(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する装置であって、標本中の特定の微小領域を選択し、該微小領域の部分に試薬液を分注し、該微小領域で反応操作が可能な微小反応手段を設けることを特徴とする標本中の微小領域測定装置。
【請求項２】
微小反応手段は、数ｐｌ以下〜数十ｎｌの液を吸引・滴下する微小ノズル機構部、その位置を制御する２次元または３次元移動機構部，微小領域の洗浄機構部を備えることを特徴とする請求項１記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項３】
微小反応手段は、反応のための試薬液を保管する試薬保管機能を備えることを特徴とする請求項１記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項４】
微小ノズル機構部は、試薬液を目的の微小領域に連続的にまたは間欠的に滴下する機能、または滴下・吸引を繰り返す機能を有することを特徴とする請求項２記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項５】
反応操作時、少なくとも標本の微小領域部分で、湿度を制御できる加湿機構部、また温度を制御できる恒温機能部を備えることを特徴とする請求項１記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項６】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する装置であって、標本中の特定の微小領域を選択し、該微小領域の部分に試薬液を分注し、該微小領域の部分で反応操作が可能な微小反応手段、及び該微小領域の部分の画像を測定し記録表示する手段、及びその制御手段を有することを特徴とする標本中の微小領域測定装置。
【請求項７】
該微小領域の部分の画像が蛍光像，発光像であることを特徴とする請求項６記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項８】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する装置であって、少なくとも標本の一部の領域の透過画像を測定・記録する手段と、透過画像から注目すべき微小領域を選別する手段を有し、該微小領域の部分に試薬液を分注し、該微小領域の部分で反応操作が可能な微小反応手段、及び該微小領域の部分の画像を測定し記録表示する手段、及びその制御手段を有することを特徴とする標本中の微小領域測定装置。
【請求項９】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する装置であって、少なくとも標本の一部の領域の透過画像を測定・記録する手段と、透過画像から注目すべき微小領域を選別する手段を有し、注目すべき微小領域の位置情報を記録する手段，位置情報に基づき標本を移動させる手段，該微小領域の部分に試薬液を分注し、該微小領域の部分で反応操作が可能な微小反応手段、及び該微小領域の部分の画像を測定し記録表示する手段、及びその制御手段を有することを特徴とする標本中の微小領域測定装置。
【請求項１０】
透過画像には、微分干渉像または位相差像を含むことを特徴とする請求項８または９のいずれかに記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項１１】
標本には、標本を個別識別するためのマーカ及び位置決めマーカを有し、それらのマーカを識別し、位置決めする手段を有することを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の標本中の微小領域測定装置。
【請求項１２】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する方法であって、標本の上の複数の指定された位置の部位に対し、順番にまたは同時に、微量の試薬液を滴下し、洗浄し、それらの部位の像を測定することを特徴とする標本中の微小領域測定方法。
【請求項１３】
細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する方法であって、少なくとも標本の一部の領域の透過画像を測定し、透過画像から注目すべき微小領域を選別し、注目すべき該微小領域の位置情報に基づき標本を移動させ、数ｐｌ以下〜数十ｎｌの試薬を一滴または連続的または間欠的に滴下して反応させ、該微小領域の部分の画像を測定することを特徴とする標本中の微小領域測定方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかに記載の微小領域測定方法であって、該微小領域を含む標本の一部の領域の透過画像と該微小領域の部分の画像を重ねて、または並べて表示する機能を有することを特徴とする標本中の微小領域測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞診や病理組織等の標本を顕微鏡等を用いて観察・検査するための反応・測定装置及び方法に関し、特に注目する特定の領域で迅速に試薬を反応させて、その結果を迅速に測定できる装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病理，細胞診等の検査は癌などの診断の上で重要な検査法であり、通常組織や細胞等を採取し、スライドガラスなどに塗抹すること等によって固定して標本を作製し、染色等の処理の後検査診断が行われる。また、細胞を蛍光標識抗体や核酸プローブと反応させ、感染や異常の検知を行う方法が、広く細胞診や感染症検査の手法として用いられている（特開２０００−３１０６３７公報、『臨床検査増刊号＜細胞診−２１世紀への展望＞Ｖol.４４，Ｎo.１１』 医学書院，東京、２０００年１０月刊行参照）。
【０００３】
染色には種々の手法が知られており、パパニコロウ染色，ヘマトキシリン・エオジン染色，ギムザ染色などが目的に合わせて適用される。たとえばパパニコロウ染色では、ギル・ヘマトキシリンによる核染色→水・エタノールによる洗浄→塩酸アルコールによる脱色分別→洗浄→アンモニアアルコールによる核の色出し→洗浄→細胞質染色→洗浄→細胞質染色→洗浄→脱水→透徹という作業工程を行うことで細胞が染色され、細胞診に利用される。このようなスライドガラスに固定された細胞を染色のための自動化装置はすでに市販されており、たとえば特開昭６２−２７６８２号等に記されている。
【０００４】
また、上記細胞診とは別に、ウイルス遺伝子，癌関連遺伝子等の注目するDNA配列等とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ，ＤＮＡプローブを活用し、組織，細胞中にその遺伝子があるか否かを直接検出する方法も近年開発されている。蛍光物質や発光物質等を標識したオリゴヌクレオチドプローブ，DNAプローブ等をつかうことで、検体中に存在する遺伝子をハイブリダイズして捕捉し、蛍光または発光測定等で検出することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細胞診等では、細胞の形，核・細胞質の大きさ，細胞同士の関係によって異常の有無等を判断している。
【０００６】
オリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡプローブ等では、目的の遺伝子ＤＮＡやＲＮＡの存在を定量的に検出する事ができる。遺伝子の存在は病気発生の危険因子があるという意味で重要な情報であり、またウィルス感染の場合等は、症状が発症する前に感染を判定でき、より確実な治療が可能になる。そこで、オリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡプローブ等による遺伝子の検出と、従来様の細胞診の両方の測定結果を合わせることでより有効な診断が可能になる。
【０００７】
通常、細胞中での遺伝子の検出は蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ，DNAプローブ等をハイブリダイズさせて蛍光検出により行う。また従来様の細胞診は上記の様な一般染色の後、透過光像測定により行う。ハイブリダイズと一般染色は各々手順が異なるため、通常同時に行わず個別に行われる。
【０００８】
通常、ハイブリダイズ反応には数時間から一晩程度と、長い時間を必要とし、操作性が悪い。スライドガラス上の標本に対して免疫染色する場合も１時間以上と時間がかかる。また、試薬液量も、例えば塗抹標本のスライドガラス上の塗抹標本部全面に試薬液を添加するため、必要な部分の液量に比較して大量の液量を必要とする。特に、ハイブリダイズ反応用の試薬は高価であり、コスト高になる。
【０００９】
本発明の目的は、上記の問題を解決し、塗抹した細胞標本などの標本に対して、ハイブリダイズ反応，免疫反応等を迅速に行う装置及び方法を提供することである。また、試薬液量を低減する装置及び方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、同一標本において、通常染色像または非染色透過光像を基に、異常細胞などの注目領域を識別し、その領域で迅速なハイブリダイゼーション，免疫染色等の反応操作を行い、ハイブリダイズ像や免疫染色像を測定し、より詳細な情報を迅速に得ることのできる装置及び方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、標本中の特定の微小領域を選択し、この部分にのみハイブリ反応等の反応操作が可能な微小反応手段を設けることにより、達成される。
【００１１】
微小反応機構部には、数ｐｌ（ピコリットル）以下ないし数十ｎｌ（ナノリットル）の液を吸引・滴下する微小ノズル機構部をもうけてもよい。そのノズル機構の位置を制御する２次元または３次元移動機構部及び微小領域の洗浄機構部を備える。また、反応させるための試薬液を保管する試薬保管機能も備えることができる。
【００１２】
微小ノズル機構部は、試薬液を目的の領域に連続的にまたは間欠的に滴下する機能、または滴下・吸引を繰り返す機能を有する。これにより、試薬液の反応効率が向上し、反応時間の短縮が可能になる。また試薬液を高濃度の溶液とすることで、反応効率の向上，反応時間の短縮を可能にする。なお、必要に応じ、少なくとも標本の微小領域部分で湿度を制御できる加湿機構または温度を制御できる恒温機能を備える。加湿機構と恒温機能の両者をそなえていてもよい。微小反応手段により反応操作した後の標本の画像、例えばハイブリダイゼーション蛍光画像または発光画像，免疫染色蛍光画像または発光画像等を測定し記録表示する画像測定記録表示機能及びその制御のための画像処理機能を備える。
【００１３】
また、上記目的を達成するため、測定対象の標本の透過画像（非染色での微分干渉像または位相差像，染色標本の透過カラー画像等）を測定・記録する機能、また、透過画像から特徴を抽出して、詳細を調べるべき注目領域を決定またはサポートする領域選別機能、さらに、選別した領域の透過画像と位置情報を記憶するデータ記録機能を備えることで、自動化が実現できる。
【００１４】
本発明によれば、細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する装置であって、標本中の特定の微小領域を選択し、該微小領域の部分で反応操作が可能な微小反応手段、及び該微小領域の部分の画像を測定し記録表示する手段、及びその制御手段を有することを特徴とする標本中の微小領域測定装置が提供される。
【００１５】
本発明は更に細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する方法であって、標本の上の複数の指定された位置の部位に対し、順番にまたは同時に、微量の試薬液を滴下し、洗浄し、それらの部位の像を測定することを特徴とする標本中の微小領域測定方法を提供する。
【００１６】
特に、本発明によれば細胞塗抹標本，組織標本等を観察・検査するために必要な試薬を滴下し反応させ画像等で測定・解析する方法であって、少なくとも標本の一部の領域の透過画像を測定し、透過画像から注目すべき微小領域を選別し、注目すべき該微小領域の位置情報を位置情報に基づき標本を移動させ、数ｐｌ以下〜数十ｎｌの試薬を一滴または連続的または間欠的に滴下して反応させ、該微小領域の部分の画像を測定することを特徴とする標本中の微小領域測定方法を提供することができる。
【００１７】
透過画像は、解像度の異なる複数の画像を記録する機能を設けてもよい。特に標本全体の透過画像に対して、注目領域に対して、より高解像度での測定画像を位置情報とともに持たせることでより、高度の解析が可能となる。
【００１８】
対話形式で注目領域を決定する場合は、透過画像をモニタに表示し、注目位置をオペレータが指示し、その位置を記録するとともに、必要なら同位置の透過像をより高解像度で測定して記録し、微小反応機構部で反応させ、その画像を記録する。なお、透過画像の測定・記録と、微小反応機構部による反応などの処理・及び画像計測・記録は、連続して行ってもよいし、また複数の標本の透過画像を順番に測定したのち、あとで注目領域の決定，微小反応機構での反応及び画像計測・記録を行ってもよい。この場合、各標本には、標本を識別するための識別手段、及び位置決め手段を備えることが望ましい。識別手段にはバーコード等、位置決め手段には標本のあらかじめ決めた位置に記した十字等の印とすることができる。また、同時にそれらマーカの読み取り機構部を備えてもよい。該微小領域を含む標本の一部の領域の透過画像と微小領域の部分の画像(たとえば蛍光画像)を重ねて、または並べて表示することで、注目部位をより詳細に判定する事ができる。
【００１９】
上記により、塗抹した細胞標本などの標本に対して、ハイブリダイズ反応，免疫反応等を迅速に行うことができる。また、その際の試薬液量を低減することもできる。さらに、同一標本において、通常染色像または非染色透過光像の測定から、ハイブリダイズ像や免疫染色像の測定を効率良く行うことができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面により説明する。
【００２１】
〔実施例１〕
図１に本発明の微小領域測定装置の構成図を示す。標本には、スライドガラスに貼りつけた組織切片または塗抹標本を使用し、周知のようなin situ ハイブリダイゼーション法等の手順に従い用意する。スライドガラス１ａ，１ｂ．．．は標本ストッカー２に挿入し、標本ストッカー２を装置本体に取り付けることで、挿入されている複数のスライドガラスが順番に処理される。スライドガラス１ａはスライドガラスローダ３により、測定用のステージ５に運ばれる。その際、バーコードリーダ４を通過する事によりスライドガラスが識別され、標本の情報として記録される。ステージ５上のスライドガラス１ａは、移動機構部６により移動でき、スライドガラス全面にわたって画像測定ができるようになっている。
【００２２】
まず、ステージ５上に運ばれたスライドガラス１ａは、透過照明光源７及びコンデンサレンズ８により上方からケーラー照明され、その透過光は対物レンズ９，励起光照明用フィルターミラーユニット１０，光路切替部１１，結像レンズ１２を通過して、光検出器１３により検出される。光検出器として２次元ＣＣＤカメラ等を使えば、そのまま透過光像として測定される。一般に測定視野はスライドガラスまたは標本の全面よりも小さいため、標本の全面の像を得るためには、移動機構部６により、視野をずらして複数枚の画像を取得し、合成する必要がある。光検出器として光電子増倍管等を使う場合は、必要な分解能まで照明光を細く絞り、移動機構部６によりスライドガラスを２次元に走査しながら、透過光強度を検出していくことにより、標本の全面の像を取得できる。その際、ＲＧＢ３色のフィルタを介して順番に取ることにより、カラー画像を得ることもできる。
【００２３】
透過光測定の時は、励起光照明用フィルターミラーユニット１０と光路切替部１１は素通しである。また、透過光像として、微分干渉像，位相差像等にすることも可能であり、目的に合わせて変更できる。その際は周知のように偏光板等の光学素子を適切な位置に追加する必要がある。測定した画像データはメモリ，
ＣＰＵを含む制御装置１７に蓄えられ、画像合成などを行い、モニタ１８に表示などする。得られた画像から、オペレータが設定したパラメータ条件に基づき、複数の注目領域を選び出し、領域番号、その位置を記録する。その際、それらの領域近傍をより高解像度で再測定し、高解像度透過光像を記録しておくとより詳細な解析が可能になる。
【００２４】
選ばれた注目領域に対して、その部分のみに標識プローブを含む反応試薬を滴下し、ハイブリダイゼーションや免疫染色などを局所的に行う。これらは微小反応機構部１９により行う。微小反応機構部１９は標本の上部に配置されており、反応操作時、透過照明光源７及びコンデンサレンズ８が横にずれ、微小反応機構部１９が標本の真上部に移動する。
【００２５】
微小反応機構部１９は図２及び図３に示すような構成になっている。図２は試薬液の分注機構部の構成図であり、標識プローブ液などの試薬液を分注するための微小ノズル部１００，移動機構１０１，シリンジポンプ１０２，ノズル洗浄液１０３、及び試薬１０４で構成される。図３は洗浄機構部の構成図である。洗浄ノズル１１０は内管１１１，外管１１２の２重管構造をしており、洗浄液１１５を送液ポンプ１１３により内管の先端から送出し、吸引ポンプ１１４により外管１１２から吸引する構造となっており、微小領域を洗浄できる。
【００２６】
注目領域の位置に一致するように、移動機構部６及び移動機構を有する微小反応機構部１９を調整し、数十ｎｌ以下の液滴を注目領域の標本部に分注する。通常は細胞１個〜数個分の領域に試薬を滴下するので、通常は数ｐｌから十数ｐｌの液を滴下する。この試薬液は、反応速度を速めるため、通常適用される周知の試薬濃度より数倍から数十倍の濃度の試薬液を使う。また、さらに反応効率を向上させるために、滴下を連続的にまたは間欠的に行ったり、滴下と吸引を繰り返して、攪拌効果を持たせることで反応時間が短縮できるようになる。反応後は、図３の様な機構により反応領域を洗浄する。これにより、微小領域での反応時間を短縮することができるようになる。反応は標本ひいてはスライドガラス全面に対して行わず、異常細胞などの注目すべき特定の位置，領域に対して実施するので、試薬液量を低減が可能である。
【００２７】
反応及び洗浄後、標識プローブの種類に応じて蛍光像，発光像等を計測する。蛍光像の場合、レーザ光源や水銀ランプ等の励起光源１６の光をレンズ１５，励起光照明用フィルターミラーユニット１０，対物レンズ９を通して標本の目的とする領域を照射することで蛍光体を励起し、蛍光を生じさせる。励起光照明用フィルターミラーユニット１０内には、蛍光励起及び検出用のフィルターユニットが組み込まれている。フィルターユニットは、通常の蛍光顕微鏡と同様に励起光源側に励起光源の光を単色にする励起フィルター１０ａ，励起光を反射し蛍光を通過させるダイクロイックミラー１０ｂ，蛍光成分をさらに分離するための干渉フィルター等の蛍光フィルター１０ｃで構成される。標本から発する蛍光は、対物レンズ９で集められ、励起光照明用フィルターミラーユニット１０を通って、蛍光成分を分離し、結像レンズ１２を通過して、光検出器１３により検出される。あらかじめ設定してある分解能と、露光時間，領域の大きさを基に蛍光像を計測及び保存する。
【００２８】
反応操作，蛍光像測定を、注目領域の数分だけ繰り返し、スライドガラスを標本ストッカー２にもどす。これらの操作をあらかじめ決められた手順に従い、制御装置１７が自動処理する。上記手順は蛍光検出の場合であるが、発光測定の場合は励起光源をつかわないようにすればほぼ同様に測定することができる。なお光路切替部１１は、目視にて標本を観察するために光路を接眼レンズ１４側に切り替える時に使用する。
【００２９】
以上の操作で、個々のスライドについて、スライドの番号，標本のほぼ全体の透過画像，標本中の注目位置のより高解像度な透過画像及び蛍光画像及びその位置情報、が記録される。測定結果の表示は、スライドの番号とともに標本の測定領域全体の透過画像の縮小イメージをモニタ画面の一部に表示し、併せて注目位置をその表示に重ねてマーキングする。モニタの別の位置に注目位置近傍の詳細透過画像と蛍光画像を並べて表示、または位置近傍の詳細透過画像と蛍光画像を合成して一つの画像として表示できるようにする。これにより、標本全体の把握、及び詳細観察が可能になり効果的な解析が可能になる。なお、透過画像としては、非染色での透過画像，微分干渉像，位相差像等のほか、パパニコロウ染色などの染色液で色づけされた標本のカラー画像とすることもでき、目的にあわせて選べるようにする。
【００３０】
以上により、通常染色像または非染色透過光像を基に、異常細胞などの注目領域を識別し、その領域で迅速なハイブリダイゼーション，免疫染色等の反応操作を行い、ハイブリダイズ像や免疫染色像を測定し、より詳細な情報を迅速に得ることができるようになる。特に蛍光像と透過光像との位置情報が正確に規定されるため、像の位置対応関係が明確であり、蛍光ＤＮＡプローブの局在を細胞像等の透過光像に照らし合わせて比較することができ、より詳細な解析が可能になる。また、図２に記載の分注機構部の替わりに、圧電素子などを使ったインクジェット方式の構成でも同様に実現できる。この場合、滴下がより高速にできる。なお、反応操作時には、反応領域の温度湿度を制御できる恒温恒湿ユニットをスライドガラス上部に配置するか、または全体が恒温恒湿槽内に配置することで、反応をより安定に行うことができる。また、上記実施例は、個々のスライドガラス標本に対して、透過光像測定，反応，蛍光像測定と順番に行っているが、すべてのスライドガラス標本に対して透過光像測定を行った後、反応，蛍光像測定を行ってもよい。そのために、スライドガラス標本には位置決め用のマーカが記され、その読みとり機能部を設けている（図示していない）。また、同一標本において、通常染色像または非染色透過光像を得ることができ、遺伝子や抗体の局在と、細胞像との比較が迅速に且つ容易に行えるようになる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、塗抹した細胞標本や組織切片標本などの標本に対して、ハイブリダイズ反応，免疫反応等を迅速に行うことができる。また、必要な領域のみに反応させるため、試薬液量が低減できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微小領域測定装置の構成図。
【図２】試薬液の分注機構部の構成図。
【図３】洗浄機構部の構成図。
【符号の説明】
１ａ，１ｂ…スライドガラス、２…標本ストッカー、３…スライドガラスローダ、４…バーコードリーダ、５…測定用のステージ、６…移動機構部、７…透過照明光源、８…コンデンサレンズ、９…対物レンズ、１０…励起光照明用フィルターミラーユニット、１１…光路切替部、１２…結像レンズ、１３…光検出器、１４…接眼レンズ、１５…レンズ、１６…励起光源、１７…制御装置、１８…モニタ、１９…微小反応機構部、１００…微小ノズル部、１０１…移動機構、102…ポンプ、１０３…ノズル洗浄液、１０４…試薬ｖ、１１０…洗浄ノズル、111…内管、１１２…外管、１１３…送液ポンプ、１１４…吸引ポンプ、１１５…洗浄液、１１６…廃液タンク。
【図１】
0003902939.tif 000002
【図２】
0003902939.tif 000003
【図３】
0003902939.tif 000004