(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の組合せ、または
（ｂ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を含まないが、そのような相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質を、
粘液細菌細胞への転移に適当なトランスファー機能（ｔｒａ）および移動機能（ｍｏｂ）を含むプラスミドを用い、大腸菌である供与体から受容粘液細菌への接合転移を介して粘液細菌の細胞中に挿入し、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液細菌の染色体中に組み込むことを特徴とするソランジウム・セルロスムである粘液細菌の遺伝子操作方法。
【請求項２】
挿入されるべき遺伝物質が前記相同または実質的に相同なＤＮＡ部分により挟まれている請求項１記載の方法。
【請求項３】
挿入されるべき前記遺伝物質が粘液細菌の細胞において機能し得る発現配列に操作可能な様式で結合されている発現性ＤＮＡである請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の段階：
（ａ）粘液細菌標的生物または関連生物の完全ＤＮＡの調製；
（ｂ）（ａ）で単離された完全ＤＮＡの断片化；
（ｃ）（ｂ）で調製された断片の適当なプラスミドベクター内へのクローニングおよびクローニングのために通常使用される宿主生物の１種内への上記ベクターの形質転換；
（ｄ）組み込まれた粘液細菌ＤＮＡ断片を有するプラスミドを含むコロニーの選択および上記プラスミドの単離；
（ｅ）粘液細菌標的生物と接合様情報交換し得る供与生物内への（ｄ）で単離されたプラスミドＤＮＡの形質転換；
（ｆ）粘液細菌標的生物への組換えプラスミドＤＮＡの接合転移；
（ｇ）形質転換された粘液細菌細胞の培養および陽性形質転換体の選択
からなる請求項１記載のソランジウム・セルロスムである粘液細菌の遺伝子操作方法。
【請求項５】
挿入されるべき遺伝物質が、発現され得る１つ以上のＤＮＡ部分を含み、
そしてその中にクローン化された相同または実質的に相同なＤＮＡ領域を含むプラスミドである請求項１または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記相同ＤＮＡ部分と粘液細菌の染色体の相当する領域との間の相同性の度合いが８０％と１００％の間である請求項１または４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記相同ＤＮＡ部分が少なくとも１００Ｂｐからなる請求項１または４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記相同ＤＮＡ部分が０．３と４Ｋｂの間からなる請求項１または４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
大腸菌、シュードモナド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体からなる群から選択される原核生物が粘液細菌ＤＮＡ断片のクローニングのための宿主生物として使用される請求項４記載の方法。
【請求項１０】
制限陰性または制限欠失菌株が粘液細菌ＤＮＡ断片のクローニングのための宿主生物として使用される請求項４記載の方法。
【請求項１１】
粘液細菌ＤＮＡ断片のクローニングが粘液細菌標的生物と接合様情報交換し得る、供与生物内で直接行われる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
粘液細菌細胞が接合ＤＮＡ転移の直前に短時間の熱処理に晒される請求項４記載の方法。
【請求項１３】
熱処理が３５℃ないし６０℃の温度で１ないし１２０分の間行われる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌細胞の形質転換の際に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液細菌のゲノム中に組み込まれるべき上記ＤＮＡの組み込みが起こるように、粘液細菌ゲノム内の相当するＤＮＡ領域と相同性を有する組み込まれるべきＤＮＡ、またはこのような相同ＤＮＡ配列により挟まれている組み込まれるべきＤＮＡを含む、前記ソランジウム・セルロスムである粘液細菌のゲノム内の規定された部位に遺伝物質の組み込みを可能にする組換えＤＮＡ分子。
【請求項１５】
前記相同ＤＮＡ部分と粘液細菌の染色体の相当する領域との間の相同性の度合いが８０％と１００％の間である請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記相同ＤＮＡ部分が少なくとも１００Ｂｐの領域からなる請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】
組み込まれるべき前記ＤＮＡ配列自体が細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と十分大きな相同性を既に有し、このＤＮＡ配列と上記相同ゲノムＤＮＡとの直接交換が相同的組換えにより起こり得る請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１８】
挿入されるべき前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１９】
挿入されるべき前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２０】
挿入されるべき前記ＤＮＡが粘液細菌の細胞において機能し得る発現配列に操作可能な様式で結合されている発現性ＤＮＡである請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２１】
前記フランキングＤＮＡ部分が環の形態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユニットに一緒に融合されている請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記相同ＤＮＡ部分が粘液細菌ゲノム自体に由来する請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項１４ないし２２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を含むクローニングベクター。
【請求項２４】
挿入されるべきＤＮＡの他に、粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同または実質的に相同なＤＮＡ部分、ならびに粘液細菌細胞への転移に適当なトランスファー機能（ｔｒａ）および移動機能（ｍｏｂ）を含む、供与生物からソランジウム・セルロスムである受容粘液細菌への接合転移のためのプラスミドＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項１４ないし２２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を含む請求項２４記載のプラスミドＤＮＡ。
【請求項２６】
相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌ゲノムの形質転換の際に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により規定される部位で相同的組換えを介して前記細菌のゲノム中に上記ＤＮＡの組み込みが起こるように、粘液細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と相同性を有する粘液細菌のゲノム中に組み込まれるべきＤＮＡを、
（ａ）適当な供給源から単離するか、または
（ｂ）組み込まれるべき上記ＤＮＡが、粘液細菌の染色体上の相当する領域に相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を含まない場合には、このＤＮＡを相当する相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合する、請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項２７】
挿入されるべき前記ＤＮＡがプラスミド上に位置し、そして相同ＤＮＡ配列があらゆる所望の部位でプラスミドＤＮＡ内にクローン化されるが、しかしそれにより挿入されるべきＤＮＡの機能的完全性を破壊することがない請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
（ａ1 ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の組合せ、または
（ａ2 ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を含まないが、そのような相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質を、
粘液細菌細胞への転移に適当なトランスファー機能（ｔｒａ）および移動機能（ｍｏｂ）を含むプラスミドを用い、大腸菌である供与体から受容粘液細菌への接合転移を介して粘液細菌の細胞中に挿入し、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液細菌の染色体中に組み込み、そして
（ｂ）陽性形質転換体をそれ自体公知の選択方法を用いて選択し、そして純粋な培養物として培養する、
ことからなるソランジウム・セルロスムである粘液細菌の遺伝子的に改変された細菌の作出方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により作出された遺伝子的に改変された粘液細菌細胞。
【請求項３０】
相同的組換えを介して粘液細菌のゲノム内に組み込まれた同種および／または異種由来の外来ＤＮＡを含むソランジウム・セルロスムである遺伝子的に改変された粘液細菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は粘液細菌、好ましくはソランジウム(Sorangium) ／ポリアンジウム(Polyangium)群の遺伝子操作の新規方法に関するものであり、該方法はこの群の生物に組換えＤＮＡ技術を特異的に適用することを初めて可能にするものである。
【０００２】
特に本発明は、同種もしくは異種由来のＤＮＡ配列または同種および異種由来のＤＮＡ配列の組合せの上記粘液細菌の染色体への相同的組換えを介する挿入方法、およびこの方法により作出される遺伝子的に改変された粘液細菌に関する。
【０００３】
同様に、本発明に係る方法の使用に特に適している組換えＤＮＡ分子、プラスミドおよびベクター、そして同種および／または異種由来の外来ＤＮＡを含むソランジウム／ポリアンジウム群の遺伝子的に改変された粘液細菌細胞も包含される。
【０００４】
【従来の技術】
ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌は通常土壌、腐敗した植物体または動物の糞中に検出される非常に特殊化した生物である。この群の微生物の特徴は唯一の炭素源としてセルロースまたはセルロース含有減成物を利用できる能力である。この群のもう１つの特徴は非常に活性な二次代謝物質を産生する能力である。
【０００５】
例えば植物微生物殺傷性化合物を合成できるこの群からの非常に多くの菌株が今では記載されている。これに関して特に重要なのは、植物病原性微生物、特に植物病原菌に対して有用な殺生物性スペクトルを有するいわゆるソラフェンと呼ばれる、巨大環状化合物である。これらの化合物は非常に有利な治療的、浸透的、そして特に予防的特性を有し、多くの栽培植物を保護するために使用され得る〔２４〕（〔  〕内の数字は本明細書の末尾に記載した参考文献一覧の相当する番号の文献に一致する）。
【０００６】
抗生物質作用を有する非常に活性な化合物を合成できる粘液細菌の群のその他の代表的なものも知られている〔１８〕。これらの化合物の重要性により、適当な場合に該化合物に特異的に影響を及ぼし得る可能性を提供するためにその合成の遺伝子的基礎を理解することに大きな興味がある。
【０００７】
このための必須条件は、例えば全体のプラスミドを含む新規遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他のＤＮＡ配列のソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌のゲノム内への標的化混入による、組換えＤＮＡ技術を用いたこれらの生物の直接、そして好ましくは標的化操作を可能にする方法の提供である。
【０００８】
粘液細菌の群のいくつかの代表種は既にこの方向での研究の対象となっている。これに関連した特別な興味は主としてミクソコッカス・キサントゥス(Myxococcus xanthus)に向けられていたが、これはいまでは詳しく研究され、そして種々の遺伝子移入方法が既に記載されている粘液細菌である。このために、例えば大腸菌ファージＰ１が、最初はミクソコッカス・キサントゥス染色体中にトランスポゾンＴｎ５の挿入のために〔１０，１１〕、そしてその後にミクソコッカス・キサントゥス中にクローン化された遺伝子を最初の大腸菌宿主に戻し移入するために〔１６，２１〕、非常に集中的に使用されてきた。
【０００９】
遺伝子移入のもう１つの方法は非常に広い宿主範囲を有するプラスミドＲＰ４の使用に基づいている。ブレットン等はこのプラスミドが大腸菌からミクソコッカス・キサントゥス中に接合を介して移入され得、そして染色体中に安定に組み込まれ得ることを示すことができた〔１〕。これらの性質に基づいて、ブレットン等やブレットンおよびゲスピン−ミカエルはミクソコッカス・キサントゥスの染色体中に外来遺伝子を組み込むことができた〔２，３〕。ジャオウア等による研究は観察された組み込みが高い確率を有し、いわゆる部位特異的組換えに基づいていることを明らかにした〔８，９〕。後者は、ミクソコッカス・キサントゥスの染色体内の狭い空間的制限を有する特定の部位に制限され、そしてＰＲ４プラスミド上の１つ以上のいわゆるホットスポットにより仲介される。さらに、ここで発見された公知ミクソコッカス系はソランジウム／ポリアンジウム群の細菌に適用され得ないことが本発明の範囲内で行われた研究の間に明らかになった。これらの生物はその染色体上での部位特異的組換えに必要である特定の構造要素を欠いていることが予想される。さらに、例えばトランスポゾンＴｎ５の使用ではこれらの生物に安定な転移が起こらないことが見いだされた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は主として、公知方法の上記の制限がなく、ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌内への遺伝物質の間接または好ましくは標的化挿入を可能にする、ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌の遺伝子操作のために普遍的に適用可能な方法の提供である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題は本発明に従って、例えば、その特定の構造により染色体内の所望部位に挿入され得、そして上記公知方法における場合のように粘液細菌の染色体または使用されるプラスミド（ホットスポット）の機能的機構により前もって決定される、または組み込まれるトランスポゾンの転移に依存する特定の組み込み部位に結合されない、遺伝子構築物、特にプラスミドベクターを調製することにより解決され得る。
【００１２】
従って、本発明はまず、同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の組合せをソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌の細胞中に挿入し、そして相同的組換えを介してランダムに、または細菌のゲノムの構造的および機能的機構の適当な知識がある場合には、挿入されたＤＮＡと粘液細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性に基づいて正確に規定される部位に特異的に、粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、前記粘液細菌の染色体中に組み込むことを特徴とするソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌目の細菌の遺伝子操作方法に関する。
【００１３】
粘液細菌目の細菌の遺伝子操作のための本発明に係る方法は特に、
（ａ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同であるＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の組合せ、または
（ｂ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を自然に含まないが、そのような相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質、
を粘液細菌の細胞中に挿入し、そして粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌の染色体中に組み込むことを特徴とする。
【００１４】
相同的組換えを介する細菌染色体への遺伝物質の組み込みは、挿入されるべきＤＮＡ内の１つ以上のＤＮＡ部分により仲介され、該ＤＮＡ部分は粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である。従って、その組み込みは特定の染色体構造の存在に拘束されず、そして原理的に細菌染色体内のあらゆる所望の部位に起こり得る。
【００１５】
本発明に係る方法の範囲内で使用され得る相同ＤＮＡ部分は、所望の組換え結果を引き起こし得るために粘液細菌の染色体上の相当する部分と１００％の同一性を有することを必ずしも必要としない。これらのＤＮＡ部分は細菌のゲノム上の相当する領域と実質的に相同であれば、すなわちこれらが６０％と１００％の間、好ましくは８０％と１００％の間、そして特に９０％と１００％の間の相同性の度合いを有していれば十分である。
【００１６】
従って、「相同」ＤＮＡ部分はまた、以下において、粘液細菌染色体上の相当する領域と１００％の同一性を有しないが、これと少なくとも「実質的に相同」である部分を意味することが意図される。
【００１７】
これに関連して、相同ＤＮＡ部分は、例えば特定のゲノムの断片化の後に、標的生物自体または関連生物のいずれかから単離されることが可能である。各々の場合に組み込みのために使用されることが意図される粘液細菌染色体上のＤＮＡ部分のＤＮＡ配列が公知である場合、これらの染色体部分と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である相当するＤＮＡ断片はもちろん合成により調製され得る。
【００１８】
本発明の範囲内で使用され得る同種由来のＤＮＡ部分はさらに、公知配列のＤＮＡ部分、または任意に例えば相同ＤＮＡの制限消化の後に得られるＤＮＡ断片のいずれであってもよい。
【００１９】
粘液細菌のゲノムの構造的および機能的機構が公知である場合に、本発明に係る方法は、天然もしくは人工改変遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列と細菌ゲノム内の相同ＤＮＡ部分との交換により、粘液細菌ゲノム上に存在する遺伝子の標的化された予測可能な改変（その場での改変）を初めて可能にする。さらに、本発明に係る方法は、遺伝子の特異的スイッチオフ（遺伝子分裂）またはその他の方法、特に突然変異方法の適用により予め不活性化された遺伝子の補足により、粘液細菌の完全ゲノム内の個々の遺伝子の機能の特異的同定を可能にする。
【００２０】
細菌に固有の遺伝子の標的化およびそれ故に非常に効率の良いその場での改変（直接突然変異誘発）の他に、本発明に係る方法は多くのその他の可能な用途、例えば高い発現速度を有することが知られている領域中の付加的遺伝子コピーの混入、ならびに望ましくない遺伝子の除去およびスイッチオフを有する。さらに以下に示す別の可能な用途について今では考えることも可能である：
・細菌に固有の興味深い機能を有する遺伝子の前に強力または調節可能なプロモーターの混入。
・粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌中に種々の起源の遺伝子のクローニング。
・種々の起源の遺伝子のクローニングおよび発現。
・挿入された遺伝子のもう１つの微生物、例えばさらに別の操作のための大腸菌への戻し移入。
・最初に、組み込み部位に隣接する粘液細菌断片を同定するための放射性プローブとして、そして次にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の範囲内での増幅のためのパターン（鋳型）としての、挿入されたベクターの異種ＤＮＡの使用。
【００２１】
本発明はさらに、
（ａ1 ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同であるＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の組合せ、または
（ａ2 ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を自然に含まないが、そのような相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質、
を粘液細菌の細胞中に挿入し、そして粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌の染色体中に組み込み、そして
（ｂ）陽性形質転換体をそれ自体公知の選択方法を用いて選択し、そして純粋な培養物として培養する、
ことからなるソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌目の遺伝子的に改変された細菌の作出方法に関する。
【００２２】
従って、本発明は、遺伝物質の組み込みが計画された操作の個々の目的に応じて、公知配列の相同ＤＮＡ部分または未知配列の任意に選択される相同部分により仲介され得る場合に、粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌のゲノムの標的化遺伝子操作を初めて可能にする。
【００２３】
同様に、本発明は、それらの特定の構造により、遺伝物質、例えば適当な場合には、相同的組換えにより細菌ゲノム内に、ランダムに、または細菌のゲノムの構造的および機能的機構が知られている場合には、挿入されたＤＮＡと粘液細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される特定の部位に標的化されて、新規で所望の特性をコードする遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を組み込むことを可能にする組換えＤＮＡ分子、ならびに該組換えＤＮＡ分子の製造方法を含む。
【００２４】
本発明はさらに、適当な場合には新規および／または改良された特性を有し、前記組換えＤＮＡ分子の挿入により作出された、遺伝子的に改変された粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の遺伝子的に改変された粘液細菌を含む。
【００２５】
本発明はさらに、前記組換えＤＮＡ分子を依然として含む前記改変粘液細菌の子孫ならびにその突然変異体および変種に関する。
【００２６】
組換えＤＮＡ技術および細菌遺伝学において慣用である多くの用語が以下の記載において使用される。
【００２７】
発明の詳細な説明および特許請求の範囲、ならびにこれらの用語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解を確実にするために、以下に定義を記載する。
異種由来の遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入される種以外の種に由来するＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列は外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡとも呼ばれる。
同種由来の遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入される種と同一種に由来するＤＮＡ配列。
このＤＮＡは内因性ＤＮＡとも呼ばれる。
ＤＮＡ相同性：２またはそれ以上のＤＮＡ配列間の一致の度合い。
合成遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段により製造されるＤＮＡ配列。
プロモーター：宿主細胞内であらゆる所望の同種または異種ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ発現の調節配列であるが、前記遺伝子配列はそのようなプロモーターと操作可能な様式で結合されており、後者は宿主細胞内で活性である。
終結塩基配列：転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位の末端のＤＮＡ配列。
過産生植物プロモーター（ＯＰＰ）：このＯＰＰで形質転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察されるよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡの形態またはポリペプチドの量で測定される）、操作可能な様式で結合されたあらゆる機能遺伝子配列の宿主細胞内での発現を引起し得るプロモーター。
３’／５’非翻訳領域：ｍＲＮＡに転写されるけれどもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上流／下流に位置するＤＮＡ部分。この領域は、調節配列例えばリボソーム結合部位（５’）を含む。
ＤＮＡ発現ベクター：適当な宿主細胞内に挿入されたＤＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオファージ。
ＤＮＡトランスファーベクター：適当な宿主細胞内への遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオファージベクター。
相同的組換え：相同ＤＮＡ分子間のＤＮＡ片の相互交換。
突然変異体，変種：自然に、または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での処理その他を用いて人工的に作出され、そして本発明に必須の特徴および特性を依然有する微生物誘導体、外因性ＤＮＡでの形質転換により本発明に必須の特徴および特性を獲得した出発菌株の誘導体。
【００２８】
遺伝物質が組み込まれ、そしてその中でランダムに、または細菌のゲノムの構造的および機能的機構の適当な知識がある場合には、粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、ある場合に予め決定され得る、細菌ゲノム内の特異的に正確に規定される位置で発現されることが今可能である、粘液細菌目の細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の細菌のゲノムの好ましくは標的化遺伝子操作を可能にする方法を提供することが本発明の範囲内で初めて今可能になった。
【００２９】
本発明に係る方法はさらに、粘液細菌のゲノム中に相同的組換えにより外因性遺伝物質を混入することを可能にする認識に実質的に基づいており、全体のプラスミドを含む天然遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他のＤＮＡ配列の他に、人工的に改変された、および／または合成遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他のＤＮＡ配列を、それらが組換えに十分であり、粘液細菌のゲノム上の相当する部分と相同性を有するＤＮＡ部分を含むか、該ＤＮＡ部分により挟まれている限り、使用することが可能である。
【００３０】
本発明の範囲内で使用され得る相同ＤＮＡ部分は、所望の組換え結果を引き起こし得るためにソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌の染色体上の相当する部分と１００％の同一性を有することを必ずしも必要としない。これらのＤＮＡ部分は細菌のゲノム上の相当する領域と実質的に相同であれば、すなわちこれらが６０％と１００％の間、好ましくは８０％と１００％の間、そして特に９０％と１００％の間の相同性の度合いを有していれば十分である。
【００３１】
前記相同領域の大きさは変化し得るが、しかし少なくとも１００Ｂｐであるべきである。０．３Ｋｂと４Ｋｂの間、好ましくは１Ｋｂと３Ｋｂの間からなる相同の領域が本発明の範囲内で好ましい。
【００３２】
特定の構造により全体のプラスミドを含む遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の興味深いＤＮＡ配列を上記のような相同的組換えにより標的細胞のゲノム中に特異的に混入することを可能にする組換えＤＮＡ分子は本発明の必須構成要件を形成する。
【００３３】
本発明は特に、相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌細胞の形質転換の際に、粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液細菌のゲノム中に組み込まれるべき上記ＤＮＡの間接または好ましくは標準化組み込みが起こる粘液細菌ゲノム内の相当するＤＮＡ領域と相同性を有する組み込まれるべきＤＮＡ、またはこのような相同ＤＮＡ配列により挟まれている組み込まれるべきＤＮＡを含む、ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌のゲノム内の規定された部位に遺伝物質、例えば遺伝子、遺伝子断片またはその他のＤＮＡ断片の標的化組み込みを可能にする組換えＤＮＡ分子に関する。
【００３４】
上記組換えＤＮＡ分子は、組み込まれるべき、そして上記特性を有するＤＮＡを、
（ａ）適当な供給源から単離するか、または
（ｂ）組み込まれるべき上記ＤＮＡが、粘液細菌の染色体上の相当する領域に相同であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を自然に含まない場合には、このＤＮＡを相当する相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合する、方法で非常に容易に製造され得る。
【００３５】
組み込まれるべき前記ＤＮＡが発現性ＤＮＡ配列であるならば、該ＤＮＡ配列は細菌細胞において機能し得る発現シグナルに操作可能な様式で結合されており、そして適当な場合には、細菌のゲノム内の特定の領域と相同性を有するＤＮＡ部分により挟まれていることが有利である。これらのフランキング相同ＤＮＡ部分は環の形態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユニットに一緒に融合されていることが好ましい。
【００３６】
上記の後者のものは、前記発現性ＤＮＡ配列自体が細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と十分大きな相同性を既に有するならば不要となり得、このＤＮＡ配列と上記相同ゲノムＤＮＡとの直接交換が相同的組換えにより起こり得る。
【００３７】
二本鎖ＤＮＡの他に、本発明に係る方法において、一本鎖ＤＮＡおよび部分的に一本鎖ＤＮＡを使用することも可能である。
【００３８】
本発明の範囲内とされる定義に従う同種および異種遺伝子またはＤＮＡ配列の両方、ならびに合成遺伝子またはＤＮＡ配列が本発明に係る方法における使用に適している。
【００３９】
さらに、組み込まれるべきＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡから排他的に構築され得る。もう１つの可能性はｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡからなるハイブリッドＤＮＡ配列の構築を含む。
【００４０】
この場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同一遺伝子またはＤＮＡ部分に由来していても、また、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは異なる遺伝子またはＤＮＡ部分に由来していてもよい。しかしながら、各々の場合において、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡは同一または異なる遺伝子またはＤＮＡ部分から調製されることが可能である。
【００４１】
ＤＮＡ配列が１つ以上の遺伝子またはＤＮＡ部分を含むならば、これらは１つの同一生物から、様々な株に属する多数の生物から、または同一種の変種もしくは同一属の異なる種、または１属以上もしくは別の分類学的単位に属する生物から誘導され得る。
【００４２】
細菌細胞中の構造遺伝子の発現を可能にするために、適当である場合にはコード遺伝子配列がソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌細胞中で機能し得る発現配列に操作可能な様式で最初に結合されることが可能である。
【００４３】
従って、本発明の発現性ハイブリッド遺伝子構築物は構造遺伝子の他に、プロモーターおよびターミネーター配列の両方、好ましくはさらに３’および５’非翻訳領域の調節配列を包含する発現シグナルをも通常含有する。
【００４４】
粘液細菌において発現性ＤＮＡ配列の発現の誘導を起こし得るあらゆるプロモーターおよびターミネーターがハイブリッド遺伝子構築物の成分として使用され得る。
【００４５】
本発明に係る方法における使用に適するプロモーターの例は以下のものである：
・ミクソコッカス・キサントゥスの光誘導性プロモーター〔２３〕
・その他のミクソコッカス・キサントゥスのプロモーター
・放線菌、特にストレプトマイセテスのプロモーター
・大腸菌のプロモーター、例えばＴａｃ（ハイブリッド）、ＰL またはＴｒｐブロモーター。
【００４６】
本発明の範囲内で使用され得る適当な終結塩基配列は例えば文献〔７，２０〕に記載されている。
【００４７】
この方法で形成され、そして粘液細菌細胞中で活性な遺伝子および発現シグナルからなる機能単位は引続き、適当である場合には、相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌細胞の形質転換の際に、ランダムにまたは好ましくは、相同的組換えにより前記粘液細菌のゲノム内で、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性に基づいて規定される部位に相同ＤＮＡ配列により挟まれている遺伝子配列の特異的組み込みが起こるような程度に、粘液細菌ゲノム内に相当するＤＮＡ領域と相同性を有する１つ以上のＤＮＡ部分を両端に配置させ得る。さらに、このフランキング相同ＤＮＡ部分は本発明の範囲内で、環の形態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユニットに一緒に融合されていることが好ましい。
【００４８】
さらに、好ましい実施態様において、挿入されるべきＤＮＡは、同種ＤＮＡ部分を既に含むか、またはそれを後にクローン化することを必要とするプラスミド中に組み込まれる。
【００４９】
従って、目的が粘液細菌のゲノム中に、単一遺伝子または遺伝子断片のみを組み込むのではなく、上記遺伝子群または遺伝子断片群を含み得る完全プラスミドＤＮＡを組み込むことであるならば、上記同種ＤＮＡ配列をプラスミドＤＮＡ中に所望部位でクローン化すれば十分であるが、可能であれば、発現が意図される遺伝子は機能的に維持されるべきである。従って、この場合にもまた、これらの相同ＤＮＡ部分が環の形態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユニットに一緒に融合されているとみなされ得るから、組み込まれるべきＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）が相同ＤＮＡ配列により挟まれていると原理的にはみなされることが可能である。
【００５０】
構造遺伝子の他に、あらゆるその他の所望の遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列、例えば調節分子の結合部位、プロモーター、ターミネーター等を使用することもまた可能である。
【００５１】
細菌ゲノム内の相当する部分と十分な大きな相同性を有し、そのため相同的組換えを介して遺伝物質の交換を可能にする同種または異種由来の適当なＤＮＡ配列の選択により、遺伝子またはその他のＤＮＡ配列を、粘液細菌ゲノム中の予め決定された部位に特異的に組み込み、そして適当な場合にそこで発現させることが今初めて可能になった。
【００５２】
相同的組換えを介する交換に必要である、相同ＤＮＡ部分と相当するゲノムＤＮＡ領域との間の相同性の程度は種々のパラメーターに依存し、そしてそれ故に使用されるＤＮＡ配列に依存して各々の場合に適当な要求に適合させなければならない。少なくとも１００Ｂｐからなる相同領域が必要な組換え結果を引き起こすのに十分であると現時点の知識では考えられる。
【００５３】
０．３ないし４Ｋｂ、好ましくは１ないし３Ｋｂに及ぶ相同領域が本発明の範囲内で好ましい。
【００５４】
本発明の範囲内の相同ＤＮＡ部分としての使用に適当なのは、主として、粘液細菌完全ＤＮＡの単離、次に適当な制限酵素での消化により得られる同種由来のＤＮＡ配列である。上記相同ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列が公知である場合には、それらはもちろん合成により調製されてもよい。
【００５５】
しかしながら、標的生物のゲノムから直接単離されず、例えば関連生物から単離され、そのため、標的生物のゲノム上の相当するＤＮＡ領域とは１００％の同一性を必ずしも有せず、実質的に相同である、すなわち６０％と１００％の間、好ましくは８０％と１００％の間、そして特に９０％と１００％の間の相同性の度合いを有する異種由来の相同ＤＮＡ部分を使用することも可能である。
【００５６】
それ故に、本発明の必須構成要件は、同種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝子物質の組合せをソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌細胞中に挿入し、そして粘液細菌の染色体中に、存在する相同性により正確に規定される部位に特異的に相同的組換えを介して組み込むことを特徴とする、粘液細菌目の細菌の特異的遺伝子操作の方法により形成される。
【００５７】
従って、上記の方法で適当なハイブリッド遺伝子構築物を調製することにより、粘液細菌のゲノム内の細菌固有遺伝子の特異的改変を行うか、または粘液細菌ゲノム中に付加的遺伝子またはその他のＤＮＡ断片を混入することが本発明の範囲内で初めて今可能となった。組み込みが機能的遺伝子またはオペロン内で起こるならば、これは通常それらの不活性化を導き、結果として表現型に目視できる悪影響を導く。
【００５８】
このための特定の方法は、相同的組換えによりランダムに、または好ましくは存在する相同性により規定され、そのために予め決められ得る部位で細菌ゲノム中に組み込まれる、上記組換えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子、ハイブリッド遺伝子またはその他のＤＮＡ断片の１つで粘液細菌細胞を形質転換することである。
【００５９】
本発明の特定の実施態様において、遺伝物質の粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌への挿入は、供与細胞からソランジウム／ポリアンジウム受容細胞への接合移入を介して間接的様式で起こる。
【００６０】
相同的組換えを介する組み込みに十分である粘液細菌染色体との相同性を有する適当なプラスミドの製造方法は、例えば、まず最初に完全ＤＮＡを粘液細菌から単離し、そして断片化することである。この断片化は剪断力等の作用による機械的または好ましくは適当な制限酵素により行われ得る。
【００６１】
非常に多数の生成断片から適当な大きさのものを単離し、引続きそれらを適当なプラスミド中にクローン化することが可能である。同種ＤＮＡ断片ならびに同種および異種由来のＤＮＡ断片の適当なクローニングベクターへの結合は例えば文献〔１３〕に記載されるような標準法を用いて行われる。
【００６２】
これは通常、最初に適当な制限酵素で切断された、ベクターと組み込まれるべきＤＮＡ配列を必要とする。適当な制限酵素は、例えばブラント末端を有する断片を生じるもの、例えばSma Ｉ、Hpa ＩおよびEcoRV 、または粘着端を形成する酵素、例えばEcoRI 、Sac Ｉ、BamHI 、SalI、Pvu Ｉ等である。
【００６３】
互いに相補的である、ブラント末端を有する断片および粘着端を有する断片のどちらも、適当なＤＮＡリガーゼにより再び結合され、単一の連続的ＤＮＡ分子が形成される。
【００６４】
突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と処理して、適当な相補的ヌクレオチドで空隙を充填することによりブラント末端を製造することもできる。
【００６５】
他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および切断されたベクター分子の端部に相補的ホモポリマー尾部を添加するか、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加し、そして次に適当な酵素で切断することにより、粘着端を人工的に製造することもできる。
【００６６】
上記され、そして同種由来のＤＮＡ断片または同種および異種由来のＤＮＡ断片の組合せを含む構築物の製造および増幅のために、全ての慣用クローニングベクター、例えば宿主細胞に適合する種に由来する複製および調節配列を必ず有するプラスミドまたはバクテリオファージベクターを使用することも原理的に可能である。
【００６７】
通常クローニングベクターは形質転換された宿主細胞において表現型の選択特徴、特に抗生物質に対する耐性を導く特定の遺伝子の他に複製開始点を有する。形質転換されたベクターは宿主細胞への形質転換の後にこれらの表現型マーカーに基づいて選択され得る。
【００６８】
本発明の範囲内で使用され得る選択可能な表現型マーカーは、本発明の対象に制限を与えるものではないが、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、カナマイシン、ネオマイシンおよびブレオマイシンに対する耐性を含む。特定のアミノ酸に対する原栄養株はその他の選択マーカーとして例えば機能し得る。
【００６９】
本発明の範囲内では主として大腸菌プラスミド、例えば本発明の範囲内で使用されるプラスミドｐＳＵＰ２０２１が好ましい。
【００７０】
本発明の範囲内の上記クローニングのために適当な宿主細胞は主として原核生物であり、細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス(A. tumefaciens)、大腸菌(E. coli) 、エス．・チフィムリウム(S. typhimurium)およびセルラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens) 、さらにシュードモナド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体を含む。
【００７１】
大腸菌宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１株が特に好ましい。大腸菌ＨＢ１０１株の感応細胞はこれに関連して大腸菌の形質転換に慣用の方法を用いて製造される（“General recombinant DNA techniques"参照）。
【００７２】
形質転換および次の適当な培地上での単離は、選択培地上に平板培養することによる異なるスクリーニングに供される生成コロニーにより続けられる。引続き、その中にクローン化されてＤＮＡ断片を有するプラスミドを含むコロニーから適当なプラスミドＤＮＡを単離することが可能である。
【００７３】
異なる大きさの組換えプラスミドはこのようにして得られる。制限分析の後に、適当な大きさのプラスミドは、該プラスミドＤＮＡの粘液細菌細胞への次の挿入のために選択されることが可能である。このＤＮＡ移入はさらに、直接または好ましくは接合移入の範囲内で仲介宿主（供与細胞）を介して起こり得る。
【００７４】
それ故に、本発明の必須構成要件は、相同部分の他に、適当な場合に、細菌細胞またはその他の有用なＤＮＡ配列中で機能し得る発現シグナルに操作可能な様式で結合されている構造遺伝子もしくはその他の所望遺伝子または遺伝子断片１つ以上からなる遺伝子構築物を１つ以上含むプラスミドの構築に関する。これに関連して相同ＤＮＡ断片は細菌（粘液細菌）に固有であり、そのため完全に同種由来であるゲノム部分から全体が構成されるか、またはそれらは相同部分の他に異種由来のより高いまたは低い発現部分をも含み得る。純粋に異種由来の相同ＤＮＡ部分の使用もまた考えられる。
【００７５】
プラスミドは、上記され、そして適当な場合に所望遺伝子産物をコードする構造遺伝子を含む遺伝子構築物の粘液細菌細胞への挿入、および細菌ゲノム中への組み込みのための別の工程段階において使用され得る。
【００７６】
粘液細菌細胞への本発明に係る遺伝子構築物の移入は種々の方法で行われ得る。供与細胞から受容粘液細菌への接合移入が本発明の範囲内で好ましい。
【００７７】
さらに移入されるべきＤＮＡをまず最初に慣用のクローニングベクター中で上記したようにクローン化し、次に供与細胞として作用する適当な仲介宿主中に形質転換することは接合移入の範囲内で可能である。仲介宿主を介する迂回経路はＤＮＡのクローニングのため、および接合の範囲内の供与細胞としての使用のための両方に適当である宿主株を用いることにより回避され得る。
【００７８】
供与細胞として本発明の範囲内で使用され得る仲介宿主は実質的に、大腸菌、シュードモナド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体からなる群から選択される原核細胞である。
【００７９】
供与細胞から受容体へのプラスミドＤＮＡの接合移入のための必要条件はトランスファー機能（ｔｒａ）および移動機能（ｍｏｂ）の存在である。さらに、移動機能は少なくともトランスファー開始点（ｏｒｉＴ）を含み、そして移入されるべきプラスミド上に位置されていなければならない。一方、トランスファー機能（ｔｒａ）はプラスミドもしくはヘルパープラスミド上に位置されているか、または供与細胞の染色体中に組み込まれて存在していてもよい。
【００８０】
上記の条件に合致し、それ故に本発明の範囲内で好ましいプラスミドは実質的に不適合群Ｐ，Ｑ，Ｔ，Ｎ，ＷおよびＣｏｌＩである。Ｐ群プラスミドの原型はプラスミドＲＰ４である。本発明の範囲内で特に好ましいのは、ｍｏｂ機能（ＲＰ４ｍｏｂ）の成分としてトランスファー開始点（ｏｒｉＴ）を有するプラスミドＲＰ４からの１．９Ｋｂ断片を含むプラスミドｐＳＵＰ２０２１である。ｍｏｂ機能（ＲＰ４ｍｏｂ）を有するその他のプラスミド、例えばｐＳＵＰ１０１、ｐＳＵＰ３０１、ｐＳＵＰ４０１、ｐＳＵＰ２０１、ｐＳＵＰ２０２、ｐＳＵＰ２０３またはｐＳＵＰ２０５およびそれから誘導される誘導体〔２２〕は同様に本発明に係る方法の範囲内で使用され得る。
【００８１】
本発明の範囲内で行われた実験の間に、受容粘液細菌が供与株との保温の前で接合移入の間に短時間の熱処理に晒される場合に有利であることが明らかとなった。３５℃ないし６０℃、好ましくは４２℃ないし５５℃、特に４８℃ないし５２℃の温度で１ないし１２０分、好ましくは５ないし２０分の受容細胞の予備保温が好ましい。
【００８２】
染色体ＤＮＡに混入されたプラスミドＲＰ４のトランスファー遺伝子（ｔｒａ）を含む大腸菌供与株が本発明の好ましい実施態様において使用される。ＲＰ４のトランスファー機能（ｔｒａ）を有するヘルパープラスミドｐＭＥ３０５を含む大腸菌供与Ｗ３１０１株（ｐＭＥ３０５）が本発明の範囲内で好ましい。
【００８３】
方法技術にとって特に興味深く、そして本発明の範囲内で特に好ましいのは、組み込まれたＤＮＡ配列を有するベクターのクローニングのためと、接合移入の範囲内で供与細胞として使用するための両方に適当である細菌株である。制限陰性であり、そのために挿入された外来ＤＮＡを分解しない細菌株も同様に特に好ましい。上記の両方の条件を大腸菌ＥＤ８７６７株（ｐＵＺ８）は理想的に満たしているが、その他の適当な細菌株の代表としてここで記載するにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８４】
上記した供与細胞から受容粘液細菌への接合遺伝子移入の他に、粘液細菌に遺伝物質を挿入するためのその他の適当な遺伝子移入方法を使用することももちろん可能である。ここでは、粘液細菌細胞が高い電場強度に短時間晒されるエレクトロポレーション〔１２〕を介する遺伝子移入が主として記載され得る。原核細胞のエレクトロポレーションのための一般的でおおまかな条件は文献〔２５〕に記載されている。
【００８５】
【実施例】
次に実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
一般的な組換えＤＮＡ技術
本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当業者にとって一般的なものであるので、通常用いられる技術に関してここで簡潔に記載しておく。別に特記したことを除いて、これらの全ての操作は文献〔１３〕に記載されている。
【００８６】
Ａ．制限エンドヌクレアーゼでの切断
反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs) およびドイツ国マンハイムのベーリンガー(Bohringer) により推奨される緩衝溶液中に約５０ないし５００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。制限エンドヌクレアーゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇにつき添加し、そして反応バッチを上記の会社により推奨される温度で１ないし３時間保温する。６５℃で１０分間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を終結させ、エタノールでＤＮＡを沈澱させる。この方法は文献〔１３〕の第１０４ないし１０６頁にも記載されている。
【００８７】
Ｂ．ブラント末端を製造するためのＤＮＡのポリメラーゼでの処理
ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／ｍｌを、製造会社ニュー・イングランド・バイオラブスおよびベーリンガーにより推奨される緩衝液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を０．２ｍＭの濃度で含有する。反応は１５℃で３０分間行われ、次いで６５℃で１０分間加熱することにより終結される。５’突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoRI およびBamHI で切断することにより得られる断片のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片またはクレノウ断片が使用される。３’突出末端を製造するエンドヌクレアーゼ例えばPstII およびSacIにより製造される断片のためには、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これらの２つの酵素の使用は文献〔１３〕の第１１３ないし１２１頁に記載されている。
【００８８】
Ｃ．アガロースゲル電気泳動およびゲルからのＤＮＡ断片の精製
アガロースゲル電気泳動を文献〔１３〕の第１５０ないし１６３頁に記載のように水平型装置で行う。使用される緩衝液はその中に記載されているトリス−アセテート緩衝液である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまたはタンク緩衝液に存在するか、または電気泳動の後に添加されるいずれかの０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを用いて染色される。ＤＮＡを長波長の紫外線の照射により可視化する。断片をゲルから分離する場合には、使用されるアガロースは低いゲル化温度のものであり、これはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル(Sigma Chemical)から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削り取り、プラスチック管内に入れ、６５℃で約１５分間加熱し、次いでフェノールで３回抽出し、そしてエタノールで２回沈澱させる。この操作は文献〔１３〕の第１７０頁の記載とはわずかに異なっている。
【００８９】
変法として、ＤＮＡはジェネクリーン・キット(Geneclean kit)[米国カリフォルニア州ラ・ジョラのバイオ１０１社(Bio 101 Inc.)] を用いてアガロースから単離され得る。
【００９０】
Ｄ．ＤＮＡ末端への合成リンカー断片の付加
ＤＮＡ分子末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加することが必要な場合、上の項に記載したように、ブラント末端を製造するために、場合によってはこの分子をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この断片約０．１ないし１．０μｇを、ニュー・イングランド・バイオラブスから得られるホスホリル化リンカーＤＮＡ約１０ｎｇに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌおよび同社により推奨される緩衝液中の１mMＡＴＰを含有する２０ないし３０μｌ容量中で添加する。１５℃で一晩保温後、６５℃で１０分間加熱することにより反応を終結させる。反応バッチを次に、合成リンカー配列で切断する制限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約１００μｌに希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約５０ないし２００単位を添加する。混合物を適温で２ないし６時間保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に供し、そして上記Ｃのように断片を精製する。精製した断片は今では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製造された終端を有するであろう。これらの終端は通常粘着性であり、その結果、生成断片は同じような粘着端を有するその他の断片に容易に連結され得る。
【００９１】
Ｅ．ＤＮＡ断片からの５’末端ホスフェートの除去
プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減少させる（文献〔１３〕の第１３頁に記載されている）。正しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断の後、ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim) から得られる子ウシ消化管のアルカリホスファターゼ１単位を添加する。ＤＮＡを３７℃で１時間保温し、次にフェノールで２回抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。
【００９２】
Ｆ．ＤＮＡ断片の連結
相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、各々の断片約１００ｎｇは、ニュー・イングランド・バイオラブスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこの会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし４０μｌの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で１ないし２０時間行われる。ブラント末端を有するＤＮＡ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼの量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に保温される。
【００９３】
Ｇ．ＤＮＡの大腸菌内への形質転換
大腸菌ＨＢ１０１株、Ｗ３１０１株およびＥＤ８７６７株がほとんどの実験において使用される。文献〔１３〕の第２５０および２５１頁に記載されているように、塩化カルシウム法を用いてＤＮＡが大腸菌内に導入される。
【００９４】
Ｈ．プラスミドのための大腸菌のスクリーニング
形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラスミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験される。２種の慣用の方法は、文献〔１３〕の第３６６ないし３６９頁に記載されている。
【００９５】
Ｉ．プラスミドＤＮＡの大規模な単離
大腸菌からプラスミドを大規模に単離する方法は文献〔１３〕の第８８ないし９４頁に記載されている。
【００９６】
実施例１：ソランジウムの培養条件
ソランジウム・セルロスム(Sorangium cellulosum)をＧ５１ｂ液体培地（「培地および緩衝液」の項参照）中３０℃の温度で培養する。１８０ｒｐｍで震盪することにより培養液に空気を通す。別の培地としてＧ５２ｃ培地を使用することも可能である。「培地および緩衝液」の項に記載されたＳｏｌＥ培地は固体培地での培養に使用され得る。培養温度はこの場合も３０℃である。
【００９７】
実施例２：大腸菌の培養条件
大腸菌細胞をＬＢ培地〔１４〕中３７℃の温度で培養する。
【００９８】
実施例３：ソランジウム・セルロスムのストレプトマイシン耐性の自然発生突然変異体の調製
液体培地中ですすいだ３日齢のソランジウム・セルロスム培養液（野生型Ｓｏｃｅ  ２６株）２００μｌを、３００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した固体培地（ＳｏｌＥ培地）上で平板培養する。３０℃の温度で培養時間は１４日である。この培地上に成長するコロニーは自然発生のストレプトマイシン耐性突然変異体であり、これはさらに濃縮および精製のために同一培地（ストレプトマイシン含有）上でもう１回培養される。
【００９９】
これらのストレプトマイシン耐性コロニーの１つが選択され、そしてＳＪ３と命名される。この突然変異ソランジウム・セルロスムＳｏ  ｃｅ  ２６株は、ブダペスト条約に従って国際寄託機関として認められている「ドイチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハー」（ドイツ国ブラウンスヴァイク）に、寄託番号ＤＳＭ６３８０の下に１９９１年１月２５日寄託された。
【０１００】
実施例４：ソランジウムの完全ＤＮＡの調製
完全ＤＮＡを単離するために、定常期にあるソランジウム培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。細胞を除去し、そしてＳＴＥ緩衝液（「培地および緩衝液」の項参照）中に再び懸濁し、そして細胞密度を約１０9 細胞／ｍｌに調整する。
【０１０１】
次にこの懸濁液４５０μｌをＲＬＭ緩衝液（「培地および緩衝液」の項参照）２００μｌおよびジエチルピロカーボネート２μｌと混合する。十分で均一な混合は適当な装置、例えばボルテックス等を用いることにより確実に行われる。７０℃で３０分間インキュベーター中で保温した後、酢酸カリウム（５Ｍ）１００μｌを添加する。この混合物を氷上で１５分間保温し、５分毎に十分に混合する（ボルテックス）。遠心分離（１００００ｒｐｍで１５分間）後、上澄みをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）５００μｌとタンパク質の抽出のために混合する。もう１回の遠心分離（１００００ｒｐｍで１５分間）の後、ＤＮＡ画分を含む上層を除去し、そしてその中に依然として存在するフェノール分をジエチルエーテル（１ｍｌ）で除去する。ＤＮＡを次にエタノール１ｍｌの添加により沈殿させる。−７０℃で３０分間の保温の後、全混合物を１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして真空下で乾燥させる。最後にＤＮＡをＴＥＲ緩衝液中に溶解させる。
【０１０２】
実施例５：ソランジウム・セルロスムＳＪ３中へのｐＳＪＢ５５の接合移入
５．１  ２段階法
５．１．１  プラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソランジウムＤＮＡのクローニング
ソランジウムＳＪ３株から単離された染色体を制限酵素Pvu Ｉで切断する。この方法で得られる断片をプラスミドｐＳＵＰ２０２１〔２２〕中にクローン化する。これは最初にPvu Ｉで消化され、次にエタノールで沈殿される、プラスミドＤＮＡ０．２μｇおよび染色体ＤＮＡ１μｇを必要とする。沈殿物を除去し、乾燥し、そして乾燥ペレットを２回蒸留水１４μｌ中に再び懸濁する。次に１０倍濃縮連結緩衝液（「培地および緩衝液」の項参照）２．５μｌ、ウシ血清アルブミン（０．１％）２．５μｌ、ＡＴＰ（１０ｍＭ）２．５μｌ、ＤＴＴ（０．２Ｍ）２．５μｌ、Ｈ2 Ｏ８μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加する。全連結混合物を次いで約８℃の温度で一晩保温する。
【０１０３】
この連結混合物５μｌを組換えプラスミドのクローニングのために大腸菌ＨＢ１０１株中に形質転換する。このために大腸菌ＨＢ１０１株の感応細胞を大腸菌の形質転換に通常用いられる方法（“General recombinant DNA techniques"参照）により調製する。
【０１０４】
形質転換および引き続くカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天上での２４時間の培養の後に、生成するコロニーを、アンピシリン含有（６０μｇ／ｍｌ）培地およびアンピシリン非含有培地上での平行平板培養による鑑別スクリーニングに供する。結果として、ソランジウムＤＮＡ断片の組み込みによるそれらのアンピシリン耐性を消失したコロニーを単離することが可能である。次にプラスミドをこれらのアンピシリン感受性コロニーから単離する。
【０１０５】
異なる大きさの組換えプラスミドがこの方法で得られる。制限分析の後、これらのプラスミドの３つがさらに実験するために選択される。これらのプラスミドはｐＳＪＢ５０、ｐＳＪＢ５５およびｐＳＪＢ５８と命名され、それぞれ１Ｋｂ、３．５Ｋｂおよび４ＫｂのソランジウムＤＮＡ挿入物を含む。
【０１０６】
５．１．２  ソランジウム・セルロスム中へのプラスミドｐＳＪＢ５５の接合移入
ソランジウム・セルロスム中へのプラスミドｐＳＪＢ５５の移入はソランジウムと接合様情報交換し得る大腸菌Ｗ３１０１株（ｐＭＥ３０５）〔８〕の仲介で起こる。大腸菌プラスミドｐＭＥ３０５〔１７〕はこの場合ｐＳＪＢ５５の移動のためのヘルパープラスミドとして使用される。
【０１０７】
最初に、大腸菌Ｗ３１０１株（ｐＭＥ３０５）の感応細胞を、大腸菌の形質転換に通常用いられる方法により、予め単離されたｐＳＪＢ５５プラスミドＤＮＡ５μｌで形質転換させる。形質転換された大腸菌細胞はそれによりプラスミドｐＳＪＢ５５のための供与体となる。
【０１０８】
実際の移入のために、定常期にあるソランジウム・セルロスムＳＪ３培養液（４×１０8 ないし１−４×１０9 細胞／ｍｌ）１５ｍｌを、相当量の細胞を含む大腸菌供与細胞の後期対数期にある培養液１０ｍｌと混合する。これらを次に４０００ないし８０００ｒｐｍで１０分間一緒に遠心分離し、そしてＧ５１ｂまたはＧ５１ｔ培地５００μｌ中に再び懸濁する。
【０１０９】
ソランジウム受容細胞を大腸菌との接合前に水浴中での熱処理に短時間晒すことは有利である。ソランジウム・セルロスムＳＪ３株での最良の移入結果は５０℃の温度で１０分間の熱処理で達成され得る。これらの条件下で１−５×１０-5の移入頻度が達成され得、これは予備的な熱処理なしでの操作と比較して１０倍の増加に相当する。
【０１１０】
ＳｏｌＥ固体培地のプレートに移し、３０℃で２日間保温する。細胞を次に集め、そしてＧ５１ｂまたはＧ５１ｔ培地１ｍｌ中に再び懸濁する。この細菌懸濁液１００μｌを、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）の他にフレオマイシン（２０ないし３５ｍｇ／ｌ）およびストレプトマイシン（３００ｍｇ／ｌ）を選択剤として含有する選択ＳｏｌＥ培地上に平板培養する。供与株〔大腸菌Ｗ３１０１（ｐＭＥ３０５）〕の逆選択がストレプトマイシンを用いて行われる。
【０１１１】
１０ないし１４日の培養期間の後に選択ＳｏｌＥ培地上に成長するコロニーはプラスミドｐＳＪＢ５５の接合移入によりフレオマイシン耐性を獲得したソランジウム・セルロスムのトランス接合体である。これらのフレオマイシン耐性コロニーは次の分子生物学的研究に使用され得る。プラスミドｐＳＪＢ５５のソランジウムへの移入の形質転換頻度は平均で受容ＳＪ３株に基づいて３×１０-6である。
【０１１２】
プラスミドｐＳＪＢ５０およびｐＳＪＢ５８はソランジウムに同様の方法で移入され得る。
【０１１３】
５．２  １段階法
５．２．１  プラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソランジウムＤＮＡのクローニング
プラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソランジウムＤＮＡのクローニングは実施例５．１．１に記載のように行われ得る。
【０１１４】
５．１．１で使用されたヘルパープラスミドｐＭＥ３０５を、このプラスミドとは異なり、アンピシリン耐性遺伝子を含まないプラスミドｐＵＺ８〔６〕に代えることにより、接合移入に意図される大腸菌供与株ＥＤ８７６７中での直接クローニングが今では可能であるので、大腸菌仲介宿主ＨＢ１０１でのクローニング段階を省略できる。
【０１１５】
プラスミドｐＵＺ８は、広い宿主範囲を有し、そして文献〔４〕に記載されているプラスミドＲＰ４の誘導体である。出発プラスミドＲＰ４と比べた場合の相違はアンピシリン耐性遺伝子および挿入エレメントＩＳ２１（これらの両方は欠失されている）、そして水銀イオンに対する耐性を付与する付加的遺伝子の混入に実質的に関する〔８〕。
【０１１６】
それ故に、実施例５．１．１で調製された連結混合物は今では大腸菌ＥＤ８７６７株中に直接形質転換され得る。このために、大腸菌ＥＤ８７６７株の感応細胞は大腸菌の形質転換に通常用いられる方法（“General recombinant DNA techniques"参照）により調製される。
【０１１７】
形質転換および引き続くテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天上での２４時間の培養の後に、生成するコロニーを、アンピシリン含有（６０μｇ／ｍｌ）培地およびアンピシリン非含有培地上での平行平板培養による鑑別スクリーニングに供する。結果として、ソランジウムＤＮＡ断片の組み込みによるそれらのアンピシリン耐性を消失したコロニーを単離することが可能である。このようにして得られる培養体は次にソランジウム・セルロスム細胞中への組換えプラスミドの接合移入のための供与細胞として直接使用され得る。
【０１１８】
上記連結混合物の代わりに、この場合には、実施例５．１．１で調製されたような組換えプラスミドｐＳＪＢ５０、ｐＳＪＢ５５およびｐＳＪＢ５８を大腸菌ＥＤ８７６７株中にクローン化することも可能であることはもちろんである。
【０１１９】
５．２．２  ソランジウム・セルロスム中への組換えプラスミドの接合移入
実際の移入のために、定常期にあるソランジウム・セルロスムＳＪ３培養液（１−４×１０9 細胞／ｍｌ）１５ｍｌを、相当量の細胞を含む大腸菌供与細胞の後期対数期にある培養液１０ｍｌと混合する。これらを次に４０００ｒｐｍで１０分間一緒に遠心分離し、そしてＧ５１ｂまたはＧ５１ｔ培地５００μｌ中に再び懸濁する。
【０１２０】
ソランジウム受容細胞を大腸菌との接合前に水浴中での熱処理に短時間晒すことは有利である。ソランジウム・セルロスムＳＪ３株での最良の移入結果は５０℃での温度で１０分間の熱処理で達成され得る。これらの条件下で１−５×１０-5の移入頻度が達成され得、これは予備的な熱処理なしでの操作と比較して１０倍の増加に相当する。
【０１２１】
形質転換されたソランジウム細胞の培養は実施例５．１．２に記載した方法と同様に行われる。
【０１２２】
供与株としての制限陰性大腸菌株、例えば大腸菌ＥＤ８７６７〔１５〕の使用により、形質転換頻度は上記の方法と比べ著しく（１０3 倍まで）高められ得る。
【０１２３】
分子遺伝学的分析
（Ａ）ソランジウム・セルロスムＳＪの染色体内へのプラスミドｐＳＪＢ５５の組み込みの検出
上記のようにして（実施例４参照）形質転換されたソランジウム細胞から単離された完全ＤＮＡをSmaIおよびSalIで消化し、そして水平トリスアセテート（４０ｍＭトリスＨＣｌ，２０ｍＭ酢酸ナトリウム，２ｍＭ  ＥＤＴＡ  Ｎａ2 ，ｐＨ７．８）アガロースゲル（０．９％）上に注入する。電気泳動の後、ゲルを最初に変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＯＨ）中に３０分間、次に中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５ＭトリスＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  Ｎａ2 ，ｐＨ７．２）中に入れる。２０倍濃縮ＳＳＣ緩衝液（「培地および緩衝液」の項参照）を用いるサザン・キャピラリー・ブロッティングによりＤＮＡをナイロンメンブラン（例えばアマルシャム・ハイボンド・ナイロンメンブラン，アマルシャム・インターナショナル社，英国ＨＰ７  ９ＮＡ，アマルシャム，アマルシャム・プレイス）上に移送し、そして６分間のＵＶ処理によりそこに固定する。この方法のその他の詳細はアマルシャム・インターナショナル・ハンドブック“Membrane Transfer and Detection Methods" (1985)に記載されている。
【０１２４】
ハイブリダイゼーションプローブとされるＤＮＡをニックトランスレーション〔１９〕により標識する。これにより、プラスミドｐＳＪＢ５５より３．５Ｋｂからなる32Ｐ−標識ＰｖｕＩ挿入物の形態で採取される。実際のハイブリダイゼーションはデンハルトの方法〔５〕をわずかに改変した方法により行われる。予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションに使用される緩衝液は以下の組成を有する：６×ＳＳＣ〔１３〕＋５×デンハルト〔１３〕＋０．５％ＳＤＳ＋０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ。
【０１２５】
予備ハイブリダイゼーションは６５℃で行われ、３時間を要し、一方、実際のハイブリダイゼーション反応は２０時間後に完了する。ハイブリダイゼーションのために、プラスミドｐＳＪＢ５５由来の３．５Ｋｂからなる32Ｐ−標識（１０5 ｃｐｍ／ｃｍ2 フィルター）変性ＰｖｕＩ断片を添加する。ハイブリダイゼーションの後に、フィルターを２倍濃縮ＳＳＣ中６５℃の温度で２×１５分、次に２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中同様に６５℃で３０分、そして最後に０．５×ＳＳＣでさらにもう１回（６５℃で１５分）洗浄する。
【０１２６】
引続き、オートラジオグラフィーがＸ線フィルム（例えばフジＸ線フィルム）を用いて行われる。トランス接合体のオートラジオグラフは、過らせん体の形態にある遊離ｐＳＪＢ５５プラスミドＤＮＡに相当するバンドを示さない。しかしながら、これに対し、陽性シグナルはフィルターメンブランの染色体領域中に見いだされる。
【０１２７】
SmaI消化プラスミドｐＳＪＢ５５は８．９、６．７および１．６Ｋｂの３つのバンドを与える。親株ＳＪ３のSmaI消化後のハイブリダイゼーションパターンは同様に３つのバンドを示し、その１つはプラスミドｐＳＪＢ５５中にクローン化されたソランジウム挿入物の１．６Ｋｂからなる内部断片に相当する。トランス接合体のSmaI消化ＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンは、３種全てに共通する１．６Ｋｂバンドを含む５つのバンド（プラスミドｐＳＪＢ５５およびＳＪ３バンドの８．９および６．７Ｋｂバンド）を示す。
【０１２８】
SalI消化の後、１４．１ＫｂのバンドがプラスミドｐＳＪＢ５５に見いだされる（ｐＳＪＢ５５の３．１Ｋｂからなるその他のSalI断片はプローブとハイブリッド形成しない）。SalI消化ＳＪ３ＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンは同様に５Ｋｂのバンドを示す。トランス接合体において、プラスミドｐＳＪＢ５５の１４．１Ｋｂ断片およびＳＪ３の５Ｋｂ断片はSalI消化の後に消失する。これらは１１．５Ｋｂおよび７．７Ｋｂの２つの新たなバンドに置換される。
【０１２９】
SmaIデータは、全てのｐＳＪＢ５５断片がトランス接合体のゲノム中で無傷であることを示す。この場合、SmaI断片の少なくとも１つが必ず消失するであろうから、部位特異的組換えの可能性がなくなる。さらに、SalI消化の結果は、プラスミドｐＳＪＢ５５がソランジウムゲノム中に、特にｐＳＪＢ５５と相同なＤＮＡ領域（＝３．５Ｋｂ  ＰｖｕＩ断片）が位置する部位に組み込まれたことを明らかにする。この組み込みは、ｐＳＪＢ５５由来の３．５Ｋｂからなるソランジウム挿入物とソランジウムゲノム内の同様な挿入物との間の相同的組換えにより起こる。
【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
寄託
本発明の範囲内の以下の微生物およびプラスミドはブダペスト条約に従って国際寄託機関として認められているドイツ国ブラウンスヴァイクにある「ドイチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハー」に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する要求を満たすために寄託された。
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【０１３３】
参考文献一覧
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