(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号２４又は２５に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを有効成分とするインターロイキン−１８の中和剤。
【請求項２】
配列表における配列番号２４又は２５に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを試料に作用させることを特徴とするインターロイキン−１８の検出方法。
【請求項３】
配列表における配列番号２０又は２１に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを認識し、インターロイキン−１８受容体へのインターロイキン−１８の結合を阻害する抗体を有効成分とするインターロイキン−１８の中和剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はサイトカインを認識する新規な受容体蛋白質、とりわけ、インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ−１８」と略記する。）を認識する新規なポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−１８は、免疫系における情報伝達物質であるサイトカインの一種である。ＩＬ−１８は、特開平８−２７１８９号公報、特開平８−１９３０９８号公報及びハルキ・オカムラら『ネイチャー』、第３７８巻、第６，５５２号、８８乃至９１頁（１９９５年）に見られるように、発見当初、インターフェロン−γ誘導因子として記載されていたが、その後、シンペイ・ウシオら『ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー』、第１５６巻、４，２７４乃至４，２７９頁（１９９６年）における提案にしたがって、「ＩＬ−１８」と呼称されるようになった。成熟型のＩＬ−１８は１５７個のアミノ酸からなり、免疫担当細胞において生理活性物質として有用なインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備している。これらの性質故に、ＩＬ−１８は抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬品として広範な用途が期待され、鋭意研究が進められている。
【０００３】
前述のとおり、ＩＬ−１８にかぎらず、サイトカインは、本来、免疫系における情報伝達を担う物質として産生され、分泌される。したがって、サイトカインが哺乳類の体内で過剰に産生されたり、外部から投与されたりすると、免疫系のバランスに片寄りを生じる可能性がある。哺乳類の細胞の表面には、通常、受容体と呼ばれるサイトカインを認識する部位があり、分泌されたサイトカインは、この受容体に結合することによって、初めて所期の情報を細胞に伝達することができる。正常な免疫系においては、サイトカインとサイトカインを認識する受容体がある一定のバランスを保っていると考えられる。したがって、斯界においては、ＩＬ−１８を医薬品として実用化するためにも、ＩＬ−１８そのものの生理作用の解明に加えて、ＩＬ−１８受容体（以下、「ＩＬ−１８Ｒ」と略記する。）の性質・性状が一刻も早く解明され、量産されることが期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、量産容易なＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドを提供することにある。
【０００５】
さらに、この発明の第二の課題は、斯かるポリペプチドの医薬としての用途を提供することにある。
【０００６】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
さらに加えて、この発明の第四の課題は、斯かるポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００８】
さらに加えて、この発明の第五の課題は、斯かるポリペプチドを用いるＩＬ−１８の中和剤を提供することにある。
【０００９】
さらに加えて、この発明の第六の課題は、斯かるポリペプチドによるＩＬ−１８の中和方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らがこれらの課題を解決すべく鋭意研究したところ、ホジキン病患者に由来するリンパ芽球様細胞の一種であるＬ４２８細胞中にＩＬ−１８を認識する物質が存在していることを突き止めた。本発明者がこの物質を分離し、性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、分離された状態においてもＩＬ−１８をよく認識し、結合することが判明した。斯くして存在が確認されたＩＬ−１８Ｒは、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８を認識し、その生理活性を中和するので、自己免疫疾患を初めとする過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に効果を発揮することが判明した。さらに、本発明者がこのＩＬ−１８Ｒの部分アミノ酸配列を手掛りにＬ４２８細胞を鋭意検索したところ、ＩＬ−１８ＲをコードするＤＮＡを取得するに到った。そして、このＤＮＡを人為的に発現させて得られるポリペプチドがＩＬ−１８をよく認識し、Ｌ４２８細胞から分離されたＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を有することを確認するとともに、そのポリペプチドが斯かるＤＮＡを用いる組換えＤＮＡ技術により、所望量を製造し得るものであることを確認してこの発明を完成した。
【００１１】
すなわち、この発明は前記第一の課題を、遺伝子の発現によって得ることができる、ＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドにより解決するものである。
【００１２】
この発明は前記第二の課題を、有効成分として、斯かるポリペプチドを含んでなるＩＬ−１８Ｒ感受性疾患剤により解決するものである。
【００１３】
この発明は前記第三の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１４】
この発明は前記第四の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させる工程と、生成したポリペプチドを採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１５】
この発明は前記第五の課題を、斯かるポリペプチドを有効成分とするＩＬ−１８の中和剤により解決するものである。
【００１６】
この発明は前記第六の課題を、ＩＬ−１８に斯かるポリペプチドを作用させることを特徴とするＩＬ−１８の中和方法により解決するものである。なお、この発明で用いるＬ４２８細胞は、平成８年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所に受託番号『ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７』で寄託されている。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この発明は、遺伝子の発現によって得ることができる、ＩＬ−１８Ｒとしてのポリペプチドに関するものである。この発明によるヒト由来のポリペプチドは、通常、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列の１又は複数を含有し、全体としては、例えば、配列表における配列番号２０に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含有する。また、この発明によるマウス由来のポリペプチドは、通常、配列表における配列番号２１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含有する。したがって、この発明でいうポリペプチドとは、配列表における配列番号２０又は２１に示すアミノ酸配列をそっくりそのまま含有するポリペプチドに加えて、例えば、それらのアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が付加したポリペプチド、とりわけ、Ｃ末端及び／又はＮ末端に１又は複数のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の１又は複数が欠失したアミノ酸配列を含有するポリペプチド、とりわけ、配列番号２２乃至２５に示すアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、さらには、上述のごときポリペプチドに糖鎖が結合したポリペプチドであっても、それらが遺伝子の発現によって得ることができ且つＩＬ−１８Ｒとしての機能を有するかぎり、すべて包含するものとする。ちなみに、ＩＬ−１８は、すでに、ヒト及びマウスに由来するものが知られており、これらはいずれも１５７個のアミノ酸を含んでなり、それぞれ、配列表における配列番号２６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）、及び、配列表における配列番号２７に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを表すものとする。）を有する。
【００１８】
この発明のポリペプチドは、通常、組換えＤＮＡ技術を応用して製造される。すなわち、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを人為的に発現させ、生成したポリペプチドを採取する。この発明は、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡに加えて、組換えＤＮＡ技術を用いる当該ポリペプチドの製造方法を提供するものでもあり、この発明の製造方法によるときには、所望量の当該ポリペプチドが容易に得られる。
【００１９】
この発明の製造方法で用いるＤＮＡとしては、それが当該ポリペプチドをコードするかぎり、天然の給源から得られたＤＮＡであっても、これを人為的に改変したり、化学合成したものであってもよい。すなわち、斯界においては、一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡを人為的に発現させるに際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ポリペプチドそのものの生理活性や物性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基の１又は複数を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜の塩基配列を連結することがある。この発明のＤＮＡにおいても斯かる変更は当然可能であり、具体的には、最終的に得られるポリペプチドが所期の生理活性を失わない範囲で、前述のごときこの発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにおける５´末端及び／又は３´末端に適宜の制限酵素による認識部位、開始コドン、終止コドン、プロモーター、エンハンサーなどの塩基配列を連結し得ることは言うまでもない。したがって、この発明でいうＤＮＡとは、前述のごときポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、さらには、それらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換したＤＮＡのすべてを包含することとなる。
【００２０】
斯かるＤＮＡを天然の給源から得るには、例えば、配列表における配列番号１２乃至２５に示すアミノ酸配列に基づき調製したオリゴヌクレオチドをプローブにして、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られるヒト及びマウスを含む哺乳類由来の細胞を検索すればよい。細胞の検索に当たり、検索対象の細胞を培養する培養培地に、斯かる細胞においてＩＬ−１８Ｒ遺伝子の発現を誘発し得る物質、とりわけ、ＩＬ−１２やＩＬ−１８を細胞１×１０6 当たり約０．０１ｐｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１ｐｇ乃至１００ｎｇ含有せしめると、目的とするＤＮＡの取得を容易にすることができる。望ましい細胞の具体例としては、リンパ球を始めとする造血系細胞などを培養株化して得られる、例えば、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）に記載されているＪＭ細胞、ＨＤＬＭ−２細胞、ＭＯＬＴ−１６細胞及びＰＥＥＲ細胞、さらには、Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４６）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）などのリンパ芽球様細胞が挙げられる。斯くして得られるＤＮＡのうち、ヒト及びマウス由来のＤＮＡは、通常、それぞれ配列表における配列番号１及び２に示す塩基配列の一部又は全部を含有する。例えば、ホジキン病患者由来のリンパ芽球様細胞の一種であるＬ４２８細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７）から得られるＤＮＡは、配列表における配列番号７に示したとおり、配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードする配列番号１に示す塩基配列と、配列番号１に示す塩基配列の５´末端に連結されたシグナルペプチドをコードする塩基配列からなる。また、配列表における配列番号２２乃至２５に示すアミノ酸配列の可溶性ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３乃至６に示す塩基配列によってコードされ、配列番号８乃至１１の塩基配列に示したように、通常、その５´末端にシグナルペプチドをコードする塩基配列を連結した形態で用いられる。斯かるＤＮＡは通常の化学合成によっても得られ、いずれにしても、一旦ＤＮＡが入手されれば、これにＰＣＲ法を適用することによって所望のレベルに容易に増幅することができる。なお、配列表における配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列は、いずれも、シグナルペプチドのアミノ酸配列とともに、ピー・パーネットら、『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告されている。しかしながら、同論文においては、配列番号２０及び２１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドがＩＬ−１８Ｒとして機能する事実について、示唆も教示もなされていない。
【００２１】
斯かるＤＮＡは、微生物及び動植物由来の適宜の宿主に導入すると、当該ポリペプチドを発現する。この発明のＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡはこの発明のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡさえ入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ＢＣＭＧＳＮｅｏ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳなどのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主において発現するための適宜塩基配列を含んでなる。なお、プロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、同じ特許出願人による特開平７−１６３３６８号公報に開示されたインターフェロン−αプロモーターを用いるときには、形質転換体における当該ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制御できることになる。
【００２２】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、まず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能である。
【００２３】
斯かる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して当該ポリペプチドの製造に用いられる。宿主としては、斯界において慣用される微生物及び動植物由来のものを用いることができるが、ポリペプチドの最終用途が医薬品である場合には、酵母や哺乳類由来の宿主が望ましい。哺乳類由来の宿主細胞の具体例としては、例えば、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、ＭＯＰ−８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７０９）及びそれらの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞が挙げられる。斯かる宿主にこの発明のＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生するクローンを選択するには、形質転換体を培養培地で培養し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３  遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００２４】
斯くして得られる形質転換体は、培養培地で培養すると、宿主内外に当該ポリペプチドを産生する。培養培地としては、形質転換体を培養するための慣用の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、宿主の代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ´ｓ  Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０4乃至１×１０7個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０5乃至１×１０6個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、通常、１ｌ当り当該ポリペプチドを約１μｇ乃至１ｍｇ含む。
【００２５】
このようにして得られた培養物は、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により菌体又は細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物から分離し、精製する。精製には菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に開示されたＩＬ−１８及び特願平８−３５６４２６号明細書に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、これらを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドが最少の時間と労力で得られる。
【００２６】
この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８を認識・結合して免疫反応を抑制したり調節する性質を有するので、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮する。免疫系は、本来、有害な異物から生体を防御するためのものであるが、ときとして、その働き故に、却って、生体に有害な結果をもたらすことがある。哺乳類に、例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、骨髄などの臓器を移植すると、同種異系抗原に対する拒絶反応や免疫反応により、Ｔ細胞が活性化され、リンパ球が増殖したり、炎症が生じることがある。症状の程度こそ違え、同様の現象は、例えば、アレルゲンのように、宿主が固有のものと見做さない異種異系抗原が侵入した場合にも観察される。自己免疫疾患においては、本来、固有のものと見做されるべき成分がアレルギー反応を惹起する。この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類に投与すると、斯かる免疫反応を抑制又は調節し、それらに起因する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。したがって、この発明でいう感受性疾患とは免疫反応の亢進に起因する疾患であって、ＩＬ−１８Ｒが直接又は間接に作用して治療又は予防し得るすべての疾患ということになり、個々の感受性疾患としては、例えば、上記のごとき臓器移植に伴う拒絶反応や、悪性貧血、萎縮性胃炎、インスリン抵抗性糖尿病、ウェジナー肉芽腫症、円板状エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症候群、クローン病、原発性胆汁性肝硬変症、交感性眼炎、甲状腺機能亢進症、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性寒冷血色素尿症、多発性筋炎、多発性結節性動脈炎、多発性硬化症、特発性アジソン病、特発性血小板減少性紫班病、バセドウ病、白血球減少症、ベーチェット病、早発性更年期、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、慢性甲状腺炎、ホジキン病、ＨＩＶ感染症、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症及びハチ毒アレルギーを含む自己免疫疾患及びアレルギー性疾患が挙げられる。なお、この発明のポリペプチドは、ＩＦＮ−γの過剰産生や過剰投与などに起因する敗血症ショックの治療や予防にも有効である。
【００２７】
斯くして、有効成分としてこの発明のポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗自己免疫疾患剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、増血剤、白血球増多剤、血小板増多剤、鎮痛剤、解熱剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形状に調製され、この発明のポリペプチドを０．００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至２０％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２８】
この発明の感受性疾患剤は、当該ポリペプチド単独の形態はもとより、それ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１若しくは複数種類との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質及びクエン酸塩若しくは燐酸塩を主体とする緩衝剤が、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、ＦＫ５０６、グルココルチコイド、シクロフォスファミド、ナイトロゲンマスタード、トリエチレンチオフォスファミド、ブズルファン、フェニラミンマスタード、クロランブシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、６−アザグアニン、８−アザグアニン、フルオロウラシル、シタラビン、メトトレキセート、アミノプテリン、マイトマイシンＣ、塩酸ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、塩酸ドキソルビシン、サイクロスポリンＡ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ヒドロキシウレア、塩酸プロカルバジン、副腎皮質ホルモン、金製剤などの他に、ＩＬ−１８以外のサイトカインの受容体アンタゴニスト、例えば、インターロイキン−１受容体蛋白質、インターロイキン−２受容体蛋白質、インターロイキン−５受容体蛋白質、インターロイキン−６受容体蛋白質、インターロイキン−８受容体蛋白質及びインターロイキン−１２受容体蛋白質に対するそれぞれの抗体、さらには、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−５受容体及びインターロイキン−８受容体に対するそれぞれのアンタゴニストなどが挙げられる。
【００２９】
さらに、この発明の感受性疾患剤は投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与してもよく、いずれの場合にも感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当り約１μｇ乃至１ｇ／回、通常、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回の当該ポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００３０】
ところで、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態でＩＬ−１８Ｒに感受性を有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入すると、例えば、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの標的細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明のＤＮＡは、例えば、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び自己免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝子療法、さらには、臓器移植やアレルギー性疾患に伴う拒絶反応や過剰な免疫反応の抑制に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斉藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ  遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行にも詳述されている。さらに、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、その一部又は全てをプローブ又はプライマーとして用いるハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を諸種の哺乳類に由来するＤＮＡやＲＮＡに適用することにより、この発明のポリペプチドと構造的に関連する物質をコードするＤＮＡ、例えば、この発明に開示された個々のＤＮＡとは相違する起源のＩＬ−１８ＲとしてのポリペプチドをコードするＤＮＡ、さらには、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬などをコードするＤＮＡの検索にも有用である。
【００３１】
また、この発明のポリペチプチドはＩＬ−１８を認識し、結合する性質があるので、当然のことながら、ＩＬ−１８を精製したり検出するためのアフィニティークロマトグラフィーや標識アッセイにおいても有用である。また、これに加え、この発明のポリペプチド、とりわけ、この発明の可溶性ポリペプチドは、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬の、生体内又は生体外での検索にも有用である。さらに、この発明のポリペプチドには、ＩＬ−１８を認識し、結合して、その生理作用を中和する性質があるので、当該ポリペプチドを有効成分とするこの発明の中和剤及び、ＩＬ−１８に当該ポリペプチドを作用させるこの発明の中和方法は、ＩＬ−１８の過剰産生やＩＬ−１８の過剰投与に起因する種々の疾患の治療に有用である。
【００３２】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例を挙げて説明する。なお、以下の実施例１乃至９において用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３  遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００３３】
【実施例１】
〈ＩＬ−１８Ｒの調製と特徴付け〉
【００３４】
【実施例１−１】
〈ＩＬ−１８Ｒの調製〉
常法により、生後間もないハムスター新生児の腹腔内にウサギ由来の抗リンパ球抗体を注射して免疫反応を減弱させた後、背部皮下にホジキン病患者に由来するリンパ芽球様細胞株の一種であるＬ４２８細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘍塊（約１０ｇ／匹）を摘出し、常法により血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により分散させ、洗浄して増殖細胞を得た。
【００３５】
この増殖細胞に対して０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと１７０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）との混液（容量比９：１）を細胞湿重量の１０倍量加え、撹拌した後、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収した。次に、細胞を適量の燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と言う。）に浮遊させ、撹拌し、２，０００ｒｐｍで遠心分離して再度回収し、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０8 個／ｍｌになるように浮遊させ、キネマティカ製細胞破砕機『ポリトロン』により破砕し、１ｍＭ塩化マグネシウム及び１Ｍシュークロースをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）をシュークロースの最終濃度が０．２Ｍになるように加えた後、１，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を採取し、これを２５，０００ｒｐｍでさらに６０分間遠心分離し、沈澱部を採取した。この沈澱に１２ｍＭ  ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（以下、「ＣＨＡＰＳ」と言う。）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドをそれぞれ適量加え、４℃で１６時間撹拌した後、２５，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、上清を採取した。
【００３６】
この上清を１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより平衡化しておいたファルマシア製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『ウィート・ジャーム・レクチン・セファロース６Ｂ』のカラムに負荷し、カラムを１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより洗浄した後、溶出液の蛋白質含量を波長２８０ｎｍの紫外線に対する吸光度でモニターしながら、０．５Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳをそれぞれ含むＰＢＳを通液した。そして、吸光度が０．１６乃至０．２０の画分を採取し、合一したところ、蛋白質含量約１ｍｇ／ｍｌの水溶液が原料細胞１０12個当り約２５ｌ得られた。
【００３７】
この水溶液の一部を小分し、常法にしたがって 125Ｉで標識したヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、４℃で１時間インキュベートし、担体としてγ−グロブリンと平均分子量６，０００ダルトンのメルク製ポリエチレングリコール『ポリエチレングリコール６０００』をそれぞれ適量加え、氷冷下で３０分間静置して結合反応させた後、反応物を６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、生じた沈澱を採取し、放射能強度を測定した。同時に、 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８に加えて未標識のヒトＩＬ−１８を３μｇ用いる系を設け、これを上記と同様に処置して対照とした。対照と比較したところ、被検水溶液から生じた沈澱の放射能強度は有意に高かった。このことは、上記で得た水溶液が正にＩＬ−１８Ｒを含有するものであり、ＩＬ−１８に作用させると、このＩＬ−１８ＲがＩＬ−１８を認識し、結合したことを示している。
【００３８】
【実施例１−２】
〈モノクローナル抗体に対する結合性〉
Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７）を０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度４×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させる一方、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に記載された方法により得た、ヒトＩＬ−１８Ｒに特異的なモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃度０．０１９μｇ／ｍｌ、０．２０９μｇ／ｍｌ、２．３μｇ／ｍｌ、２５．３μｇ／ｍｌ又は１３９．５μｇ／ｍｌになるように０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足した別のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００３９】
次に、上記で調製した細胞浮遊液を５０μｌずつとり、これに濃度の相違する上記モノクローナル抗体溶液のいずれかを５０μｌずつ加え、４℃で２時間振盪した後、常法にしたがって 125Ｉにより標識したヒトＩＬ−１８を４ｎｇ含み、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．５）を５０μｌずつ加え、同じ温度でさらに３０分間振盪した。その後、各細胞浮遊液にジブチルフタレート／ジオクチルフタレート混液（容量比１：１）を２００μｌずつ加え、２０℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を含む沈澱部を採取し、アロカ製ガンマカウンター『ＡＲＣ−３００型』を用いて放射能強度を測定した。
【００４０】
同時に、モノクローナル抗体を省略する一方、 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察された放射能強度と、試験区において観察された放射能強度をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算した。結果を図１に示す。
【００４１】
【数１】
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【００４２】
さらに、実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒを含む水溶液を５０μｌずつとり、これを上記と同様の濃度に調製したモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを５０μｌ加え、４℃で２時間振盪した後、 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇずつ加え、同じ温度でさらに３０分間振盪した。その後、４ｍｇ／ｍｌ  γ−グロブリンを５０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置した後、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＰＢＳを２５０μｌ加え、氷冷下でさらに３０分間静置し、４℃、６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈澱部を採取し、その放射能強度を上記と同様にして測定した。
【００４３】
同時に、モノクローナル抗体を省略する一方、 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を４ｎｇとともに未標識ヒトＩＬ−１８を４μｇ加える系（非特異的結合区）と未標識ヒトＩＬ−１８を加えない系（総結合区）をそれぞれ設け、これらを試験区と同様に処置した。そして、「総結合区」及び「非特異的結合区」において観察された放射能強度と、試験区において観察された放射能強度をそれぞれ数１に示す式に代入し、阻害率（％）を計算した。結果を図１に併記する。
【００４４】
図１に見られるように、Ｌ４２８細胞を用いる場合も、溶液状のＩＬ−１８Ｒを用いる場合も、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃの濃度が上昇するにしたがって、ＩＬ−１８のＬ４２８細胞及びＩＬ−１８Ｒへの結合がより強く阻害された。このことは、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが溶液中のＩＬ−１８Ｒ及びＬ４２８細胞の表面に存在すると考えられるＩＬ−１８ＲにＩＬ−１８と競合して結合したことを示すと同時に、実施例１−１の方法により得た水溶液がＩＬ−１８を認識する性質ある蛋白質、すなわちＩＬ−１８Ｒを含有し、そして、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがそのＩＬ−１８Ｒに特異的に反応するモノクローナル抗体であることを示している。
【００４５】
【実施例１−３】
〈ウェスタン・ブロッティング分析〉
実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒ水溶液の一部をとり、これに２．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム及び５０％（ｖ／ｖ）グリセリンからなる混液を２／３容量加え、３７℃で１時間インキュベートした後、常法にしたがって、還元剤非存在下においてゲル濃度１０乃至２０％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分を分離した。常法によりゲルをニトロセルロース膜上に移取り、適量の大日本製薬製固定化剤『ブロックエース』に１時間浸漬し、さらに、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に開示された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ、ブロックエース及びツイーン２０をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、１０％（ｖ／ｖ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰の抗体を除いた。ニトロセルロース膜を西洋ワサビパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体の適量と１０％（ｖ／ｖ）ブロックエース及び０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０をそれぞれ含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬して反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄した後、アマシャム製染色キット『ＥＣＬ  ｋｉｔ』を用いて発色させた。
【００４６】
同時に、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。なお、分子量マーカーには、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。結果を図２に示す。
【００４７】
図２のゲル電気泳動像において、モノクローナル抗体無添加のレーン３には見られないバンドが、モノクローナル抗体添加のレーン２には観察されるが、このバンドはＩＬ−１８Ｒに相当するバンドである。
【００４８】
【実施例１−４】
〈ＩＬ−１８に対する活性阻害〉
ヒト急性骨髄性白血病患者に由来する株化細胞の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４６）を１００μｇ／ｍｌカナマイシンと１８．８ｍＭ燐酸水素二ナトリウムをそれぞれ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度１×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に開示された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４９】
次に、９６ウェルマイクロプレートに上記ＫＧ−１細胞浮遊液を５０μｌ／ウェルずつ分注し、それに、ヒトＩＬ−１８を上記と同一の新鮮な培地に濃度０ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌになるように溶解したものを５０μｌ／ウェルずつ加え、さらに、上記と同一の新鮮な培地に濃度５μｇ／ｍｌになるように溶解したリポ多糖を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で２４時間インキュベートした後、培養上清を採取し、そのＩＦＮ−γ含量を通常の酵素免疫アッセイにより調べた。並行して、各々のヒトＩＬ−１８濃度につき、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを省略した系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を図３に示す。なお、図３に示すＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算して表示している。
【００５０】
図３に示す結果は、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが共存すると、免疫担当細胞としてのＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ産生の誘導が阻害されることを示している。このことは、モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣがＩＬ−１８と競合してＫＧ−１細胞の表面に存在するＩＬ−１８Ｒを封鎖し、結果として、ＩＬ−１８によるＫＧ−１細胞への情報伝達を妨げたことを示している。
【００５１】
【実施例１−５】
〈ＩＬ−１８Ｒの精製〉
同じ特許出願人による特願平８−３５６４２６号明細書に記載された方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃ  ７８ｍｇを適量の蒸留水に溶解し、溶液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む硼酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して４℃で１６時間透析した。その後、常法にしたがって、透析内液にファルマシア製臭化シアン活性化ゲル『ＣＮＢｒ−アクティベーテッド・セファロース４Ｂ』を適量加え、穏やかに撹拌しながら４℃で１８時間反応させてゲルにモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化した。
【００５２】
次に、プラスチック製円筒管に上記のゲルをカラム状に充填し、２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにより平衡化した後、実施例１−１の方法により得たＩＬ−１８Ｒを含む水溶液を負荷し、１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着成分を除いた。その後、カラムに２ｍＭ  ＣＨＡＰＳ含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液しつつ、溶出液を８ｍｌずつ採取し、それぞれの画分におけるＩＬ−１８Ｒの有無を実施例１−１の 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定した。このとき得られたクロマトグラムを図４に示す。
【００５３】
図４に見られるように、実施例１−１のＩＬ−１８Ｒを含む水溶液のようなＩＬ−１８Ｒと夾雑物質を含む混合物にモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用すると、ＩＬ−１８Ｒがシャープな単一ピークとなって溶出した。この単一ピークに相当する画分を採取し、合一し、凍結乾燥したところ、精製ＩＬ−１８Ｒの固状物が得られた。
【００５４】
その後、このようにして精製したＩＬ−１８Ｒの一部をとり、ＰＢＳ中、１００℃で５分間インキュベートした後、実施例１−２の方法により残存活性を測定したところ、ＩＬ−１８に対する結合性が全く観察されず、加熱により失活したことが判明した。このことは、この受容体の本質が蛋白質であることを裏付けている。
【００５５】
さらに、上記のようにして得た精製ＩＬ−１８Ｒを適量のＰＢＳに溶解し、室温下、ＰＢＳに対して一晩透析し、実施例１−１の方法により 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８の適量とピアース製架橋試薬『ＢＳ3』を１ｍＭそれぞれ加えた後、０℃で２時間静置してＩＬ−１８Ｒと 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体を形成させた。反応物にトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を濃度５０ｍＭになるように加え、０℃でさらに１時間静置して反応を停止させ、常法にしたがって、反応物に分子量マーカーとともに還元剤としてジチオトレイトールを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用して蛋白質成分を分離した後、オートラジオグラム分析した。
【００５６】
得られたオートラジオグラムにおける分子量マーカーの易動度に基づき計算したところ、このＩＬ−１８Ｒと 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８との複合体の分子量は、見掛け上、約５０，０００乃至２００，０００ダルトンであることが判明した。ヒトＩＬ−１８の分子量は約２０，０００ダルトンであるから、ＩＬ−１８ＲにヒトＩＬ−１８が１分子結合したと仮定すると、ＩＬ−１８Ｒの分子量は約３０，０００乃至１８０，０００ダルトンということになる。
【００５７】
【実施例１−６】
〈ＩＬ−１８Ｒのペプチド・マッピング〉
実施例１−５の方法により得た精製ＩＬ−１８Ｒを、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトールを含むゲル濃度７．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりゲル電気泳動し、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーを含む４０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に５分間浸漬して染色し、４０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液にさらに２時間浸漬して脱色した後、ゲルにおける分子量約８０，０００乃至１１０，０００ダルトンに相当する染色部分を切出し、０．２Ｍ炭酸アンモニウムを含む５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを加え、室温下で繰返し振盪した。次いで、ゲルを真空乾燥し、０．２Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）を加え、５分間静置してゲルを膨潤させ、プロメガ製トリプシン製剤『シーケンシング・グレード・モディファイッド・トリプシン』を０．１μｇ／μｌ含む１ｍＭ塩酸と０．２Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８．９）をそれぞれ適量加え、３７℃で一晩反応させた。１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により反応を停止させた後、反応物に０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液と６０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの混液を加え、室温下で振盪した後、上清を採取し、真空乾燥し、遠心濾過してペプチド断片を含む濃縮物を得た。
【００５８】
この濃縮物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化しておいたファルマシア製高速液体クロマトグラフィー用カラム『μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０』に負荷し、通液開始から１６０分間でアセトニトリル濃度が０％（ｖ／ｖ）から８０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、８０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を１００μｌ／分の流速で通液した。波長２１４ｎｍにおける溶出液の吸光度をモニターしながら溶出液を分画し、溶出開始から約４５分後、約５０分後、約５５分後、約５８分後、約６２分後、約７２分後、約７５分後及び約７７分後に溶出したペプチド断片をそれぞれ別々に採取した。常法にしたがって、これらのペプチド断片（以下、溶出時間の早い順に「ペプチド断片１」、「ペプチド断片２」、「ペプチド断片３」、「ペプチド断片４」、「ペプチド断片５」、「ペプチド断片６」、「ペプチド断片７」及び「ペプチド断片８」と言う。）のアミノ酸配列をパーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』により調べたところ、ペプチド断片１乃至８は、それぞれ、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列を有することが判明した。このとき得られたペプチド・マップを図５に示す。
【００５９】
【実施例２】
〈ＤＮＡの調製〉
【００６０】
【実施例２−１】
〈全ＲＮＡの調製〉
常法にしたがって、Ｌ４２８細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７７）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、３７℃で増殖させた。所期の細胞密度に達した時点で増殖細胞を採取し、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート及び０．５％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）に浮遊させ、ホモジナイザーで破砕した。
【００６１】
次に、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含む０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を注入し、その上部に上記で得られた細胞破砕物を重層し、この状態のまま、２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離し、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、クロロホルム／１−ブタノール混液（容量比４：１）を等容量加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、これにエタノールを２．５倍容加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄した後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解してＬ４２８細胞由来の全ＲＮＡを含む水溶液を得た。
【００６２】
【実施例２−２】
〈ｍＲＮＡの調製〉
実施例２−１の方法により得た全ＲＮＡを含む水溶液に１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）ザルコシルをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加え、全量を１ｍｌとした。この混液に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）３０ラテックス『オリゴテックスｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間反応させた後、氷浴中で急冷した。次いで、反応物に５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、生成したペレット状の沈澱を採取し、これを滅菌蒸留水０．５ｍｌに懸濁し、６５℃で５分間インキュベートしてラテックスからｍＲＮＡを溶離させた。得られた水溶液に適量のエタノールを加え、生成した沈澱を採取し、凍結乾燥して、ｍＲＮＡの固状物を得た。
【００６３】
【実施例２−３】
〈ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、５００ｍＭ塩化カリウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を２μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミックスを１μｌ、４０単位／μｌのリボヌクレアーゼインヒビターを０．５μｌ、そして、２００単位／μｌの逆転写酵素を１μｌそれぞれ加えた後、５０μＭランダムヘキサヌクレオチドの適量と実施例２−２の方法により得たｍＲＮＡを１０ｎｇ加え、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。得られた混合物を４２℃で２０分間インキュベートし、さらに９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を終結させて第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００６４】
この反応物を２０μｌとり、これに２．５単位／μｌのストラタジーン製ＤＮＡポリメラーゼ『クローンドＰｆｕポリメラーゼ』１μｌ、ストラタジーン製専用緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれ加え、さらに、ピー・パーネットらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告しているアミノ酸配列に基づいて調製した５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド０．１μｇをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を９５℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９５℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００６５】
得られたＰＣＲ産物を５０ｎｇとり、これにストラタジーン製プラスミドベクター『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ（＋）』を１ｎｇ加え、さらに、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させてプラスミドベクター内にこのＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を挿入した。反応物の一部をとり、常法にしたがってストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』を形質転換した。
【００６６】
【実施例３】
〈組換えＤＮＡの調製〉
実施例２−３の方法により得た形質転換体をクロラムフェニコールを３０μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを得た。ジデオキシ法により、このプラスミドＤＮＡが配列表における配列番号７に示す塩基配列を含有していることを確認した後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩをそれぞれ作用させ、得られたＤＮＡ断片１００ｎｇに、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより予め同様に切断しておいたマルチクローニングサイト改変インビトロジェン製プラスミドベクター『ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーション・キット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させた。反応物の一部をとり、これを常法にしたがって『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入してこの発明の組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』を含む形質転換体『ｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』を得た。常法にしたがって分析したところ、組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号１に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＩＬ−１８Ｒ  ｃＤＮＡ』が、図６に示すように、サイトメガロウイルス・プロモーターＰｃｍｖの下流に連結されていた。
【００６７】
【実施例４】
〈形質転換体の調製〉
実施例３の方法により得た形質転換体『ｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを採取した。別途、アフリカミドリザルの腎臓に由来する線維芽細胞株の一種であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）を常法にしたがって増殖させ、これに上記で得られたプラスミドＤＮＡを２０μｇとり、これを通常一般のエレクトロポレーション法により１×１０7 個のＣＯＳ−１細胞に導入して、この発明のＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００６８】
【実施例５】
〈ポリペプチドの製造〉
平底培養瓶に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）をとり、これに実施例４の方法により得た形質転換体を１×１０5 個／ｍｌの割合で接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養液を除去した後、培養瓶内に５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムをそれぞれ含むＰＢＳを注入して増殖細胞を脱着させた。
【００６９】
この増殖細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ハイポトニックバッファー」と言う。）で再度洗浄し、細胞密度を２×１０7 個／ｍｌとなるようにハイポトニックバッファーに懸濁した。この細胞懸濁液を氷上でダウンス型ホモジナイザーによりホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞核及び非破砕細胞を除去した後、２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳに対して一夜透析した。
【００７０】
この透析物を実施例１−５に示した方法で作製したモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化したカラムに負荷し、１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着成分を除いた。その後、カラムに２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液し、溶出液を分画採取した。そして、それぞれの画分におけるヒト由来のポリペプチドの有無を実施例１−１に示した 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２０に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０8 個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００７１】
斯くして得られたこの発明のポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られたポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１９に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００７２】
【実施例６】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
【００７３】
【実施例６−１】
〈組換えＤＮＡの調製〉
０．５ｍｌ容反応管に実施例３の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれとり、２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＴＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＴＧ−３´で表される塩基配列のポリヌクレオチドをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。次いで、混合物を、常法にしたがって、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００７４】
得られたＰＣＲ産物を５０ｎｇとり、これに宝酒造製プラスミドベクター『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）』を１ｎｇ加え、さらに、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させてプラスミドベクター内にＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を挿入した。反応物の一部をとり、常法にしたがってストラタジーン製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』を形質転換した。
【００７５】
上記で得られた形質転換体をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを得た。ジデオキシ法により、このプラスミドＤＮＡが配列表における配列番号１０に示す塩基配列を含有していることを確認した後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩをそれぞれ作用させ、得られたＤＮＡ断片１００ｎｇに、予め制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより切断しておいた、エス・ミズシマら『ニュークレイック・アシッド・リサーチ』、第１８巻、第１７号、５，３３２頁（１９９０年）に記載された方法に準じて調製したプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーションキット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用い、１６℃で２時間反応させた。反応物の一部をとり、これを常法にしたがって『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』を含む形質転換体『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号６に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４  ｃＤＮＡ』が、図７に示すように、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００７６】
【実施例６−２】
〈形質転換体の調製〉
実施例６−１の方法により得た形質転換体『ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを採取した。別途、アフリカミドリザルの腎臓に由来する線維芽細胞株の一種であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）を常法にしたがって増殖させ、これに上記で得られたプラスミドＤＮＡを２０μｇとり、これを通常一般のエレクトロポレーション法により１×１０7 個のＣＯＳ−１細胞に導入して、この発明のＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００７７】
【実施例６−３】
〈可溶性ポリペプチドの製造〉
平底培養瓶に味の素製無血清培地『ＡＳＦ１０４』をとり、これに実施例６−２の方法により得た形質転換体を１×１０５個／ｍｌの割合で接種し、常法にしたがって５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養上清を採取し、実施例１−５の方法により得たモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを固定化したカラムに負荷し、１２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除いた。その後、カラムに２ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含む３５ｍＭエチルアミン（ｐＨ１０．８）を通液し、溶出液を分画採取した。そして、それぞれの画分におけるヒト由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した１２５Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２２に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０８個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００７８】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１２乃至１７及び配列番号１９に示すアミノ酸配列をそれぞれ含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００７９】
【実施例７】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
０．５ｍｌ容反応管に実施例６−１の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれとり、２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、さらに、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ適量加えた後、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間この順序でインキュベートするサイクルを３５回繰返してＰＣＲ反応させて、配列表における配列番号５に示す塩基配列、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＳａｌＩによる切断部位とコザック配列、そして、３´末端に連結された制限酵素ＮｏｔＩにより切断部位と（Ｈｉｓ）6 タグをコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例６−１におけると同様にしてストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入し、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』を含む形質転換体を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡにおいては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』が、図８に示すように、延長因子プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００８０】
斯くして得られた形質転換体を用い、実施例６−２におけると同様にして組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』をＣＯＳ−１細胞に導入した後、そのＣＯＳ−１細胞を実施例６−３におけると同様に培養した。培養物から培養上清を採取し、膜濾過により濃縮した後、キアジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ』のカラムに負荷し、カラムに２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除いた。その後、カラムに２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液し、溶出液を分画採取する一方、それぞれの画分におけるヒト由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した 125Ｉ標識ヒトＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２３に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０8 個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００８１】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１４乃至１６及び１９に示すアミノ酸配列のそれぞれの一部又は全てを含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００８２】
【実施例８】
〈ヒト由来の可溶性ポリペプチド〉
センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレチオドを用いた以外は実施例７と同様にして、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』を含む形質転換体を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡにおいては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号３に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』が、図９に示すように、延長因子プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。その後、実施例７におけると同様にして、この組換えＤＮＡをＣＯＳ−１細胞に導入し、発現させたところ、配列表における配列番号２４に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０8 個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。
【００８３】
斯くして得られたこの発明の可溶性ポリペプチドに実施例１で述べた方法を適用し、その理化学的性質を調べた。その結果、本実施例で得られた可溶性ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１４及び１５に示すアミノ酸配列をそれぞれ含有するとともに、Ｌ４２８細胞由来のＩＬ−１８Ｒと同様の生理活性を示した。
【００８４】
【実施例９】
〈マウス由来の可溶性ポリペプチド〉
【００８５】
【実施例９−１】
〈組換えＤＮＡの調製〉
Ｌ４２８細胞由来のｍＲＮＡに代えて、マウス肝細胞から常法にしたがって調製したｍＲＮＡを用いた以外は、実施例２−３と同様に反応させて第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。さらに、ピー・パーネットらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７１巻、３，９６７乃至３，９７０頁（１９９６年）に報告しているアミノ酸配列及び配列表における配列番号１に示す塩基配列に基づいて調製した５´−ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡ−３´及び５´−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、上記で得た反応物を実施例２−３と同様にＰＣＲ反応させて、配列表における配列番号１１に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＳａｌＩによる切断部位と、配列番号１１に示す塩基配列の３´末端に連結された制限酵素ＮｏｔＩによる切断部位及び（Ｈｉｓ）6 タグをコードする塩基配列とを含んでなるＤＮＡ断片を得た。
【００８６】
その後、実施例６−１に示す方法により、このＤＮＡ断片を大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して形質転換し、形質転換体からプラスミドＤＮＡを採取し、それが配列表における配列番号１１に示す塩基配列を含んでなることを確認した後、プラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を用いて大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入し、この発明の組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭＩＬ−１８ＲＳＨＴ』を含む形質転換体『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』を得た。常法にしたがって分析したところ、この組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』においては、この発明のポリペプチドをコードする、配列表における配列番号４に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡである『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ  ｃＤＮＡ』が、図１０に示すように、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００８７】
【実施例９−２】
〈形質転換体と可溶性ポリペプチドの調製〉
実施例６−２で述べた方法により、実施例９−１の方法により得た形質転換体『ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』からプラスミドＤＮＡを採取し、これをＣＯＳ−１細胞に導入して、マウス由来の可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００８８】
平底培養瓶に味の素製無血清培地『ＡＳＦ１０４』をとり、これに形質転換したＣＯＳ−１細胞を１×１０5 個／ｍｌの割合で接種し、常法にしたがって５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養上清を採取し、キアジェン製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『Ｎｉ−ＮＴＡ』のカラムに負荷し、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除去した後、カラムに２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液し、溶出液を分画採取した。それぞれの画分におけるマウス由来の可溶性ポリペプチドの有無を実施例１−１に示した 125Ｉ標識マウスＩＬ−１８を用いる方法により判定し、選別し、合一したところ、配列表における配列番号２５に示すアミノ酸配列のポリペプチドを含む水溶液が原料細胞１０8 個当り約２ｍｌ得られた。なお、この水溶液の蛋白質含量は約１００μｇ／ｍｌであった。実施例１で述べた方法に準じて調べたところ、斯くして得られた可溶性ポリペプチドはマウスＩＬ−１８をよく中和した。
【００８９】
【実施例１０】
〈液剤〉
安定剤として林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌して４種類の液剤を得た。
【００９０】
安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、点鼻剤などとして有用である。
【００９１】
【実施例１１】
〈乾燥注射剤〉
安定剤としてシュークロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓して、４種類の粉末製剤を得た。
【００９２】
安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００９３】
【実施例１２】
〈軟膏剤〉
滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかを均一に混合した後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当り、この発明のポリペプチドを約１ｍｇ含む４種類のペースト製剤を得た。
【００９４】
延展性と安定性に優れた本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００９５】
【実施例１３】
〈錠剤〉
林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例５乃至８に記載されたいずれかの方法により得たポリペプチドのいずれかと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して、製品１錠（約２００ｍｇ）当り、この発明のポリペプチド及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む４種類の錠剤を得た。
【００９６】
摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有する本品は、自己免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００９７】
【実験】
〈急性毒性試験〉
常法にしたがって、８週齢のマウスに実施例１０乃至１３の方法により得た種々剤型の感受性疾患剤を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、被検試料のＬＤ５０は、この発明のポリペプチドの量に換算すると、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／マウス体重以上であった。このことは、この発明のポリペプチドがヒトを含む哺乳類に投与する医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００９８】
【発明の効果】
以上説明したとおり、この発明はＩＬ−１８を認識する新規な受容体蛋白質の発見に基づくものである。この発明のポリペプチドは、ヒトを含む哺乳類において免疫反応を抑制したり調節する性質を有するので、臓器移植に伴う拒絶反応の緩和や、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明のポリペプチドはＩＬ−１８の生理作用の解明や、ＩＬ−１８Ｒに特異的なモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマの樹立、さらには、ＩＬ−１８を精製したり検出するためのアフィニティークロマトグラフィーや標識アッセイにも有用である。また、これに加え、この発明のポリペプチド、とりわけ、この発明の可溶性ポリペプチドは、ＩＬ−１８Ｒに対する作動薬や拮抗薬の、生体内又は生体外での検索にも有用である。斯くも有用なるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利用するこの発明の方法により、所望量を容易に製造することができる。
【００９９】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると言える。
【０１００】
【配列表】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃが、ＩＬ−１８と競合してＬ４２８細胞及びＩＬ−１８Ｒに結合する様子を示す図である。
【図２】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるウェスタン・ブロッティング法により可視化した、ＩＬ−１８Ｒのゲル電気泳動のディスプレー上に表示した中間調画像である。
【図３】モノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０ＣによるＩＬ−１８の活性阻害を示す図である。
【図４】ＩＬ−１８Ｒにモノクローナル抗体ＭＡｂ＃１１７−１０Ｃを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用したときのクロマトグラムである。
【図５】ＩＬ−１８Ｒのペプチド・マップである。
【図６】この発明の組換えＤＮＡである『ｐｃＤＮＡ／ＨｕＩＬ−１８Ｒ』の構造を示す図である。
【図７】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４』の構造を示す図である。
【図８】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ』の構造を示す図である。
【図９】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ』の構造を示す図である。
【図１０】この発明の組換えＤＮＡである『ｐＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ』の構造を示す図である。
【符合の説明】
Ｐｃｍｖ                          サイトメガロウイルス・プロモーター
ＥＦ１αＰ                        延長因子１プロモーター
ＩＬ−１８Ｒ  ｃＤＮＡ            この発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＥＦＨＩＬ１８Ｒ−１４  ｃＤＮＡ  この発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＨＩＬ１８ＲＤ１−２−Ｈ  ｃＤＮＡ
この発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＨＩＬ１８ＲＤ１−Ｈ  ｃＤＮＡ    この発明によるヒト由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＥＦＭＩＬ１８ＲＳＨＴ  ｃＤＮＡ  この発明によるマウス由来の可溶性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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