(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン転移能検出剤であって、ガレクチン９に対する抗ガレクチン９抗体を有効成分として含むこと、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とするガン転移能検出剤。
【請求項２】
上記ガンが、少なくとも皮膚ガン、メラノーマ、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝細胞癌、肝内胆管ガンを含む肝ガン、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫及び悪性脳腫瘍から成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１記載のガン転移能検出剤。
【請求項３】
上記ガン細胞が、乳ガン細胞又は黒色腫細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のガン転移能検出剤。
【請求項４】
免疫学的方法を用いて、被検試料中のガレクチン９を定量し、その結果を利用してガン転移能を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載のガン転移能検出剤。
【請求項５】
免疫学的方法が、組織あるいは細胞染色を含む免疫染色、免疫電子顕微鏡、RIA, EIA, FIA, LIA及びサンドイッチアッセイを包含し且つ競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイを含むイムノアッセイから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一記載のガン転移能検出剤。
【請求項６】
固相化された抗ガレクチン９抗体を有効成分として含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のガン転移能検出剤。
【請求項７】
標識抗ガレクチン９抗体を有効成分として含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のガン転移能検出剤。
【請求項８】
ガン転移能検出剤であって、ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として含むこと、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とするガン転移能検出剤。
【請求項９】
該核酸が、標識されていてもよく且つガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションするプローブであることを特徴とする請求項８記載のガン転移能検出剤。
【請求項１０】
該核酸が、ポリメラーゼ  チェイン  リアクション(PCR)により、ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸を増幅できるプライマーであることを特徴とする請求項８記載のガン転移能検出剤。
【請求項１１】
in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT-PCR、Real-Time PCR及びDNAアレイ解析から成る群から選ばれた方法でガレクチン９発現遺伝子を測定及び／又は検知することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一記載のガン転移能検出剤。
【請求項１２】
ガン転移能検出法であって、請求項１〜１１のいずれか一記載のガン転移能検出剤を使用して、生体由来試料を測定すること、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とするガン転移能検出法。
【請求項１３】
被検試料中のガレクチン９あるいはガレクチン９発現遺伝子を測定、検知又は定量し、その結果を利用してガン転移能を検出すること、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とするガン転移能検出法。
【請求項１４】
検体試料中のガレクチン９の発現量あるいはガレクチン９発現遺伝子量を測定し、該測定で得られた発現量あるいは発現遺伝子量の値が、一定の閾値より下回るか否かを比較すること、並びに
該ガレクチン９の発現量あるいは発現遺伝子量の測定を（１）ガレクチン９に対する抗ガレクチン９抗体を有効成分として含む組成物あるいは（２）ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として含む組成物を使用して行うことを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一記載の方法に用いる試薬セット又はシステムであり、（１）ガレクチン９に対する抗ガレクチン９抗体あるいは（２）ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として含むこと、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とする試薬セットあるいはシステム。
【請求項１６】
ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーとして使用すること、そしてガンが、上皮性悪性腫瘍及び腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む非上皮性悪性腫瘍を包含する、臓器、組織及び血液の悪性腫瘍から選ばれたものであることを特徴とするガン転移能検出法及び／又はガン転移能測定法。
【請求項１７】
ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子を予後のガン転移能のマーカーとして使用することを特徴とする請求項１７記載のガン転移能検出法及び／又はガン転移能測定法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ガン細胞が転移能を有するか否か、及び当該ガン細胞の転移能の度合いを評価することを可能とするガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムに関する。
また、本発明は、ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用することにも関し、それに関連した測定・検出試薬、測定・検出方法及びそれに利用するシステムにも関する。
背景技術
ガン細胞は、旺盛な増殖能を有するだけでなく、自ら組織を破壊し、隣接する組織に浸潤し、さらに血管或いはリンパ管に浸潤する浸潤能もまた有する。そして、ガン細胞は、血液或いはリンパ液の流れにのって遠く離れた組織に転移する転移能もまた有する。このようなガン細胞の転移は、最終的には予後不良を引き起こす要因となる。したがって、従来よりガンの転移に関する研究がなされてきた。ガン転移の研究において、１９９２年から１９９３年にかけて、細胞接着因子であるカドヘリンの低発現或いは不活性化と高転移性との関連性が報告された。カドヘリンのなかでもＥ−カドヘリンは、上皮系細胞に発現するＣａ依存性の細胞間接着分子として知られており、ガン転移メカニズムを解明する目的で解析されている。しかしながら、ガン転移のメカニズムに関しては、Ｅ−カドヘリンのみによって十分に説明することはできず、他の要因が深く関与していると示唆されている。ところが、ガン転移に関与する具体的な要因についての報告はなく、ガンの転移を確実に予見することは困難な状況である。言い換えると、これまでガン細胞の転移能を高精度に判断することはできないといった問題点があった。
発明の開示
そこで、本発明は、ガン細胞の転移メカニズムの一端を解明することによって、ガン細胞の転移能を判断することを可能とするガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムを提供することを目的とする。上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、ガン細胞の転移能にはガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）が深く関与しており、ガン細胞におけるガレクチン９の発現を測定することによって、当該ガン細胞の転移能を高精度に検出できることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に係るガン転移能検出剤は、（１）ガレクチン９に対する抗ガレクチン９抗体又は（２）ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として含むことを特徴とするものである。また、ガン細胞はガレクチン９あるいはガレクチン９発現遺伝子を検出してそのガン転移能との相関関係を明らかにできるものであれば特には限定されないが、各種の臓器・組織の悪性腫瘍が挙げられ、例えば乳ガン細胞又は黒色腫細胞が挙げられる。本発明に係るガン転移能検出剤は、特に、乳ガン細胞又は黒色腫細胞における転移能を検出する際に好適である。また、本発明は、被検試料中のガレクチン９あるいはガレクチン９発現遺伝子を測定、検知又は定量し、その結果を利用してガン転移能を検出することを特徴とする、ガン転移能検出法、及びそれに使用するシステム（試薬セットを含む）を提供する。該システムにはガン転移能検出に必要とされる試薬の一部あるいは全てのものがセットで含まれるものであってよく、さらにそのプロトコルを説明する書類が添付されるものであってよいし、ＤＮＡアレイなどのデバイス、装置などであってよく、本明細書中では同様な意味で解してよい。本発明のガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムは、予後のガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムとしても有用であることは理解されるべきである。
本発明は、ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用することを特徴とするガン転移能検出剤あるいは腫瘍検出及び／又は測定剤、ガン転移能検出法あるいは腫瘍検出及び／又は測定法、さらにはガン転移能検出あるいは腫瘍検出及び／又は測定試薬セットあるいはシステムを提供する。また、本発明は、ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子を予後のガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用することを特徴とするガン転移能検出剤あるいは腫瘍検出及び／又は測定剤、ガン転移能検出法あるいは腫瘍検出及び／又は測定法、さらにはガン転移能検出あるいは腫瘍検出及び／又は測定試薬セットあるいはシステムを提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明に係るガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステム、さらにはガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用する技術について詳細に説明する。
転移をする腫瘍は悪性腫瘍で、一般的にその悪性腫瘍は上皮性と非上皮性のものがあるとされ、ある場合には、ガン、肉腫、白血病などに区分して考えられることもあるが、単に「ガン」と呼んだ場合、一般人では悪性腫瘍を指すことが多い。本明細書で「ガン」とは、広い意味で解釈してよく、単に上皮性の悪性腫瘍と解釈すべきではない。本明細書において「ガン」とは、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍（腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む）を包含していてよく、皮膚ガン（メラノーマを含めてよい）、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝ガン（肝細胞癌、肝内胆管ガンを含む）、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脳腫瘍（メニンギオーマ、グリオーマ、アストロサイトーマなどを含む）等が挙げられるが、これらに限定されることなく、ガレクチン９を検出してそのガン転移能との相関関係を明らかにできるものであれば特には限定されないことは理解されるべきである。
一つの態様では、本発明に係るガン転移能検出剤は、抗ガレクチン９抗体を有効成分として含むものである。ここで、抗ガレクチン９抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のガレクチン９ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、天然型のＭ型ガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  ｍｅｄｉｕｍ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｒ  ｍｅｄｉｕｍ  ｔｙｐｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）ポリペプチド又は天然型のＬ型ガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  ｌｏｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｒ  ｌｏｎｇ  ｔｙｐｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）ポリペプチドを特異的に識別できるものであり、例えば、Ｌ型ガレクチン９ポリペプチドやＭ型ガレクチン９ポリペプチドとＳ型ガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  ｓｈｏｒｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｔｙｐｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）ポリペプチドとを区別して認識できるものである。
抗ガレクチン９抗体をポリクローナル抗体として得るためには、免疫源であるガレクチン９あるいはそのフラグメント、ガレクチン９配列の一部のペプチドを哺乳動物、鳥類などに免疫し、当該哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取する。そして、この抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。
このガレクチン９を感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、当該動物から採血した血液から調製することができる。得られた抗血清は、ガレクチン９を特異的に認識するものであることを確認した後、ガン転移能検出剤として供される。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるガレクチン９は、公知のガレクチン９遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得ることができる。なお、Ｌ型ガレクチン９のアミノ酸配列を配列番号１に、またＭ型ガレクチン９のアミノ酸配列を配列番号２に、さらにＳ型ガレクチン９のアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。すなわち、ガレクチン９あるいはその一部のドメイン、ガレクチン９の一部のタンパク質あるいはポリペプチドフラグメント、ガレクチン９のアミノ酸配列に相当する一部のアミノ酸配列を持つペプチドをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のガレクチン９タンパク質あるいはその一部のドメインタンパク質、ガレクチン９の一部のタンパク質あるいはポリペプチドフラグメント、ガレクチン９のアミノ酸配列に相当する一部のアミノ酸配列を持つペプチドを公知の方法で精製する。
遺伝子組換え技術（組換えＤＮＡ技術を含む）は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｂ）＆  １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｅ）＆  １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２１８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｊ．Ｃ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〔以下、これら全てを「遺伝子組換え技術」という）。ガレクチン９あるいはその構成ドメイン、そのフラグメントをコードする核酸としては、ガレクチン９と同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードするといったそれと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該ガレクチン９をコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド���合成ＤＮＡなどの核酸であり、またヒトゲノムＤＮＡ、ヒトゲノミックＤＮＡライブラリー、ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。該ガレクチン９をコードする核酸の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。また、天然に生ずる変異体であってもよい。それら核酸は、Ｌ型ガレクチン９ペプチドあるいはその一部をコードするものであってよく、好ましいものとしてはＤＮＡが挙げられる。また上記「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな条件で配列表の配列番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基配列のうちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは１０個以上の塩基配列、より好ましくは１５個以上の塩基配列、さらに好ましくは２０個以上の塩基配列とハイブリダイズし、該ガレクチン９と実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものあるいはその相補鎖などが挙げられる。
また、本発明において、抗ガレクチン９抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体として得られたものを使用することもできる。
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７など）。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４，ｐｐ．７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：Ｓ．Ｂｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，９，ｐｐ．１０１−１０８（１９９０）；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．３７９１−３８０６（１９８４）；Ｊ．Ｂｕｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，ｐｐ．２１９−２２８（１９８７）；Ｍ．ＤＡＩＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，ｐｐ．２２３−２２９（１９８７）；Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｖ．Ｔ．Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，ｐｐ．２１４−２２１（１９８６）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ．６７３６−６７４０（１９８６）；Ｃ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
本発明に係るモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する（米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明に係るモノクローナル抗体は、哺乳動物由来のハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを挙げることができる。
抗ガレクチン９抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、以下のようにしてミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。  すなわち、ガレクチン９あるいはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。ガレクチン９あるいはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合などは、基本的には公知の方法、たとえば、ケラー及びミルステイン方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
以下、モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の作製につき詳しく説明する。
本発明の抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、例えば次のような工程で作製できる。
（１）免疫原性抗原の調製、（２）免疫原性抗原による動物の免疫、（３）ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、（５）ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化、及び（６）モノクローナル抗体の製造
（１）免疫原性抗原の調製は次のようにして実施できる。抗原としては、上記で記載してあるように、天然型のＬ型ガレクチン９ポリペプチド又はそれから誘導された断片（一部のドメインポリペプチド、リンクポリペプチド、フラグメント、一部のペプチド、合成ポリペプチドを含んでよく、天然型のＭ型ガレクチン９ポリペプチドであってもよい）を単離したものを用いることもできるが、決定されたガレクチン９のアミノ酸配列情報を基に、適当なオリゴペプチドを化学合成しそれを抗原として利用することができる。代表的には（１）配列表の配列番号：１及び配列番号：２のアミノ酸配列あるいはその一部のドメインのアミノ酸配列；（２）配列番号：３の一部のドメインのアミノ酸配列；（３）配列表の配列番号：４，５，７，８及び９のアミノ酸配列；（４）配列表の配列番号：１のうち配列番号：４に相当するアミノ酸配列に続いているＣ端側ドメインを構成するアミノ酸配列あるいはその一部のフラグメント；（５）配列表の配列番号：１のうち配列番号：４に相当するアミノ酸配列に先行するＮ端側ドメインを構成するアミノ酸配列あるいはその一部のフラグメントなどから成る群から選ばれた領域に存在するアミノ酸残基のうちの連続した少なくとも５個のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。
抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、ガレクチン９を断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。
活性化結合基としては、（１）活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。
（２）免疫原性抗原による動物の免疫は次のようにして実施できる。免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を（必要に応じアジバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤及び／又はアジバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどのマウス、ハムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物から得られたものであってよく、例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
（３）ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製は次のようにして実施できる。細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ−２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９〜２７０，１９７８）、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Ｃｕｒｒ．ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１−７，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（６５３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）などを用いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
（４）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は次のようにして実施できる。上記（２）の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。より具体的には、細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。かくして、こうして得られた脾細胞懸濁液と上記（３）の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地中に置き、細胞融合促進剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合促進剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）なども挙げられる。好ましくは、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどの補助剤を少量加え、融合効率を高めることもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合、すなわち融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ細胞株の割合は、任意に設定することができ、例えば１：１〜２０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とすることができる。
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
（５）ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化は次のようにして実施できる。選択用培地としては、通常の選択培養液、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙げられる。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというように処理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリンを除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。
ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）、発光免疫分析（ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティングなどの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
（６）モノクローナル抗体の製造は次のようにして実施できる。当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
かくして、得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、トランスジェニックマウス又はその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。
またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたＤＮＡは、発現ベクターに入れ、ＣＨＯ，ＣＯＳなどの宿主細胞に入れることができる。該ＤＮＡは、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６５８１，１９８４）。かくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。また、抗体は、下記するような縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。
ヒト化抗体は、当該分野で知られた技術により行うことが可能である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：ｐｐ．１５３４−１５３６（１９８８））。ヒトモノクローナル抗体も、当該分野で知られた技術により行うことが可能で、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞やヒト・マウスヘテロミエローマ細胞は当該分野で知られている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７））。バイスペシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：ｐｐ．５３７−５３９（１９８３）；ＷＯ９３／０８８２９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：ｐｐ．３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１，ｐｐ．２１０（１９８６））。
さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻，１０１４−１０２１頁（１９７４）；Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：ＰＰ．２１９−２３１（１９８１）；及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．１３８−１６３（１９９０）により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。
本発明での検知・測定は、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（ＲＩＡ），ＦＩＡ，ＬＩＡ，ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはＲＩＡ，ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明のＬ型ガレクチン９ポリペプチドに対する抗体あるいはＬ型ガレクチン９の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方をガレクチン９のＣ末端側残基に対する抗体とし、そして一方を検出可能に標識化する（もちろん、その他の組み合わせも可能であり、目的に応じて適宜デザインできる）。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちガレクチン９ポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えばアミノアルキルシリルガラスなどの活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、シリコンガムなど、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
さらに、ろ紙、ビーズ、チューブ、キュベット、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、マイクロプレート、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。
これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に対し特異的に反応する抗ガレクチン９抗体（抗血清や精製抗体を含む）や抗ガレクチン９モノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、非金属元素粒子、例えばセレンコロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。代表的な放射性物質の標識用同位体元素としては、［３２Ｐ］，［１２５Ｉ］，［１３１Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］，［３５Ｓ］などが挙げられる。代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極などで検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などであることもできる。
酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。このように、ビオチン−アビジン系を使用したり、抗ガレクチン抗体に対する抗体などの二次的な抗体を使用するなど、当該分野で公知の感度増強法を適宜採用することができる。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
本発明においては、信号の形成に４−ヒドロキシフェニル酢酸、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチル酸、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、チラミン、ルミノール、ルシゲニンルシフェリン及びその誘導体、Ｐｈｏｌａｄ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、ルミジェンＰＰＤ、（４−メチル）ウンベリフェリル−リン酸、ｐ−ニトロフェノール−リン酸、フェノール−リン酸、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ＡＭＰＡＫＴＭ（ＤＡＫＯ）、ＡｍｐｌｉＱＴＭ（ＤＡＫＯ）などとアルカリフォスファターゼ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドといったウンベリフェリルガラクトシド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトシドといったニトロフェニルガラクトシドなどとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼ、ＡＢＴＳなどとグルコースオキシダーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマーＲ（ＴＲＩＴＣ）などのローダミン誘導体、７−アミノ−４−クマリン−３−酢酸、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。発色、螢光などを含めた生成する信号などを検知するには、視覚によることもできるが、公知の装置を使用することもでき、例えば螢光光度計、プレートリーダーなども使用できる。また、放射性同位体（アイソトープ）などの出す信号を検知するには、公知の装置を使用することもでき、例えばガンマーカウンター、シンチレーションなども使用することができる。
標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗血清、精製抗体あるいはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、標識した抗血清、精製抗体あるいはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の測定法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。
酵素などで標識された抗血清、精製抗体、あるいはモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、下記するような界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）がより好ましい。当該分野で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清や血清タンパク質、アルブミン、ヘモグロビン、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。さらに、試料や固相などの洗浄には、上記した緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択してそれを使用でき、さらにそこにＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商品名）、ＮＰ−４０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（商品名）、Ｂｒｉｊｉ（商品名）などの非イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳなどの両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などから成る群から選ばれたものを添加して使用できる。
本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば胸腺、睾丸、腸、腎臓、脳、乳房組織、卵巣、子宮、前立腺、結腸・直腸、胃、肺、気管支、膵臓癌、肝臓などの全ての臓器及び組織、さらにそれら臓器・組織の悪性腫瘍、白血病細胞、血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、膵液、胆汁液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
本発明の抗ガレクチン９抗体、特にモノクローナル抗体を用いて、エピトープマッピングを行うこともでき、各エピトープを認識する抗体を用いれば各ガレクチン９及びその関連ペプチド断片などの検知・測定を行うことができる。
上述したように、ポリクローナル抗体（抗血清を含む）又はモノクローナル抗体として得られた抗ガレクチン９抗体を含むガン転移検出剤は、ガン化している組織から抽出したガン細胞を標本として免疫組織学的にガレクチン９量を解析することができる。すなわち、対象の細胞におけるガレクチン９量を解析することによって、当該細胞の転移能を検出することができる。
ここで、ガン転移能検出剤は、抗ガレクチン９抗体を有効成分として含むものである。「有効成分として含む」とは、ガン転移能を検出しうる濃度で抗ガレクチン９抗体を含むことを意味する。また、抗ガレクチン９抗体は、ガレクチン９タンパクにおける如何なる領域を認識してもよく、エピトープに限定されるものではない。
天然型ガレクチン９としては、現在、Ｌ型ガレクチン９、Ｍ型ガレクチン９及びＳ型ガレクチン９が報告されているが、Ｌ型ガレクチン９は配列番号４の推定リンクペプチド領域によりＮ端ドメインとＣ端ドメインとが連結されたもの、Ｍ型ガレクチン９は配列番号５の推定リンクペプチド領域によりＮ端ドメインとＣ端ドメインとが連結されたもの、そしてＳ型ガレクチン９は配列番号６の推定リンクペプチド領域によりＮ端ドメインとＣ端ドメインとが連結されたものであると考えられており、Ｍ型ガレクチン９ではＬ型ガレクチン９の当該リンクペプチド領域より配列番号７の配列のアミノ酸残基が欠失している点でＬ型ガレクチン９と異なること、そしてＳ型ガレクチン９ではＭ型ガレクチン９の当該リンクペプチド領域より配列番号８の配列のアミノ酸残基が欠失している点でＭ型ガレクチン９と異なること、すなわちＳ型ガレクチン９ではＬ型ガレクチン９推定リンクペプチド領域より配列番号９のアミノ酸残基が欠失している点でＬ型ガレクチン９と異なる。したがって、こうした違いを認識できる抗ガレクチン９抗体を提供することも本発明の目的と考えてよい。
本明細書において、ガレクチン９としては、上記Ｌ型ガレクチン９、Ｍ型ガレクチン９及びＳ型ガレクチン９、その他、それらガレクチン９ファミリーの天然に生ずる変異体、さらにそれらに人工的な変異（すなわち、一個以上のアミノ酸残基において、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したものあるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを含むものを意味してよい。
代表的な抗ガレクチン９抗体としては、Ｌ，Ｍ及びＳ型ガレクチン９の全てに結合する抗体、Ｌ及びＭ型ガレクチン９の双方に結合するがＳ型ガレクチン９とは反応しない抗体、Ｌ型ガレクチン９に結合するがＭ及びＳ型ガレクチン９とは反応しない抗体、Ｌ，Ｍ及びＳ型ガレクチン９のそれぞれに特異的な抗体、ガレクチン９のＣ−末端側ＣＲＤあるいはそのフラグメントペプチドに特異的な抗体、ガレクチン９のＮ−末端側ＣＲＤあるいはそのフラグメントペプチドに特異的な抗体、各リンクペプチドあるいはそのフラグメントペプチドに特異的な抗体などが挙げられる。
ガレクチン９の測定系としては、例えば組織に対しては免疫染色（ＭＥＴＨＯＤＳ，２４，２８９−２９６（２００１）；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４７（２），１２９−１４４（１９８１）；ｉｂｉｄ．，１５０（１−２），５−２１，２３−３２  ＆  １５１−１５８（１９９２）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ，７（１），２４−３１（２００１）等）、免疫電子顕微鏡（Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７（２），１４５−１５１（１９９７）；Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｔｅｃｈ．，１９（１），５７−６３  ＆  ６４−７９（１９９１）；ｉｂｉｄ．，１９（３），３０５−３１５（１９９１）等）といった蛋白測定系、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎといった発現遺伝子測定系が、組織抽出物に対してはＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡ，ウエスタンブロッティング（Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ（Ｔｏｋｙｏ），４５（２），１１９−１２７（１９９６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ．，３３，１−５８（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２７１，１７７−２０３（１９９６）；ｉｂｉｄ．，３０５，３３３−３４５（２０００）；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２（２），２２７−２３６（１９９２）；ｉｂｉｄ．，１７０（２），１７７−１８４（１９９４）；ｉｂｉｄ．，１９５（１−２），１４９−１５２（１９９６）；口野嘉幸他編、「遺伝子・タンパク質、実験操作  ブロッティング法」、株式会社ソフトサイエンス社、昭和６２年１１月１０日発行など）といった蛋白測定系、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：１１，１７３８−１７４３（２０００））といった発現遺伝子測定系、そして血中、体液などに対してはＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡ，ウエスタンブロッティングといった蛋白測定系を有利に利用できる。また抗ガレクチン９抗体の測定系としては、例えば血中、体液などに対してはＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡ，ウエスタンブロッティングといった蛋白測定系を有利に利用できる。
ＥＩＡの測定系において、例えば競合法では、抗ガレクチン９抗体を固相化抗体として使用し、標識抗原及び非標識抗原（抗原としては、ガレクチン９あるいはそのフラグメントペプチドなどが挙げられる）を使用するし、また非競合法で、例えばサンドイッチ法では、固相化抗ガレクチン９抗体や標識抗ガレクチン９抗体を利用できる他、抗ガレクチン９抗体を直接標識したり、固相化せずに、抗ガレクチン９抗体に対する抗体を標識したり、固相化して行うこともできる。感度増幅法としては、例えば、非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、高分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ試薬を応用したもの；Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｓｔａｉｎｉｎｇ（ＥＰＯＳ））が挙げられ、非酵素標識二次抗体との組合せでは、例えばＰＡＰ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）法などの酵素と抗酵素抗体複合体の組合せ、ＳＡＢＣ（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−アビジン複合体の組合せ、ＡＢＣ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法、ＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）法などのビオチン標識二次抗体とビオチン標識酵素−ストレプトアビジン複合体の組合せ、ＣＳＡ（ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などのＳＡＢＣとビオチン標識タイラマイドと酵素標識ストレプトアビジンの組合せ、高分子ポリマーで二次抗体と酵素を標識してあるものなどが挙げられる。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江  寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７００（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〕。
別の態様では、本発明は、ガレクチン９あるいはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として含むことを特徴とするガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムを提供する。当該ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。ガレクチン９遺伝子あるいはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり、制限なく利用できる。当該核酸は、上記した「遺伝子組換え技術」に従い入手でき、例えば公知のガレクチン９の塩基配列の情報を利用して、複数のプライマーをデザインして合成し、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）などを行うことによっても簡単に得られる。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で行うことができ、代表的にはフォスフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミダイト法などにより合成でき、例えば自動ＤＮＡ合成装置、例えば、ｍｏｄｅｌ  ３８１Ａ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを用いて合成できる。ｃＤＮＡライブラリーとセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅できる。得られた核酸は、それを特異的なハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。プローブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）などを使用して行うことができる。例えば、ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｉｎｇキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）などを使用して、プローブ用ＤＮＡを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などで標識し、放射活性を持つプローブを得ることができる。また、プローブの標識としては、当該分野で知られたものを使用でき、また、抗体のところで説明した標識から適宜選択して利用することもできる。
ハイブリダイゼーションは、所定のＤＮＡを保持するなどしている試料をナイロンフィルターなどの膜に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その膜に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブＤＮＡ断片と、ハイブリダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。ハイブリダイゼーション処理は、普通約３５℃〜約８０℃、より好適には約５０℃〜約６５℃で、約１５分〜約３６時間、より好適には約１時間〜約２４時間行われるが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション処理は、約５５℃で約１８時間行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、Ｒａｐｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などを用いることができる。転写した膜の変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また膜の固定化処理としては、普通約４０℃〜約１００℃、より好適には約７０℃〜約９０℃で、約１５分〜約２４時間、より好適には約１時間〜約４時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィルターを約８０℃で約２時間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した膜の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．０などで洗うことにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの膜としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルター［ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ］などを挙げることができる。
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび１．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、１．５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．０などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および２ｍＭ  ＥＤＴＡ）などを挙げることができる。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２％ウシ血清アルブミン、０．２％  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ］などに浸し、約３５℃〜約５０℃、好ましくは約４２℃で、約４〜約２４時間、好ましくは約６〜約８時間反応させることにより行うことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブＤＮＡ断片の変成は、例えば、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約１００℃で、約１分間〜約６０分間、好ましくは約５分間加熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約１５〜約５０ｍＭ、好ましくは約１９〜約４０ｍＭ、より好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度については約３５〜約８５℃、好ましくは約５０〜約７０℃、より好ましくは約６０〜約６５℃の条件を示す。
ハイブリダイゼーション完了後、フィルターを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーション反応をした標識プローブＤＮＡ断片以外の標識プローブを取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、例えば、０．１％  ＳＤＳ含有０．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸）溶液などで洗うことにより実施できる。
ハイブリダイズした部位は、代表的にはオートラジオグラフィーにより検出することができるが、当該分野で用いられる方法の中から適宜選択して検出に用いることもできる。
ガレクチン９発現遺伝子（ｃＤＮＡなどのＤＮＡ及びｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む）を、上記した「遺伝子組換え技術」に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２５，１６９−１９３（２０００）及びそこで引用されている文献）、ＤＮＡアレイ解析法（Ｍａｒｋ  Ｓｈｅｎａ編、“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年３月））などによって検知・測定して、ガン転移能を検知することができる。こうした技術を利用したガレクチン９発現遺伝子測定系、それに利用する試薬、方法、プロセスなどは、すべて本発明のガン転移能検出剤、ガン転移能検出法及びそれに利用するシステムに含まれる。該ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには、例えばノンＲＩ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれてよく、そこには、例えば直接法及び間接法が含まれてよい。該直接法は、例えば核酸プローブに検出可能な分子（レーポーター）が直接結合しているものを使用し、該間接法は、例えばレーポーター分子に対する抗体などを使用してシグナルを増幅せしめているものである。核酸プローブ中のオリゴヌクレオタイドには、官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、ＳＨ基など）が導入されており、こうした官能基にハプテン、螢光色素、酵素などが結合せしめられていてもよい。核酸プローブの標識としては、代表的にはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、フルオレッセインなどが挙げられるが、上記したように抗体のところで説明した標識から適宜選択して使用することができるし、また多重ラベリングも利用でき、さらに標識抗体も利用できる。核酸プローブの標識法としては、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できるが、例えばランダムプライム法、ニック・トランスレーション法、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、ラベリング／テイリング法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法などが挙げられる。処理された試料の観察には、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できるが、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡なども使用できるし、さらにフローサイトメトリーなどによることもできる。  本発明では、ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用することができ、それにより、様々な形態のガン転移能検出剤あるいは腫瘍検出及び／又は測定剤、ガン転移能検出法あるいは腫瘍検出及び／又は測定法、さらにはガン転移能検出あるいは腫瘍検出及び／又は測定試薬セットあるいはシステムを作成でき、ガンの診断、予防、治療において役立つばかりでなく、それらは優れている。さらにそれらは、がん治療した後、即ち、予後についても、それを対象としたガン転移能検出剤あるいは腫瘍検出及び／又は測定剤、ガン転移能検出法あるいは腫瘍検出及び／又は測定法、さらにはガン転移能検出あるいは腫瘍検出及び／又は測定試薬セットあるいはシステムとすることが可能であり、予後のものとしても優れた機能、作用効果を期待できる。
本明細書中で「マーカー」とは、当該「転移能」又は「腫瘍」の認識あるいは同定を可能にするものであることを指してよく、さらに当該「転移能」の程度及び「腫瘍」の悪性度の尺度としての働きを示すものであってよく、当該マーカーの存否及び／又は量的な違いにより、上記した機能を示すものを言うと考えてよい。
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
実施例
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡクローニングではＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；ＰＣＲ法を使用する場合には、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）及びＭ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の薬品等を使用している。
実施例１
抗ガレクチン９抗体を含有する抗血清の調製並びに抗ガレクチン９抗体の精製
感作抗原としてヒトガレクチン９の２つの糖認識ドメイン（ＣＲＤ）のうちＣ末端側のＣＲＤ（Ｌ型ガレクチン９〔配列番号１〕の第１９２番目〜第３５５番目のアミノ酸残基に対応する配列をもつタンパク質）を調製した。先ず、Ｃ末端側のＣＲＤをコードする塩基配列をベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に組み込み、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＣ末端側のＣＲＤとが融合した融合タンパク質を産生する発現ベクターを調製した。この発現ベクターを用いて大腸菌（ＢＬ２１、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を形質転換し、当該大腸菌内で上記融合タンパク質を発現させた。次に、この大腸菌を破砕し、得られた上清をグルタチオンセファロースカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて分画した。これにより、上清中に含まれる融合タンパク質を精製することができた。
次に、精製した融合タンパク質を含む溶液にスロンビン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を反応させて、Ｃ末端ＣＲＤとＧＳＴとを切断した。Ｃ末端ＣＲＤは、ラクトースカラム（株式会社ホーネンコーポレーション社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
精製したＣ末端ＣＲＤ  ２００μｇをフロイント完全アジュバンド（ディフコ社製）１ｍｌに混合し、感作抗原を有する溶液を調製した。この溶液を、体重３〜４ｋｇのウサギ（日本家兎、日本ＳＬＣ社製）に対して２週間毎に１ｍｌの量で皮下注射（５回）した。
次に、５回目の皮下注射の後、１週間後に兎より採血し、血清を調製した。得られた血清に含まれる抗体がガレクチン９を特異的に認識することを確認し、これを抗ガレクチン９抗体を含む抗血清とした。
一方、比較のために、抗原としてガレクチン１及びガレクチン３の分子全体を用い、上述した手法と同様にして抗ガレクチン１抗体を含む抗血清及び抗ガレクチン３抗体を含む抗血清を調製した。抗ガレクチン１抗体及び抗ガレクチン３抗体は、それぞれガレクチン１及びガレクチン３を特異的に認識していた。そして、抗ガレクチン９抗体、抗ガレクチン１抗体及び抗ガレクチン３抗体においては、相互の交差反応は見られなかった。
精製抗ガレクチン９抗体の調製は、精製ガレクチン９Ｃ末端ＣＲＤをアフィゲル（バイオラッド社製）に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって実施した。精製ガレクチン９Ｃ末端ＣＲＤ  １０ｍｇを１０ｍｌのアフィゲル−１０（バイオラッド社製）と混合し、４℃で１晩反応させた後、アフィゲルを２０ｍＭリン酸緩衝液−生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、アフィゲルの未反応官能基は１００ｍＭのモノエタノールアミンを含むＰＢＳ中で、１晩ブロッキングを行い、最終的にＰＢＳで再度洗浄して、ガレクチン９Ｃ末端ＣＲＤ固定化カラムを調製した。該固定化カラムに抗ガレクチン９抗体を含むウサギ血清１０ｍｌを添加し、ＰＢＳで十分に洗浄した後、吸着した抗ガレクチン９抗体を２０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出した。溶出した抗ガレクチン９抗体溶液は直ちに２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で中和し、ＰＢＳで１晩透析した後、−８０℃で凍結保存した。
実施例２
メラノーマ細胞を用いた転移能の検出
実施例１で調製した抗ガレクチン９抗体を含む抗血清を用い、メラノーマ細胞の転移能を検出した。
本例で使用したメラノーマ細胞は、表１に示すように、原発組織（原発巣）７５例、転移性（転移巣）３３例、色素性母斑２８例からの切除標本を使用した。
0003950050.tif 000002
これらメラノーマ細胞におけるガレクチン９の発現を、実施例１の抗ガレクチン９抗体を含む抗血清を用いて測定した。抗血清に含まれる抗ガレクチン９抗体によりガレクチン９の発現が確認されたものを陽性とし、ガレクチン９の発現が確認されないものを陰性とし、ガレクチン９の僅かな発現のみ確認されたものを弱陽性とした。結果を表２に示す。
0003950050.tif 000003
表２から判るように、良性の色素性母斑においては陽性が陰性と比較して有意に多かった。また、悪性の色素性母斑においては陽性が陰性と比較して有意に少なかった。また、原発巣及び転移巣においては、陰性のものが比較的多かったが、統計学的な有意差は見られなかった。
次に、原発巣の７５例について、腫瘍の厚さとガレクチン９の発現量との関係を測定した。腫瘍の厚さが１．５ｍｍ以下のものをＡ群、１．５ｍｍを越えて４ｍｍ未満のものをＢ群、４ｍｍ以上のものをＣ群とした。また、メラノーマ胞巣の８０％以上が陽性の場合を強陽性群とし、それ以外を陰性群とした。
Ａ群：強陽性群  ２例、陰性群２５例
Ｂ群：強陽性群１０例、陰性群１２例
Ｃ群：強陽性群１７例、陰性群  ９例
この結果から、ガン化するときにガレクチン９は、先ず消失し、その後、メラノーマ細胞の増殖（すなわち、腫瘍の厚さの増加）に伴ってより多く発現することが判る。
また、これら原発巣７５例のうち、１５例については、初診時においてリンパ節転移が認められた。これら１５例についてガレクチン９の発現量と腫瘍の厚さとの関係を測定すると、以下のようになった。
Ａ群：強陽性群  ０例、陰性群  １例
Ｂ群：強陽性群  １例、陰性群  １例
Ｃ群：強陽性群  ３例、陰性群  ９例
この結果に基づき、原発巣７５例における腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える４８例（Ｂ群及びＣ群）を母集団として統計学的検討を行った。統計学的検討の条件及び結果を図１に示す。この図１から判るように、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群において、ガレクチン９の発現とリンパ節転移との間に相関関係が認められる。すなわち、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群であってリンパ節転移を生じた１４例については、強陽性群と比較して陰性群が有意に多いことが判る。
さらに、原発巣７５例のうち、１２例については、手術後の再発が認められた。これら１２例についてガレクチン９の発現量と腫瘍の厚さとの関係を測定すると、以下のようになった。
Ａ群：強陽性群  ０例、陰性群  １例
Ｂ群：強陽性群  ０例、陰性群  ０例
Ｃ群：強陽性群  ２例、陰性群  ９例
この結果に基づき、原発巣７５例における腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える４８例（Ｂ群及びＣ群）を母集団として統計学的検討を行った。統計学的検討の条件及び結果を図２に示す。この図２から判るように、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群において、ガレクチン９の発現と術後の再発との間に相関関係が認められる。すなわち、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群であって術後に再発した１１例については、強陽性群と比較して陰性群が有意に多いことが判る。
さらにまた、原発巣７５例のうち、１３例については死亡したものである。これら１３例についてガレクチン９の発現量と腫瘍の厚さとの関係を測定すると、以下のようになった。
Ａ群：強陽性群  ０例、陰性群  １例
Ｂ群：強陽性群  ０例、陰性群  １例
Ｃ群：強陽性群  ３例、陰性群  ８例
この結果に基づき、原発巣７５例における腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える４８例（Ｂ群及びＣ群）を母集団として統計学的検討を行った。統計学的検討の条件及び結果を図３に示す。この図３から判るように、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群において、ガレクチン９の発現と死亡したものとの間に相関関係が認められる。すなわち、腫瘍の厚さが１．５ｍｍを越える原発巣群であって死亡した１２例については、強陽性群と比較して陰性群が有意に多いことが判る。
これら図１〜３の結果から、ガレクチン９の発現について陽性であるメラノーマ細胞は、転移能が低くいことが判る。したがって、抗ガレクチン９抗体を含む抗血清がガン細胞の転移能を検出することができ、ガン細胞転移能検出剤として使用可能であることが明かに示された。
実施例３
乳ガン細胞を用いた転移能の検出
実施例１で調製した抗ガレクチン抗体を含む抗血清を用い、乳ガン細胞の転移能を検出した。
本例では、乳ガン患者６７名より得た乳ガン細胞を使用した。これらの乳ガン細胞の病理組織型を区別したところ、乳頭腺管癌２０例、充実腺管癌２５例及び硬癌２２例であった。得られた乳ガン細胞について、実施例１で得られた抗ガレクチン抗体を含む抗血清を用いて、ガレクチン９の発現を確認した。結果を表３に示す。
0003950050.tif 000004
この表３より、予後良好とされる乳頭腺管癌におけるガレクチン９陽性率が最も高い値を示していることが判る。
また、乳ガン細胞３２例のうちで遠隔転移に至った１６例中、１４例がガレクチン９陰性であった。そして、ガレクチン９陽性群と陰性群との間で、非転移性累積生存率を測定した結果を図４に示す。この図４から判るように、ガレクチン９陽性群と陰性群との間では、非転移性累積生存率に有意差が認められた。
さらに、ガレクチン９陽性群と陰性群とにおける、リンパ節転移、エストロゲンレセプター発現率及び遠隔転移の相関関係を調べた。結果を表４に示す。なお、表４において、リンパ節転移は「ｎ（＋）」で示し、エストロゲンレセプター発現率は「ＥＲ」で示し、遠隔転移は「ｍｅｔａ」で示す。
0003950050.tif 000005
この表４から判るように、リンパ節転移及びエストロゲンレセプター発現率とガレクチン９の発現との間には、有意差がなく相関関係が認められなかった。しかし、遠隔転移とガレクチン９の発現との間には、有意差があり、相関関係が認められた。
一方、従来より公知のサブクローニング法に準じて、ガレクチン９高発現株及びガレクチン９低発現株をスクリーニングした。その結果、図５に示すように、５株のガレクチン９高発現株及び２株のガレクチン９低発現株を得た。なお、図５は、ウェスタンブロット法によりガレクチン９の発現を示す電気泳動写真である。図５中「ｐａｒｅｎｔ」のレーンは、ガレクチン９を示すコントロールである。
ガレクチン９高発現株（図５中Ｋ４で示すレーン）を培養したところ、図６に示すように、複数の細胞が接着した細胞塊を確認することができた。これに対して、ガレクチン９低発現株（図５中Ｋ１０で示すレーン）を培養したところ、図７に示すように、複数の細胞が分散した状態で増殖していることを確認することができた。
これらの結果より、ガレクチン９は、乳ガン細胞の細胞間接着を強固に維持することを可能とし、細胞塊（腫瘍塊）から乳ガン細胞の離脱を抑制することが示唆された。言い換えると、ガレクチン９低発現株は、細胞塊から容易に離脱し、その結果、ガンの転移を引き起こすことが示唆された。これらのことから、乳ガン細胞におけるガレクチン９の発現を、高ガレクチン９抗体を含む抗血清により測定することによって、対象となる乳ガン細胞の転移能を検出できることが明らかになった。
実施例４
免疫組織染色によるガレクチン９の検出
パラフィン包埋切片として、以下のような処理を行って免疫組織染色によりガレクチン９を検出し、ガン転移能を調査した。
脱パラフィン処理は、キシレン３回（各１０分）、そして１００％アルコール、９０％アルコール及び７５％アルコール（各２分）で行った。マイクロウェーブ（ＭＷ）処理は、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を二つの耐熱ドーゼに分注し、ＭＷ照射し沸騰させる。ドーゼの１つは切片用、もう１つは追加緩衝液とする。沸騰した緩衝液中に切片を浸し、ＭＷを照射する（５００Ｗ電子レンジで５分×２回、計１０分）。途中蒸発した分の緩衝液を補うため、沸騰した緩衝液を５分毎に追加しながら加熱する。処理した切片は室温に２０分間放置し、ゆっくり冷ます。
内因性ペルオキシダーゼをブロッキングするため、０．３％過酸化水素−メタノールを用時調製し、それに切片を室温で３０分漬ける。ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で４回洗浄する（４回目は１０分間浸漬する）。洗浄後、ろ紙で組織周辺の水分を拭き取り、湿潤箱に入れる。５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）含有ＰＢＳ（０．２％アジ化ナトリウム含有）を６滴かけて、湿潤箱で室温下１時間置いてブロッキングする。
組織試料は洗わずにそのままＢＳＡの上に、一次抗体（抗ガレクチン９抗体、１０μｇ／ｍｌ）の２％ＢＳＡ−ＰＢＳ液を６滴かけて、湿潤箱で室温下一晩置いて一次抗体と反応させる。次にＰＢＳで４回洗浄する（４回目は１０分間浸漬する）。洗浄後、ろ紙で組織周辺の水分を拭き取り、湿潤箱に入れる。二次抗体として、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ウサギ抗体（ＤＡＣＯ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ，Ｋ４００１）を使用し、それを組織試料に６滴かけて、湿潤箱で室温下１時間置いた後、ＰＢＳで４回洗浄する。ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）試薬（ＤＡＢ＋ＰＢＳ＋３０％過酸化水素）を用いて発色させる。発色の経過を観察しながら、コントロールが発色する直前で停止し、水洗８回で発色反応を止める。
核染色は、マイヤーヘマキシリンで行う。脱水、透徹、封入は、７５％アルコール、９０％アルコール及び１００％アルコール（各２分）、キシレン３回（各３分）、封入で行う。
抗ガレクチン９抗体及び正常ウサギＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ：コントロール抗体）の５，１０，２０μｇ／ｍｌ溶液を作成し、乳癌の２症例〔乳頭腺管癌の癌組織（比較的予後良好）及び硬癌（比較的予後不良）〕の切片を染色した。
５μｇ／ｍｌ溶液を使用した場合、コントロール抗体による染色性は低いものの、抗ガレクチン９抗体においても、その染色性が低いと判断された。１０μｇ／ｍｌ溶液を使用した場合、コントロール抗体による染色性は皆無ではないが、抗ガレクチン９抗体による染色性との差は十分に大きく、特異的染色が得られた。２０μｇ／ｍｌ溶液の場合、抗ガレクチン９抗体による染色性は極めて高いが、コントロール抗体による染色性も高かった。
抗ガレクチン９抗体を使用することで、癌組織の免疫組織染色によるガレクチン９発現組織の検出、さらにはその発現の程度（ガレクチン９量の多少の分別評価）が可能であることが判った。
実施例５
モノクローナル抗体の作成
（ａ）免疫源
免疫に用いる抗原は、組換えＬ型あるいはＭ型ガレクチン９をはじめ、配列表の配列番号：１，４，５，６，７，８及び９から選ばれたアミノ酸配列を基にデザインされた合成ペプチドを使用することができる。さらに、免疫に用いる抗原は、得られたｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターに連結し、これをＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞などで発現させて得られる組換えタンパク質を使用することも可能である。これらの抗原タンパク質は、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマログラフィーまたはそれ以外の各種クロマトグラフィーによって精製できる。
精製した免疫用抗原を一般的な方法で免疫し、抗体産生細胞を誘導、細胞融合によりハイブリドーマとして抗体産生細胞を得ることができる。さらに精製した免疫用抗原に対する反応性に基づいてクローニング、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして株化できる。
また、Ｌ，Ｍ及び／又はＳ型ガレクチン９特異的モノクローナル抗体を得るための免疫源としては、ガレクチン９のそれぞれに特徴的なアミノ酸配列を持つハプテン化合成ペプチドが使用できる。例えば、配列表の配列番号２のＭｅｔ１からＴｈｒ１６７、配列表の配列番号１のＩｌｅ１９２からＴｈｒ３５５あるいは配列表の配列番号２のＩｌｅ１６０からＴｈｒ３２３、推定されるリンクペプチド部分のＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ〔配列番号４〕及びＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ〔配列番号９〕から選択された連続した少なくとも３個以上、好ましくは５個以上の連続したペプチド配列を含むことが特に好ましい。
（ｂ）抗原ポリペプチドの調製
配列番号：１に記載したヒトガレクチン９のアミノ酸配列中より特徴的な配列を選択し、合成する。実施例１のＣ末端ＣＲＤの他、ペプチドはペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー９６００、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を使用して、Ｆｍｏｃ−ｂｏｐ法で合成する。ポリペプチドのＮ末端にはシステインを導入する。合成したペプチドはμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ，Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた高速液体クロマトグラフィーなどにより精製する。
（ｃ）ポリペプチドとＢＳＡの複合体の調製
システイン残基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させ、抗原コンジュゲートとする。１０．１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解したものと１．１４ｍｇのＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を２４．９μＬのジメチルホルムアミドに溶解したものと混合し、３０℃、３０分間反応させ、ついで、上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルカラム（直径１３ｍｍ、長さ１２０ｍｍ）でゲルろ過する。前記（ｂ）で合成したポリペプチドを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解し、マレイミド結合ＢＳＡに対しおおよそ５０倍モル量を混合する。すなわち、ポリペプチドに対しマレイミド結合ＢＳＡを混合し、４℃、２０時間インキュベートし、ＢＳＡ−ポリペプチド複合体を調製する。得られるＢＳＡ−ポリペプチド複合体を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で希釈した後、１５０μＬずつに分注して−３０℃で凍結保存する。
（ｄ）抗体産生細胞の調製
前記（ｃ）で調製したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を完全フロインドアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫する。おおよそ１８日目に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を不完全フロインドアジュバントと共に初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免疫する。さらにおおよそ５２日目に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を静脈内投与又は腹腔内投与し、最終免疫とする。その４日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製する。実施例１のＣ末端ＣＲＤについても同様にして免疫を行うことが可能である。
（ｅ）細胞融合
細胞融合には、以下の材料および方法を用いる。ＲＰＭＩ−１６４０又はハイブリドーマ用培地：ＲＰＭＩ−１６４０に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、抗生物質（ペニシリンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及びアンフォテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍｌ）から選択されたもの）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過する。市販のハイブリドーマ用培地を使用してもよい。ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過したウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加える。ＰＥＧ−４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレングリコール−４０００（ＰＢＧ−４０００，Ｍｅｒｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加えた無血清培地を調製する。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３×６３−Ａｇ．８Ｕ．１）あるいは×６３（Ｐ３×６３Ａｇ８）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｐ３５１〜３７２（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｎ．Ｓｈｉｉｇｉ），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）に記載のＯｉらの方法を若干改変して行う。
前記（ｄ）で調製した有核脾細胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とをおおよそ５：１〜１０：１の比率で以下の手順で融合する。免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させるために有核脾細胞とミエローマ細胞を混合する。すなわち、おおよそ４．０×１０８個の有核脾細胞に対しおおよそ８．０×１０７個のミエローマ細胞を混合する。
次に、それぞれの細胞混合液を遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去する。沈殿した細胞に３７℃に加温した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ミエローマ細胞がおおよそ３×１０７個／ｍＬとなるよう体積を決定する）を滴下し、撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。次に添加した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の２倍体積の３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地を滴下する。さらに添加した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の７倍体積のＲＰＭＩ−１６４０培地を常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散させる。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。次に、ミエローマ細胞がおおよそ３×１０６個／ｍＬとなるように３７℃に加温したＮＳ−１培地を沈殿した細胞に速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティングで分散する。さらに同培地を加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエルにウエル当りミエローマ細胞がおおよそ６．０×１０５個となるように接種する。それぞれの細胞を加えた上記マイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養する。
（ｆ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖
（１）使用した培地は以下の通りである。
ＨＡＴ培地：前記（ｅ）項で述べたＲＰＭＩ１６４０又はハイブリドーマ用培地に更にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加える。
ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組成のものである。
（２）前記（ｅ）項の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加える。２、３、５、８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１０日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。ハイブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ウエルについて固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウエルを調べる。まず、２０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した抗原ポリペプチドでポリスチレン製９６穴プレートをコート（１００ｎｇ／ウエル）し、次に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて洗浄して未吸着のペプチドを除く。各ウエルにハイブリドーマの生育が確認されたウエルの培養上清０．１ｍｌを添加し、室温で約１時間静置する。洗浄後、２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ）を加え、さらに室温で約１時間静置する。洗浄後、基質である過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え発色させる。各ウエルに２Ｎ硫酸を加え発色反応を停止し、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４５０ｎｍの吸光度で測定する。上記操作は、組換えタンパク質抗原を使用して行うことも可能である。
（ｇ）ハイブリドーマのクローニング
上記（ｆ）項で得られた抗原ペプチド及びタンパク質に対する陽性ウエル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクローン化する。すなわち、ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフィーダーとしておおよそ１０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにハイブリドーマをウエル当り５個、１個、０．５個になるように希釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加える。５日目、１２日目に全ウエルに約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加する。クローニング開始後肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認めたもの、コロニー形成陰性ウエルが５０％以上である群について（ｆ）項に記載したＥＬＩＳＡを行う。調べた全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個のウエルを４〜６個選択し、再クローニングを行う。最終的にそれぞれのポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
（ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定
前述したＥＬＩＳＡに従い、それぞれのポリペプチドをコートしたポリスチレン製９６穴プレートに、前記（ｇ）項で得られたハイブリドーマの上清を加える。次にＰＢＳで洗浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ．）を加える。ＰＢＳにより洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え、基質として過酸化水素および２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定する。同様にして組換えタンパク質抗原を使用して行うこともできる。
（ｉ）ハイブリドーマの培養とモノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養し、その上清からモノクローナル抗体を得ることができる。また、得られたハイブリドーマ１０７個を予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系、雌、６週齢）に同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウムで塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフィゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で溶出することにより精製する。
実施例６
サンドイッチＥＩＡ
下記の方法に従えば、実施例１で調製した抗ガレクチン９抗体及び実施例５で調製した抗ガレクチン９抗体から少なくとも１種を選択し、抗ガレクチン９抗体の２種の適当な組み合わせによってヒトガレクチン９を特異的に検出・測定するサンドイッチＥＩＡ系が構成できる。ＥＩＡ系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可能であり、標識抗体はＦａｂ’−ＨＲＰに限定されない。各反応緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて、短縮、延長など調整できる。また、標準品となるヒトガレクチン９は、組織培養上清、細胞培養上清または実施例１記載あるいはそれ以外の方法で発現した組換え体から精製することができる。精製にはイオン交換、ゲルろ過、抗ヒトガレクチン９抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーまたそれ以外の各種アフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによって達成される。
（ａ）標識抗体の調製
抗ヒトガレクチン９モノクローナル抗体を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．２に抗体量の２％（Ｗ／Ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化する。消化物に３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加し、反応を停止する。０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦ（ａｂ’）２画分を分取する。このＦ（ａｂ’）２画分に最終濃度０．０１Ｍとなるようにシステアミン塩酸塩を添加し、３７℃、１．５時間還元し、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦａｂ’画分を分取する。
上記の操作とは別にＨＲＰを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解、ＨＲＰの２５倍モル量のＥＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０℃、３０分間反応させる。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したＮＩＣＫ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過しマレイミド標識ＨＲＰ画分を分取する。
Ｆａｂ’画分とマレイミド標識ＨＲＰを等モルとなるように両画分を混合し４℃、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロックする。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ’−ＨＲＰ標識抗体を分取する。これに０．１％  ＢＳＡおよび０．００１％クロルヘキシジンを添加して４℃で保存する。実施例１の抗ヒトガレクチン９抗体を用いても同様に処理できる。
（ｂ）抗体結合担体の調製
抗ヒトガレクチン９モノクローナル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、５０μｇ／ｍＬの濃度に調製する。このモノクローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエルあたり１００μＬずつ加え、４℃、１８時間静置する。モノクローナル抗体溶液を除去し、生理食塩液で１回、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄後、１％  ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を加えブロッキングする。実施例１の抗ヒトガレクチン９抗体を用いても同様に処理でき、固相抗体を調製できる。
（ｃ）１ステップサンドイッチＥＩＡ法
精製したヒトガレクチン９画分を標準抗原としてヒトガレクチン９定量用標準曲線を作成する。１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｂｒｉｊ３５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で段階希釈した標準ヒトガレクチン９を分注、それぞれに１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｂｒｉｊ３５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で調製した標識抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰを添加し十分混和する。調製した抗体結合マイクロプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄し、標準抗原と標識抗体混合液を添加する。室温で１時間反応した後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄する。次に、６％ジメチルホルムアミド、０．００５％過酸化水素含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した０．０１％  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンをウエルに添加し、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を添加し反応を停止する。この反応混液の４５０ｎｍをマイクロプレートリーダーを用いて測定し、標準曲線を求める。
測定検体は、ヒト血清、脊髄液、血漿、関節液、尿および唾液などヒトに由来する体液成分、各種ヒト組織の抽出液、ヒト由来あるいは組換え体など各種培養細胞の細胞抽出液、培養上清などから調製される。それぞれの測定検体は、標準ヒトガレクチン９に代えて上記の１ステップサンドイッチＥＩＡに供し、標準ヒトガレクチン９と同時に反応を進行させる。測定検体から得られた吸光度を標準曲線にあてはめ、測定検体に含まれるヒトガレクチン９の量を算出する。
上記の他、実施例１の抗ヒトガレクチン９抗体を使用し、瓜谷郁三他編、「生物化学実験法２７、石川栄治著、酵素標識法」、株式会社学会出版センター（１９９１年６月２０日発行）及び日本生化学会編、「続生化学実験講座５、免疫生化学研究法」、ｐ１０７−１１２、東京化学同人、１９８６年３月１４日発行に記載の方法（これら文献において引用されている文献に記載の方法も含む）に従って、酵素標識抗体を調製でき、さらにそれを測定に使用できる。
実施例７
ウエスタンブロッティング
ヒトガレクチン９を発現する細胞の培養上清、精製組換えヒトガレクチン９およびヒトメラノーマ抽出蛋白を還元条件下、１０−１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。続いて５％ＢＳＡ又は５％スキムミルクおよび０．０５％アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ（ブロッキングバッファー）を用いて室温で０．５−１時間ブロッキングした後、ヒトガレクチン９特異抗体で処理し、２５℃で６時間以下の時間インキュベートした。それぞれの膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＴＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）で４回洗浄し、結合した抗体をブロッキングバッファーで１：１，０００に希釈したＨＲＰ結合ロバ抗ウサギイムノグロブリン抗体あるいはＨＲＰ結合ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体と２５℃、１時間反応させた。反応後、膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＴＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）で４回洗浄し、結合した抗体をＥｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により検出する。
上記の他、実施例１の抗ヒトガレクチン９抗体を使用し、口野嘉幸他編、「遺伝子・タンパク質、実験操作  ブロッティング法」、ｐ２１２−２４１、株式会社ソフトサイエンス社、昭和６２年１１月１０日発行に記載の方法（これら文献において引用されている文献に記載の方法も含む）に従って、ウエスタンブロッティングを実施できる。
産業上の利用可能性
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、ガン細胞の転移能の有無及びガン細胞の転移能の度合いを検出できるガン転移能検出剤を提供できる。本発明に係るガン転移検出剤は、有効成分として抗ガレクチン９抗体を有するため、非常に簡便に且つ確実にガン細胞の転移能を検出することができる。本発明によれば、ガレクチン９発現遺伝子測定系も構築でき、非常に簡便に且つ確実にガン細胞の転移能を検出することができる。
さらに、本発明によれば、ガレクチン９及びガレクチン９発現遺伝子をガン転移能のマーカーあるいは腫瘍マーカーとして使用することことで、様々な形態のガン転移能検出剤あるいは腫瘍検出及び／又は測定剤、ガン転移能検出法あるいは腫瘍検出及び／又は測定法、さらにはガン転移能検出あるいは腫瘍検出及び／又は測定試薬セットあるいはシステムを作成でき、ガンの診断、予防、治療において役立つばかりでなく、優れている。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ガレクチン９の発現とリンパ節転移との関係を統計学的に検討する差異の条件及び結果を示す図である。
図２は、ガレクチン９の発現と手術後の再発との関係を統計学的に検討する差異の条件及び結果を示す図である。
図３は、ガレクチン９の発現と死亡例との関係を統計学的に検討する差異の条件及び結果を示す図である。
図４は、ガレクチン９の発現と非転移性累積生存率との関係を示す特性図である。
図５は、ガレクチン９高発現株及び低発現株におけるガレクチン９の発現を検出するウェスタンブロット法の結果を示す電気泳動写真である。
図６は、ガレクチン９高発現株を培養した状態を示す顕微鏡写真である。
図７は、ガレクチン９低発現株を培養した状態を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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