(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
少なくとも配列表の配列番号２、及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる請求項１の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管細胞の増殖を調節するための薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物個体が成長し生きて行くためのにはそれぞれの臓器や組織に酸素や栄養を供給することが必要不可欠である。酸素や栄養分の運搬は血球成分と血漿からなる血液によって行われ、この血液の流れる道が血管である。血管は血管内皮細胞、平滑筋細胞、ペリサイト、線維芽細胞などから構成される。血管新生とは既存の血管から新しい血管ネットワークが形成される現象のことである。林と井藤の総説（「血管研究の最前線」実験医学増刊、２１−２４、１９９５、羊土社）によると血管新生の過程は次のような段階を経て行われると考えられる。
【０００３】
１．何らかの血管新生刺激により血管新生因子が放出される。
２．血管新生因子は近傍の血管内皮細胞からプラスミノーゲンアクチベーター、コラゲナーゼなどの蛋白分解酵素の分泌を刺激し、内皮細胞外の基底膜が分解される。
３．破壊された基底膜より内皮細胞は血管新生刺激の存在する場所に向かって遊走し、さらに増殖をする。
４．遊走、増殖した内皮細胞は分化して管腔を形成し、さらに基底膜構成物質を分泌し管腔外側に基底膜を形成する。
５．基底膜にそって周細胞が遊走し、３層の血管壁構造が完成する。
６．最終的には近隣の新生血管の吻合が生じ、新たな血管網が形成される。
【０００４】
１９７１年に、Ｆｏｌｋｍａｎ（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６）が固形腫瘍の発育が腫瘍血管新生に依存しているという仮説を提唱し、血管新生が様々な病態と密接に関連していることが認識されたことから、血管新生を抑制することで、ＦｏｌｋｍａｎとＫｌａｇｓｂｒｕｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，４４２−４４７、１９８７）により示された下記表１に示した種々の病態に対する新しい治療法が考えられる。
【０００５】
【表１】
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【０００６】
この他に、外科的な手術や外傷後の創傷治癒過程、あるいは心筋梗塞、脳梗塞などで血管が閉塞し、その後、側副血行路が作られる場合には、血管新生はダメージを受けた組織の治癒を促進するため、血管新生を促すことがそれらの治療につながると考えられる。
【０００７】
現在までに、血管新生を制御する分子として、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦｓ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ＴＧＦ−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−α）、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦｓ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、また炎症性のサイトカインとして知られているＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）などが誘導因子として知られ、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−α、とＩＦＮ−β、ＰＦ−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４）などが抑制因子として知られている。これらは佐藤靖史著「血管新生学」（メディカルレビュー社）に詳細に記載されている。さらに、血管新生を抑制する活性を有する体内の腫瘍由来分子としてはＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９，３１５−３２９，１９９４）が同定されている。
【０００８】
また、同様に及川の総説（血管と内皮、２、４７０−４７８、１９９２）によると、血管新生抑制作用を有する低分子の薬剤としてコルチゾン、ＭＰＡ（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ハービマイシンＡ、１５−デオキシスパガリン、エポネマイシン、スタウロスポリン、レチノイン酸などが一般の細胞増殖抑制活性を主な薬効として血管内皮細胞の増殖抑制作用を基とした血管新生抑制作用物質として挙げられている。
【０００９】
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）とはショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
【００１０】
特にヒトに関して、ヒトノッチホモログであるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅｌｌｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６，６４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に３つのノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３，２０５７−２０６２，１９９４）。また、マウスの乳ガンを引き起こすウイルスがコードしていた遺伝子から見いだされたマウスノッチホモログであるＮｏｔｃｈ−４／ｉｎｔ−３は、血管内皮細胞に特異的に発現が認められている（Ｈｅｎｄｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，２２５１−２２５９，１９９６）。
【００１１】
近年クローニングされたショウジョウバエデルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだされており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生にＸｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，７６１−７６６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊椎動物のホモログはラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８０，９０９−９１７，１９９５）。
【００１２】
この報告によれば、ラットジャグドのｍＲＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャグド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチを強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジャグドが作用しないことが見いだされている。
しかしながら、これらいずれの実験結果も本願で使用したリガンドタンパク質を用いた実験では行われてはいない。
また、下記に示した本発明者らによりリガンド血液細胞における作用も示されているが、神経細胞、筋肉系細胞、血液細胞以外に対するノッチリガンドタンパクの作用は不明であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
いままで知られていなかった血管細胞に作用する分子を提供し、血管細胞の異常などによって引き起こされる各種疾患の治療効果を有する薬剤を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはノッチリガンドをヒトに臨床応用する際、既知のニワトリ型，アフリカツメガエル型などの異種の動物種のものでは、種特異性や抗原性の問題が生じるため、未だ報告のないヒト型のノッチリガンドを取得することは不可欠であると考え、ヒトデルタ−１の分子の遺伝子クローニング、リコンビナントタンパク質製造方法並びに精製方法を確立し、ついで血液未分化細胞に対する作用を解明し既に国際特許出願を行った。（ＰＣＴ／ＪＰ９６／０３３５６）
これらの分子の遺伝子取得並びにリコンビナントタンパクの作製は上記の出願及び参考例に従って得ることができる。
【００１５】
さらに本発明者らは、ノッチリガンドが神経芽細胞、筋芽細胞、血液細胞の分化制御のみならず他の細胞の増殖・分化を制御するとの仮説を立て、数多くの細胞に対するノッチリガンドポリペプチドの作用を細胞の増殖並びに分化に対する作用を解析した。その結果、血管細胞の増殖に対して抑制的な作用を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は少なくとも配列表の配列番号１、２、および３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる血管細胞調節剤に関し、さらに血管細胞が血管内皮細胞であるこれら血管細胞調節剤に関するものであり、また前述の血管新生に関係した各種疾患に治療効果を有した薬剤に関するものである。
【００１６】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明において血管細胞とは血管を構成する細胞である血管内皮細胞、血管平滑筋細胞を意味する。また、血管細胞調節剤とは血管細胞の増殖並びに分化を抑制もしくは促進する作用を有する薬剤を意味する。この中には血管細胞増殖抑制剤、分化抑制剤、増殖促進剤、分化促進剤などが含まれる。
【００１７】
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集した  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは少なくとも配列表の配列番号１、２、および３からのアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変体も、配列表の配列番号１、２、および３からのポリペプチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規化合物に含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｅｔｔらの出願（国際公開番号ＷＯ９６／２６４５）などに詳しく記載されており、これらを参考にして作製することができる。
【００１９】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列は本発明のヒトデルター１のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまでのアミノ酸配列であり、配列番号３に示した本発明のヒトデルター１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から２００番に相当している。配列番号２のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター１のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号３に示した本発明のヒトデルター１成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から５２０番に相当している。配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター１の成熟型全長アミノ酸配列である。
【００２０】
また、配列番号４の配列は本発明のヒトデルター１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末と呼称する）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末と呼称する）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
ヒトデルター１のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトデルター１の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列に示す７２３アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１番のセリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のセリンから５２０番グリシンにあたる５２０アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の５２１番のプロリンから５５２番のロイシンにあたる３２アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の５５３番のグルタミンから７０２番のバリンにあたる１５０アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
【００２１】
ノッチのリガンドホモログは進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルター１とヒト以外の種のデルタホモログとの比較により、ヒトデルター１のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１５８番のシステインから２００番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は８回繰り返して存在し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２０５番システインから２３３番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２３６番システインから２６４番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２７１番システインから３０４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３１１番システインから３４２番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３４９番システインから３８１番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は３８８番システインから４１９番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２６番システインから４５７番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６４番システインから４９５番システインに該当した。
【００２２】
ヒトデルター１のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の４５６番のアスパラギン残基が挙がられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号１、２または３の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
【００２３】
ショウジョウバエノッチおよびそのリガンドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチのリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている（特表平７−５０３１２１号公報）。このことから、少なくともヒトデルター１のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号１に示した新規アミノ酸配列であることがわかる。
【００２４】
尚、本発明のヒトデルター１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２８。
【００２５】
上記のヒトデルター１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデルター１の発現、精製には多数の方法が成書によって知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓ，１９９０．および横田ら、バイオマニュアルシリーズ４, 遺伝子導入と発現・解析法, 羊土社、１９９４）。すなわち、分離した該ヒトデルター１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることができる。
【００２６】
本発明のヒトデルター１を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
【００２７】
本発明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。
【００２８】
本発明のポリペプチドを発現させるとき、配列表の配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもできる。
【００２９】
ヒトデルター１に関して本発明者らは参考例３に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すなわち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号５）を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号ＷＯ９４／０２０３５に記載されている）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、日本国東京医科歯科大学丸山より入手可能）に各々別々につなぎ、ヒトデルター１の細胞外部分発現ベクターを作製した。
【００３０】
また、ヒトデルター１の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、４）配列表の配列番号３の１番から７０２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および５）配列表の配列番号３の１番から７０２番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質コードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトデルター１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトデルター１をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
【００３１】
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
参考例４に示したごとく、上記の１）〜５）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導入し、ヒトデルター１をＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒトデルター１ポリペプチドを製造することができる。
【００３２】
参考例５に示したごとく、上記の様な培養物からヒトデルター１ポリペプチドを分離精製することができる。また、一般的には下記の方法により行うことができる。
すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合には、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
【００３３】
このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒトデルター１は公知のタンパク質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合には、それら機知抗原エピトープに対する抗体を用いたイムノアッセイで検出して精製を進めることができる。また、このような融合タンパク質として発現させない場合には、参考例６に記載した抗体を用いて検出することができる。
ヒトデルター１を特異的に認識する抗体は参考例６に示したように作製することができる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することができる。このように作製された抗体はヒトデルター１の精製に利用できる。
【００３４】
精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。この際に用いる抗体としては参考例６に記載した抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合には、参考例５に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いることができる。
このようにして作製されたヒト型ノッチリガンド蛋白質の生理作用について、増殖・分化に関わる細胞、すなわち神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮膚未分化細胞、血管細胞、血液未分化細胞、免疫未分化細胞など、多数の細胞を用いて探索した結果、実施例１に示したように、増殖因子存在下での培養へのヒトデルター１のＩｇＧキメラ蛋白質の添加により、ヒト血管内皮細胞の増殖を有意に抑制する活性を有していることを見いだし、本発明に到達した。
【００３５】
またさらに、ヒトデルター１に関しては血管内皮細胞に対する作用は全く知られておらず、本発明者らによって初めて明らかにされた知見である。
さらに本発明のポリペプチドの毒性については、いずれも１０ｍｇ／Ｋｇをマウスに腹腔内投与したが、マウスの死亡例は確認されず、本発明が有効な医薬品となることを明らかにし、実施例２において薬剤の具体的な作製を行った。したがって本発明分子を含む薬剤は、血管新生に関係した病態の治療および予防剤として、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体、賦形剤などと混合した医薬組成物〔例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル，マイクロカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤〕として経口的もしくは非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、投与ルート、症状などによっても異なるが、たとえば、成人には、１日あたり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度である。
【００３６】
以上の結果から本発明の血管細胞調節剤は表１に示した各種疾患にとって有効な薬剤と成る。したがって、本発明には表１に示した各種疾患を対象とした配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、更に配列番号２、３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有して成る血管細胞調節剤も含まれる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明をより詳細に記述するために、参考例並びに実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの例のみに限定されるものではない。
参考例１
ヒトデルター１プライマーによるＰＣＲ産物のクローニングおよび塩基配列の決定
Ｃ−デルター１およびＸ−デルター１に保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＤＬＴＳ１（配列表の配列番号６に記載）及びアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（配列表の配列番号７に記載）を用いた。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としては米国アプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。
【００３８】
次に、核酸及びりん酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。
【００３９】
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチ  ン）５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）４μｌ、前述の脊椎動物デルタホモログに特異的なセンスプライマーＤＬＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００４０】
ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（米国ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて作成した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にてデルタプライマーによるＰＣＲ産物の約４００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
【００４１】
ベクターとしてｐＣＲＩＩ  Ｖｅｃｔｏｒ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩＩと示す）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲＩＩを大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に遺伝子導入し、アンピシリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（日本国宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約４００ｂｐのＤＮＡが切れ出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を米国アプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ｓ）にて決定した。
【００４２】
参考例２
新規ヒトデルター１遺伝子の全長クローニングおよびその解析
ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１にｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からプラークハイブリダイゼ−ションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6 相当のプラークから行った。  出現したプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ+ ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  りん酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ  ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトデルター１プローブにてスクリーニングを行った。
【００４３】
放射性同位元素32Ｐにて標識された参考例１で作製されたＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、遺伝子配列が決定されたヒトデルター１プライマーによる精製ＰＣＲ産物（約４００ｂｐ）が組み込まれたｐＣＲＩＩより、ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
【００４４】
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうした後、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。
【００４５】
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
【００４６】
単離されたファージクローンは７クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9 ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７の３クローンは共に配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から２２４４番の配列を含むクローンであり、Ｄ４のクローンは配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９９９番から２６６３番を含むクローンであった。Ｄ５とＤ４の２クローンはキロシークエンス用デリションキット（日本国宝酒造社製）を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
さらに配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１２１４番にあるＸｈｏＩサイトを利用し、Ｄ４とＤ５を制限酵素ＸｈｏＩによって消化して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ−１を作製した。
【００４７】
参考例３
ヒトデルター１発現ベクターの作製
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター１蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ  ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
１）分泌型ヒトデルター１蛋白質（ＨＤＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
【００４８】
ヒトデルター１の発現ベクターを作製するにあたって、遺伝子産物のより安定的に発現させるために、開始コドン（配列表の配列番号４の遺伝子配列の１７９番）の５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列、ヒトデルター１の全長のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＤｅｌー１をテンプレートとし、配列表の配列番号８及び配列番号９の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作成した。以下このプラスミドをｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａと示す。
【００４９】
次に、このｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１０及び配列番号１１の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１６００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸと命名した。
【００５０】
２）分泌型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
【００５１】
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１２及び配列番号１１の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＦＬＡＧと命名した。
【００５２】
３）分泌型ヒトデルター１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号１３の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素ＸｂａＩサイトのついた配列表の配列番号１４の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、およそ１．４ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）で処理をして、同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ４  ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。
【００５３】
その後、このプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列が確かにヒトＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ９１−３２４２，１９９１を参照のこと）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。
次に、該ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加するために、配列表の配列番号１５と配列番号１６のオリゴヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイトの付加を行った。
【００５４】
このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルター１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３０００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＩｇと命名した。
【００５５】
４）全長型ヒトデルター１の蛋白質（ＨＤＦ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号３の７０２番目のＶａｌの後に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１７及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦと命名した。
【００５６】
５）全長型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
【００５７】
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号１９及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。
このベクターからヒトデルター１の全長をコードするＤＮＡを大腸菌ベクターｐＵＣ１９にクローニングして全長ヒトデルター１をコードするベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを作製した。
次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦＬＡＧと命名した。
【００５８】
参考例４
各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
参考例３で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺  伝子導入の当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＰＢＳ（−）に１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる  ようにして細胞を調製した。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
【００５９】
その翌日、培養上清を除去し、ディッシュに付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、発現ベクターｐＨＤＥＸ、ｐＨＤＥＸＦＬＡＧ、ｐＨＤＥＸＩｇ、ｐＨＳＥＸの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファーをＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、細胞培養上清を得た。
【００６０】
また、ｐＨＤＦおよびｐＨＤＦＬＡＧの場合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわち、２×１０６個の細胞をセルリシスバッファー（５０  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％  グリセロール、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ  ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を取り細胞破砕物を得た。
こうして得られたサンプルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発現を確認した。
【００６１】
すなわち、濃縮した培養上清もしくは細胞破砕物を日本国ＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
【００６２】
このように作製されたフィルターをブロックエース（日本国大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）に４℃一晩振盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書に従い、目的の蛋白質がヒトデルター１由来の場合には１次抗体として参考例６に記載した抗ヒトデルター１マウスモノクローナル抗体を用い、ＦＬＡＧキメラの場合は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
【００６３】
抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。
その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤＥＸとｐＨＤＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約６５ｋダルトン、ｐＨＤＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約９５ｋダルトン、ｐＨＤＦ、ｐＨＤＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダルトンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプルはｐＨＤＥＸＩｇを導入した場合、１２０ｋから２００ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約１８０ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
【００６４】
この実験では、コントロールとしてｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルター１マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。
以上の結果から、これら５種の発現ベクターはいずれも目的のポリペプチドを生産することができた。
【００６５】
参考例５
遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルター１蛋白質の精製
参考例４の方法で発現が検出されたＨＤＥＸＦＬＡＧおよびＨＤＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラムによって各々のキメラ蛋白質を精製した。
ＨＤＥＸＦＬＡＧに関しては、参考例４に記載した方法によって取得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チューブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、各々の画分を中和した。
【００６６】
上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキメラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは参考例４に記載の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果として、ＨＳＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバンドが検出され、この分子量は抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＦＬＡＧとも一致した。この結果からＨＤＥＸＦＬＡＧの純品が精製された。
【００６７】
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースカラムに吸着させ、溶出画分を分取した。
ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒトＩｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＩｇとも一致した。この結果からＨＤＥＸＩｇの純品が精製された。
【００６８】
参考例６
ヒトデルター１を認識する抗体作成
参考例５に記載の方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１ウサギポリクローナル抗体を精製して作製した。
また、参考例５に記載した方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上記のように精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを各々にＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトデルター１の細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルター１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
【００６９】
このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ  ＴｒａｐＧ  ＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１モノクローナル抗体を精製し作製した。
このモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。このゲルの２ｍｌを２ｃｍ×１ｃｍのサイズのカラムを作製した。
【００７０】
抗ヒトデルター１モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してはｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。
さらに参考例５に記載の方法に従って、精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結果、ｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約６５ｋダルトンのＨＤＥＸが精製されていることが確認され、アフィニティーカラムでヒトデルター１が精製可能であることが明らかとなった。
【００７１】
実施例１
ヒトノッチリガンドの血管内皮細胞増殖に及ぼす変化
血管内皮細胞は、日本国クラボウ社製の正常ヒト大動脈血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養の継代時に組織培養用９６ウェルプレート（米国ファルコン社製）に５０００細胞数／ウェルずつ蒔き、日本国クラボウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ，ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各々含有する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その際、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトノッチリガンドのヒトデルター１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。尚、対照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加蛋白質無しの条件で培養を行った。培養は３７℃，５％炭酸ガス，１００％湿度雰囲気下で３日間行った後、細胞を計数した。
【００７２】
血管内皮細胞の計数は、ＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ（３−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セットを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定した。その結果を図１に示す。図１の（ａ）は大動脈血管内皮細胞の場合であり、（ｂ）は肺動脈血管内皮細胞の場合である。縦軸には添加した蛋白質別に各カラムの種類を示し、横軸は５４０ｎｍの吸光度の値を示す。これらの結果から、ＨＤＥＸＩｇは、比較区に対して有意に血管内皮細胞の増殖を抑制することがわかった。
【００７３】
実施例２
薬剤の作製
参考例５及び６において作製した各種ポリペプチド１ｍｇに対して人血清アルブミン（ミドリ十字社製）５ｍｇとなるように１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．２２μｍの滅菌フィルターにて濾過滅菌後、バイアル瓶に分注して凍結乾燥して作製した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のノッチリガンド分子は血管細胞にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使用が可能である。
【配列表】
【００７５】
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0003989589.tif 000004
【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明分子の血管内皮細胞の増殖抑制を示すヒストグラムである。
【図１】
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