(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のＢＹ２、ＢＹ１−１及びＢＹ１−２からなる群より選ばれる式で表される４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物を有効成分とする神経細胞突起伸展剤。
【化１】
0003974729.tif 000007
（式中、Ｒ1及びＲ2は、独立に、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表す。）
【請求項２】
下記の式（１）で表される４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物であって、ビャクズク（ホワイトカルダモン）の抽出物乃至これより単離したステロイド化合物を有効成分とする神経細胞突起伸展剤。
【化２】
0003974729.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立に、ヒドロカルビル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定構造をもつステロイド化合物を有効成分とする神経細胞突起伸展剤及び食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
脳の神経系は多くのニューロン群で構成されている。類似の機能をになう集団を神経核といい、解剖学上の名前が付けられている。前脳基底野は、脳の中心部付近の１つの神経核の名称であり、この核の中に存在するニューロン群の中でもアセチルコリンを神経伝達物質とするニューロンをコリン作動性ニューロンと称している。前脳基底野は、更に３つのサブグループに分かれ、それぞれ中隔野、ブローカ対角帯核、マイネルト基底核という。最後のマイネルト基底核は、近年社会問題化しているアルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている。
【０００３】
ここで、神経成長因子（以下、ＮＧＦと称する）は、感覚及び交感神経の成長・分化・機能維持を主要効果とし、神経細胞の一生をコントロールする蛋白質である。神経細胞は神経成長因子の供給を断たれると生存できないため、ＮＧＦは、神経回路網の維持に必須の物質といえる。また、ＮＧＦは、前脳基底野コリン作動性ニューロンに作用することが知られており、アルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている。しかしながら、ＮＧＦは、その分子量が１４万と大きく、その分子の大きさが障害となって脳血液関門を通過することができず、外部投与の治療剤となり得ないなどの問題がある。そこで、ＮＧＦ自体のみならず、ＮＧＦ様活性化合物やＮＧＦ作用を促進させるための研究も行われている。例えば、特開平6-172378号公報には、ＮＧＦ産生促進作用及び神経栄養（成長）因子作用を有する生理活性物質が開示されており、また、特開平7-48397号公報には、ＮＧＦ様作用を有する生理活性物質が開示されている。
このように、ＮＧＦ、ＮＧＦ様活性化合物及びＮＧＦ作用促進化合物についての多くの研究がなされているが、より一層作用効果の高い新規な化合物が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＧＦと同等の高い神経細胞突起伸展作用乃至ＮＧＦ作用促進能を有する低分子の化合物を提供することを目的とする。また、本発明は、上記の作用を有する化合物を含有する食品を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定構造を有する化合物が神経細胞突起伸展作用を有するとの知見に基づくものである。
即ち、本発明は、４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物を有効成分とする神経細胞突起伸展剤を提供する。また、４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物を含有する食品を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、神経細胞突起とは、神経細胞を構成する４つの異なる領域、即ち、細胞体、樹状突起、軸索及び軸索末端のうちの、樹状突起領域をいう。
また、本発明における４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物とは以下の構造を有するものである。
0003974729.tif 000002
これらのうち、下記の式（１）で表されるものが好ましい。
0003974729.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立に、ヒドロカルビル基、好ましくは、アルキル、アルケニル又はアルコキシ基を表すが、より好ましくは、Ｒ3は、１〜１８個の炭素原子を有するヒドロカルビル基である。）
また、より好ましくは、本発明における４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物は以下の構造を有するものである。
【０００７】
0003974729.tif 000004
【０００８】
上記式中、Ｒ1及びＲ2におけるアルキル基としては、炭素数１〜４であるのが好ましく、より好ましくは炭素数１〜３、特に好ましくはメチル基である。また、上記化合物のうちＢＹ１−１が特に好ましい。本発明の化合物は、ＮＧＦと併用してもよく、併用しなくてもよい。その投与形態は特に限定されることはなく、例えば、食品に添加して経口投与することもできる。
また、本件明細書に記載のビャクズクとは、生姜科の植物(Amomun kravanh)の種子で、カレー主原料の１つであるカルダモンの類縁種である。タイや中国南部では香辛料や漢方薬として使用されているが、世界的にはカルダモンの代用として一部使われている程度で使用量は少ない。
【０００９】
本発明の化合物は、例えば、以下の方法により得ることができる。
まず、ビャクズク粉末を溶媒により抽出する。溶媒としては、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン及びエチルエーテル等が挙げられる。好ましくは酢酸エチルを用いる。次に、溶媒抽出物をろ過する。ろ液を減圧濃縮する。濃縮物をシリカゲルカラム等に吸着させ、例えばヘキサンやヘキサン−酢酸エチルなどで洗浄する。次いで、これをヘキサン−酢酸エチル等の混合溶媒を用いて溶出し、活性画分を得る。
このようにして得られた活性画分を濃縮し、分配クロマトグラフィーに供する。分配クロマトグラフィーは、例えば、ヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル等の２層液系を用いた遠心液々分配クロマトグラフィーであることが好ましい。
このようにして得られた活性画分を減圧濃縮乾固する。この濃縮物をメタノール等の溶媒に溶解し、逆相シリカゲルのＨＰＬＣカラム等に吸着させ、メタノール等の溶媒で溶出し、活性画分を得、これを減圧濃縮乾固する。得られた活性画分を、再度、逆相シリカゲルのＨＰＬＣカラム等に吸着させ、アセトニトリル等の溶媒を用いて溶出させてもよい。
【００１０】
また、ＮＧＦ様作用試験は、例えば、ＰＣ１２細胞の神経突起伸展で評価することができる。ＰＣ１２細胞は、ラット副腎褐色細胞腫から樹立された細胞で、ＮＧＦの刺激により神経突起の伸展、神経伝達物質の生合成に関する酵素の上昇が見られ神経細胞様に分化する細胞である。つまり、ＰＣ１２細胞は、株化した腫瘍細胞として未分化の性質を保持しており、ＮＧＦの添加によって長い神経繊維を伸ばし、ニューロン様細胞へと劇的に変化することを最大の特徴とするため、ＮＧＦによるニューロン分化の典型的モデルである。
【００１１】
また、本発明によれば、上記４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物を含有する食品が提供されるが、かかる最終食品の形態としては、例えば、固体、液体及びゲル状物が挙げられる。より具体的には、本発明の食品としては、例えば、菓子、飲料等が挙げられる。そして、これらの食品に上記４−エン−３，６−ジオン骨格を有するステロイド化合物を含有させる場合、当業界で通常行われる手段を用いることができ、求める神経細胞突起伸展作用に応じた濃度で含有させることができる。
【００１２】
【実施例】
実施例１
ビャクズク粉末200ｇを酢酸エチル1Lで2回抽出し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、濃縮物8.36gを得た。
濃縮物をヘキサンで調製したシリカゲル（ワコーゲルC−300）の500mlカラムに吸着させた。ヘキサン1.5L、ヘキサン-酢酸エチル（２０：１）800mlで洗浄後、ヘキサン-酢酸エチル（5：1）の混合溶媒で溶出し活性画分を得た。
シリカゲルカラムクロマトで得られた活性画分を濃縮し、ヘキサン-酢酸エチル-アセトニトリル（７：１：５）の2層液系を用いた遠心液々分配クロマトグラフィー（使用装置：センシュウ科学社製LLB-M）に供した。上昇法で展開し活性画分を得た。
遠心液々分配クロマトグラフィーで得た活性画分を減圧濃縮乾固した。この濃縮物をメタノールに溶解し、逆相シリカゲル（ペガシルODS（商品名：センシュー科学社製））のHPLCカラム（20φ×250mm）に吸着させ、メタノールで溶出し、活性画分１および2を集め減圧濃縮乾固した。活性画分1については再度逆相シリカゲル（ペガシルODS（商品名：センシュー科学社製））のHPLCカラム（20φ×250mm）に吸着させ、95％アセトニトリルで溶出させ活性画分１−１，1−2，および活性のない1‐3を得た。
活性画分１−１はmethylcholest-4-ene-3,6-dione（BY1-1）、活性画分1−2はstigmasta-4,22-diene-3,6-dione（BY1-2）、1‐3画分はstigmastane-3,6-dione（BY1-3）、活性画分２はstigmast-4-ene-3,6-dione（BY  ２）であった。
【００１３】
試験例１（NGF様作用試験）
NGF様作用試験は、PC12細胞の神経突起伸展で評価した。この細胞の性質を利用して、培養細胞に本発明化合物を添加して神経突起伸展効果を調べた。
（試験細胞）PC12細胞
（検体）実施例で得られたBY化合物をアセトンに溶解し、1mg／mlの溶液を作成した。
（試験方法）PC12細胞を、10％牛胎児血清、50ユニット／mlペニシリン、50μg／mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、2.5×105細胞／mlに調製し、コラーゲンコート24穴プレート（Corning社製）に0.4ml／wellずつまき、37℃、5％CO2条件で培養した。24時間後に各種濃度の検体を含む無血清の上記培地0.4mlと交換した。対照サンプルとして、本発明化合物を加えない無添加サンプルと、NGFを添加したサンプルも作成した。
このような条件下で48時間培養したのち、PC12細胞の神経突起の伸展を顕微鏡下に観察した。
神経突起の伸展は、細胞の顕微鏡画像を処理し、細胞50個あたりの突起の総延長を求め平均値で表した結果を表1に示す。BY1‐3については本化合物無添加の対照との明らかな差が見られなかったが、BY１−１、BY１−２、BY  ２については添加濃度に応じて明らかな突起伸展が見られた。
【００１４】
表−１
0003974729.tif 000005
【００１５】
試験例２（NGF作用増強試験）
NGF作用増強試験は、PC12細胞の神経突起伸展で評価した。この細胞の性質を利用して、培養細胞に低濃度のNGF存在下で本発明化合物を添加して本発明化合物のNGF作用増強効果を調べた。
（試験細胞）PC12細胞
（検体）実施例で得られたBY  ２をアセトンに溶解し、1mg／mlの溶液を作成した。
（試験方法）PC12細胞を、10％牛胎児血清、50ユニット／mlペニシリン、50μg／mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、2.5×105細胞／mlに調製し、コラーゲンコート24穴プレート（Corning社製）に0.4ml／wellずつまき、37℃、5％CO2条件で培養した。24時間後に各種濃度の検体とNGF2.5ng／mlを含む無血清の上記培地0.4mlと交換した。対照サンプルとして、本発明化合物，NGFを加えない無添加サンプルと、本発明化合物のみ加えないサンプル、NGFのみを加えないサンプルも作成した。
このような条件下で48時間培養したのち、PC12細胞の神経突起の伸展を顕微鏡下に観察した。
神経突起の伸展は、細胞の顕微鏡画像を処理し、細胞50個あたりの突起の総延長を求め平均値で表した結果を表2に示す。BY２には単独で突起伸展活性を有するのみならず、低濃度のNGFの作用を明らかに増強する効果が認められた。
【００１６】
表−２
0003974729.tif 000006
【００１７】
【発明の効果】
本発明の神経細胞突起伸展剤は、低分子でありながら、ＮＧＦと同等の高い神経細胞突起伸展作用を有する。また、ＮＧＦと併用した場合、ＮＧＦを単独で用いた場合と比べより一層高い神経細胞突起伸展作用、即ち、ＮＧＦ作用促進能を提供することができる。
一方、上記特定化合物を含有する食品は、例えば、神経障害の治療、より具体的には抗痴呆に効果的な健康食品として有用である。