(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン（ＩＬ）−１１受容体鎖をコードするかまたはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子であって、配列番号２または配列番号４で定義される核酸分子の１つまたは両方またはそれらの相補形と６５℃にて１６時間、２×ＳＳＣ、２mg／mlのウシ血清アルブミン、２mg／mlのフィコール、２mg／mlのポリビニルピロリドン、１００μmのＡＴＰ、５０μg／mlのｔＲＮＡ、２mMのピロリン酸ナトリウム、２mg／mlのサケ精子ＤＮＡ、２００μg／mlのナトリウムアジドおよび１％w/vのＳＤＳを含む溶液中でハイブリダイズすることができ、次いで６５℃にて３０分間、０．２×ＳＳＣおよび０．１％w／v ＳＤＳで洗浄される核酸分子。
【請求項２】
ＩＬ−１１受容体が哺乳動物由来のものである、請求項１記載の分離された核酸分子。
【請求項３】
ＩＬ−１１受容体がヒト由来のものである、請求項２記載の分離された核酸分子。
【請求項４】
ＩＬ−１１受容体がネズミ由来のものである、請求項２記載の分離された核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項２〜４のいずれか１項記載の分離された核酸分子。
【請求項６】
ｃＤＮＡである、請求項５記載の分離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を含むネズミＩＬ−１１受容体のα−鎖をコードしている、請求項５または６記載の分離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の分離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ−１１受容体のα−鎖をコードしている、請求項５または６記載の分離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項９記載の分離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜３６７を含むポリペプチドをコードするものである請求項５または６記載の分離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜３６６を含むポリペプチドをコードするものである請求項５または６記載の分離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１４】
請求項７または８に記載の核酸分子を含む組換ベクター。
【請求項１５】
請求項９または１０に記載の核酸分子を含む組換ベクター。
【請求項１６】
請求項１１または１２に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれかに記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１８】
哺乳類のものである請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細菌である請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸分子によりコードされるか、または請求項１７〜１９記載の宿主により製造される、哺乳動物の組換ＩＬ−１１受容体α−鎖＿。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトまたはネズミである、請求項２０記載の組換ＩＬ−１１受容体α−鎖。
【請求項２２】
配列番号５のアミノ酸配列を含むものである、請求項２１記載の組換ＩＬ−１１受容体α−鎖。
【請求項２３】
配列番号３のアミノ酸配列を含むものである、請求項２１記載の組換ＩＬ−１１受容体α−鎖。
【発明の詳細な説明】
この発明は広くは新規ヘモポイエチン受容体、またはその構成要素もしくは部分、およびヘモポイエチン受容体（haemopoietin receptors）をコードする遺伝子配列をクローニングする方法に関する。より具体的には、この発明は組換または合成ヘモポイエチン受容体またはその構成要素もしくは部分に関する。この発明の受容体分子またはその構成要素もしくは部分およびそれらの遺伝子配列は、その受容体との配位子相互作用に基づく広範なアゴニスト、アンタゴニストおよび治療剤および診断試薬の開発に有用である。
この明細書中に引用されている多数の刊行物の詳細な図書目録は明細書の末尾にまとめられている。明細書中に引用されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番号は図書目録の後に定義されている。
以下の明細書および請求の範囲を通じて、特に断らないかぎり、「含む（comprise）」、またはその変形（comprisesまたはcomprising）は述べられているそのもの、またはそのものの一群の包含を意味するのみならず、他のものまたは他のものの群の排除を意味するものではない。
種々の細胞の増殖、分化および機能はサイトカインとして知られている分泌調節剤によって制御されている。そのようなサイトカインの１種はインターロイキン（ＩＬ）−１１であり、機能的に多面的な分子であり（１，２）、ＩＬ−６−依存性形質細胞腫細胞系、Ｔ１１  ６５（３）の増殖を刺激する能力がその最初の特徴である。ＩＬ−１１の他の生物学的作用は多能力的ヘモポイエチン親細胞増殖の誘導（４，５，６）、巨核球および血小板形成の促進（７，８，９，１０）、重大な段階の蛋白合成の刺激（１１）および脂肪細胞リポ蛋白リパーゼ活性の阻害（１２，１３）を含む。ＩＬ−１１の別の多面的機能は、特にヘモポイエチン受容体との相互作用のレベルでの研究にとって、重要なヘモポイエチン分子である。
ＩＬ−１１受容体の構造は十分知られていない。ｇｐ１３０に対する抗体の中和がＴＦ−１細胞のＩＬ−１１依存性増殖を阻害し（１４）、従って、ｇｐ１３０は受容体の一部を形成するというのはあり得ることである。
ヘモポイエチン受容体族の構成員は一般にα−およびβ−鎖を含む（１５，１６，１７）。しかしながら、本発明以前は、ＩＬ−１１受容体鎖の存在に関して情報はなかった。本発明前の主要な研究において、本発明者らはヘモポイエチン受容体の配位子の先の知識が必要でないヘモポイエチン受容体のクローニング方法を開発した。そのクローニング方法は、初めてＩＬ−１１受容体の詳細な分子分析を可能にしたもので、ＩＬ−１１受容体α−鎖のクローニングに成功した。従って、本発明は、ヘモポイエチン受容体をクローニングにするための一般化された方法、特に、ＩＬ−１１受容体に基づくアゴニスト、アンタゴニスト、治療剤および診断試薬の範囲を開発する基礎を提供するヘモポイエチン受容体の構成要素鎖をクローニングする方法を提供するものである。
従って、本発明の１つの態様は、ヘモポイエチン受容体または変異体、誘導体、構成要素、部分、断片、相同体、類似体、またはそれらと均等なペプチドまたはポリペプチドをコードするかまたは相補的なヌクレオチドの配列を含む遺伝分子であって、上記受容体が、配列番号１：
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
（式中、Ｘａａはアミノ酸である）を有するアミノ酸配列を含む遺伝分子である。
さらに具体的には、本発明は、ＩＬ−１１受容体または変異体、誘導体、構成要素、部分、断片、相同体、類似体、またはそれらと均等なペプチドまたはポリペプチドをコードするかまたは相補的なヌクレオチドの配列を含む遺伝分子であって、上記受容体が、配列番号１：
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
（式中、Ｘａａはアミノ酸である）
を有するアミノ酸配列を含む遺伝分子である。
本発明の別の態様は、ヘモポイエチン受容体および、特にＩＬ−１１受容体、またはそれらの構成要素または部分をコードするかまたは相補的な遺伝子配列を識別するかまたは／およびクローニングする方法であって、配列番号１：
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
（式中、Ｘａａはアミノ酸残基である）
を有する配列を含むアミノ酸の配列から設計された１個またはそれ以上の縮重オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子材料の試料をスクリーニングすることを特徴とする方法である。
配列番号１で定義された配列は、ヘモポイエチン受容体のαおよびβ鎖の両方および特にＩＬ−１１受容体中に確認されたものである。従って、本発明の方法は受容体全長などのα−鎖またはβ−またはα−およびβ−鎖の両方の組み合わせをコードしている遺伝子配列のクローニングに応用できる。
遺伝分子はヒトに限らず、家畜類（例えば、羊、牛、豚、やぎ、馬）、実験動物（例えば、ねずみ、ラット、マウス）、ペット（例えば、猫、犬）または捕獲野生動物などの哺乳動物由来のものである。最も好ましいのはヒトおよび哺乳動物（例えばネズミ）由来のものである。遺伝子材料の原料は、これに限定されるものではないが、肝細胞、骨髄細胞、胎盤細胞、肝癌細胞などの特定の細胞型からのゲノムライブラリーまたはｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡライブラリーであってもよい。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーであり、発現ライブラリーであってもよい。さらに、変異体の生産のために、ｃＤＮＡライブラリーは変異体ライブラリーの原因である高い誤謬率のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によっても製造することができる。
「スクリーニング」なる用語は標的クローンの同定に好都合なあらゆる手段を含む。例えば、コロニーハイブリダイゼーションはオリゴヌクレオチドプローブを用いて採用することができ、またはもし発現ライブラリーが調製されれば、例えば、スクリーニングは酵素活性また抗体相互作用でもできる。「構成要素」、「部分」または「フラグメント」なる用語は、個々に、α−鎖およびβ−鎖またはそれらの部分を含む。好ましくは、「構成要素」、「部分」および「フラグメント」なる用語は機能的および、より好ましくは、機能的なα−またはβ−鎖である。
遺伝分子は一本鎖または二本鎖状、直鎖状または環状ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。遺伝分子は、ＩＬ−１１受容体遺伝子配列の発現を容易にする発現ベクター成分などのベクターもまた含んでいてもよい。
具体的な態様において、遺伝子配列はＩＬ−１１受容体のα−鎖をコードしており、好ましい実施態様において、配列番号２に記載されているヌクレオチド配列をコードしているネズミＩＬ−１１受容体α−鎖であるか、または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれらと均等である、部分、誘導体、フラグメント、一部分、誘導体、相同体、類似体またはペプチドを含む。別の好ましい実施態様において、遺伝子配列はヒトＩＬ−１１受容体のα−鎖をコードしており、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むか、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれらと均等である、部分、誘導体、フラグメント、一部分、誘導体、相同体、類似体またはペプチドまたはポリペプチドを含む。従って、遺伝子配列はＩＬ−１１受容体の全長、または、α−鎖またはβ−鎖などのばらばらのそれらの部分であって、機能的または機能的でないかのいずれかでであるか、または、Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（式中、Ｘａａがアミノ酸残基である）で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とするそれらの部分に対応していてもよい。さらに、遺伝子配列またはそれらの部分は、ＩＬ−１１受容体のα−またはβ−鎖をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス分子（複数あり）として働くこともである。このようなアンチセンス分子は遺伝子治療またはアゴニストまたはアンタゴニストの理論的設計において有用であり得る。
関連の実施態様において、ＩＬ−１１受容体または、配列番号：２または４が低いスリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドの配列を含む、それらの構成要素、部分またはフラグメントをコードしている遺伝子配列を提供する。さらに関連する実施態様において、遺伝子配列は、下記の表：
から選ばれるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る能力によって定義されるか、それらの相補的配列またはそれらの組み合わせである。
本発明は配列番号：１〜６によって定義されるオリゴヌクレオチド、および／またはそれらの標識形態またはそれらに対するヌクレアーゼ介在作用を減少させて安定させたオリゴヌクレオチドにも及ぶ。
スリンジェントの程度の定義のために、Sambrook et al（２６）の９．５２−９．５７頁の洗浄工程を高ストリンジェトと見なすとの記載を、便宜的にここに引用して本明細書の記載とする。ここで、低ストリンジェトとはＳＤＳ０．１−０．５w/v％、３７−４５℃、２−３時間であると定義する。ハイブリダイゼーションに関与する原料および核酸の濃度によって別のストリンジェトな条件、例えば、ＳＤＳ０．２５−０．５w/v％、≧４５℃、２−３時間である、ここで中程度と見なされるか、またはSambrook et alに記載の高いストリンジェトな条件を採用することができる。
本発明は特にＩＬ−１１受容体α−鎖（ＩＬ−１１ｒα）のクローニングによって例示されるようなヘモポイエチン受容体α−鎖またはβ−鎖のクローニングに有用である。しかしながら、これは本発明がヘモポイエチン受容体のα−またはβ−鎖を含むすべてのヘモポイエチン受容体のクローニング方法に及ぶものと理解されなければならない。実施例中のα−鎖に関する記載は完全な受容体またはα−またはβ−鎖を含むそれらの種々の部分に対する便法上の表記であるとみなされる。
さらなる実施態様において、遺伝子配列は異種の遺伝子配列と融合し、それによって、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、成長ホルモン、プロラクチン、ＣＮＴＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０についての受容体またはそれらのサブユニット、またはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットとの融合分子をコードしている。
遺伝分子は一本または二本鎖状、直鎖または環状ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡまたは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの形態のようなそれらの組み合わせであってもよい。この遺伝分子は、ＩＬ−１１受容体またはその構成要素または部分の発現を容易にする発現ベクター成分などのベクターもまた含んでいてもよい。好ましい実施態様において、配列番号：３（ネズミ）または配列番号：５（ヒト）に記載のアミノ酸配列を有するＩＬ−１１のα−鎖をコードしているか、またはすべてまたはそれらの一部分の部分、誘導体、フラグメント、一部分、構成要素、相同体または類似体を含む。最も好ましくは、遺伝子配列は配列番号：２（ネズミ）または配列番号：４（ヒト）に記載のヌクレオチド配列を含むか、またはすべてまたはそれらの一部分の部分、誘導体、フラグメント、一部分、構成要素、相同体または類似体を含む。
本発明はさらに、ヘモポイエチン受容体類の構成員またはそれらの構成要素または部分をクローニングするのに有用なキットに関する。上記キットは、仕切られた形態で、配列番号：１：
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
（式中、Ｘａａはアミノ酸残基である）のアミノ酸配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含むのに適した第１番目の区画を含んでおり、上記キットはさらに、配列番号：１のアミノ酸配列に基づく１個またはそれ以上のヌクレオチドおよび／またはヘモポイエチン受容体遺伝子配列のハイブリダイゼーション検出に必要な試剤を含むのに適した１個またはそれ以上の区画を含む。このキットはまた使用説明書とともに包装されていてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドはこれに限定されるものではないが、配列番号：６〜１０のオリゴヌクレオチドを含む。
さらに、本発明の別の態様は哺乳動物ＩＬ−１１受容体α−鎖の全長または部分に対応するアミノ酸配列を含む組換ポリペプチドに関する。好ましくは哺乳動物はヒトまたはマウスなどのげっ歯類である。ポリペプチドは、α−鎖の全長、またはそれらの機能的な部分、フラグメントまたは誘導体または、アゴニストまたはアンタゴニスト的性質を有する一部分、フラグメントまたは誘導体であってもよい。好ましい実施態様において、このポリペプチドは配列番号３（ネズミ）または配列番号５（ヒト）に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列、すなわち、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６５％、なおさらに好ましくは少なくとも約７５−８０％、もっと好ましくは少なくとも約９０−９５％または配列番号３または配列番号５の記載の配列とさらに類似性を有するアミノ酸配列を含む。
このポリペプチドは、ＧＳＴ、別のサイトカイン、受容体成分またはｇｐ１３０を含む、これと融合する追加のアミノ酸配列を含有していてもよい。製造のために用いられる細胞によって、非グリコシル化またはグリコシル化されていてもよい。従って、このポリペプチドは、原核細胞（例えば、E.coliまたはBacilli種）中、または真核細胞（例えば、ＢＡ／Ｆ３細胞などの哺乳動物細胞［１８］、酵母細胞、昆虫細胞）中で産生され得る。
組換ポリペプチドヘモポイエチン受容体特性の変異体および誘導体は、アミノ酸の置換、欠失、および／または付加体を含む。さらに、アミノ酸は、疎水性、親水性、電気陰性度、立体障害側鎖、相互作用および／または官能基などが似たような性質を有する他のアミノ酸で置換されていてもよい。
アミノ酸置換は典型的には単一の残基であり；挿入は通常、約１−１０個のアミノ酸残基のオーダーのものであり；削除は約１−２０個の残基の範囲のものである。削除または挿入は好ましくは、隣接する対においてなされる。すなわち、２残基の削除または２残基の挿入である。
上記のアミノ酸変異体は、固相ペプチド合成などの当業者に周知のペプチド合成技術または組換ＤＮＡ操作によって容易に製造されるものである。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位の置換変異をさせる技術は周知であり、例えば、Ｍ１３突然変異誘発による。置換、挿入または削除変異体として明示する変異体蛋白質の製造のためのＤＮＡ配列の操作は当分野では周知である。
本発明の組換ヘモポイエチン受容体ポリペプチドの組換または合成変異体および誘導体の他の例としては、炭水化物、脂質および／または蛋白質またはポリペプチドなどのリガンドと結合したいずれかの分子に単一または複数の置換、削除および／または付加したものを含む。本発明では具体的には当該リガンドの自然発生または部分変化したグリコシル化形態が予期される。
ここで予期される当該ポリペプチドのアミノ酸変化には、アミノ酸および／またはカルボキシル末端融合および単一または複数のアミノ酸の配列間挿入などの挿入が含まれる。一般に、アミノ酸配列内の挿入はアミノまたはカルボキシル末端融合よりも少なく、１〜４の残基のオーダーである。挿入アミノ酸配列変異体は１個またはそれ以上のアミノ酸残基が蛋白質の所定の部位に導入されたものである。削除変異体は配列から１個またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。置換変異体は配列内の少なくとも１個の残基が削除され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。このような置換は表１に従って行われ得る。
0003949715.tif 000002
用語「類似体」および「誘導体」もまた、インビボまたはインビトロにおいて、安定性および／または効果が増強されたことを特徴とする、リガンドのいずれかの機能的化学的均等物もまた含む。用語「類似体」および「誘導体」は上記のリガンドのいずれかのアミノ酸誘導体もさらに含む。ここに予定されるヘモポイエチンポリペプチド受容体の類似体の例として、側鎖の修飾、非天然アミノ酸の組み込みおよび／または分子の誘導体化およびそのペプチドまたはそれらの類似体上に立体配座的制約を課す架橋剤または他の方法の使用を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本発明で予定される側鎖の修飾の例には、アルデヒドとの反応ついでＮａＢＨ4による還元による還元アルキル化；メチルアセトアミドによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン化物によるアシル基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアシル基のトリニトロベンジル化；コハク酸無水物とテトラヒドロフタル酸無水物によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサール−５’−ホスフェート、ついでＮａＢＨ4による還元のリジンのピリドキシル化を含まれる。
アルギニン残基のグアニジン基は２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬との異項環縮合生成物の形成によって修飾され得る。
カルボキシル基はＯ−アシルイソウレア形成後、例えば、相当するアミドへの誘導体化を経るカルボジイミド活性化によって修飾され得る。
スルヒドリル基はヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−４クロロマーキュリベンゾアート、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、フェニルマーキュリクロリド、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を用いての水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアン化物とのカルボモイル化などの方法によって修飾され得る。
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフリルハライドとのインドール環のアルキル化などによって修飾され得る。一方、チロシン残基はテトラニトロメタンによる３−ニトロチロシン誘導体のニトロ化によって変化され得る。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾はヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはシエチルピロカルボネートによるＮ−カルベトキシ化によって行われ得る。
蛋白合成中の非天然アミノ酸および誘導体導入の例としてはノルロイシン、４−アミノラク酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタノイックアシッド、６−アミノヘキサノイックアシッド、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、ザルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタノイックアシッド、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
架橋剤は、例えば、３Ｄ配座の安定化のために用いられ、ｎ＝１からｎ＝６の（ＣＨ2）ｎスペーサーを有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび、通常、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび、マレイミドまたはジチオ分子（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基特異的分子を含んでいる異項性二官能性試剤などの二官能性架橋剤が用いられる。さらに、ペプチドは、例えば、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の組み込み、アミノ酸のＣαおよびＣβ原子間の２重結合の導入およびＮおよびＣ末端間、２個の側鎖間または１個の側鎖とＮまたはＣ末端間のアミド結合形成などの共有結合の導入によって環状ペプチドまたは類似体の形成によって立体配座的に束縛され得る。
従って、本発明は、ＩＬ−１１受容体のα−鎖の同定的特徴を有するペプチドまたはポリペプチドおよびアミノ酸および／またはそれらの化学的類似体に及ぶ。
従って、ＩＬ−１１受容体またはＩＬ−１１α−鎖の性質を有するポリペプチドには、天然由来分子、それらの組換、合成および類似体形が含まれ、それらの変異体、誘導体およびヒト−および非−ヒト相同体にはアミノ酸およびグリコシル化変異体が含まれる。
組換ＩＬ−１１受容体α−鎖およびこれをコードする遺伝子配列の利用によって、初めてＩＬ−１１の欠乏、ＩＬ−１１の過剰量または正常な内在性ＩＬ−１１濃度の異常作用を含む種々の症状を処置するための広範なアゴニスト、アンタゴニスト、治療剤および診断剤の開発が可能になった。従って、本発明は、これらのアゴニスト、アンタゴニスト、治療剤および診断剤、および１またはそれ以上のこれらを含む組成物、医薬組成物および試剤にも及ぶものである。
さらに、本発明は下記の図面および実施例によって詳述されるが、これに限定されるものではない。
図面の説明：
図１は、ＩＬ−１１受容体α鎖（ＩＬ−Ｎｒ１）のヌクレオチド配列、予測アミノ酸配列およびｃＤＮＡ構造の表現である；（Ａ）ＩＬ−１１ｒα ｃＤＮＡの構造であり、５’および３’非翻訳領域（実線）および予測シグナル配列を含むコード領域
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成熟細胞外ドメイン（□）、膜貫通ドメイン
0003949715.tif 000004
および細胞質ドメイン
0003949715.tif 000005
を示す。完全に配列された各ＩＬ−１１ｒα ｃＤＮＡクローンのサイズと位置関係を下に示す。
図２は、Ｎｒ１とヘモタンパク質受容体ファミリーの他のメンバーとの比較である；マウスＮｒ１、マウスＩＬ−６受容体α鎖、ヒトＣＮＴＦ受容体α鎖、ヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットおよびマウスＧＭＳＦ受容体α鎖のアミノ酸配列アラインメントである。アラインメントは眼によって行った。
図３は、Ｎｒ１ ｍＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ鎖分析の写真的表現である；調製した細胞質ＲＮＡの由来は次のとおりである；レーン２，３Ｔ３−Ｌ１細胞；レーン３，ＢＡｄ細胞；レーン４，ＵＭＲ−１０６細胞；レーン５，ＰＣ１３細胞；レーン６，ＮＦＳ細胞；レーン７，ＦＤＣＰ−１細胞；レーン８，３２Ｄ細胞、レーン９，Ｄ３５細胞；レーン１０，Ｍ１細胞；レーン１１，Ｊ７７４細胞；レーン１２，ＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ細胞；レーン１３，ヒト骨髄；レーン１４，；レーン１５，マウス脾臓；レーン１６，マウス胸腺；レーン１７，マウス卵巣；レーン１８，マウス子宮；レーン１９，睾丸；レーン２０，マウス精巣；レーン２１，マウス脳；レーン２２，マウス心臓；レーン２３，マウス腎臓；レーン２４，マウス大腿筋；レーン２５，マウス肝臓；およびレーン２６，マウス唾液腺。各ＲＮＡ１μｇのサノウルおよびＲＮＡを含まないコントロール（レーン１）を、逆転写酵素なしで行った反応と同じ反応において逆転写に付した。５％の第１ストランドｃＤＮＡ反応物を、Ｎｒ１特異的プライマー（上部パネル）あるいはコントロールＧＡＰＤＨ（下部パネル）とともにＰＣＲに付した。ＰＣＲ産物を１．０％ｗ／ｖのアガロースゲル上で分解し、ニトロセルロースに移し、ＧＡＰＤＨまたはＮｒ１に特異的な内部オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。
図４は、種々の細胞系へのＩＬ−１１の結合の等飽和度のスキャッチャード分析プロットを示すグラフである；（Ａ）親のＢａ／Ｆ３細胞（●）、Ｎｒ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞（○）、Ｎｒ１およびＬＩＦ受容体を発現するＢａ／Ｆ３（■）；（Ｂ）ＬＩＦ受容体およびｇｐ１３０を発現するＢａ／Ｆ３細胞（●）、Ｎｒ１およびｇｐ１３０を発現するＢａ／Ｆ３細胞（■）、Ｎｒ１，ＬＩＦ受容体およびｇｐ１３０を発現するＢａ／Ｆ３細胞（○）；（Ｃ）親Ｍ１細胞（●）、Ｎｒ１発現Ｍ１細胞（○）；および（Ｄ）３Ｔ３−Ｌ１細胞（■）を、１０〜１００倍過剰の非標識ＩＬ−１１の存在あるいは不在下において、種々の濃度の標識ＩＬ−１１とともにインキュベートした。氷上で１８時間インキュベートした後、結合および遊離ＩＬ−１１をウシ胎児血清とともに遠心分離して分離した。結合および遊離の125Ｉ−ＩＬ−１１をγカウンターで定量し、データをスキャッチャード分析で表現した。各ケースにおいて、データを細胞数に対して標準化し、１０6個の細胞に対する結合として示した。
図５は、種々の細胞系に対するＩＬ−１１結合の分子特異性を示す：指定の受容体を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、６００００ｃｐｍ（Ｂａ／Ｆ３ Ｎｒ１）または６０００ｃｐｍの125Ｉ−ＩＬ−１１（Ｂａ／Ｆ３ Ｎｒ１／ｇｐ１３０およびＢａ／Ｆ３ Ｎｒ１／ｇｐ１３０／ＬＩＦ受容体）を含む培地１００μl中、２０ｎｇのＩＬ−１１または２００ｎｇのＩＬ−６，ＬＩＦ，ＯＳＭあるいはＩＬ−３の存在または不在下で、インキュベートした。氷上で１８時間インキュベートした後、結合および遊離ＩＬ−１１をウシ胎児血清とともに遠心分離して分離した。結合および遊離の125Ｉ−ＩＬ−１１をγカウンターで定量し、結合量を競合者不在下で観察された結果のパーセントで表した。
図６は、ＩＬ−１１に応答してＮｒ１を発現するＭ１細胞の分化を示す；３００個の親Ｍ１細胞（左パネル）またはＮｒ１を発現するＭ１細胞（右パネル）を指定の濃度のＬＩＦ（○）またはＩＬ−１１（●）を含む１ｍｌの半固体寒天上で培養した。７日後、分化した細胞を含むコロニーの割合を決定した。
図７は、種々の組み合わせのＮｒ１、ｇｐ１３０およびＬＩＦ受容体を発現するＢａ／Ｆ３細胞のファクター依存性増殖を示す；およＢａ／Ｆ３細胞、Ｎｒ１発現Ｂａ／Ｆ３細胞、Ｎｒ１およびＬＩＦ受容体発現Ｂａ／Ｆ３細胞、ＬＩＦ受容体およびｇｐ１３０発現Ｂａ／Ｆ３細胞、Ｎｒ１およびｇｐ１３０発現Ｂａ／Ｆ３細胞、Ｎｒ１，ＬＩＦ受容体およびｇｐ１３０発現Ｂａ／Ｆ３細胞を、１ウエル当たり２００個、１５μl容で、指定の濃度のＩＬ−１１（●）、ＩＬ−３（□）またはＬＩＦ（○）、あるいは３μｇ／ｍｌのＩＬ−６および５００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６受容体α鎖（▲）とともにインキュベートした。４８時間後、生存する細胞の数を計数した。
図８は、ヒトＩＬ−１１受容体α鎖の複合ヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。予測アミノ酸配列を慣例の１文字コードを用いて記載する。星印は、停止コドンを表す。４つの保持されたシステイン残基、ＷＳＴＷＳモチーフおよびポテンシャルアスパラギン結合グリコシル化サイト（ＮＸＳ／Ｔ）を太字および下線で示す。ポテンシャルシグナル配列および膜貫通領域を細下線および２重下線でそれぞれ示す。コンセンサスポリアデニル化シグナルを下部および太字にて示す。枠領域は、２００個のアミノ酸ヘモタンパク質ドメイン（Ｄ２００）を表し、これは破線でマークされる２つの１００アミノ酸サブドメイン（ＳＤ１００）からなる。２つの矢印は、ｃＤＮＡクローンに存在するイントロン配列の位置を示す。
図９は、ヒト（Ｈ）およびマウス（Ｍ）ＩＬ−１１受容体α鎖の予測アミノ酸配列の比較を示す。星印は同一であることを示す。＃印はアラインメントを改善するために導入されたギャップを示す。
図１０は、（Ａ）マウスＩＬ−１１受容体α鎖ｃＤＮＡプローブ（４４５ｂｐのＳｐｈＩ／ＳａｃＩフラグメント）および（Ｂ）ヒトＩＬ−１１受容体α鎖ｃＤＮＡプローブ（＃１７．１クローン由来の５６０ｂｐのＰｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメント）の、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたヒト（Ｈ）およびマウス（Ｍ）ゲノムＤＮＡへの種交差ハイブリッド形成を説明するサザンブロットを示す写真的表現である。ナイロン膜は、高ストリンジェント条件下で処理した（０．２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ，６５℃）。曝露は、強化スクリーンを用いて−７０℃で１６時間行った。
図１１は、ヒトＩＩｒα ｃＤＮＡの構造を図式的に表現したものであり、５’および３’非翻訳領域（実線）およびシグナル配列を含むコード領域
0003949715.tif 000006
細胞外ドメイン（□）、膜貫通領域
0003949715.tif 000007
細胞質部分（■）およびポリＡテール（ＡＡＡＡ）を示す。保持されたシステイン残基（Ｃ）およびＷＳＴＷＳモチーフのおよその位置を示す。分析用に選択された４つのｃＤＮＡクローンのサイズと位置関係を下に示す。イントロンのおよその位置をｂｐで示す（Ｖ）。クローンの長さはイントロンなしで描かれている。ＰｓｔＩ部位（矢印）における連結によって、＃９．１および＃１７．１のクローンから混成のｃＤＮＡを得、発現実験に用いた。
図１２は、ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するように処理されたＭ１細胞（□）、マウスＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞（●）おおび親のＭ１細胞（○）に結合するヒトＩＬ−１１ｒの飽和等温線のスキャッチャード分析のグラフである。１０〜１００倍過剰の非標識ＩＬ−１１の存在下において、種々の濃度の標識ＩＬ−１１とともに細胞をインキュベートした。氷上で１８時間インキュベートした後、結合および遊離ＩＬ−１１をウシ胎児血清とともに遠心分離して分離した。結合および遊離のＩＬ−１１をγカウンターで定量し、データをスキャッチャード分析で表現した。各ケースにおいて、データを細胞数に対して標準化し、１０6個の細胞に対する結合として示した。非特異的結合の量は、加えた全標識ＩＬ−１１の０．１〜１％であった。高親和性結合は、ヒトＩＬ−１１ｒα（Ｋｄ＝２５０ｐＭ）およびマウスＩＬ−１１ｒα（Ｋｄ＝２７５ｐＭ）を発現するＭ１細胞に見られた。親Ｍ１細胞はいかなる特異的結合も示さなかった。
図１３は、親Ｍ１細胞、ならびにヒトＩＬ−１１（１０００Ｕ／ｍｌ）およびマイシＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）に応答してヒトＩＬ−１１受容体α鎖を発現するように処理されたＭ１細胞（Ｍ１／ｈＩＬ−１１ｒα）形態を示す写真的表現である。細胞の形態は５日間インキュベートした後に検査した。パネルａ、ｂおよびｃは、標準生理的食塩水（パネルａ）、ＬＩＦ（パネルｂ）およびＩＬ−１１（パネルｃ）で処理した親Ｍ１細胞を示す。パネルｄは、ＩＬ−１１（Ｘ４００）で刺激されたＭ１／ｈＩＬ−１１ｒα細胞を表す。
図１４は、親Ｂａ／ｆ３細胞（▲）、ヒトＩＬ−１１受容体α鎖を発現するように処理されたＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３＋ｈＩＬ−１１ｒα）およびヒトＩＬ−１１受容体α鎖ならびにヒトｇｐ１３０を発現するように処理されたＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３＋ｈＩＬ−１１ｒα＋ｇｐ１３０）の増殖を示すグラフである。３つのクローン細胞系（Ｂａ／Ｆ３＋ｈＩＬ−１１ｒα）（●）が不応答であることが立証された。ヒトｇｐ１３０分子が発現した後、すべての細胞系がＩＬ−１１応答性であった（白抜き記号）。ヒトＩＬ−１１の連続希釈効果が示されている。結果は、２回の実験における３個の平均から得たものである。すべての細胞はＩＬ−３において増殖した。
本明細書では、以下のアミノ酸残基に対応する１文字および３文字略語を用いた。
0003949715.tif 000008
次の略語を、本明細書において採用した。
ＩＬ−１１：インターロイキン１１
ＩＬ−１１ｒ：インターロイキン１１受容体
ＩＬ−１１ｒα：インターロイキン１１受容体α鎖
Ｄ：ドメイン
ＳＤ：サブドメイン
Ｎｒ１：インターロイキン１１ｒ
実施例１
ライブラリー・スクリーニング
市販のλｇｔ１０およびλＺＡＰにクローニングした成体マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック，ＣＡ，ＵＳＡおよびストラタジーン，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて菌株ＬＥ３９２の大腸菌に感染させた。感染した細菌を２０個の１５０ｍｍ寒天プレートを成長させて、プレート当たりおよそ５００００プラークを得た。次いで、直径１５０ｍｍの２重のナイロン膜［コロニー／プラーク・スクリーン（登録商標），ＮＥＮ・リサーチ・プロダクツ，ＭＡ，ＵＳＡ］にプラークを移し、細菌を溶菌し、１００℃で１分間の乾燥滅菌によるオートクレーブ処理によって、ＤＮＡを固定した。０．１％ｗ／ｖのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣとは、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム・二水和物である）で室温にてフィルターを２回濯ぎ、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌのフィコール、２ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、１００μＭのＡＴＰ、１０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、２ｍＭのピロリン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、０．１％ＮＰ４０および２００μｇ／ｍｌのナトリウムアジドを含む６×ＳＳＣ中、３７℃で一夜プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。９６０μＣｉのγ32Ｐ−ＡＴＰ［ブレサテック，Ｓ．Ａ．，オーストラリア］を用い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでハイブリダイゼーション用の縮重オリゴヌクレオチド（表１中、ＨＹＢ１，ＨＹＢ２およびＨＹＢ３）１．２μｇをリン酸化した。プレパックゲル濾過カラム［ＮＡＰ−５；ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン］を用いて結合しなかったＡＴＰを標識オリゴヌクレオチドから分離した。０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ（ＮＰ４０よりもむしろこれが適当）および１０6〜１０7ｃｐｍ／ｍｌの標識オリゴヌクレオチドを含む該プレハイブリダイゼーション緩衝液８０ｍｌ中、フィルターを３７℃で一夜ハイブリダイズさせた。６×ＳＳＣ、０．１％ｖ／ｖＳＤＳを用い、室温にて２回簡略に濯ぎ、１．５リットルの同じ緩衝液を入れた振とうウォーターバス中で４５℃にて３０分間濯ぎ（２回）、次いで、６×ＳＳＣ中で室温にて簡略に濯いだ。次いで、フィルターをドライブロットし、展開の７〜１４日前に強化スクリーンを用いて−７０℃にてオートラジオグラフィーフィルムに接触させた。
配向複写フィルター上で陽性を呈したプラークを選び、０．５％ｗ／ｖのゼラチンおよび０．５％ｎｖ／ｖのクロロホルムを含む１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４（１ｍｌ）で溶離し、４℃で貯蔵した。２日後、ＬＥ３９２細胞を、第１プラグからの該溶出液で感染させ、第２スクリーンに再コロニー形成させた。ハイブリッド形成プラークが純粋になるまで、このプロセスを繰り返した。
実施例２
陽性プラークの分析
使用説明書にしたがってプロメガ・マジック・ラムダＤＮＡカラム［プロメガ・コーポレイション，ＷＩ，ＵＳＡ］を用い、陽性・プラークからＤＮＡを調製した。各陽性バクテリオファージからのＤＮＡ１００ｎｇを、ｆｍｏｌシーケンシングキット［プロメガ・コーポレイション，ＷＩ，ＵＳＡ］を用い、33Ｐ標識オリゴヌクレオチドプライマーｇｔ１０ｆｏｒ、ｇｔ１０ｒｅｖおよびＨＹＢ１，ＨＹＢ２またはＨＹＢ３のいずれかで、シークエンシングを行った。生成物を６％ｗ／ｖポリアクリルアミドゲルで分割し、ブラスト・データベース比較プログラムおよびプログラムのウイスコンシンスイートを用い、各クローンの配列を分析した。
ひとつのクローン（Ｎｒ１−ＡＺ−３６）の配列は、ヘモタンパク質受容体ファミリーに特徴的なモチーフを含んでいた。２つのオリゴヌクレオチド，＃２６および＃６０（ヌクレオチド９４６〜９７０および１００５〜１０３４；図１；表２）を、この配列から設計し、オリジナルの肝臓ライブラリーおよび２つの他の成人肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来の第１フィルターの再スクリーニングに用いた。ジデオキシ法（１８）およびファルマシアＴ７ポリメラーゼ・シーケンシングキット［ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン］を用い、最初に単離されたｃＤＮＡクローン，Ｎｒ１−ＡＺ−３６および４つの他のｃＤＮＡクローン（Ｎｒ１−３０．２，３０．３，３０．４および３０．１７）の両方の鎖の完全なシークフエンシングを行った。ＦＡＳＴＡプログラムを用い、新規受容体の配列をＥＭＢＬおよびゲンバンク・データベースと比較した。既知のサイトカイン受容体とのアラインメントを目視によって行った。
別に、より迅速な陽性プラークの分析法において、ＷＳＸＷＳモチーフに対する縮重オリゴヌクレオチドの使用を確認した。
第１の陽性プラークを同定し、採取した。
５μｌの第１プラーク溶出液をポリメラーゼ鎖反応に付した［Ｍｇ含有１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ（ベーリンガー・マンハイム）、１０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ１μｌ（プロメガ・コーポレイション）、１００μｇ／ｍｌの各プライマー２．５μｌおよびＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（ベーリンガー・マンハイム）］。使用した該プライマーは、ハイブリダイゼーションで用いたＷＳＸＷＳプライマーとライブラリーをクローニングしたλ−バクテリオファージに対して特異的なプライマーを組み合わせて用いた。９６℃で２分間；９６℃で３０秒を２５サイクル；５５℃で３０秒および７２℃で２分間、不定期に４℃というプロトコルを用い、パーキン・エルマー９６００装置にて、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲしたもの２０μｌを、ＴＡＥ中、１％ｗ／ｖアガロースゲル上での電気泳動に付した。ジーン・クリーン試薬を用い、いずれの生成物をも単離し、33Ｐ標識ＷＳＸＷＳプライマーとｆｍｏｌシーケンシングキット［プロメガ・コーポレイション］または非標識ＷＳＸＷＳプライマーおよび蛍光ジデオキシヌクレオチドと自動ヂーケンサーのいずれかを用いてシークエンシングした。次いで、該配列を用いて、ヘモタンパク質ファニリーの受容体に共通のモチーフをチェックする。
0003949715.tif 000009
実施例３
逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応
１μｇのポリＡ＋細胞質ＲＮＡを用い、第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＦ８．３）、２０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）15および２５ユニットのＡＭＶ逆転写酵素［ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ，マンハイム，ドイツ］からなる溶液２０μｌ中、４２℃で６０分間、逆転写を行った。逆転写酵素を反応液から除く以外は同条件下にて、各ＲＮＡサンプルに対してコントロール反応を行った。逆転写反応混合物を水１００μｌで希釈し、５μｌを用いて、各ＰＣＲ反応を行った。２００μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマーおよび２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ［ベーリンガー・マンハイム，マンハイム，ドイツ］を含む反応緩衝液［ベーリンガー・マンハイム，マンハイム，ドイツ］５０μｌ中でＰＣＲ反応を行った。ＩＬ−１１受容体α鎖（Ｎｒ１）ｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー（ヘモタンパク質受容体ファミリーの他のメンバーをもつ相同体Ｙ由来）は、少なくともひとつのイントロンをもつことが予測された。これらのオリゴヌクレオチドは＃４４９および＃２８５（ヌクレオチド１３３〜１５６およびヌクレオチド６７７〜６６１；図１；表２）であるが、一方ＧＡＰＤＨｃＤＮＡプライマーの増幅には、＃４９５および＃４９６を用いた（表２）。パーキン・エルマー・セッタス・サーマル・サイクラー（パーキン・エルマー・セッタス，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、９４℃で２分間を３０サイクル；６０℃で２分間；および７２同条件下で３分間、ＰＣＲを行った。反応混合物のアリコートを、１．０％ｗ／ｖアガロースゲル上での電気泳動に付し、ＤＮＡをズィータプローブ膜に移した。リードおよびマン（１９）の記載に基づいてサザンブロット法を行った。末端標識オリゴヌクレオチド（ＩＬ−１１受容体α鎖に対して＃４８９およびＧＡＰＤＨに対して＃７４１；表２）を用いてハイブリダイゼーションを行った。
実施例４
発現の構築
Ｎｒ１３０．３を用いて３０ｆｌおよび３０ｒｌ（表２）をプライマーとするＰＣＲを行い、小さな５’または３’非翻訳領域を含むｃＤＮＡを生産した。ＢｓｔＸＩアダプター［インビトロゲン，ＣＡ，ＵＳＡ］を用い、該ＰＣＲ産物をｐＥＦ−ＢＯＳ（２１）のＢｓｔＸＩサイトへクローニングした。ｃＤＮＡ挿入物の両鎖についてシークエンシングを行った。ヒトＬＩＦ受容体およびマウスｇｐ１３０をコードするｃＤＮＡもｐＥＦ−ＢＯＳ中にサブクローニングした。トランスフェンクト前に、ｐＥＦ−ＢＯＳ中の受容体ｃＤＮＡをＡａｔＩＩで切断して線状にした。ＰＧＫプロモーターから転写された選択可能なマーカーであるプロマイシントランスフェラーゼ（ｐＰＧＫpuropＡ）およびネオマイシントランスフェラーゼ（ｐＰＧＫpneopＡ）をコードするｃＤＮＡおよびβ−グロブリン３’−非翻訳領域を含むｐＢluescript誘導体をＳcaＩで切断して線状にした。
実施例５
細胞トランスフェクション
電気穿孔によって細胞を安定にトランスフェクトさせた。簡略に述べると、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５×１０6個／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁させた。４×１０6個の細胞を、ＢｓｔＸＩサイトへクローニングされたＮｒ１，ｇｐ１３０またはＬＩＦ受容体を含むかまたは含まないｐＥＦ−ＢＯＳ２０μｌおよび選択可能なマーカーｐＰＧＫpuroまたはｐＰＧＫneoとともに、０．４ｍｍの電気穿孔キュベットに配した。氷上で１０分間ＤＮＡおよび細胞をインキュベートし、バイオーラド・ジーン・パルサー［バイオーラド・ラボラトリーズ，ＣＡ，ＵＳＡ］を用いて２７０Ｖおよび９６０μＦにて電気穿孔した。細胞を培養培地１ｍｌと混合し、ＦＣＳ３ｍｌとともに遠心分離し、培養培地１００ｍｌに再懸濁した。次いで、細胞を２４ウエルのディッシュに配した。２日後、１．２ｍｇ／ｍｌの濃度のジェネチシン（geneticin）、Ｍ１細胞に対して４０μｇ／ｍｌの濃度、Ｂａ／Ｆ３細胞に対して５μｇ／ｍｌの濃度のプロマイシンの添加によって選択を開始した。１０〜１４日後、増殖した細胞のクローンをフラスコに移し、膨張させた後、受容体の発現についてテストした。
実施例６
サイトカイン
マウスＩＬ−３およびＩＬ−１１をペプロテック［ＮＪ，ＵＳＡ］から購入し、ｐＧＥＸシステムを用いてヒトＬＩＦおよびヒトＯＳＭを生産した［本質的に（２５）の記載に基づいて］。
実施例７
生物学的アッセイ
Ｌｕｘ６０マイクロウエルＨＬ−Ａプレート［ナンク・インコーポレイテッド，ＩＬ，ＵＳＡ］を用い、サイトカインに応答したＢａ／Ｆ３細胞の増殖を測定した。２０％ｖ／ｖの新生児ウシ血清を含むＤＭＥ中で細胞を３回洗浄し、同じ培地に２×１０4個／ｍｌの濃度で再懸濁させた。３μｇ／ｍｌの精製組換えＩＬ−３、ＩＬ−１１またはＬＩＦもしくはＩＬ−６および５００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６受容体α鎖を含む連続希釈液５μｌとともに細胞懸濁物のアリコートを培養ウエルに配した。空気中に１０％ｖ／ｖのＣＯ2を含む完全湿潤インキュベーター内で３７℃にて２日間インキュベートした後、反転顕微鏡を用いて生存細胞を計数した。
サイトカインに応じたＭ１細胞の差異をアッセイするために、３００個の細胞を、２０％ｖ／ｖＦＣＳ，０．３ｖ／ｖ寒天およびＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＬＩＦあるいはＯＳＭの連続希釈液０．１ｍｌ付加したＤＭＥ１ｍｌを入れた３５ｍｍのペトリ皿で培養した。空気中に１０％ｖ／ｖのＣＯ2を含む完全湿潤雰囲気中、３７℃で７日間培養した後、Ｍ１細胞のコロニーを計数し、分散細胞を含んでいるかあるいは緊密に密集した中心部の周りの冠状の分散細胞を含んでいるかを区別して分類した。
実施例８
ＩＬ−１１との結合の実験
５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）、０．０２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０および０．０２％ｗ／ｖナトリウムアジド，ｐＨ７．４に、ＩＬ−１１を１００μｇ／ｍｌの濃度で溶かした。ボルトンおよびハンターの方法（２４）にしたがってＩＬ−１１を放射標識した。簡略に述べると、１５０ｍＭのホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５、２０μｌ中、室温にてモノヨウ化ボルトン−ハンター試薬［ニュー・イングランド・ニュクリア，ＭＡ，ＵＳＡ］を加え、２μｇのＩＬ−１１をインキュベートした。２時間後、同じ緩衝液中の１Ｍグリシン１００μｌを反応物に加えて反応を停止し、０．０２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０および０．０２％ｗ／ｖナトリウムアジドを含むＰＢＳで平衡化したプレパックセファデックスＧ−２５カラム［ＰＤ−１０；ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン］を用い、非結合のボルトン−ハンター試薬から標識されたタンパク質を分離した。該125ＩＬ−１１を使用する前に、０．０２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０および０．０２％ｗ／ｖナトリウムアジドを含む５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５で１０倍に希釈し、同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−４Ｂの２５０μｌカラム［ＰＤ−１０；ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン］に供した。カラムを５ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、１０％ｖ／ｖＦＣＳを含むＤＭＥの５ｍｌアリコートで連続溶離した。この段階で、前述の方法（２１）で125Ｉ−ＩＬ−１１調製物をアッセイしたところ、約８０％であった。125Ｉ−ＩＬ−１１の特異的放射活性は約１３００００ｃｐｍ／ｎｇであり、これは自己置換分析法（２２）によって測定した結果である。
本質的に前述の方法（２２）にしたがって結合実験を行った。簡略に述べると、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４および１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＲＨＦ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地４０μｌ中、５×１０3〜２×１０6ｃｐｍの125Ｉ−ＩＬ−１１とともに、１００倍過剰の非標識ＩＬ−１１の存在または不在下で、５×１０5〜１．５×１０7個の細胞を氷上で一夜インキュベートした。他の実験では、一定量の125Ｉ−ＩＬ−１１および増加量の非標識ＩＬ−１１または非標識ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＬＩＦ，ＯＳＭまたはＧＣＳＦで受容体を飽和させた。１８０μｌのウシ胎児血清とともに急速遠心分離を行って、細胞に結合した125Ｉ−ＩＬ−１１と遊離の125Ｉ−ＩＬ−１１とを分離し、γ−カウンターを用いて定量した。
実施例９
配列の類似性に基づいたサイトカイン受容体のクローニング
ヘモタンパク質受容体ファミリーのメンバーは、相対的に低レベルの配列類似性を示す。このファミリーの受容体の特徴のひとつは、５個のアミノ酸からなるモチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）である（１５，１６，１７）。新規ヘモタンパク質受容体のクローニングを試みて、成体マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得た１０6個のプラークを、ＷＳＸＳＷモチーフに対応する縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。第１フィルター上で２回行った結果陽性であったλ−バクテリオファージのプラークをとり、溶離し、プラーク肥大を連続して２ラウンド行って単離した。次いで、純粋なハイブリッド形成プラークのシークエンシングを行った。
この技術は、マウスＬＩＦ受容体、ＩＬ−７受容体、ｇｐ１３０および本明細書において“Ｎｒ１”と呼ぶヘモタンパク質受容体ファミリーのメンバーに関連性を示す新規配列をコードする数個のｃＤＮＡの同定において有用であった。この新規受容体をコードするｃＤＮＡ（Ｎｒ１−ＡＺ−３６）の完全なシークエンシングを行ったところ、ポリアデニル化シグナルおよび伸長ポリＡテールが含まれていたが、５’末端で明らかに端を切断されていた（図１）。
実施例１０
全長Ｎｒ１ｃＤＮＡの単離および新規サイトカイン受容体の特徴解明
全長Ｎｒ１ｃＤＮＡを単離するために、オリジナルのライブラリーおよび第２の成体マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、Ｎｒ１−ＡＺ−３６クローンの５’末端から設計されたオリゴヌクレオチドでスクリーニングした（＃２６および＃６０；表２）。８個のｃＤＮＡクローンを単離し、４個を完全にシークエンシングした（図１）。ｃＤＮＡ配列の分析により、長さが４３２アミノ酸であるタンパク質をコードする１２６９ｂｐのオープンリーディングフレームが明らかになった。予測一次配列は潜在性疎水性リーダー配列（１〜２３残基）、２つの潜在性Ｎ結合グリコシル化サイトを含む細胞外ドメイン（２４〜３６７残基）、膜貫通ドメイン（３６８〜３９３残基）およびショート細胞質テール（３９４〜４３２残基）を包含した。成熟受容体のコア分子量は約３６００ダルトンであることが初期に算出されている。
細胞外ドメインは、１００個のアミノ酸サブドメイン（ＳＤ１００）に先立つプロリン残基、４つの保存されたシステイン残基、一連の極性および疎水性残基およびＷＳＸＷＳモチーフを含む古典的ヘモタンパク質ドメイン（Ｄ２００；１５）（図１および図２）に特徴的な残基を含んでいた。新規受容体のヘモタンパク質受容体ドメインは、膜貫通ドメインの前にある８７個のアミノ酸免疫グロブリン様ドメインとそれに続く３７個のアミノ酸のあとに存在した。その全構造とその一次配列（図２）に関しては、新規受容体はＩＬ−６受容体α鎖（アミノ酸同一性は２４％）、ＣＮＴＦ受容体α鎖（アミノ酸同一性は２２％）およびＩＬ−１２のｐ４０サブユニット（アミノ酸同一性は１６％）に最も類似していた。
実施例１１
Ｎｒ１ｍ ＲＮＡの発現
Ｎｒ１ｍ ＲＮＡの発現の分布をノーザンブロット法および逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応を用いて分析した（ＲＴ−ＰＣＲ）。１５の一次組織サンプルおよび１７の細胞系由来のポリアデニル化ＲＮＡの調査中に、前脂肪細胞系３Ｔ３−Ｌ１由来のＲＮＡのみが、ノーザンブロットにおいて長さ約２．０ｋｂの検出可能なハイブリッド形成バンドを呈した。これは、単離された最長Ｎｒ１ ｃＤＮＡの長さ約１６５０ｂｐに匹敵し、このクローンが５’末端で完了しないことを示唆する。
ノーザンブロットから示唆されたＮｒ１ ｍＲＮＡの発生量の低さから、より感受性の高い検出手段としてのＲＴ−ＰＣＲの使用に想到した。３Ｔ３−Ｌ１のみであるが、すべてのサンプルが、ＲＴ−ＰＣＲによって判断されるように、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡを含んでおり、間質細胞Ｂａｄ、胚癌細胞系ＰＣ１３および因子依存性ヘモタンパク質細胞系ＦＤＣＰ−１およびＤ３５はＮｒ１ ｍＲＮＡを発現した（図３）。ヘモタンパク質組織骨髄、脾臓および胸腺ならびに肝臓、脳、心臓、腎臓、筋肉および唾腺を含む広範囲の一次組織もまた陽性であった（図３）。数種の細胞系および組織由来のｍＲＮＡサンプルにおいて、Ｎｒ１の転写物は検出できなかった。このようなネガティブな結果は、ｍＲＮＡ分析のための、より一層定量的なアプローチを用いる確認を必要とする。コントロール実験では、逆転写に付されなかったｍＲＮＡにおいてＰＣＲを行った。これらのサンプルではＮｒ１産物は検出されなかった。
実施例１２
Ｎｒ１はＩＬ−１１に対する低親和性受容体であり、ｇｐ１３０と相互作用して高親和性のＩＬ−１１受容体を生産する
ＩＬ−６およびＣＮＴＦ受容体α鎖との配列類似性および３Ｔ３−Ｌ１細胞における発現という事実によって、Ｎｒ１が、ｇｐ１３０および／またはＬＩＦ受容体と相互作用してシグナルトランスダクション可能な高親和性の受容体を生産する受容体α鎖であることが論証された。ＬＩＦ，ＯＳＭおよびＩＬ−１１については、構造的にＩＬ−６受容体α鎖に類似した受容体α鎖について記載されたものがこれまでにないので、これらのサイトカインは、Ｎｒ１の同起原のリガンドとして魅力的な候補者である。
ＬＩＦ，ＯＳＭまたはＩＬ−１１が新規受容体に結合するかどうかを試験するために、因子依存性ヘモタンパク質細胞系Ｂａ／Ｆ３およびマウス白血病細胞系Ｍ１を、Ｎｒ１をコードするｃＤＮＡを含むベクターＥＦ−ＢＯＳに安定にトランスフェクトさせた。親Ｍ１細胞は、ＬＩＦ受容体およびｇｐ１３０を発現し、したがって125Ｉ−ＬＩＦおよび125Ｉ−ＯＳＭを結合した。Ｍ１細胞においてＮｒ１が発現しても、125Ｉ−ＬＩＦあるいは125Ｉ−ＯＳＭのいずれかとも結合しなかった。これとは逆に、Ｂａ／Ｆ３細胞はＬＩＦ受容体もｇｐ１３０も発現せず、125Ｉ−ＬＩＦおよび125Ｉ−ＯＳＭとの結合は、親Ｂａ／Ｆ３細胞またはＮｒ１発現細胞のいずれにおいても観察されなかった。
親Ｍ１またはＢａ／Ｆ３細胞においては、125Ｉ−ＩＬ−１１の結合を検出することはできなかった（図４ＡおよびＣ）。しかし、驚いたことには、各タイプの細胞において、Ｎｒ１が発現することにより、125Ｉ−ＩＬ−１１を結合する能力が獲得されることから、Ｎｒ１がＩＬ−１１受容体のα鎖であることが示唆された。
飽和結合等温線のスキャッチャード形質転換によって、ＩＬ−１１の受容体に対する親和性が２つの細胞タイプの間で相違することが示された（図４Ａ対４Ｃ）。125Ｉ−ＩＬ−１１のＮｒ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞に対する結合は、非常に親和性が低かった。この相互作用の見かけの平衡解離定数（ＫD）は、約１０ｐＭであると算出され、細胞はその表面に平均２０００〜８０００の受容体を発現した（図４Ａ）。Ｎｒ１ ｃＤＮＡをトランスフェクトされたＭ１細胞は、同じ程度の数のＩＬ−１１受容体を発現したが（図４Ｃ）、相互作用の親和性は、より高かった（ＫD＝４００〜８００ｐＭ）。Ｎｒ１をトランスフェクトされたＭ１細胞上に発現したＩＬ−１１受容体の親和性は、天然に３Ｔ３−Ｌ１細胞上に発現した受容体と同定度であった（図４Ｄ）。
Ｎｒ１が発現される細胞のタイプに依存して低親和性あるいは高親和性の受容体が生じることに対するひとつの説明は、Ｎｒ１それ自身は本質的にＩＬ−１１に対する親和性が低いけれども、Ｍ１細胞が、高親和性複合体の生産に必要な過剰の追加の受容体成分を発現するというものである。ｇｐ１３０に対する抗体を中和すると、ＩＬ−１１誘発性ＴＦ−１増殖が阻害されるが、このことは、ＩＬ−１１受容体シグナルトランスダクションにおけるｇｐ１３０の役割に関する間接的な証拠である。この提案を直接的に試験するために、ｇｐ１３０および／またはＬＩＦ受容体を、親Ｂａ／Ｆ３細胞またはＮｒ１発現Ｂａ／Ｆ３細胞において発現させた。
親Ｂａ／Ｆ３細胞およびｇｐ１３０ならびにＬＩＦ受容体を（単独または組み合わせて）発現するＢａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−１１を結合しなかった（図４ＡおよびＢ）。Ｎｒ１およびＬＩＦを発現するＢａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−１１受容体α鎖を単独で発現する細胞から区別することが不可能である非常に低い親和性でＩＬ−１１を結合した（図４Ａ）。逆に、ｇｐ１３０とＮｒ１がＢａ／Ｆ３細胞においてともに発現するとき、ＩＬ−１１に対する親和性が高い受容体が生産された（図４Ｂ）。これらの受容体の親和性は、ＩＬ−１１受容体α鎖を発現する３Ｔ３−Ｌ１およびＭ１細胞によって発現された受容体の親和性に類似していた（図４Ｂ）。
Ｎｒ１は、ＩＬ−１１に特異的な受容体であるように思われる。125Ｉ−ＩＬ−１１のＮｒ１を発現するＢａ／Ｆ３細胞に対する結合は、非標識ＩＬ−１１によって競合されたが、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭあるいはＩＬ−３では競合されなかった（図５）。さらに入り組んだ状況が、Ｎｒ１がｇｐ１３０およびＬＩＦ受容体とともに発現される細胞において存在する。Ｎｒ１およびｇｐ１３０を発現するＢａ／Ｆ３細胞に対する125Ｉ−ＩＬ−１１の結合は、ＯＳＭおよび非標識ＩＬ−１１によって競合されるが（図５）、Ｎｒ１、ｇｐ１３０およびＬＩＦ受容体を発現するＮｒ１細胞への結合は、ＬＩＦならびにＯＳＭおよびＩＬ−１１によって競合される（図５）。
実施例１３
ＩＬ−１１受容体α鎖およびｇｐ１３０の共発現は、ＩＬ−１１に対する増殖性および分化誘導性応答を引き起こす
多くのサイトカインが、細胞分化誘導ならびに細胞分裂において影響を及ぼす。分化誘導性の刺激がなければ、親の白血病Ｍ１細胞のコロニーは、堅く固まり、未分化の幼若細胞で構成される。ＩＬ−１１ではなくて、ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＩＬ−６に応答して、半固体寒天上で成長するＭ１コロニーは、マクロファージ分化誘導が導入されるために分散するようになる（図６Ａ）。さらに、ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＩＬ−６は、Ｍ１細胞のクローン原性を抑制し、その結果コロニー数の減少が促進される。ＩＬ−１１受容体α鎖を発現するＭ１細胞は、ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＩＬ−６に対して正常の応答を示したが、ＩＬ−１１で刺激するとマクロファージに分化誘導された（図６Ｂ）。ＬＩＦ、ＩＬ−６およびＯＳＭの場合は、ＩＬ−１１の存在下にＮｒ１を発現するＭ１細胞が生産するコロニーは、コントロール培養物よりも数が少なく、これらのコロニーの含む細胞数は、より少ない。
ＩＬ−３依存性ヘモタンパク質細胞系Ｂａ／Ｆ３を用い、種々のサイトカイ受容体の増殖性シグナル導入能力の研究を行った。Ｂａ／Ｆ３細胞は、その増殖においてＩＬ−３に絶対的に依存性があるが、ＩＬ−１１、ＬＩＦあるいはＩＬ−６に応答して増殖することはない。したがって、Ｎｒ１、ｇｐ１３０およびＬＩＦ受容体が、これらの細胞が応答しうるサイトカインのスペクトルを広げるかどうかを測定した。ＩＬ−６単独に対して応答して増殖することができた細胞系はなかったが、他の受容体が共発現するか否かにかかわりなく、ｇｐ１３０を発現する細胞系は、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体α鎖の組み合わせに応答して増殖した（図７）。ＬＩＦに応答した増殖は、ＬＩＦ受容体とｇｐ１３０の共発現を必要としたが（図７）、これらの細胞は、ＩＬ−１１に応答して増殖することはできなかった。同様に、Ｎｒ１単独またはＮｒ１とＬＩＦ受容体を発現するＢａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−１１に応答することはできなかった。ＩＬ−１１への応答は、Ｎｒ１およびｇｐ１３０の共発現を必要とした（図７）。これらの細胞の半最大増殖は、ＩＬ−１１の濃度が２０〜１００ｐｇ／ｍｌにおいて生じた。ＬＩＦ受容体の発現は、Ｎｒ１およびｇｐ１３０を加えても、その応答は変化しなかった（図７）。
実施例１４
ヒトＩＬ−１１ｒαのクローニング
マウス受容体との相同性に基づいてヒトＩＬ−１１ｒαをクローニングする可能性を検定するために、マウスＩＬ−１１ｒαｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用い、マウスおよびヒトのゲノムＤＮＡの分析を行った（方法に関しては実施例１３を参照）。図１０Ａは、高ハイブリダイゼーション緊縮条件下（０．２×ＳＳＣ，６５℃）で試験した場合の、マウスＤＮＡにおける４．８ｋｂと比較した、ヒトＤＮＡにおける１４ｋｂの特異的バンドを示す。
次いで、同じマウスプローブ（４５ｂｐのＳｐｈＩ／ＳａｃＩフラグメント）を用い、５つのヒトｃＤＮＡライブラリー由来の約１０6個のプラークをスクリーニングした。このライブラリーは、２つの成熟骨髄ライブラリー［２７；クローンテック，カタログ番号ＨＬ１０５８ａ］およびヒト胎盤由来のライブラリー［クローンテック；カタログ番号ＨＬ１００８ｂ］、肝臓［クローンテック；カタログ番号ＨＬ１００１ａ］およびヘパトーム細胞系［クローンテック；カタログ番号ＨＬ１０１５ｂ］であった。陽性プラークを単離し、ハイブリダイゼーション−スクリーニングを連続的に繰り返して精製した（方法に関しては実施例１７を参照）。成熟骨髄ライブラリーおよび胎盤ライブラリーそれぞれから、およそ３０個の陽性クローンが得られた。この組織からマウス受容体が単離されるにもかかわらず（前記実施例を参照）、肝臓あるいはヘパトームライブラリーからは陽性クローンは同定されなかった。ＰＣＲに基づいた方策による陽性プラークの試験も行った；マウスＷＳＸＷＳモチーフをコードするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびクローニングサイトに隣接した領域におけるベクター配列から誘導される適当なオリゴヌクレオチドプライマーで開始されるＰＣＲ反応における鋳型としてプラーク溶出液を用いた。詳細な特徴付けは、骨髄ライブラリー由来の３つのクローンを最初に選んで行った。ヒトｃＤＮＡからの切断フラグメントを用いるサザンブロット分析によって、マウスＩＬ−１１ｒαを用いて検出されたバンドと等価のバンドが同定されたことによって、ヒトｃＤＮＡの同定が完了した（図１０Ｂ）。これらの各クローン（＃９．１，＃４．３，＃８．２）由来の挿入物のヌクレオチド配列を両方向に向かってシークエンシングした。＃９．１のクローン由来の挿入物を用いて骨髄ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするためのプローブを作成し、他の独特のクローン（＃１７．１，図１１）の同定を行う。このクローンのヌクレオチド配列もまた両方向に向かってシークエンシングする。
実施例１５
ヒトＩＬ−１１ｒαの配列分析
図１１に示したように、＃９．１および＃４．３クローンは不完全であったが、＃８．２および＃１７．１クローンは完全なコードィング領域を含んでいた。＃８．２および＃１７．１クローンは２８７ｋｂのイントロン配列を含み、＃４．３および＃８．２クローンは２５４ｋｂのイントロン配列を含んでいた。これらの配列はゲノムＤＮＡクローンの分析によってイントロンが確認され、典型的なスプライス供与−受容部位配列を呈し、ｍＲＮＡの不完全スプライシングに帰するものであった。図８は、４個のＩＬ−１１ｒαクローンからシークエンシングされた混成のヌクレオチド配列を示す。該配列は、３個のクローンに存在する１２７ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびポリアデニル化シグナルとポリＡテールを含む３’ＵＴＲを含んでいた。４３２個のアミノ酸（ａ．ａ．）のタンパク質をコードすると予測される１２６９ｂｐのオープンリーディングフレームがあった。予測タンパク質は、潜在的に疎水性のリーダー配列（１〜２３ａ．ａ．）、細胞外領域（２４〜３６６ａ．ａ．）、膜貫通ドメイン（３６７〜３９２ａ．ａ．）および細胞質テール（３９３〜４２３ａ．ａ．）を含んでいた。細胞外ドメインは、２つのＮ結合グリコシル化可能サイトを含んでいた（図８）。マウスＩＬ−１１ｒα（前記実施例参照）に見られるように、および他サイトカイン受容体（１５；２８）にも共通して、ヒトＩＬ−１１ｒαは細胞外領域に免疫グロブリン様ドメインおよびヘモタンパク質ドメイン（Ｄ２００，図８）を呈していた。後者は１００ａ．ａ．である２つのサブドメイン（ＳＤ１００，図８）からなり、各ドメインに先立った位置のプロリン残基、４つの保存されたシステイン残基、ＷＳＸＷＳモチーフの一連の極性および疎水性残基を含んでいた。変化しうるアミノ酸“Ｓ”は、ヒト受容体ではトレオニンとして同定されたが、マウス等価物ではアラニンであった（前記実施例参照）。
同じライブラリーから単離されたクローン間にいくつかの差異があった。＃４．３クローンにおけるヌクレオチド置換
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の結果、異なるアミノ酸残基
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となっていた。＃４．３クローンおよび＃１７．１＃クローンは、＃８．２クローンとは、コード領域において、ヌクレオチド置換において相異した
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が、それにともなうタンパク質の変化はなかった。また、＃１７．１＃クローンおよび＃８．２クローンは、３’ＵＴＲにおけるひとつの置換
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で相異した。これらの差異は、多型の表現として解釈した。
マウスおよびヒトＩＬ−１１ｒα鎖の配列を比較すると、高度の相同性が示された（図１２）。全部で核酸レベルで８５％、タンパク質レベルで８４％の同一性があった。相同性は、細胞外および膜貫通領域において、一層明らかであり、ヒト受容体の方がマウスの等価物よりも８アミノ酸だけ短い細胞質テールでは相対的に少なかった。同定可能なチロシンキナーゼ様ドメインを含むタンパク質はなかった。
実施例１６
ヒトＩＬ−１１受容体α鎖の発現の結果、ヒトＩＬ−１１の特異的結合が行われ、ＩＬ−１１シグナリングが起こる
マウス骨髄白血病細胞系Ｍ１（２９）は、ＬＩＦ、ＩＬ−６、ＯＳＭ、およびＩＬ−１１に対するシグナリング分子であるマウスｇｐ１３０を本質的に発現する。ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＩＬ−６に応答して、半固体寒天中の親Ｍ１細胞のコロニーはマクロファージへの細胞分化誘導体として分散するようになり、寒天中を移動する能力を獲得する。さらに、コロニー数を減少させるクローン原性の抑制がある。マウスＩＬ−１１ｒαを発現するように処理されたＭ１細胞は、ＩＬ−１１との特異的結合を示し、ＩＬ−１１に応答して分化誘導された（前記実施例参照）。ヒトＩＬ−１１ｒαは、哺乳類発現ベクターＥＦＢＯＳを用いてマウスＭ１細胞において発現された（３０；実施例１５）。ＩＬ−１１が特異的にこれらの細胞に結合するかどうかを試験するために、125Ｉ−標識ヒトＩＬ−１１を用いる結合の研究を行った（方法に関しては実施例１５を参照）。表３に示すように、ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するように処理されたＭ１細胞（プール＃１〜＃４）は、ヒトＩＬ−１１の有意な特異的結合を示した。陽性コントロール細胞、Ｍ１細胞およびマウスＩＬ−１１ｒαを発現しているＢａ／Ｆ３細胞およびマウスｇｐ１３０（前記実施例参照）もまた、高レベルの結合を示した。予測されたように、親Ｍ１細胞では検出可能なＩＬ−１１の特異的結合は示されなかった。ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞へのＩＬ−１１の結合の飽和等温線のスキャッチャード分析から、高い親和性の結合が確認された（図１３）。みかけの平衡解離定数（Ｋd）を算出すると２５０ｐＭであった。これらの細胞は、その表面に平均３１９０個の受容体を発現した。この結果はマウスＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞（Ｋd＝２７５ｐＭ、および４８１５受容体／細胞）に匹敵し、ヒトＩＬ−１１ｒαとマウスｇｐ１３０との相互作用に帰するものであった。
表４は、ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞の寒天培養実験の結果をまとめたものであり、該細胞のＬＩＦおよびＩＬ−１１への応答を示す。上述したように、マウスＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞は、クローン形成が抑制され、ＩＬ−１１に応答してマクロファージ分化誘導が起こった。逆に、中枢親Ｍ１細胞は、ＩＬ−１１に応答しなかった。ＩＬ−１１で処理したときにヒトＩＬ−１１ｒαを発現するように処理されたＭ１細胞の４つのプールは、クローン原性の目覚ましい抑制が示された（表４）。さらに、ＩＬ−１１で成長するコロニーでは少しのコロニーしか分化誘導表現型を示さなかった。すべての細胞系が予期されるＬＩＦに対する応答を示した。
ＩＬ−１１およびＬＩＦに応答したマクロファージ分化誘導を評価するために、懸濁培養において、ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞およびコントロール細胞の検定も行った（３１；３２）。５日間の培養後にマクロファージの形態を評価した。図１３に示されるように、大部分の細胞がＩＬ−１１の刺激に応答して、マクロファージ表現型を呈した。マウスＩＬ−１１ｒαを発現するＭ１細胞についても同様な結果が観察されたが、親Ｍ１細胞はＩＬ−１１に応答しなかった。したがって、これらの実験によって、単離したヒトｃＤＮＡの、機能的受容体タンパク質をコードする能力が証明され、ヒトＩＬ−１１ｒαおよびマウスｇｐ１３０の間の共同作動によってシグナルトランスダクションが可能になることが明らかになった。
ｇｐ１３０のの必要条件をヒトＩＬ−１１受容体シグナリングへ直接的に伝えるために、マウスＢａ／Ｆ３細胞を検定した。これらの細胞は全体としてＩＬ−３にその生存を依存しており、本質的にｇｐ１３０を発現しない。Ｂａ／Ｆ３細胞をヒトＩＬ−１１ｒαを発現するように処理し、共電気穿孔されたプロマイシン耐性遺伝子の発現に基づいて増殖させた。３個のクローン細胞系ができた。放射標識ヒトＩＬ−１１の結合によって評価されたように、これらは、低レベルにもかかわらず、ヒトＩＬ−１１ｒαを発現することが確認された［１０６；９７；１１６；１０6個の細胞当たりの結合された平均の特異的カウントｖｓ親Ｂａ／Ｆ３細胞に対する検出不可能な結合］。図１４に示されるように、これらの細胞は、ＩＬ−１１に対し、不応答であった。次いで、ヒトｇｐ１３０分子が、これらのクローン細胞系それぞれにおいて発現した。この結果から、Ｂａ／Ｆ３細胞におけるヒトＩＬ−１１ｒαの発現および増殖のためのｇｐ１３０に対する必要条件が確認された。コントロールとして用いた親Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−１１に応答せず、予期されるとおり、すべての細胞がマウスＩＬ−３に応答して増殖した。
実施例１７
ヒトライブラリーのスクリーニング
前記マウスプローブを用いて次のヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った：２つの骨髄ライブラリー（２７；クローンテック、カタログ番号ＨＬ１０５８ａ）、胎盤ライブラリー（クローンテック、カタログ番号ＨＬ１００８ｂ）、肝臓ライブラリー（クローンテック、カタログ番号ＨＬ１００１ａ）およびヘパトーム細胞ライブラリー（クローンテック、カタログ番号ＨＬ１０１５ｂ）。各ライブラリーから約１０6個のプラークをニトロセルロース膜に乗せ、真空下で２時間、８０℃にてインキュベートして固定した。フィルターを１時間プレハイブリダイズし、次いで、２×ＳＳＣ，２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌのフィコール，２ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリジン，１００μＭのＡＴＰ，５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ，２ｍＭのピロリン酸ナトリウム，２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ，２００μｇ／ｍｌのナトリウムアジドおよび１％ｗ／ｖのＳＤＳを含む溶液中、６５℃で１６時間ハイブリッド形成させた。最後にフィルターを３０分間６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。複写のフィルター上の陽性プラークを単離し、さらにハイブリダイゼーションスクリーニングを繰り返して精製した。
ヒトクローン＃９１．（図１１）にも標識をし、これをヒト骨髄ｃＤＮＡラリブラリー用のプローブとして用いた。
１５μｇのヒトゲノムＤＮＡ（末梢血管白血球から得たもの）およびマウスゲノムＤＮＡ（ＦＤＣＰ−１細胞系から得たもの）を制限酵素ＨindＩＩＩ［ベーリンガー・マンハイム，ドイツ］で完全に消化した。０．８％ｗ／ｖアガロースゲル上でＤＮＡ断片を分離し、０．４Ｍ ＮａＯＨを加えてナイロン膜［ジーン・スクリーン・プラス，バイオテクノロジー・システムズ，ＮＥＮリサーチ・プロダクツ］上に移した。
マウスＩＬ−１１ｒαクローン＃３０．１（前記実施例参照）由来の４４５ｂｐの制限酵素ＳｐｈＩ／ＳａｃＩ消化断片およびヒトｃＤＮＡクローン＃１７．１由来の制限酵素ＰｓｔＩ／ＳｂａＩ消化断片をプローブとして用いた。１００ｎｇのＤＮＡを、ランダム・デカヌクレオチド・ラベリング・キット［ブレーサテック，アデレイド，Ｓ．Ａ．，オーストラリア］を用いて標識した。結合した［32Ｐ］ＡＴＰを、ＮＩＣＫカラム（ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン）用い、結合した［32Ｐ］ＡＴＰを非結合の標識から分離した。膜をプレハイブリダイズし、次いで、製造者推薦の緩衝液中、６５℃で一夜ハイブリダイズした。最後に膜３０分間６５℃にて０．１％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭクエン酸トリナトリウム）で洗浄した。
実施例１８
ヒトＩＬ−１１α陽性プラークの分析
マウスのプローブを使用して単離した陽性プラークをさらにＰＣＲに基づいた方法によってスクリーニングした。純粋プラーク（５μl）からの溶出物を鋳型として２．５Ｕ Ｔaqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）、供給バッファー、２００μＭ  ｄＮＴＰ各々を使用して５０μlの容量のＰＣＲ反応において使用した。その反応は、２５０ngのＷＳＸＷＳのモチーフ
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に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーおよびそのクローニングされたｃＤＮＡをフランキングした適切なベクターオリゴヌクレオチドプライマーで開始した：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにはＴ３およびＴ７プロモータープライマーを、適切なγｇｔ１０およびγｇｔ１１をフォワードおよびリバースプライマーとして使用した。
その鋳型を欠如したコントロール反応をも行った。３つのプラーク（骨髄ライブラリーから単離された＃９１、４．３、８．２）を選択した。そのｃＤＮＡをジデオキシターミネーション法（１８）およびファルマシアＴ７ポリメラーゼシークエンシングキット（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて両鎖についてシークエンシングした。
実施例１９
ヒトＩＬ−１１ｒα発現構築物および生物学的アッセイ
全コーディング領域およびポリアデニル化シグナルを含むがイントロン配列は含まない合成ｃＤＮＡ構築物を＃９．１（Ｅｃｏ ＲI／Ｐｓｔ Ｉ断片）および＃１７．１（Ｐｓｔ Ｉ／Ｅｃｏ ＲI断片）からの制限酵素消化断片をライゲーションすることによって作成した。その構築物をＢｓｔ Ｉアダプター（インビトロゲン、サン・ディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いてｐＥＦ−ＢＯＳ（３０）のＢｓｔ ＸI部位にクローニングした。それをＡａｔ IIで線状にし、Ｍ１およびＢａ／Ｆ３細胞にエレクトロポーレーションした。pＰＧＫｐｕｒｏｐＡおよびpＰＧＫｎｅｏｐＡはプロマイシントランスフェラーゼおよびネオマイシントランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ誘導体であり、細胞にコエレクトロポレーションしついで選択マーカーとして使用した。ｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングしたヒトｇｐ１３０をヒトＩＬ−１１ｒαを発現するよう操作したＢａＦ３細胞にエレクトロポレーションした。Ｍ１細胞（２９）を３７℃、１０％ｖ／ｖＣＯ2中で１０％ｖ/ｖウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて増殖させた。Ｂａ／Ｆ３細胞をＩＬ−３（３４）の源と同様、１０％ v/v ＦＣＳおよびＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ-条件化（Ｄ-conditioned）培地を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。ヒトＩＬ−１１ｒα構築物を安定に発現するＭ１およびＢａ／Ｆ３細胞を上記のようにエレクトロポレーションによって生成した。細胞をｐＰＧＫＰｕｒｏｐＡとエレクトロポレーションした。ヒトＩＬ−１１ｒαを発現するＢａ／Ｆ３細胞をプロマイシン抗生物質選択で膨張させ、ヒトｇｐ１３０をｐＰＧＫｎｅｏｐＡに導入した。これらの細胞をＧ４１８中で膨張させた。
生物学的アッセイについて、Ｍ１細胞（３００／ml）をヒトＩＬ−１１（１０００Ｕ／ml）またはマウスＬＩＦ（１０００Ｕ／ml）または通常の生理的食塩水と、ＤＭＥＭ、２０％ v/v ＦＣＳ、０．３％ w/vアガー中で培養した。培養物を３７℃、１０％ ｖ／ｖＣＯ2を含む湿潤大気中でインキュベートした。７日後、コロニー数を数え、分化を標準的基準（３５）を使用して評価した。懸濁培養物中において、１．５×１０4Ｍ１細胞を１０％ v／v ＦＣＳおよびＩＬ−１１（１０００Ｕ／ml）を含むまたはＩＬ−１１（１０００Ｕ／ml）を含まず、またはＬＩＦ（１０００／ml）を含むＤＭＥＭ １．５mlにて培養し、ついで上記のようにインキュベートした。メイ−グランウォルドギームザ染色細胞の形態学的検査によって分化を決定した：最小限の２００細胞を検査した。
Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を上記のようにマイクロウェルアッセイにおいて測定した。簡単には、２００細胞／ウェルを以下の刺激を含む１５μlの培地中でインキュベートした：通常の生理的食塩水、最終濃度１０００単位／mlのマウスインターロイキン−３（ＩＬ−３）およびヒトＩＬ−１１の連続希釈。生存細胞を４８時間後に数えた。
ボルトン−ハンタ−試薬を用いたＩＬ−１１のヨウ素化およびＭ１およびＢａ／Ｆ３細胞での結合実験を前に上記に記載したように行った。
実施例２０
サイトカインの出所
マウスＩＬ−３およびヒトＩＬ−１１をペプロテク（ロッキー・ヒル、ニュージャージー、米国）から、マウスＬＩＦおよびＡＭＲＡＤをプティ・リミテッド（メルボルン、オーストラリア）より購入した。リガンド結合実験において使用したヒトＩＬ−１１をＣＯＳ−Ｍ６細胞における発現によって得た。簡単には、ヒトＩＬ−１１の成熟タンパク質をコードするｃＤＮＡをヒトストローマ細胞株１９７／１７（３６）由来のｃＤＮＡからポリメラーゼチェーンリアクションによって得た。ヒトＩＬ−１１成熟コーディング領域をＦＬＡＧ配列（イーストマンコダック、コネチカット、米国）が続くマウスＩＬ−３シグナル配列をコードする配列を含む発現ベクター由来であるｐＥＦ−ＢＯＳ（３０）であるｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧに挿入し、ついでＮ末端フラッグを有する生物学的に活性なヒトＩＬ−１１タンパク質の分泌となるＣＯＳ−Ｍ６細胞にて発現させた。Ｎ末端フラッグヒトＩＬ−１１を製造者により推薦されるようにＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）上でのゲル濾過クロマトグラフィーの前にペプチド溶出を行い、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体カラム（イーストマンコダック、コネチカット、米国）にてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したタンパク質でＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にＭＷ ２５，０００の単一のバンドを得た。
実施例２１
ＩＬ−１１レセプターα鎖に対する抗体をモニター発現に利用できないので、構築物をＮ末端ＦＬＡＧエピトープ（インターナショナルバイオテクノロジーズ／イーストマンコダック、コネチカット、米国）を有するマウスＩＬ−１１レセプターα鎖の可溶性バージョンを発現させるよう操作した。最初に、哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳの誘導体を産生し、その結果それは、唯一Ｘｂａ Ｉクローニング部位が続く、マウスＩＬ−３のシグナル配列をコードするＤＮＡ
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およびＦＬＡＧエピトープ
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を含んだ。このベクターをｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧと名付けた。
膜貫通部位または細胞質領域（Ｓ２４〜Ｑ３６７）を含まない細胞外ドメインをコードするＤＮＡ断片の増幅を使用してＰＣＲを行った。その使用したプライマーは：
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可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖ＰＣＲ産物をＸｂａ Ｉで消化し、ついでｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧのＸｂａ Ｉ部位にイン・フレームでクローニングし、ｐＥＦ−ｓＩＬ−１１αを得た。
可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖がｐＥＦ−ＳＩＧ−１１ｒαを用いて産生され得ることを確かめるため、ＣＯＳ細胞を一時的にこれらの構築物とトランスフェクションした。簡単には、コンフルエント（confluent）１７５cm2組織培養フラスコからのＣＯＳ細胞をＰＢＳに再懸濁し、ついで０．４cmキュベット（バイオラド）中で非切断ｐＥＦ−ｓＩＬ−１１ｒα ２０μgでエレクトロポレーションした（バイオラド・ジーン・パルサー；５００μＦ、３００Ｖ）。２〜３日後、３７℃、大気中１０％ ｖ／ｖＣＯ2を含む完全に湿潤なインキュベーター中で細胞をタンパク質の発現の分析に使用した。条件化した培地を遠心分離によって回収し、４℃で無菌状態で保存した。
ついで培地を抗−ＦＬＡＧ抗体アフィニティーカラム（インターナションルバイオテクノロジーズ／イーストマンコダック、コネチカット、米国）上でコロマトグラフィーにかけた。カラムに結合できなかったタンパク質を、そのカラムに結合したマウスＩＬ−１１レセプターα鎖タンパク質はug／ml ＦＬＡＧペプチドの８mlで溶出されるが、ＰＢＳで洗い流した。その精製した可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、可溶性のマウスＩＬ−１１レセプターα鎖の推定の大きさ同様の約４０，０００の明らかな分子量の主要なバンドの存在を明らかにし、銀色に染めた。
その精製した可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖をＩＬ−１１の存在下または不在下でＭ１細胞の分化を刺激する能力を試験した。ＩＬ−１１および可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖は単独ではＭ１分化を刺激できなかったが、しかしながら、組み合わせると、分化は液状および半固体培養の両者において観察された。これらの結果は、可溶性マウスＩＬ−１１レセプターα鎖はアゴニストとして作用し、ＩＬ−１１を膜結合したＩＬ−１１レセプターα鎖の不在下でｇｐ１３０を発現する細胞に影響を及ぼすように努めることができるかもしれないと示している。この点で、可溶性ＩＬ−１１レセプターα鎖は可溶性ＩＬ−６レセプターα鎖と類似である。
当業者は本明細書に記載された発明が、具体的に記載されたもの以外の変化または変更を受け易いことを認識するであろう。本発明には、そのような変化および変更がすべて含まれることを理解すべきである。本発明はまた、本明細書に引用されているかまたは指示されている工程、特徴、組成および化合物のすべてを個別または集合的に含み、および該工程または特徴の任意の２以上のすべての組み合わせをも含む。
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配列表
（１）一般的情報
（i）特許出願人（米国以外）：アムラド・コーポレイション・リミテッド（米国のみ）：ダグラス・ジェイムズ・ヒルトン
（ii）発明の名称：新規ヘモポイエチン受容体
（iii）配列の数：２５
（iv）連絡先：
（Ａ）名宛人：デイビス・コリスン・ケイブ
（Ｂ）通り：リトル・コリンズ・ストリート１番
（Ｃ）市：メルボルン
（Ｄ）州：ヴィクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）ＺＩＰ：３０００
（v）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release＃１．０，バージョン＃１．２５
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＡＵ  Provisional
（Ｂ）出願日：１９９４年９月５日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ヒューズ・ドクター，イー・ジョン・エル
（Ｃ）参照／整理番号：ＥＪＨ／ＥＫ
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：＋６１ ３ ９２５４ ２７７７
（Ｂ）ファックス番号：＋６１ ３ ９２５４ ２７７０
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.1:
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（２）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７０５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：４５．．１３４０
（xi）配列：SEQ ID NO.2:
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（２）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４３２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：SEQ ID NO.3:
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0003949715.tif 000026
（２）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８００塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１２８．．１３９６
（xi）配列：SEQ ID NO.4:
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（２）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：SEQ ID NO.5:
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（２）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.6:
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（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.7:
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（２）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.8:
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（２）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.9:
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（２）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.10:
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（２）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.11:
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（２）配列番号１２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.12:
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（２）配列番号１３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.13:
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（２）配列番号１４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.14:
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（２）配列番号１５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.15:
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（２）配列番号１６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.16:
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（２）配列番号１７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.17:
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（２）配列番号１８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.18:
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（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.19:
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（２）配列番号２０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.20:
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（２）配列番号２１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.21:
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（２）配列番号２２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.22:
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（２）配列番号２３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.23:
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（２）配列番号２４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.24:
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（２）配列番号２５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ
（xi）配列：SEQ ID NO.25:
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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0003949715.tif 000063
0003949715.tif 000064
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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