(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表わされることを特徴とする４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体。
【化１】
0003939484.tif 000007
〔式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つはフェニルボロン酸基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものは、それぞれ独立して、水素原子、低級脂肪族基または単環芳香族基から選ばれる。〕
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものが、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基から選ばれることを特徴とする４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体。
【請求項３】
請求項１または請求項２の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体から成ることを特徴とする糖質検出剤。
【請求項４】
単糖類または二糖類の検出に用いられることを特徴とする請求項３の糖質検出剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖質を検出するための技術分野に属し、特に、糖質の存在下に色調変化を起こして糖質の検出に用いることができる新規の化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖（糖質）は、タンパク質や脂質とともに生体に必須の物質の一つであり、生体内の情報伝達、エネルギー代謝、構造体形成などにおいて重要な役割を果たしている。たとえば、グルコース（Ｄ−グルコース、ブドウ糖）は、身体を構成する各種の組織細胞のエネルギー源として大切である。このグルコースは、グリコーゲンに変化して肝臓に蓄えられ、必要に応じて体液中に放出されながらエネルギー活動に消費され、正常なヒトの体内では、グルコースの生産と消費のバランスが保たれ、体液中の濃度は一定の範囲にある。したがって、血液や尿中のグルコースを測定することにより、糖尿病や副腎疾患などの疾病を診断することができる。
【０００３】
現在実用に供されている糖質の検出手段としては、酵素を用いるグルコースセンサーがよく知られている。これは、酵素（グルコースオキシダーゼ）を用いて糖質（グルコース）を分解し、その際生じる過酸化水素を適当な手段（例えば、電極）で測定することによりグルコースの濃度を求めるものである。この方法は確立された技術ではあるが、用いる酵素は生体由来であるので経時的に変質し、また、測定に特別の装置を必要とする。
【０００４】
ボロン酸基Ｂ(ＯＨ)2がジオール構造を有する化合物と反応して環状エステルを生成することは知られている。本発明者らは、この事実を利用して、アントラセン基やビナフチル基のような蛍光性色素がアミノメチル基を介してフェニルボロン酸基と結合した構造から成り、糖質の存在下に糖質のＯＨ基と結合すると蛍光を発するＰＥＴ（Photoinduced Electron Transfer）型化合物を用いる糖質のセンシングシステムを先に開発した（特許第２８８３８２４号、特許第２７９９８３７号）。このシステムは、安定な合成化合物を用いて糖質の検出を可能にした初めてのものと考えられるが、蛍光測定用の装置を必要とする。
【０００５】
そこで、糖質が存在すると可視領域における吸収スペクトル変化を起こすようなボロン酸化合物が得られれば、格別の装置を必要とせずに視覚のみによる糖質の検出も可能となるので実用的な応用が期待されるが、そのような化合物は殆ど見当たらない。
【０００６】
最近、Stronginらは、カリックス[４]レゾルカレンにフェニルボロン酸基が結合された構造のボロン酸化合物を糖とともに加熱すると、糖の種類に応じて異なる発色が認められることを報告している（C. J. Davis, P.T.Lewis, M.E.McCarroll, M.W.Read, R.Cueto and R.M.Strongin, Org. Lett., 1999, 1, 331.）。しかしながら、この系における発色（呈色）は不可逆反応であり、そのままでは実用的な糖の検出に応用することはできない。
【０００７】
また、本発明者らは、糖質の存在下に色調変化を起こす下記の式（２）で表わされるボロン酸化合物（ボロン酸修飾メチルオレンジ）を開発した（特許第２８８３８０８号）。このボロン酸化合物と糖質との反応は可逆的であり、中性ｐＨ域の水溶液中の糖質を色調変化により検出できるが、糖質添加に伴う可視領域の吸収スペクトル変化が微弱であるのが難点であった。
【０００８】
【化２】
0003939484.tif 000002
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖質の存在下に顕著な色調変化を起こし、視覚による糖質の検出を行うこともできるような新しいタイプの化合物を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、研究を重ねた結果、上記の目的を達成するものとして、４，４'−ジアミノアゾベンゼン構造にフェニルボロン酸基が結合した新規な化合物を導き出した。
かくして、本発明は、下記の一般式（１）で表わされることを特徴とする４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体を提供するものである。
【００１１】
【化３】
0003939484.tif 000003
【００１２】
式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つはフェニルボロン酸基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものは、それぞれ独立して、水素原子、低級脂肪族基または単環芳香族基から選ばれる。
【００１３】
式（１）で表わされる本発明の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体の好ましい態様においては、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものは、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基から選ばれる。
【００１４】
本発明は、さらに、別の視点から、上記の式（１）の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体から成る糖質検出剤を提供する。本発明の糖質検出剤は、特に単糖類または二糖類の検出に用いられる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
前記の式（１）で表わされる本発明の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つはフェニルボロン酸基である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものは、発色性の影響を与えない各種の官能基が可能であるが、一般的には、低級脂肪族基または単環芳香族基から選ばれる。
【００１６】
低級脂肪族基としては、炭素数１〜６のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキルビニル基などが好適である。得られるジアミノアゾベンゼン誘導体の水溶性を高めるために、アルキル基は末端にスルホン酸基やカルボン酸基を有していてもよい。アルケニル基やアルキルビニル基のような不飽和結合を有する官能基は、ジアミノアゾベンゼンをポリマー担体に担持して使用するような場合に好ましい。単環芳香族基として代表的なものは、フェニル基であるが、この他に、トリル基、キシリル基なども使用可能である。本発明の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基として特に好ましいのは、水素原子、および炭素数１〜３のアルキル基である。
【００１７】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して選択される（すなわち、それらのＲ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに同一のものだけではなく別異のものであってもよい）が、得られる４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体が全体として対称性のある分子構造を呈するように選択されることが好ましい。例えば、Ｒ1およびＲ4がフェニルボロン酸基である場合、残りのＲ2およびＲ3は同一の官能基（例えば、メチル基）とするのが好ましい。
【００１８】
以上のような式（１）で表わされる本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体は、前述の式（２）で表わされるボロン酸修飾メチルオレンジに比べて、糖の存在下における可視領域の吸収スペクトル変化が著しく大きいことが見出されており、この理由は次のように理解される。
【００１９】
式（２）に示すようにボロン酸基はメチルオレンジのドナー部位に修飾され、弱いながらもルイス酸−ルイス塩基相互作用であるボロン酸−窒素によるＢ−Ｎ相互作用を形成している。そこへ糖質を添加するとボロン酸の酸性度が上昇し、それに応じたＢ−Ｎ相互作用の強度が変化してスペクトル変化が起こる。しかしながら、メチルオレンジは、所謂“Push-Pull”型色素の１種であり、電子密度が分子内電荷移動吸収帯の影響を受けてアクセプター側に偏っているためルイス塩基性（窒素のルイス塩基性）が低く、この結果、スペクトル変化が微弱であると考えられる。これに対して、本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体においては、発色団として電子供与性のジメチルアミノ基を４，４'位に導入した対称型のアゾベンゼンを色素骨格に使用しており、この色素は分子内電荷移動吸収帯を持たないため、分子内における電子密度の変化はほとんど起こらないことが予測される。その結果、ジメチルアミノ基の比較的高い電子密度に誘起された強固なＢ−Ｎ相互作用が生じ、結果として大きな吸収スペクトル変化がもたらされるものと推測される。
【００２０】
本発明の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体は、既知の合成法を工夫することにより調製することができる。図１は、後述の実施例で用いたジアミノアゾベンゼン誘導体の合成スキームの１例を示す。概説すれば、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−４−ニトロアニリン（４−ニトロ−Ｎ−メチルアセトアニリド）を酸化鉄（III）触媒の存在下にヒドラジンと反応させた後、ＣＭＤを反応させることにより、基本骨格となるジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼンのジアセチル体を合成し（工程ｉ）、このジアセチル体に水酸化カリウムを反応させ脱アセチル化することによりジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼンを得る（工程ii）。
【００２１】
２個のフェニルボロン酸基を結合させる場合には、上記のジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼンを炭酸カリウムの存在下に２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサ−２−ボリナンを反応させる（工程iii）。単一個のフェニルボロン酸基を結合させる場合には、上記のジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼンの一方の端を炭酸カリウムの存在下にヨウ化メチルなどを用いてメチル化して保護し（工程iv）た後、工程iiiと同様に、炭酸カリウムの存在下に２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサ−２−ボリナンを反応させる（工程ｖ）。
【００２２】
基本骨格となる４，４'−ジアミノアゾベンゼンに４個のフェニルボロン酸基を結合させるには、Ｎ−アセチル−４−ニトロアニリンを原料とし酸化鉄を触媒としてＣＭＤで酸化カップリングすることにより４，４'−ジアミノアゾベンゼンを合成し、この４，４'−ジアミノアゾベンゼンに炭酸カリウムの存在下、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１−３−ジオキサ−２−ボリナンを反応させる。また、４，４'−ジアミノアゾベンゼンを炭酸カリウムの存在下、ヨウ化メチルでモノメチル化した後、同様の操作を行えば３個のフェニルボロン酸基が導入される。
なお、本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体を表わす式（１）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちフェニルボロン酸基でないものとして、上述のようなメチル基以外のものを用いる場合には、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−４−ニトロアニリンの代わりに、それぞれ所望の官能基が結合したＮ−アセチル−４−ニトロアニリンを使用する。
【００２３】
以上のようにして合成され式（１）で表わされる本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体は、糖質の存在下における可視領域の吸収スペクトル変化がきわめて大きく、その色調変化は視覚的にも明瞭に判別できる（一般に、黄色からピンク色に変化する）。後述の実施例にも示されるように、このような変化は中性ｐＨ域（ｐＨ６〜８）の水溶液または水性液中で顕著であり、且つ、ｍＭオーダーの濃度の糖質に対しても発現する。かくして、式（１）で表わされる本発明の化合物は、ジオール構造を有する各種の糖質の検出剤に用いられ、特に、単糖類および二糖類の検出剤として有用である。
【００２４】
本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体を糖質検出剤として使用するには、一般に、当該ジアミノベンゼン誘導体を水または水性溶媒（例えば、水とメタノールの１：１混合溶媒）に溶かした稀薄溶液として被検溶液に添加するだけでよい。定性的な糖質の検出は視覚観察により行うことができるが、勿論、比色計を用いて定量分析することもできる。また、既述したように式（１）のＲ1〜Ｒ4の官能基に応じて樹脂等のポリマーに固定化して使用することも可能である。
【００２５】
式（１）で表わされるジアミノアゾベンゼン誘導体から成る本発明の糖質検出剤は、糖質の存在下における最大の色調変化が中性ｐＨ域にあるので、生理的条件下でそのまま使用でき、生体液、例えば、血液中の糖濃度（糖化ヘモグロビンも含む）を測定する新しいタイプの高感度センサーとして有用である。
【００２６】
また、本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体を用いる糖質の検出においては、被検サンプルをそのままの状態（intact）で測定を行い、糖質は酵素法のように分解することもなく可逆的に元の状態に戻るので、該サンプルを別の測定に供することも可能となる。さらに、将来の展望として、糖質を分解することなく測定できるので、生体の特定部位（例えば、特定の細胞表面）における糖質をその組織を破壊することなく測定するような技術に展開することも可能である。また、合成化合物から成る本発明の糖質の検出剤は、該化合物を適宜変更することにより、各種の糖質に応じて適用可能なように設計変更する途を開いたと言える。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明の特徴を一層明らかにするため実施例に沿って本発明を説明する。なお、本明細書および図面中の構造式においては、当該分野で慣用されているように、炭素原子や水素原子を省略して示していることもある。
実施例１：ジアミノアゾベンゼン誘導体の合成
図１に示すスキームに従い、本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体として下記の式（３）および（４）に従う化合物を合成した。また、対照として下記の式（５）で表わされるボロン酸未修飾の化合物を合成した。
【００２８】
【化４】
0003939484.tif 000004
【００２９】
【化５】
0003939484.tif 000005
【００３０】
【化６】
0003939484.tif 000006
【００３１】
（１）Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−４−ニトロアニリン（６）の合成
50ｍｌのビーカーにＮ−アセチル−Ｎ−メチルアニリン35.10ｇ（0.24ｍｏｌ）を加え、氷酢酸25ｍｌに溶解させた（若干加熱）。この溶液を予め氷浴により冷却しておいた濃硫酸71ｍｌの中へゆっくりと加えた。そのまま、氷浴下濃硝酸（60％）27.5ｇをゆっくりと加え、氷冷下さらに１時間攪拌を続けた。
反応溶液を氷の入った１リットルのビーカーへ注ぎ込み、そのまま30分間攪拌を行った。析出した沈殿を濾別した。沈殿をクロロホルムに溶解させ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を再結晶（メタノール）により精製し、淡黄色固体（25.01ｇ、55％）を得た。
なお、出発原料となるＮ−アセチル−Ｎ−メチルアニリンは、例えば、Ｎ−メチルアニリンをジクロロメタンに溶かし、炭酸カリウムの存在下に臭化アセチルを反応させることにより得られる。
【００３２】
化合物の同定：ｍｐ＝146.4〜146.8℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-11662.5（νＣ＝Ｏ）、1517.9、1336.6（νＮ−Ｏ）；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ2.03（３Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ3）、3.36（３Ｈ、ｓ、ＮＣＨ3）7.43、8.29（各々２Ｈ、ｄ（9.0）、ｄ（9.0）、Ａｒ−Ｈ）。
【００３３】
（２）Ｎ，Ｎ'−ジアセチル−Ｎ，Ｎ'−ジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（７）の合成〔工程ｉ〕
200ｍｌのナス型フラスコにＮ−アセチル−Ｎ−メチル−４−ニトロアニリン30.00ｇ（155ｍｍｏｌ）を加え、メタノール400ｍｌに加熱溶解させた。酸化鉄（III）23.5ｇ（触媒）を加え、10分間攪拌した後、ヒドラジン一水和物16.68ｇ（335ｍｍｏｌ、2.2ｅｑ）を加え、加熱攪拌を続けた。１時間後、気泡の発生が止まり、ＴＬＣにて原料の消失を確認したため、反応をとめ、放冷した。
不溶物を濾別後、得られた液体にアセトンを加え、再び減圧留去した。得られた液体をクロロホルムで希釈し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、その後、４時間程度減圧乾燥し、淡黄色固体を得た。
300ｍｌのナス型フラスコにＣＭＤ171ｇ（２ｍｏｌ、13ｅｑ）およびモレキュラーシーブを加え、ベンゼン900ｍｌに懸濁させた。先に得られた淡黄色固体をベンゼン300ｍｌに溶解させ、その中へゆっくりと加えた。窒素気流下、４時間加熱還流した。
反応溶液の不溶物を濾別後、赤褐色固体を得た。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）により精製し、黄色固体（12.72ｇ、51％）を得た。
【００３４】
化合物の同定：ｍｐ＝197.5〜200.5℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-11641.3（νＣ＝Ｏ）、1421.0、924.8（νＮ−Ｏ）；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ1.99（６Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ3）、3.34（６Ｈ、ｓ、ＮＣＨ3）7.36、7.98（各々２Ｈ、ｄ（9.0）、ｄ（9.0）、Ａｒ−Ｈ）。
【００３５】
（３）Ｎ，Ｎ'−ジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（８）の合成〔工程ii〕
100ｍｌのナス型フラスコにＮ，Ｎ'−ジアセチル−Ｎ，Ｎ'−ジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン2.00ｇ（6.2ｍｍｏｌ）を加え、エタノール60ｍｌ、６Ｎ水酸化カリウム水溶液60ｍｌを加え、５時間加熱還流した。
反応溶液を放冷後、エタノールを減圧留去した。残水相へ氷を加え、氷浴下、２時間攪拌した。析出した赤色沈殿を濾別し、冷水で洗浄した。残渣をクロロホルムに加熱溶解させ、無水硫酸ナトリウムで乾燥しながら、熱時濾過した。残渣を再結晶（ベンゼン）により精製し、光沢のある暗青色固体（0.95ｇ、65％）を得た。
【００３６】
化合物の同定：ｍｐ＝205.9〜208.5℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-1νＣ＝Ｏの消失、3290.8（νＮ−Ｈ）933.5、1471.6（νＮ＝Ｎ）；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ2.91（６Ｈ、ｓ、ＮＣＨ3）、3.66（２Ｈ、ｓ、ＮＨ）6.64、7.77（４Ｈ、４Ｈ、ｄ（8.8）、ｄ（8.7）、Ａｒ−Ｈ）；元素分析（Ｃ14Ｈ16Ｎ4として）計算値：Ｃ，69.97；Ｈ，6.71；Ｎ，23.32％。測定値：Ｃ，65.86；Ｈ，6.70；Ｎ，23.02％
【００３７】
（４）Ｎ，Ｎ'−ジメチル−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ボロノベンジル）−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（３）の合成〔工程iii〕
50ｍｌの二口ナス型フラスコにＮ，N'−ジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン0.14ｇ（0.58ｍｍｏｌ）を加え、単蒸留アセトニトリル10ｍｌに溶解させた。炭酸カリウム0.32ｇ（2.3ｍｍｏｌ、２ｅｑ／unit）および２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサ−２−０ボリナン0.36ｇ（1.4ｍｍｏｌ、1.2ｅｑ／unit）を加え、一晩熱還流した。
不溶物を濾別後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムに溶解させ、蒸留水で洗浄した。溶媒を減圧留去し、残渣をＴＨＦに溶解させた後、１Ｎ塩酸水溶液を加え、一晩室温で攪拌した。溶媒を減圧留去し、残水相を炭酸水素カリウムで中和した。析出した固体を濾取し、クロロホルムに溶解させ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝５０：１）、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム：ＴＨＦ＝５：１）、カラムクロマトグラフィー（Bio Beads S-X8、クロロホルム）により精製し、得られた赤色固体を再結晶（蒸留メタノール）により精製し、赤色固体（５ｍｇ、1.7％）を得た。
【００３８】
化合物の同定：ｍｐ＝221.1〜223.3℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-13397.9（νＯ＝Ｈ）、1350.6（νＢ−Ｏ）；1Ｈ−ＮＭＲ（600ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ3.04（６Ｈ、ｓ、ＮＣＨ3）、6.89、7.25〜7.33、7.68（４Ｈ、８Ｈ、４Ｈ、ｄ（8.7）、ｍ、ｄ（8.7）、Ａｒ−Ｈ）；元素分析（Ｃ16Ｈ20Ｎ4・0.1Ｈ2Ｏとして）計算値：Ｃ，65.93；Ｈ，5.98；Ｎ，10.98％。測定値：Ｃ，65.86；Ｈ，5.98；Ｎ，10.72％；ＥＳＩ−ＭＡＳＳ（メタノール／微量のクロロホルム、ポジティブモード）計算値：509.25、523.26、537.28、551.29、565.31；測定値：509.54、523.52、537.57、551.60、565.58（計算値、測定値ともに左から順に分子イオンピーク、ボロン酸がモノメチルエステル、ジメチルエステル、トリメチルエステル、テトラメチルエステルに由来するピークである）
【００３９】
（５）Ｎ，Ｎ，Ｎ'−トリメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（９）の合成〔工程iv〕
200ｍｌの二口ナス型フラスコにＮ，Ｎ'−ジメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン0.80ｇ（3.3ｍｍｏｌ）を加え、クロロホルム150ｍｌとアセトニトリル50ｍｌに溶解させた。炭酸カリウム0.91ｇ（6.6ｍｍｏｌ、2.0ｅｑ）、ヨウ化メチル0.23ｍｌ（3.6ｍｍｏｌ、1.1ｅｑ）を加え、１日加熱還流した。
反応溶液を熱時濾過し、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）により精製し、黄色固体（144ｍｇ、17％）を得た。
【００４０】
化合物の同定：ｍｐ＝180.4〜182.4℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-13426.8（νＮ＝Ｈ）、943.1（νＮ＝Ｎ）；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ2.91、3.05（３Ｈ、６Ｈ、ｓ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、4.08（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）6.65、6.75、7.77、7.81（各々２Ｈ、ｄ（8.6）、ｄ（9.0）、ｄ（8.7）、Ａｒ−Ｈ）。
【００４１】
（６）Ｎ，Ｎ，Ｎ'−トリメチル−Ｎ'−（２−ボロノベンジル）−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（４）の合成〔工程v〕
50ｍｌの二口ナス型フラスコにＮ，Ｎ，Ｎ'−トリメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン100ｍｇ（0.39ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル20ｍｌに溶解させた。炭酸カリウム0.16ｇ（1.2ｍｍｏｌ、3.0ｅｑ）および２−（２−ブロモメチルフェニル）−１．３−ジオキサ−２−ボリナン0.12ｇ（0.47ｍｍｏｌ、1.2ｅｑ）を加え、加熱還流した。途中、反応の進行が止まったため、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサ−２−ボリナンを0.12ｇ（0.47ｍｍｏｌ、1.2ｅｑ）ずつ３回追加した。２時間後、原料がほぼ消失したことを確認し反応を止めた。
反応溶液を放冷後、不溶物を濾別し、濾液を減圧留去した。残渣をクロロホルムに溶解させ、蒸留水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Bio Beads S-X8、ベンゼン）で粗精製し、残渣をＴＨＦに溶解させ、１Ｎ塩酸水溶液で一晩攪拌した。
反応溶液を炭酸水素カリウムで中和し、ＴＨＦを減圧留去した。残水相をクロロホルムで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた油状物にヘキサンを加え、析出した沈殿を濾別した。得られた固体を再結晶（メタノール）により精製し、赤褐色固体を得た。
【００４２】
化合物の同定：ｍｐ＝134.5〜139.0℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-13426.8（νＯ−Ｈ）、1471.6、943.1（νＮ＝Ｎ）、1365.0（νＢ−Ｏ）；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ2.75、3.08（３Ｈ、６Ｈ、ｓ、ｓ、ＮＣＨ3）、4.36（２Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ2−Ａｒ）6.76、7.23、7.23、7.40、7.82、7.84、7.90（２Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ、２Ｈ、２Ｈ、１Ｈ、ｄ（8.8）、ｄ、ｄ（8.3）、ｍ、ｍ、ｄ（7.6）、ｄ（7.4）、ｄ（9.1）、ｄ（9.1）、Ａｒ−Ｈ）、7.02（２Ｈ、ｂｒ  ｓ、Ｂ（ＯＨ）2）；元素分析（Ｃ24Ｈ29ＢＮ4Ｏ2・0.25ＨＣｌとして）計算値：Ｃ，67.75；Ｈ，6.88；Ｎ，13.17％。測定値：Ｃ，67.72；Ｈ，6.49；Ｎ，13.44％：ＥＳＩ−ＭＡＳＳ（メタノール、ポジティブモード）計算値：388.21、402.22、416.24；測定値：388.05、402.06、416.07（計算値、測定値ともに左から順に分子イオンピーク、ボロン酸がモノメチルエステル、ジメチルエステルに由来するピークである）。
【００４３】
（７）Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−４，４'−ジアミノアゾベンゼン（５）の合成〔対照化合物の合成〕
300ｍｌのナス型フラスコにＣＭＤ31.89ｇ（367ｍｍｏｌ、10ｅｑ）およびモレキュラーシーブを加え、ベンゼン150ｍｌに懸濁させた。そこへＮ，Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン5.00ｇ（36.7ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（50ｍｌ）を加え、２時間30分加熱還流した。
反応溶液を濾別し、残渣を再結晶（ベンゼン）により精製し、茶赤色針状晶（0.39ｇ、８％）を得た。
【００４４】
化合物の同定：ｍｐ＝263.2〜265.9℃；ＩＲ（ＫＢｒ）波数／ｃｍ-1938.3、1471.6（νＮ＝Ｎ）、；1Ｈ−ＮＭＲ（250ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ、r.t）δ／ｐｐｍ3.06（12Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、6.76、7.81（各々４Ｈ、ｄ（9.1）、ｄ（9.1）、Ａｒ−Ｈ）；元素分析（Ｃ16Ｈ20Ｎ4として）計算値：Ｃ，71.61；Ｈ，7.51；Ｎ，20.88％、測定値：Ｃ，71.77；Ｈ，7.46；Ｎ，20.78％
【００４５】
実施例２：ｐＨに対する吸収スペクトル変化試験
実施例１のように合成した化合物（３）、（４）および（５）について、糖質不在下および糖質存在下におけるｐＨ滴定実験を行い、ｐＨ変化に伴う吸収スペクトルの変化（吸光度変化）を測定した。測定に用いた装置は、SHIMADZU UV-2500PCである。
糖質としてＤ−フルクトースを使用し、糖質存在下における糖質の濃度は、水／メタノール混合溶媒（１：１ｖ／ｖ）中、0.1ｍＭとした。化合物（３）、（４）および（５）は、水／メタノール混合溶媒（１：１ｖ／ｖ）に、それぞれ、１×10‐5Ｍの濃度で溶かし、各ｐＨは50ｍＭの無機系緩衝溶液を使用した調整した（ｐＨ1.0〜3.0  ＫＣｌ−ＨＣｌ；ｐＨ3.5〜5.5  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ；ｐＨ6.0〜8.5  ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ9.0〜11.0  ＮａＨＣＯ3−Ｎａ2ＣＯ3）。吸光度の測定は、セル長１ｃｍとし、25℃で行った。図２に波長500ｎｍにおけるｐＨ変化に対する吸光度変化の結果を示す。
【００４６】
図２に示されるように、フェニルボロン酸基を有しない対照化合物（５）は、糖質の存否に拘わらず、吸収スペクトル（吸光度）の変化は殆ど認められない。これに対して、本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体（３）および（４）は、糖質が存在するとｐＨ６〜８において大きなスペクトル変化を示し、特に化合物（３）についての変化が顕著である。視覚観察によっても、これらのｐＨ域における変化は黄色からピンク色への色調変化として明瞭に判別できた。
【００４７】
このように、フェニルボロン酸基で修飾された本発明の４，４'−ジアミノアゾベンゼン誘導体は、中性ｐＨ域の水性液中の糖質の存在を可視領域のスペクトル変化として検出することができ、この検出は視覚によって行えることが確認された。
【００４８】
実施例３：糖質濃度に対する吸収スペクトル変化試験
実施例１で合成した本発明に従う化合物（３）および（４）について、各種の単糖類の濃度を変えながら吸収スペクトルの変化を測定した。試験方法および条件は実施例２と同様であるが、水／メタノール混合溶媒（１：１ｖ／ｖ）を50ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝溶液を用いてｐＨを7.5に調整して測定を行い、また、各糖質の濃度を１×10‐4〜９×10‐2Ｍの範囲で変化させた。
図３に、化合物（４）についての測定結果を示す。図３の縦軸は、波長480ｎｍにおける吸光度の差（糖質存在の吸光度と糖質不在の吸光度の差）である。化合物（３）についても同様の結果が得られた。
図３に示されるように、本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体は、中性ｐＨの水性溶液中に存在する各種の単糖類の濃度に応じてスペクトル変化を発現し、ｍＭオーダーの濃度の糖質の検出も可能である。
【００４９】
実施例４：ニ糖類の検出試験
実施例１で合成した本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体（３）および（４）の二糖類に対する検出能を調べた。試験方法および条件は実施例３と同様であるが、二糖類の濃度は３×10‐2Ｍ（30ｍＭ）で一定とした。
図４に、化合物（３）についての測定結果を示す。図４の横軸は、波長492ｎｍにおける吸光度である。化合物（４）についても同様の結果が得られた。
図４に示されるように、本発明のジアミノアゾベンゼン誘導体は、糖不存在の場合に比べて（図４の最下段参照）、中性ｐＨの水性溶液中の各種の二糖類の存在に応じて顕著なスペクトル変化を示し、これらの二糖類の検出剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従うフェニルボロン酸基を有するジアミノアゾベンゼン誘導体の合成スキームの１例を示す。
【図２】Ｄ−フルクトースの存在下または不在下における本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体および対照化合物のｐＨ変化に伴う吸光度変化を示す。
【図３】本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体の吸光度が単糖類の濃度変化に応じて変化する様子を示す。
【図４】本発明に従うジアミノアゾベンゼン誘導体の吸光度が二糖類の存在に応じて変化することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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