(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの活性を有する組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）と、該組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱの生物学的利用能を増大させる有機添加剤とからなる皮下投与用の製薬調合剤であって、前記有機添加剤をデキストラン、ヒアルロン酸、加水分解コラーゲン、加水分解ゼラチン、ポリスターチ、ダイズ油エマルジョンからなる群から選択することを特徴とする製薬調合剤。
【請求項２】
ｉ）少なくとも１，５００ＩＵ／ｍｌの組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）と、
ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと、
ｉｉｉ）０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウムと、
ｉｖ）０．５Ｍ以上の量のカルシウム塩またはグルコン酸カルシウムと、
ｖ）１ｍＭ以上の量のＬ−シスチジンと、
ｖｉ）第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増大させる添加剤と、
からなることを特徴とする請求項１に記載の製薬調合剤。
【請求項３】
投与用に準備された安定水溶液または分散液であることを特徴とする請求項１または２に記載の製薬調合剤。
【請求項４】
投与前に乾燥されそして任意の混合物において１つまたはそれ以上の水溶液または分散液で再溶解されることを特徴とする請求項１または２に記載の製薬調合剤。
【請求項５】
血友病を治療するための皮下投与用の薬剤を製造するために請求項１または２に記載の組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）を使用する組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）の使用方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は凝固第ＶＩＩＩ因子からなる皮下、筋肉内または皮内投与用の製薬調合剤に関するものであり、又血友病ＡまたはＢを治療するための薬剤を製造するためにその製薬調合剤を使用する使用方法に関するものである。その調合剤は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの活性を有する凝固第ＶＩＩＩ因子と、該凝固第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する添加剤とからなっている。該凝固第ＶＩＩＩ因子による試験は皮下、筋肉内または皮内投与後意外に長い時間間隔にわたって血流中に第ＶＩＩＩ因子活性の治療レベルを付与する。第ＶＩＩＩ因子は適宜に非常に純化された組み換え第ＶＩＩＩ因子であり、かつ好ましくは皮下投与用の薬剤を製造するために使用され得るその欠失誘導体である。
発明の背景
血友病は数世紀にわたって知られている遺伝によって受け継がれる疾病であるが、種々の形態、すなわち、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃの間を区別することができるようになったのはここ４０年間のみである。血友病Ａは最も頻繁な形態である。それは男性のみに影響を及ぼし、生きて出生した男性１０，０００人当たり１または２人の発病率を有している。疾病は血漿中に通常存在するタンパク質である生物学的に活性の凝固第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）の非常に少ないレベルか、または不存在によって発生する。血友病Ａの臨床的明示は強い出血傾向であり、そして第ＶＩＩＩ因子濃縮物による治療が導入される前に、それらの患者の平均年齢は２０才以下であった。血漿から得られる第ＶＩＩＩ因子濃縮物が約３０年間使用可能であった。これは血友病患者の治療状況をかなり改善しかつ彼らに通常の生活で生きる可能性を与えた。
血友病ＡおよびＢのつらさは３つのカテゴリーに、すなわち、過酷、普通および軽いに分割され得るということが通常認められている。過酷な血友病Ａにおいて、血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルは通常の血漿レベルの１％以下である。普通の血友病Ａにおいて、血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルは通常の血漿レベルの１から４％の範囲内である。軽い血友病Ａにおいて、血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルは通常の血漿レベルの５から２５％の範囲である。血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の通常の血漿レベルは血液の１ＩＵ／ｍｌとして特定されている。過酷、普通および軽い血友病Ｂは上記の第ＶＩＩＩ因子で付与されたものと同一の血漿レベルにより特定されている。ここでは、インガ・マリー・ニルツソン氏著、１９９４年スウェーデン国、ストックホルムのファーマシア・プラズマ・プロダクツの「血友病」、第２頁乃至第３頁「Ｉｎｇａ  Ｍａｒｉｅ  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｐ．２−３，１９９４」を参考に引用する。
１７０〜３００ｋＤａの分子量を有する凝固第ＶＩＩＩ因子のような非常に大きくかつ不安定な分子を有する薬剤はこれらの薬剤が皮下、筋肉内または皮内に付与される場合に、不十分な吸収および激しい劣化のために通常非常に低い生物学的利用能を有するので、通常静脈に付与されている。かくして、クエン酸ナトリウム中に溶解されかつ筋肉に注射された第ＶＩＩＩ因子濃縮物は通常の血漿レベルの１．４％のみの最大循環レベルをもたらした（プール氏等、ニューイングランドジャーナル、「医薬」、１９９６年、第２７５巻、第１０号、第５４７頁乃至第５４８頁「Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＪ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１０，ｐ．５４７−５４８，１９６６」）。その研究はさらに、かかるクエン酸塩が製剤に添加されたかどうかに関係なく循環中に回収される活性に顕著な差異がないことを示した。最近の研究において、高純度の第ＶＩＩＩ因子は血友病の犬および人ボランテイアに筋肉投与された（ジョンソン氏等、英国ジャーナル「血液学」、１９７１年、第２１巻、第２１頁乃至第４１頁「Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，ｐ．２１−４１，１９７１」）。投与量はプール氏等によって使用されたよりも非常に多かったけれども、犬または人ボランティアは血漿第ＶＩＩＩ因子レベルの顕著な上昇を示さなかった。事実、血友病の人ボランテイアの血漿第ＶＩＩＩ因子濃度は通常の血漿レベルの１％以下のまま、すなわち過酷な血友病Ａは生物学的利用能を増加する添加剤の不存在における投与後も同様に存在した。
インシュリンおよび第ＶＩＩＩ因子のペプチド画分のごとき小さい分子を含んでいる多数の薬剤の吸収を高めるために種々の添加剤が提案された。従って、国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１４４０号公報は約５，８００Ｄａの分子量を有するインシュリンの経粘膜投与を高めるためにジメチル−β−シクロデキストリンを使用する方法を開示している。非侵入ルートによる小さい分子の搬送に関する情報を皮下、筋肉内または皮内投与によって静脈循環に大きな分子を搬送することに利用することはできない。これは、国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９２／−０１４４０号公報に記載の発明の目途が（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の余分な注入を行うことにあるので、とくに正当である。更に、筋肉内投与前に１，０００から２０，０００Ｄａまでの分子量を有する第ＶＩＩＩ因子のペプチド画分を溶解するのに生理食塩水が使用されている（Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３９（Ｉ），ｎｏ．４，ｐ．４６３−４６６，１９８９）。ここでもその実験は第ＶＩＩＩ因子のペプチド画分の活性が測定されていないので、未知の生物学的利用能を生じる小さい分子に関するものである。
ヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−０５２２４９１号明細書は約２０ｋＤａ以下の分子量を有する薬理学的に活性のポリペプチドの投与を高めるために実質上薬理学的活性を示さない水溶性タンパク質と組み合わせてヒアルロン酸の水溶性種類を使用する使用方法を開示している。多数のポリペプチド中には血液凝固因子が記載されている。更に例えば注入によって血液凝固因子を投与した時のヒアルロン酸の考え得る作用を示す例は示されていない。
日本の特許出願公開昭６３−６３６２４号公報に記載のものは例えば皮下投与時の特定していない薬物の徐放性を提供するためのコラーゲンの使用に関するものである。
日本の特許出願公開昭５６−１２７３０８号公報に記載のものは血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ダイズ油および燐脂質を含有するエマルジョンに関するものである。このエマルジョンの目的は通常の非経口投与で遭遇する問題を除去することにある。従って、エマルジョンは幾つかの例で示されているように経口で投与され得る。
第ＶＩＩＩ因子は血友病Ａを治療するため以外の他の治療目的で使用され得る。かくして、国際特許出願公開第ＷＯ９３／２４１３７号公報は抗炎症剤として皮内または局所投与に向けられた第ＶＩＩＩ因子を含有する調合剤を示している。該調合剤は非血友病人体への投与に向けられかつ血友病Ａを患っている人間の静脈循環への投与ではない。治療効果は従って局所的であって全身的でなく、全身的な体循環は血友病Ａを軽減するのに必要とされる。
添加剤なしの第ＩＸ因子の皮下投与がＢｅｒｒｅｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４７，ｎｏ．１，ｐ．６１−６２，１９９４から知られている。第ＩＸ因子は約５６ｋＤａの分子量を有する第ＶＩＩＩ因子より小さい分子である。ヒト第ＩＸ因子は血友病Ｂ患者の皮下組織に注入されるとき、体循環に不十分にかつ非常にゆっくり搬送された。これは第ＶＩＩＩ因子で得られた結果と一致している。
市場で現在入手し得るすべての第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子製剤は静脈投与用調合剤として製造され、そして大多数の第ＶＩＩＩ因子製剤はヒト血清アルブミンにより安定化されている。
従って、大きくかつ不安定なタンパク質はその薬剤が血流内で直接利用され得るように通常静脈に付与されている。しかしながら薬剤が皮下、筋肉内または皮内に付与され得る場合に、これらの投与形状は患者にとって取り扱いが非常に容易であるので好都合である。特にその薬剤を終生規則的に取らねばならない場合に、かつ治療を早期に開始する場合、即ち患者の間では生まれた年から治療を開始する必要がある場合に、その投与形態が好適である。
発明の概要
非常に敏感なタンパク質である第ＶＩＩＩ因子を皮下に付与することができること及び従来のあらゆる経験に対比して血液中に活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の顕著な吸収および意外に高いレベルを得ることができることが判明した。
従って、第ＶＩＩＩ因子を皮下、筋肉内または皮内に投与することが可能である調合剤であってかつ第ＶＩＩＩ因子を必要とするすべての患者に大きな利点を付与する調合剤を開発した。
組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）は典型的な血友病の治療に必要である。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの半減期は静脈に注射されると人間でおよそ１２時間である。予防治療のために１５〜４０ＩＵ／ｋｇ体重の第ＶＩＩＩ因子が週３回付与される。
静脈注射は通常５〜２０ｍｌである。皮下に付与される注射は０．０５〜１ｍｌの間であり、そして第ＶＩＩＩ因子の濃度はそのためにそのような調合剤において非常に高くなければならない。これは例えば加水分解されたゼラチン、ヒアルロン酸および／またはダイズ油エマルジョンのごとき添加剤を有する調合剤において我々の非常に純化された組み換え第ＶＩＩＩ因子により得ることができる。従って、本発明によれば静脈内投与後に得られる生物学的利用能に比べて、皮下、筋肉内または皮内投与後、少なくとも約１５％、適切には約３０％の生物学的利用能を得ることができる。本発明の調合剤の成分のとくに慎重な選択により、静脈内投与後に得られた生物学的利用能に比べて、皮下、筋肉内または皮内投与後５０％かつ同様に７０％の生物学的利用能を得ることができる。
本発明の技術的思想は従って第ＶＩＩＩ因子が皮下、筋肉内または皮内の製薬調合剤として付与されるとき血流中に吸収されることができかつこのために第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能の必要な増加を付与する特別な調合剤を製造することができる認定の組み合わせに基づくものである。
本発明は従って少なくとも２００ＩＵ／１ｍｌの活性を有する凝固第ＶＩＩＩ因子第ＩＸ因子と、該第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する添加剤とからなる皮下、筋肉内または皮内投与用の製薬調合剤に関し、その調合剤は投与後少なくとも６時間血液中に通常の血漿レベルの少なくとも１．５％の第ＶＩＩＩ因子活性の治療レベルを付与する。
本発明における治療レベルは血液中に第ＶＩＩＩ因子の通常の血漿レベルの少なくとも１．５％に関するものである。血液中の第ＶＩＩＩ因子活性は適切には通常血漿レベルの２．５％、かつ好ましくは少なくとも４％である。
本発明の調合剤によれば、ＶＩＩＩ：Ｃの治療的に許容し得るレベルを少なくとも６時間、適切には１２時間以上、好ましくは２４時間以上、かつより好ましくは４８時間以上にわたって維持することが可能である。最適な調合剤によれば、ＶＩＩＩ：Ｃの治療的に許容し得るレベルを少なくとも９６時間、かつ同様に１６８時間以上にわたって維持することが多分可能である。この方法において、投与の頻度は最小に保持され得るし、意図した治療効果も付与され得る。本発明による調合剤はまたオン−デマンド（要求に応じる）治療にも適する。
本発明は血友病ＡまたはＢの治療、存在するならば血液系統全体に普及する疾病の治療に関するものである。かくして、成功した治療の先行必要条件は全身的効果が得られるような方法における投与である。かかる全身的効果は本発明により得られ、局部作用、例えば抗炎症作用が所望される他の技術に対立している。
第ＶＩＩＩ因子を含有する調合剤は好ましくは皮下に付与される。
調合剤中の第ＶＩＩＩ因子活性は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌ、適切には５００以上そして好ましくは１，０００ＩＵ／ｍｌ以上である。第ＶＩＩＩ因子活性が調合剤中で１，５００ＩＵ／ｍｌ以上であることが特に好適であり、そしてその活性が５，０００から１００，０００ＩＵ／ｍｌであることが最も好適である。
付与される量は０．０１ｍｌ以上にすることができ、適切には０．１〜２ｍｌ、好ましくは０．２５〜１．５ｍｌ、かつより好ましくは０．５〜１ｍｌにすることができ、その量はまた０．１〜１ｍｌにすることができる。
第ＶＩＩＩ因子は血漿から誘導されるか、または組み換えＤＮＡ技術によって製造され得る。
治療第ＶＩＩＩ因子濃縮物は今まで血漿の分画により製造されていた。しかしながら、現在では例えば、ダブリユー・ウッド氏等著、ネーチャー第３１２巻、第３３０頁乃至３７頁、１９８４等（Ｗ．ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，ｐ．３３０−３７，１９８４）およびヨーロッパ特許第ＥＰ−Ａ−１６０４５７号明細書において報告されているように組み換えＤＮＡ技術を使用する細胞培養において第ＶＩＩＩ因子を製造するために利用し得る方法がある。
ヒト血漿から誘導された第ＶＩＩＩ因子濃縮物は幾つかの断片にされた十分に活性の第ＶＩＩＩ因子形態を含んでいる（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，ｐ．２９７９−８３，１９８６年５月）。ヒト第ＶＩＩＩ因子の最小活性形態は１７０ｋＤａの分子量を有しかつ金属イオン架橋によりともに保持される９０ｋＤａおよび８０ｋＤａの２つの鎖からなっている。ここでヨーロッパ特許第ＥＰ−Ａ−１９７９０１号明細書を参照する。スウェーデン国に所在のファーマシア・エービーは治療第ＶＩＩＩ因子濃縮物における１７０ｋＤａ血漿第ＶＩＩＩ因子形態に対応する組み換え第ＶＩＩＩ因子生成物を開発した。切断された組み換え第ＶＩＩＩ因子分子はｒ−ＶＩＩＩＳＱと呼ばれそして血清なしの媒体中の細胞培養方法においてチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）により製造される。
一般的な組み換え第ＶＩＩＩ因子生成物の構造および生化学はカウフマン著、生物工学における傾向、第９巻、１９９１年（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，１９９１）および（血液学、第６３巻、第１５５頁乃至第１６５頁、１９９１年（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，ｐ．１５５−６５，１９９１）に記載されている。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの構造および生化学は国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号公報に記載されている。
第ＶＩＩＩ因子が組み換えであるとき、それはその全長形態であるか、または好ましくはその欠失誘導体であっても良い。好ましくは欠失誘導体は組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）である。欠失誘導体はここではＢ−ドメインの全部または１部分が欠けている凝固第ＶＩＩＩ因子を意味する。加えて、第ＶＩＩＩ因子の分子、特にｒ−ＶＩＩＩＳＱ分子は生体内において分子の安定性を改善するために、例えば、ペギレイション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、共有結合された炭水化物またはポリペプチドにより化学的に変性され得る。
本発明の第ＶＩＩＩ因子は非常に純化され、すなわち５，０００ＩＵ／ｍｇ以上、同様に１２，０００ＩＵ／ｍｇ以上の特別な活性を有しそして好ましくはアルブミンの添加なしで安定化している。
第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する添加剤は適切にはそれ自体有機化合物、またはその塩であるか、それ自体有機化合物またはその塩を含有するエマルジョンまたは分散液であるか、例えば極性脂質の分散剤であるか、またはその添加物の組み合わせである。本発明において有用な有機化合物それ自体は例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、および多糖類である。ペプチドはジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびコラーゲンおよびゼラチンのごときポリペプチドを含む。コラーゲンおよびゼラチンは好ましくは加水分解される。多糖類は例えばキトサン、シクロデキストリン、スターチ、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、およびその添加物の誘導体、及びそれらの組み合わせを包含する。スターチは好ましくは加水分解される。エマルジョンは分散相として油を有する水中油エマルジョンと連続相として油を有する油中水エマルジョンとを含む。その油は野菜または動物起源からなるかまたは合成的に製造され得る。適切には、エマルジョンの野菜油はダイズ油またはベニバナ油、またはそのあらゆる組み合わせである。好適なエマルジョンは卵黄レシチンを含有するスウェーデン国、ストックホルム所在のファーマシア・エービーにより販売されているイントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ  登録商標）である。イントラリピドは極性を有する脂質であって、適切には極性を有する脂質は１つまたはそれ以上の燐脂質または糖脂質であるか、またはその組み合わせである。好ましくは、ヒアルロン酸はスウェーデン国、ウプサラに所在のファーマシア・エービーにより販売されているヒアロン（商標）である。好ましくは、デキストランはスウェーデン国、ウプサラに所在のファーマシア・エービーにより販売されているプロミテン（商標）である。
第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する添加剤は乾燥前または再溶解時に調合剤に添加され得るか、または第ＶＩＩＩ因子を含有する安定溶液または分散液に添加され得る。上述の添加剤の少なくとも２つの組み合わせも同様に添加され得る。そのうえ、２つまたはそれ以上の上述の添加剤が順々に添加され得る。
１つまたはそれ以上の抗凝固剤も非治療的量において調合剤に同様に添加され得る。抗凝固剤は例えば、ヘパリン、ヘパリン断片、ヘパリン誘導体のごときグルコサミノグルカンにすることができる。グルコサミノグルカンの好適なグループは約１０，０００Ｄａまで、より好ましくは２，０００から８，０００Ｄａまでの平均分子量を有する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。
投与前に、１つまたはそれ以上の水溶液または分散剤が、混合相または連続相において、安定した水溶液であるか、分散剤であるか、または乾燥形状である本発明による調合剤に添加され得る。
調合剤は好ましくは０．１Ｍ以上の量において塩化ナトリウムまたは塩化カリウムをも備えることができる。
第ＶＩＩＩ因子の重い鎖と軽い鎖の結合はカルシウム（または他の二価の金属イオン）の存在に依存する。ここで、カルシウムは塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）として添加されるが、グルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウムまたはカルシウムグルセプテート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｇｌｕｃｅｐｔｏｔｅ）のごとき他の塩も好ましくは０．５ｍＭ以上の量で同様に使用され得る。
アミノ酸は好ましくはその系を緩衝するのに使用され、そしてそれは調合剤が凍結乾燥される場合に無定形相においてタンパク質を保護する。適切な緩衝剤はＬ−ヒスチジン、リジンおよび／またはアルギニンである。Ｌ−ヒスチジンが主として約ｐＨ７のＬ−ヒスチジンの良好な緩衝剤能力のために選択される。
また調合剤中に非イオン界面活性剤を存在させることができ、その場合に好ましくはポロキサマーまたはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウレイトまたはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレアートのごときポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのごとき、ブロック共重合体から選ばれる。非イオン界面活性剤は、もし使用される場合には、好ましくは臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の量において存在すべきである。Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊｏａｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６３，ｐ．１３６，１９７４年を参照。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの量において使用される。
この調合剤に単糖類、二糖類またはシュガーアルコール、好ましくはスクロースが添加され得る。またグルタチオン、アセチルシステイン、トコフエロール、メチオニン、ブチルヒドロキシトルエンおよび／またはブチルヒドロキシアニゾールのごとき酸化防止剤が添加され得る。
ＥＤＴＡおよびクエン酸のごとき複合剤が第ＶＩＩＩ因子の鎖を結合するカルシウムまたは他の二価の金属イオンよりも金属イオンを不安定化するために強い親和力を有する場合に、第ＶＩＩＩ因子分子を安定化させるためにその複合剤を少ない濃度で存在させることができる。そのうえ、ベンジルアルコール、フエノール、ソルビン酸、パラベンおよびクロロクレゾールのごとき保存料も添加され得る。
調合剤は好ましくはＬ−ヒスチジンおよびスクロースを備えている。凍結乾燥のために組成物中の塩化ナトリウム対Ｌ−ヒスチジンおよびスクロースの比率は適切には１：１（ｗ：ｗ）以上、好ましくは２：１（ｗ：ｗ）以上である。
調合剤は、
ｉ）少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの第ＶＩＩＩ因子、好ましくは少なくとも１，５００ＩＵ／ｍｌの組み換え第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体と、
ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと、
ｉｉｉ）好ましくは０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウムと、
ｉｖ）好ましくは０．５ｍＭの量の塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムのごとき、カルシウム塩と、
ｖ）１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンのごときアミノ酸と、
ｖｉ）第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する添加剤と、
から構成されている。
調合剤は乾燥された形状にすることができ、好ましくは凍結乾燥され得る。投与の前に、乾燥された生成物は水溶液または分散液、例えば懸濁液、リポゾーム調合剤またはエマルジョンにより再溶解され得る。
本発明の調合剤はまた投与に備えた安定した水溶液にすることができる。それはまた分散液、例えば懸濁液、リポゾーム調合剤またはエマルジョンにすることも可能である。
本発明の調合剤は国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９４／２６２８６号公報に記載されているように酸素還元環境において貯蔵され得る。
本発明は血友病を治療するための皮下、筋肉内または皮内投与用の薬剤を製造するために調合剤を使用する使用方法、好ましくは皮下投与用の薬剤を製造するために組み換え第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体を使用する使用法に関するものでもある。その薬剤は安定した水溶液または分散液であるか、または乾燥され得る。それはまた調合剤の皮下、筋肉内または皮内投与による血友病の治療方法に関する。
実施例に示したデータは第ＶＩＩＩ因子、そして特にｒ−ＶＩＩＩＳＱが皮下で注射されかつ活性形状において生体内に静脈中で回収され得ることを示している。これはそのような調合剤が以前には知られていなかったので非常に驚くべき知見である。本発明はこれらの実施例による組成物に限定するものではない。
発明を実施するための最良の形態
実験
材料および方法
組み換え第ＶＩＩＩ因子ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）の製造が国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号公報の実施例１〜３に記載されたように行われた。ＤＨＦＲ不完全ＣＨＯ細胞系（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）がｒ−ＶＩＩＩＳＱを含有する発現ベーターおよびジヒドロフオレート−還元酵素遺伝子を含有する発現ベーターにより電気泳動された。選択媒体での選択に続いて、生き残っている細胞集団が段階的に増加する量のメトトレキサートの成長により増幅された。生じた細胞集団からの上清が第ＶＩＩＩ因子活性のために個々にふるいに分けられた。製造クローンが選ばれかつこれが続いて特定の媒体中の血清なしの懸濁液成長に適合されそして最後に大規模発酵方法が開発された。上清は一定の期間後に集められかつさらに後述される方法で純化される。
浄化された調節媒体がｐＨ調整されかつＳ−セフアローズＦＦコラムに適用された。洗浄後、第ＶＩＩＩ因子が５ｍＭＣａＣｌ2を含有する塩緩衝剤により溶出された。
免疫吸収が免疫親和力樹脂上で実施され、免疫親和力樹脂上のリガンドは第ＶＩＩＩ因子の重い鎖に向けられた単クローン抗体（８Ａ４）である。コラムに負荷する前に、Ｓ−溶出液が０．３％ＴＮＢＰおよび１％オクトキシノール９により処理された。コラムは平衡化され、洗浄され、そして第ＶＩＩＩ因子が０．０５ＭＣａＣｌ2および５０％エチレングリコールを含有する緩衝液により溶出された。
ｍＡｂ−溶出液がＱ−セフアローズＦＦコラムに負荷され、免疫親和力工程において溶出緩衝液により平衡化させられた。洗浄後、第ＶＩＩＩ因子は０．０５ＭＬ−ヒスチジン、０．６Ｍ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カルシウムおよびｐＨ６．８により溶出された。
Ｑ−溶出液がゲル濾過コラム（スーパーデツクス２００ｐ．ｇ．）に適用された。平衡および溶出はＬ−ヒスチジン、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを含有する緩衝液により実施された。タンパク質ピークが集められ、そして溶液が凍結乾燥前に調合された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱのこの材料は最終純化工程から収容された。第ＶＩＩＩ因子活性と不活性成分の濃度がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する適切な緩衝液で希釈することにより調整された。溶液は次いで無菌濾過（０．２２μｍ）され、分散されかつ凍結乾燥された。
実施例１
組み換え第ＶＩＩＩ因子が実験に記載した方法によって製造された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱを含有する凍結乾燥組成物は注射のために４ｍｌの殺菌水で再溶解させたガラス瓶当たり以下であった。
ガラス瓶当たりの組成物
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ                                ３１．０
塩化ナトリウム、ｍｇ                                ７０．１
塩化カルシウム／（２Ｈ2Ｏ）、ｍｇ                    ２．３５
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）、ｍｇ          ４．０
ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン
モノオレアート（ツイーン８０（商標））、ｍｇ          １
充填されたＶＩＩＩ：Ｃ  ＩＵ／ガラス瓶                ４，４００
再溶解された溶液中のＶＩＩＩ：Ｃ  ＩＵ／ガラス瓶      １，６００
体重約３０ｇおよび品種ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスに再溶解されたｒ−ＶＩＩＩＳＱを首に皮下で注射した。
１０，００ＩＵ／ｋｇの投与レベルで注射された量は９．４ｍｌ／ｋｇそして５０，０００ＩＵ／ｋｇの高い投与量において５倍大きい４７ｍｌ／ｋｇであった。プラシーボにおいて処理塩水、９．４ｍｌ／ｋｇを使用した。血液サンプリング前の３〜５分間にマウスにはメブマル（商標）（ペントバルビタル）ｖｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜中に麻酔した。注射した量は９．４ｍｌ／ｋｇ、すなわち約０．３ｍｌ／マウスであった。麻酔下で０．４５ｍｌの血液を大静脈から０．０５ｍｌ０．１３Ｍクエン酸ナトリウムを含有するプラスチック注射器に集めた。その後血漿を遠心分離（７分間８，８００ｇ）により集められた血液から調整し、そして第ＶＩＩＩ因子活性の測定時間まで−７０℃でプラスチッククリオフレックス管中に凍結されたまま保持した。
結果
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結果
１．ｒ−ＶＩＩＩＳＱ１０，０００ＩＵ／ｋｇの皮下投与後の時間による血漿中のＶＩＩＩ：Ｃの変化は皮下蓄積部から吸収されている薬物に対する典型的なパターンを示す（表１参照）。血漿中の最大ＶＩＩＩ：Ｃレベルは投与後約１．５時間で見られる（表１参照）。上記試験において使用された極端に高い投与量が十分に顕著である効果を得るのに選ばれた。
２．皮下蓄積部からのｒ−ＶＩＩＩの吸収はさらに投与量が５倍増加されるとき見られる最大濃度の増加によって確認された。皮下注射量が９．４から４７ｍｌ／ｋｇに変化させる一方ｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与量が一定のままであるときＶＩＩＩ：Ｃの得られた血漿レベルに関して顕著な効果は観察されなかった。そのうえ、血漿中に得られたＶＩＩＩ：Ｃは実質上投与溶液の浸透性に依存しなかった。
３．マウスの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能は静脈（ｉ．ｖ．）投与後の生物学的利用能の約１０％であり、後者は定義により１００％である。本試験において、投与レベルｓ．ｃ．は投与レベルｉ．ｖ．と同一であった。生物学的利用能は活性下の区域（ＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線（ＡＵＣ）から計算された。かくして、皮下投与後の生物学的利用能は以下の式（データに関しては表１および２参照）にしたがって計算され得る。
生物学的利用能ｓ．ｃ．＝ＡＵＣｓ．ｃ．／ＡＵＣｉ．ｖ．・
投与ｉ．ｖ．／投与ｓ．ｃ．            （１）
実施例２
組み換え第ＶＩＩＩ因子が実験に記載された方法によって以下の点を除いて、すなわち（ｉ）最終純化工程がら収容されたｒ−ＶＩＩＩＳＱの材料がＰＥＧを含有しない緩衝液により希釈され、（ｉｉ）ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液が凍結乾燥されず、それは−７０℃で貯蔵された点を除いて製造された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液は以下の組成を有した。
ガラス瓶当たりの組成物：
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ                                  ７．５
スクロース、ｍｇ                                  １５８
塩化ナトリウム、ｍｇ                                ４５
塩化カルシウム・（２Ｈ2Ｏ）、ｍｇ                    １．２５
ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン
モノオレアート（ツイーン８０（商標））、ｍｇ          ０．５０
充填されたＶＩＩＩ：Ｃ  ＩＵ／ガラス瓶                ６，０７０
ＶＩＩＩ：Ｃ  ＩＵ／ｍｌ★                            １，１３０
★希釈されたｒ−ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱの１部＋水の１部、ｖ：ｖ）
ＶＩＩＩ：Ｃの投与量が３，０００ＩＵ／ｋｇ体重以下だったとき投与前に注射のためｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液を殺菌水により希釈させた（１部のｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液＋１部の水、ｖ：ｖ）。
約３〜３．５ｋｇの体重の雌のカニクイザル（マカカ・フアシキユラリス）の背中の領域にｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液を皮下注射した。投与量に依存して、注射の量をおよそ０．２ないし２０．ｍｌ／ｋｇ体重の間で変化させた。２５０，２，５００および５，０００ＩＵ／ｋｇの単一投与量による皮下注射を投与した。各サンプリングの場合に１．８ｍｌの血液を抗凝固剤（０．２ｍｌ）としてクエン酸を収容する管内に集めた。遠心分離後、血漿を分離しかつ部分標本において凍結した（＜−６０℃）。
結果
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結果
１．結果（表４〜６）にしたがって時間の関数としての血漿濃度は皮下投与後に吸収される薬物の代表的なパターンに追随する。ＶＩＩＩ：Ｃの最大濃度は投与後約９時間で見られた。
２．得られた投与量−反応関係（表７）は皮下注射の結果として生じる血流中にＶＩＩＩ：Ｃの吸収があることの確認を付与する。
３．サルの皮下投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能は約５〜１０％であった（表８）。生物学的利用能はｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与量から独立している。
実施例３
上述した両方の組成物（実施例１および２）の組み換え第ＶＩＩＩ因子（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）を使用した。
体重約３０ｇおよび品種ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスにｒ−ＶＩＩＩＳＱ調合剤を首に皮下で注射した。
投与量は１０，００ＩＵ／ｋｇでありそして注射量は約１０ｍｌ／ｋｇであった。血液サンプリングの前３〜５分間にマウスにはメブマル（商標）（ペントバルビタル）ｖｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜中に麻酔した。投与量は約０．３ｍｌ／マウスであった。麻酔下で０．４５ｍｌの血液が大静脈から０．０５ｍｌのクエン酸ナトリウム（０．１３Ｍ）を含有するプラスチック注射器に集めた。遠心分離（７分間８，８００ｇ）により血液から血漿を調整しそしてその後第ＶＩＩＩ因子活性の測定まで−７０℃でプラスチッククリオフレックス管中に貯蔵した。
第ＶＩＩＩ因子の生物学的利用能を増加する種々の添加剤（表９）と組み合わせてｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液をマウスに皮下注射した。
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結果：
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結果
１．結果はｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能を増加することができることを示す。また、本発明による生物学的利用能を増加する添加剤が皮下投与調合剤に含まれるとき、活性ｒ−ＶＩＩＩＳＱの高い血漿濃度が４８ｈ以上までの非常に長い時間の期間中得られることを示している。これはかかる添加剤なしのｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液が皮下で投与されるときに得られる血漿濃度に比較している。少なくとも５０％の活性ｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能がｒ−ＶＩＩＩＳＱおよび加水分解されたゼラチンまたは大豆油エマルジョンを含有する溶液の皮下注射時に達成される。