(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素化学的性質を有し、かつ分子量が66,000であるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ。
(1)作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低い。
(2)至適pH：10.5-11.0、(3)至適温度：60 ℃付近、(4)安定pH：6-11、(5)温度安定性：50 ℃、15 分間処理で90 % 以上の残存活性を示す。
【請求項２】
バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種に属するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産能を有する微生物であるバチルスクラーキ7364株（FERM BP-7156）を培養し、培養物中にシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを生産せしめ、次いで生成したシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを採取することを特徴とする請求項1に記載のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項３】
澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液にバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種が産生する請求項1に記載のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させて主としてγ-シクロデキストリンを生成させることを特徴とするシクロデキストリンの製造方法。
【請求項４】
生成したγ-シクロデキストリンを他のシクロデキストリンから分離することを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ産生能を有するバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種菌であるバチルスクラーキ7364株（FERM BP-7156）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以下CGTaseという）、その製造方法及びそれを用いるシクロデキストリン（以下CDという）の製造方法に関する。
【０００２】
CGTase（ EC 2.4.1.19）は澱粉などのα-1,4-グルカンに作用し、その分子内転移活性により環状α-1,4-グルカンであるシクロデキストリン（CD）を生成させる酵素である。CGTaseにより生成されるCD の重合度は主として6 〜 8 であり、それぞれα-、β-及びγ-CDと呼ばれる。このCD生成反応とは別にCGTase は、分子間転移反応を通して、カップリング反応（CD を開環させ、生じる直鎖オリゴ糖を受容体糖分子に転移させる）や不均化反応（受容体糖分子に直鎖オリゴ糖を転移させる）を触媒する。さらに、CGTaseは微弱ながらα-1,4-グルコシド結合の加水分解反応も触媒する。
【０００３】
CD は多くの分子と包接物を作り、その化学的・物理的諸性質を変化させる事が可能である為、CGTase は食品、医薬、化粧品産業において重要な酵素として位置付けられている。その為、1939 年バチルスマセランス（Bacillus macerans）酵素によるCD 合成反応に始り（E. B. Tilden and S. J. Pirt, J. Am. Chem. Soc., 63, 2900-2902, 1939）、その後、CGTase生産菌の検索や酵素の精製なども含め、多くの研究がなされてきた（Sumio Kitahata, Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (2), 387-393, 1974 、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, Agr. Biol. Chem., 38 (12), 2413-2417, 1974、Sumio Kitahata and Shigetaka Okada, J. Jap. Soc. Starch Sci., 29 (1), 13-18, 1982 、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Katsube, Denpun Kagaku, 38  (2), 141-146, 1991、Lionel J. Bovetto, Daniel P. Backer, Jaques R. Villette, Philippe J. Sicard, and Stephane J-L. Bouquelet, Biotechnology and Applied Biochemstry, 15, 48-58, 1992、Shinske Fujiwara, Hirofumi Kakihara, Kim Myung Woo, Andre Lejeune, Mitsuhide Kanemoto, Keiji Sakaguchi, and Tadayuki Imanaka, Applied and environmental microbiology, 58 (12), 4016-4025, 1992 、Florian Binder, Otto Huber and August Bock, Gene, 47, 269-277, 1986、Keiji Kainuma, Toshiya Takano and Kunio Yamane, Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 149-153, 1987、Takahiro Kaneko, Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi, J. general Microbiology, 134, 97-105, 1988、Murai Makela, Pekka Mattsson, M. Eugenia Schinina, and Timo Korpela, Biotechnology and Applied biochemistry, 10, 414-427, 1988、Ernest K. C. Yu, Hiroyuki Aoki, and Masanaru Misawa, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 377-379, 1988）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
CGTase はその合成する主CDの種類によってα-、β-CGTase及びγ-CGTaseとして分類される。過去に報告された多くはα-あるいはβ- CGTaseであり、γ-CGTase として報告されている酵素は数少ない（Shigeharu Mori, Susumu Hirose, Takaichi Oya, and Sumio Kitahata, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994、Yoshito Fujita, Hitoshi Tsubouchi, Yukio Inagi, Keiji Tomita, Akira Ozaki, and Kazuhiro Nakanishi, J. Fermentation and Bioengineering, 70 (3), 150-154, 1990、Takashi Kato and Koki Horikoshi, J. Jpn. Soc. Starch Sci., 33 (2), 137-143, 1986）。
【０００５】
又、γ-CGTaseとして報告されている酵素においても、γ-CD生成量が5 %以下であったり、反応後期にβ-CDの生成速度が加速され、γ-CDと同量若しくはそれ以上のβ-CDが生成したり、あるいは10 %以上の基質濃度では著しくγ-CDの生産量が低下し、その対策として反応液中にエタノールを共存させる必要がある等、工業的に利用可能な酵素ではなかった。
【０００６】
一方、α-あるいはβ-CGTase の構造遺伝子を改変し、γ-CDの生成量を改善する試みも行われている（Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Yamane, Biochemstry, 32, 6624-6631, 1993、Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994）。しかるに、これもγ-CD生成量が増加しても元来の活性で生ずるβ-CDが顕著に減少せず、工業的観点から考えると充分な方法とはいえなかった。
【０００７】
それ故、α-CD及びβ-CDに関しては、各分野に利用されているが、γ-CDに関しては、ほとんど利用されていないのが現状である。CD含有シラップについても同様であり、α-あるいはβ-CDを主成分とするCDシラップは各分野に利用されているが、γ-CDを主成分とするCDシラップの利用は少ない。
【０００８】
そこで本発明の目的は、γ-CDを優先的に生成できる新規なγ-CGTaseを提供することにあり、そのための、新規なγ-CGTaseの生産能を有する微生物を提供することも本発明の目的である。
さらに本発明の目的は、上記γ-CGTaseを用いるγ-CDの製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明者らは、γ-CDを生産するCGTase生産能を有する微生物を広く自然界に求め探索を試みた。その結果、バチルスクラーキ種に属するものと認められる菌株の中に、本目的のCGTase生産能を有する菌株を見出した。そして、この微生物を培養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取して同定した結果、このCGTaseが新規酵素であることを見いだし、本発明を完成した。さらに、このCGTaseを使用してγ-CDを優先的に製造することができることを見いだし、γ-CDの工業的製造法を確立した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記の酵素化学的性質を有し、かつ分子量が66,000であるシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ。
(1)作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペクチン又はアミロースに作用し、主としてγ-シクロデキストリンを生成し、β-及びα-シクロデキストリンの生成量はγ-シクロデキストリンの生成量と比較して低い。
(2)至適pH：10.5-11.0、(3)至適温度：60 ℃付近、(4)安定pH：6-11、(5)温度安定性：50 ℃、15 分間処理で90 % 以上の残存活性を示す。
【００１１】
さらに本発明のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造方法は、バチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種に属するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産能を有する微生物であるバチルスクラーキ7364株（FERM BP-7156）を培養し、培養物中にシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを生産せしめ、次いで生成した上記本発明のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを採取することを特徴とする。
【００１３】
さらに本発明のシクロデキストリンの製造方法は、澱粉、デキストリン、アミロペクチン及びアミロースからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する溶液にバチルスクラーキ（Bacillusclarkii）種が産生する上記本発明のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反応させて主としてγ-シクロデキストリンを生成させ、生成したγ-シクロデキストリンを採取することを特徴とする。
【００１５】
さらに本発明は、上記本発明のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ産生能を有するバチルスクラーキ（Bacillus clarkii）種菌であるバチルスクラーキ7364株（FERM BP-7156）に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
〔シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ〕
本発明者らにより新たに発見、分離された菌株の菌学的性質を表１に纏めた。
【００１７】
【表１】
0003934851.tif 000002
【００１８】
さらにこの菌株の１６S rDNAの塩基配列を配列表に配列番号１として示す。
この菌株は伸長型をも示す運動性グラム陽性桿菌で、カタラーゼ、オキシダーゼ共に陽性を示し、芽胞の形成確認は困難ながらも伸長型末端の端立芽胞としての所見が得られ、Bacillus 属と推定された。合わせて菌体脂肪酸組成（CFA）、16S rDNA 塩基配列及び糖資化性試験を行った。該菌株はアルカリ性領域で最大増殖速度が得られかつpH 7.0 以下のpHでは生育しないことから、好アルカリ性細菌の範疇に入った。既に報告されているAlkalophilic Bacillus clarkii （Preben Nielsen, Dagmar Fritze and Fergus G. Priest, Microbiology, 141, 1745-1761, 1995）と、16S rDNA 塩基配列において96.12 % の低相同率ながらも近縁種と推定された。しかしながら、他の生理性状試験ではI. Yumoto 等の報告値（I. Yumoto et al., Int. J. Syat. Bacteriol., 48, 565-571, 1998）と良い一致を示し、該菌株はBacillus clarkii と推定された。
【００１９】
以上の結果から、この菌株は新菌種であることが明らかとなり、バチルスクラーキ7364株と命名した。この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7156として寄託されている。
尚、これまでにバチルスクラーキ種において、CGTase生産能を有する菌株は報告されておらず又、近縁種B. horti（JCM No. 9943T）、B. clarkii (ATCC No. 700162)及びB. agaradhaerens (ATCC No. 700163)にCGTase活性が無い事を確認した。即ち、本菌株がCGTase生産能を有するはじめてのバチルスクラーキ種に属する菌株である。
【００２０】
〔シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造方法〕
バチルスクラーキ7364株を利用して、CGTaseを製造する為には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産する為に必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養素等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養する。炭素源としては、澱粉またはその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα-澱粉等の炭水化物が利用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなどが挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーあるいは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。無機塩類としては、リン酸1カリウム、リン酸2カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム塩等のナトリウム塩等が用いられる。培養は振とう培養若しくは通気攪拌培養などの好気的条件下において、培地pH 7以上の範囲、好ましくはpH 8から11の範囲に調整し、温度10〜45℃の範囲、好ましくは30〜42 ℃で実施する事が望ましいが、この条件以外であっても、微生物が生育し、目的とする酵素が生成する条件であれば特に制限されない。
【００２１】
上記のような条件で培養すると、通常は培養開始48時間前後で培養液中に著量のCGTaseが生産される。次いで、培養液から菌体を除去し、培養濾液を得る。限外濾過膜で脱塩、濃縮して、酵素を回収する。こうして得られた粗精製酵素は、そのままでもCD生成反応に利用可能である。但し、必要に応じて、硫安塩析又は有機溶媒沈澱、DEAE-セファデックス、ブチルトヨパール等による吸着溶出、セファデックス、トヨパール等によるカラム分画、γ-CDをリガンドとして誘導したアフィニティークロマトグラフィー等により精製した後に使用することもできる。
【００２２】
以下に酵素の活性測定法を説明する。
（CGTase 活性測定）
CGTase 活性は、50 mM グリシン-NaCl-NaOH  (pH 10.0) 緩衝液を用いて40 若しくは50 ℃で行った。
【００２３】
（Blue value 法）
アミロース（林原製EX-III type）50 mg を2 ml の1 N NaOH に一晩かけて溶解したものを1 N HCl で中和し、50 mM グリシン-NaCl-NaOH  (pH 10.0) 緩衝液で50 ml にしたものを基質溶液とした。300 μl の基質液を40 ℃で10 分間保温し、適当に希釈した酵素溶液200 μl を添加する事で反応を開始し、同温度で10 分間反応した。4 ml の0.2 N HCl を添加する事で反応を停止した。同反応液に4 ml の水及び0.02 % I2-0.2 % KI 溶液500 μlを加え、700 nm の吸光度を測定した。同様に0.2 N HCl を添加後に酵素溶液を添加したものを対照とした。本条件で700 nm の吸光度を対照に対して1 分間に10 % 減少させる酵素量を1 U と定義した。
【００２４】
（γ-CD 生成活性）
10 %（w/v）になるように25 mM グリシン-NaCl-NaOH  (pH 10.0)緩衝液に溶解した可溶性澱粉（nacalai tesque）1 ml を10 分間50 ℃で加温した。適当に希釈した酵素溶液200 μl を添加する事で反応を開始し、同温度で30 分間反応し、3 ml の0.02 N HCl を添加する事で反応を停止した。反応液の20 μl をHPLC に供し、生成したγ-CD 量を測定した。本条件で1 分間に1 μmol/mlのγ-CD を生成する酵素量を1 U と定義した。
【００２５】
本測定に用いたHPLC 条件は以下の通りである。
Column     YMC-pack AQ-312 (6 × 150 mm)
Solvent      10 % MeOH
Flow rate     1.0 ml/min
Temp.        R. T.
Detection     RI
ATT         7
濃度既知のCD溶液を上記条件で分析し、CD含量とHPLC 面積の相関を求める事で下式検量線を得た。
(HPLC area) = 3.092 × 106 × （γ-CD w/v %）    R2= 0.999
【００２６】
（CD 生成量の分析）
反応液中のCD 含量はHPLC を用いて分析した。その分析条件は以下の通りである。
HPLC 法-1
Column     Aminex HPX-42A (Bio-Rad Lab. 7.8 × 300 mm)
Solvent      H2O
Flow rate    0.5 ml/min
Temp.       55 ℃
Detection     RI
ATT         9
【００２７】
HPLC 法-2 はCD 生成活性を分析するのに用いた方法と同様の方法によって行った。
CD 生成反応はポテト 可溶性澱粉（Sigma）を基質として行った。
【００２８】
得られたCGTaseの酵素学的諸性質を以下に示す。
該酵素200 μl （蛋白100 μg）とpH 3〜11.9 の各種緩衝液中に溶解した1.0 % (w/v) アミロース（DP 117）を40 ℃で10 分間反応させ、その相対活性（Blue value 法）を求めた。さらに50 μl の酵素溶液（蛋白25 μg）と500 μl のpH 3-11.9 の範囲の各種緩衝液を混合し、4 ℃で24時間放置し、2.75 ml の50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液を加えたものの残存活性を測定した（図１）。その結果、該酵素の至適pH 及びpH 安定性領域はそれぞれ10.5-11.0 及び6-11.0 であった。
【００２９】
該酵素200 μl （蛋白100 μg）と50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液中に溶解した1.0 % (w/v) アミロース（DP 117）を各種温度で10 分間反応させ、その相対活性（Blue value 法）を求めた。さらに20 μl の酵素溶液と1180 μl の50 mM グリシン-NaOH （pH 10.0）緩衝液を混合し、各種温度で15 分間保持し、その残存活性を測定した（図２）。その結果、該酵素の至適温度 及び温度安定性領域はそれぞれ60 ℃ 及び30 ℃以下であった。これらの結果は、γ-CD生成活性においても同様であった。
【００３０】
以上の結果及び該酵素の分子量、等電点の検討結果を合わせて、酵素の諸性質について、他菌株由来CGTase との比較を表２に示した。
【００３１】
【表２】
0003934851.tif 000003
【００３２】
バチルスクラーキ7364株由来のCDTaseの分子量はSDS-PAGEで66,000、等電点は3.98 （焦点電気泳動法）である。
【００３３】
〔シクロデキストリンの製造方法〕
本発明のCDTaseを用いてCDを製造する為には、例えば、1〜30%の澱粉（澱粉又はその組成画分、デキストリン、アミロペクチン及びアミロース等の加工澱粉などを含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製酵素又は粗酵素）を0.5〜300U（乾燥澱粉１ｇ当り）添加し、pH4.5から12、温度20から60℃にて１〜96時間酵素反応を行うことができる。尚、澱粉は必要に応じ、予め加熱し、液化処理を施して用いることができる。上述のような方法で調製した糖類(シラップ)中には、γ-CDがα-及びβ-CDより多く含まれ、これらのCDの他に、グルコースなどの単糖類、各種オリゴ糖(マルトースなど)或いはデキストリンなども含まれる場合がある。また、必要に応じて所望の単一重合度を有するCDを分離(結晶化、クロマト分画、酵母などによる醗酵処理及び酵素処理などによる)して用いることもできる。即ち、上記生成物からγ-CDを分離、精製することもできる。本発明の方法により得られる反応液は、γ-CDがα-及びβ-CDより多く含まれているため、γ-CDを従来知比べて容易に分離、精製することができる。なお形態は、上述の方法で得られるようなシラップ状の他、結晶状、凍結乾燥状、粉末状、顆粒状などの任意の形態であることはいうまでもない。
【００３４】
本発明の製造方法により製造されたCD(特に、γ-CDの含有比率が高いCD、または高純度のγ-CD)は、これまで市販されているCDと同様に経口摂取可能な全ての飲食品に使用できる。そのような飲食品としては、例えば、茶類、清涼飲料などの飲料類、キャンディー、ゼリー、和菓子などの和洋菓子類、ヨーグルト、アイスクリームなどの乳製品類、ハム、ソーゼージなどの畜肉加工品類、蒲鉾、なると等の水産加工品類や麺類、漬物類、その他調理済加工食品類やインスタント食品類などを挙げることができる。さらに、香料などの安定化や乳化作用および賦形剤などとして本発明の製造方法により製造されたCDを添加・共存させることで、極めて簡便に且つ効果的に飲食品の嗜好性及び機能性を向上させることもできる。また、本発明の製造方法により製造されたCDは、飲食品のみならず医薬品や化粧料などの有効成分の安定化や乳化作用、賦形剤などとしても利用することが可能である。
【００３５】
本発明の製造方法により製造されたCDの使用方法は、飲食品、医薬品や化粧料中にCDが共存する条件であれば特に限定されるものではない。例えば、CDを基礎となる飲食品素材加工中に同時に添加しても、或いは基礎飲食品加工終了後に添加してもよく、各種食品の製造工程の実状に適した添加方法を用いればよい。
CDの添加量は、飲食品の場合、基礎となる飲食品本来の味質並びに風味を損なわない限り特に限定はないが、一般に20重量％以下の添加量で添加するのが好ましい。20重量％以上では、CDが有するマスキング効果により、基礎となる飲食品の味質或いは風味を変えて、嗜好性を減じてしまう懸念があるので好ましくはない。医薬品や化粧料の場合には、有効成分の効果効能を損なわない限り特に限定はないが、50重量％以下にて使用するのが望ましい。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例 １
バチルスクラーキ7364株(FERM BP-7156)を炭素源としてネオタック #30T（日本食品化工（株）製） 1.0 % (w/v)、窒素源としてソヤフラワーFT（日清製油製）0.5 %及び酵母エキス（Difco 製）0.5 %、K2HPO4 0.1 %、MgSO4・7H2O 0.02 %及びNa2CO3 0.8 % を含む液体培地で37 ℃、48 時間振とう培養するとその培養液中にCGTaseを分泌した（Blue value 法 20 U/ml 培養上澄）。
得られたCGTaseをアフィニティークロマトグラフィー法により精製し、その物性は、表2に示す通りである。
【００３７】
実施例 ２
実施例１に記載の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として糖化試験を行った。本濃縮液は、55 U/ml （Blue value 法）の活性を有していた。先ず可溶性澱粉を基質として、10 %(w/v) になるように50 mM グリシン-NaCl-NaOH  (pH 10.0) 緩衝液に溶解したものを基質溶液とした。基質溶液5 ml に粗酵素液を80、40、20、10及び5 U/g - DS になる様にそれぞれ添加し、50 ℃ で反応を行った。反応開始2、4、6、24及び48 時間目にサンプリングを行い、HPLC 法-1 及び2 で、γ-CD生成量を求めた（図３）。
その結果該酵素をDS を80 U/g添加した場合、48 時間後ではγ-CD が9.7 %、α-及びβ-CD はそれぞれ1.7及び0.9 % （HPLC area）であった。
【００３８】
実施例 ３
コーンスターチを常法によりα−アミラーゼを用いて液化させ、濃度20重量％、グルコース当量が７である澱粉液化液を調製した。次いでこの澱粉液化液をpH７に調整した後、実施例１記載の培養上澄み液をUF 濃縮膜（PM-10）を用いて濃縮したものを粗酵素液として450単位/g基質添加し、55℃，48時間反応させた。その後、本反応液を加熱し酵素を失活させ、脱色、イオン交換などの精製を行いCDを含むシラップを調製した。その糖組成を表3に示した。CDの含量は、HPLC 法-1 及び2 で求めた。
【００３９】
【表３】
0003934851.tif 000004
【００４０】
実施例 ４
実施例２の反応液(DS を80 U/g添加し、48 時間反応させた反応液)をグルコアミラーゼ処理後、活性炭カラム（φ2.5 × 20 cm）に負荷し、純水で洗浄する事によりグルコアミラーゼ処理で生じたグルコースを除去した。さらに20 % エタノールで洗浄後、3 倍量の25 % エタノールで吸着画分を溶出した。溶出画分を濃縮後4 ℃で15 分間冷却することによりβ-CDを析出させ、遠心分離によって除去した。次いで、上澄をトヨパールHW-40S（φ2.9 × 90 cm）に供した。10 ml毎のフラクションのBrix を測定したところ、１つの主ピークが観測された（Tube：23-28）。各フラクションをHPLC で分析したところ画分23-26はα-CDあるいはα-CDとγ-CDの混合物であったので、画分27 及び28 を集めて濃縮、凍結乾燥した。HPLCによる検定の結果、該画分は純度99.5 % のγ-CD（であった。最終的に175 mg のγ-CDを単離した。該γ-CDはNMRによってγ-CDである事を確認した。
13C-NMR data：104.30, 83.08, 75.56, 74.93, 74.40, 62.86 ppm
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なγ-CGTaseの生産能を有する微生物、γ-CDを優先的に生成できる新規なγ-CGTaseを提供することができる。さらに本発明によれば、γ-CGTaseを用いてγ-CDを効率よく製造できる方法を提供するができる。
【配列表】
0003934851.tif 000005
0003934851.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】Bacillus clarkii 7364由来γ-CGTase活性（Blue value 法）に及ぼすpH の影響。
【図２】Bacillus clarkii 7364由来γ-CGTase活性（Blue value法）に及ぼす温度の影響。
【図３】可溶性澱粉を基質としたγ-CD 生成反応の経時変化。
【図１】
0003934851.tif 000007
【図２】
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【図３】
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