(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養培地中で哺乳類宿主細胞を培養する工程を含む、培養培地中での哺乳類宿主細胞の調節増殖方法であって、ここに該宿主細胞は
（i）発現がリプレッサー結合領域で調節される、プロモーター配列に発現的に結合した、該培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ii）誘導プロモーター配列に発現的に結合した、リプレッサー結合領域と結合するリプレッサー分子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、
を含む方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が、
（iii）所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドを製造するための、第二の誘導プロモーター配列に発現的に結合した所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列、
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一および第二の誘導プロモーター配列が同一であり、該培養工程が、該宿主細胞を培養して所望の細胞密集体とする第一工程、および該第一と第二誘導プロモーター配列のインデューサーの存在下に該宿主細胞を培養する第二工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該リプレッサー結合領域がｌａｃオペレーター配列であり、そしてリプレッサー分子をコードしている該少なくとも１つのＤＮＡ配列がｌａｃリプレッサーをコードしている、請求項１乃至３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
第一および第二の誘導プロモーター配列が、ヒトのメタロチオネインIIＡプロモーター並びに修飾されたヒトのメタロチオネインIIＡプロモーター、Ｍ（１）２及びＭ（２）６より成る群から選ばれる、請求項１乃至４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞がメタロチオネインをコードするＤＮＡ配列をさらに含みそして発現する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドを回収する工程を更に含む、請求項２乃至６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列が、インスリン、修飾インスリン、インスリン様増殖因子、サイトカイン、分裂促進プロテアーゼ及びそれらの混合物より成る群から選ばれる増殖因子をコードする、請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列がインスリン又はインスリン様増殖因子をコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列がインスリン又はインスリン様増殖因子およびトランスフェリンをコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
培養培地が蛋白／血清不含培地である、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類宿主細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
（i）発現がリプレッサー結合領域で調節される、プロモーター配列に発現的に結合した、蛋白／血清不含の培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ii）誘導プロモーター配列に発現的に結合した、リプレッサー結合領域と結合するリプレッサー分子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列、
を含む宿主細胞。
【請求項１５】
（iii）第二の誘導プロモーター配列に発現的に結合した所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列、
をさらに含み、かつ第一と第二の誘導プロモーター配列は同一であっても異なっていてもよい、請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
第一と第二の誘導プロモーター配列が同一である、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
該リプレッサー結合領域がｌａｃオペレーター配列であり、リプレッサー分子をコードする該少なくとも１つのＤＮＡ配列がｌａｃリプレッサーをコードしている、請求項１４乃至１６のいずれか一項記記載の宿主細胞。
【請求項１８】
第一と第二の誘導プロモーター配列が、ヒトメタロチオネインIIＡプロモーター並びに修飾ヒトメタロチオネインIIＡプロモーター、Ｍ（１）２及びＭ（２）６より成る群から選ばれたものである、請求項１４乃至１７のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が、メタロチオネインをコードするＤＮＡ配列をさらに含有し発現する、請求項１８記載の宿主細胞。
【請求項２０】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列が、インスリン、修飾インスリン、インスリン様増殖因子、サイトカイン、分裂促進プロテアーゼ、及びそれらの混合物より成る群から選ばれた増殖因子をコードする、請求項１４乃至１９のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項２１】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列が、インスリン又はインスリン様増殖因子をコードする、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子をコードするＤＮＡ配列が、インスリン又はインスリン様増殖因子およびトランスフェリンをコードする、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２３】
哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１４乃至２２のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項２４】
哺乳動物宿主細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項１４乃至２３のいずれか一項記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
この発明は、哺乳類細胞培養を用いて組換えバイオ医薬品並びに所望の蛋白、ポリペプチド及びペプチドの生産方法に関するものである。具体的には、この発明の方法は、低コストの培地中で複合蛋白を生成するための特に生物工学処理された哺乳類の細胞系の使用に関わる。これらの細胞系はそれ自身の増殖因子必須物のすべてを供給する細胞と共に、安価で再生可能で良く定義された無蛋白培地中における自律的かつ調節性の増殖のための後天的能力をもっている。
哺乳類細胞は多くの新規な医薬、特に細菌細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングを必要とする組換え蛋白の生産のための選り抜きの宿主細胞となってきている。そういった細胞の生産コストは、細菌細胞におけるよりも遙かに高く、発酵コストにおいては全生産コストの約３０％にも達する。発酵の増殖期や又しばしば生産期において血清源を使用せなばならぬ事が、発酵を高コストのものとしている要素の一つである。
発酵培地において添加血清や増殖因子が不要となれば、培地のコストはかなり安くなるであろう。加えてまた、添加血清や増殖因子を含まない培地は、如何なるウイルスその他の汚染物質をも含まないであろう。更に発現蛋白の純度は最大となり、したがって精製段階での工程を最小とし回収収率を最大とすることになる。これは、細菌細胞宿主による多大のコスト利益を有しつつ哺乳類宿主細胞中での複合処理蛋白の生産を可能とするであろう。さらに、将来何年かのうちに、商業的および法規的圧力は、哺乳類細胞から誘導された組換え蛋白の生産におけるそのような純度に対する要件を厳しく規制するであろう。
さらには、一段と厳格な検査による血清の価格上昇のために、よく定義された培地において増殖可能な細胞系の開発が大いに要望されている。実際にも、ＣＨＯ−Ｋ１（Mendiaz, E., et al., 1986）を含む無血清培地（Banes & Sato, 1980）での培養細胞の増殖のために多くの方法が開発されてきた。血清不存在下における増殖の保持をうたった培地は、商業的に入手可能である。これらは、培養物中の細胞による血清の必要性は、各タイプの細胞に特異的な増殖因子の結合による置換えが可能であるという事実に基づいている。これらの培地の中のどれが増殖をいつまでも保持できるかは、まだ明かでない。もっと最近になってＣＨＯ−Ｋ１細胞が、無血清培地中での高レベルの蛋白発現に用いられている（Ogata, M., et al., 1993）が、この細胞は増殖期には血清で保持され、そして増殖因子は生産期に無血清培地へ添加されるのである。このシステムでは生産物の回収は極めて容易であるが、コストを含め、蛋白／血清不含の増殖培地を所望のものとするような上記の他の因子は、このやりかたでは満たされない。
オーストラリア特許明細書Ｎｏ．２２１２０／８８（Genentech, Inc.）は、無蛋白培地中で自律的に増殖する生物工学的に処理されたＣＨＯ細胞での試みを記載している。インスリン、トランスフェリン及び所望の蛋白生成物をコード化する遺伝子をもったこれらの細胞が、血清の不存在下で連続的に増殖できるか否かは明かでない。またこれらの細胞が、満足すべきレベルで所望の蛋白生成物を発現できるか否かも明かでない。さらには、もしもＣＨＯ細胞のような細胞が、増殖因子を構成的に生産するように生物工学的処理を施されたならば、細胞分裂をひきおこすマイトジェン剤が常に存在する事になって細胞の無制御的増殖がおこるであろう。すなわち発酵という状況においては細胞数は無制御的に増大し、付着細胞培養の場合は細胞の多層化をおこし、自己免疫化した又はフロック成長した細胞の場合は分裂が継続してフロックの中心の細胞は嫌気性かつ壊死性となるであろう。懸濁培養の場合は細胞密度は、細胞と培養の代謝と生存度にマイナスの効果をもつ毒性の代謝副生物が増大するように増大するであろう。
かくて本発明者らは、低コストの蛋白／血清不含培地での自律的かつ調節的増殖のために生物工学的処理された哺乳類細胞系を用いる組換え蛋白の製造方法を確認し開発したのである。
本発明の第一の態様は、哺乳類宿主細胞を培養培地で培養する工程を含む所望の組換え蛋白、ポリペプチド又はペプチドの製造方法であって、ここに該宿主細胞は
（ｉ）第一の誘導プロモーター配列に発現可能的に結合した所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；
（ｉｉ）リプレッサー結合領域で発現が調節されているプロモーター配列に発現可能的に結合した、該培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ｉｉｉ）第二の誘導プロモーター配列に発現可能的に結合したリプレッサー結合領域と結合したリプレッサー分子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列を含み、第一と第二の誘導プロモーター配列は同一であっても異なっていてもよい。
本発明は、蛋白／血清不含有培地での増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子が生産可能な宿主細胞を用いることによって、低コストで蛋白／血清不含培地の使用を可能とするものである。従って本発明の方法で用いる培養培地は好ましくは血清を含まないか、又は特定タイプの宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子を含まないものである。しかしながら、培養培地が１つ以上の要求増殖因子を含み、そして宿主細胞自体が１つ以上の上記因子及び／または他の要求増殖因子を発現するような方法もまた本発明の範囲に属すると考えられるべきである。
宿主細胞の増殖に要求される蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードするＤＮＡ配列を、調節されたプロモータ−と発現可能的に結合することによって、因子の生成が増殖を必要とする培養期だけに限定されるように、蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド増殖因子の発現を制御可能的に調節できる。制御可能な調節は、転写調節配列（例えば哺乳類のために修飾されたｌａｃリプレッサー／オペレーター系からのようなリプレッサー結合領域；Hu and Davidson, 1987, and Kozak, 1986）を含めることにより得られる。そのような転写調節配列は、第二のプロモーターからの発現に調節的効果を発揮できるような如何なる位置にあってもよい。例えば転写調節配列は、ＴＡＴＡＡボックスと転写開始部位の間にあっても、又は転写開始部位とＡＵＧ開始コドンの間にあってもよい。
したがって、培養方法は、培養を行って所望の細胞集合とする第一段階、及び、レプレッサーの存在下に培養する第二段階を含むものであってもよい。
しかしながら宿主細胞は、誘導プロモーター配列で発現が調節されるようなリプレッサーをコードするＤＮＡ配列を更に含んでいるので、培養方法は所望の細胞集合とする第一段階の培養と第二の誘導プロモーターの存在下での第二段階の培養を含むことが好ましい。従ってインデューサーは宿主細胞培養に添加または使用され、それによりリプレッサーの発現とそれに続いての増殖因子生産のダウンレギュレーションが行われる。
リプレッサーの発現制御に使ったのと同じ誘導プロモーターの使用により所望の組換え蛋白又はペプチドの発現を制御することは特に好ましい。この場合は、インデューサーの添加や使用は、増殖因子生産のダウンレギュレーションや所望蛋白またはペプチドの同時発現を招くであろう。これは、培地を変える必要がないという効率的な方法を可能とし、宿主細胞培養は最小の蛋白生産と共に増殖し、次いで蛋白生成の時点では細胞増殖は最小となる。増殖と蛋白生成期の効果的な分離はまた、もしも特別な成分（例えば別の糖類など）が生成物の中へ優先的に取り込まれるような場合には望ましいことである。
また、別の誘導プロモーターを使用すれば、相対的発現レベルの精密制御を行うことができる。
宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチドおよび／又はペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列に発現可能的に結合するプロモーターは、好ましくはレプレッサー結合領域を含む構成的プロモーター（例えばＣＭＶやＳＶ４０プロモーター）である。
哺乳類の宿主細胞は、組換え蛋白又はペプチドの発現技術で通常用いられる細胞の如何なるものであってもよい。例えば宿主細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１のようなチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。
導入されたＤＮＡ配列はプラスミド上に存在してもよいし、又は（例えば相同的組換えにより）宿主細胞の染色体の中へ組み込まれてもよい。
宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードするＤＮＡ配列は、インスリン、修飾インスリン（例えば安定性を増大させるためのもの；Brems, D. N., et al., 1992ほか参照）、インスリン様の増殖因子（例えばＩＧＦ−１）、トランスフェリン、増殖因子から誘導された血小板（ＰＤＧＦ）、サイトカイン、分裂促進（mitogenic）プロテアーゼ（例えばトリプシン、トロンビン及びカテプシンＩ）、それ以外の増殖因子、ならびにそれらの混合物から選ぶことができる。宿主細胞がＣＨＯの場合に宿主細胞は、インスリン、インスリン様増殖因子およびトランスフェリンをコードするＤＮＡ配列を含んでいることが望ましい。
第二の態様において、本発明は第一の態様の方法で使用する宿主細胞を提供する。ここに該宿主細胞は
（ｉ）第一の誘導プロモーター配列に発現可能的に結合した所望の蛋白、ポリペプチド又はペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；
（ｉｉ）リプレッサー結合領域で発現が調節されているプロモーター配列に発現可能的に結合した宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ｉｉｉ）第二の誘導プロモーター配列に発現可能的に結合したリプレッサー結合領域に結合したリプレッサー分子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列を含んでおり、ここに第一と第二の誘導プロモーター配列は同一であっても異なっていてもよい。
低コストの蛋白／血清不含培地中で自律的および調節的増殖が可能な宿主細胞は、例えばウイルスの生産のような他の応用に対してもまた有用である。
第三の態様の実施態様において、本発明は次を提供する。すなわち、培養培地中で哺乳類宿主細胞を培養することを含む培養培地中での哺乳類宿主細胞の調節増殖方法であって、ここに該宿主細胞は
（ｉ）発現がリプレッサー結合領域で調節されるようにプロモーター配列に発現的に結合した該培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ｉｉ）導入プロモーター配列に発現的に結合したリプレッサー結合領域と結合したリプレッサー分子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むものである。
第四の態様において、本発明は次を提供する。すなわち、転写調節配列で調節され及び／または誘導可能なプロモーター配列と発現的に結合した蛋白／血清不含培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチド因子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列を含んだ宿主細胞である。
この第四の態様の好ましい実施態様において、本発明は次を提供する。すなわち、（ｉ）発現がリプレッサー結合領域鰯節されているプロモーター配列に発現的に結合した蛋白／血清不含の培養培地中の宿主細胞の増殖に必要な蛋白、ポリペプチド及び／またはペプチドをコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列；並びに
（ｉｉ）誘導可能プロモーター配列に発現的に結合したリプレッサー結合領域と結合するリプレッサー分子をコードする少なくとも１つの導入ＤＮＡ配列
を含む宿主細胞である。
研究所は、細胞が蛋白／血清不含培地に必要な増殖因子をコードしたＤＮＡ配列を含んでいるような細胞系の標品（例えば冷凍貯蔵品）を便利に入手できるであろう。次いでその標品は、所望の蛋白、ポリペプチド及び／若しくはペプチドをコードした（又はウイルスで感染させた）ＤＮＡ配列を含むように形質転換され、定義された蛋白／血清不含培地を充分な数と充分な増殖率となるまで、いかなる添加蛋白もなしに培養することができる。
さて本発明を、以下の非限定的な例により、そして添付の図面を参照して、更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１はＵＮＳＷＳＦ培地＋ＩＳ中のＣＨＯ／ＣＭＴＶｆ細胞の成長を図式的に示す。５×１０５個のＣＨＯ／ＣＭＴＶｆ細胞を１０ｃｍ平板の中で平板培養し、培地＋１０％胎牛血清（ＦＣＳ）の中で２４時間成長させた。培地をＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地（ＳＦ）または培地＋１０％ＦＣＳ（ＦＣＳ）で置換し、細胞を８日間そのまま成長させた。２日、５日および８日後に生存する細胞の数を血球計数器中の細胞を計数することにより測定した。トランスフェクションされなかったＣＨＯ細胞を対照として使用した。ＵＮＳＷＳＦ培地はＤＭＥＭ／ＣＯＯＮＳＦ１２（Bridges, M., PhD Thesis, 1995）の１：１の比の混合物から製造された、蛋白質を含まない培地である。＋ＩＳおよび時には＋ＩＴＳは１リットル当たり１０ｍｇのインスリン、Ｉ；１リットル当たり１０ｍｇのトランスフェリン、Ｔ；セレン、Ｓ、２×１０−８モル、Ｍの亜セレン酸ナトリウムの存在を指示する。
図２はＵＮＳＷＳＦ培地＋ＴＳ中のＣＨＯ／ＣＭＶＩＧＦ−１細胞の成長を図式的に示す。ＣＨＯ／ＣＭＶＩＧＦ−１の３種のクローン単離体からの細胞を５×１０４個の細胞／１０ｃｍ平板の濃度で平板培養し、培地＋１０％ＦＣＳの中で２４時間成長させた。培地をＵＮＳＷ＋ＩＳ培地（ＳＦ）または培地＋１０％ＦＣＳ（ＦＣＳ）で置換し、細胞を６日間そのまま成長させた。２日、４日および６日後に、生存細胞の数をトリパンブルー排除法により測定した。各時間点で二重の平板を使用しそして細胞の平均数を培養日数に対してプロットする。インスリン（Ｉ）、トランスフェンリン（Ｔ）およびセレン（Ｓ）の濃度は図１と同じであった。
図３はヒツジ抗−ヒトトランスフェリン一次およびアルカリ性ホスファターゼ−共役ロバ抗−ヒツジ二次抗体を使用して行われた、ＣＨＯＳＶＬＴｆ細胞のならし培地のウェスタンブロット分析である。レーン１は、トランスフェクションされなかった親ＣＨＯ細胞からのならし培地；レーン２は、バルクＣＨＯＳＶＬＴｆ細胞からのならし培地；レーン３は、トランスフェリン標準（１μｇ／ｍｌ）。
図４Ａは培地中のＣＨＯ−Ｋ１細胞の長期にわたる成長に対する規定された培地に加えられたトランスフェリンの影響を図示的に示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地またはＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳ培地を含有するスピナーフラスコ中に接種した。各時間点に関する４回の合計細胞計数および生存細胞計数の平均を培養時間に対してプロットした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞はＵＮＳＷＳＦ＋ＴＳ培地中では２４時間のそしてＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地中では３０時間の倍加時間を有していた。
図４ＢはＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地中で２５０時間成長させた後の合計細胞数および生存細胞数を示す。レーン１は、ＣＨＯＳＶＬＴｆ細胞；レーン２は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；レーン３は、ＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳ培地上のＣＨＯ−Ｋ１細胞。
図５はＣＨＯ／Ｍ（１）２ｌａｃＩＮ＋／−金属および＋／−ＩＰＴＧ中のＰＧＫｌａｃＯｃａｔの一時的発現を示すグラフである。ＣＨＯ／Ｍ（１）２ｌａｃＩＮ細胞をＰＧＫｌａｃＯｃａｔで一時的にトランスフェクションし、それを培地＋／−金属および＋／−ＩＰＴＧの中で４８時間にわたりポストトランスフェクション培養した。クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ｃａｔ）蛋白質の水準を細胞抽出物の中で測定した。ｃａｔの水準は１００％に設定された未誘導水準に関して表示された。ＰＫＬｌａｃＯｃａｔ遺伝子の＞９５％の抑制が金属の存在下で観察され、そしてＩＰＴＧは抑制解除をもたらし、観察された抑制はｌａｃリプレッサーに特異的であることを示している。
図５ＡはＣＭＶｌａｃＯＴＦを生成するためのＣＭＶＴｆ中のｌａｃＯ配列の導入を図式的に示す。１８塩基理想ｌａｃＯ配列を使用してＴＡＴＡＡボックスと転写開始点（ｔｓｐ）の間のＣＭＶプロモーター中の１８個の塩基を置換し、そしてその配列の二量体をｔｓｐとＡＴＧ開始コドンの間の制限部位ＰｍｅＩの中に挿入した。次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド中にｌａｃＯ配列を加えることにより置換が行われた。ＰＣＭＶＴｆのＰｍｅＩ部位中へのプラスミドｐＯＰ（Hannan, G., et al 1994）からの制限酵素断片の連結反応によりｌａｃＯ二量体の挿入がなされた。
図５ＢはＣＨＯ／Ｍ（１）２ｌａｃＩＮ中でのＣＭＶｌａｃＯＴｆの安定した発現を示すグラフである。プラスミドｐＣＭｌａｃＯＴｆをＣＨＯ細胞および選択された安定な形質転換細胞（標識ＣＨＯ／Ｍ（１）２ｌａｃＩＮ細胞）でトランスフェクションした。２つのクローン系統からの細胞を培地＋／−金属および＋／−ＩＰＴＧの中で１２時間成長させ、新しい培地を加え、そしてならし培地をさらに２４時間後に回収した。Ｔｆ水準をウェスタンブロット上で（可視的に）推定し、金属および１００％に設定されたＩＰＴＧの不存在下での水準に対して表示した。両方のクローンで＞９０％の金属誘導抑制水準が観察され、ＩＰＴＧは抑制のほとんどを減じ、その特異性を示した。使用したＩＰＴＧの水準（２０ｍＭ）は次善のものであるかもしれず、不完全な抑制解除が観察された。
図６はｌａｃＯ−含有−Ｔｆ遺伝子ＣＭＶｌａｃＯＴｆおよびｌａｃ遺伝子Ｍ（１）２ｌａｃＩＮＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞中の金属誘導Ｔｆ発現のウェスタンブロット分析である。
Ａ．培地＋／−金属（５０μｍのＺｎＣｌ２）中で２４時間培養されたＣＨＯ／ＣＭＶｌａｃＯＴｆ細胞系統からのならし培地をウェスタンブロットによりＴｆ発現に関して分析した。バルク細胞系統＃２およびクローン系統＃１−１９を使用した。Ｔｆは両方の系統で発現された。バルク系統＃２では、約５０％の抑制が金属の存在下で観察されたが、クローン系統では非常に少量の抑制しか観察されなかった。
Ｂ．上記の二系統からの細胞を再びＴｆ発現に関して培地＋／−金属またはＩＰＴＧ（２０ｍＭ）中で２４時間の培養後にウェスタンブロットにより試験した。サンプルは三重で行われた。系統＃２における金属の存在下での抑制水準は上記のＡと同様であった。系統＃１−１９では、それらの水準は抑制を検出するには低すぎた。ＩＰＴＧが存在する時には、抑制解除が両方の細胞系統＋および−金属の中で観察され、すなわちｌａｃＩ遺伝子は「漏出性」であった。
Ｃ．全ての細胞を金属の存在下で培養し、抑制解除を検出するためにＩＰＴＧを加えたこと以外は上記の通りにして、バルク系統＃２から単離された１２個のクローンをＴｆ発現に関して試験した。抑制解除が全てのクローンで観察された。
Ｄ．クローン３５および３６を金属およびＩＰＴＧの存在下または不存在下でＴｆ発現に関してさらに分析した。記号＋＋は金属の一般的な使用量、すなわち５０μｍのＺｎＣｌ２および１μｍのＣｄＣｌ２を示す。記号＋は＋＋水準の半分を示す。１、２または１０μｌの補充されていない培地および１０μｌの補充された培地が使用された。これにより、培地＋半強度の金属の中では＞９０％であり、そして培地＋全強度の金属の中ではそれより大きいと計算される抑制水準の可視的な推定値が得られた。
図７はプラスミドｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦを発現するｌａｃＯ−含有ＩＧＦ−１の構造を示す。
Ａ．ｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ構造を製造するために使用された方式が示されている。Ｓａｌ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＶ断片をｐＣＭＶｌａｃＯＴｆから単離し、ｐＣＭＶＩＧＦ−１中の各片の代わりに連結反応させてｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１を生成した。
Ｂ．上記の連結反応用の断片を単離するため、かつ生成した構造を同定するために使用される種々の制限エンドヌクレアーゼダイジェストに関して、アガロースゲル上で分析した予測制限パターンが示されている。
図８はｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦで安定的にトランスフェクションされたｌａｃ−発現性ＣＨＯ細胞中のＩＧＦ−１ｍＲＮＡ発現の分析を提示する。
Ａ．ｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１およびｐＰＧＫｌａｃＩＮＲで一時的にトランスフェクションされ、培地＋／−２０ｍＭのＩＰＴＧの中で４８時間培養されたＣＨＯ細胞からの１０μｇのＲＮＡをノーザンブロットによりＩＧＦ−１ｍＲＮＡ発現に関して分析した。混成フィルターをホスホリマガースクリーンに露呈し、その走査像が示されている。水準はｌａｃ−発現性プラスミドの存在下で抑制され、ＩＰＴＧの存在下で抑制解除された。
Ｂ．上記のトランスフェクションされたバルク系統から単離された細胞クローンからの１０μｇのＲＮＡを上記の通りにしてＩＧＦ−１およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現に関して分析した。種々の水準のＩＧＦ−１ｍＲＮＡがトランスフェクションされた細胞中で検出されたが、ＣＨＯ対照では検出されなかった。
Ｃ．クローン７を上記の通りにしてＩＧＦ−１およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現に関してさらに分析した。細胞を培地＋／１金属（＋＋＝５０μＭのＺｎＣｌ２および１μＭのＣｄＣｌ２、＋＝２５μＭのＺｎＣｌ２および０．５μＭのＣｄＣｌ２）並びに＋／−ＩＰＴＧ（２０ｍＭ）の中で最初の１２時間培養した。ＩＧＦ−１ｍＲＮＡの水準をイメージクアントソフトウエアを使用して定量化た。これについては本文で述べてある。
図９はスーパー−ＣＨＯクローンであるＣ１およびＣ２のウェスタンブロット分析を提示している。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞のならし培地を、正確に処理されたトランスフェリンおよびＩＧＦ−１の存在に関してウェスタンブロットにより分析した。レーン１は、１μｇ／ｍｌのトランスフェリン標準（上部ゲル）および１０μｇ／ｍｌのＩＧＦ−１標準（下部ゲル）；レーン２は、スーパー−ＣＨＯクローンであるＣ１細胞からのならし培地レーン３は、スーパー−ＣＨＯクローンであるＣ２細胞からのならし培地。
図１０は蛋白質を含まない「スーパー−ＣＨＯ」クローンの成長を示す。スーパー−ＣＨＯ細胞クローンＣ１およびＣ２を、蛋白質を含まない培地１００ｍｌを含有するスピナーフラスコの中に１×１０５個の細胞／ｍｌの密度で接種した。トランスフェクションされなかったＣＨＯ細胞もＩＴＳおよび蛋白質を含まない培地中に正および負の対照として接種した。可視的評価および合計細胞数測定用にサンプルを毎日採取した。各時点に関する４回の細胞計数の平均が培養時間に対してプロットされている。
図１１はスーパー−ＣＨＯ細胞の成長に対するＩＧＦ−１、すなわちトランスフェリン−特異的抗体、の影響を示す。スーパー−ＣＨＯ細胞クローンＣ１を３０ｍｍ組織培養皿の中に接種し、１０μｌのＩＧＦ−１／トランスフェリン−特異的抗血清または無関係の（ＷＭ５４）抗体を含有する、蛋白質を含まない培地を用いて培養した。生存細胞数を２６、４８、７９および１００時間の培養後にトリパンブルー排除法により測定した。各時点に関して三重の平板を使用し、各平板に関して四重の計数を測定した。平均細胞数が培養時間に対してプロットされている。
図１２ＡはｐＮＫ構造を図式的に示している。この構造はｐＢＫＣＭＶ（ストラタジーン）から製造し、複製細菌源（ＣｏｌＥ１ｏｒｉおよびＦ１（−１）ｏｒｉ）、ＳＶ４０プロモーターから発現されたＮｅｏ／Ｋａｒマーカー、ヒトメタロチオネインIIＡ遺伝子（Kerin, M. & Richard, R., 1982）および多重クローニング部位（ＭＣＳ）に隣接する精密に調節された、高度に誘導性のＭ（２）６プロモーター（McNeall, J. et al., 1989）を含む。
図１２Ｂはクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）マーカーをＭＣＳの中にそれがＭ（２）６プロモーターから発現するように挿入することにより製造されたｐＮＫ−ＣＡＴ構造を図式的に示す。
図１３はＵＮＳＷＳＦ＋ＴＳ培地上でのＣＨＯ／ＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１＋Ｍ（１）ｌａｃＩＮＲの成長を図式的に示す。対照細胞については培地に対する付加がなく、他の細胞には５０μＭのＺｎＣｌ２＋１μＭのＣｄＣｌ２が２４時間で加えられた。金属が加えられた細胞の成長は平らであったが、対照細胞は成長し続けた。
図１４は５０μＭのＺｎＣｌ２および１μＭのｄＣＣ１２を添加した場合と添加しない場合の１０％ＦＣＳ培地上における、の図１２に示された細胞の２４時間の成長を図式的に示す。細胞の成長は追加の金属により影響を受けなかった。
図１５は組織培養フラスコ中のＣＨＯ  Ｋ１の細胞成長を示し、それを胎牛血清補充培地中で得られた細胞成長と比較している。二種の培養に関する成長速度±標準誤差は
ＦＣＳ培地：倍加時間＝２０．７±３．１時間
ＩＴＳ培地：倍加時間＝２１．０±４．０時間
である。
図１６は攪拌された１００ｍｌのフラスコ中の微粒子担体上におけるＣＨＯ  Ｋ１の細胞成長を図式的に示す。フラスコは二重（フラスコＡおよびフラスコＢ）であった。最初の三点に関する二種の培養に関する成長速度±標準誤差は
フラスコＡ：倍加時間＝１８．９±３．２時間
フラスコＢ：倍加時間＝１８．３±５．５時間
である。
実施例
実施例１：ＣＨＯ細胞でのトランスフェリンまたはＩＧＦ−１の発現
この数年、血清を含まない培地中におけるＣＨＯ−Ｋ１の増殖要件を探る研究が行われてきた（Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｊ．，１９８９、Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｐ．等，１９９０、Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｍ．，ＰｈＤ学位論文）。インスリンまたはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフェリン及び唯一の外因性蛋白質としてのフュブロネクチンまたはラミニンにより、液体窒素から大規模に長期間増殖することができる。セレンも微量元素として添加する必要がある。ＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳと呼ぶ、血清を含まない（ＳＦ）、特徴のある培地が開発された。アメリカタイプ培養収集（ＡＴＥＣ）から数年にわたり入手したＣＣＬ６１試料が異なると、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系の増殖特性は僅かであるが変化が生じている。１９９４年にＡＴＣＣから得た現在のＣＨＯＫ１ＣＣＬ６１ストックは、ＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳ培地中で約１７時間の倍加時間で増殖する。
更に最近、ＣＨＯＫ１細胞系の増殖に関して、ＩＧＦがインスリンに代替可能であることが判明している。
タンパク質分泌のための配列を含むＩＧＦ１とトランスフェリン（Ｔｆ）遺伝子のコード化配列は、市販のヒトｃＤＮＡ肝臓ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より重合酵素鎖反応を利用して単離された。そのＡＵＧ出発コドンの配列５’は、最適翻訳開始位置を含むように改質された（ＡＣＣＡＴＧＡがＡＡＧＡＴＧＡに替わる。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１９８９）。
基本ＧＦ発現カセット（ＣＭＶ−ＧＦ）は、ｐＣＥＰ４（インビトロゲン）から得られる主要な早速の初期遺伝子からのヒトシトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０並びに市販ベクターｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのＳＶ４０後期ポリアデニル化／転写終了信号から得られるＶＰ１イントロン、及び増殖因子遺伝子コード化配列を含む。
更にこの発現ベクターは、トランスフェクションされた細胞に選択性の発現型を付与するヒグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びｐＵＣ複製開始点（大腸菌用の細菌配列）を含有し、これらはいずれもプラスミド（染色体外遺伝因子）ｐＣＥＰ４（インビトロゲン）から由来する。
トランスフェリンを含まないＵＮＳＷＳＦ培地＋インスリンの中で増殖を支持するのに十分なトランスフェリンを生成する細胞系を発生するために、プラスミドを発現する組換え型のトランスフェリンを構成し、それをＣＨＯ細胞に導入した。血清を含まない（ＳＦ）増殖に必要な高水準（１ないし１０，０００ｎｇ／ｍｌ）の外因性トランスフェリンに基づき、高発現水準が得られるようにこの構成を設計した。まず強力なＣＭＶプロモーターを用いて高転写活性を確保し、次にＡＵＧ開始点近傍の翻訳開始用の略最適配列を利用して翻訳性を最大にするようにこの構成を設計した（Ｋｏｚａｋ，１９８６）。続いて、ＴｆｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを定量化し次にＴｆフリーを含まない培地中で増殖特性を明かにすることによってトランスフェクションされたＣＨＯ細胞培養液中でこの構成の効率を試験した。
ＣＭＶＴｆ遺伝子は、５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含有する培地中でＣＨＯ細胞に標準トランスフェクションされた後、トランスフェクションされた細胞の選択により、ＣＨＯ細胞中で安定的に発現された。ヒグロマイシン耐性遺伝子を含む細胞は、組換え型遺伝子をも含む。ならし培地に高レベルのＴｆを分泌するこれら細胞はウェスタンブロット分析法で同定された。ＣＨＯ／ＣＭＶＴｆ細胞は、１０6細胞あたり２４時間で２ないし８μｇのＴｆを分泌した。この水準はトランスフェリンを含まないＳＦ培地＋インスリン＋セレン中で増殖を維持するのに十分な水準であり、これらのトランスフェクションされた細胞の増殖速度は、トランスフェクションされないＣＨＯ細胞の場合の速度と、比較すると著しく改良されている（図１）。しかしこれら細胞の増殖速度は、１０％ＦＣＳを追加した培地で増殖する同細胞の速度よりは低い。
同様にＣＭＶＩＧＦ−１遺伝子をＣＨＯ細胞に発現させた。ＣＨＯ／ＣＭＶＩＧＦ−１細胞は＞２００ｎｇ／１０６細胞／２４時間を分泌し、母線に比較するとＳＦ培地＋トランスフェリン＋セレン中での増殖特性に顕著な改良が認められた（図２）。図２において、細胞の三つのクローン単離体がＵＮＳＷＳＦ中で増殖され、その増殖はＦＣＳ培地で増殖する同細胞及びＵＮＳＷＳＦ中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１と比較された。この細胞系の推計倍加時間を表１に示す。
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この結果は、トランスフェクションされた細胞は十分な量の生物活性ＩＣＦ−１を血清を含まないインスリンを含まない培地に分泌して細胞の増殖を支援していることを示している。
実施例２：ＳＶプロモーターで制御されたトランスフェリン遺伝子の発現
トランスフェリンの発現を促すのに用いられるプロモーターが決定因子ではないことを立証するために、実施例１のトランスフェリンのコード化用ｃＤＮＡを、ベクターｐＳＶＬのＸｈｏ／Ｓａｃ１位置にクロン化してｐＳＶＬＴｆを発生させた。このＳＶＬＴｆ遺伝子は、ｐＳＶ２Ｎｅｏによる細胞への標準トランスフェクション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，１９８２）と、その後のＧ４１８含有培地中での選択により、ＣＨＯ細胞に安定に発現された。図３は培養上澄み液のウェスタンブロットを示すものであり、この細胞が正確に処理されたトランスフェリンを分泌していることを示している。
図４Ａは、トランスフェリンが限定培地中に存在することにより培養液のＣＨＯ−Ｋ１細胞の長期間成長と生存性とが助成されることを表している。図５は、ＣＨＯＳＶＬＴｆ細胞の最終細胞数と生存率とをＩＳ培地中で１０日以上の間保持されたことを示している。図４Ｂからは、三つの細胞系の最終細胞密度は近似しているが、ＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳ培地で増殖するＣＨＯ−Ｋ１はトランスフェリン発現ＣＨＯＳＶＬＴｆ細胞に近似した６０％の生存率であるが、ＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地上で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞の生存率は僅か２０％であることがわかる。このデータにより、特に長期間の安定増殖と生存性にとって、トランスフェリンを分泌するＣＨＯ細胞を有することが重要であることが判る。
実施例３：ＣＨＯ細胞中のｌａｃ抑制因子の金属誘発性発現
大腸菌ｌａｃ抑制因子遺伝子であるｌａｃＩ用のコード化配列が、哺乳類細胞での発現用に改質されている（ＨｕとＤａｖｉｄｓｏｎ，１９８７）。最適翻訳開始信号を組み込み（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１９８６）、及び核への抑制因子蛋白質の移送のためにＳＶ４０大Ｔ抗源の核局在化信号をそのＮ端末部への組み込む（Ｈａｎｎａｎ等，１９９３）ことにより、それを更に改質した。この改質した抑制因子遺伝子，ｌａｃＩNは、抑制因子蛋白質の９８％を核に輸送する（Ｈａｎｎａｎ等，１９９３）。
誘発性のｌａｃＩN遺伝子を構成した。その発現カセットは、改質人メタロチオネインIIＡプロモーター、Ｍ（１）２（ＭｃＮｅａｌｌ，Ｊ等、１９８９）、上記改質ｌａｃＩNのコード化配列、ＳＶ４０ＶＰ１イントロン（介在配列）及び実施例１に記載のＳＶ４０後期ポリアデニル化／転写終了信号を含んでいる。
ＣＨＯ細胞には、標準手法を用いてＭ（１）２ｌａｃＩN及びｐＳＶ２Ｎｅｏがトランスフェクションされた。細胞を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で二週間処理し、Ｇ４１８に耐性のクローン細胞系を選択した。クローン系（ＣＨＯ／Ｒ（５）４及びＣＨＯ／Ｒ（１０）３と呼ぶ）が得られた。これらはウェスタンブロットにより、低い基底で高い金属誘発レベルの抑制因子を産出することが検出された。この抑制因子は細胞に過渡的に導入される（図５）ｌａｃＯ含有プラスミド、ＰＧＫｌａｃＯｃａｔを抑制する能力によって（Ｈａｎｎａｎ，Ｇ．等，１９９４）、生物学的に活性であることが判った。
実施例４：ＣＭＶＴｆ遺伝子に応用されるｌａｃ抑制因子／作動遺伝子系
細菌作動遺伝子と所定のプロモーター内の許容可能な挿入位置の規則に基ずく理想的なｌａｃ作動遺伝子配列（ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ）が記述されている（ＨｕとＤａｖｉｄｓｏｎ、１９８７）。この細菌ｌａｃ抑制因子は、各種哺乳類ゲノムに観測される僅か三種のコピーを有する稀な配列である、理想的ｌａｃ作動遺伝子配列に対する会合定数が高いので（Ｓｉｍｏｎｓ等、１９８４）、目的の遺伝子の調節の特異性が優れ、宿主遺伝子に最小の影響しか及ぼさない（Ｓｉｍｏｎｓ等、１９８４）。
ｌａｃ作動遺伝子配列をＣＭＶＴｆ遺伝子に挿入してｌａｃ抑制因子による抑制を行わせた。一つのｌａｃ作動遺伝子配列（図５Ａ）はＴＡＴＡＡボックスと転写開始点との間のプロモーター野生型配列を置換し、他の二つのｌａｃ作動遺伝子配列は転写開始点とＡＵＧ開始コドンとの間に挿入された。安定な誘発性のｌａｃ抑制因子遺伝子を既に含有するＣＨＯ細胞中でのこの新規の構成体（ＣＭＶｌａｃＯＴｆ）の安定な発現（実施例３参照）は、抑制因子蛋白質が存在すると（即ち金属誘発が伴う）と著しく遮断された（図５Ｂ）。
実施例５：トランスフェリン発現の金属調整：ｌａｃＩ発現性の安定なＣＨＯクロン、ＣＨＯ／Ｒ（５）４及びＣＨＯ／Ｒ（１０）３へのｐＣＭＶｌａｃＴｆの安定発現と調整
ｐＣＭＶｌａｃＯＴｆ内のＴｆ遺伝子がＣＨＯクロンを発現するｌａｃＩのＣＨＯ／Ｒ（５）４及びＣＨＯ／Ｒ（１０）３、内で安定に発現された場合にＴｆ遺伝子が抑制されるか否かを確認するために、ＣａＰＯ4法（Ｃｈｅｎ，Ｃ．とＯｋａｙａｍａ，Ｈ．、１９８８）により細胞内に１０μｇのプラスミドをトランスフェクションした。Ｔｆ遺伝子はヒグロマイシン耐性遺伝子を有するので、トランスフェクションされた細胞を５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含有する培地中で選択した。別日の二日を選び二つのトランスフェクションバッチ、＃１と＃２、で実施した。トランスフェクションされた細胞の増殖巣の出現し始めた時に、トランスフェクションされた系ＣＨＯ／Ｒ（５）４＋Ｔｆ＃１から２４のクロンを単離し、バルク細胞系とクローン系からのならし培地を６ウェル板内の複製ウェル内で亜集密体まで増殖させ、金属を各複製ウェルの一つに添加し、培地を２４時間後に集液してウェスタンブロットによりＴｆ含有量を分析した。しかしバルク系ＣＨＯ／Ｒ（５）４＋Ｔｆ＃１は全くＴｆを産出せず、その系から単離したクローン１９とバルク系ＣＨＯ／Ｒ（５）４＋Ｔｆ＃２がＴｆを産出した。細胞を金属で処理すると５０％の抑制が観測された（図６）。
バルク系＃２とクローン１９におけるＴｆ発現パターンを、６０ｍｍプレート（処理毎に使用とするため三プレート作成）に２×１０5の細胞を接種し、細胞を２４時間沈降させ、新しい培地＋／−金属とＩＰＴＧを加え、そのならし培地を集液して細胞抽出物（Ｃ／Ｅ）を７２時間後に収集することによりより詳細に検討した。このＣ／Ｅを用いて各プレートの蛋白質レベルを確定した。次にこれら各レベルを用いてＴｆウェスターンで分析したならし培地の容積を正規化した。
誘導化細胞と非誘導化細胞内のＴｆ発現の比率を抑制の尺度として使用した。上記に類似した抑制レベルが検出されたが、誘導化及び非誘導化のいずれの細胞においてもＩＰＴＧが存在するとこのレベルは高くなった。これはＴｆ遺伝子を抑制するのに十分な非誘導化ｌａｃ抑制因子が存在すること示唆している（図６）。このような”漏れやすさ”はバルク系では予測できようが、クローン１９で観察されたよりも良好な発現のバランスのクローン系を得ることが可能となる。Ｔｆ生産にはより多くのクローンの単離とスクリーンが必要である。Ｔｆ発現バルク系＃２で１０ｃｍプレートを低密度に覆い、単離した細胞集落から細胞を“掻き落とし”て１２クローンを単離した。これらはＣＨＯ／Ｒ（５）４＋Ｔｆ−２５から３６と称する。
上記単離したクローンからの細胞を６ウェルプレートで２４時間増殖し、ならし培地のＴｆ含有量をウェスタンブロットで検定した（図６）。いずれのクローンからのならし培地も約１ないし２μｇ／ｍｌのＴｆ（Ｔｆの標準から推算、データは記載されていない）を含有していた。二つのクローン培地ＣＨＯ／Ｒ（５）４＋Ｔｆ−３５と３６）を選択し、更にＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地＋／−金属、＋／−ＩＰＴＧでのＴｆ生産を分析した。細胞を培地＋１０％ＦＣＳ中で６ウェルプレートに５０％集密レベルに接種し、２４時間沈降させた。培地をＵＮＳＷＳＦ＋ＩＳ培地＋／−金属、＋／−ＩＰＴＧに替えた。金属のレベルとして、１μＭのＣｄＣｌ2と５０μＭのＺｎＣｌ2の通常レベルまたはその半量の二つのレベルを採用した。最終濃度が２０ｍＭのＩＰＴＧを用いた。１２時間後に新しい培地を加え、２４時間後にならし培地を集液した。１２時間の前処理を実施して、産出された金屑誘発化抑制因子がその効果を発生する前に培地中に分泌される全てのＴｆを除去した。ウェスタンブロットにより、追加されならし培地の１０μｌ及び追加された培地の１、２及び１０μｌを分析した。追加を行わないならし培地の量を変え、それを用いて抑制レベルのより正確な推定を行った（データは表示されていない）。非誘発細胞＋／−ＩＰＴＧからのＴｆレベルには顕著な差は認められず、これは基底抑制が存在しないことを示している。金属誘発により、両クローンにおいてもＴｆ遺伝子の抑制のレベルは基底レベルに対して約１０％減少した。金属誘発のレベルを半量にしても同様な効果が生じた。ＩＰＴＧはこの抑制を緩和し、従ってその特異性が確認された。
クローン３５及び３６には、ｌａｃＯ含有Ｔｆ遺伝子の抑制因子調節の良好な発現が認められた。これは最適の非誘発：誘発抑制因子レベルによると推測される。
実施例６：ＩＧＦ−１発現の金属調節：抑制因子にポシティプなＣＨＯ細胞系におけるＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１からのＩＧＦ−１発現の調節
安定系でＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１遺伝子の抑制因子調節発現を試験する目的で、プラスミドを、ＣＭＶｌａｃＯＴｆ４遺伝子がうまく調節されている最適抑制因子ポシティプＣＨＯ／Ｍ（１）２ｌａｃＩＮＲ細胞系Ｒ（５）４に安定に発現させた。１０μｇのｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１（図７）ＣＨＯ／Ｒ（５）４細胞にトランスフェクションし、ヒグロマイシン耐性細胞を選択し、バルク細胞系ＣＨＯ／ＣＭＶＩＧＦ−１にプールした。このバルク細胞系内のＩＧＦ−１産出細胞を富化する目的で、細胞をＵＮＳＷＳＦ＋ＴＳ培地内で二週間増殖させ、生存細胞をプールした。
クローン単離のためにバルク系の細胞を１０ｃｍプレートに低密度に接種した。１２クローンが単離され、それを広げ、ＩＧＦ−１ｍＲＮＡ発現を目的としたスクリーニングを行った。細胞質ＲＮＡが抽出され、１０μｇを用いて上記のようにノーザン法でＩＧＦ−１特異性ｍＲＮＡの分析を行った。走査画像を図８に示す。フィルターをストリッピングし、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのために再探査した。
ＩＧＦ−１発現クローンに関する走査結果を図８に示す。６クローンはそれぞれ異なるレベルのＩＧＦ−１ｍＲＮＡを産出した。金属の存在または非存在下におけるＩＧＦ−１ｍＲＮＡ発現を更に分析するためにクローン７を選択した。細胞を培地＋１０％ＦＣＳ＋／−金属＋／−ＩＰＴＧ中の３５ｍｍプレートに亜集密状になるまで増殖させた。図８に簡単に記載したように、ＺｎＣｌ2＋ＣｄＣｌ2の二つのレベルを採用した。培地は上記のようにＵＮＳＷＳＦ＋ＴＳ培地＋／−ＩＰＴＧの金属に置き換え、更に２４時間細胞を培養した。細胞質ＲＮＡを抽出してノーザン分析を行い、ならし培地を集液してウェスターン分析を行った。
ＩＧＦ−１ｍＲＮＡ発現に関して上記と同様にノーザンハイブリッド法で１０μｇのＲＮＡを分析した。雑種形成した膜を燐画像スクリーンに露光した。その走査画像を図８Ｃに示す。膜を上記と同様にストリッピングし、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのために再探査した。このｍＲＮＡレベルを定量し（画像定量ソフトウェア）、ＩＧＦ−１レベルをＧＡＰＤＨに対して規格化した。金属レベルが半濃度と全濃度に存在すると、抑制レベルはそれぞれ８０％と９０％になった。ＩＰＴＧにより抑制の特異性を示唆する脱抑制が生じた。
我々の結果によれば、ｌａｃ発現ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクションされたＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１遺伝子を、培地に金属を添加することで制御できた。抑制は転写レベルで生じ、以前の実験でもＣＭＶＩＧＦ−１遺伝子の後転写制御が観測されていないので、上記細胞により産出されたＩＧＦ−１のレベルは観測したＩＧＦ−１ｍＲＮＡに相関するものと推定できる。
実施例７：トランスフェリンとＩＧＦ−１の両方を発現する細胞系
通常の手法によりＣＨＯ−Ｋ１にｐＳＶＬＴｆとｐＣＭＶＩＧＦ−１をトランスフェクションした。バルクトランスフェクション体からのならし培地のウェスタンブロット分析から、９０ｋＤａと７．６ｋＤａ付近に移動する二つの免疫反応性バンドの存在によって示される、正確に処理されたトランスフェリンとＩＧＦ−１の分泌が明らかになった。このバルクより限界希釈により細胞クローンを単離した。これらクローンの二つ（ＳＣ１とＳＣ２）のウェスタンブロット分析を図９に示す。発現レベルは、２４時間後の１０6細胞につきＩＧＦ−１が７５０ｎｇ、トランスフェリンが１０００ｎｇのオーダーと推算された。
血清と蛋白質を含まない限定培地（ＵＮＳＷＳＦ）中でのＳＣ１とＳＣ２の増殖性能を明確にするために、これらクローンをミクロ担体を含む攪はんフラスコ内に接種した。増殖因子及び付着因子が全く存在しない場合でも、ＳＣ１とＳＣ２のいずれも良く増殖し、倍加時間はそれぞれ１８時間と２１時間であった（図１０）。同条件下でのトランスフェクションされない母体細胞の増殖は極めて遅く、倍加時間は２００時間以上であった。この結果は、十分なＩＧＦ−１とトランスフェリンが分泌されており、血清と蛋白質が含まない特徴のある条件下で自己分泌増殖を支援していることを示している。ＵＮＳＷＳＦ中のクローンの増殖速度は、ＩＴＳを付与したＵＮＳＷＳＦ中のＣＨＯ−Ｋ１により示される増殖速度に匹敵した。ＵＮＳＷＳＦ中のＳＣ１とＳＣ２の最終細胞密度はｍｌ当り４〜５×１０6細胞であり、この値はＵＮＳＷＳＦ＋ＩＴＳ培地での母体ＣＨＯ−Ｋ１に近似する。
実施例１０に記したように、十分に限定された条件下で母体細胞系ＣＨＯ−Ｋ１を増殖するには接種フラスコをフィブロネクチンで被覆する必要性があるので、増殖因子及び付着因子が全く存在しない場合でもこのようにクローンＳＣ１とＳＣ２が良好に増殖する性能があることは予想外のことといえる。
ＳＣ１とＳＣ２系の増殖がトランスフェリンとＩＧＦ−１を発現する細胞の直接的成果であることを確認するために、クローンＳＣ１をトランスフェリン及びＩＧＦ−１に対し特異性の抗血清体または非血縁抗体（抗ＷＭ５４）の１０μｌを含む３０ｍｍ培養フラスコ内に接種した。この抗ＩＧＦ及びトランスフェリン抗体の存在下ではＳＣ１の増殖が劇的に減少した様子を図１１に示す。この結果により、クローンの増殖がＩＧＦ−１とトランスフェリンの発現の直接的成果であることがわかる。
血清含有培地でのプロセスの全ての段階においても繁殖のための一切の要件を回避するクローンＳＣ１とＳＣ２のための新規方法を開発した。細胞を液体窒素ストックからミクロ担体培養液に直接接種した。増殖速度と最終細胞密度は、細胞をミクロ担体培養培地に接種する前に接種体を含有する血清中で増殖させた場合に得られる増殖速度と最終細胞密度に同一であった。プロトコールは以下の通りである。
（i）  液体窒素ストック
（ii）  管への移送
（iii）  ２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離
（iv）  蛋白質を含まない培地（ＰＦＭ）中での再懸濁
（v）  生存可能細胞のカウント
（vi）  攪はんフラスコへの接種
この実験は血清含有液体窒素ストックで実施した。血清を含まない培地中で細胞をうまく冷凍できることは同業者に周知のことである（例えばＹｏｓｈｉｄａ及びＴａｋｅｕｔｉ、１９９１）。完全に蛋白質が含まれていない培地にストックした細胞の回収率は５０％であり、これは血清にストックした細胞の回収率が８０％であるのと比較される。
従って、本発明によれば液体窒素から攪はん培養液まで完全に蛋白質を含まない限定条件下で細胞を増殖することができることが判明した。
実施例８：ＣＨＯ細胞の調整された自己分泌増殖
この例においては、ＩＧＦ−１を発現するＣＨＯ細胞の自己分泌増殖が金属の添加で調整される。この金属は、ｌａｃ作動結合位置に結合したｌａｃ抑制因子の発現をもたらし、ＩＧＦ−１発現を遮断する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ｐＭ（１）２ｌａｃＩＮＲ含有プラスミド、厳密に調整されたＭ（１）２メタロチオネインプロモーターの制御下のｌａｃ抑制因子、ｐＣＭＶｌａｃＯＩＧＦ−１、ｌａｃ作動遺伝子結合位置を含有するＣＭＶプロモーターの制御下のＩＧＦ、及び全メタロチオネイン遺伝子含有ｐＮＫ−ＣＡＴがトランスフェクションされた（Ｋｅｒｉｎ，Ｍ．及びＲｉｃｈａｒｄ，Ｒ．、１９８２）。このｐＮＫ・ＣＡＴプラスミドはｐＮＫから構成された（図１２）。
生ずるトランスフェクション体の増殖を、血清（５０μＭのＺｎＣｌ2と１μＭのＣｄＣｌ2の±添加）存在下とＵＮＳＷＳＦ＋ＴＳ培地上で比較した。
その結果を図１３と１４に示す。ＦＣＳ存在下に培養した細胞には金属の添加による増殖阻害が認められない（図１４）ので、細胞はインスリン、血清に含まれる他の分裂プロモーター並びに細胞系で産出されるＩＧＦ−１の存在下で増殖しているものと考えられる。ＴＳ培地中で培養した細胞（図１３）は、細胞増殖を遅延する金属の添加により細胞が定常相に入り込むまでは良好に増殖している。定常相に保持された細胞が金属の毒性効果に屈しないことは、トリパンブルー排除染色により証明される。誘発性ｌａｃ抑制因子系とＩＧＦ−１コード化配列の上流のｌａｃ作動遺伝子を組み合わせれば、金属が存在しない場合にＩＧＦ−１合成を遮断して細胞を定常相へ入り込ませるｌａｃ抑制因子を産出して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の調整性の自己分泌増殖が可能となることが示された。
自己分泌増殖が可能である本研究で開発した細胞系においては、ＩＧＦ−１は分裂促進性の試剤であった。自己分泌様式で発現されるトランスフェリンは、血清と蛋白質が含まれない限定した培地ＵＮＳＷＳＦ中で細胞が増殖される場合には、細胞の長期生存能力にとって必要であった。そこで細胞の調整された自己分泌増殖を達成するためにＩＧＦ−１発現の調整が必要となるが、実施例５に示されるようにＩＧＦ−１と同じ様式でトランスフェリン発現を調節することも可能。である。このことは、細胞が所望の組換え蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する一方で増殖因子発現を最小化するのに好ましい。
実施例９：ＩＧＦ−１の調整発現によるＣＨＯ−Ｋ１からのクロラムフェニコール転移酵素（ＣＡＴ）の発現
調整された様式でＩＧＦ−１を発現できる細胞は組換え蛋白質の発現も可能であることがわかった。特に、抑制因子蛋白質の発現を発生しそれ故にＩＧＦ−１発現を減少させるのに使用できる調整可能のプロモーターは、所望の組換え蛋白質の発現を発生するのにも使用できることがわかった。実施例８で使用した細胞では、ｐＮＫ−ＣＡＴのＣＡＴ発現が、金属Ｍ（２）６プロモーターによる制御下にあった。この例においては細胞増殖の期間後に、実施例８と同じ金属濃度（５０μＭのＺｎＣｌ2と１μＭのＣｄＣｌ2）を培養液に添加した場合に、Ｍ（２）６プロモーターがＣＡＴ発現を誘発することが観察された。
実施例１０：ＣＨＯ細胞の血清を含まない増殖に最適な培養条件
ＣＨＯ  Ｋ１細胞は液体窒素下に９０％の培地と１０％のＤＭＳＯの混合液に貯えられる。氷解したら、細胞は、４００ｎｇ／ｃｍ2のフィブロネクチンで被覆した組織培養フラスコ中の基本培地＋１０ｍｇ／Ｌのインスリン＋１０ｍｇ／Ｌのトランスフェリン＋２×１０-8Ｍのセレン中で増殖できる。細胞数を増加するには、集密状態の細胞を細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ；ＵＳＡ）により分離し、類似条件下で新しい培養液を再接種するのに使用する。細胞数が１×１０5細胞／ｍｌの発酵槽接種密度を可能とするに十分な数に到達したら、この細胞を同様な方法で分離し、基本培地＋１０ｍｇ／Ｌのインスリン＋１０ｍｇ／Ｌのトランスフェリン＋２×１０-8Ｍのセレン＋１０ｍｇ／Ｌのコレステロール＋２ｇ／ＬのプルリオニックＦ６８（ＢＡＳＦ、独）＋３．０ｇ／Ｌのドルマセル２．０％ミクロ担体（Ｐｆｉｅｆｅｒ及びＬａｎｇｈａｎ、独）を含む発酵槽を接種するのに使用する。次に細胞を、ミクロ担体が発酵槽で集密になるまで増殖させる。
基本培地はＤＭＥＭとＣｏｏｎ’ｓＦ１２の各培地の１：１混合液から成る。
結果は図１５に示すように組織培養フラスコ中で細胞は増殖している。図１５ではこの細胞増殖を、仔ウシ胎児血清を追加した培地で得られた細胞増殖と比較している。二つの培養液の増殖速度±標準誤差は、
ＦＣＳ培地：倍加時間＝２０．７±３．１時間
ＩＴＳ培地：倍加時間＝２１．０±４．０時間である。
図１６は、二つの１００ｍＬ攪はんフラスコ中のミクロ担体上の細胞増殖を表す。最初の三点での二つの培養液の増殖速度±標準誤差は、
フラスコＡ：倍加時間＝１８．９±３．２時間
フラスコＢ：倍加時間＝１８．３±５．５時間である。
参考文献
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特定の実例で示した本発明には、概括的に述べた本発明の精神と範囲から逸脱することなく数多くの改変及び／または改質が可能であることは同業者各位には理解されよう。従って、本実施例は全ての面で例証的なものであり限定的なものと見なすべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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