(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）種に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を施して得られる、Δ12不飽和化活性が親株に比べて低下又は欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つが親株に比べて高められた変異株を培地中で培養し、その培養物から6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸及び／又は5,8,11−エイコサトリエン酸の少なくとも一つであるオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする、6,9−オクタデカジエン酸、8,11−エイコサジエン酸及び／又は5,8,11−エイコサトリエン酸の少なくとも一つであるオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の培養物又は脂質からオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項３】
前記変異株が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）SAM1861株（FERM BP-3590）を変異させて得たものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異株が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）SAM2086株（FERM P-15766）（FERM BP-6032）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はΔ１２不飽和化活性が低下または欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つがより高められた変異株を用いて醗酵法により、オメガ９系高度不飽和脂肪酸又はそれを含有する脂質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オメガ９系高度不飽和脂肪酸、例えば５，８，１１−エイコサトリエン酸（以下「ミード酸」ともいう）及び８，１１−エイコサジエン酸は、必須脂肪酸欠乏に陥った動物組織の構成脂肪酸のひとつとして存在することが知られている。しかしながら、その含量はわずかであるため単離精製は大変困難であった。これらの高度不飽和脂肪酸は生体内でロイコトリエン３グループの前駆体になることが可能で、その生理活性が大いに期待されており、最近、抗炎症、抗アレルギー及び抗リウマチ作用が報告されている（特開平７−４１４２１）。
【０００３】
このためオメガ９系高度不飽和脂肪酸を大量に製造する方法を開発することが強く望まれており、以前、アラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を行いΔ１２不飽和化活性の低下または欠失した微生物を単離して、オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法を完成した（特開平５−９１８８８）。しかしながら、今まで全く製造方法のなかったオメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質について、その製造方法が開発されたことは画期的なことであり意義があるが、収量の面でまだまだ改良する余地があった。このためオメガ９系高度不飽和脂肪酸をより大量に製造する方法を開発することが強く望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、安価な常用の培地を用いてより大量にオメガ９系高度不飽和脂肪酸又はそれを含有する脂質を製造することができる方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の目的を達成するための種々研究の結果、Δ１２不飽和化活性が低下又は欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つが高められた変異株を見い出し本発明を完成した。
【０００６】
従って本発明は、モルティエレラ（Mortierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドスポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に、変異処理を施して得られる、Δ１２不飽和化活性が低下または欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つがより高められた変異株を培地中で培養し、その培養物からオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記の方法により得られる培養物又は脂質からオメガ９系高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸の製造方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、変異処理に用いる微生物（以下「親株」ともいう）は、モルティエレラ（Mortierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドスポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生物である。
【０００８】
これらの微生物では、ステアリン酸はΔ９不飽和化酵素によってオレイン酸に、オレイン酸はΔ１２不飽和化酵素によってリノール酸に、リノール酸はΔ６不飽和化酵素によってγ−リノレン酸に、γ−リノレン酸は鎖長延長酵素によってジホモ−γ−リノレン酸に、ジホモ−γ−リノレン酸はΔ５不飽和化酵素によってアラキドン酸に変換される。またこれらの微生物は、Δ１２不飽和化活性が阻害されると、Δ６不飽和化酵素によってオレイン酸から６，９−オクタデカジエン酸が、鎖長延長酵素によって６，９−オクタデカジエン酸から８，１１−エイコサジエン酸が、そしてΔ５不飽和化酵素によって８，１１−エイコサジエン酸からミード酸が生合成される。
【０００９】
本発明に用いる親株としては、アラキドン酸の生産性に優れているモルティエレラ属のモルティエレラ亜属に属する微生物が好ましく、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella  elongata）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella  exigua）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグリフィラ（Mortierella  hygrophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等の菌株を挙げることができる。
【００１０】
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection，ＡＴＣＣ），及びCentrralbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また、本発明らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。
【００１１】
また本発明に用いる親株は、上記のアラキドン酸生産能を有する微生物（野性株）の変異株又は組換え株、即ち、同じ基質を用いて培養したときに、元の野性株が産生する量と比べて、油脂中のオメガ９系高度不飽和脂肪酸含量が多くなるように、または総油脂量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。さらに費用効果の優れた基質を効率よく用いて、対応する野性株と同量のオメガ９系高度不飽和脂肪酸を産生するように設計された微生物も含まれる。
【００１２】
本発明のΔ１２不飽和化活性の低下または欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つが強化された変異株を得るには、上記のアラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を行い、まずΔ１２不飽和化活性の低下または欠失した変異株を得、さらにこの変異株に変異処理を行うことにより、Δ１２不飽和化活性の低下または欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つが強化された変異株を得ることができる。Δ１２不飽和化活性の欠失した変異株として、例えばモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条寄第３５９０号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５９０）を使用することができる。
【００１３】
本発明の変異株において、親株としてΔ１２不飽和化活性の低下または欠失している微生物、好ましくはΔ１２不飽和化活性が欠失している微生物を用いることにより、そのΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性、鎖長延長活性が高められているかどうかは容易に評価することができる。
【００１４】
具体的には、Δ１２不飽和化活性の低下または欠失している微生物の場合、そもそも菌体内にオメガ６系不飽和脂肪酸、例えばリノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸が存在しないか、存在してもわずかであるため、培養後に得られた休止菌体とリノール酸を反応させればΔ６不飽和化酵素によりγ−リノレン酸が生成し、ジホモ−γ−リノレン酸を反応させればΔ５不飽和化酵素によりアラキドン酸が生成し、またγ−リノレン酸を反応させれば鎖長延長酵素によりジホモ−γ−リノレン酸が生成し、各酵素活性を容易に測定することができ、親株との比較により、変異処理により得られる微生物のもつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性および鎖長延長活性を評価することができる。
【００１５】
本発明の具体的な変異株として、例えば、Δ１２不飽和化活性の欠失している微生物、モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１から本発明者らが誘導したΔ６不飽和化活性が上昇したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（８生寄文第１２３５号、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７６６）を使用することができるが、この菌株に限定しているわけではなく、Δ１２不飽和化活性の低下又は欠失している親株のΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性又は鎖長延長活性を１として、これらの活性の内、少なくともひとつが１を越える活性を示す変異株をすべて使用することができる。
【００１６】
本発明の変異株を培養して得られるオメガ９系高度不飽和脂肪酸は、例えば６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸等を挙げることができる。
本発明では、特にΔ１２不飽和化活性が欠失し、かつΔ５不飽和化活性及びΔ６不飽和化活性が強化された変異株を用いることによって、ミード酸を大量に製造することができる。
【００１７】
突然変異を誘発させるためには、放射線（Ｘ線、γ線、中性子線）照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変異操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−ブロモウラシル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロフラビン等の色素類（その他の誘導体）や、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤や塩化マンガン、ホルムアルデヒド等のその他の化合物を挙げることができる。また親株は、生育菌体（菌糸など）でも良いし、胞子でも良い。
【００１８】
本発明の製造方法において変異株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、クエン酸等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、特にグルコース、マルトース、糖蜜、グリセロール等が好ましい。
【００１９】
また窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要に応じリン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩類及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。
【００２０】
これらの培地成分は微生物の成育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１５重量％、窒素源は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％の濃度とするのが良い。
培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けてオメガ９系高度不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。このような温度管理により、生成脂肪酸中のオメガ９系高度不飽和脂肪酸の生成量を上昇せしめることができる。培地のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜８として通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培養は通常２〜２０日間好ましくは５〜２０日間、より好ましくは５〜１５日間行う。
【００２１】
固体培養で培養する場合は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度において、３〜１４日間培養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無機塩類、微量栄養源を加えることができる。また、本発明においては、培地中にオメガ９系高度不飽和脂肪酸の基質を添加して培養することにより、オメガ９系高度不飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。
【００２２】
テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）もしくはエステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油）等を挙げることができるが、これらに限られるものではない。基質の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
これらの炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン又は基質は、生産微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又は培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は複数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連続的に添加することもできる。
【００２３】
このようにして培養して、菌体内にオメガ９系高度不飽和脂肪酸を大量に含有する脂質が生成蓄積される。液体培地を使用した場合には、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液もしくはその殺菌した培養液、または培養終了時の培養液もしくはその殺菌した培養液、またはそれぞれから集菌した培養菌体もしくはその乾燥物からオメガ９系高度不飽和脂肪酸含有脂質を採取する。例えば培養菌体からは次のようにしてオメガ９系高度不飽和脂肪酸含有脂質の採取、及びオメガ９系高度不飽和脂肪酸の単離を行う。
【００２４】
培養終了後、培養液より遠心分離及び／又は濾過等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は好ましくは水洗、破砕、乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃度にオメガ９系高度不飽和脂肪酸を含有した脂質が得られる。
【００２５】
また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
上記のようにして得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪酸がトリグリセリドやフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトールに結合した状態で存在している。培養物から採取したオメガ９系高度不飽和脂肪酸含有脂質からオメガ９系高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドの精製は、常法により、ヘキサン抽出後、脱酸、脱色、脱臭、脱ガム処理あるいは冷却分離などにより行うことができる。
【００２６】
また上記のようにして得られた脂質中には、各種オメガ９系高度不飽和脂肪酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれている。これらを直接分離することもできるが、低級アルコールとのエステル、例えば８，１１−エイコサジエン酸メチル、６，９−オクタデカジエン酸メチル、ミード酸メチル等として分離するのが好ましい。このようなエステルにすることにより、他の脂質成分から容易に分離することができ、また、培養中に生成する他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、オメガ９系高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステル化される）から容易に分離することができる。例えば、オメガ９系高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得るには、前記の抽出脂質を無水メタノールー塩酸５〜１０％、ＢＦ３ーメタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜２４時間処理するのが好ましい。
【００２７】
前記の処理液からオメガ９系高度不飽和脂肪酸メチルエステルを回収するにはヘキサン、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するのが好ましい。次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより主として脂肪酸エステルからなる混合物が得られる。この混合物には、目的とするオメガ９系高度不飽和脂肪酸メチルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル等の脂肪酸メチルエステルが含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混合物からオメガ９系高度不飽和脂肪酸メチルエステルを単離するには、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々交流分配クロマトグラフィー等を単独で、又は組み合わせて使用することができる。
【００２８】
こうして単離された各種オメガ９系高度不飽和脂肪酸メチルからオメガ９系高度不飽和脂肪酸を得るには、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。
又、オメガ９系高度不飽和脂肪酸をそのメチルエステルを経ないで採取するには、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、この分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法により抽出・精製することができる。
【００２９】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
Czapek寒天培地（０．２％NaNO3 、０．１％K2HPO4、０．０５％MgSO4 、０．０５％ KCl、０．００１％FeSO4 、３％Sucrose 、２％寒天、ｐＨ６．０）に、Δ１２不飽和化活性を欠失している変異株であるモルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）ＳＡＭ１８６１を植菌し胞子形成させ、胞子溶液（５０mMTris／malate緩衝溶液（ｐＨ７．５）、１ x１０6 spores／ml）を調製した。
得られた胞子溶液１．０mlに１００mM Tris ／malate緩衝溶液（ｐＨ７．５）０．５mlを加え、ＮＴＧ溶液（N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine ５mg／脱イオン水１ml）５００μl 加えて、２８℃で１５分間インキュベートして変異処理を施した。
【００３０】
ＮＴＧ処理された胞子懸濁液は、１０-3〜１０-4程度に希釈し、ＧＹ寒天プレート（１％グルコース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Triton）X −１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に塗布した。２８℃で培養し、コロニーが出現したものからランダムに新しいプレートにピックアップした。
ピックアップした保存コロニーを、ＧＹ寒天プレートで２８℃で２日間、１２℃で２日間培養し、寒天ごとくりぬいて１００℃で乾燥させた。
【００３１】
得られた乾燥菌体をねじ口試験管（１６．５mmφ）に入れ、塩化メチレン１ml、無水メタノール- 塩酸（１０％）２mlを加え、５０℃で３時間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ml、水１mlを加えて、２回抽出し、抽出液の溶媒を遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。そして、スクリーニングの結果、親株であるモルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina) ＳＡＭ１８６１よりミード酸の生産性の高いモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７６６）が得られた。さらにこのＳＡＭ２０８６を親株として上記と同様の変異処理を行ない、モルティエレラ・アルピナＳＡＭ２１０４が得られた。
【００３２】
実施例２
グルコース４％及び酵母エキス１％を含む培地（ｐＨ６．０）５Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）の突然変異株ＳＡＭ１８６１またはＳＡＭ２０８６の前培養液１００mlを接種し、通気量１vvm 、撹伴数３００rpm 、８日間の通気攪拌培養を行った。培養温度は、培養開始時は２８℃で、培養２日目より２０℃に下げて行った。培養１日目から４日目まで毎日１％のグルコースを添加した。培養終了後、濾過により各々の菌体を回収し、十分水洗した後、得られた湿菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体をそれぞれ９９．７ｇ、９２．５ｇ得た。
【００３３】
この菌体より、クロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いるBlight & Dyer の抽出法によって脂質を抽出したところ、それぞれ４８．９２ｇ、４４．１７ｇの脂質が得られた。油脂の脂肪酸組成を確認するためこの油脂１０mgをねじ口試験管に入れ、塩化メチレン１ml、無水メタノール−塩酸（１０％）２mlを加え、５０℃で３時間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ml、水１mlを加え、２回抽出し、抽出液の溶媒を遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。表１にその結果を示す。
ＳＡＭ１８６１から変異処理により誘導したＳＡＭ２０８６は、ミード酸の生産性並びに含有率両面において優れた変異株であることが明かとなった。
【００３４】
【表１】
0003995290.tif 000002
【００３５】
実施例３
ねじ口試験管（１６．５mmφ）に０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）１ml、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）の突然変異株ＳＡＭ１８６１またはＳＡＭ２０８６の実施例２で得た湿菌体３０mg、ＢＳＡ懸濁基質溶液（リノール酸、γ−リノレン酸、またはジホモ−γ−リノレン酸を２０mgを５％牛血清アルブミン（脂肪酸フリーＢＳＡ、シグマ社製）溶液２mlに混合し、約２０分間ソニックにかけ懸濁したもの）１００μl を加え、シリコ栓をして、２８℃、１２０rpm で振盪した。０、２、６、２０時間後に４mlエタノールを加えて反応を止めた。
【００３６】
そして、遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で乾燥した後、実施例２と同様にメチルエステル化を行い、得られた脂肪酸メチルエステル（基質及び反応生成物）をキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。なお、コントロールには同量の５％ＢＳＡ溶液を添加した。したがって、基質にジホモ−γ−リノレン酸を用いれば反応生成物であるアラキドン酸量よりΔ５不飽和化活性が求まり、基質にγ−リノレン酸を用いれば反応生成物であるジホモ−γ−リノレン酸量より鎖長延長活性が、アラキドン酸量よりΔ５不飽和化活性が求まり、そして、基質にリノール酸を用いれば反応生成物であるγ−リノレン酸量よりΔ６不飽和化活性が、ジホモ−γ−リノレン酸量より鎖長延長活性が、アラキドン酸量よりΔ５不飽和化活性が求まる。表２にその結果を示す。
【００３７】
基質にジホモ−γ−リノレン酸を用いたΔ５不飽和化活性でＳＡＭ１８６１の活性を１とした場合、ＳＡＭ２０８６の活性は１．７４となり、基質にリノール酸を用いたΔ６不飽和化活性でＳＡＭ１８６１の活性を１とした場合、ＳＡＭ２０８６の活性は１．４２となり、実施例２のＳＡＭ１８６１から変異処理により誘導したＳＡＭ２０８６のミード酸の生産性並びに含有率の上昇はΔ５不飽和化活性並びにΔ６不飽和化活性の強化によることが明かとなった。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
実施例４
グルコース２％、酵母エキス１％に、表３に示したオメガ９系高度不飽和脂肪酸の前駆体またはそれを含む油脂をそれぞれ０．５％添加した培地（ｐＨ６．０）２mlを１０mlのエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina）の突然変異株ＳＡＭ２０８６を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１１０ rpm）により、２８℃で８日間培養した。表３にその結果を示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
実施例５
グルコース２％、酵母エキス１％、オリブ油０．１％及びアデカノール０．０１％を含む培地（ｐＨ６．０）５L を１０L ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella  alpina) ＳＡＭ２１０４の前培養液１００mlを摂取し、通気量１vvm 、撹伴数３００rpm 、８日間の通気攪拌培養を行った。
培養温度は、培養開始時は２８℃で、培養２日目より２０℃に下げて行った。培養２日目及び培養３日目に１．５％グルコースを添加した。培養終了後、実施例２と同様の操作により、培地１Ｌ当り１５．８０ｇの乾燥菌体を得た。実施例２と同様に脂質を抽出し、該脂質をメチルエステル化し、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。ミード酸、８，１１−エイコサジエン酸、６，９−オクデカジエン酸の生産量（ｇ／Ｌ）及び全脂肪酸に対する割合（％）は、ミード酸が１．７６ｇ／Ｌ、２３．７６％；８，１１−エイコサジエン酸が０．３５ｇ／Ｌ、４．７５％；６．９−オクタデカジエン酸が０．８４ｇ／Ｌ、１１．３５％であった。