(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス仲介による遺伝子導入により形質導入された、生存可能な造血細胞を含む培養物であって、レトロウイルス、及び固定化された組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６を含有し、そしてレトロウイルス産生細胞を含有しない、前記培養物。
【請求項２】
形質転換された生存可能な造血細胞が臍帯血由来の造血細胞を含む、請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
形質転換された生存可能な造血細胞が造血幹細胞を富化した造血細胞である、請求項１または２に記載の培養物。
【請求項４】
形質転換された生存可能な造血細胞が、ヒト造血幹細胞を富化したヒト造血細胞である、請求項３に記載の培養物。
【請求項５】
形質転換された生存可能な造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血細胞の均一な集団である、請求項４に記載の培養物。
【請求項６】
形質転換された生存可能な造血細胞が、細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するための外因性遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入された、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項７】
細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するためのヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入された生存可能な造血細胞を含む、請求項６に記載の培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般にウイルスによる細胞の形質導入効率を高める方法、より詳細にはフィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントを用いてウイルス仲介による細胞内への遺伝子導入を増強する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの疾病の多くについて分子基準での理解が進み、かつ遺伝子導入技術が向上したことにより、最近では重篤な遺伝病に対して体細胞遺伝子療法のためのプロトコールの開発が試みられるようになった。現在、ヒトの遺伝子療法にとって有望な候補である疾病には、酵素または他のタンパク質が欠損または欠如しているものであって、酵素または他のタンパク質の水準を厳密に調節する必要のない場合、特にそれらが構成的に調節されているもの、および患者の骨髄に見られる欠損が含まれる。
【０００３】
たとえば遺伝子療法の候補である疾病の１つは、重篤な複合型免疫不全病（ＳＣＩＤ）をもたらすアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症である。ＡＤＡ欠損患者は骨髄中に検出しうる酵素をほとんど、または全く含まない。しかしＡＤＡ欠損症は適合骨髄移植によって治癒している。ＡＤＡ正常細胞はＡＤＡ欠損細胞より選択的利点をもち、患者の骨髄を正常にリポピュレート（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）するであろう。
【０００４】
骨髄組織はインビトロで容易に取り扱うことができ、かつリポピュレートする細胞を含むので、骨髄細胞は体細胞遺伝子療法の良好な標的である。あるいはヒトの臍帯血が未発達の前駆細胞を多数含有することもこれまでに証明されている。長期的にリポピュレートする細胞である造血幹細胞中への遺伝子導入に成功すれば、これらの細胞の子孫において顕性となる多様な疾病を生涯にわたって治癒することができる。
【０００５】
リポピュレートする幹細胞中への遺伝子導入およびそこでの長期的な遺伝子発現が、ネズミモデルにおいて多数の研究者により達成された。しかしより大型の動物、たとえばイヌおよび霊長類におけるインビボ実験の成功は限定されている。これは未発達の造血幹細胞の感染効率が低いことが大きな原因である。現在の遺伝子導入技術の制限は、ヒトのプロトコールに適用した場合、幾つかの要因によってさらに複雑になる。これらの要因には成人骨髄（ＡＢＭ）中に存在する幹細胞数が少ないこと、これらの細胞を精製する適切な方法がないこと、および細胞周期においてこのような未発達細胞の部分が少ないことが含まれる。
【０００６】
骨髄細胞に関するネズミおよび大型動物双方の実験において、成功例のプロトコールは大部分が標的細胞とレトロウイルス産生細胞系の同時培養を採用していることが指摘された。同様に、ＦＤＡが承認したヒトの遺伝子導入の試みは大部分が遺伝子導入のために組換えレトロウイルスベクターに依存している。組換えレトロウイルスベクターは外因性ＤＮＡを細胞内ＤＮＡ中へ効果的に導入し、正確かつ安定に組み込むので、遺伝子療法にとって望ましい。これらのベクターは遺伝子導入のための外因性ＤＮＡを含有し、ウイルス病原性を排除するためにさらに修飾される。これらの修飾がなされているため、ウイルスの産生は一般にレトロウイルスパッケージング細胞を用いて行われる。しかし臨床遺伝子療法には、生物学的安全性および品質管理の懸念から無細胞形質導入の方が望ましい。残念ながら造血細胞、たとえば幹細胞への効果的な遺伝子導入はウイルス産生細胞との同時培養なしには一般に不可能であった。
【０００７】
最近、感染に際して標的細胞を間質細胞に暴露することにより遺伝子導入効率を高めうることが示された。間質細胞は造血ミクロエンバイロンメント（ＨＭ）の主成分である。ＨＭはマクロファージ、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および多様な特定の付着分子から構成される複雑な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の統制された網状構造からなる。ＥＣＭ分子、たとえばラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびフィブロネクチンが、造血細胞と成長因子の双方に対する足場部位を提供する。間質細胞がレトロウイルス感染に及ぼすこの促進作用の基礎となるメカニズムは不明であるが、造血細胞の増殖および分化の生理学的調節はこれらの細胞がＨＭの細胞と直接に接触した際に起こることが最近知られた。
【０００８】
長期的にリポピュレートする造血幹細胞および他の細胞への効果的な遺伝子導入には依然として問題が多く、このことが現在では遺伝子導入プロトコールを造血および他の疾病の治癒的療法に広範に適用するのを妨げている。従来法がもつ危険性および制限なしに遺伝物質を哺乳動物細胞に効果的に導入する方法が依然として求められている。本発明はこれらの要求に応えるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち本発明の好ましい１態様は、レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。この方法には、生存可能な造血細胞に複製欠損性組換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形質導入を増大させるのに有効な実質的に純粋なフィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。フィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントは天然物質に由来するものであってもよく、または合成によるもの（たとえば組換え法により遺伝子工学的に合成されたもの、または化学的合成法によるもの）、もしくは天然物質と合成物質の組合わせに由来するものであってもよい。さらに本発明に用いられるフィブロネクチンポリペプチド（１または２以上）には、天然フィブロネクチンアミノ酸配列に対する突然変異体であって、それにもかかわらず本発明による形質導入の増大を達成するのに必要な付着性を備えたものが含まれることは理解されるであろう。
【００１０】
本発明の他の好ましい態様は、生存可能な造血細胞に外因性ＤＮＡを保有する複製欠損性組換えレトロウイルスを、レトロウイルスによる細胞形質導入頻度の増大に有効な量の固定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグメント、またはその固定化された混合物の存在下で感染させることを含む、形質導入された造血細胞の調製方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の好ましい態様は、改良された細胞移植法を提供する。本方法には、ドナー動物から生存可能な造血細胞を採取し；これらの造血細胞に組換えレトロウイルスベクターを感染させて、形質導入された生存可能な造血細胞を調製し、その際感染は固定化された形の、かつ形質導入頻度を増大させるのに有効なフィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下で行われ；そして形質導入された生存可能な造血細胞を細胞移植体としてレシピエント動物に導入する工程が含まれる。好ましい１態様においては、感染細胞を自己ドナー(ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｎｏｒ）に導入することができる。
【００１２】
本発明の他の好ましい態様は、細胞移植法に適した形質導入された臍帯血細胞を得る方法を提供する。本方法には、臍帯血由来の造血細胞に複製欠損性組換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効な固定化された量のフィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。本発明は、その方法で得られた、臍帯血細胞由来の生存可能な形質導入細胞集団、およびそれらの形質導入細胞集団を動物に細胞移植体として導入することをも包含する。
【００１３】
以上に述べた本発明の態様のより具体的な観点によれば、使用されるフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス結合活性を与える第１アミノ酸配列、およびフィブロネクチンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列を含むであろう。フィブロネクチンのこれら２結合ドメインを合わせて使用することにより、レトロウイルスによる標的細胞の形質導入効率が著しく増大することが証明された。
【００１４】
本発明の他の好ましい態様は、レトロウイルスベクターによる予め定めた標的細胞の形質導入頻度を増大させる構築体の製造方法を提供する。本方法には、標的細胞に結合するリガンドを、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配列を含むポリペプチドに共有結合させる工程が含まれる。本発明は、これらの構築体をレトロウイルスベクターによる予め定めた標的細胞の形質導入頻度を増大させるために使用する方法、および形質導入細胞を用いる移植法をも包含する。
【００１５】
本発明の他の好ましい態様は、ウイルスを含有する培地を、一定量のウイルスの局在化に有効な固定化された量のフィブロネクチン、またはヘパリン−ＩＩ結合性ドメインがもつウイルス結合活性を含むフィブロネクチンフラグメントの存在下でインキュベートすることを含む、一定量のウイルスを局在化する方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらに他の好ましい態様は一般に、実質的に純粋な、および／または固定化されたフィブロネクチンまたはそのフラグメントを含有する形質導入された生存可能な造血細胞および他の細胞の培養物、ならびに細胞内へのレトロウイルス仲介によるＤＮＡ導入を実施するためのキットを提供する。
【００１７】
本発明の目的は、哺乳動物細胞の効果的なレトロウイルス感染方法を提供することである。
本発明の他の目的は、同時培養の必要がない、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、自己および／または同種間細胞移植のための方法および細胞培養物を提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特色は、以下の記載から当業者に自明であろう。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明の原理を理解しやすくするために本発明の特定の態様を参照し、具体的な語を用いてそれを説明する。ただしこれは本発明の範囲の限定を意図するものでないことは理解されるであろう。本明細書に示すような本発明の原理の変更、さらに修正および適用は本発明に関連する技術分野の専門家が普通に行うものと解される。
【００２０】
前記のように、本発明はウイルス、たとえばレトロウイルスによる生存可能な細胞の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。本発明は、組換えレトロウイルスベクターを用いた生存可能な細胞中への効果的な遺伝子導入法、形質導入細胞を得る方法、ならびに自己および他の細胞移植を達成するための方法および材料をも提供する。
【００２１】
本発明の１特色は、フィブロネクチン（ＦＮ）、およびＦＮのＣＳ−１細胞付着ドメインを含むフィブロネクチンフラグメントが、フィブロネクチン受容体を保有することによりフィブロネクチンまたはそのフラグメントへの結合能を示す細胞、たとえば造血細胞、たとえばコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹細胞または長期培養−開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）中へのレトロウイルス仲介による遺伝子導入を有意に増強するという知見である。有利には、この増大した効率によりウイルス産生細胞との同時培養が不必要になる。本発明の他の特色は、フィブロネクチンのウイルス結合性ドメインがヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内にあるという知見を利用する。このウイルス結合性ドメインは、たとえばウイルスを標的細胞へ運搬するための広範な構築体を含めた多くの用途において、ウイルス粒子を局在化するために使用しうる。
【００２２】
本発明の特定の好ましい観点による組換えウイルスベクターは、外因性ＤＮＡを含有し、非病原性、すなわち複製欠損性である。これらのベクターは外因性ＤＮＡを宿主細胞、たとえば動物細胞、特に哺乳動物細胞の細胞ＤＮＡ中へ効果的に導入し、正確かつ安定に組み込む。たとえば本発明においては目的とする遺伝子のコード配列に由来する一連の塩基を含むヌクレオチド配列を、遺伝子を駆動するための適切なプロモーター、一般に外因性プロモーターの制御下に、組換えレトロウイルスベクター中へ取り込ませることができる。これに関して外因性ＤＮＡは天然または合成により産生されたＤＮＡを含むことができ、かつ異種供給源に由来する部分であってもよく、それらの部分は天然分子または化学合成された分子のいずれであってもよく、かつそれらの部分はライゲーションまたは当技術分野で既知の他の手段で結合される。前記のように、導入されたヌクレオチド配列はプロモーターの制御下にあり、したがって一般にプロモーターの下流にある。言い換えると、プロモーター配列は一般にコード配列の上流（すなわち５’末端）にある。その際、プロモーターと協同作用する他の調節要素（たとえばエンハンサー配列）、および外因性コード配列の転写を行う転写開始コドンが存在してもよく、存在しなくてもよいことは周知である。“の制御下にある”という字句は、導入された遺伝子の転写を行うためにこのような他の要素が必要であることを表す。同様に組換えＤＮＡは好ましくは、導入されたコード配列の下流に終止配列を含む。
【００２３】
選択マーカーまたは他の選択性利点を与える外因性ＤＮＡを含むレトロウイルスを使用しうる。たとえばベクターは、抗生物質、たとえばネオマイシンを含めた種々の選択試薬に対する耐性を与える１または２以上の外因性遺伝子を含むことができる。本発明に使用しうる代表的ベクターには、たとえば下記のものが含まれる：Ｎ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（ＴＫＮＥＯ）（力価：ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞上で１×１０5  Ｇ４１８r  ｃｆｕ／ｍｌ）、ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクター、およびＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡベクター、これらはすべてＭｏｒｉｔｚら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：５２９により報告されている。ＴＫＮＥＯベクターにおいては、ｎｅｏホスホトランスフェラーゼ配列が単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターによりセンス配向で（５’側ロングターミナルリピート−ＬＴＲに対して）発現する。このベクターは、形質導入された細胞の同定を容易にするためのネオマイシン耐性を与える選択マーカー遺伝子を含む。ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターにおいては、ヒトＡＤＡ（“ｈＡＤＡ”）がヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより５’ＬＴＲに対してセンス配向で発現する。それは発現しうる遺伝子配列１個のみを含み、優性選択マーカーを欠如する。ＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡ（ＰＧＫ−ｍＡＤＡ）ベクターはヒトＡＤＡ  ｃＤＮＡがネズミＡＤＡ（“ｍＡＤＡ”）ＤＮＡで置換された点以外はＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターと等しい。これらおよび他のウイルスベクターならびにそれらの調製法は周知であり、それらの実施および本発明における使用は本明細書の記載から当業者が容易になしうるものである。
【００２４】
本発明に用いられるウイルスベクターは、ヒトフィブロネクチンを含めたフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列への結合能を示す。本発明はいずれかの理論によって限定されるものではないが、後記の節に述べるように、ウイルスおよび標的細胞がそれぞれの官能性ドメインに結合することによりウイルスおよび細胞が同時局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって、ウイルスによる細胞の形質導入が促進されると考えられる。これに関してウイルスがヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列に結合し、したがって本発明において効果的に作用する効力は、ルーティン方法、たとえば後記実施例８および９に記載された方法で容易に確認しうる。一般にこれらのアッセイ法は、ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含む固定化されたポリペプチドにウイルス粒子が結合し、したがって固定化されたポリペプチドマトリックスからの洗浄に耐える程度を測定するものである。以下に要約する：たとえばフィブロネクチンヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含む固定化されたポリペプチドを収容したウェル内でウイルスを含有する上清をインキュベートすることができる。次いでウェルを生理食塩緩衝液で徹底的に洗浄したのち、ウイルスに対する標的細胞をウェル内でインキュベートして、ウェル内に残存する感染活性の水準を測定する。初期ウイルス上清と比較した感染活性、すなわち力価の低下を評価し、同様な対照試験（たとえばＢＳＡコーティングしたウェルの使用）のものと比較する。対照ウェルと比較してヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン含有ウェル内に残存する力価の方が有意に高いことは、被験ウイルスが本発明の観点に使用するのに適していることを示す。このスクリーニング法を容易にするために、ウイルスベクターは前記のように選択マーカーを含んでもよい。
【００２５】
本発明に使用するフィブロネクチンのフラグメントは天然または合成のいずれに由来するものであってもよく、天然材料からたとえば先にＲｕｏｓｌａｈｔｉら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７２７７；ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓｈ（１９８６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：４４９；ならびにＢｅｒｎａｒｄｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：４８９が記載したように、実質的に純粋に調製することができる。これに関して本明細書中で、実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントという場合、フィブロネクチンが天然にそれらと共に存在する他のタンパク質を本質的に含有しないことを意味するものとする。本発明に使用する実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは組換えにより、たとえば米国特許第５，１９８，４２３号明細書（１９９３年３月３０日にタグチらに交付され、京都の宝酒造株式会社に譲渡された）に一般的に記載された方法に従って製造することもできる。特に後記実施例においてＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１と定める組換えフラグメントならびにそれらを得る方法が、この第５，１９８，４２３号明細書に詳述されている。後記実施例で用いたＣ２７４フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明細書の記載に従って得られた。これらのフラグメントまたはそれらをルーティンに誘導しうるフラグメントは、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（メチオニンによりＨ−２７１に結合したＣ−２７７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（メチオニンによりＨ−２９６に結合したＣ−２７７）、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）として寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を同様に米国特許第５，１９８，４２３号明細書に記載された方法に従って培養することにより得られる。さらに、本発明に使用しうるフィブロネクチンに関して、またはそれらのフラグメントの出発原料に関して有用な情報が下記に見られる：Ｋｉｍｉｚｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９１）、これは前記の組換えフラグメントにつきさらに報告する；ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，１７５５−１７５９（１９８５）、これはヒトフィブロネクチン遺伝子の構造につき報告する；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，４９３６−４９４１（１９８６）、これはヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインにつき報告する。ＣＳ−１細胞付着ドメインおよびヘパリン−ＩＩ結合性ドメインの両方を含むフィブロネクチンフラグメント、たとえば約３０または３５ｋｄフラグメント（３０／３５ＦＮ）および後記実施例に報告する種々の組換えフラグメントに含まれるものが造血細胞中への遺伝子導入効率を著しく増大させることがこれまでの研究で認められ、本発明に使用するのに好ましい。したがっておおまかに言うと、本発明に使用されるフィブロネクチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ−１細胞付着ドメインがもつ細胞結合活性、およびウイルスを結合する、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列を提供する。必要な細胞��合活性およびウイルス結合活性が両方とも、これらの官能性フィブロネクチンドメインの天然アミノ酸配列により、ならびに天然配列とは異なるがなお細胞結合活性およびウイルス結合活性を示すのに十分なほど類似するアミノ酸配列により提供されることは、当業者には自明であろう。これらの類似アミノ酸配列はそれらに対応する天然アミノ酸配列に実質的に相同な配列を示し、アミノ酸が欠失、置換および／または修飾されたにもかかわらず目的とする細胞結合性またはウイルス結合性を備えたアミノ酸配列を提供するものを包含しうる。
【００２６】
これに関して、関連のバイオテクノロジー技術分野は対象となる官能ドメインにおいてアミノ酸の欠失、置換、付加または他の修飾をルーティンに実施しうる状態にまで進歩している。得られたアミノ酸配列を、次いで目的とする細胞結合活性およびウイルス結合活性につきルーティンにスクリーニングすることができる。たとえばフィブロネクチンの突然変異形または修飾形のヘパリン−ＩＩ結合性ドメインは一般的に先に述べたように、かつ実施例８および９に詳述するように、ウイルスのインキュベーション、洗浄、および対照と比較した感染性の保持を測定するためのウイルス力価アッセイによりスクリーニングすることができる。本明細書に示す教示を考慮すると、これらの結合アッセイは当業者にはルーティン実験にすぎないであろう。
【００２７】
フィブロネクチンの修飾形もしくは突然変異形のＣＳ−１細胞付着ドメインへの、または他の細胞結合性ポリペプチドへの細胞の結合も、同様に常法によりアッセイしうる。たとえばそれらの方法にはＮａｔｕｒｅ  ３５２：４３８−４４１（１９９１）に記載されたものが含まれる。以下に要約する：細胞結合性ポリペプチドをプラスチック皿にコートし、アッセイすべき細胞集団を培地に入れて３０分ないし２時間載せておく。このインキュベーション期間後に、タンパク質に付着していない細胞を回収し、計数し、生存性につきアッセイする。ポリペプチドに付着した細胞をトリプシンまたは細胞解離用緩衝液（たとえばギブコ）を用いて同様に回収し、計数し、生存性につきアッセイする。場合により、たとえば造血コロニー形成細胞については、細胞をさらに１２−１４日間培養して、細胞のコロニー形成性を確認する。次いで付着細胞の％を計算し、標準対照、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートしたプラスチック皿と比較する。アッセイされるポリペプチドに標的細胞が実質的に結合した場合、そのポリペプチド／細胞の組合わせが本発明に適しており、そのポリペプチドをフィブロネクチンからのレトロウイルス結合性フラグメントに結合させて、ウイルスベクターによる標的細胞の感染を増強するための本発明構築体を製造しうることを示す。
【００２８】
本発明のより具体的な観点によれば、レトロウイルスベクターによる形質導入を増強するために用いるウイルス結合性ポリペプチドは下記を含む：（ｉ）次式（配列番号：１）で表される、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのＡｌａ1690−Ｔｈｒ1960に相当する第１アミノ酸配列：
【００２９】
【化３】
0003934005.tif 000002
【００３０】
またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配列；
および（ｉｉ）次式（配列番号：２）で表される、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ結合性ドメインの一部（ＣＳ−１細胞結合性ドメイン）に相当する第２アミノ酸配列：
【００３１】
【化４】
0003934005.tif 000003
【００３２】
あるいは造血細胞、たとえば未発達の前駆細胞および／または長期リポピュレーションする（幹）細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配列。
【００３３】
前記のように、得られるアミノ酸配列がウイルスの結合能（ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインの場合）および標的細胞の結合能（ＣＳ−１細胞結合性ドメイン）を示すのに十分なほど類似している限り、本発明の実施に際してこれらの天然配列の一定の修飾および／または突然変異を行うのが可能であることは理解されるであろう。
【００３４】
本発明の１観点は、インビトロ細胞療法、次いで宿主への標的細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を伴う、体細胞遺伝子治療法を提供する。これは宿主への形質導入された標的細胞の“移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）”としても知られている。造血細胞または他の細胞はヒトその他の哺乳動物源から標準プロトコールにより採集することができる。たとえば造血細胞はヒトドナーの骨髄もしくは末梢血から、またはヒト胎児臍帯血から採集することができる。採集したのち、造血細胞を幹細胞および／または未発達の前駆細胞に富むものにするために、所望によりそれらを標準法で処理することができる。次いで造血細胞を適宜、たとえば組織培養プレート上でインキュベートしうる。所望によりこの期間に付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイルス感染前に予備刺激することができる。当技術分野で知られており、本発明に用いられる予備刺激とは、細胞をレトロウイルス暴露する前に増殖刺激因子に暴露させることを意味する。このような予備刺激はレトロウイルスによる造血細胞の形質導入を向上させることが証明された。
【００３５】
予備刺激ののち、細胞を収穫し、本明細書に記載するようにレトロウイルスによる細胞形質導入頻度を増大させるフィブロネクチンまたはそのフラグメントと共にインキュベートすることができる。好ましくは精製した、および／または不溶性の、たとえば固定化したフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントと共に細胞をインキュベートする。次いで細胞に組換えウイルス、たとえば細胞における酵素または他のタンパク質の欠損または異常を適正化するための遺伝子を含むレトロウイルスに、ウイルスによる細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効な量のフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させる。得られた形質導入された造血細胞を、次いで細胞移植体レシピエント動物、好ましくは自己ドナーに常法により、たとえば静脈内へ導入することができる。これには同種異系移植体も包含され、これは特に後記のように移植体として臍帯血細胞を用いる場合に利用される。
【００３６】
本発明方法は、がん、白血病などを含めた骨髄障害、タンパク質の欠損または異常を伴う障害を含む、多様な障害の遺伝子マーキングまたは遺伝子治療プロトコールに、および他の治療プロトコール、たとえば化学療法に対する抵抗性を改善するために造血細胞を改質する治療に利用しうる。本発明を利用しうる代表的障害には、たとえばＡＤＡ欠乏症、たとえばＡＤＡ欠乏性ＳＣＩＤ、小児急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、神経芽細胞腫、ならびに成人ＡＭＬおよび急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が含まれる。
【００３７】
本発明の特に好ましい１態様においては、細胞移植に用いられる細胞をヒト臍帯血から得る。たとえばヒト臍帯血を採集し、たとえば付着陰性かつ低密度の単核細胞集団を得ることにより、生存可能な未発達の造血前駆細胞および／または幹細胞を富化することができる。次いでこの集団を所望により予備刺激し、レトロウイルスベクター、ならびにベクターによる細胞の形質導入効率を増大させるために、固定化したおよび／または精製したフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下でインキュベートする。これに関して、フィブロネクチンは臍帯血中のＥＣＭの一部を構成せず、また臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／または幹細胞は骨髄由来の細胞と異なることが解明されているが、臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／または幹細胞の形質導入はフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で大幅に増強されることが見出された。特に臍帯血幹細胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−ＤＲ＋であることが解明され、これに対し骨髄由来の幹細胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−ＤＲ−であることが解明されている。臍帯血由来の未発達の前駆細胞はフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で増強された様式で効果的に形質導入されるという本発明者らの知見により、簡便な、かつ高度に幹細胞富化した造血細胞源の利用が可能となる。さらに、未発達の前駆細胞および／または幹細胞を富化した同種異系移植体を用いた多数の患者の移植に成功したという証拠により、臍帯血は極めて好ましい造血細胞源となる。Ｋｏｈｌｉ−Ｋｕｍｍｅｒら，Ｂｒｉｔ．Ｈｅａｅｍａｔｏｌ．８５：４１９−４２２（１９３３）；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  １７：３１３−３２９（１９９１）；Ｇｌｕｃｋｍａｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｅｍａｔｏｌ．４５：５５７（１９８０）；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：スプリンガー−フェルラーク，ｐｐ．６０−６８（１９８９）；Ｗａｇｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  ７９：１８７４−１８８１（１９９２）；およびＷａｇｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  ８２−８６ａ（抄録）を参照されたい。
【００３８】
所望により、収穫した形質導入された造血細胞その他の細胞を形質導入効率および遺伝子発現につき試験することができる。たとえば本発明により得られるレトロウイルス仲介遺伝子導入における著しい改良は、後記の具体的な実施例において証明される。実施例にはフィブロネクチンまたは有効なフィブロネクチンフラグメントの存在下でのレトロウイルスによる高い感染および遺伝子導入効率を証明する幾つかの試験を記載する。特にＰＧＫ−ｈＡＤＡレトロウイルスに感染したネズミ造血細胞は高水準の導入ＡＤＡ  ｃＤＮＡを発現した。同様に個々のＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス感染したヒト前駆細胞コロニーは、内因性ヒトＡＤＡタンパク質より最高１０倍高いネズミＡＤＡタンパク質を発現した。したがって導入効率を厳密に分析するために、前駆細胞コロニーは導入されたｍＡＤＡの発現が内因性ヒトＡＤＡ水準以上である場合にのみ形質導入されたとみなされた。ＴＫＮＥＯベクターからのｎｅｏの高水準の発現は、ネオホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子生成物）活性のアッセイと同様にＧ４１８薬物耐性により検出された。
【００３９】
前記のように、本発明方法はレトロウイルス産生細胞の存在下で同時培養する必要なしに有利に実施することができる。したがって本発明の１観点によれば、レトロウイルス仲介遺伝子導入を、標的である造血細胞その他の細胞以外の細胞が実質的に存在しない状態で実施することができる。たとえばレトロウイルスベクタープラスミドを含む産生細胞を培養し、上清を採集することができる。次いでレトロウイルス含有上清を、フィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントの存在下で造血細胞の感染に用いることができる。これらは好ましくは固定化された形のものであり、たとえば支持体にコートし、この上で感染を行うか、または他の方式で感染用培地と接触させる。これに関して、高力価の無ヘルパーレトロウイルスを産生する任意の産生細胞が本発明に使用するのに適していると考えられる。これらには、たとえばパッケージング細胞、たとえばＰｓｉ−２、Ｃ２、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ならびに当技術分野で知られている他の多数のパッケージング細胞系が含まれる。
【００４０】
本発明の他の観点によれば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内のアミノ酸への強いウイルス結合を利用して、広範な細胞タイプにわたるウイルス療法に用いる運搬システムを構築しうる。このためには、フィブロネクチン由来のレトロウイルス結合性ドメインを含むポリペプチドを、この構築体に標的細胞に対する特異性を与える任意のリガンドに共有結合させることができる。この方法によれば、各標的細胞に特異的なレトロウイルス細胞系を予め構築する必要性が回避されるであろう（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ａ．Ｍ．ＤｏｚｙおよびＹ．Ｗ．Ｋａｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ．１３７３−１３７６（１９９４）、ならびにＶａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ａ．Ｄｒｙｎｄａ，Ｇ．Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｍ．Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ｈｅａｒｄ，Ｏ．Ｄａｎｏｓ，Ｇ．ＶｅｒｄｉｅｒおよびＦ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．４６０９−４６１９（１９９４））。標的構築体の特異性は、たとえば下記を含めたリガンドの使用により与えることができる：１）細胞付着性タンパク質、２）ホルモンまたはサイトカイン、３）標的細胞に対するモノクローナル抗体、４）標的細胞に結合する炭水化物（Ｇ．Ａｓｈｗｅｌｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５３１−５５４（１９８２））、５）標的細胞に関する代謝産物、または６）標的細胞に結合する官能性ポリペプチド。遺伝子運搬のための構築体の効率は、数種類のヘパリン−ＩＩウイルス結合性ドメインを含有させ、したがって標的細胞に運搬されるウイルス粒子の量を増加させることによって、改善することができる。たとえば米国特許第５，１９８，４２３号明細書に記載されたフィブロネクチンのＰｒｏ1239−Ｓｅｒ1515に相当するヒトフィブロネクチン細胞結合性ドメインは、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を含めた細胞に結合することが示された（Ｋｉｍｉｚｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９１））。さらに、ヘパリン−ＩＩドメイン自体が線維芽細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞に結合することが示された。これらのポリペプチド配列をフィブロネクチン由来のレトロウイルス結合性ドメインに結合させて、レトロウイルスによる感染のために予め定めた細胞をターゲティングすることができる。
【００４１】
造血系における用途の例には、それぞれ高特異性赤血球または顆粒球の前駆細胞をターゲティングするための、フィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメインに結合したエリトロポエチンまたはＧ−ＣＳＦの構築体が含まれる。本発明による他の一般的用途は、レトロウイルス結合性ドメイン（１または２以上）を、悪性細胞に特異的にまたは主として結合するリガンドと結合させることであろう。たとえば標的細胞上の受容体に結合する物質、たとえば下記のものを用いて、乳がん細胞のインビトロ増殖に、またインビボ増殖にすら影響を及ぼしうることが示された：黄体形成ホルモン放出性誘導体、Ｅｍｏｎｓ，Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．９：１３６４−１３７９（１９９４）；エストロゲン、Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，Ｏｎｃｏｌ．８：３９−４３（１９９４）；またはアンチエストロゲン、Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４５:２９−３０(１９９５);プロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲン、Ｋｌｉｊｎ．Ｆ．Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．９  Ｓｕｐｐｌ．１：１８１−１８９（１９９４）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｋ．ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：６７２−６８７（１９９４）；これらはフィブロネクチン由来のウイルス結合性ドメイン１または２以上を含む本発明の構築体においてリガンドとして用いられるであろう。他の例として、ヨウ化物を含む構築体を用いて甲状腺（がん）細胞を高度に特異的にターゲティングすることができ、またＨＤＬもしくはその一部を含む構築体により肝（がん）細胞を高度に特異的にターゲティングすることができる。最後に、モノクローナル抗体およびフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメインの構築体は、抗体が得られるいかなる細胞および器官をもターゲティングすることができるであろう。したがってフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメインがウイルスベクターを結合および局在化しうる能力を利用することにより、広範な哺乳動物細胞タイプをターゲティングすることができる。
【００４２】
したがって本発明の他の好ましい態様は、標的細胞のウイルス形質導入を増強するために使用しうる構築体を製造するものである。フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのウイルス結合性アミノ酸配列を、標的細胞が結合するリガンドに結合させる。前記のように、リガンドはたとえばフィブロネクチン由来のもしくは他のタンパク質（細胞付着性タンパク質、たとえばラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチンまたはトロンボスポンジンを含む）由来のポリペプチド、ホルモン、代謝産物、抗体（モノクローナル抗体を含む）、または標的細胞に、好ましくは特異的に結合する能力を示す他の任意のリガンドであってもよい。得られた構築体全体を、後記の実施例に具体的に例示するフィブロネクチンポリペプチドに用いたと同様な様式で固定化された形で用いることができる。
【００４３】
構築体の安定性および特異性、ならびに生理的条件下でのレトロウイルス構築体の相互作用など種々の要因を考慮して、これらの構築体および細胞ターゲティング法を前記のようにインビトロでの、またインビボでのレトロウイルスによるターゲティングに用いることができる。運搬システムを改変して標的細胞への構築体の運搬を局在化することにより、たとえば肝細胞をターゲティングするために門脈にカテーテル挿入することにより、特異性を改良することもできる。
【００４４】
本発明方法を実施するために特に設計されたキットを用いると、レトロウイルス仲介ＤＮＡ導入が極めて簡便に実施されると考えられる。したがって本発明の他の観点は、レトロウイルスによる標的細胞の形質導入を増強する量の前記の実質的に純粋なポリペプチドまたは構築体、およびレトロウイルス感染を実施しうる人工的支持体を含むキットを提供する。ポリペプチドまたは他の構築体は別個に、または人工的支持体にコートして供給することができる。ヒト造血細胞に関する感染プロトコールの場合、キットは細胞の予備刺激のための造血細胞成長因子をも含むであろう。さらにキットは形質導入のための前記の組換えレトロウイルスベクターを含むことができる。一般にキットは、キットの取り扱い中に成分が漏出するのを防止するのに十分な程度に互いに間隔をおいてこれらの各種キット成分を保管する無菌のパッケージングを含むであろう。たとえばキット成分を互いに間隔をおいた関係に保持するための多数のコンパートメントまたは領域を備えたプラスチック成形品を用いるのが一般的である。
【００４５】
本発明をさらに理解および認識しやすくするために、以下の具体例を提示する。これらの例は説明のためのものであって限定する性質のものでないことは理解されるであろう。
【００４６】
【実施例】
実施例１  ＴＫＮＥＯを用いた骨髄細胞への遺伝子導入
１．１．ウイルス上清の調製
レトロウイルスプラスミドＴＫＮＥＯベクターを含むＧＰ＋ＥｎｖＡＭ  １２産生細胞（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６７：４００）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガン）ならびに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ、マリーランド州ガイザースバーグ）中で培養した。２０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭを１０ｍｌ添加して平板を一夜で集密化することにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲルマン・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾過し、使用時まで−８０℃に保存した。
【００４７】
１．２．フィブロネクチンフラグメントの調製
Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８２：８０３−８３１(１９８２)の記載に従ってヒト血漿(ライフソース、イリノイ州グランビュー）からＦＮを精製した。ただし４Ｍ尿素によるＦＮの溶離前にゼラチン−アガロースカラムを１Ｍ尿素で洗浄した。精製ＦＮを４℃で１０ｍＭ  ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ１１．０に対して徹底的に透析し、少量ずつに分けて−８０℃に保存した。ＦＮのキモトリプチック細胞結合性ドメイン（ＣＢＤ）（ＣＳ−１）およびヘパリン−ＩＩ結合性フラグメントを先の記載に従って精製した（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら（１９８２），前掲、ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２，ｐｐ．４４９−４５６（１９８６）、並びにＢｅｒｎａｒｄｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５，ｐｐ．４８９−４９８（１９８７））。ヘパリン−アガロースカラムからの１Ｍ  ＮａＣｌ溶出液中に３つの主要なヘパリン結合性フラグメント（３０ｋＤ、３５ｋＤおよび４２ｋＤ）が得られた。これらのヘパリン結合性フラグメントをさらに精製するために、１Ｍ  ＮａＣｌ溶出液を４℃で１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して一夜透析し、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.０）で平衡化したアニオン交換カラム（２ｍｌ ＤＥＡＥセファロース高速用（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スウェーデン国ウプサラ）／ｍｇタンパク質）に導通した。３０／３５ｋＤフラグメントは結合しない画分中に採集され、一方４２ｋＤフラグメントはカラムから１００ｍＭ  ＮａＣｌで溶離された。５００ｍｇのＦＮからほぼ２６ｍｇの３０／３５ｋＤフラグメントおよび４ｍｇの４２ｋＤフラグメントを得た。ウェスタンブロッティング法で測定すると、４２ｋＤフラグメントはフィブリン結合性ドメインに対する抗体により認識されたが、３０／３５ｋＤフラグメントは認識されなかった。４２ｋＤフラグメントはフィブリン−セファロースアフィニティーカラムにも結合する。
【００４８】
感染プロトコールに用いるために、フィブロネクチンフラグメントをＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓｈ（１９８６）、前掲、の記載に従って３５または１００ｍｍのペトリ皿（ファルコン、ニュージャージー州リンカーン・パーク）上に７５ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で固定化した。対照の皿に２％（無ＦＮ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ベーリンガー・マンハイム、ドイツ国マンハイム）で同様にコートした。
【００４９】
１．３．レトロウイルス感染プロトコール
健康な成人ドナーから骨髄試料を、インディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従って、無菌の、防腐剤を含有しない硫酸ナトリウムヘパリンを入れた試験管中へ採集した。フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（密度１．０７７ｇ／ｍｌ、ファルマシア、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）上において２５℃で４５分間遠心分離することにより、低密度単核細胞を調製した。さらに３７℃で２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において４−１６時間、組織培養皿上でインキュベートすることにより、プラスチック付着細胞を低密度骨髄細胞から除去した。
【００５０】
付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイルス感染前に、先にＬｕｓｋｅｙら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：３９６が記載したものに従って３７℃で４８時間、２０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳＣＦ（両方ともアムゲン、カリフォルニア州サウザンド・オークス）、およびＰ／Ｓを含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において細胞密度１×１０6個／ｍｌでペトリ皿内において予備刺激した。激しくピペッティングしてプラスチックにゆるく付着した細胞を除去することにより、予備刺激した細胞を収穫した。
【００５１】
予備刺激した細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を、ＢＳＡ（対照のプレート）またはフィブロネクチンもしくはそのフラグメント（タンパク質をより良くプラスチックプレートに付着させるためにＵＶ照射した）でコートしたプレート上で６時間インキュベートし、次いで成長因子（前記）および７．５μｇ／ｍｌのポリブレン（アルドリッヒ・ケミカル、ワイオミング州ミルウォーキー）の存在下にウイルス上清を感染させた。ウイルス上清を２時間後に交換し（成長因子および５．０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有）、細胞をさらに１２−２４時間インキュベートした。培地交換の度に付着していない細胞を再添加した。
【００５２】
感染プロトコールに従って、付着していない細胞をデカントし、付着した造血細胞を培養物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブコ）により採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄し、計数した。収穫した細胞をクローン原性メチルセルロース前駆細胞アッセイまたは長期骨髄培養において平板培養した。
【００５３】
１．４．長期骨髄培養
ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイを先に記載された方法に従い、わずかに改変して実施した。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ７４：１５６３（１９８９）。以下に要約する。０．５−１×１０6個の感染細胞を、６ウェル組織培養プレート（コスター、マサチュセッツ州ケンブリッジ）中で、１０％ＦＣＳ、１０％ウマ血清（シグマ）およびＰ／Ｓ、１×１０-5Ｍヒドロコルチゾン（アップジョン、ミシガン州カラマズー）ならびに３２０ｍｏｓｍｏｌ塩化ナトリウムを含有するＩＭＤＭ５ｍｌ中の、集密的な前照射した（前記に従う）同種ヒト骨髄線維芽細胞（ＢＭＦ）上での長期骨髄培養（ＬＴＭＣ）に接種した。ＬＴＭＣを３３℃において５％ＣＯ2中でインキュベートし、５０％の培地および付着していない細胞を分離することにより週１回供給した。５週間後に、付着した造血細胞をＣＤＢによりＢＭＦから分離することによって、ＬＴＣ−ＩＣ培養物を殺した。付着していない造血細胞および付着した造血細胞の両方を合わせてメチルセルロース中で平板培養し、ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーを得た。
【００５４】
１．５．クローン原性メチルセルロースアッセイ
メチルセルロースアッセイを先にＴｏｋｓｏｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐ７３５０（１９９２）が記載したものに従い、わずかに改変して実施した。以下に要約する：２−５×１０4個の感染した成人骨髄細胞を、５Ｕ／ｍｌのエリトロポエチン（Ｅｐｏ、アムゲン）、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−３(ゲンザイム、マサチュセッツ州ケンブリッジ）と共に、２５％ＦＣＳ、１０％ヒト血漿、１０-5Ｍベータ−メルカプトエタノール（シグマ）およびＰ／Ｓを含有する２．４％ＩＭＤＭメチルセルロース（フルカ、ニューヨーク州ロンコンコーマ）１ｍｌ中で平板培養した。培養物を３７℃で５％ＣＯ2／９５％空気中においてインキュベートし、１３日目に倒立顕微鏡で観察することによりコロニー（＞５０細胞）をＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球およびマクロファージを含有）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ（骨髄様および赤血球様要素を含有）、またはＢＦＵ−Ｅ（赤血球様要素のみを含有）として計数した。
【００５５】
１．６．レトロウイルス感染の分析
１３日目に１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（乾燥粉末、ギブコ）に対して耐性であるメチルセルロースコロニーの％を測定することにより、ＴＫＮＥＯウイルスによる感染効率を分析した。各実験において、骨髄をＧＰ＋ＥｎｖＡＭ  １２パッケージング系上で組換えウイルスを形成させずにインキュベートすることにより、模擬感染を行った。これらの模擬感染細胞を１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と共に培養したものは、常に＜１％のバックグラウンドコロニーを示した。
【００５６】
１．７．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率
骨髄細胞を３０／３５  ＦＮコートまたはＢＳＡコートした皿で平板培養した状態で感染させることにより、形質導入効率を比較した。これらの条件下では選択なしに感染させたのちに得られたコロニー数には差がなかった。図２は感染後のＧ４１８rコロニーの％を示す。系列限定（ｌｉｎａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）前駆細胞（ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ）および多系列（ｍｕｌｔｉｌｉｎａｇｅ）前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）に由来するものを含めてすべてのタイプの前駆細胞に由来する３０／３５  ＦＮ上に、高率のＧ４１８rコロニーが認められた。ＢＳＡと対比して３０／３５  ＦＮ上ではすべてのコミッティッド前駆細胞への感染が９倍増大した。
【００５７】
１．８．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率
ＴＫＮＥＯベクターを用いてＬＴＣ−ＩＣへの遺伝子導入を評価した。ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーへの遺伝子導入は３０／３５  ＦＮ上での感染後に検出されたにすぎない（１６％Ｇ４１８rコロニー対０％Ｇ４１８rコロニー、３０／３５  ＦＮ対ＢＳＡ）。
【００５８】
１．９．造血細胞の感染効率に対する３０／３５  ＦＮ作用の特異性
３０／３５  ＦＮ上で見られた遺伝子導入効率増大の特異性を判定するために、ＴＫＮＥＯによる感染を下記のものでコートした皿上で実施した：ＢＳＡ、３０／３５  ＦＮ、無傷のフィブロネクチン、ＲＧＤＳテトラペプチド配列を含む中心−細胞結合性ドメイン（ＣＢＤ）を含む１１５ｋｄのＦＮフラグメント、ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを特色とし、ただしＣＳ−１配列を欠如する４２ｋｄ  Ｃ−末端ＦＮフラグメント（４２ＦＮ）（図１）。ＢＳＡ上での感染では、３±１％のＧ４１８r  ＢＦＵ−Ｅ、１±１％のＧ４１８r  ＣＦＵ−ＧＭ、および０±０％のＧ４１８r  ＣＦＵ−Ｍｉｘが得られた。ＣＢＤ上ではＧ４１８rコロニーの割合には有意の増大が認めらず、一方４２ＦＮ上ではわずかに高いＢＦＵ−Ｅ（６．０±１％）の感染が見られた（図３）。しかし無傷のＦＮはすべてのコミッティッド前駆細胞への遺伝子導入の増大を促進した。無傷のＦＮ上での感染後のＧ４１８rコロニーの割合は、下記を含めてすべての系列において３０／３５  ＦＮ上でのものより低かった：ＢＦＵ−Ｅ（１６±２対２４±４％）、ＣＦＵ−ＧＭ（５±２対２０±４％)、およびＣＦＵ−Ｍｉｘ(６±１対９±１％);それぞれ無傷のＦＮ対３０／３５  ＦＮ。
【００５９】
実施例２  ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた骨髄細胞への遺伝子導入
２．１．一般法
ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清を、実施例１においてＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製した。フィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従った。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実施した。
【００６０】
２．２．レトロウイルス感染の分析
ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターによる感染効率を、ＡＤＡアイソザイム電気泳動によるタンパク質分析により測定した。個々の前駆細胞コロニーの分析を、先にＭｏｒｉｔｚ（１９９３）およびＬｉｍら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐ８８９２が記載したと同様に実施した。導入効率を厳密に分析するために、内因性ヒトＡＤＡと同じか、またはより高い水準のｍＡＤＡを発現するコロニーのみを形質導入されたとみなした。プールしたコロニーの分析のために、メチルセルロース培養物から取り出したコロニーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内で一緒にし、温培地およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離し、−２０℃に保存した。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞溶解用緩衝液中で反復凍結融解サイクルにより溶解し、先の記載に従ってアイソザイム電気泳動を実施した。
【００６１】
２．３．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率
骨髄細胞を３０／３５  ＦＮコートまたはＢＳＡコートした皿上で平板培養した状態で感染させることにより、形質導入効率を比較した。これらの条件間に、選択なしの感染後に得たコロニー数の差は見られなかった。表１に示すように、すべてのコミッティッド前駆細胞への感染効率がＢＳＡに対比して３０／３５  ＦＮ上で実質的に増大した。高力価（約１×１０7ウイルス粒子／ｍｌ）ベクターを用いる場合に予想されたように、コミッティッド前駆細胞の形質導入効率は著しく高かった。表１を参照すると、３０／３５  ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染により、別個の２実験でコミッティッド前駆細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
【００６２】
【表１】
0003934005.tif 000004
【００６３】
２．４．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率
ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いて行った４つの独立した実験で、有意の割合の５週齢ＬＴＭＣ由来の前駆細胞コロニー（すなわちＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニー）が、導入されたネズミＡＤＡ遺伝子を発現した。発現は分析したコロニーのうち２／１２（１７％）−６／６（１００％）に及んだ（表２）。導入されたｍＡＤＡ遺伝子の発現は、陽性であるとみなされたすべてのコロニーにおいて内因性ヒトＡＤＡ活性を上回るか、または少なくともそれと同等であった。ＰＧＫ−ｍＡＤＡに関する感染効率はＴＫＮＥＯに関するよりも高かった。表２に示すように、２つの別個の実験において３０／３５  ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染により、コミッティッド前駆細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
【００６４】
【表２】
0003934005.tif 000005
【００６５】
２．５．造血細胞の感染効率に対する３０／３５  ＦＮ作用の特異性
ＬＴＣ−ＩＣ中への遺伝子導入効率が３０／３５  ＦＮ上で増大した。これらの二次ＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーの大きさが比較的小さいため、単一コロニーにつきタンパク質分析を行う可能性には限界があった。ＢＳＡ、無傷のフィブロネクチン、および４２  ＦＮ上でのＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染後にネズミＡＤＡの発現を示したのは、それぞれ０／６、０／４および０／３のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーであったが、３０／３５  ＦＮ上で感染させたＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー３／５がｍＡＤＡを発現した。さらに、多数のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーをプールしたのち２つの追加実験で分析した場合、ｍＡＤＡ発現は３０／３５  ＦＮ上、およびこれより低いが無傷のＦＮ上での感染後にのみ検出され、４２  ＦＮまたはＢＳＡ上では検出されなかった。
【００６６】
実施例３  ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた骨髄細胞への遺伝子導入
３．１．一般法
ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清を実施例１においてＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。フィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従う。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実施する。
【００６７】
３．２．レトロウイルス感染の分析
プールしたコロニーの分析のために、メチルセルロース培養物から取り出したコロニーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内で一緒にして、温培地およびＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、−２０℃に保存する。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞溶解用緩衝液中での反復凍結融解サイクルにより溶解し、前記に従ってアイソザイム電気泳動を実施する。
【００６８】
実施例４  ＴＫＮＥＯを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入
４．１．一般法
ＴＫＮＥＯウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に実施例１に記載したと同様に調製した。実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集し、骨髄細胞の代わりに使用した。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実施した。
【００６９】
４．２．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率
３つの別個の実験において、３０／３５  ＦＮ上での感染はＢＳＡと比較して４倍以上増大した（表３）。
【００７０】
【表３】
0003934005.tif 000006
【００７１】
実施例５  ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入
５．１．一般法
ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を、先に実施例１に記載したと同様に調製した。実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集した。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実施した。
【００７２】
５．２．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率
高力価ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターを用いた場合、ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーの分析により、上清をＦＮ３０／３５上で用いて感染させた臍帯血から株化された培養物からのみ、導入ｍＡＤＡ  ｃＤＮＡの高水準の発現が証明された。ＢＳＡ対照プレートで感染させたＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーにはほとんどｍＡＤＡの発現が検出されなかった。
【００７３】
実施例４および５に示した結果は、臍帯血前駆細胞および幹細胞を用いた場合にもＦＮ３０／３５を用いることによって改良された感染効率を達成しうることを証明する。
【００７４】
実施例６  ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入
ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を、実施例１にＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集し、骨髄細胞の代わりに使用する。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実施する。
【００７５】
実施例７−１１
実施例７−１１のレトロウイルスベクターおよび産生細胞系
実施例７−１１には２種類のレトロウイルス産生パッケージング細胞系を用いた：それぞれエコトロピックＧＰ＋Ｅ８６細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ１１２０−１１２４（１９８８））およびアンフォトロピックＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ４００−４０６（１９８８））。ここに記載した実験で用いたレトロウイルスベクターおよび産生クローンを表４に挙げる。
【００７６】
【表４】
0003934005.tif 000007
【００７７】
細胞系はすべて１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガン）および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有する改変ダルベッコ培地（ＤＭＥ、ギブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で培養された。ただしＥＡＬ２ａ細胞は１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＤＭＥ−Ｆ１２（ギブコ）中で増殖させた。ネズミ細胞については、それぞれ１０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓを含有するアルファ最小必須培地（αＭＥＭ、ギブコ）またはヒト細胞についてはイスコブのダルベッコ培地（ＩＤＭＥ、ギブコ）１０ｍｌを添加して、１０ｃｍのプレートを一夜集密化させることにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲルマン・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾過し、使用時まで−８０℃に保存した。
【００７８】
実施例７   一次ネズミ造血細胞の形質導入
７．１．実験
ネズミ細胞を用いる実験のために、６−８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの大腿骨および脛骨から、１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（ソロパック・ラボラトリーズ、イリノイ州フランクリン・パーク）投与の２日後に骨髄を収穫した（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｊ．Ｆ．Ａｐｐｅｒｌｅｙ，Ｓ．Ｈ．ＯｒｋｉｎおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ８８９２−８８９６（１９８９））。細胞を５×１０5細胞／ｍｌの濃度においてＩＭＤＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中で、１００ｎｇ／ｍｌのラット組換え幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ；アムゲン、カリフォルニア州サウザンズ・オークス）および１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６；ペプロ・テク・インコーポレーテッド、ニュージャジー州ロックヒル）により４８時間予備刺激した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｋ.ＺｓｅｂｏおよびＤ.Ａ.Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ.８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９２））。次いでＥＰＨＡ−５産生細胞が産生したＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターによる遺伝子導入効率を３つの異なる感染プロトコールにより比較した：１）上清感染；２）ＦＮ３０／３５上での上清感染；３）ＥＰＨＡ−５産生細胞上での同時培養。したがって１００ｍｍの細菌皿に、５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）に溶解した２．５μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５（７５ｐｍｏｌ／ｃｍ2に相当）で室温においてＵＶ光線下に、皿の蓋を開けた状態で１時間、そして皿の蓋を閉じた状態でさらに１時間コートした。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フラクションＶ；ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディアナポリス）により室温で３０分間ブロッキングしたのち、２．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ  Ｈｅｐｅｓを補充したハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（両方ともギブコ）で皿を１回洗浄した。上清感染のためには皿をＢＳＡのみでコートした。５×１０6個の予備刺激したドナー細胞を、前記に従ってＥＰＨＡ−５細胞から得たウイルス上清１０ｍｌに１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣＦおよび７．５μｇ／ｍｌのポリブレンを補充したものと共にインキュベートした。付着していない細胞を採集し、新鮮なウイルス上清を再添加した。同時培養のためには、培地４ｍｌ中のＥＰＨＡ−５細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣと共に３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、トリプシン処理し、１００ｍｍの組織培養皿に１０ｍｌのαＭＥＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中３×１０6個の細胞濃度で接種した。翌日、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣＦおよび４μｇ／ｍｌのポリブレンで予備刺激した５×１０6個の骨髄細胞を４８時間添加した。感染プロトコール後に付着していない細胞をデカントし、付着した造血細胞を培養物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブコ）により、製造業者の指示に従って採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄し、約１ｍｌのＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓに懸濁した。５×１０6個の予備刺激した細胞から得た全細胞を、致死量の全身照射（７００プラス４００ｃＧｙによる、137Ｃｓ−源）した３匹のレシピエントマウスの尾静脈に注射した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｋ．ＺｓｅｂｏおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９２））。再構成マウスを、導入したヒトＡＤＡ  ｃＤＮＡの発現につき検査することにより、造血幹細胞の形質導入を分析した。このＡＤＡアイソザイム分析は、移植したマウスにおいて末梢血細胞を酢酸セルロースｉｎ  ｓｉｔｕ酵素分析によりｈＡＤＡタンパク質の存在につき検査することによって実施された（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｄ．Ａ.ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳ．Ｈ．Ｏｒｋｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.,Ｖｏｌ．７，ｐｐ３４５９−３４６５（１９８７））。検査は移植後４カ月目から実施し、月毎に反復した。
【００７９】
７．２．結果
遺伝子操作した造血幹細胞によるマウスの長期骨髄再構成は、一般に移植の４カ月後に幹細胞形質導入効率を判定するのが適切であると受け取られている。７カ月後にレシピエントの形質導入骨髄をアイソザイム分析により分析して、下記のことが明らかになった：１）ヒトＡＤＡ  ｃＤＮＡ発現は同時培養またはＦＮ３０／３５上での上清感染を採用した場合に存在したが、ＦＮ３０／３５なしの上清感染後に移植した群には存在しなかった；および２）発現の水準は同時培養群とＦＮ３０／３５群で同等であった。図４、２−４列に示すように、ＥＰＨＡ−５細胞上での同時培養により形質導入された骨髄を移植した３匹のマウスは容易に検出しうるヒトＡＤＡを立証した。同様な水準のヒトＡＤＡが、ＦＮ３０／３５上でのの上清感染により形質導入された造血細胞を移植した３匹のマウスに検出された（図４、５−７列）。これに対し、ＢＳＡ上での上清感染により形質導入された３匹のマウスにはヒトＡＤＡが検出されなかった(図４、８−１０列)。ヒトＡＤＡの位置に関する対照を図４の１および１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１列に示す。２−１０列のネズミバンドは等量のタンパク質が装填されたことを明らかにする。これらのデータはＦＮ３０／３５上での上清感染による長期再構成性の造血幹細胞の形質導入が同時培養と同等であり、かつＦＮ３０／３５なしの上清感染よりはるかに優れていることを立証する。
【００８０】
実施例８  ＦＮ３０／３５へのレトロウイルスベクター結合による形質導入改良のメカニズム
８．１．実験
形質導入の増大がウイルスと造血細胞の同時局在の結果であるか否かを調べるために、組換えレトロウイルス粒子がＦＮ３０／３５への結合を示すか否かを分析した。したがってＦＮ３０／３５コートしたプレートを、ＴＫＮＥＯウイルスを含有する上清と共に３０分間プレインキュベートしたのち、徹底的に洗浄した。上清のウイルス力価を標準法により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いて測定した（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ１１２０−１１２４（１９８８））。以下に要約する：３Ｔ３細胞を１０００個／ウェルの濃度で６ウェル組織培養プレートに接種し、一夜増殖させた。各ウェルにウイルス上清の系列希釈液を７．５μｇ／ｍｌのポリブレンと共に添加し、３７℃で２．５時間インキュベートしたのち、２ｍｌの培地を添加した。２４時間後に培地をＧ４１８（０．７５ｍｇ／ｍｌ、乾燥粉末、ギブコ）含有培地と交換し、プレートを１０−１２日間インキュベートした。Ｇ４１８耐性コロニー（Ｇ４１８r）を１０−１２日後に染色し、計数した。コロニー／ウェル×ウイルス上清希釈度の数値を、感染性粒子数（ｃｆｕ）／上清ｍｌとして用いた。ＦＮ３０／３５コートまたはＢＳＡコートした３５ｍｍのプレートをウイルス上清と共にプレインキュベートし、徹底的に洗浄したのち、３５ｍｍの細菌用皿当たり１０００個のＮＩＨ／３Ｔ３およびポリブレンを添加することにより、プレート上に残留するレトロウイルス粒子の量を評価“力価測定”した。２４時間後に培養物に０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（乾燥粉末）を含有する培地を供給し、細胞をさらに１０−１２日間インキュベートした。このインキュベーションののち、Ｇ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロニーを計数することにより付着ウイルスの存在を定量した。
【００８１】
ＦＮ３０／３５へのウイルスの結合が用量依存性様式で起こるか否かを評価するために、皿をコートするＦＮ３０／３５の濃度を漸増させて上記実験を反復した。したがって３５ｍｍの細菌用皿を上記に従って１、４、１０および２０μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５でコートした。予め感染性粒子１×１０4個／ｍｌと力価測定されたＴＫＮＥＯウイルス原液の１：５０希釈液を、ＦＮ３０／３５コートしたプレート上で３０分間インキュベートした。徹底的に洗浄したのち、各ウェルに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を添加した。上記に従って選択を行い、１０日間の選択後にＧ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロニーを計数した。
【００８２】
８．２．結果
図５に代表的な３実験中の１つの結果を提示する。ＴＫＮＥＯ上清を用いた場合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＧ４１８rコロニーにより測定したレトロウイルス力価が、ＢＳＡコートしたプレート上では３ ｌｏｇ以上低下した（４×１０3から０）が、力価低下は３０／３５  ＦＮコートしたプレート上では１ ｌｏｇにすぎなかった。これらのデータは、レトロウイルスがＦＮ３０／３５には定量的に結合するが、ＢＳＡコートした皿（対照の皿）のは結合しないことを証明する。図６は、ウイルス含有上清をより高い濃度のＦＮ３０／３５でコートすると、より多数のＧ４１８耐性コロニーが検出されたことを示す。したがってＦＮ３０／３５へのウイルスの結合は用量依存性の様式で起こる。
【００８３】
実施例９  組換えフィブロネクチンフラグメントへのウイルスの結合
９．１．実験
Ｋｉｍｉｚｕｋａらは先に大腸菌におけるクローン化ＦＮ  ＤＮＡ配列の発現につき報告した（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｄ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。クローン化およびキメラペプチドは細胞の付着に関与することが知られている、フィブロネクチン中の幾つかの重要な配列の１つまたは組合わせを含む（ＲＧＤＳ、ＣＳ−１およびヘパリン結合部位を含む）。図７を参照されたい。レトロウイルスがこれらの組換えＦＮフラグメントに結合しうるか否かを分析するために、陽性対照としての組換えフラグメントＣ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ２９６、Ｃ−ＣＳ１およびＦＮ３０／３５でコートしたプレート上で、感染性粒子１×１０4／ｍｌの凍結レトロウイルスＴＫＮＥＯ原液の２種類の異なる希釈液（１：１０および１：１００）を用いて３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイを反復した。ＦＮフラグメントは１２０−１３０ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で用いられた（Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ−ＣＳ１、ＦＮ３０／３５については４μｇ／ｃｍ2、ＣＨ−２７１、ＣＨ２９６については８μｇ／ｃｍ2に相当）。要約すると、プレートをコートし、ウイルスを添加し、プレートを徹底的に洗浄し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を２４時間添加し、次いで選択培地中で１０日間選択したのちコロニーを染色し、計数した。
【００８４】
９．２．結果
図８は、フラグメントＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１およびＣＨ２９６においてＧ４１８耐性コロニー数（したがってウイルスの付着）が増加したことを証明する。さらにこれは、結合したウイルスの量がこれらの組換えフラグメントとＦＮ３０／３５との間でほぼ同等であったことを示す。ただしこの実験ではＣＨ−２７１フラグメントが最高水準のウイルス結合を示した。これら５種類のＦＮフラグメントすべてに共通して、高親和性のヘパリン結合部位を含むタイプＩＩＩ反復配列１２−１４がある（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ３７５−４１３（１９８８）、およびＫｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。この部位は恐らく反復配列１３内に位置すると思われる（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ.ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.,Ｖｏｌ.１１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１）)。これは、ウイルス結合がこの既知の付着部位により起こっていることを示唆する。これは、４μｇ／ｃｍ2のＣＨ−２７１でコートした皿を、漸増する濃度（１０−１０００μｇ／ｍｌ）のヘパリン硫酸、すなわちヘパリン結合部位への細胞の結合を阻害することが知られている高度に帯電した分子と共にプレインキュベートすることにより証明された。図９に示すように、ヘパリン硫酸の濃度が増大するのに伴ってＣＨ−２７１のプレインキュベーションによりＧ４１８耐性コロニー数が減少する。これらのデータは、ＦＮへのウイルスの結合がＦＮのカルボキシル末端のＣＳ−１部位のすぐ隣に位置する高親和性ヘパリン結合部位により仲介されることを示唆する。
【００８５】
実施例１０  組換えフィブロネクチンフラグメント上での造血細胞の形質導入
１０．１．実験
ＦＮ３０／３５につき先に記載した造血細胞の形質導入の増大が組換えＦＮフラグメントを用いた場合にも見られるか否かを分析するために、高増殖性の潜在的コロニー形成性細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）アッセイ法を用いて、インビトロでの上清感染の形質導入効率を評価した。ＥＡＬ２ａベクターを使用し、遺伝子導入を指示するものとしてＧ４１８耐性コロニーの増殖を利用する造血細胞形質導入に種々の組換えＦＮフラグメントが及ぼす影響を、ＦＮ３０／３５またはＢＳＡ上での上清感染と比較した。さらに、既にＦＮフラグメントに付着したウイルス粒子（上清ウイルスと対比）が造血細胞に形質導入する能力を比較した。０．５−１×１０6個の予備刺激した骨髄細胞を３５ｍｍのＦＮコートしたペトリ皿上で、成長因子および５μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＥＡＬ２ａウイルス含有上清１−２ｍｌ中において、前記に従ってインキュベートした。ＦＮフラグメントに結合したウイルスによる造血細胞の形質導入を評価するためには、ウイルス含有上清と共にインキュベートした３５ｍｍのＦＮコート皿をそれぞれ２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで０．５−１×１０6個の予備刺激した骨髄細胞を、成長因子およびポリブレンを補充した培地２ｍｌ中において添加した。２２時間後に細胞を収穫し、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、および含有しないＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに接種した（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．およびＤ．Ｍｅｔｃａｌｆ，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ２８７−２９３（１９６６）の記載に従う）。培養物を７％ＣＯ2中で３３℃において１４日間インキュベートし、Ｇ４１８耐性コロニーの％として遺伝子導入効率を計算した。
【００８６】
１０．２．結果
上清感染による未発達の造血細胞の形質導入（図１０参照）は、ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）および少なくともさらに１つの有効な細胞付着部位を含むすべてのフラグメントにつき、ＢＳＡ上での上清感染より有意に高かった（中実の棒）。組換えフラグメントＣＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１の形質導入効率は、ＦＮ３０／３５、ヘパリン結合部位およびＣＳ−１部位の両方を含む３フラグメントすべての作用と類似していた。他のすべての場合、形質導入は著しく低下した。これらのデータは、先にＦＮ３０／３５につき示した未発達の造血細胞の形質導入増大を組換えＦＮフラグメントについて再現しうることを証明する。それはさらに、フィブロネクチンに直接に結合したウイルスが造血細胞の遺伝子形質導入を行いうることを証明する。最後にそれは、ＣＳ−１とヘパリン結合部位の両方が存在することが未発達の造血前駆（幹）細胞の形質導入に有用であることを確認する。
【００８７】
実施例１１  組換えフィブロネクチンフラグメント上でのネズミドナー細胞の形質導入を利用したマウスの長期骨髄再構成
１１．１．実験
未発達の造血前駆細胞についての前記のインビトロ実験（実施例１０から）を、ＢＳＡまたはＦＮ３０／３５または組換えＦＮフラグメント上での上清感染と同時培養とを対比しながら、骨髄移植を用いて反復し、造血幹細胞の再構成に対する影響を分析した。以下に要約する：致死量照射したマウスに、ヒトＡＤＡ  ｃＤＮＡを含むＥＰＨＡ−５ベクターを形質導入したドナー細胞を注射した。１カ月後に末梢血からＡＤＡアイソザイム分析により遺伝子導入効率を分析した。
【００８８】
１１．２．結果
図１１は、ヘパリン結合部位とＣＳ−１の両方を含むフィブロネクチンフラグメントＨ−２９６がＦＮ３０／３５および同時培養と類似の結果を与えることを明瞭に示す。これらの部位を両方を含むものでないフラグメントは移植可能な造血細胞の形質導入における有効性がより低い。これらのデータは、未発達の造血／幹細胞と、ＣＳ−１およびヘパリン結合部位の両方を含む組換えＦＮフラグメントに結合したレトロウイルスとの同時局在によって、移植可能な造血細胞が効果的に形質導入されることを証明する。
【００８９】
以上の記載において本発明を詳細に説明および記述したが、これは説明のためのものであって限定する性質のものではないと考えるべきであり、好ましい態様を記載したものであって、本発明の精神に包含される変更および修正はすべて保護されることを望むと解すべきである。
【００９０】
本明細書に引用した刊行物はすべて、それらが個々に引用されて完全に提示されたと同様に、それらの全体が参考として本明細書に含まれるものとする。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キモトリプチックフラグメントを含むフィブロネクチン分子の模式図である。
【図２】図２は、フィブロネクチンフラグメントの存在下でＴＫＮＥＯベクターを用いたコミッティッド（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ヒト前駆細胞の感染効率を示す；実施例１に詳細に記載する。
【図３】図３は、フィブロネクチンまたはそのフラグメントの存在下でＴＫＮＥＯベクターを用いた種々のコミッティッドヒト造血前駆細胞の感染効率を示す；実施例１に詳細に記載する。
【図４】図４は、下記の方法で形質導入された骨髄細胞を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較する：（ｉ）同時培養法（２−４列）、（ｉｉ）固定化フィブロネクチンフラグメントの存在下での上清感染（５−７列）、およびＢＳＡ上での上清感染（８−１０列）；実施例７に詳細に記載する。ｈＡＤＡに関する対照を１および１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１列に示す。
【図５】図５は、フィブロネクチンフラグメントに対するレトロウイルスの結合を示す;実施例８に詳細に記載する。
【図６】図６は、フィブロネクチンフラグメントに対するレトロウイルスの結合が用量依存性であることを示す；実施例８に詳細に記載する。
【図７】図７は、実施例９−１１で用いた種々の組換えフィブロネクチンフラグメントを示す模式図である。
【図８】図８は、種々の組換えフィブロネクチンフラグメント（幾つかの組換えフラグメントを含む）へのレトロウイルスの結合を示す；実施例９に記載する。
【図９】図９は、ヘパリンがフィブロネクチンフラグメントへのレトロウイルスの結合を遮断することを示す；実施例９に記載する。
【図１０】図１０は、種々の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下でのネズミ造血細胞のレトロウイルス感染効率を示す；実施例１０に詳細に報告する。
【図１１】図１１は、下記の方法で形質導入された骨髄細胞を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較する：（ｉ）同時培養法、（ｉｉ）種々のフィブロネクチンフラグメント上での上清感染、および（ｉｉｉ）ＢＳＡ上での上清感染；実施例１１に記載する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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