(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸を生成し、前記血清中の総酸濃度を計測することで前記血清中の脂質成分濃度を算出する血清中の脂質成分の分析方法において、前記脂肪酸生成前における前記血清中の総酸濃度を計測する第１工程と、前記血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸を生成する第２工程と、前記第２工程において脂肪酸が生成された後における前記血清中の総酸濃度を計測する第３工程と、前記第１工程における計測値と前記第３工程における計測値とに基づいて前記血清中の脂質成分濃度を算出する第４工程と、を有することを特徴とする血清中の脂質成分の分析方法。
【請求項２】
血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸及び有機酸を生成し、前記血清中の総酸濃度を計測することで前記血清中の脂質成分濃度を算出する血清中の脂質成分の分析方法において、前記脂肪酸及び前記有機酸の生成前における前記血清中の総酸濃度を計測する第１工程と、前記血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸及び有機酸を生成する第２工程と、前記第２工程において脂肪酸及び有機酸が生成された後における前記血清中の総酸濃度を計測する第３工程と、前記第１工程における計測値と前記第３工程における計測値とに基づいて前記血清中の脂質成分濃度を算出する第４工程と、を有することを特徴とする血清中の脂質成分の分析方法。
【請求項３】
前記血清中の脂質成分が、コレステロール脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１乃至請求項２のいずれかに記載の血清中の脂質成分の分析方法。
【請求項４】
前記血清中の脂質成分が、グリセリン脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１乃至請求項２のいずれかに記載の血清中の脂質成分の分析方法。
【請求項５】
前記血清中の脂質成分が、リン脂質であることを特徴とする請求項１乃至請求項２のいずれかに記載の血清中の脂質成分の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清中に含まれる脂質成分の量の分析方法に係り、より詳細には、血清中のグリセリン脂肪酸エステル、コレステロール脂肪酸エステル、リン脂質等の各成分濃度の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食の洋風化や飲酒機会の増加、運動不足、ストレス等により血清中のコレステロール、グリセリン脂肪酸エステルあるいはリン脂質各濃度検査において正常値から外れた値を示す人が急増している。各成分に関して、コレステロールの値は糖尿病、動脈硬化症、甲状腺機能低下症等で代表される生活習慣病のリスクファクター、一般的には中性脂肪と呼ばれているグリセリン脂肪酸エステルの値は脂質代謝異常症、脳血管障害、心筋梗塞、狭心症、糖尿病のリスクファクター、そしてリン脂質の値は脂質代謝異常症、閉塞性肝障害甲状腺機能亢進症、劇症肝炎のリスクファクターとしてそれぞれ注目されている。
【０００３】
このような背景から、各成分濃度をそれぞれ特異的、迅速、簡便さらに高感度に測定する方法及びその方法を利用した安価な分析装置が求められている。
【０００４】
従来の血清各成分の測定法としては、大きく分けて酵素法と化学法がある。現在主として用いられている酵素的測定方法は、例えばコレステロール脂肪酸エステル（エステル型コレステロール）の場合、３つの酵素反応によって測定が行われている。
【０００５】
すなわち、（１）コレステロール脂肪酸エステルはコレステロールエステラーゼで加水分解され遊離型コレステロールになる。（２）遊離型コレステロールはコレステロールオキシダーゼで酸化され過酸化水素を副生する。（３）この過酸化水素は、パーオキシダーゼ存在下で４−アミノアンチピリン及びジメチルアニリン誘導体とを酸化縮合しキノン色素を生成する。ここで生じた色素を分光光度計等で計測することでコレステロール脂肪酸エステルの定量を行っている。
【０００６】
グリセリン脂肪酸エステルの場合、４つの反応を経て測定が行われる。
【０００７】
すなわち、（１）血清中のグリセリン脂肪酸エステルはリポプロテインリパーゼまたはリパーゼとプロテアーゼでグリセロールと脂肪酸に加水分解する。（２）ここで生成したグリセロールは、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ＋＋）存在下でグリセロールキナーゼによりグリセロール−１−リン酸へとリン酸化する。（３）このグリセロール−１−リン酸はグリセロールリン酸オキシダーゼにより過酸化水素とジヒドロキシアセトンに酸化分解する。（４）この過酸化水素は、パーオキシダーゼ存在下で４−アミノアンチピリン及びジメチルアニリン誘導体とを酸化縮合しキノン色素を生成する。ここで生じた色素を分光光度計等で計測することでグリセリン脂肪酸エステルの定量を行っている。
【０００８】
リン脂質の場合、３つの反応を経て測定が行われる。
【０００９】
すなわち、（１）血清中のリン脂質はホスホリパーゼＤで分解されコリンを生じる。（２）コリンはコリンオキシダーゼにより過酸化水素とベタインに酸化分解する。（３）この過酸化水素は、パーオキシダーゼ存在下で４−アミノアンチピリン及びジメチルアニリン誘導体とを酸化縮合しキノン色素を生成する。ここで生じた色素を分光光度計等で計測することでリン脂質の定量を行っている。
【００１０】
次に化学的な方法は、これまで数多くの方法が報告され実用化されてきたが、酵素法が一般化した後は、測定時間がかかりすぎることや操作が煩雑なこともあり臨床検査にはほとんど利用されなくなっている。
【００１１】
たとえば、コレステロールの化学的方法の一例としてグリセリン脂肪酸エステルの分析法は、グリセリン脂肪酸エステルをメタノール・クロロホルム（１：２Ｖ／Ｖ）等の有機溶媒で抽出した後、過ヨード酸ナトリウムによる酸化を行い、アセチルアセトンで発色させ測定するというものである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、これらの従来の測定方法には、それぞれ以下に述べるような問題点がある。
【００１３】
酵素法における問題点は、（１）４種類あるいは３種類の異なる酵素及び数多くの試薬を必要とするので、作業が煩雑である。（２）４段階あるいは３段階もの反応全てが完全に進行せねば正しい値が得られない。（３）もし不具合が生じた場合、どの反応工程に問題があるかすぐには判明しない等である。
【００１４】
また、化学法における問題点は、（１）操作が煩雑で測定に時間がかかりすぎる。（２）化学物質による反応は特異性が低く、血清中に含まれる目的成分以外の数多くの夾雑物によって正確な値が得にくい。（３）大量の有機溶媒を使用するため分析装置の痛みが速く、さらには使用済み有機溶媒の廃棄に手間取る等である。
【００１５】
そして、いずれの分析方法においても、血清脂質成分を分析するためには非常に大型で高価な分析装置が必要であった。
【００１６】
そこで、本発明は、従来の測定方法及び分析装置の問題点を解決するもので、血清中に含まれる脂質成分、具体的にはコレステロール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルそしてリン脂質等の各成分濃度の分析方法において、例えば現在最も一般的に利用されている酵素法で測定までに４種類あるいは３種類の異なる酵素を用い、４段階あるいは３段階もの反応を経て過酸化水素の計測を行なっていたものを、各脂質成分からの脂肪酸の分離及びその脂肪酸量の分析に着目し、酵素反応により生じた遊離脂肪酸を直接測定するようにして、血清脂質成分の濃度を特異的、簡便、迅速、高感度に定量することができる分析方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の血清中の脂質成分の分析方法は、血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸を生成し、前記血清中の総酸濃度を計測することで前記血清中の脂質成分濃度を算出する血清中の脂質成分の分析方法において、前記脂肪酸生成前における前記血清中の総酸濃度を計測する第１工程と、前記血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸を生成する第２工程と、前記第２工程において脂肪酸が生成された後における前記血清中の総酸濃度を計測する第３工程と、前記第１工程における計測値と前記第３工程における計測値とに基づいて前記血清中の脂質成分濃度を算出する第４工程と、を有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の血清中の脂質成分の分析方法は、血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸及び有機酸を生成し、前記血清中の総酸濃度を計測することで前記血清中の脂質成分濃度を算出する血清中の脂質成分の分析方法において、前記脂肪酸及び前記有機酸の生成前における前記血清中の総酸濃度を計測する第１工程と、前記血清中の各種脂質成分にそれぞれ特異的に作用する酵素を用いて脂肪酸及び有機酸を生成する第２工程と、前記第２工程において脂肪酸及び有機酸が生成された後における前記血清中の総酸濃度を計測する第３工程と、前記第１工程における計測値と前記第３工程における計測値とに基づいて前記血清中の脂質成分濃度を算出する第４工程と、を有することを特徴とする。
【００１９】
【本発明の実施の形態】
（実施の形態１）
まず、本発明における血清中の脂質成分の分析方法を説明すると、その第一段階は、以下に述べるような各種成分のみに特異的に作用するような酵素を用いて、遊離の脂肪酸あるいは有機酸を生成するものである。各種成分より遊離の酸を生成する方法で主として知られているものについて、（化１）に示す化学式は血清中のコレステロール脂肪酸エステルを、コレステロールエステラーゼによって加水分解し遊離型コレステロールと遊離脂肪酸を生成する反応式である。
【００２０】
【化１】
0004019463.tif 000002
【００２１】
また、（化２）に示す化学式は血清中のグリセリン脂肪酸エステルを、リポプロテインリパーゼによって加水分解しグリセロールと遊離脂肪酸を生成する反応式である。この場合、グリセリン脂肪酸エステルのグリセロールに結合している脂肪酸の数は、１〜３個まで考えられるが、血清の場合、グリセリン脂肪酸エステルの９０〜９５％が脂肪酸３個のトリグリセリドであることが判っているため、グリセリン脂肪酸エステルとトリグリセリドは、ほぼ同意語として考えられる。従って、血清中のグリセリン脂肪酸エステルを分析対象にする場合、グリセリン脂肪酸エステル１分子から3個の遊離脂肪酸が生成すると考えても差し支えない。
【００２２】
【化２】
0004019463.tif 000003
【００２３】
更に、（化３）に示す化学式は血清中のリン脂質から遊離脂肪酸を生成する反応を示す。ただしリン脂質の場合、「リン脂質」という語は単一の化合物を指すものではなく、レシチン、スフィンゴミエリン、リゾレシチン、ホスファチジル、エタノールアミン等の有機リン酸基を有する化合物の総称である。ここに挙げた化合物を含めリン脂質の大部分のものは、ホスホリパーゼＡによって遊離脂肪酸が生成する。
【００２４】
【化３】
0004019463.tif 000004
【００２５】
酵素による各種成分からの遊離脂肪酸生成方法は上記の反応のみを対象とするものではなく、各種成分から特異的に遊離脂肪酸を生成できる方法であれば全て利用することができる。ただし酵素反応は、簡便性を考慮すると１段階で各種成分から遊離脂肪酸を生成するものを選ぶ方が望ましい。上記の各種酵素類は特に起源を指定するものではなく、動物臓器、微生物さらには遺伝子操作等により人工的に作製・改変したＤＮＡを用いたもの、等々いかなる起源由来のものであってもよい。ただ一つ注意すべきことは、酵素反応によって生成される物質が次の測定、すなわち遊離脂肪酸の分析を阻害するような反応は採用することができないということである。例として挙げた上記酵素反応においては、問題になるようなことは見出せなかった。
【００２６】
本発明で用いる酵素類の中で例としてあげた酵素は、全て市販のものをそのまま利用することができる。使用時の酵素使用量や反応温度、反応時間等々の諸条件は、発売元が望ましいとして提示している数字をそのまま利用することも可能であるが、分析者が目的に応じて設定を自由に変更することも可能である。
【００２７】
第一段階の酵素反応によって生成した遊離脂肪酸濃度を定量する第二段階の測定は、遊離した脂肪酸を直接計測するものである。酸を計測する方法または測定装置に関して以下に具体的に述べる。
【００２８】
ボルタンメトリーを利用し電気化学的に酸濃度を測定する方法は、酵素処理により脂肪酸を遊離した血清に有機溶媒とキノン誘導体及び電解質を混合し、その共存電解液に徐々に電荷をかけ、その過程で発生する電流を計測したとき、酸が溶液中に存在する場合のみに特徴的に見受けられるボルタモグラム還元前置波のピーク値を計測する事によって酸の濃度分析を行う方法である。この共存電解液中で脂肪酸は強いプロトン供与体として働き、共存電解液中に存在しているキノン誘導体にプロトンを与える。脂肪酸のようなプロトン供与体とキノンの付加体は、キノン単体よりも易還元性であるため、ボルタモグラムにおいて有機溶媒中のキノンが通常示す還元波よりも前に還元波（ボルタモグラム還元前置波）を生じる。その還元前置波の電流値は、溶液中の酸の濃度と比例関係にあることが分かっている。あらかじめ既知の酸濃度溶液で求めておいた検量線に照らし合わせることで試料中の酸濃度を正確に測定するものである。還元前置波の位置は脂肪酸の種類によってほとんど変化することはないため、第一段階の酵素反応によって血清より生成する脂肪酸が多種類であっても酸の合計量を正確に測定できる。
【００２９】
酵素反応前の総酸量を同様に測定し反応後の総酸量との差をとることによって試料中の各種脂質成分、具体的にはコレステロール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、リン脂質のそれぞれ個別の含有量の定量が可能となる。上述した電気化学的測定方法に用いる各種キノン誘導体や溶媒あるいは電解質の種類は酸濃度に比例した還元前置波を示すものであれば特に限定はしない。
【００３０】
以下にこの原理を応用した酸濃度測定装置の一実施形態を述べる。
【００３１】
図１は本発明の一実施の形態における電気化学的な酸濃度測定方式を利用した血清中の脂質成分分析装置である。
【００３２】
図１において、１は酵素反応部、２は酵素反応容器、３は温度保持装置、４は撹拌装置、５は血清及び酵素溶液である。また、６は酸度測定部、７は共存電解液用容器、８は共存電解液、９は作用電極、１０は対極、１１は比較電極、１２は制御部、１３は表示部である。
【００３３】
酵素反応部１は、血清中の各脂質成分に特異的に作用する酵素を入れた酵素反応容器２と、この酵素反応を安定して維持することのできる温度（多くは３０℃〜４０℃）に保つことができる温度保持装置３を備えている。この酵素反応容器２内に血清を導くことにより、血清中より脂肪酸を遊離することが可能になる。
【００３４】
撹拌装置４は酵素反応を速やかに進めるものである。
【００３５】
酵素反応部１で酵素処理された酸含有の血清をキノン誘導体、有機溶媒、電解質と混合して共存電解液用容器７に導く。キノン誘導体としてはオルトベンゾキノン誘導体もしくはパラベンゾキノン誘導体等が望ましい。というのは、これらのキノン誘導体であれば、先に説明したボルタモグラム還元前置波の位置が、液中の溶存酸素の還元波形の位置からシフトして出現するため、除酸素しなくても正確に酸の濃度分析を行うことができるからである。また有機溶媒としてはイソオクタン３５％以上を含むエタノール溶液であることが望ましい。このとき脂肪酸を十分溶解できる。そして電解質としては過酸化リチウムが適当である。
【００３６】
酸含有の血清を導入した共存電解液用容器７には共存電解液８が充たされ、作用電極９、対極１０、比較電極１１が浸漬されている。マイクロコンピューター等から構成される制御部１２は、作用電極９の電位を比較電極１１の電極電位から所定の範囲で掃引し、これと同時に作用電極９と対極１０間を流れる電流値を測定する。このような測定方法は通常ボルタンメトリーと呼称される。さらに制御部１２は、この測定した電流値の中で、キノン誘導体が示す還元波形の前方位置に存在する還元前置波の電流値を検出するものである。この電流値が血清中の総脂肪酸濃度、もしくは総脂肪酸濃度及び総有機酸濃度に比例する。ところで、ほとんどの酵素反応では脂肪酸を生成するが、リン脂質に作用する酵素の中にはわずかながらも特異的に有機酸を生成するものも存在し、ボルタンメトリーによる本実施の形態１の分析装置によれば、この有機酸をも含めて酸濃度を測定できるものである。
【００３７】
次に、制御部１２は、検量線と照らし合わせることにより、測定した電流値から血清中の脂質成分の濃度を算出する。この濃度を算出すると、制御部１２はＬＣＤ等からなる表示部１３に当該濃度を表示する。従来の酵素法による分析は、３〜４段階の酵素反応の後に過酸化水素の濃度分析を行うため、正確さに問題が残り、時間もかかるものであったが、本実施の形態１のボルタンメトリーによる血清脂質成分分析装置によれば、血清から１段階の酵素反応により生じた遊離脂肪酸を直接測定するため、血清脂質成分の濃度を特異的、簡便、迅速、高感度に定量することができる。
【００３８】
（実施の形態２）
図２は本発明の他の実施の形態における高速液体クロマトグラフィーを利用した血清中の脂質成分分析装置の概略図である。
【００３９】
図２において、１は酵素反応部、２は酵素反応容器、３は温度保持装置、４は撹拌装置、５は血清及び酵素溶液、６０は酸度測定部、１２は制御部、１３は表示部、１４は注入部、１５は定量高圧ポンプ、１６は分離カラム、１７は検出部である。
【００４０】
酵素反応容器２、温度保持装置３を供えた酵素反応部１の作用については実施の形態１と同様である。
【００４１】
本実施の形態２においては、酵素反応容器２内で酵素処理された試料を必要に応じて脱気した後、オートサンプラー等の注入部１４で一定量を量り取り、酸度測定部６に注入するものでもよい。
【００４２】
本実施の形態２おける酸度測定部６０は、高速液体クロマトグラフィーを構成するもので、定量高圧ポンプ１５と分離カラム１６と検出部１７からなる。この定量高圧ポンプ１５は微少量の試料を高圧、一定流速で送り出せるものである。そして、分離カラム１６には脂肪酸測定用に調整された充填剤が均一に詰められており、定量高圧ポンプで１５で送り込まれた試料が分離カラム１６で試料を構成する物質ごとにそれぞれ分離される。検出部１７は、この物質のうち脂肪酸の濃度を検出する。検出部１７としては、示差屈折計、紫外線可視分光光度計、レーザー光励起蛍光検出器等が適当である。このようにして得られた脂肪酸の濃度から脂肪酸の総量を算出し、さらには酵素処理前の酸の総量との差を求めることにより、試料中の各種脂質成分具体的にはコレステロール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、リン脂質のそれぞれ個別の含有量の定量が可能になる。
【００４３】
制御部１２は、定量高圧ポンプ１５の運転と、分離カラム１６での物質の分離が終了する時間を計時して、その後に検出部１７を動作せしめ、検出した脂肪酸の濃度から総量を計算し、酵素処理前の酸の総量との差を求めて試料中の各種脂質成分の含有量の定量を行うものである。
【００４４】
このように本実施の形態２の高速液体クロマトグラフィーによる血清成分分析装置によれば、光学的に血清成分を分析するため、試料に電気化学的な刺激を与えることがなく測定でき、既設の高速液体クロマトグラフィーを用いて血清中の脂質成分を特異的、簡便、迅速、高感度に測定することができる。
【００４５】
なお、以上の実施の形態１及び２の例以外にも、総酸濃度を測定するための装置としては様々なものが適用でき、たとえば、自動または半自動中和滴定装置や電位差滴定装置及び光電光度計などが考えられる。
【００４６】
【発明の効果】
本発明では、血清中のコレステロール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル及びリン脂質等の各成分濃度を特異的、高感度、簡便、迅速に測定でき、このような分析を行なうための血清中の脂質成分分析装置も安価に提供できる。
【００４７】
また、本発明の分析方法及び分析装置の適用により、信頼性が高く正確な各血清脂質成分濃度を簡単に入手できるようになり、医療現場での臨床検査のみならず家庭での個人的な健康管理においても有用な情報提供が可能になる。また、各成分に係る基礎研究や応用・開発研究において研究速度及び研究精度の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施の形態における電気化学的な酸濃度測定方式を利用した血清脂質成分分析装置の概略図
【図２】  本発明の他の実施の形態における高速液体クロマトグラフィーを利用した血清脂質成分分析装置の概略図
【符号の説明】
１  酵素反応部
２  酵素反応容器
３  温度保持装置
４  撹拌装置
５  血清及び酵素溶液
６  酸度測定部
７  共存電解液用容器
８  共存電解液
９  作用電極
１０  対極
１１  比較電極
１２  制御部
１３  表示部
１４  注入部
１５  定量高圧ポンプ
１６  分離カラム
１７  検出部
６０  酸度測定部
【図１】
0004019463.tif 000005
【図２】
0004019463.tif 000006