆転写プライマー伸長生成物（ｃＤＮＡ）を分離する働きをするからである。
【００２８】
標的増幅後、生成されたアンプリコンは、特定の核酸配列を検出するための本技術において公知の方法のいずれかによって、検出できる。例えば、増幅生成物は、オリゴヌクレオチド検出プローブへの特異的ハイブリッド形成によって検出できる。検出プローブは、検出可能な標識、すなわち検出可能シグナルを発生するか、あるいは発生するように作られ得る部分を含む短いオリゴヌクレオチドである。その標識は、ニックトランスレーション、末端標識またはプローブの化学合成時に、オリゴヌクレオチドプローブに組み入れることができる。オリゴヌクレオチドプローブと共に利用するための、直接および間接的に検出可能な多くの標識が、本技術分野において公知である。直接検出可能な標識には、検出可能とするために更なる反応を必要としない、例えば、放射性同位元素、蛍光部分、色素標識などの標識が含まれる。間接的に検出可能な標識には、検出可能とするために更なる試薬と反応させなくてはならない、例えば、着色された反応生成物を生成できる酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン(digoxigenin) 、抗原、ハプテン(hapten)または蛍光色素などの標識が含まれる。酵素標識からのシグナルは、一般に、酵素と、その基質および着色された酵素反応生成物を生じさせるために必要な追加試薬とを反応させることによって発生される。ビオチン（またはアビジン）標識は、標識されたアビジン（または標識されたビオチン）または標識された抗ビオチン（または標識された抗アビジン）抗体に結合させることにより検出される。ジゴキシゲニンおよびハプテン標識は、標識された抗ジゴキシゲニン（抗ディッグ）または抗ハプテン抗体への特異的結合によって、通常、検出される。一般に、検出プローブは、２つの増幅プライマーの結合部位の間にあるアンプリコンの中のヌクレオチド配列にハイブリッド形成するように選択される。しかし、検出プローブは、増幅プライマーのどちらかと同じヌクレオチド配列を持っていてもよい。検出プローブに対するハイブリッド形成によるｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕでの検出方法は、本技術分野において知られている。
【００２９】
あるいは、増幅生成物は、上記Walker, et al.（１９９２ｂ）により説明されているように、検出プライマーの伸長により検出できる。検出プライマー伸長法において、検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅生成物とハイブリッド形成され、ポリメラーゼの添加により伸長される。検出のために、プライマーは、例えば、32Ｐまたは蛍光標識を用いて、５’末端標識される。あるいは、ハイブリッド形成されたプライマーの伸長により、直接または間接的に検出可能な標識を含むｄＮＴＰ類似体を組み入れることも可能である。例えば、プライマーの伸長により、ディッグ誘導化ｄＮＴＰを組み入れることが可能であり、これは、伸長後、ＡＰ−α−ディッグおよび適切なＡＰ基質との反応により検出される。伸長されるプライマーは、増幅プライマーと同じでも、あるいは増幅プライマーの結合部位の間にあるアンプリコンの中のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する異なるプライマーでもよい。
【００３０】
検出可能な標識は、標的配列増幅時にアンプリコンの中に直接組み入れることもできる。例えば、従来のＳＤＡ反応におけるｄＮＴＰの１つを、検出可能な標識と直接または間接的に結合されたｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ類似体と、完全にあるいは部分的に置き換えることも可能である。次にポリメラーゼは、標識を、増幅プライマーの伸長により生成された増幅生成物の中に組み入れる。標識は、直接または間接的に検出可能なものとすることができる。ｄＮＴＰに結合された標識が蛍光標識である場合、蛍光強度を測定することによりアンプリコンにおいて直接検出できるか、あるいは蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリ(flow cytometry)によりｉｎ ｓｉｔｕで検出できる。ｄＮＴＰに結合された標識が、ビオチンまたはジゴキシゲニンである場合、アンプリコンは、ビオチンまたはジゴキシゲニン標識と、ストレプトアビジン／ＦＩＴＣとの反応によって間接的に検出でき、また、直接結合された蛍光標識に関して検出される。
【００３１】
二次増幅生成物は、米国特許第５，５４７，８６１号に記載されているように、標識配列上のシグナルプライマーのハイブリッド形成と伸長によって生成される標的配列のコピーである。二次増幅生成物は、増幅された標識配列の内部断片と、シグナルプライマーに結合された検出可能な標識を含む。シグナルプライマーの少なくとも３’末端は、標的配列とハイブリッド形成する配列を含む。これは、二次増幅生成物の捕捉と固定を促進する特徴も含むので、これらは、検出、定量または更なる操作のために分離することができる。シグナルプライマーは、増幅プライマーに見いだされる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まず、従って、ＳＤＡにおいて増幅プライマーとして機能しない。ｒｔＳＤＡ反応において二次増幅生成物が同時に生成されることにより、同質で増幅と同時に実施可能な別の検出方法が提供される。プローブのハイブリッド形成の段階は、省略され、シグナルプライマーの濃度は、一般に、ハイブリッド形成プローブの場合よりも低い。そのものの濃度が低いため、バックグラウンドは低くなり、バックグラウンドを更に低くするより厳重な洗浄も可能となる。二次増幅生成物を生成するために、ｒｔＳＤＡ反応混合物に少なくとも１つのシグナルプライマーが含まれる。２段階のｒｔＳＤＡにおいて、シグナルプライマーは、両反応中に存在するか、あるいはｃＤＮＡ増幅反応中にのみ存在し得る。シグナルプライマーは、ＲＮＡ標的配列、または増幅プライマーのハイブリッド形成部位の下流のそのｃＤＮＡコピーとハイブリッド形成し、増幅プライマーの伸長と同様の方法でポリメラーゼにより伸長される。その結果、増幅プライマーの伸長によって、標的配列からシグナルプライマーの伸長生成物が分離される。反対の増幅プライマーが、次に、伸長され分離されたシグナルプライマーとハイブリッド形成し、ポリメラーゼにより伸長され、その結果、シグナルプライマーは、標的の増幅（二次増幅生成物）を示すより長い二本鎖の中に組み込まれる。ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、残りの伸長されないシグナルプライマーは、十分小さいので細胞外で洗浄されるが、伸長されたシグナルプライマーはその中に保持される。標的増幅に特異的なシグナルは、これによって、標的が存在する細胞に結合され、標的がない細胞には実質上存在しない。
【００３２】
シグナルプライマーの他に、ＤＮＡのためのＳＤＡ反応のその他の代替物、変更および調節が、ＲＮＡ標的のＳＤＡにおいて使用するのに適している。例えば、全体の効率を改善し、効率的に増幅できる標的の長さを延長するために、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質をＲＮＡ増幅反応に加えることができる。汚染アンプリコンを米国特許第５，５３６，６４９号に報告されている方法で処理し、それらをその後のＲＮＡ増幅反応で増幅不可能にすることができ、ＤＮＡ標的のＳＤＡに使用される制限酵素とポリメラーゼのいずれも、ＲＮＡ増幅反応に使用することができる（例えば、米国特許第５，２７０，１８４号、米国特許第５，４５５，１６６号、ＥＰ  ０６８４  ３１５に開示されている酵素）。更に、上記に説明されている１段階および２段階プロトコールは共に、上記に例示されているようにＲＮＡ標的のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅、あるいはＲＮＡ標的のｉｎ ｓｉｔｕ増幅に応用できる。
【００３３】
【実施例】
実施例１
ｒｔＳＤＡを逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して１段階で実施し、反応の逆転写とＤＮＡ増幅部分を同時に実施した。この反応は、ＤＮＡ標的のＳＤＡに適したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを使用して、適切なＳＤＡ緩衝液のいずれにおいても実施できる。好熱性（すなわち熱安定性）ＤＮＡポリメラーゼが好ましい（ｅｘｏ- Ｂｃａまたはｅｘｏ- Ｂｓｔ）。なぜならば、より厳しい条件で反応を実施することが可能となるからである。鎖置換を行う任意の逆転写酵素を使用でき、好ましい逆転写酵素は、ＭＭＬＶ、ＡＭＶ、Superscript IITMである。第一の実施例において、緩衝系はトリス(TRIS)に基づき、以下の成分を含む。すなわち、総量５０μＬ中に、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、４５０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１５％のグリセロール、１．２μＭのＳＤＡ増幅プライマー、０．５μＭのＳＤＡバンパープライマー（下記に示す。制限エンドヌクレアーゼ認識配列は下線が付けられている。）を含む。
【００３４】
増幅プライマーＳ１．８（配列番号１）
ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＡＧＡＡＧ
増幅プライマーＳ２．９（配列番号２）
ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴ
バンパープライマーＧＢ１．１（配列番号３）
ＧＴＡＣＴＡＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣ
バンパープライマーＢ２．１（配列番号４）
ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧ
検出プライマー（配列番号５）
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡＴＧ
【００３５】
アッセイの鋭敏度を決定するために、ｇａｇＲＮＡ標的を種々の濃度で反応混合物の中に希釈し、７０℃で３０秒間加熱し、４８℃で２分間置いた。増幅酵素（ＢｓｏＢＩ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ）を加え、反応を約４８〜５２℃で３０分間インキュベーションした。一実施例において、増幅反応中に１６０単位のＢｓｏＢＩと、３単位のｅｘｏ- Ｂｃａと、２００単位のSuperscript IITMまたは２．５単位のＡＭＶ逆転写酵素のいずれかが、存在していた。増幅反応の終了時、上記Walker, et al., １９９２ｂにより報告されているように、標識された検出プライマーのハイブリッド形成と伸長により、増幅生成物が検出された。トリス系において、ｒｔＳＤＡは、最低約１００コピーのＲＮＡを検出した。
【００３６】
ｒｔＳＤＡ反応は、リン酸緩衝液においても実施でき、これはＤＮＡ標的のＳＤＡに典型的に使用される緩衝系である。これらの反応には、以下の成分を含む。すなわち、５０μＬの反応液中に、４５ｍＭのＫＰＯ4 （ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＯＡＣ、１５％のグリセロール、５００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１．２μＭのＳＤＡ増幅プライマー、０．５μＭのＳＤＡバンパープライマー、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１００μｇ／反応ＢＳＡ、および１６０単位のＢｓｏＢＩを含む。ｅｘｏ- Ｂｃａ（３単位）、ｅｘｏ- Ｂｓｔ（１６単位）、およびクレノウ（１５単位）を試験し、リン酸系に基づくｒｔＳＤＡ反応において機能することが見いだされた。ＡＭＶ（２．５単位）、Superscript IITM（２００単位）およびＭＭＬＶ（２００単位）の逆転写酵素も試験され、リン酸系に適合することが見いだされた。最も鋭敏なアッセイは、ＡＭＶとｅｘｏ- Ｂｓｔを２種類のポリメラーゼとして使用して達成され、最低約１００のＲＮＡ標的分子を検出した。
【００３７】
１段階／２ポリメラーゼｒｔＳＤＡ系は、ＲＮＡの検出可能な増幅に両方のポリメラーゼが必要であることが確認された。逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼのどちらかを省略すると、使用される緩衝液に関わりなく、ｇａｇＲＮＡ標的の増幅が阻害された。逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両方が同じ反応条件下で同時に機能できることが発見されたことによって、操作がより少なくて済み、シグナルプライマー検出系を使用して、増幅生成物の検出をリアルタイムで実施できる（即ち、増幅と同時に検出が行われる）ｒｔＳＤＡ反応の開発が可能となった。
【００３８】
実施例２
上記のように、ＲＮＡポリメラーゼによりクローン化ｇａｇ遺伝子断片から転写されたＲＮＡ標的配列を使用する１ポリメラーゼ／２段階方式で、ｒｔＳＤＡを実施した。第一段階において、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）に含まれる７．５Ｕ／μＬのｅｘｏ- Ｂｓｔまたは０．１５Ｕ／μＬのｅｘｏ- Ｂｃａポリメラーゼ、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．７５ｍＭのＭｎＳＯ4 またはＭｎＣｌ2 、それぞれ２００μＭのｄＧＴＰとｄＡＴＰとｄＴＴＰ、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳを使用して、Ｂ1 バンパープライマーのハイブリッド形成および伸長によって、逆転写を実施した。あるいは、ＳＤＡ段階に使用されるＫＰＯ4 緩衝系において、逆転写反応を実施した。プライマーの伸長は、５０℃で１時間継続させた。次に、逆転写反応液を増幅のために、３５ｍＭのＫＰＯ4 、４ｍＭのＭｇＯＡＣ、それぞれ２００μＭのｄＧＴＰとｄＡＴＰとｄＴＴＰ、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、５００ｎＭの増幅プライマー、５０ｎＭのバンパープライマー、１５％のグリセロール、１０ｎｇ／μＬのヒトＤＮＡの中に希釈した。ｃＤＮＡ標的は、ＳＤＡ緩衝液中で２分間沸騰させ、次に５５℃に平衡化した。１１単位のｅｘｏ- Ｂｃａまたは１６単位のｅｘｏ- Ｂｓｔを、１６０単位のＢｓｏＢＩと共に加えた。増幅反応物を５５℃で１５〜３０分間インキュベーションした。Walker, et al.（上記１９９２ｂ）により報告されているように、増幅生成物を反応終了物の部分標本中において、32Ｐ標識検出プライマーのハイブリッド形成および伸長によって検出し、更に１１単位のｅｘｏ- Ｂｃａまたはｅｘｏ- Ｂｓｔを添加した。検出プライマー伸長反応物の部分標本を、８％のポリアクリルアミドゲル上で分析した。検出プライマー伸長生成物の予想された大きさは、８２および１０１ヌクレオチド長であった。
【００３９】
クローン化ｇａｇ遺伝子が添加されなかった試料と、ＲＮＡポリメラーゼが添加されなかったデオキシリボヌクレアーゼで処理された試料は、検出可能な増幅生成物を示さなかった。同様に、転写に続いてデオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼの両者で処理した試料も、増幅生成物を認めなかった。ＲＮＡ転写物がリボヌクレアーゼで消化された試料は、ｇａｇＤＮＡ標的が増幅されたことを示す強力なバンドを示した。同じ試料を、逆転写の前にデオキシリボヌクレアーゼで処理すると、強力なバンドがやはりゲル上に認められ、ｒｔＳＤＡによるＲＮＡ標的の逆転写および特異的増幅が証明された。この実験条件下で、ｒｔＳＤＡによる増幅の効率は、ＤＮＡ標的に関するＳＤＡの効率とほぼ等しい。鋭敏度は、１００〜１０００転写物であった。この程度の量の標的は、反応条件が厳しく至適化されていなくても、簡単に検出された。反応条件の至適化により、鋭敏度は改善され、極めて少数のＲＮＡ標的分子の検出が可能となるはずである。
【００４０】
逆転写段階に存在する典型的なＳＤＡプライマー（増幅プライマーとバンパープライマー）の全てを用いて、１ポリメラーゼ／２段階反応を再現する試みは、検出可能な増幅を引き起こすことができなかった。これは、バンパープライマーが前の実験で逆転写を引き起こすのに成功しているので、ＳＤＡ増幅プライマーの存在に依るものである。ＳＤＡ増幅プライマーは、特に逆転写活性が既に抑制されているＳＤＡの条件下に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってｃＤＮＡ生成を強力に阻害する可能性がある。あるいは、効率の悪い逆転写中のバックグラウンド増幅プライマー二量体の形成が、その後の増幅反応で余計に競合(out-compete) する可能性がある。これは、一般的な問題に見えるが、全ての増幅プライマーの組み合わせに当てはまるわけではない。この問題は、ここでは、逆転写段階に逆転写プライマーを使用することによって解決された。しかし、ＳＤＡ増幅プライマーが存在する場合には、異なるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ｒｔＳＤＡにおいて逆転写でより効率的で、逆転写プライマーを使用する必要性を克服する可能性がある。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の２ポリメラーゼ／１段階の態様のｒｔＳＤＡ反応経路を示す図である。
【図１】
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