(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼの存在下で逆転写反応を行うことを特徴とするｃＤＮＡの合成方法。
【請求項２】
逆転写活性を有する酵素が、バチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ又はバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記載のｃＤＮＡの合成方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法で合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を実施することを特徴とするｃＤＮＡの増幅方法。
【請求項４】
遺伝子増幅方法がＰＣＲであることを特徴とする請求項３記載のｃＤＮＡの増幅方法。
【請求項５】
ＰＣＲのためのＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼと同じであることを特徴とする請求項４記載のｃＤＮＡの増幅方法。
【請求項６】
ｃＤＮＡを合成するためのキットであって、好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とするｃＤＮＡ合成キット。
【請求項７】
逆転写活性を有する酵素がバチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ又はバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項６記載のｃＤＮＡ合成キット。
【請求項８】
請求項１または２記載の方法で合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を実施し、ｃＤＮＡを増幅するために用いられるキットであって、好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素と異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ、並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含有することを特徴とするｃＤＮＡ増幅キット。
【請求項９】
遺伝子増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項８記載のｃＤＮＡ増幅キット。
【請求項１０】
遺伝子増幅反応のための試薬としてＰＣＲのためのＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする請求項９記載のｃＤＮＡ増幅キット。
【請求項１１】
ＰＣＲが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼで行われ、該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼとＰＣＲのためのＤＮＡポリメラーゼとが同一であることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ増幅キット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は遺伝子工学分野において有用な、新規のｃＤＮＡ合成方法、並びに該方法に使用されるキットに関する。
発明の背景
生命現象を解明するためには、様々の遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。レトロウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、即ち逆転写酵素の発見により、ＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げ、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。更に該方法はクローニング技術やＰＣＲ技術にも応用され、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等、幅広い分野において不可欠の技術となっている。
しかしながら、従来の逆転写方法には、ｃＤＮＡ合成反応が途中で止まってしまう、長いｃＤＮＡが合成出来ない、フィデリティーが低い、反応に要する時間が長いため反応の進行中に鋳型ＲＮＡが損傷を受けてしまう等の多くの問題点があった。
ｃＤＮＡ合成反応が途中で止まってしまうのは、鋳型となるＲＮＡが形成する二次構造のためと考えられる。レトロウイルス由来の逆転写酵素の反応至適温度は低いため、反応時にＲＮＡが複雑な二次構造を形成し、このような二次構造の部位でｃＤＮＡ合成反応は止まってしまう。この問題点を解決する方法として、耐熱性の逆転写酵素を用いる方法が提案されている。しかし、該方法は反応性において満足できるものではない。また、逆転写酵素の逆転写反応における校正活性は知られておらず、フィデリティーの高いｃＤＮＡ合成方法も知られていない。
このように従来の技術ではｃＤＮＡ合成を効率良く高いフィデリティーで行うことは困難であり、より効率の良いｃＤＮＡ合成方法が求められていた。
発明の目的
本発明は前記従来技術に鑑みて行われたものであり、本発明の目的は、従来技術の問題点を克服し、反応効率が高く、かつ正確なｃＤＮＡ合成を行う方法を提供することにある。
発明の要旨
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写活性を行うことを特徴とするｃＤＮＡの合成方法に関する。
本発明の第２の発明は、第１の発明の方法によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を実施することを特徴とするｃＤＮＡの増幅方法に関する。
本発明の第３の発明は、ｃＤＮＡを合成するためのキットに関し、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含有することを特徴とするｃＤＮＡ合成キットに関する。
本発明の第４の発明は、ｃＤＮＡを増幅するために用いられるキットに関し、第１の発明の方法によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を実施し、ｃＤＮＡを増幅するために用いられるキットであって、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含有することを特徴とするｃＤＮＡ増幅キットに関する。
本発明者らは、ｃＤＮＡ合成反応において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡの合成効率、並びにフィデリティーが上昇することを見出し、本発明を完成した。
発明の詳細な説明
本発明のｃＤＮＡ合成方法は、ＲＮＡを鋳型とし、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含んだ逆転写反応系によってｃＤＮＡを合成することを大きな特徴とする。
本発明の方法に使用することができるＲＮＡを含む試料には特に限定はないが、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。
本発明の方法に適用することができるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。
本発明において鋳型ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーはオリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）であっても良い。
前記プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミタイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作成しても良い。前記プライマーの逆転写反応液中の濃度は、鋳型ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の観点から、好ましくは０．１μＭ以上であり、更に好ましくは０．５μＭ以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは１０μＭ以下であり、更に好ましくは５μＭ以下である。
本発明に用いられる逆転写活性を有する酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はないが、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素（すなわち、耐熱性の逆転写酵素）が好適である。このような酵素としては、例えばサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を発揮させるためには、反応液中にマンガンイオンの存在が必須である。マンガンイオンはＰＣＲ反応においてはフィデリティーの低下を招くことが知られており、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼでの逆転写反応液をＰＣＲに使用する場合には、マンガンイオンを除去する必要がある。好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの場合は、逆転写活性のためのマンガンイオンの添加およびＰＣＲにおけるその除去は必要ではない。このような観点から、本発明には好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、更にバチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（以下、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼと記載する）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（以下、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼと記載する）が好ましい。これらの酵素は反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが出来る。
バチルス・カルドテナクスは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、該改変された酵素として例えば５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼであるＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂＳ社製）等が挙げられる。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した上記酵素は本発明に特に好適に使用できる。
前記逆転写活性を有する酵素の使用量は、特に限定はないが、例えば従来の逆転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。また、従来よりも逆転写活性を有する酵素の量を増加させることにより、より効率の高いｃＤＮＡ合成反応を行う事が出来、反応時間を短縮する事も出来る。例えばＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２０μｌで逆転写反応を行う場合、反応液中の該酵素量は０．５Ｕ以上であり、ｃＤＮＡ合成効率の観点から、好ましくは２２Ｕ以上であり、更に好ましくは４２Ｕ以上である。なお、本明細書に記載のＤＮＡポリメラーゼの活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、当該ＤＮＡポリメラーゼに適した反応条件において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕと定義する。鋳型となるＤＮＡや反応温度はＤＮＡポリメラーゼに応じて適したものが使用される。例えば、上記ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの場合、ポリデオキシ（ＡＴＰ−ＴＴＰ）を鋳型／プライマーとして用い６０℃において３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕと定義する。
本発明のｃＤＮＡ合成方法は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写反応を行うことを特徴とする。本発明に用いられる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、該活性を有していれば特に限定はなく、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。このような酵素としては、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）等）やサーモコッカス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等）等のα型ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント等）、バクテリオファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等）等のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくは強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すα型ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。尚、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、α型ＤＮＡポリメラーゼはともにそのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、そのアミノ酸配列上の特徴はヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１５巻、第４０４５−４６５７頁（１９９１）に記載されている。
本発明の目的のためには、ＲＮＡとハイブリッドを形成したＤＮＡの３’末端に作用する酵素が使用され、更に、高温で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す酵素が好適である。以上の観点から超好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。超好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばピロコッカス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
上記方法で得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、ｃＤＮＡを増幅することが出来る。核酸増幅反応としては、特に限定するものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が使用される。ＰＣＲ法に使用される酵素に特に限定はなく、通常のＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼを使用することが出来る。上記方法で得られたｃＤＮＡは鋳型ＲＮＡから高いフィデリティーで合成されたものであり、該ＲＮＡ由来の配列を出来るだけ正確に複製する観点から、ＰＣＲも高いフィデリティーで行われることが望まれる。このため、本発明のｃＤＮＡの増幅にはフィデリティーの高いＤＮＡポリメラーゼ、例えば好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用される。更に、ｃＤＮＡの合成工程において３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ）が使用される場合には、該酵素をそのままＰＣＲ工程において使用することも可能である。ｃＤＮＡ合成／増幅反応のフィデリティーは、Ｊ．Ｃｌｉｎｅらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎｅら、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、第３５４６〜３５５１頁、（１９９６））を改変した方法に基づいて測定することができる。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質のいずれであっても良い。また、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良い。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを鋳型とした場合にも、合成されるｃＤＮＡに誤って取り込まれた塩基を除去するのに有効な校正活性を示すことからフィデリティーの高いｃＤＮＡ合成が可能である。前記酵素の使用量は、ポリメラーゼ活性として、反応液２０μｌ中、ｃＤＮＡ合成効率の観点から好ましくは１Ｕ以下であり、更に好ましくは０．５Ｕ以下であり、校正活性の観点から好ましくは０．０１Ｕ以上であり、更に好ましくは０．０２Ｕ以上である。
本発明の方法を用いれば、従来の逆転写方法に比べ、ｃＤＮＡ合成量を増加させることができ、また、従来よりも長い鎖長のｃＤＮＡの合成が可能であり、更に、フィデリティーの高いｃＤＮＡ合成が可能である。また、本方法を関連する技術、例えばクローニング技術、ＰＣＲ技術等と組合わせることにより、従来よりも効率の良いｃＤＮＡライブラリー作製、ＲＴ−ＰＣＲ等が可能であり、これにより、従来困難であった発現量の少ないｍＲＮＡのより正確な解析が可能となる。
本発明のｃＤＮＡ合成キットは、上記ｃＤＮＡ合成方法に用いられるキットであり、フィデリティーの高いｃＤＮＡ合成を効率よく行うためのキットである。このようなキットとしては、上記の逆転写活性を有する酵素及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含有するもの等が挙げられる。該キットは、前記酵素を用いたｃＤＮＡ合成反応に使用する反応緩衝液、ヌクレオチドやその他の試薬を含有するものであっても良い。このようなキットを使用することによって、効率が良く、フィデリティーの高いｃＤＮＡ合成を容易に行うことができる。
本発明のｃＤＮＡ増幅キットは、上記ｃＤＮＡ増幅方法に用いられるキットであり、フィデリティーの高いｃＤＮＡ増幅を効率よく行うためのキットである。このようなキットとしては、上記の逆転写活性を有する酵素、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素並びに遺伝子増幅反応を行うための試薬を含有するものが挙げられる。ｃＤＮＡを鋳型とする遺伝子増幅反応としてＰＣＲを用いる場合、増幅反応に使用する試薬としては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ヌクレオチドやその他の試薬、が挙げられる。このようなキットを使用することによって、効率が良く、フィデリティーの高いｃＤＮＡ増幅を容易に行うことができる。上記のように、ｃＤＮＡの合成工程において３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ）が使用される場合には、該酵素をそのままＰＣＲ工程における増幅反応のためのＤＮＡポリメラーゼとして使用することも可能である。
実施例
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
尚、下記実施例において、各酵素の活性は各酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。
実施例１  ＲＮＡの調製
以下の実施例に使用するＲＮＡは、特に断らない限り、ヒト培養細胞Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３）からトライゾール試薬（ライフテック社製）を使用し、該試薬添付の説明書記載の操作により調製後、濃度を０．６６μｇ／μｌに調製したものである。ＲＮＡの純度は、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．７であった。
実施例２  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの組合わせによる効果
ｃＤＮＡ合成における３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の添加の効果を、逆転写酵素として５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  宝酒造社製）、３’−５’エキソヌクレアーゼとしてピロコッカス  スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  宝酒造社製）を用いて検討した。
ｃＤＮＡ合成反応はＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１．１）（宝酒造社製）を使用して行った。当該キットのマニュアルに従って、下記に記載の酵素とオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを含む反応液２０μｌを調製した。これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナル（宝酒造社製）にセットし、６０℃で１分、２分、３分、４分で逆転写反応を行い、各々の反応時間の後、９８℃、５分間の熱処理を行った。
酵素１  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２２Ｕ／反応系
酵素２  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ／反応系
酵素３  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２２Ｕ＋Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ０．０１７Ｕ／反応系
酵素４  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ＋Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．０３３Ｕ／反応系
次にＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記逆転写反応液２０μｌをサンプルとしてトランスフェリンレセプターｍＲＮＡ中の４．４ｋｂを標的とするＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのマニュアルに従って、上記逆転写反応液２０μｌ、トランスフェリンレセプター増幅用プライマー１（配列番号１）及びトランスフェリンレセプター増幅用プライマー２（配列番号２）を含む１００μｌの反応液を調製し、ＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットし、９４℃、３０秒〜６５℃、３０秒〜７２℃、５分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ後、得られた反応液の８μｌをアガロースＬ０３（宝酒造社製）を使用した１％アガロースゲル電気泳動に供した。ＰＣＲ産物の量は、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色した後、蛍光イメージアナライザーであるＦＭＢＩＯ  ＩＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ（宝酒造社製）にて蛍光の強度を数値化して評価した。酵素１、逆転写反応時間３分の条件で得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の蛍光強度を１．００として全サンプルについての値を換算した結果を表１に示す。
0003910015.tif 000002
ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２２Ｕ、４２Ｕ何れの場合も、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを添加する事により、ｃＤＮＡ合成効率が上昇した（表１、酵素３および４）。又、その効率の上昇はＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡボリメラーゼを４２Ｕ使用した場合（表１、酵素４）、特に顕著であった。
これらのことから、逆転写反応時に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する事でｃＤＮＡ合成効率が上昇する事が示された。更に、逆転写活性を有する酵素を大量に用いる事で更に効率が高まる事が示された。
対照実験として、ベーリンガー社製のＴｉｔａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用したｃＤＮＡ合成を行った。該キットは逆転写活性を有する酵素としてＡＭＶ−ＲＴａｓｅ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としてピロコッカス・ウォエシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ）由来のＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。
該キットのマニュアルにしたがって５０℃、３０分のｃＤＮＡ合成反応を行なった。次いでマニュアルに従って９４℃、２分間の熱処理を行なった後、トランスフェリンレセプターｍＲＮＡ中の４．４ｋｂを標的とするＰＣＲを該キットのマニュアルにしたがって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ／Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行なった。９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜６８℃、４分を１サイクルとしたＰＣＲを１０サイクル行った後、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜６８℃、４分５秒（１１サイクル目）、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜６８℃、４分１０秒（１２サイクル目）、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜６８℃、４分１５秒（１３サイクル目）、のように、伸長ステップの時間を１サイクル毎に５秒ずつ長くしたＰＣＲを２５サイクル行なった。
ＲＴ−ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動に供したが、逆転写反応を３０分間行なっているにも関わらず、ターゲットである４．４ｋｂの増幅産物は検出されなかった。
実施例３  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼとＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとの組合わせの効果
３’−５’エキンヌクレアーゼ活性を有する酵素として、ピロコッカス  スピーシーズＧＢ−Ｄ由来のＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド  バイオラボ社製）を用いた場合の効果を検討した。
下記の酵素を使用し、実施例２と同様の実験を行った。
酵素１  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ／反応系
酵素２  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ＋Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ０．０３３Ｕ／反応系
酵素３  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ＋Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．０６７Ｕ／反応系
得られた結果を表２に示す。（酵素１、逆転写反応時間２分での結果を１．０とした。）
0003910015.tif 000003
以上の結果より、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素としてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼに代えてＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合にも、ｃＤＮＡ合成効率が上昇することが示された。
実施例４  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔとＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの組合わせの効果
逆転写活性を有する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチルス・ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ニューイングランド  バイオラボ社製）を用いた場合の効果を検討した。
下記の酵素を使用し、逆転写反応時間を１０分とした以外は実施例２と同様に逆転写反応を行った。
酵素１  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ８Ｕ／反応系
酵素２  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ８Ｕ＋ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．０１Ｕ／反応系
酵素３  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ８Ｕ＋Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．００５Ｕ／反応系
酵素４  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ８Ｕ＋Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．００３３Ｕ／反応系
次に、トランスフェリンレセプターｍＲＮＡ中の２．４ｋｂを標的とするＰＣＲを行った。プライマーとしてトランスフェリンレセプター増幅用プライマー２（配列番号２）及びトランスフェリンレセプター増幅用プライマー３（配列番号３）を用い、反応条件を９４℃、３０秒〜６５℃、３０秒〜７２℃、３分の温度サイクルを３０サイクルとした以外は、実施例２と同様に行った。得られた結果を表３に示す。（酵素１での結果を１．００とした。）
0003910015.tif 000004
以上の結果より、逆転写活性をもつ酵素としてＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼに代えてＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた逆転写反応の場合にも、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する事でｃＤＮＡ合成効率が上昇することが示された。
実施例５  ｃＤＮＡ合成におけるフィデリティーに対する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の効果
ｃＤＮＡ合成におけるフィデリティーに対する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の効果を、逆転写活性を有する酵素としてＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｊ．Ｃｌｉｎｅらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎｅら、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、第３５４６〜３５５１頁、（１９９６））を改変した方法に基づいて検討した。
ｃＤＮＡ合成の鋳型ＲＮＡとしては、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）によって以下のように合成したｌａｃＩＯＺαＲＮＡを使用した。
ｌａｃＩＯＺαは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースオペロンの一部であり、リプレッサー領域（Ｉ）、オペレーター領域（Ｏ）、ｌａｃＺα因子領域（Ｚ）を含む。
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてｌａｃＩＯＺα−Ｆプライマー（配列番号４）、及びｌａｃＩＯＺα−Ｒプライマー（配列番号５）を用いたＰＣＲを行い、ｌａｃＩＯＺα領域の増幅断片を得た。得られた増幅断片（約１．９ｋｂ）をＳＰ６プロモーターを持つプラスミドｐＳＣＲＥＥＮ−ＴＴＭ−ｌ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡクローニングし、ＳＰ６プロモーターの下流にｌａｃＩＯＺα領域が結合したプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ（宝酒造社製）で消化して得られた直鎖状ＤＮＡを鋳型として用い、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を使用して、以下のようにＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＳＰ６プロモーター領域からのＲＮＡ合成を行った。
Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔのマニュアルに従って、直鎖状ｌａｃＩＯＺα−ｐＳＣＲＥＥＮ−Ｔ  ＤＮＡ  ２００ｎｇを含む反応液５０μｌを調製し、３７℃で２時間反応させ、ＲＮＡを合成した。反応後、ＤＮａｓｅ  Ｉ（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、さらに３７℃で１時間静置しＤＮＡを分解させた。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により合成ＲＮＡを精製した。このようにして得られた１９９１ベースのｌａｃＩＯＺαＲＮＡ（ＳＰ６プロモーター、リプレッサー領域（Ｉ）、オペレーター領域（Ｏ）、ｌａｃＺα因子領域（Ｚ）を含む）を鋳型ＲＮＡとして用いて、以下の実験を行った。
ＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔのマニュアルに従って、ｌａｃＩＯＺαＲＮＡ  ４５０ｎｇ、ｌａｃＩＯＺα−Ｒプライマー  ２０ｐｍｏｌ、及び下記に記載の酵素を含む反応液２０μｌを調製した。これらの反応液をＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナル（宝酒造社製）にセットし、６５℃で１分間、３０℃で１分間保温した後、１５分かけて温度を３０℃から６５℃まで上昇させ、その後６５℃で１５分間保温して逆転写反応を行い、最後に９８℃、５分間の熱処理を行った。
酵素１  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ／反応系
酵素２  ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ  ４２Ｕ／反応系＋Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．０３３Ｕ／反応系
次にＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記逆転写反応２．５μｌをサンプルとして、ｌａｃＩＯＺα領域１．９  ｋｂを標的とするＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのマニュアルに従って、上記逆転写反応液２．５μｌ、ｌａｃＩＯＺα−Ｆプライマー、ｌａｃＩＯＺα−Ｒプライマーを含む反応液１００μｌを調製し、ＰＣＲサーマルサイクラー  パーソナルにセットし、９４℃、３０秒〜６８℃、２分を１サイクルとした２８サイクルのＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ後、得られた反応液をフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿し、増幅産物を精製した。この増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で処理した後、全量をアガロースゲル電気泳動し、泳動後、ＥｃｏＲ  Ｉ処理断片のバンドを切り出し、ＥａｓｙＴｒａｐ（宝酒造社製）を用いてＥｃｏＲ  Ｉ処理断片を回収した。このＥｃｏＲ  Ｉ処理断片とλｇｔ１０  ＥｃｏＲ  Ｉ  Ａｒｍｓ（宝酒造社製）をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｉｌｌ  ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてインビトロパッケージング（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を行った。
得られた各パッケージング溶液を段階希釈した稀釈液１００μｌを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株（ｌａｃＺΔＭ１５）培養液（ＯＤ６００＝１）１００μｌに添加し、３７℃で１５分間静置した。次のこの培養液全量をＸ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（１．５ｍＭ）を含む０．７％ＬＢソフトアガー（ｓｏｆｔ  ａｇａｒ）（ＩＰＴＧ（＋））、又はＸ−ｇａｌを含みＩＰＴＧを含まない０．７％ＬＢソフトアガー（ＩＰＴＧ（−））に加え、混和後ＬＢプレート上に重層した。このプレートを３７℃で一晩培養し、出現したプラーク数を数えた。
ｌａｃＩＯＺ領域のｌａｃ  Ｉに変異がない場合、ｌａｃ  Ｉにコードされているｌａｃレッサーの働きによりＩＰＴＧ非存在下ではβガラクトシダーゼが発現せず、白いプラークを生じ、ＩＰＴＧ存在下で初めてβガラクトシダーゼが発現し、青いプラークを生じる。一方、ｌａｃＩＯＺ領域のｌａｃ  Ｉに変異が導入された場合、ｌａｃ  Ｉコードされているリプレッサーがその活性を失い、ＩＰＴＧ非存在下においてもβガラクトシダーゼが発現するため、ＩＴＰＯ（＋）、ＩＰＴＧ（−）何れのプレートにおいても青いプラークを生じる。
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従って、ＩＰＴＧ（−）プレートに生じる青プラークは変異が導入されたクローンであり、変異率（ｍｆ）は下記式に示すようにＩＰＴＧ（−）プレートに生じた青プラーク数をＩＰＴＧ（＋）プレートに生じた青プラーク数で除することによって求めることができる。
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結果を表４に示す・
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逆転写反応をＢｃａＢＥＳＴ    ＤＮＡポリメラーゼのみの存在下で行った場合の変異率（ｍｆ）が０．２２９であるのに対して、逆転写反応をＢｃａＢＥＳＴ    ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行った場合の変異率（ｍｆ）は０．１３３であり、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼが存在しない場合の約２倍のフィデリティーを示した。
このことから、逆転反応時に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を存在させることでｃＤＮＡの合成効率のみならずフィデリティーも上昇することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明は、反応効率が良く、かつフィデリティーが高いｃＤＮＡ合成を可能にする方法である。本方法は、関連する技術、例えばクローニング技術、ＰＣＲ技術等と組合わせることが可能であり、このことによって従来よりも効率の良く、かつ正確なｃＤＮＡライブラリー作製、ＲＴ−ＰＣＲ等が可能となり、ｍＲＮＡの解析方法の向上をもたらす。
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【配列表】
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