(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)豚痘ウイルスゲノム中に挿入された第一の外来DNAであって、HindIIIとEcoRI部位の両者を含有するHindIII K断片の3.2kb亜断片に相当する領域内のEcoRI部位に挿入されており、該3.2kb亜断片が配列番号１の核酸配列を含む第一の外来DNA、及び
b)豚痘ウイルスゲノム中に挿入された第二の外来DNAであって、HindIIIＭ断片の3.6kbのHindIII〜BglII亜断片に相当する領域内のAccI部位に挿入されている第二の外来DNA
を共に具備する組換え豚痘ウイルスであって、該第一の外来DNA及び該第二の外来DNAが共に、該ウイルスが導入された宿主細胞中で発現される組換え豚痘ウイルス。
【請求項２】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第一の外来ＤＮＡがポリペプチドをコードする組換え豚痘ウイルス。
【請求項３】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第二の外来DNAがポリペプチドをコードする組換え豚痘ウイルス。
【請求項４】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第一の外来DNAが大腸菌β−ガラクトシダーゼ又は大腸菌β−グルクロニダーゼをコードする組換え豚痘ウイルス。
【請求項５】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第二の外来DNAが大腸菌β−ガラクトシダーゼ又は大腸菌β−グルクロニダーゼをコードする組換え豚痘ウイルス。
【請求項６】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第一の外来DNAが異種性上流プロモーターの調節下にある組換え豚痘ウイルス。
【請求項７】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記第二の外来DNAが異種性上流プロモーターの調節下にある組換え豚痘ウイルス。
【請求項８】
請求項６又は７の組換え豚痘ウイルスであって、前記プロモーターが、
合成痘ウイルスプロモーター、痘合成後期プロモーター１、痘初期プロモーター２、痘合成後期プロモーター２初期プロモーター２、痘合成初期プロモーター２、痘O1Lプロモーター、痘I4Lプロモーター、痘I3Lプロモーター、痘I2Lプロモーター、痘I1Lプロモーター、痘E1ORプロモーター、PRV gX、HSV-1α4、内部リボソームエントリー部位（IRES）、又はHCMV前初期
である組換え豚痘ウイルス。
【請求項９】
請求項２又は３の組換え豚痘ウイルスであって、前記ポリペプチドが、ブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ブタインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザウイルスマトリックス、又はブタインフルエンザウイルス核タンパク質である組換え豚痘ウイルス。
【請求項１０】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記ウイルス（S-SPV-120）が、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子及び大腸菌β−グルクロニダーゼ（uidA）の遺伝子を具備し；及び、
前記lacZ遺伝子が、前記AccI部位に挿入され、前記uidA遺伝子が、前記3.2kb領域内の前記EcoRI部位に挿入されたユニークなNotI部位に挿入されることを特徴とする、組換え豚痘ウイルス。
【請求項１１】
前記第一の外来DNAがサイトカインをコードする請求項１の組換え豚痘ウイルス。
【請求項１２】
前記第二の外来DNAがサイトカインをコードする請求項１の組換え豚痘ウイルス。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、ブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ブタインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザウイルスマトリックス、ブタインフルエンザウイルス核タンパク質、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｂ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｃ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｄ、ブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF2、ブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF3、ブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF4、ブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF5、ブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF6、又はブタ呼吸器及び生殖器ウイルスORF7である請求項２又は３の組換え豚痘ウイルス。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ネコ白血病ウイルス表面タンパク質、ネコ白血病ウイルス膜貫通タンパク質、ネコ白血病ウイルスgag、ネコ白血病ウイルス膜貫通プロテアーゼ、ネコ免疫不全ウイルスgag/プロテアーゼ、ネコ免疫不全ウイルスエンベロープ、ネコ白血病ウイルスgag/プロテアーゼ、ネコ白血病ウイルスエンベロープ、イヌパルボウイルスVP2、又はイヌパルボウイルスVP1/2である請求項２又は３の組換え豚痘ウイルス。
【請求項１５】
請求項２又は３の組換え豚痘ウイルスであって、前記ポリペプチドが、ウシサイトカインインターロイキン-12タンパク質35、ウシサイトカインインターロイキン-12タンパク質40、ウシ呼吸器シンシチウムウイルス糖タンパク質Ｇ、ウシ呼吸器シンシチウムウイルス融合体、ニューキャッスル病融合体、ニューキャッスル病赤血球凝集素、感染性鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ、ネコジステンンパーウイルス融合体、ネコジステンパーウイルス赤血球凝集素、DV HA、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖タンパク質45、ウシウイルス性下痢ウイルス１型タンパク質48、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖タンパク質53、又はウシウイルス性下痢ウイルス２型糖タンパク質53
である組換え豚痘ウイルス。
【請求項１６】
請求項１の組換え豚痘ウイルスであって、前記ウイルス（S-SPV-217）がさらに、第三の外来ＤＮＡ及び第四の外来ＤＮＡを含み、
前記第一の外来ＤＮＡが大腸菌β−ガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子であり、前記第二の外来ＤＮＡが大腸菌β−グルクロニダーゼ（uidA）の遺伝子であり、前記第三の外来ＤＮＡがブタ呼吸器及び生殖器ウイルス（PRRS）ORF5であり、及び前記第四の外来ＤＮＡがPRRS ORF6であり；及び、
前記PRRS ORF5及び前記lacZ遺伝子伝子が、前記AccI部位に挿入されたユニークなNotI部位に挿入され；
前記PRRS PRF6及び前記uidA遺伝子が、前記3.2kb領域内の前記EcoRI部位に挿入されたユニークなNotI部位に挿入され；及び
前記第一の外来ＤＮＡ、前記第二の外来ＤＮＡ、前記第三の外来ＤＮＡ、及び前記第四の外来ＤＮＡ、該ウイルスが導入される宿主細胞中で発見される、組換え豚痘ウイルス。
【請求項１７】
豚痘ウイルスに対して動物を免疫するのに有用なワクチンであって、有効免疫量の請求項１〜１６の何れか１項の組換え豚痘ウイルス及び適切な担体を具備するワクチン。
【請求項１８】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１６の何れか１項の組換え豚痘ウイルス。
【請求項１９】
豚痘ウイルスに対して動物を免疫するための医薬の製造における、請求項１〜１６の何れか１項の組換え豚痘ウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
本願の中には、括弧内のアラビア数字によって、幾つかの出版物が参照される。これら文献の完全な書誌的引用は明細書の最後、即ち、請求の範囲の直前に見られる。これらの文献の開示は、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。
〔発明の背景〕
豚痘ウイルス（ＳＰＶ）はポックスウイルス科（family Poxviridae）に属している。このグループに属するウイルスは、宿主細胞の細胞質中で特徴的に発育する大型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＳＰＶは、スイポックスウイルス（Suipoxvirus）属の唯一のメンバーである。ＳＰＶは、幾つかの特徴によって、他のポリウイルスから区別される。ワクシニア等の他のポックスウイルスは宿主範囲が広いのに比較して、ＳＰＶは種特異性を示す（１８）。組識培養細胞系のＳＰＶ感染は、他のポックスウイルスとは劇的に異なる（２４）。ＳＰＶは、ワクシニア・ウイルスとの抗原交叉反応を示さず、また、ＤＮＡレベルにおいて、オルソ、レポリ、アヴィ、昆虫ポックスグループとの検出可能な総体的相同性を示さないことが立証されている（２４）。従って、従来技術において、他のポックスウイルスに関して知られ且つ記載されていることは、論理的に、豚痘ウイルスには適合しない。
ＳＰＶは温和な病原菌に過ぎず、自己制限的感染（self-limiting infection）を特徴とし、その病巣は皮膚および局部的リンパ節においてのみ検出される。ＳＰＶの感染は非常に制限されているけれども、ＳＰＶから回復したブタは、ＳＰＶの攻撃に対して免疫性があり、能動免疫が発生したことがわかる（１８）。
本発明は、ワクチン抗原およ治療剤のブタに対するデリバー用ベクターとしての、ＳＰＶの使用に関する。この原理は、ＳＰＶの下記特質によって支持される。ＳＰＶは、ブタにおいて唯一穏やかな病原菌であり、種特異的あり、防御的な免疫反応を誘発する。従って、ＳＰＶはウイルス性ベクターデリバリーシステムの優れた候補であり、ベクターのワクチン特性および治療的特質によって与えられる有益性とバランスされなければならない本質的危険が少ない。
本発明の従来技術としては、バクテリア性プラスミド中でのＤＮＡクローン化および分析の技術がまずあげられる。利用される技術は、マニアチス等（1983年）の大部分およびサンブルック等（1989年）に詳述されている。これらの文献には、一般的組替えDNA技法の従来技術の状態が教示されている。
ポックスウイルスの中から５つ（ワクシニア、家禽ポックス、カナリアポックス、鳩およびアライグマポックス）が、本開示の前に、外来ＤＮＡ配列を含む様に加工された。ワクシニアウイルスは、外来遺伝子のベクターとして広範に使用されてきており（２５）、これは合衆国特許4,603,112および4,722,848の主題である。同様に、家禽ポックスが外来遺伝子のベクターとして使用されており、これは幾つかの特許出願、EPA 0 284 416、PCT WO89/03429、およびPCT WO89/12684の主題である。アライグマポックス（１０）およびカナリアポックス（３１）は、狂犬病ウイルス起源の抗原を発現するために使用されてきた。ポックスウイルス中に導入される外来遺伝子挿入物の例として、スイポックスウイルス属由来のものは含まれていない。従って、豚痘ウイルスを遺伝子工学的に加工する方法、即ち、どこに挿入するか、又どのようにブタポックス中の発現物を得るかについては教示されていない。
抗原のデリバリーシステムとして生ウイルスを使用するアイデアは、最初の生ウイルスワクチンまで遡れば、非常に長い歴史を有している。デリバーされる抗原は外来性でなく、ワクチン中において、生ウイルスにより自然に発現されたものであった。外来抗原をデリバーするためにウイルスを使用することについては、組替えワクシニアウイルスの研究によって、現在では容易になってきた。ワクシニアウイルスはベクターであり、他の病原ウイルス起源の種々の抗原は外来抗原であり、該ワクチンは遺伝子工学によって作成される。この概念はこれらの開示によって明らかになったが、何によって最良のウイルスベクター候補が作られるかといった実践的疑問に対する答えは明らかにされなかった。この質問に対する回答においては、ウイルスの病原性の詳細、複製部位、それが誘導する免疫反応の種類、ウイルスが外来抗原を発現する能力、遺伝子工学の適合性、規制当局によって認可される可能性などが、選択すべき全ての因子である。これらの実用上の問題については、先行技術は何等教示していない。
治療剤をデリバーするためのポックスウイルスの使用関する先行技術は、インターロイキン２をデリバリーするワクシニアウイルスの使用である（１２）。この場合、インターロイキン２は、ワクシニアベクターに対する弱毒化効果を示したが、宿主における治療的効果は実証されなかった。
本発明のウイルス性ベクターによってデリバーされる治療剤は、ブタウイルス複製の副産物である生物学的分子でなくてはならない。これによって、治療剤はまず、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白に限られる。アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（１６）、リボザイム（３４）、サプレッサーｔＲＮＡｓ（２）、インタフェロンに誘発される二本鎖ＲＮＡの形態の夫々の化合物クラスに由来する治療剤の例が存在し、また、インシュリン等のホルモンから、インターフェロンおよびインターロイキン等のリンホカイン、天然麻酔剤までの数多くの蛋白質治療剤の例が存在する。これら治療剤の発見およびその構造および作用の解明は、ウイルスベクターデリバリーシステムにおいてそれらを使用する能力を自明にするものではない。
〔発明の概要〕
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムにおける、HindIII部位およびEcoRI部位の両者を含んだHind III K断片の3.2Kb亜断片に対応する領域内のEcoRI部位に挿入され、またウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムにおける、（ａ）HindIII M断片のHindIII〜BglII亜断片に対応する領域内のAccI部位。および（ｂ）HindIII部位およびEcoRI部位の両者を含んだHind III K断片の3.2Kb亜断片に対応する領域内のEcoRI部位に挿入され、またウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、組換え豚痘ウイルスのワクチンおよび免疫感作方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−１Ｂ：
特徴的な長いターミナル・リピート（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（kasza株）の詳細な図が示される。酵素Hind IIIが制限マップが示される（２３）。断片は、サイズが減少する順番に文字で表示される。ターミナル・リピートのサイズは、2.1Kbより大きいが、9.7Kbより小さい。
図２Ａ−２Ａ：
515.85.1 ORFとワクシニアウイルス01L ORFとの間に存在する相同性を示している。図２Ａは二つのマップを示している。図２Ａの第一の腺は、ＳＰＶのHindIII Mの制限マップであり、第二の腺はプラス身の515-85.1におけるDNA挿入物の制限マップである。515-85.1［VV 01L様］ORFもまた該マップに示されている。図２Ｂおよび図２Ｃに示したDNA配列の位置は、図２Ａの太い棒線によってマップの下に示されている。図２Ｂは、夫々のＮ末端におけるVV 01L ORFと515-85.1との間の相同性を示している。図２Ｃは、夫々のＣ末端におけるVV 01L ORFと515-85.1との間の相同性を示している。
図４３−３Ｄ
相同性ベクター520-17.5におけるDNA挿入物が記載されている。図３Ａは、プラスミド520-17.5の中に組み立てられたDNA断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図３Ｂには、断片の間にある連結部ＡおよびＢの各々に位置する配列が示される。図３Ｃには、連結部ＣおよびＤに位置する配列が示される。図３Ｂおよび３Ｃには更に、各断片を生成する制限部位が記載されているのみならず断片を繋ぎ合せるために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。合成リンカー配列には、太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子をコードしている配列の位置、調整要素もまた提示されている。下記二つの取り決めが使用された。括弧（）中の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。
図４Ａ−４Ｄ
相同性ベクター中538-46.16におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図４Ａには、プラスミド538-46.16の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図４Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図４Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が示され、および図４Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。図４Ｂ〜４Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。該合成リンカー配列には太棒で下線が施されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ），ｇ５０（ｇＤ）、糖蛋白６３（ｇ６３），初期プロモーター（ＥＰ１）、後期プロモーター１（ＬＰ１）、後期プロモーター２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（lacZ）、および大腸菌（Ｅ．coli）．
図５Ａ−５Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１３および同ベクター570-91.64におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図５Ａには、プラスミド570-91.64の中に組み立てられたDNA断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図５Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示される。図５Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が、および図５Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。図５Ｂ〜５Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず、該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモーター２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）（配列認識番号４４），ｇＩＩＩ（ｇＣ）、塩基対（ＢＰ）。
図６：
5.6キロ塩基対Hind III M豚痘ウイルスゲノムＤＮＡ断片を示すマップ。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、各オープンリーディングフレームにおけるアミノ酸コードの数と共に示される。豚痘ウイルスのＯＲＦｓは、ワクシニアウイルスＯＲＦｓと著しい配列の同一性を示し、ワクシニアウイルスの命名法（５６および５８）によってラベルされている。Ｉ４ＬＯＲＦ（配列認識番号１９６）は、リボヌクレオチド・リダクターゼの大型ユニット（５７）とアミノ酸配列相同性を示し、また０１ＬＯＲＦ（配列認識番号１９３）は、ある真核生物の翻訳調節蛋白（１３）に特徴的なロイシン・ジッパー・モチーフに対するアミノ酸配列相同性を示す。Ｉ４ＬＯＲＦ中のＢｇｌII部位および０１ＬＯＲＦ中のＡｃｃＩ部位は、ブタポックスゲノムの非必須領域中への外来ＤＮＡの挿入部位である。相同性ベクター738-94.4は、ヌクレオチド１６７９から２４５２（配列番号１８９）のＳＰＶ ＤＮＡの欠損を含む。底部の黒棒は、ＤＮＡ配列が既知である領域を示し、配列番号１８９および１９５を示す。制限部位ＡｃｃＩ，ＢｇｌII，およびHind IIIの位置が示されている。Ｉ３ＬＯＲＦ（配列認識番号１９０）、Ｉ２ＬＯＲＦ（配列認識番号１９１）、Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（配列認識番号１９４）が示される。配列認識番号２２１は、Hind III M断片の完全な５７８５塩基対配列を含んでいる。ＳＰＶHindIII M断片内のオープンリーディングフレームは、部分的なＩ４ＬＯＲＦ（４４５ＡＡ；ヌクレオチド２から１３３６）；Ｉ３ＬＯＲＦ（２７５ＡＡ；ヌクレオチド１３８７から２２１１）；Ｉ２ＬＯＲＦ（７５ＡＡ；ヌクレオチド２２１５から２４３９）；Ｉ１ＬＯＲＦ（３１３ＡＡ；ヌクレオチド２４４３から３３８１）；０１ＬＯＲＦ（６７７ＡＡ；ヌクレオチド３５２０から５５５０）；部分的Ｅ１ＯＲ ＯＲＦ（６４ＡＡ；ヌクレオチド５７８７−５５９６）。
図７Ａ−７Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０１５および相同性ベクター727-54.60におけるＤＮＡ挿入物が詳細に記載されている。図７Ａには、プラスミド727-54.60の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向を示す図および各断片の起源を示す表が含まれている。図７Ｂには、断片間の連結部ＡおよびＢに位置する配列が示され、図７Ｃには、連結部Ｃに位置する配列が、および図７Ｄには、連結部ＤおよびＥに位置する配列が示される。図７Ｂ〜７Ｄには、各断片を生成するために使用される制限部位のみならず、該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖蛋白Ｂ（ｇＢ）、塩基対（ＢＰ）。
図８Ａ−８Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２および相同性ベクター751-07A1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図には751-07A1の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。図８Ａ〜８Ｄには、断片間の連結部Ａ（配列認識番号１９７）、（配列認識番号１９８）Ｃ（配列認識番号１９９）、Ｄ（配列認識番号２００）およびＥ（配列認識番号２０１）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
図９Ａ−９Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４３よび相同性ベクター751-56.A1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド751-56.A1の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図９Ａ〜９Ｄには、断片間の連結部Ａ（配列認識番号202）、（配列認識番号203）Ｃ（配列認識番号204）、Ｄ（配列認識番号205）およびＥ（配列認識番号206）に位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず幾つかの遺伝子コード領域を結合するために使用される合成リンカー配列、および調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１），ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰＥ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
図１０Ａ−１０Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０３７および相同性ベクター752-22.1におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド752-22.1に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示されている。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図２８Ａから２８Ｄには、断片間の連結部Ａ（配列認識番号207）、（配列認識番号208）Ｃ（配列認識番号209）、およびＤ（配列認識番号210）位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）。
図１１Ａ−１１Ｂ：
図１１Ａ：ＳＰＶ ＨｉｎｄIII N断片およびＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＭ断片の一部における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム。豚痘ウイルスHind III NおよびHind III MゲノムＤＮＡの非必須部位への外来遺伝子の挿入物には、EcoR V部位（S-SPV-060）、SnaBI部位（S-SPV-061）、Hind III N（S-SPV-062）におけるBgl II部位、Hind III M（S-SPV−047）におけるBgl II部位がある。Ｉ７ＬＯＲＦ（配列認識番号２３０）およびＩ４ＬＯＲＦ（配列認識番号２３１）への外来遺伝子の挿入物によって、全オープンリーデングフレームは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適である事が示唆される。外来遺伝子のその他の挿入部位には、二つのHind III部位およびAvaIおよびBamHIがあるがこれに限定されない。
図１１Ｂ：ＳＰＶ ＨｉｎｄIIIＫゲノム断片における制限エンドヌークレアーゼマップおよびオープンリーデイングフレーム。豚痘ウイルスHind IIIＫゲノムＤＮＡの非必須部位に挿入された外来遺伝子の挿入物には、EcoRI部位（S-SPV-059）があるがこれには限定されない。ＳＰＶHind IIIＫ断片の3.2kB領域内では、３つのオープンリーデイングフレームが確認されている。Ｂ１８ＲＯＲＦ（配列認識番号２２８）への外来遺伝子の挿入によって、全オープンリーデングフレームは、豚痘ウイルスの複製に非必須であること、および外来遺伝子の挿入に最適である事が示唆される。また、Ｂ４ＲＯＲＦ（配列認識番号２２９）が外来遺伝子の挿入部位として確認された。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ１８ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ１８ＲＯＲＦは、ラビット繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）の７７．2kd蛋白よりも相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲＦは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ４ＲＯＲＦと相同性である。ＳＰＶＢ４ＲＯＲＦは、ラビット繊維腫ウイルス（ＲＦＶ）のＴ５蛋白とより相同性である。確認されたオープンリーデイングフレームは、ＳＰＶＨｉｎｄIII K断片の約３２００塩基対の内にある。ＳＰＶHind III K断片の残りの約３５００塩基対は、先にシークエンスされている（Ｒ．Ｆ．Massung et al．Virology 197，511-528（1993））。
図１２Ａ−１２Ｃ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４７および相同性ベクター779-94.31におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド779-94.31の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図１２Ａ〜１２Ｃには、断片間の連結部Ａ（Ｓ：）、、Ｃ、ＤおよびＥに位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
図１３Ａ−１３Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５２および相同性ベクター789-41.7におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.7の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図１３Ａ−１３Ｄには、断片間の連結部Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
図１４Ａ−１４Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５３および相同性ベクター789-41.27におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.27の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図１４Ａ−１４Ｄには、断片間の連結部Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ，ＦおよびＧに位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
図１５Ａ−１５Ｄ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５４および相同性ベクター789-41.47におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.47の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図１５Ａ−１５Ｄには、断片間の連結部Ａ、Ｂ、Ｃ（配列認識番号：）、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
図１６Ａ−１６Ｅ：
豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５５および相同性ベクター789-41.73におけるＤＮＡ挿入物の詳細な記載。図にはプラスミド789-41.73の中に組み立てられたＤＮＡ断片の配向が示される。各断片の起源は表に示されている。断片間の連結部の夫々に位置する配列も示されている。図１６Ａ−１６Ｅは、断片間の連結部Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨに位置する配列、および連結部に位置する配列が示される。各断片を生成するために使用される制限部位のみならず該断片を結合するために使用される合成リンカー配列が、各連結部について記載されている。幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置もまた与えられている。下記二つの取り決めが使用される。（）内の数字は、アミノ酸を示し、角括弧［］中の制限部位は、構築の最中に破壊された部位の残片を示している。下記の略字が使用されている：豚痘ウイルス（ＳＰＶ）、擬狂犬病（ＰＲＶ），大腸菌（Ｅ．coli)、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、ポックス合成後期プロモータ  １（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムにおける、HindIII部位およびEcoRI部位の両者を含んだHind III K断片の3.2Kb亜断片に対応する領域内のEcoRI部位に挿入され、またウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡは、豚痘ウイルスゲノムにおける、（ａ）HindIII M断片のHindIII〜BglII亜断片に対応する領域内のAccI部位。および（ｂ）HindIII部位およびEcoRI部位の両者を含んだHind III K断片の3.2Kb亜断片に対応する領域内のEcoRI部位に挿入され、またウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
他の態様において、オープンリーディングフレームは、B18R遺伝子をコードする。他の態様において、オープンリーディングフレームは、B4R遺伝子をコードする。他の態様において、オープンリーディングフレームは、77.2kD蛋白遺伝子のブタポックス相同体をコードする。他の態様において、オープンリーディングフレームは、T5蛋白遺伝子のブタポックス相同体をコードする。
他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの略２ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムの略2.0ｋＢのHindIII〜BamHI亜断片内におけるSnaBI、制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。
他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIII N断片における略1.2ＫｂのBamHI〜HindIII亜断片内に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡのHindIII N断片の略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスゲノムの前記略1.2ｋＢのBamHI〜HindIII亜断片内のBglII制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される。
他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡの前記HindIIIＭ断片における略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内に挿入された外来遺伝子を含んでいる。他の態様において、前記外来配列は、略3.6ｋＢの大きい方のHindIII〜BglII亜断片内のオープンリーディングフレーム中に挿入される。他の態様において、このオープンリーディングフレームは、Ｉ４Ｌ遺伝子をコードする。
一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、前記HindIIIＭ断片の非必須のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に挿入される。ＯＲＦの例には、Ｉ４Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｏ１ＬおよびＥ１０Ｌが含まれるが、これらに限定されるものではない。
他の態様において、前記組み換え豚痘ウイルスは、更に、豚痘ウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する。一つの態様において、この外来ＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスチミジンキナーゼをコードしているオープンリーディングフレーム内に位置したＮｄｅＩ部位中に挿入される。
本発明の目的において、「複製できる組み換え豚痘ウイルス」とは、当業者に周知の組み換え法、例えば、＜材料および方法＞の項の組み換えＳＰＶを作成するための相同組み換え法に記載した方法によって作成され、組み換え豚痘ウイルスの複製に不可欠の遺伝子物質を欠失されていない生の豚痘ウイルスである。
本発明の目的において、「豚痘ウイルスの複製に不可欠でない挿入部位」とは、ＤＮＡの配列がウイルスの複製のために必要とされない、豚痘ウイルスゲノムにおける特定の断片に対応する領域、例えば、複合タンパク結合配列、逆転写酵素または必須糖タンパクをコードする配列、パッケージングに必要なＤＮＡ配列等である。
本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが付着し、そこで外来ＲＮＡの複製が開始されるＤＮＡ分子上の特定のＤＮＡ配列である。
本発明の目的において、「オープンリーディングフレーム」とは、ＲＮＡに転写されてアミノ酸配列に翻訳されるコドンを含み、且つ終始コドンを含まないＤＮＡ切片である。
本発明は更に、ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列または外来ＲＮＡを提供する。好ましくは、このポリペプチドは動物において抗原性である。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、10個を越えるアミノ酸がペプチド結合によって結合された線形ポリマーであり、動物を刺激して抗体を産生させる。
Ｓ−ＳＰＶ−００３豚痘ウイルスは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335の下に、アメリカ合衆国郵便番号20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション特許カルチャー寄託施設に寄託されている。
本発明の目的において、「検出マーカーであるポリペプチド」には、ポリペプチドの形の二量体、三量体および四量体が含まれる。大腸菌βガラクトシダーゼは、四つのポリペプチドまた亜はモノマーサブユニットで構成される四両体である。
ポリペプチドをコードする外来DNAには以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：ネコ白血病表面蛋白、ネコ白血病膜貫通蛋白、ネコ白血病ウイルスｇａｇ、ネコ白血病ウイルス膜貫通プロテアーゼ、ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ／プロテアーゼ、ネコ免疫不全エンベロープ、ネコ白血病ウイルスｇａｇ／プロテアーゼ、ネコ白血病ウイルスエンベロープ、イヌパルボウイルスＶＰ２、イヌパルボウイルスＶＰ１／２、ウシサイトカインインターロイキン１２蛋白３５、ウシサイトカインインターロイキン１２蛋白４０、ウシ呼吸器シンシチアウイルス糖蛋白Ｇ、ニューキャッスル病融合、感染性鼻気管炎ウイルス糖蛋白Ｄ、イヌジステンパーウイルス融合、イヌジステンパーウイルス赤血球凝集素、ＤＶ  ＨＡ、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白４５、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白４８、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白５３、ウシウイルス性下痢ウイルス２型糖蛋白５３。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、ブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ブタインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザウイルスマトリックス、ブタインフルエンザウイルス核蛋白、アフリカブタ熱病ウイルスまたはマイコプラズマヒオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）である組換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、サイトカインはニワトリマクロファージ移動阻害因子（ｃＭＩＦ）、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＭ）である組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０６８およびＳ−ＳＰＶ−１０５と命名されている。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＦＲ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＦＲ７、仮性狂犬病ｇＢ、ｇＤ、ｇＩである組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７９、Ｓ−ＳＰＶ−０９０、Ｓ−ＳＰＶ−０８４、Ｓ−ＳＰＶ−０９１、Ｓ−ＳＰＶ−０９２、Ｓ−ＳＰＶ−０９３、Ｓ−ＳＰＶ−０９４、およびＳ−ＳＰＶ−０９５と命名されている。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、感染性鼻気管炎ウイルス糖蛋白Ｂ、糖蛋白Ｄおよび糖蛋白Ｉ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス付着蛋白（BRSV G）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合蛋白（BRSV F）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシド蛋白（BRSV N）である組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−１０９、Ｓ−ＳＰＶ−１１０、Ｓ−ＳＰＶ−１１１、Ｓ−ＳＰＶ−１１３、Ｓ−ＳＰＶ−１１５、Ｓ−ＳＰＶ−１１９、Ｓ−ＳＰＶ−１１２と命名されている。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）糖蛋白４８または糖蛋白５３である組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−０９９と命名されている。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ、ネコ白血病ウイルスｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープである組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−１０６、Ｓ−ＳＰＶ−０８９、Ｓ−ＳＰＶ−１００、Ｓ−ＳＰＶ−１０７、Ｓ−ＳＰＶ−１０８と命名されている。
本発明は更に、外来DNAがコードする抗原性ポリペプチドが、イヌパルボウイルスＶＰ２およびＶＰ１／２である組換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−１１４、Ｓ−ＳＰＶ−１１６、Ｓ−ＳＰＶ−１１７、Ｓ−ＳＰＶ−１１８と命名されている。
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、１以上の外来DNAが、豚痘ウイルスゲノムDNAの各HindIII K断片内および豚痘ウイルスゲノムDNAのHind III M断片内に挿入されており、且つウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−１２７、Ｓ−ＳＰＶ−１２８、Ｓ−ＳＰＶ−１３１、およびＳ−ＳＰＶ−１３２と命名されている。
本発明は、豚痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組替え豚痘ウイルスであって、融合蛋白をコードする１以上の外来DNAが、豚痘ウイルスゲノムDNAの各HindIII K断片内および豚痘ウイルスゲノムDNAのHindIII M断片内に挿入されており、且つウイルスが導入される宿主細胞中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、Ｓ−ＳＰＶ−１３０と命名されている。
本発明は更に、複製可能な組み換え豚痘ウイルスであって、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＥ、伝播性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、伝播性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サープリナ・ヒドジセンテリエ（Serpulina hydodysenteriae）防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼである抗原性ポリペプチド、またはこれらに由来する抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ組み換え豚痘ウイルスを提供する。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼである。
本発明は更に、複製可能な組換え豚痘ウイルスであって、サープリナ・ヒオジセンテリエ（Serpulina hyodysenteriae）、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱病ウイルス、もしくはマイコプラズマヒオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）、またはこれらに由来する抗原性ポリペプチドヲコードする外来DNAを含んだ組換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素-ノイラミニダーゼをコードするＲＮＡをコードする外来ＤＮＡを含み、更に検出マーカーであるポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む、複製可能な組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス糖タンパクＥおよび糖タンパクＧである。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性咽頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
上記組み換え豚痘ウイルスの一つの態様において、前記外来ＤＮＡ配列はサイトカインである。他の態様において、該サイトカインはニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイトカインには下記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：即ち、形質転換増殖因子ベータ、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体拮抗剤、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンジオジェニン、ケモカイネス（chemokines）、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、幹細胞因子（または肥満細胞増殖因子またはｃ−ｋｉｔリガンドとして知られている）、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ（oncostatin M）、プライオトロピン（pleiotrophin）、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体である。これらのサイトカイン類はヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタまたは鳥類に由来するものである。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
サイトカイン類を発現する組み換えＳＰＶは、単独で、もしくはサイトカイン類または疾病を起こす微生物の抗原遺伝子を含むワクチンと組み合わせて、免疫応答性を高めるために用いられる。
ヒトヘルペスウイルスから誘導されるヒト病原体の抗原性ポリペプチドには、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス（Hantaan virus）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器シンシチアウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マラリア（Plasmodium falciparum）、百日咳菌、ジフテリア菌、発疹チフスリケッチア、ボレリア・ベルフドルフェリ（Borrelia berfdorferi）、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原が含まれるが、こられに限定されるものではない。
本発明の一態様において、組み換え豚痘ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパクをコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主子において免疫を刺激することができるサイトカインをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウィルスを提供する。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスから誘導することができる。一態様において、この抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザ・ノイラミニダーゼまたは赤血球凝集素である。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー９２ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＢ、ウマ・ヘルペスイウルス１型糖タンパクＤ、ストレプトコッカス・エクイ（Streptocoddus equi）、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ウマ・ライノウイルス、およびウマ・ロタウイルスである。
更に、本発明は抗原性ポリペプチドを提供する。該抗原性ポリペプチドには豚コレラウイルスｇＥ１、豚コレラウイルスｇＥ２、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク、仮性狂犬病ウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、並びにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７からなる群から誘導される組み換え豚痘ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスから誘導された抗原性ポリペプチドをコードし、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
例えば、上記の抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウマ病原体、ウマインフルエンザウイルス、齲歯呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパクおよびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼから誘導することができる。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク４８または糖タンパク５３をコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイルスから誘導される抗原性ポリペプチドをコードし、また前記外来ＤＮＡ配列は、当該組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主中で発現することができる組み換え豚痘ウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウイルスポリタンパクおよびＶＰ２である。
本発明は更に、豚痘ウイルスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組み換え豚痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が抗原性ポリペプチドをコードする組み換え豚痘ウイルスを提供する。該抗原性ポリペプチドには下記のものが含まれるが、これらに限定されることはない：即ち、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  Ｄ、ＮＤＶ  ＨＮ、ＮＤＶ  Ｆ、ＩＬＴ  ｇＢ、ＩＬＴ  ｇＩ、ＩＬＴ  ｇＤ、ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＢＤＶ  ＶＰ３、ＩＢＤＶ  ＶＰ４、ＩＢＤＶポリタンパク、ＩＢＶスパイク、ＩＢＶマトリックス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類パラミクソウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、サルモネラｓｐｐ．、大腸菌、パスツレラｓｐｐ．、百日咳菌ｓｐｐ．（Bordetella spp.）、エイメリアｓｐｐ．（Eimeria spp.）、ヒストモナスｓｓｐ．、トリコモナスｓｓｐ．、家禽線虫、条虫、吸虫、鳥類ダニ／シラミ、鳥類原生動物である。
本発明は更に、前記挿入された外来ＤＮＡ配列がプロモータの制御下にある組み換え豚痘ウイルスを提供する。一態様において、該プロモータは豚痘ウイルスプロモータである。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、内因性の上流豚痘ウイルスプロモータの制御下にある。他の態様において、前記外来ＤＮＡ配列は、異種上流プロモータの制御下にある。
本発明の目的において、前記プロモータには、合成豚痘ウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２、初期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１Ｌプロモータ、ポックスＥ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初期、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  ｇＤ、ＩＬＴ  ｇＢ、ＢＨＶ−1.1ＶＰ８、ＩＬＴ  ｇＤ、および内部リボゾーム侵入部位プロモータが含まれるが、これらに限定されるものではない。別のプロモータは、当業者に周知の方法、例えば、材料と方法の項における「合成ポックスウィルスプロモーターの構築のための基本的手法」に記載した方法によって作成される。
本発明は、豚痘ウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡを挿入することにより組み換え豚痘ウイルスを製造するための、相同性ベクターを提供する。この相同性ベクターは、当該組み換え豚痘ウイルスが導入される動物には本来的に存在しない実質的に二本鎖の外来ＤＮ（ＲＮＡ）配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子を具備し、該外来二本鎖ＤＮＡの一端には、豚痘ウイルスの複製に不可欠でないゲノムＤＮＡの一方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有し、前記外来ＤＮＡの他端には、前記豚痘ウイルスゲノムの他方の側に位置する前記ウイルスゲノムに対して相同性である二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡを有する。好ましくは、前記ＲＮＡはポリペプチドをコードする。
本発明の他の態様において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、HindIIIＭ断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。他の対応において、上記相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、略２ｋＢのHindIII〜BglII亜断片内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましい態様において、前記二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、このHindIII〜BglII亜断片の中に位置したBglII部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
他の態様において、この二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜BglII亜断片に含まれたオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、大きい方のHindIII〜BglII亜断片に位置したAccI制限エンドヌクレアーゼ部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
一つの態様において、前記ポリペプチドは検出マーカーである。好ましくは、検出マーカであるポリペプチドは、大腸菌βガラクトシダーゼである。
一つの態様において、ポリペプチドをコードする外来DNAには下記のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：ネコ白血病表面蛋白、ネコ白血病膜貫通蛋白、ネコ白血病ウイルスｇａｇ、ネコ白血病ウイルス膜貫通プロテアーゼ、ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ／プロテアーゼ、ネコ免疫不全ウイルスエンベロープ、ネコ白血病ウイルスｇａｇ／プロテアーゼ、ネコ白血病ウイルスエンベロープ、イヌパルボウイルスＶＰ２、イヌパルボウイルスＶＰ１／２、ウシサイトカインインターロイキン１２蛋白３５、ウシサイトカインインターロイキン１２蛋白４０、ウシ呼吸器シンシチアウイルス糖蛋白Ｇ、ニューキャッスル病融合、感染性鼻気管炎ウイルス糖蛋白Ｄ、イヌジステンパーウイルス融合、イヌジステンパーウイルス赤血球凝集素、ＤＶ  ＨＡ、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白４５、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白４８、ウシウイルス性下痢ウイルス１型糖蛋白５３、ウシウイルス性下痢ウイルス２型糖蛋白５３。
他のポリペプチドには次のものが含まれる：仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、伝播性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク１９５、伝播性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、豚ロタウイルス糖タンパク３８、豚パルボウイルスキャプシドタンパク、サープリナ・ヒドジセンテリエ（Serpulina hydodysenteriae）防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５３およびｇ４８、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、豚ｆｌｕ赤血球凝集素、もしくは豚ｆｌｕノイラミニダーゼ。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク５０（ｇＤ）である。好ましくは、該抗原性ポリペプチドは、セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae）、口蹄疫ウイルス、豚コレラウイルスｇＥ１およびｇＥ２、豚インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、またはマイコプラズマ・ハイポニューモニエ、豚インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼおよびマトリックスおよび核タンパク、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７、およびＢ型肝炎ウイルス核タンパク、またはこれらから誘導されたものであるブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ブタインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザウイルスマトリックス、ブタインフルエンザウイルス核蛋白、PRRSウイルスＯＲＦ７、およびＢ型肝炎ウイルスコア蛋白。
一つの態様において、前記ポリペプチドは動物において抗原性である。
本発明の一つの態様において、相同性ベクター中の二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。
例えば、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒト・ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスからなる群から誘導される。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、ボルデテリア・ペルトゥスシス（Bordetelia pertussis）および悪性腫瘍からなる群から選択される、マラリアまたは悪性腫瘍に関連していてもよい。
本発明の一態様において、前記相同性ベクターにおける二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ヒト免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする。一つの態様において、このサイトカインは、ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である。例えば、該サイトカインはインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターフェロン、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であることができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一態様において、相同性ベクターにおける前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体から誘導された抗原性ポリペプチドをコードする。
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤからなる群から選択される組み換え豚痘ウイルスである。
本発明の一態様において、前記相同性ベクターの二本鎖外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器シンシチアウイルスまたはウシ・パラインフルエンザウイルスをコードする。
例えば、該抗原性ポリペプチドは、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器シンシチアウイルス核キャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼから誘導される。
本発明の一態様において、前記相同性ベクターの前記二本鎖外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢症ウイルスから誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢症ウイルスポリペプチドおよび感染性嚢症ウイルスＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ４である。
本発明の目的において、「相同性ベクター」とは、豚痘ウイルスゲノムの特定の部位に外来ＤＮＡを挿入するために構築されたプラスミドである。
本発明の一つの態様において、上記で述べた相同性ベクターの二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、該二本鎖豚痘ウイルスＤＮＡは、豚痘チミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム中に位置するNdeI制限エンドヌクレアーゼ内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
本発明は更に、上記の相同性ベクターであって、その外来ＤＮＡ配列が、前記外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある相同性ベクターを提供する。該プロモータは、内因性豚痘ウイルスプロモータまたは外因性プロモータであることができる。プロモータには、合成ポックスウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックスＩ４Ｌプロモータ、ポックスＩ３Ｌプロモータ、ポックスＩ２Ｌプロモータ、ポックスＩ１ＬプロモータおよびポックスＥ１０Ｒプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸ、ＨＳＶ−１・アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初期、ＢＨＶ−１．１  ＶＰ８、感染性咽頭気管炎ウイルス糖タンパクＢ、感染性咽頭気管炎ウイルスｇＤ、マレック病ウイルス糖タンパクＡ、マレック病ウイルス糖タンパクＢ、マレック病ウイルス糖タンパクＤが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、Ｓ−ＳＰＶ−０４４、Ｓ−ＳＰＶ−０４６、Ｓ−ＳＰＶ−０４７、Ｓ−ＳＰＶ−０４８、Ｓ−ＳＰＶ−０５２、Ｓ−ＳＰＶ−０５１、Ｓ−ＳＰＶ−０５３、Ｓ−ＳＰＶ−０５４、Ｓ−ＳＰＶ−０５５、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、Ｓ−ＳＰＶ−０５８、Ｓ−ＳＰＶ−０５９、Ｓ−ＳＰＶ−０６０、Ｓ−ＳＰＶ−０６１、Ｓ−ＳＰＶ−０６２と命名された組み換え豚痘ウイルスを提供する。
本発明は更に、有効免疫量の本発明の組み換え豚痘ウイルスと、適切なキャリアとを含有するワクチンを提供する。
豚痘ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、タンパク、糖などが含まれる。このような適切なキャリアの一例は、安定化された加水分解タンパク、ラクトース等のような１以上の安定家財を含有する、生理学的にバランスされた培養培地である。
本発明の目的において、「有効免疫量」の本発明の組み換え豚痘ウイルスは、１０3〜１０9ＰＦＵ／投与量の範囲である。
本発明はまた、動物を免疫化する方法であって、該動物がヒト、豚、牛、ウマヤギ（caprine）またはヒツジ（ovine）である方法を提供する。本発明の目的において、この方法には、疾患を生じるウイルス（類）に対して動物を免疫化することが含まれ、これらウイルス（類）には、仮性狂犬病ういるす、伝播性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルス、豚ロタウイルス、豚パルボウイルス、サープリナ・ヒドジセンテリエ（Serpulina hydodysenteriae）、ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、豚インフルエンザウイルス、ＰＲＲＳ、ウシ呼吸器シンシチアウイルス、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型、口蹄病ウイルス、豚コレラウイルス、アフリカ豚熱ウイルスまたはマイコプラズマ・ハイポニューモニエが含まれる。本発明の目的において、この免疫化方法にはまた、ヒト病原体、ウシ病原体、ウマ病原体、鳥類病原体に対して動物を免疫化することが含まれる。
この方法には、動物に対して、有効免疫投与量の本発明のワクチンを投与することが含まれる。このワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内注射、皮下注射、副空内注射または静脈内注射によって投与すればよい。或いは、このワクチンは、鼻腔内または経口的に投与してもよい。
本発明はまた、豚が本発明のワクチン、特に組み換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−００８（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339）を含有する実施例で予防接種されているかどうか、または天然に存在する野生型の仮性狂犬病ウイルスに感染しているかどうかを決定するために、豚を試験する方法を提供する。この方法は、試験すべき豚から適切な体液のサンプルを取得することと、該サンプル中において仮性狂犬病ウイルスに対する抗体の存在を検出する（このような抗体が存在しないことによって、前記豚が予防接種も感染もされていないことが示される）ことと、仮性狂犬病ウイルスに対する抗体が存在する豚について、前記サンプル中において、天然に存在する仮性狂犬病ウイルスに感染した豚の体液中には通常存在するが、予防接種された豚には存在しない仮性狂犬病ウイルス抗原に対する抗体が存在していないことを検出することにより、該豚が予防接種されていることまたは感染していないことが示されることとを具備する。
本発明は、外来ＤＮＡ配列または遺伝子と共に挿入されると、診断試験として用い得る組み換えＳＰＶを提供する。一つの態様においては、ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子類、並びにＤ．イミティス（immitis）ｐ３９および２２ｋｄが、ＦＩＶによって起こされたネコ免疫不全を検出し、またＤ．イミティスによって起こされたイヌ糸状虫を検出するための診断試験に用いられる。
本発明はまた、複製できる組み換え豚痘ウイルスに感染した宿主細胞を提供する。一つの実施例において、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましくは、この哺乳類細胞はベロ細胞（Vero cell）である。好ましくは、前記哺乳類細胞はＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞またはＥＭＳＫ細胞である。
本発明の目的において、「宿主細胞」とは、ベクターおよびその挿入物を増殖させるために用いられる細胞である。害細胞の感染は、当業者に周知の方法、例えば、＜材料と方法＞の項における「感染−トランスフェクション法」に記載した方法によって達成された。
上記の組み換え豚痘ウイルスを構築し、選択し、精製するための方法は、下記の＜材料と方法＞の項で詳述する。
〔実験の詳細〕
＜材料と方法＞
豚痘ウィルスストック試料の調製
豚痘ウィルス（SPV）試料はイスコーブの改良ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）（IMDM）と2mMのグルタミン，100units/mlのペニシリン，100units/mlのストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地の1:1混合溶液中（これらの構成成分はシグマ社もしくは相当の供給元から得られ，そしてこれ以後EMSK陰性培地（negative medium）と呼ぶ）でブタ胎児腎臓（EMSK）細胞，ESK-4細胞，PK-15細胞もしくはベロ細胞を，0.01PFU/細胞の感染多重度で感染させることにより調製された。感染に先立ち，細胞単層は微量のウシ胎児血清を除去するためEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された。その後，最初の接種原（10cmのプレートに対しては0.5ml；T175cmのフラスコに対しては10ml）に含まれるSPVは，30分間ごとに繰り返し拡散させつつ（redistributed），2時間細胞単層中へ吸収させられた。この期間の後，最初の接種原は規定の（recommended）容量まで完全EMSK培地（5％のウシ胎児血清を加えたEMSK陰性培地）を加えられた。プレートは細胞変性の効果が完全となるまで，5％CO2中37℃でインキュベートされた。培地と細胞は回収され，50mlのスクリューキャプ付き円錐管（conical screw cap tube）中で-70℃で凍結された。37℃で解凍されるとすぐに，ウィルスストックは1.0mlバイアルに分注され，-70℃にて再凍結された。力価は通常約106PFU/mlであった。
SPV DNAの調製
豚痘ウィルスDNAを単離するために，T175cm2フラスコ中の集密的EMSK細胞単層は多重度0.1で感染させられ，細胞が100％細胞変性の効果を示すまで4から6時間インキュベートされた。感染細胞はその後，培地中に細胞をこすり落とされ，臨床的な遠心分離（clinical centrifuge）にて300rpmで５分間遠心分離することにより回収された。培地は別の容器に移され，細胞ペレットはリン酸緩衝溶液1.0ml（PBS：水1L中に1.5gのリン酸二ナトリウム，0.2gのリン酸二水素カリウム，0.8gの塩化ナトリウム及び0.2gの塩化カリウムを含む）（T175あたり）中で穏やかに再懸濁され，連続2回の凍結−解凍処理（-70℃から37℃まで）を受けた。最後の解凍の際，細胞（氷上で）は30秒間2回の超音波処理を施され，１回目と2回目の間には45秒間の冷却時間をおいた。その後，細胞の残骸はHB4ローターで4℃下，3000rpm，5分間の遠心分離（ソーヴァル  RC-5B超高速遠心機）（Sorvall RC-5B superspeed centrifuge）により取り除かれた。上清中に存在するSPVウィルス粒子（virions）は，その後SS34ローター（ソーヴァル）（Sorvall）で４℃下，15,000rpm，20分間の遠心分離によりペレット化され，10mMのトリス（pH7.5）中に再懸濁された。その後，この画分は36％ショ糖の密度勾配（10mMトリスpH7.5中でのw/v）中へ層状化され，SW41ローター（ベックマン）で4℃下，18,000rpm，60分間遠心分離（ベックマンL8-70M超遠心機）（Beckman L8-70M ultracentrifuge）された。ウィルス粒子ペレットは10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中に再懸濁され，氷上で30秒間超音波処理を施された。この画分は20％から50％の連続的ショ糖密度勾配（continuous sucrose gradient）で層状化され，SW41ローターで4℃下，16,000rpm，60分間遠心分離された。その勾配の下方約4分の3に位置するSPVウィルス粒子のバンドが回収され，20％ショ糖溶液で希釈され，SW41ローターで4℃下，18,000rpm，60分間の遠心分離によりペレット化された。生成されたペレットは，その後微量のショ糖を除去するために10mMのトリス緩衝溶液pH7.5を用いて１回洗浄され，最終的に10mMのトリス緩衝溶液pH7.5中で再懸濁された。その後，EDTA，SDS及びプロテイナーゼKをそれぞれ20mM，0.5％及び0.5mg/mlの最終濃度になるように添加して誘導された溶解（lysis）（60℃，4時間）により精製されたウィルス粒子から，SPV DNAが抽出された。消化（digestion）の後，フェノール：クロロホルム（1:1）抽出が3回実施され，2倍量の100％エタノールの添加と-20℃，30分間のインキュベートにより試料は沈殿させられた。その後，試料はエッペンドルフミニフュージ（eppendorf minifuge）にて5分間，最高速度（full speed）で遠心分離された。上清は他の容器に移され，ペレットは風乾され，4℃にて1mM EDTAを含む0.01Mのトリス緩衝溶液pH7.5中で再水和された。
感染細胞溶解物（infected cell lysates）の調製
細胞溶解物の調製用に，血清を含まない培地が用いられた。25cm2フラスコまたは60mmペトリ皿中で集密的細胞単層（SPVに対しEMSK，ESK-4，PK-15またはVero，またはPRVに対してVERO）は100μlのウィルス試料で感染させられた。細胞変性の効果が完全となった後，培地と細胞は回収され，細胞は3000rpm，5分間の臨床的な遠心分離（clinical centrifuge）でペレット化された。細胞ペレットは250μlの破壊緩衝液（disruption buffer）（2％のドデシル硫酸ナトリウム，2％のβ-メルカプトエタノール）中に再懸濁された。試料は氷上で30秒間の超音波処理を施され，-20℃で保存された。
ウェスタンブロッティング法
細胞溶解物試料と標準タンパク質はラエムンリ（Laemnli）（1970）の方法に従ってポリアクリルアミドゲル上で泳動された。ゲル電気泳動後，タンパク質は変性され，サムブルックら（Sambrook et al.）（1982）の方法に従って処理された。１次抗体はトリスナトリウム塩化物及びアジ化ナトリウム（TSA：水1L中に6.61gのトリス塩酸，0.97gのトリス塩基，9.0gの塩化ナトリウム及び2.0gのアジ化ナトリウムを含む）中にて5％の無脂肪乾燥ミルクで1:100の割合に希釈されたブタ抗PRV血清（Shope strain;lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA）であった。２次抗体はTSAで1:1000の割合に希釈されたヤギ抗ブタアルカリ性フォスファターゼ抱合体（goat anti-swine alkaline phosphatase conjugate）であった。
分子生物学的手法
制限エンドヌクレアーゼを用いた消化，ゲル電気泳動，ゲルからのDNAの抽出，ライゲーション，キナーゼを用いたりン酸化，ホスファターゼを用いた処理，細菌培養の成長，DNAを用いた細菌の形質転換法などを含む，細菌とDNAの操作に関する技術及びその他の分子生物学的方法はマニアティスら（Maniatis et al.）（1982）及びサムブルックら（Sambrook et al.）（1989）により示されている．例外として，これらの方法には若干の修正が加えられた。
DNAシークエンシング
シークエンシングはUSBシークエナーゼキット（USB Sequenase Kit）と35S-dATP（NEN）を用いて行われた。圧縮された領域（areas of compression）を解明するためdGTP混合物とdITP混合物の両方を用いる反応が実行された。あるいは，圧縮された領域（compressed areas）はフォルムアミドゲルで解析された。テンプレートにはダブルストランドのプラスミドサブクローンもしくはシングルストランドM13サブクローンを用い，プライマーはシークエンスされるべき挿入断片のすぐ外側のベクターに対して，あるいは以前に得られた配列に対して作成された。得られた配列は編集され，ドナスターソフトウエアー（Dnastar software）を用いて比較された。得られた配列の取り扱いや比較はコラルソフトウェア（Coral Software）のスーパークローンTM（SupercloneTM）とスーパーシーTMプログラム（SuperseeTM programs）を用いて行れた。
複製連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）を用いたクローニング
種々のDNAの繰作に都合のよい制限（酵素）部位を導入するために複製連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（PCR）が用いられた。用いられた方法はインニスら（Innis，et al．）（1990）により示されている．一般に，増幅された断片はサイズ的には500塩基対より小さく，増幅された断片の臨界領域（critical region）はDNAシークエンシングにより確かめられる．それぞれの場合において用いられたプライマーは，以下に示す相同性ベクターの構築についての記述で詳しく述べられている．
組み換えSPV生成のための相同的組み換え法（Homologous Recombination Prodecure）
この方法は，豚痘ウィルスDNAとトランスフェクションされたプラスミド相同性ベクターの両方を含む組織培養細胞中に生じた，豚痘ウィルスDNAとプラスミド相同性ベクターDNA間の相同的組み換えに依拠する。相同的組み換えを生じさせるために，EMSK細胞単層はこれらの細胞中へのSPVの複製（すなわちDNA合成）を誘導するべく，感染多重度0.01PFU/細胞でS-SPV-001（カスザSPV株，17）（Kasza SPV strain，17）に感染させられる．その後，プラスミド相同性ベクターDNAは感染−トランスフェクション法（Infection-Transfected Procedure）に従い，これらの細胞にトランスフェクションされる。本方法で用いた相同性ベクターの構築は以下に示される。
感染−トランスフェクション法
EMSK細胞の6cmプレート（集密度約80％）はEMSK陰性培地中にて感染多重度0,01PFU/細胞でS-SPV-001に感染させられ，CO2濃度5％の加湿された環境下で37℃にて5時間インキュベートされた。用いられたトランスフェクション法は基本的にはリポフェクチンTM試薬（LipofectinTM Reagent)(BRL）の使用説明書に示された方法である。簡単に説明すると，6cmプレートのそれぞれにつき，15μgのプラスミドDNAが水で100μlまで希釈された。これとは別に50μgのリポフェクチン試薬が水で100μlまで希釈された。その後，ポリスチレン製の5mlのスナップキャップ付き試験管中の希釈されたプラスミドDNAに，希釈されたリポフェクチン試薬100μlが滴下的に加えられ，穏やかに混合された。その後，混合物は室温にて15から20分間インキュベートされた。この間に，ウィルスの接種原は6cmプレートから除去され，細胞単層はEMSK陰性培地を用いて１回洗浄された。その後，3mlのEMSK陰性培地がプラスミドDNA/リポフェクチン混合物に加えられ，その内容物は細胞単層上にピペットで移された。細胞は一晩（約16時間），CO2濃度5％の加湿された環境下で37℃にてインキュベートされた。翌日，3mlのEMSK陰性培地は取り除かれ，5mlのEMSK完全培地に置き換えられた。細胞はウィルスによる細胞変性の効果が80％から100％になるまで，CO2濃度5％下37℃で3日間から7日間インキュベートされた。ウィルスはウィルスストックの調製で上記したようにして回収された。このストックはトランスフェクションストック（transfection stock）と呼ばれ，引き続いて組み換え豚痘ウィルス検出用のブルオガルスクリーン（Bluogal Screen）もしくは組み換え豚痘ウィルス検出用CPRGスクリーン（CPRG Screen）により，組み換えウィルスの検出がなされた。
β−ガラクトシダーゼを発現している組み換えSPVの検出（Screen）（ブルオガル（Bluogal）及びCPRG分析）
組み換えウィルスに大腸菌（E．coli）のβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子が組み込まれた場合，組み換え体を含んでいるプラークは，２つの簡単な方法のうちのどちらか１つによって視覚化された。１番目の方法では，プラーク分析の間ブルオガル（BluogalTM）試薬（ベテスダ研究所）（Bethesda Research Labs）がアガロース上層（agarose overlay）に組み込まれ（200μg/ml），β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは青になる．青いプラークはその後，新しい細胞（EMSK）上に選び取られ，青いプラークのさらなる単離により精製された。２番目の方法では，プラーク分析の間CPRG（べーリンガー  マンハイム）（Boehringer Mannheim）がアガロース上層（agarose overlay）に組み込まれ（400μg/ml），β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているプラークは赤になる．赤いプラークはその後，新しい細胞（EMSK）上に選び取られ，赤いプラークのさらなる単離により精製された。どちらの場合においてもウィルスは，典型的には，３回のプラーク精製で精製された。
ブラックプラーク分析（Black Plaque Assays）を用いた組み換えSPV中における外来遺伝子発現の検出（screen）
組み換え豚痘ウィルスにより発現した外来抗原の発現を分析するために，EMSK細胞単層は組み換えSPVで感染させられ，アガロース栄養培地に重層され（overlayed），プラーク成長（plaque development）が生じるまで37℃で6日間から7日間インキュベートされた。その後，アガロース上層（overlay）はペトリ皿から除かれ，細胞は100％メタノールによりで室温で10分間固定され，風乾された。細胞の固定により表面抗原と同様に細胞質抗原も検出されるようになるが，未固定の細胞を用いることにより特異的な表面抗原の発現が検出可能である。その後，１次抗体はPBSを用いて適当な希釈倍率まで希釈され，細胞単層上に室温で２時間インキュベートされた。S-SPV-008由来のPRV g50（gD）の発現を検出するために，ブタ抗PRV血清（ショープ株；ロット370，PDV8201，NVSL，エームズ，IA）（shope strain；lot370，PDV8201，NVSL，Ames，IA）が用いられた（1:100希釈）．S-SPV-009由来のNDV HNの発現を検出するために，HNタンパク質に特異的なウサギ抗血清（rabbit anti-NDV#2）が用いられた（1:1000希釈）．その後結合していない抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除かれた。2次抗体としては，ヤギ抗ブタ（PRV g50（gD）；S-SPV-008）もしくはヤギ抗ウサギ（NDV HN；S-SPV-009）のいずれかと西洋ワサビパーオキシダーゼの抱合体がPBSを用いて1:250に希釈され，室温下で2時間，細胞とともにインキュベートされた。その後，結合していない2次抗体は，PBSを用いて室温下で細胞を３回洗浄することにより除去された。その後，細胞は新しく調製された基質溶液（substrate solution）（PBS中に100μg/mlの4クロロ-1-ナフトール（4-chloro-1-naphthol），0.003％の過酸化水素を含む）とともに室温で15分間から30分間インキュベートされた。正しい抗原性を発現するプラークは黒く染色される。
診断法として使用されるためのウィルス性糖タンパク質の精製に関する方法
ウィルス性糖タンパク質は抗体アフィニティカラムを用いて精製される。モノクローナル抗体を生成するために，8週から10週齢のBALB/c雌マウスはS-SPV-009,-014,-016,-017,-018もしくは-019の107PFUを2週から4週間隔で7回，腹膜内にワクチン接種（vaccinated）される。最後のワクチン接種から3週間後，マウスは相応のウィルス性糖タンパク質40mgを腹膜内に注射される。最後の抗原投与から3日後に脾臓が取り出される。
オイとハーゼンバーグ（Oi and Herzenberg）（41）の手法を改良した方法により，脾細胞はマウスNS1/Ag4プラスマ細胞腫細胞と融合される。脾細胞とプラスマ細胞腫細胞は10分間300 x gの遠心分離で一緒にペレット化される。ポリエチレングリコール（分子量1300から1600）の50％溶液１mlが，1分間攪拌されながら細胞ペレットに加えられる．ダルベッコ改良イーグル培地（Dulbecco's modified Eagles's Medium）（5ml）が3分間にわたり細胞に加えられる．細胞は300 x g，10分間の遠心分離によりペレット化され，10％のウシ胎児血清と100mMヒポキサンチン，0.4mMアミノプテリン及び16mMチミジンを含む培地（HAT）中に再懸濁される。100mlの標準の脾臓支持細胞層細胞（normal spleen feeder layer cells）を含有する8から10個の96穴の組織培養プレートに細胞（100ml）が加えられ，37℃でインキュベートされる。細胞には3日間から4日間ごとに新しいHAT培地が供給される。
ハイブリドーマ培養上清は，100ngのウィルス性糖タンパク質がコートされた96穴マイクロタイタープレート（96-well microtiter plates）中でのエリサ（ELIZA）分析により検査される。活性ハイブリドーマ由来の上清はさらにブラックプラーク分析（black-plaque assay）とウェスタンブロット（Western Blot）により解析される。選抜されたハイブリドーマは限界希釈（limiting dilution）により二度クローニングされる。プリスタン処理されたBALB/Ｃマウスに5x106ハイブリドーマ細胞を腹膜内注射することにより腹水液（ascetic fluid）が生成される。
S-SPV-009,-014,-016,-017,-018もしくは-019由来の細胞溶解物は感染細胞溶解物の調製で示されたようにして得られる．糖タンパク質を含む細胞溶解物（100mls）は，2mlのアガロース親和性樹脂を通される。製造元（AFC培地，ニューブランズウィックサイエンティフィック，エディソン，ニュージャージー）（AFC Medium，New Brunswick Scientific，Edison，N.J.）の使用説明に従うと，そのカラムでは20mgの糖タンパク質モノクローナル抗体が固定化されている．カラムは非特異的に結合した物質を除くために，0.1％のノニデット  P-40（ＮｏｎｉｄｅｔP-40）を含むリン酸緩衝溶液（PBS）100mlを用いて洗浄された。結合した糖タンパク質は100mM炭酸緩衝液（carbonate buffer），pH10.6（40）で溶出される。溶出前後の画分（pre-posteluted fractions）は，エリサ（ELISA）システム中でのSPVモノクローナル抗体に対する活性により純度（purity）がモニターされる。
エリサ検定（ELISA ASSAY）
ワクチン接種と抗原投与に引き続いておこる畜牛の免疫状態を測定するために，標準的な酵素結合免疫吸着剤検定法（ELISA）の手順が用いられる．
糖タンパク質抗原溶液（PBS中にng/mlにて100ml）（100ml at ng/ml in PBS）はマイクロタイター皿の穴に4℃下18時間吸着させられる．コートされた穴はPBSを用いて１回リンスされる。穴は1％のBSA（シグマ）（Sigma）を含むPBSを250ml加えることによりブロックされ，37℃で1時間インキュベートされる。ブロックされた穴は0.02％のツィーン20（Tween20）を含むPBSで１回リンスされる。50mlの供試血清（前もって1％BSAを含むPBS中で1:2に希釈された）が穴に添加され，37℃で1時間インキュベートされる。抗血清は除去され，穴は0.02％のツィーン20（Tween20）を含むPBSで3回洗浄される。特異的な抗原に対する抗体を含んでいる穴を視覚化するために，西洋ワサビパーオキシダーゼ（1％BSAを含むPBS中で1:500に希釈されたもの，キッケガードとペリー研究所社（Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc.））に結合した抗ウシIgGを含む50mlの溶液が添加される。溶液は37℃で1時間インキュベートされ，その後溶液は除去され，0.02％のツィーン20（Tween20）を含むPBSで3回洗浄される。それぞれの穴に100mlの基質溶液（ATBS，キッケガードとペリー研究所社）（ATBS，Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.）が加えられ，15分間発色させられ．反応は0.1Mのシュウ酸の添加により終止させられた。色は自動プレート読みとり機（automatic plate reader）にて吸光度410nmで読みとられた。
合成ポックスウィルスプロモーターを構築するための基本的手法
組み換え豚痘ベクターに関して，合成痘プロモーター（synthetic pox promoters）は，外来遺伝子発現の強度とタイミングを制御する能力を含むいくつかの利点を供する。ワクシニアウィルス（1,7及び8）中で決定されたプロモーターに基づいた３つのプロモーターカセットLP1,EP1及びLP2が設計された。それぞれのカセットはワクシニア中で決定されたDNA配列に制限酵素部位を配したものを含むように設計された。この制限酵素部位により，カセットはいかなる順番にでも，いかなる組み合わせにでも結合させて利用できるようになる．EcoRIもしくはBamHIサイトでフレーム内融合（inframe fusion）ができるように，イニシエーターメチオニンもそれぞれのカセット中に設計された。３つのリーディングフレームすべてに含まれる一連の翻訳終了コドンと初期（early）転写終止シグナル（early transcriptional termination signal）（9）もフレーム内融合（inframe fusion）サイトの下流に組み込まれた。それぞれのカセットをコードするDNAは標準的な手法に従って合成され，適当な相同性ベクターへクローニングされた（図4,5及び8参照）．
仮性狂犬病（Pseudorabies）ウィルス糖タンパク質遺伝子を含む組み換え豚痘ウィルスを用いたブタにおけるワクチン接種実験：
仮性狂犬病（Pseudorabies）非感染群からの離乳した幼ブタが，１つまたはそれ以上の仮性狂犬病（Pseudorabies）ウィルス糖タンパク質遺伝子（SPV/PRV）を有する組み換え豚痘ウィルスの効力を検査するために用いられる．約103から107プラーク形成単位（PFU）の組み換えSPV/PRVウィルスが筋肉内，皮下，あるいは経口的に幼ブタに接種される。
免疫性はPRV血清抗体のレベルを測定することと，ワクチン接種されたブタに仮性狂犬病（Pseudorabies）ウィルスの病原性株を抗原投与（challenge）することにより決定される。ワクチン接種の3から4週間後，ブタの接種したグループと接種していないグループはともに仮性狂犬病（Pseudorabies）ウィルスの病原性株（VDL4892）を抗原投与（challenge）される。抗原投与（challenge）後，ブタは14日間毎日，仮性狂犬病（Pseudorabies）の臨床的兆候を観察される。
ワクチン接種した時点，抗原投与の時点，及び接種後2から3週の間１週おきに血清試料が得られ，血清中和抗体を検査された。
ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素とノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング
カッツら（Katz et al．）（42）がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様の手法により，ウマインフルエンザウィルス赤血球凝集素（HA）とノイラミニダーゼ（NA）遺伝子がクローニングされた。ウィルスRNAはMDBK細胞（インフルエンザA/ウマ/アラスカ/91とインフルエンザA/ウマ/マイアミ/63に関して）またはMDCK細胞（インフルエンザA/ウマ/プラハ/56とインフルエンザA/ウマ/ケンタッキー/81に関して）内で成長したウィルスから調製され，最初に標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。cDNAは標的とした遺伝子領域のPCRクローニング（51）のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，EHV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。抗原型2（H3）ウィルス（インフルエンザA/ウマ/マイアミ/63，インフルエンザA/ウマ/ケンタッキー/81，及びインフルエンザA/ウマ/アラスカ/91）由来のHA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー
0003939358.tif 000002
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000003
と結合させられた。抗原型1（H7）ウィルス（インフルエンザA/ウマ/プラハ/56）由来のHA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー
0003939358.tif 000004
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000005
と結合させられた。抗原型2（N8）ウィルス（インフルエンザA/ウマ/マイアミ/63，インフルエンザA/ウマ/ケンタッキー/81，及びインフルエンザA/ウマ/アラスカ/91）由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）ため以下のプライマー
0003939358.tif 000006
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000007
と結合させられた。抗原型1（N7）ウィルス（インフルエンザA/ウマ/プラハ/56）由来のNA遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー
0003939358.tif 000008
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000009
と結合させられた。この一般的な手法は，ウマ インフルエンザAウィルスの他の株からHA遺伝子とNA遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。EIV HA遺伝子またはNA遺伝子はブラントエンド処理されたsalIまたはBamHI断片として，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターの下流のブラントエンド処理されたEcoRIサイトにクローニングされた。
パラインフルエンザ-3  ウィルス融合（parainfluenza-3 virus fusion）と赤血球凝集素遺伝子のクローニング
カッツら（Katz et al．）（42）がヒトインフルエンザウィルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング法により，パラインフルエンザ-3  ウィルス融合（F）（parainfluenza-3 virus fusion（F））と赤血球凝集素（HN）遺伝子がクローニングされた。マーデン-ダービイ（Madin-Darby）ウシ腎臓（MDBK）細胞中で成長させたウシPI-3ウィルスから調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは標的とされる領域の複製連鎖反応（PCR）クローニング（15）のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。PI-3株SF-4（VR-281）由来のＦ遺伝子をコードする領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000010
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000011
と結合させられた。PI-3株SF-4（VR-281）由来のHN遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000012
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000013
と結合させられた。この一般的な手法は，PI-3の他の株のF遺伝子とHN遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。PI-3HN（遺伝子）またはF（遺伝子）に対応するDNA断片は，それぞれ1730bpもしくは1620bpの断片を得るためにBamHIを用いて消化された。PI-3断片は，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。PI-3 F断片は相同性ベクター713-55.10.を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。
ウシウィルス性下痢ウィルス（Bovine Viral Diarrhea Virus）g48とg53遺伝子のクローニング
カッツら（Katz et al.）（42）がヒトインフルエンザウイルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシウィルス性下痢ウィルスg48とg53遺伝子はクローニングされた。マーデン-ダービイ（Madin-Darby）ウシ腎臓（MDBK）細胞中で成長したBVDウィルスシンガー株（BVD virus Singer strain）から調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは複製連鎖反応（PCR）クローニング（15）のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナルを含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。BVDVシンガー株（BVDV Singer strain）（49）由来のg48遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming)のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000014
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000015
と結合させられた。BVDVウィルスシンガー株（BVDV Singer strain）（49）由来のg53遺伝子をコードしている領域は，DNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000016
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000017
と結合させられた。この一般的な手法は，BVDVの他の株からg48遺伝子とg53遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。BVDV g48に対応するDNA断片は，678bpの断片を得るためにBamHIで消化された。BVDV g53に対応するDNA断片は，1187bpの断片を得るためにBglIIとBamHIを用いて消化された。BVDV g48とg53 DNA断片は，それぞれ相同性ベクター727-78.1と738-96を得るために，SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにクローニングされた。
ウシ呼吸器合胞体ウィルス融合（Bovine Respiratory Syncytial Virus Fusion），ヌクレオカプシド（Nucleocapsid）及び糖タンパク質遺伝子のクローニング
カッツら（Katz et al.）（42）がヒトインフルエンザウイルスのHA遺伝子に関して示したのと基本的に同様のPCRクローニング手法により，ウシ呼吸器合胞体ウィルス融合（Bovine respiratory syncytial virus fusion）（F），ヌクレオカプシド（Nucleocapsid）（N）及び糖タンパク質（G）遺伝子がクローニングされた。ウシ鼻甲介（nasal turbinate）（BT）細胞中で成長させたBRSVから調製されたウィルスRNAは最初に，標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用してcDNAに変えられた。その後，cDNAは複製連鎖反応（PCR）クローニング（15）のためのテンプレートとして用いられた。PCRプライマーは，SPV内での発現のための適当なシグナル含むベクター中に，増幅したコード領域のクローニングを可能とする制限酵素サイトを組み込むように設計された。コードする領域のそれぞれにつき１対のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であった。BRSV株375（VR-1339）由来のF遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000018
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000019
と結合させられた。BRSV株375（VR-1339）由来の領域をコードしているN遺伝子は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000020
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000021
と結合させられた。BRSV株375（VR-1339）由来のG遺伝子をコードしている領域は，cDNAのプライミング（priming）のため以下のプライマー：
0003939358.tif 000022
を用いてクローニングされ，PCRのために
0003939358.tif 000023
と結合させられた。この一般的な手法は，BRSVの他の株からF遺伝子，N遺伝子及びG遺伝子をコードする領域をクローンするために用いられたことに留意されたい。BRSVのF,N及びGに対応するDNA断片は，それぞれ1722bp,1173bp及び771bpの断片を得るためにBamHIで消化された。BRSVのF,N,及びGのDNA断片を、SPV相同性ベクターのLP2EP2プロモーターに隣接するBamHIサイトにそれぞれクローニングして、相同性ベクター727-20.10,713-55.37,及び727-20.5を得た。
コンカナバリンA（Concanavalin A）で処理されたニワトリ脾臓細胞から単離されたRNA
ニワトリ脾臓は3週齢のSPAFAS孵化ヒナから解剖して取り出され，洗浄され，細胞を解離するために注射筒/針を通して粉砕された。細胞質と残渣が除かれた後，細胞はペレット化され，PBSで二回洗浄された。細胞ペレットは赤血球細胞を溶血させるために低張性溶解緩衝液で処理され，脾細胞は回収され，PBSで二回洗浄された。脾細胞は5％FBSと5μg/mlのコンカナバリンA（concanavalin A）を含むRPMI中に5x106細胞/mlにて再懸濁され，39℃下で，48時間インキュベートされた。総RNAはグアニジンイソチオネート溶解剤（guanidine isotionate lysis reagents）とプロメガRNA単離キット（プロメガ社RNA isolation Kit）（プロメガ社  マディソン  ウィスコンシン）（プロメガ社Corporation，Madison WI）による手順を用いて細胞から単離された。4μgの総RNAが，適当なアンチセンスプライマーとAMV逆転写酵素（プロメガ社  マディソン  ウィスコンシン）（プロメガ社Corporation，Madison WI）を含むそれぞれの第一鎖（1st strand）反応に用いられた。逆転写酵素反応に続いてcDNA合成が同じ試験管内で，適当なセンスプライマー（sense primers）とVentR DNAポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ社，ベテスダ，メリーランド）（Life technologies,Inc.Bethesda,MD）を用いて行われた。
酵素のマーカー遺伝子を発現させる組み換えヘルペスウィルスの検出（Screen）
大腸菌β−ガラクトシダーゼ（uidA）マーカー遺伝子が組み換えウイルスに組み込まれた時，組み換え体を含むプラークは簡単な分析により視覚化された。プラーク分析の間，アガロース上層（agarose overlay）に酵素基質が組み入れられた（300μg/ml）．uidAマーカー遺伝子に関しては，基質X-グルクロChx（X-GlucuroChx）（5-ブロモ-4クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニック酸シクロヘキシルアンモニウム塩，バイオシンス  AG）（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid Cyclohexylammonium salt,Biosynth AG）が用いられた。マーカー酵素活性を示したプラークは青に変わった。その後，青いプラークは新しいESK-4細胞上に選び取られ，青いプラークをさらに単離することにより精製された。酵素マーカー遺伝子が除去された場合の組み換えウィルス手法では分析に際し，親（世代）の青いプラークのバックグランドから白いプラークを精製したものが用いられた。どちらの場合においても，典型的には，３回のプラーク精製によりウィルスは精製された。
相同性ベクター515-85.1
プラスミド515-85.1は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドは外来DNAが挿入されうる特異なAccI制限酵素サイトを含んでいる．AccIサイトに外来DNA挿入（断片）を有しているプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来DNAを有するウィルスが生じるだろう。相同性ベクター515-85.1内のDNA挿入（断片）の制限酵素地図を図4A-4Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用い（22と29），以下に示す供給源からの２つ制限酵素（切断）断片を結合させることで構築される。１つめの断片はpSP64（プロメガ）（プロメガ社）のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片である。２番目の断片はSPV HindIII消化断片M（23）のHindIIIからBglIIまでの約3628塩基対の亜断片（sub-fragment）である。
相同性ベクター520-17.5
プラスミド520-17.5は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子をもつ。マーカー遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。マーカー遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，マーカー遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は合成初期/後期（early/late）痘プロモーターの制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図4A-4Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて（22と30），以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図4A-4Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64（プロメガ）（プロメガ社）のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片M（23）のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である。断片3はSPV HindIII消化断片M（23）のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片（sub-fragment）である。
相同性ベクター538-46.16
プラスミド538-46,16は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。このプラスミドはSPV DNAに隣接して，大腸菌β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子とPRV g50（gD）遺伝子をもつ。外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は合成後期（late）痘プロモーター（LP1）の制御下に，g50（gD）遺伝子は合成初期/後期（early/late）痘プロモーター（EP1Lp1）の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図3A-3Cに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて（22と30），以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図3A-3Cに示す。このプラスミドベクターはpSP64（プロメガ）（プロメガ社）のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片M（23）のHindIIIからAccIまでの約2149塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片２はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3006塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI消化断片7（21）のEcoRIからStuIまでの約1571塩基対の亜断片（sub-fragment）である。EcoRIサイトはPCRクローニングによりこの断片に導入されたことに留意されたい。この手法において，以下に示されたプライマーはpSP64にサブクローニングしたPRV BamHI #7断片からなるテンプレートとともに用いられた。１つめのプライマー87.03
0003939358.tif 000024
は，PRV g50（gD）配列（26）上で，遺伝子の3'末端方向にプライミング（priming）しながら略アミノ酸3の位置にバインド（sit down）する。２つめのプライマー87.06
0003939358.tif 000025
は，逆鎖上で，遺伝子の5'末端方向にプライミング（priming）しながら略アミノ酸174の位置にバインド（sit down）する。PCR産物は，約509塩基対の断片を得るために，EcoRIとSalIで消化されてもよい。PRV BamHI #7のSalIからStuIまでの約1049塩基対の亜断片（sub-fragment）はその後，EcoRIからStuIまでの約1558塩基対の断片3を得るために約509塩基対のEcoRIからSalIまでの断片にライゲーションされてもよい。断片4はSPV HindIII消化断片M（23）のAccIからBglIIまでの約1484塩基対の亜断片（sub-fragment）である。
相同性ベクター570-91.41
プラスミド570-91.41は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子とPRV gIII（gC）遺伝子をもつ。外来遺伝子の上流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ（lacZ)マーカー遺伝子は合成後期（late）痘プロモーター（LP1）の制御下に，gIII（gC）遺伝子は合成初期後期（early late)痘プロモーター（EP1LP2）の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図5A-5Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて（22と30），以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図5A-5Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64（プロメガ）（プロメガ社）のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片M（23）のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片2はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI #2と#9の亜断片（sub-fragment）である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である。この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された。断片4はSPV HindIII消化断片M（23）のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
相同性ベクター570-91.64
プラスミド570-91.64は外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。プラスミドはSPV DNAに隣接して大腸菌β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子とPRV gIII（gC）遺伝子をもつ。外来遺伝子の上流はSPV DNAの約1484塩基対断片である。外来遺伝子の下流はSPV DNAの約2149塩基対断片である。このプラスミドが「組み換えSPV生成のための相同的組み換え法」に従って使用されると，外来遺伝子をコードするDNAを有するウィルスが生じるだろう。β-ガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は合成後期（late）痘プロモーター（LP1）の制御下に，gIII（gC）遺伝子は合成後期初期（late early）痘プロモーター（Lp2EP2）の制御下にあることに留意されたい。プラスミドの詳細を図7A-7Dに示す。このプラスミドは標準的な組み換えDNA技術を用いて（22と30），以下の合成DNA配列をもつ供給源由来の制限酵素（切断）断片を加えることで構築されるだろう。この配列を図5A-5Dに示す。このプラスミドベクターはpSP64（プロメガ）（プロメガ社）のHindIIIからBamHIまでの約2972塩基対の制限酵素切断断片を起源とする。断片１はSPV HindIII消化断片M（23）のBglIIからAccIまでの約1484塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片2はプラスミドpJF751（11）のBamHIからPvuIIまでの約3002塩基対の制限酵素断片である。断片3はPRV BamHI #2と#9の亜断片（sub-fragment）である，プラスミド251-41.AのNcoIからNcoIまでの約2378塩基対の断片である。この断片の末端のNcoIサイトとNcoIサイトはEcoRIリンカーにより置換された。断片4はSPV HindIII消化断片M（23）のAccIからHindIIIまでの約2149塩基対の亜断片（sub-fragment）である。断片1と断片4中のAccIサイトは合成DNAリンカーを用いてPstIに転換された。
相同性ベクター７２７−５４．６０
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために、プラスミド７２７−５４．６０を構築した。これにより、ＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇＢ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより、上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第７Ａ−７Ｄ図に示されている。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第７Ａ−７Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記の起源に由来する制限断片を相互に結合させることにより構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）から入手可能な略２９７２塩基対のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対のＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片）（２１）内にあるＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７５１−０７．Ａ１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−０７．Ａ１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１１４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＩＦＮ遺伝子（５４）をコードする略５７７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ断片である。逆転写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．１３）は
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であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４．１２）は
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であった。逆転写とＰＣＲにより得られたＢａｍＨＩ断片はゲル精製され、５’末端に非反復ＥｃｏＲＩ部位を導入し３’末端に非反復ＢｇｌII部位を導入するための第２ＰＣＲ反応用鋳型として用いられた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．２２
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を用い、３’末端でプライマー６／９４．３４
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を用いて略５７７塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸とアミノ末端の３１個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるニワトリインターフェロンタンパク質（５４）の第１番目アミノ酸から第１９３番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡＣＣＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７５１−５６．Ａ１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５１−５６．Ａ１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１１４６塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から分離されたＲＮＡの逆転写並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）より誘導されたｃＭＧＦ遺伝子（５５）をコードする略６４０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片である。逆転写とＰＣＲのために用いたアンチセンスプライマー（６／９４．２０）は
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であった。ＰＣＲのため用いたセンスプライマー（６／９４．５）は
0003939358.tif 000031
であった。ＰＣＲより誘導されたＢａｍＨＩ断片はサブクローニングを行ってプラスミドとし、第２ＰＣＲ反応用鋳型として用いた。第２ＰＣＲ反応では５’末端でプライマー６／９４．１６
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を用い、３’末端でプライマー６／９４．２０
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を用いて略６４０塩基対断片を産生した。このＤＮＡ断片は、ｃＭＧＦをコードする成就タンパク質の１７８個アミノ酸とアミノ末端の２３個アミノ酸シグナル配列とを含んでなるｃＭＧＦタンパク質（５５）の第１番目アミノ酸から第２０１番目アミノ酸までをコードする配列を含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略２１５６塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７５２−２２．１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２２．１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあることが注目される。本相同性ベクターはまた第２の外来遺伝子が非反復ＢａｍＨＩあるいはＥｃｏＲＩ部位に挿入された合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）を含有する。本プラスミドの詳細は第２８Ａ−２８Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、第２８Ａ−２８Ｄ図に示す合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわちＤＮＡプライマーである
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とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って、ＳｐｈＩ並びにＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である断片３は、ＳＰＶＨ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである
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を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って、ＳａｌＩ並びにＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基断片を合成した。
相同ベクター７５２−２９．３３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７５２−２９．３３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウマヘルペスウイルス１型ｇＢ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。ＬＰ２ＥＰ２プロモーター／ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子カセットは同族ベクター７３８−９４．４のＮｏｔＩ部位へ挿入された。同族ベクター７５２−２９．３３は、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである
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とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＳｐｈＩ並びにＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子を生成したものである。上記ＰＣＲ断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”断片内の３’末端に自然ＢａｍＨＩ部位を有しこの遺伝子の５’末端に合成ＥｃｏＲＩ部位を有する略４２９塩基対断片である。上記制限断片は、ＥＨＶ−１ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“Ｉ”断片内のＢａｍＨＩからＰｍｅＩに至る略２５１２塩基対断片である。５’末端ＰＣＲ断片を製造する際、ＥＨＶ−１  ＢａｍＨＩ“ａ”並びに“ｉ”断片から成る鋳型を用いて下記プライマーを適用した。
第１プライマー５／９４．３
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は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上の第２番目アミノ酸の位置に座し、上記ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入しさらにＡＴＧ開始コドンを導入する。第２プライマー５／９４．４
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は、ＥＨＶ−１  ｇＢ配列上のプライマー５／９４．３の反対鎖上の略１４４番目アミノ酸の位置に座し、上記遺伝子の５’末端方向にプライミングを行う。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化して鎖長においてＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子の５’末端に対応する４２９塩基対断片を生成した。上記のように、断片３は、ＰＣＲ反応生成物（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）と制限断片（ＢａｍＨＩ-ＰｍｅＩ）を連結して鎖長略２９４１塩基対（９７９個のアミノ酸）のＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片であるＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子を生成したものである。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。即ち、ＤＮＡプライマーである
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とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＳａｌＩ並びにＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。
相同性ベクター７４６−９４．１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４６−ｇ４．１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子（カルボキシ末端膜内外領域のアミノ酸１５８個が欠如）の第１番目アミノ酸から第４１７番目アミノ酸をコードする１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第１０Ａ−１０Ｄ図）の非反復ＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１２５０塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ＩＢＲＶ（Ｃｏｏｐｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマー１０／９４．２３
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をＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子の５’末端（第１番目アミノ酸）で且つプライマー１０／９４．２２
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をＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子の第４１７番目アミノ酸で用いてポリメラーゼ連鎖反応（１５）を行い合成した。
相同性ベクター７６７−６７．３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６７−６７．３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質５３（ＢＶＤＶ  ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＢＶＤＶ  ｇＰ５３をコードする１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片を相同性ベクター７５２−２２．１（第１０Ａ−１０Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並びにｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。
相同性ベクター７７１−５５．１１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７１−５５．１１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質４８（ＢＶＤＶ  ｇｐ４８）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。体外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯ１Ｌ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇＰ４８遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させることにより構築した。ＢＶＤＶ  ｇｐ４８をコードする６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片を相同ベクター７５２−２２．１（第１０Ａ−１０Ｄ図）の各非反復ＢａｍＨＩ部位に挿入した。上記６７８塩基対ＢａｍＨＩ断片は、「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並びにｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。
プラスミドベクター５５１−４７．２３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド５５１−４７．２３を構築した。本プラスミドには大腸菌β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）標識遺伝子が後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に取込まれる。上記標識遺伝子をＳＰＶゲノムの部位に挿入し組換え豚痘ウイルスを産生することは有用である。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い下記源由来の制限断片を結合して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の略３００５塩基対ＨｉｎｄIII制限断片から誘導した。断片１は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック社）の略１８２３塩基対ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片である。ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位はＰＣＲクローニングにより導入されたものであることが注目される。プラスミド５５１−４７．２３を用いて組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５９，Ｓ−ＳＰＶ−０６０，Ｓ−ＳＰＶ−０６１並びにＳ−ＳＰＶ−０６２を産生した。
相同性ベクター７７９−９４．３１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７７９−９４．３１を構築した。これよりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略５３８塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１８０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３０Ａ−３０Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９８６塩基対ＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略５４２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢｇｌII制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１８０塩基対ＢｇｌII−ＰｓｔＩ亜断片である。断片１と断片４のＢｇｌII部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。
相同性ベクター７８９−４１．７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３１Ａ−３１Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片４は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ  Ｃ断片内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片４は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片５は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０〜２１０４；配列番号：）が欠失していた。
相同性ベクター７８９−４１．２７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．２７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇＨ）遺伝子とＰＲＶ  ｇＣ（ｇIII）遺伝子並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３２Ａ−３２Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、図示合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限亜断片である。断片２は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡのＫｐｎＩ  Ｃ断片（２１）内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃２並びに＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＡｃｃＩ−ＢｇｌII制限亜断片である。断片１と断片４のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。断片４と断片６のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。ＳＰＶ断片４と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０〜２１０４；）が欠失していた。
相同性ベクター７８９−４１．４７
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．４７を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子も合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３３Ａ−３３Ｄ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃２並びに＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位へ変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIIIＭ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０〜２１０４；）が欠失していた。
相同性ベクター７８９−４１．７３
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８９−４１．７３を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢ（ｇII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＣ（ｇIII）遺伝子とＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１５６０塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成早期／後期痘プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、上記ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドの詳細は第３４Ａ−３４Ｅ図に示す。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子の第３番目アミノ酸から第２７９番目アミノ酸をコードする配列を含有するＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃７断片の略１５５２塩基対亜断片である。ＥｃｏＲＩ部位とＡＴＧ翻訳開始コドンはＥｃｏＲＩ部位を有する５’プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応から誘導される。３’末端のＳｔｕＩ部位は通常、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子３’−ＰＲＶ  ｇＤ遺伝子内にある。ＥｃｏＲＩ部位に始まる全オープンリーディングフレームは４０５個アミノ酸をコードする。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ  ＃２並びに＃９の亜断片であるプラスミド２５１−４１．Ａの略２３７８塩基対ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片である。本断片末端のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩリンカーにより置換した。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略４８塩基対ＡｃｃＩ−ＮｄｅＩ亜断片である。断片５は、ゲノムＰＲＶ  ＤＮＡ（２１）のＫｐｎＩ  Ｃ断片内のＰＲＶ  ｇＢ遺伝子をコードする配列を含む略３５００塩基対断片である。断片５は、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む略５３塩基対合成断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略７８塩基対ＳｍａＩ−ＮｈｅＩ断片と、ＰＲＶ  ＫｐｎＩ  Ｃゲノム断片由来の略３３７０塩基対ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２１）とを含有する。断片６は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片７は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１５６０塩基対ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡｃｃＩ部位は、ＰｓｔＩリンカーを用いて非反復ＰｓｔＩ部位へ変換した。断片３と断片６のＮｄｅＩ部位は、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて非反復ＨｉｎｄIII部位��変換した。ＳＰＶ断片３と６に広がる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII  Ｍ断片の略５４５塩基対ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド番号１５６０〜２１０４；）が欠失していた。
相同性ベクター７９１−６３．１９
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．１９を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダ＿ゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７９１−６３．４１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９１−６３．４１を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７９６−１８．９
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７９６−１８．９を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、本外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成早期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片３のＡＣＣＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７８３−３９．２
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８３−３９．２を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質５３（ＢＶＤＶ  ｇｐ５３）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させ構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＢＶＤＶ  ｇｐ５３をコードする略１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片である。この１１８７塩基対ＢａｍＨＩ断片は「ウシウイルス性下痢症ウイルスｇｐ４８並びにｇｐ５３遺伝子のクローニング」に記載のポリメラーゼ連鎖反応（１５）により合成した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７４９−７５．７８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７４９−７５．７８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接した伝染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。これらの外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１４８４塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略２１４９塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本プラスミドは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＩＢＤＶ  ＲＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とｃＤＮＡクローニングにより合成した略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＡｓｃＩ制限断片である。ｃＤＮＡとＰＣＲプライマー
0003939358.tif 000042
を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の５’末端に略１４００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を合成した。また、ｃＤＮＡとＰＣＲプライマー
0003939358.tif 000043
を用いてＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の３’末端に略１８００塩基ＢｃｌＩ−ＡｓｃＩ断片を合成した。これらの二個の断片をＢｃｌＩ部位で連結して略２７００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を産生した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII亜断片である。断片１と断片４のＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７６１−７５．Ｂ１８を構築した。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）プロテアーゼ（ｇａｇ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。本外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略８５５塩基対断片が配列し、これらの外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡの略１１１３塩基対断片が配列する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は豚痘ウイルスＯｌＬ遺伝子プロモーターの制御下にあり、上記ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子は後期／早期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２５１９塩基対ＨｉｎｄIII−ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ４（２３）の略８５５塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである
0003939358.tif 000044
とを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＳｐｈＩ並びにＢｇｌII末端を有する８５５塩基対断片を合成した。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導された３００２塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片３は、ＦＩＶ（ＰＰＲ株）（６１）由来のｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した略１８７８塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000045
はＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子の５’末端から合成し、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を更にＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000046
は、ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産生物は、ＥｃｏＲＩとＢａｌIIで消化してＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子に対応する鎖長の１８７８塩基対断片を生成した。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍの略１１１３塩基対亜断片である。すなわち、ＤＮＡプライマーである
0003939358.tif 000047
とを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行って、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII末端を有する１１１３塩基対断片を合成した。
相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１
外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するためプラスミド７８１−８４．Ｃ１１を用いた。これによりＳＰＶ  ＤＮＡが隣接したネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子が取込まれる。このプラスミドを「組換えＳＰＶを発生するための相同組換え手順」に従って用いることにより上記外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。上記β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）標識遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、上記ＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は合成後期／早期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることが注目される。本相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を用い、適切な合成ＤＮＡ塩基配列を有する下記源由来の制限断片を相互に結合させて構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社）の略２９７２塩基対ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII断片Ｍ（２３）の略１４８４塩基対ＢｇｌII−ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片３は、「ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング」に従い合成したＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子（６１）の略２５６４塩基対ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片である。このＰＣＲ反応のための鋳型としてＦＩＶ  ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡ（６１）を用いた。ＦＩＶ  ＰＰＲ株ゲノムｃＤＮＡの６２６３番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の５’末端に対応する上流プライマー１０／９３．２１
0003939358.tif 000048
を合成した。本法では５’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。このＢａｍＨＩ部位は、ＰＣＲ断片のクローニングの際破壊された。ＦＩＶ  ＰＰＲゲノムｃＤＮＡの８８２７番目ヌクレオチドに始まるＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の３’末端に対応する下流プライマー１０／９３．２０
0003939358.tif 000049
を合成した。本法では３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の略３０１０塩基対ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄIII制限断片Ｍ（２３）の略２１４９塩基対ＡｃｃＩ−ＨｉｎｄIII制限亜断片である。本ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位は、非反復ＮｏｔＩ部位へ変換した。
〔実施例〕
例  １
相同性ベクター５１５−８５．１
相同性ベクター５１５−８５．１は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入に有用なプラスミドである。プラスミド５１５−８５．１は、それに外来性ＤＮＡをクローン化し得る唯一のＡｃｃＩ制限部位を含有する。かかる外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って用いて、外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得ることができる。この方法を首尾よく行うためには、挿入部位（ＡｃｃＩ）がＳＰＶの複製に必須ではない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。相同性ベクター５１５−８５．１におけるＡｃｃＩ部位を用いて、外来性ＤＮＡを少なくとも３つの組換えＳＰＶに挿入する（例２−４参照）。
適当な挿入部位を規定するために、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のライブラリーを創製した。これらの制限断片のうちいつくかを（ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｇ、ＪおよびＭ、図１Ａ−１Ｂ参照）制限マッピング解析に付した。可能な挿入部位として２つの制限部位が各断片で同定された。これらの部位は断片ＧにおけるＮｒｕＩ、断片ＪにおけるＢａｌＩおよびＸｂａＩ、および断片ＭにおけるＡｃｃＩおよびＰｓｔＩを含むものであった。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を可能な部位の各々に挿入した。得られたプラスミドを「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」で利用した。組換えウイルスの創製は「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶをスクリーニングするアッセイ」によって判断した。６つの部位のうち４つは組換えウイルスを生じることが判明したが、これらの各ウイルスが親ＳＰＶから精製除去される能力は大きく変動した。１つの場合において、ウイルスを１％のレベルを超えて精製できず、もう１つの場合において、ウイルスを５０％のレベルを超えて精製できが、および第３の場合において、ウイルスを９０％のレベルを超えて精製できなかった。これらのウイルスを精製できないことは、挿入部位における不安定性を示す。これは対応する部位を外来性ＤＮＡの挿入に不適当とする。しかしながら、１の部位（相同性ベクター５１５−８５．１のＡｃｃＩ部位）における挿入の結果、容易に１００％まで精製できたウイルスが得られ（例２参照）、これは外来性ＤＮＡの挿入のための適当な部位を規定する。
相同性ベクター５１５−８５．１をＤＮＡ配列解析によってさらに特徴付けた。相同性ベクターの２つの領域を配列決定した。第１の領域は、唯一のＡｃｃＩ部位に隣接する５９９塩基対配列をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第２の領域は唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流の８９９塩基対をカバーする（図２Ａおよび２Ｂ参照）。第１の領域の配列はGoebelら，1990によって同定されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸１〜１１５に対して相同性を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。第２の領域の配列は同ワクシニアウイルスＯＩＬオープンリーディングフレームのアミノ酸５６８〜６６６に対して相同性を示すオープンリーディングフレームをコードする（図３Ａ−３Ｃ参照）。これらのデータは、ＡｃｃＩ部位はほぼアミノ酸４１において推定ＶＶ  ＯＩＬ−様ＯＲＦを中断することを示し、これは、このＯＲＦがＳＰＶ複製につき必須でない遺伝子をコードすることを示唆する。Goebelらは、ＶＶ  ＯＩＬ  ＯＲＦはある種の真核生物転写調節蛋白質に特徴的なロイシンジッパー・モチーフを含有することを提案しているが、彼らはこの遺伝子がウイルス複製に必須か否かは知られていないことを示している。
ＶＶ  ＯＩＬ−様ＯＲＦの上流に位置するＤＮＡ配列は、豚痘ウイルスのプロモーターを含有することが予測されるであろう。この豚痘ウイルスのプロモーターは豚痘ゲノムに導入された外来性ＤＮＡ対照要素として有用であろう。
例  ２
Ｓ−ＳＰＶ−００３
Ｓ−ＳＰＶ−００３は外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）をＳＰＶ  ５１５−８５．１ ＯＲＦに導入した。外来遺伝子（ｌａｃＺ）は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−００３はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５２０−１７．５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−００３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現していたことを示す。ここに記載するアッセイはＶＥＲＯ細胞ならびにＥＭＳＫ細胞で行い、これはＶＥＲＯ細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産のための適当な基礎となろうことを示す。Ｓ−ＳＰＶ−００３は受託番号２３３５の下でＡＴＣＣに寄託された。
例  ３
Ｓ−ＳＰＶ−００８
Ｓ−ＳＰＶ−００８は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇＤ）（２６）についての遺伝子をＳＰＶ  ５１５−８５．１ ＯＲＦに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−００８はＳ−ＳＰＶ−１００（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５３８−４６．１６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−００８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−００８を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶ血清はＳ−ＳＰＶ−００８プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００９陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−００８で観察されたプラークはブタ抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。また、黒色プラーク・アッセイを固定されていない単層で行った。固定されていない単層上のＳＰＶプラークもブタ抗−ＰＲＶ血清との特異的反応性を呈し、これはＰＲＶ抗原が感染細胞表面で発現されることを示す。
ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶ血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−００８感染細胞からの溶解物はほぼ４８ｋｄの特異的バンド、ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）（３５）の報告されたサイズを示す。
ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）はＨＳＶ−１（２６）のｇ５０（ｇＤ）同族体である。幾人かの研究者は、ＨＳＶ−１  ｇ５０（ｇＤ）を発現するＶＶはマウスをＨＳＶ−１での攻撃から保護することを示している（６および３４）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−００８はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。
いくつかの他のＰＲＶ糖蛋白質がＰＲＶ病から保護するための組換え豚痘ワクチンの創製で有用であろうことが予想される。これらのＰＲＶ糖蛋白質はｇＩＩ（２８）、ｇＩＩＩ（２７）、およびｇＨ（１９）を含む。ＰＲＶ  ｇＩＩＩ暗号領域はいくつかの合成ｐｏｘプロモーターの後に作成された。Ｓ−ＳＰＶ−００８の創製で利用した技術は、全ての４つのこれらのＰＲＶ糖蛋白質遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスを創製するのに使用されるであろう。かかる組換え豚痘ウイルスはＰＲＶ病に対するワクチンとして有用であろう。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−００８は受託番号ＶＲ２３３９の下でＡＴＣＣに寄託された。
例  ６
Ｓ−ＳＰＶ−０１３
Ｓ−ＳＰＶ−０１３は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸困β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇＣ）についての遺伝子を相同性ベクター５７０−３３．３２の唯一のＰｓｔＩ制限部位（唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０１３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター５７０−９１．６４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０１３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１２で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＭＳＫ細胞およびＶＥＲＯ細胞で行い、ＥＭＳＫ細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶで感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ヤギ抗−ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）ポリクローナル抗体を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１３感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）（３７）の報告されたサイズである２つの特異的バンド−９２ｋｄ成熟形態および７４ｋｄプレ−ゴルジ形態を示す。
組換体で発現されたＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）はマウスおよびブタにおいて有意な免疫応答を誘導することが示された（３７、３８）。さらにｇＩＩＩ（ｇＣ）をｇＩＩ（ｇＢ）またはｇ５０（ｇＤ）と共に発現させた場合、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（３９）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１３はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１３は受託番号２４１８の下でＡＴＣＣに寄託された。
組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を用いるアウエスキー病に対する保護
Ｓ−ＳＰＶ−００８およびＳ−ＳＰＶ−０１３を含有するワクチン（１×１０６ＰＦＵ／ｍｌ）（２種のウイルスの１：１混合物の２ｍｌ）を皮内接種または経口／咽頭スプレイによって、２群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には皮内および経口／咽頭接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から３週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較したＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３ワクチン接種体におけるアウエスキー病からの保護の増加を支持する。
0003939358.tif 000050
例  ７
Ｓ−ＳＰＶ−０１５
Ｓ−ＳＰＶ−０１５は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏｔＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０１５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７２７−５４．６０（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０１５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０１５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０１５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０１５で観察されたプラークは該抗血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基礎となろうことが示される。
ＰＲＶ  ｇＩＩ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０１５で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０１５感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ  ｇＩＩ糖蛋白質の予測されたサイズである、１２０ｋｄ、６７ｋｄおよび５８ｋｄに対応するバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタにおいて仮性狂犬病ウイルスに対するワクチンとして有用である。優れたワクチンは、ブタにおいて仮性狂犬病に対する保護のためにＳ−ＳＰＶ−００８（ＰＲＶ  ｇ５０）、Ｓ−ＳＰＶ−０１３（ＰＲＶ  ｇＩＩＩ）と戦うことによって処方される。
従って、Ｓ−ＳＰＶ−０１５はブタをＰＲＶ病から保護するためのワクチンとして価値があるはずである。ここに記載するＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらは、ワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR，ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。Ｓ−ＳＰＶ−０１５は受託番号２４６６の下でＡＴＣＣに寄託された。
例  ８
ＰＲＶ糖蛋白質の１種のみを発現する組換え豚痘ウイルスを用いることによって得ることができるものよりもＰＲＶ感染に対して保護する増強された能力を持つ組換え豚痘ウイルスを得るために、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対する中和抗体の産生を誘導できる、１種を超える仮性狂犬病糖蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスを構築する。
１種を超えるＰＲＶ糖蛋白質を発現するかかる組換え豚痘ウイルスのいくつかの例がある：ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩＩ（ｇＤ）を発現する組換え豚痘ウイルス、ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え豚痘ウイルス；ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）およびｇＩＩＩ（ｇＣ）を発現する組換え豚痘ウイルス；およびｇ５０（ｇＤ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇＩＩ（ｇＢ）を発現する組換え豚痘ウイルスを発現する組換え豚痘ウイルス。前記引用ウイルスの各々は、組換え豚痘ウイルスのクローニングを容易とするであろう大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有させ発現させるようにも設計される。
以下にリストするのは、ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）および大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルスの３つの例である。
ａ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
ｂ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
ｃ）ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する豚痘ウイルス。全ての４種の遺伝子は、豚痘ウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片内の唯一のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩＩ（ｇＣ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＥＰ２ＬＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩＩ（ｇＢ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、およびｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
組換え豚痘ウイルスワクチンＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３およびＳ−ＳＰＶ−０１５を用いるアウエスキー病に対する保護
Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５を含有するワクチン（１×１０７ＰＦＵ／ｍｌウイルスの２ｍｌ）またはＳ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、およびＳ−ＳＰＶ−０１５の混合物（３種ウイルスの１：１：１混合物の２ｍｌ；１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）を筋肉内接種によって、４群のブタ（群当たり５匹ブタ）に投与した。５匹ブタの対照群には筋肉内接種によってＳ−ＳＰＶ−００１を摂取させた。ワクチン接種から４週間後に、鼻孔内接種によってビルレントＰＲＶ株４９８２でブタを攻撃した。仮性狂犬病の臨床的徴候につき１４日間毎日ブタを観察し、表は臨床的応答の要約を与える。該データは、Ｓ−ＳＰＶ−００８、Ｓ−ＳＰＶ−０１３、またはＳ−ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは、Ｓ−ＳＰＶ−００１ワクチン接種対照と比較して、仮性狂犬病ウイルスによって引き起こされたアウエスキー病に対する部分的保護を有し、組合せワクチンＳ−ＳＰＶ−００８／Ｓ−ＳＰＶ−０１３／Ｓ−ＳＰＶ−０１５でワクチン接種したブタは完全な保護を有したことを示す。
0003939358.tif 000051
例  １７
種々の病気を引き起こす微生物からの抗原を発現させるための豚痘ウイルスを利用するワクチンの開発を企画することができる。
伝染性胃腸炎ウイルス
豚痘ウイルスベクターで使用する、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）の主要中和抗原、糖蛋白質１９５をクローン化した。該中和抗原のクローンは１９８７年７月２７日に出願された米国特許出願第０７８，５１９号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＴＧＥに適用できると考えられる。
ブタ・パルボウイルス
ブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）の主要キャプシド蛋白質を豚痘ウイルスベクターで使用するためにクローン化した。該キャプシド蛋白質は１９９１年１１月２６日に発行された米国特許第５，０６８，１９２号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＰＰＶに適用できると考えられる。
ブタ・ロタウイルス
ブタ・ロタウイルスの主要中和抗原、糖蛋白質３８を豚痘ウイルスベクターで使用するためにクローン化した。糖蛋白質３８のクローンは１９９１年１１月２６日に発行された米国特許第５，０６８，１９２号に開示されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＳＲＶに適用できると考えられる。
ブタ・コレラウイルス
ウシ・ウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルスの主要中和抗原を、１９８８年７月２７日に出願された米国特許出願第２２５，０３２号に開示されているごとくにクローン化した。ＢＶＤおよびブタ・コレラウイルスは交差保護性であるので（３１）、ＢＶＤウイルス抗原は豚痘ウイルスベクターで使用するために標的化されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はＢＶＤに適用できると考えられる。
セルプリナ・ヒオディセンテリエ（Serpulina Hyodysenteriae）
豚痘ウイルスベクターで使用するためのSerpulina Hyodysenteriae（３）の保護抗原はクローン化されている。ＰＲＶ  ｇ５０（ｇＤ）をＳＰＶにおいて発現させるのに使用された、および本明細書に開示した手法はSerpulina Hyodysenteriaeに適用できると考えられる。
以下の微生物からの抗原も動物ワクチンを開発するのに利用できる：ブタ・インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタ・コレラウイルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）、ブタ生殖系および呼吸器系症候群／ブタ不妊症および呼吸器系症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）。
以下の微生物からの抗原も動物ワクチンで利用できる：イヌ−ヘルペスウイルス、イヌ・ジステンパー、イヌ・アデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイルス２型（呼吸器系病）、パラインフルエンザ、レプトスピラ・カニコラ（Leptospira canicola）、イクテロヘモラジア（icterohemorragia）、パルボウイルス、コロナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、イヌ・ヘルペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Bordetella bronshiseptica）、ディロフィラエ・イミティス（Dirofilaria immitis）（イヌ糸状虫）および狂犬病ウイルス、２）ネコ−Ｆｉｖ  ｇａｇおよびｅｎｖ、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ・ヘルペスウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、イヌ・ヘルペスウイルス、イヌ・コロナウイルス、イヌ・パルボウイルス、（イヌおよびネコにおけるDirofilaria immitisを含めた）動物における寄生虫病、ウマ感染性貧血、ストレプトコッカス・エキィ（Streptococcus equi）、球虫類亜綱（coccidia）、エメリア（emeria）、ニワトリ貧血ウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ウシ・コロナウイルス、パステレラ・ヘマリティカ（Pasteurella haemolytica）。
例  ２４
相同性ベクター７３８−９４．４
相同性ベクター７３８−９４．４は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスベクターである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレームに挿入した。ｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。該相同性ベクター７３８−９４．４は、Ｏ１Ｌ  ＯＲＦの一部を示すヌクレオチド１６７９〜２４５２（配列番号：１８９）からのＳＰＶ  ＤＮＡの欠失を含む。
ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000052
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって上流ＳＰＶ配列を合成してＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得た。Ｏ１Ｌプロモーターはこの断片上に存在する。ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000053
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって下流ＳＰＶ配列を合成してＳａｌＩおよびＨｉｎＩＩＩ末端を持つ１１１３塩基対断片を得た。組換え豚痘ウイルスは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７３８−９４．４およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１（Kansza株）を利用して誘導した。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色フラーク精製の最終結果は該組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された組換え豚痘ウイルスは、外来性抗原を発現させるための発現ベクターとして、および組換え豚痘ウイルスによって発現された外来遺伝子に対して動物で保護免疫応答を生起させるためのワクチンとして利用される。Ｏ１Ｌプロモーターに加えて、ＬＰ１、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、ＨＣＭＶ即時型を含めた他のプロモーターが欠失領域に挿入され、１以上の外来遺伝子がこれらのプロモーターから発現される。
例  ２４
相同性ベクター７５２−２２．１は２つの外来遺伝子を発現させるのに利用される豚痘ウイルスベクターである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）についての遺伝子をＯ１Ｌオープンリーディングフレームに挿入した。このｌａｃＺ遺伝子はＯ１Ｌプロモーターの制御下にある。第２の外来遺伝子は、ＬＰ２ＥＰ２プロモーター配列に従ってＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位に挿入されたＬＰ２ＥＰ２プロモーターから発現される。相同性ベクター７５２−２２．１は、Ｏ１Ｌ  ＯＲＦの一部を欠失するヌクレオチド１６７９〜２４５２（配列番号：１８９）からのＳＰＶ  ＤＮＡの欠失を含む。相同性ベクター７５２−２２．１はＬＰ２ＥＰ２プロモーター断片の挿入によって相同性ベクター７３８−９４．４から誘導された（材料および方法参照）。相同性ベクター７５２−２２．１は、合成ＬＰ１プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を入れることによってさらに改良される。該ＬＰ１プロモーターの結果、ＳＰＶ  Ｏ１Ｌプロモーターと比較してより高いレベルのｌａｃＺ発現となる。
例  ２５
Ｓ−ＳＰＶ−０４１：
Ｓ−ＳＰＶ−０４１は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸困β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を７３８−９４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＥＨＶ−１  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５２−２９．３３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４１はウマにおいてＥＨＶ−１感染に対するワクチンとして有用であって、ＥＨＶ−１糖蛋白質Ｂの発現に有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０４５：
Ｓ−ＳＰＶ−０４５は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）についての遺伝子を７３８−９４．４ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４６−９４．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４５はＩＢＲＶ糖蛋白質Ｅの発現に有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０４９
Ｓ−ＳＰＶ−０４９は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質４８（ｇｐ４８）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇｐ４８遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７７１−５５．１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４９はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質４８の発現に有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０５０：
Ｓ−ＳＰＶ−０５０は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇｐ５３）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇＥ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６７−６７．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０５０はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。
例  ２６
各々ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）を発現する組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０４２またはＳ−ＳＰＶ−０４３は、家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。ニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物インターロイキン−６蛋白質と相同であり、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）は哺乳動物インターフェロンと相同である。特異的鳥類病に対するワクチンと組み合わせて用いると、Ｓ−ＳＰＶ−０４２およびＳ−ＳＰＶ−０４３は、限定されるものではないが、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、感染性気管支炎、感染性包病ウイルスを含めた鳥類を引き起こすウイルスに対して増強された粘液性、体液性、または細胞媒介免疫を供する。
例  ２６Ａ
Ｓ−ＳＰＶ−０４２：
Ｓ−ＳＰＶ−０４２は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１−０７．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４２は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２条件培地のニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞培養への添加は、水泡性口内炎ウイルスによる、またはシチメンチョウのヘルペスウイルスによるＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＳＰＶ−０４２は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強するのに有用である。
例  ２６Ｂ
Ｓ−ＳＰＶ−０４３：
Ｓ−ＳＰＶ−０４３は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＭＧＦ）についての遺伝子をＳＰＶ６１７−４８．１  ＯＲＦ（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｏＩ制限部位で置き換えた）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後記プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７５１−５６．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４３は家禽の病気に対するワクチンに添加すると、免疫応答を増強させるのに有用である。
例  ２７
非必須部位の、豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の２．０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢｇｌＩＩ領域への挿入
豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢｇｌＩＩ領域は外来性ＤＮＡのＳＰＶへの挿入で有用である。外来性ＤＮＡは該領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入される（配列番号：１９５のヌクレオチド５４０）。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って、外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを用いて外来性ＤＮＡを含有するＳＰＶを得る。この手法が首尾よく行われるためには、挿入部位がＳＰＶの複製に必須でない領域にあって、該部位に、ウイルスとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するのに適した豚痘ウイルスＤＮＡがその端部に隣接することが重要である。豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢｇｌＩＩ領域における唯一のＢｇｌＩＩ制限部位はＳＰＶ  Ｉ４Ｌオーブンリーディングフレームの暗号領域内に位置する。該Ｉ４Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスおよび天然痘ウイルス・リボヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子（５６−５８）に対して配列同様性を有する。該リボヌクレオチド・レダクターゼ（大サブユニット）遺伝子はワクシニアウイルスのＤＮＡ複製に非必須であって、豚痘ウイルスにおける適当な挿入部位である。
例  ２８
Ｓ−ＳＰＶ−０４７
Ｓ−ＳＰＶ−０４７は２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＢｇｌＩＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ亜断片内にあるＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー）に挿入した。該ＢｇｌＩＩ挿入部位は、ワクシニアウイルス・リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に対して有意な相同性を有するＳＰＶ  １４Ｌオープンリーディングフレーム内にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９９−９４．３１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０４７を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０４７プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０４７で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４７で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４７感染細胞からの溶解物は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンドを呈した。
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ  ｇＢはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；例８参照）。さらに、ＰＲＶ  ｇＢを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０４７はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋＲ、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋＲおよびＣｌｉｎＥａｓｅＲ）と適合するであろう。
Ｓ−ＳＰＶ−０５２
Ｓ−ＳＰＶ−０５２は３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｄｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５２を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５２プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５２で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５２で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５２感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ  ｇＢおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；例８参照）。さらに、ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５２はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
Ｓ−ＳＰＶ−０５３
Ｓ−ＳＰＶ−０５３は３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５３を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５３で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＣ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５３感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンドを呈した。
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ  ｇＢおよびｇＣはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；例８参照）。さらに、ＰＲＶ  ｇＢおよびｇＣを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５３はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
Ｓ−ＳＰＶ−０５４
Ｓ−ＳＰＶ−０５４は３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＳＰＶ ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５４を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５４プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５４で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＰＲＶ  ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５４感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンド、およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ  ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を刺激することが示されている（３７、３８；例８参照）。さらに、ＰＲＶ  ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５４はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
Ｓ−ＳＰＶ−０５５
Ｓ−ＳＰＶ−０５５は４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルスｇＢ（ｇＩＩ）についての遺伝子を唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＮｅＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカー；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のほぼ５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩ亜断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；）が欠失されている）に挿入した。ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）およびＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）についての遺伝子を唯一のＰｓｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＯｌＬオープンリーディングフレーム中の唯一のＡｃｃＩ部位に挿入されたＰｓｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ（ｇＩＩ）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＤ（ｇ５０）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＰＲＶ  ｇＣ（ｇＩＩＩ）遺伝子は合成初期／後記プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８９−４１．７３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５５を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０５５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５５で観察されたプラークはブタ抗−ＰＲＶ血清と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＰＲＶ  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＰＲＶポリクローナル血清を用いてＰＲＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５５感染細胞からの溶解物および上清は、ＰＲＶ糖蛋白質Ｂの予測されるサイズである１２０ｋＤ、６７ｋＤおよび５８ｋＤに対応するバンド；ＰＲＶ糖蛋白質Ｃの予測されるサイズである９２ｋＤに対応するバンド；およびＰＲＶ糖蛋白質Ｄの予測されるサイズである４８ｋＤに対応するバンドを呈した。
ＳＰＶ組換え体で発現されたＰＲＶ  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤはブタにおいて有意な免疫応答を誘発することが示されている（３７、３８；例８参照）。さらに、ＰＲＶ  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤを組換えＳＰＶで発現させ、ビルレントＰＲＶでの攻撃からの有意な保護が得られる（例６および８参照）。従って、Ｓ−ＳＰＶ−０５５はＰＲＶ病に対してブタを保護するためのワクチンとして価値がある。ここに記載したＰＲＶワクチンはＰＲＶ  ｇＸまたはｇＩを発現しないので、それらはワクチン接種動物を感染動物から区別するのに利用される現行ＰＲＶ診断テスト（ｇＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋR、ｇＩ  ＨｅｒｄＣｈｅｋRおよびＣｌｉｎＥａｓｅR）と適合するであろう。
例  ２９
ＳＰＶ−０５９
Ｓ−ＳＰＶ−０５９は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内にあるＳＰＶ  Ｂ１８Ｒオープンリーディングフレーム中の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ６．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の３．２ｋｂ領域の部分配列は、３つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｂ１８Ｒ  ＯＲＦはワクシニアウイルスＢ１８Ｒ遺伝子、ウサギ線維腫ウイルスからの７７．２Ｋ蛋白質、ワクシニアウイルスＣ１９Ｌ／Ｂ２５Ｒ  ＯＲＦおよびヒト脳変異体からのアンキリン反復領域に相同な配列を示す。該Ｂ１８Ｒ遺伝子は高親和性および広い特異性を持つ可溶性インターフェロン受容体をコードする。ＳＰＶ  Ｂ４Ｒオープンリーディングフレームはウサギ線維腫ウイルスのＴ５蛋白質に相同の配列を示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０５９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−５０．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−５０．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ６．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片中の唯一のＥｃｏＲＩ部位（平滑末端化）への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０５９を精製し、これは外来遺伝子、大腸菌ｕｉｄＡを発現し、これは７．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
ＳＰＶ−０６０
Ｓ−ＳＰＶ−０６０は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニターゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎゲノム断片内にある唯一のＥｃｏＲＶ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片（配列番号）の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６０はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．３１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．３１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片（図２９Ａ）中の唯一のＥｃｏＲＶ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６０と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。Ｓ−ＳＰＶ−０６０を精製し、これは外来遺伝子、大腸菌ｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のＥｃｏＲＩ部位が外来遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６１
Ｓ−ＳＰＶ−０６１は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎゲノム断片内にある唯一のＳｎａＢＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．４１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．４１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片中の唯一のＳｎａＢＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０６１を精製し、これは外来遺伝子、大腸菌ｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のＳｎａＢＩ部位が外来遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６２
Ｓ−ＳＰＶ−０６２は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニダーゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ）を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎゲノム断片内にある唯一のＢｇｌＩＩ制限部位に挿入した（図１１Ａ）。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＳＰＶ  ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片の部分配列は、２つの可能なオープンリーディングフレームを示す。ＳＰＶ  Ｉ７Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルスの蛋白質Ｉ７に相同な配列を示す。該ＳＰＶ  Ｉ４Ｌオープンリーディングフレームは、ワクシニアウイルスのリボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ遺伝子に相同の配列を示す。Ｉ４Ｌ  ＯＲＦおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦの間の、２つの可能なオープンリーディングフレームＩ５ＬおよびＩ６Ｌは機能が未知である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６２はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−７１．５１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター７９６−７１．５１はプラスミド５５１−４７．２３（材料および方法参照）からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡカセットを含有する平滑末端化されたＮｃｏＩ断片の、ＳＰＶ３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片中の唯一のＢｇｌＩＩ部位への挿入によって創製された。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０６２を精製し、これは外来遺伝子、大腸菌ｕｉｄＡを発現し、これは３．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のＢｇｌＩＩ部位が外来遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来遺伝子に対する抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
例  ３０：
合成初期または合成痘プロモーターの制御下にある大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する組換え豚痘ウイルス
各々、合成痘プロモーターＬＰ１、ＬＰ２、およびＥＰ１の制御下にある大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する３つの組換え豚痘ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７、およびＳ−ＳＰＶ−０５８を構築した。
Ｓ−ＳＰＶ−０５６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．１９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５７はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９１−６３．４１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。Ｓ−ＳＰＶ−０５８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７９６−１８．９（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
組換え豚痘ウイルスはヒト細胞系において大腸菌β−ガラクトシダーゼのごとき外来遺伝子を発現するが、ヒト細胞系において複製しない。外来遺伝子の発現を最適化するために、Ｓ−ＳＰＶ−０５６、Ｓ−ＳＰＶ−０５７およびＳ−ＳＰＶ−０５８を用いて、初期または後期合成ポックスウイルス・プロモーターの制御下にある大腸菌β−ガラクトシダーゼの最適発現レベルを比較する。組換え豚痘ウイルスの発現が欠失されているヒト細胞系は、限定されるものではないが、１４３Ｂ（骨肉腫）、Ａ４３１（類表皮癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ｃａｐａｎ−１（肝臓癌）、ＣＦ５００（包皮繊維芽細胞）、Ｃｈａｎｇ  Ｌｉｖｅｒ（肝臓）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（ダウン包皮繊維芽細胞）、ＨＥＬ−１９９（胚性肺）、ＨｅＬａ（子宮頸部癌）、ＨＥｐ−２（表皮咽頭癌）、ＨＩＳＭ（腸平滑筋）、ＨＮＫ（新生児腎臓）、ＭＲＣ−５（胚性肺）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（肺粘膜表皮癌）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＲＤ（横紋筋肉腫）、ＴＨＦ（単球白血球）、ＷＩＬ２−ＮＳ（Ｂリンパ球系、非分泌）、ＷＩＳＨ（羊膜）を含む。
例  ３１
Ｓ−ＳＰＶ−０５１
Ｓ−ＳＰＶ−０５１は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖蛋白質５３（ｇ５３）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０５１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８３−３９．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０５１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０５１を、ＰＲＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ＢＶＤＶ  ｇ５３に対するマウス・モノクローナル抗体はＳ−ＳＰＶ−０５１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０５１で観察されたプラークはＢＶＤＶ  ｇ５３に対するモノクローナル抗体と反応し、これは該ウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＢＶＤＶ  ｇ５３遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０５１で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ＢＶＤＶ  ｇ５３に対するモノクローナル抗体を用いてＢＶＤＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０５１感染細胞からの溶解物および上清は、ＢＶＤＶ  ｇ５３蛋白質の糖鎖付加および非糖鎖付加形態を示す５３ｋｄおよびそれを超えるバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０５１はウシにおいてＢＶＤＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＢＶＤＶ糖蛋白質５３の発現に有用である。
例  ３２：
Ｓ−ＳＰＶ−０４４：
Ｓ−ＳＰＶ−０４４は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および感染性包病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ蛋白質についての遺伝子を６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７４９−７５．７８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４４はＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質の発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０４４は組換えＩＢＤＶ弱毒化ワクチンに対するイン・ビトロのアプローチで有用である。Ｔ３またはＴ７プロモーター（pBlueScriptプラスミド；Stratagene, Inc.）を用いて弱毒化ＩＢＤＶ株からのＲＮＡ鎖を細菌発現系で合成して、ＩＢＤＶゲノムの二本鎖短鎖および長鎖セグメントを合成する。豚痘ウイルスはＩＢＤＶポリメラーゼを発現するが、ＣＥＦ細胞中で複製しない。Ｓ−ＳＰＶ−０４４から産生されたＩＢＤＶポリメラーゼは、二本鎖ＲＮＡゲノム鋳型から感染性弱毒化ＩＢＤＶウイルスを合成する。得られた弱毒化ＩＢＤＶウイルスはニワトリにおいて感染性包病に対するワクチンとして有用である。
例  ３３：
Ｓ−ＳＰＶ−０４６
Ｓ−ＳＰＶ−０４６は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇプロテアーゼ（ｇａｇ）についての遺伝子を７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＯｌＬプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７６１−７５．Ｂ１８（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
ＦＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０４６で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ネコ抗−ＦＩＶ（ＰＰＲ株）血清を用いてＦＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０４６感染細胞からの溶解物および上清は、ＦＩＶ  ｇａｇ蛋白質の予測されたサイズである２６ｋｄおよび１７ｋｄにおけるバンドを呈した。組換え豚痘ウィルスにより発現されたＦＩＶ  ｇａｇ蛋白質は適当に加工され、培地に分泌された。
Ｓ−ＳＰＶ−０４８
Ｓ−ＳＰＶ−０４８は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１ ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｃｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＦＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０４８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター７８１−８４．Ｃ１１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０４８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０４６およびＳ−ＳＰＶ−０４８は単独でまたはネコにおけるＦＩＶ感染に対するワクチンとしての組合せにおいて有用であって、ＦＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質の発現に有用である。ＦＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質双方を発現する組換え豚痘ウイルスはネコにおいてＦＩＶ感染に対するワクチンとして有用である。
ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスＦおよびＧ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスはヒトの病気に対するワクチンとして有用である。
例  ３４
組換えポックスウイルスで発現されたニワトリＩＦＮのイン・ビトロ特性
細胞培養における組換えウイルスの増殖特性。野生型豚痘ウイルスと比較して、Ｓ−ＳＰＶ−０４２は胚性ブタ腎臓細胞（ＥＳＫ−４）において増殖しなかった。
ＳＰＶ／ｃＩＦＮ組換えウイルスで感染させた細胞からの上清につきウェスタンブロット分析を行った。ウサギおよびマウス抗血清を、濃縮ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染不和済みからのｃＩＦＮに対して生起させ、ウェスタン分析用の調製において、野生型ＳＰＶで感染させたＥＳＫ−４細胞に対して予め清澄化させた。ウサギおよびマウス抗−ｃＩＦＮ抗血清は、組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮおよびＳＰＶ野生型ウイルス感染上清からのニトロセルロース上の変性蛋白質と反応した。１７−２０キロダルトンの推定分子量サイズ範囲を持つ反応性バンドがＳＰＶ／ｃＩＦＮレーンに存在し、ＳＰＶ野生型対照レーンでは存在しなかった。
水泡性口内炎ウイルスの増殖に対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ（Ｓ−ＳＰＶ−０４２）、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ、およびＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮの効果
ＳＰＶ／ｃＩＦＮ、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ｃＩＦＮ感染細胞からのビリオン清澄化上清をウイルス阻害活性の存在につきテストし、結果を表１に示す。略言すれば、ＣＥＦ細胞を系列希釈したウイルス上清と共にインキュベートした。引き続いて、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の４０，０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルを添加し、４８時間後にＶＳＶ細胞障害効果（ＣＰＥ）につきウェルをスコア取りした。ｃＩＦＮを含有する組換えウイルス上清はＶＳＶ誘導ＣＰＥを阻害することが示され、他方、対照ウイルス上清は阻害しなかった。ＶＳＶ誘導細胞障害効果はウサギ抗−ｃＩＦＮ血清の存在下では逆になったであろう。
0003939358.tif 000054
シチメンチョウのヘルペスウイルスに対するＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞の上清から発現されたｃＩＦＮの効果
ＳＰＶ／ｃＩＦＮウイルスで感染したＥＳＫ−４細胞からの組換えｃＩＦＮを含有する上清を、ＣＥＦ細胞におけるシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の増殖を阻害するその活性につきテストし、結果を表２に示す。略言すれば、系列希釈上清をＣＥＦ細胞と共にインキュベートし、次いで、１００ｐｆｕ／ウェルの野生型ＨＶＴで感染させた。４８時間後に全てのウェルでプラークを計数した。１０−１００単位のｃＩＦＮ活性はＨＶＴ（１００ｐｆｕ／ウェル）のプラーク形成を阻害した。野生型ＳＰＶからの上清はＨＶＴプラーク形成を阻害しなかった。
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ＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたｃＩＦＮでの処理の後におけるニワトリ・マクロファージによるＮＯの誘導
ＨＤ１１細胞または骨髄接着性細胞をＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清からの１０００単位／ｍｌのｃＩＦＮ、リポ多糖（ＬＰＳ）（９ｎｇ／ｍｌ）またはｃＩＦＮおよびＬＰＳ双方と共にインキュベートし、結果を表３に示す。２４時間後、上清流体を収集し、亜硝酸塩レベルを測定した。これらのデータは、ＳＰＶ／ｃＩＦＮ上清から発現されたｃＩＦＮがＬＰＳの存在下でニワトリ・マクロファージを活性化する能力を有することを示す。
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結論：
１．組換え豚痘ウイルスは、ＶＳＶ感染からのＣＥＦ細胞の保護によって測定して、生物学的に活性なニワトリ・インターフェロンを感染細胞の上清中に発現する。
２．組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたニワトリ・インターフェロンは用量依存的にＨＶＴでの感染に対してＣＥＦ細胞を保護することが示された。
３．ＳＰＶ／ｃＩＦＮから発現されたニワトリ・インターフェロンはＰＬＳと相乗的に作用して、一酸化窒素誘導によって検出して、ニワトリ・マクロファージを活性化する。
４．前記データは、ニワトリＩＦＮを発現する組換え豚痘ウイルスがイン・ビトロ、イン・ビボおよびイン・オボにおいて免疫変調剤として遊離な適用を有し得ることを示す。
例  ３５
ウイルスベクターによるデリバリー系および／またはサブユニット・アプローチを用いるＩＢＤワクチンの構築の別法として、ＩＢＤウイルスＲＮＡを直接操作して、大（セグメントＡ）および小（セグメントＢ）二本鎖ＲＮＡサブユニット双方を表すｃＤＮＡクローンから誘導された全長ＲＮＡを用いてウイルスを再構築する。ＩＢＤウイルスの生成はこのようにして最初の２つのアプローチよりも優れたいくつかの利点を与える。まず、もしＩＢＤウイルスをＲＮＡ鋳型を用いて再度生成すれば、転写（ＲＭＡの生成）に先立ってウイルス・ゲノムのクローン化ｃＤＮＡコピーを操作することができる。このアプローチを用い、ビルレントＩＢＤ株を弱毒化するか、あるいは弱毒化ワクチン骨格のＶ２可変領域をビルレント株のそれで置き換えることができる。そうする場合において、本発明は、ワクチン株の安全性および効率を供しつつ、ビルレントＩＢＤ株に対する保護を提供する。さらに、このアプローチを用い、本発明により、関連ビルナウイルス感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）から誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＰＮＶから誘導されたポリプロテインを用いて生成した温度感受性ＩＢＤウイルスが構築されテストされる。ＩＰＮＶポリメラーゼはＩＢＤＶのそれよりも低い温度で最適活性を有する。もしＩＰＮＶポリメラーゼがＩＢＤＶ上に存在する調節シグナルを認識すれば、ハイブリッド・ウイルスはニワトリに存在する高温で弱毒化されることが期待される。別法として、ＩＢＤＶ血清型２ウイルスから誘導されたＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶ血清型１ウイルスから誘導されたポリプロテインを用いて生成されたＩＢＤウイルスを構築しテストできる。
最初にBursaVacワクチン株（Sterwin Labs）を用いて、ＩＢＤＶの完全なゲノム（二本鎖ＲＮＡセグメントＡおよびＢ）を表すｃＤＮＡクローンを構築する。一旦セグメントＡおよびＢの全長コピーを表すｃＤＮＡクローンが構築されたならば、鋳型ＲＮＡが調製される。ＩＢＤＶは二セグメント化二本鎖ＲＮＡウイルスとして存在するので、pBlueScriptプラスミド（Stratagene, Inc.）を用いて、各セグメントのセンスおよびアンチセンス両ＲＮＡ鎖を得る。これらのベクターは、イン・ビトロで実質量のＲＮＡを得るために高度に特異的なファージ・プロモーターを利用する。唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を３’ＰＣＲプライマーに作成して、転写の間にラン−オフ転写体の生成のためにＤＮＡを線状化する。
精製されたＲＮＡ転写体（４鎖）をニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）にトランスフェクトして該ＲＮＡが感染性であるか否かを判断する。ＩＢＤＶ特異的Ｍａｂｓを用いる黒色プラーク・アッセイによって判断してもしＩＢＤウイルスが生成すれば、さらなる操作は必要ではなく、ワクチン株の作成を開始できる。この方法の利点は、このようにして作成されたＩＢＤウイルスは純粋でほとんど／全く精製を要せず、新しいワクチンを創製するのに要する時間を大幅に減少させるということである。もし精製されたＲＮＡを用いて陰性結果が得られれば、ヘルパーウイルスの使用による機能的ウイルスＲＮＡポリメラーゼが必要である。ビルナウイルスは鎖置き換え（半保存的）メカニズムによってその核酸を複製し、ＲＮＡポリメラーゼは二本鎖ＲＮＡ分子の末端に結合し、環化された環構造を形成する（Muller & Nitschke, Virology 159, 174-177, 1987）。豚痘ウイルスにおける約８７８アミノ酸のＲＮＡポリメラーゼ・オープンリーディングフレームを発現させ、この組換えウイルス（Ｓ−ＳＰＶ−０４４）を用いて、イン・トラントにて機能的ＩＢＤＶ  ＲＮＡを得る。ウイルス・ベクターの生成的複製の徴候がない場合、豚痘ウイルスは免疫学的に認識可能な外来性抗原を鳥類細胞（ＣＥＦ細胞）にて発現した。本発明においては、ＳＰＶ複製で細胞を汚染することくなく、豚痘ベクターを用いてＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質をトリンスフェクトしたＲＮＡとして同一細胞内で発現させる。
ゲノムＲＮＡを用いてＩＢＤウイルスはイン・ビトロで生成されるということが証明されれば、感染性包病に対する改良された弱毒化ウイルス生ワクチンが開発される。生成するＩＢＤウイルスの新しく規定された系と共に組換えＤＮＡ技術を用いて、弱毒化ウイルスの構築を容易とするウイルス・ゲノム内の特異的欠失が作成される。この技術を用い、病原性の原因となるＩＢＤＶの領域および弱毒化された免疫原性ＩＢＤＶワクチンが同定される。本発明はビルレントＩＢＤ株または弱毒化ワクチン骨格のＶＰ２可変領域のビルレント株のそれでの置き換えを提供し、かくして、ワクチン株の安全性および効果を供しつつ、ビルレント株に対して保護する。
例  ３６
シチメンチョウのヘルペスウイルスの増殖に対するウサギ抗−ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）抗体の効果
ＳＰＶ／ｃＩＰＮ（ＳＰＶ０４１）感染ＥＳＫ−４細胞からの上清を感染４８時間後に収穫し、次いで、Centricon 10カラム（Amicon）によって５−１０倍濃縮した。１ｍｌの濃縮上清をウサギに３週間間隔で３回注射し、次いで、血液採取した。次いで、このウサギ抗血清を培養で用いて、ＨＶＴの増殖に対するインターフェロンの効果を調べた。抗−ｃＩＦＮはプラーク・アッセイにおいてｃＩＦＮの添加によって誘導されたＨＶＴ（１：２００）およびＶＳＶ（１：８０）に対するブロックを逆行させることが示された。さらに、ＨＶＴウイルスＤＮＡのサブ−プラーキング・レベルで一時的にトランスフェクトしたＣＥＦの培地中への抗−ｃＩＦＮの添加（１：１００）は、ＨＶＴプラークの形成（２００プラーク／ウェル）を増強させることが示された。抗−ｃＩＦＮの不存在下でＨＶＴ ＤＮＡでトフンスフェクトしたＣＥＦはプラークを生じなかった。
ＨＶＴはＣＥＦから産生されたインターフェロンに高度に感受性であって、ｃＩＦＮをブロックした場合、ＨＶＴ増殖が増強された。
出願人は、（１）ワクチン・ストックにおいてＨＶＴ力価を増加させるための添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用；（２）コスミド再構築を介する新しい組換えＨＶＴウイルスの形成を容易とするための添加剤としてのｃＩＦＮに対する抗体の使用を含める。
Ｓ−ＳＰＶ−０６３
Ｓ−ＳＰＶ−０６３は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＰ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子を、ＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−４１．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６３を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０６３プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６３で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清またはヤギ抗−ＮＰ血清と反応し、これは該ウイルスがＳＩＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６３で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＰポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６３感染細胞からの溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＮＰ蛋白質の予測されるサイズである５６ｋｄに対応するバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０６３はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６３はＮＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ  ＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５と組み合わせたワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６４
Ｓ−ＳＰＶ−０６４は１つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を６．９ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊゲノム断片内の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入した。該ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊゲノム断片はＡ５０Ｒ  ＯＲＦの一部（ａａ２２７〜５５２）を含有する。唯一のＸｈｏＩ部位はＡ５０Ｒ  ＯＲＦ内にはない。ＸｈｏＩ部位は豚痘ウイルス・ゲノムの３’末端から２５ｋｂにある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−４２．２８およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。相同性ベクター８０７−４２．２８は、プラスミド５５１−４７．２３からのＬＰ２ＥＰ２プロモーターｕｉｄＡ遺伝子カセットを含有するＮｏｔＩ断片（材料および方法参照）の、６．９ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ断片中のＮｏｔＩ部位（ＤＮＡリンカーによって唯一のＸｈｏＩ部位はＮｏｔＩに変換した）への挿入によって生成した。「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスについてのスクリーニングスクリーニング」によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウィルスを、β−グルクロニダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察されたプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０６４を精製し、これは外来遺伝子、大腸菌ｕｉｄＡを発現し、これは６．９ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ断片内のＸｈｏＩ部位がウイルス増殖に必須でない部位であって外来遺伝子のための安定な挿入部位であることを示す。この挿入部位を利用する組換え豚痘ウイルスは外来遺伝子の発現に、病気に対するワクチンとして、または発現された外来遺伝子に対して抗体を生起させるための発現ベクターとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６５
Ｓ−ＳＰＶ−０６５は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−８４．３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６５を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０６５プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６５で観察されたプラークはブタ抗−ＳＩＶ血清と反応した。ＳＩＶ外来遺伝子。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６５で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６５感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０６５はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＰの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６５はＮＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６６およびＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６６
Ｓ−ＳＰＶ−０６６は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０７−８４．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６６と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０６６で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＮＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６６感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄに対応するバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０６６はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６６はＨＡを発現するＳ−ＳＰＶ−０６５およびＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０７１
Ｓ−ＳＰＶ−０７１は少なくとも４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ、およびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７−８６．３５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７１を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清はＳ−ＳＰＶ−０７１プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７１で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳＰＶ−０７１で感染させ、感染細胞溶解物の試料および培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。「ウェスタンブロッティング法」を用いて、該ゲルをブロットし、分析した。ブタ抗−ＳＩＶポリクローナル血清またはヤギ抗−ＨＡポリクローナル血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白質の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０７１感染細胞からの細胞溶解物および上清は、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白質の予測されるサイズである６４ｋｄおよび５２ｋｄに対応するバンドを呈した。
Ｓ−ＳＰＶ−０７１はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０７４
Ｓ−ＳＰＶ−０７４は少なくとも４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）およびＮＡ（Ｈ１Ｎ１）についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１７−１４．２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７４と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０７４を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ブタ抗−ＳＩＶ血清はＳ−ＳＰＶ−０７４プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０７４で観察されたプラークはヤギ抗−ＨＡ血清と反応し、これはウイルスがＳＩＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−０７４はブタにおいてＳＩＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡの発現で有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７４はＳＩＶ  ＮＰを発現するＳ−ＳＰＶ−０６３と組み合わせたワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−０６８
Ｓ−ＳＰＶ−０６８は少、なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびニワトリマクロわーじ移動阻害因子（ｃＭＩＦ）についての遺伝子を、７３８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６７９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ｃＭＩＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８０２−９５．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−０６８と命名した組換えウイルスであった。このウイルスを、材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性についてアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定で、且つ外来遺伝子を発現することを示す。
ｃＭＩＦ遺伝子産物の発現を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−０６８を細胞に感染させ、感染細胞溶解物のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲルを、ウエスタンブロット法を用いてブロッティングし、分析した。ポリクローナルヤギ抗ヒトｃＭＩＦ抗体を用いて、ｃＭＩＦ特異的な抗体の発現を検出した。Ｓ−ＳＰＶ−０６８感染細胞からの細胞溶解物は、ｃＭＦＩ蛋白の予想サイズである略１５ｋｄに対応したバンドを示した。
Ｓ−ＳＰＶ−０６８は、マクロファージの移動を阻害するため、および鳥類病原体による感染に対して免疫を刺激するための、ニワトリにおけるワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０６８は、ｃＭＩＦの発現のために有用である。
相同性ベクター８０２−９５．Ａ１
プラスミド８０２−９５．Ａ１は、外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築された。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびニワトリマクロファージ移動阻害因子（ｃＭＩＦ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いるれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルス０１Ｌマーカー遺伝子プロモーターの制御下にあり、ｃＭＩＦ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。このＬＰ２ＥＰ２  ｃＭＩＦ遺伝子カセットは、相同性ベクター７５５−２２．１のＢａｍＨＩ部位に挿入された。相同性ベクター８０２−９５．Ａ１は、下記の起源に由来する制限断片を合成ＤＮＡ配列を用いて連結することにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｐｈＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得るための、ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000057
を用いたポリメラーゼ鎖反応によって合成された、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対亜断片である。断片２は大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡの逆転写酵素およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ほぼ１７２８塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。逆転写およびＰＣＲに用いたアンチセンスプライマーは、
0003939358.tif 000058
であった。ＰＣＲに用いたセンスプライマーは、
0003939358.tif 000059
であった。ｃＭＩＦの本来のメチオニンコドンに先行して、ｍｅｔ−ａｓｎ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｌｙｓのためのコドンが存在している。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１１３塩基対亜断片であり、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をもつ１１１３塩基対断片を得るためのプライマー：
0003939358.tif 000060
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成した。
Ｓ−ＳＰＶ−０６９
Ｓ−ＳＰＶ−０６９は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）蛋白質についての遺伝子をＳＰＶ  ７２８−９４．４  ＯＲＦ（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；ヌクレオチド１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０６９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８１０−２１９．Ａ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０６９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現についての黒色プラーク・スクリーニング」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−０６９を、ＳＩＶ特異的抗原の発現につきアッセイした。ＨＲＳＶ  Ｆに対するモノクローナル抗体６２１（Biodesign, Inc.）はＳ−ＳＰＶ−０６９プラークと特異的に反応するがＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは特異的に反応しないことが示された。全てのＳ−ＳＰＶ−０６９で観察されたプラークはモノクローナル抗体６２１と反応し、これはウイルスがＰＲＶ外来遺伝子を安定に発現していたことを示す。ここに記載したアッセイをＥＳＫ−４細胞で行い、ＥＳＫ−４細胞はＳＰＶ組換えワクチンの生産のために適した基礎となろうことが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−０７８
Ｓ−ＳＰＶ−０７８は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）蛋白質についての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−４８．１  ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７８はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０６９およびＳ−ＳＰＶ−０７８はブタにおいてヒト呼吸器系シンシチウムウイルス感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＨＲＳＶ  ＦおよびＧ遺伝子の発現に有用である。
相同性ベクター８１０−２９．Ａ２
プラスミド８１０−２９．Ａ２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）融合（Ｆ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルス０１Ｌマーカー遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ末端をもつ８５５塩基対断片を得るための、ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000061
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対亜断片である。断片２は大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写酵素およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ１７２８塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000062
はＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子の５’末端から合成し；遺色子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ開始コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000063
はＦ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子に対応する長さの断片１７２８塩基対を得た。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をもつ１１１３塩基対断片を得るための、プライマー
0003939358.tif 000064
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１１３塩基対亜断片である。
相同性ベクター８２２−５２Ｇ．７．
プラスミド８２２−５２Ｇ．７は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＲＳＶ）付着（Ｇ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１４８４塩基対断片がある。外来遺伝子の下流にはＳＰＶ ＤＮＡのほぼ２１４９塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。それは、以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６５（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＡｃｃＩ〜ＢｇｌＩＩ制限亜断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３００６塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＨＲＳＶ株Ａ２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２）からのＲＮＡを用い、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したほぼ８９９塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000065
はＨＲＳＶ  Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧ停止コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000066
はＨＲＳＶ  Ｇ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＨＲＳＶ Ｇ遺伝子に対応する長さの断片８９９塩基対を得た。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＡｃｃＩ制限部位亜断片である。
相同性ベクター８０７−４１．３
プラスミド８０７−４１．３は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入する目的で構築した。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白質（ＮＰ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られるであろう。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＰ遺伝子のほぼ１５０１塩基対ＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ断片である。プライマー
0003939358.tif 000067
は、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の５’末端から合成して末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、プライマー
0003939358.tif 000068
は、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の３′末端から合成してＥｃｏＲＩ部位を遺伝子の３′末端に導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子に対応する長さの断片１５０１塩基対を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｕｖＩＩ制限断片である。断片４はＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｎ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。
相同性ベクター８０７−８４．８
プラスミド８０７−８４．８は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従って該プラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ断片である。プライマー
0003939358.tif 000069
はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ遺伝子を導入する。プライマー
0003939358.tif 000070
はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４はほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩ〜断片Ｍ（２３）である。
相同性ベクター８０７−８４．３５
プラスミド８０７−８４．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための手法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩ〜ＢｇｌＩＩ断片である。プライマー
0003939358.tif 000071
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000072
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。
相同性ベクター８０７−８６，３５
プラスミド８０７−８６．３５は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）遺伝子およびノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限亜断片である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ断片である。プライマー
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はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000074
はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩ〜ＢｇｌＩＩ断片である。プライマーは
0003939358.tif 000075
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000076
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た。断片４はＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。
相同性ベクター８１７−１４．２
プラスミド８１７−１４．２は外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およびブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミラダーゼ（ＮＡ）遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βグルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡおよびＨＡ遺伝子は、各々、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のほぼ１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限亜断片）である。断片２は、ＳＩＶ  ＨＩＮ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子のほぼ１７２１塩基対ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ断片である。プライマー
0003939358.tif 000077
はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にはＢａｍＨＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000078
はＳＩＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さの断片１７２１塩基を得た。断片３は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からのＲＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子のほぼ１４１４塩基対ＥｃｏＲＩ〜ＢｇｌＩＩ断片である。プライマー
0003939358.tif 000079
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
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はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成し、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応のために用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化してＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する長さの断片１４１４塩基対を得た。断片４はプラスミドｐＲＡＪ２６０（Clonetech）のほぼ１８２３塩基対ＮｃｏＩ制限断片である。断片５はＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ２１４９塩基対ＡｃｃＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限亜断片である。
単一または複数のＰＲＲＳ遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７を含有するＰＲＲＳ相同性ベクター
ＰＲＲＳ相同性ベクターは外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために用いた。それには、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７遺伝子が組み込まれており、それの側に隣接してＳＰＶ  ＤＮＡがある。外来遺伝子の上流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ８５５塩基対断片がある。外来遺伝子の下流にはＳＰＶ  ＤＮＡのほぼ１１１３塩基対断片がある。「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」に従ってこのプラスミドを用いる場合、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は豚痘ウイルスＯｌＬ遺伝子プロモーターの制御下にあり、ＰＲＲＳ遺伝子は後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。該相同性ベクターは、以下の源からの制限断片を適当な合成ＤＮＡ配列に連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。該プラスミドベクターはｐＳＰ６４（プロメガ社）のほぼ２５１９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｐｈＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ末端を持つ８５５塩基対断片を生じさせるための、ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000081
を用いるポリマラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）のほぼ８５５塩基対サブ−断片である。断片２は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドｐＪＦ７５１（４９）から誘導した３００２塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ断片である。断片３は、ＮＶＳＬ（参照株）から得られたＰＲＲＳのＵ．Ｓ．単離体からのゲノムＲＮＡを用いて逆転写およびポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成したＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。各相同性ベクターは１または複数のＰＲＲＳウイルスＯＲＦ２〜７を含有する。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000082
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000083
を逆転写およびＰＣＲのために使用し、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ２遺伝子に対応する長さの断片７７１塩基対を得た。ＯＲＦ３を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000084
；１／９６．７はＰＲＲＳ  ＯＲＦ３遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000085
を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ３遺伝子の３’末端から合成する。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ４を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000086
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子の５’末端から合成し、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000087
を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ４遺伝子に対応する長さの断片５３７塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５を合成するために、プライマー
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はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000089
を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子に対応する長さの断片６０３塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000090
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子を５’末端から合成し、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー
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を逆転写およびＰＣＲのために用い、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子の３’末端から合成する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＰＲＲＳ  ＯＲＦ６に対応する長さの５２５塩基対を得る。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ７を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000092
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ７遺伝子の３’末端から合成する。断片４は、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ１１１３塩基対を生じさせるための、ＤＮＡプライマー
0003939358.tif 000093
を用いるポリメラーゼ鎖反応によって合成したＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのほぼ１１１３塩基対亜断片である。
仮性狂犬病遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス
Ｓ−ＳＰＶ−０８６は少なくとも３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＤおよびｇＩについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７−６８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＤおよびｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７７は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７  ４８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７９は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＢについての遺伝子をＳＰＶ  ６１７  ４８．１ＯＲＦに挿入した（唯一のＡｃｃＩ制限部位は唯一のＮｏｔＩ制限部位で置き換えた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＰＲＶ糖蛋白質の発現につき「黒色プラーク・アッセイ」および「ウェスタンブロット」によってテストした。
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクターおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０７６、Ｓ−ＳＰＶ−０７７、およびＳ−ＳＰＶ−０７９はブタにおいてＰＲＶ感染に対するワクチンとして有用であって、ＰＲＶ  ｇＤ、ｇＩまたはｇＢの発現に有用である。Ｓ−ＳＰＶ−０７１はＳ−ＳＰＶ−０１１、Ｓ−ＳＰＶ−０１２、またはＳ−ＳＰＶ−０１３のごときＰＲＶ  ｇＣを発現とする組換え豚痘ウイルスと組み合わせたワクチンとして有用である。
１４３Ｂ                  癌＊  骨肉腫＊
Ａ４３１                  類表皮癌＊
Ａ５４９                  肺癌＊
Ｃａｐａｎ−１            肝臓癌＊
ＣＦ５００                包皮繊維芽細胞
Ｃｈａｎｇ肝臓            肝臓
Ｄｅｔｒｏｉｔ            ダウン包皮繊維芽細胞
ＨＥＬ−１９８            胚性肺
ＨｅＬａ                  子宮頸部癌＊
Ｈｅｐ−２                表皮咽頭癌
ＨＩＳＭ                  腸平滑筋
ＨＮＫ                    新生児腎臓
ＭＲＣ−５                胚性肺
ＮＣＩ−Ｈ２９２          肺粘液性類表皮癌＋
ＯＶＣＡＲ−３            卵巣癌＊
ＲＤ                      横紋筋肉腫＋
ＴＨＰ                    単球（白血病）＊
ＷＩＬ２−ＮＳ            Ｂリンパ球系、非分泌
ＷＩＳＨ                  羊膜
ＰＢＬ                    末梢血液リンパ球
例  ３８
ＰＲＲＳ遺伝子ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６を発現する組換え豚痘ウイルス
Ｓ−ＳＰＶ−０８０少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ２についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８１は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ３についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８２は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ４についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ４遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８３は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８４は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８５は少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ７についての遺伝子をＳＰＶ  ７３８−９４．４  ＯＲＦに挿入した（ＳＰＶ  ＯｌＬ  ＯＲＦの７７３塩基対欠失；１６６９〜２４５２の欠失、配列番号：１８９）。ｌａｃＺ遺伝子は豚痘ＰＯＩＬプロモーターの制御下にあり、ＰＲＶ  ＯＲＦ７遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はＳ−ＳＰＶ−００１（Kasza株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを創製するための相同組換え法」において相同性ベクター材料および方法（ＰＲＲＳ相同性ベクター）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ）によってトランスフェクション・ストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラーク・アッセイによってモニターした複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサートの安定性につきアッセイした。最初の３ラウンドの精製後、観察された全てのプラークは青色であり、これはウイルスが純粋で、安定であって外来遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−０８０、Ｓ−ＳＰＶ−０８１、Ｓ−ＳＰＶ−０８３、Ｓ−ＳＰＶ−０８４およびＳ−ＳＰＶ−０８５はブタにおいてＰＲＲＳ感染に対するワクチンとして個々にまたは組み合わせて有用であって、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７の発現で有用である。
例  ３９
以下の実験を行って、培養においてヒト細胞に感染する、およびｌａｃＺのごとき外来性ＤＮＡを発現する豚痘ウイルスの能力を測定した。
Ｓ−ＳＰＶ−００３をＭＯＩ＝０．１にて後記標記にリストしたヒト細胞系に２〜３時間吸着させた。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、増殖培地を添加し、細胞を３７℃で４日間インキュベートした。細胞を収穫し、３回の凍結／解凍によって２００マイクロリットルのＰＢＳ中に溶解物を調製した。細胞夾雑物をペレット化し、１０マイクロリットルの上清をＯＮＰＧアッセイによって、３７℃にて、ガラクトシダーゼ活性につき１／２時間アッセイした。表はＳ−ＳＰＶ−００３での種々のヒト細胞系の感染および細胞障害効果の相対的レベルおよびｌａｃＺの発現の結果を示す。
結果は、種々の細胞系はＳ−ＳＰＶ−００３を摂取し、ｌａｃＺを発現する能力が変化することを示す。ＣＰＥは全ての場合において最小であって、ウイルス複製の結果とはならなかった。１つの例外はＡ５４９細胞であり、これは、１つの例で、数ラウンドの細胞周期およびプレートからの剥がれを示さず、もう１つの例は継代の間の力価の１０倍増加であり、これは限定的ウイルス複製を示唆した。いくつかの細胞系は、細胞障害効果を持たない有意なｌａｃＺ活性を示す。
異なる痘プロモーターは、多数のヒト細胞系で組換え豚痘ウイルスからのｌａｃＺを発現する。ＥＰ１、ＬＰ１、ＬＰ２、ＥＰ１ＬＰ２、ＬＰ２ＥＰ２、またはＳＰＶ  ＰＯｌＬプロモーターからのｌａｃＺを発現した６種の異なる豚痘ウイルスを構築した。ウイルスを各々用いて、Ａ５４９、Ｃｈａｎｇ肝臓、または１４３Ｂ細胞を０．１ｍｏｉにて感染させ、細胞を２および３時間後にすすぎ、次いで、３７℃で４日間インキュベートした。各細胞系はプロモーター活性の異なる階層を維持し、これは以下の実験で再現性があった。例えば、ＥＰ１、ＬＰ２ＥＰ２、およびＰＯｌＬプロモーターは１４３Ｂ細胞で最大の発現を与え、他方、ＬＰ２はＣｈａｎｇ肝臓細胞で最も強力であり、ＥＰ１ＬＰ２はＡ５４９で最も強力であった。Ｃｈａｎｇ肝臓およびＡ５４９細胞において、ＰＯｌＬプロモーターからの発現は最も貧弱であり、他方、１４３Ｂにおいては、ＬＰ２からの発現が貧弱であった。従って、異なるヒト細胞系は異なる方法で痘プロモーターを利用する。これは、異なる細胞系で複製経路に沿ってどれ位遠くまで豚痘ウイルスが進行できるかを反映し得る。
これらの初期および後期プロモーターは、組換え豚痘ウイルスによって感染されたヒト細胞型に応じてより低いまたはより高いｌａｃＺ活性を呈した。異なる標的組織に対して異なるプロモーターを選択することによって、豚痘ウイルスから標的組織にデリバリーされる外来遺伝子産物の量を調節することができる。
組換え豚痘ウイルスはヒト感染性病気に対するワクチンとして、および治療剤をヒトにデリバリーするのに有用である。組換え豚痘ウイルスはヒトにおいてウイルスまたは細菌感染に対するワクチンとして、および抗生物質、腫瘍抗原、細胞表面リガンドおよび受容体、サイトカインのごとき免疫変調分子をデリバリーするための癌または遺伝病のための治療剤として有用である。
例  ４０
0003939358.tif 000094
0003939358.tif 000095
0003939358.tif 000096
Ａ５４９は、細胞が感染の間に丸くなってプレートから剥がれた場合に、１つの例において細胞障害効果につき＋＋を与えたが、この観察は反復されなかった。また、Ａ５４９は継代の間に１０倍増加の力価の証拠をもう１つの例で示し、これは限定的ウイルス複製を支持し得ることを示す。
＊＊  ３５ｍｍ皿の１／２０からの細胞溶解物当たりのＡ260単位で表したβ−ガラクトシダーゼ活性
−  活性無し
＋  ０．２−０．９Ａ260単位
＋＋  ０．９−１．６Ａ260単位
＋＋＋  １．６Ａ260単位より大
例  ４１：ウシ構築物及びワクチン
Ｓ−ＳＰＶ−１１２
Ｓ−ＳＰＶ−１１２は３個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子及びウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）付着（Ｇ）遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ＢＲＳＶ融合（Ｆ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入した）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｇ及びＦ遺伝子はそれぞれ合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１１２はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法（ＨＯＭＯＬＯＧＯＵＳ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＰＶ）」において相同性ベクター８４８−０２（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（ＳＣＲＥＥＮ  ＦＯＲ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＰＶ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物が、Ｓ−ＳＰＶ−１１２と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１２は、ウシ呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＢＲＳＶ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして使用される。ブタ痘ウイルスは、当該疾患の変異株が迅速に生成するのを防ぐべくＢＲＳＶの他のサブタイプをクローニングするために使用される。Ｓ−ＳＰＶ−１１２はＢＲＳＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＢＲＳＶ抗原は、野生型ＢＲＳＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法（ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＶＩＲＡＬＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＡＳ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ）」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−０２
プラスミド８４８−０２を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記プラスミドは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、ＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）付着（Ｇ）及び融合（Ｆ）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＭｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、ＢＲＳＶ  Ｆ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１７２２塩基対Ｂａｍ  ＨＩ断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＢＲＳＶ  Ｇ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約７７１塩基対Ｂａｍ  ＨＩ断片である。ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧ遺伝子は、「ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合、ヌクレオカプシド及び糖タンパク質遺伝子のクローニング（ＣＬＯＮＩＮＧ  ＯＦ  ＢＯＶＩＮＥ  ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ  ＳＹＮＣＹＴＩＡＬ  ＶＩＲＵＳ  ＦＵＳＩＯＮ，ＮＵＣＬＥＯＣＡＰＳＩＤ  ＡＮＤ  ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＧＥＮＥＳ）」に記載されているＰＣＲにより合成した。断片５は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び６中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を予め欠失させた。
ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧ融合タンパク質を発現する組換えブタ痘ウイルス
Ｓ−ＳＰＶ−１３０
Ｓ−ＳＰＶ−１３０は３個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入した）。ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）付着（Ｇ）及びＢＲＳＶ融合（Ｆ）遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｆ／Ｇ融合遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＢＲＳＶ  Ｆ／Ｇ融合遺伝子は、Ｇ遺伝子の約５８０ヌクレオチド（カルボキシル末端を含めて１９３アミノ酸）に対してフレーム内で融合したＦ遺伝子の約１５６０ヌクレオチド（アミノ末端を含めて５２０アミノ酸）を含む。
Ｓ−ＳＰＶ−１３０はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８０７−７５．４１（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。組換えウイルスを赤色プラーク精製により単離した。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１３０は、ウシ呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＢＲＳＶ  Ｆ／Ｇ融合タンパク質は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに特に有効であり、不可欠である。ＢＲＳＶ  Ｆ／Ｇ融合タンパク質は、Ｆタンパク質の完全アミノ末端及びＧタンパク質の完全カルボキシ末端を含み、各タンパク質の公知の免疫原領域を含んでいる。ＢＲＳＶ  Ｆ／Ｇ融合タンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧタンパク質を別々に発現させた場合またはＢＲＳＶ  Ｆ及びＧタンパク質の単離エピトープを発現させた場合に比して高い免疫応答を与える。ブタ痘ウイルスは、当該疾患の変異株が迅速に生成するのを防ぐべくＢＲＳＶの他のサブタイプをクローニングするために使用される。組換えブタ痘ウイルスはＢＲＳＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＢＲＳＶ抗原は、野生型ＢＲＳＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８０７−７５．４１
相同性ベクター８０７−７５．４１を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、ＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）付着（Ｇ）及び融合（Ｆ）遺伝子の融合タンパク質を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＢＲＳＶ  Ｆ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１５６０塩基対Ｂａｍ  ＨＩ断片である。ＢＲＳＶ菌株３７５（ＶＲ−１３３９）のＦ遺伝子コード領域を、以下のプライマー：ｃＤＮＡプライミングのために
0003939358.tif 000097
とＰＣＲのために
0003939358.tif 000098
を用いてクローニングした。前記ＤＮＡは、ＢＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ末端の５２０アミノ酸をコードする。断片５は、ＢＲＳＶ  Ｇ遺伝子に対するコード配列を含むＰＣＲにより作成される約５８０塩基対ＡｓｃＩ断片である。ＢＲＳＶ菌株３７５（ＶＲ−１３３９）のＧ遺伝子コード領域を、以下のプライマー：ｃＤＮＡプライミングのために
0003939358.tif 000099
を用いてクローニングした。前記ＤＮＡは、ＢＲＳＶ  Ｇタンパク質のカルボキシ末端の１９３アミノ酸（翻訳停止コドンを含む）をコードする。ＢＲＳＶ  Ｆ及びＧコード配列を正確な翻訳リーディングフレームにて融合させる。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び６中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−００９
Ｓ−ＳＰＶ−１３０は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入した）。２型ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ−２）（菌株８９０）糖タンパク質５３（ｇｐ５３）遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ−２  ｇｐ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−００９はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法において相同性ベクター８１５−７３．１６Ａ（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−００９と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−００９は、ウシウイルス性下痢ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＢＶＤＶ−２  ｇｐ５３抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−００９は、ＢＶＤＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＢＶＤＶ抗原は、野生型ＢＶＤＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８１５−７３．１６Ａ
相同性ベクター８１５−７３．１６Ａを、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する２型ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ−２）糖タンパク質５３（ｇｐ５３）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１１１３塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子コード領域を、逆転写のためのＲＮＡ鋳型として２型ＢＶＤＶ（菌株８９０）由来のＲＮＡ、及び以下のプライマー：逆転写のためにＢＶＤＶ  ｇｐ５３遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000100
を用いて逆転写及びＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＢＶＤＶ  ｇｐ５３タンパク質の約３７３アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１０９
Ｓ−ＳＰＶ−１０９は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子をユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトに挿入した（複数のＨｉｎｄＩＩＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１０９はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８３５−５７．５（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１０９と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１０９は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＤ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１０９は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８３５−５７．５
相同性ベクター８３５−５７．５を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１３２０塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ５２４）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000101
とＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000102
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＤタンパク質の約４４０アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び５にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１０
Ｓ−ＳＰＶ−１１０は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子をユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトに挿入した（複数のＨｉｎｄＩＩＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１１０はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８３５−５８．５（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１０と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１０は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＩ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１０は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８３５−５８．５
相同性ベクター８３５−５８．５を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＩ）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩＭ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１１４０塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ５２４）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000103
とＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000104
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＩタンパク質の約３８０アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１１
Ｓ−ＳＰＶ−１１１は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の転写方向はＬａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。
Ｓ−ＳＰＶ−１１１はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４７−１５．１Ｃ（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１１と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１１は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＢ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１１は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４７−１５．１Ｃ
相同性ベクター８４７−１５．１Ｃを、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＢ）遺伝子を含む。ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の転写方向はＬａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約２８００塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ８３０−７１）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000105
とＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000106
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＢタンパク質の約９３２アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１３
Ｓ−ＳＰＶ−１１３は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＣ）遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１１３はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４８−０８（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１３と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１３は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＣ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１３は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウィルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−０８
相同性ベクター８４８−０８を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１５６３塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ８３０−７１）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000107
とＩＢＲＶ  ｇＣ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000108
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＣタンパク質の約５２１アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１５
Ｓ−ＳＰＶ−１１５は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の転写方向はｌｚｃＺ遺伝子及びＳＰＣ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。
Ｓ−ＳＰＶ−１１５はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４７−１９．５９（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１５と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１５は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＢ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１５は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４７−１９．５９
相同性ベクター８４７−１９．５９を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子を含む。ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約２８００塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶｇＢ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ８３０−７１）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000109
とＩＢＲＶ  ｇＢ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000110
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＢタンパク質の約９３２アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１９
Ｓ−ＳＰＶ−１１９は３個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子及び糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子をユニークＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトに挿入した（複数のＨｉｎｄＩＩＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１１９はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８５３−８３（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１９と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１９は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスにより引き起こされる疾患に対するウシのワクチンとして有用である。ＩＢＲＶ  ｇＤ抗原及びｇＩ抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１９は、ＩＢＲＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＩＢＲＶ抗原は、野生型ＩＢＲＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８３５−８３
相同性ベクター８３５−８３を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接する感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＤ）遺伝子及び糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子を含む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１３２０塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ５２４）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000111
とＩＢＲＶ  ｇＤ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000112
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＤタンパク質の約４４０アミノ酸をコードする。断片５は、ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１１４０塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＩＢＲＶ  Ｃｏｏｐｅｒ菌株（ｐＳＹ  ５２４）のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片、及び以下のＰＣＲプライマー：ＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000113
とＩＢＲＶ  ｇＩ遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000114
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＩＢＲＶ  ｇＩタンパク質の約３８０アミノ酸をコードする。断片６は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び６中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
例  ４２：イヌ構築物及びワクチン
Ｓ−ＳＰＶ−１１４
Ｓ−ＳＰＶ−１１４は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。
Ｓ−ＳＰＶ−１１４はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４８−１５．１４（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１４と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１４のＣＰＶ−特異性抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のための黒色プラークスクリーン（ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＳＣＲＥＥＮ  ＦＯＲ  ＦＯＲＥＩＧＮ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＩＮ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＰＶ）」を用いて調べた。（ＮＶＳＬ由来の）ＣＰＶに対するイヌ抗血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１１４プラークと特異的に反応したが、Ｓ−ＳＰＶ−００３ネガティブコントロールプラークとは反応しなかった。観察したＳ−ＳＰＶ−１１４プラークのすべてが抗血清と反応した。このことは、ウイルスはＣＰＶ外来遺伝子を安定的に発現したことを示す。
ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＳＰＶ−１１４で感染させ、感染細胞の溶菌液のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、ウエスタンブロット法により分析した。（ＮＶＳＬ由来の）ＣＰＶに対するイヌ抗血清をＣＰＶ特異的タンパク質の発現を検出するために使用した。Ｓ−ＳＰＶ−１１４感染細胞からの細胞溶菌液は、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質の予想サイズである６０ｋｄに相当するバンドを示した。
Ｓ−ＳＰＶ−１１４は、イヌパルボウイルスにより引き起こされる疾患に対するイヌのワクチンとして有用である。ＣＰＶ  ＶＰ２抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１４は、ＣＰＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＣＰＶ抗原は、野生型ＣＰＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−１５．１４
相同性ベクター８４８−１５．１４を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質遺伝子を含む。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の転写方向はｌｚｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１７５８塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＣＰＶ  ２Ｂ野生単離物（ＮＶＳＬ）由来のＤＮＡ、及び以下のＰＣＲプライマー：ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000115
とをＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000116
用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質の約５８６アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１６
Ｓ−ＳＰＶ−１１６は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。
Ｓ−ＳＰＶ−１１６はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４８−１５．１３（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１６と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１６のＣＰＶ−特異性抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のための黒色プラークスクリーン」を用いて調べた。（ＮＶＳＬ由来の）ＣＰＶに対するイヌ抗血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１１６プラークと特異的に反応したが、Ｓ−ＳＰＶ−００３ネガティブコントロールプラークとは反応しなかった。観察したＳ−ＳＰＶ−１１６プラークのすべてが抗血清と反応した。このことは、ウイルスがＣＰＶ外来遺伝子を安定的に発現したことを示す。
ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＳＰＶ−１１６で感染させ、感染細胞の溶菌液のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、ウエスタンブロット法により分析した。（ＮＶＳＬ由来の）ＣＰＶに対するイヌ抗血清をＣＰＶ特異的タンパク質の発現を検出するために使用した。Ｓ−ＳＰＶ−１１６感染細胞からの細胞溶菌液は、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質の予想サイズである６０ｋｄに相当するバンドを示した。
Ｓ−ＳＰＶ−１１６は、イヌパルボウイルスにより引き起こされる疾患に対するイヌのワクチンとして有用である。ＣＰＶ  ＶＰ２抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１６は、ＣＰＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＣＰＶ抗原は、野生型ＣＰＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−１５．１３
相同性ベクター８４８−１５．１３を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質遺伝子を含む。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約１７５８塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＣＰＶ  ２Ｂ野生単離物（ＮＶＳＬ）由来のＤＮＡ、及び以下のＰＣＲプライマー：ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000117
とＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000118
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡはＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質の約５８６アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１７
Ｓ−ＳＰＶ−１１７は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ１／２タンパク質遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。
Ｓ−ＳＰＶ−１１７はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４８−５２Ａ３１（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１７と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１７は、イヌパルボウイルスにより引き起こされる疾患に対するイヌのワクチンとして有用である。ＣＰＶ  ＶＰ１／２抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１７は、ＣＰＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＣＰＶ抗原は、野生型ＣＰＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−５２Ａ３１
相同性ベクター８４８−５２Ａ３１を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ１／２タンパク質遺伝子を含む。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の転写方向はｌｚｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と反対である。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相向性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約２１７２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＣＰＶ  ２Ｂ野生単離物（ＮＶＳＬ）由来のＤＮＡ、及び以下のＰＣＲプライマー：ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000119
とＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000120
とを用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＣＰＶ  ＶＰ１／２タンパク質の約７２４アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
Ｓ−ＳＰＶ−１１８
Ｓ−ＳＰＶ−１１８は２個の外来遺伝子を発現するブタ痘ウイルスである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をユニークＰｓｔＩ制限サイトに挿入する（複数のＰｓｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＡｃｃＩサイトに挿入する）。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ１／２タンパク質遺伝子をユニークＮｏｔＩ制限サイトに挿入した（複数のＮｏｔＩリンカーをＳＰＶ  ０１Ｌオープンリーディングフレーム中のユニークＮｄｅＩサイトに挿入した。ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた）。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の転写方向はｌａｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。
Ｓ−ＳＰＶ−１１８はＳ−ＳＰＶ−００１（Ｋａｓｚａ菌株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」において相同性ベクター８４８−５２Ｃ８（材料と方法の欄参照）及びウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を用いて行った。トランスフェクションストックを、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」（ＢＵＬＯＧＡＬ  ＡＮＤ  ＣＰＲＧアッセイ）によりスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終産物はＳ−ＳＰＶ−１１８と称される組換えウイルスであった。このウイルスの、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、及び材料及び方法の欄に記載した青色プラークアッセイを用いてモニターされる多継代による挿入断片の安定性を調べた。最初の３回精製後、観察したプラークはすべて青色であった。このことは、ウイルスが純粋で安定であり、外来遺伝子を発現したことを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１１８は、イヌパルボウイルスにより引き起こされる疾患に対するイヌのワクチンとして有用である。ＣＰＶ  ＶＰ１／２抗原は、動物において防御的免疫応答を生ぜしめるのに不可欠である。組換えウイルスは単独でもまたは組み合わせても効果的なワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１１８は、ＣＰＶ抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。前記ＣＰＶ抗原は、野生型ＣＰＶに対する抗体を同定するために使用される。このウイルスは、単一特異性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生するための抗原ソースとしても有用である。前記抗体は、ウイルスタンパク質に対して特異的な診断テストの開発において有用である。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、「診断薬として使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製方法」（材料及び方法の欄参照）に従って前記ウイルスを用いてマウスにおいて産生される。
相同性ベクター８４８−５２Ｃ８
相同性ベクター８４８−５２Ｃ８を、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために構築した。前記ベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子及びＳＰＶ  ＤＮＡに隣接するイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ１／２タンパク質遺伝子を含む。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の転写方向はｌｚｃＺ遺伝子及びＳＰＶ  ０１Ｌ遺伝子の転写方向と同じである。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ  ＤＮＡの約１５６０塩基対断片である。プラスミドを「組換えＳＰＶを作成するための相同性組換え方法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含有するウイルスが生ずる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子は合成後期／初期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されたい。標準の組換えＤＮＡ方法（２２，３０）を用い、以下のソース由来の制限断片を合成ＤＮＡ配列で結合することにより構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約２９７２塩基対ＨｉｐｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対ＢｇｌＩＩ〜ＡｃｃＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約４８塩基対ＡｃｃＩ〜ＮｄｅＩサブ断片である。断片４は、ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子のコード配列を含むＰＣＲにより作成される約２１７２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片である。ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子コード領域を、ＤＮＡ鋳型としてＣＰＶ  ２Ｂ野生単離物（ＮＶＳＬ）由来のＤＮＡ、及びＰＣＲプライマー：ＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の３’末端に
0003939358.tif 000121
とＣＰＶ  ＶＰ１／２遺伝子の５’末端に
0003939358.tif 000122
を用いてＰＣＲによりクローニングした。前記ＤＮＡは、ＣＰＶ  ＶＰ１／２タンパク質の約７２４アミノ酸をコードする。断片５は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１５６０塩基対ＮｄｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩサブ断片である。断片１及び３中のＡｃｃＩサイトはＰｓｔＩリンカーを用いてユニークＰｓｔＩサイトに変換した。断片３及び５中のＮｄｅＩサイトはＮｏｔＩリンカーを用いてユニークＮｏｔＩサイトに変換した。ＳＰＶ断片３及び６にかかる、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の約５４５塩基対ＮｄｅＩ〜ＮｄｅＩサブ断片（ヌクレオチド１５６０〜２１０４；配列番号１８９）を欠失させた。
例  43：鳥類構築物およびワクチン
S-SPV-105：
S-SPV-105は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびチキン・インターフェロン・ガンマ（cIFNγ）の遺伝子は、738−94.4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損、1679から2452までのヌクレオチド欠損、配列認識番号189）中に挿入された。lacZ遺伝子は豚天然痘01Lプロモータの制御下にあり、cIFNγ遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-105は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター840−72. A1（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-105と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であった。これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
許容性細胞中における小胞性口内炎ウイルスの成長の阻害がS-SPV-105による共培養を、VSVとS-SPV-003との共培養と比較して測定することで、S-SPV-105がcIFNγ活性を持つ事が確認される。
S-SPV-105は、鳥類病原菌による感染に対する体液性免疫反応および細胞媒介免疫反応を刺激するチキンにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-105はcIFNγの発現にとっても有用である。
相同ベクター840-72.Al．プラスミド840-72.Alは、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたチキン・インターフェロン・ガンマ（cIFNγ）遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約855塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約1113塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、豚天然痘ウイルス01L遺伝子プロモータの制御下に、およびcIFNγ遺伝子は、後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。LP2EP2 cIFNγ遺伝子カセットは、相同ベクター752-22.1のEcoRI−BamHI部位に挿入された。相同ベクター840−72.A1は、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約2519の塩基対HindIII-SphI制限断片から得られる。断片１は、SphIおよびBglII末端を持つ855塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000123
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-HINDIII制限断片Ｍ（23）の約855の塩基対のサブ断片である。断片2は、大腸菌lacz遺伝子を含むプラスミドpJF751（49）から得られた3002塩基対BamHIからPvuII断片である。断片３は、コンカナバリアンＡ刺激チキン脾臓細胞から単離されたRNAの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Sambrook et al., 1989）によって得られたcIFNγ遺伝子（62）をコードする約522塩基対のEcoRI-BG1II断片である。逆転写およびPCRに使用するアンチセンスプライマーは、
0003939358.tif 000124
である。PCRに使用されるセンス・プライマーは、
0003939358.tif 000125
である。該DNA断片は、チキン・インターフェロン・ガンマ・プロテインの168アミノ酸のオープン読み取り枠を含む。cIFNγ天然メチオニン・コドンに、メチオニン-アスパラギン-セリンのDNAコドンが先行する。断片４は、SalIおよびHindIII末端を持つ1113塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000126
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV HindIII断片Ｍの約1113塩基対のサブ断片である。
S-SPV-086
S-SPV-086は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびチキン・インターフェロン・ガンマ（cIFNγ）のアンチセンス遺伝子は、738−94.4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損、1679から2452までのヌクレオチド欠損、配列認識番号189）中に挿入された。lacZ遺伝子は豚天然痘0ILプロモータの制御下にあり、アンチセンスcIFNγ遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-086は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で，相同ベクター836-62.B1およびウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的ににS-SPV-086と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現する事が示された。相同ベクター836-62.B1は、836-62. B1において、cIFNγ遺伝子をコードする約522塩基対EcoRI−BgIII断片が、840-72.A1と比較してLP2EP2プロモータに対して逆の配向性である事を除いては相同ベクター840−72.A1と同様の方法で構築された。
S-SPV-086は、βガラクトシダーゼ抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。抗βガラクトシダーゼ抗血清は、S−SPV-003陰性コントロール・プラークとではなく、S-SPV-086と特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−086プラークが抗血清と反応し、ウイルスがβガラクトシダーゼ外来遺伝子を安定的に発現している事が示された。
S-SPV-086は、cIFNγmRNAに対するアンチセンスRNAの発現に有用である。S-SPV-986は、カモの胚のフィブロブラスト（DEF）またはチキン胚フィブロブラスト（CEF）細胞にトランスフェクトされても、細胞を溶融しないがしかし、CEF細胞中でアンチセンスcIFNγRNAを発現し、DEFまたはCEF細胞から得られるcIFNγプロテインの発現を阻害するであろう。七面鳥のヘルペス・ウイルス（HVT）またはマレック・ウイルス等の組替ウイルスは、DEFまたはCEF細胞中にトランスフェクトされたS-SPV-086中で高力価（108から1010pfu/ml）まで生育し、トランスフェクトされた細胞が、ピューロマイシンの存在下で育生させることによって、ピューロマイシン耐性で選択された。これらのトランスフェクトされた細胞は続けて成長し、cIFNγ遺伝子に対するアンチセンスを発現し、七面鳥に対するヘルペス・ウイルスまたはマレック・ウイルスを高力価成長させる（108から1010pfu/ml）。
例  44：  ネコの構築物およびワクチン
S-SPV-106
S-SPV-106は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびネコ・免疫欠損・ウイルス（FIV）のエンベロップ（env）およびgapプロテアーゼは、SPV 617 48.1 ORF（ユニークNotI制限部位は、ユニークAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、FIV envおよびgagプロテアーゼ遺伝子は、夫々合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-106は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター836-22. A1（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-106と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの５回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現する事が示された。
S-SPV-106は、FIV特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。FIV gag-プロテアーゼに対するモノクローナル抗体は、S−SPV-003陰性コントロールプラークではなく、S−SPV-106プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−106プラークが抗血清と反応し、ウイルスがFIV gag外来遺伝子を安定的に発現していることが示された。
S-SPV-106は、FIV envおよびgagプロテアーゼ蛋白の両方を発現する組替え豚天然痘ウイルスであり、ネコにおけるFIV感染に対するワクチンとして有用である。S-SPV-106はまた、FIV envおよびgagプロテアーゼ蛋白の発現にとっても有用である。
相同ベクター836-22.Al. プラスミド836-22.Alは、外来DNAをSPVに挿入するために使用された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびネコ免疫不全ウイルス（FIV）エンベロップ（env）およびSPV DNAでフランクされたgag/プロテアーゼ遺伝子を組み入れている。このプラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、合成後期天然痘プロモータの制御下に、およびFIV envおよびgagプロテアーゼ遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を適切な合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片１は、SPV HindIII断片ＭのBglII-AccI制限サブ断片である（23）。断片2は、ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニングによって合成されたFIV env遺伝子（61）（FIV envのSUおよびTMコード領域を完全な長さで含む約860アミノ酸）の約2564の塩基対のBamHI−BamHI断片である。PCR反応のテンプレートは、FIV菌株PPRゲノムcDNA（61）であった。上流プライマー10／93.21
0003939358.tif 000127
は、FIV env遺伝子の5'末端に対応して、FIV菌株PPRゲノムcDNAのヌクレオチド6263から開始されて合成された。該方法によって、BamHI部位は、5'末端に導入された。下流プライマー10／93.20
0003939358.tif 000128
は、FIV env遺伝子の3’末端に対応して、FIV菌株PPRゲノムcDNAのヌクレオチド8827から開始されて合成された。断片3は、FIV（PPR菌株）からcDNAを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたFIV gag／プロテアーゼ（gag ORFは約452のアミノ酸；プロテアーゼORFは、約209アミノ酸）の約1878塩基対のEcoRI−BglII制限断片である（61）。プライマー
0003939358.tif 000129
は、FIV gagプロテアーゼ遺伝子の5'末端から合成され、遺伝子の５’末端に、EcoRI部位を導入する。プライマー
0003939358.tif 000130
は、FIV gagプロテアーゼ遺伝子の3'末端から合成し、該遺伝子の3'末端に、BglII部位を導入する。該PCR産物は、EcoRIおよびBglIIで消化され、FIV gag-プロテアーゼ遺伝子に対応する長さ1878塩基対の断片を産生した。断片4は、SPV HindIII制限断片Ｍの約2149塩基対のAccI-HindIII制限サブ断片である（23）。SPV相同ベクターにおけるAccI部位は、ユニークNotI部位に変換された。
S-SPV-127
S-SPV-127は、４つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびネコ・免疫欠損・ウイルス（FIV）のgag/プロテアーゼ（gag）が、738-94.4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損；ヌクレオチド1669から2452までの欠損、配列認識番号189）中に挿入された。大腸菌βグルクロニダーゼ（uidA）の遺伝子およびネコ・免疫欠損・ウイルス（FIV）のエンベロップ（env）の遺伝子が、ユニークなNotI部位（6.7kbのSPV HindIII K断片の約3.2kb領域（配列認識番号１）内のユニークなEcoRI部位に挿入されたNotIリンカー）に挿入された。lacZ遺伝子は、豚天然痘01Lプロモータの制御下にあり、uidA遺伝子は、合成初期プロモータ（EP2）の制御下にあり、FIV gagプロテアーゼ、エンベロップ遺伝子は、夫々合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-127は、S-SPV-046（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター849-61. A14（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-046を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼおよびβグルクロニダーゼを発現する組替SPVのスクリーニングによってスクリーンされた（BLUOGAL AND CPRG分析および酵素マーカー遺伝子を発現する組替ヘルペス・ウイルスためのスクリーン）。赤色プラークおよび青色プラーク精製によって最終的にS-SPV-127と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、βグルクロニダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-127は、FIV感染に対するネコにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-127はまた、FIV envおよびgagプロテアーゼ蛋白の発現にとっても有用である。
相同ベクター849-61.Al4.  プラスミド849-61.Al4は、外来DNAをSPVに挿入するために使用された。該プラスミドは、大腸菌βグルクロニダーゼ（UidA）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたネコ免疫不全ウイルス（FIV）エンベロップ（env）遺伝子を組み入れている。このプラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βグルクロニダーゼ（UidA）遺伝子は、合成初期天然痘プロモータ（EP2）の制御下に、およびFIV env遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を適切な合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約3005の塩基対HindIII制限断片から得られた。断片1は、SPV HindIII制限断片Ｋの、約1652塩基対のHindIII-EcoRI制限サブ断片である。断片2は、ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニングによって合成されたFIV env遺伝子（61）（FIV envのSUおよびTMコード領域を完全な長さで含む約860アミノ酸）の約2564の塩基対のBamHI-BamHI断片である。PCR反応のテンプレートは、FIV菌株PPRゲノムcDNA（61）であった。上流プライマー10／93.21
0003939358.tif 000131
は、FIV env遺伝子の5’末端に対応して、FIV菌株PPRゲノムcDNAのヌクレオチド6263から開始されて合成された。該方法によって、BamHI部位は、5'末端に導入された。下流プライマー10／93.20
0003939358.tif 000132
は、FIV env遺伝子の3’末端に対応して、FIV菌株PPRゲノムcDNAのヌクレオチド8827から開始されて合成された。該方法によって、BamHI部位は、3'末端に導入された。断片3は、大腸菌uidA遺伝子を含む約1800塩基対のEcoRI-XmaI制限断片である。断片4は、プラスミドpJF751の約3010塩基対のBamHI-PvuII制限断片である（11）。断片5は、SPV HindIII制限断片Kの約5053塩基対のEcoRI-HindIII制限サブ断片である。SPV相同ベクターの断片1および5におけるEcoRI部位は、ユニークNotI部位に変換された。
S-SPV-089
S-SPV-089は、３つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびネコ白血病ウイルス（FeLV）gag/プロテアーゼの遺伝子は、738−94.4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損、1679から2452までのヌクレオチド欠損、配列認識番号189）中に挿入された。lacZ遺伝子は豚天然痘0ILプロモータの制御下にあり、FeLV gag/プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-089は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター832-26. A1（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-089と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および、挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現する事が示された。
S-SPV-089は、FeLV特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ネズミ抗p27血清、ラビット抗p27血清、ラビット抗βガラクトシダーゼは、S−SPV-003陰性コントロールプラークではなく、S−SPV-089プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−089プラークが抗血清と反応し、ウイルスがFeLV gagプロテアーゼおよび大腸菌βガラクトシダーゼ蛋白を安定的に発現していることが示された。
S-SPV-089は、ネコ白血病ウイルスによって引き起こされる疾病に対するネコにおけるワクチンとして有用である。またFeLV gag／プロテアーゼ抗原は、動物における防御的免疫反応を惹起する鍵である。該組替ウイルスは、単独でもまた組み合わせても、有効なワクチンとして有用である。S-SPV-089は、またFeLV抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。このようなFeLv抗原は、野生型FeLVに対抗させる抗体を確定するために有用である。該ウイルスはまた、単一特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生用の抗原源としても有用でもある。このような抗体は、ウイルス性蛋白に特異的な診断テストの開発に有用である。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体はマウスにおいて、これらのウイルスを使用して、診断に使用するウイルス性糖蛋白の精製用手段（材料および方法）に従って生成される。
相同ベクター832-26.Al.  プラスミド832-26.Alは、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたネコ白血病ウイルス（FeLV）gag/プロテアーゼ遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約855塩基対の断片である。該外来遺伝子の下硫は、SPV DNAの約1113塩基対断片である。このプラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、豚天然痘ウイルス01L遺伝子プロモータの制御下に、およびFelV gag／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。LP2EP2 FeLV gag／プロテアーゼ遺伝子カセットは、相同ベクター752-22.1のEcoRI-BamHI部位に挿入された。相同ベクター836-26.A1は、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約2519の塩基対HindIII-SphI制限断片から得られた。断片1は、SphIおよびBglII末端を持つ855塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000133
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約855の塩基対のサブ断片である。断片2は、大腸菌lacz遺伝子を含むプラスミドpJF751（49）から得られた3002塩基対BamHI-PvuII断片である。断片３は、FeLV/FAIDS菌株、タイプA（cDNAクローンp61E；Dr.Mullens, NIAIDS貯蔵庫）から得られるcDNAを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたFeLV gag/プロテアーゼ（gag ORFは、約584アミノ酸；プロテアーゼORFは約136アミノ酸である）の約2160塩基対EcoRI-BamHIの制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000134
はFeLV gag/プロテアーゼ遺伝子の5'末端から合成され、該遺伝子の５’末端に、EcoRI部位を、およびATG開始コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000135
は、FeLV gag/プロテアーゼ遺伝子の3'末端から合成される。該PCRは、EcoRIおよびBglIIで消化され、FeLV gag／プロテアーゼ遺伝子に対応する長さの2160塩基対の断片を産生した。断片4は、SalIおよびHindIII末端を持つ1113の塩基対を持つ断片を産生するための
DNAプライマー
0003939358.tif 000136
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV HindIII制限断片Ｍの約1113塩基対の制限サブ断片である。
S-SPV-100
S-SPV-100は、２つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびネコ白血病ウイルス（FeLV）エンベロップ（env）gp70+p15Eの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF（ユニークNotI制限部位は、ユニークAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、FeLV env遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-100は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター843-9. 322（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-100と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-100は、FeLV特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ネズミ抗p70血清、ラビット抗βガラクトシダーゼは、S−SPV-003陰性コントロールプラークではなく、S−SPV-100プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−100プラークが抗血清と反応し、ウイルスがFeLV envおよび大腸菌βガラクトシダーゼ蛋白を安定的に発現していることが示された。
S-SPV-100は、ネコ白血病ウイルスによって引き起こされる疾病に対するネコにおけるワクチンとして有用である。またFeLV env抗原は、動物における防御的免疫反応を惹起する鍵である。組替ウイルスは、単独でもまた組み合わせても、有効なワクチンとして有用である。S-SPV-100は、またFeLV抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。このようなFeLV抗原は、野生型FeLVに対抗させる抗体を確定するために有用である。該ウイルスはまた、単一特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生用の抗原源として有用でもある。このような抗体は、ウイルス性蛋白に特異的な診断テストの開発に有用である。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体はマウスにおいて、これらのウイルスを使用して、診断に使用されるウイルス性糖蛋白の精製用手段（材料および方法）に従って生成される。
相同ベクター843-9.322.  プラスミド843-9.322は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたネコ白血病ウイルス（FeLV）エンベロップ（env）gp70+p15Eの遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。ガラクトシダーゼ（LacZ）マーカー遺伝子は、後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、FeLV env遺伝子は、後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SpV HindIII制限断片Ｍ（23）のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、FeLV/FAIDS菌株、タイプA（cDNAクローンp61E；Dr. Mullens, NIAIDS貯蔵庫）から得られるcDNAを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたFeLV env（gp70+p15E）（env ORFは、約658アミノ酸）の約1973塩基対のEcoRI-BamHIの制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000137
は、FeLV env遺伝子の5'末端から合成され、遺伝子の５’末端に、EcoRI部位、およびATG開始コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000138
は、FeLV env遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBglIIで消化され、FeLV env遺伝子に対応する長さの1973塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751の約3010塩基対のBamHI-PvuII制限断片である（11）。断片3は、SPV  HindIII断片Ｍの約2149塩基対のAccI-HindIIIのサブ断片である。断片1および3のAccI部位は、NotIリンカーを使用したユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-107およびS-SPV-108
S-SPV-107は、３つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子は、ユニークPstI制限部位（Spv  01Lオープン読み取り枠中のユニークAccI部位に挿入されたPstIリンカー）中に挿入された。ネコ白血病ウイルス（FeLV）gag／プロテアーゼおよびエンベロップ（env）p70+p15Eの遺伝子は、ユニークNotI制限部位（SPV  01Lオープン読み取り枠中のユニークNdeI部位に挿入されたNotIリンカー；SPV HindIII M断片の約545塩基対のNdeI−NdeIサブ断片（ヌクレオチド1560−2104；配列認識番号189）は欠損している）に挿入された。lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子の転写方向は、lacZ遺伝子およびSPV  01L遺伝子の転写方向と同方向である。
S-SPV-107は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター840-68.AlとウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-107と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および、挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現いることが示された。
S-SPV-108は、３つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子は、ユニークPstI制限部位（Spv  01Lオープン読み取り枠中のユニークAccI部位に挿入されたPstIリンカー）中に挿入された。ネコ白血病ウイルス（FeLV）gag／プロテアーゼおよびエンベロップ（env）p70+p15Eの遺伝子は、ユニークNotI制限部位（SPV  01Lオープン読み取り枠中のユニークNdeI部位に挿入されたNotIリンカー；SPV HindIII M断片の約545塩基対のNdeI−NdeIサブ断片（ヌクレオチド1560−2104；配列認識番号189）は欠損している）に挿入された。lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子の転写方向は、lacZ遺伝子およびSPV  01L遺伝子の転写方向と逆方向である。
S-SPV-108は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター840-68.A6とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-108と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現する事が示された。
S-SPV-107またはS-SPV-108は、ネコ白血病ウイルスによって引き起こされる疾病に対するネコにおけるワクチンとして有用である。また（FeLV）gag／プロテアーゼおよびenv抗原は、動物における防御的免疫反応を惹起する鍵である。組替ウイルスは、単独でもまた組み合わせても、有効なワクチンとして有用である。S-SPV-107またはS-SPV-108は、またFeLV抗原を発現するための発現ベクターとしても有用である。このようなFeLV抗原は、野生型FeLVに対抗させる抗体を確定するために有用である。該ウイルスはまた、単一特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生用の抗原源としても有用でもある。このような抗体は、ウイルス性蛋白に特異的な診断テストの開発に有用である。モノクローナルまたはポリクローナル抗体はマウスにおいて、これらのウイルスを使用して、診断に使用されるウイルス性糖蛋白の精製用手段（材料および方法）に従って生成される。
相同ベクター840-68.Alおよび840-68.A6.  相同ベクターは、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該ベクターは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたネコ白血病ウイルス（FeLV）プロテアーゼ（gag）およびエンベロップ（env）gp70+p15Eの遺伝子を組み入れている。FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子の転写方向は、相同ベクター840-68.Al中のlacZ遺伝子およびSPV  01L遺伝子の転写方向と同方向である。FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子の転写方向は、相同ベクター840-68.A6中のlacZ遺伝子およびSPV 01L遺伝子の転写方向と逆方向である。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約1560塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。lacZ遺伝子は合成後期天然痘プロモータ（LP1）の制御下にあり、FeLV gag/プロテアーゼおよびenv遺伝子は夫々、合成後期／初期天然天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII−BamHI制限断片から得られた。断片1は、SpV HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、プラスミドpJF751の約3010塩基対のBamHI-PvuII制限断片である（11）。断片3は、SPV HindIII断片Ｍの約48塩基対のAccI-NdlIのサブ断片である。断片4はFeLV/FAIDS菌株、タイプA（cDNAクローンｐ61E；Dr.Mullens,NIAIDS貯蔵庫）から得られるcDNAを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応で合成された（FeLV）gag／プロテアーゼ（gag ORFは約584のアミノ酸；プロテアーゼのORFは、約136のアミノ酸）の約2160塩基対のEcoRI−BamHI制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000139
は、FeLV gag／プロテアーゼ遺伝子の5'末端から合成され、遺伝子の５’末端に、EcoRI部位を導入する。フレーム開始コドン（ATG）の一つは、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）プロモータ中にあり、フレーム開始コドンの二つ目は、PCRプライマーによってコードされる遺伝子中にある。
0003939358.tif 000140
は、FeLV gag/プロテアーゼ遺伝子の3'末端がら合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBglIIで消化され、FeLV gag／プロテアーゼ遺伝子に対応する長さの2160塩基対の断片を産生した。断片5は、FeLV/FAIDS菌株、タイプA（cDNAクローンp61E；Dr.Mullens,NIAIDS貯蔵庫）から得られるcDNAを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応で合成されたFeLV env（gp70+p15E）（env ORFは約658のアミノ酸）の約1973塩基対のEcoRI−BamHI制限断片である。プライマー
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は、FeLV env遺伝子の5'末端から合成し、遺伝子の５’末端にEcoRI部位を導入する。フレーム開始コドン（ATG）の一つは、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）プロモータ中にあり、フレーム開始コドンの二つ目は、PCRプライマーによってコードされる遺伝子中にある。
プライマー
0003939358.tif 000142
は、FeLV env遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBglIIで消化され、FeLV env遺伝子に対応する長さの1973塩基対の断片を産生した。断片6は、SPV HindIII断片Ｍの約1560塩基対のNdeI-HindIIIのサブ断片である。断片1および3のAccI部位は、PstIリンカーを使用したユニークなPstI部位に変換された。断片3および6のNdeI部位は、NotIリンカーを使用したユニークなNotI部位に変換された。SPV断片3および6にかかるSPV HindIIIＭ断片の約545塩基対のNdeI-NdeIサブ断片（1560から2104までのヌクレオチド、配列認識番号189）は、欠損していた。
S-SPV-128
S-SPV-128は、4つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびネコ白血病ウイルス（FeLV）gag/プロテアーゼの遺伝子は、738−94．4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損、1679から2452までのヌクレオチド欠損、配列認識番号189）中に挿入された。
大腸菌βグルクロニダーゼ（UidA）遺伝子およびネコ白血病ウイルス（FeLV）エンベロップ（env）gp70+p15Eの遺伝子は、ユニークNotI部位に（6.7kbのSPV HindIII K断片の約3.2kb領域（配列認識番号１）内のユニークEcoRI制限部位に挿入されたNotIリンカー）挿入されている。lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、UidA遺伝子は、合成初期天然痘プロモータ（EP2）の制御下に、およびFeLV gag/プロテアーゼおよびエンベロップ遺伝子は各々、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-128は、S-SPV-089（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター860−2（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-089を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼおよびβグルクロニダーゼを発現する組替SPVのスクリーニングによってスクリーンされた（BLUOGAL AND CPRG分析および酵素マーカー遺伝子を発現する組替ヘルペス・ウイルスのスクリーン）。赤色プラークおよび、青色プラーク精製によって最終的にS-SPV-128と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、βグルクロニダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-128は、FIV感染に対するネコにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-128はまた、FIV envおよびgag蛋白の発現にとっても有用である。
相同ベクター860-2.  プラスミド860-2は、外来DNAをSPVに挿入するために使用された。該プラスミドは、大腸菌βグルクロニダーゼ（UidA）遺伝子およびSPV DNAでフランクされたネコ白血病ウイルス（FeLV）エンベロップ（env）gp70+p15Eの遺伝子はを組み入れている。このプラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。UidA遺伝子は、合成初期天然痘プロモータ（EP2）の制御下に、およびFeLV env遺伝子は，合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約3005の塩基対HindIII制限断片から得られた。断片1は、SpV  HindIII制限断片Ｋの約1652のHindIII-EcoRI制限サブ断片である。断片2はFeLV/FAIDS菌株、タイプA（cDNAクローンp61E；Dr. Mullens, NIAIDS貯蔵庫）から得られるcDNAを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応で合成されたFeLV env（gp70+p15E）（FIV envのSUおよびTMコード領域を完全な長さで含む約860のアミノ酸）の約1973塩基対のEcoRI−BamHI制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000143
は、FeLV env遺伝子の5'末端から合成され、遺云子の５’末端に、EcoRI部位、およびATG開始コドンを導入する。プライマー
0003939358.tif 000144
は、FeLV evn遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRI-BglIIで消化され、FeLV env遺伝子に対応する長さの1973塩基対の断片を産生した。断片3は、大腸菌uidA遺伝子を含むの約1800塩基対のEcoRI-XmaI制限断片である。断片4は、SPV HindIII断片Kの約5053塩基対のEcoRI-HindIIIの制限サブ断片である。SPV相同ベクターの断片1および4のEcoRI部位は、ユニークなNotI部位に変換された。
ブタの構築物およびワクチン
S-SPV-084：
S-SPV-084は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF6の遺伝子は、SPV738-94.4 ORF（SPV O1L ORFの773塩基対欠損、1669から2452までのヌクレオチド欠損、配列認識番号189）中に挿入された。lacZ遺伝子は、豚天然痘P01Lプロモータの制御下にあり、PRRS ORF6遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-084は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター831-68. 22（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-084と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
PRRS ORF6マトリックス蛋白遺伝子産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-084を感染させ、感染細胞の細胞溶融物のサンプルをSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、ウエスタン・ブロット手法を用いて分析した。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清を使用して、PRRS特異的蛋白の発現を検出した。S-SPV-084感染細胞からの細胞溶融物は、PRRSORF6マトリックス蛋白の予測サイズである18kdに対応するバンドを表示した。
S-SPV-084は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-084はまた、PRRS ORF6マトリックス蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター831-38.22.  相同ベクター831-38.22は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該ベクターは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF6マトリックス遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約855塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約1113塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、豚天然痘ウイルス01L遺伝子プロモータの制御下に、およびPRRS ORF6マトリックス遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約2519の塩基対HindIII-SphI制限断片から得られた。断片1は、SphIおよびBglII末端を持つ855塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000145
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-HINDIII制限断片Ｍ（23）の約855の塩基対のサブ断片である。断片2は、プラスミドpJF751（11）の約3002塩基対BamHI-PvuII制限断片である。断片３は、NVSL（標準株、IA-2）得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF6マトリックス遺伝子を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000146
がPRRS ORF6遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000147
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF6遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF6遺伝子に対応する長さ532塩基対の断片を産生した。断片4は、SalIおよびHindIII末端を持つ1113塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000148
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-Hind III制限断片Ｍの約1113の塩基対のサブ断片である。
S-SPV-091
S-SPV-091は、少なくとも2つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF2の遺伝子は、SPV7617-48.1 ORF（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF2遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-091は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター844-15.110（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-091と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-091は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-091はまた、PRRS ORF2マトリックス蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター844-15.110  プラスミド844-15.110は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF2遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、lacZ遺伝子は合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、およびPRRS ORF2遺伝子は、後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HINDIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、NVSL（標準株、IA-2）から得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF2マトリックス遺伝子を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000149
がPRRS ORF2遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000150
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF2遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF2遺伝子に対応する長さ788塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHI-PvuIIの制限断片である。断片4は、SPV-HINDIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のAccI−HindIIIのサブ断片である。断片1および４における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-092：
S-SPV-092は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF7の遺伝子は、SPV617−48. 1 ORF（（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF7ヌクレオキャプシド遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-092は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター844-19. 94、（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-092と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-092は、PRRS特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清、PRRS ORF7ヌクレオキャプシド蛋白に対するモノクローナル抗体は夫々、S−SPV−003の陰性コントロール・プラークではなくS−SPV−092プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−092プラークが抗血清と反応し、ウイルスがPRRS ORF7ヌクレオキャプシド蛋白を安定的に発現していることが示された。
S-SPV-092は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-092はまた、PRRS ORF7ヌクレオキャプシド蛋白の発現に有用である。
相同ベクター844-19.94  プラスミド844-19.94は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF7遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、および（PRRS）ORF7遺伝子は、後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意して下さい。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、NVSL（標準株、IA-2）から得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF7を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000151
がPRRS ORF7遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000152
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF7遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF7遺伝子に対応する長さ約383塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片4は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のActI−HindIIIのサブ断片である。断片1および４における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-093：
S-SPV-093は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF3の遺伝子は、SPV617-48. 1ORF（（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF3遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-093は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター839-58.9（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-093と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-093は、PRRS特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清は、S−SPV−003の陰性コントロール・プラークではなくS−SPV−093プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−093プラークが抗血清と反応し、ウイルスがPRRS ORF3蛋白を安定的に発現していることが示された。
PRRS ORF3蛋白遺伝子産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-093を感染させ、感染細胞の細胞溶融物のサンプルおよび培養上澄み液をSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、ウエスタン・ブロット手法を用いて分析した。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清を使用して、PRRS特異的蛋白の発現を検出した。S-SPV-093感染細胞からの細胞溶融物および培養上澄み液は、PRRS ORF3蛋白の予測サイズである45kdに対応するバンドを表示した。ORF3蛋白は、感染細胞から培養培地中に分泌されることがわかった。
S-SPV-093は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-093はまた、PRRS ORF3蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター839-58.9.  プラスミド839-58.9は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF3遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1486塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF3遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、NVSL（標準株、IA-2）から得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF3を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000153
がPRRS ORF3遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000154
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF3遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF3遺伝子に対応する長さ768塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片4は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のAccI−HindIIIのサブ断片である。断片1および４における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-094：
S-SPV-094は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF4の遺伝子は、SPV617−48. 1 ORF（（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF4遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-094は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター839-58.36（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-094と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-094は、PRRS特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清は、S−SPV−003の陰性コントロール・プラークではなくS−SPV−094プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−094プラークが抗血清と反応し、ウイルスがPRRS ORF4蛋白を安定的に発現していることが示された。
PRRS ORF4蛋白遺伝子産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-094を感染させ、感染細胞の細胞溶融物のサンプルをSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、ウエスタン・ブロット手法を用いて分析した。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清を使用して、PRRS特異的蛋白の発現を検出した。S-SPV-094感染細胞からの細胞溶融物は、PRRS ORF4蛋白（202アミノ酸）の予測サイズである31kdに対応するバンドを表示した。
S-SPV-094は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-094はまた、PRRS ORF4蛋白の発現に有用である。
相同ベクター839-58.36.  プラスミド839-58.36は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF4遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1486塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF4遺伝子は、後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、NVSL（標準株、IA-2）から得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF4遺伝子を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000155
がPRRS ORF4遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000156
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF4遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF4遺伝子に対応する長さ約542塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片4は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のAccI−HindIIIのサブ断片である。断片1および４における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-095：
S-SPV-095は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF5の遺伝子は、SPV617−48. 1 ORF（（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF5遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-095は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター839-58.43（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-095と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
PRRS ORF5蛋白遺伝子産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-095を感染させ、感染細胞の細胞溶融物のサンプルをSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、ウエスタン・ブロット手法を用いて分析した。ポリクローナル・ブタ抗PRRS（NVSL）血清を使用して、PRRS特異的蛋白の発現を検出した。S-SPV-095感染細胞からの細胞溶融物は、PRRS ORF5蛋白の予測サイズである26kdに対応するバンドを表示した。
S-SPV-095は、PRRS感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-095はまた、PRRS ORF5蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター839-58.43.  プラスミド839-58.43は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされたブタ・繁殖性呼吸症候群ウイルス（PRRS）ORF5遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRRS ORF5遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、NVSL（標準株、IA-2）から得られるPRRSのU.S.単離物から得られるゲノムRNAを使用して逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたEcoRI-BamHI制限断片である。PRRS ORF5を合成するために、プライマー
0003939358.tif 000157
がPRRS ORF5遺伝子の5'末端から合成され、EcoRI部位を該遺伝子の5'末端に導入する。プライマー
0003939358.tif 000158
を逆転写およびPCRに使用して、PRRS ORF5遺伝子の3'末端から合成される。該PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、PRRS ORF5遺伝子に対応する長さ606塩基対の断片を産生した。断片3は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片4は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のAccI−HindIIIのサブ断片である。断片1および４における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-076：
S-SPV-076は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子およびブタ・偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白Ｄ（gD）および糖蛋白Ｉ（gI）は、SPV617−48. 1 ORF（（ユニークNotI制限部位はユニークなAccI制限部位を置換している）中に挿入された。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRV gDおよびgI遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-076は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター829−55.16（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-076と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および、挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-076は、PRV特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ブタ抗PRV血清は、S−SPV−003の陰性コントロール・プラークではなくS−SPV−076プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−076プラークが抗血清と反応し、ウイルスがPRV gD蛋白を安定的に発現していることが示された。
S-SPV-076は、PRV感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-076はまた、PRV gDおよびgI蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター829-55.16.  プラスミド829-55.16は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされた偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白Ｄ（gD）および糖蛋白Ｉ（gI）遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1484塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約2149塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRV gDおよびgI遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約1484の塩基対のBglII-AccI制限サブ断片である。断片2は、プラスミド538-46.16（WO95/03070）から得られる約500塩基対のEcoRI-SalI制限断片である。断片3は、PRV BamHI#7ゲノムDNA断片の約1900塩基対のSalI-BamHI制限サブ断片である。断片4は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片5は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約2149の塩基対のAccI−HindIIIのサブ断片である。断片1および5における該AccI部位は、NotIリンカーを使用してユニークなNotI部位に変換された。
S-SPV-079：
S-SPV-079は、二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子および偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白B（gB）は、ユニークなHindIII制限部位（SPV 01Lオープン読み取り枠中のユニークNdeI部位に挿入されたHindIIIリンカー；SPV HindIIIＭ断片の約545塩基対NdeI-NdeIサブ断片（ヌクレオチド1560から2104、配列認識番号189）は、欠損している）。lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRV gB遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。S-SPV-079は、S-SPV-015のPRV gB遺伝子にはないカルボキシル末端での69アミノ酸を含む913アミノ酸の蛋白をコードするPRV  gB遺伝子を含んでいる。
S-SPV-079は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター825−84.3（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-079と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-079は、PRV特異的抗原の発現について、組替SPVにおける外来遺伝子発現のための黒プラークスクリーンを使用して分析された。ポリクローナル・ブタ抗PRV血清は、S−SPV−003の陰性コントロール・プラークではなくS−SPV079プラークと特異的に反応することがわかった。観察されたすべてのS−SPV−079プラークが抗血清と反応し、ウイルスがPRV gB蛋白を安定的に発現していることが示された。
PRRS gB遺伝子産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-079を感染させ、感染細胞の細胞溶融物のサンプルをSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、ウエスタン・ブロット手法を用いて分析した。ポリクローナル・ブタ抗PRV血清を使用して、PRV特異的蛋白の発現を検出した。S-SPV-079感染細胞からの細胞溶融物は、PRV gB蛋白の予測サイズである120kdのgB前駆体および67kdおよび58kdのプロセッシングされた形に対応するバンドを表示した。PRV gBは、これら3つの型を二硫化硫黄で連結した複合体として存在している。
S-SPV-079は、PRV感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-079はまた、PRV  gB蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター825-84.3.  プラスミド825-84.3は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされた偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白B（gB）遺伝子を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約1532塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約1560塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、合成後期天然痘プロモータ（LP1）の制御下にあり、PRV gB遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。相同ベクターは、標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP64（Promega）の約2972の塩基対HindIII-BamHI制限断片から得られた。断片1は、SPV-HINDIII制限断片Ｍ（23）の約1532の塩基対のBglII-NdeI制限サブ断片である。断片2は、プラスミド727-54.60から得られる約2600塩基対のEcoRI-SalI制限断片である。断片2は、PRV gBアミノ酸1から16をコードしている合成DNAの約43塩基対およびPRV KpnI CゲノムDNAの約2600塩基対のSmaI−SalIの断片を含んでいる。断片3は、PRV gB遺伝子のコード配列を含むPCRによって生成された約210塩基対のSalI-BamHI断片である。断片3は、S-SPV-015にはないPRV gBのカルボキシル末端の69アミノ酸を含む。断片3は、PRV KpnI CゲノムDNAから得られるテンプレートDNAを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたSal1-BamHI制限断片である。プライマー
0003939358.tif 000159
は、PRV gB遺伝子のSalIを越えて合成され、該gB遺伝子に対して内部でSalI部位を再生した。プライマー
0003939358.tif 000160
はPCRに使用され、PRV gB遺伝子の3'末端から合成され、PRV gB遺伝子の3'末端にBamHI部位を導入した。PCR産物は、SalIおよびBamHIで消化され、PRV gB遺伝子のカルボキシル末端に対応する長さ約210塩基対の断片を産生した。断片4は、プラスミドpJF751（11）の約3010塩基対のBamHIおよびPvuIIの制限断片である。断片5は、SPV-HindIII制限断片Ｍの約1560の塩基対のNdeI−HindIIIのサブ断片である。断片1および5における該NdeI部位は、HindIIIリンカーを使用してユニークなHindIII部位に変換された。SPV断片1および5にわたるSPVのHindIII M断片の約545塩基対のNdeI-NdeIサブ断片（ヌクレオチド1560−2104；配列認識番号189）は、欠損していた。
S-SPV-090：
S-SPV-090は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現する豚天然痘ウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）の遺伝子および偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白Ｉ（gI）は、738-94.4 ORF（SPV 01L ORFの773塩基対欠損；ヌクレオチド1679から2452の欠損、配列認識番号189）に挿入された。lacZ遺伝子は、豚天然痘01Lプロモータの制御下にあり、PRV gI遺伝子は、合成後期／初期プロモータ（LP2EP2）の制御下にある。
S-SPV-090は、S-SPV-001（Kasza菌株）から得られた。これは、組替SPVを生成するための相同組替法で、相同ベクター837−58.14（材料と方法参照）とウイルスS-SPV-001を使用して完成された。形質転換ストックは、βガラクトシダーゼを発現する組替SPVのスクリーニング（BLUOGAL AND CPRG分析）によってスクリーンされた。赤色プラーク精製によって最終的にS-SPV-079と呼称される組替ウイルスが得られた。本ウイルスは、βガラクトシダーゼ発現、純度、および挿入安定性について、青色プラーク分析によってモニターされる多経路で、材料および方法に記載されたように分析された。精製を初めの三回行なった後、観察されたすべてのプラークは青色であり、これによってウイルスは純粋、安定であり、外来遺伝子を発現している事が示された。
S-SPV-090は、PRV感染に対するブタにおけるワクチンとして有用である。S-SPV-090はまた、PRV  gI蛋白の発現にも有用である。
相同ベクター837-58.14.  プラスミド837-58.14は、外来DNAをSPVに挿入する目的で構築された。該プラスミドは、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子およびSPV DNAでフランクされた偽狂犬病ウイルス（PRV）等蛋白I（gI）を組み入れている。外来遺伝子の上流は、SPV DNAの約855塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、SPV DNAの約1113塩基対の断片である。該プラスミドを組替SPVを生成するための相同組替法に従って使用すると、外来遺伝子をコードしているDNAを配合しているウイルスが得られる。βガラクトシダーゼ（lacZ）マーカー遺伝子は、豚天然痘ウイルス01L遺伝子プロモータの制御下にあり、PRV gI遺伝子は、合成後期／初期天然痘プロモータ（LP2EP2）の制御下にある事に留意。LP2EP2 PRV gI遺伝子カセットは、相同ベクター752-22.1のNotI部位に挿入された。相同ベクター840-72Alは標準組替DNA技法（22、30）を使用して、下記供給源からの制限断片を合成DNA配列と結合することによって構築された。プラスミドベクターは、pSP65（Promega）の約2519の塩基対HindIII-SphI制限断片から得られた。断片1は、SphIおよびBglII末端を持つ855塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000161
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-HindIII制限断片Ｍ（23）の約855の塩基対のサブ断片である。
断片2は、大腸菌LacZ遺伝子を含むプラスミドpJF751（49）から得られる約3002塩基対のBamHI-PvuII制限断片である。断片3は、PRV BamHI#7DNA断片（pSY138.-09.W）をPCR反応のテンプレートとして使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Sambrook、et al.、1989）によって得られるPRV gI遺伝子をコードしている約1150塩基対である。PRV gIを合成するために、PRV gI遺伝子の5'末端からプライマー
0003939358.tif 000162
が合成され、該遺伝子の5'末端にBamHI部位を導入した。PRV gI遺伝子の3'末端からプライマー
0003939358.tif 000163
が合成され、該遺伝子の3'末端にBamHI部位を導入した。PCR産物は、BamHIで消化され、PRV gI遺伝子に対応する長さ約1150塩基対の断片を産生した。断片4は、
SalIおよびHindIII末端を持つ1113塩基対断片を産生するためのDNAプライマー
0003939358.tif 000164
を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたSPV-HindIII断片Ｍの約1113の塩基対のサブ断片である。
例  ４４：組換え豚痘ウイルスのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム領域内に外来ＤＮＡを挿入するのに有用な相同ベクター
外来ＤＮＡを組換え豚痘ウイルスに挿入するためにプラスミド８５４-９０．１を構築した。プラスミド８５４-９０．１は、ＳＰＶ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏ  ＲＩ部位（ヌクレオチド：配列番号：１）を、ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に変換することによって構築した。相同ベクター８５４-９０．１は、Ｎｏｔ  Ｉ挿入部位の上流にＳＰＶ  ＤＮＡの１６５２塩基対領域とＮｏｔ  Ｉ挿入部位の下流にＳＰＶ  ＤＮＡの５０５８塩基対領域を含む。プラスミド８５４-９０．１に挿入された外来ＤＮＡを含む相同ベクターは、「相同的組換え」によって豚痘ウイルスＤＮＡと結合した時、組換え豚痘ウイルスの構築のために有用である。
外来ＤＮＡを組換え豚痘ウイルスに挿入するためにプラスミド８５５-３７．５を構築した。プラスミド８５５-３７．５は、ユニークなＮｏｔ  Ｉ挿入部位を含むプラスミド８５４-９０．１からの豚痘ウイルスＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内の約１８７５塩基対Ｄｒａ  Ｉ制限断片をプラスミドＰＮＥＢ１９３に挿入することによって構築した。相同ベクター８５５-３７．５は、Ｎｏｔ  Ｉ挿入部位の上流にＳＰＶ  ＤＮＡの約８８１塩基対領域とＮｏｔ  Ｉ挿入部位の下流にＳＰＶ  ＤＮＡの約９９４塩基対領域を含む。相同ベクター８５５-３７．５のの全体の大きさは約３．９ｋｂであり、これは２つまたはそれ以上の外来遺伝子を相同ベクターに挿入するために、また相同的組換えによって組換え豚痘ウイルスに挿入するために理想的である。
外来ＤＮＡを組換え豚痘ウイルスに挿入するためにプラスミド８４７-４２．２Ｃを構築した。プラスミド８４７-４２．２Ｃは、ｕｉｄＡ遺伝子をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成痘プロモーターＥＰ２の制御下にある。付加的外来ＤＮＡをユニークな制限部位ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ内のｕｉｄＡ遺伝子の上流に挿入する。
外来ＤＮＡを組換え豚痘ウイルスに挿入するためにプラスミド８４７-４２．７Ｂを構築した。プラスミド８４７-４２．２Ｃは、ｕｉｄＡ遺伝子をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーターＥＰ２の制御下にある。付加的外来ＤＮＡをユニークな制限部位ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ内のｕｉｄＡ遺伝子の下流に挿入する。
Ｓ-ＳＰＶ-１２０：
Ｓ-ＳＰＶ-１２０は２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入した。大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-００３カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）からＳ-ＳＰＶ-１２０を誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター８４７-４２．２Ｃ（上記参照）とウイルスＳ-ＳＰＶ-００３を用いて実施した。「β-ガラクトシダーゼあるいはβ-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのためのＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終産物はＳ-ＳＰＶ  １２０と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
Ｓ-ＳＰＶ-１２０は、ＢＬＵＯＧＡＬあるいはＸ-ＧＬＵＣの存在下での、ＳＰＶ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位および６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位への外来ＤＮＡ挿入に関する選択のために、ホワイトプラーク選択を用いて付加的外来ＤＮＡ配列を組換え豚痘ウイルスに挿入するのに有用である。
Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位および６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位において外来ＤＮＡを発現する組換え豚痘ウイルスの例の一部は次の通りである：ブタインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび核蛋白を発現する組換えＳＰＶ；ブタ生殖器および呼吸器系疾患ウイルスＯＲＦ５およびＯＲＦ６を発現する組換えＳＰＶ；ブタ生殖器および呼吸器系疾患ウイルスＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６を発現する組換えＳＰＶ；ネコ免疫欠損ウイルスｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープを発現する組換えＳＰＶ；ネコ白血病ウイルスｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープを発現する組換えＳＰＶ；ネコ免疫欠損ウイルスｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープおよびネコ白血病ウイルスｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープを発現する組換えＳＰＶ；ウシ伝染性鼻気管炎糖蛋白Ｂ、糖蛋白Ｄおよび糖蛋白Ｉを発現する組換えＳＰＶ。
組換え豚痘ウイルス内の外来ＤＮＡ挿入部位の追加的な例は、以下のひとつまたはそれ以上によって例示されるが、これらに限定されない：ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＮｄｅＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０５２参照）；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の２．０ｋｂ  ＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブ断片内のユニークなＢｇｌＩＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０４７参照）；６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０５９参照）；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ断片内のユニークなＸｈｏＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０６４参照）；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のユニークなＢｇｌＩＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０６２参照）；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のユニークなＥｃｏＲＶ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０６０参照）；ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｎ断片内のユニークなＳｎａＢＩ制限部位（例Ｓ-ＳＰＶ-０６１参照）。
例  ４５：ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタインフルエンザウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス
組換え豚痘ウイルスは４つの外来遺伝子を発現する。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をＳＰＶ  ６１７-４８．１  ＯＲＦ（ユニークなＮｏｔＩ制限部位がユニークなＡｃｃＩ制限部位に取って代っている）に挿入した。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＳＩＶ  ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下に、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタインフルエンザウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスをＳ-ＳＰＶ-０６５カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター（プラスミド８５５-３７．５（上記参照）内のユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＳＩＶ  ＮＡおよび大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子を含む）およびウイルスＳ-ＳＰＶ-０６５を用いて達成される。「β-ガラクトシダーゼあるいはβ-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラークおよびブループラーク精製の最終的結果が組換え豚痘ウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタインフルエンザウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスは、ＳＩＶ感染に対するブタのワクチンとして有用であり、またＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白の発現のためにも有用である。
Ｓ-ＳＰＶ-１２１：
Ｓ-ＳＰＶ-１２１は、少なくともひとつの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１２１をＳ-ＳＰＶ-０５９カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」においてプラスミド８５５-３７．５（上記参照）内のユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＳＩＶ  ＨＡ遺伝子を含む相同ベクターおよびウイルスＳ-ＳＰＶ-０５９を用いて達成される。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＳＰＶに関するスクリーン（Ｘ-ＧＬＵＣアッセイ）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。ホワイトプラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-１２１と称される組換えウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-グルクロニダーゼ発現の不在、純度および挿入安定性に関してアッセイする。最初の３回の精製後、観察されるプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す白色である。
Ｓ-ＳＰＶ-１２１は、ＳＩＶ感染に対するブタのワクチンとして有用であり、またＳＩＶ  ＨＡ蛋白の発現のためにも有用である。
Ｓ-ＳＰＶ-１２２：
Ｓ-ＳＰＶ-１２２は、２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子とノイラミニダーゼ（ＮＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＳＩＶ  ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成初期／後期プロモーター（ＥＰ２ＬＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１２２をＳ-ＳＰＶ-０５９カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」においてプラスミド８５５-３７．５（上記参照）内のユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む相同ベクターとウイルスＳ-ＳＰＶ-０５９を用いて達成される。「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するスクリーン」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。ホワイトプラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-１２２と称される組換えウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-グルクロニダーゼ発現の不在、純度および挿入安定性に関してアッセイする。最初の３回の精製後、観察されるプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す白色である。
Ｓ-ＳＰＶ-１２２は、ＳＩＶ感染に対するブタのワクチンとして有用であり、またＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白の発現のためにも有用である。
例  ４６：ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス
組換え豚痘ウイルスは４つの外来遺伝子を発現する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ５に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をＳＰＶ  ６１７-４８．１  ＯＲＦ（ユニークなＮｏｔＩ制限部位がユニークなＡｃｃＩ制限部位に取って代っている）に挿入した。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）に挿入した。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下に、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスをＳ-ＳＰＶ-０９５カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター（プラスミド８５５-３７．５（上記参照）においてユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＰＲＲＳ  ＯＲＦ６および大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子を含む）およびウイルスＳ-ＳＰＶ-０９５を用いて達成される。「β-ガラクトシダーゼあるいはβ-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラークおよびブループラーク精製の最終的結果が組換え豚痘ウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
組換え豚痘ウイルスは４つの外来遺伝子を発現する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ６に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をＳＰＶ  ６１７-４８．１  ＯＲＦ（ユニークなＮｏｔＩ制限部位がユニークなＡｃｃＩ制限部位に取って代っている）に挿入する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下に、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスをＳ-ＳＰＶ-０８４カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター（プラスミド８５５-３７．５（上記参照）内のユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＰＲＲＳ  ＯＲＦ５および大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子を含む）およびウイルスＳ-ＳＰＶ-０８４を用いて達成される。「β-ガラクトシダーゼあるいはβ-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングする。レッドプラークおよびブループラーク精製の最終的結果が組換え豚痘ウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイする。最初の３回の精製後、観察されるプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスは、ＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用であり、またＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白の発現のためにも有用である。
例  ４７：ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＭおよびＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ挿入部位においてウシウイルス性下痢性ウイルス１型および２型遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルス
Ｓ-ＳＰＶ-１３２：
Ｓ-ＳＰＶ-１３２は、４つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。ウシウイルス性下痢性ウイルス１型（ＢＶＤＶ-１）糖蛋白５３（ｇｐ５３）に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をＳＰＶ  ６１７-４８．１  ＯＲＦ（ユニークなＮｏｔＩ制限部位がユニークなＡｃｃＩ制限部位に取って代っている）に挿入する。ウシウイルス性下痢性ウイルス２型（ＢＶＤＶ-２）糖蛋白５３（ｇｐ５３）に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号：１）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ＢＶＤＶ-１  ｇｐ５３遺伝子およびＢＶＤＶ-２  ｇｐ５３遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあって、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１３２をＳ-ＳＰＶ-０５１カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター（プラスミド８５５-３７．５（上記参照）内のユニークなＮｏｔＩ部位に挿入したＢＶＤＶ-２  ｇｐ５３および大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子を含む）およびウイルスＳ-ＳＰＶ-０５１を用いて達成される。「β-ガラクトシダーゼあるいはβ-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングする。レッドプラークおよびブループラーク精製の最終的結果が組換え豚痘ウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイする。最初の３回の精製後、観察されるプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
Ｓ-ＳＰＶ-１３２は、ＢＶＤＶ感染に対するブタのワクチンとして有用であり、またＢＶＤＶ-１  ｇｐ５３およびＢＶＤＶ-２  ｇｐ５３の発現のためにも有用である。
Ｓ-ＳＰＶ-１３４：
Ｓ-ＳＰＶ-１３４は、４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ６に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦにおいてユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１３４をＳ-ＳＰＶ-０８４カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター８５５-５２．３１とウイルスＳ-ＳＰＶ-０８４を用いて達成した。「β-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイ3惰Xに関するスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。ブループラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ  １３４と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５およびＯＲＦ６遺伝子産物の発現を確認するため、細胞をＳ-ＳＰＶ-１３４に感染させ、感染細胞溶解物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。「ウエスタンブロット法」を用いてゲルをブロットし、分析した。ポリクローナルブタ抗ＰＲＲＳ（ＮＶＳＬ）血清を用いてＰＲＲＳ特異的蛋白の発現を検出した。ＳＰＶ-１３４感染細胞からの細胞溶解酸物は、ＳＩＶ  ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白の予想される大きさである２６ｋｄと１８ｋｄに対応するバンドを示した。ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白間で形成されるヘテロダイマーを表わす４０ｋｄバンドも非還元条件下で見られ、ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白間でのジスルフィド結合複合体の形成を示唆した。ここで述べたアッセイはＥＳＫ-４細胞において実施したものであり、ＥＳＫ-４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した基質であることを示している。
Ｓ-ＳＰＶ-１３４は、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１３４はまた、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白の発現のためにも有用である。
相同ベクター  ８５５-５２．３１。相同ベクター８５５-５２．３１を用いて外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子を組み込んでいる。この相同ベクターを「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意しなければならない。以下の供給源からの制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列に連結することにより、標準的組換えＤＮＡ法（２２および３０）を用いて相同ベクターを構築した。プラスミド８５５-５２．３１はプラスミド８４７-４２．７Ｃを用いて構築した。このプラスミドはあらかじめ、ｕｉｄＡ遺伝子をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。次にＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、プラスミド８５５-５２．３１を生成した。ＰＲＲＦ  ＯＲＦ５遺伝子の転写および翻訳の方向はｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子は、ＰＲＲＳ  ＮＶＳＬ標準株からＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５，４２）によって合成される約６０３塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000165
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の５’末端から合成され、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入されている。下流プライマー
0003939358.tif 000166
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５の３’末端から合成され、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入されており、これを逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子に対応する６０３塩基対の長さの断片を生成した。
Ｓ-ＳＰＶ-１３６：
Ｓ-ＳＰＶ-１３６は４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ６に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１３６をＳ-ＳＰＶ-０８４カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター８５５-５２．４３とウイルスＳ-ＳＰＶ-０８４を用いて達成した。「β-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。ブループラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ  １３６と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５およびＯＲＦ６遺伝子産物の発現を確認するため、細胞をＳ-ＳＰＶ-１３６に感染させ、感染細胞溶解物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。「ウエスタンブロット法」を用いてゲルをブロットし、分析した。ポリクローナルブタ抗ＰＲＲＳ（ＮＶＳＬ）血清を用いてＰＲＲＳ特異的蛋白の発現を検出した。ＳＰＶ-１３６感染細胞からの細胞溶解酸物は、ＳＩＶ  ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白の予想される大きさである２６ｋｄと１８ｋｄに対応するバンドを示した。ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白間で形成されるヘテロダイマーを表わす４０ｋｄバンドも非還元条件下で見られ、ＯＲＦ５とＯＲＦ６蛋白間でのジスルフィド結合複合体の形成を示唆した。ここで述べたアッセイはＥＳＫ-４細胞において実施したものであり、ＥＳＫ-４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した基質であることを示している。
Ｓ-ＳＰＶ-１３６は、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１３６はまた、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白の発現のためにも有用である。
相同ベクター  ８５５-５２．４３。相同ベクター８５５-５２．４３を用いて外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子を組み込んでいる。この相同ベクターを「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意しなければならない。以下の供給源からの制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列に連結することにより、標準的組換えＤＮＡ法（２２および３０）を用いて相同ベクターを構築した。プラスミド８５５-５２．４３はプラスミド８４７-４２．７Ｃを用いて構築した。このプラスミドはあらかじめ、ｕｉｄＡ遺伝子をＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。次にＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、プラスミド８５５-５２．３１を生成した。ＰＲＲＦ  ＯＲＦ５遺伝子の転写および翻訳の方向はｕｉｄＡ遺伝子と逆である。
ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子は、ＰＲＲＳ  ＮＶＳＬ標準株からＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５，４２）によって合成される約６０３塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000167
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の５’末端から合成され、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入されている。下流プライマー
0003939358.tif 000168
はＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子の３’末端から合成され、遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入されており、これを逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５遺伝子に対応する６０３塩基対の長さの断片を生成した。
Ｓ-ＳＰＶ-１５７：
Ｓ-ＳＰＶ-１５７は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）（ＨＩＮ１）に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子ををユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１５７をＳ-ＳＰＶ-１２１カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター８０７-８４．３５とウイルスＳ-ＳＰＶ-１２１を用いて達成した。「β-ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶに関するスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-１５７と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されるプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ遺伝子産物の発現を確認するため、細胞をＳ-ＳＰＶ-１５７に感染させ、感染細胞溶解物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。「ウエスタンブロット法」を用いてゲルをブロットし、分析した。ポリクローナルヤギ抗ＨＡあるいはポリクローナルヤギ抗ＮＡ血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白の発現を検出した。ＳＰＶ-１５７感染細胞からの細胞溶解酸物は、ＳＩＶ  ＨＡとＮＡ蛋白の予想される大きさである６４ｋｄと５２ｋｄに対応するバンドを示した。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子の発現に関するブラックプラークスクリーン」を用いて、Ｓ-ＳＰＶ-１５７をＳＩＶ特異的抗原の発現に関してアッセイした。ポリクローナルブタ抗ＳＩＶあるいはポリクローナルヤギ抗ＨＡ血清は、Ｓ-ＳＰＶ-１５７プラークと特異的に反応し、Ｓ-ＳＰＶ-００１陰性対照プラークとは反応しないことを示した。観察したＳ-ＳＰＶ-１５７のプラークはすべて両方の血清と反応し、ウイルスが安定してＳＩＶ外来遺伝子を発現していることを示した。ここで述べたアッセイはＥＳＫ-４細胞において実施したものであり、ＥＳＫ-４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した基質であることを示している。
Ｓ-ＳＰＶ-１５７は、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＳＩＶ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１５７はまた、ＳＩＶ  ＨＡおよびＮＡ蛋白の発現のためにも有用である。
相同ベクター  ８０７-８４．３５。相同ベクター８０７-８４．３５を用いて外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を組み込んでいる。この相同べクターを「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意しなければならない。以下の供給源からの制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列に連結することにより、標準的組換えＤＮＡ法（２２および３０）を用いて相同ベクターを構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））の約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブ断片である。断片２は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の、約１４１４塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000169
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の５’末端から合成され、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入されている。下流プライマー
0003939358.tif 000170
はＳＩＶ  ＮＡ遺伝子の３’末端から合成され、遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位が導入されており、これを逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化して、ＳＩＶ  ＮＡ遺伝子に対応する１４１４塩基対の長さの断片を生成した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブ断片である。合成リンカーを用いてＳＰＶ相同ベクター内のＡｃｃＩ部位をユニークなＮｏｔＩ部位に変換した。
Ｓ-ＳＰＶ-１５８：
Ｓ-ＳＰＶ-１５８は、４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白（ＮＰ）（ＨＩＮ１）に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子ををユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子とノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｈ１Ｎ１）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＮＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＨＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあって、ＮＰ遺伝子は合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に、またｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-１５８をＳ-ＳＰＶ-１２２カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクター８０７-４１．０３とウイルスＳ-ＳＰＶ-１２２を用いて達成した。「β-ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶに関するスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-１５８と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイした。最初の３回の精製後、観察されたプラークはすべて、ウイルスが純粋で且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示す青色である。
ＳＩＶ  ＨＡ、ＮＡおよびＮＰ遺伝子産物の発現を確認するため、細胞をＳ-ＳＰＶ-１５８に感染させ、感染細胞溶解物のサンプルと培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。「ウエスタンブロット法」を用いてゲルをブロットし、分析した。ポリクローナルヤギ抗ＨＡ、ポリクローナルヤギ抗ＮＰ、あるいはポリクローナルヤギ抗ＮＡ血清を用いてＳＩＶ特異的蛋白の発現を検出した。ＳＰＶ-１５８感染細胞からの細胞溶解酸物は、各々ＳＩＶ  ＨＡ、ＮＡおよびＮＰ蛋白の予想される大きさである６４ｋｄ、５２ｋｄおよび５６ｋｄに対応するバンドを示した。
「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子の発現に関するブラックプラークスクリーン」を用いて、Ｓ-ＳＰＶ-１５８をＳＩＶ特異的抗原の発現に関してアッセイした。ポリクローナルブタ抗ＳＩＶ血清、ポリクローナルヤギ抗ＨＡ血清、あるいはポリクローナルヤギ抗ＮＰ血清は、Ｓ-ＳＰＶ-１５８プラークと特異的に反応し、Ｓ-ＳＰＶ-００１陰性対照プラークとは反応しないことを示した。観察したすべてのＳ-ＳＰＶ-１５８プラークが３つの血清学的試薬全部と反応し、ウイルスが安定してＳＩＶ外来遺伝子を発現していることを示した。ここで述べたアッセイはＥＳＫ-４細胞において実施したものであり、ＥＳＫ-４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した基質であることを示している。
Ｓ-ＳＰＶ-１５８は、ＳＩＶ  ＨＡ、ＮＡおよびＮＰ蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＳＩＶ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１５８はまた、ＳＩＶ  ＨＡ、ＮＡおよびＮＰ蛋白の発現のためにも有用である。
相同ベクター  ８０７-４１．０３。相同ベクター８０７-４１．０３を用いて外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）核蛋白（ＮＰ）遺伝子を組み込んでいる。この相同ベクターを「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意しなければならない。以下の供給源からの制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列に連結することにより、標準的組換えＤＮＡ法（２２および３０）を用いて相同ベクターを構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））の約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導した。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）の約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブ断片である。断片２は、ＳＩＶ  Ｈ１Ｎ１株（ＮＶＳＬ）からＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成したＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の、約１５０１塩基対のＥｃｏＲＩからＥｃｏＲＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000171
はＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の５’末端から合成され、遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入されている。下流プライマー
0003939358.tif 000172
は、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子の３’末端から合成され、遺伝子の３’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入されており、これを逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して、ＳＩＶ  ＮＰ遺伝子に対応する１５０１塩基対の長さの断片を生成した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブ断片である。合成リンカーを用いてＳＰＶ相同ベクター内のＡｃｃＩ部位をユニークなＮｏｔＩ部位に変換した。
Ｓ-ＳＰＶ-２１７：
Ｓ-ＳＰＶ-２１７は４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ５に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-２１７をＳ-ＳＰＶ-１７４カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクターとウイルスＳ-ＳＰＶ-１７４を用いて達成した。「β-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶに関するスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングする。ブループラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-２１７と称される組換えウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイする。
Ｓ-ＳＰＶ-２１７は、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１３４はまた、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白の発現のためにも有用である。
Ｓ-ＳＰＶ-２１８：
Ｓ-ＳＰＶ-２１８は４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ  ５に関する遺伝子と大腸菌β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６に関する遺伝子と大腸菌β-グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）に関する遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入する。ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ６遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）ＯＲＦ５遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、またｕｉｄＡ遺伝子は合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ-ＳＰＶ-２１８をＳ-ＳＰＶ-１７４カスザ株（Ｋａｓｚａ  Ｓｔｒａｉｎ）から誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」において相同ベクターとウイルスＳ-ＳＰＶ-１７４を用いて達成した。「β-グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶに関するスクリーン（酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスに関するスクリーン）」によってトランスフェクション株をスクリーニングする。ブループラーク精製の最終的結果が、Ｓ-ＳＰＶ-２１８と称される組換えウイルスである。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性に関してアッセイする。
Ｓ-ＳＰＶ-２１８は、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ-ＳＰＶ-１３４はまた、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６蛋白の発現のためにも有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−１９５：
Ｓ−ＳＰＶ−１９５は、外来の遺伝子を一つ発現する豚痘ウイルスである。ＦｅＬＶの表面蛋白質と膜通過蛋白質のサブユニットをコードする全長の遺伝子（ＳＵ＋ＴＭ）と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入した（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１９５は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９１１−４．Ａ１とＳ−ＳＰＶ−００１ウイルスを用いて作製された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーニング（酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのＢＬＵＯＧＡＬとＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。。レッドプラーク精製の最終結果が、Ｓ−ＳＰＶ  １９５と称された組換えウイルスであった。このウイルスは、β−ガラクトシダーゼの発現についてアッセイされ、現在、純度と安定性を判定するために、何回も多継代が行われている。
組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のブラックプラークスクリーニングを用いて、ＦｅＬＶのエンベロープのｇｐ  ７０の発現について、Ｓ−ＳＰＶ−１９５をアッセイした。モノクローナルマウス抗−ＦｅＬＶ  ｇｐ７０抗体が、Ｓ−ＳＰＶ−１９５プラークと特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことが示された。観察されたＳ−ＳＰＶ−１９５のプラークはすべて、このモノクローナル抗体と反応して、このウイルスが、ＦｅＬＶの外来遺伝子を安定的に発現していることを示した。ここで説明されているアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で実施され、ＥＳＫ−４細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した培養基であることが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−１９５は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ネコ白血病感染に対する、ネコのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−１９５は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター９０５−４．Ａ１。相同性ベクター９１１−４．Ａ１を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶＤＮＡに隣接した全長のＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子が、合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることに留意されなければいけない。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））の約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片に誘導する。断片１は、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片（２３）の制限サブ断片である。断片２は、亜型Ａ  ＦｅＬＶ／ＦＡＩＤｓ株であるｐ６１ＥからのＦｅＬＶ  ｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成されたＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子の約１９２９塩基対のＥｃｏＲＩかＢａｍＨＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000173
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000174
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。これらのプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング（ＣＬＯＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＴＨＥ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＣＨＡＩＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ）による逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限消化して、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子に対応する、長さ約１９２９塩基対の断片を生成した。
断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの約３０１０塩基対の制限断片である。断片４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の、ＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの約２１４９塩基対の制限サブ断片である。合成リンカーを用いて、ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位をユニークなＮｏｔ  Ｉ部位に変換した。
Ｓ−ＳＰＶ−２０５：
Ｓ−ＳＰＶ−２０５は、４つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のｇａｇ／プロテアーゼの遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子と、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）は、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦｅＬＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーターのＬＰ１の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期痘プロモーターのＥＰ２の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−２０５は、Ｓ−ＳＰＶ−０８９（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９０５−３１．Ａ１とＳ−ＳＰＶ−０８９ウイルスを用いて作製された。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング（Ｘ−ＧＬＵＣ、および「β−グルクロニダーゼを発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニングによって、トランスフェクション株をスクリーニングした。マーカー遺伝子を発現する組換えプラークは、ブルー／グリーンプラーク検出によって、β−グルクロニダーゼに関して陽性であることが示されており、ＳＰＶ  ２０５と命名された。
「実験材料と方法」で述べたブルー／グリーンプラークアッセイによりモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の発現、純度、および挿入安定性について、このウイルスをアッセイした。最初の３回の多継代後、調べたプラークは、すべてブルー／グリーンで、このウイルスが純粋なものであることを示していた。ＦｅＬＶのｇａｇ遺伝子とエンベロープ遺伝子の発現解析、および安定性解析が進行中である。
相同性ベクター９０５−３１．Ａ１。相同性ベクター９０５−３１．Ａ１を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶ０８９に挿入した。このベクターは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡにフランクしたＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、別々のユニークな合成初期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることに留意されなければいけない。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミド９０５−３１．Ａ１は、プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて構築された。このプラスミドは、以前、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩのゲノム断片Ｋの中にあるユニークなＥｃｏＲＩ部位の中に、ｕｉｄＡ遺伝子を挿入して構築された。そして、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ部位の中に挿入して、プラスミド９０５−３１．Ａ１を作製した。ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、亜型Ａ  ＦｅＬＶ／ＦＡＩＤｓ株であるｐ６１ＥからのＦｅＬＶ  ｃＤＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの約１９２９塩基対の断片である。上流プライマー
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が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000176
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。これらのプライマーを、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限消化して、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子に対応する、長さ約１９２９塩基対の断片を生成した。
Ｓ−ＳＰＶ−１９７：
Ｓ−ＳＰＶ−１９７は、一つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ白血病ウイルス亜型Ａ（ＦｅＬＶ）に誘導する全長のエンベロープ遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子とを、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入した（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦｅＬＶのエンベロープに対する遺伝子とβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子をユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入した（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩＫ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。エンベロープ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、別の合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１９７は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９０５−３１．Ａ１とＳ−ＳＰＶ−００１ウイルスを用いて作製された。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング（Ｘ−ＧＬＵＣ、および酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。ブルー／グリーン精製の最終的な結果得られたウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−１９７と称された組換えウイルスであった。
「実験材料と方法」で述べたブループラークアッセイによりモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の発現、純度、および挿入安定性について、このウイルスをアッセイした。最初の３回の多継代後、調べたプラークは、すべてブルー／グリーンで、このウイルスが純粋且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示していた。
ＦｅＬＶのエンベロープ外来遺伝子産物の発現を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−１９７を細胞に感染させ、感染細胞溶解液のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけた。ウエスタンブロット法を用いて、ブロットし分析を行なった。マウスのモノクローナル抗−ＦｅＬＶ  ｇｐ７０抗体を用いて、ｇｐ７０特異的な蛋白質の発現を検出した。ＳＰＶ−１９５に感染した細胞からの細胞溶解液は、プロセッシングされていないＦｅＬＶエンベロープ蛋白質とプロセッシングされたｇｐ  ７０エンベロープ表面蛋白質の予想される大きさに相当する８５ｋｄａと７０ｋｄａのバンドを示した。７０ｋｄａの蛋白質産物が、細胞溶解液中では主要であった。
組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のブラックプラークスクリーニングを用いて、ＦｅＬＶのエンベロープのｇｐ  ７０の発現について、Ｓ−ＳＰＶ−１９７をアッセイした。モノクローナルマウス抗−ＦｅＬＶ  ｇｐ７０抗体が、Ｓ−ＳＰＶ−１９７プラークと特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことが示された。観察されたＳ−ＳＰＶ−１９７のプラークはすべて、このモノクローナル抗体と反応して、このウイルスが、ＦｅＬＶの外来遺伝子を安定的に発現していることを示した。ここで説明されているアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で実施され、ＥＳＫ−４細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した培養基であることが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−１９７は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ネコ白血病感染に対する、ネコのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−１９７は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター９０５−３１．Ａ１。相同性ベクター９０５−３１．Ａ１を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡにフランクしたＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、別々のユニークな合成初期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることに留意されなければいけない。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミド９０５−３１．Ａ１は、プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて構築された。このプラスミドは、以前、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩのゲノム断片Ｋの中にあるユニークなＥｃｏＲＩ部位の中に、ｕｉｄＡ遺伝子を挿入して構築された。そして、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ部位の中に挿入して、プラスミド９０５−３１．Ａ１を作製した。
ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、亜型Ａ  ＦｅＬＶ／ＦＡＩＤｓ株であるｐ６１ＥからのＦｅＬＶ  ｃＤＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの約１９２９塩基対の断片である。上流プライマー
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が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000178
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。これらのプライマーは、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いられた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限消化して、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子に対応する、長さ約１９２９塩基対の断片を生成した。
Ｓ−ＳＰＶ−１９８：
Ｓ−ＳＰＶ−１９８は、２個の外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ白血病ウイルス亜型Ａ（ＦｅＬＶ）に誘導する全長のエンベロープ遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）をコードする遺伝子とが、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦｅＬＶのエンベロープに対する遺伝子を、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入した（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成初期痘プロモーター、ＥＰ２の制御下にある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、合成後期／初期痘プロモーター、ＥＰ１の制御下にある。同一のプロモーター因子（ＥＰ２）の間で相同的な組換えが起こるのを回避するために、２つのプロモーター／遺伝子カセットが反対向きになっていることに留意すべきである。
Ｓ−ＳＰＶ−１９８は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター８６０−２．Ａ５とＳ−ＳＰＶ−００１ウイルスを用いて作製された。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング（Ｘ−ＧＬＵＣ、および酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。ブルー／グリーンプラーク検出によって、マーカー遺伝子を発現する組換えプラークは、β−グルクロニダーゼ遺伝子に関して陽性であることが示され、ＳＰＶ  １９７と称された。
Ｓ−ＳＰＶ−１９８は、「実験材料と方法」で説明されているブラックプラークアッセイとウエスタンブロットアッセイを用いて、精製処理と、外来遺伝子の発現と安定性の解析が行われている。ここで説明されているアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で実施され、ＥＳＫ−４細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した培養基であることが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−１９８は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ネコ白血病感染に対する、ネコのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−１９８は、ＦｅＬＶのエンベロープ蛋白質を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター８６０−２．Ａ５。相同性ベクター８６０−２．Ａ５を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。このベクターは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶＤＮＡに隣接したＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子が、合成の初期／後期痘プロモーター（ＬＰ２／ＥＰ２）の制御下にあることに留意すべきである。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミド８６０−２．Ａ５は、プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて構築された。このプラスミドは、以前、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩのゲノム断片Ｋの中にあるユニークなＮｏｔＩ部位の中に、ｕｉｄＡ遺伝子を挿入して構築された。そして、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ部位の中に挿入して、プラスミド８６０−２．Ａ５を作製した。
ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子は、亜型Ａ  ＦｅＬＶ／ＦＡＩＤｓ株であるｐ６１Ｅ（ＮＩＡＩＤＳ寄託所、カタログ番号：１０９から受け取った）からのＦｅＬＶ  ｃＤＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの約１９２９塩基対の断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000179
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000180
が、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。これらのプライマーを、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限消化して、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子に対応する、長さ約１９２９塩基対の断片を生成した。
Ｓ−ＳＰＶ−２０６：
Ｓ−ＳＰＶ−２０６は、４つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ＦＩＶのエンベロープ遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔＩ制限部位に挿入された（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とエンベロープ遺伝子は、別々に、同じ合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−２０６は、Ｓ−ＳＰＶ−０４８に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９１３−１１．４とＳ−ＳＰＶ−０４８ウイルスを用いて作製された。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ、および「β−グルクロニダーゼを発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。ブルー／グリーン精製の最終的な結果得られたウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−２０６と称された組換えウイルスであった。「実験材料と方法」で述られているブルー／グリーンプラークアッセイによりモニターした多継代によってβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の発現、純度、および挿入安定性について、このウイルスをアッセイした。最初の３回の多継代後、調べたプラークは、すべてブルー／グリーンで、このウイルスが純粋で安定しており、また外来遺伝子を発現していることを示していた。
ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とエンベロープ遺伝子の産物の発現を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−２０６を細胞に感染させ、感染した細胞溶解液と培養上清のサンプルでＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけた。ウエスタンブロット法を用いて、ブロットし分析を行なった。ネコのポリクローナル抗−ＦＩＶ  ＰＰＲ血清、または、モノクローナルマウス抗−ＦＩＶ  ｇａｇ（ｐ２４）抗体を用いて、ＦＩＶエンベロープとｇａｇ特異的な蛋白質の発現を検出した。ＳＰＶ−２００に感染した細胞からの細胞溶解液は、ＦＩＶ  ｇａｇ／プロテアーゼ蛋白質とエンベロープ蛋白質の大きさのバンドを示した。
組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現に関するブラックプラークスクリーニングを用いて、ＦＩＶのエンベロープのｇａｇ／プロテアーゼ特異的抗原の発現について、Ｓ−ＳＰＶ−２００をアッセイした。モノクローナルマウス抗−ＦＩＶ  ｇａｇ（ｐ２４）抗体が、Ｓ−ＳＰＶ−２０６プラークと特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことが示された。観察されたＳ−ＳＰＶ−２０６のプラークはすべて、このモノクローナル抗体と反応して、このウイルスが、ＦＩＶの外来ｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子を安定的に発現していることを示した。ここで説明されているアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で実施され、ＥＳＫ−４細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した培養基であることが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−２０６は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＦＩＶ感染に対する、ネコのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−２０６は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープ蛋白質を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター９１３−１１．４。相同性ベクター９１３−１１．４を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶ０４８に挿入した。このベクターは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡにフランクしたＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成初期痘プロモーター、ＥＰ２の制御下にあり、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼは、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されなければいけない。これら２つのプロモーター／遺伝子カセットは、隣接するプロモーターと反対向きになっているが、同一のＥＰ２プロモーター因子の間で相同的組換えを避けるために、反対向きになっていた。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミド９１３−１１．４は、プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて構築された。このプラスミドは、以前、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩのゲノム断片Ｋの中にあるユニークなＥｃｏＲＩ部位の中に、ｕｉｄＡ遺伝子を挿入して構築された。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。そして、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ部位の中に挿入して、プラスミド９１３−１１．４を作製した。
ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、亜型Ａ  ＦＩＶ  ＰＰＲ株に誘導するｃＤＮＡを用い、逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された。上流プライマー
0003939358.tif 000181
が、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000182
が、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入して、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで制限消化して、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子に対応する、長さ約１８３９塩基対の断片を生成した。
Ｓ−ＳＰＶ−２００：
Ｓ−ＳＰＶ−２００は、３つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）のｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子と、全長のエンベロープ遺伝子、および大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とエンベロープ遺伝子は、別々に、同じ後期／初期プロモーターの制御下にある（ＬＰ２ＥＰ２。ｌａｃＺ遺伝子は、後期プロモーター（ＬＰ２）の制御下にある）。
Ｓ−ＳＰＶ−２００は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９０４−６３．Ｂ７とＳ−ＳＰＶ−００１ウイルスを用いて作製された。「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのためのスクリーニング」（ＢＬＵＯＧＡＬおよびＣＰＲＧアッセイ、および酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終結果が、Ｓ−ＳＰＶ  １５７と称された組換えウイルスであった。このウイルスは、「実験材料と方法」で説明されているブループラークアッセイによって、β−ガラクトシダーゼの発現についてアッセイされた。現在、何回も多継代を行なって、純度と挿入安定性の解析が進められており、「実験材料と方法」で説明されているブループラークアッセイによって、モニターされる。
Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとＦＩＶエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＳＩＶ感染に対する、ブタのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープ蛋白質を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター９０４−６３．Ｂ７。相同性ベクター９０４−６３．Ｂ７を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶ００１に挿入した。このベクターは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡにフランクした、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とエンベロープ遺伝子を組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とエンベロープ遺伝子は、別々ではあるが一致する合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されなければいけない。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとＦＩＶエンベロープのプロモーター／遺伝子カセットは、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子とＦＩＶエンベロープ遺伝子の転写が、互いに、同一のプロモーター間での相同的組換えの可能性を避ける方向に進むように、反対向きになっている。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの、約２９７２塩基対の制限断片に誘導していた。断片１は、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片（２３）の制限サブ断片である。断片２は、ＦＩＶのＰＰＲ株からのｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の約２５８０塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000183
が、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000184
が、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入して、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで制限消化して、ＦＩＶのエンベロープ遺伝子に対応する、長さ２５８０塩基対の断片を得た。断片３は、ＦＩＶのＰＰＲ株からのｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の約１８３９塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000185
が、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000186
が、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の３’末端からの合成を行ない、この遺伝子の３’末端にＢｌＩＩ部位を導入して、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢｌＩＩで制限消化して、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子に対応する、長さ１８３９塩基対の断片を得た。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１）の、ＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの約３０１０塩基対の長さの断片である。断片５は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍ（２３）の、ＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの約２１４９塩基対の制限サブ断片である。合成リンカーを用いて、ＳＰＶ相同性ベクターのＡｃｃＩ部位をユニークなＮｏｔ  Ｉ部位に変換した。
Ｓ−ＳＰＶ−２０７：
Ｓ−ＳＰＶ−２０７は、４つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼの遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦＩＶのエンベロープ遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子は、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は、構成的なＳＰＶプロモーターのＯ１Ｌの制御下にある。ＦＩＶのエンベロープ遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−２０７は、Ｓ−ＳＰＶ−０４６に誘導する。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター９１１−９６．Ａ２とＳ−ＳＰＶ−０４６ウイルスを用いて作製された。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング）（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ、および酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。ブルー／グリーン精製の最終的な結果得られたウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ−２０７と称された組換えウイルスであった。材料および方法で説明されているようなブルー／グリーンプラークアッセイによって、β−グルクロニダーゼ発現について、最初のウイルスの純度をアッセイした。外来遺伝子の最終純度と発現解析が進行中である。
Ｓ−ＳＰＶ−２０７は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープ蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＦＩＶ感染に対する、ネコのワクチンとして有用である。また、Ｓ−ＳＰＶ−２０７は、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼとエンベロープの遺伝子を発現させるのに役立つ。
相同性ベクター９１１−９６．Ａ２。相同性ベクター９１１−９６．Ａ２を用いて、外来ＤＮＡをＳＰＶ０４６に挿入した。このベクターは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡにフランクしたＦＩＶのエンベロープ遺伝子とを組み込んでいる。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ｕｉｄＡマーカー遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、ＦＩＶのエンベロープが、合成初期痘プロモーター（ＥＰ１）の制御下にあることに留意されなければいけない。この相同性ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（２２と３０）を利用して、以下の供給源からの制限断片と、適当な合成ＤＮＡ配列とを結合することによって構築された。プラスミド９１１−９６．Ａ２は、プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて構築された。このプラスミドは、以前、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩのゲノム断片Ｋの中にあるユニークなＥｃｏＲＩ部位の中に、ｕｉｄＡ遺伝子を挿入して構築された。ｕｉｄＡマーカー遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。そして、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子をｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ部位の中に挿入して、プラスミド９１１−９６．Ａ２を作製した。
ＦＩＶのエンベロープ遺伝子は、ＦＩＶのＰＰＲ株からのｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）とによって合成された。上流プライマー
0003939358.tif 000187
が、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の５’末端からの合成を行ない、この遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマーを逆転写とポリメラーゼ連鎖反応に用いた。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで制限消化して、ＦＩＶのｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子に対応する、長さ約２５８０塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１４２：
Ｓ−ＳＰＶ−１４２は、３つの外来の遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。１型ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１）のＥ２糖蛋白質遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子が、ユニークなＮｏｔ  Ｉ制限部位に挿入された（ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩＭ断片の０１Ｌの中のユニークなＡｃｃＩ制限部位の中に挿入されたＮｏｔ  Ｉリンカー）。１型ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１）のＥｒｎｓ糖蛋白質遺伝子、２型ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１）のＥ２糖蛋白質遺伝子、および大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子が、それぞれ、ユニークなＢａｍＨＩ、Ｎｏｔ  Ｉ、およびＰｓｔＩ部位（ＳＰＶの６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内にある、ユニークなＥｃｏＲＩ制限部位の中に挿入された合成ポリリンカーから作製された部位）に挿入された。Ｅ２遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、Ｅｒｎｓ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１４２は、Ｓ−ＳＰＶ−０５１（カズサ（Ｋａｓｚａ）株）に誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同的組換え法」の中の相同性ベクター８７４−４．６ＡとＳ−ＳＰＶ−０５１ウイルスを用いて作製された。１型ＢＶＤＶのＥ２遺伝子とｌａｃＺ遺伝子が、Ｓ−ＳＰＶ−０５１のＨｉｎｄＩＩＩのＭ部位中に既に存在していた。「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ、および酵素マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスのスクリーニング）」によって、トランスフェクション株をスクリーニングした。グリーンプラーク精製の最終結果が、Ｓ−ＳＰＶ−１４２と称された組換えウイルスであった。「実験材料と方法」で述べたグリーンプラークアッセイによりモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度、および挿入安定性について、このウイルスをアッセイした。
最初の４回の多継代後、調べたプラークは、すべてグリーンで、このウイルスが純粋且つ安定していて、外来遺伝子を発現していることを示していた。
２型ＢＶＤＶのＥ２の遺伝子産物、および１型のＥｒｎｓ遺伝子産物の発現を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−１４２を細胞に感染させ、感染した細胞溶解液と培養上清のサンプルでＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけた。このゲルを、ウエスタンブロット法を用いて、ブロットし分析を行なった。モノクローナルマウス抗−Ｅ２（２型）または、モノクローナルマウス抗−Ｅ２（２型）、または、モノクローナルマウス抗−Ｅｒｎｓ（１型）血清を用いて、ＢＶＤＶ特異的な蛋白質の発現を検出した。ＳＰＶ−１４２に感染した細胞からの細胞溶解液は、Ｅ２糖蛋白質（５３ｋｄ）の予想される大きさであるが、Ｅｒｎｓ糖蛋白質（４８ｋｄ）の予想大きさより僅かに小さい、５３ｋｄおよび４２ｋｄに相当するバンドを示した。
組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のブラックプラークスクリーニングを用いて、ＢＶＤＶ特異的な抗原の発現について、Ｓ−ＳＰＶ−１４２をアッセイした。モノクローナルマウス抗−Ｅ２血清が、Ｓ−ＳＰＶ−１４２プラークと特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことが示された。観察されたＳ−ＳＰＶ−１４２のプラークはすべて、１型Ｅ２血清とも２型Ｅ２血清とも反応して、このウイルスが、ＢＶＤＶ  Ｅ２外来遺伝子を安定的に発現していることが示された。ブラックプラークアッセイにおいて、Ｅｒｎｓ糖蛋白質と特異的に反応する試薬で、現在利用可能なものはない。ここで説明されているアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で実施され、ＥＳＫ−４細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適した培養基であることが示された。
Ｓ−ＳＰＶ−１４２は、１型および２型のＢＶＤＶ  Ｅ２糖蛋白質と１型Ｅｒｎｓ糖蛋白質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、ＢＶＤＶ感染に対する、ウシのワクチンとして有用である。
相同性ベクター８７４−４．６Ａ．相同性ベクター８７４−４．６Ａを使用して、外来性ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。そのことが、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）タイプ１Ｅｒｎｓ遺伝子とＢＶＤＶタイプ２  Ｅ２遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」に従って使用すると、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成の初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、Ｅｒｎｓ遺伝子は、後期合成痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてＢＶＤＶ  Ｅ２遺伝子は、合成の後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。相同ベクターは、以下の供給源からの制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列と連結することによって、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を使用して構築された。プラスミド８４７−９０．１Ａを使用して、プラスミド８７４−４．６Ａを構築した。合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下のＢＶＤＶタイプ２  Ｅ２遺伝子を、Ｎｏｔ  Ｉ部位の下流のＥＰ２−ｕｉｄＡカセットによって両端を挟まれたユニークなＮｏｔ  Ｉ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。Ｎｏｔ  Ｉ部位は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入した合成ポリリンカーから生じる。ＥＰ２−ｕｉｄＡカセットは、同じポリリンカー内のユニークなＰｓｔＩ部位に先に挿入された。ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子を、Ｅ２遺伝子の３’末端にある平滑末端（クレノー反応で満たされる）ＢａｍＨＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８７４−４．６Ａを生じた。Ｅｒｎｓ遺伝子の転写および翻訳方向は、Ｅ２およびｕｉｄＡ遺伝子の逆であった。
ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子は、ＢＶＤＶ１−シンガー株から得たＲＮＡを使用した逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応によって合成された約７４４塩基対（６３ｂｐシグナル配列＋６８１ｂｐコーディング配列）ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000188
は、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子シグナル配列の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000189
は、Ｅｒｎｓ遺伝子の３’末端から合成し、そしてその遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化させて、ＢＶＤＶ１  Ｅｒｎｓ遺伝子に対応する長さ７４４塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１８７：
Ｓ−ＳＰＶ−１８７を、２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆの遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔ１部位（６．７ｋｂ  ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂの領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔ１リンカー）に挿入した。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１／ＬＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８７は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８９４−２１．２５およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン（酵素性マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスためのBLUOGALおよびＣＰＲＧアッセイおよびスクリーン）」によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ１８７と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の５回の多継代の後、観察された全てのプラークは、青であり、それにより、ウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現ためのブラックプラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−１８７を、ＮＤＶ特異的抗原の発現について分析した。モノクローナルのマウス抗−ＮＤＶ  Ｆが、Ｓ−ＳＰＶ−１８７プラークと特異的に反応するが、Ｓ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１８７プラークはモノクローナル抗体と反応したが、それによりウイルスがＮＤＶ外来遺伝子を安定的に発現することが示される。ここで記述されたアッセイは、ＥＳＫ−４細胞内で行われ、それによって、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示した。
Ｓ−ＳＰＶ−１８７は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＮＤＶ感染に対するニワトリのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８７は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質の発現にも有用である。
外来遺伝子およびｕｉｄＡを含む０５９相同性ベクター：相同性ベクター８９４−２１．２５．相同性ベクター８９４−２１．２５を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたＮＤＶ  Ｆ遺伝子を組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、結果としてウイルスは、ＤＮＡコーディングを含む。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてＮＤＶ  Ｆ遺伝子が、合成初期／後期痘プロモーター（ＥＰ１／ＬＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得た制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．７Ｃおよびプラスミド４９３−９１．１１を使用して、プラスミド８９４−２１．２２を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミド８４７−４２．７Ｃを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。プラスミド４９３−１１．１を、予め構築し、そしてＮＤＶ  Ｆ遺伝子のコーディング領域の上流に、全長分子クローン（５０２５Ｆ）から誘導される約２１００塩基対断片であるＥＰ１／ＬＰ２プロモーターを含む。ＥＰ１／ＬＰ２−ＮＤＶ  Ｆカセットを、その後、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置したユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８９４−２１．２５を得た。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子のものの反対である。
Ｓ−ＳＰＶ−１８８：
Ｓ−ＳＰＶ−１８８は、４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ＨＮの遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔ１制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔ１リンカー）に挿入した。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆの遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔ１制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔ１リンカー）に挿入した。ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子は、合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１／ＬＰ２）の制御下にあり、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１／ＬＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８８は、Ｓ−ＳＰＶ−００９（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から由来し、それは、００３部位内にＥＰ１／ＬＰ２−ＮＤＶ  ＨＮとＬＰ１−ＬａｃＺを含有する。これは、「組換え体ＳＰＶを生成する相同性組換手段」での相同性ベクター８９４−２１．２５およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００９を利用して達成された。感染貯蔵物を、β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイおよび酵素性マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスためのスクリーン）によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ１８８と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによって観察される複数経路により、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の５回の多継代の後、観察された全てのプラークは青であったが、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現ためのブラックプラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−１８８を、ＮＤＶ特異的抗原の発現について分析した。モノクローナルマウス抗−ＮＤＶ  Ｆおよびモノクローナルのマウス抗−ＮＤＶＨＮが、Ｓ−ＳＰＶ−１８８プラークと特異的に反応するが、Ｓ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１８８プラークは、モノクローナル抗体と反応し、それによりウイルスがＮＤＶ外来遺伝子を安定的に発現することが示された。ここで記述されたアッセイは、ＥＳＫ−４細胞内で行われ、それによって、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示した。
組換えＳＰＶでの発現。モノクローナルマウス抗−ＮＤＶ  Ｆおよびモノクローナルマウス抗−ＮＤＶ  ＨＮは、Ｓ−ＳＰＶ−１８８プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−００３陰性対照プラークとは反応しないことが示された。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１８８プラークは、モノクローナル抗体と反応したが、それによりウイルスがＮＤＶ外来遺伝子を安定的に発現していることが示される。ここで記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞中で行われ、それによってＥＳＫ−４細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示している。
Ｓ−ＳＰＶ−１８８は、ＮＤＶ  ＨＮおよびＦタンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＮＤＶ感染に対するニワトリのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８８は、ＮＤＶ  ＨＮおよびＦタンパク質の発現にも有用である。
外来遺伝子およびｕｉｄＡを含む０５９相同性ベクター：相同性ベクター８９４−２１．２５．相同性ベクター８９４−２１．２５を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたＮＤＶ  Ｆ遺伝子を組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてＮＤＶ  Ｆ遺伝子が、合成初期／後期痘プロモーター（ＥＰ１／ＬＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得た制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．７Ｃおよびプラスミド４９３−９１．１１を使用して、プラスミド８９４−２１．２２を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミド８４７−４２．７Ｃを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。プラスミド４９３−１１．１を、予め構築し、そしてＮＤＶ  Ｆ遺伝子のコーディング領域の上流に、全長分子クローン（５０２５Ｆ）から由来される約２１００塩基対断片であるＥＰ１／ＬＰ２プロモーターを含む。ＥＰ１／ＬＰ２−ＮＤＶ  Ｆカセットを、その後、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に位置したユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、プラスミド８９４−２１．２５を得た。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子のものの反対である。
Ｓ−ＳＰＶ−１４８：
Ｓ−ＳＰＶ−１４８は、２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）切断糖タンパクＤ（ｇＤ）の遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯ１Ｌ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｇＤ遺伝子は、合成初期／後期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そして、ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１４８は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換え体ＳＰＶを生成する相同性組換手段」での相同性ベクター８５９−５２．３０およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧのアッセイ）によってスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１４８と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは、青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ＢＨＶ−１ｇＤ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１４８で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロット法」を用いて分析した。ポリクローナルのウシの抗−ＢＨＶ−１血清を使用して、ＢＨＶ−１特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１４８感染細胞から得た細胞溶解物は、６０ｋｄに対応するバンドを示し、それは、ＢＨＶ−１切断ｇＤタンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１４８は、ＢＨＶ−１ｇＤタンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＢＨＶ−１感染に対する雌ウシのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１４８は、ＢＨＶ−１ｇＤタンパク質の発現にも有用である。欠失膜内外ドメインを有するウシの伝染性鼻気管炎ウイルス糖タンパクＤ（ＩＢＲｇＤ）は、ＩＢＲ  ｇＤに対する免疫応答を改善し、ワクチン有効性を改善する。
相同性ベクター８５９−５２．３０．相同性ベクター８５９−５２．３０を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクした、切断されたウシのヘルペスウイルス糖タンパクＤ（ｇＤ）遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そして切断ＢＨＶ−１  ｇＤ遺伝子が、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得た制限断片を適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の約２９７２塩基対ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍの約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩの制限サブ断片である（２３）。断片２は、ＢＨＶ−１クーパ（Ｃｏｏｐｅｒ）株ゲノム断片から得たＤＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５，４２）によって合成されたＢＨＶ−１切断ｇＤ遺伝子の約１０８６塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000190
は、ＢＨＶ−１ｇＤ遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000191
を、ＢＨＶ−１ｇＤ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、ＢＨＶ−１切断ｇＤ遺伝子に対応する長さ１０８６塩基対の断片を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１の約３０１０塩基対ＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩの制限断片である（１１）。断片４は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍの約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩの制限サブ断片である（２３）。ＳＰＶ相同性ベクター中のＡｃｃＩ部位を、合成リンカーを用いて、ユニークなＮｏｔＩに変換した。
Ｓ−ＳＰＶ−１８６：
Ｓ−ＳＰＶ−１８６は、２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）の遺伝子と、大腸菌大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ＨＡ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあり、そして、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８６は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」で、相同性ベクター８９９−２０およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１８６と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、βグルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ＣＤＶ  ＨＡ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１８６で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのイヌの抗−ＣＤＶ血清を使用して、ＣＤＶ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１８６感染細胞から得た細胞溶解物は、７０ｋｄに対応するバンドを示し、それは、ＣＤＶ  ＨＡタンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１８６は、ＣＤＶ  ＨＡタンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＣＤＶ感染に対するイヌのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８６は、ＣＤＶ  ＨＡタンパク質の発現にも有用である。
相同性ベクター８９９−２０．相同性ベクター８９９−２０を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。そのことは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてＣＤＶ  ＨＡ遺伝子が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築し、ＣＤＶ  ＨＡ遺伝子は、ＣＤＶ（ＮＶＳＬ対抗株）から得たＲＮＡを用いて、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約１８７５塩基対のＢｇｌＩＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000192
は、ＣＤＶ  ＨＡ遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＢａｌＩＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000193
は、ＣＤＶ  ＨＡ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｌＩＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩで消化して、ＣＤＶ  ＨＡ遺伝子に対応する長さ１８７５塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１８５：
Ｓ−ＳＰＶ−１８５は、５つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのヘルペスウイルスＢＨＶ−１糖タンパクＤ（ｇＤ）の遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔ１制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯｌＬ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０、ｐ３５の遺伝子と、大腸菌＿−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｇＤ遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｂｌＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ２およびＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８５は、Ｓ−ＳＰＶ−１４８（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８７０−５６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−１４８を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１８５と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは、青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ＢＨＶ−１ｇＤおよびｂＩＬ−１２ｐ４０、ｐ３５遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１８５で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのヤギの抗−ｈＩＬ−１２およびポリクローナル  ウシ抗−ＢＨＶ血清を使用して、ｂＩＬ−１２およびＢＨＶ−１ｇＤ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１８５感染細胞から得た細胞溶解物は、６０ｋｄ、４０ｋｄおよび３５ｋｄに対応するバンドを示し、それは、ＢＨＶ−１切断ｇＤ、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１８５は、「組換えＳＰＶ中の外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」を用いて、ｂＩＬ−１２特異的抗原の発現について分析した。ポリクローナルのヤギ抗−ｈＩＬ−１２血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１８５プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−１４８陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１８５プラークは血清学上の試薬と反応させたが、それによりウイルスがウシの外来遺伝子を安定的に発現していることが示された。ここに記述された分析を、ＥＳＫ−４細胞で行い、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１８５は、ウシ抗原タンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そして細菌感染に対する雌ウシのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８５は、ＢＨＶ−１ｇＤ、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の発現にも有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８５を含有するワクチンは、細胞指向性免疫を刺激し、そして動物の成長と体重増加を改善する。
相同性ベクター８７０−５６．相同性ベクター８７０−５６を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０およびｐ３５遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてウシのサイトカイン  インターロイキン−１２遺伝子（ｂＩＬ−１２）が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ２およびＬＰ１）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて、プラスミド８７０−５６を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ｂＩＬ−１２遺伝子を、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に配置されるユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８７０−５６を生じた。ｂＩＬ−１２遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約９８４塩基対のＢａｍＨＩからＢａｍＨＩ断片である。上流プライマー
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は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマーは
0003939358.tif 000195
ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子に対応する長さ９８４塩基対の断片を得た。ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５，４２）によって合成された約６６５塩基対のＢｇｌＩＩからＢｇｌＩＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000196
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000197
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子に対応する長さ６６５塩基対の断片を生じた。
Ｓ−ＳＰＶ−１８４：
Ｓ−ＳＰＶ−１８４は、５つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのヘルペスウイルスＢＨＶ−１糖タンパクＤ（ｇＤ）の遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯｌＬ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０、ｐ３５の遺伝子と、大腸菌＿−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｇＤ遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあり、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子は、内部リボソームの導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８４は、Ｓ−ＳＰＶ−１４８（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８７０−４６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−１４８を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。レッドプラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１８４と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」の中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは青であったが、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示される。
ＢＨＶ−１ｇＤおよびｂＩＬ−１２ｐ４０、ｐ３５遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１８４で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのヤギの抗−ｈＩＬ−１２およびポリクローナル  ウシ抗−ＢＨＶ血清を使用して、ｂＩＬ−１２およびＢＨＶ−１ｇＤ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１８４感染細胞から得た細胞溶解物は、６０ｋｄ、４０ｋｄおよび３５ｋｄに対応するバンドを示し、それは、ＢＨＶ−１切断ｇＤ、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１８４は、「組換えＳＰＶ中の外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」を用いて、ＳＩＶ特異的抗原の発現について分析した。ポリクローナルのヤギ抗−ｈＩＬ−１２血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１８４プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−１４８陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１８４プラークを、血清学上の試薬と反応させ、これによりウイルスがウシの外来遺伝子を安定的に発現していることが示された。ここに記述された分析を、ＥＳＫ−４細胞で行い、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１８４は、ウシ抗原タンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そして細菌感染に対する雌ウシのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８４は、ＢＨＶ−１ｇＤ、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の発現にも有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８４を含有するワクチンは、細胞指向性免疫を刺激し、そして動物の成長と体重増加を改善する。
相同性ベクター８７０−４６．相同性ベクター８７０−４６．相同性ベクター８７０−４６を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０およびｐ３５遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてウシのサイトカインインターロイキン−１２遺伝子（ｂＩＬ−１２）が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて、プラスミド８７０−４６を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ｂＩＬ−１２遺伝子を、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に配置されるユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８７０−４６を生じた。ｂＩＬ−１２遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約９８４塩基対のＢａｍＨＩからＢａｍＨＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000198
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000199
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子に対応する長さ９８４塩基対の断片を得た。ＩＲＥＳ配列は、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得たＤＮＡを用いたＰＣＲによって合成された５０９塩基対の断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000200
は、ＩＲＥＳの５’−末端から合成され、そして５’−末端にＡｓｃＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000201
は、ＩＲＥＳの３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＢａｍＨＩで消化させて、ＩＲＥＳ配列に対応する長さ５０９塩基対の断片を得た。ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約６６５塩基対のＢｇｌＩＩからＡｓｃＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000202
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000203
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＡｓｃＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｃＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子に対応する長さ６６５塩基対の断片を生じた。
Ｓ−ＳＰＶ−１８３：
Ｓ−ＳＰＶ−１８３は、２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）融合（Ｆ）の遺伝子と、大腸菌  大腸菌  β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。Ｆ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１８３は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８８８−８１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１８３と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは、青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ＣＤＶ  Ｆ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１８３で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのイヌの抗−ＣＤＶ血清を使用して、ＣＤＶ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１８３感染細胞から得た細胞溶解物は、６０ｋｄに対応するバンドを示し、それは、ＣＤＶ  Ｆタンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１８３は、ＣＤＶ  Ｆタンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＣＤＶ感染に対するイヌのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１８３は、ＣＤＶ  Ｆタンパク質の発現のためにも有用である。
相同性ベクター８８８−８１．相同性ベクター８８８−８１を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてイヌジステンパーウイルス融合（Ｆ）遺伝子が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて、プラスミド８８８−８１を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ＣＤＶ  Ｆ遺伝子を、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に配置されるユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８８８−８１を生じた。ＣＤＶ  Ｆ遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ＣＤＶ  Ｆ遺伝子は、ＣＤＶ（ＮＶＳＬ対抗株）から得たＲＮＡを使用した逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約２０００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000204
は、ＣＤＶ  Ｆ遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000205
は、ＣＤＶ  Ｆ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用された。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ＣＤＶ  Ｆ遺伝子に対応する長さ２０００塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１６５：
Ｓ−ＳＰＶ−１６５は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ｐ３５、ｐ４０の遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｐ４０遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあり、ｐ３５遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１６５は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８７０−５６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１６５と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは青であったが、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示される。
ｂＩＬ−１２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１６５で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのヤギの抗−ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）血清を使用して、ｂＩＬ−１２特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１６５感染細胞から得た細胞溶解物は、４０ｋｄおよび３５ｋｄに対応するバンドを示し、それは、それぞれｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１６５は、「組換えＳＰＶ中の外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」を用いて、ＩＬ−１２特異的抗原の発現について分析した。ポリクローナルのポリクローナルのヤギ抗−ｈＩＬ−１２抗血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１６５プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１６５プラークは、血清学上の試薬と反応したが、これによりウイルスがｂＩＬ−１２外来遺伝子を安定的に発現していることが示される。ここに記述された分析を、ＥＳＫ−４細胞で行ったが、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１６５は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そして細菌感染に対する雌ウシのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１６５は、ｂＩＬ−１２タンパク質の発現にも有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１６５を含有するワクチンは、細胞指向性免疫を刺激し、そして動物の成長と体重増加を改善する。
相同性ベクター８７０−５６．相同性ベクター８７０−５６を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０およびｐ３５遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてウシのサイトカイン  インターロイキン−１２遺伝子（ｂＩＬ−１２）が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ２およびＬＰ１）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて、プラスミド８７０−５６を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ｂＩＬ−１２遺伝子を、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に配置されるユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８７０−５６を生じた。ｂＩＬ−１２遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約９８４塩基対のＢａｍＨＩからＢａｍＨＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000206
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000207
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子に対応する長さ９８４塩基対の断片を得た。ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約６６５塩基対のＢｇｌＩＩからＢｇｌＩＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000208
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の５’−末端から合成され、そしてその遺伝子の５’−末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000209
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子に対応する長さ６６５塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１６４：
Ｓ−ＳＰＶ−１６４は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ｐ３５、ｐ４０の遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ｐ４０遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあり、ｐ３５遺伝子は、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１６４は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８７０−４６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン」（ｘ−ｇｌｕｃ）によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１６４と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ｂＩＬ−１２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１６４で感染させ、そして感染細胞溶解物および培養上清のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ポリクローナルのヤギの抗−ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）血清を使用して、ｂＩＬ−１２特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１６４感染細胞から得た細胞溶解物は、４０ｋｄおよび３５ｋｄに対応するバンドを示したが、それは、それぞれ、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質の予測サイズである。
Ｓ−ＳＰＶ−１６４は、「組換えＳＰＶ中の外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」を用いて、ＩＬ−１２特異的抗原の発現について分析した。ポリクローナル  ポリクローナルのヤギ抗−ｈＩＬ−１２抗血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１６４プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１６４プラークは、血清学上の試薬と反応し、これによりウイルスがｂＩＬ−１２外来遺伝子を安定的に発現していることを示した。ここに記述された分析を、ＥＳＫ−４細胞で行い、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示した。
Ｓ−ＳＰＶ−１６４は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５タンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そして細菌感染に対する雌ウシのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１６４は、ｂＩＬ−１２タンパク質の発現にも有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１６４を含有するワクチンは、細胞指向性免疫を刺激し、そして動物の成長と体重増加を改善する。
相同性ベクター８７０−４６．相同性ベクター８７０−４６を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのサイトカイン  インターロイキン−１２（ｂＩＬ−１２）ｐ４０およびｐ３５遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてウシのサイトカイン  インターロイキン−１２遺伝子（ｂＩＬ−１２）が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．２Ｃを用いて、プラスミド８７０−４６を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ｂＩＬ−１２遺伝子を、ｕｉｄＡ遺伝子の上流に配置されるユニークなＮｏｔＩ部位に挿入して、それによりプラスミド８７０−４６を生じた。ｂＩＬ−１２遺伝子の転写および翻訳方向は、ｕｉｄＡ遺伝子と同じである。
ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成された約９８４塩基対のＢａｍＨＩからＢａｍＨＩ断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000210
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000211
は、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子に対応する長さ９８４塩基対の断片を得た。ＩＲＥＳ配列は、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得たＤＮＡを用いたＰＣＲによって合成された５０９塩基対の断片である。上流プライマー
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は、ＩＲＥＳの５’−末端から合成され、そして５’−末端にＡｓｃＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000213
は、ＩＲＥＳの３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＢａｍＨＩで消化させて、ＩＲＥＳ配列に対応する長さ５０９塩基対の断片を得た。ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子は、ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミドから得たＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５，４２）によって合成された約６６５塩基対のＢｇｌＩＩからＡｓｃＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000214
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000215
は、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子の３’末端から合成され、その遺伝子の３’末端にＡｓｃＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｃＩで消化させて、ｂＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子に対応する長さ６６５塩基対の断片を生じた。
Ｓ−ＳＰＶ−１７６：
Ｓ−ＳＰＶ−１７６は、４つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシの呼吸性シンシチウムウイルス糖タンパク（Ｇ）の遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯｌＬ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ウシの呼吸性シンシチウムウイルス融合（Ｆ）の遺伝子と、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ウシの呼吸性シンシチウムウイルス糖タンパクＧの遺伝子は、合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ウシの呼吸性シンシチウムウイルス融合（Ｆ）の遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１７６は、Ｓ−ＳＰＶ−０２０（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導した。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８８８−３８．９およびウイルスＳ−ＳＰＶ−０２０を利用して達成された。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン（酵素性マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスためのスクリーン）」によってスクリーニングした。ブループラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１７４と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなブループラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の３回の多継代の後、観察された全てのプラークは、青であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ウシの呼吸性シンシチウムウイルス糖タンパク（Ｇ）および融合（Ｆ）遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１７６で感染させ、そして感染細胞溶解物のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。ウシの抗−ＦＩＴＣ（アキュレート  ケミカルズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））またはＦ特異的Ｍａｂ（Ｍａｂ１９）を使用して、ＢＲＳＶ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１７６感染細胞から得た細胞溶解物は、８０ｋｄから９０ｋｄおよび７０ｋｄに対応するバンドを示したが、それは、ウシの呼吸性シンシチウムウイルス糖タンパク（Ｇ）および融合（Ｆ）遺伝子産物の予測サイズである。ここで記述される分析は、ＥＳＫ−４細胞で行われたが、これによりＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示す。
Ｓ−ＳＰＶ−１７６は、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６タンパク質を発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＰＲＲＳ感染に対するブタのワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−１３４も、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５およびＯＲＦ６タンパク質の発現に有用である。
相同性ベクター８８８−３８．９．相同性ベクター８８８−３８．９を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシの呼吸性シンシチウムウイルス融合（Ｆ）遺伝子とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、そしてウシの呼吸性シンシチウムウイルス融合（Ｆ）遺伝子が、合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−４２．７Ｃを用いて、プラスミド８８８−３８．９を構築した。ｕｉｄＡ遺伝子を、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片内のユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。ｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。その後、ウシの呼吸性シンシチウムウイルス融合（Ｆ）遺伝子を、ユニークな下流プライマー
0003939358.tif 000216
に挿入し、融合（Ｆ）遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ＰＣＲ産物を、Ｂａｍ  ＨＩで消化させて、融合（Ｆ）遺伝子に対応する長さ１７２３塩基対の断片を得た。
Ｓ−ＳＰＶ−１４３：
Ｓ−ＳＰＶ−１４３は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ウシのウイルス性下痢ウイルスタイプＩ（ＢＶＤＶ１）Ｅ２糖タンパクの遺伝子と、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の遺伝子を、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ断片のＯｌＬ  ＯＲＦ内のユニークなＡｃｃＩ制限部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー）に挿入した。ウシのウイルス性下痢のウイルス  タイプ１（ＢＶＤＶ１）Ｅ糖タンパクと、ウシのウイルス性下痢のウイルス  タイプ２（ＢＶＤＶ２）Ｅ２糖タンパクと、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子との遺伝子を、それぞれユニークなＢａｍ  ＨＩ、ＮｏｔＩおよびＰｓｔ  Ｉ部位（６．７ｋｂのＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片の約３．２ｋｂ領域（配列番号）内のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位に挿入された合成ポリリンカーから起源する部位）に挿入した。Ｅ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成初期プロモーターの制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１４３は、Ｓ−ＳＰＶ−０５１（ガスザ（Ｋａｓｚａ）株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同性組換え法」での相同性ベクター８７４−０６．２０ＢおよびウイルスＳ−ＳＰＶ−０５１を利用して達成された。ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ部位中のＢＶＤＶタイプ１Ｅ２遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子は、ウイルスＳ−ＳＰＶ−０５１に既に存在した。感染貯蔵物を、「β−グルクロニダーゼを発現する組換えＳＰＶためのスクリーン（ｘ−Ｇｌｕｃアッセイと、酵素性マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルスためのスクリーン）」によってスクリーニングした。グリーンプラーク精製の最終結果物は、Ｓ−ＳＰＶ−１４３と称される組換えウイルスであった。このウイルスを、「実験材料および方法」での中で述べたようなグリーンプラークアッセイによってモニターした多継代によって、β−グルクロニダーゼの発現、純度および挿入安定性について分析した。最初の４回の多継代の後、観察された全てのプラークは、緑であり、それによりウイルスが純粋且つ安定しており、そして外来遺伝子を発現することが示された。
ＢＶＤＶタイプ２  Ｅ２およびタイプ１Ｅ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−１４３で感染させ、そして感染細胞溶解物のサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをブロットし、そして「ウエスタンブロッティング法」を用いて分析した。モノクローナルマウス抗−Ｅ２（タイプ２）のモノクローナルマウス抗−Ｅ（タイプ１）血清を使用して、ＢＶＤＶ特異的タンパク質の発現を検出した。ＳＰＶ−１４３感染細胞から得た細胞溶解物は、５３ｋｄから４２ｋｄに対応するバンドを示し、それは、Ｅ２糖タンパク（５３ｋｄ）の予測サイズであるが、Ｅ糖タンパク（４８ｋｄ）の予測サイズよりわずかに小さい。
Ｓ−ＳＰＶ−１４３を、「組換えＳＰＶで発現する外来遺伝子ためのブラックプラークスクリーン」を用いて、ＢＶＤＶ−特異的抗原の発現について分析した。モノクローナルマウス抗−Ｅ２血清は、Ｓ−ＳＰＶ−１４３プラークと特異的に反応するが、Ｓ−ＳＰＶ−００１陰性対照プラークとは反応しないことを示した。全ての観察されたＳ−ＳＰＶ−１４３プラークは、タイプ１  Ｅ２およびタイプ２  Ｅ２血清の両方と反応し、それにより、ウイルスは、ＢＶＤＶ  Ｅ２外来遺伝子を安定的に発現していることが示された。ブラック  プラークアッセイでＥ糖タンパクと特異的に反応する試薬で、現在入手できるものはない。ここで記述される分析は、ＥＳＫ−４細胞で行われ、これによりＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの生成に適切な基質であることを示す。
Ｓ−Ｓ．Ｖ．−１４３は、タイプ１＆１  ＢＶＤＶ  Ｅ２糖タンパクおよびタイプ１  Ｅ糖タンパクを発現する組換え豚痘ウイルスであり、そしてＢＶＤＶ感染に対するブタのワクチンとして有用である。
相同性ベクター８７４−０６．２０Ｂ．相同性ベクター８７４−０６．２０Ｂを使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入した。それは、大腸菌β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子と、ＳＰＶ  ＤＮＡでフランクしたウシのウイルス性下痢のウイルス（ＢＶＤＶ）タイプ１  Ｅ遺伝子およびＢＶＤＶタイプ２  Ｅ２ゲン（ｇｅｎ）とを組込む。この相同性ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同性組換え法」に従って使用するとに、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子が、合成初期痘プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあり、Ｅ遺伝子が、後期合成痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてＢＶＤＶ  Ｅ２遺伝子が、合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに留意されなければならない。以下の源から得る制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、相同性ベクターを、標準組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して構築した。プラスミド８４７−９０．２Ｂを用いて、プラスミド８７４−０６．２０Ｂを構築した。合成後期／初期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下のＢＶＤＶタイプ２  Ｅ２遺伝子を、Ｎｏｔ  Ｉ部位の下流のＥＰ２−ｕｉｄＡカセットによって両端を挟まれたユニークなＮｏｔ  Ｉ部位に挿入することによって、このプラスミドを予め構築した。Ｎｏｔ  Ｉは、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋゲノム断片のユニークなＥｃｏ  ＲＩ部位に挿入された合成ポリリンカーから誘導された。ＥＰ２−ｕｉｄＡカセットは、平滑末端に予め挿入されており、プラスミド８７４−０６．２０Ｂを生じる。Ｅ遺伝子の翻訳方向は、Ｅ２およびｕｉｄＡ遺伝子と同様である。
ＢＶＤＶ  Ｅ遺伝子は、ＢＶＤＶ１−シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）株から得るＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応によって合成された約７４４塩基対（６３ｂｐシグナル配列＋６８１コーディング配列）のＥｃｏ  ＲＩからＢａｍ  ＨＩの断片である。上流プライマー
0003939358.tif 000217
は、ＢＶＤＶ  Ｅ遺伝子シグナル配列の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー
0003939358.tif 000218
は、Ｅ遺伝子の３’末端から合成され、そしてその遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化させて、ＢＶＤＶ１  Ｅ遺伝子に対応する長さ７４４塩基対の断片を得た。
0003939358.tif 000219
0003939358.tif 000220
0003939358.tif 000221
0003939358.tif 000222
配  列  表
（１）一般情報
(i)出願人：コシュラン  ｐＨ．Ｄ．，マーク  Ｏ
ユンカー  Ｍ．Ｓ．，デイヴィッド  Ｅ
(ii)発明の名称：組換え豚痘ウイルス
(iii)配列の数：１０１
(iv)通信宛先：
（Ａ）名宛人：ジョン  Ｐ．  ホワイト
（Ｂ）通り：１１８５  アヴェニュー・オブ・ジ・アメリカズ
（Ｃ）市：ニューヨーク
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：１００３６
(v)コンピュータ読取り可能な形態：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：Patent  In  リリース  #1.0、バージョン#1.30
(vi)現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
(viii)アトニー／エージェント情報：
（Ａ）氏名：ホワイト、ジョン  Ｐ．
（Ｂ）登録番号：２８，６７８
(ix)電信情報：
（Ａ）電話：２１２−２７８−０４００
（Ｂ）テレファックス：２１２−３９１−０５２５
（Ｃ）テレックス：４２２５２３
（２）配列認識番号：１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３１６４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(vi)起源：
（Ａ）：豚痘ウイルス
（Ｂ）株名：Kasza株
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．２３１
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３３９．．１６２８
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１６８３．．３１６１
(xi)配列の記載：配列認識番号：１：
0003939358.tif 000223
0003939358.tif 000224
0003939358.tif 000225
0003939358.tif 000226
（２）配列認識番号：２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：２：
0003939358.tif 000227
（２）配列認識番号：３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４３０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：３：
0003939358.tif 000228
0003939358.tif 000229
（２）配列認識番号：４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４９３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：４：
0003939358.tif 000230
0003939358.tif 000231
（２）配列認識番号：５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(vi)起源：
（Ａ）：ブタ生殖器及び呼吸器ウイルス
（Ｂ）株名：ＩＡ−２株（ＮＶＳＬ）
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：４７．．８１４
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：６７０．．１４３１
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１２１５．．１７４８
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１７６２．．２３６１
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：２３４９．．２８７０
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：２８６３．．３２３１
(xi)配列の記載：配列認識番号：５：
0003939358.tif 000232
0003939358.tif 000233
（２）配列認識番号：７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２５４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：７：
0003939358.tif 000234
（２）配列認識番号：８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１７８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：８：
0003939358.tif 000235
（２）配列認識番号：９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２００アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：９：
0003939358.tif 000236
（２）配列認識番号：１０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１７４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１０：
0003939358.tif 000237
（２）配列認識番号：１１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号：１１：
0003939358.tif 000238
（２）配列認識番号：１２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１２：
0003939358.tif 000239
（２）配列認識番号：１３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１３：
0003939358.tif 000240
（２）配列認識番号：１４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１４：
0003939358.tif 000241
（２）配列認識番号：１５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１５：
0003939358.tif 000242
（２）配列認識番号：１６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１６：
0003939358.tif 000243
（２）配列認識番号：１７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１７：
0003939358.tif 000244
（２）配列認識番号：１８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１８：
0003939358.tif 000245
（２）配列認識番号：１９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：１９：
0003939358.tif 000246
（２）配列認識番号：２０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２０：
0003939358.tif 000247
（２）配列認識番号：２１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２１：
0003939358.tif 000248
（２）配列認識番号：２２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２２：
0003939358.tif 000249
（２）配列認識番号：２３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２３：
0003939358.tif 000250
（２）配列認識番号：２４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列記載：配列認識番号：２４：
0003939358.tif 000251
（２）配列認識番号：２５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２５：
0003939358.tif 000252
（２）配列認識番号：２６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２６：
0003939358.tif 000253
（２）配列認識番号：２７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２７：
0003939358.tif 000254
（２）配列認識番号：２８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２８：
0003939358.tif 000255
（２）配列認識番号：２９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：２９：
0003939358.tif 000256
（２）配列認識番号：３０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３０：
0003939358.tif 000257
（２）配列認識番号：３１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３１：
0003939358.tif 000258
（２）配列認識番号：３２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３２：
0003939358.tif 000259
（２）配列認識番号：３３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３３：
0003939358.tif 000260
（２）配列認識番号：３４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３４：
0003939358.tif 000261
（２）配列認識番号：３５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３５：
0003939358.tif 000262
（２）配列認識番号：３６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３６：
0003939358.tif 000263
（２）配列認識番号：３７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３７：
0003939358.tif 000264
（２）配列認識番号：３８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３８：
0003939358.tif 000265
（２）配列認識番号：３９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：３９：
0003939358.tif 000266
（２）配列認識番号：４０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４０：
0003939358.tif 000267
（２）配列認識番号：４１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４１：
0003939358.tif 000268
（２）配列認識番号：４２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４２：
0003939358.tif 000269
（２）配列認識番号：４３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４３：
0003939358.tif 000270
（２）配列認識番号：４４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４４：
0003939358.tif 000271
（２）配列認識番号：４５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４５：
0003939358.tif 000272
（２）配列認識番号：４６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４６：
0003939358.tif 000273
（２）配列認識番号：４７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４７：
0003939358.tif 000274
（２）配列認識番号：４８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４８：
0003939358.tif 000275
（２）配列認識番号：４９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：４９：
0003939358.tif 000276
（２）配列認識番号：５０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５０：
0003939358.tif 000277
（２）配列認識番号：５１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(vi)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５１：
0003939358.tif 000278
（２）配列認識番号：５２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５２：
0003939358.tif 000279
（２）配列認識番号：５３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５３：
0003939358.tif 000280
（２）配列認識番号：５４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５５：
0003939358.tif 000281
（２）配列認識番号：５５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５５：
0003939358.tif 000282
（２）配列認識番号：５６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５６：
0003939358.tif 000283
（２）配列認識番号：５７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５７：
0003939358.tif 000284
0003939358.tif 000285
（２）配列認識番号：５９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：５９：
0003939358.tif 000286
（２）配列認識番号：６０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号：６０：
0003939358.tif 000287
（２）配列認識番号１８９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３９４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
（Ａ）生物名：豚痘ウイルス
（Ｂ）株名：Kasza
（Ｃ）固体・単離クローン名：Ｓ−ＳＰＶ−００１
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３６９
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．５９７
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：５９８．．１５３９
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１６７５．．３７０８
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：相補鎖（３７４８．．３９４２）
(xi)配列の記載：配列認識番号１８９
0003939358.tif 000288
0003939358.tif 000289
0003939358.tif 000290
0003939358.tif 000291
0003939358.tif 000292
（２）配列認識番号１９０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１２２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列認識番号１９０
0003939358.tif 000293
（２）配列認識番号１９１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：７５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１９１
0003939358.tif 000294
（２）配列認識番号１９２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１９２
0003939358.tif 000295
（２）配列認識番号１９３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：６７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１９３
0003939358.tif 000296
0003939358.tif 000297
0003939358.tif 000298
（２）配列認識番号１９４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１９４
0003939358.tif 000299
（２）配列認識番号１９５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５８３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
（Ａ）生物名：豚痘ウイルス
（Ｂ）株名：Kasza
（Ｃ）固体・単離クローン名：Ｓ−ＳＰＶ−００１
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：２．．５８３
(xi)配列の記載：配列認識番号１９５
0003939358.tif 000300
（２）配列認識番号１９６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１９４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１９６
0003939358.tif 000301
（２）配列認識番号１９７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号１９７
0003939358.tif 000302
（２）配列認識番号１９８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号１９８
0003939358.tif 000303
（２）配列認識番号１９９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号１９９
0003939358.tif 000304
（２）配列認識番号２００のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２００
0003939358.tif 000305
（２）配列認識番号２０１のための情報：
(i)配列特性
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０１
0003939358.tif 000306
（２）配列認識番号２０２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０２
0003939358.tif 000307
（２）配列認識番号２０３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０３
0003939358.tif 000308
（２）配列認識番号２０４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０４
0003939358.tif 000309
（２）配列認識番号２０５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０５
0003939358.tif 000310
（２）配列認識番号２０６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０６
0003939358.tif 000311
（２）配列認識番号２０７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０７
0003939358.tif 000312
（２）配列認識番号２０８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０８
0003939358.tif 000313
（２）配列認識番号２０９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２０９
0003939358.tif 000314
（２）配列認識番号２１０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１０
0003939358.tif 000315
（２）配列認識番号２１１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１１
0003939358.tif 000316
（２）配列認識番号２１２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１２
0003939358.tif 000317
（２）配列認識番号２１３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１３
0003939358.tif 000318
（２）配列認識番号２１４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１４
0003939358.tif 000319
（２）配列認識番号２１５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１５
0003939358.tif 000320
（２）配列認識番号２１６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１６
0003939358.tif 000321
（２）配列認識番号２１７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１７
0003939358.tif 000322
（２）配列認識番号２１８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１８
0003939358.tif 000323
（２）配列認識番号２１９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２１９
0003939358.tif 000324
（２）配列認識番号２２０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２０
0003939358.tif 000325
（２）配列認識番号２２１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５７８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２１
0003939358.tif 000326
0003939358.tif 000327
0003939358.tif 000328
0003939358.tif 000329
（２）配列認識番号２２２のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：７２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２２
0003939358.tif 000330
（２）配列認識番号２２３のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：２３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２３
0003939358.tif 000331
（２）配列認識番号２２４のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１２０５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２４
0003939358.tif 000332
（２）配列認識番号２２５のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：３０５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(xi)配列の記載：配列認識番号２２５
0003939358.tif 000333
（２）配列認識番号２２６のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１７２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１７２１
（Ｄ）他の情報：
(xi)配列の記載：配列認識番号２２６
0003939358.tif 000334
0003939358.tif 000335
0003939358.tif 000336
（２）配列認識番号２２７のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５７３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号２２７
0003939358.tif 000337
0003939358.tif 000338
0003939358.tif 000339
（２）配列認識番号２２８のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１４１４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１４１４
（Ｄ）他の情報：
(xi)配列の記載：配列認識番号２２８
0003939358.tif 000340
0003939358.tif 000341
0003939358.tif 000342
（２）配列認識番号２２９のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：４７１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号２２９
0003939358.tif 000343
0003939358.tif 000344
（２）配列認識番号２３０のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：１５０１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
(iii)ハイポセティカル：Ｎ
(iv)アンチセンス：Ｎ
(ix)配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１５０１
（Ｄ）他の情報：
(xi)配列の記載：配列認識番号２３０
0003939358.tif 000345
0003939358.tif 000346
0003939358.tif 000347
（２）配列認識番号２３１のための情報：
(i)配列特性：
（Ａ）長さ：５００アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号２３１
0003939358.tif 000348
0003939358.tif 000349
【図１Ａ】
0003939358.tif 000350
【図１Ｂ】
0003939358.tif 000351
【図２Ａ】
0003939358.tif 000352
【図２Ｂ】
0003939358.tif 000353
【図２Ｃ】
0003939358.tif 000354
【図３Ａ】
0003939358.tif 000355
【図３Ｂ】
0003939358.tif 000356
【図３Ｃ】
0003939358.tif 000357
【図４Ａ】
0003939358.tif 000358
【図４Ｂ】
0003939358.tif 000359
【図４Ｃ】
0003939358.tif 000360
【図４Ｄ】
0003939358.tif 000361
【図５Ａ】
0003939358.tif 000362
【図５Ｂ】
0003939358.tif 000363
【図５Ｃ】
0003939358.tif 000364
【図５Ｄ】
0003939358.tif 000365
【図６】
0003939358.tif 000366
【図７Ａ】
0003939358.tif 000367
【図７Ｂ】
0003939358.tif 000368
【図７Ｃ】
0003939358.tif 000369
【図７Ｄ】
0003939358.tif 000370
【図８Ａ】
0003939358.tif 000371
【図８Ｂ】
0003939358.tif 000372
【図８Ｃ】
0003939358.tif 000373
【図８Ｄ】
0003939358.tif 000374
【図９Ａ】
0003939358.tif 000375
【図９Ｂ】
0003939358.tif 000376
【図９Ｃ】
0003939358.tif 000377
【図９Ｄ】
0003939358.tif 000378
【図１０Ａ】
0003939358.tif 000379
【図１０Ｂ】
0003939358.tif 000380
【図１０Ｃ】
0003939358.tif 000381
【図１０Ｄ】
0003939358.tif 000382
【図１１Ａ】
0003939358.tif 000383
【図１１Ｂ】
0003939358.tif 000384
【図１２Ａ】
0003939358.tif 000385
【図１２Ｂ】
0003939358.tif 000386
【図１２Ｃ】
0003939358.tif 000387
【図１３Ａ】
0003939358.tif 000388
【図１３Ｂ】
0003939358.tif 000389
【図１３Ｃ】
0003939358.tif 000390
【図１３Ｄ】
0003939358.tif 000391
【図１４Ａ】
0003939358.tif 000392
【図１４Ｂ】
0003939358.tif 000393
【図１４Ｃ】
0003939358.tif 000394
【図１４Ｄ】
0003939358.tif 000395
【図１５Ａ】
0003939358.tif 000396
【図１５Ｂ】
0003939358.tif 000397
【図１５Ｃ】
0003939358.tif 000398
【図１５Ｄ】
0003939358.tif 000399
【図１６Ａ】
0003939358.tif 000400
【図１６Ｂ】
0003939358.tif 000401
【図１６Ｃ】
0003939358.tif 000402
【図１６Ｄ】
0003939358.tif 000403
【図１６Ｅ】
0003939358.tif 000404