(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたｆｌｔ３−Ｌポリペプチドであって：
（Ａ）配列番号：６のアミノ酸２８−１８２を含むポリペプチド；及び
（Ｂ）配列番号：６のアミノ酸２８−１８２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、ｆｌｔ３に結合可能であり、そして造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
単離されたｆｌｔ３−Ｌポリペプチドであって：
（Ａ）配列番号：６のアミノ酸１−１８２を含むポリペプチド；及び
（Ｂ）配列番号：６のアミノ酸１−１８２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、ｆｌｔ３に結合可能であり、そして造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項３】
単離されたｆｌｔ３−Ｌポリペプチドであって：
（Ａ）配列番号：６のアミノ酸２８−２３５を含むポリペプチド；及び
（Ｂ）配列番号：６のアミノ酸２８−２３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、ｆｌｔ３に結合可能であり、そして造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項４】
単離されたｆｌｔ３−Ｌポリペプチドであって：
（Ａ）配列番号：６のアミノ酸１−２３５を含むポリペプチド；及び
（Ｂ）配列番号：６のアミノ酸１−２３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、ｆｌｔ３に結合可能であり、そして造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を刺激する活性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項５】
寄託番号ＡＴＣＣ  ６９３８２を有する、組換えベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（−）のｃＤＮＡ挿入物によりコードされる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドが、１又はそれより多くのタンパク質又はポリペプチドに共有結合している融合タンパク質である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドが可溶性である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
下記の：
（ａ）配列番号：５の配列を有するｃＤＮＡ；
（ｂ）高度緊縮条件下で（ａ）のｃＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｃ）遺伝子コードの縮重のため、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有するｆｌｔ３−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
よりなる群から選択される、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターでトランスフェクション又は形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドでトランスフェクション又は形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして培地からポリペプチドを回収することを含む、ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
配列番号：６のアミノ酸１−２３５からなるｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、又は配列番号：６のアミノ酸１−２３５に９０％同一のアミノ酸配列を有し、かつ、ｆｌｔ３に結合可能であり、そして造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を刺激する活性を有するｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、と免疫反応性である抗体。
【請求項１５】
抗体が、配列番号：６のアミノ酸１−２３５からなるｆｌｔ３−Ｌポリペプチドと免疫反応性である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１４又は１５に記載の抗体。
【請求項１７】
医薬に使用されるための、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌ又はｆｌｔ３−Ｌポリペプチド。
【請求項１８】
有効量の、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を、それを必要とする患者において刺激するための薬剤組成物。
【請求項１９】
ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、G−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、ＬＩＦ及びＦＧＦ、並びにこれらの逐次的な又は同時の組合せよりなる群から選ばれる、有効量のサイトカインをさらに含む、造血系前駆細胞又は幹細胞の増殖を、それを必要とする患者において刺激するための、請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
患者における自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２１】
細胞減少療法を受けている患者における自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２２】
患者における骨髄異形成症候群及び貧血の症状のｉｎ  ｖｉｖｏ治療のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２３】
患者への移植のための自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２４】
細胞減少療法を受けている患者への移植のための自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２５】
患者への移植のための臍帯血由来の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２６】
細胞減少療法を受けている患者への移植のための臍帯血由来の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２７】
患者における骨髄異形成症候群及び貧血の治療のためにする患者への移植のための自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２８】
患者における骨髄異形成症候群及び貧血の治療のためにする細胞減少療法を受けた患者への移植のための自己又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖のための、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項２９】
ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、ＬＩＦ及びＦＧＦ、並びにこれらの逐次的な又は同時の組合せよりなる群から選ばれる、サイトカインをさらに含む、あるいはこれらのサイトカインとともに使用される、請求項２０ないし２８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
細胞減少療法を受けている患者の治療のための、自己、同系、及び／又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激及び増殖のための薬剤組成物であって、有効量の、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含み、そして、所望により、ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、ＬＩＦ及びＦＧＦ、並びにこれらの逐次的な又は同時の組合せよりなる群から選ばれる、有効量のサイトカインをさらに含んでいる、前記薬剤組成物。
【請求項３１】
細胞減少療法を受けている患者の治療のための、自己、同系、及び／又は同種異系の造血系前駆細胞又は幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖のための薬剤組成物であって、有効量の、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチド、及び薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含み、そして、所望により、ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、ＬＩＦ及びＦＧＦ、並びにこれらの逐次的な又は同時の組合せよりなる群から選ばれる、有効量のサイトカインをさらに含んでいる、前記薬剤組成物。
【請求項３２】
細胞増殖培地及び有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを含む造血細胞増殖培地。
【請求項３３】
外因性遺伝子を初期造血細胞にトランスフェクションする方法であって、
（ａ）初期造血細胞を、有効量の請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを含む培地で培養し；そして
（ｂ）工程（ａ）からの培養細胞を遺伝子でトランスフェクションする
工程を含む方法。
【請求項３４】
その生殖細胞及び体細胞のすべてが、その哺乳動物又はその哺乳動物の先祖に胎児期に導入された請求項８又は９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３５】
表面にｆｌｔ３受容体を有する細胞を懸濁液中の細胞混合物から分離する方法であって、請求項１ないし７のいずれか１項のｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを保有する接触表面と混合物中の細胞を接触させ、そして接触表面と懸濁液を分離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の引照
本出願は米国特許出願第０８／２０９，５６２号（１９９４年３月７日出願）の部分継続出願であり、これは米国特許出願第０８／１６２，４０７号（１９９３年１２月３日出願）の部分継続出願であり、これは米国特許出願第０８／１１１，７５８号（１９９３年８月２５日出願）の部分継続出願であり、これは米国特許出願第０８／１０６，４６３号（１９９３年８月１２日出願）の部分継続出願であり、これは米国特許出願第０８／０６８，３９４号（１９９３年５月２４日出願）の部分継続出願である。
発明の分野
本発明は哺乳動物ｆｌｔ３−リガンド、それらのリガンドをコードする核酸、組換えｆｌｔ３−リガンドの製造方法、それらのリガンドを含有する薬剤組成物、および種々の療法におけるそれらの使用に関するものである。
発明の背景
血球は特定の系統、すなわち赤血球、巨核球、顆粒球、単球およびリンパ球の系統に沿って分化すべく拘束される造血系幹細胞に由来する。細胞前駆体の増殖および成熟を刺激するサイトカインは、コロニー刺激因子（“ＣＳＦ”）と呼ばれている。数種類のＣＳＦがＴ−リンパ球により産生され、これにはインターロイキン−３（“ＩＬ−３”）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、および単球ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）が含まれる。これらのＣＳＦは成熟細胞および幹細胞の双方に作用する。これまで幹細胞に主に作用しうる因子は見出されていない。
チロシンキナーゼ受容体（“ＴＫＲ”）は多数の細胞の増殖および分化を調節する増殖因子受容体である（ヤーデンおよびウルリッヒ（Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，４４３−４７８，１９８８；ならびにカデナおよびジル（Ｃａｄｅｎａ，Ｄ．Ｌ．，Ｇｉｌｌ，Ｇ．Ｎ．），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，６，２３３２−２３３７，１９９２）。特定のＴＫＲは増殖系内で機能する。たとえば受容体ｃ−ｆｍｓはコロニー刺激因子タイプ１（“ＳＣＦ−１”）を通じてシグナルを発して、単球の生存、増殖および分化を調節する（スタンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）ら，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，１５１−１５９，１９８３）。ｃ−ｋｉｔを通じて作用するスチール因子（Ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ、“ＳＦ”；マスト細胞増殖因子、幹細胞因子、またはｋｉｔリガンドとしても知られている）は、骨髄およびリンパ双方のコンパートメントにおいて細胞の増殖を刺激する。
ｆｌｔ３（ロスネット（Ｒｏｓｎｅｔ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６，１６４１−１６５０，１９９１）およびｆｌｋ−２（マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら．Ｃｅｌｌ，６５，１１４３−１１５２，１９９１）は、ｃ−ｆｍｓおよびｃ−ｋｉｔ受容体に関連するＴＫＲの変異形である。ｆｌｋ−２遺伝子産物は造血細胞および前駆細胞上に発現し、一方ｆｌｔ３遺伝子産物はより全般的な組織分布をもつ。ｆｌｔ３およびｆｌｋ−２受容体蛋白質はアミノ酸配列が類似し、細胞外ドメインにおける２アミノ酸残基において異なり、Ｃ−末端付近に位置する３１アミノ酸セグメントにおいて異なる（ライマン（Ｌｙｍａｎ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８，８１５−８２２，１９９３）。
ｆｌｔ３−リガンド（“ｆｌｔ３−Ｌ”）は前駆細胞および幹細胞の増殖および分化を調節することが認められており、造血障害、特に再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群の治療に際して臨床的有用性をもつと思われる。さらにｆｌｔ３−Ｌは、細胞減少療法（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）を受けている患者の同種異系、同種同系または自己骨髄移植法、および細胞拡張（ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に有用であろう。ｆｌｔ３−Ｌは、遺伝子療法ならびに前駆細胞および幹細胞の動態化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）システムにも有用であろう。
癌は、電離放射線または急速に分割している細胞を殺す有毒化学物質の投与を伴う、細胞減少療法により治療される。正常細胞に対する細胞毒性作用により一般に副作用が生じ、細胞減少療法の採用を制限する可能性がある。頻度の高い副作用は骨髄抑制、すなわち白血球および赤血球ならびに血小板を産出する骨髄細胞に対する損傷である。骨髄抑制の結果、患者は血球減少症、すなわち血球欠乏を発症し、これは感染および出血性障害の危険性を高める。
血球減少症は罹患率、致死率を高め、癌治療における投与不足（ｕｎｄｅｒ−ｄｏｓｉｎｇ）をもたらす。多くの臨床研究者が骨髄に対する損傷を制限しつつ、癌療法のための用量を高める細胞減少療法の投与基準および計画を取り扱っている。１方法は骨髄または末梢血球の移植を伴うものであり、その場合、骨髄または循環している造血系前駆細胞もしくは幹細胞を細胞減少療法の前に取り出し、次いで治療後に再注入して、造血機能を再生する。米国特許第５，１９９，９４２号明細書（本明細書に参考として引用する）には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、エリトロポエチン（“ＥＰＯ”）およびそれらの組み合わせを自己移植法に用いる方法が記載されている。
高用量化学療法は、転移性癌、特に乳癌を伴う患者において標準用量療法と比較して客観的反応（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の頻度を高めうるので、有益である。その結果、予後が思わしくない患者についてすら無疾患鎮静期を延長することができる。しかしながら高用量化学療法は毒性が高く、その結果生じる多数の臨床合併症は感染症、出血性障害そのほか、長期間の骨髄抑制に伴う作用に関連するものである。
脊髄形成異常症候群は細胞成熟損傷、進行性汎血球減少症および成熟細胞の機能異常を特色とする幹細胞障害である。それらは種々の程度の血球減少症、正常個数または増加した個数であり、かつ異常な形態をもつ骨髄細胞による無効な赤血球生成および骨髄造血をも特色とする。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔ）ら（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８２；５１：１８９−１９９）はこれらの障害を５つのサブタイプに分類した：難治性貧血、輪状鉄芽球を伴う難治性貧血、過度の芽球（幼若細胞）を伴う難治性貧血、トランスフォーメーションした過度の芽球を伴う難治性貧血、および慢性骨髄単核性白血病。これらの患者の有意割合が急性白血病を発症するが、大部分は感染性または出血性の合併症により死亡する。レチノイド、ビタミンＤおよびシタラビンを用いるこれらの症候群の治療は成功しなかった。これらの症候群に罹患している患者は大部分が高齢者であり、骨髄移植または攻撃的な抗白血病化学療法に適していると思われる人々ではない。
再生不良性貧血は骨髄損傷および重篤な汎血球減少症を特色とする他の形態の疾患である。脊髄形成異常症候群と異なり、この障害においては骨髄は無細胞性または低細胞性である。現在の治療法には、組織適合性ドナーからの骨髄移植、または抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）による免疫抑制療法が含まれる。脊髄形成異常症候群と同様に、この症候群に罹患している患者の大部分は高齢者であり、骨髄移植または攻撃的な抗白血病化学療法に適さない。これらの患部おける致死率は、感染性または出血性の合併症のため著しく高い。
貧血は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）を伴う患者に一般的である。貧血はジドブジン療法を受けている患者においては通常いっそう重篤である。多くの重要な抗レトロウイルス薬、抗感染症薬および抗腫瘍薬が赤血球生成を抑制する。組換えＥＰＯは患者のヘマトクリットおよびヘモグロビン水準を正常化することが示されているが、通常は極めて高い用量を必要とする。赤血球系統の増殖を刺激する増殖因子を単独で、またはＥＰＯもしくは他の増殖因子と組み合わせて用いれば、それらの患者を治療し、必要な輸血の回数を減らすことができるであろう。Ｔ細胞の個数をも増加させる増殖因子があれば、エイズ患者の治療に特に有用であろう。
発明の概要
本発明は、単離された、または均質な蛋白質としての生物学的活性ｆｌｔ３−リガンド（ｆｌｔ３−Ｌ）に関するものである。さらに本発明は、ｆｌｔ３−Ｌをコードする単離されたＤＮＡ、およびｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを目的とする。本発明の範囲には、ｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターによりトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞、およびそれらの細胞をｆｌｔ３−Ｌが発現しうる条件下で培養することによりｆｌｔ３−Ｌを製造する方法が包含される。
ｆｌｔ３−Ｌは同種異系、同種同系または自己骨髄移植法に用いられる薬剤組成物の調製に使用しうる。薬剤組成物はｆｌｔ３−Ｌを単独で、または他の増殖因子、たとえばインターロイキン、コロニー刺激因子、蛋白質チロシンキナーゼおよびサイトカインと組み合わせて含有しうる。
本発明は、ｆｌｔ３−Ｌ組成物を遺伝子療法に、ならびに脊髄形成異常症候群、再生不良性貧血、ＨＩＶ感染症（エイズ）および癌、たとえば乳癌、リンパ腫、小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、神経芽腫、急性白血病、精巣腫および卵巣癌に罹患している患者の治療に使用する方法を包含する。
また本発明は、ｆｌｔ３−Ｌと免疫反応性である抗体、特にモノクローナル抗体に関するものである。ｆｌｔ３−Ｌの可溶性部分と免疫グロブリン蛋白質の定常ドメインを含む融合蛋白質も本発明の態様である。
本発明は、末梢血前駆細胞または幹細胞移植法におけるｆｌｔ３−Ｌの使用をも目的とする。一般に、骨髄抑制性の細胞減少療法の前に患者から末梢血前駆細胞または幹細胞を取り出し、次いで細胞減少療法と同時に、またはその後に再投与して、その療法の骨髄抑制作用に対処する。本発明は、下記の方式のうち少なくとも１つによる、有効量のｆｌｔ３−Ｌの使用を提供する：（ｉ）前駆細胞または幹細胞を採取する前にｆｌｔ３−Ｌを患者に投与して、それらの循環細胞の数を増加させ、または動態化する；（ｉｉ）患者の前駆細胞または幹細胞を採取したのち、ｆｌｔ３−Ｌを使用してｅｘ  ｖｉｖｏでそれらの細胞を拡張する；（ｉｉｉ）採取された前駆細胞または幹細胞を移植したのち、患者にｆｌｔ３−Ｌを投与して、そのグラフト化（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ、移植成立）を容易にする。本発明の移植法はさらにｆｌｔ３−Ｌとの連続または同時組み合わせとして、有効量のサイトカインを使用することを含む。それらのサイトカインには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：インターロイキン（“ＩＬ”）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４もしくはＩＬ−１５；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、もしくはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体よりなる群から選ばれるＣＳＦ；または他の増殖因子、たとえばＣＳＦ−１、ＳＦ、ＥＰＯ、白血病抑制因子（“ＬＩＦ”）もしくは繊維芽細胞増殖因子（“ＦＧＦ”）。ｆｌｔ３−Ｌは同様に同種同系または同種異系移植にも有用である。
本発明はさらに、細胞増殖培地、自己由来の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）血清、および単独の、または前記群からのサイトカインと組み合わぜたｆｌｔ３−Ｌを含む、前駆細胞または幹細胞拡張培地を包含する。
本発明はさらに、臍帯血液から採取された前駆細胞または幹細胞を拡張するためにｆｌｔ３−Ｌを使用することを包含する。拡張はｆｌｔ３−Ｌを単独で、または前記群からのサイトカインとの連続もしくは同時組み合わせとして用いて行うことができる。
本発明はさらに遺伝子療法におけるｆｌｔ３−Ｌの使用を包含する。ｆｌｔ３−Ｌは、遺伝子療法に使用するための外因性ＤＮＡでトランスフェクションされる予定の初期造血系前駆細胞または幹細胞の増殖および培養を可能にする。あるいはｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡを、最終的にその遺伝子産物を標的細胞または組織へ送達するために細胞にトランスフェクションすることができる。
さらに本発明は、貧血の治療を目的としてｉｎ  ｖｉｖｏにおける赤血球の産生を刺激するためにｆｌｔ３−Ｌを使用することを包含する。この使用は、このような赤血球刺激を必要とする患者にｆｌｔ３−Ｌを細胞減少療法と同時またはその後に投与することを含む。この治療には、前記群からのサイトカインより選ばれる他の増殖因子の同時投与を含みうる。この治療に用いるのに好ましいサイトカインには、ＥＰＯ、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。この治療は特にエイズ患者、好ましくはＡＺＴ療法を受けているエイズ患者に有用である。
ｆｌｔ３−Ｌは幹細胞の増殖を刺激するので、ｆｌｔ３受容体を保有する他の非造血性幹細胞も本発明のｆｌｔ３−Ｌにより作用される。ｆｌｔ３−Ｌは胎外受精処置に有用であり、かつｉｎ  ｖｉｖｏで不妊状態の治療に使用しうる。腸において、ｆｌｔ３リガンドは照射または化学療法により起こる腸損傷の治療に有用である。ｆｌｔ３−Ｌはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者の治療にも使用しうる。このような治療には、Ｔ細胞および赤血球のｅｘ  ｖｉｖｏ拡張と同様にｉｎ  ｖｉｖｏ産生を刺激するためにｆｌｔ３−Ｌを投与することも包含される。このような治療はＴ細胞、特にＣＤ４陽性Ｔ細胞の欠損を予防し、ウイルスに対する患者の免疫反応を高めることができ、これにより患者の生命の質が改善される。ｆｌｔ３−Ｌは毛包の発達をもたらす幹細胞を刺激し、これにより毛髪増殖を促進するために使用しうる。
さらにｆｌｔ３−Ｌを固相マトリックスに結合させ、表面にｆｌｔ３を発現する細胞をアフィニティー精製または分離するために使用しうる。本発明は、表面にｆｌｔ３受容体を有する細胞を溶液中の細胞混合物から分離する方法であって、混合物状の細胞をｆｌｔ３結合性分子を有する接触面と接触させ、接触面と溶液を分離することを含む方法をも包含する。分離した時点でｆｌｔ３−Ｌを用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡張し、そして患者に投与することができる。
発明の詳細な説明
ネズミｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡが単離され、配列番号：１に示される。ヒトｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡも単離され、配列番号：５に示される。ネズミおよびヒトｆｌｔ３−ＬをコードするこのｃＤＮＡの知見により、ｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクター；これらの発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞；均質な蛋白質としての生物学的に活性なネズミおよびヒトｆｌｔ３−Ｌ；ならびにネズミおよびヒトｆｌｔ３−Ｌと免疫反応性である抗体の構築が可能となる。
ｆｌｔ３−Ｌはｆｌｔ３受容体を発現する細胞（非ヒト造血細胞を含む）の増強、刺激または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈ）に有用である。ｆｌｔ３受容体は脳、胎盤、ならびに神経および造血系に由来する組織中に見出され、精巣、卵巣、リンパ節、脾臓、胸腺および胎児肝臓中に分布していることが認められるので、その組織損傷を伴う種々の状態の治療が可能である。ｆｌｔ３−Ｌの詳細な用途を下記に示すが、これらに限定されない。
本明細書において用いる“ｆｌｔ３−Ｌ”という語は、前駆細胞および幹細胞上に見られるｆｌｔ３受容体と独立して結合し、複合体を形成する一群のポリペプチドを表す。“ｆｌｔ３−Ｌ”という語は、配列番号：２のアミノ酸配列１−２３１または配列番号：６のアミノ酸配列１−２３５を有する蛋白質、および配列番号：２のアミノ酸配列１−２３１または配列番号：６のアミノ酸配列１−２３５と高度の類似性または高度の一致性を有する蛋白質であって、生物学的に活性であり、ｆｌｔ３受容体を結合する蛋白質を包含する。さらにこの語は、配列番号：１または配列番号：５のＤＮＡの生物学的に活性な遺伝子産物をも表す。さらに“ｆｌｔ３−Ｌ”という語には、膜結合蛋白質（これには細胞内領域、膜領域および細胞外領域が含まれる）、および可溶性の、またはトランケートした（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）蛋白質であって、主としてその蛋白質の細胞外部分を含み、生物学的活性を保持し、かつ分泌されうるものが包含される。それらの可溶性蛋白質の具体例は、配列番号：２のアミノ酸配列２８−１６３または配列番号：６のアミノ酸配列２８−１６０を含むものである。
ｆｌｔ３−Ｌに関して“生物学的に活性”という語は、ｆｌｔ３−Ｌがｆｌｔ３に結合しうることを意味する。あるいは“生物学的に活性”という語は、ｆｌｔ３−Ｌが膜結合ｆｌｔ３を通じて細胞へ刺激シグナルを伝達しうることを意味する。
“単離された”とは、ｆｌｔ３−Ｌに他の蛋白質またはポリペプチドが付随しないこと、たとえば組換え宿主細胞培養物の精製物、または精製された抽出物を意味する。
本明細書において述べる“ｆｌｔ３−Ｌ変異体”は、天然ｆｌｔ３−Ｌと実質的に相同であるが、１または２以上の欠失、挿入または置換のため天然ｆｌｔ３−Ｌ（ヒト、ネズミその他の哺乳動物種）のものと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異体アミノ酸配列は、好ましくは少なくとも８０％が天然ｆｌｔ３−Ｌアミノ酸配列と一致し、極めて好ましくは少なくとも９０％が一致する。一致率は、たとえばデベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）により記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手されるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより判定しうる。ＧＡＰプログラムは、ニードルマンおよびヴンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）をスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ，Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）が改良したものを利用する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォールトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）には下記のものが含まれる：（１）ヌクレオチドについての単項（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（一致についての１および不一致についての０の数値を含む）、および重み付き（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）比較マトリックス：グリスコフおよびバーゲス（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｂｕｒｇｅｓｓ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６；シュワルツおよびデイホフ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄａｙｈｏｆｆ）編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション，ｐｐ，３５３−３５８，１９７９に記載；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー、および各ギャップにおける各符号についてさらに０．１０のペナルティー；ならびに（３）末端ギャップについてペナルティーなし。変異体は保存置換された配列を含みうる。これはあるアミノ酸残基が類似の物理化学的特性を有する残基と交換されることを意味する。保存置換の例には、１脂肪族残基が他のもので置換されること、たとえばＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａ相互の置換、または１極性残基が他のもので置換されること、たとえばＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；ＧｌｎとＡｓｎ間の置換が含まれる。他のこのような保存置換、たとえば類似の疎水性を有する領域全体の置換は周知である。天然のｆｌｔ３−Ｌ変異体も本発明に包含される。それらの変異体の例は、オータナティブｍＲＮＡスプライシング事象により、またはｆｌｔ３−Ｌ蛋白質の蛋白質分解による開裂により生じる蛋白質であって、その際ｆｌｔ３−Ｌ結合特性は保持される。ｍＲＮＡのオータナティブスプライシングは、トランケートした、ただし生物学的に活性なｆｌｔ３−Ｌ蛋白質、たとえば天然の可溶性形態の蛋白質を生成する可能性がある。蛋白質分解に起因する変異には、たとえば異なるタイプの宿主細胞において発現する際のＮ−またはＣ−末端における相異が含���れ、これはｆｌｔ３−Ｌ蛋白質から１または２以上の末端アミノ酸が蛋白質分解により除去されることによる（一般に１−５個のアミノ酸）。
“自己移植”という語は米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載されており、これを本明細書に参考として含まれるものとする。要約すると、この語は自己の造血系前駆細胞または幹細胞の移植を行うための、下記の方法を意味する：（１）患者から細胞減少療法の前に造血系前駆細胞または幹細胞を採取し；（２）造血系前駆細胞または幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでｆｌｔ３−Ｌを用いて拡張して、増加した個数の造血系前駆細胞または幹細胞を含む細胞調製物となし；そして（３）この細胞調製物を細胞減少療法と同時に、またはその後にこの患者に投与する。前駆細胞および幹細胞は末梢血採血または骨髄外植により得られる。所望により前記の群から選ばれる１または２以上のサイトカインをｆｌｔ３−Ｌと組み合わせて、特定のタイプの造血細胞の増殖を助成し、または得られる増殖した造血細胞集団の細胞機能に影響を及ぼすことができる。前記のうちＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体が好ましく、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体が特に好ましい。“同種異系移植”という語は、骨髄または末梢血の前駆細胞または幹細胞を哺乳動物から採取し、そして同種の異なる哺乳動物に投与する方法を意味する。“同種同系移植”という語は、遺伝学的に一致する哺乳動物間での骨髄移植を意味する。
前記の本発明の移植法は所望により、ｆｌｔ３−Ｌを単独で、または補充用（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）増殖因子との連続もしくは同時組み合わせで患者に投与して、末梢血を採取する前にそれに造血細胞を補充することを含む、予備的ｉｎ  ｖｉｖｏ法を包含する。適切な補充因子は前記に挙げたものであり、好ましい補給因子はｆｌｔ３−Ｌ、ＳＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−３である。
前記の本発明方法は所望により、細胞調製物の移植後にｆｌｔ３−Ｌを単独で、またはグラフト化増殖因子との連続もしくは同時組み合わせで患者に投与して、細胞調製物からグラフト化される造血系前駆細胞または幹細胞のグラフト化および増加増殖を促進することを含む、後続ｉｎ  ｖｉｖｏ法を包含する。適切なグラフト化因子は前記に挙げたものであり、好ましいグラフト化因子はＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１、ＥＰＯ、およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体である。
本発明はさらに、細胞増殖培地、自己血清、および単独または前記に挙げたものから選ばれるサイトカイン系増殖因子と組み合わせたｆｌｔ３−Ｌを含む前駆細胞または幹細胞拡張培地を包含する。好ましい増殖因子はＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体である。
特に、ｆｌｔ３−Ｌを使用して造血系および非造血系の幹細胞の増殖を刺激することができる。このような刺激はこれらの組織に特異的な組織損傷が起こっている場合に有益である。たとえばｆｌｔ３−Ｌは神経学的損傷の治療に有用であると思われ、神経細胞に対する増殖因子となりうる。ｆｌｔ３−Ｌが胎外受精処置に有用であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで不妊状態の治療に使用しうるという可能性がある。ｆｌｔ３−Ｌは照射または化学療法の結果起こる腸損傷の治療に有用であろう。ｆｌｔ３受容体は毛包の発達をもたらす幹細職に分布しているので、ｆｌｔ３−Ｌは毛髪の生長を促進するのに有用であると思われる。
ｆｌｔ３−Ｌは赤血球と同様にＴ細胞をも刺激することが示されたので（実施例参照、後記）、ｆｌｔ３−Ｌはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者の治療にも使用しうる。このような治療には、Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡張と同様にｉｎ  ｖｉｖｏ産生を刺激するために投与することも包含される。さらにｆｌｔ３−ＬはＣＤ４+Ｔ細胞の欠乏を予防することができる。このような処置はウイルスに対する患者の免疫反応を高め、または維持し、これにより患者の生命の質を改善することができる。さらにこのようなｉｎ  ｖｉｖｏ治療は赤血球系統の細胞を刺激し、これにより患者のヘマトクリットおよびヘモグロビン水準を改善することができる。この場合、ｆｌｔ３−Ｌは単独で、または前記に挙げた群から選ばれるサイトカインとの連続もしくは同時組み合わせで投与することができる。
ｆｌｔ３−Ｌは前駆細胞および幹細胞に対するその特異性のため、遺伝子療法に有用である。遺伝子療法は外因性ＤＮＡでトランスフェクションした、グラフト化可能な細胞を宿主に投与することを伴う。たとえばボッグズ（Ｂｏｇｇｓ），ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，８：８０−９６（１９９０）；コーン（Ｋｏｈｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，７（２）：１７９−１９２（１９８９）；レーン（Ｌｅｈｎ），Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒｎｓｐｌ．，５：２８７−２９３（１９９０）；およびベルマ（Ｖｅｒｍａ），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，ｐｐ．６８−８４（１９９０）を参照されたい。当技術分野で知られている遺伝子療法を用いると、遺伝子を哺乳動物に導入する方法は下記の工程を含む：（ａ）ｆｌｔ３−Ｌを単独で、または前記に挙げた群から選ばれるサイトカインとの連続もしくは同時組み合わせで含む培地中において、初期の造血細胞を培養し；（ｂ）工程（ａ）で得た培養細胞を外因性遺伝子でトランスフェクションし；そして（ｃ）トランスフェクションした細胞を哺乳動物に投与する。この方法には、上記工程（ａ）および（ｂ）を含む方法で前駆細胞または幹細胞を遺伝子によりトランスフェクションする新規方法が包含される。さらに、同一または類似の方法を用いて、ｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡをこのような送達用細胞内へトランスフェクションして、ｆｌｔ３−Ｌ遺伝子産物を標的組織へ送達することができる。
実施例１はｆｌｔ３−Ｌのスクリーニングに用いた新規なｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質の構築を記載する。実施例１に記載したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の代わりに他の抗体Ｆｃ領域を用いることができる。他の適切なＦｃ領域は、プロテインＡまたはプロテインＧに対して高い親和性で結合しうるものであり、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、またはヒトもしくはネズミＩｇＧ１  Ｆｃ領域のフラグメント、たとえば少なくともヒンジ部を含み、従って鎖間ジスルフィド結合が形成されるフラグメントが包含される。ｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質は容易に精製しうるという利点をもつ。さらにジスルフィド結合が２つの別個の融合蛋白質鎖のＦｃ領域間に生成して、２量体が形成される。２量体ｆｌｔ３：Ｆｃ受容体は、探査されるリガンドが多量体の可能性がある点からみて、より高いｆｌｔ３−Ｌアフィニティー結合という利点の可能性をもつため選ばれた。
前記のように、本発明の１観点は可溶性ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドである。可溶性ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドは天然ｆｌｔ３−Ｌの細胞外ドメインの全部または一部を含むが、このポリペプチドを細胞膜上に保持させるトランスメンブラン領域を欠如する。可溶性ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドは合成された初期の時点では分泌を促進するために天然（または異種）シグナルペプチドを含むことが有利であるが、シグナルペプチドはｆｌｔ３−Ｌが細胞から分泌される際には開裂する。本発明に包含される可溶性ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドはｆｌｔ３受容体を結合する効力を保持する。実際には可溶性ｆｌｔ３−Ｌはｆｌｔ３−Ｌ蛋白質が分泌可能である限り、トランスメンブラン領域の一部もしくは細胞質ドメインの一部、または他の配列をも含むことができる。
可溶性ｆｌｔ３−Ｌは、目的蛋白質を発現する無傷の細胞をたとえば遠心分離により培地から分離し、そして培地（上清）を目的蛋白質の存在につきアッセイすることにより同定する（かつその不溶性の膜結合した対応物から区別する）ことができる。培地中のｆｌｔ３−Ｌの存在は、蛋白質が細胞から分泌され、従って目的蛋白質の可溶性形態であることを示す。
可溶性形態のｆｌｔ３−Ｌは天然の結合形ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質に優る多数の利点をもつ。可能性蛋白質は細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からの蛋白質の精製が可能である。さらに、可溶性蛋白質の方が一搬に静脈内投与に適切である。
可溶性ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドの例には、天然ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質の細胞外ドメインの実質部分を含むものが包含される。このような可溶性哺乳動物ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質は、配列番号：２のアミノ酸２８−１８８または配列番号：６のアミノ酸２８−１８２を含む。さらに、全体に満たない細胞外ドメインを含むトランケートした可溶性ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質が本発明に包含される。このようなトランケートした可溶性蛋白質は配列番号：２のアミノ酸２８−１６３および配列番号：６のアミノ酸２８−１６０の配列に代表される。可溶性ｆｌｔ３−Ｌは宿主細胞内で最初に発現された時点では、用いる宿主細胞内で機能性である後記の異種シグナルペプチドの１つをさら含むことができる。あるいは蛋白質は天然シグナルペプチドを含むことができ、従って哺乳動物ｆｌｔ３−Ｌは配列番号：２のアミノ酸１−１８８または配列番号：６のアミノ酸１−１８２を含む。本発明の１態様において可溶性ｆｌｔ３−Ｌは、（Ｎ−末端からＣ−末端へ）酵母α因子シグナルペプチド、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（後記および米国特許第５，０１１，９１２号明細書に記載）、および配列番号：２のアミノ酸２８−１８８を含む可溶性ｆｌｔ３−Ｌを含む融合蛋白質として発現された。この組換え融合蛋白質は酵母細胞内で発現され、そこから分泌される。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは蛋白質の精製を容易にし、のちにウシ粘膜エンテロキナーゼを用いて可溶性ｆｌｔ３−Ｌから開裂させることができる。可溶性ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列が本発明に包含される。
トランケートしたｆｌｔ３−Ｌ（可溶性ポリペプチドを含めて）は多数の常法のいずれかにより調製することができる。目的とするＤＮＡ配列はそれ自体既知の方法で化学的に合成しうる。ＤＮＡフラグメントも全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により調製し、アガロースゲル上での電気泳動により単離することができる。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（１または２以上）を含むリンカーを用いて、目的とするＤＮＡフラグメントを発現ベクターに挿入することができ、またはフラグメントをその中に天然に存在する開裂部位において消化することができる。周知のポリメラーゼ連鎖反応法も、目的蛋白質フラグメントをコードするＤＮＡ配列の増幅に採用しうる。さらに別法として、既知の突然変異誘発法を用いて終止コドンを目的の地点、たとえば細胞外ドメインの最終アミノ酸に対するコドンのすぐ下流に挿入することができる。
他の方法においては、酵素処理法（たとえばＢａｌ  ３１エキソヌクレアーゼを使用）を用いてＤＮＡフラグメントから末端ヌクレオチドを欠失させ、特定の目的末端を有するフラグメントを得ることができる。市販のリンカーには、Ｂａｌ  ３１消化により生じた平滑末端にリゲートしうる、かつ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（１または２以上）を含むものが包含される。あるいはＤＮＡフラグメントのＮ−末端またはＣ−末端を目的地点に再構築するオリゴヌクレオチドを合成し、ＤＮＡフラグメントにリゲートすることができる。合成されたオリゴヌクレオチドは、目的とするコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み、開始コドン（ＡＴＧ）をコード配列のＮ−末端に配置させることができる。
前記のように、本発明は組換えおよび非組換え両方の、単離された、または均質なｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを提供する。目的とする生物学的活性（たとえばｆｌｔ３を結合する効力）を保持した、天然ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質の変異体および誘導体が、天然ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得られる。天然アミノ酸配列の変更は多数の常法のいずれかにより行うことができる。突然変異は、天然配列のフラグメントへのリゲーションを可能にする制限部位でフランキングされた突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の座に導入しうる。リゲーション後に、得られた再構築配列は目的とするアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
あるいはオリゴヌクレオチド指向性の部位特異性−突然変異誘発法を採用して変更した遺伝子を得ることができ、その際、予め定められたコドンを置換、欠失または挿入により変更しうる。前記の変更を行う方法の一例は下記により示される：ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；バウエル（Ｂａｕｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；クレイク（Ｃｒａｉｋ）（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，プレナム・プレス，１９８１）；クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）；クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；ならびに米国特許第４，５１８，５８４および４，７３７，４６２号明細書；これらはすべて参考として本明細書に含まれるものとする。
ｆｌｔ３−Ｌは他の化合物部分、たとえばグリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基などと共有結合体または凝集結合体を形成することにより修飾して、ｆｌｔ３−Ｌ誘導体を形成することができる。ｆｌｔ３−Ｌの共有結合誘導体は、化合物部分をｆｌｔ３−Ｌアミノ酸側鎖上の官能基に、またはｆｌｔ３−ＬポリペプチドのＮ−末端もしくはＣ−末端、またはその細胞外ドメインに結合させることにより調製しうる。本発明の範囲に含まれる他のｆｌｔ３−Ｌ誘導体には、たとえば組換え体培養においてＮ−末端またはＣ−末端融合体として合成することによる、ｆｌｔ３−Ｌまたはそのフラグメントと他の蛋白質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体が含まれる。たとえば結合体はｆｌｔ３−ＬポリペプチドのＮ−末端にシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（たとえばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダー）を含むことができる。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時または翻訳後に結合体をその合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部位へ伝達するのを指示する。
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチド融合体は、ｆｌｔ３−Ｌの精製および同定を容易にするために付加されたペプチドを含むことができる。それらのペプチドには、たとえばポリ−Ｈｉｓまたは同定用抗原性ペプチドが含まれる：米国特許第５，０１１，９１２号明細書およびホップ（Ｈｏｐｐ）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８に記載。
本発明はさらに、付随する天然パターンのグリコシル化を伴うか、または伴わないｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを包含する。酵母または哺乳動物の発現系（たとえばＣＯＳ−７細胞）において発現されたｆｌｔ３−Ｌは、発現系の選択に応じて天然ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドと分子量およびグリコシル化パターンが類似するか、または有意に異なる可能性がある。細菌性発現系、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｆｌｔ３−Ｌポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を与える。
アミノ酸の残基もしくは配列の付加もしくは置換、または生物学的活性もしくは結合に不必要な末端もしくは内部の残基の欠失をコードする同等なＤＮＡ構造体は、本発明に包含される。たとえばｆｌｔ３−Ｌ細胞外ドメイン中のＮ−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を排除し、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物類似体の発現を低下させる。真核細胞ポリペプチドにおけるＮ−グリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特色とし、ここでＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。ネズミおよびヒトｆｌｔ３−Ｌ蛋白質はそれぞれこのようなトリプレット２個を配列番号：２のアミノ酸１２７−１２９および１５２−１５４、ならびに配列番号：６のアミノ酸１２６−１２８および１５０−１５２にそれぞれ含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適宜な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合を阻止するであろう。たとえばＡｓｎが異なるアミノ酸により交換されるように選ばれた単一ヌクレオチドの変更で、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。蛋白質中のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号および欧州特許第２７６，８４６号明細書に記載されたものが含まれる。これらは参考として本明細書に含まれるものとする。
他の例においては、生物学的活性に必須ではないＣｙｓ残基をコードする配列を、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で交換されるように変更して、再生に際して不適正な分子内ジスルフィド橋が形成されるのを阻止することができる。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を高めるように隣接二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。欧州特許第２１２，９１４号明細書には、蛋白質におけるＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するために部位特異性突然変異誘発を利用することが示されている。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセジング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変更してこれらの隣接塩基性残基の出現を排除するように、残基を欠失、付加または置換することにより不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合はこれらよりＫＥＸ２開裂をかなり受けにくいと考えられ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対をＬｙｓ−Ｌｙｓに変換するのはＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的な好ましい方法である。ネズミおよびヒトｆｌｔ３−Ｌは両方とも、２個のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を配列番号：２のアミノ酸２１６−２１７および２１７−２１８、ならびに配列番号：６のアミノ酸２１１−２１２および２１２−２１３にそれぞれ含む。
本発明の範囲に包含される核酸配列には、本明細書に記載する天然ｆｌｔ３−Ｌヌクレオチド配列に中等度または高度緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性ｆｌｔ３−Ｌをコードする、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）により定義される中等度緊縮条件には、５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予備洗浄液の使用、および約５５℃、５×ＳＳＣ、一夜のハイブリダイゼーション条件が含まれる。高度緊縮条件には、これより高い温度でのハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれる。プローブの長さなどの因子に従って必要に応じて温度および洗浄液の塩類濃度を調節しうることは当業者に自明であろう。
２以上のコドンが同一アミノ酸をコードしうるという既知の遺伝子コード縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号：１および配列番号：５に示したものと異なってもなお、それぞれ配列番号：２および配列番号：６のアミノ酸配列を有するｆｌｔ３−Ｌ蛋白質をコードしうる。このような変異体ＤＮＡ配列はサイレント突然変異（たとえばＰＣＲ増幅に際して起こる）の結果生じるか、または天然配列の意図的突然変異誘発の生成物である可能性がある。
本発明は下記より選ばれる、生物学的活性ｆｌｔ３−Ｌをコードする同等な単離されたＤＮＡ配列を提供する：（ａ）天然の哺乳動物ｆｌｔ３−Ｌ遺伝子のコード領域に由来するＤＮＡ；（ｂ）配列番号：１または配列番号：５に提示したヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｃ）（ａ）のＤＮＡに中等度緊縮条件下でハイブリダイズしうる、かつ生物学的活性ｆｌｔ３−ＬをコードするＤＮＡ；および（ｄ）結果的に（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に定めたＤＮＡに対して遺伝子コードの縮重であり、かつ生物学的活性ｆｌｔ３−ＬをコードするＤＮＡ。これらのＤＮＡ同等配列によりコードされるｆｌｔ３−Ｌ蛋白質は本発明に包含される。
配列番号：１または配列番号：５のＤＮＡ配列に対する同等物であるＤＮＡは、配列番号：２アミノ酸配列２８−１６３または配列番号：６のアミノ酸配列２８−１６０を含むポリペプチドをコードする天然ＤＮＡ配列に中等度緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。それらのＤＮＡによりコードされるｆｌｔ３−Ｌ蛋白質の例には、前記のように不活性化されたＮ−グリコシル化部位（１または２以上）、不活性化されたＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位（１または２以上）、またはアミノ酸の保存置換（１または２以上）を含むｆｌｔ３−Ｌフラグメント（可溶性または膜結合）およびｆｌｔ３−Ｌ蛋白質が含まれるが、それらに限定されない。他の哺乳動物種に由来するＤＮＡによりコードされるｆｌｔ３−Ｌ蛋白質であって、配列番号：１または配列番号：５のｃＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡも包含される。
要求される、ｆｌｔ３受容体に結合する効力を保有する変異体は、任意の適切なアッセイ法により同定することができる。ｆｌｔ３−Ｌの生物学的活性は、たとえばｆｌｔ３受容体のリガンド結合ドメインへの結合に対する競合により測定しうる（すなわち競合的結合アッセイ法）。
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドについての１タイプの競合的結合アッセイ法は、放射性標識された可溶性ヒトｆｌｔ３−Ｌ、および細胞表面ｆｌｔ３受容体を発現する無傷の細胞を使用する。無傷の細胞の代わりに、プロテインＡ、プロテインＧ、またはｆｌｔ３もしくはその分子のＦｃ部分に対する抗体と融合蛋白質のＦｃ領域との相互作用により固相に結合した可溶性ｆｌｔ３受容体（たとえばｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質）を使用しうる。他のタイプの競合的結合アッセイ法は、放射性標識された可溶性ｆｌｔ３受容体、たとえばｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質、およびｆｌｔ３−Ｌを発現する無傷の細胞を用いる。あるいは可溶性ｆｌｔ３−Ｌを固相に結合させて、ｆｌｔ３発現細胞を陽性として選択することができる。
競合的結合アッセイ法は下記の常法により実施しうる。たとえば放射性標識されたｆｌｔ３−Ｌを用いて推定ｆｌｔ３−Ｌ相同体と競合させ、表面結合ｆｌｔ３受容体に対する結合活性をアッセイすることができる。定量的結果は競合的オートラジオグラフプレート結合アッセイ法により得られ、またはスキャッチャードプロットを利用して定量的結果を求めることができる。
あるいはｆｌｔ３結合性蛋白質、たとえばｆｌｔ３−Ｌおよび抗ｆｌｔ３抗体を固相、たとえばカラムクロマトグラフィーマトリックス、または細胞表面にｆｌｔ３受容体を発現する細胞を同定、分離または精製するのに適した同様な支持体に結合させることができる。固相接触表面へのｆｌｔ３結合性蛋白質の結合は任意の手段によって、たとえばｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質を構築し、それをプロテインＡまたはプロテインＧとの相互作用により固相に結合させることにより達成しうる。蛋白質を固相に固定するための他の種々の手段が当技術分野で周知であり、本発明に用いるのに適している。たとえば磁性ミクロスフェアをｆｌｔ３結合性蛋白質でコーティングし、磁場を通るインキュベーション容器内に保持することができる。造血系前駆細胞または幹細胞を含有する細胞混合物の懸濁液を、ｆｌｔ３結合性蛋白質をその上に保有する固相と接触させる。それらの表面にｆｌｔ３受容体を有する細胞は固定されたｆｌｔ３結合性蛋白質に結合し、次いで結合していない細胞を洗浄除去する。このアフィニティー結合法は、それらのｆｌｔ３発現細胞を溶液から精製、スクリーニングまたは分離するために有用である。陽性として選択された細胞を固相から放出させる方法は当技術分野で周知であり、たとえば酵素の使用が包含される。それらの酵素は、細胞に対して無毒性であり、損傷を与えないものが好ましく、かつ細胞表面の結合相手を開裂させることを目的としたものが好ましい。ｆｌｔ３：ｆｌｔ３−Ｌ相互作用の場合、酵素は好ましくはｆｌｔ３受容体を開裂させ、これにより得られる細胞懸濁液を“外来”ｆｌｔ３−Ｌ物質から分離する。次いで精製された細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡張したのち、患者の造血系および免疫系を再構成するのに十分な量で患者に移植することができる。
あるいは、ｆｌｔ３+細胞を含有する疑いのある細胞混合物をまずビオチニル化ｆｌｔ３結合性蛋白質と共にインキュベートすることができる。ｆｌｔ３への十分な結合を保証するためには、インキュベーション期間は一般に少なくとも１時間である。次いで得られた混合物を、アビジンコーティングしたビーズを充填したカラムに導通し、これによりアビジンに対するビオチンの高い親和性がビーズへの細胞の結合をもたらす。アビジンコーティングしたビーズの使用は当技術分野で周知である。ベレンソン（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。結合していない物質の洗浄、および結合した細胞の放出は常法により実施される。
前記方法においては、適切なｆｌｔ３結合性蛋白質はｆｌｔ３−Ｌ、抗ｆｌｔ３抗体、およびｆｌｔ３を高アフィニティー結合しうる他の蛋白質である。好ましいｆｌｔ３結合性蛋白質はｆｌｔ３−Ｌである。
前記のように、本発明のｆｌｔ３−Ｌはｆｌｔ３受容体を発現する細胞を分離するために利用しうる。別法においては、ｆｌｔ３−Ｌまたはその細胞外ドメインもしくはフラグメントを、検出可能な部分、たとえば125Ｉに結合させて、ｆｌｔ３発現細胞を検出することができる。125Ｉによる放射性標識法は、高い比活性に標識された機能性125Ｉ−ｆｌｔ３−Ｌ分子を与える幾つかの標準法のいずれによっても実施しうる。あるいはこの分子のｆｌｔ３領域またはＦｃ領域に対するヨウ素化またはビオチニル化された抗体を使用しうる。他の検出可能な部分、たとえば比色反応または蛍光測定反応を触媒しうる酵素、ビオチンまたはアビジンを使用しうる。ｆｌｔ３受容体発現につき試験すべき細胞を、標識ｆｌｔ３−Ｌと接触させることができる。インキュベーション後に、結合していない標識ｆｌｔ３−Ｌを除去し、検出可能な部分を利用して結合を測定する。
ｆｌｔ３−Ｌ（変異体を含めて）の結合特性は、結合した可溶性ｆｌｔ３受容体（たとえば125Ｉ−ｆｌｔ３：Ｆｃ）を用いて、前記と同様な競合アッセイ法により測定することもできる。ただしこの場合、ｆｌｔ３受容体を発現する無傷の細胞、または固形支持体に結合した可溶性ｆｌｔ３受容体を用いて、推定ｆｌｔ３−Ｌ変異体を含有する試料が、結合した可溶性ｆｌｔ３との結合に対してｆｌｔ３−Ｌと競合する程度を測定する。
ｆｌｔ３−Ｌをアッセイするための他の手段には、抗−ｆｌｔ３−Ｌ抗体、ｆｌｔ３−Ｌに応答して増殖する細胞系、またはｆｌｔ３受容体を発現し、かつｆｌｔ３−Ｌの存在下で増殖する組換え細胞系の使用が含まれる。たとえばＢＡＦ／ＢＯ３細胞系はｆｌｔ３受容体を欠如し、ＩＬ−３依存性である。（ハタケヤマ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ）ら，Ｃｅｌｌ，５９：８３７−８４５（１９８９）を参照されたい）。ｆｌｔ３受容体遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクションされたＢＡＦ／ＢＯ３細胞は、ＩＬ−３またはｆｌｔ３−Ｌに応答して増殖する。ｆｌｔ３のトランスフェクションに適した発現ベクターの例は、ｐＣＡＶ／ＮＯＴプラスミドである。モスレイ（Ｍｏｓｌｅｙ）ら，Ｃｅｌｌ，５９：３３５−３４８（１９８９）を参照されたい。
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドはオリゴマー、たとえば共有結合または非共有結合した二量体または三量体として存在しうる。オリゴマーは異なるｆｌｔ３−Ｌポリペプチド上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により結合していてもよい。本発明の１態様においては、ｆｌｔ３−リガンド結合ドメインに対するｆｌｔ３−Ｌの結合を妨害しない様式でｆｌｔ３−Ｌを抗体（たとえばＩｇＧ１）のＦｃ領域に融合させることにより、ｆｌｔ３−Ｌ二量体が形成される。Ｆｃポリペプチドは、可溶性ｆｌｔ３−Ｌ（細胞外ドメインのみを含む）のＣ−末端に融合させることが好ましい。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含めて）の種々の部分に融合した異種ポリペプチドを含む融合蛋白質の一般的調製法は、たとえばアシュケナジ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ）ら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１）およびビルン（Ｂｙｒｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０）により記載されており、これらは参考として本明細書に含まれるものとする。ｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質をコードする遺伝子融合体を適宜な発現ベクターに挿入する。ｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質を抗体分子によく似た状態に組み立てると、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成されて、二価ｆｌｔ３−Ｌが生成する。融合蛋白質が抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方を備えた状態に作成される場合、４つものｆｌｔ３−Ｌ細胞外領域を備えたオリゴマーを形成することができる。あるいは２つの可溶性ｆｌｔ３−Ｌドメインをペプチドリンカーで結合させることができる。
ｆｌｔ３−ＬをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターは、周知の方法で調製することができる。発現ベクターは、適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列、たとえば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するものに作動的に結合している（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）ｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終止を制御する適宜な配列が含まれる。調節配列がｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡ配列に対し機能的に関連をもつ場合、ヌクレオチド配列は“作動的に結合している”。たとえばプロモーターヌクレオチド配列がｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡ配列の転写を制御する場合、そのプロモーターヌクレオチド配列はｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡ配列に作動的に結合している。目的とする宿主細胞内で複製する能力（通常は複製起点により与えられる）、およびそれにより形質転換体が同定される選択遺伝子を、発現ベクターにさらに取り込ませることができる。
さらに天然にはｆｌｔ３−Ｌに付随しない適宜なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクターにさらに取り込ませることができる。たとえばシグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡ配列を読み枠が一致するように（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）ｆｌｔ３−Ｌ配列に融合させ、これによりｆｌｔ３−Ｌは最初はシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳される。目的とする宿主細胞内で機能するシグナルペプチドは、ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドはｆｌｔ３−Ｌが細胞から分泌された時点でｆｌｔ３−Ｌポリペプチドから開裂しうる。
ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞またはより高等な真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞系の宿主につき用いるのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、たとえばパウエルズ（Ｐｏｗｅｌｓ）ら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ニューヨーク州エルゼビル（１９８５）に記載されている。本明細書に開示するＤＮＡ構造体に由来するＲＮＡを用いてｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを調製するために、無細胞翻訳系を用いることもできる。
原核細胞にはグラム陰性またはグラム陽性生物、たとえば大腸菌またはバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。形質転換に適した原核細胞には、たとえば大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する多様な他の種が含まれる。原核宿主細胞、たとえば大腸菌の場合、ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドは原核宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ−末端Ｍｅｔは発現した組換えｆｌｔ３−Ｌポリペプチドから開裂させることができる。
原核宿主細胞に用いられる発現ベクターは、一搬に１または２以上の表現型選択型マーカー遺伝子を含む。表現型選択型マーカー遺伝子は、たとえば抗生物質耐性を与えるか、または独立栄養要件を与える蛋白質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、市販のプラスミドに由来するもの、たとえばクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）が含まれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含み、従って形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を用いて発現ベクターを構築するためには、適宜なプロモーターおよびｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の市販のベクターには、たとえばｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スウェーデン国ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク、米国ワイオミング州マディソン）が含まれる。
組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，１９７８；およびゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；および欧州特許出願公開第３６７７６号明細書）、およびｔａｃプロモーター（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，ｐ．４１２，１９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定（ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ）リプレッサー配列を用いる。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手される、λＰLプロモーターの誘導体を取り込んだプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９に常在（ＡＴＣＣ  ３７０９２））およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１に常在（ＡＴＣＣ  ５３０８２））が含まれる。
あるいはｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを酵母系宿主細胞、好ましくはサッカロミセス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（たとえばビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））内において発現させてもよい。他の属の酵母、たとえばピチア属菌（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｋ．ラクチス属菌（ｋ．ｌａｃｔｉｓ）またはクルイベロミセス属菌（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）も使用しうる。酵母ベクターはしばしば２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択型マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、特に下記に対するプロモーターが含まれる：メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）または他の解糖酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ。酵素発現に用いられる他の適切なベクターおよびプロモーターは、さらにヒッツェマン、欧州特許出願公開第７３，６５７号明細書またはフリール（Ｆｌｅｅｒ）ら．Ｇｅｎｅ，１０７：２８５−１９５（１９９１）；およびファン・デン・バーグ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５−１３９（１９９０）に記載されている。これらに代わる他のものはグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである：ルセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）およびバイエル（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，１９８２）により記載。酵母および大腸菌の両方において複製しうるシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）を前記の酵母ベクターに挿入することにより構築しうる。
酵母α因子リーダー配列は、ｆｌｔ３−Ｌ−ポリペプチドの直接分泌のために使用しうる。α因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入される。たとえばクルジャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３．１９８２；ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５３３０，１９８４；米国特許第４，５４６，０８２号明細書；および欧州特許第３２４．２７４号明細書を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列は当業者に知られている。リーダー配列をその３′末端付近で、１または２以上の制限部位を含むように修飾しうる。これにより構造遺伝子へのリーダー配列の融合が容易になるであろう。
酵母の形質転換プロトコールは当業者に知られている。それらのプロトコールの１つがヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，１９７８により記載されている。ヒネンらのプロトコールはＴｒｐ+形質転換体を選択培地中で選択する。その際、選択培地は０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母系宿主細胞は、発現を誘発するために“富（ｒｉｃｈ）”培地中で増殖させることができる。富培地の一例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなるものである。陪地からグルコースが枯渇した時点でＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が起こる。
組換えｆｌｔ３−Ｌポリペプチドを発現させるために、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を用いることもできる。昆虫細胞における異種蛋白質産生のためのバキュロウイルス系がラッコウおよびサマーズ（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｓｕｍｍｅｒｓ），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７（１９８８）に概説されている。哺乳動物由来の樹立細胞系も使用しうる。適切な哺乳動物性宿主細胞系の例には下記のものが含まれる：サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）ら，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、ならびにアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎細胞系ＣＶＩ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系：マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）により記載。
哺乳動物系宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。慣用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物系宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を得ることができる。ウイルスの初期および後期プロモーターは、両者ともウイルスゲノムからウイルス性複製起点をも含みうるフラグメントとして容易に得られるので、特に有用である（ファイエルズ（Ｆｉｅｒｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，１９７８）。これより小型または大型のＳＶ４０フラグメントも、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＳＶ４０ウイルス性複製起点部位に位置するＢｇｌＩ部位へ伸びた約２５０ｂｐの配列が含まれる限り使用しうる。
哺乳動物系宿主細胞に用いる発現ベクターの一例は、オカヤマおよびバーグ（Ｏｋａｙａｍａ，Ｂｅｒｇ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）の記載に従って構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高水準発現に有用な系を、実質的にコスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）の記載に従って構築することができる。有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４（コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，１９８４）はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。他の有用な哺乳動物発現ベクターは、欧州特許出願公開第０３６７５６６号および米国特許出願第０７／７０１，４１５号（１９９１年５月１６日出願）明細書に記載されており、これらは本明細書に参考として含まれるものとする。ベクターはレトロウイルスに由来するものであってもよい。天然シグナル配列の代わりに異種シグナル配列、たとえば下記のものを付加してもよい：米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるＩＬ−７に対するシグナル配列；コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるＩＬ−２受容体に対するシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６号明細書に記載されるＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるタイプＩ  ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；および欧州特許第４６０，８４６号明細書に記載されるタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体シグナルペプチド。
本発明による単離された、または均質な蛋白質としてのｆｌｔ３−Ｌは、前記に従って組換え発現系により産生され、または天然細胞から精製しうる。ｆｌｔ３−ＬはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析に際して単一蛋白質バンドにより示されるように、実質的に均質になるまで精製することができる。
ｆｌｔ３−Ｌを調製するための１方法は、ｆｌｔ３−ＬをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ｆｌｔ３−Ｌの発現促進に十分な条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じて、ｆｌｔ３−Ｌを培地または細胞抽出物から回収する。当業者に知られているように、組換え蛋白質の精製法は用いた宿主細胞のタイプなどの因子、および組換え蛋白質が培地中に分泌されるか否かに従って異なるであろう。
たとえば組換え蛋白質を分泌する発現系を用いる場合、市販の蛋白質濃縮用フィルター、たとえばアミコンまたはミリポア・ペリコン限外濾過ユニットを用いて、まず培地を濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を精製マトリックス、たとえばゲル濾過材に付与することができる。あるいはアニオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白質精製に慣用される他の種類のものであってもよい。あるいはカチオン交換工程を採用しうる。適切なカチオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ基材（たとえばペンダントメチル基その他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１または２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ｆｌｔ３−Ｌをさらに精製することができる。以上の精製工程の幾つか、またはすべてを種々に組み合わせた形のもの周知であり、これらを用いて実質的に均質な組換え蛋白質を得ることができる。
ｆｌｔ３受容体のリガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを用いて、発現されたｆｌｔ３−Ｌポリペプチドをアフィニティー精製することができる。ｆｌｔ３−Ｌポリペプチドは常法により、たとえば高塩類の溶離緩衝液を用い、次いで使用するための低塩類緩衝液中へ透析するか、または用いたアフィニティーマトリックスに応じてｐＨその他の成分を変化させることにより、アフィニティーカラムから分離することができる。あるいはアフィニティーカラムは、ｆｌｔ３−Ｌを結合する抗体を含むことができる。実施例６は、ｆｌｔ３−Ｌに対するモノクローナル抗体を得るために本発明のｆｌｔ３−Ｌを利用する方法を記載する。
細菌培養物中に産生された組換え蛋白質は、通常はまず宿主細胞を破壊し、遠心分離し、不溶性ポリペプチドである場合は細胞ペレットから、または可溶性ポリペプチドである場合は上澄液から抽出し、次いで濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程のうち１または２以上により単離される。最後に、最終精製工程としてＲＰ−ＨＰＬＣを採用することができる。微生物細胞はいずれか簡便な方法により破壊することができ、これには凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。
精製を簡略化するために、ｆｌｔ３−Ｌを分泌ポリペプチドとして発現する形質転換した酵母系宿主細胞を用いることが好ましい。酵母系宿主細胞発酵により分泌された組換えポリペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）に示されたものと同様な方法で精製することができる。ウルダルらは組換えヒトＩＬ−２を調製用ＨＰＬＣカラム上で精製するために２つの連続した逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
標的ｆｌｔ３−Ｌ  ｍＲＮＡ配列に（二重らせんを形成）、または二本鎖ＤＮＡヘリックス中のｆｌｔ３−Ｌ配列に（三重らせんを形成）結合しうる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを、本発明により調製することができる。本発明によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡのコード領域のフラグメントを含む。そのフラグメントは一般に少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４−約３０のヌクレオチドを含む。特定の蛋白質に対するｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを形成しうることは、たとえばスタインおよびコーエン（Ｓｔｅｉｎ，Ｃｏｈｅｎ），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８、ならびにファン・デル・クロル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ）ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８に記載されている。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸配列に結合すると、二重らせんの分解増大、転写もしくは翻訳の早期終止を含めた幾つかの方法のうちのいずれかにより、または他の方法により、翻訳（ＲＮＡ）または転写（ＤＮＡ）を遮断する複合体が形成される。従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ｆｌｔ３−Ｌ蛋白質の発現を遮断することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（または他の糖結合、たとえば国際特許出願公開第９１／０６６２９号明細書に記載）を有するオリゴヌクレオチドを含み、その際それらの糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性である。抵抗性糖結合を有するそれらのオリゴヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することができる）が、標的ヌクレオチド配列に結合しうる配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、有機部分、たとえば国際特許出願公開第９０／１０４４８号明細書に記載のものに、また標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める他の部分、たとえばポリ−（Ｌ−リシン）に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、たとえばエリプチシン、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改質することができる。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、任意の遺伝子導入法により（たとえばＣａＰＯ4仲介ＤＮＡトランスフェクション、電気穿孔法が含まれる）、または遺伝子導入ベクター、たとえばエプスタイン−バールウイルスの使用により、標的核酸配列を含む細胞内へ導入することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを適切なレトロウイルスベクターに挿入し、次いでこの挿入配列を含むレトロウイルスベクターと細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入することが好ましい。適切なレトロウイルスベクターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬ  Ｖ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬ  Ｖに由来するレトロウイルス）、ＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと表示される二重コピーベクター（国際特許出願ＵＳ  ９０／０２６５６号明細書参照）。
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開第９１／０４７５３号明細書の記載に従ってリガンド結合性分子との結合体を形成することにより、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入することもできる。適切なリガンド結合性分子には、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。リガンド結合性分子の結合は、リガンド結合性分子がその対応する分子もしくは受容体に結合する効力を実質的に妨害せず、あるいはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型が細胞に進入するのを遮断しないことが好ましい。
あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開第９０／１０４４８号明細書の記載に従ってオリゴヌクレオチド−脂質複合体を形成することにより、標的核酸配列を含む細胞に導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、細胞内で内因性リパーゼにより解離することが好ましい。
本発明のｆｌｔ３−Ｌポリペプチドは、薬剤学的に有用な組成物を調製するために用いられる既知の方法に従って調合することができる。ｆｌｔ３−Ｌを唯一の有効物質として、または他の既知の有効物質と共に、薬剤学的に適切な希釈剤（たとえばトリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、防腐剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、補助剤および／またはキャリヤーとの混合物として組み合わせることができる。適切なキャリヤーおよびそれらの配合物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０年、マック・パブリシング・コーポレーションに記載されている。さらにそれらの組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成した、あるいは高分子化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどに含有された、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単ラメラもしくは多重ラメラ小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロブラストに取り込まれたｆｌｔ３−Ｌを含有しうる。それらの組成物はｆｌｔ３−Ｌの物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。ｆｌｔ３−Ｌを組織特異性受容体に対する抗体、リガンドもしくは抗原に結合させ、または組織特異性受容体のリガンドに結合させてもよい。ｆｌｔ３受容体が新生細胞上に見られる場合、ｆｌｔ３−Ｌを毒素に結合させ、これによりｆｌｔ３−Ｌを用いて特異的部位へ毒素を送達するか、またはそれらの新生細胞を後続投与される抗腫瘍薬に対して増感させるために用いることができる。
ｆｌｔ３−Ｌは局所的に、非経口的に、または吸入により投与することができる。“非経口的”という語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、クモ膜下槽内注射、または注入法が含まれる。これらの組成物は一般に有効量のｆｌｔ３−Ｌを単独で、または有効量の他の任意の有効物質と組み合わせて含有するであろう。それらの用量および組成物に含有される薬物の目的濃度は多数の因子に応じて異なり、これには意図する用途、患者の体重および年齢、ならびに投与経路が含まれる。用量は予め動物試験により決定することができ、ヒトに投与するための用量の比例計算は当技術分野で認められている方法で行うことができる。以上の記載を留意して、ｆｌｔ３−Ｌの一般的な用量は約１０−約１０００μｇ／ｍ2である。好ましい用量は約１００−約３００μｇ／ｍ2である。
前記のほか、具体的態様を説明するために以下の実施例を提示するが、これらは本発明を限定するためのものではない。
実施例１
ｆｌｔ３受容体：Ｆｃ融合蛋白質の調製
この例は、ネズミｆｌｔ３  ｃＤＮＡのクローニング、およびｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡクローンの検出に用いる可溶性ネズミｆｌｔ３受容体：Ｆｃ融合蛋白質をコードする発現ベクターの構築につき記載する。ネズミＴ細胞からのｆｌｔ３  ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニングを、オリゴヌクレオチドプライマーおよびライマン（Ｌｙｍａｎ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：８１５−８２２，（１９９３）（本明細書に参考として含まれるものとする）に記載の方法を用いて実施した。マウスｆｌｔ３受容体に関するｃＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列は、ロスネット（Ｒｏｓｎｅｔ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１６４１−１６５０，（１９９１）（本明細書に参考として含まれるものとする）により提示されている。マウスｆｌｔ３蛋白質は５４２アミノ酸の細胞外ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメイン、および４３７アミノ酸の細胞質ドメインを有する。
ネズミｆｌｔ３  ｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡのＮ末端に融合させる前に、増幅されたマウスｆｌｔ３  ｃＤＮＡフラグメントを、国際特許出願公開第９０／０５１８３号明細書に記載されるｐＣＡＶ／ＮＯＴのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ部位へ挿入した。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ストラタジーン・クローニング・システムズ（カリフォルニア州ラジョラ）から市販されているｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（登録商標）ベクターのＳｐｅＩ部位へクローニングした。このプラスミドベクターは大腸菌内で複製することができ、２１のユニーク制限部位を含むポリリンカーセグメントを含む。ユニークＢｇｌＩＩ部位を、挿入されたＦｃコード配列の５′末端付近に、ＢｇｌＩＩ部位がＦｃポリペプチドのアミノ酸３および４に対するコドンを包含するように導入した。
コードされたＦｃポリペプチドはＮ末端ヒンジ部から天然Ｃ末端へ伸び、すなわち本質的に全長抗体Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域のフラグメント、たとえばＣ末端でトランケートしたものも使用しうる。それらのフラグメントは好ましくは多重システイン残基（少なくともヒンジ反応におけるシステイン残基）を含み、２つの別個のｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質のＦｃポリペプチド部分間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、前記の二量体を形成することができる。
Ａｓｐ７１８制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をｆｌｔ３コード領域の上流に導入した。マウスｆｌｔ３  ｃＤＮＡのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩフラグメント（細胞外ドメイン全体、トランスメンブランドメイン領域、および細胞質ドメインの小部分を含む）を単離した。このＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ  ｆｌｔ３部分ｃＤＮＡを、Ｆｃ  ｃＤＮＡを含むｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（登録商標）ベクター中へ、ｆｌｔ３  ｃＤＮＡがＦｃ  ｃＤＮＡの上流に位置するようにクローニングした。ｆｌｔ３の細胞外ドメイン全体をＦｃ配列に完全に融合させるために、得られた遺伝子融合体に由来する一本鎖ＤＮＡを、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）、およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）に記載の方法により突然変異誘発した。突然変異ＤＮＡを配列決定して、適正なヌクレオチドが除かれた（すなわちトランスメンブラン領域および一部の細胞質ドメインＤＮＡを欠失した）こと、ならびにｆｌｔ３およびＦｃ配列が同一読み枠内にあることを確認した。次いで融合ｃＤＮＡを切り出し、ｓｆＨＡＶ−ＥＯ  ４０９と表示される哺乳動物発現ベクター（ＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切断し、ＳａｌＩおよびＡｓｐ７１８末端を平滑処理したもの）に挿入した。ｓｆＨＡＶ−ＥＯベクター（ｐＤＣ４０６としても知られている）はマクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０；Ｎｏ．１０：２８２１−２８３２（１９９１））により記載されている。
ｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質は、好ましくは組換え哺乳動物細胞培養において合成される。ｆｌｔ３：Ｆｃ融合体を含む発現ベクターをＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）およびＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（両方ともサル腎細胞に由来する）内へトランスフェクションした。ＣＶ−１およびＣＯＳ−７細胞ともにｆｌｔ３：Ｆｃ発現水準は比較的低かった。従って２９３細胞（形質転換した一次ヒト胚腎細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）における発現を試みた。
ｓｆＨＡＶ−ＥＯ／ｆｌｔ３：Ｆｃベクターでトランスフェクションした２９３細胞を回転瓶内で培養して、融合蛋白質を過渡発現させた。これはｆｌｔ３シグナルペプチドにより培地中へ分泌される。融合蛋白質をプロテインＡセファロースカラム上で精製し、溶離し、実施例２および３に記載するようにｆｌｔ３：Ｆｃの結合効力につき細胞をスクリーニングするために使用した。
実施例２
ｆｌｔ３：Ｆｃ結合に関する細胞のスクリーニング
下記の一般的カテゴリーに属する約１００の異なる一次細胞および細胞系をｆｌｔ３：Ｆｃ結合につきアッセイした：一次ネズミ胎児脳細胞、ネズミ胎児肝細胞系、ラット胎児脳細胞系、ヒト肺癌（繊維芽）細胞系、ヒトおよびネズミリンパおよび骨髄細胞系。細胞系をｆｌｔ３：Ｆｃと共に、次いでビオチニル化抗ヒトＦｃ抗体と共に、次いでストレプトアビジン−フィコエリトリン（ベクトン・ディッキンソン）と共にインキュベートした。ビオチニル化抗体はジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズから購入された。ストレプトアビジンは抗ヒトＦｃ抗体に結合したビオチン分子に結合し、この抗体がｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質のＦｃ部分に結合する。フィコエリトリンは、検出可能な標識として作用する蛍光フィコビリ蛋白質である。蛍光シグナルの水準を各細胞タイプにつきＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を用いて測定した。ｆｌｔ３：Ｆｃ結合に関して陽性であると思われる細胞タイプを同定した。
実施例３
ネズミＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーからのｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡの単離およびクローニング
細胞系Ｐ７Ｂ−０．３Ａ４のネズミＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、ｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡの供給源の可能性として選んだ。Ｐ７Ｂ−０．３Ａ４は、Ｔｈｙ１．２+、ＣＤ４、ＣＤ８、-ＴＣＲａｂ+、ＣＤ４４+のネズミＴ細胞クローンである。それは最初に細胞密度０．３３細胞／ウェルでｒＨｕＩＬ−７および固定化された抗−ＣＤ３  ＭＡｂの存在下にクローニングされ、１５ｎｇ／ｍｌ  ｒＨｕＩＬ−７を含有する培地中で週１回の継代による１年以上の連続培養により増殖した。母体細胞系は、５０ｎＭ  ＰＬＰ139-151ペプチド、および不完全フロイントアジュバント中１００μｇのヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａで免疫化したＳＪＬ／Ｊマウスのリンパ節細胞に由来するものであった。ＰＬＰは中枢神経系のミエリン鞘のプロテオリピド蛋白質成分である。アミノ酸１３９−１５１からなるペプチドは実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）である、ＳＪＬ／Ｊマウスにおける多発性硬化症に関するネズミモデルにおいて、起脳炎ペプチド（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であることが従来示されている（タヒー、ルー、ソーベル、ロールセンおよびリース（Ｖ．Ｋ．Ｔｏｕｃｈｙ，Ｚ．Ｌｕ，Ｒ．Ａ．Ｓｏｂｅｌ，Ｒ．Ａ．Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．Ｌｅｅｓ）；１９８９，ＳＪＬマウスに関するミエリンプロテオリピド蛋白質の起脳炎性決定基の同定，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１５２３）。ＰＬＰ７と表示される母体細胞系は、抗原の存在下での初期培養ののち、クローニング前にｒＨｕＩＬ−７と共に（抗原の不在下で）６カ月以上連続培養された。
Ｐ７Ｂ−０．３Ａ４は照射された同系脾臓細胞の存在下で極めて高い濃度のＰＬＰ139-151ペプチドに反応して初めて増殖し、起脳炎性または異系反応性（ａｌｌｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）ではない。このクローンは固定化された抗−ＣＤ３  ＭＡｂ、ＩＬ−２およびＩＬ−７に反応して増殖するが、ＩＬ−４には反応しない。
ｆｌｔ３：Ｆｃの結合はマウスＴ細胞およびヒトＴ細胞に対して見られ、従って増殖の容易さのためマウスＴ細胞系が選ばれた（０．３Ａ４）。ｓｆＨＡＶ−ＥＯにおけるネズミ０．３Ａ４  ｃＤＮＡライブラリーを、マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０；Ｎｏ．１０：２８２１−２８３２，１９９１）の記載に従って調製した。ｓｆＨＡＶ−ＥＯは大腸菌においても複製する哺乳動物発現ベクターである。ｓｆＨＡＶ−ＥＯはＳＶ４０、エプスタイン−バールウイルスおよびｐＢＲ３２２に由来する複製起点を含み、ダウエル（Ｄｏｗｅｒ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４３１４（１９８９）により記載されたＨＡＶ−ＥＯの誘導体である。ｓｆＨＡＶ−ＥＯは、ＨＡＶ−ＥＯ中のアデノウイルス２の３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列中に存在するイントロンを欠失することによってＨＡＶ−ＥＯと異なる。要約すると、ネズミＴ細胞ｃＤＮＡをｓｆＨＡＶ−ＥＯのＳａｌＩ部位へ、ハイマーレ（Ｈａｙｍｅｒｌｅ）ら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：８６１５，１９８６）により記載されたものと同様なアダプター法によって、下記のオリゴヌクレオチドアダプター対を用いてクローニングした。
0004028594.tif 000002
二本鎖、平滑末端、ランダムプライムドｃＤＮＡを、０．３Ａ４ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、本質的にガブラーおよびホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９（１９８３）による記載に従って、ファルマシアＤＮＡキットを用いて調製した。前記のアダプターをハイマーレらによる記載に従ってｃＤＮＡに付加した。６５℃でセファクリルＳ−１０００に導通することにより低分子量物質を除去し、予めＳａｌＩで切断して同オリゴヌクレオチド対へリゲートさせておいたｓｆＨＡＶ−ＥＯ４１０中へｃＤＮＡをリゲートした。このベクターをｓｆＨＡＶ−ＥＯ４１０と表示する。ＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ中へ電気穿孔し（ダウエル（Ｄｏｗｅｒ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５，１９８８）、３７℃で１時間増殖させたのち、形質転換細胞を１ｍｌアリコートで２０％グリセリンを含有するＳＯＣ培地（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０（１９８３））中において凍結させた。１アリコートを滴定して、アンピシリン耐性コロニーの個数を測定した。得られた０．３４Ａライブラリーは１８４万のクローンを含んでいた。
ｓｆＨＡＶ−ＥＯ４１０におけるｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクションした大腸菌株ＤＨ１０Ｂを平板当たり約１６００コロニーとなるように平板培養した。各平板からコロニーを掻き取り、プールし、各プールからプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、プールしたＤＮＡ（約１６００コロニーを示す）を用いて準−集密層のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン、次いでクロロホルム処理の採用によりトランスフェクションした：ルスマン（Ｌｕｔｈｍａｎ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：１２９５，（１９８３）、およびマッカッチャン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ）ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４１：３５１，（１９８６）と同様。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ即時型（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）エンハンサー／プロモーターから駆出されたＥＢＶ核抗原−１（ＥＢＶ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）を構成性発現する。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１は、アフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）：マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）により記載。
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞をｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクションするために、細胞を完全培地（ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ），５０Ｕ／ｍｌペニシリン，５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン，２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有）中で維持し、密度２×１０5細胞／ウェルで単一ウェルチャンバー型スライド（ラブ−テク）上において平板培養した。スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で３０分間予備処理し、次いでＰＢＳで１回洗浄した。付着細胞層から培地を除去し、６６．６μＭ硫酸クロロキンを含有する完全培地１．５ｍｌと交換した。次いで２／１０ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中、２μｇ  ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストラン）を細胞に添加し、５時間インキュベートした。インキュベーション後に培地を除去し、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地の添加により２．５−２０分間、細胞にショックを与えたのち、溶液を新鮮な完全培地と交換した。細胞を２−３日間培養して、挿入配列を過渡的に発現させた。
トランスフェクションしたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の単層を、本質的にギアリングら（ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３６６７，１９８９）の記載に従ってスライドオートラジオグラフィーによりｆｌｔ３−Ｌの発現につきアッセイした。トランスフェクションしたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（チャンバー型スライドに付着したもの）を脱脂粉乳入り結合用培地（ＢＭ−ＮＦＤＭ）（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｇ／ｍｌナトリウムアジド、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）および５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭＩ培地１６４０）で１回洗浄した。次いで細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ中のｆｌｔ３：Ｆｃと共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後にチャンバー型スライド中の細胞単層をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄して、結合していないｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質を除去し、次いで４０ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体（後記）（１：５０に希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、結合していない125Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体を除去した。細胞を室温で３０分間、ＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒド（ｐＨ７．３）中においてインキュべートすることにより固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、風乾した。細胞を含むチャンバー型スライドをホホルイマージャー（Ｐｈｏｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（モレキュラー・ダイナミックス）上で一夜露光し、次いでコダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（水中に６×希釈）に浸漬し、遮光ボックス内で暗所において４℃で３−４日間露光した。次いでスライドをコダックＤ１９現像液（４０ｇ／水５００ｍｌ）中で約４分間現像し、水ですすぎ、アグファＧ４３３Ｃ定着液中で定着した。スライドを別個に顕微鏡により２５−４０倍の倍率で検査し、明るい背景に対するオートラジオグラフィー銀粒子の存在により、ｆｌｔ３−Ｌを発現している陽性細胞を同定した。
マウス抗ヒトＦｃ抗体はジャクソン・ラボラトリーズから得られた。この抗体はＦｃγ受容体に結合したＦｃ蛋白質への最小結合を示した。この抗体をクロラミンＴ法により標識した。要約すると、セファデックスＧ−２５カラムを製造業者の指示に従って調製した。カラムおよび樹脂に対する抗体の非特異的吸着を減少させるために、１％ウシ血清アルブミンを含有する１０カラム容量のＰＢＳで予備処理した。次いでウシ血清アルブミンを含有しない５容量のＰＢＳで、結合していないウシ血清アルブミンをカラムから洗浄除去した。ミクロ遠心管内で１０μｇの抗体（１０μｌのＰＢＳに溶解したもの）を５０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に添加し、２．０ｍＣｉの無キャリヤーＮａ125Ｉを添加し、溶液を十分に混合した。次いで１５μｌの新たに調製したクロラミン−Ｔ溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いで混合物を直ちにセファデックスＧ−２５のカラムに付与した。次いで１００−１５０μｌ画分の溶離液を採取することにより、放射性標識抗体をカラムから溶離した。放射性標識抗体を含有する溶離画分に、ウシ血清アルブミン撮終濃度１％になるように添加した。放射性ヨウ素化により５−１０×１０15ｃｐｍ／ｎｍｏｌ（蛋白質）の比活性が得られた。
スライドオートラジオグラフィー法により約１，６００ｃＤＮＡのプール中において約１，８４０，０００のｃＤＮＡをスクリーニングして初めて、１つの形質転換体プールのアッセイがｆｌｔ３：Ｆｃ結合に関して明瞭に陽性である多細胞を示した。次いでこのプールを５００のプールに分割し、スライドオートラジオグラフィにより再度スクリーニングし、陽性プールを同定した。このプールを１００のプールに分割し、再度スクリーニングした。この１００のプールからの個々のコロニーを、検出可能なｆｌｔ３：Ｆｃ結合活性をもつ表面蛋白質の合成を示したクローン（クローン＃６Ｃ）が同定されるまでスクリーニングした。このクローンを単離し、その０．８８ｋｂ  ｃＤＮＡ挿入配列を配列決定した。
クローン＃６Ｃのネズミｆｌｔ３−リガンドｃＤＮＡのコード領域のヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸の配列を配列番号：１および２に提示する。このｃＤＮＡ挿入配列は０．８８ｋｂの長さである。この配列内の読み取り枠は２３１アミノ酸の蛋白質をコードしうる。従って２３１アミノ酸読み取り枠に対するＤＮＡおよびコードされるアミノ酸の配列を配列番号：１および２に提示する。配列番号：２の蛋白質はタイプＩのトランスメンブラン蛋白質であり、Ｎ末端シグナルペプチド（アミノ酸１−２７）、細胞外ドメイン（アミノ酸２８−１８８）、トランスメンブランドメイン（アミノ酸１８９−２１１）、および細胞質ドメイン（アミノ酸２１２−２３１）を含む。シグナル配列が開裂したのちの天然蛋白質の予想分子量は２３，１６４ダルトンである。成熟蛋白質は９．３７２の推定ｐＩを有する。コード領域をブランキングして、５６ｂｐの５′側非コード配列および１２６ｂｐの３′側非コード配列があり、これには付加されたｃＤＮＡアダプターが含まれる。前記のクローニング法により、ネズミｆｌｔ３リガンドクローン＃５Ｈも得られ、これは配列番号：１のヌクレオチド４９に始まってヌクレオチド５４５（アミノ酸１６３に対応する）まで＃６Ｃクローンに一致する。＃５Ｈクローンはその地点から前方は完全に異なり、オータナティブスプライシング構造体を示す。
大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞におけるｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡを含むベクターｓｆＨＡＶ−ＥＯ４１０は、米国マリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年４月２０日に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ  ６９２８６を指定された。寄託はブダペスト条約に基づいてなされた。
実施例４
ヒトｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトｆｌｔ３−ＬをコードするｃＤＮＡをヒトクローン２２Ｔ細胞λｇｔ１０ランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーから、シムズ（Ｓｉｍｓ）ら，ＰＮＡＳ，８６：８９４６−８９５０（１９８９）の記載に従ってクローニングした。ライブラリーをネズミｆｌｔ３−Ｌの細胞外ドメインに対応する４１３ｂｐのＰｌｅＩフラグメント（配列番号：１のヌクレオチド１０３−５１６）でスクリーニングした。このフラグメントをオリゴプレハイブリダイゼーション緩衝液中で５５℃においてライブラリーフィルターに一夜ランダムプラィミング、ハイブリダイズさせた。次いでフラグメントを５５℃で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおいて１時間、続いて１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおいて１時間、次いで０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおいて１時間、洗浄した。陽性ファージプラークからのＰＮＡを抽出し、挿入配列をファージアームに特異的なオリゴヌクレオチドを用いるＤＣＲにより増幅した。次いでＤＮＡを配列決定した。クローン＃９に関する配列を配列番号：５に示す。さらにヒトｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡが前記と同じλｇｔ１０ランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーから、本質的に配列番号：１のヌクレオチド１２８−５４１に対応するｃＤＮＡ配列を含むネズミクローン＃５Ｈ  ｃＤＮＡの細胞外ドメインのフラグメントでライブラリーをスクリーニングすることにより単離された。
９８８ｂｐのｃＤＮＡクローン＃９の配列決定により、２９ｂｐの５′側非コード配列および２５０ｂｐの３′側非コード配列で囲まれた７０５ｂｐの読み取り枠が解明された。３′側非コード領域はポリ−Ａテイルを含まなかった。イニシエーターメチオニンの上流には読み枠が一致した終止コドンはなかった。この読み取り枠は配列番号：６のアミノ酸１−２３５により示される２３５アミノ酸のタイプＩトランスメンブラン蛋白質をコードする。この蛋白質は２６または２７アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを有する。Ｎ末端シグナルペプチドが長さ２７アミノ酸であるより長さ２６アミノ酸である確率の方がわずかに大きい。シグナルペプチドに続いて１５６または１５５アミノ酸の細胞外ドメイン（それぞれ２６または２７アミノ酸のシグナルペプチドにつき）；２３アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび３０アミノ酸の細胞質ドメインがある。ヒトｆｌｔ３−Ｌはネズミｆｌｔ３−Ｌと全体として７２％のアミノ酸一致率および７８％のアミノ酸類似率を共有する。クローン＃９のヒトｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡを含むベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（−）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国マリーランド州ロックビル（ＡＴＣＣ）に１９９３年８月６日に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ  ６９３８２を指定された。寄託はブダペスト条約に基づいてなされた。
実施例５
酵母におけるｆｌｔ３−Ｌの発現
酵母における可溶性ｆｌｔ３−Ｌの発現のために、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（ムリスおよびファルーナ（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｆａｌｏｏｎａ），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０，１９８７）により、ｆｌｔ３−Ｌのシグナルペプチドの末端とトランスメンブランセグメントの開始部との間の細胞外コードドメイン全体を増幅した。５′側プライマー（５′−ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣ−３′）配列番号：７は一部のα因子リーダーおよび抗原性オクタペプチドをコードし、ＦＬＡＧ配列はｆｌｔ３−Ｌの予想成熟Ｎ末端に読み枠が一致するように融合した。３′側オリゴヌクレオチド（５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧ−３′）配列番号：８は、ちょうど推定トランスメンブラン領域の位置に、Ｇｌｎ−１８９に続いて終止コドンを形成した。このＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントを、酵母培地中への組換え産物の分泌を指示する酵母発現ベクター中へ（Ｋ．ラクティスにおける発現のために）リゲートした（フリール（Ｆｌｅｅｒ）ら，Ｇｅｎｅ，１０７、２８５−１９５（１９９１）；およびファン・デン・ベルク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５−１３９（１９９０））。ＦＬＡＧ：ｆｌｔ３−Ｌ融合蛋白質を前記に従ってアフィニティークロマトグラフィーにより酵母ブロスから精製した（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）。
実施例６
ｆｌｔ３−Ｌに対するモノクローナル抗体
この例はｆｌｔ３−Ｌに対するモノクローナルの抗体調製法を説明する。ｆｌｔ３−Ｌを哺乳動物宿主細胞、たとえばＣＯＳ−７またはＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞において発現させ、ｆｌｔ３：Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したｆｌｔ３−Ｌ、そのフラグメント、たとえば細胞外ドメイン、合成ペプチド、またはｆｌｔ３−Ｌを発現する細胞を用いて、常法、たとえば米国特許第４，４１１，９９３号明細書に記載の方法により、ｆｌｔ３−Ｌに対するモノクローナル抗体を形成させることができる。要約すると、完全フロイントアジュバント中に乳化し、１０−１００μｇの量で皮下または腹腔内に注射した免疫原としてのｆｌｔ３−Ｌにより、マウスを免疫化しする。１０−１２日後に、免疫化した動物を不完全フロイントアジュバント中に乳化した追加のｆｌｔ３−Ｌにより追加免疫処置する。その後マウスを毎週または２週目毎の免疫化計画で定期的に追加免疫処置する。眼窩後出血または尾先端切除により血清試料を定期的に採取して、ｆｌｔ３−Ｌ抗体につきドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ法）またはｆｌｔ３−Ｌ結合阻害により試験する。
適切な抗体力価が検出されたのち、陽性動物に食塩水中のｆｌｔ３−Ｌを最後に１回、静脈内注射する。３−４日後に動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞系、たとえばＮＳＩまたは好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が得られ、これらを複数のミクロタイタープレート内において、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖防止のためにＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中で平板培養する。
ハイブリドーマ細胞を、エングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１、および米国特許第４，７０３，００４号明細書に記載された方法を適用して精製されたｆｌｔ３−Ｌに対する反応性につき、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好ましいスクリーニング法はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２，１９９０）が述べた抗体捕獲法である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ｆｌｔ３−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を調製することができる。あるいはハイブリドーマ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでフラスコまたは回転瓶内において種々の方法により増殖させることができる。マウス腹水中に形成されたモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿により、次いでゲル排除クロマトグラフィーにより精製することができる。あるいはｆｌｔ３に対する結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーと同様に、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも採用しうる。
実施例７
ｆｌｔ３−Ｌ単独使用およびＩＬ−７またはＩＬ−３との併用
この例は、ｆｌｔ３−ＬおよびＩＬ−７を含有する組成物によるＡＡ４．１胎児肝細胞の刺激および増殖；ならびにｆｌｔ３−ＬおよびＩＬ−３を含有する組成物によるｃ−ｋｉｔ−陽性（ｃ−ｋｉｔ+）細胞の刺激および増殖を証明する。
ＡＡ４．１−陽性（ＡＡ４．１+）発現細胞を１４日齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス胎児の肝臓からオプティラックス（Ｏｐｔｉｌｕｘ）１００ｍｍプラスチック製ペトリ皿（ファルコンＮｏ．１００１、カリフォルニア州オックスナード）に細胞パンニング（ｃｅｌｌ  ｐａｎｎｉｎｇ）により単離した。１０μｇ／ｍｌのＡＡ４．１抗体を含有するＰＢＳ＋０．１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で、４℃において平板を一夜コーティングし（マックキールン（ＭｃＫｅａｒｎ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３３２−３３９，１９８４）、次いで使用前にＰＢＳ＋１％ＦＢＳで十分に洗浄した。肝細胞の単一細胞懸濁液をＰＢＳプラス１％ＦＢＳ中において１０7細胞／皿で添加し、４℃で２時間、平板に付着させた。次いで平板を十分に洗浄し、付着細胞を分析または後記の造血アッセイにおける使用のために、掻き取りにより採取した。ＡＡ４．１抗体を用いるＦＡＣＳ分析により＞９５％のＡＡ４．１+細胞集団であることが証明された。
ｃ−ｋｉｔ+多能性幹細胞は成体マウス骨髄から精製された（デブリース（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５０３−１５０９，１９９２；ビッサーおよびデブリース（Ｖｉｓｓｅｒ，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９３、提出）。レクチン小麦胚芽凝集素に対して陽性であり、かつＢ２２０および１５−１．４．１（ビッサー（Ｖｉｓｓｅｒ）ら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３３：４５１−４６８，１９９０）モノクローナル抗体により認識される抗原に対して陰性である低密度細胞
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を、ビオチニル化スチール因子により、ｃ−ｋｉｔを発現する細胞と発現しない細胞のサブ集団に分けた。ｃ−ｋｉｔ+画分は多能性幹細胞を含有することが示された（デブリース（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：９８９−９９１，１９９２；ビッサーおよびデブリース（Ｖｉｓｓｅｒ，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９３、提出；ウェア（Ｗａｒｅ）ら，１９９３、提出）。
ＡＡ４．１+胎児肝細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号明細書）および２５０ｎｇ／ｍｌの組換えｆｌｔ３−Ｌ中で培養した。ｆｌｔ３−Ｌは３つの異なる形態で実験に用いられた：（１）固定したｆｌｔ３−ＬトランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞上に存在するものとして；（２）これらと同じｆｌｔ３−ＬトランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞から濃縮された培養上清として；ならびに（３）実施例５に記載された酵母上清から精製および単離されたポリペプチド調製物として。
造血アッセイ
ｃ−ｋｉｔ+幹細胞、胎児肝ＡＡ４．１+細胞の増殖を、本質的にはデブリース（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１，１９９１、により記載された［3Ｈ］−チミジン取り込みアッセイ法によってアッセイした。精製したｃ−ｋｉｔ+幹細胞を３７℃において空気中６．５％ＣＯ2および７％Ｏ2の完全加湿雰囲気で９６時間培養した。ネズミ組換えＩＬ−３を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで用いた。次いで細胞を２μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］−チミジン（８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アメルシャム・コーポレーション、イリノイ州アーリントン・ハイツ）でパルス処理し、さらに２４時間インキュベートした。ＡＡ４．１+細胞（約２０，０００細胞／ウェル）はＩＬ−７、ｆｌｔ３−Ｌおよびｆｌｔ３−Ｌ＋ＩＬ−７中で４８時間インキュベートされたのち、６時間の［3Ｈ］−チミジンパルス処理された。ｆｌｔ３−ＬおよびＩＬ−７の結果を表Ｉに、ｆｌｔ３−ＬおよびＩＬ−３の結果を表ＩＩに示す。
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実施例８
ｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質の構築
この例はｆｌｔ３−Ｌの細胞外領域およびヒト免疫グロブリンのＦｃドメインからなる融合蛋白質の構築法を記載する。これらの方法は本質的にｆｌｔ３：Ｆｃ融合蛋白質の構築につき実施例１に記載したものと同じである。
ｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡのＮ末端に融合させる前に、ｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡフラグメントをｐＣＡＶ／ＮＯＴのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ部位に挿入する（国際特許出願公開第９０／０５１８３号明細書に記載）。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ストラタジーン・クローニング・システムズ（カリフォルニア州ラジョラ）から市販されているｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（登録商標）ベクターのＳｐｅＩ部位にクローニングする。このプラスミドベクターは大腸菌において複製可能であり、２１のユニーク制限部位を含むポリリンカーセグメントを含む。次いでユニークＢｇｌＩＩ部位を、挿入されたＦｃコード配列の５′末端付近に、ＢｇｌＩＩ部位がＦｃポリペプチドのアミノ酸３および４に対するコドンを包含するように導入する。
コードされるＦｃポリペプチドはＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端へ伸びており、すなわち本質的に全長抗体Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域のフラグメント、たとえばＣ末端にトランケートしたものも使用しうる。これらのフラグメントは好ましくは多重システイン残基（少なくともヒンジ反応におけるシステイン残基）を含み、２個の別個のｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質のＦｃポリペプチド部分間に鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となり、２量体が形成される。
ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中のｆｌｔ３−ＬのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ部分ｃＤＮＡを、Ｆｃ  ｃＤＮＡを含むｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ（登録商標）ベクターのＡｓｐ７１８−ＳｐｅＩ部位へ、ｆｌｔ３−Ｌ  ｃＤＮＡがＦｃ  ｃＤＮＡの上流に位置するようにクローニングすることができる。ｆｌｔ３−Ｌの細胞外ドメイン全体を完全にＦｃ配列に融合させるために、得られた遺伝子融合体に由来する一本鎖ＤＮＡの配列を、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）が述べた鋳型指示（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発により変更することができる。次いで得られたＤＮＡを配列決定して、適正なヌクレオチドが除去されたこと（すなわちトランスメンブラン領域および一部の細胞質ドメインＤＮＡが欠失していること）、およびｆｌｔ３−Ｌ配列とＦｃ配列が同一読み枠内にあることを確認することができる。次いで融合蛋白質を切り出し、Ａｓｐ７１８−ＮｏｔＩで切断した哺乳動物発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯＴ中へ常法により挿入する。
ｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合蛋白質は組換え哺乳動物細胞培養において合成することが好ましい。次いでｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃ融合体を含む発現ベクターをＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）またはＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）中へトランスフェクションする。２９３細胞（形質転換した一次ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）における発現も採用しうる。
ｐＣＡＶ／ＮＯＴ／ｆｌｔ３−Ｌ：Ｆｃベクターでトランスフェクションした２９３細胞を回転瓶内で培養して、融合蛋白質を過渡発現させる。これはｆｌｔ３−Ｌシグナルペプチドにより培地中へ分泌される。融合蛋白質をプロテインＡセファロースカラムで精製することができる。
実施例９
ｆｌｔ３−Ｌを過剰発現するトランスジェニックマウスの形成
この例は、ｆｌｔ３−Ｌを過剰発現するトランスジェニックマウスを形成するために用いられる方法を記載する。ｆｌｔ３−Ｌを過剰発現するトランスジェニックマウスにつき研究して、過剰発現の生物学的影響を判定した。マウス（Ｂ１６／Ｊ）前核にｆｌｔ３−Ｌ  ＤＮＡをゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：１２４４−１２４６（１９８１）が述べた方法に従ってマイクロインジェクションした。一般に、可視前核を有するマウス受精卵をまず注入チャンバーに乗せ、小ピペットで適所に保持する。次いで注入ピペットを用いてｆｌｔ３−Ｌをコードする遺伝子（クローン＃６Ｃ）を卵の前核に注入する。次いで注入された卵を（ｉ）０．５日ｐ．ｃ．の偽妊娠雌の卵管内へ移すか；（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２細胞期まで培養し（一夜）、そして０．５日ｐ．ｃ．の偽妊娠雌の卵管内へ移すか；または（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで培養し、そして２．５日ｐ．ｃ．の偽妊娠雌の子宮内へ移す。長期ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が避けられるので最初の２つのうちいずれかを採用することが好ましく、かつ小規模の同腹子を避けるために、好ましくはマイクロインジェクション卵２０−３０個を移すべきである。
実施例１０
ｆｌｔ３−Ｌは脾臓における赤血球の増殖を刺激する
この例は、ｆｌｔ３−Ｌがトランスジェニックマウスの脾臓における赤血球の産生に及ぼす効果を記載する。トランスジェニックマウスは実施例１０の方法に従って形成された。マウスを屠殺し、それぞれの無傷の脾臓を単一細胞懸濁液となした。次いで懸濁細胞を遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清を含有する培地１０ｍｌに再懸濁した。それにつき血球計数器により細胞計数を行った。それぞれの細胞検体をトリパンブルー染色して計数し、下記の方程式に従って全生存細胞数／ｍｌ（培地）を求めた：（ＲＢＣ＋ＷＢＣ）／ｍｌ。ここでＲＢＣは赤血球数であり、ＷＢＣは白血球数を意味する。次いで各検体をチュルク染色（Ｔｕｒｋ’ｓ  ｓｔａｉｎ）して計数し、全白血球数／ｍｌ（培地）を求めた。全赤血球数／ｍｌは各検体につき、全白血球数を全生存細胞数／ｍｌから差し引くことにより算出された。結果を下記の表ＩＩＩに示す。
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表ＩＩＩのデータから、白血球数／ｍｌは対照マウスとほぼ同じであった。しかし２匹のトランスジェニックマウスの脾臓からの赤血球数は対照マウスにおいて見られたものより約２−３倍多かった。ｆｌｔ３−Ｌは赤血球系統の細胞の増加を刺激する。これは恐らく赤血球前駆細胞の刺激によるか、エリトロポエチンを産生する細胞の刺激によるか、または造血を阻害するメカニズムを遮断することによるものであろう。
実施例１１
ｆｌｔ３−ＬはＴ細胞および初期Ｂ細胞の増殖を刺激する
実施例１０に従って形成した９週齢のトランスジェニックマウスからの骨髄を、種々のＴおよびＢ細胞表現型マーカーの存在につき、それらのマーカーと免疫反応性である抗体を用いてスクリーニングした。下記のマーカーを、それらのマーカーに対する周知の抗体を用いて調べた：Ｂ２２０マーカー、これはＢ細胞系統に対して特異的である；表面ＩｇＭマーカー（ｓＩｇＭ）、これは成熟Ｂ細胞に対して特異的である；Ｓ７（ＣＤ４３）マーカー、これは初期Ｂ細胞マーカーである；幹細胞抗原−１（ＳＣＡ−１）マーカー、これは活性化されたＴ細胞およびＢ細胞のマーカーである；ＣＤ４、これはヘルパーＴ細胞およびある幹細胞に対するマーカーである；ならびにＭａｃ−１マーカー、これはマクロファージに対して特異的である。下記の表ＩＶは骨髄をスクリーニングすることにより得られたデータを示す。同腹からのトランスジェニックマウス２匹を同腹からの正常マウス（対照）および無関係な正常マウス（対照）に対比して分析した。
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上記のデータは、Ｂ２２０+細胞およびＳＣＡ−１+細胞の増加により示されるように、マウスにおけるｆｌｔ３−Ｌの過剰発現がＢ細胞数の増加をもたらすことを示す。ＦＡＣＳによるＢ２２０+細胞の分析は、ｐｒｏＢ細胞（ＨＳＡ-，Ｓ７+）の増加を示した。ＣＤ４+細胞の増加はＴ細胞および幹細胞の約２倍の増加を示した。ｓＩｇＭマーカーを有する細胞の減少は、ｆｌｔ３−Ｌが成熟Ｂ細胞の増殖を刺激しないことを示した。これらのデータは、ｆｌｔ３−Ｌが幹細胞、Ｔ細胞、または初期Ｂ細胞表現型を有する細胞を増加させ、成熟Ｂ細胞またはマクロファージの増殖を刺激しないことを示す。
実施例１２
ｆｌｔ３−Ｌ過剰発現マウスからの胸腺の分析
この例は、実施例１０に従って形成したトランスジェニックマウスからの胸腺の分析を記載する。それぞれ約３カ月齢の成体マウス６匹を屠殺した。各マウスから胸腺を摘出し、単一細胞懸濁液を調製した。
ＦＡＣＳ分析は、全細胞数の変化が起こらなかったこと、およびマウスが成熟胸腺細胞の比率の変化を示さなかったことをマーカーにより立証した：ＣＤ４対ＣＤ８；ＣＤ３対αβＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；およびＣＤ３対γδＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）。しかしＣＤ４-およびＣＤ８-コンパートメント内の特定の細胞タイプ（すなわち発達に関して最も初期の細胞；これは全胸腺細胞の約２−３％を占める）の比率の変化が起こった。具体的には、胸腺のＣＤ４-およびＣＤ８-細胞は３段階で発達する。段階１はＰｇｐ−１++、ＨＳＡ+，およびＩＬ−２受容体陰性（“ＩＬ−２Ｒ”）マーカーを有する細胞を表す。段階１ののち、胸腺細胞はＰｇｐ−１+、ＨＳＡ+、およびＩＬ−２Ｒ++マーカーを有する細胞からなる段階２へ発達し、次いでＰｇｐ−１+/-、ＨＳＡ++，およびＩＬ−２Ｒ-マーカーを有する細胞を特色とする段階３へ発達する。トランスジェニックマウスの段階２における胸腺細胞は約５０％減少したが、段階３における細胞数はそれに比例して増加した。これらのデータは、ｆｌｔ３−Ｌが胸腺細胞を発達の段階２から段階３へ駆動することを示唆し、ｆｌｔ３−Ｌが初期Ｔ細胞に対して活性であることを示す。
実施例１３
末梢幹細胞移植に際してのｆｌｔ３−Ｌの使用
この例は、ｆｌｔ３−Ｌを自己末梢幹細胞（ＰＳＣ）または末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）移植に使用する方法を記載する。一搬にＰＢＰＣおよびＰＳＣ移植は、たとえば骨髄の異常または悪性腫瘍併発のためその骨髄が採取に不適当である患者に対して実施される。
細胞採取の前に循環ＰＢＰＣおよびＰＳＣを動態化し、またはそれらの数を増加させることが望ましいであろう。動態化はＰＢＰＣおよびＰＳＣの採取を改善することができ、それらの細胞を採取する前に患者にｆｌｔ３−Ｌを静脈内投与することにより達成しうる。他の増殖因子、たとえばＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質、ＬＩＦ、ＦＧＦおよびそれらの組み合わせも、ｆｌｔ３−Ｌとの連続または同時組み合わせで投与することができる。動態化または非動態化ＰＢＰＣおよびＰＳＣを当技術分野で知られているアフェレーシス法により採取する。たとえばビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ）ら，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２，ｐｐ．６１０−６１６（１９９４）を参照されたい。要約すると、ＰＢＰＣおよびＰＳＣを一般的な器具、たとえばヘモネティクス・モデルＶ５０アフェレーシス器具（ヘモネティクス、マサチュセッツ州ブレーントリー）により採取する。約６．５×１０8の単核球（ＭＮＣ）／ｋｇ（患者）が採取されるまで、一般に週５回以下で４時間の採取を実施する。採取したＰＢＰＣおよびＰＳＣのアリコートを、カルシウムまたはマグネシウムを含有しないハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で約１：６に希釈し、リンパ球分離培地（オルガノン・テクニカ、ノースカロライナ州ダーラム）上に積層することにより、顆粒球−マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）含量につきアッセイする。遠心分離後に、界面のＭＮＣを採取し、洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁する。約３００，０００個のＭＮＣ、改良マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、０．３％の寒天、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−３、および２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧ−ＣＳＦを含有する１ｍｌアリコートを、３７℃で完全加湿空気中５％ＣＯ2において１４日間培養する。所望によりｆｌｔ３−ＬまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合分子（ＰＬＸＹ３２１）を培養物に添加してもよい。これらの培養物をライト染色により染色し、ＣＦＵ−ＧＭコロニーを解剖用顕微鏡により計数する（ワード（Ｗａｒｄ）ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１６：３５８（１９８８））。あるいはＣＦＵ−ＧＭコロニーを、シエナ（Ｓｉｅｎａ）ら，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．２，ｐｐ．４００−４０９（１９９１）のＣＤ３４／ＣＤ３３フローサイトメトリー法または当技術分野で知られている他の方法でアッセイすることができる。
ＣＦＵ−ＧＭを含有する培養物を制御速度型フリーザー（たとえばクリオメド、ミシガン州マウント・クレメンズ）内で凍結し、次いで液体窒素の蒸気相中に保存する。１０％ジメチルスルホキシドを凍結保護剤として使用しうる。患者からの採取をすべて行ったのち、ＣＦＵ−ＧＭを含有する培養物を融解し、プールする。融解細胞採取物を患者に静脈内再注入するか、または再注入の前にｅｘ  ｖｉｖｏで拡張する。プールした細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、ｆｌｔ３−Ｌを増殖因子として単独で、または前記に挙げた他のサイトカインとの連続もしくは同時組み合わせで用いて実施することができる。これらのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張法は当技術分野で周知である。拡張した、または拡張していない細胞を患者の静脈内に再注入する。移植細胞のグラフト化を容易にするために、ｆｌＩｔ３−Ｌを再注入と同時に、またはその後に投与する。このｆｌｔ３−Ｌ投与は単独で、または前記に挙げたものから選ばれる他のサイトカインとの連続もしくは同時組み合わせで行われる。
実施例１４
ｆｌｔ３−Ｌを用いる造血系前駆細胞および幹細胞の精製
この例は、細胞混合物を含有する懸濁液から造血系前駆細胞および幹細胞を精製する方法を記載する。骨髄および末梢血からの細胞を常法により採取する。細胞を標準培地に懸濁し、次いで遠心分離して、血球および好中球を除去する。２相の界面こ位置する細胞（バフィーコートとしても知られる）を取り出し、再懸濁する。これらの細胞は主として単核であり、初期造血系前駆細胞および幹細胞の実質部分を占める。次いで得られた細胞懸濁液をビオチニル化ｆｌｔ３−Ｌと共に、実質的なｆｌｔ３：ｆｌｔ３−Ｌ相互作用が行われるのに十分な期間インキュベートする。一般に少なくとも１時間のインキュベーション時間で十分である。インキュベーション後に細胞懸濁液を重力下で、アビジンコーティングしたビーズを充填したカラムに導通する。それらのカラムは当技術分野で周知である。ベレンソン（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。カラムをＰＢＳ溶液で洗浄して、結合していない物質を除去する。標的細胞は常法によりビーズおよびｆｌｔ３−Ｌから放出させることができる。
配列表
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ８７９塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  成熟タンパク質
（Ｂ）存在位置：  １．．２５
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  成熟タンパク質
（Ｂ）存在位置：  ８５５．．８７９
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ５７．．７５２
（xi）配列：  配列番号：１
0004028594.tif 000008
（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ２３１アミノ酸残基
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列：  配列番号：２
0004028594.tif 000009
（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ２４塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（xi）配列：  配列番号：３
0004028594.tif 000010
（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ２０塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（xi）配列：  配列番号：４
0004028594.tif 000011
（２）配列番号：５
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ９８８塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ３０．．７３４
（xi）配列：  配列番号：５
0004028594.tif 000012
0004028594.tif 000013
（２）配列番号：６
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ２３５アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列：  配列番号：６
0004028594.tif 000014
（２）配列番号：７
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ７１塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（xi）配列：  配列番号：７
0004028594.tif 000015
（２）配列番号：８
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：  ３７塩基対
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：  ＮＯ
（iv）アンチセンス：  ＮＯ
（xi）配列：  配列番号：８
0004028594.tif 000016