(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
0003989535.tif 000085
［式中、
Ｘは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルカノイル、Ｓer−Ｐro−Ｌys−、Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）、およびＣ1−Ｃ6アルカノイル−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）から選択され；
ＡＡ1は、存在しないか、またはＳer、Ｍet、Ｇly、Ａsp、Ａla、ＴyrおよびＨisから選択され；
ＡＡ2は、存在しないか、またはＬeu、Ａsp、Ｍet、Ｖal、Ｓer、Ａla、Ｐhe、ＰroおよびＬysから選択され；
ＡＡ3は、存在しないか、またはＣys、Ｇlu、Ｓer、Ｇln、Ｈis、Ｇly、ＡrgおよびＡspから選択され；
ＡＡ4は、存在しないか、またはＡrg、Ｇly、Ａla、Ａsp、Ｍet、Ｌeu、ＴyrおよびＰroから選択され；
ＡＡ5は、存在しないか、またはＳer、ＣysおよびＡspから選択され；
ＡＡ6は、存在しないか、またはＳer、ＧlyおよびＧluから選択され；
ＡＡ7は、Ｃys、Ｎ−メチル−Ｃys、Ｄ−Ｃys、ＭpaおよびＰenから選択され；
ＡＡ8は、Ｐhe、Ｎ−メチル−Ｐhe、トリメチルフェニル−Ａla、ハロ（Ｆ，Ｃl，ＢrおよびＩ）フェニル−Ａla、トリフルオロメチルフェニル−Ａla、Ｔyr、Ｏ−メチル−Ｔyr、Ｃha、β−ナフチル−Ａla、α−ナフチル−Ａla、ビフェニル−Ａla、ジフェニル−Ａla、Ｄ−Ａla、ジベンジル−Ａla、フロレニル−Ａla、アダマンチル−Ａlaおよびβ−ナフチルオキシ−Ａlaから選択され；
ＡＡ9は、Ｇly、Ａrg、Ｔhr、Ｖal、Ａsp、Ａla、Ｄ−Ａla、ＰroおよびＧluから選択され；
ＡＡ10は、Ｇly、Ａrg、Ｓer、Ａla、Ｈis、ＰroおよびＬysから選択され；
ＡＡ11は、Ａrg、Ｌys、Ｎ−メチル−Ａrg、Ａsp、ＳerおよびＰroから選択され；
ＡＡ12は、Ｍet、Ｉle、Ｄ−Ｌeu、ＮleおよびＬeuから選択され；
ＡＡ13は、ＡspおよびＧluから選択され；
ＡＡ14は、Ａrg、Ｎ−メチル−Ａrg、ＰroおよびＳerから選択され；
ＡＡ15は、Ｉle、Ｎ−メチル−ＩleおよびＬeuから選択され；
ＡＡ16は、Ｇly、Ｔyr、Ｐhe、Ｓer、Ｐro、並びにＯrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される正に荷電したアミノ酸残基から選択され；
ＡＡ17は、Ａla、Ｓer、Ｎ−メチル−ＡlaおよびＰroから選択され；
ＡＡ18は、Ｇln、Ｓerおよびホモ−Ｃysから選択され；
ＡＡ19は、Ｓerから選択され；
ＡＡ20は、ＧlyおよびＡlaから選択され；
ＡＡ21は、Ｌeuから選択され；
ＡＡ22は、ＧlyおよびＡlaから選択され；
ＡＡ23は、Ｃysから選択され；
ＡＡ24は、Ａsnから選択され；
ＡＡ25は、ＳerおよびＶalから選択され；
ＡＡ26は、Ｐhe、Ｄ−Ｐhe、Ｎ−メチル−ＰheおよびＬeuから選択され；
ＡＡ27は、Ａrg、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrg−Ａrgから選択され；
ＡＡ28は、Ｔyr、Ａrg、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびホモＣysから選択され；そして
Ｚは、ＯＨおよびＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールおよびＣ6〜Ｃ12アリール−Ｃ1〜Ｃ6アルキルから独立に選択される）から選択され；
残基ＡＡ7およびＡＡ8を結合するアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は以下の群：
−ＣＨ2−ＮＨ−、
−ＣＨ2−Ｓ−、
−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）n−、（式中、nは１または２である）
−ＣＨ2−ＣＨ2−、
−ＣＨ＝ＣＨ−（ＥまたはＺ）、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ2−、および
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−
から選択されるアミドイソステレで場合により置き換えてもよい。
ただし、ＡＡ9、ＡＡ11およびＡＡ16の１つは次のスキームにより選択される。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ａsp、Ｓer、またはＰroであり；そして
ＡＡ16は、Ａrg、Har、Ｌys、Ｏrnおよびp−アミジノフェニル−Ａlaから選択される正に荷電したアミノ酸残基である。
また、ＡＡ11がＰroであるとき、
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、Ｖal、ＡspまたはＧluから選択され；そして
ＡＡ16は、Ｔyr、Ｐhe、Ｓer、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される。］
によって表され、ヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃへの結合親和性に対するhＮＰＲ−Ａへの結合親和性の比が、野性型hＡＮＦ（１〜２８）と比べて高い化合物、および薬学的に許容し得るその塩。
【請求項２】
一般式（II）（配列番号４７）：
0003989535.tif 000086
［式中、
Ｘは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルカノイル、およびＴhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）から選択され；
ＡＡ3は、ＡrgまたはＡspから選択され；
ＡＡ7は、Ｃys、Ｎ−メチル−Ｃys、Ｄ−ＣysおよびＰenから選択され；
ＡＡ8は、Ｐhe、Ｎ−メチル−Ｐhe、トリメチルフェニル−Ａla、フルオロフェニル−Ａla、トリフルオロメチルフェニル−Ａla、Ｔyr、Ｏ−メチル−Ｔyr、Ｃha、β−ナフチル−Ａla、α−ナフチル−Ａla、ビフェニル−Ａla、ジフェニル−Ａla、ジベンジル−Ａla、フロレニル−Ａla、アダマンチル−Ａla、２−チエニル−Ａlaおよびβ−ナフチルオキシ−Ａlaから選択され；
ＡＡ9は、Ｇly、Ａrg、Ｔhr、Ｖal、ＡspおよびＧluから選択され；
ＡＡ10は、Ｇly、Ａrg、Ｓer、Ａla、ＨisおよびＬysから選択され；
ＡＡ11は、Ａrg、Ａsp、ＳerおよびＰroから選択され；
ＡＡ12は、Ｍet、Ｉle、Ｄ−Ｌeu、ＬeuおよびＮleから選択され；
ＡＡ14は、ＡrgおよびＳerから選択され；
ＡＡ16は、Ｇly、Ｐhe、Ｔyr、並びにＯrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される正に荷電したアミノ酸残基から選択され；
ＡＡ18は、ＧlnおよびホモＣysから選択され；
ＡＡ28は、ＴyrおよびホモＣysから選択され；
Ｚは、ＯＨおよびＮＨ2から選択され；
残基ＡＡ7およびＡＡ8を結合するアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は以下の群：
−ＣＨ2−ＮＨ−、
−ＣＨ2−Ｓ−、
−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）n−、（nは１または２である）
−ＣＨ2−ＣＨ2−、
−ＣＨ＝ＣＨ−（ＥまたはＺ）、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ2−、および
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−
から選択されるアミドイソステレで場合により置き換えてもよい。
ただしＡＡ9、ＡＡ11およびＡＡ16の１つは次のスキームにより選択される。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ａsp、Ｓer、またはＰroであり；そして
ＡＡ16は、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される正に荷電したアミノ酸残基である。
また、ＡＡ11がＰroであるとき、
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、Ｖal、ＡspまたはＧluから選択され；そして
ＡＡ16は、Ｔyr、Ｐhe、Ｓer、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される。］
によって表され、ヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃへの結合親和性に対するhＮＰＲ−Ａへの結合親和性の比が、野性型hＡＮＦ（１〜２８）と比べて高い化合物、および薬学的に許容し得るその塩。
【請求項３】
ＡＡ7およびＡＡ8間にＤ−アミノ酸残基を挿入することを更に含んでなる請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＡＡ16が、Ｏrn、Har、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される正に荷電したアミノ酸残基である請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
ＡＡ16がＡrgである請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＸがＴhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＡＡ9がＡrg、Ｔhr、またはＧluである請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
ＡＡ11がＡsp、Ｓer、またはＰroである請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ＡＡ11がＡsp、Ｓer、またはＰroである請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）より、ヒトＣレセプター（hＮＰＲ−Ｃ）に対して小さい親和性を有する請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃに対して小さい親和性を有し、かつ野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べhＮＰＲ−Ａに対して等しいか、またはより大きい結合親和性を有する、請求項2に記載の化合物。
【請求項１２】
中性エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）とインキュベートした場合、野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べ大きい半減期を有する請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して５０％以下の親和性を有する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して１０％以下の親和性を有する、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
ＡＡ9、ＡＡ11、ＡＡ16が以下のスキームから選択される２以上の置換を含んでなる、請求項１又は２に記載の化合物。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ａsp、Ｓer、またはＰroであり；そして
ＡＡ16は、Ａrg、Ｈar、Ｌys、Ｏrnおよびp−アミジノフェニル−Ａlaから選択される正に荷電したアミノ酸残基である。
【請求項１６】
中性エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）とインキュベートした場合、野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べ大きい半減期を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項１７】
以下の群：
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｒ、Ｒ１１Ｄ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｅ、Ｇ１０Ｒ、Ｒ１１Ｐ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ１０Ｋ、Ｒ１１Ｓ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｇ１６Ｒ、Ｑ１８Ｐ；
hＡＮＦ（ＴＡＰＲ１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｅ、Ｇ１０Ｒ、Ｒ１１Ｐ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、残基７および８の間にＤ−Ｓerを挿入；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、残基７および８の間にＤ−Ａlaを挿入；
hＡＮＦ（ＴＡＰＲ１−２８）Ｇ１３Ｔ、Ｒ１５Ｓ、Ｍ１６Ｉ、Ｇ２０Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８Ｃha（１−シクロヘキシルアラニン）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
Ｍpa（メルカプトプロピオン酸）、Ｆ、Ｄ−Ｔhr、hＡＮＦ（１０−２８）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
Ｍpa（メルカプトプロピオン酸）、Ｆ、Ｄ−Ａla、hＡＮＦ（１０−２８）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｃ７（Ｎ−ＭeＣys）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８（Ｎ−ＭeＰhe）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆにより置換されたＣ７Ｆ８、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、
ただし、Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆは、以下のアミノ酸に由来するペプチドセグメントを表す
0003989535.tif 000087
；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９（Ｄ−Ａla）、Ｒ１１Ｄ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８Ｐhg（Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ、Ｑ１８Ｃ*、Ｙ２８Ｃ*、
ただし、Ｃ*はホモシステインを表す；
hＡＮＦ（１−２８）、Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆにより置換されたＣ７Ｆ８、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、Ｆ２６（Ｎ−ＭｅＰｈｅ）；および
hＡＮＦ（アセチル−１−２８）、Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆにより置換されたＣ７Ｆ８、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、
よりなる群から選択されるＡＮＦ変異体。
【請求項１８】
薬学的に許容し得る賦形剤および請求項１ないし１６のいずれかに記載の化合物、または請求項１７に記載のＡＮＦ変異体を含んでなる、正常な細胞外液を維持するための薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載されている、電解質均衡障害の治療のための薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載されている、ナトリウム排泄増加、利尿または血管拡張の誘導のための薬学的組成物。
【請求項２１】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）において１以上の次の置換：Ｇ９Ｔ、Ｇ９a、Ｇ９Ｒ、Ｒ１１Ｓ、Ｒ１１Ｄ、Ｇ１６Ｒ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６Ｏrn、Ｇ１６ＨarおよびＧ１６p−アミジノフェニル−Ａlaを有し、ヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃへの結合親和性に対するhＮＰＲ−Ａへの結合親和性の比が、野性型hＡＮＦ（１〜２８）と比べて高いＡＮＦ。
【請求項２２】
２以上のアミノ酸の置換を含んでなる、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２３】
置換の１つがＡＡ9の置換である、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２４】
置換の１つがＡＡ11の置換である、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２５】
置換の１つがＡＡ16の置換である、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２６】
ＡＡ9、ＡＡ11、ＡＡ16がそれぞれ置換されている、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２７】
中性エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）とインキュベートした場合、野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べ大きい半減期を有する、請求項２１に記載のＡＮＦ。
【請求項２８】
残基ＡＡ7およびＡＡ8を結合するアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は以下の群：
−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ2−Ｓ−、一ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）n−、（nは１または２である）、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＥまたはＺ）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ2−、および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
から選択されるアミドイソステレで置き換えられた、請求項２７に記載のＡＮＦ。
【請求項２９】
ＡＡ18およびＡＡ28のアミノ酸をホモＣysで置換し、それらを酸化して第２架橋部位の付加を形成した、請求項２７に記載のＡＮＦ。
【請求項３０】
以下の変化の１以上を含んでなる請求項２７に記載のＡＮＦ。
アミノ末端にテトラペプチド配列（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を加える；
アミノ末端に（Ｓer）4配列を加える；
Ｃys7−Ｐhe8アミド結合をアミドイソステレ（isostere）、Ｎ−アルキル化Ｃys7、Ｐhe8、Ａla17、Ｉle15またはＰhe26で修飾する；または
Ｄ−アミノ酸をＡＡ7およびＡＡ8の間に挿入する。
【請求項３１】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）において、ＡＡ9、ＡＡ11およびＡＡ16が、以下のスキームにより選択される置換を１以上含んでなり、ヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃへの結合親和性に対するhＮＰＲ−Ａへの結合親和性の比が、野性型hＡＮＦ（１〜２８）と比べて高いＡＮＦ。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ｓer、またはＡspであり；そして
ＡＡ16は、Ｇｌｙ以外の正に荷電したアミノ酸残基。
【請求項３２】
ＡＡ16がＡｒｇである、請求項３１に記載のＡＮＦ。
【請求項３３】
ＡＡ16がＴｙｒである、請求項３１に記載のＡＮＦ。
【請求項３４】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）において、ＡＡ9、ＡＡ11およびＡＡ16が、以下のスキームにより選択される置換を含んでなるＡＮＦ。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ｓer、ＰroまたはＡspであり；そして
ＡＡ16は、Ｇly以外の正に荷電したアミノ酸残基。
【請求項３５】
野性型hＡＮＦ（１〜２８）において、以下から選択される１以上の置換を含んでなり、ヒトクリアランスレセプター（hＮＰＲ）−Ｃへの結合親和性に対するhＮＰＲ−Ａへの結合親和性の比が、野生型hＡＮＦ（１〜２８）と比べて高いＡＮＦ；
Ｇ９Ｒ、Ｇ９Ｓ、Ｇ９Ｐ、Ｇ９Ｔ、Ｇ９Ｅ、Ｇ９ａ、Ｒ１１Ｋ、Ｒ１１Ｓ、Ｒ１１Ｄ、Ｇ１６Ｙ、Ｇ１６Ｆ、Ｇ１６Ｓ、Ｇ１６Ｐ、Ｇ１６Ｏｒｎ、Ｇ１６Ｈａｒ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６ｐ−アミジノフェニル−Ａｌａ、Ｇ１６Ｒ、及びＧ１６Ｉ。
【請求項３６】
２以上の置換を含んでなる、請求項３５に記載のＡＮＦ。
【請求項３７】
１つの置換がＡＡ9の置換である、請求項３５又は３６に記載のＡＮＦ。
【請求項３８】
１つの置換がＡＡ11の置換である、請求項３５又は３６に記載のＡＮＦ。
【請求項３９】
１つの置換がＡＡ16の置換である、請求項３５又は３６に記載のＡＮＦ。
【請求項４０】
ＡＡ9、ＡＡ11、ＡＡ16のそれぞれが置換されている、請求項３５に記載のＡＮＦ。
【請求項４１】
医薬的に許容し得る賦形剤及び請求項２１ないし４０のいずれかに記載のＡＮＦを含んでなる、正常な細胞外液を維持するための薬学的組成物。
【請求項４２】
哺乳動物における電解質均衡障害治療のために使用する、請求項２１ないし４０のいずれかに記載のＡＮＦ。
【請求項４３】
ナトリウム排泄増加、利尿または血管拡張を誘導するための、請求項２１ないし４０のいずれかに記載のＡＮＦ。
【請求項４４】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して小さい親和性を有する、請求項２１、３１又は３５のいずれかに記載のＡＮＦ。
【請求項４５】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して小さい親和性を有し、かつ野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ａに対して等しいか、またはより大きい結合親和性を有する、請求項２１、３１又は３５のいずれかに記載のＡＮＦ。
【請求項４６】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して５０％以下の親和性を有する、請求項４５に記載のＡＮＦ。
【請求項４７】
野生型ｈＡＮＦ（１−２８）に比べｈＮＰＲ−Ｃに対して１０％以下の親和性を有する、請求項４６に記載のＡＮＦ。
【請求項４８】
中性エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）とインキュベートした場合、野性型hＡＮＦ（１〜２８）に比べ大きい半減期を有する、請求項２１、３１又は３５のいずれかに記載のＡＮＦ。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、哺乳動物において利尿活性、ナトリウム排泄増加活性、および／または血管拡張活性を有する合成ペプチドに関する。本発明のペプチドは心房のナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）に関するが、ナトリウム排泄増加性ペプチドクリアランスレセプター（ＮＰＲ−Ｃ）に対する小さい結合親和性と、ナトリウム排泄増加性ペプチドを加水分解することが知られているペプチダーゼ（「エンケファリナーゼ」）に対する改良された安定性を示す。
発明の背景
正常な細胞外液容積の維持は、腎臓によるナトリウム排出（ナトリウム排泄増加）および水の排出（利尿）に主に依存する。これらは次に、(1)血漿が糸球体で濾過される速度（糸球体濾過率すなわちＧＦＲ）および(2)ナトリウムが細尿管に沿って能動的に再吸収される（水は多分受動的に従う）程度により主に決定される。ナトリウム再吸収は、部分的に副腎ステロイドホルモンアルドステロンにより、部分的に血圧、赤血球容積および血漿粘度により、および部分的に様々な心房のナトリウム排泄増加性因子（ＡＮＦ）またはホルモンにより調節される（deＢold，Ａ．Ｊ．等、Ｌife  Ｓcience  ２８：８９〜９４［１９８１］；Ｇarcia  Ｒ．，Ｅxperientia  ３８：１０７１〜７３［１９８２］；Ｃurrie，Ｍ．Ｓ．等、Ｓcience  ２２１：７１〜７３［１９８３］；Ｆlynn  Ｔ．Ｇ．等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．１１７：８５９〜８６５［１９８３］；Ｃurrie，Ｍ．Ｇ．等、Ｓcience  ２２３：６７〜６９［１９８４］、およびＫanagawa，Ｋ等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．１１８：１３１〜１３９［１９８４］）。
心房のナトリウム排泄増加性因子は細胞外液容積を検出の役目を果たす心房中のセンサーの結果として放出される。細胞外液容積の増加は、これらのセンサーにより心房伸長として検出され、増加した静脈還流容積を調節する。この刺激に応答してＡＮＦが血流中に放出され、腎臓に運ばれる。腎臓における特異的なナトリウム排泄増加性ペプチドレセプター（hＮＰＲ−Ａ）へのＡＮＦの結合は、尿細管に沿ったナトリウム再吸収の抑制を生じさせ、水の再吸収を減少させ、細胞外液容積を低下させる。
ＡＮＦは、血管拡張の刺激、副腎からのアルドステロン分泌の阻害、腎臓からのレニンの分泌、およびレニン−アンジオテンシンIIシステムを含む様々な高血圧システムに拮抗する低血圧ホルモンであることも知られている。
低血圧調節剤として作用するＡＮＦおよび関連ペプチドの血清半減期（図１参照）は比較的短いこと（Ｃrozier，Ｉ．Ｇ．等、Ｔhe  ＬancetII  １２４２〜１２４５［１９８６］）、およびこれらのペプチドはいくつかの機構により血流から除去されること（図２）が知られている。糸球体濾過に加えて、ＡＮＦ除去に有意に寄与するらしい２つの他の別の経路が同定されている。
これらの経路の第１はレセプターで媒介されるＡＮＦ除去を含む。この経路は血流からの全ＡＮＦ除去の約７０〜８０％の原因となるのに十分な能力を有すると報告されている（Ｍaack，Ｔ等、Ｓcience  ２３８：６７５〜６７８［１９８７］、ＥＰＯ公開第２３３，１４３号）。この除去の原因となるヒトのナトリウム排泄増加ペプチドレセプター（hＮＰＲ−Ｃ）は、多くの組織、特に腎臓に存在し（Ｌuft，Ｆ．Ｃ．等、Ｊ．Ｐharmacol．Ｅxp．Ｔher．２３６：４１６〜４１８［１９８６］）、hＡＮＰ、hＢＮＰおよびhＣＮＰを含む様々なヒトのナトリウム排泄増加性ペプチドを無差別に結合する（図３）（Ｂovy，Ｐ．Ｒ．、Ｍed．Ｒes．Ｒev．１０：１１５６（１９９０））。hＮＰＲ−Ｃに結合できる様々な合成ペプチド、特に直鎖のペプチド（Ｏlins，Ｇ．Ｍ．、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６３：１０９８９〜１０９９３［１９８８］）は、内因性ＡＮＦのナトリウム排出増加、利尿および血管拡張活性を高めると特許文献に記載されている。これらの除去（クリアランス）レセプター阻害剤の治療的な使用は、hＮＰＲ−Ｃにより除去されるすべてのホルモンペプチドの濃度、および従って活性を恐らく上昇させるであろう。
第２の非飽和性（nonsaturatable）除去経路も血清ＡＮＦを除去するために働き、「エンケファリナーゼ」としても知られ、本明細書でＮＥＰと呼ぶペプチターゼ、中性エンドペプチダーゼ２４．１１（ＥＣ３．４．２４．１１）の活性に関与すると信じられている（Ｓtevenson，Ｓ．Ｌ．等、Ｂiochem  ２４３Ｌ１８３〜１８７［１９８７］；Ｏlins，Ｇ．Ｍ．等、Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta．９０１：９７〜１００［１９８７］；Ｋoehn，Ｊ．Ａ．等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６２：１１６２３〜１１６２７［１９８７］；Ｙandle，Ｔ．等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．１４６：８３２〜８３９［１９８７］）。ＮＥＰは腎臓に比較的多量存在し（Ｓonnenberg，Ｊ．Ｌ．等、Ｐeptides  ９：１７３〜１８０［１９８８］）、ＡＮＦのＣys7−Ｐhe8アミド結合を加水分解することが知られている（Ｔamburine，Ｐ．Ｐ．等、Ｊ．Ｐharm．Ｅxp．Ｔher．２５１：９５６〜９６１［１９８９］）。
チオファンのようなＮＥＰの阻害剤は投与されたＡＮＰの生物学的な反応を可能にすることが見い出されている（Ｆennell，Ｓ．Ａ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２：Ａ９３６［１９８８］；Ｓeymour  Ａ．Ａ．等、上書；Ｔrapani，Ａ．Ｊ．等、上書；ＭcＭartin  Ｃ．等上書；Ｓimmerman，Ｍ．Ｂ．等、上書Ａ９３７）。しかしながらチオルファンのようなこの経路の非ペプチド性阻害剤の投与は、チオルファンが脳−血液関門を通過できるので、脳のＮＥＰまたはエンドペプチダーゼ２４．１１（「エンケファリナーゼ」）も阻害されるであろうという欠点を有する（Ｂourgoin，Ｓ．等、Ｊ．Ｐharm．Ｅxp．Ｔher．２３８：３６０〜３６６［１９８６］）。チオルファンの使用の外に、ＮＥＰの阻害のための様々な他の戦略が記載されている。これらの戦略は、ＡＮＦの芳香性のＰhe8部分から適当にはなれた金属結合用置換基の使用を含む（Ｒoques．，Ｅ．Ｐ．等、Ｎature  ２８８：２８６〜２８８［１９８０］）。Ｇordon，Ｅ．Ｍ．等、Ｌife  Ｓci．３３（Ｓupplement１）：１１３〜１１６［１９８３］；Ｍumford，Ｒ．Ｍ．等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．１０９：１３０３〜１３０９［１９８２］；Ｆournie−Ｚaluski，Ｍ．Ｃ．等、Ｊ．Ｍed．Ｃhem．２６：６０〜６５［１９８３］；Ｗaksman，Ｇ．等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．１３１：２６２〜２６８［１９８５］；米国特許第５，２４８，７６４号）をも参照。他の戦略は、Ｐhe8の代りに非天然の残基、例えばシクロヘキシルアミン（Ｆed．Ｐroc．４５：６５７［１９８６］；米国特許第５，１０６，８３４号および同４，８６１，７５５号）、またはＮ−Ｍe−Ｐheの様なＮ−アルキル化アミノ酸（Ｎutt等、ＥＰＡ０４６５０９７号）により置換することを含む。Ｄ−ＡlaまたはＤ−ＡlのようなＤアミノ酸の導入が記載されており（Ｎutt  ＲおよびＶeber，Ｄ．Ｆ．、Ｅndocrin．Ｍetab．Ｃlin．Ｎ．Ａm．１６：１９〜４１［１９８８］；米国特許第４，８１６，４４３号）、アミド結合の置換がＬewicki等、米国特許第４，９３５，４９２号（米国特許第５，０９５，００４号も参照）により一般的に記載されている。
うっ血性心不全、高血圧、急性腎不全の治療におけるナトリウム排泄増加性ペプチドおよびその変異体の明白な治療的可能性のために、野性型のＡＮＦの生物学的活性に似せるが、野性型ＡＮＦと比較した場合、改良された安定性、有効性または作用持続期間を有すると報告された多くの合成のＡＮＦが製造されている。これの合成ＡＮＦの多くは、次の米国特許：第４，４９６，５４４号、第４，４９６，５４４号、第４，６０９，７２５号、第４，６７３，７３２号、第４，７１６，１４７号、第４，７５７，０４８号、第４，７６４，５０４号、第４，８０４，６５０号、第４，８１６，４４３号、第４，８６１，７５５号、第４，９３５，４９２号、第４，９５２、５６１号、第５，０５７，４９５号、第５，０５７，６０３号、第５，０９１，３６６号、第５，０９５，００４号、第５，１０６，８３４号、第５，１５９，０６１号、第５，２０４，３２８号、および第５，２１２，２８６号に開示されている。更に、ＡＮＦアナログを記載した様々な外国文献は、ＷＯ８５／０４８７０；ＷＯ８５／０４８７２；ＷＯ８８／０３５３７；ＷＯ８８／０６５９６；ＷＯ８９／１０９３５；ＷＯ８９／０５６５４；ＷＯ９０／０１９４０；ＷＯ９０／１４３６２；ＷＯ９２／０６９９８；ＥＰＡ０３２３７４０；ＥＰＡ０３５６１２４；ＥＰＡ０２９１９９９；ＥＰＡ０３５０３１８；ＥＰＡ０４９７３６８；ＥＰＡ０３８５４７６；およびＥＰＡ０３４１６０３号を含む。これらの公開物のいずれもヒトレセプター特異性（すなわちhＮＰＲ−Ａに対する高親和性およびhＮＰＲ−Ｃに対する低親和性）を有するhＡＮＦ変異体を開示せず、この選択性を達成するために必要なhＡＮＦ（１〜２８）残基９，１１または１６への置換も開示しない。ＷＯ８８／０３５３７号だけがトランケートされた形のＡＮＦの１６位で正に荷電した残基Ｄ−Ａrgを開示する。
本発明の目的
hＡＮＦ（１〜２８）様の生物学的活性を有するが、高められた代謝安定性を有する新規化合物を提供するのが本発明の目的である。強力な血管拡張活性、ナトリウム排泄増加活性および降圧活性を有する新規なペプチドまたはペプチドミメリック化合物を提供するのが本発明の他の目的である。他のhＮＰＲ、特にhＮＰＲ−ＢおよびhＮＰＲ−Ｃに比べて、hＮＰＲ−Ａに対して高められた特異性を有する新規な化合物を提供するのが更なる目的である。本発明のこれらおよび他の目的は以下の記述から明らかになるであろう。
発明の要約
本発明の目的は、強力な血管拡張活性、ナトリウム排泄増加活性、および／または降圧活性を有し、他のhＮＰＲ、特にhＮＰＲ−ＢおよびhＮＰＲ−Ｃに比べて、hＮＰＲ−Ａに対して高められた特異性を有する新規な化合物を提供することにより達成される。本発明の化合物は、野性型のタンパク質hＡＮＦ（１〜２８）に比べてヒトのクリアランスレセプターhＮＰＲ−Ｃに対して減少した結合親和性を一般に有する。これらの化合物は、野性型のタンパク質hＡＮＦ（１〜２８）に比べて、ヒトＡレセプターhＮＰＲ−Ａに対して等しい、またはより大きい親和性をも有する。これらの生物学的特徴は、野性型hＡＮＦ（１〜２８）またはその変異体において１またはそれ以上の次の置換を提供することにより達成される；Ｇ９Ｔ、Ｇ９a、Ｇ９Ｒ、Ｒ１１Ｓ、Ｒ１１Ｄ、Ｇ１６Ｒ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６ＯrnおよびＧ１６Ｈar。更にこれらの化合物は中性エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）と共にインキュベートした場合、野性型のhＡＮＦ（１〜２８）に比べて増加した半減期を有する。半減期の増加は、ウロジラチンアミノ末端テトラペプチド配列を加えることにより、アミノ末端に（Ｓer）4配列を加えることにより、Ｃys7−Ｐhe8アミド結合をアミドイソステレ（isostere）、Ｎ−アルキル化Ｃys7、Ｐhe8、Ａla17、Ｉle15またはＰhe26で修飾することにより、またはＤ−アミノ酸をＣys7およびＰhe8の間に挿入することにより好ましくは達成される。hＮＰＲ−Ａ選択性を有する好ましい化合物は式（Ｉ）によって表されるか、またはその薬学的に受容し得る塩である。
0003989535.tif 000002
［式中、
Ｘは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルカノイル、Ｓer−Ｐro−Ｌys−、（Ｓer）4−およびＴhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）から選択され；
ＡＡ1は、存在しないか、またはＳer、Ｍet、Ｇly、Ａsp、Ａla、ＴyrおよびＨisから選択され；
ＡＡ2は、存在しないか、またはＬeu、Ａsp、Ｍet、Ｖal、Ｓer、Ａla、Ｐhe、ＰroおよびＬysから選択され；
ＡＡ3は、存在しないか、またはＣys、Ｇlu、Ｓer、Ｇln、Ｈis、Ｇly、ＡrgおよびＡspから選択され；
ＡＡ4は、存在しないか、またはＡrg、Ｇly、Ａla、Ａsp、Ｍet、Ｌeu、ＴyrおよびＰroから選択され；
ＡＡ5は、存在しないか、またはＳer、ＣysおよびＡspから選択され；
ＡＡ6は、存在しないか、またはＳer、ＧlyおよびＧluから選択され；
ＡＡ7は、存在しないか、またはＣys、Ｎ−メチル−Ｃys、Ｄ−ＣysおよびＰenから選択され；
ＡＡ8は、Ｐhe、Ｎ−メチル−Ｐhe、トリメチルフェニル−Ａla、ハロ（Ｆ，Ｃl，ＢrおよびＩ）フェニル−Ａla、トリフルオロメチルフェニル−Ａla、Ｔyr、Ｏ−メチル−Ｔyr、Ｃha、β−ナフチル−Ａla、α−ナフチル−Ａla、ビフェニル−Ａla、ジフェニル−Ａla、Ｄ−Ａla、ジベンジル−Ａla、フロレニル−Ａla、アダマンチル−Ａlaおよびβ−ナフチルオキシ−Ａlaから選択され；
ＡＡ9は、Ｇly、Ａrg、Ｔhr、Ｖal、Ａsp、Ａla、Ｄ−Ａla、ＰroおよびＧluから選択され；
ＡＡ10は、Ｇly、Ａrg、Ｓer、Ａla、Ｈis、ＰroおよびＬysから選択され；
ＡＡ11は、Ａrg、Ｌys、Ｎ−メチル−Ａrg、Ａsp、ＳerおよびＰroから選択され；
ＡＡ12は、Ｍet、Ｉle、Ｄ−Ｌeu、ＮleおよびＬeuから選択され；
ＡＡ13は、ＡspおよびＧluから選択され；
ＡＡ14は、Ａrg、Ｎ−メチル−Ａrg、ＰroおよびＳerから選択され；
ＡＡ15は、Ｉle、Ｎ−メチル−ＩleおよびＬeuから選択され；
ＡＡ16は、Ｇly、Ｔyr、Ｐhe、Ｓer、Ｔyr、Ｐro、並びにＯrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrgから選択される正に荷電したアミノ酸残基から選択され；
ＡＡ17は、Ａla、Ｓer、Ｎ−メチル−ＡlaおよびＰroから選択され；
ＡＡ18は、Ｇln、Ｓerおよびホモ−Ｃysから選択され；
ＡＡ19は、Ｓerから選択され；
ＡＡ20は、ＧlyおよびＡlaから選択され；
ＡＡ21は、Ｌeuから選択され；
ＡＡ22は、ＧlyおよびＡlaから選択され；
ＡＡ23は、Ｃysから選択され；
ＡＡ24は、Ａsnから選択され；
ＡＡ25は、ＳerおよびＶalから選択され；
ＡＡ26は、Ｐhe、Ｄ−Ｐhe、Ｎ−メチル−ＰheおよびＬeuから選択され；
ＡＡ27は、Ａrg、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaおよびＡrg−Ａrgから選択され；
ＡＡ28は、ＴyrおよびホモＣysから選択され；そして
Ｚは、ＯＨおよびＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ6〜Ｃ12アリールおよびＣ6〜Ｃ12アリール−Ｃ1〜Ｃ6アルキルから独立に選択される）から選択され；
残基ＡＡ7およびＡＡ8を結合するアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は以下の群：
−ＣＨ2−ＮＨ−、
−ＣＨ2−Ｓ−、
−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）n−、（式中、nは１または２である）
−ＣＨ2−ＣＨ2−、
−ＣＨ＝ＣＨ−（ＥまたはＺ）、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ2−、および
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−
から選択されるアミドイソステレで場合により置き換えてもよい。ただしＡＡ9、ＡＡ11およびＡＡ16の１つは次のスキームにより選択される。
ＡＡ9は、Ａrg、Ｔhr、またはＧluであり；
ＡＡ11は、Ａsp、Ｓer、またはＰroであり；そして
ＡＡ16は、Ａrg、ホモＡrg（Ｈar）、Ｌys、Ｏrnおよびp−アミジノフェニル−Ａlaから選択される正に荷電したアミノ酸残基である］。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物中のＡＡ16は、Ｏrn、Ｈar、Ｌys、p−アミジノフェニル−ＡlaまたはＡrgより選択される正に荷電したアミノ酸残基であり、最も好ましくはＡrgである。同様に、好ましくは、そして独立に、ＡＡ9はＡrg、ＴhrまたはＧluから選択され、ＡＡ11はＡsp、Ｓer、またはＰroから選択される。場合によりＡＡ3はＡspであり、ＸはＴhr−Ａla−Ｐro−Ａrg−（配列番号１）、および／または該化合物は第２のジサルファイド（または同等の）結合を含んでもよい。
場合により、式Ｉの化合物は、ＡＡ7およびＡＡ8間に挿入されたＤ−アミノ酸残基を有してもよい。
本発明の最も好ましいhＡＮＦ変異体は、
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｒ、Ｒ１１Ｄ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｅ、Ｇ１０Ｒ、Ｒ１１Ｐ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ１０Ｋ、Ｒ１１Ｓ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｇ１６Ｒ、Ｑ１８Ｐ；
hＡＮＦ（ＴＡＰＲ１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｍ１２Ｉ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｅ、Ｇ１０Ｒ、Ｒ１１Ｐ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、残基７および８の間にＤ−Ｓerを挿入；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ、残基７および８の間にＤ−Ａlaを挿入；
hＡＮＦ（ＴＡＰＲ１−２８）Ｇ１３Ｔ、Ｒ１５Ｓ、Ｍ１６Ｉ、Ｇ２０Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８Ｃha（１−シクロヘキシルアラニン）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
Ｍpa（メルカプトプロピオン酸）、Ｆ、Ｄ−Ｔhr、hＡＮＦ（１０−２８）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
Ｍpa（メルカプトプロピオン酸）、Ｆ、Ｄ−Ａla、hＡＮＦ（１０−２８）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｃ７（Ｎ−ＭeＣys）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８（Ｎ−ＭeＰhe）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６−Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆ*により置換されたＣ７Ｆ８、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｇ９（d−Ａla）、Ｒ１１Ｄ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；
hＡＮＦ（１−２８）Ｆ８Ｐhg（lまたはdフェニルグリシン）、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ；および
hＡＮＦ（１−２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ、Ｑ１８Ｃ*、Ｙ２８Ｃ*
を含む。
本発明は薬学的に受容し得る賦形剤および上記のいずれかを含む薬学的組成物を更に含む。この組成物は、ナトリウム排泄増加、利尿、および血管拡張を誘導する方法において、またはレニン−アンジオテンシンIIおよびアルドステロンシステムを調節するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
図１  野性型ヒトナトリウム排泄増加性ペプチドの配列。暗い円は、すべてのヒトホルモン（ＡＮＰ［配列番号２］、ＢＮＰ［配列番号３］、およびＣＮＰ［配列番号４］）に見出される保存された残基である。影をつけた円は「ウロジラチン」と呼ばれる腎臓特異的なヒトのＡＮＦ変異体に見出される付加的なアミノ末端残基である。影をつけない円はヒトのナトリウム排泄増加性ホルモンの間で保存されていない残基である。
図２  その短い血清半減期（t1/2）の主な原因であるＡＮＦ（またはＡＮＰ）の４つの運命。
図３  公知のナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターに対するホルモン特異性。実線の矢印は強い結合親和性を示す。破線の矢印は弱い結合親和性を示す。Ａレセプター（ＮＰＲ−Ａ）は主に副腎皮質および腎臓に見出され、Ｂレセプター（ＮＰＲ−Ｂ）は主に心房および中枢神経系に見出され、Ｃレセプターは主に腎臓の内皮組織に見出される。すべての３つのレセプターは約４４０残基を有するホモロガスな細胞外ドメインを有する。Ｃレセプターは機能未知のの小さいベスティガル（vestigall）３７アミノ酸の細胞内ドメインのみを有し、一方ＡおよびＢレセプターはグアニルサイクラーゼおよびチロシンキナーゼドメインを有する。Ａレセプターはホルモンの降圧効果の大部分の原因であり、Ｃレセプターはその早い除去を媒介する。
図４Ａおよび４Ｂ  hＮＰＲ−Ｃを発現する細胞によるＡＮＦ変異体の不活性化に対する抵抗。図４Ａで「ＡＮＰ」は野性型hＡＮＦ（１〜２８）であり、図４Ｂで「ミュータント」はhＡＮＦ（１〜２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒである。
図５  ミュータントhＡＮＦ（１〜２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒの結合特異性。
図６  エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）（０．２２５mg/ml）によるＡＮＦ変異体（０．５mg/ml）の分解。次の配列を有するペプチドを実施例２２で示すようにアッセイした。
0003989535.tif 000003
図７  エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）（０．４５μg/ml）によるＡＮＦ変異体（３０nＭ/ml）の分解。次の配列を有するペプチドを実施例２２に示すようにアッセイした。
0003989535.tif 000004
図８  エンドペプチダーゼ１１．２４（ＮＥＰ）（０．０７５および０．１５μg/ml）によるＡＮＦ５１（３２nＭ/ml）の分解。半減期＝１９２７分（０．０７５μg/ml  ＮＥＰ）および２６９（０．１５μg/ml  ＮＥＰ）。
発明の詳細な記述
Ａ．定義
請求の範囲および明細書に用いる用語は、特にことわらない限り以下に説明するよう定義される。
「hＡＮＦ」、「hＡＮＦ（１〜２８）」、「α−hＡＮＰ」および「野性型hＡＮＦ」なる語は、本明細書では互換的に使用し、以下の配列（配列番号２１）：
0003989535.tif 000005
を有する、Ｋangawa等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．１１８（１）：１３１〜１３９［１９８４］に報告された２８アミノ酸残基のペプチドを意味する。
この構造の特定の残基の上及び下の整数は、残基の位置番号を定義する。この残基位置番号は以下に記載する１文字アミノ酸略号と組合せて用い、本発明のhＡＮＦミュータント中で置換がなされる残基を示す。したがって例えば、野性型hＡＮＦの残基位置数１６でアルギニン（Ｒ）がグリシン（Ｇ）を置換するミュータントhＡＮＦが合成された場合、命名法「hＡＮＦ  Ｇ１６Ｒ」または「hＡＮＦ（１〜２８）Ｇ１６Ｒ」を用いる。多数の置換は、以下に例示するように各置換をコンマで分離して同じ方法で示す。
「hＡＮＦ（１〜２８）Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｇ１６Ｒ」という表示は、残基位置９でグリシンの代りにスレオンの置換（すなわちＧ９Ｔ）、残基位置１１でアルギニンの代りにセリンの置換（すなわちＲ１１Ｓ）、および位置１６でグリシンの代りにアルギニンの置換（すなわちＧ１６Ｒ）を有する、上に示したhＡＮＦ配列を有する３重ミュータントhＡＮＦを示す。
「hＡＮＦ（ＴＡＰＲ１〜２８）Ｍ１２Ｉ、Ｇ１６Ｒ」という表示は、hＡＮＦのＳer．残基１のアミノ基に結合したテトラペプチドＴＡＰＲを有する２重ミュータントを示す。
「Ｃ1〜Ｃ6アルキル」という語は、示した炭素原子数を有する分枝の、非分枝の、または環状の、飽和脂肪族炭化水素基を意味する。これらのアルキル基の代表的な例は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、２−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、n−ヘキシル、２−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、シクロヘキシル等を含む。「低級アルキル」および「Ｃ1〜Ｃ6アルキル」の語は同義語であり、互換的に使用する。好ましい「Ｃ1〜Ｃ6アルキル」基はメチル基である。
「Ｃ1〜Ｃ6アルカノイル」という語は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、カプロイル等を含む。
「Ｃ6〜Ｃ12アリール」という語は、示した炭素数を有する、融合しているか否かは問わない、ホモサイクリックな炭化水素芳香族基を示す。好ましいアリール基はフェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナンスレニル、ナフタセニル等を意味する（例えばＬang's  Ｈandbook  of  Ｃhemistry（Ｄean，Ｊ．Ａ編）、１３版、表７−２［１９８５］参照）。
「Ｃ6〜Ｃ12アリール−Ｃ1〜Ｃ6アルキル」の語は、示した炭素数を有するアルキル基に付加された、示した数の炭素数を有する、１、２、また３のアリール基を意味し、ベンジル、ナフチルメチル、フェネチル、ベンジヒドリル（ジフェニルメチル）、フロレニル、トリチル等を含むがこれ等に限定されない。好ましいアリールアルキル基はベンジル基である。
本明細書に記載するアミノ酸およびアミノ酸残基は以下の表に示す認められている１または３文字コードによって示す。特記しない限りこれ等のアミノ酸また残基は天然に存在するＬ立体異性体形である。
0003989535.tif 000006
一般に、特記しない限り、アミノ酸およびそのための保護基の指定に用いる略号はバイオケミカル命名法のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッションの推奨に基づく（Ｂiochemistry、１１：１７２６〜１７３２［１９７２］）。
式１の化合物を定義するのに用いた命名法はＥuropean  Ｊournal  of  Ｂiochemistry、１３８：９〜３７［１９８４］に公開されたＩＵＰＡＣにより定められたものである。
「薬学的に受容し得る塩」とは、酸付加塩および塩基付加塩を含む。
「薬学的に受容し得る酸付加塩」とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸と共に形成される、遊離塩基の生物学的有効性および性質を保持し、生物学的に、またはその他の点で望ましくないものでない酸付加塩を言う。
「薬学的に受容し得る塩基付加塩」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等の無機塩基から誘導されたものを含む。特に好ましいものは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。薬学的に許容し得る有機の非毒性塩基から誘導される塩は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、ユリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の、１級、２級および３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂の塩を含む。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、ユリンおよびカフェインである。
Ｂ．調製法
１．化学的合成
a．一般的方法
ＡＮＦ変異体を製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学的合成、およびその後の天然のコンホメーション、すなわち正しいジサルファイド結合を得るのに適当な酸化条件下での処理を含む。これは当業者によく知られた方法を用いて行うことができる（Ｋelley，Ｒ．Ｆ．およびＷinkler，Ｍ．Ｅ．Ｇenetic  Ｅngineering  Ｐrinciples  and  Ｍethod、Ｓetlow，Ｊ．Ｋ．編、Ｐlenum  Ｐress、ニューヨーク、１２巻、１〜１９ページ［１９９０］；Ｓtewart，Ｊ．Ｍ．およびＹoung，Ｊ．Ｄ．Ｓolid  Ｐhase  Ｐeptide  Ｓynthesis、Ｐierce  Ｃhemical  Ｃo．、ロックフォード、イリノイ［１９８４］を参照。米国特許第４，１０５，６０３号、同３，９７２，８５９号、同３，８４２，０６７号、および同３，８６２，９２５号をも参照）。
本発明のポリペプチドは固相ペプチド合成を用いて便利に製造できる（Ｍerrifield、Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．８５：２１４９［１９６４］；Ｈoughten．Ｐroc．Ｎatl．Ａcal．Ｓci．ＵＳＡ  ８２：５１３２［１９８５］）。固相合成は、ＳtewartおよびＹoung（上書）の２および４頁の図１−１および１−２に示されるように、適当な樹脂（例えばクロロメチル化ポリスチレン樹脂）への保護されたアミノ酸のカップリングにより、推定ペプチドのカルボキシ末端で開始する。α−アミノ保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばＴＥＡ中で中和した後、α−アミノおよび側鎖を保護したアミノ酸を付加する。残存α−アミノおよび、もし必要なら側鎖保護アミノ酸を、縮合により所望の順序に次に連続的にカップリングし、樹脂に結合した中間化合物を得る。或いは、アミノ酸を互いに結合してペプチドを形成し、その後そのペプチドを生長している固相ポリペプチド鎖へ付加してもよい。
２つのアミノ酸間、アミノ酸とペプチド間、ペプチドとペプチド間の縮合は、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法（p−ニトロフェニルエステル法）、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシスクシニックアシッドイミノエステル法、Ｗoodward  reagent  Ｋ法等の通常の縮合法に従い行うことができる。
適当な保護基を用いるアミノ酸のいずれかの反応性側鎖の保護は、ペプチドの化学合成に一般的である。所望のポリペプチド鎖が順次組立てられた後、究極的にはこれら保護基を除去する。アミノ酸またはフラグメントのαアミノ基を、その物質がカルボキシル基で反応する間保護し、その後アミノ保護基を選択的に除去することによって次の反応がその位置で起ることに可能にすることも一般的である。従ってペプチド鎖中の所望の配列に位置するアミノ酸残基のそれぞれを含む中間体化合物（様々なこれらの残基は側鎖保護基を有する）を製造するのはポリペプチド合成で一般的である。これらの保護基を次に実質的に同時に除去し、樹脂から除去した後、所望の生成物を得る。
α−およびε−アミノ側鎖を保護する適当な保護基は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚと略される）、イソニコチニルオキシカルボニル（iＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（２Ｃl］、p−ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ2］、p−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭe）］、t−ブトキシカルボニル（Ｂoc）、t−アシルオキシカルボニル（Ａoc）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２，４−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂpoc）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆmoc）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍsc）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐpt）、ジメチロホスフィノチオイル（Ｍpt）等により例示される。
カルボキシ官能基の保護基は、ベンジルエステル（ＯＢzl）、シクロヘキシルエステル（Ｃhx）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮb）、t−ブチルエステル（Ｏbut）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰic）等により例示される。アミノおよびカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システインおよびセリン等の特殊なアミノ酸は適当な保護基により保護される。例えばアルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、p−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、p−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍds）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍts）等で保護される。システインのチオール基は、p−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル（Ｔmb）等により保護され、セリン水酸基はベンジル、t−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル等で保護し得る。
ＳtewartおよびＹoung（上書）はペプチドを製造する方法に関する詳細な情報を提供する。α−アミノ基の保護は１４〜１８頁に記載されており、側鎖のブロックは１８〜２８頁に記載されている。アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリル官能基の保護基についての表は、１４９〜１５１ページに提供されている。
所望のアミノ酸配列が完成した後、ＨＦ等の試薬、および樹脂からペプチドを開裂させるばかりでなく、残存するすべての側鎖保護基をも開裂する１以上のチオ含有スカベンジーを用いる処理により、中間体ペプチドを樹脂から除去する。ＨＦ開裂の後、そのタンパク質配列をエーテルで洗浄し、大量の希酢酸に移し、水酸化アンモニウムで８．０に調節したpＨで撹拌する。
好ましくはペプチドにおける残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システインおよびチロシン残基のアルキル化）を避けるために、チオクレゾールおよびクレゾールスカベンジャー混合物を用いる。その樹脂をエーテルで洗浄し、直ちに大量の希酢酸に移し、溶解し、分子間架橋を最小限にする。２５０μＭのポリペプチド濃度を、約２lの０．１Ｍ酢酸溶液中に希釈する。その溶液を撹拌し、水酸化アンモニウムで約８にそのpＨに調節する。pＨ調節によりペプチドはその所望のコンホメーション配置をとる。
b．非ペプチド（アミドイソステレ）結合
本発明の一態様においては、アミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）を、−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＣＨ2−ＳＯ−等のアミドイソステレ結合で公知の方法により置き換える。次の文献はこれらの別の結合部分を含むペプチドアナログの製造を記載する：Ｓpatola，Ａ．Ｆ．、Ｖega  Ｄata  １（３）：「Ｐeptide  Ｂackbone  Ｍodifications」（総説）［１９８３年３月、Ｓptola，Ａ．Ｆ．、「Ｃhemistry  and  biochemistry  of  Ａmino  Ａcids  Ｐeptides  and  Ｐroteins」、Ｂ．Ｗeinstein編、Ｍarcel  Ｄekker、ニューヨーク、２６７頁［１９８３］；Ｍorley，Ｊ．Ｓ．、Ｔrends  Ｐharm．Ｓci．４６３〜４６８；Ｈudson，Ｄ．等，Ｉnt．Ｊ．Ｐept．Ｐrot．Ｒes．１４：１７７〜１８５［１９７９］（−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2ＣＨ2−）；Ｔourwe，Ｄ．等、Ｓtructural  Ｂiology  ３３１〜３３３［１９８９］（Ｅ，−ＣＨ＝ＣＨ−）；Ｓpatola，Ａ．Ｆ．等、Ｌife  Ｓci．３８：１２４３〜１２４９［１９８６］（−ＣＨ2−Ｓ）；Ｈann，Ｍ．Ｍ．、Ｊ．Ｃhem．Ｓoc．Ｐerkin．Ｔrans．１３０７〜３１４［１９８２］（−ＣＨ＝ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａlmquist，Ｒ．Ｇ．等、Ｊ．Ｍed．Ｃhem．２３：１３９２〜１３９８［１９８０］（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）；Ｊennings−Ｗhite  Ｃ．等、Ｔetrahedron  Ｌett．２３：［１９８２］（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）；Ｓzelke，Ｍ等、ＥＰ出願番号４５６６５［１９８２］Ｃhem  Ａbs：９７３９４０５［１９８２］（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）；Ｈolladay，Ｍ．Ｗ．等、Ｔetrahedron  Ｌett．２４：４４０１−４４０４［１９８３］（−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ2−）；Ｈruby，Ｖ．Ｊ．、Ｌife  Ｓci．３１：１８９〜１９９［１９８２］（−ＣＨ2−Ｓ−）；およびＣho，Ｃ．Ｙ．等、Ｓcience  ２６１：１３０３〜１３０５［１９８３］（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）。
２．組換え合成
更なる態様において、本発明は、表１に示すアミノ酸置換を含むＡＮＦ変異体から選択されるポリペプチドを含んでなる物質の組成物のタンパク質成分をコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含んでなる物質の組成物を包含する。本発明は、さらにＤＮＡ分子に作動可能に結合した発現調節配列、該ＤＮＡ分子を含む発現ベクター、好ましくはプラスミドを含み、調節配列はベクターでトランスフォームされた宿主により認識される。
本発明の好ましい発現ベクターは、pＢＲ３２２、phＧＨ１、pＢ０４７５、pＢ１５３７、pＲＩＴ５、pＲＩＴ２Ｔ、pＫＫ２３３−２、pＤＲ５４０、pＰＬ−λおよびpＢ１５３７から選択され得、最も好ましいベクターはpＢ１５３７である。
本発明の発現ベクターを含む好ましい宿主細胞は、Ｅ．coli  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎo．３１４４６）、Ｅ．coli株ＪＭ１０１、Ｅ．coli  Ｂ、Ｅ．coli  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎo．３１５３７）、Ｅ．coli  c６００、Ｅ．coli  Ｗ３１１０（Ｆ−、γ−、原栄養性、ＡＴＣＣ  Ｎo．２７３２５）、Ｂacillus  subtilis、Ｓalmonella  typhimurium、Ｓerratia  marcesansおよびＰseudomonas種から選択され得、最も好ましい宿主細胞はＥ．coli  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎo．２７３２５）、またはプロテアーゼ欠損株３４Ｂ８等のその誘導体である。
本発明の組成物は、本明細書に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を単離または合成し（標準的な技術により）、適当な宿主中でその核酸配列を発現できる適当な発現ベクター中にその核酸配列をライゲートし、核酸配列がライゲートされた発現ベクターで宿主を形質転換し、該核酸配列を発現するのに適当な条件下に宿主を培養し、それによって選択された核酸配列によりコードされたタンパク質が宿主によって発現される工程を含む方法により製造され得る。この方法においてはライゲート工程は、該核酸を適当なベクターにライゲートし、該核酸が適当な分泌シグナルに作動可能に結合され、アミノ酸配列が宿主により分泌されることを更に期待する。分泌シグナルはstII、ecotin、lam  Ｂ、herpes  gＤ、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子よりなる群から選択され得、好ましくはstIIである。
a．遺伝子合成、クローニングおよび発現
１．一般的な操作
精製したタンパク質およびそのアミノ酸配列から、ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体は組換えＤＮＡ技術を用いて製造され得る。これらの技術は、単純にした形では、ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体をコードする遺伝子を取得し；それを適当なベクターに挿入し、そのベクターを適当な宿主細胞に挿入し、宿主細胞を培養してＡＮＦまたはＡＮＦ変異体遺伝子を発現させ、それにより製造されたタンパク質を精製することを考える。
いくらかより詳しくは、ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体をコードするＤＮＡ配列をクローンし、操作し、それを便利な宿主中で発現させる。親のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムライブラリーから、ＡＮＰまたはＡＮＰホモローダを発現する細胞からのmＲＮＡに由来するcＤＮＡから、またはそのＤＮＡ配列を合成的に構築することにより入手し得る（Ｓambrook，Ｊ．等、Ｍolecular  Ｃloning（２版）、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌaboratory、ニューヨーク［１９８９］）。
宿主を形質転換するのに用いる適当なプラスミドまたはベクターにその親のＤＮＡを次に挿入する。一般に、宿主細胞とコンパティブルな種に由来する複製および制御配列を含むプラスミドベクターをこれ等の宿主と組合せて用いる。ベクターは通常複製部位、並びに形質転換された細胞中で表現型の選択を提供できるタンパク質をコードする配列を有する。
例えばＥ．coliを、Ｅ．coli種に由来するプラスミド、pＢＲ３２２を用いて形質転換する（Ｍandel，Ｍ．等、Ｊ．Ｍol．Ｂiol．５３：１５４［１９７０］）。プラスミドpＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性についての遺伝子を含み、従って容易な選択手段を提供する。他のベクターは、発現においてしばしば重要である異なるプロモーター等の異なる特徴を有する。例えばプラスミドpＫＫ２２３−３、pＤＲ７２０、およびpＰＬ−λは、現在入手し得る（Ｐharmacia  Ｂiotechnology）tac、trp、またはＰLプロモーターを有する発現ベクターを表す。
２．ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体の直接発現
直接発現用の好ましいベクターはpＢ１５３７である。このベクターは実施例２３〜２５に記載したように製造し、Ｅ．coli用の複製起点、アルカリホスホターゼプロモーター、stIIシグナル配列、ＡＮＰ遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。他の好ましいベクターはpＲ１Ｔ５およびpＲ１Ｔ２Ｔ（Ｐharmacia  Ｂiotechnology）である。これらのベクターは、適当なプロモータ、その後にタンパク質ＡのＺドメインを含み、ベクターに挿入された遺伝子を融合タンパク質として発現させることができる。これらのベクターの更なる議論は以下に見出し得る。
他の好ましいベクターは実施例２３〜２５に説明するように、本明細書に記載するベクターの関連する特徴（traits）を結合することにより標準的技術を用いて構築し得る。この例では宿主間で往復（shuttle）することができる、ファージおよびＥ．coliについての複製起点を有するベクターを用い、突然変異誘発および発現の両方を容易にした（Ｃunningham，Ｂ．等、Ｓcience  ２４３：１３３０〜１３３６［１９８９］；Ｗells，Ｊ．およびＣunningham，Ｂ．、ＷＯ９０／０４７８８（１９９０年５月３日公開）。ベクターの関連する特徴は、プロモーター，リボソーム結合部位、ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体遺伝子または遺伝子融合（プロテインＡのＺドメインおよびＡＮＦまたはＡＮＦ変異体およびそのリンカー）、シグナル配列、抗生物質抵抗性マーカー、コピー数、および適当な複製起点を含む。
ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体は、アルカリホスホターゼプロモーターおよびstIIシグナル配列を有するプラスミドを用いてＥ．coli株３４Ｂ８で発現された。これは、Ｒ３Ｄ／Ｇ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６Ｒ変異を含むＡＮＰ変異体約１２mg／ＬおよびＲ３Ｄ変異のみを含むＡＮＦバリアント約３mg／Ｌを１０l発酵のブロス中に分泌する発現系をもたらした。振とうフラスコ実験は、これらの変異が野性型のＡＮＦより劇的に大きく発現されることを示した（それぞれ、約３２００および８００倍大きい）。しかし別の株、Ｅ．coli２３Ｇ３中で野性型ＡＮＦを発現させることによりその発現は約１５倍増加した。
宿主細胞は原核生物でもよく、真核生物でもよい。原核生物は、ＤＮＡ配列をクローニングし、発現させて、親のペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチドおよびポリペプチド変異体を製造するのに好ましい。例えばＥ．coli  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎo．３１４４６）を、Ｅ．coli  Ｂ、Ｅ．coli  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎo．３１５３７）、およびＥ．coli  c６００およびc６００hfl、Ｅ．coli  Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマー、原栄養性／ＡＴＣＣ  Ｎo．２７３２５）、Ｂacillus  subtilis等のbacilli、およびＳalmonella−typhimuriumまたはＳerratia  marcesans等の他のエンテロバクテリア、および様々なシュードモナス種と同様用い得る。好ましい原核生物はＥ．coli  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物により発現される場合、ポリペプチドは典型的にはＮ−末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合には、Ｎ−末端メチオニンまたはホルミルメチオニンは、融合タンパク質のアミノ末端または融合タンパク質のシグナル配列のアミノ末端に在る。これ等の例は勿論説明のためであって、限定的なものではない。
原核生物に加えて、酵母培養物または多細胞生物に由来する真核生物を用いてもよい。原理的には、そのようないずれの細胞培養も作動可能である。しかし背つい動物細胞への興味が最大となっており、培養物中の背つい動物細胞の増殖（組織培養）が再現可能な方法となっている（Ｔissue  Ｃulture、Ａcademic  Ｐress，ＫruseおよびＰatterson編［１９７３］）。そのような有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨela細胞、Ｃhinese  Ｈamster  Ｏvary（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系である。
具体的には、本発明の場合、ＡＮＦ遺伝子を合成オリゴヌクレオチドから組立て、便利な発現ベクターに挿入した。生じたプラスミドpＢ１５３７を、アルカリホスファターゼプロモーター（ＡＰ）の制御下に転写を、トリプトファンのシャイン−ダルガーノ配列の制御下に翻訳を行わせる。stIIシグナル配列をＥ．coliペリプラズムにＡＮＦを分泌させるために用いた。
３．遺伝子融合
上の方法の変型は遺伝子融合の使用を考え、ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体をコードする遺伝子をベクター中で他のタンパク質または他のタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子と結合する。これはＡＮＦまたはＡＮＦ変異体が他のタンパク質との融合として宿主細胞により生産される結果となる。「他の」タンパク質はしばしば、細胞により分泌され得るタンパク質またはペプチドであって、培地から所望のタンパク質を単離し、および精製することを可能にし、所望のタンパク質が細胞内部に残る場合に生じる宿主細胞を破壊する必要をなくす。或いは、融合タンパク質は細胞内で発現し得る。高度に発現される融合タンパク質を用いることは有用である。
遺伝子融合の使用は、必須ではないが、Ｅ．coli中でのヘテロガスなタンパク質の発現、およびその後のこれらの遺伝子産物の精製を容易にする（Ｈarris，Ｔ．Ｊ．Ｒ．、Ｇenetic  Ｅngineering，Ｗilliamson，Ｒ．編、Ａcademic、ロンドン、４巻、１２７頁［１９８３］；Ｕhlen，Ｍ．およびＭoks，Ｔ．、Ｍethods  Ｅnzymol．１８５：１２９〜１４３［１９９０］）。プロテインＡ、より具体的にはプロテインＡのＺドメインのＩgＧへの結合は融合タンパク質の精製に対する「アフィニティハンドル」を提供するのでプロテインＡ融合にはしばしば用いられる（Ｎilsson，Ｂ．およびＡbrahmsen，Ｌ．、Ｍethods  Ｅnzymol．１８５：１４４〜１６１［１９９０］）。多くのヘテロガスなタンパク質はＥ．coli中で直接的に発現する場合分解するが、融合タンパク質として発現された場合には安定であることも示されている（Ｍarston，Ｆ．Ａ．Ｏ．、Ｂiochem．Ｊ．２４０：１［１９８６］）。
融合タンパク質として発現されたＡＮＦまたはＡＮＦ変異体は適切にフォールドされ得、または天然の構造を得るためにフォールディングを必要とする。適切にフォールドされたタンパク質は活性で薬剤として有用であり得る。より好ましいのは、公知の方法で融合タンパク質から得られる正しくフォールドされた天然のタンパク質であろう。融合タンパク質は、メチオニン位置で解裂させるシアノジェンブロマイド、またはＡsnとＧlyの間で解裂させるヒドロキシルアミン等の試薬を用い解裂させ得る。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、これらのアミノ酸をコードする核酸塩基対をＡＮＦまたはＡＮＦ変異体遺伝子の５'末端の直前に挿入し得る。
或いは、融合タンパク質のタンパク質分解的解裂を用いることができ、それは再近レビューされている（Ｃarter，Ｐ［１９９０］、Ｐrotein  Ｐurification：Ｆrom  Ｍolecular  Ｍechanisms  to  Ｌarge−Ｓcale  Ｐrocesses、Ｌadisch，ＭＲ．、Ｗilson，Ｒ．Ｃ．、Ｐainton，Ｃ．Ｃ．、およびＢuilder，Ｓ．Ｅ．編、Ａmerican  Ｃhemical  Ｓociety  Ｓymposium  Ｓeries  Ｎo．４２７、Ｃh１３、１８１〜１９３）。
Ｘa因子、スロンビン、スブチリシン、およびその変異体等のプロテアーゼをうまく用いて融合タンパク質を解裂し得る。典型的には使用するプロテアーゼにより解裂を受けることができるペプチドリンカーを「他の」タンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）およびＡＮＦまたはＡＮＦ変異体等の問題のタンパク質の間に挿入する。組換えＤＮＡ法を用いてリンカーをコードする核酸塩基対を他のタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントの間に挿入する。正しいリンカーを有する部分的に精製された融合タンパク質のタンパク質分解的解裂を、天然の融合タンパク質または還元若しくは変性した融合タンパク質について行う。
タンパク質は融合タンパク質として発現された場合適切にフォールドされているかもしれないし、されていないかもしれない。また解裂部位を有する特異的なペプチドリンカーはプロテアーゼに利用されるかもしれないし、されないかもしれない。これ等の要因が、融合タンパク質を変性し、再生（refold）しなければならないかどうか、および、もしそうなら、これらの工程を解裂の前に行うか、後に行うかを決定する。
変性および再生が必要な場合、典型的には、タンパク質をグアニジンＨＣl等のカオトロープで処理し、次に、例えば還元および酸化ジチオスライトールまたはグルタチオンを適当な割合で、適当なpＨでおよび温度で含むレドックス緩衝液で処理して、問題のタンパク質をその天然の構造に再生する。
４．ミュータントＤＮＡ製造
上に議論したように、親のＡＮＦ分子に比べて生じたタンパク質のアミノ酸配列における付加、削除、または変化をコードするミュータントＡＮＦまたはＡＮＦ変異体ＤＮＡを製造するのに現在用い得る様々な技術も利用可能である。
説明のために、ＡＮＦをコードする発現ベクターが手もとにある場合、部位指定突然変異（Ｋunkel等、Ｍethods  Ｅnzymol．２０４：１２５〜１３９［１９９１］；Ｃarter，Ｐ．等、Ｎucl．Ａcids  Ｒes．１３：４３３１［１９８６］；Ｚoller，Ｍ．Ｊ．等、Ｎucl．Ａcids  Ｒes．１０：６４８７［１９８２］）、カセット突然変異（Ｗells，Ｊ．Ａ．等、Ｇene  ３４：３１５［１９８５］）、制限選択突然変異（Ｗells，Ｊ．Ａ．等、Ｐhilos．Ｔrans．Ｒ．Ｓoc．Ｌondon  Ｓer  Ａ３１７，４１５［１９８６］）または他の公知の技術をＡＮＦ  ＤＮＡについて行ってよい。ミュータントＤＮＡを、上述の発現ベクターに挿入することより親のＤＮＡの代りに用いることができる。ミュータントＤＮＡを有する発現ベクターを含む宿主細菌の増殖はミュータントＡＮＦの製造を可能にし、それは本明細書に記載したように単離できる。
具体的には、本発明の場合、ＡＮＦの３位置でアルギニンの代りにアスパラギン酸を用いたＡＮＦの２つのミュータントは野性型ＡＮＦよりＥ．coli中で劇的に高いレベルで発現された。更に、変異Ｒ１１ＳおよびＲ１４ＳによりＡＮＦの塩基性を更に減少させたこれらの変異体の一つは最高のレベルの発現を示した。
b．精製およびキャラタリゼーション
ＡＮＦまたはＡＮＦ変異体の精製およびキャラタリゼーションはいずれかの標準的技術によって行い得る。本発明の場合、組換変異体ＡＮＦ（変異Ｒ３Ｄ／Ｇ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６Ｒを含む）を、バッチ逆相クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびＣ１８逆相ＨＰＬＣにより、１０Ｌファーメンター中で増殖したＥ．coli培養のブロスから精製した。発酵ブロス１Ｌ当り精製ＡＮＰミュータント約６mgをこの方法を用いて単離した。精製した組換えＡＮＦの同一性をマススペクトル分析（３０２６＋／−０．４amu、測定値；３０２６amu、計算値）およびアミノ酸分析により確認した。精製したＡＮＦは逆相ＨＰＬＣに基づいて＞９５％均一であるようであった。変異体のアミノ酸分析は、配列から計算したそれの実験誤差の範囲内であった。
Ｃ．発見と好ましい態様
ヒトのＡＮＦレセプターについての競合スクリーニング（hＮＰＲ−Ａ対hＮＰＲ−Ｃ）においてＡＮＦ変異体をスクリーニングする途中で、hＮＰＲ−Ａ特異性を与える多くのユニークなアミノ酸置換体を同定した。幾分驚いたことに、この方法で同定した、ヒトＮＰＲ−Ａ結合を豊富にする変異体は、ラットのＮＰＲ−Ａを結合しなかった。変異体についてのこの種特異性は、ラットおよびヒトの「Ａ」レセプター間の知られた配列の相異と一致し、改良された薬理学的性質を有するＡＮＦ変異体についてスクリーニングする場合に宿主以外のレセプターを用いる危険を指摘する。
本発明の好ましい化合物はヒトのナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（hＮＰＲ−Ａ）の合成ホルモンアゴニストである。このレセプターは、腎臓、平滑筋、副腎および他の組織に見出され（Ｎapier  Ｍ．Ａ．等、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ  ８１：５９４６〜５９５０（１９８４））、細胞内グアニルシクラーゼドメインを含む。hＮＰＲ−Ａの作用はＧＴＰの加水分解により媒介され、第２のメッセンジャーcＧＭＰを作る。従って本発明の好ましい化合物はhＮＰＲ−Ａを刺激して、少なくとも野性型のＡＮＦと同じ程度のcＧＭＰを作る。
しかしながら本発明の好ましい化合物は、野性型のＡＮＦと同じ程度にヒトのナトリウム排泄増加性ペプチドクリアランスレセプターＣ（hＮＰＲ−Ｃ）に結合しない。それらは野性型ＡＮＦの親和性の５０％未満、より好ましくは１０％未満でhＮＰＲ−Ｃに結合する。これは、hＡＮＦ（１〜２８）において、残基位置９でＴ、ＲおよびＥに、残基位置１１でＳ、ＤおよびＰに、および／または残基位置１６でＲ（または他の正に荷電した残基）および時にはＹに置換することにより好ましくは達成される。
hＡＮＦおよび本発明の化合物のhＮＰＲ−Ｃへの結合を測定する分析システムについては、Ｓchank，Ｄ．Ｂ．等、Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．１２７：４３３〜４４２（１９８５）；Ｓcarborough，Ｒ．Ｍ．、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６１：１２９６０〜１２９６４およびＷＯ９０／０１９４０を参照。
本発明の好ましい化合物は、ＮＥＰすなわち中性エンドペプチダーゼ２４．１１（ＥＣ３．４．２４．１１）による加水分解に抵抗性でもある。これはＣys7−Ｐhe8アミド結合をアミドイソステレで置換することにより該結合を安定化することにより好ましくは達成される。或いは、または付加的に、アミノ末端に「ウロジラチン」ＴＡＰＲ配列などの付加的な残基を付加することにより、またはhＡＮＦ（１〜２８）またはその変異体に第２の架橋部位を導入することによりエンドペプチダーゼ抵抗性が改良され得る。後者、すなわち第２架橋部位の付加の例は、位置１８および２８でホモＣysで置換し、それらを酸化して第２のジサルファイドを形成することにより達成され得る。
上述の見地から、最も好ましいhＡＮＦ変異体には次のものが含まれる。
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Ｄ．生物学的活性
細胞のhＮＰＲ−Ａグアニルサイクラーゼ活性を刺激し、hＮＰＲ−Ｃを発現する培養された細胞により媒介されるホルモンクリアランスをブロックする、血管作動性のホルモンhＡＮＦ（１〜２８）のレセプター特異的な変異体が単離された。図４Ａおよび４Ｂは、hＮＰＲ−Ａのみを発現する細胞の培養における、またはhＮＰＲ−ＡおよびhＮＰＲ−Ｃの両方を発現する細胞の共培養における、レセプター特異的ＡＮＦ変異体（hＡＮＦ（１〜２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ）の不活性化に対する抵抗性を示す。hＮＰＲ−Ａを発現する２９３細胞中のcＧＭＰ産生の測定は、野性型ＡＮＦがグアニルサイクラーゼ活性を刺激することを示す。hＮＰＲ−Ｃを高度に発現する（〜１０6「Ｃ」レセプター／細胞）２３９細胞の１０倍過剰を加えた場合、野性型ＡＮＦの活性は非常に小さくなる（ＥＣ50は約２５倍大きい。図４Ａ参照）。しかしながらこの実験をレセプター特異的な変異体で繰返した場合、不活性化に対する完全な抵抗性が認められる（図４Ｂ）。図４Ａおよび４Ｂの比較は、レセプター特異的な変異体はhＮＰＲ−ＡからのcＧＭＰ生産の刺激において野性型のＡＮＰに等しい強さであることも示す。これらの発見に基づいて、および文献はhＮＰＲ−Ｃで媒介される除去はインビボのＡＮＦ除去の７０〜８０％を説明すると報告していることに基づいて、本発明の変異体は優れた薬学的な利用性を有すると信じられる。
多数の変異体の分析から、最も大きいレセプター特異性を生みだす単独の天然に存在するアミノ酸の置換はＧ１６Ｒであった。この置換はＮＰＲ−Ａ結合には無視できる影響しか有さないがＮＰＲ−Ｃ親和性を約１５０倍減少させる。図５はＧ１６Ｒ置換を有する典型的な変異体についての結合特異性を示す。具体的には変異体hＡＮＦ（１〜２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒは、結合したＩ125標識した野性型ＡＮＦをhＮＰＲ−Ａから競合的に置換えたが、クリアランスレセプターhＮＰＲ−Ｃに対して測定可能な親和性を有しなかった。他のレセプター特異的変異体を下の表１に示す。
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ヒトＮＥＰ（hＮＥＰ）によるＡＮＦ変異体の解裂の阻害を図６、７および８に示す。ヒトのエンドペプチダーゼ２４．１１は、シシル（sissile）なＣys7−Ｐhe8アミド結合を解裂することによりＡＮＦを不活性する。様々なＡＮＦ変異体の半減期の測定の分析条件を実施例２２に記載する。変異体の半減期は図６、７および８の凡例（図面の簡単な説明）に見出すことができる。
Ｅ．有用性および投与
本発明の化合物は、ナトリウム排泄増加活性、利尿活性および血管緊張低下活性を有し、アルドステロンおよびレニンの放出を阻害し得る。したがってこれらの化合物は水または電解質不均衡および高血圧、特に腎血管性高血圧に関連する様々な病理学的状態の治療において治療剤としての用途を有する。そのような状態は、例えばうっ血性心不全（ＣＨＦ）、ネフローゼ症候群および肝硬変、肺の病気、および効果的でない腎潅流または減少した糸球体濾過率による腎不全を含む。
本発明はまた、上述の治療的利益を与えるのに役立つ、非毒性の付加塩、アミドおよびエステルを含む本発明の化合物の有効量を含む組成物をも提供する。そのような組成物は生理学的に許容できる液体、ゲルまたは固体の希釈剤、アジュバンドおよび賦形剤と共に提供し得る。
該化合物および組成物は、他の治療剤と類似の方法でヒトに投与し得る。投与すべき用量は、年齢、体重、性、患者の状態、投与径路を含む通常の要因によるであろう。一般に治療的な効果に要する用量は、患者の体重１kg当り、約０．０１〜１０００μg、より通常には０．１〜２５μgの範囲であろう。或いは、この範囲の用量を、所望の治療的利益が得られるまで長期間にわたって定常的な注入により投与し得る。
典型的にはそのような組成物を注入可能な液体の溶液または懸濁液として調製する。組成物は乳化させてもよい。活性成分は、生理学的に許容でき、活性成分と適合性のある希釈剤または賦形剤としばしば混合する。適当な希釈剤または賦形剤は例えば食塩水、デキストロース、グリセロール等、またはそれらの組み合わせである。更に、所望なら、組成物は湿潤剤または乳化剤、安定剤またはpＨ緩衝剤等の補助剤を少量含んでもよい。上述のものについてのより詳細な記述については、Ｒemington's  Ｐharmaceutical  Ｓcience、Ｍack  Ｐublishing  Ｃo．、イーストン、ペンシルベニア（１９７０）等の標準的な薬学のテキストを参照。
本発明の組成物は、皮下または静脈の注射により非経口的に常法により投与する。他の投与様式に適する付加的な製剤は、座剤、鼻腔内のエアロゾル、およびある場合には経口製剤を含む。座剤の場合、伝統的なバインダーおよび賦形剤は、例えばポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドを含み、そのような座剤は活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％含む混合物から形成する。経口製剤は、例えば薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤を含む。これ等の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、除放性製剤、または粉末の形をとり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含む。
該ペプチド化合物を、中性または塩型として組成物に製剤化してよい。薬学的に受容し得る非毒性の塩は、塩酸またはリン酸などの無機酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成する酸付加塩（遊離のアミノ基と形成する）を含む。遊離のカルボキシル基と形成する塩は、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンミニウム、カルシウム、水酸化鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導し得る。ナトリウム排泄増加活性、利尿活性、または血管緊張低下活性を示す本発明の化合物の外に、本発明の化合物はそのような有用な化合物の合成中間体としても用いることができる。或いは、適当な選択によって、その活性レベルが低下し、または完全になくなった本発明の化合物は、本発明の範囲外の化合物を含む、他の利尿性、ナトリウム排泄性、また血管緊張低下活性化合物を調節するのに役立ち、それは例えば別の（etenate）レセプターに結合し、レセプターのターンオーバーを刺激し、またはレセプター活性の崩壊酵素のための別の基質を提供し、それによってこれらの酵素またはレセプターを阻害することによる。このような方法で用いる場合、そのような化合物は他の活性な化合物との混合物として運搬することができ、または、例えばそれ自体の担体で別々に運搬し得る。
実施例
以下の実施例において、中間体または最終生成物について言う場合、アミノ酸は標準的な３文字アミノ酸コードにより記載する。ここに記載する直鎖のペプチドおよび中間体はペプチド合成の固相法により製造する（Ｒ．Ｍerrifield、Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc  １９６４、８５、２１４９およびＭ．Ｂodansky「Ｐrinciples  of  Ｐeptide  Ｓynthesis」、Ｓpringer−Ｖerlag、１９８４）。使用した略号は次のようである：tert−ブチルオキシカルボニル（Ｂoc）；p−トルエンスルホニル（Ｔos）；４−メチルベンジル（ＭeＢzl）；ベンジル（Ｂzl）；２−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂr−Ｚ）；シクロヘキシルエステル（Ｏchx）；４−メトキシルベンジル（ＭeＯＢzl）；２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃl−Ｚ）；フッ化水素（ＨＦ）；ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）；メチレンクロライド（ＤＣＭ）；トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；およびジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）。
ペプチドは、アプライド・バイオシステムズ・４３０Ａ・オートメイティッド・ペプチド・シンセサイザーを用いて組立てた。保護アミノ酸は様々な販売者から得た。側鎖の保護は、Ａsp（Ｏchex）、Ｃys（ＭeＯＢzl）、Ａrg（Ｔos）、Ｓer（Ｂzl）、Ｔhr（Ｂzl）、Ｌys（Ｃl−Ｚ）、およびＴyr（Ｂr−Ｚ）であった。
実施例１
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ペプチドは０．７g（１．０mmol）のＢoc−Ｔyr（Ｂr−Ｚ）ＰＡＭ樹脂（Ａpplied  Ｂiosystems）上で組立てた。結合プロトコールはＡpplied  Ｂiosystemsにより推奨されたものであり、ＤＭＡを溶媒としてＤＭＦの代りに用いた。鎖の組立て後、Ｎ−末端のＢoc基をＴＦＡを用いて除去した。そのペプチド−樹脂をジクロロメタン、次にメタノールで洗浄し、減圧下に乾燥した。次にペプチドを脱保護し、ペプチド−樹脂をＨＦ（９２．５％）、アニソール（５％）およびエチルメチルサルファイド（２．５％）混合物２０ml中で１時間０度で撹拌することにより樹脂から取り除いた。ＨＦを次に真空下に除去し、樹脂をエーテルで洗浄した。樹脂を水中の１０％酢酸、アセトニトリル、水で洗浄し、濾液を回収し、凍結乾燥した。粗製の直鎖ペプチド（３００mg）を１０Ｌの水に溶解し、pＨを濃水酸化アンモニウムで７．４〜７．６に調節した。０．００３ＭＫ3［Ｆe（ＣＮ）6］（１gを蒸留水１００mＬに溶解）を激しく撹拌しながら滴下する（約１滴／１０秒）ことにより環化が始まる。その鉄溶液の溶液の添加は明るい黄色が持続したら中止し、反応混合物を更に４〜５時間撹拌する。環化された溶液のpＨをＨＯＡcで４．５に調節する。
Ｂio  Ｒex７０カチオン交換樹脂（２００〜４００メッシュ、Ｎa+形）を１ＮＨＣlおよび次に蒸留水で洗浄する。この樹脂１１０gを環化したペプチド溶液に加え、一晩撹拌する。その樹脂を濾過し、蒸留水で十分洗浄し、カラムにスラリー充填する。そのペプチドを７０％ＨＯＡc水溶液を用いて溶出し、ＴＬＣにより同定し（ニンヒドリン視覚化）、凍結乾燥した。そのペプチドを水中の０．１％ＴＦＡ中に溶解し、２．５cm×５０cmのＣ−１８逆相カラム（１５ミクロン、３００Ａ）に加え、アセトニトリルを増加させるシャローグラジエントにより溶出する。溶出条件は、０．５％／分の１０％〜５０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）よりなる。水相は水中の０．１％ＴＦＡであった。画分を含む生成物を凍結乾燥し、純粋な標記ペプチドを得た。エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３５８６．２、測定値３５８６．３。ＨＰＬＣtR＝２９分。
実施例１の方法に従い実施例２〜９の化合物を同様に製造した。
実施例２
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１６２、測定値３１６１．３。ＨＰＬＣtR＝３１分。
実施例３
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１３５．３、測定値３１３５．６。ＨＰＬＣtR＝３１分。
実施例４
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３２１８．７、測定値３２１９．４。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例５
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１０４．８、測定値３１０４．６。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例６
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３０５４．４、測定値３０５４．０。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例７
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１９０．８、測定値３１９１．９。ＨＰＬＣtR＝３１分。
実施例８
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３０８２．４、測定値３０８２．３。ＨＰＬＣtR＝２８分。
実施例９
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次の標準的なマニュアルのペプチド合成プロトコールを、この多ジサルファイド化変異体（「タイ−ダウン」変異体）の構築に用いた。
(1)ジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄
(2)５０：５０ＴＦＡ／ＤＣＭで１分処理
(3)５０：５０ＴＦＡ／ＤＣＭで２０分処理
(4)ＤＣＭで３回洗浄
(5)５％（体積／体積）ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭで１分処理
(6)５％（体積／体積）ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭで５分処理
(7)ＤＣＭで４回洗浄
(8)Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）で１回洗浄
(9)５０：５０ＤＣＭ／ＮＭＰ中の５当量のＢoc−保護アミノ酸、５当量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）および５当量のヒドロキシベンゾチアゾール（ＨＯＢＴ）を添加
(10)ＮＭＰで１回洗浄
(11)ＤＣＭで３回洗浄
(12)Ｋaiser等、Ａnal．Ｂiochem．１９７０、３４、５９５によるニンヒドリン反応による試験
カップリング反応が不完全なら工程５〜１２を繰返す。
ペプチドはマニュアル的に合成し、１．５g（０．９２mmol）のＢoc−ホモシステイン（ＭeＢzl）メリフィールド樹脂で開始した。ペプチドは標準的なt−Ｂoc化学プロトコールを用いて合成した。システイン7およびシステイン23側鎖をアセトアミドメチル（Ａcm）チオエーテルとして保護し、ホモシステイン18およびホモシステイン28側鎖をメチルベンジル（ＭeＢzl）チオエーテルとして保護した。Ａsp13の側鎖カルボキシレートはベンジルエステルとして保護し、Ａsp3のカルボキシレート側鎖はシクロヘキシルエステルとして保護した。ペプチド鎖組立後、Ｎ−末端Ｂoc基をＴＦＡを用いて除去した。そのペプチド樹脂をジクロロメタン、次いでエタノールを用いて洗浄し、減圧下に乾燥した。次にそのペプチドを脱保護し、４０mＬのＨＦ（９２．５％）、アニソール（５％）およびエチルメチルサルファイド（２．５％）混合物中のペプチド樹脂を、１時間氷浴中で撹拌することにより樹脂から除去した。ＨＦを次に真空下に除去し、樹脂をエーテルで洗浄した。ペプチドを、水中の１０％酢酸、次いで水で洗浄することにより樹脂から抽出した。濾液を集め、凍結乾燥した。粗製の直鎖ペプチド（４００mg）を、水酸化アンモニウムでpＨ８．０に調節した８００mlの水に溶解した。その溶液を７２時間室温で撹拌し、その後溶液をＴＦＡで酸性化し、濾過し、１．０cm×５０cm  Ｃ−１８逆相カラム（１５ミクロン、３００Ａ）に充填した。ペプチドを０．５％／分でアセトニトリルを増加する１０％〜５０％アセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）のシャロウグラジエントで溶離した。水相は水中の０．１％のＴＦＡであった。中間生成物（ホモシス18、ホモシス28ジサルファイド）画分を凍結乾燥した。エレクトロンスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１１０．３、測定値＝３１１０．０。ＨＰＬＣtR＝３８分。その中間生成物（ホモシス18、ホモシス28ジサルファイド、２０mg）を４０mＬの酢酸：水（８０：２０）に溶解した。ヨード溶液を氷酢酸中で調製し、褐色がかった黄色が持続するまでペプチドを含む溶液に滴下した。その混合物を一晩（２０時間）撹拌した。少量の亜鉛末を、溶液が無色になるまで次の日その混合物に加えた。溶液を濾過し、水で希釈し、凍結乾燥した。その凍結乾燥した粗生成物を水中の５％アセトニトリル５０mlに溶解し、濾過し、ＨＰＬＣ精製のため１×５０cm  Ｖydac（１８カラム−１５〜２０ミクロン、３００Ａ）に充填した。
そのペプチドを０．２５％／分でアセトニトリルを増加する１７〜３２％アセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）のシャローグラジエントで溶出した。生成物を含む画分を凍結乾燥した。エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝２９６６．２、測定値＝２９６６．６９。
実施例１０
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Ｂoc−（Ｂr−cbz）Ｔyr−ＰＡＭ樹脂（２５g、０．５１mmol置換／g）をＢachem  Ｉnc．、トランス、カリホルニア）から購入し、残りのＢoc−アミノ酸誘導体はＳtar  Ｂiochemicals、トランス、カリホルニアから購入した。アルギニン、システインおよびセリン誘導体の側鎖保護は、それぞれtosyl（Ｔos）、p−メチルベンジル（pＭＢ）およびベンジル（Ｂz）として選択した。
合成プロトコール
洗浄容積：１０mＬ／g樹脂
予備洗浄：ＣＨ2Ｃl2、３回、各回１分混合
脱保護  ：ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃl2（１：１）、１回、１分混合
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃl2（１：１）、１回、３０分混合
洗浄    ：ＣＨ2Ｃl2、４回、各回１分混合
中和    ：５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃl2、３回、各回１分混合
洗浄    ：ＣＨ2Ｃl2、４回、各回１分混合
Ｋaiser試験を２，３のビーズについて行い、基準のビーズの色をカップリング後の試験の色と比較する。
カップリングプロトコール：
４モル過剰量のアミノ酸誘導体を、チロシンＰＡＭ樹脂の各モルについてすべてのカップリングで用いた。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を、アラニンを除くすべての残基についてアミノ酸と類似のモル過剰でカップリング試薬として用いた。アラニンは４モル過剰のベンゾトリアゾール−１−イロキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびＨＯＢＴ、および６モル過剰のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用い１時間カップリングした。ＤＩＰＣおよびＨＯＢＴカップリングは一般に２時間行った。カップリングの完了はネガティブカイザー試験により推測した。最後の５つの残基（残基番号１〜５）はＢＯＰ／ＨＯＢＴを用いてダブルカップリングしなければならなかったが、残りは最初の試みにおいてカップリングした。第２のカップリングの場合、残基１、２、３および５については半量のみを用い、第４残基については同量のアミノ酸および試薬を用いた。
合成の終りに樹脂を脱保護し、ＣＨ2Ｃl2、ＣＨ2Ｃl2／エタノール（１：１）で十分洗浄し、デシケーター中で乾燥した。樹脂ペプチドの最終重量は４５g（理論値５０．９g）であった。実施例１で用いたのと類似の方法を用いて次のペプチドの合成を完了した。
実施例１１
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３２２３．５、測定値３２２２．９。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例１２
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３２０７．５、測定値３２０７．０。ＨＰＬＣtR＝３３分。
実施例１３
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３５５９．７、測定値３３５６１．０。ＨＰＬＣtR＝２８分。
実施例１４
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１４１．８、測定値３１４２．２。ＨＰＬＣtR＝３５分。
実施例１５
0003989535.tif 000026
エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝２４３３．２、測定値２４３４．６。ＨＰＬＣtR＝３８分。
実施例１６
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝２４０３．２、測定値２４０４．３。ＨＰＬＣtR＝３６分。
実施例１７
0003989535.tif 000028
エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１５６．５、測定値３３１５．０．０。ＨＰＬＣtR＝２９分。
実施例１８
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１４８．５、測定値３１４９．６。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例１９
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１３２．５、測定値３１３３．７。ＨＰＬＣtR＝３３分。
実施例２０
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エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１２０．６、測定値３１２１．８。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例２１
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Ｃ（ψＣＨ2ＮＨ）Ｆは、以下のアミノ酸：
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に由来するペプチドセグメントを表す。
標記化合物の合成のために、残基１２〜２７を有する樹脂ペプチド１．５３gを用いた。次の４つの残基（Ｐhe−８、Ｔhr−９、Ｇly−１０、Ｓer−１１）を、上記の標準的なプロトコールを用いてマニュアル的にカップリングさせ（約４当量の試薬、ＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＮＭＭカップリング；必要な場合３当量の試薬およびＤＩＰＣとカップリングを繰返す）、Ｎ−末端t−Ｂoc保護基をＴＦＡ脱ブロック方法を用いて除去した。Ｎ−Ｂoc、Ｓ−４−メチルベンジルシステイナル（以下に記載のように製造した２．８６gの粗製の物質）を、樹脂ペプチド（標準的な脱ブロック、中和および洗浄後）およびＡcＯＨ／ＤＭＦ（１％体積／体積）中のＮaＣＮＢＨ3  １．０gに室温で１８時間加えた。樹脂をＡcＯＨ／ＤＭＦ（１％体積／体積）で２回、ＤＭＡで１回、ＣＨ2Ｃl2で２回洗浄した。Ｎ末端t−Ｂoc保護基を除去し、合成を標準的なプロトコールを用いて続けた。
Ｎ−Ｂoc，Ｓ−４−メチルベンジルシステイナル  Ｎ−Ｂoc−Ｓ−（４−メチルベンジル）Ｌ−システイン（４９．６４g、１５３mmol）、ＢＯＰ（６７g、１５１mmol）、ＨＯＢＴ（２２g、１６３mmol）および４００mＬのＣＨ2Ｃl2を磁気撹拌棒を備えた１Ｌの丸底フラスコ中で混合し、氷浴で冷却した。Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１８mＬ、１６．５６g、１６４mmol）を撹拌した溶液に５分にわたって滴加した。添加完了後、反応混合物を冷却浴から取り除き、室温で１５分間撹拌した。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１９g、１９５ミリモル）を固体として撹拌した溶液に加えた後、３５mＬ（２５．９７g、２００mmol）のジイソプロピルエチルアミンを滴下した。生じた溶液を一晩撹拌し、ＣＨ2Ｃl2、および１０％（重量／体積）Ｋ2ＣＯ3水溶液、次に１０％（重量／体積）クエン酸水溶液、次にブライン間に分配した。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、反応混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。粗生成物を、２：１ヘキサン／酢酸エチルを溶出液として用いる、１kgのシリカゲル（Ｍerck、２３０〜４００メッシュ）を用いてクロマトグラフィーにかけ、４３．９５g（１１９mmol、７９％）のＮ−Ｂoc−Ｓ−（４−メチルベンジル）Ｌ−システインＮ，Ｏ−メトキシメチルアミドを粘稠で透明な油として得た。
マグネチック撹拌棒およびＮ2入口を備え、ドライアイス／アセトン浴中で−７８℃に冷却した２５０mＬのオーブンで乾燥した丸底フラスコに、６５mＬの無水Ｅt2Ｏ中のＮ−Ｂoc−Ｓ−（４−メチルベンジル）Ｌ−システインＮ，Ｏ−メトキシメチルアミド１１．５４g（３２．６mmol）の溶液に、ＴＨＦ（Ａldrich）中の１．０ＭＬiＡlＨ4溶液３５mＬ（３５mmol）を、シリンジにより２０分かけて加えた（注意：ガスが添加中に発生する）。１５分間、−７８℃で撹拌後、反応混合物を冷却用浴から取り除き、反応混合物を０℃に暖め（約３０〜６０分要する）、氷浴を用いて更に３０〜６０分この温度に保つ。冷却用浴中に反応フラスコを保ちながら１８０mＬの脱イオン水中の９gのＫＳＯ4の溶液を撹拌しながら約２０分かけてゆっくり加える（注意：激しいガス発生および発熱。反応温度を約１０℃に保つため必要な場合ドライアイス／アセトン浴を用いる）。素早く作業して反応フラスコをドライアイス冷却用浴から取り除き、反応スラリーを室温まで暖める。更なるＥt2Ｏを加え、混合物を水で希釈する。生じた懸濁液をセライトのプラグを通して真空濾過する。有機層を分離し、水相をエーテルで抽出し（３×１００mＬ）、合わせた有機層を２×５０mＬの冷０．３ＮＨＣl、１×５０mＬのＮaＨＣＯ3飽和水溶液、および５０mＬのブラインで洗浄し、無水ＭgＳＯ4を用いて乾燥し、濾過し、室温の水浴でロータリーエバポレータを用いて濃縮し、８．５７gの粗アルデヒドを得た。ＮＭＲを用いてそのアルデヒドの純度を評価し、アルデヒドの１／３は更に精製することなく還元的アルキル化に直接用いた（Ｆeherenz等、Ｓynthesis、６７６〜６７８［１９８３］におけるのと本質的に同様に）。エレクトロスプレーイオン化：計算値Ｍ＋Ｈ＝３１１９．５、測定値３１２１．７。ＨＰＬＣtR＝３０分。
実施例２２
ヒトＮＥＰ（hＮＥＰ）によるＡＮＦ変異体の解裂の阻害
ヒトのエンドペプチダーゼ２４．１１はシシレな（sissile）Ｃys7−Ｐhe8アミド結合を解裂することによりＡＮＦを不活性化する。様々なＡＮＦ変異体の半減期は次の方法により測定した。
ＡＮＦ溶液：正確に測り取った量のＡＮＦまたはその変異体をＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し（５mlの１Ｍ  ＨＥＰＥＳと０．１mlのＴween２０を脱イオン化水で１００mlに希釈）、０．５mg／ml溶液を作った。
hＮＥＰ／ＨＥＰＥＳ溶液：hＮＥＰ（米国特許第４，９６０，７００号を参照）の１mg／ml溶液７．５μlをＨＥＰＥＳ緩衝液（上記）９９２．５μlに溶解し、渦混合する。生じた混合物をシリル化エッペンドルフ管に貯え、ＡＮＦペプチド標準に対し定期的にチェックする。
分析条件：ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＡＮＦ溶液１５０μlを８２０μlのＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し、１秒間渦混合した。hＮＥＰ／ＨＥＰＥＳ溶液３０μlが加えられるように時間に注意し、溶液を１秒間渦混合し、ＨＰＬＣオートサンプラーにより一定体積のアリコートを定期的に取り出すことに分析する。２．５cm×５０cm  Ｃ−１８逆相カラム（１５ミクロン、３００Å）を用い、溶出はアセトニトリルを増加させるシャローグラジエントを用いて行った。溶出条件は０．５％分-1での１０％〜５０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）よりなる。水相は水中の０．１％ＴＦＡであった。ＡＮＰペプチドのピーク面積をこれらの定期的な間隔で記録し、半減期をこれらの値から決定する。
以下に記載する実施例２３〜２５の組換え法において、次の材料および方法を用いた。Ｎugel  Ｐ−ＲＰ逆相樹脂をＳeparation  Ｉndustriesから、Ｖydac  Ｃ１８およびＭono  ＳカラムをＰharmacia  ＬＫＢ  Ｂiotechnology，Ｉncから購入した。オリゴヌクレオチドはハイドロジェンホスホネート化学（Ｆroehler，Ｂ．Ｃ．等、Ｎucleic  Ａcids  Ｒes．１４：５３９９〜５４０７［１９８６］）を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。、Ｅ．coli株ＸＬＩ−Ｂlue  ＭＲＦ'をＳtratageneから購入した。制限酵素はＮew  Ｅngland  Ｂiolabsから得た。得たすべての他の試薬は商業的に入手し得る最高のグレートのものであった。
実施例２３
ＡＮＦ発現ベクターの構築
すべてのＤＮＡの操作は特記しない限り標準的な方法に従って行った（Ｓambrook等、上書）。ＡＮＦ遺伝子は、ＡＮＦの公表された配列をコードし、遺伝子の５'および３'末端にそれぞれＮsi  ＩおよびＡpa制限部位をコードするよう設計された合成オリゴヌクレオチドから組み立てた。３つのセンス鎖オリゴヌクレオチドおよび３つのオーバーラップアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを合成した。センス鎖の配列は、
0003989535.tif 000034
であった。
アンチセンス鎖の配列は、
0003989535.tif 000035
であった。
これらのオリゴヌクレオチドをホスホリル化し、ライゲートし、ライゲーション生成物を、リガーゼの熱不活性化後Ｎsi  ＩおよびＡpa  Ｉで消化した。消化物を次に８９mＭトリスーホウ酸塩、１mＭ  ＥＤＴＡ、pＨ７．９中で５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そのゲルをエチジウムブロマイドで染色し、約９５塩基対のバンドを切除し、そのＤＮＡを電気溶出した。そのオリゴヌクレオチドアンセブリーから得た断片をＮsi  ＩおよびＡpa  Ｉで消化したpＳ０１３２の大きいベクター断片にライゲートすることにより、ＡＮＦ発現ベクターpＢ１３２５を作った。ライゲーション後、Ｅ．coli  ＸＬ−１細胞をその混合物で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。ＤＮＡを多くのこれらのコロニーから次に単離し、ジデオキシ配列決定に付した（Ｓanger，Ｆ．、Ｎicklen  Ｓ．およびＡ．Ｒ．  Ｃoulsen、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ  ７４：５４６３〜５４６７［１９７７］）。正しいＡＮＰ配列をコードするプラスミド、pＢ１３２５を単離し、さらに配列：
0003989535.tif 000036
を有するオリゴヌクレオチドを用いて部位指定突然変異誘発（Ｋunkel）に付し、ＡＮＦ配列のＴyr２８についてのコドンの直後にアンバー停止コドンを導入した。生じたプラスミド、pＢ１５３７は、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンシャイン−ダルガーノ配列、およびstIIシグナル配列の発現調節下に野性型ヒトＡＮＦ遺伝子を含む。振とうフラスコ実験により、２３Ｇ３中のpＢ１５３７は少量のＡＮＦを培養ブロス中に分泌することがわかった。しかしながら同じ発現ベクターにおいていくつかのＡＮＦ変異体はずっと多量のタンパク質を発現することが見出された。
実施例２４
組換えＡＮＦ変異体の発現および精製
ＡＮＦ（１−２８）Ｒ３Ｄ、Ｇ９Ｔ、Ｒ１１Ｓ、Ｍ１２Ｌ、Ｒ１４Ｓ、Ｇ１６Ｒ  ３４Ｂ８pＢ１７６１Ｔ（ＤＮＡ構築については実施例２３を参照）の培養を３７℃で約２４時間、エアレートした１０リッター発酵槽で２mg／mlのカルベニシリンを含む低ホスフェート最小培地（Ｃarter  Ｐ．等、Ｂiotechnology  １０、１６３〜１６７、１９９２）中で行った。グルコースを加えて、グルコース過剰を維持し、または細胞密度に依存する嫌気生活を回避した。pＨはＮＨ4ＯＨを添加することによりpＨ７．４に維持した。収穫時の細胞密度は１００ＯＤ550であった。
ミューテーションＲ３Ｄ／Ｇ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６Ｒを有する組換えＡＮＦを次の如く精製した。６０００rpm（Ｓorvall  ＧＳ３ロータ中）で１５分遠心分離することにより上記細胞を１lの発酵培養物から除去し、ブロスを０．４５ミクロン膜を通す濾過によりさらに透明にした。そのブロスを０．１％ＴＣＡに加え、室温で３０分インキュベートし、９０００rpmで３０分遠心分離し（Ｓorvall  ＧＳ３ローター）、すべての沈澱可能な物質を除去した。上清液に１／１０体積のＮugel  Ｐ−ＲＰ（Ｓeparation  Ｉndustries）を加え、室温で１時間おだやかに混合した。次に逆相樹脂をガラスフィルタで分離し、０．１％ＴＦＡで入念にすすいだ。結合した物質を次に５０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡで溶出した。溶出液を濃縮して、アセトニトリルを除去し、５０mlの１０mＭ酢酸塩緩衝液pＨ４．６中に再懸濁した。この溶液をＭono  Ｓカラムに充填し、２０mＭ酢酸塩緩衝液pＨ４．６で十分すすぎ、２０mＭ酢酸塩緩衝液pＨ４．６中の０〜２００mＭ  ＮaＣlグラジエントで溶出した。ＡＮＰ活性を有すると分析された溶出した画分をプールし、凍結乾燥により濃縮し、５mlのdＨ2Ｏに再懸濁した。この試料を酸性化し（最約０．１％ＴＦＡ）、製造用のＶydac  Ｃ１８カラムにのせ、０〜３０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡグラジエントにより分画した。約１６％アセトニトリルで生じた大きい主なピークを集めた。質量分析、アミノ酸分析およびＮＭＲはこれが純度９５％以上の予期するミュータントＡＮＦであることを示した。この物質を貯蔵のため凍結乾燥した。
実施例２５
ＡＮＦ変異体
ＡＮＦ発現ベクター、pＢ１５３７は、このプラスミドの部位指定突然変異誘発に用いることができる一本鎖ＤＮＡの製造を可能にするf１複製起点を含む。
配列：
0003989535.tif 000037
を有するオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋunkel（Ｋunkel，Ｔ．Ａ．、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２［１９８５］）により記載された部位指定突然変異誘発により、ＡＮＦミューテーションＲ３ＤおよびＲ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６ＲをpＢ１５３７に別々に導入した。両方のオリゴヌクレオチドから生ずる変異を結合する変異体を作るために、Ｒ３Ｄ変異体からの〜９００bp  Ｂg１II−Ｓty１ＤＮＡ断片を、Ｇ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６Ｒ変異体の〜４０００bp  Ｂg１II−Ｓty１ＤＮＡ断片にライゲートした。ＡＮＦ変異体Ｒ３Ｄ／Ｇ９Ｔ／Ｒ１１Ｓ／Ｍ１２Ｌ／Ｒ１４Ｓ／Ｇ１６Ｒをコードする生じたプラスミドをpＢ１７６１Ｔと呼ぶ。
本明細書に記載したすべての文献は本明細書の一部を構成する。
配列表
（1）一般的情報：
（i）特許出願人：ジェネンテク，インコーポレイテッド
ローエ，デイビッド
カニンガム，ブライアン・シー
オール，デイビッド
マクダウエル，ロバート・エス
バーニア，ジョン
（ii）発明の名称：レセプター特異的な心房のナトリウム排泄増加性ペプチド
（iii）配列の数：47
（iv）連絡先：
（A）住所：ジェネンテク，インコーポレイテッド
（B）通り：サン・ブルーノ・ブールバード４６０番
（C）市：サウス・サン・フランシスコ
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）ZIP：94080
（v）コンピューター解読書式：
（A）媒体型：3.5インチ，1.44 Mbフロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC適合
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：WinPatin（ジェネンテク）
（vi）本出願のデータ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）優先権主張出願のデータ：
（A）出願番号：08/152994
（B）出願日：12-NOV-1993
（viii）弁理士/代理人情報：
（A）氏名：ウィンター，ダリル・ビー
（B）登録番号：32,637
（C）参照／整理番号：P0844P1
（ix）電話連絡先情報：
（A）電話番号：415/225-1249
（B）ファックス番号：415/952-9881
（C）テレックス番号：910/371-7168
（2）配列番号1の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：4アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号1：
0003989535.tif 000038
（2）配列番号2の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号2：
0003989535.tif 000039
（2）配列番号3の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号3：
0003989535.tif 000040
（2）配列番号4の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号4：
0003989535.tif 000041
（2）配列番号5の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号5：
0003989535.tif 000042
（2）配列番号6の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号6：
0003989535.tif 000043
（2）配列番号7の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号7：
0003989535.tif 000044
（2）配列番号8の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号8：
0003989535.tif 000045
（2）配列番号9の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号9：
0003989535.tif 000046
（2）配列番号10の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号10：
0003989535.tif 000047
（2）配列番号11の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号11：
0003989535.tif 000048
（2）配列番号12の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号12：
0003989535.tif 000049
（2）配列番号13の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号13：
0003989535.tif 000050
（2）配列番号14の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号14：
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（2）配列番号15の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号15：
0003989535.tif 000052
（2）配列番号16の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号16：
0003989535.tif 000053
（2）配列番号17の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号17：
0003989535.tif 000054
（2）配列番号18の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：29アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号18：
0003989535.tif 000055
（2）配列番号19の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号19：
0003989535.tif 000056
（2）配列番号20の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号20：
0003989535.tif 000057
（2）配列番号21の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号21：
0003989535.tif 000058
（2）配列番号22の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号22：
0003989535.tif 000059
（2）配列番号23の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号23：
0003989535.tif 000060
（2）配列番号24の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号24：
0003989535.tif 000061
（2）配列番号25の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号25：
0003989535.tif 000062
（2）配列番号26の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号26：
0003989535.tif 000063
（2）配列番号27の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：29アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号27：
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（2）配列番号28の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：29アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号28：
0003989535.tif 000065
（2）配列番号29の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号29：
0003989535.tif 000066
（2）配列番号30の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号30：
0003989535.tif 000067
（2）配列番号31の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号31：
0003989535.tif 000068
（2）配列番号32の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号32：
0003989535.tif 000069
（2）配列番号33の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号33：
0003989535.tif 000070
（2）配列番号34の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号34：
0003989535.tif 000071
（2）配列番号35の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号35：
0003989535.tif 000072
（2）配列番号36の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号36：
0003989535.tif 000073
（2）配列番号37の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号37：
0003989535.tif 000074
（2）配列番号38の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：36塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号38：
0003989535.tif 000075
（2）配列番号39の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：35塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号39：
0003989535.tif 000076
（2）配列番号40の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号40：
0003989535.tif 000077
（2）配列番号41の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号41：
0003989535.tif 000078
（2）配列番号42の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：35塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号42：
0003989535.tif 000079
（2）配列番号43の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：36塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号43：
0003989535.tif 000080
（2）配列番号44の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号44：
0003989535.tif 000081
（2）配列番号45の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号45：
0003989535.tif 000082
（2）配列番号46の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：50塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号46：
0003989535.tif 000083
（2）配列番号47の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号47：
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【図１】
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【図２】
0003989535.tif 000089
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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