(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞用発現ベクターに、配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持ち、哺乳類細胞内で前記融合タンパク質を生産させることができる遺伝子治療用ベクター。
【請求項２】
前記配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチド領域は、前記目的タンパク質領域のＣ末端に結合される請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記目的タンパク質が、サイトカイン若しくはサイトカインに免疫グロブリンの定常領域を付加した融合タンパク質、成長因子、ホルモン若しくは細胞接着因子又はこれらのレセプターである請求項１又は２記載のベクター。
【請求項４】
前記サイトカイン又はそのレセプターが、インターフェロン及びそのレセプター、CTLA4、インターロイキン及びそのレセプターから成る群から選ばれる請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物又は培養哺乳動物細胞から採取された被検試料中の、配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチド領域を免疫測定することを含む、前記遺伝子治療用ベクターの発現により体内又は培養細胞内で生産された前記目的タンパク質の定量方法。
【請求項６】
前記被検試料が、前記遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物から採取されたものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記被検試料が、血液試料である請求項６記載の方法。
【請求項８】
配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチドから成る、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤。
【請求項９】
配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチドから成る、哺乳動物体内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内又は培養細胞内で生産された目的タンパク質を簡便に定量することができる、生体内で目的タンパク質を生産するための遺伝子治療用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の体内で目的のタンパク質を生産させる遺伝子治療を行った際、目的のタンパク質の血中濃度はその蛋白のELISA法など、測定法が確立している場合は可能であるが、確立していない場合は濃度測定ができない。そこで、標識蛋白を用いて、その蛋白濃度を測定するアッセイ法が実用化され販売されている。しかし、この測定感度は低く、遺伝子治療における血中濃度測定として確立した方法はない。文献(Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding IFN−γR／Fc, The Journal of Clinical Investigation, July 2000, volume 106, Number 2 p207-215)では目的のタンパク質を測定せずに影響を受けるタンパク質を定量化して間接的に目的のタンパク質の発現を証明している。これは血中濃度測定の難しさを示していると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、遺伝子治療を行った際の目的タンパク質の血中濃度を高感度にモニターでき、標識に起因する不所望の生理作用や抗原抗体反応がほとんど引き起こされない、遺伝子治療用ベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子治療により体内で生産させるべき目的タンパク質と、グルカゴンのＣ端側19−29アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだベクターで遺伝子治療を行うことにより、上記グルカゴンペプチドを標識として目的タンパク質の血中濃度を高感度に測定することができ、かつ、標識ペプチドに起因する不所望な生理作用の発現や免疫反応の誘起がほとんどないことを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、哺乳類細胞用発現ベクターに、配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持ち、哺乳類細胞内で前記融合タンパク質を生産させることができる遺伝子治療用ベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物又は培養哺乳動物細胞から採取された被検試料中の、配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチド領域を免疫測定することを含む、前記遺伝子治療用ベクターの発現により体内又は培養哺乳動物細胞内で生産された前記目的タンパク質の定量方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号1に示されるアミノ酸配列から成るペプチドから成る、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、標識ペプチドは生理作用を持つことなく、目的タンパク質の血中濃度を高感度に測定することを可能にする遺伝子治療用ベクターが初めて提供された。グルカゴンのＣ端側19−29は、それ自体生理作用を有さず、各種哺乳動物においてよく保存されているので、免疫反応を実質的に誘起せず、それでいて市販の免疫測定キットを用いて高感度に免疫測定することにより定量することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のベクターにより、目的タンパク質と融合されて発現される、「グルカゴンのＣ端側19−29アミノ酸ペプチド」とは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドである。この「グルカゴンのＣ端側19−29アミノ酸ペプチド」は、目的タンパク質の標識として用いられるので、以下、便宜的に「グルカゴン由来標識ペプチド」と呼ぶことがある。
【０００８】
本発明のベクターには、グルカゴン由来標識ペプチド領域と、目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸が組み込まれている。
【０００９】
本発明に用いられる哺乳類細胞用発現ベクターは、遺伝子治療の分野において周知であり、哺乳類細胞用発現ベクターであれば限定されない。本発明の特徴は、目的タンパク質の標識としてのグルカゴン由来標識ペプチド領域を、目的タンパク質と融合させて発現させる点にあり、哺乳類細胞用発現ベクターは、何ら限定されるものではなく、遺伝子治療の分野で用いられている公知のいずれの哺乳類細胞用発現ベクターをも用いることができる。プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよいが、安全性の観点からプラスミドベクターが好ましい。種々の哺乳類細胞用発現ベクターが周知であり、また、市販されており、これらの周知又は市販のベクターを好ましく用いることができる。周知又は市販ベクターの例として、pCAGGS (Efficient selection for high expression transfactans with a novel eukaryotic vector, Gene 1991 Dec.15,108(2)p193-P199.、遺伝子地図を図４に、その塩基配列を配列表の配列番号３に示す)、プロメガ社のpCIベクター、pSIベクター及びpTARGETベクター並びにインビトロジェン社のpcDNA5/TO等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
遺伝子治療により体内で生産させようとする目的タンパク質は、何ら限定されるものではなく、インターフェロン、インターロイキン及びCTLA4のような種々のサイトカイン、成長因子、インスリン等のホルモン及び細胞接着因子等並びにこれらのレセプターを例示することができる。また、任意の抗原タンパク質を体内で生産させ、遺伝子ワクチンとすることもできる。また、目的タンパク質自体が融合タンパク質であってもよい。例えば、Fcレセプターとの結合が求められる所望のサイトカインの一端に、免疫グロブリン、好ましくはIgG、特にIgG1の定常領域(Fc)を融合し、Fcレセプターとの結合性を高めたものを目的タンパク質とすることもできる（下記実施例１〜４参照）。IgGのFc領域をコードする核酸の塩基配列は、周知であり、例えば、ヒトのIgG Fc領域をコードする核酸の塩基配列は例えばGenBank Accession No. BC020823等に記載されており、ラットのIgG Fc領域をコードする核酸の塩基配列は本願の図１ないし図３等に示されている。
【００１１】
本発明のベクターは、目的タンパク質と、上記標識ペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸を、哺乳類細胞用発現ベクターのクローニングサイトに挿入することにより得られる。なお、標識ペプチドは、目的タンパク質の一端、特にＣ末端に融合させることが好ましい。
【００１２】
遺伝子治療は、本発明の遺伝子治療用ベクターを、哺乳動物に投与することにより行うことができる。投与経路は、静脈注射や筋肉内注射のような非経口投与が好ましい。ベクターの投与量は、目的タンパク質の性質や治療すべき疾患の種類及び程度等に応じて適宜設定することができるが、体重１kg当りのベクターの投与量は、通常、1 mg〜10 mg程度、好ましくは2 mg〜4 mg程度である。製剤としては、例えば、遺伝子治療用ベクターをリンゲル液に溶解した溶液を注射液として用いることができる。これに医薬製剤の分野で周知の注射剤用添加剤を添加することも可能である。あるいは、本発明の遺伝子治療用ベクターは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に投与することもできる。すなわち、患者のリンパ球や骨髄細胞等の細胞を体外に取り出して培養し、培養細胞に遺伝子ベクターを投与し、目的タンパク質の生産能を獲得した細胞を再び患者に戻す遺伝子治療があるが、本発明の遺伝子治療用ベクターは、このような培養哺乳動物細胞に投与することもできる。あるいは、遺伝子治療用ベクターの治療効果をインビトロで調べるため等の実験において培養される哺乳動物細胞に投与することもできる。
【００１３】
遺伝子治療において、体内に導入されたベクターにより上記目的タンパク質とグルカゴン由来標識ペプチドとの融合タンパク質が生産される。あるいは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを投与する場合には、該培養細胞内で上記目的タンパク質とグルカゴン由来標識ペプチドとの融合タンパク質が生産される。目的タンパク質は、標識ペプチドと融合しているので、目的タンパク質の濃度は、グルカゴン由来標識ペプチドの濃度を測定することにより測定することができる。なお、本発明で用いられるグルカゴン由来標識ペプチドを免疫測定するキット（グルカゴン由来標識ペプチドを抗原として得られる抗体を含む）が市販されている（第一ラジオアイソトープ研究所製膵グルカゴンRIAキット等）ので、このような市販の免疫測定用キットを用いて容易に測定することができる。
【００１４】
グルカゴン由来標識ペプチドを定量する被検試料は、本発明の遺伝子治療用ベクターを投与された個体由来の各種体液や組織等又はそれらの希釈物であり、好ましくは、全血、血清若しくは血漿又はそれらの希釈物のような血液試料である。あるいは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを投与する場合には、培養細胞のホモジネートや培養上清等である。
【実施例】
【００１５】
実施例１、比較例１
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3'と5'-tcaaccactgcacaaaatcttgggctttacccggagagtgggagagact-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、さらにそのPCR産物を300倍希釈したものを鋳型として、5'-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3'と5'-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、増幅産物を、EcoRIを用いて上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGS のクローニングサイトに組み込んだ。これにより、SwaIとNotIの制限酵素部位の入ったpCAGGS-IgG-glu19-29（免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域をコードする領域の下流に、グルカゴン由来標識ペプチドをコードする領域が結合された核酸断片がpCAGGSのEcoRI部位に挿入されたもの）が得られた。
【００１６】
次に、ラット心筋炎の心臓のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatgattctgctggtggtcctgatg-3'と5'-gcagcatcgcggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、そのPCR産物を、先に作成したpCAGGS-IgG-glu19-29にSwaIとNotIを用いて組み込んだ。
【００１７】
これにより、上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGSのEco RI部位に、配列表の配列番号２に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するＤＮＡ断片が挿入された、本発明のベクターを作製した（実施例１）。なお、配列番号２を他の情報と共に図１ないし図３に示す。図１ないし図３に示されるように、挿入した核酸断片は、両端にEcoRI部位を有し、インターフェロンγレセプター(IFNγR)タンパク質と、免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域の融合タンパク質をコードする領域の下流に、グルカゴン由来標識ペプチドをコードする領域が結合されたもの(INFγR-IgG-グルカゴン19-29)である。
【００１８】
グルカゴン由来標識ペプチドを含まないプラスミドベクター（比較例１）と、上記のように作成したグルカゴン由来標識ペプチドを含む本発明のプラスミドペクター（実施例１）を、それぞれ７匹のラットの尾静脈から急速静脈注射し、遺伝子治療を行った。注射液の組成は、一匹あたり８００μｇのプラスミドを２０ｍｌのリンゲル液に溶解したものであった。注射後、経時的に血液を採取し、採血して得た1〜10μ1の血漿を100〜1000倍希釈し、市販のRIAキット（第一ラジオアイソトープ研究所製膵グルカゴンRIAキット等）を用いて、該キットの添付文書に従ってグルカゴン由来標識ペプチドの濃度、ひいては、目的タンパク質（本実施例では、IFNγR/IgG1Fc融合タンパク質）の濃度を測定した。すなわち、RIAは、具体的には次のようにして行なった。アッセイ用緩衝液400μlに標準グルカゴン溶液あるいは希釈した被検血漿を200μl加え、さらにグルカゴン-125I溶液を100μl、グルカゴン抗血清溶液を100μl加え、4℃、48時間放置した。その後、第二抗体を100μl、グルカゴンRIA用沈殿安定剤400μlを加え4℃、30分間放置し、遠心分離（2000xg 30分間、4℃）後、上清除去後計数率を測定し濃度を求めた。
【００１９】
図５は血中濃度の測定結果である。実施例１では、静脈注射後１日目2870±1062ng/ml（平均±標準偏差）、３日目1440±334ng/ml、７日目1120±433ng/ml、１６日目281±162ng/ml、との結果が得られ、全例で測定可能であった。一方、グルカゴンペプチドを含まないプラスミドペクターでの遺伝子治療（比較例１）では同様な検査ですべて感度以下であった。
【００２０】
図６はプラスミド静脈注射4，8，12時間後の血糖値及び上記と同様にRIA測定法で検査した蛋白血中濃度の値である。実施例１では、血中濃度は４時間後2815±2318ng/ml、８時間後6061±2789ng/ml、12時間後5752±2270ng/mlを示し、最大血中濃度を示した8−12時間後の血糖は、８時間後89.3±15.1mg/dl（実施例１）vs81.8±7.5 mg/dl（比較例１）、12時間後63.5±5.7mg/dl（実施例１）vs71.4±6.9 mg/dl（比較例１）と差はなかった。
【００２１】
以上の結果から、本発明のベクターを用いることにより、ベクター投与の数十日後まで、極少量の血漿サンプルから、目的タンパク質の血中濃度を十分測定することが可能であることが明らかになった。
【００２２】
実施例２、比較例２
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatggcttgtcttggactccagagg-3'と5'-gcagcatcgcggccgcgtctgaatctgggcatggttctgg -3'をプライマーとして用いてPCRを行い、そのPCR産物を、実施例１記載の方法で作製したpCAGGS-IgG-glu19-29にSwaIとNotIを用いて組み込んだ。
【００２３】
これにより、図７ないし９及び配列番号４に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットCTLA4-IgG-グルカゴン19-29（ラットCTLA4コード領域の下流にラットIgG Fcコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGSのEco RI部位に挿入された、ラット細胞内でCTLA4-IgG-グルカゴン19-29を発現する組換えベクターが作製された（実施例２）。比較のため、CTLA4コード領域を含まないIgG-グルカゴン19-29コード領域のみを挿入した組換えベクターも作製した（比較例２）。
【００２４】
心臓移植後のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、移植心臓の生着日数も調べた。
【００２５】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０に示されるように、実施例２では、CTLA4-IgG-グルカゴン19-29蛋白が図７のように推移した。つまり前値は100倍希釈ではグルカゴンが測定不能であったが、1日目に急激に上昇し、5000ng/mlを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した105日後まで、1000ng/mlを越えるような蛋白濃度を示した。また、図１１に示されるように、実施例２では、10匹中1匹が14日目に拒絶されたが、残りの9匹はすべて評価した105日まで生着していた。CTLA4を含まないpCAGGS-SP-IgG-グルカゴン19-29で治療した群（比較例２）では、5匹中1匹が5日目に、1匹が6日目に、3匹が7日目に拒絶された。これは有意にpCAGGS-CTLA4-IgG-グルカゴン19-29治療の有効性を示している。
【００２６】
実施例３、比較例３
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatggcactctgggtgactgcagtc-3'と5'-gcagcatcgcggccgcgtggccatagcggaaaagttgctt-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、そのPCR産物を実施例１記載の方法で作製したpCAGGS-IgG-glu19-29にSwaIとNotIを用いて組み込んだ。
【００２７】
これにより、図１２ないし１４及び配列番号５に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットIL13-IgG-グルカゴン19-29（ラットインターロイキン１３(IL13)コード領域の下流にラットIgG Fcコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGSのEco RI部位に挿入された、ラット細胞内でIL13-IgG-グルカゴン19-29を発現する組換えベクターが作製された（実施例３）。比較のため、IL13コード領域を含まないSP-IgG-グルカゴン19-29コード領域（配列番号６並びに図１５及び図１６）のみを挿入した組換えベクターも作製した（比較例３）。
【００２８】
自己免疫性心筋炎ラット（A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction.
Clinical Immunology and Immunopathology, November 1990, volume 57, p250-262.）のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、投与１６日後に屠殺、解剖し、心筋炎病変部位の病変面積率も調べた。
【００２９】
結果を図１７及び図１８に示す。IL13-IgG-グルカゴン19-29蛋白が図１７のように推移した。つまり、1日目に2000ng/mlを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した16日後まで、約8ng/mlの蛋白濃度を示した。また、図１８に示すように、本発明の遺伝子治療用ベクターであるpCAGGS-IL13-IgG-グルカゴン19-29（IL13-IgG-グルカゴン19-29を挿入したベクターpCAGGS）を投与した群では、IL13を含まないpCAGGS-SP-IgG-グルカゴン19-29を投与した群に比べて、有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、pCAGGS-IL13-IgG-グルカゴン19-29治療の有効性が示された。
【００３０】
実施例４、比較例４
マウスのレクチンで刺激した培養脾細胞のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatggaaatctgctggggaccctac-3'と5'-gcagcatcgcggccgcttggtcttcctggaagtagaactt-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、そのPCR産物を実施例１記載の方法で作製したpCAGGS-IgG-glu19-29にSwaIとNotIを用いて組み込んだ。
【００３１】
これにより、図１９ないし２１及び配列番号７に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットIL1RA-IgG-グルカゴン19-29（ラットインターロイキン１レセプターアンタゴニストコード領域の下流にラットIgG Fcコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGSのEco RI部位に挿入された、ラット細胞内でIL1RA -IgG-グルカゴン19-29を発現する組換えベクターが作製された（実施例４）。
【００３２】
自己免疫性心筋炎ラット（A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction. Clinical Immunology and Immunopathology, November 1990, volume 57, p250-262.）のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、投与１６日後に屠殺、解剖し、心筋炎病変部位の病変面積率も調べた。比較のため、上記比較例３のベクターも投与した（比較例４）。
【００３３】
結果を図２２及び図２３に示す。図２２に示すように、実施例４では、IL1RA-IgG-グルカゴン19-29蛋白が図２２のように推移した。つまり、1日目に2000ng/mlを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した16日後まで、約20ng/mlの蛋白濃度を示した。また、図２３に示すように、実施例４では比較例４に比べて、有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、pCAGGS- IL1RA-IgG-グルカゴン19-29治療の有効性が示された。
【００３４】
実施例５
SwaIとNotIの制限酵素部位の入ったpCAGGS-glu19-29 を作るために、5'-gagaattcatttaaatgagagcggccgccccgggtaaagcccaagattttgtgcagtggttg-3'と5'-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3'のプライマーのみでPCRを行い、EcoRIを用いて、pCAGGSのクローニングサイトに組み込んだ。
【００３５】
次にCos7細胞のcDNAを鋳型として用い、5'-gagaattcatttaaatgacttccaagctggccgtggct-3'と5'-gcagcatcgcggccgctgaattctcagccctcttcaaaaa-3'をプライマーとして用いてPCRを行い、そのPCR産物を、先に作成したpCAGGS-glu19-29にSwaIとNotIを用いて組み込んだ。
【００３６】
これにより、図２４及び配列番号８に示す塩基配列を有するヒトIL8-グルカゴン19-29（ヒトインターロイキン８コード領域の下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターpCAGGSのEco RI部位に挿入された、ラット細胞内でIL8-グルカゴン19-29を発現する組換えベクターが作製された（実施例５）。
【００３７】
ラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、１日後に採血し、血中濃度を測定した。また、同じ試料中のヒトIL-8の濃度も定量した。ヒトIL-8の定量は、BIOSOURSE社製（Nivelles, Belgium）、IL-8 EASIAキットを用いてそのプロトコールに従って行った。
【００３８】
結果を図２５に示す。図２５に示すごとく、両者のモル濃度はほぼ一致し、グルカゴン19-29の標識ペプチドを用いた方法の正確性が証明された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】  図１は、実施例１で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図２】  図２は、図１の続きを示す図である。
【図３】  図３は、図２の続きを示す図である。
【図４】  図４は、実施例１〜５で用いた哺乳動物用発現ベクターであるpCAGGSの遺伝子地図である。
【図５】  図５は、実施例１における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
【図６】  図６は、実施例１において測定された、本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行った場合の目的タンパク質の血中濃度並びに本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行った場合及びグルカゴン由来標識ペプチドを融合していない目的タンパク質をコードする核酸を挿入したベクターを用いて遺伝子治療を行った場合の血糖値の経時変化を示す図である。
【図７】  図７は、実施例２で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図８】  図８は、図７の続きを示す図である。
【図９】  図９は、図８の続きを示す図である。
【図１０】  図１０は、実施例２における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
【図１１】  図１１は、実施例２及び比較例２における、ラットの移植心臓の生着日数を示す図である。
【図１２】  図１２は、実施例３で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図１３】  図１３は、図１２の続きを示す図である。
【図１４】  図１４は、図１３の続きを示す図である。
【図１５】  図１５は、比較例３で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図１６】  図１６は、図１５の続きを示す図である。
【図１７】  図１７は、実施例３における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
【図１８】  図１８は、実施例３及び比較例３における、ラットの心筋炎病変部位の面積率を示す図である。
【図１９】  図１９は、実施例４で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図２０】  図２０は、図１９の続きを示す図である。
【図２１】  図２１は、図２０の続きを示す図である。
【図２２】  図２２は、実施例４における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
【図２３】  図２３は、実施例４及び比較例４における、ラットの心筋炎病変部位の面積率を示す図である。
【図２４】  図２４は、実施例５で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図２５】  図２５は、実施例５における、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度と、ヒトインターロイキン８を測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との相関関係を示す図である。
【配列表】
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<150>  JP 2003-3967
<151>  2003-01-10
<160>  24
<210>  1
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  oligopeptide encoding C19-29 region of glucagon of human, mouse or rat
<400>  1
Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
1               5                   10
<210>  2
<211>  1471
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(1461)
<223>  DNA insert encoding rat IFN-r receptor, rat IgG Fc region and glucagon C19-29
region
<400>  2
gaattcattt aa atg att ctg ctg gtg gtc ctg atg ctg tct gcg gag atc     51
Met Ile Leu Leu Val Val Leu Met Leu Ser Ala Glu Ile
1               5                   10
ggg agt gga gct ttg atg agc acc gag gat cct aag ccg ccc tcg gtg       99
Gly Ser Gly Ala Leu Met Ser Thr Glu Asp Pro Lys Pro Pro Ser Val
15                  20                  25
cct gcg cca aca aat gtt cta att acg tcc tat gac ttg aac cct gtc      147
Pro Ala Pro Thr Asn Val Leu Ile Thr Ser Tyr Asp Leu Asn Pro Val
30                  35                  40                  45
gta cat tgg aag cac cag aac gtg tcg cag gct gcc gtc ttc act gta      195
Val His Trp Lys His Gln Asn Val Ser Gln Ala Ala Val Phe Thr Val
50                  55                  60
cag gta aag atg tat cca gaa tac tgg act gat gcc tgc acc aac att      243
Gln Val Lys Met Tyr Pro Glu Tyr Trp Thr Asp Ala Cys Thr Asn Ile
65                  70                  75
gcc cat cat tat tgt aat atc tac aaa cac att tcc tat cct gac tca      291
Ala His His Tyr Cys Asn Ile Tyr Lys His Ile Ser Tyr Pro Asp Ser
80                  85                  90
tct gcc tgg gcc aga gtt aag gcc aag gtt gga caa aga gaa tct gcc      339
Ser Ala Trp Ala Arg Val Lys Ala Lys Val Gly Gln Arg Glu Ser Ala
95                  100                 105
tat gcg cag tca gaa gag ttt att atg tgc cga aag ggg aag gtt gga      387
Tyr Ala Gln Ser Glu Glu Phe Ile Met Cys Arg Lys Gly Lys Val Gly
110                 115                 120                 125
ccg cct ggc ctg gac atc gga agg aag gaa gat cag ctg att gtc cac      435
Pro Pro Gly Leu Asp Ile Gly Arg Lys Glu Asp Gln Leu Ile Val His
130                 135                 140
ata ttt cac cct aag gtc aat gtg agt cag gaa acc atg ttt ggt gac      483
Ile Phe His Pro Lys Val Asn Val Ser Gln Glu Thr Met Phe Gly Asp
145                 150                 155
gga aat acc tgt tac aca ttc gac tac act gtg ttt gtg aaa cat tac      531
Gly Asn Thr Cys Tyr Thr Phe Asp Tyr Thr Val Phe Val Lys His Tyr
160                 165                 170
agg agt ggg gag atc cta cat aca gaa cat agc gtc cta aaa gaa gat      579
Arg Ser Gly Glu Ile Leu His Thr Glu His Ser Val Leu Lys Glu Asp
175                 180                 185
tgt agc gaa act ctg tgt gag tta aac atc tca gtg tcc acg ctg aat      627
Cys Ser Glu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Ile Ser Val Ser Thr Leu Asn
190                 195                 200                 205
tcc aat tac tgt gtt tca gta gtt gga aag tcg tct ttc tgg caa gtt      675
Ser Asn Tyr Cys Val Ser Val Val Gly Lys Ser Ser Phe Trp Gln Val
210                 215                 220
aat aca gaa aca tca aaa gac gcc tgt atc ccc ttt ctc cat gat gac      723
Asn Thr Glu Thr Ser Lys Asp Ala Cys Ile Pro Phe Leu His Asp Asp
225                 230                 235
aga gaa gaa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag      771
Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys
240                 245                 250
cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc      819
Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
255                 260                 265
cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc acg      867
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
270                 275                 280                 285
tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc      915
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser
290                 295                 300
tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca cca      963
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro
305                 310                 315
gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc     1011
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
320                 325                 330
ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc     1059
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr
335                 340                 345
agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa     1107
Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu
350                 355                 360                 365
ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag gaa     1155
Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu
370                 375                 380
gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc     1203
Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe
385                 390                 395
tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca cag     1251
Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln
400                 405                 410
gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt tac     1299
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
415                 420                 425
ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga     1347
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly
430                 435                 440                 445
aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat     1395
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
450                 455                 460
act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg     1443
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val
465                 470                 475
cag tgg ttg atg aat acc tgagaattct                                  1471
Gln Trp Leu Met Asn Thr
480
<210>  3
<211>  4790
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  DNA sequence of artificial expression vector pCAGGS
<400>  3
gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata     60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc    120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag    180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac    240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg    300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg    360
tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc    420
atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca    480
gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg    540
gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt    600
tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc    660
gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc    720
ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc    780
gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag    840
ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg    900
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg    960
cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc   1020
ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg   1080
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc   1140
cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc   1200
gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg   1260
ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct   1320
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg   1380
gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc   1440
tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt   1500
cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg   1560
acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg   1620
gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca   1680
acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgag gaattcactc   1740
ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca   1800
aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg   1860
agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt   1920
ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg   1980
agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg   2040
ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga   2100
aaagccttga cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta   2160
acatccctaa aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta   2220
ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt   2280
ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca   2340
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact   2400
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagcg   2460
gatccgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc   2520
ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat   2580
gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt   2640
ggaggcctag gcttttgcaa aaagctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat   2700
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg   2760
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ccgctgcatt aatgaatcgg   2820
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga   2880
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat   2940
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca   3000
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc   3060
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata   3120
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc   3180
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc   3240
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga   3300
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc   3360
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag   3420
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag   3480
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag   3540
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca   3600
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga   3660
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat   3720
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga   3780
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg   3840
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga   3900
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc   3960
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac   4020
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc   4080
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc   4140
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc   4200
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt   4260
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc   4320
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg   4380
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag   4440
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat   4500
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc   4560
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa   4620
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta   4680
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa   4740
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg              4790
<210>  4
<211>  1233
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(1224)
<223>  DNA insert encoding rat CTLA4, rat IgG Fc region and glucagon C19-29 region
<400>  4
gaattcattt aa atg gct tgt ctt gga ctc cag agg tac aaa act cac ctg     51
Met Ala Cys Leu Gly Leu Gln Arg Tyr Lys Thr His Leu
1               5                   10
cag ctg cct tct agg act tgg cct ttt gga gtc ctg ctt tct ctt ctc       99
Gln Leu Pro Ser Arg Thr Trp Pro Phe Gly Val Leu Leu Ser Leu Leu
15                  20                  25
ttc atc cca atc ttc tct gaa gcc ata caa gtg acc caa cct tca gtg      147
Phe Ile Pro Ile Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val
30                  35                  40                  45
gtg ttg gcc agc agc cac ggt gtc gcc agc ttt cca tgt gaa tat gca      195
Val Leu Ala Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ala
50                  55                  60
tct tca cac aac act gat gag gtc cgg gtg acg gtg ctg cgg cag aca      243
Ser Ser His Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr
65                  70                  75
aat gac caa gtg aca gag gtc tgt gcc acg aca ttc aca gtg aag aac      291
Asn Asp Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Val Lys Asn
80                  85                  90
acg ttg ggc ttc cta gat gac ccc ttc tgc agt ggt acc ttt aat gaa      339
Thr Leu Gly Phe Leu Asp Asp Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu
95                  100                 105
agc aga gtg aac ctc acc atc caa gga ctg agg gct gct gac acc gga      387
Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly
110                 115                 120                 125
ctg tac ttc tgc aag gtg gaa ctc atg tac cca ccg cca tac ttt gtg      435
Leu Tyr Phe Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val
130                 135                 140
ggc atg ggc aac ggg acc cag att tat gtc atc gat cca gaa cca tgc      483
Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys
145                 150                 155
cca gat tca gac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc      531
Pro Asp Ser Asp Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys
160                 165                 170
aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc      579
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
175                 180                 185
ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc      627
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
190                 195                 200                 205
acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc      675
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe
210                 215                 220
agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca      723
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro
225                 230                 235
cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc      771
Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
240                 245                 250
atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc      819
Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val
255                 260                 265
acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc      867
Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro
270                 275                 280                 285
gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag      915
Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys
290                 295                 300
gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc      963
Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly
305                 310                 315
ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca     1011
Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro
320                 325                 330
cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt     1059
Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser
335                 340                 345
tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag     1107
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln
350                 355                 360                 365
gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac     1155
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
370                 375                 380
cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt     1203
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe
385                 390                 395
gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                               1233
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
400
<210>  5
<211>  1143
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(1134)
<223>  DNA insert encoding rat IL13, rat IgG Fc region and glucagon C19-29 region
<400>  5
gaattcattt aa atg gca ctc tgg gtg act gca gtc ctg gct ctc gct tgc     51
Met Ala Leu Trp Val Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Cys
1               5                   10
ctt ggt ggt ctt gcc acc cca ggg cca gtg cgg aga tcc aca tct ccc       99
Leu Gly Gly Leu Ala Thr Pro Gly Pro Val Arg Arg Ser Thr Ser Pro
15                  20                  25
cct gtg gcc ctc agg gag ctt atc gag gag ctg agc aac atc aca caa      147
Pro Val Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln
30                  35                  40                  45
gac cag aag act tcc ctg tgc aac agc agc atg gta tgg agc gtg gac      195
Asp Gln Lys Thr Ser Leu Cys Asn Ser Ser Met Val Trp Ser Val Asp
50                  55                  60
ctg aca gct ggc ggg ttc tgt gca gcc ctg gaa tcc ctg acc aac atc      243
Leu Thr Ala Gly Gly Phe Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Thr Asn Ile
65                  70                  75
tcc agt tgc aat gcc atc cac agg acc cag agg ata ttg aat ggc ctc      291
Ser Ser Cys Asn Ala Ile His Arg Thr Gln Arg Ile Leu Asn Gly Leu
80                  85                  90
tgt aac caa aag gcc tcg gat gtg gct tcc agc ccc cca gat acc aaa      339
Cys Asn Gln Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Ser Pro Pro Asp Thr Lys
95                  100                 105
atc gaa gta gcc cag ttt ata tca aaa ctg ctc aat tac tcc aag caa      387
Ile Glu Val Ala Gln Phe Ile Ser Lys Leu Leu Asn Tyr Ser Lys Gln
110                 115                 120                 125
ctt ttc cgc tat ggc cac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt      435
Leu Phe Arg Tyr Gly His Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
130                 135                 140
gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc      483
Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe
145                 150                 155
atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct      531
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
160                 165                 170
aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc      579
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
175                 180                 185
cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act      627
His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
190                 195                 200                 205
cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa      675
Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
210                 215                 220
ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc      723
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
225                 230                 235
aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc      771
Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
240                 245                 250
aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct      819
Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro
255                 260                 265
acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta      867
Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val
270                 275                 280                 285
aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg      915
Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly
290                 295                 300
cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat      963
Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp
305                 310                 315
ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg     1011
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp
320                 325                 330
cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac     1059
Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
335                 340                 345
aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa     1107
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln
350                 355                 360                 365
gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                       1143
Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
370
<210>  6
<211>  825
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(816)
<223>  DNA insert encoding rat signal peptide, rat IgG Fc region and glucagon C19-29
region
<400>  6
gaattcattt aa atg aag tcc tgc ggc ctg ttc cct ctc atg gtg ctc ctt     51
Met Lys Ser Cys Gly Leu Phe Pro Leu Met Val Leu Leu
1               5                   10
gct ctg ggt gta ctg gca ccc tgg agt gtg gaa gga gcg gcc gcc gtg       99
Ala Leu Gly Val Leu Ala Pro Trp Ser Val Glu Gly Ala Ala Ala Val
15                  20                  25
ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca      147
Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser
30                  35                  40                  45
gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc      195
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
50                  55                  60
acc atc act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc      243
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
65                  70                  75
cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa      291
Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
80                  85                  90
gtc cac aca gct cag act cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act      339
Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
95                  100                 105
ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat      387
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
110                 115                 120                 125
ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc      435
Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro
130                 135                 140
atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat      483
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His
145                 150                 155
gta tac acc atg tca cct acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc      531
Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val
160                 165                 170
agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg      579
Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val
175                 180                 185
gag tgg cag atg aac ggg cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca      627
Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro
190                 195                 200                 205
cct acg atg gac aca gat ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat      675
Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn
210                 215                 220
gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg      723
Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
225                 230                 235
ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac      771
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
240                 245                 250
tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc          816
Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
255                 260                 265
tgagaattc                                                            825
<210>  7
<211>  1284
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(1275)
<223>  DNA insert encoding rat IL1 receptor antagonist, rat IgG Fc region and glucagon
C19-29 region
<400>  7
gaattcattt aa atg gaa atc tgc tgg gga ccc tac agt cac cta atc tct     51
Met Glu Ile Cys Trp Gly Pro Tyr Ser His Leu Ile Ser
1               5                   10
ctc ctt ctc atc ctt ctg ttt cat tca gag gca gcc tgc cgc cct tct       99
Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe His Ser Glu Ala Ala Cys Arg Pro Ser
15                  20                  25
ggg aaa aga ccc tgc aag atg caa gcc ttc aga atc tgg gat act aac      147
Gly Lys Arg Pro Cys Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Thr Asn
30                  35                  40                  45
cag aag acc ttt tac ctg aga aac aac cag ctc att gct ggg tac tta      195
Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Leu
50                  55                  60
caa gga cca aat atc aaa cta gaa gaa aag ata gac atg gtg cct att      243
Gln Gly Pro Asn Ile Lys Leu Glu Glu Lys Ile Asp Met Val Pro Ile
65                  70                  75
gac ctt cat agt gtg ttc ttg ggc atc cac ggg ggc aag ctg tgc ctg      291
Asp Leu His Ser Val Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Leu Cys Leu
80                  85                  90
tct tgt gcc aag tct gga gat gat atc aag ctc cag ctg gag gaa gtt      339
Ser Cys Ala Lys Ser Gly Asp Asp Ile Lys Leu Gln Leu Glu Glu Val
95                  100                 105
aac atc act gat ctg agc aag aac aaa gaa gaa gac aag cgc ttt acc      387
Asn Ile Thr Asp Leu Ser Lys Asn Lys Glu Glu Asp Lys Arg Phe Thr
110                 115                 120                 125
ttc atc cgc tct gag aaa ggc ccc acc acc agc ttt gag tca gct gcc      435
Phe Ile Arg Ser Glu Lys Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala
130                 135                 140
tgt cca gga tgg ttc ctc tgc aca aca cta gag gct gac cgt cct gtg      483
Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Thr Leu Glu Ala Asp Arg Pro Val
145                 150                 155
agc ctc acc aac aca ccg gaa gag ccc ctt ata gtc acg aag ttc tac      531
Ser Leu Thr Asn Thr Pro Glu Glu Pro Leu Ile Val Thr Lys Phe Tyr
160                 165                 170
ttc cag gaa gac caa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat      579
Phe Gln Glu Asp Gln Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp
175                 180                 185
tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc      627
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
190                 195                 200                 205
ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag      675
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
210                 215                 220
gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat      723
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His
225                 230                 235
ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga      771
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg
240                 245                 250
cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc      819
Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
255                 260                 265
ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag      867
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys
270                 275                 280                 285
gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa      915
Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
290                 295                 300
ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc      963
Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr
305                 310                 315
aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa     1011
Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys
320                 325                 330
ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag     1059
Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln
335                 340                 345
cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg     1107
Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly
350                 355                 360                 365
agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag     1155
Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln
370                 375                 380
cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac     1203
Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
385                 390                 395
cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat     1251
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp
400                 405                 410
ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                           1284
Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
415                 420
<210>  8
<211>  369
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  CDS
<222>  (13)..(360)
<223>  DNA insert encoding human IL8 and glucagon C19-29 region
<400>  8
gaattcattt aa atg act tcc aag ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc     51
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe
1               5                   10
ctg att tct gca gct ctg tgt gaa ggt gca gtt ttg cca agg agt gct       99
Leu Ile Ser Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala
15                  20                  25
aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac      147
Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His
30                  35                  40                  45
ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca cac tgc      195
Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys
50                  55                  60
gcc aac aca gaa att att gta aag ctt tct gat gga aga gag ctc tgt      243
Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys
65                  70                  75
ctg gac ccc aag gaa aac tgg gtg cag agg gtt gtg gag aag ttt ttg      291
Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu
80                  85                  90
aag agg gct gag aat tca gcg gcc gcc ccg ggt aaa gcc caa gat ttt      339
Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Ala Ala Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe
95                  100                 105
gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc                                369
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
110                 115
<210>  9
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IgG-glu19-29
<400>  9
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg                    45
<210>  10
<211>  49
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IgG-glu19-29
<400>  10
tcaaccactg cacaaaatct tgggctttac ccggagagtg ggagagact                49
<210>  11
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IgG-glu19-29
<400>  11
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg                    45
<210>  12
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IgG-glu19-29
<400>  12
gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc               50
<210>  13
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29
<400>  13
gagaattcat ttaaatgatt ctgctggtgg tcctgatg                            38
<210>  14
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29
<400>  14
gcagcatcgc ggccgcttct tctctgtcat catggagaaa                          40
<210>  15
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29
<400>  15
gagaattcat ttaaatggct tgtcttggac tccagagg                            38
<210>  16
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29
<400>  16
gcagcatcgc ggccgcgtct gaatctgggc atggttctgg                          40
<210>  17
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29
<400>  17
gagaattcat ttaaatggca ctctgggtga ctgcagtc                            38
<210>  18
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29
<400>  18
gcagcatcgc ggccgcgtgg ccatagcgga aaagttgctt                          40
<210>  19
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29
<400>  19
gagaattcat ttaaatggaa atctgctggg gaccctac                            38
<210>  20
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector
pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29
<400>  20
gcagcatcgc ggccgcttgg tcttcctgga agtagaactt                          40
<210>  21
<211>  62
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-glu19-29
<400>  21
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccc cgggtaaagc ccaagatttt gtgcagtggt    60
tg                                                                   62
<210>  22
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-glu19-29
<400>  22
gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc               50
<210>  23
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IL8-glu19-29
<400>  23
gagaattcat ttaaatgact tccaagctgg ccgtggct                            38
<210>  24
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide primer used for constructing a vector pCAGGS-IL8-glu19-29
<400>  24
gcagcatcgc ggccgctgaa ttctcagccc tcttcaaaaa                          40
【図１】
0003974619.tif 000002
【図２】
0003974619.tif 000003
【図３】
0003974619.tif 000004
【図４】
0003974619.tif 000005
【図５】
0003974619.tif 000006
【図６】
0003974619.tif 000007
【図７】
0003974619.tif 000008
【図８】
0003974619.tif 000009
【図９】
0003974619.tif 000010
【図１０】
0003974619.tif 000011
【図１１】
0003974619.tif 000012
【図１２】
0003974619.tif 000013
【図１３】
0003974619.tif 000014
【図１４】
0003974619.tif 000015
【図１５】
0003974619.tif 000016
【図１６】
0003974619.tif 000017
【図１７】
0003974619.tif 000018
【図１８】
0003974619.tif 000019
【図１９】
0003974619.tif 000020
【図２０】
0003974619.tif 000021
【図２１】
0003974619.tif 000022
【図２２】
0003974619.tif 000023
【図２３】
0003974619.tif 000024
【図２４】
0003974619.tif 000025
【図２５】
0003974619.tif 000026