(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスパン菌(Bacillus polyfermenticus)の生産用液体培地であって、以下の成分、すなわち；
(ａ) ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜５％(重量／容量)、大豆粉１〜５％(重量／容量)、および、とうもろこし浸漬液２〜２０％(重量／容量)よりなる群から選択された１種または２種以上の成分；および
(ｂ) 第１リン酸カリウム０.０５〜０.５％(重量／容量)、第２リン酸カリウム０.０５〜０.５％(重量／容量)、塩化カルシウム２水和物０.０１〜０.５％(重量／容量)、硫酸マグネシウム７水和物０.０１〜０.１％(重量／容量)、硫酸銅５水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)、硫酸マンガン０.００１〜０.０１％(重量／容量)、硫酸鉄７水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)、および、硫酸亜鉛７水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)を含む微量成分、
の双方の成分を含む、ことを特徴とするビスパン菌の生産用液体培地。
【請求項２】
前記(ａ)成分が、ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜５％(重量／容量)、および、とうもろこし浸漬液５〜２０％(重量／容量)からなる請求項１に記載の液体培地。
【請求項３】
前記(ａ)成分が、ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、および、大豆粉１〜５％(重量／容量)からなる請求項１に記載の液体培地。
【請求項４】
前記(ａ)成分が、ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜３％(重量／容量)、とうもろこし浸漬液２〜１０％(重量／容量)、および、大豆粉１〜３％(重量／容量)からなる請求項１に記載の液体培地。
【請求項５】
前記ビスパン菌が、バチルス ポリファメンチクス SCD(Bacillus polyfermenticus SCD；ＫＣＣＭ １０１０４)である請求項１乃至４のいずれかに記載の液体培地。
【請求項６】
ビスパン菌(Bacillus polyfermenticus)の増殖方法であって、以下の工程、すなわち、
(１) 請求項１乃至４のいずれかに記載の液体培地にビスパン菌を接種し、および、
(２) ３０〜３７℃で、ｐＨ６.８〜７.２にて、当該ビスパン菌を好気的に培養する、
工程を含む、ことを特徴とするビスパン菌の増殖方法。
【請求項７】
前記ビスパン菌が、バチルス ポリファメンチクス SCD(Bacillus polyfermenticus SCD；ＫＣＣＭ １０１０４)である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(２)が、前記液体培地でのブドウ糖の消費に応じて、ブドウ糖の最終濃度が１％(重量／容量)になるように、一定の間隔でブドウ糖を添加する流加式方法に従って実施される請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体発酵によりビスパン菌を大量に増殖させる方法に関し、さらに詳細には、活性芽胞菌を獲得することができる、高収量のビスパン菌の生産法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医薬用及び整腸剤に使用されている細菌には、ビピドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、エンテロコカス（Enterococcus）属、クロストリジウムブチリクム（Clostridium butyricum)、ラクトバチルススポロゲネス（Lactobacillus sporogenes）、バチルスサブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルスポリファメンチクス（Bacillus polyfermenticus）等がある。これらのうち、バチルスポリファメンチクス（Bacillus polyfermenticus）菌は、活性芽胞を形成して生菌の大部分が腸に到達するので、長期間の腸疾患に対して治療効果を示す最も優秀な菌であって、一般にビスパン(Bispan)菌と呼ばれている。
【０００３】
ビスパン菌は、日本薬局方外医薬品成分規格に糖化菌(Amylolytic bacillus)といってバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルスメセンテリクス(Bacillus mesentericus)と一緒に掲載されているが（日本厚生省薬務局審査課監修：日本薬局方外医薬品成分規格735〜1125、1991年）、国際命名規約（例えば、Bergey's manual）による分類名には存在しない（Sneath, P.H.A.:Endospore-forming gram-positive rods and cocci. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 第１版、1104〜1207頁、Williams及びWilkins、Baltimore、1986年）。そして、各種研究によると、ビスパン菌は、形態及び生化学的性状の点からバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）と非常に類似していると認められている。しかしながら、ビスパン菌は、ラクトースを分解する能力があり、バチルスサブチリスに比べてグルコースとラクトースからアセト酸と乳酸をもっと多く生産するという点において、ビスパン菌は、バチルスサブチリス（Bacillus subtilis）と区別することができる。
【０００４】
ビスパン菌は、１９３３年日本の微生物学者である寺門賀述博士により空気から分離された芽胞性桿菌である。この菌は、各種酵素を分泌して、病原性菌であるチフス菌、パラチフス菌、赤痢菌、コレラ菌等を溶菌させて増殖を抑制する機能を有している。また、ビスパン菌を体内に摂取する場合、ビタミンＢ1、Ｂ2を供給することにより食欲及び消化作用を促進させることができ、且つ、非経口的感染の防御作用と経口的免疫能が増強されるという事実が明らかになっている。
【０００５】
ビスパン菌の培養及び適用については、特願昭１１−１２３号公報（日本国特許第１１５２８１号）「細菌を用いて腸疾患治療薬を製造する方法」における記載を挙げることができる。上記特許には、ビスパン菌の培養液を６５℃で１時間加熱した後、３３℃で２４時間放置し、さらに６５℃で１時間加熱する操作を４回繰り返す工程と、酢酸を用いて培養液を弱酸性にし、加温下に乾燥する工程と、ビスパン菌の培養菌体に０．３〜０．５％の硫酸水を加えて、得られた混合物を３７℃に維持した後、加温下に乾燥する工程及び一定量の培養菌体を澱粉及びラクトースに混合する工程を含む方法によって、腸疾患治療薬が製造されることが開示されている。
【０００６】
しかるに、上記のような製造方法では、ビスパン菌の複数の培養工程に基づく培養菌体回収において非常に多くの段階を経ることが要求され、これにより経済性が劣るという不都合を有する。また、従来ビスパン菌の培地として使用された培地（ブイヨン培地(Bouillon)）は、高価であるので、コスト高を招く原因になっていた。
【０００７】
従って、より経済的で、且つ高い歩留まりにてビスパン菌を大量生産することができる方法が希求されているところである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ビスパン菌の大量生産方法を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、ビスパン菌の培養液中の活性芽胞数を増加させることにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明によると、（１）ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜５％(重量／容量)、大豆粉１〜５％(重量／容量)及びとうもろこし浸漬液２〜２０％(重量／容量)よりなる群から選択された１種又は２種以上の成分（ａ）と、
第１リン酸カリウム０.０５〜０.５％(重量／容量)、第２リン酸カリウム０.０５〜０.５％(重量／容量)、塩化カルシウム２水和物０.０１〜０.５％(重量／容量)、硫酸マグネシウム７水和物０.０１〜０.１％(重量／容量)、硫酸銅５水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)、硫酸マンガン０.００１〜０.０１％(重量／容量)、硫酸鉄７水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)、硫酸亜鉛７水和物０.００１〜０.０１％(重量／容量)を含む微量成分（ｂ）とを含む液体生産培地に、ビスパン菌（Bacillus polyfermenticus）を接種する工程と、
（２）３０〜３７℃でｐＨ６.８〜７.２にて、好気的に培養する工程とを含むことを特徴とする液体培養によって当該ビスパン菌を培養する方法が提供される。
【００１１】
本発明による液体生産培地は、
ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜５％(重量／容量)、とうもろこし浸漬液５〜２０％(重量／容量)及び微量成分を、蒸留水に溶解して混合したもの、
ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、大豆粉１〜５％(重量／容量)及び微量成分を、蒸留水に溶解して混合したもの、あるいは
ブドウ糖１〜３％(重量／容量)、とうもろこし澱粉１〜３％(重量／容量)、とうもろこし浸漬液２〜１０％(重量／容量)、大豆粉１〜３％(重量／容量)及び微量成分を、蒸留水に溶解して混合したものであることが好ましい。
【００１２】
そして、前記ビスパン菌が、ビスパン菌ＳＣＤ（ＫＣＣＭ１０１０４）であり、前記培養が、培養途中での培地中のブドウ糖の消費に応じて、ブドウ糖の最終濃度が１％(重量／容量)になるように、一定の間隔でブドウ糖を添加する流加式方法により行われるとよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
培地組成が菌の生産に影響を及ぼすことは公知となっているところであるが、本発明者らは、経済性及び効果に優れた炭素源、窒素源及び微量元素を選定し、これに最も適合する培養条件を究明することにより、生産条件の経済性を高めることを可能とした。
【００１４】
ビスパン菌の総生菌の数は、発酵培養液を０．１％（重量／容量）のペプトン水で連続的に希釈した後、平板培地に０．１ｍｌずつ分株し、３７℃で２４時間培養した後、コロニー形成単位(Colony Forming Unit;CFU)を測定することにより計算した。活性芽胞菌の数は、発酵培養液を８０℃で２時間熱処理して栄養細胞を死滅させ、無菌の希釈液で連続的に希釈した後、ＴＳＡ(Tryptic Soy Agar)平板培地に０．１ｍｌの希釈された培養液を滴下し、軟質寒天(soft agar)でオーバーレイ(overlay)し、３７℃で２４時間培養した後、測定した。
【００１５】
本発明の方法により培養された培養液は、適宜の方法で処理して粉剤又は液剤等で製剤化することができる。例えば、粉剤として製剤化しようとする場合は、噴霧式乾燥法、凍結乾燥法等を使用することができる。噴霧式乾燥法では、展着剤、安定剤、希釈剤等を乾燥時に添加することにより粉末を獲得することができる。この際使用される展着剤、安定剤又は希釈剤等は、当業界に周知されており、その具体的な種類と量は、製剤の種類及び使用目的に合わせて当業者により容易に決定されることができる。
【００１６】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの例に限定されるものではない。下記各種例において、％は、他の説明がない限り重量％である。
【００１７】
【実施例】
参考例１
本発明者らは、市販されているビスパン製剤からビスパン菌を分離し、同定した。
【００１８】
すなわち、輸入生菌製剤であるBisroot tablet（登録商標）の粉末を栄養寒天又はＴＳＡ(Tryptic Soy Agar)に塗抹し、３７℃で培養した。形態、色相及び表面特徴が異なると思われるコロニーを選択して、希釈法で純粋分離した。各々の菌を、グラム染色法、マラカイトグリーン(Malachite Green)胞子染色法、鞭毛染色法等を用いて顕微鏡で観察した。生化学的性質及び活性は、文献（Biochemical tests for Identification of medical bacteria;Manual for the Identification of medical bacteria）に提示された方法で試験し、その結果を、日本国で発表された腸疾患有効細胞の実験結果と比較した。
【００１９】
本発明者らは、このように分離されたビスパン菌をバチルスポリファメンチクスＳＣＤ（Bacillus polyfermenticus ＳＣＤ）と命名し、１９９７年８月５日付で韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センター(Korea Culture Center of Microorganisms；ＫＣＣＭ)にブタペスト条約の規定によって寄託し、当該ビスパン菌はＫＣＣＭ１０１０４の受託番号を付与された。
【００２０】
本発明によって分離されたビスパン菌の菌株の特性を同定した結果は、以下の表１に示す通りである。
【００２１】
【表１】
0003954711.tif 000002
【００２２】
実施例１
使用菌株：ビスパン菌(Bacillus polyfermenticus)ＳＣＤ(ＫＣＣＭ１０１０４)
種培養：培地はＴＳＢ(Tryptic soy broth)を用いて、５００ｍｌのバフル付フラスコに種菌を１白金耳(one loopful)の量で接種して、３７℃で２００ｒｐｍの攪拌速度で１０時間振盪培養して種培養を実施した。
【００２３】
［培養方法］
【００２４】
【表２】
0003954711.tif 000003
【００２５】
表２に示す生産培地の成分のうち、とうもろこし澱粉、大豆粉及び塩化カルシウム２水和物のような熱安定性のものは、１２１℃で２０分間加圧滅菌した。また、熱に不安定であるか、または錯化合物を生成する残りの成分は、ポアサイズが０．４５μｍである使い捨て用の無菌濾過器（メンブレンフィルター）を通過させた後、無菌的に発酵槽に添加した。
【００２６】
５Ｌの発酵槽に３Ｌの前記生産培地を入れ、前記種培養液３０〜６０ｍｌを接種して、３０〜３７℃で培養中にｐＨを６．８〜７．２に調節し、通気量は、１．０ｖｖｍに維持した。回転攪拌数は、５００〜７００ｒｐｍにして培養した。接種してから７２〜９６時間が経過した後、培養を終了した。
【００２７】
培養初期に、培地中にブドウ糖が消費されたことを確認した後、３〜４回にかけてブドウ糖の濃度が培地中に１％になるように、滅菌された濃縮ブドウ糖を供給する流加式培養法(fed-batch cultivation)を採択した時、表３に示すように、回分式培養(batch cultivation)に比べてビスパン菌の数が非常に増加したが、最大活性芽胞数が約５８％増加した。
【００２８】
【表３】
0003954711.tif 000004
【００２９】
実施例２〜４
実施例１と同様の条件で培養を行った。この際に使用された生産培地の組成は、以下の表４に示す通りである。
【００３０】
【表４】
0003954711.tif 000005
【００３１】
上記表４に示した各々の培地を用いて、ビスパン菌ＳＣＤを回分式で培養するか、又は上記実施例１と同様の条件の流加式で培養した培養液の最大活性芽胞数は、以下の表５に示す通りである。
【００３２】
【表５】
0003954711.tif 000006
【００３３】
実施例５
本発明による培地が、ビスパン菌の生産に優れていることを確認するため、実施例１の培地及びバチルス菌の培養に通常的に幅広く使用されるＴＳＢ(Tryptic Soy Broth)培地を用いて実施例１と同様の条件で回分式培養を行い、最大活性芽胞数及び生産性を比較した。その結果は、下記表６に示す通りである。
【００３４】
【表６】
0003954711.tif 000007
【００３５】
上記表６に示される結果から、本発明による培地を用いた培養において、ビスパン菌の生産が約４４％程度増加することを確認することができる。
【００３６】
実施例６
本発明による培地が、ビスパン菌の生産に優れていることを確認するため、実施例１と同様に実施した。すなわち、培地中のブドウ糖が消費された後、濃縮ブドウ糖を１％の濃度に添加する流加式の培養方式を採択した。２つの培地を用いて培養を行った後、得られた培養液の最大活性芽胞数及び生産性を比較した。結果は、下記表７に示す通りである。
【００３７】
【表７】
0003954711.tif 000008
【００３８】
上記表７の結果から、本発明による培地を用いた流加式培養において、ビスパン菌の生産が約９０％程度増加することを確認することができる。
【００３９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によると、従来のビスパン菌の培養方法に比べて安価な培地を使用しながらも、従来の方法に比べて一層生産性を向上させることができる。