(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素を含有する培地で、クリベロミセス(Kluyveromyces)属に属する微生物を好気的条件で培養する工程と培養工程で得られた基質を酸性条件で処理する工程とを有することを特徴とするγ−ラクトンを含有する液体組成物の製造方法。
【請求項２】
上記培養工程において、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis）、クリベロミセス・アスツアリ(Kluyveromyces aestuarii）、クリベロミセス・ブルガリカス(Kluyveromyces bulgaricus）又はクリベロミセス・ウィッケルハミ(Kluyveromyces wickerhamii）に属する微生物を用いることを特徴とする製造方法。
【請求項３】
当該処理工程において、酸性条件で３０℃以上に加熱することを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
上記処理工程において、エタノールと共に当該基質を蒸留することを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
上記培養工程の前に、当該培地を７０℃以上に加熱する工程を有することを特徴とする上記請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記γ−ラクトン中のγ−デカラクトンの濃度が５ｐｐｂ以上であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所定の微生物を利用してγ−ラクトンの前駆体を生成することにより、γ−ラクトンを含有する液体組成物を製造する方法に関する。かかる液体組成物は、食品、飲料（アルコール飲料を当然に含む。）、香料等に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
環状エステルであるラクトンのうち、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ドデカラクトン等は、ピーチに似た甘い香気を持っており、従来から香料の調製成分に用いられている。また、食品、香粧品を調合するための香料素材としても有用である。γ−デカラクトン（Ｉ）の構造式を下記に示す。
【０００３】
【化１】
0004020444.tif 000002
【０００４】
γ−デカラクトン等のγ−ラクトンは、果実などの天然物に含有するものであるが、一般には含有量が極めて少ないため、天然物から分離精製して利用することは極めて困難である。そこで、γ−ラクトンを化学合成により製造することが試みられ、特開昭５５−１３３３７１号公報、特開平４−２７５２８２号公報、特開平４−２７５２８３号公報などに化学合成法が記載されている。
【０００５】
一方、微生物を利用した発酵法により、γ−デカラクトン等を生産する方法も試みられている。特開昭５９−８２０９０号公報、特開昭６１−２３８７０８号公報、及び特開昭６０−６６９９１号公報には、カスターオイル、即ち、ヒマシ油に微生物を作用させて加水分解して、リシノール酸を主成分とする混合物を得て、この混合物中のリシノール酸にβ−酸化能を有する微生物を更に作用させ、γ−ヒドロキシデカン酸を生成して、次いで、このγ−ヒドロキシデカン酸を、ラクトン化して、γ−デカラクトンを得る方法を記載する。これらの文献では、β−酸化能を有する微生物として、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、又はカンディダ(Candida)属が挙げられている。しかし、クリベロミセス属については一切記載していない。また、これらの文献では、ヒマシ油の改質に限定されており、ヒマシ油以外の原材料を用いた場合については言及されていない。
【０００６】
特開昭６０−９４０７６号公報は、クリベロミセス・ラクチスと乳酸菌とを共生して発酵させ、発酵飲料を得る旨について記載する。しかし、特開昭６０−９４０７６号公報では、発酵条件が、静置発酵に限定されていて（第４頁、左上欄、第１４行目；第４頁、右下欄、第１６行目）、好気的条件による発酵については全く記載がない。また、特開昭６０−９４０７６号公報では、発酵の対象が麦芽エキスに限定され、麦芽エキスを含有しない原材料を用いて発酵させた場合についての記載がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
γ−デカラトクトン等のγ−ラクトンには、香料として食品、飲料（アルコール飲料を当然に含む。）等に添加する用途がある。ここで、食品、飲料としての安全性を考慮すると、複雑な化学合成工程が含まれないことが所望される。また、γ−デカラクトン等のγ−ラクトンを生産する原材料として、特定された物質に限られず、従来より食品製造に用いられてきた天然物をも幅広く利用できる方法が所望される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、窒素を含有する培地で、クリベロミセス(Kluyveromyces)属に属する微生物を好気的条件で培養する工程と培養工程で得られた基質を酸性条件で処理する工程とを有することを特徴とするγ−ラクトンを含有する液体組成物の製造方法が提供される。
本発明において、上記培養工程において、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis）、クリベロミセス・アスツアリ(Kluyveromyces aestuarii）、クリベロミセス・ブルガリカス(Kluyveromyces bulgaricus）又はクリベロミセス・ウィッケルハミ(Kluyveromyces wickerhamii）に属する微生物を用いることが好ましい。
更に、当該処理工程において、酸性条件で３０℃以上に加熱することが好ましい。
更にまた、上記処理工程において、エタノールと共に当該基質を蒸留することが好ましい。
また、上記培養工程の前に、当該培地を７０℃以上に加熱する工程を有することが好ましい。
更に、かくして得られたγ−ラクトン中のγ−デカラクトンの濃度が５ｐｐｂ以上であることが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明では、クリベロミセス属に属する微生物を好気的条件で培養することにより、γ−ラクトンの前駆体を生成し、次いで、酸性条件で処理することにより、この前駆体をγ−ラクトンに変換する。培養工程で液体の培地を用いた場合には、その培養液を酸性条件で処理することにより、γ−ラクトンを含有する液体組成物が得られる。
本発明に係る液体組成物において、γ−ラクトンとしては、一般的には、γ−デカラクトンが生成し、更に、γ−ノナラクトン、γ−ドデカラクトン等も生成する。液体組成物において、γ−デカラクトンの濃度が５ｐｐｂ以上であることが好ましく、γ−デカラクトンの濃度が２０ｐｐｂ以上であることが更に好ましく、γ−デカラクトンの濃度が５０ｐｐｂ以上であり、かつ、γ−ノナラクトンの濃度が１０ｐｐｂ以上であることが更になお好ましい。γ−デカラクトン、γ−ノナラクトン及びγ−ドデカラクトンの濃度の合計が５０ｐｐｂ以上の場合に、本発明の液体組成物が芳香の調合成分として特に有用になる。液体組成物としては、例えば、飲料が挙げられる。
【００１０】
クリベロミセス属に属する微生物としては、γ−ラクトンの前駆体を生成する能力を有するものが用いられる。例えば、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis）、クリベロミセス・アスツアリ(Kluyveromyces aestuarii）、クリベロミセス・ブルガリカス(Kluyveromyces bulgaricus）、クリベロミセス・ウィッケルハミ(Kluyveromyces wickerhamii）、クリベロミセス・テルモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans）、クリベロミセス・ポリスポラス(Kluyveromyces polysporus）等に属する微生物を用いることができる。この中でも、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis）、クリベロミセス・アスツアリ(Kluyveromyces aestuarii）、クリベロミセス・ブルガリカス(Kluyveromyces bulgaricus）又はクリベロミセス・ウィッケルハミ(Kluyveromyces wickerhamii）に属する微生物は、γ−ラクトンの収率が高いので好ましく、特にクリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis）が好ましい。
【００１１】
クリベロミセス属に属する微生物としては、例えば、Kluyveromyces lactis  IFO 648、IFO 433、IFO 1012、IFO 1090、IFO 1267、IFO 1903、JCM 6846、ATCC 36940、ATCC 36941、NRIC 1329、NRIC 1332等が挙げられる。
クリベロミセス・アスツアリ(Kluyveromyces aestuarii）種に属する微生物としては、例えば、ATCC 18862等が挙げられる。クリベロミセス・ブルガリカス(Kluyveromyces bulgaricus）に属する微生物としては、例えば、IFO 617等が挙げられる。クリベロミセス・ウィッケルハミ(Kluyveromyces wickerhamii）に属する微生物としては、例えば、IFO 1675等が挙げられる。クリベロミセス・テルモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans）としては、IFO 662、IFO 1779、IFO 1985、IFO 10067等が挙げられる。クリベロミセス・ポリスポラス(Kluyveromyces polysporus）としては、IFO 996等が挙げられる。
これらの株は、大阪の発酵研究所、埼玉の理化学研究所、米国のＡＴＣＣ、東京農業大学等より入手することもできる。また、これらの微生物は、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオーガニズム(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)より入手することができる。
【００１２】
培養工程では、クリベロミセス属に属する微生物を単独で用いても良いが、他の微生物と共存させて培養してもよい。例えば、培地のｐＨを低下させるために、乳酸菌、酢酸菌等と共存させてもよい。また、食品等の製造に通常用いられるサッカロミセス属に属するパン酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、焼酎酵母等と共存させてもよい。
【００１３】
本発明では、クリベロミセス属の微生物は、好気的条件で培養される。嫌気的条件ではなく好気的条件で培養することにより、γ−ラクトンの生成量が増加する。例えば、液体培地の場合には、培地を撹拌、振とう、還流したり、無菌空気を通気する。また、固体培地の場合には、培地の表面で培養する。撹拌、振とう、還流を激しくしたり、通気量を増加したりする場合には、γ−ラクトンの生成量が増加し、好ましい。しかし、好気的条件には、培地を撹拌、振とう、還流したりせずに培養容器を静置した状態で行う静置培養は含まれない。
１ｍｌ当たり１０7個のクリベロミセス属に属する微生物を植菌した場合には、１ｍｌ当たり５×１０7〜１×１０10個程度、好ましくは、１×１０8〜５×１０9個程度になるまで培養することが好ましい。培養温度は約２０〜４０℃が好ましく、２８〜３７℃が更に好ましい。培養に要する時間は、クリベロミセス属の菌株、培養条件、培地の組成、温度等によって異なるが、例えば、１２〜１２０時間であり、一般には、２４時間から７２時間培養すれば十分である。
【００１４】
本発明では、クリベロミセス属に属する微生物を培養する際に、窒素を含有する培地が用いられる。窒素を含有しない培地では、クリベロミセス属に属する微生物を培養できないからである。培地に窒素が不足する場合には、窒素源として通常用いられる化合物、例えば、尿素、カザミノ酸、アミノ酸、アンモニウム塩等を添加してもよい。
培地の原料としては、例えば、穀類、果実、豆類を用いることができる。穀類としては、ビールやウイスキーの原料となる麦芽やとうもろこし、日本酒の原料となる米等が挙げられる。麦芽、米等そのものではなく、麦芽、米等に含有する澱粉を糖に変換する糖化工程を経た糖化液、麦芽エキス、もろみ等が、クリベロミセスを作用させる培地として、用いられる。
また、果実としては、ワインやブランデーの原料となるぶどう、リンゴ等が挙げられる。果実の果汁を培地として用いることができる。
【００１５】
微生物の培地として、一般に市販されているペプトン、酵母エキス、カザミノ酸等と、グルコース、シュクロース等の糖との混合物を用いても良い。また、アルコール飲料の原料とこれらの培養物との混合物であってもよい。更に、一般の酵母菌体の製造に用いられる培地を用いても良い。例えば、廃糖蜜と尿素等の窒素源を混合した培地を用いても良い。
培地には、必要に応じて、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムの無機の窒素源が添加されていてもよい。また、金属塩としては、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｆｅ等の硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩等の無機塩が必要に応じて添加される。培地が液体の場合には、必要に応じて食品用シリコーン等の界面活性剤を添加することが好ましい。
【００１６】
クリベロミセス属に属する微生物を培養する前に、培地を７０℃以上に加熱することが好ましく、８０℃以上に加熱することが更に好ましい。例えば、培地として麦汁を用いた場合において、麦汁の濁度が高いときには、濁度が低いときと比較して、γ−ラクトンの生成量が減少する傾向にある。しかし、麦汁の濁度が高いときであっても、麦汁を予め７０℃以上に加熱することにより、γ−ラクトンの生成量を維持することができる。γ−ラクトンの生成を阻害する何らかの物質が、熱処理により分解するためと考えられる。また、この加熱工程において、同時に培地の雑菌が殺菌されることが好ましい。
【００１７】
本発明では、培養工程で生成したγ−ラクトンの前駆体を酸性条件で処理して、γ−ラクトンに変換する。酸性条件とは、ｐＨが７より小さいことをいい、ｐＨ５以下が好ましく、ｐＨ３．３以下が更になお好ましい。ｐＨが小さい方が、γ−ラクトンの生成量が増加するからである。通常は、培養工程で得られた基質を含有する溶液で酸性条件で処理される。
液体培地を用いてクリベロミセス属に属する微生物を培養した場合には、培養液のｐＨは一般には３〜５に低下するので、培養液のまま放置しても、酸性条件で処理されることになる。また、後に説明するように、培養液のまま加熱してもよい。
【００１８】
また、ｐＨを更に低下させるために、培養終了後に、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、酢酸等の有機酸、又は、塩酸等の無機酸を培養液に添加しても良い。一方、乳酸菌、酢酸菌等のような、有機酸を生成する微生物をクリベロミセス属に属する微生物と共存させて培養してもよい。更に、有機酸を生成する微生物を別個の培養液で培養し、ｐＨの低い培養液を得て、この培養液とクリベロミセス属に属する微生物の培養液とを混合してもよい。
【００１９】
なお、乳酸菌とは、炭水化物を分解し、主に乳酸を作る細菌類の総称である。例えば、ラクトバシルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、及びペディオコッカス(Pediococcus)属などに属するものが挙げられる。乳酸菌は、例えば、培養液１ｍｌ当たり１×１０6個〜１×１０10個になるまで培養する。
【００２０】
酸性条件で処理する際に、加熱することが好ましい。加熱することなく、室温において酸性条件で処理しても、γ−ラクトンは得られる。しかし、酸性下で加熱することにより、γ−ラクトンの生成量が増加する。
加熱条件は、ｐＨ等により異なるが、３０℃以上に加熱することが好ましく、５０℃以上に加熱することが更に好ましく、７０℃以上に加熱することが更に好ましい。例えば、６０℃の場合には、３０分間、８０℃の場合には２０分間、１００℃の場合には５分間で十分である。しかし、これよりも短い加熱時間であっても、γ−ラクトンは当然に得られる。
【００２１】
この加熱工程として、エタノールが共存した状態で培養液をエタノールと共に蒸留してもよい。例えば、クリベロミセス属に属する微生物の培養液を加えてエタノールを生成する酵母を培養した場合には、酸性条件でこの培養液を蒸留してもよい。蒸留は、大気圧で行ってもよいし、必要に応じて、減圧下で行ってもよい。
【００２２】
また、クリベロミセス属に属する微生物を培養した培養液に、エタノールを含有する溶液を添加し、次いで、酸性条件での処理として蒸留してもよい。一方、クリベロミセス属に属する微生物を培養した培養液を酸性条件で加熱して、次いで、エタノールを含有する溶液を更に添加してから、蒸留してもよい。エタノールを含有する溶液は、例えば、アルコール飲料を製造するために醸造した醸造液、エタノールを含有する水溶液等が挙げられる。この醸造液は、ウィスキー、ビール、ワイン、日本酒、焼酎等を製造する工程で得られた発酵液を用いることができる。エタノールを含有する溶液において、エタノールの含有量は、特に制限はないが、例えば、１〜６０％含有してもよく、２〜４５％含有してもよい。しかし、エタノールそのものを添加することを妨げるものではない。
【００２３】
微生物の培養物より物質を単離する通常の方法を用いて、液体組成物よりγ−ラクトンを単離することもできる。遠心分離又は濾過により菌体を分離した後、濾過液及び菌体からγ−ラクトンを抽出することができる。例えば、適当な溶剤に対する溶解度の差、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差等を利用する一般の化合物の製造に用いられる手段によって、分離、採取、精製される。γ−ラクトンは、有機溶媒に溶解し、また、沸点が比較的に高いので、極性又は無極性の有機溶媒で抽出し、この有機溶媒を留去することにより、得ることができる。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、また反復し適用される。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例及び比較例において、液体組成物中におけるγ−デカラクトン、γ−ノナラクトン、γ−ドデカラクトンの含有量は、液体組成物からヘキサンで抽出し、次いで、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、測定した。
（実施例１）
麦芽２５ｋｇに水１５０ｌを加え、６５℃で糖化した後、濾過し、培地たる麦汁１３０ｌを得た。この麦汁１０ｌに、麦汁で予め種培養したクリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を加え、３０℃で２４時間通気撹拌し、好気的に培養した。
一方、残りの麦汁１００ｌには、ウイスキー酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と、発酵液のｐＨを酸性にするために、麦汁で予め種培養した乳酸菌ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus casei)を添加し、３０℃で４日間静置発酵させ、発酵モロミを作成した。
【００２５】
そして、クリベロミセス・ラクチスの培養液と、発酵モロミとを混合したところ、ｐＨが３．４であった。次いで、１２０ｌ容の蒸留釜を用いてこの混合液を２回蒸留して、アルコール濃度が７２％になるように蒸留液を回収し、液体組成物を得た。
この蒸留液を分析したところ、２５５ｐｐｂのγ−デカラクトンが検出された。
【００２６】
（比較例１）
一方、クリベロミセス・ラクチスの培養液を添加することなく、実施例１と同一の条件で発酵モロミのみを蒸留した場合において、蒸留液をガスクロマトグラフィーで分析したところ、２ｐｐｂのγ−デカラクトンが検出された。ただし、γ−デカラクトンが実際に生成したのではなく、何らかの理由で汚染された可能性もある。
【００２７】
（実施例２）
実施例１と同様にして作成した麦汁４０ｍｌに、クリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、培養液に塩酸を加え、ｐＨを２．０に調製した後、１００℃で６０分間加熱し、液体組成物を得た。液体組成物には、６１８ｐｐｂのγ−デカラクトンが検出された。
【００２８】
【表１】
0004020444.tif 000003
【００２９】
（実施例３）
加熱時のｐＨを変えて、γ−デカラクトン等の生成量を調べた。
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、ぶどう糖２％）にクリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、培養液５ｍｌを取り、塩酸を加え、ｐＨを２から６の範囲であって表１に示す値に調製した。次いで、酸性条件の培養液を１００℃で６０分間加熱し、液体組成物を得た。
結果を表２に示す。γ−デカラクトンは、加熱工程におけるｐＨが３．３以下の場合に特に多く生成することが分かる。
【００３０】
【表２】
0004020444.tif 000004
【００３１】
（実施例４）
実施例３と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、培養液をｐＨ２．０に調製した際に、塩酸の代わりに、乳酸、リンゴ酸又はクエン酸を用いた。
結果を表３に示す。ｐＨを調製する酸の種類は、γ−デカラクトンの生成にさほど影響を与えないことが分かる。
【００３２】
【表３】
0004020444.tif 000005
【００３３】
（実施例５）
実施例３と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、培養をする際に、実施例３よりも激しく振とうし、また、塩酸を用いて培養液をｐＨ２．０に調製した。培養液には、γ−デカラクトンが１１３３ｐｐｂ含まれていた。
実施例５では、実施例３−１と比較して、より激しく振とうして培養したところ、γ−デカラクトンの生成量が増加した。
【００３４】
（比較例２）
実施例５と同一の条件で、液体組成物を得た。ただし、クリベロミセス・ラクチスの代わりに、サッカロミセス・セレビシエを培養した。液体組成物より、γ−デカラクトンが検出されなかった。
【００３５】
実施例６〜１０では、異なる培地を用いた。クリベロミセス・ラクチスの培養条件（ただし、培地を含まない。）、培養液のｐＨの調製方法及び培養液の加熱条件は、実施例６〜１０で共通する。
（実施例６）
培地として、米麹エキスを用いた。米麹１ｋｇに水３ｌを加え、５５℃で８時間撹拌して糖化し、９０℃に加熱して殺菌し、次いで、遠心して、米麹エキスを作成した。
培地として、米麹エキスそのもの（実施例６−１）、並びに、米麹エキスに窒素源としてカザミノ酸をそれぞれ０．１％、０．３％及び０．５％添加したものを用いた（実施例６−２、６−３及び６−４）。
培地にクリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養液に塩酸を加え、ｐＨを２．０に調製した後、１００℃で６０分間加熱し、液体組成物を得た。
【００３６】
（実施例７）
培地として、大麦から得られた大麦麹エキスを用いた。大麦より作成した大麦麹１００ｇに水３００ｍｌを加え、実施例６と同様にして、大麦麹エキスを作成した。培地として、麦麹エキスそのもの（実施例７−１）、並びに、大麦麹エキスに窒素源としてカザミノ酸を０．５％添加したものを用いた（実施例７−２）。
実施例７では、カザミノ酸を添加した場合に、クリベロミセス・ラクチスの発育が良くなり、γ−デカラクトンの生成量が増加した。
【００３７】
（実施例８）
培地として、ぶどう濃縮果汁をBrix１４になるように水で希釈したぶどう果汁を用いた。
（実施例９）
培地として、りんご濃縮果汁をBrix１４になるように水で希釈したりんご果汁を用いた。
実施例６〜９の結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
0004020444.tif 000006
【００３９】
（実施例１０）
実施例１０では、培地として廃糖蜜を用いた。廃糖蜜を全糖換算で２．４％になるように水で希釈し、表５に示す窒素源と、０．００８７％のリン酸を添加したものを培地に用いた。
結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
0004020444.tif 000007
【００４１】
（実施例１１）
実施例１１では、クリベロミセス・ラクチスの株の種類を変化させた。実施例２と同一の条件（即ち、培地は麦汁）で液体組成物を得た。結果を表６に示す。
【００４２】
【表６】
0004020444.tif 000008
【００４３】
（実施例１２）
実施例３と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、塩酸を用いて培養液をｐＨ２．０に調製した。
（比較例３）
比較例３では、実施例１２と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、培養工程において、振とう培養ではなく、静置培養を行った。結果を表７に示す。静置培養では、γ−デカラクトンが生成しなかったのに対し、振とう培養では、γ−デカラクトンが生成した。
【００４４】
【表７】
0004020444.tif 000009
【００４５】
（実施例１３）
実施例１３では、クリベロミセス・ラクチスを培養する際に、好気的条件、即ち、通気量及び撹拌速度を変化させた。
実施例１と同様にして得られた麦汁４００ｍｌを培地として用いた。麦汁にクリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、１Ｌのマイクロジャー中、３０℃で２４時間、表７に示す通気撹拌条件で培養した。培養終了後、塩酸を加え、ｐＨを２．０に調製した。次いで、酸性条件の培養液を１００℃で６０分間加熱し、液体組成物を得た。また、培養後に菌濃度を測定した。
結果を表８に示す。通気量及び撹拌速度が上昇するにつれて、γ−デカラクトンの生成量が増加する。
【００４６】
【表８】
0004020444.tif 000010
【００４７】
（実施例１４）
実施例１４では、表９に示すように、培地の麦汁の濁度を変化させた。
実施例１と同様にして得た麦汁１００ｍｌを培地に用いた。実施例１４−１、１４−３及び１４−５では、麦汁をオートクレーブで１２０℃に加熱して殺菌した。これに対して、実施例１４−２、１４−４及び１４−６では、麦汁を加熱殺菌することなく、そのまま用いた。
麦汁にクリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、５００ｍｌの三角フラスコ中、３０℃で２４時間、振とう培養した。培養終了後、塩酸を加え、ｐＨを２．０に調製した。次いで、酸性条件の培養液を１００℃で６０分間加熱し、液体組成物を得た。また、培養後に菌濃度を測定した。
結果を表９に示す。麦汁を加熱殺菌しない場合には、麦汁の濁度が高くなるにつれて、γ−デカラクトンの生成量が減少する。しかし、麦汁を加熱殺菌することにより、麦汁の濁度が高いときであっても、γ−デカラクトンの生成量を維持することができる。
【００４８】
【表９】
0004020444.tif 000011
【００４９】
なお、実験室レベルでは、オートクレーブを用いて１２０℃まで加熱することができる。これに対して、工場レベルでは、濁度が高い麦汁を８０〜９０℃に加熱した場合であっても、γ−デカラクトンの生成量を十分に維持することができる。
【００５０】
（実施例１５）
実施例１５では、クリベロミセス・ラクチスの株の種類を変化させた。
実施例１５−１〜１５−５では、実施例３と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、塩酸を用いて培養液をｐＨ２．０に調製した。実施例１５−６では、いわゆるＳＤ培地に更に０．５重量％のカザミノ酸を添加した培地を用いた。ここで、ＳＤ培地とは、水に０．６７重量％のイースト・ナイトロジェン・ベースと２重量％のグルコースを添加した液体培地をいう。培地以外の培養条件、培養液のｐＨの調製方法及び培養液の加熱条件は、実施例１５−１〜１５〜５と同様である。結果を表１０に示す。
【００５１】
【表１０】
0004020444.tif 000012
【００５２】
（実施例１６）
実施例１６では、クリベロミセス属の種を変化させた。培地以外の培養条件、培養液のｐＨの調製方法及び培養液の加熱条件は、実施例３と同様である。ただし、塩酸を用いて培養液をｐＨ２．０に調製した。
実施例１６−１では、ＹＰＤ培地を用いた。実施例１６−２、１６−３及び１６−８では、いわゆるＳＤ培地に更に０．５重量％のカザミノ酸を添加した培地を用いた。実施例１６−３〜１６−７では、実施例１と同様にして作成した麦汁を培地として用いた。結果を表１１に示す。
【００５３】
【表１１】
0004020444.tif 000013
【００５４】
（実施例１７）
実施例１７では、酸性条件の処理において、加熱条件を変化させた。
実施例１７−１〜１７−８では、実施例３と同一の条件（即ち、ＹＰＤ培地）で、液体組成物を得た。ただし、塩酸を用いて培養液をｐＨ２．０に調製した。
【００５５】
【表１２】
0004020444.tif 000014
【００５６】
実施例１７−８より、室温においてｐＨ２．０で放置してもγ−デカラクトンが生成することが分かる。実施例１７−１〜１７−７と実施例１７−８の比較により、酸性条件で加熱することにより、γ−デカラクトンの生成量が増加することが分かる。
【００５７】
（実施例１８）
実施例１８及び実施例１９では、本発明の製造方法により、γ−デカラクトンのみならず、γ−ノナラクトン及びγ−ドデカラクトンも生成することを示す。実施例１と同様に作成した麦汁に、クリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、３０℃で２４時間通気撹拌し、好気的に培養した。１ｍｌ当たり１．１×１０9のクリベロミセス・ラクチスが生成した。
一方、２２０ｍｌの麦汁に、ウイスキー酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と、発酵液のｐＨを酸性にするために、麦汁で予め種培養した乳酸菌ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus casei)を添加し、３０℃で６日間静置発酵させ、発酵モロミを作成した。
【００５８】
そして、クリベロミセス・ラクチスの培養液１０ｍｌを発酵モロミに添加し、混合した。即ち、γ−ラクトンの前駆体は約２０倍に希釈されたことになる。ここで、発酵モロミは、乳酸菌の作用により酸性条件下にある。混合物２００ｍｌを蒸留し、蒸留液を回収し、液体組成物を得た。
これに対して、比較例４では、実施例１８と同一の条件で、液体組成物を得た。ただし、比較例４では、クリベロミセス・ラクチスの培養液を発酵モロミに添加しなかったことのみが実施例１８と異なる。結果を表１３に示す。なお、表１３における濃度は、混合物に対する値である。
表１３及び表１４において、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１２とは、それぞれ、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ドデカラクトンを意味する。
実施例１８と比較例４との比較により、γ−デカラクトンのみならず、有意な量のγ−ノナラクトンが生成することが分かる。
【００５９】
【表１３】
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【００６０】
（実施例１９）
実施例１９−１では、ＹＰＤ培地を用いた。実施例１９−２では、実施例１と同様に作成した麦汁を培地に用いた。
クリベロミセス・ラクチス（IFO 648）を培地１ｍｌ当たり１０7個になるように植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。エタノール７％及び塩酸を含有し、かつ、ｐＨが２．０である溶液１８０ｍｌを培養液２０ｍｌに添加し、混合した。この混合溶液を蒸留し、蒸留液を回収し、液体組成物を得た。結果を表１４に示す。なお、表１４における濃度は、培養液に対する値である。
実施例１９では、γ−デカラクトンのみならず、有意な量のγ−ドデカラクトンが生成することが分かる。
【００６１】
【表１４】
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【００６２】
【発明の効果】
本発明では、γ−ラクトンを含有する液体組成物を得ることができる。例えば、アルコール飲料などの発酵食品の製造では、それまで用いていた酵母にクリベロミセス・ラクチスを追加するだけで、より良い香気を持った製品を製造できる。また、本発明では、食品、飲料の原材料を用いて良い香気を有する液体組成物が得られるので、食品、飲料に安全に添加できる液体組成物が得られる。