(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）又は（２）で表される、シアル酸誘導体を有効成分とすることを特徴とする、抗潰瘍剤又はビフィズス菌増殖促進剤として用いられる医薬組成物。
0003930559.tif 000034
（式中、Ｒ1は−GlcNAc（β1,4）GlcNAc、−GlcNAc及び−Gal（β1,4）Glcからなる群より選ばれる糖残基、又は−GlcNAc（β1,4）GlcNAcAsn、−GlcNAcAsn、IleLysValAlaAsp（−GlcNAc）LysThr及びLysValAlaAsp（−GlcNAc）LysThrからなる群より選ばれる糖ペプチド残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
0003930559.tif 000035
（式中、Ｒ2及びＲ3は水素原子、又は炭素数１〜３０の直鎖、分岐鎖、若しくは環状の飽和又は不飽和のアシル基を示す。Ｒ2及びＲ3は同一であってもよく、異なっていてもよい。ｎは１〜２０の自然数を示す。Ｘ3は３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｏ−グリコリルノイラミン酸、及び３−デオキシノヌロソン酸、並びにこれらのアルキルエステル化物、及びチオグリコシドからなる群より選ばれる化合物に由来するシアル酸誘導体残基、又は下記の一般式（３）
0003930559.tif 000036
（式中、Ｘ4及びＸ5は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ4及びＸ5は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ4及びＸ5のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。Ｙは−GlcNAc（β1,4）GlcNAc−、−GlcNAc−及び−Gal（β1,4）Gle−からなる群より選ばれる糖残基を示す。）で表されるシアリルオリゴ糖誘導体残基を示す。）
【請求項２】
鳥類卵卵黄にアーモンドを添加することを特徴とする、下記一般式（４）で表されるシアル酸誘導体の製造方法。
0003930559.tif 000037
（式中、Ｒ4は−GlcNAc（β1,4）GlcNAc、−GlcNAc及び−Gal（β1,4）Glcからなる群より選ばれる糖残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
【請求項３】
アーモンドが脱脂されたものである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
鳥類卵卵黄に杏種子を添加することを特徴とする、下記一般式（４）で表されるシアル酸誘導体の製造方法。
0003930559.tif 000038
（式中、Ｒ4は−GlcNAc（β1,4）GlcNAc、−GlcNAc及び−Gal（β1,4）Glcからなる群より選ばれる糖残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
【請求項５】
杏種子が脱脂されたものである請求項４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はシアル酸誘導体を含有する医学組成物に関する。さらに本発明は、鳥類卵卵黄よりシアル酸誘導体を製造する方法に関する。
背景技術
ウイルス性の疾患に関する治療剤、予防剤の開発には、これまで多くの労力が費やされてきたが、ある種のウイルスに対しては、いまだに有効な抗ウイルス剤の開発には至っていない。なかでもインフルエンザウイルスによる感冒は、数年に一度の割合で世界的な大流行をおこし、多数の犠牲者を出すため、世界中の人々から恐れられている。しかし、インフルエンザウイルスの抗原は頻繁に変異するため、有効な薬剤の開発は困難を極めている。
ロタウイルスは、ヒト及び動物に激しい下痢症を起こすウイルスのひとつであるが、このウイルスは授乳期において感染率が高く、特に発展途上国においては医療技術、医療設備が充実していないため、多くの死亡者が出ている。また、畜産業における被害も莫大なものである。このような現状にもかかわらず。ロタウイルス性の疾患に対する有効な予防法、治療法はいまだに開発されていない。
ヘルペスウイルスは、ヒトおよび動物に慢性的な疱疹をはじめさまざまな症状の疾患をもたらすが、潜伏感染することなどから根本的な予防法、治療法は確立されていない。
ニューカッスル病ウイルスは鳥類に対して致死的な感染性疾患であるニューカッスル病をもたらし、多くの養鶏業者が被害を受けている。ワクチンによる予防策がとられてはいるが、完全な予防は不可能であり、しかもニューカッスル病は感染が早く、常に外来ウイルスによる感染の可能性があるため、いまだに養鶏業者の脅威のひとつとなっている。
また、下痢症は大別すると、ウイルスや細菌などによる感染性のものとストレスなどによる非感染性のものとがあるが、個々の下痢症についてその原因を確定することは容易ではない。ヒトの乳幼児においておこる感染性下痢症は、主としてロタウイルスによるものとされ、特に発展途上国においては現在でも年間百万人以上の乳幼児が、このロタウイルス性下痢症により死亡していると言われている。しかし、下痢症には他のウイルスや細菌、あるいはストレスが原因であるものもあり、ほとんどの下痢症は、これらの複数の原因が複雑に関与して起こっている。したがって、下痢症の有効な予防、治療には、このような複数の原因に対して効果を発揮する手段が望まれる。家畜や家禽においても、哺乳期の下痢症は罹患率が高く、死に至ることが多いため、畜産業や養鶏業に多大の被害を与え続けている。これらの下痢症もほとんどは複数の原因によると思われる。しかしながら、複数の異なる原因による、下痢症に対する有効な予防法、治療法はいまだに開発されていないのが現状である。
ところで、シアル酸含有オリゴ糖は、糖タンパク質分子中に存在するオリゴ糖鎖、ガングリオシドに存在するオリゴ糖鎖、及び糖タンパク質もしくはガングリオシドより遊離して存在するオリゴ糖ペプチドもしくはオリゴ糖鎖として天然に存在している。
鳥類卵卵黄中ではシアル酸含有オリゴ糖はホスビチン分子に結合して存在しているものが知られている［Shainkin，R.，and Perlmann，G．E(1971)Arch．Biochem．Biophys．145，693-700］。
近年数多くの研究により、シアル酸含有オリゴ糖の生物学的意義が明らかになりつつある。シアル酸含有オリゴ糖は糖タンパク質に結合して存在しており、タンパク質分子の三次構造の保持、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、血中半減期、分子間相互作用、溶解度の増大などに関与する。またガングリオシドでは細胞間認識、細胞分化などに影響を与える構成要素となっており、種々の細胞毒素、神経伝達物質、ホルモン、インターフェロン、ウイルスなどのレセプターとしての役割もある。特に、炎症反応の初期過程においてはシアリルルイス-X抗原、潰瘍の原因となるヘリコバクター・ピロリの宿主への感染やインフルエンザウイルスの宿主への感染においてはシアル酸含有オリゴ糖鎖が重要な役割を果たしていることなどが知られている。また、インフルエンザウイルスに関するシアル酸誘導体の生物学的機能については、赤血球凝集反応、去痰効果（特開昭６１−６８４１８号）、感染防御剤（特開昭６３−２８４１３３号）などが開示されている。
このほかにも母乳中には牛乳の１．５〜７．０倍ものシアル酸が含まれていることが知られており、乳児の免疫力付加、脳の機能の発達、有用な腸内細菌の増殖促進効果などが示唆されている。このような知見に基づいてシアル酸含有オリゴ糖の医薬品及び機能性食品への応用研究が進められている。
シアル酸含有オリゴ糖の工業的規模での生産方法としては鳥類卵脱脂卵黄より精製する方法が知られている。これは鳥類卵脱脂卵黄を直接もしくはその水抽出物を酵素消化し限外ろ過及び逆浸透膜を用いて調製する方法である（特開平６−２４５７８４号公報）。ここで使用される酵素とはプロテアーゼやＰＮＧａｓｅ（ペプチド−Ｎ−グリカナーゼ）といった酵素であり、前者は糖タンパク質から糖ペプチドを、後者は糖タンパク質もしくは糖ペプチドからＮ−グリコシド型糖鎖を遊離させる酵素である。しかしこれらの酵素を使って得られるシアル酸含有オリゴ糖ペプチドまたはシアル酸含有オリゴ糖はモノシアル型とダイシアル型の混合物であった。さらにシアル酸含有オリゴ糖ペプチドはその還元末端にアミノ酸５〜６個から成るペプチドが存在するために免疫原となる可能性があり、またＰＮＧａｓｅは病原性を有する細菌由来であるものが多く、食品への応用を困難にしていた。ＰＮＧａｓｅはアーモンド種子中にも存在するがアーモンド種子中にはプロテアーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ等が夾雑酵素として存在しており、ＰＮＧａｓｅの大量精製は困難であった。さらにＰＮＧａｓｅはホスビチンのような巨大で密に折り畳まれたタンパク分子に結合した糖鎖を遊離させることができないため応用範囲も限られていた。
発明の開示
したがって本発明の目的は、シアル酸誘導体を有効成分として含有する医薬組成物を提供することにある。さらに本発明の目的は、シアル酸誘導体を工業的規模で安価・簡便に製造する方法を提供することにある。
そこで本発明者らは鋭意研究した結果、ある特定の構造を有するシアル酸誘導体が意外にも顕著に優れた抗ウイルス効果、下痢に対する効果、抗潰瘍効果、抗炎症効果、抗アレルギー効果を示すことや、腸内細菌であるビフィズス菌に対して極めて優れた増殖促進効果を有することを見い出した。さらに、鳥類卵卵黄を基質として用いた場合、精製したＰＮＧａｓｅではなくアーモンド又は杏種子そのものを添加するだけで意外にもシアル酸含有オリゴ糖鎖が極めて容易に遊離され、簡易にかつ高収率に目的物が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、
（ａ）    下記の一般式（１）又は（２）で表される、シアル酸誘導体を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物、
0003930559.tif 000002
（式中、Ｒ1は糖残基又は糖ペプチド残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
0003930559.tif 000003
（式中、Ｒ2及びＲ3は水素原子、又は炭素数１〜３０の直鎖、分岐鎖、若しくは環状の飽和又は不飽和のアシル基を示す。Ｒ2及びＲ3は同一であってもよく、異なっていてもよい。ｎは１〜２０の自然数を示す。Ｘ3はシアル酸誘導体残基、又は下記の一般式（３）
0003930559.tif 000004
（式中、Ｘ4及びＸ5は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ4及びＸ5は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ4及びＸ5のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。Ｙは糖残基を示す。）で表されるシアリルオリゴ糖誘導体残基を示す。）
（ｂ）    抗ウイルス剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｃ）    下痢治療剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｄ）    抗潰瘍剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｅ）    抗炎症剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｆ）    抗アレルギー剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｇ）    ビフィズス菌増殖促進剤として用いられる前記（ａ）記載の医薬組成物、
（ｈ）    鳥類卵卵黄にアーモンドを添加することを特徴とする、下記一般式（４）で表されるシアル酸誘導体の製造方法、
0003930559.tif 000005
（式中、Ｒ4は糖残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
（ｉ）    アーモンドが脱脂されたものである前記（ｈ）記載の製造方法、
（ｊ）    鳥類卵卵黄に杏種子を添加することを特徴とする、下記一般式（４）で表されるシアル酸誘導体の製造方法、
0003930559.tif 000006
（式中、Ｒ4は糖残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
（ｋ）    杏種子が脱脂されたものである前記（ｊ）記載の製造方法、に関するものである。
【図面の簡単な説明】
図１はシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）によるヒトロタウイルスの感染阻害を示す図である。
図２はシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）によるロタウイルス性下痢に対する予防効果を示す図である。
図３はシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）によるロタウイルス性下痢症に対する治療効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の医薬組成物は、下記の一般式（１）又は（２）で表されるシアル酸誘導体を有効成分とするものである。
0003930559.tif 000007
一般式（１）で表される化合物について
一般式（１）において、Ｒ1は糖残基又は糖ペプチド残基を示す。糖残基としては特に限定されないが、例えば−GlcNAc（β1,4）GlcNAc、−GlcNAc、−Gal（β1,4）Glc等が挙げられる。糖ペプチド残基としては特に限定されないが、例えば−GlcNAc（β1,4）GlcNAcAsn、−GlcNAcAsn、IleLysValAlaAsp(−GlcNAc)LysThr、LysValAlaAsp(−GlcNAc)LysThr等が挙げられる。
Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。
一般式（２）で表される化合物について
一般式（２）において、Ｒ2及びＲ3は水素原子、又は炭素数１〜３０、好ましくは１２〜２４の直鎖、分岐鎖、若しくは環状の飽和又は不飽和のアシル基を示す。Ｒ2及びＲ3は同一であってもよく、異なっていてもよい。炭素数１〜３０の直鎖、分岐鎖、若しくは環状の飽和又は不飽和のアシル基として特に限定されないが、例えばラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレオイル基、リノレノイル基、アラキドノイル基、エイコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基等が挙げられる。これらのうちでラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基が、入手が容易であることから好ましい。
本明細書において、一般式（２）中の−（ＣＨ2）ｎ−をスペーサーという。このスペーサー中のｎは１〜２０の自然数を示す。好ましくは４〜１６であり、より好ましくは６〜１２であり、特に好ましくは８〜１０である。Ｘ3で表されるシアル酸誘導体残基又はシアリルオリゴ糖誘導体残基の膜への埋没を防ぐ観点からｎは１以上が好ましく、可撓性の観点から２０以下が好ましい。
Ｘ3はシアル酸誘導体残基、又は下記の一般式（３）
0003930559.tif 000008
（式中、Ｘ4及びＸ5は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ4及びＸ5は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ4及びＸ5のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。Ｙは糖残基を示す。）で表されるシアリルオリゴ糖誘導体残基を示す。
ここでいうシアル酸誘導体残基とは特に限定されるものではないが、例えば以下の化合物由来のものが挙げられる。
３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グルコリルノイラミン酸、Ｏ−グルコリルノイラミン酸、及び３−デオキシノヌロソン酸、並びにこれらのアルキルエステル化物、Ｏ−アシル化物、Ｏ−アルキル化物、デオキシ化物、チオグリコシド、及びラクトン体等である。これらのうち、好ましくは３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及びＮ−アセチルノイラミン酸、並びにこれらのアルキルエステル化物、Ｏ−アシル化物、Ｏ−アルキル化物、及びデオキシ化物であり、さらに好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸である。
一般式（３）において、Ｙは糖残基を示す。糖残基としては特に限定されないが、例えば−GlcNAc（β1,4）GlcNAc、−GlcNAc、−Gal（β1,4）Glc−等が挙げられる。
従って、一般式（３）で表されるシアリルオリゴ糖誘導体残基の具体例としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
0003930559.tif 000009
次に、一般式（１）、（２）で表されるシアル酸誘導体の製造方法について説明する。
一般式（１）で表されるシアル酸誘導体は、例えば一般式（１）を満たす糖鎖構造を有する糖タンパク質を、常法に従ってプロナーゼ消化やＰＮＧａｓｅ消化することにより得ることができ、又は鳥類卵卵黄を用いる本発明の方法等により得ることができる。
鳥類卵卵黄を用いる本発明のシアル酸誘導体の製造方法についてより具体的に説明する。
本発明に用いられる鳥類卵卵黄とは、鳥類の卵の卵黄であればその起源については特に限定されるものではないが、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモなどの卵黄が好ましい。また、原料として用いる際は、液状、粉末のいずれでもよい。また、鳥類卵卵黄を有機溶媒抽出（メタノール、エタノール、ジエチルエーテル等）することにより脱脂した後の残渣（脱脂卵黄）を原料として用いてもよい。
本発明に用いられるアーモンド及び杏種子は、精製酵素にすることなく、そのままで、あるいは処理をしても含有酵素が失活するような加熱等の処理をしていないものであれば特に限定されるものではなく、そしてその形態は粉末であってもよくペースト等であってもよく。本発明においては、中でも脱脂されたアーモンド、脱脂された杏種子が好ましい。脱脂されたアーモンド及び脱脂された杏種子とは、生アーモンド及び生杏種子を例えば有機溶媒抽出（アセトン、ジエチルエーテル等）することにより脱脂したものを指し、精製酵素にしたものではない。脱脂の程度は脱質含有率が２５％以下であるものが好ましく、より好ましくは５％以下のものである。本発明においては、このような脱脂アーモンド又は脱脂杏種子そのものを粉末やペースト等にしたものがより好ましく用いられる。尚、従来法のように精製酵素を用いると、モノシアル型とダイシアル型がほぼ同量の混合物が得られるが、本発明においては、意外にもごく少量のモノシアル型と多量のダイシアル型が得られるため、モノシアル型とダイシアル型の分離を容易に行うことができるという大きな利点がある。
以下、上記の鳥類卵卵黄及びアーモンド等を用いる本発明の製造方法の具体的な操作の１例について説明する。
鳥類卵脱脂卵黄に水もしくは塩溶液（カリウム塩、ナトリウム塩もしくはｐＨ５〜１０の領域内に緩衝能を持つ塩の溶液）を加え、４〜８０℃、好ましくは４〜４０℃で１０分間〜３日間攪拌した後、ろ過を行い不溶性タンパク質を分別する。得られる抽出ろ液１リットルに対し、脱脂アーモンド粉末もしくは脱脂杏種子粉末を０．５〜２０ｇ加え、ｐＨ５．０〜５．５、３０〜４５℃で８〜２４時間攪拌する。この溶液をろ過してから陰イオン交換樹脂に吸着させ、水洗後０〜０．３ＭのＮａＣｌ水溶液でグラジエント溶出する。得られる溶出液を逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて脱塩・濃縮した後、凍結乾燥することによりシアル酸誘導体を得る。
ここで用いられる陰イオン交換樹脂は、例えばDOWEX（ダウケミカル製）、SEPABEADS（三菱化学製）、AMBERLITE（ローム・アンド・ハース製）等の製品が挙げられる。これらの製品のタイプについては特に限定されるものではないが、強塩基性型のものが好ましい。
このようにして得られるシアル酸誘導体は一般式（４）に表されるものであり、Ｒ4が糖残基であって糖ペプチド残基とならない点を除けば一般式（１）と同様のものである。
0003930559.tif 000010
（式中、Ｒ4は糖残基を示す。Ｘ1及びＸ2は、NeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−、又はGlcNAc（β1,2）−を示す。また、Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。ただし、Ｘ1及びＸ2のいずれか一方は、少なくともNeuAc（α2,6）Gal（β1,4）GlcNAc（β1,2）−を示す。）
この製造方法は一般式（４）で表されるシアル酸誘導体を従来より安価かつ簡便に製造でき、しかも得られるシアル酸誘導体は本発明の医薬組成物及びその原料に用いることができるため、工業上極めて有利である。
次に、一般式（２）で表されるシアル酸誘導体の製造方法について説明する。当該シアル酸誘導体は、例えば、糖成分、リン脂質及びスペーサーの原料となる化合物を原料として、化学合成反応とホスホリパーゼＤ（以下ＰＬＤと表記する。）を用いる酵素合成反応を組み合わせることにより調製することができる。
ここでいう糖成分とは、Ｘ3で示される、前記に列挙したようなシアル酸誘導体残基又はシアリルオリゴ糖誘導体残基をその構造中に有する化合物である。
リン脂質は水素原子又は前記のアシル基、即ち、Ｒ2及びＲ3の説明の箇所で記載したアシル基をもつリン脂質であればよい。具体的には前記のアシル基をもつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。また、リン脂質の由来については大豆などの植物由来のものでもよいし、鶏卵などの動物由来のものでもよい。また、これから化学合成、酵素合成により得られたものでもよい。
スペーサーの原料としては、炭素数１〜２０のアルキルジオールが好ましく用いられる。その具体例としては、１，２−エタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，７−ヘプタンジオール、１，８−オクタンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１１−ウンデカンジオール、１，１２−ドデカンジオール等が挙げられる。
また、本発明に用いるＰＬＤは、動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもののいずれでもよい。微生物由来のＰＬＤの例としては、ストレプトマイセス属、ノカルディオプシス属、アクチノマデューラ属由来のものなどが挙げられる。また、ＰＬＤは水溶液又は適当な緩衝液中で、又は担体に固定して使用する。緩衝液の例としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液などが挙げられる。坦体の例としてはオクチルセファロース（ファルマシア製）、ブチルトヨパール（東ソー製）などが挙げられる。また、ＰＬＤを有する菌体を使用してもよい。この場合には、それらの乾燥物をそのまま使用するか、または菌体を坦体に固定化して使用する。
一般式（２）で表されるシアル酸誘導体の具体的な調製例を次に示す。
第１の方法は、糖成分にスペーサーを結合させたものを、ＰＬＤを用いるエステル交換反応により、リン脂質の極性基部分と転移させる方法である。
まず、糖成分に酸性条件下でメタノールを作用させてメチル化物とし、これに塩化アセチル中で塩化水素を作用させて水酸基すべてをアセチル化し、糖成分の還元末端の糖残基の２位の水素原子を塩素原子に置換したパーアセチル−２−クロロ誘導体を得る。これにモレキュラーシーブ、Ａｇ2ＣＯ3存在下、アルキルジオールのモノエステルを作用させ、パーアセチル−２−Ｏ−アルキル誘導体を得る。これを塩基性条件下で脱アセチル化し、糖成分のＯ−アルキル化物を得る。これを適当なｐＨ（４．０〜８．０）の緩衝液に溶解し、カルシウム塩を加える。これにＰＬＤまたはＰＬＤを有する菌体を加え、さらにあらかじめ有機溶媒に溶解しておいたリン脂質を加えて攪拌し、数時間〜数十時間酵素反応を行う。
その結果、リン脂質の極性基部分と糖成分のＯ−アルキル化物がエステル交換されたものが得られる。これをアルカリ金属の水酸化物で処理することにより脱メチル化した後精製してシアル酸誘導体を得る。
この方法におけるＰＬＤによる酵素反応の条件は例えば次の通りである。まず反応液のｐＨについては、通常ｐＨ４．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ５．６〜７．０である。使用されるＰＬＤの至適ｐＨより±０．５の範囲内に調整するのが好ましい。その範囲外のｐＨでは反応率が低下する。また、使用するＰＬＤの量は通常リン脂質１ｇあたり１０〜１００ユニット、好ましくはリン脂質１ｇあたり２０〜５０ユニットである。反応を充分に進める観点から１０ユニット以上が好ましく、反応の効率の観点から１００ユニット以下が好ましい。反応温度は通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３０℃である。反応時間については通常０．５〜１２時間、好ましくは１〜６時間である。反応を充分に進める観点から０．５時間以上が好ましく、反応効率及び副反応を抑える観点から１２時間以下が好ましい。
また、さらにＰＬＤの酵素活性を向上させるためにカルシウム塩を加えればより好ましいが、他のイオンの塩を加えてもよい。例としてはカルシウムイオンやバリウムイオンなどの２価の典型元素イオン、マンガン、ランタン、セウリンなどの遷移元素イオンのハロゲン化物や炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩などが挙げられる。添加量としては反応液に対して１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．５Ｍである。所望の効果を得る観点から１０ｍＭ以上が好ましく、反応効率の観点から１Ｍ以下が好ましい。
反応系としては、水系、水相と有機溶媒相との２相系、有機溶媒系のいずれでもよいが、糖成分は水溶性であることが多く、リン脂質は油溶性であることから水相と有機溶媒相との２相系が好ましい。
リン脂質を溶解するために使用する有機溶媒としては、例えば融点４０℃以下のカルボン酸のアルキルエステル、アルキルエーテル、脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素及びハロゲン化炭化水素からなる群より選ばれる１種以上のものが使用できる。
カルボン酸のアルキルエステルの例としては、炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖脂肪酸と炭素数８以下の直鎖または分岐鎖のアルコールとのエステルが挙げられ、酢酸メチル、酢酸エチル、吉草酸メチル、プロピオン酸メチル、酪酸メチル、カプロン酸メチルなどを用いることができるが、なかでも酢酸メチルが好ましい。アルキルエーテルとしては炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖のアルキルエーテルが挙げられ、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、エチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどを用いることができるが、なかでもジエチルエーテルが好ましい。脂肪族炭化水素としては、炭素数６〜１２の直鎖または分岐脂肪族炭化水素が挙げられ、なかでもヘキサン、ヘプタン、石油エーテルが好ましい。脂環式炭化水素としては、置換基を有するか、または有しない炭素数６〜１２の脂環式炭化水素が挙げられ、なかでもシクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、シクロオクタンが好ましい。芳香族炭化水素としては置換基を有するか、または有しない炭素数６〜１２の芳香族炭化水素が挙げられ、なかでもベンゼン、トルエン、キシレンが好ましい。また、ハロゲン化炭化水素としては、炭素数８以下の直鎖または分岐アルカンの塩化物、臭化物、ヨウ化物が挙げられるが、なかでもクロロホルム、四塩化炭素、塩化メチレン等のクロル化物が好ましい。
また、脱メチル化反応において使用するアルカリ金属の水酸化物としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。脱メチル化反応は、通常氷冷下で行い、反応時間は約３０分〜１日である。反応物を抽出、クロマトグラフィー、再結晶など通常の精製方法に供すことにより、シアル酸誘導体を得ることができる。
また、第２の方法は、ＰＬＤによるエステル交換反応によってリン脂質にスペーサーを結合させ、次いで糖成分にグリコシル結合させる方法である。
即ち、リン脂質とアルキルジオールを有機溶媒中で混合し、これに適当なｐＨの緩衝液を加えてカルシウム塩を溶解させる。これにＰＬＤまたはＰＬＤを有する菌体を加えて攪拌し、数時間〜数十時間酵素反応を行う。その結果、リン脂質の極性基部分とアルキルジオールとがエステル交換した中間体を得る。この中間体と、上記の方法で合成した糖成分のパーアセチル−２−クロロ誘導体のベンジルエステルとを活性化剤の存在下、０℃以下の低温条件でグリコシル化することにより所望のシアル酸誘導体のアセチル化物を得る。次に、このアセチル化物をアルカリ金属の水酸化物で処理して脱アセチル化し、これを触媒存在下で水素添加することにより脱ベンジル化し、シアル酸誘導体を得る。
グリコシル化反応において使用する活性化剤としては、トルメチルシリルトリフラート、銀トリフラートなどが挙げられるが、好ましくは銀トリフラートである。添加量としては０．１〜１０当量であり、好ましくは０．１〜５当量である。反応を充分に進める観点から０．１当量以上が好ましく、反応効率の観点から１０当量以下が好ましい。
本発明に用いられるシアル酸誘導体の糖鎖構造は、ＨＰＬＣやＮＭＲを用いる公知の方法で確認することができる。
このようにして得られるシアル酸誘導体を適当な溶剤や基剤を用いて液剤、錠剤、顆粒剤などに調剤することにより、本発明の医薬組成物を得ることができる。
本発明の医薬組成物は、とりわけ抗ウイルス剤、下痢治療剤、抗潰瘍剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤として、またビフィズス菌増殖促進剤として好適に用いられる。抗ウイルス剤として用いる場合、その対象となるウイルスは特に限定されないが、特にインフルエンザウイルス、ロタウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルス等に好適に用いられる。下痢治療剤として用いる場合、非感染性の下痢症またロタウイルス、サルモネラ菌等による感染性の下痢症のいずれに対しても好適に用いられる。抗潰瘍剤としては、特にヘリコバクター・ピロリが原因の潰瘍に対して好適に用いられる。抗炎症剤としては、リューマチ、喘息等に対して好適に用いられる。抗アレルギー剤としてはアレルギー性鼻炎、花粉症等に対して好適に用いられる。
本発明の医薬組成物は、一般式（１）又は（２）で表されるシアル酸誘導体一成分を単独で用いても良く、二成分以上の混合物で用いても良い。
本発明の医薬組成物の用量は、年齢、性別、体重、症状等によって異なるが、抗ウイルス剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり１．０〜３００μｇである。下痢治療剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり０．５〜１０ｍｇである。抗潰瘍剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり１．０〜２０００μｇである。抗炎症剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり１．０〜１００μｇである。抗アレルギー剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり１．０〜３００μｇである。ビフィズス菌増殖促進剤として用いる場合、体重１ｋｇあたり１００〜１０００ｍｇである。
以下、製造例、実施例及び試験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら限定されるものではない。
製造例１  Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
Ｎ−アセチルノイラミン酸３ｇをメタノール３００ｍＬに溶解し、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）（ダウケミカル製）３ｇを加えて、室温で４時間攪拌した。反応終了後、反応液をろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去した。ろ液のメタノール溶液を１５ｍＬに濃縮し、−２０℃に冷却した。同温度でこれにジエチルエーテル６ｍＬを添加し、再結晶することによりＮ−アセチルノイラミン酸のメチル化物２．４７ｇを得た。
得られたメチル化物に−２０℃で塩化アセチル２５ｇ、無水酢酸３ｇを加えた。次いで乾燥した塩化水素ガスを飽和させ、室温で２０時間攪拌した。反応後の溶媒を留去し、ベンゼン、トルエンを用いて完全に脱水した。次いでこのものをジクロロメタン、ジエチルエーテル、ヘキサンの等量混合物により再結晶し、アセチル化物３ｇを得た。
アセチル化物を−２０℃以下で、６ｇのモレキュラーシーブ４Ａ、５ｇのＡｇ2ＣＯ3、３ｇの１，８−オクタンジオールモノメチルエステルを添加したジクロロメタン６０ｍＬに溶解し、室温で３時間攪拌してグリコシル化反応を行った。反応液をセライトろ過したのち、溶媒を留去した。次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝９８：２）で精製し、グリコシル化物１．９ｇを得た（Ｒｆ＝０．６３  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ／ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１５：１）。
グリコシル化物１．９ｇを氷冷下で、完全に脱水したメタノール３０ｍＬに溶解した。氷冷下でカリウム３００ｍｇを完全に脱水したメタノールに加えてカリウムメトキシドとし、これを先に調製しておいたグリコシル化物のメタノール溶液に加えた。０℃で３時間攪拌して反応を行ったのつち、−２０℃で反応液にＤｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）を加えた。反応液をろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去したのち、ろ液のメタノールを留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝５：１）で精製することによって脱アセチル化物０．９ｇを得た（Ｒｆ＝０．２５  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ／ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝５．１）。
脱アセチル化物をジエチルエーテル１２０ｍＬ、水２４ｍＬの混合溶媒中で０．４Ｍ酢酸カルシウム６ｍＬ、ＰＬＤ（旭化成製）１００ユニット存在下、ジパルミトイルホスファチジルコリン３ｇと３０℃で６時間攪拌して粗生成物を得た。このものをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製することにより中間体０．３ｇを得た。
得られた中間体０．３ｇをＴＨＦ１０ｍＬ、Ｈ2Ｏ５ｍＬの混合溶媒に溶解し、氷冷下で１Ｎ−ＮａＯＨ０．３ｍＬを加えて１時間攪拌した。反応液にＤｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）を加えて中和（ｐＨ８）したのち、ろ過によりＤｏｗｅｘ−５０を除去した。ろ液を濃縮してカラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ／Ｈ2Ｏ、ＭｅＯＨ）で精製することにより目的のシアル酸誘導体、すなわち、一般式（２）においてＸ3がＮ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにパルミトイル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質９．６ｍｇを得た。
このシアリルリン脂質をＴＬＣ分析したところ単一のスポットを示し、Ｄｉｔｍｍｅｒ試薬、レゾルシノール試薬の両方に呈色反応を示した。また、その機器分析値は次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ０．８９６（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）、δ１．３２７（５６Ｈ，ｍ）、δ１．５２５（４Ｈ，ｍ）、δ１．６１６（４Ｈ，ｍ）、δ１．７２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、δ１．９９７（３Ｈ，ｓ）、δ２．３１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、δ２．３２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、δ２．６７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．２，４．７Ｈｚ）、δ３．９９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、δ４．１４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．１，７．１Ｈｚ）、δ４．４３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．１，３．３Ｈｚ）、δ５．２４７（１Ｈ，ｍ）。分子量１０６７。以下このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質１とする。
製造例２  Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，８−オクタンジオール４．３９ｇをクロロホルム２００ｍＬに溶解し、大豆水添ホスファチジルコリン（太陽化学製）７．９０ｇを加えた。これに酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）３０ｍＬおよび０．４Ｍ酢酸カルシウム水溶液３ｍＬを添加し、さらにＰＬＤ３７０ユニットを前記緩衝液に溶解したものを徐々に添加し、３０〜３５℃で５０時間攪拌し、反応させた。反応終了後、有機溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：ＣＨＣｌ3＝３：１）で精製し、ホスファチジルオクタノール５．６５ｇを得た。
製造例１に記載の方法で合成したＮ−アセチルノイラミン酸のパーアセチル−２−クロロ誘導体のベンジルエステル２．３４ｇとホスファチジルオクタノール３．３３ｇをクロロホルム２００ｍＬに溶解し、リン酸水素二ナトリウム１．１４ｇおよびモレキュラーシーブ４Ａ  ２．３４ｇを加えた。これを−５０〜−４０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸銀１．０３ｇをトルエン１５ｍＬに溶解したものを滴下した。その後、徐々に室温まで昇温させながら１時間攪拌して反応させた。反応後をセライトろ過して不溶物を除去し、ろ過を得た。このろ液の有機溶媒を留去したのちシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝２０：１〜１：１）で精製し、シアリルリン脂質アセチル化誘導体のメチル化物９００ｍｇを得た。
シアリルリン脂質のアセチル化物２３４ｍｇをメタノール７０ｍＬに溶解した。このものに、氷冷下、カリウムメトキシドの３０％メタノール溶液（ＭｅＯＫ４２ｍｇ／ＭｅＯＨ１００ｍｇ）をゆっくり滴下した。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）を加えて中和したのち、ろ過によってＤｏｗｅｘ−５０を除去した。ろ液の有機溶媒を留去したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝２：１）で精製し、シアリルリン脂質のメチル化物１１１ｍｇを得た。シアリルリン脂質のメチル化物１００ｍｇをエタノール３０ｍＬとクロロホルム１０ｍＬの混合溶媒に溶解し、１０％パラジウム活性炭素２０ｍｇを加え、超音波で充分に分散させた。これに０．０１Ｎ塩酸３滴を滴下し、常圧下で攪拌しながら２４時間水素添加反応を行った。反応終了後、減圧にして水素を除去し、窒素で置換した。その後セライトろ過によってパラジウム炭素を除去し、ろ液を得た。ろ液の有機溶媒を留去したのち分取ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝７０：３０：５）で精製し、目的のシアル酸誘導体、すなわち、一般式（２）において、Ｘ3がＮ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3だ大豆水添ホスファチジルコリンのアシル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質４３．２ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質２とする。
製造例３  １−メトキシカルボニル−Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
Ｎ−アセチルノイラミン酸３ｇをメタノール３００ｍＬに溶解し、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）３ｇを加えて、室温で４時間攪拌した。反応終了後、反応液をろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去した。ろ液のメタノール溶液を１５ｍＬに濃縮し、−２０℃でジエチルエーテル６ｍＬを添加し、再結晶することによりＮ−アセチルノイラミン酸のメチル化物２．４７ｇを得た。
得られたメチル化物に−２０℃で塩化アセチル２５ｇ、無水酢酸３ｇを加えた。このものに乾燥した塩化水素ガスを飽和させ、室温で２０時間攪拌した。反応液の溶媒を留去し、ベンゼン、トルエンを用いて完全に脱水した。次いでジクロロメタン、ジエチルエーテル、ヘキサンの等量混合物により再結晶し、アセチル化物３ｇを得た。
アセチル化物を−２０℃下で、モレキュラーシーブ４Ａ  ６ｇ、Ａｇ2ＣＯ3５ｇ、１，８−オクタンジオールモノメチルエステル３ｇを添加したジクロロメタン６０ｍＬに溶解し、室温で３時間攪拌してグリコシル化反応を行った。反応後をセライトろ過したのち、ろ液の溶媒を留去した。このものをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ3：ＭｅＯＨ＝９８：２）で精製し、グリコシル化物１．９ｇを得た（Ｒｆ＝０．６３  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ／ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１５：１）。
グリコシル化物１．９ｇを氷冷下で、完全に脱水したメタノール３０ｍＬに溶解した。氷冷下でカリウム３００ｍｇを完全に脱水したメタノールに加えてカリウムメトキシドとし、これを先に調製しておいたグリコシル化物のメタノール溶液に加えた。０℃で３時間攪拌して反応を行ったのち、−２０℃で反応液にＤｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）を加えた。反応液をろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去し、ろ液のメタノールを留去した。次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝５：１）で精製することによって脱アセチル化物０．９ｇを得た（Ｒｆ＝０．２５  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ／ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝５：１）。
脱アセチル化物をジエチルエーテル１２０ｍＬ、水２４ｍＬの混合溶媒中で０．４Ｍ酢酸カルシウム６ｍＬ、ＰＬＤ１００ユニット存在下、ジパルミトイルホスファチジルコリン３ｇと３０℃で６時間反応させ、粗生成物を得た。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製することにより目的のシアル酸誘導体、すなわち、一般式（２）において、Ｘ3が１−メトキシカルボニル−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにパルミトイル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質０．３ｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質３とする。
製造例４  ９−Ｏ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，３−プロパンジオール４００ｍｇ、ジステアロイルホスファチジルコリン（フナコシ製）７９０ｍｇ、既知の方法により合成した９−Ｏ−アセチルノイラミン酸４２０ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3が９−Ｏ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにステアロイル基であり、ｎが３であるシアリルリン脂質４．５ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質４とする。
製造例５  ４−Ｏ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，４−ブタンジオール４２０ｍｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン（フナコシ製）７６５ｍｇ、既知の方法により合成した４−Ｏ−アセチルノイラミン酸４２０ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3が４−Ｏ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにミリストイル基であり、ｎが４であるシアリルリン脂質４．７ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質５とする。
製造例６  ３’−シアリルラクトシルリン脂質の調製
１，６−ヘキサンジオール２４０ｍｇ、ステアロイルリゾホスファチジルコリン（フナコシ製）４００ｍｇ、３’−シアリルラクトース２００ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3が３’−シアリルラクトース残基であり、Ｒ2がステアロイル基であり、Ｒ3が水素原子であり、ｎが６であるシアリルリン脂質２．２ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質６とする。
製造例７  ６’−シアリルラクトシルリン脂質の調製
１，１０−デカンジオール２８０ｍｇ、ジリノレイルホスファチジルコリン（フナコシ製）４００ｍｇ、６’−シアリルラクトース２００ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3が６’−シアリルラクトース残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにリノレノイル基であり、ｎが１０であるシアリルリン脂質２．１ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質７とする。
製造例８  Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，８−オクタンジオール２３０ｍｇ、ジアラキドノイルレシチン（フナコシ製）２５０ｍｇ、Ｎ−アセチルノイラミン酸２００ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3がＮ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2、Ｒ3がともにアラキドノイル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質２．５ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質８とする。
製造例９  Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，８−オクタンジオール４４０ｍｇ、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン（フナコシ製）７９０ｍｇ、Ｎ−アセチルノイラミン酸４００ｍｇを原料をして用いた。これらの原料を製造例２と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3がＮ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2がパルミトイル基、Ｒ3がステアロイル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質４．５ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質９とする。
製造例１０  Ｎ−アセチルノイラミニルリン脂質の調製
１，８−オクタンジオール４４０ｍｇ、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン（フナコシ製）７９０ｍｇ、Ｎ−アセチルノイラミン酸４００ｍｇを原料として用いた。これらの原料を製造例２の同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、即ち、一般式（２）において、Ｘ3がＮ−アセチルノイラミン酸残基であり、Ｒ2がステアロイル基、Ｒ3がパルミトイル基であり、ｎが８であるシアリルリン脂質４．３ｍｇを得た。以下、このシアル酸誘導体をシアリルリン脂質１０とする。
実施例１  モノシアリルオリゴ糖の調製
鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）４０ｋｇを２００リットルの水に懸濁し、室温で３時間攪拌した。これをろ過した後、４℃で２日間静置して微量の不溶物を沈澱させ、上清を得た。得られた上清を逆浸透膜（日東電工製、ＮＴＲ−７４１０）を用いて２０リットルに濃縮した。得られた濃縮液のｐＨを５．０に調整して脱脂アーモンド粉末を４０ｇ加え、３７℃、１日間攪拌した。得られた液をろ過し、陰イオン交換樹脂（ダウケミカル製、Ｄｏｗｅｘ１×８）１００リットルに吸着させた。これを水２００リットルで洗浄した後、０〜０．１５ＭのＡｃＯＮａ水溶液でグラジエント溶出した。０〜０．０６Ｍの画分を濃縮、脱塩、乾燥して１．４ｇのモノシアリルオリゴ糖を得た。ＨＰＬＣで純度を確認したところ９３％であった。
実施例２  ダイシアリルオリゴ糖の調製
鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）１００ｋｇを５００リットルの水に懸濁し、室温で３時間攪拌した。これをろ過した後、４℃で２日間静置して微量の不溶物を沈殿させ、上清を得た。得られた上清を実施例１と同じ逆浸透膜により５０リットルに濃縮した。得られた濃縮液のｐＨを５．０に調整して脱脂アーモンド粉末を７００ｇ加え、３７℃、１日間攪拌した。得られた液をろ過し、実施例１と同じ陰イオン交換樹脂２５０リットルに吸着させた。これを水５００リットルで洗浄した後、０〜０．３ＭのＮａＣｌ水溶液でグラジエント溶出した。０．０５〜０．１ＭＮａＣｌ溶出画分を濃縮・脱塩・乾燥して２９．５ｇのダイシアリルオリゴ糖を得た。純度をＨＰＬＣで確認したところ９５％であった。
実施例３  ダイシアリルオリゴ糖の調製
実施例２と同様にして５０リットルの濃縮液を得た。得られた濃縮液のｐＨを５．０に調製して脱脂杏種子７００ｇを加え、３７℃、１日間攪拌した。得られた液をろ過し、実施例１と同じ陰イオン交換樹脂２５０リットルに吸着させた。これを水５００リットルで洗浄した後、０〜０．３ＭのＮａＣｌ水溶液でグラジエント溶出した。０．０５〜０．１ＭＮａＣｌ溶出画分を濃縮・脱塩・乾燥して２７．２ｇのダイシアリルオリゴ糖を得た。純度をＨＰＬＣで確認したところ９２％であった。
試験例１  オリゴ糖糖鎖構造の確認
実施例１〜３で得られたオリゴ糖の糖鎖構造を確認した。具体的には、得られたオリゴ糖を文献（Journal of Food Science 58,743−747(1993)）記載の方法でＡＢＥＥ誘導体化後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、糖組成分析によりその構造を確認した。表１にＮＭＲ分析で得られたデータを示す。
0003930559.tif 000011
また、ＨＰＬＣ分析から実施例１のオリゴ糖は表１中のＭＳ１とＭＳ２の２成分が、実施例２及び３のオリゴ糖は表１中のＤＳが主成分であることが分かった。表１と文献（Journal of Food Science 58,743−747(1993)）記載の既知のデータを比較した結果、各実施例で得られたオリゴ糖の糖鎖構造は以下に示すものであることが分かった。
実施例１由来のもの
0003930559.tif 000012
鶏卵卵黄中のシアリルオリゴ糖の主成分は、既に上記のＭＳ１、ＭＳ２、及びＤＳであることが分かっている（Journal of Food Science 58,743−747(1993)）。従って、本発明の方法は、夾雑するグリコシダーゼの存在にも関わらず、糖鎖構造を損なうことなく簡易に所望のオリゴ糖を製造するものであるといえる。なお、実施例１で得られたＭＳ１とＭＳ２の混合物を、「ＭＳ」と表記する。
製造例１１  ダイシアリルオリゴ糖リン脂質の調製
１，８−オクタンジオール４．５ｇをクロロホルム２００ｍＬに溶解し、ジパルミトイルホスファチジルコリン６．８ｇを加えた。これに酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）３０ｍＬ及び０．４Ｍ酢酸カルシウム水溶液３ｍＬを加え、さらに３７０ユニットのＰＬＤを酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）０．５ｍＬに溶かしたものを徐々に添加し、３０〜３５℃で５０時間攪拌し、反応させた。反応終了後、有機溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：ＣＨＣｌ3＝３：１）で精製した。このようにしてホスファチジルオクタノール５．５ｇを得た。
実施例２で得られたダイシアリルオリゴ糖１８ｇをメタノール１リットルに溶解し、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）１０ｇを加えて室温で４時間攪拌した。反応終了後、反応後をろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去した。ろ過のメタノール溶液を３０ｍＬに濃縮し、これに−２０℃でジエチルエーテル１０ｍＬを添加して再結晶を行い、ダイシアリルオリゴ糖のメチル化物１５．３ｇを得た。
得られたメチル化物に−２０℃で塩化アセチル２５ｇ、無水酢酸３ｇを加えた。これに乾燥塩化水素ガスを飽和させて室温で２４時間攪拌した。反応液の溶媒を留去し、次いでベンゼン、トルエンを用いて反応液を完全に脱水した。この後、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ヘキサンの等量混合物により再結晶し、アセチル化物１６．２ｇを得た。
１５ｇのモレキュラーシーブ４Ａ、Ａｇ2ＣＯ3１０ｇ、上記で得られたホスファチジルオクタノール５ｇを添加したジクロロメタン１００ｍＬにアセチル化物を−２０℃で溶解し、室温で４時間攪拌してグリコシル化反応を行った。反応液をセライトろ過した後、溶媒を留去した。このものをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製し、ダイシアリルオリゴ糖リン脂質アセチル化誘導体のメチル化物１．０８ｇを得た。
当該メチル化物５００ｍｇをメタノール１００ｍＬに溶解し、氷冷下カリウムメトキシドの３０％メタノール溶液（ＭｅＯＫ４２ｍｇ／ＭｅＯＨ１００ｍｇ）をゆっくり滴下した。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）を加えて中和した後、ろ過してＤｏｗｅｘ−５０を除去し、次いで得られたろ液の有機溶媒を留去した。このものをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝２：１）で精製し、ダイシアリルオリゴ糖リン脂質のメチル化物２３５ｍｇを得た。
当該メチル化物２００ｍｇをＴＨＦ２０ｍＬ、Ｈ2Ｏ１０ｍＬの混合溶媒に溶かし、氷冷下で１Ｎ−ＮａＯＨ０．６ｍＬを加え１時間攪拌した。反応液をＤｏｗｅｘ−５０（Ｈ+）にて中和し、樹脂をＨ2Ｏで洗浄した。ろ液、洗液を合わせて濃縮し、これをカラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ／Ｈ2Ｏ、ＭｅＯＨ）で精製して目的のシアル酸誘導体（ダイシアリルオリゴ糖リン脂質（ＤＳＰＬ３））２０．１ｍｇを得た。このダイシアリルオリゴ糖リン脂質をＴＬＣ分析したところ、単一のスポットを示し、Ｄｉｔｍｍｅｒ試薬、レゾルシノール試薬の両方に呈色反応を示した。
また、用いるリン脂質とスペーサーの原料を変えることによって、アシル基及びスペーサーの異なるシアル酸誘導体を得た。リン脂質としてジステアロイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，３−プロパンジオールを用いてＤＳＰＬ１を、リン脂質としてジミリストイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，４−ブタンジオールを用いてＤＳＰＬ２を、リン脂質としてジアラキドイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，８−オクタンジオールを用いてＤＳＰＬ４を、リン脂質としてジリノレノイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，１０−デカンジオールを用いてＤＳＰＬ５を得た。以下にそれぞれのシアル酸誘導体の構造を示す。
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製造例１２  モノシアリルオリゴ糖リン脂質の調製
実施例１で得られたモノシアリルオリゴ糖（ＭＳ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び１，８−オクタンジオールを用いて、製造例１１と同様の方法により目的のシアル酸誘導体（モノシアリルオリゴ糖リン脂質（ＭＳＰＬ３））２０．１ｍｇを得た。
また、用いるリン脂質とスペーサーの原料を変えることによって、アシル基及びスペーサーの異なるシアル酸誘導体を得た。リン脂質としてジステアロイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，３−プロパンジオールを用いてＭＳＰＬ１を、リン脂質としてジミリストイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，４−ブタンジオールを用いてＭＳＰＬ２を、リン脂質としてジアラキドイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，８−オクタンジオールを用いてＭＳＰＬ４を、リン脂質としてジリノレノイルホスファチジルコリン、スペーサーの原料として１，１０−デカンジオールを用いてＭＳＰＬ５を得た。以下にそれぞれのシアル酸誘導体の構造を示す。
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製造例１３  シアリルオリゴ糖ペプチドの調製
鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）５０ｋｇを２５０Ｌの水に懸濁し、室温で３時間攪拌した。ろ過した後、４℃で２日間静置して微量の不溶物を除き、上清を得た。得られた上清を逆浸透膜（ＲＯ膜）により５０Ｌに濃縮した。濃縮液を陰イオン交換樹脂（ダウケミカル製、ＭＳＡ−１）２５０Ｌに吸着させ、水５００Ｌで洗浄後、５０ｍＭＮａＣｌ水溶液で溶出した。水洗画分及び５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分をそれぞれ濃縮・脱塩・乾燥し、５．６ｇのモノシアリルオリゴ糖ペプチド（ＭＳペプチド）と１３．８ｇのダイシアリルオリゴ糖ペプチド（ＤＳペプチド）を得た。純度をＨＰＬＣで確認したところ、それぞれ８０％、９１％であった。
試験例２  シアル酸誘導体によるインフルエンザウイルスの赤血球凝集阻害効果
表２中に示す各サンプルを表２に示す濃度含有するＰＢＳ0.25ｍＬとインフルエンザＡ2型ウイルス液0.25ｍＬ（4HA単位）とを混合し、37℃で30分間振とうした。１時間室温で放置後、ニワトリ赤血球凝集能を測定した。シアル酸誘導体を含有しないＰＢＳを用いた試験区を対象として赤血球凝集抑制率を求めた。結果を表２に示す。
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表２より、シアル酸誘導体、特にリン脂質が結合したものに、インフルエンザウイルスの赤血球凝集能の阻害効果が認められることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に阻害効果が高いことが分かった。
試験例３  シアル酸誘導体のロタウイルス感染阻害効果
表３中に示す各サンプルを表３に示す濃度、及び製造例２、４、６、８で得られたシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）とＮ−アセチルノイラミン酸を１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ含有するイーグル最小培地（日水製、以下ＥＭＥＭと表記する）100μＬをそれぞれヒトロタウイルス（ＭＯ株）ＥＭＥＭ100μＬと混合し、37℃、１時間静置した。そしてこれを、96穴プレート上で単層となるまで培養したＭＡ１０４細胞（サル腎細胞）に加えた。37℃、１時間静置した後液体部分を除去し、ＥＭＥＭを加えてさらに37℃、17時間静置した。これを冷メタノールで固定した後、間接蛍光抗体法により感染細胞を染色してロタウイルス感染率を求めた。さらに上記シアル酸誘導体含有ＥＭＥＭの代わりにこれらを含有しない
ＥＭＥＭを用いた試験区を対照として、ロタウイルス感染阻害率を求めた。その結果を図１及び表３に示す。
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図１及び表３より、シアル酸誘導体にはいずれもロタウイルス感染阻害効果が認められ、しかもいずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に阻害効果が高いことが分かった。
試験例４  シアル酸誘導体のロタウイルス増殖抑制効果
ローラーボトル中で単層となるまで培養したＭＡ１０４細胞（サル腎細胞）にヒトロタウイルス（ＭＯ株）を加え、37℃、１時間振とう培養してロタウイルスを細胞に感染させた。ＥＭＥＭで細胞を洗浄した後、表４に示すサンプルを表４に示す濃度含有するＥＭＥＭをローラーボトルに加えて37℃、３日間振とう培養した。その培養上清について、間接蛍光抗体法を用いてロタウイルスの感染力価を測定した。また上記シアル酸誘導体含有ＥＭＥＭの代わりにこれらを含有しないＥＭＥＭを用いた試験区を対照として、ロタウイルス増殖抑制率を求めた。その結果を表４に示す。
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表４より、シアル酸誘導体はいずれもロタウイルス増殖抑制効果が認められ、しかもＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に抑制効果が高いことが示された。
試験例５  シアル酸誘導体の抗ニューカッスル病ウイルス効果
表５中に示す各サンプルを表５中に示す濃度含有するＰＢＳ0.25ｍＬとニューカッスル病ウイルス液0.25ｍＬ（4HA単位）とを混合し、37℃、30分間振とうした。１時間室温で放置後、ニワトリ赤血球凝集能を測定した。これらを含有しないＰＢＳを用いた試験区を対照として、赤血球凝集抑制率を求めた。結果を表５に示す。
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表５より、シアル酸誘導体に、ニューカッスル病ウイルスの赤血球凝集能の阻害効果が認められることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に阻害効果が高いことが分かった。
試験例６  シアル酸誘導体の抗ヘルペスウイルス効果
表６中に示す各サンプルを表６中に示す濃度含有するＥＭＥＭ0.25ｍＬをそれぞれ、単純ヘルペスウイルスＩ型のＥＭＥＭ0.25ｍＬと混合し、37℃、１時間静置した。そしてこれを、ミニボトル中で単層となるまで培養したHela細胞に加えた。37℃、１時間静置した後液体成分を除去し、ＥＭＥＭを加えてさらに72時間静置した。これに10％ホルマリンを加えて固定した後、クリスタルバイオレット染色してプラーク数を測定した。そして上記シアル酸誘導体ＥＭＥＭ希釈液の代わりにこれらを含有しないＥＭＥＭを用いた試験区を対照として、プラーク形成抑制率を求めた。その結果を表６に示す。
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表６より、シアル酸誘導体、特にリン脂質が結合したものには抗ヘルペスウイルス効果が認められることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に高いプラーク形成抑制効果を示した。
試験例７  シアル酸誘導体のヘリコバクター・ピロリ接着阻害効果
表７に示す各サンプルを表７に示す濃度含有するＰＢＳをそれぞれ、ヘリコバクター・ピロリ／ＰＢＳ懸濁液（2x105CFU／ｍＬ）と混合し、37℃で30分間静置した。その後、mucin（豚由来）でコートした24穴プレートに加え37℃で２時間静置した。菌液を除いた後ＰＢＳで洗浄し、残った菌数を、菌が分泌するウレアーゼ活性を利用するインドフェノール法で測定した。上記シアル酸誘導体含有ＰＢＳの代わりにこれらを含有しないＰＢＳを用いた試験区を対照として、接着阻害率を求めた。その結果を表７に示す。
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表７により、シアル酸誘導体特にリン脂質が結合したものにヘリコバクター・ピロリ接着阻害効果が認められることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸よりも顕著に高い接着阻害効果を示した。
試験例８  シアル酸誘導体の抗炎症効果（カラゲニンひざ浮腫に対する効果）
ウイスター系雄性ラット（８週令）にラット体重１ｋｇ当り２ｍＬのエバンスブルー／生理食塩水溶液（10ｍｇ／ｍＬ）を静脈内投与した後、右ひざ関節腔内へ２％カラゲニン／生理食塩水溶液０．１ｍＬを投与した。カラゲニンの投与１５分前に、表８に示す各サンプル100、10、１μｇを生理食塩水100μＬにとかしたもの、及び対照としてこれらを含有しない生理食塩水100μＬを関節内に投与しておいた。４時間後に屠殺し皮をはいで関節部を露出し、エバンスブルーの漏出を観察した。その後、関節腔内に0.15ｍＬの生理食塩水溶液を注入して関節を切開し、５ｍＬの関節腔内液を採取した。得られた関節腔内液に含まれる細胞を数え、対照例の細胞数を100％として抑制率をみた。抑制率は下記の式に従って算出した。
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その結果を表８に示す。
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表８より、シアル酸誘導体に抗炎症効果が認められることが分かった。また、シアル酸誘導体はいずれもＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に高い抗炎症効果のあることが分かった。
試験例９  シアル酸誘導体の抗アレルギー効果（ＰＣＡ（Passive Cutaneous Anaphylaxis）反応に対する効果）
ハートレー系雄性モルモット（体重３００〜４００ｇ）に抗血清（ウサギＩｇＧ、抗体価1/36000以上）の16x103倍希釈または8x104倍希釈液0.1ｍＬを皮内投与した。４時間後にモルモット体重１ｋｇ当たり１０ｍｇに抗原（ovalbumin）に１％エバンスブルー２ｍＬを加えた抗原液を静注してＰＣＡ反応を惹起させた。その後モルモットを屠殺し、その表皮を剥離して色素浸出面積を測定した。さらに、皮膚青染部の色素量をKatayamaらの方法（Microbiol.Immunol.,22 89(1978)）に従い、吸光度（６２０ｎｍ）で測定し、色素抽出濃度を求めた。またＰＣＡ反応惹起30分前、即ち抗血清による感作３時間30分後に、以下に示す群のモルモットにシアル酸誘導体または生理食塩水を静脈内投与し、ＰＣＡ反応に対するシアル酸誘導体の作用をみた。数値はＶ群のデータを100％として換算したものである。その結果を表９に示す。
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表９より、シアル酸誘導体に抗アレルギー効果が認められることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に高い抗アレルギー効果のあることが分かった。
なお、各群のサンプルの種類、投与量を以下に示す。
Ｉ群  ：ＭＳを体重１ｋｇ当り１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ投与。
ＩＩ群：ＤＳを体重１ｋｇ当り１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ投与。
III群：ＭＳＰＬ３を体重１ｋｇ当り１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ投与。
ＩＶ群：ＤＳＰＬ３を体重１ｋｇ当り１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ投与。
Ｖ群  ：生理食塩水を体重１ｋｇ当り１ｍＬ投与。
ＶＩ群：Ｎ−アセチルノイラミン酸を体重１ｋｇ当り１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ投与。
試験例１０  シアル酸誘導体のビフィズス菌増殖促進効果
下記に示す培地に表１０に示す各サンプルを500ｍｇ／ｍＬ添加し、B.adolescentis、B.breve、B.infantis、B.longum、E.coliの５株を接種し、37℃、５日間嫌気培養を行った。６００ｎｍにおける濁度を測定して菌の増殖の程度をみた。そしてこれらの代わりに、グルコースを500ｍｇ／ｍＬ含む培地での値を１００％として増殖率を求めた。その結果を表１０に示す。
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また、培地組成は次の通りである。
（ＮＨ4）2ＳＯ4               ：０．９ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                    ：０．４５ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4                    ：０．０７５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ：０．０９ｇ
ＮａＣｌ                      ：０．９ｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ            ：０．０９ｇ
トリプティケース（ＢＢＬ）    ：１０ｇ
Yeast extract（Ｄｉｆｃｏ）   ：５ｇ
肉エキス（Ｄｉｆｃｏ）        ：２ｇ
ヘミン                        ：０．００７ｇ
Ｎａ2ＣＯ3                    ：４ｇ
Ｌ−システイン−塩酸塩一水和物：０．３ｇ
蒸留水                        ：１０００ｍＬ
ｐＨ７．２
表１０よりシアル酸誘導体にビフィズス菌増殖促進効果が認めらることが分かった。また、いずれのシアル酸誘導体もＮ−アセチルノイラミン酸より顕著に高い増殖促進効果を示した。
試験例１１  ロタウイルスによる下痢症に対するシアル酸誘導体の予防効果
製造例２、４、６、８で得られたシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）を1.0ｍｇ／ｍＬの濃度になるように生理的食塩水で希釈し、それらを生後５日齢のｄｄＹマウスに50μＬずつ経口投与した。シアル酸誘導体溶液投与１時間後、同マウスに感染に充分な濃度のロタウイルスＭＥＭ希釈液を50μＬずつ与え経口感染させた。その後５日間にわたって下痢発生の有無を観察した。その結果、図２のようになり、シアル酸誘導体投与群は、非投与群にくらべて下痢の発生率が大きく低下し、ロタウイルス性下痢症に対する優れた予防効果が得られた。
試験例１２  ロタウイルスによる下痢症に対するシアル酸誘導体の治療効果
生後５日齢のｄｄＹマウスに感染に充分な濃度のロタウイルスＭＥＭ希釈液を50μＬずつ与え経口感染させた。その後３日間、製造例２、４、６、８で得られたシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）の1.0ｍｇ／ｍＬ生理的食塩水希釈液を50μＬずつ経口投与した。経口感染後５日間にわたって下痢発生の有無を観察し罹患率を算定した。その結果、図３のようになり、シアル酸誘導体投与群は非投与群にくらべて下痢の罹患率が低く、回復も早かった。このように、シアル酸誘導体は、ロタウイルス性下痢症に対して優れた治療効果を示した。
試験例１３  サルモネラによる下痢症に対するシアル酸誘導体の治療効果
Salmonella dublinを感染させた子牛１２０頭を１０頭ずつの１２群に分け、そのうちの１１群には、それぞれ製造例１〜１０で得られたシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）、及びＮ−アセチルノイラミン酸を１頭につき１日あたり１００ｍｇとなるように添加した人工乳を毎日与え、残りの１群にはシアル酸誘導体無添加の人工乳を同量、同様に与えて、５週間にわたって飼育した。そのあいだ、下痢症の指標としての糞便スコアと糞便中のSalmonella dublinの菌数を測定した。その結果を表１１及び１２に示す。
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表１１及び１２より、シアル酸誘導体添加人工乳投与群は、無添加人工乳投与群にくらべて糞便スコアが低下し、糞便中のSalmonella  dublinの菌数が減少した。このことより、シアル酸誘導体がSalmonella  dublin感染による下痢に対して優れた治療効果を示すことが明らかとなった。また、シアル酸誘導体はいずれも、Ｎ−アセチルノイラミン酸より顕著に高い治療効果を示した。
試験例１４  非感染性の下痢症に対するシアル酸誘導体の治療効果
６０頭の子牛を１０頭ずつの６群に分け、そのうちの５群にはそれぞれ製造例２、４、６、８で得たシアル酸誘導体（シアリルリン脂質）、及びＮ−アセチルノイラミン酸を１頭につき１日あたり１００ｍｇになるように添加した人工乳を毎日与え、残りの１群にはシアル酸誘導体無添加の人工乳を同量、同様に与えて、５週間にわたって飼育した。そのあいだ、非感染性下痢症の指標としての糞便スコアと腸内細菌フローラを測定した。その結果を表１３〜１７に示す。なお、Ｎ−アセチルノイラミン酸を投与した群については、糞便スコアのみを示す。
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表１３〜１７より、シアル酸誘導体添加人工乳投与群は、無添加人工乳投与群にくらべて糞便スコアが低下し、また、ウェルシュ菌、大腸菌が減少し、ビフィズス菌、乳酸菌が増加した。このことより、シアリルリン脂質が非感染性の下痢に対して優れた治療効果を示すことが明らかとなった。また、糞便スコアの結果から、シアル酸誘導体はいずれもＮ−アセチルノイラミン酸よりも顕著に高い治療効果を示すことが分かった。
産業上の利用可能性
本発明の医薬組成物は、抗ウイルス剤、下痢治療剤、抗潰瘍剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、ビフィズス菌増殖促進剤として用いることができる。また本発明の製造方法は、シアル酸誘導体を工業的規模で安価・簡便に製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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