(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をコリネバクテリウム属細菌及びエシェリヒア属細菌よりなる群から選ばれる１種のＡＴＰ再生能を有する微生物に導入した形質転換株を、糖類、有機酸類及びエタノールよりなる群から選ばれる１以上のエネルギー供与体、イノシン若しくはグアノシン又はこれらの前駆体、及びリン酸供与体に接触反応させて、反応液中に５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項２】
ＡＴＰ再生能を有する微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである請求項１記載の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項３】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエキシグオバクテリウム・アセチリカムに由来する遺伝子である、請求項１又は２に記載の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項４】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２又は１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項３に記載の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項５】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエシェリヒア・コリに由来する遺伝子である、請求項１又は２に記載の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項６】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が、配列番号１０に示される塩基配列からなる遺伝子である、請求項５に記載の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法。
【請求項７】
エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物から得ることができ、かつ、以下の性質を有するイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質。
１）作用；リン酸供与体の存在下に、ヌクレオシドにリン酸基を転移し、ヌクレオシドの５′−モノリン酸エステルを生成する。
２）基質特異性；ヌクレオシド三リン酸のγ位のリン酸基を他のヌクレオシドに転移する。
３）至適ｐＨ；７．７−９．９
４）ｐＨ安定性；ｐＨ６．７−１２．１
５）至適温度；３０−５０℃
６）金属要求性；マグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、又は鉄イオン。
７）金属イオンによる影響；銅イオン、水銀イオンで強く阻害され、亜鉛イオン、カドミウムイオンで阻害される
８）Ｋｍ値；グアノシンに対して０．０３ｍＭ、イノシンに対して１ｍＭ、グアノシンを基質とした場合のＡＴＰに対して１．６ｍＭ。
９）分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で約３６キロダルトン。
【請求項８】
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イノシン又はグアノシンから５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸を生成させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを保持させた、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）再生能を有する微生物を利用して、イノシン若しくはグアノシン又はそれらの前駆体から、調味料などに利用される５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸を製造する方法に関する。
また、本発明は、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する新規な蛋白質、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、それで形質転換された微生物にも関する。
背景技術
従来、微生物を用いてイノシンをリン酸化し５′−イノシン酸を製造する方法として、ｐ−ニトロフェニルリン酸を用いる方法（特公昭３９−２９８５８号）、無機リン酸を用いる方法（特公昭４２−１１８６号、特公昭４９−４４３５０号）、アセチルリン酸を用いる方法（特開昭５６−８２０９８号）、ＡＴＰを用いる方法（特開昭６３−２３００９４号）等が開発されている。しかしながら、これらにより製造される５′−イノシン酸の蓄積は必ずしも満足すべきものではなかった。
また、ＡＴＰによりイノシンをリン酸化する方法の改良方法として、エシェリヒア・コリのイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を得て、遺伝子組換え技術によりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を増強したエシェリヒア・コリ菌株を用いて、イノシンまたはグアノシンをリン酸化し５′−イノシン酸または５′−グアニル酸を製造する方法も開発されているが（ＷＯ９１／０８２８６号）、反応により消費されるＡＴＰを再生する微生物を別途培養し反応液中に存在させる必要があり、さらに効率よく５′−イノシン酸及び５′−グアニル酸を得る方法が望まれていた。
さらに、イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリ（J.Gen.Microbiol,135,1263-1273(1989)）など一部の微生物について存在が知られているのみであった。
本発明者らは、５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸のさらに効率的な製造法の開発を行っていたところ、イノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を、反応により消費されるＡＴＰを再生するに充分な能力を有する微生物に導入することにより、簡便かつ高蓄積で５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸を製造することができることを見出した。また、エシェリヒア・コリから得られるイノシン−グアノシンキナーゼとは異なるアミノ酸配列を有する新規なイノシン−グアノシンキナーゼをも見出した。
発明の開示
本発明は、イノシン若しくはグアノシン又はそれらの前駆体から簡便かつ高蓄積で、調味料などに利用される５′−イノシン酸もしくは５′−グアニル酸を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は反応により消費されるＡＴＰを再生するに充分な能力を有する微生物に、イノシン及び／又はグアノシンを５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより、反応により消費されるＡＴＰを再生する微生物を別途培養し反応液中に存在させることなく、前記遺伝子を導入した微生物のみの存在下に簡便かつ高蓄積で、効率よく５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸を得る方法を提供するものである。
また、本発明は、エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物などから得ることができ、かつ、イノシン及び／又はグアノシンを５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸に変換する活性を有する新規な蛋白質、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、それで形質転換された微生物、及び、当該微生物を用いた５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸の製造法を提供するものである。
本発明の前記の新規な蛋白質は、既知のイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質に比べてアミノ酸配列を大幅に異にしており、新規な蛋白質である。エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼは既に知られている。本発明者らは従来イノシン−グアノシンキナーゼ活性があるとは知られていなかった、エキシグオバクテリウム属に属する微生物においてもイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を産生していることを見いだし、これを単離し、コードする遺伝子をクローニングすることに成功した。これらの蛋白質は既知のものに比べてアミノ酸配列を大幅に異にしていた。
従来のイノシン−グアノシン活性を有する蛋白質と、アミノ酸配列を大幅に異にする蛋白質が同様な活性を有していることは、本発明者らの新たな知見によるものである。
すなわち、本発明は、
（１）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をＡＴＰ再生能を有する微生物に導入した形質転換株を、イノシン若しくはグアノシン又はこれらの前駆体、エネルギー供与体、及びリン酸供与体に接触反応させて、反応液中に５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法、
（２）ＡＴＰ再生能を有する微生物がコリネバクテリウム属、エシェリヒア属、サッカロミセス属、スタフィロコッカス属及びキャンディダ属からなる群より選ばれる微生物である上記（１）の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法、
（３）ＡＴＰ再生能を有する微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである上記（１）の５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法、
（４）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエキシグオバクテリウム・アセチリカムに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（１）〜（３）のいずれかの５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法、
（５）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエシェリヒア・コリに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（１）〜（３）のいずれかの５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸の製造法、
（６）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をＡＴＰ再生能を有する微生物に導入した形質転換株、
（７）ＡＴＰ再生能を有する微生物がコリネバクテリウム属、エシェリヒア属、サッカロミセス属、スタフィロコッカス属及びキャンディダ属からなる群より選ばれる微生物である上記（６）の形質転換株、
（８）ＡＴＰ再生能を有する微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである上記（６）の形質転換株、
（９）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエキシグオバクテリウム・アセチリカムに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（６）〜（８）のいずれかの形質転換株、
（１０）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエシェリヒア・コリに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（６）〜（８）のいずれかの形質転換株、
（１１）コリネバクテリウム・アンモニアゲネスにおいて複製可能であり、かつイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡ、
（１２）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエキシグオバクテリウム・アセチリカムに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（１１）の組換えＤＮＡ、
（１３）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がエシェリヒア・コリに由来する遺伝子、又は該遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子である上記（１１）の組換えＤＮＡ、
（１４）エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物から得ることができ、かつ、以下の性質を有するイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質、
１．作用
リン酸供与体の存在下に、ヌクレオシドにリン酸基を転移し、ヌクレオシドの５′−モノリン酸エステルを生成する。
２．基質特異性
ヌクレオシド三リン酸のγ位のリン酸基が、他のヌクレオシドに転移する。
３．至適ｐＨ
７．７−９．９
４．ｐＨ安定性
ｐＨ６．７−１２．１
５．至適温度
３０−５０℃
６．金属要求性
マグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、又は、鉄イオン。
７．金属イオンによる影響
銅イオン、水銀イオンで強く阻害される。
亜鉛イオン、カドミウムイオンでも阻害される。
８．Ｋｍ値
Ｋｍ値は、グアノシンに対して０．０３ｍＭ、
イノシンに対して１ｍＭ、
グアノシンを基質とした場合、ＡＴＰに対しては１．６ｍＭ。
９．分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３６キロダルトン。
（１５）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有し、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、又は、該アミノ酸配列の一部においてアミノ酸が削除、置換若しくは追加されている蛋白質、
（１６）上記（１４）又は（１５）の蛋白質をコードする遺伝子、
（１７）イノシン−グアノシンキナーゼを活性を有する蛋白質をコードし、配列表配列番号１に示される塩基配列を有する、又は該塩基配列を有する遺伝子とハイブリダイズすることのできる遺伝子、
に関する。
以下、本明細書においては、イノシン及びグアノシンをＡＴＰによりリン酸化し、それぞれ、５′−イノシン酸及び５′−グアニル酸を生成させる活性のことを、「イノシン−グアノシンキナーゼ活性」ともいう。また、同活性を有する蛋白質のことを「イノシン−グアノシンキナーゼ」ともいう。反応により消費されるＡＴＰを再生するに充分な能力を有する微生物のことを、「ＡＴＰ生産菌」又は「ＡＴＰ再生菌」ともいう。
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明でいうイノシン−グアノシンキナーゼは、イノシン及びグアノシンをＡＴＰなどによりリン酸化し、それぞれ、５′−イノシン酸及び５′−グアニル酸を生成する反応を触媒する酵素であり、その由来は特に限定されないが微生物由来のものが好ましく、エキシグオバクテリウム・アセチリカム等に属する微生物から得られる新規な酵素のみならず、エシェリヒア・コリから得られる公知のイノシン−グアノシンキナーゼをも包含している。
本発明のエキシグオバクテリウム・アセチリカム等に属する微生物から得ることができ、かつ、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する新規な蛋白質は、エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物を培養し、得られた菌体を破砕して粗酵素抽出液を得、これから精製することにより得ることができる。これらの微生物の具体的な例としては、
エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ  ９５３
を挙げることができる。
なお、分類学上、エキシグオバクテリウム・アセチリカムは、従来、ブレビバクテリウム・アセチリカムと呼ばれていた（Bergey's Manual of Systcmatic Bacteriology,P.1301-1313(1986)）が、遺伝子解析の結果からエキシグオバクテリウム属にエキシグオバクテリウム・アセチリカムとして移すことが提案されている（Int.J.Syst.Bacteriol,44,74-82(1994)）。
イノシン−グアノシンキナーゼの精製法は、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を失わない方法であればいかなる方法でも用いることができるが、液体カラムクロマトグラフィーを用いる精製が一般的である。具体的には、塩化カリウムによる濃度勾配を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム濃度勾配を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、リン酸緩衝液濃度勾配を用いる吸着カラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて用いればよい。
本発明のエキシグオバクテリウム・アセチリカム等に属する微生物から得ることができ、かつ、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する酵素は、以下の性質を有している。
１．作用
リン酸供与体の存在下に、ヌクレオシドにリン酸基を転移し、ヌクレオシドの５′−モノリン酸エステルを生成する。
リン酸供与体はヌクレオシド三リン酸であり、ＡＴＰ、２′−デオキシアデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、２′−デオキシグアノシン三リン酸、チミジン三リン酸などを挙げることができる。
リン酸基が転移されるヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、２′−デオキシグアノシンなどが挙げられる。
ヌクレオシドの５′−モノリン酸エステルは、前記ヌクレオシドの５′−モノリン酸エステルであり、例えば、５′−イノシン酸、５′−グアニル酸、２′−デオキシ−５′−グアニル酸などが挙げられる。
２．基質特異性
ヌクレオシド三リン酸のγ位のリン酸基が、他のヌクレオシドに転移する。
ヌクレオシド三リン酸としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２′−デオキシアデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、２′−デオキシグアノシン三リン酸、チミジン三リン酸などが挙げられる。
リン酸基が転移される他のヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、２′−デオキシグアノシンなどが挙げられる。
３．至適ｐＨ
至適ｐＨは、ｐＨ７．７−９．９である。
４．ｐＨ安定性
ｐＨ６．７−１２．１の範囲で活性は安定である。
５．至適温度
至適温度は、３０−５０℃である。
６．温度安定性
４０℃以上では失活する。
７．金属要求性
反応の進行には金属イオンが必要であり、マグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、又は、鉄イオンによって反応の進行がみられる。
８．金属イオンによる影響
銅イオン、水銀イオンで強く阻害され、亜鉛イオン、カドミウムイオンでも阻害がみられる。
９．Ｋｍ値
Ｋｍ値は、グアノシンに対して０．０３ｍＭ、イノシンに対して１ｍＭ、グアノシンを基質とした場台、ＡＴＰに対しては１．６ｍＭである。
１０．分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３６キロダルトンである。
イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片は、精製した蛋白質を利用して公知の方法で得ることができる。例えば、当該蛋白質に対する抗体を作製し、染色体の遺伝子発現ライブラリーを探索する方法、精製された蛋白質のアミノ酸配列を解析し、これを基にプローブを作製し遺伝子ライブラリーを探索する方法がある。アミノ酸配列は、Ｎ末端配列の他、適当なプロテアーゼで切断して得た断片から決定した内部アミノ酸配列も利用することができる。プローブとしては、Ｎ末端アミノ酸配列あるいは内部アミノ酸配列から合成したオリゴヌクレオチド、Ｎ末端アミノ酸配列あるいは内部アミノ酸配列内で作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）によりその領域に相当する遺伝子を増幅したもの、Ｎ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列を基にしてそれぞれのオリゴヌクレオチドのプライマーを合成して、Ｎ末端から内部に至る遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅したもの等を用いることができる。また、染色体をカセットと呼ばれる二本鎖のオリゴヌクレオチドと連結し、Ｎ末端アミノ酸配列を基に合成したオリゴヌクレオチドのプライマーとカセットの配列を基に合成したプライマーを用いてＰＣＲ法により目的断片を取得する方法がある（Molecular and Cellular Probes,6,467(1992)）。
さらに具体的には、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、Ｎ末端アミノ酸配列からその領域に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、これを基にプライマーを合成し、カセットを用いたＰＣＲ法により増幅して取得できる。
エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３から得られる蛋白質のＮ末端の２８個のアミノ酸の配列を解析した結果は、配列表配列番号３に示す通りである（１８番目のアミノ酸は未同定）。
このＮ末端のアミノ酸配列においても、エキシグオバクテリウム・アセチリカムの蛋白質は、エシェリヒア・コリから得られたＷＯ９１／０８２８６号に記載の公知のイノシン−グアノシンキナーゼのものとは全く異なる蛋白質である。
目的遺伝子の取得には、まず、エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物の染色体を鋳型とし、上記のＮ末端アミノ酸配列を基に合成したプライマーを用いてＰＣＲ法によりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質のＮ末端アミノ酸配列部分をコードする遺伝子を特異的に増幅しクローニングする。プライマーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％付近であり、特殊な２次構造を形成せず、互いに相補的でない、との条件を満たすものであり、長さは通常１６ないし３０塩基のものがよく用いられる。プライマーの構造はＮ末端アミノ酸配列の両端に位置するものであり具体的に例示すると、配列表配列番号４及び５に示すようなものが挙げられる。
但し、配列番号４において、６番目のヌクレオチドはＴ及びＣの、９番目のヌクレオチドは、Ａ及びＧの、１２番目のヌクレオチドはＴ、Ｃ及びＡの、１５番目のヌクレオチドはＴ、Ｃ、Ａ及びＧの混合物である。また、配列番号５において、３番目及び１２番目のヌクレオチドはＴ及びＣの、６番目のヌクレオチドはＴ、Ｃ、Ａ及びＧの、９番目及び１５番目のヌクレオチドはＡ及びＧの混合物である。
ついで、エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物の染色体を適当な制限酵素により切断し、その切断物とカセットを連結したものを鋳型とし、Ｎ末端アミノ酸配列部分をコードする遺伝子の配列を基に合成したプライマーとカセットを基にしたプライマーを用いてＰＣＲ法によりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質の構造遺伝子部分あるいはその上流領域を含むＤＮＡ断片を特異的に増幅しクローニングする。プライマーとしては上記の条件を満たすものであれば用いることができるが、具体的に例示すると配列表配列番号６及び７に示すようなものが使用できる。
遺伝子のクローニングに使用するベクターとしては宿主として使用するエシェリヒア・コリで自律複製できるベクターであればいかなるものでも構わない。例えば、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９８、ｐＢＲ３２２等が用いられる。作製した組換えＤＮＡの受容菌としてはベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株ででもよく、例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等のエシェリヒア・コリ菌株が用いられる。
ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定することにより、該ＤＮＡ断片上に存在する、イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の塩基配列及びそれがコードしている蛋白質のアミノ酸配列を決定することができる。かくして明らかとなったエキシグオバクテリウム・アセチリカムＡＴＣＣ９５３のイノシングアノシンキナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１及び２に示す。
本蛋白質は３０３個のアミノ酸からなり、その分子量は約３２．５キロダルトンである。
本発明の蛋白質は配列表の配列番号２で示されるもののみならず、エキシグオバクテリウム・アセチリカムに属する微生物から得ることができ、かつ、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有するものであれば、他の天然の変異体をも包含する。
また、イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有するものであれば、このアミノ酸配列の一部が置換されたものでってもよいし、一部が削除しているものであってもよいし、それらにさらにアミノ酸が付加されたものであってもよいし、また、蛋白質が一部修飾されたものであってもよいことは当業者には明らかである。
また、イノシン−グアノシンキナーゼをコードしている限り、上記のエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来の遺伝子に代えて、該遺伝子とハイブリダイズすることができる遺伝子も使用することができる。
エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来の遺伝子とハイブリダイズすることができる遺伝子は、以下のような菌株から取得することができる。
エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２
クルチア・ギブソニ  ＡＴＣＣ４３１９５
クルチア・ゾプフィ  ＪＣＭ６１０１
このような遺伝子は、相同性を利用した公知の方法で取得することができるが、具体的には以下に述べる方法を用いることができる。
まず、上記微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行う。切断断片を適当な転写フィルターにブロッティングし、エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション法により相同性を持つ断片を検出し、大きさを決定する。
ついで、制限酵素で切断した断片のうち目的とする大きさのものを精製する。精製法は、ショ糖密度勾配遠心法、グラスパウダーによるアガロースゲルからの回収等が一般的である。精製した断片は、適当なベクターに連結し、エシェリヒア・コリ菌株に形質転換する。これら形質転換体の中からコロニーハイブリダイゼーション法により目的とするイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を含む断片を持つ菌株を選択できる。
本発明では、前記した新規なイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子に代えて、公知のイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子も使用することができる。
公知のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子としては、エシェリヒア・コリに由来するものがあり（J.Gen.Microbiol.,135,1263-1237(1989)）、例えば、以下のような菌株から取得することができる。
エシェリヒア・コリ  ＡＴＣＣ２７３２５
公知のイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子は、公知の方法により取得することができるが、以下に述べる方法により、エシェリヒア・コリ  ＡＴＣＣ２７３２５の染色体ＤＮＡから本発明で使用することができるイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を取得することもできる。
まず、配列表配列番号１０に示すエシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の配列（ＷＯ９１／０８２８６号）をもとにプライマーを合成する。プライマーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％付近であり、特殊な２次構造を形成せず、互いに相補的でない、との条件を満たすものであり、長さは通常１６ないし３０塩基のものがよく用いられる。プライマーの配列はイノシン−グアノシンキナーゼ構造遺伝子の両端に位置するものであり、具体的に例示すると、配列表配列番号１１及び１２に示すようなものが挙げられる。
ついで、本プライマーとエシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡからポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）によりイノシン−グアノシンキナーゼ構造遺伝子を増幅しクローニングすることができる。ベクターとしてはエシェリヒア・コリ由来のベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が用いられる。作成した組換えＤＮＡの受容菌としては、ベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等のエシェリヒア・コリ菌株が用いられる。
かくして、エシェリヒア・コリのイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドが得られる。
なお、エキシグオバクテリウム・アセチリカムの場合と同様に、イノシン−グアノシンキナーゼをコードする限り、エシェリヒア・コリ由来の該遺伝子と相同性を有し、ハイブリダイズすることができる遺伝子を取得し、使用することもできる。
上記のようにして得られるイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、他の適当なベクターに再度組換えるか複製起点を挿入した後、ＡＴＰ生産能を有する宿主細胞に導入させる。
すなわち、宿主細胞としては、反応により消費されるＡＴＰをＡＴＰ前駆体から再生するに充分な能力（ＡＴＰ生産能又はＡＴＰ再生能という。）を有する微生物（ＡＴＰ生産菌又はＡＴＰ再生菌という。）が用いられる。
本発明でいうＡＴＰ再生能を有する微生物としては、イノシン及び／又はグアノシンを５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸に変換する反応により消費されるＡＴＰを当該反応系においてＡＴＰ前駆体から再生し、当該反応を進行することができる能力を有する微生物であれば特に制限はないが、例えば、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、スタフィロコッカス属、サッカロミセス属、又はキャンディダ属に属する微生物を挙げることができる。特に、ＡＴＰ再生能が高いコリネバクテリウム・アンモニアゲネスに属する微生物が好適に用いられる。なお、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスは、従来ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスとして分類されていたものである。
本発明で使用されるＡＴＰ再生能を有する微生物の具体的な例としては、以下のような菌株及びこれから誘導される変異株が挙げられる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（旧名称：ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ６８７２
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（旧名称：ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ２１２９５
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（旧名称：ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ２１４７７
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０
コリネバクテリウム・グルタミカム（旧名称：ブレビバクテリウム・フラバム）  ＡＴＣＣ１４０６７
コリネバクテリウム・グルタミカム（旧名称：ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム）  ＡＴＣＣ１３８６９
エシェリヒア・コリ  Ｂ（ＡＴＣＣ１１３０３）、
サッカロミセス・セレビシェ  ＡＴＣＣ２００１８、
スタフィロコッカス・オーレウス  ＡＴＣＣ４０１２、
キャンディダ・ゼイラノイデス  ＡＴＣＣ２０３５６、
キャンディダ・サイクロフィラ（旧名称：トルロプシス・サイクロフィラ）  ＡＴＣＣ２２１６３
さらに、ＡＴＰ再生能を有する微生物としては、イノシン及び／又はグアノシンの分解活性が弱いあるいは欠失したものが望ましい。このような微生物の例として、上記の微生物の中からは、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１２９５
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７７
が挙げられる。
本発明のＡＴＰ再生能を有する微生物として、ＡＴＰ再生能と共にイノシン又はグアノシンの前駆体からイノシン又はグアノシンの生産能を有するＡＴＰ再生菌を使用することもできる。この場合には、イノシン又はグアノシンに代えてこれらの前駆体から５′−イノシン酸又は５′−グアニル酸を製造することができる。そのような前駆体としては、グルコース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、酢酸などの有機酸類、グリセロール、エタノールなどのアルコール類が挙げられる。
イノシン又はグアノシンの生産能を有するＡＴＰ再生菌としては、例えば、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７８
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７９
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４８０
などが挙げられる。
前記したイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を組み込むベクターとしては、受容菌であるＡＴＰ再生菌において複製可能なものであれば特に制限はないが、例えば、ＡＴＰ再生菌としてコリネバクテリウム属細菌を用いる場合には、当該細菌で自立複製できるプラスミドを挙げることができる。具体的に例示すれば、pAM330（特開昭５８−６７６９９号）、pHM1519（特開昭５８−７７８９５号）pAJ655、pAJ611、pAJ1844（以上、特開昭５８−１９２９００号）、pCG1（特開昭５７−１３４５００号）、pCG2（特開昭５８−３５１９７号）pCG4、pCG11（特開昭５７−１８３７９９号）、pGA1（Gene,107,69(1991)）、pHK4、pHC4（特開平５−７４９１号）等が挙げられる。また、ＡＴＰ再生菌としてエシェリヒア・コリを用いる場合には、例えば、ColE1系プラスミド、P15A系プラスミド、Ｒ因子系プラスミド、Ｆ因子系プラスミド、ファージ糸プラスミド等を用いることができる。具体的に例示すれば、pBR322（Gene,2,95(1977)）、pUC19（Gene,33,103(1985)）、pACYC184（J.Bacteriol,134,1141(1978)）、pSC101（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,70,3240(1973)）等が挙げられる。ＡＴＰ再生菌としてサッカロミセス・セレビシエを用いる場合には、YEp系プラスミド、YCp系プラスミド、YRp系プラスミド、YLp系プラスミド等を用いることができる。具体的には、YEp24、YRp7、YCp50等が挙げられる。ＡＴＰ再生菌としてスタフィロコッカス・オーレウスを用いる場合には、pRIT5（EMBO J.,4,1075(1985)）等を用いることができる。
イノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を高頻度に発現させるためにプロモーター配列およびＳＤ配列をイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子の上流に配置させることが好ましい。これらの配列を導入する方法としては特に制限はないが、プロモーター配列およびＳＤ配列をもつベクターを用い、それら配列の下流に前記遺伝子を挿入する方法、あるいはプロモーターおよびＳＤ配列を合成し、前記遺伝子の上流に挿入する方法を用いることができる。プロモーター配列およびＳＤ配列としては特に制限はないが、ＡＴＰ再生菌としてコリネバクテリウム属細菌を用いる場合には、エシェリヒア・コリ由来のtac、lac、trpプロモーター、あるいはコリネバクテリウム属細菌由来のtrpプロモーター（Gene,53,191(1987)）、fdaプロモーター（Mol.Microbiol.,3,1625(1989)）、ppcプロモーター（Gene,77,237(1989)）、lysCプロモーター（Mol.Microbiol.,5,1197(1991)）、gdhプロモーター（Mol.Microbiol.,6,317(1992)）、csp1、csp2プロモーター（特表平６−５０２５４８号）を例示することができる。ＡＴＰ再生菌としてエシェリヒア・コリを用いる場合には、エシェリヒア・コリ由来のtac、lac、trpプロモーター、λファージのＰLプロモーターを例示することができる。ＡＴＰ再生菌としてサッカロミセス・セレビシエを用いる場合には、ADH1、ENO1、PGK1、GAP-DH、GAL1、GAL10、GAL7、PHO5、MFα1プロモーターを例示することができる。ＡＴＰ再生菌としてスタフィロコッカス・オーレウスを用いる場合には、spaプロモーター（J.Bacteriol.,159,713(1984)）を例示することができる。
本発明のイノシン及び／又はグアノシンを５′−イノシン酸及び／又は５′−グアニル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡをＡＴＰ再生能を有する微生物に導入する方法としては特に制限はなく、通常の方法により行うことが出来る。例えば、ＡＴＰ再生菌として、コリネバクテリウム属細菌を用いる場合には、プロトプラスト法（特開昭５７−１８３７９９号）、電気穿孔法（特開平２−２０７７９１号）が特に有効である。ＡＴＰ再生菌としてエシェリヒア・コリを用いる場合には、塩化カルシウム法（J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、Hanahan法（J.Mol.Biol.,166,557(1983)）、SEM法（Gene,96,23(1990)）、Chungらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,2172(1989)）、電気穿孔法（Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)）などを用いることができる。枯草菌について報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（C.H.Gene,1,153(1977)）がある。あるいは、枯草菌、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Molec.Gen.Genet.,168,111(1979)、Nature,274,398(1978)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)）も応用できる。ＡＴＰ再生菌としてサッカロミセス・セレビシエを用いる場合には、スフェロブラスト法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,1929(1978)）、酢酸リチウム法（J.Bacteriol.,153,163(1983)）、電気穿孔法（"Methods in Enzymology"194,182(1991)）などによって、組換え遺伝子の導入を行うことができる。ＡＴＰ再生菌としてスタフィロコッカス・オーレウスを用いる場合には、プロトプラスト法によって組換え遺伝子の導入を行うことができる（Plasmid,5,292(1981)）。
プロトプラスト法では上記の枯草菌において使用されている方法でも充分高い頻度を得ることができるが、特開昭５７−１８３７９９号公報に開示されるように、コリネバクテリウム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態でＤＮＡを取り込ませる方法も利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、プルロニックＦ６８（セルバ社製）などの添加によってもＤＮＡのとり込みを促進させることができる。
また、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によっても組換えＤＮＡを受容菌へ導入することもできる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は電気パルス法である。
さらに、イノシン−グアノシンキナーゼの遺伝子をＡＴＰ再生能を有する微生物の染色体ＤＮＡに組み込むこともできる。染色体遺伝子に組み込む方法としては特に制限はないが、例えば、プラスミドベクターにコリネバクテリウム属細菌由来の温度感受性複製起点とイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカーとを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネバクテリウム属細菌を形質転換する。続いて、形質転換体を薬剤を含む培地でかつ温度感受性複製起点が機能しない温度で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる（J.Bacteriol.,162,1196(1985)、特開平５−７４９１号公報）。あるいは、コリネバクテリウム属細菌由来の転移因子を利用する方法も適用可能である（"Mobile Genetic Elements",Academic Press,New York(1983)、ＷＯ９３／１８１５１号）。
このようにして得られたイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入した本発明の形質転換体を、炭素源、窒素源、無機塩類、さらに必要に応じて有機微量栄養素を含有する通常の培地で培養することによりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を高レベルで発現させることができる。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類の他、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類が使用され、窒素源としては、尿素、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガスなどが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩などが使用される。有機微量栄養素としては、アミノ酸類、ビタミン類、脂肪酸類、核酸類、その他これらのものを含有するペプトン、酵母エキス、大豆蛋白加水分解物などが使用される。
培養は、温度２５ないし３７℃にて、ｐＨを５ないし９に制御しつつ、１０ないし４０時間好気的条件下にて行う。
培養終了後、培養液中に生成蓄積したイノシン−グアノシンキナーゼ活性を測定することにより力価を確認する。活性測定は、遠心分離などの操作により培養物から回収した菌体を、超音波処理、フレンチプレス処理などにより破砕した後遠心分離して菌体残渣を除去し、ゲル濾過にて低分子物質を除いたものを用いて、Molec.Gen.Genet.143,85-91(1975)記載の方法等により行うことができる。
かくして得られたＡＴＰ前駆体からＡＴＰを生合成する能力を有し、イノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子を保持する微生物の培養物、該培養物より分離した菌体もしくは該菌体の処理物をイノシン若しくはグアノシン又はこれらの前駆体、エネルギー供与体及びリン酸基供与体に接触反応させることにより、反応液中に５’−イノシン酸もしくは５’−グアニル酸を生成することができる。培養物からの菌体の分離は遠心分離機等により行うことができ、また、菌体の処理物としては、アセトン処理菌体、固定化菌体、破砕した菌体などが挙げられる。
本発明において好適に用いられる材料物質としては以下のものを挙げることができる。
イノシン又はグアノシンの前駆体としては、グルコース、シュクロース、廃糖密、澱粉加水分解物などの糖類、酢酸などの有機酸類、グリセロール、エタノールなどのアルコール類などが使用される。
エネルギー供与体としては、グルコース、シュクロース、澱粉加水分解物、廃糖蜜などの糖類の他、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類が使用される。
リン酸供与体としては、オルトリン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、トリポリリン酸、ポリメタリン酸、ヘキサメタリン酸等の無機リン酸およびその塩類のほか、フェニルリン酸、アセチルリン酸、カルバミルリン酸等の有機リン酸を用いることができる。
また、反応液中に、ＡＴＰ前駆体、界面活性剤、金属イオン等を添加することにより、反応の効率が改善される場合がある。
ＡＴＰ前駆体としては、アデノシン二リン酸、アデニル酸、アデノシン、アデニン、アデニン鉱酸塩、及びリボ核酸の加水分解液などが使用できる。
界面活性剤は、カチオン系、アニオン系もしくは両性のいずれでも、イノシンもしくはグアノシンのリン酸化を促進するものであればよい。また、金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン等が適宜使用される。
なお、イノシン−グアノシンキナーゼをＡＴＰ再生菌と組合せて使用する従来のリン酸化反応においては、反応系に有機溶剤を添加するのが一般的であったが（特開昭６３−２３００９４号、ＷＯ９１／０８２８６号）、本反応系では有機溶媒を添加しない場合でも効率的に反応が進行する。
反応は温度２５ないし３７℃にてｐＨを６ないし８に制御しつつ、１０ないし３０時間好気条件下にて行う。
反応終了後、反応液中に生成蓄積した５′−イノシン酸もしくは５′−グアニル酸は、イオン交換樹脂処理、晶析等の方法により採取することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
（エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子発現プラスミドの構築とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスへの導入）
（１）ＰＣＲ法によるイノシングアノシンキナーゼ遺伝子の増幅とクローニング
エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の両端に位置し、それぞれ制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII切断部位を有する配列表配列番号１１及び１２に示すオリゴヌクレオチドをホスホロアミダイド法によりＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル３９４）を用いて合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド０．２５μｍｏｌｅ、鋳型として斉藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）により調製したエシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）の染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットを、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、塩化カリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム１．５ｍＭ及びゼラチン０．０００１％を含有する１０ｍＭＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン（以下、トリス）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲ法を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。該ＤＮＡ断片約２μｇ及び制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIそれぞれ２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）ＤＮＡ１μｇ及び制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIII２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）におのおの混合し、温度３７℃で２時間反応させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化されたプラスミドｐＨＳＧ２９８を得た。このＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化されたｐＨＳＧ２９８を０．１μｇ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化されたＰＣＲによる増幅断片０．５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からMolecular Cloning 2nd edition(J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laboratory Press,p.1.25(1989)）記載のアルカリ溶菌法によりベクターＤＮＡを調製し常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＨＳＧ２９８にイノシングアノシンキナーゼ遺伝子が挿入された組換えプラスミドを選択した。このプラスミドをｐＩＧＫ−１と命名した。
（２）エシェリヒア・コリｔｒｐプロモーターの挿入
５′−端、３’−端にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断部位を有する配列表配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドおよび相補配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。得られたオリゴヌクレオチド各々１μｇを混合し、１００℃、５分処理の後、徐冷してアニールさせた。このオリゴヌクレオチド溶液とＢａｍＨＩ２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化カリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）におのおの混合し、温度３０℃で２時間反応させ消化液を得、該液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。得られた沈澱物を前項（１）と同様にＰｓｔＩで消化し、消化液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。かくしてＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたエシェリヒア・コリｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。
前項（１）で得られたイノシングアノシンキナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＩＧＫ−１  １μｇを同様にＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化されたプラスミドを得た。このＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化されたｐＩＧＫ−１を０．１μｇ、上記で得たＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化された断片０．５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＩＧＫ−１にエシェリヒア・コリのｔｒｐプロモーターＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを選択し、これをｐＩＧＫ−２と命名した。
（３）コリネバクテリウム由来複製起点の挿入
前項（２）で得られたイノシングアノシンキナーゼ遺伝子およびｔｒｐプロモーターを含む組換えプラスミドｐＩＧＫ−２  １μｇを前項（２）の反応組成でＢａｍＨＩ消化し、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。ＢａｍＨＩ消化で消化されたプラスミドｐＩＧＫ−２は、再結合するのを防止するため、Molecular Cloning 2nd edition(J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laboratory Press,p1.60(1989)）の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、フェノール抽出処理、エタノール沈澱を行なった。
一方、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の複製起点を含む領域をｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）に挿入して得たプラスミドｐＨＣ４（特開平５−７４９１号）１μｇ及び制限酵素ＫｐｎＩ１０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に加え、３７℃で２時間反応し、該液をフェノール抽出及びエタノール沈殿した。このＫｐｎＩで切断されたｐＨＣ４の平滑末端化をDNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用いて指定された方法にて行い、ついでリン酸化済ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造社製）をＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを用いて連結した。これによりコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドの複製起点を含む領域の両側にＢａｍＨＩ切断部位を持つＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と２０ユニットのＢａｍＨＩを前項（２）に記載した緩衝液中で混合し、温度３０℃で２時間反応した。反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。
上記で得られたＢａｍＨＩ消化で消化されたプラスミドｐＩＧＫ−２  ０．１μｇおよびＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＨＣ４由来のＤＮＡ断片０．２μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１ユニットを前項（１）記載の緩衝液中で混合し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＩＧＫ−２にコリネバクテリウム属細菌内で自律複製可能なＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを選択し、これをｐＩＧＫ−３と命名した。
なお、プラスミドｐＨＣ４を保持するエシェリヒア・コリ  ＡＪ１２６１７は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号（郵便番号３０５）工業技術院生命工学工業技術研究所において平成３年４月２４日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１２２１５のもとに寄託され、平成３年８月２６日付でブタペスト条約に基づく寄託に移管され受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５３２が付与されている。
（４）ｐＩＧＫ−３のＡＴＣＣ２１４７７株への遺伝子導入
（３）で得られたｐＩＧＫ−３  ０．１μｇを電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７７に導入した。これをポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌから成る寒天培地上にまき、形質転換体ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＩＧＫ−３を得た。
（５）組換え体のイノシン−グアノシンキナーゼ活性の測定
（４）で得られたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＩＧＫ−３をポリペプトン１％、酵母エキス１％、グルコース５％、リン酸二水素カリウム０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸アンモニウム０．５％、尿素０．５％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、チアミン塩酸塩０．００５ｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．０１ｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、アデニン０．０５％、及びカナマイシン５０ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ７．２）５０ｍｌに接種し、３２℃で２４時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
この菌体を０．９％塩化ナトリウム水溶液で懸濁し、遠心分離する操作を２回繰り返し菌体を洗浄した。該菌体を２０％グリセロール、１００ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）に懸濁し、１５０Ｗ、２０分超音波処理（Ｋｕｂｏｔａ社製）した後、１５，０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して上清を得た。この上清をセファデクスＧ−２５（Pharmacia社製）カラムクロマトグラフィーに供し、低分子量物質を除いたものを粗酵素液とした。
得られた粗酵素液のイノシン−グアノシンキナーゼ活性を１００ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＡＴＰ、２５０ｍＭ塩化カリウム、０．２ｍＭ［８−14Ｃ］−イノシンからなる反応組成液をもちいて測定した。粗酵素液と混合し、３０℃、３０分反応の後、１部をシリカゲルプレート（メルク社製）にスポットし、ｎ−ブタノール、エタノール、水それぞれ２：１：１の体積比からなる展開液で展開した。バイオイメージアナライザー（富士写真フィルム社製）で５′−イノシン酸のスポットを検出し定量した。また、粗酵素液の蛋白質濃度はウシ血清アルブミンを標準としてバイオ・ラッド社製プロテインアッセイキットを用いて測定し、酵素の比活性を算出した。対照として、プラスミドｐＨＫ４による形質転換体ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４の比活性を求めた。その結果を表１に示した。ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４では活性が検出されなかったのに対し、ＡＴＣＣ  ２１４７７／ｐＩＧＫ−３は高い活性を有していた。この結果から、導入したエシェリヒ・コリ由来の断片がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスにおいてイノシン−グアノシンキナーゼ活性を発現していることが示された。
なお、プラスミドｐＨＫ４は、ｐＩＧＫ−３からｔｒｐプロモーター及びイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を除去した構造を有しており、対照として使用した。
エシェリヒア・コリＨＢ１０１にｐＨＫ４を保持させた株は、ＡＪ１３１３６と命名され、１９９５年８月１日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号（郵便番号３０５）工業技術院生命工学工業技術研究所にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８６が付与されている。
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実施例２（エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたイノシンからの５′−イノシン酸の生産）
ポリペプトン１％、酵母エキス１％、グルコース５％、リン酸二水素カリウム０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸アンモニウム０．５％、尿素０．５％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、チアミン塩酸塩０．００５ｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．０１ｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、アデニン０．０５％、及びカナマイシン５０ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ７．２）４５０ｍｌにコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４７７／ｐＩＧＫ−３を接種し、３２℃で２４時間培養し培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し沈澱物として湿菌体２０ｇを得た。
得られた菌体をイノシン５０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／ｌ、グルコース３０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム５ｇ／ｌ、フィチン酸（重量比５０％）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５  ４ｇ／ｌ、アデニン１ｇ／ｌからなる反応液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに２００ｇ／ｌとなるように懸濁し、撹拌しつつ３２℃に保ち反応を行った。ｐＨは４Ｎ水酸化ナトリウムを用いて適宜７．２となるように調整し、リン酸二水素カリウムの減少分を適宜添加した。対照としてＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４について反応を行い３０時間反応後の反応液中の５′−イノシン酸を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。結果を表２に示す。５′−イノシン酸蓄積値は５′−イノシン酸二ナトリウム７．５水和物換算値にて示した。この結果からエシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を保持しているＡＴＣＣ２１４７７／ｐＩＧＫ−３でイノシンから５′−イノシン酸への変換がみられた。
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実施例３（エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたイノシンからの５′−イノシン酸の生産）
実施例２で得た菌体をイノシン６０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／ｌ、グルコース３０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム５ｇ／ｌ、フィチン酸（重量比５０％）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５  ４ｇ／ｌ、アデニン１ｇ／ｌからなる反応液（ｐＨ７．２）５０ｍｌに２００ｇ／ｌとなるように懸濁し、通気撹拌しつつ３２℃に保ち反応を行った。ｐＨはｐＨ計で測定しつつ常に７．２となるように４Ｎ水酸化ナトリウムを添加して調整し、リン酸二水素カリウムの減少分を適宜添加した。２２時間反応後の蓄積値は１１３．８ｇ／ｌであり添加したイノシンに対するモル収率は約１００％であった。
実施例４（エシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたグアノシンからの５′−グアニル酸の生産）
反応液中のイノシンの代わりにグアノシン１ｇ／ｌを用いて、実施例２と同様にして反応を行った。３０時間反応後、反応液中の５′−グアニル酸を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した結果、ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＩＧＫ−３を用いた反応液中には、５′−グアニル酸二ナトリウム塩・６．５水和物換算で０．０５ｇ／ｌの５′グアニル酸が蓄積していた。
実施例５（エキシグオバクテリウム・アセチリカムからのイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質の単離精製およびその諸性質）
（１）菌体および粗酵素抽出液の調製
ポリペプトン１％、バクト・イーストエキストラクト１％、グルコース０．５％及び塩化ナトリウム０．５％から成る培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌに、エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３を接種し、３０℃で２４時間培養し培養物を得た。これを２ｌの同培地に接種し、３０℃で８時間培養し、得られた培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し、沈澱物を２度０．９％塩化ナトリウムで洗浄し湿菌体１０ｇを得た。この菌体を１００ｍＭ  塩化カルシウム、及び、１ｍＭ  ジチオスレイトールを含む１００ｍＭ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）１０ｍｌに懸濁し、径０．１ｍｍのガラスビーズを加えビーズビーター（バイオスペック社製）にて破砕した。該破砕液を１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離処理し上清を同緩衝液にて透析し粗酵素抽出液約２０ｍｌを得た。
粗酵素抽出液のイノシン−グアノシンキナーゼ活性を以下の方法により測定した。粗酵素抽出液５μｌを５ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＡＴＰ、１００ｍＭ塩化カリウム及び０．２ｍＭ［８−14Ｃ］−イノシンを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液に加え５０μｌとし、３０℃、３０分反応した。反応液のうち２μｌをシリカゲルプレート（メルク社製）にスポットすることにより反応を停止し、ｎ−ブタノール、エタノール、水それぞれ２：１：１の体積比からなる展開液で展開し、バイオイメージアナライザー（ＦＵＪＩＸ社製）で５’−イノシン酸のスポットを検出し定量した。また、粗酵素液の蛋白質濃度はウシ血清アルブミンを標準としてプロテインアッセイ（バイオ・ラッド社製）を用いて測定し、酵素の比活性を算出した。粗酵素抽出液には０．４５nmol／min／mg蛋白質のイノシン・グアノシンキナーゼ活性が認められた。
（２）イノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質の精製
前項で得られた粗酵素抽出液を緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（東洋曹達社製）カラムに供し、緩衝液Ａで洗浄した後、塩化カリウムを２００ｍＭを含む同緩衝液でイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。得られた活性画分２５ｍｌに硫安を３０％飽和となるように加え４℃で３０分攪はんの後、遠心分離により沈澱物を除去した。得られた上清を３０％硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したブチルトヨパール（東洋曹達社製）カラムに供した。同緩衝液で洗浄した後、２００ｍｌの３０％から１５％硫安を含む緩衝液Ａの直線的濃度勾配によりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。得られた活性画分約１５ｍｌを２ｌの５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び２０％グリセロールを含む２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｂ）に対して透析した。
該液を１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を塩化カリウムを１００ｍＭとした緩衝液Ｂで平衡化したMonoQ FPLC HR5/5（ファルマシア社製）カラムに供した。同緩衝液で洗浄した後、１００ｍＭから５００ｍＭ硫安の直線的濃度勾配によりイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。得られた活性画分約５ｍｌを２ｌの１ｍＭジチオスレイトール及び２０％グリセロールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｃ）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したヒドロキシルアパタイトTSK-GEL HA-1000（東洋曹達社製）カラムに供した。同緩衝液で洗浄した後、３０ｍｌの１０ｍＭから５００ｍＭのリン酸カリウムを含む緩衝液Ｃの直線的濃度勾配にてイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。
得られた活性画分約６ｍｌを再度同様の操作を繰り返しヒドロキシルアパタイトカラムに供し、３０ｍｌの１０ｍＭから２００ｍＭのリン酸カリウムを含む緩衝液Ｃの直線的濃度勾配にてイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。得られた活性画分のうち高活性画分２ｍｌを１ｍＭ  ジチオスレイトール、２０％グリセロール及び１００ｍＭ  塩化カリウムを含む２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したゲル濾過Hiload Superdex 200pg 16/60（ファルマシア社製）カラムに供し、同緩衝液にて溶出した。高活性画分２ｍｌのうち５μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、銀染色（ナカライテスク社製）にて分子量約３６キロダルトンの蛋白が検出された。これによりエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質が単離されその分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上３６キロダルトンであることが明かとなった。
（３）エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼの諸性質
精製されたイノシン−グアノシンキナーゼを５ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＡＴＰ、１００ｍＭ  塩化カリウム、０．１６ｍＭ  グアノシン及び０．０４ｍＭ［８−14Ｃ］−グアノシンを含む１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に加えた反応液５０μｌを基本組成として３０℃、１０分反応した。該酵素は次の諸性質を有していた。
１．作用
ＡＴＰ、２′−デオキシアデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、２′−デオキシグアノシン三リン酸及びチミジン三リン酸からなる群より選ばれるヌクレオシド三リン酸をリン酸供与体として、グアノシン、イノシン及び２′−デオキシグアノシンからなる群より選ばれるヌクレオシドにリン酸基を転移し、それぞれ５′−グアニル酸、５′−イノシン酸及び２′−デオキシ−５′−グアニル酸からなる群より選ばれるヌクレオシドの５’−モノリン酸エステルを生成する。
２．基質特異性
グアノシンに変えて各種ヌクレオシドを０．５ｍＭ加え、ＡＴＰに［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを添加することにより反応を行った。生成したヌクレオシド５’−リン酸エステルを測定した結果を表３に示した。グアノシン、イノシン及び２’−デオキシグアノシンがリン酸受容体となった。
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ＡＴＰに代えて各種ヌクレオシド三リン酸を５ｍＭ用いて反応を行い、リン酸供与体を検討した結果を表４に示した。
ＡＴＰの他に、２′−デオキシアデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、２′−デオキシグアノシン三リン酸及びチミジン三リン酸がリン酸供与体となった。
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３．至適ｐＨ
緩衝液成分を１００ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．２−５．６）、２−モルホリノエタンスルホン酸（以下ＭＥＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４−６．３）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３−７．２）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２−８．８）、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（以下ＣＡＰＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８−１０．４）あるいはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３−１１．０）に変更し、反応を行った。至適ｐＨは７．７−９．９であった。
４．ｐＨ安定性
酵素を２．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５ｍＭ塩化カリウム、０．２５ｍＭジチオスレイトール及び５％グリセロールを含む２５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ１．５−５．６）、ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４−６．４）、ＭＯＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３−７．３）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２−８．８）、ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９−１０．４）あるいはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５−１３．３）にて室温で３０分処理を行った後活性を測定した。ｐＨ６．７−１２．１の範囲で活性は安定であった。
５．至適温度
温度を１６℃−６０℃の範囲で反応を行ったところ、至適温度は３０℃−５０℃であった。
６．温度安定性
酵素を５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭジチオスレイトール及び１０％グリセロールを含む１２．５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４−６０℃、３０分処理し、残存活性を測定した。２５℃以下の処理で５０％以上の活性が残存し、４０℃以上では失活した。
７．金属要求性
反応液中の塩化マグネシウムを各種金属イオンに変更し反応を行った。結果を表５に示した。本活性には金属イオンが必要であり、マグネシウムイオン以外にマンガンイオン、コバルトイオン及び、鉄イオンによって反応が進行した。
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８．金属イオンによる影響
反応組成に各種金属イオンを１ｍＭ加えたときの相対活性を表６に示した。本酵素は、銅イオン及び、水銀イオンで強く阻害を受け、亜鉛イオン及び、カドミウムイオンでも阻害を受けた。
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９．Ｋｍ値
反応組成の基質濃度を変化させ測定した本酵素のＫｍ値はグアノシンに対して０．０３ｍＭ、イノシンに対して１ｍＭ、グアノシンを基質とした場合、ＡＴＰに対しては１．６ｍＭであった。
１０．分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３６キロダルトンである。
実施例６（エキシグオバクテリウム・アセチリカム染色体からの遺伝子の単離）
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
実施例５（２）で得られた活性画分約２ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いて６，０００ｒｐｍで３時間の遠心操作により約０．２ｍｌに濃縮した。これをプロスピン（アプライドバイオシステム社製）を用いて遠心操作により蛋白をフィルター上にブロットした。このフィルターを２０％メタノールで３回洗浄の後、乾燥しプロテインシークエンサー４７６Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を配列表配列番号３に示す。Ｘａａは同定できなかったものを示す。未同定アミノ酸１個を含むＮ末端の２８アミノ酸が決定された。
（２）エキシグオバクテリウム・アセチリカムの染色体ＤＮＡの調製とＮ末端領域の増幅
実施例５（１）と同様に５００ｍｌの培養液からエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の湿菌体３ｇを得た。該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）により染色体ＤＮＡを抽出した。
前項（１）で得られたＮ末端アミノ酸配列を基にオリゴヌクレオチドを合成した。塩基配列は、コドンの縮退を考慮し、配列表配列番号４及び５に示すオリゴムクレオチドの混合物とした。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド０．２５μｍｏｌｅ、鋳型としてエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びタック遺伝子ポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム及び０．０００１％ゼラチンを含有する１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を１分のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ法を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、増幅された約８０ベースのＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片約０．２μｇをクレノウフラグメント２ユニット、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び７ｍＭ  塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌに添加し、３７℃で３０分平滑末端化反応した。該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。沈澱物として得られた平滑末端化されたＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０ユニット、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１ｍＭ  スペルミジン、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解し、末端リン酸化反応を３７℃で１時間行った。該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱し、沈澱物としてＰＣＲ産物の末端平滑化及びリン酸化物を回収した。
プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）１μｇ及び制限酵素ＳｍａＩ  ２０ユニットを、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、６６ｍＭ  酢酸カリウム、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール及び０．０１％牛血清アルブミンを含有する３３ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）５０μｌに混合し、温度３０℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ断片が再結合するのを防止するため、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＳｍａＩで消化されたｐＵＣ１８を０．１μｇ、ＰＣＲ産物の末端平滑化及びリン酸化物約０．１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０ｍＭ  ＡＴＰを含有する６６ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２０μｌに添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。
該プラスミドＤＮＡはエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ由来の約８０ベースのＤＮＡ断片を含んでいた。得られたプラスミドＤＮＡを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（パーキンエルマー社製）を用いSangerの方法（J.Mol.Biol,,143,161(1980)）に従って行った。これによりエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３のイノシン−グアノシンキナーゼ蛋白のＮ末端領域に相当するＤＮＡ８３ベースの塩基配列が決定された。
（３）エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子断片の単離
前項（２）で調製したエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲＩ  ４０ユニット、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に混合し、温度３７℃で２時間反応させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＥｃｏＲＩで消化されたエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡを得た。このＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡを１μｇ、ＥｃｏＲＩカセット（宝酒造社製）０．０５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ  １０ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０ｍＭ  ＡＴＰを含有する６６ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。該反応液をフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＥｃｏＲＩカセットを連結したエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ消化物を得た。
前項（２）で決定された配列を基にそれぞれ配列表配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＳ１及びＳ２を合成した。
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＳ１及びカセットプライマーＣ１（宝酒造社製）をそれぞれ０．２μｍｏｌｅ、鋳型としてＥｃｏＲＩカセットを連結したエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ消化物０．２μｇ及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム及び０．０００１％ゼラチンを含有する１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を３０秒、５５℃を２分、７２℃を３分のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲ法を行った。該反応液の１μｌを鋳型とし、プライマーとして合成したオリゴヌクレオチドＳ２及びカセットプライマーＣ２（宝酒造社製）それぞれ０．２μｍｏｌｅを用いて同条件でＰＣＲ反応を行った。該反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１、０００ベースの断片のみが特異的に増幅されており蛋白のＮ末端領域から遺伝子の下流側のＥｃｏＲＩ切断部位までを含むＤＮＡ断片が取得された。
該ＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片約０．２μｇをクレノウフラグメントを用いて３７℃で３０分平滑末端化反応した。該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。沈澱物として回収したＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端リン酸化反応を３７℃で１時間行った。該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱し、沈澱物としてＰＣＲ産物の末端平滑化及びリン酸化物を回収した。
プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）１μｇを制限酵素ＳｍａＩを用いて温度３０℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、バクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＳｍａＩで消化されたｐＵＣ１８を０．１μｇ、ＰＣＲ産物の末端平滑化及びリン酸化物約０．１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を用いて温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲによる増幅断片を含むプラスミドを得た。このプラスミドをｐＣＳ２と命名した。
オリゴヌクレオチドＳ１、Ｓ２に対して相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、それぞれＳ４、Ｓ３とした。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＳ３およびカセットプライマーＣ１（宝酒造社製）、鋳型としてＥｃｏＲＩカセットを連結したエキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ消化物を用いて同条件のＰＣＲ法による増幅を行った。得られた反応液を鋳型とし、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＳ４及びカセットプライマーＣ２（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ法を行い、約２，３００ベースの蛋白のＮ末端領域から遺伝子の上流側のＥｃｏＲＩ切断部位までを含むＤＮＡ断片を増幅した。
該ＤＮＡ断片約０．２μｇをクレノウフラグメントを用いて３７℃で３０分平滑末端化反応した。該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。沈澱物として回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ  １０ユニット、１０ｍＭ  塩化マグネシウム及び１ｍＭ  ジチオスレイトールを含有する１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌに混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。
プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）１μｇ及び制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｃIIそれぞれ５ユニットずつを１０ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ジチオスレイトールを含有する３３ｍＭ  トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）５０μｌに混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液をフェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＫｐｎＩ及びＨｉｎｃIIで消化されたｐＵＣ１８を０．１μｇ、ＰＣＲ産物の末端平滑化及びＫｐｎＩ消化物約０．１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、約６００ベースの蛋白質のＮ末端領域から遺伝子の上流側のＫｐｎＩ切断部位までを含むＤＮＡ断片を含むプラスミドを選択した。このプラスミドをｐＫＳ４と命名した。
（４）エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の塩基配列の決定
前項（３）で得られたプラスミドｐＣＳ２及びｐＫＳ４の塩基配列の決定を行った。これから推定されるオープン・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号１に示す。また、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。すなわち、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする遺伝子が、エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子である。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１に示されるＤＮＡ及びそれにコードされる蛋白質は新規であることが判明した。また、これまでイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子として唯一明らかになっているエシェリヒア・コリ由来のイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子配列とは相同性は低く全く別のイノシン−グアノシンキナーゼをコードする遺伝子であることが明かとなった。
本遺伝子のコードする蛋白質は、３０３個のアミノ酸から成り、その配列から予想される蛋白の分子量は３２．５キロダルトンであった。
実施例７（エキシグオバクテリウム・アセチリカム  ＡＴＣＣ９５３由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子発現プラスミドの構築とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスへの導入）
（１）ＰＣＲ法によるイノシングアノシンキナーゼ遺伝子の増幅とクローニングエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の両端に位置し、それぞれ制限酵素ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ切断部位を有する配列表配列番号８及び９に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド０．２５μｍｏｌｅ、鋳型として実施例６（２）で調製したエキシグオバクテリウム・アセチリカムＡＴＣＣ９５３の染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム及び０．０００１％ゼラチンを含有する１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、９４℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲ法を行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。該ＤＮＡ断片約２μｇ及び制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩそれぞれ１０ユニットを１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ジチオスレイトールを含有する５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌに混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｇ及び制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩそれぞれ２０ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ジチオスレイトールを含有する５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）におのおの混合し、温度３７℃で２時間反応させた。反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＨＳＧ２９８を得た。このＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで消化されたｐＨＳＧ２９８を０．１μｇ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで消化されたＰＣＲによる増幅断片０．５μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ  １ユニット（宝酒造社製）を６．６ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０ｍＭ  ＡＴＰを含有する６６ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で８時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製しアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＨＳＧ２９８にエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシングアノシンキナーゼ遺伝子が挿入された組換え体プラスミドを選択した。このプラスミドをｐＢＡ−１と命名した。
（２）エシェリヒア・コリのｔｒｐプロモーターの挿入
実施例１（２）と同様にして、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断されたエシェリヒア・コリｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。
前項（１）で得られたイノシングアノシンキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入された組換え体プラスミドｐＢＡ−１  １μｇをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、反応終了液を常法によりフェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化されたプラスミドを得た。このＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化されたｐＢＡ−１を０．１μｇ及びＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断されたエシェリヒア・コリｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニット（宝酒造社製）を用いて連結反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製しアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＢＡ−１にエシェリヒア・コリｔｒｐプロモーターが挿入された組換え体プラスミドを選択し、これをｐＢＡ−２と命名した。
なお、プラスミドｐＢＡ−２を保持するエシェリヒア・コリＡＪ１３０９４は、、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号（郵便番号３０５）工業技術院生命工学工業技術研究所において、平成７年４月２７日付でブタペスト条約に基づき寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０８９が付与されている。
（３）コリネバクテリウム由来複製起点の挿入
前項（２）で得られたイノシングアノシンキナーゼ遺伝子にｔｒｐプロモーターを連結したＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドｐＢＡ−２  １μｇを前項（２）の反応液組成でＢａｍＨＩにて消化し、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。これを実施例６（２）の反応組成にてＫｐｎＩで消化し、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。得られたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化されたプラスミドｐＢＡ−２をバクテリアル・アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、フェノール抽出処理、エタノール沈澱を行なった。
一方、特開平５−７４９１号に記載のプラスミドｐＨＣ４  １μｇを同様にＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。上記で得られたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化されたプラスミドｐＢＡ−２  ０．１μｇおよびＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化されたプラスミドｐＨＣ４由来のＤＮＡ断片０．２μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて、温度１６℃で８時間連結反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製しアガロースゲル電気泳動を行うことにより、プラスミドｐＢＡ−２にコリネバクテリウム属細菌由来の複製起点を含む組換え体プラスミドを選択し、これをｐＢＡ−３と命名した。
（４）ｐＢＡ−３のＡＴＣＣ２１４７７株への導入
前項で得られたｐＢＡ−３  ０．１μｇを電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７７株に導入した。これをポリペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．５％及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌから成る寒天培地上にまき、形質転換体ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＢＡ−３を得た。
（５）組換え体のイノシン−グアノシンキナーゼ活性の測定
前項で得られたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＢＡ−３をポリペプトン１％、酵母エキス１％、グルコース５％、リン酸２水素カリウム０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸アンモニウム０．５％、尿素０．５％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、チアミン塩酸塩０．００５ｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．０１ｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、アデニン０．０５％、及びカナマイシン５０ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ７．２）５０ｍｌに接種し、３２℃で２４時間培養した。該培養液を常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。
この菌体を０．９％塩化ナトリウム水溶液で懸濁し、遠心分離する操作を２回繰り返し菌体を洗浄した。該菌体を２０％グリセロール、１００ｍＭ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、１５０Ｗ、の出力で２０分超音波処理した後、１５，０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して上清を得た。この細胞破砕液をセファデクスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、低分子量物質を除いたものを粗酵素液とした。
得られた粗酵素液のイノシン−グアノシンキナーゼ活性を、プラスミドｐＨＫ４で同様に形質転換して得たＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４を対照として実施例５（１）の方法にて測定した。その結果を表７に示した。ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４では活性は検出されなかったのに対し、ＡＴＣＣ２１４７７／ｐＢＡ−３は高い活性を有していた。この結果から、導入したエキシグオバクテリウム由来の遺伝子がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスにおいてイノシン−グアノシンキナーゼ活性を発現していることが示された。
なお、プラスミドｐＨＫ４は、ｐＢＡ−３からｔｒｐプロモーター及びイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子領域を除去した構造を有しており、対照として使用した。
エシェリヒア・コリＨＢ１０１にｐＨＫ４を保持させた株は、ＡＪ１３１３６と命名され、１９９５年８月１日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号（郵便番号３０５）工業技術院生命工学工業技術研究所にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８６が付与されている。
0003948027.tif 000008
実施例８（エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５’−イノシン酸の生産）
ポリペプトン１％、酵母エキス１％、グルコース５％、リン酸二水素カリウム０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸アンモニウム０．５％、尿素０．５％、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、チアミン塩酸塩０．００５ｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．０１ｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、アデニン０．０５％、及びカナマイシン５０ｍｇ／ｌから成る培地（ｐＨ７．２）４５０ｍｌにコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４７７／ｐＢＡ−３を接種し、３２℃で２４時間培養し培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し沈澱物として湿菌体２０ｇを得た。
得られた菌体をイノシン５０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／ｌ、グルコース３０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム５ｇ／ｌ、フィチン酸（重量比５０％）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５  ４ｇ／ｌ、アデニン１ｇ／ｌからなる反応液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに２００ｇ／ｌとなるように懸濁し、撹拌しつつ３２℃に保ち反応を行った。ｐＨは４Ｎ水酸化ナトリウムを用いて適宜７．２となるように調整し、リン酸二水素カリウムの減少分を適宜添加した。対照としてＡＴＣＣ２１４７７／ｐＨＫ４について同様に反応を行った。３０時間反応後の反応液中の５’−イノシン酸を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。
結果を表８に示す。５’−イノシン酸蓄積値は５’−イノシン酸二ナトリウム７．５水和物換算値にて示した。この結果からイノシン−グアノシンキナーゼ活性を発現しているＡＴＣＣ２１４７７／ｐＢＡ−３でイノシンから５’−イノシン酸への変換がみられた。
0003948027.tif 000009
実施例９（エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５’−イノシン酸への変換）
実施例８で得た菌体をイノシン６０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／ｌ、グルコース３０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム５ｇ／ｌ、フィチン酸（重量比５０％）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５４ｇ／ｌ、アデニン１ｇ／ｌからなる反応液（ｐＨ７．２）５０ｍｌに２００ｇ／ｌとなるように懸濁し、通気撹拌しつつ３２℃に保ち反応を行った。ｐＨはｐＨ計で測定しつつ常に７．２となるように４Ｎ水酸化ナトリウムを添加して調整し、リン酸二水素カリウムの減少分を適宜添加した。３０時間反応後の蓄積値は１１１．３ｇ／ｌであり添加したイノシンに対するモル収率は約１００％であった。
実施例１０（イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子保持株を用いたグアノシンから５′−グアニル酸への変換）
実施例８で得た菌体をグアノシン２５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／ｌ、グルコース３０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム５ｇ／ｌ、フィチン酸（重量比５０％）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５  ４ｇ／ｌ、アデニン１ｇ／ｌからなる反応液（ｐＨ７．２）５０ｍｌに２００ｇ／ｌとなるように懸濁し、通気攪拌しつつ３２℃に保ち反応を行った。ｐＨはｐＨ計で測定しつつ常に７．２となるように４Ｎ水酸化ナトリウムを添加して調整した。８ｈ反応後の５′−グアニル酸の蓄積値は７．３ｇ／ｌであり添加したグアノシンに対するモル収率は約１４％であった。
実施例１１（エキシグオバクテリウムバクテリウム・アウランティアカム、クルチア・ギブソーニ、クルチア・ゾプフィにおけるイノシン−グアノシンキナーゼ活性の検出）
ポリペプトン１％、バクト・イーストエキストラクト１％、グルコース０．５％及び塩化ナトリウム０．５％及び炭酸ナトリウム１％から成る培地（ｐＨ９．７）５０ｍｌに、エキシグオバクテリウムバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２を接種し、また、ポリペプトン１％、バクト・イーストエキシトラクト１％、グルコース０．５％及び塩化ナトリウム０．５％からなる培地（ｐＨ７．２）５０ｍｌに、クルチア・ギブソーニ  ＡＴＣＣ４３１９５、クルチア・ゾプフィ  ＡＴＣＣ３３４０３をそれぞれ接種し、３０℃で４時間培養し培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し、沈殿物を０．９％塩化ナトリウムで２度洗浄し湿菌体を得た。この菌体を緩衝液Ａ  ３ｍｌに懸濁し、超音波処理にて破砕した。該破砕液を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離処理し上清をセファデクスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて脱塩し、粗酵素抽出液約３．５ｍｌを得た。粗酵素抽出液５μｌを５ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭＡＴＰ、１００ｍＭ塩化カリウム、０．０６ｍＭグアノシン及び０．０４ｍＭ［８−14Ｃ］−グアノシンを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌ中に加えた反応液を３０℃、１０分反応した。生成した５′−グアニル酸を定量し、イノシン−グアノシンキナーゼ比活性を測定した。その結果を表９に示した。いずれの株においてもイノシン−グアノシンキナーゼ活性が検出された。
0003948027.tif 000010
実施例１２（エキシグオバクテリウム・アウランティアカム、クルチア・ギブソーニ、クルチア・ゾプフィ染色体におけるエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子と相同性を有する断片の検出）
実施例１１と同様にエキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２、クルチア・ギブソーニ  ＡＴＣＣ４３１９５及びクルチア・ゾプフィ  ＡＴＣＣ３３４０３を３０℃で１６時間培養し、培養液から実施例５（２）と同様にそれぞれの染色体ＤＮＡを調製した。該染色体ＤＮＡ  １０μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ１００ユニットを１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）におのおの混合し、温度３７℃で１４時間反応させた後、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱した。得られたＥｃｏＲＩによって切断された染色体ＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laboratory Press,p9.31(1989)）に記載の方法でアガロースゲルからナイロンフィルター（デュポン社製）にアルカリ転写を行った。該フィルターをエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を含む断片をプローブとして、４２℃で１４時間、２０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーションを行った。該フィルターを０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ塩化ナトリウム、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳで洗浄したところ、いずれの菌株においても相同断片が検出された。中でもエキシグオバクテリウムバクテリウム・アウランティアカムの染色体において最も強い相同性を示す約４．６ｋｂの断片が検出された。
実施例１３（エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２染色体からのエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来イノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子と相同な断片の単離）
エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２の染色体ＤＮＡ１８μｇと制限酵素ＥｃｏＲＩ２００ユニットを３７℃で３時間反応し、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理した。該消化断片をアガロースゲル電気泳動に供し、４．６ｋｂ付近の断片をガラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収し、エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２株染色体断片を得た。
プラスミドベクターｐＭＷ２１８（日本ジーン社製）１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ２０ユニットを用いて温度３７℃で３時間反応させて消化液をフェノール抽出及びエタノール沈澱した。この後、アルカリフォスファターゼ処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱を行なった。
このＥｃｏＲＩで消化されたｐＭＷ２１８を０．２μｇ、ＥｃｏＲＩで消化されたエキシグオバクテリウム・アウランティアカム染色体断片５μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結した。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、これを１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地上にまき、約１０００個の形質転換体を得た。
得られた形質転換体から、コロニーハイブリダイゼーション法により、プローブＤＮＡとハイブリダイズする形質転換体を選択した。該形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。該プラスミドＤＮＡはエキシグオバクテリウム・アウランティアカム染色体由来の約４．６ｋｂのＤＮＡ断片を含んでいた。
実施例１４（エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子の塩基配列の決定）
実施例１３で得たプラスミドを各種制限酵素で切断の後、サザンハイブリダイゼーションを行いプローブＤＮＡとハイブリダイズする断片を同定した。その結果、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩに切断された約２．７キロベースの切断断片がハイブリダイズすることが判明した。該ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断したプラスミドベクターｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）に連結し、エシェリヒア・コリＪＭ１０９に形質転換した。得られた形質転換体の中からMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbour Laboratory Press,p.1.90(1989)）記載のコロニーハイブリダイゼーション法によりプローブＤＮＡとハイブリダイズする断片をクローン化した。該ＤＮＡ断片を含むプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ菌体の粗酵素抽出液のイノシンキナーゼ活性を実施例７（５）記載の活性測定法により測定したところ対照としたベクター保持株と比較して約３００倍の活性を示し、クローン化した断片がエキシグオバクテリウム・アウランティアカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子を含んでいることが確認された。
得られたプラスミドＤＮＡを用いてＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ切断断片の塩基配列の決定を行った。決定された塩基配列から推定されるオープン・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号１４に示した。また、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を配列表配列番号１５に示した。塩基配列、アミノ酸配列いずれもエキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼと高い相同性を示したが、明らかに新規な遺伝子であった。すなわち、配列表配列番号１５に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする遺伝子が、エキシグオバクテリウム・アウランティアカム  ＡＴＣＣ３５６５２のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子である。
以上のように、エキシグオバクテリウム・アセチリカム由来のイノシン−グアノシンキナーゼ遺伝子とハイブリダイズすることができる遺伝子が取得され、該遺伝子がイノシン−グアノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードすることが確認された。
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：味の素株式会社
（ii）発明の名称：核酸類の製造方法
（iii）配列数：１５
（iv）連絡先：
（A）宛名：味の素株式会社
（B）番地：京橋  １丁目１５番１号
（C）市：中央区
（D）州：東京都
（E）国：日本国
（F）ZIP：１０４
（v）コンピューター読取り可能形式
（A）媒体：
（B）コンピューター：
（C）操作システム：
（D）ソフトウェア：
（vi）現行出願データ
（A）出願番号：ＪＰ
（B）出願日：１９９６年３月  日
（C）分類：
（vii）優先権主張出願データ
（A）出願番号：特願平７−１０２８８８号
（B）出願日：１９９５年３月２４日
（C）出願番号：特願平７−１７７９００号
（D）出願日：１９９５年６月９日
（viii）代理人／事務所情報
（A）名前：佐伯  憲生
（B）登録番号：１０２２６
（iｘ）通信情報
（A）電話番号：０３−５６８８−５１３６
（B）ファクシミリ番号：０３−５６８８−５１３７
（２）配列番号１の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：９０９  base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エキシグオバクテリウム・アセチリカム
（B）株名：ＡＴＣＣ  ９５３
（iｘ）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..909
（C）特徴を決定した方法：Ｅ
（xi）配列：SEQ ID NO:１：
0003948027.tif 000011
（２）配列番号２の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０３  アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：SEQ ID NO:２：
0003948027.tif 000012
0003948027.tif 000013
（２）配列番号３の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：２８  アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：SEQ ID NO:３：
0003948027.tif 000014
（２）配列番号４の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：１７
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:４：
0003948027.tif 000015
（２）配列番号５の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：１７
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:５：
0003948027.tif 000016
（２）配列番号６の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：２３
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:６：
0003948027.tif 000017
（２）配列番号７の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：２１
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:７：
0003948027.tif 000018
（２）配列番号８の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:８：
0003948027.tif 000019
（２）配列番号９の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:９：
0003948027.tif 000020
（２）配列番号１０の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：１３０２  base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリヒア・コリ
（B）株名：ＨＭ  ７０
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1302
（C）特徴を決定した方法：Ｅ
（xi）配列：SEQ ID NO:１０：
0003948027.tif 000021
（２）配列番号１１の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:１１：
0003948027.tif 000022
（２）配列番号１２の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:１２：
0003948027.tif 000023
（２）配列番号１３の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：７２
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:１３：
0003948027.tif 000024
（２）配列番号１４の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：９２４  base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エキシグオバクテリウム・アウランティアカム
（B）株名：ＡＴＣＣ  ３５６５２
（iｘ）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..924
（C）特徴を決定した方法：Ｅ
（xi）配列：SEQ ID NO:１４：
0003948027.tif 000025
（２）配列番号１５の配列の情報
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：３０８  アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：SEQ ID NO:１５：
0003948027.tif 000026
0003948027.tif 000027