(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーンスターチを含む澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに野菜汁および窒素源としてイーストを添加して発酵用培地を調整し、この培地に納豆菌であるバチルス  ズブチリス  ＡＫ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２９１）および乳酸菌を含む発酵菌を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を分取して食品用原液とすることからなる保健栄養食品の製造方法。
【請求項２】
発酵が、ｐＨ４．５〜６．５、２８〜３２℃の条件で２ヶ月以上行なう発酵である請求項１記載の保健栄養食品の製造方法。
【請求項３】
熟成が、ｐＨ４．０〜６．０、１３〜１７℃の条件で４ヶ月以上行なう熟成である請求項１または２に記載の保健栄養食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、健康増進に良い影響をもたらす食品である保健栄養食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの健康を増進させる保健栄養食品として、生体に必要な諸成分を体内で効率よく生成するように代謝活性を高めると共に、Ｔリンパ球を幼若化させて免疫機能を増強する作用があると考えられている発酵代謝物エキスとしてエンザミン（商品名）が周知であり、その製造方法が特開昭５４−１６０７８７号公報に開示されている。
【０００３】
同公報によると、生体内代謝調節活性因子を含む飲料原液は、イエローコンスターチをアミラーゼで充分に消化させた後、パン酵母と野菜の圧搾汁を混ぜて高圧殺菌し、冷却した培地を用い、この培地に、訓化した納豆菌や、麹菌、乳酸菌などの発酵菌を接種して恒温状態で２ヶ月以上発酵させ、さらに６ヶ月以上熟成させて、透明化した濾液を分取することにより製造することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記した従来の保健栄養食品の製造方法では、発酵性菌類として基材を効率よく資化するものが開示されていないために、生産効率が充分に高くなく、保健作用が確実に発揮される栄養食品が効率よく製造できないという問題点がある。
【０００５】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、発酵性菌類として効率よく基材を資化する菌株を採用し、また保健作用をより確実に発揮する保健栄養食品の製造方法にすることである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、この発明では、コーンスターチを含む澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに野菜汁および窒素源としてイーストを添加して発酵用培地を調整し、この培地に納豆菌であるバチルス  ズブチリス  ＡＫ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２９１）および乳酸菌を含む発酵菌を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を分取して食品用原液とすることからなる保健栄養食品の製造方法としたのである。
【０００７】
上記したように構成されるこの発明の製造方法によると、所定の発酵用培地で所定の納豆菌が効率よく糖および窒素源を資化し、発酵生産物として各種の活性を有するアミノ酸、リポ蛋白、リポ多糖（リポポリサッカライド）、リピッドなどを生成する。このようにして得られるアミノ酸（ショートペプチド）等は、生体内細胞調整のために活性を有する因子となるものを多く含んでいると考えられ、後述の実験結果からも明らかなように、抗糖尿病性（インシュリン分泌促進性）、高血圧抑制性（アンギオテンシン変換酵素の阻害性）、免疫向上性（ムコ多糖類によるＴリンパ球の活性化）、ダイエット効果（糖吸収抑制と脂質代謝促進性）、抗菌性が確実に発揮されるものと認められる。
【０００８】
そして、バチルス  ズブチリス  ＡＫは、コーンスターチを含む澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を基材とし、これに野菜汁および窒素源としてイーストを添加した発酵用培地で効率よく増殖するものであり、通常の納豆菌に比べて紫外線やＸ線が照射されたり、競合する乳酸菌が存在したり、高・低温環境などの過酷な環境や条件下でも生育する耐性を備えており、変異株または亜種と見られる性質がある。
【０００９】
保健作用をより確実に発揮する保健栄養食品を製造するためには、バチルス  ズブチリス  ＡＫ及び乳酸菌を含む発酵菌による発酵条件は、ｐＨ４．５〜６．５、２８〜３２℃の条件で２ヶ月以上発酵させることが好ましく、熟成条件は、ｐＨ４．０〜６．０、１３〜１７℃の条件で４ヶ月以上熟成させることが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
培地用基材として用いる糖化物は、コーンスターチを含む澱粉をアミラーゼで加水分解したものであり、コーンスターチはとうもろこし（子実）から蛋白質を分離し、精製したものであるが、粗精製のイエローコーンスターチを使用することがより好ましい。コーンスターチ以外の澱粉としては、大豆、米糠などを採用することができる。
【００１１】
この発明に用いる野菜汁は、野菜の種類を特に限定したものではないが、できればサポニンまたはＳ−アリル−Ｌ−システインを含む野菜であることが好ましい。このような野菜の具体例としては、白菜、キャベツ、ニンジン、薬用ニンジン、パセリ、セロリ、玉ねぎなどである。野菜汁は、これらの野菜を圧搾することにより、絞り出された水分を主成分とする汁であり、これを例えば約１２０℃で２０分程度の高圧滅菌処理を行なってから培地用基材に添加する。
【００１２】
窒素源として用いるイースト（酵母）は、食品の発酵や醸造に用いることのできる単細胞（真核）微生物であり、サッカロミセス属などが代表例となるものである。窒素源として利用するためのイーストは、死菌体であってもよく、イーストエキスや乾燥粉末であってもよい。
【００１３】
上記のように澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物、野菜汁およびイースト以外にも培地用基材には、必要に応じて蛋白質や無機塩類などを配合してもよい。そのような無機塩類としては、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。蛋白質としては、大豆蛋白その他の植物性蛋白質などが挙げられる。
【００１４】
また、澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物に対して、さらに糖分を添加することも好ましいことであり、例えばショ糖（グラニュー糖）、グルコース（ブドウ糖）、水飴などを添加する。
【００１５】
このようにして調整された発酵用培地に接種する発酵菌は、納豆菌であるバチルス  ズブチリス  ＡＫおよび乳酸菌を含む発酵菌である。
【００１６】
バチルス  ズブチリス  ＡＫは、通常の納豆菌であるバチルス  ズブチリスに対して、紫外線、Ｘ線、高・低温環境（１００℃、０℃）、乳酸菌との競合、芽胞を作りやすい培地［肉エキス５．０、ペプトン１０．０、塩化ナトリウム５．０、寒天１５．０、野菜（キャベツ、ニンジン、セロリ、パセリ）の圧搾汁、配合割合は全て重量部］などの諸条件を設定し、これらの過酷な環境や条件下でも死なずに生育する耐性菌を発見し、その経代培養を繰り返して選抜して得たものである。
【００１７】
上記菌株の菌学的性状は、以下の通りである。
(a) 形態学的性質
▲１▼  細胞の形及び大きさ
棹菌  1.0〜1.2×3.0〜50μｍ
▲２▼  細胞の多形性の有無
無し
▲３▼  運動性の有無
有り  （周毛性の鞭毛）
▲４▼  芽胞の有無
有り  楕円  菌体のほぼ中央
(b) 培養的性質
▲１▼  肉汁寒天平板培養
円形集落  白濁
▲２▼  肉汁液体培養
上部又は下部  菌凝体
(c) 生化学的性質
▲１▼  グラム染色          陽性
▲２▼  硝酸塩の還元        陽性
▲３▼  ＭＲテスト          陰性
▲４▼  ＶＰテスト          陽性
▲５▼  インドールの生成    陰性
▲６▼  硫化水素の生成      陰性
▲７▼  クエン酸の利用      陽性
▲８▼  カタラーゼ          陽性
▲９▼  生育の範囲
ｐＨ      5.5〜7.0
温度      25℃〜40℃
この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所に「（受託番号）ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２９１」として寄託されている。
【００１８】
この発明に用いる乳酸菌は、乳酸棹菌であるラクトバチルス（Lactobacillus）、乳酸球菌であるストレプトコッカス（Streptococcus）などであり、病原性のない菌類に限るのは勿論である。
【００１９】
この発明で採用することが好ましい発酵条件は、ｐＨ４．５〜６．５、２８〜３２℃の条件で２ヶ月以上である。上記より強い酸性域で所定温度未満の条件では、２ヶ月以上発酵させても、この発明に用いる所定の納豆菌が効率よく糖および窒素源を資化しないと推定され、得られた食品に所期した効果が充分得られない。上記の酸性域を越えて中性またはアルカリ性の条件で所定温度を超えて高温では発酵不充分で所定の納豆菌が効率よく糖および窒素源を資化せず、得られた保健栄養食品は上記同様に所期した効果が充分得られないものになる。
【００２０】
この発明で採用することが好ましい熟成条件は、ｐＨ４．０〜６．０、１３〜１７℃で４ヶ月以上である。上記より強い酸性域で所定温度未満の条件では、４ヶ月以上熟成させても、発酵生産物として各種の活性を有するアミノ酸、リポ蛋白、リポ多糖（リポポリサッカライド）、リピッドなどが充分に低分子量化しないと推定され、得られた食品に所期した効果が充分得られない。上記の酸性域を越えて中性またはアルカリ性の条件で所定温度を超えて高温で熟成させても、活性が低下すると推定され、得られた保健栄養食品は上記同様に所期した効果が充分得られないものになる。
【００２１】
生成した液状成分を分取するには、ろ過または遠心分離などの周知の分離手段を採用すればよく、得られた食品用原液は、そのまま利用できるが、必要に応じて濃縮するか、または希釈して利用することもできる。
【００２２】
因みに、この発明の製造方法で得られる健康食品は、生命現象を刺激して生体内の諸機能を強化促進させ、生体の恒常性（Homeostasis）を強固に維持し、健康の増進を図ることを目的としたものであり、その構成成分としては、生体内酵素合成を容易にするための物質、すなわち発酵によって得られる酵素を可逆的に切断して活性アミノ酸残基としたフラグメントを含み、その他にビオシチン、メバロン酸、リポ酸、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、エルゴステリン、マンナン（酵母マンナン）のような生体内で活用できる有用物質を含有する。このような有用物質は、ベスレッカ（Besredka）の提唱したアンチビールスの組織活性因子、フィラトフ（Filatov）の説明する生命源刺激素を含み、これらを生物化学的反応によって組み合わせ、安全かつ有効に作用するように処理した培養濾液であると考えられる。
【００２３】
また、培養濾液が発酵過程によって産生する酵素を種類毎に以下に例示列挙する。
▲１▼  酸化還元酵素：グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ
▲２▼  加水分解酵素：ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、タンナーゼ、ホスファターゼ、ラクターゼ、インベルターゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ
▲３▼  転移酵素：ヘキソナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ
▲４▼  ペプチド加水分解酵素：エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、アスペルギロペプチダーゼ、その他のプロテアーゼ
▲５▼  異性化酵素：ホスホトリオースイソメラーゼ、ホスホリボイソメラーゼ、ブドウ糖イソメラーゼ
▲６▼  合成酵素：アセチルＣｏＡリガーゼ
▲７▼  リアーゼ：ピルビン酸デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、アスパルターゼ
【００２４】
【実施例】
まず、イエローコーンスターチ２．３ｋｇ、大豆ペプトン０．５ｋｇ、米糠汁０．５ｋｇ、塩化カルシウム８０ｇ、食塩１５０ｇに精製水５０ｋｇを加え、加熱して溶解した。次いでこれを冷却し、アミラーゼ４０ｇを加えて充分に糖化させた。糖化終了後、グラニュー糖１．５ｋｇ、グルコース（ブドウ糖）１．５ｋｇ、酵母エキス４５０ｇ、水飴１．５ｋｇ、リン酸ナトリウム８０ｇ、野菜の圧搾汁（キャベツ、ニンジン、セロリ、パセリの合計）5ｋｇ、および精製水を加えて全量を１５０ｋｇにした。
【００２５】
そして、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．３〜７．８の範囲内に調整し、これを培養缶に入れて１２０℃で２０分間高圧滅菌した。これを冷却した後、バチルス  ズブチリス  ＡＫ株を接種し、温度３０±２℃の恒温室でｐＨ４．５〜６．５で６０日間発酵させ、次いで温度１５±２℃の恒温室でｐＨ４．０〜６．０の条件下で１８０日間熟成させて培養液を透明化させた。これをフィルターによってろ過し、１２５リットルの液状の保健栄養食品の原液（以下、培養濾液と称する。）を得た。
【００２６】
得られた保健栄養食品原液１００ｇ中の一般分析結果を以下の表１中に示す。なお、表中の記号φは、検出限界以下の微量を示している。
【００２７】
【表１】
0003902015.tif 000002
【００２８】
また、上記の培養濾液について、東ソー社製カラム（ＴＳＫgel G2500PWXL）を用い、移動相を水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の55:45:0.1混合液とする液体高速クロマトグラム（Shodex社製： GPC SYSTEM-21）でサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を測定し、そのときの検出器感度(紫外分光光度計：ｍＶ)を分子量既知の標準品の溶出時間と比較して分析した分子量分布の図表を図１に示し、この図表における分子量画分の面積が全体に占める割合（百分率）を表２に示した。
【００２９】
【表２】
0003902015.tif 000003
【００３０】
さらにまた、得られた培養濾液の安全性を確かめるため、ウィスター系ラットを用いて経口による急性毒性試験を行なった。その結果については、以下の通りである。
【００３１】
４倍濃縮液を給与量換算で雄１４．０、４２ｍｌ／ｋｇ、雌１４．０、４２ｍｌ／ｋｇ（通常量の１０倍または３０倍量）を投与しても雄、雌共に死亡例が認められず、中毒症状もなく、また体重の推移も一般状態も試験期間中清浄な状態で推移し、血液検査域も正常域にあった。１０ｍｌ／ｋｇの投与量は、ラットに対する投与量としては最高投与量と考えられ、供試品を通常投与量に換算すると経口ＬＤ５０値は、雄雌共に４２．０ｍｌ／ｋｇ以上と推測された。
【００３２】
次に、上記のようにして得られた培養濾液の抗菌性、高血圧ラットに対する投与の影響、人為的に誘発した糖尿病ラットに対する投与の影響を調べた。これらの試験方法と結果を以下に示す。
【００３３】
［培養濾液の抗菌性］
使用菌株およびその測定用培地は以下の通りである。
（１）エシェリヒア  コリ（ATCC25922）:DHL寒天培地
（２）サルモネラ  エンテリティディス(ATCC25923):DHL寒天培地
（３）クレブシェラ  ニューモニエ（ATCC13883）:BTB培地
菌液調整：トリプトブイヨン３０ｍｌに前培養液１００μｌを加える。３５℃で振とう培養し、適当な吸光度で培養を止め、１０5CFU/mlの菌懸濁液１０mlとなるようにリン酸緩衝液で希釈する。
除菌操作：調製した菌液を３０００rpm,１５分遠心し、上清を被検物質と等量で置換後、３５℃、２時間振とう反応させる。また、対照として何も入れていない菌懸濁液を同じ条件下に置く。
試料の塗布・培養・計数：リン酸緩衝液で段階希釈した試料１００μｌをそれぞれの測定用培地２枚にコンラージ棒で塗布し、３５℃、４８時間培養し、発育したコロニーを計数した。これらの結果は、下記の表３に示した。
【００３４】
【表３】
0003902015.tif 000004
【００３５】
［高血圧ラットに対する投与の影響］
５日間の検疫・訓化期間を置き、健常と判断された雄性の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）、６週令を１群７匹として３群に分け、試験群−１には培養濾液を等倍量、試験群−２には１０倍量、対照群には蒸留水を給水瓶に入れ、２８日間連続して所定の餌と共に自由に摂取させた。血圧測定は、週（７日）間隔で同時に行ない、この結果を表４に示した。
【００３６】
【表４】
0003902015.tif 000005
【００３７】
表４の結果からも明らかなように、対照群に比べて培養濾液投与群は、２週間後から上昇抑制を示した。
【００３８】
［人為的に誘発した糖尿病ラットに対する投与の影響］
７日間の検疫・訓化期間を置き、健常と判断された雄性のウィスターＳＴ系ラット（６週令）に対し、ストレプトゾトシンを体重１ｋｇ当たり４０ｍｇを尾静脈内に注入し、翌日から血糖値を測定し、血糖値がほぼ一定になるように１群５匹を２群に分け、試験群（ａ）に１４日間培養濾液をヒトの投与量の約１０倍量を給水瓶に入れて経口連続投与した。
【００３９】
【表５】
0003902015.tif 000006
【００４０】
表５の結果からも明らかなように、培養濾液投与群は６日目から僅かな上昇抑制傾向を示した。一方、対照群（ｂ）は、１５日後に約３．５倍の上昇率であり、培養濾液投与群より約８０％も高い上昇率を示した。これらの傾向から、培養濾液投与群は、血糖値上昇抑制傾向を示し、糖尿病の予防や進行抑制などに良い影響を与えていることが示唆された。
【００４１】
以下に得られた保健栄養食品原液を利用して製造した健康飲料、カプセル状健康食品、化粧水、動植物用栄養剤の配合例を表６〜９に示した。
【００４２】
健康飲料は、培養濾液８〜１６％に表６に示すような他の原料を配合して調製した。
【００４３】
【表６】
0003902015.tif 000007
【００４４】
カプセル状健康食品は、培養濾液を２０倍に濃縮し、表７に示すような他の原料を配合して調製した。
【００４５】
【表７】
0003902015.tif 000008
【００４６】
化粧水は、培養濾液８％に表８に示すような他の原料を配合して調整した。
【００４７】
【表８】
0003902015.tif 000009
【００４８】
動植物用栄養剤は、培養濾液２０％に、表９に示すその他の原料を配合して調製した。
【００４９】
【表９】
0003902015.tif 000010
【００５０】
【発明の効果】
この発明は、以上説明したように、所定の発酵用培地で所定の納豆菌で効率よく糖および窒素源を資化させ、さらに所定条件で発酵および熟成させて保健栄養食品を効率よく製造することができ、特に発酵性菌類として所定の菌株を採用し、これによって保健作用をより確実に効率よく液状の保健栄養食品を提供できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイズ排除クロマトグラフィーにおける検出器感度(ｍＶ)と溶出時間（分）の関係、およびこれから分析された培養濾液の分子量分布を示す図表
【図１】
0003902015.tif 000011