(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相マトリックス；
前記固相マトリックスに共有結合され、開裂反応による開裂に対して感受性のある基質；および
前記基質に結合され、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含む第１のポリヌクレオチドであって、該コード配列は前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列との間に配置されている第１のポリヌクレオチド；
を含んでなり、前記基質がプロテアーゼによるタンパク質分解性開裂に対して感受性を有するポリペプチドであることを特徴とする、開裂反応をアッセイするための反応カセット。
【請求項２】
前記固相マトリックスを前記基質に共有結合する第１のリンカーおよび前記基質を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項１に記載の反応カセット。
【請求項３】
前記基質に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項１に記載の反応カセット。
【請求項４】
前記基質を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項２に記載の反応カセット。
【請求項５】
前記コード配列が該ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の反応カセット。
【請求項６】
固相開裂生成物および該固相開裂生成物とともに混合物を形成する可溶相開裂生成物を含んでなり、
前記固相開裂生成物は、固相マトリックスと、固相マトリックスに共有結合された基質の第１の開裂生成物とを含み、
前記可溶相開裂生成物は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された基質の第２の開裂生成物を含み、該第１のポリヌクレオチドは第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列とを分離しており、
前記第１および第２の開裂生成物が部分ポリペプチドであることを特徴とする、反応カセットからの開裂生成物の混合物。
【請求項７】
前記固相マトリックスを前記第１の開裂生成物に共有結合する第１のリンカーを含む前記固相開裂生成物、および前記第２の開裂生成物を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可溶相開裂生成物をさらに含んでなることを特徴とする請求項６に記載の反応カセットからの開裂生成物の混合物。
【請求項８】
前記基質の第２の開裂生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項６に記載の反応カセットからの開裂生成物の混合物。
【請求項９】
前記第２の開裂生成物を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項６に記載の反応カセットからの開裂生成物の混合物。
【請求項１０】
工程Ａ：試料と、開裂生成物の混合物を生成するための反応カセットとを混合すること、ここで前記開裂生成物の混合物は、潜在的に、固相マトリックスと、固相マトリックスに共有結合された基質の第１の開裂生成物とを含む固相開裂生成物；第１のポリヌクレオチドに共有結合された基質の第２の開裂生成物を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列とを分離している、可溶相開裂生成物；および開裂されていない反応カセット；を含み、前記第１および第２の開裂生成物が部分ポリペプチドであり、
工程Ｂ：固相開裂生成物および開裂されていない反応カセットから可溶相開裂生成物を分離かつ単離すること、
工程Ｃ：前記工程Ｂにおいて、分離かつ単離された可溶相開裂生成物のポリヌクレオチドのコード配列をＰＣＲを用いて増幅すること、それから
工程Ｄ：前記工程Ｃにおいて増幅されたコード配列を検出すること、
以上の工程を含んでなることを特徴とする、試料内の開裂剤を検出するための方法。
【請求項１１】
前記工程Ｄの後で、前記工程Ｄでの増幅されたコード配列の検出を、開裂剤の存在と関連づける工程Ｅをさらに含んでなることを特徴とする請求項１０に記載の試料内の開裂剤を検出するための方法。
【請求項１２】
前記開裂剤がプロテアーゼであり、そして前記工程Ａにおいて、反応カセット内に含まれた基質がプロテアーゼによる開裂に対して感受性のあるポリペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の試料内の開裂剤を検出するための方法。
【請求項１３】
固相連結反応成分および該固相連結反応成分とともに混合物を形成する可溶相連結反応成分を含んでなり、前記固相連結反応成分は、固相マトリックスと、該固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体とを含み、前記可溶相連結反応成分は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された第２の連結反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列との間に配置され、さらに前記第１の連結反応用反応体と第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオドの断片であり、前記固相連結反応成分を前記可溶相連結反応成分に結合させ、そして連結反応カセットを形成するように連結可能であることを特徴とする、連結反応をアッセイするための連結反応カセットを製造する連結されていない反応体の混合物。
【請求項１４】
前記固相マトリックスを前記第１の連結反応用反応体に共有結合する第１のリンカーを含む前記固相連結反応成分、および前記第２の連結反応用反応体を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可溶相連結反応成分をさらに含んでなることを特徴とする請求項１３に記載の連結反応成分の混合物。
【請求項１５】
前記第１の連結反応用反応体と第２の連結反応用反応体の連結によって生成する連結反応生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項１３に記載の連結反応成分の混合物。
【請求項１６】
前記第２の連結反応用反応体を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項１３に記載の連結反応成分の混合物。
【請求項１７】
固相マトリックス；
前記固相マトリックスに共有結合された連結反応生成物；および
前記連結反応生成物に結合され、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列とを分離している、第１のポリヌクレオチド；
を含み、前記連結反応生成物が第１の連結反応用反応体と第２の連結反応用反応体の連結によって生成することを特徴とする、連結反応をアッセイするための連結反応カセット。
【請求項１８】
前記固相マトリックスを前記連結反応生成物に共有結合する第１のリンカーおよび前記連結反応生成物を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項１９】
前記連結反応生成物がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項２０】
前記固相マトリックスを前記連結反応生成物に共有結合する第１のリンカーおよび前記連結反応生成物を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーをさらに含んでなり、そして前記連結反応生成物がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項２１】
前記連結反応生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項２２】
前記連結反応生成物を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項２３】
前記連結反応生成物がリガーゼによる連結反応に対して感受性を有するポリヌクレオチドであり、そして前記コード配列がオリゴヌクレオチドをコードすることを特徴とする請求項１７に記載の連結反応カセット。
【請求項２４】
連結剤を連結反応成分の混合物とインキュベートすることによって製造される連結反応カセットであって、連結されていない反応体の混合物は、固相連結反応成分および該固相連結反応成分とともに混合物を形成する可溶相連結反応成分を含んでなり、前記固相連結反応成分は、固相マトリックスと、固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体とを含み、前記可溶相連結反応成分は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された第２の連結反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列との間に配置され、前記前記第１の連結反応用反応体と第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオチドの断片であり、かつ、前記固相連結反応成分を前記可溶相連結反応成分に結合させ、そして連結反応カセットを形成するように連結可能であり、さらに前記連結剤は、前記第１および第２の連結反応用反応体に対して連結反応活性を有することを特徴とする、連結反応カセット。
【請求項２５】
前記第１および第２の連結反応用反応体が連結可能なオリゴヌクレオチドであり、そして前記連結剤がヌクレオチドリガーゼであることを特徴とする請求項２４に記載の連結反応カセット。
【請求項２６】
工程Ａ：試料と、連結反応カセットを製造するための連結反応成分の混合物とを混合すること、ここで前記連結反応成分の混合物は、固相マトリックスと、該固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体とを含む固相連結反応成分；および第１のポリヌクレオチドに共有結合された第２の連結反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲプライマー配列と前記第２のＰＣＲプライマー配列との間に配置される可溶相連結反応成分；を含み、前記第１の連結反応用反応体と第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオチドの断片であり、
工程Ｂ；可溶相連結反応成分の連結されていない部分から、前記工程Ａで形成された連結反応カセットを固相連結反応成分の連結されていない部分とともに分離かつ単離すること、
工程Ｃ：前記工程Ｂにおいて、分離かつ単離された連結反応カセットのポリヌクレオチドのコード配列をＰＣＲを用いて増幅すること、それから
工程Ｄ：前記工程Ｃにおいて増幅されたコード配列を検出すること、
以上の工程を含んでなることを特徴とする、試料内の連結剤を検出するための方法。
【請求項２７】
前記工程Ｄの後で、工程Ｄでの増幅されたコード配列の検出を、連結剤の存在と関連づける工程Ｅをさらに含んでなることを特徴とする請求項２６に記載の試料内の連結剤を検出するための方法。
【請求項２８】
前記連結剤がリガーゼであり、そして前記工程Ａにおいて、連結反応カセット内に含まれた連結反応生成物がリガーゼによる連結反応に対して感受性のあるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６に記載の試料内の連結剤を検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、開裂（又は切断）、連結反応およびそれらを促進する触媒性分子の活性を検出（アッセイ）するための方法並びに試薬に関する。さらに詳しくは、本発明は、固相マトリックスと、基質を同定するようにコードされ、そしてこのようなコード配列を増幅するためのポリメリゼーション・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）プライマー配列を含むヌクレオチド鎖との両方に共有結合された基質を用いるアッセイに関する。
政府の権利
本発明は、一部、国立衛生研究院（ザ  ナショナル  インスティチュート  オブ  ヘルス）からの助成金（ＧＭ４８３５１）に基づく政府の支援によってなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
背景技術
開裂、連結反応は、反応生成物の出現あるいは基質の消滅のいずれかをモニターすることによってアッセイできる。例えば、タンパク質またはペプチドの分解は、開裂生成物の出現を追跡することによってモニターできる。開裂生成物は、ゲル電気泳動またはクロマト分離によって、基質から分離され、紫外線吸収または比色アッセイによりモニターされる。同様に、ポリヌクレオチド連結反応も連結反応生成物の出現を追跡することによってモニターできる。
開裂または連結反応の活性が低ければ、反応生成物を検出するためには検出シグナルを増幅することが要求される。例えば、放射性同位体で標識された基質が合成され、結果得られる反応生成物をラジオイムノアッセイによって検出される。別法として、基質が比色反応を触媒する酵素にコンジュゲートされているならば、結果得られる反応生成物は、エンザイムイムノアッセイを用いて検出できる。高感度のエンザイムイムノアッセイが開発されてきた。感度の限界で用いられた時、反応生成物の存在に対応して、エンザイムイムノアッセイによって発生されるシグナルは、背景レベルのシグナルと同程度となる。
触媒性抗体の分野では、触媒活性な抗体を同定する目的で抗体ライブラリーが日常的にスクリーンされる。有用な触媒性抗体を作り出すには２つの制限がある。すなわち、第１は、基質又は反応中間体の類似体である産生免疫源を設計し、そしてこれを用いて抗体ライブラリーを作成することである。第２は、結果得られる抗体を所望の触媒活性を求めてスクリーンすることである。要するに、制限は、表示と検出である。表示の問題は、抗体の多様性を、認識および複製機能が単一の物に結びつけられ、単なる結合の出来具合でモニターされるファージ中の組合せライブラリーに変換することによって軽減することができる。しかしながら、触媒性抗体分子の少数のみを示すファージ粒子をスクリーンするには、高感度のアッセイ方法が要求される。
このような例では、示される触媒活性は、背景レベルの活性よりもほんのわずかだけ高いかもしれない。
開裂、連結反応をアッセイするための従来技術での方法には、しばしば少量の低い活性の抗体を同定するのに必要な感度が欠如している。幾つかの場合には、低いレベルの触媒活性を有する触媒性抗体が、もしもそれがこのような触媒活性を有すると確認された唯一の抗体であるか、そして／または、それがより高いレベルの触媒活性を有する抗体を作るための「進化論的計画」に用いられるならば有用でありうる。従って、抗体ライブラリーをスクリーンするために採用されるアッセイの感度は、有用な抗体を同定することに関して、制限的な因子となりうる。
アッセイの容易さ、または困難性も、これらのアッセイを実行する者の意欲を制限するかもしれない。
反応生成物、または基質に対する抗体を得ることができる場合には、イムノ−ＰＣＲアッセイが製作され、そして検出系として採用される。Ｔ．Ｓａｎｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）：２５８巻，１２０−１２２頁。イムノーＰＣＲアッセイは、酵素−抗体コンジュゲートがＰＣＲで増幅可能なポリヌクレオチド鎖にコンジュゲートされた抗体によって置換されている以外は、エンザイムイムノアッセイと同様である。イムノ−ＰＣＲアッセイは、高感度である。しかしながら、非常に低い抗原のレベルでは、イムノ−ＰＣＲアッセイは、抗体−ポリヌクレオチドコンジュゲートの非特異的な結合によって制限される。
必要なのは、開裂または連結反応を検出するための高感度のアッセイである。そのようなアッセイは、抗体コンジュゲートを採用すべきでなく、そして可能な限り低い背景レベルのシグナルを有するべきである。アッセイは、労働効率がよく、いかなる開裂反応または連結反応をアッセイするのに適応できるべきである。
発明の開示
本発明は、開裂反応または連結反応を検出するために使用可能なコードされた反応カセット並びにこのようなカセットを用いるアッセイに関する。カセットは、いかなる開裂反応または連結反応をアッセイする目的でも製作されうる。開裂反応または連結反応は、触媒されるか、あるいは触媒の恩恵なしに瞬間的である。
反応カセットは、化学結合が形成および開裂されたことを高感度で検出するために設計される。この系は、抗体および他の新規な触媒を探索するにあたって用いられる必携の考案物として採用されうる。また、カセットは、診断薬の設計において、重要な臨床的応用を有する。完全にコードされた様式で、この方法は、化学的事象を検出、およびデコード（解き明かす）することが共に可能である。
本発明のアッセイは、もともと抗体触媒の分野で応用されるように開発された。しかしながら、医学分野での診断アッセイに重要なものを含めて、いかなる合成反応または酵素反応をアッセイするためにも採用できるかもしれない。単一の反応を探索するためにカセットを用いる時は、一つのＤＮＡ配列のみが必要である。しかしながら、完全にコードされた様式では、各々の基質に特異的なポリヌクレオチド配列を用いることによって複数の基質を同時に調べることができる。起った反応の性質は、ＰＣＲ反応かＡ．Ｄ．Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ（ＴＩＢＴＥＣＨ，１２巻，２７−３２頁，１９９４年）の方法に従ってポリヌクレオチドのクローニングかのいずれかの後で、ポリヌクレオチドの配列によって簡単に決定できる。要するに、コードされた基質の組み合せライブラリーを作り、反応特異性について知ることができる。触媒の組み合せライブラリーを基質の組み合せライブラリーに対してスクリーンして、単一の操作で新しい触媒を見つけ出し、それらの基質特異性を微調整する系を設計できる。最後に、コードされたカセットを製作するための開示された方法は、新しい触媒を探しているいかなる実験の座右の備えとして、基質カセットが構築される操作手順に適用できる。これは、研究者にとって反応生成物が先行技術の方法によって容易にアッセイできるかどうかに無関係な実験を計画することを可能にする。このようにして、酵素を探そうと考える時はいつも、第１の段階は反応性を検出するコードされた反応カセットを製作することである。
さらに詳しくは、本発明は、開裂反応をアッセイするためのコードされた反応カセットに関する。反応カセットは、固相マトリックスに共有結合された基質を含み、ここで基質は開裂反応による開裂に対して感受性のある型のものである。基質に結合されているのは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含む第１のポリヌクレオチドである。コード配列は、第１のＰＣＲ配列と第２のＰＣＲ配列の間に位置する。好適な実施の形態ではコードされた反応カセットが第１および第２のリンカーを含んでもよい。第１のリンカーは、固相マトリックスを基質へ共有結合する。第２のリンカーは、基質を第１のポリヌクレオチドに共有結合する。ペプチドが好適な基質である。しかしながら、いかなる開裂されうる基質も使用できる。
別の実施の形態では、コードされた反応カセットは、シグナルをさらに増幅するための、基質に結合された１つ以上の付加的なポリヌクレオチドを含んでもよい。これらの付加的なポリヌクレオチドは、また同じ第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含んでおり、そして付加的なリンカーを介して基質に結合されている。
また、本発明は、開裂剤に晒されたコードされた反応カセットからの開裂生成物の混合物にも関する。この混合物は、固相開裂生成物および可溶相開裂生成物を含む。固相開裂生成物は、固相マトリックスに共有結合された基質の第１の開裂生成物を含む。可溶相開裂生成物は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された基質の第２の開裂生成物を含む。また、本発明は、試料内の開裂剤を検出する方法にも関する。この方法は、下記の工程を含んでなる。第１の工程に於いては、試料が、基質の開裂を促進する反応条件下で、コードされた反応カセットと混合され、開裂生成物を生成する。もし試料が開裂活性を有するならば、開裂生成物、すなわち固相開裂生成物および可溶相生成物が発生するであろう。第２の工程に於いて、固相開裂生成物および開裂されていないコードされた反応カセットから可溶相開裂生成物が分離かつ単離される。
第３の工程に於いては、第２の工程で単離された固相開裂生成物のポリヌクレオチドのコード配列がポリメリゼーション・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）反応を用いて増幅される。第４の工程に於いては、増幅されたコード配列が検出される。そして、選択できる第５の工程では、第４の工程で得られたシグナルが定量的な結果を得るために既知の基質および／または開裂剤と関連づけられる。
本発明の別の側面は、連結反応をアッセイするためのコードされた連結反応カセットを製造する連結されていない反応体の混合物に関する。その混合物は、固相連結反応成分および可溶相連結反応成分を含む。固相連結反応成分は、固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体を含む。可溶相連結反応成分は、第１のポリヌクレオチドと共有結合され第２の連結反応用反応体を含む。前記のように、第１のポリヌクレオチドは、第２のＰＣＲプライマー配列と第２のＰＣＲプライマー配列との間に位置するコード配列を含む。第１および第２の連結反応用反応体は、連結剤の存在下、コードされた連結反応カセットを形成できるように固相および可溶相連結反応成分を結合することが可能である。好適な実施の形態では、第１および第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオチドの断片である。しかしながら、連結可能な分子のいかなる対をも使用することができる。
コードされた連結反応カセットは、連結反応生成物が固相マトリックスを第１のポリヌクレオチドから分離すること以外は、コードされた反応カセットと同様である。しかしながら、コードされた反応カセットと異なって、コードされた連結反応カセットは、開裂剤による開裂に対して感受性がある必要はない。好適な連結剤は、第１および第２の連結反応用反応体に関して、連結反応活性を有する。さらに詳しくは、好適な連結反応剤は、ポリヌクレオチドリガーゼであり、そして好適な第１および第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、オリゴヌクレオチド試料内のヌクレオチド連結剤を検出するための方法にも関する。本方法は幾つかの工程を含む。第１の工程に於いては、試料が連結反応成分の混合物と一緒にされる。その結果得られる混合物は、コードされた連結反応カセットを製造するためにインキュベートされる。第２の工程に於いては、上記のようにして形成された、コードされた連結反応カセットが、可溶相連結反応成分の連結されていない部分から、固相連結反応成分の連結されていない部分とともに分離かつ単離される。コードされた連結反応カセットのポリヌクレオチドのコード配列は、それからＰＣＲを用いて増幅され、検出され、そして連結剤の存在と関連づけられる。ポリヌクレオチドリガーゼが好適な連結剤である。この場合、コードされた連結反応カセット内に含まれた連結反応生成物は、リガーゼによる連結反応に対して感受性のあるポリヌクレオチドである。
コードされた反応カセットは、増幅そしてデコードされうるポリヌクレオチドの遊離（結合開裂の場合）、または捕捉（結合形成の場合）を介して働く。合成のための化学的方法およびこの考案物の組み立ては、その感度および実用性に影響を及ぼすパラメーターの詳しい特定および最適化とともに開示される。結合開裂の検出様式では、α−キモトリプシンを代表的な触媒として用いて、反応カセットの特異性が配列中、ただ一つのアミノ酸のみが異なるペプチド基質（Ａｌａ2−Ｔｙｒ−Ａｌａ2対Ａｌａ2−Ｐｈｅ−Ａｌａ2）についての選択的な認識および開裂を通して実証される。カセット感度（０．１−１ｐｍｏｌｅ，５−５０ｎＭ）は、０．０１ｍｇ（１ビーズ）、または１０ｍｇ（１００００ビーズ）を使用するかどうかに関わらず同じであるが、α−キモトリプシンの濃度に対して依存性がある。しかし、この酵素の量は、もし濃度が５ｎＭ以上に保たれるならば、２４００分子にまで少なく減少できる。結合形成の検出様式では、α−キモトリプシンで触媒されるペプチド結合形成が邪魔されるという理由から可能ではなかった。一方、化学的に触媒される結合形成（アルデヒドの還元アミノ化反応）は、実施することができた。そして、反応カセットの原理の第２の部分、すなわち化学結合の形成の検出を実証するため原型反応として用いた。
【図面の簡単な説明】
図１は反応カセットの原理を例示する。
図２は反応カセットの組立てに使用するスペーサーを例示する。
図３はスペーサーIII−VIIを製造するための合成計画を例示する。示された合成段階は以下のとおりである。
（ａ）Ｋ2ＣＯ3，ＤＭＦ，９０−１００℃；（ｂ）Ｃｓ2ＣＯ3，ＫＩ，ＤＭＦ，９０−１００℃；（ｃ）Ｃｓ2ＣＯ3，ｎ−Ｂｕ4ＮＩ，ＤＭＦ，８５℃；（ｄ）Ａｇ2Ｏ，ｎ−Ｂｕ4ＮＩ又はＫＩ，ＴＨＦ，および又は音波処理なし，２０℃；（ｅ）ＮａＨ，ＴＨＦ，２０℃；（ｆ）Ｎａ，ＴＨＦ，２０℃；（ｇ）ＤＨＰ，ＭｅＯＨ，濃塩酸１滴；（ｈ）ＤＥＡＤ，ＰＰｈ3，フタルアミド，ＴＨＦ，２０℃；（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ，ピリジン，２０℃；（ｊ）（ＮＨ2）2，エタノール，８０℃；（ｋ）ＴｓＣｌ，ピリジン，２０℃；（ｌ）Ｎａ，２３；（ｍ）ＰＤＣ，ＤＭＦ，２０℃；（ｎ）ＦｍｏｃＣｌ，Ｎａ2ＣＯ3，ジオキサン−Ｈ2Ｏ，０℃  ｔｏ  ２０℃；（ｏ）（Ｂｏｃ）2Ｏ，Ｅｔ3Ｎ，ＤＭＦ，０℃  ｔｏ  ２０℃．
図４は、結合開裂又は形成の検出に於いて研究された基質を例示する。
図５は、α−キモトリプシンで触媒された結合開裂の検出のための反応カセットの合成ならびに用途を例示する。最上部の反応は、スペーサVI又はVII、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ2，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ2）およびスペーサーＩとＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）マトリックス上でのＳＰＰＳ（溶液相ペプチド合成）の使用を示す。次の反応は、スペーサーVIIIの取着、それに続いてβ−シアノエチルホスホラミダイトを用いるＤＮＡ合成によって、完全に保護された反応カセットを提供し、それが濃アンモニアおよびＴＢＡＦさらに続く多量の洗浄によって順次脱保護基化されることを示す。それからカセットは、α−キモトリプシンに晒され、続いてＰＣＲ増幅およびアッセイにかけられ、結合開裂検出にそのまま使用可能となる。
図６は、酵素的および化学的に触媒された結合形成の検出のための反応カセットの東側部分（Ｓ９，Ｓ１０）の合成を例示する。
図７は、酵素で触媒された結合形成の検出のための合成的アプローチを示す。即ち、西側部分（商業的に入手できる化合物２４又は２５から誘導されるＣ３４又はＣ３５）を東側部分（Ｓ９−合成を図６に示す）にカップリングする。それからカセットは、α−キモトリプシンに晒され、続いて固体支持体上のＰＣＲ増幅および蛍光アッセイによる検出にかけられ、酵素で触媒された結合形成にそのまま使用可能となる。
図８は、化学的に触媒された結合形成の検出のための合成アプローチを示す。即ち、西側部分（Ｃ３６）を東側部分（Ｓ１０）に６０％ＤＭＳＯ／０．１ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ１０）中でカップリングする。混合物は、シアノホウ水素化ナトリウムを用いて還元され、続いて多量に洗浄、そしてそれから固体支持体上のＰＣＲ増幅並びに蛍光アッセイによる検出にかけられる。
図９は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を改善するために研究されたテンプレートを例示する。
図１０は、第１世代の反応カセット（Ｃ１−Ｃ６）の一般的概要を例示する。
図１１は、第２世代の反応カセット（Ｃ７−Ｃ２５）の一般的概要を例示する。
図１２は、結合開裂の検出を例示する。反応カセットを含む媒質からの試料のＰＣＲ生成物は、α−キモトリプシンの存在、不存在とともに各レーンの上部に示されている。レーン１、３、５および７は、α−キモトリプシン（５ｎＭ）、およびカセットＣ7、Ｃ10、Ｃ31、そしてＣ32をそれぞれ含む媒質からの試料のＰＣＲ生成物に対応する。レーン２、４、６および８は、それぞれα−キモトリプシンなしの同一の実験に対応する。正のコントロール（レーン９）は、ＤＮＡ４５ｍｅｒの標準品のＰＣＲ生成物に対応する。負のコントロール（レーン１０）は、ＤＮＡ４５ｍｅｒなしの同一の実験に対応する。ＴＧ−ＮＨ2およびＮＳＫＤ−ＮＨ2は、それぞれアミノ末端基を有する官能基化されていないＴｅｎｔａＧｅｌおよびＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ樹脂に対応する。
図１３は、第３世代の反応カセット（Ｃ２６−Ｃ３２）の一般的概要を例示する。
図１４は、結合形成の検出を例示する。官能基化された、又はされていない樹脂（ＮＳＫＤ−VI2−ＮＨ2，ＴＧ−ＮＨ2，Ｃ３４，Ｃ３５，又はＣ３６）を含み、さらに官能基化されたポリヌクレオチド（Ｓ９，Ｓ１０）を含むか含まないか、そしてα−キモトリプシンを含むか含まない媒質からの１つのビーズのＰＣＲ生成物をそれぞれのレーンの上部に示す。正および負のコントロールも、また図１２中にある。ＫＳＫＤ−VI2−ＮＨ2は、２つのスペーサVIおよびアミノ末端基を有するＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ樹脂に対応し、ＴＧ−ＮＨ2は、アミノ末端基を有するＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に対応する。
図１５は、カセットの組み立てに用いられるスペーサーユニット（Ｌ−Ｉ〜Ｌ−IV）の化学構造を示す。
図１６は、示した蛋白質分解酵素に関するペプチド反応カセットの反応特異性を示す。
図１７は、図１６のペプチド反応カセットの反応感度を時間の関数として示す。
発明を実施するための最良の形態
カセットの設計上の特徴
本発明は、２つの先行技術の方法を組み合わせたものである。
即ち、その第１は、固体支持体上でポリマーを合成する手法であり、そして第２は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）である。全体のアプローチを図１に例示する。
反応カセットの中心的な操作上の特徴は、２つのプライマーを含むポリヌクレオチドの遊離（開裂の場合）または捕捉（結合形成の場合）である（図１）。このように、適当に官能基化された固体支持体（図１）が基質の接合点で反応カセットを選択的に開裂できる触媒、または触媒のライブラリーに晒される時、一本鎖ＤＮＡ（ポリヌクレオチド）が放出されるであろうし、そしてそれはＰＣＲ法で増幅できる。さらに、ポリヌクレオチドの配列は、基質の性質を交換するように選択されることができ、それによってコードする基質のライブラリーが設計できる。このような基質ライブラリーが触媒のライブラリーに晒される時、開裂されたポリヌクレオチドはコードし、そしてかくしてどの基質配列が開裂されたかを同定するので、触媒のみならず基質もまた同定できる。前記の方法に加えて、本発明の反応カセット手法は、逆の経路を経て結合形成の場合を追跡することも可能にする（図１）。この最初の報告で、本発明者らは、酵素で触媒された結合の開裂の研究について本方法論を応用することを示す。
３世代の反応カセットを以下に開示する。第１世代は、制御された（サイズを調整された）細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体に基づく。第２世代は、ポリエチレングリコールおよびポリスチレンの７０重量％の共重合体（ＴｅｎｔａＧｅｌ）に基づく。第３世代は、複合マトリックス（ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ）に基づく。
マトリックス支持体
反応カセットの理想的な支持体は、カセットを組み立てるのに用いられる合成手法（ペプチドおよびＤＮＡ合成）と機械的および化学的に適合性がある一方、用いられる触媒（酵素、ａｂｚｙｍｅ等）に接近できうる。
例えば、ポリスチレンを基剤とするマトリックスは、酵素触媒反応に使用するにはあまりにも疎水性でありすぎるが、一方ＣＰＧは、化学的および機械的安定性に乏しいため不適当であった（ポリヌクレオチド−基質コンジュゲートの遊離は、望ましくない背景反応をもたらす）。ＴｅｎｔａＧｅｌは、機械的に安定であり、そしてペプチド基質およびＤＮＡ合成と化学的に適合性があることが分かった。しかしながら、このマトリックスは、好適ではない。何故ならば、あまりにも疎水的な性質をもち、酵素に最適な接近性を許容しないからである。この理由から、第３世代のカセットが設計された。それを以下に開示する。ケイソウ土無機粒子のマクロ細孔構造内に保持されたポリジメチルアクリルアミドゲルから誘導される複合マトリックスであるＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ樹脂が使用された。このマトリックスはより疎水性であり、機械的および化学的に安定であり、そして生物触媒により適合する。
Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｉ．；Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．；Ａｕｚａｎｎｅａｕ，Ｆ−Ｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４，９１，３３１４を参照。
スペーサー
スペーサーは、好適にはヘテロ二官能基性であり、化学的に安定であり、かつ基質とＤＮＡ合成の両方に適合性がある。一方の端は、基質部分に容易に取り付け可能であるべきであり、そして他方の端は、ＤＮＡ合成のためのヒドロキシル官能基を備えるべきである。
カセット上の第１のスペーサーは、マトリックスと基質の間に位置する。ところが第２のスペーサーは、基質とポリヌクレオチド部分の間に位置する（図１）。両方のスペーサーの長さは、本方法が成功するために極めて重要である。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．；Ｊａｎｄａ，Ｄ．Ｋ．；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，９８１２を参照。ＣＰＧおよびＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤにとって、マトリックス核に近接することに由来するかもしれない障害を避けるためには、樹脂と基質の間に少なくとも３０−４０Åの距離があることが好適である。
これはスペーサーIIの長さの２倍に相当する距離である。ＴｅｎｔａＧｅｌは、既に第１のスペーサーとして働く長いポリエチレングリコール鎖を備える。第２のスペーサー（基質とポリヌクレオチドの間）の長さは、調べた触媒反応についてはあまり重要でないと開示されているが、ＤＮＡ合成（下記参照）については重要であった。
カセットを製作するためのスペーサーの異なった型および組み合せは、図２に開示されている。スペーサーＩ−VIIは、合成されたが、VIIIおよびIX（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、そしてＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、商業的に入手できる。スペーサーＩおよびIIは、文献の手順に従って合成され、本発明の初期の設計（第１および第２世代のカセット）に導入された。スペーサーＩの合成は、Ｓｃｈａｌｌｅｒらに開示されている。Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｈ．；Ｗｅｉｍａｎｎ．Ｇ．；Ｌｅｒｃｈ，Ｂ．；Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３８２１を参照。スペーサーIIの合成は、Ｎｉｅｌｓｏｎらに開示されている。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９４，６，３６１を参照。スペーサーＩは最短のスペーサーである。
多くの場合、触媒と基質間の最適の反応性のためにはあまりにも、それはきつい。好適な用途は、他のスペーサーと配列され用いられることにある。スペーサーIIは、ＳＰＰＳ（Ｂｏｃ−アミノ酸化学）およびＤＮＡ合成の夫々で要求される強酸そして強塩基の条件下、アセトキシ結合のところで化学的に不安定であることが分かった。Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４を参照。
スペーサーIIIおよびIVは、自由なアミノ基を有し、そして脱離基又はカルボキシ末端を備える基質に取り付けることができる。スペーサーＶ−VIIが最も長い。これらはペプチド基質とアミド結合を形成することができ、スペーサーＩ、IIIおよびIVとは対照的に２つ以上の配列に取り付けることができる。スペーサーＶ−VIIは、スペーサーＩ、III又はIVと組み合せて用いられた。これらのスペーサーの相互変換は、生じた末端水酸基のところでＤＮＡの合成を可能にする。スペーサーVIIIは基質とＤＮＡ合成機上のポリヌクレオチドの間に自動的に導入することができるが、これはＩ、III又はIVがすでにくっつけられているか又は基質が水酸基型の官能基を有することを前提とする。定量的にＶのアミノ末端を遊離するために要求される脱保護基工程（ヒドラジン／エタノール（１／１））は、樹脂から基質を部分的に開裂することが分かった。
低ヒドラジン濃度（０．２Ｍ）では、反応は遅く（２４時間）そして不完全（８０−９０％）である。Ｂｅｒｔｏｚｚｙ，Ｃ．Ｒ．：Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，４３２６を参照。
このスペーサーは、好適には、より安定な基質に採用される。スペーサーVIII−Ｘは、結合形成の検出についての研究用に、オリゴヌクレオチドを３′末端で誘導体化（ＤＮＡ合成機でそのまま使用可能）するのに用いた。III−VIII合成の合成計画は、図３に示されている。
基質
反応カセットを実行するための代表的な触媒としてα−キモトリプシンを採用した。この酵素は、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンのような芳香族、疎水性アミノ酸のＣ末端でアミド結合を開裂することが知られている。
Ｈｅｓｓ，Ｇ．Ｐ．Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（酵素），Ｂｏｙｅｒ  Ｐ．Ｄ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（アカデミック  プレス）；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１，２１３−２４８頁を参照。この酵素はチロシンメチルエステルとアラニンの１級アミン間にペプチド結合の形成を触媒することも知られている。Ｌａｎｅ，Ｊ．Ｗ．；Ｈｏｎｇ，Ｘ；Ｓｃｈｗａｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，２０７８を参照。基質Ｓ１−Ｓ７（図４）は、標準的なＢｏｃおよび／又はＦｍｏｃ方法に従って、組み立てられた。Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（実際の手引），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード大学出版）：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９を参照。
ペプチドＳ１およびＳ２は、第１世代のカセットに用いられたが、一方Ｓ３−Ｓ７は、第２世代および第３世代のカセットに用いられた。
同様なペプチドに対して得られたデータから見積ると、α−キモトリプシンは、基質Ｓ３よりもＳ４を〜１０倍、そして基質Ｓ１よりも〜１０3倍効率よく開裂する。例えば、Ｂａｕｍａｎｎ．Ｗ．Ｋ．；Ｂｉｚｚｏｚｅｒｏ，Ｓ．Ａ．；Ｄｕｔｌｅｒ，Ｈ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３，３９，３８１；そしてＦｉｓｈｅｒ，Ｇ．；Ｂａｎｇ，Ｈ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９８４，７９１，８７を参照。この特徴は、本発明のカセット系内でα−キモトリプシンの特異性をプローブするのに用いることができる。ペプチドＳ４は、α−キモトリプシンの最適の基質の１つである。従って、この基質がカセット系の感度の好適な下限を例示するために、ここで採用された。ペプチドＳ７は、α−キモトリプシンのＰ４、Ｐ５、Ｐ４′およびＰ５′位での相互作用をプローブするために合成された。ペプチドＳ８は標準的な溶液相ペプチド化学を用いて５段階（図７）で合成され（副物質）、そして酵素で触媒された結合形成の検出に用いられた。カセットを組み立てるのに用いた合成手順は、ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤを固体支持体として、スペーサーＩ、VI（又はVII）およびVIIIを用いて図５に例示されている。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ217およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ2）が合成の組み立てブロックとして用いられたので、この合成スキームは迅速かつ簡単である。Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，７６０５を参照。第１および第２のスペーサーは、標準的ＳＰＰＳに従って取り付けられる。スペーサーVIIIはポリヌクレオチドを組み立てるのに用いたのと同一の手法を採用してＤＮＡ合成機上で、自動的に導入される。実際、このスペーサーは、１つ以上のコピーの配列で取り付けられる。ＤＮＡ合成が完了すると、ポリヌクレオチドは、脱保護基化され、続いてＴＨＦ中、１Ｍ  ＴＢＡＦと１５分間インキュベーションによってチロシンのシリコン保護基が除去される。この工程の後、カセットは、そのまま結合の開裂検出モードに使用可能となる。
結合形成のために樹脂に取り付けられる基質のユニットは、個別に合成される。図６は、反応カセットの東側部分、（即ちポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲート（Ｓ９）および５′末端でアミノ官能基化されたポリヌクレオチド（Ｓ１０））の合成を示す。ＳＰＰＳの条件に安定なメチルホスホラミダイト（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）モノマーを用いる常法のＤＮＡ合成手順に従って、Ｓ９ユニットを合成した。Ｓ１０ユニットは、同様にして（同一モノマー）、あるいはより容易に脱保護基化されるエクスパダイト  β−シアノエチルホスホラミダイトモノマー（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリボア））を用いて、合成できる。
ＤＮＡ合成法
標準ＤＮＡ合成がＣＰＧ又はポリスチレン固体支持体を用いることにより改善された。ＣＰＧはより好ましくない化学的、機械的性質を有する（前記を参照）。ポリスチレン基材のマトリックスは、より好ましくない疎水性の特徴を有する。
ホスホラミダイト化学を用いる３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（アプライド  バイオシステム）ＤＮＡ合成機の標準的な１マイクロモル手法（方法Ａと名付ける）を以前に記載されたように第２世代のカセット用に修正した（方法Ｂと名付ける）。Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチド合成）：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（実際の手引き）：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０を参照。
ＣＰＧ、ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤおよびＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に適合させるために方法Ｂをさらに修正した（方法Ｃと名付ける）。実験の項を参照。表１は、ＣＰＧ（カセットＣ１），ＴｅｎｔａＧｅｌ（カセットＣ１０）およびＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ（カセットＣ２９）と、それぞれ方法Ａ−Ｃを用いる時の工程毎の平均収率（ＡＳＷＹ）そして全収率（ＯＡＹ）の改善を示す。
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ＤＮＡ合成の成功には、２つの因子が重要な役割を果たした。第１は基質とポリヌクレオチド間にあるスペーサーの長さであり、第２は樹脂のローディングである。一般的に、基質とポリヌクレオチド間のスペーサーが長いほど、そしてローディングが低ければ低いほどＤＮＡ合成のＡＳＷＹが良好な結果となる。表２−４を参照。例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ上で方法Ｂを用いると、ＡＳＷＹはＩ（Ｃ１０）について９６．９％、VI（又はVII）およびＩ（Ｃ２０）について９８．８％、そして２（VI）およびＩ（Ｃ２１）について９９．８％である。
同一の樹脂上で、Ｉそして方法Ｂを用いると、ローディングが１７２．１μｍｏｌｅ／ｇ（Ｃ１２）である時、ＤＮＡ合成は失敗する。ローディングが５９．９μｍｏｌｅ／ｇ（Ｃ１０）である時、ＤＮＡ合成はＡＳＷＹ９６．９％でうまくゆく。高いローディングでは、基質とポリヌクレオチドの間に長いスペーサーがあるかないかに関らず、合成は失敗する。
調べたすべての場合、濃アンモニアで脱保護基化した後でのＤＮＡ合成の収率は、カセットによって２４〜１００％の間で変化する。平均〜７０％であり、表３および表４の最後の欄を参照せよ。
基質部分がなければ、脱保護基反応は定量的である。濃アンモニアがＤＮＡ合成の前に、より少ない程度、マトリックスに影響を及ぼす事実（１０〜２０％ロス）を考慮すると、これらの結果は、ＤＮＡ合成の間、不安定な結合、分岐点等が生成され、これらが濃アンモニアとの処理で除かれるということを示唆する。この副反応の大きさは、しばしば１つのカセットから別のカセットで変わる。
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酵素で触媒された結合形成の検出のための反応カセットの東側部分を構築するのに利用した好適な合成戦略を図６に示す。このユニット（Ｓ９）は、ＤＮＡ合成するのにより安定なモノマーを用いることを要求する。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ2とのカップリング段階は、強い塩基（ＤＩＥＡ）の存在下、行われねばならない。このような条件下、通常のβ−シアノエチル保護基（結合開裂の検出に用いた）は、失われ、かくして望ましくない副反応をもたらす、メチルホスホラミダイトモノマーは、固有の安定性という結果からより適切であることが証明された。化学的に触媒された結合形成では、この制限はあてはまらない。そしてメチル又はβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーはＳ１０を合成するのに用いることができる（図６）。
ＰＣＲプロトコール
コードされた反応カセットの２つの重要な側面は、タッグの配列および長さである。タッグの長さについて、ＤＮＡ合成でＯＡＹがより良いためには出来る限り短かくあるべきである。さらに、それは高感度で特異的に増幅されねばならない。
幾つかのテンプレート（Ａ−Ｆ、図９）は、例えばｐＨ、〔ＭｇＣｌ2〕、〔プライマー〕、〔酵素〕、サイクルおよび温度等、様々なＰＣＲ条件下において特徴づけられた。テンプレートＡ−Ｆは、プライマーの配列およびＧ／Ｃ含量が異なる。これらの２つの因子は、テンプレートの３次構造およびミスプライミングに対して責任がある。テンプレート内の３次構造および自己相補的な配列を分析し、プライマーとコンピューターモデリング（ＤＮＡＳＩＳ，ＡｍｐｌｉｆｙおよびＯＬＩＧＯ）を用いて、効率よい増幅にはプライマー配列が必須の要素であることが決定された。
この理由は、携わるテンプレートが短かすぎて、ミスプライミングが容易に起こる低温度で増幅されうるからである。テンプレートＡ（第１および第２世代）、テンプレートＢ−ＥそしてテンプレートＦ（第３世代）を用いると、非特異的な増幅生成物を増加させることなしに、以前に報告されたＰＣＲ条件下、感度をテンプレートの１０-14モル以下に改善することはできなかった。
好適なモードでは、第３世代のカセットのためにＴａｑＳｔａｒｔ  ＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，クローンテック），Ａｍｐｌｉｗａｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，パーキンエルマー）およびＨｏｔｗａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，インビトロジェン）のようなＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ手法を用いる。Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐ．１９９１，１，１−４；およびＤ′Ａｑｕｉｌｌａ，Ｒ．；Ｂｅｃｈｔｅｌ，Ｌ．Ｊ．；Ｖｉｄｅｌｅｒ，Ｊ．Ａ．：Ｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｐ．；Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｃ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９１，１３，３７４９を参照。
後者の手法は好ましく、最良の結果をもたらす。その方法はサイクリング前に反応混合物に添加される、Ｍｇ2+を含むワックスに基づく。第１のサイクル前に、９４℃で３０秒間加熱すると、溶液中にＭｇ2+を遊離させ、Ｔａｑポリメラーゼを進行させることを許容する。このようにして、低温度で起こりうるミスプライミングは、Ｍｇ2+が高温でのみ遊離されるので増幅されえない。低密度のため溶融したワックスは水層の表面にとどまり、これはまた溶液の蒸発を防ぐ働きもする。テンプレートＥでは、感度を１０-17モルに改善できたが、収量および感度は悪かった（バンドが弱く、そして非特異的生成物が所望の生成物と共に泳動する）。テンプレートＦは、Ｈｏｔ  Ｗａｘおよび修正したＰＣＲプロトコール（実験の項を参照）を用いたＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ条件下、最良の結果を与えた。
本発明者らは、アガロースゲル上で臭化エチジウム染色によって少なければ６０−６００分子のテンプレートで検出することができた。
最後に、このように少量の分子を検出しようとする時、汚染や持ち越しを避けるために厳密な滅菌条件下、操作することが好ましいことを付記すべきである。Ｒｏｌｆｓ，Ａ．；Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｉ．；Ｆｉｎｃｋｈ，Ｕ．；Ｗｅｂｅｒ−Ｒｏｌｆｓ，Ｉ．ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（臨床診断および研究）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２  第５章；そしてＩｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．；Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．；編ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲプロトコール），Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（方法および応用の手引き）；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０を参照。
結合開裂
第１世代のカセット。この世代のものは、標準的な固相ペプチドおよびＤＮＡ合成を用いて、ＣＰＧ上で（Ｄ）そして（Ｌ）アミノ酸と異なったスペーサーの組合せで組み立てた。ペプチド合成のＡＳＷＹは９５−９８％であり、ＤＮＡ合成のは〜９９％であった。表２および図１０を参照。テンプレートＡ（図９）そしてスペーサーＩおよびIIの組合せをこの第１世代のカセットで用いた。
ポリヌクレオチドの通常のアンモニア脱保護基反応は、樹脂からのペプチド−ポリヌクレオチドコンジュゲートの定量的な開裂をもたらす。この結果は、エクスパダイト  ホスホラミダイト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が採用される場合も、同じであった。この方法は、例えば１６時間のかわりに１時間とほんの短時間濃アンモニアに晒らすことを要求する。ＤＮＡが脱保護基化されていないと、カセットは酵素によって開裂されない。この結果は、保護されている場合、その疏水性に起因された。ホスフェートバックボーン上のポリヌクレオチドを穏やかに脱保護基化（無水ＤＭＦ中、ＤＢＵ０．５Ｍと一晩中インキュベーション）しても、反応カセットに影響を与えない。この部分的脱保護基反応は、カセットをより親水性にし、そしてα−キモトリプシンがカセットのペプチド基質に達し、開裂するのを許容する。これは、溶液中にポリヌクレオチドを遊離することになる。残念ながら、背景反応（自動的な開裂）が反応の２５％を占め、そしてこの第１世代カセットを実用的でなくする。
第２世代のカセット
この世代のものは、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に基づく。
（Ｌ）および（Ｄ）アミノ酸の両方と、異なった組合せのスペーサーおよび異なったローディングとで幾つかのカセットがここで開示される。図１１および表３を参照。ＣＰＧおよびＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤに基づくカセットと対照的に、ＴｅｎｔａＧｅｌは既に長いポリエチレングリコール側鎖を備える。樹脂と基質の間にスペーサーを導入する必要はない。カセットを良好な収量で組み立てることができなかったので、ローディングが８０μｍｏｌｅ／ｇ以上であるすべてのＴｅｎｔａＧｅｌに基づく樹脂は、本発明者らの研究から除外した（表３）。
基質のα−キモトリプシン開裂、すなわちａ）スペルミンの存在下（１ｍＭ）、ｂ）スペルミンなしで、ｃ）ＤＭＳＯ（２０％）と、又はｄ）ＤＭＳＯなしで、ｅ）ＢＳＡ（１％）と、又はｆ）ＢＳＡなしで、ｇ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（最終濃度３．２μＭ，Ｐｒｏｍｅｇａ）と、又はｈ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質なしで、ｉ）反応カセットの異なった濃度で、ｊ）異った酵素濃度で、そしてｋ）様々なインキュベーション期間にわたって、以上がここで開示される。スペルミンおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、α−キモトリプシン（全電荷＋５〜＋６）とポリヌクレオチド（全電荷−４５）との相互作用を最小にすると期待された。Ｂｌｏｗ，Ｄ．Ｗ．Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｂｏｙｅｒ  Ｐ．Ｄ．（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１，１８５−２１２頁を参照。スペルミンは反応の感度に影響を及ぼさなかったが、一方一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は反応を阻害した。この後者の発見は、おそらくポリヌクレオチドへの結合の際に基質への接近が妨げられているためであろう。反応カセットの濃度並びにインキュベーション時間は、感度を改善しなかったが、背景反応を増加させただけであった。マトリックスとの非特異的な相互作用を最小にすると期待されたＤＭＳＯおよびＢＳＡも感度に影響を与えなかった。予期したように、（Ｄ）アミノ酸に基づくカセットは開裂されなかった。第２のスペーサーの長さは、反応カセットの感度に影響を及ぼさなかった。ここで調べたすべての例で、感度は以前に報告された、α−キモトリプシン０．１−１ｐｍｏｌｅ（５−５０ｎＭ）を超えなかった。電荷相互作用が重要ならば、正に帯電されたα−キモトリプシンは、負に帯電された基質−ポリヌクレオチドのコンジュゲートの極く近傍に封鎖されるであろう。こうしてその局部的濃度が上昇する。そこでこれは妨害効果を補償できうる。この世代のカセットを用いると、Ｃ１０はＣ．が存在しない条件のもと開裂される（図レーン１−４）。明らかに反応カセットは、ただ１つのアミノ酸に関してのみ異なる２つの非常に似かよった基質
（（Ｌ）Ａｌａ2−（Ｌ）Ｔｙｒ−（Ｌ）Ａｌａ2対（Ｌ）Ａｌａ2−（Ｌ）Ｈｅ−（Ｌ）Ａｌａ2）を識別する。溶液中のこれら２つの基質に対するα−キモトリプシンの反応性の違いは、〜１０（上記参照）と見積もられる。この結果は、コードされた反応カセットライブラリーの作製に関連がある。
反応カセット系の感度がα−キモトリプシン０．１−１ｐｍｏｌｅで止まる事実は、触媒されていない反応が０．１−１ｐｍｏｌｅ  α−キモトリプシンの反応とほとんど同じくらい速いことを意味する。第１の近似として、感度がこのレベルの最小値に達するという明らかな理由がない。この質問に対して、いくつかの可能な答がある。ａ）樹脂によって作り出された微細環境又は基質の配座によって、Ｋｍが影響が受け得る。これは酵素の基質に対する親和性を減少させる。ｂ）この反応カセット系内で触媒されていない反応が異常に速い。ｃ）基質が完全には酵素に接近できない（すなわち、マトリックスが疎水性すぎるか又は基質がＤＮＡによって妨害されている）。ｄ）ＰＣＲ条件が最適でない。
反応が起きるためには、基質が触媒によって認識されねばならない。Ｋｍはかくして直接的に反応カセットの感度に影響を及ぼすであろう。固体支持体上の基質に対してＫｍ（最良で１０-5Ｍ）16が１００倍高いと仮定すると（Ｋｍａｐｐ＝１０-3Ｍ）、用いた最も好適な濃度条件下（１２５１０-3Ｍ反応カセット、５５１０-9Ｍα−キモトリプシン）形成される錯体の分率は０．９２（４．６２５１０-9Ｍ）であるだろう。Ｋｃａｔ（最良で１００ｓ-1）が微細環境によって影響を受けず、そして形成されたすべての錯体が生産的であると仮定すると、酵素の速度は４．６２５１０-7Ｍｓ-1（４．６２５１０-9Ｍ５  １００ｓ-1）であるだろう。同一の濃度条件のもとで背景反応（ペプチドの加溶媒分解）の速度は３．６５１０-11Ｍｓ-1（３５１０-9ｓ-1５  １２５１０-3Ｍ）と概算される。Ｋａｈｎ，Ｄ．；Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，７５２９を参照。
酵素がある、なしでの速度比は１０4以上である。この粗い見積りによれば、これらのコードされた反応カセットは、少なくとも１０-17ｍｏｌｅのα−キモトリプシン（０．１５１０-12ｍｏｌｅ  ５  １０-4）を検出できるはずである。従って、感度はＫｍによって制限されるべきではない。第２の可能性は、不活性化されたペプチド結合の加溶媒分解の速度定数が３．８５１０-5ｓ-1（４．６２５１０-7Ｍｓ-1／１２５１０-3Ｍ）であろうと仮定し、これは単なる微細環境効果で説明できないので、除外されうる。基質の酵素に対する接近しやすさに関する第３の可能性はＣ２５（表３）およびＣ３３（表４）を用いて調べた。
これらのカセットはポリヌクレオチド部分を欠いており、そしてこのユニットに由来するかもしれない障害をプローブするために用いた。また、これらのカセットは、第２世代の反応カセットに於いて酵素の基質への接近しやすさを調べるために選択された。何故ならば、Ｃ３３は、生物触媒と適合性があることが示されているＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ樹脂に基づいているからである。
これらのカセットがα−キモトリプシンとインキュベートされた時、Ｃ３３は定量的に基質の部位で開裂され、溶液中にＨＯ−（Ｌ）Ｔｙｒ−（Ｌ）Ａｌａ4−Ｉ−ＯＨを遊離する（λｍａｘ＝２７６ｎｍ，ε＝１４５０Ｍ-1ｃｍ-1，０．１Ｍ塩酸）。一方、Ｃ２５は溶液中紫外線で検出されうるいかなる物質をも生じなかった。
これは実際、おそらく疏水性のため酵素がＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上の基質に対して完全には接近しやすさを有しないことを示唆する。ＴｅｎｔａＧｅｌに基づくカセットでアガロースゲル上開裂を認めた事実は、単にＰＣＲの強力な増幅効果によるものである。第４の可能性は、本研究で用いた減少する濃度でのテンプレートＡ（図９）を採用して調べた。感度はテンプレート１０-14ｍｏｌｅで水平になった。
第３世代のカセット
第３世代のカセットはいくつかの改善点を取り入れている。即ち、ａ）感度を向上するために設計およびテンプレートＦの使用によって、ＰＣＲ条件そしてプライマー配列が改善されている。ｂ）さらに感度を改善するために用いる触媒と適合性があるようにマトリックス物質が選択された。ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤのような親水性のマトリックスが好適な物質である。
第３世代のカセットを組み立てるための、標準的ＳＰＰＳおよびホスホラミダイト化学を用いる合成方法は、図５に示されている。２つのプライマおよびＡｌａ2−Ｔｙｒ−Ａｌａ2のコード配列を含むテンプレートＦは、この世代のカセットにとってタッグの役割を果たす。
α−キモトリプシンの存在下、Ｃ２６−Ｃ３２をインキュベーションすると基質部分の開裂並びに、増幅できそしてアガロースゲル上で可視化できるポリヌクレオチドの遊離をもたらす。図面、Ｃ３１については、例えばレーン５および６を参照。Ｃ３１およびＣ３２は同じ効率で開裂される。これは本発明のカセット系がＰ３，Ｐ４，Ｐ３′およびＰ４′位で異なる基質間を識別しないことを示す。そこでこれはこの世代のカセットの特異性に制限を課す。図面中、レーン７および８を参照。この情報は組合せのコードされた反応カセットの設計に極めて重要である。予期しないことにすべてのパラメーター（インキュベーション時間、ＰＣＲ感度、樹脂の選択、スペーサーの長さ、ＤＮＡ合成等）を本研究で最適化したにもかかわらず、感度の下限は、再びＴｅｎｔａＧｅｌで得られたα−キモトリプシン０．１−１ｐｍｏｌｅを超えなかった。より一層予期しなかったことは、Ｃ３０についての本発明者らの発見であった。即ち、ａ）検出限界は反応カセット〜０．０１ｍｇ（１つのビーズ）、又は〜１０ｍｇを用いようが同一である。この段階で説明することは難しいが、１つのビーズが１００００ビーズと同じ感度を導く事実は、基質および触媒の組合せライブラリーをスクリーニングするのに極めて有用でかつ経済的利点がある。ｂ）反応完了後、カセットとα−キモトリプシンとを含む１μｌの反応媒質は１０9倍まで希釈することができ、それでもなおＰＣＲの後、アガロースゲル上でポリヌクレオチドタッグに対応するバンドを与える。対照的に、触媒されていない反応媒質からの１μｌは、１０3倍希釈の後、もはやいかなる検出できる物質をも与えない。０．１−１ｐｍｏｌｅの酵素は溶液中、背景反応よりも〜１０6倍も多くポリヌクレオチドを産生し、そしてにもかかわらず背景反応に対して検出されうるのがより低濃度のα−キモトリプシンであることを、この実験は明らかにはっきりとさせる。
数字的には、４５１０-21ｍｏｌｅ以上（０．１５１０-12ｍｏｌｅ  ５  １／１０6５  １／２５≒２４００分子）の酵素量を検出することが可能であるはずだが、実験的には、α−キモトリプシンが５ｎＭ以上の濃度にとどまっていないとこの量は検出できない。０．１５１０-12ｍｏｌｅは、α−キモトリプシンの検出しうる最低の量に対応し、１／１０6はアガロースゲル上で背景に対してシグナルをなお生成できる反応媒質の希釈倍率に対応する。１／２５は反応媒質（２５μｌ）の１μｌのみがＰＣＲによる増幅に用いられたという事実からくる。おそらく、酵素はポリヌクレオチドを強く相互作用し、そしてすべての部位が飽和されるまで基質に到達することができない。
結合形成の検出
反応カセットの東側（Ｓ９）および西側（Ｓ３４）成分は図６、７にそれぞれ示されているようにして合成された。
半有機媒質中、α−キモトリプシンは、チロシンメチルエステルと自由なアミンとの間のアミド結合形成を触媒する。反応は、半有機媒質中、アミンによって攻撃される、アシル−酵素の形成を経て進行する。Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（合成有機化学に於ける酵素）；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｅ．，ＦＲＳ；Ｍａｇｎｕｓ，Ｐ．Ｄ．，ＦＲＳ；（編）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ；１２巻；Ｐｅｒｇａｍｏｎ：Ｏｘｆｏｒｄ；１９９４を参照。図１４は、α−キモトリプシンの存在下、Ｃ３４（又はＣ３５）とＳ９との反応から取られた１つのビーズのＰＣＲ生成物のアガロースゲルを示す。
ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ（Ｃ３４）がマトリックスとして用いられる時、背景反応が触媒反応を曇らせる（図１４，レーン７−９）。
樹脂のみ（基質部分なし）を用いるコントロール（対照）実験は、同じ結果を与え、これは背景反応が実際、ポリヌクレオチドのマトリックスへの吸着によるものであることを示している。吸着は多量に洗浄した後でも完全には除去することはできないが、高温でのＰＣＲ反応媒体なら放出させることができる（レーン１−３）。ＴｅｎｔａＧｅｌに基づく樹脂（Ｃ３５）では背景反応は多量の洗浄後（レーン４−６）なくすことができた。触媒存在下の反応は、背景反応（触媒されていないアミド結合形成）（レーン１０−１２）と比較すると、弱いバンドを与える。この傾向は本発明者らの期待とは矛盾しているが、次のように説明できる。即ち、ａ）α−キモトリプシンはＣ３４（又はＣ３５）のチロシンメチルエステルの加水分解を触媒し、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと反応するのに利用される基質の濃度を低下させる。触媒されていない反応はこの事実によって阻害されないので、より強いシグナル（レーン１０）を与える。ｂ）α−キモトリプシンは、最も接近しやすい部位と安定なアシル−酵素中間体を形成し、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと樹脂に結合された基質との間の触媒されていない反応への通路を遮断する。
理由がどうであれ、ここに開示されたコードされた反応カセットを用いて遅い触媒されていないペプチド結合の形成を検出できることが記載される。同時に、コードされた反応カセットが化学結合の形成を検出することができることも記載される。これらの結果は、本発明の設計では触媒の大きさが本方法を不利にするようであることも示している。この理由から以下に開示するように、ＮａＣＮＢＨ3を用いる化学的に触媒された結合形成を採用することができる。
イミン結合形成の検出
合成計画を図８に示す。論じた理由から（上記を参照）本発明者らはＴｅｎｔａＧｅｌを用いた。マトリックスは、まずグルタルアルデヒドで活性化され、それからＳ１０と結合されＮａＣＮＢＨ3還元が続く。多量に洗浄した後、１つのビーズをＰＣＲにかけた。図１４はイミン結合の形成を実証するアガロースゲルを示す。グルタルアルデヒドで前処理した樹脂は、４５−ｍｅｒバンド（レーン１３）を与えたが、一方予期されたようにこの前処理を施さなかった樹脂は４５−ｍｅｒ（レーン１４）を与えなかった。反応カセットの原理の第２の部分を証明するための用途とは別に、この合成方法は直交する合成図式を経由して予め得られたペプチド−ポリヌクレオチドコンジュゲートライブラリーから反応カセットのコードされたライブラリーを構築するのに使用することができる。このようにして得られたライブラリーは、結合開裂の検出モードに使用できる。
方法
略号
ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）、ＭＭＴｒ（モノメトキシトリチル）、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＭＦ（ジメチルフォルムアミド）、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）、ＡＳＷＹ（工程あるいは段階毎の平均収率）、ＯＡＹ（全収率）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオライド）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＭｅＯＨ（メタノール）、ｄＨ2Ｏ（蒸留水）、ＡｃＯＮａ（酢酸ナトリウム）、ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｃｏｎｃｄ（濃縮）、ＣＰＧ（細孔のサイズをそろえたガラス）
一般
ＮＭＲスペクトルは、溶媒を内部基準として、1ＨＮＭＲについては、Ｂｒｕｋｅｒ（ブルッカー）３００ＭＨｚで、そして13ＣＮＭＲについてはＢｒｕｋｅｒ５００ＭＨｚで記録した。Ｄ2Ｏ中のすべての1ＨＮＭＲおよび13ＣＮＭＲの測定は、（２−メチル）２−プロパノールを内部基準（ＣＨ3，１．３６ｐｐｍ；ＨＯＣ（ＣＨ3）3，６８．７および３１．６ｐｐｍ）に用いて実施した。融点はＦｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ（フィッシャ−ジョーンズ）融点測定装置で測定した。クロマトグラフ支持体は、Ｓｉｌｉｃａ  ｆｌａｓｈ  Ｍｅｒｃｋ（シリカ  フラッシュ  メルク）６０（０．０４０−０．０６３ｍｍ）であった。質量スペクトルは、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ザ  スクリップス  リサーチ  インスティテュート）の質量スペクトロメトリー施設で測定した。
図４に例示された基質の合成
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ2およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ2）は、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９，４７−５３頁に記載された方法に従って合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ2については、付録を、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ2）については、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，７６０５を参照せよ。他のアミノ酸、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ノヴァバイオケム）から商業的に入手できる。無水グルタル酸、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、無水ＤＭＡ（ジメチルアミン）およびＤＭＦ（ジメチルフォルムアミド）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（アルドリッチ）から商業的に入手できる。
溶媒であるＤＣＭ（メチレンクロライド）、ＭｅＯＨ（メタノール）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）はＢａｘｔｅｒ（バクスター）から商業的に入手でき、すべて低含水量（＜０．００１％）のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等級であった。使用の前に、樹脂を１０分間、３％Ｃｌ3 ＣＣＯ2 Ｈ／ＤＣＭ処理で予め適当な条件とし、続いてＤＣＭ，ＤＭＦ，１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ，ＤＭＦおよびＤＣＭで多量に洗浄する。
図４に例示される基質（Ｓ１−Ｓ７；配列番号１−５）の合成
標準的Ｆｍｏｃおよび／またはＢｏｃ方法（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４；Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）に従って、５００ÅＣＰＧ（細孔のサイズをそろえたガラス）（〜５０μｍｏｌｅ／ｇ、Ｓｉｇｍａ又はＣＰＧ  Ｉｎｃ．），ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−ＮＨ2支持体（〜２６０μｍｏｌｅ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ又はＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）、又はＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ（〜１００μｍｏｌｅ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかの上で、手作業によりペプチド基質（Ｓ１−Ｓ７；配列番号１−５）を組み立てた。４０−６０μｍｏｌｅ／ｇの最終装填量（ローディング）を得るために、合成の第１工程はアミノ酸モノマーに対して過剰の固体支持体を用いて実施する。全ての最終洗浄の後、未反応のアミノ基をキャップする（０．２５体積の２，６−ルチジン中の無水酢酸４．２３Ｍ，０．７５体積のＴＨＦ中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，３分間）。
同じ手順の部分官能基化およびキャッピングが他のローディングに応用される。ペプチド合成のＡＳＷＹは、９５−９８％であった。各カップリング工程の後で、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄する。反応の完了は、Ｋａｉｓｅｒ試験で調べる（Ｋａｉｓｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，３４，５９５）。ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）陽イオンアッセイ（Ｇａｉｔら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９９０，４８頁）又はフルベン−ピペリジン付加物アッセイ（Ｆｍａｃアッセイ；ε302nm＝７８００Ｍ-1ｃｍ-1，ピペリジン／ＤＭＦ２０％中；Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）のいずれかを用いて可能なかぎりローディングを決定する。
図５に示すように、チロシン上の水酸基のｔ−ＢｕＭｅ2Ｓｉ保護基をカセット組み立ての終わりにＴＨＦ中１Ｍ  ＴＢＡＦで処理し、続いてＴＨＦ，ＭｅＯＨ，ｄＨ2Ｏ，トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍＭ）およびｄＨ2Ｏで多量に洗浄することにより除去した。この工程後、反応カセットは、結合開裂検出モードに於いて使用可能である。
基質Ｓ８（配列番号６，図４）は、標準的な溶液相ペプチド化学（下記を参照）を用いて５段階で合成した。この化合物は、かなりの希薄溶液中でゲルを形成する傾向があるので、ＴｅｎｔａＧｅｌ又はＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤへのカップリングは次のようにして行った。すなわち、ＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ（０．５ｇ，５０μｍｏｌｅ），ＨＢＴＵ（５０ｍＭ）（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＯＢｔ（５０ｍＭ）（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物），ＤＩＥＡ（２００ｍＭ），およびＳ８（配列番号６）（５０ｍＭ）：以上の混合物をＤＭＡ（３ｍｌ）中、２０℃で８−１６時間、振盪する。これらの条件は、２−４倍に希釈した標準条件に対応する。その後、樹脂をＤＭＡ（ジメチルアミン）、ＭｅＯＨ（メタノール）およびＤＣＭ（メチレンクロライド）で洗浄する。Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）をＴＦＡ／ＤＣＭ（トリフルオロ酢酸／メチレンクロライド）（１／４）で１０分間、脱保護基化する。樹脂をＤＣＭ，ＤＭＦ，ＭｅＯＨおよびＤＣＭで洗浄し、高真空下乾燥する。樹脂は、図７に例示された基質の他の部分と組み合せて結合形成検出モードに使用可能である。ＴｅｎｔａＧｅｌについては、カップリングを次のようにして行った。すなわち、ＴｅｎｔａＧｅｌ（０．２５ｇ，６５μｍｏｌｅ），ＨＢＴＵ（６５ｍＭ），ＨＯＢｔ（６５ｍＭ），Ｓ８（配列番号６）（６５ｍＭ），およびＤＩＥＡ（２６０ｍＭ）：以上の混合物を、ＤＭＡ（３ｍｌ）中、２０℃で１６時間振盪する。Ｓ９（配合番号６）およびＳ１０（図６）の合成については、下記のＤＮＡ合成を参照。
ＤＮＡ合成
ＤＮＡ合成のためのすべてのモノマー、試薬および溶媒は、特に記載していないかぎりＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（アプライド  バイオシステム，ＡＢＩ）又はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（グレンリサーチ）から購入した。エキスパダイト  β−シアノエチル  ホスホラミダイト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ミリポア）は、アデニン、グアニンおよびシチジンのアミノ基上で、ｔ−ブチルフェノキシアセチルによって保護される。チミジンは保護されない。これらのモノマーから生じるホスフェートバックボーンは、β−シアノエチルエステルとして保護される。いくつかの第２世代カセットとともに用いられるホスホラミダイトモノマーは、濃アンモニア中、封止管で、５５℃、１６−２０時間のインキュベーションを要する。この条件にさらすのを最小にするために、ほとんどの反応カセットで、迅速な脱保護基化（濃アンモニア中、５５℃で１時間）を可能にするエキスパダイト  ホスホラミダイトを使用した。
標準のホスホラミダイト化学（Ｇａｉｔら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）を用いて、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡ合成機上でＤＮＡ合成を実施した。ＴｅｎｔａＧｅｌの合成について以前に記載されたように（方法Ｂ，９７段階と名付けて、Ｆｅｎｎｉｒｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，２２７８に記載）、標準１μｍｏｌｅサイクル（方法Ａ、９７段階と名付ける）を修正した。
これをＴｅｎｔａＧｅｌおよびＮｏｖａＳｙｎ  ＫＤ樹脂の両方に適合させるためにさらに下記のように修正した（方法Ｃ，９９段階と名付ける）。順番に、ａ）ＤＣＭ（メチレンクロライド）ボトル（ボトル１９）を無水ＤＭＦで置き換えた；ｂ）キャップＡ（ボトル１１）をエキスパダイトキャップＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で置き換えた；ボトル１５（ヨウ素０．１Ｍ）をより濃度の低いもの（０．０２Ｍ）で置き換えた；ｄ）モニターモード（段階７７）で、ボトル１８からカラム（１０秒間）をボトル１９からカラム（３５秒間）に置き換えた；ｅ）非モニターモードで、洗浄を一段階追加した、ボトル１９からカラム（３５秒間）（段階８０）；ｆ）非モニターモードで、別の洗浄段階を追加した、ボトル１９からカラム（３５秒間）（段階９４）；ｇ）非モニターモード（段階８４，８７および９０）を５秒から１０秒に延長した；ｈ）すべての洗浄段階３，５９，６１，６６および９６を１０秒から３０秒に延長した；ｉ）ホスホラミダイトおよびテトラゾールとのインキュベーション（段階４５）を２５秒から１２０秒に延長した；スペーサーVIIIの導入について、この段階を９００秒に延長した；ｊ）ＤＮＡ合成機で用いたすべてのモノマーの濃度は、無水アセトニトリル中、０．１Ｍであった；ｋ）合成は、３−５カップリング毎にモニターした。
ポリヌクレオチドは、濃アンモニアと５５℃で１時間処理して脱保護基化した。ＤＣＭ中、３％Ｃｌ3 ＣＣＯ2 Ｈ（５分間）で処理し、続いてＤＣＭ，ＴＨＦ，ＭｅＯＨ，トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍＭ）およびｄＨ2Ｏで多量に洗浄して、ＤＭＴｒ基を除去する。チロシン含有カセットをＴＨＦ中、１Ｍ  ＴＢＡＦで１５分間、処理して、フェノール性水酸基保護基であるＳｉＭｅ2 ｔ−Ｂｕを除去し、そして上記のように洗浄する。この工程の後、カセットは結合開裂検出モードに使用可能である。
酵素的触媒された結合形成の検出に用いられる基質Ｓ９（図６）
0003989542.tif 000009
酵素触媒結合形成の検出のために、第１のメチルホスホラミダイトを含む長鎖のアルキルアミノ基を備えるＣＰＧ１０００Å（１μｍｏｌｅスケール）上で、Ｓ９を下記のようにして構築した。
すなわち、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡ合成機の標準１μｍｏｌｅサイクル（方法Ａ）をメチルホスホラミダイトおよび標準ＡＢＩ試薬とともに使用した。ＤＮＡ合成の後で、スペーサーVIIIを、続いてスペーサーIX又はＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を導入した。
ＭＭＴｒアミノ保護基は、８０％酢酸と２０℃で１時間、処理し、続いてｄＨ2Ｏ、トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍＭ）、ｄＨ2Ｏ，ＭｅＯＨ，ＤＣＭで洗浄することによって除去し、そしてこれを高真空下で乾燥した。このようにして得られた官能基化されたポリヌクレオチドをさらに下記の濃度条件下、標準的なＳＰＰＳ法に従って、まだ固体支持体にある間にＦｍｏｃ−Ａｌａ2で誘導体とする。
樹脂に結合されたポリヌクレオチド４μｍｏｌｅに対して、ＤＭＡ（０．５ｍｌ）中、ＨＢＴＵ（２５ｍＭ）、ＤＩＥＡ（１００ｍＭ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ2（２５ｍＭ）を２０℃で２時間、振盪する。樹脂をＤＭＦ，ＭｅＯＨ，ＤＣＭで洗浄し、高真空下、乾燥する。この工程の後、４５分間チオフェノール／Ｅｔ3Ｎ／ジオキサン（１／１／２）の混合物を用いて、ホスフェートバックボーンを脱保護基化し、そしてジオキサンおよびＭｅＯＨで洗浄する。ペプチド−ポリヌクレオチドコンジュゲートを樹脂から脱離させ、末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸基上で、脱保護基化（濃アンモニア中、５５℃で１時間）し、そして０．８μｍの使い捨てシリンジフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過する。
この工程の後、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートを４５−５０℃で１８時間処理して核塩基上で脱保護基化する。溶液を凍結乾燥し、３Ｍ  ＡｃＯＮａ，ｐＨ５．２から３回エタノール沈澱し、そしてさらに精製することなく、酵素触媒ペプチドカップリングに使用する。
酵素的に触媒された結合形成の検出に用いられる基質Ｓ１０（図６）
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化学的に触媒された結合形成の検出のために、Ｓ１０（ポリヌクレオチド−VIII−IX又はポリヌクレオチド−VIII−Ｘ）は、１μｍｏｌｅスケールで、エクスパダイトβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーとともに５００ÅＣＰＧを用いて組み立てた。
末端アミノ基を、８０％酢酸と２０℃で１時間、処理し、続いてｄＨ2Ｏ、ＭｅＯＨおよびｄＨ2Ｏで多量に洗浄することによって、遊離させる。ポリヌクレオチドを濃アンモニアと５５℃で１時間処理することにより脱保護基化した。上澄み液を回収し、凍結乾燥する。固体を３Ｍ  ＡｃＯＮａ，ｐＨ５．２からエタノール沈澱し、そしてさらに精製することなくカップリング反応に使用した。
酵素的に触媒された結合開裂（図５）
カセット（０．０１−１０ｍｇ，５．９−３０．１μｍｏｌｅ／ｇ）を、１、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6又は０ユニットのα−キモトリプシンを含む２５μｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（２ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６ｍＭ）中に、懸濁し、そして混合物を２０℃で振盪した。
３０分、１、２、３、４、１２、２４および４８時間後、上澄み液（１−２μｌ）を採取し、そしてＰＣＲ法に供した。
酵素的に触媒された結合形成（図７）
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９６ウェル濾過プレートアセンブリー（０．６５ｍｍ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ，Ｌｏｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ；親水性デュラポア、低タンパク質，親和性，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のいくつかのウェルに数百ビーズ（〜５ｍｇ）のＣ３４又はＣ３５を載置し、そして１、０．１又は０単位のα−キモトリプシン（最終体積２００μｌ）の存在下、トリス−ＨＣｌ  １００ｍＭ  ｐＨ８／ＤＭＳＯ（４０／６０，最終ｐＨ８．７５）中で、Ｓ９（０．３２ｍＭ）とインキュベートした。プレートを１時間、振盪し、そしてＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（マルチスクリーン  フィルトレーション  システム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適合させる。これは装置を真空にし、続いてＤＭＳＯ／ｄＨ2Ｏ  ６０％，ｄＨ2Ｏ，ＡｃＯＨ  ８０％（１０分間），ｄＨ2Ｏ，濃アンモニア（１０分間），ｄＨ2Ｏ，ＴＦＡ  ２％（１０分間），濃アンモニア，ｄＨ2Ｏ  ８０℃，ＭｅＯＨで多量に洗浄することによって、反応を停止させることを可能にする。
ＰＣＲ増幅のために各ウェルからビーズを１つずつ取り出す。
化学的に触媒された結合形成（図８）−西側部分のカップリング（Ｃ３６を東側部分Ｓ１０へ）
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９６ウェル濾過プレートアセンブリー（０．６５ｍｍ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ，Ｌｏｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のいくつかのウェルに数百ビーズのＴｅｎｔａＧｅｌ（〜５ｍｇ）を載置し、そして２０体積％のグルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．５とインキュベートした。プレートを室温で３時間、振盪し、そしてそれからビーズをｄＨ2Ｏおよび０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．５で多量に洗浄した。６０％ＤＭＳＯを含む０．０５Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０中に、アミノ官能基化したポリヌクレオチドＳ１０（０．１５ｍＭ）を添加した。
プレートを３７℃で２０時間、振盪し、そしてＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに適合させた。これは装置を真空にし、続いて０．１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０で多量に洗浄することによって反応を停止させることを可能にする。それから、０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ８．５および０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ８．５中０．２Ｍ  ＮａＣＮＢＨ3 ２００μｌを各ウェルに添加し、プレートを２０℃で３時間振盪し、そして振盪せずに一晩中、４℃で保管した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ウェルから液相を濾過し除いた。
そして樹脂をｄＨ2Ｏ、８０％酢酸（２  ５  １０分間）、濃アンモニア（２  ５  １０分間）、ＴＦＡ２％（２  ５  １０分間）、濃アンモニア（２  ５  １０分間）、ｄＨ2Ｏ  ８０℃、およびＭｅＯＨで多量に洗浄した。ＰＣＲ増幅のために各ウェルからビーズを１つずつ取り出した。
ＰＣＲ実験
すべてのテンプレート（配列番号８−１４、Ａ−Ｇ、図９）および対応するプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（オペロン社）を通じて注文製造した。テンプレートＡ（配列番号１）を備える反応カセットについては、反応混合物からのアリコート（１μｌ）をＰＣＲ成分と混合した。ＭｇＣｌ2 ２．５ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，プロメガ）１．２μｌ、Ｔａｑ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）２μｌ、デオキシヌクレオチド  トリホスフェート２．５ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ファルマシア）１．６μｌ、プライマーＩ  １００ｐｍｏｌｅ／μｌ  １μｌ，プライマーII  １００ｐｍｏｌｅ／μｌ  １μｌ，ｄＨ2Ｏ  １７．７μｌ，Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌ（２．５Ｕ）を第１のＰＣＲサイクルを始める前に添加した。正のコントロール（ＰＣＲ成分のみ）は、この研究で用いた１ｐｍｏｌｅのポリヌクレオチド配列を含むｄＨ2Ｏとともに実施した。負のコントロールは、ポリヌクレオチド配列なしで同一の条件下、実施した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（パーキン  エルマー  シータス）９６００装置で、次のサイクルプログラム、すなわち、９４℃、３０秒間変性反応、５５℃、３０秒間アニーリング、７２℃、３０秒間エクステンションを用いて実施した。３５サイクル後、結果をアガロースゲル（１％  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  アガロース，２％ＦＭＣ  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ  アガロースと９０ｍＭ  トリス／６４．６ｍＭ  ホウ酸塩／２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．３（１５ＴＢＥ），１０３ｍＶで）上で分析した。テンプレートＥ（配列番号１３）（表４）を備える反応カセットについては、Ｈｏｔ  Ｗａｘ低濃度Ｍｇ++ビーズ（最終体積５０μｌ中、１．５ｍＭの最終濃度，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン），Ｔａｇ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ，ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４μｌ，プライマーＩ  １００ｐｍｏｌｅ／μｌ  ２．５μｌ，プライマーII  １００ｐｍｏｌｅ／μｌ  ２．５μｌ，Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌ（５Ｕ），反応上澄み液１μｌ，ｄＨ2Ｏ  ３４μｌを用いた。サイクルプログラムに先立って、９４℃、３０秒間の予熱工程が行われ、そして７２℃、１０分間のエクステンションで終了した。３５サイクルは次のようにプログラムされた。即ち、９４℃、３０秒間変性反応、４９℃、１分間アニーリング、７２℃、３０秒間エクステンションであった。正および負のコントロール並びにアガロースゲル上での分析も前記のごとく実施した。結合形成の検出のために、テンプレートＦ（配列番号１４）をＴａｇ（タッグ）として用い、そしてＰＣＲ条件は、前記の条件と同様であったが、このテンプレートでは２５サイクルのみであった。
スペーサー分子（従来技術に記載および／又は商業的に入手可能な化合物）の合成
化合物Ｉ（Ｓｈａｌｌｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５，３８２１）、化合物II（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９４，６，３６１），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ2）（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，７６０５）、化合物２，２１（Ｍｏｒｉｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，９２７７）、および化合物３，２２（Ｐｒａｋａｓｈら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １９９１，１２７３）は、以前に報告された方法に従って合成される。化合物１９、２０、２３、２４、２５、すべての試薬並びに溶媒はＡｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる。
様々な条件下、化合物１、５および９を化合物１９、２０、２１又は２２で誘導体化しようとしたいくつかの試みは完全に失敗するか、所望の生成物を低収量でしか与えなかった。この項では、スペーサーIII−VIIをかなりの高収量でもたらす反応を記載する（図３）。スペーサーIX（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、商業的に入手できた。
１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２イロキシ）−１７−ヒドロキシ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（５）（図３）の合成
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化合物５：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，シグマケミカルカンパニー）および３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（７．５ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）をメチレンクロライド（５００ｍｌ）中、０℃に冷却し、そして数滴の濃塩酸とともに１時間撹拌した。温度を２０℃まで上昇させ、撹拌を一晩中、継続した。炭酸ナトリウム（３ｇ）を加え、懸濁液を１時間撹拌し、それから濾過した。続いて、溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル／メチレンクロライド０−１００％）にかけると無色粘稠性オイルとして得られる化合物５（Ｃ17Ｈ34Ｏ8，９．８ｇ，３０％）を与えた。
Ｒｆ＝０．１（シリカ，酢酸エチル）。
1H NMR（CDCl3）δ:4.56（t,3J（H,H）=2.9Hz,1H,OCHO）;3.9-3.3（m,28H,CH2OCH2 and CH2OH）;1.65-1.42（m,6H,CH2CH2CH2 of THP）．
13C NMR（CDCl3）δ:98.1（OCHO）;72.1, 70.1, 70.0, 69.9, 69.8, 66.1, 61.5, 61.0,（CH2OCH2 and CH2OH）;29.7, 24.5, 18.4（CH2CH2CH2CH2O）．
FAB+MS（NBA/NaI）=367（M+H+）/z; 389（M+Na+）/z．
１−ヒドロキシ−１７−フタルイミド−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（９）（図３）の合成
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化合物９：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、フタルアミド（１２．９ｇ，８９ｍＭｏｌ）、ＰＰｈ3（２３．０ｇ，８９ｍＭｏｌ）および無水ＴＨＦ（４５０ｍｌ，ナトリウム上で蒸留）を不活性雰囲気下、２０℃で撹拌した。ＤＥＡＤ（１５．３ｇ，８９ｍＭｏｌ；ジエチルアゾジカルボキシレートはＡｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる。）無水ＴＨＦ中を２０℃で２時間にわたって滴下し、そして反応混合物を一晩中撹拌した。溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ、残渣を沸騰するｄＨ2Ｏに取った。冷却後、沈澱物を濾過し、そして水溶液を高真空下、乾燥状態にまで蒸発させた。このようにして得られた粘稠性オイルをクロマトグラフ（シリカ  フラッシュ，酢酸エチル／ヘキサン５０−１００％）にかけると、化合物９を無色粘稠性オイルとして与えた（Ｃ20Ｈ29ＮＯ8，２２．０ｇ，６０％）。
Ｒｆ＝０．１３（シリカ，酢酸エチル）。
1H NMR（CDCl3）δ:7.82（m,2H,Ar）;7.69（m,2H,Ar）;3.88（t,3J（H,H）=6.1Hz,2H,NCH2）;3.72（t,3J（H,H）=5.4Hz,2H,NCH2CH2O）; 3.69-3.54（m,22H,CH2OCH2 andCH2OH）．
13C NMR（CDCl3）δ:167.9（CO）; 133.7,131.7,122.9（Ar）; 72.2,70.3,70.2,70.1,70.0,69.95,69.7（OCH2CH2O）; 67.5（OCH2CH2N）; 61.2（OCH2CH2OH）; 36.9（CH2N）．
FAB+MS（NBA/NaI）；予想される正確な質量（M+H+）/z 412.1971,実測値412.1983; 434（M+Na+）/z．
１−フタルイミド−１７−〔（４，４′−ビスメトキシ−トリチル）−オキシ〕−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（１２）（図３）の合成
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化合物１２：化合物９（１．８ｇ，４．４ｍＭｏｌ）、ＤＭＴｒＣｌ（４，４−ジメトキシトリチルクロライドは、Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる）（２．２ｇ，６．６ｍＭｏｌ）をピリジン（２０ｍｌ）中、２０℃で４０時間、撹拌した。Ｅｔ3Ｎ（１２ｍＭｏｌ，トリエチルアミン）を加えて、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，エチルアセテート／ＤＣＭ  ０−５０％）の後で、化合物１２（Ｃ41Ｈ47ＮＯ10，２．８ｇ，８８％）を黄色粘稠性オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．１５（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０％）。
1H NMR（CDCl3）δ:7.83（m,2H,フタルイミド）; 7.68（m,2H,フタルイミド）; 7.47（d,3J（H,H）=7.1Hz,2H,Ph DMTr）; 7.34（d,3J（H,H）=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 7.26（t,3J（H,H）=7.6Hz,2H,Ph,DMTr）; 7.18（t,3J（H,H）=7.3Hz,1H,Ph DMTr）; 6.81（d,3J（H,H）=8.9Hz,4H,P-MeOPh DMTr）; 3.88（t,3J（H,H）=5.9Hz,2H,CH2N）; 3.77（s,6H,CH3O）; 3.75-3.5（m,20H,CH2OCH2）; 3.21（t,3J（H,H）=5.4Hz,2H,CH2ODMTr）．
13C NMR（CDCl3）δ: 168.2（CO）; 158.3,145.0,136.3,130.0,128.1,127.7,126.6,123.2,113.0（DMTr Ar）; 133.9,132.2,123.2（フタルイミドAr）; 85.8（（p-MeOPh）2PhCO）; 70.7,70.6,70.55,70.5,70.45,70.0,67.8（CH2OCH2）; 63.1（CH2ODMTr）; 55.1（CH3O）; 37.2（CH2N）．
FAB+MS（NBA/NaI）：予想される正確な質量（M+Na+）/z 736.3098，実測値736.3123．
１−アミノ−１７〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（III）（図３）の合成
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化合物III：化合物１２（１．７ｇ，２．３ｍＭｏｌ），（ＮＨ2）2（ヒドラジン）（２３．４ｍＭｏｌ，０．７３ｍｌ）およびエタノール（１００ｍｌ）を３時間還流した。冷却した後、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。残ったオイルをジエチルエーテルに取り、そして沈澱物を濾過した。有機相を乾燥状態にまで蒸発させると化合物III（Ｃ33Ｈ45ＮＯ8，１．２ｇ，８９％）を淡黄色粘稠性オイルとして与え、これをさらに精製することなく使用した。
1H NMR（CDCl3）δ:7.45（d,3J（H,H）=7.3Hz,2H,Ph DMTr）; 7.33（d,3J（H,H）=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 7.27（t,3J（H,H）=7.0Hz,2H,Ph DMTr）; 7.18（t,3J（H,H）=7.0Hz,1H,Ph DMTr）; 6.81（d,3J（H,H）=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 3.77（s,6H,CH3O）; 3.73-3.59（m,18H,OCH2CH2O）; 3.48（t,3J（H,H）=5.1Hz,2H,CH2CH2NH2）; 3.21（t,3J（H,H）=5.2Hz,2H,CH2ODMTr）; 2.84（t,3J（H,H）=5.1Hz,2H,CH2CH2NH2）．
13C NMR（CDCl3）δ: 158.3,145.0,136.3,130.0,128.1,127.7,126.6,113.0（Ar）; 85.8（（p-MeOPh）2PhCO）; 73.4,70.7,70.6,70.5,70.2（CH2OCH2）; 63.1（CH2ODMTr）; 55.2（CH3O）; 41.7（CH2NH2）．
FAB+MS（NBA/NaI）:584（M+H+）/z;予想される正確な質量（M+Na+）/z 606.3043，実測値606.3072．
１−ヒドロキシ−１７−〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（１３）の合成（図３の工程ｉで形成される；化合物は中間体であり示されていない）
化合物１３：化合物１（５ｇ，１７．７ｍＭｏｌ）およびＤＭＴｒＣｌ（ジメトキシトリチルクロライド６．３ｇ，１７．７ｍＭｏｌ）をピリジン（１７ｍｌ）中、不活性雰囲気下、２０℃で４８時間、撹拌した。Ｅｔ3Ｎ（４ｍｌ）を加えて、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。このようにして得たオイル状残渣をエーテル（１００ｍｌ）に取り、ｄＨ2Ｏ（１００ｍｌ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして高真空下で乾燥した。
フラッシュクロマトグラフィーの後（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０−１００％）、化合物１３（Ｃ33Ｈ44Ｏ9，３．３ｇ，３２％）を黄色オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．１２（シリカ，エチルアセテート）
1H NMR（CDCl3，塩基性アルミナ上を濾過）δ：7.46（d,3J（H,H）=7.2Hz,2H,Ph DMTr）; 7.34（d,3J（H,H）=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 7.27（t,3J（H,H）=7.8Hz,2H,PhDMTr）; 7.19（t,3J（H,H）=7.2Hz,1H,Ph DMTr）; 6.82（d,3J（H,H）=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 3.78（s,6H,CH3O）;3.7-3.57（m,22H,CH2OCH2 and CH2OH）; 3.22（t,3J（H,H）=5.3Hz,2H,CH2ODMTr）．
13C NMR（CDCl3,塩基性アルミナ上を濾過）δ:158.3,145.1,136.3,130.1,128.2,127.7,126.6,113.0（Ar）;85.9（（p-MeOPh）2PhCO）; 72.5,70.7,70.68,70.65,70.62,70.58,70.52,70.48,70.45,70.42,70.3（CH2OCH2）; 63.1（CH2ODMTr）;61.7（CH2OH）; 55.2（CH3O）．
FAB+MS（NBA/CsI）：予想される正確な質量（M+Cs+）/z 717.2040，実測値717.2022．
１，１７−ビス〔（ｐ−トルエンスルホニル）オキシ〕−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（１４）の合成（図３の工程ｋ；化合物は中間体であり示されていない）
化合物１４：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ）、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（５０．９ｇ，２６７ｍＭｏｌ）を乾燥ピリジン（７５ｍｌ）中、不活性雰囲気下、０℃で４時間撹拌した。それから反応媒体を氷上（８００ｍｌ）に注ぎ、そして激しく撹拌した。ＤＣＭ（３００ｍｌ）を加え、水層を３Ｍ塩酸で注意深くｐＨ≒１に酸性化した。水層をさらにＤＣＭ（２  ５  ３００ｍｌ）で抽出し、有機層を合せ、そして飽和塩化アンモニウム（２  ５  ３００ｍｌ）、ｄＨ2Ｏ（２  ５  ３００ｍｌ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして残ったオイルを高真空下、乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  ０−１％）の後、化合物１４（Ｃ26Ｈ38Ｓ2Ｏ9，４０ｇ，７６％）を無色粘稠性オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．４９（シリカ，酢酸エチル）。
1H NMR（CDCl3）δ: 7.75（d,3J（H,H）=8.3Hz,4H,Ar）;7.31（d,3J（H,H）=8.1Hz,4H,Ar）; 4.10（t,3J（H,H）=4.7Hz,4H,CH2OTs）;3.65-3.53（m,2OH,CH2OCH2）;2.40（s,6H,CH3 Ts）．
13C NMR（CDCl3）δ:144.7,132.7,129.7,127.8（Ar）;77.0,76.8,71.2,70.5,70.4,70.3,69.2,68.5（CH2O）;21.5（CH3 Ts）．
FAB+MS（NBA/NaI）：予想される正確な質量（M+Na+）/z 613.1753,実測値613.1740．
１，２７−ビス−（ヒドロキシ）−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカン（１５）の合成（図３の工程１；化合物は中間体であり示されていない）
化合物１５：化合物２３（１４６．５ｇ，１．６３Ｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびナトリウム（５．１ｇ，０．２２Ｍｏｌ）を不活性雰囲気下、２０℃で撹拌し、それからナトリウムが完全に溶解するまで６５℃に加熱した。混合物をさらに４５℃で２時間撹拌し、それからカニューレを通して化合物１４（６０．０ｇ，０．１０２Ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２４０ｍｌ）へ移した。化合物２３／ナトリウム溶液は高粘度であるため、それは６５℃に保たれ、化合物１４／ＴＨＦ溶液が０℃に冷却されている間に、６５℃で移された。
移送が完全に終了（１時間）した後、温度を０℃に３時間保ち、それから一晩中、２０℃に保った。反応を塩化アンモニウム飽和溶液（２５０ｍｌ）で停止した。ＴＨＦを蒸発させ、残った水層をＤＣＭ（３  ５  ２５０ｍｌ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。
フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル  ０−１０％）後、純度の高い化合物１５（Ｃ20Ｈ42Ｏ9，２５．２ｇ，５８％）を無色粘稠性オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．１７（シリカ，ＭｅＯＨ／ＥＡ）
1H NMR（CDCl3）δ: 3.61-3.52（m,28H,CH2OCH2）;3.45（t,3J（H,H）=6.0Hz,4H,CH2OH）; 1.59（m,8H,CH2CH2CH2OH）．
13C NMR（CDCl3）δ: 71.2, 71.1, 70.4, 70.3, 70.25,70.2,69.9（CH2OCH2）; 62.2（CH2OH）; 29.8,26.4（CH2CH2CH2OH）．
FAB+MS（NBA/NaI）:予想される正確な質量（M+Na+）/z 449.2727，実測値449.2738．
１−フタルイミド−２７−ヒドロキシ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカン（１６）の合成
0003989542.tif 000017
化合物１６：化合物１５（２３．６ｇ，５５．３ｍＭｏｌ）、フタルアミド（６．３ｇ，４２．５ｍＭｏｌ）、ＰＰｈ3（１１．２ｇ，４２．５ｍＭｏｌ）および無水ＴＨＦ（２９０ｍｌ、ナトリウム上で蒸留）を不活性雰囲気下、撹拌した。ＤＥＡＤ（ジエチルアゾジカルボキシレート、７．４ｇ，４２．５ｍＭｏｌ）無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）中を２０℃でシリンジポンプ（８．４ｍｌ／ｈ）を用いてゆっくりと添加した。添加が終了した後、反応混合物を２０℃で一晩中、撹拌した。溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ、そして残った固体を沸騰するｄＨ2Ｏに取った。冷却後、沈澱物を濾過し、そして水溶液を高真空下、乾燥状態にまで蒸発させた。このようにして得られたオイルをクロマトグラフ（シリカ  フラッシュ  ａ）ＤＣＭ，ｂ）ＭｅＯＨ／ＥＡ  ０−１０％）にかけると、化合物１６を無色粘稠性オイルとして与えた（Ｃ28Ｈ45ＮＯ10，１１．６ｇ，回収された化合物１５を基準にして９５．２％）。
Ｒｆ＝０．１（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル２％）
1H NMR（CDCl3）δ: 7.81（m,2H,Ar）; 7.70（m,2H,Ar）; 3.69（t,3J（H,H）=6.9Hz,2H,CH2N）; 3.63-3.45（m,30H,CH2OCH2 and CH2OH）; 1.74-1.60（m,8H,CH2CH2CH2O．
13C NMR（CDCl3）δ: 168.4（CO）; 133.9,132.1,123.1（Ar）; 71.3,70.6,70.5,70.4,70.1,70.0（CH2OCH2）; 62.6（CH2OH）; 37.7（CH2N）; 30.2,26.9,26.6,25.3（CH2CH2CH2O）．
FAB+MS（NBA/NaI）: 556（M+H+）/z;予想される正確な質量（M+Na+）/z 578.2941，実測値578.2963．
１−フタルイミド−２７−〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカン（１７）の合成（図３の工程ｉ；化合物１７は中間体であり、そのため示されていない）
化合物１７：化合物１６（１．４ｇ，２．５７ｍＭｏｌ）およびＤＭＴｒＣｌ（１．７４ｇ，５．１ｍＭｏｌ）をピリジン中（１０ｍｌ）、２０℃で４８時間撹拌した。Ｅｔ3Ｎ（１ｍｌ）を加えて、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。このようにして得られたオイル状残渣をＤＣＭ（２０ｍｌ）に取り、ｄＨ2Ｏ（２  ５  ２０ｍｌ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして高真空下、乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０−７５％）の後、化合物１７（Ｃ49Ｈ63Ｏ12Ｎ，１．９ｇ，８６％）を淡黄色オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．３３（シリカ，ＥＡ）．
1H NMR（CDCl3）δ: 7.84（m,2H,フタルイミド）; 7.71（m,2H,フタルイミド）;7.44（d,3J（H,H）=7.2Hz,2H,Ph DMTr）; 7.32（d,3J（H,H）=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr）;7.28（t,3J（H,H）=7.7Hz,2H,Ph DMTr）; 7.20（t,3J（H,H）=7.1Hz,1H,Ph DMTr）; 6.82（d,3J（H,H）=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 3.79（s,6H,CH3O）; 3.71（t,3J（H,H）=6.9Hz,2H,CH2N）; 3.64-3.42（m,28H,CH2OCH2）; 3.06（t,3J（H,H）=5.9Hz,2H,CH2ODMTr）; 1.80-1.59（m,8H,CH2CH2CH2O）．
13C NMR（CDCl3）δ: 168.5（CO）; 158.2,145.3,136.6,130.0,128.2,127.7,126.5,112.9（DMTr Ar）;133.9,132.1,123.2（フタルイミドAr）; 85.8（（p-MeOPH）2PhCO）;71.3,70.6,70.55,70.2,70.0（CH2OCH2）; 63.0（CH2ODMTr）; 55.2（CH3O）; 37.7（CH2N）; 26.9,26.7,26.6,25.3（CH2CH2CH2O）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+Cs+）/z 990.3405，実測値990.3382．
１−アミノ−２７〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカンIV（図３，工程ｊ）の合成
0003989542.tif 000018
化合物（IV）：化合物１７（１．１ｇ，２．３ｍＭｏｌ）、（ＮＨ2）2（０．４ｍｌ，１２．８ｍＭｏｌ）およびエタノール（４０ｍｌ）を２時間還流した。冷却した後、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。残ったオイルをジエチルエーテルに取り、そして沈澱物を濾過し除いた。有機相を乾燥状態にまで蒸発させると化合物IV（Ｃ41Ｈ61ＮＯ10，０．８５ｇ，９１％）を与えた。これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
1H NMR（CDCl3）δ:7.44（d,3J（H,H）=7.1Hz,2H,Ph DMTr）; 7.32（d,3J（H,H）=8.9Hz,4H,P-MeOPh DMTr）;7.28（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,Ph DMTr）; 7.20（t,3J（H,H）=7.1Hz,1H,Ph DMTr）; 6.82（d,3J（H,H）=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr）; 3.79（s,6H,CH3O）;3.65-3.40（m,28H,CH2OCH2）; 3.05（t,3J（H,H）=6.0Hz,2H,CH2ODMTr）; 2.70（t,3J（H,H）=6.5Hz,2H,CH2NH2）; 1.7-1.45（m,8H,CH2CH2CH2O）．
13C NMR（CDCl3）δ: 158.2,145.3,136.6,130.0,128.1,127.7,126.5,112.9（Ar）; 85.6（（p-MeOPh）2PhCO）;71.3,71.2,70.5,70.1,70.0（CH2OCH2）; 63.0（CH2ODMTr）;55.2（CH3O）;42.0（CH2NH2）; 30.4,27.0,26.6,26.5（CH2CH2CH2O）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+H+）/z 728.4374，実測値728.4351;860（M+Cs+）/z．
２７−フタルイミド−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカノン酸（Ｖ）（図３，工程ｍ）の合成
0003989542.tif 000019
化合物（Ｖ）：化合物１６（８．６ｇ，１５．５ｍＭｏｌ）および二クロム酸ピリジニウム（２９．２ｇ、７７．５ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（１４５ｍｌ）中、不活性雰囲気下２０℃で１２時間撹拌した。ｄＨ2Ｏ（１５００ｍｌ）を加え、反応媒体をＤＣＭ（４  ５  １５００ｍｌ）で抽出した。
有機層を合せ、５００ｍｌ最終体積にまで蒸発させ、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。残渣をジエチルエーテル（５００ｍｌ）に取り、そして不溶物質を取り除くためにＣｅｌｉｔｅ上で濾過した。溶媒を蒸発させた後、得られたオイルをクロマトグラフ（シリカ  フラッシュ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル０−１０％）にかけると、無色粘稠性オイルとして純度の高い化合物Ｖ（Ｃ28Ｈ43ＮＯ11，７．２ｇ、８２％）を与えた。
Ｒｆ＝０．４（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル１０％）。
1H NMR（CDCl3）δ: 7.82（m,2H,Ar）; 7.70（m,2H,Ar）; 3.67（t,3J（H,H）=6.9Hz,2H,CH2N）; 3.62-3.44（m,28H,CH2OCH2）; 2.41（t,3J（H,H）=7.2Hz,2H,CH2CO2H）;1.87（m,2H,CH2CH2CO2H）; 1.71（m,2H,NCH2CH2）; 1.61（m,2H,NCH2CH2CH2）．
13C NMR（CDCl3）δ: 176.8（CO2H）; 168.4（CO）; 133.9,132.1,123.2（Ar）;70.6,70.5,70.1（CH2OCH2）; 37.7（CH2N）;31.0（CH2CO2H）; 26.9（CH2CH2CO2H）; 25.3,24..8（CH2CH2CH2N）．
FAB+MS（NBA/NaI）; 570（M+H+）/z;予想される正確な質量（M+Na+）/z 592.2734，実測値 592.2748; 614（M-H+ +2Na+）/z．
２７−アミノ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカノン酸（１８）（図３，工程ｊ）の合成
0003989542.tif 000020
化合物１８：化合物Ｖ（２．７ｇ，４．７ｍＭｏｌ）、（ＮＨ2）2ヒドラジン（１．５ｍｌ，４８．０ｍＭｏｌ）およびエタノール（１２０ｍｌ）を３時間還流した。冷却した後（１時間）、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。残ったオイルを１Ｍ塩酸に取り、紙の上を濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして高真空下で乾燥した。これをＭｅＯＨ／ジエチルエーテル３０％に取り、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させると、化合物１８を塩酸塩の形態で与えた（Ｃ20Ｈ42ＮＯ9Ｃｌ、２．０ｇ、８９．４％）。出発物質（Ｖ）が注意深く精製されていないならば、この化合物は、さらにＤｏｗｅｘ  ＡＧ１Ｘ８（ＯＨ-）上で精製しかつ１Ｍ塩酸で溶離させることができる。
1H NMR（D2O）δ: 3.82-3.72（m,24H,OCH2CH2O）; 3.70-3.66（m,4H,CH2CH2CH2O）; 3.15（t,3J（H,H）=6.6Hz,2H,CH2NH3Cl）; 2.58（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,CH2CO2H）; 2.03（m,2H,CH2CH2CO2H）; 1.85（m,4H,CH2CH2CH2NH3Cl）．
13C NMR（D2O）δ: 184.2（CO2H）; 72.1,71.8,71.5,71.1（CH2OCH2）; 41.2（CH2NH3Cl）; 32.5（CH2CO2H）; 27.6（CH2CH2CO2H）; 26.0, 25.7（CH2CH2CH2NH3Cl）．
FAB+MS（NBA）:予想される正確な質量（M-Cl-）/z 440.2860,実測値440.2850．
２７−Ｆｍｏｃ−アミド−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカノン酸（VI）（図３，工程ｎ）の合成
0003989542.tif 000021
化合物１８（１．０ｇ，２．１ｍＭｏｌ）の塩酸塩および１０％炭酸ソーダ（７．８ｍｌ，７．４ｍＭｏｌ）をジオキサン（５．７ｍｌ）およびｄＨ2Ｏ（７．４ｍｌ）中で、０℃撹拌した。ジオキサン（５．７ｍｌ）中ＦｍｏｃＣｌ（０．６ｇ，２．３ｍＭｏｌ）を１５分間にわたって滴下した。温度を４時間、４℃に保ちさらに２０℃に１時間保った。０．０１Ｍ塩酸（１３５ｍｌ）を加え、その混合物をＤＣＭ（３  ５  ７０ｍｌ）で抽出した。
有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして減圧下、乾燥状態にまで蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）の後、化合物VI（Ｃ35Ｈ51ＮＯ11，１．２ｇ，８７％）を純度の高い無色粘稠性オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．２（シリカ，酢酸エチル）。
1H NMR（CDCl3）δ: 7.79（d,3J（H,H）=7.4Hz,2H,Ar）; 7.63（d,3J（H,H）=7.4Hz,2H,Ar）; 7,42（t,3J（H,H）=7.3Hz,2H,Ar）; 7.34（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,Ar）; 5.23（t,3J（H,H）=5.3Hz,1H,OCONH）; 4.43（t,3J（H,H）=6.8Hz,2H,CH2OCONH）; 4.24（t,3J（H,H）=6.7Hz,1H,CHCH2OCONH）; 3.70-3.45（m,28H,CH2OCH2）; 3.26（m,2H,OCONHCH2）; 2.43（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,CH2CO2H）; 1.92（m,2H,CH2CH2CO2H）; 1.63（m,4H,NCH2CH2CH2）．
13C NMR（CDCl3）δ: 173.9（CO2H）; 156.4（OCONH）; 143.9,141.2,127.5,127.0,125.0,119.8（Ar）; 70.8,70.5,70.0,66.2（CH2OCH2）; 51.5（CHCH2OCONH）; 47.2（CHCH2OCONH）; 40.7（OCONHCH2）; 30.6（CH2CO2H）; 26.7（CH2CH2CO2H）; 26.6,24.8（OCONHCH2CH2CH2）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+Cs+）/z 794.2516，実測値794.2527．
２７−Ｂｏｃ−アミド−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカノン酸（VII）（図３，工程ｏ）の合成
0003989542.tif 000022
化合物１８の塩酸塩（０．８４ｇ，１．７６ｍＭｏｌ）およびＥｔ3 Ｎ（１．０ｍｌ，７．３ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）中、０℃不活性雰囲気下、撹拌した。ＤＭＦ（１０ｍｌ）中Ｂｏｃ2Ｏ（０．４６ｇ，２．１ｍＭｏｌ）を１５分間にわたって滴下した。温度を２０℃に上昇し、そして混合物を３時間、さらに撹拌した。ｄＨ2Ｏ（４ｍ）を加えて、過剰のＢｏｃ2Ｏを潰し、そして高真空下乾燥状態にまで溶媒を蒸発させた。残ったオイルを０．０１Ｍ塩酸（２５ｍｌ）に取り、そして酢酸エチル（３  ５  ２５ｍｌ）で抽出した。有機層を合せ、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）の後、化合物VII（Ｃ25Ｈ49ＮＯ11，０．８ｇ，８４％）を純度の高い無色粘稠性オイルとして得た。
Ｒｆ＝０．２６（シリカ，ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １０％）。
1H NMR（CDCl3）δ: 3.70-3.40（m,28H,CH2OCH2）; 3.09（m,2H,CH2NHCO）; 2.42（t,3J（H,H）=7.1Hz,2H,CH2CO2H）; 1.88（m,2H,CH2CH2CO2H）; 1.55（m,4H,CONHCH2CH2CH2）; 1.41（s,9H,（CH3）3C）．
13C NMR（CDCl3）δ: 176.9（CO2H）; 156.0（OCONH）; 70.8,70.5,70.4,70.0,69.9（CH2OCH2 and （CH3）3C）;40.2（OCONHCH2）; 30.8（CH2CO2H）; 28.3（CH3）3C）; 26.7,26.65（OCONHCH2CH2CH2）; 24.8（CH2CH2CO2H）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+Cs+）/z 672.2360，実測値672.2385;804（M-H+ +2Cs+）/z．
FAB+MS（NBA）:予想される正確な質量（M+H+）/z 540.3384，実測値540.3405．
図４に示される（Ｓ８）のためのＦｍｏｃ−Ａｌａ2中間体の合成
本化合物は、Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９，４７−５３頁に記載されている方法に従って合成された。
典型的な手順は下記の通りである。Ｈ2ＮＡｌａ2ＯＨ（５．０ｇ，３１．２ｍＭｏｌ，Ｓｉｇｍａから商業的に入手できる）および１０％炭酸ナトリウム（８３ｍｌ，７８．０ｍＭｏｌ）をジオキサン（５５ｍｌ）およびｄＨ2Ｏ（５７ｍｌ）中、０℃で撹拌した。ＦｍｏｃＣｌ（９−フルオレニルメチルクロロフォーメート）（８．５ｇ，３２．８ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）ジオキサン（５５ｍｌ）中を３０分間にわたって滴下した。温度を０℃に１時間、２０℃に１時間維持した。反応の経過中に現われた沈澱物は、ｄＨ2Ｏ（３６０ｍｌ）およびジオキサン（２１０ｍｌ）を添加し、続いて２０℃で１時間撹拌することによって溶解させた。
反応媒体を注意深くｐＨ２〜３に酸性化し、生成した沈澱物を濾過し、そして液相を酢酸エチル（３  ５  ２５０ｍｌ）で抽出した。有機層を減圧下、乾燥状態になるまで蒸発させると、白い固体を残し、これは濾過によって得られた沈澱物と合せてそしてｄＨ2Ｏ（２５０ｍｌ）に懸濁した。それから濾過し、ｄＨ2Ｏ（５００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下、乾燥した。このようにして得られた固体をジエチルエーテル（２５０ｍｌ）に懸濁して濾過し、ジエチルエーテル（５００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下、乾燥するとＦｍｏｃＡｌａ2（Ｃ21Ｈ22Ｎ2Ｏ5，９．３ｇ，７７．５％）を白色固体として与えた。融点１９２℃
Ｒｆ＝０．３５（シリカ，クロロホルム／ＭｅＯＨ／ＣＨ3ＣＯ2Ｈ  ８５／１０／５）．
1H NMR（DMF,d7）δ: 8.18（d,3J（H,H）=7.3Hz,1H,OCONH）;7.94（d,3J（H,H）=7.5Hz,2H,Ar）;7.77（t,3J（H,H）=7.5Hz,2H,Ar）;7.53（d,3J（H,H）=7.8Hz,1H,CONH）;7.44（t,3J（H,H）=7.5Hz,2H,Ar）;7.35（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,Ar）;4.45-4.20（m,5H,CHCH2OCONH,CHCH3）; 1.37;（d,3J（H,H）=7.2Hz,6H,CH3）．
13C NMR（DMF d7）δ:174.8（CO2H）;173.2（CONH）;156.7（OCONH）;145.0,144.9,141.8,128.4,127.8,126.2,126.1,120.8（Ar）;67.0（CH2OCONH）;51.0（CHCH2OCONH）;48.5,47.7（CHCH3）;18.7,17.8（CH3）．
FAB+MS（NBA）:予想される正確な質量（M+H+）/z 383.1607，実測値383.1618．
図４に示される（Ｓ８）のためのＺ−（Ｌ）Ａｌａ2−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）ＯＭｅ（２６）中間体の合成
化合物２６：化合物２４（２．３５ｇ，８ｍＭｏｌ：Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる）、化合物２５の塩酸塩（２．３ｇ，８ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる）およびＥｔ3Ｎ（４．５ｍｌ，３２ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（８０ｍｌ）中、０℃で撹拌した。ＨＢＴＵ（６．０ｇ，１６ｍＨＣｌ）ＤＭＦ（８０ｍｌ）中を１時間にわたって滴下し、反応混合物を２０℃で３時間、撹拌し、そして０℃で一晩中保管した。ｄＨ2Ｏ（２０ｍｌ）を添加して、過剰のＨＢＴＵを潰し、そして高真空下、乾燥状態になるまで溶媒を蒸発させた。このようにして得られた固体をクロマトグラフィー（シリカ  フラッシュ，酢酸エチル／ＤＣＭ  ０−５０％）にかけると、化合物２６が白い固体として得られた（Ｃ28Ｈ37Ｎ3Ｏ7，３．７５ｇ，９１．５％）。
融点１６７℃
Ｒｆ＝０．３８（シリカ，酢酸エチル／ＤＣＭ ５０％）．
1H NMR（CDCl3）δ: 7.34（m,5H,Ph,Z）; 6.98（d,3J（H,H）=9Hz,2H,Tyr Ar）; 6.89（d,3J（H,H）=8.5Hz,2H,Tyr Ar）; 6.80（d,3J（H,H）=7.5Hz,1H,CONH）; 6.73（d,3J（H,H）=7.5Hz,1H,CONH）; 5.54（d,3J（H,H）=7.1Hz,1H,OCONH）; 5.10（d,3J（H,H）=3.0Hz,2H,CH2Ph Z）; 4.78（m,1H,CHCH2,Tyr）; 4.49（m,1H,CHCH3）; 4.26（m,1H,CHCH3）; 3.65（s,3H,CO2CH3）; 3.04（d,3J（H,H）=6.1Hz,2H,CHCH2 Tyr）, 1.40-1.20（m,15H,（CH3）3C and CH3）．
13C NMR（CDCl3）δ:172.1,171.7,171.5（CO2CH3,CONH）; 156.0（OCONH）; 154.5,136.1,130.4,129.6,128.5,128.2,128.1,124.2（Ar）;78.4（（CH3）3C）; 67.0（CH2OCONH）; 53.4,52.3,48.9（NHCHRCO）; 50.5（CO2CH3）; 37.2（CHCH2 Tyr）; 28.8（（CH3）3C）;18.7,18.3（CH3CH）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+Cs+）/z 660.1686，実測値660.1664．
図４に示される（Ｓ８）のためのＨ2Ｎ−（Ｌ）Ａｌａ2−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）ＯＭｅ（２７）中間体の合成
化合物２７：化合物２６（３．６ｇ，７ｍＭｏｌ），Ｐｄ／Ｃ  １０％（０．３６ｇ，１０重量％）をエタノール（１７５ｍｌ）中に懸濁し、５０ｐｓｉの水素圧下に置いた。反応混合物を２０℃、３時間激しく振盪した。懸濁液をそれからシーライト上で濾過し、そしてシーライトをＤＣＭ（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を合せ、そして乾燥状態になるまで蒸発させた。化合物２７を淡黄色のオイルとして得た（Ｃ20Ｈ31Ｎ3Ｏ5，２．７ｇ、定量的収率）、そしてこれをさらに精製することなしに次の工程で用いた。
Ｒｆ＝０．２８（シリカ，クロロホルム／ＭｅＯＨ／Ｅｔ3Ｎ  ８８／１０／２）
1H NMR（CDCl3）δ: 7.70（d,3J（H,H）=6.8Hz,1H,CONH）; 7.00（d,3J（H,H）=8.4Hz,2H,Ar）;6.86（m,3H,Ar and CONH）; 4.78（m,1H,CHCH2,Tyr）; 4.43（m,1H,CHCH3）;3.67（s,3H,CO2CH3）; 3.45（brd,1H,H2NCHCH3）; 3.04（m,2H,CHCH2 Tyr）; 2.16（brd,2H,NH2）; 1.40-1.15（m,15H,（CH3）3C and CH3）．
13C NMR（CDCl3）δ:175.5,171.9,171.85（CONH）;154.3,130.7,129.7,124.1（Ar）;78.4（（CH3）3C）; 53.3,52.3,48.3（NHCHRCO）; 50.4（CO2CH3）;37.1（CHCH2 Tyr）; 28.8（（CH3）3C）; 21.2,17.5（CH3CH）．
FAB+MS（NBA）：予想される正確な質量（M+H+）/z 394.2342,実測値394.2330．
図４に示される（Ｓ８）のためのＺ−（Ｌ）Ａｌａ4−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）ＯＭｅ（２８）中間体
化合物２８：化合物２７（２．６ｇ，６．６ｍＭｏｌ）、化合物２４（１．９５ｇ，６．６ｍＭｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（３．７ｍｌ，２６．４ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（６０ｍｌ）中、０℃で撹拌した。ＨＢＴＵ（４．９ｇ，１３．２ｍＭｏｌ）ＤＭＦ（６０ｍｌ）中を１時間かけて滴下し、そして反応混合物を２０℃で３時間、撹拌し、そして４℃で一晩中、保管した。ｄＨ2Ｏ（２０ｍｌ）を添加して過剰のＨＢＴＵを潰し、そして溶媒を高真空下、乾燥状態になるまで蒸発させた。化合物２８を沸騰するＤＣＭから白色結晶状固体として得た（Ｃ34Ｈ47Ｎ5Ｏ9，３．８ｇ，８７％）。
分解点２３２℃
1H NMR（DMSO d6）δ:8.24（d,3J（H,H）=7.4Hz,1H,CONH）; 8.02（d,3J（H,H）=7.3Hz,1H,CONH）; 7.92（d,3J（H,H）=7.5Hz,1H,CONH）; 7.89（d,3J（H,H）=7.7Hz,1H,CONH）; 7.49（d,3J（H,H）=7.4Hz,1H,CONH）; 7.37-7.30（m,5H,Ph Z）; 7.11（d,3J（H,H）=8.5Hz,2H,Tyr Ar）; 6.86（d,3J（H,H）=8.4Hz,2H,Tyr Ar）; 5.02（s,2H,PhCH2 Z）; 4.42（m,1H,CHCH2 Tyr）; 4.25（m,3H,CHCH3）; 4.04（m,1H,CHCH3）; 3.55（s,3H,CO2CH3）; 2.93（m,2H,CHCH2 Tyr）,1.25（s,9H,（CH3）3C）; 1.17（m,12H,CHCH3）．
13C NMR（DMSO d6）δ: 172.4,172.2,171.9,171.6（CO2CH3 and CONH）;155.8（OCONH）;153.7,137.1,131.6,129.7,128.4,127.9,127.8,123.6（Ar）;77.8（（CH3）3C）; 65.4（CH2OCONH）; 53.7,51.8,48.1,48.0,47.8（NHCHRCO）; 50.0（CO2CH3）; 36.0（CHCH2 Tyr）; 28.6（（CH3）3C）;18.3,18.1（CH3CH）．
FAB+MS（NBA）:予想される正確な質量（M+H+）/z 670.3452，実測値670.3483．
図４に示される（Ｓ８）のためのＨ2Ｎ−（Ｌ）Ａｌａ4−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）ＯＭｅ（２９）中間体の合成
化合物２９：化合物２８（３．５ｇ，５．２ｍＭｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ  １０％（０．３５ｇ，１０重量％）をエタノール／ＤＭＦ１／１（１７５ｍｌ）中、化合物２８が完全に溶解する（１５−３０分）まで音波処理し、それから５０ｐｓｉの水素圧下に置いた。懸濁液を室温で５時間激しく振盪し、シーライト上で濾過し、それからシーライトをエタノール／ＤＭＦ１／１（１００ｍｌ）で洗浄した。有機層を高真空下乾燥状態になるまで蒸発させた。得られた固体は、すべての通常の有機溶媒中でゲルを形成する強い傾向がある。
純度の高い化合物２９（Ｃ26Ｈ41Ｎ5Ｏ7，２．７ｇ，定量的収率）を沸騰アセトニトリルから黄色の泡状体として得た。
融点１９８℃
Ｒｆ＝０．１２（シリカ，アセトニトリル）
1H NMR（DMF d7）δ: 8.29（brd,1H,CONH）; 8.20（d,3J（H,H）=7.0Hz,1H,CONH）; 8.15（d,3J（H,H）=7.6Hz,1H,CONH）; 7.91（d,3J（H,H）=7.5Hz,1H,CONH）; 7.20（d,3J（H,H）=8.5Hz,2H,Ar）; 6.93（d,3J（H,H）=8.4Hz,2H,Ar）; 4.57（m,1H,CHCH2,Tyr）;4.38（m,3H,CHCH3）; 3.64（s,3H,CO2CH3）; 3.57（m,1H,H2NCHCH3）; 3.04（m,2H,CHCH2,Tyr）; 1.40-1.20（m,21H,（CH3）3C and CH3）．
13C NMR（DMF d7）δ:175.8,173.3,173.1,172.7,172.6（CONH and CO2CH3）; 155.0,132.6,130.5,124.5（Ar）;78.4（（CH3）3C）;54.8,51.2,49.6,49.5,49.2（NHCHRCO）;52.2（CO2CH3）;37.2（CHCH2 Tyr）;29.0（（CH3）3C）;21.1,18.6,18.4,18.1（CH3CH）．
FAB+MS（NBA）:予想される正確な質量（M+H+）/z 536.3084,実測値536.3070．
図４に示されるグルタレート−（Ｌ）Ａｌａ4−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）ＯＭｅ（Ｓ８）の合成
0003989542.tif 000023
化合物Ｓ８：化合物２９（１ｇ，１．９ｍＭｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（１．０ｍｌ，７．６ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）中、０℃で撹拌した。無水グルタル酸（０．２３ｇ，１．９ｍＭｏｌ）ＤＭＦ（５０ｍｌ）中を、４５分間かけて滴下した。その後で温度を２０℃（３時間）に上昇した。反応媒体を４℃で一晩中、保管した。高真空下、溶媒を乾燥状態になるまで蒸発させ、そして得られた固体を０．１Ｍ塩酸（５０ｍｌ）に懸濁し、そして音波処理（１０分間）した。白色沈澱物を濾過し、０．１Ｍ塩酸、ｄＨ2Ｏ、ＤＭＦ、ｄＨ2Ｏおよびエタノール（各１００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下乾燥すると、Ｓ８を白色粉末（Ｃ31Ｈ47Ｎ5Ｏ10，０．９６ｇ，７８％）として与えた。融点２６３℃
1H NMR（DMSO d6）δ:8.22（d,3J（H,H）=7.4Hz,1H,CONH）; 8.04（d,3J（H,H）=6.6Hz,1H,CONH）; 8.02（d,3J（H,H）=6.7Hz,1H,CONH）; 7.88（d,3J（H,H）=6.7Hz,1H,CONH）; 7.86（d,3J（H,H）=7.1Hz,1H,CONH）; 7.10（d,3J（H,H）=8.4Hz,2H,Ar）; 6.86（d,3J（H,H）=8.4Hz,2H,Ar）; 4.41（m,1H,CHCH2 Tyr）; 4.22（m,4H,CHCH3）; 3.54（s,3H,CO2CH3）; 2.92（m,2H,CHCH2 Tyr）, 2.19（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,CH2CO2H）; 2.13（t,3J（H,H）=7.4Hz,2H,CH2CONH）;1.68（m,2H,HO2CCH2CH2）; 1.25（s,9H,（CH3）3C）; 1.22-1.10（m,12H,CH3）．
13C NMR（DMF d7）δ:174.9,174.3,173.7,173.6,173.0,172.7,172.65（CONH,CO2H,CO2CH3）;155.0,132.7,130.6,124.5（Ar）; 78.6（（CH3）3C）; 54.8,50.6,50.4,49.8,49.4（NHCHRCO）; 52.2（CO2CH3）;37.3（CHCH2 Tyr）;35.1,33.8（HO2CCH2CH2CH2CONH）; 29.0（（CH3）3C）;21.5,18.2,17.8,18.7（HO2CCH2CH2,CHCH3）．
FAB+MS（NBA/CsI）:予想される正確な質量（M+Cs+）/z 782.2377，実測値782.2397; 914（M-H+ +2Cs+）/z．
コードされた反応カセットの初期の実施の形態
マトリックス：
この技術を実施するための初期の試みで、本発明者らは種々な問題に遭遇した。第１に、ＣＰＧ（細孔のサイズをそろえたガラス）のようなある種のマトリックス材料は、不安定であった。そしてポリヌクレオチド−基質混成物を遊離し、望まない背景反応をもたらした。本発明者らは、固体支持体と第１のリンカーとの間の結合がこの問題を引き起こすと推定した。不安定性の問題に加えて、ＣＰＧはポリヌクレオチド合成（２５）の間にポリヌクレオチド鎖が上でのばせる自由な水酸基を有しており、これが望ましくない不安定な結合に導いた。第２の困難はカセットの酵素的開裂が、マトリックスおよび／又はポリヌクレオチドによる基質の立体障害のために遅く、不完全（データを示さず）であるということであった。この理由から、本発明者らは、固体支持体と基質の間および／または基質とポリヌクレオチドの間のいずれかのリンカーの長さを延ばさざるを得なかった。本目的のためには、ＴｅｎｔａＧｅｌがより良い機械的および化学的性質を有することが分かった。さらに、それは障害の問題を弱める長いポリオキシエチレンアームを持つ。最後に、合成はカセットが短時間に容易に合成できるように簡単でなければならなかった。これらすべての考慮は、図式１に示す戦略を導びいた。
【図式１】
0003989542.tif 000024
ＴｅｎｔａＧｅｌはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とＰＳ（ポリスチレン）のテンタクル共重合体である。それは、固相ペプチド合成で成功裏に用いられてきた。例えば、Ｂ．Ｇ．ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ，Ｂ．Ｇ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９４：３５巻，２７３３−２７３６頁；Ｊ．Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８７）；２６巻，５１９９−５２０２頁；Ｇ．ＢａｒａｎｙらＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｌｆｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（第１２回アメリカンペプチドシンポジウム会報）（１９９２）：Ｅｓｃｏｎ，Ｌｅｉｄｅｎ，６０４頁を参照。それは固相ＤＮＡ合成に成功裏に用いられてきた。例えば、Ｈ．Ｇａｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９１）：３２巻，５４７７−５４８０頁およびＰ．Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９３）；３４巻，３３７３−３３７６頁を参照。ＴｅｎｔａＧｅｌは、また生物触媒と適合性があることも示された。例えば、Ｌ．Ｍｅｌｄａｌら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４），１８４９頁を参照。
それは極端なｐＨにも安定であり、種々の溶媒中で用いることができる。普通のすべての溶媒中での高い膨潤性（４−７倍）は、生物触媒を含む反応にそれを使用するのに興味があるものとする付加的な特徴である。このポリマーは、オリゴヌクレオチド合成のための可溶性支持体として使用されてきたポリエチレングリコールと同じ移動度および動特性を持つ。例えば、Ｅ．Ｂａｙｅｒ，Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）：３２巻，５４７７〜５４８０頁を参照。それは高い拡散係数、収着および機械的安定性を有する。官能基が完全に溶媒和されているので（上記参照）、反応速度は溶液中にあるのと同程度である。樹脂のポリエチレングリコール部（７０−８０重量％）が物理化学的な挙動を支配するので、その上に成長した基質−ポリヌクレオチド混成物は、有機又は水性溶液に可溶化されるであろう。最後に、このマトリックスは異なった官能基（ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨＯ、Ｂｒ）を持つものとして商業的に入手でき、これは異なった型の基質の導入を容易にする。
カセットの基質部の合成
本発明のカセット法を研究するために選ばれた触媒は、化学的、物理的によく定義されていなければならなかった。α−キモトリプシンは、この目的のために理想的な酵素と考えられた。カセットの基質部は、α−キモトリプシンに対して最良の基質であることが知られているＬ−Ａｌａ2−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ａｌａ2であった。例えば、Ｗ．Ｋ．Ｂａｕｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７３）：３９巻，３８１−３９１を参照。この基質の選択は、これら初期の研究に於ける本発明者らの目標は系の感度の下限を探すことであったという事実に基づいてなされたものであった。
ＴｅｎｔａＧｅｌマトリックスは、カセット基質の直接取り付けを許す末端官能基を持つ延びたポリエチレングリコールアームを備えているので、固体支持体と基質の間にスペーサーを導入する必要はなかった（図式１）。マトリックスのローディングは約２８０ｍｍｏｌｅ／ｇである。障害のある部位の発生を避けるために、合成の第１段階で大過剰のマトリックスを加え、そして未反応基をキャップすることにより最もむき出しにされたもののみを官能基化した（４０−６０ｍｍｏｌ／ｇ）。
基質とＤＮＡタッグの間の間隔がカセットの非常に重要な設計特徴であると本発明者らは予想した。そこで４つの異なったりンカーを合成した（図１５）、リンカーＬ−１は、ゆっくりとＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）保護基を失い、純粋な化合物から分離するのが実用的でない副生成物の生成を誘起する。
そこで、ＣＢＺ（ベンジルオキシカルボニル）保護基を持つより安定な誘導体Ｌ−IIを合成した。残念ながら、Ｌ−ＩおよびＬ−IIの両方のアセトキシ基は、基質の脱保護基反応に要求される強酸性条件下（ＣＦ3ＣＯ2Ｈ／エタンジチオール９５％，２時間）、不安定であることが見い出された。従って、不安定なアセトキシ基を持たない、より長いＬ−Ｉ、Ｌ−IIIを合成することが好ましい。しかしながら、Ｌ−IIIは樹脂上のペプチドと効率よくカップリングしなかった。その代り、自由なアミノ基（マトリックス−ペプチド）はリンカーのＦｍｏｃと非可逆的に反応した。例えば、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９０）Ｌ  ３５巻，１６１−２１４を参照。
従って、これらの結果はＬ−IVが好適な連結剤であることを教示する。ここに報告されたすべてのデータは、この連結剤を備えるカセットを採用する。上記の３つの連結剤のみが今まで試験されたので、未だ試されていない他の付属の連結剤がより優れているという可能性もある。
代表的な基質として選択されたペプチド配列は、チロシン−Ｏ−ｔ−Ｂｕにおいてトリフルオロ酢酸／エタンジチオール９５％、２時間との脱保護基反応を必要とする。
ポリヌクレオチド合成の後でこの脱保護基反応を実施することができないので（強酸はポリヌクレオチド上多くの副反応をもたらす）、チロシンの保護基をｔ−Ｂｕから、ＤＮＡの脱保護基反応と同時に取り除くことができる塩基に不安定な保護基に変更する必要があった。図式２に保護基の交換並びにリンカーの導入に用いられた経路を例示する。本発明の実験に於ける用途とは別に、この系が種々な基質と適合できるように、容易に変換され、そして化学的に修正されうることをこの合成は示す。
【図式２】
0003989542.tif 000025
カセットのポリヌクレオチド部の合成
ポリヌクレオチド配列を図１６に示す。それは２つのプライマーと基質を確認する１つのコード配列を有し、この場合基質は各々のアミノ酸が恣意的にトリプレットヌクレオチド配列を割当てられたペンタペプチドである。自明のことながら、基質の性質をコードするのにいかなるヌクレオチド配列を用いてもよく、そしてコードの性質の選択は試験基質の数と複雑さに依存するであろう。
３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡ合成機で、ＣＰＧ固体支持体を用いる標準的なホスホラミダイト法は、ＴｅｎｔａＧｅｌマトリックスでは効率がよくなかった。例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９９０）Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｂｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。
段階あたりの収率は〜９８％から〜８５％に落ちた。４５段階の後では、ＣＰＧでの全収率は〜４０％、そしてＴｅｎｔａＧｅｌではわずか〜０．０７％であった。古典的な方法の修正が要求された。数多くの試みの後、方法の３つの主な修正（材料および方法の項を参照）が段階あたりの収率を〜８５％から〜９７％（これは全収率に於いて〜０．０７％から〜２５％への増加に対応する）へ増加することが見い出された。このようにして得られたペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよびペプチドを脱保護基化するために濃アンモニアに晒され、続いてジメトキシトリチル保護基を取り除くために、３％ジクロロメタン−トリクロロ酢酸処理に供された。
反応特異性
カセットは酵素開裂に供され、そして遊離されたポリヌクレオチドのＰＣＲによる増幅の後での結果は、図１７に示されている。
トリプシン、ペプシン、パパイン、カルボキシペプチダーゼＡ、プロテイナーゼＫ、α−キモトリプシン、α−キモトリプシン＋Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ（ボーマン−バーク）阻害剤、および酵素なしを用いての２０℃、３０分間のインキュベート後の結果をレーン１−８が示す。例えば、Ｙ．Ｂｉｒｋ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８５）：第２５巻，１１３−１３１頁を参照。レーン９は正のコントロール、レーン１０は負のコントロールに対応する。
レーン６のデータは、α−キモトリプシンの存在下、４５ヌクレオチドに対応するバンドが存在することを示し、これはこの酵素による基質の最終的な開裂を示唆する。さらに、この解釈はコントロール実験によっても支持される。カセットがトリプシン、ペプシン、パパイン、又はカルボキシペプチダーゼＡとともにインキュベートされた時、バンドがアガロースゲル上に検出されなかった。これは、これらの酵素の特異性と一致している。Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤がα−キモトリプシン（レーン７）に添加された時、開裂が検出されなかった。予期されたように、プロティナーゼＫの存在下、バンドが検出され、これはこの酵素による最終的な開裂を示唆する。バンドの強度は、プロティナーゼＫによる開裂がα−キモトリプシンによって達成される開裂よりも弱いことを示す。この結果は、α−キモトリプシンが本研究に用いた基質に対して特異的である事実と一致する。いかなる酵素も存在しない場合（レーン８）、３０分後でも開裂が検出されない。
本研究に用いた反応条件下、α−キモトリプシンの１ｐｍｏｌｅの酵素活性が容易に検出された。本実験に用いた基質濃度（２９．５ｍＭ）はかなり飽和状態（３２）以下であったので、検出の感度を改善することができるはずである。さらに、基質とポリヌクレオチドの間にあるより長いリンカーは酵素の基質に対する接近し易さを増すことを予備的な実験が示した（データは示さず）。
アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を分析するのは、触媒のライブラリーがスクリーンされる場合には、骨がおれる仕事になりうるが、その代りに反応混合物に単にＤＮＡに挿入（インターカレーション）されると蛍光の増強を起こす蛍光プローブを加えることができる。図１７の差し込みは、ＹＯＹＯ−１の存在とともに、反応媒質の紫外線光（２５４ｎｍ）下で取られた写真を示す。第１のウェルはレーン６の実験に、第２のウェルはレーン８の実験に、そして第３のウェルは、いかなる添加物も加えない緩衝液中でのプローブに対応する。最大の蛍光の増強は、増幅されたＤＮＡを含む第１のウェルにある。第２のウェルは、プローブとプライマーとの相互作用の結果として生じる背景蛍光を示す。予期されたように、第３のウェルは検出できるいかなる蛍光をも示さない。ＹＯＹＯ−１プローブの別の利点は、ＰＣＲ生成物の量（直接的に酵素開裂の効率に関連があるべきである）が定量化できることである。例えば、Ｍ．Ｏｇｕｒａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４）：１６巻，１０３２−１０３３頁を参照。
反応感度
α−キモトリプシンが存在しなければ、２４時間後ＤＮＡ４５ｍｅｒに対応するバンドが検出されたことに興味深く気が付いた（データは示さず）。この背景反応は、固体支持体とポリヌクレオチドの第１の塩基との間のどこかでの結合の加溶媒分解か、あるいは単にマトリックスからの漏れによるであろう。開裂部位（単数または複数）を定義する試みとして、基質単位を欠く同一のカセット（ポリヌクレオチドが直接、混成ホスホジエステル結合を介してマトリックスに結合されている）を合成した。このマトリックスと標準カセットが別々に、酵素なしでインキュベートされた時、１６時間の後、背景反応を検出できる。この触媒されていない反応の検出し易さは、２９時間および５１時間の間に増加する。
もしこの触媒されていない反応がマトリックスからの漏れ又はホスホジエステル結合の加溶媒分解反応から生じたならば、カセットが基質単位を含んでいたかどうかに関わらず４５ｍｅｒＤＮＡが同時に検出されたであろう。１６時間後の検出可能な開裂がペプチド基質を含むカセットに限定されているという事実は、結合の加溶媒分解が基質の配列で、最もありそうにはペプチド結合で起こることを示唆している。ペプチド結合の背景反応開裂が観察される時すなわち１６時間後、ホスホジエステル結合の加溶媒分解は検出されない。しかしながら、２９時間後までには、ホスホジエステル結合の加溶媒分解が検出される。
ペプチド結合の加水分解の速度定数が〜３×１０-9Ｓ-1（ｔ1/2〜７年）と仮定すると、２９．５ｍＭのカセット濃度でペプチド結合の加水分解の速度は、〜９×１０-14Ｍ／ｓとなる。例えば、Ｄ．Ｋａｈｎ及びＷ．Ｃ．Ｓｔｉｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８）：１１０巻，７５２９−７５３４頁を参照。１５時間後、溶液中に〜５ｎｍｏｌｅの遊離ポリヌクレオチドがあることを予測するであろう。この量はＰＣＲで容易に検出可能であることが知られている。ホスホジエステル結合の加水分解の速度定数（５．７×１０-14 ｓ-1）は、ペプチド結合の加水分解の定数よりも非常に遅いので、基質単位を欠くカセットの背景反応は長いインキュベーション時間の後でのみ検出されるであろう。例えば、Ｅ．Ｈ．Ｓｅｒｐｅｒｓｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）：２６巻，１２８９−１３００頁を参照。
コードされたカセット系の実用性
カセット系が再現性よく働き、そして全カセットが通常の合成化学を用いて４８時間以内に組み立てることができることを開示した。本方法の簡便さおよび融通性の理由から、多数の可能性ある触媒の分析が４時間以内で実施できる。現在の検出限界は約〜１ｐｍｏｌｅであるが、この系の感度および効率は容易に改善されうる。これらの改善は、基質の濃度を増加するか、および／または固体支持体上のローディングを増加するか、および／または基質とポリヌクレオチドの間により長いリンカーを導入するかのいずれかによって達成されるかもしれない。
この系は結合の開裂又は形成が最初の出来事である変換反応に限定されない。ただ１つの要求は化学的変換が結合を他の試薬に対して不安定にするということである。例えば、ジハイドロキシレーション触媒の探索に於いて、オレフィンを基質として用いることができる。何故ならば、それがジヒドロキシル化された時、過ヨウ素酸塩によって選択的に開裂されうるからである。さらに、カセットが既知の酵素の基質となるように変換反応がカセットを修飾する系を想像することができる。例えば、Ｋ．Ｍｏｒｉｋａｗａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９３）：１１５巻，８４６３−６４頁を参照。
最後に、未だ最適化されていないＰＣＲ条件を使用してさえ、何年もの半減期を持つ触媒されていない化学反応を数時間で検出できることがここで実証された。実質的にいかなる触媒的結合開裂又は形成の事象も原理的には非常に短時間で容易に検出できることをこれは証明する。本方法は、酵素が劣るためか、又は、より重要に、触媒が大きいライブラリーのほんの一員であり、そしてそのため低濃度で存在するためか、のいずれかの理由から低効率である事象の検出に応用可能であるべきである。
材料および方法
化学薬品は、ペプチド合成について、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍおよびＡｌｄｒｉｃｈから、ＤＮＡ合成について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから、そしてＰＣＲ実験について、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。ＹＯＹＯ−１プローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（モレキュラー  プローブス  インク．）から購入した。溶媒は、ＦｉｓｈｅｒまたはＢａｘｔｅｒから購入した（水含量が０．００１％未満）。リンカーの合成のための化学薬品は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてさらに精製することなく使用した。
基質合成
ＴｅｎｔａＧｅｌは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ又はＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から商業的に入手できる。ペプチドは標準的Ｆｍｏｃ方法に従って組み立てた。例えば、Ａ．ＡｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８９）：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。典型的な手順では、３等量のアミド結合形成用のカップリング試薬、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）、３等量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、６等量のＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン（ＤＩＥＡ）および３等量のＮ−α（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ａａ）（ジメチルアセトアミド中）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤した樹脂に加える。Ｋａｉｓｅｒ試験で判定するとカップリング反応は１時間以内で完結する。例えば、Ｅ．Ｋａｉｓｅｒら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７０）：３４巻，５９５頁およびＶ．Ｋ．Ｓａｒｉｎら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）：１１７巻，１４７を参照。各段階の後で、樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、メタノールおよびＤＣＭで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中、２０％ピペリジン（２×１０分）と処理することによって除去された。各段階の収量は、少量の試料からのＦｍｏｃ基の滴定によって決定された。例えば、Ａ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ａ．＆ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｂｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８９）：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１０７頁を参照。４０−６０ｍｍｏｌｅ／ｇの最終ローディングを得るために、合成の最初の段階は、Ｆｍｏｃ−ａａに対して固体支持体の４倍過剰で実施した。すべての最終洗浄の後、未反応のアミノ基をキャップした（０．２５体積の無水酢酸４．２３Ｍ，２，６−ルチジン中；０．７５体積のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，ＴＨＦ中；２×１０分）。ペプチド合成の全収率は〜９８％であった。
チロシン上の水酸基のためのｔ−ブチル保護基は、トリフルオロ酢酸／エタンジオール９５％と２時間処理し、続いてＤＣＭ、メタノールおよびＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドで多量に洗浄することにより除去された。Ｆｍｏｃ保護基はリンカーにカップリングする前に除去された（図式IIを参照）。チロシン−Ｏ−Ｌ−IVを含むマトリックスは、フェノール環の選択的脱保護基化（濃アンモニア３時間）およびキャッピング（０．２５体積の無水酢酸４．２３Ｍ，２，６−ルチジン中；０．７５体積のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，ＴＨＦ中，３０分間）の後でチロシン−Ｏ−アセチルに変換された。各工程後の収量は、ジメトキシトリチル陽イオンアッセイによって決定した。例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｂｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９０）：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，４８頁を参照。
リンカーＬ−IVは、ピリジン中、４−ヒドロキシブチレートのナトリウム塩およびジメトキシトリチルクロライドから一段階で合成された。例えば、Ｈ．Ｓｃｈａｌｌｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）：８５巻，３８２１−３８２７頁を参照。
ＤＮＡ合成
ＤＮＡ合成は、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡ合成機で実施された。標準的な１ｍｍｏｌｅサイクルを以下のように修正した。すなわち、１）すべての洗浄段階３、５９、６１、６６、７７および９４を３０秒に延長した。より長いか、より短かい時間を用いると収量を減少させた。２）ホスホラミダイトおよびテトラゾールとのインキュベーション時間（段階４５）を２５秒から１２０秒に延長した。３）ホスホラミダイトの濃度を０．１Ｍから０．２Ｍに増加した。塩基は、５５℃で２０時間、濃アンモニアで処理することにより脱保護基化された。ジメトキシトリチル基はＤＣＭ中、３％トリクロロ酢酸と処理し（５分間）、続いてＤＣＭ、テトラヒドロフラン、メタノール、トリスー塩酸緩衝液（２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍｍｏｌｅ）、そしてｄＨ2Ｏ（脱イオン水）で多量に洗浄することによって除去した。この工程の後、カセットはそのまま使用可能である。
酵素的開裂および阻害実験
カセット（１ｍｇ，５．９ｍｍｏｌｅ／ｇ）を２０ｍｌトリス−塩酸緩衝液（２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍｍｏｌｅ）および１７０ｍｌ  ｄＨ2Ｏに懸濁した。０．８５ｎｍｏｌｅのトリプシン、ペプシン、パパイン、カルボキシペプチダーゼＡ、α−キモトリプシン、又はα−キモトリプシン＋１ｍｇ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（１９）（すべて１０ｍｌ  ｄＨ2Ｏ中）を、反応媒質に加え、そして混合物を２０℃で振盪した。３０分後、上澄み液（１８．７ｍｌ）を取り出し、ＰＣＲ試験に供した。
ＰＣＲ実験
反応混合物からのアリコート（１８．７ｍｌ）をＰＣＲ成分（ＭｇＣｌ2 ２．５ｍｍｏｌ，１．２ｍｌ；Ｔａｑ緩衝液２ｍｌ；デオキシヌクレオチドトリフォスフェート２．５ｍｍｏｌｅ  １．６ｍｌ；プライマー１００ｐｍｏｌｅ／ｍｌ  １ｍｌ）と混合した。Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ，０．５ｍｌ）を第１ＰＣＲサイクルを開始するほんの少し前に添加した。正のコントロール（ＰＣＲ成分のみ）は、本研究に用いたポリヌクレオチド配列の１ｐｍｏｌｅを含むｄＨ2Ｏで行った。負のコントロールは、同一条件下、ポリヌクレオチド配列なしで行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ  ９６００装置で次のサイクルプログラム（変性反応９４℃，３０秒；アニーリング５５℃，３０秒；エクステンション７２℃，３０秒）を用いて行った。３５サイクルの後、結果をアガロースゲル（１％Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，２％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧ，ＴＢＥ１Ｘ，１０３ｍＶ）上で分析した。
蛍光アッセイ
ＰＣＲの後、反応上澄み液（２５ｍｌ）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに移し、そしてｄＨ2Ｏ（１７５ｍｌ）およびメタノール（５０ｍｌ）で２５０ｍｌに希釈した。プローブ（１ｍｌ，ＹＯＹＯ−１）をこの媒質に加え、そして結果を紫外光（２５４ｎｍ）の下で分析した。
触媒されていない反応
基質ユニットを欠くカセットを以下のようにして合成した。
ヒドロキシ官能基を有するＴｅｎｔａＧｅｌ（１ｇ）をピリジン（４ｍｌ）中、室温で３日間、ジメトキシトリチルクロライド（１０等量，８５ｍｇ）と振盪した。ジメトキシトリチル基の滴定は、３２ｍｍｏｌｅ／ｇのローディングを示した。未反応ヒドロキシル基をアセチル化した（０．２５体積の無水酢酸４．２３Ｍ，２，６−ルチジン中；０．７５体積のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，ＴＨＦ中，３０分間）。前記の方法に従って、このマトリックス上でＤＮＡ合成を実施した。
基質を欠くカセット（０．５ｍｇ，１２．２ｍｍｏｌｅ／ｇ）および基質単位を備えるカセット（１ｍｇ，６．２ｍｍｏｌｅ／ｇ）を２０ｍｌトリス−塩酸緩衝液（２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ  １６０ｍｍｏｌｅ）および１８０ｍｌｄＨ2Ｏ中に別々に懸濁した。混合物を２０℃で振盪し、そして２時間後、１６時間後、２９時間後、および５１時間後に取ったアリコート（１８．７ｍｌ）をＰＣＲ試験に供した。
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：キム  ディー  ジャンダ
ハイカム  フェンニリ
チリャード  エー  レーナー
（ii）発明の名称：コードされた反応カセット
（iii）配列の数：１４
（iv）郵送住所：
（Ａ）受信人：ザ  スクリップス  リサーチ  インスティテュート
（Ｂ）町名：１０６６６  ノース  トーリ  パインズ  ロード
ティーピーシー８
（Ｃ）市名：ラホヤ
（Ｄ）州名：カリフォルニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：９２０３７
（v）コンピューター読み出し形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチ
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ＃１．０
バージョン＃１．２５
（vi）本出願データー
（Ａ）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ／９６
（Ｂ）出願日：１９９６年１月１８日
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願データー：
（Ａ）出願番号：ＵＳ  ０８／３７４，０５０
（Ｂ）出願日：１９９５年１月１８日
（viii）代理人情報：
（Ａ）氏名：トナルド  ジー  ルイス
（Ｂ）登録番号：２８，６３６
（Ｃ）参照（ドケット）番号：４４５．１ＰＣ
（ix）テレコミニケーション情報：
（Ａ）電話：（６１９）５５４−２９３７
（Ｂ）テレファックス：（６１９）５５４−６３１２
（２）配列番号１についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１：
0003989542.tif 000026
（２）配列番号２についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２：
0003989542.tif 000027
（２）配列番号３についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３：
0003989542.tif 000028
（２）配列番号４についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：修飾部位
（Ｂ）位置：５
（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ
付記：Ｘａａはアラニン−グルタレートである。
（xi）配列の記載：配列番号４：
0003989542.tif 000029
（２）配列番号５についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号５：
0003989542.tif 000030
（２）配列番号６についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：修飾部位
（Ｂ）位置：１
（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ
付記：Ｘａａはメチル化チロシン−ｏ−ｔ−ブチルである。
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：修飾部位
（Ｂ）位置：５
（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ
付記：Ｘａａはアラニン−グルタレートである。
（xi）配列の記載：配列番号６：
0003989542.tif 000031
（２）配列番号７についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：修飾部位
（Ｂ）位置：３
（Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａ
付記：Ｘａａはチロシン−ｏ−ｔ−ブチルである。
（xi）配列の記載：配列番号７：
0003989542.tif 000032
（２）配列番号８についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号８：
0003989542.tif 000033
（２）配列番号９についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号９：
0003989542.tif 000034
（２）配列番号１０についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号１０：
0003989542.tif 000035
（２）配列番号１１についての情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号１１：
0003989542.tif 000036
（２）配列番号１２についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号１２：
0003989542.tif 000037
（２）配列番号１３についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号１３：
0003989542.tif 000038
（２）配列番号１４についての情報：
（i）配列の特性：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列番号１４：
0003989542.tif 000039
【図１】
0003989542.tif 000040
【図２】
0003989542.tif 000041
【図３】
0003989542.tif 000042
【図４】
0003989542.tif 000043
【図５】
0003989542.tif 000044
【図６】
0003989542.tif 000045
【図７】
0003989542.tif 000046
【図８】
0003989542.tif 000047
【図９】
0003989542.tif 000048
【図１０】
0003989542.tif 000049
【図１１】
0003989542.tif 000050
【図１２】
0003989542.tif 000051
【図１３】
0003989542.tif 000052
【図１４】
0003989542.tif 000053
【図１５】
0003989542.tif 000054
【図１６】
0003989542.tif 000055
【図１７】
0003989542.tif 000056