(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル内の少数の被分析物粒子の存在を検出するシステムであって、前記サンプルが一又は二以上の個別の画素領域に分割され、前記画素領域の各々において放出される光が前期画素領域の各々における被分析物の量に関係しており、
前記画素領域の各々内に含まれる前記被分析物粒子の数が、前記被分析物粒子によって放出される光学的応答における統計変動が平均的な１個の被分析物粒子の光学的応答より小さくなるための最大検出しきい値よりも小さくなるように、大きさが定められた一又は二以上の画素領域と、
周囲バックグラウンドノイズしきい値に関連して、前記画素領域の各々からの放出信号であってそこに含まれ又は分布する被分析物粒子の光学的応答に比例するものを測定する測定手段と、
前記測定手段による測定値を受け、該測定値に基づいて、前記画素領域の各々内の被分析物粒子の数を計数し又は個々の被分析物粒子が分布する複数の画素領域をクラスタ化して、前記サンプル内の前記被分析物粒子の数を決定するデータ処理手段と、
を備えるシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、
前記データ処理手段は、１個の被分析物粒子からの光学的応答の強度に対応する値で前記測定値の各々を除算する手段を含み、
各除算の結果にもっとも近い整数が、前記画素領域の１つ内の前記被分析物粒子の数に対応しているシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムであって、
各画素領域を照明する照明手段を更に含み、
前記測定手段は、前記照明手段によって提供される光から前記光学的応答を分離する波長分離手段を含むシステム。
【請求項４】
請求項３に記載のシステムであって、
前記照明手段は、第１のスペクトル範囲に主として限定された光波長の集光された照明ビームを提供するレーザビーム手段を含むシステム。
【請求項５】
請求項４に記載のシステムであって、
前記波長分離手段は、前記第１のスペクトル範囲内に含まれる光を受け入れないように波長が合わされた光学フィルタを含むシステム。
【請求項６】
請求項５に記載のシステムであって、
前記画素領域の各々は、実質的に等しい面積で、前記サンプル内に隣接して配置され、
前記照明手段は、前記画素領域の各々を前記集光された照明ビームで所定時間間隔だけ順に照明するラスタ走査手段を更に含むシステム。
【請求項７】
請求項６に記載のシステムであって、
前記測定手段は、前記光学的応答の各々内の光子による照明への応答の検出信号を生成する光検出器を含むシステム。
【請求項８】
請求項７に記載のシステムであって、
前記測定手段は、前記検出信号によってアドレッシングされ、前記画素領域の各々から放出される光子の数を計数して画素カウントを得る検出器回路を含み、前記測定手段は前記画素カウントを記憶する電子メモリを更に含むシステム。
【請求項９】
サンプル内の被分析物粒子の存在をディジタル的に検出するシステムであって、所定の方法で照明されるときに光学的応答を放出するように各被分析物粒子が配置され、前記被分析物粒子の数が、前記光学的応答における統計変動が平均的な１個の被分析物粒子の光学的応答より小さくなるための最大検出しきい値よりも小さくされており、
前記被分析物粒子が前記光学的応答を放出するように前記サンプルを照明する照明手段と、
前記光学的応答を含む放出信号を収集する収集手段と、
前記収集された放出信号を測定し、前記サンプル内の被分析物粒子の数を計数するために、前記測定された放出信号を検出しきい値と比較する測定手段と、
を備えるシステム。
【請求項１０】
請求項９に記載のシステムであって、
前記測定手段は、前記光学的応答の１つの強度に対応する値で、前記測定された放出信号を除算する手段を含み、
前記除算された測定値にもっとも近い整数が、前記サンプル内の被分析物粒子の数に対応するシステム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のシステムであって、
前記照明手段は、前記光学的応答に関係する光学的周波数から識別できる周波数の照明光を生成し、
前記収集手段は、前記収集された光学的応答を前記照明光から波長分離する手段を含むシステム。
【請求項１２】
請求項１１に記載のシステムであって、
前記照明手段は、第１のスペクトル範囲に限定された波長の集光された照明ビームを提供するレーザビーム手段を含むシステム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、
前記波長分離手段は、前記第１のスペクトル範囲内に含まれる光を受け入れないように波長が合わされた光学フィルタを含むシステム。
【請求項１４】
サンプル内の少数の被分析物粒子の存在を検出する方法であって、前記サンプルが一又は二以上の個別の画素領域に分割され、前記画素領域の各々内において放出される光が前記画素領域の各々内における被分析物の量に関係しており、
前記画素領域の各々内に含まれる前記被分析物粒子の数が、前記被分析物粒子によって放出される光学的応答における統計変動が平均的な１個の被分析物粒子の光学的応答より小さくなるための最大検出しきい値よりも小さくなるように、前記画素領域の各々の大きさを定める工程と、
周囲バックグラウンドノイズしきい値に関連して、前記画素領域の各々からの放出信号であってそこに含まれ又は分布する被分析物粒子の光学的応答に比例するものを測定する工程と、
該測定値に基づいて、前記画素領域の各々内の被分析物粒子の数を計数し又は個々の被分析物粒子が分布する複数の画素領域をクラスタ化して、前記サンプル内の前記被分析物粒子の数を決定する工程と、
を備える方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記光学的応答の１つの強度に対応する値で前記測定値の各々を除算する工程を更に含み、
前記除算された測定値の各々に最も近い整数が、前記画素領域の１つ内の前記被分析物粒子の数に対応する方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
前記画素領域の各々を照明光で照明する工程を更に含み、
該照明する工程は、前記光学的応答に関係する光学的周波数から分離可能な周波数の照明光を生成する工程を含み、
前記測定する工程は、前記照明光から前記光学的応答を分離する工程を含む方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記照明する工程は、主として第１のスペクトル範囲に限定された波長の集光された照明ビームを提供する工程を更に含む方法。
【請求項１８】
サンプル内の分子的な被分析物粒子の存在をディジタル的に検出する方法であって、所定の方法で照明されるときに光学的応答を放出するように各被分析物粒子が配置され、前記被分析物粒子の濃度が、前記光学的応答における統計変動が平均的な１個の被分析物粒子の光学的応答より小さくなるための最大検出しきい値よりも小さくされており、
前記被分析物粒子が前記光学的応答を放出するように前記サンプルを照明する工程と、
前記光学的応答を含む放出信号を収集する工程と、
前記収集された放出信号を測定し、前記サンプル内の被分析物粒子の数を計数するために、前記測定された放出信号を検出しきい値と比較する工程と、
を備える方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記収集された放出信号を測定する前記工程は、１個の被分析物粒子からの光学的応答の強度に対応する値で、前記測定値を除算する工程を含み、
前記除算された測定値に最も近い整数が、前記サンプル内の被分析物粒子の数に対応する方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記被分析物粒子のサンプルを用意する工程を更に含み、
該サンプルを用意する工程は、
特別な結合用組部材によって、被分析物を表面に固定する工程と、
所定の方法で、前記被分析物を複数のフルオレセイン標識（fluorophore labels）に接触させることで前記被分析物粒子と結合させるように被分析物粒子を形成する工程と、
前記表面の近傍から、被分析物と特には化合していない前記フルオレセイン標識を除去する工程とを備える方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記接触工程は、前記被分析物に対して補足的な結合部材を前記表面に固定する工程を含む方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記結合部材は、前記被分析物に特有な抗体を備える方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、
前記被分析物の各々は磁気ビーズに固定され、
前記接触工程は、前記被分析物と前記表面との間を接触させるように、前記表面の近傍に磁界を印加する工程を含む方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のシステムであって、前記データ処理手段が、それぞれの画素領域で測定された放出信号に対応するデータ値を並べた列を発生させる手段を含むシステム。
【請求項２５】
請求項２４に記載のシステムであって、前記データ処理手段が、
前記データ値に基づいてバックグラウンドノイズレベルを計算する手段と、
前記データ値の各々を前記バックグラウンドノイズレベルと比較することにより少なくとも１個の被分析物粒子が各画素領域内に含まれるかどうかを判定する手段と、
を更に備えるシステム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のシステムであって、前記データ処理手段が、
前記バックグラウンドノイズレベルに関係するしきい値を超えるデータ値を小さくなる順番に整列させて一組のデータ値とする手段と、
前記整列された一組のデータ値の中の最大値を選択し、該選択されたデータ値に関係する画素領域を第１の画素クラスタの核として選定する手段と、
を更に備えるシステム。
【請求項２７】
請求項２６に記載のシステムであって、前記データ処理手段が、
前記核の近傍の画素領域に関係する、前記整列された一組のデータ値内のデータ値を同定する手段と、
前記同定されたデータ値を前記第１の画素クラスタへとグループ化する手段と、
を更に備えるシステム。
【請求項２８】
請求項２７に記載のシステムであって、前記データ処理手段が、前記第１の画素クラスタに含まれない画素領域に関係する前記整列されたデータ値の中の最大値を第２の画素クラスタの核として選定する手段、を更に含むシステム。
【請求項２９】
請求項１４に記載の方法であって、前記計数工程が、それぞれの画素領域で測定された放出信号に対応するデータ値を並べた列を発生する工程を更に備える方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記計数工程が、
前記データ値に基づいてバックグラウンドノイズレベルを計算する工程と、
前記データ値の各々を前記バックグラウンドノイズレベルと比較することにより少なくとも１個の被分析物粒子が各画素領域内に含まれるかどうかを判定する工程と、
を更に備える方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記計数工程が、
前記バックグラウンドノイズレベルに関係するしきい値を超えるデータ値を小さくなる順番に整列させて一組のデータ値とする工程と、
前記整列された一組のデータ値の中の最大値を選択し、該選択されたデータ値に関係する画素領域を第１の画素クラスタの核として選定する工程と、
を更に備える方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記計数工程が、
前記核の近傍の画素領域に関係する、前記整列された一組のデータ値内のデータ値を同定する工程と、
前記同定されたデータ値を前記第１の画素クラスタへとグループ化する工程と、
を更に備える方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記計数工程が、前記第１の画素クラスタに含まれない画素領域に関係する前記整列されたデータ値の中の最大値を第２の画素クラスタの核として選定する工程、を更に含む方法。
【請求項３４】
化学サンプル内の個別の実在物を検出し及び計数する方法であって、
前記サンプルの画素領域のアレイの各々における、前記実在物の存在及び不在を示す測定値のアレイを請求項１４に記載の方法を用いて作成して記憶する工程と、
前記実在物の存在が示された場合に前記測定値をソートする工程と、
前記測定値の第１に対応する画素領域を第１の画素クラスタの核として選択する工程と、
前記ソートされた測定値に関係する画素領域を、所定の大きさ基準に合致し前記実在物の少なくとも１つの存在を示す前記第１の画素クラスタにグループ化する工程と、
を備える方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記ソートする工程が、
前記データ値に基づいてバックグラウンドノイズレベルを計算する工程と、
所定のしきい値により前記ノイズレベルを超える一組のデータ値を小さくなる順番に整列させる工程と、
を更に備える方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記選択された第１の測定値が前記整列された一組のデータ値の中の最大値に対応する方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記グループ化する工程が、
前記第１の画素クラスタの前記核の近傍の画素領域に関係する、前記整列された一組のデータ値内のデータ値を同定する工程と、
前記同定されたデータ値を前記第１の画素クラスタへとグループ化する工程と、を更に備える方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記同定する工程が、
前記整列されたデータ値に関係する画素領域が前記第１の核の近傍の所定の場所内に存在するかどうかを示す一組の半径を記憶する工程と、
前記記憶された半径に基づいて、前記第１の核の回りの最適なクラスタ面積を算出する工程であって、前記同定されたデータ値が前記最適なクラスタ面積内の画素領域に関係するそれらの整列されたデータ値に対応する工程と、
を更に備える方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記グループ化する工程が、前記第１の画素クラスタに含まれない画素領域に関係する前記整列されたデータ値の中の最大値を第２の画素クラスタの核として選定する工程、を更に含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
導入部
技術分野
本発明の技術分野は、化学分析の光学的方法に関するものである。
【０００２】
背景
光の検出及び量子化を伴う化学分析は、多様な状況で見いだされる。この必要性の１つの応用は、特定の被分析物の存在又は量の決定のための被分析物の検出である。多くの被分析物の分析において、１つは、光の吸収又は放出（例、蛍光（フルオレセイン）又は化学発光）のいずれかに関するものである。多くの状況において、１つは、サンプルを光で照射し、そして、送出又は放出した光に対するサンプルの影響を検出することを試みる。照射により生じる放出の場合は、被分析物でない分子もまた比較的大きな暗騒音（バックグラウンドノイズ）の原因となる光を放出し、これは、光に対するサンプルの影響の測定における実質的なエラーを導入する結果となる。さらに、測定に関するノイズに集合的に寄与する余分なシステム的なエラーがある。
【０００３】
光を伴う化学測定の品質は、被分析物の存在によるサンプルからの光信号の適切な測定値と、信号中に存在するノイズ変化との比によって決定される。一般的に、この信号とノイズとの（Ｓ／Ｎ）比を増加させる努力は、特定の被分析物に関する「検出限界」を減少させるように測定装置の感度を改良することに集中していた。検出限界は、被分析物の存在による信号が所望のＳ／Ｎ比を達成するようなサンプル中の被分析物濃度に関係する。実際には、この検出限界は、被分析物濃度に関する光学的信号を引き出すために計画された実験的手法を実行することにより確認できる。特に、信号及びノイズ強度に関するデータは、検出限界の簡単な決定を可能とするために、被分析物濃度の範囲に対する較正曲線の用紙中にプロットされる。
【０００４】
未知のサンプル中の濃度の決定は、較正曲線と、未知のものから実験的に得た信号とを比較することにより得られる。化学測定における濃度の主たる単位は、モル／リットル〔即ち、モル濃度（Ｍ）〕であり、モルはアボガドロ数（6.0225×1023）として定義される。あいにく、通常の実験手法は、最も感度の良いものでも、約１フェムトモラー（ｆＭ）又はほぼリットル当たり10億被分析物のオーダの検出限界を有している。
【０００５】
濃度が較正曲線を参照して決定される測定は、ディジタルというより本質的にアナログであると特徴付けられるであろう。すなわち、被分析物濃度に関する信号は、最初に測定装置により発生する。そこで、較正曲線は、被分析物濃度の近似値を得るために参照される。較正曲線は、濃度の関数として連続して作成されるので、較正曲線から導かれた濃度は、一般的に整数ではない。対照的に、ディジタル分野の測定データは、多くは、具体的な整数をはっきりと表す二進（即ち、２レベル）信号で実現される。したがって、測定のアナログとディジタルモードとの間の根本的相違は、アナログ手段を使用して分析したサンプルへ一個の付加的な被分析物を付加することは、明確には検出できないということである。化学測定の精度が劇的に改良されているといっても、そのような改良は、信号を増大しノイズを減少させるといったアナログの概念に基本的に基礎を置いてきている。
【０００６】
被分析物濃度のレベルが低い分子サンプルにおいては、ディジタル測定法は、少なくとも２つの利点をもたらす。（ｉ）較正曲線を参照することが要求されない。（ii）サンプルに対する単一付加分子の付加の検出を可能とする。ディジタル技術は、被分析物濃度が十分に低いサンプルにおいても有効であるので、各二進測定値に伴う統計ノイズは、連続する整数間の差よりも少ないものにとどまる。したがって、本発明の目的は、本質的にディジタル測定体系の手段により低レベルの被分析物濃度を規定するための光学技術を提供することにある。
【０００７】
関連文献
ホイットン（Whitten）外、アナル．ケム．（Anal．Chem．）（1991）63:1027-1031は、蛍光を励起するレーザを使用することにより、電気力学的に空中に浮遊する微小小滴からローダミン−６Ｇ分子の検出を記述する。
【０００８】
スティーブンソン（Stevenson）外、アプライド  スペクトロスコピ（Applied Spectroscopy），(1992）46(3):407-419は、レーザビーム中の単一原子又は分子の検出が可能なレーザ分光法に関する理論的考察を論議する。
【０００９】
ニューエン（Nguyen）外、ジェイ．オプティカル  ソシエティ  オブ  アメリカ（J.Optical Society of America），（1987）4(2):138-143は、水力学的に集束された流れ中の蛍光種の検出のための装置を開示する。
【００１０】
トウ（Tou）外、パターン  レコグニション  プリンシプルズ（Pattern Recognition Principles），（1974）（ISBN 0-201-07587-3），chps.  3 & 7，は、得られたデータのセットから、特徴的な原型又はクラスタセンタ（cluster center）を規定する技術について論議する。パターン予備処理及び特徴選別についてもまた説明する。
【００１１】
発明の要約
分子サンプル中の被分析物粒子の存在をディジタル的に検出するためのシステム及び方法がここに開示される。各被分析物粒子は、周知の方法により、刺激（例、照射）に対する光学的に検出可能な応答を放出するために処理される。化学発光とは異なった蛍光の刺激のため、ディジタル被分析物検出システムは、その中に含まれる被分析物粒子の各々が光学的信号即ちフォトンを放出するように、サンプル中の多数の、「画素領域」又はより短縮された形で「画素」と呼ばれる別の空間的要素、を照射するたの光学装置を含む。画素領域は、各領域中に含まれる被粒子の数が十分に少なく、各領域により放出された光学的信号の総計が光学的応答の変動性に比例する最大検出しきい値より少なくなるように面積を決められる。
【００１２】
ディジタル検出システムは、各画素領域から放出される光学的信号を測定するための装置を更に含む。データ処理ネットワークは、光学的信号の測定値を受信し、そしてその測定値に基づいて、サンプル中の被分析物粒子の数を決定するため、各画素領域中の被分析物粒子の数をカウントする。
【００１３】
実施例の説明
サンプル中の小濃度の分子被分析物粒子の存在をディジタル的に検出するための装置及び方法が提供される。以下に説明するように、被分析物粒子という用語は、関係する分子被分析物と、刺激されて光を放出するために配置された好適に一様な標識との組み合わせをいう。そのような粒子は、DNA巨大分子又は多糖類のように小さいもの、又は、例えばラテックス粒子のように大きいものを含むような、検出可能な任意の存在物でよい。しかしながら、大きな粒子については、他の検出技術も同様の利点があるかも知れない。装置は、サンプル中の複数の画素領域から放出された低レベルの光を検出するために設けられ、そこで、各画素領域から放出される光は、そこに含まれる被分析物粒子の刺激により発生する。放出された光は、各画素領域中の被分析物の全数を決定するために、ディジタル的に分析される。
【００１４】
フォトン放出は、吸収レンジでの蛍光体の照射により、又は照射若しくは適切な化学反応により光を放出する化学発光標識の化学的若しくは物理的刺激により、達成される。殆どの部分において、蛍光は、より便利で、好適なモードである。したがって、発明を説明する目的のために、蛍光が説明される。蛍光のために、本装置は、蛍光を発生するサンプルの照射のための手段を含む。刺激は化学試薬の付加により達成されるかも知れないので、照射手段は、化学発光のためには不必要である。化学試薬が採用された場合、測定中に、測定値は混合からの時間に関係するだろうということに注意しなければならない。その代わりに、放出の率における変化は、所定の期間を超えてモニタされるであろう。本発明の目的のために、化学発光からの光学的信号は、蛍光からの光学的信号と同一視されるであろう。
【００１５】
特に蛍光測定のために、狭い波長範囲の平行光が、サンプル中の各画素領域に導かれる。放出光強度は、各画素領域中に存在する被分析物粒子の数に関係して、不連続のレベルになるであろう。放出光は、個別要素収集システムにより収集され、そして、量子化及び分析のために、光検出機構に導かれる。個別要素収集器は、サンプル点から準平行ビームへ光を屈折又は反射するために配置された個別光学要素の配列である。そのような収集器の１例は、３Ｍコーポレーション（ミネアポリス，MN）により生産されるタイプの低ｆ数のフレネルレンズ／反射器配列である。
【００１６】
図１を参照すると、本発明のディジタル被分析物検出システム10の好適な実施例は、高感度光検出装置101により集められた測定データを分析するために作用する汎用コンピュータシステム100を含む。コンピュータシステム100は、２次メモリ106（例、磁気ディスク記憶装置）、主メモリ112（即ち、高速ランダムアクセスメモリ）、及び１以上のユーザインタフェース120に、システムバス104により接続された中央処理ユニット102を含む。各ユーザインタフェース120は、典型的には、ディスプレイ又はモニタ121、キーボード122、及び選択ボタン124を有するマウスポインタデバイス123を含む。
【００１７】
主メモリ112に記憶されるものは、データアレイ126や本発明のディジタル検出方法を実行するのに使用される各種コンピュータプログラム（ソフトウェア）である。主メモリ112に搭載されたソフトウェアに含まれるものは、光検出装置101を制御するための器具保守プログラム128である。さらに、主メモリ112に記憶されるものは、以下に詳細に説明される多数のデータ分析プログラムである。特に、被分析物粒子の検出を容易にする新規なデータクラスタスキームは、暗雑音しきい値ルーチン132、データソートルーチン136、及びクラスタ統合ルーチン140を具備する。
【００１８】
高感度光検出装置101は、典型的には、例えば、米国特許第5,315,375号、発行日1994年５月24日、名称「高感度光検出システム」で説明されているものと実質的に同様の光学システムを含む。これは、引用により取り込まれる。前述のように、装置101は、各領域内の被分析物粒子の蛍光を誘導するために、被分析物粒子のサンプル中の複数の画素領域を照射するために操作される。所定時間の間既知の強度で照射される各被分析物粒子により放出される光（光学的応答）は、それに応答する電気的検出信号を発生する検出器に導かれる。各画素領域に関係する検出信号の強度は、データアレイ126に記憶される。
【００１９】
図２は、高感度光検出装置101の好適な例の正面図を示す。装置101はレーザビーム212を有し、レーザビームは第１のレンズ214を通過して広げられ、そのビームを再び平行にする第２のレンズ216へ導かれる。平行にされたビームは、ビームの径を決定する可調整開口218を通過し最後に集束レンズ220を通過する。集束レンズ220は、図示しない台上に設けられ、そこで集束レンズ220は、サンプル上に生じるビーム径を変化させるために、光軸に沿って動かされる。レーザビーム212は集束レンズ220を出て、第１の表面ミラー222により反射される。光は、放出光を収集するための第１の個別要素収集レンズ228とその光を集束するための第２の個別要素収集レンズ230とを具備する個別要素収集システム226の孔224を通過する。通例、フレネルレンズのような構造を有する第１の個別要素収集レンズの焦点距離は、第２のレンズ（これはフレネルレンズであってもなくてもよい）の焦点距離より実質的に短く、一般的には、第２のレンズの焦点距離の約60％より少ない。第１の個別要素収集レンズに対する収集角は、通常、放出方向に対して少なくとも約90°である。放出されて集束された光は、第２のレンズ232に送出され、各被分析物粒子中の蛍光体標識から放出された光の波長範囲外の光を排除するフィルタパック234に導かれる。このフィルタパックは、例えば、通常の光学フィルタ、モノクロメータ、又はタイムゲート技術を使用することにより、波長分離を行う。所望の波長の光は、分析のための電子回路への送出のために、増倍型光学管及びプリアンプリファイア236により検出される。
【００２０】
サンプル238は、投射光がそれに含まれる各画素領域を照射できるようにするＸ−Ｙ台240に搭載される。図３に示され、以下に十分に説明されるように、サンプル238は、好適には、隣接する画素領域246の２次元アレイとなるように分割される。通常所望数（例、２）より少ない被分析物粒子が各画素領域に存在するように、画素領域246は十分に小さく選択される。例えば、分析されるサンプルの量は、ほぼ５つの画素領域当たり１つの被分析物粒子が存在するように選択される。比がほぼ確実になるので、各画素領域中の被分析物粒子により発生する総蛍光エネルギー（放出信号）は、十分に小さくなり、その統計変動は、１個の被分析物粒子の光学的応答より少なく保たれる。しかしながら、もし、完全な正確さよりも低下することが許容されるならば、サンプル量は、画素領域数と被分析物粒子数との比を小さくする結果をもたらすように選択できる。１個の与えられた画素領域内の被分析物質粒子の数は、その画素領域から収集された放出信号を１個の被分析物粒子の光学的応答によって除算することにより得られる値（比）に近い整数を見いだすことにより決定される。この整数のセットはデータアレイ126に記憶され、そして、サンプル238中の被分析物粒子の数のディジタル決定をするために合計される。器具保守プログラム128の指示によりＸ及びＹ方向にサンプル238を正確に移動させるために、ステッパモータ242（図２）が備えられる。
【００２１】
Ｘ−Ｙ台240は、例えば、ニューポートモデル（Newport model）405  ２軸移送台から構成される。適当な変形によれば、6.4ミリ（１／４インチ）20ステンレス鋼ねじ棒から作成された2.54センチ（１インチ）当たり20回転の装置となる。２つのステッパモータは、Ｘ及びＹ軸の両方に対してステップ当たり3.175μｍの直線移動を行う。Ｘ及びＹの全行程は、約3.8センチ（1.5インチ）に限定される。各軸端のリミットスイッチは、台をセンタリングする手段となる。これは、０，０のｘ，ｙ基準を確立する。サンプルのイメージスキャニングは、3.175μｍのオーダにある横面積を有する画素領域に対して実行される。
【００２２】
図４において、光検出装置の第１の変形例250はビームシャッタ254と組み合わされたレーザ源252と共に図示されている。レーザビーム256はラインフィルタ258を通して導かれ、そして回転ミラー260により、拡散レンズ262、平行レンズ264、可調整開口265、及び、ステッパ駆動台268に搭載された集束レンズ266を具備するレンズシステムに向けて反射される。サンプルステッパ台270は、スライドホルダ271でサンプルを支持し、器具保守プログラム128の指示ごとにサンプルを保持し移動するために設けられる。これは、可動個別要素収集システム272（サンプルの直上の操作位置から離れて図示されている）の下に配置される。
【００２３】
殆どの部分で、光源はレーザであり、そのビームの強度は、１μｗから約100mwまでのパワー定格で変化され得る。光波長は、各被分析物粒子中に含まれるフルオレセイン標識の吸収特性に依存して、広範囲に変化できる。殆どの部分で、光は、350nm、通常約400nmを超え、通常700nm以下、より通常には約550nm以下の波長にある。好適には、各被分析物粒子は、通常少なくとも約20nm、好適には、少なくとも約50nmの大きなストークスシフトを与える蛍光体を含む。
【００２４】
ビームサイズを変更するため、あるものは、サンプルからの距離を変えてビームサイズを変える可動レンズを使用することができる。適切なステッパモータを用いることにより、各ステップにより、ビームをより小さく又はより大きく変化させることができる。
【００２５】
次いで、各画素領域246から放出される光は、光を集めること及びそれを光検出器に送ることのために準備されている個別要素収集器システムを使用して、効率的に集められる。この個別要素収集器システムは、通常、マルチレンズシステムになるであろうが、サンプルに近いその収集器レンズは、一般的に、通常、約２より小さく、かつ、約0.05より大きい低ｆ番号を有し、一般的には、約0.075から1.0までの範囲にある。低ｆ番号の個別要素収集器は、通常、高品質の平行ビームを生み出さない。しかしながら、ほぼ同一の直径でより大きなｆ番号（通常0.5より大きく、一般的には約１〜10）、第２のレンズを用いることで、光を検出器上に集束することができる。個別要素収集器レンズ及び第２のレンズは、一般的に、約０〜50cmの分離を有し、通常は、約0.1〜５cmにかなり近い。通常、個別要素収集器レンズは、少なくとも１cm2となろうが、約１×104cm2ほどの大きさとしてもよく、約500cm2よりも大きな面積となることは通常ない。
【００２６】
エミッタの背後に完全な球形の反射器を内蔵し、検出器から去る光を光源に反射して個別要素収集器システムに至らせることにより、個別要素収集器システムから出現する平行ビームに集められる立体角の比率を２倍にすることができる。この球形反射器は、光源から１球半径離れ、個別要素収集器からエミッタの反対側に置かれねばならない。面積Ａの画素領域に関しては、球形反射器の半径は、光源が反射器に比して点状となるように、Ａの10倍又はそれ以上のオーダでなければならない。そうしないと、光のより大きな部分は、レンズ内に反射されないであろう。
【００２７】
集められる光の立体角は、使用される収集器システムに基づいて計算されることができる。
【００２８】
上記システムを使用することによって、理想的な収集器を有するシステムに集められる立体角比率は、0.90ほどの高さとすることができる一方、より現実的にｆ番号を用いると、0.5から0.05に変化する個別要素収集器に関し、立体角比率の評価値は、約0.26から0.81までの範囲にあるであろう。
【００２９】
図５の参照符号300によって一般的に示される高感度光検出システムの第２の代替実現例においては、サンプルに入射する光がサンプルに対し直角となるようにする代わりに、入射光がサンプルに対して垂直以外の角度となるようにする。図５においては、レーザビーム301（これは、図２において説明されたように処理される）は、反射鏡（図示せず）によって反射され、個別要素収集器システム306の孔304を通るようにされる。その光は、サンプル308に衝突し、サンプルから孔310を通して反射され、次いで、任意の簡便な手段によって廃棄される。サンプル308からの放出光は、個別要素収集器システム306によって集束され、先に図２において説明されたように処理されるべくレンズ312に向けられる。
【００３０】
図６において参照符号350によって一般的に示される高感度光検出システムの第３の代替実現例においては、サンプルに入射した光がサンプル上から発して個別要素収集器システムの各孔を通るようにする代わりに、サンプルが透明な基体上に置かれ、入射光が下からサンプルに衝突するようにされている。図６においては、レーザビーム351が第１のレンズ352を通して拡大される。この第１のレンズ352は、レーザビームを拡大し、ビームが再び平行化される第２のレンズ354にビームを向ける。平行ビームは、第１の表面鏡356によって反射され、調節可能なステージ360（ビームがサンプル面にて集束されるのを可能とする）上に置かれた集束レンズ358に向けられる。サンプル362は、サンプルの各画素領域が入射光によって別々に照明されるのを可能とするＸ−Ｙステージ364によって支持される。器具保守プログラム128により発せられる命令によって、サンプル362がＸ及びＹ方向に正確に移動するように、ステッパモータ366が設けられている。
【００３１】
吸収されない励起光は、個別要素収集器システム368を通過し、長通過フィルタ370によって吸収される。その代わりに、長通過フィルタは、吸収されない入射ビームに対し45°の角度で置かれたダイクロイックミラーに換え、光ビームが任意の簡便な手段によって廃棄されうる検出器から離れてビームを反射するようにしてもよい。
【００３２】
サンプル362からの放出光は、個別要素収集器システム368によって集束され、図２において先に説明されたように処理されるべく、空間的開口372を通して、収集器レンズ374に向けられる。
【００３３】
被分析物粒子特性
本発明のディジタル検出技法は、発光分光学（ここにおいては、放出される光が検出される信号である）を使用して広範囲の被分析物を検出するために使用されることができる。放出光は、例えば、蛍光、化学発光、又は燐光の結果である場合もあるが、ここで使用される「光学的応答」という用語は、単一の被分析物からの光放出（しかし、誘導される）を集合的にいうものである。加えて、ここで使用される「放出信号」という用語は、特定の画素領域から検出される光学的応答の測定値に対応する。サンプルは、被分析物に縛られない検出可能な標識が従来の洗浄手順により除去されうる固体サンプルであることが好ましいであろう。加えて、サンプル分析は均一であり、各被分析物粒子が、等しい照明エネルギーにさらされるのに続いて、実質的に理想的な光学的応答を引き出すことを保証する。
【００３４】
好ましい実施例においては、各画素領域内の被分析物粒子は、バックグラウンドノイズレベルを実質的に越える光学的応答を提供する個別信号ユニットに基づいて個々に測定される。各光学的応答の強度は、特定の光検出装置が、光学的応答と周囲のバックグラウンドノイズとを区別するために使用されることができるほど十分大きなものである必要がある。信号ユニットの１又は２以上の光学的応答を単一の被分析物粒子と関連付けることができるが、ユニットの数は、低く、実質的には各被分析物粒子に関して同一となるであろう。ほとんど、被分析物当たりの信号ユニットの数は１つであろう。あらゆる所与の被分析物粒子内の信号ユニットは、蛍光粒子、又は周知の蛍光のＤＮＡ分子を挿入され再生可能な生産が可能である蛍光とすることができるであろう。被分析物粒子内に含まれる被分析物は、単一の分子又は凝集であろう。
【００３５】
分析媒体は、一般的にピコモル又はそれ未満、しばしばフェムトモル又はそれ未満の、低濃度の被分析物を有するだろう。分析容量は、通常、約100μｌ未満、しばしば10μｌ未満となり、また、１μｌ又はそれ未満となるかもしれない。各画素領域246(図３）は、一般的に100μｍ2より大きいことはなく、通常約50μｍ2より大きいこともなく、上述のように、10μｍ2ほどの低さかもしれない。各画素領域246の大きさは、被分析物の濃度、各サンプル238を処理するのに望まれる速度率、個々の光学的応答が区別されうる容易さ、等に依存する。
【００３６】
分析は、通常、特別な結合対を含み、特別の結合対によって分子が補完分子を有することを意図しており、その特別結合対の部材は、ランダム錯体形成より実質的により高い親和力にある。かくして、特別結合対は、ハプテン及び抗原（「配位子」と呼ばれる）、並びに、抗体、酵素、表面膜タンパク質受容体、レクチンなどのような補完結合部材（一般に「受容体」として知られる）、核酸シーケンス（自然に発生するもの及び合成物）、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを含む。ここで、簡便のため、核酸は、配位子及び受容体からなる特別結合部材の概念に含まれる。
【００３７】
分析を実施する上で、特別結合部材の共役及び検出可能標識が含まれるであろう。既に示したように、フルオレセイン標識が好ましいが、検出されうる他の個別標識は、化学発光標識を含む。これらの共役を作成する方法は、文献において周知である。被分析物に依存して、商業的に利用可能な試薬又は修正されうるそのような試薬と関連付けされうる種々のプロトコルが使用可能であろう。
【００３８】
高感度光検出システムを使用したデータ収集
上述のように、特定サンプル内の各画素領域からの光学的応答を高感度光検出装置によって集め量子化する方法の詳細な議論は、先述の米国特許第5,315,375号に与えられている。それにもかかわらず、本発明のディジタル技術の説明を容易化するために、放出される信号データを収集するために当該光検出システムによって利用されるコンピュータ、エレクトロニクス、及びソフトウェアの好ましい実現例を、以下に述べる。
【００３９】
エレクトロニクス
従来の光学的フィルタリング技術を使用した光学的応答エネルギーからレーザ照明を分離するのに続き、その光学的応答は、典型的には、光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用して検出される。使用されるＰＭＴは、ハママツ1477（管の片側１インチ）である。その管は、ＵＶガラス窓（ウィンドウ）を有するマルチアルカリ光電陰極で作られており、1000ボルトの陽極・陰極電位差にて5.3×106のオーダの光子・電子利得を有する。
【００４０】
PMTの電流出力は、ディジタルモードで作動するように配置されたパルス発生器回路に直接結合される。ディジタルモード動作において、１つの電子パルスは、１つの光子事象として計数される。このモード（光子計数モードとしてまた知られる）は、直流バイアスを防止するのに十分なほど光子が一般的に離隔している低レベルの光においてのみ可能である。各画素領域の次元は、かかる直流バイアス（より高感度の光学的応答エネルギーを伴う傾向がある）が起こらないほど十分に小さくなるように選択される、と仮定する。
【００４１】
当該回路は、光電子増倍管からの電流を電圧レベルに変換し、その電圧値をしきい弁別器値と比較し、遠隔のカウンタ回路へのパルスを発生させる。次いで、そのカウンタへの各パルスは、１つの光子事象として計数される。
【００４２】
１対の演算増幅器は、パルス発生器回路のプリアンプ部を構成する。そのプリアンプ部は、マイクロアンペア周辺の電流パルスをほぼ1.0ボルトの電圧パルスに変換する。これらのパルスがプリセット値よりも大きいときを検出するための弁別器として、比較器が使用される。当該パルスがこの弁別レベルよりも大きいときには、論理遷移が起こり、パルス整形回路が、これを定義済みの10nsecパルスに変換する。
【００４３】
コンピュータインタフェースは、PCコンピュータ命令を論理コマンドに、かつ、状態情報をコンピュータ論理に変換するための回路からなる。このインタフェースは、１つのPCスロット用フルサイズカード上に構築される。そのカード上の基本的な構成要素は、バストランシーバ、アドレスデコーダ、ファンクションラッチ、ラインレシーバ、及びカウンタ回路である。
【００４４】
当該コンピュータインタフェースは、８Ｉ／Ｏポートアドレス、ヘキサ0310〜0317を使用する。ポート0310〜0312からのリードは、当該カウンタからの20ビットを提供する。0317へのライトにより、当該カウンタがタイマ回路によってゲートされるときには、ラインレシーバによって受信されるパルスが、定義済みのゲート期間だけカウントされる。当該ゲート期間は、ロケーション0310〜0312へのライトによりプログラムされる。
【００４５】
当該20ビットのカウントは、100万よりも大きな容量を与える。ポート0313〜0315へライトされる付加的なビットパターンは、レーザシャッタ、高電圧電源、３軸（例えば、Ｘ、Ｙ及びＺ）ステッパモータ、並びにタイマ回路及び遠隔パルス発生器の動作モードを制御するためのものである。0313からのリードは、その３軸制限スイッチに関する情報を与える。
【００４６】
モータ駆動ボードは、コンピュータインタフェースから論理信号を受け取り、それらを位置コマンドに変換する。0.1〜1.0mWのオーダの入射照明のために、モータ駆動ボードは、ほぼ１〜100msecの滞留時間の間、各画素領域が照明されるようにする。10〜100mWの照明のため、画素滞留時間は、典型的に、10〜100μsecの範囲にある。各軸のための論理ラインは、モータイネーブル、方向、ステップサイズ、及びステップパルスを与える。Ｘ、Ｙ、及びＺ軸端の制限スイッチは、コンピュータインタフェースに供給され、また、保護回路に結線される。その保護回路は、コンピュータ命令が当該制限を検出し損なう場合に当該制限に達したときに、モータのステッピングを防止する。
【００４７】
コンピュータ
当該器具を制御し、測定値を作成し、かつ、その分析及び画像化を実行するために、PC互換コンピュータが使用される。ハードコピー出力用に、プリンタ及びカラープロッタが付いている。
【００４８】
コンピュータマザーボードには、インテル80286マイクロプロセッサ及び80287数学コプロセッサが搭載され、それらは、ともに、ＣＰＵ102（図１）を構成する。マザーボードは、さらに、1024キロバイトメモリ、キーボード及びスピーカ接続点、並びに８拡張スロットを有する。
【００４９】
ＡＳＴ有利多機能ボードは、576キロバイトの主メモリ112（図１）、プロッタ用１シリアルポート、及びプリンタ用１パラレルポートを提供する。ＩＢＭハード／フロッピィディスクコントローラボード及び外部フロッピィディスクドライバボードは、ディスク記憶媒体106への通信リンクを提供する。VIDEO SEVEN VEGA VGAボードは、最大800×600画素の高解像度グラフィック容量を提供する。
【００５０】
残りの３つのボードスロットのうちの１つは、当該器具の制御及び監視のための特注開発回路カードによって使用され、２つのスロットは、拡張用に利用可能である。特注ボードは、エレクトロニクスの章で議論されたコンピュータインタフェースボードである。それは、器具データ収集を制御する手段を提供する。
【００５１】
ソフトウェア
器具保守プログラム128（図１）内に含まれるデータ収集ソフトウェアは、Ｃプログラミング言語を用いて開発された。それは、マイクロソフトＣコンパイラバージョン5.1を用いてコンパイルされ、マイクロソフト及びバーモント・クリエイティブ・ソフトウェアからのライブラリとリンクされた。それは、データ収集及び保守オペレーションに関するいくつかのレベルを有するウィンドウ指向パッケージである。3.5インチドライブに書き込まれたデータファイルは、ヘッダ情報、オペレーティングパラメータ、及びデータを収容する２進の.ＦＣＤファイルを含む。また、画素領域の関数としての光子カウントデータの３次元画像プロッティング用の.ＧＲＤファイル、Ｘ及びＹ座標及び光子カウントデータを収容する.ＤＡＴファイル、並びに純座標を有する.ＣＯＲファイルも書き込まれる。
【００５２】
.ＤＡＴファイルは、欠落データ点の補間のための平滑係数を使用する.ＧＲＤファイルを得るために使用されることができる。.ＣＯＲファイルは、前のランと同じロケーションにて再画像化するために使用されることができる。
【００５３】
グラフィックソフトウェアは、Ｃで書かれ、ＧＳＳグラフィックライブラリとリンクされる。これは、収集されたデータの視覚表示を与え、その表示をカラープロッタへ送信することを可能とする。
【００５４】
GOLDEN SURFERソフトウェアパッケージは、３次元表面画像化及び２次元地形図を実現する商品である。GRID，SURF，TOPO，VIEW，PLOTCALL、及びPLOTの６つのプログラムがある。GRIDは、各画素領域から光子カウント（放出信号データ）を収容するデータファイルをリードし、そのデータの格子画像を生成する手段を提供する。このプログラムからの出力は、３次元画像化用SURFによって又は２次元輪郭用TOPOによってリードされることができる。PLOTCALL及びPLOTは、これらの図をカラープロッタに出力する手段を提供する。VIEWは、スクリーン上にプロッタ発生ファイルを表示し、ズーム及びパノラマ機能を提供する。
【００５５】
ロータス123スプレッドシートソフトウェアパッケージは、また、データの分析において使用される。当該器具によって自動的に通常は収集されないデータは、グラフィック機能によって処理されかつ表示されることができる。実際のデータに格子パルス積み上げ相関方程式を適用するなど、該器具によって収集されたデータに他の科学的処理をまた適用することができる。
【００５６】
画素データのコンパイル及び分析
本発明に係るディジタル検出システム100は、列126内に含まれる画素データによって表されるサンプル内の被分析物粒子の数を決定するために、２つのモードのうちの１つで動作するように設計されている。また、列126の任意の要素内に格納される値は、サンプル内の特定画素領域から収集される放出信号の強度に対応する。すなわち、システム100は、各被分析物粒子内に含まれる標識のサイズが画素領域246の面積よりも小さいことを、ユーザによって指定されたとき、第１の（すなわち、「直接計数」）モードで作動するように設計される。標識サイズが画素領域の面積を越えるときには、システム100は、第２の（すなわち、「画素クラスタリング」）モードで作動する。
【００５７】
Ｉ．直接計数
直接計数モードにおいては、各画素領域246からの放出信号の強度は、サンプルのバックグラウンド強度特性と比較される。その放出信号が個々の標識の応答でバックグラウンド強度を越える画素領域においては、被分析物粒子の数は、放出信号（バックグラウンドを減じたもの）を標識の強度で除算することにより、カウントされることができる。これは、列126内に格納された各値を、サンプルバックグラウンド強度と各被分析物粒子内の標識の強度との和に比例する検出しきい値と、比較することによって、もたらされる。次いで、その検出しきい値より小さいデータ値が一般に無視される一方、列126内の残りの要素の値は、サンプルのバックグラウンド強度を減算することによって、正規化される。列126内の各正規化されたエントリは、次いで、標識応答の強度によって割られ、最も近い整数に丸められ、サンプル内の被分析物粒子の数は、各除算の結果を合計することによって決定される。サンプルの周囲バックグラウンド強度を計算するための適当な方法は、以下の、画素クラスタリングモードの説明に含まれている。
【００５８】
直接計数モードにおいては、予測される被分析粒子濃度は十分に低く、各画素領域が個々の粒子の大きさよりもかなり大きくなるように選択されているので、被分析物粒子が隣接する画素領域の間の境界上に位置されるであろうことは相対的にありそうもないことである。それにもかかわらずそのような場合に、隣接する画素領域に関連する放出信号に与えられるエネルギーは検出しきい値より大きなどちらかの信号を提供するのに不十分であるため、粒子が検出されない可能性がある。極端な精度が要求される応用においては、この相対的なありそうもない可能性を考慮することが望まれるかもしれない。画素境界に位置する被分析物粒子の検出を容易にするために設計された１つの技術は、サンプルに関する画素配列238の方向をシフトすることおよび第２のデータセットを収集することを含んでいる。特に配列は、ＸおよびＹ方向において約４分の１の画素寸法に転換されることが望ましい。各画素領域から放出される信号に基づくデータは再度収集されて、被分析物粒子の数の第２の計数は上述のように実行される。もし第１の計数において分析粒子が画素境界に位置しており検出されていないならば、第２の計数は最初の計数を越えるであろう。同様に、第２の計数が第１のものより少ないものであれば、第１のカウント中に検出された被分析粒子と重畳するように画素境界がシフトされた可能性がある。ある場合には、より後の計数がサンプル中の被分析物粒子の数の示唆をする。
【００５９】
II．画素クラスタ化
上記から判るように、検出システム100は、使用者によって指定される画素クラスタ化モードにおいて、画素領域246の面積が個々の被分析物粒子の寸法よりも小に操作するために配置される。従って個々の粒子が分布している画素領域は、サンプル中の被分析物粒子の数の正確な決定を可能とするために、単一のものに集められ、すなわちクラスタ化されなければならない。以下に述べるように、クラスタ化処理は、各画素から収集された放出信号データを一組のバックグラウンドデータと対象の画像要素を表す一組の画素データとに分離することによって開始される。次いで、対象のデータセット内の信号値は大きさ（輝度）の降冪の順に配列される。最も大きいデータ値は第１の画素クラスタの核とされ、第１の核に十分近接した対象の画素は第１の画素クラスタ内に取り込まれる。近接の判断は、例えば被分析物粒子の形状、あるいは検出処理の特定の目標に基づいて変更されてもよい。第１のクラスタ中にグループ化された画素値は対象とされる画素値のリストから除去され、残りの値の最大値は第２の画素クラスタの核とされる。この処理は、対象の画素の予め定められたパーセンテージがクラスタへグループ化されるまで繰り返される。本発明にかかる画素クラスタ化を実行するために書かれたフォートランコンピュータプログラムは図７のフローチャートを参照して説明される。
【００６０】
図７に示されるように、クラスタ化プログラムは、画素データ配列126の大きさ及びそこに格納された値をデータファイルに読み込むことによって開始される。配列126のＸおよびＹ方向の大きさは、それぞれＮxおよびＮyと記載される。配列から読み込まれる画素値および画素値の２乗値は個々に加算され、それぞれ整数SUM1およびSUMSQ1として記憶される。SUM1は、配列126中の全要素の画素輝度の平均値（AVE1）を決定するためにＮxとＮyとの積（即ち配列126中の数）によって除される。さらに一組の画素データの標準偏差（σ1）は次式によって決定される。
σ1＝｛（SUMSQ1−(SUM1)2／(NxNy)）／(NxNy−1)｝1/2          〔１〕
【００６１】
パラメータσ1とAVE1は図７において参照されるバックグラウンドしきい値を決定するために使用される。特にバックグラウンドしきい値はTESTによって表され、次式で与えられる。
TEST＝AVE1＋2.5σ1                                           〔２〕
【００６２】
各画素データ値はTESTと比較され、TESTより小である値の合計はSUM2として区別され、TESTより小である値の２乗の合計はSUMSQ2に対応する。更新された画素輝度の平均AVE2は、
AVE2＝SUM2／Ｎ                                              〔３〕
で計算される。
【００６３】
ここでＮはTESTより小である画素値の数に対応する。このように、AVE2は式〔３〕の項SUM2中に相対的に輝度の高い特徴は含まれていないのでAVE1よりバックグラウンド輝度の性質をより有している。更新された標準偏差σ2は、
σ2＝｛（SUMSQ2−(SUM2)2／(N2)）／(N2−1)｝1/2              〔４〕
によって演算される。
【００６４】
更新されたバックグラウンド輝度AVE2および更新された標準偏差σ2に基づいて、対象の放出信号に対応する画素を取り囲む画像窓（画像ウィンドウ）がバックグラウンド輝度に対して定義される。画像窓の下限WINLOは、多分バックグラウンド輝度を標準偏差の５倍だけ超えるため、次式によって定義される。
WINLO＝AVE2＋５σ2                                          〔５〕
【００６５】
画像窓の上限WINHIは、一般的に最大画素値の大きさに固定される。対象の一組の画素値は探索され、画像窓内の大きさを有する画素値は大きさ（輝度）の降幕の順に記憶される。この記憶されたリスト中の画素値の数はNOUTで表され、記憶された画素値の対応するＸおよびＹ座標はポインタ配列INDXおよびINDYにそれぞれ記憶される。特にｉ番目の輝度の画素値のＸおよびＹ座標はポインタ配列INDX(i）およびINDY(i）に記憶される。ここでインデックス“ｉ”は１からNOUTの間にある。
【００６６】
第１の画素クラスタの合成は、INDX(1)およびINDY(1)を第１の画素クラスタの核のＸおよびＹ座標として指定することにより進む。サンプル中の被分析物粒子の断面形状が例えば比較的に円形であるような応用分野においては、円形の画素クラスタを生成することによってこの幾何学を反映することが一般的に望まれる。この場合第１の核は、第１の画素クラスタを定義するために使用される円形の中心に位置される。第１の画素クラスタに対する半径は、画像窓内に含まれる記憶された画素に対する第１の核に対して８方向（即ち45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°および360°）に探索することによって決定される。この探索の目的は、８方向のそれぞれの概略のクラスタ半径を決定し、次いで、これらの半径を使用して第１の画素クラスタの半径を定義することである。
【００６７】
より特定的には、45°の半径を決定するためにＸ座標がINDX(1）＋１、Ｙ座標がINDY(1）＋１の画素が、その座標がポインタ配列INDXおよびINDY中に含まれるか否かを決定するために検査される。もしそうであれば、検査された画素は画像窓中に含まれているために十分な輝度であると考えられる。次に、第１の画素クラスタの45°の半径は、画像窓中に含まれると考えられる検査された画素を少なくとも含むように選択されるであろう。Ｘ座標がINDX(1）＋１、Ｙ座標がINDY(1）＋１の画素が画像窓中に含まれると仮定すれば、45°の方向の次の画素（即ちINDX(1）＋２およびINDY(1）＋２の座標を有する画素）の座標がポインタ配列INDXおよびINDY中に含まれるか否かを決定する。第２の検査画素の座標がポインタ配列INDXおよびINDY中に含まれていないときには、45°半径は２の値に設定される。同様に第１の検査画素がポインタ配列INDXおよびINDY中に含まれていないときには、45°半径は単一の値に設定されるであろう。残りの７方向のベクトルに関する半径は次に本質的に同様の方法で決定される。従ってこの８つの独立の半径を単に平均することによって、第１の画素クラスタの合成半径特徴を演算することが可能となる。
【００６８】
代案として、第１のクラスタの周辺近傍に要素を有する第２の画素クラスタによって第１のクラスタの半径が不当に大きくなることを抑制するために、平均に先立って最大の２つあるいは３つの半径を除去することもできる。このシナリオは、例えば、それぞれの画素クラスタの特徴が少なくとも１方向のベクトルに沿って隣接しているようにサンプル中の一対の被分析物粒子の分離が十分に小であるときに発生する。
【００６９】
サンプル中の被分析物粒子が円形でない断面であるときには、それぞれの方向の半径は任意の形状のクラスタの周辺を定義するために使用されてよい。同様に他の円形でない（即ち楕円状の）輪郭は方向半径によって定義されるクラスタ境界を好ましい形状に一層近づけることによって好ましいものとなるであろう。
【００７０】
図７に示されるように、画像窓内に含まれるのに十分な輝度を有し第１のクラスタ核及び半径によって定義される円内に存在する画素は、第１の画素クラスタ内に区分される。このステップは第１の画素クラスタによって定義される領域に取り囲まれる座標位置を決定するためにINDXおよびINDYを走査することによって実行される。このように取り囲まれたINDXおよびINDYのエントリは第１の画素クラスタ内にあるとして指示されINDXおよびINDYから除去される。さらにクラスタ化プログラムは画像窓に最初に含まれていた画素位置の数から第１のクラスタ内に含まれる画素位置の数を減算する。もしこの数が画像窓内に含まれる画素の数の予め定めたパーセンテージ（例えば99％）よりも小であればクラスタ化処理が終了する。そうでなければ第２の画素クラスタの形成が開始される。
【００７１】
第２の画素クラスタの核は画像窓内に含まれる画素値の記憶されているリストの中に残っている最大の値を探索することによって、即ち第１の画素クラスタ中に含まれていない最も高輝度の画素を探索することによって決定される。第２の画素クラスタは第１の画素クラスタが形成されたのと同様な方法で形成される。さらに、画素値の記憶されたリストに残っているクラスタ化されていない画素値の数が当初の数の予め定められたパーセンテージ以下となるまで付加的なクラスタが形成される。
【００７２】
この発明的なクラスタ化処理は、個々の化学的存在を空間的に解析し及び計数する種々の応用に利用されるであろう。上記からわかるように、このような１つの応用は、各粒子が分子及びフルオレセイン標識からなる被分析物粒子のディジタル的検出を含んでいる。同様に核内の染色体あるいは部分的染色体の数はフルオレセイン標識のサイズに対して小さくなるように画素サイズを選択することによって決定されるであろう。個々の染色体のラベルはこのように複数の画素領域に分布されており、クラスタ化がそれぞれの核に含まれる染色体の数の計数を実行するために必要とされる。
【００７３】
本発明のクラスタ化処理は、サンプルの画像中の対象領域に急速に位置する走査モードにおいても使用されるであろう。走査モードにおいて、画像データは大きな画素サイズを使用してサンプルを調査することによって最初に収集される。クラスタ化アルゴリズムは、数多くの画素クラスタのサイズおよび中心の決定によって対象の領域を識別するために実施される。もし対象の識別された領域の高分解能画像の合成が望まれるならば、データは減少された面積の画素を使用する個々の領域から収集されるであろう。
【００７４】
実験結果
本発明にかかるクラスタ化技術は、以下の分析物のサンプル中に存在するフルオレセイン標識のビーズの数を決定するために図２に示す装置を使用して実行された。分析物は、共有的に付加された(ｄＴ)21 DNAオリゴマーによって覆われた磁気を帯びたビーズ、共有的に付加された特定配列の６型ヒト乳頭腫ウイルス（HPV-6）で覆われたフルオレセイン標識のビーズ、ＤＮＡオリゴマーおよびHPV-6シーケンスを含む被分析物であるＤＮＡ分子で構成されている。
【００７５】
この例において、磁気を帯びたビーズは捕獲プローブオリゴマーの大部分と反応する。捕獲オリゴマーは長さで51ヌクレオチドである。捕獲プローブの５′末端はHPV-6 DNAの30の基本DNA配列（810ないし840ヌクレオチド）で構成されている。捕獲プローブの３′末端は(ｄＡ)21で構成されている。(ｄＡ)21は、磁気ビーズの表面状で(ｄＴ)21オリゴマーに加水分解する。加水分解されない捕獲プローブは磁気ビーズの磁気濃度、除去および上澄み溶液の置き換えによって溶液から除去される。
【００７６】
加水分解された捕獲プローブを有する磁気ビーズは、次にHPV-6 DNA（被分析DNA）配列の量を変更して混合される。使用される被分析シーケンスは長さで42ヌクレオチドのオリゴマーである。被分析シーケンスの５′末端の21ヌクレオチドは捕獲プローブ状のHPV-6 DNAシーケンスにおいて30ヌクレオチドの21に対する補色である。被分析DNAの３′末端の21ヌクレオチドは、フルオレセイン性のラベルビーズ上のDNAオリゴマーの補色である。被分析DNAは磁気ビーズ上で捕獲プローブに加水分解される。
【００７７】
特定の形式および磁気ビーズの濃度は、各領域から合計の放出された信号が上限検出しきい値より小さいままとするために各画素領域内の被分析物の濃度を制限するように選択される。この制限に影響を与える１つの方法は、１つの拘束力のある一対だけを有するビーズを選択することである。代案として、被分析物の数に対する大部分のビーズが使用されるであろう。
【００７８】フルオレセイン性の標識ビーズは磁気捕獲ビーズ上で被分析DNAに加水分解される。自由な標識ビーズは過度の捕獲プローブおよび自由な標識ビーズに対して以下に述べるように洗浄ステップを繰り返して除去された。
【００７９】
サンプルを準備するために使用される特定の方法論は、磁気2.8μｍビーズ（DYNAL，Inc.，Great Neck，NY）のマイクロリットル当たり12マイクロリットルの1.5×105の磁気ビーズを100マイクロリットルの洗浄緩衝液（0.5M GuSCN，0.04M Tris-HCl，0.008M EDTA，0.5％ N-lauryl sarcosine，0.5％ BSA，pH7.4）に加えることを含んでいる。ビーズ懸濁は混合され、ビーズは磁気的に収集され、上澄みとともに除去される。50ミリリットルの洗浄緩衝液が加えられ、ビーズは再懸濁される。51ヌクレオチドの捕獲プローブの６マイクログラムが加えられ、懸濁は１時間摂氏37度で培養される。ビーズは磁気的に収集され、上澄みは再び除去される。この洗浄方法はさらに２回繰り返される。洗浄されたビーズペレットは65ミリリットルの洗浄緩衝液中で再懸濁され、10マイクロリットルのビーズ懸濁は６本のチューブに移される。マイクロリットル当たり１マイクログラムの１マイクロリットルのイーストtRNAが各チューブに加えられる。
【００８０】
100pg／マイクロリットルの被分析DNA １マイクロリットルおよび洗浄バッファ９マイクロリットルがチューブ１に加えられる。１pg／マイクロリットルの被分析DNA 10マイクロリットルがチューブ２に加えられる。洗浄緩衝液７マイクロリットルおよび１pg／マイクロリットルの被分析DNA ３マイクロリットルがチューブ３に加えられる。１pg／マイクロリットルの被分析DNA １マイクロリットルおよび洗浄緩衝液９マイクロリットルがチューブ４に加えられる。0.1pg／マイクロリットルの被分析DNA １マイクロリットルおよび洗浄緩衝液９マイクロリットルがチューブ４に加えられる。洗浄緩衝液10マイクロリットルがチューブ６に加えられる。
【００８１】
６つのサンプルは摂氏37度で１時間培養される。洗浄緩衝液３マイクロリットルおよび0.74umのフルオレセインビーズ（YG BEADS，Inc.，Warrington，PA）２マイクロリットル（106ビーズ／マイクロリットル）が各サンプルに加えられる。培養がさらに摂氏37度で１時間続行される。培養後、捕獲ビーズは磁気的に収集され、自由標識ビーズを含む上澄みは除去される。捕獲ビーズは洗浄緩衝液50マイクロリットル中に再懸濁され、混合される。洗浄方法はさらに５回繰り返される。最後の洗浄後、ビーズは洗浄バッファ50マイクロリットル中に再懸濁される。顕微鏡のスライド上に各サンプルの適量（例えば５マイクロリットル）を置くことは、ここに述べた発明的ディジタル検出技術に基づいて実行される観察を許容する。
【００８２】
被分析物の正確なディジタル検出が放出されたフルオレセイン性あるいは他の標識の使用によって影響を受けることは、上記および本発明のクラスタ化技術に記述から明らかである。このようにサンプル中に極めて僅かの濃度存在する広い範囲の分析物を検出するかもしれない。
【００８３】
個々の刊行物あるいは出願が明確に個別的に参考文献として組み込まれることが示唆されているように参考文献として、全ての刊行物およびこの明細書に記載された特許出願は参考文献として組み込まれる。
【００８４】
先行発明は図面あるいは理解の明確化のための例によってある程度詳細に記述されているけれども、本発明の教える技術分野において通常の知識を有するものにとって、ある種の変更および改造は添付された請求項の精神あるいは範囲を逸脱することなしに成されうるものであることは殆ど明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のディジタル分子被分析物検出システムの好適な実施例の概略を表すブロック図である。
【図２】図２は、本発明の検出システムにおいて好適に導入される高感度光検出装置の正面図を示す。
【図３】図３は、分析されるサンプルが連続した画素領域の２次元配列に分割される方法を表す。
【図４】図４は、高感度光検出装置の第１の変形例を示す平面図である。
【図５】図５は、高感度光検出装置の第２の変形例を示す平面図である。
【図６】図６は、高感度光検出装置の第３の変形例を示す。
【図７】図７は、本発明のディジタル検出方法に利用される画素クラスタリング処理を表すフローチャートである。
【図１】
0003954089.tif 000002
【図２】
0003954089.tif 000003
【図３】
0003954089.tif 000004
【図４】
0003954089.tif 000005
【図５】
0003954089.tif 000006
【図６】
0003954089.tif 000007
【図７】
0003954089.tif 000008