(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨあるいはこれらの類似構造体をコファクターとして要求しプロドラッグを細胞毒性薬物に変換可能なニトロレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を発現するウイルスベクター
（ii）該ベクターによりコードされるニトロレダクターゼにより細胞毒性薬物に変換されることができるプロドラッグ
を含み、腫瘍の治療において同時に、個別にまたは順次使用するための製品。
【請求項２】
該ニトロレダクターゼが、配列番号２の配列、そのフラグメントまたはその同族体（homologue）である請求項１記載の製品。
【請求項３】
ベクターが、ウイルス粒子の形態である請求項１または２に記載の製品。
【請求項４】
ベクターが、細胞中に組み込まれている請求項１または２に記載の製品。
【請求項５】
細胞毒性薬物が、循環細胞（cycling cells）及び非循環細胞（non-cycling cells）に対して活性である、請求項１〜４のいずれかに記載の製品。
【請求項６】
プロドラッグがナイトロジェンマスタード化合物である請求項１〜５のいずれかに記載の製品。
【請求項７】
プロドラッグが１−アジリジン−１−イル−２，４−ジニトロベンズアミドまたは２，４−ジニトロ−５−（Ｎ，Ｎ−ジ−（２−クロロエチル））アミノベンズアミドである請求項１〜６のいずれかに記載の製品。
【請求項８】
内科的治療方法において、請求項１〜７のいずれかに記載の製品に使用される請求項１〜７のいずれかに定義されたウイルスベクター。
【請求項９】
腫瘍治療のための薬剤製造のために使用される請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
人体または動物体の治療方法に使用される請求項１〜７のいずれかに記載の製品。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウィルスを媒介させる遺伝子治療法と腫瘍の治療におけるその使用に関する。
“ウィルスで管理された酵素プロドラッグ治療法”（VDEPT）と名付けられた治療的アプローチが、プロドラッグを使用する患者における腫瘍細胞の治療方法として提案されている。腫瘍細胞は、プロドラッグを活性化しうる酵素をコードする遺伝子を運ぶウィルス性ベクターにより、ターゲットとされる。遺伝子は、組織特異性のプロモーター或いはエンハンサー配列により、転写的に制御される。ウィルス性ベクターは、プロドラッグが腫瘍細胞の近傍においてのみ活性薬物に変換される様に、腫瘍細胞に入り、酵素を発現する｛フーバーら（Huber et al）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991)88, 8039｝。
VDEPTシステムは、腫瘍部位に運ばれ得る抗ガン剤の濃度を高めることができるが、ドラッグデリバリーの特異性と効率とをさらに高める必要がある。
本発明は、ニトロレダクターゼをコードするVDEPTウィルス性ベクターを使用することにより、その様な課題に対処するものである。
従って、本発明は、下記の構成を備えたシステムを提供する：
（ｉ）ニトロレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を有するウィルス性ベクター、該ニトロレダクターゼはプロドラッグを細胞毒性薬物に変換させることができる；および
（ｉｉ）ベクターによりコードされたニトロレダクターゼにより活性薬物に変換し得るプロドラッグ。
本発明は、さらに、本明細書で定義するベクターと本明細書で定義するプロドラッグとを備えたキットをも提供する。
他の態様として、本発明は、人体または動物体の治療方法において、特に腫瘍の治療方法において使用するための本明細書で定義するシステムまたは本明細書で定義するキットを提供する。
さらに他の態様として、本発明は、腫瘍を有する個体に対し、（ｉ）本明細書に定義するベクターの有効量と
（ｉｉ）ベクターによりコードされたニトロレダクターゼにより活性薬物に変換され得るプロドラッグの有効量とを投与することからなる腫瘍の治療方法を提供する。
さらに他の態様として、本発明は、人体または動物体に対し、本明細書に定義するベクターの有効量とベクターによりコードされたニトロレダクターゼにより活性薬物に変換され得るプロドラッグの有効量とを投与することからなる正常組織の削摩方法（method of ablating normal tissue）を提供する。
さらに他の態様として、本発明は、腫瘍の治療または組織の削摩において同時に、個別に或いは順次使用するための組合せ調剤としての、本明細書に定義するウイルス性ベクターと本明細書に定義するプロドラッグとを含む製品を提供する。
ウィルス性ベクターは、例えば、レトロウィルス、アデノウィルス或いはウイロソームベクターなどの腫瘍細胞をターゲットとし得る任意の入手可能なベクターでよい。フーバーら（Huber et al）｛Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1991)88, 8039｝は、肝ガン、胸、大腸或いは皮膚の細胞のトランスフォーメーションのために、両種性レトロウィルスを使用することを報告している。カルヴァーら（Culver et al）｛Science(1992)256;1550-1552｝も、VDEPTにおけるレトロウィルスベクターの使用を記述しており、ラムら（Ram et al）｛Cancer Research(1993)53;83-88｝も同様である。エングルハートら｛（Englehardt et al）Nature Genetics(1993)4;27-34｝は、細胞中への嚢胞性繊維症貫膜コンダクタンスプロダクト（CFTR）の送達において、アデノウィルス起源のベクターの使用を記述している。
従って、本発明によるベクターの調製に際しては、上述のタイプのベクターを含む任意の適切なRNAまたはDNAベクターを使用することができる。当業者であれば、例えば、サムブルックら（Sambrook et al）｛Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1989｝により記述されている様な公知の遺伝子工学技術により修飾されたベクターを調製することが、可能である。
本発明のウィルス性ベクターは、好ましくは、ニトロレダクターゼをコードする遺伝子に作動可能な状態で連結されたプロモーターを備えている。“作動可能な状態で連結された”とは、プロモーターと酵素をコードする配列とが、コード化配列がプロモーターの制御の下に発現できるような関係で並置していることを意味する。従って、プロモーターにもコード化配列にも由来しない５′非コード化配列の様な要素が、プロモーターとコード化配列との間に存在していても良い。この様な配列は、プロモーターによるコード化配列の正確なコントロールを妨げない限り、ベクター中に含めても良い。適切なプロモーターは、例えば、ミルクタンパク質用プロモーター、CEA遺伝子プロモーター或いはCA-125遺伝子プロモーターの様な組織および腫瘍特異性プロモーターを含む。ミルクタンパク質用プロモーターは、好ましくはヒツジ由来のLHβプロモーター、β-ラクトグロブリン（BLG）プロモーター、α-ラクトアルブミンプロモーターおよび乳漿酸性タンパク質プロモーターを含む。
ベクター中には、天然のほ乳類またはヒトプロモーター配列を含むことが好ましいが、ほ乳類またはヒトの配列に選択的にハイブリッド形成し得る修飾プロモーター配列をベクター中に含んでいても良い。ヒトのプロモーター配列に選択的にハイブリッド形成し得るプロモーター配列は、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば40、60または100或いはそれ以上の連続するヌクレオチド領域にまたがるプロモーター領域またはそのフラグメントに対し、一般に少なくとも70%が、好ましくは少なくとも80%または90%が、より好ましくは少なくとも95%が相同である。
一般に、ベクターからの発現の組織特異性を確保するために、プロモーターのある領域は保持されなければならないが、プロモーターの他の領域は、特異性を著しく損なうことなく、修飾もしくは欠失できることは、当業者には明らかなところである。
ベクターを治療に使用するためには、例えばラムら（上述）が述べている様に、ベクターは、通常ウィルス粒子中にパッケージされ、この粒子が腫瘍部位に送達される。この粒子は、医者が利用できる任意の手段により、腫瘍に送達できる。例えば、非経口的にである。ウィルス粒子は、腫瘍細胞に選択的に感染できることが好ましい。“選択的に感染すること（selectively infecting）”とは、ウィルス粒子が、第一次的に腫瘍細胞に感染し、且つ、治療されている病気の性質を仮定すれば、プロドラッグの投与により非腫瘍細胞の損傷が許容できる程度に低くなる様に、非腫瘍細胞の割合がなっていることを意味する。
１つの好適な投与経路は、滅菌溶液中の粒子を注射することである。
本発明のシステムにおけるニトロレダクターゼは、ニトロレダクターゼ活性を維持しているフラグメントとその相同体を含む。本発明によるニトロレダクターゼは、各種の化合物において、ニトロ基を対応するヒドロキシルアミノ基に還元しうる酵素である。
ニトロレダクターゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号：１（SEQ ID NO:1）に示される配列のオリゴヌクレオチド、そのフラグメント或いはこれとハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドを含む。配列番号：１に示す配列のオリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントにハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドは、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば40、60または100或いはそれ以上の連続するヌクレオチド領域にわたる配列番号：１に示す配列のオリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントに対し、一般に少なくとも70%が、好ましくは少なくとも80または90%が、より好ましくは少なくとも95%が相同である。オリゴヌクレオチドの配列は、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドを欠失するか、少なくとも１つのヌクレオチドを挿入するか或いは少なくとも１つのヌクレオチドを置換することにより、変化させることができる。
オリゴヌクレオチドは、RNA或いはDNAであっても良い。オリゴヌクレオチドフラグメントは、典型的には、少なくとも10、例えば、少なくとも20、30、40、60或いは100ヌクレオチドの長さである。
ベクターによりコード化されるニトロレダクターゼは、好ましくはバクテリアのニトロレダクターゼ、EP-A-540 263に記載されている様な、例えば、分子量が20〜60kDaの範囲のフラビンタンパク質であり、補因子としてNADH或いはNAD(P)H或いはその類似構造体を要求し、１〜100μMの範囲にNADH或いはNAD(P)HのためのKmを有しているニトロレダクターゼである。代表的には、このニトロレダクターゼは、E. Coli.、Salmonella或いはClostridia微生物から得られるものと同じである。
好ましくは、本発明のニトロレダクターゼは、配列番号：２（SEQ ID No:2）の配列を有するニトロレダクターゼ、そのフラグメント或いはその相同体である。
実質的に純粋な形態にある配列番号：２のニトロレダクターゼは、調製物中のタンパクの90%を越えて、例えば、95%,98%或いは99%がSEQ ID No:2のそれであるという、調製物中のタンパクを包含する。
配列番号：２の相同体は、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば40、60または100或いはそれ以上の連続するアミノ酸領域にわたる配列番号：２のタンパクに対し、一般に少なくとも70%が、好ましくは少なくとも80%または90%が、より好ましくは少なくとも95%の相同である。
通常、配列番号：２のフラグメント或いはその相同体は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、例えば20、25、30、40、50または60個のアミノ酸長さである。ポリペプチドの配列は、少なくとも１個のアミノ酸を欠失し、挿入し或いは置換することにより、変わり得る。
本発明のベクターとともに使用されるプロドラッグは、ベクターによりコード化されているニトロレダクターゼにより、細胞毒性薬物に変換され得る化合物である。治療を受けている患者に対するプロドラッグの毒性は、活性薬物に比して、患者に対して少なくとも１オーダー毒性の度合いが低いであろう。細胞毒性薬物は、数オーダー、例えば２、３、４またはそれ以上のオーダーで毒性の度合いが高いことが好ましい。
好適なプロドラッグは、WO93/08288またはEP-A-540263に記載されている様なナイトロジェンマスタード化合物およびその他の化合物である。好ましいプロドラッグは、下記一般式の化合物である：
0003867211.tif 000002
および：
0003867211.tif 000003
（式中、R1およびR2は、化合物R1NH2およびR2OHを細胞毒性化合物とする様な基である。）
化合物R1NH2およびR2OHは、芳香族細胞毒性化合物であることが好ましい。化合物R1NH2は、例えば、p-フェニレンジアミンを基本とする周知のナイトロジェンマスタード化合物の任意の１つであって良い。化合物R1NH2は、
0003867211.tif 000004
或いは一般式IVを有する上記化合物の構造類似体であってもよい；
0003867211.tif 000005
（式中、R′およびR″は、H、FまたはCH3であり、特にR′=HでR″=CH3であるか；
或いはR′：CH3でR″=Hであるか；
或いはR′=HでR″=Fであるか；
或いはR′=FでR″=Hである。）
本発明において使用することができるアミノ細胞毒性化合物の他のタイプは、アクチノマイシンＤおよびマイトマイシンＣの様な化合物である。アクチノマイシンＤおよびマイトマイシンＣから得られるプロドラッグの構造を以下にＶおよびVIIとしてそれぞれ示す。
0003867211.tif 000006
類似のp-ニトロベンジルオキシ誘導体は、他のアクチノマイシンおよび上述のタイプの他の細胞毒性化合物のアミノ置換で、得ることができる。
細胞毒性化合物上のアミノ基でp-ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を形成する以外にも、ヒドロキシ基、特に細胞毒性化合物のフェノール性ヒドロキシ基で、類似の誘導体を得ることができる。この点に関して、フェノール性ナイトロジェンマスタード化合物と一般式VIIIの化合物が注目される：
0003867211.tif 000007
好適なプロドラッグはまた、他の芳香族ニトロ化合物、例えば5-クロロ-2,4-ジニトロベンズアミド、3,5-ジニトロベンズアミド、3-ニトロベンズアミド、4-ニトロベンズアミドおよび5-ニトロ-2-フルフラルデヒドセミカルバゾン（ニトロフラゾン）などを含む。
特に好ましいプロドラッグは、WO93/11099に開示されているCB 1954（5-（アジリジン-1-イル）-2,4-ジニトロベンズアミド）、SN 23862（5-（ビス（2′-クロロエチル）アミノ）-2,4-ジニトロベンズアミド）およびCB 1954またはSN 23862の構造類似体、或いは例えば、デスカルボキサミドCB 1954（1-アジリジン-1-イル-2,4-ジニトロベンズアミド-CB 1837として知られている）、N,N-ジメチルCB 1954（N,N-ジメチル-（5-アジリジン-1-イル）-2,4-ジニトロベンズアミド-CB 10-107として知られている）、CB 10-199、CB 10-200、CB 10-201、CB 10-217、CB 10-021およびCB 10-214である。
0003867211.tif 000008
0003867211.tif 000009
0003867211.tif 000010
本発明によるシステムにおいて使用されるプロドラッグは、通常適当な保護基に結合された細胞毒性薬物からなる。通常、保護基は、本明細書で定義されているニトロレダクターゼにより除去可能であるか、或いは本明細書で定義されているニトロレダクターゼにより他の置換基に変換される。或いは、プロドラッグは、ニトロレダクターゼにより、直接活性体に変換される。CB1954とその構造類似体の場合には、活性形は、2-および4-ヒドロキシルアミノ誘導体の混合物である。これらは、等しい割合でニトロレダクターゼにより形成される（ノックスら（Knox et al）、Biochem. Pharmacol. 44:2297-2301, 1992）。4-ハイドロキシルアミン（5-（アジリジン-1-イル）-4-ハイドロキシルアミノ-2-ニトロベンズアミド）の場合には、これは、アセチル補酵素Ａ、ブチルおよびプロピル補酵素Ａ或いはS-アセチルチオ-コリンとの非酵素性の直接反応により、DNAに結合でき且つ鎖間の架橋を生み出す種となることができる。CB 1954のこの誘導体である最終的に得られるDNA反応性の種は、4-（N-アセトキシ）-5-（アジリジン-1-イル）-2-ニトロベンズアミドであると考えられる（ノックスら（Knox et al）、Biochem. Pharmacol 42:1691-1697, 1991）。SN 23862の場合には、ニトロレダクターゼにより、ただ１個の生成物のみが得られ、これは、2-ハイドロキシルアミンである。このハイドロキシルアミンは、チオエステルとの直接反応により、DNA架橋剤に活性化することができる。
本発明によるシステムのプロドラッグは、化学合成法により製造するのが有利である。例えば、p-ニトロベンジルオキシカルボニル化合物は、化学合成法により製造するのが有利である。たとえば、アミノ或いはヒドロキシ細胞毒性化合物は、塩化水素アクセプター、特にトリエチルアミンのようなアルキルアミンの存在下、無水条件下に4-ニトロベンジルクロロホルメートと反応させることができる。この反応は、クロロホルムの様な乾燥有機溶媒中で行うことができ、生成する化合物は、クロマトグラフィーのような常法により、有機溶媒から単離することができる。
プロドラッグは、本明細書に定義するニトロレダクターゼにより除去或いは修飾され得る適当な基を有していても良く、該基は、不安定であり、“自己崩壊（self immolation）”を起こして細胞毒性薬物を形成する。
本発明のニトロレダクターゼは、多くの基質分子中のニトロ基を還元することができる。本発明者は、ニトロレダクターゼは、細胞毒性化合物の種々のp-ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体のニトロ基を還元する能力の点で特に有用であり、その結果として生成する自己崩壊性化合物は、自動的に分解して細胞毒性の化合物を放出することを見出した。一般に、ニトロレダクターゼはニトロ基を還元し対応するヒドロキシルアミノ基に還元する。
本アプローチの利点は、アミノまたはヒドロキシ置換基、特に芳香族アミノまたはヒドロキシ置換基を有する種々の細胞毒性化合物が、アミノまたはヒドロキシ親化合物よりもかなり細胞毒性の低いアミノまたはヒドロキシ基のp-ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を与えるという点に存する。かくして、上述のタイプのシステムにおいてp-ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体をプロドラッグとして使用することができる。このシステムでは、プロドラッグは、腫瘍細胞中で発現されるポリペプチドの影響下に、抗ガン剤に変換される。
例えば、一般式（Ｉ）
Ｒ1−ＮＨ−ＣＯ．Ｏ−ＣＨ2−Ｐｈ−ＮＯ2  （Ｉ）
［上記式中、Ｐｈはフェニレン環であり、Ｒ1は、
Ｒ1−ＮＨ2が細胞毒性化合物となるような基である。］；及び（ＩＩ）
Ｒ2−Ｏ−ＣＯ．Ｏ−ＣＨ2−Ｐｈ−ＮＯ2  （ＩＩ）
［上記式中、Ｐｈは上記に同じであり、Ｒ2は、
Ｒ2−ＯＨが細胞毒性化合物となるような基である。］で表される化合物は、ＷＯ９３／０８２８８に記載されているイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロレダクターゼを含む、本明細書に定義されるニトロレダクターゼと共に、ＶＤＥＰＴシステムにおけるプロドラッグとして使用できる。本発明は、その定義に関して、式Ｉ又はＩＩの化合物について、プロドラッグに対する該ニトロレダクターゼの作用の正確な様式に依存するものではないが、下記反応式に従い、ｐ−ニトロフェニル−ベンジルオキシ−カルボニル残基のニトロ基が対応するヒドロキシルアミノ基に変換され、生じるｐ−ヒドロキシル−アミノベンジルオキシカルボニル化合物が酵素的還元に使用される反応条件下で自動的に分解して上記細胞毒性化合物を放出し、ｐ−ヒドロキシルアミノベンジルアルコール及び二酸化炭素を副生物として生成するものと信じられている。
0003867211.tif 000011
（マウガー（Mauger）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J.Med.Chem.）１９９４  第３７巻第３４５２〜３４５８頁）
ＶＤＥＰＴにおいて使用するに際し、全てのタイプのプロドラッグは、好ましくは、細胞に入ることができるべきである。従って、例えば、プロドラッグを多かれ少なかれ親油性にする等のプロドラッグにおける修飾を行なっても良い。
本明細書に記載のニトロレダクターゼでプロドラッグの還元を行うには、反応系にコファクター(cofactor）を存在させることが必要である。ニトロレダクターゼは、コファクターとしてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは非常に短い血清半減期を有しているので、血流中での濃度は非常に低い。従って、細胞溶解により血流中に放出された本発明のシステムに従い製造されるニトロレダクターゼは、いずれも、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが存在しないために、循環中のプロドラッグをいずれも活性化することができないであろう。従って、コファクターの存在又は不存在が、ＶＤＥＰＴシステムの選択性をより大きいものとし、そのためプロドラッグが細胞内のみで活性化される。
ＶＤＥＰＴにおいて、プロドラッグは、通常、ニトロレダクターゼをコードする修飾されたウィルス(modified virus)の投与に続いて投与される。典型的には、該ウィルスが患者に投与され、次いで、感染された細胞による該ウィルスの取り込み(uptake)が、例えば、標的組織のバイオプシーサンプルの回収及び分析により、モニターされる。
ＶＤＥＰＴのための正確な投与レジーム(regime)は、勿論、個々の臨床医により個々の患者について決定される必要があり、これは、一方で、プロドラッグ及び該プロドラッグから放出される細胞毒性化合物の正確な性質によりコントロールされるであろうが、或る一般的な指針を与えることができる。この種の化学療法は、通例、プロドラッグ及び修飾されたウィルスの双方の非経口的投与を包含し、静脈内経路による投与が、最も実用的であることがしばしば見い出される。
本発明のシステムのベクターは、動物及びヒトに対して、治療されるべき症状に適した経路のいずれによっても投与することができ、適した経路としては、経口、直腸、経鼻、局所（バッカル(buccal)及び舌下を含む）、膣及び非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内(intrathecal)及び硬膜上(epidural)）の投与を包含する。好ましい経路は、例えば、レシピエント(recipient)の状態により変わり得ることが認識されるであろう。
上記した有用性及び適用のそれぞれについて、個々の有効成分の必要量は、数多くのファクター、例えば、治療すべき状態の重篤度及びレシピエントのアイデンティティ等に依存し、究極的には付き添う医師の裁量によるであろう。しかしながら、一般には、これら有用性及び適用のそれぞれについては、適当な有効投与量は、１日当たり、レシピエントの体重１ｋｇ当たり、１μｇ〜１０ｇの範囲、好ましくは１日当たり、体重１ｋｇ当たり、０．０１〜１００ｍｇの範囲、最も好ましくは１日当たり、体重１ｋｇ当たり、０．１〜１０ｍｇの範囲である。必要ならば、該投与量は、１日において適当な間隔で投与される２、３、４又はそれ以上のサブドーズとして与えても良い。これらサブドーズは、例えば、単位投与形態当たり、１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ、最も好ましくは０．１〜１０ｍｇの有効成分を含む単位投与形態で投与することができる。
化合物を単独で投与することもできるが、それらを医薬製剤として与えることが好ましい。本発明の製剤は、上記した有効成分の少なくとも１種を、一又はそれ以上の許容されるその担体及び必要に応じて他の治療成分と共に含むものである。該担体は、該製剤の他の成分に対する適合性を有し、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。
製剤は、経口、直腸、鼻、局所（バッカル及び舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内、硬膜上）投与に適したものを包含する。該製剤は、単位投与形態で提供されるのが便利であり得、調剤分野で周知の方法のいずれによっても調製することができる。かかる方法は、有効成分を、一又はそれ以上の補助的成分(accessory ingredients)を構成する担体と混合する工程を含む。一般に、該製剤は、有効成分を液体担体又は微細な固体担体又は両者と均一に且つ完全に混合し、次いで、必要に応じて生成物を成形することにより、製造される。
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ予め定められた量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤(cachets)又は錠剤のような独立した単位として；散剤又は顆粒剤として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油形液体エマルジョン又は油中水形液体エマルジョンとして提供されても良い。有効成分は、大型丸剤(bolus)、舐剤又はパスタ剤として提供されても良い。
錠剤は、必要に応じて一又はそれ以上の補助的成分と共に、圧縮又はモールディングにより製造できる。圧縮錠剤は、適当な装置中で、粉末又は顆粒のようなさらさらした形態の有効成分を、必要に応じてバインダー（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤と混合して、圧縮することにより製造することができる。すり込み錠剤(moulded  tablet)は、適当な装置中で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物をモールディングすることにより製造できる。錠剤は、必要に応じて、被覆し又は刻み目をつけて、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを変化する比率で用いて所望の放出プロフィールを付与し、中の有効成分の徐放性又は制御された放出性を付与するように製剤化することもできる。
製剤は、有効成分を例えば０．０７５〜２０％ｗ／ｗ、好ましくは０．２〜１５％ｗ／ｗ、最も好ましくは０．５〜１０％ｗ／ｗの量で含有する局所用軟膏又はクリームとして適用することもできる。軟膏に製剤化する場合、有効成分は、パラフィン性又は水混和性軟膏基剤と共に使用すればよい。或いは、有効成分は、水中油形クリーム基剤を用いてクリームに製剤化しても良い。
目への局所投与に適した製剤には、有効成分が適当な担体、特に有効成分用の水性溶媒の中に溶解もしくは懸濁している点眼剤もまた含まれる。有効成分は、好ましくは、そのような製剤中に、０．５〜２０重量％、有利には０．５〜１０重量％、特に約１．５重量％の濃度で存在する。
口中への局所投与に適した製剤には、矯味基剤、通常ショ糖およびアラビアゴムもしくはトラガント中に有効成分を有するトローチ剤；ゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に有効成分を有する錠剤；及び適当な液体の担体中に有効成分を有する口内洗剤が含まれる。
直腸投与用の製剤形態は、例えばカカオ脂またはサリチレートを有する適当な基剤を用いた坐剤として与えられる。
担体が固体である鼻投与に適当な製剤は、例えば２０から５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗末を含む。該粗末は吹入剤で摂取される方法、すなわち鼻の非常に近くに保持された粉末の容器から鼻道を通じた迅速な吸入によって投与される。担体が液体である、例えば点鼻スプレーまたは点鼻剤のような投与に適した製剤は、有効成分の水性または油性溶液が含まれる。
膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当業界で適切なものとして知られている担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレーとして与えられる。
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象のレシピエントの血液との等張化する溶質を含んでいても良い水性及び非水性滅菌注射液；及び懸濁化剤および濃稠化剤を含んでいても良い水性及び非水性滅菌懸濁液、及び化合物を血液成分または１もしくはそれ以上の器官にターゲッティングするように計画されているリポソームまたは他の微粒子システムを含む。該製剤は、例えば封をされたアンプルおよびバイアルといった単一用量もしくは多用量の容器中に与えられてもよく、使用する直前に、例えば注射用水のような滅菌液体担体の添加のみを要する、凍結乾燥された条件下で貯蔵されてもよい。注射溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から即座に調製されてもよい。
好ましい単位用量の製剤は、上記で記載したような、一日の用量または単位、一日のサブ−ドーズ(sub-dose)、または有効成分の適切な画分を含むものである。
この発明の製剤には、上記で特に述べられた成分に加えて、問題の製剤のタイプに関係を有する技術分野において、慣用されている他の物質（例えば、経口投与に適するものとして、矯味矯臭剤が含まれる）が含まれていてもよいと理解されるべきである。
本発明のシステムのプロドラッグは、また、ここで述べられる任意の手段により、ここで述べられる任意の製剤及びここで述べられる用量割合で動物またはヒトに投与されてもよい。
本発明のシステムで治療され得る腫瘍の例としては、例えば、骨原性及び軟部組織肉腫を含む肉腫(sarcomas)、癌腫、例えば乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌及び卵巣癌、ホジキン(Hodgkin)及び非ホジキン・リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、及び急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、神経膠腫、網膜芽細胞腫が挙げられる。
更に、本発明の更なる態様によれば、患者に投与される前に、ウイルスベクターが、例えば線維芽細胞のような細胞に組み込まれる。遺伝子は、例えばリン酸カルシウムまたはエレクトロポレーションのような基本技術を用いて細胞内に導入されてもよい。この場合、標的化は、ＤＮＡを合成するこれらの細胞へのウイルス挿入の制限によって達成される。また、標的化は特定の腫瘍に対する抗体を用いることにより達成されると考えられる。抗体指向性酵素プロドラッグ治療(Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy)とは異なり、抗体がインターナライズ(internalised)されるであろう。しかし、ウイロソームの性質は、次にそれらが細胞核に向けて標的化され、挿入に通常関連した分画化及び分解が回避され、るようなものである。
本発明のシステムは、正常な組織、例えば乳房組織、特に”乳癌遺伝子”を有すると示されている女性の正常組織を削摩するために、または正常組織の成長に関する研究（薬理遺伝学(pharmacogenics)）用に動物の特定の正常細胞を削摩するために用いることができる。
ニトロレダクターゼにより活性型に変換する、本発明のシステムのプロドラッグは、循環細胞(cycling cells)に対してと同様に非循環細胞(non-cycling cells)に対して細胞毒性である。
本発明は、以下の実施例により、例証される。
実施例１
Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼの存在下での、Ｖ７９細胞の生存に対するＣＢ  １９５４の影響を表Ｉに示す。全ての処理は、３７℃で２時間行われ、次いで細胞は、生じたそれらのコロニー形成能力を求めるために外で培養された(Plated out)。ＮＡＤＨは、両酵素の補因子として用いられた。
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実施例２
Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼの存在下での、Ｖ７９細胞の生存に対するＳＮ２３８６２の影響。全ての処理は３７℃で２時間行われ、次いで細胞は生じたそれらのコロニー形成能力を求めるために外で培養された。ニトロレダクターゼ濃度は２μｇ／ｍｌであり、ＮＡＤＨが補因子として用いられた。初めの細胞密度は、２×１０5／ｍｌであった。
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実施例３
アクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）のＮ−４−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体に対するＮＲの作用による細胞毒性の生成
種々の濃度のプロドラッグを、ＰＢＳ中、Ｖ７９細胞（２×１０5／ｍＬ）１ｍＬ、ＮＡＤＨ（５００μＬ）及びＮＲ（２、５又は１０μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。３７℃で２時間後、細胞を回収してコロニー形成能力を測定した。結果をＦｉｇ．１に示す。これから、プロドラッグの細胞毒性はＮＲの存在下で非常に増強し、また該酵素の濃度に依存することが分かる。
実施例４
ニトロレダクターゼが導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＣＢ  １９５４の細胞毒性
大量に感染された、非選択細胞の集団が有効に死滅したという観察によって示唆されるように、第三者効果(bystander effect)が、３Ｔ３−ＮＴＲ１４細胞が非形質導入ＮＩＨ３Ｔ３細胞と混合された際に見られた。Ｆｉｇ．２は3Ｈ−チミジンの取り込みの９０％阻害（１０％減少／分として示される）が、５０％のみ形質導入された細胞で達成されたことを示す。
実施例５
ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４とチミジンキナーゼ／ガンシクロビア(ganciclovir)酵素／プロドラッグシステムとの比較
細胞は、細胞毒性ＧＣＶトリホスフェートのＤＮＡへの組込みのためにＳ期でなくてはならず、一方、架橋剤として働く活性化ＣＢ  １９５４は、細胞障害作用のために、活性な細胞分裂を要求する。実際、血清欠乏によるＮＴＲ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の同様の停止は、ＣＢ  １９５４によるそれらの死滅に、全く影響しない（Ｆｉｇ．３ａ）一方、ＴＫ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の同様な停止がＧＣＶ死滅を防げる（Ｆｉｇ．３ｂ）。
実施例６
胸上皮細胞(Breast Epithelial Cells)におけるニトロレダクターゼ（ＮＲ）のインビトロ発現
ａ）ニトロレダクターゼのクローニング
２種のプライマーを、パブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービス(Public Health Laboratory Service)(PHLS)により供給され、ＮＴＲ１００３と名付けられたプラスミドからのコード化領域を増幅するために使用した。
センスプライマーは：
5'CGCAAAAAAGCTTTCACATTGAGTCATTATGG3'
である。
これは、ＨｉｎｄIII部位を加え、上流のＡＴＧを破壊し、哺乳動物細胞の翻訳開始部位を改良するためにデザインされた。
アンチセンスプライマーは：
5'CGGCAAGGGATCCTTACACTTCGGTTAAGGTGATG3'
である。
これは、ＢａｍＨＩ部位を付加するようデザインされた。コード化領域は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて増幅し、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片は、方向性をもってｐＲＥＰ８（インビトロージェン(Invitrogen)）にクローン化した。正確な制限地図を有するクローンが、ＲＳＶエンハンサー領域から配列され、クローンの５’末端が正確であり、デザインしたＮＲＲ８／３であることを確認した。ｐＲＥＰ８およびｐＮＲＲ８／３は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＦＲ−３４３（ニトロレダクターゼ欠損）にトランスフェクトされ、アンピシリン耐性コロニーがアッセイのために選択された。ｐＲＥＰ８およびｐＲ８ＮＲが”キアジェン(Qiagen)”試薬を用いて哺乳動物細胞にトランスフェクトするために精製された。
ｂ）上皮細胞中でのニトロレダクターゼの発現
ＨＢ４ａ、ＳＶ４０で条件付きで不死化したヒト胸（内腔(lumenal)）細胞株がリン酸カルシウム沈殿を用いｐＲＥＰ８およびｐＮＲＲ８／３でトランスフェクトされ、安定なトランスフェクト体(transfectant)が１ｍＭヒスチジノール下に選択された。各プラスミドの５０−６０の薬物耐性コロニーが得られ、該コロニーは次いでプールされ、連続的に選択下に維持された。
ＨＢ４ａ／ＲＥＰ８およびＨＢ４ａ／ＮＲのプールされた集団は広げられ、ニトロレダクターゼ蛋白発現について調べられた。ウサギポリクローナル抗体、ｒｂ  ６ｓ４／ｎｔｒを用いた全細胞ライゼートのイムノブロッティングは、ＨＢ４ａ／ＮＲが、組換えＥ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ蛋白と比べて適当な重量にバンドを有する多量のニトロレダクターゼ蛋白を発現することを示した（Ｆｉｇ．４）。
予期されたように、ＨＢ４ａ／ＲＥＰ８はニトロレダクターゼ蛋白を全く発現しなかった。
ｃ）ＣＢ１９５４の酵素的還元
ＣＢ１９５４（１００μＭ）及びＮＡＤＨ（５００μＭ）を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中、３７℃で音波処理により調製された細胞ライゼート（２５０μｌ、１ｍｇ／ｍＬ蛋白）とともにインキュベートした。数回アリコート（１０μｌ）をＰａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＣＸ（１１０×４．７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、１％（ｖ／ｖ）メタノール中の５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4で無勾配的に溶出（２ｍｌ／ｍｉｎ）した。溶出液をダイオード−アレー検出器(diode-array detector)を用いて２６０、３１０、３４０ｎｍでの吸収を連続的にモーターした。或いは、［Ｕ−3Ｈ］ＣＢ１９５４を加えて、１ｎｍｏｌｅ当たり１．６×１０5ｄｐｍの活性を得た。サンプル（０．３ｍｌ）は集められ、そのトリチウム活性が液体シンチレーションカウンティングにより測定された。蛋白濃度は標準法（バイオラド(Biorad)）により測定され、ウシアルブミンに対して校正された。
ｄ）生存細胞の測定
細胞をトリプシン処理し、新鮮な培地中、１ｍＬ当たり２×１０5細胞で再懸濁した。それらは、次いでＣＢ１９５４（ＤＭＳＯ中の適当なストック１０μｌ）で２時間処理された。処理された細胞は、次いでスピンダウンし（spun down)、新鮮な培地で洗浄され、各種濃度で３つの部分に分けて外で培養した(plated out)。細胞は、５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃で１４日間インキュベートした後、固定及び染色された。
ｅ）ＨＯＳＰＩＰ細胞中での発現
上記の修飾された遺伝子をｐＲＥＰ４ベクターおよびｐＲＥＰ８ベクターに連結した。ＲＳＶ  ＬＴＲからの高レベルの構成的転写を有するこれら２つのベクターは、組換え蛋白の共発現(coexpression)のための各々選択可能なマーカーであるハイグロマイシン及びヒスチジノールを有する。これら両方の構造物は、リン酸カルシウム技術によりラット乳癌細胞株ＨＯＳＰＩＰにトランスフェクトされ、現在耐性クローンを単離するための適当な選択条件下にある。
ｆ）ＤＮＡインターストランド架橋の測定
ＨＢ４ａ／ＮＲ細胞を［3ｈ］チミジン中４８時間培養することにより放射標識した。細胞は、次いで０、１０または５０μＭのＣＢ１９５４で２４時間処理し、次いでそのＤＮＡをアルカリ性シュクロース中での沈降により分析した。
結果
ＣＢ１９５４の酵素的還元
ＨＢａ／ＲＥＰ８細胞ではなく、ＨＢ４ａ／ＮＲ細胞はＣＢ  １９５４濃度の時間依存性の減少を示した（Ｆｉｇ．５）。痕跡量の測定も、ＣＢ  １９５４の２−および４−ヒドロキシルアミノ還元産物の形成を示した。これは、放射標識されたプロドラッグの使用により確認された（Ｆｉｇ．６）。純粋な蛋白質と比較することにより、アッセイ混合物中のＨＢ４ａ／ＮＲライゼートの蛋白濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬと測定され、酵素活性は０．０５μｇ／ｍＬと評価された（Ｆｉｇ．５及びＦｉｇ．６参照）。従って、ＮＲ活性は１．７μｇ／ｍｇ細胞蛋白（〜１．７μｇ／１０6細胞）である。
生存細胞
ＨＢ４ａ／ＮＲおよびＨＢ４ａ／ＲＥＰ８細胞株の平板効率は不十分であり、高い初期細胞密度（ディッシュ当たり１×１０4）でプレート培養したときのみ細胞は成長した。これらのプレートは、細胞成長を肉眼により評価した。結果を表IIIに示す。２つの細胞株の間に劇的な細胞生存の相違がある。２時間の曝露の後、ＨＢ４ａ／ＮＲ株は１．０μＭで細胞毒性を示す一方、ＨＢ４ａ／ＲＥＰ８株は、
＞１００μＭの用量まで細胞毒性を示さなかった。
ＤＮＡ架橋形成
ＨＢ４ａ／ＮＲ細胞中でのＣＢ  １９５４の細胞毒性がその酵素的還元によることの確認は、この化合物がＤＮＡインターストランド架橋を形成する能力を示すことにより得られる（Ｆｉｇ．７）。ＣＢ１９５４の増加する量は、アルカリ性シュクロースグラジエント（沈降は左から右である）にさらに沈降する高分子量ＤＮＡの増加する比率により示される架橋されたＤＮＡ量の連続的増加を生み出す（Ｆｉｇ．７）。ＤＮＡ鎖の破損（自由な切断またはアルカリ性に不安定な部位）もまた観察され、明瞭のため、沈降プロフィールが、鎖切断された実験的ＤＮＡと同じ分子量のモデル化されたコントロールに関して示された。１０μＭのＣＢ１９５４は、１０9ダルトンのＤＮＡ当たり約６の架橋と２５の切断を生み出す。一方、５０μＭのＣＢ  １９５４は、１２の架橋と２８の切断を生み出す。これらの効果は未処理の細胞中では見られなかった。
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配列表
（1）一般的情報
（i）出願人
（A）名称：キャンサー リサーチ キャンペーン テクノロジー リミテッド
（B）ストリート：ケンブリッジ ハウス
（C）シティ：ケンブリッジ テラス 6-10
（D）ステート：リージェンツ パーク
（E）カントリー：ロンドン
（F）郵便番号：エヌダブリュ1 4ジェイエル
（ii）発明の名称：癌治療に関する改良
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター リーダブル フォーム：
適用できない
（v）現在の出願データ：
適用できない
（2）配列番号：１の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：１１６７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vi）起源：
（A）生物名：Escherichia coli
（B）株名：Ｂ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）位置：１７６．．８２９
（xi）配列：配列番号：１：
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（2）配列番号：２の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：２１７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質(protein)
（xi）配列：配列番号：２：
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
0003867211.tif 000025
【図６】
0003867211.tif 000026
【図７】
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