(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0003937367.tif 000029
〔式中、Ａで示される環はベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環又はフラン環であり、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 はＡがベンゼン環以外の場合には全て水素原子を示し、Ａがベンゼン環の場合には同一又は異なって水素原子、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、ハロゲン置換低級アルキル基、フェニル基、フェノキシ基、低級アルカノイルオキシ基、ヒドロキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基又は低級アルキルスルホニル基を示す。Ｒ4 は(1) 置換基として低級アルキル基を有するチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基、(2) 置換基として低級アルキル基、フェニル基、フェニル低級アルキル基、フェニルチオフェニル基及びハロゲン原子から選ばれる基の１〜２個を有することのあるピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基、(3) ６位に低級アルキル基を有し更に窒素原子の一つがフェニル低級アルキル基で置換されることのあるピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル基及び(4) ２位に低級アルキル基を有し更に窒素原子の一つが低級アルキル基又はフェニル低級アルキル基で置換されることのあるプリン−６−イル基から選ばれる複素環基を示し、Ｒ5 は水素原子又は基
【化２】
0003937367.tif 000030
（式中、Ａ、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は上記に同じ）を示す。〕
で表されるアミド誘導体を有効成分として、その有効量を製剤担体と共に含有することを特徴とする一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式中、Ａがベンゼン環で、Ｒ5 が水素原子である化合物を有効成分とする請求項１に記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載の一般式中、Ｒ4 で示される複素環基が置換基として２位に低級アルキル基を有するチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基、置換基として２位に低級アルキル基を有するピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基又は２位に低級アルキル基を有する９Ｈ−プリン−６−イル基である化合物を有効成分とする請求項２に記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１に記載の一般式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が同一又は異なって水素原子、低級アルコキシ基又はハロゲン原子である化合物を有効成分とする請求項３に記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項５】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，３，４−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，４−ジクロロベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−クロロベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２，４−ジクロロベンズアミド及びＮ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３−メトキシベンズアミドから選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする請求項４に記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項６】
有効成分がＮ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドである請求項５に記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項７】
誘導型一酸化窒素合成酵素を選択的に阻害する請求項１〜６のいずれかに記載の一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項８】
請求項１に記載のアミド誘導体の有効量を、製剤担体と共に含有することを特徴とする敗血症予防及び治療剤。
【請求項９】
請求項１に記載のアミド誘導体の有効量を、製剤担体と共に含有することを特徴とするエンドトキシンショック改善剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な一酸化窒素合成酵素阻害剤、より詳しくは誘導型一酸化窒素合成酵素の誘導を阻害する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年代前半に、生体内における窒素酸化物の研究過程で、一酸化窒素（以下「ＮＯ」という）が生体内で産生していることが初めて見出された。その発見をきっかけに、ＮＯは多くの研究者の注目を集め、１９８７年には、ＮＯが血管内皮由来弛緩因子の本体であるとの報告がなされた。そして、現在では、循環、免疫、神経系等の広い分野で、ＮＯの生理機能や病態との関連が明らかにされている。
【０００３】
そのうちの一つは、体内で常時産生されているＮＯが循環動態の恒常性を維持する重要な役割を担うという事実である。また、敗血症においては、エンドトキシンにより活性化されたサイトカインの働きにより、大量のＮＯが産生され、これが内皮細胞障害、心筋収縮力低下等のエンドトキシンショック状態を引き起こすといわれている。
【０００４】
ＮＯは、ＮＯ合成酵素（以下「ＮＯＳ」という）によってＬ−アルギニンから産生される。該酵素は、病態時のＮＯ産生に係わる誘導型ＮＯＳ（以下「ｉＮＯＳ」という）と、常時発現している構成型ＮＯＳ（以下「ｃＮＯＳ」という）とに大別できる。
【０００５】
上記したように、ＮＯは敗血症等の種々の疾患に関与しているので、そのメカニズムの解明、惹いてはそれら疾患に対する治療薬への応用等を目的として、ＮＯＳ阻害剤の研究が進められている。該阻害剤の代表例としては、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン等のアルギニン類縁体が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、上記代表例を含む従来公知のＮＯＳ阻害剤の殆どは、ｉＮＯＳだけでなく、ｃＮＯＳをも阻害してしまう。従って、之等の治療薬としての利用によれば、恒常的な循環動態の調節までもが抑制されてしまい、血圧上昇、臓器血流減少等の副作用を回避することはできない。更に、之等の利用時には、中枢神経系への悪影響やインポテンツ等の問題も懸念される。
【０００７】
以上のように、従来知られているＮＯＳ阻害剤は、医薬品として評価できるものではなく、之等に代わって、ｉＮＯＳを選択的に阻害できる新しいＮＯＳ阻害剤の提供が当業界で要望されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、当業界で要望されているｉＮＯＳのみを選択的に阻害できる物質及びこれを利用したＮＯＳ阻害剤を提供することにある。
【０００９】
本発明者らの研究グループは、かねてより医薬製剤有効成分化合物の開発を目的として、種々の化合物の合成及びそれらの有する薬理作用の研究、解明等を行なってきた。その過程で、先に、強力な鎮痛作用を有する一連のアミド誘導体の合成に成功し、この化合物に係わる発明を特許出願した〔ＷＯ９７／４６５６０号公報参照〕。
【００１０】
引き続く研究において、本発明者らは、上記一連の化合物を含むある種の化合物が、先に見出された鎮痛作用とは別個に、しかも該作用とは無関係に、ｉＮＯＳの誘導阻害作用を有するという新事実を見出した。本発明は該発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、下記一般式（１）で表わされるアミド誘導体を有効成分として、製剤担体と共に、含有するＮＯＳ阻害剤が提供される。
【００１２】
【化３】
0003937367.tif 000002
【００１３】
〔式中、Ａで示される環はベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環又はフラン環であり、Ｒ1 、Ｒ2 及び  Ｒ3 はＡがベンゼン環以外の場合には全て水素原子を示し、Ａがベンゼン環の場合には同一又は異なって水素原子、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、ハロゲン置換低級アルキル基、フェニル基、フェノキシ基、低級アルカノイルオキシ基、ヒドロキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基又は低級アルキルスルホニル基を示す。Ｒ4 は(1) 置換基として低級アルキル基を有するチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基、(2) 置換基として低級アルキル基、フェニル基、フェニル低級アルキル基、フェニルチオフェニル基及びハロゲン原子から選ばれる基の１〜２個を有することのあるピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基、(3) ６位に低級アルキル基を有し更に窒素原子の一つがフェニル低級アルキル基で置換されることのあるピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル基及び(4) ２位に低級アルキル基を有し更に窒素原子の一つが低級アルキル基又はフェニル低級アルキル基で置換されることのあるプリン−６−イル基から選ばれる複素環基を示し、Ｒ5 は水素原子又は基
【００１４】
【化４】
0003937367.tif 000003
【００１５】
（式中、Ａ、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は上記に同じ）を示す。〕
上記一般式（１）で表わされる誘導体は、ＮＯＳ阻害作用、殊にｉＮＯＳを選択的に阻害する作用を有しており、従って、血圧上昇、臓器血流減少、中枢神経系への悪影響等の副作用を殆ど示さない点において特徴づけられる。
【００１６】
本発明ＮＯＳ阻害剤の有効成分を表わす上記一般式（１）中の各基としては、例えば次の各基を例示できる。尚、各基における「低級」なる語は、炭素数１〜６を示すものとする。
【００１７】
低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル基等の直鎖又は分枝鎖状低級アルキル基を例示できる。
【００１８】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基等を例示できる。
【００１９】
フェニル低級アルキル基としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル、６−フェニルヘキシル基等等を例示できる。
【００２０】
ハロゲン原子には、弗素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が包含される。
【００２１】
ハロゲン置換低級アルキル基としては、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ノナフルオロブチル、ウンデカフルオロペンチル、トリデカフルオロヘキシル基等を例示できる。
【００２２】
低級アルカノイルオキシ基としては、アセトキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、バレリルオキシ、ヘキサノイルオキシ、ヘプタノイルオキシ基等を例示できる。
【００２３】
低級アルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ基等を例示できる。
【００２４】
低級アルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、プロピルスルフィニル、ブチルスルフィニル、ペンチルスルフィニル、ヘキシルスルフィニル基等を例示できる。
【００２５】
低級アルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ペンチルスルホニル、ヘキシルスルホニル基等を例示できる。
【００２６】
Ｒ4 で示される複素環基中、(1) に示す置換基として低級アルキル基を有するチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基としては、２−メチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−エチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ｎ−プロピルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ｎ−ペンチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ｎ−ヘキシルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基等を例示できる。
【００２７】
Ｒ4 で示される複素環基中、(2) に示す置換基として低級アルキル基、フェニル、フェニル低級アルキル基、フェニルチオフェニル基及びハロゲン原子から選ばれる基の１〜２個を有することのあるピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基としては、無置換のそれに加えて、以下の各置換ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基を例示できる。
【００２８】
２−メチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−エチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ペンチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ヘキシルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ベンジルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−（２−フェニルエチル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−（３−フェニルプロピル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−（４−フェニルブチル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−（５−フェニルペンチル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−（６−フェニルヘキシル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−メチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−エチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−フェニル−２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ペンチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ヘキシル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−メチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−エチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、７−フェニル−２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ペンチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ヘキシル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−メチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−エチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−（４−フェニルチオフェニル）−２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ペンチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ヘキシル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−メチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−エチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−ｎ−ペンチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、８−ブロモ−２−ｎ−ヘキシルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−８−フルオロピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−８−クロロピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル、２−ｎ−ブチル−８−ヨードピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基等。
【００２９】
Ｒ4 で示される複素環基中、(3) に示す６位に低級アルキル基を有し、更に窒素原子の一つがフェニル低級アルキル基で置換されることのあるピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル基としては、次の各基を例示できる。
【００３０】
６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ヘキシル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−メチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−エチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−プロピル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ペンチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ヘキシル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−メチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−エチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−ｎ−プロピル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−ｎ−ペンチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、２−ベンジル−６−ｎ−ヘキシル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（１−フェニルエチル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（３−フェニルプロピル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（４−フェニルブチル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（５−フェニルペンチル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−２−（６−フェニルヘキシル）−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−エチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−ｎ−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−ｎ−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、１−ベンジル−６−ｎ−ヘキシル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（１−フェニルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（２−フェニルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（３−フェニルプロピル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（４−フェニルブチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（５−フェニルペンチル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−１−（６−フェニルヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、６−ｎ−ブチル−５Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル、５−ベンジル−６−ｎ−ブチル−５Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル基等。
【００３１】
また、Ｒ4 で示される複素環基中、(4) に示す２位に低級アルキル基を有し、更に窒素原子の一つが低級アルキル基又はフェニル低級アルキル基で置換されることのあるプリン−６−イル基としては、次の各基を例示できる。
【００３２】
２−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−エチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−プロピル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ペンチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ヘキシル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−メチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−エチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−プロピル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ペンチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ヘキシル−７Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−エチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−ｎ−プロピル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−ｎ−ペンチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−ベンジル−２−ｎ−ヘキシル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（１−フェニルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（２−フェニルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（３−フェニルプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（４−フェニルブチル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（５−フェニルペンチル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−（６−フェニルヘキシル）−９Ｈ−プリン−６−イル、２，９−ジメチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−エチル−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−メチル−２−ｎ−プロピル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル、９−メチル−２−ｎ−ペンチル−９Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ヘキシル−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−メチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−エチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−ｎ−プロピル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−ｎ−ペンチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−ベンジル−２−ｎ−ヘキシル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（１−フェニルエチル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（２−フェニルエチル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（３−フェニルプロピル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（４−フェニルブチル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（５−フェニルペンチル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−（６−フェニルヘキシル）−７Ｈ−プリン−６−イル、２，７−ジメチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−エチル−７−メチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−メチル−２−ｎ−プロピル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−７−メチル−７Ｈ−プリン−６−イル、７−メチル−２−ｎ−ペンチル−７Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ヘキシル−７−メチル−７Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−メチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−エチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−ｎ−プロピル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−ｎ−ブチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−ｎ−ペンチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−ベンジル−２−ｎ−ヘキシル−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（１−フェニルエチル）−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（２−フェニルエチル）−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（３−フェニルプロピル）−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（４−フェニルブチル）−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（５−フェニルペンチル）−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−（６−フェニルヘキシル）−１Ｈ−プリン−６−イル、１，２−ジメチル−１Ｈ−プリン−６−イル、２−エチル−１−メチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−メチル−２−ｎ−プロピル−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ブチル−１−メチル−１Ｈ−プリン−６−イル、１−メチル−２−ｎ−ペンチル−１Ｈ−プリン−６−イル、２−ｎ−ヘキシル−１−メチル−１Ｈ−プリン−６−イル等。
【００３３】
上記一般式（１）で表わされるアミド誘導体は、ＮＯ合成酵素阻害剤、特にｉＮＯＳを選択的に阻害する薬剤として、例えば敗血症、エンドトキシンショック、慢性関節リウマチ等の治療及び予防剤として、より好ましくは、敗血症予防及び治療剤及びエンドトキシンショック改善剤として有用である。特に、本発明ＮＯ合成酵素阻害剤は、従来のそれに見られる如き副作用が非常に少ない利点を有している。
【００３４】
一般式（１）に包含され且つＮＯ合成酵素阻害剤有効成分として好ましいアミド誘導体としては、上記一般式（１）中、Ａがベンゼン環でＲ5 が水素原子である化合物を例示できる。
【００３５】
なかでも、Ｒ4 で示される複素環基が、置換基として２位に低級アルキル基を有するチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル基、置換基として２位に低級アルキル基を有するピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル基又は２位に低級アルキル基を有する９Ｈ−プリン−６−イル基であるものは好適であり、その内でもＲ1、Ｒ2及びＲ3が同一又は異なって水素原子、低級アルコキシ基又はハロゲン原子であるものは、より好ましい。
【００３６】
本発明ＮＯＳ阻害剤有効成分として特に好ましい化合物の具体例としては、例えばＮ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，３，４−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，４−ジクロロベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−クロロベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２，４−ジクロロベンズアミド及びＮ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３−メトキシベンズアミドを例示できる。この内でもＮ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドは、最も好ましい。
【００３７】
一般式（１）で表わされる本発明有効成分化合物は、各種の方法により製造できる。その例としては、例えば前記ＷＯ公報に記載の方法を挙げることができる。より具体的には、対応する複素環アミン誘導体と酸ハロゲン化物とを反応させる方法を例示することができる。その具体例は後述する実施例の項に詳述する通りである。
【００３８】
かくして得られる本発明ＮＯＳ阻害剤の有効成分化合物の具体例としては、後記実施例の項に示される各化合物（実施例１〜１２０として示す）を例示できる。
【００３９】
一般式（１）で表わされる本発明有効成分化合物は、医薬的に許容される酸付加塩とすることができ、之等の塩も本発明有効成分化合物に包含される。上記酸付加塩を形成させ得る酸としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等の有機酸を例示でき、この酸付加塩の形成反応は常法に従うことができる。
【００４０】
また、本発明有効成分化合物の内、Ｒ5 が水素原子であるものは、これを常法に従い例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、その他銅塩等とすることができ、之等の塩もまた本発明有効成分に包含される。
【００４１】
尚、本発明有効成分化合物の内、下記化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）は、下記に示す共鳴構造（１ｃ）〜（１ｅ）及び（１ｆ）〜（１ｈ）のそれぞれをとると考えられ、之等のいずれの構造式でも表し得る。
【００４２】
【化５】
0003937367.tif 000004
【００４３】
本発明ＮＯＳ阻害剤は、上記一般式（１）で表わされる化合物及びその塩から選ばれる少なくとも一種を有効成分として、これを、適当な製剤担体と共に用いて、一般的な医薬製剤組成物の形態とされ実用される。
【００４４】
上記製剤担体としては、製剤の使用形態に応じて、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。之等は得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００４５】
上記医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、軟膏剤等が挙げられる。
【００４６】
錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
【００４７】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００４８】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００４９】
坐剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を使用できる。
【００５０】
カプセル剤は、常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の製剤担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００５１】
液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製される場合、之等は殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、之等の形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。尚、この場合等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００５２】
更に、本発明医薬製剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。
【００５３】
ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト等を使用できる。
【００５４】
本発明医薬製剤中に含有されるべき有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通常医薬製剤中に約１〜７０重量％程度含有されるものとするのがよい。
【００５５】
本発明医薬製剤の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与される。
【００５６】
上記医薬製剤の投与量は、その用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常有効成分化合物の量が１日当り体重１ｋｇ当り約０．５〜２０ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜４回に分けて投与することができる。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明ＮＯＳ阻害剤において有効成分とする化合物の製造のための原料化合物の製造例を参考例として挙げ、次いで該有効成分化合物の製造例を実施例として挙げ、更に本発明ＮＯＳ阻害剤の調製例を製剤例として挙げ、最後に薬理試験例を挙げる。
【００５８】
【参考例１】４−アミノ−２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジンの製造
３−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル５．０ｇの無水ピリジン５０ｍｌ溶液に、ｎ−ペンタン酸クロリド３．８ｍｌを０℃で加え、０℃で１時間撹拌後、室温で２時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、１Ｎ塩酸、飽和重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチルを減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１で溶出）で精製して、３−ペンタノイルアミノチオフェン−２−カルボン酸メチルの無色油状物７．０ｇを得た。
【００５９】
上記で得られた化合物４．０ｇのジメトキシエタン５ｍｌ溶液に、２５％アンモニア水溶液２０ｍｌを加え、封管中１００℃で２４時間加熱した。反応溶液を減圧濃縮し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を集めて減圧濃縮し、ジクロロメタン−ｎ−ヘキサンより再結晶して、５−ｎ−ブチル−７−ヒドロキシチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジンの無色結晶１．３５ｇを得た。
【００６０】
得られた結晶１．３５ｇのトルエン１４ｍｌ溶液に、オキシ塩化リン２．４ｍｌ及びトリエチルアミン１．３ｍｌを加え、１１５℃で１２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、氷水中に注ぎ込み、酢酸ナトリウムで中和後、セライトで濾過した。濾液を酢酸エチルで抽出し、有機層を集めて水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１で溶出）で精製して、５−ｎ−ブチル−７−クロロチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジンの無色油状物１．４ｇを得た。
【００６１】
得られた油状物１．４ｇのジメトキシエタン３ｍｌ溶液に、２５％アンモニア水溶液１５ｍｌを加え、封管中８０℃で２０時間加熱した。反応終了後、水冷し、析出した結晶を濾取し、水洗後、乾燥して、目的化合物の無色結晶１．２ｇを得た。
【００６２】
また、上記と同様にして、４−アミノ−２−ｎ−プロピルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジンを製造した。
【００６３】
【参考例２】４−アミノ−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンの製造
３−アミノ−４−シアノピラゾール５ｇの無水ＤＭＦ５０ｍｌ溶液に、オルトｎ−ペンタン酸トリメチル１２ｍｌを加え、９０℃で２０分間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水及び飽和食塩水で順次洗浄した後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１で溶出）で精製して、４−シアノ−３−〔Ｎ−（１−メトキシペンチリデン）アミノ〕ピラゾールの無色油状物６．５ｇを得た。
【００６４】
上記で得られた化合物６．５ｇに、アンモニアのメタノール溶液（約７％）５０ｍｌを加え、室温で３６時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、残渣をエタノール−ｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶４．１ｇを得た。
【００６５】
【参考例３】４−アミノ−２−ベンジルオキシカルボニル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンの製造
参考例２で得られた化合物７５０ｍｇの無水ＤＭＦ７．５ｍｌ溶液に、トリエチルアミン１．１ｍｌ及びベンジルオキシカルボニルクロリド（約３０％のトルエン溶液）３．４ｍｌをそれぞれ０℃で加え、０℃で１時間撹拌した。反応液を氷水中に移し、析出した結晶を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１→１０：１で溶出）で精製した後、更にエタノール−ｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶３９０ｍｇを得た。
【００６６】
【参考例４及び５】４−アミノ−２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン及び４−アミノ−１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンの製造
参考例２で得られた化合物、ベンジルブロマイド及び塩基として水素化ナトリウムを用い、参考例３と同様に処理し、得られた粗生成物をジクロロメタン−ジエチルエーテルより再結晶して、４−アミノ−２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンの無色結晶を得た。
【００６７】
一方、再結晶母液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：３で溶出）で精製した後、更にジエチルエーテル−ｎ−ヘキサンより再結晶して、４−アミノ−１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンの無色結晶を得た。
【００６８】
【参考例６】６−アミノ−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリンの製造
４−アミノ−５−シアノイミダゾール１０ｇの無水ＤＭＦ２４ｍｌ溶液に、オルト−ｎ−ペンタン酸トリメチル２４ｍｌを加え、９０℃で２０分間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルで溶出）で精製し、更に酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより再結晶して、５−シアノ−４−〔Ｎ−（１−メトキシペンチリデン）アミノ〕イミダゾールの無色結晶１７．７ｇを得た。
【００６９】
上記で得られた化合物１５ｇに、アンモニアのメタノール溶液（２Ｎ）１００ｍｌを加え、室温で６日間撹拌した。反応終了後、析出した結晶を濾取し、メタノールで洗浄後、乾燥して、目的化合物の無色結晶９．５ｇを得た。尚、濾液を濃縮し、残渣をエタノール−ｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶３．０ｇを更に得た。
【００７０】
【参考例７】６−アミノ−９−ベンジルオキシカルボニル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリンの製造
参考例６で得られた化合物１０ｇの無水ＤＭＦ１００ｍｌ溶液に、トリエチルアミン２２ｍｌ及びベンジルオキシカルボニルクロリド（約３０％のトルエン溶液）４５ｍｌをそれぞれ０℃で加え、０℃で５時間撹拌した。反応液を氷水中に移し、クロロホルムで抽出し、クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、減圧濃縮した。残渣をクロロホルム−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶８．５ｇを得た。尚、母液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１で溶出）で精製後、クロロホルム−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶２．４ｇを更に得た。
【００７１】
【参考例８】６−アミノ−１−ベンジル−２−ｎ−ブチル−１Ｈ−プリンの製造
参考例６で製造した５−シアノ−４−〔Ｎ−（１−メトキシペンチリデン）アミノ〕イミダゾール５ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ベンジルアミン３．２ｍｌを加え、５０℃で２時間撹拌した。放冷後、析出した結晶を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄して、目的化合物の無色結晶６．２ｇを得た。
【００７２】
【参考例９】６−アミノ−２−ｎ−ブチル−１−メチル−１Ｈ−プリンの製造
参考例８と同様にして、目的化合物の無色結晶を得た。
【００７３】
【参考例１０】６−アミノ−７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリンの製造
１−ベンジル−４−アミノ−５−シアノイミダゾールを用い、参考例６と同様にして、目的化合物の無色結晶を得た。
【００７４】
【参考例１１】６−アミノ−９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリンの製造
３−ベンジル−４−アミノ−５−シアノイミダゾールを用い、参考例６と同様にして、目的化合物の無色結晶を得た。
【００７５】
【参考例１２】４−アミノ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジンの製造
３−アミノピラゾール５０ｇの無水ＤＭＦ２５０ｍｌ溶液に、オルト−ｎ−ペンタン酸トリメチル１２０ｍｌを加え、７０℃で２２時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１→２０：１で溶出）で精製して、３−〔Ｎ−（１−メトキシペンチリデン）アミノ〕ピラゾールの無色油状物６０ｇを得た。
【００７６】
上記で得られた化合物６０ｇをメタノール３００ｍｌに溶解し、シアナミド１５．３ｇを加え、６０℃で１７時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１で溶出）で精製し、更にジイソプロピルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶３６．４ｇを得た。尚、再結晶母液を同様に精製して、目的化合物の無色結晶７ｇを得た。
【００７７】
【参考例１３】４−アミノ−２−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジンの製造
参考例１２と同様にして、目的化合物の無色結晶を得た。
【００７８】
【参考例１４〜２０】
更に、参考例１２と同様にして、下記各化合物の結晶を得た。
【００７９】
参考例１４＝４−アミノ−２−メチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例１５＝４−アミノ−２−エチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例１６＝４−アミノ−２−ｎ−プロピルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例１７＝４−アミノ−２−ｎ−ペンチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例１８＝４−アミノ−２−ベンジルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例１９＝４−アミノ−２−ｎ−ブチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
参考例２０＝４−アミノ−２−ｎ−ブチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン
【００８０】
【実施例１】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの製造
参考例１で得られた化合物２００ｍｇの無水ピリジン４ｍｌ溶液に、３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド２７０ｍｇを０℃で加え、０℃で１時間、次いで室温で３日間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１０％塩酸、飽和重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：２で溶出）で精製し、更にｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶１６０ｍｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第１表に示す。
【００８１】
【実施例２〜８】
実施例１と同様にして、第１表に記載の各化合物を製造した。得られた化合物の構造及び融点を第１表に示す。尚、油状物については、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ（δ：ｐｐｍ値；溶媒＝重クロロホルム；内部基準＝テトラメチルシラン）を示す。
【００８２】
【実施例９】
Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの製造
参考例７で得られた化合物５ｇの無水ピリジン５０ｍｌ溶液に、３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド５．３ｇを０℃で加え、０℃で２時間、次いで室温で５日間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１０％塩酸で洗浄後、５％水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。水層を集め、１０％塩酸で中和し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を集め、水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１→２０：１で溶出）で精製し、更にジクロロメタン−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶２．７ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第１表に示す。
【００８３】
【実施例１０】
Ｎ−（６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの製造
参考例３で得られた化合物１００ｍｇの無水ピリジン２ｍｌ溶液に、３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド１０６ｍｇを０℃で加え、０℃で１時間、次いで室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１０％塩酸、飽和重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝１：１で溶出）で精製し、更にジクロロメタン−ｎ−ヘキサンより再結晶して、無色結晶１５０ｍｇを得た。
【００８４】
得られた結晶をエタノール１０ｍｌに溶解し、１０％パラジウム−炭素２０ｍｇを加え、水素ガス中室温で１晩撹拌した。パラジウム−炭素をセライトで濾去し、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１で溶出）で精製し、更に酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶６０ｍｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第１表に示す。
【００８５】
【実施例１１及び１２】
Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド及びＮ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの製造
参考例１１で得られた化合物１．５ｇの無水ピリジン３０ｍｌ溶液に、３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド１．８５ｇを室温で加え、室温で６日間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸、飽和重曹水、水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１→５０：１で溶出）で精製し、前の画分をｎ−ヘキサンより再結晶して、Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシベンゾイル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの無色結晶０．７５ｇを得た。更に、後の画分をｎ−ヘキサンより再結晶して、Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの無色結晶０．７２ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第１表に示す。
【００８６】
【表１】
0003937367.tif 000005
【００８７】
【表２】
0003937367.tif 000006
【００８８】
【表３】
0003937367.tif 000007
【００８９】
【表４】
0003937367.tif 000008
【００９０】
尚、上記第１表に記載の実施例３の化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ分析値は、次の通りである。
【００９１】
０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２），１．３−１．５（２Ｈ，ｍ），１．８−１．９（２Ｈ，ｍ），２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７），３．６２（６Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），５．６−６．２（２Ｈ，ｂｒｓ），７．１８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９），７．２−７．４（５Ｈ，ｍ），８．１３（１Ｈ，ｓ），１２．３−１２．５（１Ｈ，ｂｒｓ）。
【００９２】
【実施例１３〜５３】
更に、実施例１と同様にして、第２表に記載の各化合物を製造した。得られた化合物の構造及び融点を第２表に示す。尚、油状物については、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ（δ：ｐｐｍ値；溶媒＝ＤＭＳＯ−ｄ6；内部基準＝テトラメチルシラン）を示す。
【００９３】
【実施例５４】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メチルスルフィニルベンズアミドの製造
実施例４７で得られた化合物１．２ｇの酢酸１８ｍｌ溶液に、３０％過酸化水素水０．４４ｍｌを加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を集めて水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣にジエチルエーテルを加え、析出した結晶を濾取し、ジクロロメタン−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶０．４８ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９４】
【実施例５５】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メチルスルホニルベンズアミドの製造
実施例５４で得られた化合物１．０ｇのクロロホルム１０ｍｌ溶液に、メタクロロ過安息香酸１．４４ｇのクロロホルム１５ｍｌ溶液を、−７８℃で滴下し、その温度で４５分間攪拌した後、更に０℃で１時間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝４０：１）で精製し、更に酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより再結晶して、目的化合物の無色結晶０．９５ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９５】
【実施例５６】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−ヒドロキシベンズアミドの製造
実施例４４で得られた化合物１．５ｇのエタノール１５ｍｌ懸濁液に、１０％水酸化ナトリウム水溶液２．０ｍｌを０℃で加え、その温度で１時間攪拌した。
反応液に１０％塩酸２．２ｍｌ及び水８０ｍｌを加え、析出した結晶を濾取し、水洗後、６０％の含水エタノールより再結晶して、目的化合物の無色結晶１．１２ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９６】
【実施例５７】
Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−４−ヒドロキシベンズアミドの製造
実施例５６と同様にして、実施例４６で得られた化合物より、目的化合物を製造した。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９７】
【実施例５８】
Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドの製造
実施例７で得られた化合物１．０ｇを１，２−ジメトキシエタン−水（３：１）２０ｍｌに溶かし、これにＮＢＳ０．５１ｇを０℃で加え、０℃で１時間撹拌した。反応混合液を水で希釈し、析出した結晶を濾取した。得られた粗結晶を水洗し、メタノール−水より再結晶して、目的化合物の無色結晶０．９４ｇを得た。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９８】
【実施例５９〜６２】
実施例７、１３、１４及び２５におけるシリカゲルクロマトグラフィーの前の画分より、第２表に実施例５９〜６２として示す各化合物を、それぞれ単離した。得られた化合物の構造及び融点を、第２表に示す。
【００９９】
【表５】
0003937367.tif 000009
【０１００】
【表６】
0003937367.tif 000010
【０１０１】
【表７】
0003937367.tif 000011
【０１０２】
【表８】
0003937367.tif 000012
【０１０３】
【表９】
0003937367.tif 000013
【０１０４】
【表１０】
0003937367.tif 000014
【０１０５】
【表１１】
0003937367.tif 000015
【０１０６】
【表１２】
0003937367.tif 000016
【０１０７】
【表１３】
0003937367.tif 000017
【０１０８】
【表１４】
0003937367.tif 000018
【０１０９】
【表１５】
0003937367.tif 000019
【０１１０】
【表１６】
0003937367.tif 000020
【０１１１】
【表１７】
0003937367.tif 000021
【０１１２】
尚、上記第２表に記載の実施例４３の化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ分析値は、次の通りである。
【０１１３】
０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４），１．２−１．４（２Ｈ，ｍ），１．５−１．７（２Ｈ，ｍ），２．４７（３Ｈ，ｓ），２．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０），７．２−７．４（２Ｈ，ｍ），７．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０），１１．６−１１．９（１Ｈ，ｂｒｓ）。
【０１１４】
【実施例６３〜７５】
更に、実施例１と同様にして、第３表に記載の各化合物を製造した。得られた化合物の構造及び融点を第３表に示す。
【０１１５】
【実施例７６〜８２】
実施例６３−６４及び実施例６８−７２におけるシリカゲルクロマトグラフィーの前の画分より、第３表に実施例７６〜８２として示す各化合物を、それぞれ単離した。得られた化合物の構造及び融点を、第３表に示す。
【０１１６】
【実施例８３】
実施例７５で得られた化合物より、実施例５６と同様にして、第３表に記載の化合物を製造した。得られた化合物の構造及び融点を第３表に示す。
【０１１７】
【表１８】
0003937367.tif 000022
【０１１８】
【表１９】
0003937367.tif 000023
【０１１９】
【表２０】
0003937367.tif 000024
【０１２０】
【表２１】
0003937367.tif 000025
【０１２１】
【表２２】
0003937367.tif 000026
【０１２２】
【表２３】
0003937367.tif 000027
【０１２３】
【実施例８４〜１２０】
適当な出発物質を用い、上記参考例及び実施例と同様の反応を行なって、以下の各化合物を製造することができる。
【０１２４】
実施例８４＝Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例８５＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例８６＝Ｎ−（１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例８７＝Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例８８＝Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）ニコチンアミド
実施例８９＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）ニコチンアミド
実施例９０＝Ｎ−（１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）ニコチンアミド
実施例９１＝Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）ニコチンアミド
実施例９２＝Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例９３＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例９４＝Ｎ−（１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例９５＝Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例９６＝Ｎ−（１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例９７＝Ｎ−（２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例９８＝Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例９９＝Ｎ−（７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例１００＝Ｎ−（１−ベンジル−６−ｎ−ブチル−１Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０１＝Ｎ−（２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０２＝Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０３＝Ｎ−（７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０４＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例１０５＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−７−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０６＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例１０７＝Ｎ−（２−ｎ−ブチル−８−フェニルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド
実施例１０８＝Ｎ−〔２−ｎ−ブチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル〕−３−クロロベンズアミド
実施例１０９＝Ｎ−〔２−ｎ−ブチル−８−（４−フェニルチオフェニル）ピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル〕−２−メトキシベンズアミド
実施例１１０＝Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例１１１＝Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン＝６−イル）ニコチンアミド
実施例１１２＝Ｎ−（９−ベンジル−２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン＝６−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例１１３＝Ｎ−（７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例１１４＝Ｎ−（７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル）ニコチンアミド
実施例１１５＝Ｎ−（７−ベンジル−２−ｎ−ブチル−７Ｈ−プリン−６−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例１１６＝Ｎ−（２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−１−ナフトイルアミド
実施例１１７＝Ｎ−（２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）ニコチンアミド
実施例１１８＝Ｎ−（２−ベンジル−６−ｎ−ブチル−２Ｈ−ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−２−フランカルボキサミド
実施例１１９＝Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−３−クロロベンズアミド
実施例１２０＝Ｎ−（８−ブロモ−２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２−メトキシベンズアミド
【０１２５】
【製剤例１】
カプセル剤の調製
有効成分としてＮ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドを用いて、１カプセル当りその２５０ｍｇを含有する硬質ゼラチンカプセル（１０００個）を、次の処方により調製した。
【０１２６】
有効成分化合物                                              ２５０ｇ
結晶セルロース（日本薬局方品）                                ３０ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品）                                １７ｇ
タルク（日本薬局方品）                                          ２ｇ
ステアリン酸マグネシウム                                        １ｇ
即ち、上記処方に従い各成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように混和した後、所望の寸法を有する経口投与用ゼラチンカプセルに充填して、目的のカプセルを得た。
【０１２７】
【製剤例２】
錠剤の調製
有効成分化合物としてＮ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，４−ジクロロベンズアミドを用いて、１錠当りその３００ｍｇを含有する錠剤（２０００錠）を、次の処方により調製した。
【０１２８】
有効成分化合物                                              ６００ｇ
乳糖（日本薬局方品）                                          ６７ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品）                                ３３ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品）          ２５ｇ
メチルセルロース（日本薬局方品）                              １２ｇ
ステアリン酸マグネシウム                                        ３ｇ
即ち、上記処方に従い、有効成分化合物、乳糖、コーンスターチ及びカルボキシメチルセルロースカルシウムを充分混合し、メチルセルロース水溶液を用いて顆粒化し、２４メッシュの篩に通し、ステアリン酸マグネシウムと混合後、打錠（プレス）して、目的の錠剤を調製した。
【０１２９】
【薬理試験例１】
スプラークダウリュー（Spraque Dawley）系雄性ラット（６〜９週齢、２００〜２５０ｇ）を頚椎脱臼により屠殺し、直ちに胸部大動脈を摘出し、周囲の結合組織を剥離した。次に、これを５〜７個に輪切りに分割し、それぞれ縦に切り開いた後、血管内皮細胞に存在するｃＮＯＳの影響をなくすため、血管内腔を洗浄綿棒にて擦過して内皮細胞を除去して、標本を調製した。
【０１３０】
３０μＭ濃度に調製した本発明有効成分化合物（供試化合物）のジメチルスルホキシド溶液を添加し、更に４００μＭ濃度となるようにＬ−アルギニンを添加したクレブス・ヘンゼライト液（ＮａＣｌ １１８．３ｍＭ、ＫＣｌ ４．７ｍＭ、ＣａＣｌ2 ２．５ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4 １．２ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ3 ２５．０ｍＭ及びグルコース１１．１ｍＭ）中に、上記標本を入れ、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で２４時間インキュベートした（供試化合物を用いた実験群、本発明群）。
【０１３１】
次に、上清を９６穴プレートに取り、文献〔新生化学実験講座１０、血管、内皮と平滑筋、１３５頁、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３年〕に記載のＮＯ2測定法に従い、ＮＯ2をグリース（Griess）液で発色させ、バイオカイネチックスリーダー（Biokinetics reader, BIO-TEK Instruments 社製、ＥＬ−３４０型）で測定して、蓄積されたＮＯ2量を算出した。
【０１３２】
また、標本の血管片を、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、バイオラッドＤＣプロテインアッセイキット（Bio-Rad DC protein assay kit, Bio-Rad Laboratories社製）で発色させ、スペクトロフォトメーター（Spectrophotometer, HITACHI社製、Ｕ−３０００型）で測定して、蛋白量を算出した。そして、之等の値より、蛋白１ｍｇ当たりのＮＯ2生成量を求めた。
【０１３３】
一方、供試化合物の代わりにジメチルスルホキシドを加えた対照群、及びＬＰＳも加えないコントロール群について、同一試験を繰り返した。
【０１３４】
以上のようにして求められた各群における蛋白１ｍｇ当たりのＮＯ2生成量より、ｉＮＯＳ誘導阻害率を下式に従い求めた。
【０１３５】
阻害率（％）＝｛１−〔（本発明群値）−（コントロール群値）〕／〔（対照群値）−（コントロール群値）〕｝×１００
得られた結果を第４表に示す。
【０１３６】
【表２４】
0003937367.tif 000028
【０１３７】
第４表より、本発明有効成分化合物は、ＬＰＳによるｉＮＯＳの誘導を阻害していることが明らかである。