(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養温度３５〜４５℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌ、炭素源が果糖である培養条件下で生育可能であるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、３５〜４０℃の発酵条件で残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、かつ発酵歩合が８５〜９５％であるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する高発酵能酵母Ｋａ４−１０（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３７）。
【請求項２】
培養温度３５〜４５℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌ、炭素源が果糖である培養条件下で生育可能であるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、もろみ温度が３５〜４０℃の発酵条件で、もろみ中の酢酸濃度が４００〜７００ｍｇ／ｌであるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する低酢酸生成酵母Ｋａ５−５（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３８）。
【請求項３】
培養温度３５〜４５℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌ、炭素源が果糖である培養条件下で生育可能であるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、もろみ温度が３５〜４０℃の発酵条件で、残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、発酵歩合が８５〜９５％であり、もろみ中の酢酸濃度が４００〜７００ｍｇ／ｌであるサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母Ｋａ４−３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６３６）。
【請求項４】
請求項１から請求項３に記載した少なくとも一つの酵母を使用する酒類の製造方法。
【請求項５】
サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母を、エタノール４０〜１２０ｇ／ｌ含有した炭素源を果糖とする果糖選択培地に塗抹し、培養温度３５〜４５℃の条件下にて静置培養し、生育した果糖資化性酵母を分離し、得られた酵母を用いて、もろみ温度が３５〜４０℃の発酵条件で発酵させて、残存果糖濃度、発酵歩合、酢酸濃度を測定することにより、果糖資化性であり、高発酵能であり、低酢酸生成である酵母を分離する方法。  
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、酒類製造において、高温条件下においてもアルコール収得が高いサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母並びに当該酵母を使用する酒類及びその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
焼酎製造において、もろみは酵母の発酵熱により高温となるため、もろみを冷却する必要がある。特に黒糖焼酎においては、黒糖を投入後もろみ温度が急昇するため、温度制御が難しい。
【０００３】
黒糖焼酎用酵母の分離については、中田ら（醸造協会誌８７、４５３（１９９２））により報告されている。中田らは、黒糖の集積培養液から糖高濃度条件で発酵が良好な酵母を分離した。この酵母はもろみ温度２７℃の条件で発酵試験したとき、他の焼酎用酵母と比較して黒糖焼酎製造においてアルコール生成能が高かった。
【０００４】
また高峯ら（鹿児島県工業技術センター研究報告８、１（１９９４））は、焼酎用酵母の分離を目的として、鹿児島２号酵母（Ｋ２）、４号酵母（Ｃ４）及び５号酵母（Ｈ５）の発酵試験を行った。もろみの最高温度を３５℃としたとき、３０℃の場合と比較して、各酵母は発酵中に酢酸を多く生成した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、高温、高エタノール条件下で、果糖を炭素源にして生育できる新規な酵母及びその分離技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、もろみ温度が高温であっても、果糖の資化性が高く、アルコール収得を低下させずに酒類を製造できる新規な酵母及びその分離技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、もろみ温度が高温であっても、アルコール発酵中の酢酸生成が少なく、製品中の酢酸濃度が低い酒類を製造できる新規な酵母及びその分離技術を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、次に記載した発明を完成した。
本発明者らは、黒糖焼酎製造において、もろみ温度が高温となった場合、酵母の果糖資化性が低下し、その結果アルコール収得が低下することを見いだした。そこで本発明者らは、高温、高エタノール条件下で、果糖を炭素源にして生育できる果糖資化性酵母を分離した。次いで、この果糖資化性酵母を用いて、もろみ温度が高温であっても、果糖の資化性が高く、アルコール収得の高い高発酵能酵母を分離するという新規な方法を確立した。さらに、この高発酵能酵母を用いて黒糖焼酎を製造することで、上記課題を解決した。
【０００７】
また、黒糖焼酎において他原料の焼酎と比べて、酵母はアルコール発酵中に、もろみ中で過剰に酢酸を生成しやすい。そこで本発明者らは、高温、高エタノール条件下で、果糖を炭素源にして生育できる果糖資化性酵母を分離した。次いで、この果糖資化性酵母を用いて、もろみ温度が高温であっても、酢酸生成の少ない低酢酸生成酵母を分離するという新規な方法を確立した。この低酢酸生成酵母を用いて黒糖焼酎を製造することで、上記課題を解決した。
【０００８】
本発明において、分離に用いる酵母は、エタノールを生成するすべての酵母である。また酵母は分離前に変異処理を行っても差し支えない。
本発明において、果糖資化性酵母は、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌの培養条件下で果糖を炭素源に生育できる酵母である。
【０００９】
本発明において、果糖選択培地は、果糖資化性酵母を分離するための選択用培地であり、エタノールを４０〜１２０ｇ／ｌ含有し炭素源を果糖とする固層培地である。この培地の組成は、例えば、エタノール４０〜１２０ｇ／ｌ、Difco Nitrogen Base６．７ｇ／ｌ、果糖５〜２００ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌである。この培地に適量の酵母を塗抹し、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で生育したコロニーを分離する。
【００１０】
本発明において、発酵試験は、酵母の中から高発酵能酵母又は低酢酸生成酵母を分離するための試験である。そのもろみは、黒糖１００重量部、米麹３０〜１００重量部、水２００〜４００重量部の組成である。
本発明において、もろみ温度は、上述のもろみの温度を指す。
【００１１】
本発明において、高発酵能酵母は、もろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件で発酵試験を行い、発酵もろみ中の残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌとなり、発酵歩合が８５〜９５％となる酵母である。果糖濃度は、高速液体クロマトグラフィーを用いた外部標準物質による絶対検量線法で定量する。発酵歩合は、発酵終了もろみ中の純エタノール容量と全原料（米麹及び黒糖）から得られる理論上の純エタノール容量の割合から求める（アルコールハンドブック（財）発酵工業協会）。その際に必要なアルコール度数、原料の全糖分の測定は国税庁所定分析法による。
【００１２】
本発明において、低酢酸生成酵母は、もろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件で発酵試験を行い、もろみ中の酢酸濃度が４００〜７００ｍｇ／ｌとなる酵母である。もろみ中の酢酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーを用いた外部標準物質による絶対検量線法で定量する。
【００１３】
本発明において酒類とは、酒税法で定義する、アルコール分１度以上の飲料をいう。狭義には、果糖又は蔗糖を含有する原料を用いて得られる、アルコール分１度以上の飲料をいう。
【００１４】
本発明のサッカロマイセス  セレビシエ（以下、Saccharomyces cerevisiaeとする）に属する果糖資化性酵母は、Saccharomyces cerevisiaeに属する酵母を用いて、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌ、炭素源が果糖の培養条件で生育可能な酵母を分離して得られる。
これらの酵母のうち、Ka4-3、Ka4-10及びKa5-5を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636、FERM P-18637及びFERM P-18638である。
【００１５】
本発明のSaccharomyces cerevisiaeに属する高発酵能酵母は、Saccharomyces cerevisiaeに属する酵母を用いて、もろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件で発酵試験し、残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、かつ発酵歩合が８５〜９５％である酵母を分離して得られる。
これらの酵母のうち、Ka4-3及びKa4-10を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636及びFERM P-18637である。
【００１６】
本発明のSaccharomyces cerevisiaeに属する低酢酸生成酵母は、Saccharomyces cerevisiaeに属する酵母から、もろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件で発酵試験し、もろみ中の酢酸生成が４００〜７００ｍｇ／ｌである酵母を分離して得られる。
これらの酵母のうち、Ka4-3及びKa5-5を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636及びFERM P-18638である。
【００１７】
本発明は、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、エタノール濃度４０〜１２０ｇ／ｌ、炭素源が果糖の培養条件で生育可能であって、もろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件で発酵試験し、残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、発酵歩合が８５〜９５％であり、もろみ中の酢酸生成が４００〜７００ｍｇ／ｌである酵母を分離して得られるSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母も含まれる。
これらの酵母のうち、Ka4-3を寄託した。この寄託番号は、FERM P-18636である。
【００１８】
本発明は、前述で得られる酵母の少なくとも１つを使用する酒類製造方法である。
本発明は、これらの製造方法により製造される酒類である。
【００１９】
本発明の果糖資化性酵母の分離方法は、酵母をエタノール４０〜１２０ｇ／ｌ含有し炭素源を果糖とする果糖選択培地に塗抹し、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃の条件下にて静置培養し、生育した酵母を分離することからなる。
【００２０】
本発明の高発酵能酵母の分離方法は、酵母をもろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃にて発酵試験し、残存果糖が１〜２０ｇ／ｌであり、かつ発酵歩合が８５〜９５％である酵母を分離することからなる。
【００２１】
本発明の低酢酸生成酵母の分離方法は、酵母をもろみ温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃にて発酵試験し、もろみ中の酢酸生成が４００〜７００ｍｇ／ｌである酵母を分離することからなる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
高温、高エタノール条件下で果糖を炭素源にして生育できる酵母（以下、果糖資化性酵母）は以下の手法により分離できる。純粋培養した酵母又はもろみ中の酵母群を果糖選択培地に塗抹し、高温下で生育した酵母を分離することから成る。具体的には以下のとおりである。
【００２３】
分離に用いる酵母として、エタノールを生成できる酵母すべてを用いることができ、保存菌株からの純粋培養又は発酵もろみ中に存在する酵母群を用いることができる。純粋培養における培養液は、その酵母が生育可能なものであれば特に限定されない。
また酵母は分離前に変異処理を行っても差し支えない。変異処理としては、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線の照射、化学的変異誘発剤、例えば亜硝酸、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、アクリジン色素誘導体を接触させる方法がある。
【００２４】
純粋培養した酵母又はもろみ中の酵母群を、遠心分離により集菌し滅菌水で洗浄する。この洗浄操作を複数回繰り返す。洗浄した菌塊を果糖選択培地に適量塗抹する。果糖選択培地は、果糖資化性酵母を分離するための選択用培地であり、エタノール４０〜１２０ｇ／ｌ含有し炭素源を果糖とする固層培地である。この培地の組成は、例えば、エタノール４０〜１２０ｇ／ｌ、Difco Nitrogen Base６．７ｇ／ｌ、果糖５〜２００ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌである。この培地に適量の酵母を塗抹し、培養温度３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃で生育したコロニーを分離する。この分離法はさらに適当な回数繰り返して処理しても良い。
【００２５】
果糖選択培地はエタノール濃度が４０ｇ／ｌ未満では、エタノール耐性の低い酵母も生育し、目的の酵母の分離が困難になる。また、エタノール濃度が１２０ｇ／ｌを超えると、酵母が生育できないか、生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。培養温度は３５℃未満では、高温耐性の低い酵母も生育し、目的の酵母の分離が困難になる。また、４５℃を超えると、酵母が生育できないか、生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。
【００２６】
もろみ温度が高温であっても、果糖の資化性が高く、アルコール収得収得が低下しない酵母（以下、高発酵能酵母）は、以下の手法で分離できる。
果糖資化性酵母を用いて、発酵試験を行う。そのもろみは、黒糖１００重量部、米麹３０〜１００重量部、水２００〜４００重量部の組成である。次に発酵終了もろみの果糖濃度及び発酵歩合から、高発酵能酵母を分離することから成る。具体的には以下のとおりである。
【００２７】
ＹＰＤなどの適当な合成培地又は麹汁培地に果糖資化性酵母を培養する。次に、培養液、米麹、水を混合し１次もろみを仕込む。１次もろみの組成は米麹１００重量部、水１００〜１４０重量部である。培養液は１次もろみ仕込み時点で酵母密度１×１０４〜１×１０７／ｍｌ、好ましくは１×１０５〜１×１０６／ｍｌとなるように添加する。酵母密度は国税庁所定分析法により測定する。この１次もろみを、２〜７日間発酵させる。
【００２８】
次に上記１次もろみに黒糖１００重量部、水２００〜４００重量部を加え２次もろみを仕込み、１〜５日間発酵させる。さらに上記２次もろみに黒糖１００重量部、水２００〜４００重量部を加え３次もろみを仕込み，発酵が終了するまで、８〜１６日間発酵させる。
【００２９】
もろみ温度は２５〜３２℃とした後に、３次もろみの任意の時期に、高温経過を実現するため、６〜２４時間、３５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃とする。その後２５〜３２℃とする。発酵終了もろみの果糖濃度及びアルコール度数を測定し、果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、発酵歩合が８５〜９５％であるものについて高発酵能酵母として分離する。
【００３０】
もろみ温度が高温であっても、アルコール発酵中の酢酸生成が少ない酵母（以下、低酢酸生成酵母）は、以下の手法で選別できる。高発酵能酵母と同様に、発酵試験を行ない、次に発酵終了もろみの酢酸濃度を高速液体クロマトグラフィーの外部標準物質による絶対検量線法により定量し、酢酸濃度４００〜７００ｍｇ／ｌの範囲にあるものを低酢酸生成酵母として分離する。
【００３１】
【実施例】
〔実施例１〕
果糖資化性酵母を以下の手法により分離した。黒糖もろみ中のSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母を遠心分離により集菌し滅菌水で洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。洗浄した菌塊を果糖選択培地（エタノール８０ｇ／ｌ、Difco Nitrogen Base６．７ｇ／ｌ、果糖５ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ）に適量塗抹し、培養温度４０℃で１４日間静置培養した。この結果、果糖資化性酵母２０株のコロニーが出現した。
これらの酵母のうち、Ka4-3、Ka4-10及びKa5-5を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636、FERM P-18637及びFERM P-18638である。
【００３２】
〔実施例２〕
高発酵能酵母を以下の手法により分離した。実施例１で得た果糖資化性酵母を用いて、表１に示したもろみ組成で発酵試験を行った。すなわち、米麹２０ｇ、水２４ｇ及び酵母培養液０．５ｇを２００ｍｌ容の三角フラスコに加え１次もろみを仕込み，５日間発酵した。この１次もろみに，黒糖２０ｇを水６０ｇに溶解した黒糖溶液を加え２次もろみを仕込み，２日間発酵した。この２次もろみに黒糖３０ｇを水５０ｇに溶解した黒糖溶液を加え，３次もろみを仕込み１２日間発酵した。発酵条件として、もろみ温度を１次仕込みから３次仕込み後２４時間経過するまで３０℃に保ち、その後１６時間を３７℃に保ったのち，３０℃に保った。
【００３３】
仕込み中の炭酸ガス減量経過の一例を図１に示した。また発酵歩合及び発酵終了もろみの果糖濃度を表２に示した。
この結果、高温条件下においても、残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、かつ発酵歩合が８５〜９５％であるアルコール発酵能が高い酵母を９株分離できた。この分離した酵母を表２の評価欄の○印で示した。これらの酵母のうち、Ka4-3及びKa4-10を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636及びFERM P-18637である。高発酵能酵母は、高温条件下においても既存の酵母と比べて極めて果糖資化性が高く、またアルコール収得も高い。
【００３４】
〔比較例１〕
既存酵母であるSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母の鹿児島２号酵母（Ｋ２）を用いて、実施例２と同様の条件で発酵試験を行った。仕込み中の炭酸ガス減量経過を図１に示した。また発酵歩合及び発酵終了もろみの果糖濃度を表２に示した。この結果が示すように、Ｋ２は炭酸ガス減量が少ないことがわかる。
【００３５】
〔実施例３〕
低酢酸生成酵母を以下の手法により分離した。実施例１で得た果糖資化性酵母及び比較対照の既存株としてSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母である鹿児島２号酵母（Ｋ２）を用いて、実施例２同様に発酵試験を行った。発酵終了もろみの酢酸濃度を表２に示した。この結果、高温条件下においても、もろみ中の酢酸濃度が４００〜７００ｍｇ／ｌである酢酸生成の少ない酵母を１７株分離できた。この分離した酵母を表２の評価欄の○印で示した。これらの酵母のうち、Ka4-3及びKa5-5を寄託した。それぞれの寄託番号は、FERM P-18636及びFERM P-で18638ある。低酢酸生成酵母は、高温条件下においても既存の酵母と比べてアルコール発酵中に生成する酢酸が極めて少ない。
【００３６】
〔比較例２〕
既存株であるSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母の鹿児島２号酵母（Ｋ２）を用いて、実施例３と同様の条件で発酵試験を行った。発酵終了もろみの酢酸濃度を表２に示した。この結果が示すように、Ｋ２は１４３０ｍｇ／ｌと酢酸濃度が極めて高い。
【００３７】
〔実施例４〕
実施例１で得たKa４−３酵母（以下４−３酵母）を用いて、表３に示したもろみ組成で発酵試験を行った。すなわち、米麹３６ｇ、水３６ｇ及び酵母培養液０．５ｇを３００ｍｌ容の三角フラスコに加え１次もろみを仕込み，５日間発酵した。この１次もろみに黒糖３０ｇを水９０ｇに溶解した黒糖溶液を加え２次もろみを仕込み，２日間発酵した。この２次もろみに黒糖３０ｇを水９０ｇに溶解した黒糖溶液に加え３次もろみを仕込み，９日間発酵した。
【００３８】
発酵条件として、もろみ温度を１次仕込みから３次仕込み後２４時間経過するまで３０℃に保ち、その後１６時間を３７℃に保ち、さらにその後３０℃に保った。仕込み中の炭酸ガス減量経過を図２に示した。また発酵歩合及び発酵終了もろみの果糖濃度を表４に示した。
この結果、本発明者らが分離したKa４−３酵母は、高温条件下においても、残存果糖濃度が２ｇ／ｌであり、発酵歩合が９０．２％である、極めて優れた高発酵能酵母である。またKa４−３酵母は、もろみ中の酢酸濃度が５０４ｍｇ／ｌであり、極めて優れた低酢酸生成酵母であった。
【００３９】
〔比較例３〕
Saccharomyces cerevisiaeに属する既存酵母である鹿児島２号酵母（Ｋ２）、鹿児島５号酵母（Ｈ５）、協会酵母（ＳＨ−４）、泡盛１号酵母（ＡＷ−１）、宮崎酵母（ＭＫ）を用いて、実施例４と同様の条件で発酵試験を行った。仕込み中の炭酸ガス減量経過を図２に示した。また発酵歩合及び発酵終了もろみの果糖濃度を表４に示した。この結果，これら既存の酵母は，炭酸ガス減量が少なく，酢酸濃度が高い。本発明者らが選別したKa４−３酵母は、既存酵母と比較して、高温条件下においても果糖資化性及びアルコール収得が高く、酢酸生成が少ない。
【００４０】
【表１】
0003876975.tif 000002
【００４１】
【表２】
0003876975.tif 000003
【００４２】
【表３】
0003876975.tif 000004
【００４３】
【表４】
0003876975.tif 000005
【００４４】
【発明の効果】
上述の結果から明らかなように、本発明により、高温、高エタノール条件下で、果糖を炭素源にして生育できる酵母を分離する新規な技術を完成した。この技術により、新規な酵母を取得できる。
【００４５】
また、本発明により、もろみ温度が高温であっても、果糖の資化性が高く、アルコール収得を低下させずに酒類を製造できる酵母を分離する新規な技術を完成した。この技術により、高温条件下においても、残存果糖濃度が１〜２０ｇ／ｌであり、かつ発酵歩合が８５〜９５％である、アルコール発酵能が高い新規な酵母を分離できる。これらの分離酵母は、高温条件下においても既存の酵母と比べて極めて果糖資化性が高く、またアルコール収得も高い。
【００４６】
さらに、本発明者により、もろみ温度が高温であっても、アルコール発酵中の酢酸生成が少なく、製品中の酢酸濃度が低い酒類を製造できる酵母を分離する新規な技術を完成した。この技術により、もろみ中の酢酸濃度が４００〜７００ｍｇ／ｌである酢酸生成の少ない酵母を分離できる。これらの分離酵母は、高温条件下においても既存の酵母と比べてアルコール発酵中に生成する酢酸が極めて少ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明者らが分離したKa4-3酵母と既存酵母である鹿児島２号酵母（Ｋ２）の発酵経過を示すグラフである。
【図２】本発明者らが分離したKa4-3酵母と既存酵母６株の発酵経過を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
0003876975.tif 000007