(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノメチルホスホン酸の存在下に酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼを触媒として用いてグリコール酸を酸素と反応させてグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸を含んでなる生成物混合物を製造する方法において、アミノメチルホスホン酸を、アルキル基が独立にメチル、エチル、プロピル及びイソプロピルから選ばれるアミノメチルホスホン酸ジアルキルと置き換えることを含んでなり、それによって、グリオキシル酸の収率が増加したグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物を製造し、該増加した収率がアミノメチルホスホン酸によるカタラーゼの阻害の除去によるものであり、ここで、カタラーゼがハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）カタラーゼであることを特徴とする改良法。
【請求項２】
得られるグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルを含んでなる生成物混合物を、
（ａ）  対応するＮ−（ジアルコキシホスフェニルメチル）グリシンに還元し、そして
（ｂ）  加水分解してＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造する
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の製造法に関し、その方法では、グリコール酸及び酸素が、アミノメチルホスホン酸ジアルキルならびにグリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ、ＥＣ  １．１．３．１５）及びカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）から成る触媒の存在下に、水溶液中で反応させられる。この方法で製造され、得られるグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物は、多様な植物の成長の抑制に有用な広範囲の発芽後植物毒素（post-emergent phytotoxicant）及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造における有用な中間体である。
関連技術の説明
葉の茂った緑色植物及び哺乳類細胞に通常見いだされる酵素であるグリコレートオキシダーゼは、グリコール酸からグリオキシル酸への酸化を触媒し、過酸化水素を同時に生成する：
0003937445.tif 000002
は、グリコール酸からグリオキシル酸の中間生成を介した蟻酸及びＣＯ2への酸化を触媒する、タバコの葉から抽出された酵素を最初に報告した。エチレンジアミンなどのある種の化合物を添加すると、中間グリオキシル酸がさらに酸化されるのが制限された。酸化は約８のｐＨにおいて、典型的に約３〜４０ｍＭ（ミリモル）の濃度のグリコール酸を用いて行われた。グリコレート酸化のための最適ｐＨは、８．９であると報告された。シュウ酸（１００ｍＭ）は、グリコレートオキシダーゼの触媒作用を阻害することが報告された。同様に、Ｋ．Ｅ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３６，１２８０−１２８４（１９６１）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む緩衝液が、グリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒酸化においてシュウ酸の形成を阻害することを示した。Ｃ．Ｏ．Ｃｌａｇｅｔｔ，Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｒｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７８，９７７−９８７（１９４９）は、酸素を用いたグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒酸化の最適ｐＨが約７．８〜８．６であり、最適温度が３５〜４０℃であると報告した。
Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３）及びＪ．Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３７，２００１−２００９（１９６２）は、グリコール酸のホウレンソウグリコレートオキシダーゼ−触媒酸化における蟻酸及びＣＯ2の形成が、Ｈ2Ｏ2及びグリオキシル酸の非−酵素的反応から生ずることを報告した。彼らは、Ｈ2Ｏ2の分解を触媒する酵素であるカタラーゼの添加が、蟻酸及びＣＯ2の形成の抑制によりグリオキシル酸の収率を非常に向上させることを観察した。ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加がグリコレートオキシダーゼの安定性を非常に増すことも見いだされた。
Ｎ．Ａ．Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  ａｎｄ  Ｈ  Ａ．Ｈａｒｂｕｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３１，１３５−１５７（１９５８）は、ホウレンソウから単離されるグリコール酸オキシダーゼの調製及び性質につき報告した。精製された酵素は、溶液中で非常に不安定であることが見いだされ；この不安定性の原因は、酵素の活性部位へのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の比較的弱い結合、ならびに酵素的に活性な酵素のテトラマー及び／又はオクタマーの、酵素的に不活性で不可逆的に凝集し、沈澱するモノマー及びダイマーへの解離に帰せられた。酵素の溶液へのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加は、酵素の安定性を非常に増し、高いタンパク質濃度又は高いイオン強度は酵素をオクタマー又はテトラマーとして保持した。
グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の混合物の製造法は、米国特許第５，１３５，８６０号に記載された。グリコール酸及び酸素が水溶液中で、ならびにＡＭＰＡ及び２種の酵素触媒、グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下で反応させられた。この方法は、カタラーゼ（蟻酸の製造に責任のある副生成物である過酸化水素の破壊のため）及び、グリオキシレートと酸化−抵抗性Ｎ−置換ヘミアミナール及び／又はイミン錯体（さらなる酸化を制限）を形成することができるアミン添加物としてのＡＭＰＡの両方を用いることの相乗効果を示した。９２％もの高いグリオキシル酸の収率が報告され、得られるグリオキシル酸とＡＭＰＡの混合物は、発芽後植物毒素及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造に用いられた。
発明の概略
本発明は、水溶液中で、ならびにアミノメチルホスホン酸ジアルキル及び２種の酵素触媒、グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ、ＥＣ  １．１．３．１５）及びカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）の存在下において酸素を用いてグリコール酸を酸化することによるグリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の製造に関する。以前に用いられたアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）をアミノメチルホスホン酸ジアルキルに置換すると、ＡＭＰＡがカタラーゼ活性を阻害する反応におけるグリオキシル酸の収率の予期せぬ向上を生ずる。グリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物は、発芽後植物毒素及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造のために有用である。
米国特許第５，１３５，８６０号は、触媒として可溶性ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ及び可溶性カタラーゼ（例えばアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からの可溶性カタラーゼ）を用いたグリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の混合物の製造法を記載している。米国特許第５，１８０，８４６号は、これらの混合物を水添してＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造する方法を記載している。関連特許出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９５１，４９７は、ホウレンソウからの酵素グリコレートオキシダーゼ及び内因性カタラーゼの両方を発現する遺伝子操作された微生物の形質転換株を触媒として用いたグリオキシル酸／ＡＭＰＡ混合物の製造を記載している。ＡＭＰＡは、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換株により生産された内因性カタラーゼが過酸化水素を水と酸素に分解するのを可逆的に阻害し、有意な量のホルメート（過酸化水素によるグリオキシレートの酸化の生成物）の製造を生ずることが観察された。反応混合物にカタラーゼの第２の供給源（例えばアスペルギルス・ニゲルからの可溶性カタラーゼ）を添加すると、Ｈ．ポリモルファ又はＰ．パストリス形質転換株触媒のいずれを用いた場合も高収率のグリオキシル酸が製造された。
アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・ニズランス、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ、ピチア・パストリス及び牛肝臓からのカタラーゼが今回それぞれ、グリコレート／ＡＭＰＡ混合物の酸化の間に生成される過酸化水素の分解のための触媒として調べられ、以前には報告されていなかった、Ｈ．ポリモルファ、Ｐ．パストリス及び牛肝臓からのカタラーゼのＡＭＰＡによる可逆的な阻害が発見された。この阻害は、可溶性カタラーゼ、固定化カタラーゼ又はカタラーゼ−含有全細胞触媒のいずれが用いられるかにかかわらず起こった。触媒としてＡＭＰＡに阻害されるカタラーゼの供給源（例えばＨ．ポリモルファ又はＰ．パストリス形質転換株）を用いるグリコレート／ＡＭＰＡ反応物に追加の阻害−抵抗性のカタラーゼの供給源を加える代わりとして、これらの同じ反応物におけるＡＭＰＡの、アミノメチルホスホン酸ジアルキルへの置換は、アミン添加物としてＡＭＰＡが用いられると通常起こるある種のカタラーゼの阻害を除去する、又は有意に軽減する予期せぬ効果を有した。
触媒として可溶性グリコレートオキシダーゼ及びＡ．ニゲル可溶性カタラーゼ（これはＡＭＰＡにより阻害されない）又はＨ．ポリモルファ可溶性カタラーゼ（ＡＭＰＡにより阻害される）のいずれかを用いるグリコール酸の酸化において、ＡＭＰＡ及びアミノメチルホスホン酸ジエチル（ＤＥＡＭＰＡ）をアミン添加物として比較した；グリオキシル酸製造に最適の反応条件下（添付実施例に記載の通り）で得られたグリオキシル酸及び蟻酸の収率を下表に挙げる。Ａ．ニゲル又はＨ．ポリモルファ可溶性カタラーゼのいずれを用いた場合も、ＤＥＡＭＰＡを用いて製造されるグリオキシル酸の収率はＡＭＰＡを用いて得られる収率より高かった。Ａ．ニゲルカタラーゼの比較的低濃度におけるグリオキシレートの収率の向上は、ＤＥＡＭＰＡプロトン化アミンのｐＫa、（ｐＫa約６．４）がＡＭＰＡ（ｐＫa１０．８）より低いためであり得る；ＤＥＡＭＰＡの、より低いｐＫaは、反応が行われたｐＨ（ｐＨ８．３〜８．５）における非プロトン化ＤＥＡＭＰＡの、グリオキシル酸との酸化−抵抗性ヘミアミナール又はイミン錯体の形成に有利である。
0003937445.tif 000003
ＤＥＡＭＰＡ又はＡＭＰＡのいずれか、及びＨ．ポリモルファ可溶性カタラーゼを用いた反応におけるグリオキシレートの収率及びホルメートの製造の比較（上表を参照）は、アミン添加物としてＤＥＡＭＰＡを用いた場合の、予期せぬグリオキシレートの収率の顕著な向上及びホルメートの製造の減少を示している。ＤＥＡＭＰＡを用い、有意に低濃度のＨ．ポリモルファ可溶性カタラーゼを用いて高収率のグリオキシレートを得ることができた；ＡＭＰＡを用いた場合にこの同じカタラーゼの濃度を増加させてもＤＥＡＭＰＡを用いて得た収率に匹敵するグリオキシレートの収率を与えなかった。触媒としてＨ．ポリモルファ又はＰ．パストリス形質転換株のいずれかを用い、ＡＭＰＡをＤＥＡＭＰＡに置換した場合、類似のグリオキシレートの収率の向上及びホルメートの製造の減少が得られた（添付実施例を参照）。
好ましい実施態様の説明
グリコール酸の触媒酸化は、グリオキシル酸を形成するグリコール酸とＯ2の反応を触媒する酵素触媒の存在下でグリコール酸及び酸素分子源を接触させることにより簡便に行われる。１つのそのような触媒は、グリコール酸オキシダーゼとしても知られる酵素、グリコレートオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１５）である。グリコレートオキシダーゼは、当該技術分野（同上）において周知の多数の供給源から単離することができる。反応で用いられるグリコレートオキシダーゼは、有効な濃度で、通常約０．０１〜約１０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは約０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在しなければならない。ＩＵ（国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔ））は、１分当たりに１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。この酵素のアッセイのための方法は、Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３）に見いだされる。この方法は、回収される、又は再循環されるグリコレートオキシダーゼのアッセイにも用いられる。
グリコール酸からグリオキシル酸への酸化的変換のための触媒としてのグリコレートオキシダーゼの利用における最適の結果は、過酸化水素の分解のための触媒を反応溶液中に挿入することにより得られる。１つのそのような、グリコレートオキシダーゼとの組み合わせにおいて有効な過酸−破壊触媒は、酵素カタラーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．１１．１．６）である。カタラーゼは、過酸化水素の水及び酸素への分解を触媒し、本方法において、グリコール酸とＯ2のグリコレートオキシダーゼ触媒反応における副生成物として製造される過酸化水素の分解を促進することにより、グリオキシル酸の収率を向上させると思われる。カタラーゼの濃度は、５０〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは２，０００〜１５，０００ＩＵ／ｍＬでなければならない。カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼの濃度を上記の範囲内で、カタラーゼ対グリコレートオキシダーゼの比率（各酵素に関してＩＵで測定）が少なくとも約２５０：１であるように調節するのが好ましい。
触媒として可溶性酵素の使用に加え、グリコレートオキシダーゼ活性を内因性カタラーゼ活性と共に発現する微生物形質転換株が製造され、本発明における微生物触媒としてのそれらの利用が示された。本発明において用いられた微生物細胞触媒は、ハンセヌラ・ポリモルファ（メチロトローフ酵母（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ））の形質転換株である。十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有するＨ．ポリモルファの数種の形質転換株が、グリコレートオキシダーゼに関するＤＮＡをホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターの制御下の発現ベクター中に挿入することにより製造された。Ｈ．ポリモルファがこのベクターを用いて形質転換され、多量のグリコレートオキシダーゼを生産する株が選択され、Ｈ．ポリモルファＧＯ１と命名された。
典型的にＨ．ポリモルファ細胞触媒は、Ｈ．ポリモルファ形質転換株の接種材料を最初に５００ｍＬのＹＰＤ（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ４．４中で増殖することにより製造された。次いでこの培養物をｐＨ５．０において１０ＬのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）ｗ／ｏアミノ酸（１４ｇ）、硫酸アンモニウム（５０ｇ）及びメタノール（１００ｇ）を含む発酵槽中に接種した。発酵槽は３７℃、４００ｒｐｍの掻混ぜ（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）速度、５．０の一定のｐＨ、４０％溶解酸素（制御）及び１４ｐｓｉｇの空気において４２．５時間運転した。発酵の完了時に１．０ｋｇのグリセロールを加え、遠心により細胞を収穫し、液体窒素中において凍結し、−８０℃で保存した。
本発明で用いた第２の微生物細胞触媒は、ピチア・パストリス（メチロトローフ酵母）の形質転換株であり、それはホウレンソウからのグリコレートオキシダーゼ酵素を内因性カタラーゼと共に発現する。ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをＰ．パストリス発現ベクター（ｐＨＩＬ−Ｄ４）中に、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼＩプロモーターの制御下となるように挿入し、プラスミドｐＭＰ１を生成することにより、十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有するＰ．パストリスの数種の形質転換株が製造された。Ｐ．パストリス株ＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）をプラスミドｐＭＰ１により置換質転換し、線状プラスミドｐＭＰ１の染色体アルコールオキシダーゼＩ遺伝子座中への組み込み及びグリコレートオキシダーゼ遺伝子によるアルコールオキシダーゼ遺伝子の置換に関して選択した。そのような形質転換株のプールを次に、発現カセットの組み込みコピーの最大数に関して選択した。Ｐ．パストリス株ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０と命名された高いコピー数の形質転換株を単離し、１９９２年９月２４日にＮＲＲＬ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩｌｌｉｎｏｉｓにおいてＮＲＲＬ  Ｎｏ．Ｙ−２１００１として寄託した。
典型的にＰ．パストリス細胞は、１％のグリセロールを含む１００ｍＬのＹＮＢにおいて接種材料を増殖することにより製造した。３０℃において４８時間増殖させた後、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）ｗ／ｏアミノ酸（１３４ｇ）、グリセロール（１００ｇ）及びビオチン（２０ｍｇ）を含む１０Ｌの培地を含む発酵槽中に細胞を移した。発酵は、ｐＨ５．０（ＮＨ4ＯＨを用いて制御）、３０℃、２００ｒｐｍの掻混ぜ速度、５ｓｌｐｍのエアレーション、５ｐｓｉｇの空気及び５０％飽和以上に保持された溶解酸素において運転した。グリセロールが枯渇したら、グリセロールをメタノール（５０ｇ）に置換する以外は同じ培地において増殖させることにより、グリコレートオキシダーゼを発現するように細胞を誘導した。誘導の間のグリコレートオキシダーゼ活性を酵素アッセイにより追跡した。誘導の２４時間後、グリセロール（１ｋｇ）を用いた処理の後に細胞を収穫した。収穫の後、細胞を液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
Ｈ．ポリモルファ及びＰ．パストリス形質転換細胞は、グリコール酸からグリオキシル酸への酸化のための触媒として用いる前に、浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を必要とする。浸透化の多様な既知の方法が、十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有する細胞の調製に有用であった（Ｆｅｌｉｘ，Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１２０，２１１−２３４（１９８２）を参照）。典型的に、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０重量％の湿潤細胞の懸濁液を１５分間混合し、次いで液体窒素中で凍結し、解凍し、２０ｍＭリン酸塩／０．１ｍＭ  ＦＭＮ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。浸透化の第２の方法は、０．２％（ｗ／ｖ）ベンザルコニウムクロリド／２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０重量％の湿潤細胞の懸濁液を６０分間混合し、次いで浸透化された細胞を２０ｍＭリン酸塩／０．１ｍＭ  ＦＭＮ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄することにより行った。浸透化したら、反応混合物に加える全細胞触媒の量を、対応する可溶性酵素に関して上記で記載したグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性の必要な濃度を与えるように選択した。初期値の１００％より高いグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性の回復は、反応の経過の間の全細胞触媒の浸透化の向上のためである。
約５〜１０ｍｇの湿潤細胞（濾紙上で過剰の水分を除去する）を磁気撹拌棒及び、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール（ＤＣＩＰ）が０．１２ｍＭであり、ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．３）が８０ｍＭである２．０ｍＬの溶液を含む３−ｍＬの石英のキュベット中に正確に量り込むことにより微生物形質転換細胞をグリコレートオキシダーゼ活性に関してアッセイした。キュベットにゴム栓で蓋をし、窒素を５分間泡立てることにより溶液から酸素を除去した。次いでキュベットに４０μＬの１．０Ｍグリコール酸／１．０Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．３）をシリンジにより加え、６０５ｎｍ（ε＝２２，０００）において時間による吸収の変化を測定しながら混合物を撹拌した。
約２〜５ｍｇの湿潤細胞（濾紙上で過剰の水分を除去する）を磁気撹拌棒及び２．０ｍＬの蒸留水を含む３−ｍＬの石英のキュベットに正確に量り込み、次いで５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の５９ｍＭの過酸化水素を１．０ｍＬ加え、２４０ｎｍ（ε＝３９．４）において時間による吸収の変化を測定することによりカタラーゼ活性をアッセイした。種々の培地において培養されたＨ．ポリモルファ及びＰ．パストリスの湿潤細胞（浸透化）のグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性は、グリコレートオキシダーゼに関して湿潤細胞１グラム当たり２０〜１２０ＤＣＩＰ  ＩＵであり、内因性カタラーゼに関して湿潤細胞１グラム当たり３０，０００〜２０，０００ＩＵの範囲内であった。
反応混合物において任意であるが、多くの場合に有益な成分は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）であり、それは一般に最高約２．０ｍＭ、好ましくは約０．０１〜約０．２ｍＭの濃度で用いられる。ＦＭＮはグリコレートオキシダーゼの生産性を向上させると思われ、生産性とは酵素の単位当たりにグリオキシルシ酸に変換されるグリコール酸の量を意味する。多くの場合にＦＭＮは、酵素の製造の間にも酵素に加えられるので、ＦＭＮの添加濃度は、酵素と共に存在するＦＭＮに加算される濃度と理解されるべきである。ＦＭＮの構造及びその分析法は、Ｋ．Ｙａｇａｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．Ｘ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６２，ｐ．３１９−３５５に見いだされ、その記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。
グリコール酸からグリオキシル酸への変換は、水性媒体中で簡便に行われ、それが好ましい。グリコール酸（２−ヒドロキシ酢酸）は商業的に入手可能であり、本反応においてその初期濃度は０．１０Ｍ〜２．０Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜１．０Ｍの範囲内である。それはそのままで、あるいはそれらの適合性の塩、すなわち水溶性であり、そのカチオンがグリコール酸からグリオキシル酸への所望の変換又は、続くグリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルとのＮ−（ホスホノメチル）グリシンを与える反応と抵触しない塩として用いることができる。適した、及び適合性の塩−形成カチオン基は、試みることにより容易に決定される。代表的なそのような塩類は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、置換アンモニウム、ホスホニウム及び置換ホスホニウム塩類である。
本発明のアミノメチルホスホン酸ジアルキルは、式
0003937445.tif 000004
［式中、Ｘ及びＹはそれぞれ個別にアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルなどであり、得られるアミノメチルホスホン酸ジアルキルが部分的に、又は完全に水性反応混合物に可溶性となる］
を有する。アミノメチルホスホン酸ジアルキルは、アミノメチルホスホン酸ジアルキル／グリコール酸（出発量）のモル比が０．０１〜３．０、好ましくは０．２５〜１．０５の範囲内となるように加えられる。水溶液中でアミノメチルホスホン酸ジアルキル及びグリコール酸を合わせた後、得られる混合物のｐＨを６〜１０、好ましくは７．０〜９．０の値に調節する。このｐＨ範囲内で、アルカリ金属水酸化物類、炭酸塩類、重炭酸塩類及びリン酸塩類を含むいずれの適合性及び非抵触性の塩基を用いても、正確な値を調節し、所望のｐＨを得ることができる。反応混合物のｐＨは、反応が進行すると共にわずかに低下し、従って最大酵素活性ｐＨ範囲の高端近く、約９．０〜８．５で反応を開始し、反応の間に低下するのを許すのが多くの場合に有用である。酵素活性はｐＨと共に変化するので、場合により非抵触性無機又は有機緩衝液を別に加えることによりｐＨを維持することができる。
グリコール酸及びグリオキシル酸は水中で高度に解離しており、７〜１０のｐＨにおいては、完全ではなくとも大部分がグリコレート及びグリオキシレートイオンとして存在することが理解される。グリオキシル酸（及びその共役塩基、グリオキシレートアニオン）は水和物、例えば（ＨＯ）2ＣＨＣＯＯＨ及び／又はヘミアセタール、ＨＯＯＣＣＨ（ＯＨ）ＯＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨとしても存在することができ、それらの組成物及び対応するそれらのアニオンは、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン形成のための適した反応物であるという本目的に関し、グリオキシル酸及びそのアニオンと同等であることも、当該技術分野における熟練者に認識されるであろう。同様に、アミノメチルホスホン酸ジアルキルは部分的に、又は完全にプロトン化アミンカチオンとして存在することができ、その対イオンは、反応混合物中に存在する利用できるアニオン種のいずれの１つ又はそれ以上であることもできる。
グリコール酸からグリオキシル酸への変換の酸化剤である酸素（Ｏ2）は、気−液界面において液体を掻混ぜることにより、又は酸素に対して浸透性の膜を介して気体として反応に加えることができる。ほとんどの条件下で、反応速度は少なくとも部分的に、酸素が水性媒体中に溶解することができる速度により制御されると思われる。かくして酸素を空気中として反応に加えることができるが、比較的純粋な形態の酸素を用い、高圧を用いるのさえ好ましい。酸素圧の上限は知られていないが、最高５０気圧の酸素圧を用いることができ、１５気圧の上限が好ましい。高い酸素溶解（従って反応）速度を保持するために掻混ぜは重要である。撹拌（stirring）などのいずれの簡便な形態の掻混ぜも有用である。他方、酵素の技術分野における熟練者に周知の通り、高剪断掻混ぜ又は泡を発生する掻き混ぜは、可溶性酵素の活性を低下させ得、可溶性酵素触媒を用いる場合には避けなければならない。
反応温度は、反応速度及び酵素の安定性に影響を与える点で重要な変数である。０℃〜４０℃の反応温度を用いることができるが、好ましい反応温度範囲は５℃〜１５℃である。好ましい温度範囲における運転は、反応の最後において回収される酵素活性を最大にする。温度は水溶液が凍結し始める程低くてはならない。温度は、通常の方法により、例えばこれらに限られるわけではないがジャケット付き反応容器を用い、適した温度の液体をジャケットに通過させることにより制御することができる。反応容器は、反応成分に不活性ないずれの材料から構築されることもできる。
反応が完了したら、可溶性酵素は濾過又は遠心により取り出し、再利用することができる。別の場合、例えば７０℃に５分間加熱することによりそれらを変性し、沈澱させるか、及び／又は混合物のＮ−（ホスホノメチル）グリシンへの変換、及び反応混合物からのＮ−（ホスホノメチル）グリシンの回収という続く段階においてその存在が邪魔でなければ、反応混合物中に残しておくこともできる。微生物形質転換細胞は、再循環のために濾過又は遠心により回収することができる。反応溶液のＯ2との接触を停止した後、好ましくは可溶性酵素又は全細胞触媒の除去の後、溶液を活性炭と接触させることにより、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を場合により除去することができる。
得られるグリオオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物（対応するヘミアミナール及びイミンと平衡状態にあると思われる）は、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの製造のための、当該技術分野において既知のいずれの方法に従って処理することもできる。グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物を接触水添し、続いて得られるＮ−（ジアルコキシホスフィニルメチル）グリシンを加水分解するのが、グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物からＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造するための好ましい方法である。この目的に適した水添触媒には種々の白金属の金属、例えばイリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、白金及びパラジウム；又、種々の他の遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル及び亜鉛が含まれる（がこれらに限られるわけではない）。触媒は例えばラネイニッケル又は酸化白金のように担持されていないことができ；あるいは例えばカーボン担持白金、アルミナ担持パラジウム又はキーゼルグール担持ニッケルのように担持されていることができる。カーボン担持パラジウム、キーゼルグール担持ニッケル及びラネイニッケルが好ましい。水添は、４〜１１、好ましくは５〜１０のｐＨにおいて行うことができる。水添及び及び圧力は広く変化させることができる。温度は一般に０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲であり、Ｈ2圧は一般に大体大気圧〜約１００気圧、好ましくは１〜１０気圧の範囲である。
グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の水添を介して製造されるＮ−（ジアルコキシホスフィニル）グリシンを、水添段階からの混合生成物水溶液に過剰の塩酸又は臭化水素酸を加え、加熱することにより加水分解し、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを製造することができる。発芽後除草剤として有用なＮ−（ホスホノメチル）グリシンは、当該技術分野において既知のいずれの回収法を用いることによっても、得られる混合物から回収することができる。
本発明をさらに例示するための以下の実施例において、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートの収率、ならびにグリコレートの回収収率は、反応の開始時に存在するグリコール酸の合計量に基づくパーセンテージである。反応混合物の分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラムを用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。
実施例１
３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁気撹拌棒及び、ｐＨ８．５においてグリコール酸（０．２５Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．２６３Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、プロピオン酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１２５Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１，４００ＩＵ／ｍＬ）を含む１０ｍＬの水溶液を入れた。反応容器を密封し、反応混合物を１５℃に冷却し、次いで撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧し、大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシした。次いで容器を７０ｐｓｉｇの酸素で加圧し、混合物を１５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによる分析のために試料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し（容器中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。５時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ７０．４％、１９．６％及び２．２％であり、５．３％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ２７％及び１００％であった。
実施例２
ｐＨ８．５及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．５００Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１４，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液を用い、実施例１に記載の方法を繰り返した。２１時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ８５．２％、１．５％及び３．３％であり、５．５％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ４９％及び９３％であった。
実施例３
ｐＨ８．５及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び１４，０００ＩＵ／ｍＬのアスペルギルス・ニゲル、サッカロミセス・セレビシアエ、牛肝臓又はハンセヌラ・ポリモルファ可溶性カタラーゼのいずれかを含む水溶液を用い、実施例１に記載の方法を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例４
１４，０００ＩＵ／ｍＬのアスペルギルス・ニゲル又はハンセヌラ・ポリモルファ可溶性カタラーゼのいずれかを用い、１５℃において実施例３における反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例５
５，６００ＩＵ／ｍＬ又は５６，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性ハンセヌラ・ポリモルファカタラーゼを用い、実施例３における反応を繰り返した。３種類すべての濃度のカタラーゼに関する反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例６
ｐＨ８．３及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸ジエチル（ＤＥＡＭＰＡ、０．３９８Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１４，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液を用い、実施例１に記載の方法を繰り返した。２０時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９７．４％、０．８％及び１．８％であり、グリコレートは残らなかった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ１０％及び９５％であった。
実施例７
ｐＨ８．３においてグリコール酸（０．５０Ｍ）、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１，４００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液を用い、実施例６の反応を繰り返した。２３時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９５．３％、３．９％及び１．５％であり、グリコレートは残らなかった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ１２％及び１００％であった。
実施例８
１，４００ＩＵ／ｍＬ又は１４，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性ハンセヌラ ポリモルファカタラーゼを用い、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）を用いた実施例７における反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例９
３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁気撹拌棒及び、ｐＨ８．３（５０％のＮａＯＨで調節）においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含む１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１凍結解凍を用いた処理により浸透化された０．４７ｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株Ｇ０１（１０ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び２２，１００ＩＵカタラーゼ）を加え、次いで反応容器を密封し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧し、大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐｓｉｇの酸素で加圧し、混合物を５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによる分析のために試料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し（容器中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。１６時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ５７．６％、３２．５％及び２．６％であり、８．９％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それらの初期値のそれぞれ６０％及び３７８％であった。
実施例１０
１４，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼも反応混合物に加えること以外は、実施例９の反応を繰り返した。１６時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９０．１％、１．３％及び５．９％であり、３．０％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ８６％及び１３６％であった。
実施例１１
ハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１凍結解凍で処理することにより浸透化された０．７５ｇのピチア・パストリス形質転換株ＭＳＰ１０（１３．２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び２１，２００ＩＵカタラーゼ）に置換し、実施例９の反応を繰り返した。１６時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ３０．５％、５９．２％及び１０．７％であり、０．８％のグリコレートが残った。
実施例１２
３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁気撹拌棒及び、ｐＨ８．３（５０％のＮａＯＨで調節）においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含む１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１凍結解凍を用いた処理により浸透化された１．５ｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株Ｇ０１（８．０ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３８，０００ＩＵカタラーゼ）を加え、次いで反応容器を密封し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧し、大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐｓｉｇの酸素で加圧し、混合物を５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによる分析のために試料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し（容器中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。９時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９８．４％、０％及び２．０％であり、グリコレートは残らなかった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それらの初期値のそれぞれ６３％及び２５０％であった。
実施例１３
ｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）、フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）及び、０．２％ベンザルコニウムクロリド（Ｌｏｎｚａ  Ｂａｒｑｕａｔ  ＯＪ−５０）を用いた処理により浸透化された０．７２ｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株Ｇ０１（４３．０ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９，８８０ＩＵカタラーゼ）を含む混合物を用い、実施例１２の反応を繰り返した。１時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ５０．２％、４７．４％及び１．１％であり、２．２％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それらの初期値のそれぞれ９５％及び１０５％であった。
実施例１４
ＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）のいずれかをアミン添加物として用い、実施例１３の反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例１５
ｐＨ８．３（５０％  ＮａＯＨを用いて調節）及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）のいずれか、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）、フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）及び、０．２％のベンザルコニウムクロリド（Ｌｏｎｚａ  Ｂａｒｑｕａｔ  ＯＪ−５０）を用いた処理により浸透化された０．２３ｇのピチア・パストリス形質転換株ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０（１２．３ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９，４２０ＩＵカタラーゼ）を含む混合物を用い、実施例１２の反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、グリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例１６
アミン添加物としてＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）を用いて実施例１５の反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、グリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる：
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実施例１７
実施例１２に記載の通りに微生物形質転換株触媒を用い、グリコール酸（０．５０Ｍ）及びＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）の混合物から製造されたグリオキシル酸（０．４９Ｍ）及びＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）の混合物を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性タンパク質を除去し、０．１０ｇの活性炭と混合してＦＭＮを除去し、濾液を、磁気撹拌棒を備えた３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒびんに入れる。次いでびんに０．１００ｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加え、びんを密封し、窒素ガスをフラッシし、次いで水素で５０ｐｓｉｇに加圧し、２５℃で撹拌する。水素圧が下がった時に、追加の水素を加えて圧力を５０ｐｓｉｇに保持する。水素圧力が一定のままとなったら、圧力を排気し、窒素ガスをフラッシすることにより反応を停止させる。Ｎ−（ジエトキシホスフィニルメチル）グリシンを含む得られる水溶液に過剰の濃塩酸を加え、混合物を加熱して煮沸すると、ジアルキルホスホネートエステルの加水分解が起こる。得られる混合物を濃縮し、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを結晶化により単離する。
かくしてある程度特定的に記載し、例示したが、以下の請求の範囲はそのように制限されるべきではなく、請求の範囲の各要素の表現及びそれらの同等事項に相応した範囲を与えられるべきであることが認識されなければならない。