(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象ＤＮＡ断片と前記分析対象ＤＮＡ断片の比較基準とするヘテロ接合型の基準ＤＮＡ断片とをそれぞれ異なる蛍光色素で標識する工程と，
前記分析対象ＤＮＡ断片と前記基準ＤＮＡ断片とをキャピラリ電気泳動を用いるＳＳＣＰ法により同一のキャピラリで同時に電気泳動で分離する工程と，
前記分離する工程で得られた泳動パターンの前記基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度を用いて，前記泳動パターンの前記分析対象ＤＮＡ断片のピークの信号強度を補正する工程と，
前記補正する工程の結果から、前記分析対象ＤＮＡ断片のヘテロ接合性の消失の有無を判定する工程と有し，
前記基準ＤＮＡ断片がヘテロ接合型の健常者の健常細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とする３'末端が平滑なＰＣＲ産物であり，前記分析対象ＤＮＡ断片が被験者の被検細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とする３'末端が平滑なＰＣＲ産物であり，前記基準DNA断片と前記分析対象DNA断片とは，同一のプライマーを用いてPCR増幅されたものであることを特徴とする遺伝子多型解析方法。
【請求項２】
前記ヘテロ接合型の基準ＤＮＡ断片の野生型と変異型の各々に対応する２つのピークの信号強度比を用いて，前記分析対象ＤＮＡ断片のピークの信号強度を補正することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多型解析方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲ産物は、Ｔｓｐポリメラーゼを用いて行うＰＣＲ反応の産物であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多型解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，キャピラリ電気泳動を用いるＳＳＣＰ法による遺伝子（核酸）多型解析方法に係り，特に遺伝子の欠失やヘテロ接合性の消失等，癌等の疾病と関連のある遺伝子異常を，遺伝子多型マーカーを用いて検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト正常細胞には父母由来の１対の染色体が含まれ，特定の遺伝子座について，例えば，片方のアリルが野生型，もう片方のアリルが変異型である場合のごとく，両者の遺伝子型が異なる場合はヘテロ接合体と呼ばれる。一方，両者の遺伝子型が同じ場合はホモ接合体と呼ばれる。健常なヘテロ接合体の場合，それぞれのアリルの存在量の比は理論的に１：１である。ヘテロ接合体をＳＳＣＰ法で解析すると，野生型と変異型等，それぞれのアリルに対応する２つのピークが観測され，２つのピークの信号強度比は１：１となる。
【０００３】
一方，殆どの悪性の癌細胞では遺伝子の欠失や増幅等の異常が生じる。ヘテロ接合体で片方の対立遺伝子が欠失や増幅を起こすと，いわゆるヘテロ接合性の消失（ロス  オブ  ヘテロツァイゴシティ，ＬＯＨ）が生じる。ＳＳＣＰ法ではＬＯＨはヘテロ接合体の各アリルに対応する２つのピークの信号強度比が１：１から外れる現象として観測される。
【０００４】
遺伝子の多型性，即ち，塩基配列の個人差をマーカーとして利用し，癌の診断を行なう方法（特開平９−２０１１９９号公報，以下，従来技術−１という）。の概略を以下に説明する。遺伝子の塩基配列中の特定の領域を標識プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した後，３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント等）により３’末端を平滑化する。このＰＣＲ産物をスラブゲル型電気泳動装置を用いて一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）法による解析を行ない，１塩基多型を持つ対立遺伝子（アリル）を分離検出する。
【０００５】
正常組織由来のＤＮＡ断片と癌組織由来のＤＮＡ断片とを同一の蛍光色素で標識し，複数レーンを持つスラブゲル型電気泳動装置を用いてそれぞれ別のレーンで測定している。正常組織由来の２つのピークＡ１，Ａ２の信号強度比と，癌組織由来の２つのピークＢ１，Ｂ２の信号強度比とから，癌細胞の割合を推定している。ｐ５３遺伝子での１塩基多型を指標とする膀胱癌のＬＯＨ検出の例では，癌細胞の割合が１０％を越えた場合，異常（ＬＯＨ＋，陽性）としている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術−１ではスラブゲル型電気泳動装置を使用しているが，ルーチンの臨床検査に適用するためには自動化，省力化，高速化が求められる。本発明では，従来技術−１に於いてスラブゲル型電気泳動装置に代えて，ゲルの自動充填機構やサンプルの自動注入機構を持つキャピラリ電気泳動装置を使用し，自動化，省力化，高速化を図る検討を行った。しかし，キャピラリ電気泳動装置を用いたＳＳＣＰは研究段階であり，多くの課題が残されている。キャピラリ電気泳動装置を従来技術−１に適用することを試みたが，正常組織と癌組織とを同一の蛍光色素で標識して別々のキャピラリで電気泳動すると，又は，１本キャピラリで２回に分けて電気泳動すると，測定条件の変動等によりピークの信号強度が変動しＬＯＨを正しく判定できないという問題が見出された。
【０００７】
本発明の目的は，キャピラリ電気泳動装置を用いてＳＳＣＰ法による解析を行ないＬＯＨを検出する遺伝子多型解析方法に於いて，泳動ピークの信号が泳動条件等により変動しても，ＬＯＨ判定を正確に行ない，診断のための信頼性の高いデータを得ることができる遺伝子多型解析方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は，キャピラリ電気泳動装置によるＳＳＣＰ法に於いて，健常細胞と被検細胞とに由来する標的ＤＮＡ断片をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し，同一のキャピラリで同時に電気泳動して泳動パターンを比較することにより，ＬＯＨの正確な判定（ヘテロ接合性の消失の有無の判定）を可能とし，癌等の診断のために信頼性の高いデータを提供する。
【０００９】
本発明では，１又は複数のキャピラリ電気泳動を用いるＳＳＣＰ法により遺伝子多型解析を行なう。分析対象とする分析対象ＤＮＡ断片とこの分析対象ＤＮＡ断片の比較基準とするヘテロ接合型の基準ＤＮＡ断片とがそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。分析対象ＤＮＡ断片と基準ＤＮＡ断片とが同一のキャピラリで同時に電気泳動分離される。得られた泳動パターンに出現する２つの基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度を用いて，泳動パターンに出現する分析対象ＤＮＡ断片のピークの信号強度を補正して，分析対象ＤＮＡ断片のヘテロ接合性の消失の有無の判定がなされる。分析対象ＤＮＡ断片のピークの信号強度の補正は，２つの基準ＤＮＡ断片のピークの信号強度比を用いて実行される。
【００１０】
基準ＤＮＡ断片として被験者の健常細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用され，分析対象ＤＮＡ断片として同一の被験者の被検細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用される。また，基準ＤＮＡ断片としてヘテロ接合型の健常者の健常細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用され，分析対象ＤＮＡ断片として被験者の被検細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物が使用される。特に，分析対象ＤＮＡ断片として血液中から回収した上皮細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物が使用される。血液中からの上皮細胞の回収は，抗原抗体反応に基づいて上皮細胞を選択的に吸着するカラムを具備する遺伝子多型解析装置を用いて実行される。上記のＰＣＲ産物を得るＰＣＲ反応ではＴｓｐポリメラーゼが使用される。
【００１１】
分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片がｐ５３遺伝子のｅｘｏｎ４に於けるｃｏｄｏｎ７２の一塩基多型サイトを含む場合には，分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片のｒｅｖｅｒｓｅ鎖について，温度範囲，４４℃ないし４８℃で電気泳動を行なう。
【００１２】
本発明では，注目している標的ＤＮＡ断片（分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片）の二次構造を計算により求め，多型による二次構造の差異の拡大を指標として電気泳動に於ける断片の分離（Ｒｓ）が大となる好適な温度条件を求め，この好適な温度条件で電気泳動を行なう。
【００１３】
また，本発明では，ＰＣＲ増幅される注目している標的ＤＮＡ断片（分析対象ＤＮＡ断片，基準ＤＮＡ断片）の二次構造を計算により求め，ＰＣＲ反応に於けるプライミングサイトを変化させて，多型による二次構造の差異の拡大を指標として電気泳動に於ける断片の分離（Ｒｓ）が大となる好適なプライマ配列を求め，この好適なプライマ配列を用いて標的ＤＮＡ断片を調製する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
〔実施例１〕
図１は，本発明の実施例１であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図である。以下，実施例１での手順の概略を図１を用いて説明する。
【００１５】
（工程Ａ）健常細胞からのゲノムＤＮＡ抽出と標的ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：
実施例１では診断対象を膀胱癌とし，被検細胞は被験者の尿中に漏洩した膀胱癌由来の癌細胞，対照実験に用いる健常細胞は同じ被験者の血液中の白血球とした。工程Ａでは健常細胞のゲノムＤＮＡを得るために，血液中の白血球からＤＮＡを抽出した。実施例１では自動核酸抽出装置を使用し，迅速簡便かつ安全な抽出作業を実現し，ルーチンの臨床検査に好適に適用可能とした。
【００１６】
次に，抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし，前記の従来技術−１と同様にＴａｑ酵素（ＡＢＩ社製，ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ）を用いてＰＣＲ増幅を行ない，標的ＤＮＡ断片を得た。工程Ａでは従来技術−１で使用しているプライマーセットと同じ塩基配列のプライマーを使用したので，標的ＤＮＡ断片の領域（癌抑制遺伝子ｐ５３のｅｘｏｎ４の一部）や長さ（１１５ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ｂａｓｅ））は従来技術−１と同じとなる。
【００１７】
但し，従来技術−１では，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖（Ｃｌｉｃｋ鎖）に対して５’端を蛍光色素Ｃｙ５で標識したプライマーを，ｆｏｒｗａｒｄ鎖（Ｗａｔｓｏｎ鎖）に対して標識しないプライマーをＰＣＲに使用するのに対し，実施例１では，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖に対して５’端をＲＯＸで標識したプライマー（ＧＥＮＳＥＴ社製）を，ｆｏｒｗａｒｄ鎖に対して５’端をＦＡＭで標識したプライマー（ＧＥＮＳＥＴ社製）をＰＣＲに使用して，ＰＣＲ産物として標的ＤＮＡを得た。
【００１８】
最後に，従来技術−１に記載の方法と同様にして，ＰＣＲ産物の３'末端の平滑化処理をで行った。即ち，Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｋｌｅｎｏｗ酵素）を加えて３７℃，３０分間反応させ，３'末端の突出端のｄＮＴＰを除去し，目的とする１１５ｎｔの標的ＤＮＡ断片を得た。
【００１９】
（工程Ｂ）被検細胞からのゲノムＤＮＡ抽出と標的ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：
基本的に工程Ａと同様の手順により，同一の被験者から被検細胞を得て，ゲノムＤＮＡ抽出を行ない，ＰＣＲ増幅を行った。
【００２０】
工程Ｂが工程Ａと異なるのは被検細胞が尿中に漏れ出た膀胱由来の細胞である点であり，被験者の尿から細胞を回収しＤＮＡ抽出と増幅を行った。回収した細胞からのゲノムＤＮＡの抽出では工程Ａと同様に自動核酸抽出装置を使用した。また，工程Ｂではこの被検細胞から得たゲノムＤＮＡに基づくＰＣＲ増幅の際，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖に対して５’端をＦＡＭで標識したプライマーを，ｆｏｒｗａｒｄ鎖に対して５’端をＲＯＸで標識したプライマーを用いて標的ＤＮＡ断片を得た。
【００２１】
（工程Ｃ）健常細胞に基づく増幅ＤＮＡ断片の電気泳動と多型分離検出：
実施例１では電気泳動装置として１本のキャピラリを有するＤＮＡシーケンサ（ＡＢＩ社）を使用し，基本的にＡＢＩ社推奨のＳＳＣＰ条件に基づき泳動を行ない，１塩基多型を有するＰＣＲ増幅産物の分離検出を行った。この装置は泳動ポリマをキャピラリに自動充填する機構と，オートサンプラ上の試料をキャピラリに自動注入する機構を備えるため，全自動の連続測定が可能であり，ルーチンの臨床検査に好適に使用可能である。この装置は，複数の異なる発光波長を検出できる機能（以下，多波長検出という）を有し，標準蛍光色素を用いた蛍光の相互干渉を事前評価して補正マトリクスを予め作製し，実試料での干渉の影響をマトリクス変換により除去し，複数の蛍光色素を独立に検出可能である。
【００２２】
試料調製条件は下記の通り。ＰＣＲの反応液を水で１／２０ないし１／５０に希釈した溶液１μＬ，サイズスタンダード（ＡＢＩ社製ＧｅｎｅＳｃａｎ  ５００  ＴＡＭＲＡ）０．５μＬ，ホルムアミド１２μＬを混合，９４℃で２分間熱変性，室温まで放冷する。但し，工程Ｄで説明する通り，実際には工程Ｃ，工程Ｄの電気泳動は同時に同一のキャピラリで実施した。従って，ＰＣＲ反応液は，工程Ｃによる健常細胞由来のもの０．５μＬと，工程Ｄによる被検細胞由来のもの０．５μＬの，合計１μＬを用いた。
【００２３】
実施例１でのＳＳＣＰ法による泳動条件は下記の通り。キャピラリ寸法は，有効長３０ｃｍ，全長４１ｃｍ，内径５０μｍ，外径３７５μｍである。試料注入条件は，１５ｋＶ，５秒で行った。泳動電圧は，１５ｋＶである。泳動バッファは，グリセロール１０重量％を含む１ｘＴＢＥ緩衝溶液である。泳動ポリマは，泳動バッファをベースとし，ＡＢＩ社製ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒを９重量％となるよう添加した。
【００２４】
図２は，本発明の実施例１であり，上記の試料について，ＳＳＣＰ法による電気泳動を行って得られた電気泳動パターンの例を示す図である。図２（ａ）の横軸は時間（ｔ）に相当し，左から右にむけてｔは大となる。縦軸は特定の発光波長での蛍光信号強度を示し，ピークの高さは発光波長で蛍光を発する蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片の濃度に比例する。図２（ａ）の縦軸は，蛍光色素ＦＡＭの蛍光波長の信号強度を示す。
【００２５】
事前の検討で，標的ＤＮＡ断片（ｐ５３ｅｘｏｎ４の一部）のｆｏｒｗａｒｄ鎖の一塩基多型に関し野生型のホモ接合型の試料は，図２（ａ）のピーク１２と同じ位置に単一のピークを示し，また変異型の試料の場合は，図２（ａ）のピーク１３と同じ位置に単一のピークを示すことを確認した。
【００２６】
従って，図２（ａ）のピークはそれぞれ，標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型と変異型の断片に由来する。一方，ＦＡＭで標識されているｆｏｒｗａｒｄ鎖は工程Ａで説明した健常細胞由来の試料であるため，この健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片は，ｅｘｏｎ４の一塩基多型に関し，野生型と変異型とを含むヘテロ接合型であることが理解される。２つのピーク１２，１３が観測されたことから，この一塩基多型を有する２つの標的ＤＮＡ断片が，実施例１によるＳＳＣＰ法により分離検出できることが示された。なお，各ピークの泳動時間はそれぞれ２３．６分，２３．８分，信号強度はそれぞれ２５５，２６３（任意単位）であった。
【００２７】
一方，ＲＯＸで標識したｒｅｖｅｒｓｅ鎖の信号も同様に分離検出されたが，図２の時間軸範囲の外であったため図２では省略した。ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型，変異型のピークの泳動時間はそれぞれ２０．３分，２０．４分であった。このｒｅｖｅｒｓｅ鎖の分離特性については後述する。従来技術−１の泳動時間は約５時間であるから，実施例１は従来技術−１と比較して約１５倍高速という特長を有する。これは放熱特性に優れるキャピラリ方式の採用により，約３６６Ｖ／ｃｍと高い電場の採用が可能となり，泳動が高速化したためと考えられる。
【００２８】
（工程Ｄ）被検細胞に基づく標的ＤＮＡ断片の電気泳動と多型分離検出：
被検細胞から工程Ｂにより得られた標的ＤＮＡ断片について，工程Ｃと同じ手順でＳＳＣＰ法による解析を行なうことにより，ｅｘｏｎ４の一塩基多型に関する解析を行った。なお，使用した装置が多波長検出できるので，実際には工程Ｃと工程Ｄの試料を混合し，同じキャピラリで同時に電気泳動を行ったのは前述の通りである。電気泳動の結果を図２（ｂ）に示した。
【００２９】
図２（ｂ）の横軸と図２（ａ）の横軸は共通の原点と時間スケールを持つ時間軸であり，既知試料との比較から，２つのピーク１４，１５は標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型と変異型の断片に対応する。図２（ｂ）の縦軸は蛍光色素ＲＯＸの蛍光波長の信号強度を示し，ＲＯＸで標識されているｆｏｒｗａｒｄ鎖は工程Ｂで説明した被検細胞由来の試料であるため，この被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片は，ｅｘｏｎ４の一塩基多型に関し，野生型と変異型とを含むヘテロ接合型である。
【００３０】
マトリクス変換による干渉補正を用いた多波長検出により，同一キャピラリで被検細胞と健常細胞から得た標的ＤＮＡ断片を同時に電気泳動するにもかかわらず，図２（ａ）に示したＦＡＭで標識した健常細胞のｆｏｒｗａｒｄ鎖の断片に基づく信号と，図２（ｂ）に示したＲＯＸで標識した被検細胞のｆｏｒｗａｒｄ鎖の断片に基づく信号とは互いに独立に検出できることが理解される。ピーク１４，１５の泳動時間はそれぞれ２３．６分，２３．７分，信号強度はそれぞれ２５５，２７４（任意単位）であった。
【００３１】
なお，ピーク１２，１４はそれぞれ同一の配列を有する標的ＤＮＡ断片のピークであることを，それぞれＦＡＭ，ＲＯＸで標識した野生型試料の泳動結果との比較により確認したが，両者の泳動時間は僅かに異なった。これは，蛍光色素の違いにより移動度が僅かに影響を受けるためと考えられる。ピーク１３と１５についても変異型である点以外は同様である。なお，ＦＡＭで標識した被検細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖の断片に基づく信号は図２の時間軸の範囲外であったが，工程Ｃでのｒｅｖｅｒｓｅ鎖の断片に基づく信号の結果と類似の結果が得られた。
【００３２】
（工程Ｅ）対立遺伝子が互いに異なるヘテロ接合型か否かの判定：
工程Ｃに関する説明の通り，健常細胞から得たＤＮＡはＳＳＣＰ法で２つのピーク１２，１３が得られたことから，標的ＤＮＡ断片（ｐ５３ｅｘｏｎ４）のｃｏｄｏｎ７２について野生型と変異型とを含み，換言すると対立遺伝子が互いに異なるヘテロ接合型であった。従って，この被験者の被検細胞について，この遺伝子座に関するＬＯＨ判定を行なうことが可能である。
【００３３】
一方，ＳＳＣＰ法でピーク１２又は１３どちらか一方のピークしか観測されなかった場合は，この被験者はこの遺伝子座に関してホモ接合型であり，被検細胞のＤＮＡを調べてもＬＯＨに関する情報が得られず，この遺伝子座に関するＬＯＨ判定を行なうことができない。従って，別の遺伝子座について検査を行なう必要がある。
【００３４】
（工程Ｆ）健常細胞の対立遺伝子に由来する断片の信号強度からの補正係数の算出：
以下の説明では，Ｘ＝Ｓ，Ｐ，Ｃとして，変数Ｘ１（Ｓ１，Ｐ１，Ｃ１），Ｘ２（Ｓ２，Ｐ２，Ｃ２）を使用するが，Ｘに続く１，２はそれぞれ，野生型，変異型に対応することを示す。工程Ｃに関する説明の通り，健常細胞のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型，変異型に対応する標的ＤＮＡ断片の信号強度Ｓ１，Ｓ２は，それぞれ２５５，２６３であった。補正係数Ｆは（数１）によって定義され，補正係数Ｆの値は２６３／２５５＝１．０３１である。
【００３５】
【数１】
Ｆ＝Ｓ２／Ｓ１                                                …（数１）
（工程Ｇ）：被検細胞の対立遺伝子に由来する断片の信号強度と，補正係数とから，被検細胞での対立遺伝子の存在量の比を求める：
工程Ｄの説明の通り，被検細胞のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型，変異型に対応する標的ＤＮＡ断片の信号強度Ｐ１，Ｐ２はそれぞれ２５５，２７４であった。被検細胞での対立遺伝子の存在量の比Ｔは（数２）によって定義され，Ｔ＝２７４／２５５／１．０３１＝１．０４２である。
【００３６】
【数２】
Ｔ＝Ｐ２／Ｐ１／Ｆ                                            …（数２）
（工程Ｈ）Ｔの１からの乖離（ずれ）の判定：
工程Ｇで求めた通りＴ＝１．０４２であり，Ｔの１からの乖離は＋４．２％である。Ｔの１からの乖離が±１０％以上をＬＯＨあり（異常有り）と判定する基準を設けて，このケースは被検細胞にＬＯＨなし（異常なし）と判断した。このケースではＴの１からの乖離が１０％未満であったが，Ｔ≦０．９の場合や，Ｔ≧１．１の場合はＴの１からの乖離が±１０％以上となるため，ＬＯＨあり（異常有り）と判断する。この結果を，膀胱癌の診断を行なうためのデータとして医師に提供することができる。
【００３７】
なお，実施例１で用いた被検細胞は健常者のものであったため，上記の異常無しの判定は正しい結果であった。実施例１ではそれぞれの標的ＤＮＡ断片を異なる蛍光色素で標識したにもかかわらず，工程Ｃと工程Ｄで同一のキャピラリで同時に電気泳動を行ったために，健常細胞由来の断片の強度比を基準とする被検細胞由来の断片の強度比の補正が有効に機能したと考えられる。注意すべき点は，蛍光色素の違いによる両者の挙動の違いが事実上無関係であったことである。これは従来当業者の予見が困難であった事実であり，本発明の進歩性のポイントの一つである。
【００３８】
実施例１では，ＳＳＣＰ法による解析を行なうためのキャピラリ電気泳動装置として，例えば，光源としてＡｒ＋レーザとＨｅ−Ｎｅレーザ，検出器として回折格子とＣＣＤカメラを用いて，多波長の蛍光検出が可能な装置も使用できる。本発明の適用範囲はこれら装置に限定されるものではなく，広く一般の多波長の蛍光検出が可能なキャピラリ電気泳動装置が適用できる。実施例１では，簡単のために２種の蛍光色素からの蛍光検出を行なう場合について例示し，被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片を１種のみ用いる方法を例示した。ｎ種の蛍光色素からの蛍光検出が可能な装置を使用して，各標的ＤＮＡ断片をｎ種の異なる蛍光色素で標識すれば，当然（ｎ−１）種までの被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片を同時に測定可能である。
【００３９】
本発明の適用範囲は，実施例１で示した試料，ＰＣＲ領域，適用用途等についても，上記の血液や尿から採取した細胞から抽出したゲノムＤＮＡ試料のｐ５３ｅｘｏｎ４領域，膀胱癌の診断に限定されない。本発明は，その他の生体に由来する細胞から得た試料に適用可能であり，他の遺伝子領域での一塩基多型，マイクロサテライト多型，ショートタンデムリピート多型等をマーカーとして使用可能である。また，ＬＯＨが指標となる他の疾病の遺伝子診断にも適用可能である。他のキャピラリ電気泳動装置応用の分析試験に対しても，信号強度比を高精度に評価する必要がある場合には，同様に適用可能である。
【００４０】
実施例１の特有の効果は，健常細胞由来の断片と，被検細胞由来の断片とを，同時に同じキャピラリで電気泳動することにより，蛍光色素の違い以外の全ての泳動条件を統一できることである。ＬＯＨの判断基準となる対立遺伝子由来の断片の信号強度比に影響を及ぼすような電気泳動条件の変動があったとしても，変動要因の影響を相殺でき高精度の測定が可能になるという効果がある。
【００４１】
〔実施例２〕
実施例２は実施例１と同様であるが，ＰＣＲ増幅に用いた酵素並びにＰＣＲ後の工程が異なる。実施例１の工程Ａ，工程Ｂでは，ＰＣＲ酵素としてＴａｑポリメラーゼを使用した。この場合３'末端にｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）が一つ付加したＰＣＲ産物が生じ，それによるゴーストピークがＳＳＣＰ法での定量的解析を妨害する不具合がある。この不具合を避けるためにＰＣＲ産物をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理して３'末端を平滑化して，３'末端の突出端部のｄＮＴＰを除去した。
【００４２】
実施例２では，ＰＣＲ酵素としてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｔｓｐポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を使用することにより，３’末端に対するｄＮＴＰの付加を抑制しＫｌｅｎｏｗ酵素処理を省略した。実施例２により，時間，手間，コストがかかるＫｌｅｎｏｗ酵素反応を省略した。また，酵素反応ステップを１段省略することにより，その酵素の失活による再現性不良等の誤差要因を排除した。従って，実施例２は，迅速，簡便，安価かつ信頼性の高い臨床検査を行えるという特有の効果がある。なお，３’末端に対するｄＮＴＰ付加が起こりにくいとされるＰＣＲ酵素は各種報告されているが，各種酵素を比較検討した結果，上記のＴｓｐが最も好適であった。
【００４３】
図３は，本発明の実施例２であり，各種ポリメラーゼを用いてｐ５３遺伝子のｅｘｏｎ４領域をＰＣＲ増幅した産物について，変性ゲルＰＯＰ４（ＡＢＩ社製）を充填したキャピラリ電気泳動装置を用いてフラグメント長の解析を行った結果の一例である。図３（ａ）ではＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社製）を，図３（ｂ）ではＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｔｓｐを，図３（ｃ）ではＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造社製）を，図３（ｄ）ではＰｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）をそれぞれ，ポリメラーゼとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンの例である。
【００４４】
図３（ａ），図３（ｃ）の泳動パターンでは，ＰＣＲ産物として目的とする１１５ｎｔの断片１６の他に，それより塩基数の多い断片１７，１８が副産物として生成している。図３（ｄ）の泳動パターンでは，ＰＣＲ産物として１１５ｎｔの断片１６より塩基数の短い断片１９が生成している。図３（ｂ）に示すように，Ｔｓｐポリメラーゼを使用したＰＣＲ産物の泳動パターンでは，目的とする１１５ｎｔの断片１６以外の長さの副産物が殆ど含まれていない。従って，ＰＣＲ反応でＴｓｐをポリメラーゼとして用いることにより，３’末端が平滑なＤＮＡ断片が得られＫｌｅｎｏｗ酵素反応を省略できるという効果がある。
【００４５】
〔実施例３〕
図４は，本発明の実施例３であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図である。実施例３の手順は実施例２の手順と類似であるが補正係数Ｆの算出方法が異なる。
【００４６】
（工程Ｉ）：実施例２では，補正係数Ｆは被験者の健常細胞から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた標的ＤＮＡ断片を標準試料として補正係数Ｆを求めた。実施例３では必ずしも被験者自身の健常細胞からではなく，他の個人や他の生物の細胞等から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた標的ＤＮＡ断片，又は，化学合成によって得られた標的ＤＮＡ断片を単独もしくは混合して用いた。
【００４７】
単独で用いる場合には，試料はヘテロ接合型の健常細胞から得られたものである必要があるが，混合して用いる場合はこの限りでなく，ホモ接合型やＬＯＨの細胞から得られたものや，化学合成品であってもよい。勿論，ホモ接合型やＬＯＨの細胞から，又は化学合成品によって標的ＤＮＡ断片を得た場合には，野生型だけでなく変異型の試料も用意し混合することによりヘテロ接合型と類似の組成とする（この場合，下記の理由により組成比は，必ずしも厳密に１：１である必要はない）。何れにせよ，工程Ｉにより，実施例１，実施例２の工程Ａに相当するヘテロ接合型類似の組成を有する標的ＤＮＡ断片を，標準試料ストックとして準備する。
【００４８】
（工程Ｊ）：ヘテロ接合型類似の組成を有する標的ＤＮＡ断片（標準試料ストック）の対立遺伝子に由来する断片（実施例３では野生型と変異型）の濃度Ｃ１，Ｃ２を定量する。様々な方法を用いて濃度を定量できる。実施例３では，野生型と変異型の一次標準試料（濃度検定済み）をそれぞれ準備し，標準試料ストックと各一次標準試料を使用して電気泳動装置を用いたＳＳＣＰ法による解析を行ない，野生型と変異型のそれぞれに由来する断片に対応する泳動ピークの高さを比較することにより，標準試料ストックの対立遺伝子に由来する各断片の濃度Ｃ１，Ｃ２を定量した。
【００４９】
濃度Ｃ１，Ｃ２決定の他の方法としては，ＬＯＨが無いことが確認されているヘテロ接合型の一次標準試料（濃度検定済み，この場合は野生型と変異型の濃度は同じ）を準備し，そのＳＳＣＰパターンを標準試料ストックのそれと比較することにより濃度Ｃ１，Ｃ２を決定する。或いは，野生型，変異型のそれぞれについて標的ＤＮＡ断片を準備し，予めＵＶ吸収測定，ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）等のインターカレータとの相互作用による蛍光強度測定等により，それぞれの断片の濃度を求めた後，それらを所定の割合で混合することにより濃度Ｃ１，Ｃ２を決定する。或いは，ヘテロ接合型の健常者を多数集め，彼らがＬＯＨを有さないことを確認し，彼らから得た標的ＤＮＡ断片を概ね等量ずつとなるように混合することにより，概ね１：１に近い濃度比を持つと見做すことのできる標準試料ストックを準備し，その標的ＤＮＡ断片の合計濃度Ｃを求め（数３）により濃度Ｃ１，Ｃ２を決定する方法もある。
【００５０】
【数３】
Ｃ１＝Ｃ２＝Ｃ／２                                            …（数３）
工程Ｉでの標準試料ストックの由来に関わらず，工程Ｊで標準試料ストックの対立遺伝子に由来する断片の濃度Ｃ１，Ｃ２を決定する。工程Ｉ，工程Ｊにより，対立遺伝子に由来する濃度既知の断片を含むヘテロ接合型（類似）の標準試料ストックが得られる。
【００５１】
（工程Ｋ）：標準試料ストックの電気泳動を行ない塩基配列多型性に基づき分離検出を行なう。工程Ｋは，実施例１，実施例２での工程Ｃと同様であり，その結果，対立遺伝子に由来する各断片の信号強度Ｓ１，Ｓ２を得た。異なるのは，用いる試料が標準試料ストックである点と，それが確実にヘテロ接合型かもしくはヘテロ接合型類似の組成であることが判明している点，その対立遺伝子に由来する各断片の濃度がそれぞれＣ１，Ｃ２である点である。
【００５２】
（工程Ｆ’）：断片１，断片２の信号強度Ｓ１，Ｓ２と，濃度Ｃ１，Ｃ２とから補正係数Ｆを求める。ＤＮＡ断片１，２はそれぞれ，野生型，変異型に対応する。工程Ｆ’は，実施例１，実施例２での工程Ｆと類似である。異なるのは断片１，２が被験者の健常細胞由来でなく，上記の標準試料ストック由来である点，断片１，断片２の濃度が必ずしも等しくなくその濃度がＣ１，Ｃ２で与えられるため補正係数Ｆも（数４）に示すように濃度を勘案して求める点である。勿論，Ｃ１＝Ｃ２の完全なヘテロ接合型の場合は，実施例３の工程Ｆ’により求めた補正係数Ｆは，実施例１，実施例２での工程Ｆにより求まる補正係数Ｆと一致する。
【００５３】
【数４】
Ｆ＝（Ｓ２／Ｃ２）／（Ｓ１／Ｃ１）                            …（数４）
（工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅ）：実施例３での工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅは，実施例１，実施例２での工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅとほぼ同じである。異なるのは実施例３では工程Ｃで健常細胞から得た断片のＳＳＣＰ法解析での信号強度は補正係数Ｆの計算には使用せず，ただ単に工程Ｅでヘテロ接合型であるか否かの判定のみに使用することである。
【００５４】
（工程Ｂ，工程Ｄ，工程Ｇ）：実施例３での工程Ｂ，工程Ｄ，工程Ｇは，実施例１，実施例２での工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅとほぼ同じである。異なるのは実施例３では工程Ｄで，被検細胞からのＤＮＡ断片の電気泳動を工程Ｋでの標準試料ストックと一緒に行なう点である。勿論，実施例１，実施例２と同様，工程Ｃの健常細胞からのＤＮＡ断片と一緒に電気泳動を行っても良いが必ずしも必要ではない（上述の通り，健常細胞のデータはヘテロ接合型であることの確認にのみ利用され，補正係数には反映されないため）。
【００５５】
工程Ｃの健常細胞からのＤＮＡ断片と一緒に電気泳動を行なう場合，工程Ｃの健常細胞からのＤＮＡ断片を，工程Ｋの標準試料ストックや工程Ｄでの被検細胞からのＤＮＡ断片と区別するため，工程Ａでの健常細胞からのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅では，工程Ｉ，工程Ｂで用いた蛍光色素と異なる第３の蛍光色素で標識する。
【００５６】
（工程Ｇ，工程Ｈ）：実施例３での工程Ｇ，工程Ｈは，実施例１，実施例２と同様である。唯一の相違点は，工程Ｇでの被検細胞の対立遺伝子の存在量の比Ｔを求める際の補正係数Ｆとして，工程Ｆ’の説明の通り標準試料ストックの測定により求めた値を用いる点である。実施例３では補正係数Ｆを求める際，被検者の健常細胞由来のＤＮＡ断片の泳動パターンを用いる代わりに，標準試料ストックの泳動パターンを用いる。以下，実施例３の特有の効果を説明する。
【００５７】
第１に，健常細胞と想定して用いた被験者の細胞中の標的領域での対立遺伝子の存在量の比Ｔが万一１：１からずれ（乖離し）ていたとしても，被検細胞のＬＯＨが高精度に算定可能となるという効果がある。この様なことが起こるケースとしては，例えば，健常細胞として血液中の白血球を用いる場合に，被験者が白血病に罹患している場合等がある。
【００５８】
第２に，工程Ｉ，工程Ｊはユーザではなく，好ましくは機器メーカ或いは試薬メーカが実行し，ユーザは濃度既知の標準試料ストックを機器メーカ或いは試薬メーカから購入して使用することができる。この場合，分析結果の信頼性向上が可能となるという効果がある。更に，被験者に関する事前の検討により，その被験者が標的領域について本来ヘテロ接合型であることが確認されている場合は，工程Ａ，工程Ｃ，工程Ｅは省略できる。この場合，ユーザは標準試料ストックの購入使用により基準となる試料の調製作業を省略できるため，ユーザにとって省力化が可能となるという効果もある。
【００５９】
第３に，標準試料ストックはヘテロ接合型，あるいはそれに類似した組成であることが事前に確認されている。従って，工程Ｋでこの試料をＳＳＣＰ法により分析した際に２つのピークが検出されない場合は，分析方法に何らかの問題があること意味し，この情報を用いて分析方法の品質管理が可能となるという効果がある。標準試料ストックの組成比と泳動パターンのピーク強度比とを比較して両者が大きく乖離した場合は，分析条件の大きな変動を意味する場合があるため，分析方法の品質管理が可能となるとともに，ユーザに注意を喚起して原因究明と対策を促すこともできるという効果もある。
【００６０】
（実施例４）
図５は，本発明の実施例４によるＬＯＨ判定の手順の概略を表すフロー図である。実施例４の手順は，実施例３の手順と類似であるが，泳動パターンの信号強度や濃度の計算の各段階で，対立遺伝子に由来する断片について独立に計算を行なうのではなく，対立遺伝子に由来する２つの断片に関する比の値を用いて計算を行なう点が異なる。具体的には，工程Ｊ’で，断片１，断片２の濃度をそれぞれＣ１，Ｃ２として求める代わりに，（数５）により濃度比Ｃ1,2を求める。同様に，工程Ｆ”で，信号強度Ｓ１，Ｓ２の代わりに，（数６）により信号強度比Ｓ1,2を求め，Ｆを（数７）から求める。同様に，工程Ｇ’で被検細胞の断片１，断片２の信号強度Ｐ１，Ｐ２の代わりに，（数８）により信号強度比Ｐ1,2を求め，Ｔを（数９）から求める。
【００６１】
【数５】
Ｃ1,2＝Ｃ２／Ｃ１                                            …（数５）
【００６２】
【数６】
Ｓ1,2＝Ｓ２／Ｓ１                                            …（数６）
【００６３】
【数７】
Ｆ＝Ｓ1,2／Ｃ1,2                                              …（数７）
【００６４】
【数８】
Ｐ1,2＝Ｐ２／Ｐ１                                            …（数８）
【００６５】
【数９】
Ｔ＝Ｐ1,2／Ｆ                                                …（数９）
実施例４の特有の効果は，扱う情報量が約半分で済むため，計算機にとっては記憶容量が少なくて済み，ユーザにとっては数値入力の手間が省け，また計算の流れがより理解しやすくなることである。
【００６６】
（実施例５）
実施例５は実施例２と同様であるが，工程Ｃ，工程Ｄで分離定量するＤＮＡ断片をｆｏｒｗａｒｄ鎖由来の断片でなく，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片とした点が異なる。手順の変更点としては，電気泳動開始後約２０分付近の泳動パターンを取得し，健常細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来のＲＯＸで標識した断片，被検細胞由来のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来のＦＡＭで標識した断片について解析を行った。観測したピークがｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片である点を除けば，実施例２と同様の手順により，実施例２と同等の結果が得られた。
【００６７】
この時の分析条件は，ＡＢＩ社推奨のＳＳＣＰ条件，即ち，ポリマ濃度３％，温度３０℃であった。この場合，ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の対立遺伝子に由来する２つの断片のピークの分離Ｒｓ（泳動パターンのピーク形状をガウス分布型と仮定した場合，ピーク間隔を，バンド幅，即ち，４シグマで割った値として定義される）は約０．８〜１．０であった。
【００６８】
次に，ポリマ濃度について検討を行った。６％以上の泳動ポリマ調製の際は，予めＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ溶液（７％）（ＡＢＩ社製）を遠心濃縮して約１５％に濃縮した溶液に基づき，泳動ポリマを調合した。その結果，ポリマ濃度が９％までの範囲では濃度上昇とともに分離が直線的に改善することが判明した。濃度９％でのｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片の分離は約２．３という高い分離が得られた。
【００６９】
１０％以上のポリマ濃度では電気泳動結果の再現性が低下した。これは，ポリマ溶液の粘性が増し，キャピラリへのポリマ溶液の充填が均一にできなくなったためと考えられる。従って，高い分離を得る観点からはポリマ濃度の最適値は約９％であると考えられる。実施例１でのポリマ濃度９％の条件も，以上の検討から得られた知見に基づいて設定した。
【００７０】
次に，電気泳動を行なう温度について検討した。従来技術−１ではｐ５３  ｅｘｏｎ４の電気泳動の温度条件として２０℃を採用している。また，一般にＳＳＣＰ法では低温の方が高分離の傾向があるとされているため，低温での電気移動を試みた。しかし，キャピラリ電気泳動法を用いる本発明での検討では，温度２０℃の条件下でも分離は殆ど改善しなかった。逆に，３０℃より高温の条件での電気泳動について検討したところ，驚くべき事に，約４６℃〜４８℃でのｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片の分離が特異的に改善する現象が見出された。
【００７１】
図６は，本発明の実施例５であり，ｐ５３ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片のＳＳＣＰ法による分離（Ｒｓ）の温度依存性の例を示す図である。図６は，３０℃から６０℃まで温度変えた場合のｐ５３  ｅｘｏｎ４  ｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型と変異型由来の断片の泳動ピークの分離のポリマ濃度による変化，即ち，ポリマ濃度３％での分離の温度変化２３（○印），ポリマ濃度６％での分離の温度変化２４（△印），ポリマ濃度９％での分離の温度変化２５（□印）を示す。
【００７２】
図６から明らかなように，３０℃から４０℃の範囲では分離（Ｒｓ）は温度によらずほぼ一定であったが，４０℃から５０℃付近の狭い温度範囲で急峻な分離（Ｒｓ）の改善が見られた。この範囲での分離（Ｒｓ）の最高値はポリマ濃度３％，６％，９％でそれぞれ，約３．３，４．８，６．０であった。これらの値は，３０℃での値と比較した場合，約３倍高かった。
【００７３】
実施例５では，この様な大きい分離（Ｒｓ）を与える特異的な温度である４６℃〜４８℃を電気泳動条件として採用したため，ピークの分離，定量が容易となり，測定精度が改善するという効果がある。また，分離（Ｒｓ）はキャピラリ有効長の（１／２）乗に比例するが，分析（泳動）時間はキャピラリ有効長に比例するため，温度の最適化により得た３倍の分離（Ｒｓ）の改善を，キャピラリ有効長短縮による分離（Ｒｓ）の低下と相殺した場合，同じ分離（Ｒｓ）をキャピラリ有効長９分の１で，従って，分析（泳動）時間も９分の１で実現できる。
【００７４】
従って，温度の最適化によって得られた３倍の分離（Ｒｓ）の改善と引き替えに約１桁の高速化が可能となるという効果もある。同様に，温度の最適化により得られた大きい分離（Ｒｓ）を，ポリマ濃度の低下による分離（Ｒｓ）の低下と相殺すれば，高速化が可能である。
【００７５】
なお，上記のようなＳＳＣＰ法の分離（Ｒｓ）に関する特異温度，特に４６℃〜４８℃という高い温度での分離（Ｒｓ）の改善の報告は少なく，そのメカニズムも未解明である。そこでそのメカニズムを解析するためにＤＮＡ断片の２次構造の計算を，パブリックドメインのソフトウエア  ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  １２５，１６７−１８８，１９９４）を使用して行った。計算のアルゴリズムには，分配関数（partition function）とペア確率（pair probabilities）を併用する計算方法を採用した。
【００７６】
文献（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１４６０−１４６５，１９９８）に記載のＤＮＡ用のパラメータを，エネルギー計算に使用した。勿論，ＤＮＡ断片の２次構造計算のためのソフトウエアは他にも幾つか存在し，他のソフトウエアでも同様の計算が可能である。
【００７７】
図７は，本発明の実施例５であり，上記の特異温度を示したｐ５３ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型，変異型のＤＮＡ断片の３０℃と４６℃での二次構造の計算結果を示す図である。図７では，縮尺の都合で個々の塩基配列が見にくいため，野生型と変異型との唯一の相違点である一塩基多型の位置（ｃｏｄｏｎ７２）をアロー（←）により，またその塩基の種類をＣ（野生型）又はＧ（変異型）で示した。図７（ａ）は３０℃での野生型の２次構造を示し，図７（ｂ）は３０℃での変異型の２次構造を示す。図７（ａ），図７（ｂ）に示す２次構造はともに自己会合の多い２次構造を示し，その構造は一塩基多型の位置の近傍で僅かに異なるが，全体として良く類似した２次構造であることが理解される。
【００７８】
図７（ｃ）は４６℃での野生型の２次構造を示し，図７（ｄ）は４６℃での変異型の２次構造を示す。図７（ｄ）の２次構造は，末端が一部解離している他は基本的に図７（ｂ）に示す２次構造と相似であった。一方，図７（ｃ）の２次構造は，図７（ａ）の２次構造と大きく異なり，自己会合構造の多くが解離しており一本鎖領域が多いという結果となった。
【００７９】
以上の２次構造計算結果は，３０℃，４６℃で，ＳＳＣＰ法での野生型と変異型の両断片の分離特性が大きく異なることに対応づけられると考えられる。即ち，３０℃では野生型と変異型の両断片は自己会合の多い２次構造を取るが，その構造は互いに類似している。従って，ＳＳＣＰ法による電気泳動を行っても，構造上大きな差異がないために分離が良くない。４６℃に昇温すると，野生型と変異型の両断片は互いに共通点が殆ど無いほど２次構造が異なるため，ＳＳＣＰ法による電気泳動で高い分離（Ｒｓ）が得られる。
【００８０】
４６℃での電気泳動特性は以下のような更に詳細な考察も可能と考えられる。野生型は自己会合構造の大部分が解離し，一本鎖部分の割合が多いため，禁止点が少なく柔軟となる。すると泳動ゲルの間を移動する際の動的半径が減少し，換言すると移動度が高くなる。一方，変異型は４６℃に昇温しても構造変化が少ないため，移動度の変化も小さい。従って，野生型の泳動時間が変異型と比較して相対的に短縮し分離が改善すると考えられる。
【００８１】
ＳＳＣＰ法は一塩基多型等の塩基配列変化により泳動断片の高次構造が変わることが分離のメカニズムであると提唱されてきたが，高次構造と対応づけて分離特性を解析した例は少ない。特に約４６℃というＳＳＣＰ法としては異例に高い温度での特異的かつ急峻な分離（Ｒｓ）の改善現象について解析し，分離改善の原因を高次構造と対応づけて解析するのに成功した例は，本発明が初めてであると考えられる。従来はＳＳＣＰ法は分離が得られるか否かは試行錯誤が必要であった。即ち，あるケースでは分離が得られさもなければ断念するという勘と経験と運に依存する技法であった。実施例５の上記した検討により，核酸２次構造とＳＳＣＰ分離との関係が理論的に対応付けられる可能性が示された。
【００８２】
従って，ＳＳＣＰ法による分離を試みる前に，予め２次構造を計算により予測し，一塩基多型等を有する断片同士の分離が期待できるか否か，また最も分離（Ｒｓ）が良い温度が何度位であるか等の予測を計算により行ない，その結果を踏まえてＳＳＣＰ法の条件を最適化するという方法が，実施例５で有効であることが示された。
【００８３】
この方法で最適化可能なＳＳＣＰ法の条件としては，泳動温度，断片の配列等がある。目的とする一塩基多型の位置が決まっていても，それを挟むプライマーの位置を変更すると，ＰＣＲ増幅する断片の配列を変えることができ，その場合の分離特性を上記と同様の手順により予測，最適化することが可能である。当然，最適化の結果に基づいてプライマーを設計することも実施例５では有効である。また，プライマーの５’端に任意の配列を付加し分離改善を図るシミュレーションも可能である。
【００８４】
実施例５の特有の効果は，癌抑制遺伝子として注目されているｐ５３遺伝子上の，パピローマウイルスによる子宮頚癌のかかり易さ等との関連が報告されているｅｘｏｎ４ｃｏｄｏｎ７２の遺伝子座の一塩基多型を分離検出する際，従来比３倍以上の極めて高い分離（Ｒｓ）がＳＳＣＰ法で得られ，理論解析によりその理由を説明でき，ＳＳＣＰ法の分離をシミュレートできることである。
【００８５】
（実施例６）
実施例６は実施例２と同様であるが，工程Ｂで，尿中の膀胱由来の細胞ではなく，組織由来の上皮細胞を抹消血中から回収して使用した点が異なる。
【００８６】
血液中からの上皮細胞の選別回収はセルソータを用いる文献（Ｒａｃｉｌａ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，４５８９−４５９４（１９９８））に記載の方法を採用した。具体的には，ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）に対する抗体を結合した磁性粒子と抹消血とを混合した後，磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，磁性粒子に結合した細胞を含む分画を得た。
【００８７】
この分画をフィコエリスリンを結合した抗サイトケラチン抗体と，ペリディニンクロロフィルでラベルした抗ＣＤ４５抗体とを含む溶液で処理した。磁石によるＢ／Ｆ分離，精製の後，セルソータにより測定した。上記文献に記載されているように，ＣＤ４５抗体の数が少なく，高い濃度でサイトケラチン抗体が反応した上皮細胞の分取を行った。この際，分取した細胞の数を記録した。
【００８８】
この様にして抹消血中から上皮細胞を選別回収した後，実施例２の工程Ｂと同じ手順により，ＤＮＡ抽出と増幅を行った。他の工程については実施例２と同じ工程を採用して，血液中の上皮細胞由来の核酸のＬＯＨを求めた。
【００８９】
上記の文献に記載の通り，ＣＤ４５抗体の数が少なく，高い濃度でサイトケラチン抗体が反応した細胞は上皮細胞系の細胞であり，抹消血中に存在する上皮細胞の多くは癌腫の細胞であるから，セルソータで分取した細胞の多くは転移性の癌細胞と考えられる。しかし，抹消血の採取の際の穿針による上皮細胞の混入や，各種の外傷や炎症等により癌細胞以外の上皮細胞が抹消血中へ混入する場合もあるため，セルソータで記録された上皮細胞の数だけに基づいて癌の診断を行なうと偽陽性となる場合があり，精度が低いという課題があった。
【００９０】
実施例６では，抹消血中の上皮細胞を分取して計数するだけでなく，その細胞のゲノムＤＮＡのＬＯＨを求めることにより，その細胞が癌細胞由来であるか否かを高精度に評価可能である。従って，実施例６は，偽陽性の少ない，精度の高い診断材料を提供できるという特長がある。また，膀胱癌に限らず広く転移性の癌腫一般を抹消血を用いて検出，診断できるため，適用範囲が広く，被験者に対する侵襲性も少なく，各種の癌の早期発見のためのスクリーニング法として有効であり，早期治療，生存率の改善に貢献できるという特長がある。
【００９１】
（実施例７）
実施例７は実施例６と同様であるが，セルソータによる分取を行わず，免疫法のみによる細胞分離を行った点が異なる。具体的には，ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）に対する抗体を結合した磁性粒子と抹消血とを混合した後，磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，磁性粒子に結合した細胞を含む分画を得た。
【００９２】
ＥＰＣＡＭと磁性粒子との結合を切断した後，磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，非結合分画と抗サイトケラチン抗体を結合した磁性粒子とを混合し，磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行ない，磁性粒子に結合した細胞を含む分画を得た。この分画から，実施例２の工程Ｂと同じ手順により，ＤＮＡ抽出と増幅を行った。他の工程については実施例２と同じ工程を採用して，血液中の上皮細胞由来の核酸のＬＯＨを求めた。
【００９３】
実施例７では，免疫反応だけでなくＤＮＡのＬＯＨも判断材料とするため，少量の白血球が混入しても影響が少ない。従って，簡便な装置，方法で高精度の診断が可能な判断材料を提供できるという効果がある。
【００９４】
なお，以上の説明では免疫法による細胞分離法として磁気免疫法を例にとって説明したが，勿論磁気を用いない各種の免疫法による細胞分離法も適用可能である。例えば，抗体を結合した無機又は有機のビーズ等の担体を用い，遠心分離によりＢ／Ｆ分離を行なう免疫ビーズ法，抗体を結合した無機又は有機のビーズ状あるいは繊維状の担体を充填したカラムによりＢ／Ｆ分離を行なう免疫クロマトグラフィー法等も適用可能である。なお，上記の説明ではＥＰＣＡＭとサイトケラチンに対する２種の免疫反応を，両方とも磁気免疫法で行なうために，途中で磁性粒子との結合を切断するステップを採用した。
【００９５】
しかし，後段の免疫反応を磁気免疫法以外の方法，例えば，免疫クロマトグラフィー法で行なう場合には，この磁性粒子除去のステップは不要であり，直接第２の抗体を有するカラムによるＢ／Ｆ分離にかけられる。カラム内の担体に結合した細胞は，一旦結合を切断して細胞として回収してから後工程であるＤＮＡ抽出を行なうことができる。或いは，カラム内に細胞を結合したまま，細胞を溶解する試薬を加えて核酸を遊離させ，抽出することも可能である。
【００９６】
次に，本発明の効果，即ち，高精度なＬＯＨ判定ができることについて説明する。ここで，本発明との対比のための対比例の方法について説明する。本発明との比較を行なうこの対比例の方法は，従来技術−１の方法の一部の条件を変更した方法である。従来技術−１と本発明の実施例１は，（１）健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を，従来技術−１では同じ蛍光色素で，本発明では異なる蛍光色素で標識する点，（２）電気泳動で，従来技術−１ではスラブゲルを，本発明ではキャピラリを用いる点，（３）健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を，従来技術−１では別の泳動路で，本発明では同じキャピラリで泳動する点で基本的に異なる。
【００９７】
対比例の方法では，健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を，従来技術−１と同様に同じ蛍光色素で標識し，健常細胞の標的ＤＮＡ断片，被検細胞の標的ＤＮＡ断片を，一本キャピラリを用いて電気泳動する。健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片は同じ蛍光色素で標識されているので，電気泳動は２回行なうことになる。対比例の方法は，従来技術−１の方法を１本キャピラリを用いる電気泳動に適用した方法である。
【００９８】
図８は，本発明の実施例１の手順と比較例の手順によるＬＯＨ判定の精度比較例の結果を示す図である。図８は，４種類の異なる試料（実験番号１，２，３，４）に関して，繰り返して実験を行って得たＬＯＨ判定の結果を示す。また，実施例１の手順による，生データ（測定データ）Ｓ１，Ｓ２，Ｐ１，Ｐ２と，解析結果としてＬＯＨの値（Ｔの１からのずれ（乖離）の割合を％表示）を示す。
【００９９】
図８では，実施例１の手順による測定データＳ１，Ｓ２，Ｐ１，Ｐ２をそのまま使用して，健常細胞からの標的ＤＮＡ断片のデータＳ１，Ｓ２として，各実験番号でのｎ（ｎ＝１，２，…）回目の測定データを，被検細胞からの標的ＤＮＡ断片のデータＰ１，Ｐ２として，各実験番号での（ｎ＋１）回目の測定データをそれぞれ使用して解析することにより，比較例をシミュレートした。図８の最右欄は比較例の手順によるＬＯＨの値を示す。
【０１００】
本発明では，実験番号１から実験番号４の試料の何れついても，ＬＯＨの値が全て±１０％以内となり，被検細胞にＬＯＨなし（異常なし）と判断された。使用した試料は健常細胞，被検細胞ともに健常者の正常細胞であったためこの判断結果は全て正しい。一方，比較例では，殆どの実験番号の試料について同様の結果が得られたが，実験番号２の試料の１回目の測定，実験番号３の試料の２回目の測定では，ＬＯＨの値が−１０．７％，＋１３．８％となり，±１０％の範囲を超えたため，被検細胞にＬＯＨあり（異常あり）と誤った結果となった。
【０１０１】
実験番号３の試料に関しては平均しても±１０％の範囲を超えている。図８に示すように，対比例では，実験番号１から実験番号４の試料のうち，半分の試料で誤った結果となった。
【０１０２】
以上の結果は，シングルキャピラリ装置を使用した場合の比較結果であるが，キャピラリを複数有するマルチキャピラリ装置を使用した場合にも，同様に高精度なＬＯＨ判定ができる。本発明をマルチキャピラリに適用する場合，異なる蛍光色素で標識された，健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を混合して試料毎に異なるキャピラリに注入して，複数の試料に関する断片を各キャピラリで同時に泳動分離する。これに対する対比例として，全ての標的ＤＮＡ断片を同じ蛍光色素で標識し，あるキャピラリに健常細胞の標的ＤＮＡ断片を注入し，別のキャピラリに被検細胞の標的ＤＮＡ断片を注入し，各試料についてそれぞれ２本のキャピラリを使用して，複数の試料に関する断片を各キャピラリで同時に泳動分離する方法が考えられる。
【０１０３】
この対比例の方法では，本発明の方法と同様に経時的な測定条件の変動の影響は被らない。しかし，この比較例では，キャピラリ毎の微妙な条件の差が測定結果に影響を及ぼすが，本発明の方法では，同一のキャピラリで健常細胞と被検細胞の標的ＤＮＡ断片を同一のキャピラリで泳動分離するので，キャピラリ間での条件の差の影響は受けず，本発明の方法の方が比較例，従来技術−１よりも高精度であることが理解できる。
【０１０４】
以上の比較から明らかなように，本発明の実施例１は対比例と比較してＬＯＨを高精度に判定可能であり，高精度の診断に好適なデータを提供できるという効果がある。また，本発明の他の実施例も同様である。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明によれば，泳動ピークの信号が電気泳動条件等により変動しても，ＬＯＨを高精度に判定可能であり，信頼性の高いデータを診断のために提供できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を示すフロー図。
【図２】本発明の実施例１であり，ＳＳＣＰ法による電気泳動パターンの例を示す図。
【図３】本発明の実施例２であり，各種のポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の断片長の解析例を示す図。
【図４】本発明の実施例３であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を示すフロー図。
【図５】本発明の実施例４であり，ＬＯＨ判定の手順の概略を示すフロー図。
【図６】本発明の実施例５であり，ｐ５３ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖由来の断片のＳＳＣＰ法による分離の温度依存性の例を示す図。
【図７】本発明の実施例５であり，ｐ５３ｅｘｏｎ４のｒｅｖｅｒｓｅ鎖の野生型，変異型のＤＮＡ断片の３０℃と４６℃での二次構造の計算結果を示す図。
【図８】本発明の実施例１の手順と比較例の手順によるＬＯＨ判定の比較結果例を示す図。
【符号の説明】
１…野生型対応するＤＮＡ断片，２…変異型に対応するＤＮＡ断片，３…工程Ｅ，４…情報なし，５…工程Ｆ，５’…工程Ｆ’，５”…工程Ｆ”，６…工程Ｂ，７…工程Ｄ，８…工程Ｇ，８’…工程Ｇ’，９…工程Ｈ，１０…ＬＯＨなし（正常），１１…ＬＯＨあり（異常），１２…健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型のＦＡＭ標識された断片に対応する泳動ピーク，１３…健常細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の変異型のＦＡＭ標識された断片に対応する泳動ピーク，１４…被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の野生型のＲＯＸ標識された断片に対応する泳動ピーク，１５…被検細胞由来の標的ＤＮＡ断片のｆｏｒｗａｒｄ鎖の変異型のＲＯＸ標識された断片に対応する泳動ピーク，１６…目的とする１１５ｎｔの断片，１７…１１５ｎｔより１塩基長い断片，１８…１１５ｎｔより１塩基以上長い断片，１９…１１５ｎｔより短い断片，２０…工程Ｉ，２１…工程Ｊ，２１’…工程Ｊ’，２２…工程Ｋ，２３…ポリマ濃度３％での分離の温度変化，２４…ポリマ濃度６％での分離の温度変化，２５…ポリマ濃度９％での分離の温度変化，１００…工程Ａ，２００…工程Ｃ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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