(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（protox）をコードする領域を含むDNA分子であって、未修飾のprotoxは配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する植物protoxであり、当該修飾は第１アミノ酸置換および第２アミノ酸置換からなり、
前記第１アミノ酸置換がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、
前記第２アミノ酸置換が前記第１アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、
前記第１アミノ酸置換が、配列番号：２のアミノ酸位置426位に対応する位置に存在するチロシンのメチオニンによる置換であり、そして
前記第２アミノ酸置換が、配列番号：２のアミノ酸位置305位に存在するセリンのロイシンによる置換である、
ことを特徴とするDNA分子。
【請求項２】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤に対して寛容であるか又は耐性である植物の製造方法において、
i．請求項１に記載のDNAにより植物材料を形質転換し、
ii．前記形質転換された植物材料を選択し、そして
iii．前記形質転換された植物材料を、形態的に正常な、繁殖可能な、全体植物体に再生する、
ことを含んで成る方法。
【請求項３】
望ましくない植生の成長を抑制する方法であって、請求項２に記載の方法により得られた植物及び望ましくない植生に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤を、前記不所望の植生の成長を抑制するのに適当な量で適用することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般に、植物酵素プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（「ｐｒｏｔｏｘ」）に関する。本発明は特に、この酵素をコードするＤＮＡ分子およびこの酵素の阻害物質耐性修飾体に関する。本発明はさらに、これらの修飾体に基づく組織培養選択法および除草剤適用法に関する。
発明の背景
Ｉ．Ｐｒｏｔｏｘ酵素およびそのクロロフィル／ヘム生合成経路への関与
クロロフィルおよびヘムを産生する各生合成経路は、共通する多くの段階を共有している。クロロフィルは、すべての緑色光合成生物の中にある、光を取り入れる色素である。ヘムは、ヘモグロビン、チトクロム、Ｐ４５０混合機能オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼの補助因子であり（例えばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ニューヨーク（１９７５年）参照）、従ってすべての好気性生物にとって必要な成分である。
クロロフィルおよびヘムの生合成の最終共通段階はプロトポルフィリノーゲンＩＸのプロトポルフィリンＩＸへの酸化である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本明細書では「ｐｒｏｔｏｘ」と呼ぶ）はこの最終の酸化段階を触媒する酵素である（Ｍａｔｒｉｎｇｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２６０：２３１（１９８９年））。
ｐｒｏｔｏｘ酵素は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｅ．Ｈ．Ｄａｉｌｅｙ編「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ  ａｎｄ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ」マグローヒル：ニューヨーク，２３５〜２８５（１９９０年）に収載のＬａｂｂｅ−ＢｏｉｓおよびＬａｂｂｅによる章）、大麦エチオプラスト（ｅｔｉｏｐｌａｓｔ）（ＪａｃｏｂｓおよびＪａｃｏｂｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２４４：２１９（１９８７年））およびマウス肝臓（ＤａｉｌｅｙおよびＫａｒｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６：２６９７（１９８７年））を含む多くの生体から部分精製または完全精製された。大腸菌（Ｓａｓａｒｍａｎ等，Ｃａｎ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１１５５（１９９３年））および枯草菌（Ｄａｉｌｅｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８１３（１９９４年））の２種類の原核生物からｐｒｏｔｏｘをコードする遺伝子を単離した。これらの遺伝子には配列類似性がなく、その予想される蛋白生成物にもアミノ酸配列同一性が全くない。この大腸菌蛋白はおよそ２１ｋＤａであり、細胞膜に付随している。枯草菌蛋白は５１ｋＤａであり、可溶な細胞質活性体である。
また、ヒト（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１４））８０７６〜８０８０（１９９５）参照）および植物（１９９５年１２月２１日に出願され、１９９５年６月８日にＷＯ９５／３４６５９として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２号）からもＰｒｏｔｏｘをコードする遺伝子が単離された。
ＩＩ．除草剤の標的としてのＰｒｏｔｏｘ遺伝子
作物に紛れ込んだ雑草や植物などの望ましくない植生を防除するために除草剤を使用することは、ほとんど普遍的な慣行となっている。関連市場は年間１０億ドルを超える。この広範な使用にもかかわらず、雑草防除は農業従事者にとって重大かつ費用がかかる問題のまま残されている。
除草剤を有効に使用するには、しっかりした管理が要求される。例えば、適用の時期および方法と雑草植物発育の段階は、除草剤による十分な雑草防除を行なうには極めて重要である。様々な雑草種が除草剤に耐性であるため、有効な除草剤を作り出すことがますます重要となっている。
残念ながら、土壌中で比較的強い効力と広い雑草スペクトルと速い分解速度を示す除草剤はまた、作物に対しても比較的強い植物毒性を持ち得る。この問題に対処する一解決策は、除草剤に対して耐性または許容性の作物を開発することである。作物を除草剤耐性の雑種または品種にすると、作物損傷の危険を伴わずに除草剤を使用することが可能になる。耐性を高くすると、それまでは作物の除草剤への感受性のため、使用できなかったり使用が制限（例えば雑草発芽前の使用に、など）されていた、除草剤の作物への適用が可能となる。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ他の米国特許第４，７６１，３７３号は、種々のイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に対して耐性の植物に関するものである。この耐性は、変更アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素によって付与される。Ｇｏｏｄｍａｎ他の米国特許第４，９７５，３７４号は、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）を阻害することが知られている除草剤、例えばホスフィノトリシン、メチオニンスルホキシイミンなどによる阻害に対して耐性の突然変異体ＧＳをコードする遺伝子を含む植物細胞および植物に関するものである。Ｂｅｄｂｒｏｏｋ他の米国特許第５，０１３，６５９号は、植物をスルホニル尿素除草剤による阻害に対して耐性にする突然変異体アセト乳酸シンターゼを発現する植物に関するものである。Ｓｏｍｅｒｓ他の米国特許第５，１６２，６０２号は、シクロヘキサンジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパン酸の各除草剤による阻害に許容性の植物を開示している。この許容性は、変更アセチル補酵素Ａカルボキシル化酵素（ＡＣＣａｓｅ）により付与される。
ｐｒｏｔｏｘ酵素は様々な除草化合物の標的の役割を果たす。ｐｒｏｔｏｘを阻害する除草剤には、多種多様な構造をもつ分子が含まれる（Ｄｕｋｅ等，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．３９：４６５（１９９１年）；Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ等，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：１９３（１９９２年）；Ｍａｔｒｉｎｇｅ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４５：３５（１９８９年）；ＹａｎａｓｅおよびＡｎｄｏｈ，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：７０（１９８９年））。このような除草化合物としては、ジフェニルエーテル｛（例えばアシフルオルフェン、即ち５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］２−ニトロｂｅｚｏｉｃ  ａｃｉｄ；そのメチルエステル；あるいはオキシフルオルフェン、即ち２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロベンゼン）｝、（オキシジアゾール（例えばオキシジアゾン、即ち３−［２，４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル］−５−（１，１−ジメチルエチル）−１、３、４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２、即ちＮ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリム、即ちＮ−（４−クロロフェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド）、フェニルピラゾール、（例えばＴＮＰＰ−エチル、即ちエチル２−［１−（２，３，４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ］プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、フェノピレートとそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体などがある。これらの化合物の多くは、酵素により触媒される通常の反応を競争的に阻害して、見かけ上、基質類似体の役割を果たす。
典型的には、ｐｒｏｔｏｘに対する阻害的影響は約３９５乃至４１０ｎＭで励起した後に約６２２乃至６３５ｎｍで蛍光測定することによって測定される（例えばＪａｃｏｂｓおよびＪａｃｏｂｓ，Ｅｎｚｙｍｅ２８：２０６（１９８２年）；Ｓｈｅｒｍａｎ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：２８０（１９９１年）参照）。この測定法は、プロトポルフィリンＩＸは蛍光色素であるがプロトポルフィリノーゲンＩＸは蛍光性ではないという事実に基づいている。
予想されるｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤の作用機序には、葉緑体中でのプロトポルフィリノーゲンＩＸの蓄積が関与している。この蓄積は、ペルオキシダーゼ活性によってプロトポルフィリノーゲンＩＸに酸化されるとプロトポルフィリンＩＸの細胞質ゾルへの漏出をもたらすと考えられる。プロトポルフィリンＩＸは、露光すると細胞質ゾル中に一重項酸素を生成し得る。一重項酸素により他の反応性酸素種が生成し、それにより脂質の過酸化と細胞膜の破壊が引き起こされ、迅速な細胞死がもたらされ得る（Ｌｅｅ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：８８１（１９９３年））。
すべてのｐｒｏｔｏｘ酵素が植物ｐｒｏｔｏｘ酵素を阻害する除草剤に感受性であるわけではない。大腸菌（Ｓａｓａｒｍａｎ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１１５５（１９９３年））および枯草菌（Ｄａｉｌｅｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８１３（１９９４年））から単離された遺伝子によってコードされるｐｒｏｔｏｘ酵素は両方とも、これらの除草効果のある阻害物質に耐性である。さらに、フェニルイミド除草剤Ｓ−２３１４２に耐性の単細胞の藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの突然変異体が報告されている（Ｋａｔａｏｋａ等，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉ．１５：４４９（１９９０年）；Ｎ．Ｍｕｒａｔａ編「Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第ＩＩＩ巻），Ｋｌｕｗｅｒ：オランダ，５６７〜５７０（１９９２年）収載のＳｈｉｂａｔａ他の章）。これらの突然変異体の少なくとも１つは、突然変異体の選択基準とした除草効果のある阻害物質だけでなく、他の種類のｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対しても耐性の修飾ｐｒｏｔｏｘ活性を持つらしい（Ｏｓｈｉｏ等，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４８ｃ：３３９（１９９３年）；Ｓ．Ｄｕｋｅ編「ＡＣＳ  Ｓｙｍｏｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｃ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ」，ＡＣＳ  Ｐｒｅｓｓ：ワシントン（１９９４年）収載のＳａｔｏ他の章）。また、阻害物質Ｓ２１４３２に耐性の突然変異体タバコ細胞株も報告されている（Ｃｈｅ等，Ｚ．Ｎａｔｕｆｆｏｒｓｃｈ．４８ｃ：３５０（１９９３年））。
発明の概要
本発明は、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子およびキメラ遺伝子を提供する。このような単離ＤＮＡ分子の配列を配列番号：９（コムギ）、１１（ダイズ）、１５（ワタ）、１７（テンサイ）、１９（ナタネ）、２１（イネ）および２３（モロコシ）に示す。
本発明はまた、非修飾天然植物ｐｒｏｔｏｘ酵素を阻害する化合物に耐性の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素修飾体および、このような阻害物質耐性の植物ｐｒｏｔｏｘ酵素をコードするＤＮＡ分子とを提供する。本発明は、植物中に阻害物質耐性の植物ｐｒｏｔｏｘ酵素を発現し得るキメラ遺伝子および天然ｐｒｏｔｏｘ遺伝子変更体を含む。
阻害物質耐性の植物ｐｒｏｔｏｘ酵素をコードする遺伝子は、ｐｒｏｔｏｘ阻害除草剤に対する耐性を植物全体に付与するために使用することができ、また植物細胞形質転換方法の中の選択マーカーとして使用し得る。従って本発明は、これらの修飾ｐｒｏｔｏｘ酵素をコードする、発現可能な遺伝子を含む、植物並びにその子孫、植物組織および植物種子を含む。これらの植物、植物組織および植物種子は、通常は植物中の天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量のｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対して耐性である。特に本発明に含まれる植物としては、ｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤の潜在的な標的となるもの、具体的にはトウモロコシをはじめ、大麦、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビおよびイネなどの他の穀類作物など、農業経済学上重要な作物がある。また、サトウキビ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネおよびタバコなどの他の作物も含まれる。
本発明はさらに、本発明の方法によって予め形質転換された遺伝子組み換え植物あるいはそれらの子孫を起源とする、例えば植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの植物材料、並びに他の繁殖する材料および植物の一部、例えば花、茎、実、葉、根などを含む、本明細書に提供する植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体を産生する植物の作出方法に関する。このような植物は、耐性ｐｒｏｔｏｘをコードする構造遺伝子により安定して形質転換されるか直接選択技術によって作られ、それによって除草剤耐性株が単離され、特徴が明らかにされ、育成される。さらに、本発明は植物葉緑体内部にｐｒｏｔｏｘ遺伝子を発現するための生活組織形成形質転換技術の使用を含む。
本発明はさらに、植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体をコードする遺伝子の存在を検出し、植物組織中の阻害物質耐性のｐｒｏｔｏｘ複写物量を定量するためのプローブおよび方法に関する。これらの方法は、植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体をコードする遺伝子を含み、かつ／または発現する植物または植物組織を識別またはスクリーンするために使用される。
配列表の説明
配列番号：１：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：２：配列番号：１によってコードされるアラビドプシスｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：３：アラビドプシス・タリアナｐｒｏｔｏｘ−２蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：４：配列番号：３によってコードされるアラビドプシスｐｒｏｔｏｘ−２アミノ酸配列
配列番号：５：トウモロコシｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：６：配列番号：５によってコードされるトウモロコシｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：７：トウモロコシｐｒｏｔｏｘ−２蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：８：配列番号：７によってコードされるトウモロコシｐｒｏｔｏｘ−２アミノ酸配列
配列番号：９：コムギｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：１０：配列番号：９によってコードされるコムギｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：１１：ダイズｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：１２：配列番号：１１によってコードされるダイズｐｒｏｔｏｘ−１蛋白
配列番号：１３：アラビドプシス・タリアナｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号：１４：トウモロコシｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号：１５：ワタｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：１６：配列番号：１５によってコードされるワタｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：１７：テンサイｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：１８：配列番号：１７によってコードされるテンサイｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：１９：ナタネｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：２０：配列番号：１９によってコードされるナタネｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：２１：イネｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：２２：配列番号：２１によってコードされるイネｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：２３：モロコシｐｒｏｔｏｘ−１蛋白配列をコードするＤＮＡ
配列番号：２４：配列番号：２３によってコードされるモロコシｐｒｏｔｏｘ−１アミノ酸配列
配列番号：２５：トウモロコシｐｒｏｔｏｘ−１イントロン配列
配列番号：２６：テンサイｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号：２７：Ｐｃｌｐ＿Ｐ１ａ−色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモータートップストランドＰＣＲプライマー
配列番号：２８：Ｐｃｌｐ＿Ｐ１ｂ−色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターボトムストランドＰＣＲプライマー
配列番号：２９：Ｐｃｌｐ＿Ｐ２ｂ−色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターボトムストランドＰＣＲプライマー
配列番号：３０：Ｔｒｐｓ１６＿Ｐ１ａ−色素体ｒｐｓ１６遺伝子トップストランドＰＣＲプライマー
配列番号：３１：Ｔｒｐｓ１６＿ｐ１ｂ−色素体ｒｐｓ１６遺伝子ボトムストランドＰＣＲプライマー
配列番号：３２：ｍｉｎｐｓｂ＿Ｕ−プラスチックのｐｓｂＡ遺伝子トップストランドプライマー
配列番号：３３：ｍｉｎｐｓｂ＿Ｌ−色素体ｐｓｂＡ遺伝子ボトムストランドプライマー
配列番号：３４：ＡＰＲＴＸＰ１ａ−トップストランドＰＣＲプライマー
配列番号：３５：ＡＰＲＴＸＰ１ｂ−ボトムストランドＰＣＲプライマー
寄託
下記のベクター分子を以下に示す年月日に米国農業研究部特許培養株保管所北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）（米国イリノイ州ピオリア、ノースユニバーシティーストリート１８１５）に寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のコムギＰｒｏｔｏｘ−１ａを１９９６年３月１９日にｐＷＤＣ−１３（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４５）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のダイズＰｒｏｔｏｘ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｒｏｔｏｘ）−１を１９９５年１２月１５日にｐＷＤＣ−１２（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５１６）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のワタＰｒｏｔｏｘ（Ｃｏｔｔｏｎ  Ｐｒｏｔｏｘ）−１を１９９６年７月１日にｐＷＤＣ１５（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５９４）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のテンサイＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年７月２９日にｐＷＤＣ−１６（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５９５Ｎ）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のナタネＰｒｏｔｏｘ（Ｒａｐｅ  Ｐｒｏｔｏｘ）−１を１９９６年８月２３日にｐＷＤＣ−１７（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６１５）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のイネＰｒｏｔｏｘ（Ｒｉｃｅ  Ｐｒｏｔｏｘ）−１を１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−１８（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６４８）として寄託した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のモロコシＰｒｏｔｏｘ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  Ｐｒｏｔｏｘ）−１を１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−１９（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６４９）として寄託した。
ｐＭｕｔ−１プラスミド中の耐性突然変異体ｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓを１９９４年１１月１４日にｐＷＤＣ−７の名称でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託名称ＮＲＲＬ＃２１３３９Ｎが与えられた。
アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターを含むＡｒａＰＴｌＰｒｏを１９９５年１２月１５日にｐＷＤＣ−１１（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５１５）として寄託した。
トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターをトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列の残りの部分と融合させたものを含むプラスミドを１９９６年３月１９日にｐＷＤＣ−１４（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４６）として寄託した。
テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターを含むプラスミドを１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−２０（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６５０）として寄託した。
発明の詳細な説明
１．植物Ｐｒｏｔｏｘコード配列
一態様では、本発明はプロトポルフィリノーゲンＩＸのプロトポルフィリンＩＸへの酸化を触媒する、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシ由来の酵素であるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本明細書では「ｐｒｏｔｏｘ」と称する）をコードする単離ＤＮＡ分子に関する。
コムギｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９および１０として提供する。ダイズｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１１および１２として提供する。ワタｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１５および１６として提供する。テンサイｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１７および１８として提供する。ナタネｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１９および２０として提供する。イネｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２１および２２として提供する。モロコシｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２３および２４として提供する。
以前に単離したアラビドプシス・タリアナおよびトウモロコシ由来のｐｒｏｔｏｘ酵素のＤＮＡコード配列および相当するアミノ酸配列を本明細書では配列番号：１〜４（アラビドプシス）および配列番号：５〜８（トウモロコシ）として再掲する。
従って、本発明は第１に、コムギｐｒｏｔｏｘ酵素、ダイズｐｒｏｔｏｘ酵素、ワタｐｒｏｔｏｘ酵素、テンサイｐｒｏｔｏｘ酵素、ナタネｐｒｏｔｏｘ酵素、イネｐｒｏｔｏｘ酵素およびモロコシｐｒｏｔｏｘ酵素から成る群から選択される真核生物ｐｒｏｔｏｘを含むプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子に関する。
本発明の範囲内で好ましいのは、双子葉植物の植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子、特に配列番号：１１、１５、１７および１９に示したものなどの、ダイズ植物、ワタ植物、テンサイ植物およびナタネ植物由来の単離ＤＮＡ分子である。より好ましいのは、配列番号：１１に示したダイズと配列番号：１７に示したテンサイ由来のものなどのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子である。
また、好ましいのは単子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子、特に配列番号：９、２１および２３に示したものなどの、コムギ植物、イネ植物およびモロコシ植物由来の単離ＤＮＡ分子である。より好ましいのは、配列番号：９に示したものなどの、コムギ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子である。
別の態様では、本発明は双子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素蛋白質をコードする単離ＤＮＡ分子であって、前記蛋白が配列番号：１２、１６、１８および２０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ＤＮＡ分子に関する。さらに含まれるのは、単子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素蛋白質をコードする単離ＤＮＡ分子であって、前記蛋白が配列番号：１０、２２および２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ＤＮＡ分子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子であって、前記蛋白が配列番号：１０に示したコムギ由来のアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡ分子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする単離ＤＮＡ分子であって、前記蛋白が配列番号：１２に示したダイズおよび配列番号：１８に示したテンサイ由来のアミノ酸配列を含む単離ＤＮＡ分子である。
本発明によって提供される情報を使用すると、標準の方法を使用して、任意の真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の配列をコードするＤＮＡが得られる。
別の態様では、本発明はコムギｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃でハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：９のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に関する。
別の態様では、本発明はダイズｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：１１のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に関する。
別の態様では、本発明はワタｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：１５のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に関する。
別の態様では、テンサイｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：１７のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に本発明に関する：
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
別の態様では、ナタネｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：１９のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に本発明に関する：
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
別の態様では、イネｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：２１のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に本発明に関する：
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
別の態様では、モロコシｐｒｏｔｏｘ酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号：２３のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ分子に本発明に関する：
（ａ）７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃ででハイブリダイゼーション
（ｂ）２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄
本発明の教示による単離真核生物ｐｒｏｔｏｘ配列は、任意の所望の目的に適する標準の遺伝子工学技術によって操作される。例えば、ｐｒｏｔｏｘ配列全体あるいはその一部は、ｐｒｏｔｏｘをコードする配列およびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用する。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、このようなプローブには、ｐｒｏｔｏｘをコードする配列中で独特であり、好ましくは長さが少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも２０のヌクレオチドの配列が含まれる。このようなプローブは、選択した生体由来のｐｒｏｔｏｘをコードする配列を有名なポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法を介して増幅、分析するために使用し得る。この技術は、所望の生体からさらにｐｒｏｔｏｘコード配列を単離するのに有用であり、あるいは生体中のｐｒｏｔｏｘをコードする配列の存在を判定する診断分析としても有用であろう。
ハイブリッドの安定に影響する要因は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。このような要因の１つは融解温度Ｔｍであり、これはＧｅｏｒｇｅ  Ｈ．ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｒｋ  Ｍ．Ｍａｎａｋ著「ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥＳ」Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社（１９９３年）の第１章「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」８ページ以下に提供される公式によって容易に計算し得る。好ましいハイブリダイゼーション温度は、融解温度の計算値Ｔｍより約２５℃下の範囲内であり、好ましくは融解温度の計算値Ｔｍより約１２〜１５℃下の範囲内であり、オリゴヌクレオチドの場合は融解温度Ｔｍより約５〜１０℃下の範囲内である。
本発明に含まれるのは、上文に定義した、本発明によるＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ分子であるが、好ましくは穏和なストリンジェント条件下で前記ＤＮＡ分子から入手できる、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素配列の、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの近接部分を含むオリゴヌクレオチドプローブである。
本発明はさらに、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子、あるいはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブの、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）での使用を実施する。
さらに一実施態様では、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性をコードする真核生物のＤＮＡ配列あるいはそれぞれのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブと、本発明によるプローブを使用して真核生物の前記ＤＮＡ配列を検出する方法とを提供する。
また、ゲノムｐｒｏｔｏｘ配列の選択的ハイブリダイゼーションに基づいた標準の技術を使用して、選択した生体のゲノム中の天然真核生物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子の位置をマッピングするためにｐｒｏｔｏｘ特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。これらの技術には、ｐｒｏｔｏｘプローブ配列内に確認または包含されるＤＮＡ多形の確認と、２種類の多形親株雑種の自家受精から得られるｐｒｏｔｏｘ遺伝子の、他の既知の遺伝子マッピング集団地図位置マーカーを基準とした分離の追跡への、このような多形の使用が含まれるが、これらに限定されない（例えばＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９（１９８５年）．Ｓｏｍｍｅｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：８２（１９９２年）；Ｄ’Ｏｖｉｄｉｏ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１６９（１９９０年）参照）。任意の真核生物由来のｐｒｏｔｏｘ遺伝子をマッピングするためのプローブとしていかなる真核生物のｐｒｏｔｏｘ配列も有用と考えられる一方で、好ましいプローブは選択した生体とより密接な関係がある生体由来のｐｒｏｔｏｘ配列であり、最も好ましいプローブは選択した生体由来のｐｒｏｔｏｘ配列である。このような方法のｐｒｏｔｏｘ遺伝子のマッピングは植物での育種の目的に特に有用と考えられる。例えば、除草剤耐性を付与する突然変異体ｐｒｏｔｏｘ遺伝子の遺伝地図位置を知ることによって、参照遺伝地図から隣接するＤＮＡマーカーを識別し得る（例えばＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ３：２１７（１９８７年）参照）。新しい育種株の中へ除草剤耐性形質を遺伝子移入する間に、戻し交配の各回後に再生する親の中に依然として存在する、ｐｒｏｔｏｘで結合された隣接染色体ＤＮＡの程度をモニターするためにこれらのマーカーを使用し得る。
また、ノーザンブロット分析などの標準の技術を用いて生体中のｐｒｏｔｏｘ  ｍＲＮＡ量を定量するためにＰｒｏｔｏｘ特異性のハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。この技術は、神経精神病の徴候および皮膚傷害の両方を特徴とし、ｐｒｏｔｏｘ活性レベル低下と関係のある、ヒト常染色体優性障害などの特定有害状態に関係するｐｒｏｔｏｘ発現レベル変化を検出するための診断的測定法として有用であろう（ＢｒｅｎｎｅｒおよびＢｌｏｏｍｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０２：７６５（１９８０年））。
本発明のさらなる実施態様は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子を産生する方法であって、
（ａ）植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブを調製する段階であって、前記プローブが長さ少なくとも１０ヌクレオチドの植物由来ｐｒｏｔｏｘ蛋白をコードする配列の近接部分を含む段階と、
（ｂ）段階（ａ）によって調製されたヌクレオチド・プローブを使用して、選択した生体由来のクローン化されたゲノムＤＮＡ断片またはゲノムｃＤＮＡ断片の集団中の他のｐｒｏｔｏｘコード配列をプローブで探る段階と、
（ｃ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子を単離、増幅する段階とを含む方法である。
本発明のさらなる実施態様は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ部分を含む、任意の植物からＤＮＡ分子を単離する方法であって、
（ａ）植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブを調製する段階であって、前記プローブが長さ少なくとも１０ヌクレオチドの植物由来ｐｒｏｔｏｘ蛋白をコードする配列の近接部分を含む段階と、
（ｂ）段階（ａ）によって調製されたヌクレオチド・プローブを使用して、選択した生体由来のクローン化されたゲノムＤＮＡ断片またはゲノムｃＤＮＡ断片の集団中の他のｐｒｏｔｏｘコード配列をプローブで探る段階と、
（ｃ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子を単離、増幅する段階とを含む方法である。
本発明はさらに、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素活性を示す蛋白質をコードする、ほぼ純粋なＤＮＡ配列を作成する方法であって、
（ａ）適切なクローニング・ベクターを使用して適当な原料生体からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、
（ｂ）プローブ分子を備えたライブラリーをハイブリダイズする段階と、
（ｃ）ライブラリーからのＤＮＡクローンに対するプローブのポジティブハイブリダイゼーションを識別する段階であって、クローンがプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列を含む可能性がある段階とを含む方法を含む。
本発明はさらに、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素活性（方法はそれを含む）を示す蛋白質をコードするほぼ純粋なＤＮＡ配列を作成する方法であって、
（ａ）ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡ全体を調製する段階と、
（ｂ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）のアミノ酸配列の低縮重部分を示すプライマーによるＰＣＲ反応のテンプレートとして段階（ａ）のＤＮＡを使用する段階と
を含む方法を含む。
本発明のさらなる目的は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素活性の阻害物質を識別する測定法であって、
（ａ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）およびその基質の最初の試料をインキュベートする段階と、
（ｂ）段階（ａ）からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）の阻害されていない反応性を測定する段階と、
（ｃ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）の最初の試料およびその基質を、阻害物質化合物を含む別の試料がある状態でインキュベートする段階と、
（ｄ）段階（ｃ）からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の阻害された反応性を測定する段階と、
（ｅ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の阻害されていない反応性と阻害された反応性とを比較する段階と、
を含む測定法である。
本発明のさらなる目的は、阻害物質耐性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）突然変異体を識別する測定法であって、
（ａ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の最初の試料およびその基質を、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素阻害物質を含む別の試料がある状態でインキュベートする段階と、
（ｂ）段階（ａ）由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の変異させていない反応性を測定する段階と、
（ｃ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素阻害物質を含む別の試料がある状態で、変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素およびその基質の最初の試料をインキュベートする段階と、
（ｄ）段階（ｃ）からの変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の変異反応性を測定する段階と、
（ｅ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素の変異させていない反応性と変異反応性とを比較する段階とを含む測定法である。
本発明のさらなる目的は、本発明による方法によって得られるｐｒｏｔｏｘ酵素阻害物質である。
宿主生体で酵素を組換え産生するには、選択した宿主向けに設計し、組換え産生する宿主に導入する発現カセットにｐｒｏｔｏｘコード配列を挿入してもよい。プロモーター、シグナル配列、５’非翻訳配列および３’非翻訳配列、エンハンサーなどの特定の調節配列の選択は、当業者の技能水準の範囲内である。得られた分子は適切な読み枠中で連結した個々の要素を含むが、これを宿主細胞で形質転換し得るベクターに挿入する。蛋白質の組換え産生に適した発現ベクターおよび方法は、大腸菌（例えばＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３（１９８６年）；Ｂｒｏｓｉｕｓ，ＤＮＡ８：７５９（１９８９年）参照）、酵母（例えばＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：３７３（１９９１年）参照）および昆虫細胞（例えばＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：４７（１９８８年）参照）などの宿主生体に対するものがよく知られている。具体例としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）、ｐＦＬＡＧ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，コネティカット州ニューヘーヴン）、ｐＴｒｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州ラホーヤ）、バキュロウイルス発現ベクターなどのプラスミドなどで、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のゲノム由来のものなどがある。好ましいバキュロウイルス／昆虫系はｐＶＩ１１３９２／Ｓｆ２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州ラホーヤ）である。
組換え産生した真核生物のｐｒｏｔｏｘ酵素は、様々な目的に役立つ。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏでｐｒｏｔｏｘに酵素の活性を提供するために使用してもよい。また、それを公知の除草薬であって、それらがｐｒｏｔｏｘを阻害するかどうか判定するためにその標的を識別していないものをスクリーンするｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ測定法で使用してもよい。このようなｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ測定法はまた、ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害し、従って除草剤候補である化学薬品を識別するために、より一般的なスクリーンとして使用してもよい。組換え産生した真核生物のｐｒｏｔｏｘ酵素はまた、阻害物質耐性のｐｒｏｔｏｘ突然変異体を識別する測定法で使用してもよい（１９９５年６月８日に出願され、１９９５年１２月２１日にＷＯ９５／３４６５９として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２号参照、その全体を参照により本明細書の一部とする）。別法として、酵素の除草剤抵抗体と共に新しい阻害性除草剤も合理的に設計するために、組換え産生したｐｒｏｔｏｘ酵素と公知の阻害物質との関連性の特徴をさらに明らかにするのにその酵素を使用してもよい。
ＩＩ．阻害物質耐性植物Ｐｒｏｔｏｘ酵素
別の態様では、本発明は任意の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本明細書では「ｐｒｏｔｏｘ」と呼ぶ）酵素のアミノ酸配列になし得る変更であって、この酵素の阻害物質耐性体を得るための変更を教示する。本発明は、本明細書で教示する変更を有する阻害物質耐性の植物ｐｒｏｔｏｘ酵素と、この修飾酵素をコードするＤＮＡ分子と、植物中でこの修飾酵素を発現し得る遺伝子に関する。
従って、本発明は少なくとも１つのアミノ酸変更を有する、修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードする単離ＤＮＡ分子であって、前記アミノ酸変更がｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有する、即ち前記修飾ｐｒｏｔｏｘが真核生物のｐｒｏｔｏｘを阻害する量の前記除草剤に対して耐性である単離ＤＮＡ分子に関する。本明細書で使用する「阻害する」とは、対象除草剤存在しない状態で観察される酵素活性レベルと比較したときの、対象除草剤が存在する状態で観察される酵素活性の低下をいい、ここで低下度（％）は好ましくは少なくとも１０％であり、より好ましくは少なくとも５０％であり、最も好ましくは少なくとも９０％である。
好ましいのは、少なくとも１つのアミノ酸変更を有するコムギｐｒｏｔｏｘ酵素、ダイズｐｒｏｔｏｘ酵素、ワタｐｒｏｔｏｘ酵素、テンサイｐｒｏｔｏｘ酵素、ナタネｐｒｏｔｏｘ酵素、イネｐｒｏｔｏｘ酵素およびモロコシｐｒｏｔｏｘ酵素から成る群から選択される真核生物のｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性であるＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：６のアミノ酸１５９に相当する位置に生じるシステインが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記システインがフェニルアラニンまたはリジンと置換された前記ＤＮＡ分子であり、最も好ましいのは、前記システインがフェニルアラニンと置換された前記ＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡであって、配列番号：６のアミノ酸４１９に相当する位置に生じるイソロイシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡである。
特に好ましいのは、前記イソロイシンがトレオニン、ヒスチジン、グリシンあるいはアスパラギンと置換されたＤＮＡ分子であり、最も好ましくは前記イソロイシンがトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：６のアミノ酸１６４に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがトレオニン、ロイシンまたはバリンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：６のアミノ酸１６５に相当する位置に生じるグリシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記グリシンがセリンまたはロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：６のアミノ酸３７０に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがイソロイシンまたはメチオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のアミノ酸３５６に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記バリンがロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のアミノ酸４２１に相当する位置に生じるセリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記セリンがプロリンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のアミノ酸５０２に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記バリンがアラニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のアミノ酸２１１に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがバリンまたはトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のアミノ酸２１２に相当する位置に生じるグリシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記グリシンがセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡであって、配列番号：１０のアミノ酸４６６に相当する位置に生じるイソロイシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記イソロイシンがトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１２のアミノ酸３６９に相当する位置に生じるプロリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記プロリンがセリンまたはヒスチジンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１２のアミノ酸２２６に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがトレオニンまたはロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１２のアミノ酸５１７に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記バリンがアラニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１２のアミノ酸４３２に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがロイシンまたはイソロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１６のアミノ酸３６５に相当する位置に生じるプロリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記プロリンがセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、配列番号：１６のアミノ酸４２８に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがシステインまたはアルギニンと置換されたＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡであって、配列番号：１８のアミノ酸４４９に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾ｐｒｏｔｏｘが天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがシステイン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
本発明はさらに、第１アミノ酸置換および第２アミノ酸置換を有する植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、前記第１アミノ酸置換がｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第２アミノ酸置換が前記第１アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有するＤＮＡ分子に関する。好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、前記植物がトウモロコシ、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネ、モロコシおよびアラビドプシスから成る群から選択されるＤＮＡ分子である。より好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、前記植物がトウモロコシ、コムギ、ダイズ、テンサイおよびアラビドプシスから成る群から選択されるＤＮＡ分子である。
好ましいのは、前記第２アミノ酸置換が
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸３０５のセリンに相当する位置
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２４９のトレオニンに相当する位置
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１１８のプロリンに相当する位置
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸４２５のアスパラギンに相当する位置
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸４９８のチロシンに相当する位置から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
また好ましいのは、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸１６５のグリシンに相当する位置
（ｃ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
（ｄ）配列番号：６のアミノ酸１５９のシステインに相当する位置
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸４１９のイソロイシンに相当する位置
（ｆ）配列番号：１０のアミノ酸３５６のバリンに相当する位置
（ｇ）配列番号：１０のアミノ酸４２１のセリンに相当する位置
（ｈ）配列番号：１０のアミノ酸５０２のバリンに相当する位置
（ｉ）配列番号：１０のアミノ酸２１１のアラニンに相当する位置
（ｋ）配列番号：１０のアミノ酸２１２のグリシンに相当する位置
（Ｉ）配列番号：１０のアミノ酸４６６のイソロイシンに相当する位置
（ｍ）配列番号：１２のアミノ酸３６９のプロリンに相当する位置
（ｎ）配列番号：１２のアミノ酸２２６のアラニンに相当する位置
（ｏ）配列番号：１２のアミノ酸４３２のチロシンに相当する位置
（ｐ）配列番号：１２のアミノ酸５１７のバリンに相当する位置
（ｑ）配列番号：１６のアミノ酸４２８のチロシンに相当する位置
（ｒ）配列番号：１６のアミノ酸３６５のプロリンに相当する位置
（ｓ）配列番号：１８のアミノ酸４４９のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、植物ｐｒｏｔｏｘが配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０および２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ分子である。最も好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子であって、植物ｐｒｏｔｏｘが配列番号：２、４、６、８、１０、１２および１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸１６５のグリシンに相当する位置
（ｃ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
（ｄ）配列番号：６のアミノ酸１５９のシステインに相当する位置
（ｅ）配列番号：６のアミノ酸４１９のイソロイシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、前記第２アミノ酸置換が配列番号：２のアミノ酸３０５のセリンに相当する位置で起き、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸３０５に相当する位置に生じる前記セリンがロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、ＤＮＡ分子であって、前記第２アミノ酸置換が配列番号：２のアミノ酸２４９のトレオニンに相当する位置で起き、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸２４９に相当する位置に生じる前記トレオニンがイソロイシンとアラニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡである。
より好ましいのは、前記第２アミノ酸置換が配列番号：２のアミノ酸１１８のプロリンに相当する位置で起き、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸１１８に相当する位置に生じる前記プロリンがロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、前記第２アミノ酸置換が配列番号：２のアミノ酸４２５のアスパラギンに相当する位置で起き、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸４２５に相当する位置に生じる前記がアスパラギンセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、前記第２アミノ酸置換が配列番号：２のアミノ酸４９８のチロシンに相当する位置で起き、前記第１アミノ酸置換が
（ａ）配列番号：６のアミノ酸１６４のアラニンに相当する位置
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸３７０のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：２のアミノ酸４９８に相当する位置に存在する前記チロシンがシステインと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：６のアミノ酸３７０に相当する位置に存在する前記チロシンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：６のアミノ酸３７０に相当する位置に存在する前記チロシンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：６の残基１６４に相当する位置に存在する前記アラニンがバリン、トレオニン、ロイシン、システインおよびチロシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：６の残基１６５に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンとロイシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：６の残基１６５に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：６の残基１５９に相当する位置に存在する前記システインがフェニルアラニンとリシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：６の残基１５９に相当する位置に存在する前記システインがフェニルアラニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：６の残基４１９に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニン、ヒスチジン、グリシンおよびアスパラギンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
特に好ましいのは、配列番号：６の残基４１９に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基３５６に相当する位置に存在する前記バリンがロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基４２１に相当する位置に存在する前記セリンがプロリンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基５０２に相当する位置に存在する前記バリンがアラニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基４６６に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基２１２に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１０の残基２１１に相当する位置に存在する前記アラニンがバリンまたはトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１２の残基３６９に相当する位置存在する前記プロリンがセリンまたはヒスチジンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１２の残基２２６に相当する位置に存在する前記アラニンがロイシンまたはトレオニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１２の残基４３２に相当する位置に存在する前記チロシンがロイシンまたはイソロイシンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１２の残基５１７に相当する位置に存在する前記バリンがアラニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１６の残基４２８に相当する位置に存在する前記チロシンがシステインまたはアルギニンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１６の残基３６５に相当する位置に存在する前記プロリンがセリンと置換されたＤＮＡ分子である。
より好ましいのは、配列番号：１８の残基４４９に相当する位置に存在する前記プロリンがロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたＤＮＡ分子である。
本発明は、発現カセットおよび組換えベクターであって、前記発現カセットがプロモーターを必ず含むが、特に本発明による真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットおよび組換えベクターに関する。本発明による発現カセットはさらに、前記ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記ＤＮＡ分子によりコードされる蛋白質を葉緑体またはミトコンドリアにターゲティングし得る。
本発明は、プロモーターを必ず含む発現カセットを含むキメラ遺伝子に関し、特に本発明による真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする異種ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットを含むキメラ遺伝子に関する。好ましいのは、ＤＮＡ分子がアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。より好ましいのは、ＤＮＡ分子がダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生、イネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がコムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。最も好ましいのは、ＤＮＡ分子がダイズ、テンサイおよびコムギから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。
より好ましいのは、配列番号：１０に示す配列を含むコムギｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１２に示す配列を含むダイズｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１６に示す配列を含むワタｐｒｏｔｏｘ：、配列番号：１８に示す配列を含むテンサイｐｒｏｔｏｘ、配列番号：２０に示す配列を含むナタネｐｒｏｔｏｘ、配列番号：２２に示す配列を含むイネｐｒｏｔｏｘ、および配列番号：２４に示す配列を含むモロコシｐｒｏｔｏｘから成る群から選択されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードする異種ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物の中で活性なプロモーターを含むキメラ遺伝子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素が配列番号：１０に示す配列を含むコムギｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１２に示す配列を含むダイズｐｒｏｔｏｘ、および配列番号：１８に示す配列を含むテンサイｐｒｏｔｏｘから成る群から選択されるキメラ遺伝子である。
本明細書に使用する「ｐｒｏｔｏｘ−１」とは、葉緑体ｐｒｏｔｏｘをいい、「ｐｒｏｔｏｘ−２」はミトコンドリアｐｒｏｔｏｘをいう。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性またはｐｒｏｔｏｘ−２活性を有するアラビドプシス種由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白質が配列番号：２または配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性またはｐｒｏｔｏｘ−２活性を有するトウモロコシ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：６または配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するコムギ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：１０に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するダイズ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：１２に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するワタ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：１６に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｆｏｘ−１活性を有するテンサイ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：１８に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するナタネ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：２０に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するイネ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号：２２に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がｐｒｏｔｏｘ−１活性を有するモロコシ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、前記蛋白が配列番号：２４に示すアミノ酸配列を好ましくは含むキメラ遺伝子である。
本発明はまた、プロモーターを必ず含む発現カセットを含むキメラ遺伝子を実施するが、特に相当する非修飾版の酵素を阻害する量の除草剤に対して耐性の本発明による真核生物由来プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットを含むキメラ遺伝子を実施する。
好ましいのは、ＤＮＡ分子がアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。
より好ましいのは、ＤＮＡ分子がダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生、またイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、ＤＮＡ分子がアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするキメラ遺伝子である。
本発明に含まれるのは、少なくとも１つのアミノ酸変更を有する真核生物のｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子であって、前記アミノ酸変更がｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有するキメラ遺伝子である。
また本発明に含まれるのは、第１アミノ酸置換および第２アミノ酸置換を有する植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子であって、前記第１アミノ酸置換はｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第２アミノ酸置換が前記第１アミノ酸置換によって付与された前記耐性を増強する特性を有するキメラ遺伝子である。好ましいのは、前記ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含む前記キメラ遺伝子であって、前記シグナル配列が前記ＤＮＡ分子によりコードされる蛋白質を葉緑体またはミトコンドリアにターゲティングし得るキメラ遺伝子である。
本発明によるキメラ遺伝子はさらに、前記ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記ＤＮＡ分子によりコードされる蛋白質を葉緑体にターゲティングし得る。
本発明によるキメラ遺伝子はさらに、前記ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記ＤＮＡ分子によりコードされる蛋白質をミトコンドリアにターゲティングし得る。
また、本発明に含まれるのは、本明細書で前に述べた、宿主・ゲノムへ安定して組み込まれる任意のＤＮＡ配列である。
本発明はさらに、植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）またはその機能的に等価な誘導体を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明はさらに、前記組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡベクターに関する。
本発明のさらなる目的は、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが宿主細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。
本発明のさらなる目的は、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが植物、植物種子、植物組織または植物細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。好ましいのは、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、植物にで安定して形質転換可能な組換えベクターである。このベクターにより安定して形質転換された植物、植物種子、植物組織または植物細胞は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子を発現し得る。好ましいのは、組換えベクターであって、前記ベクターにより安定して形質転換された植物、植物種子、植物組織または植物細胞が、相当する非修飾版の酵素を阻害するレベルで除草剤に対して耐性の植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子を発現可能な組換えベクターである。
好ましいのは、配列番号：１０に示す配列を含むコムギｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１２に示す配列を含むダイズｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１６に示す配列を含むワタｐｒｏｔｏｘ、配列番号：１８に示す配列を含むテンサイｐｒｏｔｏｘ、配列番号：２０に示す配列を含むナタネｐｒｏｔｏｘ、配列番号：２２に示す配列を含むイネｐｒｏｔｏｘおよび配列番号：２４に示す配列を含むモロコシｐｒｏｔｏｘから成る群から選択されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードする異種ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが宿主細胞で安定して形質転換し得る組換えベクターである。
また好ましいのは、第１アミノ酸置換および第２アミノ酸置換を有する植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記第１アミノ酸置換がｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第２アミノ酸置換が前記第１アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、前記ベクターが植物細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。
また、本発明に含まれるのは、本発明によるベクターで安定して形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞が前記ＤＮＡ分子を発現可能な宿主細胞である。好ましいのは、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞から成る群から選択される宿主細胞である。
本発明はさらに、許容性が本明細書で教示するようにして阻害物質耐性の修飾ｐｒｏｔｏｘ酵素を発現する遺伝子により付与される、植物中の天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する除草剤に許容性の植物およびその子孫、植物組織および植物種子に関する。代表的な植物としては、この除草剤をその通常意図される目的のために適用する任意の植物などである。好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネ等などの被子植物および裸子植物である。より好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、ワタ、ダイズ、ナタネ、テンサイ、トウモロコシ、イネ、コムギ、大麦、エンバク、ライ麦、モロコシ、キビ、芝生、フォーレージ、芝草などの被子植物および裸子植物である。特に好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネなどの被子植物および裸子植物である。
好ましいのは、第１アミノ酸置換および第２アミノ酸置換を有する植物ｐｒｏｔｏｘを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）をコードするＤＮＡ分子を含む植物であって、前記第１アミノ酸置換がｐｒｏｔｏｘ阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第２アミノ酸置換が前記第１アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、前記ＤＮＡ分子が前記植物中で発現されて天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対する植物許容性を前記植物に付与する植物である。好ましいのは、前記ＤＮＡ分子が相当する天然ｐｒｏｔｏｘコード配列と置換した植物である。本発明に含まれるのは、前記キメラ遺伝子が天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対する前記植物耐性付与する、本発明によるキメラ遺伝子を含む植物およびその子孫である。
本発明に含まれるのは、本発明による少なくとも１つのキメラ遺伝子により安定して形質転換された植物およびその子孫、種子、培養組織を含むトランスジェニック植物組織である。好ましいのは、プロモーターを必ず含むが特に植物組織中で相当する非修飾版の酵素を阻害する量の除草剤に対して耐性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）酵素をコードするＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーター発現カセットを含む、少なくとも１つのキメラ遺伝子により安定して形質転換された植物、種子および培養組織を含むトランスジェニック植物組織である。
本発明の組換えＤＮＡ分子は、技術的に認識された多くの方法によって植物細胞に導入し得る。当業者なら、方法の選択が形質転換の標的とする植物の種類、即ち単子葉植物、双子葉植物などに依存し得ることを理解しよう。植物細胞を形質転換する適切な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ等，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：３２０〜３３４（１９８６年））、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５６０２〜５６０６（１９８６年））、アグロバクテリウムによる形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５〜９２１（１９８８年））、直接遺伝子転移（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等，ＥＭＢＯ  Ｊ：３．２７１７〜２７２２（１９８４年））、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ社（ウィスコンシン州マディソン）およびＤｕＰｏｎｔ社（デラウェア州ウィルミントン）から市販の装置を使用する弾道粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ他の米国特許第４，９４５，０５０号、ＭｃＣａｂｅ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６．９２３〜９２６（１９８８年）参照）、プロトプラスト形質転換／再生法（１９９４年９月２７日にチバ−ガイギー社に対して発行された米国特許第５，３５０，６８９号参照）などがある。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ等，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１〜４７７（１９８８年）；Ｓａｎｆｏｒｄ等，Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７〜３７（１９８７年）（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１〜６７４（１９８８年）（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３〜９２６（１９８８年）（ダイズ）；Ｄａｔｔａ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：７３６〜７４０（１９９０年）（イネ）；Ｋｌｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：４３０５〜４３０９（１９８８年）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９〜５６３（１９８８年）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０〜４４４（１９８８年）（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８．８３３〜８３９（１９９０年）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ等，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２：６０３〜６１８（１９９０）（トウモロコシ）も参照のこと。
本発明の範囲に含まれるのは、トランスジェニック植物、特に前記の方法によって形質転換したトランスジェニック稔性植物および無性および／または有性の子孫であって、植物中で天然ｐｒｏｔｏｘ活性を通常阻害するレベルで除草剤による阻害に対して耐性または少なくとも許容性のものである。また子孫植物としては、親植物とは異なる遺伝的背景をもつ植物であって、戻し交配プログラムから得られ、そのゲノム中に依然として本発明による除草剤抵抗形質を含む植物などがある。なかでも特に好ましいのは、植物中の天然ｐｒｏｔｏｘ活性を通常阻害する量の除草剤による阻害に対して耐性または少なくとも許容性の雑種植物である。
本発明によるトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。好ましいのは、ライグラス属（Ｌｏｌｉｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃａｒｕｍ）、ブロムグラス属（Ｂｒｏｎｕｓ）、イネ属（Ｏｒｙｚａｅ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ライ麦属（Ｓｅｃｕｌｅ）、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）の各植物を含むイネ科族の単子葉植物である。より好ましいのは、トランスジェニックトウモロコシ、コムギ、大麦、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビおよびイネである。特に好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生およびイネである。
双子葉植物の中では、本明細書ではアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、サトウキビ、脂肪種子ナタネ、タバコおよびヒマワリがより好ましい。
特に好ましいのは、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイおよび脂肪種子ナタネである。
「子孫」（又は後代）（ｐｒｏｇｅｎｙ）の表現は、「無性的」および「有性的」に産出されたトランスジェニック植物の子孫の両方を含むと理解する。この定義はまた、例えば細胞融合または突然変異体選択などの公知の方法によって入手可能な突然変異体および形質転換体をすべて含むことを意味し、形質転換植物材料のすべての交雑・融合生成物と同様に、依然として最初の形質転換植物特有の特性を示すことを意味する。これはまた、戻し交配プログラムから得られる子孫植物をも含むが、ただし前記子孫植物が依然として本発明による除草剤耐性形質を含む場合に限る。
本発明の別の目的は、トランスジェニック植物の増殖材料に関する。本発明に関しては、トランスジェニック植物の増殖材料を、有性的または無性的にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖する任意の植物材料と定義する。本発明の範囲内で特に好ましいのは、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子、並びにトランスジェニック植物から得られた他の繁殖材料である。
植物の一部、例えば本発明の方法によってあらかじめ形質転換され、従って少なくとも部分的にはトランスジェニック細胞から成るトランスジェニック植物またはその子孫を起源とする花、茎、実、葉、根などもまた本発明の目的である。
本発明のさらなる目的は、本発明の方法によって形質転換され、従って本発明によるＤＮＡによって植物または植物の一部を形質転換することにより植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体を産生するトランスジェニック植物またはその子孫を起源とする植物、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子、並びに他の繁殖材料、植物の一部、例えば花、茎、実、葉、根などを産生する方法である。好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を作成する方法であって、本発明による組換えベクター分子により前記宿主細胞を形質転換する段階を含む方法である。さらに好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離ＤＮＡ分子を含む植物細胞を作成する方法であって、本発明による組換えベクター分子により前記植物細胞を形質転換する段階を含む方法である。好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離ＤＮＡ分子を含むトランスジェニック親植物のトランスジェニック子孫を産生する方法であって、公知の植物育種技術を要する、本発明による組換えベクター分子によって前記親植物を形質転換する段階と、除草剤を耐性形質を前記トランスジェニック親植物の子孫に移し入れる段階とを含む方法である。
好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体を産生する植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部が耐性ｐｒｏｔｏｘ酵素をコードする構造遺伝子により安定して形質転換される方法である。特に好ましいのは、植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部が本発明によるＤＮＡにより安定して形質転換される方法である。とりわけ好ましいのは、植物ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体を産生する前記の植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部を直接選択技術により調製し、それによって除草剤耐性株を単離し、特徴を明らかにし、育成する方法である。
上述のトランスジェニック種子およびトランスジェニック植物に導入された遺伝的特性は、有性生殖または栄養生長によって伝えられ、こうして子孫植物に維持、伝達され得る。一般に、前記の維持と伝達は、耕作、播種、収穫などの特定の目的に適するように開発された公知の農業の方法を利用する。また、水耕法または温室技術などの専門の方法も適用し得る。成長中の作物は、昆虫または伝染病が引き起こす攻撃および破損、並びに雑草植物による競争に対して脆弱であるため、雑草、植物病害、昆虫、線虫および他の逆の条件をコントロールして収穫量を改善する手段を講じる。これらには、土壌の耕作または雑草および感染植物の除去などの機械的な手段、並びに除草剤、殺菌剤、花粉発育阻止剤、線虫駆除剤、成長調節剤、成熟剤、殺虫剤などの農薬の使用などが含まれる。
本発明によるトランスジェニック植物およびトランスジェニック種子の有利な遺伝的特性は、害虫許容性、除草剤許容性、ストレス許容性、栄養価の改善、収穫量の増大、あるいは倒伏または破砕によって引き起こされる損害を少なくする構造改善などの改善された特性を備えた植物の開発を目的とした植物育種に利用し得る。様々な育種の段階は、交雑株の選択、親株授粉の支配、適切な子孫植物の選択などの明確な人の介在を特徴とする。所望の特性により、様々な育種法が取られる。適切な技術は当技術分野でよく知られており、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交雑、多株育種、品種混合、種間交雑、異数体技術などが含まれるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション技術はまた、機械的、化学的または生化学な手段による雄性または雌性の不稔植物を作成するための植物の不稔化を含む。異なる株の花粉によって雄性の不稔植物を他家受粉すると、雄性は不稔であるが雌性は稔性の植物のゲノムに両親株の特性が一様に得されることが確実になる。従って、本発明によるトランスジェニック種子およびトランスジェニック植物は、例えば除草剤または殺虫剤処理などの従来法の有効性を増大させるか、変更されたその遺伝的特性により前記方法を省くことが可能な、改善された植物株の育種に使用し得る。別法として、それらの最適化された遺伝の「設備」により、匹敵する有害な発育条件に耐えられなかった生産物よりも質のよい収穫生産物をもたらす、改善されたストレス耐性を備えた新しい作物を得ることができる。
種子作出では種子の発芽の質と均質性が最も重要な産物特性であるのに対し、農業従事者によって収穫・販売される種子の発芽の質と均質性は重要ではない。作物を他の作物および雑草の種子が無い状態に保ち、種子伝染性の病害を防除し、よい発芽を備えた種子を生産することは困難なので、純粋な種子の育成、調質およびマーケティングの技術に熟達した種子産生者がかなり広範で明確な種子生産実践規範を開発している。従って、農業従事者が自分の作物から収穫された種子を使用する代わりに特定の品質基準に合った保証された種子を買うことが一般的慣行である。種子として使用される繁殖材料は通例、除草剤、殺虫剤、殺かび剤、殺菌剤、線虫駆除剤、軟体動物駆除剤、あるいはそれらの混合物を含む保護剤コーティングで処理する。通例使用される保護剤コーティングとしては、キャプタン、カルボキシン、サイラム（ＴＭＴＤ）、メタラキシル（Ａｐｒｏｎ）およびピリミホスメチル（Ａｃｔｅｌｌｉｃ）などの化合物などがある。望むなら、細菌、かびまたは動物の悪疫によって引き起こされる損害からの保護を提供するために、製剤化技術で通例使用されるさらなる担体、界面活性剤または適用促進アジュバントと共にこれらの化合物を製剤化する。保護剤コーティングは、繁殖材料に液体製剤をしみ込ませることによって、あるいは複合の湿性または乾性の製剤でコーティングすることによって適用してもよい。他の適用方法としてはまた、芽または実向けの処理なども可能である。
従って栽培植物用の植物繁殖材料、特に、通例種子処理に使用される種子保護剤でコーティング処理される植物種子を提供することは本発明のさらなる目的である。
本発明によるトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする、上で例証された方法などの新しい農業の方法を提供することは本発明のさらなる態様である。本発明に含まれるのは、除草剤に対する耐性を付与する植物中で除草剤標的蛋白の除草剤抵抗体を発現するのに十分な量の本発明によるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物またはその子孫を使用する農業の方法である。
本発明の方法によって形質転換した植物から子孫を育種するために、次のような方法を使用し得る。以下の実施例に示すようにして作成したトウモロコシ植物を当技術分野で知られている温室内の植木鉢、あるいは土壌中で育成し、開花させる。成熟した雄穂から花粉を得て、同一植物、同胞植物または任意の望ましいトウモロコシ植物の雌穂への授粉に使用する。同様に、同一植物、同胞植物または任意の望ましいトウモロコシ植物から得られた花粉を、形質転換された植物に生じる雌穂に授粉してもよい。この方法によって得られた形質転換子孫は、導入遺伝子の存在および／または付随するＤＮＡ（遺伝子型）、あるいは付与された表現型によって、非形質転換子孫と識別される。望ましい形質をもつ任意の植物について通常行なわれているのと同様に、形質転換子孫を自家受粉するか、他の植物と交雑してもよい。同様に、この方法によって作出したタバコまたは他の形質転換植物を、所望の特徴を持つ子孫を産むためのものとして当技術分野で知られている方法で自家受粉するか、交雑してもよい。同様に、当技術分野で知られている方法と本発明の方法との組合せにより作出した他のトランスジェニック生物を、所望の特徴を持つ子孫を産むためのものとして当技術分野で知られている方法で育種してもよい。
本発明の阻害物質耐性の修飾ｐｒｏｔｏｘ酵素は、その天然相当物（即ち、直接的な組換えＤＮＡ法あるいは間接的な選択育種などを介した人間による操作を受けることなく、植物に天然に生じる阻害物質感受性体）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、追加または欠失を有する。ｐｒｏｔｏｘ酵素の阻害物質耐性体の産生または阻害物質耐性の増強のために変更し得るアミノ酸位置を、表１のアラビドプシス、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネ、モロコシおよびコムギ由来の植物ｐｒｏｔｏｘ−１配列中に太字で示す。当業者なら、本発明による変更アミノ酸の配列および識別を可能にするために本明細書に示したｐｒｏｔｏｘ酵素配列に十分に類似した構造を有する任意の植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子に対して同等の変更を行なって酵素の阻害物質耐性体を生成させ得ることを理解するであろう。このような追加の植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子は、１９９５年６月８日に出願され、ＷＯ９５／３４６５９として１９９５年１２月２１日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２に記載された標準的技術を使用して得てもよく、その関連部分を参照により本明細書の一部とする。
本明細書で教示した除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘコード配列をコードするＤＮＡ分子は、作物中で最適に発現するように遺伝子組換えしてもよい。これには、対象作物品種で最適に発現させるための抵抗対立遺伝子のコード配列変更が含まれる。特定の作物品種で最適の発現を達成するためにコード配列を変更する方法は、よく知られている（例えば、Ｐｅｒｌａｋ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：３３２４（１９９１年）；Ｋｏｚｉｅｌ等，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ１１：１９４（１９９３年）参照）。
最適な発現のためのｐｒｏｔｏｘコード配列の遺伝子組換えにはまた、適切な調節配列（即ち、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーターなど）と作用可能な状態で連結することも含まれる。植物または植物細胞中で機能し得るプロモーター（即ち、植物細胞中のｐｒｏｔｏｘなどの関連構造遺伝子の発現を制御し得るもの）としては、例えばカリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターまたは３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ二重プロモーター；ノパリンシンターゼプロモーター；病因関連（ＰＲ）蛋白プロモーター；リブロースビスリン酸カルボキシル化酵素（ｓｓｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモーターの小サブユニット、ＥＰＡ０５５９６０３参照のＢｒａｓｓｉｃａ由来の熱衝撃蛋白プロモーター（ｈｓｐ８０プロモーター）、ＷＯ９５／１４０９８参照のアラビドプシスアクチンプロモーターおよびＳｕｐｅｒＭａｓプロモーター等がある。好ましいプロモーターは高レベルの構成的発現を付与するもの、あるいはより好ましくは、除草剤による損傷に感受性の組織内高レベル特異的発現を付与するものであろう。好ましいプロモーターは、イネ・アクチン・プロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ等，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ２３１：１５０（１９９１年））、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーター（ＥＰ０３４２９２６；Ｔａｙｌｏｒ等，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２：４９１（１９９３年））、タバコ、アラビドプシスまたはトウモロコシ由来のＰＲ−１プロモーター（Ｒｙａｌｓ他の米国特許出願第ＥＰ−３３２  １０４および０８／１８１，２７１を参照、その全体を参照により本明細書の一部とする）などである。当技術分野で認められた方法に従って、プロモーターの強度を操作してｐｒｏｔｏｘ発現を増大させるためにプロモーター自体を変更してもよい。
発明者はまた、阻害物質耐性のｐｒｏｔｏｘコード配列として使用するための別の好ましいプロモーターが天然ｐｒｏｔｏｘ遺伝子に付随するプロモーター（即ち、ｐｒｏｔｏｘプロモーター；共同所有された本願と同時係属であり本願と同日出願の「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター）」という名称の国際出願＿＿＿＿＿＿＿＿（整理番号ＰＨ／５−２０７５６／Ｐ１／ＣＧＣ１８４６）参照、その全体を参照により本明細書の一部とする）であることを発見した。アラビドプシスｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子由来のプロモーター配列を配列番号：１３に、トウモロコシｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子由来のプロモーター配列を配列番号：１４に、テンサイｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子を由来のプロモーター配列を配列番号：２６に示す。
ｐｒｏｔｏｘプロモーター自体が阻害物質耐性ｐｒｏｔｏｘコード配列の発現に適しているため、本明細書で教示した変更は、異種調節配列を備えたキメラ遺伝子を構築する必要のない植物細胞ゲノム中にある天然の３８ｐｒｏｔｏｘ遺伝子に対して直接行なってもよい。このような変更は、同種組換えなどの定方向突然変異誘発技術によって行ない、得られた除草剤抵抗表現型に基づいて選択し得る（例えば、実施例１０，Ｐａｚｋｏｗｓｋｉ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４０２１〜４０２６（１９８８年）、および米国特許第５，４８７，９９２号、特に１８〜１９段および実施例８参照）。この方法の利点はさらに、天然ｐｒｏｔｏｘプロモーターを含むことに加え、得られた変更遺伝子が天然遺伝子の一部であるシグナルペプチドまたは輸送ペプチドのコード配列などの他の任意の調節要素をも含むことである。
シグナルペプチドまたは輸送ペプチドは、本発明のキメラＤＮＡ構築物中のｐｒｏｔｏｘコード配列と融合させて、所望の活性部位に発現されるｐｒｏｔｏｘ酵素の輸送するようにさせてもよい。シグナルペプチドとしては、例えば植物病因関連蛋白と天然に連結したもの、例えばＰＲ−１、ＰＲ−２等がある。例えば、Ｐａｙｎｅ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：８９〜９４（１９８８年）参照のこと。輸送ペプチドとしては、例えばＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９．１０４〜１２６（１９９１年）、Ｍａｚｕｒ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：１１１０（１９８７年）、Ｖｏｒｓｔ等，Ｇｅｎｅ  ６５：５９（１９８８年）に記載されたものなどの葉緑体輸送ペプチド、Ｂｏｕｔｒｙ等，Ｎａｔｕｒｅ３２８：３４０〜３４２（１９８７年）に記載されたものなどのミトコンドリア輸送ペプチドなどがある。葉緑体とミトコンドリア輸送ペプチドは、ミトコンドリアおよび葉緑体内で典型的に生じるｐｒｏｔｏｘ酵素活性として本発明で特に有用であると考えられる。葉緑体でのｐｒｏｔｏｘ酵素活性阻害がｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤の作用の主要な根拠と考えられるため、使用に最も好ましいのは葉緑体輸送ペプチドである（ＷｉｔｋｏｗｓｋｉおよびＨａｌｌｉｎｇ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６３２（１９８８年）、Ｌｅｈｎｅｎ等，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：２３９（１９９０年）、Ｄｕｋｅ等，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．３９：４６５（１９９１年））。また、コードされる蛋白質の液胞などの様々な細胞区画への局在化をもたらす配列も含まれる。例えば、Ｎｅｕｈａｕｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０３６２〜１０３６６（１９９１年）およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１年）を参照する。これらの出版物の適切な開示は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
本発明のキメラＤＮＡ構築物は、多数のｐｒｏｔｏｘ構造遺伝子複製物または多数のプロモーター複製物を含み得る。さらに、この構築物は、マーカーのコード配列とシグナルまたは輸送ペプチドなどの他のペプチドのコード配列とを各々ＤＮＡ分子中の他の機能エレメントを備えた適正な読み枠中に含み得る。このような構築物の調製は、通常レベルの当業者の技能の範囲内である。
有用なマーカーとしては、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、グリホサート、ホスフィノトリシンなどに対する耐性などの、除草剤耐性、抗生物質耐性または薬物耐性を提供するペプチドなどがある。これらのマーカーは、本発明のキメラＤＮＡ構築物で形質転換細胞を非形質転換細胞から選択するのに使用し得る。他の有用なマーカーは、可視の反応、例えば発色反応などによって容易に検出し得るペプチド酵素、例えばルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどである。
形質転換細胞に選択有利性を与えることにより所望のヌクレオチド配列の組込みが可能な遺伝形質転換細胞のポジティブ選択を、参照によりＷＯ９４／２０６２７として本明細書の一部とする。
各植物細胞中にある数千コピーの環状色素体ゲノムすべてに同種組換えにより遺伝子を挿入する色素体発現によると、核で発現した遺伝子に対する卓越したコピー数の優位を利用して総可溶植物蛋白の１０％をこえる発現レベルが可能となる。また、色素体によりコードされる形質が花粉伝達性でないため、色素体発現が望ましく、こうすればトランスジェニック植物の野生同系種への偶発的な導入遺伝子逸出の危険の可能性が回避される。色素体形質転換技術は、米国特許第５，４５１，５１３号、第５，５４５，８１７号および第５，５４５，８１８号（これら全ての全体を参照により本明細書の一部とする）；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７８３（その全体を参照により本明細書の一部とする）；ＭｃＢｒｉｄｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：７３０１〜７３０５（１９９４年）（これも全体を参照により本明細書の一部とする）などに詳細にわたって記載されている。タバコ葉緑体形質転換の基礎技術は、ラトガーズ大学（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔｔａｗａｙ）のＰａｌ  Ｍａｌｉｇａ博士の研究所の中で開発、改善されており、選択可能な抗生物質抵抗マーカーと隣接するクローン化色素体ＤＮＡ領域による葉組織の粒子ボンバードを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる１〜１．５ｋｂのブランキング領域は、色素体ゲノムによる同種組換えを促進し、それによってタバコプラストームの１５６ｋｂの特定領域の置換または変更が可能になる。最初、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する耐性を付与する、葉緑体１６ＳリボソームＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子での点突然変異が形質転換の選択マーカーとして利用された（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，８５２６〜８５３０、参照により本明細書の一部とする；Ｓｔａｕｂ，Ｊ．ＭおよびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９２年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ４，３９〜４５、参照により本明細書の一部とする）。これにより、標的葉のボンバード１００回につきおよそ１回の頻度で安定したｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ形質転換体が得られた。これらのマーカー間にクローン化部位が存在すると、外来遺伝子の導入のための色素体ターゲティングベクターの創製が可能となる（Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１〜６０６（１９９３年）、参照により本明細書の一部とする）。劣性リボソームＲＮＡまたはｒ−蛋白抗生物質耐性遺伝子の優性選択マーカー、即ちスペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌ａａｄＡ遺伝子との置換によって形質転換頻度のかなりの上昇が得られた（Ｓｖａｂ，Ｚ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，９１３〜９１７、参照により本明細書の一部とする）。かつてこのマーカーは、緑藻クラミドモナスｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの色素体ゲノムの高頻度形質転換に成功裡に使用された（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｍ．（１９９１年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４０８３〜４０８９、���照により本明細書の一部とする）。
従って、本発明にはさらに、天然の、あるいは改変されたコムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネまたはモロコシのｐｒｏｔｏｘ酵素をコードするＤＮＡ分子などの、天然植物ｐｒｏｔｏｘ酵素または修飾植物ｐｒｏｔｏｘ酵素のいずれかをコードする単離ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結した植物色素体プロモーターを含むキメラ遺伝子が含まれる。特に好ましい植物色素体プロモーターはｃｌｐＰ遺伝子プロモーターである。
キメラ遺伝子は、好ましくは単離ＤＮＡ分子と作用可能な状態で連結された、色素体プロモーター由来の５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）および色素体遺伝子’３非翻訳配列（３’ＵＴＲ）をさらに含む。好ましくは、３’ＵＴＲは色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳配列である。
本発明はまた、直ちに上記のキメラ遺伝子並びにこのような色素体形質転換ベクターで形質転換された植物色素体を含む色素体形質転換ベクターであって、前記修飾植物ｐｒｏｔｏｘ酵素が前記植物色素体中で発現される色素体形質転換ベクターをも含む。本発明はまた、修飾植物ｐｒｏｔｏｘ酵素が植物中で発現され、この植物に天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を付与する、この植物色素体を包む植物または植物細胞およびそれらの子孫を含む。
作物を再生成し得る天然遺伝子の作物または植物培養細胞中での定方向突然変異を介して除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘ対立遺伝子が得られる場合、除草剤許容性作物を開発するための従来の育種技術を使用して、変更コード配列の遺伝子組換えと植物での形質転換を必要とせずに、それを商用品種へ移行し得る。
別法として、除草剤耐性遺伝子を単離し、最適に発現するように遺伝子組換えを行なった後に所望の品種へ形質転換してもよい。
ｐｒｏｔｏｘ阻害物質に耐性の修飾ｐｒｏｔｏｘをコードする遺伝子も植物細胞形質転換法の中で選択マーカーとして使用し得る。例えば、導入遺伝子で形質転換された植物、植物組織または植物細胞も、植物によって発現し得る、修飾ｐｒｏｔｏｘをコードする遺伝子によって形質転換し得る。こうして形質転換された細胞を形質転換細胞だけが生存するｐｒｏｔｏｘ阻害物質含有培地に移す。選択剤として特に有用と考えられるＰｒｏｔｏｘ阻害物質は、ジフェニルエーテル｛例えば、アシフルオルフェン、即ち５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ｎｉｔｒｏｂｅｚｏｉｃ  ａｃｉｄ；そのメチルエステル；またはオキシフルオルフェン、即ち２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾール、（例えばオキシジアゾン、３−［２，４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル］−５−（１，１−ジメチルエチル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２、即ちＮ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド；クロロｐｈｔｈａｌｉｍ、即ちＮ−（４−クロロフェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド）、フェニルピラゾール、（例えばＴＮＰＰエチル、エチル２−［１−（２，３，４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ］プロピオネート；Ｍ＆Ｂ  ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ  ８２−５５６）、ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅとそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体、および国際特許出願ＷＯ９２／０４８２７に開示される２環式Ｔｒｉａｚｏｌｏｎｅｓ；ＥＰ５３２１４６）などである。
この方法は、修飾ｐｒｏｔｏｘコード遺伝子で形質転換し得る、任意の植物細胞に適用可能であり、任意の対象導入遺伝子で使用し得る。導入遺伝子およびｐｒｏｔｏｘ遺伝子の発現は、植物細胞上で機能する同一プロモーター、あるいは個別のプロモーターによって制御し得る。
本発明の阻害物質耐性の修飾ｐｒｏｔｏｘ酵素は、天然ｐｒｏｔｏｘ活性を阻害する除草剤に対して耐性である。ｐｒｏｔｏｘを阻害する除草剤としては、多種多様の構造をもつ分子、即ち（Ｄｕｋｅ等，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．３９：４６５（１９９１年）；Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ等，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：１９３（１９９２年）；Ｍａｔｒｉｎｇｅ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４５：３５（１９８９年）；ＹａｎａｓｅおよびＡｎｄｏｈ，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：７０（１９８９年））、ジフェニルエーテル｛（例えばａｃｉｆｌｕｏｒｉｆｅｎ、即ち５−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］２−ニトロｂｅｚｏｉｃ  ａｃｉｄ；そのメチルエステル；あるいはオキシフルオルフェン、即ち  ２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾール（例えばｏｘｉｄｉａｚｏｎ、３−［２，４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル］−５−（１，１−ジメチルエチル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２、即ちＮ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド；クロロｐｈｔｈａｌｉｍ、即ちＮ−（４−クロロフェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド）、フェニルピラゾール、（例えばＴＮＰＰエチル、エチル２−［１−（２，３，４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ］プロピオネート；Ｍ＆Ｂ  ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ  ８２−５５６）、ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅとそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体などがある。
特に重要なジフェニルエーテルは一般式：
0003961570.tif 000002
［式中、Ｒは−ＣＯＯＮａ（式ＩＩ）、−ＣＯＮＨＳＯ2ＣＨ3（式ＩＩＩ）または−ＣＯＯＣＨ2ＣＯＯＣ2Ｈ5（式ＩＶ；Ｍａｉｇｒｏｔ等，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ：４７〜５１（１９８９年）参照）と等しい］を有するものである。
さらに対象のジフェニルエーテルは、Ｒが
0003961570.tif 000003
（式ＩＶａ；Ｈａｙａｓｈｉ等，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ：５３〜５８（１９８９年）参照）と等しいものである。
さらに対象のジフェニルエーテルは、式：
0003961570.tif 000004
（式ＩＶｂ；ビフェノックス、Ｄｅｓｔ等，Ｐｒｏｃ．Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｃｏｎｆ．２７：３１（１９７３年）参照）を有するものである。
さらなる対象のジフェニルエーテルは、式：
0003961570.tif 000005
（式ＩＶｃ；オキシフルオルフェン；ＹｉｈおよびＳｗｉｔｈｅｎｂａｎｋ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２３：５９２（１９７５年）参照）を有するものである。
また別の対象のジフェニルエーテルは、式：
0003961570.tif 000006
（式ＩＶｄ；ラクトフェン著，Ｃ．Ｔｏｍｌｉｎ編「Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ」第１０版，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，英国サリー州（１９９４年）の６２３頁参照）を有するものである。
また、重要なものとしては、一般式：
0003961570.tif 000007
［式中、Ｑは
0003961570.tif 000008
（Ｒａｇｄａｌｅ他編「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｉｇｈｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第８回国際殺虫剤化学会議紀要）」、Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，ワシントン，４２〜４８（１９９４年）収載のＨｅｍｐｅｒ等（１９９５年）参照）と等しく、Ｒ1はＨ、ＣｌまたはＦと等しく、Ｒ2はＣｌと等しく、Ｒ3は最適に置換されたエーテル、チオエーテル、エステル、アミノまたはアルキル基である］を有するイミドとして知られている除草剤の品種がある。別法として、Ｒ2とＲ3が合わさって５員環または６員環の複素環を形成してもよい。特に関心の対象のイミド除草剤の例は、
0003961570.tif 000009
（式ＶＩＩａ；フルチアセット−メチル、Ｍｉｙａｚａｗａ等，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ２３〜２８（１９９３年）参照）
0003961570.tif 000010
（式Ｘ：ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ、Ｖａｎ  Ｓａｕｎ等，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ７７〜８２（１９９１年）参照）
0003961570.tif 000011
0003961570.tif 000012
（Ｍｉｕｒａ等，ｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ：３５−４０（１９９３年）参照）
0003961570.tif 000013
0003961570.tif 000014
などである。
上記の化合物の除草活性は、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９１Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｅｅｄｓ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）（式Ｘおよび式ＸＶＩ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９３Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｅｅｄｓ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）（式ＸＩＩおよび式ＸＩＩＩ）、米国特許第４，７４６，３５２号（式ＸＩ）およびＡｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ第３３巻９頁（１９９３年）（式ＸＩＶ）に記載されている。
最も好ましいイミド除草剤はアリールウラシルに分類され、一般式：
0003961570.tif 000015
［式中、Ｒは参照により本明細書の一部とする米国特許第５，１８３，４９２号に開示される基（Ｃ2-6−アルケニロキシ）カルボニル−Ｃ1-4−アルキルを示す］を有するものである。
また、重要なものとしては、一般式：
0003961570.tif 000016
（ＷｅｉｌｅｒらおよびＢｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ２９〜３４（１９９３年）参照）
0003961570.tif 000017
（Ｖａｎ  Ｓａｕｎ等，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ：１９〜２２（１９９３年）参照）を有する除草剤、
一般式：
0003961570.tif 000018
［式中、Ｒ1は自由選択で１個以上のハロゲン原子と置換されたＣ1〜Ｃ4のアルキルであり、Ｒ2は水素、あるいは各々自由選択で１個以上のハロゲン原子と置換されたＣ1〜Ｃ4のアルコキシであり、
Ｒ1およびＲ2は合わさって基−（ＣＨ2）n−Ｘ−（ＸはＲ2で結合する）を形成し、
Ｒ3は水素またはハロゲンであり、
Ｒ4は水素またはＣ1〜Ｃ4のアルキルであり、
Ｒ5は水素、ニトロ、シアノ、あるいは基−ＣＯＯＲ6または−ＣＯＮＲ7Ｒ8であり、
Ｒ6は水素、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル、Ｃ2〜Ｃ6のアルケニルまたはＣ2〜Ｃ6のアルキニルである］のＮ置換ピラゾール、
（Ｓｃｈｅｒｉｎｇの国際特許公開ＷＯ９４／０８９９９、ＷＯ９３／１０１００および米国特許第５，４０５，８２９号参照）、
0003961570.tif 000019
（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｒｔｈｉｎｇ編「Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ」第９版，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｓｕｒｒｅｙ（１９９１年）の６２１ページを参照。）などのＮ−フェニルピラゾール、
および３−置換−２−アリール−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｎｄａｚｏｌｅｓ（Ｌｙｇａ等，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉ．４２．２９〜３６（１９９４年））などがある。
0003961570.tif 000020
また、重要なものとしては、ＷＯ９６／０１２５４およびＷＯ９７／００２４６（それらの両方を参照により本明細書の一部とする）に記載された種類のフェニルピラゾールがある。（式ＸＸＩＩ）。
通常、ｐｒｏｔｏｘの活性を阻害する除草剤の量としては、当技術分野で知られている適用率などがあり、それは部分的に適用の環境、時間および方法などの外部要因に依存する。例えば、式Ｖ乃至式ＩＸによって表わされるイミド除草剤、より詳しくは式Ｘ乃至式ＸＶＩＩによって表わされるイミド除草剤の場合、適用率は、０．０００１〜１０ｋｇ／ｈａの範囲であり、好ましくは０．００５〜２ｋｇ／ｈａの範囲である。除草剤のこの適用量または濃度は所望の作用および使用される特定の化合物によって異なり、当技術分野で知られている方法によって決定し得る。
本発明のさらなる目的は、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネ等から成る群から選択される植物の集団に有効量のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤を適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。好ましいのは、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、飼草およびイネから成る群から選択される植物の集団に有効量のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤を適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。特に好ましいのは、アラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネから成る群から選択される植物の集団に適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。
本発明をさらに、以下の詳細な実施例を参照することによって記載する。これらの実施例は説明のみの目的で提供するものであり、特に指示がない限り、限定しようとするものではない。
実施例
本明細書で使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野でよく知られており、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク市コールドスプリング港（１９８９年）と、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ著「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（遺伝子融合による実験）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク市コールドスプリング港（１９８４年）に記載されている。
セクションＡ  植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｘ）遺伝子の単離および特性決定
実施例１．トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくコムギＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
特別注文でλＵｎｉ−Ｚａｐベクター中でｃＤＮＡライブラリーを構築するため、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（栽培品種：Ｋａｎｚｌｅｒ）から調製したＲＮＡ全体をＣｌｏｎｔｅｃｈに提出した。およそ５０，０００ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：５；１９９５年６月８日に出願され、１９９５年１２月２１日にＷＯ９５／３４６５９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２の実施例２参照）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃であった。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃とした（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１〜１９９５．（１９８４年）、その全体を参照により本明細書の一部とする）とした。ポジティブにハイブリダイズしたプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。最初のスクリーン作業から得られた「コムギＰｒｏｔｏｘ−１」と称する最長のコムギＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡは、長さが１４８９塩基対であった。既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると、コムギＰｒｏｔｏｘ−１は、輸送ペプチドのコード配列と成熟コード配列のおよそ１２６個のアミノ酸が欠失している。
より長いコムギｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡを得るために２回目のスクリーンを実施した。このスクリーンでは、λＵｎｉ−Ｚａｐベクターを使用して、生体内でＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（栽培品種：Ｋａｎｚｌｅｒ）ｃＤＮＡライブラリーを調製した。プローブおよびハイブリダイゼーションとしてコムギＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡを使用し、洗浄条件を５０℃の代わりに６５℃とした以外は上記と同様にして、およそ２００，０００ｐｆｕのＤＮＡライブラリーをスクリーンした。このスクリーン作業から得られた「コムギＰｒｏｔｏｘｌａ」と称する最長のコムギｃＤＮＡは、長さ１８１１塩基対であった。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９および１０に示す。他の公知の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列および相当するゲノム配列と比較すると、このｃＤＮＡは完全長であるか、ほんの少数の輸送ペプチド・コドンが欠失している（表１）。このコムギ蛋白配列は、配列番号：６に示すトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１蛋白配列と９１％相同（９５％類似）である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のコムギＰｒｏｔｏｘ−１ａを１９９６年３月１９日にｐＷＤＣ−１３（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４５）として寄託した。
実施例２．アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくダイズＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
ダイズ（ｖ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２、上胚軸）から調製されたＬａｍｂｄａ  Ｕｎｉ−Ｚａｐ  ｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。およそ５０，０００ｐｆｕのライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、コロニー／プラーク・スクリーン膜（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）上に複製フィルター・リフトを作製した。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：１；１９９５年６月８日に出願され、１９９５年１２月２１日にＷＯ９５／３４６５９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２の実施例１参照）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ダイズＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のダイズｃＤＮＡは、既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると完全長である（表１）。ダイズＰｒｏｔｏｘ−１は長さが１８４７塩基対であり、５８．８ｋＤａの蛋白質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に１１および１２示す。このダイズ蛋白はアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１蛋白と７８％相同（８７％類似）である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のダイズＰｒｏｔｏｘ−１を１９９５年１２月１５日にｐＷＤＣ−１２（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５１６）として寄託した。
配列番号：２、６、１０、１２、１５、１７、１９、２１、２３に示す配列によりコードされる、それぞれの蛋白質の予想アミノ酸配列のアライメントを表１に示す。配列番号：４と８に示す配列によりコードされる、それぞれの蛋白質の予想アミノ酸配列を表２に示す。
0003961570.tif 000021
0003961570.tif 000022
0003961570.tif 000023
0003961570.tif 000024
0003961570.tif 000025
0003961570.tif 000026
0003961570.tif 000027
実施例３．トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくワタＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．（７２時間暗生長子葉）から調製されたλＵｎｉ−Ｚａｐ  ｃＤＮＡライブラリーをアリゾナ州立大学植物学教室のＤｉｃｋ  Ｔｒｅｌｅａｓｅ博士から入手した（Ｎｉ  Ｗ．およびＴｒｅｌｅａｓｅ  Ｒ．Ｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８９：２３７〜２４３（１９９１年））。およそ５０，０００ｐｆｕのライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、コロニー／プラーク・スクリーン膜（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）上に複製フィルター・リフトを作製した。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：５）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ワタＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のワタｃＤＮＡは、既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると完全長である（表１）。ワタＰｒｏｔｏｘ−１は長さが１８２６塩基対であり、５８．２ｋＤａの蛋白質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に１３および１４示す。このワタ蛋白はアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１蛋白と７７％相同（８６％類似）である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のワタＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年７月１日にｐＷＤＣ−１５（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５９４）として寄託した。
実施例４．アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくテンサイＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
β  ｖｕｌｇａｒｉｓから調製されたλ−Ｚａｐ  ｃＤＮＡライブラリーをＰｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ペンシルヴェニア州フィラデルフィア）植物学部門のＰｈｉｌｉｐ  Ｒｅａ博士から入手した（Ｙｏｎｇｃｈｅｏｌ  Ｋｉｍ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｊ．ＫｉｍおよびＰｈｉｌｉｐ  Ａ．Ｒｅａ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：３７５〜３８２（１９９４年））。およそ５０，０００ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：１）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「テンサイＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のテンサイＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡは、既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると完全長である（表１）。テンサイＰｒｏｔｏｘ−１は長さが１９１０塩基対であり、６０ｋＤａの蛋白質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に１５および１６示す。このテンサイ蛋白はアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１蛋白と７３％相同（８２％類似）である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のテンサイＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年７月２９日にｐＷＤＣ−１６（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５９５Ｎ）として寄託した。
実施例５．アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくナタネＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（３〜４週、成熟緑葉）から調製されたλＵｎｉ−ＺａｐIIｃＤＮＡライブラリーをヨハネス・グーテンベルク大学マインツ校Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｆｕｅｒ  Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｂｏｔａｎｉｋ（ドイツ）のＧｕｅｎｔｈｅｒ  Ｏｃｈｓ博士から入手した（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ  Ｏｃｈｓ、Ｇｅｒａｌｄ  ＳｃｈｏｃｋおよびＡｌｏｙｓｉｕｓ  Ｗｉｌｄ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：３０３〜３０４（１９９３年））。およそ５０，０００ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｉｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：１）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ナタネＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のナタネＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡは、既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると完全長である（表１）。ナタネＰｒｏｔｏｘ−１は長さが１７８４塩基対であり、５７．３ｋＤの蛋白質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に１７および１８示す。このナタネ蛋白はアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１蛋白と８７％相同（９２％類似）である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のナタネＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年８月２３日にｐＷＤＣ−１７（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６１５）として寄託した。
実施例６．トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づくイネＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（５日間黄化した苗条）から調製されたλｇｔｌｌ  ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。およそ５０，０００ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：５）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、Ｗｉｚａｒｄ  λ−Ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、λＤＮＡを調製した。標準の技術を使用して、このｃＤＮＡインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクターにＥｃｏＲＩ断片としてサブクローン化した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「イネＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のイネＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡは、長さが１２２４塩基対であった。既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると、成熟コード配列のおよそ１７２個のアミノ酸と輸送ペプチドコード配列が欠失している（表１）。この部分ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に１９および２０示す。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のイネＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−１８（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６４８）として寄託した。
実施例７．トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列との配列相同性に基づいたモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの単離
Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（３〜６日の緑色実生苗）から調製されたλ−ＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーをシュツットガルト大学細胞生物免疫研究所（ドイツ）のＫｌａｕｓ  Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ博士から入手した（Ｈｅｒａｌｄ  Ｗａｊａｎｔ、Ｋａｒｌ−Ｗｏｌｆｇａｎｇ  ＭｕｎｄｒｙおよびＫｌａｕｓ  Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：７３５〜７４６（１９９４年）。およそ５０，０００ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーをペトリ皿１０ｃｍ当たりおよそ５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）。このプラークリフトをランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：５）で探査した。ハイブリダイゼーション条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃とした。洗浄条件は、２倍濃度ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０℃であった（Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート（１９８４年）とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入した。ｃＤＮＡインサートの配列を蛍光性色素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「モロコシＰｒｏｔｏｘ−１」と称する、得られた最長のモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡは、長さが１５９０塩基対であった。既知の他の植物ｐｒｏｔｏｘペプチド配列との比較によると、成熟コード配列のおよそ４４個のアミノ酸と輸送ペプチドコード配列が欠失している（表１）。この部分ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：に２１および２２示す。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のモロコシＰｒｏｔｏｘ−１を１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−１９（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６４９）として寄託した。
実施例８．細菌系でのＰｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対する植物Ｐｒｏｔｏｘクローンの感受性実験
Ｐｒｏｔｏｘ−１／ＳＡＳＸ３８、Ｐｒｏｔｏｘ−２／ＳＡＳＸ３８およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅの液体培養物をＬ  ａｍｐ100中で培養した。様々な濃度（１．０ｎＭ〜１０ｍＭ）の式ＸＶＩＩのｐｒｏｔｏｘ阻害性アリールウラシル除草剤を含む各培養物の１００μｌアリコートをＬ  ａｍｐ100培地上にプレーティングした。各平板の２組ずつを３７℃で１８時間インキュベートした。
ｐｒｏｔｏｘ+大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、いかなる濃度でも除草剤に感受性を示さず、報告されている類似除草剤に対する天然細菌酵素の耐性と一致した。Ｐｒｏｔｏｘ−１／ＳＡＳＸ３８は明らかに感受性であり、１０ｎＭという低濃度の阻害物質によって細菌層がほぼ完全に除去された。より高い濃度（１０ｕＭ）の除草剤だけではＰｒｏｔｏｘ２／ＳＡＳＸ３８も感受性であった。除草剤は、ほぼ完全な暗中に維持した平板上でさえ有効であった。平板に２０ｕｇ／ｍｌのヘマチンを添加したところ、除草剤毒性が完全に除去された。
２つの植物Ｐｒｏｔｏｘ株間での異なる除草剤許容性は、酵素感受性のなんらかの固有差ではなく、これら２つのプラスミドからの示差的発現の結果であると思われる。Ｐｒｏｔｏｘ−１／ＳＡＳＸ３８は、任意のヘム欠乏培地中でＰｒｏｔｏｘ−２／ＳＡＳＸ３８よりもずっとゆっくり成長する。成長速度がアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１／ＳＡＳＸ３８に匹敵するＭｚＰｒｏｔｏｘ−２／ＳＡＳＸ３８株も、より低濃度（１０〜１００ｎＭ）の除草剤に対して非常に感受性である。
セクションＢ  Ｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤耐性植物Ｐｒｏｔｏｘ遺伝子
実施例９．大腸菌発現系でのＰｒｏｔｏｘ阻害性除草剤耐性植物Ｐｒｏｔｏｘ遺伝子の選択
プラスミド・ベクターｐＦＬ６１中のアラビドプシス・タリアナ（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｎｅｓ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：４１７〜４２２（１９９２年））を入手し、増幅した。大腸菌ｈｅｍＧ突然変異体ＳＡＳＸ３８（Ｓａｓａｒｍａｎ等，Ｊ．、Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１３：２９７（１９７９年））を入手し、２０ｕｇ／ｍｌヘマチンを含むＬ培地（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）上で維持した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒおよび製造者の条件を用いたエレクトロポレーションにより、このプラスミドライブラリーをＳＡＳＸ３８に形質転換した。エレクトロポレーションを行なった細胞をおよそ５００，０００形質転換体／１０ｃｍ平板の密度で１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天上にプレーティングした。次いで、細胞を微光中で３７℃４０時間インキュベートし、外因性ヘム添加のない状態で成長する能力によって選択した。ｐＦＬ６１ライブラリーからヘム原栄養体が４００／１０7の頻度で回収された。２２個の相補性クローンの塩基配列分析から、９個が葉緑体ｐｒｏｔｏｘ酵素を発現すると期待される「Ｐｒｏｔｏｘ−１」と称するタイプのｐｒｏｔｏｘ遺伝子であることが示された。
ｐＦＬ６１ライブラリーは、アラビドプシスｃＤＮＡが二方向性で挿入された酵母発現ライブラリーである。これらのｃＤＮＡは細菌の中でも発現し得る。ｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡは明らかに、ベクターの中のＮｏｔＩクローニング部位方向へおよそ１０アミノ酸５’の酵母ＰＧＫ３’配列の中の読み枠内ＡＴＧから開始し、一方のｌａｃＺプロモーターからさらに３００塩基対上流または不確定の潜在細菌プロモーターから発現する。葉緑体通過配列の重要部分を含んでいたＰｒｏｔｏｘ−１  ｃＤＮＡが、大腸菌ＳＡＳＸ３８株の成長を阻害したため、突然変異誘発／除草剤選択実験用として最小量の葉緑体通過配列が結合したクローンを選択した。このクローン、即ちｐＳＬＶ１９は、ＤＮＡ配列がアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：１）の塩基対１５１から開始する、１７アミノ酸だけの推定葉緑体輸送ペプチドを含む。
プラスミドｐＳＬＶ１９で無作為突然変異誘発株ＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ  ホーヤ）を形質転換した。５０ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地上に形質転換株をプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。形質転換細胞層を平板からはがし、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。この突然変異誘発株から単離されたプラスミドＤＮＡは、２０００ヌクレオチド当たりおよそ１つの無作為塩基変異を含むことが予想される（Ｇｒｅｅｎｅｒ等，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ７（２）：３２〜３４（１９９４年）参照）。
この突然変異プラスミドＤＮＡでｈｅｍＧ突然変異体ＳＡＳＸ３８を形質転換し（Ｓａｓａｒｍａｎ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．１１３：２９７（１９７９年）、様々な濃度のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤を含むＬ培地上にプレーティングした。平板を３７℃で２日間インキュベートした。野生株を効果的に殺滅する除草剤濃度で成長した全てのコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。次いで単離ＤＮＡでＳＡＳＸ３８を形質転換し、観察された耐性が確実にプラスミドで運搬されるように除草剤上に再びプレーティングした。このスクリーンを通過したプラスミド由来のｐｒｏｔｏｘコード配列をＮｏｔＩ消化により切り出し、突然変異を起こさせていないベクターに再度クローン化し、除草剤耐性を付与する能力に関して再び試験した。次いで、除草剤耐性を付与したｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を決定し、野生アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１）と比較することによって突然変異を確認した。
１回目の突然変異誘発実験から単一のコード配列突然変異体が回収された。この突然変異体は、成長速度を上昇させることによってのみ除草剤「耐性」が増強される。それには、配列番号：２のアミノ酸５６でトレオニンのＡＣＧコドンがリシンのＡＡＧコドンに変換され、細菌の突然変異体の相補性が改善される、ｐＳＬＶ１９の切断型葉緑体輸送配列内の配列番号：１のヌクレオチド１９７でのＣからＡへの変異が含まれる。このプラスミドには、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）がＡＧＴ（Ｓｅｒ）に変わる、ヌクレオチド１０５９での無形質コード配列の変異も含まれる。このプラスミドをｐＭｕｔ−１と命名した。
次いで、上記と同様にしてｐＭｕｔ−１プラスミドで突然変異誘発体ＸＬ１−Ｒｅｄ株を形質転換し、変異したＤＮＡを単離し、突然変異を起こさせていないｐＭｕｔ−１  ｐｒｏｔｏｘ遺伝子にとって致死濃度の除草剤上にプレーティングした。３７℃２日間培養後に除草剤耐性のコロニーを単離し、上記と同様にして分析した。多数のプラスミドが除草剤耐性のｐｒｏｔｏｘコード配列を含むことが明らかにされた。塩基配列分析によると、耐性遺伝子が２種類に分類されることが示唆された。確認された１つの耐性変異は配列番号：１に示すアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列のヌクレオチド６８９でのＣからＴへの変異であった。この変異は、配列番号：２のアミノ酸２２０でアラニンのＧＣＴコドンをバリンのＧＴＴコドンへ変換し、これをｐＡｒａＣ−１Ｖａｌと命名した。
２つ目の種類の除草剤耐性の突然変異体は、アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列のヌクレオチド１３０７ＡからＧへの変異を含む。この変異は、アミノ酸４２６でチロシンのＴＡＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変換し、これをｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓと命名した。
３つ目の耐性突然変異体はアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列のヌクレオチド６９１でのＧからＡへの変異を有する。この変異は、アミノ酸２２１のグリシンのＧＧＴコドンをｐＡｒａＣ−１中の変異に隣接するコドン位置のセリンのＡＧＴコドンに変換する。このプラスミドをｐＡｒａＣ−３Ｓｅｒと命名した。
ｐＭｕｔ−１プラスミド中の耐性の突然変異体ｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓを１９９４年１１月１４日にｐＷＤＣ−７の名称でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託名ＮＲＲＬ＃２１３３９Ｎが与えられた。
実施例１０．無作為スクリーンで確認された位置での別の除草剤耐性コドン置換
無作為スクリーンで除草剤抵抗部位であることが確認されたアミノ酸を他のアミノ酸と置換し、細菌系での機能および除草剤耐性に関して試験した。
トランスフォーマ部位特異的突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を実施する。塩基配列分析によってアミノ酸変更を確認した後、変異プラスミドでＳＡＳＸ３８を形質転換し、Ｌ−ａｍｐ100培地上にプレーティングして機能に関して試験し、また様々な濃度のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤上にプレーティングして耐性に関して試験する。
この方法をアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１）のヌクレオチド６８８〜６９０のアラニン・コドンおよびヌクレオチド１３０６〜１３０８のチロシン・コドンに適用する。その結果、ヌクレオチド６８８〜６９０のアラニン・コドンがバリン、トレオニン、ロイシン、システインまたはイソロイシンのコドンに変異され機能が保持された除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘ酵素を産生し得ることが立証された。この結果からさらに、ヌクレオチド１３０６〜１３０８のチロシン・コドンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、バリンまたはアラニンのコドンに変異され機能が保持された除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘ酵素を産生し得ることが立証された。
実施例１１．あらかじめ確認された耐性突然変異体の酵素機能および／または除草剤許容性を増強する別の突然変異体の単離
除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘ遺伝子を含むプラスミドで突然変異誘発株ＸＬ１−Ｒｅｄを形質転換し、変異ＤＮＡを上記と同様にして単離する。変異プラスミドをＳＡＳＸ３８に形質転換し、元の「耐性」突然変異体の成長を阻害するのに十分な除草剤濃度で形質転換体をスクリーンする。耐性のコロニーを単離し、比較的耐性の高い表現型がコード配列に依存することを上記と同様にして確認する。これらの突然変異体の配列を決定し、祖先配列と比較して変異を確認する。
この方法を上記のｐＡｒａＣ−１Ｖａｌ突然変異体に適用した。その結果、アミノ酸３０５（配列番号：２）のセリン・コドンがロイシンのコドンに変異されｐＡｒａＣ−１Ｖａｌ突然変異体単独よりもｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対する耐性が高い酵素を産生し得ることが立証された。この第２部位変異体をＡｒａＣ３０５Ｌｅｕと称する。アミノ酸２４９のトレオニン・コドンでも同じ結果を示し、イソロイシンへの変異でもアラニンへの変異でもより許容性の高い酵素が得られる。これらの変異体をそれぞれＡｒａＣ２４９ＩＩｅおよびＡｒａＣ２４９Ａｌａと称する。
この方法をさらに上記のｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓ突然変異体に適用した。その結果、アミノ酸１１８（配列番号：２）のプロリン・コドンがロイシンのコドンに変異されｐＡｒａＣ−１Ｃｙｓ突然変異体単独よりもｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対する耐性が高い酵素を産生し得ることが立証された。この変異をＡｒａＣ１１８Ｌｅｕと称する。アミノ酸３０５のセリンコドンでも同じ結果を示し、ロイシンに変異させると、より許容性の高いｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓ酵素が得られる。この変異体もｐＡｒａＣ−１Ｖａｌ突然変異体で上記と同様にして単離され、これをＡｒａＣ３０５Ｌｅｕと称する。ｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓ突然変異体の除草剤耐性を増強する、別の変異としては、ＡｒａＣ４２５Ｓｅｒと称するアミノ酸４２５でのアスパラギンからセリンへの変異、ＡｒａＣ４９８Ｃｙｓと称するアミノ酸４９８でのチロシンからシステインへ変異などがある。
これらの変異は、除草剤耐性を単独で付与するのには十分ではなく、既に突然変異体である酵素の機能および／または除草剤耐性を増強するため、「第２部位」変異と呼ぶ。あらゆる可能な置換に関する徹底的な試験を実施していないので、このことは、これらの部位での他のアミノ酸置換が除草剤耐性の酵素を産生するのに十分である可能性を排除していない。
実施例１２．確認された耐性変異と確認された第２部位変異の組合せによる高機能／高許容性Ｐｒｏｔｏｘ酵素の創製
上記のＡｒａＣ３０５Ｌｅｕ変異は、ＡｒａＣ−１ＶａｌとＡｒａＣ−２Ｃｙｓの両方の突然変異体プラスミドの機能／除草剤耐性を増強することが分かった。この第２部位変異の一般的な有用性を調べるため、これをＡｒａＣ−２Ｌｅｕ、ＡｒａＣ−２ＶａｌおよびＡｒａＣ−２ＩＩｅ変異と組合せ、除草剤許容性に関して試験した。各場合では、ＡｒａＣ３０５Ｌｅｕの変異によって、ｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に関して耐性のｐｒｏｔｏｘ突然変異体の成長速度が著しく速くなった。ＡｒａＣ−２ＩＩｅ耐性突然変異体をＡｒａＣ２４９ＩＩｅまたはＡｒａＣ１１８Ｌｅｕのいずれかの第２部位突然変異体と組み合わせることによっても、より許容性の高い突然変異体ｐｒｏｔｏｘ酵素が産生された。ＡｒａＣ２４９ＩＩｅ変異によると、ＡｒａＣ−１突然変異体を増強することが確認された第２部位変異もＡｒａＣ−２突然変異体の耐性を増大させることが立証される。ＡｒａＣ２ＩＩｅ、ＡｒａＣ３０５ＬｅｕおよびＡｒａＣ２４９ｌｌｅを含む３つの変異プラスミドも、高機能、高除草剤許容性のｐｒｏｔｏｘ−１酵素を産生することを示した。
実施例１３．変異させると除草剤許容性が得られるトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の部位の確認
他のプラスミドを使用した場合上流プロモーター突然変異体が高頻度で単離されるのに対して、上記のｐＭｕｔ−１アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１プラスミドは、突然変異誘発／スクリーニング実験で使用すると、真正のコード配列突然変異体が高頻度で得られる点で非常に有効である。トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１の効率的なプラスミドスクリーニング系を作成するため、アラビドプシスｃＤＮＡとほぼ同じ配列中のｐＭｕｔ−１ベクターにトウモロコシｃＤＮＡを組み込んだ。標準的方法の重複ＰＣＲ融合を使用して、ｐＭｕｔ−１  アラビドプシスクローンの５’末端（上記のようなセンス混合変異が１つある１７アミノ酸の葉緑体輸送ペプチドを含む）をトウモロコシ配列のアミノ酸１４（配列番号：６）から開始するトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ配列と融合した。トウモロコシｃＤＮＡの３’末端は変異していなかった。この融合の両端にＮｏｔＩ制限部位を設け、ｐＭｕｔ−１由来のｐＦＬ６１プラスミドバックボーンにキメラ遺伝子をクローン化した。塩基配列分析から、ヌクレオチド７４５〜７４７（配列番号：５）のＡＣＧコドンがＡＣＴコドンに変換される、ＰＣＲによる単一ヌクレオチドの無形質変異が明らかになったが、ＡＣＧコドンとＡＣＴコドンは両方ともトレオニンをコードする。このキメラアラビドプシス−トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プラスミドをｐＭｕｔ−３と称する。
上記と同様にしてｐＭｕｔ−３プラスミドで突然変異誘発ＸＬ１−Ｒｅｄ株を形質転換し、変異ＤＮＡを単離し、突然変異が起きていないｐＭｕｔ−３トウモロコシｐｒｏｔｏｘ遺伝子にとり致死濃度の除草剤上にプレーティングした。３７℃で２日間培養後に除草剤許容性コロニーを単離し、上記と同様にして分析した。この分析から、除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１酵素をもたらす５つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの３つは、かつてアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。３つのうちの２つはアミノ酸１６４（配列番号：６）のアラニン（ＧＣＴ）をバリン（ＧＡＴ）またはトレオニン（ＡＣＴ）のいずれかに変換するｐＭｚＣ−１ＶａｌおよびｐＭｚＣ−１Ｔｈｒである。この位置は上記のｐＡｒａＣ−１変異に相当する。第３の相同性変異はアミノ酸１６５のグリシン（ＧＧＴ）をＳｅｒｉｎｅ（ＡＧＴ）に変換し、上記のＡｒａＣ−３Ｓｅｒ変異に相当する。これらの結果は、１つの植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子で確認された除草剤耐性の変異が別の品種由来の同等の植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子にも除草剤耐性を付与するだろうという予想を確認するのに役立つ。
トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１スクリーンから単離された変異のうち２つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。１つの変異は、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：６）のアミノ酸１５９のシステイン（ＴＧＣ）をフェニルアラニン（ＴＴＣ）に変換する。第２の変異はアミノ酸４１９のイソロイシン（ＡＴＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変換する。
トウモロコシ突然変異体部位のうち３つでさらにアミノ酸を置換して試験した。グリシン１６５がロイシンに変異した時、あるいはシステイン１５９がロイシンまたはリシンのいずれかに変異した時に許容性を示した。また、ヒスチジン、グリシンまたはアスパラギンにイソロイシン４１９を変異することによっても許容性酵素が創製された。
許容性の高いアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸１６４（配列番号：６）のアラニン（ＧＣＴ）をロイシン（ＣＴＴ）に変異すると許容性の高いトウモロコシ酵素が産生されることが立証された。トウモロコシでの無作為スクリーンでは、アラビドプシス中のＡｒａＣ−２部位と相同の変異は単離されなかった。しかしながら、この部位、即ちトウモロコシ酵素（配列番号：６）中のチロシン３７０をイソロイシンまたはメチオニンのいずれに変異すると、除草剤許容性酵素が産生された。
実施例１４．変異させると除草剤許容性が得られるコムギＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の部位の確認
効率のよいコムギＰｒｏｔｏｘ−１用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシｃＤＮＡについての上の記載と同様にしてコムギｃＤＮＡをｐＭｕｔ−１ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−コムギＰｒｏｔｏｘ−１キメラプラスミドをｐＭｕｔ−４と称する。ｐＭｕｔ−４ＤＮＡを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のコムギＰｒｏｔｏｘ−１酵素をもたらす７つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの４つは、かつてアラビドプシスおよび／またはトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。２つの変異がアミノ酸２１１（配列番号：１０）のアラニン（ＧＣＴ）をバリン（ＧＡＴ）またはトレオニン（ＡＣＴ）のいずれかに変換する。この位置は上記のｐＡｒａＣ−１変異に相当する。第３の相同性変異はアミノ酸２１２のグリシン（ＧＧＴ）をＳｅｒｉｎｅ（ＡＧＴ）に変換し、上記のＡｒａＣ−３Ｓｅｒ変異に相当する。第４の変異は、アミノ酸４６６のイソロイシン（ＡＴＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変換し、これはトウモロコシ由来のＭｚ４１９Ｔｈｒ突然変異体に相当する。コムギＰｒｏｔｏｘ−１スクリーンから単離された変異のうち３つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。１つの変異は、コムギＰｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１０）のアミノ酸３５６のバリン（ＧＴＴ）をロイシン（ＣＴＴ）に変換する。第２の変異はアミノ酸４２１のセリン（ＴＣＴ）をプロリン（ＣＣＴ）に変換する。第３の変異はアミノ酸５０２のバリン（ＧＴＴ）をアラニン（ＧＣＴ）に変換する。
実施例１５．変異させると除草剤許容性が得られるダイズＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の部位の確認
効率のよいダイズＰｒｏｔｏｘ−１用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシｃＤＮＡについての上の記載と同様にしてダイズｃＤＮＡをｐＭｕｔ−１ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−ダイズＰｒｏｔｏｘ−１キメラプラスミドをｐＭｕｔ−５と称する。ｐＭｕｔ−５ＤＮＡを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のダイズＰｒｏｔｏｘ−１酵素をもたらす４つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの２つは、かつてアラビドプシスおよび／またはコムギＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。１つの変異がアミノ酸２６６（配列番号：１２）のアラニン（ＧＣＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変換する。この位置は上記のｐＡｒａＣ−１Ｔｈｒ変異に相当する。第２の相同性変異はアミノ酸５１７のバリン（ＧＴＴ）をアラニン（ＧＣＴ）に変換し、コムギ由来のＷｈｔ５０２Ｖａｌ変異に相当する。
ダイズＰｒｏｔｏｘ−１スクリーンから単離された変異のうち２つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。１つの変異は、ダイズＰｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１２）のアミノ酸３６９のプロリン（ＣＣＴ）をセリン（ＴＣＴ）に変換する。第２の変異はこの同じプロリン３６９をヒスチジン（ＣＡＴ）に変換する。
許容性の高いアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってダイズＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸２２６（配列番号：１２）のアラニン（ＧＣＡ）をロイシンに変異すると許容性のダイズ酵素が産生されることが立証された。アミノ酸４３２（配列番号：１２）のチロシン（ＴＡＣ）をロイシンまたはイソロイシンのいずれかに変異しても除草剤許容性酵素が産生された。
実施例１６．変異させると除草剤許容性が得られるテンサイＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の部位の確認
効率のよいテンサイＰｒｏｔｏｘ−１用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシｃＤＮＡについての上の記載と同様にしてテンサイｃＤＮＡをｐＭｕｔ−１ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−テンサイＰｒｏｔｏｘ−１キメラプラスミドをｐＭｕｔ−６と称する。ｐＭＵｔ−６ＤＮＡを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、除草剤許容性のテンサイＰｒｏｔｏｘ−１酵素をもたらす１つの単一塩基の変異が明らかになった。この変異はアミノ酸４４９のチロシン（ＴＡＣ）をシステイン（ＴＧＣ）に変換し、アラビドプシス中のＡｒａＣ−２変異と相同である。
許容性の高いアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってテンサイＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸４４９のチロシン（ＴＡＣ）をロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニンのいずれかに変異したところ、除草剤許容性酵素が産生された。
実施例１７．変異させると除草剤許容性が得られるワタＰｒｏｔｏｘ−１遺伝子中の部位の確認
効率のよいワタＰｒｏｔｏｘ−１用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシｃＤＮＡについての上の記載と同様にしてワタｃＤＮＡをｐＭｕｔ−１ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−ワタＰｒｏｔｏｘ−１キメラプラスミドをｐＭｕｔ−７と称する。ｐＭｕｔ−７ＤＮＡを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性ｐｒｏｔｏｘのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のワタＰｒｏｔｏｘ−１酵素をもたらす３つの単一塩基の変異が明らかになった。２つの突然変異体が、アミノ酸４２８（配列番号：１６）のチロシン（ＴＡＣ）をそれぞれシステイン（ＴＧＣ）およびアルギニン（ＣＧＣ）に変異する。アルギニンは、以前に確認されたこのＡｒａＣ−２部位で耐性を与える新規の置換である。第３の変異はアミノ酸３６５のプロリン（ＣＣＣ）をセリン（ＴＣＣ）に変換する。この変異はダイズ突然変異体Ｓｏｙ３６９Ｓｅｒに相当する。
実施例１８．種々のＰｒｏｔｏｘ阻害性化合物に対する耐性変異の交差許容性実験
元々単一のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対する耐性に基づいて識別された耐性の突然変異体プラスミドを、他の様々なｐｒｏｔｏｘ阻害性化合物について試験した。この試験については、各致死濃度を決定するため、野生型プラスミドを含むＳＡＳＸ３８株を一連の濃度の各化合物上にプレーティングする。ＳＡＳＸ３８中の耐性の突然変異体プラスミドをプレーティングし、野生型のプラスミドを含むＳＡＳＸ３８に致死の濃度より少なくとも１０倍高い各化合物濃度で残存する能力を評価する。
下記表３Ａおよび表３Ｂに示した細菌の交差耐性試験の結果から、確認された各変異によって様々なｐｒｏｔｏｘ阻害化合物に対する耐性が付与されることが明らかである。
0003961570.tif 000028
0003961570.tif 000029
セクションＣ  トランスジェニック植物での除草剤耐性Ｐｒｏｔｏｘ遺伝子の発現
実施例１９．同種組換えまたは遺伝子転換によるｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤許容性植物の遺伝子組換え
天然ｐｒｏｔｏｘプロモーターの調節下で発現すると、記載された突然変異体コード配列は有効に除草剤許容性を付与するので、ｐｒｏｔｏｘコード配列の天然染色体の位置を標的とした変異は、除草剤耐性の植物および植物細胞を作成する代替手段であることを意味する。所望の変異を含むがそれ自体の発現シグナル（プロモーターまたは３’非翻訳領域のいずれか）が欠失しているｐｒｏｔｏｘＤＮＡ断片は、当技術分野で認められた任意の方法（例えばアグロバクテリウム形質転換、プロトプラストへの直接遺伝子転移、微量噴出性ボンバードなど）により導入し、除草剤許容性の形質転換体を選択し得る。導入されたＤＮＡ断片はまた、コードされるアミノ酸配列（即ち、無形質変異）を変異させずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発により導入される診断用制限酵素部位または他の配列多形を含む。かつて様々な選択マーカーおよび除草剤許容性遺伝子について報告されたように（例えば、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４０２１〜４０２６（１９８８年）、Ｌｅｅ等，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２：４１５〜４２５（１９９０年）、Ｒｉｓｓｅｅｕｗ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：１０９〜１１９（１９９５年）参照）、ある形質転換体は、突然変異体ＤＮＡのｐｒｏｔｏｘ染色体座中への相同的組込みにより、あるいは天然ｐｒｏｔｏｘ染色体配列の導入された突然変異体配列への転換により得られることが分かっている。これらの形質転換体は、その除草剤許容性表現型の組合せと、そのｐｒｏｔｏｘ染色体座中の診断用制限酵素部位の存在によって認められる。
実施例２０．植物形質転換ベクターの構築
多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明の遺伝子はこのような任意のベクターと共に使用し得る。使用するベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的種に依存する。ある標的種に対して異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいことがある。形質転換に通常使用される選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｒｒａ，Ｇｅｎｅ１９：２５９〜２６８（１９８２年）；Ｂｅｖａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ３０４．１８４〜１８７（１９８３年））、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ等，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：１０６２（１９９０年）、スペンサー等，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ７９：６２５〜６３１（１９９０年））、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（ＢｌｏｃｈｉｎｇｅｒおよびＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ４：２９２９〜２９３１）、およびメトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子、（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．２（７）１０９９〜１１０４（１９８３年））などがある。
Ｉ．アグロバクテリウムの形質転換に適したベクターの構築
アグロバクテリウム−ツメファシエンスを使用する多くのベクターが形質転換に利用可能である。通常これらは少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列をもち、ｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｓｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４年））およびｐＸＹＺなどのベクターを含む。２種類の代表的なベクターの構築を以下に記載する。
ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築：アグロバクテリウムに使用する組換えベクター構築用のバイナリーベクター、ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１を使用して、次のようにして構築した。ｐＴＪＳ７５のＮａｒｌ消化によりｐＴＪＳ７５ｋａｎを作成して（ＳｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒおよびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｎｏｌ．１６４：４４６〜４５５（１９８５年））テトラサイクリン抵抗遺伝子の切り出しを可能にした後、ＮＰＴＩＩをもつｐＵＣ４Ｋ由来のＡｃｃｌ断片を挿入した（ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｒｒａ，Ｇｅｎｅ１９：２５９〜２６８（１９８２年）；Ｂｅｖａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ３０４：１８４〜１８７（１９８３年）；ＭｃＢｒｉｄｅ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１４：２６６〜２７６（１９９０年））。左右のＴ−ＤＮＡ境界、植物選択可能なｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含むｐＣＩＢ７のＥｃｏＲＶ断片にＸｈｏＩリンカーをライゲートし（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ５３：１５３〜１６１（１９８７年））、ＸｈｏＩ消化断片をＳａＩＩ消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローン化してｐＣＩＢ２００を作成した（ＥＰ０３３２１０４、実施例１９も参照）。ｐＣＩＢ２００は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇＩＩＩ、ＸｂａＩおよびＳａＩＩの特有のポリリンカー制限部位を含む。ｐＣｌＢ２００１は、ポリリンカーに追加制限部位を挿入することによって作成されるｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー中の特有の制限部位はＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａＩＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩおよびＳｔｕＩである。これらの特有の制限部位を含むことに加え、ｐＣＩＢ２００１はまた、植物および細菌のカナマイシン選択、アグロバクテリウムによる形質転換用の左右のＴ−ＤＮＡ境界、大腸菌と他の宿主との間で動員するためのＲＫ２由来のｔｒｆＡ機能およびこれもＲＫ２由来のＯｒｉＴとＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適する。
ｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体の構築：バイナリーベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン耐性をコードする遺伝子、Ｔ−ＤＮＡの右境界配列および左境界配列を含む上、広範囲の宿主のプラスミドｐＲＫ２５２由来の配列を組み込んでおり、それによって、大腸菌とアグロバクテリウムの両方で複製が可能である。その構築については、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ５３：１５３〜１６１（１９８７年）に記載されている。Ｇｒｉｔｚ等，Ｇｅｎｅ２５：１７９〜１８８（１９８３年）に記載された、ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだ、ｐＣＩＢ１０の様々な誘導体が構築された。これらの誘導体によると、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）またはハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）に関するトランスジェニック植物細胞の選択が可能になる。
ＩＩ．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクターの構築
アグロバクテリウム−ツメファシエンスを使用しない形質転換によると、選択される形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列に対する要求が回避され、従って、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む上記などのベクターに加え、これらの配列が欠失しているベクターを利用し得る。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術としては、粒子ボンバード、プロトプラスト取込み（例えばＰＥＧおよびエレクトロポレーション）、マイクロインジェクションを介する形質転換などがある。ベクターの選択は主として、形質転換する種にとって好ましい選択に依存する。以下にいくつかの代表的なベクターの構築について記載する。
ｐＣＩＢ３０６４の構築：ｐＣＩＢ３０６４は除草剤ｂａｓｔａ（またはホスフィノトリシン）による選択と組み合せた直接遺伝子転移技術に適するｐＵＣ由来のベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび作用状態で大腸菌ＧＵＳ遺伝子と融合したＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターを含み、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含む。標準のＰＣＲ技術を使用して、ＡＴＧが除去され、制限部位ＳｓｐＩおよびＰｖｕＩＩが生じるようにこれらの部位を変異させた。新しい制限部位は、特有のＳａＩＩ部位から９６塩基対および３７塩基対離れ、実際の開始部位から１０１塩基対および４２塩基対離れていた。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名した。次いで、ＳａＩＩとＳａｃＩによる消化によってｐＣＩＢ３０２５からＧＵＳ遺伝子を切り出し、末端を平滑末端化し、再度ライゲーションを行なってプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成させた。Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（ノリッジ）からプラスミドｐＪＩＴ８２を入手し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来のｂａｒ遺伝子を含む４００塩基対のＳｍａＩ断片を切り出し、ｐＣＩＢ３０６０のＨｐａＩ部位に挿入した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２５１９〜２５２３（１９８７年））。これによって、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと草剤選択用のターミネーター、即ちアンピシリン耐性の遺伝子（大腸菌での選択用）および特有の部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを備えたポリリンカーの調節を受けるｂａｒ遺伝子を含むｐＣＩＢ３０６４が生成した。このベクターは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適する。
ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築：ｐＳＯＧ３５は、選択マーカーとして大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用し、メトトレキサートに対する耐性を付与する形質転換ベクターである。ＰＣＲを使用して３５Ｓプロモーター（約８００塩基対）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子由来のイントロン６（約５５０塩基対）およびｐＳＯＧ１０由来の１８塩基対のＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅した。大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼＩＩ型遺伝子をコードする２５０塩基対の断片もＰＣＲによって増幅し、これらの２個のＰＣＲ断片をｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＳａｃＩ−Ｐｓｔ１断片と組み合わせた。これらの断片を組み合わせたところ、イントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと融合した３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９が生成した。ｐＳＯＧ１９中のＧＵＳリーダーをトウモロコシＣｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＣＭＶ）由来のリーダー配列と置換したところ、ベクターｐＳＯＧ３５が生成した。ｐＳＯＧ１９とｐＳＯＧ３５は、アンピシリン耐性のｐＵＣ遺伝子を保有し、外来配列のクローニングに利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する。
実施例２１．植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物での発現を目的とした遺伝子配列はまず、発現カセットの中の適切なプロモーターの後ろで適切な転写ターミネーターの上流に組み立てる。次いで、これらの発現カセットは上記の実施例２０に記載した植物形質転換ベクターに容易に転移し得る。
Ｉ．プロモーターの選択
発現カセットの中で使用するプロモーターの選択により、トランスジェニック植物中の導入遺伝子の空間的、時間的な発現パターンが決定される。選択されたプロモーターは、特定の細胞型（葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の皮質細胞など）または特定の組織または器官（例えば根、葉または花など）の中で導入遺伝子を発現し、この選択は、導入遺伝子の発現の所望の位置を反映している。別法として、プロモーターを光誘発型、または他の一時的に調節して選択されたプロモーターが遺伝子の発現を制御するようにしてもよい。さらなる別法は、選択されたプロモーターを化学的に調節するということである。これによると、望むときに化学的誘導物質処理によって引き起こす時だけに導入遺伝子の発現を誘起する可能性が提供されるであろう。
ＩＩ．転写ターミネーター
様々な転写ターミネーターが発現カセットでの使用に利用できる。これらは、導入遺伝子およびその正確なポリアデニル化を超える転写を終了させる役割を果たす。適切な転写ターミネーターは植物中で機能することが知られており、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター、ｔｍＩターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳＥ９ターミネーター、並びに植物ｐｒｏｔｏｘ遺伝子に天然で付随するターミネーター（即ち、「ｐｒｏｔｏｘターミネーター」）などが含まれる。これらは、単子葉植物と双子葉植物の両方で使用し得る。
ＩＩＩ．発現の強化または調節のための配列
多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強し、これらの配列を本発明の遺伝子と共に使用してトランスジェニック植物中でのそれらの発現を増大させ得ることが分かっている。
様々なイントロン配列が、特に単子葉の細胞中で発現を増強することが分かっている。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞へ導入されると、その同種のプロモーター下での野生型遺伝子の発現を著しく増強することが分かった。イントロン１は、特に有効であることが分かり、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子による融合構築物中での発現を増強した（Ｃａｌｌｉｓ等，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１：１１８３〜１２００（１９８７年））。同じ実験系で、トウモロコシｂｒｏｎｚｅｌ遺伝子由来のイントロンに発現増強で類似の効果があった（Ｃａｌｌｉｓ等，前出）。イントロン配列は常法により植物形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダー内に組み入れた。
ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列も発現を増強することが知られており、これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、「Ｗ配列」）、Ｍａｉｚｅ  Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＣＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）由来のリーダー配列は、発現増強に有効なことが示された（例えば、Ｇａｌｌｉｅ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８６９３〜８７１１（１９８７年）；Ｓｋｕｚｅｓｋｉ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１５：６５〜７９（１９９０年）など）。
ＩＶ．植物内遺伝子産物のターゲティング
植物には遺伝生産物ターゲティングの様々なメカニズムが存在することが知られており、これらのメカニズムの機能を調節する配列の特徴をかなり詳細に調べた。例えば、葉緑体への遺伝生産物のターゲティングは、様々な蛋白質のアミノ末端に見られ、葉緑体移入中に切断されて成熟した蛋白質を産生するシグナル配列によって調節される（例えば、Ｃｏｍａｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１０４〜１５１０９（１９８８年）など）。これらのシグナル配列は、異種遺伝生産物と融合させて異種生産物の葉緑体への移入を達成させ得る（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ等，Ｎａｔｕｒｅ３１３：３５８〜３６３（１９８５年））。ＲＵＢＩＳＣＯ蛋白、ＣＡＢ蛋白、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２蛋白および葉緑体に局在していることが知られている他の多くの蛋白質をコードするｃＤＮＡの５’末端から、適切なシグナル配列をコードするＤＮＡを単離し得る。
他の遺伝生産物がミトコンドリアやペルオキシゾームなどの他の細胞器官に局在する（例えば、Ｕｎｇｅｒ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１３：４１１〜４１８（１９８９年））。また、これらの生産物をコードするｃＤＮＡもこれらの細胞器官への異種遺伝生産物のターゲティングを達成するために操作し得る。このような配列の例は、核コード化ＡＴＰアーゼおよびミトコンドリアの特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソフォームである。細胞蛋白体へのターゲティングについてはＲｏｇｅｒｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６５１２〜６５１６（１９８５年）に記載されている。
また、他の細胞区画への遺伝生産物のターゲティングを引き起こす配列の特徴が明らかにされた。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラストおよびアリューロン細胞からの細胞外分泌物へのターゲティングの役割を果す（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＨｏ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２：７６９〜７８３（１９９０年））。さらに、カルボキシ末端配列と組み合わせたアミノ末端配列は、遺伝生産物の空胞へのターゲティングの役割を果す（Ｓｈｉｎｓｈｉ等，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ．１４：３５７〜３６８（１９９０年））。
上記の適切なターゲティング配列の対象導入遺伝子配列との融合によって、導入遺伝子生産物を任意の細胞器官または細胞区画に指向させることが可能である。例えば葉緑体ターゲティングのためには、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子またはＧＳ２遺伝子由来の葉緑体シグナル配列を導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧと読み枠内で融合する。選択されたシグナル配列には、既知の切断部位を含むようにし、構築する融合には、切断に必要な切断部位の後に任意のアミノ酸を考慮に入れるべきである。ある場合には、この要求は切断部位と導入遺伝子ＡＴＧとの間に少数のアミノ酸を挿入することによって、あるいは別法として導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸の置換によって満たしてもよい。葉緑体移入のために構築した融合体は、（Ｅｄｅｌｍａｎｎ他編「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１０８１〜１０９１（１９８２年）収載のＢａｒｌｅｔｔ等の章；Ｗａｓｍａｎｎ等，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：４４６〜４５３（１９８６年））に記載された技術を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで葉緑体取込みを行なうことによって、葉緑体取込み効果を試験し得る。これらの構築技術は当技術分野でよく知られており、ミトコンドリアとペルオキシゾームと等しく適用可能である。導入遺伝子の発現に必要なターゲティングの選択は、所与の経路の開始点として必要な前駆体が細胞内のどこに局在するかに依存する。通常これはサイトゾルまたは葉緑体であるが、ミトコンドリアまたはペルオキシゾームの場合もある。導入遺伝子発現生成物には通常、ＥＲ、アポプラストまたは液胞へのターゲティングは要求されない。
上記の細胞ターゲティングメカニズムは、ターゲティングシグナルが由来するプロモーターのものとは異なった発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で特定細胞のターゲティングを行なうという目標を達成するために、それらと同種のプロモーターだけでなく異種プロモーターとも併用し得る。
実施例２２．双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は当技術分野でよく知られており、アグロバクテリウムを核とした技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術としては、直接プロトプラストまたは細胞による外因性遺伝材料の取込みなどがある。これはＰＥＧまたはエレクトロポレーションによる取込み、粒子ボンバードによる送達、またはマイクロインジェクションによって達成し得る。これらの技術の例については、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等，ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７〜２７２２（１９８４年）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９〜１７７（１９８５年）、Ｒｅｉｃｈ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１００１〜１００４（１９８６年）、Ｋｌｅｉｎ等，Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０〜７３（１９８７年）などに記載されている。各場合とも、形質転換細胞は当技術分野で知られている標準の技術を使用して植物全体に再生されている。
アグロバクテリウムによる形質転換は、形質転換効率が高く、かつ多種多様な種を幅広く利用できるため、好ましい双子葉植物形質転換技術である。アグロバクテリウムにより通常、形質転換し得る多くの作物種としては、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、脂肪種子ナタネ、じゃがいも、ダイズ、アルファルファ、ポプラなどがある（ＥＰ０３１７５１１（ワタ）、ＥＰ０２４９４３２（トマト、Ｃａｌｇｅｎｅ社）、ＷＯ８７／０７２９９（アブラナ、Ｃａｌｇｅｎｅ社）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換には通常、アグロバクテリウムと植物由来の外植片との同時培養が含まれ、当技術分野でよく知られている手順に従う。形質転換した組織は、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡ境界間に存在する抗生物質耐性マーカーまたは除草剤耐性マーカーを保有した状態で、選択培地上で再生する。
実施例２３．単子葉植物の形質転換
今やほとんどの単子葉植物種の形質転換もルーチンとなった。好ましい技術としては、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションの技術を使用する、プロトプラストへの直接遺伝子転移や、カルス組織中への粒子ボンバードなどがある。形質転換は単一のＤＮＡ種または多数のＤＮＡ種（即ち同時形質転換）で行なうことができ、これらの技術は両方とも本発明での使用に適する。同時形質転換は、複合ベクター構築が回避でき、対象遺伝子および選択マーカーのための非連結遺伝子座を備えたトランスジェニック植物が作成できるという利点を有し、望ましいと見なす場合には、後代で選択マーカーを除去することが可能になる。一方、同時形質転換を使用する場合の欠点は、分離ＤＮＡ種のゲノムへの組み込み頻度が１００％未満だということである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１０９３〜１０９６（１９８６年））。
特許出願ＥＰ０２９２４３５（チバ−ガイギー）、ＥＰ０３９２２２５（チバ−ガイギー）およびＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）は、トウモロコシ優良同系繁殖株由来のカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用したプロトプラストの形質転換、形質転換プロトプラストからのトウモロコシ植物の再生の各技術について記載している。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ等，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０年）およびフロム等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３〜８３９（１９９０年）は、粒子ボンバードを使用したＡ１８８由来トウモロコシ株の形質転換技術を発表した。さらに、出願ＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギー）およびＫｏｚｉｅｌ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４〜２００（１９９３年）は、粒子ボンバードによるトウモロコシ優良同系繁殖株の形質転換技術について記載している。この技術は、授粉１４〜１５日後にトウモロコシ雌穂から切り出された１．５〜２．５ｍｍの長さの未熟トウモロコシ胚芽と、ボンバード用のＰＤＳ−１０００Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（微粒子銃）装置を利用している。
イネの形質転換もプロトプラストまたは粒子ボンバードを利用した直接遺伝子転移技術によって行なうことができる。プロトプラストによる形質転換は、ジャポニカ型およびインディカ型について記載されている（Ｚｈａｎｇ等，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ７：３７９〜３８４（１９８８年）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等，Ｎａｔｕｒｅ３３８：２７４〜２７７（１９８９年）；Ｄａｔｔａ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：７３６〜７４０（１９９０年））。両方の型とも通例、粒子ボンバードを使用して形質転換される（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９５７〜９６２（１９９１年））。
特許出願ＥＰ０３３２５８１（チバ−ガイギー）は、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの生成、形質転換および再生の技術について記載している。これらの技術によると、オーチャードグラスとコムギの形質転換も可能である。さらに、コムギ形質転換は、長期再生可能なカルスのタイプＣ細胞への粒子ボンバードを使用するものがＶａｓｉｌ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７〜６７４（１９９２年）に、また未熟胚芽および未熟胚芽由来のカルスの粒子ボンバードを使用するものがＶａｓｉｌ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１５５３１５５８（１９９３年）、Ｗｅｅｋｓ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７〜１０８４の（１９９３）に記載されている。しかしながら、コムギ形質転換の好ましい技術としては、遺伝子送達前に高蔗糖または高麦芽糖のいずれかの段階を含む、未熟胚芽の粒子ボンバードによるコムギの形質転換などがある。ボンバードに先立ち、任意の数の胚芽（長さ０．７５〜１ｍｍ）を体細胞不定胚誘導用の３％蔗糖（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔｅｒｕｍ１５：４７３〜４９７（１９６２年））および３ｍｇ／ｌの２，４Ｄを含むＭＳ培地上にプレーティングし、暗中で生育させる。ボンバードに選択した日に誘導培地から胚芽を取り除き、ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ（即ち、蔗糖またはマルトースを所望の濃度、典型的には１５％加えた誘導培地）の上に置く。胚芽を、２〜３時間原形質単離させた後、ボンバードする。標的平板当たり胚芽２０個が決定的ではないが典型的である。標準の方法を使用して、ミクロン大の金粒子上に適切な遺伝子保有プラスミド（ｐＣＩＢ３０６４またはｐＳＧ３５など）を付着させる。各胚芽平板を、８０メッシュの標準スクリーンを使用して−１０００ｐｓｉの爆圧を使用するＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓのヘリウム装置によって撃つ。ボンバード後、胚芽を暗中に戻し、約２４時間（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ上）で回復させる。２４時間後、ｏｓｍｏｔｉｃｕｍから胚芽を取り出して誘導培地上に戻し、再生まで約１月間静置する。およそ１か月後、成育中の胚性カルス付きの胚芽外植片を、適切な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合１０ｍｇ／ｌのｂａｓｔａ、ｐＳＯＧ３５の場合２ｍｇ／ｌのメトトレキサート）をさらに含む、再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、５ｍｇ／ｌのＧＡ）に移す。およそ１か月後、生育した苗条を、半濃度のＭＳ、２％蔗糖および同濃度の選択剤を含む、「ＧＡ７ｓ」として知られている、より大きい滅菌容器に移す。特許出願ＷＯ９４／１３８２２にはコムギ形質転換法が記載されており、これを参照により本明細書の一部とする。
例２４．アラビドプシス・タリアナＰｒｏｔｏｘ−１プロモーター配列の単離
アラビドプシス・タリアナ（コロンビア、全植物）から調製されたＬａｍｂｄａ  ＺａｐＩＩゲノムＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。およそ１２５，０００個のファージを１５ｃｍのペトリ皿当たり２５，０００ｐｆｕの密度でプレーティングし、複製リフトをＣｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎ膜（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）上に作成した。このプラークリフトを、ランダムプライミング法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：１）で探査した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１〜１９９５（１９８４年）に記載されているように６５℃とした。ポジティブにハイブリダイズするクローンを精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに導入した。ゲノムＤＮＡインサート由来の配列を蛍光色素で標識したジデオキシターミネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた連鎖停止法によって決定した。１つのクローン、即ちＡｒａＰＴｌＰｒｏが、Ｐｒｏｔｏｘ−１蛋白コード配列の開始メチオニン（ＡＴＧ）の上流に５８０塩基対のアラビドプシス配列を含むことが決定された。このクローンはまた、Ｐｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ配列の塩基１２４１に向かって伸長するコード配列およびイントロンをも含む。５８０塩基対の５’非コード断片は推定アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターであり、配列番号：１３に配列を示す。
ＡｒａＰＴｌＰｒｏは、１９９５年１２月１５日にｐＷＤＣ−１１（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５１５）として寄託した。
実施例２５．天然アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１の後ろに変更Ｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築
適当な変異アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡの完全長ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部分消化断片として単離し、植物発現ベクターｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸでクローン化した（１９９５年６月８日に出願され、１９９５年１２月２１日にＷＯ９５／３４６５９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２の実施例９参照）。このプラスミドをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化してアグロバクテリウム−ツメファシエンスのｔｍＩ遺伝子の完全なＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡと３’非翻訳配列由来の転写ターミネーターとで構成された断片を作成した。上記のＡｒａＰＴｌＰｒｏプラスミドをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよび５８０塩基対の推定アラビドプシスＰｒｏｔｏｘ１プロモーターを含む断片を作成した。これらの２個の断片をライゲートしたところ、変異ｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡが天然ｐｒｏｔｏｘプロモーターへ融合された。Ｐｒｏｔｏｘ−１プロモーター／Ｐｒｏｔｏｘ−１  ｃＤＮＡ／ｔｍＩターミネーター融合体を含む発現カセットをＫｐｎＩによる消化によって切り出し、バイナリーベクターｐＣＩＢ２００でクローン化した。エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムをこのバイナリープラスミドで形質転換した後、真空浸潤法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ等，Ｃ．Ｒ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ３１６：１１９４〜１１９９（１９９３年））を使用してＡｍｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換した。変更Ｐｒｏｔｏｘ遺伝子を発現する形質転換体をカナマイシンまたは種々の濃度のＰｒｏｔｏｘ阻害性除草剤について選択した。
実施例２６．天然Ｐｒｏｔｏｘ−１プロモーター／変更天然Ｐｒｏｔｏｘ−１融合体の発現による除草剤許容性植物の作成
上記の方法を使用して、Ｐｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１）のヌクレオチド１３０６〜１３０８にＴＡＣからＡＴＧ（チロシンからメチオニン）への変異を含むアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡを天然Ｐｒｏｔｏｘ−１プロモーター断片と融合し、アラビドプシス・タリアナを形質転換した。この改変Ｐｒｏｔｏｘ−１酵素（ＡｒａＣ−２Ｍｅｔ）は、前記の細菌発現系で試験するとき、様々なｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対して天然酵素よりも１０倍を超える高い許容性を示した。真空浸潤させた植物由来の種子を集め、一連の濃度（１０．０ｎＭ〜１．０ｕＭ）の式ＸＶＩＩのｐｒｏｔｏｘ阻害性アリールウラシル除草剤上にプレーティングした。野野生型アラビドプシスでの多数の実験から、濃度１０．０ｎＭのこの化合物が正常な実生苗の発芽を防ぐのに十分であることが示された。天然Ｐｒｏｔｏｘ−１プロモーターと融合したＡｒａＣ−２Ｍｅｔ修飾酵素を発現するトランスジェニック種子は、５００ｎＭまでの除草剤濃度で正常なアラビドプシス実生苗を産生し、野生型アラビドプシスと比較して少なくとも５０倍高い除草剤許容性を示した。従って、このプロモーター／修飾ｐｒｏｔｏｘ酵素融合体は、植物形質転換の有効な選択マーカーとして機能する。１００．０ｎＭのｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤上で発芽した植物のいくつかを土壌に移植し、２〜３週間成長させ、様々な濃度のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤による噴霧測定法で試験した。空ベクター対照形質転換体と比較したところ、ＡｒａＰＴｌＰｒｏ／ＡｒａＣ−２Ｍｅｔトランスジェニック植物は、除草剤スプレーに対する許容性が１０倍を超えていた。
実施例２７．アラビドプシス発芽測定法での様々なｐｒｏｔｏｘ阻害性化合物に対する耐性変異体の交差許容性実験
上記の方法を使用して、Ｐｒｏｔｏｘ−１配列（配列番号：１）中のヌクレオチド１３０６〜１３０８のＴＡＣからＡＴＣ（チロシンからイソロイシン）への変異およびヌクレオチド９４５〜９４７のＴＣＡからＴＴＡ（セリンからロイシン）への変異を両方とも含むアラビドプシスＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡを天然Ｐｒｏｔｏｘ−１プロモーター断片と融合し、アラビドプシス・タリアナを形質転換した。この修飾Ｐｒｏｔｏｘ−１酵素（ＡｒａＣ−２ＩＩｅ＋ＡｒａＣ３０５Ｌｅｕ）は細菌系で試験したとき、式ＸＶＩＩのｐｒｏｔｏｘ阻害性アリールウラシル除草剤に対する許容性が天然酵素の１０倍を超えていることを示した（実施例８〜１２参照）。上記と同様にして、実生苗発芽測定法でｐｒｏｔｏｘを阻害する除草剤に対して高い許容性を示した形質転換体から、この融合体を含む同型接合アフビドプシス株を作成した。野生型アラビドプシスの発芽阻害を示した化合物濃度について発芽測定法を繰り返すことより、１株由来の種子につき、様々なｐｒｏｔｏｘ阻害化合物に対する交差許容性を試験した。これらの実験の結果を表４に示す。
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実施例２８．トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーター配列の単離
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからλＦＩＸＩＩベクターに挿入したトウモロコシ（ミズーリ１７同系交配黄化実生）ゲノムＤＮＡライブラリーを購入した。このライブラリーおよそ２５０，０００ｐｆｕを１５ｃｍ平板当たり５０，０００個ファージの密度でプレーティングし、Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅスクリーン膜（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）上に複製リフトを作成した。このプラークリフトを、ランダムプライミング法（ライフ・テクノロジーズ）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列番号：５）で探査した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、Ｃｈｕｒｃｈおよびギルバート，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１〜１９９５（１９８４年）の記載と同様に６５℃とした。Ｗｉｚａｒｄ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ポジティブにハイブリダイズする３個のファージからλファージＤＮＡを単離した。制限消化、ハイブリダイゼーションパターンおよびＤＮＡ配列分析による解析から、以前ｃＤＮＡクローンとして単離されたトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列の５’に位置するおよそ３．５ｋｂのトウモロコシゲノムＤＮＡを含むλクローンが確認された。この断片はトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターを含む。この断片の配列を配列番号：１４に示す。ヌクレオチド１〜３５３２から、この配列は５’非コード配列から成る。ヌクレオチド３５３３〜３８４８から、この配列は、トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１蛋白の５’末端をコードする。
トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１コード配列の残部と融合させた配列番号：１４の配列を含むプラスミドを、１９９６年３月１９日にｐＷＤＣ−１４（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５４６）として寄託した。
実施例２９．天然トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターの後ろに改変Ｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子を発現する植物形質転換ベクター
単離したλファージクローンから３８４８塩基対のゲノム断片（配列番号：１４）をＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部分消化生成物として切り出し、アミノ酸１６４（配列番号：６）にアラニンからロイシンへの変異を含む改変トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ由来のＫｐｎＩ−Ｎｏｔ１断片とライゲートした。これにより、細菌系中で除草剤許容性を付与することを示す（実施例８〜１３）、天然トウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターの完全長ｃＤＮＡとの融合体が作成された。この融合体をＣａＭＶ３５Ｓターミネーター配列を含むｐＵＣ１８由来ベクターでクローン化してｐｒｏｔｏｘプロモーター／改変ｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡ／ターミネーターカセットを作成した。このカセットを含むプラスミドをｐＷＣｏ−１と命名した。
トウモロコシゲノムクローン由来のコード配列中に見出した第１イントロンを元のトウモロコシｃＤＮＡに組み込むことによってトウモロコシ形質転換のための第２の構築物を作成した。この挿入は標準のオーバーラップＰＣＲ融合技術を使用して行なった。イントロン（配列番号：２５）は長さ９３塩基対であり、実施例２８に記載したλクローンの天然配列に示されるように、正確に配列番号：６のヌクレオチド２０３とヌクレオチド２０４の間に挿入された。この発現カセットのイントロン含有版をｐＷＣｏ−２と命名した。
実施例３０．トランスジェニックトウモロコシ植物中のトウモロコシＰｒｏｔｏｘ−１プロモーター活性の実験
トウモロコシｐｒｏｔｏｘプロモーター／改変ｐｒｏｔｏｘ融合体で形質転換されたトウモロコシ植物は導入遺伝子に特異的なプライマーによるＰＣＲ分析を使用して確認した。ＰＣＲポジティブの植物からＲＮＡ全体を調製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｍ−ＭＬＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して推奨条件下でＲＮＡを逆転写した。改変ｐｒｏｔｏｘ配列に特異的となるように設計したＰＣＲ反応中で逆転写反応物２μｌを使用した。この反応では、非形質転換対照からは生成物が生じなかったが、一方ｐＷＣｏ−１で形質転換した植物のおよそ８５％からは肯定的な結果が得られ、導入遺伝子由来のｍＲＮＡの存在が示された。これは、あるレベルのトウモロコシｐｒｏｔｏｘプロモーター活性を示す。また、このトランスジェニックトウモロコシ植物由来のＲＮＡも、配列番号：６由来の放射性同位体標識トウモロコシｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用する標準のノーザンブロット分析に供した。トランスジェニックトウモロコシ植物のうちのいくつかに非形質転換対照のものをかなり上回るＰｒｏｔｏｘ−１  ｍＲＮＡレベルが検出された。この高いｍＲＮＡレベルは、クローン化トウモロコシｐｒｏｔｏｘプロモーター由来の改変ｐｒｏｔｏｘ−１  ｍＲＮＡの発現によると推定される。
実施例３１．テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーター配列の単離
ゲノムテンサイライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅによりλＦｉｘＩＩベクター中に調製された。トウモロコシについて実施例２８に記載されているようにして、およそ３００，０００ｐｆｕのライブラリーをテンサイｐｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ配列（配列番号：１７）上にプレーティングして探査した。制限消化、ハイブリダイゼーションパターンおよびＤＮＡ配列分析による解析から、以前ｃＤＮＡクローンとして単離されたテンサイコード配列の５’に位置するおよそ７ｋｂのテンサイゲノムＤＮＡを含むλクローンが確認された。λクローンから２６０６ｂｂのＰｓｔＩ−Ｓａｌｌ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローン化した。この断片は２０６８塩基対の５’非コード配列を含み、テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターを含む。それはまた、ｐｒｏｔｏｘ−１コード配列の最初の４５３塩基対およびコード配列に含まれる８５塩基対の第１イントロンをも含む。この断片の配列を配列番号：２６に示す。
配列番号：２６の配列を含むプラスミドを１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−２０（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６５０）として寄託した。
実施例３２．天然テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターの後ろに改変Ｐｒｏｔｏｘ−１遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築
実施例３１に記載したゲノムサブクローンからテンサイゲノム断片（配列番号：２６）を、２０６８塩基対の５’非コード配列とテンサイＰｒｏｔｏｘ−１コード配列の最初の３００塩基対とを含むＳａｃＩ−ＢｓｒＧＩ断片として切り出した。この断片を、アミノ酸４４９（配列番号：１８）にチロシンからメチオニンへの変異を含む改変テンサイＰｒｏｔｏｘ−１ｃＤＮＡ由来のＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ断片とライゲートした。これにより、細菌系で除草剤許容性を付与することを示す（実施例８〜１３）、天然テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーターの完全長のｃＤＮＡへの融合体が作成された。この融合体をＣａＭＶ３５Ｓターミネーター配列を含むｐＵＣ１８由来ベクターでクローン化してＰｒｏｔｏｘプロモーター／改変ｐｒｏｔｏｘ  ｃＤＮＡ／ターミネーターカセットを作成した。このカセットを含むプラスミドをｐＷＣｏ−３と命名した。
実施例３３．天然テンサイＰｒｏｔｏｘ−１プロモーター／改変テンサイＰｒｏｔｏｘ−１融合体の発現による除草剤許容性植物の作成
アグロバクテリウム、プロトプラストおよび微粒子銃形質転換技術を含む、双子葉植物植物に適用可能な任意の形質転換方法を使用して、ｐＷＣｏ−３由来の発現カセットをテンサイに形質転換する。ＲＮＡ−ＰＣＲによって改変ｐｒｏｔｏｘ−１酵素を発現するトランスジェニックテンサイを確認し、非形質転換テンサイにとり致死濃度のｐｒｏｔｏｘ阻害性除草剤に対する許容性について試験する。
セクションＤ  植物色素体中のＰｒｏｔｏｘ遺伝子発現
実施例３４．色素体形質転換ベクター中のＧＵＳレポーター遺伝子および色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳配列と融合したタバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターおよび天然ｃｌｐＰ  ５’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
Ｉ．タバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターおよび完全５’非翻訳ＲＮＡ（５’ＵＴＲ）の増幅
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種「Ｘａｎｔｈｉ  ＮＣ」由来のＤＮＡ全体を、構成的に発現した色素体ｃｌｐＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンを基準として−１９７の位置に導入ＥｃｏＲＩ制限部位を含む左から右への「トップストランド」プライマー（プライマーＰｃｌｐ＿Ｐ１ａ：５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃａｔａｃｔｔａｔｔｔａｔｃａｔｔａｇａａａｇ−３’（配列番号：２７）；下線部はＥｃｏ−ＲＩ制限部位）と、翻訳開始点に導入ＮｃｏＩ制限部位を組み込むｃｌｐＰプロモーターのＡＴＧ開始コドンを基準として−２１から−１までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーＰｃｌｐ＿Ｐ２ｂ：５’−ｇｃｇｃｃａｔｇｇｔａａａｔｇａａａｇａａａｇａａｃｔａａａ−３’（配列番号：２８）；下線部はＮｃｏＩ制限部位）とによるＰＣＲのテンプレートとして使用した。このＰＣＲ反応は、以下の製造者（パーキン・エルマー／Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ブランチバーグ）の推奨によりＰｆｕ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラ  ホーヤ））を用いてパーキン・エルマーＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０中で行なった。９５℃７分間後に９５℃１分間／４３℃２分間／７２℃１分間を４サイクル、次いで９５℃１分間／５５℃２分間／７２℃２分間を２５サイクル。このプロモーターと、左末端のＥｃｏＲＩ部位および右末端のＮｃｏＩ部位を含みＮ．ｔａｂａｃｕｍ色素体ＤＮＡ配列のヌクレオチド７４７００〜７４５０５に相当するｃｌｐＰ遺伝子の５’非翻訳領域を含む２１３塩基対の増幅産物（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２０４３〜２０４９（１９８６年））を標準法を用いてゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化した（制限酵素は全てＮｅｗ  Ｉｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ベヴァリー）から購入した）。
ＩＩ．タバコ色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳ＲＮＡ配列（３’ＵＴＲ）の増幅
上記と同様に、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種「Ｘａｎｔｈｉ  ＮＣ」由来のＤＮＡ全体を、リボソーム蛋白Ｓ１６をコードする色素体ｒｐｓ１６遺伝子のＴＡＡ停止コドン直後に導入ＸｂａＩ制限部位を含む左から右へのトップストランドプライマー（プライマーｒｐｓ１６Ｐ＿１ａ（５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＣＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＡＡＧＧ−３’（配列番号：３０）；下線部はＸｂａＩ制限部位）と、ｒｐｓ１６  ３’ＵＴＲの３’末端に導入ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込むｒｐｓ１６のＴＡＡ停止コドンを基準として＋１３４から＋１５１までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーｒｐｓ１６Ｐ＿１ｂ（５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＡＡ−３’（配列番号：３１）；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位）とによるＰＣＲのテンプレートとして使用した。左末端のＸｂａＩ部位と右末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含みＮ．ｔａｂａｃｕｍ色素体ＤＮＡ配列のヌクレオチド４９４３〜５０９３に相当する領域を含むｒｐｓ１６遺伝子の３’非翻訳領域を含む１６９塩基対の増幅産物（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ等、１９８６年）をゲル精製し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
ＩＩＩ．ＧＵＳリポーター遺伝子断片のｃｌｐＰ遺伝子プロモーターと５’および３’ＵＴＲとのライゲーション
ＡＴＧ開始コドンのＮｃｏＩ制限部位および天然３’ＵＴＲの後のＸｂａＩ部位を含む、プラスミドｐＲＡＪ２７５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の１８６４塩基対のｂ−ガラクツロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子断片をＮｃｏＩおよびＸｂａＩによる消化によって作成した。この断片を２０１塩基対のＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ  ｃｌｐＰプロモーター断片、１５７塩基対のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｒｐｓ１６  ３’ＵＴＲ断片およびクローニングベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）由来の３１４８塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片に４通りの反応でライゲートしてプラスミドｐＰＨ１３８を構築した。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＰＲＶ１１１ａ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏ等、１９９４年）を消化し、得られた７２８７塩基対断片をｐＰＨ１３８の２２２２塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にライゲートすることによって色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４０を構築した。
実施例３５．色素体形質転換ベクター中のレポーター遺伝子および色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳配列と融合したタバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターとタバコ色素体ｐｓｂＡ遺伝子最小５’ＧＵＳ非翻訳配列のキメラ遺伝子の調製
タバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターおよび切断型５’非翻訳ＲＮＡ（５’ＵＴＲ）の増幅：上記と同様にしてＮ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種「Ｘａｎｔｈｉ  ＮＣ」由来のＤＮＡ全体を、左から右への「トップストランド」プライマーＰｃｌｐ＿Ｐ１ａ（配列番号：２７）と、ＣｌｐＰ５’ＵＴＲの位置−１１に導入ＸｂａＩ制限部位を組み込むｃｌｐＰプロモーターのＡＴＧ開始コドンを基準として−３４から−１１までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーＰｃｌＰ＿Ｐｌｂ：５’−ｇｃｇｔｃｔａｇａａａｇａａｃｔａａａｔａｃｔａｔａｔｔｔｃａｃ−３’（配列番号：２９）；下線部はＸｂａＩ制限部位）とによるＰＣＲのテンプレートとして使用した。左末端のＥｃｏＲＩ部位と右末端のＸｂａＩ部位を含み、プロモーターおよびｃｌｐＰ遺伝子の切断型５’ＵＴＲを含む２０２塩基対の増幅産物をゲル精製し、ＸｂａＩ消化した。このＸｂａＩ部位を、クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｉｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でほぼ満たし、断片をＥｃｏＲＩ消化した。これを、タバコ色素体ｐｓｂＡ遺伝子の５’ＵＴＲの最終の３８ヌクレオチドおよびＡＴＧ開始コドン（ＮｃｏＩ制限部位オーバーハング開始コドンをＡＴＧに導入）に相当する２本鎖ＤＮＡ断片に５通りの反応でライゲートしてプラスミドｐＰＨ１３９を構築したが、この２本鎖ＤＮＡ断片は、合成オリゴヌクレオチドｍｉｎｐｓｂ＿Ｕ（トップストランド：５’−ｇｇｇａｇｔｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔａａａｔａａａｃｃａａｇａｔｔｔｔａｃ−３’（配列番号：３２））およびｍｉｎｐｓｂ＿Ｌ（ボトムストランド：５’−ｃａｔｇｇｔａａａａｔｃｔｔｇｇｔｔｔａｔｔｔａａｔｃａｔｃａｇｇｇａｃｔｃｃｃ−３’（配列番号：３３）下線部はＮｃｏＩ制限部位５’オーバーハング））、上記のＮｃｏＩ／Ｘｂａｌ  ＧＵＳリポーター遺伝子断片、上記のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｒｐｓ１６  ３’ＵＴＲ断片、および上記のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）断片をアニーリングすることによって作成した。プラスミドｐＰＲＶ１１１ａ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２２：３８１９〜３８２４（１９９４年））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られた生じる７２８７塩基対断片をｐＰＨ１３９の２２５１塩基対ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にライゲートすることによって色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４４を構築した。
実施例３６．タバコ色素体形質転換用のベクター中でアラビドプシス・タリアナＰｒｏｔｏｘ−１コード配列および色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳配列と融合したタバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターおよび完全５’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
アミノ末端の色素体輸送ペプチド、完全長のｃＤＮＡおよび３’非翻訳領域の一部をコードするプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ（「ＰＲＯＴＯＸ」）遺伝子由来のｃＤＮＡ配列を含むアラビドプシス・タリアナＮｏｔＩインサートを保有するプラスミドＡｒａＣ−２Ｍｅｔ由来のＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを、成熟ＰＲＯＴＯＸ蛋白コード配列の推定された開始点に導入されたＮｃｏＩ制限部位および新しい開始コドンＡＴＧ（プライマーＡＰＲＴＸＰ１ａ：５’−ＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧ−３’（配列番号：３４）；下線部はＮｃｏＩ制限部位）を含む左から右への「トップストランド」プライマー（完全長の前駆体蛋白のＡＴＧ開始コドンを基準として＋１７２から＋１９４のヌクレオチドと相同）とＰＲＯＴＯＸ前駆体蛋白の天然ＡＴＧ開始コドンを基準として＋９１７から＋９４０のヌクレオチドに相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーＡＰＲＴＸＰ１ｂ：５’−ＣＴＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：３５））とを使用する上記のＰＣＲのテンプレートとして使用した。７７８塩基対の生成物をＮｃｏＩおよびＳｆｕＩで消化し、得られた６８２塩基対の断片をＰＲＯＴＯＸコード配列の３’部分を含むＡｒａＣ−２Ｍｅｔを含む８４４塩基対のＳｆｕＩ／ＮｏｔｌＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の２９７８塩基対のＮｃｏＩ／Ｎｏｔｌ断片にライゲートしてプラスミドｐＰＨ１４１を構築した。ｐＰＨ１４１をＮｃｏＩおよびＳｓｐＩにより消化し、完全なＰＲＯＴＯＸコード配列を含む１４９１塩基対の断片を単離し、上記のｒｐｓ１６Ｐ＿１ａおよびｒｐｓ１６Ｐ＿１ｂの各ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これらをｐＰＨ１４０の７４３６塩基対のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にライゲートすることによって、ｒｐｓ１６  ３’ＵＴＲにより２７６’８５４−耐性ＳＶ１−Ｍｅｔ  ＰＲＯＴＯＸ遺伝子を制御するｃｌｐＰプロモーターを含む色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３を構築した。
実施例３７．タバコ色素体形質転換用のベクター中でアラビドプシス・タリアナＰｒｏｔｏｘ−１コード配列および色素体ｒｐｓ１６遺伝子３’非翻訳配列と融合したタバコ色素体ｃｌｐＰ遺伝子プロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子最小５’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
ｐＰＨ１４１をＮｃｏＩおよびＳｓｐＩにより消化し、完全なＰＲＯＴＯＸコード配列を含む１４９１塩基対の断片を単離し、上記のｒｐｓ１６Ｐ＿１ａおよびｒｐｓ１６Ｐ＿１ｂの各ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これらをｐＰＨ１４４の７４６５塩基対のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にライゲートすることによって、ｒｐｓ１６  ３’ＵＴＲにより２７６’８５４−耐性ＳＶ１−Ｍｅｔ  ＰＲＯＴＯＸ遺伝子を制御するｃｌｐＰプロモーター／ｐｓｂＡ  ５’のＵＴＲ融合体を含む色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４５を構築した。
実施例３８．タバコ色素体ゲノムのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ形質転換
基本的に記載（Ｓｖａｂ、Ｚ．およびＭａｌｉｇａ、Ｐ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０、９１〜９１７）の通り、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ栽培品種「Ｘａｎｔｈｉ  ｎｃ」の種子をＴ寒天培地の上に円形に配列し平板１枚当たり７個発芽させ、播種から１２〜１４日後にプラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５由来のＤＮＡで被覆した１μｍのタングステン粒子（Ｍ１０、Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ヘラクレス）でボンバードした。ボンバードした実生をＴ培地上で２日間インキュベートした後、葉を切り出して背軸面を明光（３５０〜５００μｍｏｌ光子／ｍ2／ｓ）側にして５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンジヒドロクロリド（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を含むＲＭＯＰ培地（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９０年）ＰＮＡＳ８７，８５２６〜８５３０）の平板上に置いた。ボンバードから３〜８週間後に白くなった葉の真下に現われた耐性苗条を、同じ選択培地上にサブクローン化してカルスを形成させ、二次苗条を単離、サブクローン化した。標準的技術のサザンブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，（１９８９年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリング港）により、独立したサブクローン中の形質転換色素体ゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティー：ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃｉｔｙ）を評価した。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した全細胞ＤＮＡ（Ｍｅｔｔｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．（１９８７年）Ｐｌｓｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ５，３４６〜３４９）を、１％トリス−ホウ酸塩（ＴＢＥ）アガロースゲル上で単離し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、ｒｐｓ７／１２色素体ターゲティング配列の一部を含むｐＣ８由来の０．７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片に相当するＤＮＡ配列を32Ｐ−標識した無作為プライミングＤＮＡ配列で探査した。ホモプラスミック（Ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）な苗条を、スペクチノマイシンを含むＭＳ／ＩＢＡ培地（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｋ．Ｅ．等（１９９４年）ＰＮＡＳ９１，７３０１〜７３０５）上で無菌的に根付かせ、温室へ移した。
本明細書に記載した発明の様々な修正は当業者には明白であろう。このような修正は添付した請求の範囲の中に含まれるものとする。
配列表
(1)一般情報：
（ii）発明の名称：植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするＤＮＡ分子およびその阻害物質耐性突然変異体
(iii)配列の数：35
(vii)前の出願のデーター：
(A)出願番号：US 60/012,705
(B)出願日：1996年2月28日
(vii)前の出願のデーター：
(A)出願番号：US 60/013,612
(B)出願日：1996年2月28日
(vii)前の出願のデーター：
(A)出願番号：US 60/020,003
(B)出願日：1996年6月21日
(2)配列番号：1:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1719塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Arabidopsis thaliana
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-2（NRRL B-21238）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：31..1644
(D)他の情報：/product=”Arabidopsis protox-1”
(xi)配列の記載：配列番号：1：
0003961570.tif 000031
0003961570.tif 000032
0003961570.tif 000033
0003961570.tif 000034
0003961570.tif 000035
(2)配列番号：2:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：537アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列数:2:
0003961570.tif 000036
0003961570.tif 000037
0003961570.tif 000038
(2)配列番号：3
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1738塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイホセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Arabidopsis thaliana
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-1（NRRL B-21237）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：70..1596
(D)他の情報：/product=”Arabidopsis protox-2”
(xi)配列の記載：配列番号:3:
0003961570.tif 000039
0003961570.tif 000040
0003961570.tif 000041
0003961570.tif 000042
0003961570.tif 000043
(2)配列番号：4:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：508アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:4:
0003961570.tif 000044
0003961570.tif 000045
0003961570.tif 000046
(2)配列番号：5:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1691塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Zea mays（maize）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-4（NRRL B-21260）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：1..1443
(D)他の情報：/product=”Maize protox-1 cDNA”
(xi)配列の記載：配列番号:5:
0003961570.tif 000047
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0003961570.tif 000049
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0003961570.tif 000051
(2)配列番号：6:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：481アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列数:6:
0003961570.tif 000052
0003961570.tif 000053
0003961570.tif 000054
(2)配列番号：7:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：2061塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Zea mays（maize）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-3（NRRL B-21259）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：64..1698
(D)他の情報：/product=”Maize protox-2”
(xi)配列の記載：配列番号:7:
0003961570.tif 000055
0003961570.tif 000056
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0003961570.tif 000059
(2)配列番号：8:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：544アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:8:
0003961570.tif 000060
0003961570.tif 000061
0003961570.tif 000062
(2)配列番号：9:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1811塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(vi)由来：
(A)生物：Triticum aestivum（wheat）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-13（NRRL B-21545）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：3..1589
(D)他の情報：/product=”wheat protox-1”
(xi)配列の記載：配列番号:9:
0003961570.tif 000063
0003961570.tif 000064
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0003961570.tif 000066
(2)配列番号：10:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：528アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:10:
0003961570.tif 000067
0003961570.tif 000068
0003961570.tif 000069
(2)配列番号：11:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1847塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(vi)由来：
(A)生物：大豆
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-12（NRRL B-21516）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：55..1683
(D)他の情報：/product=”soybean protox-1”
(xi)配列の記載：配列番号:11:
0003961570.tif 000070
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0003961570.tif 000074
(2)配列番号：12:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：543アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:12:
0003961570.tif 000075
0003961570.tif 000076
0003961570.tif 000077
0003961570.tif 000078
(2)配列番号：13:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：583塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：DNA（genomic）
(iii)ハイポセティカル：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：promoter
(B)位置：1..583
(D)他の情報：/function=”arabidopsis protox-1 promoter”
(xi)配列の記載：配列番号:13:
0003961570.tif 000079
(2)配列番号：14:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：3848塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：DNA（genomic）
(iii)ハイポセティカル：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：promoter
(B)位置：1..3848
(D)他の情報：/function=”maize protox-1 promoter”
(xi)配列の記載：配列番号:14:
0003961570.tif 000080
0003961570.tif 000081
0003961570.tif 000082
0003961570.tif 000083
(2)配列番号：15:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1826塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Gossypium hirsutum（ワタ）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-15（NRRL B-21594）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：31..1647
(D)他の情報：/product=”Cotton protox-1 coding region”
(xi)配列の記載：配列番号:15:
0003961570.tif 000084
0003961570.tif 000085
(2)配列番号：16:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：539アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：無関係
(D)トポロジー：無関係
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:16:
0003961570.tif 000086
0003961570.tif 000087
0003961570.tif 000088
(2)配列番号：17:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1910塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Beta vulgaris（Sugar Beet）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-16（NRRL B-21595N）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：1..1680
(D)他の情報：/product=”Sugar Beet Protox-1 coding region”
(xi)配列の記載：配列番号:17:
0003961570.tif 000089
0003961570.tif 000090
(2)配列番号：18:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：560アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：無関係
(D)トポロジー：無関係
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:18:
0003961570.tif 000091
0003961570.tif 000092
0003961570.tif 000093
(2)配列番号：19:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1784塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Brassica napus（rape）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-17（NRRL B-21615）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：47..1654
(D)他の情報：/product=”Rape Protox-1 coding region”
(xi)配列の記載：配列番号:19:
0003961570.tif 000094
0003961570.tif 000095
(2)配列番号：20:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：536アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：無関係
(D)トポロジー：無関係
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:20:
0003961570.tif 000096
0003961570.tif 000097
0003961570.tif 000098
0003961570.tif 000099
(2)配列番号：21:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1224塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Oryza sative（イネ）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-18（NRRL B-21648）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：1..936
(D)他の情報：/product=”Rice Protox-1 partial coding region”
(xi)配列の記載：配列番号:21:
0003961570.tif 000100
(2)配列番号：22:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：312アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：無関係
(D)トポロジー：無関係
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:22:
0003961570.tif 000101
0003961570.tif 000102
(2)配列番号：23:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1590塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Sorghum bicolor（モロコシ）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-19（NRRL B-21649）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY:misc＿feature
(B)位置：1..1320
(D)他の情報：/product=”Sorghum Protox-1 partial coding region”
(xi)配列の記載：配列番号:23:
0003961570.tif 000103
(2)配列番号：24:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：440アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：無関係
(D)トポロジー：無関係
(ii)分子型：蛋白質
(xi)配列の記載：配列番号:24:
0003961570.tif 000104
0003961570.tif 000105
0003961570.tif 000106
(2)配列番号：25:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：93塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”maize protox-1 intron sequence”
(xi)配列の記載：配列番号:25:
0003961570.tif 000107
(2)配列番号：26:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：2606塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：DNA（genomic）
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)由来：
(A)生物：Beta vulgaris（テンサイ）
(vii)直接の由来：
(B)クローン：pWDC-20（NRRL B-21650）
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：1..6
(D)他の情報：/note=”SalI site”
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：complement（1..538）
(D)他の情報：/note=”3'-5'方向のテンサイprotox-1の部分cDNA”
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：539..2606
(D)他の情報：/note=”3'-5'方向のテンサイprotox-1のプロモーター領域（pWDC-20からサブクローニングされた〜3kb PstI-SalI断片の部分配列）”
(xi)配列の記載：配列番号:26:
0003961570.tif 000108
0003961570.tif 000109
0003961570.tif 000110
(2)配列番号：27:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：31塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”PclP＿P1a-プラスミドclpP遺伝子プロモータートップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：4..9
(D)他の情報：/note=”EcoRI restriction site”
(xi)配列の記載：配列番号:27:
0003961570.tif 000111
（2）配列番号：28:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：32塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”Pclp＿P1b-プラスミドclpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：4..9
(D)他の情報：/note=”XbaI restriction site”
(xi)配列の記載：配列番号:28:
0003961570.tif 000112
(2)配列番号：29:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”Pclp＿P2b-プラスミドclpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：4..9
(D)他の情報：/note=”NcoI restriction site”
(xi)配列の記載：配列番号:29:
0003961570.tif 000113
(2)配列番号：30:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”Trps16＿P1a-プラスミドrps16遺伝子3'非翻訳領域XbaI/HindIIIトップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：4..9
(D)他の情報：/note=”XbaI restriction site”
(xi)配列の記載：配列番号:30:
0003961570.tif 000114
(2)配列番号：31:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：27塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”Trps16＿p1b-プラスミドrps16遺伝子3'非翻訳領域XbaI/HindIIIボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：4..9
(D)他の情報：/note=”HindIII restriction site”
(xi)配列の記載：配列番号:31:
0003961570.tif 000115
(2)配列番号：32:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：36塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”minpsb＿U-プラスミドpsbA遺伝子5'非翻訳領域38nt（blunt/NcoI）ATG開始コドン、トップストランドプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列の記載：配列番号:32:
0003961570.tif 000116
(2)配列番号：33:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：40塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”minpsb＿L-プラスミドpsbA遺伝子5'非翻訳領域38nt（blunt/NcoI）ATG開始コドン含有（ボトムストランドプライマー）”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列の記載：配列番号:33:
0003961570.tif 000117
(2)配列番号：34:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：32塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”APRTXPla-変異Arabidopsis protox遺伝子の5'-部分を増幅するためのトップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：misc＿feature
(B)位置：5..10
(D)他の情報：/note=”NcoI restriction site/ATG start codon”
(xi)配列の記載：配列番号:34:
0003961570.tif 000118
(2)配列番号：35:
(i)配列の特徴：
(A)長さ：24塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子型：他の核酸
(A)DESCRIPTION：/desc=”APRTXP1b-変異Arabidopsis protox遺伝子の5'部分を増幅するためのドトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(xi)配列の記載：配列番号:35:
0003961570.tif 000119