(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚癌の治療；ヘアロスを除く非悪性皮膚障害の治療；及び急性前骨髄球性白血病以外の悪性細胞発生のインビボ修飾のための医薬組成物であって、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−フェニル−９−ｃｉｓ−レチノイン酸、４−ハイドロキシ−９−ｃｉｓ−レチノイン酸および４−ケト−９−ｃｉｓ−レチノイン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
皮膚癌を治療するための請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
角化障害を治療するための医薬組成物であって、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−フェニル−９−ｃｉｓ−レチノイン酸、４−ハイドロキシ−９−ｃｉｓ−レチノイン酸および４−ケト−９−ｃｉｓ−レチノイン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項４】
毛脂肪構造をコントロールするするための医薬組成物であって、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−フェニル−９−ｃｉｓ−レチノイン酸、４−ハイドロキシ−９−ｃｉｓ−レチノイン酸および４−ケト−９−ｃｉｓ−レチノイン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
ヘアロス以外の非悪性皮膚障害の治療のための請求項１の医薬組成物。
【請求項６】
急性前骨髄球性白血病以外の悪性細胞発生のインビボ修飾のための請求項１の医薬組成物。
【請求項７】
該化合物が１０ｎＭ−２μＭの濃度で循環するのに十分な投与量で含有する請求項１から６のいずれかの医薬組成物。
【請求項８】
該化合物が１００ｎＭ−２００ｎＭの濃度で循環するのに十分な投与量で含有する請求項１から６のいずれかの医薬組成物。
【請求項９】
該化合物が、９−ｃｉｓ−レチノイン酸である請求項１の医薬組成物。
【請求項１０】
該化合物が、９−フェニル−９−ｃｉｓ−レチノイン酸である請求項１の医薬組成物。
【請求項１１】
該化合物が、４−ハイドロキシ−９−ｃｉｓ−レチノイン酸である請求項１の医薬組成物。
【請求項１２】
該化合物が、４−ケト−９−ｃｉｓ−レチノイン酸である請求項１の医薬組成物。
【請求項１３】
経口、静脈内、皮下、筋肉内または皮膚内に投与するための請求項１から１２のいずれかの医薬組成物。
【請求項１４】
クリーム剤、ローション剤、錠剤、分散性粉剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、滅菌水溶液もしくは非水溶液剤、懸濁剤またはエマルジョン剤から選ばれる薬学的に許容し得る担体を含む請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
該担体が、保湿剤、乳化および懸濁剤、分散剤、甘味剤、香味剤または香料剤から選ばれる剤を含む請求項１４の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は細胞内受容体およびそのリガンドに関する。特定の態様においては，本発明はレチノイド受容体によって仲介される過程を修飾する方法に関する。
発明の背景
真核生物の分子生物学における中心的な課題は，依然として，ホルモンまたは成長因子のような外因性インデューサーに応答して特異的遺伝子調節を仲介する分子および機構の解明である。この問題に対する科学的探究の一部として，多くの研究により，特異的な遺伝子調節を仲介できる外因性インデューサーを同定するための努力が払われてきた。
遺伝子調節の詳細についてはなお解明すべき多くの問題が残されてはいるものの，外因性のインデューサーが，細胞内受容体ならびにホルモンレスポンスエレメント（ＨＲＥ）として知られる部分ＤＮＡ配列を包含する細胞内成分とともに働くことにより，遺伝子転写を修飾することが明らかにされている。
ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのさらに他のメンバーが同定されるとともに，このような新たに発見された受容体の外因性インデューサー［すなわち，天然に存在する（または合成の）インデューサー］の探索が，遺伝子調節の詳細についての解明への努力の重要な部分となってきたのである。
ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのレチノイドメンバーは，たとえば，レチノイン酸，レチノール（ビタミンＡ），および広範囲の系において発生および分化に強力な作用を発揮することが見出されている一連の天然および合成の誘導体を包含するレチノイドと呼ばれる化合物に応答する。
レチノイド受容体と相互作用し，それによってレチノイン酸（またはビタミンＡの他の代謝物）に応答する遺伝子の転写に影響を与える化合物の同定は，たとえば治療的応用に重要な価値をもつものと思われる。
最近，ＲＡＲ−α（レチノイン酸受容体-α）とばれるレチノイン酸依存性転写因子が同定された。続いて，さらに２種類のＲＡＲ-関連遺伝子が単離され，したがって現在，少なくとも３種の異なるＲＡＲサブタイプ（α，βおよびγ）のマウスおよびヒトにおける存在が知られている。これらのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）はステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受容体のスーパーファミリーとホモロジーを有し，類似のリガンド依存性機構によって特定の遺伝子発現を調節することが明らかにされた［Umesonoら，Nature336:262 (1988)］。これらのＲＡＲサブタイプは，発生の過程を通じまた成熟生物において独特なパターンで発現される。
さらに最近，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのさらに新規なメンバー，たとえばレチノイドＸ受容体-α［ＲＸＲ−α；Mangelsdorfら，Nature345:224-229(1990)参照］，レチノイドＸ受容体−β［ＲＸＲ−β；Hamadaら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86:8289-8293(1989)参照］，およびレチノイドＸ受容体−γ［ＲＸＲ−γ；Mangelsdorfら，Genes & Development 6:329-344(1992)参照］が同定された。これらの新規な受容体はレチノイン酸に応答するが，これらの受容体に対する一次的な外因性インデューサーは同定されていない。
ＲＡＲおよびＲＸＲはいずれもインビボでレチノイン酸に応答するが，これらの受容体はいくつかの重要な点で異なっている。第一に，ＲＡＲとＲＸＲは一次構造が有意に異なる（たとえば，ＲＡＲαとＲＸＲαのリガンド結合ドメインはわずか２７％のアミノ酸が一致するのみである）。これらの構造的な差は，様々なビタミンＡ代謝物および合成レチノイドに対するＲＡＲおよびＲＸＲの相対的な応答程度の差に反映している。さらにＲＡＲおよびＲＸＲの組織分布には明らかに異なるパターンが認められる。内臓組織では高レベルの発現をみないＲＡＲとは異なり，ＲＸＲαのｍＲＮＡは肝臓，腎臓，肺臓，筋肉および腸に最も豊富であることが明らかにされている。結局，ＲＸＲに対する応答性は付与するが，ＲＡＲに対しては応答性を付与しないレスポンスエレメントが，最近，細胞性レチノール結合蛋白質II型（ＣＲＢＰII）およびアポリポ蛋白ＡＩ遺伝子中に同定された。実際，ＲＡＲはまた，ＣＲＢＰII−ＲＸＲレスポンスエレメントによるＲＸＲ仲介アクチベーションを抑制することが，最近明らかにされている。これらのデータは，ＲＡＲおよびＲＸＲの両者がＲＡＲβプロモーターのＲＡＲレスポンスエレメントを介してアクチベートできることの観察とともに，この２つのレチノイン酸応答経路は単に重複しているのではなく，複雑な相互作用を提供するものであることを示している。
これらの受容体の類似の，しかしながら明らかに異なる性質から，レチノイドＸ受容体に対してレチノイン酸より高い選択性を示すリガンドの同定が，これらの受容体種の一方または両者によって仲介される過程の選択的な制御に大きな価値があるものと思われる。
本発明の理解および実施に役立つ他の情報は，ともに譲渡された係属中の米国特許出願連続番号第１０８，４７１号，１９８７年１０月２０日出願（現時点では米国特許第５，０７１，７７３号として発行）；第２７６，５３６号，１９８８年１１月３０日出願（現時点では米国特許第４，９８１，７８４号として発行）；第３２５，２４０号，１９８９年３月１７日出願；第３７０，４０７号，１９８９年６月２２日出願；および４３８，７５７号，１９８９年１１月１６日出願に見出すことができる。これらはすべてその全体を参考として本明細書に導入する。
発明の簡単な説明
本発明によれば，レチノイド受容体仲介過程を，このような受容体に対する高親和性，高特異性リガンドを用いて修飾する方法が開発された。
本発明の一つの特定の態様においては，レチノイド受容体に対する高親和性，高特異性リガンドであるリガンドが提供される。すなわち，本発明の一態様においては，レチノイドＸ受容体に対して全-trans−レチノイン酸よりもさらに選択性の高いリガンドが提供される。本発明の他の態様においては，本発明者らは，レチノイン酸受容体仲介過程を誘導できる他の（全-trans−レチノイン酸以外の）リガンドを発見した。
本発明のさらに他の態様においては，容易に入手できるレチノイド化合物からこのようなレチノイド受容体リガンドを製造する方法が開発された。
【図面の簡単な説明】
図１は，レチノイン酸（ＲＡ）−処置Ｓ２細胞から得られる様々なＨＰＬＣ分画のトランスアクチベーション像である。
図２ａは，ＲＡＲ−αおよびＲＸＲ−αに対する全-trans−レチノイン酸（ＲＡ）のトランスアクチベーション像の比較である。
図２ｂは，ＨＰＬＣ分画１８（ＲＡに代えて）を用いた場合の，図２ａに示したのと同様の比較である。
図３は，様々なレチノイン酸異性体によるＲＸＲ−αもしくはＲＡＲ−αアクチベーションの分析のためのいくつかのアクチベーション像を提示する。パネルａは昆虫Ｓ２細胞で行った実験を示し，一方，パネルｂおよびｃは哺乳動物ＣＶ−１細胞で実施した実験を示す。図中，黒丸は９-cis−レチノイン酸を表示するために使用し，白丸は全-trans−レチノイン酸を示すために，白三角は13-cis−レチノイン酸を示すために，白四角は11-cis−レチノイン酸を示すために使用した。
図４は，９-cis−レチノイン酸の飽和結合分析の結果を示す。細胞抽出物を，トリチウム化レチノイドの濃度を上昇させていって，非トリチウム化レチノイドの不存在下（総結合）または２００倍過剰の存在下（非特異的結合）にインキュベートした。非特異的結合を総結合から差し引き特異的結合としてプロットした。図４ａに示したデータは［3Ｈ］−９-cis−レチノイン酸のＲＸＲα（黒丸）もしくは偽（白丸）抽出物に対する特異的結合，またはＲＸＲαに対する［3Ｈ］−全-trans−レチノイン酸の特異的結合（白四角）を表示する。
図４ｂは，（ａ）におけるＲＸＲαへの特異的９-cis−レチノイン酸結合をスキャッチャード分析によって変換してプロットしたスキャチャード分析を示す。線形回帰によりＫｄ＝１１．７ｎＭ（ｒ＝０．８６）が得られた。
図５は，バキュロウイルス発現ＲＸＲに結合した放射標識９-cis−レチノイン酸のＤＮＡ−セルロースカラム像を示す。図５ａにおいては，ＲＸＲα蛋白質を含むサンプル細胞抽出物を，１０ｎＭ［3Ｈ］−９-cis−レチノイン酸により，非放射標識９-cis−レチノイン酸の不存在下（白四角）または２００倍過剰の存在下（白丸）に標識し，ついでＤＮＡ−セルロースカラムに適用した。一定のベースラインが確立するまで，流出する放射能をモニタリングした。ついで，ＤＮＡ結合成分を直線塩勾配で溶出した。次に，ピークの放射性分画（標識１〜１５）を，ｈＲＸＲα−特異的抗血清を用いてイムノブロット分析に付した。ピーク放射性分画（矢印で指示）はＲＸＲα特異的蛋白質のピーク量と正確に共移動した。
図５ｂには，ＤＮＡ−セルロースカラムのピーク放射性分画は９-cis−レチノイン酸を含むことが示されている。ピーク分画［（ａ）中の矢印］を抽出し，Ｃ18カラム上移動相Ｇによって展開して分析した。図に示すように，抽出された放射能の０．９５％は標品の９-cis−レチノイン酸と共溶出した（吸収ピーク）。
図６は，９-cis−レチノイン酸の存在下，アポリポ蛋白Ａ１遺伝子（ＡＰＯＡ１３）または細胞性レチノール結合蛋白II型（ＣＲＢＰII）のいずれかから誘導されたレチノイドレスポンスエレメントを含有するルシフェラーゼレポーターを用いた場合の，ＲＸＲ-αについてのトランスアクチベーション像の比較である。
発明の詳細な説明
本発明によれば，レチノイド受容体によって仲介される過程を修飾する方法において，上記過程を構造
0004001618.tif 000002
の少なくとも１種の化合物の存在下に行わせることからなる方法を提供する。
構造Ａ中，
炭素原子Ｃ9とＣ10の間の不飽和はシス立体配置を有し，炭素原子Ｃ11〜Ｃ14の間の不飽和の一方の部位または両部位はシス立体配置を有してもよく，
「Ｒing」は１個または２個以上の置換基をもっていてもよい環状残基であり，
Ｚは，カルボキシル（−ＣＯＯＨ），カルボキシアルデヒド（−ＣＯＨ），ヒドロキシアルキル［−（ＣＲ’2）n−ＯＨ，式中，Ｒ’はそれぞれ独立に水素または低級アルキルから選択され，ｎは１から約４までの範囲の数である］，チオアルキル［−（ＣＲ’2）n−ＳＨ，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，ヒドロキシアルキルホスフェート［−ＣＲ’2）n−ＯＰ（ＯＭ）3，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りであって，Ｍは水素，低級アルキル，またはＮa+，Ｌi+，Ｋ+等のような陽イオン種である］，ヒドロキシアルキル基のアルキルエーテル［−（ＣＲ’2）n−ＯＲ’，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，チオアルキル基のアルキルチオエーテル［−（ＣＲ’2）n−ＳＲ’，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，ヒドロキシアルキル基のエステル［−（ＣＲ’2）n−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，ヒドロキシアルキル基のチオエステル［−ＣＲ’2）n−Ｏ−ＣＳ−Ｒ’，式中Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，チオアルキル基のエスチル［−ＣＲ’2）n−Ｓ−ＣＯ−Ｒ’，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，チオアルキル基のチオエステル［−ＣＲ’2）n−Ｓ−ＣＳ−Ｒ’，式中Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，アミノアルキル［−（ＣＲ’2）n−ＮＲ’2，式中Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］，Ｎ−アシルアミノアルキル［−（ＣＲ’2）n−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ”，式中Ｒ’およびｎは上に定義した通りであり，Ｒ”は低級アルキルまたはベンジルである］，カルバメート［−（ＣＲ’2）n−ＮＲ’−ＣＯ−ＯＲ’もしくは−（ＣＲ’2）n−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ’2，式中，Ｒ’およびｎは上に定義した通りである］等から選ばれ，Ｒは，それぞれ独立に，Ｈ，ハロゲン，アルキル，アリール，ヒドロキシ，チオール，アルコキシ，チオアルコキシ，アミノ，または任意のＺ置換基等から選ばれ，あるいは，
Ｒ基の任意の２個またはそれ以上が互いに連結して１個または２個以上の環構造を形成することができる。
最後に挙げた場合のＲ基の例は，アルキレン，オキシアルキレン，チオアルキレン等から選択される。
本明細書で用いられる「修飾する」の語は，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーに対するリガンドが，ホルモン発現制御下に維持された遺伝子の発現を誘導するまたはこのような制御下に維持された遺伝子の発現を抑制する能力を意味する。
本明細書で用いられる「レチノイド受容体によって仲介される過程」の句は，天然のもしくは合成のレチノイド，または本明細書で定義される天然のもしくは合成の化合物（本明細書に記載される多くの化合物のレチノイドＸ受容体を選択的にアクチベートする能力により，本明細書においては「レキソイド」と呼ぶ）に応答する受容体または複合受容体によって仲介される生物学的，生理学的，内分泌学的または他の生体過程を意味する。このような過程の修飾は，インビトロまたはインビボにおいて達成できる。インビボ修飾は，広範囲の対象，たとえばヒト，齧歯類動物，ヒツジ，ブタ，ウシ等で実施できる。
レチノイド，および本明細書において定義された天然または合成化合物（すなわち，「レキソイド」）に応答する受容体の例には，レチノイン酸受容体−α，レチノイン酸受容体β−，レチノイン酸受容体−γ，およびこのような受容体の遺伝子によってコードされるスプライシング変異体；レチノイドＸ受容体−α，レチノイドＸ受容体−β，レチノイドＸ受容体−γ，およびこのような受容体の遺伝子によってコードされるスプライシング変異体；ならびにそれらの様々な複合体（すなわち，ホモダイマー，ホモトリマー，ヘテロダイマー，ヘテロトリマー等）および，このような受容体と，レチノイド受容体がヘテロダイマー，ヘテロトリマーおよびより高度なヘテロマルチマーを形成して相互作用できる他のステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーとの複合体が包含される。たとえばレチノイン酸受容体−αはレチノイドＸ受容体−αとヘテロダイマーを形成し，レチノイン酸受容体−βはレチノイドＸ受容体−αとヘテロダイマーを形成し，レチノイン酸受容体−γはレチノイドＸ受容体−αとヘテロダイマーを形成し，レチノイドＸ受容体−αは甲状腺ホルモン受容体とヘテロダイマーを形成し，レチノイドＸ受容体−βはビタミンＤ受容体とヘテロダイマーを形成し，レチノイドＸ受容体−γはレチノイン酸受容体−αとヘテロダイマーを形成する等である。
本明細書において使用される「ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー」（「核受容体」または「細胞内受容体」としても知られる）の句は，リガンド依存性転写因子として作動するホルモン結合蛋白質を意味し，特異的リガンドがまだ確認されていないステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーの同定されたメンバー（以下，「オーファン受容体」という）も包含する。これらのホルモン結合蛋白質は特異的ＤＮＡ配列に結合する固有の能力を有する。結合に続いて，標的遺伝子（すなわち，特異的ＤＮＡ配列を伴う遺伝子）の転写活性が，受容体に結合するリガンドの機能として修飾される。
これらの核受容体すべてのＤＮＡ結合ドメインは類似し，６６〜６８アミノ酸残基からなり，９個のシステインを含む約２０個の不変アミノ酸を有する。
スーパーファミリーのメンバーは上述の不変アミノ酸残基を含有する蛋白質として同定され，これらは，ヒトのグルココルチコイド受容体（アミノ酸４２１〜４８６），エストロゲン受容体（アミノ酸１８５〜２５０），鉱質コルチコイド受容体（アミノ酸６０３〜６６８），ヒトのレチノイン酸受容体（アミノ酸８８〜１５３）のような既知のステロイド受容体のＤＮＡ−結合ドメインの部分である。スーパーファミリーのメンバーのＤＮＡ-結合ドメインの高度に保存されたアミノ酸は次の通りである。
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式中，ＸはＤＮＡ−結合ドメイン内の非保存アミノ酸を意味し，星印を付した残基はほぼ普遍的に保存されているが同定されたホルモン受容体の一部で変異が見出されている残基，括弧内の残基は任意の残基である（したがって，ＤＮＡ−結合ドメインは最低６６アミノ酸長であるが，さらに数個のアミノ酸を含有することもある）。
ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーの例には，ステロイド受容体たとえばグルココルチコイド受容体，鉱質コルチコイド受容体，プロゲステロン受容体，アンドロゲン受容体，ビタミンＤ3受容体等；さらにはレチノイド受容体，たとえばＲＡＲα，ＲＡＲβ，ＲＡＲγ等，およびＲＸＲα，ＲＸＲβ，ＲＸＲγ等；甲状腺ホルモン受容体たとえばＴＲα，ＴＲβ等；ならびにそれらの構造および性質により上に定義したスーパーファミリーのメンバーと考えられる他の遺伝子産物が包含される。オーファン受容体の例にはＨＮＦ４［たとえばSladekら，Genes & Development4:2353-2365(1990)参照］，ＣＯＵＰファミリー受容体［たとえばMiyajimaら，Nucl.Acids Res.16:11057-11074(1988)，Wangら，Nature 340:163-166(1989)参照］，ＣＯＵＰ様受容体およびＣＯＵＰ類縁体［たとえばMlodzikら，Cell 60:211-224(1990)およびLadiasら，Science251:561-565(1991)に記載されている］，ウルトラスピラクル受容体［たとえばOroら，Nature 347:298-301(1990)参照］等が包含される。
本発明において，レチノイド受容体によって修飾されることが可能な過程には，インビトロ細胞分化および増殖，メラノーマ細胞系のインビトロ増殖，マウス奇形癌細胞（Ｆ９細胞）のインビトロ分化，ヒト表皮角化細胞のインビトロ分化，四肢形態形成，細胞性レチノール結合蛋白質（ＣＲＢＰ）の調節等が包含される。本技術分野の熟練者には容易に認識されるように，レチノイドＸ受容体のリガンドを利用できることは，上記受容体に対するアゴニストの同定のためのアッセイを初めて可能にするものである。
本発明において，レチノイド受容体によって修飾されることが可能な過程にはまた，脂質代謝のインビボ修飾，皮膚関連過程（たとえば，座瘡，加齢，皺，皮膚癌等）のインビボ修飾，たとえば急性前骨髄球性白血病，睾丸腫瘍，肺癌等で起こる悪性細胞発生のインビボ修飾等が包含される。本発明の化合物のこのような過程を修飾する能力は多くの方法によって立証されている。たとえば，図６には，ＲＸＲ−αがそれに対するリガンド（たとえば９-cis-レチノイン酸）の存在下に，アポリポ蛋白ＡＩの調節エレメントの制御下にある遺伝子の発現に強力な影響を発揮する能力をもつことが示されている。同様に，実施例に示したような様々な疾患状態に対するモデル系（たとえば，急性前骨髄球性白血病のモデルとしてのＨＬ６０細胞の分化，皮膚癌のモデルとしてのメラノーマ細胞系の増殖，非悪性皮膚疾患のモデルとしての角化細胞の分化等）での研究により，レチノイド受容体の，それに対するリガンドたとえば９-cis-レチノイン酸の存在下においてこのような疾患状態に強力な影響を発揮する能力が証明されている。本発明のこのようなインビボ適用は，望ましくない副作用の発生を抑えて様々な生物学的過程等の修飾を可能にするものである。
本発明の方法（および組成物）のインビボ適用は広範囲の対象，たとえばヒト，齧歯類動物，ヒツジ，ブタ，ウシ等に使用できる。
本明細書において用いられる「アルキル」の語は，「低級アルキル」，すなわち１から約４個までの炭素原子を有するアルキル残基を意味し，メチル基，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，n-ブチル基，イソブチル基，sec-ブチル基，tert-ブチル基等である。
本発明の実施に際して使用される化合物の一部として意図される環状残基には，５−，６−，および７−員の炭素環，ヘテロ環，芳香環またはヘテロ芳香環が包含される。この定義に包含される環状残基には，たとえば，任意に置換された飽和，モノ不飽和またはポリ不飽和炭素環種，たとえばシクロペンタン，シクロペンテン，シクロヘキサン，シクロヘキサ−２−エン，シクロヘキサ−３−エン，シクロヘキサ−４−エン，およびシクロヘキサ−５−エン異性体，ならびにその２，４−，２，５−，および３，５−シクロヘキサジエン変異体が包含される。本発明の実施に際して使用される化合物の一部として意図されるヘテロ環種の例には，ジヒドロフラン，テトラヒドロフラン，ジヒドロチオフェン，テトラヒドロチオフェン，ジヒドロピラン，テトラヒドロピラン，ジヒドロチオピラン，テトラヒドロチオピラン，ピペリジン，ピロリジン等，ならびにそれらの誘導体が包含される。本発明の実施に際して使用される化合物の一部として意図される芳香環またはヘテロ芳香環種の例には，フェニル，トリル，キシリル，メシチル，ベンジル，ピリジル，チオフェニル，フラニル等，ならびにそれらの誘導体が包含される。
好ましい環状残基は通常，ジェミナルにジ置換されたモノ不飽和種である。現時点で好ましいジェミナルにジ置換されたモノ不飽和環状残基は，天然に存在するレチノイン酸の１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造（すなわち，β−イオノンの環状構造，環上の置換基の位置はβ−イオノンの環状構造に対する旧来のレチノイン酸慣用命名法を用いて指定する），ならびに旧来のβ−イオノン構造のヒドロキシ−またはケト−置換誘導体によって与えられる１，１，４，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造である。
本発明の実施における使用が意図される化合物には以下の構造
0004001618.tif 000004
を有する化合物が包含される。
構造Ａ中，炭素原子Ｃ9とＣ10の間の不飽和はシス立体配置を有し，炭素原子Ｃ11〜Ｃ14の間の不飽和の一方または両部位はシス立体配置を有してもよく，
「Ｒing」は環状残基であり，
Ｚは，カルボキシル，カルボキシアルデヒド，ヒドロキシアルキル，チオアルキル，ヒドロキシアルキルホスフェート，ヒドロキシアルキル基のアルキルエーテル，チオアルキル基のアルキルチオエーテル，ヒドロキシアルキル基のエステル，ヒドロキシアルキル基のチオエステル，チオアルキル基のエステル，チオアルキル基のチオエステル，アミノアルキル，Ｎ-アシルアミノアルキル，カルバメート等から選ばれ，
Ｃ7，Ｃ8，Ｃ9，Ｃ10，Ｃ11，Ｃ12，Ｃ13，またはＣ14それぞれの上のＲは，独立に，Ｈ，ハロゲン，アルキル，アリール，ヒドロキシ，チオール，アルコキシ，チオアルコキシ，アミノ，または任意のＺ置換基から選ばれ，あるいは，Ｒ基の任意の２個またはそれ以上が互いに連結して１個または２個以上の環構造を形成することができる。
上記一般構造によって表される現時点で好ましい化合物には，９-cis−レチノイン酸，ならびにその新規な誘導体たとえば９−フェニル−９-cis−レチノイン酸，４−ヒドロキシ−９-cis−レチノイン酸，４−ケト−９-cis−レチノイン酸等が包含される。
本発明の他の好ましい実施態様においては，Ｃ9およびＣ13上の置換基はメチルであり，さらに他の好ましい態様においては，側鎖炭素（すなわちＣ7，Ｃ8，Ｃ9，Ｃ10，Ｃ11，Ｃ12，Ｃ13，またはＣ14）の２個またはそれ以上の上の置換基は互いに連結して環構造を形成することができる。たとえば次の構造のように，
0004001618.tif 000005
Ｃ8およびＣ11上の置換基が互いに連結して拘束された９-cis二重結合を有する構造（すなわち９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を形成することができる。
上記構造Ｉ中，
Ｘは，−［（ＣＲ2）xＷ’−（ＣＲ2）y］−であり，
Ｘ’は，−Ｏ−，カルボニル（＞ＣＯ），−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ）−，
−Ｓ（Ｏ）2−，チオカルボニル（＞ＣＳ），−ＮＲ”-，または−ＣＲ2−であり，
Ｒ，ＲingおよびＺは先に定義した通りであり，
Ｒ”は水素，アルキル，ヒドロキシ，チオールまたはアルコキシアシル（−ＣＯ−Ｏ−アルキル）であり，
ｘは０，１または２であり，
ｙは０，１または２であり，
ｘ＋ｙは２または２より小さい。
このような化合物にはシクロペンテン誘導体，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ジヒドロフラン誘導体，ジヒドロピロール誘導体等が包含され，この場合，Ｃ8およびＣ11を連結した環状構造はＣ9とＣ10の間のcis二重結合の異性化を防止するのに有効である。
構造Ｉにおいてとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基であり，Ｒingは次の構造
0004001618.tif 000006
を有するβ−イオノン様種の誘導体である。
上記構造中，
Ｒはそれぞれ独立に上に定義した通りであり，
Ｃ2，Ｃ3，またはＣ4の任意の一つは，−Ｏ−，カルボニル（＞ＣＯ），−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ）−，−Ｓ（Ｏ）2−，チオカルボニル（＞ＣＳ），または−ＮＲ”-（Ｒ”は上に定義した通りである）で置換されることが可能で，
上記環状残基は，飽和，２−エン，３−エン，４−エン，もしくは５−エンモノ不飽和異性体，それらの２，４−，２，５−，もしくは３，５−ジエン誘導体，またはそれらの芳香環誘導体として存在する。
本発明の実施に際して使用するのにとくに好ましい種は，構造ＩにおいてＺがカルボキシル基であり，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
同様に，Ｃ10およびＣ13上の置換基は互いに結合して拘束された９，11-ジ−cis立体配置を有する構造（すなわち９-cisが固定されたレキソイド誘導体），以下の構造のように形成することができる。
0004001618.tif 000007
上記構造II中，
Ｘ，Ｘ’，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，Ｒing，ｘおよびｙは上に定義した通りである。
このような化合物にはシクロペンテン誘導体，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ジヒドロフラン誘導体，ジヒドロピロール誘導体等が包含され，この場合，Ｃ10およびＣ13を連結した環状構造はＣ9とＣ10の間のcis二重結合の異性化を防止し，またＣ11およびＣ12の間のcis二重結合の異性化を妨害するのに有効である。
構造IIのとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基であり，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
同様に，Ｃ8，Ｃ11，および／またはＣ14上の少なくとも２つの置換基は互いに連結して拘束された９，13-ジ-cis立体配置を有する構造（すなわち９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を，以下に構造IIIとして示すように形成することができる。
0004001618.tif 000008
上記構造III中，
一方のＡはＸであり，他方のＡはＸ’であり，
Ｘ，Ｘ’，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，Ｒing，ｘおよびｙは上に定義した通りである。
本技術分野の熟練者には明らかなように，２個の架橋基（Ａ）の間の連結は，互いに融合環を連結するのに必要な結合を収容できるように，原子価３または４の原子（すなわち，炭素または窒素）を介してのみ存在できる。
同様に，Ｃ8，Ｃ11，および／またはＣ14上の少なくとも２つの置換基は互いに連結し，さらにＣ5またはＣ5上の置換基に連結して，拘束された９，13-ジ-cis立体配置を有する構造（すなわち９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を，以下に構造IVとして示すように形成することができる。
0004001618.tif 000009
上記構造IV中，
一方のＡはＸ，他方のＡはＸ’であり，
ＢはＸ’であり，
Ｘ，Ｘ’，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，Ｒing，ｘおよびｙは上に定義した通りである。
本技術分野の熟練者には明らかなように，架橋基（Ａ）および（Ｂ）の間の連結は，互いに融合環を連結するのに必要な結合を収容できるように，原子価３または４の原子（すなわち，炭素または窒素）を介してのみ存在できる。
このような化合物にはシクロペンテン誘導体，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ジヒドロフラン誘導体，ジヒドロピロール誘導体等が包含され，この場合，Ｃ8，Ｃ11，および／またはＣ13を連結する環状構造は炭素９および炭素13における二重結合の異性化を防止するのに有効である。
構造IIIおよびIVのとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
同様に，Ｃ10およびＣ11上の置換基は互いに連結し，拘束された９-cis二重結合を有する構造（すなわち９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を，以下に示すように形成することができる。
0004001618.tif 000010
上記構造Ｖ中，
Ｘ”は−［（ＣＲ2）a−Ｘ’−（ＣＲ2）b］−であり，
Ｘ’，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，ＲingおよびＺは上に定義した通りであり，
ａは０，１，２，３または４であり，
ｂは０，１，２，３，または４であり，
ａ＋ｂは２以上であるが，４以下である。
このような化合物にはシクロペンテン誘導体，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ジヒドロフラン誘導体，ジヒドロピロール誘導体等が包含され，この場合，Ｃ10およびＣ11を連結する環状構造はＣ9とＣ10の間のcis二重結合の異性化を防止するのに有効である。
構造Ｖのとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
同様に，Ｃ7およびＣ9上の置換基は互いに連結し，またＣ10およびＣ12上の置換基は互いに連結して，拘束された９-cis二重結合を有する構造（すなわち，９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を，以下に示すように，形成することができる。
0004001618.tif 000011
上記構造VI中，
Ｙは−［（ＣＲ2）c−Ｘ’−（ＣＲ2）d］−であり，
Ｘ’，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，ＲingおよびＺは上に定義した通りであり，
ｃは０，１，２または３であり，
ｄは０，１，２または３であり，
ｃ＋ｄは１以上であるが，３以下である。
このような化合物にはシクロペンテン誘導体，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ジヒドロフラン誘導体，ジヒドロピロール誘導体等が包含され，この場合，Ｃ7およびＣ9，ならびにＣ10およびＣ12を連結する環状構造はＣ9とＣ10の間のcis二重結合の異性化を防止するのに有効である。
構造VIのとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
同様に，Ｃ9およびＣ10上の置換基は互いに連結して，拘束されたＣ−９二重結合を有する構造（すなわち，９-cisが固定されたレキソイド誘導体）を，以下に示すように形成することができる。
0004001618.tif 000012
上記構造VII中，
Ｘ”’は，Ｘ”であるかまたは構造
−［Ｑ＝ＣＲ−Ｊ］
（構造中，Ｑは−Ｎ＝または−ＣＲ＝であり，Ｊは−ＣＲ＝ＣＲ−，−Ｎ＝ＣＲ−，−ＣＲ＝Ｎ−，−Ｏ−，−Ｓ−，または−ＮＲ”-である）であって，レキソイド化合物のＣ9およびＣ10を芳香性（または擬芳香性）環に導入する不飽和連結基であり，
Ｘ’，Ｘ”，Ｒ，Ｒ”，Ｚ，Ｒing，Ｚ，ａおよびｂは上に定義した通りである。
このような化合物には，シクロヘキセン誘導体，シクロペプテン誘導体，ベンゼン誘導体，ピリジン誘導体，フラン誘導体，チオフェン誘導体，ピロール誘導体，オキサゾール誘導体，チアゾール誘導体，イミダゾール誘導体，ピラゾール誘導体等が包含され，この場合Ｃ9およびＣ10を連結する環状構造はＣ9−Ｃ10二重結合の異性化を防止するのに有効であるが，８−９および／または１０−１１単結合の周囲の回転は依然として起こりうる。
構造VIIのとくに好ましい誘導体は，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の誘導体である。
上に掲げた構造に加えて，本技術分野の熟練者であれば，本発明の実施に際して使用される基本的なシス立体配置を含むレキソイド化合物を拘束する別の手段を容易に確認することが可能であろう。
本発明の好ましい実施態様においては，環状残基は上述のβ−イオノン構造を有する。とくに好ましい構造は，１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造（β−イオノンの特徴）ならびにそれと極めて類似した１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造であって，これらから本発明の多くのレキソイド化合物を製造することができる。
本発明のとくに好ましい実施態様においては，本発明の方法に使用される化合物は，上掲の構造Ａによって意図されるような９-cis−レチノイン酸およびその誘導体，ならびに上掲の構造Ｉ〜VIIで示されるようなレチノイン酸の９-cisが固定された誘導体から選択される。本発明の実施に際しての使用が意図される特定の化合物の例には，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingがβ−イオノンに特徴的な１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造（またはそれと極めて類似した１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造）であって，構造Ｉ〜VIIについて上述したような側鎖構造を有する化合物がある。
上述の「レキソイド」誘導体は，本技術分野の熟練者には容易に利用可能なよく知られた様々な合成法を用いて製造することができる。たとえば，Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids，Dawson & Okamura編，CRS Press Inc., (1990)に記載の方法が参考になる。とくに，Ito著，第４章（78-97頁）およびLeraら著，第９章（202-227頁）は本明細書に記載の化合物の製造にそのまま適用できる。この刊行物の内容は参考として本明細書に導入する。また，Asatoら，J.Am.Chem.Soc.108:5032 (1986)，Shevesら，J.Am.Chem.Soc.108:6440 (1986)，Akitaら，J.Am.Chem.Soc.102:6370 (1980)，Derguini & Nakanishi，Photobio-chem. and Photobiophys.13:259 (1986)が参考になる。これらの全内容を参考として本明細書に導入する。
本発明の他の実施態様においては，レチノイド受容体によって仲介される過程を修飾する方法において，その過程を，
（ａ）構造
0004001618.tif 000013
（上記構造中，炭素原子Ｃ7〜Ｃ14からなる側鎖における不飽和の各部位はトランス立体配置を有し，「Ｒing」，Ｚ，およびＲは上述の通りである）の化合物少なくとも１種，および
（ｂ）少なくとも９−二重結合をトランス−立体配置からシス−立体配置に変換できるcis/transイソメラーゼ
の存在下に実施することからなる方法を提供する。
ここで使用した「cis/transイソメラーゼ」の語は，二重結合における幾何的立体配置の変化を促進する酵素を意味する。このような酵素の例には，マレイン酸イソメラーゼ，マレイルアセト酢酸イソメラーゼ，レチナールイソメラーゼ，マレイルピルビン酸イソメラーゼ，リノレン酸イソメラーゼ，フリルフラミドイソメラーゼ等が包含される。
本発明のさらに他の実施態様においては，構造
0004001618.tif 000014
（上記構造中，炭素原子Ｃ9とＣ10の間の不飽和はシス立体配置を有し，Ｃ11〜Ｃ14上の間の不飽和の一方または両部位は任意にシス立体配置を有し，
「Ｒing」は環状残基であり，
Ｚは，カルボキシル，カルボキシアルデヒド，ヒドロキシアルキル，チオアルキル，ヒドロキシアルキルホスフェート，ヒドロキシアルキル基のアルキルエーテル，チオアルキル基のアルキルチオエーテル，ヒドロキシアルキル基のエステル，ヒドロキシアルキル基のチオエステル，チオアルキル基のエステル，チオアルキル基のチオエステル，アミノアルキル，Ｎ-アシルアミノアルキル，カルバメート等から選ばれ，
Ｒは，独立に，Ｈ，ハロゲン，アルキル，アリール，ヒドロキシ，チオール，アルコキシ，チオアルコキシ，アミノ，または任意のＺ置換基から選ばれる）
の化合物を相当する全トランス立体配置の原料から製造するにあたり，その全トランス立体配置の原料をcis/transイソメラーゼと異性化条件下に接触させることからなる方法を提供する。
本発明のさらに他の実施態様においては構造Ａの化合物（以前から同定されていた化合物たとえばレチノイン酸を除く）ならびに上掲の構造Ｉ〜VIIから選択される拘束された化合物からなる新規な組成物を提供する。このような化合物の例には，９−フェニル−９-cis−レチノイン酸，４−ヒドロキシ−９-cis−レチノイン酸，４−ケト−９-cis−レチノイン酸等が包含される。現時点で好ましい化合物は，Ｚがカルボキシル基で，Ｒingが１，１，５−トリ置換シクロヘキサ−５−エン構造または１，１，４，５−テトラ置換シクロヘキサ−５−エン構造の化合物である。
本発明の化合物は，インビトロおよびインビボの両適用に使用することができる。インビボ適用のためには，本発明の化合物は，投与用に，医薬的に許容される処方中に導入することができる。本発明の化合物をそのように使用する場合の適当な投与量レベルは，本技術分野の熟練者であれば容易に決定することができる。
本明細書で用いられる「適当な投与量レベル」の句は，レチノイド受容体のアクチベーションを生じるのに十分高い循環濃度を提供する化合物のレベルを意味する。この濃度は通常約１０ｎＭから２μＭまでの範囲であり，約１００ｎＭから２００ｎＭの範囲の濃度がとくに好ましい。
本発明の特定の実施態様においては，少なくとも１種の９-cis−レチノイン酸様化合物（上述のような）と医薬的に許容される担体からなる組成物が意図される。医薬的に許容される担体の例には，経口，静脈内，皮下，筋肉内，皮内等の投与に適当な担体が包含される。クリーム，ローション，錠剤，分散性粉末，顆粒，シロップ，エリキシール，滅菌水溶液もしくは非水溶液，懸濁液もしくは乳化液等の形態での投与が意図される。
経口投与用液製剤の製造に適当な担体には，乳化液，溶液，懸濁液，シロップ等が包含され，これらには湿潤剤，乳化剤および懸濁剤，甘味剤，矯味剤および芳香剤等のような添加剤を任意に含有させることができる。
非経口投与用の液体の製造に適当な担体には，滅菌水溶液もしくは非水溶液，懸濁液，または乳化液が包含される。非水性溶媒またはビヒクルの例には，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，植物油たとえばオリーブ油およびトーモロコシ油，ゼラチン，ならびに注射可能な有機エステルたとえばオレイン酸エチルがある。このような剤形にはまた，防腐剤，湿潤剤，乳化剤および分散剤のような補助剤を添加することができる。これらは，たとえば，細菌除去濾過器を通す濾過，組成物中への殺菌剤の添加，組成物の放射線照射，または組成物の加熱によって滅菌することができる。これらはまた，使用の直前に，滅菌水またはある種の他の滅菌注射用メジウムの形態に調製することもできる。
本発明は，以下の非限定的実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例
例１
ＲＸＲを活性化する化合物の同定
レチノイン酸がＲＸＲに直接結合する生成物に変換して転写を修飾できるか否かを確認するために，ＲＸＲの転写特性を修飾できるレチノイン酸代謝物を同定するための戦略を開発した。このような活性代謝物の同定が行われれば，この代謝物が受容体蛋白質に直接結合できるか否かをさらに決定することが可能になるものと思われる。
したがってDrosophila melanogasterシュナイダー細胞系（Ｓ２）を全-trans-レチノイン酸（ＲＡ）とともにまたはその不存在下に，２４時間インキュベートした。レチノイン酸の添加前に，Drosophila melanogasterシュナイダー細胞系（Ｓ２）細胞をペニシリン，ストレプトマイシンおよび１２％熱不活性化ＦＣＳ（Irvine Scientific）を補充したシュナイダーDrosophilaメジウム（GIBCO）中で増殖させた。１００個の組織培養フラスコ（７５cm2）に１０7個の細胞と１２ml／フラスコの培地を配置した。２４時間後，各フラスコに全-trans−レチノイン酸（またはエタノール溶媒対照）を最終濃度５×１０-6Ｍになるように減光条件下に添加した。２４時間後に，８００ｇで５分間遠心分離して細胞を収穫した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し，得られたペレットを抽出するまで，−８０℃で凍結した。
平行して，６４個の組織培養皿（１５０mm）にＣＶ−１細胞２×１０6個と培地２５ml／皿を配置した。ＣＶ−１細胞（付着性）はそれぞれの皿の中でＰＢＳで洗浄し，遠心分離および凍結の前にゴムポリスマンで掻き落としたほかは，Ｓ２細胞の場合と同様にして，レチノイン酸で処理し収穫した。
インキュベーション後，細胞ペレットを集め，有機溶媒で抽出し，ＨＰＬＣによってクロマトグラフ的に分画した。様々なＨＰＬＣ分画について，ＲＸＲによって仲介される転写活性にリガンド依存性増大を引き起こす能力を検定した。この検定系には，ＲＸＲ受容体とＲＸＲレスポンスエレメント（ＲＸＲＥ）を含むプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター分子とに対するｃＤＮＡによる，細胞のトランスフェクションを包含する［Mangelsdorfら，Cell66:555(1991)］。ＲＸＲをアクチベートできるリガンドの添加によりルシフェラーゼ活性の増大を生じる。
シュナイダー細胞，ＣＶ−１細胞およびマウス組織は，C.Thaller & G.Eichele，Nature Vol. 327:625(1987)の記載に従って抽出した。マウスの組織は，生体内にＲＸＲリガンドが存在するか否かを測定するために用いた。組織抽出物の場合には２・１０5dpmの内部標準［11，12-3Ｈ］−全-trans−レチノイン酸（New England Nuclear）または９-cis−レチノイン酸（光による異性化で生成）をホモジネートに添加した。抽出物は，Waters Novapak３００mmＣ18分析カラム上，１ml・min-1の速度で分画した。移動相（Ｇ）は，
Ａ［ＣＨ3ＣＮ／ＣＨ3ＯＨ／２％ＣＨＣＯＯＨ水溶液（３：１：１）］および
Ｅ［ＣＨ3ＣＮ／ＣＨ3ＯＨ／２％ＣＨＣＯＯＨ水溶液（11：３：10）］
の１：１混合物である。
使用した他の移動相は以下の組成を有する。
Ｃ：ＣＨ3ＣＮ／ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＯＯＨ（80：10：10：１），
Ｈ：ＣＨ3ＯＨ／１０ｍＭ酢酸アンモニウム（９：１）を，等容量のＣＨ3ＯＨ／１０ｍＭ酢酸アンモニウム（３：１）と混合
ＨＰＬＣ分画に含有されるレチノイン酸異性体のメチルエステルおよび／または代謝物は，Weddenら［Meth.Enzymol. 190:201(1990)］の記載によって生成させた。使用した対照標準は，Aldrich，Sigmaから入手したか，またはHoffmann-La Rocheによって恵与された。標品の９-cis−レチノール，９-cis−レチノイン酸および９-cis−レチノイン酸メチルエステルは，９-cis-レチナールから合成するか［E.J.Coreyら，J.Am.Chem.Soc.90:5616(1968)；C.D.B.Bridges & R.A.Alvares，Meth.Enzymol. 81:463(1982)参照］または全-trans−異性体の光異性化ついで得られた異性体のＨＰＬＣによる分画化によって生成させた。
全-trans−異性体の光異性化は本技術分野の熟練者にはよく知られた標準的異性化技術によって実施される。たとえば，レチノイン酸は極性溶媒たとえばエタノールに溶解し，水晶キューベットに取り，各種波長の光（たとえば蛍光燈）によって照射することができる。照射を行う温度にはとくに制限はなく，したがって，照射は室温で実施できる。照射時間にもとくに制限はない。通常の照射時間は約０．５〜２時間の範囲である。
様々なＨＰＬＣ分画を１：１００に希釈し，それらがＲＸＲの転写特性を修飾する能力について検定した。
ＣＶ−１細胞におけるコトランスフェクションアッセイ
サル腎臓細胞系，ＣＶ−１をcis-trans検定に使用した。細胞は２種のＤＮＡトランスフェクションベクターでトランスフェクトした。trans-ベクターはこれらの細胞中でレチノイド受容体（たとえば，ＲＡＲまたはＲＸＲ）の効率的な産生を可能にした。これらの細胞は正常時にはこれらの受容体を発現しない。cis-ベクターは，レチノイド応答性プロモーターに連結した容易に検定できる遺伝子，この場合はホタルルシフェラーゼを含有する。レチノイン酸または適当な合成レチノイドの添加はルシフェラーゼ遺伝子をアクチベートするレチノイド−受容体複合体の形成を生じ，細胞抽出物から光の放射が起こる。ルシフェラーゼ活性のレベルは遺伝子発現をアクチベートするレチノイド-受容体複合体の有効性に正比例する。この感度および再現性の高いコトランスフェクションアプローチによれば，様々な受容体アイソフォームと相互作用するレチノイドの同定が可能になる。
細胞は１０％炭末樹脂-処理ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養し，実験は９６−ウエルプレート中で行った。プラスミドはリン酸カルシウム法により［Umesono & Evans，Cell57:1139-1146(1989)；Bergerら，J.Steroid Biochem.Molec.Biol. 41:733-738(1992)］１０ngのｐＲＳ（ラウス肉腫ウイルスプロモーター）受容体-発現プラスミドベクター，５０ngのレポータールシフェラーゼ（ＬＵＣ）プラスミド，内部標準としての５０ngのｐＲＳβ−ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ），および９０ngのキャリヤープラスミドｐＧＥＭを用いて一時的にトランスフェクトした。細胞は６時間トランスフェクトしたのち，洗浄して沈殿を除去した。細胞をついで３６時間，レチノイドとともに，またはレチノイドを加えないでインキュベートした。トランスフェクション後のすべての工程はBeckman Biomek自動化ワークステーション上で実施した。細胞抽出物はBergerら（前出）の記載に従って調製し，ついでルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性について検定した。すべての定量は２回の独立した実験の３重測定によって行い，内部対照としてβ−ガラクトシダーゼを用いてトランスフェクション効率について標準化した。レチノイド活性はレチノイン酸の活性に対して標準化し，最大観察応答の５０％を産生するのに必要なレチノイド濃度である効力（ＥＣ50），ならびにレチノイン酸１０-5Ｍの最大応答に対する観察された最大応答である効率（％）として表示する。
コトランスフェクションアッセイに用いた受容体発現ベクターは以前に報告されている［ｐＲＳｈＲＡＲ−α：Giguereら，Nature330:624-629(1987)；ｐＲＳｈＲＡＲ−βおよびｐＲＳｈＲＡＲ−γ：Ishikawaら，Mol.Endocrinol. 4:837-844(1990)；レチノイドＸ受容体−α（ＲＸＲ−α）：Mangelsdorfら，Nature345:224-229(1990)；レチノイドＸ受容体−β（ＲＸＲ-β）およびレチノイドＸ受容体−γ（ＲＸＲ−γ）：Mangelsdorfら，Genes & Development 6:329-344(1992)参照］。ＴＲＥ−２回回転対称レスポンスエレメント５’-ＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡ−３’［配列番号２；Umesonoら，Nature336:262-265(1988)参照］の２つのコピーを含む基本レポータープラスミドΔＭＴＶ−ＬＵＣ［Hollenberg & Evans，Cell55:899-906(1988)］を，レチノイド受容体のすべてのトランスフェクションに使用した。
競合的結合アッセイに用いたＰＥＴ−８ｃ−ＲＡＲ−αの細菌発現ベクターは以前に報告されている［Yangら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3559-3563(1991)］。ＰＥＴ−８ｃベクター系を用いた類似の発現ベクター［Studierら，Methods in Enzymology185:60-69(1990)］をＲＡＲ−βおよびＲＡＲ−γについて構築した。
様々なレチノイン酸異性体および／または代謝物を含有する様々な分画についてのＲＸＲ−αのトランスアクティベーション像を図１に示す。これらのデータにより，２つの異なる領域の活性が明らかである。１つは比較的早い分画（分画７）で，他方は比較的遅く溶出する第２の広い活性領域（分画１６〜２１）である。全-trans−レチノイン酸は，分画２０および２１に共溶出し（図１），細胞抽出物中に存在する主要なＵ．Ｖ．吸収物質である。しかしながら，活性像は，全-trans−レチノイン酸に加えて，全-trans−レチノイン酸に由来するかまたはそれから誘導されると考えられる，ＲＸＲをアクチベートする活性成分の存在を示している。
全-trans−レチノイン酸と同じまたはそれ以上の活性を有する可能性のある化合物を同定するためには，個々の分画の活性のみではなく，それらの濃度も考慮しなければならない。したがって，全活性分画は，個々の分画の相対濃度を考慮しながら，広い濃度範囲にわたって再検定した。分画の相対濃度を決定するためには，以下の初期仮定を設けた。すなわち，１）活性分画はレチノイン酸代謝物であり，２）各活性分画の分子吸光係数は比較的類似している（すなわち，ファクター２以内）とした。この仮定は多数のレチノイドについて文献に報告されている値によって支持される。ＲＡＲ-αおよびＲＸＲ−αに対する全-trans−レチノイン酸（すなわち分画２０）のトランスアクティベーション像の比較を図２ａに示す。レチノイン酸によるＲＡＲおよびＲＸＲの最大アクティベーション（すなわち効率）は類似し，ＲＡＲの方が約１０倍のファクターで感度が高い（すなわち１０倍効力が大きい）。これに反し，上述のようにして生成させた様様な分画の分析により，分画１８は，ＲＡＲよりＲＸＲに対してかなり活性が高いことが明らかである（図２ｂ参照）。これらのデータは，レチノイン酸で前処置したＳ２細胞中に存在する代謝産物はＲＡＲサブファミリーよりもＲＸＲサブファミリーに効力の高いアクチベーターであることを示唆するものである。
例２
ＲＸＲのトランスアクチベーターとしての９-cis-レチノイン酸の同定
２つの観察から，分画１８（ピークＸ，図１参照）は全-trans−レチノイン酸の細胞性代謝物であることが示唆される。第一に，全-trans−レチノイン酸の不存在下に増殖させたシュナイダー細胞の抽出物にはピークＸは認められなかった。第二に，細胞を全-trans−レチノイン酸に暴露した場合には，Ｘが時間依存性様式で出現する。
したがって，Ｘを化学的に同定するため，分画１８を化学的誘導体化，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および気相クロマトグラフィー／マススペクトメトリー（ＧＣ／ＭＳ）に付した。ジアゾメタンでメチル化すると，ピークＸの保持時間は劇的にシフトした（すなわち，使用したＨＰＬＣ条件下に１０．２分から１９．５分に）。これはピークＸに相当する化合物が遊離のカルボキシル基をもつことを示している。メチル化されたＸをＧＣ／ＭＳで分析すると，電子衝撃法で，Ｘはレチノイン酸メチルエステルの場合に相当する分子イオンをm/z３１４に生じることが明らかにされた。これは，Ｘがレチノイン酸の立体異性体であることを示唆する。Ｘがいずれの異性体であるかを決定するため，Ｘの保持時間を９-cis−，11-cis−および13-cis−レチノイン酸と比較した。Ｘは標品の９-cis-レチノイン酸と共溶出することが見出された。さらに，Ｘのメチルエステルは９-cis−レチノイン酸メチルエステルと共溶出し，Ｘのメチルエステルを水素化リチウムアルミニウムでアルコールに還元した場合には，得られた生成物は標品の９-cis−レチノールと共溶出する。
ＧＣ／ＭＳ分析には，メチル化レチノイン酸異性体をヘキサンに溶解した。サンプルを投下針インジェクターを介して（２８０℃），電子衝撃様式（７０eV）で操作されるＶＧ−Ｔrio-１０００質量分析計のイオン化室に直接挿入した３０m×０．３２mm熔融シリカＤＢ５毛細管カラム（Ｊ＋Ｊ scientific）中に注入した。サンプルは温度勾配（２００〜３００℃，１０℃/min）で溶出した。
結局，標品９-cis−レチノイン酸メチルエステルのマススペクトルはメチル化されたピークＸの場合と同一であることが明らかである。これらの分析結果を考え合せて，ピークＸは９-cis−レチノイン酸と確認される。初期の研究では魚の肝臓に９-cis−レチノールの存在が指示されているが，９-cis−レチノイン酸がインビボに存在するか否か（すなわち，９-cis−レチノイン酸が生理学的化合物であるか否か）は不明であった。９-cis−レチノイン酸がインビボに存在するか否かを明らかにするため，マウスの肝臓および腎臓組織を抽出した。これらの組織は，広スペクトルのレチノイド代謝物を含有し，またＲＸＲを発現することから選択されたものである。抽出に先立って，腎臓ホモジネートに放射標識９-cis−レチノイン酸を加えて，内部標準として利用した。抽出物は最初，移動相Ｇを用いて，逆相カラム上で分画化した（Waters Novo pak 300mm Ｃ18分析用カラム，流速１ml／分）。
放射性内部標準を含有する腎臓抽出物からの分画を，移動相Ｈを用いて，第二のＣ18カラム上再クロマトグラフィーに付した。この操作では，標品９-cis−レチノイン酸と共移動する小さいが明瞭な吸収ピークを与えた。
同様に，肝臓抽出物を逆相カラム上で分画化し，移動相Ｇで溶出した。しかしながら，用いた条件下では，９-cis-レチノイン酸は全-trans-レチノール（これは肝臓に豊富に存在する）とともに溶出した。これらの２種のレチノイドを分離するために，この分画をジアゾメタンでメチル化し，ついでＨＰＬＣにより，移動相Ｃを用いて再度分析した。このアプローチにより，標品の９-cis−レチノイン酸メチルエステルと共溶出する明瞭なピークを生じた。
９-cis−レチノイン酸が抽出操作時に全-trans−レチノイン酸から形成された可能性を除外するため，肝臓組織ホモジネートに，トリチウム化全-trans−レチノイン酸を加えた。以後のＨＰＬＣ分画化により，放射能の９４％は依然として全-trans−レチノイン酸中に残存し，約５％が13-cis−レチノイン酸中に，１％もしくはそれ未満が９-cis-レチノイン酸中に認められた。ピーク面積の積分に基づいて，９-cis−レチノイン酸の腎臓および肝臓内濃度はそれぞれ，湿重量１gあたり約４ngおよび約４ngと推定される。これは，内因性９-cis−レチノイン酸が抽出時に全-trans−レチノイン酸から形成されたものではないことを指示する。結論として，これらの実験は，９-cis-レチノイン酸が天然に存在するレチノイン酸異性体であることを確証するものである。
例３
ＲＸＲおよびＲＡＲに対するレチノイド異性体の
トランスアクチベーション像
ピークＸが全-trans−レチノイン酸の立体異性体であることの確立から，様々なレチノイド異性体が異なるレチノイド受容体アクチベーション像をもつ可能性が示唆された。レチノイン酸異性体がＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−αの転写特性を修飾する能力をさらに分析するために，全-trans-レチノイン酸の４種の主要な光学異性体を同定し，ＲＸＲおよびＲＡＲをトランスアクチベートする能力を検定した。図３には，ＲＡＲ−αおよびＲＸＲ−α両者に対する13-cis−，11-cis−，９-cis−および全-trans−レチノイン酸の用量反応曲線を示す。
レチノイン酸の４種の主要な異性体中，９-cis−レチノイン酸は，昆虫Ｓ２細胞（図３Ａ参照）および哺乳類ＣＶ−１細胞（図３Ｂ参照）の両者で，効力および効率の最も高いＲＸＲ−αのアクチベーターであることが明らかである。最大応答（ＥＣ50値）はそれぞれ１０-8Ｍおよび５×１０-8Ｍである。種々の異性体について観察された効力の順位は，両細胞系において同一である。９-cis−レチノイン酸は，11-cis−，13-cis−または全-trans−レチノイン酸よりも約４０倍効力の強いＲＸＲのアクチベーターである。これらのトランスアクチベーションのデータは，９-cis−レチノイン酸が内因性のＲＸＲ-αアクチベーターであることを強く示唆するものである。
これに反して，９-cis−レチノイン酸は，ＲＡＲ-αのアクチベーターとしては全-trans−レチノイン酸とほぼ等しい効力を示す（図３Ｃ参照）。９-cis−レチノイン酸のＲＡＲ−αに対するＥＣ50値は２×１０-7Ｍである。９-cis−レチノイン酸は，これまでに試験された最も効力の強いＲＸＲ−αリガンドである。
同様に，ＲＸＲの他のアイソフォーム（すなわち，ＲＸＲ−β，ＲＸＲ−γ）およびＲＡＲの他のアイソフォーム（すなわち，ＲＡＲ-β，ＲＡＲ−γ）の９-cis-レチノイン酸によるトランスアクチベーションについても調べた。表１に示すように，９-cis−レチノイン酸はまた同様に，これらのアイソフォームの強力なアクチベーターでもあることが明らかにされた。
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例４
９-cis−レチノイン酸はＲＸＲに直接結合する
９-cis−レチノイン酸がＲＸＲ−αをトランスアクチベートする能力から９-cis-レチノイン酸がＲＸＲに直接結合することも可能であったのか否かを調べるための試験が示唆された。ＲＸＲ−αをバキュロウイルス中で発現させ，哺乳動物細胞で発現させた蛋白質と同一の生化学的性質をもつことを示した。バキュロウイルス発現蛋白質は，分子量５１，０００で，ＲＸＲ−α抗体と特異的に反応し，特異的ＲＸＲレスポンスエレメントでることが以前に明らかにされているＤＮＡ配列［すなわちＣＲＢＰII，Mangelsdorfら，Cell66:555(1991)参照；アポリポ蛋白質ＡＩ遺伝子，Rottmanら，Mol.Cell Biol.11:3814(1991)参照］にインビトロで結合することが可能であった。
バキュロウイルス由来ＲＸＲへの９-cis-レチノイン酸のリガンド結合特性を特徴づけるため，飽和結合分析を実施した（図４参照）。放射標識９-cis-レチノイン酸は，飽和可能な様式でＲＸＲ−αに特異的に結合する。スキャッチャード分析により，Ｋd値１１．７n Ｍの単一高親和性結合部位が示唆される（図４ｂ参照）。同一の結合条件下に，［3Ｈ］−全-trans−レチノイン酸はＲＸＲ−αに結合しなかった（図４ａ参照）。さらに，９-cis-レチノイン酸はまた，高親和性リガンドとしてＲＡＲ−αに特異的に結合することも可能であった。９-cis−レチノイン酸は偽バキュロウイルス抽出物（すなわち，ＲＸＲを発現しない細胞からの対照抽出物）には結合しなかった。
同様に，ＲＸＲの他のアイソフォーム（すなわち，ＲＸＲ−β，ＲＸＲ−γ），ＲＡＲの他のアイソフォーム（すなわち，ＲＡＲ−β，ＲＡＲ−γ），および細胞性レチノイン酸結合蛋白質（ＣＲＡＢＰ）について全-trans−レチノイン酸および９-cis−レチノイン酸との結合試験を実施した。全-trans−レチノイン酸がこれらの「受容体」のそれぞれと結合することは知られているが，９-cis−レチノイン酸も，表２に示すように，レチノイド受容体の他のアイソフォームに結合することが見出された（ただし，細胞性レチノイン酸結合蛋白質，ＣＲＡＢＰとは結合しなかった）。
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ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの多くのメンバーの性質がこれまで，ＤＮＡセルロースクロマトグラフィーを用いて特性づけられ，定義されている［たとえば，Pike & Haussler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5485(1979)およびPikeら，J.Biol.Chem.258:1289(1983)参照］。ＶＤＲのような受容体は，それらの同族リガンドの存在下にＤＮＡ-セルロースと高い親和性をもって結合して［たとえば，Allegrettoら，J.Biol.Chem.258:1289(1983)参照］，リガンド−受容体複合体は塩勾配で溶出することが明らかにされている。予め，［3Ｈ］−９-cis−レチノイン酸で標識されたバキュロウイルス発現ＲＸＲのＤＮＡ−セルロースカラム像を図５に示す。２つの異なる像，すなわち，１）結合［3Ｈ］−９-cis−レチノイン酸の総量，および２）２００倍過剰のコールド（すなわち非標識の９-cis−レチノイン酸）の存在下に残存する結合のレベル，を示す。
０．１５Ｍ−ＫＣlでＤＮＡ-セルロースカラムから溶出する放射能ピークが存在する（図中に矢印を付す）。この溶出像は［3Ｈ］−全-trans−レチノイン酸の存在下にＲＡＲαで見られる像に類似する。２００倍過剰のコールドリガンド（すなわち非特異的な）が，結合総放射能の９０％以上と競合できることは，ピーク分画中の放射能はＲＸＲに特異的に結合した９-cis-レチノイン酸であることを示している。
カラムから溶出した放射能を有機溶媒で抽出してＨＰＬＣ分析に付した。
図５ｂを検討すると，ＲＸＲに結合した放射能は，クロマトグラフィーにおいて標品の９-cis−レチノイン酸と共移動することが明らかである。この観察は，［3Ｈ］−９-cis−レチノイン酸がＲＸＲに結合した種であることをさらに確証するものである。
ピーク分画中に含有される蛋白質が実際にＲＸＲであることを証明するために，これらの分画（図５ａにおける標識１〜１５）を，ＲＸＲα特異的ポリクローナル抗血清を用いてイムノブロッティングに付した（図５ａ，最上図）。放射能を含有するすべての分画がＭｒ５１，０００に明瞭なＲＸＲαのバンドを示している。バキュロウイルス偽抽出物で実施した同様の実験では，カラム上に特異的な放射能の残存は認められなかった。以上を合せて考えるとこれらのデータは，９-cis−レチノイン酸がＲＸＲに特的に結合できることが強く示唆される。
蛋白質サンプルを２×サンプル緩衝液［Laemelli,Nature Vol.227:680(1970)］に再懸濁し，５分間煮沸したのち，９％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に負荷した。電気泳動によって分離したのち，ゲルをHoefferのエレクトロトランスファー装置を用いて，３０ボルトで８時間，ニトロセルロース膜（Scheicher and Schuell）にイムノブロットした。ついで膜を，１０％イソプロパノール，１０％酢酸中１５分間インキュベートし，脱イオン水中で５分間およびＴ−ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ−TrisｐＨ７．５，１５０ｍＭ−ＮａＣｌおよび０．５％Ｔriton Ｘ−１００）中で５分間洗浄した。膜はＴ−ＴＢＳ中５％脱脂ミルクで１時間ブロックした。以下のプロトコールは，AmershamのＥＣＬ（増強化学ルミネッセンス）ウエスタンブロッティング検出システムキットによった。一次抗体はｈＲＸＲαのアミノ酸２１４〜２２９に相当する合成ペプチドに対して産生させた，ウサギポリクローナル血清とした［Kliewerら，Proc. Natl. Acad.Sci.USA89:1448-1452(1992)］。一次抗血清はＴ−ＴＢＳ中に１：５０００に希釈した。二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに接合させたロバ抗ウサギＩｇＧ，Amersham）は１：２５００に希釈して使用した。
例５
ライノマウスにおけるケラチン充満毛嚢のサイズに対する
９-cis−レチノイン酸の局所適用の効果（全-trans−レチノイン酸との比較）
全-trans−レチノイン酸が細胞分化に影響し，ケラチン化疾患の処置に強力な治療効果を発揮することが知られている［Eliasら，Arch.Dermatol.Vol.117:160-180(1981)］。Mezickら［J.Invest.Derm.Vol.83:110-113(1984)参照］によれば，全-trans−レチノイン酸によるライノマウス（hr/hr）の局所処置はケラチン化毛脂構造（ケラチン充満毛嚢）を軽減できることが明らかにされている。この動物試験モデルを，９-cis−レチノイン酸の「抗ケラチン化」作用の評価に使用した。結果は表３にまとめる。
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９-cis−レチノイン酸は局所適用１４日後に平均毛脂直径を低下させた。これらの結果は，１４日間の期間の９-cis−レチノイン酸の局所適用がライノマウス皮膚におけるケラチン化毛脂構造（ケラチン充満毛嚢）を軽減できることを証明するものである。９-cis−レチノイン酸による平均毛脂直径の低下は全-trans−レチノイン酸で認められた効果に匹敵するものであった。
例６
ＨＬ６０細胞の分化に対する９-cis−レチノイン酸の作用
（全-trans−レチノイン酸との比較）
レチノイドは，ヒト前骨髄球性白血病細胞を分化させることが知られている。ＨＬ細胞（前骨髄球性白血病に対するモデル系）の分化はニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）染料の還元（スーパーオキシドアニオンの生成）および白血球付着受容体，ＣＤ１８のβサブユニットをコードする遺伝子の上方調節の測定によって評価できる（J.B.C.Vol.263,No.27,pp.13863-13867）。
処置６日後にＮＢＴによって測定した９-cis-レチノイン酸誘導分化のＥＣ-50は０．２μＭで，全-trans−レチノイン酸の場合の２μＭに匹敵するものであった。最大効果（効率）はほぼ等しく，ＣＤ１８は両リガンドによって上方調節された。α−インターフェロンは，ＮＢＴで測定した場合，全-trans−レチノイン酸および９-cis−レチノイン酸両者により誘導される分化を増強した。
ＨＬ６０Ｒ細胞は全-trans−レチノイン酸による分化に抵抗性を示し，これは多分，レチノイン酸受容体−α遺伝子の変異に関連するものと思われる。この細胞系は，全-trans−レチノイン酸および９-cis−レチノイン酸の両者による分化に，１０μＭまでの濃度で抵抗性を示すことが見出された。
９-cis−レチノイン酸は，ＮＢＴおよびＣＤ１８の上方調節で明らかなように，ＨＬ６０細胞の分化に影響する。全-trans−レチノイン酸と比較すると，９-cis−レチノイン酸はより高い効力を示し，効率はほぼ等しい。
例７
メラノーマ細胞系の増殖に対する９-cis-レチノイン酸の作用
（全-trans-レチノイン酸との比較）
全-trans−レチノイン酸および数種の合成類縁体（レチノイド）は，インビボにおいて，良性および悪性の，化学的に誘発された上皮腫瘍の発症を防止することが知られている［Sponら，Fed.Proc.Vol.35:1332-1338(1976)］。Lotanら［J.Natl.Cancer,Vol.60:1035-1041(1978)］は，全-trans−レチノイン酸がインビトロにおいて数種の腫瘍細胞の増殖を阻止することを見出している。これらの以前の所見から，９-cis-レチノイン酸の増殖阻止活性を評価することに興味がもたれた。
９-cis-レチノイン酸は，以下のように，濃度依存性様式でマウスメラノーマ細胞系クローンＭ３の増殖を阻害した。
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同様に，９-cis-レチノイン酸はヒト一次転移メラノーマ細胞系ｃ８１−４６ｃの増殖を濃度依存性様式で阻害した。
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要約すると，９-cis-レチノイン酸は，インビトロにおいて，マウスメラノーマ細胞系クローンＭ３およびヒト転移メラノーマ細胞系ｃ８１−４６ｃの増殖を濃度依存性に阻害することが明らかにされた。９-cis-レチノイン酸は全-trans−レチノイン酸に比較して，これらの細胞に等しい阻害作用を有する。
例８
Ｆ９細胞の分化に対する９-cis-レチノイン酸の作用
（全-trans−レチノイン酸との比較）
レチノイドはマウス奇形癌腫細胞（Ｆ９）を分化させることが知られている。Ｆ９細胞の分化は特異的に，形態の不可逆的変化，ならびに生化学的マーカー，アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の誘導を伴う（Biochem.J.Vol.274:673-678）。
全-trans−レチノイン酸および９-cis-レチノイン酸はいずれも，細胞形態学的な不可逆的変化によって指示されるように，Ｆ９細胞の部分内皮様細胞への分化を誘導した。全-trans−レチノイン酸はＡＬＰの誘導において，９-cis−レチノイン酸より４０倍高い効力を有し，最大応答は類似していた。
組織プラスミノーゲンアクチベーター因子の応答は，全-trans−レチノイン酸に対してよりも９-cis−レチノイン酸に対する方が低かった。９-cis−レチノイン酸（または全-trans−レチノイン酸）の１μＭ濃度では，ｔＰＡの細胞性活性にそれぞれ０．４８±０．０５および０．８０±０．０８の上昇が観察された。この作用は濃度依存性であった。
要約すれば，９-cis−レチノイン酸は，形態学的変化およびマーカー酵素活性によって明らかなように，Ｆ９細胞の分化を促進した。全-trans−レチノイン酸に比較すると，９-cis-レチノイン酸の方が，両酵素マーカーに関して，効力が低かった。効率はＡＬＰでは匹敵するものであったが，ｔＰＡについては不明確であった。
例９
角化細胞の分化に対する９-cis-レチノイン酸の作用
（全-trans-レチノイン酸との比較）
レチノイドは培養正常ヒト上皮角化細胞（ＮＨＥＫ５３４細胞系）の扁平細胞分化を，形態的変化ならびにトランスグルタミナーゼ（Ｉ型）の誘導阻害から判断して，阻害することが知られている（J.Biol.Chem.Vol.261:15097,1986；Lab.Invest.Vol.56:654,1987）。
全-trans-レチノイン酸および９-cis-レチノイン酸はいずれも，形態的変化およびトランスグルタミナーゼ活性から判断して，濃度依存性様式で，扁平細胞分化を阻害した。全-trans-レチノイン酸および９-cis-レチノイン酸による分化阻害のＥＣ50は同一であった（２０±２．８ｎＭ）。トランスグルタミナーゼ活性に対する作用については，９-cis-レチノイン酸と全-trans−レチノイン酸のＥＣ50および効力はほぼ同一であった。
例１０
９−フェニル−９-cis−レチノイン酸
以下のホスフォネート試薬
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４４mg（０．１０mmole）のＴＨＦ（０．５ml）中溶液に室温でＮａＨ（油中６０％，５mg；０．１３ml）を加え，混合物をその温度で１０分間撹拌した。これに，ＴＨＦ（０．５ml）中アルデヒド
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２６mg（０．０８mmole）を室温で加え，この混合物を３０分間そのまま撹拌した。常法での水溶液後処理［ＮＨ4Ｃｌ水溶液，Ｈ2Ｏ，食塩水，ＭgＳＯ4］を行うと９−フェニル−９-cisエステルおよび９−フェニル−９，13-ジcisエステルの混合物（３０mg，９２％）が得られた（９-cis：９，13-ジcisの計算比＝４：１）。
９−フェニル−９-cis−レチノイン酸エチルエステル
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９−フェニル−９，13-ジcis-レチノイン酸エチルエステル
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９-cisと９，13-ジcisエステル（２０mg，０．０５mmole）のメタノール（０．７ml）およびＨ2Ｏ（０．７ml）中混合物に２５℃でＫＯＨ（１４．３mg，０．２５mmole）を加えた。ついで，混合物を７０℃に２時間加熱した。反応混合物を０℃に冷却し，１０mlのジエチルエーテルで希釈し，ＨＣｌ（０１２Ｍ−ＨＣｌ，２．１７ｍｌ）で酸性にした。常法での水溶液後処理［Ｈ2Ｏ，食塩水，ＭgＳＯ4］を行うと９-cisおよび９-13-ジcis酸の混合物が得られた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ，ベンゼン中１３％酢酸エチル）によって，純粋な９−フェニル−９-cis−レチノイン酸（１４．５mg，１００％）が得られた。
９−フェニル−９-cis−レチノイン酸の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは次の通りである。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨz，ＣＤＣl3）：δ７．４−７．３（ｍ，５Ｈ，芳香性），７．２０（ｄｄ，Ｊ＝１６，１２Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．６０（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．３８（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．２５（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．１５（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），５．８０（ｓ，１Ｈ，オレフィン性），２．４８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．０５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），１．７９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．７０−１．４０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−ＣＨ2），１．００（ｓ，６Ｈ，２×ＣＨ3）。
９−フェニル−９-cis−ＲＡ：ＴＬＣ−Ｒｆ＝０．２３（ベンゼン中１３％酢酸エチル）
例１１
４−ヒドロキシ−９-cis−レチノイン酸
９-cis-レチノイン酸（５１mg，０．１７mmole）の１，４−ジオキサン（２ml）中溶液に，ＳeＯ2（１９mg，０．１７mmole）を６０℃で加えた。この溶液をその温度でそのまま３時間撹拌した。ついで反応混合物をシリカ床を通して濾過した。濾液を濃縮して，残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ，石油エーテル中７５％エーテル）に付すと，４−ＯＨ−９-cis−レチノイン酸（２１mg，４０％収率）が得られた。その特性は次の通りである。
油状，ＴＬＣ−Ｒｆ＝０．２５（シリカ，石油エーテル中７５％エーテル）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．０８（ｄｄ，Ｊ＝１６，１２Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．６４（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．２１（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．２０（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．０４（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，オレフィン性），５．７９（ｓ，１Ｈ，オレフィン性），４．０２（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−Ｏ），２．１８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．０２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．８２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．０−１．６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−ＣＨ2），１．０５，１．０３（２×ｓ，２×３Ｈ，２×ＣＨ3）。
例１２
４−ケト−９-cis−レチノイン酸
４−ヒドロキシ−９-cis−レチノイン酸（１６mg，０．０５mmole）のＣＨ2Ｃl2（１．５ml）中溶液に，デス-マーチン試薬［Dess & Martin,J.Org.Chem.48:4155(1983)参照］（４２mg，０．１mmole）を一度に２５℃で加えた。５分間撹拌したのち，混合物を１０mlのエーテルで希釈し，これにＮaＳＯ3（５５mg）を含む飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５ml）を加えた。エーテル層をＨ2Ｏ（２×５ml），食塩水（５ml）で洗浄し，乾燥した（ＭｇＳＯ4）。溶媒を減圧下に回収し，残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン中６０％エーテル）に付すと，４−ケト−９-cis−レチノイン酸（１４mg，９０％）が得られ，その特性は次の通りであった。
ＴＬＣ−ｒｆ＝０．６（シリカ，ヘキサン中８０％エーテル）；
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．０５（ｄｄ，Ｊ＝１６，１２Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．８２（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．３２（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．３０（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），６．２０（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン性），５．８０（ｓ，１Ｈ，オレフィン性），２．５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2−ＣＯ），２．３１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．０１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．８９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．２０（ｓ，６Ｈ，２×ＣＨ3）。
例１３
９−フェニル−９-cis−レチノイン酸，４−ヒドロキシ-９-cis-レチノイン酸
および４-ケト-９-cis-レチノイン酸のインビトロにおける評価
例１０，１１および１２に記載の化合物の効力および効率を，例１に「ＣＶ−１細胞におけるコトランスフェクションアッセイ」の標題で記載したようにして測定した。結果は表４に示す。
0004001618.tif 000024
以上，本発明を，その一部の好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明したが，その修飾および改変は，記載され請求された発明の精神および範囲内に包含されるものであることを理解すべきである。
配列表
配列番号１：
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配列番号：２
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
0004001618.tif 000030
【図３ｂ】
0004001618.tif 000031
【図３ｃ】
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【図４ａ】
0004001618.tif 000033
【図４ｂ】
0004001618.tif 000034
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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