(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の病因に関連する免疫因子の免疫複合体から分離した抗原および/または抗体からなる患者特異的な免疫吸着剤であって、該抗原および/または抗体が活性化した固体担体に結合されている、上記免疫吸着剤。
【請求項２】
免疫系調節不全に起因にするかまたはこれによって持続される疾患を有する患者から分離した抗原および/または抗体を含む、請求項１に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項３】
リューマチ様関節炎、急性進行性糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、抗燐脂質症候群、脈管炎、組織不適合移植組織の受容者、多筋炎、神経性自己免疫疾患あるいは感染症の後遺症としての免疫病理学的調節不全などの自己免疫疾患の患者または免疫病理学的反応状態にある患者から分離した抗原および／または抗体を含む、請求項１または２に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項４】
リューマチ様関節炎、紅斑性狼瘡あるいは多発性硬化症の患者から分離した抗原および/または抗体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項５】
免疫複合体成分をその表面に十分に多く共有結合することができる生体親和性物質に結合した、請求項１〜４のいずれか１項に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項６】
免疫複合体成分をセファロースまたはパールセルロースに結合した、請求項１〜５のいずれか１項に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項７】
体外搬出法に使用するためのものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の患者特異的な免疫吸着剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の患者特異的な免疫吸着剤の製法であって、患者の血液または他の体液から免疫複合体を分離し、これを臨床使用のため体外浄血法で洗浄し、活性の成分である抗体および抗原に分解し、これら成分を固体の担体に共有結合させることを特徴とする上記方法。
【請求項９】
体液が髄液である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫複合体をプロテインＡ免疫吸着剤を介するプラズマ搬出法（血漿分離法）で分離する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
酸性ないしアルカリ性環境にてNaCl、MgCl2、LiClなどの塩あるいは尿素あるいは塩酸グアニジンを加え、免疫複合体を個々の成分に分解し、pH２〜１２領域で固体担体にカップリングさせることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫複合体の個々の成分を分別した後に固体担体にカップリングさせることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
特定濃度以上で反応パートナーを解離状態に保つのに適するNaCl、MgCl2、LiClなどの塩あるいは尿素あるいは塩酸グアニシジンを加えて、固体担体にカップリングさせることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
酸性ないしアルカリ性環境が、ｐＨ領域が２〜５もしくは１０〜１２であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７記載の患者特異的な免疫吸着剤の、身体固有の免疫学的に有意な物質の製造およびその加工への使用。
【発明の詳細な説明】
説明
本発明は、免疫病理学的プロセスに起因する種々の疾患を発現させ、あるいはこれを持続させる特異性抗体および（または）抗原から免疫吸着剤を製出する方法に関するものである。この発明は、臨床的結果に関与する免疫病理学的制御回路に−たとえば従来の薬物による免疫制御療法におけるように−免疫系全体に作用することなく、選択的に影響を及ぼすことを可能とする。
この発明における方法はさらに、免疫病理的に関与する生体固有の物質の濃縮と純化を可能とし、原因の研究と療法の開発に新しい可能性をもたらす。
免疫反応の機能的基本は複雑であり、非特異的防御の局所的および全身的に作用する細胞性および体液性要素の良好に調節された相互作用、ならびに活性化したリンパ造成系細胞とこれが生成する伝達物質および抗体とからなる特異的防御を根底とする。
主要な防御能は、刺激の種類により多様でありうる。
この上昇した防御状態は自然的には感染の経過、人工的には薬物によって獲得される。この獲得は全身的にも局所的にも呼吸器、消化器および泌尿生殖器の粘膜を介して行われる。
生体は感染に対しただちに反応する。この即時反応の質および量は、抗原の種類およびその進入部位に依存する。同じ反応は原則として、ワクチンその他の生体異質物質の投与によっても起こる。特異的防御（たとえば特異的抗体の証明によって測定できる）は、数日後にはじめてその効果を現す。原因が取り除かれれば、特異性抗体の生成は下方調節され、いずれ停止する。抗体の生物学的分解ののちには、特異性“記憶細胞”の存在だけが「生体が過去にいかなる抗原と対決したか」を示すにすぎない。特定の条件下では（多くの場合、個々には因果関係の同定はもはや不可能である）生体は体固有の構造に過剰に反応する。発展する自己免疫反応は体固有組織を持続的に破壊し、その破壊産物がさらに免疫系を刺激する。この病的制御回路が中断されなければ、その結果は少なくとも当該組織にとり致命的である。
免疫病理学的に起因する、またはこれが関与する疾患の頻度は高い。その臨床的経過および治療の難しさは患者の生活の質を低下させ、国民経済的にも多大な損害をもたらす。リューマチ様関節炎は高頻度自己免疫疾患の１つであり、国民の１％がこれに罹患する。主要な発現年齢は４０歳前後で、その１０年後には患者のおよそ５０％が労働不能となり、１０〜２０％が重度障害者となる。従来の免疫抑制療法とこれを補う補助療法で達成させる成果は不十分であり、治療の中止が治療の終了を意味する例が多い。基礎治療薬による初期治療を受けた患者のうち、３年後に効果的投薬を受ける患者は５０％にすぎない。
従来の免疫抑制療法は効果が不十分であることが多く、副作用が強いため、自己免疫疾患
の新しい治療法がつねにもとめられてきた［J. Sany: Early approaches to Immunotherapy of rheumatoid artheritis. EUR-J-RHEUMATOL-INFLAM: 11(1991), 139-147］。
これらの療法は体液および細胞性免疫メカニズム、ならびに伝達物質系に影響を与えることを目的とする。これは実験的な試みの療法であり、動物実験および臨床実験で最初の成果がもたらされたが、自己免疫疾患の予後の決定的な前進には至っていない。
プラズマ交換法およびプラズマ吸収法が様々な自己免疫疾患および免疫病理学的関連疾患の治療に適用され、効果をあげた[R. T. Baldwin, R. R. Pierce and O. H. Frazier : Guillan-Barre syndrome after heart transplantation.J-HERRT-LUNGTRANSPLANTATI0N:11(1992), 817-819; J. Braun. J. Sieper, A. Schwarz, F. Keller, J. Heitz and H.V. Amln: Sever lups crisis with aganulocytosis and anuric renal failure due to a mesangial lesion(WHO IBB)- succesful treatment with cyclophosamide pluse followed bei plasmapheresis in acute multiple sclerosis(2). BR-J-RHEUMATOL:30 (1991), 312-313; P.C. Dau: Plasmapheresis in acute muitiple sclerosis:Ratioaleand results. J-CLIN-AHERESIS: 6 (1991), 200-204; H. H. Euler, J. O. Schroeder, R. A. Zeuner and E. Teske: A randomized trail of plasmapheresis and subsequent pulse cyclophosphamide in severe lupus: Design of the LPSG trail. INT-J-ARTIF- ORGANS: 14 (1991),639-646; D. C. Hess, K. Sethi and E. Awad: Thrombitic throm-bocytopenic purpura in systemic lupus erythemastosus and antiphospholipid anti-bodies: Effective treatment with plasma exchange and immunosupression. J-RHEUMATOL:19(1992), 1474-1478; R. Korinthenberg and M. Sauer: The Guillain-Barresyndrom In childhood. Clinical course and therapeutic measures. MONATSSCHRKINDERHEILK: 40 (1992), 792-798]。
プラズマ交換法はプラズマ吸収法より古い治療法で、分離したプラズマ（膜プラズマ搬出法または遠心分離法）を廃棄し、同時に提供者のプラズマまたはヒト・アルブミンと交換する。１回の治療で患者のプラズマと等量または２倍量を交換する。この方法は選択的ではない。１つはまたは複数の病因的に重要な成分を除去するため、プラズマをすべて廃棄するから、患者に必須の物質も除去される。これが患者にとり重大な結果をもたらすため、様々な置換療法による補充が試みられる。このほかHIVあるいは肝炎病原体のような病原体に感染する危険も存在する。
プラズマ吸収法においては、あらかじめ分離しておいたプラズマを吸着材に導く。吸着材には、プラズマの特定成分と結合し、これを患者のプラズマから除去する物質が結合している。プラズマ吸収法が免疫学的に重要な物質の除去に用いられる場合は免疫吸着法と呼ばれる。この免疫吸着法は、使用する吸着剤により選択性と用途が異なり、これがまた治療の効果と副作用を決定する。プラズマから分離した免疫グロブリンを吸着するため、様々なリガンドおよび担体が臨床的に用いられている。
表１
体外搬出法に臨床的に用いられるリガンドの例
−  ブトウ球菌プロテインＡ
−  疎水性アミノ酸（トリプトファンないしフェニルアニリン）
−  硫酸デキストラン
−  凝集免疫グロブリンＧ
−  抗ヒト免疫グロブリンＧ
−  血液型抗原
以下の表で体外搬出法による療法が有効な自己免疫疾患を概観する。
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自己免疫疾患の薬物療法における短所
薬物による免疫抑制は非選択的、非特異的である。新しい免疫学的療法（免疫細胞および伝達物質の活性化マーカあるいはレセプター構造に対するモノクロナーナルまたはポリクローナル抗体）も免疫応答を選択的に抑制せず、あるいは療法そのものが生体の免疫現象を誘発する。
自己免疫疾患の従来の搬出／吸着療法における短所
これまで知られている搬出法ないし吸着法にはすべて、薬物による免疫抑制法と同様に選択性が不十分であるという短所がある。これは、すでに用いられているBalintおよびHargreavensの黄色ブドウ球菌プロテインＡを適切な担体に固定化する方法（米国特許第4,681,870号）について言えることである。この方法では、患者の血液から非特異性IgGを除去する。同様のことは、Davis（ＰＣＴ−出願WO86/07152）が報告した担体に結合した非特異性蛋白（様々な免疫グリブリンの種が好んで用いられる）を免疫複合体の吸着剤に用いる方法についても言える。
この方法ではたしかに免疫複合体は除去されるが、自己免疫疾患においてつねに、あらたに生成する個々の反応性成分は除去されない。
LibertiおよびPoollora（米国特許第4,551,435号）は、血液から物質と免疫複合体を除去する方法を報告した。この方法では患者の血液を特定濃度の特異性抗体と混合し、除去すべき物質と免疫複合体を生成させる。これを固体担体に固定化したFc受容体を持つ細胞、リューマチ因子、Fc受容体などの因子とともに血液から除去する。この方法は解放される誘因が知られていること（自己免疫疾患症例のほとんどは誘因が不明である）、および誘因となる抗原が精製され、用意されていることを前提とする。免疫複合体の除去そのものは非特異的因子的でプロテインＡを介さず、免疫グロブリンと生理的に高い親和性を有する生体分子によりおこなう。
ここでは、個々の自己免疫疾患に病理生理学的に関与する免疫構造が、たとえそれが同一の疾患である場合でも多様であることに注意する必要がある。従来の搬出システムは免疫病理学的に重要な免疫グリブリンだけでなく、生理的な−生体固有の防御に必須の−免疫グリブリンまで除去する。その結果として、敗血性合併症のリスクをともなう免疫系全体の弱化をもたらす。
本発明は免疫系の調節不全に起因する疾患、あるいは免疫病理学的プロセスにより慢性の治療困難な経過形態を示す疾患に苦しむ患者のための治療法を提供することを目的とする。
発明の根底となる課題は、個々の患者に特異の免疫吸着剤を開発し、これにより病因論的に意味を持つ免疫複合体、自己抗体および抗原を患者に血液またはプラズマから吸着、除去することにある。この課題は請求項１および７の方法により解決される。従属項は優利な変法である。
このためには公知の方法、たとえばプロテインＡ免疫吸着剤を用いる方法で患者のプラズマから免疫複合体を除去し、所定の溶出ののち生物学的に活性の成分要素に分解する。これら成分要素は公知の方法たとえばゲル・クロマトグラフィーにより分離し、個々に、または抗体と抗原の混合物として担体にカップリングさせることができる。この免疫吸着剤を用いることにより、患者のプラズマから疾患に重要な意味を持つ免疫複合体、抗体および抗原をプラズマ搬出法で除去することができる。これらカラムは再活性化が可能であり、繰り返し使用される。このような患者特異性の免疫吸着剤は通常、自己免疫複合体が病理学的に関与する疾患すべてにおいて製造が可能である。
この課題の解決法は、本発明の特許の請求項から導き出すことができる。
本発明においては、患者特異性の免疫吸着剤は患者の病理学的に関与する免疫因子の複合体から分離した抗原および／または抗体からなり、活性化した個体担体に結合させたものである。この免疫吸着剤は調節不全に起因する、あるいはこれを持続する疾患を有する患者の分離した抗原および／または抗体を含む。自己免疫疾患あるいは免疫病理的反応状態には、特に以下のものがある。
リューマチ様関節炎、急性進行性系球腎炎、全身性紅斑性狼瘡、抗燐脂質症候群、脈肝炎、組織非適合性移植体受容体、多筋炎、神経性自己免疫疾患または感染症に起因する免疫調節不全。担体材料としては、その表面に十分に多量の免疫複合体を共有結合するあらゆる生体親和性材料が適する。特に好ましいものはセロファースおよびパールセルロースである。
患者特異性免疫吸着剤の製造法は以下のようなステップを特徴とする。
まず免疫複合体を周知の非選択的方法、たとえばプロテインＡ免疫吸着剤を用いて患者のプラズマから分離し、所定の溶出ののちに生物学的に活性な諸成分に分解する。これら成分は周知の方法、たとえばゲル濾過法により分離され、または個々に、ないしは抗体と抗原の混合物として担体材料にカップリングさせることができる。免疫複合体は通常、酸性またはアルカリ性環境（特にpH２〜５または１０〜１２の範囲）で個々の成分に分解する。これは場合によっては分別し、場合によってはNaCl、Mgcl2、LiCl等の塩もしくは尿素またはグアニジン塩酸（特定濃度以上で反応体を解離状態に保つのに適する）を加えたのち、pH範囲２〜１２で周知の方法により個体材料にカップリングさせることができる。
この免疫吸着剤を用いて患者のプラズマから特異的に、患者に関与する免疫複合体、抗体および抗原を体外免疫吸着剤により除去することができる。このカラムは再活性化が可能で、くり返し使用することができる。このような患者特異性免疫吸着剤は通常、自己免疫複合体が病因論的に関与するあらゆる疾患において製造可能である。
この方法は治療への応用のほか、免疫学的調節不全に少なくとも共同して関与する物質の患者の血液からの分離を可能にする。これにより自己免疫疾患、ないし免疫学的不調の継続により増強される疾患における病因の検査が単純化される。従来の方法との比較における長所は：
１、免疫複合体のほか、従来法では確認不可能であった個々の反応パートナーをも除去することができる。
２、異種免疫グブリンを有する代替物を必要としない（HIVなどへの感染を排除し、付加的コストを回避することができる。
３、病因を解明することなく、患者特異性免疫吸着剤を製造できる。したがってコスト上の理由から医療産業が開発を躊躇するような罹患率の低い疾患についても特異的な治療手段を用意することができる。
４、個々の自己免疫疾患の発現ないし持続に関与する抗原および／または抗体を特異的に濃縮し、分離して以後の検査のため用意することができる。
以下に、本発明について詳しく説明する。
たとえばリューマチ様関節炎、紅斑性狼瘡あるいは多発性硬化症などの自己免疫疾患に罹患した患者に対し、葡萄球菌Ａプロテイン免疫吸着剤を用いる体外搬出法を実施する。搬出サイクル終了後、カラムを洗浄剤を加えた緩衝剤で十分に洗い、あるいはイオン濃度を高め（たとえば１〜３mol/NaCl）、吸着結合したプラズマ成分をカラムから除去する。吸着したプラズマ成分が除去されたことを電気誘導法または洗浄緩衝剤の免疫分析法でチェックしたのち、免疫グロブリン、免疫複合体ならびに解離した免疫反応パートナーをpH勾配（たとえばpH７〜２のクエン酸または酢酸緩衝液）もしくは様々なpH値の塩溶液（pH４〜７）で溶出する。電気泳動、クロマトグラフィーなど適切な解離法により、溶出したフラクションを免疫複合体のそのプロテインのスペクトルおよび解離度について検査する。
固体担体への固定化には、免疫複合体を反応性成分に分解したフラクションを使用する。これは、必要に応じ、固定前に適当な分離法により分離することができる。免疫複合体の各成分は個々にあるいは混合物として、周知の方法により、ONBカルボネート・エチルエステルあるいはＮヒドロキシスクシンイシド・エチルエステルで活性化した担体材料にカップリングする。結合しない成分すべてを除去すると、患者に特異的な、再生可能な免疫吸着剤が得られる。この免疫吸着剤を用いることにより、患者の血液から免疫病因性、液性調節不全に関与する物質だけが選択的に除去される。
以下に本発明の実施例を詳しく説明する。
実施例１
固定化したヒト免疫グロブリンG(IgG)の生物学的活性を抗ヒトIgG（ヤギ）との結合により測定するモデル検査  -----（表３）
ヒトIgGの担体（セファロース6FFおよびパールセルロース）へのカップリングは溶出条件のもとで行った。カップリングにはONBカルボネート群１m1当たりおよそ３０molのCL-CO-NBO活性化ゲルを使用した。
抗血清（抗ヒトIgG５．３mg）をｌml PBSで希釈し、それぞれの担体上に加えた（流量：０．１ml/min）。カラムはその容積の数倍のPBSおよび３M NaCL pH ５．０にて洗浄した。溶出は０．１Mグリシン-HCL、０．０５％のトウィーン２０pH２．０で行った（流量：１．０ml/min，２〜６℃）。プロテイン濃度の測定は溶出液の０．５MK2PO4による中和後、分光測光法により波長２８０nmにて行った。ゲル１mlあたりの相対的抗体結合容量はヒトIgGの標準条件（０．５M燐酸塩緩衝液、トウィーン２０  ０.０５％、pH７．２）下におけるカップリングに関連する。
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実施例２
アルカリ活性化ONBカルボネート・セファロース６FF pH３．０で固定化したヒトIgG（抗原抗体）の結合容量を測定するための、抗ヒトIgG（抗体）を過剰に用いる親和性クロマトグラフィーによるモデル検査−−−  （表４）
カップリングのためヒトIgG（Sigma）をカップリング緩衝液に溶解し、濾過した（０．２μm）。この溶液を溶剤に湿した活性化したセファロースに加えた。カップリングは室温にて注意深く攪拌しながら行った（1h）。ブロッキング（０．ｌMの棚酸塩中のエタノールアミンｌM、pH８．０/lh）ののち、ゲルをたとえば、それぞれカラム容積の１０倍のフリットを用い、カップリング緩衝液-水-０．０ｌN HCL-水-０．１酸塩緩衝液２４hpＨ８．３/１h-水の順で十分に洗った。
親和性クロマトグラフィーによる検査はECONO-SystemとOmnifitカラム（５．０  X  ０．３cm I.D.（３５０μｌゲル）を用い、２〜６℃で行った。流量は０．２５〜０．１ml/minとした。溶出はUV流出フォトメーター（２８０nm）で測定した。抗体を結合し、PBSで洗ったのち、抗体を以下のプログラムで溶出した：
１、PBSで30 min
２、3 M NaCl pH 5で60 min
３、PBSで30 min
４、Glycin* HCL pH 2.0で30 min
５、PBSで30 min
流量：0.25 ml / min
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実施例３
ａ）HSA被覆した微量測定プレートを用いてHSA抗体（ウサギ）を抗体抗原複合体HSAから溶出し、親和性クロマトグラフィーのための理想的な溶出条件を求める。（表５）
96孔の微量測定プレートをHSAで被覆した。各孔では0.1μgの抗HSAをインキュべートさせた。
検出システム（ELIS）としては、アルカリ性フォスファターゼ（基質：ニトロフェニールフォスフェート、λ405nm）で抱合した抗ウサギIgGを用いた。
それぞれの溶出緩衝液200μlをピペットで孔に敵下した。溶出は室温にて１時間、微量測定プレートを常に動かしながら行った。孔を十分に洗ったのち、抗HSAを検出した。
その分析のため、各８の孔の測定値の平均を求めた（％＝4.4）。溶出した抗HSA抗体のPBSに対するパーセンテージは０％に
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ｂ）塩基性触媒に反応させ、活性化したONBカルボネート6FF（免疫親和性クロマトグラフィーの溶出媒質として使用される）のカップリング媒質中における固定化−（表６）
カップリングするプロテインを混合し、濾過（0.45μｍ）したカップリング媒質を湿らせ、活性化したONBカルボネート・セファロースに加えた。カップリングは室温で１時間、かるく攪拌しながら行った。こののち室温にて、エタノールアミンとともに棚酸塩緩衝液(pH8.1)中でブロッキングした。ONBカルボネート群を分光光度計（λMAXおよそ267nm）により定量した。
洗浄は実施例２と同様に行った。
前実験で親和性クロマトグラフィー（0.05〜0.1 Mクエン酸pH 2.0）により抗HAS抗体を用意し、0.5 Ｍ Ｋ2HPO4で中和し、−20℃で保存しておいた。これを解凍し、カップリングのため希釈したBCLでpH 3.0ないし4.0に調節した。
抗原抗体混合物のカップリングのためのHSAをPBSに溶解し、希釈したHCLで所定のpH値に調節し、抗体溶液に加えた。
カップリング緩衝液中でのプロテインは分光光度計OD280nmで定量した（抗体E0.1%＝１．３８HAS E0.1%＝０．６７）。不動化したプロテインは、ゲルをlN NaOHで処理したのちの上澄みをLowryの方法で定量した。
カップリングの結果（％）は供したプロテイン量に対する固定化プロテインの相対量である。
実施例４
免疫複合体の分解条件で固定化した抗HＳA/HＳAをモデルとする抗原および抗体の生物学的活性（結合能）の証明 --（表７）
塩基性触媒に反応させ、活性化したONBカルボネート・セファロース６FFを溶出条件
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下（pH３．０；pH４．０；４M グアニジン*HCL）で実施例１および３bの説明と同様に抗HSA / HSAとカップリングした。カラムを洗ったのちHSAないし抗HSAを結合緩衝液に供した。カラムをPBSで再度洗ったのち、溶出（pH 2.0）とフォトメトリーによるプロテイン濃度の測定を行なった。
このモデル実験により、分解条件下で担体に固定化した免疫複合体（抗HSA / HSA）からの抗体（抗HSA）も抗原（抗原HSA）も結合能を維持することが証明された。免疫複合体から固定化したHSAはつねに抗HSAを結合し、ELISA中で再度溶出したのちHSAと強い反応を示した。（結果の説明は省く）。１ MolのHSAが１ Molの抗HSAと結合するという前提のもとで、2.1 mg抗HSAと結合した免疫複合体（実施例３）0.9 mg HSA / MLゲルを固定化した。免疫複合体から抗HSA（抗ウサギ IgG）はこのモデルで標準カップリング条件下でも効率的に固定化し、その成果は抗ウサギIgGで証明できる。しかしこの場合、前提とするカップリングはHSAの結合を立体的に障害する分子領域で行なわれることになる。抗体そのものはその生物学的活性を維持する。
実施例５
紅斑性狼瘡患者のプラズマ親和性クロマトグラフィー（同時に標準法）
紅斑性狼瘡に罹患した患者のプラズマが用意された。総γグロブリンを得るためプロテインAカラム（PHARMACIA）を使用した。抗体はONBカルボネートで活性化したセファロース６FF（20μ Mol / ml）を介して固定化した。
免疫吸着法のための緩衝液
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方法
プロテインAをカップリングしたカラム（５mlゲル、Pharmacia）を緩衝液PAで平衡化した。高速で遠心分離した新鮮なプラズマ20 mlを１：２で緩衝液PAと混合し、塗布した。クロマトグラフィーにはEconoシステム（BIORAD）を使用した。完全な吸着を達成するため、カラム通過後再びプラズマを塗布した。吸着されなかった物質を除去するため、カラム容量の５倍のPAで十分に洗浄する必要があった。非特異的に結合したプロテインは3 M NaClを含む洗浄緩衝液で除去した。0.1 Mクエン酸塩、pH 2.2 0.05 %のトウィーン20で免疫グロブリンとプロテインを免疫複合体からシャープなピークとして溶出した。溶出物の量は6.5 mlであった。プロテイン濃度はλ280nm、17.6 mg / mlのUV吸着を介して測定した。溶出後ただちに、個々に分離したIgGおよびプロテインをONBカルボネートで活性化したセファロースにカップリングした。このためには製造者の指示にしたがって準備し、吸引したゲル６mlを加え、lhの攪拌を行った。溶出物のpH値は、これに含まれるプロテインの緩衝作用により３〜４を示した。自由結合は0.1 M pH 8.0の棚酸塩緩衝剤中のl Mエタノールアミンで飽和させる必要があった。合わせた洗浄液中のプロテイン濃度とプロテインA溶出物との比較から57％の結合効率を確認した。十分な洗浄後のゲルは親和性クロマトグラフィーによる実験に供する。
このためには患者のプラズマ40 mlを遠心分離し、1 : 2でPAにより希釈し、カラム上に加える。結合しなかった、ないし非特異的に結合した物質はそれぞれカラム容量の１０倍のPA、洗浄緩衝剤およびPAの順で除去した。特異的に結合したプロテインを0.1Mクエン酸pH 2.2で溶出した（図１）。
プラズマプロテインおよびクロマトグラフィー法で得たフラクションはSDSポリアクリルアミド電気水泳動（SDS-PAGE）規格法により分析した（ミニプロテアン(Miniprotean)II、BioRad)。ゲルはモノマー濃度10〜25％の匂配ゲルであった。染色にはCoomassie Grillant Blue R-250を使用した（図２および３）。
図２から明らかなように、プロテインA溶出物には抗体のほか、他のプロテインが含まれている。これらは、固定化ののち患者のプラズマ中の対応する反応パートナーと特異性には結合することができる。親和性クロマトグラフィー（図１）後の溶出ピーク２（0.lMクエン酸、pH2.2）ではPAGE中に種々のプロテインを同定することができた。免疫グロブリンおよび多くの高分子プロテインとならび３種のプロテインが決定的に濃縮されている。これはプロテインA溶出物のPAGEにはかすかに見える程度の帯状として証明できるにすぎない（図３）。その相対的モル濃度は40 kD前後である。
実施例６
多発性硬化症患者のプラズマの親和性クロマトグラフィー
プラズマの処理、プロテインAの溶出、および溶出プロテインのカップリングは実施例５と同様に行った。吸着性結合したプロテインを免疫吸着剤から洗い落としたのち（図６のピーク１）、特異的に結合したプロテインを溶出緩衝剤でマトリックスから分離する。これは主として免疫グロブリンからなる混合プロテインであることが証明される。
実施例７
リューマチ様関節炎患者のプラズマの親和性クロマトグラフィー
プラズマの処理、プロテインAの溶出、および溶出プロテインのカップリングは実施例５と同様に行った。吸着性結合したプロテインを免疫吸着剤から洗い落としたのち（図６のピーク１）、特異的に結合したプロテインを溶出緩衝剤でマトリックスから分離する。これは主として免疫グロブリンからなる混合プロテインであることが証明される。
図１〜６の説明
図１：
規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセフアロース６FFに吸着後の患者のプラズマの溶出プロフィル。
マークは洗浄および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は表さない）：
No 1＝洗浄緩衝液、No.２＝０．ｌMクエン酸緩衝液pH２．２
図２：
ONBカルボネートで活性化させたセファロースとのカップリング前および後のプロテインAカラムの溶出物のPAGE。
No.１/２＝カップリング前の材料５ないし１０μl、No.３＝１０kD導体、No.４＝γグロブリン・スタンダード、No.５〜８＝１〜４に同じ（ただしカップリング後、なわち非結合物）
図３：
pH２．２で免疫吸着剤カラムから均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPAGE。
No.１〜７/９〜１５＝ピーク分留、No.８/１７＝kDプロテイン・マーカー、No.１６＝後洗浄
図４：
規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセファロース６FFに吸着後の患者のプラズマの溶出プロフィル。
マークは洗浄時および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は示さない）：
No.１---洗浄緩衝液、No.２---０．１Mクエン酸緩衝液pH２．２
図５：
免疫吸着剤カラムからpH２．２で均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPAGE。
No.１＝１０kDスタンダード、No.２＝γグロブリン・スタンダード、No.３＝ピーク分留（ピーク２  図４）、No.４＝Amicon centrifree▲Ｒ▼で濃縮後のピークフラクション
図６：
規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセファロース６FFに吸着後の患者のプラズマの溶出プロフィル。
マークは洗浄および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は示さない）：
No.１---洗浄緩衝液、No.２---０．ｌMクエン酸緩衝液pH６．０/ツイーン、
No.３---0.1Mクエン酸緩衝液pH２．２
図７  免疫吸着剤カラムからpH２．２で均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPAGE。
No.１〜４＝洗浄緩衝液からのプロテイン、No.５/６＝ピークフラクション（ピーク３図６）、No.７＝１０kDスタンダード、No.８＝γグロブリン・スタンダード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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