(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔を有するシリカゲル担体の表面にメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヘキサジメチリンブロマイドより選ばれる親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖が化学的に結合したクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
親水性高分子物質が分子量１０００から２００００００である請求項１記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
炭素鎖が、シアノ基、アリル基、アリール基、アミノ基、カルボン酸基、スルフォン酸基若しくは硫酸基で修飾されていてもよい直鎖状又は分岐を有する炭素鎖である請求項1記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
直鎖状又は分岐を有する炭素鎖の炭素数が１から３０である請求項３記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
親水性高分子物質が化学修飾を施した親水性高分子物質である請求項1記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
化学修飾がジオール化、還元化又はグルタール化である請求項５記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項１記載のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム。
【請求項８】
請求項１に記載した充填剤を充填したクロマトグラフィー用カラムに全血、血漿又は血清を注入し微量成分を分析又は分離する方法。
【請求項９】
細孔を有するシリカゲルにメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヘキサジメチリンブロマイドより選ばれる親水性高分子物質の水溶液を加え、乾燥させて表面に親水性高分子物質が結合したシリカゲル担体を得た後、有機溶媒とC4-12を有するクロロシランまたはオクタデシルトリクロロシランを加え、乾燥させて細孔中に炭素鎖を化学的に結合させることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、更に詳しくは血清等に存在する微量成分を直接分析できるクロマトグラフィー用充填剤に関する。
従来技術
近年、種々の物質の分離若しくは定性・定量分析などに高速液体クロマトグラフィーが広く用いられているが、その分離能力は接続されるカラムに大きく依存するため種々のカラムが開発、市販されている。中でも、特に広く用いられているのはシリカゲルなどの担体に炭素鎖を結合したカラムで、一般に逆相カラムと称されている。一方、高速液体クロマトグラフィーにおける分析方法は高分離能、高感度であるため生体成分、例えば血漿中の低分子化合物の定量などに使用されることが多い。しかしながら、血漿中のアルブミンなどの生体成分は、特に逆相系のカラムを使用した場合、カラムに吸着しやすくカラム分離能の低下や溶媒送液圧の上昇をもたらすため、血漿蛋白質などを除去するための前処理が必要であった。これらの欠点を克服するため、ピンカートンらは多孔性のシリカゲル担体の内部のみを化学修飾したカラムを開発している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５，Ｖｏｌ．５７，ｐ１７５７−１７６３）。
ピンカートンらが開発したカラムは、分析中における生体成分の妨害を除去する点では優れているが、低分子化合物のカラムへの保持力、分離能及び耐久性などの点において十分に満足できるものではない。また、ピンカートンらの開発したカラムと同様な目的で開発されているカラム、例えば特開平５−８７７９０号公報に開示されるカラムも同様に満足できるものではない。しかも、ピンカートンらの開発したカラムを始めとしたこれらのカラムは製造が煩雑であるため製造コストの面から高価なカラムとなっている。
発明の開示
本発明者らは生体成分の妨害を除去し、しかも十分な保持力と分離力を有した充填剤及び充填剤を充填したカラムについて鋭意研究してきたが、以下に示す構成により従来のカラムの欠点を解決できることを見出し本発明を完成した。
本発明は、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖が化学的に結合したクロマトグラフィー用充填剤である。本発明はまた、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖が化学的に結合したクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムである。本発明は更に、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖が化学的に結合したクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムに全血、血漿又は血清を注入し微量成分を分析又は分離する方法である。また、本発明は、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖が化学的に結合した充填剤のクロマトグラフィー用充填剤としての用途である。
本発明にかかるクロマトグラフィー用充填剤を用いて生体試料中の低分子化合物の分析を行うと、徐タンパク等の前処置が不要となり、直接生体成分の分析を行うことができ、分析法が簡便になり、分析時間も短くなるが、こうした充填剤を提供することが本発明の目的である。
本発明における細孔を有する担体とは、シリカゲル、セルロース、アガロース又は合成ポリマー等を意味し、その粒子径は通常２〜１００μｍである。担体は表面から陥没した多数の細孔を有すため大きな比表面積を有する。
親水性高分子物質とは、ヒドロキシル基等の親水性基を有する分子量１０００から２００００００の高分子物質であり、具体的にはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン又はヘキサジメチリンブロマイド等を挙げることができる。
本発明において、「担体の表面に親水性高分子物質が結合する」とは、実質的に担体の細孔中には親水性高分子が結合しておらず、担体表面に親水性高分子物質が物理的又は化学的に結合していることを意味する。
本発明における、親水性高分子物質は、その官能基の一部又は全部が化学的修飾されていてもよい。化学的修飾とは例えば、ジオール化、還元化又はグルタール化である。ジオール化とは、メタクリロキシ環の環状部位を希硫酸等で酸処理することにより２つのヒドロキシ基を生成させる反応等を意味する。
本発明おける、細孔中に結合した炭素鎖は、シアノ基、アリル基、アリール基、アミノ基、カルボン酸基、スルフォン酸基、硫酸基等で修飾されていてもよい直鎖状又は分岐を有する炭素鎖であり、炭素鎖は、担体とエステル結合、エーテル結合、アミド結合等の化学的な結合をしている。炭素鎖を修飾するには例えば、炭素鎖を有するシリル化剤をトルエン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン等の有機溶媒に溶解し、この溶液中に細孔に炭素鎖が結合したシリカゲルを入れ炭素鎖を化学的に修飾する方法等がある。
炭素鎖は、直鎖状でも分岐を有していてもよく炭素鎖の炭素数は１から３０である。
炭素鎖は、それを含む化合物より得られ、例えば、Ｃ４−１２を有するクロロシラン、イオン交換基を導入する材料である。オクタデシルトリクロロシランを含む。
これら炭素鎖が担体中の表面に開いている細孔に化学的結合する。
細孔径は、５０〜５００Åが良い。
本発明にかかるクロマトグラフィー用充填剤は、例えば次のようにして製造することができる。シリカゲルに０．２ｗ／ｖ％のポリブレン（ヘキサジメチリンブロマイド）水溶液を加え、約１時間攪拌する。グラスフィルターでろ過後、水で洗浄し、約１３０℃で約１時間乾燥させると、シリカゲルの表面にポリブレンが結合した担体が得られる。これにヘキサンとトリエチルアミンを加え、攪拌しながらオクタデシルトリクロロシランを徐々に加え、約３０分攪拌した後、エタノールを加える。得られた担体をグラスフィルターでろ過し、エタノールで洗浄後約１３０℃で１時間乾燥させると、本発明にかかる充填剤を得ることができる。更に、得られた充填剤をカラムカートリッジに充填することにより本発明にかかるカラムを得ることができる。カラムカートリッジは、ＨＰＬＣ分析用に用いる場合は通常ステンレス製であるが、生体成分中の微量物質のトラップ用として独立して用いる場合には合成樹脂等の材質であってもよい。
生体試料を本発明にかかるカラムに直接注入すると、生体試料中の蛋白質などの高分子種は充填剤表面の親水性高分子により排除され、細孔中の炭素鎖に到達することなくカラムを通過する。一方、低分子化合物は充填剤表面の親水性高分子物質を通り抜け、充填剤細孔に達し細孔中の炭素鎖により保持される。従って、生体試料中の蛋白質などの高分子種の影響を受けずに低分子化合物に対してのみ十分な保持力と分離能を有する分析が可能となる。
実施例１により得られたカラムを用いて、本発明の効果を示す試験例を以下に示す。
１．装置
ポンプ：ＬＣ−５Ａ、ＬＣ−９Ａ（島津製作所製）
ＵＶ検出器：８７０−ＵＶ（ＪＡＳＣＯ製）
インテグレータ：ＬＣ−４ＡＸ（島津製作所製）
サンプルインジェクター：７１２５（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ製）
ＨＰＬＣ流路切替えバルブ：７０００（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ製）
カラムカートリッジ：４．６ｍｍ（ｉ．ｄ．）×１０ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
分析カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＶＸ−ＯＤＳ（５μｍ）４．６ｍｍ（ｉ．ｄ．）×１５０ｍｍ（信和化工製）
２．試料溶液
ブランク溶液：超純水を用いた
ＢＳＡ試料溶液：ＢＳＡ１０００ｍｇを量り、０．５％酢酸アンモニウム５．０ｍｌを加え、ＢＳＡ試料溶液を調製した（ＢＳＡ濃度２００ｍｇ／ｍｌ：ＢＳＡとは仔牛血清アルブミン（蛋白質）の略号である）。
ｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸試料溶液：ｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸１０ｍｇを量り、エタノール１ｍｌを加えた後、超純水を９ｍｌ加え、さらにこの溶液を超純水で１００倍希釈し試料溶液とした（１０μｇ／ｍｌ）。
３．操作
装置は図１に示すカラムスイッチングＨＰＬＣ装置を用いた。操作は以下のように行った。
（１）シリンジを用いて試料溶液をサンプルループに一定量注入し、サンプルインジェクターバルブを切替え、トラップＨＰＬＣシステムの移動相により試料をトラップカラムに導入した。
（２）１０分間送液を続け、試料中のタンパクを排除した。
（３）次に流路切替えバルブを切替えることにより、トラップカラムに分析ＨＰＬＣシステムの移動相を送液し、目的成分をトラップカラムから溶出させ、分析カラムに導入しこの時のクロマトグラムを記録した。
４．試験条件
以下の条件により、試料をシリンジを用いて一定量注入し、本発明にかかるカラムの効果を試験した。
ＨＰＬＣ条件
トラップシステム
カラム：本発明にかかるカラム４．６ｍｍ（ｉ．ｄ．）×１０ｍｍ
移動相：０．５％酢酸アンモニウム溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ付近の一定流量
サンプル注入量：ＢＳＡ試料溶液１００−３００μｌ（ＢＳＡとして２０−６０ｍｇ）
ｎ−プロピル−ヒドロキシ安息香酸試料溶液１０μｌ（１００ｎｇ）
トラップ時間：１０ｍｉｎ
分析システム
カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＶＸ−ＯＤＳ（５μｍ）４．６ｍｍ（ｉ．ｄ）×２５０ｍｍ
移動相：０．２％ＴＦＡを含む４５％アセトニトリル溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ付近の一定流量
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
分析時間：１０ｍｉｎ
５．結果
本発明にかかるカラムで得た（１）ブランク溶液、（２）ｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸試料溶液（負荷量１００ｎｇ）、（３）ＢＳＡ溶液（負荷量２０ｍｇ）及び（４）ＢＳＡおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸混合試料溶液（負荷量それそれ２０ｍｇ、１００ｎｇ）のクロマトグラムを図２に示す。
図２より、注入したＢＳＡ（蛋白質）は本発明にかかる充填剤の表面に吸着しないことから、表面が親水性基で修飾されたために蛋白質を排除しているものと考えられる（（３）のクロマトグラム）。また、ｐ−ヒドロキシ安息香酸が疎水性相互作用により、本発明にかかる充填剤に保持されていることから充填剤内部は炭素鎖により修飾されているものと考えられる（（２）のクロマトグラム）。ＢＳＡとｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸の混合試料溶液を注入した場合は、ＢＳＡに妨害されることなくｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸が検出できた（（４）のクロマトグラム）。
また、ＢＳＡ溶液を繰り返し注入した際のトラップカラムの保持能を示す図を図３に示した。図３よりＢＳＡを大量に注入してもトラップカラムの性能が劣化しないことが明らかである。
図４には、ラット血漿を１０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した上澄を試料とし、本発明にかかるカラム及び市販のカラム（担体表面をオクチルデシル基で修飾したもの）に３００μｌ注入した場合のクロマトグラムを示した。市販のカラムにプラズマを注入するとカラムに保持されるため著しいテーリングを起こし（（３）のクロマトグラム）プラズマ中の微量物質の検出は極めて困難であるが、一方、本発明にかかるカラムにより得られたクロマトグラム（（２）のクロマトグラム）は、プラズマがカラムに保持されないためテーリングを起こさず、プラズマ中の微量分析に適していることが明らかである。
以上の結果より、本発明にかかる血清直接注入カラム充填剤は充填剤外表面の親水性高分子がＢＳＡを高度に排除し、内表面のＯＤＳ鎖は十分な保持能を有することが確認された。また、ＢＳＡとして３０００ｍｇ以上のタンパクを注入した後にも、トラップカラム、分析カラムともに、カラムパフォーマンスの低下や送液時のカラム圧力の顕著な上昇は認められなかった。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるわけではない。
実施例１
シリカゲル１ｇに０．２ｗ／ｖ％のポリブレン（ヘキサジメチリンブロマイド）水溶液３０ｍｌを加え、約１時間攪拌した。グラスフィルターでろ過後、水で洗浄し、１３０℃で１時間乾燥させ、シリカゲルの表面にポリブレンが結合した担体を得た。これに３０ｍｌのヘキサンとトリエチルアミン０．３ｍｌを加え、攪拌しながらオクタデシルトリクロロシラン０．５ｍｌを徐々に加え、約３０分攪拌した後、エタノールを１０ｍｌ加えた。得られた担体をグラスフィルターでろ過し、エタノールで洗浄後１３０℃で１時間乾燥させ、本発明にかかる充填剤を得ることができた。
実施例２
シリカゲル１ｇに０．２ｗ／ｖ％のメチルセルロース水溶液３０ｍｌを加え、約１時間攪拌した。グラスフィルターでろ過後、水で洗浄し、１３０℃で１時間乾燥させ、シリカゲルの表面にメチルセルロースが結合した担体を得た。これに３０ｍｌのヘキサンとトリエチルアミン０．３ｍｌを加え、攪拌しながらオクタデシルトリクロロシラン０．５ｍｌを徐々に加え、約３０分攪拌した後、エタノールを１０ｍｌ加た。得られた担体をグラスフィルターでろ過し、エタノールで洗浄後１３０℃で１時間乾燥させ、本発明にかかる充填剤を得ることができた。
実施例３
実施例１で得られた充填剤に０．１％のアルギン酸水溶液を２０ｍｌ加えて攪拌し、水で洗浄後ろ過して、親水性高分子物質が修飾された充填剤を得た。
【図面の簡単な説明】
図１は、本願発明を評価するために用いたＨＰＬＣシステムの模式図である。
図２は、本願発明にかかる充填剤を用いて得られたクロマトグラムである。
図３は、本願発明にかかる充填剤にタンパク（ＢＳＡ）を繰り返し注入した場合のｐ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）ピーク面積の変化を示す図である。
図４は、本願発明にかかる充填剤及び市販の充填剤にラット血漿を注入した場合のクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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