(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、変性ヒトアクチビンＡから生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡへのリフォールディングを促進する物質のスクリーニング方法。
（ａ）生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡと被験物質を作用させつつ還元変性反応を行う工程。
（ｂ）還元変性反応後の生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡの残存活性を測定する工程。
（ｃ）生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡの残存活性が高い物質を選抜する工程。
【請求項２】
生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡと被験物質との作用を緩衝作用を有するバッファー中で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記工程を含む、変性ヒトアクチビンＡから生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡへのリフォールディング方法。
（ａ）チオール基がすべてフリーである、可溶化された変性ヒトアクチビンＡのチオール基をグルタチオン及び／又は亜硫酸ナトリウムを用いて保護する工程。
（ｂ）保護された変性ヒトアクチビンＡ含有液を、タウロデオキシコール酸(Taurodeoxycholic acid)またはその塩を含有し、ｐＨ７．５〜１０．５で緩衝作用を有するリフォールディングバッファーで透析後、チオール化合物を添加することにより、ジスルフィド結合交換反応を行う工程。
【請求項４】
下記工程を含む、変性ヒトアクチビンＡから生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡへのリフォールディング方法。
（ａ）チオール基がすべてフリーである、可溶化された変性ヒトアクチビンＡのチオール基をグルタチオン及び／又は亜硫酸ナトリウムを用いて保護する工程。
（ｂ）保護された変性ヒトアクチビンＡ含有液を、チオール化合物及びタウロデオキシコール酸(Taurodeoxycholic acid)またはその塩を含有し、ｐＨ７．５〜１０．５で緩衝作用を有するリフォールディングバッファーで置換することにより、ジスルフィド結合交換反応を行う工程。
【請求項５】
リフォールディングバッファーがアルギニンもしくはその塩を更に含有することを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、変性ヒトアクチビンＡを生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡにリフォールディングする方法に関するものである。天然型ヒトアクチビンＡは、医薬品等への用途が期待できる有用蛋白質である。
背景技術
ヒトアクチビンＡはヒト白血病細胞株THP-1(IFO 50147)の培養上清より単離精製された、アミノ酸１１６個のポリペプチド鎖2本からなるホモダイマー蛋白質である。分子量は、約25,000ダルトンであり、ポリペプチド鎖毎に9個のCysが存在（ダイマーで合計18個）、合計9個の分子内、分子間ジスルフィド結合を形成している。（Biochemical and Biophysical Research Communications，142，1095-1103，1987）
ヒトアクチビンＡは、ヒト骨髄性白血病細胞THP-1(IFO 50147)をホルボールエステルを用いて刺激後に得た培養上清（細胞工学、別冊4、Ｐ48〜58、1988年）や、ヒトアクチビンＡのc-DNAを有する発現ベクターを導入して得たヒトアクチビンＡ高生産組み換えＣＨＯ細胞由来培養上清（Biochemical and Biophysical Research Communications，151，230-235，1988）を原料にして、多段階のクロマトグラフィーや沈殿、濃縮操作を繰り返すことにより精製、製造される。しかし、これらの動物細胞由来培養上清を精製原料として精製する製造法を工業的製造法として用いるには問題点が多い。
すなわち、(1)生産宿主である動物細胞が分泌したり、培地成分として予め添加された牛胎児血清等に由来する不純物を高度に除去する必要があるため、ヒトアクチビンＡの精製回収率は極めて低値に留まる。
(2)組み換え微生物を生産宿主とする場合に比較して、生産性は極めて低く、精製原料を十分に供給するためには極めて高い生産能力を有する動物細胞または培養装置が必要となる。(3)生産宿主を培養するためには培地に高濃度の牛胎児血清を添加したり、成長因子等を含有する無血清培地を用いる必要がある。しかし、これらは極めて高価であり、製造に欠かせない一定品質の安定入手にも問題がある。以上に記したようにヒトアクチビンＡを動物細胞を用いて生産する場合には、低生産性等の問題点があり、工業的製造法を確立する際にはこれらを解決する必要がある。
これらの問題点を解決するために、従来より種々の検討がなされている。組み換え大腸菌等の微生物を生産宿主に用いると、その蛋白質生産性は一般に動物細胞のそれの100倍以上向上するため、生産宿主の微生物への変更は生産性を向上するために有効な方法といえる。しかし、大腸菌によるヒトアクチビンＡの生産では、得られるヒトアクチビンＡが天然型とは異なる分子内及び／又は分子間のジスルフィド結合をもつ変性ヒトアクチビンＡとなってしまうことが多い。（欧州特許出願公開(EP0222491)、日本特許出願公開(特開昭63-119679)）
ここでいう変性ヒトアクチビンＡとは、ヒトアクチビンＡのポリペプチド鎖は有するが、分子内及び／又は分子間ジスルフィド結合が解裂して高次構造を失ったモノマー構造のもの、あるいはジスルフィド結合が転移して天然型とは異なる構造となったもの、あるいは新たな分子間ジスルフィド結合により多量体化した分子等、高次構造と共に生物活性を失ったものを意味する。
このような変性ヒトアクチビンＡは生物活性を持たないため、生物活性を有する天然型の蛋白質と同じ高次構造へ再構成（リフォールディング）する必要がある。しかしながら、一般的に、蛋白質によっては、容易にリフォールディングできないもの、もしくはまったくリフォールディングできないものもあり、リフォールディング条件を決定することは、非常に困難である。特に、多量体蛋白質やジスルフィド結合を多く有する蛋白質については、検討しても適正なリフォールディング条件を設定できるとは限らず、リフォールディング条件の決定は容易ではない。
天然型ヒトアクチビンＡは、合計9個の分子間、分子内ジスルフィド結合を有するため、変性ヒトアクチビンＡをリフォールディングするための条件設定は極めて困難であり、ヒトアクチビンＡのリフォールディング法に関する従来技術はない。一方、A．J．Masonらは動物細胞を用いたアクチビンＡの分泌発現効率と発現ベクターの構造との関係を検討することにより、アクチビンＡのリフォールディングと分泌にはアクチビンＡのアミノ酸列に加えてプロ配列領域が必須であり、ヒトアクチビンＡのアミノ酸配列だけではリフォールディングも分泌もされないことを示した（Science，247，1328，1330，1990）。この報告は微生物を生産宿主として発現された変性ヒトアクチビンＡのリフォールディングが極めて困難であることを示唆している。
本発明の課題はヒトアクチビンＡの工業的製造を構築するために、微生物により生産された変性ヒトアクチビンＡを生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡにリフォールディングする方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、下記工程（ａ）、（ｂ）を含む変性ヒトアクチビンＡから生物活性を有する天然型ヒトアクチビンＡへのリフォールディング方法を開発した。
（ａ）チオール基がすべてフリーである、可溶化された変性ヒトアクチビンＡのチオール基をグルタチオン及び／又は亜硫酸ナトリウムを用いて保護する工程。
（ｂ）保護された変性ヒトアクチビンＡ含有液をリフォールディングバッファーで置換後、チオール化合物を添加することにより、ジスルフィド結合交換反応を行う工程。
または、
（ａ）チオール基がすべてフリーである、可溶化された変性ヒトアクチビンＡのチオール基をグルタチオン及び／又は亜硫酸ナトリウムを用いて保護する工程。
（ｂ）保護された変性ヒトアクチビンＡ含有液をチオール化合物を含有するリフォールディングバッファーで置換することにより、ジスルフィド結合交換反応を行う工程。
詳しくは、本発明は、
(1)チオール基がすべてフリーである変性ヒトアクチビンＡ中のCys残基のチオール基を亜硫酸ナトリウムもしくはグルタチオンを用いて保護し、
(2)次いで、リフォールディングバッファーで置換し、
(3)次いで、チオール化合物を添加して分子内及び／又は分子間結合ジスルフィドを形成せしめ、天然型ヒトアクチビンＡを得る方法、
または
(1)チオール基がすべてフリーである変性ヒトアクチビンＡ中のCys残基のチオール基を亜硫酸ナトリウムもしくはグルタチオンを用いて保護し、
(2)次いで、チオール化合物を含有し、リフォールディングバッファーで置換し、分子内及び／又は分子間結合ジスルフィドを形成せしめ、
天然型ヒトアクチビンＡを得る方法、
において、
リフォールディングバッファーが、リフォールディングバッファーで０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解された天然型ヒトアクチビンＡを０．２ｍＭ量のジチオトレイトール（Dithiothreitol；ＤＴＴ）で還元変性するとき、該バッファーのかわりにＴｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて還元変成したときに比べて天然型ヒトアクチビンＡの構造を２０％以上安定に維持することができるバッファーであることを特徴とする、
変性ヒトアクチビンＡのリフォールディング方法に関するものであり、本発明により、効率的に変性ヒトアクチビンＡの生物活性を回復できる。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明で用いる原料は、ヒトアクチビンＡ遺伝子を組み込んだ微生物、例えば組み換え大腸菌を培養して得られる変性ヒトアクチビンＡ培養物である。大腸菌を生産宿主として用いた場合、ヒトアクチビンＡの殆どは菌体中に不溶性顆粒として蓄積されるので、この顆粒を原料としてもよい。
常法に従って回収されたヒトアクチビンＡの不溶性顆粒を低濃度（１〜１０mM）のEDTA（Ethylenediaminetetraacetic acid）水溶液に懸濁後、蛋白質変性剤であるグアニジン及び／又は尿素を用いて可溶化する。塩酸グアニジン濃度と尿素濃度は、一般に蛋白質を変性するのに必要なそれぞれ４〜７M、６〜１０M程度でよい。ヒトアクチビンＡ濃度には特に制限がないが、出来るだけ高濃度にするのが以降の操作上好ましい。また、不必要な結合を形成しないために、ｐＨは６以下に保つことが好ましい。可溶化操作は、室温で2〜4時間攪拌することで完了する。
次に、ヒトアクチビンＡの可溶化液に還元剤を１〜１００mM、好ましくは５〜４０mMになるよう添加し、２０mMTris/HClでｐＨ８〜９に調整したのち、２０〜５０℃で１５〜３６０分間の還元反応に供し、Cys残基であるチオール基をフリーとする。還元剤としては、還元型グルタチオン、ＤＴＴ（Dithiothreitol）、２−メルカプトエタノール等の化合物が使用可能であるが、ＤＴＴが、特に好ましい。ＤＴＴの添加量は、５〜４０mMが好ましい。尚、微生物によって生産される変性ヒトアクチビンＡのチオール基が全てフリーである場合は、この還元反応は必要ない。
チオール基が全てフリーであるヒトアクチビンＡの可溶化液に酸化型グルタチオンを0.05〜0.3M好ましくは0.08〜0.16Mになるよう添加し、０〜５０℃で２〜２４時間以上静置し、チオール基を保護する。酸化型グルタチオンの替わりに亜硫酸ナトリウムを用いてスルホニル化を行い、チオール基を保護することもできる。この場合は、チオール基が全てフリーであるヒトアクチビンＡに亜硫酸ナトリウムを最終的に0.05〜0.5M、好ましくは0.08〜0.16Mになるよう添加し、同時にテトラチオン酸ナトリウムを5〜20mM、好ましくは8〜16mMになるよう添加し、０〜５０℃で２〜２４時間以上静置する。また、酸化型グルタチオンと亜硫酸ナトリウムを混合して用いることも可能である。
チオール基の保護状態はブチル基を化学結合したシリカゲルカラム、例えば、Vydac214TP54（4.6φx250mm、Separations group）を用いる逆相HPLCで確認することができる（Biochemical and Biophysical Research Communicatons，142，1095-1103，1987）。以上の操作で用いる試薬は予め十分に脱気した溶媒に溶解して用い、反応溶液の気相には窒素やヘリウム等の不活性を充填して酸素による空気酸化を抑制しておく事が望ましい。また、次の工程を効率的に行うために、得られたチオール基が保護されたヒトアクチビンＡ溶液から、未反応のチオール基の保護剤を透析等によって除去しておくことが好ましい。
上記の方法で得られたチオール基が保護されたヒトアクチビンＡ溶液をｐＨ７．５〜１０．５のリフォールディングバッファーに置換する。本発明に使用されるリフォールディングバッファーとしては、そのリフォールディングバッファーで０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解された天然型ヒトアクチビンＡを０．２ｍＭのジチオトレイトール（Dithiothreitol；ＤＴＴ）で還元変性するとき、該バッファーのかわりにＴｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて還元変成したときに比べて天然型ヒトアクチビンＡの構造を２０％以上安定に維持することができるバッファーであれば、使用可能である。その詳細については、後述する。保護されたヒトアクチビンＡをリフォールディングバッファーに置換する方法としては、十分に脱気されたリフォールディングバッファーで平衡化されたゲル濾過カラム、例えば、セファデックスG-25（ファルマシアバイオテク製）にチオール基を保護したヒトアクチビンＡを供し、蛋白質画分を回収する方法が挙げられる。また、チオール基を保護したヒトアクチビンＡを透析膜、例えばSpectra/Por membrane，No.1（Spectrum Medical Industries，Inc.製）に注入し、十分に脱気されたリフォールディングバッファー、５００倍量以上に対して０〜２０℃で３〜２４時間以上透析する方法も適用可能である。
続いて、チオール基が保護されたヒトアクチビンＡのジスルフィド結合の形成をチオール化合物の添加により行う。上述した方法でリフォールディングバッファーに置換したヒトアクチビンＡ含有液にチオール化合物を１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭを添加し、０〜５０℃で０．５〜１４日間静置する。リフォールディングの完了と生物活性の回復は、前述の逆相ＨＰＬＣと生物活性測定（例えばフレンド白血病細胞の分化誘導活性測定、Biochemical and Biophysical Research Communicatons，142，1095-1103，1987）により確認することができる。チオール化合物としては、システイン、還元型グルタチオン、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール等のチオール化合物が使用可能であるが、システインまたは還元型グルタチオンが特に好ましい。システインまたは還元型グルタチオンは、２〜５mMの濃度になるような添加量が好ましい。
なお、リフォールディングバッファーに置換すると同時にジスルフィド結合の形成を開始することもできる。チオール基が保護されたヒトアクチビンＡに塩酸を添加してｐＨを２〜４まで低下させて、ジスルフィド結合の交換反応を停止する。これを変性剤、例えば尿素または塩酸グアニジンを含む１〜１００ｍＭの塩酸、５００倍量以上に対して０〜２０℃で３〜２４時間透析することにより、未反応のチオール基の保護剤を除去する。これを後述する条件を満足するリフォールディングバッファーを用いて希釈し、０〜５０℃で０．５〜１４日間静置する。リフォールディングバッファーには予めジスルフィド結合の形成を促進するよう、前述したチオール化合物を上記と同様の濃度加えておく。
リフォールディングバッファー条件は以下に示す方法で決定された。ヒトアクチビンＡのリフォールディングを効率的に実施するにはリフォールディングに都合の良い変異体をつくるのではなく、ヒトアクチビンＡの高次構造を安定化する溶媒環境を確保すれば良いと考えられる。高次構造の安定性は、それと相関すると考えられる化学的安定性を測定することにより、推定可能である。ここでいうヒトアクチビンＡの化学的安定性とは、本来は分子内に形成されているジスルフィド結合の転移による分子間会合、および凝集沈澱を代表とする変化が起きていないことを意味する。
先ず、１mMＨＣｌに溶解した天然型ヒトアクチビンＡを変性剤、界面活性剤、塩、有機酸、アミノ酸、糖、有機溶媒等の組み合わせからなるｐＨ７．５〜１０．５のバッファーに希釈する。天然型ヒトアクチビンＡの濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌに調整する。ここへ天然型ヒトアクチビＡに対して約５０等量の還元剤（例えばＤＴＴ、２−メルカプトエタノールまたは還元型グルタチオン）を添加し、室温で約１２時間放置し、逆相ＨＰＬＣで天然型ヒトアクチビンＡの残存量を測定する。コントロールとして、Ｔｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて上記の同様の反応を行い、残存量を比較する。Ｔｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いる場合の天然型ヒトアクチビンＡの残存量に対して残存量が増加した分の割合を残存量の向上率として表す。このとき、天然型ヒトアクチビンＡの残存量の向上率が大きいほど、化学的な安定性が高く、つまりヒトアクチビンＡの高次構造を安定化し、リフォールディングを促進するバッファー条件として好ましい。種々の化合物を組み合わせてバッファーを作成し、実験的にスクリーニングした結果、天然型ヒトアクチビンＡを還元変性したとき、上記のＴｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に比べて、その構造を２０％以上安定に維持することができるバッファーであれば、リフォールディングバッファーとして適切であることが判明した。すなわち、この条件を満たす（天然型ヒトアクチビンＡを還元変性したとき、Ｔｒｉｓバッファー（尿素；１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に比べて、その構造を２０％以上安定に維持することができる）バッファーであれば、本発明で使用するリフォールディングバッファーとして使用可能である。具体的には、この条件を満たすリフォールディングバッファーとして、下記のものを挙げることができる。
（Ｉ）ｐＨ７．５〜１０．５で緩衝作用を有するバッファーに
（ａ）表１に記載した分類Ａおよび／または分類Ｂの試薬；表の濃度の０．５〜２倍の濃度
（ｂ）尿素；０．１〜３Ｍ好ましくは０．５〜１Ｍ
を添加し、ｐＨを７．５〜１０．５好ましくは８．５〜９．５に調整したもの、
（II）ｐＨ７．５〜１０．５で緩衝作用を有するバッファーに
（ａ）表１に記載した分類Ａおよび／または分類Ｂの試薬；表１の濃度の０．５〜２倍の濃度
（ｂ）尿素；０．１〜３Ｍ好ましくは０．５〜１Ｍ
（ｃ）表３に記載した分類Ａ、分類Ｂおよび／または分類Ｃの試薬；表３の濃度の０．５〜２倍の濃度
を添加し、ｐＨを７．５〜１０．５好ましくは８．５〜９．５に調整したものを挙げることができる。ｐＨ７．５〜１０．５で緩衝作用を有するバッファーとしては、Trisバッファー、トリメチレンジアミンバッファー、エタノールアミンバッファー等を挙げることができる。また、上記の尿素の替わりに塩酸グアニジン；０．０５〜２Ｍ好ましくは０．１〜１Ｍを用いることができる。
実施例
以下、本発明を実施例にて具体的に説明する。
実施例１
組み換えＣＨＯ細胞由来培養上清よりクロマトグラフィーを繰り返して得た天然型ヒトアクチビンＡ（Biochemical and Biophysical Research Communicatons，151，230-235，1988）を１mM HClを用いて２mg/mlに調製し、尿素濃度（１．５M、および３．０M）、NaCl濃度（１．０M、および０M）、CHAPS濃度（２％、０．５％、および０M）を組み合わせた１２種の２０mMTris/HClバッファー（ｐＨ８．５）を用いて最終的に０．１mg/mlになるよう希釈した。ここへDTTを最終的に０．２mMになるよう添加し、室温で１２時間静置して還元反応を進行し、逆相ＨＰＬＣ（Vydac214TP54、46φx250mm、Separations group製）を用いて残存するヒトアクチビンＡ量を調べた。
このうち最も高い残存量を示したバッファーは、（尿素；１．５M、CHAPS；２％、Tris/HCl；２０mM、ｐＨ８．５）からなるバッファーであった。
実施例２
実施例１で選択されたスクリーニングされたリフォールディングバッファーを用いてヒトアクチビンＡのリフォールディングを実施した。
ヒトアクチビンＡをコードするＤＮＡを導入した大腸菌を合成培地で培養（1L）し、トリプトファンプロモーターを酸で誘導することにより、ヒトアクチビンＡを不溶性顆粒として菌体内に蓄積させた（欧州特許出願公開（EP0222491）、日本特許出願公開（特開昭63-119679））。この顆粒を常法に従い顆粒懸濁液（１mM EDTA、ｐＨ６以下）に調製、尿素を最終的に８Mになるよう添加、室温で３時間攪拌し、変性可溶化（２０ml）した。これを２０mMTris/HClでｐＨ８．５に調整後、ＤＴＴを最終的に２０mMになるよう添加し、更に３７℃で３０分間加熱した。
ヒトアクチビンＡの分子内および分子間ジスルフィド結合が完全に還元されたことを逆相ＨＰＬＣで確認後、酸化型グルタチオン最終的に０．１Mになるよう添加し、５℃で１５時間静置した。ヒトアクチビンＡとグルタチオンとの混合結合が形成されたことを逆相ＨＰＬＣで確認後、希釈バッファー（８M尿素、２０mMTris/HCl、ｐＨ８．５）を用いてヒトアクチビンＡ濃度を０．１mg/mlに調整した。これを透析膜（Spectra/Por membrane，No.1；Spectrum Medical Industries，Inc.製）に注入し、５００倍量の実施例１で選ばれたリフォールディングバッファー（尿素；１．５M、Tris/HCl；２０mM、CHAPS；２%、ｐＨ８．５）に対して５℃で１５時間透析した。
透析内液にシステインを最終的に３mMになるよう添加し、５℃で３日間静置した。ヒトアクチビンＡの高次構造が再構成されたことは生物活性（フレンド白血病細胞の分化誘導活性）測定で確認された。その結果、投入した変性ヒトアクチビンＡ質量の２４％にあたる生物活性（フレンド白血病細胞の分化誘導活性）を確認できた。
これを10%TFA（トリフルオロ酢酸）を用いてｐＨ３に調整後、逆相ＨＰＬＣ（Vydac214TP54、4.6φx250mm、Separations group；アセトニトリル濃度勾配溶出法）で電気泳動的に単一な成分まで精製した。
実施例３
表１に示した試薬をTris/HClバッファー（尿素；１．５M、Tris/HCl；２０mM、ｐＨ８．５）にそれぞれの濃度添加し、これらを実施例１のTris/HClバッファーの替わりに用いて室温で１２時間の還元反応を行い、逆相ＨＰＬＣを用いて天然型ヒトアクチビンＡの残存量を調べた。その結果を同じ表１に示した。残存量の向上率は、何も添加しないTris/HClバッファー（尿素；１．５M、Tris/HCl；２０mM、ｐＨ８．５）を用いて還元反応を行った時の残存量に対して増加した分の割合で示した。その結果、用いた試薬の種類によって残存率の変化に大きな違いのあることがわかった。分類ＡまたはＢの試薬を添加するとき、天然型ヒトアクチビンＡの残存率は向上し、特に０．５３％のTDCA/Na塩を添加するとその残存率は極めて向上することがわかった。
0004019432.tif 000002
次に、表１に示した各試薬をTris/HClバッファー（尿素；１．５M、Tris/HCl；２０mM、ｐＨ８．５）に添加したものをリフォールディングバッファーとして、大腸菌で生産した変性ヒトアクチビンＡのリフォールディングを実施例２に従って実施した。その結果、表１の天然型ヒトアクチビンＡの残存率が変化しなかった又は低下した試薬を用いた場合（Ｄ、Ｅ）は、生物活性（フレンド白血病の文化誘導活性）の回復が全く認められず、逆に残存率が高まった試薬を用いた場合（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、残存率の向上に相関した生物活性の回復、つまりリフォールディングが進行したことが認められた（表２）。特に、２０％以上の残存量の向上が認められた分類Ａ、Ｂの試薬を添加したバッファーは、リフォールディングバッファーとして有効であった。すなわち、天然型ヒトアクチビンＡを還元変性したとき、その構造を２０％以上安定に維持できるバッファーをリフォールディングバッファーとして用いれば、効果的にリフォールディングできることがわかった。
これらの結果は還元変性反応における残存率を検討することによりリフォールディングに適するバッファーをスクリーニングできることを示した。
0004019432.tif 000003
実施例４
表３に示した試薬を、実施例３で有効性の確認された0.13%TDCA/Naを含むTris/HClバッファー（尿素；１．５M、TDCA/Na；０．１３%、Tris/HCl；２０mM、ｐＨ８．５）にそれぞれ添加し、これらを実施例３のTrisバッファーの替わりに用いて室温で12時間の還元反応を行い、逆相ＨＰＬＣを用いて天然型ヒトアクチビンＡの残存量を調べた。その結果を同じ表３に示した。残存量の向上率は、Tris/HClバッファ（尿素；1.5M、TDCA/Na；0.13%、Tris/HCl、20mM；pH、8.5）を用いて還元反応を行った時の残存量に対して増加した分の残存量の割合で示した。用いた試薬の種類によって残存率の変化に大きな違いのあることがわかった。分類Ａ、ＢまたはＣの試薬を添加すると、TDCA/Naを単独で添加したときに比べ、天然型ヒトアクチビンＡの残存率は向上し、特に１Mのアルギニン塩酸塩を添加するとその残存率は極めてよく向上することがわかった。
従って、表１の分類ＡまたはＢの試薬を添加し、さらに表３の分類Ａ、ＢまたはＣの試薬を添加したバッファーは、リフォールディングバッファーとしてより効果的であると考えられる。
0004019432.tif 000004
実施例５
実施例２と同様に調製された還元済みヒトアクチビンＡに亜硫酸ナトリウムを最終的に０．１Mになるよう、およびテトラチオン酸ナトリウムを最終的に０.０１Mになるよう添加し、５℃で１５時間静置した。ヒトアクチビンＡと亜硫酸イオンとの混合ジスルフィド結合が形成されたことを逆相ＨＰＬＣで確認後、希釈バッファー（８M尿素、２０mMTris/HCl、ｐＨ８．５）を用いてヒトアクチビンＡ濃度を０．１mg/mlに調整した。これを透析膜（Spectra/Por membrane，No.1；Spectrum Medical Industries，Inc.製）に注入し、500倍量のリフォールディングバッファー（尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．５３％、アルギニン塩酸塩；１Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に対して５℃で１５時間透析した。透析内液にCysを最終的に３mMになるよう添加し、５℃で３日間静置した。ヒトアクチビンＡの高次構造が再構成されたことは生物活性（フレンド白血病細胞の分化誘導活性）測定で確認された。これを１０％TFAを用いてｐＨ３に調整後、逆相ＨＰＬＣ（Vydac214TP54、22φx250mm、Separations group製；アセトニトリル濃度勾配溶出法）で電気泳動的に単一な成分まで精製した。
実施例６
実施例２と同様にしてヒトアクチビンＡとグルタチオンとの混合結合が形成されたことを逆相HPLCで確認後、塩酸を添加してpHを3.0まで低下した。これを透析膜（Spectra/Por，membrane，No.1；Spectrum Medical Industries，Inc.製）に注入し、500倍量の40mM塩酸を含む8M尿素に対して5℃で15時間透析した。透析内液を最終的にリフォールディングバッファー組成（尿素；1.5M、TDCA/Na；0.13%、アルギニン塩酸塩；0.1M、Tris/HCl；20mM、pH8.5）に一致し、かつヒトアクチビンＡの濃度が0.1mg/mlになるように計算されたバッファーで希釈し、５℃で３日間静置した。ヒトアクチビンＡの高次構造が再構成されたことは生物活性で（フレンド白血病細胞の分化誘導活性）で確認した。これを10%TFAを用いてpH3に調整後、逆相HPCL（Vydac214TP54、4.6φx250mm、Separations group製；アセトニトリル濃度勾配溶出法）で電気泳動的に単一な成分まで精製した。
実施例７
実施例６で用いたリフォールディングバッファーの替わりに、以下に示すリフォールディングバッファーをそれぞれ用いて同様の操作を実施することにより、ヒトアクチビンＡの高次構造を再構成し、電気泳動的に単一な成分まで精製した。
バッファー１：尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．５３％、アルギニン塩酸塩０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー２：尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．５３％、塩化ナトリウム；１Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー３：尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、アルギニン塩酸塩；１Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー４：尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、アルギニン塩酸塩；０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー５：尿素；１Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、酢酸カルシウム；０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５）
実施例８
実施例６で用いたリフォールディングバッファーの替わりに、以下に示すリフォールディングバッファーをそれぞれ用いて同様の操作を実施することにより、ヒトアクチビンＡの高次構造を再構成し、電気泳動的に単一な成分まで精製した。
バッファー６：塩酸グアニジン；０．５Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．５３％、アルギニン塩酸塩０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー７：塩酸グアニジン；０．５Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．５３％、塩化ナトリウム；１Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー８：塩酸グアニジン；０．５Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、アルギニン塩酸塩；１Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー９：塩酸グアニジン；０．５Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、アルギニン塩酸塩；０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
バッファー１０：塩酸グアニジン；０．５Ｍ、ＴＤＣＡ／Ｎａ；０．１３％、酢酸カルシウム；０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ８．５
産業上の利用可能性
以上に示したように、本発明の方法により、初めて変性ヒトアクチビンＡを天然型ヒトアクチビンＡにリフォールディングすることができるようになり、簡便な方法で変性ヒトアクチビンＡの生物活性を回復できるようになった。すなわち、従来は真核細胞を生産宿手として生産せざるを得なかった天然型ヒトアクチビンＡを組換え微生物を生産宿手として簡便かつ安価に生産することが可能となった。