(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能であることを特徴とする大腸菌。
【請求項２】
リコンビナーゼ遺伝子が、Cre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項１記載の大腸菌。
【請求項３】
リコンビナーゼ遺伝子とインデューシブルなプロモーターが大腸菌ゲノム中にインテグレートされた請求項１または２記載の大腸菌。
【請求項４】
インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子とを有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能であることを特徴とするプラスミドが導入された大腸菌。
【請求項５】
リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項４記載の大腸菌。
【請求項６】
クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターがさらに導入された請求項１〜５のいずれか１項に記載の大腸菌。
【請求項７】
リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLPリコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項６記載の大腸菌。
【請求項８】
クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項６または７記載の大腸菌。
【請求項９】
クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターであって、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子をさらに有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能であるクローニングベクターが導入された大腸菌。
【請求項１０】
リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項９記載の大腸菌。
【請求項１１】
リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項９記載の大腸菌。
【請求項１２】
クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の大腸菌。
【請求項１３】
クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能である大腸菌に導入する工程、及びリコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の大腸菌菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、を含む形質転換体の製造方法。
【請求項１４】
大腸菌が、リコンビナーゼ遺伝子とインデューシブルなプロモーターが大腸菌ゲノム中にインテグレートされた大腸菌である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能であるプラスミド、及びクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを大腸菌に導入する工程、及びリコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の大腸菌菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、を含む形質転換体の製造方法。
【請求項１６】
クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能であるプラスミドを有する大腸菌に導入する工程、及びリコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の大腸菌菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、を含む形質転換体の製造方法。
【請求項１７】
クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列、インデューシブルなプロモーター及び前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が前記プロモーターの働きを制御することにより制御可能である直鎖状のクローニングベクターを大腸菌に導入する工程、及びリコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の大腸菌菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、を含む形質転換体の製造方法。
【請求項１８】
クローニングベクターまたはクローニングベクター及びプラスミドをエレクトロポレーション法により導入する請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法により得られた形質転換体を、その菌体内のリコンビナーゼ遺伝子が抑制された条件下で培養して前記形質転換体を増幅する方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により増幅した形質転換体から、クローニングすべきＤＮＡ断片を回収するＤＮＡ断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Cre リコンビナーゼのようなリコンビナーゼの発現を制御することが可能な宿主及びプラスミドに関する。さらに、リコンビナーゼの発現を制御することが可能な宿主を用い、loxP配列のような認識配列と挿入ＤＮＡとを有するＤＮＡ断片をリコンビナーゼの活性により、環状化し、さらに環状化した挿入ＤＮＡを有するＤＮＡ断片（プラスミド）をリコンビナーゼの発現を制御した条件下で増幅して、挿入ＤＮＡをクローニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子ＤＮＡの塩基配列を調べるためにゲノムＤＮＡライブラリーが用いられる。特に、近年ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列に高い関心が寄せられている。ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定するために用いられるゲノムＤＮＡライブラリーは、元になるmRNAの完全長に対応するcDNAであって、かつ元になるmRNAのポピュレーション（長さと発現量）を反映したcDNAであることが理想である。
【０００３】
ゲノムＤＮＡライブラリーの調製の過程を大きく２つに分けると、１つ目のステップがmRNAに対応する完全長cDNAを調製する工程、２つ目のステップは得られた完全長cDNAをクローニングする工程である。１つ目のステップの技術的なポイントは、如何にして鋳型に用いるmRNAに対応する完全長の（鋳型の長さと同じ）cDNAを調製するかである。この点については本発明者らは既に開発を終え、特許出願をしている。
２つ目のステップの技術的なポイントは、長鎖のcDNAであっても、また発現量の少ないcDNAであっても、クローニングの過程で取りこぼすことなく増幅するかである。せっかく１つ目のステップで鋳型に用いるmRNAに対応する完全長の（長鎖の）cDNAを作成しても、クローニングの過程でオミットされてしまっては意味がない。また、発現量の少ないcDNAをオミットしてしまったライブラリーからは、完全な遺伝子情報は得られないし、発現量の少ない遺伝子にこそ、貴重な情報が含まれている可能性であるからである。
【０００４】
従来知られているゲノムＤＮＡライブラリーとしてノーマライズド（またはイクオライズド）ライブラリーがある。このライブラリーは、ＰＣＲ法を利用して、全てのcDNAを一本鎖で回収したものである。しかし、このライブラリーは、以下の理由でmRNAに完全に対応するライブラリーとはなり得ないという問題がある。まず、ＰＣＲ法で増幅されにくい配列を有するcDNAやＰＣＲ法での増幅が困難な長鎖のcDNAはオミットされる可能性がある。さらに、元々発現量の少ない断片もオミットされる可能性である。
【０００５】
そこで本発明者は、上記ゲノムＤＮＡライブラリーに本来要求される特性、即ち、mRNAに対応する完全長を有し、かつ発現量に応じた量の各cDNA断片を含むＤＮＡライブラリーの作成に適したＤＮＡ断片のクローニング法を提供すべく検討した。特に、遺伝子工学の分野で常用されている、増幅したい遺伝子を挿入した形質転換体を用いた方法において、上記課題を解決できるＤＮＡ断片のクローニング法を提供すべく検討した。
【０００６】
形質転換体を用いるＤＮＡ断片のクローニングには、ベクターにＤＮＡ断片を挿入したプラスミドを用いる。このようなプラスミドは、それぞれ一本鎖にしたＤＮＡ断片とベクターとをライゲーションすることで作成される。しかし、ＤＮＡ断片の鎖長が長くなるとライゲーションによる環状化の効率は、長さの３乗に比例して低くなる。ＤＮＡライブラリーの作成においては、10kbp を超える鎖長を有するＤＮＡ断片をその長さを保ったままで増幅する必要があり、これまでに知られたＤＮＡ断片とベクターとのライゲーション法では環状化は事実上不可能であった。
【０００７】
また、プラスミドベクター以外のベクターとしてファージベクターがある。ファージベクターは、比較的長鎖のＤＮＡ断片を取り込んで環状化することが知られている。さらに、ファージベクターには、ベクターに挿入できるＤＮＡ断片の長さによって、インサーションベクターとサブスティチューションベクターとが知られている。しかるに、インサーションベクターに挿入できるＤＮＡ断片は０〜9kbpの範囲であり、サブスティチューションベクターに挿入できるＤＮＡ断片は9 〜18kbp の範囲である。一方、通常のＤＮＡライブラリーの作成においては、ベクターに挿入したいＤＮＡ断片は約０〜15kbp の範囲であり、何れのベクターを用いてもこの範囲をカバーすることはできない。また、ファージベクターでは、挿入ＤＮＡ断片の鎖長が上記０〜9kbpの範囲または9 〜18kbp の範囲内であっても、長さに応じて、λファージへのパッケージング効率は桁違いに変化し、発現量をそのまま反映するライブラリーを得ることはできない。
【０００８】
そこで本発明者は、上記課題を解決するため、1kbpに満たない短鎖のＤＮＡ断片から10kbp を超える長鎖のＤＮＡ断片まで、鎖長に係わらず一律にベクターに挿入できる新たな方法を見出した。
即ち、環状化してクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つの認識配列（例えば、loxP配列）を有するＤＮＡ断片を、前記認識配列を認識するリコンビナーゼ（例えば、Cre リコンビナーゼ）発現活性を有する宿主菌体内に取り込む工程、と前記ＤＮＡ断片を取り込んだ宿主菌体のリコンビナーゼを発現させて、前記ＤＮＡ断片を環状化する工程を含むことを特徴とする形質転換体の作製方法を見出した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法において、Cre リコンビナーゼ発現活性を有する市販の２種類の宿主菌体を用いて挿入ＤＮＡ断片のクローニングを行った。その結果、何れの場合も挿入ＤＮＡ断片のクローニングは行えるが、宿主の種類により回収率が低い場合があるという新たな問題が明らかになった。回収率が低い原因について検討したところ、Cre リコンビナーゼ発現活性の高い宿主では回収率が低くなくことが分かった。Cre リコンビナーゼ発現活性は線状化したプラスミドの環状化に必須であり、より高いことでプラスミドの調製も効率よく行うことができる。
【００１０】
例えばloxP配列のような認識配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドの調製には、宿主菌体のCre リコンビナーゼ発現活性が影響する。例えば、大腸菌DH10B(ZIP)はCre リコンビナーゼを発現する低コピー数プラスミドを有する宿主であるが、通常のプラスミドより収量が低い。大腸菌BM25.8はP1ライソジェンであり、Cre リコンビナーゼを発現するが、プラスミドの純度がシークエンシングには適さない。何故なら、Cre リコンビナーゼ発現条件下ではloxPを有するプラスミドのコピー数が減少し、その結果、プラスミドの収量が通常の高コピー数プラスミドより少ないからである。このような低収量は、完全長DNA の調製には適さない。
Cre リコンビナーゼの制御、即ち、ライブラリーの構築に際しては誘導でき、プラスミドの調製に際しては抑制できることが、loxP配列のような認識配列とCre リコンビナーゼを用いる遺伝子のクローニング法には必要である。
【００１１】
そこで、本発明は、線状化したプラスミドの環状化に必要なCre リコンビナーゼ発現活性は維持し、かつクローンの回収率も高められる新たな手段を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、Cre リコンビナーゼによりクローニングベクターが環状化された後には、Cre リコンビナーゼの発現を抑制できる新たな方法及び新たな宿主菌を提供することを目的とする。
さらに本発明の目的は、ＤＮＡ断片のクローニング法として有用な、上記リコンビナーゼの発現を制御できる宿主を利用して挿入ＤＮＡ断片を有するクローニングベクターの調製方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下のとおりである。
〔請求項１〕  インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が制御可能であることを特徴とする宿主。
〔請求項２〕  リコンビナーゼ遺伝子が、Cre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項１記載の宿主。
〔請求項３〕  リコンビナーゼ遺伝子とインデューシブルなプロモーターが宿主ゲノム中にインテグレートされた請求項１または２記載の宿主。
〔請求項４〕  インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子とを有することを特徴とするプラスミド。
〔請求項５〕  リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項４記載のプラスミド。
〔請求項６〕  請求項４または５に記載のプラスミドが導入された宿主。
〔請求項７〕  クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターがさらに導入された請求項１〜３及び６のいずれか１項に記載の宿主。
〔請求項８〕  リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項７記載の宿主。
〔請求項９〕  クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項７または８記載の宿主。
〔請求項１０〕  クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターであって、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子をさらに有するクローニングベクター。
〔請求項１１〕  リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項１０記載のクローニングベクター。
〔請求項１２〕  リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項１０記載のクローニングベクター。
〔請求項１３〕  クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
〔請求項１４〕  請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のクローニングベクターが導入された宿主。
〔請求項１５〕  クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が制御可能である宿主に導入する工程、及び
リコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の宿主菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、
を含む形質転換体の製造方法。
〔請求項１６〕  宿主が、リコンビナーゼ遺伝子とインデューシブルなプロモーターが宿主ゲノム中にインテグレートされた宿主である請求項１５に記載の製造方法。
〔請求項１７〕  インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミド、及びクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを宿主に導入する工程、及び
リコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の宿主菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、
を含む形質転換体の製造方法。
〔請求項１８〕  クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドを有する宿主に導入する工程、及び
リコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の宿主菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、
を含む形質転換体の製造方法。
〔請求項１９〕  クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列、インデューシブルなプロモーター及び前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有する直鎖状のクローニングベクターを宿主に導入する工程、及び
リコンビナーゼ遺伝子が発現された状態の宿主菌体内で前記クローニングベクターを環状化する工程、
を含む形質転換体の製造方法。
〔請求項２０〕  クローニングベクターまたはクローニングベクター及びプラスミドをエレクトロポレーション法により導入する請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
〔請求項２１〕  リコンビナーゼ認識配列が、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列またはR リコンビナーゼ認識配列である請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
〔請求項２２〕  リコンビナーゼ遺伝子がCre リコンビナーゼ遺伝子、FLP リコンビナーゼ遺伝子またはR リコンビナーゼ遺伝子である請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の製造方法。
〔請求項２３〕  クローニングすべきＤＮＡ断片がｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡである請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の製造方法。
〔請求項２４〕  請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法により得られた形質転換体を、その菌体内のリコンビナーゼ遺伝子が抑制された条件下で培養して前記形質転換体を増幅する方法。
〔請求項２５〕  請求項２４に記載の方法により増幅した形質転換体から、クローニングすべきＤＮＡ断片を回収するＤＮＡ断片の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の宿主
本発明の宿主は、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が制御可能であることを特徴とするものである。より具体的には、上記インデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセットの宿主中での存在状態としては、以下の場合がある。
（１）インデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセットが宿主ゲノムにインテグレーションされた宿主。宿主ゲノムへの上記カセットのインテグレーションは、例えば、相同配列組換え法により行うことができる。尚、リコンビナーゼ遺伝子及びインデューシブルなプロモーターのカセットは、適当な源から常法により制限酵素用いて切り出して調製することができる。
（２）インデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセット及びクローニングすべきＤＮＡ断片を有するクローニングベクターが導入された宿主。
（３）インデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセットを有するプラスミドが導入された宿主。
（４）インデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセットを有するプラスミドとクローニングすべきＤＮＡ断片を有するクローニングベクターとが導入された宿主。
【００１４】
上記（２）〜（４）で用いるインデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセットを有するクローニングベクター及びプラスミドは、適当な源からリコンビナーゼ遺伝子及びインデューシブルなプロモーターを制限酵素用いて切り出し、リガーゼを用いてこれらをクローニングベクターまたはプラスミド中に連結させることで構築することができる。
上記リコンビナーゼ遺伝子及びインデューシブルなプロモーターを載せるプラスミドには特に制限はなく、宿主菌体とともに増幅可能なものであればよい。例えば、pBluescript II SK 及びpAYCYC184 を挙げることができるが、これらに制限される意図はない。
【００１５】
上記（２）のインデューシブルなプロモーターとリコンビナーゼ遺伝子のカセット及びクローニングすべきＤＮＡ断片を有するクローニングベクター及び（４）のクローニングすべきＤＮＡ断片を有するクローニングベクターにおいて、クローニングすべきＤＮＡ断片は、例えば、ｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡであることができる。また、これらのクローニングベクターにおいてクローニングすべきＤＮＡ断片は、２つのリコンビナーゼ認識配列の間に挟まれた状態であり、かつ直鎖状のクローニングベクターであることができる。２つのリコンビナーゼ認識配列の間に挟まれたＤＮＡ断片は、後にリコンビナーゼ遺伝子の発現により環状化される。リコンビナーゼ認識配列としては、例えば、Cre リコンビナーゼ認識配列、FLP リコンビナーゼ認識配列及びR リコンビナーゼ認識配列等を挙げることができる。
【００１６】
「インデューシブルなプロモーター」としては、ラクトースプロモーターを挙げることができる。より具体的には、lacIq -lacO/P を挙げることができる。これ以外のインデューシブルなプロモーターとしては、マルトースプロモーターやキシロースプロモーター等を挙げることができる。
「リコンビナーゼ遺伝子」としては、例えば、Cre リコンビナーゼ遺伝子を挙げることができるが、これ以外にも例えば、FLP リコンビナーゼ遺伝子やR リコンビナーゼ遺伝子等を挙げることができる。
本発明のプラスミド、クローニングベクター及び宿主においては、リコンビナーゼ遺伝子が前記インデューシブルなプロモーターの下流に存在する。即ち、誘導物質の存在下あるいは抑制物質の不存在下でプロモーターが誘導されている状態のときには、このプロモーターの働きによりリコンビナーゼが発現し、誘導物質の不存在下あるいは抑制物質の存在下ででは、リコンビナーゼの発現が低下する状態になる。
【００１７】
形質転換体の作製方法
上記宿主を利用した挿入ＤＮＡ断片を有する形質転換体の調製方法及びこの方法を用いるＤＮＡライブラリーの調製方法について説明する。
第１の工程は、環状化してクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクターを、前記認識配列を認識するリコンビナーゼ発現活性を有する本発明の宿主菌体内に取り込む工程である。
【００１８】
上記「環状化してクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のクローニングベクター」は、形質転換直前の状態で、クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有するようにデザインされたものであることができる。そのようなクローニングベクターは、例えば、以下のようにして調製することができる。リコンビナーゼ認識配列を有するプライマーでｍＲＮＡ3'側よりプライミングして2 本鎖cDNAを合成する。得られた2 本鎖cDNAを2 本鎖cDNA中の上記プライマーと反対側（ｍＲＮＡ5'側）でリコンビナーゼ認識配列を持ったベクターとライゲーションにより結合する。これにより、プライマー上及びベクター上にリコンビナーゼ認識配列を有し、かつこの２つのリコンビナーゼ認識配列の間にクローニングすべきcDNA断片を有する上記直鎖状のクローニングベクターを調製することができる。
【００１９】
あるいは、リコンビナーゼ認識配列を有するプライマーでｍＲＮＡ3'側よりプライミングして第１鎖cDNAを合成する。得られた第１鎖cDNAの第１鎖cDNA中の上記プライマーと反対側（ｍＲＮＡ5'側）に塩基配列を付加的に接続または伸長する。リコンビナーゼ認識配列を１箇所に有するベクターの複製必要領域を挟んで、前記リコンビナーゼ認識配列と反対側に、前記第１鎖cDNAに接続または伸長した塩基配列と相補的な塩基配列を用いて、第２鎖を合成する。これによっても、プライマー上及びベクター上にリコンビナーゼ認識配列を有し、かつこの２つのリコンビナーゼ認識配列の間にクローニングすべきcDNA断片を有する上記直鎖状のクローニングベクターを調製することができる。
【００２０】
第１の工程では、まず、形質転換直前の状態で、クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つの認識配列を有するようにデザインされたＤＮＡ断片を用意する。「クローニングすべきＤＮＡ断片」とは、少なくとも宿主菌体内で増幅可能なプロモーター配列とクローニング対象のＤＮＡ断片とを有するＤＮＡ断片である。宿主菌体内で増幅可能なプロモーター配列は、各種の宿主菌体においてプロモーター配列として知られているいずれの配列であっても良い。また、クローニング対象のＤＮＡ断片にもついても、由来、鎖長等に特に制限はない。
「リコンビナーゼ認識配列」とは、リコンビナーゼにより認識される配列であり、例えば、Cre リコンビナーゼに認識されるloxP配列を挙げることができる。但し、認識配列及びリコンビナーゼとしては、loxP配列及びCre リコンビナーゼに限定されることはなく、例えば、FLP リコンビナーゼとその認識配列、及びR リコンビナーゼとその認識配列等を挙げることもできる。
【００２１】
次いで上記で用意したＤＮＡ断片を、このＤＮＡ断片中の認識配列を認識するリコンビナーゼ発現活性を有し、かつリコンビナーゼ発現活性を制御可能な本発明の宿主菌体内に取り込ませる。
例えば、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子の発現が制御可能である宿主、具体的には、リコンビナーゼ遺伝子とインデューシブルなプロモーターが宿主ゲノム中にインテグレートされた宿主に取り込ませる。
或いは、形質転換直前の状態でクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有するようにデザインされた直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドとともに宿主に導入することもできる。
さらに、形質転換直前の状態でクローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列を有するようにデザインされた直鎖状のクローニングベクターを、インデューシブルなプロモーターと前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドを予め有する宿主に導入することもできる。
また、クローニングすべきＤＮＡ断片を間に挟むように２つのリコンビナーゼ認識配列、インデューシブルなプロモーター及び前記プロモーターにより制御されるリコンビナーゼ遺伝子を有する直鎖状のクローニングベクターを宿主に導入することもできる。
【００２２】
ＤＮＡ断片の宿主菌体内への取り込みは、例えば、エレクトロポレーション法で行うことができる。エレクトロポレーション法の条件等には特に制限はなく、常法により行うことができる。また、認識配列を認識するリコンビナーゼ発現活性を有する宿主菌体は、例えば、リコンビナーゼがCre リコンビナーゼの場合、市販の宿主菌体があり、容易に入手できる。また、遺伝子工学の技術で、所望のリコンビナーゼ発現活性を有する宿主菌体を適宜調製することもできる。これにより、ＤＮＡ断片の鎖長の短長に係わらず、10kbp を超える断片であっても容易に、クローニングすべきＤＮＡ断片が宿主菌体内に取り込まれる。
【００２３】
第２の工程は、前記ＤＮＡ断片を取り込んだ宿主菌体を誘導物質存在下、培養してリコンビナーゼを発現させて、前記ＤＮＡ断片を環状化する工程である。
前記ＤＮＡ断片を取り込んだ宿主菌体のリコンビナーゼを発現させて、前記ＤＮＡ断片を環状化させる。即ち、ＤＮＡ断片を取り込んだ宿主菌体を培養することで、宿主菌体内でリコンビナーゼを発現させる。本発明の特徴は、この培養をリコンビナーゼ発現条件下で行うことである。
リコンビナーゼ発現条件は、宿主菌体中のインデューシブルなプロモーターにより適宜選択することができる。例えば、宿主菌体中のインデューシブルなプロモーターがラクトースプロモーターである場合、誘導物質としては、イソプロピル- β-D- チオガラクトシドを用いることができる。イソプロピル- β-D- チオガラクトシドは、培地中に例えば、0.1 〜1mM の範囲で添加することで、ラクトースプロモーターを誘導することができる。
【００２４】
宿主菌体中のインデューシブルなプロモーターが、マルトースプロモーターである場合、誘導物質としては、例えば、マルトースを用いることができる。
リコンビナーゼ発現条件下、この作用により、宿主菌体内のＤＮＡ断片の内、２つの認識配列により挟まれた環状化してクローニングすべきＤＮＡ断片が、ＤＮＡ断片の鎖長の短長に係わらず、環状化されてプラスミドベクターとなる。
【００２５】
第３の工程は、環状化したＤＮＡ断片を含む宿主菌体をリコンビナーゼ遺伝子抑制下、培養して宿主菌体を増幅する工程である。上記宿主菌体は、誘導物質の不存在下または抑制物質の存在下では、リコンビナーゼが発現しないか、またはしにくくなり、その結果、クローニングしたい環状化したＤＮＡ断片（プラスミドベクター）の収量が増加する。
本発明では、増幅した宿主菌体から挿入ＤＮＡ断片を常法により回収することで、クローニング対象のＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２６】
上記方法を図３及び４に基づいてさらに説明する。
図３に示すように認識配列としてloxP配列を１つ有するベクターをSstIとEcoRI で消化する。次いで図４に示すように、消化して一本鎖になったベクターのSstI部位にloxP配列が末端についた挿入断片を連結して、２つのloxP配列を末端付近に有する直鎖状のＤＮＡ断片を得る。次いで、この直鎖状のＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより宿主菌体に導入する。宿主菌体としては、組み換え酵素としてCre リコンビナーゼが発現する菌体を用いる。次に、この宿主菌体を誘導物質の存在下培養し、Cre リコンビナーゼが発現すると、Cre リコンビナーゼの作用により挿入断片を含むプラスミドベクターが構築される。さらに、このプラスミドベクターを含む宿主菌体を誘導物質の不存在下培養することで、目的とする挿入断片を含むプラスミドベクターを増幅することができる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、直鎖状ベクターの環状化の際には、必要なリコンビナーゼ発現活性は維持でき、かつプラスミドの調製に際してはリコンビナーゼ発現活性を抑制することにより、クローンの回収率を高めることができる宿主を提供することができる。
さらにこの宿主を用いることで、loxP配列のような認識配列とCre リコンビナーゼを用いる遺伝子のクローニング法を効率良く実施することができる。即ち、本発明によれば、1kbpに満たない短鎖のＤＮＡ断片から10kbp を超える長鎖のＤＮＡ断片まで、鎖長に係わらず一律にベクターに挿入し、ゲノムＤＮＡライブラリーに本来要求される特性、即ち、mRNAに対応する完全長を有し、かつ発現量に応じた量の各cDNA断片を含むＤＮＡライブラリーの作成に適したＤＮＡ断片のクローニングが高収率で可能になる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例１
lacO/Pと高抑制lac リプレッサー変異体lacIq の下流にcre 遺伝子を有するプラスミドを構築した。構築の様子を図１に示す。宿主は誘導条件下では高い切除(excision)効率、及び抑制条件下ではプラスミドの改善された収量を示した。
cre 遺伝子のオープンリーディングフレームは、P1ライソジェンである大腸菌BM25.8から得たプライマー5'-CCC CCC ATA TGT CCA ATT TAC TGA CCG TAC ACC AAA AT-3'及び5'-CCC CCT CTA GAG CTA ATC GCC ATC TTC CAG CA-3'を用いてPCR 法により増幅した。上流プライマーは、開始コドンの周辺の配列を変形し、その領域が上流においてlacO/Pと連結させるためのNdeI部位を有するようにした。lacIq 及びlacO/Pはプライマー5'-GAC ACC ATC GAA TGG TGC AAA ACC TTT-3' 及び5'-CCC CCC ATA TGT GTT TCC TGT GTG AAA TTG-3' を用いて同様に増幅した。下流プライマーはlacO/Pの末端にNdeI部位を有するように変形した。
【００２９】
増幅した各DNA フラグメントはNdeIで消化し、連結した。lacIq -lacO/P-cre をアガロースゲル電気泳動及びバンド切除により単離した後、フラグメントはT4DNA ポリメラーゼにより平滑端（ブラント）にした。このフラグメントをプラスミドベクターpBluscript II SK(+) にEcoRV 部位で連結した。得られたプラスミドを用いて大腸菌DH5 αを形質転換し、白色コロニーをプラスミド調製に用いた。lacIq -lacO/P-cre を有するクローンをpCreH と命名し、イソプロピル- β-D- チオガラクトシド(IPTG)の存在または不存在下で培養し、音波処理して粗抽出物を調製した。この粗抽出物を抗cre 抗体(Novagen, USA)を用いたウェスタン・アナリシス及びECL ウェスタン・ブロッティング検出装置(Amersham, USA) に供した。pCreH の形質転換体は、図２に示すように、十分量のCre リコンビナーゼを発現した。Cre リコンビナーゼの量は、構成的にCre リコンビナーゼを発現するBM25.8より多かった。
【００３０】
次に、構築物をテトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する低コピー数プラスミド、pACYC184 (Nippon, Gene, Japan)にテトラサイクリン耐性遺伝子のEcoRV 部位で連結し、サブクローン化した。pCreL と命名した。このプラスミドは、pBluscriptのような通常の高コピー数プラスミドとは相性が異なり、通常の高コピー数プラスミドは、この低コピー数プラスミドを有する宿主に導入することができる。最後に、Cre リコンビナーゼの発現を評価した。図２に示すように、BM25.8のそれよりCre リコンビナーゼの発現は高かった。この発現レベルは、Cre リコンビナーゼを構成的に発現する宿主DH10B(ZIP)のそれと同等であった。
【００３１】
実施例２
構築したプラスミドpCreL をその他の大腸菌 DH10B及びXL1-Blueに導入した。切除効率を切除可能なプラスミドの両端に 2つのloxP部位を有するファージベクターλTriplEx (Clontech, USA) に構築されたマウスcDNAライブラリーを用いてタイターを測定した。各宿主は、IPTG存在又は不存在下、マグネシウムイオン及びマルトース含有LB培地で培養し、感染させた。得られたコロニーは計数し、表 1に示すように切除効率を評価した。DH5 α(pCreL) 及びXL1-Blue(pCreL) の切除効率は、Cre リコンビナーゼを構成的に発現する宿主より高かった。DH10B(pCreL)K 効率は、BM25.8またはDH10B(ZIP)と同レベルであった。このことは、切除効率がλファージの感染効率に影響されたことを示唆する。IPTG不存在下では、DH5 α(pCreL) 及びDH10B(pCreL)は影響されなかった。DH5 α及びDH10B はlacIq を有さない。この結果及びウェスタン・アナリシスは、pCreL 上のlacIq が効率良く作用せず、Cre リコンビナーゼの発現がIPTG不存在下で抑制されなかったことを示した。しかし、XL1-Blue(pCreL) の場合、IPTG不存在下での効率はIPTG存在下と比べて減少した。XL1-Blue(pCreL) はIPTG不存在下で高い効率を示したが、Cre リコンビナーゼの発現レベルはBM25.8と同じレベルである（図２参照）。このことは、抑制条件下でのCre リコンビナーゼの発現の低いレベルは、効果的な切除には十分であることを示唆する。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
実施例３
得られたコロニーからプラスミドを調製し、収量を決定した。各コロニーは、IPTGの存在下、培養してCre リコンビナーゼを誘導するか、またはグルコースの存在下、培養してCre リコンビナーゼを抑制した。誘導条件下では、各菌体のプラスミド収量は低いが、抑制条件下では大幅に増加した（表２）。Cre リコンビナーゼを構成的に発現する宿主DH10B(ZIP)は各菌体の誘導条件と同様の結果であった。Cre リコンビナーゼの発現は、収量またはloxPを有するプラスミドの純度に影響することが分かった。さらに、そのようなプラスミドの低収量は制御されたcre 遺伝子を有する宿主を使用することにより改善されることも示唆する。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
ここで記載した低コピー数プラスミドを有する宿主はCre-loxP系に基づくλ- ファージベクターを用いるプラスミドライブラリーの構築に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  lacO/P−lacIq の下流にcre 遺伝子を有するプラスミドの構築方法の説明図。
【図２】  各宿主のウェスタン・ブロッティングの結果。
【図３】  本発明のプラスミドの構築方法の説明図。
【図４】  本発明のプラスミドの構築方法の説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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