(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニンによる阻害が解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを保持することを特徴とする、Ｌ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミド上に保持することを特徴とする、請求項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンを搭載するプラスミド（Ａ）と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載するプラスミド（Ｂ）との２種類のプラスミドを保持することを特徴とする、請求項２記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、配列表配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の９５３番から１１６０番までが欠損したＤＮＡ配列を有するものである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
前記２種のプラスミドのうち、プラスミド（Ａ）がｐＶＩＣ４０でありかつプラスミド（Ｂ）がｐＭＷＤ５である、請求項４記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項６】
前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項７】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有する宿主株に導入されたものである、請求項６記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌を培地に培養し、Ｌ−イソロイシンを当該培地中に生成蓄積せしめ、当該培地からＬ−イソロイシンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法。
【請求項９】
Ｌ−スレオニンによる阻害が解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−リジンによる阻害が解除されたアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子と、Ｌ−イソロイシンによる阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを保持することを特徴とする、Ｌ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌。
【請求項１０】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｌｙｓＣ遺伝子と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミド上に保持することを特徴とする、請求項９記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１１】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと前記ｌｙｓＣ遺伝子とを搭載するプラスミド（Ｃ）と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載するプラスミド（Ｂ）との２種類のプラスミドを保持することを特徴とする、請求項１０記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１２】
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、配列表配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の９５３番から１１６０番までが欠損したＤＮＡ配列を有するものである、請求項９ないし１１のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１３】
前記２種のプラスミドのうち、プラスミド（Ｃ）がｐＶＩＣＬＣ＊８０Ａでありかつプラスミド（Ｂ）がｐＭＷＤ５である、請求項１２記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１４】
前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項９ないし１３のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１５】
前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｌｙｓＣ遺伝子と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有する宿主株に導入されたものである、請求項１４記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌を培地に培養し、Ｌ−イソロイシンを当該培地中に生成蓄積せしめ、当該培地からＬ−イソロイシンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法と同製造法において利用されるエシェリヒア属細菌に関する。Ｌ−イソロイシンは、人間や動物にとっての必須アミノ酸であり、主に栄養剤をはじめとする医薬用として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
イソロイシンには不斉炭素が２つ存在するため、化学合成による方法ではＬ体のみを工業的に安価に製造することは困難である。また、α−アミノ酪酸やα−ケト酪酸等のＬ−イソロイシン生合成の前駆体を原料として生物変換によってＬ−イソロイシンを製造する方法も知られている。しかし、これらの方法は原料が高価であり、工業的に安価にＬ−イソロイシンを製造するのに有利な方法とはいえない。
【０００３】
安価な炭素源および窒素源を用いて直接発酵法によりＬ−イソロイシンを製造する方法として以下のものが知られている。１）Ｌ−イソロイシンのアンタゴニストに耐性なコリネバクテリウム属、セラチア属あるいはエシェリヒア属の変異株をＬ−イソロイシン生産株として用いる方法（特公昭５１−２１０７７号公報、特公昭５２−４６２９号公報、特公昭５６−２９９９８号公報、特公昭５６−３０３５号公報等）、２）Ｌ−イソロイシン生合成のキー酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいは同アセトヒドロキシ酸シンターゼが組換えＤＮＡ技術によって増強されたエシェリヒア属あるいはコリネバクテリウム属の微生物をＬ−イソロイシン生産株として用いる方法（特開平２−４５８号公報、特開平２−４２９８８号公報等）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、発酵法を用いてＬ−イソロイシンをより高収率で安価に製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを保持することを特徴とする、Ｌ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌を用いて、Ｌ−イソロイシンをより高収率で安価に製造することに成功した。
【０００６】
本発明は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを保持することを特徴とするＬ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌を提供するものである。
本発明のエシェリヒア属細菌は、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミド上に保持することができる。
本発明のエシェリヒア属細菌は、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンを搭載するプラスミド（Ａ）と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載するプラスミド（Ｂ）との２種類のプラスミドを保持することができる。
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの具体例としては、配列表配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の９５３番から１１６０番までが欠損したＤＮＡ配列を有するものが挙げられる。
【０００７】
プラスミド（Ａ）の具体例としてはｐＶＩＣ４０が、またプラスミド（Ｂ）の具体例としてはｐＭＷＤ５が挙げられる。
前記エシェリヒア属細菌として好ましいものはエシェリヒア・コリである。
本発明のさらに好ましいエシェリヒア属細菌は、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有する宿主株に、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとが導入された、エシェリヒア・コリである。その具体例としてはエシェリヒア・コリＡＪ１２９１９株が挙げられる。
【０００８】
本発明はまた、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−リジンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子と、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを保持することを特徴とする、Ｌ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌を提供するものである。
本発明のエシェリヒア属細菌は、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｌｙｓＣ遺伝子と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミド上に保持することができる。
【０００９】
本発明のエシェリヒア属細菌は、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと前記ｌｙｓＣ遺伝子とを搭載するプラスミド（Ｃ）と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載するプラスミド（Ｂ）との２種類のプラスミドを保持することができる。
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの具体例としては、配列表配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の９５３番から１１６０番までが欠損したＤＮＡ配列を有するものが挙げられる。
プラスミド（Ｃ）の具体例としてはｐＶＩＣＬＣ＊８０Ａが挙げられ、プラスミド（Ｂ）の具体例としてはｐＭＷＤ５が挙げられる。
前記エシェリヒア属細菌として好ましいものはエシェリヒア・コリである。
本発明のさらに好ましいエシェリヒア属細菌は、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有する宿主株に、前記ｔｈｒＡＢＣオペロンと、前記ｌｙｓＣ遺伝子と、前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが導入された、エシェリヒア・コリである。その具体例としてはエシェリヒア・コリＡＪ１３１００株が挙げられる。
【００１０】
本発明はさらに上記エシェリヒア属細菌を培地に培養し、Ｌ−イソロイシンを当該培地中に生成蓄積せしめ、当該培地からＬ−イソロイシンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法を提供するものである。
以下、本願明細書においては、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を「解除型ｔｈｒＡ遺伝子」と呼ぶことがある。また、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンを「解除型ｔｈｒＡＢＣオペロン」と呼ぶことがある。
【００１１】
本願明細書においては、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を「解除型ｉｌｖＡ遺伝子」と呼ぶことがある。また、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子（解除型ｉｌｖＡ遺伝子）を含むｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを「解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン」と呼ぶことがある。解除型ｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを「完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン」と呼ぶことがある。
本願明細書においては、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩを「ＡＫＩ−ＨＤＩ」と略することがある。また、スレオニンデアミナーゼを「ＴＤ」と略することがある。
【００１２】
本願明細書においては、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩを「解除型ＡＫＩ−ＨＤＩ」と呼ぶことがある。また、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼを「解除型ＴＤ」と呼ぶことがある。
以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１．Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロン＞
【００１４】
Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロン、すなわち解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンは、含まれるｔｈｒＡ遺伝子が変異を有する点で野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンと相違する。同変異とは、ｔｈｒＡ遺伝子がコードするＡＫＩ−ＨＤＩに対するＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除される変異を意味する。
【００１５】
このような解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを取得する方法は以下の通りである。まず、野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで解除型ＡＫＩ−ＨＤＩを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを保持している。また、野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで解除型ＡＫＩ−ＨＤＩを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを保持している。
【００１６】
野生型ＡＫＩ−ＨＤＩを生産する微生物を変異処理し、解除型ＡＫＩ−ＨＤＩを生産する変異株を創成した後、該変異株から解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを取得してもよい。もしくは、野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンが連結されている組換えＤＮＡが導入されている形質転換体を変異処理し、変異型ＡＫＩ−ＨＤＩを生産する変異株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれば、同ＤＮＡ上に解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンが創成されることがある。
【００１７】
ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4 −ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射または N−メチル−N'−ニトロ−N −ニトロソグアニジン（NTG)等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
ｔｈｒＡＢＣオペロンとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli；以下、「E. coli 」と呼ぶことがある）由来のｔｈｒＡＢＣオペロンが挙げられる。
【００１８】
エシェリヒア属細菌由来のｔｈｒＡＢＣオペロンを利用する場合、野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡの供与菌としては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. et. al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1）にあげられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109  株や、MC1061  株などがあげられる。ｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のｔｈｒＡＢＣオペロンを含むＤＮＡが取得できる。
【００１９】
（１）野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンの取得
以下に、ｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡの調製例について説明する。まず、野生型のＡＫＩ−ＨＤＩをもつE. coli 例えばMC1061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、又は肉エキスに塩化ナトリウム（NaCl）を加えた培地が用いられる。具体的には、Ｌ−ｂｒｏｔｈ（バクト・トリプトン１％、バクト・イースト・エキストラクト０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ブドウ糖０．１％、ｐＨ＝７．２）である。なお、培地の初発ｐＨは、６〜８に調整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気かく拌深部培養、振とう培養または静置培養等により行う。
【００２０】
このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli MC1061株の菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)) 、K. S. Kirby の方法（Biochem. J., 64, 405, (1956)）等の方法により染色体ＤＮＡを得ることができる。
【００２１】
こうして得られた染色体ＤＮＡからｔｈｒＡＢＣオペロンを単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００２２】
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００２３】
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、あるいはE. coli Gif106M1株（thrA1101, metLM1000, lysC1001, ilvA, argH)のようなアスパルトキナーゼ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979)あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理する方法（Mandel,M. and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) 等により行うことができる。なお、E. coli Gif106M1株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。
【００２４】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、アスパルトキナーゼ活性が増大した株あるいはアスパルトキナーゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｔｈｒＡ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
【００２５】
ｔｈｒＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｔｈｒＡ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してアスパルトキナーゼ活性が増大していることを確認することにより達成できる。アスパルトキナーゼの酵素活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことができる（Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras,G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)）。
【００２６】
また、アスパルトキナーゼ欠損変異株はＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン酸要求性であるので、アスパルトキナーゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン酸を含有しない最少培地上で、またはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｔｈｒＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
ただしE. coli には３種類のアスパルトキナーゼが存在し、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子も３種類存在する。そこで、目的とするｔｈｒＡ遺伝子が単離されたかどうかを確認するためには、その塩基配列あるいは制限酵素切断パターンを解析し、確認することが好ましい。なお、E. coli のｔｈｒＡ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（Katinka,M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 5730 (1980)）。
【００２８】
そして、上記菌株より、ｔｈｒＡ遺伝子を含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡを、例えば P. Guerryらの方法（J. Bacteriol., 116, 1064, (1973)) 、D. B. Clewell の方法（J. Bacteriol., 110, 667, (1972))などにより単離することができる。
【００２９】
ｔｈｒＡＢＣオペロン全長を単離するには、ｔｈｒＡＢＣオペロン全長を含む組換えＤＮＡを保持する形質転換体を染色体ＤＮＡライブラリーの中から再度選択する必要がある。すなわち、得られたｔｈｒＡ遺伝子をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法による選択を行う。コロニーハイブリダイゼーション法は常法に従う（Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989) ）。
【００３０】
ｔｈｒＡＢＣオペロン全長が単離されたかどうかを確認するには、単離された候補ＤＮＡをｔｈｒＢ遺伝子を欠損した株に導入して、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損が回復することを確認し、さらに単離された候補ＤＮＡをｔｈｒＣ遺伝子を欠損した株に導入して、ｔｈｒＣ遺伝子の欠損が回復することを確認すれば良い。ｔｈｒＢ遺伝子を欠損する株としては E. coli YA73 株（thrB1000, thi-1, relA1, λー, spoT1）がある。ｔｈｒＣ遺伝子を欠損する株としては E. coli Gif41株（thrC1001, thi-1, relA1, λー, spoT1）がある。なお、E. coli YA73株と E. coli Gif41株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。
【００３１】
これ以外にｔｈｒＡＢＣオペロン全長が単離されたかどうかを確認するには、単離された候補ＤＮＡの塩基配列あるいは制限酵素切断パターンを解析し確認する。なお、E. coli のｔｈｒＢ遺伝子の塩基配列はすでに報告されており（Cossart, P et al., Nucleic Acids Res., 9, 339 (1981)) 、E. coli のｔｈｒＣ遺伝子の塩基配列もすでに報告されている（Parsot, C et al., Nucleic Acids Res., 11, 7331 (1983) ）。
【００３２】
野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンの取得は、染色体上に野生型ｔｈｒＡＢＣオペロンを有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White, T.J. et al; Trends Genet. 5, 185 (1989) 参照）により、ｔｈｒＡＢＣオペロンを増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ｔｈｒＡＢＣオペロンの全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ｔｈｒＡＢＣオペロンの一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ｔｈｒＡＢＣオペロンの全領域を増幅した場合には、増幅されたｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによってｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡ断片を回収できる。
【００３３】
ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. coli において既知となっている配列を基にして適宜作成すればよい。E. coli のｔｈｒＡ遺伝子の塩基配列はKatinka, M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 5730 (1980) に報告されており、E. coli のｔｈｒＢ遺伝子の塩基配列は  Cossart, P et al., Nucleic Acids Res., 9, 339 (1981)に報告されており、E. coli のｔｈｒＣ遺伝子の塩基配列はParsot, C et al., Nucleic Acids Res., 11, 7331 (1983) に報告されている。
【００３４】
プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380B 等）を用いて合成することができる。また、ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ反応装置（パーキンエルマー社製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000 型等）を使用し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３５】
ＰＣＲ法により増幅されたｔｈｒＡＢＣオペロンは、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ｔｈｒＡ遺伝子への変異の導入などの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらにｔｈｒＡＢＣオペロンの存在の確認方法は上述した方法と同じである。
【００３６】
（２）ｔｈｒＡＢＣオペロンへの変異の導入
上記のようにして得られたｔｈｒＡＢＣオペロンに、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R., 61, PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989))）、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits,H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et.al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。
【００３７】
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
さらに、染色体もしくはプラスミド上のｔｈｒＡＢＣオペロンを直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1039(1984))がある。また、ｔｈｒＡＢＣオペロンを保有するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法または N−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００３８】
解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンの選択方法としては、まずｔｈｒＡＢＣオペロンを含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変異処理し、これで例えば、E. coli Gif106M1株を形質転換する。次にＬ−スレオニンのアンタゴニスト、例えばα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）を含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野生型のｔｈｒＡＢＣオペロンを含有する組換えＤＮＡを保持する株は、その組換えＤＮＡにより発現されるＡＫＩ−ＨＤＩがＡＨＶにより阻害されるために、Ｌ−ホモセリン及びジアミノピメリン酸(DAP) の合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、Ｌ−スレオニンによる阻害の解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンを含有する組換えＤＮＡを保持する株は、同組換えＤＮＡ中のｔｈｒＡ遺伝子にコードされる解除型ＡＫＩ−ＨＤＩがＡＨＶによる阻害を受けないので、ＡＨＶが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、ＡＨＶに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された解除型ｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンを含有する組換えＤＮＡを保持する株を選択することができる。
【００３９】
こうして得られた該解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを、組換えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫＩ−ＨＤＩを保有し、ｔｈｒＡＢＣオペロンにコードされるＬ−スレオニン生合成系の酵素群の発現が増強された微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えばエシェリヒア・コリ（E. coli)があげられる。
【００４０】
また、組換えＤＮＡから解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19 、pUC18 、pBR322、pHSG299 、pHSG298 、pHSG399 、pHSG398 、RSF1010 、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４１】
さらに、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンの発現を効率的に実施するために、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンの上流に位置する転写制御領域（オペレーターあるいはアテニュエーター）を除去しても良い。あるいは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ｔｈｒＡＢＣオペロン固有のプロモーターを増幅して用いてもよい。
【００４２】
また、上記のように、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのような染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、ｔｈｒＡＢＣオペロンを、トランスダクション、トランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００４３】
＜２．Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン＞
Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、すなわち解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、含まれるｉｌｖＡ遺伝子が変異を有する点で野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンと相違する。この変異とは、ｉｌｖＡ遺伝子がコードするＴＤに対するＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除される変異を意味する。
【００４４】
Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、すなわち完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに加えてアテニュエーションが起こらないように変異が導入されている点で野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンあるいは解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンと相違する。この変異とは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部、一部または近傍部分を除去するものの他に、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するものも含まれる。
【００４５】
解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取得する方法は以下の通りである。まず、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで解除型ＴＤを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保持している。また、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで解除型ＴＤを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保持している。
【００４６】
野生型ＴＤを生産する微生物を変異処理し、解除型ＴＤを生産する変異株を創成した後、該変異株から解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取得してもよい。もしくは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが連結されている組換えＤＮＡが導入されている形質転換体を変異処理し、変異型ＴＤを生産する変異株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれば、同ＤＮＡ上に解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが創成されることがある。
【００４７】
ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4 −ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射または N−メチル−N'−ニトロ−N −ニトロソグアニジン（NTG)等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にエシェリヒア・コリ（E. coli)由来のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンがあげられる。
【００４８】
エシェリヒア属細菌由来のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを利用する場合、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡの供与菌としては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C. et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1) にあげられるものが利用できる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡが取得できる。
【００４９】
ただし、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのＤＮＡ供与菌として E. coliを用いる場合、K12 野生株はｉｌｖＧ遺伝子がフレームシフト変異をもっているために活性のあるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムII（ＡＨＡＳII）が発現していない（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 922, 1981）。従って K12株をＤＮＡ供与菌とする場合には、ｉｌｖＧ遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸シンターゼIIの活性が回復するようにフレームが戻った変異株を調製してから同変異株をＤＮＡ供与菌として用いる必要がある。あるいは K12株由来の株以外の E. coliをＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＧ遺伝子のみを単離し、これを K12株由来のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに導入してもよい。すなわち、 K12株をＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＭＥＤＡ部分を単離し、 K12株由来の株以外の E. coliをＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＧ遺伝子のみを単離し、両者を連結して完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとする。なお、アセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムII（ＡＨＡＳII）は大小２つのサブユニットにより構成されており、大サブユニットはｉｌｖＧ遺伝子にコードされている。小サブユニットはｉｌｖＭ遺伝子にコードされている。
【００５０】
完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取得する方法は以下の通りである。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーターの位置および塩基配列はR. P. Lawther らによって報告されている（Nucleic Acids Res.15, 2137 (1987))。解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーターが完全に除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することにより完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる。
【００５１】
配列表の配列番号１として記載した塩基配列はアテニュエーションに必要な領域を開示している。999 番目から1007番目にいたるＤＮＡ配列はリーダーペプチド内に存在するバリン残基の連続部分をコードし、1008番目から1016番目にいたるＤＮＡ配列はリーダーペプチド内に存在するイソロイシン残基の連続部分をコードする。1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列はアテニュエーター内にあるロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成する部分をコードする。
【００５２】
細胞内にＬ−イソロイシンが十分量存在すると、1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列より転写されるＲＮＡによりロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループが形成されるためＲＮＡポリメラーゼによる転写が終結してｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは発現しない。
【００５３】
細胞内にＬ−イソロイシンが不足すると細胞内にイソロイシンが結合したｔＲＮＡが不足し、リーダーペプチドをコードする領域内に存在するイソロイシン残基の連続部分でリボゾームによる翻訳が停滞する。このため、ｍＲＮＡが新たな立体構造を形成するようになって、結果として1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列より転写されるＲＮＡにより形成されていたロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループが形成されなくなる。このためＲＮＡポリメラーゼによる転写が続行してｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは発現する。
したがって、アテニュエーションに必要な領域を除去するためには、配列表の配列番号１に開示される配列の1008番目から1016番目にいたるＤＮＡ配列、または1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列を除去すれば良い。
【００５４】
ところで、アテニュエーションに必要な領域を除去するとは、アテニュエーションが起こらないように変異が導入されていることを意味する。したがって同変異はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部を除去するものだけに限定されない。要するに、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成できなくなる変異であってもよい。リーダーペプチド内にイソロイシン残基の連続部分が含まれないようにする変異であってもよい。いずれの場合もアテニュエーションは機能しなくなるからである。
【００５５】
すなわち、この変異とはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部、一部または近傍部分を除去するものの他に、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するものも含まれる。
【００５６】
なお、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、すなわち完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに変異を導入してアテニュエーションが起こらないようにした後で、同ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに含まれるｉｌｖＡ遺伝子に変異を導入し、同ｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼに対するＬ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたものとなるようにしても調製できる。
【００５７】
（１）野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡを取得するには、ｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｉｌｖＤ遺伝子及びｉｌｖＡ遺伝子をおのおの取得し、これらを連結する方法が考えられる。
【００５８】
まず、野生型のＴＤをもつE. coli 例えば、E. coli K12 株、E. coli W3110 株、E. coli MC1061株（以上の３株はｉｌｖＧがフレームシフトを起こしている）、E. coli MI162 株（thr-10, car-94, λ-, relA1, ilvG603, thi-1）、E. coli B 株（以上の２株は正常なｉｌｖＧを有している）を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、又は肉エキスに塩化ナトリウム（NaCl）を加えた培地が用いられる。具体的にはＬ−ｂｒｏｔｈ（バクト・トリプトン１％、バクト・イースト・エキストラクト０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ブドウ糖０．１％、ｐＨ＝７．２）である。なお、培地の初発ｐＨは、６〜８に調整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気かく拌深部培養、振とう培養または静置培養等により行う。なお、E. coli MI162 株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC5919である。同株の詳しい性質は、Mol. Gen. Genet. 143, 243 (1976), J. Bacteriol., 149, 294 (1982)に記載されている。
【００５９】
このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli の菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963))、K. S. Kirby の方法（Biochem. J., 64, 405 (1956))等の方法により染色体ＤＮＡを得ることができる。
【００６０】
こうして得られた染色体ＤＮＡからｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００６１】
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００６２】
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば E. coli MI262株（leuB6, ilvI614, ilvH612,λ-, relA1, spoT1, ilvB619, ilvG603, ilvG605(am), thi-1 ）のようなアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株、E. coli AB2070株（proA2, trp-3, hisG4, ilvE12, metE46, thi-1, ara-9, lacY1 or lacZ4, galK2, malA1, mtl-1, rpsL8 or rpsL9, ton-1, tsx-3, λR,λ-, supE44)のようなトランスアミナーゼＢ欠損変異株、あるいは E. coli AB1280 株（hisG1, ilvD16, metB1, argH1, thi-1, ara-13, lacY1 or lacZ4, gal-6, xyl-7, mtl-2, malA1, rpsL8,9 or 17, tonA2, λR,λ-, supE44)のようなジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株、E. coli AB1255株（thi-1, ilvA201, argH1, metB1, hisG1, lacY1 or lacZ4, malA1, mtl-2, xyl-7, ara-13, gal-6, rpsL8,9 or 17, tonA2, tsx-5, λR,λ-, supE44)のようなスレオニンデアミナーゼ欠損変異株、を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979)あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) 等により行うことができる。なお、E. coli MI262 株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC5769である。同株の詳しい性質は、Mol. Gen. Genet.,156,1(1977)に記載されている。E. coli AB2070株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC2070である。同株の詳しい性質は、J. Bacteriol., 109, 730 (1972)に記載されている。E. coli AB1280株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC1280である。E. coli AB1255株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC1255である。同株の詳しい性質は、J. Bacteriol., 109, 730 (1972)に記載されている。
【００６３】
ところで、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列は明らかにされている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）ので、特定の制限酵素を選んで染色体ＤＮＡを消化することにより、目的とする遺伝子が存在するＤＮＡ断片を特定の長さのものとすることができる。この特定の長さを有するＤＮＡ断片だけをベクターＤＮＡに連結して組換えＤＮＡを作成し、この組換えＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作成する方が、より効率よく目的とする遺伝子が存在するＤＮＡ断片を取得することができる。
【００６４】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が増大した株あるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、トランスアミナーゼＢ活性が増大した株あるいはトランスアミナーゼＢ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＥ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
【００６５】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が増大した株あるいはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＤ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
【００６６】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、スレオニンデアミナーゼ活性が増大した株あるいはスレオニンデアミナーゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＡ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
【００６７】
ｉｌｖＧＭ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＧＭ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が増大していることを確認することにより達成できる。アセトヒドロキシ酸シンターゼの酵素活性測定法は、M. D. Feliceらの方法により行うことができる（Methods in Enzymology 166, 241）。
【００６８】
また、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株はイソロイシン、ロイシン及びバリン要求性であるので、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、バリンを含有しない最少培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００６９】
あるいは、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）。そこで候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
【００７０】
上述した通り、E. coli K12 株のｉｌｖＧ遺伝子のオープン・リーディング・フレーム内部には変異が生じている。その結果フレームシフトが起き、さらに途中に終始コドンが出現するために翻訳が終了してしまう。すなわち、ｉｌｖＧ遺伝子の開始コドンのATG （１〜３番目）から数えて982 〜984 番目に終始コドンが出現している。したがって、同株より取得したｉｌｖＧＭ遺伝子を用いる場合には、サイト・ダイレクティッド・ミュータジェネシス法により変異部分を正常に戻す必要がある。たとえばエシェリヒア・コリＭＩ１６２株のｉｌｖＧ遺伝子（ilvG603)では、982 〜984 番目にある終始コドンTGA の前に、TGの２塩基対が挿入されて、フレームが正常に戻っている。その他については J. Bacteriol. 149, 294 (1982)の Fig. 2 に詳しく記載されている。
【００７１】
ｉｌｖＥ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＥ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認する方法は以下の通りである。トランスアミナーゼＢ欠損変異株はイソロイシン要求性であるので、トランスアミナーゼＢ欠損変異株を宿主に用いた場合は、イソロイシンを含有しない最少培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＥ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００７２】
あるいは、ｉｌｖＥ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
【００７３】
ｉｌｖＤ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＤ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認する方法は以下の通りである。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株はイソロイシン、ロイシン、バリン要求性であるので、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、バリンを含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００７４】
あるいは、ｉｌｖＤ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
【００７５】
ｉｌｖＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＡ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してスレオニンデアミナーゼ活性が増大していることを確認することにより達成できる。スレオニンデアミナーゼの酵素活性測定法は、Methods in Enzymology 17B, 555 (1971) に記載されている。
【００７６】
また、スレオニンデアミナーゼ欠損変異株はイソロイシン要求性であるので、スレオニンデアミナーゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、イソロイシンを含有しない最少培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００７７】
あるいは、ｉｌｖＡ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
上記菌株おのおのより、組換えＤＮＡを、例えば P. Guerryらの方法（J. Bacteriol., 116, 1064 (1973))、D. B. Clewell の方法（J. Bacteriol., 110, 667 (1972)) などにより単離することができる。
【００７８】
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全長を単離するには、ｉｌｖＧＭ遺伝子を有するＤＮＡ断片、ｉｌｖＥ遺伝子を有するＤＮＡ断片、ｉｌｖＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片、及びｉｌｖＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を連結する。連結するときには、R. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全塩基配列を参考にできる。
【００７９】
野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得は、染色体上に野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White, T.J. et al; Trends Genet. 5, 185 (1989) 参照）により、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全領域を増幅した場合には、増幅されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによってｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡ断片を回収できる。
ＤＮＡプライマーを作成するには、R. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）E. coli のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全塩基配列を参考にできる。
【００８０】
プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380B 等）を用いて合成することができる。また、ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ反応装置（パーキンエルマー社製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000 型等）を使用し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００８１】
ＰＣＲ法により増幅されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ｉｌｖＡ遺伝子への変異の導入操作およびアテニュエーションに必要な領域の除去操作等がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらにｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの存在の確認方法は上述した方法と同じである。
【００８２】
（２）ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンへの変異の導入
上記のようにして得られたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi, R., 61, PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)) ）、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et.al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987) ）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
【００８３】
さらに、染色体もしくはプラスミド上のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1039(1984))がある。また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保有するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００８４】
解除型ｉｌｖＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片の選択方法は以下の通りである。まずｉｌｖＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変異処理し、これで例えば E. coli W3110株を形質転換する。次にＬ−イソロイシンのアンタゴニスト、例えば適当量のグリシル−Ｌ−ロイシンを含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養すると、野生型のｉｌｖＡ遺伝子を有する組換えＤＮＡを保持する株は、Ｌ−イソロイシンの合成が出来なくなり生育が抑えられる場合がある（ベクターに少コピーのものを用いる方がジーン・ドーセージ効果による影響を少なくできるので好ましい）。これに対し、Ｌ−イソロイシンによる阻害の解除されたＴＤをコードするｉｌｖＡ遺伝子を有する組換えＤＮＡを保持する株は、グリシル−Ｌ−ロイシンが存在するときにもＬ−イソロイシンを過剰量合成するので、グリシル−Ｌ−ロイシンが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、グリシルーＬ−ロイシンに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された解除型ｉｌｖＡ遺伝子を有する組換えＤＮＡを保持する株を選択することができる。
【００８５】
こうして得られる解除型ｉｌｖＡ遺伝子を含む解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを、組換えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＴＤを保有し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンにコードされるＬ−イソロイシン生合成系の酵素群の発現が増強された微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えばエシェリヒア・コリ（E. coli)があげられる。
【００８６】
また、組換えＤＮＡから解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19 、pUC18 、pBR322、pHSG299 、pHSG298 、pHSG399 、pHSG398 、RSF1010 、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００８７】
さらに、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの発現を効率的に実施するために、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの上流に位置する転写制御領域（オペレーターあるいはアテニュエーター）を除去しても良い。あるいは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン固有のプロモーターを増幅して用いてもよい。
【００８８】
また、上記のように、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのような染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを、トランスダクション、トランスポゾン（Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００８９】
（３）ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのアテニュエーションに必要な領域の除去
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンからアテニュエーションに必要な領域を除去する、すなわちｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンにアテニュエーションが起こらないような変異を導入するには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部、一部または近傍部分を除去するものの他に、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するものも含まれる。なお、ここで「アテニュエーター」とは、ロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成する塩基配列である。たとえば配列表配列番号１に記載される塩基配列の1081番目から1104番目にいたる部分である。
【００９０】
アテニュエーターを除去するためにはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して両者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21 (1991)）塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
【００９１】
解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーターの一部または近傍部分が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することにより完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる場合がある。アテニュエーターの位置および塩基配列はR. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）ので、この配列を基にして除去するＤＮＡを決定する。
【００９２】
除去するＤＮＡは、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成するために必要なＤＮＡ部分か、同シュテム／ループの上流に位置する連続するイソロイシン残基をコードする領域を含む適当なＤＮＡ部分か、あるいはその両方を含むＤＮＡ部分が好ましい。アテニュエーターの一部または近傍部分を除去するためにはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して両者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21 (1991)）塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
【００９３】
解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片が挿入されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することにより完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる場合がある。アテニュエーターの位置および塩基配列は、R. P. Lawther ら、あるいはG. Coppolaらによってすでに報告されているので、この配列を基にして挿入される新たなＤＮＡ断片の挿入位置および挿入されるＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
【００９４】
挿入される新たなＤＮＡ断片は、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成するために必要なＤＮＡ部分か、あるいは同シュテム／ループの上流に位置する連続するイソロイシン残基をコードするＤＮＡ部分に挿入されることが好ましい。挿入の結果、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成できなくなることがあり、このためアテニュエーターが機能しなくなることが期待されるからである。
【００９５】
挿入される新たなＤＮＡ断片の塩基配列は、挿入されたときにアテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成しないように設計され、挿入されたときに同シュテム／ループの上流に連続するイソロイシン残基が位置しないように設計されることが好ましい。
【００９６】
アテニュエーターの内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するためには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して、さらに挿入される新たなＤＮＡ断片を調製して３者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawther らによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1987)）塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21 (1991)）塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
【００９７】
挿入される新たなＤＮＡ断片は化学合成によって調製できる。
【００９８】
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片、あるいはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅する際に、プライマーＤＮＡに挿入される新たなＤＮＡ断片を連結しておくこともできる。例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を増幅するために用いる３’側ＤＮＡプライマーに、挿入される新たなＤＮＡ断片の片方の鎖を連結する。同様にしてｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を増幅するために用いる５’側ＤＮＡプライマーに、挿入される新たなＤＮＡ断片の相補鎖を連結する。これらのプライマーを用いて増幅される２種のＤＮＡ断片を連結する。
【００９９】
こうして得られた該完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを、組換えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＴＤを保有し、アテニュエーションが生じないためにｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンにコードされるＬ−イソロイシン生合成系の酵素群の発現が一層増強された微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えばエシェリヒア・コリ（E. coli)があげられる。
【０１００】
また、組換えＤＮＡから完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19 、pUC18 、pBR322、pHSG299 、pHSG298 、pHSG399 、pHSG398 、RSF1010 、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【０１０１】
さらに、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの発現を効率的に実施するために、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの上流にｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン固有のプロモーターを増幅して用いてもよい。
【０１０２】
また、上記のように、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのような染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを、トランスダクション、トランスポゾン（Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【０１０３】
ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（lysC) を含有するＤＮＡの供与菌としては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるものを用いてもかまわない。具体的には、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C. et,al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, Table 1)にあげられるものが利用できる。たとえば、E. coli JM109 株や、MG1061株などがあげられる。
【０１０４】
ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（lysC) を含有するＤＮＡの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＡＫＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡが取得できる。この遺伝子に変異を導入してＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫＩＩＩ遺伝子（lysC* ) を得るには、ＤＮＡを直接ヒドロキシルアミンで処理するin vitro変異処理法を採用すればよい。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4 −ヒドロキシシトシンに変えることによりＣ→Ｔの変異を起こす化学変異処理剤である。
また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡを取得するには、ＡＫＩＩＩ活性に対するＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異株をＤＮＡ供与菌に用いることによって取得することができる。該変異株は、例えば、通常の変異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を施した変異株の細胞群の中から取得することができる。
【０１０５】
次に、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（lysC) を含有するＤＮＡの調製について述べる。
まず、野生型のlysCをもつE. coli 、例えばMC1061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、液体培養法を採用して培養するのが集菌効率の見地から好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、７〜８に調整するのが適当である。また、培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通常攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により行う。このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli MC1061株の菌体を得る。
この菌体より、例えば斉藤らの方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619,(1963))、K. S. Kirby の方法(Biochem. J., 64, 405,(1956)) 等の方法により染色体ＤＮＡを得ることができる。
【０１０６】
lysC遺伝子を単離する方法は、上記方法により得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。ついで、エシェリヒア属細菌細胞内で増殖し得るベクターＤＮＡを接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア属の微生物のアスパルトキナーゼＩ、II、III 全欠損変異株、例えばＧＴ３を形質転換せしめ（遺伝子ライブラリー）、リジンを含有しない最少培地上生育可能となった菌株を単離し、これよりlysC遺伝子の組換えＤＮＡを分離できる。
【０１０７】
具体的には、染色体ＤＮＡを制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素温度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）作用させて消化し、部分分解して種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。エシェリヒア属細菌細胞内で増殖し得るベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤＮＡを得る。次いで、上記のようにして得たE. coli MC1061株由来で、lysC遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【０１０８】
本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、プスラミドベクターＤＮＡが好ましく、例えば pUC19、 pUC18、 pBR322 、pHSG299 、pHSG399 、RSF1010 等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。目的有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを用いてもよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有用遺伝子をトランスポゾン（Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いた方法で染色体に組み込んだものも含まれる。
【０１０９】
この組換えＤＮＡを用いて、例えば大腸菌 K-12 株、好ましくは GT3株等を形質転換して、ＡＫ活性が増大した株あるいは栄養要求性が相補された株より lysC 遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。この形質転換は、 D.M.Morrison の方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979 ）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J.Mol. Biol.,  53, 159 (1970)) により行うことができる。そして、上記菌株より、lysC遺伝子を含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡを、例えば P. Guerryらの方法(J. Bacteriol., 116, 1064, (1973))、D.B. Clewellの方法(J. Bacteriol., 110, 667, (1972)) などにより単離することができる。
【０１１０】
候補株が、実際に lysC がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、細胞抽出液を調製し、そこより粗酵素液を調製してアスパルトキナーゼ活性を確認することにより達成できる。アスパルトキナーゼの酵素活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことができる（Stadtman, E.R., Cohen, G. N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem.,  236,2033(1961))。
【０１１１】
あるいは、 lysC 遺伝子の取得は、前記斎藤らの方法等により取得された染色体ＤＮＡよりPCR (polymerase chain reaction; White, T. J. et al; Trends Genet., 5, 185 (1989)参照) によりlysC遺伝子を増幅することによっても行える。増幅に用いるＤＮＡプライマーは、lysC遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両3 ′末端に相補するものを用いる。lysC遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子ライブラリーよりスクリーニングする必要がある。全領域を増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のバンドを切り出すことによってlysC遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
【０１１２】
ＤＮＡプライマーとしては、例えば、E. coti において既知となっている配列(Cassan,M., Parsot, C., Cohen, G.N., and Patte, J.C., J. Biol. Chem.,  261, 1052(1986)) を基にして適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする 1347base の領域を増巾できる、 5′-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3 ′（後掲配列表の配列番号６）および 5′-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3 ′（後掲配列表の配列番号７）の２種のプライマーが適当である。ＤＮＡの合成は、Applied Biosystems社製「ＤＮＡ合成機  model 3808」を使用し、ホスホアミダイド法を用いて（Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981) 参照）常法に従って行なうことができる。PCR 反応は、宝酒造社製「DNA サーマルサイクラーPJ2000型」を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【０１１３】
PCR 法により増幅されたlysC遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内において増殖し得るベクターＤＮＡに接続され、エシェリヒア属細菌細胞に導入される。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらにlysCの確認方法は上述した方法と同じである。
得られたlysCにアミノ酸置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi, R., 61, PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton Press (1989)) 、部位特異的変異法(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)) およびKunkel, T.A. et.al., Meth. in Enzymol.,  154, 367 (1987)) などがある。これらの方法を用いる場合には目的部位に目的の変異を起こすことができる。さらに、染色体もしくはプラスミド上の目的遺伝子ＤＮＡを直接ヒドロキシルアミン処理する方法(Hashimoto, T. and  Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)) または該ＤＮＡを保有する菌体を紫外線照射法もしくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学薬剤処理による常法、目的遺伝子を化学合成する方法等を用いればランダムに変異を導入できる。
【０１１４】
阻害解除型変異遺伝子lysC *の取得方法としては、まず変異処理した組換えＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E.coli GT3 株に形質転換する。次に著量のリジンを含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野性型のlysCを持つプラスミドを保持する株は唯一のＡＫがリジンにより阻害されるために、スレオニン、イソロイシン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸(DAP) の合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、リジンによる阻害の解除されたlysC *  を持つプラスミド保持株は著量のリジンが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、リジンあるいはリジンのアナログであるＳ−２−アミノエチルシステイン(AEC) に耐性となっている株、すなわち阻害の解除されたlysC *を持つプラスミド保持株を選択することができる。
【０１１５】
こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫを保有する微生物を取得できる。
スレオニンを生産するために、取得されたlysC遺伝子あるいは変異型lysC遺伝子 (lysC * )が導入され増幅される宿主としては、上記したエシャリヒア属細菌の野性株があげられるが、これ以外にも、ここで構築した組換えベクターＤＮＡの複製起点と lysC 遺伝子あるいは変異型 lysC 遺伝子 (lysC * )が機能し、組換えベクターＤＮＡが複製可能でかつ lysC 遺伝子あるいは変異型 lysC 遺伝子 (lysC * )の増強が可能な菌なら、全て宿主として利用できる。最も好ましい宿主は、E.coli B-3996 株である。
【０１１６】
＜３．本発明によるＬ−イソロイシンの製造＞
上記のようにして得られる解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを導入することによって形質転換され、さらに解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保持するエシェリヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−イソロイシンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−イソロイシンを採取することにより、Ｌ−イソロイシンを効率よく製造することができる。すなわち、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンと解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをともにエシェリヒア属細菌に保持させることによって、Ｌ−イソロイシンを効率よく製造させることができる。
【０１１７】
さらには、上記のようにして得られる解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを導入することによって形質転換され、さらに完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保持するエシェリヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−イソロイシンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−イソロイシンを採取することにより、Ｌ−イソロイシンを一層効率よく製造することができる。すなわち、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンと完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをともにエシェリヒア属細菌に保持させることによって、Ｌ−イソロイシンをさらに効率よく製造させることができる。
【０１１８】
解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを保持するエシェリヒア属細菌としては、解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含むＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌、または該ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞内に導入されることによって形質転換されたエシェリヒア属細菌等が挙げられる。
【０１１９】
一方、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって形質転換するには、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで形質転換してもよく、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に導入することによって形質転換してもよい。
【０１２０】
さらに、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって形質転換するには、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで形質転換してもよく、完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に導入することによって形質転換してもよい。
【０１２１】
解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンおよび解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの両方、または解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンおよび完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの両方をエシェリヒア属細菌に導入する場合には、両方のオペロンがエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上に組み込まれて保持されていても、細胞内で単一または別々のプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして保持されていてもよい。さらに、各々のオペロンの一方が染色体ＤＮＡ上に組み込まれて保持され、もう一方のオペロンが細胞内でプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして保持されていてもよい。解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンと、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンまたは完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを、別々のプラスミドの形でエシェリヒア属細菌に持たせる場合には、２種のプラスミドが不和合性を示さないよう、異なる種類の複製起点を有することが好ましい。
【０１２２】
解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含むＤＮＡおよび解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入するに際しては、両ＤＮＡの導入の順序は問わない。
解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンを含むＤＮＡおよび完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入するに際しては、両ＤＮＡの導入の順序は問わない。
【０１２３】
宿主として用いるエシェリヒア属細菌としては、その細胞内で解除型ｔｈｒＡＢＣオペロン、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンおよび完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのプロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他のプロモーターが機能し、さらに同オペロンのいずれかをプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合には、導入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細胞内で機能して複製可能なものであれば利用できる。解除型ｔｈｒＡＢＣオペロンと、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンまたは完全解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを、別々のプラスミドの形でエシェリヒア属細菌に持たせる場合には、２種のプラスミドの複製起点がともに機能する必要がある。
【０１２４】
本発明による微生物によるＬ−イソロイシンの生産は、通常の微生物培養方法にて実施可能である。
使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。
【０１２５】
炭素源としては、グルコースをはじめとする各種炭水化物、ピルビン酸をはじめとする各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。
窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種酸のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。
無機物としては、燐酸第一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【０１２６】
培養は、振とう培養、通気かくはん培養等の好気的条件下で行われ、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整する。
通常１〜３日の培養によって、培養液中にＬ−イソロイシンが蓄積する。
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によってＬ−イソロイシンを回収することが出来る。
【０１２７】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１  ｐＭＷＤ５の構築）
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株より、染色体ＤＮＡを抽出した。該染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断した。ｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片は４．８ｋｂの長さであることが判明している。そこで４．８ｋｂ前後の長さを有するＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と、宝酒造社より購入したプラスミドベクターｐＢＲ３２２をＨｉｎｄIII で切断して得られるＤＮＡ断片とを連結した。得られたＤＮＡ混合物をアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株であるエシェリヒア・コリＭＩ２６２株に導入した。形質転換されてアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損の形質が相補された株を選択し、その株が保有するプラスミドを単離した。同プラスミドの構造を解析した結果、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII 部位にｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．８ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。同プラスミドをｐＢＲＧＭ７と命名した。
【０１２８】
Gene 97, 21, (1991) 、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号２と配列番号３に記載した合成オリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。両ＤＮＡをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号１に記載される塩基配列のうち２５番目から９５２番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ａ）とする。
【０１２９】
同様にして、Gene 97, 21, (1991) 、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号４と配列番号５に記載した合成オリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。両ＤＮＡをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号１に記載される塩基配列のうち1161番目から2421番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ｂ）とする。
【０１３０】
断片（Ａ）をＳｍａＩで消化して得られる大断片と、ｐＵＣ１８（宝酒造）をＳｍａＩで消化して得られるＤＮＡ断片とを連結してプラスミドｐＵＣＡを作成した。断片（Ｂ）をＫｐｎＩで消化して得られる大断片と、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造）をＨｉｎｃＩＩ及びＫｐｎＩで消化して得られる大断片とを連結してプラスミドｐＨＳＧＢを作成した。
【０１３１】
プラスミドｐＵＣＡをＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ａ）を含むＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＨＳＧＢをＨｉｎｄIII で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ｂ）を含むＤＮＡ断片を単離した。両ＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＨＳＧＳＫを作成した。
【０１３２】
ｐＨＳＧＳＫに搭載される、断片（Ａ）及び断片（Ｂ）に由来するＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片を断片（Ｃ）と命名した。断片（Ｃ）は、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．８ｋｂのＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII 断片をＳｍａＩとＫｐｎＩで切断して得られる断片に相当し、プロモーター、ＳＤ配列及びｉｌｖＧ遺伝子上流域を含むが、リーダー配列からアテニュエーター領域に至る配列約０．２ｋｂを欠いている。以上、ｐＨＳＧＳＫを構築する手順を図１にまとめた。
【０１３３】
プラスミドｐＨＳＧＳＫをＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより断片（Ｃ）を得、プラスミドｐＢＲＧＭ７をＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより大ＤＮＡ断片を得、両者を連結した。得られたプラスミドをｐｄＧＭ１と命名した。ｐｄＧＭ１に搭載される、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．６ｋｂのＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII 断片は、アテニュエーションに必要な領域を欠いている。アテニュエーションに必要な領域を欠いたｉｌｖＧＭ遺伝子を、本実施例及び図面において「△ａｔｔＧＭ」と表現する。以上、ｐｄＧＭ１を構築する手順を図２にまとめた。
【０１３４】
特開平２−４５８号公報に記載されているプラスミドｐＤＲＩＡ４は、エシェリヒア属細菌で自律複製可能でありかつブレビバクテリウム属細菌で自律複製可能なシャトルベクターｐＤＲ１１２０と、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とが結合されて調製される。なお同ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片は、特開平２−４５８号公報では、２．３ｋｂと記載されているが、現在では２．７５ｋｂであることが判明している。プラスミドｐＤＲＩＡ４はブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０８７）あるいはブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０８８）の染色体ＤＮＡ外に存在する。これらの株から常法によりプラスミドｐＤＲＩＡ４を調製できる。
【０１３５】
プラスミドｐＤＲＩＡ４上のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ  ２．３ｋｂのＤＮＡ断片中、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製し、ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで切断して得られるＤＮＡ断片と連結した。こうして作製されたプラスミドをｐＭＷＡ１と命名した。Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を、本実施例及び図面において「Ａ＊」と表現することがある。
【０１３６】
プラスミドｐＭＷＡ１をＨｉｎｄIII で切断して得られるＤＮＡ断片と、プラスミドｐｄＧＭ１をＨｉｎｄIII で切断して得られるｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結した。プラスミド上に存在する制限酵素認識部位の位置を解析することによって、ｉｌｖＧＭ遺伝子の転写方向とｉｌｖＡ遺伝子の転写方向とが同方向となったものを選択し、これをプラスミドｐＭＷＧＭＡ２と命名した。以上、ｐＭＷＧＭＡ２を構築する手順を図３にまとめた。
【０１３７】
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを調製し、これをＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ベクターｐＵＣ１９（宝酒造社）をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片を調製した。ＤＮＡ断片混合物とｐＵＣ１９が切断されて得られるＤＮＡ断片とを連結し、ＤＮＡ混合物を得た。このＤＮＡ混合物を、トランスアミナーゼＢ欠損株であるＡＢ２０７０株に導入し、形質転換されて分岐鎖アミノ酸要求性が回復した株を選択した。この株よりプラスミドを調製したところ、プラスミドｐＵＣ１９がＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断して得られるＤＮＡ断片と、ｉｌｖＥ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片が連結されていた。このプラスミドをｐＵＣＥ１と命名した。
【０１３８】
ｐＭＷＧＭＡ２をＨｉｎｄIII で部分消化してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ｐＵＣＥ１をＨｉｎｄIII で切断しｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を調製した。両者を連結して得られるＤＮＡ混合物を用いてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ遺伝子産物）欠損株ＡＢ１２８０株を形質転換し、形質転換された株のうち分岐鎖アミノ酸要求性が消失したものを選択した。同形質転換株から、プラスミドを調製したところ、ｐＭＷＧＭＡ２が△ａｔｔＧＭとＡ＊との間に存在するＨｉｎｄIII 部位でのみ切断されて得られるＤＮＡ断片と、ｐＵＣＥ１に由来するｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片が連結されており、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが再生されていた。こうして得られるプラスミドをｐＭＷＤ５と命名した。以上、ｐＭＷＤ５を構築する手順を図４にまとめた。
【０１３９】
以上の様にして得られたプラスミドｐＭＷＤ５は、ｐＭＷ１１９をベクターとしており、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたＴＤをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載したプラスミドである。
【０１４０】
（実施例２  Ｌ−イソロイシン生産菌株の造成）
実施例１で得られたプラスミドｐＭＷＤ５を、特表平３−５０１６８２号公報及びＵＳＰ５，１７５，１０７に記載されるＬ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリＢ−３９９６株に、常法である塩化ルビジウム法により、導入した。ｐＭＷＤ５により形質転換された株のうち、ストレプトマイシン 100μg/mlとアンピシリン 100μg/mlに同時に耐性となった形質転換株を選択した。得られた形質転換株をＡＪ１２９１９株と命名した。
【０１４１】
Ｌ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリＢ−３９９６株は、旧USSRアンチバイオティクス・リサーチ・インスティチュート(the USSR Antibiotics Research Institute) に登録番号１８６７のもとに寄託されている。Ｂ−３９９６株の宿主菌はエシェリヒア・コリＴＤＨ−６株であり、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、サッカロース資化性を有し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼを欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有している。そしてＢ−３９９６株は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンが広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０由来のベクターに搭載されて得られるプラスミドｐＶＩＣ４０を保持している。従って、プラスミドｐＶＩＣ４０とプラスミドｐＮＷＤ５とを保持するエシェリヒア・コリＡＪ１２９１９株は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたＴＤをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミドベクターによって保持する株である。
【０１４２】
（実施例３  ＡＪ１２９１９株によるＬ−イソロイシン生産試験（１））
実施例２で得られたＡＪ１２９１９株のＬ−イソロイシン発酵生産試験を行った。バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１．５％、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌからなる組成の培地にＡＪ１２９１９株を塗布し、３７℃で１８ないし２４時間培養後、その一部を白金耳で２０ｍｌの発酵培地（グルコース４％、硫酸アンモニウム１．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸第一鉄７水塩０．００１％、硫酸マンガン５水塩０．００１％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム３％、ｐＨ７．０）に接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。菌体を除去した培養上清中のＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。結果を表１に示す。
【０１４３】
【表１】
菌株  Ｌ−イソロイシン濃度（g/L) Ｌ−スレオニン濃度（g/L ）
ＡＪ１２９１９  １０   ０  
【０１４４】
（実施例４  ＡＪ１２９１９株によるＬ−イソロイシン生産試験（２））
ＡＪ１２９１９株を実施例３と同様の寒天培地にて３７℃、２４時間培養後、実施例３と同様の組成の発酵培地３００ｍｌを含む１リットル容発酵槽に接種し、かくはん数４００ｒｐｍ、通気量３００ｍｌ／ｍｉｎにて３７゜Ｃで１６時間培養して種培養液を得た。得られた種培養液３０ｍｌをグルコース６％、硫酸アンモニウム１．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸第一鉄７水塩０．００１％、硫酸マンガン５水塩０．００１％、酵母エキス０．２％、ｐＨ７．０の組成の発酵培地２５０ｍｌを含む１リットル容発酵槽に接種して、３７℃、通気量３００ｍｌ／ｍｉｎにて、培地中の容存酸素濃度が５％以上となるようにかくはん数を制御しながら、グルコースを適宜供給し、アンモニアガスにてｐＨを７．０付近に維持しつつ、２３時間培養を行った。菌体を除去した培養上清中のＬ−イソロイシン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果、培養上清中のＬ−イソロイシンの蓄積量は３９ｇ／Ｌであった。
【０１４５】
（実施例５  Ｌ−イソロイシン生産菌株の造成（２））
国際公開特許ＷＯ９４／１１５１７号公報には、旧USSRアンチバイオティクス・リサーチ・インスティチュート(the USSR Antibiotics Research Institute）に登録番号１８６７のもとに寄託されているＬ−スレオニン生産菌Ｂ−３９９６株の保持するプラスミドｐＶＩＣ４０と、日本の工業技術院生命工学工業技術研究所に登録番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３１３６（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４６２）のもとに寄託されている、Ｌ−リジンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子搭載プラスミド（ｐＬＬＣ＊８０）とから、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−リジンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子とが広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０由来のベクターに搭載されたプラスミドｐＶＩＣＬＣ＊８０Ａを構築する方法と、該プラスミドｐＶＩＣＬＣ＊８０ＡをＢ−３９９６株の宿主Ｂ−３９９株（ＴＤＨ−６株）に導入したＬ−スレオニン生産菌とが開示されている。
【０１４６】
プラスミドｐＶＩＣＬＣ＊８０ＡをＢ−３９９６株の宿主Ｂ−３９９株（ＴＤＨ−６株）に導入したＬ−スレオニン生産菌に実施例１で得られたプラスミドｐＭＷＤ５を、常法である塩化ルビジウム法により導入した。ｐＭＷＤ５により形質転換された株のうち、ストレプトマイシン100 μg/mlとアンピシリン100 μg/mlに同時に耐性となった形質転換株を選択した。得られた形質転換株をＡＪ１３１００株と命名した。
【０１４７】
ＡＪ１３１００株の宿主菌はエシェリヒア・コリＴＤＨ−６株（Ｂ−３９９株）であり、ｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、サッカロース資化性を有し、５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン存在下で増殖でき、スレオニンデヒドロゲナーゼを欠失し、ｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有している。そしてＡＪ１３１００株は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンとＬ−リジンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子とが広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０由来のベクターに搭載されたプラスミドｐＶＩＣＬＣ＊８０Ａと、実施例１で得られたプラスミドｐＭＷＤ５とを保持している。従って、エシェリヒア・コリＡＪ１３１００株は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩ−ＨＤＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−リジンによる阻害が実質的に解除されたＡＫＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子と、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたＴＤをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとをプラスミドベクターによって保持する株である。
【０１４８】
（実施例６  ＡＪ１３１００株によるＬ−イソロイシン生産試験）
実施例５で得られたＡＪ１３１００株のＬ−イソロイシン発酵生産試験を行った。バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１．５％、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌからなる組成の培地にＡＪ１３１００株を塗布し、３７℃で１８ないし２４時間培養後、その一部を白金耳で２０ｍｌの発酵培地（グルコース４％、硫酸アンモニウム１．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸第一鉄７水塩０．００１％、硫酸マンガン５水塩０．００１％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム３％、ｐＨ７．０）に接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。実施例２で得られたＡＪ１２９１９株も同様に培養した。菌体を除去した培養上清中のＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。結果を表２に示す。
【０１４９】
【表２】
菌株  Ｌ−イソロイシン濃度（g/L) Ｌ−スレオニン濃度（g/L ）
ＡＪ１２９１９            １０                          ０
ＡＪ１３１００  １２       ０            
【０１５０】
【発明の効果】
本願発明であるＬ−イソロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンが複数コピーのプラスミド上に搭載されて増幅されているため、Ｌ−イソロイシンの前駆体物質であるＬ−スレオニンを十分量生合成する。さらに、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが複数コピーのプラスミド上に搭載されて増幅されているため、Ｌ−スレオニンをＬ−イソロイシンに効率よく変換する。
【０１５１】
Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを用いると、ｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｉｌｖＤ遺伝子及びｉｌｖＡ遺伝子に由来するＬ−イソロイシン生合成系の酵素群がバランスよく産生される。転写は本来のプロモーターによって行なわれるので効率よく行なわれる。
【０１５２】
一般には、多コピーのプラスミドを用いてＬ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの遺伝子量を増加するだけで、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの転写レベルのネガティヴ・コントロールは解除され、Ｌ−イソロイシンの生産性は十分改善されるものと思われる。ところが本願発明では、さらにアテニュエーションに必要な領域を除去することにより、意外にもいっそうＬ−イソロイシンの生産性を改善することに成功した。
【０１５３】
【配列表】
0003975470.tif 000002
0003975470.tif 000003
0003975470.tif 000004
0003975470.tif 000005
0003975470.tif 000006
0003975470.tif 000007
【０１５４】
0003975470.tif 000008
【０１５５】
0003975470.tif 000009
【０１５６】
0003975470.tif 000010
【０１５７】
0003975470.tif 000011
【０１５８】
0003975470.tif 000012
【０１５９】
0003975470.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＨＳＧＳＫの構築手順を示す。
図１で用いられている略記号のうち、ＨはＤＮＡ上に存在するＨｉｎｄIII 切断部位を示す。同様にＰはＰｓｔＩ切断部位を、ＫはＫｐｎＩ切断部位を、ＢはＢａｍＨＩ切断部位を、ＸはＸｂａＩ切断部位を、ＳｍはＳｍａＩ切断部位を示す。＆は制限酵素による再切断が不能であることを示す。
Ｐ→はプロモーターを示す。ＳＤはシャイン・ダルガノ配列を示す。ＡＴＧは翻訳開始コドンを示す。ＴＧＡは翻訳終始コドンを示す。
Ａｐは形質転換株にアンピシリン耐性を付与するマーカー遺伝子である。Ｃｍは形質転換株にクロラムフェニコール耐性を付与するマーカー遺伝子である。
【図２】ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのアテニュエーションに必要な領域を除去したｉｌｖＧＭ遺伝子を造成し、プラスミドｐｄＧＭ１を構築する手順を示す。
図２で用いられている略記号は、図１で用いられている略記号と同じ意味のものである。
【図３】プラスミドｐＭＷＧＭＡ２の構築手順を示す。
図３で用いられている略記号は、図１で用いられている略記号と同じ意味のものである。
【図４】プラスミドｐＭＷＤ５の構築手順を示す。
図４で用いられている略記号は、図１で用いられている略記号と同じ意味のものであるが、加えて、ＳはＳａｌＩ切断部位を示す。また、ｐａｒはプラスミドの安定化領域を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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