(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２の位置番号７６番以降のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項１記載の蛋白質。
（ａ）配列番号２の位置番号７６番以降のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１又は２記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２５３塩基から１０１１塩基を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項４記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２５３塩基から１０１１塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のプレプロ型カテプシンＢ様システインプロテアーゼ蛋白質。
（ａ）配列番号２からなる蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質のプレプロ体。
【請求項７】
請求項６記載のプレプロ型カテプシンＢ様システインプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１記載のＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項３〜５又は請求項７〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターで形質転換されたカテプシンＢ様システインプロテアーゼを発現することができる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の宿主細胞を用いてカテプシンＢ様蛋白質を発現させ、回収することを含むカテプシンＢ様システインプロテアーゼ蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチド。
（ａ）配列番号２の位置番号１から１５（Ｍｅｔ〜Ａｌａ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチドとして機能できるペプチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２８塩基から７２塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチド。
（ａ）配列番号２の位置番号１６から７５（Ｇｌｕ〜Ｇｌｕ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチドとして機能できるペプチド。
【請求項１６】
請求項１５記載のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の７３塩基から２５２塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素のプロペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項３〜５又は７〜８のいずれか１項記載のＤＮＡ又はその相補鎖の連続する１５塩基以上からなるカテプシンＢ様システインプロテアーゼ遺伝子検出用のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホッコクアカエビより新たに同定された新規プロテアーゼであるカテプシンB様システインプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を加水分解する最も重要な酵素群の一つで、微生物、植物および動物に広く分布しており、多種多様な生物学的プロセスに関与する。また、プロテアーゼは、触媒基に基づいて、アスパラギン酸―、システイン―、セリン―、メタロ―プロテアーゼの大きく４つのファミリーに分類されている。これらの酵素の分子的作用機序は広く研究されている。
【０００３】
プロテアーゼの応用範囲も多岐にわたっており、例えば、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、ビールの清澄剤用、皮革なめし剤用、医薬用などに利用されている。
【０００４】
システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーに属するカテプシンB (EC 3.4.22.1) およびそのホモログは、現在までのところ、数種類の生物から同定され、配列が決定されている。以下にそれを列挙する。
Aedes aegypti (yellow fever mosquito), Ancylostoma caninum (dog hookworm), Bos taurus (cow), Caenorhabditis elegans, Gallus gallus (chicken), Haemonchus contortus, Homo sapiens(human) , Leishmania major, Leishmania mexicana, Mus musculus (house mouse), Rattus norvegicus (Norway rat), Sarcophaga peregrina, Triticum aestivum (bread wheat), Schistosoma mansoni
【０００５】
最もよく研究されているのは、哺乳類のカテプシンBであるが、寄生虫のカテプシンBホモログについても広く研究されている。寄生虫のカテプシンBホモログは、哺乳類のカテプシンBとは異なる性状をいくつかもつことが示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在までのところ、エビ類由来のカテプシンBをコードするcDNAはクローニングされていない。また、低温適応種のカテプシンBに関するデータもほとんどない。したがって、低温適応種であるホッコクアカエビからカテプシンBをコードするcDNAをクローニングできれば、構造と機能の関係などの基礎的な知見を与えるばかりでなく、新規特異性や高い触媒効率など上記に示したカテプシンBとは異なる性状をもつ酵素の開発に寄与すると考えられる。さらに、この発明はバイオテクノロジーにおいて極めて重要なものになる可能性があり、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、医薬用などに応用する際に、非常に有用な酵素を提供できることとなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者等は、低温適応種由来のカテプシンBを自然界に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、偶然にも、日本産ホッコクアカエビの肝膵臓から、カテプシンBをコードする遺伝子を見出すことに成功した。
【０００８】
ホッコクアカエビは、北太平洋、北大西洋に分布し、通常、-1.6〜5℃の低温環境下に生息する低温適応種である。低温適応種の酵素はそれらに対応する哺乳類の酵素より、実質的に高い触媒効率を示すことがいくつか報告されている。例えば、プロテアーゼの中でも特によく研究されているセリンプロテアーゼのトリプシンでは、ウシトリプシンと比較してサケトリプシンの触媒効率は40倍高いことが報告されている。
【０００９】
本発明者等は、遺伝子工学的手法を駆使して種々研究した結果、低温適応種であるホッコクアカエビより、カテプシンBをコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、遺伝子の塩基配列および演繹アミノ酸配列のすべてを明らかにし、本発明を完成させるに至った。この遺伝子にコードされるタンパク質をホッコクアカエビ・カテプシンBと命名した。
【００１０】
ホッコクアカエビ・カテプシンBをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組込み、該発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換することにより、ホッコクアカエビ・カテプシンBを遺伝子組換え法により生産することができる。発現ベクターとしては、周知の種々のベクターを用いることができるが、例えば、宿主を大腸菌とする場合には、一連のpURベクター、pATHベクター、pGEXベクター等が挙げられ、COSやCHO等動物細胞を宿主として用いる場合には、pXM、pDC201等のベクターを用いることができる。
【００１１】
例えば、大腸菌を用いた系では、pET39b (Novagen)、pRSET (Invitrogen)に本発明の遺伝子を挿入し、大腸菌に導入して、発現誘導することにより、発現することができた。SDS-PAGEにより、目的の分子量を持つ蛋白質が発現されたことを確認した。また、酵母を用いた系では、本遺伝子を挿入した酵母発現ベクターpPICZαをエレクトロポレーション法により、宿主酵母P. pastoris KM71H株に導入し、高濃度(2mg/ml)のzeocinを含む培地で増殖できる形質転換体を選別した。ゼラチンザイモグラフィーで活性を確認したところ、目的の酵素に相当するサイズのバンドが検出された。また、カテプシンBの特異的基質であるZ-Arg-Arg-MCA (Bachem)を用いて活性を確認できた。
【００１２】
本発明は、ホッコクアカエビ・カテプシンBのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンB様酵素活性を有する蛋白質を包含する。また、本発明は、このカテプシンB様酵素のプレプロ体をも包含する。また、このカテプシンBとアミノ酸配列の全部又は1部と80％以上同一であるポリペプチドをも包含する。さらに、本発明は、このカテプシンBのシグナルペプチド及びプロペプチドをも包含する。このプロペプチドはカテプシンB様酵素の阻害剤としても有用である。
【００１３】
そして、本発明は、この酵素、そのシグナルペプチド及びプロペプチドをコードするDNAも包含する。
例えば、本発明には上記ホッコクアカエビ・カテプシンB又はそのプレプロ体の相補鎖からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンB様酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAを包含する。
【００１４】
なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、120℃で20分間処理してDNAを結合させたHybond N+ナイロンメンブレン(アマシャムファルマシア)をチャーチリン酸塩緩衝液（0.5M Na2HPO4, 1mM EDTA, 7%SDS）中、65℃で5分間処理し、プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは同緩衝液中、後述の操作で得られたプローブを加え、65℃で17時間行う。ハイブリダイゼーション後のメンブレンは室温で20分間、0.1％SDSを含む2xSSC (standard saline citrate; 1xSSCは150mM NaCl, 15mM sodium citrate, pH7.0)で処理した後、0.1％SDSを含む1xSSC中65℃で20分間の洗浄を2回を行う。さらに0.1％SDSを含む0.1xSSC、65℃で20分間処理し洗浄を完了する。X線フィルムへの感光は-80℃で24時間行う。
【００１５】
プローブの作成では、例えば、PCRにより増幅したcDNA断片を、Takara random primer DNA labeling kit Ver.2 (Takara)を用いて、[α32P]-dCTPによるプローブの標識を行う。その後、遠心フィルター(Millipore)を用いて未反応のアイソトープを除去する。
【００１６】
さらに，本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンBおよびそのプレプロ体のアミノ酸配列に対し1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンB様酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA、またはカテプシンB様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体をコードするDNAも包含される。
【００１７】
また、本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンBおよびそのプレプロ体をコードするDNAに対して、1〜100個、好ましくは1〜10、さらに好ましくは1〜数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加したDNAであって、ホッコクアカエビ・カテプシンBの活性を有する蛋白質をコードするDNAを包含するものである。
【００１８】
また、ホッコクアカエビ・カテプシンBのアミノ酸配列の全部または1部と80％以上同一であるポリペプチドの産生能を有するDNAを包含する。さらに、このカテプシンBまたはプレプロカテプシンBをコードするDNA配列に対し、相同性が80％、好適には、90％、特に好適には、95％以上となるカテプシンBの活性を有する蛋白質またはプレプロカテプシンBとして機能する蛋白質をコードするDNAを包含する。
【００１９】
本発明は、この遺伝子を検出するためのプライマー、例えば、ホッコクアカエビ・カテプシンBをコードする塩基配列中の連続する15塩基以上の配列または当該配列に１または数個の欠失、置換、付加がなされた塩基配列を包含する。
【００２０】
【実施例】
実施例は例示であって、本発明を限定するものではない。
[実施例1]   ホッコクアカエビ・カテプシンBのクローニング。
クローニングはRACE法により、行った。その概要を図1に示した。
【００２１】
＜ホッコクアカエビの解剖＞
石川県にある西海漁協より生きたホッコクアカエビを購入し、解剖して肝膵臓、筋肉、腸を採取した。採取した各組織は、直ちに液体窒素中で凍結し、使用するときまで-80℃に凍結保存した。
【００２２】
＜全RNAの抽出＞
ホッコクアカエビの肝膵臓、筋肉及び腸より、ISOGEN(ニッポンジーン)を用いて、全RNAを抽出した。100mgの組織から、約100μgの全RNAが得られた。
【００２３】
＜プライマーの設計＞
種々の哺乳類から得たカテプシンBのよく保存されている領域FDAREQWとSCGSCWAを参考にして、縮重プライマーP1及びP2を作成した（表1、図1）。
【００２４】
【表１】
0003910909.tif 000002
位置は配列番号１の位置番号を示す。3'-及び5'-AUAPプライマーは3'- 及び 5'-RACE kitに含まれているプライマーで同じ配列である。NはA/C/G/Tを表す。
【００２５】
＜1st strand cDNAの作成＞
肝膵臓より抽出した全RNA1μgから、3'RACE System for rapid amplification of cDNA ends (GIBCO BRL)を用いて、1st strand cDNAを作成した。
【００２６】
＜3'RACE＞
上記の1st strand cDNA約1μgを鋳型にして、20 pmolのプライマー（P1及び3'-AUAP）、20 nmol dNTP、10μlの10 x Ex taq buffer、1Uの Ex taq DNA polymerase(Takara)を含む100μlの反応液でPCRを行った。PCRは、DNAサーマルサイクラー(PCR system 9700、PERKIN ELMER)を用いて、94℃で3分間処理後、94℃で30秒間の熱変性 、60℃で30秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸張反応のサイクルを30回行い、最後の伸張工程は5分間延長し、終了させた。さらに、nestedプライマーP2を用いて、同様の反応条件でPCRを行った。増幅産物は1％アガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイド染色により検出した（図.1A）。次に、増幅産物をpGEM-T Easyベクターに挿入して、サブクローニングし、3'末端側の塩基配列を決定した。
【００２７】
＜5'RACE＞
3'RACE法で決定した配列を基に、表１に示したアンチセンス鎖のプライマーP3、P4及びP5を作成し、5'RACE System for rapid amplification of cDNA ends, version 2 (GIBCO BRL)を用いて、プロトコールに従って5'RACE法を行った（図.1A）。得られたPCR断片を、3'RACE法と同様にサブクローニングし、5'末端側の塩基配列を決定した。
【００２８】
＜全長の単離と配列決定＞
全長のcDNAを増幅するために、5'RACEで得られた塩基配列の5'末端側よりプライマーP6を作成した。上述の1st strand cDNAからプライマーP6と3'-AUAPを用いて、ホッコクアカエビ・カテプシンBをコードする全長のcDNAを単離し（図.1B）、塩基配列を決定した。決定した塩基配列と演繹アミノ酸配列を図２に示した。
【００２９】
全長はポリAテールを含めて1,159塩基からなり、開始コドン(ATG)から終始コドン(TGA)までの987bpの翻訳領域を含んでいた。ポリアデニレーションシグナルAATAAAは3'非翻訳領域の1110-1115塩基目に存在した。
【００３０】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンBの一次構造＞
ホッコクアカエビ・カテプシンB遺伝子は、328アミノ酸残基をコードしており、推定された15残基のシグナルペプチド、60残基のプロペプチド及び253残基の成熟型酵素領域を含んでいた（図2）。演繹アミノ酸配列をBLAST searchによる相同性検索に供した結果、哺乳類のカテプシンBと高い相同性を示した。
【００３１】
図.3はBLASTPで高い相同性を示した哺乳類のカテプシンB及び無脊椎動物のカテプシンB様システインプロテアーゼとともに、ホッコクアカエビ・カテプシンBをアラインメントした図である。プレプロ領域は一次構造よりもむしろ二次構造において保存されているので、それらは一次構造の相同性が低いため、成熟型酵素領域（図.3B）から分離して（図.3A）アラインメントした。
【００３２】
パパインスーパーファミリーに属するシステインプロテアーゼは配列に基づいて、プロ領域にERFNINモチーフを持つカテプシンL様酵素などのグループと、それを持たないカテプシンB様酵素の2つのサブグループに分けられている(Karrer et al., 1993)。ホッコクアカエビ・カテプシンBには、ERFNINモチーフが存在しなかった。また、ほとんどのシステインプロテアーゼにおいて、保存されているGNFDモチーフ(Vernet et al., 1995)は、ホッコクアカエビ・カテプシンBにも存在した（図.3A）。
【００３３】
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンBはヒトカテプシンBと最も高い相同性（53％）を示した。その他の生物のカテプシンBまたはカテプシンB様酵素とのアミノ酸配列の相同性を表2に示す。
【００３４】
【表２】
0003910909.tif 000003
【００３５】
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンBは、一般的にシステインプロテアーゼの特徴を示すアミノ酸残基のすべて、及びカテプシンBに特徴的なアミノ酸残基を含んでいた。すなわち、ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンBは、触媒基であるCys29、His199及びAsn219（番号はヒトの成熟型カテプシンBの位置番号を示す。以下同様）、オキシアニオンホールを形成するGln23及びGly27、基質の主鎖と相互作用する部位の近傍であるGly73、Gly74及びTrp221、N末端付近に存在するPro2を含んでいた（図.3B）。カテプシンBは、パパインスーパーファミリーに属する他のシステインプロテアーゼに比べ、エキソペプチダーゼ活性を示すという点で特徴的である。この特徴を示すために重要な役割を担うoccludingループ（105塩基目から126塩基目）（Musil et al., 1991）は、ホッコクアカエビ・カテプシンBにも存在していた。さらに、このループに存在し、S2'サブサイト（Schechter and Bergerの表記法）を構成する2つの連続するヒスチジン残基(His110及びHis111)は、保存されていた（図.3B）。また、ヒト・カテプシンBにおいて6つのジスルフィド結合を形成する12のシステイン残基は、ホッコクアカエビ・カテプシンBにおいても保存されていた（図.3B）。
【００３６】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンBの系統関係＞
ホッコクアカエビ・カテプシンB、パパイン及びパパインスーパーファミリーに属する典型的なカテプシンについて、プレプロ領域を除いた成熟型酵素の系統樹を作成した。系統樹は近隣結合法により、PHYLIP package, version 3.5c (Felsenstein, 1993) を用いて構築した。系統樹においても、ホッコクアカエビ・カテプシンBは、カテプシンBの系統群に分類された（図.4）。
【００３７】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンBの構造特性＞
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンBの分子量の計算値は28,108であり、これまでに知られているカテプシンB及びそのホモログの分子量の範囲と良く一致した。ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンBは、カテプシンBの中で最も高い負の電荷を持っていた。等電点の理論値は、他のホモログに比べて顕著に低く、pI 4.19であった。また、Kyte and Doolittle (1982)の方法で計算したhydropathicityは、‐0.487と推定された。電荷、等電点及びhydropathicity値の結果から、ホッコクアカエビ・カテプシンBは、低温適応した水圏生物の典型的な構造特性を示した。
【００３８】
＜ノーザンブロット解析＞
Sambrook (1989)らの方法に従って、以下の操作を行った。上述の各組織の全RNA (10μg)を電気泳動後、Hybond-N+膜に転写した後、65℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。3'末端領域のDNA断片369塩基（696-1064塩基目）をPCRにより増幅し、Random Primer DNA Labeling kit Ver.2.0 (Takara)を用いて、〔α-32P〕dCTPにより標識した。ノーザンブロット解析を行った結果、肝膵臓において圧倒的に強いシグナルが検出された（図５）。
【００３９】
＜発現系の構築＞
大腸菌を用いた系では、pET39b（Novagen）に本発明の遺伝子を挿入し、大腸菌BL21（DE3）株に導入して、発現誘導することにより、発現することができた。SDS-PAGEにより、目的の分子量を持つ融合蛋白質が発現されたことを確認した。
【００４０】
酵母を用いた系では、本遺伝子を挿入した酵母発現ベクターpPICZ α (Invitrogen)をエレクトロポレーション法により、宿主酵母 P. Pastoris KM71H 株に導入し、高濃度（2mg/ml）のzeocinを含む培地で増殖できる形質転換体を選別した。単一コロニーの形質転換株（KM71H株）を125mlのGY（glycerol-complex medium,pH<3.0）に接種し、30℃で72時間振盪培養した。次に、この培養液を遠心により集菌して、15mlのMM（minimal methanol medium,pH<3.0）に再懸濁した。メタノール添加を約24時間ごとに繰り返し、26℃で120時間振盪培養した。SDS-PAGEによる解析で、目的の蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された。次に、ゼラチンザイモグラフィーで活性を確認したところ、目的の酵素に相当するサイズのバンドが検出された。また、カテプシンBの特異的基質であるZ-Arg-Arg-MCA（Bachem）を用いて活性を確認できた。
【００４１】
REFERENCES
Felsenstein, J., 1993. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of Genetics, University of Washington, Seattle.
Karrer, K.M., Peiffer, S.L., DiTomas, M.E., 1993. Two distinct gene   subfamilies within the family of cysteine protease genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 3063-3067.
Kyte, J., Doolittle, R.F., 1982. A simple method for displaying the   hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105-132.
Musil, D., Zucic, D., Turk, D., Engh, R.A., Mayr, I., Huber, R., Popovic, T., Turk, V., Towatari, T., Katunuma, N., et al., 1991. The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin B: the structural basis for its specificity. EMBO J. 10, 2321-2330.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular cloning: A   laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring  Harbor laboratory press, New York.
Schechter, I., Berger, A., 1967. On the size of the active site in proteinases. I. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162.
Vernet, T., Berti, P.J., de Montigny, C., Musil, R., Tessier, D.C., Menard, R., Magny, M.C., Storer, A.C., Thomas, D.Y., 1995. Processing of the papain precursor. The ionization state of a conserved amino acid motif within the Pro region participates in the regulation of  intramolecular processing. J. Biol. Chem. 270, 10838-10846.
【００４２】
[実施例２]  ホッコクアカエビ肝膵臓粗抽出液のカテプシンB酵素活性。
＜粗抽出液の調製＞
粗抽出液は、‐80℃で凍結保存した肝膵臓から調製した。凍結した組織を部分解凍し、2倍量の150mM  NaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH 6.5)とともに、ポリトロンホモジナイザーを用いて5分間ホモジナイズした。1/3倍量のテトラクロロメタンをゆっくりと加えて攪拌後、混合液を遠心分離することにより、脱脂を行った。脱脂された上清を粗抽出液として用いた。
【００４３】
＜カテプシンB活性の測定＞
カテプシンBの特異的基質であるZ-Arg-Arg-MCAを用いて粗抽出液の活性を測定した。2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.05% Triton X-100を含む100 mM酢酸緩衝液(pH 5.5)中、基質の終濃度100μMで反応を行った。遊離するAMCの蛍光強度を励起波長370 nm、蛍光波長460 nmで測定した。測定は5回繰り返し行った。標準曲線を作成して遊離するAMCを定量し、25℃で、1分間に1μmolのAMCを遊離させる酵素量を1Uとした。その結果、粗抽出液は、438.1±9.1 mUと高いカテプシンB活性を示した。この活性は、システインプロテアーゼの特異的阻害剤であるE-64により阻害された。また、セリンプロテアーゼの特異的阻害剤であるPMSFはほとんど影響しなかった。以上のことから、ホッコクアカエビ肝膵臓には蛋白質レベルでもカテプシンBが存在することが示唆された。
【００４４】
省略記号：  AMC, 7-amino-4-methylcoumarin; DTT, dithiothreitol; E-64, L-trans-epoxysuccinyl-leucyl-agmatine; MCA, 4-methyl-7-coumarylamide; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride, Z, benzyloxycarbonyl.
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、ホッコクアカエビ由来新規カテプシンBが提供される。本酵素はホッコクアカエビ肝膵臓より、または本酵素をコードする遺伝子を導入し、形質転換した宿主細胞を培養することにより得ることができ、食品分野、化粧品分野、医薬分野など幅広い分野において有用に利用することができる。
【００４６】
【配列表】
0003910909.tif 000004
0003910909.tif 000005
0003910909.tif 000006
0003910909.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】  ホッコクアカエビ・カテプシンBをコードするcDNAのクローニングの概要を示した図である。(A)3'-及び5'-RACEに用いたプライマーの位置の模式図とそれぞれのPCR産物の電気泳動図を示した。(B)シングルPCRによる全長cDNAの単離を模式的に示した図とPCR産物の電気泳動図である。M, DNAサイズマーカー； 3',  3'RACE産物；  5',  5'RACE産物；  F,  全長cDNA。
【図２】  ホッコクアカエビ・カテプシンBのヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列を示した図である。塩基配列の太字は、開始コドン(ATG)および終始コドン(TGA)を示し、下線は推定されるポリアデニレーションシグナル(AATAAA)およびポリAテールを示す。アミノ酸配列の白い長方形とグレーの長方形で囲った領域は、それぞれシグナルペプチドとプロペプチドを示し、白抜きは、活性部位のシステイン、ヒスチジンおよびアスパラギン残基を示す。
【図３】  ホッコクアカエビ・カテプシンBをその他の生物のカテプシンBまたはカテプシンB様システインプロテアーゼとともにアラインメントした図である。省略記号は、Pb, ホッコクアカエビ; CtB,  cathepsin B;  Hs, Homo sapiens; Bt, Bos taurus; Sp, Sarcophaga peregrina; Dm, Drosophila melanogaster; Bm, Bombyx mori; Sm, Schistosoma mansoniを示す。ホッコクアカエビ・カテプシンBと同一のアミノ酸残基及び類似のアミノ酸残基をそれぞれ黒とグレーで示した。(A)プレプロ領域のアラインメントを示した図である。(B)成熟型酵素のアラインメントを示した図である。
なお、配列上の数字は、ヒトカテプシンＢにおける位置番号を示している。
また、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ１’、Ｓ２’はバインディングポケットを構成するアミノ酸残基を表す。アスタリスク＊の付いた番号は、触媒基のシステイン、ヒスチジン、アスパラギンを表す。
黒丸印は、ヒトカテプシンＢにおいてジスルフィド結合を形成するシステイン残基を、四角で囲った部分はoccluding loopを示す。
【図４】  図.3に示したすべてのカテプシンB（太字で示す）と様々なシステインプロテアーゼの成熟型酵素の配列に基づき、近隣結合法により無根系統樹を作成した図である。省略記号は、Ct, cathepsin; Rn, Rattus norvegicus; Lma, Leishmania major; Lme, Leishmania mexicana; PAM, percent accepted mutationを示す。各分岐点の数値はブートストラップ検定の値を示す。
【図５】  ホッコクアカエビの各組織におけるカテプシンBをコードするmRNAのノーザンブロット解析の結果を示した図である。全RNA10μgを、0.9%アガロースゲルで電気泳動後、Hybond-N+ membraneにブロッティングした。レーン1、筋肉；レーン2、肝膵臓；レーン3、腸。RNAサイズマーカーを左側に示した。
【図１】
0003910909.tif 000008
【図２】
0003910909.tif 000009
【図３】
0003910909.tif 000010
【図４】
0003910909.tif 000011
【図５】
0003910909.tif 000012