(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分子をエレクトロスプレーイオン化してアナライザーに導く構成の質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ）のイオン源における試料導入用のカラムであって、次の（１）〜（３）の構成を備えるマイクロスプレーカラム。
（１）カラムの先端開口部内口径が０．５μｍ以下であること。
（２）カラム充填剤の粒径が０．５μｍより大きく５μｍ以下であること。
（３）フリットレスであること。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロスプレーカラムから噴霧された液滴中の試料分子をイオン化する構成のイオン源を備えることを特徴とする質量分析計。
【請求項３】
請求項１記載のマイクロスプレーカラムによってナノフローエレクトロスプレーを行うことを特徴とする質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析に係わる改良技術に関する。詳細には、試料分子をエレクトロスプレーイオン化して導入する構成の質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ）及び質量分析方法の改良技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
質量分析計（以下、「ＭＳ」（ｍａｓｓ  ａｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）と称する。）は、大別すると、試料のイオン化を行うための「イオン源」と、イオンを質量／電荷の比であるｍ／ｚｅ（ｍ：質量、ｚ：電荷数、ｅ：単位電荷）に従って分離するための「アナライザー」と、及び分離されたイオンの「検出・記録部」と、から構成されている。
【０００３】
そして、ＭＳのアナライザーに対して試料分子をイオン化して導入する方法の一つとして、一般に「ＥＳＩ」（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎの略）とも称される、エレクトロスプレーイオン化技術が知られている。
【０００４】
このエレクトロスプレーイオン化技術は、酸などにより溶液中でイオン状態とされた試料分子に高電圧をかけてスプレーして、多プロトン化分子に溶媒分子が多数会合しているミクロンオーダーの液滴（ミスト）を形成し、窒素などを吹き付けて溶媒を乾燥除去させて試料分子をイオン化した後、これを前記アナライザーに導く技術である。この技術は、生成するイオンの電荷数が多くなるので、ペプチドやタンパク質の測定に特に有用であるとされている。
【０００５】
ここで、ＭＳの前記イオン源における試料分子のエレクトロスプレーイオン化は、一般に微小口径の開口部を備える細長い石英ガラス製のカラムから試料分子を少量ずつ吐出して霧吹き（スプレー）することによって行われている。このカラムを、以下「マイクロスプレーカラム」と称することにする。
【０００６】
図２は、従来のエレクトロスプレーイオン化技術の構成を簡略化して表す図である。符号１０は、従来の典型的なマイクロスプレーカラムを表している。この先端が尖頭形を備えるように形成されたマイクロスプレーカラム１０には、粒径５０μｍ程度の化学結合型シリカゲル等の充填剤１０ａが多数充填され、該カラム１０の先端部内口径ｄはせいぜい１０〜１５μｍ程度に形成されている。そして、マイクロスプレーカラム１０の最先端部には、フリットとも称されるビーズ吐出防止用の大粒径ビーズ１０ｂが装填されている。
【０００７】
このマイクロスプレーカラム１０は、質量分析計１１のイオン源の構成部材であり、高電圧が負荷されるプレカラム１２の前方に延出するように取り付けられる。マイクロスプレーカラム１０の先端部からは、質量分析計１１のアナライザー１３に向かって、試料分子を含む微細な液滴１４を噴霧する構成となっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のマイクロスプレーカラムにおいては、該カラムの充填剤の粒径が大きいため（一般に、５０μ程度）、クロマトの分離効率が悪かった。
【０００９】
また、充填剤の粒径が大きいことに併せて、前記マイクロスプレーカラムの先端開口部の内口径が大きかったことから、試料の吐出量が多くなり、スプレーによって形成される帯電液滴の粒径も大きかった。この結果、溶媒が乾燥蒸発される過程において、該溶媒に荷電していた電子の試料分子への移行効率が悪かった。即ち、試料分子のイオン化効率が悪かった。
【００１０】
更には、前記マイクロスプレーカラムの先端開口部近傍部の充填剤の未充填領域が多い構成であるため、試料の吐出量が多く、スプレーによって形成される帯電液滴の粒径も大きかった。
【００１１】
そこで、本発明は、イオン化効率を向上させることができるマイクロスプレーカラム及びこのマイクロスプレーカラムを用いた高感度の質量分析計及び質量分析方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記技術課題を解決するために、本発明では、以下の手段を採用する。
【００１３】
まず、本発明では、試料分子をエレクトロスプレーイオン化してアナライザーに導く構成の質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ）のイオン源に試料を導入するためのマイクロスプレーカラムを、（１）カラムの先端開口部内口径を０．５μｍ以下とし、（２）前記カラムの充填剤の粒径を０．５μｍより大きく５μｍ以下とし、（３）フリットレスとした。ここで、「フリット」とは、カラム先端に装填されるビーズ塞き止め用の大径ビーズその他の部材を意味し、「フリットレス」とは、このフリットを用いず、カラムに対して充填剤のみを充填した構成であることを意味する。
【００１４】
この手段では、従来では発想し得ない程度に、充填剤の粒径が極小径であることに併せて、マイクロスプレーカラムの先端開口部の内口径を小さくしたので、試料溶液の単位時間当たりの吐出量を従来に比して大幅に少なくすることができる。このため、スプレーによって形成される帯電液滴の粒径を微細化することができる。この結果、溶媒に荷電していた電子の試料分子への移行効率が大幅に向上し、試料分子のイオン化効率を高めることが可能となる。
【００１５】
なお、マイクロスプレーカラムの先端部はできるだけ先細りの形状が望ましく、先端部にはできるだけ面積が無い形態が望ましい。これは、先端部の面積が大きいと、カラムから吐出される溶液がカラム先端部に付着したまま大きな液滴を形成してしまう現象が起こり、液滴の微細化を妨げてしまうからである。
【００１６】
カラムの先端開口部内口径に関しては、０．１μｍ以上であることが望ましい。これは、先端開口部内口径が０．１μｍ未満であると、溶液を吐出するのに高圧力が必要になってしまうからである。
【００１７】
また、本発明では、前記マイクロスプレーカラムから噴霧された帯電液滴中に含まれる試料分子をイオン化するように構成されたイオン源を備えることを特徴とする質量分析計、並びに前記マイクロスプレーカラムによってナノフローエレクトロスプレーを行うことを特徴とする質量分析方法を提供する。ここで、「ナノフローエレクトロスプレー」とは、ナノリッター（ｎＬ／ｍｉｎ）レベルの流量で送液されてくる試料分子を含む溶液を安定してエレクトロスプレーイオン化し、質量分析計のアナライザーに導くことができる技術を意味する。
【００１８】
この手段では、イオン化効率に優れ、検出感度の高い質量分析計並びに質量分析方法を提供することができる。
【００１９】
以上から、本発明は、マイクロスプレーカラムから噴霧される帯電液滴を微細化することによって、試料分子のイオン化効率が向上し、ナノフローエレクトロスプレーを確実に行うことができる。とりわけこの技術では、生成するイオンの電荷数が多くなるので、ペプチドやタンパク質の高分子量化合物の高感度測定が可能になるという技術的意義を有している。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の好適な実施形態について、添付図面に基づいて説明する。
【００２１】
図１は、本発明に係るマイクロスプレーカラムの先端部付近を拡大して示す図である。図１中の符号１は、細長で内部空洞の円筒形状を備える石英ガラス製のマイクロスプレーカラム（以下、単に「カラム」と称する。）を表している。このカラム１は、試料分子をエレクトロスプレーイオン化してアナライザーに導くように構成された質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ）のイオン源を構成する試料導入用のカラムとして機能する。
【００２２】
図１に示すように、カラム１の先端部１ａは、徐々に先細る尖頭形状を備え、その最先端部には試料溶液を吐出して、図示しない質量分析計のアナライザーに向けて噴霧するために、所定口径の先端開口部１ｂが設けられている。
【００２３】
また、カラム１内部には、試料を分離する際の吸着剤として機能する充填剤２が均密に充填されており、先端開口部１ｂには、フリットが装填されていない構成となっている。即ち、本発明に係るカラム１はフリットレスのカラムである。
【００２４】
ここで、本発明では、カラム１の先端開口部１ｂの内口径Ｄ１は、０．５μｍ以下、好適には０．１μｍ以上０．５μｍ以下に形成し、前記充填剤２の粒径Ｄ２を０．５μｍより大きく、かつ５μｍ以下とする。
【００２５】
先端開口部１ｂの内口径Ｄ１を０．５μｍ以下（Ｄ１≦０．５μｍ）としたのは、カラム１により分離されて該先端開口部１ｂから噴霧される試料分子を含む帯電液滴を充分に小さくして、試料分子のイオン化効率を確実に高めることができるからである。具体的には、先端開口部１ｂの内口径Ｄ１を０．５μｍ以下とすることによって、質量分析計においてペプチドやタンパク質等の高分子量化合物の高感度測定を実現できる程度に、試料分子のイオンの電荷数を多く生成させることができるからである。
【００２６】
また、充填剤２の粒径Ｄ２を０．５μｍよりも大きくし、５μｍ以下（０．５μｍ＜Ｄ２≦５μｍ）とした理由は、内口径０．５μｍ以下の先端開口部１ｂから充填剤２が吐出してしまわないようにするために、前記先端開口部１ｂの内口径Ｄ１よりも充填剤粒径Ｄ２を大きくする（Ｄ１＜Ｄ２）一方、充填剤２の粒子径Ｄ２を５μｍ以下と小さくすることによって、充填剤２全体の表面積総計を大きくし、高度のクロマト分離を達成するためである。
【００２７】
また、充填剤２の粒子径Ｄ２を５μｍ以下としたことによって、ナノフローレベルの少容量の溶出液で、短時間に結果を得ることができる。なお、充填剤２としては、化学結合型シリカゲル（例えば、吸着力の大きいＣ１８等）を用いることができる。
【００２８】
ここで、図３は、従来のマイクロスプレーカラムを使用した時の質量分析計のクロマトグラフ（Ａ）と本発明に係るマイクロスプレーカラムを使用したときの質量分析計のクロマトグラフ（Ｂ）の状態を対比するための概念図である。
【００２９】
この図３に示すように、本発明に係るマイクロスプレーカラムでは、質量分析計のクロマトグラフのピークがシャープである。より具体的には、ピーク立ち上がりのリーディングやピーク後半のテーリングがなく、検出限界を超えるシャープなピークが得られる傾向が顕著に現れる。質量分析計の感度は濃度依存的であるので、ピーク高が高いほどシグナル強度が上がる。従って、本発明に係るマイクロスプレーカラムを用いることにより、質量分析計の感度、分解能が高くなり、アミノ酸配列の解読率（シークエンスカバレッジ）も飛躍的に向上させることが可能となる。
【００３０】
【実施例】
５０フェントモル（ｆｅｍｔｏ  ｍｏｌｅ）以下量の人血清アルブミン（分子量６５，０００〜７０，０００）のトリプシン酵素の消化産物を含む溶液を本発明に係るマイクロスプレーカラムから噴霧した。なお、カラムの先端口径は０．５μｍ以下、フリットレス、充填剤の粒径は１．０μｍの条件で行った。
【００３１】
本実施例によって得られた質量分析計のクロマトグラフを図４に示す。図３の概念図で示すように、実際の実験結果でも、リーディングやテーリングのないシャープなピークが得られるので、アミノ酸配列の解読を飛躍的に高めることができた。
【００３２】
図５は、前記消化産物の全アミノ酸配列表（６０９アミノ酸）を示している。本実施例では、この図５の四角囲いされた３６アミノ酸部分を除く領域の５７３アミノ酸配列を解読できた。解読率は、９４％（５７３÷６０９）と非常に高かった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明に係るマイクロスプレーカラムによれば、充填剤の粒径が極小径であることに併せて、マイクロスプレーカラムの先端開口部の内口径を所定口径以下としたので、試料溶液の単位時間当たりの吐出量を従来に比して大幅に少なくすることができ、スプレーによって形成される帯電液滴の粒径を微細化することができる。この結果、溶媒に荷電していた電子の試料分子への移行効率が大幅に向上し、試料分子のイオン化効率を高めることができる。
【００３４】
また、本発明では、前記マイクロスプレーカラムから噴霧された帯電液滴中に含まれる試料分子をイオン化するように構成されたイオン源を備えることを特徴とし、イオン化効率に優れ、検出感度の高い質量分析計を提供することができる。
【００３５】
そして、本発明では、前記マイクロスプレーカラムによってナノフローエレクトロスプレー又はナノＬＣグラジエント分析を確実に行うことができる質量分析方法を提供することができるので、ペプチドやタンパク質の高分子量化合物の高感度測定を確実に行うことができ、ペプチドやタンパク質のアミノ酸解読率を飛躍的向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るマイクロスプレーカラムの先端部付近を拡大して示す図
【図２】従来のエレクトロスプレーイオン化技術の構成を簡略化して表す図
【図３】（Ａ）従来のマイクロスプレーカラムを使用した時の質量分析計のクロマトグラフの概念図
（Ｂ）本発明に係るマイクロスプレーカラムを使用したときの質量分析計のクロマトグラフの概念図
【図４】実施例によって得られた質量分析計のクロマトグラフ
【図５】人血清アルブミンのトリプシン酵素の消化産物の全アミノ酸配列表（６０９アミノ酸）
【符号の説明】
１  マイクロスプレーカラム（カラム）
１ａ  先端部
１ｂ  先端開口部
２  充填剤
Ｄ１  （先端開口部１ｂの）内口径
Ｄ２  （充填剤２の）粒径
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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