(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
コーヒー酸二量体が、コケ植物由来である請求項１記載の抗酸化剤。
【請求項３】
コーヒー酸二量体が、酵素、塩化第二鉄又は過ヨウ素酸ナトリウムを使用して調製されたものである請求項１記載の抗酸化剤。
【請求項４】
コーヒー酸二量体が、化学式１、化学式２又は化学式３で示される化合物及び／又はその塩類であることを特徴とする請求項１記載の抗酸化剤。
【化１】
0004001432.tif 000006
【化２】
0004001432.tif 000007
【化３】
0004001432.tif 000008
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、コケ植物由来のコーヒー酸二量体や、酵素、塩化第二鉄又は過ヨウ素酸ナトリウムを使用して調製されるコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間をはじめとする好気性生物にとって酸素は不可欠であるが、活性酸素と呼ばれる酸素分子由来のフリーラジカルが、生体に障害をもたらすことが知られている。このような活性酸素による細胞や遺伝子の障害は、ガン、糖尿病などの生活習慣病の発生や進行に関係があり、また、老化の原因の一つであるとも言われている。
生体内には、脂質の過酸化により生じた種々の酸化障害に対し、酸化抑制酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼによって過酸化物質を分解し、安定化する機構が存在する。また、これらの酵素による生体防御機構と共に、生体内酸化抑制物質が酸化抑制的防御機構に重要な役割を果たしているものと推定されている。例えば、脂溶性の物質であるビタミンＥは、生体膜を物理的に安定化したり、脂質の過酸化過程におけるフリーラジカルの連鎖反応の停止剤として作用するなど、多くの報告がある。また、最近では、食品成分として摂取する天然酸化抑制物質の探索が行われており、ゴマ種子由来のセサモリノール、セサミノール、茶カテキンに含まれるエピガロカテキンガレート、コーヒー酸など、植物由来の成分について多くの研究がなされている。このように、植物中には酸化を抑制する成分が多量に存在することが明らかにされてきているが、コ−ヒー酸二量体が抗酸化性を有することについては全く報告されていない。
【０００３】
コーヒー酸は、図に示される構造式を有するものであるが、コーヒー酸を基本単位とした1-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-1,2-dihydro-2,3-naphthalenedicarboxylic acid (DDDN) の形態でコケ植物を含むいくつかの高等植物の中に多量に存在している。DDDNは分子内に２つの不斉炭素を有し、維管束植物では (-)体のみ又はラセミ体として存在している。しかし、コケ類では (+)体又は (-)体の一方のみ存在する。今までにコケ植物のうちウロコゴケ目のアキウロコゴケから、1-(6-carboxy-2-oxo-2H-3-pyranyl)-6,7-dihydroxy-1,2-dihydro-2,3-naphthalenedicarboxylic acid (jamesopyrone)を単離したが、この化合物は、生合成においてはDDDNの芳香環が酸化されて、α−ピロン環になったものと考えられる。これらのことから、コケ植物は維管束植物におけるリグナンの生合成系とは異なり、コーヒー酸からエナンチオ選択的なカップリング反応を経て、DDDNやjamesopyroneを生合成すると考えられる。
【０００４】
DDDNの前駆体と考えられるコーヒー酸のような4-ヒドロキシ桂皮酸類は、植物に豊富に含有されており、植物を加工する際、また植物を起源とする食品製造の際に、この反応が起こりうる可能性が考えられる。CilliersとSingleton は、非酵素的にpHを変化させた水溶液で種々の二量体が形成されることを報告している(J.J.L.Cilliers and V.L.Singleton, J. Agric. Food Chem., 39, 1298-1303, 1991) 。しかし、酵素や酸化剤を用いて上記のような反応を計画的に制御して二量体を生成させた研究例はない。さらに、コーヒー酸のような単純な化合物が、植物体内や食品中で二量化して生成した二量体化合物の生理活性については知られておらず、特にコーヒー酸二量体の酸化抑制作用の研究については皆無である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、コ−ヒ−酸二量体を有効成分とする新規な抗酸化剤を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、コーヒー酸二量体の有する生理作用について研究した結果、コーヒー酸二量体が優れた酸化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明で用いるコーヒー酸二量体は、コケ植物から抽出するか、又は酵素、塩化第二鉄、過ヨウ素酸ナトリウムなどを使用して調製することができる。
即ち、コーヒー酸又はコーヒー酸メチルエステルに各試薬を反応させた後、酢酸エチルで抽出し、抽出物を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムに通液して精製する。溶媒は目的とする二量体によって適宜変更すればよい。このようにして、純度95％以上の、図に示される構造式を有するコーヒー酸二量体（Ｌ−１、Ｌ−４、及びＬ−５）を得ることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の抗酸化剤は、例えば、コケ植物から抽出するか、又はコーヒー酸から調製して得られるコーヒー酸二量体を有効成分とする。
本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、錠剤、タブレット、粉末などの製剤にして用いることができる。
また、本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、飲食品に添加して用いることもできる。
本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、ラジカルスカベンジャー活性を有することから、成人一日当たり 100μg 〜1,000mg を一回又は数回に分けて摂取することによって、活性酸素や過酸化脂質による酸化的細胞障害を予防又は改善することができ有用である。
次に、本発明のコーヒー酸二量体の調製方法を実施例を挙げて説明する。
【０００８】
【実施例１】
（トサカゴケからのコーヒー酸二量体の抽出）
トサカゴケ(Lophocolea heterophylla) カルスの風乾物1gを、メタノール抽出し、抽出物を減圧濃縮後、逆相HPLC (ODS 0.5%HCOOH/20%CH3CN-H2O) で分離精製し、 1.3mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−１）を得た。
【０００９】
【実施例２】
（酵素法によるコーヒー酸二量体の調製）
コーヒー酸を 0.4mMの濃度になるよう pH7.5のリン酸緩衝液400ml に溶解させ、これに西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ(Sigma Type 1 、Sigma 社製）1mg を加えた。次いで、 0.5mMの過酸化水素を加え、１時間反応させた。反応液に1N塩酸を添加してpH3 の酸性にした後、分液ロートに移し、ジエチルエーテル80mlで３回繰り返し洗浄した。次いで、水層を酢酸エチル80mlで３回繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を濃縮乾固させて得られた抽出物を、逆相HPLC (ODS 0.5%HCOOH/20%CH3CN-H2O) によって分離精製し、 1.5mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−１）を得た。
【００１０】
【実施例３】
（酵素法によるコーヒー酸二量体の調製）
100ml容の三角フラスコにコーヒー酸90mg、β−シクロデキストリン570.6mg 及び水20mlを入れて加熱溶解し、超音波処理下でアスピレーターで減圧して、脱気した。これに30％過酸化水素水60μl 及び西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ(Sigma Type 1 、Sigma 社製）1mg を添加し、30℃で１時間、攪拌しながら反応させた。反応後、希塩酸でpH2 の酸性にし、酢酸エチル20mlで３回繰り返し抽出した後、抽出液を減圧濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−酢酸エチル(1:1))によって分離精製し、48.9mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−４）を得た。
【００１１】
【実施例４】
（塩化第二鉄を用いたコーヒー酸二量体の調製）
塩化第二鉄６水和物3.2gを水3.2ml に溶解した塩化第二鉄水溶液を調製した。次に、 300ml容の三角フラスコにコーヒー酸1g及びアセトン60mlを入れ、氷冷下で前記の塩化第二鉄水溶液を添加して５時間攪拌して反応させた。次いで、エバポレーターでアセトンを除去した後、水−酢酸エチル(1:1) 400ml で分配した。その後、酢酸エチルで３回繰り返し抽出し、得られた抽出物を減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−アセトン(1:1))で分離精製し、 120mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−４）を得た。
【００１２】
【実施例５】
（過ヨウ素酸ナトリウムを用いたコーヒー酸二量体の調製）
300ml容の三角フラスコにコーヒー酸180mg 、水100ml を加えて加熱溶解し、放冷した後、過ヨウ素酸ナトリウム214.5mg を添加し、10分間反応させた。反応液を酢酸エチル50mlで３回繰り返し抽出した後、酢酸エチル層を飽和食塩水100ml で洗浄した。次いで、得られた酢酸エチル抽出物を減圧濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−酢酸エチル(1:1))で分離精製し、81mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−４）を得た。
【００１３】
【実施例６】
（過ヨウ素酸ナトリウムを用いたコーヒー酸二量体の調製）
300ml容のナスフラスコにコーヒー酸メチルエステル100mg 、水100ml を入れ、加熱溶解し、超音波処理下でアスピレーターで減圧して脱気し、次いで窒素ガスを通気した。次に、過ヨウ素酸ナトリウム107mg を添加し、20分間反応させた。反応液を酢酸エチル50mlで３回繰り返し抽出した後、酢酸エチル層を飽和食塩水100ml で洗浄した。得られた酢酸エチル抽出物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−酢酸エチル(4:1))で分離精製し、10.4mgのコーヒー酸二量体（Ｌ−５）を得た。
次に、本発明の効果を確認した試験例を示す。
【００１４】
【試験例１】
（コーヒー酸二量体の抗酸化活性）
実施例で得られたコーヒー酸二量体の抗酸化活性を、大澤らの方法(J. Agric. Food Chem., Vol.35, No.5, p.809-812, 1987) により測定した。すなわち、ウサギ保存血液と等張液（10mMリン酸緩衝液/152mM NaCl, pH7.4）とを等量混和し、４℃、1,500 ×g(3,500rpm) 、20分間の遠心分離を３回行って洗浄した。洗浄された血球に低張液（10mMリン酸緩衝液, pH7.4)をよく混和し、４℃、20,000×g(11,000rpm)、40分間の遠心分離を４回行った。得られた緩い沈澱部分 (ゴースト) を用いてコーヒー酸二量体の抗酸化活性を検討した。
実施例で得られたコーヒー酸二量体（Ｌ−１、Ｌ−４及びＬ−５）を初濃度で 0、0.01、0.1 、1 、10mMとなるように調製し、上記の赤血球膜ゴーストと混合し、酸化剤を加えて酸化反応を行った。対照としては、既知の抗酸化剤であるビタミンＥを用いて同様の処理を行なった。次いで TBA反応を行い、 532nmで吸光度を測定して酸化生成物を定量した。抗酸化活性の評価は、サンプル無添加での吸光度を 100％として、各サンプルを添加したときの吸光度から次式で定義されるゴースト酸化率を算出することで行った。
なお、このゴースト酸化率が低いものほどゴーストの酸化が抑制されており、抗酸化活性が高いことを示している。また、吸光度測定に当たっては、対照としてゴースト無添加で TBA反応を行って得られた吸光度をブランク値として吸光度から差し引いた。
結果を表１に示す。
【００１５】
【数１】
ゴースト酸化率(%) ＝（吸光度／サンプル無添加での吸光度）×100
【００１６】
コーヒー酸二量体（Ｌ−１、Ｌ−４及びＬ−５）を添加すると、濃度依存的な抗酸化活性を示し、その活性はコーヒー酸よりも高いものであった。
以上、本試験例の結果により、コーヒー酸二量体（Ｌ−１、Ｌ−４及びＬ−５）には抗酸化活性（ラジカルスカベンジャー活性）が認められ、活性酸素や過酸化脂質による酸化的細胞障害の予防・改善に有用であることがわかった。
なお、コーヒー酸二量体は、コーヒー酸と比べ水への溶解性が高いため、飲料等へ利用する場合の適性が良好である。さらに、コーヒー酸二量体は、コーヒー酸と比べ水溶液とした場合の安定性が高く、効果の持続性が良好であり、有用なものである。
【００１７】
【表１】
0004001432.tif 000002
【００１８】
次に、本発明のコーヒー酸二量体の利用例を実施例により説明する。
【００１９】
【実施例７】
（抗酸化剤を配合した飲料の製造）
表２に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱滅菌して、酸化抑制作用を付与した飲料を製造した。
【００２０】
【表２】
0004001432.tif 000003
【００２１】
【実施例８】
（抗酸化剤を配合した錠剤の製造）
表３に示した配合で原料を混合した後、加圧成型して、酸化抑制作用を付与した錠剤を製造した。
【００２２】
【表３】
0004001432.tif 000004
【００２３】
【実施例９】
（抗酸化剤を配合したタブレットの製造）
表４に示した配合で原料を混合し、酸化抑制作用を付与したタブレットを製造した。
【００２４】
【表４】
0004001432.tif 000005
【００２５】
【発明の効果】
本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、錠剤、タブレット、粉末などの製剤にして用いることができる。
また、本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、飲食品に添加して用いることもできる。
本発明のコーヒー酸二量体を有効成分とする抗酸化剤は、ラジカルスカベンジャー活性を有することから、成人一日当たり 100μg 〜1,000mg を一回又は数回に分けて摂取することによって、活性酸素や過酸化脂質による酸化的細胞障害を予防又は改善することができ有用である。