(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノム中に外来ＤＮＡ配列が挿入される親ウイルスに由来する少なくとも２０ｋｂの組換えウイルスベクターを原核細胞において作製する方法であって、(i)親ウイルスの上記ゲノムのすべてまたは一部を含んだ第一ＤＮＡ断片と、(ii)(i)に相同的なフランキング配列ＡおよびＢにより囲まれた上記外来ＤＮＡ配列を含んだ第二ＤＮＡ断片との分子間組換えにより作製し、原核細胞が大腸菌のｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＢＣ株に由来し、かつ親ウイルスがアデノウイルスである方法。
【請求項２】
親ウイルスがヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタまたはサル起源のアデノウイルスであるか、あるいはハイブリッドアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親ウイルスがイヌ起源のＣＡＶ−２型アデノウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
親ウイルスがヒト起源の血清型Ｃアデノウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
親ウイルスがヒト起源の５型アデノウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複製に欠陥のある組換えウイルスベクターの作製に関する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域から選択される、複製に必須な少くとも１つの領域のすべてまたは一部を欠いた組換えアデノウイルスベクターの作製に関する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組換えアデノウイルスベクターがＥ３領域のすべてまたは一部を更に欠いている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
親ウイルスが、イヌ起源のＣＡＶ−２型アデノウイルスおよびヒト起源の５型アデノウイルスから選択されるアデノウイルスであり、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域から選択される複製に必須な少なくとも１つの領域のすべてまたは一部を欠いた複製に欠陥のある組換えアデノウイルスベクターを作製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
外来ＤＮＡ配列が、凝固因子、成長ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍抑制ポリペプチド、細胞レセプター、細胞レセプターに対するリガンド、プロテアーゼ阻害剤、抗体、毒素、免疫毒素、ジストロフィンおよびＣＦＴＲタンパク質のような細胞イオンチャンネルに関与するポリペプチドからなる群より選択される治療対象のポリペプチドをコードしている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
相同的フランキング配列ＡおよびＢが、長さ１０ｂｐ〜１０ｋｂ、有利には２０ｂｐ〜５ｋｂ、好ましくは３０ｂｐ〜２ｋｂ、絶対的に好ましくは４０ｂｐ〜１ｋｂである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一ＤＮＡ断片が外来配列の挿入領域で線状化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも３０ｋｂの組換えウイルスベクターの作製に関する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
(i)親ウイルスのゲノムのすべてまたは一部を含んだ第一ＤＮＡ断片、(ii)５’末端にフランキング配列Ａを備えた対象ＤＮＡ配列の第一部分を含んだ第二ＤＮＡ断片、および(iii)３’末端にフランキング配列Ｂを備えた対象ＤＮＡ配列の第二部分を含んだ第三ＤＮＡ断片（上記第二および第三ＤＮＡ断片はそれらの各３’および５’末端に相同的配列を含んでいる）の間の分子間組換えによる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１以上のヌクレオチドまたは外来ＤＮＡ配列の欠失、変異および／または置換による修飾をウイルスゲノム中に導入する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
大腸菌のｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＢＣ株に由来する原核細胞がＢＪ５１８３株である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えウイルスベクターを含む感染性ウイルス粒子の作製方法であって、
（ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を実施することによって組換えウイルスベクターを得、該得られた組換えウイルスベクターを哺乳動物細胞中に導入してトランスフェクトされた哺乳動物細胞を作製し、
（ｂ）上記トランスフェクトされた哺乳動物細胞が上記ウイルス粒子の生産を行うために適切な条件下で培養され、そして
（ｃ）上記ウイルス粒子が工程（ｂ）で得られた細胞培養物から回収されることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、原核細胞中インビトロでウイルスベクターを作製するための方法と、治療用、特に遺伝子療法用向けの感染性ウイルス粒子を作製するためのその適用に関する。
遺伝子療法でヒト疾患を治療する可能性は、数年間で理論的考察の段階から臨床適用の段階まで変わってきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）についてコードする遺伝子に影響を与える変異の結果として遺伝的に免疫不全となった患者で１９９０年９月にアメリカ合衆国（ＵＳ）で開始された。この最初の実験が比較的成功したため、様々な遺伝的または後天性疾患（感染疾患、および特にエイズのようなウイルス疾患、またはがん）に関する新たな遺伝子治療プロトコールの開発を促した。これまでに記載されてきたプロトコールの大部分では、治療遺伝子を治療される細胞に移してそこでそれを発現させるために、ウイルスベクターを用いる。
現在まで、レトロウイルスベクターは特にそれらゲノムの単純さのために最も広く用いられている。しかしながら、それらの制限されたクローニング能力とは別に、それらはそれらの系統的使用を制限する２つの大きな欠点を呈する：一方でそれらは主として分裂細胞に感染し、他方で宿主細胞のゲノムでのランダムなそれらの組込み結果、挿入変異誘発のリスクは些細なものではない。この理由から、多くの科学チームは他のタイプのベクターを開発する努力をしており、その中ではアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルスおよびヘルペスウイルスから得られるものが挙げられる。一般的に言えば、それらの組織とそれらの感染サイクルは、当業者に利用しうる文献で詳細に記載されている。
この関係から、アデノウイルスベクターの使用は有望な代替法であるとみられている。アデノウイルスは多くの動物種で証明されており、広い宿主範囲を有し、病原性をほとんど有さず、それらが休止細胞で複製して非組込み性であるためレトロウイルスに伴う欠点を示さない。説明すると、それらのゲノムは、ウイルス複製に必要な初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４）および後期構造遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）双方で約３０以上の遺伝子を有する約３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる（図１参照）。
一般的に言えば、アデノウイルスベクターはウイルス遺伝子の少くとも１つの部分（特にウイルス複製に必須なＥ１領域）の欠失により得られ、治療遺伝子で置き換えられる。こうして、それらは、複製に欠陥があるが宿主細胞に感染できるウイルスベクター粒子を作るために欠失ウイルス機能をin transで供給する、相補系と呼ばれる細胞系で増殖される。Ｅ１機能に欠陥があるアデノウイルスを補う、ヒト胎児性腎臓細胞から樹立された２９３系（Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36,59-72）が常用される。
アデノウイルスベクターの作製技術は文献で詳細に記載されている（特に、Graham and Prevec,Methods in Molecular Biology,Vol.7;Gene Transfer and Expression Protocols;Ed: E.J.Murray,1991,The Human Press Ins.,Clinton,NJ参照）。最も多く用いられる方法の１つでは、アデノウイルス挿入領域内でサブクローニングされる対象遺伝子とアデノウイルスゲノムとを有した細菌プラスミドでトランスフェクトされた相補細胞において組換えアデノウイルスベクターを作製する。通常、後者は親ウイルスＤＮＡの感染力を減少させて組換えアデノウイルスの単離効率を増加させるために適切な制限酵素で開裂される。しかしながら、それにもかかわらず、非経口源の感染性ウイルス粒子の実質的バックグラウンドが観察され、得られるプラークの分析の特に困難な（各プラークは増幅されて個別に分析されねばならないため、時間およびコスト観点から困難な）作業を要する。これは親ウイルスが組換えアデノウイルスよりも選択的な利点を示すとき、例えば後者が対象の大サイズ遺伝子（VIII因子、ジストロフィン）の挿入結果として親ウイルスよりも遅く複製するときに問題であり、それを得る確率を比例的に減少させてしまう。
分子生物学の標準技術により作製され、かつ組換えアデノウイルスベクターの５′および３′部分を各々有する２つのＤＮＡ断片間の結合も用いることができる。相補（complementation）細胞中への結合混合物のトランスフェクションは、組換えアデノウイルスのゲノムをキャプシド化（encapsidate）して感染性粒子を形成させることを理論上可能にする。この技術は低効率であり、その適用は制限された数の適切で独特な制限部位により限定される。
５型アデノウイルスのゲノムを有するプラスミドとアデノウイルス配列ＡおよびＢで囲まれた外来ＤＮＡ配列を有するインサートとの分子間相同組換えによりEscherichia coli（大腸菌）で組換えアデノウイルスベクターを作製できることがここに示された（図２）。この方法では外来配列によりＡおよびＢ間に位置する標的領域のアデノウイルスゲノムで置換を導く。適切な相補系中へのこうして作製された組換えアデノウイルスベクターのトランスフェクションでは感染性ウイルス粒子を生じ、これは宿主細胞を感染させるために事前の精製工程なしで用いることができる。バックグラウンド（親ウイルス粒子による汚染）は減少するかまたは消失さえもする。加えて、意外にも、大腸菌ｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＢＣ株の使用は２つのＤＮＡ断片間の分子間組換えを促進する上で特に有利であることがわかった。
本発明の方法は、相同組換えに関与する原核細胞の内在酵素活性の利用に基づく。この分子間組換え技術は、細菌ベクター中への小さなインサートのクローニング（Bubeck et al.,1993,Nucleic Acids Research,21,3601-3602）または分子内組換えによるハイブリッド遺伝子の作製（Calogero et al.,1992,FEMS Microbiology Letters,97,41-44 ;Caramori et al.,1991,Gene,98,37-44）について既に記載されている。しかしながら、この組換え技術は（感染性ウイルス粒子中にキャプシド化することができる）感染性ウイルスベクターを作製するために原核細胞で用いられたことがなかった。
本発明の方法は、速くて特に効率的であり、インビトロで少ない操作数を要するだけであるという、従来の技術にはない利点を有する。更に、それはＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）により作製されたＤＮＡ断片と共に用いてもよく、それによりウイルスゲノムの挿入領域中に外来ＤＮＡ配列をサブクローニングする工程を避けることができる。最後に、それは文献で明確に指摘されたバックグラウンドの問題に対して有利な解決策を与える。その結果、それは大サイズウイルスまたは大サイズ外来ＤＮＡ配列の挿入が考えられるウイルスに由来するベクターで特に効果的であることがわかる。
したがって、本発明の主題は、そのゲノム中に外来ＤＮＡ配列が挿入される親ウイルスに由来する組換えウイルスベクターを、（ｉ）親ウイルスの上記ゲノムのすべてまたは一部を含んだ第一ＤＮＡ断片と、（ii）（ｉ）に相同的なフランキング配列ＡおよびＢにより囲まれた上記外来ＤＮＡ配列を含んだ第二ＤＮＡ断片との分子間組換えにより、原核細胞において作製する方法である。
本発明の目的から、組換えウイルスベクターは、外来ＤＮＡ配列をウイルスゲノムの適切な部位に有して発現させるように修飾された親ウイルスから得られる。本発明の関係で用いることができる親ウイルスは、例えばアルファウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアまたはカナリヤポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および最も具体的にはアデノウイルスである。
この関係において、親アデノウイルスの選択の幅は非常に広い。それはヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタまたはサル起源のアデノウイルスでも、あるいは異なる起源のアデノウイルスゲノム断片を含んだハイブリッドアデノウイルスであってもよい。非常に特別な優先性がヒト起源の血清型Ｃアデノウイルスと、好ましくは２型または５型アデノウイルス、あるいはＣＡＶ−１もしくはＣＡＶ−２（イヌ）、ＤＡＶ（トリ）またはＢＡｄ（ウシ）タイプの動物起源のアデノウイルスに与えられる。これらのウイルスおよびそれらのゲノムは文献で記載されている（例えばZakharchuk et al.,1993,Arch.Virol.,128,171-176 ;Spibey and Cavanagh,1989,J.Gen.Virol.,70,165-172;Jouvennu et al.,1987,Gene,60,21-28;Mittal et al.,1995,J.Gen.Virol.,76,93-102参照）。
本発明による方法の目的は、宿主細胞への外来ＤＮＡ配列のトランスファー及びその中でのその発現のために組換えウイルスベクターを作製することである。
“外来ＤＮＡ配列”とは、コード配列とそのコード配列を発現させる調節配列とを含んだ核酸を意味すると理解され、コード配列とは本発明で用いられる親ウイルスのゲノムに通常存在しないか、またはそれらが存在するにしても異なるゲノム関係にある配列のことである。本発明の関係において、外来ＤＮＡ配列はおそらく１以上の遺伝子から構成されている。調節配列はいかなる起源であってもよい。
好ましくは、外来ＤＮＡ配列は、後で対象タンパク質に翻訳されるアンチセンスＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡについてコードできる。それはゲノムタイプ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）タイプでも、または混合タイプ（少くとも１つのイントロンが欠失されているミニ遺伝子）でもよい。それは成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に分泌されるはずの前駆体についてコードでき、結果的にそれにはシグナルペプチド、多様起源の配列の融合から得られるキメラタンパク質、あるいは改善または改変された生物学的性質を示す天然タンパク質の変異体がある。このような変異体は、天然タンパク質についてコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの変異、欠失、置換および／または付加により得られる。
本発明の関係においては、以下を用いることが有利である：
−インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン、特にＩＬ−２、ＩＬ−６またはＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とコロニー刺激因子（ＣＳＦ）のようなサイトカインまたはリンホカインについてコードする遺伝子；
−病原性生物（ウイルス、細菌または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識されるレセプターのような細胞レセプター、または細胞レセプターに対するリガンドについてコードする遺伝子；
−成長ホルモン（ＨＧＦ）についてコードする遺伝子；
−VIII因子およびIX因子のような凝固因子についてコードする遺伝子；
−ジストロフィンまたはミニジストロフィンについてコードする遺伝子；
−インスリンについてコードする遺伝子；
−ＣＦＴＲタンパク質（嚢胞性繊維症膜貫通型調節タンパク質）のような細胞イオンチャンネルに直接的または間接的に関与するポリペプチドについてコードする遺伝子；
−病原性生物のゲノムに存在する病原性遺伝子、または発現が調節解除された細胞遺伝子、例えばがん遺伝子、により生産されるタンパク質の活性を阻害することができるアンチセンスＲＮＡまたはタンパク質についてコードする遺伝子；
−α１−抗トリプシンまたはウイルスプロテアーゼの阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤についてコードする遺伝子；
−例えば、標的配列と結合する上で天然タンパク質と競合してＨＩＶの複製を妨げることができるＨＩＶウイルスＴＡＴタンパク質のトランス優性変種のような、生物学的機能を損なうように変異された病原性タンパク質の変種についてコードする遺伝子；
−宿主細胞の免疫性を増加させるような抗原性エピトープについてコードする遺伝子；
−抗がん性質を有するポリペプチド、特にｐ５３タンパク質のような腫瘍サプーレッサーについてコードする遺伝子；
−主要組織適合性複合体クラスＩおよびのIIタンパク質についてコードする遺伝子と、これら遺伝子の発現を調節するタンパク質についてコードする遺伝子；
−細胞酵素または病原性生物により生産されるものについてコードする遺伝子；
−自殺遺伝子。ＨＳＶ−１  ＴＫ遺伝子について更に具体的に説明する。ウイルスＴＫ酵素はあるヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビルまたはガンシクロビル）について細胞ＴＫ酵素よりも顕著に大きな親和性を示す。それはそれらを一リン酸化分子に変換するが、これ自体は細胞酵素により毒性であるヌクレオチド前駆体に変換されうる。これらのヌクレオチドアナログでは、合成の過程でＤＮＡ分子に、このため主として複製をうける細胞のＤＮＡに組み込むことができる。この組込みで、がん細胞のような分裂細胞を特異的に破壊することができる。
−抗体、抗体断片または免疫毒素についてコードする遺伝子；
−β−ガラクトシダーゼについてコードするＬａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子のようなリポーター遺伝子
このリストは制限的なものではなく、他の遺伝子も天然で同様に用いてよい。
加えて、本発明で用いられる外来ＤＮＡ配列には、非治療遺伝子、例えばトランスフェクトされた宿主細胞を選択または同定することができる選択マーカーについてコードする遺伝子も含む。抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼについてコードする）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子またはｇｐｔ（キサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子が挙げられる。
当然、本発明で用いられる遺伝子は宿主細胞でその発現に適した要素のコントロール下に置いてもよい。“適した要素”とは、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）へのその転写とタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に必要な要素の組を意味すると理解される。転写に必要な要素の中では、プロモーターが特に重要と思われる。後者には構成プロモーターまたは調節プロモーターがあり、それは真核細胞または更にはウイルス起源の遺伝子から単離してもよい。一方、それは問題の遺伝子の天然プロモーターでもよい。一般的に言えば、本発明で用いられるプロモーターは調節配列を含むように修飾してもよい。組織特異的プロモーターの例としては、リンパ球宿主細胞中で発現させることが求められたときの免疫グロブリン遺伝子、および肝臓特異性発現のためのα１−抗トリプシン遺伝子の場合が挙げられる。ＨＳＶ−１  ＴＫ（ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ）とネズミまたはヒトＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子の構成プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲまたはアデノウイルスＭＬＰプロモーター、特にヒトアデノウイルスタイプ２のプロモーターも挙げられる。
本発明による方法では、分子間相同性組換えメカニズムを用いる。一般的に言えば、それは２つのＤＮＡ断片間の相同的配列の交換からなる。これらの配列は同一でもまたは実質的に相同性であってもよい。換言すれば、配列ＡおよびＢと第一ＤＮＡ断片の対応部分との相同性の程度は変動してもよいが、分子間組換えを行えるほど十分でなければならない。本発明の目的から、それは好ましくは７０％以上、有利には８０％以上、好ましくは９０％以上であり、絶対的に好ましくは１００％の領域である。更に、短い相同性の領域（配列ＡおよびＢと第一ＤＮＡ断片におけるそれらの相同的配列とで共通する少くとも１０の連続ヌクレオチド）で十分かもしれない。本発明の関係において、配列ＡおよびＢの長さは、好ましくは１０ｂｐ〜１０ｋｂ、有利には２０ｂｐ〜５ｋｂ、好ましくは３０ｂｐ〜２ｋｂ、絶対的に好ましくは４０ｂｐ〜１ｋｂである。
有利な態様によれば、本発明による方法では外来配列によって配列ＡおよびＢに相同的な第一ＤＮＡ断片の配列間に位置する遺伝物質の置換を行う。この分子間交換では原核細胞ベクター（プラスミド、コスミドまたはファージ）の形で環状組換えウイルスベクターを作製して、原核細胞でその操作および／またはその増殖を行うことができる。本発明の関係で用いられるメカニズムの態様は図２で説明されている。
外来配列の挿入領域はウイルスゲノムのどの箇所に位置してもよいが、複製に必要なin cisで作用する領域を避けることが好ましい。これらの領域には、特にレトロウイルスの場合だと５′および３′ＬＴＲとキャプシド化シグナル、アデノウイルスだと５′および３′ＩＴＲとキャプシド化領域を含んでいる。挿入領域は選択された相同的配列ＡおよびＢに応じて様々な位置に向けてもよい。
上記のように、第一ＤＮＡ断片は本発明の関係で用いられる親ウイルスのゲノムのすべてまたは一部を含んでいる。これは野生型ウイルスのゲノムでも、あるいは１以上ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換により修飾されたそれに由来するウイルスのゲノムでもよい。特に、１以上の遺伝子は問題のゲノムから全部または一部欠失させてもよい。
第一ＤＮＡ断片は慣用的ベクターに含まれることが好ましい。後者の選択幅は非常に広いが、ｐＢＲ３２２、ｐポリIIまたは別にｐポリIII*I（Lathe et al.,1987,Gene,57,193-201）がより具体的に挙げられる。本発明による方法の有利な態様によれば、第一ＤＮＡ断片は挿入のターゲッティングが考えられる領域で線状化されることが好ましい。特に、それは１以上の制限酵素で開裂され、その部位は配列ＡおよびＢと相同的な第一ＤＮＡ断片の配列間に位置し、これら後者の内部にもあるが、この態様は好ましくない。採用された親ウイルスに応じて用いられる制限部位の選択は当業者の能力に属する。有利には、第一ＤＮＡ断片で強く表れない部位、特に独特な部位、を用いることが好ましい。更に、このような部位は特定的変異誘発の標準技術により作ることができる。
本発明で用いられる第二ＤＮＡ断片は、特に分子間組換えに関与する配列ＡおよびＢにより囲まれた外来ＤＮＡ配列を有している。直鎖状ＤＮＡ断片を用いることが好ましい。それはＰＣＲにより作製して、いずれかのベクターから切り出しても、あるいは合成でまたは当業界の分野でいずれか慣用的な方法により作製してもよい。例として、本発明の関係で用いられる第二ＤＮＡ断片は、５′末端に配列ＡおよびＢを備えた適切なプライマーを用いて、従来のベクター、ゲノムライブラリーまたは適切なｃＤＮＡから外来ＤＮＡ配列の増幅により得られる。加えて、第二ＤＮＡ断片はその５′および３′末端にプラスミド配列を含んでもよく、これはそれらが第一ＤＮＡ断片に含まれるプラスミド配列と相同的であれば配列ＡおよびＢによって場合により用いられる。
本発明による目的によれば、本発明による方法は複製に欠陥のある組換えウイルスベクターの作製のために行われる。この用語は宿主細胞で自律感染サイクルを行えないベクターを表す。通常、これらの欠陥ベクターのゲノムは複製に必須な１以上の遺伝子、初期遺伝子および／または後期遺伝子を欠いている。それらは変異（１以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換）により全部または一部欠失させても、あるいは無機能化させてもよい。この関係において、本発明による方法によればＥ１、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４領域のすべてまたは一部を欠いた組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。
説明のために、下記態様が挙げられる。Ｅ１領域の代わりに外来ＤＮＡ配列の挿入が考えられる５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ５）由来の組換えアデノウイルスベクターを原核細胞で作製しようとするときには、（ｉ）（レファレンスＭ７３２６０でGenebankデータバンクに開示されたような、Ａｄ５ゲノムの９１８位に位置する制限部位で）酵素ＣｌａＩで開裂されたＡｄ５ゲノムを含んだベクター、および（ii）アデノウイルスキャプシド化（encapsidation）領域と相同的な配列Ａ、外来ＤＮＡ配列、その後にｐIXタンパク質についてコードする配列と相同的な配列Ｂを含んだＤＮＡ断片を用いることができる。更に、（Ａｄ５ゲノムの２７０８２位で）酵素ＳｐｅＩで開裂されたアデノウイルスゲノムを有するベクターと、Ｅ２領域の５′末端と相同的な配列Ａ、外来ＤＮＡ配列、およびＥ４領域の３′末端と相同的な配列Ｂを含んだＤＮＡ断片の使用で、外来ＤＮＡ配列がＥ３領域の代わりに挿入された組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。当然、これらの具体的態様は例示である。最後に、本発明による方法はウイルスゲノムの特定領域に欠失、変異および／または置換を導入するために用いてもよい。
本発明は、少くとも２０ｋｂ、絶対的に好ましくは少くとも３０ｋｂの組換えウイルスベクター、更に具体的には長さが対応野生型ウイルスのゲノムの場合の８０〜１２０％、特に９０〜１１０％、好ましくは９５〜１０５％であるゲノムを有したベクターを作製しようとするときに特に有利なことがわかった。
もう１つの態様によれば、本発明による方法は、（ｉ）親ウイルスのゲノムのすべてまたは一部を含んだ第一ＤＮＡ断片、（ii）５′末端にフランキング配列Ａを備えた外来ＤＮＡ配列の第一部分を含んだ第二ＤＮＡ断片、および（iii）３′末端にフランキング配列Ｂを備えた外来ＤＮＡ配列の第二部分を含んだ第三ＤＮＡ断片（上記第二および第三ＤＮＡ断片はそれらの各３′および５′末端に重複する相同的配列を含んでいる）の間の分子間組換えにより、少くとも２つのＤＮＡ断片をウイルスゲノム内に挿入するために用いてもよい。説明すると、第二および第三ＤＮＡ断片間で相同的なこれらの配列は、配列ＡおよびＢと同様の相同性および長さの基準を満たしている。この具体的態様は大サイズ外来配列のクローニングにとり特に有利である。
本発明による方法はいずれの原核細胞で、特に大腸菌株に由来する細菌で行ってもよい。しかしながら、例えば株ＣＥＳ２００、ＣＥＳ２０１、Ｗ５４４９およびＢＪ５１８３のようなｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＢＣ株を用いることが特に最も好ましい（Hanahan,1983,J.Mol.Biol.,166,557-580）。
本発明による方法に典型的な操作は、下記工程を含む：
（ａ）上記のような第一ＤＮＡ断片および（ii）第二ＤＮＡ断片が原核細胞中に同時または別々に導入され、
（ｂ）工程（ａ）で得られた原核細胞が分子間組換えにより組換えウイルスベクターを作製させるために適切な条件下で培養され、そして
（ｃ）組換えウイルスベクターが回収される。
本発明による方法の関係において、第一および第二ＤＮＡ断片の量は変えてもよい。第一断片の場合より１０倍大きな濃度の第二断片を用いることが好ましい。原核細胞中へのＤＮＡ断片の導入と、これら同細胞からのベクターの回収は、Maniatis et al（1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）で詳述された遺伝子工学および分子クローニングの一般的技術に従い行われる。
本発明は、本発明による方法を行うことで得られた組換えウイルスベクターを含む感染性ウイルス粒子を作製するための方法にも関し、それによれば
（ａ）上記組換えウイルスベクターがトランスフェクトされた哺乳動物細胞を作るために哺乳動物細胞中に導入され、
（ｂ）上記トランスフェクトされた哺乳動物細胞が上記ウイルス粒子の作製を行うために適切な条件下で培養され、そして
（ｃ）上記ウイルス粒子が工程（ｂ）で得られた細胞培養物から回収される。
細胞は当業者に周知の標準技術に従いトランスフェクトされる。リン酸カルシウム技術、ＤＥＡＥ−デキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透ショックに基づく方法、マイクロインジェクションまたはリポソームの使用に基づく方法が特に挙げられる。好ましい態様によれば、哺乳動物細胞は有利には相補細胞、特にアデノウイルス由来ベクターの関係から２９３細胞である。ウイルス粒子は培養上澄から、但し慣用的プロトコールに従い細胞からも回収してよい。
本発明には、特に遺伝子治療による人体の治療または外科処置のための、本発明による方法に従い作製された感染性ウイルス粒子または組換えウイルスベクターの使用もカバーしている。本発明による方法は、遺伝病（血友病；サラセミア、気腫、ゴシェ病、嚢胞性繊維症、デュシェーヌまたはベッカーミオパシーなど）、がんおよびウイルス疾患（エイズ、ヘルペス感染、あるいはサイトメガロウイルスまたはパピローマウイルスに起因する感染）のような疾患の予防または治癒治療について更に具体的に考えられる。本発明の目的から、本発明による方法で作製されたベクターおよびウイルス粒子は、患者から取り出された宿主細胞中にインビトロでまたは治療される体中に直接インビボで導入される。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞、好ましくは肺臓、繊維芽、筋肉、肝臓またはリンパ球細胞あるいは造血系の細胞である。
本発明は、本発明による方法に従い作製された感染性ウイルス粒子または組換えウイルスベクターの治療上有効量を、薬学的観点から許容されるビヒクルと一緒に含んでなる、医薬組成物にも関する。このような医薬組成物は常用される技術に従い製造され、いずれか公知の投与経路、例えば全身的（特に静脈内、気管内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内または頭蓋内）あるいはエアゾールまたは肺内注入により投与される。
最後に、本発明の主題は、また、細胞系での対象ＤＮＡ配列の発現に関する、本発明による方法に従い作製された感染性ウイルス粒子または組換えウイルスベクターの使用である。
本発明は、下記図面および下記例で更に詳細に記載される。
図１はヒトアデノウイルス５型ゲノムの概略図であり（０〜１００の任意単位で示されている）、異なる遺伝子の位置を示している。
図２は２つのＤＮＡ断片間の分子間組換えの方法について示している。プラスミド配列は細線、ウイルス配列は太線、外来配列は陰影ボックスで示される。
図３は、ヒトＦＩＸ遺伝子の発現用カセットの挿入によりＥ１領域で修飾された組換えアデノウイルスのゲノムがクローニングされるｐポリIIに相当する、ベクターｐＴＧ３６１４の概略図である。
図４は、ヒトＣＦ遺伝子の発現用カセットの挿入および部分的欠失によりＥ１、Ｅ３およびＥ４領域で修飾された組換えアデノウイルスのゲノムがクローニングされるｐポリIIに相当する、ベクターｐＴＧ４６５２の概略図である。
実施例
下記例は本発明の１態様を示している。
下記構築はManiatis et al.（1989,supra）で詳述された遺伝子工学および分性生物学の一般的技術に従い行う。５′突出制限部位は大腸菌  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントとの処理で平滑部位に変換され、一方３′突出部位はＴ４ポリメラーゼで処理される。ＰＣＲ増幅工程では、PCR Protocols-A guide to
methods and applications（1990,ed.Innis,Gelfand,Sninsky and White,Academic Press Inc.）に記載されたようなプロトコールが適用される。細胞は慣用的方法でトランスフェクトされ、供給業者の勧めに従い培養される。下記の異なる組立物中に挿入される断片は、レファレンスＭ７３２６０でGenebankデータバンクに開示されたようなＡｄ５ゲノムでそれらの位置に従い正確に示されている。
例１：細菌プラスミドの形での５型ヒトアデノウイルス由来組換えウイルスベクターの組立て
Ａ．ｐポリII中へのアデノウイルス５（Ａｄ５）ゲノムのクローニング
Ａｄ５ゲノムの左側末端（ヌクレオチド１〜９３５）はオリゴヌクレオチドプライマーｏＴＧ６５９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびｏＴＧ６５９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いてＰＣＲにより合成する。第一プライマーは５′ＩＴＲの最初の２１ヌクレオチドとハイブリッド形成し、ウイルス配列のすぐ上流にＰａｃＩ部位とクローニングに用いられるＥｃｏＩ部位とを有している。第二プライマーは、ＳａｌＩとその後にＢｇｌII部位をウイルス配列の下流に導入させることができる。この反応で利用された鋳型は、慣用的方法に従い作製されたＡｄ５ゲノムＤＮＡである。こうして増幅された断片をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌIIで切断し、これらと同様の２つの制限酵素で既に開裂されたプラスミドｐポリII（Lathe et al.,1987,supra）中にクローニングして、ｐＴＧ１６９２を得る。
Ａｄ５ゲノムの右側末端（ヌクレオチド３５１０３〜３５９３５）に相当するＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチド対ｏＴＧ６５９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびｏＴＧ６５９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を用いて、同原理に従い作製する。ｐＴＧ１６９３はＥｃｏＲＩおよびＢｇｌIIで切断された増幅断片をｐポリIIの同部位中に挿入することにより構築する。増幅配列を有するＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断片は、アデノウイルス５′配列の下流にあるｐＴＧ１６９２のＢｇｌII部位中にそれを導入するために、ｐＴＧ１６９３から切り出す。それにより得られたｐＴＧ３６０１を制限酵素ＢｇｌIIまたはＳａｌＩ切断によりＡｄ５ゲノムの左側および右側末端の間で線状化させる。こうして作られた末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントの作用により平滑化させる。塩化カルシウム処理でコンピテント化されたＢＪ５１８３細菌（Hanahan,1983,supra）を上記作製物およびＡｄ５ゲノムＤＮＡで同時形質転換させる。得られたコロニーは制限地図作成により分析する。１つのクローンを選択し、ｐＴＧ３６０２と表示し、分子間相同組換えにより作製するが、その場合にアデノウイルス配列（ヌクレオチド９３６〜３５１０２）は完全Ａｄ５ゲノムを含んだプラスミドベクターを作製できるようにＰＣＲにより作製された２つの断片間に挿入されていた−ｐＴＧ３６０２はＣ６００細菌で生産する（Huynh et al.,1985,DNA cloning,Volume 1,ed.Glover,IRL Press Limited: Oxford,England,PP.56-110）。
Ｂ．ｐＴＧ３６０２の感染力の評価
ウイルスゲノムを制限酵素ＰａｃＩの作用で遊離させる。単層で培養された２９３細胞をリン酸カルシウム沈降技術によりこの切断産物でトランスフェクトする。他の感受性細胞、例えばＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１８５）を用いることも可能である。細胞を９〜１４日間寒天下で増殖させたが、その期間中における細菌叢上の溶解プラークの出現は感染性ウイルス粒子の生産、ひいてはｐＴＧ３６０２から得られるＡｄ５ゲノムの複製しうる能力の証拠となる。
Ｃ．外来遺伝子がＥ１初期領域に置き換わった欠陥組換えアデノウイルスベクターの構築
β−ガラクトシダーゼについてコードするＬａｃＺリポーター遺伝子がウイルス的関係でおかれたプラスミド、例えばＡｄ５  ５′配列（ヌクレオチド１〜４５８）、Ａｄ２  ＭＬＰプロモーター、ＬａｃＺ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルおよびヌクレオチド３３２９〜６２４１にあるＡｄ５配列を含んだｐＭＬＰ−Ａｄｋ７（Stratford-Perricaudet and Perricaudet,1991,Human Gene Transfer,219,51-61）由来のプラスミド、を用いる。
アデノウイルス配列で囲まれたＬａｃＺ遺伝子発現カセットを制限酵素ＢｓｒＧＩ（Ａｄ５ゲノムの１９２位）およびＰｓｔＩ（３７８８位）の作用で切り出し、その後精製する。ｐＴＧ３６０２をＣｌａＩ部位（９１８位）で線状化し、その後クレノウフラグメントで処理する。得られた２つの断片をコンピテントＢＪ５１８３細菌中に同時形質転換する。相同的アデノウイルス配列での組換えは、プラスミドｐＴＧ３６０３においてリポーター遺伝子用発現カセットによるＡｄ５  Ｅ１領域（ヌクレオチド４５９〜３３２８）の置換を起こす。
その感染力は、ＰａｃＩで予め切断されたｐＴＧ３６０３でトランスフェクトされた２９３細胞叢のトランスフェクションにより証明される。そのときには形成された溶解プラークを選別して、ウイルス粒子を再懸濁し、２９３細胞の単層を感染させるために用いる。Ｘ−Ｇａｌの添加後における細胞の青色化はＬａｃＺ遺伝子の発現の証拠となる。
Ｄ．外来遺伝子がＥ３初期領域に代った組換えアデノウイルスベクターの構築Ａｄ５  Ｅ３領域（ヌクレオチド２８７３１〜２９２１７）のｇｐ１９タンパク質についてコードする遺伝子の発現用カセットは、一方がＲＳＶ（Rous肉腫ウイルス）３′ＬＴＲ（オリゴヌクレオチドプライマーｏＴＧ５８９２−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５８９３−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）に相当し、他方がｇｐ１９についてコードする配列（ｏＴＧ５４５５−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および５４５６−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に相当する２つのＰＣＲ断片をクローニングすることにより、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８（Gibco BRL）でアセンブリーする。ベクターＭ１３ＴＧ１６８３を得て、そこから発現用カセットをＸｂａＩ切断により切り出す。クレノウフラグメントで処理した後、それをｐＴＧ８５１９の（ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑化された）ＢｓｍＩ部位中に導入する。後者はプラスミドｐｕｃ１９（Gibco BRL）から誘導するが、その中にはＳｐｅＩ部位とゲノムの右側末端（ヌクレオチド２７０８２〜３５９３５）との間に位置するが、Ｅ３領域の大部分（ヌクレオチド２７８７１〜３０７５８）を欠いたアデノウイルス配列が挿入されていた。ｐＴＧ１６９５を得て、プラスミド配列を有したそのＳｃａＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＴＧ１６５９の精製相当断片と置き換える。後者はヌクレオチド２１５６２から３５８２６に至るＡｄ５配列を含んだｐｕｃ１９に相当する。これで得られたｐＴＧ１６９７はＢａｍＨＩ（２１５６２位）部位から３′ＩＴＲ（３５９３５位）に至るアデノウイルス配列を有しており、その配列の中でＥ３領域はＲＳＶ構成プロモーターのコントロール下でｇｐ１９発現カセットと置き換えられている。ＤｒａＩ断片（Ａｄ５ゲノムの２２４４４〜３５１４２位）を精製し、ＳｐｅＩで線状化されたｐＴＧ３６０２と共にコンピテントＢＪ−５１８３細菌中に同時導入し、クレノウフラグメントで処理する。組換えで作製されたプラスミドを有する組換え体をＲＳＶプロモーターの存在についてスクリーニングする。こうしてＡｄ−ｇｐ１９＋ゲノムを有するプラスミドベクター、ｐＴＧ３６０５を証明する。
プラスミドｐＴＧ３６０５から切り出されたウイルスゲノムの感染力は、既に前記されたプロトコールに従い試験する。機能性ｇｐ１９タンパク質の生産は主要組織適合性複合体クラスＩの抗原およびタンパク質の同時免疫沈降によりモニターする（Burgert and Kvist,1985,Cell,41,987-997）。
Ｅ．初期領域Ｅ１およびＥ３双方が外来遺伝子で置き換えられた欠陥組換え
アデノウイルスベクターの構築
ＢＪ−５１８３細胞を上記ｐＴＧ１６９７から単離されたＤｒａＩ断片およびｐＴＧ３６０３から単離されたＳｐｅＩ断片（klenow）で同時形質転換する。得られたプラスミドを上記と同様の条件下で試験する。
Ｆ．ＦＩＸ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターの構築
ヒトＦＩＸについてコードするｃＤＮＡをＢａｍＨＩ断片の形でプラスミドｐＴＧ３８１中にクローニングした。後者において、ＦＩＸ遺伝子の５′非コード末端はKozak's規則に従うように修飾した。プラスミドｐＴＧ３８１は特許公開ＦＲ２，６００，３３４に記載されている。ＦＩＸ遺伝子をｐＴＧ６５１２のＢａｍＨＩ部位中に再クローニングして、ｐＴＧ４３７５を得る。ｐＴＧ６５１２はＡｄ２主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の欠失およびポリリンカーによる置換後にベクターｐＴＧ６５１１から誘導する。説明すると、ｐＴＧ６５１１の組立ては国際出願ＷＯ９４／２８１５２の例１で詳細に記載されている。ネズミＰＧＫプロモーターは、Adra et al.（1987,Gene,60,65-74）に従いマウスゲノムＤＮＡから慣用的方法によるか、またはレファレンスＸ１５３３９でGenebankデータバンクに開示された配列のデータから作られた適切なプライマーにより単離する。ＰｓｔＩ制限部位は、後でクローニング工程を容易にするために、プライマーの５′末端に含ませる。ＰＧＫプロモーターを有する断片をＴ４ポリメラーゼで処理し、その後ヒトＦＩＸ遺伝子の上流でｐＴＧ４３７５のＨｐａＩ部位中に導入し、そこからＥ１アデノウイルス配列（５′末端の１８５ｂｐおよび３′末端の２０４５ｂｐ）で囲まれたＦＩＸカセットを有するいわゆる“置換”断片をＭｓｃＩ切断により切り出す。
後者の断片をＣｌａＩ（９１８位）で切断されたベクターｐＴＧ３６０２の存在下でＢＪ５１８３細菌中に同時形質転換する。形質転換株をアンピシリンで選択し、制限地図作成により分析する。ｐＴＧ３６１４と表示される、Ｅ１領域の代わりにＦＩＸ治療遺伝子を含んだアデノウイルスベクターに相当するクローン（図３）を選択する。ウイルスストックは、２９３系中へのＰａｃＩ切断で遊離されたアデノウイルスゲノムのトランスフェクションにより、慣用的方法で作製する。増幅工程後、細胞を溶解させ、ＡｄＴＧ３６１４ウイルス粒子を塩化セシウム遠心により精製する。
ＦＩＸ遺伝子をトランスファーして発現する能力はマウス動物モデルで評価する。この目的のため、１．５×１０９ｐｆｕを５〜６週齢雌性Ｃ５７Black６マウスの尾血管中に注入する。血液サンプルを規則的に採取し、そのときにヒトＦＩＸの量をＥＬＩＳＡ（Diagnostica Stago Kit,Asnieres,France ;AsserachiromＲIX：Ａｇ００５６４）により調べる。ＦＩＸを数週間にわたりマウスの血清で検出したが、最大は５日目である。
Ｇ．Ｅ２領域で修飾されたアデノウイルスベクターの構築
正常ウイルスサイクルにおいて、Ｅ２領域の遺伝子の発現はＥ１およびＥ４の初期産物により誘導され、Ｅ２によりコードされるタンパク質、特にＤＢＰタンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質に関する）の豊富な生産が観察される。実際には、この高発現はインビボで問題になることがある（炎症反応の誘導またはトランスジーン発現の干渉）。この理由から、Ｅ２Ａ機能に欠陥のあるアデノウイルスベクターをＥ２Ａ中への温度感受性変異の導入（２２７９５位；ＣからＴへでＰｒｏからＳｅｒに変化させる）またはＤＢＰ遺伝子の部分的欠失により構築した。
温度感受性変異を有するベクターｐＴＧ９５５１を、ＢｇｌIIで切断されたｐＴＧ３６０１とＡｄｓＨｔｓ１２５ウイルスの精製ゲノムＤＮＡとのＢＪ細胞における相同組換えにより作製する（Ensinger and Ginsberg,1972,J.Virol.,10,328-339）。こうして再構築されたゲノムをＰａｃＩ切断により遊離させ、２９３細胞中にトランスフェクトし、それをウイルス粒子の生産のため３２℃でインキュベートする（非許容温度は３９℃である）。
欠陥Ｅ２Ａ特徴は、ＤＢＰ遺伝子のコード領域の部分的欠失により作成して、他の読み枠をカバーした領域を避けてもよい、構築はｐＴＧ３６０１  ＢｇｌIIとＨ５ｄ１８０２ウイルスから作製されたウイルスＤＮＡとの相同組換えにより行う（Rice and Klessig,1985,J.Virol.,56,767-778）。ウイルスはＤＢＰ機能をトランスで補う適切な相補系、例えばＤＢＰ遺伝子の構成または調節発現を行うベクターでトランスフェクトされた系２９３で生産してもよい。
Ｈ．Ｅ４領域で修飾されたアデノウイルスベクターの構築
第一段階では、Ｅ１アデノウイルス領域内に置かれたＣＦＴＲタンパク質についてコードする遺伝子の発現用カセットを含んだ、いわゆる“置換”ベクターを構築する。ｐＴＧ８５８５と表示されるこのベクターは、文献ですべて記載された下記要素を含んでいる：
−Ａｄ５  ５′ＩＴＲ（１〜４５８位）
−Ａｄ２  ＭＬＰプロモーター
−ヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡ
−ウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナル
−ＲＳＶウイルス（Rous肉腫ウイルス）３′ＬＴＲ
−ｇｐ１９タンパク質についてコードするアデノウイルス配列（Ａｄ５の
２８７３１〜２９２１７位）および
−Ｅ１Ｂ領域の３′部分（３３２９〜６２４１位）
並行して、Ｅ３およびＥ４領域をカバーしたアデノウイルス配列をベクターｐポリII中にサブクローニングし、分子生物学の標準技術により欠失させる。Ｅ３配列（２８５９２〜３０４７０位）をＸｂａＩ切断により除去し、Ｅ４配列（３２９９４〜３４９９８位）を除去する。こうして修飾されたアデノウイルスゲノムを、上記ベクターから単離されたこれらの修飾を有する置換断片と、ＳｐｅＩで切断されたｐＴＧ３６０３との相同組換えにより再構築する。組換えアデノウイルスゲノム（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ遺伝子）を有したｐＴＧ８５９５を得たが、これはＥ３およびＥ４機能に欠陥がある。
上記ＣＦＴＲおよびｇｐ１９遺伝子の発現用カセットを、ｐＴＧ８５８５から単離されたＰａｃＩ−ＢｓｔＥII断片とＣｌａＩで線状化されたベクターｐＴＧ８５９５でのＢＪ５１８３細胞の同時形質転換により、ＬａｃＺ遺伝子の代わりとしてｐＴＧ８５９５中に導入する。ｐＴＧ４６５２（図４）を作製したが、これは国際出願ＷＯ９４／２８１５２に記載されたように欠陥Ｅ１およびＥ４機能を補う細胞系で増殖させることができる。
ウイルス粒子を増幅させ、細胞を溶解し、全細胞抽出物をWesternブロッティング（８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）によりＣＦＴＲ遺伝子の発現について分析する。フィルターをヒトＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸７２２〜７３４に相当する合成ペプチドに対するモノクローナル抗体ＭＡＢ１１０４の１／５０００希釈物の存在下でインキュベートする。検出はＥＣＬ（増強化学発光；Amersham kit）法により行う。ＣＦＴＲコントロールと同時移動する高分子量産物に相当する、強い強度でむしろ拡散したバンドが、ＡｄＴＧ４６５２で感染された細胞の抽出物で観察される。このバンドは、ＣＦＴＲ発現カセットを含まない親ウイルスｐＴＧ８５９５から得られる抽出物中に存在しない。
例２：細菌プラスミドの形でイヌアデノウイルス２（ＣＡＶ２）由来組換えウイルスベクターの組立て
Ａ．ｐポリII中へのＣＡＶ２ゲノムのクローニング
ＣＡＶ２ゲノムをｐポリII  ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ１４（Lathe et al.,1987,supra）中にクローニングし、Ａｄ５の操作の場合で用いられたのと同様の方法に従い適切な部位を用いて組換えベクターを作製するために修飾する。左側末端（Genebank配列Ｄ０４３６８のナンバリングに従うとヌクレオチド１〜８１０）および右側末端（ヌクレオチド〜２７６００から末端まで）を各々オリゴヌクレオチドプライマー対ｏＴＧ６９７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ｏＴＧ６９７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ｏＴＧ６９７６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）およびｏＴＧ６９７４間のＰＣＲにより合成する。それらを左側末端の場合でウイルス配列の後にＰＣＲ中に導入されたＰｓｔＩ部位を介してアセンブリーし、右側末端の場合にはゲノムの末端から約１２００ｂｐで地図化する。コンピテントＢＪ５１８３細菌をＰｓｔＩで線状化されたこうして得られるプラスミドおよびＣＡＶ２  ＤＮＡで同時形質転換する。欠いているウイルス配列（ヌクレオチド８１１〜２７６００）の導入は相同組換えにより行う。得られたプラスミドにより保有されるＣＡＶ２ゲノムをＰＣＲ中に導入されたＮｏｔＩ部位を介して切り出し、その後ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）の単層中にトランスフェクトする。その後の工程は例１に記載されている。
Ｂ．イヌ起源の組換えアデノウイルスベクターの構築
ＣＡＶ２ウイルス（TorontoＡ２６／６１株；ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）ゲノムＤＮＡを標準技術により作製する（犬腎臓系ＭＤＣＫ  ＧＨＫなどで増幅、細胞の溶解、塩化セシウム遠心によるウイルスの精製、プロテイナーゼＫでの処理および最後にフェノール／クロロホルム抽出）。長さが３１ｋｂｐであるＣＡＶ２ゲノムを相同組換えによりプラスミドベクター中に導入する。この目的から、ＣＡＶ２ゲノムの左側および右側末端をＰＣＲおよび酵素切断により単離して、５′および３′ＩＴＲのすぐ向こう側にＮｏｔＩ部位を組込む。ベクターｐＴＧ４４５７は、ＢｓｔＢＩ部位（８７０位）までウイルスゲノムの５′部分、その後ＳａｌＩ部位（２７８００位）から出発する３′部分をｐポリII中に導入することにより得る。完全ゲノムはゲノムＤＮＡ（１００〜５００ｎｇ）とＢｓｔＢＩで切断されたｐＴＧ４４５７（１０〜１００ｎｇ）との同時形質転換により再調製してもよい。ウイルスゲノムはＮｏｔＩ切断により上記ベクターｐＴＧ５４０６から切り出してもよい。ＤＮＡは犬ＭＤＣＫまたはＧＨＫ細胞中への１〜５μｇのトランスフェクションにより感染性であることが証明されている。プラークの生産が観察される。
組換えベクターは下記方法で得る：
ＣＡＶ２の左側末端は、Ｅ１Ａコード配列をそれら全体でおよびＥ１Ｂコード配列を一部欠失するようにサブクローニングおよび修飾させる。これはＮａｒＩ切断、その後キャプシド化領域、Ｅ１Ａプロモーター領域および転写開始部位をカバーするＰＣＲにより増幅された断片の再誘導により行う。そのプライマーは独特なＸｂａＩ制限部位も組込めるようにデザインされている。ｐＴＧ５４０７を得て、その中にＣＡＴ遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子（ｐＴＧ５４０８）をＸｂａＩ部位に導入する。後者のプラスミドをＸｈｏＩで切断し、ウイルスゲノムの３′部分をＳａｌＩ断片の形で挿入する（２７８００位〜３′ＩＴＲの末端）。これで得られたベクターｐＴＧ５４０９をＳａｌＩで線状化し、ＳｗａＩで切断されたＣＡＶ−２ゲノムで大腸菌  ＢＪ５１８３中に同時形質転換する。Ｅ１領域の代わりにＣＡＴリポーター遺伝子を有したイヌ起源のアデノウイルスベクターを得る。
配列表
配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ヒトアデノウイルス
（Ｂ）株名：血清型５
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６５９７
（xi）配列
0003989541.tif 000002
配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＹＥＳ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ヒトアデノウイルス
（Ｂ）株名：血清型５
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６５９８
（xi）配列
0003989541.tif 000003
配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ヒトアデノウイルス
（Ｂ）株名：血清型５
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６５９９
（xi）配列
0003989541.tif 000004
配列番号４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ラウス肉腫ウイルス
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ５８９２
（xi）配列
0003989541.tif 000005
配列番号５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：４７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＹＥＳ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ラウス肉腫ウイルス
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ５８９３
（xi）配列
0003989541.tif 000006
配列番号６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ヒトアデノウイルス
（Ｂ）株名：血清型５
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ５４５５
（xi）配列
0003989541.tif 000007
配列番号７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＹＥＳ
（vi）起源
（Ａ）生物名：ヒトアデノウイルス
（Ｂ）株名：血清型５
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ５４５６
（xi）配列
0003989541.tif 000008
配列番号８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：イヌアデノウイルス
（Ｂ）株名：ＣＡＶ−２
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６９７４
（xi）配列
0003989541.tif 000009
配列番号９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＹＥＳ
（vi）起源
（Ａ）生物名：イヌアデノウイルス
（Ｂ）株名：ＣＡＶ−２
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６９７５
（xi）配列
0003989541.tif 000010
配列番号１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源
（Ａ）生物名：イヌアデノウイルス
（Ｂ）株名：ＣＡＶ−２
（Ｃ）単離クローン名：合成オリゴヌクレオチドＯＴＧ６９７６
（xi）配列
0003989541.tif 000011
【図１】
0003989541.tif 000012
【図２】
0003989541.tif 000013
【図３】
0003989541.tif 000014
【図４】
0003989541.tif 000015