(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠失した本来のブタ繁殖・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）核酸の少なくとも一部を有するＰＲＲＳＶレプリコンであって、ＰＲＲＳＶポリメラーゼ領域由来のＰＲＲＳＶの５’非コーディング領域−ＯＲＦ１ａ−ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７−３’非コーディング領域に由来するｉｎ  ｖｉｖｏにてＲＮＡ複製が可能な必須配列要素を含むレプリコン。
【請求項２】
ＰＲＲＳＶの５’非コーディング領域−ＯＲＦ１ａ−ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７−３’非コーディング領域由来の必須配列要素および少なくとも１つの異種微生物に由来する核酸をさらに含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにてＲＮＡ複製が可能な、ブタ繁殖・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）レプリコン。
【請求項３】
少なくとも１つの異種微生物に由来する核酸をさらに含む、請求項１に記載のレプリコン。
【請求項４】
少なくとも、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７領域におけるヌクレオチド１４６４３〜１４６８７の間の領域に相当する核酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項５】
Ｎ−タンパク質をコードするＯＲＦ７遺伝子において、Ｎ−タンパク質カプシド形成を不可能にする核酸の置換または欠失を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項６】
Ｎ−タンパク質の部位２７および／または７６においてシステインを欠失する核酸の改変を含む、請求項５に記載のレプリコン。
【請求項７】
Ｎ−タンパク質におけるアミノ酸２５〜３０を含むＢ領域および／またはアミノ酸５１〜６７および／またはアミノ酸８０〜９０を含むＤ領域のアミノ酸の交換を導く核酸の改変を含む、請求項５に記載のレプリコン。
【請求項８】
血清学的な区別を可能とするマーカーが導入されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項９】
Ｎ−タンパク質の部位６２における本来のアスパラギン残基のアミノ酸交換を導く核酸の改変を含む、ウイルス産生可能な、請求項８に記載のレプリコン。
【請求項１０】
ＯＲＦ２、３、４、５、および／または６においてアミノ酸交換を導く核酸の改変を含む、請求項８に記載のレプリコン。
【請求項１１】
ＰＲＲＳＶの病原性マーカーにおける核酸の改変を含む、請求項１〜４および８〜１０のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項１２】
膜貫通Ｍ−タンパク質をコードするＯＲＦ６における核酸の改変を含む、ウイルス産生可能な、請求項１１に記載のレプリコン。
【請求項１３】
前記改変が、第２と第３の膜貫通断片の間においてタンパク質Ｍを改変する、請求項１２に記載のレプリコン。
【請求項１４】
前記異種微生物が病原体を含む、請求項２〜１３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項１５】
前記病原体がウイルスである、請求項１４に記載のレプリコン。
【請求項１６】
ワクチンを得るための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のレプリコンの使用。
【請求項１７】
前記ワクチンが非伝播性ワクチンである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ワクチンがマーカーワクチンである、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のレプリコンを含むワクチン。
【請求項２０】
ブタにワクチン接種するための、請求項１９に記載のワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスの分野およびＰＲＲＳウイルスから得られた感染性クローンに関する。さらに、発明は、ＰＲＲＳウイルスのかかる感染性クローンを用いて、およびそれを改変することによって得ることができるワクチンおよび診断用アッセイに関する。
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）および類人猿出血熱ウイルスと共にアルテリウイルス族に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Meulenberg et al., 1993）。最近、ウイルス分類学の国際委員会は、この族をＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（ゲノム長、２８〜３０塩基対）およびＴｏｒｏｖｉｒｉｄａｅ（ゲノム長２６〜２８塩基対）と共に、新しいウイルスの目、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目に組み入れることを決定した。Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目は、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含有するエンベロープのあるＲＮＡウイルスであり、複製の際にサブゲノムＲＮＡの３’入れ子状態のセットを合成する。コロナウイルスおよびアルテリウイルスのサブゲノムＲＮＡは、ウイルスゲノムの５’末端に由来するリーダー配列を含有する。トロウイルスのサブゲノムＲＮＡはリーダー配列を欠く。ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼをコードするＯＲＦ１ａおよび１ｂは、ゲノムＲＮＡから発現されるが、構造タンパク質をコードする、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓのゲノムの３’末端におけるさらに小さなＯＲＦはサブゲノムｍＲＮＡから発現される。
【０００３】
本明細書におけるレプリコンは組換え核酸に由来するとして定義される。ＰＲＲＳＶに関するゲノム情報は今や明らかになりつつあるが、たとえば、得られた組換え核酸がｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡ複製ができるような機能的なレプリコンとして使用することができるように、（ポリメラーゼまたは構造［エンベロープ］タンパク質のような）必須の（ＰＲＲＳ）ウイルスタンパク質を発現する（相補的な）細胞において、またはかかるＰＲＲＳレプリコンをコードする核酸を含むワクチンで接種した後、ブタのような動物において独立したｉｎ  ｖｉｖｏのＲＮＡ複製ができるような機能的なレプリコンとして使用することができるように、ＰＲＲＳＶゲノムのどこに欠失または改変が位置することができるのかは判っていない。
【０００４】
ＰＲＲＳＶ（レリスタッド株ウイルス）は、１９９１年、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔらによって初めて単離され、今やブタ繁殖・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）として知られる新しい疾患の原因物質であることが明らかにされた。疾患の主な症状は、ブタにおける呼吸器の問題および雌ブタにおける流産であり、時には雌ブタの死亡率によって厄介なことになる。１９８７年米国で、および１９９１年欧州で最初に認められたように重大な発生は減少していったが、このウイルスは種々の毒性があり、または毒性の低い形態もあり、米国、欧州、およびアジアにおける集団で依然として経済的に大きな損失の原因となっている。
【０００５】
ＰＲＲＳＶは好ましくは、肺胞マクロファージの中で増殖する（Wensvoort et al., 1991）。ＣＬ２６２１株およびサルの腎臓細胞株からクローン化したその他の細胞株であるＭＡ１０４株のようなわずかな細胞株がウイルスに感受性である。周知のＰＲＲＳＶ株の一部は、受入番号、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、Ｉ−１１４０、Ｉ−１３８７、Ｉ−１３８８、ＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８、または、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、およびＶＲ２４０２のもとで知られている。ＰＲＲＳＶのゲノムは長さ１５ｋｂであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）をコードする遺伝子および構造タンパク質（ＯＲＦ２〜７）をコードする遺伝子を含有する（Meulenberg et al., 1993; Meulenberg et al., 1996）。ＯＲＦ５はＧＰ5と命名された、エンベロープの主要糖タンパク質をコードする。ＯＲＦ２、３、および４はそれぞれ、ＧＰ2、ＧＰ3およびＧＰ4と命名された糖タンパク質をコードする。このような糖タンパク質は、ＰＲＲＳＶのレリスタッド株ウイルス単離物の精製ビリオンにはさほど豊富に存在しない。ＧＰ5タンパク質は、ＯＲＦ６によりコードされる膜タンパク質Ｍとジスルフィド結合したヘテロダイマーを形成する。ヌクレオカプシドタンパク質ＮはＯＲＦ７によってコードされる。欧州および北米に由来するＰＲＲＳＶ単離物のゲノム配列、およびモノクローナル抗体との反応性の分析によって、それらが２つの異なった抗原性の種類を示すことが判明した。このような大陸に由来する単離物は、遺伝的に区別することができ、相対的に遠い過去、共通の祖先から分岐したにちがいない（Murtaugh et al., 1995）。
【０００６】
ＰＲＲＳＶは口鼻経路を介してブタに感染することができる。肺胞マクロファージによって肺の中のウイルスが取りこまれ、このような細胞の中で、ＰＲＲＳＶの複製は９時間以内に完了する。ＰＲＲＳＶは１２時間以内に肺から肺リンパ節に移り、３日以内に末梢リンパ節、骨髄および脾臓に移動する。このような部位では、ごくわずかな細胞がウイルス抗原に対して陽性に染まる。ウイルスは少なくとも２１日間、多くの場合それより長く血中に存在する。７日後、ＰＲＲＳＶに対する抗体が血中に見い出される。ＰＲＲＳに感染したブタにおけるウイルスと抗体の混在は、低レベルであったとしても、抗体の存在にかかわらず、ウイルス感染が長期間持続する可能性があることを示している。少なくとも７週間、肺における肺胞細胞の集団は、通常のＳＰＦの肺とは異なっている。
【０００７】
ＰＲＲＳＶは口鼻経路を介してブタに感染するためにはエンベロープを必要とし、したがってブタの正常な免疫反応は、とりわけ、１またはそれより多くのエンベロープタンパク質に対して向けられた中和抗体の産生を必然的に伴い；かかる抗体はウイルスを非感染性にすることができる。しかしながら、いったん肺胞マクロファージに入ると、ウイルスは、時には部分的にいずれか一方の糖タンパク質を含有するＭ−および／またはＮ−タンパク質によってカプシドに包まれたＲＮＡで構成される剥き出しのカプシドも産生する。このような不完全なウイルス粒子または（部分的には）剥き出しのカプシドの細胞内および細胞外の存在は、電子顕微鏡によって明示することができる。時には、核酸を含有しない剥き出しのカプシドを見い出すこともできる。剥き出しのカプシドは血流によって全身に分布し、脾臓、リンパ節および骨髄のマクロファージに血液から取り込まれる。ブタが産生した抗体によってこのような剥き出しの、しかし感染性のあるウイルスのカプシドを中和することはできず、したがって、抗体の存在下においてウイルス感染が持続することを説明することができる。このようにして感染した骨髄細胞に由来するマクロファージの子孫は生体の新しい部位にウイルス感染を広げて行く。骨髄のマクロフェージ系列の細胞がすべて感染するわけではないので、末梢部位におけるごくわずかなマクロファージが感染し、ウイルスを産生する。たとえば、組換え仮性狂犬病−ＯＲＦ７ベクターウイルスをマクロファージに感染させることにより、他のウイルスタンパク質の非存在下でＯＲＦ７タンパク質のみから成るＰＲＲＳＶカプシドを形成することができる。ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７ゲノム情報を含有するようにＰＲＶウイルスを操作する。感染１８時間後、感染細胞の細胞質は、大量の、ＰＲＲＳウイルスのヌクレオカプシドの大きさを持った小さな球状構造を含有する。
【０００８】
現在、弱毒化した生ワクチンおよび死菌ＰＲＲＳＶワクチンを利用することができるが、一般にこれらは、免疫力が不充分、または特定のブタ、すなわち、年少の子ブタまたは妊娠９ヵ月目の雌ブタにとって毒性が強過ぎることが示されている。免疫原性が充分でないＰＲＲＳＶワクチンが市場で長持ちしないのは明らかである。しかしながら、数種の既存の免疫原性のあるワクチンが安全でないということは、毒性を軽減した弱毒化ＰＲＲＳＶワクチンのニーズを物語っている。
【０００９】
さらに、特定の状況下では、数種の既存のワクチンが集団の中で伝播し、接種の必要のない、または接種すべきではないブタに不用意に感染する可能性があるということは、非伝播性のＰＲＲＳＶワクチンのニーズを物語っている。
【００１０】
さらに、既存のワクチンが一般に、野生型の野外のウイルスと区別できないということは、たとえば、血清抗体の差異に基づいて、野外のウイルスに感染したブタからワクチン接種したブタを区別することができるようにするような、ゲノムの突然変異によって得られるいわゆるマーカーワクチンのニーズを物語っている。
【００１１】
世界中で広く使用され、一般にブタ以外の動物には感染性ではないＰＲＲＳワクチンが、他の病原体に対する防護を提供するために他の（ブタの）病原体に由来する外来抗原を持つのに魅力的な候補ワクチンであるということは、他の病原体に対するワクチン接種ができ、または陽性マーカーの識別ができるＰＲＲＳＶキャリアまたはベクターワクチンのニーズを物語っている。
【００１２】
１またはそれより多くのこのような特徴を合わせ持つＰＲＲＳＶワクチンが好まれるのは言うまでもない。このようなニーズに対する解決手法を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
本発明は、少なくとも本来のＰＲＲＳＶ核酸の欠失を一部有し、本明細書ではまた、置換も含むＰＲＲＳＶ（ブタ繁殖・呼吸器症候群ウイルス）のレプリコン、ｉｎ  ｖｉｖｏにてＲＮＡ複製が可能である前記レプリコン、さらに少なくとも本来のＰＲＲＳＶ核酸の一部を欠失し、および／または異種の微生物に由来する核酸で補われた前記レプリコンを提供する。
【００１４】
驚くべきことに、ＰＲＲＳＶゲノムからかなり大量の核酸を取り去ることができることが見い出された。ｉｎ  ｖｉｖｏで独自にＲＮＡ複製を行うことができる独立し、かつ機能的なＰＲＲＳＶのレプリコンは、ＯＲＦ７タンパク質由来の必須要素ではなく、ＯＲＦ２〜ＯＲＦ６をコードする核酸のストレッチまたはその断片が欠失するおよび／または改変される場合でも依然として存在することができる。核酸のかかる大きなストレッチが欠失した、または改変されたレプリコンを有することによって、前記レプリコンにＰＲＲＳＶ以外の生物に由来する異種の核酸を付加する大きな容量が開くことになり、それによってキャリア容量の大きなＰＲＲＳＶベクターレプリコンが提供される。このようにして、発明者はブタ繁殖・呼吸器症候群ウイルスのゲノムにおいて、ウイルス核酸をさほど傷めることなく、もはやｉｎ  ｖｉｖｏにてＲＮＡ複製を提供できないようにした、ウイルスの弱毒化に重要な、非伝播性または微伝播性をつくるのに重要な、またはマーカーの導入に重要な特定の核酸領域の識別を提供する。さらに、発明者は、ＰＲＲＳＶレプリコンが外来抗原、好ましくは他の（ブタ）病原体由来の抗原の発現に対するベクターとして使用することができ、他の病原体に対するワクチン接種ができ、陽性のマーカー識別ができることを立証する。
【００１５】
発明によって提供されるとき、ＰＲＲＳＶレプリコンまたはＰＲＲＳＶベクターレプリコンに必要な最小配列は、５’非コーディング領域−ＯＲＦ１ａ−ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７−３’非コーディング領域（たとえば、ＰＲＲＳＶのポリメラーゼ領域に由来する）を含む必須要素であり、それによって、たとえば、図２で示されるデータにしたがってＯＲＦ７コーディング領域をさらに欠失することができる。好ましい実施態様では、発明は、たとえば、以下に記載するようにおよび／またはＯＲＦ７遺伝子（ＰＲＲＳＶのレリスタッド株ウイルス単離物の核酸配列において同定されるような、しかしながら、当業者は、いかなる他のＰＲＲＳＶゲノムにおいても前記必須要素が位置する配列によって容易に決定することができる）におけるヌクレオチド１４６４２〜１４６８６の間の４４個のヌクレオチドの必須領域に由来する核酸を少なくとも含む、ＰＲＲＳＶポリメラーゼ領域に由来する必須要素を少なくとも含むＰＲＲＳＶレプリコンまたはベクターを提供する。
【００１６】
もう１つの実施態様では、発明は、ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂの必須配列要素またはＰＲＲＳＶポリメラーゼ領域に由来する核酸を少なくとも含み、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、または欠失したＯＲＦ７の非必須要素由来の核酸を有し、外来核酸の挿入ができ、それによって外来抗原をコードする容量を有するＰＲＲＳＶベクターレプリコンを提供する、ＰＲＲＳＶレプリコンを提供する。これはＷＯ９８／５５６２６とは対照的であり、ＷＯ９８／５５６２６では、ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７を発現するために同種のポリメラーゼが異種のアルテリウイルスのものと置き換えられ、他の病原体に対する防護を提供し、他の病原体に対するワクチン接種ができるようなほかの（ブタ）病原体由来の外来抗原の発現は、本質的には開示されていない（ＰＲＲＳＶベクターレプリコンまたは必須配列要素が残るべきレプリコンを提供するには、外来抗原をコードするＰＲＲＳＶゲノム核酸の位置が決められてもよいことは言うまでもない）。
【００１７】
ＯＲＦ１によってコードされるＰＲＲＳＶのレプリカーゼポリタンパク質は、１３の処理された最終産物（非構造タンパク質−ｎｓｐと命名された）および多数の中間生成物において切断されると考えられている。ｎｓｐ１α、ｎｓｐ１β、ｎｓｐ２およびｎｓｐ４に位置するプロテアーゼドメインによってポリタンパク質は切断される。ＰＲＲＳＶの必須ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸結合／ＲＮＡヘリカーゼモチーフはそれぞれ、ｎｓｐ９およびｎｓｐ１０で同定された。その他の保存された（必須の）ドメインはｎｓｐ１１で見い出され、保存されたＣｙｓ／Ｈｉｓリッチドメインはｎｓｐ１０で見い出された。たとえば、後者のタンパク質はサブゲノムのｍＲＮＡ合成で役割を果していることが示されている。
【００１８】
さらなる実施態様では、発明は、レプリコンが感染性コピーｃＤＮＡのＲＮＡ転写物である、独自にｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡ複製が可能なＰＲＲＳＶの前記レプリコンを提供する。多数のプラス鎖ＲＮＡウイルスについては、５’および／または３’非コーディング領域が、プラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡ合成の開始を制御する必須シグナルを含有することが示されている。ＰＲＲＳＶについては、このような配列が単独で複製に充分なのかどうかは確定されていなかった。ほとんどのＲＮＡウイルスに関しては、ＰＲＲＳＶは簡潔なゲノムを含有し、ほとんどの遺伝情報は必須であると予想されている。さらに、ＰＲＲＳＶゲノムへの外来遺伝子の統合に関する最大容量は未だ判っていない。付加的な限界は、ＰＲＲＳＶの構造タンパク質をコードするＯＲＦが部分的に重なり合っていることである。このような重なり合った領域に突然変異を導入すると、２つの変異構造タンパク質を生じることが多く、したがって、生存不能のウイルスを生産することがさらに多いと予想される。
【００１９】
感染性クローンを製造することによって我々は、ＰＲＲＳＶゲノムにおける複製シグナルを解析することができた。この研究において我々は、感染性クローンに欠失を導入することにより複製に必要なシス作動性配列要素の位置を決定した。驚くべきことに、我々は、構造タンパク質をコードするゲノムの領域に由来するシス作動性配列が適切な複製にも必須であることを明らかにした。我々は、ＯＲＦ７遺伝子を欠損するｃＤＮＡクローンに由来する転写物は複製されないことを明らかにした。さらに体系的な欠失によって、ＯＲＦ７遺伝子におけるヌクレオチド１４６４２〜１４６８６の間の４４個のヌクレオチドの領域が、ＰＲＲＳＶのＲＮＡの複製に必須であることが明らかにされた。ほとんどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの複製に必須の配列は、５’および３’非コーディング領域に存在するので、このことは興味深い知見であった。欠失のあるＯＲＦを発現する補完的細胞株において救済のみが可能なウイルスレプリコンを開発することが誰の目的であるのかは研究にとって重要な成果である。このようなＲＮＡに必要な最小配列は、５’非コーディング領域−ＯＲＦ１ａ−ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７−３’非コーディング領域に位置している。ウイルス形成に必須のタンパク質がトランスで供給される場合、そのほかのＰＲＲＳＶオープンリーディングフレーム（読み取り枠）からの断片または他の（異種）病原体の抗原を発現するオープンリーディングフレームの断片の選択で補われたこのような配列要素を含有するウイルスＲＮＡまたはレプリコンは、ウイルス粒子にパッケージングされることが可能である。このような粒子が、たとえばワクチンとしてブタに与えられた場合、それらは、マクロファージのような特定の宿主細胞に入り、ＲＮＡを複製するために、ウイルス抗原または異種の抗原が発現され、免疫反応を誘導する。しかしながら、ＲＮＡはパッケージングおよび新しい粒子の生産に必要なタンパク質を（すべて）発現するわけではないので、レプリコンはさらに伝播することはできず、ＰＲＲＳＶ病原体および／または異種の病原体に対して有効な、極めて効率の高い、しかし安全で、非伝播性の組換えウイルスが創られる。
【００２０】
好ましい実施態様では、発明は、Ｎ−タンパク質カプシドの形成ができない、発明に基づいたレプリコンを提供する。たとえば、２つのＣｙｓ残基がＮタンパク質配列の２７位と７６位に存在し、Ｎタンパク質のＣｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６に突然変異を起こすまたはそれを欠失させることによって、ＰＲＲＳＶの感染性粒子の産生を阻害する。Ｃｙｓ残基がそれぞれＡｓｎおよびＬｅｕ残基に置換されるようにＮタンパク質をコードするＯＲＦ７で突然変異を起こしたが、たとえば以下に見ることができるように、他のアミノ酸による置換またはコーディング配列の欠失によっても同様の所望の結果が得られた。
【００２１】
ＰＲＲＳＶのレリスタッド株ウイルス単離物の感染性クローンｐＡＢＶ４３７にＣｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異を続いて導入し、プラスミドｐＡＢＶ５３４−５３６（Ｃｙｓ−２７→Ａｓｎ）およびｐＡＢＶ４７２−４７５（Ｃｙｓ−７６→Ｌｅｕ）を得た。このような突然変異した感染性クローンからＲＮＡを転写し、ＢＨＫ−２１細胞に移入した。構造タンパク質が正しく発現され、このような突然変異ＲＮＡは複製し、サブゲノムＲＮＡが合成された。しかしながら、遺伝子移入されたＢＨＫ−２１細胞の上清をマクロファージに移しても、マクロファージにおけるウイルスタンパク質の産生は起こらず、細胞変性効果（ｃｐｅ）の誘導も起こらなかったので、感染性の粒子は分泌されなかった。
【００２２】
したがって、このような残基は、ＰＲＲＳＶのウイルス形成におけるＮタンパク質の正しい構造または機能若しくはその両方にとって必須である。Ｎタンパク質は、ウイルス形成における最初の段階、ウイルスのゲノムＲＮＡの結合およびカプシド構造の形成に関与している。Ｃｙｓ−２７および／またはＣｙｓ−７６の欠失を含有するゲノム長のｃＤＮＡクローンの転写物は野生型レベルで複製したので、Ｃｙｓ残基における突然変異によってＮタンパク質によるＲＮＡの結合が破壊される。別の方法では、それらは、正しいカプシドの形成を阻害する異なった構造のＮタンパク質を誘導する。（ＢＨＫ−２１）細胞株内における一過性に発現されるまたは連続して発現される野生型のＮタンパク質によって、ウイルスＲＮＡゲノムのカプシド被包の欠損を完成することができる。このようにして、たった１回だけ感染／複製することができるウイルスが製造される。したがって、かかるウイルスが、ブタにおけるＰＲＲＳＶに対する防御のための極めて安全なワクチンであるとみなされる。
【００２３】
別の実施例では、発明は、ＢおよびＤと命名された２つの抗原性のある領域を含有するＮタンパク質領域をコードするゲノムにおける置換が、感染性ウイルス粒子の産生を阻害した、Ｎ−タンパク質のカプシド形成ができないレプリコンを提供する。Ｂ領域はＰＲＲＳＶのＮタンパク質のアミノ酸２５〜３０（ＱＬＣＱＬＬ）を含み、Ｄ領域；アミノ酸５１〜６７（ＰＥＫＰＨＦＰＬＡＡＥＤＤＩＲＨＨ）およびアミノ酸８０〜９０（ＩＳＴＡＦＮＱＧＡＧＴ）。ＶＲ２３３２株およびその他の米国の株において、そのような株のＮタンパク質を並べた場合、相当する部位が見い出される。ＲＮＡ複製およびサブゲノムｍＲＮＡの合成は野生型のレベルであると思われたので、このような突然変異は、たぶんＮタンパク質による正しいカプシドの形成を妨げた。
【００２４】
発明はさらに、血清学的な区別ができるマーカーが導入された、発明に基づいたレプリコンを提供する。たとえば、タンパク質ＮのＤ領域における１つのアミノ酸（Ａｓｐ−６２またはそれに相当するアミノ酸）の突然変異誘発によって、ＰＲＲＳＶおよびその他のあらゆるＰＲＲＳＶウイルスとは異なったＭＡｂ結合特性を有するレプリコンが生じる。かかるレプリコンは、このような他のＰＲＲＳＶ単離物と比べて、ブタにおける抗体の異なったスペクトルを誘導する。したがって、血清抗体に基づいて野外のウイルスからそれを区別することができ、それは、ＰＲＲＳＶに対するマーカーワクチンを開発するために優れた突然変異である。
【００２５】
上記実施例は微妙な改変に関与しており、マーカーワクチンに有用なレプリコンを生じる。しかしながら、今や更に広範な変更も可能であり、得られるレプリコンの複製特性を調節することなく、構造タンパク質２、３、４、５、および／または６をコードする核酸を部分的にまたは完全に欠失することができることが知られている。このような構造タンパク質の１またはそれより多くの（抗原性のある）断片を欠損するＰＲＲＳＶレプリコンは、たとえばかかるレプリコンを含むワクチンを接種した後、このような欠失した断片に対して免疫反応が起きず、さらに具体的には抗体が形成されないという利点を有する。再び、かかるレプリコンは、野生型ＰＲＲＳＶと比べて、ブタにおける抗体の異なったスペクトルを誘導する。したがって、血清抗体に基づいて野外のウイルスからそれを区別することができ、それは、ＰＲＲＳＶに対するマーカーワクチンを開発するために優れた突然変異である。
【００２６】
さらに、発明は、ＰＲＲＳＶの毒性マーカーにおいて核酸の改変を含むレプリコンを提供する。毒性における種々の差異が認められているにもかかわらず、ＰＲＲＳＶの毒性マーカーは解明されていない。しかしながら、ＰＲＲＳＶまたはそのレプリコンを上手く弱毒化するためには、最も毒性が少なく、しかし最も免疫原性の高い可能性のあるレプリコンまたはウイルスの選択に、かかる知識が役立つ。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ複製に影響を与えることなく、ＯＲＦ２〜ＯＲＦ６領域を欠失すること、または改変することが可能であると判った以上、かかる毒性マーカーは容易に検出することができる。たとえば、発明は、膜貫通Ｍ−タンパク質をコードするＯＲＦ６における核酸の改変を含むレプリコンを提供する。膜タンパク質は、ウイルス形成、ウイルスの安定性、またはマクロファージへのウイルスの侵入に影響を与えることが判っており、これらの要因はすべてＰＲＲＳＶの毒性に寄与している。アルテリウイルスおよびコロナウイルスの間で、Ｍタンパク質は最も保存された構造タンパク質である。該タンパク質は、３つのＮ末端疎水性膜貫通ドメインを含有する内在性膜タンパク質である（Rottier, 1995）。タンパク質は膜を３回貫通し、短いＮ−末端ドメインをビリオンの外側に残し、短いＣ−末端ドメインをビリオンの内側に残す。コロナウイルスのＭタンパク質は、ウイルス形成で重要な役割を果すことが示されたが（Vennema et al., 1996）、その時毒性因子であるとは確定されなかった。特に発明は前記改変が、特定のＰＲＲＳＶ単離物の毒性を決定するのに必須である、第２膜貫通断片と第３膜貫通断片との間におけるタンパク質Ｍを改変するレプリコンを提供する。たとえば、発明は、ｖＡＢＶ５７５を含むレプリコンを提供する。ｖＡＢＶ５７５におけるＭの第２膜貫通断片と第３膜貫通断片との間にＴｈｒ−５９→Ａｓｎの突然変異がある。この突然変異は、ウイルス形成、ウイルスの安定性、またはＰＡＭへのウイルスの侵入に影響を及ぼす。
【００２７】
発明はさらに、前記異種微生物が病原体を含むレプリコンを提供する。ＰＲＲＳＶは具体的にはマクロファージに感染するので、免疫系のこの特定の細胞にその他の（呼吸器）作用物質の重要な抗原を送達するためのベクターとして、それを使用することができる。感染性ｃＤＮＡクローンによって我々は、ウイルスのゲノムに部位特異的な突然変異、欠失および挿入を導入することができる。
【００２８】
好ましい実施態様では、発明は、前記病原体がウイルスであるレプリコンを提供する。我々は、外来タンパク質抗原である、インフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素のＨＡエピトープの発現についてベクターとしてＰＲＲＳＶを上手く使用してきた。Ｎタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に結合したＨＡタグを産生する組換えＰＲＲＳＶベクターのレプリコンを設計した。さらに、Ｎタンパク質のＮ−末端に結合した口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のプロテアーゼ２Ａと同様にＨＡ−タグを含有するＰＲＲＳＶ変異体を創った。
【００２９】
さらに発明は、発明に基づいたレプリコンまたはベクターレプリコンを含むワクチンを提供する。たとえば、特定のブタ群、すなわち、年少の子ブタまたは妊娠９ヵ月目の雌ブタにとって充分な安全性を付与した特定の抗原性または免疫原性と共に、今やＰＲＲＳＶワクチンは提供されている。
【００３０】
さらに発明は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡの複製を妨げずに、Ｎ−タンパク質のカプシド形成ができない、またはＯＲＦ２〜６によりコードされる構造タンパク質（の断片）が存在しないためにさらに感染できない、それによって所望の免疫反応に対するタンパク質を製造できるレプリコンまたはベクターレプリコンを含む、非伝播性のＰＲＲＳＶワクチンを提供する。
【００３１】
さらに発明は、たとえば、血清抗体における差異に基づいて野外のウイルスに感染したブタからワクチン接種したブタを区別できるようにゲノムに突然変異を誘発することによって得られる、野生型の野外のウイルスから区別することができるワクチン、いわゆるマーカーワクチンを提供する。
【００３２】
さらに、世界中で広く使用され、一般にブタ以外の動物には感染性ではないＰＲＲＳワクチンを今や、他の（ブタの）病原体に由来する外来抗原を運び、そのような他の病原体に対するワクチン接種ができ、陽性のマーカーを識別できるベクターワクチンとして提供する。
【００３３】
ＰＲＲＳＶは一般に極めて宿主特異性が高く、ブタのマクロファージ内で複製し、それによって免疫系の重要な抗原提示細胞を標的とするので、発明に基づいたワクチンの使用は、ブタのワクチン接種において特に有用である。
【００３４】
発明を限定することなく、詳細な説明においてさらに発明を説明する。
詳細な説明
１．Ｎタンパク質におけるＣｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異は、ＰＲＲＳＶの感染性粒子の産生を阻害する。
【００３５】
ヌクレオカプシドＮ（ＯＲＦ７によって発現される）は、ＰＲＲＳＶの精製されたビリオンにおいてモノマーとして存在する。しかしながら、実験によっては、我々はＮのホモダイマーも検出した。たとえば、Ｎ−特異的なＭＡｂによって精製したビリオンからＮタンパク質を免疫沈降し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動した場合、還元条件下では１５ｋＤａのタンパク質が優勢に観察されたが、非還元条件下では３０ｋＤａのホモダイマーが優勢に観察された（Meulenberg et al., 1996）。しかしながら、Ｎ−メチルマレイミドまたはヨードアセトアミドのような化合物を用いて非特異的なジスルフィド結合の形成を妨害すると、このようなＮのダイマーは検出されなかった。このことは、分析のために細胞溶解物を処理している間に非特異的なジスルフィド結合が形成されたために、Ｎのダイマーが形成されることを示していた。Ｎタンパク質の配列には２つのシステイン残基が存在する。どちらのシステイン残基が非特異的なジスルフィド結合の形成に関与したのか、およびシステイン残基は、Ｎタンパク質の構造と機能にとって重要なのかどうかという疑問が生じた。この疑問に答えるために、我々はＰＲＲＳＶの感染性クローンにおいて２つのシステイン残基に個々に突然変異を誘発し、得られた変異型ウイルスゲノムのＲＮＡの感染性を調べた。
【００３６】
２．Ｎタンパク質におけるマーカーの導入
ＰＲＲＳＶのＮタンパク質は、Ａ〜Ｄと命名された４つの抗原性のある部位を含有する（Meulenberg et al., 1998）。２つの部位、ＢおよびＤは、ＰＲＲＳＶの欧州単離物および北米単離物において保存されているエピトープを含有する。血清学的に野生型ウイルスから区別することができるウイルスを製造するために、ＢおよびＤドメインにおいて、Ｎ−特異的ＭＡｂの結合を阻害する突然変異をＰＲＲＳＶの感染性ｃＤＮＡクローンに導入した。構造タンパク質の発現および感染性ウイルスの産生を検出することにより、ＲＮＡの複製について、得られた変異型完全長ｃＤＮＡクローンの転写物を解析した。
【００３７】
３．レリスタッド株ウイルスの構造タンパク質をコードする領域に存在する複製シグナルの解明
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、複製に必須の５’および３’非コーディング領域を含有する。５’および３’末端におけるＲＮＡ配列は通常、特異的な二次構造を有し、それはウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、プラス鎖およびマイナス鎖の合成を開始するが、アルテリウイルスの場合、サブゲノムＲＮＡの合成を開始する。我々は、Ｎタンパク質を発現する細胞に形質移入させた場合、感染性粒子の産生を補完することができる欠陥のあるＲＮＡレプリコンを作製するための最初の試みにおいて、ＰＲＲＳＶの感染性クローン（Meulenberg et al., 1998）からＯＲＦ７遺伝子を欠失させた。ウイルスの３’非コーディング領域に影響を及ぼすことなく、ＯＲＦ７遺伝子は正確に除かれた。驚くべきことに、この欠失変異型のＲＮＡはＢＨＫ−２１細胞の中で複製しなかった。このことは、ＲＮＡの複製シグナルがＯＲＦ７のコーディング領域に存在することを示唆していた。この研究の目的は、このような複製シグナルの位置をさらに特定することであった。ＯＲＦ７のコーディング領域および上流の配列の広範な欠失分析によって、我々は、ＰＲＲＳＶのＲＮＡの複製に重要であるＯＲＦ７遺伝子における４４個のヌクレオチドの領域を同定することができた。
【００３８】
４．ＯＲＦ６におけるＮｄｅＩ部位の欠失による弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスの製造
最近我々は、ＰＲＲＳＶの感染性クローンのｃＤＮＡクローンを樹立した（Meulenberg et al., 1998）。完全長のｃＤＮＡクローンは、２つのＮｄｅＩ部位、最初がゲノム配列中のヌクレオチド１２５５９（ＯＲＦ３）および２番目がヌクレオチド１４２６５（ＯＲＦ６の中）を含有している。ウイルスの構造タンパク質（ＯＲＦ２〜７）をコードする領域における突然変異誘発および断片の交換を促進するために、我々は、ＰＣＲによる定方向突然変異誘発によって２番目のＮｄｅＩ部位を破壊した。これによってＭタンパク質における５９位でアミノ酸の置換が生じた（Ｔｈｒ→Ａｓｎ）。独特のＮｄｅＩ部位を含有する変異型完全長ｃＤＮＡクローンから産生されるウイルスの増殖特性を解析した。
【００３９】
５．来抗原または外来タンパク質を発現するためのベクターとしてのレリスタッド株ウイルス
ＰＲＲＳＶの感染性ｃＤＮＡクローンの作出（Meulenberg et al., 1998）がＰＲＲＳＶ研究の突破口であり、新しいウイルスベクターを開発するための新しい可能性を開いている。ＰＲＲＳＶはマクロファージに特異的に感染するので、免疫系のこの特異的な細胞に別の（呼吸器）作用物質の重要な抗原を送達するためのベクターとしてそれを使用することができる。感染性ｃＤＮＡクローンによって我々は、部位特異的な突然変異、欠失および挿入をウイルスのゲノムに導入することができる。しかしながら、ＰＲＲＳＶゲノムのどの領域が必須であり、または突然変異誘発を可能にするのかは未だ判っていない。ほとんどのＲＮＡウイルスについて言えば、ＰＲＲＳＶは簡潔なゲノムを含有し、遺伝情報のほとんどは必須であると予想されている。さらに、ＰＲＲＳＶゲノムの中に外来遺伝子を組み入れる最大容量は未だ判っていない。付加的な限界は、ＰＲＲＳＶの構造タンパク質をコードしているＯＲＦが部分的に重なり合っているということである。このような重なり合った領域への突然変異の導入によって、２つの変異型構造タンパク質を生じ、したがって生存不能のウイルスを生むことがさらに多いと予想される。
【００４０】
この研究の目的は、変異型ウイルスで感染させた後、ブタの免疫系にさらす外来抗原を導入することができる、ＰＲＲＳＶゲノムにおける領域を同定することであった。最初のアプローチで我々は、ＰＲＲＳＶにおいて発現させるために、ヒトＡ型インフルエンザ血液凝集素の９個のアミノ酸という小さなエピトープを選択した。
【００４１】
方法
細胞およびウイルス
５％ＦＢＳ、１０％リン酸トリプトース培養液（ギブコ  ＢＲＬ）、２０ｍＭのｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ（ギブコ  ＢＲＬ）および２００ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと共に完成させたＢＨＫ−２１培地（ギブコ  ＢＲＬ）中でＢＨＫ−２１細胞を増殖させた。１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのカナマイシン、２００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＭＣＡ−ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、ブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を維持した。形質移入されたＢＨＫ−２１細胞のＰＡＭ上における培養上清中に分泌される組換えＰＲＳＳＶウイルスの連続継代によってウイルスのストックを作製した。通常感染から４６時間後、ＰＭＡが細胞変性効果（ｃｐｅ）を呈したとき、ウイルスを回収した。終点希釈を用いて、ＰＡＭ上でウイルス力価（ｍｌあたり５０％の組織培養感染用量［ＴＣＩＤ50］として表現される）を測定した（Wensvoort et al., 1986）。
【００４２】
突然変異誘発
１．Ｃｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異誘発
プライマーＬＶ１０８およびＬＶ９７と共にＰＣＲによる定方向突然変異誘発によってＣｙｓ−２７をＡｓｎに突然変異させた。この研究で使用したプライマーの配列を表１に掲げる。作製したＰＣＲ断片をＨｐａＩとＰｆｌｍＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＡＢＶ４３１のＯＲＦ７遺伝子に挿入した。これによってプラスミドｐＡＢＶ４５１を生じた。プライマーＬＶ１０８およびＬＶ１００と共にＰＣＲによる定方向突然変異誘発によってＣｙｓ−７６をＬｅｕに突然変異させた。作製した断片をＨｐａＩとＣｌａＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＡＢＶ４３１のＯＲＦ７遺伝子に挿入した。これによってプラスミドｐＡＢＶ４５２を生じた。続いて変異型ＯＲＦ７遺伝子を独特のＨｐａＩ（ｎｔ  １４５８１）およびＰａｃＩ（ｎｔ  １４９８１）と共に、ゲノム長のｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４３７に移し、プラスミドｐＡＢＶ５３４−５３６（Ｃｙｓ−２７→Ａｓｎ）およびプラスミドｐＡＢＶ４７２−４７５（Ｃｙｓ−７６→Ｌｅｕ、図１）を創った。
【００４３】
２．Ｎタンパク質における抗原性のある部位ＢおよびＤの突然変異誘発
ＰＲＲＳＶのＮタンパク質における抗原性のある部位Ｂ（アミノ酸２５〜３０）およびＤ（アミノ酸５１〜６７および８０〜９０）を、それぞれＥＡＶおよびＬＤＶの相当するアミノ酸についてこの領域でアミノ酸置換を行うことによって、突然変異させた。プラスミドｐＡＢＶ４５５、ｐＡＢＶ４６３およびｐＡＢＶ４５３を含有するこのようなそれぞれの変異型は以前、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８年）によって記載された。さらに、プライマーＬＶ１０８およびＬＶ１８８と共にＰＣＲにおいて、Ｎタンパク質のＤ領域における６２位のＡｓｐをＴｙｒに突然変異させた。このようなプライマーの配列は表１に示す。ＰＣＲ断片をＨｐａＩとＣｌａＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＡＢＶ４３１のＯＲＦ７遺伝子に挿入した。これによってプラスミドｐＡＢＶ５８２を生じた。独特のＨｐａＩ（ｎｔ  １４５８１）およびＰａｃＩ（ｎｔ  １４９８１）を用いて突然変異を含有するＯＲＦ７遺伝子をｐＡＢＶ４３７に挿入した（図１）。
【００４４】
３．ＰＲＲＳＶの完全長ｃＤＮＡクローンにおける欠失突然変異の創出
ＰＲＲＳＶのｐＡＢＶ４３７完全長ｃＤＮＡクローンにおいて数種の欠失を作製した（図２）。先ず、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６の５’側半分を除いた。ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩでｐＡＢＶ４３７を消化し、クレノウ酵素によって部位を平滑にした(ファルマシア・バイオテック）。断片を精製し、連結した。これによりクローンプラスミドｐＡＢＶ５９４が生じた。２番目に、ＰＲＲＳＶの感染性コピーからＯＲＦ７を除いた。この目的のために、ＯＲＦ７の停止コドンのすぐ下流にあるＳｗａＩ制限部位を含有する感染性の完全長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４４２をＨｐａＩとＳｗａＩで消化し、連結した。これによってクローンプラスミドｐＡＢＶ５２１を生じた。３番目に、ＯＲＦ６の３’末端を除くために、プライマーＬＶ１９８とＬＶ１９９を用いてＰＣＲによる突然変異を誘発した。ＰＣＲによる突然変異誘発に使用したプライマーを表１に掲げ、説明する。作製した産物をＨｐａＩとＮｈｅＩで消化し、ｐＡＢＶ４３７の相当する部位に連結した。これによってプラスミドｐＡＢＶ６２７を生じた。４番目に、ＯＲＦ７のコーディング領域の上流において数種の欠失を作製した。前向きプライマーＬＶ１８８〜１９１またはＬＶ１９５〜１９７および逆向きプライマーＬＶ１１２によってＰＣＲによる突然変異誘発を行った。作製した産物をＨｐａＩとＰａｃＩで消化し、ｐＡＢＶ４３７の同じ制限部位に連結した、プラスミドｐＡＢＶ６０２−６０５およびｐＡＢＶ６２５−６２７を生じた。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換し、３２℃、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンで増殖させた。各コンストラクトについて、２つの別々のＰＣＲ断片を含有する２つのクローンを配列決定して、クローンの正確な配列を確認した。得られた変異体を図２に示す。
【００４５】
４．ＰＲＲＳＶの感染性ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４３７における１４２６５位でのＮｄｅＩ部位の突然変異誘発
１４２６５位でのＮｄｅＩ部位を突然変異させるために、プライマーＬＶ２７（ｎｔ  １２５２６）とＬＶ１８２（ｎｔ  １４２５７、表１）を用いてＰＣＲにより１．７ｋｂの断片を増幅した。プライマーＬＶ１８２はＡｓｅＩ部位を含有する。ＡｓｅＩとＮｄｅＩは互換性のある末端を有するが、末端を互いに連結すると両者の制限部位を破壊する。ＮｄｅＩとＡｓｅＩでＰＣＲ断片を消化し、ＮｄｅＩで消化したｐＡＢＶ４３７で連結した。正しい方向でＰＣＲ断片を含有し、１４２６５位でのＮｄｅＩ部位を失い、かつ１２５５９位と１４２６５位の間にＰＣＲの間違いによる変異を有さない完全長クローンｐＡＢＶ５７５を、さらなる解析のために選択した（図３）。
【００４６】
５．抗原性のあるＨＡタグをコードする、ＰＲＲＳＶの完全長ゲノムｃＤＮＡ変異体の構築
ＰＲＲＳＶの感染性クローンにおける変異体を創るためにＰＣＲによる突然変異誘発を用いた。最初に、レリスタッド株ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡクローン（ｐＡＢＶ４３７；Mulenberg et al., 1998）のＰａｃＩ変異体におけるＯＲＦ７の開始コドンのすぐ下流に、ヒトＡ型インフルエンザの血液凝集素のエピトープをコードする２７個のヌクレオチド配列（ＨＡ−タグ；Kolodziej et al., 1991）を導入した。プライマーＬＶ１９２とＬＶ１１２と共に、およびプライマーＬＶ１９３とＬＶ１１２と共に２回の連続ＰＣＲを行った。ＰＣＲ−断片を創出するのに使用したプライマーを表１に掲げ、説明する。２番目に、ＯＲＦ７の開始コドンのすぐ下流に、このＨＡタグおよびＦＭＤＶのプロテアーゼ２Ａをコードする５１個のヌクレオチド配列（Percy et al., 1994）の両方を導入した。プライマーＬＶ１３９とＬＶ１１２と共に、およびプライマーＬＶ１４０とＬＶ１１２と共に２回の連続ＰＣＲ反応を行った。３番目に、プライマーＬＶ１０８とＬＶ１９４によるＰＣＲにおいてＯＲＦ７遺伝子の３’末端にＨＡタグを導入した。得られた３つのＰＣＲ断片をＨｐａＩとＰａｃＩで消化して、同じ酵素で消化したｐＡＢＶ４３７に連結した。基本的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９年）に記載されるように、標準的なクローニング手順を行った。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換し、３２℃、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンで増殖させた。各コンストラクトについて、２つの別々のＰＣＲ断片を含有する２つのクローンを配列決定して、クローンの正確な配列を確認した。ＯＲＦ７の５’末端におけるＨＡエピトープの導入によりクローンｐＡＢＶ５２５を生じ、ＯＲＦ７の５’末端におけるＨＡタグとプロテアーゼ２Ａの両方の導入によってクローンｐＡＢＶ５２３を生じ、またＯＲＦ７の３’末端におけるＨＡエピトープの導入によってクローンｐＡＢＶ５２６を生じた（図４）。
【００４７】
配列の解析
オリゴヌクレオチドの配列決定によって作製したｃＤＮＡクローンを解析した。ＰＲＩＳＭレディダイ・デオキシターミネータ・サイクル配列決定キットおよび自動シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）によってオリゴヌクレオチドの配列を決定した。
【００４８】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写および形質移入
ポリ（Ａ）ストレッチのすぐ下流に位置する完全長のゲノムｃＤＮＡクローンおよびその誘導体をＰｖｕＩで直線化した。直線化したプラスミドをエタノール中で沈殿させ、ＬｉｌｊｅｓｔｒoｍとＧａｒｏｆｆ（１９９１年）がＳＦＶについて記載された方法によってＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うのにこのようなプラスミド１．５μｇを用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて転写されたＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、使用するまで−２０℃に保存した。
【００４９】
ＢＨＫ−２１細胞を３５−ｍｍのウエルに播き（およそ１０6個／ウエル）、以前記載されたような（Meulenberg et al., 1998）最適条件下で１０ｍｌのリポフェクチンと混合した２．５μｇのＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物で形質移入した。別の方法として、最適条件下で２ｍｌのリポフェクチンと混合した０．５μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡと共に、２０−ｍｍウエル中のＢＨＫ−２１細胞に、ＲＮＡを導入した。形質移入の２４時間後、培地を回収し、ＣＬ２６２１細胞またはＰＡＭに移し、感染性ウイルスを救済した。基本的に、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８６年）により記載されたような免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ（ＩＰＭＡ）によってＰＲＲＳＶタンパク質の発現に関して形質移入細胞および感染細胞を調べた。このアッセイで染色するのに、それぞれＧＰ3、ＧＰ4およびＭタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）１２２．１４．１２２．１および１２６．３（van Nieuwstadt et al., 1996）を用いた。Ｎタンパク質の発現を調べるためには（Meulenberg et al., 1998）、４つの異なった抗原性のある部位Ａ〜Ｄに対するＭＡｂのパネル（１２２．１７、１２５．１、１２６．９、１２６．１５、１３０．２、１３０．４、１３１．７、１３１．９、１３８．２２、ＷＢＥ１、ＷＢＥ４、ＷＢＥ５、ＷＢＥ６、ＳＤＯＷ１７、ＮＳ９５、およびＮＳ９９）を用いた。ＨＡ−エピトープの発現を検出するにはＭＡｂ、１２ＣＡ５を用い、ベーリンガー・マンハイムからそれを購入した。さらに我々は、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９６年）が記載したように、形質移入した細胞または感染させた細胞を代謝的に標識し、続いてＰＲＲＳＶの構造タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体またはペプチド血清を用いて免疫沈降を行うことによってＰＲＲＳＶタンパク質の発現を解析した。
【００５０】
組換えウイルスのゲノムＲＮＡの配列解析
ＲＴ−ＰＣＲによってウイルスＲＮＡを分析するために、継代３回目のＨＡを発現しているウイルスで感染させたＰＡＭの培養上清を用いた。５００μｌ容量のプロテイナーゼＫ緩衝液（１００ｍＭのトリスＨＣｌ［ｐＨ７．２］、２５ｍＭのＥＤＴＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２％（重量／容量）のドデシル硫酸ナトリウム）および０．２ｍｇのプロテイナーゼＫを５００μｌの上清に加えた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、フェノール−クロロホルムによってＲＮＡを抽出し、エタノールで沈殿させた。プライマーＬＶ７６によってＲＮＡを逆転写した。次いで、断片ｖＡＢＶ５２３およびｖＡＢＶ５２５を増幅するためにはプライマーＬＶ３７とＬＶ１１２によって、および断片ｖＡＢＶ５２６を増幅するためにはプライマーＬＶ３７とＬＶ７５によってＰＣＲを行った（表１）。配列解析を行って、継代４回目の変異体ウイルスが依然として挿入された外来配列を含有しているかどうかを確定した。
【００５１】
結果
１．完全長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４３７におけるＣｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異
Ｎタンパク質の配列には２７位と７６位において２つのＣｙｓ残基が存在する。Ｃｙｓ残基がそれぞれＡｓｎおよびＬｅｕ残基で置換されるようにＮタンパク質をコードするＯＲＦ７遺伝子を突然変異させた。Ｃｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異は続いて、ＰＲＲＳＶのレリスタッド株ウイルス単離物の感染性クローンｐＡＢＶ４３７に導入され、プラスミドｐＡＢＶ５３４−５３６（Ｃｙｓ−２７→Ａｓｎ）およびｐＡＢＶ４７２−４７５（Ｃｙｓ−７６→Ｌｅｕ；図１）を生じた。このような突然変異を持った感染性クローンからＲＮＡを転写し、ＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。このような細胞はＩＰＭＡにおけるＮに特異的なＭＡｂによって陽性に染まった。免疫沈降とＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるｐＡＢＶ５３４−５３６およびｐＡＢＶ４７２−４７５により合成されたＮタンパク質の解析によって、見かけの分子量は野生型Ｎタンパク質と類似しており、還元条件下で１５ｋＤａに移動することが示された。次に我々は、Ｎ−メチルマレイミドまたはヨードアセトアミドの非存在下、非還元条件下でＮタンパク質を解析した。このような条件下では、ｐＡＢＶ４７２−４７５（Ｃｙｓ−７６→Ｌｅｕ）により発現されるＮタンパク質は、野生型Ｎタンパク質に類似しており、主としてダイマーとして検出されたが、ｐＡＢＶ５３４−５３６（Ｃｙｓ−２７→Ａｓｎ）により発現されるＮタンパク質はモノマーとして検出された。このことは、２７位のＣｙｓ残基が非特異的なジスルフィド結合の形成に関与していることを示している。プラスミドｐＡＢＶ５３４−５３６（Ｃｙｓ−２７→Ａｓｎ）およびｐＡＢＶ４７２−４７５（Ｃｙｓ−７６→Ｌｅｕ：図１）からの完全長ＲＮＡの形質移入後、ＩＰＭＡおよび免疫沈降において、ＧＰ3、ＧＰ4およびＭのようなその他の構造タンパク質の産生も検出した。構造タンパク質が正しく発現されていたので、変異型ＲＮＡは複製し、サブゲノムＲＮＡも合成された。しかしながら、形質移入したＢＨＫ−２１細胞の上清をＰＡＭに移してもＰＡＭにおけるウイルスタンパク質の産生は起きず、細胞変性効果も生じなかったので、感染性粒子は分泌されなかった。したがって、ウイルス形成においてＮタンパク質の正しい構造または機能またはその両方にとって双方のＣｙｓ残基は必須である。
【００５２】
２．ＰＲＲＳＶのＮタンパク質の抗原性のある部位において突然変異を含有する完全長ｃＤＮＡクローンの性状分析
部位Ｂ（アミノ酸２５〜３０）および部位Ｄ（アミノ酸５１〜６７および８０〜９０）は、欧州および北米のＰＲＲＳＶ単離物で保存されている２つの抗原性のある領域である。ＬＤＶまたはＥＡＶのＮタンパク質における相当するアミノ酸でアミノ酸配列を置換することにより、部位ＢおよびＤを突然変異させると、それぞれＢ特異的およびＤ特異的なＭＡｂによるＮタンパク質の結合は阻害される（Meulenberg et al., 1998）。抗原性の上でＰＲＲＳＶの野外型ウイルスとは異なるＰＲＲＳＶウイルスを作製するために、我々は、我々の感染性クローンｐＡＢＶ４３７に変異型ＢおよびＤ領域を含有するＯＲＦ７遺伝子を導入した。これによって、変異型Ｂ部位（アミノ酸２５〜３０）を含有するｐＡＢＶ５２７−５３３、変異型Ｄドメイン（アミノ酸５１〜６７）を含有するｐＡＢＶ５３７−５３９、および変異型Ｄドメイン（アミノ酸８０〜９０）を含有するｐＡＢＶ５１２−５１５を生じた（図１）。このような完全長のクローンのＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞に形質移入すると、形質移入後２４時間で、Ｎ特異的ＭＡｂによりこのような細胞は陽性に染まった。予想通り、ｐＡＢＶ５２７−５３３により発現されるＮタンパク質は、Ａ−、Ｃ−、およびＤ−特異的ＭＡｂで認識されたが、Ｂ−特異的なＭＡｂでは認識されなかった。それに対して、ｐＡＢＶ５３７−５３９およびｐＡＢＶ５１２−５１５により発現されるＮタンパク質は、Ａ−、Ｂ−、およびＣ−特異的ＭＡｂで認識されたが、Ｄ−特異的なＭＡｂでは認識されなかった。ｐＡＢＶ５２７−５３３、ｐＡＢＶ５３７−５３９およびｐＡＢＶ５１２−５１５に由来するＲＮＡで形質移入された細胞のＧＰ3、ＧＰ4およびＭに対するＭＡｂによる染色性は、野生型ｐＡＢＶ４３７に由来するＲＮＡで形質移入された細胞で観察されたものに類似していた。このことは、ＲＮＡの複製およびサブゲノムのｍＲＮＡ合成は突然変異によって影響を受けないことを示唆していた。ｐＡＢＶ５２７−５３３、ｐＡＢＶ５３７−５３９およびｐＡＢＶ５１２−５１５に由来するＲＮＡで形質移入された細胞の培養上清をＰＡＭに移した場合、細胞変性効果は生じなかった。たぶん、ＢおよびＤ領域における突然変異は、正しいカプシド構造の形成においてＮタンパク質の機能を破壊した。
【００５３】
ドメインＢにおける４個のアミノ酸の突然変異およびドメインＤにおける５個または９個のアミノ酸の突然変異によっては感染性粒子を生じなかったので、次に我々は、Ｄ領域におけるアミノ酸１個のさらに微妙な突然変異を創出した。我々は、ＰＲＲＳＶの感染性クローンにおけるＮタンパク質においてＡｓｐ−６２をＴｙｒ突然変異に引き合わせた。ＰＣＲによる定方向突然変異によってＰＲＲＳＶのＮタンパク質におけるアミノ酸Ａｓｐ−６２をＴｙｒに突然変異させて、ｐＡＢＶ４３７に移して、ｐＡＢＶ６００を得た。ｐＡＢＶ６００から転写されたＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。形質移入後２４時間でこのような細胞は、ＧＰ3、ＧＰ4、ＭおよびＮに対するＭＡｂで陽性に染まり、ＲＮＡが複製され、かつサブゲノムのｍＲＮＡが合成されていることが示唆された。ｐＡＢＶ６００からの転写物で形質移入されたＢＨＫ−２１細胞の培養上清をＰＡＭに移した場合、接種後２〜３日で、細胞変性効果が検出された。感染させた細胞は、ＰＲＲＳＶ特異的なＭＡｂで陽性に染まり、感染性のウイルスが産生されていることがさらに確認された。したがって、Ｎタンパク質におけるＡｓｐ−６２からＴｙｒへの突然変異はウイルスにおいて認容され、Ｎタンパク質の機能を破壊していない。Ｎに特異的なＭＡｂのパネルによって変異型ウイルスｖＡＢＶ６００をさらにタイプ分けした（表２）。Ｄ特異的ＭＡｂ、ＳＤＯＷ１７のみならず、Ｄ特異的ＭＡｂ、１３０．２、１３０．４、１３１．７および１３１．９およびＷＢＥ１のｖＡＢＶ６００に対する結合が顕著に減弱していた。このようなＭＡｂのハイブリドーマ培養上清を０．３〜０．５μｇのＩｇＧ／ｍｌに希釈した場合、野生型ＰＲＲＳＶでは明るい染色が観察されるが、ｖＡＢＶ６００では染色を観察することはできなかった。しかしながら、ＭＡｂ、１３０．２、１３０．４、１３１．７、および１３１．９のＩｇＧを精製し、さらに濃縮して（１０μｇのＩｇＧ／ｍｌ）使用すると、かすかな染色が観察された。Ａ−およびＢ−特異的なＭＡｂによるｖＡＢＶ６００の染色性はＰＲＲＳＶと同等であった。このようなデータは、我々が、野生型ＰＲＲＳＶまたは北米のＰＲＲＳウイルスとは抗原性の上で異なっているウイルスを創出したことを示している。
【００５４】
３．ＰＲＲＳＶゲノムの３’末端における複製シグナルの同定
ＲＮＡ複製（プラス鎖および／またはマイナス鎖合成および／またはサブゲノムのｍＲＮＡ合成）にとって必須のシグナルであるシス作動性配列を確定するために、感染性ｃＤＮＡクローンにおいて数種の欠失を作製し、ＢＨＫ−２１細胞における複製に関して、このような欠失突然変異に由来する転写物を分析した。ＯＲＦ７の全遺伝子を欠いたｐＡＢＶ５２１からの転写物をＢＨＫ−２１細胞に形質移入した場合、ＩＰＭＡにおいてＮタンパク質の発現を検出することができなかった（図２）。興味深いことに、このような転写物は、ＧＰ3、ＧＰ4およびＭのようなそのほかの構造タンパク質の発現においても欠陥があった。このことは、このようなＲＮＡは複製していないし、サブゲノムのｍＲＮＡも産生していないことを示していた。それに対して、感染性コピー（ｐＡＢＶ５９４）からのＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６の５’末端の欠失は、依然として複製が可能なウイルスＲＮＡを生じた。したがって、複製シグナルは、ＯＲＦ２〜６をコードする領域ではなく、ＯＲＦ７のコーディング領域に存在する。これを調べ、複製に関与する領域の位置をさらに特定するために、ＯＲＦ７におけるさらに小さな欠失を含有する変異体を構築した。形質移入したＢＨＫ−細胞のＩＰＭＡにおいてＰＲＲＳＶタンパク質の発現を検出することによって複製能に関してこのようなコンストラクトの転写物を調べた（図２）。これらの結果から、ＰＲＲＳＶゲノムの複製に必須のシグナルは、ヌクレオチド１４６４３〜１４６８７の間に存在すると結論付けることができた。この領域を欠くウイルスＲＮＡは複製において欠陥があった。
【００５５】
４．ＯＲＦ６におけるＮｄｅＩ部位を欠く完全長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ５７５の解析
１４２６５位に第２のＮｄｅＩ部位の突然変異があるために１２５５９位で独特のＮｄｅＩ部位を有する完全長ｃＤＮＡクローン、ｐＡＢＶ５７５をＰＣＲによって創出した。ｐＡＢＶ５７５からＲＮＡが産生され、親クローンｐＡＢＶ４３７由来のＲＮＡと共にそれをＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。ｐＡＢＶ５７５のＲＮＡおよびｐＡＢＶ４３７のＲＮＡで形質移入した２４時間後、ＩＰＭＡにおいて、Ｍ特異的およびＮ特異的ＭＡｂによって同じ数の細胞が陽性に染まった（図３）。さらに、染色性の強度も類似していた。しかしながら、形質移入したＢＨＫ−２１細胞の培養上清をＰＡＭに移し、２４時間インキュベートした場合、ｖＡＢＶ５７５で感染させた細胞の数は、ｖＡＢＶ４３７について観察されるものよりもはるかに少なかった。さらに、ｖＡＢＶ４３７に比べてｖＡＢＶ５７５を接種したＰＡＭでは細胞変性効果の進展が極めて遅かった。ＢＨＫ−２１におけるｖＡＢＶ５７５のＲＮＡ複製およびサブゲノムのＲＮＡ合成は野生型レベルであると思われたが、産生されたウイルスはマクロファージへの感染性が低かった。このことは、たぶん、１４２６５位でのＮｄｅＩ部位の破壊を結果的に生じるＭタンパク質でのアミノ酸の突然変異（Ｔｈｒ→Ａｓｎ）によると思われた。
【００５６】
５．ＰＲＲＳＶの感染性クローンにおけるＨＡタグの導入
様々な組換えＰＲＲＳＶウイルスによりＡ型インフルエンザの血液凝集素のエピトープ（ＨＡ−タグ；Kolodziej et al., 1991）が発現された。主として２つの理由によってＰＲＲＳＶにおいて発現する外来抗原としてＨＡエピトープを選択した；第１に、タグは限られたサイズ（２７個のヌクレオチド）を有し、それは、ウイルスの複製または結合されるタンパク質の発現若しくは機能を乱す機会を低減する。第２に、このエピトープの発現を検出するための抗体が入手可能である。ＨＡタグは、それがほかのＯＲＦで突然変異を誘発しないように、ＯＲＦ７の５’末端（ｐＡＢＶ５２５）およびＯＲＦ７の３’末端（ｐＡＢＶ５２６；図４）に導入された。感染細胞ではサブゲノムのメッセンジャーＲＮＡ７（ＯＲＦ７をコードする）が最も豊富に産生されているので、我々は、ＯＲＦ７遺伝子に挿入することによって外来抗原の高い発現が得られることを期待した。我々はＮタンパク質の機能と構造におけるＨＡエピトープの影響を予測することができなかったので、口蹄疫ウイルスの１６個のアミノ酸である自己切断性の２Ａ型プロテアーゼ（ＦＭＤＶ；Percy et al., 1994）を追加的にインフレーム挿入で創出した。このプロテアーゼはＯＲＦ７の５’末端でＨＡタグの下流に導入され、それによってクローンｐＡＢＶ５２３を生じた（図４）。我々は、これによって、タンパク質分解により切断され、ＨＡタグとＮタンパク質の両方を放出することができるようなポリタンパク質が発現が起きることを期待した。
【００５７】
５．ＨＡエピトープを発現するＰＲＲＳＶの組換え体の解析
先ず、ＩＰＭＡにて、組換え完全長ｃＤＮＡからの種々の転写物による構造タンパク質の発現を調べた。ｐＡＢＶ５２３、５２５および５２６の転写物で形質移入されたＢＨＫ−２１細胞は、ＧＰ3、ＧＰ4、Ｍタンパク質およびＮタンパク質に対するＭＡｂで陽性に染まり、それは、このようなＰＲＲＳＶタンパク質が正しく発現されていることを示していた（図４）。細胞がＨＡに対するＭＡｂでも陽性に染まったということは、これら３種のＲＮＡすべてによってＨＡエピトープが発現されていることを示していた。したがって、ＨＡを発現している転写物は、ＢＨＫ−２１細胞中で複製していた。さらに、ＨＡタグが接続されているＮタンパク質も変異型ＲＮＡにより発現されていた。
【００５８】
ｐＡＢＶ５２３、５２５および５２６の転写物が感染性ウイルスを産生することができるかどうかを調べるために、形質移入したＢＨＫ−２１細胞の培養上清を用いてＰＡＭに感染させた。
【００５９】
ＩＰＭＡにおいてＰＭＡは、ＰＲＲＳＶのタンパク質、ＧＰ3、ＧＰ4、Ｍタンパク質およびＮタンパク質に対するＭＡｂで陽性に染まったのみならず、ＨＡエピトープに対するＭＡｂ、１２ＣＡ５によっても陽性に染まった。しかしながら、ＨＡタグおよびＮタンパク質に対するＭＡｂにより、ＰＡＭを二重染色すると、我々は、Ｎタンパク質に対するＭＡｂでのみ染色され、ＨＡ−タグに対するＭＡｂでは染色されないＰＡＭも検出した。ｐＡＢＶ５２５およびｐＡＢＶ５２６に由来するウイルスについては、Ｎ特異的なＭａｂでのみ染色される細胞の比率は、さらにプロテアーゼ２Ａを含有するｐＡＢＶ５２３に由来するウイルスに関するものより高かった。このことは、Ｎタンパク質のＮ末端またはＣ末端に直接結合されたＨＡタグが、ある程度まで、ウイルスＲＮＡのパッキングまたはウイルスの感染性を妨げることを示していた。しかしながら、プロテアーゼ２Ａを導入して、プロテアーゼ２ＡによってＮタンパク質からＨＡタグを切り離すと、得られたウイルス（ｖＡＢＶ５２３）の適応性は低下しなかったか、またはほとんど低下しなかった（図４）。組換えウイルスは、ｖＡＢＶ５２３、ｖＡＢＶ５２５およびｖＡＢＶ５２６と命名した。
【００６０】
ｖＡＢＶ５２３中のプロテアーゼ２Ａの活性の解析
放射性免疫沈降法によってプロテアーゼ２Ａの活性をさらに解析した。Ｎ特異的なＭＡｂ、１２２．１７によってｐＡＢＶ５２３の転写物で形質移入した細胞から、１５ｋＤａのタンパク質に加えてさらに約１８ｋＤａのタンパク質が免疫沈降された。１５ｋＤａのタンパク質は野生型のＮタンパク質とサイズが似ており、１８ｋＤａのタンパク質は、ＨＡ−プロテアーゼ２Ａ−Ｎのポリタンパク質の予想サイズに類似していた。このようなデータは、ＦＭＤＶのプロテアーゼ２Ａが細胞においてＨＡ−プロテアーゼ２Ａ−Ｎポリタンパク質を切断することができ、その結果Ｎタンパク質からのＨＡタグの放出が生じることを示していた。
【００６１】
５．ＨＡを発現しているウイルスの増殖の特徴
ｐＡＢＶ４３７およびｐＡＢＶ５２３からの転写物で形質移入したＢＫＨ−２１細胞により産生されるウイルスの量は一般に、ｐＡＢＶ５２５およびｐＡＢＶ５２６からの転写物で形質移入したＢＨＫ−２１細胞により産生されるものよりも多い。
【００６２】
ＰＡＭにおけるＨＡを発現しているウイルスの連続継代によっておよそ１０7  ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価を持つｖＡＢＶ５２３、ｖＡＢＶ５２５およびｖＡＢＶ５２６のストックを得た。ＨＡを発現しているウイルスが、ＰＲＲＳＶの感染性コピーの野生型ウイルス（ｖＡＢＶ４３７）と同じ増殖特性を有するのかどうかを解決することが必要である。これは増殖曲線で調べられるだろう。
【００６３】
５．ＨＡを発現しているウイルスの安定性の解析
ＨＡを発現しているウイルスの安定性を確定するために、継代４回目でウイルスＲＮＡを調べた。この目的で、単離されたウイルスＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行った。ＯＲＦ７遺伝子の一部、ＨＡタグが挿入された部位をＰＣＲによって増幅し、得られた断片をアガロースゲル上で解析した。我々は、ｖＡＢＶ５２３およびｖＡＢＶ５２５について２つの断片並びにｖＡＢＶ５２６については１つの断片を得た。最も豊富に増幅された断片の配列解析は、継代４回目でｖＡＢＶ５２３が依然として、ＨＡタグおよびプロテアーゼ２Ａをコードする、正しく挿入された核酸配列を含有することを示した。それに対して、ｖＡＢＶ５２５およびｖＡＢ５２６は双方ともＨＡタグをコードする挿入された核酸配列を失っていた。
【００６４】
１．Ｎタンパク質におけるＣｙｓ−２７およびＣｙｓ−７６の突然変異は、ＰＲＲＳＶの感染性粒子の産生を阻害する。
【００６５】
この研究で我々は、ＰＲＲＳＶのＮタンパク質におけるＣｙｓ−２７→ＡｓｎおよびＣｙｓ−７６→Ｌｅｕの突然変異がＢＨＫ−２１細胞における感染性粒子の産生を妨害することを見い出した。我々は、ＰＲＲＳＶのウイルス形成におけるＮタンパク質の正しい構造または機能若しくはその両方にとってこのような残基が必須であると結論付けている。Ｎタンパク質は、ウイルスのゲノムＲＮＡの結合およびカプシド構造の形成という、ウイルス形成の最初の段階に関与している。Ｃｙｓ−２７→ＡｓｎおよびＣｙｓ−７６→Ｌｅｕを含有するゲノム長のｃＤＮＡクローンの転写物は、野生型のレベルで複製したので、Ｃｙｓ残基における突然変異はＮタンパク質によるＲＮＡの結合を破壊する。別の方法としては、それらは、正しいカプシドの形成を阻害するＮタンパク質の別の構造を誘発する。（ＢＨＫ−２１）細胞株で一過性に発現されたまたは永久に発現されている野生型Ｎタンパク質によってウイルスＲＮＡゲノムのカプシド被包の欠陥は補完される。このようにして、たった１回だけ感染／複製を完了することができるウイルスが産生される。したがって、ブタにおいてＰＲＲＳＶに対する防御のために、かかるウイルスは極めて安全なワクチンであるとみなされる。
【００６６】
２．ＰＲＲＳＶのＮタンパク質におけるマーカーの導入
この研究の目的は、野外のウイルスから血清学的に区別することができ、ＰＲＲＳＶに対してマーカーワクチンを開発するのに有望な変異体でありうる変異型ＰＲＲＳウイルスを創出することである。多数の研究によってＮタンパク質がＰＲＲＳＶにおいて最も抗原性の高いタンパク質であることが明らかにされているので、血清学的マーカーを持つウイルスを創出する突然変異のための最初の候補としてＮタンパク質が選択された。たとえば、ＰＲＲＳＶに感染したブタは、ＰＲＲＳＶのＮタンパク質に対して強い抗体反応を展開する（Meulenberg et al., 1995）。さらに、Ｎタンパク質は、欧州および米国でのＰＲＲＳＶ単離物で保存されている、ＢおよびＤと命名された２つの抗原性領域を含有し、このような領域に対するＭＡｂも入手可能である（Meulenberg et al., 1998）。ここで我々は、部位Ｂにおける４個のアミノ酸の、ＥＡＶのＮタンパク質において相当するアミノ酸への突然変異、およびＤドメインにおける５個または９個のアミノ酸の、ＬＤＶのＮタンパク質において相当するアミノ酸への突然変異が、感染性ウイルス粒子の産生を阻害することを立証した。ＲＮＡの複製およびサブゲノムのｍＲＮＡ合成は野生型レベルであると思われたので、このような変異体はたぶん、Ｎタンパク質による正しいカプシドの形成を妨害した。しかしながら、Ｄ領域における単一アミノ酸の突然変異誘発（Ａｓｐ−６２→Ｔｙｒ）によって、ＰＲＲＳＶおよびそのほかすべてのＰＲＲＳＶウイルスとは異なったＭＡｂ結合性を有するウイルス、ｖＡＢＶ６００を生じた。ｖＡＢＶ６００は、ほかのＰＲＲＳＶ単離物に比べて、ブタにおいて抗体の異なったスペクトルを誘発した。したがって、ｖＡＢＶ６００は、血清抗体に基づいて野外のウイルスから区別することができ、ＰＲＲＳＶに対するマーカーワクチンをさらに開発するためには優れた変異体である。
【００６７】
３．レリスタッド株ウイルスのＯＲＦ７における複製シグナルの解明
多数のプラス鎖ＲＮＡウイルスについて、その５’および／または３’非コーディング領域は、プラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡ合成の開始を制御する必須のシグナルを含有していることが明らかにされている。ＰＲＲＳＶについては、このような配列が単独で複製に充分なのかどうかは未だ確定されていなかった。感染性クローンを製造することによって我々は、ＰＲＲＳＶゲノムにおける複製シグナルを解析することができた。この研究では我々は、感染性クローンに欠失を導入することによって複製に必要なシス作動性の配列要素の位置を決定した。我々は、ＯＲＦ７遺伝子を欠くｃＤＮＡクローンに由来する転写物は複製しないことを明らかにした。さらに体系的な欠失の分析によって、ＯＲＦ７遺伝子におけるヌクレオチド１４６４４〜１４６８７の間の４４個のヌクレオチドの領域が、ＰＲＲＳＶのＲＮＡの複製に重要であることを明らかにした。ほとんどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの複製に必須の配列は、５’および３’非コーディング領域に存在するので、このことは本質的な興味深い知見である。誰の目的が、欠失したＯＲＦを発現している補完細胞株で救済のみが行われうるウイルスのレプリコンを開発することであるかも研究にとっては重要な成果である。このようなＲＮＡにとって必要な最小配列は、５’非コーディング領域−ＯＲＦ１ａ−ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７−３’非コーディング領域である。ウイルス形成に必須のタンパク質がトランスで供給される場合、その他のＰＲＲＳＶのオープンリーディングフレームに由来する断片またはそのほかの（異種の）病原体の抗原を発現するオープンリーディングフレームの断片を選択することで補われたこのような配列要素を含有するウイルスＲＮＡまたはレプリコンがウイルス粒子にパッケージングされる。このような粒子が、たとえばワクチンとしてブタに与えられた場合、ＲＮＡの複製によって、それらはマクロファージのような特定の宿主細胞に入り、ウイルス抗原または異種の抗原が発現され、免疫反応を誘導する。しかしながら、ＲＮＡはパッケージングおよび新しい粒子の産生に必要な（すべての）タンパク質を発現するわけではないので、レプリコンはさらに伝播することができず、ＰＲＲＳＶおよび／または異種の病原体に対して有効な、極めて効率の高い、しかし安全でかつ非伝播性の組換えワクチンが創出される。
【００６８】
４．ＯＲＦ６におけるＮｄｅＩの欠失による弱毒化されたＰＲＲＳＶの製造
この研究では我々は、親株、ｖＡＢＶ４３７と比べて、ＰＡＭにおいて異なった増殖特性を有する変異体ＰＲＲＳウイルス、ｖＡＢＶ５７５を製造した。ｖＡＢＶ５７５またはｖＡＢＶ４３７のＲＮＡによりＢＨＫ−２１細胞で発現された構造タンパク質には差異は認められなかったが、ＢＨＫ−２１細胞を感染させたＰＡＭにおいて産生されるｖＡＢＶ５７５ウィルスはｖＡＢＶ４３７よりも速度が遅かった。ＰＡＭにおける増殖曲線を作成することによって、ｖＡＢＶ５７５の増殖速度動態をさらに解析する必要がある。ｖＡＢＶ５７５を作製するのに用いたｃＤＮＡクローン、ｐＡＢＶ５７５では、ＯＲＦ６における１４２６５位でのＮｄｅＩ部位で突然変異が起きていた。これによってＭタンパク質においてＴｈｒ−５９→Ａｓｎというアミノ酸変換が生じていた。変異型Ｍタンパク質は、依然としてＭ特異的なＭＡｂ、１２６．３に結合した。Ｍタンパク質は、アルテリウイルスおよびコロナウイルスの間で最も保存されている構造タンパク質である。該タンパク質は、３つのＮ−末端疎水性膜貫通ドメインを含有する内在性膜タンパク質である（Rottier, 1995）。短いＮ末端ドメインをビリオンの外側に残し、短いＣ末端ドメインをビリオンの内側に残して、タンパク質は膜を３回貫通する。コロナウイルスのＭタンパク質は、ウイルス形成において重要な役割を担っていることが明らかにされている（Vennema et al., 1996）。Ｔｈｒ−５９→Ａｓｎの突然変異は、ＡＢＶ５７５におけるＭの第２膜貫通断片と第３膜貫通断片との間に位置している。この突然変異は、ウイルス形成、ウイルスの安定性、またはＰＡＭにおけるウイルスの侵入に影響を及ぼす。
【００６９】
５．組換えＰＲＲＳＶウイルスにおけるＨＡエピトープの発現
この研究では我々は、外来抗原、Ａ型インフルエンザウイルスの血液凝集素のＨＡエピトープを発現するためのベクターとしてＰＲＲＳＶを上手く使用した。Ｎタンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合されたＨＡタグを産生する組換えＰＲＲＳＶウイルスを設計した。さらに、Ｎタンパク質のＮ末端で結合するＦＭＤＶのプロテアーゼ２Ａと同様にＨＡタグを含有するＰＲＲＳＶの変異体を創出した。プロテアーゼ２ＡはＰＲＲＳＶウイルスという背景で機能的に活性があり、Ｎタンパク質からＨＡタグを切り離した。これによって、変異体で欠損している１番目と２番目のアミノ酸（ＭｅｔおよびＡｌａ）を除いて、野生型Ｎタンパク質と同じＮタンパク質を生じた。継代４回目の組換えウイルスの遺伝的解析によって、ＨＡタグとプロテアーゼ２Ａの両方を含有する変異体ウイルスの方が、ＨＡ−Ｎ結合タンパク質を発現する変異体ウイルスよりも安定であることが示された。明らかに、ＮのＮ−末端またはＣ−末端に対して９個のアミノ酸であるＨＡタグを付加するよりも、ＮのＮ−末端における第１のメチオニン？の欠損および第２のアミノ酸の突然変異の方がウイルスには良好に認容されている。このようなウイルスで観察された安定性の差異を説明するには、さらに遺伝的および機能的解析を行うことが必要である。さらに、抗体反応がＨＡエピトープに対して誘導されたのかどうかを確定するためには、ＨＡを発現している変異体でブタを感染させる必要がある。
【００７０】
主として２つの理由によって、ＨＡタグを挿入するためにＯＲＦ７遺伝子を選択した；（Ｉ）この遺伝子を発現するサブゲノムＲＮＡ７が、感染細胞中で産生される最も豊富なサブゲノムＲＮＡであり、（ＩＩ）  ＯＲＦ７はＯＲＦ６の５’末端とほとんど重なり合っておらず、その他のＯＲＦの３’末端とも重なり合っていないので、他のＯＲＦを突然変異させることなくＨＡタグを挿入することができた。しかしながら、ほかのＯＲＦに影響を及ぼすことなく、ＯＲＦ２の５’末端およびＯＲＦ５の５’末端にＨＡタグおよびプロテアーゼ２Ａを導入することにより、同様のコンストラクトを作製することができる。
【００７１】
ＯＲＦ７の５’末端におけるプロテアーゼ２Ａと組合せたＨＡタグの発現が成功したことによって、ブタコレラウイルスのＥ２タンパク質またはパルボウイルスのＢ細胞エピトープのようなその他の外来抗原をＰＲＲＳＶによって発現する新たな機会が創出される。ＰＲＲＳＶは、抗原提示能および抗原処理能を有する、免疫系のマクロファージに特異的に感染するので、ＰＲＲＳＶは、ブタにおける抗原の発現およびこのような抗原に対する免疫の誘導に関する優れたベクターとなる可能性がある。
【００７２】
図の説明
図１．ＯＲＦ７遺伝子における突然変異を含有するＰＲＲＳＶの完全長ｃＤＮＡクローンの特性。示されている独特のＨｐａＩおよびＰａｃＩによって突然変異を起こしたＯＲＦ７遺伝子を感染性のｃＤＮＡクローン、ｐＡＢＶ４３７に挿入した。得られたコンストラクトのプラスミド番号（ｐＡＢＶ）を示す。完全長のｃＤＮＡクローンの転写物をＢＨＫ−２１細胞に形質移入した後、ＩＰＭＡにおいて構造タンパク質の発現を検出することによってＲＮＡの複製を確定した。Ｎタンパク質の産生はＩＰＭＡまたは免疫沈降法によって確定した。感染性ウイルスの産生は、形質移入されたＢＨＫ−２１細胞の培養上清をＰＡＭに移し、細胞変性効果（ｃｐｅ）を検出することによって立証した。
【００７３】
図２．構造タンパク質をコードする領域における複製シグナルの存在を解明するために、ＬＶの構造タンパク質をコードする領域において欠失を含有するＰＲＲＳＶの完全長ｃＤＮＡクローンの特性。欠失させた領域（点線の棒）、ＯＲＦ７がなおも存在する領域（黒い棒）および得られたクローンのプラスミド（ｐＡＢＶ）番号を示す。ＩＰＭＡにおける構造タンパク質の発現およびＮタンパク質の発現、特に両者を検出することによってＲＮＡの複製を確定した。形質移入されたＢＨＫ−２１細胞の上清によってＰＡＭを感染させることにより感染性ウイルスの産生を立証した。ＬＶ−タンパク質の発現を検出するためにＩＰＭＡを行った。
【００７４】
図３．感染性ｃＤＮＡクローン、ｐＡＢＶ５７５の特性。このクローンは、ＯＲＦ６における１４２６５位のＮｄｅＩ部位での突然変異によって構築された。ＢＨＫ−２１細胞において完全長ｃＤＮＡクローンの転写物を形質移入した後、ＩＰＭＡにおける構造タンパク質の発現を検出することによってＲＮＡの複製を確定した。感染性ウイルスの産生は、形質移入されたＢＨＫ−２１細胞の培養上清をＰＡＭに移し、細胞変性効果（ｃｐｅ）を検出することによって立証した。
【００７５】
図４．ＰＲＲＳＶの感染性クローンにおける抗原性のあるマーカーの導入。プラスミド、ｐＡＢＶ５２５、５２３および５２６におけるＨＡタグ配列およびプロテアーゼ２Ａの配列の挿入を示す。完全長ｃＤＮＡクローンの転写物を形質移入した後、ＩＰＭＡにおける構造タンパク質の発現を検出することによってＲＮＡの複製を確定した。ＮおよびＨＡの発現もＩＰＭＡにて確定した。感染性ウイルスの産生は、形質移入されたＢＨＫ−２１細胞の培養上清をＰＡＭに移し、細胞変性効果（ｃｐｅ）を検出することによって立証した。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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【００７８】
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【００７９】
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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