(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲルの表面に下記一般式（I）で表される化合物が結合していることを特徴とするＳＥＣ用カラム充填剤。
【化１】
0003949987.tif 000006
【請求項２】
請求項１記載のＳＥＣ用カラム充填剤において、蛋白質の分離に用いることを特徴とするＳＥＣ用カラム充填剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＥＣ用カラム充填剤、特にその蛋白分離能の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶媒中における溶質の分子サイズによって分離を行う方法であり、小さな分子はカラム充填剤の細孔中へ浸透することにより長くカラム中に保持され、大きな分子は細孔中へ入り込むことができずに早く溶出してくるといった原理によるものである。ＳＥＣは、高分子量の物質の分子量による分離に非常に適しており、このような分離・分析の手段として非常によく用いられている。
【０００３】
一般に、ＳＥＣ用のカラム充填剤としては、シリカゲル等の無機系充填剤と、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体等の有機ポリマーよりなる有機系充填剤とに大別することができる。しかしながら、有機系のカラム充填剤は、耐圧性に劣る、溶媒により膨潤・収縮する、加熱殺菌が不可能である等の難点があるために、実際には無機系充填剤、特にシリカゲルを基剤とした充填剤が主に用いられている。これらシリカゲル系充填剤は優れた分離能を示し、機械的強度も良好である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一方で、ＳＥＣにおいては、前述したように分子サイズによる分離を行うものであるために、基本的に溶質とゲルとの間の相互作用が起こらないようにする必要がある。すなわち、通常の分配・吸着クロマトグラフィーとは異なり、ゲル表面での吸着・脱離は生じさせてはならない。このために、吸着が生じないように、移動相に極性の強い溶媒を用いたり、また、充填剤表面を処理して親水性官能基を修飾したりするといった工夫がなされ、このような充填剤が多く市販されてきた。
しかしながら、従来のシリカゲル系充填剤は、シリカゲルと蛋白質との間で吸着が起こってしまうために、ＳＥＣにおいては精度の良い蛋白質の分離・分析を行うことができず、この問題は未だ解決されていなかった。
本発明は、このような従来の課題に鑑みなされたものであり、その目的は優れた蛋白分離能を有するＳＥＣ用カラム充填剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記従来技術の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シリカゲルの表面にＮ-(３-トリエトキシシリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を結合したものをカラム充填剤として用いると、シリカゲルと蛋白質との吸着が低減されることにより、蛋白質の分離能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルの表面に下記一般式（I）で表される化合物が結合していることを特徴とする。
【化２】
0003949987.tif 000002
また、前記ＳＥＣ用カラム充填剤は、蛋白質の分離に用いられることが好適である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表される化合物が結合されていることを特徴とする。このために、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルと蛋白質との吸着を低減することにより、蛋白質の分離能を向上することができる。
【０００８】
本発明のＳＥＣ用カラム充填剤に用いるシリカゲルは、粒子の形状、粒径及び細孔径により特に限定されるものではなく、分離目的に合わせて適した性質のものを適宜選択し用いることができる。このようなシリカゲルとしては、通常カラム充填剤用として市販されている多孔質球状シリカゲルを好適に用いることができる。また、蛋白質分離の目的で用いる場合には、通常、粒径５〜１０μｍ、細孔径１０〜５０ｎｍのシリカゲルが好適である。
本発明のＳＥＣ用カラム充填剤に用いる上記一般式（I）で表される化合物は、公知の方法により製造したものを用いることができる。例えば、上記一般式（I）で表される化合物は、市販の３−アミノプロピルトリエトキシシランとグルコノ−δ−ラクトンを等モル反応させることによって容易に製造することができ、このようにして製造したものを用いることができる。
【０００９】
本発明のＳＥＣ用カラム充填剤の製造方法は、シリカゲルと上記一般式（I）で表される化合物とを結合させる方法であれば特に限定されない。例えば、シリカゲルを上記一般式（I）で表される化合物の酸性水溶液中に浸漬し、室温中で反応させる方法が好適な方法として挙げられる。また、シリカゲルに、予め前記３−アミノプロピルトリエトキシシランを修飾し、この後に、前記グルコノ−δ−ラクトンを結合させても、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤と同一のものを製造することができるが、このようなものも本発明の範疇である。
【００１０】
このようにして得られる本発明のＳＥＣ用カラム充填剤の構造を図１に示す。すなわち、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤のシリカゲル表面には、上記一般式（I）で表される化合物がシロキサン結合を介して修飾されている。
本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、カラムに充填することによりＳＥＣ用のカラムとして用いる。カラムの材質は特に限定されず、ステンレス、合成樹脂等、いずれのものも用いることができる。また、カラムへの充填方法も特に限定されるものではなく、平衡密度法、スラリー充填法等の公知の充填方法を用いることができる。
【００１１】
そして、このようなＳＥＣ用カラムを用いて蛋白質の分離を行うと、蛋白質分子を含む流体は、カラムの一端から入ってシリカゲル粒子の細孔及び／又は間隙を通過して他端から溶出する。この通過途中で、従来のシリカゲル系充填剤においてはシリカゲル粒子と蛋白質分子との吸着が起こっていたのに対し、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤においてはシリカゲル表面に上記一般式（I）の化合物を結合させることにより、蛋白質との吸着反応を低減することができるため、より高い精度で分離・分析を行うことが可能となる。このため、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、蛋白質の分離に用いることが好適である。
また、通常、ＳＥＣにおいては、溶離液として非水系の有機溶媒を用いて分離を行う場合をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、溶離液として水系の溶媒を用いて分離を行う場合をゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）と呼び、この両者は区別されているが、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は特に限定されるものではなく、このどちらの場合においても用いることができる。
【００１２】
以下に、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤の作用について説明する。
ＳＥＣにおける溶質分子とカラム充填剤粒子の模式図を図２に示す。カラム充填剤粒子１０の細孔の孔径より大きなサイズの溶質分子ａ１２は細孔に入れず、充填剤粒子の間隙を通って溶出する。これに対して、カラム充填剤粒子１０の細孔の孔径より小さなサイズの溶質分子ｂ１４及び溶質分子ｃ１６は細孔から充填剤粒子１０の細孔の内部へ入り込むため、遅れて溶出してくる。この結果、サイズの大きな溶質分子が小さな溶質分子よりも先に溶出されてくることとなり、分子のサイズによる分離が可能となる。
【００１３】
すなわち、前記サイズの小さい溶質分子ｃ１６は充填剤の細孔の体積(ＶＩ)、及び充填剤の外側の体積(Ｖｏ)を利用できるが、前記サイズの大きい溶質分子ａ１２は充填剤の外側の体積(Ｖｏ)のみしか利用できない。そしてこれらの中間のサイズの溶質分子ｂ１４は、一部の充填剤の細孔の体積(ＶＩ)を利用することができる。ここで、ＳＥＣにおける保持容量ＶＲは、下記一般式（a）により表される。
【数１】
ＶＲ＝ＶＯ＋αＶＩ  （０≦α≦１）    …  （a）
ここで、αは試料分子が細孔内のどこまで入り込むことができるかを示すものであり、α＝０のときは全く入り込むことができず、α＝１のときは完全に入り込むことができる。
【００１４】
前記保持容量ＶＲと分子量の対数との関係をプロットした校正曲線とこれに対応した溶出量検出曲線の模式図を図３に示す。
前記保持容量ＶＲと分子量の対数はＡ〜Ｂ間で直線関係を示し、分子量がＡよりも大きい溶質はα＝０となりすべてＶＯに溶出し、Ｂよりも小さい溶質はα＝１となりすべてＶＯ＋ＶＩに溶出する。ここで、Ａを排除限界分子量、Ｂを全浸透限界分子量という。そして、図２において分子量がＡとＢの間（αが０〜１の間）にある溶質については、得られたＶＲを前記校正曲線の直線部分に当てはめることによって、その分子量を求めることができる。
【００１５】
以上説明したＳＥＣの機構においては、溶質分子とカラム充填剤との間に相互作用を生じると、分子サイズによる分離挙動の妨げとなる。
すなわち、前述したように、溶質分子とカラム充填剤との間に相互作用の無い理想的な系においては、保持容量ＶＲと分子量対数は直線関係となる。しかしながら、溶質分子とカラム充填剤との間で吸着が生じている場合、カラム充填剤との間の吸着強度の低い溶質分子は早く溶出し、吸着強度の高い溶質分子は溶出が遅れるというように、保持容量ＶＲに吸着の影響を及ぼしてしまう。
【００１６】
これによって、試料の溶出ピークはブロードとなり、保持容量ＶＲの近い試料のピーク同士が重なってしまうために分離が困難となり、また、前述の保持容量ＶＲと分子量対数との直線関係も崩れてしまうため、保持容量ＶＲの実測値から正確な分子量を算出することができなくなる。
したがって、ＳＥＣにおいて、より精度の高い分離・分析を行うためには、ＳＥＣ用カラム充填剤と試料との間で吸着反応が起こらないようにする必要がある。
【００１７】
ここで、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲルの表面に上記一般式（I）で表される化合物が結合されていることによって、シリカゲルと蛋白質との吸着を著しく低減することができる。そして、これを用いてＳＥＣによる蛋白質の分離・分析を行うと、前述したような溶質（蛋白質）分子とカラム充填剤との間に相互作用の無い理想的な系へと近づけることができ、より高い精度で蛋白質の分離・分析を行うことが可能となるのである。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について更に詳しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
▲１▼ＳＥＣ用カラム充填剤の製造
市販のシリカゲル（洞海化学製、粒径５μｍ、細孔径３０ｎｍ）５ｇを、０．０６ｍｏｌ Ｎ-(３-トリエトキシシリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）０．０１Ｍ酢酸水溶液５０ｍｌ中に浸漬し、室温にて１昼夜反応させた。
▲２▼ＳＥＣ用カラムの作製
▲１▼により得られたカラム充填剤を、溶媒として水を用い、スラリー充填法により、内径２ｍｍ、長さ３００ｍｍのステンレス管に充填し、ＳＥＣ用カラムを作成した。
【００１９】
▲３▼ＳＥＣによる蛋白質分離能試験
▲１▼、▲２▼により作製したＳＥＣ用カラムを用い、ブルーデキストラン（分子量２００万）、アルブミン（分子量６６０００）、カルボアンヒドロゲナーゼ（分子量２９０００）、インシュリン（分子量７０００）の４種の蛋白質試料について、それぞれの分離能について調べた。尚、移動相には0.1M Tris-buffer(pH6.95)-0.15M Na2SO4を流量０．１μl/minで送液し、検出は２７８ｎｍにおける吸光度の測定により行った。また、試料注入量は、３、５、１０μｌのそれぞれで行った。
【００２０】
上記試験の結果を表１〜３に示す。また、各種蛋白質試料におけるクロマトグラム（試料注入量３μｌ）を図４〜７に示す。
【表１】
0003949987.tif 000003
【００２１】
【表２】
0003949987.tif 000004
【００２２】
【表３】
0003949987.tif 000005
【００２３】
上記表１〜３より、いずれの蛋白質試料においても、保持時間の測定結果にばらつきが少なく、優れた再現性が得られた。また、３、５、１０μｌの各試料注入量の間においても、得られた測定結果にばらつきは少なかった。また、図４〜７より、いずれの蛋白質試料においてもシャープな溶出ピークが検出された。これらのことから、本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤が、蛋白質試料に対して優れた分離能を有することが示された。
【００２４】
つづいて、上記表１〜３の試験結果（保持時間の測定結果）から、ブルーデキストラン（排除限界分子量に相当）の保持容量をＶ０、他の各蛋白質試料の保持容量をＶＲとして、各蛋白質試料の保持容量比ＶＲ／Ｖ０を求め、各蛋白質試料の既知の分子量対数とともにプロットし、分子量対数−保持容量比プロットを得た。この結果を図８〜１０に示す。
【００２５】
図８〜１０より、分子量対数−保持容量比プロットは、いずれも非常に優れた直線性を示した。前述したように、カラム充填剤と溶質分子との吸着が生じていない系では分子量対数−保持容量比プロットは理論的に直線となるため、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤では、シリカゲルと蛋白質との吸着が殆ど生じていないものであると考えられる。このことから、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤を用いることにより、ＳＥＣにおいて蛋白質の分離・分析を高い精度で行うことが可能となることが示された。
【００２６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のＳＥＣ用カラム充填剤は、シリカゲル表面上にＮ-(３-トリエトキシシリルプロピル)グルコン酸アミド（ＴＥＰＧ）を結合させることにより、シリカゲルと蛋白質との吸着を低減することができ、ＳＥＣにおいて蛋白質の分離・分析を高い精度で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤の構造図である。
【図２】  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の原理の説明図である。
【図３】  分子量対数−保持容量校正曲線及び溶出量検出曲線のそれぞれの相互関係を示した説明図である。
【図４】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるブルーデキストランのクロマトグラムである。
【図５】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるアルブミンのクロマトグラムである。
【図６】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるカルボアンヒドロゲナーゼのクロマトグラムである。
【図７】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量３μｌの条件での実施例におけるインシュリンのクロマトグラムである。
【図８】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量３μｌの条件での実施例における分子量対数−保持容量比プロットである。
【図９】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量５μｌの条件での実施例における分子量対数−保持容量比プロットである。
【図１０】  本発明にかかるＳＥＣ用カラム充填剤を用いた、試料注入量１０μｌの条件での実施例における分子量対数−保持容量比プロットである。
【符号の説明】
１０  カラム充填剤粒子
１２  溶質分子ａ
１４  溶質分子ｂ
１６  溶質分子ｃ
【図１】
0003949987.tif 000007
【図２】
0003949987.tif 000008
【図３】
0003949987.tif 000009
【図４】
0003949987.tif 000010
【図５】
0003949987.tif 000011
【図６】
0003949987.tif 000012
【図７】
0003949987.tif 000013
【図８】
0003949987.tif 000014
【図９】
0003949987.tif 000015
【図１０】
0003949987.tif 000016