(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フマル酸２アンモニウム溶液にアスパルターゼを作用させてＬ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を得、フマル酸を添加した後に該溶液からＬ−アスパラギン酸を結晶化してなるＬ−アスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を５０〜１３０℃に加温後、該溶液に含まれるフマル酸とＬ−アスパラギン酸の合計に対して０．４〜０．８倍モルのフマル酸を、フマル酸乾燥結晶、水分を含んだフマル酸結晶又はフマル酸の水懸濁液の形態で添加し、せん断力をかけることによって一旦均質溶液とした後、放置又は冷却して前記均質溶液を５０〜９５℃の温度で０．１秒〜１時間保持し、０．１〜５℃／分の速度で冷却して該溶液からＬ−アスパラギン酸を析出させ、析出したＬ−アスパラギン酸を分離する際のＬ−アスパラギン酸結晶含有懸濁液の温度が２５〜６０℃の範囲であることを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法。
【請求項２】
水分を含んだフマル酸結晶とＬ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を連続的に混合する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記析出を連続法で行う請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アスパラギン酸を析出させる際の冷却を、減圧下で水を蒸発させ、蒸発した水を凝縮器で冷却凝縮させて、Ｌ−アスパラギン酸の結晶析出槽に戻すか又は留出させる方法により行う請求項１記載の方法。
【請求項５】
減圧下での冷却の際に、冷却したい液が沸騰し始める蒸気圧より１０〜２００Torr高い範囲から１〜２０Torr／分の速度で減圧する請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記フマル酸２アンモニウム溶液が、Ｌ−アスパラギン酸を析出させた後の母液から調製される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアスパルターゼを用いてフマル酸から結晶性のL−アスパラギン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
D,L−アスパラギン酸２ナトリウム溶液にフマル酸を添加してD,L−アスパラギン酸を析出回収する方法が特開昭４８−５６６１８号公報に開示されている。この方法では、フマル酸２ナトリウムと大過剰のアンモニアを化学的に反応させてD,L−アスパラギン酸を生成させ、過剰のアンモニアを追い出した後、フマル酸を添加することによってD,L−アスパラギン酸を析出させて分離している。
【０００３】
この場合、フマル酸を添加する前の溶液にはD,L−アスパラギン酸２ナトリウムが溶解しており、これにフマル酸を添加し、D,L−アスパラギン酸を分離した濾液にはフマル酸２ナトリウムが含有されている。この濾液にフマル酸に対して大過剰のアンモニアを追加して同じ反応を繰返すことが開示されている。
【０００４】
通常、L−アスパラギン酸をフマル酸２アンモニウムから酵素を用いて製造する場合、原料であるフマル酸に対して１倍モル以上のアンモニアが必要であり、反応の平衡をL−アスパラギン酸側に片寄らせるために通常２〜２．３倍モルのアンモニアが用いられている。またこの反応を触媒する酵素であるアスパルターゼの至適ｐHは８．３付近であり、このｐHよりあまりに高いｐH範囲では酵素活性の低下、酵素タンパク質の変性等の問題が生じてくる。特開昭４８−５６６１８号公報の方法ではフマル酸２ナトリウム溶液に大過剰のアンモニアを追加して繰返しの反応に用いているが、アンモニアをアスパルターゼの酵素反応に用いる場合にはアンモニアを大過剰に用いることはできない。
【０００５】
フマル酸２ナトリウム（濃度：１．７２mol/l）のｐHは８．４であるが、これに１倍モルのアンモニアを追加した溶液は、３０℃でｐH１２．１であり、アスパルターゼが変性してしまう。したがってアスパルターゼによる酵素反応にはアンモニアを使用することができない。
【０００６】
また、日本国特許第２５２４３０６号明細書においては、L−アスパラギン酸モノアンモニウム溶液にフマル酸を添加してL−アスパラギン酸を析出回収する方法が開示されている。そしてこの方法には、フマル酸２アンモニウム溶液をアスパルターゼの作用によってL−アスパラギン酸モノアンモニウム溶液とした後に、フマル酸を添加して、L−アスパラギン酸を析出させ、分離し、結晶を分離した後の濾液にアンモニアを追加して次の反応に再使用することが示されている。
【０００７】
この方法ではＬ−アスパラギン酸モノアンモニウム溶液にフマル酸を添加することによって、L−アスパラギン酸とフマル酸の塩交換反応を、フマル酸若しくはL−アスパラギン酸のどちらか一方又は両方の結晶が常に存在する不均一条件下で行っている。この方法では、フマル酸の溶解とＬ−アスパラギン酸の結晶析出が同時に起こるため、Ｌ−アスパラギン酸が結晶として析出する際に、未溶解のフマル酸結晶を核として結晶成長し、これによって得られるＬ−アスパラギン酸にフマル酸が混入して純度が低下するという問題があった。しかも、結晶核としてフマル酸が混入するため、結晶を再度懸濁するなどの洗浄操作を行っても、混入したフマル酸を効果的に除くことができない。また、この方法で析出させた結晶は、数μｍの大きさの微小であるため、取り扱いが困難である。
【０００８】
以上のように、L−アスパラギン酸のアンモニウム塩にフマル酸を添加してL−アスパラギン酸を晶析させる方法においては、完全に均質な溶液とした後、L−アスパラギン酸の結晶を析出させる効果的な方法は見出されていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決し、アスパルターゼを用いる、より純度の高い結晶性のL−アスパラギン酸を製造する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、あらかじめ加温したL−アスパラギン酸アンモニウム溶液にフマル酸を添加して一旦均質に溶解し、その後にL−アスパラギン酸を析出させると、得られるL−アスパラギン酸結晶の純度が高くなることがわかった。
【００１１】
すなわち、フマル酸アンモニウム溶液をアスパルターゼの作用によってL−アスパラギン酸アンモニウム溶液とし、この溶液を５０〜１３０℃に加熱したところに、この溶液中に含まれるフマル酸とL−アスパラギン酸の合計に対して０．４〜０．８倍モルのフマル酸を添加、攪拌すると、すぐに溶解して結晶が存在しない均質な溶液を得ることができる。この一旦均質となった溶液を放置又は冷却すると、L−アスパラギン酸の結晶のみを析出させることができ、また、結晶の形状も平均１００〜１０００μｍの長さの針状結晶にすることができることを見出した。
【００１２】
このように、L−アスパラギン酸アンモニウム溶液をあらかじめ加温しておけば、フマル酸がすぐに溶解し均質溶液にすることができるため、フマル酸結晶がL−アスパラギン酸に混入してくるのを防ぐことができる。
さらに、L−アスパラギン酸アンモニウム溶液にフマル酸を添加した後に、０．１〜５℃／分の速度で冷却することによってL−アスパラギン酸を析出させると、得られるL−アスパラギン酸結晶の純度が高くなることがわかった。
【００１３】
以上のような方法により、純度の高いL−アスパラギン酸結晶を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１４】
（１）フマル酸２アンモニウム溶液にアスパルターゼを作用させてL−アスパラギン酸アンモニウム溶液を得、フマル酸を添加した後に該溶液からL−アスパラギン酸を結晶化してなるL−アスパラギン酸の製造方法において、前記L−アスパラギン酸アンモニウム溶液を５０〜１３０℃に加温後、該溶液に含まれるフマル酸とL−アスパラギン酸の合計に対して０．４〜０．８倍モルのフマル酸を添加し、せん断力をかけることによって一旦均質溶液とした後、該溶液からＬ−アスパラギン酸を析出させることを特徴とするL−アスパラギン酸の製造方法。
【００１５】
（２）析出したＬ−アスパラギン酸を分離する際のＬ−アスパラギン酸結晶含有懸濁液の温度が２５〜１００℃の範囲である（１）記載の方法。
（３）前記均質溶液を５０〜１３０℃の温度で０．１秒〜１時間保持する（１）記載の方法。
（４）水分を含んだフマル酸結晶とＬ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を連続的に混合する（１）記載の方法。
（５）前記析出を連続法で行う（１）記載の方法。
（６）前記フマル酸２アンモニウム溶液が、Ｌ−アスパラギン酸を析出させた後の母液から調製される、（１）記載の方法。
【００１６】
本発明に用いるアスパルターゼとしてはアスパルターゼ遺伝子を含む形質転換体、又はその処理物を固定化したものを用いることができる。
また、アスパルターゼとして、２５０U／ｍｌ以上の活性を有する固定化アスパルターゼを含む反応器にフマル酸換算で５〜２５％のフマル酸、及びL−アスパラギン酸を含有する、フマル酸２アンモニウム、L−アスパラギン酸アンモニウム混合溶液を通液する上記方法で通液速度はLHSV=２〜２５とすることが好ましい。
【００１７】
なお、１Uは１μmolL−アスパラギン酸生成／ｍｉｎ／ｍｌ固定化酵素を、LHSV（空塔速度）は通液容量（ｍｌ）／触媒充填容量（ｍｌ）１時間あたり、をそれぞれ意味する。
また、固定化アスパルターゼとしては固定化の担体としてイオン交換樹脂を用い、吸着あるいはポリマーでの被覆によって菌体あるいは菌体処理物を前記担体に固定化したものを用いることができる。
また、固定化アスパルターゼとしては固定化の担体として球状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂を用い、次の一般式（Ｉ）
【００１８】
【化１】
0003995850.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次式
【００２０】
【化２】
0003995850.tif 000003
【００２１】
により表される２価基であり、Ｒ1及びＲ2は相互に独立に水素原子又は有機残基であり、
【００２２】
【化３】
0003995850.tif 000004
【００２３】
は陰イオンを表し、そしてｎは100〜5000の数である）
により表されるポリマーと菌体あるいは菌体処理物を混合し球状スチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂表面に被覆したものを前記担体に固定化したものを用いることができる。
【００２４】
前記式（Ｉ）において、Ｒ1又はＲ2で表される有機残基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、特にメチル基が好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシル基等の置換基を有する有機残基を使用することができ、例えば、４−クロロ−２，２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２,５−ジクロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３,５−ジメチルノニル基など、好ましくは３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル基を用いることができる。また、陰イオンとしては、例えば、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-等のハロゲンイオンが挙げられる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるアスパルターゼ活性を有する酵素含有物は、例えば、高アスパルターゼ活性を有することが知られている大腸菌やブレビバクテリウム属、シュードモナス属の微生物などの菌体、あるいはこれらの菌体を超音波、摩砕、凍結融解、酵素処理、界面活性剤処理などを施して破砕した菌体破砕物、さらに硫酸アンモニウム塩析、アセトン沈殿など、常法により得られる部分精製したもの、あるいはクロマトカラム等、常法で得られる精製したものなどであり、そのいずれでも使用できる。生産性を高める目的から、アスパルターゼ活性を有する菌体としては、特にアスパルターゼ遺伝子を組み込んだプラスミドによって形質転換され、アスパルターゼを著量生成するようになった大腸菌を用いるのが好ましい。本発明に使用できるアスパルターゼ遺伝子は、大腸菌（Escherichia coli）やシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens)、エンテロバクター(Enterobacter)属、シトロバクター(Citrobacter) 属に属する微生物などで大腸菌（Escherichia coli)と自然界で遺伝子の交雑が認められている微生物であってアスパルターゼ活性を有している微生物由来のものであれば好適に使用できる。 そして、この遺伝子は、例えば、大腸菌Escherichia coli K-12(IFO3301)ゲノムＤＮＡ、Pseudomonas fluorescens(IFO3081)ゲノムＤＮＡから、公知のアスパルターゼ遺伝子配列をもとにして作成したプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって増幅することにより取得することができる。
【００２６】
アスパルターゼ遺伝子を組み込むプラスミドは大腸菌Escherichia coliに属する微生物菌体内で複製されるプラスミドであれば特に限定されないが、pUC18、pUC19、pKK223-3などを用いることができる。またアスパルターゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを導入する宿主微生物としては大腸菌Escherichia coli K-12株が好適に用いられる。これらのアスパルターゼ活性含有微生物菌体、あるいはその処理物、又は酵素を担体に固定化して用いることもできる。
【００２７】
固定化の担体としては、セルロース、アルギン酸、カラギーナン、マンナンゲルなどの天然系高分子、あるいは、イオン交換樹脂やポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどの適当な合成高分子を常法により用いることができる。これらの中でも、特に、球状のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂担体に、前記一般式（Ｉ）により表されるポリマーと菌体あるいはその処理物とを混合したものを被覆することによって固定化したものが好ましい。
【００２８】
この方法で固定化して作成した固定化アスパルターゼは圧力損失が少なく、拡散層も薄いので拡散抵抗が小さく、高ＬＨＳＶでの反応に使用することができる。
本発明に用いられる基質はフマル酸２アンモニウム溶液、すなわちフマル酸アンモニア中和塩水溶液である。中和に用いるアンモニアの使用量は特に限定されないが、基質液中のフマル酸に対して、好ましくは１．８〜２．８倍モル、より好ましくは２．０〜２．４倍モルの範囲である。基質液のｐHは特に限定されないが、２５℃の温度条件下で、好ましくは6〜１１、より好ましくは７〜１０、最も好ましくは７．５〜９．５の範囲にする。
【００２９】
反応の際のフマル酸濃度は通常５〜２５重量％の範囲が好ましいが、生産性と得られるL-アスパラギン酸の純度、フマル酸塩の溶解度を考慮すると特に１２〜２５重量％の範囲で反応させるのが効果的である。
【００３０】
また基質媒体にはさらに、塩化マンガン、硫酸マンガンなどのマンガン塩、又は塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩、コバルト塩などの２価金属塩を添加することが望ましく、好ましくは０．１〜５０ｍM、より好ましくは１〜１０ｍMの濃度で添加することが望ましい。
【００３１】
本発明における反応槽の態様は特に限定されないが、たとえばバッチ型反応装置、カラム型反応装置など、従来から知られている反応槽で行うことができる。反応槽は一つであっても、複数であっても差し支えない。工業的な大量生産には、特にカラム型反応装置が好ましく、先のスチレンジビニルベンゼン共重合体イオン交換樹脂担体に、一般式（Ｉ）により表されるポリマーと、アスパルターゼ遺伝子を組み込んだプラスミドによって形質転換され、アスパルターゼを著量生成するようになった大腸菌菌体を混合したものを被覆して作成した固定化アスパルターゼを用いると、通液速度LHSV=２〜２５の範囲で反応を行うことができる。通常の大腸菌を固定化して用いる場合には活性があまり高くないので、反応時間を長くしたり、通液速度を遅くしたりする必要があるが、上記のアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼは非常に活性が高いので、上記の通液速度でも十分に転化率をあげることができる。反応の際の温度は、低温では反応速度が低下するため、通常１０℃を下限とし、高温下ではアスパルターゼの失活を招くため５０℃を上限とするのが好ましく、より好ましくは１５〜４０℃の範囲とする。
【００３２】
上記のような条件で、フマル酸アンモニウム溶液を、アスパルターゼによる酵素反応に供し、L−アスパラギン酸アンモニウム溶液に転化する。反応は、転化率が高ければよいが、平衡に達していなくても、転化率９０％程度であれば、後のL−アスパラギン酸の結晶析出には支障はない。
【００３３】
次に、このようにして得られた反応液を加温する。加温する温度は５０℃以上である。加熱温度の上限は特にないが、反応液の変質などの問題がない１３０℃程度を上限とする。この時の温度があまり低すぎるとフマル酸を添加したときに均質に溶解せず、フマル酸結晶を包含したL-アスパラギン酸が析出し、純度が低下する。また、上記の上限より高すぎると、反応液が変質したり、また高耐圧の装置を使用する必要が出てくる。次いで、加温された反応液にフマル酸を添加する。添加するフマル酸の量は、反応液中に存在するフマル酸とL−アスパラギン酸の合計に対して、下限は０．４倍モル以上、好ましくは０．４５倍モル以上であり、上限は０．８倍モル以下、好ましくは０．６倍モル以下である。この量が０．４倍モル未満であると、結晶として分離できるL−アスパラギン酸量が少なくなる。また、０．８倍モルより多いと、フマル酸を添加した後、均質な状態に溶解せず、得られるL−アスパラギン酸にフマル酸及びその塩が混入してくることにより純度が低下する。
【００３４】
フマル酸の添加の際の形態としては、フマル酸乾燥結晶、水分を含んだフマル酸結晶、フマル酸の水懸濁液などを用いることができる。プロセスへの負荷という面では、特に、水分含量０．５％未満のフマル酸乾燥結晶を用いると、結晶を分離した後の濾液を濃縮する際の負荷が小さくなるという利点があるため、好ましい。また、取り扱いという面では、特に、水分を含んだフマル酸結晶は粉塵などを含まず、また加温した反応液へのなじみも良いため、これを用いると溶解に要する時間が短くなるなどの利点がある。水分を含んだフマル酸結晶の含水率は、含水フマル酸結晶の重量に対して、下限は好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは３重量％以上、上限は好ましくは４０重量％以下、より好ましくは１０％以下である。上記含水率が０．５重量％より少ないと、フマル酸粉塵が発生する恐れがある。また、４０重量％より多いと、粉体として取り扱うことが難しくなる。また、フマル酸の水懸濁液を使用すると、ポンプを用いてスラリーを反応液に添加することができ、工業的に実施しやすくるなるため好ましい。フマル酸の水懸濁液中の水分含量は、フマル酸に対して、下限は好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上、上限は好ましくは２００重量％以下、より好ましくは１５０重量％以下である。上記水分含量が５０重量％より少ないと、流動性が少なくなり、スラリーとしてポンプで添加するのが難しい。また、２００重量％より多いと、反応液をリサイクル使用する際に濃縮する水の量が多くなる。また、この水分を含んだフマル酸結晶又はフマル酸の水懸濁液を、上述のように加温した反応液と同じ温度に加温しておくと、反応液への溶解が早くなるため好ましい。
【００３５】
フマル酸を添加した反応液は５０℃以上１３０℃以下でせん断力をかけて溶解させる。せん断力は、具体的には激しく攪拌、混合することによりかけることができる。これにより、反応液はフマル酸の結晶もL−アスパラギン酸の結晶も存在しない均質溶液となる。このときのせん断力をかける方法はバッチ式の攪拌槽、連続式の混合管などを用いることができる。連続式の混合管としては、スタティックミキサーなどのラインミキサー等が好ましい。混合溶解に要する時間はラインミキサーでは０．１〜数秒程度であり、攪拌槽では１〜１０分程度である。フマル酸の添加にフマル酸の水懸濁液を用いる場合、図２に示すような装置を用いると連続的な溶解を行うことができるので好ましい。
【００３６】
フマル酸を溶解させた反応液は、０．１秒〜１時間、その温度を保持することが好ましい。場合によっては、この操作によってL−アスパラギン酸の結晶の析出が始まる。このとき、溶液中のフマル酸とL−アスパラギン酸の合計に対するアンモニアのモル比は、（フマル酸＋L−アスパラギン酸）：アンモニア＝１．１：１〜１．８：１であり、アンモニアの量がL−アスパラギン酸とフマル酸を中和するに必要な量よりも少ない。このような条件下では、フマル酸とL−アスパラギン酸の結晶がアンモニアによって完全には中和されていないため、通常の条件では完全に溶解せず、フマル酸が溶解するに従って、アンモニウムイオンと対塩を形成することによって溶解しているL−アスパラギン酸がアンモニウムイオンをフマル酸に奪われて、L−アスパラギン酸結晶として析出してくる。しかし、反応液を加温しておき、フマル酸の溶解を速やかに行うと、フマル酸の結晶もL−アスパラギン酸の結晶も存在しない均質溶液とすることができ、その後析出させるL−アスパラギン酸の純度を高くすることができる。
【００３７】
L−アスパラギン酸の結晶析出は、この溶液を攪拌しながら放置又は冷却することによって行うことができる。この操作は、当業者に公知の方法により行うことができるが、特に例示すれば次のように行う。まず、２３％L−アスパラギン酸アンモニウム溶液（２５℃、でのｐH８．５）１Lを９５℃に加熱し、この反応液にフマル酸を１００ｇ添加し激しく攪拌すると、一旦均質溶液となる。この溶液を攪拌しながら放置すると、約３分で少量のL−アスパラギン酸の微結晶が析出しはじめ、溶液が半透明となる。さらに攪拌を３０分継続するとL−アスパラギン酸の結晶析出が進み、全体が白濁した状態となる。この溶液をさらに冷却すると、大量のL−アスパラギン酸の結晶が析出する。
【００３８】
また、別の例では、２３％L−アスパラギン酸アンモニウム溶液（２５℃、でのｐH９．５）１Lを９５℃に加熱し、この反応液にフマル酸を１００ｇ添加し激しく攪拌すると、一旦均質溶液となる。この溶液を攪拌しながら３０分放置しても結晶は析出しない。この溶液を冷却すると８３℃付近で半透明となり、Ｌ−アスパラギン酸の微結晶が析出し始める。この溶液をさらに冷却するとL−アスパラギン酸結晶が析出する。
【００３９】
このときの冷却の速度は特に限定されないが、下限は、好ましくは０．１℃／分以上、より好ましくは０．２℃／分以上、上限は、好ましくは５℃／分以下、より好ましくは３℃／分以下である。５℃／分より速いと、析出するL−アスパラギン酸の純度が低下するだけでなく、結晶のサイズが小さくなり、結晶の取り扱いが困難となる。また、０．１℃／分より遅いと、冷却に長時間を要することとなり、生産性が悪くなる。なお、この範囲であれば適宜冷却速度を変えて行うこともできる。
【００４０】
この冷却の方法としては、通常、攪拌槽を使用する方法を用いる。このような方法としては、ジャケットにおいて冷却する方法、減圧下で水を蒸発させ、凝縮器によって蒸発させた水を凝縮させて、攪拌槽に戻すか又は系外に留出させることによって、蒸発潜熱を奪うことにより冷却する方法などを採用することができる。特に、蒸発潜熱による冷却方法では、冷却面にL−アスパラギン酸の結晶が付着することがなく、冷却効率が低下しないので、効率よく冷却を行うことができるため、工業的に有利である。
【００４１】
この蒸発潜熱による冷却方法での冷却の際の減圧の速度は、フマル酸を添加した液が沸騰を始める蒸気圧から１０Torr以上、好ましくは５０Torr以上、２００Torr以下、好ましくは１００Torr以下で高い圧力から、１分間に１Torr以上、好ましくは２Torr以上、２０Torr以下、好ましくは１０Torr以下の速度で減圧度を高めるのが好ましい。１Torr／分より遅いと、冷却に長時間を要し、また、２０Torr／分より速すぎると、フマル酸を添加した液が突沸したり、析出する結晶のサイズが小さくなりすぎたりする。結晶が小さくなりすぎた場合には、結晶サイズが数μｍになることもあり、結晶分離の際やその後の取り扱いが困難となる。
【００４２】
フマル酸を添加した液は、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、好ましくは１００℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは６０℃以下まで冷却する。冷却を終了した液は、その温度を保ったまま、１分〜１時間保持してL−アスパラギン酸結晶の析出を完了させることが好ましい。このようにして析出させたL−アスパラギン酸の結晶の形状は、主に平均３０〜１０００μｍの長さの針状結晶であり、濾過の際の液切れが良く、簡易な洗浄操作によって純度を高くすることができる。
【００４３】
析出したL−アスパラギン酸の分離方法については、吸引濾過や遠心濾過など、通常の方法で行うことができるが、特に含水率を低くすることができる遠心濾過などの方法が好ましい。遠心濾過では遠心器の能力によって異なるが、分離したL−アスパラギン酸結晶含水率を５〜３０％程度に下げることができ、これによって高純度のL−アスパラギン酸結晶を得ることができる。
【００４４】
分離されたL−アスパラギン酸の結晶は、必要に応じて水で洗浄される。洗浄を行わない場合、L−アスパラギン酸の純度は９８〜９９重量％程度になるが、洗浄を行うことにより、L−アスパラギン酸の結晶に少量混入してくるフマル酸塩の量を少なくすることができ、得られるL−アスパラギン酸の純度を安定して９９重量％以上にすることができるので好ましい。しかしながら、結晶を分離した母液の再使用を考えた場合、あまり大量の水で洗浄することは好ましいことではない。使用する洗浄水の量は、L−アスパラギン酸結晶の量に対して、２重量％以上、好ましくは４重量％以上、より好ましくは８重量％以上であり、２００重量％以下、好ましくは１００重量％以下、より好ましくは８〜５０重量％以下である。
【００４５】
晶析の工程を連続的に行う場合には、あらかじめ晶析終了に相当する温度に設定した晶析スラリー槽に、均一に溶解した液又は部分的に結晶が析出し始めた液をフィードすることによって、晶析スラリー槽内のＬ-アスパラギン酸結晶を成長させ、大きな結晶とすることもできる。この際の冷却は減圧下で水を蒸発させる方法、ジャケットや冷却コイルで冷却する方法などの方法を採用することができるが、減圧下で水を蒸発させて蒸発潜熱を奪う方法が特に好ましい。減圧した槽に均一に溶解した液をフィードする方法としては、オリフィスなどを用いて減圧槽との間に抵抗をつけて槽内に導入する方法、晶析スラリー槽からスラリーを循環させ、このラインに導入する方法などが特に好ましい。このような方法によると、析出した結晶が大きく成長しやすい。均一に溶解した液のフィード速度をコントロールする必要は特にないが、導入した液が十分に冷却され、晶析スラリー槽の温度が、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、好ましくは１００℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは６０℃以下に保たれることが望ましい。連続晶析の際の晶析スラリーの滞留時間は１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上であり、１０時間以下、好ましくは５時間以下、より好ましくは２時間以下である。
【００４６】
このようにして、簡単な方法により、少量の、例えば０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１重量％のフマル酸塩を含有するL−アスパラギン酸を得ることができる。このフマル酸塩を含有する結晶は、乾燥後の結晶が飛散しにくいため取り扱いが容易であり、工業用L−アスパラギン酸として極めて有用である。また、このL−アスパラギン酸はさらに精製を繰り返すことによって、食品添加物、医薬品用などに用いることも可能である。
【００４７】
L−アスパラギン酸を分離した母液は、上記洗液と混合し、フマル酸及びアンモニアを添加してL−アスパラギン酸製造用の基質液として再使用することができる。この場合には、必要に応じて、母液及び／又は洗液を濃縮するなどの適切な調整をする。例えば、洗液や添加するアンモニア水からくる水の量だけ容量が増えるので、母液及び／又は洗液を濃縮することによってアンモニア水添加後に初期の容量になるようにすることができる。
【００４８】
添加するフマル酸の量は、結晶として分離されたL−アスパラギン酸のモル数からL−アスパラギン酸の晶析のために添加したフマル酸のモル数を差し引いた量であればよい。また、アンモニアの量は、結晶として分離されたL−アスパラギン酸のモル数と同モルの量であればよい。こうすることによって、溶液中に存在するフマル酸とL−アスパラギン酸の合計モル数に対して、アンモニアとL−アスパラギン酸の合計モル数の比を１：１．５〜２．５の範囲にすることができる。このとき、溶液のｐHは２５℃で７．５〜９．５の範囲である。
【００４９】
具体的には、L−アスパラギン酸を分離した母液と洗浄液に上記フマル酸を添加し、加熱減圧することによって過剰の水分を留去して濃縮し、ここに上記アンモニアを添加することによってL−アスパラギン酸製造のための原料液とすることができる。
【００５０】
このようにして調節した基質液を用いて、アスパルターゼ活性を有する酵素含有物による反応、加熱、フマル酸の添加、冷却によるL−アスパラギン酸結晶の析出、L−アスパラギン酸結晶の分離及び母液の再調製を繰り返すことにより、母液が基質液として循環使用される。本発明によれば、母液の循環は１０回以上可能である。
【００５１】
また循環使用を繰り返すことによって反応液が淡黄色に着色するが、必要に応じて酵素含有物による反応後、その反応液の一部をパージし、着色物質の蓄積を防ぐこともできる。パージする反応液の量は、全反応液に対して、下限は１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であり、上限は２０％以下、好ましくは１０％以下である。パージした反応液中に含まれるL−アスパラギン酸は硫酸などの鉱酸によって、通常の方法で結晶析出及び分離することによって回収することができる。また、着色物質の蓄積を防ぐためには、反応液を活性炭処理するなどの通常の方法を用いることもできる。
【００５２】
【実施例】
次に本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例に限定されるものではない。
〔調製例１〕
遺伝子工学的手法による大腸菌由来のアスパルターゼの調製方法を説明する。
（ｉ）Escherichia coliアスパルターゼ組み換え体の作成
財団法人醗酵研究所から購入した大腸菌（Escherichia coli）ＩＦＯ３３０１株を表１に示すＬＢ培地に接種して、37℃で８時間培養した。この培養液１mlから菌体を回収し、蒸留水１mlに懸濁した。この菌体懸濁液１μlをアスパルターゼ遺伝子を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００５３】
【表１】
0003995850.tif 000005
【００５４】
（ii）ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅と挿入断片の作成
公知の大腸菌（Escherichia coli）Ｋ−12株のアスパルターゼ遺伝子配列（配列番号１）(Biochem.J., 237(2),547-557)をもとに大腸菌（Escherichia coli）のアスパルターゼ遺伝子を増幅するために以下の２つのプライマーを作成した。
プライマーＦ：ＧＧＡＴＡＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡ（配列番号２）
プライマーＲ：ＣＧＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴ  （配列番号３）
ＫＯＤDNAポリメラーゼ(ＴＯＹＯＢＯ)を用いて、下記表２に示す組成の反応液を調製し、ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅を行った。
【００５５】
【表２】
0003995850.tif 000006
【００５６】
ＰＣＲ条件
▲１▼９８℃  ５分
▲２▼９８℃  ３０秒
▲３▼５３℃  ３０秒
▲４▼６８℃  １分    ▲２▼から▲４▼のサイクルを３０回繰り返す
ＰＣＲの反応終了後、増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動、エチジウムブロマイド染色したところ、予想された約1600bpの断片が増幅されていた。
この断片をアガロースゲルから切り出して、Prep-A-Gene (Bio Rad)でＤＮＡを回収した。
【００５７】
（iii）ベクターへの挿入断片の結合
ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）クローニングベクターに制限酵素ＳｒｆとＤＮＡリガーゼの存在下、先に回収したＤＮＡ断片を結合させた。
この挿入ＤＮＡ断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE1株と命名した。このPUaspE1株をアンピシリン100ppmを添加したLB培地３mlに接種し、37℃で一夜振とう培養し、その培養液1.5ml から菌体を回収した。この菌体から、アルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE1と命名した。
【００５８】
このプラスミドの挿入断片の配列を解析したところベクターのプロモーターに対して逆向きにアスパルターゼ遺伝子が挿入されていることがわかった。
プロモーターに対して、順向きにつなぎ直すために、プラスミドpUaspE1 から制限酵素SacIとBamHIで挿入断片を切り出し、pUC19に導入することにした。プラスミドpUaspE1 を制限酵素BamHIで切断した後エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してPrep-A-Gene(Bio Rad)でＤＮＡを回収した。
【００５９】
（iv）ベクターの作成
プラスミドpUC19 （ニッポンジーン製）１μg を制限酵素BamHIで切断後、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してPrep-A-Gene(Bio Rad)でＤＮＡを回収してベクターとした。
【００６０】
ベクターへの挿入断片の結合
制限酵素で切断したベクターと挿入断片をライゲーションハイ（TOYOBO) を用いて16℃、30分結合させた。
【００６１】
（v）大腸菌の形質転換
ベクターと挿入断片を結合させた反応液２μｌを大腸菌コンピテントセル(ＸＬ２-Blue MRF' Ultracompitent cells STRATAGENE社製) 200μｌに入れ、大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン100ppmを含有するＬＢ寒天培地に広げて37℃、一夜培養した。
コントロールとして、挿入断片を挿入していないプラスミドpUC19で形質転換し、同様にアンピシリン100ppmを含有するＬＢ寒天培地に広げて37℃で一夜培養した。
【００６２】
出現したコロニーを20個釣り上げ、アンピシリン100ppmを含有するＬＢ培地に接種して、37℃で振とう培養した。８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜30℃で振とう培養し、培養液１mlから菌体を回収した。
同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体１株を培養し、菌体を回収した。この回収した菌体に表３に示すフマル酸アンモニウム基質液１mlを添加して、菌体を懸濁させ、30℃で１時間反応させた。
【００６３】
【表３】
0003995850.tif 000007
【００６４】
反応液を分析したところ、挿入断片を入れた大腸菌形質転換体は、Ｌ−アスパラギン酸への転化率99.5％であった。一方挿入断片を入れていないコントロールの形質転換体は転化率５％であった。
この挿入断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE2と命名した。
【００６５】
PUaspE2をアンピシリン100ppmを添加したＬＢ培地３mlに接種し37℃で８時間培養した。 この培養液1.5mlからアルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE2と命名した。プラスミドpUaspE2を制限酵素SmaI、ついで制限酵素HindIIIで切断後、１％アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ断片の大きさを計算したところ、約2960bpと1600bpの２本の断片が存在していた。
【００６６】
PUaspE2株をアンピシリン100ppmを添加したＬＢ培地３mlに接種し、37℃で振とう培養し、８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜30℃で振とう培養した。この培養液１mlから菌体を回収するとともに菌体濃度OD660nmを測定したところ吸光度8.0であった。この菌体を20％フマル酸アンモニウム基質液10mlに懸濁し、30℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、2,000,000μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／OD660nm菌体濃度であった。
同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体1株を培養し、菌体を回収するとともに菌体濃度OD660nmを測定したところ吸光度8.5であった。
【００６７】
この菌体を20％フマル酸アンモニウム基質液10mlに懸濁し、30℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、10,000μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／hr／OD660nm菌体濃度であった。このように取得したPUaspE2株は挿入アスパルターゼ遺伝子を持たない株の 200倍のアスパルターゼ活性を有していた。
【００６８】
（vi）組み換え体の培養
大腸菌（Escherichia coli）のアスパルターゼの組換え大腸菌PUaspE2株を表１に示す培地にアンピシリン100ppmを含む培地３mlを入れた試験管10本に接種して37℃で８時間培養後、同組成の培地にＩＰＴＧを１mMを添加した培地 100mlを入れた坂口フラスコ10本にそれぞれ１本ずつ接種し、30℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ1.05molesL-アスパラギン酸生成/hr/g菌体であった。
【００６９】
アスパルターゼ遺伝子組み換え体を用いた固定化アスパルターゼの作成
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでｐＨ7.0付近にしたもの70ｇ及び脱イオン水230ｇをよく混合し、先に回収した菌体を均一に分散させた。６Ｌのナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４ＳＣｌ型オルガノ社製、平均粒径0.5mm）300mlと 0.5インチのテフロン球 200個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１／６を入れ、30℃で回転させながらエバポレーターで１時間乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。この操作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルターゼの活性は3500Ｕ／mlであった。（１Ｕ＝１μmolesＬ−アスパラギン酸生成／min／ml固定化酵素）
【００７０】
大腸菌ＩＦＯ３３０１株の培養
アスパルターゼ遺伝子を導入してない、大腸菌株ＩＦＯ３３０１をアンピシリンとＩＰＴＧを添加しない以外は先と同様に培養し、菌体を回収した。
非組み換え体固定化アスパルターゼの作成
大腸菌ＩＦＯ３３０１株菌体を用いた以外は、先と同様にして、ビーズ状の固定化アスパルターゼを得た。この固定化アスパルターゼの活性は 180Ｕ／mlであった。（１Ｕ＝１μmolesＬ−アスパラギン酸生成／min／ml固定化酵素）
【００７１】
〔実施例１〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
【００７２】
【表４】
0003995850.tif 000008
【００７３】
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００７４】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．０ｋｇを添加して攪拌すると、約２分でフマル酸結晶が完全に溶解した。攪拌を継続すると約１分でL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。溶液の温度を９５℃で３０分保持した後、フラスコ内を１分間に５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.24℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７８℃）に達した後は、１分間に３Torrの割合で減圧していった。約２時間後、５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度0.33℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を、遠心濾過器によって分離し、水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８６ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７３ｋｇ、純度は９９．７％であり、その形状は主に平均５００μｍの長さの針状結晶であった。このL−アスパラギン酸結晶を１０Lの水に懸濁して攪拌し、ついで遠心濾過してL−アスパラギン酸の結晶を分離した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８４ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７１ｋｇ、純度は９９．９％であった。
【００７５】
L−アスパラギン酸を分離した母液とL−アスパラギン酸を洗浄した洗液をあわせ、ここにフマル酸０．５１ｋｇを添加してロータリーエバポレータで水２ｋｇを留去して濃縮した。この液に２５％アンモニア水８８５ｇを追加し、水を加えて全量を１１．１ｋｇとした。この溶液のｐHは２５℃で８．５であった。
【００７６】
表４に示した基質液１０Lを用いて同様の操作を行い、L−アスパラギン酸結晶１．８９ｋｇ（含水率７．２％）を得た。このL−アスパラギン酸結晶の純度は９９．６％であった。同様に母液、洗液にフマル酸を０．５３ｋｇ添加し、濃縮した後に２５％アンモニア水を追加し、２５℃でのｐHを８．５に調節し、水を加えて１１．１ｋｇとした。この液を先の再調製液とあわせて２０℃の恒温水槽で保温し、前記のアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを充填したカラムに、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。この反応液１０Lを用いて先と同様の操作を行い、L−アスパラギン酸結晶１．８６ｋｇ（含水率７．１％）を得た。このL−アスパラギン酸結晶の純度は９９．７％であった。さらにこの操作を繰り返し、２０Lを１単位とした反応液を５回再調製して使用した。その結果を表５に示す。
【００７７】
【表５】
0003995850.tif 000009
【００７８】
〔実施例２〕
L−アスパラギン酸の晶析のために添加するフマル酸として５％の水分を含んだフマル酸湿結晶を用いた以外は実施例１と同様にして、加熱、フマル酸の添加を行った。５％含水フマル酸１．０６ｋｇを添加して攪拌すると、約３０秒でフマル酸結晶が完全に溶解した。攪拌を継続すると約３分でL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。実施例１と同様にして冷却後、析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８５ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７２ｋｇ、純度は９９．７％であり、その形状は主に平均５００μｍの長さの針状結晶であった。
【００７９】
〔実施例３〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ９．５）に一晩浸漬したのち、その５０ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表６に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
【００８０】
【表６】
0003995850.tif 000010
【００８１】
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７％であった。
【００８２】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、フマル酸結晶が完全に溶解した。攪拌を３０分継続してもL−アスパラギン酸の結晶は析出せず均質な溶液であった。溶液の温度を９５℃で３０分保持した後、フラスコ内を１分間に１０Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近で溶液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.47℃／分）。途中、液温８３℃付近でL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。圧力が４００Torr（液体の温度：７８℃）に達した後は、１分間に３Torrの割合で減圧していった。約２時間後、５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度0.33℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．６８ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．５６ｋｇ、純度は９９．７％であり、結晶形状は主に平均７００μｍの長さの針状結晶であった。
【００８３】
L−アスパラギン酸を分離した母液とL−アスパラギン酸を洗浄した洗液をあわせ、ここにフマル酸１６０ｇを添加してロータリーエバポレータで水２ｋｇを留去して濃縮した。この液に２５％アンモニア水６８０ｇを追加し、水を加えて全量を１１．１ｋｇとした。この溶液のｐHは２５℃で９．５であった。
【００８４】
表６に示した基質液１０Lを用いて同様の操作を行い、L−アスパラギン酸結晶１．４５ｋｇ（含水率７．２％）を得た。このL−アスパラギン酸結晶の純度は９９．７％であった。同様に母液、洗液にフマル酸を１７０ｇ添加し、濃縮した後に２５％アンモニア水を追加して、２５℃でのｐHを９．５に調節した後、水を加えて１１．１ｋｇとした。この液を先の再調製液とあわせて２０℃の恒温水槽で保温し、前記のアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼ充填したカラムに、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７％であった。この反応液１０Lを用いて先と同様の操作を行い、L−アスパラギン酸結晶１．６９ｋｇ（含水率７．１％）を得た。このL−アスパラギン酸結晶の純度は９９．７％であった。さらにこの操作を繰り返し、２０Lを１単位とした反応液を５回再調製して使用した。その結果を表７に示す。
【００８５】
【表７】
0003995850.tif 000011
【００８６】
〔実施例４〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００８７】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、フマル酸結晶が完全に溶解した。約３分攪拌を継続するとL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。溶液の温度を９５℃で３０分保持した後、フラスコ内を１分間に１５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.71℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７８℃）に達した後は、１分間に５Torrの割合で減圧していった。約１．５時間後、５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度0.54℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、洗浄水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８６ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７３ｋｇ、純度は９９．７％であり、結晶形状は主に平均５００μｍの長さの針状結晶であった。上記のL−アスパラギン酸の晶析操作を再度行い、析出したL−アスパラギン酸を遠心濾過によって分離し、洗浄水５００ｍｌで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８８ｋｇ（含水率７．１％）であり、乾燥後の重量は１．７５ｋｇ、純度は９９．６％であった。同様にして洗浄水の量を２５０ｍｌにしたところ、得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８６ｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７３ｋｇ、純度は９９．５％であった。同様にして洗浄水の量を１２５ｍｌにしたところ、得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８５ｋｇ（含水率７．２％）であり、乾燥後の重量は１．７２ｋｇ、純度は９９．４％であった。水での洗浄を行わない以外は同様にして行ったところ、得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．９８ｋｇ（含水率７．２％）であり、乾燥後の重量は１．７５ｋｇ、純度は９８．９％であった。
【００８８】
〔実施例５〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００８９】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、フマル酸結晶が完全に溶解した。約３分攪拌を継続するとL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。溶液の温度を９５℃で３０分保持した後、フラスコ内を１分間に１５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.71℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７８℃）に達した後は、１分間に１０Torrの割合で減圧していった。約１時間後、５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度1.09℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、洗浄水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．８６ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．７３ｋｇ、純度は９９．７％であった。上記のL−アスパラギン酸の晶析操作を再度行い、冷却を３５℃まで行った。析出したL−アスパラギン酸を遠心濾過によって分離し、洗浄水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．９５ｋｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は１．８１ｋｇ、純度は９９．７％であった。同様の操作を冷却の温度を３０℃にして行ったところ、遠心濾過で得られたL−アスパラギン酸の結晶は１．９９ｋｇ（含水率７．１％）であり、乾燥後の重量は１．８５ｋｇ、純度は９９．１％であった。
【００９０】
〔実施例６〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００９１】
この反応液５Lをフラスコにとり、９５℃に加熱した。またフマル酸５００ｇと水５００ｇを混合してスラリーとし、９５℃に加熱した。この２つの液を、シリコンチューブを通してポンプで送り、それぞれの流量を、反応液は１１１０ｇ／分、フマル酸スラリーは２００ｇ／分に設定した。この２つの液を三叉ジョイントで混合してからジャケットに９５℃の温水を循環させた、ノリタケ製スタティックミキサー（材質ガラス、ジャケット付き、型式1/4(1)-N40-174-0、内径５ｍｍ、長さ３２５ｍｍ、エレメント数２４）を２本連結して導入した（図１参照）。この時のスタティックミキサー中の液の線速は約１．１ｍ／秒であった。スタティックミキサー１本目で２つの液が混合され、フマル酸の結晶もL−アスパラギン酸の結晶も存在しない均質な溶液となった。この液のスタティックミキサーでの滞留時間は約０．５秒であった。この液を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした１０Lのフラスコに導入し、攪拌を継続したところ、約５分後にL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。４Lの液が入ったところで液の導入を停止し、フラスコ内を１分間に１５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.71℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７９℃）に達した後は、１分間に１０Torrの割合で減圧していった。約２時間後、５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度1.11℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。４０℃まで冷却し、遠心濾過によってL−アスパラギン酸結晶を分離し、水１００ｍｌで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は７５３ｇ（含水率７．０％）であり、乾燥後の重量は７００ｇ、純度は９９．７％であり、その形状は主に平均５００μｍの長さの針状結晶であった。
【００９２】
〔実施例７〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００９３】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、フマル酸結晶が完全に溶解した。均質な溶液となってから、フラスコ内を１分間に２０Torrの割合で減圧すると、すぐにL−アスパラギン酸が析出し、液が激しく沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった。約４０分後、５０Torrで、Ｌ−アスパラギン酸が析出した液の温度が４０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度1.55℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、洗浄水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は２．１８ｋｇ（含水率２４％）であり、乾燥後の重量は１．６６ｋｇ、純度は９８．８％であり、その形状は主に平均３０μｍの針状結晶であった。
【００９４】
このL−アスパラギン酸結晶を１０Lの水に懸濁して攪拌し、次いで遠心濾過してL−アスパラギン酸の結晶を分離した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は２．１４ｋｇ（含水率２３％）であり、乾燥後の重量は１．６５ｋｇ、純度は９９．７％であった。
【００９５】
〔実施例８〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【００９６】
この反応液５Lをフラスコにとり、９５℃に加熱した。この液をシリコンチューブを通して１１１０ｇ／分の流速でポンプで送り、この中へ粉体フィーダーを用いて、５％含水フマル酸を１０５ｇ／分の速度で連続的に供給した。このフマル酸を添加した液を実施例６と同様に、ジャケットに９５℃の温水を循環させた、ノリタケ製スタティックミキサー導入し、混合した。スタティックミキサーの出口では、フマル酸の結晶もL−アスパラギン酸の結晶も存在しない均質な溶液であった。この液を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした１０Lのフラスコに導入し、攪拌を継続したところ、約１０分後にL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。４Lの液が入ったところで液の導入を停止し、フラスコ内を１分間に１５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコの外部に留出させながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.67℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７９℃）に達した後は、１分間に１０Torrの割合で減圧していった。１５０TorrでＬ−アスパラギン酸が析出した液の温度が５０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度1.16℃／分）。この状態で１０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。遠心濾過によってL−アスパラギン酸結晶を分離し、水１００ｍｌで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は７６０ｇ（含水率８．０％）であり、乾燥後の重量は６９９ｇ、純度は９９．６％であり、その形状は主に平均３００μｍの長さの針状結晶であった。
【００９７】
〔実施例９〕
図２に示す連続晶析装置を用いてL-アスパラギン酸を製造した。
攪拌機付き１０Lセパラブルフラスコ（Ａ）にフマル酸２ｋｇと水２ｋｇを入れてフマル酸５０重量％スラリーを調製した。２０Lポリタンク（Ｂ）に実施例６で使用したものと同じ反応済みL-アスパラギン酸アンモニウム水溶液を入れた。この２つの容器からポンプ（Ｃ，Ｄ）を用いて、１００℃のバスに浸したステンレス製パイプ（Ｅ，Ｆ）約５mを通して送液した。送液の流量はフマル酸スラリーが２８．４ｇ／分、L-アスパラギン酸アンモニウム水溶液が１５７ｇ／分になるように設定した。
【００９８】
この２つの液をあわせて９５℃の熱媒を循環させたジャケット付きラインミキサー（Ｇ）に導入した。ラインミキサー出口の液はフマル酸もL-アスパラギン酸の結晶も存在しない均一に溶解した状態であり、その温度は約９０℃であった。この均一な液を内部を５０Torrに設定した攪拌機付き１０Lセパラブルフラスコ（Ｈ）に導入し、水分を蒸発させ、蒸発潜熱による冷却、晶析を行った。この際、凝縮器（Ｉ）で凝縮させた水はセパラブルフラスコ（Ｈ）に戻さず、受器（Ｊ）に導入した。１時間後、１０Lセパラブルフラスコにほぼ一杯に晶析スラリーが溜まったので、３０Torrに減圧したスラリー抜き出し槽（Ｋ）に差圧を利用してスラリー抜き出しを開始した。セパラブルフラスコ（Ｈ）の液面が一定になるように抜き出しを行い、この状態で更に１時間晶析の操作を行った。１時間後、スラリー抜き出し槽（Ｋ）が一杯になったので、５０％フマル酸スラリーの供給を先に停止し、その後にL-アスパラギン酸アンモニウム水溶液の供給を停止した。１０Lセパラブルフラスコ（Ｈ）を解圧して常圧に戻し、L-アスパラギン酸が晶析したスラリーを抜き出した。セパラブルフラスコ（Ｈ）とスラリー抜き出し槽（Ｋ）のスラリーのそれぞれ１１００gを遠心濾過し、その濾過ケークを水５０mlで洗浄して、それぞれウェットL-アスパラギン酸結晶１９０g、１９３ｇを得た。この結晶の純度はどちらも９９．６重量％（水分を除く）であった。
【００９９】
〔比較例１〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発砲ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【０１００】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を２０Lのフラスコに入れ、３０℃でフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、結晶が常に存在する状態で不均質のスラリーとなった。攪拌を３０分継続したのち、析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は２．３３ｋｇ（含水率２４．０％）であり、乾燥後の重量は１．７７ｋｇ、純度は９８．２％であり、その形状は主に１０μｍ以下の微小な不定形結晶、及びその会合物であった。
【０１０１】
このL−アスパラギン酸結晶を１０Lの水に懸濁して攪拌し、次いで遠心濾過してL−アスパラギン酸の結晶を分離した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は２．０８ｋｇ（含水率２２．０％）であり、乾燥後の重量は１．６２ｋｇ、純度は９９．２％であった。
【０１０２】
〔比較例２〕
調製例１において調製したアスパルターゼ遺伝子組み換え体固定化アスパルターゼを２０％フマル酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．３）に一晩浸漬したのち、その５００ｍｌをカラムに充填し、カラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の表４に示す基質液を、断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時５Lの速度（LHSV＝１０．０）で流通させ連続反応を行った。
反応開始後１時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．２％であった。
【０１０３】
この反応液１０Ｌ（重量１１．１ｋｇ）を、冷却管を取り付けて減圧、還流できるようにした２０Lのフラスコに入れ、９５℃に加熱した。ここにフマル酸１．００ｋｇを添加して攪拌すると、フマル酸結晶が完全に溶解した。約３分攪拌を継続するとL−アスパラギン酸の結晶が析出し始めた。溶液の温度を９５℃とし、その温度を３０分保持した後、フラスコ内を１分間に１５Torrの割合で減圧すると、６００Torr付近でL−アスパラギン酸が析出した液が沸騰を始めた。その後は、冷却管で蒸発した水を凝縮させてフラスコに戻しながらさらに減圧していった（平均冷却速度0.71℃／分）。圧力が４００Torr（液体の温度：７８℃）に達した後は、１分間に３Torrの割合で減圧していった。約２時間半後、Ｌ−アスパラギン酸が析出した液の温度が２０℃になったので、フラスコ内を常圧にもどした（平均冷却速度0.9℃／分）。この状態で３０分攪拌を継続しＬ−アスパラギン酸の結晶析出を完了させた。析出したL−アスパラギン酸の結晶を遠心濾過器によって分離し、洗浄水１Lで洗浄した。得られたL−アスパラギン酸の結晶は２．１０ｋｇ（含水率１２％）であり、乾燥後の重量は１．８４ｋｇ、純度は９８．５％であった。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明により、純度の高い結晶性のL−アスパラギン酸を、煩雑な工程を要せず、優れた作業効率で製造することができる。
【０１０５】
【配列表】
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【０１０６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：大腸菌K-12株（Escherichia coli K-12）由来のアスパルターゼ遺伝子のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ。
配列番号２及び３：大腸菌K-12株（Escherichia coli K-12）由来のアスパルターゼ遺伝子に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
【図面の簡単な説明】
【図１】連続式の混合管を用いて均質溶液を調製するための、具体的な装置を示す概略図である。
【図２】連続晶析装置の概略図である。
【図１】
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【図２】
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