(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体を有効成分とする、腎不全死防御剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＣＦ−II変異体を有効成分とする、腎疾患予防及び／又は治療剤に関する。本発明の腎疾患予防及び／又は治療剤は、虚血性腎障害、薬物性腎障害、糖尿病性腎症、糸球体腎症、糸球体硬化症、膜性腎症、自己免疫疾患に関連した慢性腎症、及びネフローゼなどの腎疾患、あるいはこれらの疾患を原因とする腎不全の予防及び／又は治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、虚血性腎障害、薬物性腎障害、糖尿病性腎症、糸球体腎症、糸球体硬化症、膜性腎症、自己免疫疾患に関連した慢性腎症、及びネフローゼなどの腎疾患、あるいはこれらを原因とする腎不全などに対する有効な治療剤は見つかっておらず、臨床の現場では保存療法、即ち症状に合わせた透析、栄養管理、利尿剤あるいは強心剤の投与による悪化因子の除去、あるいはステロイド療法などが行われており、腎臓疾患領域での有効な薬剤が切望されていた。
【０００３】
ＴＣＦ−IIは、本発明者らにより見出された、ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−90の産生する腫瘍細胞壊死因子として知られる糖蛋白質であり(WO 90/10651号）、優れた肝臓細胞増殖活性、腎臓細胞増殖活性、抗腫瘍活性などの薬理活性を有することが知られている。ＴＣＦ−IIは、天然型ＴＣＦ−IIあるいは遺伝子組換えによるＴＣＦ−II等が知られている。さらに、この蛋白質の糖鎖欠失変異体（特表平7-507328号）、あるいは点変異体(WO 96/20214号）などのＴＣＦ−II変異体が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上述の状況に鑑み、これらの腎臓疾患に対し有効な物質を求め鋭意探索した結果、ＴＣＦ−II変異体、特に点変異体であるＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体、又はＮ末端２７番目からのアミノ酸配列Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体が腎臓疾患の予防または治療に対して有効であることを見出した。従って、本発明は、ＴＣＦ−II変異体を有効成分とする新規な腎疾患予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＣＦ−II変異体、特にＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体、又はＮ末端２７番目からのアミノ酸配列Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体を有効成分とする、腎疾患予防及び／又は治療剤に関する。本発明の腎疾患及び／又は治療剤は、虚血性腎障害、薬物性腎障害、糖尿病性腎症、糸球体腎症、糸球体硬化症、膜性腎症、自己免疫疾患に関連した慢性腎症、及びネフローゼなどの腎疾患、あるいはこれらの疾患を原因とする腎不全の予防及び／又は治療に有用である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−II変異体は、ＴＣＦ−II変異体の変異導入部位に対応する塩基配列に置き換えたオリゴヌクレオチドを合成し、ＴＣＦ−IIｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法による部位特異的変異法により調製することができる。このようにして得られたｃＤＮＡは適当な発現プロモーター（サイトメガロウィルス(CMV),SRα (Mole. Cell. Biol. vol.8, No.1 pp466-472(1988) 及び特開平1-277489号公報）を有したベクター（例えばWO 92/01053 号公報）に挿入し、哺乳動物細胞などの真核細胞をトランスフェクトし、この細胞を培養することにより、培養液から目的とするＴＣＦ−II変異体を回収、調製することができる。用いられるＴＣＦ−II変異体は、ＴＣＦ−IIに対し人為的に変異を加えたものであればどのようなものでも用いられるが、特に好ましくは、WO 96/20214 号公報に開示されるＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させた変異体、又はＮ末端２７番目からのアミノ酸配列Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala に変異させた変異体が用いられる。
【０００７】
本発明の腎疾患予防及び／又は治療剤は、注射剤として静脈、筋肉内、あるいは皮下に投与することができる。これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ製造され、必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を添加することができる。本発明の製剤を患者に投与する場合、投与患者の症状の程度、健康状態、年齢、体重等の条件によって異なり、特に限定されないが、成人１日当たり精製ＴＣＦ−IIとして 0.6mg〜600mg 、好ましくは 6mg〜60mgを含有する製剤を１日１回若しくはそれ以上投与すれば良い。
【０００８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。しかし、これらは単なる例示であって、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０００９】
【実施例１】
ＴＣＦ−II変異体の調製
WO 96/20214 号公報に開示される方法に従って、天然型ＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させた変異体（以下、RKRR2AAAA と表す）、及びＮ末端２７番目からのアミノ酸配列 Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-LysをAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala （以下、KIKTKK27AIATAAと表す）に変異させた変異体の点変異体２種を調製した。即ち、RKRR2AIAA ｃＤＮＡの発現ベクターを含む大腸菌(FERM BP-5266)、および KIKTKK27AIATAA ｃＤＮＡの発現ベクターを含む大腸菌(FERM BP-5265)を50μg/mlのアンピシリンを含むＬ培地(400ml) 中３７℃で振盪培養し、OD 600が 1.0になったところで終濃度が0.3 mg/ml となるようにスペクチノマイシン（シグマ社) を添加し、一晩培養した。Maniatisの方法(Molecular Cloning 2nd ed. pp 1.21-1.52(1989), Cold Spring Harbor Laboratory発行) に従い、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、塩化セシウム密度勾配遠心法によりそれぞれの変異体発現プラスミドを精製した。
【００１０】
得られたこれらの発現プラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。あらかじめ25μｌのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA)に溶かしておいた、 200μg の発現プラスミドと10μg のブラストサイジン耐性遺伝子発現プラスミドpSV2 bsr（フナコシ社）ＤＮＡを、10％牛胎児血清（ギブコ社）を含んだＩＭＤＭ培地（ギブコ社）0.8ml に懸濁した 2×106 個のＣＨＯ細胞にエレクトロポレーション法で遺伝子導入した。330V,960μF の条件でエレクトロポレーションを行った後、細胞懸濁液を１０分間室温で放置し、10mlの10％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ培地に懸濁し２日間37℃の炭酸ガスインキュベーター（５％CO2)中で培養した。２日後細胞をトリプシン（ギブコ社）処理によりフラスコ底面より剥がし、生細胞数を数えた後、10,000個／ウエルになるように96ウエルプレート（Nunc社）にまき、５μg/mlのブラストサイジン（フナコシ社）を含んだ選択培地 200μl ／ウエル中で３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５％CO2)中で培養した。２−３週間後、ウエルあたり50μｌの培養上清を取り、エンザイムイムノアッセイ（N.Shima 他、Gastrpenterologia Japonica, Vol. 26, No.4, pp 477-482 (1991)) を行いＴＣＦ−II変異体生産細胞を選びだした。生産細胞を１枚当たり100ml の培地中、50-200枚の225cm2フラスコを用い、一枚あたり100ml の培地を用い37℃の炭酸ガスインキュベーター（５％CO2)中で４−７日培養し、5-20L の培養上清を回収した。この培養上清から、ヘパリンーセファロース CL-6Bカラム (25mm×120mm,ファルマシア社）、Mono Sカラム(5mm×50mm, ファルマシア社）、及びヘパリン5-PWカラム(8mm×75mm, 東ソー社）により各変異体を精製した。得られたＴＣＦ−II変異体は、0.01％ Tween20を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して透析し最終精製品とした。最終精製品については、ローリー法による蛋白質量定量、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度検定、及びアミノ酸シークエンサーによるアミノ酸配列決定により構造を確認した。
【００１１】
【実施例２】
ＴＣＦ−ＩＩ変異体製剤の製造
前述の実施例１で得られたＴＣＦ−ＩＩ変異体の注射剤の製造例を示す。
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上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１２】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１３】
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上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１４】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１５】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１６】
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上記組成を pH6.03 のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１７】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１８】
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上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
これらの凍結乾燥品は、使用時に滅菌蒸留水に溶解して用いられる。
【００１９】
【実施例３】
塩化第二水銀による腎不全死防御効果
実施例１に従って得られた、ＴＣＦ−IIの２番目からのアミノ酸を変異させた RKRR2AAAA、及び27番目からのアミノ酸を変異させた KIKTKK27AIATAA を用いて、塩化第二水銀による腎不全死に対する防御効果を試験した。
即ち、ＩＣＲ系雄マウス（体重30〜35ｇ；一群20匹）に１日２回、計９回各ＴＣＦ-II 変異体（それぞれ25μｇ／匹／回）、陽性対照としてＴＣＦ−II(25,50,100μg/匹／回）、及び溶媒を静脈内投与した。最終投与の６時間後、5mg/kgの塩化第二水銀 (和光純薬社) を静脈内投与し、塩化第二水銀による腎不全死に対するＴＣＦ−II変異体の防御効果を生存匹数として経時的に観察した。結果を図１及び図２に示す。この結果より、溶媒投与群と比較して、ＴＣＦ−II及びＴＣＦ−II変異体投与群は、明らかに塩化第二水銀による腎不全死を防御した。さらに、ＴＣＦ−II変異体投与群はＴＣＦ−II投与群と比較して、低用量で同等の活性を示すことが確認された (RKRR2AAAA では天然型ＴＣＦ−IIの４分の１量、KIKTKK27AIATAAでは２分の１量) 。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により優れた腎疾患予防及び／又は治療剤が提供される。本発明は、ＴＣＦ−IIのＮ末端２番目からのアミノ酸配列Arg-Lys-Arg-Arg をAla-Ala-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体、又はＮ末端27番目からのアミノ酸配列Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala に変異させたＴＣＦ−II変異体を有効成分とする、腎疾患予防及び／又は治療剤に関し、虚血性腎障害、薬物性腎障害、糖尿病性腎症、糸球体腎症、糸球体硬化症、膜性腎症、自己免疫疾患に関連した慢性腎症、及びネフローゼなどの腎疾患、さらにこれらの疾患を原因とする腎不全の予防及び／又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】塩化第二水銀による腎不全死に対する、ＴＣＦ−II変異体（RKRR2AAAA)の防御効果を示す。
【図２】塩化第二水銀による腎不全死に対する、ＴＣＦ−II変異体 (KIKTKK27AIATAA) の防御効果を示す。
【図１】
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【図２】
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