(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部位を有するオリゴヌクレオチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、（１）該粒子は、平均粒子径が０．１〜１０μｍ、該平均粒子径の標準偏差が１５％以下、かつ比重が０．９〜２ｇ／ｃｍ3であり、
（２）該オリゴヌクレオチドは、アニール後も常に一本鎖状態を維持する塩基数１〜７０の中央部Ａと互いに相補的な塩基数２〜１００の両側鎖ＢおよびＢ’とより構成される一本鎖オリゴヌクレオチドを、同一分子内および他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドであり、同一分子内でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドと他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドとの割合は０／１０〜９／１（モル数比）であり、かつ形成された二本鎖オリゴヌクレオチドの末端および必要に応じて相補鎖中に特定の制限酵素の認識部位を有し、
（３）該オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該オリゴヌクレオチドを構成する中央部Ａ内の塩基に少なくとも１つ以上存在する第１級アミノ基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結合により固定化されており、かつ
（４）該粒子担体表面には、該粒子担体１個当たり１〜１０5個の前記二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されている、
ことを特徴とする核酸結合用粒子担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸結合用粒子担体に関し、さらに詳しくは遺伝子工学、クローニング、ゲノム核酸解析等の分野における特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出、特に生植物のゲノム核酸の解読に行われる制限酵素ランドマークの一次スクリーニングに有効な粒子担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一本鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして固定化された水不溶性固相担体と、プローブと相補的な塩基配列とを相補的な結合で結合させることによって形成される特定の制限酵素の認識部位を有する担体を用いて、標的核酸（またはその断片）を前記特定の制限酵素を用いた反応により結合させ、特定の塩基配列を抽出、分離する試みは以前から行われてきた。
従来の水不溶性固相担体にオリゴヌクレオチドを固定化する技術としては、例えばオリゴヌクレオチドの末端部位にアーム、スペーサー等の物質を介して水不溶性固相担体の表面に存在する所望の官能基に結合する方法、スペーサー等を介することなく、オリゴヌクレオチドの末端塩基を化学的に修飾することによって水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法、オリゴヌクレオチドの末端塩基をそのまま水不溶性固相担体の表面の官能基に結合する方法等を挙げることができる（特開昭６１−１３０３０５号、特開昭６１−２４６２０１号、特開昭６３−２７０００号、特開平１−１７１４９９号、特開平３−１４７８００号、Ｃｅｌｌ  ５，３０１（１９７５）等）。しかしながら、いずれの場合においても一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を選択的に固相担体表面に固定化する技術であり、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。
また、一般に知られている化学反応あるいはビオチン／アビジン反応のような生化学的な反応も一本鎖オリゴヌクレオチドの固相表面への固定化には利用することができるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの固定化には利用できない。そこで、それらの反応により固定化された一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体は、ハイブリタイゼーション法を用いた特定の核酸、プローブ核酸およびターゲット核酸の捕捉、検出等への利用に限られていた。
【０００３】
一方、一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化した固相担体を、特定の制限酵素によって処理した核酸断片の回収、接続あるいはＤＮＡ結合蛋白質との結合に用いる場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドに相補鎖をアニールし、前記特定の制限酵素の認識部位に形成させることが必要である。
そこで、例えば固定化された一本鎖オリゴヌクレオチドを一旦、相補鎖過剰の条件でアニーリングさせて固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し、さらにその末端に特定の制限酵素認識部位を形成させた後、余分な相補鎖を除去することによって調製される特定の制限酵素認識部位を末端にもつ二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された担体を用いて、前記制限酵素で切断されるＤＮＡ断片の分離、抽出に使用する方法が挙げられる（特開平３−１４７８００号）。
しかし上記方法において固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させるには過剰な相補鎖と長時間とを必要とし、また固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドの結合が数十ベース長の塩基による水素結合のみであるために、アニーリングの効率の悪さによって満足に制限酵素認識部位を末端に形成させられないという欠点がある。さらに、得られる固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドは保存安定性が悪く、二本鎖形成時の条件で保存しなければならず、使用上および保存上、効率的であるとはいえない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度よく行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部位を有するオリゴヌクレオチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、
（１）該粒子は、平均粒子径が０．１〜１０μｍ、該平均粒子径の標準偏差が１５％以下、かつ比重が０．９〜２ｇ／ｃｍ3であり、
（２）該オリゴヌクレオチドは、アニール後も常に一本鎖状態を維持する塩基数１〜７０の中央部Ａと互いに相補的な塩基数２〜１００の両側鎖ＢおよびＢ’とより構成される一本鎖オリゴヌクレオチドを、同一分子内および他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドであり、同一分子内でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドと他分子間でアニールさせることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドとの割合は０／１０〜９／１（モル数比）であり、かつ形成された二本鎖オリゴヌクレオチドの末端および必要に応じて相補鎖中に特定の制限酵素の認識部位を有し、
（３）該オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該オリゴヌクレオチドを構成する中央部Ａ内の塩基に少なくとも１つ以上存在する第１級アミノ基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結合により固定化されており、かつ
（４）該粒子担体表面には、該粒子担体１個当たり１〜１０5個の前記二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されている、
ことを特徴とする核酸結合用粒子担体、によって達成される。
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。これにより、本発明の目的、構成および効果がより明確になるであろう。
本発明に用いる粒子は、有機高分子を主成分とする水不溶性の粒子である。ここで主成分となる有機高分子としては、例えばスチレン、クロルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合して得られる水不溶性の有機高分子を挙げることができる。さらに他の有機高分子としてアガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体を挙げることができる。
これらの粒子は、乳化重合、懸濁重合、溶液沈澱重合等によって製造することができる。また、有機高分子を非溶媒中に分散し架橋したり、または溶媒を揮散させることなどによって該粒子を得ることができるが、粒子の製造方法はこれらに限定されるものではない。
【０００７】
なお、これらの粒子には必要に応じて粒子の内部、または表面に有機染料、顔料、蛍光色素を含有または被覆させてもよいし、無機物質からなる充填剤、例えばマグネタイト、ニッケル等の金属あるいは金属化合物のような磁性もしくは超常磁性を有する物質を含有させ、粒子を複合化させてもよい。
【０００８】
以上のようにして得られる粒子の表面は非多孔質であることが望ましい。ここで、粒子の表面が「非多孔質」であるとは、長径が０．０１μｍ以上である孔を粒子の表面に有しないことを意味する。粒子の表面が非多孔質でないと、すなわち、長径で０．０１μｍ以上である孔が粒子の表面に存在すると、核酸の検出法等で用いられる制限酵素切断末端をもつ核酸断片が粒子の内部に捕捉される等の原因により感度や精度の向上が望めない。なお、このように、粒子の表面は非多孔質であることが望ましいが、粒子の内部に独立気泡等が存在してもよい。
【０００９】
粒子の平均粒子径は０．１〜１０μｍであり、好ましくは０．３〜５μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満であると遠心分離等の簡便な操作で粒子を回収しにくくなり、一方１０μｍを超えると粒子の単位体積当たりの表面積が小さくなり、かつ核酸断片の分離、抽出等において適当な条件下で粒子が均一に分散する状態を保てなくなるために、高い分離率、抽出率等を達成できない恐れがある。
【００１０】
粒子の平均粒子径の標準偏差（ＣＶ値）は、１５％以下であることが必要であり、好ましくは１０％以下である。ＣＶ値が１５％を超えると核酸断片の分離、抽出等にバラつきが生じ再現性が乏しくなる。
また、粒子の比重は使用する条件によって異なるが、通常、０．９〜２ｇ／ｃｍ3であり、さらに好ましくは１〜１．５ｇ／ｃｍ3である。比重が前記範囲内であると特定の制限酵素による反応の間にも検査試料中での粒子担体の分散状態が均一に保たれ、また反応後の特定の制限酵素認識部位をもつ核酸断片と粒子担体とが結合した結合型と特定の制限酵素認識部位をもたない核酸断片とが結合していない型（遊離型）との分離（すなわちＢ／Ｆ分離）も容易に行うことができる。比重が０．９ｇ／ｃｍ3未満であったり、２ｇ／ｃｍ3を超えると検査試料中での粒子担体の分散性が悪くなる。
【００１１】
さらに、本発明において使用する粒子は、後述するようにオリゴヌクレオチド中の塩基のアミノ基とのアミド結合を形成させるために、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシル基を有する必要がある。もし粒子がその表面にカルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキシル基を導入する必要がある。カルボキシル基は粒子表面積１ｎｍ2当たり少なくとも１個存在することが好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは５個以上である。
このようなカルボキシル基を表面に有する前記有機高分子からなる粒子としては、例えばイムテックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０３２、Ｇ０３０１、Ｇ０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１およびＬ０１０２；ならびにイムテックスＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３等の商品名（日本合成ゴム（株））で市販しているものが挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する粒子は酵素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの耐熱性を有している。また、カルボキシル基を有しない粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従来より知られている種々の方法を利用することができる。
【００１２】
次に本発明に用いるオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明に用いるオリゴヌクレオチドは中央部Ａと両側鎖ＢおよびＢ’により構成される。中央部Ａは粒子との固定化部位であり、塩基配列には相補性がないため、アニール後も常に一本鎖状態を維持する。中央部Ａは、中央部Ａ内の塩基に少なくとも１つ以上の第１級アミノ基を有し、かつその塩基数は１〜７０であり、より好ましくは５〜３５である。中央部Ａの塩基数が７０を超えるとオリゴヌクレオチドの合成効率が低下したりする恐れがある。
ここで第１級アミノ基を有する塩基としては、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）等を挙げることができるが、粒子表面にあるカルボキシル基との反応性が高い点でｄＡおよびｄＣが好ましい。中央部Ａの塩基配列は、１種の塩基で構成されていてもよいし、相補性を回避した２種以上の塩基で構成されていてもよいが、オリゴヌクレオチドをより効率的に粒子の表面に固定化するためには、１種の塩基、例えばｄＡあるいはｄＣのみを使用することが好ましい。
【００１３】
両側鎖ＢおよびＢ’はアニーリングにより二本鎖を形成するものであり、かつアニール後に得られる二本鎖オリゴヌクレオチドの末端および必要に応じて相補鎖中に特定の制限酵素の認識部位を形成するものである。また、必要に応じて、該二本鎖オリゴヌクレオチドに複数の同一または異なる制限酵素の認識部位をもたせてもよい。
両側鎖ＢおよびＢ’によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチドの制限酵素の認識部位は、塩基数の異なる接着末端型であってもよいし、塩基数の揃った平滑末端型であってもよい。さらにＤＮＡリガーゼ等の酵素反応によって二本鎖オリゴヌクレオチドの末端を延長して制限酵素の認識部位を導入してもよい。
なお、両側鎖ＢおよびＢ’の塩基数はそれぞれ２〜１００であり、好ましくは４〜７５、より好ましくは５〜５０である。塩基数が１であると二本鎖オリゴヌクレオチドの末端が制限酵素の認識部位を形成することができず、また、１００を超えるとオリゴヌクレオチド合成の効率が低下する恐れがある。
ここで、両側鎖ＢおよびＢ’の塩基数はまったく同一に揃える必要はなく、前述したような末端の制限酵素の認識部位の型によって同一塩基数であってもよいし、異なる塩基数であってもよい。
【００１４】
また、両側鎖ＢおよびＢ’により形成される二本鎖オリゴヌクレオチドは、同一分子内で形成されたもおよび他分子間で形成されたものである。同一分子内で形成された二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「分子内二本鎖」という。）は図１で模式的に表されるような形状を有し、他分子間で形成された二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「分子間二本鎖」という。）は図２で模式的に表されるような形状を有する。
なお、分子内二本鎖と分子間二本鎖との割合は、０／１０〜９／１であることが必要であり、好ましくは１／９〜８／２である。
二本鎖オリゴヌクレオチドの割合が前記範囲内であることによって固定化効率が高く、かつ二本鎖オリゴヌクレオチドの調整を容易に行うことができる。
ここで、分子内二本鎖のみを調製することはオリゴヌクレオチドの濃度を極度に低くしなければならない一方、固定化反応に使用するには濃度を高くしなければならず実用的でない。
【００１５】
二本鎖オリゴヌクレオチドによって形成される制限酵素の認識部位は、粒子１個当たり１〜１０5個であり、より好ましくは１０〜１０，０００個である。制限酵素の認識部位が１０5個を超えると粒子表面に存在するカルボキシル基の約５０％が固定化されるため粒子の分散安定性が著しく劣る傾向がある。
本発明に用いるオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成器を用いて容易に調製することができる。
【００１６】
以上のような中央部Ａおよび両側鎖ＢおよびＢ’から構成されるオリゴヌクレオチドはアニーリングによって中央部Ａが一本鎖状態、かつ両側鎖ＢおよびＢ’が二本鎖状態となる。アニール後のオリゴヌクレオチドは両側鎖ＢおよびＢ’の塩基配列中に存在する第１級アミノ基がアニーリングにより水素結合で束縛され、中央部Ａの塩基中にあるアミノ基のみがフリーな状態となるため、中央部Ａが特異的に粒子表面に固定化される。従って、前記オリゴヌクレオチドを用いればオリゴヌクレオチドの特定部位を特別な化学的修飾をすることなく、特異的に、かつ高い効率で粒子表面に固定化することができる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドを粒子に固定化させる方法としては、操作の簡便さ、固定化効率の高さおよび精度を考慮すると、粒子表面のカルボキシル基とオリゴヌクレオチド中の塩基のアミノ基とをアミド結合によって固定化させることが必要である。
上記固定化反応は、例えば適当な大きさの反応容器に粒子と、前記オリゴヌクレオチドとを仕込んだ後、１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）プロピルカルボジイミド等の水溶性カルボジイミドを添加することにより行うことができる。粒子の使用量は、オリゴヌクレオチド１ミリモル当たり、通常、０．５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇである。上記反応は、通常、ｐＨ３〜１１程度の水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。  また、水溶性カルボジイミドの使用量は、使用する粒子の表面に存在するカルボキシル基１グラム当量に対して、通常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モルである。
【００１８】
上述のようにして得られる本発明の担体を用いて目的の特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片と結合させるとき、粒子担体は通常、水溶性媒体に分散させた状態で用いられる。この際の分散液の濃度は、通常、０．５〜２５重量％であり、より好ましくは１〜１５重量％である。粒子濃度が０．５重量％未満であると、特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片と効率的に結合することができず、２５重量％を超えると制限酵素が粒子表面に付着して有効に働かない。
【００１９】
本発明の粒子担体を実際に特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出等に用いる際に、粒子の表面に固定化されたオリゴヌクレオチドの両側鎖ＢおよびＢ’部分が一本鎖状態となっている場合には、アニーリングにより二本鎖状態に戻す必要がある。その際、分子内二本鎖が固定化されていた場合にはアニーリングにより再度分子内二本鎖を形成する確立が高いが、分子内二本鎖が固定化されていた場合にはアニーリングにより再度分子間二本鎖を形成する以外に新たに分子内二本鎖を形成しうるので、アニーリングの効率が良く好ましい。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例
（１）一本鎖オリゴヌクレオチドの調整
ＤＮＡ合成装置（アプライド  バイオシステム社モデルＡＢＩ３８１Ａ型）を用いてβ−シアノエチルホスホアミド法で図３に示す塩基配列を有し、かつ両末端がアニーリングによってＮｏｔＩの認識部位を形成しうる一本鎖オリゴヌクレオチドａを１μＭスケールで合成した。
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドａを濃水酸化アンモニウム１０ｍｌで前記装置のカラムから切り出した後、５５℃で一夜放置した。次いで２０本のＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ社製）を用いて前記濃水酸化アンモニウムで切り出した一本鎖オリゴヌクレオチドａを０．５ｍｌずつ分取し、２０重量％のアセトニトリルで一本鎖オリゴヌクレオチドａを溶出した。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドａの溶出液から、エタノールで沈澱させることにより一本鎖オリゴヌクレオチドａを精製した。続いて精製した一本鎖オリゴヌクレオチドａ全量を５００μｌの滅菌水に溶解した後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量したところ、約５ｍｇの一本鎖オリゴヌクレオチドａが得られた。
【００２１】
（２）一本鎖オリゴヌクレオチドの末端リン酸化処理
（１）で合成した一本鎖オリゴヌクレオチドａを８８μｌ（３ｍｇ）、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）５００ユニットおよびアデノシン−５’三リン酸２ｎｍｏｌを混合し、１０倍プロトレーディンエンドキナーゼ緩衝液（東洋紡社製）５０μｌを加えてから滅菌蒸留水で５００μｌに調整した。
これを３７℃のウォーターバス中で２時間反応させた後、９５℃で３分間放置し、エタノールを用いて沈澱、精製した。続いて、精製した末端リン酸化処理された一本鎖オリゴヌクレオチドａ１ｍｇをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）５００μｌに溶解した。
【００２２】
（３）二本鎖オリゴヌクレオチドの形成
（２）で得られた末端リン酸化処理した一本鎖オリゴヌクレオチドａを６ｎｍｏｌ採取し、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、１０倍アニーリング溶液（１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）、６０ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液）を１０μｌ加え、滅菌蒸留水で１００ｍｌに調整した。
これを８０℃のウォーターバスにて１０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時間４時間）。この反応により一本鎖オリゴヌクレオチドａ中の両側鎖ＢおよびＢ’が分子内二本鎖および分子間二本鎖となり、それぞれの末端に制限酵素ＮｏｔＩの認識部位が形成された。
【００２３】
（４）分子内二本鎖および分子間二本鎖の割合
２０％ポリアクリルアミドゲルを８．５％の過硫酸アンモニウムとＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリスホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡおよび８９ｍＭホウ酸からなる緩衝液）で調製した（村松正實，ラボマニュアル  遺伝子工学，２２−２４）。このゲル溶液をスラブゲル用泳動板に組み立て、（３）で得られた二本鎖オリゴヌクレオチド３μｌを６倍のＢＰＢ色素およびＸＣ色素（タカラ社製）とともに２０Ｖの定電圧で４０分間泳動させた。次いで０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド液をゲルにかけ、３０分間放置した後、紫外線照射下で二本鎖オリゴヌクレオチドのバンドを観察した。その結果、３７塩基（分子内二本鎖）に対応するＢＰＢ色素のバンドと、７４塩基（分子間二本鎖）に対応するＸＣ色素のバンドの発色光はほぼ同じ強度であった。
次いで、上記の３７塩基および７４塩基に対応するバンドの前後をカッターで切断し、Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１ペーパーを入れ、上記と同様の条件で電気泳動させた。２つのバンドに完全に吸着させた２つの上記ペーパーを取り出してそれぞれを底に穴のある２本の２００ｍｌのチューブにいれてから別々の１．５ｍｌのチューブに入れた。これに１００μｌのＴＥ緩衝液／１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えてから１５，０００ｒｐｍで５分間遠心洗浄し、さらに１００μｌのＴＥ緩衝液／１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、遠心した。この操作を３回繰り返した後、ＴＥ緩衝液／ＮａＣｌ溶液を１００μｌ加え、５分間静置してから、５００ｒｐｍで２分間遠心洗浄した。この操作を３回繰り返し、それぞれのチューブに回収された６００μｌの溶液をフェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を各１回行ってからエタノール沈澱させたところ、３７塩基長のオリゴヌクレオチドが０．９１μｇおよび７４塩基長のオリゴヌクレオチドが０．８４μｇ得られていた。この結果から分子内二本鎖と分子間二本鎖との割合がほぼ１．０８：１であることが確認された。
【００２４】
（５）二本鎖オリゴヌクレオチドの粒子への固定化
平均粒子径が１．０μｍ、平均粒子径の標準偏差が５％、かつ粒子表面積１ｎｍ2当たり５個のカルボキシル基を有するポリスチレン粒子イムノテックスＬ０１０１（日本合成ゴム（株）製）の１０（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（３）で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを４ｎｍｏｌおよび１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０．５（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸溶液５００μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより二本鎖オリゴヌクレオチド中の中央部Ａのｄｃ塩基の塩基配列のアミノ基と粒子表面のカルボキシル基とをアミド結合させた。
その後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してオリゴヌクレオチド固定化粒子を沈澱として回収した。次に結合用緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１（Ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液）をオリゴヌクレオチド固定化粒子に１ｍｌ添加し再分散させた後、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、オリゴヌクレオチドが固定化された粒子を回収した。この操作を３回繰り返して最終的にオリゴヌクレオチドが固定化された粒子をＴＥ緩衝液１ｍｌ（固形分１０（Ｗ／Ｖ）％）に分散した（以下、「分散液ａ」という。）。
【００２５】
（６）ＮｏｔＩ末端をもつ核酸断片の調整
プラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）（ｐＢＳII  東洋紡社製）７５μｇ（約３８μＭ）、ＮｏｔＩ（１０ユニット／μｌ）２００ユニット、１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌ（いずれもタカラ社製）および滅菌蒸留水２９４μｌを混合し、３７℃にて３時間反応させた。反応終了後、反応混合液と等量のＰ．Ｃ．Ｉ（フェノール：クロロホルム：イソアミノアルコール＝２５：２４：１（容量比））溶液を加えて充分に混和し、１５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上部の水層を回収した。回収した水層に８Ｍアンモニウムアセテート１００μｌを加えて充分に混合をし、次いで１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離してＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）をＴＥ緩衝液２０μｌに分散させた。
【００２６】
（７）32Ｐによる標識
（６）で調整したＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）のＴＥ緩衝液にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーハイム社製）１μｌ（酵素活性にして８ユニット）、α−32Ｐシトシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣｉ）、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液５μｌおよび滅菌水１９μｌを加えて混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
次に反応液からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（”Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratories,1982,458）によって除去した後、反応液をＴＥ緩衝液で膨潤させたセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有するものである。
組成；０．５Ｍトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．６
０．１Ｍ塩化マグネシウム
５０ｍＭジチオスレイトール
１ｍＭスペルミジン
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各画分の放射線量をチェレンコフカウント法によって測定して素通り画分を判別し集めた。
この結果、32Ｐによって標識したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）のＮｏｔＩ消化物のＴＥ緩衝液（以下、「ＴＥ緩衝液Ｉ」という。）２０μｌが得られた。
【００２８】
（８）ＳｃａＩによる消化
（７）で得られたＴＥ緩衝液ＩにＳｃａＩ（１００／μｌ、タカラ社製）および１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌを加え、滅菌水で４００μｌに調製してから３７℃で３時間反応させた。反応終了後、等量のＰ．Ｃ．Ｉ溶液を加えて充分に混合し、次いで１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上部の水層を回収した。
回収した水層に８Ｍアンモニアアセテート１００μｌおよびエタノール８００μｌを加えて充分に混合してから１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片を１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。（７）と同様にしてチェレンコフ−カウント法によって放射線量を測定したところ、１μｌ当たり４０，０００ｒｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。また、プラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片の濃度は０．３０ｐｍｏｌ／μｌ、ＮｏｔＩ末端サイトは０．６ｐｍｏｌｅ／μｌであった。
【００２９】
（９）ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片の捕獲および分離の評価
（５）で得られた分散液ａを１０μｌずつＡ−１〜Ａ−５までの５本の遠心管に入れた。（８）で調製したＮｏｔＩおよびＳｃａＩで消化したプラスミドBluescriptII  ＳＫ（＋）の断片を１、２、４、６、６ｐｍｏｌとなるようにＡ−１からＡ−５まで５本の遠心管に加えた。それら５本の遠心管にそれぞれ１０倍のライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、６６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液）５μｌ、５０ｍＭ  ５’−アデノシン三リン酸５μｌ、５０％ポリエチレングリコール５μｌおよび３Ｍ塩化ナトリウム５μｌを加えた。そしてＡ−１からＡ−４までの遠心管にＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ社製、３５０ユニット／μｌ）５μｌを加えた後、Ａ−１からＡ−５までの５本の遠心管に滅菌蒸留水を加えて５０μｌに調製した後、１７℃にて１２時間反応させた。反応終了後、５本の遠心管のチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のトータルカウントとした。
また、上記反応終了後、５本の遠心管にＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液）１０００μｌずつを加え、反応を停止させた。次いで５本の遠心管を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ＴＥ緩衝液５０μｌに分散してチェレンコフカウントを測定し、それぞれを各遠心管のカウント２とした。
次いで、５本の遠心管にＮｏｔＩ（１００ユニット／μｌ）４０ユニットおよび１０倍ＨＢ緩衝液１０μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌに調製し、３７℃で３時間反応させた。続いて１０，０００ｒｐｍで５分間遠心洗浄し、沈澱物をＴＥ緩衝液／０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回遠心洗浄した後、ＴＥ緩衝液で５０μｌに再分散したもののチェレンコフカウントを測定し、これらをカウント３とした。
ＮｏｔＩで消化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の捕獲率および分離率を次式により算出し、表１に示した。
【００３０】
【数１】
0004019433.tif 000002
【００３１】
【数２】
0004019433.tif 000003
【００３２】
【表１】
0004019433.tif 000004
【００３３】
【本発明の効果】
本発明によれば特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度良く行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】分子内二本鎖の形状を示す図である。
【図２】分子間二本鎖の形状を示す図である。
【図３】一本鎖オリゴヌクレオチドａの塩基配列を説明する図である。
【図１】
0004019433.tif 000005
【図２】
0004019433.tif 000006
【図３】
0004019433.tif 000007