(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、４又は６に記載のアミノ酸配列から成り、且つアントシアニン芳香族アシル基転移活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号：１、４又は６に記載のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸の付加、除去又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列から成り、且つアントシアニン芳香族アシル基転移活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含んで成るベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターにより形質転換された宿主。
【請求項５】
前記宿主が、微生物又は動物細胞である、請求項４に記載の宿主。
【請求項６】
前記宿主が、植物細胞である、請求項４に記載の宿主。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の遺伝子によりコードされているタンパク質。
【請求項８】
請求項４〜６の何れか１項に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、アントシアニン芳香族アシル基転移活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項４〜６の何れか１項に記載の宿主細胞を培養し、当該培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、アントシアニン芳香族アシル基転移活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
粗酵素抽出液を、シバクロンブルー3 GAを固定した樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより処理することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７に記載のタンパク質に対する抗体にタンパク質を結合させることを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子及びその利用に関するものである。更に詳しくは、リンドウ（Gentiana triflora var．japonica）、ペチュニア（Petunia hybrida）、シソ（Perilla ocimoides）及びサイネリア（Senecio cruentus）由来の芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子及びその利用に関するものである。
背景技術
花産業は新規かつ種々の品種を開発することに努力している。新規な品種の育成のための有効な方法の一つとして花の色を変えることがあり、古典的な育種方法を用いて、ほとんどの商業的品種について広範囲な色を作出することに成功している。しかしながら、この方法では種ごとで遺伝子プールが制限されていることから、単一の種が広範囲の種類の着色品種を有することは稀である。
花の色は主として２つのタイプの色素、即ちフラボノイド及びカロチノイドに基づき、フラボノイドは黄色から赤ないし青色の範囲に寄与し、カロチノイドはオレンジ又は黄色の色調に寄与する。花色に主たる寄与をするフラボノイド分子はシアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン及びペラルゴニジンの配糖体であるアントシアンであり、異なるアントシアンが顕著な花の色の変化をもたらす。さらに花の色は無色のフラボノイドの補助発色、金属錯体形成、グリコシル化、アシル化、メチル化及び液胞のｐＨにより影響される（Forkmann，Plant Breeding 106：1，1991）。
アシル化されたアントシアンは、サイネリア（Senecio cruentus）由来のシネラリン（Goto et al.，Tetrahedron 25：6021，1984）、ツユクサ（Commelina communis）由来のアオバニン（Goto and Kondo，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．30：17，1991）及びオヤマリンドウ（Gentiana Makinoi）由来のゲンチオデルフィン（Yoshida et al.，Tetrahedron 48：4313，1992）を始め、自然界からの数多くの分離例が報告されている（タイマツバナ：Kondo et al.，Tetrahedron 26：5879，1985；シソ、パンジー：Goto et al.，Tetrahedron 27：2413，1987；シマフムラサキツユクサ：Idaka et al.，Tetrahedron 28：1901，1987；ヤマノイモ：Shoyama et al.，Phytochemistry 29：2999，1990；アカキャベツ、キキョウ、ロベリア、ラークスパー、チョウマメ：Goto and Kondo，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．30：17，1991．；ニンジン：Glabgen et al.，Phytochemistry 31：1593，1992；アサガオ：Lu et al.，Phytochemistry 32；659，1992；Saito et al.，Phytochemistry 40：1283，1995；キランソウ、トウバナ、オドリコソウ、ラベンダー、イヌハッカ、オオキセワタ、プレクトランサス、ウツボグサ、ヒゴロモソウ、ネジリイモ：Saito and Harborne，Phytochemistry 31：3009，1992；オオオニバス：Strack et al.，Phytochemistry 31：989，1992；カンパニュラ：Brandt et al.，33：209，1993；リンドウ：Hosokawa et al.，Phytochemistry 40：941，1995；ヒヤシンス：Hosokawa et al.，Phytochemistry 40：567，1995；）。
これらのアントシアンを含むフラボノイドを修飾するアシル基は構造的に２種類に分けられる。一つはハイドロキシ桂皮酸を中心とする芳香族アシル基であり、もう一つはマロニル基のような脂肪族アシル基である。これらのアシル基転移反応のうち、グルコースを介して芳香族アシル基、好ましくはクマル酸やコーヒー酸が結合したアントシアンはその吸収極大が長波長側に移動することがアサガオ（Pharbitis nil）のアントシアン系色素を用いた実験により観察された（Dangle et al．Phytochemistry 34：1119，1993）。
さらに、サイネリア（Senecio cruentus）由来のシネラリンは１個の脂肪族アシル基と３個の芳香族アシル基を有するが、シネラリンからの芳香族アシル基の解離により、中性の水溶液中で色素の安定性が低下することが報告されている（Goto et al.，Tetrahedron 25：6021，1984）。また、リンドウ（Gentiana makinoi）に由来するゲンチオデルフィンはその分子内に存在する２つの芳香族アシル基により、サンドイッチ型の分子内スタッキングが起こり、水溶液中で色素が安定化されることが報告されている（Yoshida et al.，Tetrahedron 48：4313，1992）。さらに、吉田らは、リンドウのアントシアニンにはアントシアニンの５位のグルコースと３’位のグルコースのそれぞれにアシル基が結合していることを明らかにした（Tetrahedron 48，4313，1992）。また、シソ（Perilla ocimoides）の葉のアントシアニンはシアニジン３，５−ジグルコシドの３位のグルコースにクマール酸が結合したシソニンであることも報告されている（Tetrahedron Letters 27，2413-2416，1978）。
しかしながら、これらの研究は有機化学的側面から天然色素の構造学的研究においてなされており、アシル基を転移する酵素を単離するなどの生化学的側面からの研究はなされていない。
また、植物におけるアントシアン系色素へのアシル基転移酵素のうち、脂肪族アシルであるマロニル基転移酵素についてはパセリの培養細胞（Matern et al.，Arch．Biochem．Biophys．208：233，1981；Matern et al.，Arch．Biochem．Biophys．226：206，1983；Matern et al.，Eur．J．Biochem．133：439，1983）やCicer arientiumの実生（Koster et aｌ.，Arch．Biochem．Biophys．234：513，1984）からのものを始めとして多くの報告が為されている。
また、芳香族アシル基転移反応は1980年にナデシコ科の植物であるSilene（Kamsteeg et al.，Biochem．Physiol．Pflanzen 175：403，1980）で初めて示され、Matthiolaの可溶化酵素画分にも同様の芳香族アシル基転移酵素活性が見い出されている（Teusch et al.，Phytochemistry 26：991，1986）。
しかしながら、これらの報告では酵素活性の存在を示したのみに留まっており、対応する酵素蛋白質を特定したり、その一次構造やさらにはそれをコードする遺伝子についてはなんら知見が得られていない。それ以外の芳香族アシル基転移酵素についても蛋白質や遺伝子の一次構造を明らかにした報告はなく、さらにこのアントシアン系色素のアシル化反応を花色幅の拡大に積極的に利用して花を育種した例や、アシル化を用いてアントシアンの安定化をはかった報告もない。
一方、ペチュニア（Petunia hybrida）のアントシアニンの生合成経路はよく研究されており（Wiering，H．and de Vlaming，P．Inheritance and biochemistry of pigments．Petunia，P49-65，（1984）、Griesbach，R．J.，asen，S．and Leonhardt，B．A.，Phytochemistry，30，1729-1731，1991）、アシル基を含むアントシアニンが存在することが知られている。ペチュニアのアントシアニンのアシル基はクマル酸あるいはカフェ酸が知られており、アントシアニンの３位のルチノシドに一分子のクマル酸又はカフェ酸が結合していて、化学構造はアントシアニジンがマルビジンの場合、それぞれ3-O-（6-O-（4-O-クマロイル）-α-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル-マルビジン、3-O-（6-O-（4-O-カフェオイル）-α-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル−マルビジンであるとされていた。しかし、アシル基を２つ持つアントシアニンについての報告例はなかった。
発明の開示
本発明は、芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子及びその利用に関するものである。即ち、当該利用に関しては、植物において、フラボノイド、好ましくはアントシアンへのアシル基転移反応を制御する方法が挙げられ、それにより単一種が広範囲の花色を発現する可能性を提供する。特に、芳香族アシル基の転移により、アントシアンの吸収極大が長波長側に移動することから、既存の花色に青味を持たす場合に有効であると考えられる。
これらの技術を実現化させるためには芳香族アシル基転移反応をつかさどる酵素を明らかにし、その酵素をコードするｃＤＮＡを分離する必要がある。更に、一つのアシル基転移酵素のｃＤＮＡから遺伝子の相同性を利用して他のアシル基転移酵素遺伝子の分離が可能となる。また、アシル化によりアントシアンの安定性が増すことから、安定なアントシアン色素の生産も可能となる。
本発明者らは、リンドウの花弁からアシル基転移酵素を精製し、その一次構造を決定した。更には、遺伝子組換え技術を用いてリンドウ、ペチュニア、シソ及びサイネリアのアシル基転移酵素のｃＤＮＡを単離し、構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、本発明はリンドウ、ペチュニア、サイネリアの花弁及びシソの葉に存在するアシル基転移酵素をコードしているＤＮＡ配列を提供するものである。また、本発明に係る酵素を用いてアントシアン系色素をアシル化することにより花色を変化させることができ、アントシアンの安定性を増すことができる。
具体的な記載
アシル基転移酵素をコードする遺伝子は例えば次のようにして得ることが出来る。即ち、まず、リンドウの花弁よりアシル基転移酵素を精製する。従来、本発明が成される以前に、芳香族アシル基転移酵素の精製に成功した例はなく、本発明者らは各種のクロマトグラフィー法、特にシバクロンブルー3ＧＡ（Cibacron Blue 3GA）を固定した樹脂（例えば、ブルーセファロース（登録商標）樹脂等）を用いたアフィニティークロマトグラフィー法を行うことにより初めて当該酵素の精製に成功した。
次に、常法に従ってアシル基転移酵素の部分アミノ酸配列を解明し、それらのアミノ酸配列に対応する合成ヌクレオチドを作製する。
一方、同じリンドウの花弁よりｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡを抽出し、常法により、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、更にｃＤＮＡライブラリーを作製する。前述の２本鎖ｃＤＮＡを鋳型にし、前述の合成ＤＮＡとｃＤＮＡを合成する際に使用した合成ＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により、アシル基転移酵素遺伝子に特異的なＤＮＡ断片を取得する。次に、このＤＮＡ断片をプローブにして、前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを得る。そして、このクローンから回収されるプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ塩基配列を決定する。更に精製したアシル基転移酵素の分析により得られたアミノ酸配列とＤＮＡ塩基配列から推定したアシル基転移酵素のアミノ酸配列とを比較することにより、陽性クローンが求めるｃＤＮＡクローンであることを確認する。
また、本発明者らは、ペチュニア品種サフィニアパープル（サントリー（株））の花色が通常の赤紫から紫に変化した変異株（ＶＭ）を見いだし、アントシアニンの構造決定を、例えば吉田らの文献（Yoshida et al.，Tetrahedron 48；4313，1992）に記載の方法に従って行った。
本発明のＤＮＡとしては、例えば配列番号：１〜６のいずれかに記載するアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質も、もとの蛋白質と同様の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸により置換されている修飾されたアミノ酸配列を有し、なお、芳香族アシル基転移活性を維持している蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。
本発明はまた、配列番号：１〜６のいずれかに記載の塩基配列又はその部分、例えばコンセンサス領域の６個以上のアミノ酸をコードする部分に対して、例えば２ないし５×SSC，50℃の条件下でハイブリダイズし、且つ芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関する。なお、最適なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその長さにより異り、塩基配列が短くなるに従ってハイブリダイゼーション温度は低くするのが好ましく、例えばアミノ酸６個をコードする塩基配列（18塩基）の場合は、50℃以下の温度が好ましい。本発明はさらに、配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して15％以上、好ましくは25％以上、例えば30％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ芳香族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関する。
生来の塩基配列を有するDNAは、実施例に具体的に記載するように、例えばcDNAライブラリーのスクリーニングにより得られる。
また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするDNAは、生来の塩基配列を有するDNAを基礎にして、常用の部位特定変異誘発やPCR法を用いて合成することができる。例えば、修飾を導入したい部位を含むDNA断片を、上記により得られたcDNA又はゲノミックDNAの制限酵素消化により得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発又はPCR法を実施し、所望の修飾を導入したDNA断片を得、これを、目的とする酵素の他の部分をコードするDNAに連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするDNAを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするDNAを、所望の制限酵素により切断し、得られたDNA断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合には、不足部分を合成DNAを連結することにより補えばよい。
また、このクローンを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られた遺伝子がアシル基転移酵素をコードしていることを確認し、アシル基転移酵素遺伝子の翻訳領域を明らかにすることにより本発明に係るアシル基転移酵素をコードする遺伝子が得られ、更に、当該遺伝子を発現させることにより遺伝子産物である目的のアシル基転移酵素蛋白を得ることができる。
あるいはまた、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、前記蛋白を得ることができる。
従って本発明はまた、前記のDNAを含んでなる組換えベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、等常用の宿主を用いることができる。
真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。酵母としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus）属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ペニシリウム（Penicillium）属微生物等が挙げられる。さらに、動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、又はカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターは、それらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーター及びターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trp Ｃ等が使用される。また、動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモーター、SV40レートプロモーター等が使用される。
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も、常法に従って行うことができる。
前記蛋白質の製造方法においては、前記の発現ベクターにより形質転換された宿主を培養、栽培又は飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする蛋白質を回収、精製することができる。
なお、本明細書においてはリンドウ、ペチュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル基転移酵素について述べているが、当該酵素の精製法をそのまま又は一部を改変して、他の植物のアシル基転移酵素を精製し、当該酵素に係るアミノ酸配列を決定することにより、当該酵素をコードする遺伝子をクローニングすることができる。更に、本発明に係るリンドウ由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡをプローブとして用いることにより、リンドウから別のアシル基転移酵素のｃＤＮＡ、ペチュニアから別のアシル基転移酵素のｃＤＮＡを得ることができた。従って、アシル基転移酵素の遺伝子の一部または全部を用いると、他のアシル基転移酵素遺伝子を得ることができる。また、これらのアミノ酸配列を比較したところ、保存されているアミノ酸配列があった。この領域を用いて、シソ及びサイネリア由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡを得ることに成功したが同様の手法を用いることにより、他の植物に応用し、類似のアシル基転移酵素のｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡクローンを得ることが可能である。
また、本明細書において示したように、リンドウ、ペチュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル基転移酵素を精製し、常法に従って当該酵素に対する抗体を得ることにより、その抗体と反応する蛋白質を作るｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡをクローニングすることができる。従って、本発明はリンドウ、ペチュニア、シソ及びサイネリア由来のアシル基転移酵素の遺伝子のみに限定されるものではなく、広く芳香族アシル基転移酵素に関するものである。
さらに本発明は、アシル基転移酵素の遺伝子を導入することにより、色が調節された植物もしくはその子孫又はそれらの組織に関するものであり、その形態は切花であってもよい。
また、本明細書においてはアントシアンを含むフラボノイドのアシル基転移反応において、アシル基の供与体としてｐ−クマロイル−ＣｏＡ又はカフェオイル−ＣｏＡ等のＣｏＡエステルを挙げたが、ｐ−クマロイル、フェルロイル又はシナポイル−１−Ｏ−グルコースといったハイドロキシシンナモイル−１−Ｏ−グルコースも芳香族アシル基の供与体としての利用が可能であるので（Glassgen and Seitz，Planta 186：582，1992）、本発明に係る酵素を用いた利用が可能である。
実施例
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。実験の手順は特に記述しない限りSambrookらのMolecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）に従った。
実施例１．植物からのアシル基転移酵素の検索
（１）基質の調製
デルフィニジン３，５−ジグルコシドおよびシアニジン３，５−ジグルコシドはバーベナ（Verbena hybrida）の一品種であるタピアンバイオレット（サントリー（株）より購入可能）の花弁からそれぞれのジアセチル体を抽出し、脱アセチル化することにより取得した。タピアンバイオレットの花弁（３４８ｇ）を液体窒素とともにホモジナイザーで摩砕し、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液１．５Ｌに浸して３日間放置した。
濾紙上にケイソウ土（＃１００）を敷き詰めて吸引ろ過し、ロータリーエバポレーターで約半分量に濃縮して、ＨＰ−２０（ファルマシア社）にて、ゲル濾過を行った。８００ｍｌの蒸留水で洗浄後、５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ  ８００ｍｌで色素画分を溶出した。エバポレーターで濃縮後、凍結乾燥して、粗色素（７．３ｇ）を得た。
タピアンの主色素はデルフィニジン及びシアニジンの３，５−ジアセチルグルコシドであるため、以下の脱アセチル化操作を行った。粗色素１ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、窒素ガスを１５分間通気して溶存酸素を除いた後、氷冷した。
一方で、１Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍｌから同様に溶存酸素を除き、氷冷下で先の色素溶液に撹拌しながら滴下し、更に３０分間撹拌して加水分解反応をさせた。６Ｎ塩酸１ｍｌを加えて反応を停止させ、蒸留水５ｍｌを加えてエバポレーターで約半量に濃縮し、終濃度１０％になるようにメタノールを加えて２ｍｌずつＳｅｐ  Ｐａｃ  Ｃ１８カラム（ウォーターズ  アソシエーション社）にアプライし、蒸留水５ｍｌで洗浄した後、３０％アセトニトリル、０．６％ＴＦＡ２ｍｌで溶出させた。
溶出液をすべて集めてエバポレーターで濃縮し、ＨＰＬＣによる分取を行った。ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ＯＤＳ−１０／２０（５０×３００ｍｍ；野村化学（株））カラムを用い、１２０分間でＴＦＡが０．１％から０．３％、アセトニトリルが１０％から３０％の直線濃度勾配によって溶出させた。毎分３２ｍｌの流速で０．５分毎に分取し、各画分の色素画分の吸収スペクトルを測定して、デルフィニジン３，５−ジグルコシドおよびシアニジン３，５−ジグルコシドを分離してそれぞれを濃縮、凍結乾燥した（デルフィニジン３，５−ジグルコシド  ７５ｍｇ、シアニジン３，５−ジグルコシド  ５０ｍｇ）。各々を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．５％ＴＦＡに溶解して、使用するまで−８０℃に保存した。
もう一方の基質であるヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡの合成は以下の方法で行った。最初に、文献（Stockigt and Zenk，Z．Naturforsch．30：352，1975）に従ってカフェ酸（ナカライテスク社）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）よりエステルを合成した。このエステル０．５ｍｍｏｌを２ｍｌのアセトンに溶解し、一方でコエンザイムＡ（ＣｏＡ：ＫＯＨＪＩＮ）０．１ｍｍｏｌと炭酸水素ナトリウム１ｍｍｏｌとを２０ｍｌの水に溶解して、これに先のエステル溶液を１滴ずつ加えた。
撹拌しながら窒素ガスの下で室温で一晩反応させた後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、遠心（２７０００×ｇ、１０分）によって不溶物を除いて、ＨＰＬＣで目的の生成物を分取した。ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ＯＤＳ−１０／２０（５０×３００ｍｍ；野村化学（株））カラムを用い、０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリルが４０分間で１８％から３６％の直線濃度勾配によって溶出させた。毎分３２ｍｌの流速で０．８分毎に分取し、各画分の吸光スペクトル（２００〜４００ｎｍ）を調べて３４４〜３４８ｎｍに極大吸収を持つ画分をカフェオイルＣｏＡ画分として集めた。それらをロータリーエバポレーターで濃縮した後、同じカラムで再び分離した。
但し、アセトニトリル１８％、ＴＦＡ０．１％の等濃度クロマトグラフィーで分離を行い、同様に吸光スペクトルを調べて、目的の化合物を含む画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥した。この方法で３５μｍｏｌの生成物が得られた。また、上記の方法中カフェ酸のかわりにクマル酸を用いることによりｐ−クマロイル−ＣｏＡが合成でき２ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水に溶解して、使用するまで−８０℃に保存した。
（２）粗酵素液の抽出方法
酵素を抽出する植物組織（花弁や食用部分等）３ｇを液体窒素で凍結させて乳鉢上で磨砕した。１０ｍｌの抽出用緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール）を加えて更に磨砕し、ガーゼ３層で濾過した。ＤＯＷＥＸ（１−Ｘ２、１００−２００ｍｅｓｈ；室町化学工業（株））３ｇを添加して１０分間撹拌した後に吸引ろ過によって樹脂を除去し、遠心分離（２７０００×ｇ、２０分）によって植物体残査を除いた。７０％飽和硫安で塩析を行い、タンパク質を沈殿させた。沈殿を１ｍｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、遠心分離（２７０００×ｇ、５分）によって不溶物を除去した後、溶解用緩衝液で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ−１０；ファルマシア社）を用いて脱塩した溶液を粗酵素液として用いた。
（３）酵素活性の測定方法
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、デルフィニジン３，５−ジグルコシド  ２４ｎｍｏｌ、カフェオイル−ＣｏＡ  ２１．５ｎｍｏｌ、及び酵素液２０μ１を含む反応液５０μｌを３０℃で１０分間反応させた。１３．８％（ｖ／ｖ）酢酸を含むアセトニトリル５０μｌを加えて反応を停止させ、遠心分離（１８０００×ｇ、５分）によって不溶物を除いた後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。分析はＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、６．０×１５０ｍｍ；ワイエムシィ社）を用い、２１．６％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸を毎分１ｍｌの流速で流し、反応液２０μｌを分析した。化合物の検出には三次元クロマトグラフィーシステム（ＣＬＡＳＳ−ＬＣ１０；（株）島津製作所）を使用し、生成物は、基質にはない３３０ｎｍ付近に極大吸収をもつこと、及び可視部の吸収極大値が５１９ｎｍから５２５ｎｍへと約６ｎｍ長波長側に移動していることから、アシル基（カフェ酸）が結合し、デルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシドが生成していることを確認した。
５２０ｎｍの波長で検出し、基質（デルフィニジン３，５−ジグルコシド）と生成物（デルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシド）とのピーク面積の和に対する生成物のピーク面積の比を求め、生成物のモル数を計算して酵素活性（ｋａｔ）とした。このＨＰＬＣ分析における各化合物の展開時間は次の通りである。カフェオイル−ＣｏＡ：６．３分、デルフィニジン３，５−ジグルコシド：３．３分、デルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシド：５．３分。
但し、この反応条件下においては反応液中のデルフィニジン３，５−ジグルコシドがアシル基転移酵素により、カフェ酸で修飾されることにより、反応液の色が濃青色から赤紫色に変化するため、簡便な方法として、マイクロタイタープレート中にて反応を行い、色の変化によって酵素活性を調べることができる。
なお、反応後のプレートを室温で長期間（１日〜１週間）放置すると、アシル化されていないデルフィニジン３，５−ジグルコシドは無色化するのに対して、酵素の働きによってアシル化されたデルフィニジン３，５−ジグルコシドでは赤紫色が残ることから、デルフィニジン３，５−ジグルコシドがアシル化されることによって中性からアルカリ性の水溶液中での安定化が認められた。同様にシアニジン３，５−ジグルコシドを基質とした場合も反応液の色が赤紫色から濃青色に変化し、色素が安定化することから、簡易的酵素アッセイ方法での酵素活性の検出が可能である。
一方、カフェオイル−ＣｏＡのかわりにｐ−クマロイル−ＣｏＡを基質とした場合もアシル化による色の変化及びアントシアニンの安定化が認められるが、色調の変化の度合いはカフェオイル−ＣｏＡの場合に比べ少ない。
（４）アシル基転移酵素の検索
各種の植物（リンドウ、アイリス、デルフィニウム、ストック、トルコキキョウ、ナデシコ、スイートピー、ラークスパー、パンジー、サイネリア（以上、花弁）、赤キャベツ、赤タマネギ、金時ニンジン、西洋ニンジン、ムラサキイモ、シソ（以上、食用部分）及びナス（果実上皮部分））から上記の方法によって粗酵素液を抽出し、酵素活性を測定したところ、トルコキキョウ、ナデシコ及び、リンドウに各々０．６３、０．００１２及び２１．８ｎｋａｔ／ｍｇ蛋白質のアシル基転移活性が認められた。抽出タンパク質当たりのアシル基転移酵素活性が最も高いリンドウを酵素精製の材料として用いることにした。
なお、タンパク質濃度の定量にはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。
実施例２．リンドウ由来のアシル基転移酵素の精製
（１）酵素の精製
エゾリンドウ（Gentiana triflora var．japonica）の花弁から酵素の精製を行った。以下の実験は記載がない限り、０〜４℃で行った。エゾリンドウの花弁３ｋｇを液体窒素存在下でエクセル・オート・ホモジナイザー（ＤＸ−３；日本精機製作所）を用い磨砕した。８Ｌの抽出用緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１０μＭ  ｐ−アミジノフェニルフッ化メタンスルフォニル塩酸塩（ｐ−ＡＰＭＳＦ；和光純薬工業（株））、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ；ナカライテスク社））とポリクラールＳＢ−１００（和光純薬工業（株））５００ｇを加えてポリトロンで完全に粉砕した。
粉砕液をガーゼ４層で搾ったのち、さらに遠心分離（１１０００×ｇ、３０分）して細胞残査を除去した。４０％飽和硫安で塩析を行い、不溶物を除去した後に７０％飽和硫安で再び塩析を行った。沈殿を２５０ｍｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、遠心分離によって不溶物を除去した後、同緩衝液で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（９５×１１０ｍｍ；ファルマシア社）のカラムを用いて脱塩した。蛋白質を含む画分を集め（８６０ｍｌ）、以下のクロマトグラフィーに供した。
なお、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ及びＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅの各クロマトグラフィーは室温でＦＰＬＣシステム（ファルマシア社）を用いて行った。
まず、溶解用緩衝液で平衡化させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２６×１００ｍｍ；ファルマシア社）にアプライし、同じ緩衝液で十分に洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を６０分間で０Ｍから０．４Ｍに変化させる直線勾配により溶出させた（８ｍｌ／ｍｉｎ）。酵素活性のある画分を集めた（１３０ｍｌ）後、アフィニティクロマトグラフィーを行った。溶解用緩衝液で平衡化させたＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ（５ｍｌ、１６×２５ｍｍ；ファルマシア社）を３本直列に繋いだカラムにアプライし、同緩衝液で十分に洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出させた。活性画分を７０％飽和の硫安で塩析し、蛋白質の沈殿を得た。
この沈殿物を１ｍｌの溶解用緩衝液に懸濁して遠心分離によって不溶物を除いた後、溶解用緩衝液で平衡化させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（２５×１１５０ｍｍ；ファルマシア社）にアプライした。毎分０．２ｍｌの流速で、約３ｍｌずつ分取し、再び活性画分を集めて（２７ｍｌ）、１Ｍになるように硫安を加えた。十分に撹拌した後、遠心分離（３９０００×ｇ、１０分）により不溶物を除去し、１Ｍ硫安を含む溶解用緩衝液で平衡化させたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ５／５（５．０×５０ｍｍ；ファルマシア社）にアプライした。
毎分０．５ｍｌの流速で、十分に洗浄した後、硫安濃度を６０分間で１Ｍから０Ｍに直線的に下げることにより蛋白質を流出させた。０．５ｍｌずつ分取した各画分の酵素活性を測定し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％  アクリルアミドゲル；第一化学（株））で分析した結果、ほぼ単一の蛋白質として分子量約５０，０００のバンドが認められ、且つこの蛋白量と活性との相関が認められることから、この蛋白質が目的のアシル基転移酵素であると断定した。更に単一標品を得るために活性を持つ画分（１２ｍｌ）を逆相ＨＰＬＣにより精製した。
カラムはＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ３００Ｃ４−ＨＧ−５（４．６×２５０ｍｍ；野村化学（株））を用い、毎分１ｍｌの流速で、トリフルオロ酢酸０．１％存在下、３０分でアセトニトリル濃度を４０．５％から５６．７％の直線濃度勾配で変化させることにより溶出させた。２８０ｎｍの吸収をモニターしながら１ｍｌずつ分画し、さらに各画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析して分子量約５０，０００の蛋白質を含む画分を集めた。このＨＰＬＣ操作を３０回繰り返し、スピードバック（サバント社）で濃縮することにより約０．２ｍｇの単一蛋白質標品を得ることができた。
（２）精製蛋白質の分析
５００ｐｍｏｌの精製標品をアミノ酸シークエンサー（ＰＳＱ−１；（株）島津製作所）に供したところ、エドマン分解の第一段目で２００ｐｍｏｌのグルタミン酸、更に第二段でも９０ｐｍｏｌのグルタミン酸が検出されたが、三段目以降は判読不能であったため、本酵素のＮ末端は何らかの形でブロックされていると考えられた。
しかしながら、Ｎ末端がグルタミン酸である場合にはピログルタミル基が生じ、エドマン分解によるシークエンスでは上述のような結果を示すことが知られていることから本酵素のＮ末端はグルタミン酸である可能性が高い。
残りの沈殿を８０μｌの４５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、３．６Ｍ尿素、０．０９％ＳＤＳを含む溶液に溶解し、リシルエンドペプチダーゼ（ＬｙｓｙｌＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ：Achromobactor lyticus由来；和光純薬工業（株））１６ｐｍｏｌを加えて、３７℃で６時間反応させた。反応液をそのままＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ３００Ｃ４−ＨＧ−５カラムで分離した。
分離条件は、０．１％トリフルオロ酢酸のもと、７０分でアセトニトリル濃度が０％から８０％の直線濃度勾配、毎分０．７ｍｌの流速で、２１０ｎｍの吸収をモニターしながら吸収のピーク画分のみを分取した。得られた１３本のピーク画分のうち、アセトニトリル濃度が３２％から４０％の時点で溶出されたピーク画分の３本を、スピードバックによる濃縮後、さらにＯＤＳカラム（ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ  ３００ＯＤＳ−ＨＧ−５；野村化学（株））を用い、先と同じ条件で分離及び精製を行った。
各ピーク画分をスピードバックで濃縮・乾固させ、４０％アセトニトリル３０μｌに溶解させ、アミノ酸シークエンサーに供した。その結果６本のペプチドのアミノ酸配列を判読することができた。以下に、各々のペプチドのアミノ酸配列を示す（アミノ末端からカルボキシル末端の方向に示す）。
アミノ酸配列（ＡＴ７３）；Arg-Phe-Leu-Gly-Ile-Thr-Gly-Ser-Pro-Lys（配列番号：７）
アミノ酸配列（ＡＴ７２）；Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys（配列番号：８）
アミノ酸配列（ＡＴ７４１−１）；Gly-Val-Glu-Ile-Gly-Val-Ser-Leu-Pro-Lys（配列番号：９）
アミノ酸配列（ＡＴ７４１−２）；Ala-Ser-Leu-Ser-Leu-Thr-Leu-Lys（配列番号：10）
アミノ酸配列（ＡＴ９）；His-Tyr-Val-Pro-Leu-Ser-Gly-Asn-Leu-Leu-Met-Pro-Ile-Lys（配列番号：11）
アミノ酸配列（ＡＴ８３）；Val-Arg-Ala-Thr-Tyr-Val-Leu-Ser-Leu-Ala-Glu-LIe-Gln-Lys（配列番号：12）
実施例３．リンドウ由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡクローニング（１）
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
市販されているリンドウ（Gentiana trlflora var．janonica）から花弁を集め、液体窒素中で乳鉢で磨砕した。この磨砕物から、グアニジンチオシアネート／塩化セシウムを用いる方法によりＲＮＡを得、オリゴテックス（日本ロッシュ）を用い、製造者が推奨する方法にて、ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡを得た。グアニジンチオシアネート／塩化セシウムを用いる方法は、R．McGookin，Robert J．Slaterらの、Methods in Molecular Biology vol ２，（Humana Press Inc．1984）に詳細に示されている方法に従った。
得られたｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡを鋳型とし、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ファージベクターλＺＡＰＩＩへのクローニングを行った。更に、同社のＧｉｇａｐａｃｋＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔキットを用いて、当該キットに記載された方法でｃＤＮＡライブラリーを作製した。
（２）合成ＤＮＡプライマーの設計
実施例２で得られた部分アミノ酸配列のうち、Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys（配列番号：13）で示される配列は、リジルエンドペプチダーゼの特異性を考えると、Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys（配列番号：14）であると考えられる。この配列の中のアミノ酸配列；Lys-Ile-His-Met-Asp-Ala-Phe-Ala（配列番号：15）で示される部分を用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ヌクレオチドの配列（オリゴ１）；5'-AARATHCAYATGGAYGCITTYGC-3'（配列番号：16）
但し、特に記載のないかぎり、核酸の配列はＩＵＰＡＣ−ＩＢＵ準拠の核酸コード表に従って一文字で表記する。即ち、Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン、Ｙ：Ｃ又はＴ、Ｒ：Ａ又はＧ、Ｈ：Ａ又はＣ又はＴ、及びＩはイノシンを示す。
また、先に述べたｃＤＮＡライブラリー作製時に使用したプライマーをもとに以下の他のオリゴヌクレオチドも合成した。
ヌクレオチドの配列（オリゴ２）；5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号：17）
（３）アシル基転移酵素遺伝子断片のクローニング
リンドウの花弁のＲＮＡに由来する２本鎖ｃＤＮＡ約０．１μｇを鋳型にオリゴ１とオリゴ２をプライマーとして、ＰＣＲ反応を行った。反応はポリメラーゼチェイン反応キットＧｅｎｅ  Ａｍｐ（宝酒造（株））を用いて、９５℃１分、４５℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、３５サイクル行い、得られた反応物を１％アガロース電気泳動したところ、約４００ｂｐの特異的なＤＮＡ断片が観察された。このＤＮＡ断片を回収し、その１０ｎｇをＤＩＧ−ヌクレオチド混合液（ベーリンガー社）と合成ヌクレオチドＩとＩＩを用いて、前述のＰＣＲ反応を２５サイクル行い、ＤＩＧで標識したＤＮＡ断片を得た。
（４）アシル基転移酵素のｃＤＮＡのクローニング
上記のようにして得られたλファージライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ストラタジーン社）に感染させ、１プレート当りプラーク５万個を含む５枚のプレート（直径１３．５ｃｍ）をスクリーニングした。
ファージをフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマーシャム社）に吸着させ、製造者の推奨する方法で処理した後、このフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、７％ＳＤＳ、２％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（ベーリンガー社）、０．１％ラウロイルサルコシン、８０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で４２℃で１時間保持した。ＤＩＧ標識した前述のＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション液中に加え、さらに１６時間のインキュベーションを行った。
洗浄液（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）でフィルターを洗浄し、アルカリホスファターゼで標識されたＤＩＧ特異的な抗体による酵素免疫測定法（ベーリンガー・マンハイム株式会社）により５−ブロモ４−クロロ３−インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾリウム塩の発色反応によって検出した。検出方法は製造者による使用説明書に従った。
この結果、数十個の陽性クローンが得られ、うち２０クローンをストラタジーン社の推奨する方法で、ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ-上に回収した。アガロースゲル電気泳動でｃＤＮＡの挿入を調べたところ、全てのクローンにおいて各種サイズのｃＤＮＡの挿入が認められ、そのうち最長のものは１．７ｋｂであった。それらのうちから適当に９クローン選び制限酵素による解析を行ったところ、サイズは異なるが全てのクローンで同様の制限酵素パターンを示した。
（５）塩基配列の決定
得られたクローンからプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３７３Ａ・ＤＮＡ  シークエンサー（パーキンェルマー社）を用い、同社の推奨する蛍光試薬によるダイデオキシ  シークエンス法で、前述の９クローンのうち全長を含むと考えられる６つのクローン（ｐＧＡＴ２、ｐＧＡＴ３、ｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ７、ｐＧＡＴ８及びｐＧＡＴ１１）についてｃＤＮＡの５’側の塩基配列を決定した。
その結果、これらのクローンは互いに同じ塩基配列を持っており、ｃＤＮＡの長さが異なるものと考えられた。これらのクローンのうちｐＧＡＴ４の全塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて、一連の欠失クローンを得た後、各々のクローンを用いて上述の方法により行った。
（６）塩基配列とアミノ酸配列の比較
ｐＧＡＴ４に挿入されたｃＤＮＡは１７０３塩基でありその中に１４１０塩基（終止コドンを含む）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出された。この配列を配列表・配列番号１に示す。実施例２で明らかになったアシル基転移酵素の部分アミノ酸配列の全てがＯＲＦ中のアミノ配列として存在することから、クローニングされたｃＤＮＡは、リンドウ由来のアシル基転移酵素遺伝子であると結論した。開始コドンについては、アミノ末端の解析からグルタミン酸がアミノ末端の残基であると推測されたので、ｃＤＮＡの塩基配列の上で、５’側から最初のＡＴＧが開始コドンであると推察した。
一方、ｐＧＡＴ８に係るｃＤＮＡは、５’側がｐＧＡＴ４よりも７塩基短いため、完全長のｃＤＮＡではないと考えられた。
実施例４．大腸菌における遺伝子の発現
（１）発現プラスミドの構築
大腸菌でのアシル基転移酵素遺伝子の発現には、大腸菌の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）を用いた。このｐＴｒｃ９９Ａはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能な大腸菌のｔｒｃプロモーターを含み、その下流に目的遺伝子を挿入することにより、大腸菌での遺伝子発現が可能になる。
また、制限酵素ＮｃｏＩ部位が開始コドンであるＡＴＧ配列を利用して導入されており、ＮｃｏＩ部位で組換えることにより、目的遺伝子の開始コドンからの直接発現が可能である。
ｐＧＡＴ４を当該ベクター内に存在する制限酵素部位ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片（配列表・配列番号１記載の塩基配列を全て含む）を前述のｐＴｒｃ９９ＡのＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位に組換えることにより、ｐＧＡＴ１０１を構築した。
アシル基転移酵素の開始コドン近傍にＮｃｏＩ部位の導入を行うために、開始コドン近傍、及びアシル基転移酵素遺伝子内部（開始コドンから３００塩基目付近）に対応する以下の２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチド（ＧＡＴ−ＮｃｏＩ）；5'-TTCACCATGGAGCAAATCCAAATGGT-3'（配列番号：18）
オリゴヌクレオチド（ＧＡＴ−ＳｃａＩ）；5'-CGAGTCGCCCTCATCAC-3'（配列番号：19）
１０ｎｇのｐＧＡＴ４を鋳型とし、上記のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。反応はポリメラーゼチェイン反応キットＧｅｎｅ  Ａｍｐ（宝酒造（株））を用いて、９５℃１分、５６℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、１５サイクル行い、得られた反応物を１％アガロース電気泳動したところ、約３００ｂｐの特異的なＤＮＡ断片が観察された。このＤＮＡ断片を回収し、制限酵素ＮｃｏＩとＡａｔＩで切断後、ｐＧＡＴ１０１をＮｃｏＩとＡａｔＩで切断して得られる約６ｋｂの断片と連結することにより、ｐＧＡＴ１０２を構築した。ＰＣＲ法により増幅した部分の塩基配列はｐＧＡＴ１０２構築後にｐＧＡＴ４と同じであることを確認した。
（２）アシル基転移酵素遺伝子の大腸菌での発現
ｐＧＡＴ１０２で大腸菌ＭＭ２９４（supE44 hsdR endA1 pro thi）（Meselson and Yuan，Nature，217，1110-，1968）を形質転換した。なお、ここで形質転換される宿主は、形質転換用の宿主として利用可能な大腸菌であれば特に特定されるものではなく、遺伝子組換えに一般に用いられ、当業者が容易に入手できるその他の株（例えば、ＪＭ１０９やＤＨ５等）を利用することができる。また、大腸菌の形質転換方法はＨａｎａｈａｎの方法に従った（J．Mol．Biol.，166，557-，1983）。形質転換された大腸菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌのＬＢ培地（トリプトン  １０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇを１リッターの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整する）に植菌し、３７℃で一晩培養した。
この培養液１ｍｌを１０ｍｌのＭ９培地（リン酸一水素ナトリウム  ０．６％、リン酸二水素カリウム  ０．３％、塩化ナトリウム  ０．５％、塩化アンモニウム  ０．１％、グルコース  ０．５％、硫酸マグネシウム  １ｍＭ、ビタミンＢ１  ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）にカザミノ酸０．５％とアンピシリン５０μｇ／ｍｌを加えた培地に接種し、３７℃で３時間培養後、０．５ＭのＩＰＴＧを４０μｌ添加（終濃度２ｍＭ）し、更に５時間培養を続けた。集菌後、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄菌体を同じバッファー１ｍｌに懸濁した。１ｍｇリゾチーム、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡを２５μｌ加えて３０分間０℃に放置した後、凍結・融解を３回繰り返して菌体を破壊した。
これを１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心をして得た上清を粗酵素液とし、実施例１（３）で示した酵素活性測定法により酵素活性を測定した。マイクロタイタープレート法により、ｐＧＡＴ１０２を導入した大腸菌ではアシル基転移反応が確認されたので、ＨＰＬＣによる分析を行った。
その結果、ｐＧＡＴ１０２を導入した大腸菌では２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，５−ジグルコシドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−ＣｏＡから１８．３ｎｍｏｌのデルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシドの生成が認められた。
この結果と、リンドウのアントシアニンにおいては５位と３’位のグルコースにアシル基が結合しているという既知の事実と併せて考えると、ｐＧＡＴ４がコードするアシル基転移酵素はアントシアニジン３，５−ジグルコシドの５位のグルコースにアシル基を転移する反応を触媒することが判った。
また、大腸菌で生産されたアシル基転移酵素によりアシル化されたデルフィニジン３，５−ジグルコシドも、リンドウから精製して得られたアシル基転移酵素によりアシル化されたものと同様に室温で長期間放置しても安定な発色を示した。
実施例５．酵母における遺伝子の発現
（１）酵母の発現ベクター
酵母の発現ベクターは、特開平４−２２８０７８に記載のｐＹＥ２２ｍを使用した。
（２）アシル基転移酵素遺伝子の酵母での発現
ｐＧＡＴ４又はｐＧＡＴ８を当該各ベクター内に存在する制限酵素部位ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片とｐＹＥ２２ｍを同じくＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して得られる約８ｋｂのＤＮＡ断片を連結して酵母発現プラスミドｐＹＧＡＴ４とｐＹＧＡＴ８を各々構築した。ｐＹＧＡＴ４は第４番目のメチオニンからの翻訳を行うが、ｐＹＧＡＴ８では分離したｃＤＮＡの５’側の一部が欠けているため、アシル基転移酵素の翻訳開始メチオニン（配列表・配列番号１におけるアミノ酸配列番号；−１）ではなく、次のメチオニン（配列表・配列番号１におけるアミノ酸配列番号；５）からの翻訳が行われる。
これらの酵母発現プラスミドでは、アシル基転移酵素をコードしているｃＤＮＡは酵母の構成的なプロモーターのひとつであるグリセロアルデヒド−３リン酸脱水素酵素のプロモーターの下流に連結されており、同プロモーターにより転写が制御されている。
伊藤らの方法（Ito et al．J．Bacteriol.，153，163-168，1983）を用いｐＹＧＡＴ４及びｐＹＧＡＴ８で、酵母Saccharomyces cerevisiae G1315（Ashikari et al．、Appl．Microbiol．Biotechnol．30，515-520，1989）を形質転換した。形質転換された酵母はトリプトファンの合成能の回復により選択した。
なお、ここで形質転換に用いる酵母の宿主は特に限定されるものではなく、ＴＲＰ１遺伝子が不完全なためにトリプトファンの要求性を示す株であれば何れのものでも用いることができる（例えば、イースト・ジェネティク・ストック・センターより購入可能（Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ第７版（１９９１年）第３６頁）。
得られた形質転換株を１０ｍｌの１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）を含むバークホルダー培地（Burkholder，Amer．J．Bot．30，206-210）にて、３０℃で４０時間振盪培養した。併せて、対照実験のために、トリプトファンの合成能を自然に回復した酵母も同様に培養した。
これらを集菌後、同量の菌体破砕用バッファー（３０ｍＭ  トリス塩酸ｐＨ７．５、３０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄し、さらに１ｍｌの同じバッファーにサスペンドし、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。遠心分離後、上清を除き０．４ｍｌの同じバッファーで沈殿菌体を再度サスペンドし、４００ｍｇのグラスビーズ（Ｇｌａｓｓ  Ｂｅａｄｓ  ４２５−６００ｍｉｃｒｏｎｓ  Ａｃｉｄ−Ｗａｓｈ、シグマ社）を加えて激しく振盪することにより、酵母菌体を破砕した。
遠心分離後の上清を粗酵素液とし実施例１（３）で示した酵素活性測定法により酵素活性を測定した。マイクロタイタープレート法により、ｐＹＧＡＴ４及びｐＹＧＡＴ８を導入した酵母は何れもアシル基転移反応が確認されたので、ＨＰＬＣによる分析を行った。なお、対照に用いた酵母ではアシル基転移活性は認められなかった。
その結果、ｐＹＧＡＴ４及びｐＹＧＡＴ８を導入した酵母では２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，５−ジグルコシドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−ＣｏＡから各々１６．６ｎｍｏｌと２０．９ｎｍｏｌのデルフィニジン３−グルコシル５−カフェオイルグルコシドの生成が認められた。ｐＹＧＡＴ４とｐＹＧＡＴ８から生産される蛋白質はそのアミノ末端が異なるが、ともにアシル基転移酵素活性を保持していた。
また酵母で生産されたアシル基転移酵素によりアシル化されたデルフィニジン３，５−ジグルコシドも、リンドウから精製して得られたアシル基転移酵素によりアシル化されたものと同様に室温で長期間放置しても安定な発色を示した。
実施例６．リンドウ由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡクローニング（２）
実施例３（６）に記載のｐＧＡＴ４、即ち配列表・配列番号１記載のＤＮＡを有するｐＧＡＴ４を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうち、アシル基転移酵素の翻訳領域を含むＤＮＡ断片２つをまとめて回収し、前述の方法でＤＩＧ標識した。これをプローブとして実施例３（４）に記載したリンドウの花弁のｃＤＮＡライブラリーのファージを吸着させたフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマーシャム社）を、製造者（アマーシャム社）が推奨する方法でフィルターに結合した色素及びＤＩＧ標識を除去して再生した後、低濃度ホルムアミドハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、３０％ホルムアミド、５０ｍＭ Tris-HCl、pH7.5、1％ＳＤＳ）中で４２度で１６時間ハイブリダイズした。
洗浄液（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で５０度で洗浄し、実施例３（４）に記載したように発色させた。数十のクローンが発色したが、発色したクローンのうちで、実施例３（４）では発色しなかったクローンを１２個得た。これらのクローンのｃＤＮＡの塩基配列を先に述べたような方法で、５’側から決定したところ、１１クローンはｐＧＡＴ４の塩基配列と一致したが、１クローンは一致しなかった。これをｐＧＡＴ１０６とした。
ｐＧＡＴ１０６の全塩基配列を先に述べたようにして決定した。ｐＧＡＴ１０６に挿入されたｃＤＮＡは１６２２塩基でありその中に１４４０塩基（終止コドンを含む）からなるＯＲＦが見い出された。これを配列表・配列番号２に示す。配列番号２が含むＯＲＦについて、ｐＧＡＴ４がコードするアミノ酸配列と全領域にわたって、相同性を調べた。そのホモロジーは、３８％であった。
ｐＧＡＴ１０６のコードするアミノ酸配列は、アシル基転移酵素であるｐＧＡＴ４のコードしている酵素と相同であるため、同様な酵素活性、つまりアントシアニンにアシル基転移を触媒する活性を持っていると推測される。リンドウのアントシアニンは、５位と３’位のグルコースにアシル基が結合しているので、ｐＧＡＴ１０６がアントシアニンの３’位のグルコースにアシル基を転移する酵素反応を触媒することを示唆する。また、この結果はアシル基転移酵素は、アシル基を転移するアントシアニンの糖の位置は異なっていても、アミノ酸配列及びそれをコードしている塩基配列は相同であることを示している。
先に述べたようにアシル基を有するアントシアニンは多数存在し、これら化合物のアシル基の数や位置は多様性に富み、アシル基の転移反応を触媒する酵素も多数あることが推測されるが、それらの酵素のアミノ酸配列は、ここで得られたｐＧＡＴ４及びｐＧＡＴ１０６のアミノ酸配列と相同性がみられることは容易に類推でき、これに基づき、他のアシル基転移酵素遺伝子を得ることができる。
実施例７．ペチュニアのアントシアニン
ペチュニア（Petunia hybrida）品種サフィニアパープル（サントリー（株））の花色が通常の赤紫から紫に変異した変異株（ＶＭ）のアントシアニンを、その花弁を液体窒素中で粉砕し、５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液で抽出した。濾過後、濾液をＯＤＳ、ＯＤＰの逆相カラムクロマトグラフィーで分離、精製した。そのうちの一つの化合物の構造をＦＡＢＭＳ、1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲを用いて、詳細に解析したところ、新規なアントシアニンを見いだした。その構造を以下に示す。
0003950986.tif 000002
即ち、この構造は3-O-（6-O-（4-O-（4-O-（6-O-カフェオイル-β-D-グルコピラノシル）-クマロイル）-α-L-ラムノシル）-β-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル-マルビジンであり、アシル基が２つ結合したアントシアニンであった。
また、3-O-（6-O-（4-O-（4-O（6-O-クマロイル-β-D-グルコピラノシル）-クマロイル）-α-L-ラムノシル）-β-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル-マルビジン、3-O-（6-O-（4-O-（4-O-（6-O-カフェオイル-β-D-グルコピラノシル）-カフェオイル）-α-L-ラムノシル）-β-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル-マルビジン、3-O-（6-O-（4-O（4-O-（6-O-クマロイル-β-D-グルコピラノシル）-カフェオイル）-α-L-ラムノシル）-β-D-グルコピラノシル）-5-O-β-D-グルコピラノシル-マルビジンも検出された。このアントシアニンは、ＶＭの花弁のみならず、フルコンブルー（サカタのタネ（株））、Old Glory Blue（Ball Seeds）などの濃い紫色の花弁にも存在していることがわかった。即ち、アシル基を２つ持つアントシアニンはペチュニアの濃い紫色に寄与していると思われる。
従って、ペチュニア由来のアントシアニンに関するアシル基転移酵素には、アントシアニンの３位のルチノシドにクマル酸又はカフェ酸を転移する反応を触媒する酵素と、モノアシルマルビジンにグルコースを介してクマル酸又はカフェ酸を転移する反応を触媒する酵素の２種類があることを示唆する。
実施例８．ペチュニア由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡクローニング
実施例３（６）に記載のｐＧＡＴ４、即ち配列表・配列番号１記載のＤＮＡを有するｐＧＡＴ４のｃＤＮＡ部分を、前述の方法でＤＩＧ標識し、ペチュニア（Petunia hybrida）品種オールドグローリーブルーの花弁のｃＤＮＡライブラリー（Nature，366，276-279，1993）をプラークハイブリダイゼーションの手法により、スクリーニングした。ハイブリダイゼーションと洗浄は、実施例６と同様の条件で行った。
約２０万クローンをスクリーニングし、弱くハイブリダイズするクローンを１つ得た。このクローンをｐＰＡＴ５とした。塩基配列を決定したところ、ｐＰＡＴ５には複数のＤＮＡが挿入されていた。すなわち、プラスミドのリバースプライマー側に、ｐＧＡＴ４およびｐＧＡＴ１０６のコードする蛋白質のＣ末端の配列に似た配列が存在した。そこで、リバースプライマーのもとに、ヌクレオチド配列；5'-AACAGCTATGACCATG-3'（配列番号：20）を合成し、このオリゴヌクレオチドをＲＰプライマーとした。
ｐＰＡＴ５のｃＤＮＡの完全長を取得するために、ＲＰプライマー、オリゴ２プライマー各１００ｎｇ、ＸｈｏＩで消化したｐＰＡＴ５・１０ｎｇを最終体積５０μｌで、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、２０サイクル行った。得られた約６００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動後、ジーンクリーンで精製した。この断片をＳｍａＩで酵素消化した後、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を同様に精製した。このＤＮＡ断片を前述のＤＩＧで標識した。
この標識したＤＮＡ断片を用いて、前述のペチュニアの花弁ｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションの手法を用いて、スクリーニングした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、０．２ＸＳＳＣ、６５℃、１時間とした。得られたクローンから回収したプラスミドの塩基配列を決定したところ、ｐＰＡＴ４８が、ｐＰＡＴ５と同じ配列を含むことがわかった。これを配列表・配列番号３に示す。この配列は、ｐＧＡＴ４とｐＧＡＴ１０６に対して、アミノ酸配列レベルで、それぞれ２０％、１６％のホモロジーがあった。
実施例９．シソ由来の粗酵素液の抽出
シソ（Perilla ocimoides）・品種赤チリメンの植物体から、赤い若い葉を採集し、実施例１（２）に記載の方法に従って、粗酵素液の抽出を行った。最終濃度５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、０．４８ｍＭデルフィニジン３，５−ジグルコシド、０．４３ｍＭカフェオイル−ＣｏＡと２０μｌの酵素液を含む５０μｌの混合物を３０℃で１０分間反応させた。反応液に１３．８％の酢酸を含む５０μｌのアセトニトリルを加えて反応を停止した。１５０００回転で５分間遠心した後、上清のうちの１０μｌを以下の条件でＨＰＬＣにて解析した。
カラムはYMC-Pack ODS-A（6．O X 15cm）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸、２１．６％アセトニトリルの溶媒で、流速１ｍｌ／分の条件でサンプルを分離した。検出は、５２０ｎｍで行った。この条件で未反応のデルフィニジン３，５−ジグルコシドは、３分で、デルフィニジン３，５−ジグルコシドの３位にカフェ酸が転移したものは、４．７分に溶出され、この化合物の吸収極大値は、５３１ｎｍであった。
基質として、デルフィニジン３−グルコシドを用いた場合も、カフェ酸による修飾が見られた。また、アシル基の供与体として、クマロイル−ＣｏＡを用いても、クマール基の転移が見られた。シソは天然にはアントシアニンとしてデルフィニジングルコシドは含まないが、シソのアシル基転移酵素はデルフィニジン３−グルコシドとデルフィニジン３，５−ジグルコシドをアシル基受容体として、クマロイル−ＣｏＡをアシル基供与体として利用できることがわかった。
実施例１０．シソ由来のアシル基転移酵素の精製
シソアシル基転移酵素の精製は、実施例２（１）に準じて行った。３ｋｇのシソの葉を、液体窒素で凍結させ、凍結したままホモジナイザーで、粉砕した。粉末状になったものに１０ｌの抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、５ｍＭジチオスレオトール、１０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、５％（ｗ／ｖ）ポリクラールＳＢ−１００）中で、再び、ホモジナイザーで磨砕した。これを４層に重ねたガーゼで濾過後、遠心分離（８０００回転、４度、３０分）を行った。上清に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて、溶解後、同じ条件で遠心分離を行う。上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、溶解後、同じ条件で遠心分離を行う。沈殿を最小量の脱塩緩衝液（ピストリス塩酸、ｐＨ６．３、１ｍＭジチオスレイトール、１０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール）に溶解した後、同じ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５メディウム（ファルマシア社、９．５Ｘ４５ｃｍ）で脱塩した。
脱塩したサンプルをＱ−セファロースファーストフロー２６／１０を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行った。脱塩緩衝液をもとにした塩化ナトリウムの０から０．５Ｍの直線濃度勾配を８ｍｌ／分の流速で１時間かけて行った。活性画分は、食塩濃度０．１５から０．３Ｍ付近で溶出された。この活性画分を、脱塩緩衝液で平衡化したHiTrapBlue（５ｍｌ）を４本直列に接続したカラムに吸着させた。同じ緩衝液でカラムを良く洗浄した後、脱塩緩衝液をもとにした０から１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配（２時間、流速５ｍｌ／分）で溶出した。活性画分は塩化ナトリウム濃度０．８から０．９Ｍで溶出した。この画分を次にヒドロキシアパタイトカラム（セラミックタイプII  ４０ｍｍ；バイオラド社）でクロマトグラフィーを行った。緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ｍＭジチオスレイトール、１０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール）で、サンプルをかけたカラムをよく洗浄し、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ｍＭジチオスレイトール、１０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０％グリセロール）への直線濃度勾配（１時間、流速２．５ｍｌ／分）で酵素を溶出したところ、約０．２Ｍリン酸ナトリウムで溶出した。この活性画分を用いて酵素の生化学的性質を調べた。
粗酵素標品を用いた場合と同様に、アシル基の受容体としては、シアニジン３−グルコシド、シアニジン３，５−ジグルコシド、デルフィニジン３−グルコシド、デルフィニジン３，５−ジグルコシドのいずれを用いることができた。アシル基の供与体としては、クマロイル−ＣｏＡでも、カフェオイル−ＣｏＡでも用いることができた。また、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動から、分子量は約５００００であった。等電点は、Mono-Pカラム（ファルマシア社）を用いて、５．３と決定した。
実施例１１．シソ由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡクローニング
実施例３、実施例６及び実施例８でクローニングしたｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８の構造を比較すると、アミノ酸配列；Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys（配列番号：21）が保存されていることがわかった。従って、この構造は、アシル基転移酵素において保存されていることが予想される。そこで、この配列をもとに、ヌクレオチド配列；5'-GA（TC）TT（TC）GGITGGGGIAA-3'（配列番号：22）を合成し、このオリゴヌクレオチドをＡＴＣプライマーとした。
シソの若い葉からＲＮＡを実施例３に記載の方法で抽出し、同じく、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。この際にできた２本鎖のｃＤＮＡ約５０ｎｇを鋳型にして、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ用い、最終体積５０μｌにて、ＰＣＲキット（宝酒造（株）製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて、ベクターにクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定したところ、ｐＳＡＴ１０４としたクローンがｐＧＡＴ４に対して高いホモロジーを示した。
１０ｎｇのｐＳＡＴ１０４を鋳型にして、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ用いて、最終体積５０μｌにて、ＰＣＲキット（宝酒造（株）製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、１５サイクル行った。この反応物の１μｌを用い、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ用いて、最終体積５０μｌにて、同様にＰＣＲキットを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ただし、この際デオキシヌクレオチド溶液として、ＤＩＧ標識ヌクレオチド溶液（ベーリンガー社製）を４μｌ用いた。反応終了後、５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと１００μｌのエタノールを加え、エタノール沈殿を行い、以後の実験に用いた。
このｐＳＡＴ１０４由来の標識ＤＮＡを用いて、シソの葉のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションの手法でスクリーニングした。洗浄は、１ＸＳＳＣ、６５℃で１時間行った。ハイブリダイズしたクローンの塩基配列を決定したところ、ｐＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０７、ｐＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２０９、ｐＳＡＴ２１０などのクローンがｐＳＡＴ１０４の塩基配列を含んでいることがわかった。これらのクローンの５’側の塩基配列をｐＧＡＴ４と比較したところ、どのクローンもｐＧＡＴ４よりアミノ末端が短く開始コドンも見られなかった。また、ｐＳＡＴ２０６とｐＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２０９とｐＳＡＴ２１０は、５’側の塩基配列は同一であった。ｐＳＡＴ２０７は、ｐＳＡＴ２０６より６残基、ｐＳＡＴ２０９はｐＳＡＴ２０６より５残基短かった。
ベクターpBluescript SK上で、これらのｃＤＮＡは、ベクターのＬａｃＺ遺伝子と融合できる形となっている。上のクローンの内、ｐＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０８、ｐＳＡＴ２０７は、ＬａｃＺのコードしている大腸菌のβガラクトシダーゼと融合蛋白として発現できる形になっているが、ｐＳＡＴ２０９とｐＳＡＴ２１０は、フレームがずれているので融合蛋白質とはならない。ｐＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０７、ｐＳＡＴ２０９、ｐＳＡＴ２１０を大腸菌で発現させ、デルフィニジン３，５−ジグルコシドとカフェオイル−ＣｏＡを用いて、３位のグルコースへのアシル基転移酵素活性を測定した。発現の誘導などの方法は、実施例４に記載の方法に従った。
ｐＳＡＴ２０９、ｐＳＡＴ２１０を含む大腸菌は、アシル基転移酵素活性を全く示さなかったが、ｐＳＡＴ２０６を含む大腸菌は、デルフィニジン３，５−ジグルコシドの４８％をアシル化する酵素活性を示し、ｐＳＡＴ２０７を含む大腸菌は同じく２４％をアシル化する酵素活性を示した。このことから、得られたｐＳＡＴ２０６、ｐＳＡＴ２０７などは、シソのアントシアニンの３位のグルコースにアシル基を転移する酵素活性を持つ遺伝子をクローニングできたことが証明できた。
これらのクローンの内、ｐＳＡＴ２０８のｃＤＮＡ由来の塩基配列を決定した。これを配列表・配列番号４に示す。その塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、ｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８に対して、３７％、２９％、１５％のホモロジーを示した。先に述べたようにこの配列は、完全長のｃＤＮＡではないが、ＬａｃＺとの融合遺伝子などとして、適当な開始コドンを与えることで、活性のある酵素を発現できる。
また、このように本発明で明らかになったアシル基転移酵素のアミノ酸配列を比較することにより、保存されている領域が明らかになった。この領域のアミノ酸配列をもとにすれば、アントシアニンの他の位置の糖を修飾するアシル基転移酵素をクローニングすることができる。
実施例１２．サイネリア由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡクローニング
サイネリア（Senecio cruentus）品種ジュピターブルー（サカタノタネ）の花弁から実施例３に記載の方法でＲＮＡを抽出し、さらにＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
この際にできた２本鎖のｃＤＮＡ約５０ｎ９を鋳型にして、ＡＴＣプライマーとオリゴ２プライマーを各１００ｎｇ用い、最終体積５０μｌにて、宝のＰＣＲキットを用いて、ＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて、ベクターにクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定したところ、ｐＪＡＴ４としたクローンがｐＧＡＴ４に対して高いホモロジーを示した。
次にサイネリアの花弁ｃＤＮＡライブラリーをｐＪＡＴ４でスクリーニングした。いくつかのクローンが得られたが、それらのｃＤＮＡの５’末端側の塩基配列から類推したアミノ酸配列は、ｐＧＡＴ４のコードしている蛋白質の配列と比較してみると、サイネリアのクローンのｃＤＮＡはいずれも完全長ではなかった。そのうち、ｐＣＡＴ８としたクローンのｃＤＮＡの前塩基配列を決定した。これを配列表・配列番号５に示す。その塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、ｐＧＡＴ４、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８、ｐＳＡＴ２０８に対してそれぞれ２８％、３５％、１６％、３７％のホモロジーを示した。
実施例13．リンドウ由来のアシル基転移酵素遺伝子を含むバイナリベクターの作製
リンドウのアシル基転移酵素遺伝子ｐＧＡＴ４をKpnIで完全に消化した後、XbaIで部分消化して得られる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のKpnIとXbaIの制限酵素認識部位を用いてサブクローニングし、プラスミドｐＵＣＧＡＴ４を得た。ｐＵＣＧＡＴ４をBglIIで完全消化したのち、SacIで部分消化し、約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片と、ｐＵＣＧＡＴ４をXbaIとBglIIで消化して得られる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐ２１１３Ｇ（たとえば、Aida et al.，Acta Horticulture，392，219-225，1995に記載されている）をXbaIとSacIで消化して得られるＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＢＥＧＡ４とした。このプラスミドは、バイナリーベクターであり、リンドウのアシル基転移酵素ｃＤＮＡは、植物細胞内においては、エンハンサーを有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素ターミネーターの制御下にある。また、リンドウアシル基転移酵素ｃＤＮＡの５’末端に、Ω配列と呼ばれる翻訳のエンハンサーを含んでいる。この際、プロモーターやターミネーターは本記載に限定されるものではなく、構成的なプロモーターであっても、また、カルコン合成酵素遺伝子のプロモーター等のように花弁で特異的に働くものであっても良い。
実施例14．リンドウ由来のアシル基転移酵素遺伝子の植物への導入
ｐＢＥＧＡ４をPlant Molecular Biology Manual（Kluwer Academic Publishers）に記載されている方法で、Agrobacterium tumefacienceのＡｇ１０株（Lazo et al.，Bio/Technology，9，963-967，1991）に導入した。一方、バラ品種ラバンデの茎頂を、ＭＳ培地にＢＡ（６−ベンジルアミノプリン）２．２５ｍｇ／ｌ、ＧＡ３（シベレリン酸）３．４６ｍｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、ジェランガム２ｇ／ｌを加えた固体培地で培養してEmbriogenic Callus（ＥＣ）を得た。前述のＡｇ１０株をＬＢ培地で一晩振とう培養したものを２０μｇ／ｍｌのアセトシロンゴンを含むＭＳ液体培地に懸濁し、約５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調整した。この菌液中にＥＣを５分間浸漬した後、滅菌濾紙で余分な液を十分に拭き取り、ＢＡ２．２５ｍｇ／ｌ、ＧＡ３  ０．３５ｍｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、ジェランガム２ｇ／ｌを加えたＭＳ培地に移植し培養することにより、形質転換体を得ることができる。得られたカナマイシン抵抗性カルスから、トリゾール（ライフテックオリエンタル社）を用いてＲＮＡを得た。このＲＮＡを鋳型にして、ｐＧＡＴ４の塩基配列をもとにして合成したヌクレオチドＧＡＴ−１；5'-TGGCAACTGTCTTGCGTCATG-3'（配列番号：23）と、ヌクレオチドＧＡＴ−２；5'CCATGTCAGGTGTGAGGTTCAAC-3'（配列番号：24）をプライマーとして用いて、アクセスＲＴ−ＰＣＲシステム（プロメガ社）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。また、同じＲＮＡを鋳型として、バイナリーベクター上のnptIIの塩基配列にもとづいて合成したオリゴヌクレオチドＫａｎ−１；5'-ATCGTTTCGCATGATTGAAC-3'（配列番号：25）と、ヌクレオチドＫａｎ−２；5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3'（配列番号：26）とを用いて、同様にＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。反応は、９４℃３０秒、６０℃１分、６８℃２分を１サイクルとし、４０サイクル行った。形質転換体のカルスからは、ｐＧＡＴ４に由来するバンド及びnptIIに由来するバンドが観察されたが、非形質転換体のカルスからはこれらに対応するバンドは検出できなかった。この結果は、リンドウのアシル基転移酵素遺伝子をバラに導入できたことを示す。
また、ここに述べたバイナリーベクターの構築や植物への形質転換は、ｐＧＡＴ４に含まれるリンドウのアシル基転移酵素遺伝子に限られるものではなく、他のアシル基転移酵素も、植物への導入と植物での遺伝子発現が可能である。また、植物の種として、ここでは、バラをあげたが、他の多くの植物で（たとえば、カーネーション、キク、タバコ、ペチュニア、ガーベラ、ペチュニアなど）形質転換の方法が報告されているので、公知の方法を用いれば、多くの植物種にアシル基転移酵素の導入が可能である。
実施例15．完全長のシソ由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡの合成
シソアシル基転移酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ｐＳＡＴ２０８は、先に述べたように活性のある酵素はコードしているが、完全長ではなかった。そこで、リンドウのアシル基転移酵素遺伝子ｐＧＡＴ４の塩基配列をもとに開始コドンを含む完全長ｃＤＮＡを合成した。すなわち、以下に示すＤＮＡを合成した。また、そのコードするアミノ酸配列を併記した。最初の下線はクローニングのためのBamHI認識配列で、次の下線はｐＳＡＴ２０８に含まれる配列である。また、BamHIの認識配列の後に植物で翻訳開始コドンの直前によく見られる配列AACAを挿入してある。
0003950986.tif 000003
このプライマーと−２０プライマー；5'-GTAAAACGACGGCCAT-3'（配列番号：28）とをそれぞれ１００ｎｇ、ｐＳＡＴ２０８を１０ｎｇを含むＰＣＲ反応を最終体積５０μｌで行った。反応は、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、１５サイクル行った。反応後、反応液からＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Bio101社）を用いて製造者の推奨する方法で、回収した。回収したＤＮＡをBamHIとEcoRIで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＳＡＴ２０８をEcoRIで消化して得られる約３．３ｋｂのＤＮＡ断片とライゲーションし、得られたプラスミドをｐＳＡＴＦ２０８とした。このプラスミドの塩基配列をｃＤＮＡの５’末端から決定し、塩基配列を確認した。
実施例16．シソ由来のアシル基転移酵素遺伝子の酵母における発現
実施例５で述べた方法に従って、ｐＳＡＴＦ２０８を酵母で発現させ、酵素活性の測定を行った。すなわち、ｐＹＥ２２ｍをBamHIとSalIで消化して得られる約８ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＳＡＴＦ２０８をBamHIとSalIで消化して得られる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションし得られたプラスミドをｐＹＳＡＴ２０８とした。
ｐＹＳＡＴ２０８で酵母Ｇ１３１５を形質転換し、得られた形質転換体のアシル基転移酵素活性を測定した。その結果、ｐＹＳＡＴ２０８を導入した酵母では、２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，５−ジグルコシドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−ＣｏＡから１０ｎｍｏｌのデルフィニジン３−カフェオイルグルコシド５−グルコシドの生成が認められた。従って、ｐＳＡＴＦ２０８に含まれる合成した完全長ｃＤＮＡは、アシル基転移酵素活性をコードすることが確認できた。
実施例17．シソ由来のアシル基転移酵素遺伝子を含むバイナリーベクターの作製
プラスミドｐＥ１２ΩＧＵＳは、プラスミドｐ２１１３Ｇ（Aida et al.，Acta Horticulture，392，219-225，1995）上のＧＵＳ遺伝子の発現ユニットがプラスミドｐＵＣ１９のHindIIIとEcoRI認識部位に挿入されているプラスミドである。ｐＥ１２ΩＧＵＳをSacIで消化し、DNAブランティングキット（宝酒造（株））で、平滑末端化した後、XhoIリンカー（東洋紡（株））とライゲーションした。得られたXhoIリンカーの挿入されたプラスミドをｐＥ１２ΩＧＵＳｘとした。このプラスミドをHindIIIとEcoRIで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、HindIIIとEcoRIで消化したｐＢｉｎ１９とライゲーションし、得られたプラスミドをｐＢＥＧＵＳｘとした。ｐＢＥＧＵＳｘをBamHIとXhoIで消化して得られる１１ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＳＡＴＦ２０８をBamHIとXhoIで消化して得られるＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＢＥＳＡ２０８とした。このプラスミド上で、シソのアシル基転移遺伝子は、エンハンサーを含むカリフラワーモザイクウィルスのプロモーターとノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターの制御下にある。
実施例18．シソ由来のアシル基転移酵素遺伝子の植物への導入
ｐＢＥＳＡ２０８をPlant Molecular Biology Manual（Kluwer Academic Publishers）に記載されている方法で、Agrobacterium tumefacienceのＡｇ１０株（Lazo et al.，Bio/Technology，9，963-967，1991）に導入した。Ａｇ１０株の形質転換体を用いて、Plant Molecular Biology Manual（Kluwer Academic Publishers）に記載されている方法を用いて、ペチュニア  フルコンレッド（サカタのタネ）、バカラレッド（サカタのタネ）、タイタンレッド（サカタのタネ）に形質転換した。なお、これらのペチュニアの花弁にはシアニジン３−グルコシドが主なアントシアニンとして含まれている。
また、先に述べた方法でバラ品種ラバンデにも形質転換を行った。
実施例19．完全長のサイネリア由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡの合成
サイネリア由来のアシル基転移酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ｐＣＡＴ８は、先に述べたように完全長ではなかった。そこで、リンドウのアシル基転移酵素遺伝子ｐＧＡＴ４の塩基配列をもとに開始コドンを含む完全長ｃＤＮＡを合成した。すなわち、以下に示すＤＮＡを合成した。そのコードするアミノ酸配列を併記した。最初の下線はクローニングのためのBamHI認識配列で、次の下線はｐＣＡＴ８に含まれる配列である。
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このプライマーと−２０プライマーをそれぞれ１００ｎｇ、ｐＣＡＴ８を１０ｎｇを含むＰＣＲ反応を最終体積５０μｌで行った。反応は、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、１５サイクル行った。反応後、反応液からＤＮＡ断片をGeneclean（Bio101社）を用いて製造者の推奨する方法で、回収した。回収したＤＮＡをBamHIとMvaIで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＣＡＴ８をMvaIとXhoIで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と、BamHIとXhoIで消化したpBluescript IISKとをライゲーションし、得られたプラスミドをｐＣＡＴＦ８とした。このプラスミドの塩基配列をｃＤＮＡの５’末端から決定し、塩基配列を確認した。
実施例20．ラベンダー由来のアシル基転移酵素をコードするｃＤＮＡのクローニング
シソ科のラベンダー（Lavandula angustifolia）の花弁由来のｃＤＮＡライブラリーを、実施例３で述べた方法で作製し、同じく実施例３に述べた方法で、プラークハイブラリダイゼーションの方法を用いて、約３０万クローンをスクリーニングした。すなわち、プローブには、合成ヌクレオチドのＲＩプライマー；5'-CTCGGAGGAATTCGGCACGAC-3'（配列番号：30）とオリゴ２をそれぞれ１００μｇ、ｐＳＡＴ２０８を１０ｎｇ用い、ヌクレオチドとしてＤＩＧ標識ヌクレオチドを使用し、最終体積５０μ１でＰＣＲを行って得られたものを使用した。反応は、９５℃１分、５０℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、２５サイクル行った。
標識したｃＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション液中に加え、さらに１６時間、３７℃に保持し、ハイブリダイゼーションを行った。洗浄液（５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）でフィルターを洗浄し、アルカリホスファターゼで標識されたＤＩＧ特異的抗体による酵素免疫測定法（ベーリンガーマンハイム社）による５−ブロモ４−クロロ３−インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾリウム塩の発色反応によって陽性クローンを検出した。なお、検出方法は製造社による使用説明書に従った。
この結果１個の陽性クローンが得られ、このｃＤＮＡをストラタジーン社の推奨する方法でλファージをベクターとする形からプラスミドpBluescript II SK-をベクターとする形に回収した。得られたクローンからプラスミドを抽出し、これをｐＬＡＴ１とした。先に述べたように、ABI373 DNAシークエンサー（パーキンエルマー社）を用い、同社の推奨する蛍光色素によるダイデオキシシークエンス法で、ｐＬＡＴ１のｃＤＮＡの５’末端付近の塩基配列を決定した。得られた塩基配列から導かれるアミノ酸配列は、シソやリンドウのアシル基転移酵素のアミノ酸配列と高い相同性を示し、ｐＬＡＴ１がラベンダーのアシル基転移酵素をコードすることが推察された。しかし、ｐＬＡＴ１のコードするアミノ酸配列はシソやリンドウのアシル基転移酵素のアミノ酸配列と比べて短く、アシル基転移酵素の全長をコードするには満たないと考えられた。そこでＤＩＧで標識したｐＬＡＴ１のｃＤＮＡフラグメントをプローブとし、ラベンダーの花弁由来のｃＤＮＡライブラリーを上に述べたのと同様の条件でスクリーニングした。プローブは、ｐＬＡＴ１プラスミド約１ｎｇを鋳型とし、下記に示すＲＩプライマーとオリゴ２各５００ｎｇ、ｄＮＴＰ標識混合液（ベーリンガー）８μｌを含む最終体積５０μｌのＰＣＲ反応により標識した。ＰＣＲ反応は９５℃１分、４２℃２分、７２℃３分からなるサイクルを２５サイクル行い、さらに伸長反応を完全にするため７２℃に７分保持した。プラークハイブリダイゼーションは、ハイプリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度は５０％、フィルターの洗浄は２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで行った以外は上に述べたのと同様であった。得られた陽性クローンの５’末端付近の塩基配列を前述同様にして決定し、ｐＬＡＴ１よりも１１ｂｐ長いクローン、ｐＬＡＴ２１を得た。これを配列表、配列番号６に示す。しかしｐＬＡＴ２１も開始メチオニンコドンを含まず、アシル基転移酵素の全長をコードするには満たないクローンであった。
実施例21．完全長のラベンダー由来のアシル基転移酵素のｃＤＮＡの合成
ラベンダーのアシル基転移酵素をコードすると考えられるｃＤＮＡ、ｐＬＡＴ２１は開始メチオニンコドンを含まないため、酵母での発現のためにはｃＤＮＡの５’末端に開始メチオニンコドンを付加する必要がある。そこで、下記の様なプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、開始メチオニンコドンをｐＬＡＴ２１のｃＤＮＡの５’末端に付加したフラグメントを合成した。プライマーＬＡＴ−ＡＴＧはｐＬＡＴ２１の５’末端２０塩基の配列に加えて、開始メチオニンコドンと、その上流に隣接して存在するといわれている植物での遺伝子発現のための保存配列AACA、および酵母発現ベクターへの連結に必要な制限酵素BamHI認識部位GGATCCを５’上流から３’方向に含むようにデザインされている。LAT-ATGプライマー
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ＰＣＲ反応はｐＬＡＴ２１プラスミド約１００ｎｇを鋳型とし、ＬＡＴ−ＡＴＧプライマーとオリゴ２各５００ｎｇ、を含む最終体積５０μｌでＰＣＲ反応を行った。反応は９５℃１分、４２℃２分、７２℃３分からなるサイクルを１０サイクル行い、さらに伸長反応を完全にするため７２℃に７分保持した。得られたＤＮＡ断片をBamHIとEcoRIで切断し、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
このＤＮＡ断片をプラスミドベクターpBluescript II SK-のBamHIとEcoRIサイトにサブクローニングし、ｐＬＡＴＰＣＲ１１とした。前述同様にしてｐＬＡＴＰＣＲ１１の塩基配列を決定し、ＰＣＲによって増幅されたこのＤＮＡ断片が、ｐＬＡＴ２１ｃＤＮＡの５’末端からEcoRIサイトまでと同一の配列をもち、ＬＡＴ−ＡＴＧプライマー中の開始メチオニンコドンと植物での遺伝子発現のための保存配列、および酵母発現ベクターへの連結に必要な制限酵素BamHI認識部位を含むものであることを確認した。
さらに、ｐＬＡＴ２１のｃＤＮＡ部分の全塩基配列をｐＧＡＴ４のｃＤＮＡの塩基配列を決めたのと同様な方法で決定した。このｃＤＮＡがコードしていると予想されるアミノ酸配列は、ｐＳＡＴ２０８、ｐＧＡＴ４、ｐＣＡＴ８、ｐＧＡＴ１０６、ｐＰＡＴ４８に対して、それぞれ、６９％、３８％、３７％、３７％、１９％のホモロジーを示した。
実施例22．ラベンダー由来のアシル基転移酵素遺伝子の酵母における発現
ｐＬＡＴＰＣＲ１１からBamHIとEcoRIで切断される約５５０ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＬＡＴ２１からEcoRIとXhoIで切断して得られる約１kbのＤＮＡ断片と、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍをBamHIとSalIで切断して得られる約８ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＹＥＬＡＴ２１とした。先に述べたように、酵母Ｇ１３１５をこのプラスミドで形質転換し、アシル基転移酵素活性を測定した。
その結果、ｐＹＥＬＡＴ２１を導入した酵母では、２４ｎｍｏｌのデルフィニジン３，５−ジグルコシドと２１．５ｎｍｏｌのカフェオイル−ＣｏＡから１９．９ｎｍｏｌのデルフィニジン３−カフェオイルグルコシド５−グルコシドの生成が認められた。従って、ｐＹＥＬＡＴ２１に含まれる合成した完全長ｃＤＮＡは、アシル基転移酵素活性をコードすることが確認できた。
実施例23．ラベンダーアシル基転移酵素遺伝子を含むバイナリーベクターの作製
ｐＬＡＴＰＣＲ１１からBamHIとEcoRIで切断される約５５０ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＬＡＴ２１からEcoRIとXhoIで切断して得られる約１ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢＥＧＵＳｘをBamHIとXhoIで消化して得られる約１１ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＢＥＬＡ１１とした。これを先に述べた方法でAgrobacterium tumefacienceのＡｇ１０株に形質転換し、ペチュニアとバラの形質転換に供した。
実施例24．アシル基転移酵素に対する抗体の作製
ある酵素に対して、アミノ酸配列が似ている酵素の遺伝子をとる方法の一つとして、ある酵素に対する抗体で、発現型のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が上げられる。ここでは、以下のようにして、リンドウのｐＧＡＴ４のコードするアシル基転移酵素に対する抗体を作製した。同様にして、他のアシル基転移酵素の抗体を作製することが可能である。
まず、Bulk and RediPack GST Purification Modules（pharmacia Biotech）を用いて大腸菌でＧＡＴ４タンパク質を大量発現させ、そこから精製を行った。
（１）発現プラスミドの構築
大腸菌でのアシル基転移酵素遺伝子の発現にはｐＧＥＸ−４Ｔ−１を用いた。このｐＧＥＸ−４Ｔ−１を用いてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質をつくり、その後グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのアフィニティカラムを用いることで効率的な精製が行える。
ｐＧＥＸ−４Ｔ−１をSmaIとXhoIで消化した後、DNAブランティングキット（宝酒造（株））を用いて平滑末端化した。得られた約４．９ｋｂのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼＢＡＰ  Ｃ７５（宝酒造（株））を用いて脱リン酸化した。ｐＧＡＴ４を当該ベクター内に存在する制限酵素部位SmaIとKpnIで消化して得られる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を前述と同じように平滑末端化し、前述のｐＧＥＸ−４Ｔ−１をSmaIとXhoIで消化した後平滑末端化した部位に組み換えて、ｐＧＥＸＧＡＴ４を構築した。EcoRIとBglIIで消化してｐＧＡＴ４上のｃＤＮＡとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの向きが同方向であることを確認した。
（２）アシル基転移酵素の大腸菌における発現
ｐＧＥＸＧＡＴ４で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。大腸菌の形質転換法はHanahanの方法に従った（J．Mol．Biol.，166，557-，1983）。形質転換された大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び２％グルコースを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキストラクト１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇを１リットルの蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調製する）５０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液４０ｍｌを４００ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び２％グルコースを含む２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で３時間培養後、０．１ＭのＩＰＴＧを４４０μｌ（終濃度１０ｍＭ）添加し、さらに５時間培養した。集菌後、１０μＭのＡＰＭＳＦを含む１×ＰＢＳ（塩化ナトリウム８．２ｇ、塩化カリウム２．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４３ｇ、リン酸二水素カリウム２．４５ｇを１リットルの蒸留水に溶かした）１００ｍｌに懸濁した。この懸濁液を超音波破砕した後、２０％トリトンＸ−１００を５ｍｌ（終濃度１％）添加した。氷中で冷却しながら３０分振蕩した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた沈殿を１２ｍｌの６ＭのＵｒｅａに懸濁し等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて９０℃、５分間処理し試料として用いた。
この試料０．８ｍｌをディスクゲル電気泳動（分離ゲル７．５％アクリルアミド、濃縮ゲル５％アクリルアミド；ATTO（株）BI0 PHORESISI III）にて分離し、０．８ｍｌずつ分取した。各画分をＳＤＳ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分離ゲル１０％アクリルアミド、濃縮ゲル４．５％アクリルアミド）で分析した結果、ｐＧＡＴ４のコードするアシル基転移酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの融合蛋白質の大きさと一致する分子量約７５０００の蛋白質が単一の蛋白質として存在する画分があった。
この画分（３．２ｍｌ）をCentricon 10（amlcon社）で濃縮し約０．３μｇの融合蛋白質を得た。この試料を用いて、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを用いて常法に従い、抗体を作製した。この抗体を用いて、アシル基転移酵素のホモログを取得することができる。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明においてはリンドウ由来の芳香族アシル基転移酵素の精製、当該酵素のｃＤＮＡのクローニング及び当該ｃＤＮＡの塩基配列の決定を行った。また、大腸菌と酵母での活性発現を行うことにより、分離したｃＤＮＡが芳香族アシル基転移酵素をコードするものであることを確認した。
従って、本発明に係るｃＤＮＡを適当な植物発現ベクターに接続し、植物に導入することにより、アシル化反応を植物の花色調節に利用することが可能となった。
また、本酵素活性を利用することにより、植物の中であるいは試験管内でアントシアンの構造を改変し、より安定なアントシアンを提供することができる。
〔配列表〕
配列番号（SEQ ID NO）：１
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１７０３
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：リンドウ（Gentiana triflora var．japonica）
組織の種類（TISSUE TYPE）：花弁（petal）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pGAT4
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１６２２
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：リンドウ（Gentiana triflora var．japonica）
組織の種類（TISSUE TYPE）：花弁（petal）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pGAT106
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：３
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１６０５
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：ペチュニア（Petunia hybrida）
組織の種類（TISSUE TYPE）：花弁（petal）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pPAT48
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：４
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１４７９
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：シソ（Perilla ocimoides）
組織の種類（TISSUE TYPE）：葉（leaf）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pSAT208
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：５
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１５０８
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：サイネリア（Senecio cruentus）
組織の種類（TISSUE TYPE）：花弁（petal）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pCAT8
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１５２１
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
アンチセンス（ANTI-SENSE）：No
起源（ORIGINAL SOURCE）
生物名（ORGANISM）：ラベンダー（Lavandula angustifolia）
組織の種類（TISSUE TYPE）：花弁（petal）
直接の起源（IMMEDIATE SOURCE）
ライブラリー名（LIBRARY）：cDNA library
クローン名（CLONE）：pLAT21
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配列の型（SEQUENCE TYPE）：アミノ酸（amino acid）
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配列の種類（MOLECULE TYPE）：peptide
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１０
配列の型（SEQUENCE TYPE）：アミノ酸（amino acid）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：peptide
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：１０
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配列の型（SEQUENCE TYPE）：アミノ酸（amino acid）
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配列の種類（MOLECULE TYPE）：peptide
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配列の種類（MOLECULE TYPE）：peptide
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：９
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配列の種類（MOLECULE TYPE）：peptide
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２３
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鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
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鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
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ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
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配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
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配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１６
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
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配列番号（SEQ ID NO）：２２
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１７
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：２３
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２１
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
0003950986.tif 000050
配列番号（SEQ ID NO）：２４
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２３
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
0003950986.tif 000051
配列番号（SEQ ID NO）：２５
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２０
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
0003950986.tif 000052
配列番号（SEQ ID NO）：２６
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２０
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：２７
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：５３
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：２８
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：１６
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：２９
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：４５
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（double）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：３０
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２１
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：一本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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配列番号（SEQ ID NO）：３１
配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：３５
配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid）
鎖の数（STRANDEDNESS）：二本鎖（single）
トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear）
配列の種類（MOLECULE TYPE）：synthetic DNA
ハイポセティカル配列（HYPOTHETICAL SEQUENCE）：No
配列（SEQUENCE DESCRIPTION）
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