(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Doc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質のスクリーニング方法であって、
Doc2α類似体と、Munc13類似体とを、該候補物質の存在下および非存在下で反応させる工程；および、
結合能を増加または減少させる該候補物質を選択する工程；
を包含し、
ここで、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるが、ただし、配列番号２の全アミノ酸配列およびヒトDoc2βの全アミノ酸配列ならびにC2領域を含まず、
前記Munc13類似体が、配列番号４の851位〜1461位のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるが、ただし、配列番号４の全アミノ酸配列ならびにC2領域を含まない、方法。
【請求項２】
前記Doc2α類似体が、キャリアタンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Munc13類似体が、キャリアタンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Doc2α類似体を発現するベクターであって、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の９位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜78位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜90位のアミノ酸配列、およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、ベクター。
【請求項５】
Doc2α類似体とキャリアタンパク質との融合タンパク質であって、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の９位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜78位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜90位のアミノ酸配列、およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、融合タンパク質。
【請求項６】
Doc2α類似体であって、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の９位〜37位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜78位のアミノ酸配列、配列番号２の１位〜90位のアミノ酸配列、およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、Doc2α類似体。
【請求項７】
Doc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質のスクリーニングのために用いられる組成物であって、該組成物が、Doc2α類似体とキャリアタンパク質との融合タンパク質を含み、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるが、ただし、配列番号２の全アミノ酸配列およびヒトDoc2βの全アミノ酸配列ならびにC2領域を含まない、組成物。
【請求項８】
Doc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質のスクリーニングのために用いられる組成物であって、該組成物が、Doc2α類似体を含み、該Doc2α類似体が、配列番号２の13位〜37位のアミノ酸配列およびヒトDoc2βの14位〜38位のアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるが、ただし、配列番号２の全アミノ酸配列およびヒトDoc2βの全アミノ酸配列ならびにC2領域を含まない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Doc2αとMunc13との結合に影響を与えるアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法；その方法に用いるペプチド；およびそのペプチドにより神経伝達物質またはホルモンの放出を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質の放出に関与すると考えられるタンパク質として、Doc2α、Munc13-1などが報告された。
【０００３】
ヒトのcDNAライブラリーから単離され、発現されたDoc2タンパク質は、２つのＣ２領域を有することから、Double C2と命名されたタンパク質である[１および２]（以下、[]は、参考文献の番号を表し、参考文献はまとめて後に記載する）。Doc2タンパク質には、Doc2αおよびDoc2βのタンパク質が含まれる。
【０００４】
Doc2αは脳特異的に発現しており、Doc2αをPC12細胞で過剰発現させると、カルシウムイオン依存性の分泌が促進されることから、神経伝達物質の放出において重要な役割を果たしていると考えられている[３]。
【０００５】
Doc2βは、調べられた全ての組織で発現しており、細胞内に普遍的に存在する小胞輸送に関与していると考えられている[４]。
【０００６】
Doc2αおよびDoc2βは、上記のように２つのＣ２領域を有しているが、膜貫通領域およびラブフィリン(Rab)3A結合領域を持たない。その代わり、Doc2αおよびDoc2βは、Doc2に特異的なアミノ酸配列が保存されている領域（Doc2特異領域）を有している[４]。
【０００７】
Doc2αおよびDoc2βが有するＣ２領域とは、最初にプロテインキナーゼＣタンパク質[５および６]で発見された領域であり、カルシウムイオンおよびホスファチジルセリンと結合する領域である[７]。プロテインキナーゼＣ以外に、数種類のタンパク質がＣ２領域を持っていることが知られている。それらは、ホスフォリパーゼA2[８]、ホスフォリパーゼCγ[９]、unc-13[10]、Munc13-1[11]、シナプトタグミンＩ[12]、ラブフィリン3A[13]などである。
【０００８】
Munc13は、線虫（Caenorhabditis elegans）のunc-13遺伝子[14]と類似するラット遺伝子がコードしているタンパク質である。線虫のunc-13遺伝子が１つのＣ１領域および２つのＣ２領域を有するのに対して、Munc13は１つのＣ１領域および３つのＣ２領域を有する[10、11、15]。Ｃ１領域には、ホルボールエステル、ジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンなどのリン脂質が結合することが知られている[10および15]。線虫ではunc-13遺伝子の変異により、体内にアセチルコリンが蓄積し運動障害が起こることから、unc-13はアセチルコリンなどの神経伝達物質の放出に関与していると考えられている[16]。Munc13には３種類の類似したタンパク質Munc13-1、Munc13-2およびMunc13-3が存在していることが報告されている。いずれのMunc13も脳特異的に発現しており、Munc13-1はシナプス膜に存在することが報告されている[11]。これらのことから、Munc13もunc-13と同様に、神経伝達物質の放出に関与していると考えられている[11]。
【０００９】
以上のように、Doc2αおよびMunc13は、神経伝達物質の分泌において重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、Doc2αおよびMunc-13が、どの様な機構で神経伝達物質またはホルモンの分泌に関与しているかは全く明らかでなく、神経伝達物質またはホルモンの分泌を制御するために、その機構を解明することが望まれている。さらに、神経伝達物質またはホルモンの分泌に関与する物質のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることで、より効果的な神経伝達物質またはホルモンの制御が期待されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、神経伝達物質またはホルモンの分泌を制御する物質、その物質を用いるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Doc2αがMunc13-1（発見されている３つのMunc13のうちの１つ）と結合することを発見して、本発明を完成させたものである。この発見に基づいて、以下の種々の知見が得られた。
【００１２】
(1)Doc2αとMunc13-1の結合は、ホルボールエステルで処理することにより促進され、この促進効果はMunc13-1のＣ１領域を介して行なわれること、
(2)Munc13-1のDoc2αとの結合に必要な領域をPC12細胞に発現させると、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質およびホルモンの分泌が阻害されること、および、
(3)Munc13-1のDoc2αとの結合に必要な領域と、Doc2αとを同時に発現させると、カルシウムイオン依存性の分泌阻害効果は抑制されること。
【００１３】
以上から、ホルボールエステルで誘導されるDoc2αとMunc13-1との結合は、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質およびホルモンの分泌に重要な働きをしていると考えられる。このことは、ホルボールエステルがアゴニストとして作用していることを示唆する。
【００１４】
以上から、Doc2αとMunc13-1との結合の速度、強度等を測定することにより、結合を阻害する物質(アンタゴニスト)あるいは促進する物質(アゴニスト)がスクリーニングできる。スクリーニングされた物質は神経細胞の神経伝達物質放出機能を制御することができ、それにより、神経疾患の治療薬、例えば、抗痴呆薬、抗てんかん薬、向精神薬、あるいは脳代謝改善薬として使用することが可能となる。
【００１５】
本発明のDoc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質のスクリーニング方法は、Doc2αまたはDoc2α類似体と、Munc13またはMunc13類似体とを、該候補物質の存在下および非存在下で反応させる工程；および、結合能を増加または減少させる該候補物質を選択する工程；を包含する。
【００１６】
好ましい実施態様では、上記Doc2αまたはDoc2α類似体は、キャリアタンパク質との融合タンパク質である。
【００１７】
好ましい実施態様では、上記Munc13またはMunc13類似体は、キャリアタンパク質との融合タンパク質である。
【００１８】
好ましい実施態様では、上記Doc2αまたはDoc2α類似体は、Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの９位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜78位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜90位のアミノ酸配列、およびDoc2αの全アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１９】
好ましい実施態様では、上記Munc13またはMunc13類似体は、Munc13-1の851位〜1461位のアミノ酸配列、Munc13-1の840位〜1743位のアミノ酸配列およびMunc13-1の全アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２０】
好ましい実施態様では、上記Doc2α類似体は、Doc2βの14位〜38位のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２１】
好ましい実施態様では、上記Munc13類似体は、Munc13-2の1110位〜1695位のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２２】
本発明のDoc2αとMunc13-1との結合のアゴニストまたはアンタゴニストは、上記のいずれかの方法によって得られる。
【００２３】
本発明のDoc2αまたはDoc2α類似体を発現するベクターは、神経伝達物質またはホルモンのカルシウムイオン依存性の分泌を阻害するために用いられる。
【００２４】
好ましい実施態様では、上記Doc2αまたはDoc2α類似体は、Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの９位〜37位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜78位のアミノ酸配列、Doc2αの１位〜90位のアミノ酸配列、およびDoc2αの全アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２５】
好ましい実施態様では、上記Doc2αまたはDoc2α類似体は、Doc2βの14位〜38位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２６】
本発明のMunc13またはMunc13類似体を発現するベクターは、神経伝達物質またはホルモンのカルシウムイオン依存性の分泌を阻害するために用いられる。
【００２７】
好ましい実施態様では、上記Munc13またはMunc13類似体は、Munc13-1の851位〜1461位のアミノ酸配列、Munc13-1の840位〜1743位のアミノ酸配列およびMunc13-1の全アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２８】
好ましい実施態様では、上記Munc13またはMunc13類似体は、Munc13-2の1110位〜1695位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２９】
本発明の融合タンパク質は、Doc2αまたはDoc2α類似体とキャリアタンパク質との融合タンパク質である。
【００３０】
本発明の融合タンパク質は、Munc13-1またはMunc13類似体とキャリアタンパク質との融合タンパク質である。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列を含み、かつMunc13-1に対する結合能を有する、90個以下のアミノ酸残基からなる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、Munc13-1の851位〜1461位のアミノ酸配列を含み、かつDoc2αに対する結合能を有する、904個以下のアミノ酸残基からなる。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、Doc2α類似体であって、90個以下のアミノ酸残基からなる。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、Munc13類似体であって、904個以下のアミノ酸残基からなる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３６】
本発明においては、特に指示のない限り、当該分野で公知である組換えDNA法、タンパク質の分離および分析法、および免疫学的手法が採用され得る。これらの方法を行う際には、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用し得る。
【００３７】
（Doc2α）
本発明のスクリーニング方法に用いられるDoc2αは、天然源及び組換え法により入手し得る。Doc2α類似体には天然の完全長Doc2βが含まれ、さらに、天然のDoc2αの一部の配列であって少なくともDoc2αの13位〜37位のアミノ酸配列Mid（Munc13-1-interacting domain of Doc2α：配列表の配列番号１）を含むポリペプチド、およびDoc2αの13位〜37位のアミノ酸配列中のアミノ酸の１またはそれ以上の置換または欠失、または、これらのアミノ酸配列中への１またはそれ以上のアミノ酸の挿入または付加を有する配列を含むポリペプチドであってMunc13-1に対する結合能を有する任意のポリペプチドが含まれる。アミノ酸の１またはそれ以上の置換、欠失、挿入または付加を有するポリペプチドは、当業者に周知の方法、例えば組換えDNA技術で作成され得る。
【００３８】
Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列を含むポリペプチドの例としては、Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、Doc2αの１位〜37位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、Doc2αの９位〜37位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、Doc2αの１位〜78位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、Doc2αの１位〜90位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、およびDoc2αの全アミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。Doc2αは、キャリアタンパク質との融合タンパク質であってもよい。Doc2αの全アミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列を配列番号２に示す。
【００３９】
（Munc13）
本発明のスクリーニング方法に用いられるMunc13またはMunc13類似体は天然源及び組換え法により入手し得る。Munc13としては、Munc13-1、Munc13-2、およびMunc13-3が用いられ得る。Munc13類似体には、天然のMunc13の一部の配列であって少なくともMunc13-1の851位〜1461位のアミノ酸配列Did（Doc2α-interacting domain of Munc13-1：配列表の配列番号３）を含むポリペプチド、および、このアミノ酸配列中のアミノ酸の１またはそれ以上の置換または欠失、または、これらのアミノ酸配列中への１またはそれ以上のアミノ酸の挿入または付加を有する配列を含むポリペプチドであってDoc2αに対する結合能を有する任意のポリペプチドが含まれる。Munc13-1の全アミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列を配列番号４に示す。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法に用いられるDoc2α、Doc2α類似体、Munc13およびMunc13類似体は、キャリアタンパク質との融合タンパク質であり得る。キャリアタンパク質として使用されるタンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ（６つの連続するヒスチジンからなるアミノ酸配列）、およびマルトース結合タンパク質が挙げられる。これらの融合タンパク質は、例えば当業者に周知の組換えDNA法で調製され得る。
【００４１】
（Doc2αと結合するポリペプチドをコードするDNAの分離）
Doc2αまたは2α類似体と結合するポリペプチドをコードするDNAは、例えばtwo-hybrid法を用いて単離され得る。two-hybrid法の原理は、転写因子に存在するDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインの２つのドメインを利用する。転写因子のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインの２つのドメインが同一タンパク質分子として発現した場合、転写が活性化される。しかし、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインの２つのドメインを切り離して発現させても転写は活性化されない。他方で、別々に発現させたDNA結合ドメインと転写活性化ドメインとの結合を仲介する物質ＸとＹとが存在すれば、DNA結合ドメインと転写活性化ドメインとが同一タンパク質分子として機能し、転写を活性化させる。従って、同一細胞内で、転写活性化ドメインと物質Ｘとの融合タンパク質、およびDNA結合ドメインと物質Ｙとの融合タンパク質を同時に発現させ、転写活性を測定することにより、物質Ｘと物質Ｙとが結合するか否かが決定される。
【００４２】
本発明におけるtwo-hybrid法は、まず、Doc2αのMunc13-1との結合領域のコード配列を転写活性化ドメインのDNA配列に結合させたプラスミド、およびスクリーニングされるポリペプチドのコード配列をDNA結合ドメインのDNA配列に結合させたプラスミドを作製する。そして、この２つのプラスミドを、レポーター遺伝子（例えばβ-ガラクトシダーゼ遺伝子）およびそのプロモーター配列を有する宿主に同時に形質転換して、レポーター遺伝子の発現を確認する。レポーター遺伝子の発現が確認されれば、Doc2αと結合するポリペプチドのDNAが取得される。なお、レポーター遺伝子およびそのプロモーター配列は、上記２つのプラスミドのいずれかに含まれていてもよい。
【００４３】
Doc2αまたはDoc2α類似体と結合するポリペプチドをコードするDNAは、種々のライブラリーから得られ得る。哺乳動物の脳由来のcDNAから作製されたライブラリーが好ましく、ヒトまたはラットの脳由来のcDNAから作製されたライブラリーがより好ましく、ラットの脳由来のcDNAから作製されたライブラリーがさらにより好ましい。
【００４４】
（Doc2αと結合するタンパク質の同定およびそのタンパク質をコードする全長cDNAの単離）
上記で得られたDNA配列を、プログラムBLASTおよびデータベースGenBankを用いてホモロジー検索し、Munc13-1遺伝子の一部であることが確認される。次に、このDNA配列をプローブとして標識を行い、例えば、コロニーハイブリダイゼーション方法を用いて任意のcDNAライブラリーをクローニングすることにより、Munc13-1遺伝子の全長をコードするcDNAを単離することができる。単離されたcDNAは、当業者に周知の方法によって配列決定される。
【００４５】
（Munc13-1のDoc2α結合領域の決定）
上記で得られるMunc13-1の全長cDNAから、種々の欠失変異体DNAを作製し、このDNAによりコードされるペプチドとDoc2αまたはDoc2α類似体との結合の有無および強さを調べることにより、Munc13-1のDoc2α結合領域を決定し得る。
【００４６】
これは、例えばtwo hybrid法を用いて以下のように行い得る。上記で得られるMunc13-1全長cDNAの配列をもとに欠失変異体を得るための種々のプライマーを設計する。１つの欠失変異体ごとに、全長cDNA（鋳型DNA）、Ampli Taq DNA Polymerase、１組のプライマー、10×PCR用緩衝液、およびdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を用いて、使用するプライマーに適切なPCR反応条件でPCR反応を行い、欠失変異体DNA断片を増幅する。得られた欠失変異体DNA断片を、two hybrid法におけるDNA結合ドメインをコードするプラスミドに挿入し、プラスミドを作製する。他方で、Doc2αのアミノ酸配列の１位〜90位に相当するcDNAを、two hybrid法における転写活性化ドメインをコードする遺伝子を含むプラスミドに挿入してプラスミドを作製する。この作製した２つのプラスミドで同一の細胞を形質転換する。上記の「Munc13-1のDoc2α結合領域の決定」と同様に、形質転換細胞におけるレポーター遺伝子の発現の有無を確認することにより相互作用の有無を知ることができる。また、レポーター遺伝子の発現量を測定することにより結合の強さを知ることができ、種々の欠失変異体の結合の強さを比較することにより、Doc2αとの結合に必要な部位を特定し得る。
【００４７】
あるいは、Doc2αを単離し、種々の改変されたMunc13タンパク質との結合性を検討することによっても、結合領域を決定し得る。
【００４８】
（Doc2αのMunc13-1結合領域の決定）
Doc2αの全長cDNAから、種々の欠失変異体DNAを作製し、このDNAによりコードされるペプチドとMunc13-1との結合の有無および強さを調べることにより、Doc2αのMunc13-1結合領域を決定し得る。
【００４９】
これは、上記「Munc13-1のDoc2α結合領域の決定」と同様にして、Doc2α（１位〜90位）の代わりにMunc13-1（851位〜1461位）を用い、上記のMunc13-1の欠失変異体の代わりにDoc2αの欠失変異体を用いたtwo-hybrid法により行い得る。
【００５０】
（組換えDoc2αおよびMunc13タンパク質の精製）
本発明のスクリーニング方法に用いられるDoc2αまたはDoc2α類似体およびMunc13またはMunc13類似体は、Doc2αまたはDoc2α類似体をコードするDNAまたはMunc13またはMunc13類似体をコードするDNAを、適切なベクターに組み込んだ発現ベクターを用いて調製され得る。この発現ベクターを、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体を作製し培養する。目的のタンパク質は当業者に周知の精製方法（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、HPLCなど）を用いて培養物中から精製される。それぞれのタンパク質をキャリアタンパク質との融合タンパク質として発現させる場合、キャリアタンパク質を特異的に吸着するカラム（例えば、アフィニティーカラム）を用いることにより、融合タンパク質を容易に精製し得る。
【００５１】
（インビトロでのDoc2αとMunc13との結合）
Doc2αまたはDoc2α類似体およびMunc13またはMunc13類似体を用いて、その結合をインビトロで試験する。これは例えば、以下のような方法で行われる。
【００５２】
Munc13またはMunc13類似体をコードするDNAを、適切なin vitro translation用プラスミドに挿入し、得られたプラスミドを用いて標識アミノ酸の存在下でin vitro translationを行い、そして標識されたMunc13またはMunc13類似体を得る。他方でDoc2αまたはDoc2α類似体（キャリアタンパク質との融合タンパク質であり得る）を、カラムに吸着させる。ペプチドを吸着させたカラムに標識されたMunc13またはMunc13類似体をアプライし、適切な条件（例えば、４℃で５時間）で結合緩衝液中でインキュベートし、Doc2αまたはDoc2α類似体とMunc13またはMunc13類似体とを結合させる。結合したMunc13またはMunc13類似体をカラムから溶出し、溶出物のSDS-PAGEを行い、得られた泳動ゲルを用いてＸ線フィルムを感光および現像することによって確認することにより、結合したタンパク質の存在および量を確認し得る。
【００５３】
（インビボでのDoc2αとMunc13との結合の確認）
Doc2αまたはDoc2α類似体と、Munc13またはMunc13類似体とがインビボで結合していることを確認するために、Doc2αまたはDoc2α類似体をコードするDNAおよびMunc13またはMunc13類似体をコードするDNAを、それぞれ異なるタグとの融合タンパク質として発現し得るように適切なベクターに挿入して発現ベクターを作製する。得られた２つの発現ベクターを細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して同時に発現させる。細胞を溶解し、一方のタグを吸着するカラムを用いてタンパク質を吸着し、吸着されたタンパク質に他方のタグがあるか否かを検出する。検出は、ウエスタンブロッティング法によって行い得る。あるいは、いずれか一方をタグしておき、タグを吸着させ、他方のタンパク質を抗体を用いるウエスタンブロッティング法により検出する方法もある。タンパク質が検出されれば、Doc2αまたはDoc2α類似体とMunc13またはMunc13類似体とがインビボで結合することが示される。
【００５４】
（カルシウムイオン依存性の、神経伝達物質の分泌またはホルモンの分泌に対するDoc2α類似体またはMunc13類似体の影響）
Doc2α類似体またはMunc13類似体をコードするDNA断片を適切なベクターに挿入し、発現ベクターを作製する。この発現ベクターを、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質またはホルモン分泌を行う細胞に導入し、形質転換体を作製する。この形質転換体および非形質転換体を、カルシウムイオン依存性分泌の誘導条件下または非誘導条件下で培養し、分泌物の量を測定する。形質転換体の分泌量と、非形質転換体の分泌量を比較することにより、Doc2α類似体またはMunc13類似体がカルシウムイオン依存性分泌に影響を及ぼすか否かが確認される。
【００５５】
（Doc2αとMunc13-1との結合に影響する物質のスクリーニング）
上記の「インビトロでのDoc2αとMunc13との結合」のアッセイ方法において、アゴニストまたはアンタゴニストの候補物質を添加した結合緩衝液を用い、候補物質を用いないときのDoc2α類似体とMunc13類似体との結合量と、候補物質を添加したときのDoc2αまたはDoc2α類似体とMunc13またはMunc13類似体との結合量を比較することにより、Doc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができる。タンパク質の結合量を増加させる物質はアゴニストであり、タンパク質の結合量を減少させる物質はアンタゴニストである、と判定される。
【００５６】
（カルシウムイオン依存性の神経伝達物質またはホルモン分泌の調節のために用いられるベクター）
Doc2αまたはDoc2α類似体、あるいはMunc13-1またはMunc13-1類似体をコードするDNA断片を適切なベクターに挿入し、発現ベクターを作製する。この発現ベクターをカルシウムイオン依存性の神経伝達物質またはホルモン分泌を行う細胞に導入し、この細胞内でDoc2αまたはDoc2α類似体、あるいはMunc13-1またはMunc13-1類似体を発現させることにより、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質またはホルモン分泌を阻害することができる。この方法を用いて、例えば、痴呆症を治療することができる。
【００５７】
ここで用いられるベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、Human Immunodeficiency Virus(HIV)ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【００５８】
【実施例】
実施例１
酵母細胞を用いたtwo-hybrid systemによるDoc2αに結合するタンパク質のクローニング
文献[17]に記載の方法に基づいて、ヒトDoc2αのアミノ酸残基番号１〜90とLexAのDNA結合領域とを融合タンパク質として発現するプラスミドpBTM116-Doc2α(1-90アミノ酸)を構築した。
【００５９】
スクリーニングの対象となるライブラリーは、１×106個の独立したクローンを持つ、ラット脳由来cDNAが挿入されているrat brain MATCHMAKER cDNAライブラリー（Clontech社製、CA、USA）を用いた。このライブラリーのプラスミドは、転写活性化ドメインをコードする配列を有している。
【００６０】
プラスミドpBTM116-Doc2α(1-90アミノ酸)およびrat brain MATCHMAKER cDNAライブラリーを用いて、文献[18]に記載される方法で酵母L40株（His要求株）を形質転換した。形質転換された酵母を、ヒスチジンを含まず、2.5mM 3-アミノ1H-1,2,4-トリアゾールを含むSD-LWH培地（0.67％ Yeast nitrogen base w/o amino acid; Difco社製、２％ グルコース、300mg/l L-イソロイシン、1500mg/l L-バリン、200mg/l L-アデニンヘミ硫酸塩、200mg/l L-アルギニン塩酸、300mg/l L-リジン塩酸、200mg/l L-メチオニン、500mg/l L-フェニルアラニン、2000mg/l L-トレオニン、300mg/l L-チロシン、200mg/l ウラシル）で作製したプレート上でコロニーを形成し、かつβ-ガラクトシダーゼ活性の発現がみられる陽性クローンを選択した。β-ガラクトシダーゼ活性の発現については、常法に従ってアッセイを行った。これにより、７個の陽性クローンを得た。この陽性クローンをそれぞれ、Sanger法[19]により、Autoread Sequencing Kit（Pharmacia Biotech社製、Uppsala、Sweden）を使用して配列決定を行なった。その結果、これら７個のクローンは全く同じ配列を持っていることが判明した。このヌクレオチド解析により、最も長いcDNAを持つ陽性クローンは、ラットMunc13-1のアミノ酸残基番号840-1743の領域がGAL4の転写活性化領域の下流の制限酵素EcoRIの部位で融合しているタンパク質を発現することがわかった。
【００６１】
実施例２
Munc13-1遺伝子全長cDNAの単離
two-hybridスクリーニングで得られたMunc13-1 cDNA断片（Munc13-1のアミノ酸残基番号840-1743の領域をコードする）を、マルチプライムDNA標識システム（アマシャム・ジャパン社製）を用いて製造者の説明書に従って32Pで標識し、これをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション方法を用いてラット脳cDNAライブラリー（rat brain MATCHMAKER cDNAライブラリー; Clontech社製、CA、USA）をスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーション方法は常法[20]に従って以下のように行った。ラット脳cDNAライブラリーを構成している（常法に従って導入してある）大腸菌DH5αをLB-プレート（10g トリプトン、５g イーストエキストラクト、10g NaCl、15g アガー/l）に播き、一晩、37℃にて培養した。プレートに生えた大腸菌のコロニーを、ナイロン膜（Hybond-N+、アマシャム・ジャパン社製）にトランスファーし、その後、SDS処理(10％ SDS)、アルカリ変性（0.5M NaOH、1.5M NaCl）、および洗浄(２×SSC)（1×SSCは0.15M NaCl、0.015M Sodium Citrateよりなる）の操作を行った。洗浄後のナイロン膜は、６×SSC、５×Denhardt's solution、0.5％ SDS、50％ホルムアミド、100μg/mlサケ精子DNAからなるハイブリダイゼーション溶液中で、プローブとして32Pで標識したMunc13-1 cDNA断片（430-bp）を用いて、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を、２×SSC＋0.5％ SDS中で室温にて10分間、１×SSC＋0.5％ SDS中で65℃にて30分間（２回）、および0.1×SSC＋0.5％ SDS中で65℃にて30分間（２回）で洗浄した後、Ｘ線フィルム（Kodak社製）を感光させ、そのフィルムを現像して、プローブと反応するコロニーを同定した。最終的に１つのcDNAクローンが得られた。cDNAの塩基配列は、Sanger法[18]に従い、Autoread Sequencing Kit（Pharmacia Biotech社製、Uppsala、Sweden）を使用して配列決定した。塩基配列の決定の結果、このクローンは、ラットMunc13-1の全長を含んでいることが明らかとなった。
【００６２】
実施例３
Munc13-1のDoc2α結合領域の決定
クローニングしたラットMunc13-1遺伝子全長cDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を以下のように用いて図１に示すDNA断片を得た。上記実施例２で得られたクローンから常法に従って得たプラスミドを制限酵素EcoRIで切断したものを鋳型DNAとして用いた。鋳型DNA(ラットMunc13-1 cDNA断片)0.5ng、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、２種のプライマーをそれぞれ50pmol、および10×PCR用緩衝液（100mM Tris-HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.1％ gelatin)５μlを混和し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとした。それぞれのDNA断片を得るために用いたプライマーは、DNA断片840−1743については、正プライマー５’-CATGAATTCCTTCACATCAGTGTGGAGATC-３’（配列番号５）、逆プライマー５’-CATGAATTCCATGGGCGCAGGCGCGGCACC-３’（配列番号６）；DNA断片851−1461については、正プライマー５’-CATGAATTCGAGAAGGTGGCACCCTACCATG-３’（配列番号７）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGCTTGGCAGTTTCACCCTGCC-３’（配列番号８）；DNA断片851−1336については、正プライマー５’-CATGAATTCGAGAAGGTGGCACCCTACCATG-３’（配列番号７）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGTGGCAAACACGTGGCTGAG-３’（配列番号９）；DNA断片851−1208については、正プライマー５’-CATGAATTCGAGAAGGTGGCACCCTACCATG-３’（配列番号７）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGAGTGCACCATGCAGGAAGTC-３’（配列番号１０）；そしてDNA断片1208−1461については、正プライマー５’-CATGAATTCCTCGAGGGGGACAAGAAGGATG-３’（配列番号１１）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGCTTGGCAGTTTCACCCTGCC-３’（配列番号８）である。PCR反応の反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返した後、72℃で５分間であった。PCR反応産物を、２％アガロースゲル（SeaKem Agarose、FMC社製、宝酒造より購入）で泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そしてゲルから単離した。単離された反応産物を、上記のようにEcoRＩで消化し、その後、常法に従って酵母発現プラスミドpGAD424（Clontech社製、CA、USA）の制限酵素EcoRＩ部位に挿入した。
【００６３】
Did部分の欠失しているDNA断片１−851＋1461−1743については、DNA断片１−851を得るために、正プライマー５’-CATGAATTCATGAAGCGACATGGCCGGCGA-３’（配列番号１２）と逆プライマー５’-CATAGCGCTCTTTCCCGAAATTGGAGGCAGCG-３’（配列番号１３）とのプライマーセットを用い、DNA断片1461−1743を得るために、正プライマー５’-CATAGCGCTAGCCACTCAGACGGGACACAAATG-３’（配列番号１４）と逆プライマー５’-CATGAATTCCTAGGGCGCAGGCGCGGCACC-３’（配列番号１５）とのプライマーセットを用いてそれぞれ上記のようにPCRを行い、それぞれのDNA断片を増幅および単離した。そして単離されたそれぞれの増幅断片をEcoRIおよびEco47IIIで消化し、これをEcoRIで消化されたpGAD424と混合し、常法に従って３つのDNAの連結を行い、pGAD424の制限酵素EcoRI部位にDNA断片１−851と1461−1743とが正方向で連結されたものを選択した。
【００６４】
得られたプラスミドのいずれか１つと先述したpBTM116-Doc2α(1-90アミノ酸)をともに用いて文献[17]に記載されているように酵母L40株を形質転換し、β-ガラクトシダーゼ活性の発現を指標として、Munc13-1のDoc2α結合領域の決定を行った。
【００６５】
β-ガラクトシダーゼ活性は、文献[21]に従って以下の方法で測定した。Munc13-1遺伝子の種々のDNA断片のいずれか１つを挿入したpGAD424プラスミドとpBTM116-Doc2αプラスミドを用いて形質転換された酵母を、５mlのSD-LW培地（Yeast nitrogen base w/o amino acid; Difco社製：２％ グルコース、300mg/l L-イソロイシン、1500mg/l L-バリン、200mg/l L-アデニンヘミ硫酸塩、200mg/l L-アルギニン塩酸、200mg/l L-ヒスチジン塩酸、300mg/l L-リジン塩酸、200mg/l L-メチオニン、500mg/l L-フェニルアラニン、2000mg/l L-トレオニン、300mg/l L-チロシン、200mg/l ウラシル）中で30℃にて一晩培養し、集菌後５mlの0.27％メルカプトエタノールを含むＺ緩衝液（16.1g/lリン酸水素二ナトリウム七水和物、5.5g/lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.75g/l塩化カリウム、0.246g/l硫酸マグネシウム七水和物）中に懸濁した。この懸濁液のOD600を分光光度計にて測定後、500μlを新しいエッペンドルフチューブにとり、液体窒素にて凍結後30℃で融解することを２回繰り返した。これを30℃のインキュベーターに置き、ここに基質溶液（４mg/ml o-ニトロフェニルガラクトシドを含むＺ緩衝液）を100μl加えた。基質溶液添加時を０分として正確に10分後、250μlの１M Na2CO3を加えて反応を停止した。この反応液を14,000rpmで10分間遠心後、その上清のA420を分光光度計で測定した。β-ガラクトシダーゼ活性(unit)は以下の式で計算した。
【００６６】
unit=(1000×A420)/(t×V×OD600×１/0.85)
t：反応時間（分）
V：反応に使用した培養液量（ml）
以上の実験の結果を図１に示す。
【００６７】
図１は、Munc13-1およびDoc2αの一次構造模式図、酵母two-hybrid systemに用いた各変異体、X-galの発色反応の強さから推定した結合能力、およびβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。β-ガラクトシダーゼ活性の強さは、結合能力の強さを示す。Munc13-1およびDoc2αの一次構造模式図のＣ１はＣ１領域を、Ｃ２はＣ２領域を示し、結合能の＋＋は強い発色を、＋は弱い発色を、−は発色しなかったことを示す。Munc13-1のアミノ酸残基番号851-1461の領域を含むペプチドの結合能が強く、この領域のアミノ酸残基に欠失が存在すると結合能が著しく減少することから、Munc13-1のアミノ酸残基番号851-1461の領域がDoc2αとの結合に必要であることが明らかとなった。従って、この領域をDid(Doc2α-interacting domain of Munc13-1)と命名した。Didの配列を、配列番号１に示す。
【００６８】
実施例４
Doc2αのMunc13-1結合領域の決定
ヒトDoc2α遺伝子全長cDNAから、以下のようにPCRを用いて図２に示すDNA断片を得た。PCR反応は、鋳型DNA(ヒトDoc2α cDNA断片)0.5ng、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、２種のプライマーをそれぞれ50pmol、および10×PCR用緩衝液５μlを混和し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとして行った。それぞれのDNA断片を得るために用いたプライマーは、DNA断片１−90については、正プライマー５’-CATGAATTCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３’（配列番号１６）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGCGGTGGCATCATCCGAGTC-３’（配列番号１７）；DNA断片１−78については、正プライマー５’-CATGAATTCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３’（配列番号１６）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCACTCCGCACCATCCTCAGGCGT-３’（配列番号１８）；DNA断片１−37については、正プライマー５’-CATGAATTCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３’（配列番号１６）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGGGAAGTAGTCAGAGATCTG-３’（配列番号１９）；DNA断片９−37については、正プライマー５’-CATGAATTCATGACCATCAACATCCAGGAG-３’（配列番号２０）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGGGAAGTAGTCAGAGATCTG-３’（配列番号１９）；DNA断片13−37については、正プライマー５’-CATGAATTCATCCAGGAGCACATGGCCATC-３’（配列番号２１）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGGGAAGTAGTCAGAGATCTG-３’（配列番号１９）；DNA断片９−32については、正プライマー５’-CATGAATTCATGACCATCAACATCCAGGAG-３’（配列番号２０）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGATCTGGCGGATGGGCCGGAT-３’（配列番号２２）；DNA断片19−37については、正プライマー５’-CATGAATTCATCAACGTGTGCCCCGGGCCCATC-３’（配列番号２３）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGGGAAGTAGTCAGAGATCTG-３’（配列番号１９）；そしてDNA断片90−400については、正プライマー５’-CATGAATTCCAAGGCAAGCTGGAGTTTGAC-３’（配列番号２４）、逆プライマー５’-CATGAATTCTCAGGCTGAGGACAGAGCCCC-３’（配列番号２５）である。PCRの反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返した後、72℃で５分間であった。反応産物は、２％アガロースゲルで泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そしてゲルから単離した。単離された反応産物を、上記のようにEcoRＩで消化し、その後、常法に従って酵母発現プラスミドpBTM116の制限酵素EcoRＩ部位に挿入した。得られたプラスミドのいずれか１つと、先述したpGAD424のEcoRＩ部位にラットMunc13-1-Did（これは、Munc13-1の851〜1461位のアミノ酸配列を有するペプチドである）を挿入したプラスミドとをともに用いて、文献[18]に記載されているように酵母L40株を形質転換し、β-ガラクトシダーゼ活性の発現を指標として、Doc2αのMunc13-1との結合領域の決定をおこなった。β-ガラクトシダーゼ活性は、上記の実施例３と同じ方法を用いて測定を行った。
【００６９】
以上の実験の結果を図２に示す。図２は、Munc13-1およびDoc2αの一次構造模式図、酵母two-hybrid systemに用いた各変異体、X-galの発色反応の強さから推定した結合能力、およびβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。Munc13-1およびDoc2αの一次構造模式図のＣ１はＣ１領域を、Ｃ２はＣ２領域を示し、結合能の＋＋は強い発色を、＋は弱い発色を、−は発色しなかったことを示す。Doc2αのアミノ酸残基番号13-37の領域を含むペプチドの結合能が強く、この領域のアミノ酸残基に欠失が存在すると結合能が著しく減少することから、Doc2αのアミノ酸残基番号13-37の領域がMunc13-1との結合に必要であることが明らかとなった。従って、この領域をMid（Munc13-1-interacting domain of Doc2α）と命名した。Midの配列を、配列番号２に示す。
【００７０】
実施例５
Doc2ファミリータンパク質とMunc13ファミリータンパク質との結合
ヒトDoc2β遺伝子全長cDNAを鋳型として以下のようにPCR反応を行い、ヒトDoc2βのＣ２領域の上流部分であるアミノ酸残基番号1-122の領域をコードするDNA断片を得た。鋳型DNA(ヒトDoc2β cDNA断片) 0.5ng、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、２種のプライマーをそれぞれ50pmol、および10×PCR用緩衝液5μlを混和し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとした。用いたプライマーは、正方向プライマー５'-CATGAATTCATGACCCTCCGGCGGCGCGGGGAG-３'（配列番号２６）、および逆方向プライマー５'-CATGAATTCTCAGGCAGTGCAGTCGTCCGACTCGT-３'（配列番号２７）である。PCR反応の反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返した後、72℃で５分間であった。PCR反応産物を、２％アガロースゲル泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そしてゲルから単離した。単離された反応産物をEcoRＩで消化し、その後、常法に従って酵母発現プラスミドpBTM116の制限酵素EcoRＩ部位に挿入した。
【００７１】
一方、ラットMunc13-2のラットMunc13-1と類似性が高い領域（アミノ酸残基番号1110-1695）をコードするDNA断片を、以下のようにPCRを用いてラット脳cDNAライブラリー（rat brain MATCHMAKER cDNAライブラリー；Clontech社製、CA、USA）より得た。鋳型DNA(ラット脳cDNAライブラリー) 0.5mg、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、オリゴヌクレオチドをそれぞれ50pmol、および10×PCR用緩衝液5μlを混和し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとした。用いたプライマーは、正方向プライマー５'-CATGAATTCGACGATGCATGGAAGGTGTAC-３'（配列番号２８）、および逆方向プライマー５'-CATGAATTCTCAGGTGCCTGTCTGGTCAATGAG-３'（配列番号２９）である。PCR反応の反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返した後、72℃で５分間であった。PCR反応産物を、２％アガロースゲルで泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そして単離した。単離された反応産物を、DNA配列決定して確認し、上記のようにEcoRＩで消化し、その後、常法に従って酵母発現プラスミドpGAD424の制限酵素EcoRＩ部位に挿入した。
【００７２】
このようにして得られた２つのプラスミド、ならびに上記のプラスミドpBTM116-Doc2α(1-90アミノ酸)およびpGAD424-Munc13-1-Didを、図３に示す組み合わせで用いて、文献[17]の方法で酵母L40株を形質転換し、β-ガラクトシダーゼ活性の発現を指標として、Doc2αおよびDoc2βに対するMunc13-1およびMunc13-2の結合能を調べた。β-ガラクトシダーゼ活性は、上記の実施例３と同じ方法を用いて測定を行った。
【００７３】
結果を図３に示す。図３は、Munc13-1、Munc13-1、Doc2αおよびDoc2βの一次構造模式図、酵母two-hybrid systemに用いた各変異体、X-galの発色反応の強さから推定した結合能、およびβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。Munc13-1、Munc13-1、Doc2αおよびDoc2βの一次構造模式図のＣ１はＣ１領域を、Ｃ２はＣ２領域を示し、結合能の＋＋は強い発色を、＋は弱い発色を示す。Doc2αまたはDoc2βと、Munc13-1またはMunc13-2とのいずれの組み合わせでも結合がみられたことから、Doc2αおよびDoc2βは共に、Munc13-1およびMunc13-2と結合することが明らかになった。これにより、Doc2ファミリーのタンパク質とMunc13ファミリーのタンパク質とが結合することが明らかになった。
【００７４】
Doc2αのMid領域（アミノ酸残基13位〜37位）はDoc2βのMid領域（アミノ酸残基14位〜38位）と92％の類似性を有しており、Munc13-1のDid領域（アミノ酸残基851位〜1461位）はMunc13-2のDid領域（アミノ酸残基1110位〜1695位）と81％の類似性を有している。この領域は、それぞれのタンパク質にとって、他のタンパク質と類似性がない特異的な領域であるので、両者の結合も特異的であると考えられる。
【００７５】
実施例６
大腸菌におけるDoc2αおよびMunc13-1タンパク質の発現ならびに発現されたタンパク質の精製
Doc2αのアミノ酸残基番号１から90に相当する部分を発現するベクターpGEX-2T-Doc2-N、およびMunc13-1のDid領域（アミノ酸残基番号851から1461）を発現するベクターpGEX-2T-Munc13-1-Didを、以下の方法で構築した。まず、Doc2αについてはpSPORT1ベクターを鋳型にして、Munc13-1については実施例２で得られたMunc13-1遺伝子全長を含むクローンから単離されたプラスミドを鋳型にして、PCR反応を行うことによりそれぞれのアミノ酸配列をコードするDNA断片を得た。pSPORT1ベクターには、ヒト脳からクローニングしたDoc2のcDNAの全長1.7kbが組み込まれており、このベクターは、Gibco-BRL社から入手可能である。鋳型DNA 0.5mg、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、２種のプライマーをそれぞれ100pmol、および10×PCR用緩衝液5μlを混合し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、およびdCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとした。それぞれ用いたプライマーは、Doc2αについては、正プライマー５'-CATGGATCCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３’（配列番号３０）；逆プライマー５'-CATGGATCCTCAGGCGGTGGCATCATCCGAGTC-３'（配列番号３１）、Munc13-1については、正プライマー５'-CATGGATCCGAGAAGGTGGCACCCTACCATG-３'（配列番号３２）；逆プライマー５'-CATGGATCCTCAGCTTGGCAGTTTCACCCTGCC-３'（配列番号３３）であった。PCR反応の反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返しであった。PCR反応産物を、２％アガロースゲルで泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そしてゲルから単離した。単離された反応産物を、製造者の説明書に従ってBamHＩで消化した。次に、消化して得られたそれぞれのDNA断片を、常法に従ってpGEX-2T（Pharmacia社製）のBamHＩ部位に挿入した。このようにして、pGEX-2T-Doc2-NおよびpGEX-2T-Munc13-1-Didが得られた。
【００７６】
pGEX-2T-Doc2-NまたはpGEX-2T-Munc13-1-Didを用いて、常法に従って大腸菌DH5α株を形質転換した。得られた形質転換株を、それぞれ、LB培地（１リットルあたり10gトリプトン、5gイーストエキストラクトおよび10g NaCl）中37℃で培養し、次いで0.1mM IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を加えた後、30℃で３時間培養することにより、タンパク質誘導を行った。タンパク質誘導後の培養物を、それぞれ、10,000×gで20分間遠心分離することにより集菌し、上清を捨て、細菌ペレットを10mlのPBS(-)（8g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4、0.2g KH2PO4/１L蒸留水、pH7.4）に懸濁させた。細菌懸濁液に超音波処理を行って細胞を破砕し、次いで100,000×gで、１時間、４℃の条件で遠心分離した。得られた上清をそれぞれグルタチオンセファロースカラム（Pharmacia社製）にかけ、カラムをPBSで洗浄し、次いで溶出緩衝液（20mMグルタチオン、50mM Tris-HCl、pH8.0）を用いて溶出することにより、融合タンパク質を精製した。
【００７７】
得られたそれぞれの形質転換株は、それぞれのタンパク質をグルタチオントランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現した。
【００７８】
実施例７
Doc2αとMunc13-1の試験管内での結合
まず、pGEM-1プラスミド（Promega社製）にHAタグ（アミノ酸配列、Met-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala）をコードするDNA断片を挿入したプラスミドpGEM-HAを作製した。これは、HAタグを含む化学合成した、互いに相補的な２つのオリゴヌクレオチド５'-AATTCGGTACGATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTGGTACCG-３'（配列番号３４）および５'-GATCCGGTACCAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATCGTACCG-３'（配列番号３５）をアニールさせた後、制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断したpGEM-1と正方向で連結することにより作製した。さらにpBluescript（Strategene社製）プラスミドにmycタグ（アミノ酸配列、Met-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Gln-Glu-Asp-Leu）をコードするDNA断片を挿入したプラスミドpBluescript-mycを作製した。これは、mycタグを含む化学合成した、互いに相補的な２つのオリゴヌクレオチド５'-GATCGATGGAGCAGAAGCTTATCAGCGAGGAGGACCTGG-３'（配列番号３６）および５'-GATCCCAGGTCCTCCTCGCTGATAAGCTTCTGCTCCATC-３'（配列番号３７）をアニールさせた後、制限酵素BamHIで切断したpBluescriptと正方向で連結することにより作製した。
【００７９】
次に、ヒトDoc2αのアミノ酸残基１位〜400位、１位〜241位、および90位〜400位のアミノ酸配列、ならびにラットMunc13-1のアミノ酸残基１位〜1743位、851位〜1461位、および１位〜851位＋1461位〜1743位のアミノ酸配列をコードするDNA断片を、PCR反応を行うことによって得た。鋳型DNA 0.5ng、Ampli Taq DNA Polymerase 5ユニット、２種のプライマーをそれぞれ50pmol、および10×PCR用緩衝液5μlと混和し、さらにdNTP（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）を最終濃度200mMとなるように加え、滅菌蒸留水で最終的に50μlとした。鋳型DNAは、ヒトDoc2αについては、ヒトDoc2α 全長cDNAを用い、ラットMunc13-1については、ラットMunc13-1全長cDNAを用いた。プライマーは、ヒトDoc2αのアミノ酸残基１位〜400位については、正プライマー５'-CATGGATCCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３'（配列番号３８）、逆プライマー５'-CATGGATCCTCAGGCTGAGGACAGAGCCCC-３'（配列番号３９）；ヒトDoc2αの１位〜241位については、正プライマー５'-CATGGATCCATGAGGGGCCGCAGGGGCGAT-３'（配列番号３８）、逆プライマー５'-CATGGATCCTCACTGCTCCAAGTCCTTCAGATA-３'（配列番号４０）；ヒトDoc2αの90位〜400位については、正プライマー５'-CATGGATCCCTAGGCAAGCTGGAGTTTGAC-３'（配列番号４１）、逆プライマー５'-CATGGATCCTCAGGCTGAGGACAGAGCCCC-３'（配列番号３９）；ラットMunc13-1のアミノ酸残基１位〜1743位については、正プライマー５'-CATGGATCCATGAAGCGACATGGCCGGCGA-３'（配列番号４２）、逆プライマー５'-CATGGATCCCTAGGGCGCAGGCGCGGCACC-３'（配列番号４３）；およびラットMunc13-1の851位〜1461位については、正プライマー５'-CATGGATCCGAGAAGGTGGCACCCTACCATG-３'（配列番号４４）、逆プライマー５'-CATGGATCCTCAGCTTGGCAGTTTCACCCTGCC-３'（配列番号４５）を用いた。PCR反応の反応条件は、94℃で５分間加熱後、94℃で１分間、55℃で１分間、そして72℃で２分間の反応サイクルを30回繰り返した後、72℃で５分間であった。得られた反応産物を、それぞれ２％アガロースゲルで泳動した後、エチジュウムブロマイド(500ng/ml)で５分間染色して確認し、そしてゲルから単離した。単離された反応産物を、Doc2αについては上記のようにBamHIで消化した後、pGEM-HAのBamHI部位に、Munc13-1については上記のようにBamHIで消化した後、pBluescript-mycのBamHI部位に挿入した。この部位はT7プロモーターの下流であり、この部位に挿入することにより、T7 RNAポリメラーゼによってそれぞれのDNA断片からmRNAが合成される。
【００８０】
Did部分の欠失しているMunc13-1のアミノ酸残基１−851＋1461−1743をコードするDNA断片については、アミノ酸残基１−851をコードするDNA断片を得るために、正プライマー５'-CATGGATCCATGAAGCGACATGGCCGGCGA-３'（配列番号４２）と逆プライマー５’-CATAGCGCTCTTTCCCGAAATTGGAGGCAGCG-３’（配列番号１３）とのプライマーセットを用い、アミノ酸残基1461−1743をコードするDNA断片を得るために、正プライマー５’-CATAGCGCTAGCCACTCAGACGGGACACAAATG-３’（配列番号１４）と逆プライマー５'-CATGGATCCCTAGGGCGCAGGCGCGGCACC-３'（配列番号４３）とのプライマーセットを用いてそれぞれ上記のようにPCRを行い、それぞれのDNA断片を増幅および単離した。そして単離されたそれぞれの増幅断片をBamHIおよびEco47IIIで消化し、これをBamHIで消化されたpBluescript-mycと混合し、常法に従って３つのDNAの連結を行い、pBluescript-mycの制限酵素BamHI部位にDNA断片１−851と1461−1743とが正方向で連結されたものを選択した。
【００８１】
得られたこれらのプラスミドを鋳型として、35Ｓ-メチオニン存在下で、TNT T7 coupled Reticulocyte Lysate System（Promega社製）を製造者の説明書に従って用いてin vitro translationにより35Ｓで標識されたタンパク質を合成した。
【００８２】
Doc2αとMunc13-1との試験管内での結合については、まず、実施例６で得られたGSTとMunc13-1との融合タンパク質２μgを、結合緩衝液（150mM NaCl、50mM HEPES、pH7.4、および１mM EGTA）に溶かし、グルタチオンセファロースカラム（Pharmacia社製）に注ぎ、４℃で１時間反応させることによりカラムに結合させた。次いで、上記35Ｓで標識されたDoc2αの変異体のいずれか１つ（２μg）を、結合緩衝液（150mM NaCl、50mM Hepes、pH7.4、および１mM EGTA）に溶解し、カラムに加え、そして４℃で５時間反応させた。次いで、カラムを結合緩衝液で４回洗浄し、そして100μlの溶出緩衝液を用いて結合したタンパク質を溶出した。得られた溶出物に、１mｇのSDSを添加し、100℃で５分間反応させSDS化した。SDS化したタンパク質を、12％アクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEにアプライし、泳動後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルム（Kodak社製）を感光させ、現像して出てくるバンドを解析した。
【００８３】
結果を図４に示す。図４は、Doc2αの一次構造模式図、in vitro translationにより作製した35S標識Doc2αとその変異体（１から３）、およびGST-Munc13-Didとの結合反応後に得られた溶出物を電気泳動したゲルのオートラジオグラフィーを示す。矢印は、GST-Munc13-Didに結合したDoc2αとその変異体の位置を示す。また、オートラジオグラフィーの右側に示した数字は、タンパク質の分子量（単位はダルトン、Ｋはキロ）を示す。この結果、Doc2αの13位〜37位の領域を有するタンパク質（１および２）は、試験管内でもMunc13-1のDid領域と結合することが明らかになった。
【００８４】
次に、実施例６で得られたGSTとDoc2αとの融合タンパク質（２μg）をグルタチオンセファロースカラム（Pharmacia社製）に結合させた。次いで、上記35Ｓで標識されたMunc13-1の変異体のいずれか１つ（２μg）を、Doc2αの変異体について記載したのと同様にして、カラムに固定化されたDoc2αと結合したタンパク質の溶出物を得、SDS-PAGEを行い、そしてバンドの解析を行った。
【００８５】
結果を図５に示す。図５は、Munc13-1の一次構造模式図、in vitro translationにより作製した35S標識Munc13-1とその変異体（１から３）、およびGST-Doc2α(1-90)との結合反応後に得られた溶出物を電気泳動したゲルのオートラジオグラフィーを示す。矢印は、GST-Doc2α(1-90)に結合したMunc13-1とその変異体の位置を示す。また、オートラジオグラフィーの右側に示した数字はタンパク質の分子量（単位、ダルトン、Ｋはキロ）を示す。この結果、Munc13のDid領域を含むタンパク質（１および２）は、試験管内でもDoc2αのMid領域を含むアミノ酸残基番号1-90の領域と結合することが明らかになった。
【００８６】
試験管内でもDoc2αはMunc13-1と結合することが明らかとなったことから、Doc2αとMunc13-1との結合を阻害または促進する物質の試験管内での検索が可能となった。
【００８７】
実施例８
PC12細胞でのDoc2αとMunc13-1との結合
ラット副腎褐色細胞腫由来であるPC12細胞（PC12 phenochromocytoma cell line；文献30を参照のこと）を、35mmφdishに5×105となるように播き、10％牛胎児血清および５％馬血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で37℃で18時間培養した。培養後のPC12細胞を、T7RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス(L0-T7株)（東京都臨床研小原道法先生より贈与された）で30分間感染させ、次いで、上記実施例７で作製した、ヒトDoc2αのアミノ酸残基１位〜400位をコードするcDNA断片がpGEM-HAに挿入されたプラスミドおよびラットMunc13-1のアミノ酸残基１位〜1743位をコードするcDNAがpBluescript-mycに挿入されたプラスミドを、リポフェクトアミン（Gibco BRL社製）を用い、製造者の説明書に従ってトランスフェクションを行うことにより導入した。
【００８８】
トランスフェクション後、細胞をさらに５時間培養した。分泌刺激を与えた場合と、与えない場合のDoc2αタンパク質とMunc13-1タンパク質の発現量を比較するために、高濃度カリウム処理またはTPA処理を行い、無処理のものをコントロールとした。分泌刺激を与える場合は、培養後のPC12細胞を、PSS（140mM NaCl、4.7mM KCl、2.5mM CaCl2、1.2mM MgSO2、1.2mM KH2PO4、20mM HEPES、pH7.4、および11mM glucose）に懸濁して洗浄し、遠心分離を行い、ペレットを、60mM KClおよび85mM NaClを含むPSS（高濃度カリウム処理の場合）または100nMのTPA（12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate）を含むPSSに懸濁し、37℃で、10分間処理をおこなった。処理後に遠心分離して細胞を回収し、細胞を洗浄し、500μlの溶解緩衝液（20mM Tris/HCl at pH7.5、150mM NaCl、１％ NP-40および10mM p-amidino-phenylmethanesulfonyl fluoride）に懸濁して30分間放置することにより細胞を溶解し、得られた細胞溶解液を100,000×gで１時間遠心分離し、上清を得た。
【００８９】
この上清を細胞質画分とした。この細胞質画分（500μl）に３μgの抗HAモノクローナル抗体（Berkeley Antibody 社製）および20μlのプロテインA-セファロース（Pharmacia社製）を加え、４℃で４時間反応させることにより、免疫沈降を行った。反応後の細胞質画分を、1,000×gで１分間遠心分離し、プロテインA-セファロースに結合したタンパク質のペレットを得た。このペレットに１mｇのSDSを含むSDS溶液100μlを加えて100℃で５分間加熱することにより、プロテインA-セファロースに結合したタンパク質をSDS化すると共にプロテインA-セファロースから遊離させた。SDS化後に溶液を1,000×gで１分間遠心分離し、SDS化したタンパク質を含む上清を得た。この上清を、12％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEにかけ、ナイロン膜（商品名Immobilon、Millipore社製）に電気的に移した。この膜を５％スキムミルク（Difco Laboratories社製）の入ったPBS緩衝液中でブロッキングを行った後、1000倍希釈の抗mycモノクローナル抗体（ベーリンガー  マンハイム社製）および５％スキムミルクを添加したPBS緩衝液中で、室温、１時間反応させた。その後、１％ Tween20の入ったPBSを用いて、室温で３回洗浄した。次に、５％スキムミルクおよび1000倍希釈したhorseradish peroxidaseと結合した抗マウスイムノグロブリンヒツジポリクローナル抗体（アマシャム・ジャパン社製）を添加したPBS緩衝液中で、室温にて１時間反応させた。その後、１％ tween20の入ったPBSを用いて、室温で３回洗浄した。洗浄後、ECLウエスタンブロッティング検出システム（アマシャム・ジャパン社製）を製造者の説明書に従って用いて発色反応を行い、Ｘ線フィルム（Kodak社製）を感光させ、現像して出てくるバンドを検出した。このバンドは、HAタグとDoc2αの融合タンパク質に結合したmycタグとMunc13-1の融合タンパク質を示す。
【００９０】
結果を図６に示す。図６は、抗HA抗体を用いた免疫沈降産物を、抗myc抗体でウエスタンブロット解析した結果であり、１は分泌刺激していないPC12細胞、２は高濃度カリウム刺激により分泌刺激したPC12細胞、３はTPA処理により分泌刺激したPC12細胞を示す。左側の矢印は、Doc2αに結合したMunc13-1の位置を示す。また、右側の数字はタンパク質の分子量（単位、ダルトン、Ｋはキロ）を示す。これにより、Doc2αはMunc13-1とPC12細胞中でも結合することが示された。また、その結合は高濃度カリウムイオンあるいはTPA処理により促進されることが明らかになった。高濃度カリウムイオン刺激などにより分泌を起こさせると細胞内カルシウムイオン上昇とジアシルグリセロールの産生が誘導されるという従来の報告から[22]、ジアシルグリセロールと同様の作用を示すTPAで誘導されるDoc2αとMunc13-1の結合は、カルシウムイオン依存性の分泌に重要な働きをしていると考えられる。したがって、Doc2αとMunc13-1の結合がカルシウムイオン依存性の分泌に働いていることが予想される。
【００９１】
実施例９
PC12細胞での成長ホルモンの分泌に対するDoc2α-MidまたはMunc13-1-Didの影響ヒトDoc2α-MidをコードするDNA断片が発現ベクターpEF-Bosに挿入されたプラスミドは以下のようにして構築した。実施例４で得られたDoc2α-Mid（これは、Doc2αの13位〜37位のアミノ酸配列を有するペプチドである）をコードするDNAがpBTM116に挿入されているプラスミドを制限酵素XbaIで切断し、Doc2α-MidをコードするDNA断片を単離し、これを発現ベクターpEF-BosのXbaI部位に正方向に挿入して連結する。
【００９２】
ラットMunc13-1-DidをコードするDNA断片が発現ベクターpEF-Bosに挿入されたプラスミドは以下のようにして構築した。実施例４で得られたMunc13-1-Did（アミノ酸残基番号851から1461）をコードするDNAがpGAD424に挿入されたプラスミドを制限酵素XbaIで切断し、Munc13-1-MidをコードするDNA断片を単離し、これを発現ベクターpEF-BosのXbaI部位に正方向に挿入して連結する。
【００９３】
PC12細胞を35mm dishで5×105となるように播き、10％牛胎児血清および５％馬血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で18時間培養した。その後、ヒトDoc2α-Mid（アミノ酸残基番号13から37）またはラットMunc13-1-Did（アミノ酸残基番号851から1461）をコードするDNA断片を発現ベクターpEF-Bosに挿入したプラスミドのいずれか一方を、ヒト成長ホルモンを発現するプラスミドpXGH5と共に15μgのリポフェクトアミン（Gibco BRL社製）と１ml opti-MEM（Gibco BRL社製）を製造者の説明書に従って用いて、トランスフェクションした。トランスフェクションに用いたプラスミドの量は、それぞれ２μgである。いずれかのトランスフェクション細胞を４時間培養した後、培地交換を行い10％牛胎児血清および５％馬血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で48時間培養した。分泌刺激を与えた場合と、与えない場合のDoc2αタンパク質とMunc13-1タンパク質の発現量を比較するために、上記実施例８と同様に高濃度カリウム処理またはTPA処理を行い、無処理のものをコントロールとした。分泌刺激後、細胞ペレットを回収し、500μlの１％ Triton-X-100含有PSSに懸濁して細胞内に残存する成長ホルモンを溶解した。培養上清および細胞溶解物に含まれる成長ホルモンの量を、抗ヒト成長ホルモン抗体を用いるラジオイムノアッセイ用の測定キット（Nichols Institute社製）を製造者の使用説明書に基づいて用いて測定した。得られた測定値をもとにして、産生された全成長ホルモン量に占める分泌された成長ホルモン量の割合を決定した。
【００９４】
結果を図７に示す。図７は、プラスミドを導入していないコントロールPC12細胞、Doc2α-Midを発現させたPC12細胞および、Munc13-1-Didを発現させたPC12細胞を、それぞれ低濃度カリウムイオン(low K+)、高濃度カリウムイオン(high K+)、およびTPA処理した時の、全成長ホルモン量に対する分泌されたホルモン量の割合を百分率で示す。Doc2α-MidとMunc13-1-Didは、いずれもPC12細胞での成長ホルモンの分泌に対して抑制作用を示した。ヒト成長ホルモンをPC12細胞で発現させると、ヒト成長ホルモンは、神経伝達物質の１つであるノルエピネフリンを含む分泌顆粒に輸送され、カルシウムイオン依存性の分泌によりノルエピネフリンとともに分泌されることが知られている。従って、成長ホルモンの分泌量は、カルシウムイオン依存性の分泌量を反映している。この結果から、Munc13-1のDidおよびDoc2αのMidがいずれもカルシウム依存性分泌に影響をおよぼすことが明らかになった。
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、Doc2αとMunc13-1との結合のアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質のスクリーニング方法；神経伝達物質またはホルモンのカルシウムイオン依存性の分泌を阻害する方法；Doc2α類似体とキャリアタンパク質との融合タンパク質などが提供される。
【００９６】
本発明でDoc2αとMunc13とが結合することから、神経細胞または内分泌細胞における、神経伝達物質またはホルモンの、カルシウムイオン依存性の分泌機構の解明に新たな展開がもたらされる。
【００９７】
Doc2αとMunc13は、いずれもＣ２領域を有しており、この領域にカルシウムイオンが結合することによりカルシウムイオンセンサーとして機能していると考えられる。PC12細胞を用いた成長ホルモンの分泌の実験から、Doc2αとMunc13との結合がカルシウムイオン依存性分泌を調節していると予想される。以上のことから、Doc2αとMunc13との結合を阻害する物質(アンタゴニスト)または促進する物質(アゴニスト)は、神経細胞における神経伝達物質放出機能を制御するために使用し得る。Doc2αとMunc13との結合のアゴニストまたはアンタゴニストは、神経伝達物質またはカルシウムイオンが関与している神経疾患の治療薬（例えば、抗痴呆薬、抗てんかん薬、向精神薬、あるいは脳代謝改善薬）として使用することが可能である。
【００９８】
さらに、Doc2α-Midはわずか25アミノ酸からなっているので、この25アミノ酸を化学合成して樹脂または96ウェルプレートに結合させ、次いでアゴニストまたはアンタゴニストの候補物質と共に、組み換え体タンパク質として作製、精製、および標識したMunc13-Didを加え、樹脂または96ウェルプレートに結合した標識を測定し、Munc13-DidとDoc2α-Midとの結合が促進または阻害されたか否かを決定することにより、アゴニストおよびアンタゴニストを迅速にスクリーニングすることが可能である。
【００９９】
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【０１００】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】酵母two-hybrid法による、Munc13-1のDoc2αとの結合領域の解析結果を示す図表である。
【図２】酵母two-hybrid法による、Doc2αのMunc13-1との結合領域の解析結果を示す図表である。
【図３】酵母two-hybrid法による、Doc2ファミリータンパク質がMunc13ファミリータンパク質と結合するかを解析した結果を示す図表である。
【図４】  (a)大腸菌で作製し精製したMunc13-1-Didタンパク質と、in vitro translationにより作製したDoc2αおよびその欠失変異体タンパク質の、試験管内での結合実験の結果を示す電気泳動の写真である。
(b)結合実験に用いたDoc2αおよびその欠失変異体タンパク質を示す図である。
【図５】  (a)大腸菌で作製し精製したDoc2α-N末端タンパク質（1-90アミノ酸）と、in vitro translationにより作製したMunc13-1およびその欠失変異体タンパク質の、試験管内での結合実験の結果を示す電気泳動の写真である。
(b)結合実験に用いたMunc13-1およびその欠失変異体タンパク質を示す図である。
【図６】  PC12細胞内で、Doc2αとMunc13-1が結合することを免疫沈降法により示した、ウエスタンブロット解析の結果を示すＸ線写真である。
【図７】  Doc2α-MidおよびMunc13-1-Didが、PC12細胞におけるカルシウムイオン依存性の分泌を抑制すること、成長ホルモンの分泌量を測定することにより調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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