(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡであって、その配列の前に、さらに配列番号４に示すアミノ酸配列からなる植物細胞外分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが結合されたＤＮＡで形質転換され、該シグナルペプチドと該タンパク質との融合タンパク質を発現する、イネいもち病に対して抵抗性を有するイネ科植物：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（Ｂ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
イネ科植物がイネである請求項１に記載のイネ科植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、農業生産上重要な各種菌類病に対し抵抗性を示すイネ科植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子工学技術を用いて植物に有用遺伝子を導入し、植物菌類病に強い菌類病耐性植物を作出する試みが進められている。例えば、植物菌類病の病原菌に対する防御機構の強化を目的として、キチナーゼ遺伝子の植物への導入が進められている。
【０００３】
植物菌類病の病原菌として種々の糸状菌が知られているが、糸状菌は、その細胞壁を構成する主要成分の一つとしてキチンを有している。一方、植物はキチンを分解する酵素、キチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１４）を有しており、これが植物に感染しようとする糸状菌の細胞壁中のキチンに作用して、これらの病原菌による感染・発病を防止する防御機構となっていると考えられている。
【０００４】
上記のような防御機構に着目し、種々の生物に由来するキチナーゼ遺伝子を植物に導入する事によって、防御機構が強化された耐病性植物が作出されている。例えば、植物由来のキチナーゼ遺伝子を導入した例としては、１．インゲン豆から単離したキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５４巻、第１１９４頁−第１１９７頁（１９９１）］、２．タバコから単離したキチナーゼ遺伝子をタバコ、ニンジン、ヒマワリ、トマト、ワタ、トウモロコシ、カモガヤに導入したもの［特開平３−３５７８３号公報、特開平３−１１２４８８号公報］、３．マメ類のアラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）から単離したキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの［特開平５−７６８７３号公報］、４．トマトから単離したキチナーゼ遺伝子をトウモロコシ、ダイズ、ピート、コムギ、オオムギ、ケシ、アブラナ、ヒマワリ、アルファルファ、バラ、カーネーション、ガーベラ、トマト、ニンジン、レタス、チコリ、メロン、キャベツ、タバコへ導入したもの［特開平６−３８７６２号公報］、イネのクラスＩキチナーゼ（Ｃｈｔ−２）を高発現させた組換えイネ［セオレティカルアプライドジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．）、第９９巻、３８３頁〜３９０頁、１９９９年］等が知られている。
【０００５】
これに対し、微生物由来のキチナーゼ遺伝子を導入した例としては、１．細菌セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から単離されたキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの［トランスジェニックリサーチ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３巻、第９０頁〜第９８頁（１９９４）］、２．リゾプス・オリゴスポラス由来のキチナーゼをベントグラスに導入したもの［特開平８−１７２９５７号公報］等が知られている。
【０００６】
しかしながら、高い抗真菌活性を示すキチナーゼを植物細胞内で過剰発現させたにもかかわらず、植物体の耐病性が上がらなかった例も報告されている。例えば、タバコのクラスＩキチナーゼを過剰発現させてもタバコ白星病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａ）耐病性は上がらなかった例［プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．）、第１６巻、  １４１頁〜１５１頁、１９９１年］、てん菜のクラスIIIキチナーゼをタバコで過剰発現させてもタバコ白星（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａ）耐病性は上がらなかった例［モレキュラープラントマイクローブインタラクション（Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、第６巻、  ４９４頁〜５０６頁、１９９３年］等が知られている。また、植物細胞内でキチナーゼ遺伝子を発現させた場合、必ずしもその植物におけるキチナーゼ活性とその植物が新たに獲得した病害抵抗性との間に、正の相関が得られるとは限らない事が知られている。［セオレティカルアプライドジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．）、第９９巻、３８３頁〜３９０頁、１９９９年］。このように、キチナーゼ遺伝子を植物に導入して病害抵抗性を増強させようと試みる場合、必ずしも高い抗真菌活性を示すキチナーゼを植物内で大量に発現させることが、植物の病害抵抗性の増強に繋がるわけではないと推測されていた。
【０００７】
そこで本発明者らは、キチナーゼの持つ抗真菌活性の強弱とは別に、キチナーゼのグループ分けに着目して病害抵抗性イネ科植物を作出すべく鋭意検討を進めた。すなわち、自然界のキチナーゼは２つのグループに大別され、１つはアミノ酸配列の保存領域の違いから植物由来キチナーゼのファミリー１９と呼べるグループであり、微生物を含むそれ以外はファミリー１８と呼べるキチナーゼであることが解っていた［渡邉剛志  化学と生物  ３５巻  ６号  ４０８頁  １９９７年］。
【０００８】
しかるに、微生物由来の様々なキチナーゼ塩基配列を検索した過程で、ストレプトマイセス・グリセウス由来のキチナーゼＣと命名したキチナーゼは植物以外では唯一ファミリー１９に共通するドメイン構造を有するキチナーゼであることが見いだされた［ＴＳＵＹＯＳＨＩ ＯＨＮＯ， ＴＡＫＥＳＨＩ ＷＡＴＡＮＡＢＥ， Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ， １７８巻 １７号 ５０６５頁 １９９６年］。さらに、該キチナーゼの性質を調べた結果、高い抗真菌活性を有することが明らかとなっていた［特開２０００−９３１８２号公報］。
【０００９】
このように、微生物由来であるキチナーゼＣは、高い抗真菌活性を有することはもちろんだが、これまで利用されてきた微生物由来のキチナーゼと異なり植物により近いアミノ酸配列の保存領域を有するファミリー１９に属している極めて特徴的なキチナーゼと考えられるが、このキチナーゼＣ遺伝子をイネ科植物に導入発現させて病害抵抗性を付与するという試みは未だ知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる観点からなされたものであり、菌類病に対して抵抗性を示すイネ科植物を作出する事を課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意検討を進めた結果、ストレプトマイセス・グリセウス由来のファミリー１９に属するキチナーゼＣ遺伝子をイネ科植物に導入することにより病害抵抗性を増強することに初めて成功し、これまで作出されたキチナーゼを過剰発現させた形質転換イネより極めて高い病害抵抗性を示すイネ科植物を作出する事が可能となり、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
【００１２】
（１）下記タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換され、病害抵抗性を有するイネ科植物：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、キチナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）前記タンパク質をコードするＤＮＡが、さらに配列番号４に示すアミノ酸配列を有する植物細胞外分泌シグナルペプチドをコードし、同シグナルペプチドと前記タンパク質との融合タンパク質を発現する（１）に記載のイネ科植物。
（３）イネ科植物がイネである（１）又は（２）に記載のイネ科植物。
（４）病害が菌類病であるである（１）〜（３）のいずれかに記載のイネ科植物。
（５）前記菌類病がイネいもち病である（４）に記載のイネ科植物。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を詳しく説明する。
本発明の病害抵抗性イネ科植物の作出は、ストレプトマイセス・グリセウス由来のキチナーゼＣをコードするＤＮＡを導入して形質転換することにより得られる。前記キチナーゼＣをコードするＤＮＡの塩基配列は、特開２０００−９３１８２号公報に記載されている。また、キチナーゼＣをコードするＤＮＡは、例えば同ＤＮＡをｐＵＣ１１９に上に含むプラスミドｐＧＣ０１（特開２０００−９３１８２号公報）を鋳型とするＰＣＲ法（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ３７， １７２（１９８５））により、同プラスミドから調製することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば配列番号６及び７に示すオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１４】
本発明においては、キチナーゼＣは、キチナーゼ活性を有し、かつ、イネに病害抵抗性を付与することができる限り、その一部であってもよい。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜３０で表される領域は、欠失していてもよい。具体的には、本発明に用いるＤＮＡとしては、下記タンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、キチナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
前記「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３５個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。
尚、  配列番号２に示すキチナーゼＣのアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜２９は、シグナルペプチドであると推定される。
【００１６】
本発明に用いるＤＮＡは、キチナーゼＣ又はその一部に加えて、後述する植物細胞において分泌シグナルとして機能するシグナルペプチドをコードする配列をさらに含み、同シグナルペプチドと前記タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。さらに、シグナルペプチドと前記タンパク質との間に、他のタンパク質由来の配列又はリンカー等の人為的な配列が挿入された融合タンパク質であってもよい。本発明おいては、このような融合タンパク質を、単に「キチナーゼＣ」と呼ぶことがある。
【００１７】
本発明を適用することが出来る植物はイネ科植物であり、イネ科に属する物であれば特に制限はされない。具体的には、イネ、ムギ（コムギ、オオムギ、ライムギ等）、ヒエ、アワ、シバ、トウモロコシ等があげられ、本発明においては特にイネが好ましい。
【００１８】
本発明においては、キチナーゼＣをコードするＤＮＡは、適当なベクターを用いてイネ科植物細胞に導入される。その際、キチナーゼＣをコードするＤＮＡは、その５’末端側にイネ科植物で機能するプロモーターを、及び３’末端側にイネ科植物で機能するターミネーターを連結して導入される。このような、キチナーゼＣをコードするＤＮＡに加えて、これを発現させるために必要な配列、例えばプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡを、「キチナーゼＣ遺伝子」と呼ぶことがある。
【００１９】
具体的には例えば、キチナーゼＣをコードするＤＮＡは、イネ科植物で機能するプロモーター、及びイネ科植物で機能するターミネーターを有するプラスミドに挿入してキチナーゼＣ発現プラスミドを調製し、同プラスミドを用いて導入することができる。例えば、プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５ＳＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）のプロモーター等が使用できる。また、ターミネーターとしては、アグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子由来のターミネーター等が使用できる。もちろんこれらに限定されるわけではない。
【００２０】
キチナーゼＣタンパク質が植物において安定して蓄積するように、例えば、キチナーゼＣをコードする配列の前に分泌シグナルペプチドを結合して、キチナーゼＣを細胞外に分泌させても良い。分泌シグナルペプチドはイネ科植物細胞内で機能するものであれば特に制限されない。例えば、配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するイネ由来キチナーゼのシグナルペプチド等が使用できるが、もちろんこれに限定されるわけではない。同シグナルペプチドは、例えば配列番号３に示す塩基配列によってコードされ得る。同シグナルペプチドとキチナーゼＣとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例を、配列番号５に示す。
前記イネ由来キチナーゼでは、成熟タンパク質のＮ末端はグルタミン酸残基である。したがって、前記配列番号５に示す融合タンパク質の設計に当たっては、シグナルペプチドと成熟タンパク質との切断を確実にするために、配列番号３に示すアミノ酸配列には、シグナルペプチドのアミノ酸配列に加えて、Ｃ末端にグルタミン酸残基が付加されている。一方、キチナーゼＣの成熟タンパク質からは、Ｎ末端と推定されるアラニン残基（配列番号２中、アミノ酸番号３０）を除去してある。このように、本願発明において、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するシグナルペプチドとは、シグナルペプチドと、そのＣ末端に付加されたグルタミン酸残基からなるペプチドである。本発明においては、このグルタミン酸残基は必須なものではなく、シグナルペプチドとキチナーゼＣとの切断が起こり、活性のあるキチナーゼＣを生成し得るものであれば、切断部位の前後の配列は特に制限されない。
【００２１】
病害抵抗性イネ科植物の選抜を容易にするために、キチナーゼＣ遺伝子と同時に薬剤耐性遺伝子を選抜マーカー遺伝子として導入する手法を用いても良い。この手法を用いると、形質転換されたイネ科植物に導入される遺伝子は、キチナーゼＣ遺伝子と薬剤耐性遺伝子となる。薬剤耐性遺伝子としては、形質転換体の選抜が容易であることが望ましい。例えば、ネオマイシンフォスフォトランスフェレース（ＮＰＴ）遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェレース（ＨＰＴ）遺伝子等が好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【００２２】
薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモーターとしては、上記植物遺伝子プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
組み換えたキチナーゼＣ遺伝子が発現し得るように、キチナーゼＣ遺伝子とその発現を調節するプロモーター、ターミネーター、シグナルペプチド等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動しうる状態で連結されている核酸配列を発現カセットという。この発現カセットは定法によって構築され得る。
【００２４】
発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等が用いられ得る。バイナリーベクターであるｐＢＩ系のベクターはアグロバクテリウムを介して植物に発現カセットを導入し得る。例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。ｐＵＣ系のベクターは、直接植物に発現カセットを導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。本発明では、ｐＢＩ−ＥＮ４が好適に用いられ得る。このベクターは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域４反復を含む発現カセットと、マーカー遺伝子としてＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの支配下で発現されるＨＰＴ遺伝子を含んでいる。
【００２５】
発現カセットや発現ベクターをイネ科植物細胞に導入するには、上記のようにアグロバクテリウムを介する方法と、直接細胞に導入する方法とがある。
アグロバクテリウムを介する方法は、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクトロポーレション法等を用いてアグロバクテリウムに形質転換し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。発現カセット、発現ベクターを直接導入する方法としては、エレクトロポーレーション法、遺伝子銃法等が挙げられる。
【００２６】
発現カセット又は発現ベクターを導入されたイネ科植物細胞は、まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択され、ついで常法により、植物体に再生されうる。
【００２７】
形質転換されたイネ科植物における外来遺伝子の確認には、周知の方法が用いられ得る。例えば、Ｗａｌｂｏｔらの方法（Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２１１， ２７−３４，（１９８８））に準じた方法で植物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ３７， １７２（１９８５））もしくはサザン法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８，５０５（１９８０））により確認できる。
【００２８】
また、形質転換されたイネ科植物が組み込まれたキチナーゼＣ遺伝子を発現していることは、例えば、キチナーゼＣ遺伝子のあるいはその一部をプローブとして用いるノザン法（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７，５２０１−５２０５（１９８０））によりキチナーゼ遺伝子転写産物を確認する方法、あるいはキチナーゼＣに対する抗血清を用いたウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６， ４３５０−４３５４（１９７９））によりキチナーゼＣ遺伝子産物を確認する方法等により明らかに出来る。
【００２９】
得られた形質転換体は、各種病原に対する抵抗性試験に供試される。病原としては対象とする植物に応じて異なることもあるが、例えばイネの場合、イネいもち病、イネ紋枯病などが代表的な菌類病としてあげられ、特にイネいもち病に対する効果が顕著である。かかる抵抗性試験には再生当代の個体（Ｒ０世代）を用いても良いし、自殖後代の個体群（Ｒ１世代以降）を用いても良い。
【００３０】
接種用のイネいもち病菌胞子は、定法に従いイネいもち病菌をオートミール寒天培地上で２５℃、約２週間生育させた後、蛍光灯あるいはブラックライトランプを数日間照射することにより得られる。イネいもち病に対する抵抗性は、かかるイネいもち病菌胞子懸濁液を植物体に接種することで容易に判定できる。例えば定法により栽培したイネの４〜５葉期苗に、Ｔｗｅｅｎ２０等の展着剤を０．０５％加えたイネいもち病菌の胞子懸濁液を噴霧接種する。接種後２０〜２４時間、湿度ほぼ１００％の２５℃チャンバーにおき、以降温室にて７〜８日間栽培する。抵抗性は接種葉上の病斑出現程度等により判定できる。
【００３１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り本例に制約されるものではない。
【００３２】
【実施例１】
＜キチナーゼＣ遺伝子発現用ベクターの構築＞
キチナーゼＣ遺伝子の発現用ベクターの構築を、図１に基づいて説明する。プロモーター、選抜マーカー遺伝子、ターミネーターを有するベクターとして、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター及びそのエンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターＥＮ４、大腸菌のハイグロマイシンフォスフォトランスフェレース遺伝子、及びアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーターを有するプラスミドｐＵＣ−ＥＮ４（独立行政法人農業生物資源研究所、広近洋彦博士より入手）を用いた。
【００３３】
キチナーゼＣ遺伝子を有するベクターとしては、ｐＵＣ−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを用いた。同ベクターは、キチナーゼＣをコードするＤＮＡをｐＵＣ１１９に上に含むプラスミドｐＧＣ０１（特開２０００−９３１８２号公報）からＳａｃＩ及びＫｐｎＩで切り出した断片と、イネ由来キチナーゼ遺伝子のｃＤＮＡクローン（ＥＭＢＬ Ａｃｃ． ＃Ｘ５６７８７）を鋳型にして５’−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧ−３’プライマー（配列番号６）と５’−ＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’プライマー（配列番号７）を用いてＰＣＲを行って得られたイネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする断片をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した断片を、ＤＮＡライゲーションキット（東洋紡製）を用いてｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩとＫｐｎＩサイト間に連結することにより調製した。
【００３４】
ｐＵＣ−ＥＮ４を制限酵素ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断して得られた大断片と、ｐＵＣ−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣをＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断して得られたキチナーゼＣ遺伝子を含む断片を連結することにより、ｐＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを構築した。
【００３５】
このｐＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣをＥｃｏＲＩで切断して得られた断片と、これとは別にバイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＴ−ＤＮＡ領域に３５Ｓプロモーターとハイグロマイシンフォスフォフォトランスフェレース（ＨＰＴ）遺伝子とノパリンシンターゼ遺伝子由来ターミネーターを有するプラスミドｐＢＩ−ＨＰＴ（筑波大学、鎌田博 博士より入手）をＥｃｏＲＩで処理して得られた大断片を連結し、キチナーゼＣ遺伝子導入用プラスミドｐＢＩ−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを構築した。このプラスミドの構造を図１に示した。
【００３６】
形質転換アグロバクテリウムは、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．， ６７， ３２５（１９９０））に従って、発現ベクターｐＢＩ−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）に導入した後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地上、２８℃で培養することによって得た。
【００３７】
【実施例２】
＜発現ベクターのイネへの導入＞
イネの形質転換は、超迅速形質転換法（特許３１４１０８４号公報）に従って行った。すなわち、籾殻を取り除いたイネの完熟種子を無傷の状態で２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中で殺菌し、滅菌水で十分に洗浄後、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含むＮ６Ｄ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２．８ｇ／Ｌプロリン、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間２８℃に静置した。
【００３８】
形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液に前培養した上記の種子を浸漬した後、２Ｎ６・ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌグルコース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／Ｌ  アセトシリンゴン、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植し、２８℃暗黒下で３日間共存培養した。
【００３９】
ゲルライトを除いたＮ６Ｄ培地にアグロバクテリウム用抗生物質であるカルベニシリンを５００ｍｇ／Ｌを加えた洗浄液を用いて、種子からアグロバクテリウムを十分洗浄した後、カルベニシリン５００ｍｇ／Ｌと選抜マーカーとしてハイグロマイシンを５０ｍｇ／Ｌ加えたＮ６Ｄ培地に洗浄した種子を置床して、２８℃で約２週間選抜培養した。
【００４０】
選抜されたカルスを再分化培地（５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン、３０ｇ／Ｌスクロース、３０ｇ／Ｌソルビトール、２ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／Ｌ  α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８となるよう添加したＭＳ培地）に移植して、２８℃で再分化するまで培養を続けた。
【００４１】
再分化固体を発根培地（ハイグロマイシン３０ｍｇ／Ｌとなるように添加した、ホルモンフリーのＭＳ培地）に置床し、ハイグロマイシン耐性を検定した。非形質転換体は新しい根が伸長せず１週間ほどで枯死するのに対し、遺伝子が導入されたと考えられる形質転換体は耐性を示し、野生株と同様の生育を示した。形質転換植物が大きくなったところで、馴化を経てポットに移植し温室内で生育させたところ、成熟した完全な形質転換イネ植物体が得られた。
【００４２】
【実施例３】
＜形質転換イネ植物体のキチナーゼＣの発現の確認＞
再生した形質転換イネ植物体の葉から水溶性タンパク質を抽出し、ウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ７６， ４３５０，（１９７９））によりキチナーゼＣタンパク質の検出を試みた。
【００４３】
イネの葉をｐＨ６．０に調整したクエン酸−リン酸バッファーで抽出後、１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間で遠心分離を行った。上清をサンプルとして、常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。泳動後のゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に密着させ、ブロッティングバッファー（２５ｍＭ  トリスヒドロキシアミノメタン， １９２ｍＭ  グリシン， １５％メタノール）で、セミドライブロッティング装置（日本エイドー製）を用いて、１８０ｍＡ、６Ｖ、１時間の条件で通電することにより、ゲルからメンブランにタンパク質を転写した。
【００４４】
メンブラン上のキチナーゼＣタンパク質の検出は、１次抗体としてウサギをキチナーゼＣで免疫して得られたキチナーゼＣタンパク質に対する抗血清を、２次抗体としてウサギＩｇＧに対するアルカリフォスファターゼ結合したヤギＩｇＧ（ＩＣＮ社製）を用い、これらを含む溶液及びアルカリフォスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びブロモクロロインドールフォスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液にメンブランを順次浸漬し、基質を発色させることによって行った。
【００４５】
その結果、キチナーゼＣタンパク質に対する抗血清に反応する約３１．５ｋＤａのバンドを主とするタンパク質が検出された。
【００４６】
【実施例４】
＜自殖次世代へのキチナーゼＣ遺伝子の伝達＞
形質転換後代における導入遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）の存在をＰＣＲによって確認した。
実施例２で得られた再生植物体を温室にて常法により育成することにより、約４ヶ月後に自殖種子（Ｒ１世代）を得た。
【００４７】
それら自殖種子の籾殻を除去後、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、２５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含む１％寒天プレート上で約１０日間栽培し、ハイグロマイシン耐性個体を各系統１０個体ずつボンソル培養土（住友化学）に鉢上げした。
【００４８】
非形質転換体を含む各系統の葉身約１ｃｍから、川崎努の方法（「ＰＣＲ解析用の簡便なイネゲノムＤＮＡの単離法」植物のＰＣＲ実験プロトコール  秀潤社）に従って全ＤＮＡを抽出した。
【００４９】
抽出した各系統のＤＮＡ溶液１００μｌのうち１μｌを鋳型とし、プライマー１：ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡ（配列番号１０）、およびプライマー２：ＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡ（配列番号１１）を用いてアニーリング温度６０℃でＰＣＲを行った。
【００５０】
ＰＣＲ後、反応液の一部を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、バンドの有無、および、コントロールとして実施例１で構築したプラスミドｐＢＩ−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを鋳型に用いたＰＣＲ産物の長さとの比較を行った。その結果、自殖次世代に導入遺伝子が遺伝していることが確認された。
【００５１】
【実施例５】
＜形質転換植物の病害抵抗性＞
実施例２で得られた形質転換イネのイネ葉いもち病に対する抵抗性を検定した。接種用のイネとしては、再分化植物の自殖種子（Ｒ１世代）の籾殻を除去後、１％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌し、２５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含む１／４×ＭＳ培地上で約１０日間栽培し、ハイグロマイシン耐性個体を各系統１０個体ずつボンソル培養土（住友化学）に鉢上げし、温室内で４〜５葉期まで栽培した個体を用いた。
コントロールとしては、非形質転換イネ（日本晴）の籾殻を除去した種子を上記と同様に滅菌後、ハイグロマイシンを含まない１／４×ＭＳ培地上で同様に生育させ、以下、形質転換イネと同様に栽培した植物体を用いた。また、キチナーゼＣ以外のキチナーゼ遺伝子を導入したイネとの比較として、イネのクラスＩキチナーゼ（Ｃｈｔ−２）を高発現させた組換えイネ［セオレティカルアプライドジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．）、第９９巻、３８３頁〜３９０頁、１９９９年］を対照に用いた。
【００５２】
いもち病菌胞子懸濁液は、イネいもち病菌をオートミール寒天培地上で２５℃、約２週間生育させた後、ブラックライトランプを４日間照射することにより形成させた胞子を滅菌した絵筆でかき取り、５×１０5／ｍｌになるように０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０水溶液に懸濁して調製した。このイネいもち病菌胞子懸濁液を噴霧した植物体を、湿度１００％、２５℃、暗黒下の接種箱に２４時間静置した後、２８〜３０℃（夜間２３℃）の隔離温室にて７〜８日間栽培した。
【００５３】
抵抗性検定は、農林水産省（旧）中国農業試験場の古田研究室が開発した罹病面積を基にした葉いもち病抵抗性判定図に従って行った。すなわち、接種葉上に形成されたいもち病斑の程度を判定図に照らし合わせて病斑面積率で表し、元品種の病斑面積率と比較して防除価を算出し、キチナーゼＣを発現しない形質転換イネの防除価と比較した。非形質転換体と比較して、キチナーゼＣ遺伝子を恒常的に発現する形質転換イネでは病斑の数と伸展が著しく抑えられていた。また、イネキチナーゼを高発現する形質転換イネと比較しても、キチナーゼＣを恒常的に発現する形質転換イネは病斑の数と伸展が著しく抑えられ、防除価が高まっていた。この結果を図２に示した。
【００５４】
尚、防除価は、下記式により算出した。
防除価（％）＝（コントロールの平均病斑面積率−被験系統の平均病斑面積率）／コントロールの平均病斑面積率×１００
【００５５】
【実施例６】
＜同一系統内でのキチナーゼＣ発現量と病害抵抗性＞
同一系統内でのいもち病抵抗性を調べ、それぞれのキチナーゼＣ発現量をウェスタン法により分析し、キチナーゼＣ発現量といもち病抵抗性の相関関係を調査した。
【００５６】
実施例２で得られた形質転換イネの再分化植物の自殖種子（Ｒ１世代）を、１系統につき１０粒ずつボンソル培養土（住友化学）に播種し、温室内で４〜５葉期まで栽培した個体を用いて、実施例５に示した抵抗性検定を行った。その後、いもち病抵抗性検定後の接種葉を回収し、実施例３で示したウェスタン法を用いてキチナーゼＣの発現量の確認を行った。
【００５７】
その結果、表１に示すように、キチナーゼＣを発現している個体でのみ、いもち病抵抗性を示す高い防除価を示し、キチナーゼＣの発現がいもち病抵抗性の付与に関与していることが強く示唆された。
【００５８】
【表１】
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Ａ、Ｂ：キチナーゼＣ遺伝子導入形質転換イネ系統
＋  ：ウェスタン分析によるキチナーゼＣ発現有り
−  ：ウェスタン分析によるキチナーゼＣ発現無し
【００５９】
〔配列表の説明〕
配列番号１：キチナーゼＣ遺伝子の塩基配列
配列番号２：キチナーゼＣのアミノ酸配列
配列番号３：イネ由来キチナーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号４：イネ由来キチナーゼのシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号５：シグナルペプチドとキチナーゼＣとの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：イネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナル配列増幅用プライマー
配列番号７：イネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナル配列増幅用プライマー
配列番号８：導入遺伝子確認用プライマー
配列番号９：導入遺伝子確認用プライマー
【発明の効果】
本発明の病害抵抗性イネ科植物は、キチナーゼＣ遺伝子を導入されて形質転換されたことにより、イネいもち病等の菌類病に対する抵抗性が上昇し、農業生産上重要なイネ科植物を提供することが出来る。
【００６０】
【配列表】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  キチナーゼＣ遺伝子導入用プラスミドｐＢＩ−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣの構造の模式図。
【図２】  形質転換植物のイネ葉いもち病に対する抵抗性の試験結果を表すグラフ。
【符号の説明】
３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター
ＨＰＴ：ハイグロマイシン耐性遺伝子
ＮＯＳ３’：ＮＯＳ遺伝子ターミネーター
ＥＮ４：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（エンハンサー４反復）
ＲＣＣ２ＳＳ／ＣｈｉＣ：イネ・キチナーゼ遺伝子のシグナル配列を持つキチナーゼＣキメラ遺伝子
ＲＢ，  ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列、左側ボーダー配列
ＮＰＴＩＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子
ＮＴ：非形質転換体（コントロール）
Ｐ：キチナーゼＣ遺伝子を含まないプラスミドによる形質転換イネ
Ｃ：Ｎ−ＥＲ２−５５−５−１（イネキチナーゼ高発現形質転換イネ）
１、２，３，４：キチナーゼＣ発現形質転換イネ
【図１】
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【図２】
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