(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子、あるいは、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子（配列番号２）のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】
組換えベクターが、形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＳＩＤ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７９）に保持されている組換えベクターｐＥＮＳ１である、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の組換えベクターを挿入してなる形質転換体。
【請求項６】
形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＳＩＤ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７９）。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の組換えベクターを含む組換え麹菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、黒麹菌のフェリクローム生合成に必要なオルニチンモノオキシゲナーゼとペプチドシンテターゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるオルニチンモノオキシゲナーゼ、ペプチドシンテターゼ蛋白質を生成させることによってフェリクローム高生産麹菌を育種する方法、両フェリクローム生合成遺伝子を麹菌以外の生物に導入して生産させる方法、及び黒麹菌ペプチドシンテターゼ蛋白質を用いて任意のペプチドを合成する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。特に好気性を示す生物群では、多大なエネルギーを生産する電子伝達系の反応に鉄イオンは欠くことができない。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００３】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００４】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００５】
このように、黄麹菌（Aspergillus oryzae）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、黄麹菌と類縁で焼酎、泡盛製造に関わる黒麹菌もまた、麹などの固体培養においてフェリクローム化合物を生産することが知られている。実際の焼酎、泡盛の蒸留酒では商品中でのフェリクロームについては問題視されていないが、黒麹菌もまた黄麹菌と同様にフェリクローム生産が可能な微生物と考えられる。また黒麹菌も長年食品微生物として使用されており、その安全性が高く評価されている。これらの点から、黒麹菌が生産するフェリクロームは貧血症の医薬または機能性食品の利用が期待される。しかしながら黒麹菌のフェリクローム生合成についてはその生合成に関与する遺伝子が未解明のため、生産量を上げるなどの有効利用ができず、いまだに効率的な活用がなされていない。
【０００６】
もし、フェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、黒麹菌によるフェリクローム類の生産を自由に調節できる可能性がある。例えば、医薬品製造においては、フェリクローム生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクローム生産が可能となる。さらに黒麹菌が生産するフェリクロームは清酒や泡盛その他飲食品として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。黒麹菌によりフェリクロームが大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる。
このように、黒麹菌のフェリクローム生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Aspergillus niger等の黒麹菌のフェリクローム生産を自由に制御するために、黒麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子群を提供することにある。本発明の他の目的は本遺伝子群を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供することにある。
【０００８】
黄麹菌（Aspergillus oryzae）におけるフェリクロームの生合成経路については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は、既にその生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定するのに成功するとともに、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子がフェリクローム生合成遺伝子クラスターを形成していることも確認している。
【０００９】
一方、黒麹菌（例えば、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii、Aspergillus usamii、Aspergillus shirousamii、Aspergillus saitoiなど）もまた、黄麹菌と同様に、長年焼酎、泡盛製造に利用されており、安全性の高い有望なフェリクローム生産菌である。そして各方面から検討の結果、これら黒麹菌の真のフェリクローム高生産を実現するために、フェリクローム生合成遺伝子クラスターを形成する遺伝子の取得が必要である点に本発明者らははじめて着目した。これら黒麹菌のフェリクローム生合成遺伝子クラスターが取得できれば、安全性の高いフェリクロームを工業的に食品、医薬品へ供給することが可能となる。
【００１０】
したがって本発明の目的は、黒麹菌のフェリクローム生合成を形成するクラスター遺伝子を開発することである。また、本発明の他の目的は、フェリクローム生合成クラスター遺伝子群の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクロームを高生産する麹菌を提供することにある。またこうして生産されたフェリクロームを鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供するのが可能となる。またさらなる目的はこれらの麹菌のフェリクローム生合成に関わる遺伝子クラスターを麹菌以外の生物に導入してフェリクローム類を生産させることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、先ずはじめに黒麹菌（アスペルギルス・ニガー：Aspergillus niger等）について検討を行った。
【００１２】
黒麹菌（例えば、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii、Aspergillus usamii、Aspergillus shirousamii、Aspergillus saitoiなど）は、焼酎、泡盛などの我が国の伝統的醗酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株は、上記醗酵産業で有用な蛋白質や低分子を非常に大量に生産することが知られている。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている。（Biotechnology、６、１４１９（１９８８）、特開昭６２−２７２９８８）発明者らの研究から、Ａ．ｎｉｇｅｒを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。またＡ．ｎｉｇｅｒは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、クエン酸などの有機酸発酵のように産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。黒麹菌が生産する低分子化合物の中でフェリクロームは、近年貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１３】
この黒麹菌のフェリクロームを医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、フェリクローム生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクロームの大量生産が可能であると考えた。アスペルギルス属菌におけるフェリクロームの生合成遺伝子群については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は既に黄麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅよりフェリクローム生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定している。
【００１４】
本発明者らは、この取得方法に着目し、この取得方法を黒麹菌に適用すれば黒麹菌のａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子も取得できるという可能性について、新規着想を得た。そして、黒麹菌においてもこれらのクラスター遺伝子が取得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え黒麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になるとの着想を得、そこで我々は、黒麹菌が生産する鉄イオンキレート低分子フェリクロームを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、そのフェリクローム生合成クラスターの遺伝子クローニングを行い、フェリクロームの工業生産に適した遺伝子組み換え黒麹菌を育種することを、新規技術課題として新たに設定した。
【００１５】
一方、本発明者らの研究の結果、黄麹菌Aspergillus oryzaeにおいては、フェリクロームの生合成経路に属するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−８３６４０）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）について、他の関連生合成遺伝子群と約３６−ｋｂのクラスターを形成していた（特願２００１−３２４１８１）。他に、Aureobasidium pullulansのフェリクローム生合成遺伝子においても、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子、フェリクロームのＡＢＣトランスポーター遺伝子、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子が約３０−ｋｂのクラスターを形成することが報告された。また、Ustilago maydisにおいても、オルニチンＮ５オキシゲナーゼ遺伝子とペプチドシンテターゼ遺伝子が４．３−ｋｂの塩基を介してクラスターを形成していることが報告された(Walter MY, et al., J. Bacteriol., 183, pp4040-4051, 2001)。
【００１６】
これらを検討した結果、本発明者らは、黒麹菌においても、フェリクローム生合成は、他の糸状菌のフェリクローム生合成遺伝子群と同様に、染色体上でクラスターを形成する可能性について、はじめて、その着想を得た。そして、鋭意研究を行い、黒麹菌において、フェリクローム生合成クラスターを形成する遺伝子を単離、確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。
以下、黒麹菌フェリクローム生合成遺伝子群の単離方法を具体的に述べる。
【００１７】
フェリクローム生合成の第一段階であるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepacia由来のものがクローニングされている。そこで、これらのシデロフォア生合成に関与するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の相同性から、非常に保存性の高い２つの領域を見いだし、この領域それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約１６０ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ、Pseudomonas  aeruginosaのL-オルニチンN5-オキシゲナーゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００１８】
得られた遺伝子断片の塩基配列をプローブとしてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、陽性クローンを得た。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでいた。得られた遺伝子をｎｓｂ１と命名した。さらに、本遺伝子のｃＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して、得られた形質転換体は、菌体内に著量のＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼを生産することを確認した。よって、得られたｎｓｂ１遺伝子には黒麹菌のフェリクリシン生合成の律速となるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００１９】
次に、ヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須な糸状菌のペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のものがクローニングされている。そこで、これらのシデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、非常に保存性の高い２つの領域を見いだし、それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの部分遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００２０】
得られた遺伝子断片をプローブとしてＡ．ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、陽性クローンが得られた。その結果、得られた部分遺伝子の全長ＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は７０６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。得られた遺伝子をnsb2と命名した。ｎｓｂ２遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００２１】
単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクロームの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する（E.S.Unkleら、Mol. Gen. Genet.,218, p. 99-104、1989）。この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株(硝酸を資化できない麹菌変異株:Nitrate Reductase欠損株)としては、例えば、Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707)を使用することができる。
以下に、本発明の詳細について述べる。
【００２２】
まず、鉄制限下でヒドロキシオルニチン類を基本構成アミノ酸とするシデロフォア生産が報告されている微生物の中で、Ｌ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているものを選択した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Ala-Val-Ile-Gly-(Ala or Ser)-Gly-Gln-Ser-(Ser or Ala)-(Thr or Ala)-Glu-(Met or Ile)-Phe-Met-Asn-Leu-(His or Pro)-Ser-(Arg or Gln)-Phe-Pro（配列番号５：図４８）、もう１つはAla-Leu-(Val or Arg)-Pro-Ser-Asp-Asp-(Ser or Thr)-(Gly or Pro)-Phe-Val-Asn-(Ser or Glu)-Ala-(Ala or Val)-Phe-Asp-Pro-Glu-Arg-Thr-Asp（配列番号６：図４９）である。これら２種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約１６０ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ遺伝子と高い相同性を示した。
【００２３】
得られた遺伝子断片の塩基配列をプローブとして、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長クローンが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基（配列番号１：図４、５）からなる蛋白質をコードしていた。プロモーター領域は配列番号２の１から１３７９ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の１３８０から２９３６ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の２９３７から３４８２ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の２２４６から２３０２ｂｐまでである。得られた遺伝子をｎｓｂ１（配列番号２：図６、７）と命名した。ｎｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ｎｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
【００２４】
得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたｎｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクリシン生合成の律速となるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。本菌株をEscherichia coli  NSID1と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７９として寄託した。本寄託菌株を用いることによって、１ｍＭ  ＩＰＴＧ誘導培養条件下でＴ７プロモーター支配下でｎｓｂ１蛋白質を大腸菌で生産提供することが出来る。
【００２５】
一方、ペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、既にクローニングされているUstilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Tyr-(Val or Leu)-Phe-Thr-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Pro-Lys-(Gly or Ala)-Val（配列番号９：図５２）、もう１つはAsp-(Thr or Arg)-Gln-Val-Lys-Val-(Arg or Asn)-Gly-Gln-Arg-(Ile or Met)-Glu-Leu-(Gly or Asp)-Glu（配列番号１０：図５３）である。これら２種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼ遺伝子と高い相同性を示した。
【００２６】
得られた遺伝子断片をプローブとして、Ａ．ｎｉｇｅｒのラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、得られた部分遺伝子の全長遺伝子をコードするクローンが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、７０６４アミノ酸残基（配列番号３：図８〜図３５）からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。プロモーター領域は配列番号４の１から１７２５ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の１７２６から２３０２４ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の２３０２５から２３１１４ｂｐまでである。イントロンは、配列番号４の１１１９１から１１２４０ｂｐと１９１７０から１９２２３ｂｐであった。得られた遺伝子をｎｓｂ２（配列番号６：図３６〜図４７）と命名した。ｎｓｂ２遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００２７】
以上の結果よりクローニングした遺伝子断片ｎｓｂ１、ｎｓｂ２は、黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成遺伝子であることが明らかとなり、両遺伝子はクラスターを形成していた。この遺伝子を用いて、黒麹菌のフェリクロームを高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能である。
【００２８】
【実施例１】
ｎｓｂ１遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の微生物由来Ｌ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。
【００２９】
一方のアミノ酸配列保存領域（１）は、配列番号５（図４８）に示されるアミノ酸配列を有し（配列中、左から１番目のＸａａはＡｌａ又はＳｅｒ、２番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、３番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｌａ、４番目のＸａａはＭｅｔ又はＩｌｅ、５番目のＸａａはＨｉｓ又はＰｒｏ、６番目のＸａａはＡｒｇ又はＧｌｎをそれぞれ、示す。）、他のアミノ酸配列保存領域（２）は、配列番号６（図４９）に示されるアミノ酸配列を有した（配列中、左から１番目のＸａａはＶａｌ又はＡｒｇ、２番目のＸａａはＳｅｒ又はＴｈｒ、３番目のＸａａはＧｌｙ又はＰｒｏ、４番目のＸａａはＳｅｒ又はＧｌｕ、５番目のＸａａはＡｌａ又はＶａｌを、それぞれ、示す。）。
【００３０】
これら保存配列（１）、（２）をもとに、２本の縮重オリゴヌクレオチドＤＮＡ合成プライマーＰ１、Ｐ２をそれぞれ合成した。プライマーＰ１の塩基配列を配列番号７（図５０）に示し、プライマーＰ２の塩基配列を配列番号８（図５１）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ｓはＧ又はＣ、ｗはＡ又はＴ、ｒはＡ又はＧ、ｙはＴ又はＣ、ｍはＡ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を示す。
【００３１】
上記した縮重プライマーＰ１、Ｐ２を用いて、Aspergillus niger IFO 4067株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応条件の一例は次のとおりである。
【００３２】
（ＰＣＲ条件）
・  ９６℃（５分）、１サイクル
・  ９６℃（２０秒）、４５℃（１分）、７２℃（３分）、３０サイクル
・  ７２℃（７分）、１サイクル
【００３３】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、約１６０ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼと相同性を示した。得られた部分遺伝子１６０−ｂｐをプローブとして黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＩＦＯ４０６７株のラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅラベリングキットを用いてプローブのフルオレッセンラベルを行い、約５０００個のファージクローンをスクリーニングした。得られた陽性クローンに含まれる全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。
【００３４】
その結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。プロモーター領域は配列番号２の１から１３７９ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の１３８０から２９３６ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の２９３７から３４８２ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の２２４６から２３０２ｂｐまでである。得られた遺伝子をｎｓｂ１と命名した。その塩基配列を配列番号２（図６、図７）に示し、それに対応するアミノ酸配列を配列番号１（図４、図５）に示す。
【００３５】
【実施例２】
ｎｓｂ２遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の糸状菌由来シデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須な糸状菌のペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のものがクローニングされている。そこでこれらのシデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、麹菌におけるペプチドシンテターゼ活性を担う遺伝子が取得できると考えた。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。
【００３６】
一方のアミノ酸配列保存領域（３）は、配列番号９（図５２）に示されるアミノ酸配列を有し（配列中、左から１番目のＸａａはＶａｌ又はＬｅｕ、２番目のＸａａはＧｌｙ又はＡｌａを、それぞれ、示す。）、他のアミノ酸配列保存領域（４）は、配列番号１０（図５３）に示されるアミノ酸配列を有した（配列中、左から１番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｒｇ、２番目のＸａａはＡｒｇ又はＡｓｎ、３番目のＸａａはＩｌｅ又はＭｅｔ、４番目のＸａａはＧｌｙ又はＡｓｐを、それぞれ、示す。）。
【００３７】
これら保存配列（３）、（４）をもとに、２本の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰ３、Ｐ４をそれぞれ合成した。プライマーＰ３の塩基配列を配列番号１１（図５４）に示し、プライマーＰ４の塩基配列を配列番号１２（図５５）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ｒはＡ又はＧ、ｙはＴ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を示す。
【００３８】
上記した縮重プライマーＰ３、Ｐ４を用いて、Aspergillus niger IFO 4067株より調製した染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。反応条件はｎｓｂ１と同様に行った。
【００３９】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、約８００ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、確かに上記Ｐ３、Ｐ４配列を含んでおり、相同性を検索した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼをコードする遺伝子と相同性を示した。得られた部分遺伝子８００−ｂｐをプローブとして黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅラベリングキットを用いてプローブのフルオレッセンラベルを行い、約５０００個のファージクローンをスクリーニングした。その結果、１つの陽性クローンが得られた。得られたクローンに含まれる全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。
【００４０】
その結果、本遺伝子は、７０６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。プロモーター領域は配列番号４の１から１７２５ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の１７２６から２３０２４ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の２３０２５から２３１１４ｂｐまでである。イントロンは、配列番号４の１１１９１から１１２４０ｂｐと１９１７０から１９２２３ｂｐであった。得られた遺伝子をｎｓｂ２と命名した。またｎｓｂ２遺伝子は、図１に示すようにＡ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００４１】
ｎｓｂ２遺伝子の塩基配列を配列番号４（図３６〜図４７）に示し、それに対応するアミノ酸配列を配列番号３（図８〜図３５）に示す。本遺伝子は、プローブとしてフルオレッセンラベル化した後、アスペルス・ニガー  ＩＦＯ  ４０６７株のラムダＥＭＢＬ３ファージを用いたゲノム遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができた。また、本遺伝子については、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上の位置を特定されているし、その塩基配列及びそれがコードする蛋白質のアミノ酸配列も本発明者らによって明らかにされているので、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体から分離することにより、本遺伝子を取得ることができ、本発明の実施は容易である。
【００４２】
【実施例３】
ｎｓｂ１遺伝子の大腸菌での大量発現と酵素アッセイ
ｎｓｂ１遺伝子の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を行った。ｎｓｂ１のｃＤＮＡの取得をまず試みた。具体的には３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Oligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ  ０．５μｇをもとに全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の１３８０から２９３３  ｂｐ）をＲＴ−ＰＣＲで増幅後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端断片を調製した。本断片をノバジェン社ｐＥＴ−２３ｂベクターのＨｉｎｃII部位へＴ７プロモーターと正方向にサブクローニングした。
【００４３】
本プラスミドをｎｓｂ１大腸菌高発現プラスミドｐＥＮＳ１（図２）とした。本プラスミドをノバジェン社大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体を３７℃でＯＤ０．６までＬＢ培地で培養後、最終１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてさらに３０℃で３時間培養した。得られた大腸菌の菌体内蛋白質から東洋紡のMag ExtractorHis-Tag kitを用いて精製した（図３）。得られた精製蛋白質を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）で抽出後、上清に最終１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−オルニチンを加え、３７℃で好気的に約２時間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸で反応停止後、遠心上清中のヒドロキシアミンをヨード酸化法（ＧｉｌｌａｍらAnal. Chem. 5:841-844、１９８１）に従って定量した。比活性は１分当たりに１ｎｍｏｌのヒドロキシアミンを産生する酵素量を１  ｕｎｉｔとして、菌体蛋白質ｍｇあたりの生産量を算出し、下記表１に示した。
【００４４】
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【００４５】
表１に示したようにＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が認められた。よって、ｎｓｂ１がフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードすることが明らかとなった。本菌株をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＮＳＩＤ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７９として寄託した。本寄託菌株を用いることによって、１ｍＭ  ＩＰＴＧ誘導培養条件下でＴ７プロモーター支配下でｎｓｂ１蛋白質を大腸菌で生産提供することが出来る。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ｎｓｂ１には、フェリクローム類生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。またクローニングした遺伝子断片ｎｓｂ２には、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼがコードされていた。ｎｓｂ１とｎｓｂ２はクラスターを形成していた。またこの遺伝子を用いて、フェリクローム類を高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム類生産が可能となった。本発明により大量生産可能となったフェリクローム類は非常に安全性が高く、食品、医薬、研究用試薬など様々な産業分野に利用が可能である。またｎｓｂ２にコードされるペプチドシンテターゼ蛋白質の各ドメインを、蛋白質工学的に組み換えることにより任意のペプチドを設計することも可能となる。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】黒麹菌アスペルギルス・ニガーのフェリクローム生合成遺伝子クラスターを示す。
【図２】ｎｓｂ１遺伝子の大腸菌発現プラスミドｐＥＮＳ１を示す写真である（図面代用写真）。
【図３】ｎｓｂ１大腸菌発現蛋白質の精製とＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターンを示す写真である（図面代用写真）。
【図４】オルニチンモノオキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】ｎｓｂ１遺伝子の塩基配列を示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】ペプチドシンテターゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図９】同上続きを示す。
【図１０】同上続きを示す。
【図１１】同上続きを示す。
【図１２】同上続きを示す。
【図１３】同上続きを示す。
【図１４】同上続きを示す。
【図１５】同上続きを示す。
【図１６】同上続きを示す。
【図１７】同上続きを示す。
【図１８】同上続きを示す。
【図１９】同上続きを示す。
【図２０】同上続きを示す。
【図２１】同上続きを示す。
【図２２】同上続きを示す。
【図２３】同上続きを示す。
【図２４】同上続きを示す。
【図２５】同上続きを示す。
【図２６】同上続きを示す。
【図２７】同上続きを示す。
【図２８】同上続きを示す。
【図２９】同上続きを示す。
【図３０】同上続きを示す。
【図３１】同上続きを示す。
【図３２】同上続きを示す。
【図３３】同上続きを示す。
【図３４】同上続きを示す。
【図３５】同上続きを示す。
【図３６】ｎｓｂ２遺伝子の塩基配列を示す。
【図３７】同上続きを示す。
【図３８】同上続きを示す。
【図３９】同上続きを示す。
【図４０】同上続きを示す。
【図４１】同上続きを示す。
【図４２】同上続きを示す。
【図４３】同上続きを示す。
【図４４】同上続きを示す。
【図４５】同上続きを示す。
【図４６】同上続きを示す。
【図４７】同上続きを示す。
【図４８】アミノ酸保存領域（１）のアミノ酸配列を示す。
【図４９】アミノ酸保存領域（２）のアミノ酸配列を示す。
【図５０】プライマーＰ１を示す。
【図５１】プライマーＰ２を示す。
【図５２】アミノ酸保存領域（３）のアミノ酸配列を示す。
【図５３】アミノ酸保存領域（４）のアミノ酸配列を示す。
【図５４】プライマーＰ３を示す。
【図５５】プライマーＰ４を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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