(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質をコードする単離・精製されたＤＮＡ分子であって、以下：
【化１】
0003918877.tif 000014
0003918877.tif 000015
に示される配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ。
【請求項４】
精製組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を産生させる方法であって、
（ａ）適当な酵母宿主を、請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換して形質転換細胞を産生させるステップ；
（ｂ）組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で形質転換細胞を培養するステップ；
（ｃ）組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を精製するステップ
を含む前記方法。
【請求項５】
組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を含む精製ウイルス様粒子を製造する方法であって、
（ａ）適当な酵母宿主を、請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換して形質転換細胞を産生させるステップ；
（ｂ）組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を発現させる条件下で形質転換細胞を培養するステップ；
（ｃ）組換えヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質を精製するステップ；及び
（ｄ）該タンパク質をさらに精製してウイルス様粒子を産生させるステップを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、精製ヒトパピローマウイルス１１型Ｌ１タンパク質及びその誘導体をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、合成オリゴヌクレオチドを用いたＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１遺伝子構築の概略図である。
図２は、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子、公表されたＨＰＶ６ａ及びＨＰＶ１１  Ｌ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
図３は、パピローマウイルス  Ｌ１キャプシドタンパク質の発現に用いた二方向型酵母発現ベクターｐＧＡＬ１−１０を示す。
図４は、酵母由来のＨＰＶ１１  Ｌ１  ｍＲＮＡのノザン分析である。
図５は、ウエスタン分析（イムノブロット）による酵母中でのＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現を示す。
図６は、ＨＰＶ６／１１  ハイブリッドＤＮＡと比較した、野生型（ｗｔ）ＨＰＶ１１から発現したＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰのＥＬＩＳＡ反応性を示す。
図７は、酵母中で発現したＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
図８は、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
発明の背景
パピローマウイルス（ＰＶ）感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ及びウシを含む多様な動物に発生する。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般に感染部位に良性の上皮腫又は線維上皮腫を誘発する。ＰＶは種特異的感染物質であり、ヒトパピローマウイルスは非ヒト動物には感染し得ない。
パピローマウイルスは、感染する宿主に基づいて異なるグループに分類し得る。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列の相同性に基づいてさらに７０以上もの型に分類される。ＰＶの型は、ある型のパピローマウイルスによる感染に対する中和免疫が別の型のパピローマウイルスに対する免疫を付与することはないという型特異的免疫原であると考えられる。
ヒトでは、種々の型のＨＰＶがそれぞれ異なる疾患を引き起こす。１、２、３、４、７、１０及び２６〜２９型のＨＰＶは、正常な個体にも免疫力が低下した個体にも良性のいぼをつくる。５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６及び４６〜５０型のＨＰＶは、免疫力低下個体に扁平な病変をつくる。６、１１、３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５型のＨＰＶは、生殖器又は呼吸器の粘膜の非悪性コンジロームを引き起こす。１６、１８、３１、３３、３５、４５及び５８型のＨＰＶは、生殖器粘膜の上皮形成異常を引き起こし、頚部、膣部、外陰部及び肛門管の殆どのｉｎ  ｓｉｔｕ及び潜在的なガンの原因物質である。
パピローマウイルスは、最大８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子とをコードする、エンベロープを有さない小型（５０〜６０ｎｍ）の正２０面体ＤＮＡウイルスである。該ウイルスゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ８及びＬ１、Ｌ２（ここで、「Ｅ」は初期を、「Ｌ」は後期を表す）と称されている。Ｌ１及びＬ２はウイルスのキャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルスの複製、転写調節及び細胞の形質転換のような機能に関与する。
Ｌ１タンパク質は、主要キャプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有している。Ｌ２タンパク質は、５５〜６０ｋＤａの予測分子量及びポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して７５〜１００ｋＤａの見かけ分子量を有するマイナーのキャプシドタンパク質である。免疫学的データにより、殆どのＬ２タンパク質はＬ１タンパク質の内側のウイルスキャプソメア内に存在することが示唆されている。Ｌ１  ＯＲＦは、種々のパピローマウイルス中に高度に保存されている。Ｌ２タンパク質は、種々のパピローマウイルス中でほとんど保存されていない。
Ｌ１及びＬ２遺伝子は、免疫予防剤の良好な標的とみなされている。初期遺伝子のなかには、ワクチン開発の潜在的標的となることが証明されたものもある。ワタオノウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）系での実験により、（細菌中で発現させるか、ワクシニアベクターを用いて発現させた）組換えＬ１及び／又はＬ２タンパク質で免疫感作すると、動物がウイルス感染から保護されることが証明された。バキュロウイルス発現系中でパピローマウイルスＬ１遺伝子を発現させるか又はワクシニアベクターを用いることにより、ウイルスチャレンジからの動物保護と相関関係を有する高タイターウイルス中和抗体応答の誘発に用いられているウイルス様粒子（ＶＬＰ）のアセンブリーが得られた。さらに、Ｌ１及びＬ２遺伝子は、動物のパピローマウイルス感染を予防及び治療するためのワクチンの製造にも用いられている。
大量の精製ウイルス及び精製タンパク質が得られないために、Ｌ１タンパク質、Ｌ１＋Ｌ２タンパク質、又は修飾Ｌ１若しくはＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む、ＰＶの感染及び疾患に対する予防及び治療用ワクチンの開発や商品化が遅れている。ＰＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養が難しく、そのために必要量のＬ１及びＬ２タンパク質をＰＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖により産生させることは困難である。その結果、供給量不足により、ＰＶ及びＰＶタンパク質の特性決定に困難をきたしている。従って、粗ＰＶタンパク質、特にＰＶ  Ｌ１及びＬ２タンパク質又は修飾Ｌ１及びＬ２タンパク質の容易に再生可能な供給源を開発することが有用である。さらに、大量の粗パピローマウイルスタンパク質を免疫学的研究及びワクチンの開発に適した純度レベルに精製する方法を開発することも有用である。また、天然タンパク質のコンホメーションのような、天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のパピローマウイルスタンパク質を製造することも有用である。さらに、ＰＶタンパク質の分析法、及び該タンパク質や該タンパク質を含む組成物の相対純度の測定法を開発することも有用である。そのような高度に精製されたタンパク質は、ＰＶ感染の研究に有用な種々の試薬の製造にも有用である。そのような試薬には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び分析標準が含まれるがそれらには限定されない。
ＨＰＶ６及び１１は、〜９０％の良性の陰部ゆう贅の原因物質であり、悪性のものに関与することは極くまれである（Ｇｉｓｓｍａｎｎら，１９８３，ＰＮＡＳ  ８０，５６０−５６３）。ＨＰＶ６ａは、尖形コンジロームに最も多く見られるＨＰＶ６のサブタイプであると考えられる（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１６６７−１６７３）。最近、陰部ゆう贅（尖形又は扁平コンジローム）患者が増大傾向にあり、一般人（１５〜４９才）の〜１０％が生殖管ＨＰＶ感染を有していると予想される（Ｋｏｕｔｓｋｙら，１９８８，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０，１２２−１６３）。殆どのコンジロームはＨＰＶ６が原因物質であるが、喉頭乳頭腫の場合には、ＨＰＶ１１が主要な型である。気道の上皮細胞中でＨＰＶ１１が複製されると、これらの細胞の増殖が刺激されて、隔離された臨床的にはあまり関連のない病変又は多発性の伝染性病変及び再発性疾患を招き得る。若年層が多く罹患する疾患である再発性呼吸器乳頭腫は、気道の閉塞を起こすことにより致命的な疾患となり得る。最近、感染性ＨＰＶ１１の複製を可能にする動物モデルが開発された（Ｋｒｅｉｄｅｒら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７，６３９−６４０；Ｋｒｅｉｄｅｒら  １９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、５９０−５９３）。該モデルにより、モノクローナル抗体を用いて、天然ウイルス粒子及びバキュロウイルスで発現したＶＬＰの高次構造中和エピトープの同定が可能になった（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，５６７８−５６８１；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＫｒｅｉｄｅｒ  １９９１，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２１，１６９−１７９；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＫｒｅｉｄｅｒ  １９９３，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２８，１９５−２０２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら  １９９４，７５，２２７１−２２７６）。
ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含むウイルス様粒子が昆虫細胞系及び哺乳動物細胞系で発現した。酵母細胞中でＶＬＰを発現させれば、費用効率が高く且つ発酵槽での大量増殖に容易に適合させ得るという利点が得られる。しかし、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は酵母細胞中では低レベルでしか発現しない。これは、ＨＰＶ１１  Ｌ１  ｍＲＮＡの切断の結果であることが判明した。それに対し、ＨＰＶ６  Ｌ１遺伝子は、全長のｍＲＮＡとして転写され、高レベルで発現する。ＨＰＶ６  Ｌ１  ＤＮＡを修飾してＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードさせれば、全長のｍＲＮＡの転写が容易になり、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現を増大させることができる。本発明は、ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１遺伝子配列及び合成オリゴヌクレオチドを用いたＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１遺伝子の構築法を提供する。該ハイブリッド遺伝子は、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１配列（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．Ｊ．ら，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，公表に同意を得た）を用いて設計したが、該遺伝子は、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードするのに必要な最小数の塩基変化しか含んでいない。野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１遺伝子とは異なり、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含んでおらず、その結果、全長のＨＰＶ６／１１  ｍＲＮＡが産生され、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現が増大する。
本発明は、高度に精製されたＰＶ  Ｌ１タンパク質に関する。本発明はさらに、天然パピローマウイルスタンパク質の免疫付与特性を有する組換えパピローマウイルスタンパク質の製造法及び精製法をも包含する。本発明は、パピローマウイルス感染を予防及び治療するためのワクチンの製造に関する。電子顕微鏡検査法及び高次構造抗体との結合により、本発明の組換えタンパク質がウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し得ることを示す。
発明の要旨
本発明は、精製ヒトパピローマウイルス１１型  Ｌ１タンパク質及びその誘導体をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、精製ヒトパピローマウイルス１１型  Ｌ１タンパク質及びその誘導体をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。本発明の種々の実施態様には、組換えＨＰＶ  ＤＮＡ分子、該組換えＨＰＶ  ＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、該組換えＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質、該組換えＤＮＡ分子及び関連タンパク質に対する抗体、該ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は抗体を含む組成物、該ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は抗体並びにそれらの誘導体の使用法が含まれるがそれらには限定されない。そのような誘導体には、該ＤＮＡによりコードされるペプチド及びタンパク質、該ＤＮＡに対する抗体又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗体、該ＤＮＡを含むワクチン又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含むワクチン、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含む免疫組成物、該ＤＮＡ、該ＤＮＡ由来のＲＮＡ又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含むキットが含まれるがそれらには限定されない。
ＨＰＶ６及び１１は、〜９０％の良性の陰部ゆう贅の原因物質であり、悪性のものに関与することは極くまれである（Ｇｉｓｓｍａｎｎら，１９８３，ＰＮＡＳ  ８０，５６０−５６３）。最近、陰部ゆう贅（尖形又は扁平コンジローム）患者が増大傾向にあり、一般人（１５〜４９才）の〜１０％が生殖管ＨＰＶ感染を有していると予想される（Ｋｏｕｔｓｋｙら，１９８８，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０，１２２−１６３）。殆どのコンジロームはＨＰＶ６が原因物質であるが、喉頭乳頭腫の場合には、ＨＰＶ１１が主要な型である。気道の上皮細胞中でＨＰＶ１１が複製されると、これらの細胞の増殖が刺激されて、隔離された臨床的にはあまり関連のない病変又は多発性の伝染性病変及び再発性疾患を招き得る。若年層が多く罹患する疾患である再発性呼吸器乳頭腫は、気道の閉塞を起こすことにより致命的な疾患となり得る。最近、感染性ＨＰＶ１１の複製を可能にする動物モデルが開発された（Ｋｒｅｉｄｅｒら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７，６３９−６４０；Ｋｒｅｉｄｅｒら  １９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，５９０−５９３）。該モデルにより、モノクローナル抗体を用いて、天然ウイルス粒子及びバキュロウイルスで発現したＶＬＰの高次構造中和エピトープの同定が可能になった（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら  １９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，５６７８−５６８１；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＫｒｅｉｄｅｒ  １９９１，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２１，１６９−１７９；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＫｒｅｉｄｅｒ  １９９３，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２８，１９５−２０２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら  １９９４，７５，２２７１−２２７６）。
大量の精製ウイルス及び精製タンパク質が得られないために、Ｌ１タンパク質、Ｌ１＋Ｌ２タンパク質、又は修飾Ｌ１若しくはＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む、ＰＶの感染及び疾患を予防及び治療するためのワクチンの開発や商品化が遅れている。ＰＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養が難しいために、必要量のＬ１及びＬ２タンパク質をＰＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖により合成することは困難である。ＰＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が困難なために、ＰＶ及びＰＶタンパク質の化学的、免疫学的及び生物学的特性決定にも困難をきたしている。従って、粗ＰＶタンパク質、特にＰＶ  Ｌ１及びＬ２タンパク質又は修飾Ｌ１及びＬ２タンパク質の容易に再生可能な供給源を開発することは有用である。さらに、大量の粗パピローマウイルスタンパク質を免疫学的研究及びワクチンの開発に適した純度レベルに精製する方法を開発することも有用である。また、天然タンパク質のコンホメーションのような、天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のパピローマウイルスタンパク質を合成することも有用である。さらに、ＰＶタンパク質の分析法、及び該タンパク質や該タンパク質を含む組成物の相対純度の測定法を開発することも有用である。そのような高度に精製されたタンパク質は、ＰＶ感染の研究に有用な種々の試薬の製造にも有用である。そのような試薬には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び分析標準が含まれるがそれらには限定されない。
ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含むウイルス様粒子が昆虫細胞系及び哺乳動物細胞系で発現した。酵母細胞中でＶＬＰを発現させれば、費用効率が高く且つ発酵槽での大量増殖に容易に適合させ得るという利点が得られる。しかし、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は酵母細胞中では低レベルでしか発現しない。これは、ＨＰＶ１１  Ｌ１  ｍＲＮＡの切断の結果であることが判明した。それに対し、ＨＰＶ６  Ｌ１遺伝子は、全長のｍＲＮＡとして転写され、高レベルで発現する。ＨＰＶ６  Ｌ１  ＤＮＡを修飾してＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードさせれば、全長のｍＲＮＡの転写が容易になり、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現を増大させることができる。本発明は、ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１遺伝子配列及び合成オリゴヌクレオチドを用いたＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１遺伝子の構築法を提供する。該ハイブリッド遺伝子は、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１配列を用いて設計したが、該遺伝子は、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードするのに必要な最小数の塩基変化しか含んでいない。野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１遺伝子とは異なり、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含んでおらず、その結果、より高レベルのｍＲＮＡが得られ、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現が増大する。
ＤＮＡ又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含む医薬上有用な組成物は、公知方法により、例えば、医薬上許容し得る担体を添加して配合し得る。そのような担体及び配合法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与に適した医薬上許容し得る組成物を形成するためには、該組成物は、有効量のタンパク質又はＶＬＰを含む。そのような組成物は１つ以上の型のＨＰＶ由来のタンパク質又はＶＬＰを含み得る。
本発明の治療又は診断用組成物は、ＰＶ感染の治療又は診断に十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のような多様な要素に応じて異なり得る。他の要素には投与形態が含まれる。一般に、該組成物は、約１μｇ〜約１ｍｇの用量範囲で投与される。
該医薬組成物は、皮下、局所、経口、経粘膜、静脈内及び筋肉内のような種々の経路を介して個体に投与し得る。
本発明のワクチンは、宿主に中和抗体の形成を誘発させるのに必要な抗原決定基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡによりコードされるタンパク質を含む。そのようなワクチンは、臨床感染の恐れなく投与し得るに十分なほど安全であり、毒性の副作用が無く、効果的な経路を介して投与し得、安定であり且つワクチン担体との相容性を有する。
該ワクチンは、種々の経路を介して、例えば、経口的に、非経口的に、皮下に、粘膜を介して、静脈内又は筋肉内に投与し得る。投与量は、個体の症状、性別、体重及び年齢；投与経路；並びにワクチンのＰＶ型に応じて異なり得る。該ワクチンは、カプセル剤、懸濁剤、エリキシル剤又は液体溶剤のような剤形で用いることができる。該ワクチンは、免疫学的に許容し得る担体と配合し得る。
本発明のワクチンは、治療上有効量、即ち、免疫保護応答を生起させるに十分な量で投与される。治療上有効な量は、ＰＶのタイプに応じて異なり得る。該ワクチンは単一又は多重用量で投与し得る。
本発明の精製タンパク質は、免疫原性組成物の配合に用いることができる。そのような組成物は、適当な宿主に導入されると、該宿主に免疫応答を誘発し得る。
本発明の精製タンパク質又はその誘導体は、抗体の産生に用いることができる。本明細書に用いられている「抗体」という用語は、抗原又はハプテンに結合し得る、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2断片を包含する。
本発明のタンパク質及びその誘導体は、ＨＰＶ感染及びＨＰＶスクリーニングの血清型分類に用いることができる。精製タンパク質、ＶＬＰ及び抗体は、ＨＰＶの検出及び血清型の分類に適したキットの調製に有用である。そのようなキットは、少なくとも１個の容器を密封保持するのに適したコンパートメント化キャリアーを含む。該キャリアーは、Ｌ１若しくはＬ２タンパク質、組換えＨＰＶ６／１１由来のＶＬＰ、他の組換えＨＰＶ型ＤＮＡ分子又はこれらのタンパク質に対する抗体のような試薬をさらに含み得る。また該キャリアーは、標識した抗原又は酵素基質などのような検出手段をも含み得る。
該精製タンパク質は、免疫標準、分子量マーカー及び分子サイズマーカーとしても有用である。
特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにかなりの量の重複性が存在することは公知である。従って、本発明は、最終的翻訳としての同一アミノ酸をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書では、１個以上の置換コドンを有する配列は、縮重変異体と定義される。また、発現したタンパク質の基本的物性を実質的に変性させない、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質における突然変異体も本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、又はグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化は起こらない。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然ペプチドの特性とは異なる特性を有するペプチドをコードするように改変し得ることは公知である。ＤＮＡ配列の改変方法には、部位特異的突然変異形成が含まれるがそれには限定されない。
本明細書に用いられている、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子の「機能性誘導体」とは、実質的にＨＰＶ６／１１の生物学的活性に類似した生物学的活性（機能性又は構造性）を有する化合物である。用語「機能性誘導体」とは、ＨＰＶ６／１１の「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」又は「化学誘導体」を包含するものとする。
用語「類似体」とは、全ＨＰＶ６／１１分子又はその断片と実質的に類似の機能を有する分子を指す。
本明細書に記載の方法により得られたクローン化ＨＰＶ６／１１のＤＮＡ又はその断片を、適当なプロモーター及び他の適切な転写調節成分を含む発現ベクター中に分子クローン化して組換え体として発現させ、原核又は真核宿主細胞に移入して、組換えＨＰＶ１１を作製し得る。そのような操作方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に詳細に記載されており、当業界では公知である。
本明細書において、発現ベクターとは、適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列であると定義される。そのようなベクターを用いて、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞及び動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現させることができる。特異的に設計されたベクターにより、細菌−酵母、細菌−動物細胞、細菌−真菌細胞又は細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間でのＤＮＡの移動（shuttling）が可能になる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中での自律複製用複製起点、選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数の能力、及び活性プロモーターを含む。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始するように誘導するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡに高頻度で開始させるようにし向けるプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド又はウイルスが含まれ得るがそれらには限定されない。
種々の哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞中でＨＰＶ６／１１のＤＮＡ又はその断片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６／１１のＤＮＡの発現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が含まれるがそれらには限定されない。
種々の細菌発現ベクターを用いて、細菌細胞中でＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ又はその断片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６／１１  ＤＮＡの発現に適当であり得る市販の細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるがそれらには限定されない。
種々の菌類細胞発現ベクターを用いて、菌類細胞中でＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ又はその断片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６／１１  ＤＮＡの発現に適当であり得る市販の菌類細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクター（Ｒｈｅｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｅｒｍａｎｙ）が含まれるがそれらには限定されない。
種々の昆虫細胞発現ベクターを用いて、昆虫細胞中でＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ又はその断片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６／１１  ＤＮＡの発現に適当であり得る市販の昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅ  ＢａｃIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるがそれには限定されない。
ＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ又はその断片を含む発現ベクターを用いて、細胞、組織、器官、又は動物中で、ＨＰＶ１１タンパク質又はその断片を発現させることができる。本明細書に用いられている動物という用語にはヒトが含まれる。宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、菌類細胞（例えば、酵母）、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類由来の細胞系を含むがそれらには限定されない）、並びに昆虫細胞（ショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系を含むがそれらには限定されない）を含むがそれらには限定されない原核細胞又は真核細胞であってよい。適当であり得且つ市販されている哺乳動物種由来の細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が含まれるがそれらには限定されない。
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション（lipofection）、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを含む（但し、それらには限定されない）多くの方法のいずれかを用いて宿主細胞中に導入し得る。発現ベクター含有細胞をクローン増幅し、個別に分析して、該細胞がＨＰＶ１１タンパク質を産生するかどうかを決定する。ＨＰＶ１１を発現する宿主細胞のクロる。ＨＰＶ１１を発現する宿主細胞のクローンは、抗ＨＰＶ１１抗体との免疫反応性を含む（但し、それらには限定されない）いくつかの手段により同定し得る。
ＨＰＶのＤＮＡ断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製された合成ｍＲＮＡ又は天然ｍＲＮＡを用いて発現させることもできる。合成ｍＲＮＡ又はＨＰＶ６／１１ハイブリッドＤＮＡを発現する細胞から単離されたｍＲＮＡは、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む（但し、それらには限定されない）種々の無細胞系に効率的に翻訳することもできるし、またカエルの卵母細胞を含む（但し、それには限定されない）細胞ベース系にも顕微注入することによって効率的に翻訳され得るが、カエルの卵母細胞に顕微注入するのが好ましい。
宿主細胞中でＨＰＶ１１タンパク質を発現させた後で、該タンパク質を回収して、精製形態のＨＰＶ１１タンパク質を得ることができる。利用可能且つ使用に適したＨＰＶ１１精製手順がいくつかある。本明細書に記載のように、組換えＨＰＶ１１タンパク質は、細胞の溶解物及び抽出物から、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーを組み合わせたり、別個に用いたりして精製し得る。
さらに、組換えＨＰＶ１１タンパク質は、全長の新生ＨＰＶ１１又はＨＰＶ１１のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製したイムノアフィニティーカラムを用いて、他の細胞タンパク質から分離することができる。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、当業界で公知の種々の方法に従って産生させ得る。本明細書に用いられているモノクローナル又は単一特異性抗体とは、ＨＰＶ１１とホモジニアスな結合特性を有する単一抗体種又は多重抗体種であると定義される。本明細書に用いられているホモジニアス結合とは、抗体種が特異的抗原又はエピトープに結合する能力であると定義される。
単一特異性抗体産生法を利用してＨＰＶポリペプチド断片又は全長の新生ＨＰＶポリペプチドに特異的な抗体を産生させ得ることは当業者には明らかである。特に、十分に機能性のＨＰＶタンパク質又はその断片に特異的な単一特異性抗体を産生し得ることは当業者には明らかである。
本発明はさらに、ＨＰＶをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現並びにｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＰＶ１１タンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング法にも関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子であり得る。化合物は、ＨＰＶ１１をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現又はＨＰＶ１１タンパク質の機能を増強若しくは減弱させたりして調節し得る。ＨＰＶ１１をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現又はＨＰＶ１１タンパク質の機能を調節する化合物は、種々のアッセイにより検出し得る。該アッセイは、発現又は機能が変化したかどうかを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイであってよい。該アッセイは、テスト試料の発現又は機能を標準試料の発現又は機能レベルと比較することにより定量し得る。
ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＤＮＡ、ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＤＮＡの断片、ＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ又はＨＰＶ１１タンパク質に対する抗体、ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＲＮＡ又はＨＰＶ１１タンパク質を含むキットを作製し得る。そのようなキットを用いて、ＨＰＶ６／１１ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出したり、試料中のＨＰＶ１１タンパク質又はペプチド断片の存在を検出する。そのような特性決定は、法廷分析及び疫学的研究を含むがそれらには限定されない多様な目的に有用である。
アンチセンス療法用に、ＨＰＶ６／１１  ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を合成し得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートのような安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡのような安定なＲＮＡ誘導体、又は他のＨＰＶ６／１１アンチセンスオリゴヌクレオチド模擬体であってよい。ＨＰＶ６／１１アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入又はアンチセンス配列を有するベクターから発現させることにより細胞に導入し得る。ＨＰＶ６／１１アンチセンス療法は、ＨＰＶ１１活性を低減させることが有利である疾患の治療に特に有用である。
用語「化学誘導体」とは、通常、基礎分子の一部ではない追加の化学部分を含む分子を指す。そのような部分は、基礎分子の溶解度、半減期、吸収率などを改善することができる。あるいは、該部分は、基礎分子の望ましくない副作用を減弱させたり、又は基礎分子の毒性を低減させたりし得る。そのような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような様々な文献に記載されている。
本明細書に開示されている方法で同定された化合物は、日常的試験によって定義された適切な用量で単独で用いて、潜在的な毒性を最小限にしながらＨＰＶ１１又はその活性を最適に阻害することができる。また、他の薬剤との同時投与又は順次投与も望ましい。
本発明の化合物は、１日１回用量で投与するか、１日当たりの全用量を数回分に分割して投与するのが有利である。さらに、本発明の化合物は、経鼻、経皮、座薬、経口などの経路を含む（但し、それらには限定されない）多様な経路を介して投与し得る。
別々の剤形の１種以上の活性剤との組み合わせ治療の場合、該活性剤を同時に投与してもよいし、別個に時間をずらせて投与してもよい。
本発明の化合物を用いる投薬計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的な症状；治療すべき症状の重篤度；投与経路；患者の腎臓及び肝臓の機能；並びに用いられる特定の化合物を含む（但し、それらには限定されない）様々な要素に応じて選択する。通常の技術を有する医師であれば、該症状の進行の予防、治療又は治癒に必要な薬剤の有効用量を容易に決定・処方し得るであろう。毒性なしに効能を生じる範囲内の薬剤濃度の最適且つ正確な量を知るには、標的部位に対する薬剤の利用性についての動力学に基づく投薬計画が必要である。これには、薬剤の分布、平衡状態及び排泄についての考慮が含まれる。
本発明の方法において、本明細書に詳細に記載されている化合物は有効成分を形成し得、意図する投与形態、即ち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、座薬、ゲルなどに適当であるとして選択され、且つ慣用医療に合致した適当な医薬稀釈剤、賦形剤又は担体（本明細書では、集合的に「担体」物質と称する）と混合して投与する。
例えば、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与する場合、有効薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などのような、医薬上許容し得る無毒性の経口不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望又は必要な場合には、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤を混合物中に配合することもできる。適当な結合剤には、非限定的に、スターチ、ゼラチン、天然糖類（例えば、グルコース若しくはβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの剤形に用いられる滑沢剤には、非限定的に、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、非限定的に、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。
液体形態の場合、有効薬剤成分を、合成及び天然ガム、例えば、トラガカント、アカシア、メチルセルロースなどのような、適当に賦香した懸濁剤又は分散剤と組み合わせることができる。用い得る他の分散剤には、グリセリンなどが含まれる。非経口投与の場合、滅菌懸濁剤及び溶剤が望ましい。静脈内投与が望ましい場合には、一般に適当な保存剤を含む等張製剤を用いる。
有効薬剤成分を含む局所用製剤は、例えば、アルコール類、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような、当業界では周知の種々の担体物質と混合して、例えば、アルコール性溶剤、局所用洗浄剤、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション及びクリーム若しくはゲル配合物状のシャンプーを形成し得る。
本発明の化合物は、小型の単層小胞、大型の単層小胞及び多層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンのような種々のリン脂質から形成し得る。
本発明の化合物は、該化合物の分子が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体を用いて送達することもできる。また、本発明の化合物は、指向性薬剤担体として可溶性ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール又はパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンを包含し得る。さらに、本発明の化合物は、薬剤の制御放出に有用な生分解性ポリマー種、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタル、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋結合性又は両親媒性ブロックコポリマーに結合し得る。
以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明は該実施例には限定されない。
実施例１
合成Ｌ１遺伝子の構築
ＨＰＶ１１  Ｌ１の１．５ｋｂｐの読み取り枠は、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから取り寄せた合成ＤＮＡオリゴマーを用いて構築した。５′末端ホスフェートを含むオリゴマーを購入した。必要とされた合計２４のオリゴマーを以下に列記する：
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0003918877.tif 000003
0003918877.tif 000004
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相補対を形成するオリゴマー（＃２４１−１と＃２４１−２４、＃２４１−２と＃２４１−２３、＃２４１−３と＃２４１−２２、＃２４１−４と＃２４１−２１、＃２４１−５と＃２４１−２０、＃２４１−６と＃２４１−１９、＃２４１−７と＃２４１−１８、＃２４１−８と＃２４１−１７、＃２４１−９と＃２４１−１６、＃２４１−１０と＃２４１−１５、＃２４１−１１と＃２４１−１４、＃２４１−１２と＃２４１−１３、図１）を、２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む別々の管中でアニーリングした。管を４分間９８℃に加熱し、次いで、２５０ｍｌ容量のビーカー中の２００ｍｌの水（９８℃）に入れてゆっくり冷却した。水が室温まで冷却されたら、以下のようなアニーリングされたオリゴマー対を管に加えた：断片Ａ（オリゴマー対＃２４１−１と２４、及び＃２４１−２と２３）；断片Ｂ（＃２４１−３と２２、＃２４１−４と２１、＃２４１−５と２０及び＃２４１−６と１９）；断片Ｃ（＃２４１−７と１８、＃２４１−８と１７、＃２４１−９と１６及び＃２４１−１０と１５）並びに断片Ｄ（＃２４１−１１と１４及び＃２４１−１２と１３）。これらのオリゴマー対混合物を２分間６２℃に加熱し、次いで、前と同様にゆっくり冷却した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）及び製造業者により供給された試薬を用い、各管の内容物を２３℃で一晩連結反応させた。
連結反応後に、断片Ｂは、ＰＣＲ増幅により全長産物の量を増大させる必要があった。これには、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｔａｑポリメラーゼ及び以下のオリゴマープライマー：
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を用いる、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサーモサイクラー中での１０サイクルの増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分、次いで７２℃で１０分）を必要とした。
連結反応生成物と断片ＢのＰＣＲ産物を以下のように制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）で消化した：断片ＡはＢｇｌII及びＳｐｈＩで消化；断片ＢはＳｐｈＩ及びＫｐｎＩで消化；断片ＣはＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化；断片ＤはＸｈｏＩ及びＢｇｌIIで消化した。消化した断片を低融点アガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ゲル上で分離し、バンドを切断し、供給業者により推薦されたＡｇａｒａｓｅ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）を用いてアガロースを消化して、正しいサイズの断片を分離した。エタノール沈降法により断片Ａ、Ｂ及びＤを回収し、次いで、同様に制限酵素で消化して連結される各断片にマッチさせておいたベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）に別々に連結した。
先ず、ＫｐｎＩ  ＸｈｏＩで消化した断片Ｃを、アニーリングしたオリゴマー：
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に連結した。
次いで、断片ＣをＸｈｏＩで再切断し、４５０ｂｐのＫｐｎＩ  ＸｈｏＩ断片をＫｐｎＩ、ＸｈｏＩで消化したｐＳＰ７２ベクターと連結した。連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を形質転換した。形質転換体を、コロニーハイブリダイゼーション（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により、挿入物含有クローンについてスクリーニングした。Ｗｉｚａｒｄミニプレプキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、陽性クローンからプラスミドＤＮＡを分離し、次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて配列決定した。４つの断片それぞれの正しいＤＮＡ配列を含むクローンを前と同じように消化して、ｐＳＰ７２ベクターから該断片を分離した。ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩで消化した断片Ｃを、ＸｈｏＩ、ＢｇｌIIで消化した断片Ｄ及びＫｐｎＩ、ＢｇｌIIで切断したｐＳＰ７２と３者間連結した。次いで、連結反応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。得られた形質転換体を配列決定し、正しい配列のクローン（ＣＤと称する）を得た。ＣＤの７５０ｂｐのＢｇｌII  ＫｐｎＩ挿入体をｐＳＰ７２ベクターから再切断し、前と同じように、ＢｇｌII、ＳｐｈＩで消化した断片Ａ及びＳｐｈＩ、ＫｐｎＩで消化した断片Ｂと３者間連結したが、但し、ＢｇｌIIを加えて不要な連結反応生成物を減少させた。連結反応生成物をアガロースゲル上で分離し、１．５ｋｂｐの断片を単離して、Ｄ３６１−１と称した。
実施例２
配列の比較
ＨＰＶ６／１１ハイブリッド、ＨＰＶ６ａ及びＨＰＶ１１  Ｌ１のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の比較を図２に示す。ＨＰＶ６バックボーン配列をＨＰＶ１１をコードする翻訳枠に変換するために、ＨＰＶ６のバックボーン配列に対して合計５５のヌクレオチド置換を行った。さらに、ＨＰＶ１１には見出されたがＨＰＶ６には見出されなかった追加のアミノ酸（チロシン132）をコードする３つの塩基対挿入体を＃４１１−４１３ｂｐで加えた。これらの改変を合わせると、１１型特異的コンホメーション依存性中和モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ８７４０  ＭＡｂ）と、酵母中で発現させたＨＰＶ６／１１  Ｌ１  ＤＮＡのＬ１タンパク質との結合が可能になる。これは、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子から誘導されたタンパク質が天然ＨＰＶ１１と免疫学的に区別がつかないように見えることを示唆している。
ＨＰＶ６／１１ハイブリッドＤＮＡ配列と公表されたＨＰＶ１１  Ｌ１配列とを比較すると、１９４の塩基対の置換が示される。野生型１１  Ｌ１配列に対するかなりの数の置換が存在し、該置換を組み合わせたり、又は全ての改変を行うことにより、酵母中での１１型Ｌ１タンパク質の発現を増大させ得ると考えられる。
実施例３
Ｌ１遺伝子のＤＮＡ配列決定
製造業者（ＡＢＩ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により指定された、色素ターミネーター配列決定反応〔ＰＲＩＺＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ〕を用いるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＃３７３Ａを用いて、ＨＰＶ６／１１  Ｌ１遺伝子の配列決定を行った。
実施例４
ＨＰＶ６／１１  Ｌ１、ＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ６  Ｌ１酵母発現ベクターの構築
（Ｍａｒｋ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより提供された）プラスミドｐＢＭ２７２由来のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅのダイバージェントなＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーターを含むｐＵＣ１８／二方向型ＧＡＬプロモータープラスミドから１．４ｋｂｐのＳｐｈＩ断片を分離して、ｐＧＡＬ１−１０酵母発現ベクターを構築した。ダイバージェントなプロモーターのの両側には、酵母ＡＤＨ１転写ターミネーター〔Ｂｅｎｎｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．及びＨａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３０１８−３０２５〕のコピー、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの最初のコピーとの間に位置するＢａｍＨＩ部位及びＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの２番目のコピーとの間に位置するＳｍａＩクローニング部位が位置している。ｐＢＲ３２２、酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子（Ｅｒｈａｒｔ，Ｅ．及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｐ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：６２５−６３５）及び酵母２μプラスミド（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから恵与）からなる酵母シャトルベクター（Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．及びＶｏｌｋｅｒｔ，Ｆ．Ｃ．，１９９１，Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、ＳｐｈＩで消化し、１．４ｋｂｐのＳｐｈＩダイバージェントＧＡＬプロモーター断片と連結して、ｐＧＡＬ１−１０を得た（図３）。
ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードするＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１  ＤＮＡ（実施例１からの試料Ｄ３６１−１）は、ＨＰＶ６／１１  Ｌ１開始メチオニンコドンに対してすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１３５−１４１）を含む。ｐＧＡＬ１−１０プラスミドを、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターとの間で切断するＢａｍＨＩを用いて線状にし、１．５ｋｐｂのＨＰＶ６／１１  Ｌ１遺伝子断片（試料Ｄ３６１−１）と連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）形質転換体をスクリーニングし、ＨＰＶ６／１１  Ｌ１遺伝子を含むｐＧＡＬ１−１０プラスミドを単離して、Ｄ３６２−１と称した。
尖形コンジローム病変（Ｄａｒｒｏｎ  Ｂｒｏｗｎ博士から恵与）から野生型ＨＰＶ１１（ｗｔ−ＨＰＶ１１）ＤＮＡをクローン化した。全ヒトゲノムＤＮＡを抽出し、制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｗｔ−ＨＰＶ１１  ＤＮＡを含む画分をＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターと連結して、ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）、１０サイクルの増幅（９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分４５秒）、及びプランキングＢｇｌII部位（下線）を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより、ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１遺伝子を増幅した：
0003918877.tif 000010
該センスプライマーは、ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調）に対してすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１３５−１４１）を導入する。１．５ｋｐｂのｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＰＣＲ産物をＢｇｌIIで消化、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１−１０プラスミドと連結して、プラスミド、ｐ３２９−１を得た。
ＨＰＶ６ａ陽性尖形コンジローム病変（Ｄａｒｒｏｎ  Ｂｒｏｗｎ博士から恵与）から全ゲノムＤＮＡを抽出した。テンプレートとして生検試料ＤＮＡ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、３５サイクルの増幅（９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分４５秒）、ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１のＰＣＲ用に上記に列記したプライマー、及び以下の配列を有するアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲにより、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１遺伝子を増幅した：
0003918877.tif 000011
１．５ｋｂｐのＨＰＶ６ａ  Ｌ１  ＰＣＲ産物をＢｇｌIIで消化、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１−１０プラスミドと連結して、プラスミドＤ１２８を得た。
実施例５
株１５５８の作製
ステップａ：酵母株Ｕ９の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株２１５０−２−３（ＭＡＴａｌｐｈａ，ｌｅｕ２−０４，ａｄｅ１，ｃｉｒ°）は、Ｌｅｌａｎｄ  Ｈａｒｔｗｅｌｌ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から得た。株２１５０−２−３の細胞を、５ｍｌのＹＥＨＤ培地（Ｃａｒｔｙら，Ｊ．Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  ２（１９８７）１１７−１２１）中３０℃で一晩増殖させた。細胞を滅菌蒸留水中で３回洗浄し、２ｍｌの滅菌蒸留水に再懸濁し、ｕｒａ３突然変異体（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を選択するために、０．１ｍｌずつの細胞懸濁液を６個の５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）プレートに入れた。プレートを３０℃でインキュベートした。該培地は、２５０ｍｌの蒸留水当たり：アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない、３．５ｇのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ；０．５ｇの５−フルオロ−オロト酸；２５ｍｇのウラシル；及び１０．０ｇのデキストロースを含んでいた。
０．２μｍの膜を通して濾過して培地を殺菌し、次いで、５０℃に維持した４％Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）２５０ｍｌ、アデニンの１．２ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌ及びＬ−ロイシン溶液（１８０ｍｇ／５０ｍｌ）５ｍｌと混合した。得られた培地をペトリ皿１個当たり２０ｍｌで分注した。
５日間インキュベートした後、多くのコロニーが出現した。初期ＦＯＡプレート由来のコロニーから新鮮なＦＯＡプレート上に再画線培養して単コロニーを分離し、次いで、３０℃でインキュベートした。第２セットのＦＯＡプレート由来の数個のコロニーを、ＹＥＨＤプレート及びウラシルを欠くプレート上にレプリカプレーティングしてｕｒａ３突然変異体の存在についてテストした。結果は、ＹＥＨＤ培地上で所望の良好な増殖が見られ、ウラシルを欠く培地上では増殖が見られなかった。これらの特性を示す１つの単離体（Ｕ９）を得た。該単離体を、後で使用するために、凍結グリセロール保存株（株＃３２５）として−７０℃で保存した。
ステップｂ：酵母ＭＮＮ９遺伝子を破壊するためのベクターの作製
ＭＮＮ９遺伝子を破壊（disrupt）するためのベクターを作製するためには、先ず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子をクローン化する必要があった。これは、標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行った。全長のＭＮＮ９コード配列のＰＣＲ用５′センスプライマーと３′アンチセンスプライマーを、酵母ＭＮＮ９遺伝子（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＥＰＯ特許出願第８８１１７８３４．７号，公開番号０−３１４−０９６−Ａ２）の公開配列に基づいて設計した。フランキングＨｉｎｄIII部位（下線）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いた：
0003918877.tif 000012
ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンは太字で強調してある。ＰＣＲは、テンプレートとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲＹ１８８、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及び２５サイクルの増幅（９４℃で１分、３７℃で２分、７２℃で３分）を用いて行った。得られた１．２ｋｂｐのＰＣＲ断片をＨｉｎｄIIIで消化、ゲル精製し、ＨｉｎｄIIIで消化し且つアルカリ−ホスファターゼで処理したｐＵＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と連結した。得られたプラスミドをｐ１１８３と称した。
酵母ＵＲＡ３遺伝子でＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、（ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII部位にサブクローン化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子をコードする１．１ｋｐｂのＨｉｎｄIII断片を含む）プラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３をＨｉｎｄIIIで消化し、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、ＰｍｌＩで消化したプラスミドｐ１１８３（ＰｍｌＩがＭＮＮ９コード配列内部で切断する）と連結した。得られたプラスミドｐ１１９９は、機能性ＵＲＡ３遺伝子によるＭＮＮ９遺伝子の破壊体を含む。
ステップｃ：ＭＮＮ９遺伝子破壊体を含むＵ９誘導体株１３７２の構築
株Ｕ９（＃３２５）のＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、３０μｇのプラスミドｐ１１９９をＨｉｎｄIIIで消化して、線状ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３破壊カセットを作成した。スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３）に従い、株３２５の細胞を、ＨｉｎｄIIIで消化したｐ１１９９ＤＮＡで形質転換し、ウラシルを欠き、１．０Ｍ  ソルビトールを含む合成寒天培地上で形質転換体を選択した。該合成培地は、蒸留水１リットル当たり：寒天、２０ｇ；アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、６．７ｇ；アデニン、０．０４ｇ；Ｌ−チロシン、０．０５ｇ；ソルビトール、１８２ｇ；グルコース、２０ｇ；及びＬｅｕｃｉｎｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｓｏｌｕｓｉｏｎ  ＃２、１０ｍｌを含んでいた。Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＃２は、蒸留水１リットル当たり：Ｌ−アルギニン、２ｇ；Ｌ−ヒスチジン、１ｇ；Ｌ−ロイシン、６ｇ；Ｌ−イソロイシン、６ｇ；Ｌ−リシン、４ｇ；Ｌ−メチオニン、１ｇ；Ｌ−フェニルアラニン、６ｇ；Ｌ−トレオニン、６ｇ；Ｌ−トリプトファン、４ｇを含む。
プレートを３０℃で５日間インキュベートしたが、その間に多くのコロニーが出現した。１０個のコロニーから染色体ＤＮＡ調製物を作り、次いで、ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄIIIで消化した。次いで、ＤＮＡ消化体を、プローブとして（プラスミドｐ１１９９から分離した）ＭＮＮ９遺伝子を有する１．２ｋｂｐのＨｉｎｄIII断片を用いるサザーンブロット（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により評価した。サザーンブロット上で予測ＤＮＡバンドシフトを示し、且つｍｎｎ９突然変異体に典型的な極端な凝集性（ｃｌｕｍｐｉｎｅｓｓ）を示す分離体を同定した（株＃１３７２）。
ステップｄ：酵母ＨＩＳ３遺伝子の破壊用ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子がＵＲＡ３遺伝子で破壊される破壊カセットを構築するために、プラスミドＹＥｐ６（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５）をＢａｍＨＩで消化し、ＨＩＳ３遺伝子を有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、あらかじめＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたｐＵＣ１８と連結した。得られた（ｐ１５０１又はｐＵＣ１８−ＨＩＳ３と称される）プラスミドを（ＨＩＳ３コード配列内部を切断する）ＮｈｅＩで消化し、ベクター断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。ＨｉｎｄIIIで消化して、ＵＲＡ３遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３から分離し、ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、上記のｐＵＣ１８−ＨＩＳ３  ＮｈｅＩ断片と連結した。得られた（ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３又はｐ１５０５と称される）プラスミドは、酵母ＨＩＳ３遺伝子を機能性ＵＲＡ３遺伝子で破壊する破壊カセットを含む。
ステップｅ：ＨＩＳ３遺伝子による酵母ＰＲＢ１遺伝子破壊用ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＲＢ１遺伝子を保有するプラスミドＦＰ８ΔＨは、Ｃａｒｎｅｇｉｅ−Ｍｅｌｌｏｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＥ．Ｊｏｎｅｓ博士から提供された（Ｃ．Ｍ．Ｍｏｅｈｌｅら，１９８７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５：２５５−２６３）。該プラスミドをＨｉｎｄIII＋ＸｈｏＩで消化し、ＰＲＢ１遺伝子を保有する３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とした。プラスミドｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化、ゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とした。得られたベクター断片を上記のＰＲＢ１遺伝子断片に連結して、プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を得た。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドＹＥｐ６をＢａｍＨＩで消化した。得られた、機能性ＨＩＳ３遺伝子を保有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とした。プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を、ＰＲＢ１コード配列内で切断するＥｃｏＲＶ＋ＮｃｏＩで消化し、プロテアーゼＢ活性部位及びプランキング配列を分離した。ｐＵＣ１８中のＰＲＢ１コード配列の残りの５′及び３′部分を保有する５．７ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩ断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化して、上記の平滑末端ＨＩＳ３断片と連結した。得られた（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、保存株＃１２４５と称される）プラスミドは、上記のように欠失したＰＲＢ１遺伝子部分の代わりに機能性ＨＩＳ３遺伝子を含む。
ステップｆ：ＭＮＮ９遺伝子及びＰＲＢ１遺伝子の破壊体を含むＵ９関連酵母株の構築
ＭＮＮ９遺伝子破壊体を含むＵ９関連株１３７２は実施例５ｃに記載した。株１３７２のクローン分離体を、（実施例５ａに記載のように）ＦＯＡプレート上で継代して、ｕｒａ３突然変異体を選択した。株１３７２からいくつかのｕｒａ３分離体を得、引き続きＨＩＳ３遺伝子を破壊するために１つの特定の分離体（株１２９３０−１９０−Ｓ１−１）を選択した。ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３遺伝子破壊ベクター（ｐ１５０５）をＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＩで消化して、線状ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３破壊カセットを形成し、酢酸リチウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２９０（１９９１）〕による株１２９３０−１９０−Ｓ１−１の形質転換に用いた。ウラシルを欠く合成寒天培地上でＵｒａ+形質転換体を選択し、該培地上でクローン分離体を再画線培養し、次いで、ウラシル又はヒスチジンを欠く培地上にレプリカプレートして、該分離体をＵｒａ+及びＨｉｓ-であるものについてスクリーニングした。引き続きＰＲＢ１遺伝子を破壊するために１つの分離体（株１２９３０−２３０−１）を選択した。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、保存株＃１２４５）をＳａｃＩ＋ＸｂａＩで消化して、線状Ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊カセットを形成し、酢酸リチウム法による株１２９３０−２３０−１の形質転換に用いた。ヒスチジンを欠く寒天培地上でＨｉｓ+形質転換体を選択し、該培地上でクローン分離体を再画線培養した。得られたＨｉｓ+分離体のいくつかからゲノムＤＮＡを作製し、ＥｃｏＲＩで消化、次いで、０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。次いで、放射性標識した６１７ｂｐプローブを用い、以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲで作製しておいたＰＲＢ１遺伝子についてサザーンブロット分析を行った：
0003918877.tif 000013
プローブと２．４４ｋｐｂのｐｒｂ１：：ＨＩＳ３  ＤＮＡ断片との予測ハイブリダイゼーションを示した１１個の分離体を得た。これは、該プローブと野生型ＰＲＢ１遺伝子の１．５９ｋｂｐの断片とのハイブリダイゼーションとは対照的であった。所望のｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊体を含むこれらの分離体のうちの１つをその後の使用のために選択し、株＃１５５８と称した。
実施例６
酵母におけるＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ６  Ｌ１の発現
スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，１９２９−１９３３）に従い、プラスミドＤ３６２−１（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ６／１１  Ｌ１）、ｐ３２９−１（ｐＧＡＬ１−１０＋ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１）、Ｄ１２８（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ６  Ｌ１）及びｐＧＡＬ１−１０を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５５８（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−０４、ｐｒｂｌ：：ＨＩＳ３、ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３、ａｄｅｌ、ｃｉｒ°）を形質転換した。プラスミドＤ３６２−１で形質転換した＃１５５８酵母株を株＃１７８２と称した。ＲＮＡ実験用には、酵母のクローナル分離体を、０．１Ｍ  ソルビトール及び２％グルコース又はガラクトースを含むＹＥＨ複合培地（Ｃａｒｔｙら，１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．２，１１７−１２１）中３０℃で２６時間増殖させた。細胞を収穫した後、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，１９９３）に記載のような高温酸性フェノール法（hot acidic phenol method）を用いて酵母ＲＮＡを抽出した。タンパク質の分析には、同一分離体を０．１Ｍ  ソルビトール、２％グルコース及び２％ガラクトースを含むＹＥＨ複合培地中で７０時間３０℃で増殖させた。細胞を収穫した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、イムノブロット分析により、細胞溶解物をＨＰＶ１１  Ｌ１又はＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の発現について分析した。
実施例７
酵母中で発現させたＨＰＶ  Ｌ１  ＲＮＡのノザンブロット分析
１０μｇの全ＲＮＡを含む試料を、グリオキサル及びＤＭＳＯ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９３）で処理して、変性させ、リン酸緩衝した１．２％アガロースゲルを通して電気泳動させた。ＲＮＡをナイロン膜上に移し、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６  Ｌ１  ＤＮＡ配列に相補的な32Ｐ−標識したオリゴヌクレオチドを用いて検出した。
ノザンブロットを図４に示す。グルコース培地上で増殖させた試料には予測サイズの全長のＨＰＶ  Ｌ１  ＲＮＡに対応するバンドは検出されなかった（レーン１、３及び５）。これは、グルコースが酵母ＧＡＬ１プロモーターからの転写を抑制するためであると考えられる。それに対し、ＧＡＬ１プロモーターからの転写を誘発させるガラクトース培地中で増殖させた試料は強力なＨＰＶ  Ｌ１  ＲＮＡシグナルを示す。ＨＰＶ６  Ｌ１は全長のＲＮＡ種として転写される（レーン２）が、野生型（ｗｔ）−ＨＰＶ１１  Ｌ１の大多数は、切断形態として転写される（レーン４）。この結果は、酵母転写終結シグナルがｗｔ−ＨＰＶ１１Ｌ１  ＯＲＦ内に位置し、ＨＰＶ６  Ｌ１配列には存在しないことを示唆していた。ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子から転写されたＲＮＡは全長のようである（レーン６）。ｐＧＡＬ１−１０対照酵母試料にはＨＰＶ特異的ＲＮＡは検出されない（レーン７）。
実施例８
酵母中で発現したＨＰＶ  Ｌ１タンパク質のウエスタン分析
２０μｇの全細胞タンパク質を含む試料を変性条件下に１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｃ．）を通して電気泳動させ、ニトロセルロースフィルター上に電気ブロットした。一次抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１  Ｌ１融合タンパク質に対して産生されたウサギ抗血清（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｒ．ら，１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１：４６−５４）及び二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用い、Ｌ１タンパク質を免疫検出した。化学ルミネセントＥＣＬ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）でフィルターを処理した。ｐＧＡＬ１−１０陰性対照（レーン４）を除く全ての試料に５０〜５５ｋＤａのＬ１タンパク質バンドが検出された（図５）。さらに、ＨＰＶ６／１１ハイブリッド遺伝子（レーン３）によって発現したＨＰＶ１１Ｌ１タンパク質の量は、ｗｔ−ＨＰＶ１１遺伝子（レーン２）又はＨＰＶ６  Ｌ１遺伝子（レーン１）によって発現したＬ１タンパク質の量の〜１０倍も大きいようである。
実施例９
酵母中で発現したＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを用いてｗｔ−ＨＰＶ１１又はＨＰＶ６／１１ハイブリッドを発現する酵母クローンから産生させたＶＬＰの相対量を測定した。ＥＬＩＳＡを用い、強度に中和性の抗体応答に対して形成される高次構造エピトープがＨＰＶ６／１１ハイブリッドＤＮＡから誘導されたＶＬＰ上に保持されることも証明された。この高次構造エピトープは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｍａｂ８７４０としてＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から入手し得るモノクローナル抗体Ｈ１１．Ｂ２（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，５６７８−５６８１）により定義されている。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ  Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）のウエルを、１００μｌのＰＢＳ中にＨＰＶ６／１１（ハイブリッド）又はｗｔ−ＨＰＶ１１  ＶＬＰを含む減少量の全酵母タンパク質でコーティングした。対照として、ＣｓＣｌ精製したｗｔ−ＨＰＶ１１ウイルス粒子（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ博士から恵与）及び対照酵母タンパク質を用いた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、プレートを室温で２時間、ＴＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の２５０μｌの１０％粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）で吸引・ブロックした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１回洗浄し、ウエルを室温で１時間、ＴＴＢＳ中１％粉乳中の抗ＨＰＶ１１ウイルス粒子モノクローナル抗体Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ８７４０の１：１０００稀釈液１００μｌと共にインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄し、次いで、プレートを室温で１時間、１％粉乳＋ＴＴＢＳ中１：１０００に稀釈したアルカリホスファターゼ（Ｋｉｅｒｋｅｇａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に結合した抗マウスＩｇＧ１００μｌと共にインキュベートした。プレートを再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄し、ホスファターゼ基質（ジエタノールアミン緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェート）１００μｌを加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。５０μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加えて反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置により４０５ｎｍでプレートの読み取りを行った。
対照酵母タンパク質から得られたバックグラウンド読み取り値に対して補正した２つのウエルの平均ＯＤ405nmの読み取り値を、ウエル中の全酵母タンパク質に対してプロットし、図６に示す。ＨＰＶ６／１１ハイブリッド酵母クローンは、ｗｔクローンと比べて、１０倍以上の量の天然ＶＬＰを産生させた。さらに、これらのＶＬＰ上にはＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｍａｂ８７４０により認識される強度に中和性のエピトープが示されている。
実施例１０
電子顕微鏡実験
ＥＭ分析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）では、各試料（粗な清澄化溶解物又は精製ＶＬＰ）のアリコートを２００メッシュ炭素コーティングした銅グリッド上に置いた。該グリッド上に１滴の２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）、ｐＨ７．０を２０秒間置いた。透過ＥＭ検査の前にグリッドを風乾した。１００ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ  １００ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて全顕微鏡検査を行った。作製された顕微鏡写真は、１００，０００×の最終倍率を有する。図７に示されているように、全てのＨＰＶ１１試料に４５〜５５ｎｍの粒径範囲のＶＬＰが認められたが、酵母対照試料には検出されなかった。
実施例１１
ＨＰＶ６／１１  Ｌ１（株＃１７８２）の発酵
株１７８２を平板培養した表面増殖体を、（１Ｌ当たり）：アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない、８．５ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース；０．２ｇのアデニン；０．２ｇのウラシル；１０ｇのコハク酸；５ｇの硫酸アンモニウム；及び０．２５ｇのＬ−チロシンを含む、ロイシンを欠く液体培地に無菌移入した。この培地は、滅菌前にＮａＯＨを加えてｐＨを５．０〜５．３に調整した。回転振とう機上２５０ｒｐｍで２５時間２８℃で増殖させた後、滅菌グリセロールを加えて最終濃度を１７％（ｗ／ｖ）にして、凍結培養バイアルを作製し、−７０℃で保存した（低温バイアル１個当たり１ｍｌ）。該培地（２Ｌ容量のフラスコ１個当たり７５０ｍｌ）中で株１７８２の発酵用接種材料を増殖させ、２つの凍結培養バイアルから解凍した内容物を２Ｌ容量のフラスコに移し、回転振とう機上２５０ｒｐｍで２５時間２８℃でインキュベートして発酵を開始した。株１７８２の発酵には、接種後１８Ｌ作業容量でＣｈｅｍａｐ  ２３Ｌ発酵槽を用いた。用いた産生培地は、（１Ｌ当たり）：２０ｇのＤｉｆｃｏ酵母エキス；１０ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  ＨｙＳｏｙペプトン；２０ｇのガラクトースを含んでいた。該培地は、滅菌する前にｐＨを５．３に調整した。２Ｌ容量の接種材料フラスコの全内容物（５００ｍｌ）を発酵槽に移し、２８℃、毎分９Ｌの空気、５００ｒｐｍ、圧力３．５ｐｓｉでインキュベートした。必要に応じて攪拌数を増大させ、４０％を超える溶解酸素飽和レベルに維持した。発酵の進行をオフライングルコース測定法（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２  Ａｎａｌｙｚｅｒ）及びオンライン質量分析法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  １２００）でモニターした。６６時間インキュベートした後では、１Ｌ当たり９．３２ｇの乾燥細胞重量の細胞密度に達した。そのような２つの発酵槽内容物（合計１７．５Ｌブイヨン）をプールし、細胞を回収した。培養体を、ホローファイバー濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＤＣ−１０濾過システム中のＡｍｉｃｏｎ  Ｈ５ＭＰ０１−４３カートリッジ）により約２Ｌに濃縮し、２Ｌのリン酸緩衝塩水で透析濾過（diafilter）し、さらに（約１Ｌに）濃縮して、５００ｍｌ容量の遠心ボトルに分注した。８，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心（Ｓｏｒｖａｌ  ＧＳ３ローター）して細胞ペレットを補集した。上清をデカントした後、ペレット（合計３５８ｇの湿潤細胞）を使用時まで−７０℃で保存した。
実施例１２
組換えＨＰＶ１１型Ｌ１キャプシドタンパク質の精製
特に断りのない限り、全てのステップは４℃で実施した。
細胞を−７０℃で凍結した。凍結細胞（湿潤重量＝１８０ｇ）を２０〜２３℃で解凍し、９００ｍｌの「破壊緩衝液」（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、５００ｍＭ  Ｎａｃｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ及びペプスタチンＡを加えて、それぞれ１ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度とした。約１６，０００ｐｓｉの圧力下に、Ｍ１１０−Ｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に４回通して細胞スラリーを破壊した。破壊された細胞スラリーに、十分量の１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００▲Ｒ▼界面活性剤（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加え、ＴＸ−１００の濃度を０．５％とした。スラリーを２０時間攪拌した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した溶解物を１２，０００×ｇで４０分間遠心して細胞片を除去した。Ｌ１タンパク質を含む上清液を回収した。
３００Ｋ  接面流動膜（tangential flow membrane）カセット（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて、上清液を５容量の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２，０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して透析濾過した。ラジオイムノアッセイ及びウエスタンブロッティングにより、該膜によって保持された物質はＬ１タンパク質を含むことが示された。
保持物質を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で平衡にした、ＳＰ  Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ（Ｍ）▲Ｒ▼樹脂（ＩＢＦ，Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の高分離能アフィニティーカラム〔１１．０ｃｍ（内径）×５．３ｃｍ〕にかけた。平衡緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１．０Ｍ  ＮａＣｌで段階洗浄した後、Ｌ１タンパク質を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、２．５Ｍ  ＮａＣｌで段階洗浄して溶離した。洗浄・溶離中に画分を補集した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従い、カラム画分を全タンパク質についてアッセイした。次いで、画分を、ウエスタンブロッティング、及びコロイドクーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。画分をさらにラジオイムノアッセイにより分析した。
同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＳＰ  Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ画分をプールした。
最終生成物を、ウエスタンブロッティング、及びコロイドクーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１タンパク質は＞９０％ホモジニアスであると予測された。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロッティングにより同定した。最終生成物を０．２２μｍ膜を通して無菌濾過し、４℃で保存した。この処理により、合計１００ｍｇのタンパク質を得た。
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により電子顕微鏡分析を行う。試料のアリコートを２００メッシュ炭素コーティング銅グリッド上に置く。該グリッド上に１滴の２％リンタングステン酸、ｐＨ７．０を２０秒間置く。ＴＥＭ検査の前にグリッドを風乾する。全ての顕微鏡検査は、１００ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ  １００ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて実施する。作製された顕微鏡写真は１００，０００×の最終倍率を有する。
全タンパク質についてのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ
市販のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ▲Ｒ▼キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて全タンパク質をアッセイした。試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏに適切なレベルで稀釈した。必要な容量は、標準プロトコル及びマイクロアッセイプロトコルに対して、それぞれ０．１ｍｌ及び１．０ｍｌであった。どちらのプロトコルでも、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて標準曲線を作製した。アッセイは、製造業者の指示に従って実施した。標準曲線は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  IIｃｉコンピューターでＣｒｉｃｋｅｔＧｒａｐｈ▲Ｒ▼ソフトウエアを用いてプロットした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイ
全てのゲル、緩衝液及び電気泳動装置はＮｏｖｅｘ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、製造業者の指示に従って操作した。簡潔に言えば、試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏに等タンパク質濃度に稀釈し、２００ｍＭ  ＤＴＴを含む試料インキュベーション緩衝液と１：１混合した。試料を１００℃で１５分間インキュベートし、予形成した１２％トリス−グリシンゲル上に充填した。試料を１２５Ｖで１時間４５分電気泳動させた。市販のキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いてコロイドクーマシー染色によりゲルを発色させた。
ウエスタンブロット法では、タンパク質を２５Ｖで４０分間ＰＶＤＦ膜に移し取った。膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏで洗浄し、風乾した。一次抗体は、ＴｒｐＥ−ＨＰＶ１１  Ｌ１融合タンパク質に対して産生されたポリクローナルウサギ抗血清（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ博士から恵与）であった。抗血清をブロッティング緩衝液（６．２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ3中５％脱脂粉乳）に稀釈して抗体溶液を調製した。インキュベーションは２０〜２３℃で少なくとも１時間行った。ＰＢＳ（６．２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を３回変えて、各１分ずつブロットを洗浄した。二次抗体溶液は、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗血清（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をブロッティング緩衝液に稀釈して調製した。上記と同じ条件下に少なくとも１時間インキュべーションを行った。
ブロットを上記のように洗浄し、１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて検出した。
実施例１３
免疫原性組成物の調製
精製したＶＬＰを、医薬上許容し得る担体、安定剤又はワクチンアジュバントの混合によるような公知方法に従って配合する。本発明の免疫原性ＶＬＰは、例えば、ＰＢＳ、生理的食塩水又は蒸留水のような生理学的に許容し得る組成物と組み合わせてワクチン用に製造し得る。免疫原性ＶＬＰは、所望の免疫原性効果を得るために、約０．１〜１００μｇ、好ましくは約１〜約２０μｇの用量範囲で投与する。製剤当たりのＶＬＰの量は、個体の症状、体重、年齢及び性別を含む（但し、それらには限定されない）種々の要素に応じて異なり得る。ＶＬＰ製剤は、経口、皮下、局所、経粘膜、及び筋肉内を含む（但し、それらには限定されない）種々の経路を介して投与し得る。そのようなＶＬＰ製剤は、単一型ＶＬＰ（即ち、ＨＰＶ１１由来のＶＬＰ）か、ＶＬＰ混合物（即ち、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８由来のＶＬＰ）から構成し得る。
場合によって、抗菌性保存剤、例えば、チメロサルが存在してもよい。所望なら、本発明の免疫原性抗原をワクチン安定剤及びワクチンアジュバントと組み合わせて用いてもよい。典型的な安定剤は、特異的化合物、例えば、ヘパリン、イノシトールヘキサ硫酸、硫酸化β−シクロデキストリンのようなポリアニオン、特異性の低い賦形剤、例えば、アミノ酸、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、デキストロース、トレハロース、及び溶液条件、例えば、中性ｐＨ、高イオン強度（約０．５−２．０Ｍ  塩）、２価のカチオン（Ｃａ2+、Ｍｇ2+）を変動させる成分である。アジュバントの例には、Ａｌ（ＯＨ）3及びＡｌ（ＰＯ4）がある。本発明のワクチンは、凍結又は凍結乾燥形態で保存し得る。
実施例１４
ＶＬＰに対する抗体の調製
精製されたＶＬＰを用いて抗体を産生させる。本明細書に用いられている用語「抗体」には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにそれらの断片、例えば、抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2断片が含まれる。抗体は、組換えＶＬＰの精製、天然Ｌ１又はＬ２タンパク質の精製及びキットを含む（但し、それらには限定されない）種々の用途に用いられる。キットは、少なくとも１個の容器を密閉保持するのに適したコンパートメント化されたキャリアーを含む。該キャリアーはさらに、ＨＰＶ、ＨＰＶの断片又はＨＰＶに対する抗体の検出に適した抗ＶＬＰ抗体又はＶＬＰのような試薬を含む。キャリアーはさらに、標識抗原又は酵素基質などのような検出媒体をも含み得る。抗体、ＶＬＰ又はキットは法廷用分析及び疫学的研究を含む（但し、それらには限定されない）多様な目的に有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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