(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体と、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ピリジン、環式カーボネート類、テトラヒドロフラン、乳酸エチル、アセトニトリル又はこれらの混合物である抽出溶媒との懸濁液に、２価以上の金属塩および／または界面活性剤を添加して、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含む溶液から未溶解細胞残査を凝集させて除去することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の抽出分離方法。
【請求項２】
界面活性剤が陽イオン性である請求項１記載のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の抽出分離方法。
【請求項３】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子が導入された菌株である請求項１または２記載の抽出分離方法。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）とＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）とＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との３成分共重合体である請求項１〜３記載の抽出分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の、微生物菌体からの抽出分離方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋め立てなどにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋め立て地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際問題としてプラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋め立て、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多い。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならない生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。
【０００３】
これら生分解プラスチックの中でも、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の菌体内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される生分解性を有する熱可塑性ポリエステルであり、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されているために、特に注目されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能であると考えられている。
【０００４】
微生物によって生成されたＰＨＡは、顆粒体を形成して菌体内に蓄積されており、これらをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内から分離して取り出す必要がある。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶剤にＰＨＡを溶解させて抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法とがある。
【０００５】
有機溶媒を用いたＰＨＡの抽出分離方法としては、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといった疎水性のハロゲン含有炭化水素を抽出溶媒として用いる方法（特開昭５５−１１８３９４号、特開昭５７−６５１９３号）、また、ジオキサン（特開昭６３−１９８９９１号）またはプロパンジオール（特開平０２−６９１８７号）またはテトラヒドロフラン（特開平０７−７９７８８号）の様な親水性の抽出溶媒を用いた方法が提案されている。しかし、これらの方法においてはＰＨＡを実用に値する濃度まで溶解しようとすると、その抽出液は極めて粘重となり、抽出溶媒に溶解しなかった菌体残査とＰＨＡを含む溶媒層との分離が非常に困難であるという欠点を有している。
【０００６】
一方、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法もいくつか提案されているが（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９，１９８−２０９頁（１９５８）、特公平０４−６１６３８号、特表平０８−５０２４１５号、特開平０７−１７７８９４号）、ＰＨＡの著しい低分子化が起こったり、得られるＰＨＡの純度が低い等の問題点を有する上に、処理工程が多く複雑であったり、毒性の高い薬品を必要とする、あるいはコストが極めて高くなるなど、いずれも、実用には適さない方法であるのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微生物菌体からのＰＨＡの抽出において、抽出溶媒に溶解しなかった菌体残査とＰＨＡを含む溶媒層とを効率よく分離する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＨＡを工業的有利に生産できる方法について鋭意検討した結果、ＰＨＡを含有する微生物菌体と抽出溶媒の懸濁液に、２価以上の金属塩、または界面活性剤を添加することにより、抽出液に溶解しなかった細胞残査を凝集させ、効率よく分離除去できることを見いだし、本発明に到達した。
【０００９】
即ち、本発明は、ＰＨＡを含有する微生物菌体と抽出溶媒の懸濁液に、２価以上の金属塩および／または界面活性剤を添加して、ＰＨＡを含む溶液から未溶解細胞残査を凝集させて除去することを特徴とするＰＨＡの抽出分離方法に関する。
【００１０】
好ましい実施態様としては、界面活性剤が陽イオン性である上記抽出分離方法に関する。
【００１１】
別の好ましい実施態様としては、ＰＨＡを含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子が導入された菌株である上記抽出分離方法に関する。
【００１２】
更に別の好ましい実施態様としては、ＰＨＡが、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体、または、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体である上記抽出分離方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えば、アルカリゲネス・リポリチカ（Ａｉｃａｌｉｇｅｎｅｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、アルカリゲネス・ラタス（Ａｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔａｓ）等のアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌が挙げられ、中でも、アロエモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）等の菌株、または、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群の遺伝子が導入された菌株、例えば、アルカリゲネス・ユウトロファスＡ３２Ｃ（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）等がより好ましい。
【００１４】
これらの微生物の培養方法は、ＰＨＡを多量に効率よく菌体内に蓄積できるものであれば特に限定はなく、例えば、前記アルカリゲネス・ユウトロファスＡ３２Ｃ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）を用いる場合には、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８８０頁（１９９７）等に記載の方法が好ましい。
【００１５】
本発明におけるポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）とは、特に限定されないが、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）のホモポリマーや３ＨＢと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体が好ましく、更には、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）との２成分共重合体（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））または、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（特開平０８−２８９７９７号）などが、物性の面からより好ましい。ここで、３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＢユニットの含有量が１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニット含有量が１〜９５モル％、３ＨＶユニット含有量が１〜９６モル％、３ＨＨユニット含有量が１〜３０モル％といった組成比のものが好適である。またこれらＰＨＡの分子量は１０万以上が好ましく、５０万以上がより好ましい。
【００１６】
ＰＨＡの微生物菌体中の含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥菌体中に２０重量％以上が好ましく、抽出操作、分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮すると５０重量％以上が特に好ましい。
本発明においては、前記のようにして培養して得られた微生物菌体を、培養液から分離した湿菌体としてそのまま用いても良いし、または湿菌体を凍結乾燥機等で乾燥処理して乾燥菌体として用いても良い。さらには、ミルや高圧ホモジナイザー等の物理的破砕処理、界面活性剤、次亜塩素酸ナトリウムや有機溶剤等の化学処理で菌体の一部を破壊し、または菌体の一部を除去してＰＨＡの含有量を高めたものを用いても良い。
【００１７】
本発明で使用するＰＨＡの抽出溶媒としては、ＰＨＡが溶解するものであれば特に限定されず、例えば、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ピリジン、１，２−プロピレンカーボネートのような環式カーボネート類、テトラヒドロフラン、乳酸エチルやアセトニトリル等やこれらの溶媒の混合物、例えばクロロホルムとメタノールの混合物やクロロホルムとテトラヒドロフランの混合物等の混合溶媒系が挙げられる。
【００１８】
本発明で使用する金属塩としては、２価以上の金属イオンと、一般的な対イオンからなる金属塩であれば特に限定されず、例えば、金属イオンとしては、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、アルミニウム、バリウム、マンガン、銅、コバルト等が挙げられ、対イオンとしては、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン等が挙げられ、金属塩の具体的な例としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄、塩化亜鉛、塩化バリウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化マンガン、塩化アルミニウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等が例示できる。また、本発明で使用される界面活性剤としては、陰イオン性、陽イオン性、両性もしくは非イオン性でも良いが、好ましくは陽イオン性界面活性剤であり、具体的には、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、テトラデシルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド、トリエチルヘキシルアンモニウムブロミド、４，４−トリメチレンビス（１−メチルピペリヂン）、トリメチルフェニルアンモニウムブロミド、ベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アセタミン８６（花王株式会社製）コータミン２４Ｐ（花王株式会社製）等が挙げられる。
【００１９】
本発明で使用する金属塩や界面活性剤の添加量は特に制限されないが、微生物菌体懸濁液１Ｌあたり０．００１〜１０重量％の範囲の濃度となるように添加するのが好ましく、さらには、０．０１〜５重量％の範囲の濃度がより好ましい。０．００１重量％以下の濃度では効果が低く、１０重量％を超える濃度の場合、コストの面から好ましくない。
【００２０】
本発明においては、上記金属塩と界面活性剤をいずれか単独で使用しても良いし、併用しても良い。金属塩や界面活性剤の投入方法は、液体や固体のまま菌体懸濁液に投入し溶解させても良いし、あらかじめ溶液としたのち菌体懸濁液に投入しても良い。金属塩や界面活性剤の投入に際しては菌体懸濁液内での金属塩や界面活性剤の分散を促進させるために菌体懸濁液を攪拌したほうが好ましい。微生物菌体の未溶解細胞残渣を凝集させるための攪拌時間、攪拌温度については適宜設定できる。
【００２１】
本発明においては、ＰＨＡを含有する微生物菌体と抽出溶媒との懸濁液に、上記のように金属塩や界面活性剤を添加処理することで、懸濁液中の未溶解細胞残渣が凝集するために、ＰＨＡ溶液を容易に分離することが出来る。ここで利用できる分離操作は、特に限定されないが、例えば、ろ過、デカンテーション、遠心分離機や膜分離などを一般に知られている方法が利用できる。ろ過による分離操作については一般に用いられるろ材、具体的にはろ紙、ろ布、網（メッシュ）、多孔性セラミック、多孔性金属板、多孔性フィルムなどが利用できる。デカンテーションによる分離操作としては例えば、微生物懸濁液を攪拌後、5分から2時間、好ましくは１０分から１時間静置し、適当な方法、たとえば吸引機などで懸濁液上部の澄んだ溶液を回収すればよい。遠心分離器による分離操作については一般に知られている条件を利用でき、遠心分離器は回分式、連続式どちらでも利用できる。
【００２２】
この様にして未溶解細胞残渣と分離して得られたＰＨＡ溶液のポリマー純度は非常に高く、これを公知の方法で溶媒を除去すれば高純度のＰＨＡを得ることが出来る。もちろん目的に応じて、結晶化やその他の精製方法を用いて更に純度を向上させることも出来る。
【００２３】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユウトロファス  ＡＣ３２（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）株を、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０項（１９９７）に記載の方法で培養し（培地：Na2HPO4・12H2O 11.3g、KH2PO4 1.9g、(NH4)2SO4 6g、プロエキス（播州調味料（株）製 10g、MgSO4・7H2O 1g、ヤシ油 50g、微量金属元素溶液（組成：FeCl2・6H2O 16.2g、CaCl2・2H2O 10.3g、CoCl2・6H2O 0.2g、NiCl3・6H2O 0.1g、CrCl3・6H2O 16.2g、CuSO4・5H2O 0.2g / 1L 0.1N-HCl）5ml / 1L、ｐＨ６．７、培養温度30℃、培養時間72時間）、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（３ＨＢユニット：３ＨＨユニット＝９０：１０（モル比）、分子量  約１００万）を約５０重量％含有した菌体を得た。これを遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して培養液から分離し、湿菌体とした。この湿菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体としたのちに、乾燥菌体で５０ｇ／ｌとなるようにクロロホルムに懸濁し、室温で５時間攪拌を行って３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の抽出を行った。この微生物菌体を含む抽出液に、陽イオン界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドを１０ｇ／ｌとなるように加えて更に１時間攪拌し未溶解細胞残査を凝集させ、これをろ紙（桐山製作所製、Ｎｏ．４）を用いて桐山ロートにて吸引ろ過し、凝集菌体残査を分離除去した。この時目詰まりすることなくろ過を行うことが出来た。得られた濾液に、攪拌しながらメタノールを加えて３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の結晶を析出させ、該結晶をろ過により集め減圧下に乾燥した。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率を計算したところ、９８％であった。
【００２５】
（実施例２）
実施例１において、陽イオン性界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドをヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率は９６％であった。
【００２６】
（実施例３）
実施例１において、抽出溶媒をクロロホルムからテトラヒドロフランに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率は８７％であった。
【００２７】
（実施例４）
実施例１で得られた湿菌体を、乾燥することなく５０ｇ／ｌとなるようにテトラヒドロフランに懸濁し、加熱還流下で５時間攪拌を行って３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の抽出を行った。この微生物菌体を含む抽出液に、塩化カルシウムを１０ｇ／ｌとなるように加えて更に１時間攪拌し未溶解細胞残査を凝集させ、これをろ紙（桐山製作所製、Ｎｏ．４）を用いて桐山ロートにて吸引ろ過し、凝集菌体残査を分離除去した。この時目詰まりすることなくろ過を行うことが出来た。得られた濾液を、攪拌しながら室温まで冷却し、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の結晶を析出させ、該結晶をろ過により集め減圧下に乾燥した。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率は８０％であった。
【００２８】
（実施例５）
実施例４において、塩化カルシウムをベンジルトリメチルアンモニウムクロリドに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率は８３％であった。
【００２９】
（実施例６）
アルカリゲネス・ユウトロファス（ＡＴＣＣ１７６９９）株を、グルコースを炭素源として培養し（培地：グルコース  20g、Na2HPO4・12H2O 9g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 6g、MgSO4・7H2O 0.2g、微量金属元素溶液（組成：FeCl2・6H2O 16.2g、CaCl2・2H2O 10.3g、CoCl2・6H2O 0.2g、NiCl3・6H2O 0.1g、CrCl3・6H2O 16.2g、CuSO4・5H2O 0.2g / 1L 0.1N-HCl）5ml / 1L、ｐＨ６．８、培養温度30℃、培養時間４８時間）、３ＨＢのホモポリマー（３ＨＢユニット  100％）を菌体内に約６０重量％含有した菌体を得た。これを遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して培養液から分離し、湿菌体とした。この湿菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体としたのちに、乾燥菌体で５０ｇ／ｌとなるようにクロロホルムに懸濁し、室温で５時間攪拌を行って３ＨＢホモポリマーの抽出を行った。この微生物菌体を含む抽出液に、陽イオン性界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドを１０ｇ／ｌとなるように加えて更に１時間攪拌しクロロホルムに溶解しない細胞残査を凝集させ、これをろ紙（桐山製作所製、Ｎｏ．４）を用いて桐山ロートにて吸引ろ過し、凝集菌体残査を分離除去した。この時目詰まりすることなく、ろ過を行うことが出来た。得られた濾液に、攪拌しながらメタノールを加えて３ＨＢホモポリマーの結晶を析出させ、該結晶をろ過により集め減圧下に乾燥した。得られた３ＨＢホモポリマーの回収率を計算したところ、９５％であった。
【００３０】
（実施例７）
実施例６において、陽イオン性界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドをヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢホモポリマーの回収率は９４％であった。
【００３１】
（実施例８）
実施例６において、抽出溶媒をクロロホルムからテトラヒドロフランに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢホモポリマーの回収率は８５％であった。
【００３２】
（実施例９）
実施例６で得られた湿菌体を、乾燥することなく５０ｇ／ｌとなるようにテトラヒドロフランに懸濁し、加熱還流下で５時間攪拌を行って３ＨＢホモポリマーの抽出を行った。この微生物菌体を含む抽出液に、塩化カルシウムを１０ｇ／ｌとなるように加えて更に１時間攪拌し未溶解細胞残査を凝集させ、これをろ紙（桐山製作所製、Ｎｏ．４）を用いて桐山ロートにて吸引ろ過し、凝集菌体残査を分離除去した。この時目詰まりすることなくろ過を行うことが出来た。得られた濾液を、攪拌しながら室温まで冷却し、３ＨＢホモポリマーの結晶を析出させ、該結晶をろ過により集め減圧下に乾燥した。得られた３ＨＢホモポリマーの回収率は８１％であった。
【００３３】
（実施例１０）
実施例９において、塩化カルシウムを陽イオン性界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドに変更した以外は同様の操作を行った。得られた３ＨＢホモポリマーの回収率は８３％であった。
【００３４】
（実施例１１）
実施例１において、アルカリゲネス・ユウトロファス  ＡＣ３２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）をアエロモナス・キャビエ  ＦＡ４４０（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４３２）に変更した以外は同様の条件で培養し、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（３ＨＢユニット：３ＨＨユニット＝１０：９０（モル比））を約３０重量％含有した菌体を得た。これを遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して培養液から分離し、湿菌体とした。この湿菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体としたのちに、乾燥菌体で５０ｇ／ｌとなるようにクロロホルムに懸濁し、室温で５時間攪拌を行って３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の抽出を行った。この微生物菌体を含む抽出液に、陽イオン界面活性剤であるベンジルトリメチルアンモニウムクロリドを１０ｇ／ｌとなるように加えて更に１時間攪拌し未溶解細胞残査を凝集させ、これをろ紙（桐山製作所製、Ｎｏ．４）を用いて桐山ロートにて吸引ろ過し、凝集菌体残査を分離除去した。この時目詰まりすることなくろ過を行うことが出来た。得られた濾液に、攪拌しながらメタノールを加えて３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の結晶を析出させ、該結晶をろ過により集め減圧下に乾燥した。得られた３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体の回収率を計算したところ、９６％であった。
【００３５】
（比較例１）
実施例１において、ベンジルトリメチルアンモニウムクロライドを添加しなかった以外は同様の操作を行った。ろ過の段階で目詰まりが激しく菌体残渣を分離することができなかった。
【００３６】
（比較例２）
実施例６において、ベンジルトリメチルアンモニウムクロリドを添加しなかった以外は同様の操作を行った。その結果、ろ過の段階で目詰まりが激しく菌体残渣を分離することができなかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＨＡを含有する微生物菌体と抽出溶媒との懸濁液に、２価以上の金属塩や界面活性剤を添加するという極めて簡便な操作によって、未溶解細胞残査を凝集させて除去することが可能となり、容易に高純度のＰＨＡが得られるため、本発明は、微生物によるＰＨＡの工業的生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するものである。