(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤの含量が、飼料乾燥重量１００ｇあたり８０国際単位以下である飼料を非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することを特徴とする非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の繁殖能力の付与方法。
【請求項２】
ビタミンＤの含量が、飼料乾燥重量１００ｇあたり８０国際単位以下である飼料を非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することを特徴とする非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の寿命の延長方法。
【請求項３】
動物がマウスである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ビタミンＤの含量が、飼料乾燥重量１００ｇあたり８０国際単位以下である飼料を非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することを特徴とする非ヒトクロソ変異ホモ動物または非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の飼育方法。
【請求項５】
動物がマウスである請求項４記載の飼育方法。
【請求項６】
ビタミンＤの含量が、飼料乾燥重量１００ｇあたり８０国際単位以下である飼料を給餌することによって早期老化様症状が改善されているクロソ蛋白質を発現していない非ヒトクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物。
【請求項７】
動物がマウスである請求項６記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症の治療または予防方法および早期老化様症状が改善されているクロソ蛋白質を発現していないクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロソ変異マウスは黒尾ら（非特許文献１）によって挿入突然変異により樹立された、ヒトの早期老化症状に似た特徴を示す系統である。この変異は劣性遺伝で、ホモ個体は授乳期までは野生型およびヘテロ個体と同様な発育を示すが、離乳時期の３週齢以降、体重増加の滞り、寿命の短縮（約９週齢以下）、動脈中膜をはじめとする異所性の石灰沈着、骨密度の低下などの骨形成の異常、胸腺の萎縮、脳プルキンエ細胞の脱落、生殖腺の低形成による不妊、皮下脂肪や毛根の減少を伴う皮膚の希薄化、歩行など運動機能の異常、下垂体機能の異常など、多くの老化様の症状を呈し始める。これら全ては唯一クロソ遺伝子の発現を損なうことによってほぼ同時に起ることから、短い期間に多くの老化症状を単一のモデル系で観察できる。
【０００３】
このように、クロソ変異マウスのホモ個体の病態はヒトの早期老化様の症状を呈することから、クロソ遺伝子は、老化抑制遺伝子と認定されている。したがって、クロソ遺伝子あるいはクロソ蛋白質を増加または低下させることによって様々なクロソ遺伝子の関連する疾患の治療および予防が可能であると考えられている。
【０００４】
これまで、動物のクロソ蛋白質発現量を増加または低下させる方法は、該蛋白質をコードする遺伝子そのものやその発現調節領域の遺伝子をノックアウトするクロソ蛋白質発現量低下方法、クロソ蛋白質を発現する細胞の移植および遺伝子操作によるクロソ蛋白質発現量の増加方法が知られている。
また、クロソ変異マウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトマウスのホモ個体の病態はヒトの早期老化様の症状を呈することから、クロソ変異マウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトマウスのホモ個体は老化メカニズムの解明と老化を抑制または軽減する方法の重要な実験材料となる。
【０００５】
しかしながら、クロソ変異マウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトマウスのホモ個体は、寿命が短く老化メカニズムの解析と老化を抑制する方法に関する実験材料としては十分でない場合がある。特に加齢（成熟）した個体の老化モデル実験系は重要であるのにも関わらず未だ十分なものが提供されていない。
また、クロソ変異マウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトマウスのホモ個体は繁殖能力を欠くことから、その繁殖および系統の維持にはクロソ変異またはクロソ遺伝子ノックアウトヘテロ動物の雄雌同士の交配が必要である。それによって出産する子供の遺伝子型は野生型：ヘテロ：ホモの割合が1：２：１のメンデルの法則に一致したものになり、得られるホモ個体数は、子供の総数の１／４であり、十分でない。従って、医薬品開発や老化研究のために十分量のホモマウスを安定に供給する上で、繁殖の困難さが最大の障害となっている。また、３週齢前後までは遺伝子型の肉眼的識別は困難であることから、ホモ個体を同定するには各個体の遺伝子を分離して行なう煩雑なポリヌクレオチド連鎖反応（Polynucleotide Chain Reaction、PCR）法で遺伝子型を判定する必要がある。
【０００６】
これまで、二価の陽イオン金属を含有する化合物および／またはリンを含有する化合物を含む飼料を給餌することを特徴とする動物の老化に伴う疾患の治療または予防方法、二価の陽イオン金属を含有する化合物および／またはリンを含有する化合物を含むことを特徴とする動物またはヒトの老化に伴う疾患の治療または予防用の飼料または食品、二価の陽イオン金属を含有する化合物および／またはリンを含有する化合物を含む飼料を給餌することを特徴とする動物のクロソ蛋白質発現の調節方法、二価の陽イオン金属を含有する化合物および／またはリンを含有する化合物を含む飼料を給餌して得られるクロソ蛋白質発現量が調節された動物、クロソ変異ホモ動物に給餌することにより該クロソ変異ホモ動物の早期老化様症状の発症を抑制または軽減させることができる、クロソ変異ホモ動物用の飼料、該飼料を用いるクロソ変異ホモ動物の寿命を延長する飼育方法、クロソ変異ホモ動物の繁殖能力を付与する飼育方法、クロソ変異ホモ動物の繁殖方法、クロソ変異ホモ動物に特有の早期老化様症状の発症を抑制または軽減化する飼育方法、クロソ変異ホモ動物のクロソ蛋白質発現量を調節する方法、およびクロソ変異ホモ動物の疾患の治療または予防方法並びに該方法により得られるクロソ変異ホモ動物が知られている（非特許文献２）。
【０００７】
【非特許文献１】
ネイチャー（Nature）, 390, 45 (1997）
【０００８】
【非特許文献２】
国際公開特許第WO01-05244号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症の治療または予防方法および早期老化様症状が改善されているクロソ蛋白質を発現していないクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（１５）に関する。
（１) クロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することにより該クロソ変異ホモ動物もしくは該クロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症を治療もしくは予防するための、ビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制されたクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
【００１１】
（２) ビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制された飼料が、ビタミンＤの作用を抑制する物質を含有するものである請求項１記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
（３) ビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制された飼料が、ビタミンＤを含有しないかもしくはビタミンＤの含量が制限されたものである請求項１記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
【００１２】
（４) ビタミンＤの含量が、飼料乾燥重量１００ｇあたり８０国際単位以下である（１）〜（３）のいずれかに記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
（５) 二価の陽イオン金属を含有する化合物を含有する（１）〜（４）のいずれかに記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
【００１３】
（６) リンを含有する化合物含量が制限されたものである（１）〜（５）のいずれかに記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
（７) クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物がマウスである（１）〜（６）のいずれかに記載のクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料。
【００１４】
（８) （１）〜（７）のいずれかに記載の飼料をクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することを特徴とするクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症の治療または予防方法。
（９) 動物がマウスである（８）項記載の方法。
【００１５】
（１０) 早期老化様症の治療または予防が、繁殖能力の付与である（８）または（９）に記載の方法。
（１１) 早期老化様症の治療または予防が、寿命の延長である（８）または（９）に記載の方法。
（１２) （１）〜（７）のいずれかに記載の飼料をクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することを特徴とするクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の飼育方法。
【００１６】
（１３) 動物がマウスである（１２）記載の飼育方法。
（１４) 早期老化様症状が改善されているクロソ蛋白質を発現していないクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物。
（１５) 動物がマウスである（１４）記載の動物。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるクロソ変異ホモ動物とは、老化を抑制する活性を有するクロソ蛋白質をコードする遺伝子（クロソ遺伝子）が変異しているホモ接合体である。なお、クロソ変異ヘテロ動物とは、該クロソ遺伝子が変異しているヘテロ接合体である。
【００１８】
また、本発明のクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物とは、老化を抑制する活性を有するクロソ蛋白質をコードする遺伝子（クロソ遺伝子）がノックアウトされたホモ接合体である。なお、クロソ遺伝子ノックアウトヘテロ動物とは、一対の遺伝子の片方のクロソ遺伝子だけがノックアウトしているヘテロ接合体である。
本発明でいう、クロソ蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子は、老化抑制ポリペプチドおよび老化抑制遺伝子として、例えばＷＯ９８／２９５４４号公報に記載されている。
【００１９】
本発明のクロソ変異ホモ動物の取得方法としては、クロソ遺伝子の発現調節領域が既知である動物の場合で、クロソ遺伝子発現調節領域への外来遺伝子の挿入、部分的欠失あるいは変異の導入のための任意の人為的手法を卵子または受精卵に対して施した後、発生した個体の臓器、例えば腎臓の一部を採取し、そのクロソ遺伝子の発現量を、既知のクロソ遺伝子をプローブとしたノーザンブロット法や抗クロソ蛋白質抗体を用いたウェスタンブロット法などを用いて定量し、発現の低下した個体を選択する方法等があげられる。
【００２０】
また他の方法としては、例えば外来遺伝子の挿入や部分的欠失等の変異の導入のための任意の人工的手法を各種動物の卵子または受精卵に対して施した後、発生したトランジェニック動物を交配し、交配で得られる個体の臓器、例えば腎臓の一部を採取し、その老化を抑制する活性を有するポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を、老化を抑制する活性を有するポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロット法や該ポリペプチドをコードするＤＮＡをプローブとしたノーザンブロット法などを用いて定量し、発現の認められない個体または発現の低下した動物を選択して得る方法等があげられる。
【００２１】
具体的なクロソ変異ホモ動物としては、例えば第１８回日本分子生物学会年会（鍋島ら、２Ｋ−０２、１９９５年）で報告された早期老化様症状を示すクロソ変異ホモマウスをあげることができる。該マウスは、ヒトエロンゲーションファクター１αプロモーター（ＥＦ１アルファプロモーター）にＮａ+／Ｈ+逆輸送担体を連結した外来遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（特開平５−２６８８５６号公報）であり、その方法によって得られたヘテロ個体を掛け合わせヘテロ個体および早期老化様症状を示すホモ個体を取得したものである。該ホモ個体は、京都大学大学院医学研究科病理系腫瘍生物学講座、鍋島陽一より入手できる。
【００２２】
また上述と同様な手法で、各種クロソ変異ヘテロ動物が得られ、これらの交配によりクロソ変異ホモ動物を得ることができる。
本発明のクロソ遺伝子ノックアウト動物は、公知の遺伝子標的法[例えば、Cell, 51, 503(1987)等]により胚の染色体クロソ遺伝子を選択的に破壊させて取得することが出来る。具体的なクロソ遺伝子ノックアウトマウスの取得方法は、例えば、ＷＯ９８／２９５４４号公報に記載されている。
【００２３】
本発明において、クロソ変異ホモ動物およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の老化様症状の発症の具体的症状としては、例えばマウスにおいては離乳時期の３週齢以降、体重増加の滞り、寿命の短縮、動脈中膜等の異所性の石灰沈着、骨密度の低下等の骨形成の異常、胸腺の萎縮、脳プルキンエ細胞の脱落、生殖腺の低形成による不妊、皮下脂肪や毛根の減少を伴う皮膚の希薄化、歩行など運動機能の異常、下垂体機能の異常等をあげることができる。
【００２４】
老化様症状の具体的判定方法としては、例えば、体重の測定、繁殖能力の獲得の有無、血糖値、寿命の観察、皮膚の観察、歩行等の運動機能の観察により行うことができる。また、胸腺重量、肋骨胸腔内面に形成される石灰化結節の大きさなどの観察によっても判定できる。また、クロソ遺伝子のｍＲＮＡまたはクロソ蛋白質の定量により判定することもできる。
【００２５】
クロソ蛋白質の定量方法としては、抗クロソ蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降法、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）などがあり、クロソ遺伝子のｍＲＮＡを定量する方法としては、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）法などがある。定量の方法および定量に必要な組織サンプル、クロソ遺伝子、クロソ蛋白質、プローブＤＮＡ、プライマー、抗体などの取得方法はＷＯ９８／２９５４４号公報に記載された方法などがある。
【００２６】
以下、マウスを例にして本発明を詳細に説明する。
本発明において早期老化様症状の治療または予防とは、たとえば以下の様な状態の内いずれか一つを示すことをいう。
５週齢において、クロソ変異ホモマウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの体重が、クロソ変異ヘテロマウスまたはクロソ遺伝子ノックアウトヘテロマウスの体重の６割以上に増加することであり、７割以上に増加することが好ましく、８割以上に増加することがより好ましい。
【００２７】
１０週齢において５割以上の生存率を示すことであり、６割以上の生存率を示すことが好ましく、８割以上の生存率を示すことがより好ましい。
２０週齢までに３割以上の個体が繁殖能力を獲得することであり、５割以上の個体が繁殖能力を獲得することが好ましく、８割以上の個体が繁殖能力を獲得することがより好ましい。
【００２８】
クロソ変異ホモマウスにおいては、同週齢においてクロソ遺伝子のｍＲＮＡ発現量またはクロソ蛋白質発現量が、野生型に対して日本クレア社製の市販飼料ＣＥ２を与えて飼育した時のｍＲＮＡ発現量またはクロソ蛋白質発現量の５００分の１以上を示すことであり、２０分の１以上の発現量を示すことが好ましく、５分の１以上の発現量を示すことがより好ましい。
【００２９】
クロソ遺伝子ノックアウトホモ動物において早期老化様症状が改善されているとは、例えばクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスでは、例えば以下に列挙するいずれかの状態を示すことをいう。
３週齢から６週齢までのクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの１週間あたりの体重増加率が１ｇ／週を超えることであり、２．５ｇ／週を超えることが好ましく、３．５ｇ／週を超えることがより好ましい。
【００３０】
６週齢におけるクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの非絶食時血糖が１００ｍｇ／ｄｌを越えることであり、１５０ｍｇ／ｄｌを超えることが好ましく、２００ｍｇ／ｄｌを超えることがより好ましい
クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスが１０週齢において生存していることであり、１２週齢において生存していることが好ましく、１５週齢を超えて生存していることがより好ましい。
【００３１】
本発明の飼料は、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物飼育用飼料であり、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の寿命を延長させる飼料、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に特有の老化様症を治療または予防する飼料、繁殖能力を付与する飼料またはクロソ蛋白質発現量を調節する飼料として用いることができる。
【００３２】
これら飼料をクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することにより、寿命が延長された状態のクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物、早期老化様症の発症が抑制もしくは軽減されたクロソ変異ホモ動物およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物、繁殖能力を獲得したクロソ変異ホモ動物およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物またはクロソ蛋白質発現量が調節されたクロソ変異ホモ動物等を提供することができる。
【００３３】
これら動物は、早期老化様症を発症しているクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物と同様に、老化症状の治療および予防法、老化メカニズムの解析、クロソ遺伝子またはクロソ蛋白質のメカニズム解析等の研究に有用な実験材料となる。
本発明のクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症の治療または予防方法、飼育方法、繁殖方法または寿命の延長方法は、本発明の飼料および必要に応じて飲料水を給餌する以外は特に制限が無く、通常の対象動物を飼育する方法および繁殖させる方法で行うことができる。本発明の飼料で飼育し、成熟期を迎えたクロソ変異ホモ個体およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物は繁殖能力を獲得しており、ホモ個体同士、雄雌の交配によりホモ個体の繁殖が可能である。
【００３４】
本発明の飼料は離乳以降から連続して給餌することが好ましいが、本発明の飼料は３週齢における離乳後から生存期間中絶えず与え続ける必要は無く、離乳後1週間〜４週間与えることによってもその後の発育を期待することができ、また、一旦繁殖能力を獲得したクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に対しては、その後は本発明の飼料を必ずしも与える必要は無く、本発明以外の飼料を与えることができる。ただし、試料中のビタミンＤ以外の他の成分組成や動物の種等により発症抑制作用の強さや持続性は異なるので、対象とする動物ごとに条件を検討する事が望ましい。本発明の飼料を給餌する期間としては、離乳以降２日間以上が好ましく、離乳以降1週間以上がより好ましく、クロソ変異ホモ動物およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物以外の通常の対象動物が繁殖可能な時期となるまで給餌するのが特に好ましい。通常の対象動物が繁殖可能な時期は、マウスでは通常生後８週齢前後なので、離乳以降８〜１５週後まで本発明の飼料を給餌することがより好ましい。繁殖能力を獲得したクロソ変異ホモ動物およびクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物は、遺伝的にホモであり、得られる子孫は全てクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物となることから、繁殖親として好適に用いることができる。
【００３５】
なお、プロビタミンＤが飼料中に添加されている場合、プロビタミンＤたとえば７−デヒドロコレステロールが紫外線によってビタミンＤ3（コレカルシフェロール）に変換されるのを避けるために、動物の飼育は照度を落とした室内で行うことが好ましい。
本発明の飼料をクロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の離乳後から与えて早期老化様症の発症を抑制して発育させた後、飼料を発症誘導できるものに切替えることによって該動物の発症を誘導することができる。発症の誘導にあたっては、発症の程度をコントロールするために、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に発症を誘導できる既存飼料に切替える時期について対象とする動物ごとに条件を検討することが望ましい。また、発症を誘導するための飼料についても、その飼料中の二価の陽イオン金属を含有する化合物、リンを含有する化合物およびビタミンＤの濃度を対象とする動物ごとに条件を検討することが望ましい。この手法によりクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物を必要な週齢において必要な程度にまで早期老化様症を発症させることができる。
【００３６】
本発明の飼料は、クロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物に給餌することにより該クロソ変異ホモ動物もしくは該クロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症を治療もしくは予防するための、ビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制されたクロソ変異ホモ動物もしくはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料である。
【００３７】
ビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制された飼料とは、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の老化様症状のいずれか一つの発症を抑制または軽減させることができるように、ビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料またはビタミンＤを含有しないかもしくはビタミンＤの含有量が制限された飼料である。
【００３８】
本発明のビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制された飼料としては、動物の体内でビタミンＤの作用を持たないかまたはその作用が抑制されている飼料であれば特に制限はないが、例えばビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料があげられる。
ビタミンＤの作用を抑制する物質とは、生体内でビタミンＤの作用を抑制する物質であれば特に制限はないが、例えばビタミンＤを活性型に導く１α−水酸化酵素を阻害する物質、ビタミンＤとその受容体結合を抑制するビタミンＤのアンタゴニスト、ビタミンＤがその受容体と結合することを抑制するかまたはビタミンＤとその受容体との複合物が核内においてＤＮＡと結合することを抑制するビタミンＤ受容体のアンタゴニストなどがあげられる。
【００３９】
１α−水酸化酵素の阻害剤としては、例えば２５−ヒドロキシジヒドロタキステロール、２−ノル−１，３−セコ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、２−オキサ−３−デオキシ−２５−ヒドロキシビタミンＤ3などのビタミンＤ3誘導体やアンチマイシンなどの抗生物質などがあげられる。
ビタミンＤのアンタゴニストとしては、例えばレチニル酢酸などのビタミンＡ、あるいは２４−オキサ−ビタミンＤ3や２４−オキサ−１α−ヒドロキシビタミンＤ3といったビタミンＤ3誘導体、さらにジクロロメチレン二リン酸などがあげられる。ビタミンＤ受容体アンタゴニストとしては２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２、２６，２３−ラクトン ＴＥＩ−９６４７、ポックスウイルスのMolluscum contagiosum由来蛋白ＭＣ０１３Ｌなどがあげられる。
【００４０】
飼料中のビタミンＤの作用を抑制する物質の濃度としては、飼料中に含有するビタミンＤ濃度により変化するが、飼料中のビタミンＤの作用を抑制できる量を含有し、上記早期老化様症状のいずれか一つの発症を抑制または低減させることができる濃度であればいずれでもよい。具体的には、飼料１００ｇ中、１ｎｇ〜１ｇが好ましく、１ｎｇ〜１ｍｇがより好ましく、１ｎｇ〜１μｇが特に好ましい。
【００４１】
なお該ビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料は、ビタミンＤを含有していてもよく、そのビタミンＤの濃度は早期老化様症状のいずれか一つの発症を抑制または低減させることができる濃度であればその濃度は制限されない。
また本発明のビタミンＤの作用を有しないかまたはその作用が抑制された飼料としては、動物の体内でビタミンＤの作用を持たないかまたはその作用が抑制されている飼料で有れば特に制限はないが、例えばビタミンＤを含有しない飼料またはビタミンＤ含量を制限された飼料があげられる。
【００４２】
ビタミンＤとしては、５，７−ジエンステロール骨格を有するプロビタミンＤのＵＶ照射によって生成するすべての抗クル病因子が含まれる。プロビタミンＤとしては、すなわち、プロビタミンＤ2（エルゴステロール）、プロビタミンＤ3（７−デヒドロコレステロール）、プロビタミンＤ4（２２−ジヒドロエルゴステロール）、プロビタミンＤ5（７−デヒドロシトステロール）、プロビタミンＤ6（７−デヒドロスティグマステロール）、プロビタミンＤ7（７−デヒドロカンペステロール）が含まれる。
【００４３】
ビタミンＤとしては、例えばビタミンＤ2、ビタミンＤ3（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ4、ビタミンＤ5、ビタミンＤ6、ビタミンＤ7などがあげられる。
ビタミンＤの生体内での作用は、その種類で異なるので、本発明におけるビタミンＤの濃度は、乾燥飼料重量当たりの力価（国際単位）で表す。なお、精製された純品のビタミンＤ3の０．０２５μｇの力価が１国際単位（ＩＵ）と定義されている。ビタミンＤの力価は公知の方法で測定することにより求めることができる。
【００４４】
また、ビタミンＤの含量は、各ビタミンＤの力価と該ビタミンの重量から計算により求めることができる。ビタミンＤの重量は公知の方法で求めることができる。ビタミンＤ3とビタミンＤ2は、力価が高く食品や医薬品によく用いられているビタミンＤであるが、その濃度は、ＨＰＬＣによる分画定量法等で測定することができる。乾燥飼料とは、該飼料の重量が、飼料を６０℃のオーブンで乾燥させたとき、一日当たりの重量減少量が乾燥前の重量の１％以下を示すものをいう。
【００４５】
ＨＰＬＣによる分画定量法による具体的なビタミンＤ3およびビタミンＤ2濃度の測定方法を以下に例示する。
飼料１０ｇに対し、１０ｍｌの１００％エタノールを加え、３回振盪抽出する。全量を回収した後、すべてのエタノールを遠心濃縮機（タイテック株式会社製）により除去し、再び１ｍｌのエタノールに溶解する。移動相：水／アセトニトリル＝５／９５、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃の条件下で、逆相系カラムＡｓａｈｉｐａｃｋ ＯＤＰ−５０ ６Ｄ（昭和電工社製）を装着したＨＰＬＣ装置に対し、抽出サンプル１００μＬを注入し、紫外線検出装置で２６０ｎｍにおける吸収を測定する。ビタミンＤ3およびビタミンＤ2濃度が既知であるの標準サンプルを同様に処理して検量線を作成し、サンプル中のビタミンＤ3およびビタミンＤ2濃度を算出する。
【００４６】
本発明のビタミンＤが制限された飼料としては、飼料中のビタミンＤの濃度が上記老化様症状のいずれか一つの発症を抑制または低減させることができる濃度に制限されていることをいい、具体的には、飼料１００ｇ中８０ＩＵ以下であり、５０ＩＵ以下が好ましく、１０ＩＵ以下がより好ましく、１ＩＵ以下が特に好ましい。
【００４７】
なお、本発明の飼料には、前述のビタミンＤの作用を抑制する物質を含有していてもよい。
本発明のビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料は、飼料原料または飼料にビタミンＤの作用を抑制する物質を添加して調製することができる。
また本発明のビタミンＤを含有しない飼料は、ビタミンＤを含有しない飼料原料を混合することにより調製できる。
【００４８】
また、本発明のビタミンＤの含量が制限された飼料は、ビタミンＤを含有しない飼料または飼料原料に対してビタミンＤを添加して調製できるが、ビタミンＤを含有している飼料または飼料原料に対してビタミンＤをさらに添加する場合は、必要に応じて飼料または飼料原料中のビタミンＤ濃度を測定し、添加すべきビタミンＤの量を求め、飼料または飼料原料中にビタミンＤを添加し調製することができる。
【００４９】
飼料としては、例えば、イヌ、ネコ、ネズミ等のペット用飼料、ウシ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ、七面鳥等の家禽用飼料、タイ、ハマチ等の養殖魚用飼料等があげられる。
ビタミンＤ含量を制限した具体的な飼料としては、例えば蛋白質が１０〜７０重量％、油脂類が０〜５０重量％、炭水化物が５〜８０重量％、ビタミンＤ以外のビタミン混合物が０．１〜５重量％、ミネラル混合物が０．５〜１５重量％、繊維質が０〜２０重量％並びにビタミンＤが０〜８０ＩＵ／１００ｇ飼料乾燥重量となるように調製された飼料があげられる。
【００５０】
蛋白質としては、例えば大豆などの豆類、トウモロコシなどの穀類、馬鈴薯など芋類等に由来する植物性蛋白質、家禽の卵由来アルブミンおよびグロブリン、家畜乳由来のカゼインおよびホエイ、家禽家畜肉由来のコラーゲン、家禽家畜肉および魚貝類由来の蛋白質、家禽家畜血液由来のグロブリンおよびアルブミン等の動物性蛋白質等があげられる。
【００５１】
油脂としては、例えばコーン、大豆、サフラワー、キャノーラ、菜種、オリーブ、胡麻、ひまわり、綿実、ピーナツ、ココナツ、カカオ、米、椿、クヘア、ならびにヤシなどに由来する植物性脂肪、ラード（豚脂）、タロー（牛脂）、鶏油、羊油、魚油、鯨油など畜肉水産物由来の脂肪、ならびにバターなどの乳脂に由来する脂肪等の動物性脂肪等があげられる。
【００５２】
炭水化物としては、例えば、馬鈴薯およびさつまいもなど芋類由来のでんぷん、コーン、米、小麦などの穀類由来のでんぷんおよびでんぷんの加水分解物、麦芽糖、しょ糖、ならびに乳糖などの二糖類、果糖、ブドウ糖、ガラクトース、アラビノース、マンノース、ならびにキシロースなどの単糖類等があげられる。
繊維質としては、例えばセルロースおよびヘミセルロースに含まれるグルカン、キシラン、マンナン、ガラクタンおよびそれらの誘導体、アルギン酸、カラギーナンおよびファーセレランなど海草由来食物繊維、ポリウロニドなどのガム類、デキストリン中の難消化性成分、ガラクツロナン、リグニン、キチン、キトサン、およびサイリウム並びにそれらの加水分解物等があげられる。
【００５３】
ミネラルとしては、例えばカルシウム、リン、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、コバルト、ヨウ素、セレニウム、クロム、臭素、フッ素、モリブデン、ヴァナジウム、ニッケル、リチウム等があげられる。
ビタミンとしては、例えばビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、ビオチン、ビタミンＫ3等があげられる。
【００５４】
本発明の飼料は、リンの消化管吸収、および腎臓における再吸収を阻害または促進する物質、およびステロイド等を含有するものが好ましい。
飼料原料としては、例えば穀物類、そうこう類、植物性油かす類、動物性飼料原料、その他飼料原料、精製品等があげられる。
穀物としては、例えばマイロ、小麦、大麦、えん麦、らい麦、玄米、そば、あわ、きび、ひえ、とうもろこし、大豆等があげられる。
【００５５】
そうこう類としては、米、大麦、小麦、あるいはトウモロコシなどのぬか、脱脂ぬか、ふすま、末粉、胚芽、スクリーニング、あるいはペレット等があげられる。
植物性油かす類としては、例えば大豆油かす、きな粉、あまに油かす、綿実油かす、落花生油かす、サフラワー油かす、やし油かす、ごま油かす、ひまわり油かす、なたね油かす、カポック油かす、からし油かす等があげられる。
【００５６】
動物性飼料原料としては、例えば肉粉、肉骨粉、血粉、分解毛、骨粉、フェザーミール、脱脂粉乳、カゼイン、乾燥ホエイ等があげられる。
その他飼料原料としては、植物茎葉類（アルファルファ、ヘイキューブ、アルファルファリーフミール、ニセアカシア粉末等）、トウモロコシ加工工業副産物（コーングルテン、ミール、コーングルテンフィード、コーンステープリカー等）、でんぷん加工品（でんぷん等）、砂糖、発酵工業産物（酵母、ビールかす、麦芽根、アルコールかす、しょう油かす等）、農産製造副産物（柑橘加工かす、豆腐かす、コーヒーかす、ココアかす等）、その他（キャッサバ、そら豆、グアミール、海藻、オキアミ、スピルリナ、クロレラ、鉱物等）等があげられる。
【００５７】
精製品としては、タンパク質（カゼイン、アルブミン等）、アミノ酸、糖質（スターチ、セルロース、しょ糖、グルコース等）、ミネラル、ビタミン等があげられる。
なお、鴨類の肉、魚介類および家禽の卵、一部の畜肉副産物、キノコ類はビタミンＤを多く含むことから、飼料原料に用いない方が好ましいが、前述のビタミンＤの作用を抑制する物質を含有させることにより、これらビタミンＤを多く含む原料も使用できる。なお、これらビタミンＤを多く含む飼料原料は、脱脂などの操作によりビタミンＤ含量を減少させて用いることが好ましい。
【００５８】
本発明のビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料、本発明のビタミンＤを実質的に含有しない飼料および本発明のビタミンＤの含量が制限された飼料には、二価の陽イオン金属を含有する化合物を含有するものが好ましい。
二価の陽イオン金属としては、例えばカルシウム、マグネシウムおよび亜鉛が好ましくマグネシウム、亜鉛がより好ましく、亜鉛が特に好ましい。
【００５９】
該金属を含有する化合物としては、例えば、有機金属塩、無機金属塩があげられる。有機金属塩としては、オロット酸亜鉛等のオロット酸等の有機酸金属塩、また、無機金属塩としては、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等のハロゲン化金属塩があげられる。
飼料中の二価の陽イオン金属を含有する化合物濃度としては、飼料中の他の成分、例えばリン濃度等により変化するが、例えば金属濃度として飼料中の乾燥重量あたり０．００１重量％〜５重量％が好ましく、０．０１重量％〜２重量％がより好ましく、０．１重量％〜１重量％が特に好ましい。
【００６０】
本発明のビタミンＤの作用を抑制する物質を含有する飼料、本発明のビタミンＤを実質的に含有しない飼料および本発明のビタミンＤの含量が制限された飼料には、リンを含有する化合物濃度が制限されたものが好ましい。
リンを含有する化合物としては、例えば無機リン酸塩およびリン酸エステル等があげられる。無機リン酸としては、たとえばリン酸塩（ＰＯ43-）、リン酸水素塩（ＨＰＯ42-）リン酸二水素塩（Ｈ2ＰＯ4-）、二リン酸塩（Ｐ2Ｏ74-）、二リン酸二水素塩（Ｈ2Ｏ7Ｐ22-）、三リン酸塩（Ｐ3Ｏ105-）、四リン酸塩（Ｐ4Ｏ136-）、メタリン酸塩（ＰＯ3-）、亜リン酸塩（ＨＰＯ32-）、次リン酸塩（Ｐ2Ｏ64-）、次亜リン酸塩（ＰＨ2Ｏ2-）、ヒドロキシアパタイトなどがあげられる。また、リン酸エステルとしては加水分解時に無機リン酸を遊離するアデノシン三リン酸、フィチン酸などがあげられる。
【００６１】
飼料中のリンを含有する化合物の濃度としては、飼料中の他の成分、例えば二価の陽イオン金属の濃度等により変化するが、例えばリン濃度として乾燥重量あたり０．００１重量％〜０．８重量％が好ましく、０．０１重量％〜０．７重量％がより好ましく、０．１重量％〜０．６５重量％が特に好ましい。
以下に本発明の実施例を示す。なお、下記実施例で使用する化合物は、下記製造会社のものを用いた。
【００６２】
ラード（キシダ化学社製）、コーン油（ナカライテスク社製）、ショ糖（キシダ化学社製）、セルロース（オリエンタル酵母社製）、カゼイン（オリエンタル酵母社製）、塩化コリン（キシダ化学社製）、ＡＩＮ−７６標準組成ビタミン混合物（オリエンタル酵母社製）、ビタミンＤ欠乏ＡＩＮ−７６ビタミン組成（オリエンタル酵母社製）、ミネラル混合物（ＡＩＮ−７６、オリエンタル酵母社製）、リン酸二水素カリウム（キシダ化学社製）、ビタミンＤ3（ナカライテスク製）。
【００６３】
なお、ＡＩＮ−７６標準組成中のビタミンＤはビタミンＤ3（コレカルシフェロール）であり、その含量は２５０μｇ／１００ｇ（１００００ＩＵ／１００ｇ）である。
【００６４】
【実施例】
実施例１
６０℃の湯浴中で溶かしたラード５重量部、コーン油１重量部、ショ糖２０重量部およびセルロース５重量部をボール中でゴムへらを用いて均一に混和した。カゼイン２０重量部のおよそ半分量で塩化コリン０．２重量部およびビタミンＤ欠乏ＡＩＮ−７６組成ビタミン混合物１重量部をそれぞれ乳鉢を用いて希釈した。ミネラル混合物３．５重量部、カゼイン２０重量部の残りおよびコーンスターチ４４．３重量部を、あらかじめ乳鉢を用いて希釈したものおよびあらかじめボール中で作製した混合物とともに、自動ミキサーを用いて１０分間程度処理することで均一に混和し、粉末飼料を調製した。
【００６５】
本飼料中ののリン含量は０．５７重量％となる。また、本飼料中にビタミンＤは含まれていない。
実施例２
１ｍｇのビタミンＤ3を１０ｋｇのカゼインに対して均一に混合したもの、すなわち０．１ｐｐｍ（４００ＩＵ／１００ｇ）ビタミンＤ3を作成した。作成にあたっては初め、極少量のカゼインに対して乳鉢を用いて混ぜ込むようにし、徐々にカゼインで希釈し、最終的にカゼイン１００ｇ中にビタミンＤ3が均一に含まれるようにしたものを作成し、次に、その１ｇをさらに同様の手法で１００ｇのカゼインに対して徐々に希釈した。
【００６６】
６０℃の湯浴中で溶かしたラード５重量部、コーン油１重量部、ショ糖２０重量部およびセルロース５重量部をボール中でゴムへらを用いて均一に混和した。カゼイン１９．７５重量部のおよそ半分量で、あらかじめ作成した０．１ｐｐｍビタミンＤ3の０．２５重量部、塩化コリン０．２重量部、ならびにビタミンＤ欠乏ＡＩＮ−７６組成ビタミン混合物１重量部、リン酸二水素カリウム１．７６重量部をそれぞれ乳鉢を用いて希釈した。ミネラル混合物３．５重量部、カゼイン１９．７５重量部の残りおよびコーンスターチ４２．５４重量部を、あらかじめ乳鉢を用いて希釈したものおよびあらかじめボール中で作製した混合物とともに、自動ミキサーを用いて１０分間程度処理することで均一に混和し、粉末飼料を調製した。
【００６７】
本飼料中のリン含量は０．９７重量％となる。また、本飼料中のビタミンＤは添加したビタミンＤ3にすべて由来しており、その含量は０．０２５μｇ／１００ｇ（１ＩＵ／１００ｇ）となる。
実施例３
６０℃の湯浴中で溶かしたラード５重量部、コーン油１重量部、ショ糖２０重量部およびセルロース５重量部をボール中でゴムへらを用いて均一に混和した。カゼイン２０重量部のおよそ半分量で塩化コリン０．２重量部、ビタミンＤ欠乏ＡＩＮ−７６組成ビタミン混合物１重量部、ならびにリン酸ニ水素カリウム１．７６重量部をそれぞれ乳鉢を用いて希釈した。ミネラル混合物３．５重量部、カゼイン２０重量部の残りおよびコーンスターチ４２．５４重量部を、あらかじめ乳鉢を用いて希釈したものおよびあらかじめボール中で作製した混合物とともに、自動ミキサーを用いて１０分間程度処理することで均一に混和し、粉末飼料を調製した。
【００６８】
本飼料中のリン含量は０．９７重量％となる。また、本飼料中にビタミンＤは含まれていない。
比較例１
６０℃の湯浴中で溶かしたラード５重量部、コーン油１重量部、ショ糖２０重量部およびセルロース５重量部をボール中でゴムへらを用いて均一に混和した。カゼイン２０重量部のおよそ半分量で塩化コリン０．２重量部およびＡＩＮ−７６標準組成ビタミン混合物１重量部をそれぞれ乳鉢を用いて希釈した。ミネラル混合物３．５重量部、カゼイン２０重量部の残りおよびコーンスターチ４４．３重量部を、あらかじめ乳鉢を用いて希釈したものおよびあらかじめボール中で作製した混合物とともに、自動ミキサーを用いて１０分間程度処理することで均一に混和し、粉末飼料を調製した。
【００６９】
本飼料中のリン含量は０．５７重量％となる。また、飼料中のビタミンＤはそのすべてがＡＩＮ−７６標準組成ビタミン混合物に由来するビタミンＤ3であり、該飼料中のビタミン含量は２．５μｇ／１００ｇ（１００ＩＵ／１００ｇ）となる。
比較例２
６０℃の湯浴中で溶かしたラード５重量部、コーン油１重量部、ショ糖２０重量部およびセルロース５重量部をボール中でゴムへらを用いて均一に混和した。カゼイン２０重量部のおよそ半分量で塩化コリン０．２重量部、ＡＩＮ−７６標準組成ビタミン混合物１重量部、ならびにリン酸ニ水素カリウム１．７６重量部をそれぞれ乳鉢を用いて希釈した。ミネラル混合物３．５重量部、カゼイン２０重量部の残りおよびコーンスターチ４２．５４重量部を、あらかじめ乳鉢を用いて希釈したものおよびあらかじめボール中で作製した混合物とともに、自動ミキサーを用いて１０分間程度処理することで均一に混和し、粉末飼料を調製した。
【００７０】
本飼料中のリン含量は０．９７重量％となる。また、飼料中のビタミンＤはそのすべてがＡＩＮ−７６標準組成ビタミン混合物に由来するビタミンＤ3であり、該飼料中の含量は２．５μｇ／１００ｇ（１００ＩＵ／１００ｇ）となる。
実施例４
京都大学大学院医学研究科病理系腫瘍生物学講座より分与されたクロソ変異ヘテロマウスのひとつがいを交配し、クロソ変異を有するマウスを繁殖させた。ＰＣＲ法によりクロソ変異ホモ接合体（ｋｌ／ｋｌと標記する）とクロソ変異ヘテロ接合体（ｋｌ／＋と標記する）を確認した。経時的にマウスの体重を測定し、市販の粉末給餌器（夏目製作所社製：ＫＮ−６７５  Ｎｏ．４）を用いて粉末飼料を、およびフィルターを通した水道水をいずれも自由摂取で与えた。飼育室は室温２４±１℃、湿度５５±１０％のＳＰＦ（specific pathogen free）環境とした。
【００７１】
３週齢で離乳したホモ接合体の雄雌それぞれに対して、１群４頭ずつ実施例１または比較例１で製造した飼料を与え、６週齢まで飼育した。６週齢時点の外観を観察し、体重、血糖値、血清無機リンを測定した。血糖値と血清無機リンは血清生化学自動分析装置、富士ドライケム３５００（富士フイルムメディカル社製）を用いて測定した。
【００７２】
６週齢時点において雄雌とも比較例１の飼料を与えられたマウスは実施例１の飼料を与えられたマウスに比較して、クロソマウスの特徴である背骨の湾曲を若干呈していた。６週齢における雄雌の体重、血糖値、血清無機リン、また雌については子宮重量と卵巣重量の合計重量をも併せて第１表に示す。
【００７３】
【表１】
0004001808.tif 000002
【００７４】
雄雌ともに、６週齢時点の体重は比較例１の飼料を与えられた群より実施例１の飼料を与えられた方が有意に体重が大きかった（t-検定、Ｐ＜０．０１）。
実施例１の飼料を与えられた群の雄は比較例１の飼料を与えられた群の雄に比べ有意に高い血糖値、（実施例１と比較例１でそれぞれ、１９３．５±１２．２および１３０．９±１４．１ｍｇ／ｄｌ）また、有意に低い血清無機リン濃度（実施例１と比較例１でそれぞれ１１．６±１．５および１６．９±２．２ｍｇ／ｄｌ）を示した。実施例１の飼料を与えられた群の雌は比較例１の飼料を与えられた群の雌に比べ、血清無機リンはほとんど差がなかったが、血糖値は高い傾向を示した。また、子宮と左右の卵巣を合わせた重量は、実施例１の飼料を与えられた群の雌は比較例１の飼料を与えられた群の雌に比べ有意に高い値を示した（実施例１と比較例１それぞれ１０８．３±４１．０および２２．５±１４．６ｍｇ、Ｐ＜０．０１）
以上のように、ビタミンＤ3を含有しない実施例１の飼料を与えられたマウスは、ビタミンＤ3を１００ＩＵ／１００ｇ含む比較例１の飼料を与えられたマウスに比べ、雄雌共に早期老化様症状の発現が強く抑制されることが示された。
実施例５
実施例４と同様の方法によって得らたクロソ変異マウスホモ接合体の雌雄に対して、それぞれ比較例２、実施例２または実施例３で製造した飼料を離乳直後の３週齢から５週齢まで２週間与えて飼育した。その結果を第２表に示す。
【００７５】
【表２】
0004001808.tif 000003
【００７６】
雄のクロソ変異ホモマウスでは各群の５週齢平均体重はビタミンＤ3添加量依存的な値を示し、実施例２および実施例３の飼料を与えて飼育した群の５週齢の体重（それぞれ１４．３±２．６および１６．３±１．４ｇ）は、いずれも比較例２の飼料を与えた群の５週齢体重より有意に高い値であった（Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔ、Ｐ＜０．０５）。
【００７７】
雌のクロソ変異ホモマウスの５週齢平均体重に有意差は認められなかったものの、ビタミンＤ3添加量依存的な値を示し、体重は比較例２、実施例２、実施例３それぞれの群で１３．３±１．４、１３．８±０．９、１４．３±０．３ｇを示した。
実施例６
実施例５で飼育したクロソ変異マウスホモ接合体の雄雌を同条件で１１週齢となるまで更に６週間飼育を継続した。各条件４頭中の生存数を第３表に示す。
【００７８】
【表３】
0004001808.tif 000004
【００７９】
比較例２の飼料を与えられた雄の４頭のうち２頭は１１週齢以前に死亡し、また同じく比較例２の飼料を与えられた雌は４頭すべての個体が死亡した。それに対し、実施例２の飼料を与えられた雌の４頭のうちわずか１頭が１１週齢より以前に死亡しものの、実施例３の飼料を与えられた群の個体は雄雌ともに死亡例はなかった。
実施例７
実施例６で１１週齢まで生存した個体の血糖値および血清無機リンを実施例４と同様の方法により測定した。その結果を第４表に記す。なお、実施例２の飼料を与えられた雌については１１週齢まで生存した３頭についての平均値であり、他は４頭の平均値である。
【００８０】
【表４】
0004001808.tif 000005
【００８１】
１１週齢雄の体重はビタミンＤ3濃度依存的な値を示し、比較例２、実施例２、および実施例３それぞれ、１６．１±２．０、２１．０±２．６、および２４．０±１．９ｇであった。１１週齢雄の血糖値もビタミンＤ3濃度依存的な値を示し、比較例２、実施例２、および実施例３でそれぞれ、１３３±４８、１７３±３１、および２１４±３０ｍｇ／ｄｌであった。１１週齢雄の血清無機リン値はビタミンＤ3を減じた実施例２と実施例３で近い値を示したが（それぞれ１０．９±２．４および１０．７±２．７ｍｇ／ｄｌ）、ビタミンＤ3を１００ＩＵ／１００ｇ含む比較例２の飼料を与えられた群ではこれらよりも高い値、１６．５±０．４ｍｇ／ｄｌを示した。
【００８２】
雌では実施例２を与えられた群よりも実施例３の飼料を与えられた群において体重および血糖値ともに高い値を示した（体重の場合、実施例２と３でそれぞれ、１３．７±３．６および１７．７±２．８ｇ、血糖値の場合、実施例２と３でそれぞれ、１３０±４３および１６２±４５ｍｇ／ｄｌ）。
以上のように、ビタミンＤ3を１００ＩＵ／１００ｇ含み、リンを０．９７重量％まで負荷した比較例２の飼料を与えられたマウスでは、雄雌共に発症が強く誘導され、多くの死亡例も認められたのに対し、ビタミンＤ3濃度を１ＩＵ／１００ｇに減じた飼料（実施例２）あるいはビタミンＤを全く含まない飼料（実施例３）を与えられたマウスでは体重が伸び、血糖値が上昇するなど、早期老化様症状の発現が穏やかであることが示された。
参考例１    クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの取得
ターゲッティングベクターには、クロソ遺伝子の第一エクソンを含むマウスゲノムDNAを用いた（WO98/29544）。5'側アームには、SacI-BglIによって切り出した約8．２ｋｂ、3'側アームには、SacI-EcoRIによって切り出した約３．２ｋｂのフラグメントを用いた。これらのフラグメントの中に、バクテリアのβガラクトシダーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子（βgeo）と、loxP配列によって囲まれたPGKneo（PGKプロータ-ネオマイシン耐性遺伝子）カセットを挿入した。また3'側アームの外側にネガティブセレクション用のDTA（ジフテリア毒素A鎖）をつないだ。これらをpBluescriptにサブクローニングし、DNAを回収した後、NotIでリニアライズしトランスフェクションに用いた。ES細胞であるCCE細胞［Robertson et al. Nature 323,445-448 (1986)］にエレクトロポーレーションでDNAを導入した後、G418でセレクションを行い、ターゲッティングベクターがゲノムに挿入されたクローンを解析した。EcoRVで切断後、サザンハイブリダイゼーションにより、相同組み換えが起きたクローンを選択した。サザンハイブリダイゼーションのプローブの鋳型には、5'側については、SacIで切り出した約０．６ｋｂのフラグメント、3'側にはEcoRI-SacIで切り出した約０．７ｋｂのフラグメントを用いた。このうちの１クローンを用いて、C57Bl/6マウスの胚盤胞へマイクロインジェクションすることによりキメラマウスを作製した。キメラマウスを野生型C57Bl/6の雌と掛け合わせ、毛色がアグチ色になった個体の染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションにより解析し、ヘテロマウスを選択した。更にこのヘテロマウスの雄とC57Bl/6の雌を掛け合わせ、受精卵を回収しその前核にCreレコンビナーゼの発現ベクターpBS185(Gibco BRL)を顕微注入した。この受精卵から得られたマウスの染色体DNAに対し、neo遺伝子をプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを行い、PGKneobpA （PGKプロータ-ネオマイシン耐性遺伝子-ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル配列）カセットを失ったマウスを選択した。試験にはこれらのヘテロマウス同士の交配により得られたマウスを用いた。なお、その後のgenotypingにはPCR法を用いて、野生型、ヘテロ接合体マウス、ホモ接合体マウスの判定を行った。
実施例８  クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに対するビタミンＤ欠乏食による発症抑制効果（その１）
参考例１で取得したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの雄または雌を３週齢から市販飼料ＮＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社。ビタミンＤ3含有量１５５ＩＵ／１００ｇ）または市販のビタミンＤ欠乏飼料[PMI Feeds社製 Test Diet, 商品コード5826。以下ＶＤ（−）と略記。]で飼育し、経時的に体重を測定した。水はフィルターを通した水道水を自由摂取で与えた。飼育室は室温２４±１℃、湿度５５±１０％のＳＰＦ（specific pathogen free）環境とした。
【００８３】
その結果を第５表に示す。
【００８４】
【表５】
0004001808.tif 000006
【００８５】
第５表に示す通り、ＮＭＦ飼料で飼育したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの成長は鈍く、９週齢までに死亡する個体も現れたのに対し、ＶＤ（−）飼料で飼育した場合は、雄および雌とも、クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの成長が安定的に維持された。また、病理組織学的にも、ＶＤ（−）飼料で飼育したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスでは、骨端部の異常なカルシウム沈着や骨端部軟骨板の変形、骨幹部の密度変化、腎臓のカルシウム沈着といった、ＮＭＦ飼料で飼育したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに見られる病変が、ほとんどすべての個体で改善していた。これらの結果は、ＶＤ（−）飼料によってクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの早期老化様症状の発現が全体的に著しく抑制されたことを示す。
【００８６】
さらに、ＶＤ（−）飼料で飼育したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの雄および雌を交配させたところ、雌個体の妊娠、出産および哺育が観察された。すなわち、本発明の飼料を給餌することにより繁殖能を持つ雄および雌のクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスが取得可能であることが明らかとなった。
実施例９  クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに対するビタミンＤ欠乏食による発症抑制効果（その２）
参考例１で取得したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスおよび野生型マウスの雄および雌を３週齢からＶＤ（−）飼料で飼育した。水はフィルターを通した水道水を自由摂取で与えた。飼育室は室温２４±１℃、湿度５５±１０％のＳＰＦ（specific pathogen free）環境とした。１５週齢の時点で採血し、血糖値を測定した。その結果を第６表に示す。
【００８７】
【表６】
0004001808.tif 000007
【００８８】
第６表に示す通り、ＶＤ（−）飼料で１５週齢まで飼育したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの血糖値は野生型のマウスよりも低値を示すことはなかった。これは、クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスが発症した場合の特徴的な早期老化様症状の一つである低血糖の発現が、ＶＤ（−）飼料によって著明に抑制されたことを示す。
【００８９】
ビタミンＤ3含有する飼料でクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスが１５週齢まで生存する事はないので、ＮＭＦ飼料で飼育した１５週齢のクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの血糖値のデータは取得できない。ＮＭＦ飼料がクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに対して低血糖状態を引き起こすことを検証するため、ＮＭＦ飼料で飼育した７週齢のクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスおよび野生型マウスの血糖値を比較した。その結果を、第７表に示す。
【００９０】
【表７】
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【００９１】
第７表に示す通り、ビタミンＤ3含有飼料ＮＭＦを与えられたクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの血糖値は雄雌それぞれ平均で２２４ならびに１９７ｍｇ／ｄｌであったのにに対して同じ飼料を与えられた野生型マウスでは雄雌それぞれ平均で３８２ならびに３３０ｍｇ／ｄｌの値を示し、ＮＭＦ飼料がクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに対して低血糖状態を引き起こすことを確認した。
実施例１０  ビタミンＤ欠乏食で飼育後に一般飼料に切り替える事によるクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスに対する発症誘導効果
参考例１で取得したクロソ遺伝子ノックアウトホモマウスおよび野生型マウスの雌を３週齢から４週齢までＶＤ（−）飼料で飼育した後、飼料をＮＭＦ飼料に切り替えて６週齢まで飼育した。４週齢、５週齢、６週齢の時点で体重を測定した。６週齢で解剖し、腎臓の病理組織像を観察した。水はフィルターを通した水道水を自由摂取で与えた。飼育室は室温２４±１℃、湿度５５±１０％のＳＰＦ（specific pathogen free）環境とした。実験結果を第８表に示す。
【００９２】
【表８】
0004001808.tif 000009
【００９３】
第８表に示す通り、ビタミンＤ（−）食で飼育後にビタミンＤを含有するＮＭＦ飼料に切り替える事により、クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスの体重増加が抑制された。また、腎臓の病理組織学的観察の結果、野生型マウスでは腎臓の石灰化は全く認められなかったのに対し、クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスでは全例において腎臓の石灰化を認めた。すなわち、クロソ遺伝子ノックアウトホモマウスにビタミンＤ（−）食を与えて早期老化様症状の発現を抑制しながら飼育した後にビタミンＤを含有するＮＭＦ飼料に切り替える事によって、ビタミンＤ含有飼料に切り換えた時点から早期老化様症状の発現が誘導されて来る事が明らかとなった。
【００９４】
【発明の効果】
本発明により、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物用飼料、クロソ変異ホモ動物またはクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物の早期老化様症の治療または予防方法および早期老化様症状が改善されているクロソ蛋白質を発現していないクロソ遺伝子ノックアウトホモ動物を提供することができる。