(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロプロジギオシンまたはその塩を有効成分として含有するＶ−ＡＴＰase (vacuolar ＡＴＰase)脱共役 H+ ポンプ阻害剤。
【請求項２】
有効成分がシクロプロジギオシンである請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
有効成分がシクロプロジギオシン塩酸塩である請求項１記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｖ- ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤に関する。本発明のＶ- ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤は、細胞内のオルガネラに存在するＶ−ＡＴＰase (vacuolar ＡＴＰase 、液胞型 H+ - ＡＴＰase ともいう) の活性を阻害せず、 H+ （プロトン）ポンプ活性のみを阻害し、その活性によって生ずる骨粗鬆症その他各種の疾病を治療乃至予防することができる。
【０００２】
【従来の技術】
シナプス小胞、ゴルジ体、液胞、リソソームなどの細胞内膜系(central vacuolar system) に属するオルガネラには、一群のプロトンを輸送するＡＴＰase が存在している。このＡＴＰase は、その存在する場所にちなんで、Ｖ−ＡＴＰase (vacuolar ＡＴＰase 、液胞型ＡＴＰase)と称せられている。Ｖ−ＡＴＰase はミトコンドリアなどに存在するＡＴＰ合成酵素であるＦ−ＡＴＰase や、胃粘膜に存在し胃液の酸性化をつかさどっているＰ−ＡＴＰase とは、構造的にも、また各種薬剤に対する感受性の面でも異なった酵素である。
Ｖ−ＡＴＰase の機能は、ＡＴＰの加水分解と共役して H+ をオルガネラ内部に輸送し、内外に H+ の電気化学的ポテンシャル差を形成すること、あるいは内部のpHを酸性にすることである。形成された H+ の電気化学的ポテンシャル差や酸性pHがそれぞれのオルガネラに固有な機能と密接に結びついている。リソソームにおける異物の分解やシナプス小胞内への神経伝達物質の濃縮などが例としてあげられる。また、受容体のリサイクリングや蛋白質のソーティングにも関与しているといわれている。Bowmanらはマクロライド系抗生物質の一種バフィロマインが、Ｖ−ＡＴＰase の強力な阻害剤であることを見出した(Proc. Natl. Acad.Sci. USA.,85, 7972-7976(1988))。
【０００３】
そしてバイフィロマイシンがマクロファージからの酸分泌を阻害することが見出され、原形質膜に存在するＶ−ＡＴＰase が細胞内外のpHを調節していることが示された(J.Biol.Chem.,265, 7645-7654(1990)) 。さらにＶ−ＡＴＰase が破骨細胞からの酸分泌に関係していることも確認された (J. Cell Biol.,111,1305-1311(1990))。すなわち、Ｖ−ＡＴＰase は、顆粒内部を酸性にするだけではなく、原形質膜にも存在し、 H+ を細胞外に放出し細胞外に局所的に酸性の場を作り出している。特に、Ｖ−ＡＴＰase は破骨細胞の波状縁(ruffled border)と呼ばれる原形質膜に存在し、骨の吸収部位であるハウシップ窩に H+ を放出し、その部位のpHをおよそ4 にしており、その酸性pHがCa2+を骨組織から遊離させやすくし、かつプロテアーゼを活性化してコラーゲンの分解を促進している。
【０００４】
また、バフィロマイシンなどのＶ−ＡＴＰase 阻害剤がコレステロールエステルの蓄積を阻害していることが報告されており(Eur.J.Biochem., 207, 383-389(1992))、Ｖ−ＡＴＰase による酸性オルガネラの酸性化阻害活性をもつ物質を動脈硬化の治療あるいは予防する医薬として利用することが期待されている。
また、癌細胞が同時に複数の制癌剤に耐性になる現象が知られている。これは、癌細胞の原形質膜にＰ糖蛋白質(multidrug resistant factor MDR)とよばれる薬剤排出ポンプが存在し、この薬剤排出機構にＶ−ＡＴＰase が関与しているためであると考えられている(Biochem. Pharmacol.36, 2879-2887(1988))。すなわち、Ｐ糖蛋白質の基質となる抗癌剤のダウノマイシンは、薬剤耐酸性株細胞のリソソームと思われる酸性オルガネラに濃縮され、バフィロマイシンの添加によって、ダウノマイシンが細胞外に排出されにくくなり、同様にダウノマイシンに対する細胞の感受性が増加する(J.Natl, Cancer Inst, 83, 1098-1102(1991))。従って、このことからみて、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤による酸性化オルガネラの酸性化阻害活性は、制癌剤増強作用を有し、医薬としての利用が期待されている。
さらに、ジフテリア毒素は、エンドゾーム内でプロテアーゼによって切断されて活性型となり、細胞質内に侵入し毒性を示すと考えられている。Ｖ−ＡＴＰase 阻害活性のあるバフィロマイシンを培養細胞に添加するとエンドサイトーシスに関与する細胞内膜系のタンパク分解が効率的に阻害され、断片化が生じ、その結果としてジフテリア毒素の毒性が発現しなくなった (J. Biol. Chem. 265, 21940-21945(1990))。また、水泡性口内炎ウィルスやインフルエンザウィルスなどのウィルスは動物細胞表面の受容体に結合した後、エンドソームとして細胞内に侵入することが知られており、この過程にV-ATPaseが関与していることが明らかとなっている (Ｊ.Gen. Virol.75, 2595-2606(1994); J.Virol. 70, 576-579(1996) ）。従って、V-ATPase阻害剤は効果的な抗ウィルス剤として利用することが考えられる。
また、マラリアはマラリア原虫の感染によって引き起こされる疾患であるが、マラリア原虫の宿主肝細胞や赤血球への侵入と増殖の過程に細胞内酸性化が関わっていることが最近明らかにされつつある。さらにマラリア原虫の細胞膜にもV-ATPaseが存在し、感染時にこの活性が関与する可能性も指摘されている。これらのことは適切なV-ATPaseの阻害剤の利用によりマラリア感染を防御することが可能であろう。
シナプス小胞は、神経末端に数多く存在する直径が50nm程度の微小なオルガネラであり、神経の化学伝達に重要である。すなわち、小胞内部に含まれている高濃度の神経伝達物質が、刺激によりシナプス間隙に放出される。Ｖ−ＡＴＰase はシナプス小胞の全タンパク質のうちおよそ10％以上を占めており、内部に H+ を輸送している(J.Exp.Biol.172,92-99(1992))。形成された H+ の電気化学的ポテンシャル差が小胞膜に存在する伝達物質の輸送（モノアミン輸送、グルタミン酸輸送、γ−アミノ酪酸、アセチルコリン輸送）を駆動する(Biochem.Biophys.Res.Commun.173,443-448(1991))。Ｖ−ＡＴＰase を阻害すると輸送系も阻害される（同上誌）。従って、Ｖ−ＡＴＰase の H+ ポンプを阻害することは、鎮静剤として期待できるであろう。
【０００５】
本発明者らは、バフィロマイシンのような新規なＶ−ＡＴＰase 阻害作用をもつ物質を開発するために種々の化合物を用いてＶ−ＡＴＰase 阻害効果を検討したところ、海洋細菌の１種のシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas  denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)の産生する赤色物質シクロプロジギオシン塩酸塩が、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害活性を有することを見出した。そしてこの化合物をＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤の有効成分として用いることについて検討した。  また、この化合物から塩化水素をはずした遊離のシクロプロジギオシンについても同様の作用があることを見出した。
従って、本発明は、シクロプロジギオシンあるいは塩類のこのようなＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害活性を利用して骨粗鬆症治療薬、動脈硬化治療薬、抗生物質、制癌剤増強剤、鎮静剤等の薬剤あるいはオルガネラを中性に誘導する試薬とすることに係るものである。
従来、シクロプロジギオシンが抗菌活性や抗真菌活性を持つことは知られているが（Tetrahedron Letters 30 (13) 1725 (1989))、シクロプロジギオシン及びその塩酸塩の前記したような阻害活性に関しては、全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のことからみて、本発明の課題は、新規なＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、シクロプロジギオシン及びその塩類の新規用途を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記の課題を解決するためになされたものであって、シクロプロジギオシン (式I)あるいはシクロプロジギオシン塩酸塩 (式II) その他の塩を有効成分として含有するＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤に関する。
【０００８】
【化１】
0003949198.tif 000002
【０００９】
【化２】
0003949198.tif 000003
【００１０】
このような化合物としては、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、カルボン酸塩 (例えば、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩等) 、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、ピクリン酸塩、スルホン酸塩、テトラフルオロボレート塩等を例示することができる。
【００１１】
シクロプロジギオシンは、海洋細菌のアルテロモナス  ルブラ、(Alteromonasrubra)(Tetrahedron  Letters 24 (26),2701-2704(1983))あるいはベネッケアガゾゲネス(Benekea gazogenes) (同上誌  24(27),2797-2798(1983)) から産生される赤い色素であり、また 2- メチルシクロヘキサノンを出発物質として次の工程を経て合成する方法も知られている(Tetrahedron  Letters 25,(13) 1387-1388(1984))。
【００１２】
【化３】
0003949198.tif 000004
【００１３】
シクロプロジギオシン塩酸塩等の前記化合物は、このようにして得られたシクロプロジギオシンを塩の形に変換することによって得ることができる。塩とする手段は、通常の塩形成手段を用いることができる。
しかし、これらの海洋細菌から得られるシクロプロジギオシンは、数種のプロジギオシン類を爽雑物の形で産生しているので、抽出物のなかからシクロプロジギオシン単体を単離するには煩雑な単離操作を必要とした。
また、前記化学合成によってシクロプロジギオシンを製造する方法は多工程にわたる複雑な工程を必要としていた。
【００１４】
本発明者らは、海洋細菌の代謝産物について検討を行なっていたところ、シュードアルテロモナス  デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1 株(FERM P-15771)がシクロプロジギオシン塩酸塩を、他のプロジギオシン類の爽雑物を含むことなく産生することを見出した。従って、前記菌体を培養するとシクロプロジギオシン塩酸塩が菌体内及び培地中に大量に生成蓄積されるので、これを高純度で大量に作ることができる。このシクロプロジギオシン塩酸塩は、カラムクロマトグラフィー処理することによって容易に塩化水素をはずし塩酸塩のない遊離のシクロプロジギオシンを得ることができる。そして、この遊離シクロプロジギオシン (シクロプロジギオシン塩酸塩から塩化水素をはずした式(I) で示される化合物をいう) をリン酸、硫酸等の酸で処理することによって前記した塩類とすることができる。
本発明で使用するシクロプロジギオシン塩酸塩その他の塩は、水に可溶性であり、蒸留水等に溶解して使用することができる。従って、注射剤、ドリンク剤等としても用いることができる。
【００１５】
本発明は、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩その他の塩がＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害活性を有するということを見出し、この知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
本発明によるシクロプロジギオシンあるいはその塩類がＶ−ＡＴＰase 脱共役
H+ ポンプ阻害作用を有することは次の実験によって確認された。
〔実験１〕
神経成長因子（ＮＧＦ）により分化誘導をしているまたはしていないＰＣ12細胞（ラット副腎髄質細胞）を10％ＨＳ５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で培養を行なった。この細胞にシクロプロジギオシン塩酸塩を50nM添加し１時間培養を行なった。そして細胞の顆粒内のpHの変化をアクリジンオレンジの蓄積を指標にして蛍光顕微鏡（図１及び２）及び位相差顕微鏡（図３及び４）で観察した。その結果を図１〜４に示した。すなわち、まずＰＣ12細胞をＮＧＦにより分化誘導を行なった細胞の状態が図１及び３に示されている。また、分化誘導していない細胞の状態が図２及び４に示されている。そして前記シクロプロジギオシン塩酸塩で処理した細胞の状態がＢ及びＤとして示されている。Ａ及びＣはシクロプロジギオシン塩酸塩処理しない対照である。
対照においては、矢印で示すように、分化して形成された神経末端様の突起がアクリジンオレンジで染まっている。これは酸性小胞であるシナプス小胞と判断される。さらに、細胞の核周辺には比較的大きなリソソームと思われる顆粒が染まっている。これに対し、前記シクロプロジギオシン塩酸塩で処理すると突起部分のアクリジンオレンジの染色がなくなっており、この部分の酸性環境がなくなっていることを示しいる。
【００１７】
一方、リソソームは、シクロプロジギオシン塩酸塩のこの濃度ではあまり影響を受けないが、リソソーム内のアクリジンオレンジの染色もシクロプロジギオシン塩酸塩１μM の濃度にすることによって完全に消失した。
このことからシクロプロジギオシン塩酸塩により、酸性オルガネラであるシナプス小胞内部が中性化され、またリソソーム内部も１μM で中性化されることが判明した。
【００１８】
〔実験２〕
(1)  シクロプロジギオシン塩酸塩を図５に示した濃度で用い、リン脂質平面膜法(1992 年７月10日 (株) 東京化学同人発行、 (財) 日本生化学会編  新生化学実験講座「生体膜と膜輸送（上）」第181-187 頁) の張合わせ法によりリン脂質単分子膜を張り合わせ、その膜に一定の電圧を負荷し、電流を測定することで比抵抗値を求めた。この比抵抗値が大きくなることは、膜に直接的な傷害を与えることを示す。
また対照として、カルボニルシアニド-P- トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンを用いた。その結果を図５に示した。図５にみられるように、カルボニルシアニド-P- トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンはその濃度の増加に伴なっていちじるしく比抵抗が増加するのに対し、シクロプロジギオシン塩酸塩は比抵抗が増加せず、膜に直接的な傷害を与えることが非常に少ない。また、このことは、シクロプロジギオシン塩酸塩は、イオノフォア活性を示さず、毒性がきわめて低いことを示唆している。
【００１９】
(2)  ウシ副腎から髄質部分を単離し、ワーリングブレンダーで破砕し、破砕液を４層のガーゼで濾過し、濾液を遠心分画及びショ糖密度勾配遠心によりクロマフィン顆粒画分を調製した。得られたクロマフィン顆粒画分を低張処理し、遠心分画によってクロマフィン顆粒膜画分を得た。
【００２０】
このようにして得られたクロマフィン顆粒膜のＶ−ＡＴＰase を図６に示される濃度のシクロプロジギオシン塩酸塩で10分間刺激し、アクリジンオレンジの蓄積を指標としてプロトンポンプ活性を測定した。一方、ＡＴＰase 活性をＡＴＰから遊離される無機リンの量を定量することによって行なった。
この結果を図６に示す。図６に示されるようにプロトンポンプ輸送活性は、シクロプロジギオシン塩酸塩10nMで完全に阻害される。これに対し、Ｖ−ＡＴＰase 活性はシクロプロジギオシン塩酸塩を1000倍量用いても全く阻害されなかった。
【００２１】
さらに、シクロプロジギオシン塩酸塩の上記Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ活性阻害作用に基づく破骨細胞の骨吸収活性に対する効果を調べた。
すなわち、1994年11月10日共立出版 (株) 発行  大野忠夫編著、「動物実験代替法マニュアル  培養細胞を用いた理論と応用」第 102頁象牙質切片を用いた破骨細胞の骨吸収能の測定法(J. Bona Miner. Ris., 8, 953-960(1993)) に従ってシクロプロジギオシン塩酸塩の破骨細胞の形成能に対する影響を調べた。
【００２２】
すなわち、マウスの骨髄細胞と骨芽細胞をコラーゲンゲル上で活性型ビタミンＤ3 10-8M の存在下で共存培養した。培養６日目に培養プレートをコラケナーゼで処理し、形成された破骨細胞画分を回収した。破骨細胞画分を象牙切片( 直径:4mm) にまき、シクロプロジギオシン塩酸塩(0.1〜100nM)(n＝4)の溶液の存在下で８〜24時間培養した。培養終了後、切片上の細胞を除き、破骨細胞で形成された吸収窩をマイヤーのヘマトキシリン染色液で染色した。破骨細胞が形成する吸収窩は赤染色に染色される。従って、この吸収窩の面積を測定し、シクロプロジギオシン塩酸塩で処理していないものの面積を 100とし、破骨細胞の吸収窩面積比を求めた。その結果を表１に示した。
【００２３】
【表１】
0003949198.tif 000005
【００２４】
表に示されるようにシクロプロジギオシン塩酸塩は 100nMにおいて破骨細胞の吸収窩形成能を強力に抑制した。従って、このシクロプロジギオシン塩酸塩は破骨細胞の骨吸収機能を強力に抑制するので、この活性を利用して骨粗鬆症治療薬とすることができる。
【００２５】
このように、シクロプロジギオシン塩酸塩は (1)のリン脂質平面膜法でイオノフォア活性がなく、(2) のクロマフィン顆粒膜による実験でＶ−ＡＴＰase の脱共役 H+ ポンプ活性のみを特異的に阻害する。このような性質はバフィロマイシン等の従来のＶ−ＡＴＰase 活性阻害剤には認められず、シクロプロジギオシンの作用は従来のＶ−ＡＴＰase 阻害剤とは全く異なる作用様式によるものと考えられる。
本発明におけるシクロプロジギオシン塩酸塩は、Ｖ−ＡＴＰase 活性を阻害することなく、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ活性を特異的に阻害する。従って、この活性阻害作用に基づいて次の用途に用いることが挙げられる。
【００２６】
(1)  酸性化オルガネラが関与する現象の解析に用いる試薬
酸性化オルガネラにおいて、実験１に示すようにオルガネラにより中性化の有効濃度が異なることより、各小器官における中性化を誘導することができ、それに伴う現象を解析する試薬として用いることができる。
【００２７】
(2)  骨粗鬆症治療薬
加齢にともなって、血清カルシウムの濃度は変化を受けず一定に保たれるが、カルシウム代謝ホルモンの分泌は、大きく変わってくる。副甲状腺ホルモンは、破骨細胞の動員により骨からの細胞外液にカルシウムの動員を促す働きをしているが、このホルモンの血中濃度は上昇し、その拮抗ホルモンであるカルシトニンは、破骨細胞の作用を抑制して、カルシウム動員を減少させるホルモンは、逆に低下する。また活性型ビタミンＤの血中濃度も低下するといわれている。これらホルモンの変化は、骨からカルシウムを遊離させ、そのカルシウムが血清カルシウム濃度を一定に保つとともに、血管内壁に沈着し、動脈硬化の引き金になるといわれている。
従って、酸性pHを中性化することにより、Ca2+の遊離を抑制することで、骨粗鬆症治療薬としての作用が期待される。
【００２８】
(3)  動脈硬化阻害剤
また、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤がコレステロールエステルの蓄積を阻害することが報告されていることから、動脈硬化阻害剤としての作用も期待される。
(4)  制癌剤効果増強剤
ガン細胞が、複数の制癌剤に耐性になる現象が知られているが、これは原形質膜にＰ糖蛋白質とよばれる薬剤排出ポンプが存在しているためである。こうした薬剤排出機構にＶ−ＡＴＰase が関与している可能性が指摘されているが、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤として知られているバフィロマイシンの添加によりＰ糖蛋白質の基質となる抗癌剤のダウノマイシンが細胞外へ排出されにくくなり、同時にダウノマイシンに対する感受性が増加するという報告がある。
すなわち、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害剤であるシクロプロジギオシン塩酸塩も、薬剤排出を阻害し、制癌剤増強効果が期待できる。
【００２９】
(5)  抗生物質
ジフテリア毒素の毒性発現過程やウィルスの動物細胞感染過程にはエンドソームのV-ATPaseを介するエンドソーム内の酸性化が関与していることが明らかとなっている。従って、V-ATPase脱共役 H+ ポンプ阻害剤であるシクロプロジギオシン塩酸塩も、新しい阻害効果のある抗ウィルス剤として期待できる。また、マラリア感染にV-ATPaseが関与する可能性が示されていることから、シクロプロジギオシン塩酸塩は有効な抗マラリア剤としても期待できる。
(6)  鎮静剤
Ｈ+ ポンプを阻害することにより神経伝達物質の輸送系が阻害される。従って、シクロプロジギオシン塩酸塩もこの輸送系を阻害することにより、鎮静剤として期待できる。
【００３０】
本発明でこれらの医薬として用いるときは、これらを単独で用いてもよいし他の医薬と併用してもよい。特に、骨粗鬆症治療薬として用いるときは、カルシトニン、ビタミンＤあるいは無機カルシウム塩と併用するとよい。また、制癌剤増強剤として用いるとき、制癌剤と併用してもよい。さらに、試薬として用いるときは、アクリジンオレンジなどを併用してキットの形にすることもできる。
【００３１】
これらを医薬として用いるときは、シクロプロジギオシン、シクロプロジギオシン塩酸塩あるいはその他の塩は、これをそのままあるいは他の薬剤と併用して用いることができる。通常は、賦形剤、その他の補助剤とともに適当な製剤の形にして経口あるいは非経口の形で投与される。経口剤としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドリンク剤等がある。また、非経口製剤には、坐剤、パップ剤、注射剤等がある。注射剤は、筋肉注射、動脈注射あるいは静脈注射の形の剤型とするとよい。
これらの賦形剤その他の補助剤としては、乳糖、しょ糖、各種のでん粉、ぶどう糖、セルロースあるいはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が用いられる。また、蒸留水等の溶媒を用いることができる。これらは、製剤手段として通常知られている手段で経口あるいは非経口の製剤にすることができる。
投与量は、症状、年齢、性別等によって相違するが、経口投与の場合は、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩その他の塩を１日当り 0.1〜0.5/体重kg、非経口投与の場合は、注射剤で１日当り 0.1〜0.5mg/体重kgを投与することが望ましい。
【００３２】
これらの化合物の毒性については、シクロプロジギオシン塩酸塩をＩＣＲ雌性マウス（５週令、体重25〜29g)の腹腔内に投与したところ LD50 値は10mg以上であった。
また、シクロプロジギオシン塩酸塩を前記のようにリン脂質平面膜法で比抵抗を測定したところイオノフォア活性が認められなかったことからみて、毒性がきわめて低いものと判断される。
【００３３】
本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩の製造例を示す。
バクトペプトン(Difco)2.5g 、バクトイーストエクストラクト(Difco)0.5g 及びリン酸鉄(III)n水和物（和光純薬)0.1g を天然海水1L中に溶解した後、滅菌し、その 3ml中に、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)  AK-1株 (FERM P-15771) を、接種し、15〜20℃で１日間振盪培養を行なった。得られた培養物を上記組成の培地 600mlに移し、１日間培養を行なった。
【００３４】
このようにして培養された培地を22,000 rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体は５〜10g が回収された。この菌体にアセトン- ジエチルエーテル(4:1) 混液を加え200 振盪/minで色素 (シクロプロジギオシン塩酸塩) を抽出した。抽出液を12,000 rpmで10分間遠心分離して上清液を得た。この上清液に無水硫酸マグネシウムを加えて水分を吸着除去し、この硫酸マグネシウムを濾過して除去した。濾液を乾固するまで濃縮し、これを薄層クロマトグラフィーによって分析した(Kieselgel 60 F254; 展開溶媒ベンゼン: エーテル＝1:1)。Rf 0.20 に単一のスポットが得られた。この濃縮物を塩化メチレン5ml に溶解し、この溶液から温度差を利用して再結晶した。生成した結晶をペンタンで洗浄し、吸引濾過して結晶 5mgを採取した。
この結晶は、赤色の金属光沢をもった針状結晶であって、融点はなく、約 230℃で分解した。この結晶を、元素分析し、またその Mass スペクトル、UVスペクトル、IRスペクトル、 H-NMRスペクトルを解析したところ、シクロプロジギオシン塩酸塩（化II) のそれと一致し（Tetrahedron  Letters, 24 (26), 2701-2704(1983)) 、同化合物であることが同定された。
【００３５】
このようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩 5mgを塩化メチレン10mlに溶解し、シリカゲルカラム (口径 1.5cm，長さ12cm, 流速1.2ml/min)を通過させ、溶媒を留去して遊離シクロプロジギオシン 4mgを得た。この物質が遊離シクロプロジギオシンであることは N-NMR等のデータによって確認された。
【００３６】
次に実施例として製剤例を示す。
【実施例１】
シクロプロジギオシン塩酸塩            0.5g
乳糖                                400  g
バレイショ澱粉                      100  g
結晶セルロース                       30  g
軽質無水ケイ酸                       30  g
シクロプロジギオシン0.5g, 乳糖400mg,  バイレショ澱粉100mg,結晶セルロース30mg及び軽質無水ケイ酸30mgを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース20mgをメタノールに溶解した溶液 (ヒドロキシプロピルセルロース10重量％) を加えて混練し、造粒した。
次にこれを径0.8 mmのスクリーンで押出し、顆粒とし、乾燥後、ステアリン酸マグネシウム10mgを加え、200mg ずつ打錠して錠剤とした。
【００３７】
【実施例２】
シクロプロジギオシン塩酸塩           20  mg
Tween 80                              0.4 g
蒸留水                              200  ml
シクロプロジギオシン塩酸塩20mgをTween 80 0.4g とともに蒸留水 200mlに溶解し、20mlのアンプルに充填し、加熱殺菌して静脈注射剤を調製した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩等のシクロプロジギオシン塩のＶ−ＡＴＰase 脱共役 H+ ポンプ阻害作用を利用してこれらの化合物を化学試薬、骨粗鬆症治療薬、動脈硬化治療薬、抗生物質、制癌剤増強剤、鎮静剤等として有効に用いることができる。そして得られた剤は、医薬として用いる場合は、経口または非経口で投与することによりこれらの疾病の治療効果が期待できる。また、試薬して用いる場合はキットとして用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の蛍光顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ａ：ＮＧＦで分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｂ：前記分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図２】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の蛍光顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ｃ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｄ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図３】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の位相差顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ａ：ＮＧＦで分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｂ：前記分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図４】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の位相差顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ｃ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｄ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図５】実験２(1) のシクロプロジギオシン塩酸塩のリン脂質平面膜の比抵抗を示す。
【図６】実験２(2) のシクロプロジギオシン塩酸塩のＶ−ＡＴＰase 活性及びＶ−ＡＴＰase 活性に対する影響を示す。
【符号の説明】
−○−  Ｖ−ＡＴＰase 共役 H+ ポンプ活性
−×−  Ｖ−ＡＴＰase 活性
【図１】
0003949198.tif 000006
【図２】
0003949198.tif 000007
【図３】
0003949198.tif 000008
【図４】
0003949198.tif 000009
【図５】
0003949198.tif 000010
【図６】
0003949198.tif 000011