(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)KFCC 10743の変異株であって、3,4-デヒドロ-DL-プロリン耐性を有し、30 mg/Lより低濃度の3,4-デヒドロプロリンの存在下で生育し、5'-キサンチル酸を過剰生産することを特徴とする、韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms)に寄託番号KCCM-10340として寄託されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスCJXPK001。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、5'-キサンチル酸を過剰生産する微生物に関し、より詳細には、3,4-デヒドロ-DL-プロリンに対して耐性を有する、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)KFCC 10743の変異株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスCJXPK001に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸は主に細胞の核に存在している物質であって、牛肉の味を出すイノシン酸(イノシネート、IMP)と茸の味を出すグアニル酸(グアニレート、GMP)などの成分を含んでいる。このような事実が知られて以来、核酸を食品または薬品分野の原料として用いるために魚やイカなどから核酸を少量ずつ抽出した初期段階を経て、大量生産するための方法が開発されてきた。そのうち、グアニル酸を生産するための方法として5'-キサンチル酸(XMP)を製造原料として使用する方法が最も広く用いられている。5'-キサンチル酸はプリンヌクレオチド生合成経路の中間生成物であって、XMP-グルタミンアミドトランスフェラーゼによりグアニル酸に変換される。従って、最初に5'-キサンチル酸を生産し、次にこれを酵素的に5'-グアニル酸に変換させることにより5'-グアニル酸を製造する方法が用いられている。しかし、5'-グアニル酸を大量に生産するためには、それに相当する量の5'-キサンチル酸が必要であるため、5'-キサンチル酸を大量生産するための研究が進行中である。
【０００３】
5'-キサンチル酸を製造するための従来の方法としては、化学合成法、酵母においてリボ核酸が分解されて生産される5'-グアニル酸を脱アミノ化する方法、発酵培地中に前駆物質としてキサンチンを添加する方法、微生物変異株を利用する製造方法、抗生物質の添加による製造方法(特許文献１および２参照)、並びに界面活性剤の添加による製造方法(特許文献３および４参照)などが知られている。中でも特に、微生物変異株を利用した5'-キサンチル酸の直接的な発酵製造方法が工業的に非常に有利である。そこで、本発明者らはイノシン酸およびグアニル酸などの核酸の生産に利用される産業用微生物であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)を利用して5'-キサンチル酸を高収率で生産しようとする研究を継続してきたが、既存のコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743が保有している固有の性質を改良して5'-キサンチル酸の生産性が向上した変異株を開発することができ、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【特許文献１】
特公昭第42-1477号公報
【特許文献２】
特公昭第44-20390号公報
【特許文献３】
特公昭第42-3835号公報
【特許文献４】
特公昭第42-3838号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、5'-キサンチル酸を高収率で生産することができる微生物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するために、本発明は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743の変異株である、3,4-デヒドロプロリン耐性のCJXPK001を提供する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
大部分の微生物は、菌体外部の浸透圧による脱水現象を防ぐために、カリウムイオンやオスモライト(osmolytes)などの有機溶質を菌体内部に蓄積させることにより菌体内部の浸透圧を高めている。前記オスモライトとしては、プロリン、ベタインおよびカルニチンが挙げられ(Beumer, R.R.ら，Appl. Environ. Microbiol. 60：1359‐1363，1994)、中でもプロリンは浸透圧調節の最も重要な因子として知られている。さらに、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)では、菌体外部の5'-キサンチル酸により増加した外部浸透圧の条件下で、プロリン生合成経路の重要な酵素であるピロリン-5-カルボキシレートレダクターゼの活性が増加するので菌体内部にプロリンが蓄積されることが報告されている(Yoshio K.ら， Agr. Bio. Chem., 53(9)：2475‐2479，1989)。また、大腸菌(E. coli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および霊菌(Serratia marcescens)などの場合には、菌体内部にL-プロリンが蓄積され、これは外部浸透圧により調節されることが報告されている(V.J. Dunlapら, J. Bacteriol., 163：296, 1985)。
【０００９】
従って、本発明者らは、既存のコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743にL-プロリン類似体に対する耐性を付与し、かつフィードバック阻害によるプロリン合成の阻害を抑制させることにより、L-プロリン合成能が強化され、これにより微生物の浸透圧耐性形質が高められて、5'-キサンチル酸を高収率で生産することができる変異株を開発した。
【００１０】
【発明の実施の形態】
具体的には、本発明ではコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743を親株として使用し、それを通常の方法に従って紫外線照射、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)などの突然変異誘発剤で処理した後、下記表１の最少培地にプロリン類似体である3,4-デヒドロプロリン(Sigma社)を0〜50 mg/Lの濃度で添加することにより生育する変異株を開発した。その中から30 mg/L濃度の3,4-デヒドロプロリンの存在下で生育する菌株を選別してCJXPK001と命名し、2001年12月6日に韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms)(361-221, Yurim B/D, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, SEOUL 120-091, Republic of Korea)に寄託番号KCCM-10340として寄託した。
【００１１】
【表１】
0004017975.tif 000002
【００１２】
表１の最少培地に3,4-デヒドロプロリンを0〜50 mg/Lの濃度で添加して30℃で5日間培養しながら本発明による変異株CJXPK001と親株KFCC 10743の生育度を調査し、その結果を下記表２に示した。
【００１３】
【表２】
0004017975.tif 000003
【００１４】
表２に示した通り、親株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743は、プロリン類似体である3,4-デヒドロプロリン5 mg/Lでは耐性があるが、10 mg/L以上の濃度では全く生育しなかった。これに反して、本発明による変異株CJXPK001は30 mg/Lまでの濃度の3,4-デヒドロプロリンに対して耐性を示した。
【００１５】
本発明による変異株CJXPK001を利用して5'-キサンチル酸を生産するために用いられる発酵培地としては、工業的に安価な糖質原料(グルコース、フルクトース、およびこれらを含む多糖類の加水分解産物)、窒素源(有機または無機)、および微生物の生育に必要な無機ミネラル塩、微量元素、ビタミンなどを適宜に添加した培地すべてが使用可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記実施例は単に本発明を例示したものであり、本発明の範囲を下記実施例に限定するものではない。
【００１７】
実施例１
グルコース30 g/L、ペプトン15 g/L、酵母エキス15 g/L、塩化ナトリウム2.5 g/L、尿素3 g/L、アデニン150 mg/L、グアニン150 mg/Lで構成された種培地(pH7.2) 5mLを直径18 mmの試験管に入れて加圧滅菌した後、本発明による変異株CJXPK001を播種して180 rpm、30℃で18時間震盪培養した(種培養物)。その後、発酵培地として、本培地(グルコース60 g/L、硫酸マグネシウム10 g/L、硫酸第一鉄20 mg/L、硫酸亜鉛10 mg/L、硫酸マンガン10 mg/L、アデニン30 mg/L、グアニン30 g/L、ビオチン100μg/L、硫酸銅1 mg/L、チアミン塩酸塩5 mg/L、塩化カルシウム10 mg/L、pH7.2)および別培地(一塩基性リン酸カリウム10 g/L、二塩基性リン酸カリウム10 g/L、尿素7 g/L、硫酸アンモニウム5 g/L)をそれぞれ別個に調製して加圧滅菌した。次に、予め加圧滅菌した500 mL容量の震盪用三角フラスコに本培地と別培地をそれぞれ29 mL、10 mLずつ入れて、前記種培養物１mLを播種した後、200 rpm、30℃で90時間培養した。その後、培養が完了した培地中の5'-キサンチル酸の蓄積量を測定した。その結果を下記表３に示した(5'-キサンチル酸の蓄積濃度は5'-キサンチル酸ナトリウム・7H2Oで表される)。
【００１８】
比較例１
親株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743を使用したことを除いて、実施例１と同一の方法で培養した。培養が完了した培地中の5'-キサンチル酸の蓄積量を測定して下記表３に示した。
【００１９】
【表３】
0004017975.tif 000004
【００２０】
表３に示した通り、本発明の変異株CJXPK001(実施例１)を使用した場合の5'-キサンチル酸の生産量は、親株KFCC 10743(比較例１)に比べて、約13％増加していた。
【００２１】
実施例２
実施例１における種培地50 mLを500 mL容量の震盪用三角フラスコに入れて加圧滅菌した後、本発明による変異株CJXPK001を播種して180 rpm、30℃で24時間震盪培養した(1次種培養物)。その後、第2の種培地(グルコース60 g/L、一塩基性リン酸カリウム2 g/L、二塩基性リン酸カリウム2 g/L、硫酸マグネシウム1 g/L、硫酸第一鉄22 mg/L、硫酸亜鉛15 mg/L、硫酸マンガン10 mg/L、硫酸銅1 mg/L、塩化カルシウム100 mg/L、ビオチン150μg/L、アデニン150 mg/L、グアニン150 mg/L、チアミン塩酸塩5 mg/L、消泡剤0.6 ml/L、pH7.2)を5L容量の実験用発酵槽に2Lずつ分注して加圧滅菌した。続いて、前記種培養物50 mLを播種して、空気を0.5 vvmで供給しながら900 rpm、31℃で24時間培養した。培養中は、アンモニア水で培地のpHを7.3に調節した(2次種培養物)。
【００２２】
その後、発酵培地(グルコース151 g/L、リン酸32 g/L、水酸化カリウム25 g/L、アデニン198 mg/L、グアニン119 mg/L、硫酸第一鉄60 mg/L、硫酸亜鉛42 mg/L、硫酸マンガン15 mg/L、硫酸銅2.4 mg/L、アラニン22 mg/L、NCA 7.5 mg/L、ビオチン0.4 mg/L、硫酸マグネシウム15 g/L、シスチン30 mg/L、ヒスチジン30 mg/L、塩化カルシウム149 mg/L、チアミン塩酸塩15 mg/L、消泡剤0.7 mL/L、CSL 27 mL/L、マグロエキス6 g/L、pH7.3)を30 L容量の実験用発酵槽に8 Lずつ分注して加圧滅菌した。次に、2次種培養物を1.5 Lずつ播種し、空気を１vvmで供給しながら400 rpm、33℃で培養した。培養中に残存糖濃度が１％以下になったときは、滅菌済みのグルコースを供給して発酵培地中の総糖量を30％に調節した。培養中、アンモニア水で培地のpHを7.3に調節して90時間培養した。培養が完了した培地中の5'-キサンチル酸の蓄積量を測定して下記表４に示した(5'-キサンチル酸の蓄積濃度は5'-キサンチル酸ナトリウム・7H2Oで表される)。
【００２３】
比較例２
親株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスKFCC 10743を使用したことを除いて、実施例２と同一の方法で培養した。培養が完了した培地中の5'-キサンチル酸の蓄積量を測定して下記表４に示した。
【００２４】
【表４】
0004017975.tif 000005
【００２５】
表４に示した通り、本発明の変異株CJXPK001(実施例２)を使用した場合の5'-キサンチル酸の生産量は、親株KFCC 10743(比較例２)に比べて、約15.1％増加していた。
【００２６】
【発明の効果】
上述した通り、本発明によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスCJXPK001は、浸透圧の調節において重要な役割を担っている、L-プロリン類似体である3,4-デヒドロ-DL-プロリンに対し耐性を有することにより、培地中に蓄積された高濃度の溶質に起因する浸透圧によって影響を受けないため、5'-キサンチル酸を高収率・高濃度で生産することができる。