(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体の懸濁液に界面活性剤を添加し、得られる混合液を物理的破砕処理することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【請求項２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体またはＤ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との３成分共重合体である請求項１記載の分離精製方法。
【請求項３】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子が導入された菌株である請求項１または２記載の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の微生物菌体からの分離精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋め立てなどにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋め立て地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋め立て、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならない生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。
【０００３】
これらの生分解性プラスチックの中でも、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は、多くの微生物種の菌体内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されているため、特に注目されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能と考えられる。
【０００４】
前記ＰＨＡは、顆粒体を形成して微生物菌体内に蓄積されており、これらをプラスチックとして利用するためには、微生物菌体内から分離精製する必要がある。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別するとＰＨＡが可溶である有機溶媒にＰＨＡを溶解させ、ＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法とがある。これらの中で、ＰＨＡの分離が容易で、かつ処理工程がより簡素であるという点では、後者の方法が好ましい。
【０００５】
前記ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、例えば、J. Gen. Microbiology, 19, 198-209 頁 (1958) には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、プロセスとしては簡単ではあるが、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにコストが高くなる。また、ＰＨＡの著しい低分子化が引き起こされることや得られたＰＨＡ内に無視できない量の塩素が残存することから実用には適さないと考えられる。また、特公平４−６１６３８号公報には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせて、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、熱処理によってタンパク質が変性・不溶化するために、次のタンパク質分解酵素処理工程での負荷が増大すること、更には、処理工程が多く複雑であること等の欠点を有している。
【０００６】
また、他に微生物菌体を破砕処理する工程を有する方法として、界面活性剤で処理したのち、菌体から放出された核酸を過酸化水素処理して分解し、ＰＨＡを分離する方法が提案されている（特表平８−５０２４１５号公報）が、毒性の強い過酸化水素を利用するため工業的レベルでの実施は困難である。また、ＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平７−１７７８９４号公報）。しかし、この方法は微生物菌体懸濁液を少なくとも３回程度繰り返して高圧処理しなければ純度の高いＰＨＡを得ることはできず、かつ得られるＰＨＡの純度は最高でも７０〜８９％程度と低いという欠点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＰＨＡを含有する微生物菌体から、少ない工程数で高純度のＰＨＡを高収率で得ることのできるＰＨＡの分離精製方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を含有する微生物菌体の懸濁液に界面活性剤を添加し、得られる混合液を物理的破砕処理することを特徴とするＰＨＡの分離精製方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えば、アルカリゲネス・リポリチカ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、アルカリゲネス・ラタス（Ａ．ｌａｔａｓ）等のアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌が挙げられ、中でも、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）等の菌株、またはアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群の遺伝子が導入された菌株、例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスＡＣ３２（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）（J. Bacteriol., 179, 4821-4830 頁 (1997) ）等がより好ましい。
【００１０】
これらの微生物の培養方法は、ＰＨＡを多量に効率よく菌体内に蓄積できるものであれば特に限定はなく、例えば、前記アルカリゲネス・ユウトロファスＡＣ３２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）を用いる場合には、J. Bacteriol., 179, 4821-4830 頁 (1997) 等に記載の方法が好ましい。
【００１１】
本発明におけるポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）とは、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）のホモポリマーや３ＨＢと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体などを示すが、中でも３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体（Macromolecules, 28, 4822-4828 (1995)) または３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（特開平８−２８９７９７号公報）が、物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については、特に限定されるものではないが、３ＨＢの含有量が１〜９９モル％、３ＨＨユニットの含有量が１〜９９モル％のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含有量が１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含有量が１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含有量が１〜３０モル％のものが好適である。また、これらのＰＨＡの分子量は、１０万以上が好ましく、５０万以上がより好ましい。
【００１２】
ＰＨＡの微生物菌体中の含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥菌体中に２０重量％以上が好ましく、界面活性剤処理、物理的破砕処理、分離操作、分離したＰＨＡの純度等を考慮すると５０重量％以上が特に好ましい。
【００１３】
本発明においては、前記のように培養して得られた微生物菌体の懸濁液に界面活性剤を添加する。なお、本発明における「微生物菌体の懸濁液」とは、培養終了後の培養懸濁液または培養液から遠心分離等で分離した菌体を水に懸濁させた水性の懸濁液を意味する。該懸濁液中における菌体濃度は、湿菌体換算で５００ｇ／ｌ以下が好ましく、３００ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。
【００１４】
本発明で使用する界面活性剤としては、陰イオン性、陽イオン性、両性もしくは非イオン性でも良く、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−２−ヒドリキシ−１−プロパンスルホン酸、ドデシル−Ｎ−ベタイン、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ポリエチルエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。本発明においては、特にドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム等が、価格、使用量や添加効果の点から好ましい。
【００１５】
界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、微生物菌体重量（湿菌体換算）１００重量部に対して、０．００１〜５０重量部が好ましく、１〜２０重量部がより好ましい。該添加量は、界面活性剤の添加効果が良好な観点から、０．００１重量部以上が好ましく、低コストである観点から、５０重量部以下が好ましい。また、得られた混合液は、ＰＨＡ以外の菌体構成成分の可溶化を促進させる観点から、室温下で１分〜２時間程度攪拌することが好ましい。
【００１６】
次いで、前記混合液を物理的破砕処理する。本発明においては、かかる物理的破砕処理を行なうことにより、前記微生物菌体を破砕してＰＨＡを菌体外に漏出させる効果を有する。
【００１７】
本発明における物理的破砕処理とは、超音波による破砕、高圧ホモジナイザーやミル等による破砕等が挙げられる。高圧ホモジナイザーとしては、独国のＡＰＶ・ゴーリン社製「マントンゴーリン（商品名）」、デンマークのＡＰＶラニー社製「ミニラボ（商品名）」、米国のマイクロフルイディックス(Microfluidics) 社製「マイクロフルイタイザー（商品名）」等が挙げられ、ミルとしては、スイスのウィリー・エー・バックオフェン(Willy A. Bachofen) 社製「ダイノーミル（商品名）」等が挙げられるが、同等の破砕効果が得られればこれらに限定されるものではない。
【００１８】
物理的破砕処理の条件としては、用いる手段により一概には限定できないが、例えば、超音波による破砕の場合、米国のブランソン（Branson)社製、ソニファイヤーを用いて、出力５、簡欠サイクル５０％で３０分間の超音波処理であることが好ましい。
高圧ホモジナイザーによる破砕の場合、デンマークのＡＰＶラニー社製のミニラボを用いて、５００ｋｇｆ／ｃｍ2 で１時間の高圧破砕処理であることが好ましい。
ミル等による破砕の場合、スイスのフィリー・エー・バックオフェン社製のダイノーミルを用いて１ｌ／ｈの流量で１時間の破砕処理であることが好ましい。
【００１９】
また、前記物理的破砕処理は、破砕処理液を少量遠心管にとり、例えば、３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理を行なった後、沈澱物が得られるかどうかを確認することで完了する。
【００２０】
次に、物理的破砕処理して得られた処理液を、遠心分離してＰＨＡを沈殿させる。本発明においては、かかる遠心分離を行なうことにより、ＰＨＡ以外の菌体構成成分とＰＨＡとを容易に分離することができる。該遠心分離の条件は、特に限定はなく、室温下で、１０００〜１５０００ｒｐｍ、５〜６０分間程度行なえばよい。遠心分離は、必要に応じて、複数回行なってもよい。また、得られたＰＨＡの沈殿物を常法により乾燥することが好ましい。
【００２１】
得られたＰＨＡの純度は、実用化、加工性及び物性の観点から、９０％以上が好ましい。なお、該純度の測定方法としては、例えば、後述の実施例に記載の方法が挙げられる。
【００２２】
また、得られたＰＨＡは、そのままでも高純度であるが、目的に応じて、公知の精製方法、例えば、リゾチーム等の溶菌酵素（特公平４−６１６３８号公報）、トリプシンやプロナーゼ等の蛋白質分解酵素（特開平５−３３６９８２号公報）、過酸化水素等の過酸化物（特表平８−５０２４１５号公報）等を作用させて、更に純度を向上させることができる。
【００２３】
以上のような構成を有する本発明のＰＨＡの精製分離方法は、従来の方法に比べ、工程数が少なく、効率よくＰＨＡを得ることができるものである。
【００２４】
本発明により得られたＰＨＡは、実用品として十分に高い純度を有するものであり、例えば、プラスチック製品、回収不要のインプラント材料、薬物担体、肥料担体、農業用マルチフィルム、釣糸等の漁具、コンポスト用ゴミ袋等の原料として好適に用いられる。
【００２５】
【実施例】
本実施例で用いた微生物は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユウトロファス  ＡＣ３２（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）である。これを、J. Bacteriol., 179, 4821-4830 頁 (1997) に記載の方法で培養し〔培地： Na2HPO4・12H2O 11.3g 、KH2PO4 1.9g 、(NH4)2SO4 6g、プロエキス（播州調味料（株）製）10g 、 MgSO4・7H2O 1g 、ヤシ油50g 、微量金属元素溶液（組成： FeCl3・6H2O 16.2g、 CaCl2・2H2O 10.3g、 CoCl2・6H2O 0.2g 、 NiCl2・6H2O 0.1g 、 CrCl3・6H2O 0.1g 、 CuSO4・5H2O 0.2g/1l 0.1N HCl) 5ml/1l 、ｐＨ６．７、培養温度３０℃、培養時間７２時間〕、ポリ（Ｄ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）、３ＨＢユニット：３ＨＨユニット＝９０：１０（モル比）、分子量約１００万) を約５０重量％（乾燥重量）含有した菌体を得た。次にこれを遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）によって培養液から分離し、得られたペースト状菌体に水を加えて１００ｇ／ｌ（湿菌体換算）の水性懸濁液とした。この水性懸濁液を用いて、以下に示す実施例を行なったが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００２６】
なお、菌体から分離して得られたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度は、以下のようにして決定した。すなわち、菌体より分離して得られた沈殿物の乾燥物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、メタノール０．８５ｍｌと濃硫酸０．２５ｍｌを加えて１００℃で１４０分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモニア飽和水溶液０．５ｍｌを加えて激しく攪拌して静置し、下層部をキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、分離物中のポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度を求めた。
【００２７】
実施例１
上記のポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有微生物菌体の懸濁液１０００ｍｌに、１０ｇ／ｌとなるようにドデシル硫酸ナトリウムを加えて、室温で１時間攪拌した。次にこれを「ダイノーミル」（スイス、ウィリー・エー・バックオフェン社製）を用いて１ｌ／ｈの流速で１時間、破断処理した。得られた処理液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿物を集めた。該沈殿物を乾燥後、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度を決定したところ９４％であった。
【００２８】
実施例２
上記のポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有微生物菌体の懸濁液１０００ｍｌに、１０ｇ／ｌとなるようにドデシル硫酸ナトリウムを加えて、室温で１時間攪拌した。次にこれを「ミニラボ」（デンマーク、ＡＰＶラニー社製）を用いて５００ｋｇｆ／ｃｍ2 で１時間、破断処理した。得られた処理液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿物を集めた。該沈殿物を乾燥後、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度を決定したところ９５％であった。
【００２９】
実施例３
実施例１においてドデシル硫酸ナトリウムをドデシルスルホン酸ナトリウムに変更した以外は同様の操作を行なった。該沈殿物を乾燥後、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の純度を決定したところ９４％であった。
【００３０】
比較例１
実施例１において「ダイノーミル」による破断操作を行なわなかった以外は同様の操作を行なった。その結果、遠心分離しても沈殿物は得ることはできず、ポリマーは全く分離できなかった。
【００３１】
比較例２
実施例１においてドデシル硫酸ナトリウム処理を行なわなかった以外は同様の操作を行なった。その結果、遠心分離して得られた沈殿物の純度は、懸濁前のポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有微生物菌体の純度と同じ５０％であった。
【００３２】
比較例３
ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含有微生物菌体の懸濁液１００ｍｌを「ダイノーミル」を用いて１ｌ／ｈの流速で１時間破断処理した後、１０ｇ／ｌになるようにドデシル硫酸ナトリウムを加えて室温で１時間攪拌した。得られた菌体懸濁液は非常に粘重で、遠心分離処理してもポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を得ることはできなかった。
【００３３】
以上の結果より、実施例１〜３で得られたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、いずれも界面活性剤を使用していない比較例２で得られたものに比べ、高純度のものであることがわかる。
【００３４】
また、実施例１〜３及び比較例１〜３の結果より、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の分離精製方法には、物理的破砕処理と界面活性剤の添加の両方が必要であるが、界面活性剤の添加処理液を物理的破砕処理することにより顕著な効果が得られる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を効率よく、極めて簡便に得られるため、本発明は、ＰＨＡの工業的生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するものである。また、本発明により得られるＰＨＡは、実用品として十分に高い純度を有するものであり、例えば、プラスチック製品、回収不要のインプラント材料、薬物担体、肥料担体、農業用マルチフィルム、釣糸等の漁具、コンポスト用ゴミ袋等の原料として好適に用いられる。