(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−腫瘍活性を示す接合体であって、該接合体がＣＤ３３蛋白質に対するＭ１９５抗体とゲロニンとよりなることを特徴とする接合体。
【請求項２】
接合体がＳＭＰＴ（４−サクシイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）−修飾Ｍ１９５抗体と２−ＩＴ（２−イミノチオラン）−修飾ゲロニンとの接合によって得られる請求項１記載の接合体。
【請求項３】
接合体がＭ１９５抗体とゲロニンとの間の融合蛋白質である請求項１記載の接合体。
【請求項４】
Ｍ１９５抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項５】
ゲロニンが天然ゲロニン又は組み換えゲロニンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項６】
薬理効果を示す量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の接合体と薬学的に受入れ可能なキャリアとを一体化してなる腫瘍細胞を措置するための医薬組成物。
【請求項７】
単一ユニット投与形体（single unit dose form）にある請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍細胞が急性および慢性骨髄白血病、急性および慢性骨髄異形成症候群、不応性貧血、リンパ球性白血病、そして未分化細胞性白血病よりなる群から選択される腫瘍細胞を措置するための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物が腫瘍細胞の成長速度を遅らせる請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
腫瘍細胞がヒトまたはヒト以外の動物のものである請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組成物が腫瘍性疾患の再発を防ぐ請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１２】
組成物が腫瘍細胞の宿主の生き残り時間を延長させる請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍細胞がインビトロにある請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍細胞が骨髄で発見されるものである請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍性疾患を有する個体から取り出した骨髄を、取り出した骨髄中の腫瘍細胞に対して細胞破壊的に有効な量の医薬組成物と接触させて使用され、医薬組成物が生体外骨髄内の腫瘍細胞を殺す請求項６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、基本的には、腫瘍性疾患の措置の分野に関するものである。より具体的には、本発明は新しい免疫接合体と腫瘍性疾患の措置におけるその使用に関するものである。さらにより具体的には、本発明はCD33抗原の表現によって特徴づけられる白血病細胞に対する毒性を有する新しい免疫接合体に関連している。
関連技術の説明
腫瘍性疾患は西側世界における死および疾患状態の主要な原因のひとつである。すべての腫瘍性疾患あるいは「癌」は少なくともひとつの特徴、つまり、細胞成長を規制するプロセスにおいて欠陥を有していることに起因している。
癌細胞の表面にある抗原は、リンパ球白血病の非リンパ球白血病からの区別、急性腫瘍性白血病の区分け、治療結果の予測、およびイン・ビボまたは骨髄腫を取り出してのエクス・ビボでの治療において有益である。急性非リンパ球細胞を表現する抗原は、その成長の初期の段階で正常な増血細胞も識別する。
CD33抗原はバースト形成ユニット-エリスロイド（BFU-EおよびCFU-顆粒白血球、エリスロイド、モノサイト、メガカリオサイト）CFU-GEMMのフラクション上で、正常なコロニー形成ユニット顆粒白血球-モノサイト（CFU-GM）で見いだされるが、正常な多能性幹細胞には存在しない、分子量67キロドルトンの糖蛋白質である。
抗体は、通常抗原決定子に応答して、動物の免疫システムによってつくりだされる蛋白質である。抗体はそれらが向けられた特定の抗原と結合する。特定のモノクローナル抗体の開発は、抗原に関連した腫瘍を過剰表現する細胞に対して選択的に化学療法剤を移動させることができる手段を研究者に提供する。
免疫毒素はひとつの毒素に共有結合したモノクローナル抗体で構成されるハイブリッド分子である。免疫毒素は、腫瘍細胞に対する選択性および非常に強力な毒素伝達の可能性など、従来の抗腫瘍剤と対比していくつかの利点を有している。
急性非リンパ球白血病細胞および急性骨髄腫白血病細胞上にCD33抗原が存在していると、選択性のある免疫毒素が形成される可能性がある。現在、そのような有効な免疫毒素は存在していない。したがって、この技術分野では、白血病細胞を選択的に殺すための化合物および方法に対する大きなニーズおよび要求が存在している。
発明の要約
本発明はCD33蛋白質に対する選択的結合性を有する抗原結合領域と細胞成長調節子との接合体で構成される新しい組成物を提供する。このような組成物は、CD33抗原の過剰表現を特徴とする腫瘍細胞を選択的に殺すための免疫毒素として作用する。
したがって、本発明のひとつの実施例においては、CD33抗原に対する選択的な結合性を示す抗原結合領域と細胞成長調節子との接合体によって構成される物質の新しい組成を提供する。この細胞成長調節子は毒素、細胞毒性薬、細胞分裂阻止薬、または生物学的反応修飾子などである。好ましくは、この細胞成長調節子はゲロニン（gelonin）である。
本発明の別の実施例においては、本発明の免疫毒素を細胞毒性的に有効な量を措置を必要とする個人に投与するステップを含む腫瘍性疾患の措置法を提供するものである。
本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患を有する個人から骨髄腫を取り出して、その骨髄腫を本発明による組成物によって処理し、その処理された骨髄腫をその個人に戻すステップで構成される、骨髄腫内の腫瘍細胞を殺す方法を提供する。
本発明による他の実施例においては、その疾患がCD33蛋白質の表現を特徴とする腫瘍性疾患の再発を防ぐための方法を提供する。再発は、本発明による免疫毒素を細胞毒性的に有効な分だけ投与することによって阻止することができる。
本発明のさらに別の実施例においては、CD33抗原結合領域と細胞成長調節子との溶融によって形成される溶融蛋白質で構成される物質の新しい組成を提供する。好ましくは、その成長調節子はゲロニンである。
本発明の他の実施例で、本発明による腫瘍を有する哺乳動物に生き残り時間を、本発明による免疫毒素をその哺乳動物に投与することによって延長するための方法が提供される。さらに別の実施例で、本発明による免疫毒素の投与によって、腫瘍の成長速度を遅らせる方法を提供する。さらに、本発明による免疫毒素で構成される医薬品組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ゲロニンおよびＭ195免疫毒素によるHL60細胞上での蛋白質合成の抑制を示している。
図２は、SKLY16およびHL60細胞株による蛋白質合成の抑制を示している。
図３は、Ｍ195免疫毒素をHL60と共に３日間培養した場合の蛋白質合成の抑制を示している
図４は、Ｍ195-ITをHL60細胞上で５日間培養した場合の蛋白質合成の抑制を示している。
図５は、HuG１およびHuG１-ITのHL60，Ｕ937，MOLT４細胞に対する結合を示している。
図６は、HL60細胞上でのHuG１-ITによるDNA合成の抑制を示している。
図７は、HuG１-ITおよびHuG１またはFD79間の競合を示している。
図８は、Ｍ195のみ、反応混合物、ゲロニンのみ、または精製Ｍ195ゲロニンの電気泳動パターンを示している。
［本発明の詳細な説明］
ここで使われている「キメラ性抗体」または「キメラ性ペプチド」という用語は、それらペプチドの一部が第一の遺伝子ソースから誘導される抗体またはペプチドにおける対応する配列から誘導された、あるいはそれと類似したアミノ酸配列を有しており、その鎖の残りの部分が他の遺伝子ソースの対応する配列と同じであるような抗体、または抗体ペプチドを意味している。例えば、キメラ性重鎖抗体ペプチドは、マウス可変領域とヒト不変領域を持っているような場合がある。これら２つの遺伝子ソースは、通常、２つの別個の種であるが、場合によって、同じ種に属する場合もある。
キメラ性抗体またはペプチドは通常、組み替え分子および／または細胞技術を用いてつくられる。多くの場合、キメラ性抗体はひとつの哺乳動物種から誘導された抗体の可変領域を模倣する軽鎖および重鎖の両方の可変領域を有しているが、不変および／またはフレームワーク部分は第２の異なった哺乳動物種から誘導された抗体内の配列と同じである。
ここで使われているキメラ性抗体は、本例に限定されるものではない。キメラ性抗体は、これらのソースが別のクラス、異なった抗原反応、あるいは別の種からのものであるかどうかには関係なく、また、融合点が可変領域と不変領域のいずれにあるかには関係なく、重鎖および軽鎖のいずれか一方、またはその両方が異なったソースの抗体内における配列を模倣する組み合わせで構成されている。例えば、キメラ性抗体はフレームワークおよび相補性決定領域（CDR）が異なったソースからのものである抗体を含んでいる。例えば、非ヒトCDRがヒト不変領域に結合されたヒトフレームワーク領域内に統合され、「ヒト化抗体」がつくられる。すべて引用によって本文に組み入れているPCT出願公開No.WO 87/02671；米国特許第4,816,567；欧州特許出願0173494；Jones，et al.,Nature，321：522-525（1986）、およびVerhoeyen，et al.,Science，239：1534-1536（1988）参照。
ここで使われている「ヒト様フレームワーク領域」はそれぞれの抗体鎖のためのフレームワーク領域で、通常、少なくとも約70又はそれ以上のアミノ酸残基、通常は75−85又はそれ以上の残基で構成されている。ヒト様フレームワーク領域のアミノ酸残基はヒト免疫グロブリンと少なくとも約80％、好ましくは約80-85％、そして最も好ましくは85％以上のヒト免疫グロブリンと同じである。この他のエンドエルゴニアス（endergeneous）抗体と共通の特徴は、「自己」マーカーに対する応答を最小限化するメカニズムなど、副次的な免疫反応だけを導入する標的部分を発生させる上で有益である。
ここで使われている「ヒト化」または「ヒト様免疫グロブリン」という用語は、ヒト様フレームワーク領域および、例えば、少なくとも約80％又はそれ以上、好ましくは約80−90％又はそれ以上、そして最も好ましくは約95％又はそれ以上ヒト免疫グロブリンと実質的には同じな不変領域を有する免疫グロブリンを指している。したがって、CDRを除いて、ヒト様免疫グロブリンは、１つ以上の天然由来ヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的には同じである。
ここで使われている「ハイブリッド抗体」という用語は各鎖が哺乳動物抗体鎖に関しては同じであるが、その組み合わせが新しい集団を形成し、したがって、２つの抗原がその抗体によって認識されるような抗体を指している。ハイブリッド抗体においては、１つの重鎖および軽鎖対が１つの抗原識別特性、例えばエピトープに対して発生する抗体の中に見いだされるものと同じであるが、もう１つの重鎖および軽鎖対は別のエピトープに対して発生する抗体の中に見いだされるものと同じである。その結果、少なくとも２つのエピトープと同時に結合する能力など、多機能性結合価という性質をもたらす。こうしたハイブリッドは、勿論、キメラ性鎖を用いてもつくることができる。
ここで使われている「モノクローナル抗体」とは、個別の抗体決定子を識別する抗体組成を意味している。この用語はその抗体のソースや、それがつくられる方法を限定するものではない。
本発明においては、１つの抗体、あるいはその他のペプチドは、標準的な抗体−抗原あるいは競合アッセイなどのリガンド−受容体アッセイ、飽和アッセイ、またはELISAまたはRIAなどの標準的な免疫アッセイで測定または判定されるところの、蛋白質などCD33に結合することができる場合に、CD33に対して特殊性を有していると認められる。特殊性に関するこの定義は単一の重鎖および／または軽鎖、CDR、溶融蛋白質または重鎖および／または軽鎖のフラグメントに対しても適用され、これらも、CD33のみに結合するか、あるいは相補性のある可変領域および不変領域との免疫グロブリン立体配座内に適切に組み込まれると、CD33との結合特性を示す場合に、CD33に対して特殊性を有するとみなされる。
競合アッセイにおいては、１つの抗体やペプチドフラグメントの抗原と結合する能力は、そのペプチドのその抗原と結合することが知られている化合物の結合性と競合する能力を検出することによって判定することができる。いろいろなタイプの競合アッセイが知られており、ここでも検討されている。また、抑制因子が存在していない状態で、テスト化合物の結合性を測定するアッセイを用いることもできる。例えば、ひとつの分子なり他の化合物のｃ-erbB-2蛋白質と結合する能力は、その分子を直接ラベルすることによって検出することができるし、ラベルしない場合、種々のサンドウィッチアッセイを用いて間接的に検出することができる。競合結合アッセイなど、いろいろなタイプの結合アッセイが知られている（例えば、ここで引用により本文に組み入れている、米国特許第3,376,110、4,016,043、およびHarlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，N.Y．（1988）参照）。競合アッセイ以外の、テスト化合物のひとつの成分への結合性を測定するためのアッセイも利用することができる。例えば、免疫グロブリンを用いてCD33の存在を確認することができる。ELISAなど、モノクローナル抗体アッセイの標準的な手順を用いることもできる（HarlowおよびLane，supra参照）。利用可能な種々の信号発生システムに関しては、ここに引用により本文に組み入れている米国特許第4,391,904参照。
さらに、CD33に対する結合部分の特殊性はそれら部分の親和性によって判定することができる。その部分の分離定数（ＫD＝１/Ｋ；ここでＫは親和性定数）が＜１μM、好ましくは＜100nM、最も好ましくは＜１nMの場合に、そうした特殊性が存在していると認められる。抗体部分と、通常、低い範囲のＫDを有している。ＫD＝［Ｒ−Ｌ］／［Ｒ］［Ｌ］で、［Ｒ］，［Ｌ］および［Ｒ−Ｌ］はそれぞれ受容体またはCD33［Ｒ］、リガンド、抗体またはペプチド［Ｌ］、および受容体-リガンド複合体［Ｒ−ｌ］の均衡時の濃度である。通常、リガンドまたはペプチドと受容体または抗原との間の結合作用には静電引力、ファンデルワース力、および水素結合などの非可逆的結合などが含まれる。
他のアッセイ方式では、ここで引用により本文に組み入れている1991年１月18日付け出願の米国特願第07/644,361ダウン・モジュレーション、内部化、あるいはフォスフォリル化などから発生する種々の生理学的または化学変化の存在または不存在の検出を含む場合もある。Receptor-Effector Coupling-A Practical Approach，ed．Hulme，IRL Press，Oxford（1990）も参照。
ゲロニンはゲロニウムマルチフォーラムの種子から精製された糖蛋白（分子量：約29−30,000Kd）である。ゲロニンは強力なリボソーム非活性化植物毒素のタイプに属する。他のリボソーム非活性植物毒素のクラスに属するものとしては、アブリン、リシン、およびモデシンである。ゲロニンは、アブリンおよびリシンと同様、哺乳動物リボソームの60Ｓサブユニットを破壊することによって蛋白質合成を抑制する。ゲロニンは化学的および物理的処理に対しては安定的である。さらに、ゲロニン自体は細胞には結合せず、単独で投与された場合、通常は非毒性（濃度が高い場合を除いて）であり、実験室で取り扱う場合は安全である。リボソームの非活性化は非可逆的であり、補助因子が関与するようには思われず、効率的に行われるので、これはゲロニンが酵素的に作用することを示唆している。
ゲロニンとリシンは蛋白質重量ベースで見て、蛋白質合成を抑制する最も活性の高い毒素である。ゲロニンは蛋白質合成においては、リシンＡ鎖より10−1000倍も活性が高い。リシンおよびアブリンのようなペプチドは毒性を持つユニットであるＡ鎖と細胞に接合することによって作用するＢ鎖との２つの鎖で構成されている。リシンおよびアブリンと違って、ゲロニンは単鎖であり、それはＢ鎖を持っていないので、それ自体は普通の細胞に対しては比較的毒性が低い。
哺乳動物細胞は天然のゲロニン分子に結合する、および／またはそれを内部化する能力を明らかに欠いている。ある種の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原に向けられたＭ195など、腫瘍標的試薬とゲロニンの接合体はゲロニンをその細胞に結合させるための方法と、ゲロニン−抗体複合体の内部化のためのルートの両方を提供する。
免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬あるいはバクテリア性または植物性由来の酵素活性毒素、あるいはそうした毒素、の酵素活性フラグメント（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントが好ましく、ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非活性フラグメント、（シュードモナスアクルギノーサからの）外毒素Ａ鎖、リシン鎖Ａ、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、オウリテス  フォージイ（Aleurites fordii）蛋白質、ジアンシン蛋白質、フィトイカ  アメリカナ（Phytoiaccaamericana）蛋白質（PAP I，PAP IIおよびPAP-S）、モルモディカ・チャランティアインヒビター（momordica charantiainhibitor）、カルシン（curcin）、クロチン、サポナリアオフィシナリスインヒビター（saporaria officinalis inhibitor）、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンなどがその具体例である。最も好ましいのは、ゲロニンとの接合体である。
活性フラグメントおよび誘導体にはゲロニンの全長構造と同じ核構造を有しているが主要配列全体を欠いている化合物を含んでいる。これらのフラグメントまたは誘導体は、ゲロニンと同じ、あるいはそれより改善された生物学的、あるいは細胞毒性活性を有している。ゲロニンフラグメントまたは誘導体はウサギ網状赤血球細胞溶解物アッセイを用いて、当業者によって簡単に判定することができる。
Ｍ195抗体に結合され、本発明において用いることができる生物学的応答修飾子としては、限定するものではないが、IL-１，IL-２、インターフェロン（α，βまたはγ）、TNF，LT，TGF-βおよびIL-６などのリンフォカインおよびサイトカインなどである。これら生物学的応答修飾子は腫瘍細胞に対していろいろな影響を及ぼす。こうした影響の中には、直接の作用によって殺される腫瘍細胞の増大、および、ホスト細胞防衛仲介プロセスの増大によって殺される腫瘍細胞の増大などがある。抗体Ｍ195とこれら生物学的応答修飾子との接合体は、腫瘍内部への選択的局在化、したがって、より優れた抗増殖効果をもたらす同時に、非標的細胞の毒性につながる不特定効果は抑制される。
本発明において有益な細胞毒性薬（およびその誘導体）には、限定するものではないが、アドリアマイシン、シス-プラチニウム複合体、ブレオマイシン、およびメソトレキセートなどがある。これらの細胞毒性薬は再発性腫瘍の治療的管理のためには有益であるが、副作用が激しく、非標的細胞の受ける損傷も激しいので、その使用法は非常に難しい。Ｍ195抗体は、腫瘍への伝達と、腫瘍細胞自体への侵入をしやすくるための両方の効率的な手段を提供してくれ、こうした薬剤の有益なキャリアとしての役割を果すことができる。さらに、特定の抗体による細胞毒性薬の腫瘍への伝達は肝臓などCD33および骨髄ステム細胞を表現しない鋭敏な場所を、化学治療剤の悪性の作用から保護する。伝達システムとしてのＭ195抗体に接合された薬剤の使用は、すべての薬剤部分が腫瘍細胞に集中する抗体に接合されており、通常、そこに内部化されるので、薬剤自体の用量を減らす。
このモノクローナル抗体の接合体は種々の２機能性蛋白質結合剤を用いてつくることができる。こうした試薬の例としてはSPDP、イミノチオラン（IT）、ヂメチルアジピミデートなどのイミドエステルの２機能性誘導体、HCl、ジサクシイミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス（ｐ-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビス-アジド化合物、ビス-（ｐ-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミンなどのビス-ジアゾニウム誘導体、トルエン２，６-ジイソシアネートなどのジイソシアネート類、および１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼンなどのビス-活性ふっ素化合物などがある。
CD33蛋白質の表現によって特徴づけられる白血病を持っていると診断された個人に対して本発明による免疫毒素を投与すると、その細胞毒性薬の、腫瘍細胞を殺すためにそれが必要とされている場所への移動と集中が可能になる。そのように細胞毒性薬を目的の場所に向かわせることによって、他の器官、組織およい細胞への毒性が除去され、あるいは低下される。
イン・ビボで治療に用いられる場合には、この免疫毒素は治療的に有効な量、つまり、腫瘍の負担をなくすか、あるいは軽減する量、または化学療法または放射線療法による初期の治療後に残っている疾患を除去するための量だけ、治療対象のヒトまたは動物に対して投与する。通常は経皮的に、好ましくは静脈注射で投与される。用量および処方は白血病の性質、その密度、そして、治療指数などの特定の免疫毒素の特性、患者、そしてその患者の病歴などに依存する。投与される免疫毒素の量は、通常、患者の体重の0.01−1.0mg/Kg程度の範囲である。
経皮投与を行うためには、免疫毒素は、薬学的に受け入れ可能な経皮投与伝達手段との組み合わせによる、ユニット投与による注射可能な形態（溶液、懸濁液、およびエマルジョン）の形で処方される。そうしたベヒクルは非毒性で、治療上の効果をもたないものであることが好ましい。そうしたベヒクルの実例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンなどがある。固定オイルおよびエチルオレエートなどの非水性伝達手段も用いることが可能である。キャリアとしてリボソームの使用も可能である。これらのベヒクルは、緩衝剤や保存剤など、等張性および化学的安定性を強化する物質などの添加物を多少含んでいてもよい。免疫毒素は通常、そうしたベヒクル内で約0.1mg/ml−10mg mlの濃度で調製される。
本発明による免疫毒素は、骨髄腫における腫瘍細胞を殺すための方法においても用いることができる。この方法では、白血病など腫瘍性疾患を有する個人から、先ず、骨髄腫が取り出される。次に、その骨髄腫を細胞毒性的に有効な量の本発明による免疫毒素によって処理する。
以下の実例は、本発明による免疫毒素の調製、特徴付け、および使用法に関する詳細な説明である。これらの例はいずれの意味においても、本発明を限定することは意図していない。
実施例１
ゲロニンの精製
Gelonium multiforumの種子の外皮をとり、実をホモジナイザーで、５mMリン酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14Ｍ NaCl８容積分と共に砕く。この均一化されたものを一昼夜４℃の温度で継続的に撹拌しながら放置し、氷上で冷やして、０℃の温度で、20分間、35,000times ｇで遠心分離にかける。上澄液を取り除いて、５mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で透析してから、pm10フィルターを用いて遠心分離する。サンプルを５mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で均衡化させたCM-52イオン交換カラム（20×1.5cm）上で層状に置く。このイオン交換樹脂に結合した物質を400mlの０−0.3M線形勾配を持つNaClで、４℃の温度下、１時間あたり25mlの割合で溶出させた。５ml単位でフラクションを集める。各フラクションを電子顕微鏡で観察した。ゲロニンは画分55−70で溶出し、最後の主要溶出ピークであった。フラクション55−70が集められ、２回蒸留された水で透析され、凍結乾燥の方法で濃縮された。各製剤の純度および分子量を、TSK3000ゲル浸透カラムを用い、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4および15％ナトリウム・ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS-ページ）によって、高圧液体クロマトグラフィーで検査した。ジェロニンは単一の帯として移動し、その分子量は29,000−30,000ドルトン程度と推定された。
実施例２
ゲロニン活性のアッセイ
ゲロニンの活性は無細胞蛋白質合成抑止アッセイによって観察された。この無細胞蛋白質合成抑止アッセイは、50μlウサギ細胞質溶解物に以下の成分（0.5mlの0.2Ｍトリス-HCl（pH7.8）、8.9mlのエチレングリコール、および0.25mlの１M HCl）を追加し、追加する度によくかき回した。
0.375Ｍ KCl，10mM Mg（CH3CO2）２，15mMグルコース、0.25−10mMアミノ酸（ロイシンを除く）、５mM ATP，１mM GTP，50mMトリス-HCl（pH7.6）、10μlクレアチニンフォスフェート-クレアチニンフォスフォキナーゼ、８μl14Ｈロイシン（Amersham，348mCi/mmol）で構成される塩-アミノ酸エネルギー混合体（SAEM）と、いろいろの濃度のゲロニン混合物を含む溶液1.5μlの追加。この混合物を30℃の温度で60分間培養した。14Ｃ-ロイキンのとり込みが、グラスファイバーフィルター上に合成された蛋白質を沈殿させ、10％TCAおよびアセトンで洗浄し、そして、アクアゾルシンチレーション液を用いるベーターカウンターでその放射能を測定することによって観察した。これら抗体との接合には特殊な活性が４×109Ｕ/mg以上のゲロニンが用いられた。ゲロニンの活性の単位は、無細胞アッセイにおいて［14Ｃ］ロイシンの蛋白質への取り込みを50％抑制するゲロニンの量を基準としている。
実施例３
イミノチオランによるゲロニンの調製
２-IT修飾ゲロニンの調製
フォスフェート緩衝食塩水内のゲロニンをセントリプレップ10濃縮器で10mg/ml程度に濃縮した。トリエタノールアミンヒドロクロライド（TEA/HCl），pH8.0およびEDTAを加えて最終的な濃度が60mM TEA/HClおよび１mM EDTA，pH8.0となるようにした。２-イミノチオラン保存液（１mM EDTAを含む60mM TEA/Hcl緩衝液、pH8.0）を加えて最終的な濃度が１mMとなるようにし、サンプルを窒素ガス流の存在下、攪拌しながら４℃の温度で90分培養した。過剰なイミノチオランは0.01M Na2HPO4，0.0018M KH2PO4，0.0034M KCl，0.001M EDTAおよび0.17M NaClを含むフォスフェート-EDTA緩衝液、pH7.5で予め均衡化させたセファデックスＧ−25（１×24cm）カラム上でのゲルろ過で除去した。フラクションを分析し、バイオ-ラッドアッセイを用いて、マイクロタイタープレートで蛋白質の含有量を調べた。ゲロニンは空隙容積で溶出した（フラクション約21−23）。これらのフラクションを集めて、４℃で保存した。
４-サクシイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α（２-ピリジルジオチ）トルエン（SMPT）と結合したＭ195は、２-IT-４修飾ゲロニンをSMPT-修飾MAB Ｍ195と結合して調製した。要するに、Ｍ195をSMPTで修飾するために、PBS1.0ml内の抗体10mgを２Ｘ硼酸塩緩衝液（0.05Ｍ硼酸ナトリウム1.7％塩化ナトリウム、pH9.0）で１：１に希釈し、乾燥DMF内の４mM SMPT 52μlを抗体溶液にゆっくり加えた。この反応物を室温で２時間、Ｎ2の存在下、攪拌しながら培養した。過剰なSMPTは反応混合物を、フォスフェートEDTA緩衝液，pH7.5を含むセファデックスＧ-25カラムを通過させることによって除去し、バイオ-ラッドアッセイで抗体ポジティブフラクションを評価した。これらのフラクションを集めて、Ｎ2の存在下、４℃の温度で保存した。２-ITとのクロス−リンクを27℃の温度で、Ｎ2の存在下、攪拌しながら96時間行った。最終生成物をSPDPについて述べたのと同じように精製した。
実施例４
マウスモノクローナル抗体Ｍ195の調製
NS-１マウス骨髄腫細胞と急性非リンパ球白血病（FAB-Ｍ２）をもった親からの白血病細胞で免疫化した生後５週間のHALB/cマウスの脾臓細胞との融合から得られたハイブリドーマからマウスモノクローナル抗体Ｍ195を作成した。クローンされたハイブリドーマ培養株からの上澄液を、スタフイロコッカス  アウレウス蛋白質Ａ（PA）赤血球ロゼッティングを用いて、白血病細胞株および元のANLL白血病細胞のパネルでスクリーニングした。繰り返しサブクローンされたＭ195ハイブリドーマを２倍にプリステイン−プライムした（pristane-primed）（Ｃ57 BL/６倍BALB/c）Ｆ１マウス内で拡大した。
連続pHステップ希釈法を用いて、Ｍ195を親和性クロマトグラフィーでPA-セファロース上で精製した。純度はクロマシ輝青色に染色したナトリウム・ドデシル（SDS）-ポリアクリルアミド・ゲル上で判定した。ヒト化モノクローナル抗体Ｍ195はCo et al.,“Chimeric and Humanized Antibodies with Specificity for the CD33 Antigen”，Ｊ．Immunol.,148：1149−1154（1992）に述べられている手順にしたがって調製され、上に述べたようにハイブリドーマから造り精製された。
簡単に述べると、マウスＭ195に対して重鎖および軽鎖に関して非常に変わりやすいドメイン（Ｖ領域）が固定（anchored）PCR法でクローンされた。まず最初に、Ｍ195ハイブリドーマ細胞を溶解して、ホットフェノール法を用いてRNAを抽出した。ウィルス性逆転写酵素による培養で、RNAからcDNAを合成した。PCRプライマーを設計し、簡単なサブクローニングのためにECO RIおよびHind III部位の両方を上流および下流プライマーに含めた。温度循環（92℃を１分間、50℃を２分間、そして72℃を３分間）を30回繰り返すプログラム可能加熱ブロックで、PCR反応を行った。PCR生成物を低融点アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。バンドを切り取り、制限酵素で消化して、PUC18ベクター内にクローンして、配列を判定した。マウス重鎖および軽鎖可変領域を、異なったベクターを用いて、プラズミド含有相補性ヒト重鎖および軽鎖にスライスした。キメラ性マウス／ヒト軽鎖および重鎖をコード表現するベクターを電気泳動でSP 2/0細胞内にトランスフェクトした。生き残ったコロニーをプレートして、ヒト化αCD33抗体をつくりだす能力についてテストした。
実施例５
SPDP-修飾モノクローナル抗体Ｍ195と
イミノチオラン修飾ゲロニンの接合体
実施例１で述べたように調製された精製ゲロニン（PBS内に２mg/ml）１mgを実施例３に述べたように、イミノチオランで修飾した。実施例４に述べたように修飾されたモノクローナル抗体Ｍ195を等量の修飾ゲロニンと混合した。この割合では、ゲロニンが抗体と比較してモル数で５倍多かった。この混合物のpHを0.05Ｍ TEA/HCl緩衝液pH8.0を追加して調整し、その混合物を４℃の温度で、窒素の存在下、20時間培養した。遊離スルフヒドリル基が残らないようにするために、ヨードアセトアミド（0.1Ｍ）を追加して最終濃度を２mMとなるようにして、さらに約25℃程度の温度で培養を１時間続けた。ゲルろ過による精製を行うまで、この反応混合物を４℃の温度で保存した。
実施例６
ゲロニン−モノクローナル抗体Ｍ195複合体の精製
PBSで予め均衡化したセファデックス３−300カラム（1.6×31cm）上でのゲルろ過によって実施例６の反応混合物から非接合ゲロニンおよび低分子量生成物を除去した。
セファデックスカラムに入れる前に、セントリコン30マイクロ濃縮器によって実施例５からの反応混合物を１ml程度に濃縮した。このカラムをPBSで洗浄した。１mlフラクションを集めて、50μl画分を分析し、ブラッドフォードアッセイで蛋白質について調べた。
未接合Ｍ195を取り除くために、Ｓ-300カラムからの高分子量ピーク（フラクション28−40）を0.1M NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液（pH7.2）で予め均衡化したブルーセパラースCL-６Ｂ（１×４cm）の親和性クロマトグラフィーカラムにかけた。サンプルを入れた後、カラムを30mlの緩衝液で洗浄して、未接合抗体を完全に除去した。このカラムを10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2中0.1−２Ｍ直線塩勾配のNaClで洗浄した。溶出されたフラクションの蛋白質含有量をブラッドフォードアッセイで判定した。
未接合抗体を0.1Ｍ NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2で予め均衡化させたブルーセファロースのカラム（１×24cm）上での親和性クロマトグラフィーによって、ゲロニン接合抗体から取り除いた。Ｓ-300溶出サンプルを入れた後、カラムを30mlのサンプル緩衝液で洗浄して、溶出未接合抗体を完全の除去した。
ゲロニン接合抗体はカラムに結合し、10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2内で0.2−２Ｍの直線塩勾配のNaClで溶出した。抗体-ゲロニン複合体は0.7Ｍ NaCl程度で溶出した。溶出フラクションの蛋白質含有量をブラッドフォードアッセイで判定した。この蛋白質を含んだフラクションを集め、５−20％勾配非還元ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって溶出パターンを確認した。図８はＭ195のみ、Ｍ195の未精製反応混合物、ゲロニンとＭ195-ゲロニン、ゲロニンのみ、または精製Ｍ195-ゲロニンの電気泳動を示す。フロー・スルーピーク（フラクション14−20）は遊離抗体のみを含んでいるが、高塩分で溶出されたフラクション50−80は、未接合ゲロニンまたは抗体を含んでいなかった。最終的な生成物は１，２または３ゲロニン分子を結合したＭ195抗体を含んでいた。平均ゲロニン含有量は抗体分子１個あたり1.5分子であった。ウサギ網状赤血球イン・ビトロ翻訳システムを用いて基本的に純粋なゲロニンＭ195抗体複合体のゲロニン活性を測定した。このアッセイにおける活性の１単位は未処理コントロールと比較して蛋白質合成を50％抑制するのに必要な蛋白質の量として定義された。このアッセイを用いて、天然ゲロニンとＭ195-ゲロニン接合体はそれぞれ２×108U/mgおよび8.2×105U/mgであると判定された。基本的に純粋なゲロニンＭ195抗体は網状赤血球溶解アッセイにおいて活性である。元のサンプルを１：1000で希釈すると蛋白質合成が50％抑制された、つまり、蛋白質への14Ｃ-ロイシンの取り込みが50％減少した。したがって、最初の調製物の活性は1000U/mlであった。
実施例７
本発明による組成物はＭ195モノクローナル抗体と細胞毒性部分との融合構造を含むことができる。本発明による免疫毒素のこうした融合構造は、引用により本文に組み入れているCo，et al.,による方法で調製された。
これらの研究で用いる前に、Sp2/0-Ag14細胞を最初0.1μg/mlの天然ゲロニンの存在下で成長する。数か月間に、最終的に細胞を10mg/mlの濃度で維持できるようになるまで、ゲロニンの濃度を徐々に増大する。次に、10mg/mlの存在下での制限希釈で細胞をクローンし、その結果できるゲロニンに抵抗性のあるコロニーを拡大する。そして、ゲロニンを２つのパッセージとして培養液から取り除いて、その細胞を再度ゲロニンに露出させ、安定した抵抗性を示すクローンの形成を確認する。ヒト化Ｍ195の生成および活性を確認するためのテストを実施した後、抗体をつくりだすゲロニンに抵抗性のあるSP2/0細胞を成長させ、制限エンドヌクレアーゼでの培養によってトータルDNAからＭ195抗体を取り出した。それと平行して、最適化ゲロニンを表現するJM105大腸菌からのcDNAを取り出し、精製して、HindIIIおよびEco RIでの消化後、そのDNAをコード表現するゲロニンを遊離する。このゲロニン遺伝子を重鎖フラグメント内に結紮して、それをゲロニン抵抗性SP2/0細胞内に置換する。つぎに、制限希釈で細胞をサブクローンし、クローンをスクリーニングしてヒト化抗体の生成およびゲロニン含有量について調べる。最後に、ポジティブクローンを拡大して、組み替え融合蛋白質を精製し、イン・ビトロ細胞毒性アッセイとイン・ビボ組織分布、薬力学、治療および毒性の両面に関するテストを行う。それぞれの長所と短所を判定するために、Ｍ195ゲロニン融合蛋白質の性質と上に述べたＭ195ゲロニン構造の特性との比較を行う。これらの調査に基づいて、進行した乳癌をもった患者で、キメラ性Ｍ195-ゲロニン融合蛋白質のフェーズＩ臨床調査を行うことができる。
実施例８
図１で、Ｍ195免疫毒素のHL60細胞を殺す能力と遊離ゲロニンの同様の能力との比較を行った。（トリチウムを含む混合アミノ酸（0.5μCi/ml；New England Nuclear Corp．）のトリクロロ酢酸（TCA）沈殿可能蛋白質への取り込みを利用した）蛋白質合成の抑制が用いられた試薬の活性の尺度として用いられた。Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の最終的な濃度は４μg/mlから５ナノグラムの範囲であった。ゲロニンの最終的な濃度は44μg/ml−0.6μg/mlの範囲であった。
Ｍ195-ゲロニン免疫毒素は遊離ゲロニンのみの場合と比較して、600倍程度以上強力であった。Ｍ195-ゲロニン免疫毒素に対するID50は0.4nM程度であった。Ｍ195-免疫毒素による蛋白質合成の抑制は、その後で、細胞分裂の欠如か細胞の死のいずれかに導く。細胞の死は生きた細胞の総数および生きた細胞の割合を判定するためのトリパンブルー排除法を用いた実験で確認された。図１で、最終濃度１×106細胞／ccのHL60細胞をＭ195-ゲロニン免疫毒素またはゲロニンのみの存在下で、37℃の温度下、３日間培養した。
図２で、最終濃度５×105細胞／ccのHL60 SKLY細胞をゲロニンのみ、またはＭ195-ゲロニン免疫毒素のいずれかの存在下で、37℃の温度下、３日間培養した。Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の最終的な濃度は４μg/ml−15.2pg/mlの範囲であった。また、ゲロニンの最終濃度は10μg/ml−0.1μg/mlの範囲であった。蛋白質合成のレベルはトリクロロ酢酸沈殿可能蛋白質へのトリチウムを含有するアミノ酸への取り込みを５時間実施して判定された。
図２に示されているように、Ｍ195ゲロニン免疫毒素の集中によってHL60蛋白質合成の80％以上が抑制された。しかし免疫毒素の同様の濃度ではSKLY16細胞に対する影響は認められなかった。したがって、Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の選択性は明らかである。
図３および４で、最終濃度１×106のHL60細胞を、Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の存在下、37℃の温度で、３日間（図３）または５日間（図４）培養された。免疫毒素の最終濃度は４μg/ml−0.9ng/mlの範囲であった。蛋白質合成のレベルは、トリチウムを含有するアミノ酸のトリクロロ酢酸沈殿可能蛋白質への取り込みを５時間実施して判定した。
図３および４の比較で分かるように、免疫毒素への露出時間の長さがその活性に影響を及ぼす。実際、HL60細胞で５日間培養を行うと、Ｍ195-ゲロニンの強さが３日間の培養と比較して10倍も増大することが認められる。
図５で、ヒト化Ｍ195（HuGI）-免疫毒素のHL60，Ｕ937およびMOLT４細胞への結合が調べた。HuG1およびHuG1免疫毒素を５μg/ml−５ng/mlの範囲の濃度でHL60細胞（図５、パネルＡ）またはＵ937およびNOLT４細胞株（図５、パネルＢ）に加えた。これらの細胞を氷中で１時間培養した後、過剰な抗体を洗い流した。その後、ヤギ抗ヒトFITCを細胞に加えてから、それらの細胞をさらに１時間氷上で培養した。過剰な抗体を洗い流した後、0.5％パラフォルムアルデヒドで混合し、EPICSファイルフローサイトメータで読み取った。
図５はヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素が標的細胞に選択的に結合できることを示している。間接フローサイトメトリーにおいて、ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素は、図５で、ヒト化Ｍ195抗体のみの場合と比較して、CD33ポジティブ細胞株（HL60）およびＵ937とほぼ同等な選択的結合性を示している。それはCD33ネガティブ細胞株には結合しなかった（MOLT４；図５、パネルＢ）。
図６において、最終濃度３×104および５×104の濃度のHL60細胞が、最終濃度が４μg/ml−0.2ng/mlの範囲のヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素の存在下で、37℃の温度で５日間培養された。ゲロニンの最終濃度は50μg/ml−0.5μg/mlの範囲であった。DNA合成はトリチウム含有チミジンによる５時間の培養で判定された。図６に示されているように、ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素はゲロニンのみの場合と比較して、4500倍程度の蛋白質抑制効果を示した。
図７はヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素のHL60細胞を殺す能力を示している。図７に示されているように、ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素に対するID50は10ピコモル以下であった。この免疫毒素に対するID50はゲロニン単独の場合と比較して、4000分の１以下であった。
図８で、HL細胞はヒト化Ｍ195抗体またはＦ79、アイソタイプ・マッチされた（isotype matched）HuG１コントロール抗体の存在下で氷の上で１時間培養された。ヒト化Ｍ195-ゲロニン免疫毒素は0.15μg/mlの濃度で加えた。細胞は37℃の温度で、90時間培養された。生きた細胞の量はトリパンブルー排除法（trypan blue exclusion technique）で判定された。抑制の割合は、免疫毒素のみで殺された細胞と比較して、競合する抗体が存在する状態で殺された細胞の減少傾向を示す。
図８に示されているように、ヒト化Ｍ195抗体はヒト化Ｍ195抗体-ゲロニン免疫毒素の毒性を用量に依存する形で阻止することができる。対照的に、不特定ヒト化IgGIであるFd79は同じレベルで何の影響も示さなかった。
したがって、結論的に言うと、ここに開示された本発明および実施例は冒頭に規定された課題および目的を達成するのによく適合している。本発明の精神と範囲から逸脱せずに、方法および装置に一定の変更を加えることができる。また、変更が可能であることと、さらに、以下の各請求項で触れられている要素またはステップは基本的に同じ、あるいは同等の方法で基本的に同じ結果を達成するためのすべての同等の要素またはステップを指すものと理解されるべきである。したがって、上に述べた課題および目的、およびそれらと本質的に付随した他の課題および目的を実行、達成するのに良く適合している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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