(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなる、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（Ａ）〜（Ｂ）からなる群より選択された核酸であり、かつスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしてなる核酸：
（Ａ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしてなる核酸；及び
（Ｂ）配列番号：１９に示される塩基配列からなる核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含んでなる、組換えＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２記載の核酸又は請求項３記載の組換えＤＮＡを保持してなる形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現に適した条件下に培養し、ついで、得られた培養物中よりスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸並びにそれらを用いる技術に関する。更に詳しくは、スフィンゴ脂質の構造や機能等を解析するためのスフィンゴ脂質工学用試薬として有用なスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチド；該ポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸；スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法；該ポリペプチドの検出方法及びそのキット並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子の検出方法及びそのキットに関する。
背景技術
近年、真核生物の細胞膜脂質の構成成分として、グリセロ脂質と共にスフィンゴ脂質の持つ様々な生理機能が注目されている。このスフィンゴ脂質に作用して、脂肪酸とリゾスフィンゴ脂質とを生成するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ（ＳＣＤａｓｅ）は、スフィンゴ脂質の生理作用を解明する上で有用であるばかりでなく、スフィンゴ脂質の誘導体作製や標識化といったスフィンゴ脂質工学の分野で非常に重要な酵素である。
従来、セラミドに作用してスフィンゴシン塩基と脂肪酸との間の酸アミド結合を加水分解する酵素としては、セラミダーゼ（Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ：ＥＣ  ３．５．１．２３）として知られている〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２４１巻、第３７３１−３７３７頁（１９６６）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第８巻、第１６９２−１６９８頁（１９６９）、バイオキミカ  エ  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）、第１７６巻、第３３９−３４７頁（１９６９）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１７８巻、第１１００−１１０２頁（１９７２）〕。しかしながら、かかる酵素は、スフィンゴ糖脂質あるいはスフィンゴミエリン中のセラミド部分のスフィンゴシン塩基と脂肪酸との間の酸アミド結合を加水分解することはできないものである。
一方、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物によって生産される酵素〔ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１０３巻、第１−４頁（１９８８）、特開平６−７８７８２号公報、特開平７−１０７９８８号公報〕は、スフィンゴ糖脂質に作用してスフィンゴシン塩基と脂肪酸との間の酸アミド結合を加水分解し、リゾスフィンゴ糖脂質と脂肪酸とを生成することができる。しかしながら、いずれの酵素も基質特異性が狭く、全てのスフィンゴ脂質に作用することはできないという性質を有する。
すなわち、ノカルディア属に属する微生物によって生産される酵素は、ＧＤ１ａ、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３等のいわゆる酸性糖脂質には作用するが、中性糖脂質にはほとんどかあるいは全く作用しない。逆にロドコッカス属に属する微生物によって生産される酵素は、中性糖脂質には作用するが、酸性糖脂質には作用できない。また、ストレプトマイセス属に属する微生物が産生する酵素は、ＧＭ３や中性糖脂質であるラクトシルセラミド、セレブロシド等には作用しない。また、上述した酵素はいずれもスフィンゴミエリンに作用しない。
これに対して、シュードモナス  エスピー  ＴＫ−４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＫ−４）株由来のＳＣＤａｓｅ〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２７０巻、第２４３７０−２４３７４頁（１９９５）、特開平８−８４５８７号公報〕は、酸性糖脂質、中性糖脂質、及びスフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質全般に対して広い基質特異性を持つことが知られている。また、このＳＣＤａｓｅは、スフィンゴ脂質から対応するリゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する加水分解反応のみならず、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸からスフィンゴ脂質を合成する縮合反応、さらにスフィンゴ脂質の脂肪酸部分を他の脂肪酸と交換する反応をも触媒する（国際公開第９８／０３５２９号パンフレット）。したがって、スフィンゴ脂質工学の分野で極めて重要なツールであり、産業上の利用価値が高い。しかしながら、上述したＳＣＤａｓｅを微生物から工業的に有利に製造しようとする場合、天然に存在する該酵素の産生を誘導するために、培養時に培地にガングリオシド混合物を添加する必要がある。そのため、培養液中に遊離脂肪酸やリゾスフィンゴ糖脂質が生成したり、スフィンゴミエリナーゼ等、目的以外の酵素も同時に生産され、これらの脂質や混在する酵素と目的のＳＣＤａｓｅを分離精製することが困難であった。
そこで、シュードモナス  エスピー  ＴＫ−４が生産するＳＣＤａｓｅを遺伝子工学的に製造するために、このＳＣＤａｓｅの遺伝子がクローニングされ、該遺伝子を導入した形質転換体が作製されている（特開平１１−２７６１７７号公報）。しかしながら、形質転換体中に産生されるＳＣＤａｓｅ活性は低いか、又は検出できないレベルであり、遺伝子工学的にＳＣＤａｓｅを製造することは困難であった。
本発明の目的は、スフィンゴ脂質工学の分野で有用なスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸；該ポリペプチドを容易かつ大量に製造可能な遺伝子工学的な製造方法；該核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、該オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを用いたスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の検出方法、それに用いるためのキット、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片、該抗体又はその断片を用いたスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの検出方法、それに用いるキットを提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を単離するべく鋭意研究を重ねた結果、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の単離とその塩基配列の解明に成功し、さらにこの知見を基に高純度のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを容易にかつ大量に製造しうる方法、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの検出方法及びその遺伝子の検出方法を確立し、本発明の完成に至った。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されたポリペプチドであり、かつスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチド：
（ａ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも２５％の配列同一性を有するポリペプチド、
〔２〕  下記（Ａ）〜（Ｈ）からなる群より選択された核酸であり、かつスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしてなる核酸：
（Ａ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドをコードしてなる核酸；
（Ｂ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしてなる核酸；
（Ｃ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも２５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（Ｄ）配列番号：１９に示される塩基配列又はその一部を有する核酸；
（Ｅ）配列番号：１９に示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有する塩基配列を有する核酸；
（Ｆ）前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる核酸；
（Ｇ）前記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかに記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核酸；及び
（Ｈ）前記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかに記載の核酸の塩基配列と少なくとも１７％の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸、
〔３〕  前記〔２〕記載の核酸を含んでなる、組換えＤＮＡ、
〔４〕  前記〔２〕記載の核酸又は前記〔３〕記載の組換えＤＮＡを保持してなる形質転換体、
〔５〕  前記〔４〕記載の形質転換体を、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現に適した条件下に培養し、ついで、得られた培養物中よりスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法、
〔６〕  前記〔２〕記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、
〔７〕  連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる、前記〔６〕記載のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、
〔８〕  核酸を含有した被験試料と、前記〔６〕又は〔７〕記載のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、ついで、核酸とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッドを検出することを特徴とする、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法、
〔９〕  核酸を含有した被験試料を鋳型試料とし、前記〔６〕又は〔７〕記載のプライマーを用いて核酸増幅を行なうことを特徴とする、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法、
〔１０〕  前記〔６〕又は〔７〕記載のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はプライマーを含有してなる、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット、
〔１１〕  前記〔１〕記載のポリペプチドに特異的に結合しうる抗体又はその断片、
〔１２〕  ポリペプチドを含有した被験試料と、前記〔１１〕記載の抗体又はその断片とを接触させ、ポリペプチドと抗体又はその断片との複合体を検出することを特徴とする、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの検出方法、並びに
〔１３〕  前記〔１１〕記載の抗体又はその断片を含有してなる、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキットに関する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ」とは、前記のように、スフィンゴ脂質に作用して、スフィンゴイド塩基と脂肪酸とに加水分解する活性を有するが、セラミドには、ほとんど又は全く作用しない酵素をいう。
なお、本明細書において、「スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチド」を、「スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ」と記載する場合がある。
本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼは、広い基質特異性を有するため、細胞工学的に糖脂質の生物機能を解析する方法、有用フィンゴ脂質の大量生産、スフィンゴ脂質の機能変換、スフィンゴ脂質プローブの作製、新規スフィンゴ脂質の創製等のスフィンゴ脂質工学に有用である。また、神経系の疾患（例えば、神経変性疾患等）、白血病、創傷等の疾患の治療への応用に有用である。
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性は、例えば、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２７０巻、第２４３７０−２４３７４頁（１９９５）に記載の方法に従って測定することもできる。具体的には、例えば、０．１％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と１０ｎｍｏｌのＧＭ１とを含有した５０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ６．０）１０μｌに、酵素液１０μｌを加え、得られた反応液を３７℃で所定時間インキュベートする。その後、１００℃で５分間煮沸して反応を止め、スピードバックコンセントレーターを用いて、反応液を完全に乾燥する。１５μｌのクロロホルム／メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）を加え、超音波処理で反応生成物を溶解する。得られた溶解物をシリカゲルＴＬＣプレート（商品名：Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ、メルク社製）にスポットする。これをクロロホルム／メタノール／０．２％  ＣａＣｌ２（５／４／１、ｖ／ｖ）で展開後、オルシノール硫酸を噴霧する。噴霧後のＴＬＣプレートを１１０℃のホットプレートで加熱後、反応により、遊離したリゾＧＭ１と未反応のＧＭ１とを発色させる。
分解率は、クロマトスキャナー〔島津ＣＳ−９３００、島津製作所社製〕を用いて、遊離したリゾＧＭ１と未反応のＧＭ１とに対応するスポットを波長５４０ｎｍで定量し、得られた値を基に［分解率（％）＝〔遊離したリゾＧＭ１の面積×１００〕／〔遊離したリゾＧＭ１の面積＋未反応のＧＭ１の面積〕」の式により求められうる。
なお、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの活性の１単位（ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのＧＭ１を分解する酵素量として定義される。
本発明においては、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの起源は、特に限定されないが、例えば、細菌類、放線菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物、あるいは植物、動物、昆虫等の生物体等が挙げられる。かかる起源由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼも本発明の範囲に含まれる。具体的には、例えば、海水から単離された海洋性細菌シェバネラ  アルガ  Ｇ８（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｌｇａ  Ｇ８）株は、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを取得するための材料に好適である。
なお、前記シェバネラ  アルガ  Ｇ８については、次のようにして取得することができる。
各地から集めた試料（海水、河川水、又はそこに住む生物の体表や消化管等）を滅菌生理食塩水に懸濁させる。得られた懸濁液１０μｌを、エッペンドルフチューブに入れた０．０１％セラミド、０．０５％  ＮＨ４Ｃｌ、０．０５％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％酵母エキス、２．０％  ＮａＣｌ、０．０１％  ＴＤＣ（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ｐＨ７．０を含む液体培地４００μｌに接種し、２５℃で４日間振とう培養する。その後、上記の方法で酵素活性の測定を行ない、活性のある培養液を選択する。選択した培養液を滅菌生理食塩水で希釈し、得られた希釈物を平板培地に塗布する。塗布後の平板培地を２５℃で２日間培養し、コロニーの形成を行なわせる。この作業を単一コロニーになるまで繰り返す。このようにして、試料よりスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを生産するシェバネラ  アルガ  Ｇ８を単離することができる。
なお、前記シェバネラ  アルガ  Ｇ８は、九州大学大学院  農学研究科生物機能科学部門  伊東研究室において保存されており、必要により、分譲可能である。
本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼとしては、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチド等が挙げられ、好ましくは、該配列番号：１のＣ末端領域を欠失したアミノ酸配列（アミノ酸番号：１〜６７７）又はその一部を有するポリペプチド等が挙げられる。具体的には、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、前記配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末端欠失体ポリペプチドであり、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を示す。
すなわち、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼとしては、（ａ）配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列（天然型のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＣ末端領域を欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド）又はその一部を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、「配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列の一部を有するポリペプチド（部分ペプチドともいう）」は、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであればよい。
前記部分ペプチドは、具体的には、慣用の遺伝子工学的な手法により、配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列中の任意の部分を含むポリペプチドを発現させ、ついで、そのポリペプチドについて、前記活性測定方法により、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を測定し、それにより該活性を示すポリペプチドを選択することにより、得られうる。かかる部分ペプチドを発現させる手法としては、例えば、配列番号：１又は２０のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、配列番号：２又は１９）の任意の位置にストップコドンを導入して、発現させる手法；制限酵素等により所望の部分ペプチドに対応する領域を切り出し、適切な発現ベクターに導入して、発現させる手法等が挙げられる。
また、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（ｂ）配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
前記「変異」は、得られたポリペプチドがスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するような変異であれば、２つ以上の変異であってもよい。ここで、「変異を有するアミノ酸配列」は、天然由来の変異及び人為的な変異を導入されたアミノ酸配列を含むことを意図する。また、「少なくとも１つ」とは、１若しくは複数個、又はそれ以上を含む意味である。
前記「変異」は、後述の本発明の核酸、具体的には、配列番号：１又は２０のアミノ酸配列をコードする核酸を用い、後述のランダム変異導入方法、部位特異的変異導入方法等に従って生じさせうる。
さらに、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（ｃ）配列番号：２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも２５％、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上の配列同一性を有するポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
なお、前記（ｃ）のポリペプチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも２５％、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上の配列同一性を有する。
なお、本明細書において、「配列同一性」とは、２つのポリマー性分子、具体的には、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の残基の配列類似性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象のアミノ酸配列又は塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つのアミノ酸配列又は塩基配列を比較することにより決定されうる。ここで、比較対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ、オーバーハング等）を有していてもよい。
配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の塩基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム〔Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．、第２巻、第４８２頁（１９８１）〕、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム〔ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４８巻、第４４３頁（１９７０）〕、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法〔プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ジ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）、第８５巻、第２４４４頁（１９８８）〕が挙げられる。より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等が挙げられる。
ポリペプチド間の配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等を用いて測定される。また、核酸間の配列同一性は、例えば、配列解析ソフト、具体的には、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ等を用いて測定される。前記ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮは、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、ＦＡＳＴＡはホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般に利用可能である。
また、本発明には、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列との間に少なくとも２５％、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上の配列相同性を有するポリペプチドも含まれる。
さらに、本発明には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列との間に少なくとも２５％、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上の配列相同性を有するポリペプチドも含まれる。
前記配列相同性を有するポリペプチドは、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列において、保存的置換を有するポリペプチドであってもよい。前記「保存的置換」は、類似した性質（すなわち疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴）を有するアミノ酸との置換；本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸との置換を包含する。保存的置換としては、例えば、下記：▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
前記「配列相同性」は、配列解析ソフト、例えば、ＢＬＡＳＴ〔ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２１５巻、第４０３−４１０頁（１９９０）〕、ＦＡＳＴＡ〔プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ジ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）、第８５巻、第２４４４−２４４８頁（１９８８）〕等により決定されうる。
本発明の核酸は、前記スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものであり、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸をいう。例えば、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする核酸が挙げられ、具体的には、（Ａ）配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドをコードした核酸；
（Ｂ）配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸；
（Ｃ）配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも２５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードした核酸；
（Ｄ）配列番号：２又は１９に示される塩基配列又はその一部を有する核酸；
が挙げられる。
前記配列番号：２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードした核酸及び配列番号：１９に示される塩基配列を有する核酸は、例えば、配列番号：２に示される塩基配列を有する核酸における塩基番号：１〜２０３１の塩基配列に対応する。
なお、前記配列番号：２に示される塩基配列を有する核酸は、該核酸を保持したプラスミドｐＳＣＤ４４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＥ５〕から得ることができる。かかる「配列番号：２に示される塩基配列を有する核酸を保持したプラスミドｐＳＣＤ４４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９」は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＥ５と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター〔郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６〕に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１７として、２００１年８月２４日〔２０００年９月２２日（原寄託日）〕に、ブダペスト条約の下、寄託されている。
本発明においては、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（Ｅ）配列番号：２又は１９に示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有する塩基配列を有する核酸も本発明の核酸に含まれる。前記（Ｅ）の核酸は、配列番号：２又は１９に示される塩基配列において、アミノ酸配列に翻訳されるかたちで、少なくとも１つの塩基の欠失、付加、挿入若しくは置換を有する塩基配列を有する核酸であることが望ましい。
ここで、「置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列」とは、天然由来の変異及び人為的な変異を導入された塩基配列を含む。また、「少なくとも１つ」とは、１若しくは複数個、又はそれ以上を含む意味である。前記「変異」は、後述のランダム変異導入方法、部位特異的変異導入方法等に従って生じさせうる。
また、「アミノ酸配列に翻訳されるかたち」とは、欠失、付加又は挿入により、本来のオープンリーディングフレームがずれないか、あるいは本来有するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を維持する程度のフレームのずれであることを意図する。
また、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：１又は２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（Ｆ）前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる核酸も本発明の核酸に含まれる。
前記ハイブリダイゼーションには、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載の核酸若しくはその相補鎖の全部又は一部をプローブとして用いることができる。ここで、「前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載の核酸若しくはその相補鎖の一部」は、本発明の核酸に特異的な配列を有するものであればよい。また、プローブとして、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかに記載の核酸に特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）等に記載された条件でハイブリダイズ可能なことをいう。具体的には、例えば、以下の条件でハイブリダイズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンブレンを０．５％  ＳＤＳ、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％  ポリビニルピロリドン、０．１％  フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は、０．１倍濃度までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行なう。
ハイブリダイゼーションにより得られた新たな核酸について、そこにコードされているポリペプチドの有する活性を、前記活性測定方法で調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％  変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等をいう。
オリゴヌクレオチドプローブのＴｍは、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）                                                  （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
また、オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
また、本発明には、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（Ｇ）前記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかに記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核酸も含まれる。
遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする核酸は、そのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は、自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異ともいう）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
さらに、本発明には、前記活性測定方法で活性を測定することによって、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性が認められるものであれば、（Ｈ）前記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかに記載の核酸の塩基配列と少なくとも１７％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２３％の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸も含まれる。
配列同一性は、前記した手法により求められうる。
本発明の核酸により、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを大量に得ることができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行なわれている（例えば、特公平７−１０２１４６号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。
本発明によりスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子にランダムな変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列中の、１個以上のアミノ酸残基に、欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも一つを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることが可能である。これにより、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なったスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれらのスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを製造することが可能となる。
ランダム変異導入方法としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングス  オブ  ジ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ジ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ    ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）、第７９巻、第１４０８−１４１２頁（１９８２）〕、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行ない、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２２４巻、第３４７−３５３頁（１９９５）〕等を用いることができる。
部位特異的変異導入方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド  デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第９４４１−９４５６頁（１９８４）〕、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）遺伝子を欠損した宿主を利用する方法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８２巻、第４８８−４９２頁（１９８５）〕、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開第９８／０２５３５号パンフレット）等を用いることができる。これらの方法で目的の遺伝子に部位特異的な変異を導入するための各種のキットが市販されており、該キットを利用することにより、所望の変異を導入された遺伝子を容易に取得することが可能である。
以下に、ハイブリダイゼーション法を用いて微生物由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を取得する方法について説明する。
まず、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子をクローニングするためのプローブを作製するための情報として、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの部分アミノ酸配列を調べる。精製したスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをそのまま常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２５６巻、第７９９０−７９９７頁（１９８１）〕によるアミノ酸配列分析に供するか、あるいはリジルエンドペプチダーゼやＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等の基質特異性の高い蛋白質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行なって得られるペプチド混合物より分離精製された精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行なう。
こうして明らかとなった部分アミノ酸配列の情報をもとにハイブリダイゼーション用のプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計し、化学的に合成する。
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で完全消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロン膜にブロッティングする。このナイロン膜上のＤＮＡ断片と、上記の合成オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、一般的な条件で行なう。例えばサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中でナイロン膜をブロッキングした後、３２Ｐでラベルした合成オリゴヌクレオチドプローブとともに一晩保温する。このナイロン膜を洗浄した後、オートラジオグラムを作成して合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
オートラジオグラム上のシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられる方法によってベクター、例えばプラスミドベクターに組み込み、組換えＤＮＡ分子を作製する。ベクターには市販の種々のベクターが使用できる。次いで該組換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、上記のモレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることができる。
次にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の断片を有する形質転換体を選択する。選択の方法はベクターの種類に応じてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等を適宜用いる。また、コロニーやプラークをそのまま試料として用いるＰＣＲ法や、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性の発現を指標とする方法を用いることもできる。
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の断片を含む形質転換体より該断片を組み込まれた組換えＤＮＡ分子を調製し、該断片の塩基配列を解析する。塩基配列の解析は通常の方法、例えばジデオキシ法により決定することができる。決定された塩基配列と、先に得られたスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの部分アミノ酸配列やスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの分子量等とを比較することによって、得られたＤＮＡ断片が目的のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の全部であるか、又はその一部であるかを決定する。
得られたＤＮＡ断片がスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の全長を含まない場合は、該断片の一部をプローブとして用い、ゲノムＤＮＡを他の制限酵素で消化したうえで同様にしてハイブリダイゼーション等を行ない、欠損している部分を得ることにより目的のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子全長を得ることができる。こうして得られたスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片からスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の構造並びにスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの全アミノ酸配列を決定する。
上記のようなハイブリダイゼーション法の他、ＰＣＲ法によって本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を取得することもできる。例えば、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列や内部部分アミノ酸配列から設計されたプライマーを使用するＰＣＲ法、あるいはこれらのプライマーに加えてカセットＤＮＡとカセットプライマーとを使用するＰＣＲ法によってスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を取得することができる。
また、配列番号：２に示される塩基配列を有する核酸は、該配列番号：２に召される塩基配列を基に化学合成法により作製されうる。
化学合成により配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸を作製する場合、例えば、慣用のホスホロアミダイト法等により、化学合成したオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させることにより、前記核酸を合成しうる。具体的には、例えば、下記工程：
（１）配列番号：２に示される塩基配列を網羅しうる数十種類のオリゴヌクレオチドＡｎ（ｎは、正の整数を示す）と、
該Ａｎの配列から３’側又は５’側に数塩基ずれた塩基配列に相補的な配列からなる該Ａｎと同鎖長のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドＡｎとのアニーリングにより、５’突出末端又は３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡを生じる相補鎖オリゴヌクレオチドａｎ（ｎは、正の整数を示す）と
を、それぞれ、慣用の化学合成法により合成する工程；
〔例えば、前記Ａｎは、配列番号：２の塩基番号：１〜２０（Ａ１）、２１〜４０（Ａ２）、４１〜６０（Ａ３）、６１〜８０（Ａ４）、８１〜１００（Ａ５）、１０１〜１２０（Ａ６）、１２１〜１４０（Ａ７）、１４１〜１６０（Ａ８）・・・・２８４１〜２８６２（Ａ１４３）のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドなどであり、
前記ａｎは、配列番号：２の塩基番号：１〜２３（ａ１）、２４〜４３（ａ２）、４４〜６３（ａ３）、６４〜８３（ａ４）、８４〜１０３（ａ５）、１０４〜１２３（ａ６）、１２４〜１４３（ａ７）、１４４〜１６３（ａ８）、・・・・２８４４〜２８６２（ａ１４３）のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドなどの相補鎖である〕
（２）ＡＴＰと慣用のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを用いて、前記工程（１）で得られた各オリゴヌクレオチドＡｎと対応する相補鎖オリゴヌクレオチドａｎとのそれぞれの５’末端をリン酸化する工程；
（３）前記工程（２）で得られた各オリゴヌクレオチドＡｎと対応する相補鎖オリゴヌクレオチドａｎとをアニーリングさせて、数十種類の「５’突出末端又は３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）」を得る工程；
（４）前記工程（３）で得られた二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）について、ｎの昇べきの順に、配列番号：２に示される塩基配列に対応して、数ブロックに分け、各ブロックに対応するように、前記工程（３）で得られた二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）を１つのチューブにまとめる工程；
〔例えば、オリゴヌクレオチドＡ１〜Ａ４と相補鎖ａ１〜ａ４とのチューブ、
0003995591.tif 000002
を設定する〕
（５）前記工程（４）の各ブロックに対応するチューブ毎に、二本鎖ＤＮＡをライゲーションして、それにより、各ブロックに対応する二本鎖ＤＮＡを得る工程；
（６）前記工程（５）で得られた二本鎖ＤＮＡをゲル電気泳動に供し、各ブロックに対応する目的の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡのバンドをゲルから抽出する工程；
（７）前記工程（６）で得られた各ブロックに対応する目的の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡを１つにまとめ、ライゲーションする工程；
（８）前記工程（７）で得られたＤＮＡについて、ゲル電気泳動により鎖長を調べること、及び／又は塩基配列解析を行なうことにより、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡであることを確認する工程；
を行なうことにより、配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸を作製しうる。
次に、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの場合を例にして具体的に説明する。
まず、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株の生産するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを精製する。シェバネラ  アルガ  Ｇ８株を通常用いられる液体培地〔ＰＹ培地（組成：０．５％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）〕を用いて２５℃で培養し、得られる培養上清を濃縮して通常用いられるカラムクロマトグラフィーに供し、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを精製する。
次にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの部分アミノ酸配列を調べる。前記スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列は、その対応するコドンの種類が多く、プライマーの配列の組み合わせが膨大なものとなる。また、前記プライマーを用いてＰＣＲを行なった場合、非特異的な増幅産物が多数生じるため、そのなかから、目的とする遺伝子に由来する産物を同定することは困難である。
本発明者らは、プライマーの設計に用いるためのアミノ酸配列として、対応するコドンの縮重が少ない配列を得るため、蛋白質加水分解酵素又は臭化シアン等に代表される蛋白質限定分解用の試薬を用いてペプチドマッピングを行ない、ついでプライマーの設計を試みた。そこで、本発明者らは、得られたアミノ酸配列をもとに合成オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列Ｃ−６０３（配列番号：７）からデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーＳＳ２ａ（配列番号：９）、部分アミノ酸配列Ｃ−６０６（配列番号：３）からデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーＳＡ３（配列番号：１３）をそれぞれ合成した。シェバネラ  アルガ  Ｇ８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記の２種のプライマーを使用したＰＣＲを行なうことにより、特異的に増幅されるＤＮＡ断片を得ることができる。該断片の塩基配列を調べ、これとスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼについて得られている上記以外の部分アミノ酸配列とを比較することにより、該断片がスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする遺伝子の一部を含むことがわかる。
この増幅ＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーション等を行なうことによってスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
以上のようにして得られる、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする遺伝子の全塩基配列を配列番号：１５に示す。また、該配列より推定されるスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。さらに、このアミノ酸配列と、配列番号：７に示されたシェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列とを比較することにより、該菌株が生産するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼは、その翻訳後にＮ末端の３８アミノ酸からなるポリペプチドが除去された成熟型酵素に転換されることがわかる。この成熟型スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列を配列番号：１に、また上記のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の塩基配列のうち、成熟型のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする部分の塩基配列を配列番号：２にそれぞれ示す。なお、前記シェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、公知のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列及び塩基配列との有意な相同性が観察されなかったため、前記シェバネラ  アルガ  Ｇ８株由来の酵素は、新規なファミリーに属するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼであることが示唆される。
さらに、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列から、Ｃ末端側の２７７アミノ酸を欠失させたポリペプチド（Ｃ末端欠失体ポリペプチド）も、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有する。前記Ｃ末端欠失体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２０に示し、塩基配列を配列番号：１９に示す。
このようにして、本発明において、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする核酸の全塩基配列が明らかにされたため、そのスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の全体あるいはその一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株以外の生物体から得たゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのライブラリーから、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができる。ハイブリダイゼーションは、一般的に用いられる条件で行なうことができる。例えば、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株以外の生物から得たゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのライブラリーを用いて、上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
一方、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の塩基配列からＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲを行なうことによって本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、その遺伝子全体を得ることもでき、さらにはスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを生産する生物を検出することが可能である。
上記のハイブリダイゼーション、あるいはＰＣＲによって得られた遺伝子がスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、得られた遺伝子の塩基配列を本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列と比較することにより推定することができる。また、下記に記載の方法を用いて、得られた遺伝子にコードされるポリペプチドを製造し、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を測定することにより、目的の遺伝子であるかどうかを確認することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号：２若しくは配列番号：１９記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作製することができる。かかる組換えＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
前記組換えＤＮＡの作製に使用されるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すればよい。
例えば、前記組換えＤＮＡを導入する対象となる宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ等のプラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔｌｌ等のファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３等が挙げられる。宿主が昆虫の場合、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ等が挙げられる。宿主が動物の場合、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４等が挙げられる。かかるベクターには、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等の因子を適宜有していてもよい。
本発明のポリペプチドを容易にかつ大量に製造する観点から、外来遺伝子を誘導発現させることが可能なベクター；レポーター遺伝子産物等との融合蛋白質として発現させることが可能なベクター等を用いてもよい。
融合タンパク質として発現させることが可能なベクターとしては、宿主内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター等）を有するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔ等）；前記適切なプロモーターを有するタグ（Ｈｉｓタグ等）配列を有するベクター等が挙げられる。
さらに、本発明の核酸又は本発明の組換えＤＮＡにより、該核酸又は組換えＤＮＡを保持した細胞導入用担体も提供される。かかる細胞導入用担体も本発明の範囲に含まれる。本発明の細胞導入用担体は、具体的には、本発明の核酸又は本発明の組換えＤＮＡを保持した担体からなる。前記担体としては、リポソーム、ＨＶＪ−リポソーム、デキストラン、リン酸カルシウム、金粒子等が挙げられる。
また、本発明の核酸又は本発明の組換えＤＮＡ又は本発明の細胞導入用担体を適当な宿主に導入して形質転換体を作製することができる。前記形質転換体は、本発明の核酸又は本発明の組換えＤＮＡを保持する形質転換体であり、本発明に含まれる。
使用される宿主としては、例えば、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株等）、酵母（サッカロミセス・セルビジエ等）、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物の培養細胞（Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、Ｈｅｌａ等）、植物の培養細胞、昆虫の培養細胞（ｓｆ９等）等が挙げられる。
また、宿主への組換えＤＮＡの導入方法としては、公知の導入方法が使用でき、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法等が挙げられる。
前記形質転換体により、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法が提供される。かかるスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法も本発明に含まれる。
本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法は、前記形質転換体をスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現に適した条件下に培養し、得られた培養物からスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを採取する工程を含むことを１つの大きな特徴とする。なかでも、本発明の形質転換体を用いるため、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを効率よく大量に得ることができる。また、発現ベクターを用い、異種宿主においてＳＣＤａｓｅを特異的に発現させているため、例えば、シュードモナス  エスピー  ＴＫ−４の場合〔特開平８−８４５４７号公報、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７０（４１）、２４３７０−２４３７４（１９９５）〕に比べ、ＳＣＤａｓｅの発現に際してＳＣＤａｓｅ産生誘導物質（アシアロＧＭ１などのガングリオシド）を必要せず、スフィンゴミエリナーゼなどのＳＣＤａｓｅ以外のタンパク質が同時に生産されず、培地由来の脂肪酸又は誘導物質由来の脂肪酸の生産が無く、精製が容易であるという優れた効果を発揮する。
本発明の製造方法において、該形質転換体が微生物あるいは培養細胞である場合には、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等についてスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現の最適な条件を決定することによって、効率よくスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
形質転換体の培養物からスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌のように細胞内にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換体細胞を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法の他、イオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティー等の各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換体によっては発現産物が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行なえばよい。
形質転換体が生産するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドには、それが細胞内に生産されるときは細胞内の諸酵素、タンパク質が共存するが、これらは発現されるスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼが菌体外に分泌され、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを含む画分には、培地成分等が共存する。しかしながら、これらは通常スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとんど含まないため、例えば、シェバネラ  アルガ  Ｇ８株の培養物からのスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの精製に必要であった煩雑な分離精製操作を必要としないという利点がある。
また、例えば、宿主が大腸菌の場合、発現産物が不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）として形成されることがある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等を行なうことにより封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーを行なうことにより精製した後、透析法あるいは希釈法等を用いたリフォールディング操作を行なうことによってスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を保持したポリペプチドを含む標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを得ることができる。
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現の確認は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を測定することにより行なうことができる。活性測定は、例えば形質転換体の細胞抽出液を試料としてジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２７０巻、第２４３７０〜２４３７４頁（１９９５）に記載の方法で行なうことができる。また、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼに対する抗体を使用することもできるが、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを他のポリペプチドとの融合体として発現させる場合にはそのポリペブチド部分に対する抗体を用いてもよい。抗体を使用する場合には、例えば形質転換体の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上に転写し、この膜上で抗体を用いて検出することができる。
さらに、本発明の核酸により、スフィンゴシン脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を特異的に検出しうるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが提供される。前記オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、本発明の核酸又は該核酸に相補的な核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるものであればよい。ここで、ストリンジェントな条件は、前述の「オリゴヌクレオチドプローブ使用時のストリンジェントな条件」であればよい。
また、前記オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーに適した配列は、公知のソフトウェア、例えば、Ｏｌｉｇｏ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）等を用いて、２次構造の形成、Ｔｍ値、本発明の核酸に対する特異性等を考慮して、得られうる。
前記オリゴヌクレオチドプローブは、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の塩基配列をもとに設計し、例えば、常法により化学的に合成し作製することができる。
前記オリゴヌクレオチドプローブの鎖長としては、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、すなわち、連続した１５ヌクレオチド以上であることが好ましく、１８ヌクレオチド以上であることがさらに好ましい。
また、本発明のプライマーにおいても、前記オリゴヌクレオチドプローブと同様の塩基配列を有する核酸が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の塩基配列をもとに設計し、化学的に合成すること等により作製することができる。プライマーの鎖長には、特に限定はないが、例えば、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、具体的には、１５〜４０ヌクレオチド塩基の鎖長のものを使用することができ、特に１７〜３０ヌクレオチドの鎖長のものを好適に使用することができる。前記プライマーは、ＰＣＲ法をはじめとする種々の遺伝子増幅法に使用することが可能であり、これによって本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の検出を特異的に行なうことができるという優れた性質を有する。
また、前記オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーとして、天然由来のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする核酸を、制限酵素処理、エキソ型ヌクレアーゼ処理等の酵素的処理、超音波処理等の物理的処理等により断片化し、得られた断片を、アガロースゲル等に代表される各種核酸分離法により分離精製することにより得られた核酸を用いてもよい。前記のようにして得られた核酸は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼに特徴的な配列を有する領域由来であることが望ましい。
前記オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、公知の方法にしたがって適当な標識を施し、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の検出に使用することができる。標識には、特に限定するものではないが、放射性同位元素の他、蛍光物質、ビオチンやジゴキシゲニンのようなリガンド等を用いることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーにより、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法が提供される。本発明の検出方法は、前記オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はプライマーを使用することを１つの大きな特徴とし、それにより被験試料中の遺伝子を検出する。より具体的には、核酸を含有した被験試料と、本発明のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、ついで、核酸とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッドを検出する方法、又は核酸を含有した被験試料を鋳型試料とし、本発明のプライマーとして、核酸増幅を行なう方法が挙げられる。
本発明の検出方法においては、前記オリゴヌクレオチドプローブを用いてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション法等により遺伝子の検出を行なってもよく、また、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅方法により遺伝子の検出を行なってもよい。また、両者を組み合わせて用いてもよい。
オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、被験試料としては、例えば、微生物のコロニーや組織切片のような試料、これらの試料中のＤＮＡやＲＮＡを膜上に固定したもの、これらの試料から抽出されたＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。なかでも試料の安定性の観点から、膜上に固定されたＤＮＡあるいは抽出されたＤＮＡが好ましい。
オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、上記のストリンジェント条件でハイブリダイゼーションを行なうことにより遺伝子の検出を行なうことができる。
プライマーを用いる場合、被験試料としては、例えば、微生物培養液、微生物コロニー、微生物菌体のような微生物試料、皮膚、組織、組織切片のような生体由来試料等が挙げられる。
前記プライマーを用いる場合の被験試料は、例えば、単離した微生物をそのままの状態で用いてもよく、適切な処置を施した状態で用いてもよい。また組織のような固体試料は浸出液や懸濁液を調製して使用することができる。また、これらの試料の上清又はこれらの試料について界面活性剤処理のような細胞溶解処理が施された試料やその上清も使用することができる。さらに、検出対象である核酸を損なわない範囲で試料中の他の成分を除去する操作が施されていてもよい。
前記プライマーを用いてＰＣＲ法により検出を行なう場合、ＰＣＲ条件は、用いるプライマーのＴｍ値、増幅し検出する対象の領域の長さ等により、適宜選択することができる。
前記プライマーを用いる場合、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅方法により増幅し、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認することにより検出することができる。増幅の有無の確認法には特に限定はないが、例えば核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等で染色し、紫外線を照射して生じるバンドの有無を検出することにより確認できる。バンドの検出は肉眼で観察してもよいが、例えば蛍光イメージアナライザー等を用いて検出することもできる。
本発明の検出方法においては、検出感度を上昇させるために、前記プローブ及びプライマーを併用してもよい。例えば、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、試料中に微量に存在するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅し、ついで、プローブを用いて該遺伝子とハイブリダイズさせることによって、高感度かつ正確に検出することができる。
本発明の検出方法によりスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の検出を行ない、さらに該遺伝子の発現量を決定する場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルの強度、プライマーを用いて増幅された産物に由来するバンドの蛍光強度等を定量することにより行なうことができる。
本発明の核酸の検出方法に用いるためのキットは、前記オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はプライマーを含有することを１つの特徴とする。
本発明のキットには、さらに、核酸を固定するための膜やハイブリダイゼーション緩衝液等に代表されるハイブリダイゼーション用の各種試薬、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用緩衝液等に代表されるＰＣＲ用試薬、プローブや増幅されたＤＮＡを検出するための試薬や微生物増殖用の培地、試料より核酸を抽出するための試薬等を含有してもよい。
また、本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸を発現させて得られるポリペプチドにより、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供される。かかる抗体又はその断片も本発明に含まれる。
本発明の抗体又はその断片は、ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等を使用することもできる。本発明の抗体は、例えば、１９９２年、ジョンワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｅｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、ジョン  Ｅ．コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント  プロトコルズ  イン  イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。また、ポリペプチドのある部分断片に特異的に結合しうる抗体又はその断片も含まれる。
さらに、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。得られた抗体又はその断片の用途としては、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ生産菌の検出、アフィニティークロマトグラフィー、各種ライブラリー（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のスクリーニング、医薬、診断薬、研究用試薬等への応用が考えられる。
また、本発明の抗体又はその断片は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等による検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。
本発明のポリペプチドの検出方法は、前記抗体又はその断片を使用することを特徴とし、それにより、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを検出する。具体的には、ポリペプチドを含有した被験試料と、前記抗体又はその断片とを接触させ、ポリペプチドと抗体又はその断片との複合体を検出する。
本発明においては、被験試料として、例えば、微生物の細胞破砕物、皮膚等の組織の抽出液あるいは洗浄液、組織や微生物由来のタンパク質が固定された膜等のタンパク質試料を用いることができる。
抗体又はその断片の前記ポリペプチドへの特異的な結合の検出は、公知の方法が利用できるが、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等が挙げられる。
本発明のポリペプチドの検出方法に用いるためのキットは、前記抗体又はその断片を含有することを１つの特徴とする。本発明のキットによれば、前記抗体又はその断片を含有しているため、特異的、かつ簡便にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドを検出することを可能にする。
本発明のキットには、さらに、反応用緩衝液、標識二次抗体、発色試薬等を含有してもよい。
さらに、本発明の核酸によれば、スフィンゴ脂質の代謝に関連する疾患、例えば、神経系疾患（例えば、神経変性疾患等）、白血病、創傷等の疾患の治療への応用が可能になる。すなわち、本発明の核酸を有効成分として含有した、スフィンゴ脂質の代謝に関連する疾患、具体的には、神経系疾患（例えば、神経変性疾患等）、白血病、創傷等の治療剤、スフィンゴ脂質の代謝に関連する疾患、具体的には、前記神経系疾患、白血病、創傷等の疾患の治療への本発明の核酸の使用が提供されうる。
前記治療剤は、前記有効成分を安定に維持しうる担体に該有効成分を担持させて得られた剤であってもよく、例えば、前記細胞導入用担体等が挙げられる。具体的には、例えば、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織等の生体への導入を容易にしうる薬学的に許容されうる担体に、有効成分を保持させてもよい。また、治療剤には、該治療剤の投与が必要な状態、疾患〔例えば、神経系疾患（例えば、神経変性疾患等）、白血病、創傷等〕；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織に応じて、他の助剤をさらに含有していてもよい。具体的には、有効成分の効果を発現させる対象となる部位に到達するまでの間に、該核酸の分解を抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を含有してもよい。有効成分の含有量は、投与が必要な状態、疾患；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢等に応じて、適宜選択されうる。
前記治療剤の投与形態としては、局所投与、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等が挙げられる。
また、本発明の核酸を、スフィンゴ脂質の代謝に関連する疾患、具体的には、前記神経系疾患、白血病、創傷等の疾患の治療に使用する場合、例えば、ウイルスベクター、リポソーム等の細胞への導入に適した担体に該核酸を担持させて得られた治療剤を直接体内に導入する方法を行なってもよく、動物、例えば、哺乳動物から、ある種の細胞に対して体外で治療剤を導入し、得られた細胞を体内に戻す方法を行なってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ生産微生物の検索
各地から試料（海水、河川水、又はそこに住む生物の体表や消化管）を集め、滅菌生理食塩水に懸濁させた。得られた懸濁液１０μｌを、エッペンドルフチューブに入れた０．０１％  セラミド、０．０５％  ＮＨ４  Ｃｌ、０．０５％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％  酵母エキス、２．０％  ＮａＣｌ、０．０１％  ＴＤＣ、ｐＨ７．０を含む液体培地４００μｌに接種し、２５℃で４日間振とう培養した。その後、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ（以下、ＳＣＤａｓｅともいう）活性の測定を行ない、活性のある培養液を選択した。
前記培養液のＳＣＤａｓｅ活性をＮＢＤ−ＧＭ１を基質として用い、測定した。ＮＢＤ−ＧＭ１はセラミドの脂肪酸部分をＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）で標識したＧＭ１であり、ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、第１２６巻、第６０４−６１１頁（１９９９）に記載の方法に従って調製した。
なお、ここで、活性測定は、下記のように行なった。すなわち、０．１％のトリトンＸ−１００とＮＢＤ−ＧＭ１  １００ｐｍｏｌとを含む５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）１０μｌに酵素液１０μｌを加え、３７℃で所定時間インキュベートした。その後、１００℃で５分間煮沸して反応を止め、スピードバックコンセントレーターを用いて反応液を完全に乾燥する。１５μｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を加え、ソニケーションで反応生成物を溶解した。得られた溶解物をシリカゲルＴＬＣプレートにスポットした。クロロホルム／メタノール／０．２％  ＣａＣｌ２（５：４：１、ｖ／ｖ）で展開後、分解率を島津クロマトスキャナーＣＳ−９３００を用いて測定（吸光度４７５ｎｍ）した。さらに、「分解率（％）＝〔遊離したリゾＧＭ１の面積×１００〕／〔遊離したリゾＧＭ１の面積＋未反応のＧＭ１の面積〕の式より分解率を求めた。１単位（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのＮＢＤ−ＧＭ１を分解する酵素量として定義した。
上記のように選択した培養液を滅菌生理食塩水で希釈し、得られた希釈物を平板培地に塗布した。塗布後の平板培地を２５℃で２日間培養し、コロニーの形成を行なわせた。これらの一連の作業を単一コロニーになるまで繰り返した結果、長崎県小長井町の海砂から採取した試料より、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを生産するシェバネラ  アルガ  Ｇ８株を単離した。
実施例２
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ構造遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの抽出精製
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの生産菌であるシェバネラ  アルガ  Ｇ８株をＰＹ培地（０．５％  ポリペプトン、０．１％  酵母エキス、０．５％  塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）２００ｍｌに接種し、２５℃で２２時間培養した。培養終了後、得られた培養液を遠心分離して菌体を集め、１０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁物に、さらに５０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム溶液０．２ｍｌを加えて３０℃で１５分間反応させた。ついで、反応終了後に得られた溶液に２ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて穏やかに攪拌し、溶液が粘性を持つようになってから即座に１０ｍｌのＴＥ緩衝液飽和フェノールと１．５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌとを加えて室温で１時間緩やかに攪拌した。撹拌後に得られた溶液を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層を回収した。得られた上層に等量のクロロホルムを加えて１０分間攪拌したのち、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収した上層に、さらにもう一度等量のクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離して上層を回収した（以下、この一連の操作をフェノール−クロロホルム処理と記載する）。回収した溶液に等量のイソプロパノールをゆっくりと加えて界面に析出するＤＮＡをパスツールピペットで巻きとり、１０ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られた溶液に２０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＮａＣｌにＲＮａｓｅ  Ａを１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、１００℃で１５分間加熱処理したもの）を加えて５０℃で１時間保温した。さらに保温後に得られた溶液に１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ溶液、２００μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、４００μｌの１０％  ＳＤＳを加えて３７℃で１時間保温することにより、反応させた。反応後に得られた溶液を室温に戻し、フェノール−クロロホルム処理を行なった。これを２回繰り返し、得られた水層に等量のイソプロパノールと１／１０容量の３Ｍ  酢酸ナトリウムを加えて−２０℃で１時間冷却した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた沈殿を７０％エタノールでリンスしてＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ溶液とした。この操作により１．１ｍｇのゲノムＤＮＡが得られた。
（２）スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの部分アミノ酸配列の決定
シェバネラ  アルガ  Ｇ８株の生産するスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを精製した。シェバネラ  アルガ  Ｇ８株を、０．５％  ポリペプトン、０．１％  酵母エキス、２％  ＮａＣｌ、０．１％  ウシ脳アセトンバウダーを含む培地で、２５℃、２２時間培養する。培養終了後、培養液を８，３００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、培養上清４．６リットルを得た。この培養上清中のＳＣＤａｓｅ活性は、５５．５ユニット（Ｕ）であった。なお、ＳＣＤａｓｅ活性の１単位（ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのＧＭ１を分解する酵素量として定義した。
得られた培養上清について、ミニタン  ウルトラフィルトレーションシステム（ミリポア社製）で分子量１０，０００カットの限外濾過膜を使用して１リットルにまで濃縮し、ブチルトヨパール６５０Ｍのカラムクロマトグラフィー（ベッドボリューム８０ｍｌ）に供した。あらかじめ２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに、濃縮した培養上清を負荷した。ついで、カラムを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２％ルブロールＰＸ（ナカライテスク社製）を含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で、吸着したＳＣＤａｓｅを溶出した。
活性画分を集めたところ、１７．７ＵのＳＣＤａｓｅを得た。
次に、この活性画分を、あらかじめ０．１％  ルブロールＰＸを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロース（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）のカラム（３０ｍｌ）に供した。前記平衡化緩衝液で十分カラムを洗浄した後、１Ｍ  塩化ナトリウムと０．１％  ルブロールＰＸとを含む２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で吸着した酵素を溶出した。
活性画分を集めたところ、１３．５ＵのＳＣＤａｓｅを得た。
この画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ分子量７５，０００に相当する位置にＳＣＤａｓｅのバンドが検出された。
上記の精製法によって、最終的に２４％の収率で１６００倍に精製された１３．５ＵのＳＣＤａｓｅを得た。
得られたＳＣＤａｓｅ約５μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、電気泳動を行なった。ついで、エレクトロブロッティング法によりゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア社製）に転写した。この膜のＳＣＤａｓｅのバンドに対応する部分（約５０ｐｍｏｌ）を切り出し、０．２ｍｇのリジルエンドペプチダーゼ（０．９Ｕ）、８％  アセトニトリルを含む２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液１００μｌ中で振とうしながら、３７℃、１６時間保温することにより、酵素消化を行なった。
この酵素消化液を逆相クロマトグラフィーに供し、ペプチド断片の精製を行なった。得られたペプチド断片をモデル４７７気相式ペプチドシークエンサー（アプライド  バイオシステム社製）を用いたエドマン分解法により分析し、ＳＣＤａｓｅの内部部分アミノ酸配列Ｃ−６０６（配列番号：３）、Ｃ−５９９（配列番号：４）、Ｃ−６１４（配列番号：５）、Ｃ−６１６（配列番号：６）を決定した。
また、これとは別に上記のＰＶＤＦ膜をリジルエンドペプチダーゼ処理することなくペプチドシークエンサーに供し、Ｎ末端アミノ酸配列Ｃ−６０３（配列番号：７）を決定した。
（３）スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅
実施例２−（２）で決定したスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列、及び内部部分アミノ酸配列より、プライマーをデザインし、ＤＮＡ合成機で合成した。
すなわち、配列番号：７で表わされるＣ−６０３に対応して、センスミックスプライマーＳＳ１（配列番号：８）、センスミックスプライマーＳＳ２ａ（配列番号：９）及びセンスミックスプライマーＳＳ２ｂ（配列番号：１０）を、配列番号：３で表わされるＣ−６０６に対応して、アンチセンスミックスプライマーＳＡ１ａ（配列番号：１１）、アンチセンスミックスプライマーＳＡ１ｂ（配列番号：１２）及びアンチセンスミックスプライマーＳＡ３（配列番号：１３）をそれぞれ合成した。
これらのプライマーを用いて、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲにおいては、アンプリタックゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、ピーイーバイオシステムズ社製）を添付のプロトコールに従って用い、９５℃：０．３分、５２℃：０．５分、７２℃：１．５分を１サイクルとして、３５サイクルの反応を行なった。
実施例２−（１）で得られたシェバネラ  アルガ  Ｇ８株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＳＳ２ａとプライマーＳＡ３；ＳＳ１とＳＡ１ａ；ＳＳ１とＳＡ１ｂ；ＳＳ１とＳＡ３；ＳＳ２ａとＳＡ１ａ；ＳＳ２ａとＳＡ１ｂ；ＳＳ２ｂとＳＡ１ａ；ＳＳ２ｂとＳＡ１ｂ；ＳＳ２ｂとＳＡ３の組み合わせによるＰＣＲを行なった。その結果、約１，０００ｂｐに相当する特異的なバンドの増幅が検出された。
上記の約１，０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後のゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に連結し、それにより組換えプラスミドを作製した。該プラスミドを鋳型とし、ジデオキシ法で上記の増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
その結果、得られた塩基配列中にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列Ｃ−６０３、部分アミノ酸配列Ｃ−６０６及びＣ−５９９のそれぞれをコードする塩基配列が見出され、この増幅ＤＮＡ断片が目的のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。
（４）スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の検出
実施例２−（３）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブに用い、ＳＣＤａｓｅ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片のスクリーニングを行なった。
まず、実施例２−（１）で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを、それぞれ制限酵素ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＳａｃＩ各１００ユニットを用い、３７℃で２２時間消化した。得られた制限酵素消化ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜〔ハイボンド−Ｎ＋（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）、アマシャム社製〕にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例２−（３）で得たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片０．１μｇをＤＮＡラベリングキット〔レディートウー  ゴー（ＲｅａｄｙＴｏ  Ｇｏ）、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製〕を添付のプロトコールに従って３２Ｐで標識したものを用いた。
上記のナイロン膜を０．５Ｍチャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）法リン酸緩衝液〔プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８１巻、第１９９１−１９９５頁（１９８４）〕ｐＨ７．０、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、６５℃で１時間以上プレハイブリダイゼーションを行なった。ついで、上記の標識プローブを６ｆｍｏｌ／ｍｌとなるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。
次に６５℃に加温しておいた洗浄液（１％  ＳＤＳ、４０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液）中、６５℃で１５分間の洗浄を３回繰り返した。ナイロン膜より余分な水分を除いた後、これを富士フィルム社製イメージングプレート（富士フィルム社製）に２０分間接触させて感光させた。感光後のイメージングプレートをＢＡＳ１０００イメージングアナライザー（富士フィルム社製）で分析し、ナイロン膜上のプローブを検出した。その結果、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＳａｃＩの各消化物でそれぞれ約１０ｋｂ、約５ｋｂ、約２．３ｋｂ、約４．４ｋｂ、約１０ｋｂ、約１０ｋｂ、約４ｋｂの位置にハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルが認められた。
（５）スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子のクローニング
実施例２−（４）の結果に基づき、約４．４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片のクローニングを行なった。ＥｃｏＲＶ消化したゲノムＤＮＡ１０ｍｇを１％アガロースゲル電気泳動で分離し、約４．４ｋｂのサイズに対応する位置のアガロースゲルを切り出した。ゲルからセファグラス  バンドプレップ  キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ  Ｂａｎｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）によりＤＮＡ断片を抽出精製し、該ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（東洋紡社製）のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、それにより組換えプラスミドを作製した。前記プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ついで、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、１％寒天）プレート上で一晩培養して出現したコロニーより３００コロニーを選択し、同じ培地プレート上においたナイロン膜〔ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製〕上に接種した。３７℃で１６時間培養した後、このナイロン膜をアルカリ変性溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸したろ紙上で５分間（変性）、中和溶液（０．５Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、３Ｍ  ＮａＣｌ）に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でリンスした。
このナイロン膜について実施例２−（３）で得たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブに用い、上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行なったところ、２個のコロニーに対してシグナルが得られた。このうちの一つのコロニーよりプラスミドを調製してｐＳＣＤ１と命名し、該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行なった。その結果、実施例２−（２）で得られたアミノ酸配列Ｃ−６０６、Ｃ−５９９、Ｃ−６１４、Ｃ−６１６、Ｎ末端アミノ酸配列Ｃ−６０３のそれぞれに対応する配列及びそれらの配列と同じフレームに停止コドンが見いだされた。すなわちこのプラスミドは２９７６ｂｐのオープンリーディングフレームからなるＳＣＤａｓｅ遺伝子全長を含むことが明らかとなった。このプラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＥ５と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター〔郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６〕に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１７として、２００１年８月２４日〔２０００年９月２２日（原寄託日）〕に原寄託より、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管されている。
プラスミドｐＳＣＤ１の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を第１図に示す。このプラスミドの塩基配列の解析結果より、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子の全塩基配列及びスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列が決定された。シェバネラ  アルガ  Ｇ８株の生産するＳＣＤａｓｅをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を配列番号：１４に、また、このＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号：１５にそれぞれ示す。
また、実施例２−（２）で得られたスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列Ｃ−６０３（配列番号：７）から明らかとなった、成熟型ＳＣＤａｓｅをコードする塩基配列を配列番号：２に、この塩基配列がコードする成熟型ＳＣＤａｓｅのアミノ酸配列を配列番号：１にそれぞれ示す。
実施例３  スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを発現するプラスミドを以下の操作にしたがって構築した。
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのＮ末端及びＣ末端のそれぞれの塩基配列を基に、それぞれＮｈｅＩサイトを付加したプライマーＵＮ１（配列番号：１６）と、ＸｈｏＩサイトを付加したプライマーＬＣ１（配列番号：１７）とをそれぞれ合成した。これらのプライマーを用いて、上記実施例２記載のプラスミドｐＳＣＤ１を鋳型としたＰＣＲを行なった。ＰＣＲにおいては、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、９８℃：１０秒、６８℃：３．５分を１サイクルとして、２５サイクル行なった。上記の条件でのＰＣＲの結果、約３ｋｂの特異的バンドの増幅が検出された。
この約３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、制限酵素Ｎｈｅ１とＸｈｏＩとで消化し、得られた断片をｐＥＴ２３ａベクター（ノバジェン社製）に連結して組換えプラスミドｐＳＣＤ２を作製した。
実施例４
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの形質転換大腸菌における発現
実施例３で得られたプラスミドｐＳＣＤ２で大腸菌ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社製）を形質転換し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＳＣＤ２を得た。これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩振とう培養した。ついで、得られた培養液の０．５ｍｌを５０ｍｌの同培地に接種した。その後、３７℃で培養し、濁度（６００ｎｍの吸光度）がおよそ０．５に達した段階で、終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに３７℃で３０分振とう培養を行なった。培養終了後、培養液を遠心分離し、菌体を集め、５ｍｌの０．１％トリトンＸ−１００及び０．８Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。ついで、超音波処理を行ない菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して上清を採取し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液のＳＣＤａｓｅ活性を前記実施例１と同様に、ＮＢＤ−ＧＭ１を基質として用い、測定した。その結果、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ／ｐＳＣＤ２は培養液１リットル当たりに約１Ｕのスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを生産することが示された。
実施例５  スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキットの構築
配列番号：２に示される塩基配列を基に、オリゴヌクレオチドプローブとプライマーとを作製し、下記に示すスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキットを構築した。
本キットには、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼに特異的な領域を増幅することができるプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用バッファー、ｄＮＴＰミクステュアーが含まれている。
なお、増幅後のハイブリダイゼーションを行なうための増幅領域に特異的なプローブは、必要に応じてキットに含める。
例えば、次のようなキットを作製した。
キットの構成（ＰＣＲ１００回分）
ＳＳ１（２０ｐｍｏｌ／μｌ）              １１０μｌ
ＳＳ２ａ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）            １１０μｌ
ＳＳ２ｂ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）            １１０μｌ
ＳＡ１ａ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）            １１０μｌ
ＳＡ１ｂ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）            １１０μｌ
ＳＡ３（２０ｐｍｏｌ／μｌ）              １１０μｌ
１０×ＰＣＲバッファー                        １ｍｌ
タカラ  タック（５Ｕ／μｌ）                ５０μｌ
ｄＮＴＰミクステュアー（各２．５ｍＭ）  １．２８μｌ
実施例６  スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキットの構築
配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原とし、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を免疫することにより、抗スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ抗体を作製し、下記に示すスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキットを構築した。
本キットは、抗ＳＣＤａｓｅモノクローナル抗体をコートした９６ｗｅｌｌプレート、ペルオキシダーゼ標識抗ＳＣＤａｓｅモノクローナル抗体、標準品、希釈液、基質液（ＴＭＢＺ：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）及び反応停止液（１Ｎ硫酸）を含むサンドイッチＥＩＡ用キットである。
例えば、次のようなキットを作成した。
キットの構成（９６回分）
抗ＳＣＤａｓｅモノクローナル抗体プレート
９６ｗｅｌｌ（８ｗｅｌｌ×１２ｓｔｒｉｐｓ）    １枚
ペルオキシダーゼ標識抗ＳＣＤａｓｅモノクローナル抗体
（凍結乾燥品）                １１ｍｌ用×１本
標準品（凍結乾燥品）              １ｍｌ用×１本
希釈液                            １１ｍｌ×１本
基質液（ＴＭＢＺ）                １２ｍｌ×１本
反応停止液（１Ｎ硫酸）            １２ｍｌ×１本
実施例７  Ｃ末欠失スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼポリペプチドを発現するプラスミドの構築
スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼＣ末欠失体を発現するプラスミドを、以下の操作にしたがって構築した。
精製酵素の推定ペプチド配列で明らかになったＮ末端から７５ｋＤａの部分、すなわちＣ末端側（ＥＲＡＥＡＨ）の部分に対応する塩基配列をもとにプライマー  ＬＳＣＤ２１２５（配列番号：１８）を合成した。得られたプライマー  ＬＳＣＤ２１２５と、実施例３で合成したプライマーＵＮ１（配列番号：１６）とを用いて、上記の実施例２記載のプラスミドｐＳＣＤ１を鋳型としたＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、９６℃：１０秒、６８℃：２．５分を１サイクルとして３０サイクル行なった。上記の条件でのＰＣＲの結果、約２ｋｂの特異的バンドの増幅が検出された。
得られた２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩとで消化することにより、Ｃ末領域を欠失したＳＣＤａｓｅをコードした断片を得た。得られた断片を、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩとで消化したｐＥＴ２３ｂベクター（ノバジェン社製）に連結して、組換えプラスミドｐＥＴＳＣＤ−ｄｅｌを作製した。
Ｃ末領域を欠失したＳＣＤａｓｅをコードしたＤＮＡの塩基配列を、配列番号：１９に示し、前記塩基配列によりコードされたアミノ酸配列を、配列番号：２０に示す。
実施例８  スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼＣ末欠失体の形質転換大腸菌における発現
実施例７で得られたプラスミドｐＥＴＳＣＤ−ｄｅｌを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ（ノバジェン社製）を形質転換し、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ／ｐＥＴＳＣＤ−ｄｅｌを得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと３５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールとを含む５ｍｌのＬＢ培地に接種して、２５℃で一晩振とう培養した。ついで、得られた培養液を、２リットル容の羽付きフラスコに入れた１リットルの同培養液に接種した。その後、得られた培養液を、２５℃で１８時間振とう培養し、ついで、培養液に終濃度０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２５℃で１時間振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、菌体を回収し、０．１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、５μｇ／ｍｌ  キモスタチン及び５μｇ／ｍｌ  ロイペプチンを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）  ５０ｍｌに懸濁した。ついで、得られた懸濁物を、−８０℃にて凍結した後、融解させて菌体を破壊した。さらに、超音波処理を行ない、菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して上清を採取し、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液のＳＣＤａｓｅ活性測定は、以下の方法により行なった。すなわち、１０μｌの基質溶液〔１０ｎｍｏｌ  ＧＭ１ａ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２％  トリトンＸ−１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）〕に、１０μｌの粗酵素液を加え、３７℃で３０分間インキュベートして、粗酵素液と基質とを反応させた。その後、１００℃で５分間煮沸して、反応を止めた。得られた反応物を、、遠心濃縮機を用いて、濃縮乾固した。得られた産物に、１０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加し、得られた混合物を超音波処理して、反応生成物を溶解した。得られた溶解物を、シリカゲルＴＬＣプレートにスポットした。クロロホルム／メタノール／０．０２％  ＣａＣｌ２（５：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）で展開し、オルシノール硫酸法により、シリカゲルＴＬＣプレート上の糖脂質を発色させた。発色後のシリカゲルＴＬＣプレートについて、、ＴＬＣクロマトスキャナー（島津製作所製）を用いて吸光度（波長：５４０ｎｍ）を測定し、以下の式により分解率を測定した。
分解率（％）＝（〔遊離したリゾＧＭ１ａの面積〕／〔遊離したリゾＧＭ１ａの面積＋未反応のＧＭ１ａの面積〕）×１００
ここで、ＳＣＤａｓｅの１単位（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのＧＭ１ａを分解する酵素量として定義した。
上記方法により、活性を測定したところ、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼＣ末欠失体をコードする遺伝子を保持した大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ／ｐＥＴＳＣＤ−ｄｅｌは、培養液１リットルあたり８７２Ｕのスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼＣ末欠失体を生産することが示された。
以下の方法により、ＳＣＤａｓｅ精製標品を得た。
すなわち、０．１％トリトンＸ−１００と１５０ｍＭ  ＮａＣｌとを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に、前記粗酵素液を負荷した。ついで、２０ｍＭ  イミダゾルを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により、夾雑タンパク質を溶出した。その後、５０ｍＭ  イミダゾルを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により、ＳＣＤａｓｅを溶出させ、活性画分（１）を回収した。
回収された活性画分（１）を、０．１％  トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。０．１％  トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に、前記透析液を負荷した。次いで、０．１％  トリトンＸ−１００と１Ｍ  ＮａＣｌとを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により、ＳＣＤａｓｅを溶出させ、活性画分（２）を回収した。
０．１％  トリトンＸ−１００と１５０ｍＭ  ＮａＣｌとを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に上記活性画分（２）を負荷した。カラムに吸着せずに通過した活性画分（３）を回収した。
０．１％  トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に上記活性画分（３）を負荷した。ついで、０．１％トリトンＸ−１００及び１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にてＳＣＤａｓｅを溶出させ、活性画分（４）を回収した。回収された活性画分
（４）を酵素精製標品とした。
得られた酵素精製標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドを示した。総タンパク質量が３９．３ｍｇであり、総活性が５２５８Ｕであった。
配列表フリーテキスト
配列番号：８に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：９に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１０に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１１に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１２に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１３に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１６に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１７に示される配列は、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１８に示される配列は、Ｃ末欠失スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：１９に示される配列は、Ｃ末欠失スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。前記配列は、配列番号：２における塩基番号：１〜２０３１の配列に対応する。
配列番号：２０に示される配列は、Ｃ末欠失スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列を示す。前記配列は、配列番号：１におけるアミノ酸番号：１〜６７７の配列に対応する。
産業上の利用可能性
本発明により、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼのアミノ酸配列並びにそれをコードする塩基配列が初めて提供される。これにより、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードした核酸を用いるスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法、該スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの検出方法が提供される。本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ製造方法によれば、スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼの発現を誘導するために培地にスフィンゴ脂質を添加する必要がなく、同時に誘導されるスフィンゴミエリナーゼ等の酵素や、培地に加えたスフィンゴ脂質あるいはその分解物の混在もなく、目的のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを容易に精製することが可能であるという優れた効果を奏する。また、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードした核酸に特異的にハイブリダイズするプローブ及びプライマー、本発明のスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供される。かかるプローブ、プライマー、並びに抗体又はその断片により、簡便、かつ高感度にスフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼを検出することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＳＣＤ１の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。
【図１】
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