(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に０価の銀または銅の薄膜が形成された固相担体の表面に、アルキン基を末端部に有するＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断片をアルキン基末端部にて該薄膜に結合させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
【請求項２】
薄膜が０価の銀の薄膜であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
【請求項３】
請求項１もしくは２に記載の方法により得られたＤＮＡチップ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はまた、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００４】
ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】
その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。
【０００６】
しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作製技術が必要とされる。
【０００７】
ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チップ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】
予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法がある。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着して、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在する。
【０００９】
ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しかし、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】
（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡとの相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着しやすいため、検出を妨害するという問題がある。このため、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体表面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は下記の本発明によって解決された。
本発明は、表面に０価の銀または銅の薄膜が形成された固相担体の表面に、アルキン基を末端部に有するＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断片をアルキン基末端部にて該薄膜に結合させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法にある。
【００１３】
本発明は、また、上記記載の本発明の固定方法により得られたＤＮＡチップにもある。
【００１４】
本発明は、さらに、上記記載の本発明のＤＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にもある。
【００１５】
本発明は、さらにまた、上記記載の本発明のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
【００１６】
本発明についてさらに詳しく述べる。０価の銀または銅が薄膜状に施された固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は化学結合の形成をもって行われる。一般に遷移金属と末端アルキンが極めて速やかに化学結合を形成することは広く知られている。例えば、山本明夫著「有機金属化学」裳華房刊（１９８２年）、山崎博史、若槻康雄著「有機金属の化学」大日本図書（１９８９年）、山川浩司、松島美一、久留正雄著「有機金属錯体の化学」講談社刊（１９８９年）、Ｃｈ．Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈ、Ａ．Ｓａｌｚｅｒ著「オーガノメタリックス，ア・コンサイス・イントロダクション（Organometallics, A Concise Introduction）」ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊（１９８９年）、渡部正利、矢野重信、碇屋隆雄著「錯体化学の基礎」講談社（１９９０年）、伊藤卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信著「＜化学総説１７＞前周期遷移金属の有機化学」山崎博史編、学会出版センター刊（１９９３年）、辻二郎著「遷移金属が拓く有機合成その多彩な反応形式と最新の成果」（株）化学同人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｓ．Ｆ．Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖｅｒｋｒｕｉｊｓｓｅ共著「アプリケーション・オブ・トランジション・メタル・キャタリスツ・イン・オーガニック・シンセシス（Application of Transition Metal Catalysts in Organic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ刊（１９９８年）、Ｐａｕｌ  Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オーガニック・シンセシス・イン・ウォーター（Organic Synthesis in Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＆  ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８年）などの成書に、種々の０価遷移金属と末端アルキンが速やかな化学結合を形成することが記載されている。
【００１７】
一方、本発明の目的である核酸断片の検出法においては、被検体試料の核酸断片には一般に０価の銀または銅と強固な相互作用を有する基は存在しないため、０価の銀または銅が固相担体表面に露出していても、ハイブリダイゼーションの際に被検体試料核酸断片は無差別には固相担体表面に結合せず、ハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００１８】
本発明はさらに以下のように具体化することができる。
本発明は、末端アルキンを結合したＤＮＡ断片を準備し、該末端アルキンを有するＤＮＡ断片を含む水性液を０価の銀または銅を薄膜状に施した固相担体上に点着することにより固定が完了する。
【００１９】
本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法の好ましい態様は、以下の通りである。
（１）０価の銀を薄膜状に施した固相担体を作製する。
（２）ＤＮＡ断片として、末端アルキンを結合したＤＮＡ断片で、その塩基配列が既知であるものを用いる。
【００２０】
（３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着し、ＤＮＡ断片を固相担体上に固定する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の代表的な固定方法について説明する。
ゼロ（０）価の銀または銅が薄膜状に施された固相担体の表面に、ＤＮＡ断片を含む水性液を点着し、ＤＮＡ断片が固相担体表面と化学結合を形成する。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行い、必要によっては加熱処理を施すことによってＤＮＡチップを得ることができる。
【００２２】
０価の銀または銅が薄膜状に施された固相担体は、蒸着法によって作製することが好ましい。蒸着は、通常の金蒸着装置を用いて行うことができる。薄膜の厚さは、０．２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、０．３乃至５００ｎｍの範囲にあることがさらに好ましく、０．５乃至４００ｎｍの範囲あることが特に好ましい。また、０価の銀または銅が薄膜状に施された固相担体としては、０価の銀または銅の微粒子（直径は、１０乃至５００ｎｍの範囲にあることが好ましい）をポリビニルアルコール、ゼラチン等のバインダーに分散したものを固相担体上に塗布して作製したものも好ましく用いることができる。この場合には、公知の硬膜剤を用いて硬膜することが好ましい。
【００２３】
本発明で用いる固相担体は、疎水性、あるいは親水性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００n mの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２４】
末端アルキンを有するＤＮＡ断片を得る方法は大別して次の二つの方法が挙げられる。
一つは該官能基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法にて、該官能基を有するＤＮＡ断片を増幅する方法であり、他の一つはアミノ基などの反応性基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅したのち、末端アルキンを有する化合物を連結する方法である。
【００２５】
通常は後者の方法が容易であり、本発明においても好ましい。末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に入手可能である。従って、カップリング成分を固相担体に固定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング成分や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップリング成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮＡ断片のアミノ基と結合させることができる。この中ではカルボキシル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するものが好ましく、カルボキシル基を有するものは適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００２６】
末端アルキンを有するＤＮＡ断片を固相担体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができる。
酸としては無機酸および有機酸のいずれでも用いることができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフルオロ酢酸、酢酸が好ましい。
【００２７】
塩基としては、無機塩基および有機塩基の何れも用いることができるが、１メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピリジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２−ピロリドンを用いることが特に好ましい。
加熱する場合には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００２８】
表面処理された固相担体表面上には、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施した固相担体も好ましく用いることができる。
【００２９】
末端アルキンを有するＤＮＡ断片は、当該官能基とリン酸エステル基との間に、合成の都合上、クロスリンカーを有していてもよい。クロスリンカーは、単結合、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルアミノへキシレン基であることが特に好ましい。
【００３０】
ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００３１】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。
【００３２】
点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
【００３３】
また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００３４】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００３５】
ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００３６】
表面に０価遷移金属薄膜が形成された固相担体の表面にに、アルキン基を有するＤＮＡ断片を点着させると、該ＤＮＡ断片が固相担体表面の一部に固定される。該ＤＮＡ断片が固定されていない薄膜部分には、ハイブリダイゼーションの際に、標識された核酸断片試料が非特異的な反応によって固定される可能性があるため、予め、その薄膜部分をブロッキング処理（ブロッキング処理を施さなくても、本発明の固定方法によって製造された、ＤＮＡ断片固定固相担体は、充分にＤＮＡチップとして使用することができる。）しておくことも好ましい。ブロッキング処理に使用されるブロッキング試剤としては、水溶性の末端アルキン化合物、あるいは水溶性のメルカプト化合物を用いることが好ましく、具体例としては、プロパルギルアルコール、３−スルホフェニルアセチレン、チオグリコール酸、あるいはチオサリチル酸を挙げることができる。
【００３７】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【００３８】
標織方法としては、大別してＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、たとえば、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００３９】
なお、上記の標識を利用する以外にも、導電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもできる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップはこの検出方法に利用することもできる。
【００４０】
試料として用いる核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００４１】
試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製することが好ましい。
【００４２】
ハイブリダイゼーション操作は、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００４３】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００４４】
【実施例】
［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成及びＤＮＡ断片の固定量の測定
（１）０価の遷移金属を薄膜状に施したスライド（Ｃ）の作成
スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）の上に金属銀（０価）を蒸着したものを作製し、スライド（Ｃ）とした。
【００４５】
（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定
３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を５−ヘキシノイックアシッド（東京化成工業（株）製）および１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（いずれも東京化成工業（株）製）で処理し、３'末端に５−ヘプチノイルアミノ基が導入されたＤＮＡ断片を作成した。このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）とし、上記（１）で得たスライド（Ｃ）にこれを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍプロパルギルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）中に１時間浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、それぞれ１５５２であった。本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００４６】
［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出
（１）ＤＮＡチップの作成
末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定された（Ｄ２）を得た。
【００４７】
（２）試料ＤＮＡ断片の検出
５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌクレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、５９８であった。
本発明の固定化方法によって作成されたＤＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固相担体表面に金属銀を蒸着した場合には、末端アルキンを結合したＤＮＡ断片を強固に固定することができる。ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製を可能になる。その一つの例として、本発明によって作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よく検出することができる。