(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料群中の各核酸の混合物を遺伝子増幅法で増幅する工程と、増幅産物を制限酵素で消化する工程と、消化物を電気泳動にかける工程と、泳動バンドの濃さを測定する工程と、測定された各バンドの濃さに基づいて前記核酸試料群中の、核酸の種類の比率を測定する工程とを含む、核酸試料群中の、核酸の種類の比率の測定方法。
【請求項２】
可視化された泳動バンドの濃さを測定する工程は、電気泳動ゲル上の核酸バンドの濃度を紫外線吸収又は蛍光法による可視像を光学的手法で読み取り、濃度値をコンピューターに取込み、データ処理することにより行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸試料群中の核酸試料の数は２〜６である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸試料群中には、２種類の核酸が含まれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記それぞれの核酸試料は、それぞれ生物個体に由来し、生物個体群中の生物の種類の比率が測定される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物はウナギである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子増幅法は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成る第１の核酸プライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成る第２の核酸プライマーを用いて行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１の核酸プライマーとして、配列表の配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成るプライマーを用い、前記第２の核酸プライマーとして、配列表の配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成るプライマーを用いる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸プライマーとして、配列表の配列番号３に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）を有する核酸から成るプライマーを用い、前記第２の核酸プライマーとして、配列表の配列番号６に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）を有する核酸から成るプライマーを用いる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記制限酵素は、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩから成る群より選ばれる１又は２以上の制限酵素である請求項７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記制限酵素はＨｉｎｆＩである請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸試料混合物中の核酸の種類の比率の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本産のウナギは、学名がAnguilla japonica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フランス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のあるA. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. australis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等がある。
【０００３】
養鰻業は、ウナギの稚魚（シラス）を養殖することにより行われている。シラスは市販のものを購入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入している場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖しても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外見上、区別がつかない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のウナギのシラスの場合のように、外見上区別できない生物の種類を識別する方法として、遺伝子検査による方法が考えられる。しかしながら、遺伝子検査による方法では、各生物個体について、それぞれ分析する必要があり、日本産ウナギシラスの中に外国産ウナギシラスが混入することが予想される場合等では、かなりの数のシラスを無作為抽出して１個体ずつ分析する必要があるので、効率が悪くコストがかかる。もし、複数の生物個体を一括で処理し、その生物個体群中の生物の種類の混合比率（例えば、一群のウナギシラスにおける日本産と外国産の比率）がわかれば手間とコストを大きく削減することができ有利である。
【０００５】
従って、本発明の目的は、一括した処理により、核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定することができる方法を提供することである。
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、核酸試料混合物についてＰＣＲ−ＲＦＬＰを行い、電気泳動により現れる泳動バンドの濃さに基づいて核酸試料混合物中のの核酸の種類の比率を測定することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、核酸試料群中の各核酸の混合物を遺伝子増幅法で増幅する工程と、増幅産物を制限酵素で消化する工程と、消化物を電気泳動にかける工程と、泳動バンドの濃さを測定する工程と、測定された各バンドの濃さに基づいて前記核酸試料群中の、核酸の種類の比率を測定する工程とを含む、核酸試料群中の、核酸の種類の比率の測定方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、複数の核酸試料を含む核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定するものである。核酸試料が由来する生物としては、何ら限定されるものではなく、例えば、従来技術の項で述べたウナギの他に、マグロ、サケ等の魚、ウマ、ウシ、ヒツジ等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類、綿花、ダイズ、イネ、ムギ、各種野菜等の植物、カイコ等の昆虫等を例示することができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。また、核酸試料は、生物由来の各種加工品、例えば、各種生鮮食品や加工食品、羊毛、綿、繊維製品等に由来するものであってもよい。また、本明細書において、「核酸の種類」とは、次のことを意味する。すなわち、後述の核酸増幅領域中に、問題とする塩基が相違する塩基配列が２種類以上存在する場合に、各種類の塩基配列を有する核酸が、それぞれ「核酸の種類」を構成する。例えば、後述の実施例では、日本産のウナギであるAuguilla japonica と、フランス産のウナギであるAnguilla anguilla とを含む生物個体群について試験を行っているが、この場合、増幅領域中に問題とする塩基が異なる塩基配列が２種類存在するので、「核酸の種類」は２種類である。この実施例の個体群にさらにオーストラリア産のウナギであるAnguilla australisを加え、これら３種のウナギの混合比率を求める場合には、「核酸の種類」は３種類である。しかしながら、試料が３種のウナギ由来の核酸混合物である場合であっても、日本産と外国産（この例ではanguillaとaustralis の合計）の混合比率を求めることを目的とする場合には、日本産ウナギの塩基配列のみがその他の外国産ウナギと異なる塩基に注目するので、問題とする塩基配列が異なる塩基配列が２種類存在することになり（つまり、ある特定の部位の塩基が特定の塩基かそれ以外の塩基かということで２種類に分けられる）、従って、「核酸の種類」は２種類になる。このように、「核酸の種類」は、同じ核酸試料混合物であっても、検査の目的に応じて変化する概念である。さらに、増幅が起きない場合も１種類の核酸として扱われる。従って、例えば、核酸試料混合物中に、増幅操作により増幅が起きる核酸と起きない核酸が含まれており、増幅が起きる核酸試料の比率を求める場合も本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
核酸試料混合物中の核酸試料の数は、特に限定されないが、あまりに多くなると分析の精度が低下するので、通常、２〜６程度が好ましい。試料の数が２〜６程度であれば、測定された混合比率から、混合物中の各核酸の種類に該当する試料の数を特定することが可能である。もっとも、混合比率から各種類の試料の数までを特定する必要はなく、おおまかな混合比率さえわかればよい場合には、試料の数の上限は特にない。また、存在する可能性のある核酸の種類の数も特に限定されないが、あまりに多くなると分析の精度が低下するので、通常、２〜６種類程度が好ましい。
【００１０】
核酸試料の調製は、常法により行うことができる。なお、核酸試料混合物は、各核酸試料の供給源からそれぞれ核酸を抽出した後に混合してもよいが、先に供給源を混合し、それから一括して核酸を抽出する方が手間が省けるので好ましい。
【００１１】
次に、核酸試料混合物中に含まれる特定の核酸領域を遺伝子増幅法により増幅する。なお、増幅される核酸領域は、上記した核酸の種類が複数存在し得る領域である。例えば、ウナギの個体群中のウナギの種の混合比率を求める場合には、後でさらに詳しく述べるように、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子中の領域を増幅領域とすることができる。
【００１２】
遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこの分野において周知であり、それらのいずれをも用いることが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例にも、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
【００１３】
次に、増幅産物を制限酵素で消化する。消化に用いる制限酵素は、核酸の種類に応じて異なる長さの制限断片を生じさせるものを選んで用いる。すなわち、この工程は、この分野において周知の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法の工程であり、常法により行うことができる。
【００１４】
次いで、消化物を電気泳動にかける。電気泳動としては、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル等のゲルを用いたゲル電気泳動が好ましい。核酸増幅産物の制限酵素消化物の電気泳動法自体はこの分野において周知であり、従来のＲＦＬＰと同様に行うことができる。
【００１５】
次いで、電気泳動により得られる泳動バンドの濃さを測定する。バンドの濃さは相対的なものであってよく、各バンドの濃さの比率がとれればよい。バンドの濃さの測定は、例えば、電気泳動ゲル上の核酸バンドを紫外線吸収又は蛍光法により可視化し、可視化した泳動バンドパターンを写真に撮り、該電気泳動写真をスキャナーでスキャンするか、若しくはデジタルカメラで撮影するか、又は電気泳動写真のネガをフィルムスキャナーでスキャンしてコンピューターに取込み、コンピューター内で画像解析ソフトを用いて各バンドの濃度を測定することにより行うことができる。スキャナー、デジタルカメラ、フィルムスキャナーは、通常の市販のものを用いることができ、解像度は３００ｄｐｉ以上のものが好ましい。また、画像処理ソフトとしては、米国ＮＩＨ（National Institutes of Health)から「Image 」という名称のソフトが入手可能であり、このソフトを好ましく用いることができる。なお、電気泳動バンドの濃度の測定方法自体は公知であり、例えば小島清嗣著、「スキャナを利用した電気泳動ゲルの画像取込みと画像処理（Image ）。医学、分子生物学研究のためのMacintosh ハンドブック」pp.112-121；「遺伝子解析、データ解析から論文発表まで」法橋尚宏、丸山和夫編、羊土社（１９９２）；及びNIH Image 1.44マニュアル：Wayne Rasband (1992)に記載されている。また、バンドの濃さを測定するためには、必ずしもバンドを可視化する必要はなく、発光強度やフォトン強度を測定機器を用いて測定したり、あるいは、核酸増幅に用いるヌクレオチドとして放射標識したものを用い、バンドの放射能を測定することによりバンドの濃さを測定することもできる。
【００１６】
次に、測定された各バンドの濃さに基づいて、核酸試料群中の核酸の種類の比率を測定する。これは、混合物中の各核酸の種類の混合比率が公知である各対照混合物について試料と同じ操作を行い、そのバンドの濃さの相対比率と被検試料混合物について得られたバンドの濃さの相対比率とを比較することにより行うことができる。なお、下記実施例に具体的に記載するように、核酸の種類が２種類である場合には、注目する核酸の比率を横軸にとり、該泳動バンドの濃さの比率を縦軸にとる検量線を作成すると、この検量線がほぼ直線になるので、この検量線を利用して被検核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を求めることができる。
【００１７】
次に、本発明の方法を、ウナギ個体群中のウナギ種の混合比率の測定に用いる場合について説明する。
【００１８】
ウナギの核酸試料の供給源としては、生きたシラスであってもよいし、成鰻や蒲焼き等、どのような成育段階のものや加工された食品であっても構わない。先ず、混合された供給源から、核酸を抽出する。シラス等の供給源から、遺伝子増幅法の鋳型として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法をも採用することができる。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げることができる。第１法では、先ず、シラス等を液体窒素で凍結し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。第２法では、シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。
【００１９】
遺伝子増幅法は、鋳型として被検核酸試料混合物を用い、さらに目的とする核酸領域を増幅するために選択された第１及び第２の核酸プライマーを用いる。ウナギ種の検査のためには、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子中の特定領域を用いることが好ましい。なぜなら、この領域は、ウナギの種毎に塩基配列が異なっているからである。
【００２０】
第１の核酸プライマーは、配列表の配列番号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成ることが好ましい。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号１に示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。
【００２１】
第２の核酸プライマーは、配列表の配列番号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から成ることが好ましい。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号４に示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。例えば、下記実施例で具体的に記載される第２の核酸プライマーであるＴＷ１１は、５’末端から２７番目のアデニンを意図的にシトシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を導入している。
【００２２】
なお、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要がある。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列を有するプライマーを用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号４に示される塩基配列と同一又は相同な配列を有する核酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列を有する核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとしては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列を有するプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸鎖とその相補鎖は、バックボーンの５’→３’方向が逆になっており、一方、明細書における塩基配列は５’側を左側（上流側）に記載するように決められているから、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する場合、元の核酸鎖の下流側（３’側）と相補的な領域が上流側（５’側）に記載される。
【００２３】
この方法では、上記第１及び第２のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて遺伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの一領域を増幅する。増幅される領域は、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子内の領域である。この方法により増幅可能な、Anguilla japonica のミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番号７に示す。また、各種ウナギの当該領域の塩基配列と、制限酵素部位を図１及び図２に示す。なお、図１及び図２中、A. japonica 以外のウナギの配列は、A. japonica と異なる部位のみ記載してある。また、制限酵素の切断部位が矢印で示されていないものは、japonica以外の種において制限酵素部位が存在するものである。図２は図１の続きである。
【００２４】
配列番号１に示される配列は、図１に示される第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。また、配列番号４に示される配列は、図２に示される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。第１及び第２のプライマーを用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによって挟まれた領域が増幅される。
【００２５】
次いで、遺伝子増幅法により得られた増幅産物を制限酵素で消化する。図１及び図２に示されるように、増幅領域には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩの制限酵素部位が含まれるので、これらの制限酵素を用いてＲＦＬＰを行うことにより種の鑑定を行うことができる。また、下記実施例で用いられるプライマーＴＷ１１は、japonicaの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるように、上記の通り人為的に塩基を置換している。これらのうち、ＨｉｎｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔＩは、japonicaの切断部位のみが外国産ウナギの切断部位と異なっているので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれか一方を用いることにより、日本産と外国産との識別が可能である。また、(1) ＨｉｎｆＩと、(2) ＭｂｏIIとＲｓａＩとをそれぞれ別個に用い、それぞれにおいて得られる消化断片の大きさから種を同定することも可能である。例えば、下記実施例において用いられる、配列番号３で示される塩基配列を有する第１プライマー（ＴＷ６、配列番号７の１１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイズ）と、配列番号６で示される第２プライマー（ＴＷ１１、配列番号７の３７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハイブリダイズ）とを用いて増幅を行った場合には、下記表１に示されるサイズの断片を指標として種の同定を行うことができる。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１からわかるように、ＨｉｎｆＩで消化した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるのは日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いることができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用いて調べ、外国産であることが判明した試料についてのみＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定することもできる。
【００２８】
本発明の方法は、生物個体群中の特定の種類の生物個体の混合比率の測定の他、特定の感染症にかかった生物個体の混合比率、食品又は食料の群中の、特定の感染症にかかったり又は遺伝子操作を受けた生物由来の食品又は食料の混合比率、生物由来の繊維製品や糸等の群における特定の種類の生物個体由来のものの混合比率等、種々のものの測定に適用することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
１．ＤＮＡ試料の調製
日本産ウナギAnguilla japonica （以下、単に「Ｊ」と表記することがある）及びフランス産ウナギAnguilla anguilla （以下、単に「Ａ」と表記することがある）のシラスを核酸の供給源として用いた。１群５匹とし、第１群は５匹ともＪ、第２群は４匹がＪ、１匹がＡ、第３群は３匹がＪ、２匹がＡ、第４群は２匹がＪ、３匹がＡ、第５群は１匹がＪ、４匹がＡ、第６群は５匹ともＡとした。
【００３１】
各群のシラスをそれぞれ群毎に混合し、液体窒素で凍結後、乳鉢を用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投入した。洗浄用バッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M NaCl 1.0 ml、蒸留水45.5 ml を混合して調製）０．５ｍｌを加え、すりつぶし、５分間遠心分離した。上澄み液をデカンテーションで捨て、ＳＴＥバッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M NaCl 1.0 ml、10% SDS 0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合して調製）０．５ｍｌとProteinase K溶液（10 mg/ml) ４０μｌを加え、５６℃で３０分間消化した。消化物をボルテックスミキサーで撹拌後、５分間遠心分離し、１００μｌの上清を取り、９８℃、１０分間加熱処理して酵素を失活させた。このうち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
【００３２】
２．  ＰＣＲ
市販のＰＣＲキット及び装置を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライマーとしては、上記したＴＷ６及びＴＷ１１を用いた。
【００３３】
蒸留水                          14.8μｌ
10xGA バッファー（Mg2+ 1.5 mM)   2.0μｌ
2.5 mM dNTP                      1.6μｌ
25μＭ  各プライマー             0.4μｌ
Taq ポリメラーゼ（5U/ μｌ）     0.2μｌ
ＤＮＡ                           1.0μｌ
【００３４】
ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、６０℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工程を３５サイクル行った。
【００３５】
３．  ＲＦＬＰ
各ＰＣＲ産物６μｌ、１０ｘバッファー１．５μｌ、ＨｉｎｆＩ（濃度１０U ／μｌ）０．７５μｌ及び蒸留水６．７５μｌから成る混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることにより消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％アガロースゲル電気泳動にかけた。
【００３６】
４．  泳動バンドの濃さの測定及び混合比率の測定
泳動バンドをエチジウムブロミドで染色し、紫外線を照射し、アガロースゲルからのトランスイルミネーター蛍光をポラロイド６６７（商品名）白黒フィルムで撮影した。この電気泳動写真をマッキントッシュPerforma 5220 （商品名）とエプソンGT-5000 スキャナ（商品名）で３００ｄｐｉで取込み、画像を反転後、NIH Image 1.6 のゲル解析ソフトで処理した。各バンドの積分濃度を泳動方向にプロットし、ベースラインを手で引いた後、各ピークの面積を計算し、表計算によりＡ特有の上の方のバンド（Ｈ）（サイズ３９８ｂｐ）とＪ特有の下の方のバンド（Ｌ）（サイズ２２０ｂｐ）の強度比［I(H)/I(L)]を縦軸にとり、ＡとＪの数の比率を横軸にとって検量線を作成した。この検量線を図３に示す。
【００３７】
図３に示すように、検量線はほぼ直線となった。従って、混合比率が未知の被検個体群も上記と同様に処理し、図３に示す検量線を用いることにより、未知の被検個体群中のＪとＡの混合比率を測定することができる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、一括した処理により、核酸試料混合物中の核酸の種類の比率を測定することができる方法が初めて提供された。本発明の方法によれば、各試料についてそれぞれ遺伝子検査を行う場合に比べ、遥かに簡便かつ迅速に遺伝子検査を行うことができる。
【００３９】
【配列表】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により増幅される、各種ウナギのミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵素部位を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】本発明の実施例において作成された、日本産ウナギとフランス産ウナギから成る個体群中の、日本産ウナギとフランス産ウナギの比率を求めるための検量線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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