(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患又は肝炎を治療するためのＢＢＩを含む組成物。
【請求項２】
薬剤学的に許容されるキャリヤーをさらに含む、請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の資金援助よる研究中に生まれた。米国政府は、本発明に一定の権利を有するかも知れない。
発明の背景
本発明は、炎症性疾病を治療する組成物及び方法に関する。
プロテアーゼインヒビターは、マメ、穀類、木の実、果実および野菜のような、、多くの型の異なる食物に一般的に認められる化合物の種類である。特徴の最も良く分かっているプロテアーゼインヒビターの一つが、大豆より得られたボーマン・バークインヒビター（Ｂｏｗｍａｎ  Ｂｉｒｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＢＢＩ）である。このインヒビターは、７つのジスルフィド結合を持つ７１のアミノ酸からなる鎖であって、１：１でトリプシンおよびキモトリプシンと異なる結合部位で結合し、おおよそ８０００の分子量を持つ。
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行ったトリプシンインヒビターの研究では、ＢＢＩが特に、効果的な抗発癌剤（ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）であることが示された。Ｂｏｗｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．，１９４６，６３，５４７およびＢｉｒｋら、Ｂｕｌｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｉｓｒａｅｌ，１９６２、Ｓｅｃ．１，１１，４８およびＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９６３，６７，３２６に記載され、後にボーマン・バークインヒビター（ＢＢＩ）と呼ばれるようになった酵素阻害剤は、培養細胞および実験動物細胞の放射線または化学誘導による悪性のトランスフォーメーションを阻害または少なくとも大きく減少させる確かな生理活性を持つことが明らかになっている。
Ｙａｖｅｌｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、８２，５３９５−５３９９は、アセトンで脱脂したダイズ粗抽出物が、インビトロで細胞のトランスフォーメーションを効果的にブロックする、と報告している。疫学的データによるこれらの所見から、ＢＢＩは、特に結腸癌に関する、抗発癌性食品としての可能性があると示唆される。
Ｗｅｅｄら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９８５，６，１２３９−１２４１は、ボーマン・バークプロテアーゼインヒビターを含むダイズ抽出物をジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）で処理したマウスの食餌に加えると、結果として結腸粘膜の腺腫様腫瘍（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｔｕｍｏｒｓ）が有意に抑制される、と開示している。マウスのＤＭＨ−誘導結腸癌は、一般的に、ヒトの結腸に起こる腫瘍とよく似た結腸直腸腺癌を誘導する発癌物質で処理したヒトの疾病の優れた動物モデルと考えられており、研究された種類の食品添加物が、望ましくない副作用なしにヒト結腸癌の進行に対してある種の保護を与える可能性を示唆している。ＢＢＩ抽出物およびその調製方法は、Ｙａｖｅｌｏｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８３，４３，２４５４−２４５９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，５３９５−５３９９に記載の方法に従った。
Ｍｅｓｓａｄｉら、ＪＮＣＩ１９８６，７６，４４７−４５２は、プロテアーゼインヒビターＢＢＩを含むダイズ抽出物が、ハムスターの頬袋７，１２−ジメチル−ベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）−誘導の発癌を抑制することを、示した。この口内癌のモデルは、ヒトの口内癌である扁平上皮癌の最も一般的な型と同じ組織病理、増殖パターンおよび前癌性病変を持つ。この研究では、ＢＢＩがハムスター頬袋の発癌を阻害できることが示され、ヒト口内発癌も、類似の様式でＢＢＩに応答するであろうことが示唆された。この研究に用いられたＢＢＩ調製物は、Ｙａｖｅｌｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８５、８２，５３９５−５３９９に記載の方法に従って調製されたインヒビターの粗抽出物である。
Ｂａｔｕｒａｒｙら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９８６，２，２１−３２は、アセトンで脱脂したダイズの粗抽出物を用いたＢＢＩ試料が、発癌補助物質であるピレンで強化されるまたは強化されない、放射能でおよび化学的に誘導されるトランスフォーメーションをインビトロで抑制することを、開示している。Ｙａｖｅｌｏｗら、１９８５は、純粋なＢＢＩまたは彼らの方法に従って調製されたＢＢＩ抽出物のいずれかが、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の放射能誘導トランスフォーメーションを抑制することを示している。Ｋａｎｎｅｄｙら、１９８４は、純粋なＢＢＩまたは彼らの方法に従って調製されたＢＢＩ抽出物のいずれかが、ブルーム症候群（高レベルの染色体異常によって、正常より高い発生率で患者を癌にかかりやすくすると考えられる遺伝病）患者の細胞の染色体異常の程度を減少させると、報告している。さらに、その他の研究は、ダイズ誘導プロテアーゼインヒビターが、インビボで皮膚癌、乳癌および肝臓癌の発癌抑制効果を持ちうることを示唆している。
ｋｅｎｎｅｄｙら、”Ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ”、Ｃｅｒｕｔｔｉら編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９８７，２８５−２９５頁は、ダイズをアセトンで脱脂することによって調製したＢＢＩ粗抽出物を用いたさまざまなシステムで、ＢＢＩが発癌を抑制することを、開示している。彼らの結果から、非常に低濃度のＢＢＩ型のプロテアーゼインヒビター調製物が結腸癌の化学予防剤として有効であろうことが示唆された。化学予防剤としてプロテアーゼインヒビターを用いると、起こりうる可能性のある毒性問題によって余病を併発するかもしれないことを示唆する証拠はない
Ｓｔ．Ｃｌａｉｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９０，５０，５８０−５８６は、ＤＭＨ処理したマウスの飼料に０．５％または０．１％の半精製したＢＢＩを加えると、結果として、血管肉腫ならびに肝臓および結腸の発癌の結節性過形成を充分に有意に抑制すると、報告している。また、この研究の結果は、飼料中にＢＢＩが０．５％またはそれより少なく含まれていても、マウスの健康に悪影響を及ぼすことはなく、肝臓及び結腸の発癌を抑制する能力を持つことを、示している。
ボーマン・バークインヒビター濃縮物（ＢＢＩＣ）と呼ばれるＢＢＩを多く含むダイズ抽出物は、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｔａｔｕｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎから得られ、ヒトの癌の化学療法剤としてのＢＢＩＣを評価するため、ヒトでの試行が始まった。
Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９８７，８（９），１２０７−１２１２は、プロテアーゼインヒビターおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の非存在下または存在下で、１２−Ｏ−テトラデノイル−ホルボル−１３−アセテート（ＴＰＡ）で活性化された多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）（ＰＭＮｓ）によるＨ2Ｏ2の形成をモニターした。試験されたプロテアーゼインヒビターには、ジャガイモインヒビター１（ＰｔＩ−１）および２（ＰｔＩ−２）、ＰｔＩ−２のキモトリプシン抑制性フラグメント（ＰＣＩ−２）、ニワトリのオボインヒビター（ＣＯＩ）、七面鳥のオボムコイドオボインヒビター（ＴＯＯＩ）、ボーマン・バークインヒビター（ＢＢＩ）、ライマメ（ｌｉｍａ  ｂｅａｎ）インヒビター（ＬＢＩ）ならびにダイズ（ｋｕｎｉｔｚ）トリプシンインヒビター（ＳＰＴＩ）が含まれる。Ｈ2Ｏ2形成の阻害によって測定された活性の順序は、Ｐｔ−１≧ＰＣＩ−２≧ＰｔＩ−２≧ＣＯＩ≧ＢＢＩ≧ＴＯＯＩ≧ＬＢＩ≧ＳＢＴＩであり、このことは、トリプシン特異的インヒビターではなくキモトリプシンに特異的なプロテアーゼインヒビターが、刺激を受けたヒトのＰＭＮｓ（多形核白血球）の酸化的バースト中、活性酸素種の形成を阻害する能力を持つことを示している。ＢＢＩは、キモトリプシンおよびトリプシンの両方のインヒビターとしての特徴を持っていた。
Ｐｅｒｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ，１９７０，１９，８６０−８６１は、脱脂したダイズ抽出物からＢＢＩを得る精巧な方法について、記載している。
米国特許第４，７９３，９９６号（ｋｅｎｎｅｄｙら）は、ダイズのアセトン処理、次いでエタノール抽出さらにアセトン沈殿を含む、ＢＢＩを得るための方法を開示している。ダイズは、アセトン処理の前に脱脂しても良い。さらに、ＢＢＩは、従来技術によってさらに精製することもできる。ｋｅｎｎｅｄｙらは、ダイズからＢＢＩを調製する従来の方法では、細胞の悪性トランスフォーメーションを阻害するＢＢＩの能力に悪影響を与える因子が残っていることを、発見した。この因子を除去したならば、得られたＢＢＩ生成物は、細胞の悪性トランスフォーメーションを阻害する能力を持っていた。Ｐｅｒｌｍａｎｎらの教えにより、ダイズをエタノール抽出する前にアセトンで処理することによって、この因子を除去できることが分かった。
Ｋｅｎｎｅｄｙらは、生成物が単一のタンパク質のみを含む点まで抽出物の完全精製を要求する方法を実行する必要はないと、教授している。そのかわりに、インヒビターの粗抽出物が得られるある点で精製手順を停止させると効果的であることを、見いだした。この粗抽出物はそれ自身が食用に適し、例えば経口摂取によって、細胞の悪性トランスフォーメーションのインヒビターとして用いることができる。Ｋｅｎｎｅｄｙらは、ダイズを脱脂し、その脱脂ダイズからインヒビターを抽出することを含む、悪性細胞トランスフォーメーションのインヒビターを含むダイズ粗抽出物を調製する方法について、開示している。
ＢＢＩの抗発癌活性は知られているが、その抗炎症性効果は、今まで知られていなかった。
発明の概要
本発明の目的は、炎症を治療するＢＢＩ組成物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、腸の炎症性疾病を持つ動物に有効量のＢＢＩを投与することを含む、動物の腸炎症性疾病を治療する方法を提供することである。
本発明のその他の目的は、肝臓に炎症を持つ動物に有効量のＢＢＩを投与することを含む、動物の肝臓の炎症を治療する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
図１は、プロテアーゼ活性についてのヒト生検サンプルの分析を示す。結腸上皮領域非含有（即ち正常に見える）および含有のヒト結腸粘膜生検サンプルを、潰瘍性結腸炎の患者から得た。サンプルをホモジナイズし、ゼラチンザイモグラム上でプロテアーゼ活性について分析した。５０μｇのタンパク質を、ゲルの列のそれぞれに、負荷した。サンプルは未処理のままか、またはザイモグラム泳動前に、トリプシンで活性化した。含有：結腸含有領域からの組織生検。非含有：正常に見える結腸上皮から得られた物質。４４ｋＤａプロテアーゼは、結腸の正常出現領域から得られた非活性化サンプルには存在しない。しかしながら、このプロテアーゼは、ＵＣ患者の結腸含有領域に（トリプシンによる活性化なしに）存在する。図１の右の数字は、分子量（ｋＤａ）を指す。図１の左の矢印は、４４ｋＤａのプロテアーゼ活性の位置を示す。
図２は、腸の炎症性疾病のラットモデルシステムでの潰瘍性結腸炎病変に関連するタンパク質分解活性の分析を示す。組織は、７日目のＤＮＢＳ／エタノールサンプルからのものである。結腸組織の小片を取り、重量を測定し、４００μｌの冷リン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ）を加えた２ｍｌの微小遠心管内に入れた。組織ホモジナイザー内で１０秒間（氷上で）、組織をすりつぶし、次いで、ＰＢＳを、最終濃度が５０ｍｇ組織／ｍｌ（ＰＢＳ）になるように、加えた。その後、サンプルを氷上で１０秒間、音波処理した。ホモジナイズされた組織を１４，００００ｘｇで５分間、５℃で遠心分離した。上澄み液を抜き取り、ゲル穴内に置いた。ゲルを泳動させ、カラム毎に切断し、特異性の異なるインヒビターを含む媒質内でインキュベートした。ゼラチンを含むこのＳＤＳポリアクリルアミドゲルで示される結果は、特定のクラスのプロテアーゼへのインヒビターの影響を示している。ペプスタチン（アスパラギン酸プロテアーゼのインヒビター）およびＮＥＭ（チオールプロテアーゼのインヒビター）は、ほとんど影響を持たないが、ＥＤＴＡ（メタロプロテアーゼのインヒビター）は、サンプルのタンパク質分解活性に影響を与えるある能力を持っている。ＤＦＰ（セリンプロテアーゼのインヒビター；ＤＦＰは神経ガスとしても知られている）およびＢＢＩは、ＵＣ病変内に存在するタンパク質分解活性を実質上完全に破壊する。これらの研究で、ＤＦＰは１ｍＭを用いたが、ＢＢＩは、１．２５μＭを用いた；このように、ＢＢＩは、ＵＣ病変内でタンパク質分解活性を阻害するＤＦＰの濃度よりかなり低い濃度で効果がある。
図３は、ラット結腸のＵＣ病変への、２つの異なるＢＢＩ生成物（ＢＢＩおよびＢＢＩＣ）での治療効果を示している。ＢＢＩまたはＢＢＩＣ（１０μｇ／ｍｌ）を、いくらかの生検サンプルホモジネートに加え、プロテアーゼ活性をゼラチンザイモグラムで分析した。１４日ＤＮＢＳ／エタノールで処理したラットから得られた同じラットの結腸サンプルを、プロテアーゼ／ザイモグラム分析に用いた。ゲルを２００Ｖで４０分間泳動させ、次いで、小片に切断した。それぞれのゲル／カラムを、次の様に処理した：１）コントロール−５ｎｇのトリプシンを含む；２）トリスｐＨ８．０中でインキュベートしたＵＣサンプル；３）最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにＢＢＩを加えたトリスｐＨ８．０中でインキュベートしたＵＣサンプル；４）コントロール−最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように加えられたＢＢＩと共に５ｎｇのトリプシンを含む；５）最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにＢＢＩＣを加えたトリスｐＨ８．０中でインキュベートしたＵＣサンプル；６）コントロール−最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように加えられたＢＢＩＣと共に５ｎｇのトリプシンを含む。
列４および６を列１と比較すると、ＢＢＩおよびＢＢＩＣの両方がトリプシンのタンパク質分解活性を効果的に阻害することを、見いだすことができる。これらの結果から、ＢＢＩはＵＣサンプルのタンパク質加水分解活性を２．８倍まで阻害するが、ＢＢＩＣは活性を３．１倍まで阻害することが示唆される。この結果は、スキャニングデンシトメトリー（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって定量した。
図４は、正常個体から採取した結腸粘膜生検片および結腸癌への進行の危険性が増した結腸粘膜生検片でのタンパク質分解活性のレベルを示す。結腸癌への進行の危険性が増した結腸粘膜生検片からの組織サンプルは、１）潰瘍性結腸炎；２）内視鏡手術により除去された一つまたはそれ以上の腺腫様ポリーブの経験がある；即ちポリーブ経験；および３）結腸癌の経験がある：患者の正常に見える結腸粘膜の領域を示す。これらのデータは、結腸癌に進行する危険性が正常より高く、個体より採取した結腸粘膜組織内のある種のタンパク質分解活性のレベルが、上昇していることを示している。
図５は、ＤＭＨのみを受けたラットに比べてＤＭＨ＋ＢＢＩで処理されたラットでは、３つの異なる基質で測定した時、タンパク質分解活性が減少することを示すデータを提供している。結腸粘膜生検片は、結腸発癌研究でＤＭＨの最終投与を動物に投与した後、１ヶ月の動物から採取した。結腸粘膜の正常に見える領域をＤＭＨ処理すると、結果として、正常な動物で認められるレベルと比較してタンパク質分解活性のレベルが有意に上昇するが、これに対してこれらのＤＭＨに晒した正常に見える領域のＢＢＩ処理は、結果として、ＤＭＨに晒されなかった対照動物と有意に違わないレベルの活性を生ずる。
発明の詳細な説明
腸の炎症性疾病（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＩＢＤ）は、１９世紀初頭に記載され、後に、２つの主要なカテゴリー、潰瘍性結腸炎およびクローン病、に分類された。これらのカテゴリーならびにＩＢＤの型として分類されるその他の稀な状態のいずれにも同様に属さない病状のＩＢＤの小さな部分集合が存在する。米国では、ＩＢＤの評価にかなりの変動が見られるが、大多数の研究では、一年あたり１００万人から２００万人が罹患し、２０，０００から２５，０００の新しい病状を伴う、と予想される。白人では、クローン病では１５−３０歳に、および潰瘍性結腸炎では２０−３５歳にピークを持つ、発現年齢の二頂分布が存在する。この疾病の第二のピークは約７０歳に起こる。より若年から始まる疾病は、通常、より重症である。工業化国家、特に米国および北欧では、ＩＢＤが最も高率であるが、これに対して日本および南米の国々では、最も低い発生率である。
潰瘍性結腸炎は、最初に結腸の粘膜の内層を侵すが、回腸の末端部分をも侵す可能性のある病気である。この病気は、緩解期に進みうるが、通常、再発するであろう。臨床上のサインは、典型的には、腹部痙攣、倦怠感、体重減少、出血性下痢および／または便秘を含む。劇症の場合には、潰瘍性結腸炎は、命を脅かす可能性がある。患者の約１０％のみが腸管の外側に病変を持ち、患者の約２０−２５％が病気を持ってから１０年後に心膜切開を行うであろう。また、皮膚、肝臓、胆管路、関節、血液悪液質および眼の疾病とも関連する可能性がある。潰瘍性結腸炎患者の内視鏡および組織病理学的評価は、結腸粘膜の対照的持続性炎症を示す。病気は、通常、直腸内で始まり、肛門および回腸に向かって進行する。病状は絶え間なく続く。びらんおよび炎症それに続く治癒の循環パターンが存在し、時には、粘膜表面上に炎症性浸出物が存在する。病気の急性期は、炎症性細胞の顕著な浸潤と共に、筋層に広がる陰か膿瘍（ｃｒｙｐｔ  ａｂｓｃｅｓｓｅｓ）および潰瘍化を特徴とする。慢性期は、粘膜構築のリンパプラスマ細胞の浸潤およびかゆみを伴う腸壁のさらなる線維組織形成および厚化を伴う。潰瘍性結腸炎の病因は、知られていない。
クローン病は、腸壁の層のすべてを含み、口から肛門に至る胃腸管のどこにでも起こりうる慢性の再発過程である。臨床上のサインは、典型的には、下痢（出血を伴う場合も、または伴わない場合もある）、腹痛および体重減少を含む。時には、肛門周辺がフィステル（ｆｉｓｔｕｌａ）形成にかかわる場合もある。クローン病に関連する重症の腎臓病もまた、存在するであろう。内視鏡検査および組織病理学上、クローン病は、障害の境界のはっきりした、寄せ集めの部分的な疾病である。腸は、厚く線維性になり、慢性の場合には、消化管の内面に長い曲がりくねった裂溝を持ち、ゴムホース様に固くなるであろう。慢性の経壁炎症、壁内洞、リンパ球凝集、および非乾酪化肉芽腫は、クローン病の主な特徴である。クローン病の病因は、分かっていない。
結腸癌の危険性の増加と関係するＩＢＤは、今世紀の初頭から知られていた。調査データから、潰瘍性結腸炎は、クローン病よりわずかではあるが結腸癌に進行しやすいらしく、癌に進行する機会は、病気の開始期間よりの時間と共に増加する。小腸内のクローン病である限り、結腸の外側のその他の部位で癌の危険性が増すことはない。小腸のクローン病患者では、小腸腺癌になる危険性は、一般の人々の危険性の５０から１００倍である。追跡研究では、一般の人々と比較して、結腸癌になる危険性の大きさは、潰瘍性結腸炎で３倍から３０倍であり、クローン病患者では約４倍から２０倍である。危険性の評価が変動するのは、研究した集団の型、研究の長さおよび方法ならびにその他の疫学的因子による。結腸炎症の範囲および期間は、ＩＢＤ患者が癌になる危険性の主な因子であるらしく、その危険性は、病気の開始時期から８年から１０年で大きく増加する。慢性炎症の影響が結腸癌への進行を導くと考えられる。ＩＢＤ患者の癌の診断は、癌の症状を隠すＩＢＤの症状によって複雑になる。典型的には、ＩＢＤ患者は、毎年行う内視鏡試験および生検で追いかけ、形成異常および癌への進行について観察する。
現在の病因研究の領域には、遺伝学、代謝欠損、粘膜欠損、免疫傷害、自己免疫および食餌の要素が含まれる。治療法開発での現在の興味ある領域には、免疫調整、即ち、サイトカイン、Ｔ細胞および抗酸化剤のような、特異性の高い標的を伴う薬剤の使用、が含まれる。
本発明では、炎症を治療するためのＢＢＩを含む組成物が提供される。望ましい実施態様では、これらの組成物は、さらに医薬として適当なキャリヤーを含む。これらの組成物は、特に腸炎症性疾病および肝炎の治療に有効である。”ＢＢＩ”とは、限定するわけではないが、この技術分野で既知の方法によって調製されたＢＢＩ、および米国特許第５，２１７，７１７号の方法に従って調製されたＢＢＩ濃縮物を含む、任意のボーマン・バークインヒビターまたはボーマン・バークインヒビター生成物を含むことを意味する。また、ＢＢＩを含む有効量の組成物を投与することによって動物の炎症を治療する方法もまた、提供される。「動物」とは、ヒトを含む任意の哺乳動物を含むことを意味するが、該哺乳動物に限定されない。
予防的な補助食（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）または医薬のいずれかとしての、請求の範囲に記載されている組成物の有効量の投与は、本発明の教示の範囲内にある。用語「有効量」とは、例えば４４ｋＤａのタンパク質の、ある型のタンパク質分解活性の発現を妨げる量をさす。当業者らは、既知方法に従って、その量を決定することができる。本発明の組成物は、非経口、直腸、局所、経皮または経口、望ましくは経口で投与することができる。医薬的または予防的な補助食剤型の例としては、これらに限定されるわけではないが、シロップ、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）および含そう薬が含まれる。
本発明の一つの実施態様は、医薬として適当な液体キャリヤー中に組成物の懸濁液または溶液を含む液体調合物である。適当な液体キャリヤーは、これらに限定されるわけではないが、懸濁剤、保存剤、香味剤あるいは着色剤、またはそれらの任意の適当な組み合わせと共に、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコールのような非水溶媒、油脂または水を含む。
本発明に有効なＢＢＩ組成物のその他の液体剤型は、長い粘膜接触時間を提供し、美味であり、投与しやすく、そして低価格での大量生産に適している、安定な含そう薬溶液である。代用唾液は、粘膜接触時間および生物学的利用能を増加させるために必要な粘度を持つ溶液を提供し、多くの化合物を持続的に放出することが分かっている。一つの調合物には、ＢＢＩ濃縮（ＢＢＩＣ）生成物、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、またはメチルパラベンのような代用唾液、および水が含まれる。
その他の実施態様では、錠剤の形の組成物は、固体調合物を製造するために日常的に用いられている任意の適当な医薬キャリヤーを用いて、製造される。そのようなキャリヤーの例としては、これらに限定されるわけではないが、ステアリン酸マグネシウム、澱粉、ラクトース、スクロースおよびセルロースが含まれる。
カプセルの形の組成物は、日常的に用いられるカプセル化方法を用いて、製造される。例えば、本発明の組成物を含むペレット、顆粒または粉末を、標準的なキャリヤーを用いて製造し、次いで硬いゼラチンカプセル内に充填することが出来る。代わりに、分散液または懸濁液を、任意の適当な医薬キャリヤーを用いて製造し、次いで分散液または懸濁液を、柔らかいゼラチンカプセル内に充填することもできる。適当な医薬キャリヤーには、これらに限定されるわけではないが、水性ガム、セルロース、ケイ酸塩および油脂が含まれる。
さらにもう一つの実施態様では、非経口投与のための組成物は、溶液または懸濁液として調合される。この溶液または懸濁液は、一般的に、無菌の水性キャリヤーまたは非経口に適した油脂中に、本発明の組成物を含むであろう。非経口に適する油脂の例としては、これらに限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油およびゴマ油が含まれる。代わりに、溶液を凍結乾燥し、次いで、投与の直前に適当な溶媒で再形成することもできる。
慢性結腸炎のハプテン誘導モデルは、ＩＢＤの病因に免疫成分が存在するという理論を基に、開発された。このモデルでは、エタノールを用いて保護粘膜を取り除き、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いてラットに慢性結腸炎を誘導する。関連モデルでは、２，４，６−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）を用いて、ＴＮＢＳモデルと同様に、結腸に慢性の炎症および潰瘍を作り出す。これらのモデルは両方とも、慢性結腸炎の炎症媒介物質を測定するために用いられた。
正常なおよび結腸上皮領域を含むヒト生検サンプルを、潰瘍性結腸を持つ患者から得た。サンプルをホモジナイズし、ゼラチンザイモグラム上でプロテアーゼ活性について分析した。５０ｍｇのタンパク質を、ゲルのそれぞれの列に負荷した。サンプルは、未処理のまま、またはトリプシンで活性化した後、ザイモグラム上を泳動させた。結腸含有領域からの組織生検は、ブラッシング法を用いて得た。材料は、同一方法で、正常の結腸上皮非含有領域から得た。図１に示すように、正常な結腸上皮から得られた非活性化サンプル内には、４４ｋＤａのプロテアーゼが存在しない。同様の結果が、その他の結腸生検サンプルでも得られた。
ＢＢＩおよびＤＦＰは、両方とも、ＵＣ病変内に存在するプロテアーゼの活性の阻害に非常に有効であり、結果として、サンプル内に存在するほとんどすべてのプロテアーゼ活性を除去する。図２を参照のこと。結果をスキャニングデンシトメトリーで分析すると、プロテアーゼインヒビター活性を持たないＵＣ病変を示すカラムでは、ＢＢＩカラムより７．７倍高い活性を持ち、ＥＤＴＡカラムより１．６倍高い活性を持ち、さらにＤＦＰカラムより１０．１倍高い活性を持つ。ペプスタシン（アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター）およびＮＥＭ（チオールプロテアーゼインヒビター）は、ＵＣ病変のプロテアーゼ活性にほとんど影響を与えない。
同様にザイモグラムを分析して、ＵＣ病変内に存在するタンパク質分解活性へのＢＢＩＣの影響とＢＢＩの影響とを比較した。これらの結果を図３に示す。ＵＣ病変内に存在するタンパク質分解活性の阻害において、ＢＢＩはＢＢＩと同様に効果的であることを、図３に見出すことができる。
図２および３に示された結果から、ＢＢＩおよびＢＢＩＣによって影響を受けるＵＣ病変内にいくつかの異なるタンパク質分解活性が高レベルで存在することが、示唆される。ＩＢＤの原因として作用し、ＵＣ病変内に存在するプロテアーゼの一つは、４４ｋＤａのプロテアーゼであると考えられ、４４ｋＤａのプロテアーゼは、ＵＣのラットモデルでＢＢＩによってその活性が阻害されるプロテアーゼの一つであると考えられる。ＢＢＩがその他のもしかすると重要であるかも知れないタンパク質分解活性の発現レベルに影響を与えうることは、その他の型の実験でも認められた。これらの特定のタンパク質分解活性のレベルは、インビボおよびインビトロのシステムの両方で、発癌物質で処理した細胞内で増加し、癌に進行する危険性が平均より高いヒト組織内では上昇している。ＵＣ患者の結腸粘膜生検サンプル内でのタンパク質分解活性のレベルを定量した。図４に示すように、ＵＣ患者の結腸粘膜を含まない、即ち正常に見える、領域内では、マーカーであるタンパク質分解活性のレベルが上昇している。ＢＢＩを含む組成物で処理すると、これらの高レベルのタンパク質分解活性は、ＵＣ患者の結腸を含まない領域内の正常なレベルに戻るであろう。動物の結腸癌発癌の研究では、ＤＭＨで処理した結腸粘膜では、特定のタンパク質分解活性が上昇し、ＤＭＨおよびＢＢＩまたはＢＢＩＣで処理した動物では、ＤＭＨで誘導された結腸癌発癌をＢＢＩが抑制するのに並行して、これらのタンパク質分解活性のレベルが減少することが分かった。ＢＢＩを含む組成物で処理すると、ＵＣ患者の正常に見える結腸粘膜内のこれらのタンパク質分解活性のレベルもまた、制御され、従って、潰瘍形成に導く炎症プロセスを防御するであろうと、考えられる。図４の度数分布図に示すデータは、以下の表１に示す、個人の患者、即ちＵＣ患者または正常な個人、について示している。ＩＢＤの証拠を持つまたは持たない個人からの結腸粘膜生検サンプルはすべて、結腸粘膜の正常に見える領域から採集した。
0004026851.tif 000002
タンパク質分解活性のレベルは、以下のように定量される。結腸粘膜生検サンプルを氷上で解かし、無菌のテフロン−ガラスホモジナイザー内、氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。タンパク質分解活性のレベルは、サンプルのアリコートを０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）−５ｍＭ  ＣａＣｌ2中で、以下の合成基質：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ；Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ；およびＧｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）：のそれぞれと共に、インキュベートすることによって、測定した。これらの基質を切断するタンパク質分解活性がＢＢＩによって影響を受けることが知られていることから、これらの基質が選択された。３７℃で２時間インキュベーションしたのち、１．８ｍｌの蒸留水で希釈して、反応を終了させた。蛍光レポーター基（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、アミノ−メチルクマリン、の遊離を、分光光度計を用い、励起波長３８０ｎｍおよび発光波長４６０ｎｍで、測定した。タンパク質含有量は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２，２４８−２５４に記載のＢｒａｄｆｏｒｄの方法に従って、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、定量した。データは、タンパク質含有量をもとに標準化し、タンパク質分解活性／μｇタンパク質で表した。これらのデータを表４に示す。ｔ−テストを行い、Ｗｅｌｃｈの修正を用いて不等分散（ｕｎｅｑｕａｌ  ｖａｒｉａｎｃｅｓ）を満たすように調整した場合、得られたｐ値は、ＵＣ患者対正常な対照タンパク質分解活性のレベルが互いに有意に異なることを示してた。
対照ラット対化学発癌物質ＤＭＨに晒し、ＢＢＩ処理を行ったおよび行っていないラットの結腸粘膜生検サンプルのタンパク質分解活性のレベルを定量するために、同様の研究を行った。これらの研究では、動物を処理しないか、またはＤＭＨで週に２回、３週間の間、動物を処理した。投与されたＤＭＨの量（全投与量、８０ｍｇ／ｋｇ）は、あらかじめ動物に結腸癌を起こすことが明らかにされている。また、処理した動物の一つのグループは、ＤＨＭ注射期間中およびその後に、０．１％の食料ＢＢＩＣに晒した。最後にＤＭＨ注射を与えた後１ヶ月で、動物を殺した。結腸生検サンプルが得られ、そしてヒト粘膜生検サンプルに関して記載された方法に従って、タンパク質分解活性のレベルを定量した。これらの研究のデータを、以下の表２に示す。
0004026851.tif 000003
また、これらのデータを表５にも示す。これらの結果から、ＤＭＨ単独での処理の後１ヶ月では、タンパク質分解活性のレベルが有意に高く上昇するが、これに対して、ＤＭＨに晒しＢＢＩＣで処理された動物では、タンパク質分解活性のレベルは、ほぼ正常である。これらの研究の結果は、発癌性として知られる投与量のＤＭＨで、動物はＤＭＨが最終投与された１ヶ月後、有意に上昇したレベルのタンパク質分解活性を持つことを、示している。ＤＭＨ処理が動物の結腸癌の原因となる条件下で、０．１％の食料中ＢＢＩＣは、結腸癌の動物数および／または動物あたりの腫瘍数を有意に減少に導く。これらのデータは、食料中ＢＢＩＣが結腸癌の動物数を減少させる条件下で、ＤＭＨで処理した動物のプロテアーゼレベルもまた減少することを、示している。ＢＢＩＣ処理は、ＤＭＨで上昇したおおよそのプロテアーゼレベルを有意に減少させ、未処理の対照動物で認められるレベルに近づける能力を持つ。これらの実験の結果は、ＤＭＨ＋ＢＢＩＣ処理グループのプロテアーゼレベルが、ＤＭＨ処理グループに認められるレベルと比較した場合、有意に減少していることを、示している。抗発癌活性として用いられる投与量のＢＢＩおよびＢＢＩＣもまた、タンパク質分解活性レベルの減少と相互に関係するこの抗炎症活性で、炎症を減少し阻害するために、有効であろう。
ＩＢＤの症状およびＵＣ患者に内視鏡で認められるような肉眼で見える炎症を緩和する、ＢＢＩを含む組成物の効果を決定するためのヒトでの試行では、ＢＢＩＣの毎日の投与量を４種類に変化させて、即ち、１００、２００、４００および８００キモトリプシンインヒビター（Ｃ．Ｉ．）ユニットについて、研究されるであろう。２００Ｃ．Ｉ．ユニット投与量は、伝統的日本食のダイズのプロテアーゼインヒビター活性の量に近い。投与量グループあたり８人の患者について、研究がなされるであろう。患者は、３ヶ月間丸薬の形でＢＢＩＣを摂取するであろう。投与は、ＢＢＩＣでの治療期間全体で３回（研究の開始時、研究中１．５ヶ月、およびＢＢＩＣ処理開始後３ヶ月）ならびにＢＢＩＣ試行期間の終了後１ヶ月になされるであろう。ＢＢＩＣ療法を始める前および３ヶ月の試行期間終了時に、曲がりやすいＳ状結腸鏡検査および生検法が行われるであろう。以下の分析を行うために、３種類の生検サンプルが、採取されるであろう：１）基質Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＬｙｓおよびＧｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの加水分解によって定量されるようなタンパク質分解活性；２）４４ｋＤａプロテアーゼのタンパク質分解の比活性；および３）サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−２および脂質過酸化のような炎症マーカーのレベル。ＵＣ患者の結腸粘膜の正常に見える領域から採取した一つの生検サンプルは、基質加水分解アッセイに用いられ、一方、４４ｋＤａプロテアーゼのレベルおよび炎症マーカーについての分析には、結腸粘膜の最もひどく侵された領域から採取した２種類の生検サンプルが用いられるであろう。ＩＢＤの症状へのＢＢＩＣの影響は、これらのマーカーの影響と相互に関係するであろう。血液内へのＢＢＩ代謝物の取り込みおよび尿中への排出もまた、ＵＣ患者のＢＢＩＣの複数回投与プロトコールの一部として、行われるであろう。３ヶ月の研究の開始時、中間期および終了時のＢＢＩＣ投与後２４時間以上にわたって、尿サンプルのすべてが集められるであろう。
患者は、飲み込まれる含そう薬として、ＢＢＩＣ組成物の投与量を４種類に違えて（２５、１００、２００および４００Ｃ．Ｉ．ユニット）、投与された。ＢＢＩＣ処理前、およびＢＢＩＣ処理後おおよそ４週間に、血液サンプルを患者から採取した。血液サンプルの分析の一環として、肝臓の機能分析を行った。正常範囲以上の濃度の血清グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）および血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）は、肝炎の共通サインである。この研究中、ＳＧＯＴおよびＳＧＰＴが上昇していた３人の患者では、ＢＢＩＣ治療がこれらの濃度を正常に戻すことが分かった。これらの研究では、ＳＧＯＴの正常濃度は、５から４０Ｕ／Ｌの範囲である。ＳＧＰＴの正常濃度は、これらの研究では、７−５６Ｕ／Ｌの範囲である。この研究のデータを表３に提供する。
0004026851.tif 000004
数字の隣の”Ｈ”は、これらの臨床実験室アッセイで、”高い（ｈｉｇｈ）”を示す。高濃度のＳＧＯＴおよびＳＧＰＴを正常値に戻すＢＢＩＣ治療効果は、ＢＢＩ組成物の抗炎症効果と一致する。
以下の実験は、本発明の実施およびそれから得られる生成物の特徴および用途を説明するものである。それらは、説明する目的でのみ提供され、本発明を制限するつもりのものではない。
実施例
化学薬品
ＤＮＢＳは、ＩＣＮより購入した。ゼラチンは、ＤＩＦＣＯ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）より購入した。ＥＴＤＡ、エタノール、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）、トリプシンおよびペプスタチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より得た。ボーマンバークインヒビター濃縮物（ＢＢＩＣ）は、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｏｙａ（Ｆｔ．Ｗａｙｎｅ，ＩＮ）より得、さらに精製されたＢＢＩは、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによってＢＢＩＣより得た。
結腸サンプル
３８匹のオスの、ウイルス抗体を持たない、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０−３００ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入し、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの標準セットに従って、アスペンチップ（ａｓｐｅｎ  ｃｈｉｐ）を敷き詰めたミクロアイソレーターケージ（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ  ｃａｇｅ）内で飼育した。ラットは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃５００１（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で飼育した。動物を４つのグループ：負または手順上の対照グループ；塩類溶液浣腸剤を与えられた正の対照グループ；０．２５ｍｌのエタノールを与えられたベヒクル対照グループ；および０．２５ｍｌエタノール中のＤＮＢＳ３０ｍｇを与えられたＤＮＢＳ／エタノールグループ：に分けた。化合物は、金属の栄養補給用針を直腸にチップが肛門から約８ｃｍになるまで挿入して、浣腸剤として与えられた。この位置は、ほぼ左結腸曲（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｆｌｅｘｕｒｅ）の位置に相当する。点滴注入後おおよそ３０秒間は、動物をそのままにして置いた。３匹の動物は、手順上の対照グループであり；動物は、１、３および７日に、Ｃ０2で安楽死させた。５匹の動物は、塩類溶液対照グループであり；１匹のラットは１日目、２匹のラットは７日目、そして２匹のラットは１４日目に、安楽死させた。１５匹の動物は、残りの処理グループのそれぞれである。それぞれのグループから５匹の動物は、浣腸後１日、７日および１４日に、ＣＯ2で安楽死させた。動物はすべて、生きている間、１、１、７および１４日に体重を測定した。結腸から中心方向に８ｃｍを切除し、縦に切り開いた。便を取り除き、組織を塩類溶液でリンスした。結腸内の肉眼的病変は、潰瘍、炎症および出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）（ＭＧ）をもとに評価した。ホルマリン中に置いた組織の半分の結腸を再度縦に切断し、残りの半分はドライアイス上に置いて、その後、プロテアーゼ活性についてアッセイするまで、−８０℃に冷凍した。
組織病理
ホルマリンで固定した結腸組織は、慣用の様式で進めた：パラフィンに埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオリンで染色した。結腸片のそれぞれの端から１サンプル、および結腸の中央部から２サンプルが、それぞれの組織ごとに試験され、以下のように格付けした：
０    ＝正常
１ａ  ＝病巣びらん（上皮表面に限定される損傷９
１ｂ  ＝粘膜に限定される炎症
２ａ  ＝病巣潰瘍形成
２ｂ  ＝経壁炎症
３ａ  ＝病巣潰瘍形成および経壁炎症
３ｂ  ＝広範囲のびらんおよび経壁炎症
４    ＝広範囲の潰瘍形成または正常粘膜に隣接する凝固壊死および経壁炎症
５ａ  ＝切片全体を含む広範囲の潰瘍形成および経壁炎症
５ｂ  ＝切片全体を含む広範囲の粘膜凝固壊死および経壁炎症
定義
びらん：  粘膜の部分が失われているが、粘膜筋板を覆う粘膜が残っている
潰瘍形成：粘膜が粘膜筋板のレベルまで、またはそれより深く、失われている
経壁：    粘膜、粘膜下組織、筋板層および漿膜を含む
組織のサンプリングおよびホモジナイゼーション
結腸片の中央部または潰瘍の中心部から採取した組織サンプルを、”Ｃ”で示し、組織の中心部と端の間の中途から採取したサンプルを、”Ｉ”で示し、そして組織サンプルの端からのサンプルを、”Ｅ”で示した。組織の小片を結腸の切片から集め、重量を測定し、４００μｌの冷リン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ）と共に、２ｍｌの微小遠心管内に置いた。Ｔｅｋｍａｒ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザー（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて、氷上で１０秒間、組織をすりつぶした。１ｍｌのＰＢＳあたり組織が５０ｍｇの比率になるまで、ＰＢＳを充分に加えた。氷上に置いたまま、フィッシャー音波ディスメンブラネーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒ）（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて、１０秒間、サンプルを音波処理した。ホモジナイズした組織を、５℃、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液は、必要になるまで、氷上に保って置いた。
チモーゲンプロテアーゼアッセイ
０．１％のゼラチンを含む０．７５ｍｍの厚さの１２％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルを、調製した。暖かい蒸留水にゼラチンを溶解することによって、前もって２％のゼラチンストックを調製した。サンプルは、０．１％ＳＤＳを含むがβ−メルカプトエタノールを含まない標準のＳＤＳ−ゲル−負荷バッファー中、ゲル穴に置いた。サンプルは、負荷前に、沸騰させなかった。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ  ＰｒｏｔｅａｎII装置中、２００Ｖで４０分間、ゲルを泳動し、その後、回転振とう器（ｇｙｒｏｒｏｔａｒｙ  ｓｈａｋｅｒ）上、２０℃で１５分間、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む蒸留水中に浸した。ＥＤＴＡを含むバッファー内に置くべきゲルは、蒸留水中に１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に浸した。ゲルをインキュベーション用バッファーに移し、３８．５℃で１６時間インキュベートし、アミドブラックで染色し、次いで、水−メタノール−酢酸（７％メタノールおよび５％酢酸／Ｌ）で脱染した。
インキュベーション用のバッファー
最適ｐＨの決定は、ｐＨ５．２、８、９および１０．２のインキュベーションバッファーを調製して、行なわれた。５０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．２および５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨバッファーｐＨ１０．２は、前もって調製して置いた。また、ｐＨ８およびｐＨ９のバッファーは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌを用いて調製した。
プロテアーゼ特異的インヒビターを調製した。セリンプロテアーゼのインヒビターとして、１０μｌの純粋なジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）保存液を５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ内に入れた。１００ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）／エタノールの保存溶液を前もって調製しておき、そして、濃度が１ｍＭになるように、これを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に加え、チオールプロテアーゼインヒビターとした。１００ｍＭのペプスタチン／メタノールの保存溶液を前もって調製しておき、そして、濃度が１ｍＭになるように、これを５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に加え、酸プロテアーゼインヒビターとした。２０ｍＭのＥＤＴＡ／蒸留水の保存溶液を前もって調製しておき、そして、最終濃度が１０ｍＭになるように、これを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に加え、メタロープロテアーゼインヒビターとした。５００ｍｇ  ＢＢＩ／ｍｌ（水）のアリコートを前もって調製しておき、必要になるまで、−２０℃に冷凍した。次いで、５００ｍｇ  ＢＢＩのアリコートを、４９ｍｌのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０にくわえ、ＢＢＩによって阻害されるプロテアーゼインヒビターとした。
組織の分析
それぞれの試験グループからの組織を、以下の様に分析した：
0004026851.tif 000005
肝炎を抑制するためのＢＢＩＣ含そう薬の投与
ダイズからのＢＢＩ濃縮物（ＢＢＩＣ）は、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｏｙａから、純粋な粉末（Ｃ．Ｉ．活性＝１００ｍｇ／ｇ）として、供給された。ＢＢＩＣは、含そう薬として投与される。この生成物は、長い粘膜接触時間が提供され、美味で、投与しやすく、そして低価格での大量生産に好適である、安定な含そう薬溶液にする。代用唾液は、粘膜接触時間および生物学的利用能を増加させるのに必要な粘度を持つ溶液を提供し、多くの化合物の持続的放出を提供することが示された。これらの実験で調製された調合物には、ＢＢＩ濃縮物（ＢＢＩＣ）、「代用唾液」（Ｒｏｘａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）および水が含まれる。
それぞれ２０ｍｌの投与量を、２つの別々の容器内に入れて、研究目的の被検者に提供した。２オンス瓶のそれぞれは、１４ｍｌの唾液代用物および６ｍｌの水を含む。ＢＢＩＣ（２５および１００Ｃ．Ｉ．）は、別々の容器内に提供され、投与前に混ぜ合わされた。２００および４００ユニットの投与量を、４０ｍｌおよび８０ｍｌの含そう薬容量で、投与した。
成分を混合し３０秒間懸濁液を振とうした直後に、それぞれの患者は、２０ｍｌ（または４０あるいは８０ｍｌ）の含そう薬を自己投与し、１分間口に含み、その後飲み込んだ。それぞれの患者は、胃腸吸収を助けるために、ＢＢＩＣ投与後、６オンスの水を飲むことを要求された。
ＢＢＩＣの投与前、基準線（０時間）の血液サンプルを、静脈系を通して回収した。ＢＢＩＣ投与後おおよそ４週間で、血液サンプルをもう一度採取した。ＳＧＯＴおよびＳＧＰＴレベルを、周知の方法に従って、それぞれの血液サンプル毎に測定した。
【図１】
0004026851.tif 000006
【図２】
0004026851.tif 000007
【図３】
0004026851.tif 000008
【図４】
0004026851.tif 000009
【図５】
0004026851.tif 000010