(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜２０記載の対合プライマーであるＳ１３Ｆ２５（配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号２）；Ｍ２ＣＧＦ２０（配列番号３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列番号４）；Ｍ１１Ｆ２０（配列番号５）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６）；Ｂ１Ｆ２５（配列番号７）およびＢ１Ｒ２０（配列番号８）；ＷＫＡ９Ｆ２０（配列番号９）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列番号１０）；Ｊ６Ｆ１８（配列番号１１）およびＪ６Ｒ２０（配列番号１２）；Ｂ１８Ｆ１５（配列番号１３）およびＢ１８Ｒ２１（配列番号１４）；Ｅ３０Ｆ２８（配列番号１５）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号１６）；Ｇ２２Ｆ２７（配列番号１７）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号１８）；Ｂ４３Ｆ１７（配列番号１９）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２０）からなる群より選択された１種類あるいは２種類以上の対合プライマーを用い、餅試料から抽出、精製したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によって鋳型ＤＮＡを増幅し、得られた増幅ＤＮＡの多型によって餅試料の原料米の品種を判別することを特徴とする餅試料の原料米の品種判別方法。
【請求項２】
餅試料が、凍結乾燥したものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
対合プライマー存在下、餅試料から抽出したＤＮＡを鋳型としてアニーリング温度を６０℃±５℃とするＰＣＲ法を行う請求項１記載の方法。
【請求項４】
餅試料が、アミラーゼ処理および／またはプロテアーゼ処理したものである請求項１または２記載の餅試料の原料米の品種判別方法。
【請求項５】
ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲ法である請求項１〜４のいずれかに記載の餅試料の原料米の品種判別方法。
【請求項６】
対合プライマーとして、ＷＫＡ９Ｆ２０（配列番号９）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列番号１０）；Ｅ３０Ｆ２８（配列番号１５）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号１６）；Ｇ２２Ｆ２７（配列番号１７）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号１８）；Ｂ１Ｆ２５（配列番号７）およびＢ１Ｒ２０（配列番号８）の４種類のプライマーを混合し、アニーリング温度を６０℃±５℃とするマルチプレックスＰＣＲ法を行う請求項１〜４のいずれかに記載の餅試料の原料米の品種判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、餅を試料とした原料米の品種判別方法に関し、詳しくは、餅試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、選定した適正な対合プライマーの存在下でＰＣＲ法を行いＤＮＡを増幅した後、電気泳動等により品種間の識別性の現れた増幅ＤＮＡの多型を検出することによって、原料米の品種を判別する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
餅の原料米である糯米には、米飯向けの「コシヒカリ」や「ササニシキ」に相当する「こがねもち」や「滋賀羽二重糯」のような良質な原料米があり、これらは需要も多く、高価格で取り引きされている。一方では、生産しやすくて収量性に優れた一般的な糯米や安価に取り引きされる輸入糯米もある。
市販されている包装餅の袋に記載されている原料米の品種名と内容物である餅の実際の品種とが一致するかどうかは、食品産業界および消費者にとってきわめて重要な情報である。
しかし、これまでは餅として加工されたものを試料として原料米の品種を確認するためには、原料購入経路の調査や専門家による食味試験、微妙な香気成分の比較などを総合して行う以外に明確な方法がなく、きわめて困難な問題とされてきた。そのため、餅の原料米の品種を科学的に、かつ簡易迅速に判別する技術の開発が求められている。
【０００３】
これまでに、粳米の分野では、精米あるいは米飯を試料とするＤＮＡ品種判別技術が開発され、報告されてきた（特許第３０４８１４９号明細書、特開２００１−９５５８９号公報）。
しかし、餅は精米とは異なり、製造工程において吸水した後に「蒸し」という加熱工程を必要とする。この加熱工程において澱粉の糊化とタンパク質の変性が起こり、餅試料からのＤＮＡの抽出を困難なものとしている。
さらに、餅は米飯とも異なり、製造過程において行われる「杵搗き」や「練り出し」あるいは「混捏」という工程によって、物理的な剪断力を受け、米飯よりもさらに澱粉粒やタンパク質顆粒は破壊され、細胞構造が原型をとどめないほどの変化を受けている（永島伸浩、「澱粉科学」、３９巻、１号、２３−３１、１９９２年）。
したがって、これまでの公知の技術では、餅を試料とした原料米の品種判別は不可能であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、餅を試料として、原料米の品種を正確に、かつ簡易迅速に判別する方法を提供することである。すなわち本発明は、餅の原料米購入経路の調査や餅の食味試験等の複雑な検査を必要とせず、餅を試料として直接その原料米の品種を判別する方法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、餅試料からＤＮＡを効率よく抽出し、該ＤＮＡを鋳型として対合プライマー存在下でＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡの多型を検出することによって、原料米の品種を判別できることを見出し、本発明に到達したものである。
【０００６】
すなわち、請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号１〜２０記載の対合プライマーであるＳ１３Ｆ２５（配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号２）；Ｍ２ＣＧＦ２０（配列番号３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列番号４）；Ｍ１１Ｆ２０（配列番号５）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６）；Ｂ１Ｆ２５（配列番号７）およびＢ１Ｒ２０（配列番号８）；ＷＫＡ９Ｆ２０（配列番号９）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列番号１０）；Ｊ６Ｆ１８（配列番号１１）およびＪ６Ｒ２０（配列番号１２）；Ｂ１８Ｆ１５（配列番号１３）およびＢ１８Ｒ２１（配列番号１４）；Ｅ３０Ｆ２８（配列番号１５）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号１６）；Ｇ２２Ｆ２７（配列番号１７）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号１８）；Ｂ４３Ｆ１７（配列番号１９）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２０）からなる群より選択された１種類あるいは２種類以上の対合プライマーを用い、餅試料から抽出、精製したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によって鋳型ＤＮＡを増幅し、得られた増幅ＤＮＡの多型によって餅試料の原料米の品種を判別することを特徴とする餅試料の原料米の品種判別方法である。
【０００７】
請求項２記載の本発明は、餅試料が、凍結乾燥したものである請求項１記載の方法である。
請求項３記載の本発明は、対合プライマー存在下、餅試料から抽出したＤＮＡを鋳型としてアニーリング温度を６０℃±５℃とするＰＣＲ法を行う請求項１記載の方法である。
【０００８】
請求項４記載の本発明は、餅試料が、アミラーゼ処理および／またはプロテアーゼ処理したものである請求項１または２記載の餅試料の原料米の品種判別方法である。
請求項５記載の本発明は、ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲ法である請求項１〜４のいずれかに記載の餅試料の原料米の品種判別方法である。
請求項６記載の本発明は、対合プライマーとして、ＷＫＡ９Ｆ２０（配列番号９）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列番号１０）；Ｅ３０Ｆ２８（配列番号１５）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号１６）；Ｇ２２Ｆ２７（配列番号１７）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号１８）；Ｂ１Ｆ２５（配列番号７）およびＢ１Ｒ２０（配列番号８）の４種類のプライマーを混合し、アニーリング温度を６０℃±５℃とするマルチプレックスＰＣＲ法を行う請求項１〜４のいずれかに記載の餅試料の原料米の品種判別方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明における餅試料とは、糯米を原料として水に浸漬し、加熱して澱粉を糊化させた後に、杵搗き、練り出し、混捏あるいは超高圧処理等によって原料米の組織構造および細胞構造を破壊し、均一な生地として調製したものである。
【００１０】
本発明の対象である糯米の品種については特に限定はなく、例えば「ヒヨクモチ」、「はくちょうもち」、「こがねもち」等に代表される国内産糯水稲品種の他に、「トヨハタモチ」、「ゆめのはたもち」等に代表される国内産陸稲糯品種、「Calmochi101 」、「Nep Hoa Vang」に代表される外国産糯品種等のいずれの品種であっても適用が可能である。
しかも、試料として用いる餅試料の原料米品種としては、１種類の品種に限定されず、２品種以上を混合して餅を調製したものであってもよい。
【００１１】
餅試料からのＤＮＡ抽出は、生の餅試料をそのまま用いて行ってもよく、あるいは酵素処理、例えばアミラーゼおよび／またはプロテアーゼを用いる２〜４８時間の酵素処理を行った後の餅試料について実施することが可能である。しかしながら、生の餅試料から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法に用いた場合、品種間の識別性の現れる識別バンドを検出することができないことがある。それ故、ＤＮＡの抽出を効率よく実施するためには、生の餅試料を予めアミラーゼおよび／またはプロテアーゼによる処理を行って、ＤＮＡ抽出を妨げる糊化澱粉や変性タンパク質を分解した後に抽出操作を行うことが好ましい。
【００１２】
酵素処理あるいはＤＮＡ抽出処理を行うに際しては、餅試料をでんぷんの糊化温度以上の高温にさらすことなく微粉砕することが必要である。このため、本発明においては、餅試料として凍結乾燥したものが用いられるが、凍結乾燥した後にさらに粉末化することが好ましい。
餅試料を凍結乾燥する方法としては、例えば餅試料を冷凍庫に入れたり、液体窒素処理等によって−２０℃〜−２００℃に凍結した後に、凍結乾燥機（例えばＥｙｅｌａ製ＦＤ−１等）を用いて凍結乾燥する方法がある。次に、適当な粉砕器（例えばイワタニ製ミルサーＩＦＭ１００等）によって凍結乾燥物を粉砕することによって粉末餅試料が得られる。
凍結乾燥した餅試料の粉末について、前記の酵素処理を施し、次いでＤＮＡ抽出と精製を行うことによって、精製度の高いＤＮＡを高収率で抽出、精製することができる。
【００１３】
上記したように、凍結乾燥した餅試料の粉末からＤＮＡ抽出を行うに先立ち、アミラーゼおよび／またはプロテアーゼによる酵素処理を行う。餅試料の場合には、精米や米飯粒の場合とは異なり、製造工程で加熱処理および物理的剪断力を受けて、組織や細胞構造が破壊されている。そのため、澱粉の糊化およびタンパク質の変性が起こっている。したがって、精製度の高いＤＮＡを効率よく抽出するためには、ＤＮＡを抽出する前に酵素による前処理が必要である。
【００１４】
本発明で用いるアミラーゼとは、澱粉分解酵素の総称であり、澱粉分子の途中を無差別に切断するα−アミラーゼ、澱粉の非還元末端からマルトースを順次切り出すβ−アミラーゼ、澱粉の非還元末端からグルコースを順次切り出すグルコアミラーゼなどが挙げられる。本発明においては、これらの澱粉分解酵素のいずれをも使用することができるが、下記に示す理由から、耐熱性アミラーゼを用いることが好ましい。
【００１５】
本発明に用いる耐熱性アミラーゼとしては、至適温度が６０℃以上のアミラーゼが好適である。通常のアミラーゼは、至適温度が３０〜４５℃程度であるが、耐熱性アミラーゼは至適温度が高いため、反応温度を高くすることが可能であり、これによって反応時間を短縮したり、反応収率を高めたり、他の酵素反応、例えばＤＮＡ分解反応を抑制できるという利点がある。そのため、本発明では、アミラーゼ処理を行う場合、５５〜６５℃もしくはそれ以上の温度で実施する。
本発明に用いられる耐熱性の高いアミラーゼの具体例としては、例えばバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来のα−アミラーゼがあり、この酵素を用いて８０℃で１時間の酵素反応を行うことにより、ＤＮＡを分解させることなく、糯米の糊化澱粉を効率よく分解することができる。
【００１６】
本発明において、糊化澱粉を分解するために通常のアミラーゼを使用して酵素処理を行う場合、１００〜１０００Ｕ／ｍｇのアミラーゼを０．１〜５ｍｇ／ｍＬの水溶液として用いる。この酵素液をＤＮＡ抽出液に０．００５〜０．１容、好ましくは０．０１〜０．０５容の割合で添加する。添加後、反応温度３０〜９０℃、好ましくは５０〜８５℃で１０分間以上、通常は３０〜１２０分間反応させて糊化澱粉を分解する。
一方、アミラーゼとして耐熱性アミラーゼを使用する場合は、糯米澱粉の糊化温度よりも高い温度である６０〜８５℃で反応させることが可能であるため、特に良好な分解率と時間の短縮という効果が得られる。
【００１７】
次に、本発明で用いるプロテアーゼとは、タンパク質分解酵素の総称であり、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン等を例示することができる。本発明においては種々のプロテアーゼを使用することができるが、界面活性剤存在下でも高い活性を有するもの、例えばトリチラチウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼ（商品名：プロテアーゼＫ、ワシントン・バイオケミカル社製）等を用いることが好ましい。
この酵素は、反応性が広く、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸等のカルボキシル基側を切断し、またラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アガロース、アクリルアミド等の存在下でも活性を発現するという利点がある。
プロテアーゼを反応させることにより、餅試料中のＤＮＡ抽出を妨害するタンパク質を分解、除去できる上に、タンパク質であるＤＮＡ分解酵素自身も該酵素の作用によって分解され、ＤＮＡの分解を防止することができる。
【００１８】
プロテアーゼを使用する場合、１０〜１０００Ｕ／ｍｇのプロテアーゼを５〜５０ｍｇ／ｍＬの水溶液として用いる。この酵素液をＤＮＡ抽出液に対して０．００１〜０．１容、好ましくは０．０２〜０．０５容の割合で添加し、２０〜６０℃、好ましくは２５〜４０℃で１０分間以上、通常は３０〜１２０分間程度反応させてタンパク質を分解する。なお、タンパク質の可溶化や酵素作用の効率向上のため、ＳＤＳ等の界面活性剤やトリス塩酸緩衝液のようなｐＨ安定剤を併用することができる。
【００１９】
このようにして酵素処理により澱粉とタンパク質を分解して低分子化した餅試料からＤＮＡの抽出を行う。ＤＮＡの抽出は、例えばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法やアルカリＳＤＳ法等により行うことができる。１例を示すと、上記の低分子化した餅試料にエチルアルコール等を加え、遠心分離などの固−液分離を行って分解産物を上清画分として除去し、ＤＮＡを沈殿画分として得る。
沈殿として得たＤＮＡをエチレンジアミン４酢酸 (以下、ＥＤＴＡと略記することがある。) 存在下のトリス緩衝液で溶解し、さらにフェノールあるいはフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール混合溶液（以下、ＰＣＩ溶液と略記することがある。）等の有機溶媒で処理することによって脂質等の不純物を除去する。続いて、エチルアルコールあるいは７０％エチルアルコールによってＤＮＡ画分の沈殿形成とその洗浄を行い、精製された鋳型ＤＮＡが得られる。
【００２０】
次に、本発明では、上記の操作により得られたＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ(Polymerase chain reaction) 反応によって、ＤＮＡの増幅を行う。この反応は、好適なプライマーとＤＮＡポリメラーゼの存在下に行う。
これは、ＤＮＡのうち、次のＰＣＲ用の対合プライマー設計の基となる品種間の識別性を有する塩基配列を増幅させるために行うものである。
ここで、本発明におけるＰＣＲ反応とは、変性、アニーリング（結合）、伸長の３種類の工程を２０〜５０回反復することによって、もとの鋳型ＤＮＡを１００万〜１０億倍に増幅する反応のことである。
プライマーとは、ＰＣＲ反応において鋳型ＤＮＡと塩基の相補性に基づいて結合し、２本鎖部分を形成してＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の開始点を形成する８〜５０量体、好ましくは８〜３０量体の遺伝子断片のことである。
【００２１】
また、対合プライマーとは、品種間の識別性の現れる塩基配列を増幅させることができる一対のプライマーであり、上記餅試料より得られるＤＮＡからＰＣＲを行って得られる品種間に識別のあるバンド部分の塩基配列を基に設計されるものである。
対合プライマーを得るためのＰＣＲにおいては、任意のランダムプライマーを用いる。ランダムプライマーとは、餅試料から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増幅する際に、変性して一本鎖に分れたＤＮＡに相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型ＤＮＡ複製の開始点となるプライマーを指す。通常は１０〜２０量体のヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーのことである。
本発明において、ランダムプライマーとしては、通常用いられているものを選択すればよく、例えばオペロン社から市販されている１０量体ランダムプライマーや、和光純薬社から市販されているＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）等を挙げることができる。
【００２２】
続いて、ＰＣＲで得られる増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これは、増幅産物のうち、目的とする対合プライマーを設計するための基となる、品種間の識別性の現れる塩基配列であることを示すバンドを検出するためである。
ここで、電気泳動とは、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡが、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差によって分離され、これを臭化エチジウムによって帯状に染色し、紫外線照射等を行うことによりバンドパターンとして増幅ＤＮＡの相違が検出される操作をいう。
【００２３】
このようにして検出された品種間の識別性の現れたバンドから、次のようにして一対の対合プライマーを作製する。
すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出して回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増殖し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
【００２４】
決定された塩基配列から、対合プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型である餅試料由来のＤＮＡのうちランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している筈である。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲにおける対合プライマーの母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。
したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さを有する餅試料の原料米の品種判定に有用な対合プライマーを設計することができる。
【００２５】
本発明における対合プライマーは、互いに同一配列あるいは相同配列を有していることが望ましい。
また、プライマーのサイズは、好ましくは８〜５０塩基、より好ましくは８〜３０塩基の範囲内であることが必要である。
対合プライマーを選定することにより、最初のＰＣＲ法においてランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数箇所のうち、第２次のＰＣＲ法においては、品種識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。
【００２６】
本発明者らは、上記のＰＣＲを行った結果、各品種間に識別性の現れる数種のバンドを得、これらのバンドに由来する種々の対合プライマーを得た。
本発明に用いることができるプライマーの例としては、配列表の配列番号１〜２０に記載された１０組、２０個の対合プライマーがあり、この中から適正なものを選定し、ＰＣＲ法に使用する。すなわち、以下の対合プライマーから選択される１種類あるいは２種類以上の対合プライマーが本発明に用いられる。
Ｓ１３Ｆ２５（配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号２）；Ｍ２ＣＧＦ２０（配列番号３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列番号４）；Ｍ１１Ｆ２０（配列番号５）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６）；Ｂ１Ｆ２５（配列番号７）およびＢ１Ｒ２０（配列番号８）；ＷＫＡ９Ｆ２０（配列番号９）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列番号１０）；Ｊ６Ｆ１８（配列番号１１）およびＪ６Ｒ２０（配列番号１２）；Ｂ１８Ｆ１５（配列番号１３）およびＢ１８Ｒ２１（配列番号１４）；Ｅ３０Ｆ２８（配列番号１５）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号１６）；Ｇ２２Ｆ２７（配列番号１７）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号１８）；Ｂ４３Ｆ１７（配列番号１９）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２０）
【００２７】
対合プライマー、Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４によって増幅される識別バンドＤＮＡは約１．８ｋｂｐであり、「こがねもち」と「コトブキモチ」が−であり、Ｍ２ＣＧＦ２０およびＭ２ＣＧＲ１５によって増幅される識別バンドＤＮＡは約１．２ｋｂｐであり、「わたぼうし」のみが−であり、Ｍ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．７３ｋｂｐであり、「ヒヨクモチ」のみが−であり、Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．５ｋｂｐであり、「ヒヨクモチ」のみが＋であり、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０によって増幅される識別バンドＤＮＡは約１．６ｋｂｐであり、「わたぼうし」と「マンゲツモチ」のみが＋であり、Ｊ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．９ｋｂｐであり、「こがねもち」のみが−であり、Ｂ１８Ｆ１５およびＢ１８Ｒ２１によって増幅される識別バンドＤＮＡは約１．０ｋｂｐであり、「わたぼうし」のみが−であり、Ｅ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．８ｋｂｐであり、「はくちょうもち」のみが＋であり、Ｇ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．６５ｋｂｐであり、「はくちょうもち」と「こがねもち」が＋であり、Ｂ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８によって増幅される識別バンドＤＮＡは約０．９ｋｂｐであり、「こがねもち」が＋で、「カリフォルニア産糯米」および「タイ産糯米」では−であった。
以上の１０組２０個のプライマーが餅を試料とする糯米の品種判別に有用である。
【００２８】
このように、本発明では、餅から抽出、精製したＤＮＡを鋳型とし、好適な対合プライマーの存在下でＰＣＲ法によって鋳型ＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡの多型によって原料米の品種を判別することができる。また、餅試料が凍結乾燥試料である場合には、ＤＮＡの抽出効率が向上し、一層簡易迅速に判別することが可能となる。
さらに、好適なプライマーがＥ３０およびＧ２２を含む群の１種あるいは２種以上の対合プライマーである場合には、判別が特に明瞭になる。また、好適なプライマーがＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３、Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０、Ｅ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４であり、これら４種類のプライマーを混合し、アニーリング温度を６０℃±５℃とするマルチプレックスＰＣＲ法の場合には、ＰＣＲおよび電気泳動の回数が減少し、簡易迅速、かつ高精度に品種を判別することが可能となる。
【００２９】
これらの対合プライマーは、上記したような一連の手順により、すなわち餅試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたＰＣＲにより品種間の識別性の現れるバンドを切り出して、クローニング、シークエンスして識別部分のＤＮＡ塩基配列を決定し、その配列と予想融解温度（Ｔｍ）に基づいて本発明者らが設計したものである。
【００３０】
対合プライマーを選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。その結果、本発明の目的とする餅試料の原料米の品種判別が可能となるのである。
【００３１】
前記したように、ＰＣＲにおいては、上記の対合プライマーのうち２種類あるいはそれ以上を同時に使用することができる（マルチプレックスＰＣＲ法）。融解温度がほぼ等しく、プライマーダイマーを形成しない対合プライマーの組み合わせを選定し、１回あるいは２回のＰＣＲと電気泳動等の検出方法によって、簡易迅速に餅原料米の品種を判定することが可能となる。
【００３２】
従来のランダムプライマーを用いる方法（ＲＡＰＤ法）では、品種識別バンド以外に多数の共通バンドが出現するために、複数のプライマーを同時に使用することは不可能であり、１回のＰＣＲに使用できるプライマーは１組に限られていた。
これに対して、本発明においては、上記のようにして得られた各プライマーを使用することにより、それぞれのプライマーに対応する識別バンドＤＮＡのみが出現する。したがって、対合プライマーの混合使用が可能となり、従来のように１回のＰＣＲにかけられるプライマーは１組に限られず、２種類以上を使用して原料米の品種識別を効率よく行うことができる。
各種の対合プライマーを混合使用することにより、プライマー毎にＰＣＲを行う必要がなくなり、１回のＰＣＲで多くの品種を正確、かつ簡便に判別することができ、品種判別に要する労力、時間、費用を大幅に減少させることができる。
【００３３】
このＰＣＲを効率よく進めるためには、使用する対合プライマーそれぞれの融解温度および該融解温度を考慮したＰＣＲのアニーリング温度の調整が必要である。ここで、融解温度（Ｔｍ）とは、ＤＮＡの二本鎖がそれぞれの一本鎖に分離する温度をいう。一般に、ＰＣＲのアニーリング温度は、通常、使用するプライマーのＴｍ付近が適している。
本発明においては、対合プライマーの併用に際し、Ｔｍの類似した対合プライマー同士を選択して混合し、かつＴｍに近い適正なアニーリング温度を選定することにより、各対合プライマーを単独で使用した場合に得られる識別バンドを１回あるいは少数回のＰＣＲで得ることができる。
【００３４】
具体的には、使用する対合プライマーのＴｍの平均値と、各対合プライマーのＴｍとの差が１５℃以内で、かつＰＣＲのアニーリング温度もその範囲とすることが好ましい。すなわち、本発明のマルチプレックスＰＣＲ法においては、アニーリング温度を６０℃±５℃とするものである。
アニーリング温度が３６℃よりも低い温度でＰＣＲを行うと、本来識別バンドが現れない品種にも識別バンドが現れて識別が困難となる恐れがあるため、好ましくない。一方、８０℃よりも高い温度でＰＣＲを行うと、本来出現すべき識別バンドが出現しなくなるので、不適当である。
【００３５】
本発明におけるＰＣＲでは、前記のようにして餅試料から抽出、精製したＤＮＡを鋳型として用い、前記の対合プライマーから好ましい組み合わせのものを選定して使用すること以外は、常法にしたがって行えばよい。
その１例を挙げると、１０〜５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．５〜１０ｎｇの対合プライマー、０．５〜５ＵのＤＮＡポリメラーゼ、５０〜５００μＭのデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液（ｄＮＴＰ）、1 〜５μＭの塩化マグネシウムおよび１０〜５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を混合し、９０〜９８℃で０．５〜３分間の変性、３６〜６５℃で０．２〜２分間の結合、６０〜８０℃で０．５〜５分間の伸長の各反応工程を２０〜５０サイクル繰り返してＤＮＡを増幅する。ＤＮＡ増幅装置としては市販品を使用することができ、例えばアステック（株）社製ＰＣ−７００や宝酒造（株）製サーマルサイクラーＭＰ等を使用することができる。
【００３６】
本発明では、以上のようなＰＣＲを行った後、増幅したＤＮＡの多型を解析する。これにより、品種特異的な識別バンドのみが検出され、品種の判別が可能となる。すなわち、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの多型に基づいて、餅試料の原料米の品種を判別するものである。
多型性とは、同一種内の正常な個体間に形質や形態について多様性の存在することを指す。本発明においては、餅試料から抽出、精製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅させたＤＮＡについて、分子量や塩基配列の多様性が出現することを意味する。
識別バンドのみが検出されるのは、ＰＣＲにおいては対合プライマーが所定の品種特異的な識別部位のみに結合、増幅しているからである。
本発明において、ＰＣＲで対合プライマーを２種類以上用いると、複数の品種の識別バンドが出現するので、１回で多数の品種の判別を効率よく行うことができる。
【００３７】
得られた増幅したＤＮＡの多型の具体的な解析方法としては、アガロースゲル電気泳動法やアクリルアミドゲル電気泳動法等の常法が挙げられる。すなわち、ＰＣＲ終了後に、アガロースゲル電気泳動法やアクリルアミドゲル電気泳動法等を用いて分子量分布による分離を行い、泳動終了後にゲルをエチジウムクロライド染色する。その後、染色したゲルに紫外線を照射し、それによって現れる各ＤＮＡバンドパターン（泳動像）を写真撮影する。
次に、該泳動写真に示される各試料のバンドパターンを、予め品種の判明している試料のバンドパターンとの異同を比較することにより、原料米がどの品種であるかを判別することができる。
また、最近使用されるようになってきた定量ＰＣＲのように、ＰＣＲと同時並行して、蛍光プライマーや蛍光色素と結合したモノマーを蛍光検出器によって定量、比較することによって、品種の判別をすることも可能である。
【００３８】
このように、本発明では、餅試料から抽出、精製したＤＮＡを鋳型とし、好適な対合プライマーの存在下でＰＣＲを行うことによって鋳型ＤＮＡを増幅し、該増幅ＤＮＡの多型によって原料米の品種を判別することができる。特に、餅試料が凍結乾燥物を粉末化したものであるときは、ＤＮＡの抽出効率が向上し、一層簡易、迅速に、かつ高精度に原料米の品種を判別することが可能となる。
さらに、対合プライマーとして、Ｅ３０およびＧ２２を含む群より選ばれた１種類あるいは２種類以上の対合プライマーを用いた場合には、餅試料の原料米の品種判別が特に明瞭になる。
【００３９】
さらに、ＷＫＡ９（ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０）、Ｅ３０（Ｅ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４）、Ｇ２２（Ｇ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３）、Ｂ１（Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０）の４種類の対合プライマーすべてを混合し、アニーリング温度を６０±５℃とするマルチプレックスＰＣＲ法を行った場合には、ＰＣＲおよび検出のための電気泳動の回数が減少するため、簡易迅速、かつ高精度に餅試料の原料米の品種を判別することが可能となる。
また、米の食味評価においては、アミロースのみならずアミロペクチンも重要である。本発明の餅試料の原料米の品種判別方法は、アミロペクチンしか含んでいない糯米同士でも食味特性が異なっていることをＤＮＡレベルで識別することができ、餅製造業界で問題になっている低価格糯米の不正混入問題等への技術的寄与が可能である。
【００４０】
【実施例】
以下において、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
（１）餅試料の作製
「ヒヨクモチ」および「はくちょうもち」は、それぞれ３００ｇの糯精米を試料とし、家庭用餅つき機（タイガー餅つき機、ＳＭＫ−１８００）によって常法にしたがって製餅した。また、「こがねもち」、「わたぼうし」および輸入糯米は、それぞれ１ｋｇの糯精米を試料とし、蒸籠で蒸煮した後、杵搗き法によって製餅した。
製餅の後、約１０ｇの餅試料を−８０℃で一晩冷凍した後、Ｅｙｌａ製凍結乾燥機ＦＤ−１によって凍結乾燥し、イワタニ製ミルサーＩＦＭ−１００によって粉砕して餅粉末試料とした。
【００４１】
（２）ＤＮＡの抽出・精製
凍結乾燥後に粉砕した餅粉末１００ｍｇを微量遠心チューブに採り、１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１Ｍ  食塩含有）１．５ｍｌを加えた後、耐熱性アミラーゼ（シグマ製、バチルス・リケニホルミス由来のαーアミラーゼ、７９０Ｕ／固形物ｍｇ、１ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加し、８０℃で１時間反応させた。
次いで、「プロテアーゼＫ」（ワシントンバイオケミカル社製、２７．７Ｕ／ｍｇ、２０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加え、ＳＤＳ水溶液を濃度０．２％となるように加え、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、微量遠心機（日立製、ｈｉｍａｃＣＦ１５Ｒ、１５０００ｒｐｍ、４分間）で遠心分離して得られる上清に２倍容のエチルアルコールを加え、再度同条件で遠心分離して沈殿を得た。
【００４２】
得られた沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）３００μｌに溶解した。溶解後、等量の中性フェノール溶液を加えてタンパク質を除去し、遠心分離して得られる上清に等量のＰＣＩ溶液を加えて精製した。その後、遠心分離上清に２倍容のエチルアルコールを加えて遠心分離して得られた沈殿を７０％エチルアルコール水溶液で２回洗浄した後、１０倍希釈ＴＥ溶液３０μl に溶解し、これをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ溶液とした。
なお、比較のために、凍結乾燥粉末１００ｍｇに代えて、餅を調製する前の糯米原料粉末１１０ｍｇおよび約１６０ｍｇの餅断片を微量遠心チューブに採り、上記と同様に操作を行った。
【００４３】
（３）ＤＮＡの定量
上記のようにして調製した鋳型ＤＮＡの量を第１表に示す。ＤＮＡの定量は、島津製、紫外可視分光光度計ＵＶ１５０による２６０ｎｍの吸光度によって行った。なお、表中のＯＤ２６０／ＯＤ２８０は、２６０ｎｍでの吸光度を２８０ｎｍでの吸光度で除した値であり、１．８以上であれば、タンパク質の混入が少なく、ＰＣＲに使用可能とされる。
【００４４】
【表１】
第１表  餅試料から抽出・精製した鋳型ＤＮＡの量
0003989186.tif 000002
【００４５】
（４）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
上記（２）において調製した鋳型ＤＮＡを使用し、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては宝酒造（株）製Taq polymerase、対合プライマーとしてはＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４、Ｍ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ２３、Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０、Ｍ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０の４種類の対合プライマーをそれぞれ単独で使用した。
反応液の組成を示すと、鋳型ＤＮＡ  ２００ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼ  １ｕｎｉｔ、２ｍＭのｄＮＴＰ溶液  ２．０μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ2   ２．０μｌ、１０倍希釈緩衝液（１００ｍＭ  トリス塩酸、ｐＨ８．３、ＫＣｌ  ５００ｍＭ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）２．０μｌであり、滅菌水を加えて反応系の全量を２０μｌに調整した。
ＤＮＡの増幅は、変性を９４℃で１分間、アニーリングを６０℃で１分間、伸長を７２℃で２分間の条件で３５サイクル行い、ＰＣＲ装置は宝酒造（株）製、サーマルサイクラーＭＰを使用した。
【００４６】
（５）増幅ＤＮＡの電気泳動
上記の（４）においてＰＣＲによるＤＮＡ増幅終了後、ＰＣＲ産物を含む反応液にローディングバッファー（グリセリン３０％、ブロモフェノールブルー０．２５％、滅菌水６９．７５％）3 μl を加え、１００μｌのクロロホルムでミネラルオイルを除去した。
次に、上記の試料１５μｌをアガロースゲル（サワデーテクノロジー社製、Ultra-pure Agarose、２％）に注入し、ミューピッド電気泳動装置（コスモバイオ社製）を用いて１００Ｖで４０分間電気泳動した。ＤＮＡの染色は、エチジウムブロマイドによって行い、紫外線照射下でＰＣＲ産物のバンドパターンの写真撮影を行った。なお、電気泳動における分子量マーカーとしては和光純薬（株）製のＭａｒｋｅｒ‐４（φＸ１７４ファージ、Hae ・）を用いた。
【００４７】
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す泳動写真を図１及び図２に、ＰＣＲの結果を第２表に示す。図１は原料糯米を試料とした場合の、図２は該糯米から製餅した餅を試料とした場合の、それぞれのアガロースゲル泳動後のバンドパターンである。図１、図２中の（ａ）は対合プライマーとしてＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４を使用した場合、（ｂ）は対合プライマーとしてＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ２３を使用した場合、（ｃ）は対合プライマーとしてＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０を使用した場合、（ｄ）は対合プライマーとしてＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０を使用した場合の結果を示す。
図１および図２から明らかなように、ＰＣＲの結果は、使用した４種類の餅試料とその原料糯米の場合で全く同じ結果を示しており、餅を試料として原料米の品種判別と同じ結果が得られることが示された。
また、図１、図２および第２表から明らかなように、増幅ＤＮＡのパターンは４種類の餅および糯米でそれぞれ異なっており、餅を試料として、その原料米の品種判別が可能であることを示している。
【００４８】
なお、比較のために行った凍結乾燥粉末に代えて、直接餅断片から抽出したＤＮＡ試料の場合には、ＰＣＲの結果、識別バンドが全く現れず、品種の識別ができなかった。したがって、餅試料の原料米の品種の判別を行うには、餅試料を凍結乾燥することが重要であることが明らかとなった。
また、特許第３０４８１４９号明細書の実施例１の米飯粒に代えて５０ｍｇの餅試料を用いた比較例の場合にも、ＰＣＲによる原料糯米の品種識別が不可能であった。この結果から、（１）餅試料の凍結乾燥、（２）酵素処理条件の強化、（３）適正プライマーの選定、という、本明細書で記述した本発明の３つの条件が餅試料からの原料糯米の品種判別には必要不可欠であることが示された。
【００４９】
【表２】
第２表  餅試料から抽出した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲの結果
0003989186.tif 000003
＋：識別バンドが出現する      −：識別バンドが出現しない
【００５０】
実施例２
餅試料あるいは原料糯米について、実施例１と同様に、これらから抽出・精製した鋳型ＤＮＡを用い、プライマーとしてＷＫＡ９（ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０）、Ｅ３０（Ｅ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４）、Ｇ２２（Ｇ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３）、Ｂ１（Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０）の４種類、合計８個の対合プライマーを混合使用してマルチプレックスＰＣＲを行った。プライマー以外の条件は、全て実施例１と同じ条件で行った。
【００５１】
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図３に、ＰＣＲ法の結果を第３表に示す。なお、図３は、アガロースゲル泳動後のバンドパターンである。図中（Ａ）は原料糯米、（Ｂ）は餅試料の結果を示す。
第３表および図３から明らかなように、「ヒヨクモチ」、「こがねもち」、「はくちょうもち」および「わたぼうし」の４種類の餅試料および原料糯米は、いずれもすべて異なるＤＮＡパターンを示しており、本発明の餅を試料とするマルチプレックスＰＣＲ法により、１回のＰＣＲと１回の電気泳動で餅試料の原料米品種を識別できることが明らかとなった。
【００５２】
【表３】
第３表  餅試料から抽出した鋳型ＤＮＡによるマルチプレックスＰＣＲ法の結果
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＋：識別バンドが出現する      −：識別バンドが出現しない
【００５３】
次に、上記４種類の対合プライマーを単独で使用して上記と同様にＰＣＲ法を行った場合のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図４に示す。図４（ａ）は、対合プライマーとしてＷＫＡ９を用いた場合、図４（ｂ）は、対合プライマーとしてＥ３０を用いた場合、図４（ｃ）は、対合プライマーとしてＧ２２を用いた場合、図４（ｄ）は、対合プライマーとしてＢ１を用いた場合の結果を示す。図中（Ａ）は原料糯米、（Ｂ）は餅試料の結果を示す。
これらの結果から、対合プライマーのＥ３０によって北海道産主力糯米である「はくちょうもち」、Ｇ２２によって生産量日本一の「ヒヨクモチ」を、それぞれ高級品種である「こがねもち」と識別できることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
試料として国産糯米「こがねもち」と外国産糯米２種類（カリフォルニア産およびタイ産）を用いて製餅したものを用い、実施例１と同様にして鋳型となるＤＮＡを抽出、精製した。
次いで、この例では、実施例１で用いた組み合わせとは異なる対合プライマーの組み合わせによるマルチプレックスＰＣＲを行った。すなわち、プライマーとしてＷＫＡ９（ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０）、Ｇ２２（Ｇ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３）、Ｂ４３（Ｂ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８）およびＭ１１（Ｍ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０）の４種類、合計８個の対合プライマーを混合使用した。プライマー以外は、すべて実施例１と同じ条件で行った。
【００５５】
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図５に、ＰＣＲ法の結果を第４表に示す。なお、図５はアガロースゲル泳動後のバンドパターンである。図中の１、２、３は原料糯米を試料とした場合で、１は「こがねもち」、２はカリフォルニア産糯米、３はタイ産糯米の結果を示す。また、４、５、６は餅試料を用いたときの結果であり、４は「こがねもち」、５はカリフォルニア産糯米、６はタイ産糯米の結果を示す。
第４表および図５から明らかなように、２種類の外国産糯米を原料とする餅は、国産糯米「こがねもち」の場合とは異なるＤＮＡパターンを示しており、本発明に係るマルチプレックスＰＣＲ法により、１回のＰＣＲと１回の電気泳動によって、これらの外国産を原料とする餅と「こがねもち」を原料とする餅とを識別できることが示された。
【００５６】
【表４】
第４表  餅試料から抽出した鋳型ＤＮＡによるマルチプレックスＰＣＲ法の結果
0003989186.tif 000005
＋：識別バンドが出現する      −：識別バンドが出現しない
【００５７】
実施例４
糯米原料を「マンゲツモチ」と「コトブキモチ」としたこと以外は、実施例１と同様にして製餅し、これを凍結乾燥後に粉末としたものを前記の如く酵素処理を行ってからＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、対合プライマーとしてＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４、Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０をそれぞれ添加してＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で検出した。ＰＣＲの結果を第５表に示す。
表から明らかなように、３種類のプライマーの使用により、２種類の糯米原料を識別することができた。
【００５８】
【表５】
第５表  餅試料から抽出した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲの結果
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【００５９】
試験例１
ＰＣＲ法におけるアニーリング温度を３６℃あるいは８０℃に変えたこと以外は、全て実施例２と同様にして行った。
この結果、アニーリング温度が３６℃の場合には、識別バンド以外に多数のマイナーバンドが出現して試料の米品種識別が困難であった。一方、８０℃の場合には、品種判別に必要な識別バンドも消失してしまい、品種識別が不可能であった。
以上のことから、識別バンドを確実に出現させるためには、アニーリング温度を６０℃±５℃とすることが重要であることが示された。
【００６０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、既に加工されている餅から、その原料米のＤＮＡを抽出、精製し、これを対合プライマー存在下で行うＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用することにより、餅試料の糯米原料の品種判別がＤＮＡレベルで可能でなる。
また、本発明の方法において、好適な対合プライマーを混合使用するマルチプレックスＰＣＲ法を行うことによって、僅か１回のＰＣＲと１回の電気泳動によって、簡易迅速、かつ高精度に餅を試料とする原料米の品種判別が可能となる。さらに、本発明によって、外国産糯米を原料とする餅と国内産「こがねもち」を原料とする餅とを識別することが可能となった。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  原料糯米から抽出した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜４は順に原料米の「はくちょうもち」、「ヒヨクモチ」、「こがねもち」、「わたぼうし」を示す。図中の（ａ）は、対合プライマーとしてＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４を使用した場合、（ｂ）は、対合プライマーとしてＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ２３を使用した場合、（ｃ）は、対合プライマーとしてＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０を使用した場合、（ｄ）は、対合プライマーとしてＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０を使用した場合の結果を示す。
【図２】  餅試料から抽出した鋳型ＤＮＡによるＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜４は順に原料米の「はくちょうもち」、「ヒヨクモチ」、「こがねもち」、「わたぼうし」を示す。図中の（ａ）は、対合プライマーとしてＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４を使用した場合、（ｂ）は、対合プライマーとしてＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ２３を使用した場合、（ｃ）は、対合プライマーとしてＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０を使用した場合、（ｄ）は、対合プライマーとしてＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０を使用した場合の結果を示す。
【図３】  原料糯米および該糯米から製餅した餅を試料とした場合のマルチプレックスＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜４は順に「ヒヨクモチ」、「こがねもち」、「はくちょうもち」、「わたぼうし」を示し、（Ａ）は原料糯米、（Ｂ）は餅試料の結果である。
【図４】  原料糯米および該糯米から製餅した餅を試料とした場合における単品の対合プライマーを使用した場合のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜４は順に「ヒヨクモチ」、「こがねもち」、「はくちょうもち」、「わたぼうし」を示し、（ａ）は対合プライマーとしてＷＫＡ９を用いた場合、（ｂ）は対合プライマーとしてＥ３０を用いた場合、（ｃ）は対合プライマーとしてＧ２２を用いた場合、（ｄ）は対合プライマーとしてＢ１を用いた場合の結果を示す。（Ａ）は原料糯米、（Ｂ）は餅試料の結果である。
【図５】  国産糯米と外国産糯米の原料米と該原料米から製餅した餅を試料とした場合についてのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
１〜３は順に「こがねもち」、カリフォルニア産糯米、タイ産糯米を、４〜６は順に「こがねもち」、カリフォルニア産糯米、タイ産糯米を示し、（Ａ）は原料糯米、（Ｂ）は餅試料の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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