(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0004028647.tif 000012
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、フェニル基及びハロゲン化フェニル基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、いずれも水素原子であり、Ｘn-は硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン又はスルホン酸イオンである。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記一般式（２）
【化２】
0004028647.tif 000013
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基およびフェニル基からなる群より選択され、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 はメチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基からなる群より選択され、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
及びギ酸の存在下において光照射下に反応させることにより得られる反応生成物を含有してなる混合物であることを特徴とする化学発光試薬。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光試薬。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
【請求項４】
前記光照射に用いられる光源が、可視光を発する光源である請求項１〜３のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項５】
下記一般式（１）
【化３】
0004028647.tif 000014
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、フェニル基及びハロゲン化フェニル基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、いずれも水素原子であり、Ｘn-は硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン又はスルホン酸イオンである。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記一般式（２）
【化４】
0004028647.tif 000015
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基およびフェニル基からなる群より選択され、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 はメチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基からなる群より選択され、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物に
ギ酸を添加し、光照射下に反応させることにより得られる反応生成物を含有してなる混合物であることを特徴とする化学発光試薬の製造方法。
【請求項６】
前記光照射に用いられる光源が、可視光を発する光源である請求項５に記載の化学発光試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能であり、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる新規な化学発光試薬及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必ずしも充分とは云えない。
【０００４】
従って、試薬の調製及び発光系の操作が容易で、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記の事情に鑑み、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボンアミド化合物及びギ酸の存在下において光照射することにより得られる反応生成物を含有する化学発光試薬が、特定アルカリ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
従って、本発明の第一は、
下記一般式（１）
【０００７】
【化５】
0004028647.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記一般式（２）
【０００８】
【化６】
0004028647.tif 000003
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
及びギ酸の存在下において光照射下に反応させることにより得られる反応生成物を含有してなることを特徴とする化学発光試薬
に関するものである。
また、本発明の第二は、
下記一般式（１）
【０００９】
【化７】
0004028647.tif 000004
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記一般式（２）
【００１０】
【化８】
0004028647.tif 000005
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
及びギ酸の存在下において光照射下に反応させることを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、上記一般式（１）
で表わされる化合物である。
【００１２】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
【００１４】
また、一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン、ハロゲンイオン（例えば、塩素イオン、フッ素イオン、臭素イオン等）、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１５】
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げることができる。これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適である。
【００１６】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、上記一般式（２）
で表わされる化合物である。
【００１７】
上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ1 及びＲ3 のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基のものを挙げることができる。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１８】
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の化学発光試薬におけるギ酸の存在は、得られた化学発光試薬の発光反応時において発光強度を大幅に増大させる効果を有し、光照射による反応において化学発光性物質の生成量を増大させる作用を示すものと考えられる。この作用はギ酸に特異的であり、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等の他の有機酸類やホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒド類にはその効果は全く認められない。
【００２０】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられる光照射用の光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部を挙げることができ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。
【００２１】
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位又は溶媒和によって安定化され、この安定化されたビラジカル性化合物が、過酸化水素の酵素分解により生成する活性酵素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。
【００２２】
この発光反応におけるギ酸の作用については、明確な反応機構は不明であるが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進する作用を有するものと考えられる。
【００２３】
これらＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の使用割合としては、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で用い、ギ酸を１〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍モル、さらに好ましくは５０〜５００倍モルの量で用いることができる。さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２４】
本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２５】
本発明の新規化学発光試薬は、化学発光分析を行なう場合には、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で用いるのが望ましい。
【００２６】
前記発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。
【００２７】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としての過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量が必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍モルの範囲で用いるのが望ましい。
【００２８】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２９】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、発光反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例等に限定されるものではない。
［実施例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを２時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得た。
【００３１】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ギ酸を添加せずに発光反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認められた。
【００３２】
【表１】
0004028647.tif 000006
【００３３】
［比較例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得た。
【００３４】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光強度が得られた。
【００３５】
【表２】
0004028647.tif 000007
【００３６】
［実施例２］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを５時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得た。
【００３７】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ギ酸を添加せずに発光反応を行なった比較例２に較べて発光強度において大幅な改善が認められた。
【００３８】
【表３】
0004028647.tif 000008
【００３９】
［比較例２］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりルシゲニン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド複合体を含有する化学発光試薬を得た。
【００４０】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光強度が得られた。
【００４１】
【表４】
0004028647.tif 000009
【００４２】
［実施例３］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを２時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得た。
【００４３】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、ギ酸を添加せずに光反応を行なった比較例３に較べて発光強度において大幅な改善が認められた。
【００４４】
【表５】
0004028647.tif 000010
【００４５】
［比較例３］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを１時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得た。
【００４６】
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表６に示すような発光強度が得られた。
【００４７】
【表６】
0004028647.tif 000011
【００４８】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて比較的に短時間で容易に製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。