(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的ポリペプチドの製造方法において、
（１）保護ポリペプチド及び目的ポリペプチドを含んでなる融合蛋白質〔ここで、当該融合蛋白質は、式（１）A-L-B、又は式（２）A-L-B-L-Cで示され、Ａ及びＣは保護ポリペプチド、Ｂは目的ポリペプチド、Ｌは大腸菌内在性OmpTプロテアーゼが特異的に認識する部位を有するリンカーペプチドを示す〕をコードする遺伝子を有する発現ベクターにより大腸菌を形質転換し；
（２）前記形質転換された大腸菌を培養して前記遺伝子を発現させ、これにより封入体を構成する不溶性融合蛋白質を生成せしめ；
（３）前記培養後に大腸菌を破砕して前記封入体を分離した後、当該封入体を構成する不溶性融合蛋白質を変性剤により可溶化し；そして
（４）前記融合蛋白質から、前記封入体の分離操作により当該封入体の画分中に存在する前記破砕された大腸菌内在性OmpTプロテアーゼにより、前記リンカーペプチドＬの領域で切断して、前記目的ポリペプチドを切り出す；
ことを含んでなる目的ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記の切断を、前記変性剤の濃度を下げることにより生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合蛋白質を可溶化する変性剤が、尿素、塩酸グアニジンまたは界面活性剤である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記融合蛋白質を可溶化する変性剤が尿素であり、当該尿素の濃度が１〜６Ｍである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記リンカーペプチドが、１乃至２塩基性アミノ酸対を当該リンカーペプチド中に含み、且つ当該リンカーペプチドが２〜50のアミノ酸残基からなるペプチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカーペプチドが、１乃至２塩基性アミノ酸対を当該リンカーペプチドのＮ末端部及び／又はＣ末端部に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リンカーペプチドが、アミノ酸配列RLYRRHHRWGRSGSPLRAHE（配列番号：１）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記保護ポリペプチドが、大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチド及び／又はトランスポゾン903由来のアミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ由来ポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記保護ポリペプチドＡが、大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチドであり、保護ポリペプチドＣがトランスポゾン903由来のアミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ由来ポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
目的ポリペプチドが活性型となるようにリフォールディングを生じさせる工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
変性剤存在下でOmpTプロテアーゼにより切断された目的ポリペプチドを、当該変性剤の濃度を下げることによりリフォールディングを生じさせ、活性型の目的ポリペプチドを得る、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的ポリペプチドが、20〜800のアミノ酸残基からなる、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生理活性ポリペプチドが、モチリン、グルカゴン、副腎皮質ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、セクレチン、成長ホルモン、インシュリン、成長ホルモン分泌ホルモン、パゾプレッシン、オキシトシン、ガストリン、グルカゴン様ペプチド（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド（GLP-2）、グルカゴン様ペプチド（7-36アミド）、コレシストキニン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（vasoactive intestinal polypeptide ；VIP ）、下垂体アデノレートサイクラーゼ活性化ポリペプチド（Pituitary adenolate cyclase activating polypeptide）、ガストリン放出ホルモン、ガラニン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（PTH、PTH(1-34)、PTH(1-84)）、ペプチド・ヒスチジン・イソロイシン（peptide histidine isoleucine；PHI ）、ニューロペプチドＹ（neuropeptide Y）、ペプチドＹＹ（peptide YY）、パンクレアチック・ポリペプチド（pancreatic polypeptide）、ソマトスタチン、TGF−α、TGF−β、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、リラキシン、プロラクチン、利尿性ペプチド、アンジオテンシン、脳由来神経栄養因子（BDNF）、又はKEX2エンドプロテアーゼである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記利尿性ペプチドがANP、BNP又はCNPである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的ポリペプチドが酵素である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が蛋白質分解酵素である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記蛋白質分解酵素がKEX2エンドプロテアーゼ又は当該プロテアーゼ誘導体である請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛋白質分解酵素が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ又は当該プロテアーゼ誘導体である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ誘導体が、配列番号：７の125位のValから336位のAspまでのアミノ酸配列、或いは配列番号：22、23又は24に記載されるアミノ酸配列からなる誘導体である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子組換え技術を用いた目的ポリペプチドの製造方法であって、以下の工程；
（１）融合蛋白質が保護ポリペプチド、目的ポリペプチド及びリンカーペプチドからなり、当該保護ポリペプチドが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチド及び／又はトランスポゾン903由来のアミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ由来ポリペプチドであり、当該目的ポリペプチドがスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ誘導体であり、当該保護ポリペプチドと当該目的ポリペプチドの間の当該リンカーペプチド領域が大腸菌の外膜に存在する内在性OmpTプロテアーゼにより特異的に認識される部位を有するリンカーペプチド領域である、当該融合蛋白質をコードする遺伝子を有する発現ベクターにより大腸菌を形質転換し、
（２）前記遺伝子を大腸菌内で発現させることにより、封入体を構成する不溶性の融合蛋白質を生成せしめ、前記スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ誘導体が当該封入体中で不活性型の状態にあり、
（３）当該菌体を破砕し、当該融合蛋白質を分離した後、菌体内在性プロテアーゼである大腸菌OmpTプロテアーゼと当該融合蛋白質が存在する画分を得、
（４）当該融合蛋白質を変性剤により可溶化し、
（５）可溶化後、大腸菌OmpTプロテアーゼの活性が発現する状態まで変性剤の濃度を下げて、上記リンカーペプチド領域を当該プロテアーゼで切断することにより目的ポリペプチドを融合蛋白質より得る工程、
を含んでなる、目的ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
前記融合蛋白質を可溶化する変性剤が、尿素、塩酸グアニジンまたは界面活性剤である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記融合蛋白質を可溶化する変性剤が尿素であり、当該尿素の濃度が１〜８Ｍである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記大腸菌OmpTプロテアーゼによるプロセッシング工程時の尿素濃度が４Ｍである、請求項21〜23のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーペプチドが、２塩基性アミノ酸対を当該リンカーペプチドのＮ末端及びＣ末端、または当該リンカーペプチド中に含み、且つ当該リンカーペプチドが２〜50のアミノ酸残基からなるペプチドである、請求項21〜24のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記リンカーペプチドが、アミノ酸配列RLYRRHHRWGRSGSPLRAHE（配列番号：１）を有する、請求項21〜25のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的ポリペプチドが、配列番号：７の125位のValから336位のAspまでのアミノ酸配列、或いは配列番号：22、23又は24に記載されるアミノ酸配列からなるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ誘導体の何れかである、請求項21〜26のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
目的ポリペプチドが活性型となるようにリフォールディングを生じさせる工程を更に含んでなる、請求項21〜27のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた目的ポリペプチドの製造方法に関する。好ましくは、目的ポリペプチドは生理活性ポリペプチドであり、例えばプロテアーゼのごとき酵素である。一例として、目的ポリペプチドがスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ誘導体である当該ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
さらに具体的な一例としては、大腸菌発現系を用いてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8株由来のＶ８プロテアーゼ誘導体を不溶性の融合蛋白として発現させ、変性剤の存在下に大腸菌由来の内在性のompTプロテアーゼにより、当該融合蛋白からＶ８プロテアーゼ誘導体を切断し、必要であればリフォールディングを経て、活性型のＶ８プロテアーゼ誘導体を製造する方法である。
【０００３】
【従来の技術】
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（以下Ｓ．アウレウス（S. aureus））V8プロテアーゼはS. aureus  V8株が培地中に分泌するセリンプロテアーゼの一種である。この酵素は、１９７２年にDrapeau, G. R.等によりS. aureus  V8株の培地中に分泌されるグルタミン酸およびアスパラギン酸のＣ末端側を特異的に切断するセリンプロテアーゼの一種として単離精製され（Jean Houmard and Gabriel R. Drapeu (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3506-3509）、１９８７年にはCynthia Carmona 等により本酵素のDNA 塩基配列が明らかになっている（Cynthia Carmona and Gregory L. Gray (1987) Nucleic  Acids Res. 15, 6757)。
【０００４】
本酵素は３３６個のアミノ酸残基からなる前駆体として発現されたのちＮ末端から６８個のプレプロ配列が除去され成熟蛋白として分泌されると考えられている。さらに、本酵素にはそのＣ末端領域（アミノ酸番号２２１ー２５６）にプロリン−アスパラギン酸−アスパラギンのリピート（繰り返し）配列が存在していることが知られている。この繰り返し配列が酵素活性に必要であるか否かについては不明であり、Gray等はこの酵素が分泌される前に不活性型の酵素として存在する際に機能しているのではないかと考えている。
【０００５】
酵素としての機能解析は不十分であるにもかかわらず、本酵素はグルタミン酸およびアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断することから、蛋白質のアミノ酸配列の決定に汎用されている。また本酵素は尿素存在下（２Ｍ程度）でも基質に作用することから遺伝子組換え技術で不溶性の融合蛋白として菌体内に大量に発現させた融合蛋白を尿素で可溶化した後、本酵素を作用させて目的ペプチドを融合蛋白から遊離させる工程にも使用されている。
【０００６】
本発明者等はヒトカルシトニンの遺伝子組換え法による製造に上に述べた方法を用い効率良くヒトカルシトニンの製造に成功している（特開平５−３２８９９２）。またヒトグルカゴンを大腸菌発現系で融合蛋白として発現させた例においても、S. aureus V8プロテアーゼが融合蛋白からヒトグルカゴンの切り出しに使用されている（Kazumasa Yosikawa et al. (1992) Journal of Protein Chemistry, 11, 517-525 ）。
【０００７】
このように本酵素は非常に多くの研究また遺伝子組換えによるペプチドの製造に用いられているにもかかわらず、S. aureus V8株の培養液から精製されているため、（１）微量に他のプロテアーゼが混在していること、（２）病原菌と考えられる菌から精製を行なわなければならないこと、（３）高価であること、が問題点としてあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は目的のポリペプチド、例えばS. aureus V8プロテアーゼの大量生産を目的とする。高純度の目的ポリペプチド、例えばS. aureus V8プロテアーゼを製造することは研究上および産業上非常に有用であり、当該ポリペプチドの大量の工業的製造が非常に望まれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的を達成するためには、目的ポリペプチドをコードする遺伝子、例えばS. aureus V8株よりS. aureus V8プロテアーゼの遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術を用いて安全な宿主細胞、例えば大腸菌を使用することにより、大量に、しかも安価に当該ポリペプチド、例えば酵素を生産・精製することが必要である。
【００１０】
一般に、遺伝子工学的方法により目的とするポリペプチド又は蛋白を製造するには、宿主により生産されたポリペプチドが宿主の生存や増殖、さらには目的ポリペプチド又は蛋白質の発現に悪影響を与えないようにするため、さらには発現された目的ポリペプチド又は蛋白質の単離・精製を容易にするために、目的ポリペプチド又は蛋白質を融合蛋白質として生成せしめ、それを不溶性の封入体として宿主細胞中に蓄積させることが好ましい場合がある。
【００１１】
しかしながら、目的とするポリペプチド又は蛋白質を含む融合蛋白質が必ずしも常に封入体を形成するとは限らない。このため、本発明の１つの態様においては、目的ポリペプチド又は蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として発現せしめ、封入体として宿主細胞中に蓄積せしめる。宿主細胞が生来的に有するプロテアーゼは封入体に対に作用することができないが、封入体を単離し、溶解した後には、封入体に随伴している宿主由来のプロテアーゼが融合蛋白質に作用しこれを開裂せしめ、目的ポリペプチド又は蛋白質を遊離せしめることができる。こうして、本発明によれば、目的ポリペプチド又は蛋白質を効率的に製造することができる。
【００１２】
しかしながら、目的ポリペプチド又は蛋白質を常法に従って融合蛋白質にした場合、該融合蛋白質が封入体を形成するとは限らない。この様な場合、本発明においては、目的ポリペプチド又は蛋白質のＮ末端側とＣ末端側に保護ペプチドを連結することによって融合蛋白質を形成することにより封入体を形成せしめる。
そこで、本発明においては、遺伝子工学的手法を用い大腸菌発現系でS. aureus V8プロテアーゼを大量にしかも純度良く効率的に製造する方法を具体例として記載する。
【００１３】
まず、本発明者らはS. aureus V8プロテアーゼを大量に大腸菌発現系を用いて生産させるには酵素活性を持たない融合蛋白法による発現方法が適切であると考えた。なぜなら本酵素は蛋白質分解酵素であるため菌体内に直接本酵素を発現させると大腸菌蛋白を分解してしまい菌の増殖が停止し大量にS. aureus V8プロテアーゼを得ることが出来ないと考えられるからである。
従って、酵素活性のない融合蛋白として発現させ、その後融合蛋白から他のプロテアーゼを用いてS. aureus V8プロテアーゼ部分を切り出し、活性の発現に必要な場合はリフォールディングを行ない、活性型のS. aureus V8プロテアーゼを精製することを考えた。
【００１４】
さらにこの融合蛋白からの切り出しに用いる他のプロテアーゼとして、本発明者らは大腸菌の外膜に存在すると考えられるompTプロテアーゼの利用を考えた。安価にS. aureus V8プロテアーゼを製造するのに新たに他の酵素を添加することはコストの面で非常に不利と考えられるからである。
ompTプロテアーゼを利用した大腸菌による生産は、（１）製造プロセスが簡単である、（２）他のプロテアーゼを新たに反応系に添加する必要がなく、コストが安くなる、（３）大腸菌発現系で生産した各種の融合蛋白を大腸菌を宿主として生産したＶ８プロテアーゼで切断する際にはＶ８プロテアーゼに混入する恐れのあるＶ８プロテアーゼ生産宿主由来蛋白（市販Ｖ８プロテアーゼではS. aureus 由来蛋白）の混入を考えなくてよい、等の面からも非常に有利であることは言うまでもない。
【００１５】
大腸菌ompTプロテアーゼは大腸菌外膜画分に存在し塩基性アミノ酸対の間を選択的に切断するプロテアーゼである（Keijiro Sugimura and Tatsuro Nishihara (1988) J. Bacteriol. 170, 5625-5632）。Sugimura等はompTプロテアーゼを精製し、50 mM リン酸緩衝液（pH6.0 ）を用い２５℃３０分間の反応条件で様々なペプチドをompTプロテアーゼで切断し、アルギニンーアルギニン、リジンーリジン、アルギニン−リジンおよびリジン−アルギニンの塩基性アミノ酸対の間を切断する酵素であることを報告している。
【００１６】
しかし、尿素存在下（２Ｍ以上の尿素濃度）でompTプロテアーゼが活性を持つかどうかについては言及していない。ompTプロテアーゼは外膜に存在することから大腸菌体内で封入体としてS. aureus V8プロテアーゼを生産させた後、菌体破砕後封入体を含む不溶性画分を遠心操作で分離すると沈殿画分にこのompTプロテアーゼも共沈することが考えられる。
【００１７】
このようにして得られた沈殿画分に尿素を加えS. aureus V8プロテアーゼの融合蛋白を可溶化させる。この条件下でompTプロテアーゼの活性が保持できているならば、融合蛋白からS. aureus V8プロテアーゼの切り出しにompTプロテアーゼが利用できるのではないか、さらに切り出されたS. aureus V8プロテアーゼを活性型に変換するためにリフォールディングを行なえばS. aureus V8プロテアーゼが大量に簡単なプロセスで生産できるのではないかということが考えられた。
【００１８】
以下、本発明を説明する。
S. aureus V ８プロテアーゼ遺伝子の遺伝子配列から成熟蛋白のＮ末端側には分泌に必要なシグナル配列（プレ配列）および機能不明なプロ配列が存在し、Ｃ末端には前述のリピート配列が存在することが報告されている。そこで成熟蛋白のＮ末端からＣ末端までの遺伝子I の調製、および成熟蛋白のＣ末端側にある機能不明なリピート配列を欠失した遺伝子IIの調製を行なった。
この機能不明な繰り返し配列が酵素活性に必要かどうかはわからないが、もし必要でないならば融合蛋白の分子量を下げることは細胞あたりの発現蛋白の分子数を上げることができ、発現蛋白量を増加させることが可能になると考えた。
【００１９】
そこで、Staphylococcus aureus V8株（ATCC27733 ）から染色体DNA を分離し、ＰＣＲを行ない２種類のＶ８プロテアーゼ誘導体遺伝子I 、IIを調製した。これらの誘導体の発現を行なうために大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体を融合蛋白の保護ペプチドとした発現プラスミドpV8RPT(+) およびpV8RPT(-) を作製した。これらの発現プラスミドでは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体蛋白遺伝子とＶ８プロテアーゼ誘導体遺伝子（I またはII）の間のリンカーペプチド遺伝子としてompTプロテアーゼの認識切断アミノ酸配列であるアルギニンーアルギニン残基を含むリンカー遺伝子（例えばＲ６リンカー遺伝子）を挿入した融合蛋白をラクトースプロモーターの支配下に発現する。
【００２０】
このようにデザインされた融合蛋白では、不溶性の融合蛋白としてＶ８プロテアーゼ誘導体を発現させた後、尿素を用いて融合蛋白を可溶化し、尿素濃度を下げればompTプロテアーゼが融合蛋白を切断し、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体蛋白とＶ８プロテアーゼ誘導体蛋白を分離できると考えられたからである。
以上のようにデザインされた発現プラスミドを作製し、大腸菌JM101 を宿主としてIPTG（イソプロピルーβ−D-チオーガラクトピラノシド；以下IPTG）を用いて発現誘導させたところ、２種類の融合蛋白質はともに不溶性にならずに菌体破砕後その上清画分に酵素活性が認められた。
【００２１】
一方、発現誘導後菌体の増殖は著しく低下していた。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による解析では菌体内蛋白が、発現したＶ８プロテアーゼ誘導体の酵素活性により分解されていることが明らかになった。従って、この大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とＶ８プロテアーゼ誘導体との融合蛋白発現法は、（１）発現蛋白が酵素活性を持ち宿主の増殖阻害を引き起こすこと、さらに（２）融合蛋白の発現量も非常に低いことからＶ８プロテアーゼ誘導体の生産方法としては適していないことが明らかになった。
【００２２】
但し、これらの結果から、（１）Ｎ末端側のプロ配列はＶ８プロテアーゼのフォールディングに関与していない可能性があること、及び、（２）Ｃ末端のリピート配列を持たないタイプのＶ８プロテアーゼ誘導体IIにおいても活性があることから、このリピート配列はＶ８プロテアーゼ酵素活性には必要ない可能性が考えられた。
次に、本発明者等はＶ８プロテアーゼを大腸菌発現系で不溶性の融合蛋白として発現させ、その後尿素による可溶化をおこない蛋白分解酵素を用い尿素存在下に融合蛋白からＶ８プロテアーゼ部分を遊離し、リフォールディングを行ない、酵素活性を有するＶ８プロテアーゼを生産するにあたり、以下に述べる作業仮説を設定し実験に着手した。
【００２３】
（１）上述の大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体をＶ８プロテアーゼのＮ末端側に融合させた場合、不溶性の融合蛋白質にはならない。従って、そのような場合は不溶性の融合蛋白質を形成させるために更に保護ペプチドを付加することを考え、当該保護ペプチドとしてトランスポゾン９０３であるカナマイシン耐性遺伝子（Nucleic Acids Res. (1988) 16, 358-358 ）由来のアミノグリコシド３’ーホスホトランスフェラーゼ蛋白を用いることにした。即ち、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体及びＶ８プロテアーゼからなる融合蛋白質のＣ末端にリンカーペプチドを介しさらにアミノグリコシド３’ーホスホトランスフェラーゼ蛋白の一部を付加することにより融合蛋白の不溶化を促進させ、封入体形成を行なうことを考えた。
【００２４】
また、（２）生産された融合蛋白質からＶ８プロテアーゼ部分を酵素的に遊離させるのに前述のＲ６リンカーをＶ８プロテアーゼのＮおよびＣ末端側に配置し、塩基性アミノ酸対の間を切断するompTで切断させることにより融合蛋白からＶ８プロテアーゼを解離させることができるのではないかと考えた。
【００２５】
そこで、以上のような作業仮説を基にして新規発現プラスミドの構築に着手し、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体−Ｖ８プロテアーゼ誘導体にアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部を融合させた融合蛋白を発現するプラスミドpV8Dを作製した。なお、このプラスミドにコードされたＶ８プロテアーゼ誘導体（以下、Ｖ８Ｄ蛋白と記載）は前述のＶ８プロテアーゼ誘導体IIよりＣ末端より８アミノ酸が欠失したものであり、このＶ８ＤのＮ末端側とＣ末端側はＲ６リンカーペプチドを介して大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部と融合されている。
【００２６】
pV8Dを有する大腸菌JM101 を培養し、IPTGによる発現誘導を行なったところ発現した６０キロダルトンの融合蛋白は不溶性の封入体を菌体内に形成していたことがSDS PAGEによる解析から明らかになった。従って、Ｖ８Ｄ蛋白のＣ末端側にアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ蛋白の一部を融合することで不溶性の封入体形成が起こることが明らかになった。
次に、菌体破砕後、遠心操作を行ない封入体を分離し、変性剤を用いて融合蛋白を可溶化する。変性剤としては尿素、塩酸グアニジンまたは界面活性剤等を用いることができる。
【００２７】
本願の実施例では、８Ｍの尿素を用いて封入体を可溶化し、４Ｍ尿素濃度に希釈し、３７℃で２時間インキュベートを行なった。大腸菌の内在性ompTプロテアーゼはこの条件下において融合蛋白を切断し、β−ガラクトシダーゼ誘導体、Ｖ８Ｄ蛋白、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ蛋白の一部にそれぞれ相当する１２KDa,２６KDa および２２KDa のバンドを生成していることがSDS PAGE解析により明らかになった。
【００２８】
一方、ompT欠損変異株であるＷ３１１０Ｍ２５を宿主菌として同様な実験を行なった結果では上記のバンドは検出できず、融合蛋白を特異的に切断しているのは大腸菌内因性のompTであることを明らかになった。さらにompTにより特異的に切断されていることを確認するため、SDS PAGEからＶ８Ｄ蛋白に相当する２６KDa のバンドをSDS PAGEのゲルから切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定したところＲ６リンカーペプチドのアルギニンーアルギニン配列の間で切断が起きていることが確認された。
【００２９】
従って、融合蛋白及び大腸菌内在性のompTプロテアーゼは、遠心操作により生成する沈殿物の封入体画分に存在し、変性剤による可溶化、特に８Ｍ尿素による封入体の可溶化後、４Ｍ尿素存在下でも十分に酵素活性を有し、しかも正確に期待されるアミノ酸配列を切断することができるということが本発明により初めて明らかになった。
尿素存在下で生成されたＶ８プロテアーゼ誘導体蛋白は変性状態にあるために酵素活性は非常に低いと考えられる。そこで、活性の発現のために必要であれば変性剤の濃度を下げることによりＶ８Ｄ蛋白のリフォールディングを行ない、酵素活性のあるＶ８Ｄ蛋白が得られるかどうかを検討した。
【００３０】
ompT切断反応後の試料を０. ４Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７. ５）で２０倍に希釈後、氷中に一夜放置した。この操作によりＶ８Ｄ蛋白は約２０％リフォールディングされ酵素活性の回復が見られた。この操作後のサンプルをSDS −PAGEによる解析を行なうとリフォールディング後にはＶ８Ｄ蛋白が主として存在する蛋白であった。
これはリフォールディング前のサンプルにはβ−ガラクトシダーゼ誘導体、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ蛋白の一部および大腸菌由来蛋白が存在するが、リフォールディング後、プロテアーゼ活性を持ったＶ８Ｄ蛋白が他の混在する蛋白を分解したことによると考えられる。この結果はリフォールディング後にＶ８Ｄ蛋白を精製する際に非常に有利である。
【００３１】
次に、上述の操作により活性型となったＶ８Ｄ蛋白が天然型のS. aureus  V8プロテアーゼと同一な基質認識があるかどうかを検討した。基質（例えば、ヒトカルシトニン前駆体の融合蛋白）にリフォールディングを行なったＶ８Ｄ蛋白および天然型酵素を３０℃、１時間反応させ、酵素により切断された融合蛋白から生じるペプチド断片を高速液体クロマトグラフィーで解析した。その結果、両酵素から生じるペプチド断片は同一の溶出パターンを示し、上述の方法で作製したＶ８Ｄ蛋白は天然型と同じ基質特異性を持つ事が明らかになった。
【００３２】
S. aureus V8プロテアーゼを不溶性の封入体として菌体内に発現させるには、融合蛋白に蛋白分解酵素としての酵素活性がないことが必要であるが、一方、リフォールディングを行なった後は酵素活性を有していなければならない。この一見矛盾する性質がＶ８プロテアーゼ誘導体蛋白に要求される。Ｖ８Ｄ蛋白においては天然型Ｖ８プロテアーゼのＮ末端から２１２番目のアミノ酸までを用い融合蛋白を作製したが、さらにＣ末端側にＶ８プロテアーゼ部分を延ばしアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ蛋白の一部との融合蛋白を作製した場合、封入体形成とリフォールディングによる再活性化が起こるかどうかを検討した。
【００３３】
本発明者らは、上述のＶ８プロテアーゼ誘導体のＣ末端側が２，４，６および８アミノ酸延長した融合蛋白を発現するプラスミド(pV8H, pV8F, pV8A, pV8D2, およびpV8Q）をPCR 法と遺伝子クローニングにより作製した。大腸菌株JM101 にこれらのプラスミドを形質転換し、組換え体を作製した。
得られた菌株を培養しIPTGを用いて発現誘導させたところ、前述のpV8D，pV8HおよびpV8Fのプラスミドを有する菌株のみが融合蛋白の封入体を形成し、さらにompTによる融合蛋白の切断後のリフォールディングにおいても酵素の再活性化が出来た。他の菌株は封入体形成は起こらず、菌体破砕後の可溶性画分にＶ８プロテアーゼ活性が認められた。
【００３４】
従って、Ｖ８プロテアーゼ誘導体蛋白を融合蛋白発現方法で発現させ、封入体を形成させた後、酵素的に切断し、リフォールディングを行なうにはS. aureus Ｖ８プロテアーゼ蛋白のＮ末端から２１５番目のアミノ酸であるフェニルアラニン以前で融合させることが必要であることが明らかになった。
以上、本発明を、目的ポリペプチド又は蛋白質としてＶ８プロテアーゼを例にとって具体的に説明したが、これと同様の原理及び手法を他の目的ポリペプチド又は蛋白質に応用することにより、所望の目的ポリペプチド又は蛋白質を効率よく製造することができる。
【００３５】
従って、本発明は、保護ポリペプチド及び目的ポリペプチドからなる融合蛋白をコードする遺伝子を有する発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、当該遺伝子を発現させ、当該宿主細胞の内在性プロテアーゼにより当該融合蛋白より目的ポリペプチドを切断して得ることを特徴とする目的ポリペプチドの製造方法に関するものである。
【００３６】
更に、本発明は、融合蛋白を式（１）Ａ−Ｌ−Ｂ、又は式（２）Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ｃ（式中、Ａ及びＣは保護ポリペプチド、Ｂは目的ポリペプチド、Ｌは宿主細胞内在性プロテアーゼが特異的に認識する基質を有するリンカーペプチドを示す）のように表すことができるので、当該融合蛋白をリンカーペプチドＬの領域で切断して当該融合蛋白から目的ポリペプチドＢを得ることを特徴とする製造方法に関する。ここで目的ポリペプチドとは、前述のS. aureus V8プロテアーゼに加えて、例えば生理活性ペプチド、例えばモチリン、グルカゴン、副腎皮質ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、セクレチン、成長ホルモン、インシュリン、成長ホルモン分泌ホルモン、パゾプレッシン、オキシトシン、ガストリン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−２）、グルカゴン様ペプチド（７−３６アミド）、コレシストキニン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド (vasoactive intestinal polypeptide ；VIP ）、
【００３７】
下垂体アデノレートサイクラーゼ活性化ポリペプチド（Pituitary adenolate cyclase activating polypeptide）、ガストリン放出ホルモン、ガラニン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ，ＰＴＨ（１−３４）  ＰＴＨ（１−８４））、ペプチド・ヒスチジン・イソロイシン（peptide histidine isoleucine；PHI ）、ニューロペプチドＹ（neuropeptide Y）、ペプチドＹＹ（peptide YY）、パンクレアチック・ポリペプチド（pancreatic polypeptide）、ソマトスタチン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、リラキシン、プロラクチン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（artrial natriuretic peptide ；ANP ）、Ｂ−型利尿ペプチド（B-type natriuretic peptide；BNP ）、Ｃ−型利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；CNP ）、アンジオテンシン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）更に、例えば酵素、例えばＫＥＸ２エンドプロテアーゼなどが挙げられる。
【００３８】
また、本発明における好ましい態様としては、目的ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである場合、好ましくは当該生理活性ポリペプチドが酵素である場合、さらに好ましくは当該酵素が蛋白分解酵素である場合が挙げられる。そして、具体例として最も好ましい態様としては、目的ポリペプチドが蛋白質分解酵素であって、目的ポリペプチドを不活性型の融合蛋白として宿主細胞内に発現させ、当該細胞を破砕し、当該融合蛋白を分離した後、当該融合蛋白を可溶化する変性剤により融合蛋白を可溶化し、その後、リンカーペプチド領域を宿主細胞内在性プロテアーゼで切断することにより目的ポリペプチドを融合蛋白より得る目的ポリペプチドの製造方法が挙げられる。
【００３９】
更にその他の好ましい態様としては、目的ポリペプチドが蛋白質分解酵素である際に、目的ポリペプチドを不活性型の融合蛋白として宿主細胞内に発現させ、当該細胞を破砕し融合蛋白を分離した後、当該融合蛋白を可溶化する変性剤により融合蛋白を可溶化し、その後、宿主細胞由来の内在性プロテアーゼ活性が発現しうる程度にまで当該変性剤の濃度を下げて、リンカーペプチドＬを当該内在性プロテアーゼで切断することにより目的ポリペプチドを融合蛋白より得る目的ポリペプチドの製造方法が挙げられる。上記の場合、何れも宿主細胞由来の内在性プロテアーゼが融合蛋白と菌体破砕後の分離操作において同じ画分に存在することが好ましい。
【００４０】
保護ポリペプチドは、目的ポリペプチドの発現時に当該保護ポリペプチドとの融合蛋白として発現しうるものであれば特に特定されるものではないが、例えば大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチドやトランスポゾン９０３由来のアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ由来ポリペプチド等を挙げることができ、必要であればそれらポリペプチドを組み合わせて保護ポリペプチドとして用いることもできる。
【００４１】
リンカーペプチドは、目的ポリペプチドの発現ベクターを有する宿主細胞の内在性プロテアーゼにより特異的に認識される部位を有するリンカーペプチドであればよい。当該リンカーペプチドの好ましい態様としては、例えば１塩基性アミノ酸残基又は連続した２塩基性アミノ酸残基を有する塩基性アミノ酸対配列を当該リンカーペプチド中に含み、且つ当該リンカーペプチドが２〜５０のアミノ酸残基からなるポリペプチドであることが望ましく、当該塩基性アミノ酸対を当該リンカーペプチドのＮ末端部及び／又はＣ末端部に含む場合であってもよい。
【００４２】
融合蛋白を可溶化する場合の変性剤も特に特定される必要はなく、例えば、尿素、塩酸グアニジン又は界面活性剤等が挙げられる。好ましくは尿素を用いることが挙げられ、この場合の尿素濃度は１−８Ｍであることが望ましい。また、融合蛋白を可溶化した後の尿素濃度は、宿主細胞由来の内在性プロテアーゼ活性が発現しうる程度であれば特に特定されるものではない。
【００４３】
また、本発明は宿主細胞由来の内在性プロテアーゼを用いて融合蛋白より目的ポリペプチドを切断して得ることを特徴とする目的ポリペプチドの製造方法であり、宿主細胞由来の内在性プロテアーゼ及び目的ポリペプチドは特に特定される必要はない。即ち、当該プロテアーゼは、種々の目的ポリペプチドまたは蛋白を不溶性の融合蛋白として発現させた後、当該融合蛋白からの目的ポリペプチドまたは蛋白のプロセッシングに用いることができればよく、例えば蛋白質分解酵素等を挙げることができ、好ましくは、以下の実施例で示すように大腸菌ｏｍｐＴプロテアーゼ等を挙げることができる。また、目的ポリペプチドは２０〜８００のアミノ酸残基からなるポリペプチドであることが好ましく、例えば以下の実施例で示すようにS. aureus V8プロテアーゼ及び／又は当該誘導体等を挙げることができる。
【００４４】
以上の結果、本発明に係る遺伝子組換え技術を用いた目的ポリペプチドの製造方法においては、特にＶ８プロテアーゼ誘導体蛋白を大腸菌発現系で生産できることが明らかになった。即ち、当該目的ポリペプチドの製造方法における好ましい態様としては、以下の製造工程を挙げることができる。即ち、；
【００４５】
（１）融合蛋白が保護ポリペプチド、目的ポリペプチド及びリンカーペプチドからなり、当該保護ポリペプチドが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチド及び／又はトランスポゾン９０３由来のアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ由来ポリペプチドであり、当該目的ポリペプチドがS. aureus V8プロテアーゼ誘導体であり、当該保護ポリペプチドと当該目的ポリペプチドの間の当該リンカーペプチド領域が宿主細胞内在性プロテアーゼにより特異的に認識される基質を有するリンカーペプチド領域である、当該融合蛋白をコードする遺伝子を有する発現ベクターにより宿主細胞である大腸菌を形質転換し、
【００４６】
（２）S. aureus V8プロテアーゼ誘導体が不活性型の状態で当該融合蛋白を大腸菌内で発現させ、
（３）当該菌体を破砕し、当該融合蛋白を分離した後、菌体内在性プロテアーゼである大腸菌ompTプロテアーゼと当該融合蛋白が存在する画分を得、
（４）当該融合蛋白を変性剤により可溶化し、
【００４７】
（５）可溶化後、大腸菌ompTプロテアーゼの活性が発現する状態まで変性剤の濃度を下げて、上記リンカーペプチド領域を当該プロテアーゼで切断することにより目的ポリペプチドを融合蛋白より得る工程、
からなることを特徴とする目的ポリペプチドの製造法を挙げることができ、更に必要であれば、当該目的ポリペプチドが活性型となるようにリフォールディングを生じさせる工程、
が加わることを特徴とする製造法を挙げることができる。
【００４８】
Ｖ８プロテアーゼ誘導体のリフォールディング後、この蛋白質を精製する方法としては、例えばゲル濾過、イオンクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の通常の蛋白の精製操作により、高純度に精製できる。さらに、実施例で示したＶ８プロテアーゼ誘導体に関しては、リフォールディング反応終了時には当該誘導体が反応成分の主要蛋白成分であることから、精製法が非常に容易であることは述べるまでもない。
【００４９】
【実施例】
以下、実施例において本発明を詳述する。
実施例１． S. aureus V8  プロテアーゼ遺伝子の単離
PCR 法により V8 プロテアーゼ遺伝子を単離するため、報告されているDNA 塩基配列に基づき、PCR 法により遺伝子の単離を行った。図1 の(b) に示す配列を持つ３種のPCR プライマーを設計しDNA 合成機（アプライド・バイオシステム社製 392型）により合成した。プライマーI 、IIおよびIII は図１(a) に示すV8プロテアーゼ遺伝子領域に対応し、5'側にはXho I あるいはSal I 制限酵素部位を設けている。
【００５０】
Jayaswal, R. K. ら（J. Bacteriol. 172:5783-5788 (1990)）の方法により単離調製したスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8株（ATCC27733)の染色体とこれらのPCR プライマーを用いてPCR を行った。1.0 μＭのプライマー、１μg の染色体DNA, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgCl2、0.01% ゼラチン、200 μＭのdNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTPの混合物）を含む50μl の反応液に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼを添加し、94℃、1 分、72℃、2 分、55℃、2 分のPCR を30サイクル行った。
【００５１】
その結果、プライマーI とプライマーIIによりプレプロ配列を含まずリピート配列を含む成熟体のV8プロテアーゼ遺伝子（プロテアーゼ遺伝子誘導体 I，0.8kb ) が得られ、プライマーI とプライマーIII により、プレプロ配列およびリピート配列を欠くV8プロテアーゼ遺伝子 (V8プロテアーゼ遺伝子誘導体 II, 0.7kb) が得られた。次に、これらの遺伝子を寒天ゲル電気泳動し、SUPREP-2（宝酒造（株））を用いて精製した後、制限酵素XhoIおよびSalIで切断し、XhoI，SalIの粘着末端をもつV8プロテアーゼ誘導体遺伝子断片 Iおよび II を調製した。
【００５２】
実施例２． 発現ベクターpV8RPT(+) およびpV8RPT(-) の作製並びにV8プロテアーゼ誘導体の発現
本実施例で用いるpG97S4DhCT[G]R6 は、大腸菌βーガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシトニン前駆体(hCT[G])との融合蛋白質を高発現するプラスミドであり、当該プラスミドはプラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より作成することができる（特開平５−３２８９９２、及び図２参照）。プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株はブダペスト条約に基づいて工業技術院生命工学技術研究所にEscherichai coli SBM323 として１９９１年８月８日に寄託されており、受託番号微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０３）が付与されている。
【００５３】
PCR により得られたV8プロテアーゼ遺伝子誘導体 Iおよび II を発現させるため、pG97S4DhCT[G]R6 をXhoIおよびSalIで処理し、ヒトカルシトニン前駆体遺伝子部を欠いたDNA 断片(3.1kb) を寒天ゲル電気泳動により調製した。このDNA 断片と先に得られたXhoI、SalIの粘着末端をもつV8プロテアーゼ遺伝子断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、JM101 に形質転換を行い、V8プロテアーゼ遺伝子誘導体 IがクローニングされたpV8RPT(+) 、およびV8プロテアーゼ遺伝子誘導体 II がクローニングされたpV8RPT(-) を作製した（図３）。
【００５４】
なおプラスミドの宿主菌にはJM101 株（本菌株は、例えば宝酒造（株）、In Vitrogen Catalog No.c660-00等より入手できる）を用いた。これらのプラスミドより発現されるV8プロテアーゼ誘導体とβーガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質のアミノ酸配列を図４に示す。JM101/pV8RPT(+) およびJM101/pV8RPT(-) をそれぞれ100ml のLB培地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプトン、0.5 ％NaCl）を用い37℃でOD660 が1.0 になるまで培養後、イソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度が2mM になるように添加し発現の誘導を行った。添加後さらに2 時間培養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し、OD660 が５となるようにTEバッファー（10mM Tris-HCl  (pH8.0),1mM EDTA ）に懸濁した。
【００５５】
本懸濁液を超音波破砕機（Cellruptor; 東湘電気（株））で破砕後、12000rpm， 5分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清画分を粗酵素液として使用した。V8プロテアーゼの活性測定には合成基質（Z-Phe-Leu-Glu-4-nitranilide ；ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。940 μl の100mM Tris-HCl(pH8.0) 緩衝液に20μl の10mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitranilide溶液（DMSO溶液）を混合後、40μl の粗酵素液を添加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を測定した。測定には日立分光光度計U-3200を使用した。
【００５６】
その結果、JM101/pV8RPT(+) およびJM101/pV8RPT(-) 共に、それらの菌体より調製した粗酵素液には8 μg/mlの酵素活性が認められ、βーガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質の形で、かつプレプロ配列を欠いた状態で活性があることが判明した。またＣ末端リピート配列を欠失しているpV8RPT(-) においても活性が認められたことからこの配列は活性に必須ではないことも判明した。
【００５７】
JM101/pV8RPT(-) およびJM101/pV8RPT(+) が生産するV8プロテアーゼ誘導体Ｉおよび II の生産量は低く、SDS ーポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）でそのバンドが確認できないことから、精製操作が困難である。菌体増殖はIPTGの添加とともに停止すること、かつ誘導をかけた菌は誘導していない菌に比べ高分子量の蛋白質が減少していることを考慮すると、細胞内で発現したV8プロテアーゼ誘導体が菌にとって致死的であることが発現量の低い原因と考えられる。
【００５８】
実施例３． 発現ベクターpV8Dの作製
V8プロテアーゼの場合、前述のようにN 末端側にβ−ガラクトシダーゼ誘導体を融合させた場合においても活性を有していることから、N 末端側のみの融合では不活性体に出来ない。そのためＣ末端側にさらにアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部を融合させV8プロテアーゼを不活化することを試みた。Ｃ末端側の融合にはリピート配列の手前のEcoRV 部位を用いた。
【００５９】
Ｖ８プロテアーゼ誘導体に係るプラスミドpV8Dは図５に示す手順で作製した。pV8RPT(-) よりBgl II-Sal I断片（3.0kb ）およびEcoRV-Bgl II断片（0.7kb ）を調製し、pG97S4DhCT[G]R10より調製したNar I-Sal I 断片（0.2kb ）と連結させることによりpV8hCT[G] を得た。なお、pG97S4DhCT[G]R10は上記のpG97S4DhCT[G]R6 と同様にプラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より作成することができる（特開平５−３２８９９２、及び図２参照）。
【００６０】
次に、得られたpV8hCT[G] のhCT[G]部分（0.1kb BstE II-Sal I 断片）をpUC4K (Vieira, J. and Messing, J., Gene 19, 259 (1982), Pharmacia Ca. No.27-4958-01)のアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子領域を含む0.8kb SmaI-Sal I断片と入れ換えpV8Dを作製した。本プラスミドより発現されるV8プロテアーゼ誘導体の融合蛋白質(V8D融合蛋白質）のアミノ酸配列を図６に示す。
【００６１】
本融合蛋白質は、V8プロテアーゼのＮ末端およびＣ末端にR6リンカー配列を介してβーガラクトシダーゼ誘導体およびアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部がそれぞれ融合された構造をもつ。R6リンカーは以下の配列、即ち、RLYRRHHRWGRSGSPLRAHE（配列番号：１）を有し、当該配列中のRRの中央のペプチド結合が大腸菌のOmpTプロテアーゼにより切断される構造を有している。
【００６２】
実施例４． V8D 融合蛋白質の発現
常法によりｐＶ８Ｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０１（JM101/pV8D）を100ml のLB培地にて37℃でOD660 が0.6 まで培養後、IPTGを最終濃度が2mM になるように添加しV8D 融合蛋白質の生産を誘導した。添加後さらに2 時間培養を続け、その後、遠心分離により菌体を回収した。本菌株の場合、JM101/pV8RPT(+) およびJM101/pV8RPT(-) のように融合蛋白質の発現の誘導と共に菌体増殖が停止する現象はなく、菌体内にはV8プロテアーゼ活性は認められなかった。
【００６３】
また顕微鏡により菌体内には封入体を形成していることが観察された。誘導前後の菌体および菌体を超音波破砕して得られた不溶性画分と可溶性画分の16% SDS-PAGEの結果を図７に示す。誘導後の菌体には60kDa のV8D 融合蛋白質が高発現しており、さらにそれは封入体を形成しているため不溶性画分に存在していることがわかる。
【００６４】
V8プロテアーゼ誘導体のＣ末端側にアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部を融合させたことにより菌体内において本来の立体構造をとれず不活性となり、菌体増殖を阻害しなくなったため、封入体を形成するレベルまで高発現したと考えられた。なお60kDa のV8D 融合蛋白質以外に27kDa の蛋白質も不溶性画分に認められ、この蛋白質をSDS PAGEのゲルより分離しアミノ酸配列を調べたところV8D 融合蛋白質のＮ末端から282 番目のメチオニン以降を含む分解物であることが判明した。
【００６５】
実施例５． V8D 融合蛋白質のOmpTプロテアーゼによるプロセッシング
実施例４に示した培養により得られた菌体を10mlのTEバッファーに懸濁後、超音波処理し菌体を破砕した。その後、遠心分離により封入体を回収した。得られた封入体を再度10mlの脱イオン水に懸濁後、遠心分離することにより封入体の洗浄を行った。OD660 の値が100 となるように封入体を脱イオン水で希釈後、150 μl を採取し1M Tris-HCl(pH8.0)を25μl, 1M ジチオスレイトール（DTT ）を2.5 μl 、および尿素を120mg 加え封入体を溶解した後、500 μl になるように脱イオン水を加え、37℃で2 時間加温した。
【００６６】
図８A は加温前後の16% SDS-PAGEの結果である。加温後の試料には12kDa 、26kDa 、22kDa の分子量をもつ、それぞれβーガラクトシダーゼ誘導体、Ｖ８プロテアーゼ誘導体、アミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部に相当するバンドが出現していることがわかる。
一方図８B はOmpT  プロテアーゼの欠損株W3110 M25 (Sugimura, K.  (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 753-759)  を宿主とし、V8D 融合蛋白質を発現させ、得られた封入体に対し同様の操作を行ったものである。この場合上記の３つのバンドはSDS-PAGE中に検出できないことより、本融合蛋白質のプロセッシングはOmpT  プロテアーゼ ( Sugimura, K. and Nishihara, T. (1988) J. Bacteriol., 170, 5625-5632 )による特異的な切断と判断される。
【００６７】
さらにSDS-PAGEより26kDa のバンドを切り出しN 末端アミノ酸配列を調べたところ、R6配列（RLYRRHHRWGRSGSPLRAHE）（配列番号：１）のRR部分の中央で切断されていることが確認され、融合蛋白質の切断はOmpTプロテアーゼにより特異的に行われていることが確認された。上記の操作は封入体溶解時には８Ｍ尿素、プロセッシング時には４Ｍ尿素の存在化で行われており、以上の結果により、OmpTプロテアーゼがこのような高濃度の尿素に対して耐性を持ち、封入体より溶解された融合蛋白質を特異的に切断出来ることが初めて示された。
【００６８】
実施例６． 組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) のリフォールディング
プロセッシング処理後の試料を0.4Mリン酸カリウムバッファー（pH7.5 ）で20倍希釈し、氷中に一晩放置した。この操作により組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) がリフォールディングし、前述の方法に従い測定したところ30μg/mlに相当する活性が得られた。なおリフォールディングの効率は約20％であった。図９はリフォールディング操作前後の16% SDS-PAGEの結果である。
【００６９】
組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) がリフォールディングした際、強力なプロテアーゼとして働くことによりβーガラクトシダーゼ誘導体、アミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ由来の蛋白、およびその他の大腸菌由来の蛋白質は分解を受けるためそれらの蛋白質のバンドは消失する。従ってリフォールディング操作を施した後の試料は組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) のみが主要な蛋白質として残り、後の精製操作の大幅な軽減が期待できる。
このようにして得られた組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) は遺伝子の構築上、天然型のものに比べＣ末端が56アミノ酸欠失したものであるが活性は維持しており、この欠失領域は活性には必須ではないことが判明した。
【００７０】
実施例７． 封入体からのリフォールディングにより得られた組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) の基質特異性
リフォールディングにより得られた組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) の基質特異性を天然型のものと比較するため、基質としてヒトカルシトニン前駆体（hCT[G]）の融合蛋白質を用い、当該蛋白質に両プロテアーゼを作用させhCT[G]を遊離させる実験を行った。
【００７１】
実験に用いたヒトカルシトニン融合蛋白質は、βーガラクトシダーゼ誘導体（108 アミノ酸）とhCT[G]がグルタミン酸を有するリンカーを介して融合された構造を持ち、天然型のＶ８プロテアーゼはこのグルタミン酸残基のカルボキシル側のペプチド結合を切断しhCT[G]を遊離させることができる。なお、当該融合蛋白をコードする遺伝子を有するプラスミドとしては、pG97S4DhCT[G]R4(特開平５−３２８９９２参照) を挙げることができる。
【００７２】
10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA, 5mM DTT, 2M 尿素及び 10mg/mlのヒトカルシトニン融合蛋白質を含む溶液1ml に、天然型のＶ８プロテアーゼに換算して1.2 μg の活性に相当する量の組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) を加え30℃で1 時間反応した後、反応液を、高速液体クロマトグラフィー（0.1%トリフルオロ酢酸(TFA) と0.1%TFA/50% アセトニトリルを用いた直線濃度勾配による溶出）により分析した。
【００７３】
なお組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) はリフォールディング後の試料を直接用い、また比較対照として市販の天然型Ｖ８プロテアーゼを同条件で作用させた試料を用いた。
図10に高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示す。組換えＶ８プロテアーゼ(V8D) と天然型Ｖ８プロテアーゼ間でヒトカルシトニン融合蛋白質に対する切断パタンは同一であり基質特異性において両プロテアーゼは同等であることが確認された。
【００７４】
実施例８． Ｖ８プロテアーゼのＣ末端側の融合部位についての検討
V8D 融合蛋白質に比べ、Ｖ８プロテアーゼ部のＣ末端側が２、３、４、６および８アミノ酸だけ伸長した融合蛋白質を作製するため、図11に示すPCR プライマーを合成した。３アミノ酸伸長したタイプの融合蛋白質(V8F融合蛋白質) をコードするpV8Fは以下の方法により作製した。プライマーb と図１(b) に示したプライマーI を用い、鋳型DNA として実施例１で作製したpV8RPT(-) を0.1 μg 用いてＶ８プロテアーゼ遺伝子側の増幅反応を行った後、EcoRI およびSacI  で切断し0.1kb の遺伝子断片を調製した。
【００７５】
一方プライマーg とプライマーh および鋳型DNA としてpV8Dを0.1 μg 用いてＲ６リンカー配列とアミノグルコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子部の増幅反応を行った後、EcoT22I およびSacIで切断し0.3kb の遺伝子断片を調製した。なおPCR は実施例１の条件に従った。このようにして得られた0.1kb と0.3kb の遺伝子とpV8DのEcoRI-EcoT22I 断片（4.2kb ）を連結しpV8Fを作製した（図12、図14参照）。
プライマーa, c, d, eおよびプライマーg についても、同操作（但し pV8H の作製についてはSacI  の代わりにNdeIを使用）を行うことにより pV8H, pV8A, pV8D2, pV8Qを作製した。これらのプラスミドの作製に使用したプライマーと鋳型DNA の組み合わせを以下に示す。
【００７６】
pV8H：プライマーa 、プライマーI 、pV8RPT(-) およびプライマーf 、プライマーh 、pV8Dの組み合わせより得られたPCR 産物より作製。
pV8A：プライマーc 、プライマーI 、pV8RPT(-) およびプライマーg 、プライマーh 、pV8Dの組み合わせより得られたPCR 産物より作製。
pV8D2 ：プライマーd 、プライマーI 、pV8RPT(-) およびプライマーg 、プライマーh 、pV8Dの組み合わせより得られたPCR 産物より作製。
pV8Q：プライマーe 、プライマーI 、pV8RPT(-) およびプライマーg 、プライマーh 、pV8Dの組み合わせより得られたPCR 産物より作製。
【００７７】
これらのプラスミドからは実施例４で示したV8D 融合蛋白質に比べ、Ｖ８プロテアーゼ領域のＣ末端部分がそれぞれ 2, 4, 6、および8 アミノ酸分だけ伸長した融合蛋白質が生産される（図13、図14参照）。
JM101 株にこれらのプラスミドを形質転換し実施例４と同じ操作により各融合蛋白質の発現を調べた結果を図13に示す。封入体の形成はpV8H, pV8FおよびpV8Dに認められ、得られた封入体は実施例５に示した操作を施すことで活性ある組換えＶ８プロテアーゼにリフォールディングさせることが出来た。一方、pV8A, pV8D2, pV8Q の場合封入体は得られず、可溶性画分にＶ８プロテアーゼ活性が認められた。
【００７８】
これらのプラスミドの場合、発現した融合蛋白質はプロテアーゼ活性を持ち、増殖を阻害することが封入体を形成しない原因と考えられる。すなわちＶ８プロテアーゼを不活性な融合蛋白質として発現させるにはＮ末端から215 番目のフェニルアラニン以前で融合させることが重要であり、この部位を超えて融合した場合にはＶ８プロテアーゼ部分が本来の立体構造を形成しプロテアーゼ活性をもった融合蛋白質が生産されるため増殖阻害を起こし高発現出来ないことが判明した。
【００７９】
【発明の効果】
本発明により目的のポリペプチドを大量に且つ安価に製造することができるようになった。特に本発明では目的ポリペプチドとしてS. aureus V8プロテアーゼを検討したが、高純度な当該酵素を遺伝子組換え技術を用いて、安全な宿主細胞、例えば大腸菌を使用することにより、大量に且つ安価に効率的な精製・製造をすることができるようになった。
【００８０】
【配列表】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ遺伝子の構成（ａ）、及び本発明の遺伝子のクローニングに用いたＰＣＲ用プライマーの塩基配列（ｂ）を示す図である。
【図２】図２は、pG97S4DhCT[G]R6 及びpG97S4DhCT[G]R10の作製過程を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドpV8RPT（＋）及びpV8RPT（−）の作製過程を示す図である。
【図４】図４はプラスミドpV8RPT（＋）及びpV8RPT（−）中にコードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドpV8Dの作製過程を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドpV8D中にコードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】図７は、本発明の融合蛋白質が封入体を形成して不溶性画分に移行することを示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図８】図８は、V8D 融合蛋白質が、宿主由来のプロテアーゼompTにより開裂されてＶ８プロテアーゼを遊離させることを示す電気泳動図であって、図面に代る写真である。
【図９】図９は、ompTプロテアーゼにより遊離したＶ８プロテアーゼのリフォルディングを示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図１０】図１０は、ヒトカルシトニン前駆体を含む融合蛋白質を、本発明の方法により得た組換えＶ８プロテアーゼ（Ａ）又はＳ．アウレウスからのＶ８プロテアーゼ（Ｂ）により切断した場合の生成物を比較したチャート図である。
【図１１】図１１は、種々の融合蛋白質をコードするDNA を含むプラスミド（pV8H，pV8F，pV8A，pV8D2 及びpV8Q）の作製において使用したプライマーの塩基配列を示す図である。
【図１２】図１２は、プラスミドpV8H，pV8F，pV8A，pV8D2 及びpV8Qの作製の過程を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドpV8D，pV8H, pV8F，pV8A，pV8D2 及びpV8Q中にコードされているＶ８プロテアーゼのＣ−末端アミノ酸配列、及び各プラスミドの発現生成物（融合蛋白質）による封入体の形成の有無を表示した図である。
【図１４】図１４は本発明の方法により製造される目的ポリペプチドのアミノ酸配列の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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