(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程(ａ)〜(ｆ)、すなわち；
(ａ) 生体から採取した検体より食細胞を取得し、
(ｂ) 得られた食細胞を支持担体の表面に固定し、
(ｃ) 当該食細胞の細胞膜の透過性を亢進させる処理を行い、
(ｄ) 溶菌酵素およびプロテアーゼ阻害剤を用いて、当該食細胞の細胞内に存在する感染症原因微生物のＤＮＡを露出させ、
(ｅ) 界面活性剤の存在下、ストリンジェントな条件下で、露出させた当該ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いて、in situハイブリダイゼーションを行い、および
(ｆ) 出現したハイブリダイゼーションシグナルによって感染症原因微生物を検出および／または同定する、
工程を含むことを特徴とする、感染症原因微生物を検出および／または同定するための方法。
【請求項２】
前記露出工程(ｄ)で用いる溶菌酵素が、１単位/ml〜１,０００単位/mlの力価のリゾスタフィン、１,０００単位/ml〜１,０００,０００単位/mlの力価のリゾチーム、１０単位/ml〜１０,０００単位/mlの力価のＮ-アセチルムラミダーゼ、および、５０単位/ml〜５００単位/mlの力価のザイモラーゼ、および、これらの組み合わせからなるグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記露出工程(ｄ)において、２６℃〜５９℃で、１５分〜１２０分間、前記食細胞を処理する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記露出工程(ｄ)で用いるプロテアーゼ阻害剤が、フェニルメチルスルフォニルフルオライドである請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記露出工程(ｄ)で用いるプロテアーゼ阻害剤が、ジメチルスルフォキシドで溶解したフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む溶液である請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記溶液に含まれるフェニルメチルスルフォニルフルオライドの濃度が、１０μmol/l〜１０mmol/lである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液に含まれるジメチルスルフォキシドの濃度が、５％(ｖ/ｖ)未満である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、アニオン界面活性剤である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アニオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーション工程(ｅ)において、２５℃〜５０℃で、３０分〜９００分間、in situハイブリダイゼーションを行う請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持担体が、３-アミノプロピルトリエトキシシランをコートしたスライドグラスである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程(ｆ)において、ハイブリダイゼーションシグナルと細胞との間のコントラストを明確にするための色素を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検体が、血液である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固定工程(ｂ)において固定される食細胞の密度（ｘ個/ml）が、５×１０6個/ml＜ｘ個/ml＜１×１０8個/mlである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出用ＤＮＡプローブが、３５０塩基長〜６００塩基長の鎖長を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出用ＤＮＡプローブの濃度が、０.１ng/μl〜２.２ng/μlである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
以下の要素(１)〜(３)、すなわち；
(１) リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ-アセチルムラミダーゼ、および、ザイモラーゼからなるグループから選択される少なくとも一つの溶菌酵素；
(２) 少なくとも一つの検出用ＤＮＡプローブ；および
(３) プロテアーゼ阻害剤
を含む、ことを特徴とする感染症原因微生物の検出および／または同定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法に関する。また、感染症原因微生物を検出および／または同定するためのキット、臨床検体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法および敗血症原因微生物または菌血症原因菌を特定する方法に関する。
背景技術
従来より、血液中に存在する菌の証明法として血液培養法が広く用いられているが、培養・分離同定の操作に３〜１４日程度の日数がかかる上、検出率が約１０％と低く、敗血症のような緊急を要する診断法としては、十分治療に寄与していないのが現状である。
そこで、本発明者らは上記問題を解決するために、貪食細胞によって貪食された外来微生物を検出または同定するための方法、すなわち、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子を、該遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションすることのできるプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを施すことで、その検出を図る方法を発明した（特公平７−４０号）。
特公平７−４０号に記載された方法に従って、敗血症が疑われた患者血液を用いて検査したところ、血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出し、さらに２４時間以内に判定できたことなどから、感染症分野において脚光を浴びるに至っている。
本願発明は、特公平７−４０号に記載された発明、すなわち、生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因菌のＤＮＡを露出させる処理を施し、この露出ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、得られたシグナルにより感染症原因菌を検出および／または同定するための方法について、この方法による検出効率・検出感度をさらに高めることを目的とする。
発明の開示
本発明は、以上詳説した現状に鑑みて成し遂げられたものであり、その要旨とするところは、以下のとおりである。
生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物のＤＮＡを露出させる処理を施し、該ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および／または同定するための方法であって、下記（１）〜（８）の特徴、すなわち、
（１）固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）が、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌであること、
（２）ＤＮＡ露出工程においてリゾスタフィンが使用され、その力価が、約１単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌであること、
（３）ＤＮＡ露出工程においてリゾチームが使用され、その力価が、約１，０００単位／ｍｌ〜約１，０００，０００単位／ｍｌであること、
（４）ＤＮＡ露出工程においてＮ−アセチルムラミダーゼが使用され、その力価が、約１０単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌであること、
（５）ＤＮＡ露出工程においてザイモラーゼが使用され、その力価が、約５０単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌであること、
（６）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程において界面活性剤を使用すること、
（７）検出用ＤＮＡプローブが、約３５０〜約６００塩基長の鎖長を有する１種以上のＤＮＡプローブであること、および
（８）検出用ＤＮＡプローブの濃度が、約０．１ｎｇ／μｌ〜約２．２ｎｇ／μｌの濃度であること、
の少なくとも１つ以上の特徴を有する、感染症原因微生物を検出および／または同定するための方法である。
ＤＮＡ露出工程にあっては、好ましくは、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼおよびザイモラーゼより選択される１つ以上の酵素が使用され、そして、リゾスタフィンの力価が、約１０単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌ、リゾチームの力価が約１０，０００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌ、Ｎ−アセチルムラミダーゼの力価が約１００単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、ザイモラーゼの力価が約１００単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌであるものを使用する。
ＤＮＡ露出工程にあっては、好ましくは、酵素を使用し、そして、この酵素を反応させる温度を約２６℃〜約５９℃とし、また、この酵素を反応させる反応時間を約１５分〜約１２０分とする。
ＤＮＡ露出工程にあっては、好ましくは、さらに食細胞の形態を保持させる物質、特に、フェニルメチルスルフォニルフルオライドを、好ましくは、約１０μｍｏｌ／ｌ〜約１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用する。食細胞の形態を保持させる物質として、好ましくは、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質を使用する。
食細胞の形態を保持させる物質を、好ましくは、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質とし、そして、ジメチルスルフォキシドはＤＮＡ露出工程で用いられる溶液において５％未満の濃度で調製する。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程にあっては、ＤＮＡとＤＮＡプローブとが、界面活性剤、特に、アニオン界面活性剤、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下でハイブリダイズされる。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程にあっては、好ましくは、ハイブリダイズ反応させる温度を約２５℃〜約５０℃とし、そして、ハイブリダイズ反応させる反応時間を約３０分〜約９００分とする。
固定工程の前に、得られた食細胞を支持担体上に支持させる工程をさらに含み、なおかつ、その支持担体を、３−アミノプロピルトリエトキシシランをコートしたスライドグラスとする。
シグナルの検出の際に、シグナルと細胞のコントラストを明確にさせるための色素を使用する。また、臨床検体を、好ましくは、血液とする。
さらに、本発明によれば、食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、その細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、その食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物のＤＮＡを露出させる処理を施し、該ＤＮＡにストリンジェントな条件下ハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いて界面活性剤の存在下でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および／または同定するためのキットであって、
（１）ＤＮＡ露出工程において使用される酵素が、少なくとも、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼからなる群より選択される１種以上の酵素であり、および
（２）少なくとも１種以上の検出用ＤＮＡプローブを含む、
感染症原因微生物を検出および／または同定するためのキットも提供される。
また、本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法であって、前出の感染症原因微生物の検出および／または同定方法におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて該遺伝子を検出する工程を含み、該臨床検体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
そして、敗血症または菌血症の診断方法であって、前出の感染症原因微生物の検出および／または同定方法におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて原因微生物の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因微生物または菌血症原因菌を特定する方法も、本願発明によって提供される。
発明を実施するための最良の形態
本実施態様において使用することができる臨床検体としては、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体であればいずれでも良く、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液など、その他、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも本発明の臨床検体とすることができる。
加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。これは、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、固定マクロファージ、遊離マクロファージ、ハンゼマンマクロファージ、炎症性マクロファージ、肝クッパー細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含む組織も本発明の臨床検体として用いることができる。例えば、腎炎が疑われる患者より腎生検により腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることにより細胞を剥離して該組織中に存在する食細胞を得、得られた食細胞を用いることによって、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。
本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物をはじめとする異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。また、Ｕ９３７細胞、ＨＬ６０細胞などの食細胞系も使用できる。感染症の原因ともなる外来微生物としては、食細胞によって貪食される微生物であれば特に制限はなく、細菌、真菌、ウィルス、原虫、寄生虫等が含まれる。細菌としては、例えば、ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌、連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、リステリア、エルシニア、ブルセラ等が挙げられる。真菌としては、例えば、カンジダ、アスペルギルス、アクチノミセス、コクシジオイデス、ブラスミセス等が挙げられる。ウィルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、エイズウイルス等が挙げられる。原虫としては、例えば、アメーバ赤痢、膣トリコモナス、マラリア、トキソプラズマ等が挙げられる。寄生虫としては、トリパノゾーマ等が挙げられる。特に、敗血症または菌血症の原因菌としては、例えば、グラム陽性菌であるスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、グラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の大腸菌類縁腸内細菌群（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、好気性桿菌であるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、嫌気性菌であるクロストリジウム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バクテロイデス菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）等が挙げられる。まれに、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ等が、原因菌となることもある。
臨床検体からの食細胞（白血球）画分の取得には、公知の方法を使用することができる。例えば、ヘパリン加静脈血約５ｍｌ（白血球数の少ない場合には１０ｍｌ）を採取し、この血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（分子量２００，０００〜３００，０００）１．５ｇ、滅菌精製水にて全量２５ｍｌに調製したもの）とを４：１程度の割合で混和した後、約１０℃〜約４０℃で、約１５分〜約１２０分間、好ましくは、約３７℃で、約３０分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得することができる。
このようにして得た白血球画分を、０℃〜約２０℃にて、約１００×ｇ〜約５００×ｇで、約３分〜約６０分間、好ましくは、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。この際に赤血球が混入した場合、溶血操作を行うのが好ましい。例えば、白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁し、直ちに過剰量のＰＢＳ（塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物１．１２３ｇ、滅菌精製水にて全量１２０ｍｌにしたもの（ＰＢＳ原液；以下、単に「ＰＢＳ原液」と称する）を滅菌精製水にて２０倍に希釈したもの；以下、単に「ＰＢＳ」と称する）を加えて等張化した後、再度４℃下、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離すれば良い。また、上記遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本来保有する接着能力を利用して、後述するスライドグラスに接着させることもできる。
白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球を支持せしめ、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１の容量比で混合した液）に約２０分間程度浸した後、約５０％〜約９０％、好ましくは、約７５％エタノール液に約５分間浸し、完全に風乾する。
前記支持担体は、不溶性素材のものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、アガロースなど）が好ましい。
不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。
特に、本発明の実施態様として好ましい支持担体は、スライドグラスを使用するのが好ましい。このようなスライドグラスとして、例えば、日本エアーブラウン社製のスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ）が挙げられる。このスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ）には、直径５ｍｍの円形ウェルが１４個設けられている。また、実際に使用する際には、細胞の接着性を上げるため、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）をスライドグラスにコートしたＡＰＳコートスライドグラスを使用するのが好ましい。その他、ポリ−Ｌ−リジンやゼラチンをコートしたスライドグラスも使用することができる。
ＡＰＳコートスライドグラスを作製するには、まず、スライドホルダーにスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ）を固定した後、希釈した中性洗剤で３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却する。その後、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。さらに再度、スライドグラスを約１〜約１０％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する操作を行った後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約４２℃で乾燥させることにより作製することができる。
白血球をＡＰＳコートスライドグラスに支持させる際には、各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し風乾するのが好ましい。固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）が、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、約１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦約５×１０７個／ｍｌに調製されたものを使用することが好ましい。
また、このような１ｍｌ当たりの食細胞の密度の変化に対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、約２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜約５×１０５個／ウェル、好ましくは、約５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦約２．５×１０５個／ウェルとなるように調製するのが好ましい。具体的には、白血球画分を、４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離することによって得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。細胞数が、約５×１０４個／ウェル〜約２．５×１０５個／ウェルとなるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより調製することができる。
食細胞膜の透過性を亢進させる処理として、約３〜約３０分間ＰＢＳに浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃），ｐＨ（５ｗ／ｖ％）５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を、滅菌精製水で約２〜約５０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約３〜約３０分間浸透する方法を用いることができる。
食細胞中に存在する感染症原因菌のＤＮＡを露出させる処理として、スライドグラス１枚につき酵素試薬（Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームおよび／またはリゾスタフィン）に酵素試薬溶解液（フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）をＰＢＳで約１００倍希釈して調製したもの）を１ｍｌ加えて酵素試液を調製した後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、この酵素試液１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下し、約１０〜約６０分間静置する。その後、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて２０倍希釈し、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で３〜３０分間浸透することによって目的を達成できる。ＤＭＳＯは５％以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフィンの活性を低下させる可能性があるため、５％未満の濃度で使用するのが好ましい。食細胞の形態を保持させる物質としてのＰＭＳＦ以外に他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびそれらの混合物などを用いることもできる。その際には、適宜ＤＭＳＯなどの溶解剤を変更すれば良い。
酵素試薬として用いる各酵素の好ましい力価範囲は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの溶菌においては、リゾスタフィンの力価は１単位／ｍｌで十分効果を示すが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの溶菌においては、１０単位／ｍｌ以上のリゾスタフィン力価が必要であった。ゆえに、リゾスタフィンの至適力価は、約１単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌに設定するのが良い。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの溶菌においては、リゾチームの力価を約１０，０００単位／ｍｌで固定したとき、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価が約１０単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった。リゾチームについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価を１００単位／ｍｌに固定したとき、リゾチーム力価が１，０００単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった。ゆえに、Ｎ−アセチルムラミダーゼの至適力価は、約１０単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、リゾチームの至適力価は、約１，０００単位／ｍｌ〜約１，０００，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０，０００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌに設定すると良い。また、原因菌がＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等の真菌である場合には、ザイモラーゼ約５０単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌの力価範囲にすると良い。また、ザイモラーゼを使用する際には、特に、ＰＭＳＦまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を使用するのが好ましい。
また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、適宜使用酵素を選択することができる。特に、グラム陽性菌、グラム陰性菌にかかわらず、より効果的に溶菌させるには、２種類以上の酵素を併用すればよい。本発明においては、リゾチーム、リゾスタフィンおよびＮ−アセチルムラミダーゼの３種を混合したものを使用することにより、単独の酵素によった場合と比較して溶菌活性が高まることが明らかとなった。
酵素処理温度は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、好ましくは約４℃〜約６０℃、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、約２５℃より高く、好ましくは約３７℃以上、また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓでは、約２５℃より高く約６０℃未満、好ましくは約３７℃〜約４２℃とすれば良い。ゆえに、至適酵素処理温度を、約３７℃〜約４２℃に設定するのが最も好ましい。また、３種類の菌に対する共通の範囲の内、限界とされる温度は約２６℃〜約５９℃と予想できる。
また、酵素処理時間は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのいずれの貪食サンプルでも酵素処理時間２０分以上（０分および１０分においては不適であった）であり、また、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも約１５分以上、好ましくは約２０分以上、さらに至適酵素処理時間を約３０分〜約６０分とするのが好ましい。また、酵素処理時間を約１５分〜約１２０分としてもよい。
また、Ｎ−アセチルムラミダーゼとは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの熱処理乾燥粉末とＮ−アセチルムラミダーゼを、２ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウムを含む５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度を下げる酵素である。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＩＦＯ  ３３５０）の熱処理細胞を、３７℃、ｐＨ７．０で１分間に１ｕｇ溶菌する酵素活性を１単位とした場合、２，０００単位／ｍｇ以上のものを使用するのが好ましい。
リゾチームは、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓとリゾチームをＰＢＳ内で、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度を下げる酵素である。また、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓを、３５℃、ｐＨ６．２で１分間に５４０ｎｍの吸収を０．００１下げるときの酵素活性を１単位とした場合、５０，０００単位／ｍｇ以上のものを使用するのが好ましい。
リゾスタフィンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとリゾスタフィンをＰＢＳ内にて３７℃で５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度を下げる酵素である。また、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを、３７℃、ｐＨ７．５で、１０分間に６２０ｎｍの吸収を０．２４０から０．１２５に下げるときの酵素活性を１単位とした場合、５００単位／ｍｇ以上のものを使用するのが好ましい。
ザイモラーゼ（商品名：ザイモリエイス、生化学工業）とは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｓｕｌの培養液から調製された酵素であり、酵母生細胞の細胞壁に対して強い溶解活性を有している。ザイモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関わる必須酵素はβ−１，３−グルカン・ラミナリペンタオヒドロラーゼ（ｌａｎｉｍａｒｉ−ｐｅｎｔａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であり、β−１，３−結合のグルコースポリマーに作用して、主生産物としてラミナリペンタオースを生成する。ザイモリエイス−１００Ｔは硫安分画により精製され、さらにアフィニティークロマトグラフィーにより精製され（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６０，２５７，１９８２）、１００，０００単位／ｇの活性を有している。しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，３２３，１９７４、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４５，１７６１，１９８１、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，５５３，１９８２）。ザイモリエイス−１００Ｔには、β−１，３−グルカナーゼを約１．０×１０７単位／ｇ、プロテアーゼを約１．７×１０４単位／ｇ、マンナーゼを約６．０×１０４単位／ｇ含み、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは認められない（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ．，１８，５７，１９７２）。また、ザイモリエイスの至適ｐＨは、約５．５〜約８．５、好ましくは、約６．５〜約７．５であり、至適温度は、約２５℃〜約５５℃、好ましくは約３５℃〜約４５℃である。さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スペクトラム（属名）は、Ａｓｈｂｙａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋｌｏｅｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｈｅｌｓｃｈｋｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓなどが挙げられる。
特に、カンジダ属として、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パラシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ガラクタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇａｌａｃｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等が挙げられる。本酵素の賦活剤として、ＳＨ化合物、例えば、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを用いることができる。
これらの属に属する菌も、本発明に使用できる。この酵素は、ビール酵母懸濁液を基質として、約２５℃で、２時間の内に、反応液（酵素：０．０５〜０．１ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ、基質：ビール酵母懸濁液（２ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）３ｍｌ、緩衝液：Ｍ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌ、滅菌精製水１ｍｌで全量１０ｍｌに調製したもの）のＡ８００が約３０％減少するために必要な酵素活性を１単位とする。ザイモリエイス−１００Ｔは、１００，０００単位／ｇの活性を有している。
酵素試薬溶解液として用いるＰＭＳＦ（プロテアーゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加）の濃度として、１０μｍｏｌ／ｌ以上の濃度で効果が認められ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上のＰＭＳＦ濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約１０μｍｏｌ／ｌ〜約１０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜約１ｍｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。また、ＤＭＳＯの濃度として、５％未満、好ましくは２％以下、さらには１％程度の濃度であることが好ましい。ゆえに、酵素試薬溶解液は、０．１ｍｏｌ／ｌフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）をＰＢＳで１００〜１，０００倍希釈して調製したものであることが好ましい。
感染症原因菌のＤＮＡを露出させる工程の後に、細胞膜タンパク質のアセチル化の工程を挿入しても良い。具体的には、アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約２倍〜約５０倍希釈、好ましくは約１０倍希釈し、無水酢酸の終濃度を０．１〜３．０％、好ましくは０．８％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で５〜３０分間振とうすることにより行うことができる。その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次、２〜５分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
また、細胞膜タンパク質のアセチル化工程の後に、感染症原因菌のＤＮＡをアルカリ処理することにより一本鎖ＤＮＡとする工程を挿入することもできる。具体的には、スライドグラスを、約１０ｍｍｏｌ／ｌ〜約３００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約７０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌに調製したもの）に約２〜約５分間浸すことにより行うことができる。その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次、２〜５分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
露出された感染症原因菌のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うには、例えば、プローブ希釈液にて調製した検出用ＤＮＡプローブを含有する液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約２５℃〜約５０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で約１〜約３時間、好ましくは、約２時間静置させる。
その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇ、滅菌精製水にて全量７５ｍｌに調製したもの：以下、単に「ハイブリダイゼーション原液」と称する）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次、約３５〜約４５℃、好ましくは、約４２℃で１０分間ずつ浸す。その後、ＰＢＳに浸し、そのまま振とう機上で約５〜約３０分間振とうさせる。詳細には、プローブ希釈液には、サケ精子ＤＮＡ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、ハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌが含まれる。プローブ液は各検出用ＤＮＡプローブ１５ｎｇを含むのが好ましく、プローブ希釈液にて全量５０μｌとするのが良い。
ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ濃度は、約０．６ｎｇ／μｌ〜約１．８ｎｇ／μｌ、好ましくは約０．６ｎｇ／μｌ〜約１．２ｎｇ／μｌとするのが良い。また、０．０６ｎｇ／μｌにおいては不適であり、０．６ｎｇ／μｌにおいては適であったことから、少なくとも０．１ｎｇ／μｌ以上とするのが好ましい。さらに、２．４ｎｇ／μｌにおいては不適であり、１．８ｎｇ／μｌにおいては適であったことから、２．２ｎｇ／μｌ以下とするのが好ましい。また、陽性コントロールおよび陰性コントロールの至適濃度を、それぞれ０．４〜２．０ｎｇ／μｌおよび０．６〜２．０ｎｇ／μｌ、好ましくは共通して０．６〜１．０ｎｇ／μｌとするのが良い。
また、ハイブリダイゼーションを行う時間は、少なくとも３０分以上、好ましくは６０分以上、より好ましくは９０分以上とするのが好ましい。さらに好ましい至適ハイブリダイゼーション時間は、約１２０分〜約９００分に設定すると良い。
また、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程においてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を使用するのが、検出感度を高めることができる点から好ましい。ＳＤＳの濃度は、１％以下が好ましく、より好ましくは約０．１％〜約０．５％、さらに好ましくは約０．２５％とする。ＳＤＳは、ハイブリダイゼーションの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合したものを用いてもよい。
さらに、検出用ＤＮＡプローブを、約３５０〜約６００塩基長、好ましくは、約３５０〜約５５０塩基長の鎖長を有する１種以上のＤＮＡプローブとすることで、食細胞内にプローブを円滑に導入し、取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されるので好ましい。対象となるプローブの塩基長（塩基対の数）が、必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意味するものではなく、プローブの塩基長の分布に、上記範囲の塩基長が含まれていればよいこととする。これらプローブは、１種で用いても数種（１種以上）で用いても良い。１種以上のプローブとは、一菌種に対しハイブリダイズできる複数種のプローブであっても良く、また、一菌種に対してプローブは１つであるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていても良く、プローブの種類が１種以上であれば特に限定されない。
これらプローブは、食細胞自体といかようにもハイブリダイズしない配列を有するＤＮＡ断片を含むものとすることが好ましく、また他の種の菌に由来する遺伝子と交差ハイブリダイズするものであってはならない。例えば、サブトラクション法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。これらプローブは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰ）等の非放射性同位体標識用物質を用い、定法のニックトランスレーションに従って、調製およびラベルするとよい。プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加するＤＮａｓｅＩとＤＮＡポリメラーゼＩの量比を変化させることにより、最も効率よくラベルできるように制御することができる。例えば、ＤＮＡプローブ（ＳＡ−２４）２μｇを効率よくラベル化し、また、外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約３５０〜約６００の塩基長）に調節するには、全量１００μｌの反応液中に、１０Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼＩの２μｌに対し、全量１００μｌ中に約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは約５０〜約１５０ｍＵとなるように調製されたＤＮａｓｅ  Ｉの６μｌが存在するようにすればよい。このとき、各酵素の容量および反応液全量などは、上記必須至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更しても良い。また、換言すれば、全量１００μｌ中にＤＮＡポリメラーゼＩを２０Ｕに対し、ＤＮａｓｅ  Ｉを約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵに調製すればよい。さらに換言すれば、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩに対し、約０．５／１，０００〜約１７．５／１，０００、好ましくは、約１．２５／１，０００〜約１０／１，０００、より好ましくは、約２．５／１，０００〜約７．５／１，０００単位のＤＮａｓｅ  Ｉを用いてニックトランスレーション反応を行うと良い。また、ＤＮＡ１μｇに対してみれば、ＤＮＡポリメラーゼＩを約１０Ｕ、ＤＮａｓｅ  Ｉを約５〜約１７５ｍＵ、好ましくは、約１２．５〜約１００ｍＵ、より好ましくは、約２５〜約７５ｍＵに調製すれば良い。他のプローブについては、上記至適反応条件を参考にしてＤＮＡ量、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮａｓｅ  Ｉの至適反応条件を決定することができ、また、効率よくラベル化し、外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約３５０〜約６００の塩基長）に調節することができる。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う際のストリンジェントな条件とは、例えば、ホルムアミドが約３０％〜約６０％、好ましくは、約５０％の存在下、約３０〜約５０℃、好ましくは、約３８〜約４２℃でインキュベートし、その後、洗浄する条件である。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行っても良い。具体的には、湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌ、ＰＢＳ原液０．５ｍｌ、滅菌精製水にて全量１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、１５〜６０分間静置する。その後、ブロッキング試薬を除去する。
菌由来の遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズした結果に生じるシグナルの検出のためには、定法の抗原−抗体反応等を利用した呈色反応を行うとよい。すなわち、ハイブリダイゼーションを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング操作を行い、次いで、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、次いで、接合物の発色系にてシグナルを発色し、ハイブリダイゼーションの状況を確認する。例えば、プローブとして前記のジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたものを用いた場合、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファターゼに対する基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート等）を利用して検出すればよい。次いで、呈色反応を行った後に洗浄した塗沫標本は、ナフトールブラック、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（２０ｍｇ／５０ｍｌ、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡によって細胞内シグナルが観察される。
詳細には、ハイブリダイゼーションによるシグナルを得るには、例えば、検出用ＤＮＡプローブとしてジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量０．７ｍｌに調製したもの）で１０〜２００倍希釈、好ましくは５０倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、１５〜６０分間静置すると良い。その後、標識抗体洗浄液（ポリソルベート２０  １ｍｌ、ＰＢＳ原液５０ｍｌ、滅菌精製水にて全量１００ｍｌに調製したもの）を２〜５０倍、好ましくは、１０倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で５〜３０分間浸透する。この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇ、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で５〜３０分間振とうすれば良い。その後、スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ））１ｍｌを０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で約１０℃〜約４５℃、好ましくは、約３７℃で、約１５〜約６０分間遮光静置する。その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に約２〜約１０分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇ、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）を２〜５０倍、好ましくは１０倍に希釈した溶液および、約０．１〜約５％、好ましくは約１％の酢酸溶液に浸す。その後、前記発色試薬洗浄液を約２〜約５０倍、好ましくは約１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗い流し、完全に風乾すると良い。また、上記発色試薬は、別々に調製したものであっても良い。
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンにジゴキシゲニンラベルしたＤＮＡの１ｎｇをブロットし、ブロッキング後、１０，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を反応させるとＤＮＡのブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンラベルしていないＤＮＡで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが好ましい。また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒツジ由来のものが好ましい。詳細には、免疫したヒツジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィーで精製すると良い。
発色試薬（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液、ｐＨ９．０〜１０．０）は、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）３．３ｍｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）１．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、塩酸適量、塩化ナトリウム５８．４ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇ、滅菌精製水適量にて全量１０ｍｌに調製したものであるのが好ましい。
この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッティング用メンブレンにブロットし、当該発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れるものを使用するのが好ましい。
上記した対比染色を行う場合に、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色４号（タートラジン）を使用することができる。その理由は、基質によって紫色が呈色し、ナフトールブラックによって青色に呈色することから、類似色のために対比染色しづらいことが挙げられる。この方法を本発明に応用したところ、対比染色を行う際に有用であることが判明した。食用色素を用いるという手法は、これまでに無かった方法である。
ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレーション法を用いることができる。その他に、ＰＣＲ法、ランダムプライマーラベリング法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスクリプションラベリング法、ターミナルトランスフェラーゼラベリング法などを使用することができる。
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）するときに、上述した対比染色液により染まった単一ウェル内の細胞に於いて、青紫色の発色が１つでも認められた場合に陽性と判定するのがよい。
また、検出用プローブの作成方法として、日本国特許第２５５８４２０号、特許第２７９８４９９号、特許第２９６５５４３号、特許第２９６５５４４号および特許第３０２６７８９号などを参照することができる。
例えば、ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、ワーキングセルバンク（ＳＡ−２４）を滅菌シャーレに作製した５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬ−ブロス固形培地に、白金耳または使い捨てプラスチックループ等で画線塗抹する（釣菌）。
一晩培養した後に、シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬ−ブロス培地５ｍｌに植菌して、３７℃で終夜振とう培養する（前培養）。
前記培地４００ｍｌ入り培養用フラスコに、前培養液を２．５ｍｌずつ植菌して、約３７℃で終夜振とう培養する（本培養）。
次に、ＳＡ−２４プラスミドＤＮＡを抽出するために、本培養した培養液を、４℃、４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。培養上清を取り除き、ＳＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン−四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム）を２０ｍｌ加えて菌体を再懸濁し、４℃、４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液−１（５０ｍｍｏｌ／ｌグルコース、２５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、菌体を懸濁して室温で５分間放置する。溶液−２（０．２ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））１０ｍｌを加え、転倒混和して氷上で１０分間放置する。氷冷した溶液−３（３ｍｏｌ／ｌ酢酸カリウム（ｐＨ４．８））７．５ｍｌを加え、転倒混和して氷上で１０分間放置する。
高速冷却遠心機により、４℃、４５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。放置した後、０．６容量（約２４ｍｌ）のイソプロパノールを加え、転倒混和して室温で１５分以上放置する。高速冷却遠心機により、２５℃、２８，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨て、７０％エタノールでペレットを洗浄して風乾する。風乾後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）を８ｍｌ加えて溶解する（プラスミドＤＮＡの抽出）。
次に、ＳＡ−２４含有プラスミドＤＮＡを精製するために、得られたプラスミドＤＮＡに、１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド８００μｌおよび塩化セシウム８．６ｇを加え、転倒混和して溶解させる。その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。垂直型ローターにより、２０℃、５００，０００×ｇで５時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用してプラスミドＤＮＡのバンドを分取する。分取したプラスミドＤＮＡ溶液に、等量のＴＥ飽和１−ブタノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機により、１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を取り除く。この操作を繰り返し、プラスミドＤＮＡ溶液中のエチジウムブロマイドを取り除く。次に、ＴＥを加えて１．５ｍｌとし、脱塩カラム（ＮＡＰ−１０）で脱塩する。脱塩したプラスミドＤＮＡ溶液に３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム溶液を３０μｌ加えて混和した後、３倍量の９９．５％エタノールを加えて転倒混和し、−２０℃で３０分以上放置する。
放置後、微量冷却高速遠心機により、４℃、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除いた後、冷７０％エタノールを加えて懸濁し、再度、微量冷却高速遠心機により、４℃、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除き、プラスミドＤＮＡの沈渣を減圧下乾固させる。プラスミドＤＮＡに１００μｌのＴＥを加えて完全に溶解させ、２６０ｎｍの吸光度で濃度を測定する（ＳＡ−２４含有プラスミドＤＮＡの精製）。その後、ＳＡ−２４含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動によるＳＡ−２４のサイズチェックを行う。
ＳＡ−２４含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動によるＳＡ−２４の精製を行うには、分子量チェックの終了したＳＡ−２４含有プラスミドＤＮＡ  １ｍｇを、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、３７℃で１．５時間以上の反応により消化する。プラスミドＤＮＡを消化した後、反応液の一部を０．８％アガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。消化を確認した後、分取用の０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＡ−２４のバンドを採取する。採取したＳＡ−２４をアガロースゲルから抽出、精製して、吸光度計にて濃度を測定する。精製したＳＡ−２４の一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。
ＳＡ−２４のラベル化を行うには、精製したＳＡ−２４の２μｇを用い、以下の表１に記載の組成を有する反応液において、ジゴキシゲニンラベルを施すとよい。
0003934605.tif 000002
表１において、Ｘは、プローブ原液の濃度に応じて上記好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量であり、この容量に伴い精製水量Ｙを決定して最終容量を調整する。
ラベル化後、反応液にＴＥを１００μｌ加えて反応を停止させる。反応停止液をスピンカラムに注入し、４℃、３８０×ｇで１０分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、ＴＥで１０ｎｇ／μｌに調製する。
ラベル化を確認するために、ラベルしたＳＡ−２４の０．５μｌをメンブレンに滴下し、風乾する。ブロッキング試薬にメンブレンを浸し、室温で３０分間ブロッキングする。０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムで５，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、メンブレンを室温で３０分間浸す。０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で１０分間振とうして２回洗浄する。０．５ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ９．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウムに、メンブレンを室温で１０分間浸す。発色試薬にメンブレンを室温で遮光下、１０分間浸す。メンブレンをＴＥに浸し、発色を停止させる。スポット下部分の青紫色の発色で、ラベル化の確認を行う。
スピンカラムを作製するには、１ｍｌのディスポーザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填する。１ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳで膨潤させたセファデックスＧ−５０をシリンジにつめる。１５ｍｌのディスポーザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、４℃、３２０×ｇで１０分間遠心分離し、余分の緩衝液を落とす。ディスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れて作製する。
プローブの特異性を確認するため、以下の手順に従って、ドットブロットハイブリダイゼーションを行うとよい。
まず、スポットした各ゲノムＤＮＡを変性するために、定法に従い０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製３ＭＭ）上に、調製した各種細菌ゲノム１００ｎｇをナイロンメンブレン（ポールバイオダインタイプＢ、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを１０分間静置する。次に、０．５ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液で飽和した前出の濾紙上に１０分間静置して変性ＤＮＡを中和する。さらに、２×ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）溶液で飽和した前記濾紙上に５分間静置し、リンスする。その後、メンブレンを風乾し、２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間浸透する。定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイブリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、４２℃、６０分間親和させる。プラスチックバッグ内で、プローブ４００ｎｇを含むハイブリタイゼーション溶液１５ｍｌ内にメンブレンを浸し、４２℃で、一晩反応させる。次に、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する（２回繰り返す）。その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液にメンブレンを浸し、６０℃、１０分間洗浄する（３回繰り返す）。２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する。メンブレンを３％ウシ血清アルブミン、１％ブロッキングバッファー（ベーリンガー社製）、０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、３０分間おだやかに振とうする。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）を、０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液で５，０００倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、３０分間おだやかに振とうする。次に、０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、１５分間振とうする（２回）。０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ９．５）、０．１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム溶液にメンブレンを浸し、５分間振とうする。ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液を、以下の表２に示す。
0003934605.tif 000003
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。
アニオン界面活性剤は、陰イオン界面活性剤とも呼ばれ、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。界面活性剤の分子中の親油基をＲとして表現すると、ＲＣＯＯＮａ、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａなどがある。ＲＣＯＯＮａのように弱酸性基を含有する界面活性剤の水溶液は加水分解しやすく弱アルカリ性であるが、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａなどの強酸性基を有する界面活性剤の水溶液は加水分解を受けにくく、中性となる。陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。
非イオン性界面活性剤は、親水基が非イオン性のものをいう。親水基として酸化エチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）が多用され、この基の数が多くなる程親水性が増す。反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。従って、親水性・親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ない為、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などに広く使用される。水溶性の非イオン性界面活性剤は温度が上昇すると、ある温度で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤ともいう。水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのアニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。また、繊維やプラスチックの帯電防止能もある。カチオン界面活性剤の代表的なもので、ドデシルトリメチルクロリド［Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ３）３Ｎ］Ｃｌは水溶性であるが、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド［（Ｃ１２Ｈ２５）２（ＣＨ３）２Ｎ］Ｃｌは水に溶解しにくく、水中では２分子膜状のベシクルを形成し、ベンゼンには溶解する。
両性界面活性剤は、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側ではアニオン界面活性剤として、酸性側ではカチオン界面活性剤として作用する。等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などに用いられる。
また、アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分けられ、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型およびアルカノールアミド型に分けられる。カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモニウム塩型に分けられ、両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型およびグリシン型に分けられる。
さらに、アニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、Ｎ−アシルサルコシン塩およびＮ−アシルグルタミン酸塩に細分される。それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩には、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用せっけんがあり、Ｎ−アシルサルコシン塩は、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩にＮ−ラウロイルグルタミン酸二ナトリウムがある。また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物およびＮ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩に細分される。代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩は、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルカンスルホン酸塩は、ドデカンスルホン酸ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩には直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸塩はブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩にはＮ−メチル−Ｎ−ステアロイルタウリンナトリウムがある。また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。代表例として、アルキル硫酸塩は、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびセチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミンがある。また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩に細分される。代表例を挙げると、アルキルリン酸塩には、モノラウリルリン酸二ナトリウムがある。ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル（８ＭＯＬ）がある。
非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンは、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンは、モノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。代表例を挙げると、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルエーテルがあり、また、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとして、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがある。また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。それそれの代表例は、脂肪酸ポリエチレングリコールは、オレイン酸ポリエチレングリコール、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートがある。また、アルカノールアミド型は、脂肪酸アルカノールアミドの１つのみである。代表例は、ラウリン酸ジエタノールアミドである。
カチオン界面活性剤のアルキルアミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩およびトリアルキルアミン塩があり、代表例は、モノステアリルアミン塩酸塩である。また、第四級アンモニウム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムおよび塩化アルキルベンザルコニウムに細分される。それぞれの代表例は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化アルキルベンザルコニウムは塩化ラウリルベンザルコニウムがある。
両性界面活性剤のカルボキシベタイン型は、アルキルベタインの１つのみである。代表例は、ラウリルベタインである。また、２−アルキルイミダゾリンの誘導型は、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインの１つのみである。代表例として、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが挙げられる。また、グリシン型は、アルキル（又はジアルキル）ジエチレントリアミノ酢酸があり、代表例として、ジオクチルジエチレントリアミノ酢酸が挙げられる。
さらに、上記代表例に加えて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ラウリルサルコシン、サポニン、ＢＲＩＪ３５、アルキルアリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクワラン、ステアリルアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セタノール、セトマクロゴール１０００、セバシン酸ジエチル、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル３５ヒマシ油、マクロゴール４００、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシルＬ−アルギニンエチル・ＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウロマクロゴール、メチルセルロース、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド、ノニデットＰ４０、ｎ−オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート等も挙げることができる。
上掲の各種界面活性剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程で使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。例えば、プローブ液またはプローブ希釈液中に混合されていても良いし、プローブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加しても良いし、当業者は適宜変更することができる。
なお、本発明において、陽性コントロールプローブが必要であれば、次のように作製することができる。例えば、まず、Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）のゲノムＤＮＡの抽出と精製を行うには、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ２）内のＲＰＭＩ１６４０培地（２５ｍｌ）を用い、Ｕ９３７細胞を培養する。Ｕ９３７培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収する。細胞を１０ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃、１８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞を回収する。その後、上清を捨て、細胞を１ｍｌの２００μｇ／ｍｌプロテネースＫ含有１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置する。フェノール抽出を３〜４回線り返し、除蛋白を行う。エタノール沈殿により析出したゲノムを回収し、５００μｌの２．５μｇリボヌクレアーゼ含有滅菌精製水に溶解し、４２℃で３０分間放置する。フェノール抽出を２〜３回繰り返し、除蛋白を行う。エタノール沈殿により析出したゲノムを回収し、５００μｌのＴＥに溶解する。その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コントロールプローブを作製することができる。また、陽性コントロールプローブは、Ｕ９３７ゲノムを１００ｎｇスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼーションするとき、ハイブリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。陰性コントロールプローブが必要であれば、公知の方法で作製することができる。
また、本発明には、食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因菌のＤＮＡを露出させる処理を施し、このＤＮＡにストリンジェントな条件下ハイブリダイゼーションできる検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、得られたシグナルにより感染症原因菌を検出および／または同定するためのキットであって、ＤＮＡ露出工程で使用される酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼからなる群より選択される少なくとも１種以上の酵素、界面活性剤が添加されたプローブ液、１種以上の検出用ＤＮＡプローブを有することを特徴とする、感染症原因菌を検出および／または同定するためのキットも含まれる。キットには、後出の実施例に示す、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液−１、発色前処理液−２、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、ＡＰＳコートスライドグラス、プローブ希釈液、バッファーＡ等が含まれる。これらのうち、少なくとも酵素試薬とプローブ液を具備することが好ましい。また、本発明に使用する各種試薬、例えば、クロロホルム、エタノール、無水酢酸、ＤＭＳＯ、ＰＭＳＦ、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等を含んでいても良い。
さらに、低速遠心機、恒温機、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、０．２μｍシリンジトップフィルターの機械や器具を含んでいても良い。
また、本発明は、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法を提供する。さらに、本発明は、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌が特定されることを特徴とする方法を提供する。
この方法を、様々なセプシスが疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約４倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになっている。そして、血液培養では検査に３日以上１４日程度を要するのに比較して、本発明の方法では全操作完了までに約８時間と極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができるので、特に敗血症または菌血症など、速やかな善処が必要とされる感染症の診断や予後診断のモニター等において有用マーカーとなり得る。
実  施  例
以下に、本発明を実施例に沿って具体的に説明するが、これら実施例の開示によって本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
実施例１：採血・血液検体の処理
臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液１２検体（検体Ａ〜Ｌ）を用いた。各患者からヘパリン加静脈血１０ｍｌを採取し、これら血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（分子量：２００，０００〜３００，０００）１．５ｇ、滅菌精製水にて全量２５ｍｌに調製したもの）を４：１の割合で混和した後、３７℃で、３０分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得した。この白血球画分を、４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離することで、白血球を得た。次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁し、直ちに過剰量のＰＢＳ（塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物１．１２３ｇ、滅菌精製水にて全量１２０ｍｌにしたもの（ＰＢＳ原液）を、滅菌精製水にて２０倍に希釈したもの）を加えて等張化した後、再度４℃で、１６０×ｇで１０分間遠心分離した。
実施例２：白血球の固定
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）がスライドグラス（日本エアーブラウン社製、商品番号ＭＳ３１１ＢＬ）にコートされたＡＰＳコートスライドグラスを使用した。ＡＰＳコートスライドグラスの作製は、まず、スライドホルダーにスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ）を固定した後、希釈した中性洗剤で３０分以上浸すことにより洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却した。その後、このスライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾した。さらに、再度、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で、順次軽く洗浄した後、風乾する操作を行った後、４２℃で乾燥させることにより作製した。
白血球画分を、４℃にて、１６０×ｇで１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。細胞数が１×１０５個／ウェルとなるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球をＡＰＳコートスライドグラスに支持させた。その後、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１の容量比で混合した液）に２０分間浸した後、７５％エタノール液に５分間浸し、完全に風乾させた。
実施例３：白血球細胞膜の透過性亢進処理
ＰＢＳに１０分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％）５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を滅菌精製水で１０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で１０分間浸透させた。
実施例４：菌体壁の溶菌酵素処理
感染症原因菌のＤＮＡを露出させるため、スライドグラス１枚につき酵素試薬（Ｎ−アセチルムラミダーゼ１，０００単位／ｍｌ、リゾチーム１００，０００単位／ｍｌおよび／またはリゾスタフィン１００単位／ｍｌ）に酵素試薬溶解液（ＰＢＳで０．１ｍｏｌ／ｌフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１００倍希釈して製したもの）を１ｍｌ加えて酵素試液を調製した後、３７℃〜４２℃の湿潤箱内で、酵素試液１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下し、３０分間静置した。その後、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて２０倍希釈し、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で１０分間浸透させた。
実施例５：細胞膜タンパク質のアセチル化
アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で１０倍希釈し、無水酢酸の終濃度を０．８％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で１０分間振とうすることにより行った。その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次、３分間ずつ浸し、完全に風乾させた。
実施例６：菌体ＤＮＡのアルカリ処理（二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性）
スライドグラスを、７０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌに調製したもの）に３分間浸すことにより行った。その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次、３分間ずつ浸し、完全に風乾させた。
実施例７：ハイブリダイゼーション
プローブ希釈液（０．２５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ  ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、ハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌが含まれる）で調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ１５ｎｇを含有する液（プローブ液；１．０ｎｇ／μｌ）を塗抹部位に塗布し、３７℃〜４２℃の湿潤箱中で２時間静置させた。ＳＤＳ無添加のプローブ液を対照とした。ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーション法にて作製した。その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇ、滅菌精製水にて全量７５ｍｌに調製したもの）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次、４２℃で１０分間ずつ浸した。
その後、ＰＢＳに浸して、そのまま振とう機上で１０分間振とうさせた。ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブとして、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対するプローブとして、ＳＡ−２４（配列番号：１）、ＳＡ−３６（配列番号：２）およびＳＡ−７７（配列番号：３）ならびにＳＥ−２２（配列番号：４）、ＳＥ−３（配列番号：５）およびＳＥ−３２（配列番号：６）（日本国特許第２７９８４９９号参照）の各プローブを利用した。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するプローブとして、Ｐ２−２（配列番号：７）（日本国特許第２９６５５４４号参照）のプローブを利用した。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに対するプローブとして、ＥＦ−１（配列番号：８）、ＥＦ−２７（配列番号：９）およびＥＦ−７（配列番号：１０）（日本国特許第２９６５５４３号参照）を利用した。そして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するプローブとして、ＥＣ−２４（配列番号：１１）、ＥＣ−３４（配列番号：１２）およびＥＣ−３９（配列番号：１３）ならびにＥＴ−４９（配列番号：１４）およびＫＩ−５０（配列番号：１５）（日本国特許第３０２６７８９号参照）を利用した。さらに、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対するプローブとして、ＣＡ−２６（配列番号：１６）、ＣＡ−２６−１（配列番号：１７）、ＣＡ−２６−２（配列番号：１８）およびＣＡ−２６−３（配列番号：１９）（日本国特許第２５５８４２０号参照）を利用した。これらプローブの配列を用いて、ニックトランスレーション法によりプローブの作製を行った。
実施例８：ブロッキング
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行った。湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌ、ＰＢＳ原液０．５ｍｌ、滅菌精製水にて全量１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、３０分間静置した。その後、ブロッキング試薬を除去した。
実施例９：標識抗体との反応
標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量０．７ｍｌに調製したもの）で５０倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、３０分間静置させた。その後、標識抗体洗浄液（ポリソルベート２０  １ｍｌ、ＰＢＳ原液５０ｍｌ、滅菌精製水にて全量１００ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に浸して、そのまま振とう機上で１０分間浸透させた。この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇ、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）とを等量混合し、滅菌精製水で５倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうさせた。
実施例１０：検  出
スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）溶液、ｐＨ９．０〜１０．０：ＮＢＴ  ３．３ｍｇ、ＢＣＩＰ  １．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、塩酸適量、塩化ナトリウム５８．４ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇ、滅菌精製水適量にて全量１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、３７℃、３０分間遮光静置した。その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇ、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に５分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇ、滅菌精製水適量にて全量５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液および１％酢酸溶液に浸した。その後、前記発色試薬洗浄液を１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗い流し、完全に風乾させた。
実施例１１：判  定
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）するとき、単一ウェル内で対比染色液によって染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが１つでも認められた場合に陽性と判定した。その結果、本発明の方法により、１２検体中５検体で菌を検出した。５検体の内訳は、検体Ａ−ＳＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、検体ＦおよびＧ−ＳＥ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、検体Ｊ−ＳＥおよびＥＦ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、検体Ｌ−ＳＡおよびＣＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であった。なお、同じ検体を用いて、公知の方法に従い血液培養を行ったところ、検体ＡはＳＡを検出し同一の結果を示したが、検体Ｆ、Ｇ、ＪおよびＬは菌を検出することができなかった。従って、本発明の方法が、血液培養と比較して、迅速に感度よく検出できることが判明した。
検体Ａ−ＳＡにおける結果に関し、プローブ希釈液へのＳＤＳの添加の効果を、第１図に示した。第１図から、ＳＤＳを０．２５％添加することで、シグナルの検出感度が格段に高められることが明らかである。その他の検体についても同様に、ＳＤＳを添加することで良好なシグナル検出が可能となった。なお、本実施例において使用したプローブは、ＳＡ−２４（配列番号：１）、ＳＡ−３６（配列番号：２）およびＳＡ−７７（配列番号：３）の塩基配列を組み合わせて用い、ニックトランスレーションによって作製したプローブである。
実施例１２：塗抹固定する至適白血球数の検討
ＡＰＳコートスライドグラスのウェル（直径５ｍｍの円形ウェル）に塗抹する至適白血球数を検討した。ヘパリン加健常ヒト血液１０ｍｌを採取し、実施例１に記載の手順に従って白血球を採取した。次に、得られた白血球を適量のＰＢＳで懸濁した後、血球計算盤を用いて１ｍｌ当たりの白血球数を測定し、（ａ）１×１０８個／ｍｌを始点として、（ｂ）５×１０７個／ｍｌ、（ｃ）１×１０７個／ｍｌ、（ｄ）５×１０６個／ｍｌ、（ｅ）１×１０６個／ｍｌ、（ｆ）５×１０５個／ｍｌおよび（ｇ）１×１０５個／ｍｌの希釈系列を作成した後、各々５μｌをスライドグラスに塗抹した。風乾後、カルノア固定（実施例２参照）を行い、直ちに前記対比染色液で染色し、実施例１１に記載した方法を用いて判定した。その結果、細胞数が１×１０８個／ｍｌでは細胞数が過剰であり、検出不適であった。また、５×１０６個／ｍｌ以下では、ウェルに観察される細胞数が少なく、検出不適であった。よって、固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）としては、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌ、とりわけ、約１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦約５×１０７個／ｍｌが好ましい。また、それに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、約２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ）＜約５×１０５個／ウェル、好ましくは、約５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ）≦約２．５×１０５個／ウェルとなるように調製するのが良いことが判明した。試料（ａ）〜（ｆ）に関する実験結果を、第２図（ａ）〜（ｆ）にそれぞれ示した。
実施例１３：使用溶菌酵素の選択
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ  １２６００）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ  １４９９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １０１４５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １９４３３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ  １１７７５）を溶菌する酵素条件を検討した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでは、溶菌酵素としてリゾスタフィン（Ｂｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８，２９３−３００，１９７３）を使用した。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓには、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（Ａｒｃｈｓ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．，２３，５４３−５４９，１９７８）、リゾチーム（生化学工業）を使用した。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉについては、７０ｍｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム含有ＰＢＳを使用した。これら各種細菌を５ｍｌのＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）液体培地（ＤＩＦＣＯ社製）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集めた菌をＰＢＳで懸濁して試料とした。
溶菌はマイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける菌液の濁度の減少により評価した。その結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、リゾスタフィンにより溶菌した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉについては、７０ｍｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム含有ＰＢＳで溶菌したため、酵素処理は必要としなかった。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ単独よりもリゾチームと併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。また、貪食作用を受けて取り込まれた菌が、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどである場合には、アルカリ処理に際して菌の細胞壁が溶解され、遺伝子が露出した状態となるので、必ずしもこの酵素処理を行う必要はない。本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処理用の各酵素は、前述した細菌株に対して有効であるのみならず、他のスタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、バシルス属およびミクロコッカス属を初めとする他の菌種等でも有効である。また、かような酵素は、各々単独で用いることもできるが、混合した場合の方が有効である。それら結果を、第３図、具体的には、（ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、（ｂ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ならびに（ｃ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓについて示した。
実施例１４：酵素溶解液に関する検討（ＤＭＳＯの至適濃度の検討）
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、白血球の形態を劣化させることから、白血球の形態を保持させるために添加するＰＭＳＦの溶解剤であるＤＭＳＯの酵素活性に及ぼす影響を検討した。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを、５０ｍｌの前記ＢＨＩ液体培地に植菌し、３７℃で、８時間以上培養した。この培養液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌し、ＰＢＳで懸濁した後、オートクレーブ（１２０℃、１０分）により熱処理を行った。次に、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌのＰＢＳで沈渣を懸濁させた後、凍結乾燥させた。この凍結乾燥試料を０〜１０％ＤＭＳＯ含有５ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ６．０）、２ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウムで懸濁し、Ｎ−アセチルムラミダーゼに対する試料とした。また、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ（ＪＣＭ１４６４）を、５ｍｌのＢＨＩ液体培地（前出）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨て、菌のペレットをＰＢＳ  ５ｍｌで懸濁洗浄し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。このようにして集めた菌を、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾチームに対する試料とした。一方、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓをリゾチームの場合と同様に培養、集菌し、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾスタフィンに対する試料とした。酵素活性は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける試料の濁度の減少により評価した。ただし、本試験中それぞれの酵素力価は、（ａ）Ｎ−アセチルムラミダーゼ３００単位／ｍｌ、（ｂ）リゾチーム１０，０００単位／ｍｌ、（ｃ）リゾスタフィン５０単位／ｍｌとし、酵素活性に対するＤＭＳＯの影響を検討した。それぞれの酵素活性を単位時間当たりにおける菌濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）の減少で評価した結果、ＤＭＳＯは、Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、リゾチームおよびリゾスタフィンに対しては、共に５％以上のＤＭＳＯで活性の低下が認められた。また、２％以下のＤＭＳＯの濃度では、酵素活性の低下は認められなかった。ゆえに、ＰＭＳＦを溶解させるＤＭＳＯ濃度は少なくとも５％未満、好ましくは２％以下、さらには１％程度とするのが好ましい。その結果を、第４図（ａ）〜（ｃ）および下記表３に示した。
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実施例１５：酵素溶解液に関する検討（ＰＭＳＦの至適濃度の検討）
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させることから、白血球の形態を保持させるために添加するＰＭＳＦ（ＰＩＥＲＣＥ社製）の効果を検討した。１００μｌのＤＭＳＯ（和光純薬社製）にＰＭＳＦを溶解し、ＰＭＳＦの終濃度が無添加（０ｍｍｏｌ／ｌ）〜１ｍｍｏｌ／ｌとなるようにＰＢＳで１０ｍｌに希釈した。この溶液に、プロテアーゼの力価が０．２単位／ｍｌとなるよう、プロテイネースＫ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加した。ヘパリン加健常ヒト血液５ｍｌを採取し、実施例１に記載の方法に従って白血球を採取した。次に、白血球を適当量のＰＢＳで懸濁して、血球計算盤で細胞数を計測し、細胞数を、約５×１０４個／ウェル〜約２．５×１０５個／ウェルに調製し、その５μｌをＡＰＳコートスライドグラスのウェルに塗抹し、風乾後、実施例２に記載のカルノア固定の方法に従って固定した。このサンプルを用いて、実施例３〜１１に記載の方法に従って試験を行った。１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌのＰＭＳＦの濃度で試験を実施した結果、１０μｍｏｌ／ｌ以上の濃度で効果が認められ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上のＰＭＳＦ濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。その結果を、第５図の（ａ）プロテアーゼ０．２単位／ｍｌのみ、（ｂ）ＰＭＳＦ  １μｍｏｌ／ｍｌ添加、（ｃ）ＰＭＳＦ  １０μｍｏｌ／ｍｌ添加、（ｄ）ＰＭＳＦ  ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ添加、および（ｅ）ＰＭＳＦ  １ｍｍｏｌ／ｍｌ添加についてそれぞれ示した。
実施例１６：溶菌酵素ザイモラーゼの至適力価の検討
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を溶菌してＤＮＡを露出させるためのザイモラーゼの至適力価を検討した。カンジダ・アルビカンスをＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で一昼夜培養した。その後、基質としてカンジダ・アルビカンスをＰＢＳで懸濁した溶液（基質１）、およびカルノア固定後、７０％エタノールに浸し、風乾し、ＰＢＳにて懸濁した溶液（基質２）の２種類を調製した。反応は、ザイモラーゼ／ＰＢＳ：０．５ｍｌ、基質：１．５ｍｌ、Ｍ／１５リン酸緩衝液：２．５ｍｌ、滅菌精製水：０．５ｍｌにて全量５．０ｍｌに調製したものを用いた。
その後、３７℃で、２時間反応させ、そのＯＤ８００を測定した。また、ザイモラーゼ（ザイモリエイス−１００Ｔ）濃度は、０ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌを用いた。その結果、基質１を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．５３３、０．５２１、０．５５３、０．５５４、０．５４８、０．４１７、０．３９４、０．２８８、０．１６３、０．１１３であり、また、基質２を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．４４５、０．４１１、０．３５９、０．２８２、０．２３２、０．１４６、０．１１５、０．０９６、０．０８、０．０５７であった。基質１および基質２がともに、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、特に、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で有効であることが判明した。すなわち、ザイモラーゼの使用量は、５０単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌ、特に１００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌであることが好ましい。
実施例１７：至適酵素処理条件（力価）の検討
（１）貪食サンプルの作製
▲１▼Ｕ９３７細胞の調製
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ２）中のＲＰＭＩ１６４０培地（２５ｍｌ）でＵ９３７細胞（ヒト単球株化細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）を培養した。次に、Ｕ９３７細胞培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収した。その後、回収したＵ９３７細胞をＰＢＳ２００μｌで懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を１×１０４個／μｌ〜２×１０４個／μｌに調製した。
▲２▼細菌貪食サンプルの調製
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ  １２６００）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ  １４９９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １０１４５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １９４３３）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ  １１７７５）を、各々５ｍｌのＢＨＩ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットをＰＢＳ  ５ｍｌで懸濁し、再度、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集菌した菌をＰＢＳ  ５ｍｌで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（０．０１〜０．０３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｓ（０．０１〜０．０３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（０．０２〜０．０３）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（０．０１〜０．０３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（０．０２〜０．０３）にそれぞれ調製したものを１５ｍｌ作製した。作製した菌液は、個別の１７５ｃｍ２の培養用フラスコに移し、３０分間室温で静置した。ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍｌを採取し、血球分離試薬を４：１の割合で加え、３７℃で３０分間静置し、白血球画分を分取した。分取した白血球画分をＰＢＳで５０ｍｌにした。培養用フラスコ（前出）の上清を静かに捨て、ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍｌずつフラスコに加え、室温で１０分間静置した。培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ１０ｍｌで１５ｍｌの遠沈管に回収し、４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められたので、滅菌精製水１ｍｌにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳを１４ｍｌ加えて等張化を行い、再度４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集した。収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μｌ〜５×１０４個／μｌに調製した。この貪食サンプルを、それぞれＳＡ貪食サンプル、ＳＥ貪食サンプル、ＰＡ貪食サンプル、ＥＦ貪食サンプル、ＥＫ貪食サンプルとした。
▲３▼塗抹固定
実施例１７（１）▲１▼で調製したＵ９３７細胞と、実施例１７（１）▲２▼で作製した各細菌貪食サンプルとをＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに５μｌずつ塗抹し、風乾させた。次に、実施例２に記載のカルノア固定液に２０分間浸した後、７５％エタノールに５分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで４℃で保存した（実施例２参照）。次いで、固定サンプルの前処理を、実施例３に従って行った。
（２）貪食サンプルの規格及び試験方法
▲１▼細  胞  数
各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定する細胞の数を、５．０×１０４〜２．５×１０５個／ウェルとし、また、Ｕ９３７細胞の細胞の数を５．０×１０４〜１．０×１０５個／ウェルとした。
▲２▼貪  食  率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルを、アクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（×１，０００）で無作為に約２００個の細胞を計測した。計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞（第６図で矢印にて示す、貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞）を陽性細胞とし、以下の数式に従ってその貪食率（％）を算出した。
貪食率（％）＝［（陽性細胞数／計測細胞数）×１００］
この時に算出した各細菌貪食サンプルの貪食率（％）は、１０％以上であった。
▲３▼試験方法
実施例１７（２）▲１▼および▲２▼で作成した貪食サンプルを検体とした。使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２３％であり、１．９８×１０５個／ウェルであった。ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２７％であり、１．７４×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、６．４０×１０４個／ウェルであった。
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例３に記載の方法に従って、酵素前処理を行った。次に、酵素前処理済みのスライドグラスを湿潤箱に置き、各種力価に調製した各酵素溶液１ｍｌを検体塗抹部位に滴下して反応させた。その後、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸含有ＰＢＳ、７０％エタノールにそれぞれ１０分間浸し、風乾させた。このスライドグラスを、７０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム含有ＰＢＳに３分間、７０％エタノールに１０分間浸した後に風乾し、１％アクリジンオレンジ染色液で染色した。その後、蛍光顕微鏡（×１，０００）により評価した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、リゾスタフィンで至適力価の検討を行った。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓは、Ｎ−アセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討するため、Ｎ−アセチルムラミダーゼを１００単位／ｍｌに固定した場合のリゾチーム至適力価の検討と、リゾチームを１０，０００単位／ｍｌに固定した場合のＮ−アセチルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。判定は、酵素処理により菌体が白血球中に確認されなくなるとき「適」とした。
▲４▼結  果
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの溶菌においては、表４に記載のように、リゾスタフィンの力価は１単位／ｍｌで十分効果を示すが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの溶菌においては、１０単位／ｍｌ以上のリゾスタフィン力価が必要であった。ゆえに、リゾスタフィンの至適力価を、１０単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌに設定した。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの溶菌においては、リゾチームの力価を１０，０００単位／ｍｌで固定したとき、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価が１０単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった。リゾチームについては、表５に記載の通り、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価を１００単位／ｍｌに固定したとき、リゾチーム力価が１，０００単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった。ゆえに、Ｎ−アセチルムラミダーゼの至適力価は、１００単位／ｍｌ〜１，０００単位／ｍｌ、また、リゾチームの至適力価は、１０，０００単位／ｍｌ〜１００，０００単位／ｍｌに設定した。その結果を、第７図に示すが、図中、（ａ）は酵素処理前のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの貪食サンプル、（ｂ）は処理前のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの貪食サンプル、（ｃ）はサンプル（ａ）を酵素処理した後、および（ｄ）はサンプル（ｂ）を酵素処理した後の様子を示している。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各酵素の至適力価も同一とした。
実施例１８：至適酵素処理条件（温度）の検討
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１７（２）▲３▼に記載の方法に準じて検討した。ただし、本試験の酵素処理時間は３０分、検討温度は４℃、２５℃、３７℃、４２℃、６０℃とし、また、各酵素力価は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社製）とした。
判定は、実施例１７（２）▲３▼に記載の方法に準じて行った。その結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、４℃〜６０℃の温度範囲で白血球の菌体は確認されなかった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、処理温度４℃および２５℃では白血球中の菌体が残存していたが、３７℃以上では菌体が確認されなかった。
また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓでは、処理温度４℃、２５℃および６０℃で菌体が残存していたが、３７℃および４２℃では確認されなかった。ゆえに、至適酵素処理温度を３７℃〜４２℃に設定した。その結果を、表６に示した。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適温度も同一とした。
実施例１９：至適酵素処理条件（時間）の検討
実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。検討した時間は、０分、１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分とした。使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は１８％であり、７．８０×１０４個／ウェルであった。ＳＥ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、１．１０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、１．３０×１０５個／ウェルであった。各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１７（２）▲３▼に記載の方法に準じて検討した。但し、本試験の酵素処理温度は３７℃、各酵素力価はＮ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ）とした。判定は、実施例１７（２）▲３▼に記載の方法に準じて行った。その結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ貪食サンプルともに酵素処理時間２０分以上（０分および１０分においては不適であった）で、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも１５分以上、好ましくは２０分以上、さらに至適酵素処理時間を３０分〜６０分とするのが好ましい。その結果を、表７に示した。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。
実施例２０：プローブ濃度の検討
本発明のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応において、プローブ濃度はハイブリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。プローブ濃度が低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。また、過剰量のプローブの使用は、非特異的反応の原因に繋がる。
ゆえに、各種プローブ液について、至適濃度を検討した。まず、実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、１．４８×１０５個／ウェルであった。ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、２．０７×１０５個／ウェルであった。ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１１％であり、１．５９×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、１．７２×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１２％であり、１．６３×１０５個／ウェルであった。各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１７（２）▲３▼に記載の方法に準じて検討した。プローブは、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対する各プローブ濃度を、それぞれ、０．０６ｎｇ／μｌ、０．６ｎｇ／μｌ、１．２ｎｇ／μｌ、１．８ｎｇ／μｌ、２．４ｎｇ／μｌ、３ｎｇ／μｌに調製した。貪食サンプルを塗抹したスライドグラス（第８図参照）に、上記各種濃度に調製したプローブ液を使用し、実施例３〜１１に記載の方法に従い検討した。
その結果、低濃度（０．０６ｎｇ／μｌ）ではシグナルが明確でなくなり、一方で、高濃度（２．４ｎｇ／μｌおよび３ｎｇ／μｌ）ではバックグラウンドの増大が認められた。ゆえに、ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ濃度を０．６〜１．８ｎｇ／μｌ、好ましくは０．６〜１．２ｎｇ／μｌとした。また、０．０６ｎｇ／μｌにおいては不適であり、０．６ｎｇ／μｌにおいては適であったことから、少なくとも０．１ｎｇ／μｌ以上とするのが好ましい。
さらに、２．４ｎｇ／μｌにおいては不適であり、１．８ｎｇ／μｌにおいては適であったことから、２．２ｎｇ／μｌ以下とするのが好ましい。その結果を、以下の表８〜表１２に示した。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各プローブの至適濃度も同一とした。
実施例２１：ハイブリダイゼーション温度の検討
ハイブリダイゼーション反応における反応温度は、ハイブリッド形成速度とハイブリッドの安定性に影響を与えるパラメーターである。ハイブリダイゼーション反応を高温にすると細胞の形態が劣化することが知られていることから、至適温度の検討（４℃、２５℃、３７℃、４２℃、５０℃、６０℃）を行った。
まず、実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は３１％であり、１．３８×１０５個／ウェルであった。ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４２％であり、１．９５×１０５個／ウェルであった。ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１４％である、１．２７×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４８％であり、１．０５×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１７％であり、１．８５×１０５個／ウェルであった。
貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（第９図参照）を使用して、実施例３〜１１に記載の方法に従い検討した。その結果、ハイブリダイゼーション温度が４℃以下ではハイブリッド形成速度が低下し、各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。また、６０℃においては細胞形態の変化が認められ、安定なシグナルが観察されなかった。
また、２５℃および５０℃では３７℃および４２℃に比べ、シグナルが明確でなかったが検出することは可能であった。ゆえに、至適ハイブリダイゼーションの温度は、２５℃〜５０℃、より好ましくは３７〜４２℃に設定すると良い。それら結果を、以下の表１３〜表１７に示した。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同一とした。
実施例２２：ハイブリダイゼーション時間の検討
実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とし、１０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、９００分間のハイブリダイゼーション時間について検討した。使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、１．４５×１０５個／ウェルであった。ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、１．３３×１０５個／ウェルであった。ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１５％である、１．９１×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４１％であり、１．４５×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は２０％であり、１．２３×１０５個／ウェルであった。
貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（第９図に示すものに同じ）を使用して、実施例３〜１１に記載の方法に従い検討した。
その結果、ハイブリダイゼーション時間が１０分ではシグナルが観察されなかったが、６０分以上でシグナルが観察され、９０分以上で安定したシグナルが観察された。また、ハイブリダイゼーション時間が９００分においてもシグナルの検出には変化は認められなかった。ゆえに、少なくとも３０分以上、好ましくは６０分以上、より好ましくは９０分以上とするのが好ましい。さらに好ましい至適ハイブリダイゼーション時間は、１２０分〜９００分に設定すると良い。それら結果を、以下の表１８〜表２２に示した。
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貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適時間も同一とした。
実施例２３：ハイブリダイゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響
実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。プローブ希釈液に各種界面活性剤（ＳＤＳ、ラウリスサルコシン、サポニン、ＢＲＩＪ  ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加し、実施例７に従ってハイブリダイゼーションを行ったところ、０．２５％のＳＤＳを添加することにより検出感度が飛躍的に増強された。また、ラウリルサルコシン、ＢＲＩＪ  ３５、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）によって検出感度を高めることができた。その結果を、以下の表２３に示した。
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さらに、ＳＤＳを種々の濃度で用いた結果、好ましい濃度は、１％以下、より好ましくは０．１％〜０．５％、さらに好ましくは０．２５％であることが明らかになった。
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明においてもｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程に界面活性剤、特に、ＳＤＳを添加するのが好ましい。
実施例２４：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブ鎖長の検討
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプローブ（ＳＡ−２４（配列番号：１））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａプローブ（Ｐ２−２（配列番号：７））を、ジゴキシゲニンでラベル化した。
まず、精製した各種ＤＮＡプローブ１μｇを、１０×Ｌ．Ｂ．（０．５ｍｏｌ／ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）５μｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、０．５ｍｇウシ血清アルブミン）５μｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール５μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ａ、Ｇ、Ｃ）各１ｎｍｏｌ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）０．５ｎｍｏｌ、ｄＴＴＰ各０．５ｎｍｏｌ、ＤＮａｓｅ３μｌ（２５ｍＵ、７５ｍＵおよび２００ｍＵ相当量）、１０Ｕ／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ１μｌおよび滅菌精製水適量にて全量５０μｌとなるように調製した。１５℃、２時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。ラベル化後、５分間煮沸し反応を停止させた。反応停止液をスピンカラム（ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ  ＣＯＬＵＭＵＮＳ  ＣＳ９０１、ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．）に注入し、２５℃で２分間遠心分離（３，０００×ｇ）を行い、遊離のヌクレオチドを除去した。その後、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、３％アガロースゲルにて電気泳動しサイズを確認した。
次に、サザンブロッティング法によりアガロースゲル内のＤＮＡをニトロセルロース膜に転写させた。その後、２％ブロッキング試薬（ロシュ社製）に３０分間浸した後、１／５，０００量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加え、３０分間浸した。次に、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうし、２回洗浄した。その後、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ９．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうして洗浄した。その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液に浸して発色させた。
最後に、精製水に浸し発色を止めて乾燥させた。その結果、第１０図の（ａ）ＳＡプローブ使用時および（ｂ）ＰＡプローブ使用時についてそれぞれ示すように、２５ｍＵのＤＮａｓｅ（図中、レーン１）を用いて、その鎖長が、主として約３５０〜約６００塩基長に分布するように切断した場合に、ラベル効率が高いことが示された。こうして得られた検出用プローブを、貪食サンプルや感染症患者からの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用し、ハイブリダイゼーションを行ったところ、優れた感度でシグナルが検出された。従って、ハイブリダイゼーションに使用するプローブの鎖長は、約３５０〜約６００の塩基長、好ましくは、約３５０〜約５５０の塩基長とすることが良いものと判明した。
実施例２５：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブの検討
実施例１７（１）▲１▼および▲２▼に記載の方法で作成した、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの貪食サンプルを検体として、検出用プローブについての検討を行った。
検出用プローブは、ＥＣ−２４（配列番号：１１）、ＥＣ−３４（配列番号：１２）およびＥＣ−３９（配列番号：１３）から、実施例２４に記載したようにジゴキシゲニンラベル化し、約３５０〜約６００塩基長を有するように調製したものを、それぞれ単独または３種を組み合わせて使用した。得られた結果から、第１１図に示すとおり、（ａ）ＥＣ−２４、（ｂ）ＥＣ−３４または（ｃ）ＥＣ−３９のそれぞれを単独で検出用プローブとして用いるよりも、（ｄ）これらを混合してなる混合プローブ「ＭＩＸ」の方がシグナルが明瞭に検出され、感度が高められることが明らかであった。
産業上の利用可能性
本発明の方法におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、２時間以下でも安定なシグナルを観察することができるので、評価判定を非常に迅速に得ることができる。このような時間短縮は、敗血症の迅速な診断に適用する価値を実証するものに他ならない。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを（ａ）界面活性剤（ＳＤＳ）不使用下および（ｂ）界面活性剤（ＳＤＳ）使用下で実施した結果を示す図である。
第２図は、種々の白血球細胞密度で固定した際の様子を示す図である。
第３図は、（ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、（ｂ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ならびに（ｃ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに対する溶菌酵素の活性を経時的に示す図である。
第４図は、（ａ）Ｎ−アセチルムラミダーゼ３００単位／ｍｌ、（ｂ）リゾチーム１０，０００単位／ｍｌ、および（ｃ）リゾスタフィン５０単位／ｍｌの溶菌活性に対するＤＭＳＯの添加による濃度依存的効果を示す図である。
第５図は、白血球に形態劣化をもたらすプロテアーゼの作用を抑制するために用いるＰＭＳＦの添加効果を、（ａ）プロテアーゼ０．２単位／ｍｌのみ、（ｂ）ＰＭＳＦ  １μｍｏｌ／ｍｌ添加、（ｃ）ＰＭＳＦ  １０μｍｏｌ／ｍｌ添加、（ｄ）ＰＭＳＦ  ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ添加、および（ｅ）ＰＭＳＦ  １ｍｍｏｌ／ｍｌ添加について示す図である。
第６図は、本発明に従って調製した貪食サンプルにおいて、食細胞が細菌を貪食して形態変化を起こしていることを示す図である。
第７図は、貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図で、（ａ）酵素処理前のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの貪食サンプル、（ｂ）酵素処理前のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの貪食サンプル、（ｃ）サンプル（ａ）を酵素処理した後の様子、および（ｄ）サンプル（ｂ）を酵素処理した後の様子を示す図である。
第８図は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適プローブ濃度の検討のために用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。
第９図は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適温度の検討のために用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。
第１０図は、（ａ）ＳＡプローブおよび（ｂ）ＰＡプローブのジゴキシゲニンラベル化で得られる検出用プローブの鎖長とラベルによるシグナル強度を示すサザンブロット（上段）および電気泳動（下段）の図である。
第１１図は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ貪食サンプルに関するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、検出用プローブとして、（ａ）ＥＣ−２４、（ｂ）ＥＣ−３４、（ｃ）ＥＣ−３９、および（ｄ）プローブ（ａ）〜（ｃ）の混合プローブ（ＭＩＸ）を用いた場合に認められたシグナル検出の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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