(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する新規フィターゼ。
(1)作用；フィチン酸を加水分解して、ミオイノシトール及び遊離のリン酸を生成する。
(2)基質特異性；フィチン酸に対して強く作用し、各種リン酸エステルにも作用する。
(3)作用ｐＨ及び至適ｐＨ；２〜６の範囲で活性を示し、至適ｐＨは４〜５である。
(4)ｐＨ安定性；３７℃で１時間保持した場合、ｐＨ２．５〜６．５の範囲で安定である。
(5)作用温度及び至適温度；３０〜６０℃の範囲で活性を示し、至適温度は５５℃である。
(6)温度安定性；ｐＨ５．５で３０分間保持した場合、５５℃まで安定である。
(7)分子量；ゲル濾過法による分子量は130〜150kDaである。
(8)等電点；ショ糖密度勾配等電点電気泳動法による等電点は、４．４である。
【請求項２】
請求項１に記載のフィターゼを生産するペニシリウム
（Penicillium）属に属する微生物
【請求項３】
請求項２に記載の新規微生物株を培養し、培養物中に請求項１に記載のフィターゼを生成蓄積せしめ、該培養物中からこれを採取することを特徴とするフィターゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規フィターゼ、これを生産する微生物及び該フィターゼの製造法に関する。更に詳細にはペニシリウム（Penicillium）属由来の新規フィターゼに関し、飼料や食品の品質改善及び環境汚染防止に利用することができ、飼料工業、食品工業分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
リンは全ての生物の生育に必須の元素であるが、穀類、豆類等の植物種子に含有されているリンの大部分はフィチン態で存在する。単胃動物であるヒトや、豚、鶏等の家畜は、フィチンを分解できないため、植物種子由来の食品や飼料（穀類、豆類）を摂取しても、フィチン態リンを全く利用できない。そのため、単胃家畜を良好に生育させるために、不足分のリン酸分としてリン酸カルシウム等の無機リン酸を飼料中に添加することが一般的に行われている。また、食品や飼料中のフィチン態リンは、栄養源として利用されないだけでなく、そのまま排泄物中に排出されるため、環境汚染（リン公害）を引き起こし、問題となっている。さらに、フィチン酸は、タンパク質と結合し、消化酵素の働きを阻害させたり、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、鉄等のミネラルをキレートし、栄養的に重要なミネラルの吸収を妨げることから、栄養学的な面からフィチン酸の除去方法が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これらの問題を解決するため、微生物由来のフィターゼの利用、すなわち、食品や飼料にフィターゼを添加することによりフィチン酸を分解せしめ、ミネラルの吸収阻害を防止し、また排泄されるフィチン態リンの量を低減させ、環境汚染を防止することが報告されている（J.Nutrition,101,1289(1971)等）。
【０００４】
フィターゼ生産菌としてはアスペルギルス（Aspergillus）属、ノイロスポラ（Neurospora）属等のかび、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、バチラス（Bacillus）属、シュウドモナス（Pseudomonas）属等の細菌が知られている。しかしながら、これまで知られた微生物の多くはフィターゼ生産能が非常に低く、酵素製造コストが高くなるため応用はほとんど進んでいない。また、フィターゼ生産能が比較的高いものとして、ノイロスポラ（Neurospora）属（特開平7-59562）やペニシリウム・カゼイコラム（Penicillium caseicolumn）（特開平7-67635）が報告されているが、飼料や食品にフィターゼを直接添加し消化器系で作用させるためには、中性から酸性領域で安定であり且つ作用することが必要であるのに対し、前者は酸性域での安定性に、後者は弱酸性〜中性域での安定性に問題がある。
本発明は、実用的に使用可能なフィターゼ生産能の高い微生物により、中性から酸性域で安定且つ良好に作用する新規なフィターゼを製造する方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記のような性質を有するフィターゼ生産能の高い微生物を広く自然界より探索した結果、土壌より分離したペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物が顕著に高いフィターゼ生産能を有し、本菌の生産するフィターゼがかかる用件を満たすことを見い出した。さらに、鋭意検討の結果、本菌を用いてフィターゼを著量製造する方法を確立すると共に、ペニシリウム属の菌株において、中性から酸性域で安定且つ良好に作用するフィターゼ生産菌株は本菌株が初めてであることを知ることによって本発明を完成するに到った。すなわち本発明はペニシリウム属に属する新規な微生物を培養することにより、その培養液中に中性から酸性域で安定且つ良好に作用する特定の新規フィターゼを生成蓄積せしめ、培養物から該フィターゼを採取することを可能にするものである。
【０００６】
−生産菌−
本発明のフィターゼの生産に使用する微生物は、ペニシリウム属に属し、上記の理化学的性質を有するフィターゼを生産することができるものであれば、いかなるものでも良いが、具体的には本発明者らが土壌より分離したペニシリウムＡ−１３４６株が挙げられる。本菌株は、以下に示すような菌学的性質を有する。
（ａ）形態
分生子柄は単生で、滑面であり、長さ10〜58μｍ、幅は約２μｍである。フィアライドは矛先型で、長さ10〜18μｍ、幅２〜３μｍであり、１分生子柄当たり１〜３個形成する。分生子は卵形〜楕円形で長さ４〜５μｍ、幅２〜３μｍであり、フィアライド先端部に連鎖状に形成する。
（ｂ）生育
ツァペックイーストエキス寒天培地で培養した場合は、37℃、７日間で直径27〜32ｍｍ、25℃、７日間で直径26〜28ｍｍの菌叢に生育する。集落表面の組織は薄いビロード状であり、集落表面の色調は白色〜黄色がかった白色、集落裏面の色調は灰色がかった黄色である。生育ｐＨ範囲は３〜７で最適ｐＨは５〜６、生育温度範囲は15〜40℃で最適温度は２８〜３０℃である。
上記の菌学的性質に基づき文献〔Compendium of Soil Fungi, volume１(1993)等〕を参考に検討した結果、この菌株はペニシリウム（Penicillium）属に属することが判明した。また本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７４４として寄託されている。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のフィターゼを製造するにあたっては、上記菌株を培養し、その培養物より採取すればよい。
培地の栄養源としては、本菌が円滑に生育する限り特に限定されるものではなく、炭素源としては、資化しうる炭素化合物、例えばグルコース、フラクトース、マルトース、サッカロース、油脂、穀類などを使用することができ、窒素源としては資化しうる窒素化合物、またはこれを含有するものであればよく、例えば硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、各種ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、コーンスティープリカーなどを用いることができる。また、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム等の無機塩や、無機、有機微量栄養源を培地中に添加することができる。
【０００８】
培養の形態は、液体、固体培養いずれでも良い。液体培養における培養条件は培地組成により多少異なるが、培地の初発ｐＨを３〜７の範囲、好ましくは５〜６の範囲に調整し、培養温度15〜40℃、好ましくは28〜30℃で好気的に３〜７日間程度培養を行い、フィターゼ生産量が最大に達したときに培養を終了すれば良い。この様な培養により目的とするフィターゼは主として菌体外に得られる。
【０００９】
こうして得られた培養液から、目的物であるフィターゼを回収並びに精製するには、一般的に行われる酵素の採取法ないし精製方法に準じて行えばよい。すなわち、得られた培養液は、遠心分離や濾過等によって菌体を除去した後、その上澄液を粗酵素液として回収する。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて硫安等の塩類による塩析法、あるいはエタノール、アセトン等の有機溶剤による沈澱法等によって活性画分を回収し、限外濾過膜法等の常法により濃縮後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の精製手段を適宜組み合わせてフィターゼを分別精製することができる。また、所望により適宜な乾燥法により、粉末状に回収することもできる。
【００１０】
−酵素活性測定法−
本発明において使用したフィターゼ活性の測定方法は以下に示すとおりである。即ち、4mMフィチン酸ナトリウムを含む 0.2M酢酸緩衝液（pH 5.5）0.5ml、蒸留水 0.4ml及び酵素液 0.1mlからなる反応液を 37℃で 30分間反応させ、10％ＴＣＡ 1.0mlを加えて反応を停止させる。この反応液中の無機リン酸量をFiske-Subbarow法により定量し、活性を求めた。活性の単位は、１分間に１マイクロモルの無機リン酸を遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１１】
−酵素学的性質−
ペニシリウムＡ−１３４６株の生産するフィターゼの酵素学的性質は、以下のとおりである。
（１）作用：フィチン酸を加水分解して、ミオイノシトール及び遊離のリン酸を生成する。
（２）基質特異性：種々の基質に対する活性を測定し、フィチン酸ナトリウムに対する活性を１００として表１に示した。本発明のフィターゼは種々の基質に作用し、特にフィチン酸及びｐ−ニトロフェニルリン酸に対してよく作用した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
(3)作用ｐＨ及び至適ｐＨ：フィチン酸ナトリウムを基質とした際のｐＨの影響を図１に示した。本発明のフィターゼの作用ｐＨ範囲は２〜６であり、至適ｐＨは４〜５であった。
(4)ｐＨ安定性：各ｐＨ値において、３７℃で１時間処理した際のｐＨ安定性を図２に示した。本発明のフィターゼは、ｐＨ２．５〜６．５の範囲で安定であった。
(5)作用温度及び至適温度：フィチン酸ナトリウムを基質とした際の、0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)中における作用温度を図３に示した。本発明のフィターゼの作用温度は３０〜６０℃であり、至適温度は５５℃であった。
(6)温度安定性：0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）中で、３０分間処理した際の温度安定性を図４に示した。本発明のフィターゼは５５℃まで安定であった。
(7)分子量：ゲル濾過法により得られた分子量は、130〜150kDaであった。
(8)等電点：ショ糖密度勾配等電点電気泳動法により得られた等電点は、４．４であった。
(9)金属イオンの影響：活性測定時に1mMの各種金属イオンを共存させた際の活性発現率を表２に示した。本発明のフィターゼの活性は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｎ２＋、Ｐｂ２＋、Ａｌ３＋により阻害された。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
（１０）各種阻害剤の影響：活性測定時に５mMの各種キレート剤、各種ＳＨ酵素阻害剤及びアジ化ナトリウムを共存させた際の活性発現率を表３に示した。本発明のフィターゼの活性は、これらの阻害剤にほとんど影響されなかった。
【００１６】
【表３】
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【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明を詳細に説明するが、これによって本発明は限定を受けるものではない。
【００１８】
−実施例１−
フィターゼ生産に従来よく用いられているアスペルギルス属の菌株を用いて、本菌株との生産性の比較を行った。米ぬか10％、塩化アンモニウム0.5％、硫酸マグネシウム0.05％、塩化カリウム0.05％を含む液体培地20mlを100mlの三角フラスコに入れ、121℃で20分間滅菌した後、各菌株の胞子懸濁液を接種し、30℃、210rpmで５日間、回転振盪培養した。この培養液を遠心分離し、その上澄のフィターゼ活性を測定した。その結果を表４に示した。本菌株はアスペルギルス属の菌株に比べて顕著に高い生産性を示した。
【００１９】
【表４】
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【００２０】
−実施例２−
実施例１の液体培地2.5Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、121℃で20分間滅菌した後、予め30℃、３日間振盪培養したペニシリウムＡ−１３４６株の前培養液を接種し、30℃、500rpm、１vvmで５日間通気撹拌培養した。この培養液を遠心分離により菌体を除去して、上澄液を回収し、フィターゼ活性を測定したところ4.8Ｕ／mlであった。この上澄液に硫酸アンモニウムを0.8飽和となるまで添加して、沈澱する酵素を回収した後、再溶解して限外濾過膜（旭化成製  分画分子量6000）により脱塩、濃縮を行った。さらに、凍結乾燥を行い、比活性257Ｕ／ｇの粗酵素粉末を約25ｇ得た。
【００２１】
−実施例３−
各飼料成分（脱脂米糠、小麦ふすま、とうもろこし）１ｇを水15mlに懸濁した後、本酵素を５Ｕ添加し、39℃で60分間処理した（食道の条件）。次に、0.5％ペプシン溶液（pH３）を５ml添加後、塩酸を用いてｐＨ３に調整し、39℃で90分間処理した（胃の条件）。処理後の遊離リン酸量を定量し、酵素無添加の条件での遊離リン酸量を差し引くことにより、酵素反応による遊離リン酸量を算出した。その結果を表５に示した。本酵素により各飼料成分に含まれているフィチン酸が有効に分解されることが認められた。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
【発明の効果】
ペニシリウム属のカビを用いることにより、大量のフィターゼを容易且つ安価に取得できる。また、本発明のフィターゼは、中性から酸性域で安定且つ良好に作用するため、飼料や食品にフィターゼを直接添加することにより、消化器官内でフィチンを分解し、遊離したリン酸の有効利用、ミネラル吸収阻害防止、並びに排泄物中のリン低減化による環境汚染防止等の効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の酵素の作用ｐＨ及び至適ｐＨの関係を示す。縦軸の値は、pH4.5における活性を100％とした相対活性である。
【図２】  本発明の酵素のｐＨ安定性を示す。縦軸の値は、37℃にて１時間処理した後の残存活性である。
【図３】  本発明の酵素の作用温度及び至適温度の関係を示す。縦軸の値は、55℃における活性を100％とした相対活性である。
【図４】  本発明の酵素の温度安定性を示す。縦軸の値は、pH 5.5にて30分間処理した後の残存活性である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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