(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基の塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを特徴とするステロイド性大腿骨頭壊死症のリスクを判定する方法。
【請求項２】
基板表面に区画された複数の領域の少なくとも１つにＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の野生型または変異型の塩基を含むオリゴヌクレオチドを結合させたＤＮＡチップを用いてステロイド性大腿骨頭壊死症のリスクを判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ステロイド性大腿骨頭壊死症のリスクを判定する方法及びＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
特発性の大腿骨頭壊死症（ＯＮＦ）は、大腿骨頭の無腐性、虚血性壊死により生じる。結果として生じる大腿骨頭の圧潰は、股関節の機能に重大な悪影響を与える。ＯＮＦは、徐々に進行し、人工関節置換術などの外科的治療が必要になることが多く、頻度は若年及び中年で高い。発生機序は十分には解明されていないが、ステロイド投与、長年にわたる多量のアルコール摂取、喫煙習慣、脂質代謝異常のような因子の関与が実証された（Cruess RL, Clin Orthop 1986, 208, 30-9; Hirota Y. et al., Am J. Epidemiol 1993; 137, 530-8）。なかでもステロイド誘発ＯＮＦは、高い割合を占める。高用量のステロイドは膠原病、ネフローゼ症候群、臓器移植において投与される。そのような患者数は増大しており、ステロイド性ＯＮＦも増加している。同様なステロイド治療を受けた患者でも、ＯＮＦ発生をみる場合とそうでない場合があり、ステロイド感受性の個人差の存在が指摘される（Kubo T. et al., Transplant Proc. 1998, 30, 3039-40）。
【０００３】
ＯＮＦは、頸椎後縦靱帯骨化症とともに整形外科分野の特定疾患に指定されており、その発症を予防する事が極めて重要である。
【０００４】
本発明は、ステロイドに対する各患者の感受性の違いをステロイド投与前に確認し、ステロイド性ＯＮＦの発生を防止することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、術後に拒絶反応を抑制するためのステロイド治療を全例施行する腎移植患者を対象として患者血液よりＤＮＡを採取し、輸送タンパク質P-glycoprotein(P-gp)をコードする遺伝子であるＭＤＲ１のＤＮＡ配列上の塩基多型（以下、ＳＮＰ）の中で、エクソン２６の３４３５位の塩基をdirect sequencingにより解析した。さらにＯＮＦとの関連について統計的に解析し、Ｃ３４３５Ｔ（３４３５位のＣ（野生型）がＴ（変異型）に置換されたもの）のホモ接合体遺伝子をもつ患者において、ＯＮＦ発生が非常に低いことを見出した。
【０００６】
本発明は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基のＳＮＰを検出することを特徴とするステロイド性大腿骨頭壊死症のリスクを判定する方法を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、基板表面に区画された複数の領域の少なくとも１つにＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の野生型または変異型の塩基を含むオリゴヌクレオチドを結合させたＤＮＡチップを提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基は、野生型が「Ｃ」であり、変異型が「Ｔ」である。この３４３５番目の遺伝子型が変異型のホモ接合体（ＴＴ）の場合には、ステロイドを多量に投与してもＯＮＦの発生は１９例中２例（発症率１０．５％）であるが、遺伝子型が野生型ホモ（ＣＣ）またはヘテロ（ＣＴ）の場合には、いずれも３０症例中１１例（ＣＣ；３６．７％）及び４０症例中１４例（ＣＴ；３５％）の高い割合でＯＮＦが発生することが明らかになった。
【０００９】
ステロイドは、膠原病、ネフローゼ症候群、臓器移植などにおいて高用量で使用される臨床上有用な薬物である。従って、ＯＮＦの確率の低い変異型ホモ（ＴＴ）の患者では、ステロイドを高用量で使用することができ、ステロイド投与時のＯＮＦの検査についても頻度を抑えることができる。一方、野生型ホモ（ＣＣ）或いはヘテロ（ＣＴ）の患者では、ＯＮＦの発症率が３５％程度と高いため、ステロイドの投与量を抑え、代替薬物（例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６）を投与することが検討される。特に、ＦＫ５０６はＯＮＦの発症リスクが低いために好ましい（表３参照）。また、このようなＯＮＦのリスクの高い患者では、ステロイドの投与量を抑えた場合であっても、ＯＮＦの検査を定期的に行うことが推奨される。
【００１０】
本発明のＤＮＡチップは、基板表面に区画された複数の領域の少なくとも１つにＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の野生型（Ｃ）及び／又は変異型（Ｔ）の塩基を含むオリゴヌクレオチドを結合させている。結合されるオリゴヌクレオチドは、１５〜３５個、好ましくは１８〜２５個程度の塩基長を有し、ＭＤＲ１遺伝子又はその相補鎖の野生型と変異型のいずれか一方のみとハイブリダイズし、その塩基多型を検出することができる。該オリゴヌクレオチドは３４３５番目以外の１又は２の塩基がＭＤＲ１遺伝子又はその相補鎖の配列と異なっていてもよい。
【００１１】
基板としては、疎水性、あるいは親水性の低い基板であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２〜５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板の材質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。基板の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００１２】
基板は、その表面がポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等で処理されていることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンで処理されていることが特に好ましい。また、基板は、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種カップリング剤によってその表面が処理されていてもよく、ポリ−Ｌ−リシン等を用いる処理に、シランカップリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。表面処理を行うことによって、疎水性、あるいは親水性の低い基板とＤＮＡ断片との静電気的な相互作用を促進することができる。
【００１３】
表面処理がされた基板表面上に、さらに、電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって表面処理がされた基板の凹凸を軽減することができる。基板の種類によっては、その基板中に該高分子物質等を含有させることも可能であり、このような処理を施した基板も好ましく用いることができる。
【００１４】
ＤＮＡ断片の接着は、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて基板表面上に滴下して行うことが好ましい。
【００１５】
ＤＮＡ断片の固定は、親水性ポリマーの添加処理によって安定に行うことができるが、さらに安定に行うために、該処理に加えて、下記に記載する二種類の処理の何れか一方あるいは両方を組み合わせて行うことが好ましい。
【００１６】
その処理の一つとして、ＤＮＡ断片の末端に、予め静電的な相互作用に関与しうる官能基を導入する。そのような官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、ビオチン基等を挙げることができるが、アミノ基であることが好ましい。
【００１７】
もう一つの処理として、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとの混合溶液を基板表面に点着した後、加熱、紫外線（ＵＶ）、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施す。また、これらの後処理は、複数種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。これらの後処理によって、ＤＮＡ断片の末端に導入した官能基と基板表面との間に架橋が形成され、その結果、ＤＮＡ断片がさらに安定に結合すると考えられる。
【００１８】
親水性ポリマーとしては、カチオン性、アニオン性もしくは両性のイオン性の親水性ポリマーを用いることが好ましい。ノニオン性ポリマーも好ましく用いることができる。親水性ポリマーは、ＤＮＡ断片との静電的な相互作用が強いこと、かつハイブリダイゼーションに対する阻害作用が少ないことが好ましい。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、ステロイド投与時のＯＮＦの発症リスクを正確に評価することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
（１）患者及び方法
(i)研究デザイン：対象は1983年から2001年に京都府立大学病院移植外科で腎移植を施行された89例である。そのうち27例が大腿骨頭壊死症(ONF)を発生した。この研究は当該病院における人間を対象とする医学倫理委員会の研究許可のもとに実施しており，各患者から，同意書を得ている。またONFの診断は厚生労働省大腿骨頭壊死症調査研究班による診断基準により行った。
(ii)MDR1遺伝子エクソン26(C3435T)の検討：ゲノム DNA をDNeasyTMTissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany)を用いて末梢血から抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅後、ABI PRISM377 Sequencerを用いて，塩基配列決定を行った。PCRには既知の塩基配列（GenBank accession no:M29445）をもとにプライマーを作成した。プライマーの塩基配列は5'-TTCAGCTGCTTGATGGCAAA-3’(ｆ：フォワードプライマー；配列番号２)，5’-AGGCAGTGACTCGATGAAGG-3’(r：リバースプライマー；配列番号３)である。PCRの条件は最初の変性を1サイクル94℃5分，続いて94℃1分，58℃1分，72℃1分を35サイクル，最後に伸長72℃1分を1サイクルで施行した。
(iii)臨床情報（Clinical information）：SNPの情報以外に，以下の情報を収集した。つまり，性別，移植時年齢，移植腎の種別（生体腎・死体腎）, 急性拒絶反応の有無 ，そして術後9週目までの経口ステロイド量（プレドニゾロン換算）である。統計解析時，経口ステロイド量は3分位とし，変数に組み込んだ。すなわち、投与量が1392.5mg未満, 1392.5-1485.0mg, そして 1485.0mg以上の3群に分けた。
(iv)統計解析（Statistical analysis）：統計解析にはlogistic regression modelを用いオッズ比（odds ratio；OR)ならびに95%信頼区間(95%CI)を計算した。なおこれらの解析にはすべてStatistical Analysis System (SAS, ver 6.12)を使用した。
【００２１】
結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0003918075.tif 000002
【００２３】
統計解析は、＊Chi square test又は#Wilcoxon rank sums testを用いて行った。
【００２４】
表１にONF発生・非発生群別の一般特性を示す。ＯＮＦ発生例で術後シクロスポリンを投与された症例が有意に高かった(88.9% vs 48.4%, p=0.001)。 そして，術後9週目までの経口ステロイド量は，ONF発生群の方が有意に高かった (p=0.001)。
【００２５】
MDR1遺伝子のC3435T出現頻度はCC 遺伝子型33.7%,CT 遺伝子型 44.9%, TT 遺伝子型 21.3%であった。表２に個々のMDR1遺伝子型の一般特性を示す。特にＯＮＦ発生群と非発生群で有意差を示す項目はなかった。
【００２６】
【表２】
0003918075.tif 000003
【００２７】
統計解析は、＊Mantel-extension method又は#Kruskal-Wallis testを用いて行った。
全ての因子を加味した多変量解析では，TTはCCと比較してONFリスクの有意な低下を認めた (オッズ比（OR）=0.14, 95%CI: 0.02-0.88, p=0.036)(表３)。
【００２８】
表３，表４において、補正後のオッズ比の「補正」とは、遺伝子型のほかに，ONF発生に影響を与えうる様々な臨床データ（性，移植時年齢，急性拒絶反応の有無，術後に使用した免疫抑制剤の種類，術後9週目までのステロイド量）を多変量解析（統計学的にそれぞれの因子の影響を補正する手法）を用いて解析しており、遺伝子型の情報を臨床データで統計学的に補正したことを意味する。
【００２９】
【表３】
0003918075.tif 000004
【００３０】
オッズ比は、イベントが起きる確率と起きない確率の比を意味し、リスク比に近似する概念である。具体的に言うとMDR1遺伝子CCの遺伝子型のONF発生が起こる可能性を1とすると，CTの遺伝子型でONF発生起こる可能性は0.63,TTの遺伝子型では0.13ということになる。ただし95%信頼区間(95%CI)が1をまたいでいると統計学的には有意ではない。
【００３１】
さらに我々は、シクロスポリン投与群のみを対象として同様の解析を施行した（表４）。
【００３２】
【表４】
0003918075.tif 000005
【００３３】
CC・CTを一群にした群とTTでの比較で，単変量・多変量ともにTTでONFリスクが有意に減少した (単変量 0.09: 0.01-0.74,多変量 0.10: 0.01-0.95)。ステロイド量に関しては単変量・多変量ともに有意に量依存的にONFリスクは増加した (単変量 p=0.016, 多変量p=0.016)。そして，1485mg以上投与群で境界領域のONFリスクの増加を認めた (単変量 7.31: 0.76-70.0, 多変量11.2: 0.73-172.0)。
【００３４】
なお、ONFリスクが増加したとは、pは、表中にあるようにトレンドpで、3群間で（<1392.5，<1485.0，1485.0+の３群で）傾向を持って統計学的な差があることを意味する。
【００３５】
【配列表】
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