(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の非感染形を、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の細胞と接触するような条件下で適用することを含む、植物に病原体耐性を付与する方法、ここで、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は植物病原細菌に由来する。
【請求項２】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が、Ｅrwinia amylovora、Ｅrwinia chrysanthemi、Ｐseudomonas syringae、Ｐseudomonas solancearum、Ｘanthomonas campestrisおよびこれらの混合物からなる群から選択される病原体に由来するものに対応する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質がＥrwinia chrysanthemiに由来するものに対応する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が配列番号１記載のアミノ酸配列を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が３４ｋＤａの分子量を有する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質がＥrwinia amylovoraに由来するものに対応する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が配列番号３記載のアミノ酸配列を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が３７ｋＤａの分子量を有する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質がＰseudomonas syringaeに由来するものに対応する、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が配列番号５記載のアミノ酸配列を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が３４−３５ｋＤａの分子量を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質がＰseudomonas solancearumに由来するものに対応する、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が配列番号７記載のアミノ酸配列を有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質がＸanthomonas campestrisに由来するものに対応する、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が配列番号９記載のアミノ酸配列を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
植物を、双子葉植物および単子葉植物からなる群から選択する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
植物を、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、エンダイブ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、トウナス、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、モロコシおよびサトウキビからなる群から選択する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
植物を、シロイヌナズナ、セントポーリア、ペチュニア、ペラゴニウム、ポインセチア、キク、カーネーションおよびヒャクニチソウからなる群から選択する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
植物が耐性になる病原体を、ウイルス、細菌、真菌およびこれらの組み合わせからなる群から選択する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
適用を、スプレー、注入または適用に行う直前に葉を傷つけることにより実施する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を、更に担体を含む組成物として植物に適用する、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
担体を、水および水性溶液からなる群から選択する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
組成物が５００nＭ以上の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、肥料、殺虫剤、殺菌剤およびこれらの混合物からなる群から選択される更なる添加剤を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質が単離形である、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を、疾病の原因とならない、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子で形質転換されている細菌として適用する、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を、ある植物種では疾病の原因となるが、適用する種では疾病の原因とならない、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子で形質転換されている細菌として適用する、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
適用がポリペプチドまたはタンパク質の植物内への浸透をもたらす、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＵＳＤＡ  ＮＲＩコンペティティブ・リサーチ・グラント・ナンバー91-37303-6430で米国政府の補助金による援助を受けてなされた。
発明の分野
本発明は、植物に過敏応答誘発耐性を付与することに関する。
発明の背景
生存生物は、環境からの信号を認識し、反応できるようにする生化学的経路の複合的配列を所有している。これらの経路は、受容体器官、ホルモン、２次メッセンジャーおよび酵素の修飾を含む。現在、病原体の攻撃に応答する間、植物で活性化される信号伝達経路についてほとんど知られておらず、この知識は疾病感受性および耐性の理解が中心である。植物耐性の共通の形は、感染部位の回りの小さい区域に病原体増殖を限定させることである。多くの場合、この限定は、宿主組織の局所的死滅(即ち、壊死)を含む。病原体限定および局所組織壊死は、共に、過敏応答の特徴である。局所防御応答に加えて、多くの植物が植物の非感染部分における防御の活性化により感染に応答する。結果として、全植物が、２次感染に、より耐性となる。この全体的獲得耐性(systemic acquired resistance)は数週間またはそれ以上（Ｒ.Ｅ.Ｆ.Ｍatthews,Ｐlant Ｖirology(Ａcademic Ｐress,Ｎew Ｙork,ed.２,1981））持続し、しばしば無関係病原体に対する交差耐性を付与する（Ｊ．Ｋuc,in Ｉnnovative Ａpproaches to Ｐlant Ｄisease Ｃontrol,Ｉ.Ｃhet,Ｅd.(Ｗiley,New York,1978),pp.255-274，参考として本明細書に包含させる）。
全体的獲得耐性の発現は、免疫化組織に通常有害病原体が侵入するのを阻止することを含む（Ｋuc,Ｊ.,“Ｉnduced Ｉmmunity to Ｐlant Ｄisease”,Ｂioscience,32：854-856(1982)，参考として本明細書に包含させる）。全体的獲得耐性の確立は、全体的な細胞壁ヒドロキシプロリンレベルおよびペルオキシダーゼ活性の増加（Ｓmith,Ｊ.Ａ.,et al.,“Ｃomparative Ｓtudy of Ａcidic Ｐeroxidases Ａssociated with Ｉnduced Ｒesistance in Ｃucumber,Ｍuskmelon and Ｗatermelon”,Ｐhysiol.Ｍol.Ｐlant Ｐathol.,14：329-338(1988),参考として本明細書に包含させる）およびいわゆる全体的獲得耐性遺伝子の９つのファミリーの一群の発現（Ｗard,Ｅ.Ｒ.,et al.,“Ｃoordinate Ｇene Ａctivity in Ｒesponse to Ａgents that Ｉnduce Ｓystemic Ａcquired Ｒesistance”，Ｐlant Ｃell 3：49-59(1991)，参考として本明細書に包含させる）に関連する。これらの防御遺伝子の５つが病原体関連タンパク質であり、その生理学的機能はまだ立証されていない。しかしながら、これらのタンパク質の幾つかがインビトロで抗真菌活性を有し（Ｂol,Ｊ.Ｆ.,et al.,“Ｐlant Ｐathogenesis−Ｒelated Ｐroteins Ｉnduced by Ｖirus Ｉnfection”,Ａnn.Ｒev.Ｐhytopathol．28：113-38（1990），参考として本明細書に包含させる）、Ｒhizoctonia solaniの感染に対するトランスジェニックタバコタンパク質におけるビーン・キチナーゼ遺伝子の構造的発現（Ｂroglie,Ｋ.,et al.,“Ｔransgenic Ｐlants with Ｅnhance Ｒesistance to the Ｆungal Ｐathogen Ｒhizoctonia Ｓolani”,Ｓcience 254：1194-1197(1991)，参考として本明細書に包含させる）は、これらの全体的獲得耐性タンパク質が免疫化状態を付与し得ることを示す（Ｕknes,Ｓ.,et al.,“Ａcquired Ｒesistance in Ａrabidopsis”,Ｐlant Ｃell 4：645-656(1992)，参考として本明細書に包含させる）。
サリチル酸は、免疫化後、内因性レベルが増加し、（Ｍalamy,Ｊ.,et al.,“Ｓalicylic Ａcid：Ａ Ｌikely Ｅndogenous Ｓignal in the Ｒesistance Ｒesponse of Ｔobacco to Ｖiral Ｉnfection”，Ｓcience 250：1002-1004(1990)，参考として本明細書に包含させる）、外因性サリチル酸が獲得耐性遺伝子（Ｙalpani,Ｎ.,et al.,“Ｓalicylic Ａcid is a Ｓystemic Ｓignal and an Ｉnducer of Ｐathogenesis−Ｒelated Ｐrotein in Ｖirus−Ｉnfected Ｔabacco”,Ｐlant Ｃell 3：809-818(1991)，参考として本明細書に包含させる）および獲得耐性（Ｕknes,Ｓ.,et al.,“Ａcquired Ｒesistance in Ａrabidopsis”,Ｐlant Ｃell 4：645-656(1992），参考として本明細書に包含させる）を誘発するため、全体的獲得耐性の導入に信号機能を担うようである。更に、サリチル酸がサリチレートヒドロキシラーゼをコードする細菌トランスジーンの作用により破壊されるトランスジェニックタバコ植物では全体的獲得耐性を示さない（Ｇaffney,Ｔ.,et al.,“Ｒequirement of Ｓalicylic Ａcid for the Ｉnduction of Ｓystemic Ａcquired Ｒesistance”，Ｓcience 261：754-296(1993)，参考として本明細書に包含させる）。しかしながら、この効果は、全体的信号機能よりむしろ局所の阻害を反映している可能性があり、キュウリでの詳細な動態分析は、サリチル酸が長距離信号伝達に必須でない可能性を示す（Ｒasmussen,Ｊ.Ｂ.,et al.,“Ｓystemic Ｉnduction of Ｓalicylic Ａcid Ａccumulation in Ｃucumber after Ｉnoculation with Ｐseudomonas Ｓyringae pv.Ｓyringae”，Ｐlant Ｐhysiol.97：1342-1347(1991),参考として本明細書に包含させる）。
生物的薬剤を使用した免疫化は広汎に研究されている。緑莢インゲンは、栽培変種非病原種（Ｒahe,Ｊ.Ｅ.,“Ｉnduced Ｒesistance in Ｐhaseolus Ｖulgaris to Ｂean Ａnthracnose,”Ｐhytopathology 59：1641-5(1969)；Ｅlliston,Ｊ.,et al.,“Ｉnduced Ｒesistance to Ａnthracnose at a Ｄistance from the Ｓite of the Ｉnducing Ｉnteraction,”Ｐhytopathology 61：1110-12(1971)；Ｓkipp,Ｒ.,et al.,“Ｓtudies on Ｃross Ｐrotection in the Ａnthracnose Ｄisease of Ｂean,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 3：299-313(1973)，参考として本明細書に包含させる）、症状が発生する前に宿主組織中で加熱することにより弱毒化した栽培変種病原種（Ｒahe,Ｊ.Ｅ.,et al.,“Ｍetabolic Ｎature of the Ｉnfection-Ｌimiting Ｅffect of Ｈeat on Ｂean Ａnthracnose”,Ｐhytopathology 60：1005-9(1970)，参考として本明細書に包含させる）またはマメの非病原体のいずれかによる前感染により、Ｃolletotrichum lindemuthianum栽培変種病原種による疾病に対して、全体的に免疫化された。キュウリの炭疽病病原体であるＣolletotrichum lagenariumは、マメ炭疽病のすべての種に対する全体的防御の誘発物として有効な非病原種として等しく有効であった。１個またはそれ以上のＣ．lindemuthianumの種に耐性な栽培変種および報告されたすべての種に感受性の、即ち、病原体に対する“遺伝的耐性欠失”と呼ばれる栽培変種においてＣ．lagenariumにより防御が誘発された（Ｅlliston,Ｊ.,et al.,“Ｐrotection of Ｂean Ａgainst Ａnthracnose by Ｃolletotrichum Ｓpecies Ｎonpathogenic on Ｂean,”Ｐhytopathologische Ｚeitschrift 86：117-26(1976)；Ｅlliston,Ｊ.,et al.,“Ａ Ｃomparative Ｓtudy on the Ｄevelopment of Ｃompatible,Ｉncompatible and Ｉnduced Ｉncompatible Ｉnteractions Ｂetween Ｃollectotrichum Ｓpecies and Ｐhaseolus Ｖulgaris,”Ｐhytopathologische Ｚeitschrift 87：289-303(1976)，参考として本明細書に包含させる）。これらの結果は、同じ機構が、耐性遺伝子“所有”または“欠失”として報告されている栽培変種で誘導され得ることを示す（Ｅlliston,Ｊ.,et al.,“Ｒelation of Ｐhytoalexin Ａccumulation to Ｌocal and Ｓystemic Ｐrotection of Ｂean Ａgainst Ａnthracnose,”Ｐhytopathologische Ｚeitschrift 88：114-30(1977)，参考として本明細書に包含させる）。Ｃ．lindemuthianumの全ての種に感受性な栽培変種は、病原体に対する耐性機構の遺伝子を欠失していないことも明らかである。
Ｋuc,Ｊ.,et al.,（“Ｐrotection of Ｃucumber Ａgainst Ｃollectotrichum Ｌagenarium by Ｃollectrichum Ｌagenarium,”Physiological Ｐlant Ｐathology 7：195-9(1975)，参考として本明細書に包含させる）は、キュウリ植物が、Ｃolletotrichum lagenariumによる疾病から、同真菌の子葉または最初の本葉の接種により、全体的に防御されることを示す。続いて、キュウリは真菌、細菌およびウイルス性疾患に対して、真菌、細菌またはウイルスいずれかの接種により全体的に防御される（Ｈammerschmidt,Ｒ.,et al.,“Ｐrotection of Ｃucumbers Ａgainst Ｃolletotrichum Ｌagenarium and Ｃladosporium Ｃucumerium,”Ｐhytopathology 66：790-3(1976)；Ｊenns,Ａ.Ｅ.,et al.,“Ｌocalized Ｉnfection with Ｔabacco Ｎecrosis Ｖirus Ｐrotects Ｃucumber Ａgainst Ｃollectorichum Ｌagenarium,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 11：207-12(1977)；Ｃaruso,Ｆ.Ｌ.,et al.“Ｉnduced Ｒesistance of Ｃucumber to Ａnthracnose and Ａngular Ｌeaf Ｓpot by Ｐseudomonas Ｌachrymans and Ｃolletotrichum Ｌagenarium,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 14：191-201(1979)；Ｓtaub,Ｔ., et al.,“Ｓystemic Ｐrotection of Ｃucumber Ｐlants Ａgainst Ｄisease Ｃaused by Ｃladosporium Ｃucumerinum Ｃolletotrichum Ｌagenarium by Ｐrior Ｌocalized Ｉnfection with Ｅither Ｆungus,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology,17：389-93(1980)；Ｂergstrom,Ｇ.Ｃ.,et al.,“Ｅffects of Ｌocal Ｉnfection of Ｃucumber by Ｃolletotrichum Ｌagenarium,Ｐseudomonas Ｌachrymans or Ｔobaco Ｎecrosis Ｖirus on Ｓystemic Ｒesistance Ｃucumber Ｍosaic Ｖirus,”Ｐhytopathology 72：922-6(1982)；Ｇessler,Ｃ.,et al.,“Ｉnduction of Ｒesistance to Ｆusarium Ｗilt in Ｃucumber by Ｒoot and Ｆoliar Ｐathogens,”Ｐhytopathology 72：1439-41(1982)；Ｂasham,Ｂ.,et al.,“Ｔabacco Ｎecrosis Ｖirus Ｉnduces Ｓystemic Ｒesistance in Ｃucumbers Ａgainst Ｓphaerotheca Ｆuliginea,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 23：137-44(1983)，参考として本明細書に包含させる）。Ｃ．lagenariumまたはタバコ壊死ウイルスにより誘発される非特異的防御は、絶対的および機能的寄生真菌、局所病変域および全体的ウイルス、立ち枯れ真菌および細菌を含む少なくとも１３種の病原体に対して有効であった。同様にまた、防御が根病原体による誘発され、また有効であった。他のスイカおよびマスクメロンを含むウリ科植物がＣ．lagenariumに対して全体的に防御される（Ｃaruso,Ｆ.Ｌ.,et al.,“Ｐrotection of Ｗatermelon and Ｍuskmelon Ａgainst Ｃollectotrichum Ｌagenarium by Ｃollectotrichum Ｌagenarium,”Ｐhytopathology 67：1285-9(1977),参考として本明細書に包含させる）。
タバコにおける全体的はまた広範囲の疾病に対して誘導されている(Ｋuc,Ｊ.,et al.,“Ｉmmunization for Ｄisease Ｒesistance in Ｔabacco,”Ｒecent Ａdvance in Ｔabacco Ｓcience 9：179-213(1983)，参考として本明細書に包含させる）。タバコモザイウウイルスによる壊死領域は、ウイルスによる疾病に対する上部の葉の耐性を促進させる（Ｒoss,Ａ.Ｆ.,et al.,“Ｓystemic Ａcquired Ｒesistance Ｉnduced by Ｌocalized Ｖirus Ｉnfection in Ｐlants,”Ｖirology 14：340-58(1961)；Ｒoss,Ａ.Ｆ.,et al.,“Ｓystemic Ｅffects of Ｌocal Ｌesion Ｆormation,”Ｉn：Ｖiruses of Ｐlants pp.127-50(1966)，参考として本明細書に包含させる）。Ｐhytophthora parasitica var．nicotianae、Ｐ．tabacinaおよびＰseudomonas tabaciはアブラムシＭyzus persicaeの繁殖を減少させる(ＭcＩntyre,Ｊ.Ｌ.,et al.,“Ｉnduction of Ｌocalized and Ｓystemic Ｐrotection Ａgainst Ｐhytophthora Ｐarasitica var.nicotianae by Ｔobacco Ｍosaic Ｖirus Ｉnfection of Ｔobacco Ｈypersensitive to the Ｖirus,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 15：321-30(1979);ＭcＩntyre,Ｊ.Ｌ.,et al.,“Ｅffects of Ｌocalized Ｉnfections of Ｎicotiana Ｔabacum by Ｔobacco Ｍosaic Ｖirus on Ｓystemic Ｒesistance Ａgainst Ｄiverse Ｐathogens and an Ｉnsect,”Ｐhytopathology 71：297-301(1981)，参考として本明細書に包含させる）。加熱殺菌Ｐ．tabaci(Ｌovrekovich,Ｌ.,et al.,“Ｉnduced Ｒeaction Ａgainst Ｗildfire Ｄisease in Ｔobacco Ｌeaves Ｔreated with Ｈeat-Ｋilled Ｂacteris,”Ｎature 205：823-4(1965),参考として本明細書に包含させる）およびＰseudomonas solanacearum(Ｓequeira,Ｌ.,et al.,“Ｉnteraction of Ｂacteria and Ｈost Ｃell Ｗalls：Ｉts Ｒelation to Ｍechanisms of ＩnducedＲesistance,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 10：43-50(1977)，参考として本明細書に包含させる）のタバコ葉への浸潤は、浸潤に関して同細菌に対する耐性を誘導した。タバコ植物は、また、線虫Ｐratylenchus penetransにより、Ｐ．parasitica var．nicotianaに対して防御された(ＭcＩntyre,Ｊ.Ｌ.,et al.,“Ｐrotection of Ｔobacco Ａgainst Ｐhytophthora Ｐarasitica Ｖar.Ｎicotianae by Ｃultivar-Ｎonpathogenic Ｒaces,Ｃell-Ｆree Ｓonicates and Ｐratylenchus Ｐenetrans,”Ｐhytopathology 68：235-9(1978)，参考として本明細書に包含させる）。
参考として本明細書に包含させるＣruikshank,Ｉ.Ａ.Ｍ.,et al.,“Ｔhe Ｅffect of Ｓtem Ｉnfestation of Ｔobacco with Ｐeronospora Ｔabacina Ａdamon Ｆoliage Ｒeaction to Ｂlue Ｍould,”Ｊournal of the Ａustralian Ｉnstitute of Ａgricultural Ｓcience 26：369-72(1960)は、青黴(即ち、Ｐ．tabaciba)に対して、真菌の幹への注射により、タバコ葉の免疫化の最初の報告であるが、矮小および成熟前老化も含んだ。木部へ外部注射は、矮小軽減だけでなく、成長および発育を促進することが最近発見された。温室および野外実験の両方で、免疫化タバコは、対照植物より約４０％高く、乾燥重量で４０％増加し、生重量で３０％増加し、４−６枚葉が多かった(Ｔuzun,Ｓ.,et al.,“Ｔhe Ｅffect of Ｓtem Ｉnjections with Ｐeronospora Ｔabacina and Ｍetalaxyl Ｔreatment on Ｇrowth of Ｔobacco and Ｐrotection Ａgainst Ｂlue Ｍould in the Ｆield,”Ｐhytopathology 74：804(1984)，参考として本明細書に包含させる）。これらの植物は対照植物より約２−３週間早く花を咲かせた(Ｔuzun,Ｓ.,et al.,“Ｍovement of a Ｆactor in Ｔobacco Ｉnfected with Ｐeronospora Ｔabacina Ａdam which Ｓystemically Ｐrotects Ａgainst Ｂlue Ｍould,”Ｐhysiological Plant Pathology 26：321-30(1985)，参考として本明細書に包含させる）。
全体的防御は、感染に対する完全な免疫性を付与しないが、疾病の重症度を軽減し、症状の発症を遅くする。真菌病原体による病変域の数、病変域の大きさおよび胞子形成の程度が全て減少する。疾病の領域が９０％以上減少し得る。
キュウリに最初の接種後３−６週間後に“追加”免疫接種(booster inoculation)をした場合、Ｃ．lagenariumにより誘発される免疫化が開花時期および結実時期と通して持続した(Ｋuc,Ｊ.,et al.,“Ａspects of the Ｐrotection of Ｃucumber Ａgainst Ｃolletotrichum Ｌagenarium by Ｃolletotrichum Ｌagenarium,”Ｐhytopathology 67：533-6(1977)，参考として本明細書に包含させる）。防御は、一度植物が果実を付けると、誘発されない。タバコ植物は、Ｐ．tabacinaの胞子嚢に幹注射により、成育季節に免疫化された。しかしながら、全体的青黴発育を防止するために、この方法は、植物が２０cm以上の高さになった時のみ有効であった。
誘導葉の免疫化キュウリ植物からの除去は、あらかじめ存在した伸びた葉の免疫化レベルを減少させなかった。しかしながら、続いて頂端部の芽から発芽した葉は、前からあったものより段階的に防御されていなかった(Ｄean,Ｒ.Ａ.,et al.,“Ｉnduced Ｓystemic Ｐrotection in Ｃucumber:Ｔime of Ｐroduction and Ｍovement of the「signal」,”Ｐhytopathology 76：966-70(1986)，参考として本明細書に包含させる）。同様な結果が、あらかじめタバコモザイクウイルスに感染させることにより、タバコモザイクウイルスに対して免疫化したタバコ(領域宿主)で、本明細書に参考として包含させるＲoss,Ａ.Ｆ.,“Ｓystemic Ｅffects of Ｌocal Ｌesion Ｆormation,”Ｉn：Ｖiruses of Ｐlants pp.127-50(1966)により報告された。比較して、Ｐ．tabacinaの幹注射により免疫化されたタバコ植物の若枝から発芽した新葉は、高度に防御されていた(Ｔuzun,Ｓ.,et al.,“Ｔransfer of Ｉnduced Ｒesistance in Ｔobacco to Ｂlue Ｍould(Ｐeronospora Ｔabacina Ａdam.)Ｖia Ｃallus,”Ｐhytopathology 75：1304(1985)，参考として本明細書に包含させる）。免疫化植物の葉の組織培養から再生した植物は、非免疫化親の葉から再生した植物と比較して、青黴の有意な減少を示した。植物の加令により、病変域拡大および胞子形成の両方が減少した。しかしながら、他の発明者らは、同じ結論に達しなかったが、一つの実験における胞子形成における有意な減少が報告されている(Ｌucas,Ｊ.Ａ.,et al.,“Ｎontransmissibility to Ｒegenerants from Ｐrotected Ｔobacco Ｅxplants of Ｉnduced Ｒesistance to Ｐeronospora Ｈyoscyami,”Ｐhytopathology 75：1222-5(1985)，参考として本明細書に包含させる）。
キュウリおよびスイカの保護は、温室内および野外で有効である(Ｃaruso,Ｆ.Ｌ.,et al.,“Ｆield Ｐrotection of Ｃucumber Ａgainst Ｃolletotrichum Ｌagenarium by Ｃ．Ｌagenarium,”Ｐhytopathology 67：1290-2(1977)，参考として本明細書に包含させる）。一つの試験において、保護キュウリのＣ．lagenariumの全障害領域は、非保護対象植物の障害領域より２％少なかった。同様に、保護された攻撃植物で６６個中１個のみ枯死したが、非保護の攻撃スイカの６９個中４７個が枯死した。ケンタッキー州およびプエルトリコにおける大規模な野外試験において、Ｐ．tabacina胞子のタバコへの幹注射は、青黴の制御において、少なくとも最良の殺菌剤メタラキシルと同程度有効であった。植物は、壊死領域および胞子形成程度を基本にして９５−９９％保護されており、治療されたタバコで１０−２５％収率の増加をもたらす。
細菌およびウイルスに対する耐性の誘導は、疾病の症状または病原体複製または両方の抑制として具現される（Ｃaruso,Ｆ.Ｌ.,et al.,“Ｉnduced Ｒesistance of Ｃucumber to Ａnthracnose and Ａngular Ｌeaf Ｓpot by Ｐseudomonas Ｌachrymans and Ｃolletorichum Ｌagenarium,”Ｐhysiological Ｐlant Ｐathology 14：191-201(1979)；Ｄoss,Ｍ.,et al.,“Ｓystemic Ａcquired Ｒesistance of Ｃucumber to Ｐseudomonas Ｌachrymans as Ｅxpressed in Ｓuppression of Ｓymptoms,but not in Ｍultiplication of Ｂacteria”，Ａcta Ｐhytopathologia Ａcademiae Ｓcientiarum Ｈungaricae 16：(3-4),269-72(1981)；Ｊenns,Ａ.Ｅ.,et al.,“Ｎon-Ｓpecific Ｒesistance to Ｐathogens Ｉnduced Ｓystemically by Ｌocal Ｉnfection of Ｃucumber with Ｔobacco Ｎecrosis Ｖirus,Ｃolletotrichum Ｌagenarium or Ｐseudomonas Ｌachrymans”，Ｐhytopathologia Ｍediterranea 18：129-34(1979)，参考として本明細書に包含させる）。
上記のように、全体的獲得耐性の研究は、感染性病原体で植物を感染させることを含む。この領域の研究は、どのように全体的獲得免疫が作用するかの理解に有用であるが、このような植物−病原体接触は、植物を弱め、または殺し得るため、感染作動体によるこのような耐性の誘発は商業的に有用ではない。本発明は、この欠点に打ち勝つことを意図する。
発明の要約
本発明は、植物に病原体耐性を付与することに関する。この方法は、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の非感染形を、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の細胞と接触するような条件下で適用することを含む。
本発明の他の態様は、非感染性過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質と接触させた細胞を有する病原体耐性植物に関する。
本発明の更に別の態様は、植物に病原体耐性を付与する組成物に関する。組成物は、非感染性過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質と担体を含む。
本発明は：今まで処置不可能であった植物疾病の処置；費用のために別々に処置することを望まない全体的疾病の処置；および疾病を処置するために、感染性作動体の使用を避けるのに有効である。本発明は、処置する植物またはその処置の近くに位置する植物に病原性の作動体を使用することなく、耐性を付与できる。本発明は、完全に生物分解性の天然産物の使用を含むため、環境を汚染しない。
【図面の簡単な説明】
図１はＥrwinia amylovoraの過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子群（即ち、hrpＮ）の遺伝的組織化を示す。上の線はプラスミドベクターpCPP430の制限酵素地図であり、Ｅ＝Ｅco ＲＩ、Ｂ＝Ｂam ＨＩおよびＨ＝Ｈind IIIである。長方形は翻訳単位および長方形の下の矢印は転写の方向を示す。長い矢印は過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の過敏応答の最終的翻訳に必須の領域を示す。pCPP430  hrpNはpCPP430の誘導体であり、その中にhrpＮをトランスポーザーＴnＳtacの挿入により変異させた。
図２はプラスミドベクターpＣＰＰ９の地図である。著しい特徴は、結合のための可動化(mob)部位；λの粘着部位(cos)；およびプラスミドの安定な遺伝のための分配領域(par)である。Ｂ，ＢamＨＩ;Ｅ,ＥcoＲＩ;Ｈ,ＨindIII;Ｐ，ＰstＩ:Ｓ,ＳaII；Ｓm，ＳmaＩ；oriＶ，複製起点；Ｓpr，スペクチノマイシン耐性；Ｓmr，ストレプトマイシン耐性。
発明の詳細な説明
本発明は、植物に病原体耐性を付与する方法に関する。この方法は、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の非感染形を、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の全体または一部の細胞と接触する条件下で、植物全体または一部に適用することを含む。
本発明の他の態様は、非感染性過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質と接触させた細胞を有する病原体−耐性植物に関する。
本発明の更に別の態様は、植物に病原体耐性を付与する組成物に関する。組成物は、非感染性過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質と担体を含む。
本発明で使用する過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、広範囲の病原体に由来する過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質に対応し得る。このようなポリペプチドまたはタンパク質は、誘発剤が接触した植物組織に局所的壊死を誘発し得る。対象となる病原体は、Ｅrwinia amylovora 、Ｅrwinia chrysanthemi、Ｐseudomonas syringae、Ｐseudomonas solancearum、Ｘanthomonas campestrisまたはこれらの混合物を含む。
本発明の目的のために、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の非感染形は、ポリペプチドまたはタンパク質が接触する植物の疾病の原因とならずに過敏応答を誘発できる。これは：１）単離された誘発ポリペプチドまたはタンパク質の適用；２）病気の原因とならず、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子で形質転換した細菌の適用；および３）ある植物種に疾病をもたらす（が、適用する種ではもたらさない）、本質的に過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含む細菌の適用を含む多くの方法で達成できる。
本発明の一つの態様において、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、対応する生物から単離し得、植物に適用し得る。このような単離方法は、参考として本明細書に包含させるＡrlat,Ｍ.,Ｆ.Ｖan Ｇijsegem,Ｊ.Ｃ.Ｈuet,Ｊ.Ｃ.Ｐemollet and Ｃ.Ａ.Ｂoucher,“ＰopＡ１,a Ｐrotein which Ｉnduces a Ｈypersensitive-like Ｒesponse in Ｓpecific Ｐetunia Genotypes is Ｓecreted via the Ｈrp Ｐathway of Ｐseudomonas solanacearum,”ＥＭＢＯ Ｊ.13：543-553(1994)；Ｈe,Ｓ.Ｙ.,Ｈ.Ｃ.Ｈuang and Ａ.Ｃollmer,“Ｐseudomonas syringae. pv.syringae Ｈarpinpss：a Ｐrotein that is Ｓecreted via the Ｈrp Ｐathway and Ｅlicits the Ｈypersensitive Ｒesponse in Ｐlants,”Ｃell 73：1255-1266(1993)；およびＷei,Ｚ.-Ｍ.,Ｒ.Ｊ.Ｌaby,Ｃ.Ｈ.Zumoff,Ｄ.Ｗ.Ｂauer,Ｓ.-Ｙ.Ｈe,Ａ.Ｃollmer and Ｓ.Ｖ.Ｂeer,“Ｈarpin Ｅlicitor of the Ｈypersensitive Ｒesponse Ｐroduced by the Ｐlant Ｐthogen Ｅrwinia amylovora,”Ｓcience 257：85-88(1992)に記載のように、既知イである。本明細書に参考として包含させる継続米国特許出願番号第０８／２００,０２４号および０８／０６２,０２４号もまた参照。しかしながら、好ましくは、本発明の単離過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記のように組換えで製造し、精製する。
本発明の他の態様において、本発明の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含む細菌を適用することにより、植物に適用できる。このような細菌は、誘発剤が植物細胞と接触するように、ポリペプチドまたはタンパク質を分泌または放出できなければならない。これらの態様において、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、植物内で、または植物に細菌を導入する直前に細菌により製造される。
本発明の細菌適用方法の一つの態様において、細菌は疾患の原因とならず、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子で形質転換(例えば、組換え的に)されている。例えば、植物に過敏応答を誘発しないＥ．coliを過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子で形質転換し、次いで植物に適用できる。細菌種(Ｅ．coli以外)もまた本発明のこの態様に使用できる。
本発明の細菌適用方法の他の態様において、細菌は疾病をもたらし、天然で過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含む。このような細菌の例は上記である。しかしながら、この態様において、これらの細菌は、この細菌により媒介される疾病に感受性ではない植物に適用する。例えば、Ｅrwinia amylovoraは、リンゴまたはナシで疾病をもたらすが、トマトではもたらさない。しかしながら、このような細菌は、トマトで過敏応答を誘発する。したがって、本発明のこの態様に従い、Ｅrwinia amylovoraをトマトに適用し、この種に疾病をもたらすことなく、病原体耐性を付与できる。
Ｅrwinia chrysanthemi由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する：
0003961023.tif 000002
この過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、３４kＤaの分子量を有し、熱安定性であり、１６％以上のグリシン含量を有し、実質的にシステインを含まない。Ｅrwinia chrysanthemi過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号２に対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子によりコードされる：
0003961023.tif 000003
0003961023.tif 000004
Ｅrwinia amylovora由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号３に対応するアミノ酸配列を有する：
0003961023.tif 000005
0003961023.tif 000006
この過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は約３７kＤaの分子量を有し、約４.３のpＩを有し、１００℃で少なくとも１０分、熱安定性である。この過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は実質的にシステインを有しない。Ｅrwinia amylovora由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、より詳細に、参考として本明細書に包含させるＷei,Ｚ.-Ｍ.,Ｒ.Ｊ.Ｌaby,Ｃ.Ｈ.Zumoff,Ｄ.Ｗ.Ｂauer,Ｓ.-Ｙ.Ｈe,Ａ.Ｃollmer and Ｓ.Ｖ.Ｂeer,“Ｈarpin Ｅlicitor of the Ｈypersensitive Ｒesponse Ｐroduced by the Ｐlant Ｐathogen Ｅrwinia amylovora,”Ｓcience 257：85-88(1992)に記載されている。このポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、下記の配列番号４に対応するヌクレオチド配列を有する：
0003961023.tif 000007
Ｐseudomonas syringae由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号５に対応するアミノ酸配列を有する：
0003961023.tif 000008
この過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、３４−３５kＤaの分子量を有する。グリシンに富み(約１３.５％)、システインおよびチロシンを欠く。
Ｐseudomonas syringae由来の過敏応答誘発剤ついての更なる情報は、参考として本明細書に包含させるＨe,Ｓ.Ｙ.,Ｈ Ｃ Ｈuang and Ａ.Ｃollmer,“Ｐseudomonas syringae pv.syringae Ｈarpinpss：a Ｐrotein that is Ｓecreted via the Ｈrp Ｐathway and Ｅlicits the Ｈypersensitive Ｒesponse in Ｐlants,”Ｃell 73：1255-1266(1993)に見られる。Ｐseudomonas syringae由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、欠きのように、配列番号６に対応するヌクレオチド配列を有する：
0003961023.tif 000009
Ｐseudomonas solanacearum由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号７に対応するアミノ酸配列を有する：
0003961023.tif 000010
これは、下記の配列番号８に対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子によりコードされる。
0003961023.tif 000011
Ｐseudomonas solanacearum由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質も関する更なる情報は、参考として本明細書に包含させるＡrlat,Ｍ.,Ｆ.Ｖan Ｇijsegem,Ｊ.Ｃ.Ｈuet,Ｊ.Ｃ.Ｐemollet and Ｃ.Ａ.Ｂoucher,“ＰopＡ１,a Ｐrotein which Ｉnduces a Ｈypersensitive-like Ｒesponse in Ｓpecific Ｐetunia Ｇenotypes is Ｓecreted via the Ｈrp Ｐathway of Ｐseudomonas solanacearum,”ＥＭＢＯ Ｊ.13：543−533(1994)に明示されている。
Ｘanthomonas campestirs pv．glycines由来の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、下記の配列番号９に対応するアミノ酸配列を有する：
0003961023.tif 000012
この配列は、Ｘanthomonas campestirs pv．glycinesの過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質由来の２６残基のみを有するアミノ末端配列である。これは他のtanthomouas campestris pathovarsで決定された繊毛サブユニットタンパク質と合致する。
上記誘発剤は例示である。他の誘発剤が、誘発剤をコードする遺伝子の発現下で過敏応答を誘発する細菌を成育させることにより同定できる。培養上清由来の無細胞調整物を、それを適当な植物組織に侵入させるために使用して、誘発活性（則ち、局所壊死）を試験し得る。
上記過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントおよび他の病原体由来の完全な長さの誘発剤のフラグメントを、本発明の方法に使用することも可能である。
適当なフラグメントは、幾つかの手段により製造できる。最初に、既知の誘発タンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを、慣用の分子遺伝子操作により、遺伝子フラグメントをサブクローニングすることにより製造する。次いで、サブクローンをインビトロまたはインビボで細菌細胞中で発現させ、小さいタンパク質またはペプチドを製造し、それを下記の方法に従って誘発剤活性について試験できる。
別法として、誘発タンパク質のフラグメントが、完全な長さの誘発タンパク質を、キモトリプシンまたはＳtaphylococcus proteinase Ａまたはトリプシンの様なタンパク質分解酵素で消化させて製造される。異なるタンパク質分解酵素が、誘発タンパク質のアミノ酸配列を基本にして、誘発タンパク質を異なる部位で開裂するようである。タンパク質分解で得たフラグメントの幾つかが耐性の有効な誘発剤であり得る。
他の研究において、タンパク質の一次構造の知識を基本にして、誘発タンパク質のフラグメントを、ＰＣＲ技術を使用して、タンパク質の特定の部分を提示させるために選択した特異的プライマーのセットで合成し得る。次いで、これらを切断ペプチドまたはタンパク質の増加および発現のための適当なベクターにクローンする。
変法は、加えて（あるいは別に）、例えば、ポリペプチドの特性、２次構造およびに親水性性質に最小の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加により修飾し得る。例えば、ポリペプチドを、タンパク質の共翻訳的または後翻訳的直接移入である、タンパク質のＮ−末端でシグナル(またはリーダー)配列と結合し得る。ポリペプチドをまた、ポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするためのリンカーまたは他の配列と結合し得る。
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、慣用の方法で純粋な形（好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは９０％純粋）で製造する。典型的に、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換えＥ.coliの成育培地に分泌される。タンパク質を単離するために、組換えプラスミドを担持するＥ.coli宿主細胞を増殖させ、均質化し、均質物を遠心して細菌残骸を除去する。次いで、上清を連続硫酸アンモニウム沈殿に付す。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を含むフラクションを、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドゲルでゲル濾過し、タンパク質を分離する。必要であれば、タンパク質フラクションをＨＰＬＣにより更に精製し得る。
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、慣用の組換えＤＮＡ技術を使用して細胞内に挿入できる。一般に、これはＤＮＡ分子の、ＤＮＡが異種(則ち、通常存在しない)である発現系に挿入することを含む。異種ＤＮＡ分子を発現系またはベクターに、適当にセンス配向および正しい読み取り枠で挿入する。ベクターは、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。
参考として本明細書に包含させるＣohenおよびＢoyerの米国特許第４,２３７,２２４号は、制限酵素開裂およびＤＮＡリガーゼでのライゲーションを使用した組換えプラスミドの形の発現系の製造を記載する。次いで、これらの組換えプラスミドを、形質転換の手段により挿入し、培養培地で成育させた真核生物および原核細胞を含む単細胞性培養物中で複製させる。
組換え遺伝子を、またワクチニアウイルスのようなブイルスに挿入し得る。組み合えウイルスは、ウイルスを感染させた細胞内へのプラスミドの形質導入により製造できる。
適当なベクターは、ラムダ・ベクター系gt１１、gtＷＥＳ.tＢ、Ｃharon ４およびプラスミドベクターpＢＲ３２２、pＢＲ３２５、pＡＣＹＣ１７７、pＡＣＹＣ１８４、pＵＣ８、pＵＣ９、pＵＣ１８、pＵＣ１９、pＬＧ３３９、pＲ２９０、pＫＣ３７、pＫＣ１０１、ＡＶ４０、pＢluescript II ＳＫ ＋／−またはＫＳ ＋／−（参照“Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems”Ｃatalog(1993),Ｓtrata gene，Ｌa Ｊolla，Ｃalif.、参考として本明細書に包含させる）、pＱＥ、pＩＨ８２１、pＧＥＸ、pＥＴシリーズ（参照  Ｆ.Ｗ.Ｓtudier et al.,“Ｕse of Ｔ７ ＲＮＡ Ｐolymerase to Ｄirect Ｅxpression of Ｃloned Ｇenes,”Ｇene Ｅxpression Ｔechnology vol.185(1990),参考として本明細書に包含させる）、およびその誘導体のようなウイルスベクター系を含むが、これらに限定されない。組換え分子を、形質転換、特にトランスダクション、結合、移動化およびエレクトロポレーションにより細胞に挿入できる。ＤＮＡ配列を、本明細書に参考として包含させるＭaniatis et al.，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｌaboratory，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork(1982)に記載のように、当分野で既知の標準クローニング法を使用してベクターにクローンする。
種々の宿主−ベクター系を使用して、タンパク質−コード配列を発現し得る。第１に、ベクター系は使用する宿主細胞と適合性でなければならない。宿主−ベクター系は、以下のものを含むが、これらに限定されない：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクター含有酵母のような微生物；ウイルスに感染した哺乳類細胞（例えば、ワクチニアウイルス、アデノウイルス等）；ウイルスで感染させた昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；および細菌で感染させた植物細胞。これらのベクターの発現要素は、その強度および特性により変化する。使用する宿主−ベクター系に依存して、適当な数の転写および翻訳要素を使用できる。
異なる遺伝的信号および処理情事象が遺伝子発現の多くのレベルを制御する（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)翻訳）。
ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し、それによりｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列のプロモーターの存在に依存する。真核プロモーターのＤＮＡ配列は、原核プロモーターと異なる。更に、真核プロモーターおよび関連遺伝子信号は、原核系に認識されないか、利用されず、更に、原核プロモーターは真核細胞に認識されず、機能しない。
同様に、原核細胞のｍＲＮＡの翻訳は、真核細胞と異なる適当な原核細胞信号の存在に依存する。原核細胞のｍＲＮＡの有効な翻訳は、ｍＲＮＡ上に、結合部位、いわゆるＳhine−Ｄalgarno(“ＳＤ”)配列の存在を必要とする。この配列は、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列であり、開始コドンである、通常タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードするＡＵＧの前に位置する。ＳＤ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ(リボソームＲＮＡ)の３'末端と相補的であり、ｒＲＮＡと２重によるｍＲＮＡとリボソームの結合を恐らく促進し、リボソームの正確な位置を可能にする。遺伝子発現を最大とするためのレビューのために、参考として本明細書に包含させるＲobertsおよびＬauer，Ｍethods in Ｅnzymology，68:473(1979)参照。
プロモーターはその“強度”（即ち、転写を促進する能力）が異なる。クローン遺伝子を発現する目的のために、高レベルの転写、従って遺伝子の発現を得るために強いプロモーターの使用が望まれる。使用した宿主細胞系に依存して、適当なプロモーターの適当な数を使用し得る。例えば、Ｅ.coliにクローニングした時、そのバクテリオファージまたはプラスミド、Ｔ７ファージプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、recＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、コリファージラムダおよび、lacＵＶ５、ompＦ、bla、lppを含むがこれらに限定されない他のＰRおよびＰLプロモーター等が隣接ＤＮＡセグメントの転写の高いレベルを指示するために使用し得る。更に、ハイブリッドtrp−lacＵＶ５（tac）プロモーターまたは他の合成ＤＮＡ技術を、挿入遺伝子の転写を提供するために使用し得る。
細菌宿主細胞株および発現ベクターは、特別に誘導されない限り、プロモーターの活性を阻害するように選択し得る。ある操作において、特異的誘発剤の添加が挿入ＤＮＡの有効な転写に必要である。例えば、lacオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加により誘発される。trp、pro等の他の種々のオペロンは異なる制御下にある。
特異的開始信号がまた原核細胞における有効な遺伝子転写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開始信号は、遺伝子特異的メッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質合成の量でそれぞれ測定して、“強度”が変化し得る。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターがまた種々の“強度”の転写および／または翻訳開始信号の組み合わせも含み得る。例えば、Ｅ.coliにおける有効な翻訳のために、リボソーム結合部位を提供するための開始コドン（ＡＴＧ）の約７−９塩基５'にＳhine−Ｄalgarno(ＳＤ)配列を必要とする。したがって、宿主細胞リボソームが利用できるＳＤ−ＡＴＧの組み合わせを使用し得る。このような組み合わせは、cro遺伝子、コリファージラムダのＮ遺伝子、またはＥ.coliトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子由来のＳＤ−ＡＴＧを含むが、これらに限定されない。更に、組換えＤＮＡまたは合成ヌクレオチドの挿入に関する他の技術により製造されるＳＤ−ＡＴＧの組み合わせを使用し得る。
一度、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子が発現系にクローンされたら、宿主細胞への挿入は容易である。このような挿入は、ベクター／宿主細胞系に依存して、上記の形質転換の種々の形により行うことができる。適当な宿主細胞は、細菌、ウイルス、酵母、哺乳類細胞、昆虫、植物等を含むがこれらに限定されない。
本発明の方法は、広範囲の植物び処理に使用でき、病原体耐性を付与する。適当な植物は双子葉および単子葉植物を含む。より具体的に、有用な農作物は：イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、エンダイブ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、トウナス、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、モコロシおよびサトウキビを含む得る。適当な鑑賞用植物の例は：シロイヌナズナ(Ａrabidopsis thaliana)、セントポーリア、ペチュニア、ペラゴニウム、ポインセチア、キク、カーネーションおよびヒャクニチソウである。
本発明により病原体耐性を植物に付与する方法は、ウイルス、細菌および真菌を含む広範囲の病原体に対する耐性の付与に有用である。
とりわけ、以下のウイルスに対する耐性が、本発明の方法により達成できる：タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。
とりわけ、以下の細菌に治する耐性が、本発明により植物に付与される：Ｐseudomonas solancearum、Ｐseudomonas syringae pv．tabaciおよびＸanthamonas campestris pv．pelargonii。
植物は、本発明の方法の使用により、とりわけ以下の真菌に対して耐性となり得る：Ｆusarium oxysporumおよびＰhytophthora infestans。
本発明の方法は、処理する植物の全体または一部に過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を適用する種々の方法により達成できる。これは、植物への過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質の浸潤を含み得る(が必須ではない)。適当な適用法は、高圧または低圧スプレー、注入および誘発剤適用を行う直前に葉を傷つけることを含む。他の適当な適用法は、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質と植物細胞の有効な接触が可能となるように、当業者が容易に推測できる。
過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質は、植物に、本発明に従って単独で、または他の物質との混合物で適用できる。
本発明の一つの態様は、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を担体中に含む、植物に病原体耐性を誘発するための組成物を含む。適当な担体は、水または水性溶液を含む。この態様において、組成物は５００nＭ以上の過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質を含む。
必須ではないが、この組成物は、肥料、殺虫剤、殺菌剤およびそれらの混合物を含む更なる添加剤を含み得る。適当な肥料は(ＮＨ4)2ＮＯ3を含む。適当な殺虫剤の例はメラチオンである。有効な殺虫剤はカプタンを含む。
他の適当な添加剤は、緩衝化剤、湿潤剤および浸食剤を含む。これらの物質は、本発明の方法を促進するために使用し得る。
実施例
実施例１−南部細菌性立ち枯れ病(Ｓouthern bacterial wilt disease)
(Ｐseudomonas solanacerum)に対するトマトのハルピン−誘発耐性
温室で８×１５cm平面に成長した２週令トマト苗を下記のように処理した：２０本の植物をＡからＦと名付けた各６種の処理に使用し、それは下記の通りである：
（Ａ）２００μｇ／ml粗ハルピン（すなわち、過敏応答誘発ポリペプチドまたはタンパク質）製剤約１００μl（参考として本明細書に包含させるＺ―Ｍ．Ｗei,“Ｈarpin，Ｅlicitor of the Ｈypersensitive Ｒesponse Ｐroduced by the Ｐlant Ｐathogen Ｅrwinia amylovora”，Ｓcience 257:85-88(1992))を各苗の最も下の本葉に浸透させた。
（Ｂ）（Ａ）で使用したのと同じハルピン製剤を４００メッシュカーボランダムで、苗の葉表面にスプレーし、次いで親指で穏やかに擦り込んだ。
（Ｃ）Ｅ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）（プラスミドベクターpＣＰＰ４３０の地図は図１参照）をＬＢ培地で、ＯＤ620＝０.７となるまで成育させた。培養物を遠心し、次いで５mＭリン酸素カリウム緩衝液、pＨ６.５に再懸濁した。約１００μlの細胞懸濁液を苗の各葉に浸透させた。
（Ｄ）Ｅ.coli ＤＨ５(pＣＰＰ４３０：：hrpＮ)(プラスミドベクターpＣＰＰ４３０：：hrpＮの地図は図１参照)を(Ｃ)のように使用した。細胞を成育させ、懸濁液および使用した接種量は(Ｃ)に記載の通りであった。
（Ｅ）Ｅ.coli ＤＨ５(pＣＰＰ９)(図２参照)を成育させ、懸濁液および使用した接種量は(Ｃ)に記載の通りであった。
（Ｆ）５mＭリン酸カリウム緩衝液の葉への浸透は、(Ｃ)に記載の通りであった。
攻撃病原細菌、Ｐseudomonas solanacearum株Ｋ６０をＯＤ620＝０.７（約１０8cfu／ml）までキング培地Ｂで成育させた。培養値を遠心し、１００容量の５mＭリン酸カリウム緩衝液に再懸濁し、最終濃度約１×１０6cfu／mlとした。
３日後、トマト苗をハルピンまたは細菌で処理し、それらを引き抜き、約１千値の根をハサミで切った。次いで苗を３分、Ｐ.solanacearum Ｋ６０の懸濁液に３分浸した。接種植物を同じ植木鉢に再移植した。植物を温室に放置し、疾病の症状を接種後７日に記録した。
Ａ.ハルピンでの処理の効果
２４時間後、ハルピンまたはＥ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）を浸透させた葉の部分のみが落葉した。ハルピンおよびカルボランダムをスプレーした葉は、僅かに斑点状に壊死を示した。
Ｂ.南部細菌性立ち枯れ病の発症に対するハルピン処理の効果
２０本のハルピン侵入植物はＰ.solancearum K60浸透１週間後、症状を示さなかった（表１）。２０植物中１本が矮小症状を示した。しかしながら、２０本の緩衝液侵入植物中７本が矮小症状を示した。Ｅ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０-）（過敏衰弱を誘発できないトランスポゾン誘発変異体）またはＥ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ９）での処理は、緩衝液で処理した植物と比較して有意な差はなかった。これらの結果は、ハルピンまたはハルピンを製造するＥ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）が、Ｐ.solanacearum Ｋ６０によりもたらされる南部細菌性立ち枯れ病に対してトマトに耐性を誘発することを示す。
0003961023.tif 000013
接種４週間後、ハルピンまたはＥ.coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）で処理した植物は、緩衝液で処理したものと比較して、背が高く、広かった。ハルピンまたは緩衝液を浸透させた１０本の植物の平均の高さを表２に示す。
0003961023.tif 000014
実施例２−南部細菌性立ち枯れ病Ｐseudomonas solanacearumに対するトマトのハルピン誘発耐性
浸透および接種に使用した全ての方法は、Ｐ.solanacearum Ｋ６０の濃度が約５×１０4cfu／mlである以外、実施例１の記載と同様であった。
緩衝液浸透植物は、Ｐ.solanacearum Ｋ６０接種後１５日で症状を示した。２０本の植物中６本が１５日後に矮小症状を示した；２本の植物が２１日後に立ち枯れた。立ち枯れ植物は最後に枯死した。しかしながら、２０本のハルピン処理植物は矮小症状を示さなかった。接種３週間後、２０本のハルピン処理植物中３本が矮小症状を示した。３週間後、その植物がその誘発耐性を失った可能性がある。最初の実験のように、ハルピン処理植物全体の幹回りおよび高さは、緩衝液で処理したものより大きかった。
実施例３−南部細菌性立ち枯れ病Ｐseudomonas solanacearumに対するトマトのハルピン誘発耐性
この実験は、Ｐseudomonas solanacearum Ｋ６０の追加接種を、処理トマト植物の植木鉢に添加した以外、実施例１と同様であった。
ハルピンを２週令トマト苗に浸透させた。各植物の２つの区画に、５mＭリン酸カリウム緩衝液中に、２００μg／mlの濃度で懸濁させた約２００μlのハルピンを浸透させた。全２０本のトマト苗に浸透させた。同数のトマト苗に緩衝液を浸透させた。２日後、Ｓpeudomonas solanacearum Ｋ６０を、根浸潤により植物に接種した。ハルピンまたは緩衝液処理植物を土壌混合物から引き抜き、少しの根をハサミで切り取り、次いで残りの根をＰ.solanacearum Ｋ６０の懸濁液に３分浸した。細菌細胞懸濁液の濃度は約５×１０8cfu／mlであった。苗を同じ植木鉢に再移植した。更に３mlの細菌懸濁液を、個々の４インチ直径植木鉢の土壌に添加した。疾病の症状を１週間後採点した。全ての実験は、温室内で、限定された温度コントロール下に行った。
３週間後、２０本の緩衝液浸透トマト植物中１１本が死に、２本の植物が立ち枯れから回復したが、重い矮小症状が残った。非接種トマトと比較して、僅かに４本の植物が正常に成育した。ハルピン処理植物中１５本が健康に見えた；３本の植物が矮小であり、２本の植物が接種３週間後立ち枯れた。これらの結果は下記表３に要約する。
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実施例４−タバコモザイクウイルスに対するタバコのハルピン誘発耐性
４週令タバコ苗（栽培変種、Ｘanthi、Ｎ遺伝子担持）の低い葉の一つの区画を、Ｅ．amylovoraハルピンで、２００μg／mlの濃度で浸透させた。３日後、植物をタバコモザイクウイルス(“ＴＭＶ”)で攻撃した。ウイルスの２つの濃度（５μgおよび１００μg／ml）を使用した。約５０μlのウイルス懸濁液を、タバコの上部の葉一枚に付着させた。葉に４００メッシュカルボランダムをふりかけ、葉を穏やかにこすった。各濃度は、３本の植物で試験した。壊死領域を接種４日後およびその後連続２日計数し、３枚の葉の平均数を報告する（表４）。１０日目に、壊死領域の幾つかが融合したため、個々の領域を区別するのが難しかった。従って、記録された領域の数は、７日目に報告されたのより少ないようである。緩衝液処理葉の壊死領域の大きさは、ハルピン処理葉より大きかった。
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タバコモザイクウイルスを１００μg／mlで接種した時、ハルピン処理および緩衝液処理タバコで発症する局所領域の数に有意な差はなかった。
実施例５−Ｆusarium立ち枯れ病に対するトマトのハルピン誘発耐性
６週令のトマト植物を、実施例３記載のようにハルピンで処処置した。真菌病原体、Ｆusarium oxysporumをＬima Ｂean Ａgar培地で５日間、２７℃で成育させた。菌糸体を含む二つの完全な寒天プレートを、２分間、５mＭリン酸カリウム緩衝液２０ml中に撹拌した。ハルピンまたは緩衝液処理トマト植物の根を、木の杭を植木鉢中の土に突き刺すことにより傷付けた。次いで、３mlの真菌懸濁液を、４インチ植木鉢の土壌に注いだ。接種植物は、２４℃の、一日当たり１６時間明るい制御環境チャンバーに放置した。疾病の症状を接種７日後に記録した。各処理は１０本の植物に適用した。結果は下記表５に示す。
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実施例６−野火病(Ｐseudomonas syringe pv．tabaci)に対するハルピン誘発耐性
ハルピンを４週令タバコ植物（２０cm高）の下部の葉の１区間に浸透させた。３日後、Ｐseudomonas syringe pv．tabaciを上部の葉の１区間に浸透させた。４日後、疾病の症状を、表６に記載のように記録した。
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実施例７−細菌性斑点葉（Ｘanthamonas campestris pv．pelargonii）に対するゼラニウム（Ｐelargonium hortorum）のハルピン誘発耐性
この実験は、温室内で人工土壌混合物で、個々の４"または６"植木鉢で成育させたゼラニウムの発根した切り枝で行った。各植物の２枚の下部の葉に、０.０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.５(対照)またはハルピンまたはＥscherichia coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）（Ｅ．amylovoraの完全クローンhrpクラスター）を浸透させた。浸透２日から７日後、全ての植物に、細菌性斑点葉病原体Ｘanthamonas campestris pv．pelargoniiの純粋培養物を接種した。細菌（５×１０6cfu／ml）の懸濁液を、低圧で植物の上部および下部の両方の葉に噴霧した。各処理を２本の植物（表７で“Ａ”および“Ｂ”と命名）で行った。植物を低温霧噴霧器で供給した加湿下で、閉鎖チャンバーに４８時間維持した。次いで、植物を環境湿度および２３℃から３２℃の気温の温度ベンチに、１０日間維持し、その後病気の発症を評価した。
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実施例８−Ｐseudomonas syringae pv．tabaciによりもたらされる野火病に対する耐性の誘発における数種のハルピンの活性
タバコ植物（Ｎicotiana tabacum var．Ｘanthi）を温室で成育させた。４週令で、ハルピン製剤を各植物の下部の２枚の葉の単一区画に浸透させた。１２本の植物を各ハルピン製剤で処理し、３本を、ハルピンを製造するのに使用した同じリン酸カリウム緩衝液で処理した。ハルピン製剤を浸透させた葉の区画で、２４時間以内に過敏壊死が発症したが、緩衝液ではしなかった。
ハルピン処理７、１０、１１および１２日後、全ての植物に。Ｐseudomonas syringae pv．tabaciの１０から１０6細胞／mlの懸濁液を、上部の−の区画に浸透させることにより接種した。植物を温室内で７日間インキュベートし、その後発症を評価した。結果は下記表８に表として示す：
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３種の細菌の結果は、ハルピン製剤が立ち枯れ病原体に対する耐性の誘発に有効であることを示す。いずれのハルピンで処理した植物も使用した二つの低い接種濃度で症状を示さなかった。高い濃度で、症状はハルピン処理植物よりも緩衝液処理植物でより重かった。
実施例９−Ｐhytophthora infestansによりもたらされる葉枯れ病に対するハルピン誘発耐性
葉枯れ病病原体は、主にジャガイモおよびトマトに影響を与える、悪名高きジャガイモ欠乏をもたらした。この病原体に対する耐性を誘発するハルピンの活性を、温室で成育させたトマト苗で試験した。３週令苗（栽培変種、“Ｍama Ｍia”、約６から８インチ高）をハルピンで処理し、続いてＰhythophthora infestansを接種した。各植物の下部の葉の２つの区画にハルピンの溶液、ハルピンを製造および分泌するＥscherichia coli ＤＨ５（pＣＰＰ４３０）またはリン酸カリウム緩衝液を浸透させた。
浸透後２、３または４日後、植物にＰhytophthora infestansの菌糸懸濁液を接種した。トマトに非常に有毒なＵ.Ｓ.７株を使用した。菌糸懸濁液を、菌をその上およびその中に２週間２１℃で成育させた２つの大麦ひき割り粉寒天プレートの中身を穏やかに撹拌することにより製造した。懸濁液を処理植物当たり一枚の葉の上面および下面に、広い絵筆で塗った。
処理および接種植物を、温室内の温度を２０−２３℃に保ち、その間高い相対的湿度を保つように設計した、特別に作った加湿チャンバーでインキュベートした。湿度は、精製水から、数個の冷却霧噴霧器により、最大速度で提供された。疾病の兆候を、Ｐhytophthora infestans接種後１３日に評価し、結果を表９に示す。各処理を４本の個々の植物で適用した。
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ハルピンでの処理は、処理と接種の間の全ての間隔で植物に発症する領域の数を減少させた。発症した葉枯れ病領域の数もまたハルピンを製造および分泌するＤＨ５（pＣＰＰ４３０）での前処理により減少した。
本発明は、説明のために詳細を記載したが、このような詳細は単にこの目的のためだけであり、その変法を、以下の請求の範囲に定義の本発明の精神および範囲から外れることなく、当業者がなし得る。
配  列  表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：植物における過敏応答誘発耐性
（iii）配列の数：９
（iv）連絡住所
（Ａ）宛名：ニクソン・ハーグレイブ・デビアンス＆ドーリー・エルエルピー
（Ｂ）通り：クリントン・スクエアー、ピー・オー・ボックス１０５１
（Ｃ）都市：ロチェスター
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：１４６０３
（ｖ）コンピューター読み取り可能形式：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：Ｐatent Ｉn Ｒelease＃1.0，Ｖersion＃1.30
（vi）現出眼データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）優先主張出願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／４７５，７７５
（Ｂ）出願日：１９９５年６月７日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ゴールドマン・ミヒャエル・エル
（Ｂ）登録番号：３０，７２７
（Ｃ）参照／ドケット番号：１９６０３／１００５１
（ix）遠距離連絡情報：
（Ａ）電話：（７１６）２６３−１３０４
（Ｂ）ファクシミリ：（７１６）２６３−１６００
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３３８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号１の記載：
0003961023.tif 000022
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２１４１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
（xi）配列番号２の記載：
0003961023.tif 000023
0003961023.tif 000024
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３８５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号３の記載：
0003961023.tif 000025
0003961023.tif 000026
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１１５８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
（xi）配列番号４の記載：
0003961023.tif 000027
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３４１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号５の記載：
0003961023.tif 000028
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１０２６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
（xi）配列番号６の記載：
0003961023.tif 000029
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３４４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号７の記載：
0003961023.tif 000030
0003961023.tif 000031
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１０３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
（xi）配列番号６の記載：
0003961023.tif 000032
（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号９の記載：
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【図１】
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【図２】
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