(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径＜４５ｎｍの磁性酸化鉄である磁鉄鉱Fe3O4の単結晶及びこの結晶を取り囲むリン脂質膜からなる特異的マグネトソーム（magnetosome）。
【請求項２】
膜がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルコリンからなり、その中にパルミチン酸、パルミトレイン酸及びオレイン酸が存在することを特徴とする請求項１に記載のマグネトソーム。
【請求項３】
膜が53±6％のホスファチジルエタノールアミン、38±6％のホスファチジルグリセロール、8.9±0,5％のホスファチジルコリンからなることを特徴とする請求項１及び２に記載のマグネトソーム。
【請求項４】
100個以下の連鎖をなし、陽イオン表面電荷を有することを特徴とする請求項１及び３に記載のマグネトソーム。
【請求項５】
さらに抗体又は治療薬が、場合によっては適当な反応基を介してマグネトソームの膜に共有結合されていることを特徴とする請求項１ないし４に記載のマグネトソーム。
【請求項６】
リポソームの中に充填されていることを特徴とする請求項１ないし５に記載のマグネトソーム。
【請求項７】
古典的リポソーム、ステルス（Stealth）リポソーム、ミセル系、イムノリポソーム、カチオンリポソーム又は融合誘導リポソームに充填されていることを特徴とする請求項１ないし６に記載のマグネトソーム。
【請求項８】
さらに表面に化学的に結合された抗体を有することを特徴とする請求項１−４及び６−７に記載のマグネトソーム。
【請求項９】
さらに単数又は複数の封入された治療薬を含むことを特徴とする請求項１−４及び６−７に記載のマグネトソーム。
【請求項１０】
さらに放射性核種を含むことを特徴とする請求項１−４及び６−７に記載のマグネトソーム。
【請求項１１】
プラスミド、治療遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又は遺伝子診断薬とともに、遺伝子転移に適した陽イオン錯体を形成することを特徴とする請求項１−４及び６−７に記載のマグネトソーム。
【請求項１２】
鉄に対する錯体形成物質を含まない簡単な培養液を使用して磁性菌マグネトスピリルム・グリフィスワルデンス（Magnetospirillum gryphiswaldense）から分離し、その際培養液の酸素濃度を２％以下に保ち、後で酢酸ナトリウム及びFeSO4を加え、磁性細胞を遠心分離により収穫し、続いて細胞分解の後、磁気分離カラムで永久磁石により細胞破片と細胞液を分離することによりマグネトソームを得ることを特徴とする請求項１ないし４に記載の特異的マグネトソームの製造方法。
【請求項１３】
請求項１−４及び６−７に記載の特異的マグネトソームの、NMRコントラスト剤の製造における使用。
【請求項１４】
請求項１ないし５に記載の特異的マグネトソームの、パージング（病原細胞の除去）のための治療薬の製造における使用。
【請求項１５】
腫瘍疾患又はリンパ管造影、炎症過程、多発性硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病のための診断薬の製造における、請求項１−４及び６−７に記載の特異的マグネトソームの使用。
【請求項１６】
腫瘍疾患に対する治療薬の製造における、請求項１ないし１０に記載の特異的マグネトソームの使用。
【請求項１７】
10-60個のマグネトソームの連鎖をなし、陽イオン表面電荷を有することを特徴とする請求項１及び３に記載のマグネトソーム。
【発明の詳細な説明】
本発明は最大43-45nmの磁性粒子を有する特異的磁気体（マグネトソーム、Magnetosome）、その製造方法及び使用に関する。また本発明はこの磁気体をリポソームで包んで得られる磁気リポソーム（マグネトリポソーム、Magnetoliposome）に関する。
本発明の応用分野は医薬及び製薬業である。
超常磁性鉄粒子を医学診断でNMRコントラスト剤として又はイムノコンジュゲートの形で又は合成医薬担体として使用することが知られている。Matsunagaその他は1989年に磁性菌Magnetospirillum spec. ABM1から得た磁気体（日本国特許第7-241192号−Ａ明細書）及びその応用を記載した。ところがこの磁気体は比較的大きく、従って医療に応用した場合栓塞を引き起こす危険があるという欠点がある。
そこで本発明の課題は、公知のものより小さく、従って
−患者の体内で所定の目標への到達の可能性に関連して医学的応用範囲が改善され、
−同時に栓塞の危険が減少される
特異的磁気体を提供することである。
＜50nmの磁石粒子を有する磁気体が細菌Magnetospirillum gryphiswaldenseに含まれていることが判明した。
意外なことに、この特異的磁気体を磁性菌Magnetospirillum gryphiswaldenseから半工業的規模で製造することができた。
そこで本発明の主題は磁気体自体、その製造／調製方法及び好ましくは医学及び製薬学でのその使用である。
本発明は請求項に従って実現される。
本発明に係る磁気体は43-45nmの最大直径を有し、リン脂質膜で包まれた磁性酸化鉄、磁鉄鉱Fe3O4の単結晶を特徴とする。この結晶は通常立方八面体の形状を有する。
膜はホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルコリンからなり、その中に主として脂肪酸パルミチン酸、パルミトレイン酸及びオレイン酸があることが好ましい。膜が53±6％のホスファチジルエタノールアミン、38±6％のホスファチジルグリセロール及び8,9±0,5％のホスファチジルコリンからなり、そこに主として脂肪酸、パルミチン酸（約18,4％）、パルミトレイン酸（約25,6％）及びオレイン酸（約49,9％）があれば特に好適である。
特に好適な実施態様では磁気体は100個以下、好ましくは10-60個の磁気体の連鎖をなし、陽イオン表面電荷を有する。磁気体のこの連鎖形態により、抗体及び治療薬がこれに正しく結合して、作用する確率が高められる。
また本発明に係る磁気体は、さらに適当な反応基を介して磁気体膜に結合された共有結合抗体又は治療薬を有する磁気体である。
さらに本発明はこの新規な磁気体の製造方法に関する。この磁気体は新規な発酵法により磁性菌Magnetospirillum gryphiswaldenseから分離される。そのために、0,3gのKH2PO4、1gの酢酸ナトリウム、1gのダイズ・ペプトン（Merck）、0,1gの0,1 NH4Cl、0,1gの酵母エキスからなり、鉄に対する錯体形成物質を含まないpH6,9の新規で簡単な培養液を使用することが好ましい。培養液の酸素濃度は2%以下に保たれ、後で酢酸ナトリウムとFeSO4が添加される。約30時間後に磁性細胞を収穫することができる。新規な方法によれば、細胞分解の後強力な永久磁石（Sm-Neodyn）を備えた磁気分離カラムで細胞破片と細胞液を除き、洗浄して精製することにより、高い収量で磁気体が得られる。
また本発明の主題はリポソームに包まれ、他の脂質とともにそれ自体がリポソームを形成し、又はリポソームの表面に結合された本発明に係る磁気体である。このようなリポソームは次のとおりである。
−いわゆる古典的リポソーム（MLV、SUV、LUV）
−いわゆる“Stealth”リポソーム（PEG）
−ミセル系（例えばSDS、トリトン、コラン酸ナトリウム）
−例えば疾患に関連する抗原に対する抗体もしくはFabフラグメント又はリポソームの表面に結合された接着性分子を含むイムノリポソーム
−いわゆるカチオンリポソーム（DAC-Chol、DOCSPER）
−いわゆる融合誘導リポソーム（リポソームの中の再構成融合タンパク質）
これらの磁気リポソームの製造のために例えばドイツ国特許第4134158号明細書、ドイツ国特許第4430593号明細書、ドイツ国特許第4446937号明細書及びドイツ国特許第19631189号明細書に記載されたそれ自体公知のリポソーム製造法が使用される。その場合磁気体は出発脂質に添加することが好ましい。磁気リポソーム及び磁気体の本発明に属する好適な修飾を次の表１に示す。
0003902794.tif 000002
本発明に係る磁気体及び磁気リポソームはさらに表面に化学的に結合された特異抗体、単数又は複数の治療薬及び封入された即ちカプセルで包んだ放射性核種を含むことができる。
また遺伝子材料例えばプラスミド、治療遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又は遺伝子診断薬とともに、遺伝子転移に適した陽イオン錯体を形成する。
本発明に係るこれらの磁気体及び磁気リポソームは広範な応用分野を有する。その磁気的性質に基づきそのまま（即ち変更せずに）NMR検査のコントラスト剤として、SQUID生物磁力計による磁気的感受性のマッピングのためのマーカーとして、また種々の疾患及び炎症巣の検出のため診断薬として、又は例えばパージング（「病原細胞の除去」）のための治療薬として、腫瘍疾患又はリンパ管造影、炎症過程、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のための診断薬として、又は腫瘍疾患、炎症過程及び代謝疾患に対する治療薬として応用される。
診断薬としての使用はイムノ磁気体又はイムノ磁気リポソームの形で行うことが好ましい。そのために疾患に関連する抗原もしくは接着性分子又は配位子に対する抗体又はFabフラグメントが、適当な基を介して磁気体又は磁気リポソーム膜に、好ましくは種々の長さのスペーサーを介して、膜に包まれるホスファチジルエタノールアミンに共有結合される。
特に腫瘍の検出又はリンパ管造影のための診断薬として使用され、その場合とりわけ抗-CEA、抗-CD44が試薬として磁気体膜又は磁気リポソーム膜に結合される。
また炎症過程例えば関節症の検出（好ましくは抗-CD54、抗-CD56による）又は多発性硬化症又はアルツハイマー病（好ましくは抗βアミロイド、抗-APOE4）、ホジキン・リンパ腫細胞（好ましくは抗-CD30による）及びパーキンソン病の識別のために、これらの抗体結合産物が適している。
上記の診断的使用のために、本発明に係る磁気体がはなはだ好適である。
同時に適量の治療物質を目標部位に送るには、磁気リポソームを使用することが必要である。それは治療薬を結合するだけでなく、封入するためにも適している。磁気体の場合はスペーサーを介在してはじめて治療薬を結合することができる。
本発明に基づく重要な用法は、治療薬を結合（磁気体）し又は結合もしくは封入（磁気リポソーム）することにある。この治療薬は親油性又は親水性に従ってリポソームの膜又は水性の内室に封入することができる。
こうして本発明に基づき次の好適な組合せ変型が生じる。
−単数又は複数の治療薬が磁気体に結合され又は膜の中に封入される。
−単数又は複数の治療薬が磁気体に結合され又は膜の中に封入され、かつリポソームに充填される。
−磁気体がリポソームとして充填され、単数又は複数の治療薬がリポソームの水性の内室に封入される。
−治療薬が磁気体に結合され又は膜の中に封入され、磁気体がリポソームに充填され、少なくとも１つの別の治療薬がリポソームの水性又は親油性内室に封入される。
考えられる重要な治療薬は化学療法剤例えばカルボプラチン又はタキソール及び放射線治療薬例えばイットリウム、ヨウ素、テクネチウム又はホウ素である。また治療遺伝子例えば自殺遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はサイトカイン遺伝子を結合することができる。
本発明により広範な医学的応用が可能になる。本発明に係るに磁気体及び磁気リポソームの重要な利点は次のとおりである。
−体内の移転部によく到達し、早期に発見することができる。
−リンパ管内の濃縮が改善される。
−新規な粒子によって良好な血液・脳疾患適用性が得られる。それは特にアルツハイマー斑の検出及び脳腫瘍の診断のために重要である。
次に本発明の実施例を詳述する。
１．磁気体の製造
磁気体の大量製造のために磁性菌Magnetospirillum gryphiswaldenseの細胞を100リットル発酵槽（LP352, Bioeng AG）で30℃で下記の組成の培養液で培養した（1000ml当り）。0.3g KH2PO4、1g酢酸ナトリウム、1gダイズ・ペプトン（Merck）、0,1g NH4Cl、0,1g酵母エキス、pH6,9。70リットルの培養液に5リットルの原培養を加えて接種を行った。培養液の酸素濃度が２％の飽和を超えないように、攪拌と圧縮空気の供給により通気の調整を行った。OD400=0,55で70gの酢酸ナトリウム及びFeSO4を加えて濃度100μMとした。約30時間後に磁性細胞を収穫することができた。
細胞を遠心分離して洗浄した。３回の継代培養の後、フレンチプレスとその後の低回転数遠心分離により細胞抽出物を磁気分離カラム（Miltenyi Biotec）により20mM HEPES/4mM EDTAに加えた。磁性粒子の分離のためにカラムを強力な永久磁石（Sm-Neodyn）の磁界にさらした。これは磁化可能なカラム材料に強い不均質磁界を発生し、磁性粒子の特異な結合を生じた。特異に会合した汚染物を除去するために、磁気体をカラムで20mM HEPES/200mM NaClで洗浄した。20mMのHEPESで洗浄した後、磁界を取り除いた上で磁気体をカラムから洗い出した。場合によって存在する膜汚染物を分離するために、磁気体懸濁液を２段階（50/55%サッカロース）の砂糖勾配に掛け、限外遠心分離機で25Trpmで２５時間遠心分離した。場合によって存在する膜成分は中間相、緩衝液−サッカロース溶液に集まり、磁気体粒子は小管の底にペレットとして現れた。こうして得た磁気体は電子顕微鏡的に純粋であり、明瞭な脂質−タンパク質パターンを有した。
２．磁気体の使用
Magnetospirillum gryphiswaldenseから得た鉄含量（原子吸収分光分析（AAS）で算定）1,35g Fe/リットルの磁気体を使用した。
緩和能が37℃、0,47TでBruker Minispec pc 120で次のように決定された。
R1=25,503mM-1*・-1
R2=226,179mM-1*・-1
この緩和能、特にR2は種々のSPI0（超常磁性酸化鉄配合物）と比較して高い。SPI0-SUV（small unilamellar vesicle［小単層板小胞］）でだけ比較可能な値が得られた。次のin-vivo実験を行った。即ち肝臓にCC531腺がんを移植した雄のWAG/RIJ（270g）の尾部静脈に残留物質量（0,4ml）を静脈注射した。こうして動物はラット体重kg当り35,81μmolの用量の磁気体を得た。Bruker Bio-spec BMT 24/40でNMR検査を行った。その際注射の前、直後、さらに表２に示した時点で、ラットの腹腔を貫いて厚さ3mmの９個の層と、添付した外部標準小管がRARE配列（TR=2500ms, TE=20ms, RF=8; NE=8）で記録された。肝臓と腫瘍の信号強度を４つの異なる層で測定し、評価した。相対信号強度SIrelの表示された弱化は次のように計算される。
SIrel=（SIpost Lip./SIStandard）/（SIpre Lip/SIStandard）
SIpre Lip=リポソームの適用の前の信号強度
SIpost Lip=リポソームの適用の後の信号強度
SIStandard=標準の信号強度
肝臓ではこの比較的僅かな用量ですでに90%に及び信号強度の減少が得られたが、腫瘍では信号強度の微弱な減少しか得られなかった（表２）。それは腫瘍が健全な肝組織からはっきり際立っていることを意味する。
0003902794.tif 000003
【図１】
0003902794.tif 000004