(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び２の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるユーバクテリウム・アエロファシエンス用プライマーの組み合わせ。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーを使用することを特徴とするユーバクテリウム・アエロファシエンスの同定方法。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーを使用することを特徴とするユーバクテリウム・アエロファシエンスの検出方法。
【請求項４】
（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）請求項１記載のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なう工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むユーバクテリウム・アエロファシエンスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトや動物腸内の優勢菌であるユーバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium aerofaciens）菌種の同定に有用なＤＮＡプライマー及びプローブ並びにこれを用いるアエロファシエンス菌種の同定・検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の腸管内には様々な細菌群が常在し複雑な腸内菌叢を形成している。これらは宿主が健康でありさえすれば、安定した状態であることが知られている。その腸内菌叢を形成する最優勢菌群の１つとしてユーバクテリウム属が挙げられる。従ってユーバクテリウム属細菌は土壌や泥から分離されることも多いが、主にヒトや動物の腸管や臨床材料から分離される。
【０００３】
このユーバクテリウム属細菌のうち、腸内で最も優勢であるアエロファシエンスは、腸内のユーバクテリウム属細菌のうち約８０％を占め、ヒトの腸内菌叢の約１０％を占めている。またアエロファシエンスは、食餌成分の違いにより腸内の菌数の割合が変化することが知られている。例えば、農村部の日本人の腸内からはアエロファシエンスは２５．１％と高率に分離されたが、都市部の北米人では５．２％と低いことが報告されている。また、食物繊維（玄米食）をヒトに給与するとアエロファシエンスの構成比が著しく減少するとも報告されており、生活環境や個体の差によりアエロファシエンスの菌数や出現頻度に違いが生まれることが示唆される。
更に、ユーバクテリウム属細菌の動向は腸内の有用細菌であるビフィドバクテリウム属細菌と類似していることもわかっている。
【０００４】
これらのことから、ヒトや動物の腸管内におけるアエロファシエンスの動向は、生体の健康状態に密接に関わっているものと考えられている。このため、ユーバクテリウム属細菌に関するさらなる研究を行ない、生理作用等の知見を蓄積することが要望されている。このため、糞便等からアエロファシエンスを迅速且つ正確に検出し、その動向から個体の健康状態を把握することが重要である。
【０００５】
しかしながら、現状においてアエロファシエンスはグラム陽性、無芽胞の桿菌の内プロピオニバクテリウム(Propionibacterium) 属細菌、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属細菌及びラクトバチルス(Lactobacillus) 属細菌等以外の細菌として分類されているのみであり、生理活性等未知の部分の多い細菌である。従って、その検出同定は、コロニー形状や顕微鏡観察、糖分解性状を検査することにより行なわれており、このような表現形質を元にした同定方法は、操作が煩雑であり、試験者の熟練を要するものであった。
【０００６】
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行なわれるようになっている（TAKAYUKI EZAKI, YASUHIRO HASHIMOTO, AND EIKO YABUUCHI. IJSB, 1989, vol. 39, p224-229）。しかしながら、この同定法も長時間を必要とし、迅速な菌種同定を行なうには好ましいものではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、発酵性状の違いやＤＮＡ―ＤＮＡホモロジーからアエロファシエンスの同定・解析を行なうには、長時間を要し、また操作が煩雑である等の問題があった。
従って、本発明の目的は、糞便や腸内細菌叢中のアエロファシエンスを迅速、簡便に同定・検出しうる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
斯かる現状に鑑み本発明は鋭意研究を行なったところ、アエロファシエンスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見い出し、これを用いれば、細菌の糖分解性状の確認など煩雑な操作を行なうことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便にアエロファシエンスの同定・検出が可能となることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１及び２の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるユーバクテリウム・アエロファシエンス用プライマーの組み合わせを提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、上記のユーバクテリウム・アエロファシエンス用プライマーを使用することを特徴とするユーバクテリウム・アエロファシエンスの同定又は検出方法を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）上記のユーバクテリウム・アエロファシエンス用プライマーを用いてＰＣＲ反応を行なう工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むユーバクテリウム・アエロファシエンスの検出方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ユーバクテリウム属細菌とは嫌気性、非鞭毛、非運動性、無芽胞、非分岐状、グラム陽性で、菌の配列が対になっているか短鎖状を呈する桿菌として命名、提唱された菌属である。また、代謝産物により他のグラム陽性桿菌であるプロピオニバクテリウム属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌などと区別されている。この内、糖分解性状として、ブドウ糖、マンノース、ガラクトース、フルクトース、マルトース及びラクトースより酸を産生し、アラビノース、キシロース、メレチトース、可溶性デンプン、グリコーゲン、マンニット、ソルビット、イノシット及びエリスリットより酸を産生しない菌群がユーバクテリウム・アエロファシエンスである。
【００１３】
上記のような分類において、アエロファシエンスのプライマーを作成するにあたり、まず遺伝学的な分類を明確化させることとした。すなわち、系統分類の指標として信頼性の高い１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットに用い、分類を行なった。ここで本発明者が比較対象として新たに１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンシングを行なったアエロファシエンス菌株は、具体的には、基準株であるユーバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium  aerofaciens）ＪＣＭ６４７９株及び参考株であるＪＣＭ７７９０株、ＪＣＭ７７９１株である。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。
【００１４】
本発明者がシークエンスを行なって得た塩基配列とデータベース（DDBJ、Genbank 等）より得た配列とを比較・検討し、ＮＪ法（Saitou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor-Joining method ：a new method for reconstracthiong phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4：406-425）を用いて分類を行なった。その結果、アエロファシエンスはユーバクテリウム属ではなくコリオバクテリウム属（Coriobacterium）に属するのが妥当であると考えられた。しかしながら、本明細書においては便宜上ユーバクテリウム属に属するものとして記載する。
【００１５】
一方で、アエロファシエンス特異的プライマーの作成は以下のようにして行った。まず、ターゲットには１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００１６】
上記３株及び最も近縁の種であるユーバクテリウム・レンタム（Eubacterium lentum）の遺伝子配列を比較することによりプライマーを設計した。その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプライマーとして各３種類ずつが設計された（表１）。そこで、ＡＥＲＯ−ＦとＡＥＲＯ−Ｒを用いて特異性を検討したところ、アエロファシエンスだけでなく、レンタムについても増幅する結果が得られた。このため、ＡＥＲＯ―Ｆ１とＡＥＲＯ−Ｒ１、ＡＥＲＯ−Ｆ２とＡＥＲＯ−Ｒ２についても検討したところＡＥＲＯ―Ｆ１とＡＥＲＯ−Ｒ１との組み合わせにおいて良好な結果が得られた。
【００１７】
こうして得られたＡＥＲＯ−Ｆ１及びＡＥＲＯ−Ｒ１のオリゴヌクレオチドの長さは２１ｂ．ｐで、それぞれ配列番号１及び２に示した。これらはＰＣＲ反応等の操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配列が付加させたものを用いても良い。このとき、塩基配列の増減したプライマーが、他種の細菌を増幅する場合もあるので、そられについては、使用しないか、ＰＣＲ条件の改変等を行なう必要がある。
【００１８】
またこのとき、ＰＣＲ反応の条件についても検討を行った。すなわち、アニーリング温度を５８、６０、６３℃と変化させ、サイクル数も２５及び３０サイクルの２種類で検討した。その結果、６３℃、２５サイクルが最も好適な条件であった。
【００１９】
上記のプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その種特異性は、ユーバクテリウム属細菌の基準株及び参考株９種１１株及びアエロファシエンスの分離株３株のＤＮＡに、プライマーを反応させた場合の増幅の有無を指標として確認した。結果として、プライマーのアエロファシエンスに対する特異性に問題はなかった。また、他の属の細菌４株についても検討したところ、やはり増幅は見られなかった。更に、グラム陽性桿菌の新鮮分離株約３００株から、糖発酵試験によってユーバクテリウム・アエロファシエンスと同定された株１７８株と本発明のプライマーとを反応させたところ、全ての株とバンドを形成した。なお、糖発酵試験でアエロファシエンスと同定されなかった株と本発明のプライマーとは反応しなかった。
【００２０】
本発明のプライマーは、ユーバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium aerofaciens）に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、アエロファシエンスの同定、解析を行なうためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライマー等と組み合わせて用いることも可能であるが、その組み合わせによっては種特異的な検出を行なえないものもあるので、配列番号１又は２記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと組み合わせることが好ましい。
【００２１】
なお、今回新たにシークエンスを行なったことにより、配列番号１及び２に示す配列以外にも種特異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの配列や他の公知のプライマーで同定を行なっても、別の種に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しない場合も多く、使用上好ましいものではなかった。このようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定によって種特異的な反応性は達成されるものと考えられるが、現状ではそのような条件は見出されていない。
【００２２】
本発明のプライマーは、このように種特異性を有するため、これらを用いて糞便や組織切片中のアエロファシエンスを迅速に同定できる。また、アエロファシエンスをＥＧ（Eggerth-Gagnon）培地（栄研社製）等に培養し、形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、プライマーとの反応性を調べることによって菌種の簡易同定を行なうことができる。
【００２３】
また、本発明のプライマーを用いれば、アエロファシエンスのＤＮＡから直接同定を行なうことも可能である。例えば、糞便等を遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとし、本発明のプライマーで増幅反応を行なうことにより、アエロファシエンス特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無からアエロファシエンスを同定することができる。
【００２４】
ＤＮＡを抽出する方法としては、定法であるMarmur法、その変法である酵素法、及び簡便法である塩化ベンジル法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、純粋培養した細菌等から抽出したＤＮＡに対しては、前述の方法の他、フェノール法等も好適に使用しうる。
【００２５】
通常、ＰＣＲ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライマーを１組として用いる必要がある。例えば、配列番号１及び２に係るプライマーを用いれば、他種類存在する細菌群のうち、ユーバクテリウム・アエロファシエンスのＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間で増幅反応が起こり、これを同定することができる。また、上記プライマーと公知のユニバーサルプライマーとを組み合わせて用いてもよいが、その場合には、両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせになるようにする必要がある。また、ＰＣＲを行なう際に、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈し、同様の解析を行えば、アエロファシエンスの定量化も可能である。また、本発明のプライマーは、アエロファシエンス特異的な配列を有しているため、単独でもプローブとして使用できる。
【００２６】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行なえる。現状では、アエロファシエンス以外の菌を検出することは不可能であるものの、アエロファシエンスの分布、菌数がわかれば、ビフィドバクテリウム属細菌等の菌数も予測されるため、個体健康状態等様々な情報が得られる。更に、その他の多岐にわたる細菌のプライマー、例えば本出願人が先に出願（特願平９―２１９５６７号）しているビフィドバクテリウム属細菌用プライマー等と組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用すれば、迅速、簡便、低コスト且つ高精度にユーバクテリウム・アエロファシエンスの同定を行なうことができる。また、他の菌種特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行なうことができる。更に、解析の結果から消化管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１    プライマーの設計及び合成：
系統学的に近隣の位置にあるユーバクテリウム・レンタムの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者らが解読した上記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を元に、アエロファシエンス特異的なプライマーの設計を行なった。その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプライマーとして各３種類ずつが設計された（表１）。これらのプライマーの大腸菌のナンバリングにおける位置は、ＡＥＲＯ−Ｆが４３９〜４８６、ＡＥＲＯ−Ｆ１が４３６〜４６６、ＡＥＲＯ−Ｆ２が６９４〜７１３、ＡＥＲＯ−Ｒが１０５５〜１０３１、ＡＥＲＯ−Ｒ１が１０６０〜１０３９、ＡＥＲＯ−Ｆ２が１００１〜９８２であった。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成し、特異性を確認したところ表１記載のプライマー（ＡＥＲＯ−Ｆ１とＡＥＲＯ−Ｒ１）において好適な結果が得られた。
【００３０】
【表１】
0003950918.tif 000002
【００３１】
実施例２    プライマーとユーバクテリウム属細菌との反応性の検討：
本発明のプライマーが、実際にアエロファシエンス特異性を有しているかを確認するため、ユーバクテリウム属細菌の各菌種の基準株、参考株及び分離株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びコロニーの単離
表２に示す、９菌種１４株のユーバクテリウム属細菌及び他の属に属する腸内細菌５株をＥＧ培地（栄研社製）にて嫌気的に二晩純粋培養した。こうして得た菌体１５種類各々のコロニーをかきとり、０．５mlのエッペンドルフチューブを用いて、滅菌水に懸濁した。これを１００℃で５分間ボイルし、熱変性させた後に本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００３２】
（２）ＰＣＲ反応
総量を１００μｌとし、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2及び２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物に、各々０．２５ｐＭプライマー（AERO-F1及びAERO-R1）、２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmercetus, Norwalk, conn.）により、９４℃３分の後、９４℃３０秒、６３℃１分３０秒、７２℃２分を２５サイクルのＰＣＲ反応を行なった。
【００３３】
（３）プライマーの菌種特異性の検討
（２）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合能を確認し、プライマーの特異性を判定した。１％Agarose TypeII（シグマ社製) で、ミューピットにより１００Ｖ、２５分電気泳動し、ethidium Bromideで染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果、プライマーはアエロファシエンス特異的にバンドを形成した（表２）。
【００３４】
【表２】
0003950918.tif 000003
【００３５】
ＴはType（基準株）を示す。
ＰＣＲの結果はＡＥＲＯ−Ｆ１とＡＥＲＰ−Ｒ１を用いた場合の結果である。
Ａ１０７とＡ２３５とＡ２４３は分離株である。
【００３６】
実施例３    プライマーを用いた分離株からのアエロファシエンス同定：
ヒトの糞便由来の分離株から、性状試験によりグラム陽性桿菌約３００株を選別した。これらについて、従来の性状試験及び本発明のプライマーによる同定を行ない、プライマーの特異性を確認した。
（１）菌株の純粋培養及びコロニーの単離
性状試験からユーバクテリウム属と同定された新鮮分離株約３００株をＥＧ培地で２日間嫌気培養したコロニーを滅菌水に懸濁し、熱変性したものをサンプルとした。
（２）ＰＣＲ反応
（１）で得られたＤＮＡを鋳型とし、実施例２と同一の条件でＰＣＲ反応を行なった。
（３）プライマーの菌種特異性の検討
分離株をＥＧ培地で嫌気培養することにより得られた約３００株について、糖分解試験を行なったところ、１７８株がユーバクテリウム・アエロファシエンスと同定された。一方で、３００株に本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なったところ、糖分解試験と同一の１７８株のＤＮＡのみに増幅が見られた。
なお、この１７８株のうちから、Ａ１０７株、Ａ２３５株、Ａ２４３株の３株（表２に記載）についてシークエンシングを行なったところ、ユーバクテリウム・アエロファシエンスＪＣＭ６４７９株、ＪＣＭ７７９０株及びＪＣＭ７７９１株と同様に、設計したプライマー配列を有していることが確認された。さらにＡ１０７株についてＪＣＭ６４７９株、ＪＣＭ７７９０株及びＪＣＭ７７９１株とＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを行ない、同種であることを確認した。
【００３７】
【配列表】
0003950918.tif 000004
【００３８】
0003950918.tif 000005