(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通促進有効量のサイモシンα1またはその塩を含有する医薬投与単位を含む、哺乳動物精子による哺乳動物卵子の貫通を増大させるための組成物。
【請求項２】
該医薬投与単位が精子懸濁液１００μｌあたり０．０５ないし１０μｇの範囲のサイモシンα1またはその塩を含む、精子懸濁液と接触させることによってイン・ビトロ（in  vitro）で哺乳動物精子による哺乳動物卵子の貫通を増大させるための請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該医薬投与単位が注射用のものであって、医薬上許容される液体担体を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該医薬投与単位が医薬上許容される液体担体中の９００ないし１２００μｇ／ｍ2哺乳動物体表面積のサイモシンα1またはその塩を含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
該医薬投与量単位が雌の膣管に挿入する徐放性カプセル剤に処方されている請求項１記載の組成物。
【請求項６】
該徐放性カプセル剤が４ないし６ｍｇのサイモシンα1またはその塩を含む請求項５記載の組成物。
【請求項７】
先体反応誘導量のサイモシンα1またはその塩を含有する医薬投与単位を含む先体反応した精子のパーセントを増大するのに使用するための組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、哺乳動物雄における不妊症を治療する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ある種のサイモシン・ポリペプチドおよび抗体の、雄不妊症を治療するための使用に関する。
発明の背景
胸腺は、身体の免疫学的および内分泌学的ホメオスタシスに関係する。ベセドブスキィ（Besedovsky）ら［ネイチャー（Nature）２４９：３５６−３６１（１９７４）］参照。発育における胸腺の重要性および哺乳動物における免疫学的能力の老化は、今日、一般的に受け入れられている。胸腺の種々の因子は、自然発生的および実験的に誘導された自己免疫病を引き起こし、妊娠中に免疫応答を変化させ得る性ホルモンのレベルを変調させると認められている。オーテス（Oates）ら［トレンズ・ファルマコル・サイエンス（Trends Pharmacol.Sci.）５：３４７（１９８４）］参照。ホルモン様活性を有するいくつかの液性因子が胸腺またはその抽出物から単離され、特徴付けられている。例えば、ゴルドシュタイン（Goldstein）ら［プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）７４：７２５−７２９（１９７７）］参照。単離されている因子はプロサイモシン−α（ＰｒｏＴα）、サイモシン−α1（Ｔα1）およびサイモシン−β4（Ｔβ4）を含む。Ｔα1およびＴβ4は配列決定され、合成されている。Ｔα1の配列は、例えば、米国特許第４，０７９，１２７号（ゴルドシュタイン（Goldstein）ら）に示されている。Ｔβ4の配列は米国特許第４，２９７，２７６号（ゴルドシュタイン（Goldstein）ら）で提供されている。
ヒト精漿における、およびヒト卵胞液におけるＴα1の存在が報告されている。引用して本明細書の一部とみなすナズ（Naz）らのインターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーティリティ（Int.J.Fertil.）３２：３７５（１９８７）参照。
ナズらは、精漿中のＴα1の量と精子カウント数および精液容量の間に相関関係があり、欠陥のある精子機能を持つ雄においてはそのレベルは有意に低いことを報告している。
受精は、卵形質膜との融合前に一連の事象を受ける精子が必要とする複雑な過程である。この事象鎖は、透明帯に結合する精子の受精能獲得、先体反応、および透明体を通過する貫通を含み、これらは、すべてナズらのカラント・オピニオンオブ・イミュノロジー（Current Opin.Immunol.）２：７４８−７５１（１９９０）に記載されている。受精能獲得は、哺乳動物精子細胞が卵母細胞に受精できる前に受けなければならない生理学的過程である。
不妊症は、集団の実質的部分につき問題が残っている。累積するデータは、子供が欲しい米国の結婚したカップル４人のうち１人もと多くの者が子供を孕むのに困難を有している。該問題の原因のいくつかを克服するために、人工受精、配偶子のマイクロマニピュレーションおよび試験管受精のごとき多数の技術が、近年、精力的に開発されてきた。しかしながら、これらの技術の多くはかなり費用がかかり、かつ成功率は低い。従って、不妊症の治療に有用な組成物および方法についての実質的な必要性が存在する。
発明の概要
本発明の目的は、哺乳動物雄における不妊症を治療するための組成物およびその治療方法を提供することにある。さらに詳しくは、本発明の目的は、欠陥のある精子機能によって引き起こされる哺乳動物雄における不妊症の治療を提供することにある。
本目的および他の目的は、Ｔα1のごとき受精促進サイモシン・ペプチド、または抗−Ｔα1もしくは抗−Ｔβ4のごとき受精促進抗−サイモシン抗体を受精促進量投与することによって達成される。該サイモシン・ペプチドまたは抗−サイモシン抗体は、不妊症雄の精液から精子を収集し、それを、受精促進サイモシンペプチドもしくは抗−サイモシン抗体と共に、精子の受精能を促進するのに十分な時間インキュベートすることによってin vitroで投与することができる。次いで、該精子を洗浄し、卵が受精できる条件下で、卵子と共にインキュベートする。
別法として、該受精促進サイモシンは、精子の受精能を促進するのに十分な量をin vivo投与することもできる。
発明の詳細な記載
本発明の１の具体例は、受精促進サイモシン・ペプチドの、不妊症哺乳動物雄を治療するための使用に関する。本明細書中で用いる「受精促進サイモシン・ペプチド」なる語は、卵に受精する精子の能力を促進するサイモシン・ペプチドを意味する。精子が卵に受精する能力は、例えば、精子の受精能獲得を促進することによって、または精子による先体反応を促進することによって改善することができ、また、卵を貫通する精子の増加によって証明することができる。かかるサイモシン・ポリペプチドはＴα1およびその生物学的に活性なアナログおよび断片を包含する。該サイモシン・ポリペプチドは天然で単離することができ、組換えによって生産でき、あるいは合成によって生産することができる。
サイモシン分子での治療は、in vitroまたはin vivoいずれかで行うことができる。in vitro治療では、サイモシン・ペプチドを、不妊症哺乳動物雄の精液から収集した精子に添加し、精子の受精能を増大させるのに十分な時間、典型的には、約５ないし１０時間インキュベートする。インキュベーション後、精子試料を洗浄し、単離した卵子と共にインキュベートすることができる。該インキュベーションは公知の技術に従って、in vitroまたはin vivoで行うことができる。
別法として、サイモシン・ペプチドはin vivoで投与することもできる。１の具体例において、サイモシンは、不妊症雄の精漿中のサイモシンの量および当該雄精子の受精能を増加させるのに十分な一連の注射によって当該雄に投与することができる。別法として、該サイモシンは哺乳動物雌に投与して、雌の膣管にサイモシンを提供することができ、それにより、サイモシンは膣管に侵入する精子と反応し、精子の受精能を増加させることができる。例えば、サイモシン・ペプチドを注射でき、血流中のサイモシンは膜を通過して膣管に移動でき、かくして、精子と反応することができる。別法として、サイモシンは徐放性カプセル剤に処方でき、これを雌の膣管に挿入することができる。該カプセル剤はサイモシンをゆっくりと放出し、これは、次いで、膣管に侵入する精子細胞と反応して、該精子の受精能を促進することができる。
in vitroまたはin vivo投与用の好ましい受精促進サイモシン・ペプチドはTα1またはその生物学的に活性なアナログもしくは断片よりなる。Ｔα1は当業者に知られており、例えば、マディソン州、ベセスダ（Bethesda）にあるアルファ・ワン・バイオケミカルズ・インコーポレイテッド（Alpha 1 Biochemicals,Inc.）から入手できる。Ｔα1の構造は米国特許第４，０７９，１２７号に開示されている。本明細書中で用いる「Ｔα1」は、米国特許第４，０７９，１２７号に開示されているＴα1の構造を有するペプチド、または米国特許第４，６１２，３６５号に開示されているごときその分子の生物活性アナログもしくは断片を包含する。好ましくは、かかる断片は、４ないし１８個のアミノ酸長であり、サイモシン活性を保持するその塩を包含する。
本発明のもう１つの具体例において、後記するごとく受精促進抗−サイモシン抗体は哺乳動物雄において不妊症を治療するためにin vitroで投与する。本明細書中で用いる「受精促進抗−サイモシン抗体」なる語は、精子の受精能を増加させるサイモシン・ペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を意味する。サイモシン・ペプチドは天然のもの、組換えたもの、または合成したものであり、全長ペプチドおよびその生物学的に活性なアナログもしくは断片を包含する。受精促進抗体は抗−Ｔα１抗体および抗−Ｔβ4抗体を包含する。
前記したごとく、本発明の１の方法において、不妊症哺乳動物雄からの精液からの精子を収集し、卵子と共にインキュベートするに先立って、受精促進サイモシン・ペプチドまたは受精促進抗−サイモシン抗体で処理する。
精液を収集する方法は当業者に知られており、本発明はかかる方法に指向されるものではない。好ましくは、精液は液化し、あるいはスイム−アップ（swim-up）精子集団を収集する。好ましくは、該液化は、３７℃で１５ないし３０分間加熱することによって起こる。かかる手法はナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）９９：１５７−１６５（１９９１）に記載されている。該スイム−アップ（swim-up）から収集した精子細胞は精子懸濁液を形成し、これを洗浄する。懸濁させ洗浄する手法用の適当な培地は、（ジブコ（Gibco）、ニューヨークから得られる）Biggers,Witten and Wittingham（「ＢＷＷ」）培地およびHam's Ｆ−１０培地を含む。該培地にはウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を補うのが好ましい。他の補充を用いることができるが、１％補充が十分である。試料の精子濃度は所望のものに調整する。一般に、適当な濃度は培地１ミリリットル当たり約５ないし約１０×１０6運動型精子の範囲内である。次いで、該精子を受精促進サイモシン・ペプチドと共にインキュベートする。好ましくは、該インキュベーションは、二酸化炭素を増やした雰囲気下、約３７℃で行う。好ましい雰囲気は９５％空気および５％二酸化炭素よりなるものと決定された。インキュベーション時間は変えることができる。しかしながら、通常、約５ないし約１０時間、好ましくは約５ないし８時間のインキュベーション時間が受精能獲得が起こるのに十分である。
また、精子含有試料に添加すべきサイモシンの量も変化させることができる。効果的な濃度は本発明の開示を理解する当業者ならば決定することができる。典型的には、該濃度は精子懸濁液１００マイクロリットル当たり約０．０５ないし約１０マイクログラムの範囲内である。好ましくは、サイモシンの濃度は精子懸濁液１００マイクロリットル当たり約０．０５ないし約０．５マイクログラムの範囲内である。適当な量の決定は、精子が受精能獲得に要する時間量に基いて当業者ならば行うことができる。望ましくは、十分なサイモシンを添加して、約５ないし１０時間内に精子に受精能を獲得させる。
インキュベーション時間の後、好ましくは１％ＢＳＡを補った培地で再度洗浄する。この時点で、精子はオオキストと共にインキュベートされる準備ができている。接触は人工授精によるin vitroまたはin vivoで行うことができる。かくして、卵を雌から単離し、再着床に先立って、処理精子で受精させることができる。別法として、サイモシン処理精子をin vivoで卵と共にインキュベートすることができる。両方の例で適用できる技術は当業者に公知である。
受精促進サイモシンの有効量で精子細胞を処理する別法として、精子細胞を受精促進抗−サイモシン抗体の有効量で処理することができる。適当な抗体は、精子の受精能獲得を増大させることによるなどして、精子の貫通率を刺激するのに有効な抗−サイモシン抗体を包含する。
本発明の好ましい具体例において、該抗体はＴα1およびＴβ4に対する抗体から選択される。かかる抗体はポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体よりなることができる。モノクローナル抗体は、例えば、マウスまたはヒト・モノクローナル抗体よりなることができる。一般に、モノクローナルを生起させる技術は公知である。例えば、ナズらのサイエンス（Science）、２２５：３４２−３４４（１９８４）およびナズらのＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８３：５７１３−５７１７（１９８６）参照。ポリクローナル抗体を用いる場合、それらはウサギ、マウスまたはラットのごとき哺乳動物からのポリクローナル抗血清よりなることができる。好ましい抗血清を得るには、Ｔα1またはＴβ4を適当な担体蛋白質にカップリングさせることができる。かかる担体は当業者に公知であり、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、チログロブリン、ヒト血清アルブミン等を包含する。該カップリングは当業者に公知の技術を用いて行う。公知のカップリング剤を用いることができる。好ましいカップリング剤はグルタルアルデヒドである。
適当な免疫原を得たならば、選択した動物を免疫する。適当な免疫技術は当業者に公知である。しかしながら、典型的には、フロイントの完全アジュバント中に乳化させた免疫原で、ウサギまたは他の動物に筋肉内または皮下部位にて注射する。ブースター法を変形することができる一方、好ましくは、ブースターは２週間後、週ベースで投与することができる。ブースターは要するだけの期間継続させることができる。典型的には、３週間のブースターが、例えば、ウサギを用いる場合に十分であることが判明した。免疫過程における種々の時点で、血液を、動物から抜き、所望の抗体の存在について力価を測定することができる。通常、最後のブースターの１週間後、動物から血液を採取し、抗血清を力価測定する。所望ならば、次いで、プロテイン−Ａセファロースカラムを用いて抗体をアフィニティー精製することができる。動物から血液を採取するには種々の技術がある。当業者に公知のごとく、免疫原のブースター投与は、典型的には、フロイントの不完全アジュバントで乳化した免疫原よりなる。
本発明の方法で抗体を用いる場合、サイモシン・ペプチドと共にするインキュベーションについて記載したごとく、それらは精子懸濁液と共にインキュベートする。典型的には、抗体の濃度は精子懸濁液１００マイクロリットル当たり約５ないし約２５マイクロリットルで変化し得る。限定する意図ではないが、その例としては、Ｔα1およびＴβ4抗血清についての好ましい濃度範囲は、精子懸濁液１００マイクロリットル当たり約１０ないし約２０マイクロリットル、あるいは１００μｌ当たり特異的ＩｇＧ約２μｇないし約１０μｇである。
インキュベーション期間の最後において、精子細胞を洗浄する。この例において、該洗浄により未反応抗体が除かれる。再度、次いで、洗浄した精子細胞を前記したごとく卵と共にインキュベートすることができる。
受精促進サイモシン・ペプチドおよび抗体での精子細胞のin vitro処理に加え、サイモシン・ペプチドをin vivoで投与することができる。この具体例の１例において、精子の受精能獲得を促進するのに十分な量で、１回用量またはそれ以上の用量にて、サイモシン・ペプチドの溶液を不妊症哺乳動物雄に静脈内注射する。投与すべきポリペプチドの量は、処理前の患者の精漿中のＴα1のレベルおよび精子の運動性を含めた多数の因子に依存する。サイモシン・ペプチドは、雄の精子の受精能獲得を促進するのに十分な量で投与する。これは、精漿中のＴα1のレベルを上げることによってなすことができる。
また、サイモシンは、不妊症雄精子を膣管に導入する前に哺乳動物雌に注射することもできる。血流に注射されたサイモシンは膜を通過して膣管に移動でき、そこで、不妊症雄からの精子と反応して、精子の受精能を増大させることができる。
雌または雄への注射については、一般に、サイモシン・ペプチドの適当な医薬投与単位は、医薬上許容される担体中、約９００ないし約１２００μｇ／ｍ2体表面積の範囲内である。マンニトールおよびリン酸緩衝液を含有するサイモシン・ペプチドの凍結乾燥調製物は分配に先立って希釈剤に溶解させる。サイモシンは１ｍｌの投与バイアルに分配するのが便宜である。
ヒトについては、約１５００ないし約１７００μｇの毎週２回の注射の投与法が便利である。用量および治療の長さは融通が効き、サイモシンに対する患者の臨床的応答によって決定できる。
別法として、前記したごとく、サイモシン・ペプチドは生体適合性の徐放性カプセルに処方でき、これを哺乳動物雌の膣管に移植することができる。該カプセルは長時間にわたってサイモシンをゆっくりと膣に放出し、そこで、サイモシンは不妊症雄からの精子と反応して、精子の受精能を増加させることができる。生物学的に適合する徐放性カプセル剤の製法は当該分野でよく知られている。適当なカプセル剤の例はラドモスキィー（Radomosky）らのバイオロジー・オブ・リプロダクション（Biol.of Reproduction）、４７：１３３−１４０（１９９２）に記載されている。典型的には、ヒト雌における移植用カプセルは約４ないし約６ｍｇのサイモシン・ペプチドを有し得る。
理論に拘束されるつもりはないが、受精促進サイモシンペプチドまたは抗−サイモシン抗体で処理した哺乳動物精子細胞は受精能獲得および先体反応を促進し、その促進された受精能の基礎を提供することができると信ずる。前記したごとく処理した精子細胞は、非処理精子細胞と比較した場合、上澄み中により多量のアクロシンを放出することが示された。かくして、本発明の１の具体例は、受精促進サイモシン・ペプチドまたは抗−サイモシン抗体の受精能獲得増大量と精子とを接触させることを特徴とする、精子細胞が卵の細胞膜を貫通することを可能とする種々の生理学的および生化学的変化を受ける間に生理学的現象である精子受精能獲得を増大させる方法よりなる。かかる効果に必要な量は前記した。
さらにもう１つの具体例において、本発明は、サイモシン・ポリペプチドまたは抗体の先体反応誘導量と精子とを接触させることによって、先体反応した精子の数を増加させる方法よりなる。先体は精子の前端に位置する非常に小さな体であり、精子が卵と受精すべき場合に、アクロシンのその内容物を放出しなければならない。この事象を行うのに必要なサイモシンの濃度は前記した。
本発明を一般的に記載してきたが、以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１−ポリクローナル抗血清の調製
グルタルアルデヒドの存在下で、等しい量の抗体およびＫＬＨを用い、Ｔα1およびＴβ4をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合でカップリングさせた。若い成体ニュージランド・ウサギに、フロイントの完全アジュバントで乳化したＴα1−ＫＬＨまたはＴβ4−ＫＬＨを筋肉内および皮下部位にて注射した。２週間後、該ウサギを各抗原調製物で３週間免疫した。これらの３週間の間のブースターはフロイントの不完全アジュバントで乳化した。最後の注射後１週間後、後眼窩穿刺によって動物から血液採取し、ラジオイムノアッセイを用いて抗血清を力価測定した。
対照抗血清を供するため、カップリングしたサイモシン・ペプチド無くして同量のＫＬＨをウサギに注射するか、あるいはＨＧＰ−３０と命名された対照の３０個のアミノ酸長のペプチドに連結したＫＬＨを注射する以外は、同一手法を行った。このペプチドはエイカー，エイ（Achour,A.）らのＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：７０４５（１９９０）に記載されている。すべての抗血清を５６℃の温度で３０分間加熱不活化し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
実施例２−ヒト精子との抗体結合の分析
ナズらのプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Acad.Sci,）８１：８５７−８６１（１９８４）によって記載されているごとくに、実施例１で調製した抗体を、間接免疫蛍光技術（ＩＦＴ）にて、メタノール固定したヒト精子とのその結合について分析した。ナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）９９：１５７−１６５（１９９１）に記載されている手法を用い、妊性男性から得られた精液試料をＰＢＳ中で洗浄した。高度に運動性の精子のスイム−アップ（swim-up）集団を収集し、再度ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、スライド上で風乾し、室温にて３０分間メタノールで固定した。引き続いて、該スライドを風乾し、湿潤チャンバー中、リン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）での１：５０希釈にて、室温で１・１／２時間抗血清で処理した。フルオレセイン標識したヤギ抗−ウサギ抗体（１：５０希釈）と共にインキュベートすることによって、抗体結合の位置決めをした（カペル・ラボラトリーズ（Cappel Labs.）、マルボーネ（Malvourne）、ペンシルベニア州）。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、アジ化ナトリウム（０．１％）および１，４−ジアザビシクロ（２，２，２）オクタン（１ミリリットル当たり１０ミリグラム）を含有するＰＢＳ中の９０％グリセロール中に入れて、観察の間にフォトブリーチングを減少させた。調べるまで試料を湿潤チャンバー中、４℃に維持した。
抗−Ｔα１抗体は、ＩＦＴ中でメタノール固定したヒト精子細胞の先体領域と優先的に結合することが示された。また、抗−Ｔβ4抗体は先体領域と強力に反応し、メタノール固定精子細胞の尾部領域とは弱く反応した。各々、これらの抗体のＴα1またはＴβ4とでの吸収は、精子細胞との抗体の免疫反応性を有意に吸収した。正常なウサギ血清または抗−ＫＬＨ複合体抗体はメタノール固定精子細胞と反応しなかった。
実施例３−精子貫通アッセイ
無帯ハムスター卵母細胞（ＳＰＡ）のヒト精子貫通アッセイは、ナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）１０２：４８７−４９４（１９９２）に記載されているごとくに行った。サイクルの第１日目に３０ＩＵのｅＣＧ（妊馬血清ゴナドトロピン）（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズリー州）の腹腔内注射によって、過剰排卵を成体雌ゴールデンハムスターで誘導した。５５−７２時間後、２０ＩＵ  ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）（シグマ（Sigma））を腹腔内投与した。１５−１７時間後、該動物を犠牲にし、成熟未受精卵を輸卵管から収集した。Biggers,Witten and Wittingham（ＢＷＷ）培地中、０．２％ヒアルロニダーゼと共にインキュベーションすることによって、周囲の卵丘細胞から卵子を分離し、およびＢＷＷ中、０．１％膵臓トリプシンで処理することによって透明膜から卵子を分離した。無帯卵子をＢＷＷ中で２回洗浄し、組織培養皿の中央に置いた。
不妊症男性からの精液を３７℃で１５〜３０分間液化し、スイム−アップ（swim-up）精子集団を収集した。収集技術はナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）、９９：１５７−１６５（１９９１）に記載されている。該スイム−アップ（swim-up）からの精子細胞を、１ミリリットル当たり５〜１０×１０6運動性精子に調整した１％ＢＳＡ（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.））を補ったＢＷＷで洗浄し、次いで、Ｔα1もしくはＴβ4（精子懸濁液１００ミリリットル当たり０．１〜１０マイクログラム）または免疫原に応答して誘導されたポリクローナル抗血清（抗血清１０〜２０マイクロリットル／精子懸濁液１００マイクロリットル）または同量の対照抗体（正常なウサギ血清、抗−ＫＬＨ抗体または抗−ＨＧＰ−３０抗体）または等容量の０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）と共に３７℃で（５％ＣＯ2および９５％空気混合物）５〜６時間インキュベートした。インキュベーション後、精子を洗浄して、未反応サイモシンまたは抗−サイモシン抗体を除去し、帯裸出ハムスター卵母細胞（各アッセイで３０〜５０個の卵／処理）と共に３ないし４時間共インキュベートした。該卵母細胞を取り出し、徹底的に洗浄し、３％グルタルアルデヒドで固定し、アセトカルミン溶液で染色した。精子貫通は、卵子の細胞質中の認め得る尾部と共に膨潤した精子頭部の存在によって判定した。卵子と一緒のインキュベーションの前後の精子の運動性を記録した。異なる妊性提供者を用いて少なくとも３ないし８回、該アッセイを繰り返し、各試料を少なくとも８２〜４８０個の卵母細胞でテストした。
貫通した卵のパーセントを以下の式に従って計算した。
％貫通卵子＝（貫通卵子の合計数／インキュベート卵子の合計数）×１００
このアッセイを用いて、ほぼ９３〜１０８％の卵子が妊性男性からの精子で貫通され、卵母細胞当たり貫通卵１個の平均値であった。該アッセイの結果を表１に示す。
表１から分かるように、濃度０．０５ないし０．５μｇ  Ｔα1／１００μ１精子浮懸濁でテストして、Ｔα1は、ＰＢＳ−ＢＳＡ処理対照精子と比較して、貫通卵子のパーセントを有意に（Ｐ＜．００１）増加させた（２．６倍まで）。
表２に示すごとく、Ｔα1およびＴβ4に対する抗体は、共に、濃度依存的に、有意に（Ｐ＜．００１）貫通率を増加させた（４．７倍まで）。同濃度（２０μｌ／１００μｌ）でテストした、ＫＬＨ担体に対する、ＨＧＰ−３０／ＫＬＨ複合体または正常なウサギ血清に対する抗体は、ＰＢＳ／ＢＳＡ処理対照精子と比較して、貫通率に影響しなかった。各ペプチドでの抗−Ｔα1および抗−Ｔβ4抗体の免疫吸収は、該抗体の受精促進活性において有意な（Ｐ＜．００１）減少を引き起こした。
また、シムス（Syms）らのファーティリティ・アンド・ステリリティ（Fertil.and Steril.）４３：７６６（１９８５）の方法によって、表３に示すごとく、ＳＰＡを不妊症（ｎ＝１８）および妊性男性（ｎ＝５）について行った。このアッセイでは、液化精液を等容量の予め加温した（３７℃）テスト卵黄緩衝液（例えば、ナズらのジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）９９：１５７（１９９１）に記載）と組み合せ、４℃で２４時間受精能を獲得させた。次いで、精子を洗浄し、無帯ハムスター卵母細胞に添加し、卵子当たりの貫通した精子の数を前記した手法によって測定した。妊性男性からの精子では１００％の卵子が貫通され、卵母細胞当たり貫通精子２６．２〜３４．９の平均であった（表３）。もし、精子機能が異常であれば、卵母細胞当たりの貫通精子が減少し、もし精子の異常性が深刻であれば、貫通卵子のパーセントは減少した。Ｔαレベルは、妊性男性のそれと比較して、不妊症男性の精漿では有意に（Ｐ＝．００２）低かった（平均±Ｓ．Ｄ．、不妊症男性１３２１．８９±５１６．６３；妊性男性２９６２．２０±１８１１．２５）。Ｔα1のレベルは、ＳＰＡによると、卵子当たりの精子の数と有意に相関していた（Ｒ＝０．５６６、Ｐは＜０．０１）（表３）。
実施例４−先体反応の評価
サイモシン・ペプチドおよびその抗体の効果を、ヒト精子先体反応について調べた。先体反応に対する効果は、抗体またはペプチドと共にインキュベートした後、精子の先体状態を測定することによって、ならびに先体反応の後にアクロシンの分布を調べることによって評価した。
Ａ．先体状態の評価
ナズらの前記文献に記載されたスイム−アップ（swim-up）手法によって、運動性精子を妊性男性から収集した。良好な性質の精子試料、すなわち、（１ミリリットル当たり５×１０6運動性精子）、７５％を超える運動性で、０ないし＋５のスケールで＋３ないし＋４の前進のものを、Ｔα1もしくはＴβ4または抗−Ｔα1抗体もしくは抗−Ｔβ4抗体と共にインキュベートした。前記したごとく、同一量の正常ウサギ血清、抗−ＫＬＨ抗体、抗−ＨＧＰ３０抗体またはＰＢＳ−ＢＳＡで対照を処理した。インキュベーション後、精子を遠心し、ＰＢＳ中で洗浄し、２つのアリコットに分けた。１のアリコットはカルシウムイオノフォア（カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ（Sigma））で先体反応へと誘導し、精子懸濁液と共に１時間インキュベートした。他のアリコットは、カルシウムイオノフォア処理することなく、自然に先体反応をさせた。カルシウムイオノフォア処理を行って、受精能獲得精子の先体反応を誘導した。先体状態は、ヤゲール（Jager）らの、アーキ・アンドロル（Arch.Androl.）１２：５３−５８（１９８４）によって記載されている三重染色手法を用いて評価した。精子をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％トリパン・ブルー（Trypan blue)(シグマ（Sigma）1:1 v/v）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、精子を２回洗浄し、３％のグルタルアルデヒド、０．１Ｍカコディレート緩衝液中で６０分間固定し、次いで、ＰＢＳ中で再度２回洗浄した。この懸濁液の一滴をスライドガラス上に置き、一晩風乾した。乾燥したスライドを脱イオン水（ｐＨ１．８、２Ｎ  ＨＣｌを含む）中の０．８％ビスマルクブラウン（シグマ（Sigma））で染色し、脱イオン水中ですすぎ、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコディレート緩衝液中の０．８％ローズベンガル（シグマ（Sigma））中、室温で４５分間染色した。該スライドを再度脱イオン水中で洗浄し、一連のアルコース中で脱水し、キシレン中で清澄化し、ペルマウント（permount）およびカバースリップ（coverslip）で設置した。試料当たり合計２００〜５００の精子を評価し、生きたもの、または死滅したものとして記録した。生きた精子をさらに先体無傷または先体非無傷（反応）精子として評価した。実験は、少なくとも３人の異なる妊性提供者の精子を用いて３〜５回反復した。
濃度０．５マイクログラム／マイクロリットル（Ｔα1が貫通率を有意に増加させた用量）でテストすると、Ｔα1は、ヒト精子細胞の受精能獲得および先体反応を有意に増加させた（表４）。５〜６時間Ｔα1とインキュベートするに際し、試料は、ＰＢＳ−ＢＳＡで処理した精子試料と比較して、先体反応した精子のより高いパーセントを有意に示した（表４）。Ｔα1で処理した精子試料は、（イオノフォア処理なくしての）自然な先体反応につきテストしたか、またはイオノフォア誘導先体反応の後に調べたかに拘わらず、より高いパーセントの先体反応精子を示した。効果はイオノフォア処理の後により支配的であった。Ｔβ4は有意な効果を示さなかった。
Ｔα1およびＴβ4に対する抗体は、共に、先体反応した精子のパーセントの有意な増加を引き起こした（表４）。効果はイオノフォア処理の後により支配的であったが、再度、自然な先体反応をチェックしたか、または抗体処理精子のイオノフォア誘導先体反応の後に調べたかに拘わらず、効果は明らかであった。先体反応した精子のパーセントに対する有意な効果は、ＰＢＳ−ＢＳＡ対照と比べて、ＫＬＨに対する抗体またはＨＧＰ−３０ペプチド／ＫＬＨ複合体に対する抗体での処理によっては観察されなかった。
Ｂ．アクロシン分布の評価
前記したごときカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で処理する共にあるいはそれ無くして、サイモシン・ペプチドまたは抗−サイモシン抗体または対照抗体またはＰＢＳ−ＢＳＡと共にインキュベートした後、精子細胞を遠心し、ケネディ（Kennedy）ら［ジャーナル・オブ・アンドロロジー（J.Androl.）１０：２１−２７（１９８９）］の方法によって、アクロシン活性を上澄みおよび細胞で測定した。ＰＢＳ９０マイクロリットルに懸濁した上澄みまたはペレット化精子細胞９０マイクロリットルを、反応混合物１ミリリットルと混合した。反応混合物は０．０５５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＮ−ベンゾイル−ｄｌ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリン（ＢＡＰＮＡ）塩酸塩、０．０５５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖ（ジメチルスルホキシド）、０．１％ｖ／ｖ（トリトン−Ｘ−１００）の１ミリリットル当たり１ミリグラムよりなるものであった。次いで、該溶液を室温で３時間インキュベートした。０．５Ｍ  ベンズアミジン１００マイクロリットルの添加によって反応を停止し、Beckmanの分光光度計を用いて、４０５ナノメーターで吸光度を測定した。アクロシン活性はμＩＵ／１０6精子として表した。アッセイの毎日の変化性は、寒冷保存した部分的精製ヒト・アクロシン抽出物を用いて正規化した。かかる抽出物の沈殿はナズら［ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）１０２：４８７−４９４（１９９２）］によって教示されている。
Ｔα1（０．５マイクログラム／１００マイクロリットル）、抗−Ｔα1抗体（２０マイクロリットル／１００マイクロリットル）または抗−Ｔβ4抗体（２０マイクロリットル／１００マイクロリットル）と共にインキュベートすると、ＰＢＳ−ＢＳＡ処理精子比べて、上澄み中に放出された有意により高いアクロシン濃度および精子細胞におけるより低いアクロシン濃度が示された（Ｐ＝０．０４ないし０．００１未満）（表４）。効果はイオノフォア処理の後により支配的であったが、イオノフォア処理の有り無しで調べたたどうかに拘わらず、効果は明らかであった。対照抗体はいずれも精子細胞のアクロシン分布に対して効果を示さなかった。Ｔβ4は有意な効果を示さなかった。
Ｃ．精子の運動性分析
前記したごときサイモシン・ペプチドまたはその抗体で５ないし６時間インキュベートしたの後、精子懸濁液のアリコット（７マイクロリットル）をMaklerチャンバー（セフィ・メディカル・インストルメンツ（Sefi Medical Instruments）、イスラエル）に入れ、コンピューター化した精液分析機（セル・セフト・クリオ・リソーシズ（Cell Soft Cryo Resources）、ニューヨーク）を用いて精子の運動性特質を測定した。パラメーターのセッティングは、３０Ｈｚのイメージ周波数、運動性についての３フレームの最小サンプリング、外側頭部運動（「ＡＬＨ」）測定の速度および増幅についての１５フレームの最小サンプリング、第２閾値速度当たり１０マイクロメーター、ＡＬＨ測定についての２．５の最小直線性および４〜４０ピクセルの細胞サイズ範囲にて、ピクセル当たり０．６８８マイクロメーターの倍率キャリブレーションで、３０フレーム分析した。
試料における運動性精子細胞のパーセントに対する効果は、Ｔα1、Ｔβ4（１００マイクロリットル当たり０．５マイクログラム）またはその各抗体（１００マイクロリットル当たり２０マイクロリットル）での処理に際して観察されなかった。しかしながら、Ｔα1、Ｔα1に対する抗体およびＴβ4に対する抗体は速度、ＡＬＨおよび精子細胞のビート頻度に有意に影響した。効果はＡＬＨおよびビート頻度の増加に対してより明らかであった。Ｔβ4ペプチドまたは対照抗体は、いずれも、ＰＢＳ−ＢＳＡ処理対照と比べて、精子細胞の運動性特性に影響しなかった（表５）。
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