(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロプロジギオシンまたはその塩を有効成分として含有するメチシレン耐性黄色ブドウ球菌感染防御剤。
【請求項２】
有効成分がシクロプロジギオシン塩酸塩である請求項１記載の感染防御剤。
【請求項３】
シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas  denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)の産生するシクロプロジギオシン塩酸塩を用いる請求項２記載の感染防御剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なメチシレン耐性黄色ブドウ球菌の感染防御剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗生物質は、その作用機序によって細胞壁合成阻害剤（ペニシリン系、セフェム系など）、タンパク質合成阻害剤（アミノ酸糖体、マクロライド系、テトラサイクリン系など）、核酸合成阻害剤（ニュー・キノロン系など）などに分類されている。これらのうちの主流は、細胞壁合成阻害剤のセフェム系で市場の約50％の売り上げを占めている。これらの抗生物質は、1960年頃から開発され、抗菌スペクトルの拡大、抗菌力およびβ- ラクタマーゼに対する安定性の向上等を目的として改良が加えられ、その開発段階によって第１、第２、第３世代に分類されている。
すなわち、1960年代に開発されて第１世代セフェム系は、グラム陽性菌に強い抗菌力を示すが、グラム陰性菌に弱く、またβ−ラクタマーゼに不安定であった。1970年代に開発された第２世代セフェム系は、これらの欠点、すなわちその抗菌力がグラム陰性菌に弱く、またβ−ラクタマーゼに不安定である点が改良されている。続いて第３世代として開発されたセフェム系抗生物質では、β−ラクタマーゼに対して安定となり、今まで無効であった緑膿菌、セラチアなどにも抗菌力を示すようになった。しかし、グラム陽性菌に対する抗菌力は、第１世代及び第２世代の抗生物質よりも劣っている。現在グラム陽性菌、グラム陰性菌、特に緑膿菌に対して抗菌活性を有する第４世代抗生物質の開発が進んでいる。
【０００３】
一方、このような第３世代のセフェム系抗生物質に対して耐性菌が出現してきている。すなわち、第３世代のセフェム系抗生物質に対して耐性を示すメチシレン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が出現してきており、それが、入院患者から分離されるブドウ球菌の30〜80％を占めている (1991年日経のバイオテク編「日経バイオテクノロジ最新用語辞典91 224〜225 頁) 。
このようなメチシレン耐性黄色ブドウ球菌 (以下、ＭＲＳＡという）に対して抗菌力を示す抗生物質の開発が強く望まれている。しかし、現在までのところ、いくつかのアミノ酸糖体系の抗生物質がＭＲＳＡ抗生物質として開発されているにすぎない。
【０００４】
本発明者らは、このような現状に鑑み新規なＭＲＳＡ感染防御剤の開発について着目し、種々の化合物を用いてＭＲＳＡに対する抗菌作用を検討したところ、海洋細菌の１種のシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas  denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)の産生する赤色物質シクロプロジギオシン塩酸塩が、ＭＲＳＡの生育を特異的に抑制することを見出し、この化合物をＭＲＳＡ感染防御剤の有効成分として用いることについて検討した。
そして、この化合物から塩酸を除去した遊離のシクロプロジギオシンについても同様にＭＲＳＡの生育を抑制することを見出した。
従来、シクロプロジギオシンが抗菌活性や抗真菌活性を持つことは知られているが（Tetrahedron Letters 30 (13) 1725 (1989))、シクロプロジギオシン及びその塩酸塩の前記したようなＭＲＳＡに対する抗菌活性は全く知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のことからみて、本発明の課題は、新規なＭＲＳＡ感染防御剤を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、シクロプロジギオシン及びその塩類の新規な用途を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記の課題を解決するためになされたものであって、シクロプロジギオシン (式I)、シクロプロジギオシン塩酸塩 (式II) あるいはその他の塩を有効成分として含有するメチシレン耐性黄色ブドウ球菌感染防御剤に関する。
【０００７】
【化１】
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【０００８】
【化２】
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【０００９】
このような化合物としては、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩等) 、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、ピクリン酸塩、スルホン酸塩、テトラフルオロボレート塩等を例示することができる。
【００１０】
シクロプロジギオシンは、海洋細菌のアルテロモナス  ルブラ、(Alteromonasrubra)(Tetrahedron  Letters 24 (26),2701-2704(1983))あるいはベネッケアガゾゲネス(Benekea gazogenes) (同上誌  24(27),2797-2798(1983)) から産生される赤い色素であり、また 2- メチルシクロヘキサノンを出発物質として次の工程を経て合成する方法も知られている(Tetrahedron  Letters 25,(13) 1387-1388(1984)).
【００１１】
【化３】
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【００１２】
シクロプロジギオシン塩酸塩等の前記化合物は、このようにして得られたシクロプロジギオシンを塩の形に変換することによって得ることができる。塩とする手段は、通常の塩形成手段を用いることができる。
しかし、これらの海洋細菌から得られるシクロプロジギオシンは、数種のプロジギオシン類を爽雑物の形で産生しているので、抽出物のなかからシクロプロジギオシン単体を単離するには煩雑な単離操作を必要とした。
また、前記化学合成によってシクロプロジギオシンを製造する方法は多工程にわたる複雑な工程を必要としていた。
【００１３】
本発明者らは、海洋細菌の代謝産物について検討を行なっていたところ、シュードアルテロモナス  デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas  denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)がシクロプロジギオシン塩酸塩を、他のプロジギオシン類の爽雑物を含むことなく産生することを見出した。従って、前記菌体を培養するとシクロプロジギオシン塩酸塩が菌体内及び培地中に大量に生成蓄積されるので、これを高純度で大量に作ることができる。このシクロプロジギオシン塩酸塩は、カラムクロマトグラフィー処理することによって容易に塩化水素をはずし塩酸塩のない遊離のシクロプロジギオシンを得ることができる。そして、この遊離シクロプロジギオシン (シクロプロジギオシン塩酸塩から塩化水素をはずした式(I) で示される化合物をいう) をリン酸、硫酸等の酸で処理することによって前記した塩類とすることができる。
本発明で使用するシクロプロジギオシン塩酸塩、その他の塩は、水に可溶性であり、蒸留水等に溶解して使用することができる。従って、注射剤、ドリンク剤等としても用いることができる。
【００１４】
本発明は、シクロプロシギオシン、シクロプロジギオシン塩酸塩あるいはその他の塩がＭＲＳＡに対し抗菌活性を有するという知見に基づいてなされたものである。
ここに本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩のＭＲＳＡに対する抗菌活性を実験例をあげて示す。
【００１５】
〔実験１〕
(1) 原理
寒天平板培地に被検薬物を倍々になるように希釈して加え、この平板培地に表1 に示した被検菌を塗布した。培養後、被検菌の発育を阻止した被検薬物の最小濃度(minimum inhibitory cocentration; MIC)を決定した (Chemotherag (Tokyo) 29, 76〜79日本化学療法学会最小発育阻止濃度 (MIC)測定委員会最小発育阻止濃度 (MIC)測定法再改定について) 。
【００１６】
(2) 実験方法
1)  被検薬物希釈列の作成
i)  シクロプロジギオシン塩酸塩
後記の方法で製造されたシクロプロジギオシン塩酸塩 1.2mgを精秤し、ＤＭＳＯ（和光純薬製)240μl に溶解して 5mg/ml のシクロプロジギオシン塩酸塩溶液 (Ａ溶液）を調製した。これを、滅菌プラスチックシャーレ (90×20mm、以下同じ) に、 100μl,50μl,25μl ずつとり、ミュラーヒントンＳ寒天培地（ＳＴＡ培地) ((株) 栄研製）を10ml加え、50μg/ml, 25μg/ml, 12.5μg/mlの希釈列を作成した。
次に、Ａ溶液50μl にＤＭＳＯ 750μl を加えて312.5 μg/mlのシクロプロジギオシン塩酸塩溶液（Ｂ溶液) を調製した。滅菌プラスチックシャーレに、 200μl, 100μl,  50μl,  25μl ずつとり、ＳＴＡ培地を10ml加えて、6.25μg/ml, 3.13μg/ml, 1.56μg/ml, 0.78μg/mlの希釈列を作成した。さらに、Ｂ溶液25μl にＤＭＳＯ 375μl を加えて19.5μg/mlのシクロプロジギオシン塩酸塩溶液（Ｃ溶液) を調製した。これを滅菌プラスチックシャーレに 200μl, 100μl,50μl とり、ＳＴＡ培地を10ml加えることによって0.39μg/ml,  0.2μg/ml, 0.1 μg/mlの希釈列を作成した。またＤＭＳＯ 200μl を滅菌プラスチックシャーレにとり、ＳＴＡ培地を10ml加え、これをコントロールとして用いた。
【００１７】
ii) メチシレン(methicillin)
メチシレン((株) 万有製薬製、力価  850 mg/ml) 5.88 mgを精秤し、力価を考慮して滅菌水 1mlに溶解することによって 5mg/ml のメチシレン溶液（Ａ溶液）を調製した。Ａ溶液を滅菌したプラスチックシャーレに 200μl, 100μl,  50μl,  25μl とり、ＳＴＡ培地を10ml加えることによって 100μg/ml, 50μg/ml, 25μg/ml, 12.5μg/mlの希釈列を作成した。
【００１８】
iii)ノルフロキサシン(norfloxacin)
ノルフロキサシン((株) 杏林製薬製、力価 1000 mg/ml) 5mgを精秤し、0.1 N NaOH 1mlに溶解し5mg/mlのノルフロキサシン溶液（Ａ溶液）を調製した。Ａ溶液を滅菌したプラスチックシャーレに 200μl, 100μl, 50 μl とり、ＳＴＡ培地を10ml加えて 100μg/ml, 50μg/ml, 25μg/mlの希釈列を作成した。
【００１９】
次にＡ溶液 100μl に滅菌水 700μl を加えることにより、 625μg/mlのノルフロキサシン溶液 (Ｂ溶液）を調製した。これを、滅菌プラスチックシャーレに 200μl, 100μl,  50μl とり、ＳＴＡ培地を10ml加えることにより、12.5μg/ml, 6.25μg/ml, 3.13μg/mlの希釈列を作成した。さらに、Ｂ溶液 100μl に滅菌水 700μl を加えることにより、 78.13μg/mlのノルフロキサシン溶液 (Ｃ溶液）を調製した。これを、滅菌プラスチックシャーレに 200μl, 100μl,  50μl とり、ＳＴＡ培地を10ml加えることにより、1.56μg/ml, 0.78μg/ml, 0.39μg/mlの希釈列を作成した。Ｃ溶液100 μl に滅菌水700 μl を加えることにより、9.8 μg/mlのノルフロキサシン溶液 (Ｄ溶液）を調製した。滅菌プラスチックシャーレに 200μl, 100μl,  50μl をとり、これにＳＴＡ培地を10ml加えることにより、 0.2μg/ml,  0.1μg/mlの希釈列を作成した。
【００２０】
2) 菌液の調製
-80 ℃のフリーザー中で保存した表１の菌株を、感受性ブイヨン培地 (ＳＴＢ培地)( (株) 栄研製) 10mlに接種し、37℃のふ卵器内で18時間培養した。得られた菌液を生理的食塩水で100 倍に希釈した。
3) 菌の接種とＭＩＣの測定
先に調製した薬物希釈系列を含むＳＴＡ平板培地上に、菌液希釈液 5μl をイノキュレーターで接種した。接種した菌液が寒天培地中に浸透した後、37℃のふ卵器内で培養した。18時間後、完全に発育が阻止された最小濃度をもってＭＩＣ値とした。
【００２１】
この結果を表１に示した。
【表１】
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【００２２】
表１に示すようにシクロプロジギオシン塩酸塩はグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対しキノロン系抗菌剤のノルフロキサシンと同程度の抗菌力を有し、メチシレン耐性菌に対しては、ノルフロキサシンにくらべて特異的に高い抗菌力を示した。
さらに、シクロプロジギオシン塩酸塩について京都薬科大学微生物学教室に保管されるＭＲＳＡ耐性菌株についてその抗菌力を検討した。
なお、コントロールとしてメチシレンを使用した。この結果を表２に示した。表２にみられるようにシクロプロジギオシン塩酸塩がメチシレン耐性菌に対して高い抗菌力を示した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
本発明におけるシクロプロジギオシン、シクロプロジギオシン塩酸塩あるいはその他の塩は、これをそのままＭＲＳＡ感染防御剤として用いることができるが、通常は、賦形剤、その他の補助剤とともに適当な製剤の形にして経口あるいは非経口の形で投与される。経口剤としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドリンク剤等がある。また、非経口製剤には、坐剤、パップ剤、注射剤等がある。注射剤は、筋肉注射、動脈注射あるいは静脈注射の形の剤型とするとよい。また、散布剤として通常の形態にしてＭＲＳＡの発育するような場所、例えば病院に散布することもできる。
これらの賦形剤あるいはその他の補助剤としては、乳糖、しょ糖、各種のでん粉、ぶどう糖、セルロースあるいはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が用いられる。また、蒸留水等の溶媒を用いることができる。これらは、製剤手段として通常知られている手段で経口あるいは非経口の製剤にすることができる。  投与量は、症状、年齢、性別等によって相違するが、経口投与の場合は、シクロプロジギオシン、その塩酸塩あるいはその他の塩を１日当り 0.1〜0.5mg/体重kg、非経口投与の場合は、注射剤で１日当り 0.1〜0.5mg/体重kgを投与することが望ましい。また、散布剤として散布する場合は、濃度0.01〜0.1mg/l の散布液として適宜散布するとよい。
【００２５】
これらの化合物の毒性については、シクロプロジギオシン塩酸塩をＩＣＲ雌性マウス（５週令、体重25〜29g)の腹腔内に投与したところ LD50 値は10mg以上であった。
また、シクロプロジギオシン塩酸塩をリン脂質平面膜法 (1992年７月10日 (株) 東京化学同人発行、 (財) 日本生化学会編新生化学実験講座「生体膜と膜輸送 (上) 」第 181〜187 頁) により比抵抗を検討した。その結果を図１に示した。この図に示されるようにイオノフォアのひとつであるカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)に比較して、イオノフォア活性が示さなかったことからみて、毒性がきわめて低いものと判断される。
【００２６】
本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩の製造例を示す。
バクトペプトン(Difco)2.5g 、バクトイーストエクストラクト(Difco)0.5g 及びリン酸鉄(III)n水和物（和光純薬)0.1g を天然海水1L中に溶解した後、滅菌し、その 3ml中に、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)  AK-1株(FERM P-15771)を、接種し、15〜20℃で１日間振盪培養を行なった。得られた培養物を上記組成の培地 600mlに移し、１日間培養を行なった。
【００２７】
このようにして培養された培地を22,000 rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体は５〜10g が回収された。この菌体にアセトン- ジエチルエーテル(4:1) 混液を加え200 振盪/minで色素 (シクロプロジギオシン塩酸塩) を抽出した。抽出液を12,000 rpmで10分間遠心分離して上清液を得た。この上清液に無水硫酸マグネシウムを加えて水分を吸着除去し、この硫酸マグネシウムを濾過して除去した。濾液を乾固するまで濃縮し、これを薄層クロマトグラフィーによって分析した(Kieselgel 60F254;  展開溶媒ベンゼン: エーテル＝1:1)。Rf 0.20 に単一のスポットが得られた。この濃縮物を塩化メチレン5ml に溶解し、この溶液から温度差を利用して再結晶した。生成した結晶をペンタンで洗浄し、吸引濾過して結晶 5mgを採取した。
この結晶は、赤色の金属光沢をもった針状結晶であって、融点はなく、約 230℃で分解した、この結晶を、元素分析し、またその Mass スペクトル、UVスペクトル、IRスペクトル、 H-NMRスペクトルを解析したところ、シクロプロジギオシン塩酸塩（式II) のそれと一致し（Tetrahedron  Letters, 24 (26), 2701-2704(1983)) 、同化合物であることが同定された。
【００２８】
このようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩 5mgを塩化メチレン10mlに溶解し、シリカゲルカラム (口径 1.5cm，長さ12cm, 流速1.2ml/min)を通過させ、溶媒を留去して遊離シクロプロジギオシン 4mgを得た。この物質が遊離シクロプロジギオシンであることは H-NMR等のデータによって確認された。
【００２９】
次に実施例として製剤例を示す。
【実施例１】
シクロプロジギオシン塩酸塩            0.5g
乳糖                                400  g
ヒドロキシプロピルセルロース         50  g
澱粉                                 50  g
上記の成分を混合し、常法により顆粒剤を製造した。
【００３０】
【実施例２】
シクロプロジギオシン塩酸塩           20  mg
Tween 80                              0.4 g
蒸留水                              200  ml
シクロプロジギオシン塩酸塩20mgをTween 80 0.4g とともに蒸留水 200mlに溶解し、20mlのアンプルに充填し、加熱殺菌して静脈注射剤を調製した。
【００３１】
【実施例３】
シクロプロジギオシン塩酸塩          20 mg
エタノール                         200 ml
シクロプロジギオシン塩酸塩20mgをエタノール 200mlに溶解し、この溶液を充填容器に充填し散布剤を調製した。
なお、実施例１〜３のシクロプロジギオシン塩酸塩は、上記シクロプロジギオシン塩酸塩の製造法で得られたものを使用した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩等のシクロプロジギオシン塩のＭＲＳＡに対する抗菌力を利用してＭＲＳＡ感染防御剤としてＭＲＳＡ感染者あるいは感染のおそれあるものに対して経口または非経口で投与してこの疾病の防御あるいは治療することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】シクロプロジギオシン塩酸塩のリン脂質平面膜の比抵抗を示す。
【図１】
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