(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質：
（ａ）バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）により生産されうる；
（ｂ）SDS-PAGEにより測定した見かけ分子量が26 kDaである；
（ｃ）最適温度が約60℃であり、70℃において50％の相対活性を維持している；
（ｄ）最適pHがpH 5.5〜6.0に存在し、pH 8において60％の相対活性を維持している；
（ｅ）キシログルカンの主鎖中のβ−1,4−グルコシド結合を開裂せしめる；
（ｆ）pH 7.5において、最大キシログルカナーゼ活性対カルボキシメチルセルロースに対する最大活性の比が少なくとも5:1である；
を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項２】
下記の性質：
（ａ）バシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）により生産されうる；
（ｂ）SDS-PAGEにより測定した見かけ分子量が61 kDaである；
（ｃ）最適温度が約50℃であり、60℃において20％の相対活性を維持している；
（ｄ）5.0〜10.5のpH域において、50％より高い相対活性を維持している；
（ｅ）キシログルカンの主鎖中のβ−1,4−グルコシド結合を開裂せしめる；
（ｆ）pH 7.5において、最大キシログルカナーゼ活性対カルボキシメチルセルロースに対する最大活性の比が少なくとも2:1である；
を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸残基30からアミノ酸残基261 までのアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸残基30からアミノ酸残基261 までのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸残基30からアミノ酸残基261 までのアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の置換、削除または付加により修飾されたアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項６】
配列番号１の塩基番号88〜783の塩基配列を有する核酸と高緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基537 までのアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基537 までのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項９】
配列番号４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基537 までのアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の置換、削除または付加により修飾されたアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項１０】
配列番号３の塩基番号1〜1611塩基配列を有する核酸と高緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するキシログルカナーゼ酵素。
【請求項１１】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素をコードする核酸。
【請求項１２】
DNAである請求項11に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項７〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素をコードする核酸。
【請求項１４】
DNAである請求項13に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項11に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
【請求項１６】
請求項14に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
【請求項１７】
請求項15に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項16に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載のキシログルマナーゼ酵素の製造方法であって、当該酵素を生産することができるバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）種に属する微生物を培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２０】
前記バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）種に属する微生物が、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）ATCC 14580株である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２に記載のキシログルマナーゼ酵素の製造方法であって、当該酵素を生産することができるバシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）種に属する微生物を培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２２】
前記バシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）種に属する微生物が、バシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）NCIMB  40482株である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素の製造方法であって、請求項17に記載の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２４】
請求項７〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素の製造方法であって、請求項18に記載の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２５】
請求項１または10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素を含んで成る酵素調製物。
【請求項２６】
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクテートリアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびトランスグルタミナーゼから成る群より選ばれた１もしくは複数の酵素；またはそれらの混合物を更に含んで成る、請求項２５に記載の酵素調製物。
【請求項２７】
請求項25又は26に記載の酵素調製物、或いは請求項１〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素を含んで成る洗剤組成物。
【請求項２８】
布の機械的処理方法であって、前記布を機械的洗浄工程の洗浄サイクルの間に、請求項25又は26に記載の酵素調製物、或いは請求項１〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素を含有する洗浄溶液で処理することを含んで成る方法。
【請求項２９】
セルロース系繊維、糸、織布または不織布の性質を改善するための、繊維工業における、請求項25又は26に記載の酵素調製物、或いは請求項１〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素の使用。
【請求項３０】
前記酵素調製物またはキシログルカナーゼ酵素が精錬工程において使われる、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
大麻、ジュート、亜麻およびリネンから成る群より選ばれた繊維の浸水（ratting)のための、セルロース繊維加工業における、請求項25又は26に記載の酵素調製物、或いは請求項１〜10のいずれか１項に記載のキシログルカナーゼ酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルカリ性キシログルカナーゼ、即ち、中性とアルカリ性ｐＨ域でそれらの主要酵素活性としてのキシログルカナーゼ活性を示す酵素；そのような酵素の生産方法；および繊維、洗剤およびセルロース繊維加工業におけるそのような酵素の使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
キシログルカンは、植物の一次（成長中）細胞壁中の主要構造の多糖類である。構造上、キシログルカンは、しばしば様々な側鎖により置換されるセルロース様β−１，４−結合グルコース主鎖から成る。大部分の双子葉植物、ある種の単子葉植物および雌性精子植物のキシログルカンは、主鎖中のグルコース残基の約７５％がＯ−６位にグリコシル側鎖を担持している多分枝多糖類である。分枝グルコース残基に直接結合したグリコシル残基は、必ずα−Ｄ−キシロースである。キシログルカン中の側鎖の５０％までが、キシロース残基のＯ−２位におけるβ−Ｄ−ガラクトースまたはα−Ｌ−フコース−（１−２）−β−Ｄ−ガラクトース成分の存在のために、複数の残基を含有する〔Ｃ．Ｏｈｓｕｍｉ  ＆  Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３５：９６３−９６７；Ｇ．Ｊ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ  ＆  Ｓ．Ｃ．Ｆｒｙ（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４３：５９１−５９５；Ｊ．Ｌ．Ａｃｅｂｅｓ他（１９９３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３４３−１３４５〕。綿繊維から抽出されたキシログルカンは、酸加水分解すると、５０：２９：１２：７の比でグルコース、キシロース、ガラクトースおよびフコースを生成した（Ｈａｙａｓｈｉ他，１９８８）。
【０００３】
ナス科植物により生産されるキシログルカンは、典型的にはβ−１，４−結合グルコース残基の４０％だけがＯ−６位にグルコシル側鎖を担持しているので珍しい。更に、キシロース残基の６０％まではＯ−２位のところでα−Ｌ−アラビノース残基により置換されており、或るナス科植物、例えばジャガイモも、キシロース残基の一部分のＯ−２位のところにβ−Ｄ−ガラクトース置換基を有するキシログルカンを含有する（Ｙｏｒｋ他，１９９６）。
【０００４】
キシログルカンはセルロースミクロフィブリルを架橋してセルロース−キシログルカン網状構造を形成することにより、植物の一次細胞壁において機能を果たすと考えられる。この網状構造は一次細胞壁の構造的完全性に必要であると考えられる（Ｃａｒｐｉｔａ他，１９９３）。キシログルカンの別の重要な機能は、植物細胞増殖の生理学的活性調節因子であるキシログルカンサブユニットオリゴ糖の貯蔵所として働くことである。キシログルカンサブユニットは、植物細胞壁の伸長に一定の役割を果たすと仮定されている細胞壁関連酵素であるキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）の作用を活性調節することもできる。従って、キシログルカンは細胞壁の弛緩に重要な役割を果たし、よって細胞の伸展に重要な役割を果たすのかもしれない（Ｆｒｙ他，１９９２）。
【０００５】
多くの双子葉植物種の種子は主な多糖備蓄貯蔵品としてキシログルカンを含有する。種子子葉細胞壁の内側の堅い肥大部分に置かれるこの種のキシログルカンは、主としてグルコース、キシロースおよびガラクトースから構成される（Ｒｏｓｅ他，１９９６）。
【０００６】
タマリンド樹Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ  ｉｎｄｉｃａ  の種子は、ゴム質が紙や繊維の糊剤として有用であると発見された１９４３年にゴムの商業的入手源となった。そのゴムが安価で優れた性質を有するために、タマリンドのキシログルカンによるジュートや綿の糊付けがアジアで広範囲に渡り行われている。タマリンドキシログルカンの食品用途としては、菓子、ジャムおよびゼリーでの使用並びにアイスクリームやマヨネーズの安定剤としての使用が挙げられる（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ他，１９９３）。
【０００７】
キシログルカン活性は、酵素命名法（１９９２年）により与えられた酵素の分類法に含まれていない。今まで、この酵素活性は単にグルカナーゼ活性として分類され、そしてしばしばセルロース分解活性（ＥＣ  ３．２．１．４）、即ちセルロースまたはセルロース誘導体基質中のβ−１，４−グリコシド結合に対する活性と同じであると思われ、または少なくともセルロース分解活性を有する酵素の副活性であると思われてきた。しかしながら、真正のキシログルカナーゼは、キシログルカンからキシログルカンオリゴ糖への可溶化を触媒することができるが実質的なセルロース分解活性、例えば常用されるセルロース様基質ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＨＥセルロースおよびアビセル（Ａｖｉｃｅｌ；微結晶セルロース）に対する活性を示さない、真正キシログルカン特異的酵素である。キシログルカナーゼはキシログルカンの主鎖のβ−１，４−グリコシル結合を開裂させる。
【０００８】
キシログルカナーゼ活性はＶｉｎｃｋｅｎ他（１９９７）により記載されており、彼らはいずれもセルロースまたはＣＭＣに対して高活性を有するトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）〔Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に類似〕由来の３種類のエンドグルカナーゼを特徴づけており、そしてＥｎｄｏＩ〔これはグリコシルヒドロラーゼのファミリー５に属する；Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．他（１９９１，１９９３）を参照のこと〕がキシログルカンに対して本質的に全く（即ち、ほとんど）活性を持たないこと、およびＥｎｄｏＶ（グリコシルヒドロラーゼのファミリー７に属する）とＥｎｄｏＩＶ（グリコシルヒドロラーゼのファミリー１２に属する）がそれぞれキシログルカンとＣＭＣに対して同じ程度の活性を有することを示している。
【０００９】
国際特許公報ＷＯ  ９７／１３８６２は、ＥＰ−Ａ−０  ４６３  ７０６に記載されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｎ４００由来の２つのセルラーゼを記載している。ＥＭＢＬデータベース中の既知の相同セルラーゼとの比較により、ｌａｃ１２の配列はファミリー１２に帰することができ、そしてｌａｃ６４の配列はファミリー５に属すると決定されている。両酵素ともセルラーゼ活性とβ−グルカナーゼ活性を有する。それらは大麦β−グルカンに対して最高の活性を有し、そして共に優れたＣＭＣ活性と幾らかのキシログルカナーゼ活性を示す。両酵素ともＣＭＣに対しては３．５の最適ｐＨ、大麦β−グルカンに対しては５．５の最適ｐＨを有する。
【００１０】
国際特許公報ＷＯ  ９４／１４９５３は、真菌アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｌｅａｔｕｓ）からクローニングされ、真菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）中で発現させた、高キシログルカナーゼ活性と微小のセルロース活性を有するキシログルカナーゼ（ＥＧ  ＩＩ）を開示している。このＥＧ  ＩＩ酵素は２．５〜６のｐＨ域でキシログルカナーゼ活性を示しそしてｐＨ３〜４で最適活性を示し、この酵素もグリコシルヒドロラーゼのファミリー１２に属する。
【００１１】
要約すれば、今までキシログルカナーゼ活性はグリコシルヒドロラーゼのファミリー７と１２に属し且つ酸性から中性付近のｐＨ域でこの活性を示す真菌酵素にいおいてしか認められていない。
【００１２】
しかしながら、工業生産された物質を使う多くの重要な工程はアルカリ性ｐＨで行われる。よって、本発明の目的は、アルカリ性ｐＨで高いキシログルカナーゼ活性を有し且つセルロースまたはセルロース誘導体に対して本質的に全く活性を持たない真のキシログルカナーゼ酵素を提供することである。
【００１３】
発明の要約
本発明者らは、アルカリ性領域で実質的なキシログルカナーゼ活性を有する酵素を発見した。そのような酵素はセルロース分解活性を全くまたはわずかなしかもたない。
【００１４】
従って、本発明は、ｐＨ７でまたはｐＨ７以上で少なくとも５０％の相対キシログルカナーゼ活性を有し、且つ好ましくはセルロースまたはセルロース誘導体基質に対してはほとんどまたは全く活性を持たない、例えば最大キシログルカナーゼ活性対ＣＭＣまたはアビセルに対する最大活性の比が少なくとも２：１である、キシログルカナーゼを含んで成る酵素調製物に関する。
【００１５】
本発明者らはキシログルカナーゼをクローニングしそして発現させることにも成功した。よって、本発明は、更なる面として、（ａ）バシラス・アガラヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ  ４０４８２により生産されるポリペプチド；（ｂ）配列番号４の１〜５３７位に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプチドと少なくとも７０％相同であるか、または１個もしくは数個のアミノ酸の置換、削除もしくは付加により前記ポリペプチドから誘導されるか、または前記ポリペプチドに対して惹起させたポリクローナル抗体と免疫学的に反応性である、（ａ）または（ｂ）に限定したポリペプチドの類似体、のいずれかであるキシログルカナーゼに関する。本発明はまた、キシログルカナーゼ活性を有する精製されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、（ａ）配列番号１のヌクレオチド８８からヌクレオチド７８３までに示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基３０からアミノ酸残基２６１までに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列、から成る群より選ばれる単離されたポリヌクレオチド分子に関する。本発明はまた、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、（ａ）配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド１６１１までに示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基５３７までに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列、から成る群より選ばれる単離されたポリヌクレオチド分子に関する。
【００１６】
別の面では、本発明は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子であるＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクター；前記ＤＮＡセグメントまたは前記発現ベクターを含んで成る細胞；およびキシログルカナーゼ活性を有する酵素の生産方法であって、酵素の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養し、そして培地から前記酵素を回収することを含んで成る方法を提供する。
【００１７】
更に別の面では、本発明は、キシログルカナーゼ活性を示す単離された酵素であって、（ｉ）相同不純物を含まないこと、および（ｉｉ）該酵素が上記方法により生産されることを特徴とする、単離された酵素に関する。
【００１８】
本発明の新規酵素は、セルロース系材料、特にセルロースを含有する繊維、糸、織布または不織布の処理に有用である。この処理は、セルロース系材料を衣料品製造または布製造にすぐ利用できる材料へと加工する間に、例えば糊抜きまたは精錬工程において実施でき；あるいはそのような布または衣料品の工業用または家庭用洗濯の間に実施することができる。
【００１９】
本発明はセルロース系材料のプレパレーションの際に、例えばその後の染色作業での適切な反応のために、真に酵素的な精錬工程を用いることを可能にする。更に、新規酵素を含有する洗剤組成物が、洗濯時に存在する汚れや染み、特にキシログルカンを含有する食品や植物などからくる泥や汚点を除去または漂白できることも期待される。新規酵素を含む洗剤組成物での処理が、セルロース系材料上に残ったキシログルカンに汚れが付くのを防止することができることも期待される。
【００２０】
具体的説明
セルラーゼはグリコシルヒドロラーゼの１０種以上の異なるファミリーの中に見つかる。ある種のセルラーゼはキシログルカナーゼ活性も示す。現在、そのようなセルラーゼはファミリー５，７および１２に分類されたものの中に見つかっている。しかしながら、基質特異性はファミリーとは直接関連性がなく、１つのファミリー内で主な酵素活性がセルラーゼもしくはマンナーゼ活性（ファミリー５）であるか、またはリチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼもしくはキシログルカントランスフェラーゼ活性（ファミリー１６）である場合がある。主酵素活性としてキシログルカンに対する活性を有するとして今までに開示されている唯一の酵素は、ＷＯ  ９４／１４９５３に開示されたアスペルギルス・アクレータスＥＧ  ＩＩである。上述したように、この活性はまだ正式な酵素命名法に登録されていない。
【００２１】
本明細書中、「酵素調製物」という用語は次のいずれかを意味するものである：微生物の単一種からの、恐らく単離されそして精製されている、通常の酵素醗酵生成物であって、普通は多数の異なる酵素活性を含んでなる調製物；または一成分酵素の混合物、好ましくは従来の組換え技術を使って細菌または真菌種から誘導された酵素の混合物であって、醗酵されそして恐らく単離されそして別々に精製されており、且つ異なる種、好ましくは真菌または細菌種に由来する酵素の混合物；または組換えキシログルカナーゼの発現のための宿主細胞として働くが、別の酵素、例えばキシログルカナーゼ、プロテアーゼもしくはセルラーゼを同時に生産しない微生物の醗酵生成物であって、微生物の天然醗酵生成物、即ち対応する天然に存在する天然微生物により通常生産される酵素の複合体である酵素生成物。
【００２２】
好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適ｐＨでの活性に比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％のｐＨ７での相対活性を有する。
別の好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適ｐＨでの活性に比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも９０％のｐＨ８での相対活性を有する。
【００２３】
更に別の好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適ｐＨでの活性に比較して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％のｐＨ９での相対活性を有する。
更に別の好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適ｐＨでの活性に比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％のｐＨ９．５での相対活性を有する。
更に別の好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適ｐＨでの活性に比較して少なくとも５％のｐＨ１０での相対活性を有する。
【００２４】
別の好ましい態様では、キシログルカナーゼは、最適温度での活性に比較して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の５０℃の温度での相対活性を有する。
更に別の好ましい態様では、６０℃の温度では、相対キシログルカナーゼ活性が少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％であり；７０℃の温度では相対キシログルカナーゼ活性が少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、特に少なくとも５０％である。
【００２５】
好ましい態様では、キシログルカナーゼはセルロースまたはセルロース誘導体基質に対してほとんどまたは全く活性を持たない。セルロース活性（エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性、ＥＣ  ３．２．１．４）を測定するために常用される基質はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。セルラーゼまたはセロビオヒドロラーゼ活性（ＥＣ  ３．２．１．９１）を測定するために常用される別の基質は、当業者に周知の微結晶セルロースであるアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）である。好ましくは、最大キシログルカナーゼ活性対ＣＭＣまたはアビセルに対する最大活性の比は２：１であり、より好ましくは少なくとも３：１、より好ましくは少なくとも４：１、更により好ましくは少なくとも５：１、更により好ましくは少なくとも８：１、特に少なくとも１０：１である。
【００２６】
本発明のキシログルカナーゼ調製物は、更にプロテアーゼ、セルラーゼ（エンド−１，４−グルカナーゼ）、β−グルカナーゼ（エンド−β−１，３（４）−グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノグルタミナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびトランスグルタミナーゼから成る群より選ばれた１もしくは複数の酵素、またはそれらの混合物を含んで成ってもよい。好ましい態様では、前記調製物中の１もしくは複数のまたは全部の酵素が組換え技術を使って生産され、即ち、１または複数の酵素が一成分酵素であり、それを１または複数の別の酵素と混合して、所望の酵素ブレンドを有する酵素調製物が形成される。
【００２７】
別の面では、本発明は、本発明の酵素調製物の生産方法であって、キシログルカナーゼ酵素の生産を可能にする条件下でキシログルカナーゼを生産することができる微生物を培養し、そして培養物から該酵素を回収することを含んで成る方法にも関する。培養は常用の醗酵技術を使って、例えば増殖培地上に十分な通気を確保してキシログルカナーゼ酵素の生産を誘導するように通気しながら振盪フラスコまたは醗酵槽中で培養することにより実施できる。増殖培地は、通常の窒素源、例えばペプトン、酵素エキスまたはカザミノ酸、減少した量の通常の酸素源、例えばブドウ糖またはショ糖、および誘導物質、例えばキシログルカンまたは合成植物基質、例えば穀物のぬか（例えばふすままたは米ぬか）を含んでもよい。回収は常用技術、例えば遠心または濾過によるバイオマスと上清の分離、上清の回収、または着目の酵素が細胞内酵素であるならば細胞の破壊に続いて、おそらくＥＰ  ０  ４０６  ３１４に記載のような更なる精製またはＷＯ  ９７／１５６６０に記載されたような結晶化、を使って行うことができる。
【００２８】
本明細書中、「発現ベクター」という用語は、着目のポリペプチドをコードするセグメントとそれに作用可能に連結されたそのセグメントの転写に備える追加のセグメントを含んで成る、直鎖状または環状のＤＮＡ分子を意味する。そのような追加のセグメントとしてはプロモーターおよびターミネーター配列が挙げられるが、所望により１もしくは複数の複製開始点、１もしくは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方の要素を含んでもよい。本発明の発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ技術にかけられる任意の発現ベクターであることができ、ベクターの選択は該ベクターを導入しようとする宿主細胞にしばしば依存するだろう。よって、ベクターは自己複製性ベクター、即ちその複製が染色体の複製から独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入すると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００２９】
本明細書中でポリペプチドまたはタンパク質の発現に関して用いられる「組換え発現」または「組換え発現された」という語は、当該技術分野での標準定義に従って定義される。タンパク質の組換え発現は、通常はすぐ上に記載した発現ベクターを使って実施される。
【００３０】
「単離された」という語は、ポリヌクレオチド分子に用いる場合、そのポリヌクレオチドが生来の遺伝環境から分離されており、従って他の外来のまたは望ましくないコード配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質生産系での使用に適当な形態であることを意味する。そのような単離された分子は、生来の環境から分離されておりそしてｃＤＮＡおよびゲノムクローンを包含するものである。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、それらが普通は連関している他の遺伝子を含まないが、天然の５′および３′非翻訳領域、例えばプロモーターやターミネーターは含んでもよい。関連した領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ  ＆  ＴｉＪａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：７７４−７８，１９８５を参照のこと）。「単離されたポリヌクレオチド」という語は、代わりに「クローン化ポリヌクレオチド」と称することもできる。
【００３１】
タンパク質／ポリペプチドに用いる場合、「単離された」という語は、タンパク質がその生来の環境以外の状態で見つかることを表す。好ましい形態では、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に別の相同タンパク質〔即ち、「相同不純物」（下記参照）〕を実質的に含まない。４０％以上純粋な形、より好ましくは６０％以上純粋な形が好ましい。タンパク質を高度に精製された形、即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した時に８０％より高純度に、より好ましくは９５％より高純度に精製された形で提供することが好ましい。
【００３２】
「単離されたタンパク質／ポリペプチド」という語は、代わりに「精製されたタンパク質／ポリペプチド」と称することもできる。
「相同不純物」という語は、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞より生じるいずれかの不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外の別のポリペプチド）を意味する。
【００３３】
特定の微生物源に関連して本明細書中で用いる「から得られる」という語は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが特定の源によりまたはその源由来の遺伝子が挿入されている細胞により生産されることを意味する。
「作用可能に連結された」という語は、ＤＮＡセグメントに言及する時、それらのセグメントが意図する目的に合わせて機能するように、例えば転写がプロモーターで開始し、そしてコードセグメントを経由してターミネーターの方へと進行するように、それらのセグメントが配置されていることを意味する。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」という語は、５′末端から３′末端の方に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡとＤＮＡを包含し、そして天然源より単離されてもよく、試験管内で合成されてもよく、または天然分子と合成分子の組合せから調製されてもよい。
【００３５】
「ポリヌクレオチド分子の相補体」という語は、参照配列に比較して相補的な塩基配列と逆の配向を有するポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ  ３’配列は５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ  ３’に相補的である。
【００３６】
「縮重ヌクレオチド配列」という語は、１または複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは異なるヌクレオチドトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（即ち、ＧＡＵ  トリプレットとＧＡＣ  トリプレットは各々Ａｓｐをコードする）。
【００３７】
「プロモーター」という語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写の開始に備えるＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部分を意味する。プロモーター配列は常にではないが一般に、遺伝子の５′非コード領域中に見つかる。
【００３８】
「分泌シグナル配列」という語は、より長いポリペプチドの一成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してより長いポリプチドを差し向けるポリペプチド（「分泌ポリペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を表す。より長いペプチドは一般に、分泌経路を通る輸送の間に開裂されて分泌ペプチドが除去される。
【００３９】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様によれば、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中緊縮性条件下で、配列番号１もしくは配列番号３または同様な大きさのそれらに相補的な配列の領域にハイブリダイズするだろう。
【００４０】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも中緊縮性条件下で、好ましくは下記に詳述するような高緊縮性条件下で、配列番号３の全配列もしくは配列番号１の８８〜７８３位に示される全配列のいずれかを含んで成る変性二本鎖ＤＮＡプローブ、または少なくとも約１００塩基対の長さを有する配列番号３もしくは配列番号１の部分配列を含んで成る任意のＤＮＡプローブにハイブリダイズするだろう。ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡまたはＲＮＡ配列との中緊縮性または高緊縮性でのハイブリダイゼーションを測定するのに適当な実験条件は、ＤＮＡ断片またはＲＮＡを含有するフィルターを５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム，Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）中に１０分間予備浸漬してハイブリダイズさせ、そして該フィルターを５×ＳＳＣ，５×デンハーツ溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９），０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）を含有する溶液中で予備ハイブリダイゼーションさせ、次いで１０ｎｇ／ｍｌの濃度のランダム−プライムド〔Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．＆  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３〕３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識（比活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同溶液中で約４５℃にて１２時間ハイブリダイゼーションさせることを含む。次いで該フィルターを少なくとも６０℃（中緊縮性）、より好ましくは少なくとも６５℃（中／高緊縮性）、更に好ましくは少なくとも７０℃（高緊縮性）、更により好ましくは少なくとも７５℃（超高緊縮性）において、２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中で３０分間ずつ２回洗浄する。
【００４１】
それらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした分子をＸ線フィルムを使って検出する。
【００４２】
上述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡを包含する。ＤＮＡおよびＲＮＡを単離する方法は当該技術分野で周知である。着目の遺伝子をコードするＤＮＡとＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法を使って、Ｇｅｎｅ  ＢａｎｋｓまたはＤＮＡライブラリーにおいてクローニングすることができる。
【００４３】
次いで、例えばハイブリダイゼーションまたはＰＣＲにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定しそして単離する。
【００４４】
本発明は更に、異なる細菌株からの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（オルトログおよびパラログ）を提供する。特に着目されるのは、バシラス種を含む、グラム陽性好アルカリ性菌株からのキシログルカナーゼポリペプチドである。
【００４５】
本発明のキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体は、本発明により提供される情報と組成物を従来のクローニング技術と組み合わせて使ってクローニングすることができる。例えば、該タンパク質を発現する細胞型より得られた染色体ＤＮＡを使って本発明のＤＮＡ配列をクローニングすることができる。ＤＮＡの適当な入手源は、本明細書中に開示する配列からデザインしたプローブを用いてノーザンブロットを探査することにより同定することができる。次いで陽性細胞の染色体ＤＮＡからライブラリーを調製する。次いで様々な方法により、例えば本明細書中に開示する配列に基づいて調製した縮重プローブの１もしくは複数セットを用いてまたは本明細書の発明の詳細な説明もしくは特許請求の範囲に海図する配列からのデザインしたプローブを用いて探査することにより、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列を単離することができる。本発明のＤＮＡ配列は、本明細書中に開示する配列からデザインしたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を使ってクローニングすることもできる。追加の方法では、ＤＮＡライブラリーを使って宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションせしめることができ、そして材料と方法並びに実施例５，６および７に記載されたようにして発現させそして精製した、Ｂ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  １４５８０からまたはＢ．アガラヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ  ４０４８２からクローニングしたキシログルカナーゼに対して惹起せしめた抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を使って、あるいはキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドに関する活性試験により、着目のＤＮＡの発現を検出することができる。
【００４６】
ポリペプチド
配列番号４の配列および配列番号２のアミノ酸番号30〜261 の配列は、それぞれ触媒活性ドメインの成熟キシログルカナーゼ配列である。本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドに実質的に相同であるキシログルカナーゼポリペプチドおよびそれらの種相同体（パラログまたはオルトログ）も提供する。「実質的に相同」という用語は、配列番号４に示される配列もしくは配列番号２のアミノ酸番号30〜261 に示される配列またはそれのオルトログもしくはパラログに対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、そして更に好ましくは少なくとも90％、の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書中で用いられる。そのようなポリペプチドは、配列番号４に示される配列もしくは配列番号２のアミノ酸番号226 〜490 に示される配列またはそれのオルトログもしくはパラログに対して、より好ましくは少なくとも95％同一、最も好ましくは98％以上同一であろう。配列同一性％は、例えばＧＣＧプログラムパッケージに提供されたＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, 1994 年８月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,Wisconsin, USA 53711）〔Needleman, S. B. & Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48:443-453（参考としてその全内容が本明細書中に組み込まれる）〕のような当業界で既知のコンピュータープログラムを使って常法により決定される。ＧＡＰはポリペプチド配列比較のために次の設定：ＧＡＰ生成ペナルティー 3.0およびＧＡＰ延長ペナルティー 0.1を使って行われる。
【００４７】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、ＤＮＡ配列比較のために次の設定：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０およびＧＡＰ延長ペナルティー０．３を使って同様な方法により決定される。
【００４８】
実質的に相同のタンパク質およびポリペプチドは、１または複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴付けられる。それらの変更は、好ましくは重要でない性質のもの、即ち保存的アミノ酸置換（表１参照）あるいはタンパク質またはポリペプチドの活性や折り畳みに有意な影響を及ぼさない他の置換；小規模の欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸の欠失；および小規模のアミノ末端またはカルボキシ末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基の付加、約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチドの付加、または精製を促進する小規模の伸長（アフィニティー標識）、例えばポリヒスチジン領域、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ他，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５，１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３，１９９１）の付加である。一般的記載についてはＦｏｒｄ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７，１９９１を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる。アフィニティー標識をコードするＤＮＡは供給業者（例えば．Ｒｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｙ，ＭＡ）より入手可能である。
【００４９】
しかしながら、前記変更が好ましくは重要でない性質のものであっても、そのような変更が、キシログルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドへのアミノ末端またはカルボキシル末端伸長部分としての長い性質のもの、例えば３００アミノ酸以下またはそれ以上の長いポリペプチドの融合体であってもよい。
【００５０】
【表１】
0003961767.tif 000002
【００５１】
２０種類の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα−メチルセリン）により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。限定数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸、によりアミノ酸残基を置換してもよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾されておりそして／またはそれらの１もしくは複数の側鎖中に標準アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然アミノ酸は化学的に合成できるか、または好ましくは市販されているものであり、そのような非天然アミノ酸としてはピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンが挙げられる。
【００５２】
本発明のキシログルカナーゼポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該技術分野で既知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １０８１−１０８５，１９８９）に従って同定することができる。後者の技術では、分子中のあらゆる残基のところで単一のアラニン変異を導入し、そして生じた変異体分子を生物活性（即ちキシログルカナーゼ活性）について試験して、分子の活性にとって決定的であるアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８，１９９６も参照されたい。核磁気共鳴、結晶学、電子回析または光親和性標識のような技術により測定された構造の物理分析を、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせることにより、リガンドレセプターの部位または他の生物学的相互作用も決定することができる。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ他，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２を参照のこと。必須アミノ酸の本質は、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析から推測することができる。
【００５３】
突然変異誘発、組換えおよび／または鎖入替え（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）の既知方法に続いて、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７，１９８８）、Ｂｏｗｉｅ  ＆  Ｓａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６，１９８９）、ＷＯ  ９５／１７４１３またはＷＯ  ９５／２２６２５により開示されたような関連のスクリーニング手順を使って、多重アミノ酸置換を構築および試験することができる。簡単に言えば、前記著者らは、ポリペプチド中の２以上の位置を同時に無作為にし、または異なる突然変異の組換え／入替え（ＷＯ  ９５／１７４１３，ＷＯ  ９５／２２６２５）に続いて、機能についてポリペプチドを選択し、次いで変異型ポリペプチドを配列決定して各位置に許容される置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用できる他の方法としては、ファージ表示（例えばＬｏｗｍａｎ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ他，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９２／０６２０４）および領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ他，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒ他，ＤＮＡ  ７：１２７，１９８８）が挙げられる。
【００５４】
上記に開示される突然変異誘発法および／または鎖入替え法を、高処理量の自動化スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞中のクローン化変異型ポリペプチドの活性を検出することができる。活性ポリペプチドをコードする変異型ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、そして最新型装置を使って迅速に配列分析することができる。それらの方法は、着目のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定できるようにし、そして未知の構造を有するポリペプチドに適用することができる。
【００５５】
上述の方法を使って、当業者は、配列番号４の配列または配列番号２の残基３０〜２６１の配列に実質的に相同であり且つ野性型タンパク質のキシログルカナーゼ活性を保持している様々なポリペプチドを同定および／または調製することができる。
【００５６】
本発明のキシログルカナーゼ酵素は、触媒活性ドメインを含む酵素コアに加えて、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）も含んで成り、本発明の酵素のセルロース結合ドメインと酵素コア（触媒活性ドメイン）は作用可能に連結している。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）がコードされる酵素の不可欠部分として存在してもよく、または別の起源からのＣＢＤをキシログルカナーゼ酵素に導入して酵素ハイブリッドを作製してもよい。本明細書中、「セルロース結合ドメイン」という語は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ  ＆  Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｈ．Ｐｅｎｎｅｒ編，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．６１８，１９９６中のＰｅｔｅｒ  Ｔｏｍｍｅ他，“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ：  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”により定義されたように解釈すべきである。この定義は１２０以上のセルロース結合ドメインを１０ファミリー（Ｉ〜Ｘ）に分類しており、ＣＢＳがセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼといった様々な酵素中に見つかることを示している。ＣＢＤは非加水分解性多糖結合タンパク質として藻類、例えば紅藻Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａにおいても見つかっている（Ｔｏｍｍｅ他，前掲参照）。しかしながら、大部分のＣＢＤはセルラーゼとキシラナーゼからのであり、ＣＢＤはタンパク質のＮ末端とＣ末端に見つかるか、または内部にある。酵素ハイブリッドは技術の現状において周知であり（例えばＷＯ  ９０／００６０９およびＷＯ  ９５／１６７８２参照）、そしてリンカーを介してまたは介さずにキシログルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に連結したセルラーゼ結合ドメインをコードするＤＮＡの断片を少なくとも含んで成るＤＮＡ構成物を用いて宿主細胞を形質転換せしめ、次いでその宿主細胞を増殖させて融合遺伝子を発現させることにより調製することが可能である。酵素ハイブリッドは次の式により表すことができる：
【００５７】
ＣＢＤ−ＭＲ−Ｘ
上式中、ＣＢＤは少なくともセルロース結合ドメインに相当するアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端領域であり；ＭＲは中間領域であり（リンカー）、そして結合であるか、あるいは好ましくは炭素原子数約２〜約１００の、より好ましくは炭素原子数２〜４０の短鎖連結基であるか、または好ましくはアミノ酸数約２〜１００の、より好ましくはアミノ酸数約２〜４０アミノ酸の短鎖連結基であり；そしてＸは本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端領域である。
【００５８】
キシログルカン基質
キシログルカンについて上述したものに加えて、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社（オーストラリア国）により供給されるタマリンド種子からのキシログルカンは、グルコース、キシロース、ガラクトースおよびアラビノースを４５：３６：１６：３の比で有する複雑な分枝構造を有する。従って、このキシログルカンに対する触媒活性を示す酵素は、異なる源（被子植物または裸子植物）からの別のキシログルカン構造に対しても触媒活性を有すると強く信じられる。
【００５９】
洗剤工業における使用
通常は洗浄および着用の間に、染色した布または衣服の色素が抜け落ち、布が色あせて使い古したように見えるだろう。布からの表面繊維の除去はその布の元の色と外観を一部復元するだろう。本明細書中で用いる「色の清澄化」という語は、多数回の洗浄サイクル後の布または衣服の元の色の部分的復元を意味する。
【００６０】
「毛玉除去」という語は布表面からの毛玉の除去を意味する。
「ソーキング液」という語は、通常の洗浄工程にかける前に洗濯物を浸すことができる水性液体を意味する。ソーキング液は洗浄工程または洗濯工程に常用される１または複数の成分を含んでもよい。
【００６１】
「洗浄溶液」という語は、洗濯物を洗浄工程、即ち、手でまたは洗濯機の中での化学的および機械的組合せ作用、にかけるのに使われる水性液体を意味する。通常、洗浄溶液は粉末または液体洗剤組成物の水溶液である。
【００６２】
「すすぎ液」という語は、通常は洗浄工程にかけた後すぐに、洗濯物をすすぐために、即ち洗濯物から洗剤溶液を除去するために、洗濯物が浸漬されそして処理される液体を意味する。すすぎ液はコンディショナーまたは柔軟剤（ソフナー）組成物を含んでもよい。
【００６３】
本発明の方法にかける洗濯物は通常の洗浄可能な布であることができる。好ましくは、洗濯物の大部分は、綿、ミックスド綿、または天然もしくは人造セルロース系材料から作られた編物、織物、デニム、糸およびタオルをはじめとする縫製または非縫製布である（キシラン含有セルロース繊維、例えばパルプから得られるもの）。混紡の例は、綿またはレーヨン／ビスコースと、１または複数の随伴材料、例えばウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、塩化ポリビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）との混紡である。
【００６４】
洗剤の開示と例
・界面活性剤系
本発明の洗剤組成物は界面活性剤系を含んで成り、その界面活性剤は、非イオンおよび／またはアニオンおよび／またはカチオンおよび／または両親媒性および／または両イオン性および／または半極性界面活性剤より選択することができる。
【００６５】
界面活性剤は典型的には０．１重量％〜６０重量％のレベルで存在する。
界面活性剤は好ましくは組成物中に存在する酵素成分と適合性であるように配合される。液状またはゲル状組成物の場合、最も好ましくは、界面活性剤がそれらの組成物中のいずれかの酵素の安定性を促進するように、または少なくとも分解しないように配合される。
【００６６】
本発明に従って使用するのに好ましい系は、界面活性剤として本明細書中に記載の１または複数の非イオンおよび／またはアニオン界面活性剤を含んで成る。
【００６７】
アルキルフェノールのポリエチレン−、ポリプロピレン−およびポリブチレンオキシド縮合物が本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用に適し、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。それらの化合物としては、直鎖状または分枝状構造において、約６〜約１４個の炭素原子、好ましくは約８〜約１４個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルキルフェノールとアルキレンオキシドとの縮合生成物が挙げられる。好ましい態様では、アルキルフェノール１モルあたりエチレンオキシド約２〜約２５モル、より好ましくは約３〜約１５モルの量でエチレンオキシドが存在する。このタイプの市販の非イオン界面活性剤としては、ＧＡＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより販売されているＩｇｅｐａｌＴＭＣＯ−６３０；Ｒｏｈｎ  ＆  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙより販売されているＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−４５，Ｘ−１１４，Ｘ−１００およびＸ−１０２が挙げられる。それらの界面活性剤は通常、アルキルフェノールアルコキシレートと呼ばれる（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）。
【００６８】
第一および第二脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシドとの縮合生成物は本発明の非イオン界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用に適する。脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖状でも分枝状でもよく、第一級でも第二級でもよく、そして通常は約８〜約２２個の炭素原子を含む。好ましいのは、約８〜約２０個の炭素原子、より好ましくは約１０〜約１８個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールと、アルコール１モルあたり約２〜約１０モルのエチレンオキシドとの縮合生成物である。アルコール１モルあたり約２〜約７モルのエチレンオキシド、最も好ましくは２〜５モルのエチレンオキシドが前記縮合生成物中に存在する。このタイプの市販の非イオン界面活性剤の例としては、共にＵｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより販売されているＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ１５−Ｓ−９  Ｃ１１〜Ｃ１５直鎖アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）およびＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ２４−Ｌ−６ＮＭＷ（狭い分子量分布を有するＣ１２〜Ｃ１４第一アルコールと６モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）；Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙより販売されているＮｅｏｄｏｌＴＭ４５−９（Ｃ１４〜Ｃ１５直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ２３−３（Ｃ１２〜Ｃ１３直鎖アルコールと３．０モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ４５−７（Ｃ１４〜Ｃ１５直鎖アルコールと７モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ４５−５（Ｃ１４〜Ｃ１５直鎖状アルコールと５モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏｍｐａｎｙより販売されているＫｙｒｏＴＭＥＯＢ（Ｃ１３〜Ｃ１５アルコールと９モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）；並びにＨｏｅｃｈｓｔより販売されているＧｅｎａｐｏｌ  ＬＡ  ０５０（Ｃ１２〜Ｃ１４アルコールと５モルのエチレンオキシドとの縮合生成物）が挙げられる。それらの生成物の好ましいＨＬＢ範囲は８〜１１であり、最も好ましくは８〜１０である。
【００６９】
本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤として同じく有用であるのは、約６〜約３０個の炭素原子、好ましくは約１０〜約１６個の炭素原子を含む疎水性基を有する、米国特許第４，５６５，６４７号明細書に開示されたアルキル多糖、および約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７多糖単位を有する疎水性基を有する多糖類、例えばポリグリコシドである。５または６個の炭素原子を含む任意の還元糖を使用でき、例えばグルコース、ガラクトースおよびガラクトシル成分をグルコシル成分により置換することができる（所望により疎水性基が２位、３位、４位などで結合し、従ってグルコシドまたはガラクトシドとは反対向きにグルコースまたはガラクトースを与えてもよい）。糖間結合は、例えば、後の糖単位の１位と、前の糖単位上の２位、３位、４位および／または６位との間であることができる。
【００７０】
好ましいアルキルポリグリコシドは下式を有する：
【化１】
0003961767.tif 000003
【００７１】
上式中、Ｒ２はアルキル基が約１０〜約１８個、好ましくは約１２〜約１４個の炭素原子を含むアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニルおよびそれらの混合物から成る群より選ばれ；ｎは２または３、好ましくは２であり；ｔは０〜約１０、好ましくは０であり；そしてｘは約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７である。グリコシルは好ましくはグルコースから誘導される。それらの化合物を調製するためには、まずアルコールまたはアルキルポリエトキシアルコールを形成せしめ、次いでそれをグルコースまたはグルコースの源と反応させて、グリコシドを形成せしめる（１位での結合）。次いで、後のグリコシル単位の１位を前のグリコシル単位の２位、３位、４位および／または６位、好ましくは主に２位に結合させることができる。
【００７２】
プロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により形成された疎水性塩基とエチレンオキシドとの縮合生成物も、本発明の追加の非イオン界面活性剤としての使用に適する。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは約１５００〜１８００の分子量を有し、そして水不溶性を示すだろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶性を増加させる傾向があり、そしてこの生成物の液体特性は、ポリオキシエチレン含量が縮合生成物の総重量の約５０％である点まで（これはエチレンオキシド約４０モルまでとの縮合に相当する）保持される。このタイプの化合物の例としては、ＢＡＳＦにより販売されている或る種の市販ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ界面活性剤が挙げられる。
【００７３】
同じく本発明の非イオン界面活性剤としての使用に適するのは、プロピレンオキシドとエチレンジアミンとの反応から生じた生成物とエチレンオキシドとの縮合生成物である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミンと過剰のプロピレンオキシドとの反応生成物から成り、そして通常は約２５００〜約３０００の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約４０重量％〜約８０重量％のポリオキシエチレンを含みそして約５，０００〜約１１，０００の分子量を有するような範囲でエチレンオキシドと縮合する。このタイプの非イオン界面活性剤の例はＢＡＳＦにより販売されている市販のＴｅｔｒｏｎｉｃＴＭ化合物である。
【００７４】
本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用に好ましいのは、アルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮合物、第一級および第二級脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシドとの縮合物、アルキル多糖類、およびそれらの混合物である。最も好ましいのは、３〜１５個のエトキシ基を有するＣ８〜Ｃ１４アルキルフェノールエトキシレートおよび２〜１０個のエトキシ基を有するＣ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレート（好ましくは平均Ｃ１０）、並びにそれらの混合物である。
【００７５】
非常に好ましい非イオン界面活性剤は、下式のポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤：
【化２】
0003961767.tif 000004
【００７６】
（上式中、Ｒ１はＨであるか、あるいはＲ１はＣ１−４ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピルまたはそれらの混合物であり、Ｒ２はＣ５−３１ヒドロカルビルであり、そしてＺは直鎖状ヒドロカルビル鎖を有しそしてその鎖に少なくとも３つのヒドロキシルが連結されているポリヒドロキシヒドロカルビルである）、またはそれのアルコキシル化誘導体である。好ましくは、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が直鎖Ｃ１１−１５アルキルまたはＣ１６−１８アルキルもしくはアルケニル鎖（例えばやしアルキル）またはそれらの混合物であり、そしてＺが還元アミノ化反応によりグルコース、フルクトース、マルトースまたはラクトースのような還元糖から誘導される。
【００７７】
非常に好ましいアニオン界面活性剤としては、アルキルアルコキシル化スルフェート界面活性剤が挙げられる。その例は、式ＲＯ（Ａ）ｍＳＯ３Ｍの水溶性塩または酸である。式中、Ｒは非置換Ｃ１０〜Ｃ２４アルキルまたはＣ１０〜Ｃ２４アルキル成分を有するヒドロキシアルキルであり、好ましくはＣ１２〜Ｃ２０アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、より好ましくはＣ１２〜Ｃ１８アルキルまたはヒドロキシアルキルであり；Ａはエトキシまたはプロポキシ単位であり；ｍは０より大きく、典型的には約０．５〜約６であり、より好ましくは約０．５〜約３であり；ＭはＨであるかまたはカチオン、例えば金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなど）、アンモニウムもしくは置換アンモニウムカチオンであることができるカチオンである。アルキルエトキシル化スルフェート並びにアルキルプロポキシル化スルフェートも挙げられる。置換アンモニウムカチオンの具体例としては、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオンおよび第四級アンモニウムカチオン（例えばテトラメチルアンモニウムカチオンおよびジメチルピペリジウムカチオン、並びにアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンから誘導されるもの）またはそれらの混合物などが挙げられる。典型的な界面活性剤はＣ１２〜Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（１．０）スルフェート〔Ｃ１２〜Ｃ１８Ｅ（１．０）Ｍ〕、Ｃ１２〜Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（２．２５）スルフェート〔Ｃ１２〜Ｃ１８Ｅ（２．２５）Ｍ〕、Ｃ１２〜Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（３．０）スルフェート〔Ｃ１２〜Ｃ１８Ｅ（３．０）Ｍ〕およびＣ１２〜Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（４．０）スルフェート〔Ｃ１２〜Ｃ１８Ｅ（４．０）Ｍ〕であり、ここでＭは便利にはナトリウムまたはカリウムから選択される。
【００７８】
使用するのに適当なアニオン界面活性剤は、アルキルエステルスルホネート界面活性剤であり、その例としては“Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ”５２（１９７５）３２３−３２９頁に従って気体状ＳＯ３を使ってスルホン化されたＣ８〜Ｃ２０カルボン酸（即ち脂肪酸）の直鎖状エステルが挙げられる。適当な出発物質は獣脂およびパーム油などから誘導されるような天然脂肪物質を包含する。
【００７９】
好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤、特に洗濯用のものは、下記構造式を有するアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る：
【００８０】
【化３】
0003961767.tif 000005
【００８１】
（上式中、Ｒ３はＣ８〜Ｃ２０ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはその混合物であり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはその混合物であり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性塩を形成するカチオンである）。適当な塩形成性カチオンとしては、金属イオン、例えばナトリウム、カリウムおよびリチウムカチオン、並びに置換または非置換アンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンが挙げられる。好ましくは、Ｒ３がＣ１０〜Ｃ１６アルキルであり、Ｒ４がメチル、エチルまたはイソプロピルである。特に好ましいのは、Ｒ３がＣ１０〜Ｃ１６アルキルであるメチルエステルスルホネートである。
【００８２】
別の適当なアニオン界面活性剤としては、式ＲＯＳＯ３Ｍの水溶性塩または酸であるアルキルスルフェート界面活性剤が挙げられる。ここでＲは好ましくはＣ１０〜Ｃ２４ヒドロカルビル、好ましくはアルキルまたはＣ１０〜Ｃ２０アルキル成分を有するヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ１２〜Ｃ１８アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨまたはカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム）またはアンモニウムもしくは置換アンモニウムカチオン〔例えば、メチル−、ジメチル−およびトリメチル−アンモニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオン（例えばテトラメチルアンモニウムおよびジメチルピペラジニウムカチオン）並びにアルキルアミン（例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン）から誘導された第四級アンモニウムカチオン、並びにそれらの混合物など〕である。典型的には、より低い洗浄温度（例えば約５０℃未満）にはＣ１２〜Ｃ１６のアルキル鎖が好ましく、そしてより高い洗浄温度（例えば約５０℃以上）にはＣ１６〜Ｃ１８アルキル鎖が好ましい。
【００８３】
洗浄目的に有用である別のアニオン界面活性剤を、本発明の洗濯用洗剤組成物に含めることもできる。そのような界面活性剤としては、石鹸の、Ｃ８〜Ｃ２２第一級または第二級アルカンスルホネート、Ｃ８〜Ｃ２４オレフィンスルホネート、例えばイギリス特許第１，０８２，１７５号明細書に記載されたようなクエン酸アルカリ土類金属塩のピロリル化生成物のスルホン化により調製されたスルホン化ポリカルボン酸）の、Ｃ８〜Ｃ２４アルキルポリグリコールエーテルスルホネート（１０モル以下のエチレンオキシドを含む）の塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−およびトリ−エタノールアミン塩）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イセチオネート（例えばアシルイセチオネート）、Ｎ−アシルタウレート、アルキルスクシナメートおよびスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に飽和または不飽和Ｃ１２〜Ｃ１８モノエステル）およびスルホスクシネートのジエステル（特に飽和または不飽和Ｃ６〜Ｃ１２ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキル多糖スルフェート〔例えばアルキルポリグルコシドスルフェート（非硫酸化非イオン化合物を後述する）〕、分枝状第一級アルキルスルフェート、およびアルキルポリエトキシカルボキシレート〔例えば式ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｍ＋のもの（ここでＲはＣ８〜Ｃ２２アルキルであり、ｋは１〜１０の整数であり、そしてＭは水溶性塩を形成するカチオンである）〕を挙げることができる。樹脂酸および水素化樹脂酸（例えばロジン、水素化ロジン、並びにタル油中に存在するかまたはタル油から得られる樹脂酸および水素化樹脂酸）も適当である。
【００８４】
アルキルベンゼンスルホネートが非常に好ましい。特にアルキル基が好ましくは１０〜１８個の炭素原子を含む直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）が好ましい。
【００８５】
更なる例は“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ＰｅｒｒｙおよびＢｅｒｃｈ著，第ＩおよびＩＩ巻）に記載されている。そのような界面活性剤は米国特許第３，９２９，６７８号明細書（２３欄，５８行〜２９欄，２３行；これは参考として本明細書中に組み込まれる）にも一般的に開示されている。
【００８６】
本明細書中に含める時、本発明の洗濯用洗剤組成物は、その中にアニオン界面活性剤を含む場合、そのようなアニオン界面活性剤を約１重量％〜約４０重量％、好ましくは約３重量％〜約２０重量％含んで成る。
本発明の洗濯用洗剤組成物は、カチオン、両性、両イオンおよび半極性界面活性剤、並びに本明細書中に既に記載したもの以外の非イオンおよび／またはアニオン界面活性剤を含んでもよい。
【００８７】
本発明の洗濯用洗剤組成物における使用に適するカチオン界面活性剤は長鎖ヒドロカルビル基を有するものである。そのようなカチオン界面活性剤の例としては、アルキルトリメチルアンモニウムハロゲニドのようなアンモニウム界面活性剤、および下式を有する界面活性剤：
【００８８】
【化４】
0003961767.tif 000006
【００８９】
〔上式中、Ｒ２はアルキル鎖中に約８〜約１８個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキルベンジル基であり；各Ｒ３は−ＣＨ２ＣＨ２−，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−およびそれらの混合物から成る群より選ばれ；各Ｒ４はＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、２つのＲ４基が一緒になって形成されるベンジル環構造、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＯＲ６ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ（ここでＲ６は約１０００未満の分子量を有する任意のヘキソースもしくはヘキソースポリマーである）から成る群より選ばれ、そしてｙが０でない時には更に水素であってもよく；Ｒ５はＲ４と同じであるか、または炭素原子の総数またはＲ２＋Ｒ５が約１８以下であるアルキル鎖であり；各ｙは０〜約１０であり、ただしｙ値の和は０から約１５であり；そしてＸは任意の適合性アニオンである〕が挙げられる。
【００９０】
非常に好ましいカチオン界面活性剤は、本発明の組成物において有用な下式を有する水溶性第四級アンモニウム化合物である：
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−    （ｉ）
〔上式中、Ｒ１はＣ８〜Ｃ１６アルキルであり、Ｒ２，Ｒ３およびＲ４の各々は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、ベンジルおよび−（Ｃ２Ｈ４０）ＸＨであり、ここでＸは２〜５の数値であり、そしてＸはアニオンである〕。Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の１つ以下がベンジルでなければならない。
【００９１】
Ｒ１の好ましいアルキル鎖は、特にアルキル基がパームやし油もしくは核油から得られるかまたはオレフィン合成もしくはオキソアルコール合成により合成的に得られる場合、Ｃ１２〜Ｃ１５である。
Ｒ２，Ｒ３およびＲ４の好ましい基はメチルおよびヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸはハロゲン化物イオン、メソ硫酸イオン、酢酸イオンおよびリン酸イオンから選ぶことができる。
【００９２】
本発明における使用に適した第四級アンモニウム化合物の例は下記のものである：
ヤシ油塩化または臭化トリメチルアンモニウム；
ヤシ油塩化または臭化ジヒドロキシエチルアンモニウム；
塩化デシルトリエチルアンモニウム；
塩化または臭化デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム；
【００９３】
塩化または臭化Ｃ１２〜Ｃ１５ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム；
ヤシ油塩化または臭化ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム；
メチル硫酸ミリスチルトリメチルアンモニウム；
塩化または臭化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム；
塩化または臭化ラウリルジメチル（エテノキシ）４アンモニウム；
【００９４】
コリン酸エステル〔Ｒ１が
【化５】
0003961767.tif 000007
であり、そしてＲ２Ｒ３Ｒ４がメチルである式（ｉ）の化合物〕；
ジアルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕。
【００９５】
本発明において有用な他のカチオン界面活性剤は米国特許第４，２２８，０４４号およびヨーロッパ特許第０００  ２２４号明細書にも記載されている。
【００９６】
本発明の洗濯用洗剤組成物は、その中にカチオン界面活性剤を含む場合、典型的にはそのようなカチオン界面活性剤を０．２重量％〜約２５重量％、好ましくは約１重量％〜約８重量パーゼント含んで成る。
【００９７】
両性界面活性剤も本発明の洗濯用洗剤組成物への使用に適当である。それらの界面活性剤は、第二もしくは第三アミンの脂肪族誘導体として、または複素環式第二もしくは第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載することができる（ここで脂肪族基は直鎖であっても分枝鎖であってもよい）。脂肪族置換基のうちの１つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には約８〜約１８個の炭素原子を含み、そして脂肪族置換基のうちの少なくとも１つが水溶性アニオン基、例えばカルボキシ、スルホン酸基、硫酸基を含む。両性界面活性剤の例については米国特許第３，９２９，６７８号明細書（１９欄，１８〜３５行）を参照のこと。
【００９８】
本発明の洗濯用洗剤組成物は、その中に両性界面活性剤を含む場合、そのような両性界面活性剤を典型的には約０．２重量％〜約１５重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％含んで成る。
【００９９】
両イオン性界面活性剤も本発明の洗濯用洗剤組成物への使用に適当である。それらの界面活性剤は、第二および第三アミンの誘導体として、複素環式第二および第三アミンの誘導体として、または第四級アンモニウム化合物、第四級ホスホニウム化合物もしくは第三級スルホニウム化合物の誘導体として広く記載することができる。両イオン性界面活性剤の例については米国特許第３，９２９，６７８号明細書（欄１９，３８行〜欄２２，４８行）を参照のこと。
【０１００】
本発明の洗濯用洗剤組成物は、その中に両イオン界面活性剤を含む場合、そのような両イオン界面活性剤を典型的には約０．２重量％〜約１５重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％含んで成る。
【０１０１】
半極性界面活性剤は、約１０〜約１８個の炭素原子を有するアルキル成分を１つと約１〜約３個の炭素原子を有するアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群より選ばれた成分を２つ含有する水溶性アミンオキシド；約１０〜約１８個の炭素原子を有するアルキル成分を１つと約１〜約３個の炭素原子を有するアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群より選ばれた成分を２つ含有する水溶性ホスフィンオキシド；および約１０〜約１８個の炭素原子を有するアルキル成分を１つと約１〜約３個の炭素原子を有するアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群より選ばれた成分を１つ含有する水溶性スルホキシドを包含する、非イオン界面活性剤の特別な範疇である。
【０１０２】
半極性非イオン洗剤界面活性剤としては、下式を有するアミンオキシド界面活性剤が挙げられる：
【化６】
0003961767.tif 000008
【０１０３】
（ここでＲ３は約８〜約２２個の炭素原子を含むアルキル、ヒドロキシアルキルもしくはアルキルフェニル基またはそれらの混合物であり；Ｒ４は約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレンもしくはヒドロキシアルキレン基またはそれらの混合物であり；ｘは０〜約３であり；そして各Ｒ５は約１〜約３個の炭素原子を含むアルキルもしくはヒドロキシアルキル基または約１〜約３個の炭素原子を含むポリエチレンオキシド基である）。Ｒ５基は、例えば酸素原子または窒素原子経由で、互いに結合して環構造を形成することもできる。
【０１０４】
それらのアミンオキシド界面活性剤としては、特にＣ１０〜Ｃ１８アルキルジメチルアミンオキシドおよびＣ８〜Ｃ１２アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドが挙げられる。
【０１０５】
本発明の洗濯用洗剤組成物は、その中に半極性非イオン界面活性剤を含有する場合、半極性非イオン界面活性剤を典型的には０．２重量％〜約１５重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％含んで成る。
【０１０６】
ビルダー系
本発明の組成物はビルダー系を更に含んでもよい。任意の常用のビルダー系が本発明での使用に適当であり、例えばアルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレートおよび脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸およびジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が挙げられる。明確な環境上の理由からあまり好ましくないけれども、ホスフェートビルダーも使用できる。
【０１０７】
適当なビルダーは無機イオン交換材料、一般に無機水和アルミノシリケート材料、特に水和合成ゼオライト、例えば水和ゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，ＨＳまたはＭＡＰであることができる。
別の適当な無機ビルダー材料は積層シリケート、例えばＳＫＳ−６（Ｈｏｅｃｈｓｔ）である。ＳＫＳ−６は珪酸ナトリウムから成る結晶性積層シリケートである（Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）。
【０１０８】
カルボキシ基を１つ含有する適当なポリカルボキシレートとしては、ベルギー特許第８２１，３６８号、同第８２１，３６９号および同第８２１，３７０号明細書に開示されたような乳酸、グリコール酸およびそれのエーテル誘導体が挙げられる。カルボキシ基を２つ含有するポリカルボキシレートとしては、コハク酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグルコール酸、酒石酸、タルトロン酸およびフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ国特許公開第２，４４６，６８６号と第２，４４６，４８７号公報および米国特許第３．９３５，２５７号明細書に記載されたエーテルカルボキシレートおよびベルギー特許第８４０，６２３号明細書に記載されたスルフィニルカルボキシレートが挙げられる。カルボキシ基を３つ含有するポリカルボキシレートとしては、特に、水溶性クエン酸塩、アコニット酸塩およびシトラコン酸塩、並びにコハク酸誘導体、例えばイギリス特許第１，３７９，２４１号明細書に記載されたカルボキシメチルオキシコハク酸塩、オランダ特許出願第７２０５８７３号明細書に記載されたラクトキシコハク酸塩、およびイギリス特許第１，３８７，４４７号明細書に記載された２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートのようなオキシポリカルボキシレート材料が挙げられる。
【０１０９】
カルボキシ基を４つ含有するポリカルボキシレートとしては、イギリス特許第１，２６１，８２９号明細書に開示されたオキシジスクシネート、スルホ置換基を含む１，１，２，２−エタンテトラカルボキシレート、１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート（スルホコハク酸誘導体を含む）、イギリス特許第１，３９８，４２１号と同第１，３９８，４２２号および米国特許第３，９３６，４４８号明細書に開示されたスルホスクシネート誘導体、およびイギリス特許第１，０８２，１７９号明細書に記載されたスルホン化熱分解クエン酸塩が挙げられ、一方、ホスホン置換基を含むポリカルボキシレートはイギリス特許第１，４３９，０００号明細書に開示されている。
【０１１０】
脂環式および複素環式ポリカルボキシレートとしては、シクロペンタン−シス，シス，シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロフラン−シス，シス，シス−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロフラン−シス，シス−ジカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフランテトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサンヘキサカルボキシレート、および多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトールおよびキシリトール）のカルボキシメチル誘導体が挙げられる。芳香族ポリカルボキシレートとしては、メリット酸、ピロメリット酸、並びにイギリス特許第１，４２５，３４３号明細書に開示されたフタル酸誘導体が挙げられる。
【０１１１】
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、１分子あたり３個のカルボキシ基を含有するヒドロキシカルボキシレート、より好ましくはクエン酸塩である。
【０１１２】
本発明の組成物における使用に好ましいビルター系としては、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡまたは積層シリケート（ＳＫＳ−６）と、水溶性カルボキシレートキレート化剤（例えばクエン酸）との混合物が挙げられる。
【０１１３】
本発明の洗剤組成物中に含めるのに適したキレート化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）またはそれのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩もしくは置換アンモニウム塩、あるいはそれらの混合物である。好ましいＥＤＤＳ化合物は遊離酸の形とそれのナトリウム塩もしくはマグネシウム塩の形である。そのような好ましいＥＤＤＳナトリウム塩の例としてはＮａ２ＥＤＤＳおよびＮａ４ＥＤＤＳが挙げられる。好ましいＥＤＤＳマグネシウム塩としてはＭｇＥＤＤＳおよびＭｇ２ＥＤＤＳが挙げられる。本発明の組成物中に含めるのに最も好ましいのはマグネシウム塩である。
【０１１４】
好ましいビルダー系としては、水不溶性アルミノシリケートビルダー（例えばゼオライトＡ）と水溶性カルボキシレートキレート化剤（例えばクエン酸）との混合物が挙げられる。
【０１１５】
粒状組成物中に使用されるビルダー系の一部を構成することができる他のビルダー料としては、無機材料、例えばアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、および有機材料、例えば有機ホスホン酸塩、アミノポリアルキレンホスホン酸塩およびアミノポリカルボン酸塩である。
【０１１６】
別の適当な水溶性有機塩は、ポリカルボン酸が２個以下の炭素原子だけ互いから離れている少なくとも２つのカルボキシル基を含んで成る、ホモポリマーもしくはコポリマーまたはそれらの塩である。
【０１１７】
このタイプのポリマーはＧＢ−Ａ−１，５９６，７５６に開示されている。そのような塩の例は、ＭＷ（分子量）２０００−５０００のポリアクリレート、およびそれと無水マレイン酸とのコポリマーであり、そのようなコポリマーは２０，０００〜７０，０００の分子量、特に約４０，０００の分子量を有するコポリマーである。
洗剤力ビルダー塩は、通常は組成物の５重量％〜８０重量％の量で含められる。好ましいビルダーレベルは５％〜３０％である。
【０１１８】
酵素
好ましい洗剤組成物は、本発明の酵素調製物に加えて、清浄力および／または布保護効果を提供する１または複数の別の酵素を含んで成る。
そのような酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えばラッカーゼ）などが挙げられる。
【０１１９】
プロテアーゼ：アルカリ溶液中での使用に適する任意のプロテアーゼを使用できる。適当なプロテアーゼとしては動物、植物または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾されたまたは遺伝子修飾された変異体も含まれる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例はズブチリシン、特にバシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えばズブチリシン  Ｎｏｖｏ、ズブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン  ３０９、ズブチリシン  １４７およびズブチリシン  １６８（ＷＯ  ８９／０６２７９中に記載）である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタまたはウシ起源のもの）およびＷＯ  ８９／０６２７０中に記載のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
【０１２０】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ（デンマーク国）により商品名Ａｌｃａｌａｓｅ，Ｓａｖｉｎａｓｅ，Ｐｒｉｍａｓｅ，ＤｕｒａｚｙｍおよびＥｓｐｅｒａｓｅのもとに販売されているもの、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより商品名Ｍａｘａｔａｓｅ，Ｍａｘａｃａｌ，Ｍａｘａｐｅｍ，Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ，ＰｕｒａｆｅｃｔおよびＰｕｒａｆｅｃｔ  ＯＸＰのもとに販売されているもの、並びにＳｏｌｖａｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓにより商品名ＯｐｔｉｃｌｅａｎおよびＯｐｔｉｍａｓｅのもとに販売されているものが挙げられる。プロテアーゼ酵素は、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１２１】
リパーゼ：アルカリ性溶液中での使用に適する任意のリパーゼを使用できる。適当なリパーゼとしては細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾されたまたは遺伝子修飾された変異体も含まれる。
【０１２２】
有用なリパーゼの例としては、例えば欧州特許第２５８  ０６８号および欧州特許第３０５  ２１６号に記載のようなフミコラ・ラヌギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、例えば欧州特許第２３８  ０２３号に記載のようなリゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ）リパーゼ、例えば欧州特許第２１４  ７６１号に記載のＣ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、例えばＣ．アンタークティカリパーゼＡもしくはＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば欧州特許第２１８  ２７２号に記載のようなＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ、例えば欧州特許第３３１  ３７６号に記載のようなＰ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、例えば英国特許第１，３７２，０３４号に開示されたようなＰ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ、例えばＢ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ〔Ｄａｒｔｏｉｓ他（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｉｃａ  Ａｃｔａ  １１３１，２５３−２６０〕、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号）およびＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（ＷＯ  ９１／１６４２２）が挙げられる。
【０１２３】
更に、多数のクローン化されたリパーゼ、例えばペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｎｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ〔Ｙａｍａｇｕｃｈｉ他（１９９１），Ｇｅｎｅ  １０３，６１−６７〕、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ〔Ｓｃｈｉｍａｄａ，Ｙ．他（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６，３８３−３８８〕、並びに様々なリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼ、例えばＲ．デレマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ〔Ｈａｓｓ，Ｍ．Ｊ．他（１９９１），Ｇｅｎｅ  １０９，１１７−１１３〕、Ｒ．ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ〔Ｋｕｇｉｍｉｙａ他（１９９２），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，７１６−７１９〕およびＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼが挙げられる。
【０１２４】
クチナーゼのような他のタイプの脂質分解酵素も有用であり、例えばＷＯ  ８８／０９３６７号に記載されたようなシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ、またはフザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）由来のクチナーゼ（例えばＷＯ  ９０／０９４４６に記載）も有用である。
特に適当なリパーゼは、Ｍ１  ＬｉｐａｓｅＴＭ，Ｌｕｍａ  ｆａｓｔＴＭおよびＬｉｐｏｍａｘＴＭ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＬｉｐｏｌａｓｅＴＭおよびＬｉｐｏｌａｓｅ  ＵｌｔｒａＴＭ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、並びにＬｉｐａｓｅ  Ｐ“Ａｍａｎｏ”（Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）のようなリパーゼである（ＴＭは商標）。
【０１２５】
リパーゼは普通、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１２６】
アミラーゼ：アルカリ性溶液中での使用に適する任意のアミラーゼを使用できる。適当なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。市販のアミラーゼはＤｕｒａｍｙｌＴＭ，ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ，ＦｕｎｇａｍｙｌＴＭおよびＢＡＮＴＭ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから入手可能）並びにＲａｐｉｄａｓｅＴＭおよびＭａｘａｍｙｌ  ＰＴＭ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）である。
【０１２７】
アミラーゼは普通、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１２８】
セルラーゼ：アルカリ性溶液中での使用に適する任意のセルラーゼを使用できる。適当なセルラーゼとしては細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。適当なセルラーゼは、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）から生産される真菌セルラーゼを記載している米国特許第４，４３５，３０７号明細書に開示されている。ＷＯ  ９６／３４１０８とＷＯ  ９６／３４０９２はバシラスからの細菌好アルカリ性セルラーゼ（ＢＣＥ  １０３）を開示しており、そしてＷＯ  ９４／２１８０１，ＵＳ  ５，４７５，１０１およびＵＳ  ５，４１９，７７８はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からのＥＧ  ＩＩＩセルラーゼを開示している。特に適当なセルラーゼは色彩保護（ｃｏｌｏｒ  ｃａｒｅ）に役立つセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は欧州特許出願第０４９５２５７号明細書に記載されたセルラーゼである。市販されているセルラーゼはフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の株により生産されたＣｅｌｌｕｚｙｍｅＴＭおよびＣａｒａｚｙｍｅＴＭ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、ＫＡＣ−５００（Ｂ）ＴＭ（花王）、並びにＰｕｒａｄａｘＴＭ（Ｇｅｎｅｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）である。
【０１２９】
セルラーゼは普通、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１３０】
ペルオキシダーゼ／オキシターゼ：ペルオキシダーゼ酵素は過酸化水素またはその源（例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩）と組み合わせて使用される。オキシダーゼ酵素は酸素と組合せて使用される。どちらのタイプの酵素も「溶液漂白」に、即ち、染色した布と別の布を一緒に洗浄液中で洗浄する時に繊維色素が染色布から別の布に移らないようにするために、好ましくはＷＯ  ９４／１２６２１およびＷＯ  ９５／０１４２６に記載されたような強化剤と一緒に使われる。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。
【０１３１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ酵素は普通、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１３２】
上述した酵素の混合物も本発明に含まれ、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよび／またはセルラーゼの混合物も包含される。
【０１３３】
本発明の酵素または洗剤組成物中に含められる別の任意の酵素は普通、本発明の組成物の０．００００１重量％〜２重量％の酵素タンパク質レベルで、好ましくは該組成物の０．０００１重量％〜１重量％の酵素タンパク質レベルで、より好ましくは該組成物の０．００１重量％〜０．５重量％の酵素タンパク質レベルで、更に好ましくは０．０１重量％〜０．２重量％の酵素タンパク質レベルで本発明の組成物中に含めることができる。
【０１３４】
漂白剤
本発明の洗剤組成物中に含めることができる追加の任意洗剤成分としては、漂白剤、例えばＰＢ１，ＰＢ４および４００〜８００μｍの粒子の大きさを有する過炭酸塩が挙げられる。それらの漂白剤成分は１または複数の酸素漂白剤、および選択する漂白剤によっては１もしくは複数の漂白活性化剤を含み得る。存在する場合には、酸素漂白化合物は典型的には約１％〜約２５％のレベルで存在するだろう。一般に、漂白化合物は非液体製剤、例えば粒状洗剤中の任意添加成分である。
【０１３５】
本発明の組成物中で使用される漂白剤成分は、酸素漂白剤をはじめとする洗剤組成物に有用な漂白剤並びに当該技術分野で既知の他のもののいずれであってもよい。
本発明に適当な漂白剤は活性化漂白剤または非活性化漂白剤であることができる。
【０１３６】
使用できる酸素漂白剤の１つのカテゴリーは過カルボン酸漂白剤およびその塩を包含する。この部類の漂白剤の適当な例としては、モノペルオキシフタル酸マグネシウム六水和物、ｍ−クロロ過安息香酸マグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸およびジペルオキシドデカンジオン酸が挙げられる。そのような漂白剤は米国特許第４，４８３，７８１号、同第７４０，４４６号，ヨーロッパ特許第０  １３３  ３５４号および米国特許第４，４１２，９３４号明細書に開示されている。非常に好ましい漂白剤としては、米国特許第４，６３４，５５１号明細書に記載されたような６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸が挙げられる。
【０１３７】
使用できる漂白剤の別のカテゴリーはハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロ酸漂白剤の例は、例えばトリクロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウムおよびカリウム、並びにＮ−クロロおよびＮ−ブロモアルカンスルホンアミドである。そのような剤は通常最終製品の０．５〜１０重量％で、好ましくは１〜５重量％で添加される。
【０１３８】
過加水分解されて漂白活性種として過酸を生成し、漂白作用の向上をもたらす漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸（ＮＯＢＳ；米国特許第４，４１２，９３４号明細書に記載）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホン酸（ＩＳＯＮＯＢＳ；ヨーロッパ特許第１２０５９１号公報に記載）またはペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）を過酸化水素漂白剤と組み合わせて使用することができる。その上、漂白活性化剤Ｃ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼンスルホン酸、Ｃ９（６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホン酸およびＣ１０（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホン酸またはそれらの混合物は非常に適当である。ヨーロッパ特許出願第９１８７０２０７．７号公報に開示されたようなアシル化クエン酸エステルも適当な活性化剤である。
【０１３９】
本発明の洗浄組成物における使用に有用なペルオキシ酸を含む漂白剤、および漂白活性化剤と過酸素漂白化合物を含んで成る漂白系が、米国特許出願第０８／１３６，６２６号明細書に記載されている。
【０１４０】
洗浄および／またはすすぎ工程の初めにまたは間に過酸化水素を生成できる酵素系（即ち酵素とそのための基質）を添加することによって過酸化水素が存在してもよい。そのような酵素系はヨーロッパ特許出願第０  ５３７  ３８１号公報に開示されている。
【０１４１】
酸素漂白剤以外の漂白剤も技術の現状において知られており、それを本発明においても使用できる。特に着目される非酸素漂白剤の１種類は、スルホン化亜鉛および／またはアルミニウムフタロシアニンのような光活性化漂白剤である。それらの剤は洗浄工程の間に基質上に沈着され得る。酸素の存在下で光放射されると、例えば乾燥させるために日光の下に衣服をかけておくことによりスルホン化亜鉛フタロシアニンが活性化され、結果として基質が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアミンと光活性化漂白法は米国特許第４，０３３，７１８号明細書に記載されている。典型的には、洗剤組成物は約０．０２５重量％〜約１．２５重量％のスルホン化亜鉛フタロシアミンを含有するだろう。
【０１４２】
漂白剤はマンガン触媒を含んでもよい。マンガン触媒は、例えば、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ ３６９，１９９４，６３７−６３９頁に記載された化合物のうちの１つであることができる。
【０１４３】
泡立ち抑制剤
別の任意成分は、シリコーンやシリカーシリコーン混合物により代表される泡立ち泡抑制剤である。シリコーンは一般にアルキル化ポリシロキサンにより代表され、一方シリカは通常はシリカエーロゲルとキセロゲル並びに様々なタイプの疎水性シルカにより代表される微粉砕形態において使用される。それらの材料は、有利には水溶性または水分散性で実質的に非界面活性洗剤非浸透性のキャリヤーの中に泡立ち抑制剤が放出できるように含まれている粒子として洗剤組成物中に含めることができる。あるいは、泡立ち抑制剤を液体キャリヤー中に溶解または分散させ、そして１または複数の別の成分の上に噴霧することにより適用することができる。
【０１４４】
好ましいシリコーン泡立ち抑制剤は米国特許第３，９９３，６７２号明細書中に記載されている。別の特に有用な泡立ち抑制剤は、ドイツ特許出願ＤＴＯＳ  ２，６４６，１２６号公報中に記載されている自己乳化性シリコーン泡立ち抑制剤である。そのような化合物の例は、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社から市販されている、シロキサン−グリコールコポルマーであるＤＣ−５４４である。特に好ましい泡立ち抑制剤は、シリコーン油と２−アルキルアルカノールの混合物を含んで成る泡立ち抑制剤系である。適当な２−アルキルアルカノールはＩｓｏｆｏｌ  １２Ｒの商品名のもとに市販されている２−ブチルオクタノールである。
【０１４５】
そのような泡立ち抑制剤はヨーロッパ特許第０  ５９３  ８４１号公報に記載されている。
特に好ましいシリコーン泡立ち抑制剤はヨーロッパ特許出願第９２２０１６４９．８号公報に記載されている。前記組成物は、非孔質ヒュームドシリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌＲ）と共にシリコーン／シリカ混合物を含んで成ることができる。
上述の泡立ち抑制剤は通常は組成物の０．００１重量％〜２重量％、好ましくは０．０１重量％〜１重量％のレベルで使用される。
【０１４６】
他の成分
洗剤組成物に使われる他の成分、例えば汚れ懸濁剤、汚れ剥離剤、随意の蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、および／またはカプセル封入されたもしくは未封入の香料を使用してもよい。
【０１４７】
特に適当なカプセル封入材料は、イギリス特許第１，４６４，６１６号明細書に記載されたような多糖とポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０１４８】
別の適当な水溶性カプセル封入材料は、米国特許第３，４５５，８３８号明細書に記載されたような置換ジカルボン酸の未糊化デンプン酸エステルから誘導されたデキストリンを含んで成る。それらの酸エステルデキストリンは、好ましくは、もち性トウモロコシ、もち性モロコシ類、サゴ、タピオカおよびジャガイモのようなデンプンから調製される。前記カプセル封入材料の適当な例としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈにより製造されたＮ−Ｌｏｋが挙げられる。Ｎ−Ｌｏｋ封入材料は化工トウモロコシデンプンとグルコースから成る。このデンプンはオクテニルコハク酸無水物のような一価の置換基を付加することにより化工される。
【０１４９】
本発明の組成物において適当である再付着防止剤および汚れ懸濁剤としては、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、並びにポリカルボン酸ホモポリマーもしくはコポリマーまたはそれらの塩が挙げられる。この種のポリマーとしては、ビルダーとして上記に挙げたポリアクリレートおよび無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテルもしくはメタクリル酸とのコポリマー（ここで無水マレイン酸は前記コポリマーの少なくとも２０モル％を占める）が挙げられる。これらの材料は通常は組成物の０．５重量％〜１０重量％、より好ましくは０．７５重量％〜８重量％、最も好ましくは１重量％〜６重量％のレベルで使用される。
【０１５０】
好ましい任意添加の蛍光増白剤は性質がアニオン性であるものであり、その例は、４，４′−ビス（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′−ビス（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′−ビス（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホン酸二ナトリウム、４′，４″−ビス（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホン酸一ナトリウム、４，４′−ビス〔２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ〕スチルベン−２，２′−ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′−ビス（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２′−ジスルホン酸二ナトリウム、４，４′−ビス〔２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ〕スチルベン−２，２′−ジホスホン酸二ナトリウム、２−（スチルビル−４″−（ナフト−１′，２′：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２″−スルホン酸二ナトリウム、および４，４′−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。
【０１５１】
別の有用なポリマー材料はポリエチレングリコール、特に分子量１０００〜１００００のもの、より好ましくは２０００〜８０００、最も好ましくは約４０００のものである。それらは０．２０重量％〜５重量％、より好ましくは０．２５重量％〜２．５重量％のレベルで使用される。それらのポリマーと前に言及したポリカルボン酸塩ホモポリマーまたはコポリマーは、白さの維持の向上、布の灰分付着、並びに遷移金属不純物の存在下での泥、タンパク様の汚れおよび被酸化性の汚れに対する洗浄力を向上させるのに有効である。
【０１５２】
本発明の組成物において有用な汚れ剥離剤は、通常は、様々な配置にあるテレフタル酸とエチレングリコール単位および／またはプロピレングリコール単位とのコポリマーもしくはターポリマーである。そのようなポリマーの例は米国特許第４，１１６，８８５号および同第４，７７１，７３０号明細書並びにヨーロッパ特許第０  ２７２  ０３３号公報に開示されている。ヨーロッパ特許第０  ２７２  ０３３号公報に従って、特に好ましいポリマは下式を有する：
［ＣＨ３（ＰＲＧ）４３］０．７５（ＰＯＨ）０．２５［（Ｔ−ＰＯ）２．８（Ｔ−ＰＥＧ）０．４］Ｔ（ＰＯＨ）０．２５［（ＰＥＧ）４３ＣＨ３］０．７５ここでＰＧＡは−（ＯＣ２Ｈ４）Ｏ−であり、ＰＯは（ＰＣ３Ｈ６Ｏ）であり、そしてＴは（ｐＯＯＣ６Ｈ４ＣＯ）である。
【０１５３】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコールおよび１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーとしての改質ポリエステル（末端基は第一にはスルホベンゾエステルから成りそして第二にはエチレングリコールおよび／または１，２−プロパンジオールから成る）も非常に好ましい。目標は、両端がスルホ安息香酸基によりキャップされたポリマーを得ることである。「第一に」とは、前記コポリマーの大部分がスルホ安息香酸基により末端キャップされるであろうことを意味する。しかしながら、幾らかのコポリマーは決して完全にはキャップされないだろうから、それらの末端基はそれのエチレングリコールおよび／または１，２−プロパンジオールのモノエステル、即ちそのような「第二」の種から成るものもある。
【０１５４】
本明細書中選択されたポリエステルは、約４５重量％のテレフタル酸ジメチルエステル、約１６重量％の１，２−プロパンジオール、約１０重量％のエチレングリコール、約１３重量％のスルホ安息香酸ジメチルエステルおよび約１５重量％のスルホイソフタル酸を含有し、そして約３，０００の分子量を有する。これらのポリエステルおよびそれらの調製法はヨーロッパ特許第３１１  ３４２号公報に詳細に記載されている。
【０１５５】
柔軟剤
布柔軟剤も本発明の洗濯用洗剤組成物中に含めることができる。柔軟剤は無機型であっても有機型であってもよい。無機柔軟剤は、ＧＢ−Ａ−１  ４００８９８およびＵＳ  ５，０１９，２９２に記載された緑粘土により代表される。有機布柔軟剤としては、ＧＢ−Ａ−１  ５１４  ２７６およびＥＰ  ０  ０１１  ３４０に開示されたような水溶性第三アミン、ＥＰ−Ｂ−０  ０２６  ５２８に開示されたようなモノＣ１２〜Ｃ１４第四級アンモニウム塩と上記第三アミンとの組合せ、およびＥＰ−０  ２４２  ９１９に開示されたようなジ−長鎖アミドが挙げられる。布柔軟剤系の別の有用な有機成分としては、ＥＰ  ０  ２９９  ５７５およびＥＰ  ０  ３１３  １４６に開示されたような高分子量ポリエチレンオキシド材料が挙げられる。
【０１５６】
緑粘土の量は５重量％〜１５重量％、より好ましくは８重量％〜１２重量％であり、この材料は洗濯組成物の他の残りのものに乾燥混合成分として添加される。水不溶性第三アミンまたはジ−長鎖アミド材料のような有機布柔軟剤は、０．５重量％〜５重量％、通常は１重量％〜３重量％のレベルで組成物中に添加されるが、一方で高分子量ポリエチレンオキシド材料と水溶性カチオン材料は０．１重量％〜２重量％、通常は０．１５重量％〜１．５重量％のレベルで添加される。これらの材料は普通は組成物の噴霧乾燥部分に添加されるが、場合によってはそれらを乾燥混合粒状物として添加するか、またはそれらを溶融液として組成物の他の固形成分上に噴霧することが一層便利であるかもしれない。
【０１５７】
ポリマー染料転移防止剤
本発明の洗剤組成物は、０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜２重量％、より好ましくは０．０５重量％〜１重量％のポリマー染料転移防止剤を含んで成ってもよい。前記ポリマー染料転移防止剤は、通常、染色した布からの染料がそれと一緒に洗浄した布に移るのを防ぐために洗剤組成物中に含められる。それらのポリマーは、洗浄中に染料が別の物に付着するようになる機会をもつ前に、染色した布から染みだした染料を吸着するかまたはそれと錯体を形成することができる。
【０１５８】
特に適当なポリマー染料転移防止剤は、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはそれらの混合物である。
【０１５９】
そのようなポリマーの添加は本発明の酵素の性能も強化する。
本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、棒または顆粒の形であることができる。
【０１６０】
無塵性粒子は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号および同第４，６６１，４５２号（共にＮｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉ  Ａ／Ｓへの特許）に記載されたようにして製造することができ、そして所望により当該技術分野で既知の方法によりコーティングすることができる。ワックスコーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコール成分が１２〜２０個の炭素原子を含みそして１分子中に１５〜８０エチレンオキシド単位を含むエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−，ジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフィルム形成性コーティング材料はイギリス特許第１４８３５９１号明細書に与えられている。
【０１６１】
本発明の粒状組成物は「圧縮粉形」であることもでき、即ちそれらが普通の粒状洗剤よりも比較的高密度、即ち５５０〜９５０ｇ／ｌを有することができる。そのような場合、本発明の粒状洗剤組成物は通常の粒状洗剤に比較して少量の「無機充填剤塩」を含むだろう。典型的な充填剤塩は、アルカリ土類金属の硫酸塩および塩化物、典型的には硫酸ナトリウムである。「圧縮粉」洗剤は典型的には１０％以下の充填剤塩を含む。本発明の液体組成物は「濃縮形」であることもでき、そのような場合、本発明の液体組成物は通常の液体洗剤よりも少量の水を含むだろう。典型的には濃縮液体洗剤の水分は、洗剤組成物の３０重量％未満、より好ましくは２０重量％未満、最も好ましくは１０重量％未満である。
【０１６２】
本発明の組成物は、例えば手洗い用および機械洗浄用洗剤組成物として、例えば洗濯用添加剤組成物および染色布の前処理に適する組成物、すすぎ液に添加する布柔軟剤組成物、並びに一般家庭用硬質面クリーニング作業および皿洗い作用に使われる組成物として製剤することができる。
【０１６３】
下記の例は本発明の組成物を例示するためのものであり、必ずしも本発明の範囲を制限するかまたは他の形で限定するものではない。洗剤組成物中に含まれる成分の略語は次の意味である：
ＬＡＳ：直鎖Ｃ１２アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
ＴＡＳ：獣脂アルキル硫酸ナトリウム
ＸＹＡＳ：Ｃ１Ｘ〜Ｃ１Ｙアルキル硫酸ナトリウム
ＳＳ：  式２−ブチルオクタン酸の第二石鹸界面活性剤
【０１６４】
２５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合した主として直鎖のＣ１２〜Ｃ１５第一アルコール
４５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合した主として直さのＣ１４〜Ｃ１５第一アルコール
ＸＹＥＺＳ：１モルあたり平均Ｚモルのエチレンオキシドと縮合したＣ１Ｘ〜Ｃ１Ｙアルキル硫酸ナトリウム
【０１６５】
Ｎｏｎｉｏｎｉｃ：ＢＡＳＦ  ＧｍｂＨにより商品名Ｐｌｕｒａｆａｘ  ＬＦ４０４で販売されている、３．８の平均エトキシル化度と４．５の平均プロポキシル化度を有するＣ１３〜Ｃ１５混合エトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール
ＣＦＡＡ：Ｃ１２〜Ｃ１４アルキルＮ−メチルグルカミド
ＴＦＡＡ：Ｃ１６〜Ｃ１８アルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート：非晶質珪酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ比＝２．０）
ＮＡＳＫＳ−６：式ｄ−Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５の結晶質積層シリケート
【０１６６】
炭酸塩：非晶質炭酸ナトリウム
リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム
ＭＡ／ＡＡ：１：４マレイン酸／アクリル酸のコポリマー、平均分子量約８０，０００
ポリアクリレート：ＢＡＳＦ  ＧｍｂＨにより商品名ＰＡ３０のもとに販売されている平均分子量８，０００を有するポリアクリル酸ホモポリマー
ゼオライトＡ：１〜１０μｍの平均粒度を有する式Ｎａ１２（ＡｌＯ２ＳｉＯ２）１２の水和アルミノ珪酸ナトリウム
【０１６７】
クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム二水和物
クエン酸：クエン酸
過ホウ酸塩：無水過ホウ酸ナトリウム一水和物、漂白、実験式ＮａＢＯ２・Ｈ２Ｏ２
ＰＢ４：無水過ホウ酸ナトリウム四水和物
過炭酸塩：実験式２Ｎａ２ＣＯ３・３Ｈ２Ｏ２の漂白無水過炭酸ナトリウム
ＴＥＡＤ：テトラアセチルエチレンジアミン
ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロースナトリウム
【０１６８】
ＤＥＴＰＭＰ：Ｍｏｎｓａｎｔｏより商品名Ｄｅｑｕｅｓｔ  ２０６０のもとに販売されている、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドンポリマー
ＥＤＤＳ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸、ナトリウム塩の形の〔Ｓ，Ｓ〕異性体
泡立ち抑制剤：２５％パラフィンワックス（融点５０℃）、１７％疎水性シリカ、５８％パラフィン油
【０１６９】
粒状泡立ち抑制剤：１２％シリコーン／シリカ、１８％ステアリルアルコール、７０％粒状デンプン
硫酸塩：無水硫酸ナトリウム
ＨＭＷＰＥＯ：高分子量ポリエチレンオキシド
ＴＡＥ  ２５：獣脂アルコールエトキシレート（２５）
【０１７０】
洗剤例Ｉ
本発明の粒状布洗浄組成物は次の通り調製することができる：
0003961767.tif 000009
【０１７１】
洗剤例ＩＩ
本発明の圧縮粒状布洗浄組成物（密度８００ｇ／ｌ）は次の通り調製することができる：
0003961767.tif 000010
【０１７２】
洗剤例ＩＩＩ
染色した布の洗濯において有用である本発明の粒状布洗浄組成物は次の通り調製した：
0003961767.tif 000011
【０１７３】
洗剤例ＩＶ
洗浄力によって柔軟を提供する本発明の粒状布洗浄組成物は次の通り調製した
0003961767.tif 000012
【０１７４】
洗剤例Ｖ
本発明の強力液体布洗浄組成物は次の通り調製した：
0003961767.tif 000013
【０１７５】
繊維工業およびセルロース系繊維加工業における使用
本明細書中、「セルロース系材料」という用語は、綿、ミックスド綿または天然もしくは合成セルロース系材料（例えばキシラン含有セルロース繊維、例えば木材パルプからのもの）またはそれらの混紡から製造した、編物、織物、デニム、糸およびタオルを包含する、繊維、縫製布および不縫製布を意味するものである。混紡の例は、綿またはレーヨン／ビスコースと、１または複数の共材料、例えば毛、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、塩化ポリビニル繊維、塩化ポリビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）またはセルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、ラミー、大麻、亜麻／リネン、ジュート、セルロースアセテート繊維、リオセル）との混紡である。
【０１７６】
本発明の組成物はセルロース系繊維加工業において大麻、亜麻またはリネンからの繊維の前処理または浸水（ｒｅｔｔｉｎｇ）に有用である。
【０１７７】
例えば綿繊維から衣料品製造用の材料へといった、繊維産業でのセルロース系材料の加工は次の数段階を含んでなる：繊維から糸への紡糸；糸から織布または編布への組立；並びにその後のプレパレーション、染色および仕上げ作業。織物は一列のたて糸の間によこ糸を織ることにより作られる。たて糸とよこ糸は異なる種類のものであってもよい。編物は、１本の連続長さの糸より絡み合ったループの網状構造を形成させることにより作られる。セルロース系繊維は不織布にも使用できる。
【０１７８】
プレパレーション工程は染色作業における適切な反応に備えて繊維を準備するものである。プレパレーション工程に含まれるサブ工程は糊抜き（織物の場合）、精錬および漂白である。１段階の精錬／漂白組合せ工程が工業的に最もよく使われている。プレパレーション工程は布の状態で汎用されるが、精錬、漂白および染色作業は繊維または糸の状態で行うこともできる。
【０１７９】
処理方法はバッチ式または連続式であることができ、布を拡広またはロープ形で連続処理液流と接触せしめることができる。連続処理は一般に、サチュレーターを使用して布重量あたりほぼ同重量の薬品バッチを布に適用し、次いで熱した保持チャンバーに適用し、その中で化学反応が起こる。次いで洗浄工程が次の処理工程のために布を準備する。バッチ式処理は通常、１回の処理浴の中で行われ、それにより布がその重量の約８〜１５倍の薬液浴と接触させられる。反応時間の後、薬液を排水し、布をすすぎ、次の薬品を適用する。不連続パッドバッチ式処理法は、サチュレーターを使用して布の重量あたりほぼ同重量の薬品浴を布に適用し、次いで保持期間（冷却パッドバッチの場合には１日かそれ以上である）を設けることを含む。
【０１８０】
織物は編織布構造の一般的形態である。製織工程は、たて糸を磨耗から守るために糸の「糊付け」を要する。使われる典型的な糊剤の例は、入手可能性と費用の面から、デンプン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース、ワックスおよびアクリル酸バインダーである。糊剤は織物製造の第一段階としての製織工程の後に除去しなければならない。ロープ形または拡広形のいずれかの糊付けした布を、糊抜き剤を含有する処理液と接触せしめる。使用する糊抜き剤は除去すべき糊剤の種類に依存する。ＰＶＡ糊剤には、湯または酸化法がしばしば使われる。綿織物用に最も汎用される糊剤はデンプンを基剤としたものである。従って、最も頻繁には、綿織物は湯、デンプンを加水分解する酵素α−アミラーゼおよび湿潤剤か界面活性剤の組合せにより糊抜きされる。セルロース系材料は、糊抜きに十分な長さの「滞留時間」の間、糊抜き用薬品と一緒に置いておく。滞留時間は加工処理法の種類と温度に依存し、１５分から２時間に及ぶが、場合により数日に及ぶこともある。典型的には、糊抜き剤は通常約１５℃〜約５５℃であるサチュレーター浴の中に投入される。次いで、十分な熱（約５５℃〜約１００℃）を提供する「Ｊボックス」のような装置の中に布を維持する。除去された糊剤を含む薬品は滞留時間の間に洗い落とされる。
【０１８１】
高い白度  および／または優れた柔軟性を確保するために、適用される糊剤などは徹底的に除去されなければならない。一般に効率的な糊抜きは次のプレパレーション工程、即ち精錬と漂白にとってきわめて重要である。
【０１８２】
精錬工程は、綿の中に天然に存在する非セルロース系化合物の大部分を除去する工程である。天然の非セルロース系不純物に加えて、精錬は紡績、コーン巻きまたはたて糊付け減摩剤のような製造中に導入された残留物を取り除くことができる。精錬工程は水酸化ナトリウムまたは関連する苛性化剤、例えば炭酸ナトリウム、水酸化カリウムもしくはそれらの混合物を使用する。一般に、疎水性化合物の可溶化を高めるためおよび／またはそれらが布に再付着するのを防ぐために、該工程にアルカリに安定な界面活性剤が添加される。処理は通常は高温で、例えば８０℃〜１００℃で、精錬剤の強アルカリ性溶液、例えばｐＨ１３−１４の溶液を使用して行われる。化学処理の非特異的性質のために、不純物だけでなくセルロース自体も攻撃され、強度や他の望ましい布性質の損傷を引き起こす。セルロース系織物の軟らかさは、残留天然綿ろうの働きによるものである。高温強アルカリ性精錬工程の非特異的性質は、望ましい天然綿減摩剤と製造中に導入される減摩剤とを区別できない。更に、従来の精錬工程は、それらの工程からの強アルカリ性流出液のために環境問題を引き起こし得る。不適切に精錬された布はその後の漂白工程においてより高レベルの漂白剤を必要とするだろう。
【０１８３】
漂白工程は天然綿顔料を脱色し、そしてジンニング、カーディングまたは精錬中に完全に除去されなかった天然綿木からの残留成分を除去する。今日使用されている主な方法はアルカリ過酸化水素漂白である。多くの場合、特に極端に高い白度が必要でない時には、漂白を精錬と組み合わせることができる。
【０１８４】
精錬工程は本発明のキシログルカナーゼまたはキシログルカナーゼ酵素調製物を幾つかの別の酵素活性と組み合わせて、約５０〜８０℃の温度および約７〜１１のｐＨにおいて使用でき、かくして強苛性アルカリ剤を置換または補足することができると考えられる。
【０１８５】
材料および方法
菌株：
バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  １４５８０、およびバシラス・アガラヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ  ４０４８２はそれぞれ、キシログルカナーゼをコードする本発明のＤＮＡ配列を含んで成る。
【０１８６】
他の菌株：
Ｅ．コリ株：Ｅ．コリ  ＳＪ２（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ他，１９９０）の細胞を調製し、そして、供給業者により記載された通りにＢＩＯ−ＲＡＤからのＧｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＴＭエレクトロポレーターを使ったエレクトロポレーションにより形質転換せしめた。
【０１８７】
Ｂ．サチリス  ＰＬ１８８５（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ他，１９９０）。
Ｂ．サチリス  ＰＬ２３０６。この株は、既知のバシラス・サチリスセルラーゼ遺伝子の転写単位中に破壊されたａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子を有し、結果としてセルラーゼ陰性細胞であるＢ．サチリス  ＤＮ１８８５である（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ他，１９９０）。
【０１８８】
Ｂ．サチリス  ＰＬ２３１６。この株は、既知のバシラス・サチリスのキシラナーゼ遺伝子の転写単位中に破壊されたａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子を有糸、結果としてキシラナーゼ陰性細胞である〔Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｂ．，Ｗｅｄｓｔｅｄ，Ｕ．，Ｈｅｄｅｇａａｒｄ，Ｌ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｃ．（１９９０）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｄＢ，ｗｈｉｃｈ  ｃｏｄｅｓ  ａｌｐｈａ−ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ａｎ  ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，４３１５−４３２１〕。この破壊は本質的にＡ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ他（１９９３）に記載された通りに行った。
【０１８９】
受容能のある細胞はＹａｓｂｉｎ他（１９８５）により記載された通りに調製しそして形質転換せしめた。
【０１９０】
プラスミド：
ｐＳＪ１６７８（ＷＯ  ９４／１９４５４参照）。
ｐＭＯＬ９４４。このプラスミドは、本質的にバシラス・サチリス中で増殖可能なプラスミドにする要素であるカナマイシン耐性遺伝子を含有し且つＢ．リヘニフォルミス  ＡＴＣＣ  １４５８０のａｍｙＬ遺伝子からクローニングした強力プロモーターとシグナルペプチドを有する、ｐＵＢ１１０誘導体である。シグナルペプチドは、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡをクローニングするのに便利にするＳａｃＩＩ部位を含有する。これは、細胞の外部の方に差し向けられるプレタンパク質の発現をもたらす。
プラスミドは下記に簡単に記載するように通常の遺伝子操作技術を使って作製した。
【０１９１】
ｐＭＯＬ９４４の作製：
ｐＵＢ１０プラスミド（ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｔ．他，１９８６）をユニーク制限酵素ＮｃｉＩで消化した。プラスミドｐＤＮ１９８１（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ他，１９９０）上にコードされるａｍｙＬプロモーターから増幅させたＰＣＲ断片をＮｃｉＩで消化し、そしてそれをＮｃｉＩで消化したｐＵＢ１１０中に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６２４を作製した。
【０１９２】
使用した２つのＰＣＲプライマーは下記の配列を有する：
＃ＬＷＮ５４９４  ５’−ＧＴＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ−３’
＃ＬＷＮ５４９５  ５’−ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ−３’
プライマー  ＃ＬＷＮ５４９４はプラスミド中にＮｏｔＩ部位を挿入する。
【０１９３】
次いでプラスミド  ｐＳＪ２６２４をＳａｃＩとＮｏｔＩで消化し、そしてｐＤＮ１９８１上にコードされるａｍｙＬプロモーターから増幅させた新しいＰＣＲ断片をＳａｃＩとＮｏｔＩで消化し、生じたＤＮＡ断片をＳａｃＩ−ＮｏｔＩで消化したｐＳＪ２６２４中に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６７０を作製した。
【０１９４】
このクローニングは、クローニングする最初のａｍｙＬプロモーターを逆向きの同じプロモーターにより置き換える。ＰＣＲ増幅に使用した２つのＰＣＲプライマーは次の配列を有する：
＃ＬＷＮ５９３８  ５’−ＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ−３’
＃ＬＷＮ５９３９  ５’−ＧＴＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ−３’
【０１９５】
プラスミドｐＳＪ２６７０を制限酵素ＰｓｔＩとＢｃｌＩで消化し、そしてアルカリ性アミラーゼＳＰ７２２をコードするクローン化ＤＮＡ配列（国際特許出願公開第ＷＯ  ９５／２６３９７号公報、これは参考として本明細書中に組み込まれる）から増幅させたＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＢｃｌＩで消化し、それを挿入してプラスミド  ｐＭＯＬ９４４を得た。ＰＣＲ増幅に使用した２つのプライマーは次の配列を有する：
【０１９６】
＃ＬＷＮ７８６４  ５’−ＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣ−３’
＃ＬＷＮ７９０１  ５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧ−３’
プライマー  ＃ＬＷＮ７９０１はプラスミドにＳａｃＩ部位を挿入する。
【０１９７】
培地：
ＴＹ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他，１９９５に記載された通り）。
ＬＢ寒天（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他，１９９５に記載された通り）。
ＬＢＰＧは、０．５％グルコースと０．０５Ｍリン酸カリウム，ｐＨ７．０を補足したＬＢ寒天培地である。
ＡＺＣＬ−キシログルカンは、ＬＰＧＰ寒天に０．５％添加される。ＡＺＣＬ−キシログルカンはＭｅｇａｚｙｍｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手される。
【０１９８】
ＢＰＸ培地はＥＰ  ０  ５０６  ７８０（ＷＯ  ９１／０９１２９）に記載されている。
培地Ａ：フラスコあたり、３０ｇの小麦胚芽、４５ｍｌの次の溶液：１０ｇのＲｏｆｅｃ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ  １０１−０４４１），１０ｇのＮＨ４，ＮＯ３（Ｍｅｒｃｋ  １１８７），１０ｇのＫＨ２ＰＯ４（Ｍｅｒｃｋ  ４８７３），４０ｇのＳｏｌｃａｆｌｏｃ（Ｄｉｃａｌｉｔｅ−Ｅｕｒｏｐｅ−Ｎｏｒｄ，９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍより入手可能なＤｉｃａｃｅｌ），０．７５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ  ５８８６），１５ｇのＣａＣＯ３、水道水で１０００ｍｌにし、ｐＨを６．５に調整。１２１℃で４０分間オートクレーブ滅菌。
【０１９９】
培地Ｂ：３０ｇの大豆ミール，１５ｇのＭａｌｔｏｄｅｘ  ０１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ  １０１−７８４５），５ｇのペプトン（Ｄｉｆｃｏ  ０１１８），０．２ｍｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＰＥ−６１００，１０１−３０６８），脱イオン水で１０００ｍｌにする。２バッフルを有する５００ｍｌのアーレンマイヤーフラスコ中１００ｍｌ。１２１℃で４０分間オートクレーブ滅菌。
培地Ｃ：１５ｇの小麦胚芽，５ｇのブドウ糖，６．７ｇのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｂａｓｅ，脱イオン水で１０００ｍｌにする。２バッフルを有する５００ｍｌのアーレンマイヤーフラスコ中１００ｍｌ。１２１℃で４０分間オートクレーブ滅菌。
【０２００】
培地Ｄ：２０％ショ糖，５％大豆フレークおよび１％リン酸ナトリウム。
培地Ｅ：５ｇの酵母エキス，１０ｇのトリプトン，３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４，３ｇのＫ２ＨＰＯ４，２ｇのＫＨ２ＰＯ４，１ｇのＣＭＣ，１０ｇのマルトデキストリン，３０ｇの小麦胚芽，脱イオン水で１０００ｍｌにし、ｐＨを７．０に調整する。２バッフルを有する５００ｍｌのアーレンバイヤーフラスコ中１００ｍｌ。１２１℃で４０分間オートクレーブ滅菌。
【０２０１】
醗酵法：
真菌株は下記の増殖条件下で振盪フラスコ中で増殖させた。
培地：  Ａ，ＢまたはＣ（培地の一覧を参照のこと）
温度：  ２６℃
ＲＰＭ：  Ａ，静置；ＢおよびＣ，１２５〜２００ｒｐｍ
インキュベーション時間：Ａ，６〜３０日；ＢおよびＣ，２〜２１日
細菌は培地ＤまたはＥを含む振盪フラスコ中で２５０ｒｐｍで振盪しながら３００℃にて３〜４日間増殖させた。
【０２０２】
キシログルカナーゼアッセイ（ＸＧＵ）：
キシログルカナーゼ活性は、基質としてＭａｇａｚｙｍｅ社（オーストラリア）からのＡＺＣＬ−キシログルカンを使って測定する。
０．２％の青色基質溶液を攪拌下で０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５中に懸濁させる。この溶液を攪拌しながら１．５ｍｌのエッペンドルフ管に分配し（各々０．７５ｍｌずつ）、５０μｌの酵素溶液を添加し、それらをエッペンドルフサーモミキサー５４３６型中で１２００ｒｐｍで混合しながら４０℃で２０分間インキュベートする。インキュベーション後、１４，０００ｒｐｍで４分間の遠心により、着色した溶液を固体から分離し、そして上清の吸光度を６００ｎｍで測定する。
１ＸＧＵ単位は、１ｃｍキュベット中で６００ｎｍの波長で０．２４の吸光度を提供する酵素の量として定義される。
【０２０３】
等電点電気泳動：
等電点電気泳動は、製造業者の使用説明書に従ってプレキャストＡｍｐｈｏｌｉｎｅ  ＰＡＧプレート  ｐＨ３．５−９．５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で実施した。二重反復試験において試料を適用し、そして電気泳動後、ゲルを二分した。１％アガロースと０．４％ＡＺＣＬ−キシログルカン水溶液を含む上塗層をゲルの半分の上にそそぎ、そしてＡＺＣＬ−ＨＥセルロースを含む同様な上塗層を残りの半分の上にそそいだ。３０℃で２〜１６時間インキュベートした。酵素活性は青色ゾーンにより同定した。
【０２０４】
一般分子生物学方法：
ＤＮＡ操作と形質転換は分子生物学の標準法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他編，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｐｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．＆Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．編，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９０〕を使って実施した。
ＤＮＡ操作用の酵素は、供給業者の指示書に従って使用した。
下記の実施例は本発明を例証する。
【０２０５】
実施例１
アルカリ性キシログルカナーゼを生産する微生物についてのスクリーニング
スクリーニングしようとする微生物を材料と方法の項目に記載した通りに液体培養として増殖させた。遠心分離後、培養上清をキシログルカナーゼおよびセルラーゼ活性について試験した。次のアッセイを利用した：０．０８Ｍ  Ｂｒｉｔｔｏｎ＝Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液ｐＨ７またはｐＨ９中の１％アガロースおよび０．２％ＡＺＣＬ−キシログルカンまたは０．２％ＡＺＣＬ−ＨＥセルロースをそれぞれ含有するアガロースプレートを使用し、そのアガロースプレート中の直径＝４ｍｍの穴に１０ｍｌ試料を適用し、３０℃で２〜１６時間インキュベートした。青色ゾーンにより酵素活性を同定した。
【０２０６】
ＡＺＣＬ−キシログルカンに対して良好な活性を有し且つＡＺＣＬ−ＨＥセルロースに対して無活性であるかまたは低活性しか有さない培養ブロスを、上記の材料と方法に記載した通りに等電点電気泳動（ＩＥＦ）により更に試験した。上記の材料と方法に列挙した微生物は、ＩＥＦによってＡＺＣＬ−ＨＥセルロースに対する活性から分離できるＡＺＣＬ−キシログルカンに対する活性を有する酵素を生産することがわかった。キシログルカナーゼ活性についてスクリーニングするとセルラーゼ活性も検出され、それが同じ酵素に由来するかどうかを決定した。これは、タンパク質を電荷またはｐＩにより分離するＩＥＦ等電点電気泳動を用いた酵素の分離によって行った。この分離の後、再び積層技術を使って異なる酵素活性を同定した。試料を２つの並行パネルに適用した：１つのパネルはキシログルカナーゼ活性について染色し、もう１つはＡＺＣＬ−ＨＥセルロース活性について染色した。同じレーンが２つの活性を有したならばそれはセルラーゼであり、ただ１つのレーンがキシログルカナーゼ活性を有し且つセルラーゼ活性を全く有さなければ、それはキシログルカナーゼである。それは精製またはクローニングにより更に特徴づけることができる。
【０２０７】
実施例２
バシラス・リヘニフォルミスのキシログルカナーゼ（ＸＧ）の生産
この実施例は、バシラス・リヘニフォルミスからキシログルカナーゼを生産させる方法を例証する。
【０２０８】
バシラス・リヘニフォルミス  ＡＴＣＣ  １４５８０を、基質としてＰＳ  １（２０％ショ糖，５％大豆フレークおよび１％リン酸ナトリウム）を使って振盪フラスコ中で２５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃で４日間増殖させた。培養ブロス（合計１０Ｌ）をＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した後、室温で攪拌しながら５０ｍｌのカチオン凝集剤で処理し、次いで４７０ｍｌの０．１％アニオン凝集剤溶液で処理した。凝集した材料を、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ  ３Ｂを使って１０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により分離した。ワットマンガラス濾過器Ｎｏ．Ｆを使って上清を清澄化した。１０ＸＧＵ／ｍｌの活性を有する合計９Ｌの液体が得られた。
【０２０９】
この液体を１０ｋＤａのカットオフを有するフィルトロン上で１．５リットルに濃縮した。
プロテアーゼを除去するためにセファロースに架橋結合したバシトラシンを使って、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。次いで結合しなかった材料を酢酸でｐＨ５．０に調整し、そして２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で平衡化されたＳＰ−セファロースカラムに適用した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配を使ってカラムからＸＧ活性を溶出させた。ＸＧ活性を有する画分をプールし、そして８ｋＤａのカットオフ値を有するＧＲ  ８１ポリスルホン膜を使ってＡｍｉｃｏｎセル上で濃縮した。
【０２１０】
３６３ＸＧＵ／ｍｌの活性を有する濃縮溶液を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを使ったサイズクロマトグラフィーにかけた。純粋なＸＧ１は２６ｋＤａの見かけ分子量で溶出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで２６ｋＤａの単一バンドを与えた。比活性はＡ２８０あたり２２１ＸＧＵと決定された。
【０２１１】
実施例３
バシラス・リヘニフォルミスのキシログルカナーゼの特徴づけ
前記２６ｋＤａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥと等電点電気泳動を行った後、実施例２に記載の通りに生産させた酵素のアミノ酸配列を得た。アミノ酸配列は配列表の配列番号２に与えられる。
【０２１２】
このアミノ酸配列は、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）として現在分類されているファミリー１２からのグリコシルヒドロラーゼと最高の相同性を示す：ファミリー１２のエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）β−１，４−グルカングルカノヒドロラーゼ（ｃｅｌＳ−Ｐ１６６３０  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）に対して６５％相同性。
【０２１３】
従って、本発明は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するかまたはそれと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列を有する酵素に関する。
【０２１４】
得られたバシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）キシログルカナーゼ酵素を、キシログルカナーゼ活性測定のためにはＭａｇａｚｙｍｅ  ＡＺＣＬ−キシログルカンおよびエンドグルカナーゼ活性測定のためにはＡＺＣＬ−ＨＥセルロースを使って分析した。青色の相対的放出量は、同じ量の精製酵素を使った時、ＨＥセルロースに比較してキシログルカン基質に対して４０倍高かった。
【０２１５】
特許出願第ＷＯ  ９４／１４９５３号公報に記載された酸性アスペルギルス・アクレータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）キシログルカナーゼ酵素（ＥＧＩＩ）についても同じ結果が観察され、ＨＥセルロースに対して２％の相対活性を示した。
【０２１６】
最適温度
ＭｅｇａｚｙｍｅからのＡＺＣＬ−キシログルカンを最適温度の決定にも使用した。様々な温度で実施例２のキシログルカナーゼと共に２０分間インキュベートした後に活性を測定し、そして６００ｎｍで青色の放出を測定した。６０℃では色の大部分が放出され、７０℃でもまだ５０％の相対活性が得られた。
【０２１７】
ｐＨ活性プロフィール
実際的なｐＨ活性プロフィールを得るために、実際のｐＨの１．０内のｐＫａ値を有する緩衝液を使って活性測定を実施した。次の緩衝液系を使用した：ｐＨ４．５−５．５：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６：ＭＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ６．５−７．５：ＭＯＰＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ８−８．５：バルビツール酸緩衝液、ｐＨ９−１０．５：グリシン緩衝液。
【０２１８】
並行処理した試験管中で４０℃で２０分間のインキュベーション後にｐＨを測定した。最終基質濃度は１．３３ｇキシログルカン／Ｌであった。これはＫＭである（ｐＨ５．５での定常状態について下記参照）。定常状態について記載される還元性末端の形成の測定後に活性を測定した。
【０２１９】
【表２】
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【０２２０】
実施例４
可溶性キシログルカンおよびＣＭＣに対する定常状態速度論
キシログルカンに対する活性の測定方法を開発した。
基質はタマリンド種子からのキシログルカン（アミロイド）である（この基質はＭｅｇａｚｙｍｅより市販されている）。緩衝液は０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．５である。
【０２２１】
緩衝液１Ｌ中に基質５ｇを含有する原液として基質を調製する。混合した後、透明溶液が得られるまで磁気攪拌器を使ってそれを加熱する。次いでその溶液を４０℃に冷却し、そして４０℃の温度制御浴中に維持する。
希釈した酵素溶液０．５ｍｌを１０分間予熱し、１．０ｍｌの基質と混合し、そして２０分間インキュベートする。
【０２２２】
１．５ｇのＰＨＢＡＨに加えて５ｇの酒石酸ナトリウムカリウムを使うＬｅｖｅｒ（１９７２）から改良された方法でｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＨＢＡＨ）を使うことにより、還元糖の形成を測定する。還元種の測定の比較参照としてグルコースを使用する。
【０２２３】
タマリンド種子からのキシログルカンに対する次の２つの既知セルラーゼ（エンド−β−１，４−グルカナーゼ）の見かけの触媒特性を測定した：
ａ．ＷＯ  ９５／２４４７１に開示されたフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのＥＧ  Ｉ（グリコシルヒドロラーゼのファミリー７に属すると分類されている）。
ｂ．米国特許第５，４７５，１０１号明細書に開示されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からのＥＧ  ＩＩ。
【０２２４】
酵素は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを与えるように高均質性に精製し、そして酵素濃度の計算にはモル吸光係数を使用した。測定は１Ｌあたり０．２５ｇから３．３ｇまでの異なる基質濃度に基づいて行った。速度論測定は、コンピュータープログラムＧｒａｆｉｔに従いそしてミハエリス−メンテン速度論を仮定した。
【０２２５】
結果
本発明の酵素：２６ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）キシログルカナーゼ１。アミノ酸分析により決定した７８，０００のモル吸光度に基づくと、キシログルカンに対するｋｃａｔはｐＨ７．５で１６．５／秒（標準偏差０．６）であり、Ｋｍは１．１ｇ／ｌ（標準誤差０．１）であった。基質としてＣＭＣを使った場合、ｋｃａｔは測定不可能であり３／秒未満であった。最大キシログルカナーゼ活性対ＣＭＣに対する最大活性の比は少なくとも５：１である。
【０２２６】
ａ．比較酵素ＥＧ  Ｉ，フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのアルカリ性セルラーゼ、ＭＷ  ５０ｋＤａ、モル吸光係数６６３１０。キシログルカンに対するｋｃａｔはｐＨ７．５で１９／秒（標準誤差０．７）であり、Ｋｍは０．７ｇ／ｌ（標準誤差０．０８）であった。ＣＭＣに対するκｃａｔは８６／秒であった（標準誤差５）。最大キシログルカナーゼ活性対ＣＭＣに対する最大活性の比は２：９である。
【０２２７】
ｂ．比較酵素ＥＧ  ＩＩＩ，トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からの酸性セルラーゼ、ＭＷ  ２４ｋＤａ、モル吸光係数７１９３０。キシログルカンに対するｋｃａｔはｐＨ７．５で１６／秒（標準誤差１．７）であり、Ｋｍは０．５ｇ／ｌ（標準誤差０．１５）であった。ＣＭＣに対するｋｃａｔは１８／秒（標準誤差０．６）であった。最大キシログルカナーゼ活性対ＣＭＣに対する最大活性の比は８：９である。
【０２２８】
実施例５
バシラス・リヘニフォルミスからのキシログルカナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡの調製：
バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株ＡＴＣＣ  １４５８０を液体ＴＹ培地中で増殖させた。３０℃および３００ｒｐｍで１６時間インキュベーションした後、細胞を収得し、そしてＰｉｔｃｈｅｒ他（１９８９）により記載された方法によりゲノムＤＮＡを単離した。
【０２２９】
ゲノムライブラリーの作製：
ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化し、そして０．７％アガロースゲル上での電気泳動によりサイズ分画した。ＤＥＡＥ−セルロース紙上への電気泳動により、２〜１０ｋｂのサイズの断片を単離した（Ｄｒｅｔｚｅｎ  他，１９８１）。
単離したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＳＪ１６７８プラスミドＤＮＡと連結し、そして連結混合物を用いてＥ．コリ  ＳＪ２を形質転換せしめた。
【０２３０】
陽性クローンの同定：
上記の通り作製したＥ．コリ中のＤＮＡライブラリーを、０．５％ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍａｇａｚｙｍｅ）と９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上でスクリーニングし、３７℃で一晩インキュベートした。加水分解活性を示すクローンは青色の拡散円として現れた。このクローンのプラスミドを１ｍｌの一晩培養物（２５０ｒｐｍで攪拌しながら、９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＴＹ培地中で３７℃でインキュベートした細胞）から、Ｑｉａｇｅｎプラスミドスピンプレップにより単離した。それらのクローンのうちの１つ（ＰＬ２９４９）をクローン化Ｓａｕ３Ａ  ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定により更に特徴づけた。
【０２３１】
該ＤＮＡは、Ｔａｑデオキシーターミナルサイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）、蛍光標識したターミネーターおよびプライマーとしての適当なオリゴヌクレオチドを使ったＤＮＡ配列決定により特徴づけた。
【０２３２】
配列データの分析はＤｅｖｅｒｅｕｘ他（１９８４）に従って行った。成熟タンパク質をコードする配列は配列番号１に示される（シグナル部分＋成熟部分；成熟部分は８８〜７８３位に相当する）。誘導されるタンパク質配列は配列番号２に示される（成熟タンパク質は配列番号２の３０〜２６１位に相当する）。
【０２３３】
Ｂ．サチリスにおけるＢ．リヘニフォルミス由来キシログルカナーゼ遺伝子のサブクローニングおよび発現：
本発明のキシログルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を、次の２つから成るＰＣＲプライマーセットを使ってＰＣＲ増幅せしめた：
【化７】
0003961767.tif 000015
制限部位ＰｓｔＩとＮｏｔＩに下線が引かれている。
【０２３４】
上述したようにＢ．リヘニフォルミスより単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、製造業者の教示に従ってＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ，ＵＳＡ）および１００ピコモルの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中に用意した。
【０２３５】
ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って行った。９４℃で１分間のインキュベーションを１回、次いで９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長からなる循環プロフィールを使ったＰＣＲサイクルを３０回行った。増幅生成物の５μｌアリコートを０．７％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ，ＦＭＣ）上での電気泳動により分析した。約０．８ｋｂのＤＮＡ断片サイズの出現は遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
【０２３６】
ＰＣＲ断片のサブクローニング：
上記の通り調製したＰＣＲ生成物の４５μｌアリコートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使って製造業者の教示に従って精製した。精製したＤＮＡを５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５中に溶出させた。５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を共にＰｓｔＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低融解温度アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ，ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関連する断片をゲルから切り取り、そして製造業者の教示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使って精製した。単離されたＰＣＲ生成ＤＮＡ断片を次いでＰｓｔＩ−ＮｏｔＩで消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結せしめた。この連結は０．５μｇの各ＤＮＡ断片，１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って１６℃で一晩行った。
【０２３７】
連結混合物を用いて受容能のある（コンピテント）Ｂ．サチリス  ＰＬ２３１６を形質転換せしめた。形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に塗布した。３７℃で１８時間インキュベーション後、コロニーがプレート上に観察された。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離することにより数個のクローンを分析した。
【０２３８】
そのような１つの陽性クローンを上記で使用したのと同じ寒天プレート上で数回再画線培養した。このクローンをＰＬ２９５４と命名した。クローン  ＰＬ２９５４をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、そして翌日１ｍｌの細胞を使って、Ｂ，サチリスのプラスミド調製についての製造業者の推奨通りにＱｉａｏｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット＃２７１０６を用いて細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡをＤＮＡ配列決定した。すると、配列番号１中の８８〜７８３位に示されるキシログルカナーゼの成熟部分と一致するＤＮＡ配列を明らかにした。
【０２３９】
Ｂ．リヘニフォルミス由来キシログルカナーゼの発現および精製
５００ｍｌの２バッフル振盪フラスコ中に入った１０μ／ｍｌカナマイシンを含む２５×２００ｍｌ  ＢＰＸ培地中で３７℃，３００ｒｐｍにてＰＬ２９５４を５日間増殖させた。
【０２４０】
実施例６
バシラス・アガラヘレンスからのキシログルカナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
ゲノムＤＮＡの調製：
バシラス・アガラヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）株ＮＣＩＭＢ  ４０４８２をＷＯ  ９４／０１５３２に記載の通りに液体培地中で増殖させた。３０℃および３００ｒｐｍで１６時間インキュベーションした後、細胞を収得し、そしてＰｉｔｃｈｅｒ他（１９８９）により記載された方法によりゲノムＤＮＡを単離した。
【０２４１】
ゲノムライブラリーの作製：
ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化し、そして０．７％アガロースゲル上での電気泳動によりサイズ分画した。ＤＥＡＥ−セルロース紙上への電気泳動により、２〜７ｋｂのサイズの断片を単離した〔Ｄｒｅｔｚｅｎ  Ｇ．，Ｂｅｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｐ．，Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．（１９８１）“Ａ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｇａｒｏｓｅ  ａｎｄ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ”，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，２９５−２９８〕。
【０２４２】
単離したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＳＪ１６７８プラスミドＤＮＡと連結し、そして連結混合物を用いてＥ．コリ  ＳＪ２を形質転換せしめた。
０．１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム、Ａｑｕａｌｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）と９μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上に細胞を塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０２４３】
陽性クローンの同定：
上記の通り作製したＥ．コリ中のＤＮＡライブラリーを、０．１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム、Ａｑｕａｌｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）と９μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上でスクリーニングし、３７℃で一晩インキュベートした。続いて同じ種類のプレート上に形質転換体をレプリカ塗布し、それらの新規プレートを３７℃で８時間または一晩インキュベートした。
１ｍｇ／ｍｌのコンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を使って元のプレートを着色した。穏和な軌道振盪しながら着色を３０分間続け、その後、プレートを１Ｍ  ＮａＣｌで１５分間づつ２回洗浄した。
【０２４４】
セルラーゼ陽性クローンが存在する場所に黄色の円が出現した。レプリカプレートからそれらのセルラーゼ陽性クローンを救済し、０．１％ＣＭＣと９μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上に再画線し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
そのようなクローンの１つ（ＭＢ１１０）をクローン化Ｓａｕ３Ａ  ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定により更に特徴づけた。
【０２４５】
該ＤＮＡは、Taq デオキシ−ターミナルサイクル配列決定キット（Perkin-Elmer, USA ）、蛍光標識したターミネーターおよびプライマーとしての適当なオリゴヌクレオチドを使ったＤＮＡ配列決定により特徴づけた。
配列データの分析はDevereux他 (1984) に従って行った。成熟タンパク質（この後でサブクローニングする）をコードする配列は配列番号３に示される。誘導されるタンパク質配列は配列番号４に示される。
【０２４６】
Ｂ．サチリスにおけるキシログルカナーゼ遺伝子のサブクローニングおよび発現  本発明のキシログルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を、次の２つから成るＰＣＲプライマーセットを使ってＰＣＲ増幅せしめた：
【化８】
0003961767.tif 000016
制限部位ＳａｃＩＩとＮｏｔＩに下線が引かれている。
【０２４７】
上述したようにＢ．アガラヘランスより単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、製造業者の教示に従ってＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ，ＵＳＡ）および１００ピコモルの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中に用意した。
【０２４８】
ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って行った。９４℃で１分間のインキュベーションを１回、次いで９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で２分間の伸長からなる循環プロフィールを使ったＰＣＲサイクルを３０回行った。増幅生成物の５μｌアリコートを０．７％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ，ＦＭＣ）上での電気泳動により分析した。約１．６ｋｂのＤＮＡ断片サイズの出現は遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
【０２４９】
ＰＣＲ断片のサブクローニング：
上記の通り調製したＰＣＲ生成物の４５μｌアリコートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使って製造業者の教示に従って精製した。精製したＤＮＡを５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５中に溶出させた。５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を共にＳａｃＩＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低融解温度アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ，ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関連する断片をゲルから切り取り、そして製造業者の教示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使って精製した。単離されたＰＣＲ生成ＤＮＡ断片を次いでＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩで消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結せしめた。この連結は０．５μｇの各ＤＮＡ断片，１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って１６℃で一晩行った。
【０２５０】
連結混合物を用いて受容能のある（コンピテント）Ｂ．サチリス  ＰＬ２３０６を形質転換せしめた。形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−０．１％ＡＺＣＬ−キシログルカン−寒天プレート上に塗布した。３７℃で１８時間インキュベーション後、クローン化キシログルカナーゼを陽性発現している細胞が青色の輪により囲まれたコロニーとして観察された。１つのそのような陽性クローンを上記で使用した寒天プレート上で数回再画線培養した。このクローンをＭＢ５６３と命名した。クローン  ＭＢ５６３をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、そして翌日１ｍｌの細胞を使って、Ｂ，サチリスのプラスミド調製についての製造業者の推奨通りにＱｉａｏｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ＃２７１０６を用いて細胞からプラスミドを単離した。
【０２５１】
Ｂ．アガラヘレンスキシログルカナーゼの発現および精製
５００ｍｌの２バッフル振盪フラスコ中に入った１０μ／ｍｌカナマイシンを含む２５×２００ｍｌ  ＢＰＸ培地中で３７℃および３００ｒｐｍにてＭＢ５６３を５日間増殖させた。
【０２５２】
実施例７
バシラス・アガラヘレンスのキシログルカナーゼの特徴づけ
精製および特徴づけ：
バシラスから、実施例６に記載の通り発現させたクローン  ＭＢ５６３を含有する７０００ｍｌの振盪フラスコ培養液を得た。醗酵培地をＮａＯＨでｐＨ７．５に調整し、そしてカチオン凝集剤Ｃ５２１（１０％溶液）およびアニオン凝集剤Ａ１３０の０．１％溶液を使って凝集させた。室温で攪拌しながら、７０００ｍｌの醗酵培地に１６８ｍｌのＣ５２１（１０％）と３３５ｍｌのＡ１３０を同時に添加した。Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ  ３Ｂ遠心機を使った１０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心により、凝集材料を分離した。ＷｈａｔｍａｎガラスフィルターＮｏ．Ｆを使って上清を清澄化した。２２７，５００ＸＧＵ単位を含む合計６５００ｍｌの透明溶液が得られた。
【０２５３】
透明溶液２５００ｍｌを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．０で平衡化された１０００ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。結合した酵素をＮａＣｌ勾配を用いて溶出させた。
部分精製された生成物を、６ｋＤａのカットオフ値を有する膜を取り付けたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルを使って濃縮した。合計７０，０００ＸＧＵ単位および２．５グラムの酵素タンパク質が得られた。
【０２５４】
純粋な試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて６１ｋＤａの見かけ分子量を有する単一バンドを与えた。酵素タンパク質の濃度の計算には１２３，０４０のモル吸光係数を使ったが、これはＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸組成に基づいている。
濃縮した画分を４０％ソルビトールと共に配合し、それを洗剤および繊維用途での酵素試験に使用した。
【０２５５】
免疫学的方法：
クローン  ＭＢ５６３から得られた高度に精製されたバシラス・アガラヘレンスＸＥＧ１を抗血清の製造に使用した。
免疫処置はウサギを使ってＤＡＫＯにて行った。１００μｌのアジュバントと混合した１００μｌのセルラーゼ（０．４ｍｇタンパク質／ｍｌ）を用いて各ウサギを免疫処置した。各ウサギは１週間おきに１５回免疫処置した。ウサギ血清を収集し、その血清からγ−グロブリンを精製した。
【０２５６】
最適温度：
ＭｅｇａｚｙｍｅからのＡＺＣＬ−キシログルカンを最適温度の測定にも使用した。様々な温度でバシラス・アガラヘレンスＸＥＧ１と共に２０分間インキュベートした後に活性を測定し、そして６００ｎｍで青色の放出を測定した。５０℃では色の大部分が放出され、６０℃でもまだ２０％の相対活性が得られた。
【０２５７】
可溶性キシログルカンおよびＣＭＣに対する定常状態速度論：
実施例４に記載したキシログルカンに対する活性の測定方法を本発明のＢ．アガラヘレンスのキシログルカナーゼに適用した。基質を少なくとも８つの異なる濃度に希釈し、その４つは見かけＫｍより低かった（下記参照）。
【０２５８】
タマリンド種子からのキシログルカンに対するバシラス・アガラヘレンスＸＥＧ１（エンド−β−１，４−キシログルカナーゼ）の次の見かけの触媒特性を調べた：ｐＨ７．５で１８３／秒のｋｃａｔおよび０．０５ｇ／ｌの見かけＫｍが得られた。比較のために、同じ定常状態速度論法を使って、Ｋｍより低い８つの異なる基質濃度を二重反復試験において使ってＣＭＣ（置換率０．７および重合度２００）に対する活性データを得た：６４／秒のｋｃａｔおよび２．２ｇ／ｌの見かけＫｍ。このことは、この酵素がカルボキシメチルセルロースよりもキシログルカンを好むことを示す。
【０２５９】
グリシン緩衝液とキシログルカン基質を使ったアルカリ性活性は、９０／秒のｋｃａｔおよび０．０８ｇ／ｌの見かけＫｍを与えた。このことは、このキシログルカナーゼが非常に高いアルカリ性活性を有することを示す。
青色のＭａｇａｚｙｍｅ  ＡＺＣＬ−キシログルカン基質を使ったｐＨ活性プロフィールは、該酵素が５．０〜１０．５のｐＨ域において５０％より高い相対活性を有することを示した。
【０２６０】
青色のＭａｇａｚｙｍｅ基質を使った洗剤マトリックスにおいて次のデータが得られた。ドイツ水硬度９でＵＳ  Ｔｉｄｅ粉末洗剤中１ｇ／Ｌでは、６６％の相対活性を示した。５ｇ／ｌの量およびドイツ水硬度１８においてヨーロッパ条件と粉末Ａｒｉｅｌを使った場合、８６％の相対活性が得られた。これらのデータは、バシラス・アガラヘレンスＸＥＧ１が洗剤マトリックス中での使用に非常に適することを示す。
【０２６１】
参考文献
【表３】
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【表４】
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配列表
（１）一般情報
（ii）発明の名称：アルカリ性キシログルカナーゼ
（iii）配列の数：４
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノミック）
（vi）由来：
（Ａ）生物：Bacillus licheniformis ATCC 14580
（xi）配列の記載：配列番号：１：
【表５】
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（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２：
【表６】
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【表７】
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（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６１４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノミック）
（vi）由来：
（Ａ）生物：Bacillus agaradhaerens NCIMB 40482
（xi）配列の記載：配列番号：３：
【表８】
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【表９】
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（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４：
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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