(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体又は被検体類似体に対して特異性を有する第１の特異的結合剤と、前記第１の特異的結合剤に結合しない且つ前記被検体又は被検体類似体の検出を実現する複合体の形成に関与しない別の特異的結合剤との対照反応に関与することが可能な非特異的タンパク質と、で同時感作した直接粒子標識を含む、免疫検定に有用な試薬。
【請求項２】
前記第１の特異的結合剤が、第１の種において産生される抗体であり、前記非特異的タンパク質が別の種からの免疫グロブリンである請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記第１の特異的結合剤がマウス抗体である請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記非特異的タンパク質がウサギ免疫グロブリンである請求項２に記載の試薬。
【請求項５】
前記非特異的タンパク質だけで感作した直接粒子標識の第２の集団を更に含む請求項１から４のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６】
抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体とウサギＩｇＧとで同時感作した直径０．５ミクロン未満の着色ラテックス粒子を含む請求項２に記載の試薬。
【請求項７】
ウサギＩｇＧだけで感作した直径０．５ミクロン未満の同色の着色ラテックス粒子を更に含み、前記同時感作粒子対前記第２の粒子の比が少なくとも２：１である請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記同時感作粒子対前記第２の粒子の比が３：１である請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
標識化試薬が請求項１から８のいずれかに記載の通りであることを特徴とする、試料液体が前記標識化試薬を再構成して前記標識化試薬を検出区域内と対照区域内とに搬送し、これらの区域内での前記標識化試薬の結合が検定結果を示すタイプの検定装置。
【請求項１０】
前記検出区域が、前記被検体又は被検体類似体の直接的又は間接的捕獲手段として働くが前記非特異的タンパク質には結合しない固定化された特異的結合剤を含み、且つ、前記対照区域が、前記非特異的タンパク質に結合するが前記第１の粒子上の同時感作特異的結合剤には結合しない特異的結合剤を含む請求項９に記載の検定装置。
【請求項１１】
前記検出区域が、ｈＣＧの直接的又は間接的捕獲手段として働く固定化された特異的結合剤を含み、前記対照区域が固定化された抗ウサギＩｇＧ抗体を含み、且つ、前記標識化試薬が請求項６から８のいずれかに記載の通りである請求項１０に記載の検定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫検定（immunoassay）に有用な試薬と、この試薬を使用する検定装置とに係わる。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＰ−Ａ−２９１１９４に開示されている方法を使用する様々な検定（又はアッセイ）が現在利用可能であり、この方法では、多孔性ストリップのような多孔性担体内で実施される検定の結果を得るために、金ゾル又は着色ラテックス粒子のような粒子直接標識を使用する。多孔性ストリップにおける比較的小さな検出区域内の粒子標識の濃度が検定結果を示す。多孔性ストリップが対照区域を含むことが通例であり、この対照区域は通常は検出区域の下流に位置しており、この対照区域内では、試験が適正に完了したことを使用者が再確認することを可能にするための着色シグナルも生じさせられる。この着想に基づく市販製品の殆どでは、同一の粒子標識を使用して試験シグナルと対照シグナルを発生させる。
【０００３】
この方法は大半の検定状況に非常に良好に適合するが、シグナルの明瞭度を改善することが必要である極端な状況があり得る。例えば、被検体（analyte）の濃度が著しく高く、従って粒子標識の殆どが検出区域内で結合状態になり、その結果、持続する強い対照シグナルを与えるには不十分な標識しか残らない場合には、対照区域シグナルの表出が非常に微弱なものとなる可能性がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試験試料の中に存在する可能性がある被検体の量に関係なく検定シグナルの明瞭度の改善が得られる、検定用の試薬と装置を提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、過剰な量の標識試薬を使用せずに適切で明瞭な検定シグナルを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によって、本出願人は、被検体又は被検体類似体に対して特異性を有する第１の特異的結合剤と、この第１の特異的結合剤に結合しない且つ被検体又は被検体類似体の検出を実現する複合体の形成に関与しない別の特異的結合剤との対照反応に関与することが可能な非特異的タンパク質と、で同時感作した直接粒子標識を含む、免疫検定に有用な試薬を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この同時感作した粒子上の特異的結合剤の量は、その粒子上の非特異的タンパク質の量よりも多いことが好ましい。同時感作粒子上のこれらの２つの材料の間の重量比が少なくとも２：１であることが好ましい。この重量比が少なくとも約５：１であることが更に好ましく、約１０：１であることが理想的である。従って、被検体結合シグナル及び対照シグナルの形成に関する一次比活性は、被検体結合にとって有利である形に著しく偏らされている。
【０００８】
上記試薬は、必要に応じて非特異的タンパク質だけで感作した第２の集団の直接粒子標識を更に含むことが可能である。
【０００９】
上記の第１の特異的結合剤が、第１の種において産生される抗体であり、上記非特異的タンパク質が別の種からの免疫グロブリンであることが好ましい。例えば、第１の特異的結合剤はマウス抗体であることが可能である。
【００１０】
非特異的タンパク質は例えばウサギ免疫グロブリンであることが可能であるが、その免疫グロブリンが被検体に結合しないか又はその被検体の検出に関与するあらゆる試薬に結合しない限り、任意の種から得られる任意の免疫グロブリンを使用することが可能である。
【００１１】
本発明による好ましい試薬は、抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体とウサギＩｇＧとで同時感作した、直径０．５ミクロン未満の着色ラテックス粒子を含む。この試薬が更に、ウサギＩｇＧだけで感作した直径０．５ミクロン未満の同色の着色ラテックス粒子を含むことが好ましく、同時感作粒子対第２の粒子の重量比が少なくとも２：１であることが好ましく、約３：１であることが更に好ましい。
【００１２】
本発明の別の実施様態は、使用する標識試薬が上記パラグラフのいずれかで説明した通りであることを特徴とする、試料液体が標識試薬を再構成してその標識試薬を検出区域内と対照区域内とに搬送し、これらの区域内での標識試薬の結合が検定結果を示すタイプの検定装置である。
【００１３】
検出区域が、被検体又は被検体類似体に対する直接的又は間接的捕獲手段として働くが非特異的タンパク質には結合しない固定化された特異的結合剤を含み、且つ、対照区域が、非特異的タンパク質に結合するが第１の粒子上の同時感作特異的結合剤には結合しない特異的結合剤を含むことが好ましい。
【００１４】
上記粒子は、ストリップフォーマット検定（ｓｔｒｉｐ−ｆｏｒｍａｔ  ａｓｓａｙ）において易動性標識として使用可能な微小粒子であることが可能である。こうした検定は、ＥＰ−Ａ−２９１１９４、ＥＰ−Ａ−３８３６１９、ＷＯ  ９６／０９５５３、及び、ＷＯ  ９６／０９５４６を含む様々な刊行物に開示されている。適切な粒子は、直径が一般に約０．５ミクロン未満であるラテックス（ポリスチレン）粒子、金属ゾル（例えば、金ゾル）、非金属元素ゾル（例えば、セレンゾル又は炭素ゾル）、及び、染料ゾルを含む。
【００１５】
以下では、体液被検体の検査に使用可能な試験キット、特に、妊娠の判定に関連した尿被検体（ｈＣＧ）の在宅検査、又は、（例えば、ＬＨ及び／又はＥ３Ｇ及び／又はＰ３Ｇの測定による）人間の排卵サイクルの受精能力状態の在宅検査に使用可能な試験キットに特に関連付けて、本発明を説明する。これは単なる一例にすぎず、他の試料液体と被検体とに関連した他の様々な用途、例えば、癌マーカー検定、心臓マーカー検定、血中グルコース検定、濫用薬物検定、ホルモン検定、感染性疾病マーカー検定、治療薬剤検出試験、製造及び原料品質管理、並びに、廃水及び汚染レベルの試験に、本発明が使用可能であることが理解できるだろう。
【００１６】
検出区域が、ｈＣＧの直接的又は間接的捕獲手段として働く固定化された特異的結合剤を含み、対照区域が、固定化された抗ウサギＩｇＧ抗体を含み、且つ、易動性の標識化試薬が、抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体とウサギＩｇＧとで同時感作した、直径約０．５ミクロン未満の着色ラテックス粒子を含むことが好ましい。
【００１７】
本発明の新規の試薬の調製とこの試薬を使用する検定装置の製造は両方とも従来の方法を使用して行うことが可能である。市販の粒子標識（例えば、適切な大きさのラテックス（ポリスチレン）粒子）を、水性懸濁液中において、その粒子を感作するための上記の２つの材料の混合物と接触させることによって、同時感作された粒子標識を調製することが可能である。例えば、これらの材料は、ｈＣＧのα鎖に対するマウスモノクローナル抗体と、非特異的ポリクローナル抗体（例えば、ウサギＩｇＧ）との混合物であることが可能である。本明細書の他の箇所で述べる通りの適切な重量比でこれらの材料が存在することが必要である。標準的な手順の場合と同様に緩衝化条件下で同時感作を行うことが必要である。上記材料がラテックス粒子上に付着するのに十分な時間間隔を置いた後に、従来の方法（例えば、遠心分離、濾過、及び／又は、限外濾過）によって未結合の材料を分離させ、検定用にそのまま直ちに使用することが可能な従来通りの貯蔵緩衝液の形に同時感作粒子を再懸濁させることが可能である。同時感作手順の特定の例を次に示す。
【００１８】
本発明の利点を更に詳細に説明するために、検定ストリップ中の易動性直接標識として着色ラテックス粒子を使用する免疫クロマトグラフィーフォーマットに基づく妊娠試験に本発明の試薬を使用する事例を示すことが可能である。この検定ストリップ（例えば、Ｍｙｌａｒポリエステルで裏打ちした細孔径約８ミクロンのニトロセルロースで作成した検定ストリップ）は、付着した固定化特異的結合剤の２つの横行ライン、即ち、抗β  ｈＣＧマウスモノクローナル抗体を含む試験ラインと、この試験ラインの下流に配置した、ウサギＩｇＧに対する固定化マウスモノクローナル抗体を含む対照ラインとを含む。上記試験ラインの上流には、直径約０．３ミクロンの着色ラテックス粒子を含む易動性試薬が位置する。この易動性試薬は、ニトロセルロース上に位置するか、又は、試料液体（尿）がその流路を経てニトロセルロースに到達することが可能な流路内の上流にある別個の多孔性材料のパッド又はガーゼ（ｗｉｃｋ）中に位置することが可能である。易動性試薬は２つのラテックス粒子集団を含み、即ち、
（１）抗α  ｈＣＧマウスモノクローナル抗体と、対照ライン抗体をそれに対して産生させた同じウサギＩｇＧとで同時感作した粒子、及び、
（２）ウサギＩｇＧだけを有する同じラテックス粒子の第２の集団
を含む。
【００１９】
尿試料を添加すると、ラテックス粒子の移動が生じるだろう。尿がｈＣＧを含む場合には、同時感作粒子上の抗ｈＣＧモノクローナル抗体と試験ライン中の抗ｈＣＧ抗体との間にサンドイッチ複合体が形成されることが可能である。従って、同時感作粒子の少なくとも一部分が試験ライン内において結合状態になり、ｈＣＧの存在を示す着色シグナルを生じさせるだろう。例えば、試料中に存在するｈＣＧの量に対して同時感作粒子の量が過剰であるために試験ライン内において結合状態になっていない、残りの可動化された同時感作粒子は、対照ライン抗体と同時感作粒子上のウサギＩｇＧとの間の相互作用によって、対照ライン内の下流において結合状態となるだろう。これに加えて、ウサギＩｇＧだけを含むラテックス粒子の第２の集団が可動化され、試験ラインを越えて搬送され、対照シグナルを増強するだろう。
【００２０】
尿試料中のｈＣＧ濃度が比較的高い（しかし、見掛けｈＣＧシグナルの低下を引き起こす公知の「フック作用（ｈｏｏｋ  ｅｆｆｅｃｔ）」を生じさせるほどには高くない）場合には、抗ｈＣＧ粒子の大部分が試験ライン内で結合状態にあることを、本出願人は実際に確認している。典型的には、ｈＣＧ濃度が約５０００ｍＩＵ／ｍＬから約１５０００ｍＩＵ／ｍＬまでの範囲内である場合に、こうした状態が生じるだろう。こうした条件下では、強い試験ラインシグナルは得られるだろうが、対照ラインシグナルは非常に微弱（feint）であるか全く得られないだろう。しかし、試験ライン中で結合することが恐らく不可能なラテックス粒子の第２の集団の存在によって、こうした条件下であっても強い対照ラインシグナルを得ることが可能である。同時感作粒子と単感作粒子との適切な混合は約３：１である。サンドイッチフォーマット検定では、この粒子の組合せは、被検体濃度が極度に高い場合を除く大半の検定条件において、検定に必要な粒子の総数を最小限度に留めながら、良好で鮮明な試験シグナルと対照シグナルをもたらす。試験シグナルと対照シグナルを各々に全く別個の粒子集団によって発生させる場合には、これよりも著しく多い数の粒子が必要となるだろう。
【００２１】
【実施例】
この実施例では、本発明による試薬を調製するために使用することが可能な感作手順を説明する。
【００２２】
抗α  ｈＣＧモノクローナル抗体とウサギ免疫グロブリンとで同時感作したラテックス粒子試薬を、次のように調製することが可能である。
【００２３】
市販の直径約０．３ミクロンの青色着色ラテックス粒子の懸濁液（固体１０％）１０ｍＬを、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）４０ｍＬに加え、激しく撹拌する。この混合物を１３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清液を除去する。ラテックスペレットを上記緩衝液２０ｍＬ中に再懸濁させる。
【００２４】
更に別の上記懸濁液２０ｍＬに、マウス抗β  ｈＣＧモノクローナル抗体４００μｇ／ｍＬとウサギＩｇＧ  ５０μｇ／ｍＬとを加える。ラテックスを含む緩衝液と抗体を含む緩衝液の両方を水浴中で４０℃まで加熱し、この温度に達した時に、エタノール５ｍＬを各々の緩衝液に加える。その直後に抗体溶液をラテックス含有懸濁液に加え、マグネティックスターラーを使用して混合し、水浴中で６０分間インキュベートする。この時点で、予め４０℃に温めた上記緩衝液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液５０ｍＬを加え、このインキュベーションを４０℃で更に３０分間続ける。その後で、溶液を１３５００ｒｐｍで２５分間遠心し、上清液を除去する。ペレットを１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ９．０）５０ｍＬ中に再懸濁させ、固体２％を含む懸濁液を得る。必要に応じて２０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び１０％（ｗ／ｖ）のＢＳＡのような防腐剤を加えることが可能である。このラテックス懸濁液を検定装置の製造にそのまま直ちに使用することが可能である。
【００２５】
上記ウサギ免疫グロブリンだけで感作したラテックス粒子を調製するために、上記手順と同じ手順を使用することが可能である。この場合には、ラテックス粒子懸濁液２０ｍＬを、ウサギＩｇＧ  １５０μｇ／ｍＬを含む緩衝液２０ｍＬと組み合わせる。
【００２６】
同時感作粒子と単感作粒子の組合せを使用する検定装置のその後の製造においては、これら２つの感作粒子の懸濁液を適切な割合（適切な混合物をもたらす割合、例えば、これら２つの粒子集団が３：１で含まれる割合）で組み合わせ、単一の組合せ試薬として試験ストリップ上に又は検定装置の別個のパッド形成部品もしくはガーゼ形成部品中に付着させることが可能である。