(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）またはその変異株。
【請求項２】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）。
【請求項３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）またはその変異株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項４】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いたε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合した高分子化合物である。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。したがってトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。
【０００３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株を培地に培養し、得られる培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)No. 346-D株（微工研菌寄第3834号）（特公昭59-20359号公報）、No. 346-D株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である11011A-1株（微工研条寄第1109号）（特公平3-42070号公報）、No. 346-D株のプラスミド増幅変異株である50833株（微工研条寄第1110号）（特公平3-42075号公報、特公平6-75501号公報）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、11011A-1株の変異株であるB21021株（FERM BP-5926）（特開平9-173057号公報）およびストレプトマイセス・ノールセイ(Streptomyces noursei)に属する菌株（FERM P-9797）（特開平1-187090号公報）が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する新規な菌株および該菌株を用いる発酵法による収率の高いε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、スクリーニングの結果、ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する新規な菌株を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）またはその変異株（以下、本発明菌株ともいう）を提供する。
【０００７】
また、本発明は、本発明菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法（以下、本発明製造法ともいう）を提供する。
【０００８】
本発明菌株は、好ましくはストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（FERM P-16810）である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明菌株
本発明菌株は、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下、ポリリジンという）を生産する性質を有する。ポリリジンを生産するとは、採取可能な量でポリリジンを生産することを意味する。また、本発明菌株は、例えば生産培地（2.0％グリセロール、2.0％クエン酸・H2O（pH 4.5）、1.0％(NH4)2SO4、0.2％L-リジン・HCl）を用いて３０℃で培養した場合、Streptomyces albulus IFO 14147株が同条件で培養されたときに培養液中のポリリジン量が低下する期間（通常には培養６日目以降）においても、培養液中のポリリジン量の低下がIFO 14147株と比べ小さいかまたはないという性質を有する。さらに、本発明における好ましい菌株は、同期間において培養液中のポリリジン量の実質的な低下がないという性質を有する。さらに、本発明菌株は後述の如くメラニン様色素（溶解性色素）を生産しないことから、本発明菌株をポリリジンの生産に用いたとき、ポリリジンの脱色、精製が容易になるという実用上好ましい性質も有している。培養液中のポリリジン量は、後記実施例１(1)(c)に記載した方法により測定することができる。
【００１０】
本発明菌株のうち、ストレプトマイセスｓｐ．SP-72株（以下、SP-72株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによってポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。
【００１１】
SP-72株の菌学的性質は以下の通りである。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）上で２８℃、１〜２週間生育したSP-72株の気菌糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。
▲１▼  胞子形成菌糸の分枝法および形態：らせん状(spiral)。
▲２▼  胞子の表面構造および大きさ：胞子は円ないし楕円形で大きさは約0.7〜1.1μｍであり、その表面構造はスパイニー(spiny)である。
【００１２】
（２）各種培地上における生育状態
下記表１に示す各種培地上における性状はそれぞれ２８℃で２週間培養後の観察結果である。
【００１３】
【表１】
0004017760.tif 000002
【００１４】
（３）生理的性質
▲１▼  ゼラチンの液化：陽性。
▲２▼  細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック(Staneck)らの方法(アプライド・マイクロバイオロジー第28巻第226頁(1974年)参照)により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
▲３▼  各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上）：
Ｌ−アラビノース    −
Ｄ−キシロース      −
Ｄ−グルコース      ＋
Ｄ−フラクトース    ＋
Ｌ−ラムノース      −
Ｄ−ガラクトース    ＋
シュークロース      −
ラフィノース        ＋
Ｄ−マンニトール    ＋
ｉ−イノシトール    ＋
サリシン            −
メリビオース        ＋
注）＋：同化する、−：同化しない。
▲４▼  メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地）：なし。
【００１５】
上記の菌学的性質、特に形態学的性質および細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、SP-72株はストレプトマイセス属に属すると判定される。バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)並びにＥ．Ｂ．シーリング(E. B. Shirling)及びＤ．ゴットリーブ(D. Gottlieb)のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Intern. J. Syst. Bacteriol.)第18巻第69頁-第189頁(1968年)、同第19巻第391頁-第512頁(1969年)及び同第22巻第265頁-第394頁(1972年)を参照して類縁菌種を検索したところ、菌学的性質が一致する種は見出されず、また、既知のストレプトマイセス属に属するポリリジン生産菌とも相違する性質を有している。以上から、本発明菌株をストレプトマイセス属に属する新菌株と認め、ストレプトマイセスｓｐ．SP-72株と命名した。このストレプトマイセスｓｐ．SP-72株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年５月１９日に寄託され、受託番号FERM P-16810が付与されている。
【００１６】
また、本発明菌株には、SP-72株と同等以上にポリリジンを生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の好ましい性質）を有する限り、SP-72株の変異株も包含される。SP-72株の変異株とは、SP-72株に変異処理をして誘導することのできるポリリジン生産性変異株またはSP-72株の自然突然変異株を意味する。
【００１７】
SP-72株の変異株は、SP-72株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やSP-72株の自然突然変異株を、ポリリジンを生産する性質などを指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジンなどの変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質などを指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。
【００１８】
＜２＞本発明製造法
本発明製造法は、本発明菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したポリリジンを採取することを特徴とする。本発明菌株は、好ましくは、SP-72株である。
【００１９】
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセリン、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセリンを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。
【００２０】
培養は、好気的条件下で振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜９が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。
【００２１】
このような培養により、培養液中にポリリジンが生成蓄積する。
培養液中に生成蓄積したポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法によりポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、さらにカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することによりポリリジンが得られる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
【００２３】
【実施例１】
ポリリジン生産菌の取得
(1) ポリリジン生産菌のスクリーニング
(a) 土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（10ml）に縣濁し、30℃で振とう（200rpmで10分間）、静置（30分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。この培地を28℃で１〜２週間培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
【００２４】
(b) ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（30℃、１〜３日）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、30℃で２日間振とう培養した。
【００２５】
(c) ポリリジンの検出
分離・取得株を生産培地（培地４）で培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ポリリジンの検出を行った。ポリリジンの検出はイツアキ(Itzhaki)（アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)第50巻第569頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液0.5 mlと１mMメチルオレンジ及び50 mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0)の水溶液２mlとを混合し、室温で30分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（470nm）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジン量を求めた。
【００２６】
上記培地１〜４の組成を下記表２〜５に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。
【００２７】
【表２】
表２
培地１  放線菌分離用培地（Glycerol-Czapek培地）
グリセロール       0.3％
NaNO3              0.2％
K2HPO4（pH 7.0）   0.1％
KCl                0.05％
MgSO4・7H2O        0.05％
FeSO4・7H2O        0.001％
寒天               1.5％
シクロヘキシミド   50μg/ml
ナイスタチン       50μg/ml
【００２８】
【表３】
表３
培地２  酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）
酵母エキス         0.4％
麦芽エキス         1.0％
グルコース         0.4％
寒天             1.5％
ｐＨ  7.2
【００２９】
【表４】
表４
培地３  生育培地
グリセロール              2.0％
酵母エキス                0.5％
MgSO4・7H2O               0.05％
KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.8）  1/50Ｍ
【００３０】
【表５】
表５
培地４  生産培地
グリセロール             2.0％
クエン酸・H2O（pH 4.5）  2.0％
（NH4)2SO4                1.0％
L-リジン・HCl            0.2％
【００３１】
上記のスクリーニング方法により、ポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、滋賀県犬上郡多賀町の土壌より、ポリリジンを著量生産するポリリジン生産菌を分離・取得した。
【００３２】
(2) 取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態および生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
【００３３】
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。また、既知のポリリジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）No.346-D株（特公昭59-20359号公報記載）とはラフィノース及びメリビオースの資化性、メラニン色素（溶解性色素）の生産性などで区別されるなどの点から新規菌株と認められた。本菌株は、ストレプトマイセスｓｐ．SP-72株と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年５月１９日に寄託され、受託番号FERM P-16810が付与されている。
【００３４】
(3) SP-72株の生産物の確認
SP-72株を生産培地（培地４）で培養後、培養ろ液をメタノールで沈殿させ回収した（４０〜６０％画分）。次に回収したメタノール沈殿画分をゲルろ過カラム（Superdex 75pg）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってDABS（dimethylaminoazobenzenesulfonyl-）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
【００３５】
アミノ酸分析の結果、SP-72株の生産物はリジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
【００３６】
また、SP-72株の生産するポリリジンの分子量をSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって測定したところ、その分子量は約4000であった。さらに、SP-72株の生産するポリリジンは、ε−ポリアミド結合を加水分解するタンパク質分解酵素（Aspergillus oryzae由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解された。一方、α−ポリアミド結合したα−ポリリジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。
【００３７】
SP-72株の生産するポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるBacillus brevis(IFO 3331)及びグラム陰性細菌であるEscherichia coli K-12（IFO 3301）に対してStreptomyces albulus No.346-D株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。
【００３８】
【実施例２】
SP-72株のポリリジン生産性
SP-72株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で36時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４）に移し、坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液のポリリジン（ε−ＰＬ）濃度を前記の方法により測定した。また、pHも測定した。メラニン様色素（溶解性色素）が生産されていないことを確認した。
【００３９】
さらに、Streptomyces albulus IFO 14147株（特公昭59-20359記載のNo.346-D株と同じ）を用いて同様の操作を行い、SP-72株と比較した。
【００４０】
結果を図１に示す。６日間の培養では、Streptomyces albulus IFO 14147株は1.9g/lのポリリジンを生産したのに対して、SP-72株は3.6g/lと非常に良い生産性を示した。また、Streptomyces albulus IFO 14147株では6日以降さらに培養を続けると逆にポリリジンが分解されていくが、SP-72株ではポリリジンが分解されなかった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、ポリリジンの生産性の高い菌株が提供される。この菌株を用いるポリリジンの製造法によれば、ポリリジンを高収率で製造することができ、ポリリジンの生産コスト及び精製コストを従来に比べて引き下げることができる。特に、この菌株を用いた場合、長期間の培養におけるポリリジンの分解が認められず、工業的生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリリジンの生産曲線を示す。
【図１】
0004017760.tif 000003