(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のペプチド：
(1)配列番号１における第１−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(2)配列番号１における第６−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(3)配列番号１における第１−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(4)配列番号１における第６−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(5)配列番号１における第８−１８位アミノ酸配列からなるペプチド；
(6)配列番号１における第８−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
(7)配列番号１における第１１−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
のいずれかである酸化低密度リポタンパク質認識用ペプチド。
【請求項２】
被験者から採取した生体試料中の低密度リポタンパク質に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、以下のペプチド：
(1)配列番号１における第１−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(2)配列番号１における第６−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(3)配列番号１における第１−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(4)配列番号１における第６−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(5)配列番号１における第８−１８位アミノ酸配列からなるペプチド；
(6)配列番号１における第８−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
(7)配列番号１における第１１−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
(8)配列番号１における第１２−１５位アミノ酸配列からなるペプチド、
のいずれかである酸化低密度リポタンパク質認識用ペプチドと結合した低密度リポタンパク質が酸化低密度リポタンパク質であると判定することを特徴とする酸化低密度リポタンパク質の検出方法。
【請求項３】
以下のペプチド：
(1)配列番号１における第１−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(2)配列番号１における第６−２９位アミノ酸配列からなるペプチド；
(3)配列番号１における第１−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(4)配列番号１における第６−２１位アミノ酸配列からなるペプチド；
(5)配列番号１における第８−１８位アミノ酸配列からなるペプチド；
(6)配列番号１における第８−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
(7)配列番号１における第１１−１６位アミノ酸配列からなるペプチド、
(8)配列番号１における第１２−１５位アミノ酸配列からなるペプチド、
のいずれかである酸化低密度リポタンパク質認識用ペプチドを有することを特徴とする動脈硬化の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、動脈硬化の初期病変形成に関与する生体内危険因子である酸化した低密度リポタンパク質を認識し、動脈硬化の早期診断を可能とする酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現代社会の深刻な問題として、様々な生活習慣病が取り上げられている。中でも脳血管疾患や心疾患の原因となる動脈硬化は、その早期診断と早期治療が重要と考えられており、各種血液成分の臨床化学的な検査による間接的な診断法、あるいは血管造影やＸ線ＣＴ（コンピューター断層撮影）などの機器による診断法、更にＰＴＣＡ（経皮経管冠動脈拡張術）等の外科的治療法が用いられている。しかし、これらの方法は、いずれも正確性に欠けること、初期診断が不可能なこと、侵襲度が高いこと等の欠点があり、現在のところ、動脈硬化が発見された時には既に治療が困難である場合が多い。
【０００３】
したがって、動脈硬化の新しい診断方法、動脈硬化病巣部位及び動脈硬化進展度の非侵襲的な診断のための薬剤、更には動脈硬化病巣・内部肥厚部を特異的に認識して退縮を促す治療薬が望まれている。
【０００４】
その具体的アプローチとして、近年、動脈硬化の初期病変形成に関与する生体内危険因子として知られる酸化変性した低密度リポタンパク質（Low Density Lipoprotein：ＬＤＬ）を種々の酸化ＬＤＬ認識分子によって直接検出・定量する研究がなされている。
【０００５】
このような酸化ＬＤＬを認識する分子としては、これまでに、各種スカベンジャー受容体や酸化ＬＤＬ受容体がクローニングされ、それら分子構造が明らかにされている。しかし、これらの受容体の酸化ＬＤＬ認識機構は、酸化ＬＤＬ以外の種々のリガンドとの反応性や受容機能の多面性から、いずれも非特異的であると考えられている（Urs P. Steinbrecher, Biochimica et Biophysica Acta, 1436 (1999), 279-298）。また、酸化ＬＤＬを認識する分子として、各種の抗体も報告されているが、これらもまた、他の抗原との交差反応を示し、必ずしも酸化ＬＤＬに特異的とは言い難かった（Hiroyuki Itabe et. al, Journal of Biological Chemistry, Vol.269, No.21, 1994, 15274-15279）。また、以上のとおりの種々の方法は、いずれも、初期診断のために必要と考えられている極めて酸化度の低い酸化ＬＤＬを検出することができず、検出感度の点において有意な応用例は未だに報告されていない。
【０００６】
したがって、これまでのところ、これらの受容体や抗体を利用した酸化ＬＤＬの検出には、その検出感度及び特異性に限界があったのが実情である（長谷川ら、日本臨床、57巻12号、1999年、118-122）。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、酸化ＬＤＬを特異的に、高い精度で認識する、酸化ＬＤＬ認識用プローブを提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、ＹＫＤＧ配列を有するポリぺプチドであることを特徴とする酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを提供する。
【０００９】
第２には、この出願の発明は、ＹＫＤＧ配列からなることを特徴とする酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを提供する。
【００１０】
また、この出願の発明は、第３には、前記のいずれかの酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを用いる動脈硬化の診断方法を提供する。
【００１１】
第４には、この出願の発明は、前記のいずれかの酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを有する動脈硬化の診断剤をも提供する。
【００１２】
すなわち、発明者等は、これまで、Aspergillus fumigatus由来のタンパク質毒素であるAsp-hemolysinのｃＤＮＡクローニング及びタンパク質一次構造解析の過程において、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体のリガンド結合領域と局所的類似性を示す領域を見出し、実際にヒトＬＤＬが高い親和性（Ｋｄ＝４．５μｇ／ｍＬ）でAsp-hemolysinに結合することを見出し、報告している（K.Ebina et.al, Biochimica et Biophysica Acta, 1219, (1994), 148-150; K.Ebina et.al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, Vol.19, (1996), 1380-1381; K.Ebina et.al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, Vol.19, (1996), 547-550; K.Ebina et.al, FEMS Microbiology Letters 167, (1998), 275-280; K.Ebina et.al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, Vol.22, (1999), 549-550）。
【００１３】
更なる研究により、Asp-hemolysinは、酸化ＬＤＬに対しても高親和性（Ｋｄ＝０．６μｇ／ｍＬ）を示して結合することが明らかになった。また、その結合特性を解析したところ、スカベンジャー受容体の生体内リガンドとして知られている酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬのみを特異的に認識し、酸化ＨＤＬやその他のスカベンジャー受容体リガンド（例えば、アセチル化ＬＤＬ、マレイル化アルブミン、ｐｏｌｙｌ、ｆｕｃｏｉｄｉｎ等）は認識しないことが明らかとなった。
【００１４】
この出願の発明は、以上のとおりの知見に基づいた、発明者らの鋭意研究とAsp-hemolysinの一次、二次構造の解析結果からなされたものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１６】
この出願の発明の酸化ＬＤＬ認識用プローブは、アミノ酸配列ＹＫＤＧを有するポリぺプチドであればよい。このようなポリぺプチドとしては、具体的には配列表１に示されるAspergillus fumigatus由来のタンパク質毒素であるAsp-hemolysinから得られるＰ２９が好ましく例示される。
【００１７】
配列表１に示したＰ２９は、ＹＫＤＧをターン構造として有し、その両末端にα−ヘリックスを有するぺプチドであるが、この出願の発明の酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドとしては、ＹＫＤＧアミノ酸配列のＮ末端側に１１以下のアミノ酸残基とＣ末端側に１３以下のアミノ酸残基を有するぺプチドであることがより好ましい。
【００１８】
この出願の発明の酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドとしては、さらに、アミノ酸残基がＹＫＤＧ配列からＮ末端側およびＣ末端側に各々６以下のアミノ酸残基を有するぺプチドであることが好ましい。同時に、このような酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドでは、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に少なくとも１つのアミノ酸残基を有している必要がある。つまり、ＹＫＤＧアミノ酸配列のＮ末端のみ、あるいはＣ末端のみにアミノ酸残基を有するぺプチドでは、酸化ＬＤＬ認識能が低下するため、好ましくない。特に好ましくは、ＹＫＤＧアミノ酸配列のみからなるものである。
【００１９】
この出願の発明は、また、以上のとおりの酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを用いて動脈硬化の診断を行う方法をも提供する。このような動脈硬化の診断方法は、前記の酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを用いるものであれば、どのような方法、手順、操作によるものであってもよい。例えば、前記の酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを、患者から採取した血漿や血清等と混合、共存させ、結合反応を電気泳動法や分光法等の一般的な化学的、生物化学的分析法によって検出する方法があげられる。もちろん、この出願の発明の動脈硬化の診断方法は、これに限られず、この出願の発明の酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチド以外に、種々の溶媒、緩衝液、標識剤等を添加し、種々の公知又は新規の分析法を用いて行われてもよい。
【００２０】
さらに、この出願の発明は、前記のとおりの酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドを含有する動脈硬化の診断剤をも提供する。このような診断剤においては、この出願の発明の酸化低密度リポタンパク質認識用ぺプチドによる高い診断精度を阻害するものでなければ、他に、診断に最適な環境や条件を得るために必要な溶媒、緩衝液、標識剤等の様々な試薬を含んでいてもよい。
【００２１】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２２】
【実施例】
準備 酸化ＬＤＬの調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加した正常ヒト血漿からＣＰ１００α日立分離用遠心機、Ｐ１００ＡＴアングルローターを用いて１０００００ｒｐｍ、５時間で段階的分画浮上法により比重１．００６〜１．０６３ｇ／ｃｍ3の画分をＬＤＬ画分として分画調製した。
【００２３】
得られたＬＤＬは、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有のｐＨ７．４リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で４℃、２４時間透析し、さらにＥＤＴＡ不含ＰＢＳ溶液で４℃、２４時間透析した。
【００２４】
ＬＤＬタンパク質の定量は、Lowryらの方法を改良したMarkwellらの方法により行った。
【００２５】
次にタンパク質濃度２００μｇ／ｍＬにＰＢＳで調製したＬＤＬ溶液を３７℃で５μＭ硫酸銅処理し、酸化反応時間を０〜２４時間までに様々に変化させ、酸化度の異なる酸化ＬＤＬを作成した。酸化反応の停止は、終濃度０．３ｍＭのＥＤＴＡ、２５μＭのＢＨＴを添加して行なった。また、酸化度の確認は、アガロース電気泳動法およびチオバルビツール酸蛍光法で行なった。
実施例１ 各ぺプチドの調製
ＧＥＮＥＴＹＸを用いたAsp-hemolysinの一次、二次構造の解析結果からデザインした２９アミノ酸残基より成るぺプチドを基本に、酸化ＬＤＬ結合性と上記タンパク質解析ソフトを用いたぺプチド配列の物理・化学的特性を指標として、図１に示したアミノ酸残基数の異なる種々のぺプチド（Ｐ２９、Ｐ２４、Ｐ２１、Ｐ１６、Ｐ１５、Ｐ１１、Ｐ９、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ４）を順にデザイン、合成した。各ぺプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析より確認し、純度９５％以上に精製した。
実施例２ 各ぺプチドの酸化ＬＤＬ結合性
実施例１で調製した各ぺプチドの酸化ＬＤＬに対する結合解析を、Ｎ末端ビオチニル化ぺプチドをプローブとして行なった。
【００２６】
まず、２５μＬの酸化ＬＤＬ溶液（２００μｇ／ｍＬ）と１〜２μＬのビオチニル化ぺプチド水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を３７℃で３０分間反応した後、その混合液を４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で遊離ぺプチドと酸化ＬＤＬ結合ぺプチドに分離した。
【００２７】
次に、電気泳動後のゲルからウェスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜に酸化ＬＤＬを転写し、そのＰＶＤＦ膜について、５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキングを行なった後、さらに３０００倍に希釈したストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼｃｏｍｐｌｅｘ（アマシャム社製）を反応させ、酸化ＬＤＬと結合したビオチニル化ぺプチドをペルオキシダーゼの活性として検出した。検出は、エンハンストケミルミネッセンス法（アマシャム社製）にて発生した化学発光をＸ線フィルムに感光させることで行った。
【００２８】
図２に８時間酸化した酸化ＬＤＬに対する各ぺプチドの結合性を示した。
【００２９】
ビオチニル化ぺプチドの酸化ＬＤＬ結合活性は、酸化ＬＤＬ泳動部位と一致し、ストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼｃｏｍｐｌｅｘ反応陽性バンドとして検出された。
【００３０】
Ｐ１５、Ｐ７を除く供試したすべてのぺプチドにおいて、シグナルの強弱はあるものの、十分な酸化ＬＤＬ結合性が認められた。
【００３１】
したがって、ＹＫＤＧ配列が存在し、両末端にアミノ酸残基を有する場合、あるいはＹＫＤＧ配列のみからなる場合に、ぺプチドが酸化ＬＤＬ結合活性を発現することが確認された。
【００３２】
Ｐ２９、Ｐ２４、Ｐ２１の各ぺプチドでは、酸化ＬＤＬ泳動部位以外にも、遊離ビオチニル化ぺプチドに由来したバンドが検出されたが、アミノ酸残基１６以下のぺプチドでは、遊離ぺプチドのシグナルは認められなかった。
【００３３】
これより、ＹＫＤＧ配列のＮおよびＣ末端側にそれぞれ６以下のアミノ酸残基を有するぺプチドが、酸化ＬＤＬを特異的に認識することが確認された。
実施例３ 酸化度の異なる酸化ＬＤＬに対する各ぺプチドのビオチニル化ぺプチドの結合性
酸化度の異なる酸化ＬＤＬ（０〜２４時間）に対するＰ２９、Ｐ２１、およびＰ４のビオチニル化ぺプチドの結合性を試験した。
【００３４】
結果を図３に示した。
【００３５】
図３（ａ）〜（ｃ）において、各ぺプチドの酸化ＬＤＬ結合性は、同様の感度を示した。すなわち、いずれのぺプチドも、０分酸化ＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅＬＤＬに対してあらかじめ終濃度０．３ｍＭのＥＤＴＡと２５μＭのＢＨＴを加え、その後５μＭ硫酸銅を添加したもの）より結合性が認められ、ＬＤＬの酸化時間が延長するに伴って、結合性の増大が示された。
実施例４ 各ぺプチドの酸化ＬＤＬ認識能
実施例３の結果より、ぺプチドが極めて酸化度の低い０分酸化ＬＤＬ５μｇ（チオバルビツール酸反応物質：ＴＢＡＲＳ値が０．０５ｎｍｏｌ以下）に対しても結合性を示したことより、ＬＤＬの分画調製中および保存中の自然酸化が懸念された。
【００３６】
そこで、それぞれ保存期間の異なる（１日、２週間、４週間後）通常分離ＬＤＬ画分と、血漿の段階からＢＨＴを５０μＭ添加し、調製したＬＤＬ画分について、Ｐ２１およびＰ４ビオチニル化ぺプチドの結合性を検討した。
【００３７】
結果を図４（ａ）、（ｂ）に示した。
【００３８】
図４（ａ）、（ｂ）において、予め血漿にＢＨＴを添加したＬＤＬ（ＢＨＴ＋）では、すべてのＬＤＬにおいて両ぺプチドの結合性は認められなかった。一方、ＢＨＴ無添加の通常分離ＬＤＬ（ＢＨＴ−）では、分離調製直後（１日後）のＬＤＬ及び各保存期間のＬＤＬにおいて、ぺプチドの結合が認められた。
【００３９】
以上の結果より、Ｐ２１およびＰ４ぺプチドは、チオバルビツール酸蛍光法での検出限界以下の酸化ＬＤＬをも認識することが示された。
実施例５ 酸化ＬＤＬ結合阻害実験
Ｐ４ビオチニル化ぺプチド（１０μｇ）の２時間酸化ＬＤＬに対する結合反応系に、未標識Ｐ４ぺプチドを過剰（１０μｇ〜５０μｇ）添加し、酸化ＬＤＬ結合阻害実験を行なった。
【００４０】
結果を図５に示した。
【００４１】
図５より、Ｐ４ぺプチドの添加量が増大するにつれビオチニル化ぺプチドの酸化ＬＤＬに対する結合は減少し、未標識Ｐ４ぺプチドの５倍量添加した系では、その結合は消失した。
【００４２】
以上の結果より、未標識ぺプチドが濃度依存性にビオチニル化ぺプチドの酸化ＬＤＬに対する結合を競合阻害することが示された。
【００４３】
したがって、各ビオチニル化ぺプチドの酸化ＬＤＬ結合性は、真にＹＫＤＧ配列に依存していることが示された。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、酸化ＬＤＬ検出用プローブとして作用するぺプチドが提供される。このぺプチドを用いることにより、従来の酸化ＬＤＬ検出法よりもさらに特異性の高い検出が可能となり、従来検出が不可能であった極めて酸化度の低い酸化ＬＤＬをも高感度で検出することできる。
【００４５】
また、この発明は、動脈硬化の早期発見、予防、診断、治療薬の開発、さらには動脈硬化に起因する各種疾病の病態解明に大きく寄与するものである。
である。
【００４６】
【配列表】
0004017326.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドを例示した概略摸式図である。（Ｐ２９：２９アミノ酸残基、Ｐ２４：２４アミノ酸残基、Ｐ２１：２１アミノ酸残基、Ｐ１６：１６アミノ酸残基、Ｐ１５：１５アミノ酸残基、Ｐ１１：１１アミノ酸残基、Ｐ９：９アミノ酸残基、Ｐ７：７アミノ酸残基、Ｐ６：６アミノ酸残基、Ｐ４：４アミノ酸残基）
【図２】この発明の酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドと８時間酸化した酸化ＬＤＬの結合性を示した図である。
【図３】この発明の酸化ＬＤＬ認識用ぺプチドと酸化時間の異なる各酸化ＬＤＬの結合性を示した図である。（ａ）Ｐ２９、（ｂ）Ｐ２１、（ｃ）Ｐ４
【図４】分離、保存期間（１日、２週間、４週間後）の異なるＬＤＬ画分とＰ２１およびＰ４ビオチニル化ぺプチドの結合性を示した図である。（ａ）Ｐ２１、（ｂ）Ｐ４、ＢＨＴ（−）：ＢＨＴ無添加の通常分離ＬＤＬ、ＢＨＴ（＋）：ＢＨＴ添加ＬＤＬ。
【図５】未標識Ｐ４ぺプチドによるＰ４ビオチニル化ぺプチドの酸化ＬＤＬ結合阻害を示した図である。
【図１】
0004017326.tif 000003
【図２】
0004017326.tif 000004
【図３】
0004017326.tif 000005
【図４】
0004017326.tif 000006
【図５】
0004017326.tif 000007