(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成能力が無く、コロニー色素を生産せず、運動性が無く、菌体脂肪酸としてＣ１４及びＣ１７：０を保有しないがＣ１８：０−３０Ｈを保有し、炭素源として酢酸及びコハク酸を利用できないが、グルコース、フラクトース及びプロピオン酸を唯一の炭素源として利用する性質を有するロドバクター・グルコニカム（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）に属する微生物。
【請求項２】
微生物がロドバクター・グルコニカム（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６１５である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
グルコースを基質とする栄養培地で請求項１記載の微生物を好気的条件下で培養することを特徴とするグルコン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロドバクター・グルコニカムに属する新種の微生物に関する。この微生物は、酪酸、プロピオン酸等の有機酸塩を利用する能力が有り、活性汚泥の処理に利用できるほか、グルコースを基質としたグルコン酸の生産に利用できる微生物である。
【０００２】
【従来の技術】
ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物は、その硝酸還元・脱窒能を利用して窒素化合物を含む排水処理等の環境浄化に利用され、更にトリメチルアミンＮ−オキサイドやジメチルスルフォキサイド等を分解する能力を有することが知られており（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６，１１７−１４３，１９８７）、天然界の窒素循環や産業界における活性汚泥処理において需要な役割を果たしている。
【０００３】
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第9版によればロドバクター属のタイプスピーシーズはロドバクター・カプシュラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）であり、その菌学的性質はグラム陰性の単桿菌（０．５〜１．２μＭ）、運動性又は非運動性、光合成能を有し、褐色の色素を生産し、光合成下では嫌気条件下有機化合物の存在で生育が認められ、多くは好気的条件下で化学栄養により生育することが記載され、利用面ではカロチノイド系色素の生産等が記載されている(特開平０８−２３９６５８、 特開平０８−０８９２４１、特開平０７−０８２５５６及び特開平０５−０４９４８７号公報)。
【０００４】
ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）は５−アミノレブリン酸生産菌として特開平０９−１７３０５４号公報に記載され、その菌学的性質も記載されている。即ち、グラム陰性の単桿菌（０．５〜１．５μＭ）で、運動性を有し、色素を生成、光合成下では嫌気条件下有機化合物の存在で生育が認められ、多くは好気的条件下で化学栄養により生育すること等が記載されている。
【０００５】
ロドバクター・スフェロイデスの５−アミノレブリン酸生産への利用については特開平１１−０４２０８３、特開平１０−１７９１４１、特開平０７−２４６０８８、特開平０６−１６９７５８及び特開平０５−０９５７８２号公報にも記載され、グルコースを原料としたＬ−リボースの製造方法については特開平１１−３３２５９２号公報に、カルボン酸の製造方法については特開平１０−１７９１８３号公報に、更にはリビトールからリブロースの製造方法については特開平１１−０１８７９２号公報に記載されている。
【０００６】
ロドバクター属の他の種については、ロドバクター・ベルドカンピィ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）がＩｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３５，１１５−１１６，１９８５に、ロドバクター・ブラスティカス（Ｒ．ｂｌａｓｔｉｃｕｓ）がＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１１９，４５６−４７２，１９８０に記載されている。
【０００７】
尚、特開平０５−０４９４８７号公報にはポリヒドロキシ有機酸エステルの製造にロドバクター・ベルドカンピィの他に、ロドバクター．スルフィドフィルス及びロドバクター・アドリアティクス（Ｒ．ａｄｒｉａｔｉｃｕｓ）の微生物が利用されることが記載されているが、ロドバクター・スルフィドフィラス（Ｒ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）及びロドバクター・アドリアティクスは、その後ロドバクター属ではなくロドブラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）属への属の変更がなされた（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、４４、１５（１９９４）。
【０００８】
【本発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は環境浄化や産業上有用な新規な微生物を、更にはロドバクター属の新種な微生物を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記発明の課題についての研究において、ロドバクター属微生物の生息が予測される淡水の湖、沼及び活性汚泥等から新規な微生物を検索した結果、ロドバクター属に属する新種の微生物を見出だし、本発明を完成した。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、食品工場の活性汚泥曝気槽から分離した菌株の中から、各種の有機酸及び糖類の資化能力の優れた菌株、ＡＳ−３株を分離した。
【００１１】
ＡＳ−３株は、光合成能力が無く、コロニー色素を生産せず、運動性が無く、菌体脂肪酸としてＣ１４：０及びＣ１７：０を保有しないがＣ１８：０−３０Ｈを保有し、炭素源として酢酸及びコハク酸を利用できず、酪酸、プロピオン酸、グルコース及びフラクト‐スを唯一の炭素源として利用することからロドバクター属の新種の微生物と判定し、ロドバクター・グルコニカムと命名し、平成１３年１１月２１日、独立行政法人  産業技術総合研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１８６１５として寄託した。
【００１２】
ロドバクター・グルコニカムＡＳ−３株（以下ＡＳ−３株と略す）の菌学的性質を以下に記する。尚、菌学的性質はＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第９版記載の方法に従って測定した。
【００１３】
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尚、菌体脂肪酸はその炭素数と不飽和結合の数で表した。例えばＣ１４：１は炭素数が１４、不飽和結合１を表す。
【００１４】
次に、常法に従い、ＡＳ−３株の１６ＳｒＲＮＡを分離し、１６ＳｒＲＮＡの
塩基配列を決定した。その結果を【配列表】に示す。
【００１５】
このようにして得られた１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を用いて、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されている種についてＧＥＮＢＡＮＫデータベースによるホモロジー解析を行った。得られた系統図を図１に示す。
【００１６】
以上の性質から本菌株(ＡＳ−３）は、グラム陰性の桿菌で、プロピオン酸（Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）及び酪酸（Ｂｕｔｙｌａｔｅ）を唯一の炭素源として利用できること、図１に示す１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく系統発生解析から、本発明者はＡＳ−３株をロドバクター属に属すると判定した。
【００１７】
図１に示す系統図からロドバクター属は３つのグループ（亜属）に分けられる。即ち、第一番目はロドバクター・スフェロイデスとロドバクター・ロドフォーマンス（Ｒ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）のグループ、第二番目はロドバクター・カプシュラタス（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）及びロドバクター・アピグメンタム（Ｒ． ａｐｉｇｍｅｎｔｕｍ）のグループ、第三番目はロドバクター・ベルドカンピィ、ロドバクター・ブラスティカス及びＡＳ−３株のグループに分けられる。第一番目の代表にロドバクター・スフェロイデス、第二番目の代表にロドバクター・カプシュラタス、第三番目の代表にロドバクター・ベルドカンピィを選び、ＡＳ−３株と菌学的性質を比較した。
【００１８】
ＡＳ−３株の一般的な菌学的性質を上記代表３種と比較した。結果は表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
ＡＳ−３株は細胞の形（Ｓｈａｐｅ）、グラム染色性（Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ）では差が無いが、色素の生産性（Ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｇｍｅｎｔ）及び光合成（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）では明らかに差が認められる。
ＡＳ−３株の炭素源利用性を代表３種と比較した。結果は表２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２に示すように、ＡＳ−３株の炭素源利用性を３種のものと比較すると、ＡＳ−３株は酢酸（Ａｃｅｔａｔｅ）、リンゴ酸（Ｍａｌａｔｅ）及びコハク酸（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を唯一の炭素源として利用できないのに対し、他の３種はいずれも利用できる点で明らかな差異が認められる。
ＡＳ−３株の化学的な性質を上記代表３種と比較した。結果は表３に示す。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
表３に示すように、ＡＳ−３株の菌体組成脂肪酸を比較すると、ＡＳ−３株はＣ１４：０及びＣ１７：０を保有しない点並びにＣ１８：０−３０Ｈを保有する点で他の3種と明らかな差異が認められる。
【００２５】
図２に示す系統図においてＡＳ−３株の近縁種はロドバクター・ブラスティカスであり、その菌学的性質はＪ．Ｇｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１１９，４５６−４７２，１９８０に記載されている。
【００２６】
上記文献によれば、ロドバクター・ブラスティカスの菌学的性質は、グラム陰性の桿菌で色素を生産する光合成細菌、細胞分裂の型が出芽によること、酢酸（Ａｃｅｔａｔｅ）、リンゴ酸（Ｍａｌａｔｅ）、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）などの炭素源を利用し、ＧＣ含量が６５．３％であり、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄｅｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌であると記載されている。
【００２７】
これらの菌学的性質をＡＳ−３株のそれと比較すると、グラム陰性の桿菌であることを除いた菌学的性質は全て異なっている。
【００２８】
ロドバクター属の微生物は広範な有機化合物を炭素源として利用することが知られており、この性質を利用してグルコースを出発原料としたＬ−リボースの製造方法が特開平１１−３３２５９２号公報に記載されている。
【００２９】
ＡＳ−３株の利用する炭素源は表２に示すように他のロドバクター属のものと異なっていることから、ＡＳ−３株の炭素源利用の特異性に着目し、ＡＳ−３株をグルコースを含む栄養培地で好気的条件下で培養したところ培養液中にL−グルコン酸が好収率で蓄積されることを見出した。
【００３０】
このように、ＡＳ−３株は菌学的性質及び１６ＳｒＤＮＡ塩基解析からロドバクター属の公知の種とは区別されること及びグルコースからグルコン酸を生産することから、本発明者らはＡＳ−３株をロドバクター属の新種の微生物と判定し、ロドバクター・グルコニカムと命名し、独立行政法人産業技術総合研究所にFERM P−１８６１５として寄託した。
【００３１】
ＡＳ−３株は乳酸、酪酸、プロピオン酸、ピルビン酸等の有機酸、グルコース等の糖類を含む排水の活性汚泥処理に有用であり、グルコースを基質とするグルコン酸の製造法に利用できるほか、マルトース等のアルドース系糖類から強力な有機酸生成能を有することから、バイオマスからの有機酸等の有用物質の生産にも利用できるものである。
【００３２】
グルコン酸の製造に使用する培地は基質としてはグルコース及びグルコースを含有する糖液を使用し、窒素源としては肉エキス、ペプトン等の通常の窒素源、無機塩類としては通常の無機塩類が使用され、活性汚泥遠心上清液も利用できる。
【００３３】
【実施例】
実施例１
ニュートリエント．ブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ:Ｄｉｆｃｏ）０．８%、活性汚泥遠心上清液１０%、グルコース５．５％を含む培地５ｍｌを普通の滅菌試験缶に移し、１１０℃、１０分間オートクレーブで滅菌し、これに別殺菌したＣａＣＯ３を５%添加してグルコン酸生産用培地を調整した。これに寒天斜面培地上に生育させたＡＳ−３菌を１エーゼ植菌し、３１．５℃、４５時間振とう培養を行った。
【００３４】
培養後、培養液中に蓄積したグルコン酸をＨＰＬＣで分析した。分析条件は以下のとおりである。
【００３５】
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分析結果は下記のとおりで、基質グルコースからのグルコン酸の対モル収率は１０２%と高収率を示した。
【００３６】
基質（グルコース）濃度        ５５（ｇ／ｌ）
生成グルコン酸量              ６２（ｇ／ｌ）
対モル収率                    １０２（％）
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微生物(ＡＳ−３株)及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。縦棒は各微生物種の系統樹上の位置関係を示す。横棒は、各微生物種間の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性を示す。目盛り(０．０２)は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性について１００個の塩基中２個が相違した時の横棒の長さ(２．２ｃｍ）を示す。例えば数字［１００］は、相同性が同一とでた計算結果が１００回の内、１００回でたことを示す。
【図１】
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