(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列認識番号７のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたまたは組換え体のポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離されたまたは組換え体の核酸。
【請求項３】
前記核酸がゲノムＤＮＡである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２に記載の単離されたまたは組換え体の核酸。
【請求項６】
前記核酸が調節要素に動作可能に連結されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
請求項２または６の核酸を含んでなる組換えベクター。
【請求項８】
請求項７のベクターを含んでなるホスト細胞。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドをコードする配列認識番号１に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたまたは組換え体の核酸。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９３年９月２４日に提出された米国シリアルＮｏ．０８／１２６，５９７の一部継続であって、これを参照により本出願に含める。
本出願には、いくつかの刊行物が括弧内のアラビア数字により参照されている。これら刊行物の完全な引用は、請求の範囲に先行する本明細書の末尾に見出すことができる。これら刊行物の開示内容は、本発明が関連する技術の現状をより完全に記述するために、参照により本出願に含める。
〔発明の背景〕
伝染性喉頭気管炎ウイルスは、種々のビルレンスの呼吸疾患をチキン類に引き起こすヘルペスウイルスである。生の弱毒化ＩＬＴＶワクチンは、この疾病に対して保護するために利用できるが、いくつかの報告がワクチンウイルスを当該疾患の可能性のある再発と蔓延に関連づけており（６５および７２）、突発の初期に非感染鳥類にワクチン化を使用することを制限している。より有効な弱毒化ワクチンを設計するために、ＩＬＴＶウイルスのゲノムの構成が研究されている。
ウイルスＤＮＡを分離し、この分離したＤＮＡをバクテリアプラスミド中にクローン化する能力は、ウイルスワクチンを作るために利用し得る研究を大幅に拡大している。本発明を構成するために使用される方法は、クローン化されたウイルスＤＮＡ配列を挿入、欠失、および単一もしくは多重塩基変更により修飾することを含む。ついで、この修飾ＤＮＡをウイルスゲノム中に再挿入してウイルスを非病原性とする。得られた生ウイルスを宿主動物中に免疫応答を誘起させ、動物を疾病に対して保護するためのワクチン中に使用することができる。
動物ウイルスの１グループであるヘルペスウイルスもしくはヘルペトウイルス科は、この研究によく応じ得るウイルスのクラスである。これらのウイルスは、１００，０００ないし２００，０００塩基対のＤＮＡをその遺伝子物質として含んでいる。重要なことに、このゲノムのいくつかの領域は、細胞培養におけるインビトロでのウイルスの複製に可欠のものであると同定されている。このＤＮＡのこれらの領域における修飾は、ウイルスの病原性を低下、すなわち弱毒化し得る。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化は、ヒト単純ヘルペスウイルスを非病原性にし（１）、およびブタの仮性狂犬病ウイルスを非病原性にする（２）。
反復領域の除去は、ヒト単純ヘルペスウイルスを非病原性にする（３、４）。反復領域は、ウイルス腫瘍形成に関連するマレク病ウイルスにおいて同定されている（５）。ヘルペスウイルスサイミリ（saimiri）における領域は、同様に、腫瘍形成と関連づけられている（６）。反復領域の部分の除去は、仮性狂犬病ウイルスを非病原性にする（１９８９年１０月３１日に発行された米国特許第４，８７７，７３７号）。仮性狂犬病ウイルスにおける領域は、天然のワクチン株において欠失されていることが示され（７、８）、これらの欠失は、これらの株の病原性の欠如の少なくとも部分的な原因をなすことが示されている。
一般に、ヘルペスウイルスは、ゲノムの種々の部分にＤＮＡの可欠領域を含有することが同意されている。これらの領域のいくつかは、ウイルスの有毒性に関連し、それらの修飾は、より病原性の低いウイルスをもたらし、それからワクチンを誘導することができる。
伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）すなわちアルファヘルペスウイルス（９）は、卵生産損失および死亡の原因となる、米国、欧州およびオーストラリアにおける家禽類の重要な病原である（１０）。これは、呼吸低下、喘ぎ、および血の滲出液の喀出により特徴づけられるチキンの急性疾病を引き起こす。ウイルスの複製は、気管の感染が組織糜爛および出血を生じさせる呼吸路の細胞に制限されている。
チキンにおいては、損傷形成の程度の低下、または臨床的兆候の減少に有効な薬はなかった。細胞継代および／または退屈な養生の投与により誘発された種々の修飾型ＩＬＴウイルスによる鳥類のワクチン化は、罹病チキンに許容し得る保護を与えるために使用されている。現在のＩＬＴＶワクチンの弱毒彼の宣言された程度故に、適正レベルのウイルスが維持されることを確保するように注意しなければならない。すなわち、保護を与えるには充分であるが、集団に疾病を引き起こすには十分でないことである（１１〜２１）。さらに、これらのウイルスは、有毒性に逆戻りし、それに対する保護を与えるよりも、疾病を引き起こす。
ＩＬＴＶは、分子レベルで分析されている。ＩＬＴＶゲノムの制限地図が報告されている（２２〜２６）。いくつかの遺伝子のＤＮＡ配列が同定されており、すなわち、チミジンキナーゼ（２７、２８）、糖タンパクｇＢ（２７、２９、３０）、リボヌクレオチドリダクターゼ（２７、３１）、カプシドｐ４０（３１、３２）である。
さらに、シェパードら（５３）は、伝染性喉頭気管炎ウイルスのゲノムＤＮＡのユニーク長領域に位置するいくつかの遺伝子がウイルス複製には可欠であることを開示した。
本発明者らは、予期せざることに、ＩＬＴウイルスのゲノムＤＮＡのユニーク長領域がＩＬＴＶ有毒性と関連する遺伝子を含むこと、およびこれらの遺伝子における欠失が弱毒化ＩＬＴＶをもたらすことを見い出した。特に、ＩＬＴウイルスの糖タンパクＧ（ｇＧ）における欠失は、毒性ＩＬＴＶ株による後の攻撃に対するワクチンとして有用である弱毒化ウイルスを結果として生じされることが見い出された。
本発明者らは、また、ユニーク短領域の糖タンパクＩ（ｇＩ）における欠失もＩＬＴＶを弱毒化することを見い出した。さらに、ユニーク短領域のＵＳ２遺伝子、ＵＬ−４７様遺伝子および糖タンパクｇ６０遺伝子における欠失もまたＩＬＴＶを弱毒化するであろうことが企図されている。
ＩＬＴＶは、健康な動物において潜在的となり得、これがそれらを当該ウイルスの潜在的キャリヤーとする。この理由のため、非病原性ウイルスでワクチン化した動物を疾病誘起野生型もしくは天然ウイルスで感染された動物から区別し得ることが明らかに有利である。区別的ワクチンおよびそれに伴う診断検査の開発は、仮性狂犬病の管理に価値があることが証明されている（５５）。同様の区別性マーカーワクチンは、ＩＬＴＶ誘起疾病の管理に大きな価値を有するであろう。鑑別診断法の構築は、糖タンパクの欠失に集中されている。理論的には、診断様マーカーであるように選ばれた糖タンパクは、以下の特性を有すべきである：（１）糖タンパクおよびその遺伝子が組織培養における感染性ウイルスの生産に可欠であるべきこと、（２）糖タンパクが動物における大部分の血清学的応答を誘発すべきこと、および（３）糖タンパクが保護性免疫に有意の寄与をなすものでないこと。
ＩＬＴウイルスは、単一クローン性抗体により同定された通りの少なくとも４つの大きな糖タンパク（Ｍr＝２０５Ｋ、１１５Ｋ、９０Ｋおよび６０Ｋ）を特定することが示されている。３つの糖タンパクは抗原的に関連しているように思われる（Ｍr＝２０５Ｋ、１１５Ｋおよび９０Ｋ）（３４〜３６）。
３つの大きなＩＬＴウイルス糖タンパク、すなわちｇＢ（２９、３０）、ｇＣ（２７、５１）およびｇ６０（３４、５３）は、文献に記述されている。これらの３つの遺伝子は、配列決定され、ＩＬＴＶ遺伝子の２つがＨＳＶ糖タンパクｇＢおよびｇＣと相同であることが示されている。
これらのうち、ＩＬＴＶｇＢ遺伝子は、不可欠遺伝子であり、欠失マーカー遺伝子としては適切でない。さらに、ヘルペスウイルスのｇＣ遺伝子は、中和性抗体のターゲットとして（５６）および細胞媒介免疫のターゲットとして（５７）保護的免疫に有意の寄与をなすことが示されている。従って、ｇＣ遺伝子は、欠失マーカー遺伝子として望ましくない。
上に挙げた他の糖タンパクをコードする遺伝子に関して、それらが、診断用ワクチンとして使用し得る組換えＩＬＴウイルスを構築するために、欠失用の好適な候補であるかどうかは知られていない。
本発明者らは、予期せざることに、２つの糖タンパクをコードする遺伝子が、診断用ワクチンとして使用し得る組換えＩＬＴウイルスを構築するために安全に欠失させ得るＩＬＴウイルスゲノムのユニーク短領域内に位置することを見い出した。これらは、糖タンパクｇＧ遺伝子と糖タンパクｇＩ遺伝子である。糖タンパクＧ遺伝子または糖タンパクＩ遺伝子に欠失するＩＬＴウイルスを遺伝子的に加工することにより、糖タンパクＧまたは糖タンパクＩを発現しないＩＬＴウイルスが生産される。ウイルスのユニーク短領域におけるこれら２つの遺伝子が診断用ＩＬＴウイルスワクチンを作るための欠失に適切な候補であることを教示あるいは示唆する先行技術はない。ヘルペスウイルスのいくつかは遺伝子的に加工されているが、組換えＩＬＴＶの例は報告されていない。
ワクチニアウイルスおよびヘルペスウイルスのような大きなゲノムを有するＤＮＡウイルスを加工する能力は、これらの組換えウイルスがワクチン抗原を導出するためのベクターとしておよび動物用治療剤として使用し得るという発見に至る。ヘルペスウイルスは、それらの宿主範囲が主に単一ターゲット種に制限され（３７）、またそれらが異種遺伝子の安定なインビボ発現を提供し得る潜在的乾性を確立するための能力を有する（３８）ので、ベクターとしての開発のための魅力的な候補である。いくつかのヘルペスウイルス種が異種遺伝子生産物を発現するように加工されているが、異種遺伝子生産物を発現する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスは構築されていない。上記伝染性喉頭気管炎ウイルスは、重要な家禽疾患を引き起こす微生物からのワクチン抗原の誘起のためのベクターとして使用し得る。ＩＬＴＶベクターを有する多価ワクチンに含められ得る他のウイルス抗原は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性包嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）、およびマレク病ウイルス（ＭＤＶ）を含む。このような多価組換えウイルスは、ＩＬＴ疾患および他の疾患に対して保護を与えるであろう。同様に、伝染性喉頭気管炎ウイルスは、治療の誘起のためのベクターとして使用し得る。本発明のウイルスベクターにより誘起された治療剤は、ＩＬＴＶ複製の副生成物である生物学的分子にちがいない。この事は、最初の分析における治療剤をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパクのいずれかに制限する。アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（３９）、リボザイム（４０）、サプレッサーｔＲＮＡ（４１）、感染誘起二本鎖ＲＮＡの形態にあるこれらのクラスの化合物のそれぞれからの治療剤の例、およびホルモン、例えば、インスリンから、インホカイン例えばインターフェロンおよびインターロイキンまで、および天然のアヘン剤まで、多数のタンパク治療剤の例がある。しかしながら、適切な挿入部位が存在するかどうかを決定するために必要な実験故に、これらの治療剤の発見並びにそれらの構造および機能の解明は、ウイルスベクター導出システムにおいてそれらを使用させることには必ずしもならない。
ＩＬＴＶは、ユニーク長領域および逆転反復により側面が接触されたユニーク短領域から構成されるタイプＤゲノムを有するアルファヘルペスウイルス（７８）として分類されている。オーストラリアＩＬＴＶ分離株（ＳＡ−２）のゲノム制限地図はジョンソンら（６６）によって記述された。この地図を用いて、グオら（６２）は、ユニーク短領域から誘導されたと思われるＵＳＤＡチャレンジ株からのＤＮＡ断片を分離し、配列決定した。本発明者らは、ＩＬＴＶのＵＳＤＡチャレンジ株を地図作成し、ユニーク短領域に存在する推定遺伝子の特性を報告する。ここに開示された地図は、グオら（６２）により同定された配列が短い反復配列の部分であり、ユニーク短領域からではないことを示している。他の報告（６９および７０）は、２つの遺伝子、１つはＰＲＶ  ｇＧと相同であり、他は他の報告されたヘルペスウイルスとは異なる遺伝子の配列を記述している。これらの２つの遺伝子は、ＳＡ−２のユニーク長領域に位置づけられた。しかしながら、これらの配列は、本出願においてユニーク短領域からのものであるとして同定された配列と同一である。本出願におけるデータは、ＩＬＴＶの短領域の全体的な構成が他のヘルペスウイルスに類似していることを示している。
〔発明の概要〕
本発明は、糖タンパクｇＧ遺伝子中に欠損を含む伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムからなる組換え型の弱毒化された伝染性喉頭気管炎ウイルスを提供するものである。この弱毒性ウイルスは、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとして有用である。
本発明は、また、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、又は糖タンパクｇ６０遺伝子中に欠損を含む伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムからなる組換え弱毒伝染性喉頭気管炎ウイルスを提供するものである
本発明は、また、糖タンパクｇＧを産生しない組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスで免疫感作されたニワトリは他の家禽類を、天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものと区別する方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−１Ｈ
伝染性喉頭気管炎ウイルスの独特な短領域に由来する連続ＤＮＡの13、473塩基対のヌクレオチド配列。本配列には、全13,098塩基対の独特な短領域のみならず、一端にある273塩基対の繰り返し領域、および他端にある102塩基対の繰り返し領域が含まれる。図１Ａ−１Ｈのヌクレオチド配列は、内部繰り返し配列で始まり、末端繰り返し配列内で終る。該独特な短領域は、本図の塩基対274で始まる。配列認識番号59は、伝染性喉頭気管炎ウイルスの独特な短領域および繰り返し領域由来の連続ＤＮＡの18,912塩基対のヌクレオチド配列を含む。この配列領域には、全13,094塩基対の独特な短領域のみならず2909塩基対の内部繰り返し領域および2909塩基対の短い末端繰り返し領域が含まれる。該ヌクレオチド配列は、該内部繰り返し配列で始まり、該末端繰り返し配列内で終る。該独特な短領域は、塩基対2910で始まる。
図２
Ａｓｐ718Ｉ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ＵＳＤＡ８３−２ゲノムの制限酵素地図。上方の図は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ゲノム中にみられる独特の長領域（ＵL）、内部繰り返し領域（ＩＲ）、独特の短領域（ＵS）および末端繰り返し領域（ＴＲ）を識別している。伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ゲノムのＡｓｐ718Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位の地図を下記に示す。文字Ａ乃至Ｏは、Ａｓｐ718Ｉ制限エンドヌクレアーゼ断片を識別し、「Ａ」は最大断片を示す。断片「Ｌ」は、2..5ＫｂのＡｓｐ718Ｉ断片である。断片「Ｈ」は、５１６４塩基対のＡｓｐ718Ｉ断片であり、断片「Ｇ」は、8.0ｋｂのＡｓｐ718Ｉ断片である。アステリスクを付した断片には、１乃至１２回繰り返される約９００塩基対の超可変性領域が含まれる。ある一つのサイズが寡占していないので、これらの断片はサブモル量で出現する。この量は、エチジウムブロマイド染色ゲル上では、良好に分解されない。これら繰り返しの位置分は、図中、湾曲点線で示されている。
図３
伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ＵＳＤＡ８３−２の独特な短領域内のオープン・リーディング・フレーム。伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の短領域の１３、４７３塩基対には、13,098塩基対の独特な短領域のみならず、一端にある２７３の繰り返し領域、および他端にある１０２塩基対の繰り返し領域が含まれる。該独特な短領域には、１１０アミノ酸より大きいか又は等しい１３のメチオニンで始まるオープン・リーデイング・フレームが含まれる（小さい入れ子式オープン・リーデイング・フレームは除く）。１３のすべてのオープン・リーデイング・フレームは、ＤＮＡアライメントオプション（デフォルト設定）に対するＩＢＩＭａｃベクタータンパクを利用したＧｅｎｂａｎｋＤＮＡデータベースのＥｎｔｒｅｚリリース6.0ウイルス・デビジョンに、整列されている。上記オープン・リーディング・フレームのうちの８つは、下記の他のウイルス遺伝子との顕著な相同性を示した：独特の短領域（ＵＳ２）遺伝子，プロテイン・キナーゼ（ＰＫ）遺伝子、独特の長領域４７様（ＵＬ４７様）遺伝子および糖タンパクｇＧ，ｇ６０、ｇＤ，ｇＩおよびｇＥの遺伝子。
図４Ａ−４Ｂ
相同性ベクター472-73.27のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド472-73.27で組み立てられるＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表中に示す。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号２０、２１、２２および２３）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付について記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は、構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），ヒト・サイトメガロウイルス即時型初期（ＨＣＭＶＩＥ），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），ラクトースオペロンＺ遺伝子（ＬａｃＺ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（poly A)，およびベースペア（ＢＰ）。
図５Ａ−５Ｂ：
相同性ベクター501.94中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド501-94中に組み立てられるＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号２４、２５、２６および２７）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。
下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），ヒト・サイトメガロウイルス即時型初期（ＨＣＭＶＩＥ），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），ラクトースオペロンＺ遺伝子（ＬａｃＺ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（Poly A），チミジンキナーゼ（ＴＫ）、および塩基対（ＢＰ）。
図６Ａ−６Ｂ：
相同性ベクター544-55.12中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド544-55.12中に組み立てられるDNA断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号28、29、30および31）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。
下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（poly A)，および塩基対（ＢＰ）。
図７Ａ−７Ｃ：
相同性ベクター562-61.1F中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド562-61.1F中に組み立てられるDNA断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号32、33、34，35，36および37）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー列は、各連結部に付き記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（poly A)，塩基対（ＢＰ）。
図８Ａ−８Ｃ：
相同性ベクター560-52.F1中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド560-52.F1中に組み立てられるDNA断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号38、39、40，41および42）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（poly A），独特の長領域４７（ＵＬ４７様）、オープン・リーデイング・フレーム（ＯＲＦ４），糖タンパクＧ（ｇＧ），および塩基対（ＢＰ）。
図９Ａ−９Ｂ：
相同性ベクター579-14.G2中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド579-14.G2中に組み立てられるＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号43、44、45，および46）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ），単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１），仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポリアデニレーション信号（poly A）および塩基対（ＢＰ）。
図10Ａ−10Ｂ：
プラスミドベクター544-39.13中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド544-39.13中に組み立てられるＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号47、48，49，および50）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。該合成リンカー配列は、太線で下線が施されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA）、大腸菌（Ｅ．coli）、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１），ポリアデニレーション信号（poly A）および塩基対（ＢＰ）。
図11Ａ−11Ｃ：
プラスミドベクター388-65.2中のＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には、プラスミド388-65.2中に組み立てられるＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の各々に位置する配列も示されている（配列認識番号51、52，53，および54）。各断片を生成するために使用された制限部位および該断片を結合するのに使用された合成リンカー配列は、各連結部に付き記載されている。該合成リンカー配列は、太線で下線が施されている。数個の遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。括弧内の制限部位は構築の際に破壊された部位の残片を示す。下記の略語が使用されている：ヒトサイトメガロウイルス即時型初期（HCMV ＩＥ）ラクトースオペロン（lacZ）、大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ）、狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），ポリアデニレーション信号（poly A）および塩基対（ＢＰ）。
図１２
独特の長領域（ＵＬ）、独特の短領域（ＵＳ），内部繰り返し（ＩＲ），末端繰り返し（ＴＲ）が識別されている伝染性喉頭気管炎ウイルスのゲノムが示されている。該ウイルスのBamHI、Ａｓｐ718Ｉ、NotI，ＳｆｉＩ制限地図が、一組の波線で示される、短い繰り返しが高度に繰り返されている領域と共に、その下に描写されている。伝染性喉頭気管炎ウイルスの地図を決めるために使用されたコスミドの位置が、制限地図の下の描写されている。なお、コスミド２Ｆ１２は、２つの不連続セクションを含んでいる。伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを特徴づけるために使用された３つのプローブが、Ｐ１，Ｐ２，およびＰ３として示されている。Ｐ１は、独特の長領域領域の末端に見られる0.9kbのＮｏｔＩ断片であり、Ｐ２は、短い繰り返し内の複数コピーに見られる８５６塩基対のHindIII断片であり、Ｐ３は、末端繰り返しの末端にある断片を認識するのに使用される６．６ｋｂのＮｏｔＩ断片である。
図１３
配列決定された領域およびＡｓｐ718Ｉ、BamHI、Not I，およびSfiI部位の位置を示す。伝染性喉頭気管炎ウイルスの独特の短領域中に見られるオープン・リーディング・フレームの範囲および配向およびフランキング短繰り返し領域を示す。
図１４
短繰り返し内の８５６塩基対エレメントの繰り返しを示すサザンブロット。SfiI(a),HindIII(b),NotI(c)，Ａｓｐ718Ｉ(d)，又はBamHI(e)で消化されたゲノム伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡを、短い繰り返し由来の８５６塩基対HindIII断片で、プローブした。分子量マーカーの位置が明示されている。
図１５
ＵＳＤＡ菌株における８５６塩基対の繰り返し領域の位置を、ジョンソンらによって記載されたようなＳＡ−２菌株由来の同領域と比較して描写されれいる。３つの繰り返しが、ＵＳＤＡ菌株中に任意に示されている。該領域はＳＡ２中では繰り返されていない。Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｈ＝Hind III,、R=856塩基対繰り返し。
図１６
独特の長領域および内部繰り返しの連結部を含む6.6kbのNotI断片とハイブリダイズする内部および末端繰り返し由来の断片を認識しているサザンブロット。NotI(a)，Ａｓｐ718Ｉ(b)，又はBamHI(c)で消化されたゲノム伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡは、6.6kbのNotI断片とプローブされた。分子量マーカーの位置が明示されている。
図１７
保存領域における。、ヘルペスウイルスＵＬ４７タンパク相互の関係、およびヘルペスウイルスＵＬ４７タンパクおよび伝染性喉頭気管炎ウイルスＵＬ４７同族体に対する関係。伝染性喉頭気管炎ウイルスＵＬ４７および他のＵＬ４７タンパク間で共有されているアミノ酸は、太字活字である。配列間における一対比較がなされている。垂直線は、同一アミノ酸を示す。二つの点は、起こりうることが肯定的な許容可能な突然変異率を示し、一つの点は、起こりうることが暖昧である許容可能な突然変異率を示す（６０）。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記ウイルスゲノムの独特の短領域における欠失を含み、該欠失は糖タンパクｇＧ遺伝子に存在する組換えウイルスを提供する。前記欠失によって上記ウイルスは弱毒化され、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとしての使用に適するようになる。この発明の好ましい態様は、Ｓ−ＩＬＴ−０１４（ＡＴＣＣ受付番号第2427号）と称する組換え型の伝染性喉頭気管炎ウイルスである。このＳ−ＩＬＴ−０１４ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、1993年9月22日に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に対して、ＡＴＣＣ受付番号大2427号の下に寄託されている。この発明の他の好ましい態様は、Ｓ−ＩＬＴ−００２と称する組換え型の伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明の目的にとって、「組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルス」とは、当業者に周知の組換え法、例えば、材料および方法の項に挙げた「組換えＩＬＴウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション」により作製された生の伝染性喉頭気管炎ウイルスであり、このウイルスは、伝染性喉頭気管炎ウイルスの複製に不可欠な遺伝子物質を欠失していない。
本発明は更に、組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失およびＵＳ２遺伝子における欠失を含む組換えウイルスを提供する。この発明の一つの好ましい態様は、Ｓ−ＩＬＴ−００９と命名された組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明は更に、組み換え型咽頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失およびＯＲＦ４遺伝子における欠失を含む組み換えウイルスを提供する。
本発明は更に、組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは、糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失およびＵＬ４７様遺伝子における欠失を含む組換えウイルスを提供する。
本発明は更に、組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失、ＯＲＦ４遺伝子における欠失およびＵＬ４７様遺伝子における欠失を含む組換えウイルスを提供する。この発明の好ましい態様は、Ｓ−ＩＬＴ−０１５と命名された組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明は更に、組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失および糖タンパクｇ６０遺伝子における欠失を含む組み換え型咽頭気管炎ウイルスを提供する。この発明の好ましい態様は、Ｓ−ＩＬＴ−０１７と命名された組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明は更に、組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備し、該ゲノムは糖タンパクｇＧにおける欠失および糖タンパクｇＩ遺伝子における欠失を含む組換え型咽頭気管炎ウイルスを提供する。
本発明は更に、組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、糖タンパクｇＧ遺伝子における欠失およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における欠失を含む伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備した、組換え型咽頭気管炎ウイルスを提供する。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備した組み換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、該ゲノムの独特の短領域における欠失を含み、該欠失は糖タンパクｇＧ遺伝子内に存在し、また外来遺伝子の挿入を含んだ組換えウイルスを提供する。この外来遺伝子は、組換え型伝染性喉頭気管炎に感染した宿主細胞中で発現できるような方法で、前記伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの非必須部位に挿入される。
本発明の目的において、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの「非必須部位」とは、ウイルスの感染および複製に必要とされないウイルスの領域である。
伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムにおける下記の非必須部位は、該ウイルスに外来遺伝子を挿入するための好ましい部位である：チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、糖タンパクｇＧ遺伝子、糖タンパクｇ６０遺伝子、および糖タンパクｇＩ遺伝子。
伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムにおける非必須部位に挿入される外来遺伝子は、大腸菌（E.coli）β−グルコシダーゼ、または大腸菌β−グルクロニダーゼのようなスクリーニング可能なマーカー遺伝子をコードしてもよい。
伝染性咽頭気管炎ウイルスゲノムの非必須部位に挿入される外来遺伝子は、宿主細胞に導入されたときに鳥類疾患を起こす物質（当該抗原を誘導しまたは誘導可能なもの）に対する保護抗体の産生を誘発する、抗原性ポリペプチドをコードし得る。この抗原性ポリペプチドには、マレック氏病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＡ、マレック氏病ウイルスｇＢ、マレック氏病ウイルスｇＤ、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＢ）ＨＮ、ニューキャッスル病ウイルスＦ、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）ｇＢ、伝染性喉頭気管炎ウイルスｇＩ、伝染性喉頭気管炎ウイルスｇＤ、感染性嚢症ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、感染性嚢症ウイルスＶＰ３、感染性嚢症ウイルスＶＰ４、感染性嚢症ウイルスポリタンパク、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）スパイク、感染性気管支炎ウイルスマトリックス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス（avian parmyxovirus）、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血物質、サルモネラ種（Salmonella spp.）、大腸菌（E.coli）、パスツレラ種（Pasteurella spp.）、ボルデテラ種（Bordetella spp.）、アイメリア種（Eimeria spp.）、ヒストモナス種（Histomonas spp.）、トリコモナス種（Trichomonas spp.）、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミおよび家禽原虫が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスの一態様において、前記外来ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。他の態様において、当該サイトカインはニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイトカインには、形質転換増殖因子ベータ、上皮増殖因子科、繊維芽細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体拮抗剤、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンジオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血球阻害因子、オンコスタチンＭ、プレオトロフィン（pleiotrophin）、分泌性白血球プロテアーゼ阻害因子、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、およびＴＮＦ受容体が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのサイトカイン類は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、豚または鳥類由来のものである。サイトカインを発現する組換えＩＬＴウイルスは、疾患を引き起こす微生物の抗原を含有する抗原と組み合わせれば、免疫反応を高めるために有用である。
サイトカインを発現する組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスは、単独または疾患原因微生物の抗原遺伝子を含有するワクチンと組み合わせて、免疫反応をを高めるために使用される。
ヒトヘルペスウイルスに由来するヒト病原体の抗原性ポリペプチドには、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス（hantaan virus）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、狂犬病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マラリア（プラスモジウム・ファルチパルム（Plasmodium falciparum）、百日咳（Bordetella pertussis）、ジフテリア、発疹チフスリケッチア（Rikettsia prowazekii）、ボレリア・ベルフドルフェリ（Borrelia berfdorferi）、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスから誘導される。一態様において、上記抗原性ポリペプチドは、インフルエンザノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素である。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＢ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤ、ストレプトコッカスequi、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、ウマ・ライノウイルス、およびウマ・ロタウイルスである。
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウシ呼吸器合胞体ウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスから誘導され、また組換え型感染性ウシ鼻気管炎ウイルスに感染した宿主中で発現されることができる。例えば、抗原性ポリペプチドは、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、およびウシ・パラインフルエンザ３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼから誘導される。
外来遺伝子は、内因性の上流伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモータの制御下に置けばよく、或いは、異種上流プロモータの制御下に置いてもよい。この異種上流プロモータは、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸプロモータおよびＢＨＶ−1.1ＶＰ８プロモータから誘導すればよい。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記ウイルスゲノムの独特の短領域における欠失または他の変異を含み、該欠失または変異は、当該組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスが複製に際して糖タンパクｇＧを産生しないように、糖タンパクｇＧ遺伝子の中に存在する組換えウイルスを提供する。下記の組換えウイルス、即ち、Ｓ−ＩＬＴ−００２、Ｓ−ＩＬＴ−０１４，Ｓ−ＩＬＴ−００９、Ｓ−ＩＬＴ−０１５およびＳ−ＩＬＴ−０１７と命名された組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスは、この発明の好ましい態様である。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記ウイルスゲノムの独特の短領域における欠失または他の変異を含み、該欠失または変異は、当該組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスが複製に際して糖タンパクｇＩを産生しないように、糖タンパクｇＩ遺伝子中に存在する組換えウイルスを提供する。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記ウイルスゲノムの独特の短領域における欠失または他の変異を含み、該欠失または変異は、当該組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスが複製に際して糖タンパクｇＧおよび糖タンパクｇＩを産生しないように、糖タンパクｇＧ遺伝子および糖タンパクｇＩ遺伝子中に存在する組換えウイルスを提供する。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、前記ウイルスゲノムの独特の短領域における欠失を含み、該欠失は、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子および糖タンパクｇ６０遺伝子中に存在する組換えウイルスを提供する。これら遺伝子の何れか一つにおける欠失によって、当該組換えウイルスは、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対するワクチンとして使用できるようになると思われる。
本発明は更に、組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムの独特の短領域内に挿入された外来遺伝子を具備するが、その挿入は、プロテインキナーゼ遺伝子、糖タンパクｇＤ遺伝子、糖タンパクｇＥ遺伝子およびＯＲＦ１０遺伝子の中には存在しない組換えウイルスを提供する。この外来遺伝子は、当該組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染した宿主細胞内で発現できるように挿入される。好ましい挿入部位は、ＵＳ２遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子および糖タンパクｇ６０遺伝子である。
外来遺伝子は、本発明の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染した宿主細胞中で発現され得るような方法で、これら部位のうちの何れか一つの中に挿入され得る。
こうして挿入された外来遺伝子は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ、大腸菌β−グルクロニダーゼのような、スクリーニング可能なマーカーをコードすればよい。
こうして挿入された外来遺伝子は、前記宿主細胞内に導入されたときに、鳥類疾患を起こす物質（前記抗原を誘導しまたは誘導可能なもの）に対する保護抗体の産生を誘起する抗原性ポリペプチドをコードしてもよい。このような抗原性ポリペプチドは、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性嚢症ウイルスおよびマレック氏病ウイルスからなる群から誘導され、または誘導可能であり得る。このような抗原性ポリペプチドはまた、鳥類の脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血物質、サルモネラ種（Salmonella spp.）、大腸菌（E.coli）、パスツレラ種（Pasteurella spp.）、ボルデテラ種（Bordetella spp.）、アイメリア種（Eimeria spp.）、ヒストモナス種（Histomonas spp.）、トリコモナス種（Trichomonas spp.）、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽原虫から誘導され、または誘導可能であってもよい。
こうして挿入された外来遺伝子は、内因性の上流伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモータの支配下に置かれてもよく、または異種上流プロモータの支配下にあってもよい。この異種上流プロモータは、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＰＲＶｇＸプロモータまたはＢＨＶ-1.1ＶＰ８プロモータで有り得る。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスのためのワクチンであって、適切なキャリアと、有効免疫量の本発明の何れかの組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスとを含有するワクチンと提供する。このワクチンは、不活性化ウイルスまたは組み換え体生ウイルスの何れかを含有し得る。
組換え体ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、このなかにはタンパク、糖等が含まれる。このような適切なキャリアの一例は、タンパク加水分解物および乳糖等のような１以上の安定化剤を含む、生理学的にバランスのとれた培養培地である。好ましくは、生ワクチンは組織培養液を採取し、安定化作用を有するタンパク加水分解物のような安定化剤を添加することによって作成される。好ましくは、不活性化ワクチンは、ウイルスを不活性化した後の組織培養液を直接使用する。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスとを含有するワクチンであって、該組換えウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有しており、該ゲノムはその独特の短領域内に欠失を含んでおり、該欠失は糖タンパクｇＧ遺伝子の中に存在するワクチンを提供する。この発明の好ましい態様は、適切なキャリアと、有効免疫量の下記の何れか一つのウイルスとを含有するワクチンである：即ち、これらウイルスは、Ｓ−ＩＬＴ−０１４、Ｓ−ＩＬＴ−００２、Ｓ−ＩＬＴ−００９、Ｓ−ＩＬＴ−０１５およびＳ−ＩＬＴ−０１７と命名された組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎および一以上の他の鳥類疾患のための多価ワクチンであって、独特の短領域内の欠失を含む伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを具備した有効免疫量の組換えウイルスを含有し、前記欠失は糖タンパクｇＧ遺伝子の中に存在しており、また外来遺伝子は前記ウイルスゲノムの非必須部位に挿入されているワクチンを提供する。
前記外来遺伝子は抗原性ポリペプチドをコードし、これには鳥類疾患原因物質（上記抗原を誘導し、また誘導可能なもの）に対する保護抗体の宿主細胞による産生が含まれる。
上記の外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性嚢症ウイルス、マレック氏病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血物質、サルモネラ種（Salmonella spp.）、大腸菌（Ｅ．coli）、パスツレラ種（Pasteurella spp.）、ボルデテラ種（Bordetella spp.）、アイメリア種（Eimeria spp.）、ヒストモナス種（Histomonas spp.）、トリコモナス種（Trichomonas spp.）、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミおよび家禽原虫から誘導され、または誘導可能であり得る。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該ウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムはその独特の短領域内に欠失または他の変異を含んでおり、該欠失または変異は、当該組換えウイルスが複製の際に糖タンパクｇＧを産生しないように、糖タンパクｇＧ遺伝子の中に存在しているワクチンを提供する。この発明の好ましい態様は、適切なキャリアと、有効免疫量の下記の何れか一つのウイルスとを含有するワクチンである：即ち、これらウイルスは、Ｓ−ＩＬＴ−０１４、Ｓ−ＩＬＴ−００２、Ｓ−ＩＬＴ−００９、Ｓ−ＩＬＴ−０１５およびＳ−ＩＬＴ−０１７と命名された組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスである。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該ウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムはその独特の短領域内に欠失または他の変異を含んでおり、該欠失または変異は、当該組換えウイルスが複製の際に糖タンパクｇＩを産生しないように、糖タンパクｇＩ遺伝子の中に存在しているワクチンを提供する。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該組換えウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムはその独特の短領域内に欠失または他の変異を含んでおり、該欠失または変異は、当該組換えウイルスが複製の際に糖タンパクｇＧおよび糖タンパクｇＩを産生しないように、糖タンパクｇＧ遺伝子および糖タンパクｇＩ遺伝子の中に存在しているワクチンを提供する。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該組換えウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムはその独特の短領域内に欠失を含んでおり、該欠失がＵＳ２遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子および糖タンパクｇ６０遺伝子中に存在するワクチンを提供する。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該組換えウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムはその独特の短領域内に欠失を含んでおり、該欠失がＵＳ２遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、ＵＬ４７様遺伝子または糖タンパクｇ６０遺伝子の中に存在し、また前記ウイルスゲノムの非必須部位に外来遺伝子が挿入されているワクチンを提供する。
上記の外来遺伝子は抗原性ポリペプチドをコードし、これには鳥類疾患原因物質（上記抗原を誘導し、また誘導可能なもの）に対する保護抗体の宿主細胞による産生が含まれる。
上記の外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性嚢症ウイルス、マレック氏病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血物質、サルモネラ種（Salmonella spp.）、大腸菌（Ｅ．coli）、パスツレラ種（Pasteurella spp.）、ボルデテラ種（Bordetella spp.）、アイメリア種（Eimeria spp.）、ヒストモナス種（Histomonas spp.）、トリコモナス種（Trichomonas spp.）、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミおよび家禽原虫から誘導され、または誘導可能であり得る。
本発明は更に、適切なキャリアおよび有効免疫量の組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを含有するワクチンであって、該組換えウイルスは伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを有し、該ウイルスゲノムの非必須部位に外来遺伝子が挿入されているワクチンを提供する。この外来遺伝子は抗原性ポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、鳥類疾患原因物質（前記抗原を派生しまたは派生し得る）に対する保護抗体の宿主細胞による産生を誘導する。
上記の外来遺伝子は、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性嚢症ウイルス、マレック氏病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血物質、サルモネラ種（Salmonella spp.）、大腸菌（Ｅ．coli）、パスツレラ種（Pasteurella spp.）、ボルデテラ種（Bordetella spp.）、アイメリア種（Eimeria spp.）、ヒストモナス種（Histomonas spp.）、トリコモナス種（Trichomonas spp.）、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミおよび家禽原虫から誘導され、または誘導可能であり得る。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対して動物を免疫感作する方法であって、ニワトリまたは他の家禽に対し、有効免疫量の本発明のワクチンを投与することを具備した方法を提供する。
本発明は更に、糖タンパクｇＧを産生しない有効免疫量の組換えウイルスで予防接種されたニワトリまたは他の家禽を、天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから区別する方法を提供する。この方法は、ニワトリまたは他の家禽から得た体液のサンプルを、糖タンパクｇＧおよび天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリまたは他の家禽において正常に発現される少なくとも一つの他の抗原の存在について分析することを具備する。上記体液中に、天然に存在する咽頭気管炎ウイルスに感染したニワトリで正常に発現される抗原は存在するが、糖タンパクｇＧは存在しないことによって、上記組み換え体ワクチンで予防接種されており、且つ天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスには感染していないことが示される。体液中における糖タンパクｇＧおよび前記抗原の存在は、体液中において、当該抗原および糖タンパクｇＧに特異的な抗体を検出することにより決定すればよい。
本発明は更に、糖タンパクｇＩを産生しない有効免疫量の組換えウイルスで予防接種されたニワトリまたは他の家禽を、天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから区別する方法を提供する。この方法は、ニワトリまたは他の家禽から得た体液のサンプルを、糖タンパクｇＩおよび天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリまたは他の家禽において正常に発現される少なくとも一つの他の抗原の存在について分析することを具備する。上記体液中に、天然に存在する咽頭気管炎ウイルスに感染したニワトリで正常に発現される抗原は存在するが、糖タンパクｇＩは存在しないことによって、上記組み換え体ワクチンで予防接種されており、且つ天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスには感染していないことが示される。体液中における糖タンパクｇＩおよび前記抗原の存在は、体液中において、当該抗原および糖タンパクｇＩに特異的な抗体を検出することにより決定すればよい。
本発明は更に、糖タンパクｇＧを産生せず且つ糖タンパクｇＩを産生しない有効免疫量の組換えウイルスで予防接種されたニワトリまたは他の家禽を、天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したものから区別する方法を提供する。この方法は、ニワトリまたは他の家禽から得た体液のサンプルを、糖タンパクｇＧおよｇＩ並びに天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染したニワトリまたは他の家禽において正常に発現される少なくとも一つの他の抗原の存在について分析することを具備する。上記体液中に、天然に存在する咽頭気管炎ウイルスに感染したニワトリで正常に発現される抗原は存在するが、糖タンパクｇＧおよびｇＩは存在しないことによって、上記組み換え体ワクチンで予防接種されており、且つ天然に存在する伝染性喉頭気管炎ウイルスには感染していないことが示される。体液中における前記抗原ならびに糖タンパクｇＧおよびｇＩの存在は、体液中において、当該抗原ならびに糖タンパクｇＧおよびｇＩに特異的な抗体を検出することにより決定すればよい。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ゲノムＤＮＡの独特の短領域中に外来ＤＮＡを挿入することにより、組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを製造するための相同性ベクターであって、二本鎖の外来遺伝子から実質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を具備しており、何れの側にも前記ゲノムＤＮＡの独特の短領域に位置するＤＮＡ対して相同性である二本鎖ＤＮＡが隣接している相同性ベクター（但し、該隣接配列は糖タンパクｇＤ遺伝子、糖タンパクｇＥ遺伝子、プロテインキナーゼ遺伝子、およびＯＲＦ１０遺伝子に対して相同性ではない）を提供する。上記の外来遺伝子は、大腸菌Ｂ−ガラクトシダーゼまたは大腸菌Ｂ−グルクロニダーゼのようなスクリーニング可能なマーカーをコードし得る。
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスのゲノムＤＮＡに挿入されている、スクリーニング可能なマーカーをコードするＤＮＡを欠失させることにより組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスを製造するための相同性ベクターであって、欠失させるべき二本鎖ＤＮＡ分子から実質的になる二本鎖ＤＮＡを具備し、何れの側にも伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパクｇＧ遺伝子、糖タンパクｇＩ遺伝子、ＵＳ２遺伝子またはＵＬ−４７様遺伝子に対して相同的な二本鎖ＤＮＡが隣接しているベクターを提供する。この発明の好ましい実施例は、相同性ベクターー544-55.12、相同性ベクター562-61.1F、相同性ベクター472-73.27、相同性ベクター560-52.F1および相同性ベクター579-14.G2と命名された相同性ベクターである。
本発明は、ＵＳ１０遺伝子（配列ＩＤ番号６０および７０）、ＡｖＳｐ遺伝子（配列ＩＤ番号６１および７１）、ＵＳ２遺伝子（配列ＩＤ番号６２）、ＰＫ遺伝子（配列番号６３）、ＵＬ４７遺伝子（配列ＩＤ番号６４）、ｇＧ遺伝子（配列番号６５）、ＯＲＦ５遺伝子（配列ＩＤ番号６６）、ｇＤ遺伝子（配列ＩＤ番号６７）、ｇＩ遺伝子（配列ＩＤ番号６８）、ｇＥ遺伝子（配列ＩＤ番号６９）またはＯＲＦ９遺伝子（配列ＩＤ番号７０）をコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明は、ＵＳ１０遺伝子（配列ＩＤ番号６０および７０）、ＡｖＳｐ遺伝子（配列ＩＤ番号６１および７１）、ＵＳ２遺伝子（配列ＩＤ番号６２）、ＰＫ遺伝子（配列番号６３）、ＵＬ４７遺伝子（配列ＩＤ番号６４）、ｇＧ遺伝子（配列番号６５）、ＯＲＦ５遺伝子（配列ＩＤ番号６６）、ｇＤ遺伝子（配列ＩＤ番号６７）、ｇＩ遺伝子（配列ＩＤ番号６８）、ｇＥ遺伝子（配列ＩＤ番号６９）またはＯＲＦ９遺伝子（配列ＩＤ番号７０）によってコードされる単離されたペプチドを提供する。
〔実験の詳細〕
＜材料及び方法＞
伝染性喉頭気管炎ウイルスストック試料の調製：始原ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫ：スパファス社（Spafas Inc.）から入手）又は始原ニワトリ腎臓細胞（ＣＫ：ハイバック（Hyvac）より供給された受精卵から孵化した雛から入手）（５０）を、２２５ｃｍ2フラスコ内において、ハンクの塩（ＢＭＥ）、１０％ブロモエチルアミン（ＢＥＩ）処理仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１％グルタミンストック、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）ストック、及び１％重炭酸ナトリウムストックを含む１×イーグル基本培地（変性）（これらの成分はアービン・サイエンティフィック（Irvine Scientific）又は等価の供給者から入手し、以後この成長培地を完全ＢＭＥ培地と呼ぶ）中に１０5−１０6ｐｆｕを含むウイルスストック０．５ｍｌで感染させることにより、伝染性喉頭気管炎ウイルスストック試料を調製した。４−５日後、ウイルスストックを回収した。感染した培地及び細胞を２０％無菌全乳を含む完全培地に再懸濁させ、−７０℃で凍結保存した。
伝染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡの調製：ウイルス感染の４ないし５日後、各フラスコから細胞及び培地を１５ｍｌ円錐形遠心管にこすり落とし、１７００×ｇで５分間、４℃でペレット化した。５０％ものウイルスが培地中に存在する可能性があるため、上清を保存し以下に説明される通りに処理した。細胞ペレットを管当り１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して合わせ、再度１７００×ｇで５分間遠心した。そのペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有する１ｍｌ／フラスコのバッファーに再懸濁させ、４℃で１５分間インキュベートした。フラスコ当り２５μｌの２０％ＮＰ４０を添加した後、その混合物をダウンス（dounce）ホモジナイザにおいてＡ乳棒を用いてホモジナイズした。この調製品を１７００×ｇで１０分間、４℃で遠心し、その上清を保持した。この上清に１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、５０μｌの２０％ＳＤＳ、及び２５μｌの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを添加した（元のフラスコ当り）。幾つのかの場合においては、これを細胞培地上清から得られるウイルスと合わせた（上を参照）。次に、この混合物を６５℃で１−１６時間処理した後、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で飽和したフェノールで２回抽出した。次いで、水相中のＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウム（１／１０容量）及び２．５容量の１００％エタノールを添加することにより沈殿させた。
この培地からウイルスを得るため、細胞培地上清を２３，５００×ｇで３０分間遠心し、十分に水切りした。そのペレットを上記プロテイナーゼＫ含有混合物中に説明される通りに再懸濁した。ＤＮＡペレットを２０μｌ  ＴＥ／フラスコに再懸濁させた。これは、この時点でさらなる実験に用いることも可能であり、あるいは膵臓ＲＮアーゼＡでさらに処理してＲＮＡを除去した後、フェノール抽出及びエタノール沈殿によりＤＮＡを得ることも可能であった。
ウイルスＤＮＡミニプレップを調製するため、感染させた１０ｃｍディッシュを円錐形遠心管に掻き落とし１０００×ｇで５分間遠心した。細胞培地上清を保持し、上述の通りに処理した。これらの細胞ペレットを、それぞれ、０．５ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０に再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼＡを添加し、その沈殿を１０００×ｇで５分間遠心した。その上清に２５μｌの２０％ＳＤＳ及び２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加し、その沈殿全体を細胞培地からのウイルスペレットが用いられている場合にはそこに添加した。この混合物を５５−６５℃で１時間インキュベートし、バッファー飽和フェノールで抽出して１ｍｌのエタノールを添加することにより沈殿させた。そのＤＮＡペレットを２０μｌのＴＥに再懸濁させて４℃で保存した。
ポリメラーゼ補填反応：ＤＮＡを、５０ｍＭトリス  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、及び各々４００μモル濃度の４種類のデオキシリボヌクレオチドを含有するバッファーに再懸濁させた。１０単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ）を添加し、室温で１５分間反応を進行させた。ＤＮＡを上述の通りフェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
ＤＮＡ配列決定：シーケナーゼキット（Sequenase Kit）（ＵＳバイオケミカルズ（US Biochemicals））及びα35Ｓ−ｄＡＴＰ（ニュー・イングランド・ニュークリア（New England Nuclear））を用いて配列決定を行った。圧縮の領域を明確にするため、ｄＧＴＰミックス及びｄＩＴＰミックスの両者を用いる反応を行った。あるいは、ホルムアミドゲルで圧縮領域を分解した。テンプレートは二本鎖プラスミドサブクローン又は一本鎖Ｍ１３サブクローンであり、プライマーは配列決定しようとするインサートのすぐ外側のベクター又は以前に得られている配列のいずれかに対して作製した。得られた配列を組立て、ドナスター（Dnastar）ソフトウェアを用いて比較した。得られた配列の操作及び比較は、コーラル・ソフトウェア（Coral Software）のＩＢＩマックベクター（IBI MacVector）、スーパークローン（Superclone）及びスーパーシー・アライン（Supersee Align）プログラムを用いて行った。
分子生物学的技術：制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、ライゲーション、キナーゼでのリン酸化、ホスファターゼでの処理、細菌培養物の成長、ＤＮＡでの細菌の形質転換、及び他の分子生物学的方法のような手順を含む細菌及びＤＮＡを操作するための技術は説明されている（４２、４３）。様々なＤＮＡの操作に都合のよい制限部位の導入にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた（４４）。一般に、増幅された断片のサイズは５００塩基対未満であり、増幅された断片の重要な領域はＤＮＡ配列決定により確認した。注記されている場合を除いて、これらの技術を大きな変形を加えることなく用いた。
ＤＮＡのサザーンブロッティング：サザーンブロッティングの一般手順はＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（４２、４３）から採用した。ＤＮＡを０．４Ｍ  ＮａＯＨ中でナイロンメンブラン（バイオラッド・ゼータプローブ（Biorad Zetaprobe））にブロットし、０．２５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳを含有する溶液中において６５℃で５分間予備ハイブリダイズした。ベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）からのジェニアスTM（GeniusTM）非放射性ラベリングキットを用いる無作為プライミングによって標識されている標識プローブを添加した。６５℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターを４０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＳＤＳで２回、次いで４０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳで２回、各々６５℃で３０分間洗浄した。ベーリンガー−マンハイム・ジェニアスTM非放射性検出キットを用いて結合したプローブを検出した。
組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入：この方法は、以下の修正が加えられたＣｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａのＣａＣｌ2法（１９８７）（４５）に基づく。組換えＩＬＴウイルスの生成は、ＩＬＴウイルスＤＮＡと適当なヘルペスウイルスクローン化配列が横列する所望の外来ＤＮＡを含むプラスミド相同ベクターとの均質な組換えに依存する。プラスミドＤＮＡ（１０−４０ｍｇ）を０．２５Ｍ  ＣａＣｌ2の最終濃度の溶液２５０ｍｌに添加した。このＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液に、等容量の、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．９５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4を含有するバッファーを添加した。室温で１０分後、この混合物を維持培地上のＣＥＫ細胞の６ｃｍディッシュに滴下により添加し、３９℃で４ないし５時間放置した。細胞をＰＢＳで１回、ＰＢＳ中２０％のグリセロールで１回２分間すすぎ、再度ＰＢＳですすいで、維持培地を加えた。この培地に１．５ｍｌのＩＬＴウイルスストックを添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、新鮮な維持培地を添加し、細胞をさらに２日間インキュベートした。形質移入ストックを回収し、分別して−７０℃で凍結した。
ＩＬＴサブゲノムＤＮＡ断片の生成手順：クローン化重複サブゲノム断片の同時形質移入によってヘルペスウイルスを生成する能力がシュードラビエスウイルスについて示されている（４６）。同時形質導入に先立ってサブゲノム断片に直接削除及び／又は挿入が行われている場合、この手順はゲノムの変更を含むウイルスを高頻度で生じる結果となり、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大きく低下させる。コスミドをマップ制限酵素部位に重ねる手順を用いた。
重複ＩＬＴＶサブゲノム断片を含むサブクローンのライブラリーを以下のように生成させた。ＵＳＤＡＩＬＴＶ株８３−２はＳ−ＩＬＴ−００１と呼ばれている。０．５ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）中約２０μｇの（Ｓ−ＩＬＴ−００１から得られる）ＩＬＴＶ  ＤＮＡを、以前に説明される通り（４６）２５ゲージの針に２回通過させることにより切断した。このＤＮＡを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．３Ｍ  ＮａＣｌ中の１５−４０％グリセロール勾配を通して２７４，０００×ｇで５．５時間遠心した。断片を０．３％アガロースゲル上で分析して３５−５０ｋｂのＤＮＡを含むものをプールし、ＴＥで２倍に希釈して１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容量のエタノールで沈殿させた。これらの管を１０９，０００×ｇ、１０℃で１時間遠心した。ペレットを再懸濁させて微小遠心管に移し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容量のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡをＴＥに再懸濁させた。ＤＮＡの末端をポリメラーゼ補填反応によって平滑末端にした。ＤＮＡをフェノールで飽和したバッファー及びエーテルの両者で抽出することにより精製し、上述の通り酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させ、ＴＥに再懸濁させた。この物質の半分を、ＤＮＡライゲーション反応によって３ｍｇのベクターｐＳＹ１６２６にライゲートした。用いられたベクターはｐＳＹ１６２６であり、これは以下のように作製した。コスミドｐＨＣ７９（ギブコＢＲＬ）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｖａＩで切断してテトラサイクリン遺伝子を除去し、その末端をクレノウポリメラーゼで補填した（補填反応）。このベクターにｐＷＥ１５（ストラタジェーン（Stratagene））に由来するポリリンカーをライゲートした。このポリリンカーはＥｃｏＲＩでの消化により単離し、その末端をクレノウポリメラーゼで補填し（補填反応）、その断片をＬＭＰ−アガロースゲル上で精製した。ＤＮＡライゲーションは溶融アガロースの存在下において行った。得られたコスミドｐＳＹ１００５を、ｐＮＥＯ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（P-L Biochemicals））に由来するネオマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ部位に平滑末端挿入することにより修飾してｐＳＹ１６２６を作製した。ｐＳＹ１６２６を切断してＢａｍＨＩ部位を平滑末端化し、上述のように切断されたＩＬＴＶ断片とライゲートした。このライゲーション混合物を、ギガパックＸＬ（Gigapack XL）（ストラタジェーン）を用い、製造者の指示に従ってパッケージ化した。このパッケージ化混合物をマルトースの存在下において成長させたＡＧ１細胞（ストラタジェーン）に添加し、カナマイシンを含むＬＢプレート上でコロニーを選別した。ＩＬＴＶ  ＤＮＡを含むコスミドサブクローンを、個々のコスミドクローンの制限酵素マップを互いに、及びＩＬＶＴＶゲノムＤＮＡと比較することにより同定し、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡの連続配列を得た。
酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＩＬＴＶのスクリーニング：大腸菌β−ガラクトシダーゼ又はβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカーが組換えウイルスに組込まれている場合、単純な検定でその組換え体を含むプラークが可視化された。プラーク検定の間、酵素基質をアガロースオーバーレイに組込んだ（３００μｇ／ｍｌ）。ｌａｃＺマーカー遺伝子については基質ブルオガルTM（BluogalTM）（ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ギブコＢＲＬ）を用いた。ｕｉｄＡマーカー遺伝子については基質Ｘ−グルクロＣｈｘ（X-Glucuro Chx）（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄグルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩、バイオシンスＡＧ（Biosynth AG））を用いた。活性マーカー酵素を発現するプラークは青色になった。次に、これらの青色プラークを新鮮な細胞上に取り、さらに青いプラークを単離することにより精製した。酵素マーカー遺伝子が取り除かれている組換えウイルス戦略においては、この検定は、親の青いプラークの背景から白いプラークをプラーク精製することを包含する。ウイルスを、典型的には、５ないし１０回のプラーク精製で精製した。
黒色プラーク検定を用いる組換えＩＬＴＶにおける外来遺伝子発現のスクリーニング：組換えＩＬＴウイルスによって発現される外来抗原の発現を分析するため、ＣＥＫ細胞の単層に組換えＩＬＴウイルスを感染させ、栄養アガロース培地で覆って３９℃で３−５日間インキュベートした。プラークが出現したらアガロースの覆いをディッシュから取り除き、単層をＰＢＳで１回すすいで１００％メタノールで１０分間室温で固定し、細胞を風乾した。このプレートをＰＢＳで再度湿らせた後、一次抗体をＰＢＳ及びブロットー（Blotto）で適当な希釈率に希釈し、この細胞単層と共に２時間ないし一晩室温でインキュベートした。未結合抗体を、室温でＰＢＳを用いて４回洗浄することにより細胞から除去した。適当な二次抗体結合体をＰＢＳで１：５００に希釈し、それらの細胞と共に２時間室温でインキュベートした。未結合二次抗体を、室温でＰＢＳを用いて細胞を３回洗浄することにより除去した。単層を発色バッファー（１００ｍＭトリス  ｐＨ９．５／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中ですすぎ、新たに調製した基質溶液（発色バッファー中の０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム＋０．１５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ）と共に１０分ないし一晩室温でインキュベートした。基質溶液をＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で置き換えることにより反応を停止させた。正しい抗原を発現するプラークは黒く染まる。
ＩＬＴウイルス又はＩＬＴＶ  ｇＧを発現する組換えウイルスからのＩＬＴＶ  ｇＧの精製：野性型ＩＬＴＶ又はＩＬＴＶ  ｇＧを発現するＦＰＶもしくはＳＰＶベクターを感染させた細胞の培地からＩＬＴＶ  ｇＧを精製した。細胞に対する細胞変性効果（ＣＰＥ）を完了させ、培地を注ぎ出して細胞の破片を台上遠心でペレット化した。この培地を、アミコン（Amicon）濃縮器においてＹＭ３０限外濾過膜を用いて１５ｐｓｉで濃縮した。この濃縮物を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０に対して透析し、同じバッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（DEAE-Sephaccel）（ファルマシア（Pharmacia））カラムにのせた。この物質を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中の０ないし１．５Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配を用いて溶離した。３ｍｌの画分を集め、ウェスタンブロットにより検定した。ＩＬＴＶ  ｇＧを含む画分の同定にＩＬＴＶ  ｇＧに対するペプチド抗体を用いた。画分をプールし、セントリコン−１０微小濃縮器（Centricon-10microconcentrator）（アミコン）においてさらに濃縮した。
ニワトリ腎臓細胞及びＩＬＴウイルスの成長：ニワトリ喉頭気管炎チャレンジウイルスと呼ばれるロットナンバー８３−２のＩＬＴＶウイルスを国立獣医部門研究所（National Veterinary Services Laboratories）、ＵＳＤＡ／ＡＰＨＩＳ、アメス、アイオワ州から入手した。ＩＬＴＶウイルスを、ハイ−バック・ラボラトリー・エッグス社（Hy-Vac Laboratory Eggs Co.）から入手した６−９齢ＳＰＦ雛に由来する腎臓を解体することにより得られる始原ニワトリ腎臓細胞（ＣＫ）において成長させた。新鮮な腎臓細胞を細かく刻み、５ｍｇ／ｍｌトリプシンで分離した後、ペレット化して１．３×１０6細胞／ｍｌで再懸濁させた。成長培地（ＧＭ）は、１０％二元エチレンイミン処理仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、２００単位／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び８．９ｍＭ重炭酸ナトリウムが添加された、ハンクの塩を含む１×イーグル基本培地（変性）であった（８５）。再懸濁させた後、細胞をプレートにのせ、３９℃でインキュベートした。細胞をすすぎ、２４時間後に維持培地（ＭＭ）を加えた。このＭＭは１％ＦＢＳを含むＧＭである。ＣＫにＩＬＴＶを０．０１ないし０．１ＭＯＩで接種し、４−５日後に掻き落として超音波処理することによりウイルスストックを回収した。力価は、典型的には、１０5−１０6ｐｆｕ／ｍｌであった。
ウイルスＤＮＡの調製：感染したフラスコからの細胞及び培地を１７００ｇで５分間４℃でペレット化した。最初に上清及びペレットを別々に処理した。ビリオン粒子は２３，５００ｇで３０分間上清の外に遠心した。元の細胞ペレットはＰＢＳですすぎ、再度回転した。このペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有するバッファー１ｍｌ／フラスコに再懸濁させ、４℃で１５分間インキュベートした。これに２５μｌ／フラスコの２０％ＮＰ４０を添加し、この混合物をＡ乳棒を用いてダウンスホモジナイズした。この調製品を１７００ｇで１０分間４℃で遠心し、上清をすすいでペレットを廃棄した。この上清に１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、５０μｌの２０％ＳＤＳ、及び２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加した（元のフラスコ当り）。この混合物を、第１の上清の高速遠心によって得られるウイルス粒子のペレットの再懸濁に用いた。この混合物を６５℃で１−１６時間処理し、バッファー飽和フェノールで２回抽出して塩及びエタノールを添加することにより沈殿させた。得られたＤＮＡペレットを１００μｌ  ＴＥ／フラスコに再懸濁させた。これを膵臓ＲＮアーゼＡでさらに処理してＲＮＡを除去した後、フェノール抽出及びエタノール沈殿によりＤＮＡを得た。
コスミドライブラリーの作製：ｖａｎ  Ｚｉｊｌら（８３）のプロトコルに従い、ＩＬＴＶ  ＤＮＡのコスミドライブラリーを作製した。０．５ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）中約２０μｇのＩＬＴＶ  ＤＮＡを２５ゲージの針に２回通すことにより切断した。ＤＮＡを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ中の１５−４０％グリセロール勾配を通して２７４，０００ｇで５．５時間遠心した。画分を０．３％アガロースゲルで分析して３５−５０ｋｂのＤＮＡを含むものをプールし、ＴＥで２倍に希釈して塩及びエタノールを添加することにより沈殿させた。管を１０℃、１０９，０００ｇで１時間回転させた。ペレットを再懸濁させ、塩及びエタノールを添加して再沈殿させた。このＤＮＡをＴＥに再懸濁させ、適当なバッファー及び２５μＭ  ｄＮＴＰの存在下においてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５℃で２時間処理し、次いで０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰを用いてクレノウポリメラーゼで１５℃で１６時間処理することにより末端を平滑化した。このＤＮＡをフェノール、次いでエーテルで抽出し、塩及びエタノールを添加して沈殿させ、ＴＥに再懸濁させた。この物質を３μｇのコスミドベクターｐＳＹ１６２６と一晩ライゲートした。コスミドｐＳＹ１６２６は、コスミドｐＨＣ７９（ＢＲＬ）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｖａＩで消化してテトラサイクリン遺伝子を除去することにより作製した。残余の断片及びｐＷＥ１５（ストラタジェーン）に由来するＥｃｏＲＩ消化ポリリンカーをクレノウポリメラーゼで補填し、共にライゲートした。得られたコスミドベクターｐＳＹ１００５を、カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＮＥＯ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）に由来する１．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を平滑末端挿入することによりＥｃｏＲＩ部位で修飾してｐＳＹ１６２６を作製した。コスミドベクターとして使用するため、ｐＳＹ１６２６を切断してＢａｍＨＩ部位で平滑化した。このライゲーション混合物を、ギガパックＸＬ（ストラタジェーン）を用いて製造者の指示に従ってパッケージ化した。カナマイシンを含むＬＢプレートでコロニーを選別した。
配列決定：35Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いてＢＲＬシーケナーゼキットで配列決定を手で行った。このキットはＳａｎｇｅｒら（８０）によって説明されるジデオキシリボヌクレオチド鎖終止法を用いる。ｄＧＴＰ及びｄＩＴＰミックスの両者を用いる反応を行って圧縮の領域を明確にした。あるいは、ホルムアミド中４０％の８％アクリルアミドゲルで圧縮領域を分解した。アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（ＡＢＩ）３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサーを用いて自動蛍光配列決定を行った。配列決定を容易にするためサブクローンを作製した。内部プライマーはＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザーで合成した。両鎖について配列を得、これをＤＮＡスター（DNAstar）ソフトウェアを用いて組み立てた。配列の操作及び比較は、コーラル・ソフトウェアからのＤＮＡスタープログラム、スーパークローン及びスーパーシープログラムで行った。ジーンバンクとの比較は、ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴネットワークサービス（５８）を用いて行った。
相同ベクター５０１−９４：プラスミド５０１−９４は、ＩＬＴウイルスからチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子コーディング領域の一部を欠失させる目的で構築した（２８）。これはＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター及びＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、を含む。このＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター−大腸菌ｌａｃＺ遺伝子はＩＬＴＶ  ＴＫ遺伝子に対して反対の転写方向に挿入される。このマーカー遺伝子の上流は、ＩＬＴＶ  ＴＫ遺伝子の最初の７７アミノ酸コドンを含む約１０８７塩基対のＩＬＴＶＤＮＡの断片である。ｌａｃＺ遺伝子の下流は、ＩＬＴＶ  ＴＫ遺伝子の３’末端の８０アミノ酸コドンを含む約６７５塩基対のＩＬＴＶ  ＤＮＡの断片である。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、ＩＬＴＶ  ＴＫ遺伝子のアミノ酸７８ないし２８５をコードするＤＮＡがｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。ｌａｃＺマーカー遺伝子はヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）直前（ＩＥ）遺伝子プロモーターの制御下にあり、その遺伝子の３’末端にシュードラビエスウイルス（ＰＲＶ）ｇＸ遺伝子ポリアデニル化シグナルも含む。このプラスミドの詳細な説明が図５Ａ−５Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターはｐＳＰ６４／６５（プロメガ（Promega））の約３００２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ断片から誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ２．４ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片の約１０８７塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢｃｌＩのサブ断片である。断片２は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、及びＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルを含む約５０１７塩基対のＳａｌＩからＳａｌＩの断片である（図５Ａ−５Ｄを参照）。断片３は、ＩＬＴＶ  ２．４ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片の約６７５塩基対のＢｃｌＩからＨｉｎｄＩＩＩのサブ断片である。
相同ベクター５４４−５５．１２：プラスミド５４４−５５．１２は、ＩＬＴウイルスからＵＳ２遺伝子コーディング領域の一部を欠失させ、外来ＤＮＡを挿入する目的で構築した。これは、ＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子、を含む。ＰＲＶ  ｇＸプロモーター−大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶ  ＵＳ２遺伝子に対して反対の転写方向に挿入される。ｕｉｄＡ遺伝子の上流は、ＵＳ２遺伝子の３’末端の４１アミノ酸コドンを含む約２３００塩基対のＩＬＴＶ  ＤＮＡの断片である（配列番号２：ａａ．１８８−２２９）。ｕｉｄＡ遺伝子の下流は、ＵＳ２遺伝子の５’末端の２２アミノ酸コドンを含む約８０９塩基対のＩＬＴＶ  ＤＮＡの断片である（配列番号２：ａａ．１−２２）。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、アミノ酸２３ないし１８７をコードするＩＬＴＶ  ＵＳ２  ＤＮＡが大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。ｕｉｄＡマーカー遺伝子はシュードラビエスウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下にあり、その遺伝子の３’末端にＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１  ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナルも含む。このプラスミドの詳細な説明が図６Ａ−６Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ１８／ｐＳＰ１９融合体の約２９５８塩基対Ａｓｐ７１８１制限断片から多重クローニング部位がＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ／Ａｓｐ７１８１／ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩであるように誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ２．５ｋｂ  Ａｓｐ７１８１断片の約２３００塩基対のＡｓｐ７１８１からＤｒａＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１−４０５）。断片２は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子、及びＨＳＶ−１ＴＫポリアデニル化部位を含む約３０３９塩基対のＸｂａＩ断片である（図６Ａ−６Ｄを参照）。断片３は、ＩＬＴＶ  １０９７ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約８０９塩基対のＸｂａＩからＡｓｐ７１８１のサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．９０５−１７１４）。
相同ベクター５６２−６１．１Ｆ：プラスミド５６２−６１．１Ｆは、ＩＬＴウイルスからｇＩ遺伝子の一部を欠失させ、外来ＤＮＡを挿入する目的で構築した。これはＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子、を含む。ＰＲＶ  ｇＸプロモーター−大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子プロモーターに対して反対の方向に転写される。９８３塩基対の欠失は翻訳開始コドンの１２塩基対上流で始り、ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子の５’末端の３６３アミノ酸コドンのうちの３２４を欠失させる（配列番号１１：ａａ．３２５−３６３）。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子をコードするＤＮＡが大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。このプラスミドの詳細な説明が図７Ａ−７Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターはｐＵＣ１９の約２６４７塩基対のＡｓｐ７１８１からＨｉｎｄＩＩＩの断片から誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ８．０ｋｂ  Ａｓｐ７１８１断片の約１６１９塩基対のＡｓｐ７１８１からＸｂａＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．７５５６−９１７５）。断片２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した約６９１塩基対のＸｂａＩからＸｈｏＩの断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．９１７５−９８６１）。そのテンプレートはＩＬＴＶ  ８．０ｋｂ  Ａｓｐ７１８１断片であった。上流プライマー９２．０９（５’−ＣＣＴＡＧＣＡＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＧＣＧ−３’：配列番号５５）はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子の８２１塩基対上流の部位に位置し、遺伝子の３’末端に向かってＤＮＡを合成する。下流プライマー９２．１１（５’−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧ−３’：配列番号５６）はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子の翻訳開始部位の１２塩基対上流に位置し、ｇＤ遺伝子の５’末端に向かってＤＮＡを合成する。このＰＣＲ反応の産物は８１８塩基対である。このＤＮＡ断片をＸｂａＩを用いて５’末端（ＩＬＴＶ  ＤＮＡに存在する制限酵素部位）で、及びＸｈｏＩを用いて３’末端（ＰＣＲプライマー中に作製される制限酵素部位−下線を付された配列を参照）で消化して約６９１塩基対のＸｂａＩからＸｈｏＩの断片を作製する。断片３は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、ｕｉｄＡ遺伝子、及びＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化部位を含む約３０５１塩基対のＳａｌＩ断片である（図６Ａ−６Ｄを参照）。断片４は、ＰＣＲによって生成した約６２４塩基対のＸｈｏＩからＨｉｎｄＩＩＩの断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１０，８４７−１１，４６１）。そのテンプレートはＩＬＴＶ  ８．０ｋｂ  Ａｓｐ７１８１断片であった。上流プライマー９２．１０（５’−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧ−３’：配列番号５７）はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子内の翻訳終止コドンの１１７塩基対上流の部位に位置する。下流プライマー９２．０８（５’−ＣＴＣＧＴＣＣＧＡＡＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧ−３’：配列番号５８）はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子の翻訳終止部位の６０４塩基��下流の部位、かつＩＬＴＶ  ｇＥ遺伝子内に位置する。このＰＣＲ産物（７２９塩基対）を、上流ＰＣＲプライマーによって生じる独自の部位であるＸｈｏＩ（下線）及びＩＬＴＶ  ｇＥ遺伝子内の部位のＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化により約６２４塩基対の断片４が作製される。断片５はＩＬＴＶ  ８．０ｋｂ  Ａｓｐ７１８１断片の約２７００塩基対のＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１１，４６１−１３，４７３及び未配列決定ＤＮＡ）。
相同ベクター４７２−７３．２７：プラスミド４７２−７３．２７は、ＩＬＴウイルスから糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）遺伝子コーディング領域の一部を欠失させ、外来ＤＮＡを挿入する目的で構築した。これはＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、を含む。ＨＣＭＶＩＥプロモーター−大腸菌ｌａｃＺ遺伝子はＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子プロモーターと同じ方向に転写される。ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子の８７４塩基対の欠失は翻訳開始部位の６０ヌクレオチド上流からアミノ酸コーディング配列の内部８１４ヌクレオチドにまで及び、ｇＧタンパク質の２９２アミノ酸のうちの２７１（配列番号７）のコーディング能力を取り除く。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子のアミノ酸１ないし２７１をコードするＤＮＡが大腸菌ｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。このプラスミドの詳細な説明が図４Ａ−４Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターはｐＵＣ１９（ギブコ、ＢＲＬ）の約２６８６塩基対Ａｓｐ７１８１制限断片から誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約２８３０塩基対のＡｓｐ７１８１からＮｈｅＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１７１４−４５４）。断片２は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、及びＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化シグナルを含む約５０１７塩基対のＳａｌＩからＳａｌＩの断片である（図４Ａ−４Ｄを参照）。断片３は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約１７０９塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ７１８１のサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．５４１９−６８７８）。
相同ベクター５６０−５２．Ｆ１：プラスミド５６０−５２．Ｆ１は、ＩＬＴウイルスからＵＬ４７様遺伝子の一部、ＯＲＦ４の全て、及びＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子の一部を欠失させ、外来ＤＮＡを挿入する目的で構築した。これはＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子、を含む。ＰＲＶ  ｇＸプロモーター−大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶ  ＵＬ４７様、ＯＲＦ４、及びｇＧ遺伝子プロモーターに対して反対方向に転写される。この２６４０塩基対の欠失は、ＵＬ４７様遺伝子の３’末端の５１１アミノ酸コドンのうちの４４２（配列番号４）、ＯＲＦ４遺伝子のコーディング配列全体（配列番号５）及びＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子の５’末端の２９３アミノ酸コドンのうちの２７１（配列番号７）を取り除く。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、ＩＬＴＶ  ＵＬ４７様、ＯＲＦ４及びｇＧ遺伝子をコードするＤＮＡがＰＲＶ  ｇＸプロモーター−大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。このプラスミドの詳細な説明が図８Ａ−８Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターはｐＳＰ１８／ｐＳＰ１９の約２９５８塩基対のＡｓｐ７１８１制限断片から多重クローニング部位がＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ／Ａｓｐ７１８１／ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩであるように誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約１０６６塩基対のＡｓｐ７１８１からＢｓｓＨＩＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１７１４−２７７７）。断片２は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約１２３塩基対のＳａｌＩからＢｃｌＩのサブ断片である。断片３は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、ｕｉｄＡ遺伝子、及びＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化部位を含む約３０２７塩基対のＢａｍＨＩ断片である（図８Ａ−８Ｄを参照）。断片４は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約１３３４塩基対のＢｃｌＩからＡｓｐ７１８１のサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．５５４４−６８７８）。
相同ベクター５７９−１４．Ｇ２：プラスミド５７９−１４．Ｇ２は、ＩＬＴウイルスから全ｇＧ遺伝子及びｇ６０遺伝子の一部を欠失させ、外来ＤＮＡを挿入する目的で構築した。これはＰＲＶ  ｇＸプロモーター及びＩＬＴウイルスＤＮＡが横列するスクリーニング可能なマーカー、大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子、を含む。このＰＲＶ  ｇＸプロモーター−大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶ  ｇＧ及びｇ６０遺伝子プロモーターと同じ方向に転写される。この３３５１塩基対の欠失は、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子の全コーディング配列（配列番号７）及びｇ６０遺伝子の５’末端の９８６アミノ酸のうちの７３３（配列番号８）を含む。このプラスミドを「組換えＩＬＴウイルスを生成させるためのＤＮＡ形質移入」に従って用いると、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子及びＩＬＴＶ  ｇ６０遺伝子のアミノ酸１ないし７３３をコードするＤＮＡが大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。このプラスミドの詳細な説明が図９Ａ−９Ｄに示されている。これは、指示されているＤＮＡ源から標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して構築された。このプラスミドベクターｐＵＣ１９（ギブコ、ＢＲＬ）は約２６７７塩基対のＡｓｐ７１８１からＢａｍＨＩの断片より誘導される。断片１は、ＩＬＴＶ  ５１６４ｂｐ  Ａｓｐ７１８１断片の約２８３０塩基対のＡｓｐ７１８１からＮｈｅＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．１７１４−４５４４）。断片２は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子、及びＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化部位を含む約３０５１塩基対のＳａｌＩ断片である（図９Ａ−９Ｄを参照）。断片３は、ＩＬＴＶ  ４５４５ｂｐ  ＢａｍＨＩ断片の約１７０９塩基対のＳａｌＩからＢａｍＨＩのサブ断片である（配列番号１：Ｎｕｃｌ．７８９５−９６０４）。
プラスミド５４４−３９．１３：プラスミド５４４−３９．１３は、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子、及びＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化部位からなるβ−グルクロニダーゼ発現カセットを含む。このマーカー遺伝子の詳細な説明が図１０Ａ−１０Ｄに示されている。これは、標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して以下の源に由来する制限断片を図１０Ａ−１０Ｄに指示される合成ＤＮＡ配列と結合することにより構築された。プラスミドベクターｐＳＰ７１（プロメガ）は約３０６６塩基対のＸｍａＩからＳｍａＩの断片より誘導される。断片１は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃１０（４７）の約４２２塩基対のＳａｌＩからＥｃｏＲＩの制限サブ断片である。このＥｃｏＲＩ部位はＰＣＲクローニングによって図１２Ａ−１２Ｄに指示される位置に導入されたことに注意されたい。断片２は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック（Clonetech））の約１８２６塩基対のＥｃｏＲＩからＳｍａＩの断片である。このＥｃｏＲＩ及びＸｍａＩ部位はＰＣＲクローニングにより図１０Ａ−１０Ｄに指示される位置に導入されたことに注意されたい。断片３は、ＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（４８）の約７８４塩基対のＸｍａＩサブ断片である。この断片は、ポリアデニル化配列（ＡＡＴＡＡＡ）が大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子との接合部に最も近く位置するように配向されることに注意されたい。
プラスミド３８８−６５．２：プラスミド３８８−６５．２は、ＨＣＭＶ直前（ＩＥ）プロモーター、大腸菌ｌａｃＺマーカー遺伝子、及びＰＲＶ  ｇＸ遺伝子ポリアデニル化部位からなるβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。このβ−ガラクトシダーゼ発現カセットの詳細な説明が図１１Ａ−１１Ｄに示されている。これは、標準組換えＤＮＡ技術（４２、４３）を利用して以下の源に由来する制限断片を図１１Ａ−１１Ｄに指示される合成ＤＮＡ配列と結合することにより構築された。プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ）は約３０７６塩基対のＰｓｔＩからＰｓｔＩの断片より誘導される。断片１は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターを含むＨＣＭＶ  ２．１ｋｂ  ＰｓｔＩ断片から誘導される約１１５４塩基対のＰｓｔＩからＡｖａＩＩの断片である。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導される３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩの断片である。断片３は、ＰＲＶ  ｇＸ遺伝子のカルボキシ末端の１９アミノ酸及びポリアデニル化シグナルを含むＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃７から誘導される約７５０塩基対のＮｄｅＩからＳａｌＩの断片である。
実施例
実施例１
伝染性喉頭気管炎ルイルス（Laryngotracheitis Virus）（ＩＬＴＶ）の特徴的短領域の完全配列：ＩＬＴウイルスの短領域に連接したＤＮＡの１３，４７３塩基対長の配列（配列番号１）を決定した。該配列には特徴的短領域の全１３，０９８塩基対と、その一端にある２７３塩基対長の繰り返し領域と別の一端にある１０２塩基対長の繰り返し領域が含まれる。特徴的短領域には１１０アミノ酸長の長さを越える、１３のメチオニンに始まるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれる（入れ子状の短いＯＲＦは除く）。この１３個のＯＲＦは全てＩＢＩＭａｃＶｅｃｔｏｒＰｒｏｔｅｉｎのＤＮＡアラインメントオプション（デフォルト設定）を利用したＧｅｎｂａｎｋデータベースのＥｎｔｅｒｅｚｒｅｌｅａｓｅ６．０ウイルス版でアラインメントを調べた。８個のＯＲＦは１種類以上のウイルス遺伝子に明らかなホモロジーを有していた（表１参照）。以下に引用されるヌクレオチド配列番号のものは内部繰り返し配列内に開始し、内部繰り返し配列内に終止している。特異短領域は配列番号１の２７４の位置の塩基対から始まる。
0003964458.tif 000002
ＵＳ２遺伝子
ＵＳ２遺伝子は全長６９０塩基対で、２２９アミノ酸長の蛋白質をコードしており、分子量はおよそ２５，２７２ダルトンである（配列番号１２，１３）。ＩＬＴＶ  ＵＳ２はウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）−１とＥＨＶ−４  ＵＳ２蛋白に相同である。ＵＳ２遺伝子は、ＩＬＴＶの特異短域（配列番号１）の逆向き相補鎖のヌクレオチド９７０から２８１から転写した。ＵＳ２遺伝子の機能は不明である。
プロテインキナーゼ遺伝子
プロテインキナーゼ遺伝子はヌクレオチド位置１０５９から２４８９の全長１４３１塩基対で、４７６アミノ酸をコードし、分子量は約５４，３１６ダルトン（配列番号２）である。ＩＬＴＶのプロテインキナーゼはマークス病ウイルス（ＭＤＶ）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）−１および４、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、水泡−単純疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サル水疱ウイルス（ＳＶＶ）、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１および−２のプロテインキナーゼに相同である。
ＵＬ４７−様遺伝子
ＵＬ４７−様遺伝子はＩＬＴウイルスの特異短域内に特異的に位置する遺伝子である。既知の全ヘルペスウイルスにあるＵＬ４７−様遺伝子は特徴的な長さの配列の中に位置している。ＵＬ４７−様遺伝子はヌクレオチド位置２５７５から４１０７までの１５３３塩基対より成り、５１０アミノ酸長の蛋白をコードし、その分子量は約５７，６１５ダルトンになる（配列番号３）。
ＯＲＦ４
ＯＲＦ４は機能不明の蛋白をコードする。ＯＲＦ４はヌクレオチド位置４１１３から４４４５までの３３３塩基対より成り、１１０アミノ酸長のオープンリーディングフレームをコードし、その分子量は約１２，０１５ダルトンである（配列番号４）。
ＯＲＦ４逆向き相補鎖
ＯＲＦ４逆向き相補鎖（ＲＣ）は機能不明の蛋白をコードする。ＯＲＦ４ＲＣはヌクレオチド位置４５１９から４１３９の３８０塩基対から成り、１２６アミノ酸長のオープンリーディングフレームで、分子量およそ１３，８６０ダルトン（配列番号１４，１５）のものをコードしている。
ｇＧ遺伝子
ｇＧ遺伝子はヌクレオチド位置４６０９から５４８７の全長８７９塩基対で、２９２アミノ酸長で分子量約３１，６９９ダルトン（配列番号５）の糖蛋白をコードしている。ＩＬＴＶ  ｇＧ糖蛋白はＰＲＶ  ｇＸ、ウシ単純ヘルペスウイルス（ＢＨＶ）ー１，３ｇＧ、ＥＨＶ−１ｇＧおよびＥＨＶ−４ｇＧに相同である。仮痘ウイルスベクターあるいは伝染性上皮腫ウイルスベクタ内で生産した組換体ＩＴＬＶｇＧ蛋白は精製でき（材料と方法を参照）、ペプチドを用いて得たＩＬＴＶ  ｇＧに対する抗血清と反応した。このペプチド抗血清は野生型ウイルスから得たＩＬＴＶ  ｇＧには反応するが、ＩＬＴＶ遺伝子を欠損したウイルスには反応しない。ｇＧ遺伝子の欠損はＩＬＴウイルスを減毒化し、その結果鶏のＩＬＴ病に対するワクチンとして有効であり（実施例６参照）、また感染動物からワクチン化したものを区別する上の陰性マーカーとしても利用できる。
ｇ６０遺伝子
ｇ６０遺伝子は糖蛋白６０として同定されている（３３，５３）。ｇ６０遺伝子はヌクレオチド位置５６９７から８６５４の２９５８塩基対から成り、９８５アミノ酸長、分子量およそ１０６，５０５ダルトン（配列番号６）の糖蛋白をコードする。
ＯＲＦ６逆向き相補鎖
ＯＲＦ６ＲＣはヌクレオチド位置７８２６から６９４８の８７８塩基対から成り、２９２アミノ酸長で分子量およそ３２，１２０ダルトン（配列番号１６，１７）のものをコードする。ＩＬＴＶ  ＯＲＦ６ＲＣはＨＳＶ−１とＨＳＶ−２リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット（ＵＬ３９）の一部に限定して相同である。
ｇＤ遺伝子
伝染性上皮腫ウイルスあるいは七面鳥のヘルペスウイルス（３３）にベクター化されたｇＤ糖蛋白の発現は鶏において十分に予防的な免疫反応を惹起する。ｇＤ遺伝子はヌクレオチド位置８４６２から９７６６までの１３０５塩基対からなり、４３４アミノ酸長、分子量およそ４８，４７７ダルトン（配列番号１０，１１）の糖蛋白をコードする。ＩＬＴＶｇＤ糖蛋白はＰＲＶｇ５０ならびにＨＳＶ−１，ＭＤＶ、ＩＰＶ、そしてＢＨＶ−１．１のｇＤに相同である。ＩＬＴウイルスに対するモノクローナル抗体は特異的にＩＬＴＶのｇＤ蛋白と反応し、また七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）ウイルスベクターで発現させたＩＬＴＶｇＤ蛋白とも反応する。ＨＶＴベクターで発現させたＩＬＴＶｇＤはサブユニットワクチンとして有用である。
ｇＩ遺伝子
ｇＩ遺伝子はヌクレオチド位置９８７４から１０，９６２までの１０８９塩基対からなり、３６２アミノ酸長の、分子量約３９，７５３ダルトン（配列番号７）の糖蛋白をコードする。ＩＴＬＶｇＩ糖蛋白はＶＺＶ糖蛋白と相同である。仮痘ウイルスベクターで発現させた組換体ＩＴＬＶｇＩ蛋白はＩＬＶ感染鶏の回復期血清と反応する。ｇＩ遺伝子の欠損はＩＬＴウイルスを減毒化し、得られたウイルスは鶏のＩＬＴ病に対するワクチンとして有用である。ｇＩを欠損した組換体ウイルスを呼吸管に直接自然経路でワクチン投与した動物試験では安全であるが、親ウイルスは同一経路で摂取した鶏の９０％に傷害を発生させた。ｇＩ遺伝子の欠損は、感染動物とワクチン投与した動物とを区別する陰性マーカーとして利用できる。
ＯＲＦ８逆向き相補鎖
ＯＲＦ８逆向き相補鎖は機能不明の蛋白をコードする。ＯＲＦ８ＲＣはヌクレオチド位置１１，１５０から１０，６１７の間の５３３塩基対から成り、１７７アミノ酸長で分子量約１９，４７０ダルトン（配列番号１８，１９）のオープンリーディングフレームをコードする。
ｇＥ遺伝子
ｇＥ遺伝子はヌクレオチド位置１１，１５９から１２，６５８の間の４９９塩基対から成り、４９９７アミノ酸長で分子量約５５，３９７ダルトン（配列番号８）の糖蛋白をコードする。ＩＬＴＶｇＥ糖蛋白はＶＺＶ、サルヘルペスウイルス（ＳＨＶ）、ＥＨＶ−１、ＨＳＶ−１、ならびにＰＲＶのｇＥ糖蛋白と相同である。ＩＬＴＶｇＥはサブユニットワクチンとして有用な中和抗原である。
ＯＲＦ１０
ＯＲＦ１０はヌクレオチド位置１２，６６５から１３，４４７の間の７８３塩基対から成り、２６１アミノ酸長、分子量約２７，８９８ダルトン（配列番号９）の蛋白をコードする。
実施例２
Ｓ−ＩＬＴ−００４
Ｓ−ＩＬＴ−００４は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子におよそ６２０塩基対の長さの欠損を持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である（２８）。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）をＴＫの位置に挿入し、ＨＣＭＶ極初期（ＩＥ）プロモーターの制御下におく。ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺ遺伝子の転写はＴＫプロモーターとは逆の方向に進む。
Ｓ−ＩＬＴ−００４はホモロジーベクター５０１−９４（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００１（ＵＳＤＡ  ＩＬＴＶ株８３−２）を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞のストックをＢｌｕｏｇａｌTM組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。青色のプラークを精製した結果、組換体ウイルスＳ−ＩＬＴ−００４を得た。該ウイルスは制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析によりβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の存在とＴＫ遺伝子のおよそ６１９塩基対の欠損を確認した。残ったＴＫ遺伝子には、アミノ酸１から７７とアミノ酸２８６から３６３までを含む蛋白がコードされていた。ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺ遺伝子はＴＫ遺伝子の転写と逆向きに位置している。
Ｓ−ＩＬＴ−００４はＩＬＴＶ  ＴＫ遺伝子の欠損により減毒化されるが、その他のＩＬＴウイルスに対する鶏の免疫反応に関わる既知の遺伝子は保存されている。従って、Ｓ−ＩＬＴ−００４はＩＬＴ病から鶏を守るための死滅ワクチンとして利用できるだろう。
実施例３
Ｓ−ＩＬＴ−００９
Ｓ−ＩＬＴ−００９は、ＩＬＴＶ  ＵＳ２遺伝子におよそ４９８塩基対の長さの欠損と、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子におよそ８７４塩基対の欠損を持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ）をＵＳ２の内に挿入し、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｐＸプロモーターの制御下におく。
Ｓ−ＩＬＴ−００９はホモロジーベクター５４４−５５．１２（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００２（ＵＳＤＡ  ＩＬＴＶ株８３−２）を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞のストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。青色のプラークを精製した結果、組換体ウイルスＳ−ＩＬＴ−００９を得た。該ウイルスは制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析によりＰＲＶ  ｇＸプロモーターβガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子の存在とＩＬＴＶ  ＵＳ２遺伝子のおよそ４９８塩基対の欠損、ならびにＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子のおよそ８７４塩基対の欠損を確認した。しかし、ＢｌｕｏｇａｌTMによる組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子スクリーニングの間に、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺ遺伝子の欠損が既存のＩＬＴＶ  ｇＧ欠損内に発見された。残ったＩＬＴＶ  ｇＧ欠損内の挿入遺伝子には、ｌａｃＺ遺伝子の全てとＰＲＶ  ｇＸポリアデニレーションサイトの一部が失われたおよそ２０００塩基対長のＤＮＡが含まれる。この欠損は詳細な制限酵素地図により特徴付けされ、Ｓ−ＩＬＴ−０１４欠損（実施例５参照）とは僅かに異なることが判明した。
Ｓ−ＩＬＴ−００９はＩＬＴＶＵＳ２およびｇＧ遺伝子の欠損により減毒かされているが、その他のＩＬＴウイルスに対する鶏の免疫反応に関わる既知の遺伝子は保存されている。従って、Ｓ−ＩＬＴ−００４は表に示すようなＩＬＴ病から鶏を守るための減毒化ワクチンあるいは死滅ワクチンとして利用できるだろう。Ｓ−ＩＬＴ−００９はＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子を発現しないから、前記の如く感染した動物とワクチン投与された動物を区別する陰性マーカーとして利用できる。
0003964458.tif 000003
実施例４
Ｓ−ＩＬＴ−０１１
Ｓ−ＩＬＴ−０１１は、ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子におよそ９８３塩基対の長さの欠損を持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ）をｇＩ遺伝子の内に挿入し、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｐＸプロモーターの制御下におく。ＰＲＶ  ｇＸプロモーターｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの転写方向と逆向きに位置する。
Ｓ−ＩＬＴ−０１１はホモロジーベクター５６２−６１．１Ｆ（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００１を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞のストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。青色のプラークを精製した結果、組換体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０１１を得た。該ウイルスは制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析により、βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子の存在と、ｇＩ遺伝子の５’端から３６３アミノ酸コドン中３２５が欠損するＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子のおよそ９８３塩基対の欠損を確認した。
Ｓ−ＩＬＴ−０１１は減毒化されており、またＩＬＴ病から鶏を守るための死滅ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１１は組織培養中では小さなプラーク表現形を示し、ゆっくりとしたウイルスの増殖と減毒化を示している。Ｓ−ＩＬＴ−０１１はＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子を発現しないから、感染した動物とワクチン投与された動物を区別する陰性マーカーとして利用できるだろう。実施例１に示す様に、ＩＴＬＶ−感染ひよこはＩＬＴＶ  ｇＩ蛋白に対する抗体を作る。
実施例５
Ｓ−ＩＬＴ−０１３
Ｓ−ＩＬＴ−０１３は、ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子におよそ９８３塩基対の長さの欠損と、およそ８７４塩基対の長さの欠損をＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子内（ならびに非機能的なｌａｃＺ遺伝子を作るＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子の欠損）に持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ）をｇＩ遺伝子の内に挿入し、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｐＸプロモーターの制御下におく。
Ｓ−ＩＬＴ−０１３はホモロジーベクター５６２−６１．１Ｆ（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−０１４を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞のストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。青色のプラークを精製し、組換体ウイルスＳ−ＩＬＴ−０１１を得た。該ウイルスは制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析により、βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子の存在と、ｇＩ遺伝子の５’端から３６３アミノ酸コドン中の３２５コドンを除くことになるＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子のおよそ９８３塩基対長の欠損を確認した。この解析はまた親のＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子内のおよそ８７４塩基対長の欠損、ならびにＨＣＭＶＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子ＤＮＡにおよそ１９０６塩基対長の挿入があり、その結果ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター部分とｌａｃＺ遺伝子の大部分が残っていないことを確認している。（実施例６参照）
Ｓ−ＩＬＴ−０１３は減毒化されており、またＩＬＴ病から鶏を守るための死滅ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１３は組織培養中では、ゆっくりとしたウイルスの増殖と減毒化を示す小さなプラーク表現形を表した。Ｓ−ＩＬＴ−０１３はＩＬＴＶ  ｇＩあるいはｇＧ遺伝子を発現しないため、ＩＬＴＶｇＩならびにｇＧを、感染した動物とワクチン投与された動物を区別する陰性マーカーとして利用できる。
実施例６
Ｓ−ＩＬＴ−０１４
Ｓ−ＩＬＴ−０１４は、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子におよそ８７４塩基対の長さの欠損と、ｌａｃＺ遺伝子を機能させなくするため挿入されたＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子を欠損させた、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。Ｓ−ＩＬＴ−０１４は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子の欠損が起きている精製したＳ−ＩＬＴ−００２ウイルスストックから誘導した。
Ｓ−ＩＬＴ−００２はホモロジーベクター４７２−７３．２７（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００１を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。ウイルスＳ−ＬＩＴ−００２はＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子内に８７４塩基対長の欠損と、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子内に大腸菌βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の挿入を有している。しかし、ＢｌｕｇａｌＴＭ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いる作業では、ＩＬＴＶ  ｇＧ欠損内のｌａｃＺ遺伝子の欠損を含む白色のプラークを取り上げた。
該ウイルス、Ｓ−ＩＬＴ−０１４は制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析により、ＩＴＬＶｇＧ遺伝子におよそ８７４塩基対長の欠損と、親ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃＺマーカー遺伝子ＤＮＡ（２９５８塩基対長）におよそ１９５６塩基対長の挿入があることを確認した。残ったＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターｌａｃマーカー遺伝子ＤＮＡは、およそ１１５４塩基対長のＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの内のおよそ６８６塩基対長の長さのＤＮＡ断片とβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の３０１０塩基対の内の５２０塩基対長を含む１２７０塩基対長のＤＮＡ断片ならびにＰＲＶ  ｇＸポリアデニレーションシグナルのおよそ７５０塩基対長のほぼ全長から構成される。
Ｓ−ＩＬＴ−０１４は以下の表に示すようにＩＬＴ病から鶏を守るための減毒化生ワクチンあるいは死滅ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１４はＩＬＴＶ  ｇＧを発現しておらず、また実施例１に示す様に鶏はｇＧに対する抗体を作ることから、ＩＬＴＶ  ｇＧを感染した動物とワクチン投与された動物を区別する陰性マーカーとして利用することができる。
0003964458.tif 000004
実施例７
Ｓ−ＩＬＴ−０１５
Ｓ−ＩＬＴ−０１５は、ＵＬ４７様遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、ならびにＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子のおよそ２６４０塩基対の長さの欠損を持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。大腸菌βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）をＵＬ４７様、ＯＲＦ、ならびにｇＧ遺伝子の位置に挿入し、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下におく。ＰＲＶｐＸプロモーターｕｉｄＡ遺伝子はＩＬＴＶのＵＬ４７様、ＯＲＦ４、ならびにｇＧ遺伝子の転写方向と逆の方向に位置する。
Ｓ−ＩＬＴ−０１５はホモロジーベクター５６０−５２．Ｆ１（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００１を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞ストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。得られた青色のプラークを精製したものがＳ−ＩＬＴ−０１５であった。該ウイルス、Ｓ−ＩＬＴ−０１４は制限酵素地図ならびにＤＮＡのサザンブロッティング法により特徴付した。この解析により、ＵＬ４７様遺伝子の３’端の全長５１１アミノ酸コドン配列中の４４２アミノ酸部分、ＯＲＦ４遺伝子の全て、そしてｇＧ遺伝しの５’端の２９７アミノ酸コドンのうちの２７１に相当する配列を含む２６４０塩基対長を欠損していることが確認された。
Ｓ−ＩＬＴ−０１５は以下の表に示すように、ＩＬＴ病から鶏を守るための減毒化生ワクチンあるいは死滅ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１５はＩＬＴＶ  ｇＧを発現していないため、ＩＬＴＶ  ｇＧを感染した動物とワクチン投与された動物を区別する陰性マーカーとして利用することができる。
0003964458.tif 000005
実施例８
Ｓ−ＩＬＴ−０１７
Ｓ−ＩＬＴ−０１７は、ＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子、ＯＲＦ４遺伝子、ならびにｇ６０遺伝子のおよそ３３５１塩基対の長さの欠損を持つ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。大腸菌βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）をＩＬＴＶ  ｇＧならびにｇ６０内に挿入し、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＸプロモーターの制御下におく。
Ｓ−ＩＬＴ−０１７はホモロジーベクター５７９−１４．Ｇ２（材料と方法を参照）とＳ−ＩＬＴ−００１を用いて、組換体ＩＬＴウイルス作成用ＤＮＡ形質転換細胞内に構築した。形質転換細胞ストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングした。得られた青色のプラークを精製したものがＳ−ＩＬＴ−０１７である。
Ｓ−ＩＬＴ−０１７はＩＬＴＶｇ６０とｇＧ遺伝子を欠損することで減毒化されているが、その他のＩＬＴに対する鶏の免疫反応に関わる遺伝子は保存されている。従って、Ｓ−ＩＬＴ−０１７はＩＬＴ病から鶏を守るための死滅ワクチンとして有用である。Ｓ−ＩＬＴ−０１７はＩＬＴＶ  ｇＧあるいはｇ６０遺伝子を発現していないため、感染動物とワクチン投与された動物とを区別する陰性マーカーとして利用することができる。
実施例９
感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）スパイクおよびマトリックス蛋白遺伝子を発現する組換体伝染性喉頭気管炎ウイルス
ホモロジーベクターを用いてＩＢＶアーカンサススパイク蛋白遺伝子を含むＩＬＴウイルスを作成する。組換体ＩＬＴウイルスには、ｇＧ，ＵＳ２，ＵＬ４７様、ならびにＯＲＦ４を含むＵＩＬＴＶ遺伝子を１つ以上の欠損と、２種類の外来遺伝子：大腸菌βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）ならびにＩＢＶアーカンサススパイク蛋白遺伝子の挿入がある。ｕｉｄＡ遺伝子はＰＲＶｐＸプロモーターの制御下にあり、またＩＢＶアーカンサススパイク蛋白遺伝子はＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下にある。
ＩＬＴウイルス内への挿入外来遺伝子を含むホモロジーベクターを構築するため、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＩＢＶアーカンサススパイク蛋白およびＨＳＶ−１ＴＫポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片を、ＩＬＴＶホモロジーベクター内のＩＬＴＶ  ｇＧ遺伝子の欠損部位にある制限酵素サイトに挿入する。ＰＲＶ  ｇＸプロモーターと大腸菌βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）をＩＬＴＶホモロジーベクター内の特異的な制限酵素サイトに挿入する。ＩＢＶアーカンサススパイク蛋白遺伝子と大腸菌βガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子を含む最終のホモロジーベクターとＳ−ＩＬＴ−００１を組換体ＩＬＴウイルス作成用のＤＮＡ形質転換細胞体の中で組み合わせて構築した。形質転換細胞ストックをＸ−Ｇｌｕｃ組換体ヘルペスウイルス発現酵素マーカー遺伝子用スクリーンを用いてスクリーニングし、ｕｉｄＡ遺伝子の存在を検出し、外来遺伝子発現用の黒色プラークアッセーを用いてＩＢＶアーカンサススパイク蛋白の存在を確認した。
同様の進め方でアーカンサス、マサチューセッツ、あるいはコネチカット血清型のＩＢＶ  Ｓ１蛋白、アーカンサス、マサチューセッツ、あるいはコネチカット血清型のＩＢＶマトリックス蛋白、ならびにアーカンサス、マサチューセッツ、あるいはコネチカット血清型のＩＢＶ核カプシドを有する組換体ＩＬＴウイルスを構築する。該方法はまたニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ＨＮおよびＦ遺伝子や感染性ブルサール病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリプロテインあるいはその部分を有する組換体ＩＬＴウイルスの構築にも利用される。また該方法はマークス病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＡ、ｇＤ、ならびにｇＢ遺伝子を有する組換体ＩＬＴウイルスの構築にも利用される。
これら抗原を有する組換体ＩＬＴウイルスは多価ワクチンとしてＩＬＴＶが原因の病気から鶏を守る上で有用であり、またＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶあるいはＭＤＶ単独あるいは複数に由来する病気から鶏を守るうえでも有用である。本明細書記載のＩＬＴＶワクチンはＩＬＴＶ  ｇＧを発現しないので、感染動物とワクチン投与された動物を区別する際の陰性マーカーとしても有用である。
実施例１０
様々な疾患を引き起こす微生物類の抗原を発現するＩＬＴＶ応用ワクチン
以下の微生物類の抗原は家禽用ワクチンの開発に応用される：ひよこ貧血菌、鳥能脊髄炎ウイルス、鳥オレウイルス、鳥パラミクソウイルス、鳥インフルエンザウイルス、鳥アデノウイルス、仮痘ウイルス、鳥コロナウイルス、鳥ロタウイルス、サルモネラ菌、大腸菌、パスチュルラ菌、ヘモフィリス菌、クラミジア菌、マイコプラズマ菌、カンビロバクター菌、ボレデテラ菌、家禽線虫、サナダムシ、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽原生動物（エイメリア類、ヒストモナス類、トリコモナス類）。
実施例１１
伝染性喉頭気管炎ウイルスならびに特異短領域内に存在する遺伝子の配列と構成に関する遺伝子地図
エンドヌクレアーゼマッピング．４３の重なり合うコスミッドをＡｓｐ７１８ＩとＮｏｔＩで処理して解析した。Ａｓｐ７１８Ｉはゲノムを比較的低頻度に切断することが知られており（６３）、一方ＮｏｔＩはゲノムを１０倍以下で切断し、その結果挿入ＩＬＴＶ  ＤＮＡからベクターを切り出すことができることが知られている。切断された３種類のコスミッドを比較することで、ＩＬＴＶゲノムの８５％以上をカバーするＡｓｐ７１８Ｉ断片の配置を決めることができた（図１２）。ゲノムの長端上に７つのコスミッドが特定されたが、これらはクローン化された挿入体の端から０．９ｋｂの位置にＮＯｔＩサイトを有していた；その他のコスミッド挿入体はこの共通端とは異なる端部を有していた。この０．９ｋｂの断片を（図１２のＰ１）Ａｓ７１８Ｉ、ＮｏｔＩ、あるいはＢａｍＨ１で処理したゲノムＩＬＴＶに対するプローブとして使用した；ハイブリダイズしたゲノム断片の大きさは、クローン化されたコスミッド挿入体から切り出した断片の大きさに同一であることから、クローン化された挿入体は特異長全長あるいはそれに極めて近い長さまで伸長していることが示唆される。この０．９ｋｂの断片はその他のＩＬＴＶ消化体であるその他のバンドとはハイブリダイズせず、このウイルスがＰＲＶに似おり、また長い繰り返し構造を持たないという従来の報告に一致した（６６）。また、コスミッドクローンは、より頻繁に切断する酵素、ＢａｍＨＩの制限酵素サイトについても整理しマップを作成した。
得られたマップから、コスミドライブラリーにはゲノム由来の特異短域部位のクローンが含まれていないことが示された。ＨＶＴ（７６）およびＰＲＶ（８３）の特異短域に拡がるコスミッドはコスミッドライブラリーに開示されている。野生型ＩＬＴＶをＡｓｐ７１８Ｉで処理したコスミッドクローンに認められるＡｓｐ７１８Ｉ断片と、今回みつかったコスミッドライブラリー中にはない８．０，５．１，ならびに２．５ｋｂの断片（図１３）を比較した。これらの断片をプラスミド中にクローン化し、相互ならびにＢａｍＨＩで処理したＩＬＴＶにハイブリダイズした。Ａｓｐ７１８Ｉの２．５および８．９ｋｂ断片が相互にハイブリダイズすることから、両クローンには繰り返し配列が含まれることが示唆される。Ａｓｐ７１８Ｉ  ２．５ならびに８．０ｋｂ断片の詳細なマッピングから、両断片には２．１ｋｂの同一の配列が含まれることが示された。ＢａｍＨＩで処理されたＩＬＴＶとハイブリダイゼーションさせた結果、Ａｓｐ７１８Ｉ断片と重複する７．５，６．５，４．５ｋｂのＢａｍＨＩバンドが同定された。これらのＢａｍＨＩ断片をクローン化してから制限酵素で処理しハイブリダイゼーションした。この操作により特異短領域全体の詳細な地図が得られ、幾つかの短い繰り返し配列も明らかになった（図１３）。この領域のサブクローンを作り、全特異領域の配列を調べた。
ゲノムマップを完成させるために、マップを上記の８．０あるいは２．５ｋｂのＡｓｐ７１８Ｉ断片の短繰り返し配列に挟まれた領域を覆うＡｓｐ７１８ＩあるいはＢａｍＨＩ断片とコスミッドマップ中に同定される特異長領域について調べた。コスミッドＤ５の最右端から１０ｋｂ  ＮＯｔＩ断片（図１２）をゲノムＩＬＴＶ消化物とサザンブロットを用いてハイブリダイズした。興味有ることに、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ならびにＡｓｐ７１８Ｉを使用するとラダー状のハイブリダイズしたバンドが観察された。これらのラダーに相当するバンドはエチジウムブロマイド染色したゲルでは通常観察されない。引き続きサブクローニングし１０ｋｂのＤ５断片をマッピングした結果、８５６塩基対長の断片の繰り返しが５回まであることが、またコスミッド挿入体がクリカエシモチーフ内で終止していることが示された。該繰り返しを１回切断するＨＩｎｄIIIを用いて８５６塩基対長断片をクローン化した。この断片（図１２，Ｐ２）をプローブとして用いてＳｆｔＩ、ＮｏｔＩ、Ａｓｐ７１８ＩおよびＢａｍＨＩで処理したＩＬＴＶを調べると、ハイブリダイゼーションのラダーがまた見られた（図１４）。これらのラダーは、異なるウイルス分子内では８５６塩基対長の繰り返し数が様々であることに由来している。ＳｆｉＩはＩＬＴＶ株では１回だけ切断し、高分子にラダーが観察される。特徴的短域は逆転していると考えられることから、特異短域とターミナル繰り返し配列（ＴＲ）を含む重複する２種類のＳｆｉＩラダーが存在するはずである；しかし、バンドはこの領域では大きすぎて区別することができなかった。ＮｏｔＩとＡｓｐ７１８Ｉは繰り返しから遠く離れており、その結果１０．５あるいは１２ｋｂから始まるラダーを作る。Ａｓｐ７１８Ｉ消化物は、特異長域内のＡｓｐ７１８Ｉサイトで１つの断片が結合し、もう一つはＴＲ短で結合することから、２つの重複するラダーをつくるはずである。一方、ＮｏｔＩ消化では１種類のラダーが作られるはずである。図１４のレーンｃ（ＮｏｔＩ）とレーンｄ（Ａｓｐ７１８Ｉ）を比較すると、レーンｄ内に２番目のラダーが、少し高い位置から始まる第一のラダー内に組み込まれいることが示唆される。ＢａｍＨＩは繰り返し域の近傍を切断し、そのラダーは３．４ｋｂから開始することが分かった。ＨｉｎｄIIIは繰り返し配列内で切断し、その結果強くハイブリダイズする８５６塩基対長のバンドを生じさせると同時に繰り返し配列部分を含むおよそ１．１と２．５ｋｂのＨＩｎｄIII断片をも生じる。この８５６塩基対長の繰り返し配列の存在は、エチジウムブロマイドで染色したＡｓｐ７８１Ｉ消化体中に極めて細かいバンドが時折観察されることに関係している。また、これはエチジウムブロマイドで染色したゲル中にから、コスミッドクローンの分析によりこの領域全体をカバーすると思われる１０ｋｂ以上の大きさのＡｓｐ７１８ＩあるいはＢａｍＨＩバンドが１モルあるいはサブモル量消失することにも関係する。ＢａｍＨＩ消化体に見られる様に、この領域内には１３以上の繰り返しが存在している。この繰り返し配列をＪｏｈｎｓｏｎらはＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列と比較した（６７）し、この配列がＩＬＴＶＩＣＰ４遺伝子の直���上流域であるヌクレオチド１１４０から１９９６の間の配列に同じ（同一率９９％）であることを示した。この繰り返し配列と周辺の配列との関係を図１５に示す。制限酵素処理から、示した繰り返し配列の右端の領域は２つの株で類似している：しかし、ＢａｍＨＩサイトの位置から、繰り返し配列の左端が両株で異なることが示された。
８５６塩基対長の繰り返し領域からこの特異短域の配列決定に使用したＢａｍＨＩ断片までの短領の残りを明らかにするために、この短域部分を含むＡｓｐ７１８Ｉ断片をプローブに用いて第二のＩＬＴＶコスミッドライブラリーを調べた。１つのコスミッド、クローン２Ｆ１２がプローブとハイブリダイズした。２Ｆ１２の制限エンドヌクレアーゼ分析とコスミッドマップの比較から、これが単一の連接したコスミッドでなく、２つの大きな比連接断片から成っていることが示された（図１２参照）。差右端断片の切断点は８５６塩基対域の繰り返し内に存在した。この断片には少なくとも２つの８５６塩基対長の繰り返し配列が含まれており、この短い繰り返し配列の残りが特異短域に入ることにより４．６ｋｂまで配列長が伸長した。
ＴＲ端を決めるため、長いならびに短い内部繰り返し（ＩＲ）（図中のＰ３）を覆う６．６ｋｂのＮｏｔＩ断片をプローブに用いた。エチジウムブロマイド染色したゲルに認められる２．９ｋｂ  ＮｏｔＩ断片は、制限エンドヌクレアーゼマップには認められないことから、ＴＲの端を示していると考えられた。ＩＬＴＶのＮｏｔＩ消化体とＰ３がハイブリダイゼーションすることからもこの考えは支持された（図１６）。２．９ｋｂのＮｏｔＩバンドはプローブの６．６ｋｂのバンドと同様にハイブリダイズする。ＢａｍＨＩ消化では、予想される１３ｋｂのＩＲ部位を含む断片と、ＴＲの端に相当する３．５ｋｂの断片が示された。Ａｓｐ７１８Ｉ消化では、特徴的な長域から得た重複する２．７ｋｂの断片がハイブリダイズし、前記の高分子のラダーが観察された。
ＩＬＴＶ特徴的な短いブランキング域の配列をした結果、図１３（配列番号５９）に図示す様に特異配列域内に９つのオープンリーディングフレームと繰り返し配列域内に２つのオープンリーディングフレームを見いだした。これらのオープンリーディングフレームにコードされる蛋白をＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＢＬＡＳＴホモロジー検索．国立生物情報センター、ＮＣＢＩ）と比較した結果、想定される蛋白の多くと他の既知ヘルペスウイルス遺伝子産物との間に同一性が示された。表Ｖは各遺伝子と最も高い相同性が認められたものを要約し、検索プログラムによるこれら相同性の確実性スコアを示す。ＯＲＦ２（配列番号６３）、蛋白キナーゼ（ＰＫ）遺伝子（配列番号６３）はヘルペスとの相同性が最も保存されたＩＬＴＶのＯＲＦである。逆に、糖蛋白遺伝子は保存性が低い。ＩＬＴＶ蛋白キナーゼ、ｇＧ、ならびにＯＲＦ５遺伝子の配列の一部はすでに公表されている（６９，７０ならびに８１）；しかし、これらの遺伝子が特徴的な長い領域内にマップされたことを記す必要がある。９つの特徴的短遺伝子ならびにブランキング単域内にある２つの遺伝子のそれぞれについて以下記す。
特徴的な短い遺伝子内にある最初のオープンリーディングフレームには、他のヘルペスウイルスＵ２と同一性を示す２２９アミノ酸がコードされている（配列番号６２）。他のＵＳ２遺伝子同様、この遺伝子も特徴的な短い遺伝子内にある他のオープンリーディングフレームとは逆向きに配置されている。この遺伝子のコーディング配列は特徴的な短い領域内で終止し、ポリＡ付加サイトと思われる配列がこの短い領域内の１１５塩基下流に見いだされる。２カ所のＴＡＴＡプロモーターと思われる配列が開始コドンの３７および７０塩基上流に見られた。
ＯＲＦ２は他のヘルペスウイルスの蛋白キナーゼや細胞性蛋白キナーゼと強い同一性を持つ蛋白カイネースをコードしている。５’端が互いに近接し、そのプロモーターが重複していると思われるＵＳ２とＰＫ遺伝子の位置関係は、他のヘルペスウイルスに見られる関係に類似している。２つのＴＡＴＡ配列がＰＫの開始コドンの１４ならびに４９塩基上流にあり、２カ所のポリアデニレーションシグナルは、１つは終止コドン直後に、残りは５０塩基下流にある。
ＯＲＦ３は単純ヘルペスウイルスＵＬ４７遺伝子に類似した６２３アミノ酸の蛋白をコードする（配列番号６４）。この蛋白と他のＵＬ４７蛋白をプログラムを用いて比較したところ、低い相同性のスコアが想定された。しかし、少なくともＩＬＴＶと、他のヘルペスウイルスの間で保存されているＵＬ４７内の領域部分のＨＳＶ  ＵＬ４７との間に、同一性を有する領域が１カ所あったことから、この同一性は重要であることが示唆された（図１７）。さらに、ｇＧあるいはｇＩ遺伝子と比較した場合に相同性スコアが共に低かったのと同様に、特定の相同性組み合わせでも低いスコアが見られたことは、これらのスコアがホモロジーの決定に十分でないことを示唆している。通常他のヘルペスウイルスでは特徴的な長い領域にあるＩＬＴＶ  ＵＬ４７遺伝子がＩＬＴＶでは特徴的な短い領域に転移したと考えられる。
４番目のオープンリーディングフレームはＰＲＶ  ｇＧに相同な２９２アミノ酸からなる糖蛋白をコードしている（配列番号６５）。共通配列ＮＸＴあるいはＮＸＳを持つ４カ所のＮ−結合グリコシレーションサイトがあった。この蛋白はＧ／ＡＰ箇所で開裂することができる２６アミノ酸長のシグナル配列を有しているが、トランスメンブレンアンカーを欠いている。従って、この蛋白は、ヘルペスウイルスｇＧ相同体と同様に分泌されると思われる。この遺伝子にはＡＴＧ開始コドンから８３塩基上流にコンセサンスＴＡＴＡ配列があり、また終止コドンの７３および１６６塩基下流にポリアデニレーションサイトと思われる所が２カ所ある。
ＯＲＦ５は９８５アミノ酸長の蛋白をコードする（配列番号６６）。疎水性のシグナル配列がアミノ末端に見られ、また疎水性の配列がカルボキシル末端にある。９カ所のグリコシレーションサイトがあることから、この蛋白が糖蛋白であることが示唆されている。ＯＲＦ５にはアミノ酸４３１からアミノ酸６７７までにおよそ２３回繰り返す不完全な３０から３６塩基対長の繰り返し構造がある。この繰り返し構造により作られる疎水性のアミノ酸共通配列はＦＴＱＴＰＳＴＥＰＥＴ／Ａである。ＯＲＦ５を他のヘルペスの配列と比較した結果（表Ｖ）、ウマヘルペス１ＵＳ５遺伝子（配列番号８２）の糖蛋白産物との間に類似性が認められた。この同一性の蓋然性が低いのは、一義的には両遺伝子にスレオニンリッチな繰り返し配列が含まれることに原因している。このことが形、機能、あるいはその両方での相同性に関係するかは不明である。ＥＵＳ５とＩＬＴＶ  ＯＲＦ５遺伝子は共に大きな遺伝子で、特徴的な短い領域内のブランキング遺伝子の間に同じ様に位置しており、シグナル配列を有し、そして糖蛋白をコードしているが、その他の類似性は無い。ＯＲＦ５の繰り返し域がやはりスレオニンリッチな繰り返し構造を持う粘液の遺伝子に似ていることは興味深い。例えば、ヒトの粘液遺伝子はＧＴＯＴＰＴＴＴＰＩＴＴＴＴＴＶＴＰＴＰＴＰＴという繰り返し配列をもっており、はじめの１１のアミノ酸のうち７つのアミノ酸がＯＲＦ５の繰り返し配列に同じである。この場合も、この類似性がコードされた蛋白の機能上の類似性に関係するかは不明である。ＴＡＴＡ配列が開始コドンの上流５６０塩基の位置に一つある。このことはＯＲＦ５の転写がｇＤの転写と同一カ所で終止することを示唆している。
ｇＤ相同体のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ６）（配列番号６７）はＯＲＦ５の終止部分に重複している。４つのフレーム内メチオニンがオープンリーディングフレームの初めの５８アミノ酸までの領域にあり、そして実際の翻訳開始コドンがどこであるか不明である。ＴＡＴＡプロモーターと考えられる配列が最初のＡＴＧコドンの６−９塩基上流に位置しているが、さらに上流にも別の複数のＴＡＴＡ配列があり、転写の開始に使用される可能性がある。他の３つの開始コドンとなりうる配列はＯＲＦ内の２３，４７ならびに５８の位置にある。４つのＡＴＧ周辺の配列を真核生物の翻訳開始共通配列Ａ／ＧＣＣＡＴＧＧ（７１）と比較したところ、後の２つのＡＴＧコドンが翻訳開始部位により相応しいことが示唆された。各開始コドンから読みとった蛋白の配列について真核生物のシグナル配列とシグナル開裂サイトの有無を調べた。ＯＲＦ内のアミノ酸５８の位置より開始すると、２つのアラニン残基の間に１つの開裂サイトと思われる部位を有する２６アミノ酸長のシグナルペプチドが得られる。他の開始位置から読み始めると、この同じシグナル配列がアミノ末端からより遠くなり、またより疎水性の強い配列内に埋め込まれる様になる。ＩＬＴＶｇＤの開始位置を仮に５８の位置とすると、３７７アミノ酸長の蛋白が得られる。もちろん生体内での開始コドンが複数であることもあり得る。Ｚｅｌｎｉｋら（８８）の実験から、生体内の状態を帰ることなくフレーム内の別のＡＴＧコドンを用いてＭＤＶとＨＶＴｇＤの転写が生体内で開始することが示された。翻訳開始コドンを特定するためには、ＩＬＴＶ内でのｇＤ転写ならびに翻訳に関する別の実験が必要である。ＩＬＴＶｇＤ相同体は分泌シグナルとトランスメンブレンヘリックス（アミノ酸３５２−３７２）をカルボキシル末端に持っている。グリコシレーションの可能性のあるサイトは１カ所だけで、アミノ酸２５０−２５２に位置する；これはＮＰＳのなかであり、おそらくプロリン残基のグリコシレーションは無いだろう。従って、プロセスされたＩＬＴＶｇＤがＮ結合性のオリゴサッカライドを含んでいるかという問題には疑問がある。このことはやはりＮ結合性のグリコシレーションサイトを欠く偽狂犬病ウイルスのｇＤ相同体に似ている（７５）。他のヘルペスウイルスと同様に、ｇＤコーディング配列には本遺伝子が直ぐに続いているポリＡ付加シグナルは無く、最も接近しているシグナルはｇＩ遺伝子端のものである。
７番目のオープンリーディングフレームは３６２アミノ酸長の蛋白をコードしており、水疱帯状疱疹ウイルス糖蛋白Ｉ（配列番号６８）に最も相同である。コードされた蛋白は、グリシンとイソロイシンの間の２２と２３の位置に開裂サイトとなりえる配列を有するシグナル配列を持つことや、トランスメンブレンヘリックスをカルボキシル末端の２７２−２９２に有すること、そして４カ所のＮ結合性グリコシレーションサイトと思われる配列を有することなど、関連するｇＩ糖蛋白の持つ全ての特徴を示す。ＴＡＴＡ配列はメチオニン開始コドンから上流５１塩基のところにある。ＩＬＴＶ  ｇＩをコードする配列内に２つのポリＡ付加シグナルとなりえる配列があり、上流のｇＤならびにＯＲＦ５転写単位によりシグナルが利用されていると考えられる。
ｇＥ遺伝子（ＯＲＦ８）はｇＩに続くものである。この遺伝子は４９９アミノ酸長であり、４カ所のＮ結合性グリコシレーションサイトを有する（配列番号６９）。１８アミノ酸からなるシグナル配列があり、さらに２つの膜と結合したヘリックスと３つの同様の可能性があるヘリックスが蛋白のカルボキシル端部位にある。ｇＥ遺伝子には開始コドンの８６塩基上流にＴＡＴＡボックスがあり、コーディング域の３’端の直前にはポリＡ付加シグナルと思われる配列がある。この配列はｇＩ遺伝子のポリアデニレーションに関与するのだろう。
９番目のオープンリーディングフレームは特徴的な短い領域と短い繰り返し域の接続部を越えて延びており、２６０アミノ酸長の蛋白をコードしている（配列番号７０）。この蛋白にはシグナル配列あるいはメンブレンアンカーがないが、グリコシレーションサイトと思われるカ所が１つある。ＧｅｎＢａｎｋの検索では、本蛋白とＥＢＶのＢＬＲＦ２との間に類似性が見られたが、この類似性が有意であるか不明である。短繰り返し域内のポリＡ付加シグナルもこの遺伝子により利用されると考えられる。ＴＡＴＡ配列と思われる配列がＯＲＦの最初のＡＴＧの１７８塩基上流にある。
短い繰り返し内にある最初のオープンリーディングフレーム（ＳＲＯＲＦ１）（配列番号６１と７１）には２９４アミノ酸長の蛋白がコードされ、ＭＤＶＳＯＲＦ３（７９と８４）ならびにＨＶＴＯＲＦ３（８７）の遺伝子産物との間に相同性を示した。ＭＤＶとＨＶＴでは、対応する遺伝子が特徴的な短域内に１コピー見つかっているがその機能は不明である。哺乳動物のヘルペスウイルスとの相同性は認められない。ＭＤＶＳＯＲＦ３はＰａｒｃｅｌｌら（７４）により発見され、鶏の感染に必須ではないと考えられている。
ＳＲＯＦＲ２は他のヘルペスウイルスＵＳ１０遺伝子に相同性を有する２７８アミノ酸長の蛋白をコードする（配列番号６０と７２）。ＥＨＶ−４ＵＳ１０に見つかった亜鉛フィンガーモチーフがＩＬＴＶ  ＵＳ１０内に高く保存されている（アミノ酸２０１−２１８）；このことはＩＬＴＶ  ＵＳ１０遺伝子がＤＮＡ結合蛋白であることを示唆している。ポリＡ付加シグナルを含む規則的配列が停止コドン後１６３塩基の位置にある；この遺伝子のプロモーターの位置は不明である。
＜考察＞：
ＩＬＴＶの特徴的な短い領域内にある遺伝子の配置は、他のヘルペスウイルスに見られる配置に類似している。糖蛋白をコードする幾つかの遺伝子が存在し、これらの遺伝子の配置はウマヘルペスウイルス１の配置と類似しており、特にＯＲＦ５については近似している。鳥のヘルペスウイルスとの類似性についても、鳥特異的遺伝子の存在やＳＲＯＲＦ１、そしてＨＶＴならびにＭＤＶとは短い繰り返しと複製した形であること、そしてＯＲＦ９遺伝子の下流に存在する点で異なるがＵＳ２とＰＫとの位置関係についても認められる。ＰＫ遺伝子それ自体はＭＤＶやＨＶＴのＰＫ遺伝子とほとんど同じである；しかし、その他の遺伝子はＥＨＶ、ＰＲＶ、そしてＳＨＶ  ＳＡ８の様な別系統のヘルペスウイルスとの間により高い相同性が認められる。ＩＬＴＶの特徴的な短い領域の特徴は通常は長い領域に見られる遺伝子、ＵＬ４７相同配列を包含していることと、特徴的な遺伝子、変化した繰り返し配列のセットを含むＯＲＦ５の存在にある。
ＩＬＴＶの構造分析の結果はこれまでの報告と一致しない。本明細書に記載された配列をオーストラリアＩＬＴＶ株ＳＡ−２の配列と比較すると、Ｋｏｎｇｓｕｗａｎら（６９）により報告されている３２ｋｄの蛋白は本明細書のｇＧとほとんど同一であり、またＫｏｎｇｓｕｗａｎら（６９）によるｇ６０蛋白の配列決定された断片は、本明細書中のＯＤＲ５遺伝子の一部と同じである。しかし、かれらはＳＡ−２の特徴的な長い領域に由来するこれらの遺伝子の両方を含む５ｋｂのＡｓｐ７１８Ｉ断片を見つけている（６６）。最近、Ｇｕｏら（６２）はＵＳＤＡを感染株から得た領域の配列を報告しており、Ｊｏｈｎｓｏｎら（６６）により提示されたマップと比較して特徴的な短い領域があることを記載している。この配列と本明細書記載の特徴的な短い配列との間には同一性はなかった。しかし、Ｇｕｏら（６２）が記載した配列は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（６７と６８）によりＧｅｎＢａｎｋに最近登録されたＩＬＴＶのＩＣＰ４遺伝子をコードすると報告されている配列と９８％の相同性を有している。ＩＣＰ４のコーディング域内のＢａｍＩサイトにより２つの連接する１．２ｋｂと１．７ｋｂの断片が得られる（図１５参照）。本明細書記載の地図では、この大きさの連接する２つのＢａｍＨＩ断片が短域内に認められる（図１２）。さらに、ＩＣＰ４遺伝子の直ぐの上流にある８５６塩基対長の繰り返しエレメント（図１５）は本明細書では短い繰り返し配列内にマップされている。このことから、本試験で用いた株のＩＣＰ４遺伝子はＩＲｓとＴＲｓ内に存在していることを示している。しかし、オーストラリアＳＡ−２ワクチン株で異常な再配置が起こり、特徴的な長い領域や特徴的な短い領域、そして短い繰り返し配列の関係が変化することは考えにくい。しかし、Ｇｕｏら（６２）は本明細書で記載したものと同一の感染株を使用しているが、報告された配列は特徴的な短い領域に存在しておらず、短い繰り返し配列内に存在し、他のヘルペスウイルスのＩＣＰ４遺伝子に類似している。
ＯＲＦ５によりコードされる遺伝子にはスレオニンリッチな変化した繰り返し配列が含まれる。これは粘液遺伝子に見られる組成と繰り返しの特徴に類似している。粘液の繰り返し域はＯ結合性のグリコサッカライドで修飾されており、強い疎水性を示す。ＩＬＴＶ内で発現し、このいくらか似た領域が感染にどの様な機能を果たしているのか推測することは興味深い。少なくとも該遺伝子の一部は発現されていることが知られており、Ｋｏｎｇｓｕｗａｎら（６９）はラムダｇｔ１１ライブラリーを６０ｋｄのＩＬＴＶ蛋白（ｇ６０）と結合することが分かっているモノクロナール抗体を用いてウエスタンブロット上で探索し得た断片をクローン化し配列を決定した（８６）。この６０ｋｄ蛋白とＯＲＦ５について予想される９８５アミノ酸長の産物との関連性は不明である。本明細書の配列をｇ６０をコードする領域の全配列（８１）とを比較した結果、ＳＡ−２株とＵＳＤＡ株の相同性は９８．５％であった。興味深いことに、ＯＲＦ５に関係するｇ６０の中に１０アミノ酸長のブロックの挿入がある；この違いが、ＳＡ−２株に見られる別の型の繰り返し配列を生む。
前記の如く、Kongsuwanら（７０）はＰＲＶｇＧに類似した３２ｋｄ蛋白をコードするＩＬＴＶ遺伝子を報告している。本明細書中き記載されたＩＬＴＶｇＧ蛋白の配列と彼らの３２ｋｄ蛋白を比較すると、蛋白の先頭側の２７３残基中に１０アミノ酸の違いが発見された。ＵＳＤＡ株と比べると、ＳＡ−２では２７４番目のアミノ酸位置に１塩基対の欠損があり、これによりフレームシフトが起きて、ＳＡ−２では残りが２６残基であるのに対し感染株では１９残基になる。カルボキシ末端配列から得たペプチドを用いて、マウスでＩＬＴＶ  ｇＧと反応する抗体を作成した；このことは本明細書中に記載された配列が実際のＵＳＤＡ株のカルボキシ末端を有していることを示している。同じことが本明細書に記載されたＩＬＴＶ  ｇＤ蛋白をＪｏｈｎｓｏｎらによりＧｅｎＢａｎｋに登録されたＩＬＴＶ  ｇＤ配列（６８）と比較した場合にも認められた。先頭側の４１９アミノ酸中に１０カ所の違いが認められ、その他本明細書中に記載された配列と比較するとＳＡ−２株には１カ所の欠損があり、その結果カルボキシ末端位置が異なり、ＵＳＤＡ株ではさらに１５アミノ酸があるのに対してＳＡ−２では９アミノ酸となる。この様な違いがこれらの遺伝子のクローニングと配列決定作業中に生じたエラーである可能性がある。また、ＩＬＴＶ  ｇＧとｇＤ遺伝子のカルボキシ末端がこれらの株では異なっている可能性もある。
短い繰り返し配列中に認められた８５６塩基対長の繰り返し配列はＪｏｈｎｓｏｎら（６７）により記載されたＩＣＰ４遺伝子の直ぐ上流に位置しているが、配列自体はＳＡ−２株では繰り返していない。この繰り返し域を含むＢａｍＨＩ断片はＳＡ−２では２８４８塩基対長である。最も短い繰り返し配列は図１４のＢａｍＨＩラダーに薄く見られた３．４ｋｂの長さのものである。この配列は２つの繰り返しを含むには長さが不十分であり、２つの株ではこの領域に別の違いがあることが示唆される。バンドのサブモル特性は現在のところ不明であるが、この種の繰り返し配列がこのＩＬＴＶ株あるいは他のＩＬＴＶ株で報告されたことはなかった。ラダーの出現は欠損干渉粒子の存在を推測させるが、今回使用したウイルスストック内には欠損干渉粒子が存在していないと考えられている。その理由は以下の通りである。１）欠損干渉粒子は一般にウイルスが高い増殖性をもってパッセージされている時に見られるものであるが、本明細書のＩＬＴＶウイルスストックは低い増殖性でパッセージされている。実際、単一のプラークから得たウイルスストックについて、そのＤＮＡをサザンブロットで分析すると同様のラダーがみられることから、単一ウイルス粒子にも複数の繰り返しのセットが含まれていて、短時間の増殖でも完全な幅でラダーを生ずることができることが示唆される。２）欠損干渉粒子集団が存在するなら、直鎖状のウイルスマップ中に対応する切断断片の存在が期待される（実施例、７７参照）が、分析したコスミッドでは一つを除き、ゲノムＩＬＴＶ消化物中に存在するこれらに同一のＡｓｐ７１８Ｉバンドで作成した連接地図は同じであった。例外は２Ｆ１２であり特徴的な短い領域を含むスクリーニングした数百のコスミッドクローンから１つだけ得られた特異的なものである。これはおそらく異常なクローニングの結果であり、欠損ウイルス粒子に広く認められる現象ではない。３）欠損干渉粒子はしばしば通常のウイルス粒子より大量に存在することがあり、その結果干渉粒子に由来する制限酵素断片が過剰表現される。逆に、８５６塩基対長のラダーのバンドは量的には少なく、エチジウムブロマイドで染色したゲルでは薄く認められるに過ぎない。４）欠損干渉粒子には複製オリジンが含まれる。８５６塩基対長の繰り返し配列自体にはＢａｕｍａｎｎら（５９）の共通配列として規定されるヘルペスウイルスの複製オリジンは含まれていない。上記のことから、８５６塩基対長の単位がＩＬＴＶのＵＳＤＡ感染株から得た通常のウイルスＤＮＡの短い繰り返し配列中に多様な数存在していると結論できる。この領域を１３以上含む断片が存在することから、ＩＬＴＶのゲノムＤＮＡは短い繰り返し領域内で１１ｋｂにわたり様々である可能性がある。繰り返し領域はその他のヘルペスウイルスにも同定されている：例えば、マークス病ウイルスには長い繰り返し領域内に１３２塩基対長の繰り返し配列が含まれており（６１と７３）、この繰り返し配列が大きくなるとウイルスの発癌性が低下する。逆に、この株は鶏に重度の臨床疾患を引き起こすことから、ＩＬＴＶ中の８５６塩基対長の前後繰り返し配列の存在はウイルスの病原性に影響しないようである。この繰り返し配列を持つ他のＩＬＴＶ株について調べることは興味深い。
表ＶにはＩＬＴＶの特徴的な短い領域のＯＲＦと、相同性が認められるこれら遺伝子のＨＳＶ命名を示してある。３列目にはＢｌａｓｔ相同性検索の結果の最大一致例がしめしてあり（ＮＣＢＩ）、示された一致性についてプログラムを利用し蓋然性スコアを決めた。数字が小さいほど、偶然の一致の可能性が少ないことを示している。
伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴＶ）のゲノムマップと、全ての特徴的な短い領域とブランキングしている短い繰り返し配列を含む１８，９１２塩基対長の配列を示した。ゲノムマップを作成する中で、１３回繰り返す８５６塩基対長の配列からなる領域が短い領域内に存在していることが判明した。特徴的な短い配列には９カ所のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）となり得る配列が含まれる。これらのＯＲＦの内の６つは既知のヘルペスウイルスの特徴的な短い遺伝子と相同性を有している。単純ヘルペスウイルスの命名規約を準用すると、これらの遺伝子はＵＳ２、蛋白キナーゼ、ならびに糖蛋白Ｇ，Ｄ，Ｉ，ならびにＥ（それぞれＳＯＲＦ１，２，４，６，７，ならびに８）である。興味深いことに、ＨＳＶ−１のＵＬ４７と相同なオープンリーディングフレーム（ＳＯＲＦ３）が特徴的な短い領域に認められる。大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ５）は１つであり、そこにはスレオニンリッチな変化をした繰り返し配列が含まれている。この遺伝子はヘルペスウイルスにあってＩＬＴＶに特徴的であると思われる。短い繰り返し領域の中に２つのＯＲＦが認められた。ＳＲＯＲＦ１はＭＤＶならびにＨＶＴの両方にある特徴的な短い領域に認められる遺伝子（ＳＯＲＦ３）に相同であり、鳥ヘルペスウイルスに特異的なようである。ＳＲＯＲＦ２はＨＳＶ  ＵＳ１０に相同である。
0003964458.tif 000006
0003964458.tif 000007
0003964458.tif 000008
0003964458.tif 000009
0003964458.tif 000010
0003964458.tif 000011
0003964458.tif 000012
配列表
（１）一般情報
(i)出願人
(A)氏名：ワイルド，マーサ  Ａ．
コシュラン，マーク  Ｄ．
(ii)発明の名称：組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその使用
(iii)配列の数：７２
(iv)通信宛先：
(A)名宛人：クーパー・アンド・ダンハム  ＬＬＰ
(B)通り：１１８５  アヴェニュー・オブ・ジ・アメリカズ
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：１００３６
(V)コンピュータ読取り可能な形態：
(A)媒体タイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウエア：Patent Inリリース  ＃１．２５
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：１９９５年３月２３日
(C)分類：
(vii)先行出願データ：
(A)出願番号：ＵＳ  ０８／１２６，５９７
(B)出願日：１９９３年９月２４日
(viii)アトニー／エージェント情報
(A)氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
(C)登録番号：２８，６７８
(C)参照／ドケット番号：３９１１６−Ａ
(ix)電信情報：
(A)電話：（２１２）２７８−０４００
(B)テレファックス：（２１２）３９１−０５２５
（２）配列認識番号：１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１３４７３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１０５９．．２４８９
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：２５７５．．４１０７
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：４１１３．．４４４５
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：４６０９．．５４８７
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：５６９７．．８６５４
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：９８７４．．１０９６２
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１１１５９．．１２６５８
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１２６６５．．１３４４７
(xi)配列の記載：配列認識番号：１：
0003964458.tif 000013
0003964458.tif 000014
0003964458.tif 000015
0003964458.tif 000016
0003964458.tif 000017
0003964458.tif 000018
0003964458.tif 000019
0003964458.tif 000020
0003964458.tif 000021
0003964458.tif 000022
0003964458.tif 000023
0003964458.tif 000024
0003964458.tif 000025
0003964458.tif 000026
0003964458.tif 000027
（２）配列認識番号：２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４７６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：２：
0003964458.tif 000028
0003964458.tif 000029
（２）配列認識番号：３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５１０アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：３：
0003964458.tif 000030
0003964458.tif 000031
0003964458.tif 000032
（２）配列認識番号：４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１１０アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：４：
0003964458.tif 000033
（２）配列認識番号：５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：５：
0003964458.tif 000034
（２）配列認識番号：６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：９９８５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６：
0003964458.tif 000035
0003964458.tif 000036
0003964458.tif 000037
（２）配列認識番号：７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３６２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：７：
0003964458.tif 000038
（２）配列認識番号：８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４９９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：８：
0003964458.tif 000039
0003964458.tif 000040
（２）配列認識番号：９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２６０アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：９：
0003964458.tif 000041
（２）配列認識番号：１０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１３０５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．１３０５
(xi)配列の記載：配列認識番号：１０：
0003964458.tif 000042
0003964458.tif 000043
（２）配列認識番号：１１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４３４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１１：
0003964458.tif 000044
0003964458.tif 000045
（２）配列認識番号：１２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６９６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．６８９
(xi)配列の記載：配列認識番号：１２：
0003964458.tif 000046
（２）配列認識番号：１３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２２９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１３：
0003964458.tif 000047
（２）配列認識番号：１４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３８１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．３８０
(xi)配列の記載：配列認識番号：１４：
0003964458.tif 000048
（２）配列認識番号：１５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１２６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１５：
0003964458.tif 000049
（２）配列認識番号：１６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：８７９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．８７８
(xi)配列の記載：配列認識番号：１６：
0003964458.tif 000050
0003964458.tif 000051
（２）配列認識番号：１７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１７：
0003964458.tif 000052
（２）配列認識番号：１８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５３４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．５３３
(xi)配列の記載：配列認識番号：１８：
0003964458.tif 000053
（２）配列認識番号：１９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１７７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１９：
0003964458.tif 000054
（２）配列認識番号：２０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２０：
0003964458.tif 000055
（２）配列認識番号：２１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２１：
0003964458.tif 000056
（２）配列認識番号：２２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２２：
0003964458.tif 000057
（２）配列認識番号：２３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２３：
0003964458.tif 000058
（２）配列認識番号：２４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２４：
0003964458.tif 000059
（２）配列認識番号：２５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２５：
0003964458.tif 000060
（２）配列認識番号：２６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２６：
0003964458.tif 000061
（２）配列認識番号：２７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２７：
0003964458.tif 000062
（２）配列認識番号：２８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２８：
0003964458.tif 000063
（２）配列認識番号：２９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２９：
0003964458.tif 000064
（２）配列認識番号：３０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３０：
0003964458.tif 000065
（２）配列認識番号：３１のための情報：
0003964458.tif 000066
(i)配列特性：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３１：
0003964458.tif 000067
（２）配列認識番号：３２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３２：
0003964458.tif 000068
（２）配列認識番号：３３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３３：
0003964458.tif 000069
（２）配列認識番号：３４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５７塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３４：
0003964458.tif 000070
（２）配列認識番号：３５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３５：
0003964458.tif 000071
（２）配列認識番号：３６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３６：
0003964458.tif 000072
（２）配列認識番号：３７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３７：
0003964458.tif 000073
（２）配列認識番号：３８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３８：
0003964458.tif 000074
（２）配列認識番号：３９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３９：
0003964458.tif 000075
（２）配列認識番号：４０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２７塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４０：
0003964458.tif 000076
（２）配列認識番号：４１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４１：
0003964458.tif 000077
（２）配列認識番号：４２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４２：
0003964458.tif 000078
（２）配列認識番号：４３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４３：
0003964458.tif 000079
（２）配列認識番号：４４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４４
0003964458.tif 000080
（２）配列認識番号：４５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４２基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４５：
0003964458.tif 000081
（２）配列認識番号：４６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４６：
0003964458.tif 000082
（２）配列認識番号：４７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４７：
0003964458.tif 000083
（２）配列認識番号：４８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４８：
0003964458.tif 000084
（２）配列認識番号：４９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４９：
0003964458.tif 000085
（２）配列認識番号：５０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５０：
0003964458.tif 000086
（２）配列認識番号：５１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５１：
0003964458.tif 000087
（２）配列認識番号：５２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５２：
0003964458.tif 000088
（２）配列認識番号：５３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１０５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５３：
0003964458.tif 000089
（２）配列認識番号：５４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５４：
0003964458.tif 000090
（２）配列認識番号：５５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５５：
0003964458.tif 000091
（２）配列認識番号：５６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５６：
0003964458.tif 000092
（２）配列認識番号：５７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２７塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５７：
0003964458.tif 000093
（２）配列認識番号：５８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５８：
0003964458.tif 000094
（２）配列認識番号：５９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１８９１２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：６９７．．１５３３
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：相補的（１９００．．２７８４）
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：相補的（２９１６．．３６０５）
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：３６９４．．５１２４
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：５２１０．．７０８１
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：７２４５．．８１２３
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：８３３３．．１１２９０
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１１０９８．．１２４０２
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１２５１０．．１３５９８
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１３７９２．．１５２９１
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１５２９８．．１６０８０
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１６１２９．．１７０１３
(D)他の情報
(ix)配列の特徴：
(A)名称／記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：相補的（１７３８０．．１８２１６）
(D)他の情報
(xi)配列の記載：配列認識番号：５９：
0003964458.tif 000095
0003964458.tif 000096
0003964458.tif 000097
0003964458.tif 000098
0003964458.tif 000099
0003964458.tif 000100
0003964458.tif 000101
0003964458.tif 000102
0003964458.tif 000103
0003964458.tif 000104
0003964458.tif 000105
0003964458.tif 000106
0003964458.tif 000107
0003964458.tif 000108
0003964458.tif 000109
0003964458.tif 000110
0003964458.tif 000111
（２）配列認識番号：６０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２７８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６０：
0003964458.tif 000112
（２）配列認識番号：６１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６１：
0003964458.tif 000113
（２）配列認識番号：６２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２２９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６２：
0003964458.tif 000114
（２）配列認識番号：６３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４７６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６３：
0003964458.tif 000115
0003964458.tif 000116
0003964458.tif 000117
（２）配列認識番号：６４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６２３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６４：
0003964458.tif 000118
0003964458.tif 000119
0003964458.tif 000120
（２）配列認識番号：６５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６５：
0003964458.tif 000121
（２）配列認識番号：６６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：９８５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６６：
0003964458.tif 000122
0003964458.tif 000123
0003964458.tif 000124
0003964458.tif 000125
（２）配列認識番号：６７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４３４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６７：
0003964458.tif 000126
0003964458.tif 000127
（２）配列認識番号：６８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３６２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６８：
0003964458.tif 000128
（２）配列認識番号：６９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４９９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：６９：
0003964458.tif 000129
0003964458.tif 000130
（２）配列認識番号：７０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２６０アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：７０：
0003964458.tif 000131
（２）配列認識番号：７１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２９４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：７１：
0003964458.tif 000132
（２）配列認識番号：７２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２７８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：７２：
0003964458.tif 000133
【図１Ａ】
0003964458.tif 000134
【図１Ｂ】
0003964458.tif 000135
【図１Ｃ】
0003964458.tif 000136
【図１Ｄ】
0003964458.tif 000137
【図１Ｅ】
0003964458.tif 000138
【図１Ｆ】
0003964458.tif 000139
【図１Ｇ】
0003964458.tif 000140
【図１Ｈ】
0003964458.tif 000141
【図２】
0003964458.tif 000142
【図３】
0003964458.tif 000143
【図４Ａ】
0003964458.tif 000144
【図４Ｂ】
0003964458.tif 000145
【図５Ａ】
0003964458.tif 000146
【図５Ｂ】
0003964458.tif 000147
【図６Ａ】
0003964458.tif 000148
【図６Ｂ】
0003964458.tif 000149
【図７Ａ】
0003964458.tif 000150
【図７Ｂ】
0003964458.tif 000151
【図７Ｃ】
0003964458.tif 000152
【図８Ａ】
0003964458.tif 000153
【図８Ｂ】
0003964458.tif 000154
【図８Ｃ】
0003964458.tif 000155
【図９Ａ】
0003964458.tif 000156
【図９Ｂ】
0003964458.tif 000157
【図１０Ａ】
0003964458.tif 000158
【図１０Ｂ】
0003964458.tif 000159
【図１１Ａ】
0003964458.tif 000160
【図１１Ｂ】
0003964458.tif 000161
【図１１Ｃ】
0003964458.tif 000162
【図１２】
0003964458.tif 000163
【図１３】
0003964458.tif 000164
【図１４】
0003964458.tif 000165
【図１５】
0003964458.tif 000166
【図１６】
0003964458.tif 000167
【図１７】
0003964458.tif 000168