(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース還元末端構造、を持ち
0004001625.tif 000016
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリル化された７糖反復単位からなり、
0004001625.tif 000017
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
0004001625.tif 000018
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１−で表わされる２糖である）］で表される断片を生産するために、グループＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）ＩＩ型およびＩＩＩ型多糖類を脱重合する方法であって、
該方法は、脱重合されるＧＢＳ ＩＩ型またはＧＢＳ ＩＩＩ型多糖を提供し、水層中の多糖を塩基と反応させて部分的に脱Ｎ−アセチル化された多糖産物を生産し、脱Ｎ−アセチル化された多糖産物をニトロソ化試薬で脱重合してＧＢＳ ＩＩ型またはＧＢＳ ＩＩＩ型断片を形成し、次いで、この断片を回収する方法。
【請求項２】
塩基を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよびヒドラゾンのグループから選ぶ、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
ニトロソ化試薬が、亜硝酸ナトリウムあるいは硝酸である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
塩基が水酸化ナトリウムであり、ニトロソ化試薬が亜硝酸ナトリウムである、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
多糖がＧＢＳ  ＩＩ型細菌から得られる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
得られたＧＢＳ  ＩＩ型断片が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの分子量を持つ、請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
多糖がＧＢＳ  ＩＩＩ型細菌から得られる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項８】
得られた断片が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの分子量を持つ、請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
請求の範囲第１項にしたがって調製される、ＧＢＳ  ＩＩ型またはＧＢＳＩＩＩ型多糖断片。
【請求項１０】
脱Ｎ−アセチル化するための塩基が水酸化ナトリウムであり、ニトロソ化試薬が亜硝酸ナトリウムである、請求の範囲第９項にしたがって調製される、ＧＢＳ  ＩＩ型またはＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖断片。
【請求項１１】
次の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース還元末端構造を持ち、
0004001625.tif 000019
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリル化された７糖反復単位からなり、
0004001625.tif 000020
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
0004001625.tif 000021
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１−で表わされる２糖である）］で表されるＧＢＳ ＩＩ型およびＧＢＳＩＩＩ型多糖類断片。
【請求項１２】
分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲を持つ、請求の範囲第１１項に記載のＧＢＳ  ＩＩ型多糖断片。
【請求項１３】
分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲を持つ、請求の範囲第１１項に記載のＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖断片。
【請求項１４】
ＧＢＳ  ＩＩ型およびＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖断片から選ばれた、少なくとも一つの多糖断片からなり、また該断片がタンパク質に共有結合し、複合分子が次の構造式
0004001625.tif 000022
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリル化された７糖反復単位からなり、
0004001625.tif 000023
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
0004001625.tif 000024
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１−で表わされる２糖である）］で表される複合分子。
【請求項１５】
タンパク質が細菌由来である、請求の範囲第１４項に記載の複合分子。
【請求項１６】
タンパク質が、破傷風類毒素、ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み換え型クラス３外膜タンパク質から選ばれた細菌由来である、請求の範囲第１５項に記載の複合分子。
【請求項１７】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩ型多糖であり、タンパク質が破傷風類毒素であり、多糖断片の分子量が約５ｋＤａから５０ｋＤａである、請求の範囲第１６項に記載の複合分子。
【請求項１８】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖であり、タンパク質が破傷風類毒素であり、多糖断片の分子量が約５ｋＤａから５０ｋＤａである、請求の範囲第１６項に記載の複合分子。
【請求項１９】
タンパク質に対する多糖のモル比が約１から１０である、請求の範囲第１６項に記載の複合分子。
【請求項２０】
タンパク質に対する多糖のモル比が約３から１０である、請求の範囲第１９項に記載の複合分子。
【請求項２１】
ＧＢＳ  ＩＩ型およびＧＢＳ  ＩＩＩ型断片からなる、請求の範囲第１４項に記載の複合分子。
【請求項２２】
タンパク質が、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質である、請求の範囲第２１項に記載の複合分子。
【請求項２３】
複合分子が次の構造式
0004001625.tif 000025
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリル化された７糖反復単位からなり、
0004001625.tif 000026
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
0004001625.tif 000027
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１−で表わされる２糖である）］で表される、タンパク質に共有結合したグループＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）ＩＩ型およびＩＩＩ型多糖断片からなる、複合分子を含むワクチン組成物。
【請求項２４】
断片がＧＢＳ  ＩＩ型多糖であり、また多糖断片の分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａである、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
断片がＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖であり、また多糖断片の分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａである、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
タンパク質が、破傷風類毒素、ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み換え型クラス３外膜タンパク質から選ばれた細菌由来である、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
タンパク質が、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み換え型クラス３外膜タンパク質である、請求の範囲第２６項に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
ＧＢＳ  ＩＩ型およびＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖断片との複合物からなる、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
請求の範囲第１４項の複合物によって免疫された非ヒト哺乳動物によって産生される抗体を含む免疫血清。
【請求項３０】
請求の範囲第１４項の複合物によって免疫された非ヒト哺乳動物によって産生される抗体。
【請求項３１】
複合物の多糖類がＧＢＳ  ＩＩ型多糖の断片である、請求の範囲第３０項に記載の抗体。
【請求項３２】
複合物の多糖類がＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖の断片である、請求の範囲第３０項に記載の抗体。
【請求項３３】
哺乳類に免疫に化する量の請求の範囲第２３項のワクチンを投与することからなる、ヒトを除く哺乳類をＧＢＳ  ＩＩ型またはＧＢＳ  ＩＩＩ型感染に対して免疫する方法。
【請求項３４】
請求の範囲第１項にしたがって調製した多糖断片を固形支持体に固定化し、該固形支持体を、ＧＢＳ  ＩＩ型抗体またはＧＢＳ  ＩＩＩ型抗体が多糖断片に結合できる様な条件下で血清に結合した多糖と組み合わせ、また残った血清を固形支持体から分離することからなる、ＧＢＳ  ＩＩ型抗体またはＧＢＳ  ＩＩＩ型抗体を血清から分離する方法。
【請求項３５】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩ型である、請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３６】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩＩ型である、請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３７】
多糖断片が固形支持体に固定化される、請求の範囲第１項の方法にしたがって調製された、ＧＢＳ  ＩＩ型多糖断片またはＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖断片からなる、免疫アッセイ試薬。
【請求項３８】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩ型である、請求の範囲第３７項に記載の免疫アッセイ試薬。
【請求項３９】
多糖断片がＧＢＳ  ＩＩＩ型である、請求の範囲第３７項に記載の免疫アッセイ試薬。
【請求項４０】
請求の範囲２３項のワクチンと医薬的に許容される担体とから成る医薬組成物。
【請求項４１】
請求の範囲２３項のワクチンと医薬的に許容される担体とから成るＧＢＳＩＩ型またはＧＢＳ  ＩＩＩ型感染症の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
［発明の分野］
本発明は、抵抗性抗体を誘導する免疫原を生ずる、タンパク質に複合させるために有用な、抗原性莢膜多糖断片に関連するものである。さらに詳細には、本発明は分析可能な還元末端基を持つ、グループB連鎖球菌莢膜多糖類（GBS CR）と、その調製法、ならびに複合ワクチンへのその利用に関連している。
［発明の背景］
GBS細菌は、細菌および／または幼児における髄膜炎および成人における感染に対する、認められた病因学的な作因である。ベーカー（Baker）、「グループB連鎖球菌感染（Group B Streptococcal Infections）」、Advances in Internal Medicine, 25: 475-500（1980）。これによると、GBSの診断には、迅速かつ決定的なアッセイ法およびGBSに対する抵抗性を生ずる方法を開発することが、特に幼児と危険状態にある個体において重要である。
GBS細菌由来の莢膜多糖類は、GBSの毒性および抵抗性免疫の発生に重要であることが知られている。カスパー（Kasper）ら、米国特許第5,302,386号明細書を参照のこと。さらに、認められているGBS型（I-V）のCPは、化学的には近縁だが抗原性は異なり、ガラクトース、グルコース、N-アセチルグルコサミンおよびN-アセチル-ノイラミン（サリチル）酸からなる反復構造を持っている。
幼児および若年の子供は、多糖類抗原に対して弱い免疫応答しか持たない。これらの応答は、T細胞非依存的であることが知られ、したがって、引き続く感染に対して、長期的な免疫的抵抗性を与えるために必要な、記憶、インタイプ変換または親和性成熟などの重要な特性には関与しない。こうした多糖類に対する、幼児および若年の子供における有効な免疫応答の欠如をうまくやり過ごすために、多糖類の細胞性抗原を担体タンパク質に共有結合させ、複合分子を作ることによって、T細胞非依存的応答を、T細胞依存的応答へ転換する方法が開発されてきた。
タンパク質に莢膜多糖類を複合化するために、さまざまな方法が当業において述べられてきた。概説としては、本明細書に参考文献として取り入れられている、Contributions to Microbiology and Immunology、第１０巻、Conjugate Vaccine、J.M.クルーズ（Cruse）とR.E.ルイスジュニア（Lewis, Jr.）編、1989を参照のこと。一つの方法では、共有結合を形成するためタンパク質と反応可能な還元末端基を生むために、多糖類は弱い酸加水分解を受ける。アンダーソン（Anderson）P.A.、Infect. Immun. 39: 233-238（1983）。しかし、タンパク質との複合化に関わる末端糖グループは、ヘミアセタールとアルデヒドの平衡状態で存在し、したがってタンパク質と低い効率でしか結合しない。末端還元糖類の低い反応性を克服するため、当業はタンパク質との複合化に使う多糖類の末端位に、安定なアルデヒト基を導入する弱い酸化処理を行う方向へ転じた。ジェニングスら、米国特許第4,356,170号明細書、前出。
カスパー（Kasper）ら、米国特許第5,302,386号明細書および国際特許第WO 94/06467号明細書は、それぞれGBSIII型とGBSII型複合ワクチンに関連しており、そのいずれも本明細書の参考文献に取り入れられている。第5,302,386号明細書によると、タンパク質への複合化に適した産物を生産するための、多糖骨格を開裂するために、エンド-b-ガラクトシダーゼが使われる。架橋された複合物を作るための、少なくとも２つの末端サリチル酸残基の酸化は、第WO 94/06467号明細書に記載されている。
III型GBS莢膜多糖類は、反復した分枝五糖単位の骨格からなっている。（ジェニングスら、Canadian J. Biochem., 58: 112-120（1980））。III型GBS莢膜多糖類に関する研究は、天然の免疫決定因子部位が、側鎖-骨格連結部にあることを報告している。（ジェニングスら、Biochemistry, 20: 4511-4518（1980））。その報告によると、側鎖の末端にN-アセチル-ノイラミン酸残基が存在することが、免疫決定因子の発現に重要である。
これまでのGBS II型またはIII型多糖類を脱重合する方法は、高価な酵素法あるいは不安定な末端サリチル酸基が除かれるために、CPの抗原性を変えるかもしれない酸加水分解に依存するものである。したがって、CP-タンパク質複合ワクチンを生産するために有用な、断片を生ずるような方法で、GBS II型およびIII型CPを脱重合するために有効な、比較的安価で穏やかな化学的方法が必要とされている。
［発明の要約］
本発明は、グループB連鎖球菌II型（GPS-II）およびIII型（GBS-III）莢膜多糖類（CP）を、2,5-アンヒドロ-D-マンソース構造を末端に持つ産物を生成するために、脱アミ開裂によって脱重合する方法に関連するものである。本発明によると、GPS-II CPおよびGBS-III CPを水酸化ナトリウム、および亜硝酸ナトリウムなどのニトロソ化試薬によって処理して、多糖骨格の端に末端アルデヒド基を持つ断片を生産するために、GBS多糖類を脱重合化する。その結果生ずるCP断片は抗原性を持ち、またタンパク質に結合して、新生児を含む哺乳類における、抵抗性免疫応答を誘導するのに有効な免疫原を生産するために有用でもある。
したがって、本発明の他の態様は、ワクチンとして使うための複合分子を作る方法である。この方法は、GBS-IIまたはGBS-III CPを、2,5-アンヒドロ-D-マンノース残基を末端に持つ断片を作るための、塩基およびジアゾニウム塩を形成する試薬による治療に用いることからなる。次に、2,5-アンヒドロ-D-マンノース末端を持つ断片を、タンパク質と組み合わせ、本発明の複合分子を形成するために、還元的アミノ化を行う。したがって、本発明のもう一つの態様は、末端2,5-アンヒドロ-D-マンノースを介してタンパク質に連結した、GBS-IIまたはGBS-III CP断片からなる、GBS-IIおよびGBS-III CP複合分子である。GBS II型およびGBS III型多糖類を脱重合化する過程が、骨格の末端位に単一の反応部位をもつ断片を生ずるため、本発明は第二アミンによって末端還元糖を介し、それぞれのGBS II型およびGBS III型多糖鎖が単一のタンパク質に結合する、複合分子を作り出す方法を提供する。
本発明の複合物は、GBS-IIおよびGBS-III細菌感染に対して個人を免疫するための、活性をもつワクチンとして有用である。また本発明は、異なる血清型または細菌種由来の多糖類からなる、多価ワクチンを提供する。
それに加え、本発明は、本発明の複合分子による免疫に応答して生じ、またGBS II型およびGBS III型細菌の存在を検出するための試薬として有用であるか、または能動的な免疫を与えるためのワクチンとして有用な免疫血清または抗体を含む。本発明のもう一つの態様は、GBS II型またはGBS III型抗体を、分離および／または検出するために有用な方法および組成物である。本態様を実施する一つの方法によると、本発明にしたがって調製された多糖類断片は、固形支持体に固定される。血清などの抗体の材料と固形支持体に結合した多糖類断片を組み合わせることにより、多糖類断片に結合した抗体は、標準的な免疫アッセイ法によって検出するか、または出発材料あるいは血清から分離してもよい。
本発明の目的は、複合分子の作製に有用な断片を生産するために、GBSII型およびGBSIII型多糖類を断片化する方法を提供するものである。本発明のもう一つの目的は、感染に対して抵抗するためのワクチンおよび免疫剤として有用な、GBSII型およびGBSIII型多糖類を生産することである。
【図面の簡単な説明】
第１図は天然のII型多糖（200キロダルトン）破傷風菌毒素複合物への結合を100%結合対照として比較した、ウサギ抗II型特異的多糖抗体の、（平均分子量15、33および51キロダルトンの断片を持つ）II型断片多糖破傷風菌毒素複合物への直接的結合。
第２図は天然のIII型多糖（90キロダルトン）破傷風菌毒素複合物への結合を100%結合対照として比較した、ウサギ抗III型特異的多糖抗体の、（平均分子量13、18、26、34および48キロダルトンの断片を持つ）III型断片多糖破傷風菌毒素複合物への直接的結合。
第３図は約200キロダルトンの分子量を持つ、天然のGBS II型多糖のH-NMRスペクトル。
第４図は約12キロダルトンの分子量を持ち、本発明の方法によって調製した2,5-アンヒドロ-D-マンノースに関連する水素ピークを示す、GBS II型多糖断片のH-NMRスペクトル。
第５図は約100キロダルトンの分子量を持つ、天然のGBS III型多糖のH-NMRスペクトル。
第６図は約9キロダルトンの分子量を持ち、本発明の方法によって調製した2,5-アンヒドロ-D-マンノースに関連する水素ピークを示す、GBS III型多糖断片のH-NMRスペクトル。
［発明の詳細な説明］
本発明は、次の2,5-アンヒドロ-D-マンノース還元末端構造：
0004001625.tif 000002
を持ち、ここでR１は水素であり、R２はシアリル化された次の化学式
0004001625.tif 000003
をもつ七糖反復単位であり、この化学式で、nはGBSII型については約5から約50であり、R1は、シアリル化された次の化学式
0004001625.tif 000004
をもつ五糖反復単位であり、この化学式で、nは約5から約50であり、R2はGBSIII型については二糖αNeuAc（2-3）β-D-Galp1-であるところの、グループB連鎖球菌II型およびIII型抗原性多糖-断片に関連するものである。
本発明に従い、次に示す構造：
0004001625.tif 000005
を持ち、この化学式では天然の多糖については、nは約200であるか；あるいはGBS III型
0004001625.tif 000006
については反復単位であり、ここで天然の多糖については、nは約100である構造を持つ、より大きな分子量のGBS II型およびGBS III型多糖類を脱重合することによって、３つの断片が生産される。
本明細書で用いられるように、グループB連鎖球菌または（GBS）細菌という用語は、特に分類学的に連鎖球菌アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）と呼ばれる細菌を含むために、特にランスフィールド（Lancefield）、J. Exp. Med., 108: 329-341（1938）および、それに続いてグループB血清型についてさらに特徴づけを行った研究、たとえば、ラッセル-ジョーンズ（Russell-Jones）、J. Exper. Med., 160: 1476（1984）に参照される、当業者によって理解されるものと同じ意味を持つ。
本発明の新規な断片を生産する、GBS II型およびGBS III型莢膜多糖を断片化するための本発明の方法は、化学的脱重合反応に由来する、GBS II型およびGBSIII型多糖断片を得るための、穏やかな非変成条件を用いる。これらの断片は高収率で得られるかもしれないため、この方法はワクチンの大規模生産を経済的にするかもしれない。
GBS II型およびGBS III型CPは、本発明の方法に従い、次のようにして脱重合した。II型およびIII型GBS CP（式I）における、骨格の2-デオキシ-2N-アセトアミド-β-D-グルコピラノシル基は、穏やかな塩基によって水溶液中で、部分的に脱N-アセチル化される。本発明の方法において用いるのに適した塩基の例として、水層のアルカリ金属水酸化溶液、たとえば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、あるいはアンモニア水、ヒドラジン、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムを含むが、しかしこれに限定されるわけではない。塩基処理に続いて、得られたグルコサミン残基（式II）は、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸などの適当な試薬を用い、たとえば不安定なN-ニトロソ誘導体（式III）を形成するためにニトロソ化を受けられる。２番炭素原子上の酸素環による求核攻撃のための再配列は、環の縮小と隣接するグリコシド結合の開裂を引き起こす（式IV）。この反応は、ヘパリンや種々のグリコサミノグリカンの構造解析に用いられてきた。本明細書に取り入れられている、バーネット（Barnett）、米国特許第4,438,261号明細書を参照のこと。
0004001625.tif 000007
多糖断片の還元末端に形成された、得られた2,5-アンヒドロ-D-マンノース（式IV）残基中のアルデヒド基は、それ以上の化学的操作（たとえばスペーサー・アームを使うこと）を加えずに、還元的アミノ化を介してポリマー、好ましくはタンパク質を含むアミノ基に結合させるために直接利用可能である。
より詳細には、本発明にしたがってGBS多糖類を脱重合するために、この反応は簡便な大きさの容器内で、水溶液中において行われる。反応を開始するには、水溶液中の適量の多糖類を、骨絡グルコピラノシル残基を部分的に脱N-アセチル化するために、塩基で処理する。簡単に述べると、塩基性の水層中で、温度を高めた中で、たとえば約５０℃から１１０℃において、またpHに約１３から１４において反応を行う。塩基の量は経験から最適化する。好ましくは、塩基とN-アセチル基の比率は約１０から５０meqの間である。さらに好ましくは、この比率は２０から２５meqの間である。反応の速度と到達度は、塩基の濃度、または反応温度、または反応時間を調節することによって適正化してもよい。脱N-アセチル化の度合は'H-NMRによって監視してもよい。
５kDから60kDの間の断片を得るために、脱N-アセチル化の度合は、反応可能な部位の総量の約２０％から約２％にするべきである。脱アセチル化反応を停止するために、反応を冷却、すなわち氷中で冷却するか、あるいは約pH4.0に酸性化してもよい。酸性化は、残存するシアル酸残基の加水分解を避けるために、慎重に行わなければならない。
次に、アルデヒドを形成するためのニトロソ化反応は、亜硝酸ナトリウムまたは希硝酸などの他の適した試薬を、脱N-アセチル化した多糖類に添加することによって行う。亜硝酸ナトリウムなどのニトロソ化試薬は、脱N-アセチル化された残基のモル数に比べてモル過剰量加えることが好ましい。ニトロソ化試薬と多糖の反応は、低温、たとえば４℃で、撹拌しながら、約２時間または反応が完結するまで行う。反応の到達度は、アルデヒド基の存在についてアッセイすることによって監視してもよい。反応の全般を通して、アルデヒド基の濃度は、飽和状態に達するまで上昇するはずである。反応の終了は、反応液を希釈し、また水酸化ナトリウムなどの塩基性希釈剤によって、約７までpHを上げることで行ってもよい。余剰の試薬の除去は、標準的な方法を用いた透析によって行ってもよい。
反応終了後、骨格の端末部に末端アルデヒド基を持つ多糖断片は、標準的なクロマトグラフィー法を用いてサイズ分画し、収集してもよい。タンパク質への結合に好ましいサイズは、GBS II型多糖については5kDから50kDの間であり、GBS III型多糖については約5kDから50kDの間である。より好ましいサイズは、GBS II型については5kDから20kDの間であり、GBS III型については10kDから50kDの間である。サイズ分画した断片は、先に述べた標準的な還元的アミノ化法（たとえば、米国特許第4,356,170号明細書および国際特許第WO94/06467号明細書を参照）による結合反応に用いてもよく、あるいは後の使用のために保存しておいてもよい。
GBS II型に適用された脱アミノ化による開裂および結合は、次の発明にしたがって行ってもよい：
0004001625.tif 000008
還元的アミノ化によって担体タンパク質に直接複合できる、抗原性III型断片を生ずる、脱アミノ開裂によるIII型多糖の脱重合過程は、次に描かれている：
0004001625.tif 000009
本発明の複合分子のタンパク質部分は、T細胞依存的応答を引き起こすために十分な長さの、生理的に許容されるどのようなタンパク質またはポリペプチドでもよい。そうしたタンパク質の例は、破傷風菌毒素または類毒素、およびCRM197のような交差反応物質、およびグループB連鎖球菌Ia/Ib型のB-C抗原の、組換え体非IgA結合タンパク質、および組換え体３型外膜タンパク質および髄膜炎菌（Neisseria Meningitides）由来の（OMP）を含む、細菌タンパク質またはポリペプチドからなるが、しかしそれに限定するものではない。
本発明の複合分子中のタンパク質に対する多糖のモル比は、タンパク質１モルあたり、約１モルから約１０モルの多糖が好ましい。より好ましくは、この比はタンパク質１モルあたり３から１０の多糖断片であるとよい。タンパク質／多糖比に関する変化は、結合反応中の出発組成の比を調整して行ってもよい。
GBS II型またはGBS III型多糖からなる複合分子を提供することに加え、本発明はまた異なる型の多糖類が単一のタンパク質に結合する多価複合物およびそのワクチンをも意図している。たとえば、GBS I型、II型、III型、IV型、あるいはV型多糖類と同様に、たとえばインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b型または髄膜炎菌A型、B型、またはC型などの、他の細菌由来の多糖類は、さまざまな組み合わせでタンパク質と結合してもよい。好ましい組み合わせは、GBS II型およびGBS III型の多糖類であろう。
本発明にしたがって調製した複合分子は、少なくとも一つのGBS II型またはGBS III型多糖断片が、多糖断片の骨格の末端に、単一の結合部位を介して結合するタンパク質を通常含んでいる。したがって、もし必要であれば、本発明はGBS II型またはGBS III型複合分子を生産する能力をもち、その場合、多糖構成成分は、一端を除いてはタンパク質によって覆われていない。GBS II型およびGBS III型多糖類を、分枝の末端シアル酸を介してタンパク質に結合させる他の方法は、タンパク質の大部分の部位において多糖類を架橋および結合する結果を招くかもしれない。本発明はまた、方法を組み合わせて用いることによって作られるかもしれない、複合分子を意図するものである。たとえば、本発明に従い、単一の反応性2,5-アンヒドロ-D-マンノース末端基を作ることによって合成された複合物は、さらに複数の部位で活性化された多糖類と反応させてもよい。
本発明にしたがってワクチンを調製する方法は、哺乳類において、特に子供を持つ年齢の女性、新生児、免疫不全の成人およびGBS感染の危険性のある子供において、GBS II型およびGBS III型感染に対する保護をあたえるために重要な、有用なワクチンを提供する。これらのワクチンは、誕生前の胎児における免疫応答を引き起こす方法として、妊娠中の女性に投与するために特に有用と予想される。
ワクチンは免疫応答を引き起こすのに充分量投与される。典型的な例として、そうした応答を引き起こすためには、約1から50ugの間の投与量が用いられる。投与量は、ワクチンを受ける個体のサイズ、体重、または年齢に基づいて調整してもよい。個体における抗体応答は抗体価あるいは細菌の活性をアッセイすることでモニターでき、もし必要であれば応答を増強するために追加投与を行うことができる。
ワクチンは、当業者に知られる、ワクチンに適した標準的な担体、緩衝剤あるいは保存料を含んでもよい。それに加え、免疫応答を増強するために、ミョウバンまたはステアリンチロシンなどのアジュバントを組成に含んでもよい。
本発明にしたがって調製した多糖断片はまた、GBS II型またはGBS III型抗体の免疫アッセイおよび分離に用いるための、種々の免疫試薬を調製するために有用である。たとえば免疫アッセイには、多糖断片は本発明の複合物における場合と同様に、固形支持体に直接、あるいはタンパク質リンカーを介して固定化してもよい。次にこの固形支持体は、GBS II型またはGBS III型細菌に対する抗体の存在を検出するために、ラジオイムノアッセイおよびELISAアッセイを含む、当業者に知られるさまざまな免疫アッセイ系に用いることができる。こうしたアッセイ法は、血清中のGBS II型またはGBS III型抗体の存在をアッセイすることによって、個体における感染の存在を診断するために使ってもよい。
分離化学における利用では、多糖断片は親和性カラムを調製するために、固形支持体に固定化してもよい。好ましい態様においては、多糖断片は初め本発明の方法にしたがってタンパク質に結合し、そして次に得られた複合物を支持体マトリックスに結合させる。タンパク質を親和性カラムに結合させる方法は、当業者に知られている。親和性カラムの一般的な支持体はアガロースから調製され、またそれらは市販されており、たとえば活性化セファロース（ファルマシア社）がある。次にこうした親和性カラムは、血清などの原料からGBS II型抗体またはGBS III型抗体を分離するために用いてもよい。GBS II型抗体またはGBS III型抗体をふくむと考えられる血清と、固定化した多糖断片を、抗体が固定化された断片に結合できるような条件の下で合わせることにより、血清から調製してもよい。結合した抗体は次に、従来のアッセイ技術を用いて検出してもよく、あるいは固定化された支持体から残存した血清成分を除いた後、多糖断片から分離および除去してもよい。
本発明は、次に示す非制限的な実施例を例として説明されるだろう。
［実施例］
実施例１：GBS II型およびGBS III型2,5-アンヒドロ-D-マンノースを末端に持つ断片を生産するための、塩基脱重合および亜硝酸ナトリウムによる環収縮
GBS II型
平均分子量約200,000の、天然GBS II型CP（75mg）を3mlの0.5N水酸化ナトリウムに溶解し、次にその溶液を３つに分けた（それぞれ1ml）。試料（S1-S3）を70℃でぞれぞれ60分、90分、および180分間熱し、次に氷水槽中で冷却した。各試料に125cmLの氷酢酸を加え、pHを４とした。200mcLの5%（w/v）NaNO2を添加した後、試料を４℃で２時間撹拌し続けた。次にS1-S3試料を、脱イオン水で5mlに希釈し、そのpHを0.5N水酸化ナトリウムで７とした。過剰な試薬は、ダイアフロー（Diaflo）限外ろ過膜（アミコンYM10）を用いて、脱イオン水に対して透析ろ過し、その溶液を凍結乾燥した。三種類のII型多糖類断片（II-1-II-3）が得られた。
GBS III型
平均分子量約100,000の、天然GBS III型CP（125mg）を5mlの0.5N水酸化ナトリウムに溶解し、次にその溶液を５つに分けた（それぞれ1ml）。試料（S1-S5）を70℃でぞれぞれ60分、90分、180分、および240分間熱し、次に氷水槽中で冷却した。各試料に125cmLの氷酢酸を加え、pHを４とした。200mcLの5%（w/v）NaNO2を添加した後、試料を４℃で３時間撹拌し続けた。次にS1-S5試料を、脱イオン水で5mlに希釈し、そのpHを0.5N水酸化ナトリウムで７とした。過剰な試薬は、ダイアフロー（Diaflo）限外ろ過膜（アミコンYM10）を用いて、脱イオン水に対して透析ろ過し、その溶液を凍結乾燥した。五種類のIII型多糖断片（III-1-III-5）が得られた。
CP断片のサイズ分画
それぞれの断片の平均分子量（avMw）はスーパーロース-12（Superose-12）サイズ排除カラム（ファルマシア社）を用いたHPLCによって、10,000から2,000ダルトンの平均分子量のデキストラン系列を用いて推定された。空隙率（Vｏ）および総容量（Vt）は、それぞれデキストラン2,000およびアジ化ナトリウムを用いて決定した。本法で決めたそれぞれの断片の平均分子量（avMw）は、次の通りである：
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多糖断片の物理化学的分析
その元となる天然の多糖と比べた、それぞれの断片の構造的保存性は、ブルーカー（Bruker）AM500分光計を用いた、500MHzにおける高解像度一次元H-NMR分光分析によって決定した。II型およびIII型断片と、それらの天然多糖のH-NMRスペクトルの比較から、化学処理の間に何らの構造上の変化は起こっておらず、最も重要なことに、末端シアル酸残基がニトロソ化処理の間も保存されていたことが示唆された。
実施例２：II型およびIII型多糖ハプテンの、破傷風類毒素への結合
破傷風類毒素（SSI、デンマーク）は、最初にバイオゲル-Aカラム（バイオラッド・ラボラトリーズ）によるゲルろ過によって、その単量体まで精製された。得られた破傷風類毒素単量体（TTm）（150,000ダルトン）は、25mg/mlの濃度で0.2Mのリン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、以下に示す量の乾燥したGBS II型（II-1からII-3）またはGBS III型（III-1からIII-5）多糖類、および再結晶化したナトリウムシアノボロヒドリドNaCNBH3を添加した：
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次に反応混合液を37℃で４日間インキュベーションした。結合反応の進行は、スーパーロース-12（ファルマシア）で分析した反応混合液の少量をHPLCにかけることによって監視した。複合物は、0.01%のチメロザールを含むPBSを溶出液として用いた、スーパーデックスG-200（ファルマシア）カラムを用いた、分子排除クロマトグラフィーによって精製した。カラムから溶出した画分は、ウォーターズR403示差屈折計、および280nmのUV分光計によって監視した。複合物を含む画分を取り分け、0.22umのミリポア膜によってろ過滅菌し、それぞれについてブラッドフォード法（ブラッドフォード（Bradford）、M.M., 1976. Anal. Biochem., 72: 248-254）およびレゾルシノールアッセイによって、そのタンパク質含量とシアル酸含量を分析した。各II型複合分子およびIII型複合分子における、平均的な炭化水素含量は、シアル酸含量をとり、反復単位の組成に基づいて、それぞれ4および3.3の補正係数を掛けることによって算出された。それぞれ個々の複合物の分析は、以下の第１表に示されている：
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天然の莢膜多糖類エピトープについて観察された特異性と比較した場合の、II型およびIII型多糖-複合物に対するウサギポリクローナル抗体の免疫化学的特異性は、ELISAによって観察され、第１図（GBS II型）および第２図（GBS III型）で報告されている。
実施例３；GBS II型およびGBS III型-破傷風類毒素複合ワクチンによる免疫に対する、雌のネズミの免疫原応答
ａ．免疫
１０個体の雌のスイス・ウェブスターマウスのグループ（4-6週齢）は、2μｇの天然のII型またはIII型多糖、あるいはそれに対応する破傷風菌-類毒素複合物により皮下免疫を行った。ワクチンは、0.01%のチメロサールを含む10mMPBS1mlあたり1mgの含有アルミ濃度で、水酸化アルミ（アルヒドロゲル（Alhydrogel）；スーパーフォス（Superfos）、デンマーク）に吸着された。マウスは０日、２１日および４２日目にワクチンを投与され、最終的に５２日目に放血された。血清を回収し、-70℃で保存した。
ｂ．複合血清のELISAとオプソニン活性
ELISAs：マイクロタイタープレート（ヌンク、ポロソープELISAプレート）を、ウエル当たり100μlの0.02%アジ化ナトリウム入りPBSに溶かした天然II型またはIII型多糖-HSA複合物（1μｇ/ml）を加えることによって慣らした。このプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを0.05%のビトゥイーン20を含むPBS（PBS-T）で洗い、PBS中の0.5%BSA溶液により、室温で１時間ブロッキングした。次に、ウエルを100μlのマウス抗血清のPBS-Tによる２倍希釈系列で満たし、このプレートを室温で１時間インキュベーションした。PBS-Tで洗ったあと、プレートを100μlのペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスIgG（H+L）（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（Kirkegaard & Perry Laboratories））で満たし、次にPBS-Tで５回洗った。最後に、50μlのTMBペルオキシダーゼ基質（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ）をそれぞれのウエルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベーションした後、50μlの1Mリン酸を加えることによって反応を停止した。このプレートは、650nmを対照波長とし、モレキュラー・デバイス・アメックス社（Molecular Device Amex）のマイクロタイタープレートリーダーを用いて、450nmで測定した。
天然のIII型多糖、またはIII型断片多糖-破傷風菌類毒素複合物でワクチン処理されたマウスの、III型多糖特異的な抗体のタイターは、第II表に示されている。
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天然のII型多糖、またはII型断片多糖-破傷風菌類毒素複合物でワクチン処理されたマウスの、II型多糖特異的な抗体のタイターは、第III表に示されている。
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複合抗血清のオプソニン活性：II型GBS、またはIII型断片多糖-破傷風菌類毒素複合物に対するマウス抗血清のオプソニン活性は、ヒトの前骨髄細胞由来の白血病HL-60細胞（ATCC寄託番号CCL 240）を用いた、in vitroのオプソニン食菌アッセイ法で試験した。簡単に述べると、200cfuのGBS II型株18RS21株あるいはIII型株M781を、等量の血清抗体と混合し、５％二酸化炭素インキュベーター中、３５℃で１５分間振とうしながらインキュベーションした。子ウサギの補体と、90mM DMF存在下で５日間培養したHL-60細胞（5x10５）を混合液に加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。調製用培養のために一部を取り分けた。タイターは、細菌の生存率が５０％であることに対応させて、抗体希釈系列を外挿することによって決めた。
ｃ．  ELISA結合実験：さまざまな破傷風-類毒素複合物に対する、（III型またはII型GBS全細胞で過免疫したウサギから得られた）ウサギ抗-GBS II型またはIII型莢膜多糖特異的抗体の直接的結合は、次のようにして行った：
マイクロタイタープレートを、ウエル当たり、100μlの0.01%チメロサール入りPBSに溶かした、種々のサイズのII型GBSまたはIII型多糖-破傷風類毒素（TT）複合物（1μｇ/ml）を加えることによって慣らした。このプレートを室温で１時間インキュベーションし、上述のようにして処理し、100μlのウサギ抗血清のPBS-Tによる２倍希釈系列で満たした。残りのELISA過程は、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗-ウサギIgG（H&L）二次抗体（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ）を加えることを除き、上述と同様である。
種々の破傷風-類毒素複合物に対する、ウサギ抗-GBS II型またはIII型多糖特異的抗体の結合は、第１図および第２図にそれぞれ示されているように、天然のII型またはIII型多糖-破傷風-類毒素複合物の結合と比較した、パーセントで表わされている。
実施例４：新生マウスにおけるGBS感染に対する抵抗性を与えるための、マウスのメスの免疫
カールスリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories）、ウィリントン、MAの、６から８週齢のメスのCD-1マウス（n=3）の腹腔内に、第０日および第２１日目に２回の複合ワクチン（アルヒドロゲル1.3%（スーパーフォスバイオセクターa/s、バッチ番号#2043）中、2μｇ（マウス当たり1μｇの多糖に相当）の多糖断片（平均分子量約11,000ダルトン）、総容量0.5ml I.P.）の注射を行った。対照マウス（n=3）は、2μｇの天然III型GBS CPを含むワクチンを与えられた。マウスは２１日目に出産し、（生後３６時間以内の）子供に対して、致死量のIII型GBS M781細菌（6x10５ CFU）を腹腔内に接種した。
第IV表に示すように、出産前にGBS III型-TT複合物でメスのマウスをワクチン処理すると、直後に出産した子供の94%が抵抗性を持った。
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参考文献：ローレンスC.（Lawrence C.）、メードフ（Madoff）ら、Infection and Immunity, 60: 4989-4994（1992）
ロードワルド，A.K.（Rodwald, A.K.）ら、Ｊournal of Infectious Disease, 166: 635-639（1992）
本発明は特定の態様と関連して説明されたが、前出の記述と照らして、多数の代替法や変法が当業者に明らかなのは明白である。したがって、本発明は、添付の請求の範囲の精神と展望の範囲に入る、全ての代替法や変法を含むことを意図している。更に、上述の米国特許の内容は、本明細書に参考文献として取り入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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