(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを生産する遺伝子組換え微生物を−２０℃以下で１週間以上凍結することにより殺菌する遺伝子組換え微生物の凍結殺菌方法。
【請求項２】
前記遺伝子組換え微生物が、遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え微生物の凍結殺菌方法。
【請求項３】
前記遺伝子組換え大腸菌の宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２由来のＷ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）またはＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）であることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子組換え微生物の凍結殺菌方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝仕組換え微生物の凍結殺菌に関するものであり、例えば酵素、特にニトリルヒドラターゼ等の工業的に有用な酵素を産生する遺伝子組換え微生物の凍結殺菌方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組換え微生物を利用した有用物質の製造が一般的に行われている。しかし遺伝仕組換え微生物を利用する場合、死滅化されていない遺伝子組換え微生物の使用にあたっては、各種ガイドラインに従い、全ての遺伝子組換え微生物を閉鎖設備内で取り扱う必要がある。 また、閉鎖系外で利用する場合、遺伝子組換え微生物は完全に死滅していなければならない。
【０００３】
凍結による殺菌は、例えば高野の総説（高野光男：冷凍第５８巻６７４号（1983））に見られるように以前よりなされている。また、凍結を利用した殺菌方法は特開平６-２７７０１７、特開平１１−４２２７３、特開２０００−１４００７３に見られるよう多数出願されている。しかしながら、これらは食品、医療用液状製剤、医療用器具に存在する雑菌と称される一般微生物（非組換え微生物）を殺菌する方法であり、有用物質を生産する遺伝仕組換え微生物を殺菌する方法を述べたものではない。このように、有用物質を生産する遺伝子組換え微生物を凍結により死滅化することはこれまでに試みられたことはない。ましてやその有用物質がニトリルヒドラターゼであるところの遺伝子組換え微生物においては凍結殺菌が試みられてことは無い。通常これらの殺菌では熱処理による殺菌方法が用いられているが、遺伝子組換え微生物が生産する有用物質の変性、失活が問題となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
先にも述べたが、各種ガイドラインに示されているように有用物質を生産する遺伝子組換え微生物を閉鎖系外で利用する際、その微生物が完全に死滅されている必要がある。本発明の課題はこのことを実現するため、有用物質を生産する遺伝子組換え微生物を有用な物質を変性、失活させることなく完全に死滅化する方法を新たに提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、有用物質を生産する遺伝子組換え微生物を有用な物質を変性、失活させることなく完全に死滅化する方法を鋭意検討したところ、ニトリルヒドラターゼを生産する遺伝子組換え微生物を−２０℃以下で１週間以上凍結殺菌することにより本課題が達成されることを見出しだ。つまり、本発明は有用物質であるニトリルヒドラターゼを生産する遺伝子組換え微生物を−２０℃以下で１週間以上凍結殺菌することによりニトリルヒドラターゼを変性、失活させることなく完全に死滅化する方法を提供することである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で述べられている有用物質とは、人類が何らかの目的を持って遺伝子組換え微生物に生産させた、医農薬になるような生理活性物質、化学品等の製造に有用な酵素等が挙げられる。本発明の有用物質とは、特に、ニトリルヒドラターゼのことであり、また、本発明に述べる酵素としては、ニトリルヒドラターゼを挙げることができる。
【０００７】
本発明の遺伝子組換え微生物としては、有用物質を生産する遺伝子組換え菌であれば特に制限はないが、例えばニトリルヒドラターゼを産生する微生物を挙げることができる。
【０００８】
ニトリルヒドラターゼを産生する遺伝子組換え微生物の具体例としては、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌に導入されているＭＴ-１０８２２株（ＦＥＲＭＢＰ―５７８５、特開平１１−２５３１６８参照）等が挙げられる。
【０００９】
本発明の微生物は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には３０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させることにより得られる。
【００１０】
凍結殺菌を実施する場合その対象としては、例えば菌体を含む培養液、培養液から遠心分離等利用し回収した菌体、さらに適当な緩衝液で洗浄した洗浄菌体、その処理物が挙げられる。処理物とは例えば、細胞膜の透過性向上、遺伝子組換え菌が生産する有用物質の安定性向上等の目的のため、菌体を含む培養液、菌体、洗浄菌体を熱処理、薬剤処理をおこなったもの、破砕菌体処理したもの等が上げられる。さらに、薬剤処理、熱処理等で部分的に死滅化した処理物と凍結殺菌を併用することも可能である。
【００１１】
凍結殺菌時の菌体濃度は、特に制限はなく、乾菌体濃度０．0１重量％程度の低濃度ではもちろんのこと１０重量％以上の高濃度でも可能である。凍結温度は殺菌を実施する培養液、菌体等が凍結する温度であれば特に制限はないが、通常−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下、より好ましくは−８０℃以下であることが望ましい。凍結期間も特には制限はないが、１日以上望ましくは１週間以上であることが望ましい。また、その際の培養液、菌体等のｐHも特には制限はないが、遺伝子組換え微生物が生産する有用物質の変性、失活等がおこりにくいｐHに設定することが望ましい。また、遺伝子組換え微生物が生産する有用物質の変性、失活等が起りにくいよう安定剤、例えば酵素であればその基質、生成物等を添加することも有効である。まれに、一回の凍結殺菌で遺伝仕組換え菌の完全な死滅化が実施されないことがあるが、その際には凍結殺菌を複数回実施すれば完全な死滅化が達成される。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明の凍結殺菌方法を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１３】
（実施例１）
本実施例に使用する酵素触媒はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ-１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―５７８５、特開平１１−２５３１６８参照）を用いた。
【００１４】
本菌株の培養は２ｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地５００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株を一白金耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰＴＧを終濃度１００μmol/lになるよう添加し培養する。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、乾菌体濃度が１５重量％となるよう湿菌体（以下菌体液）を得た。この一部をサンプリングし下記方法にて酵素活性測定した。その後、１００ｍＬのポリエチレン製の容器に50ｍｌずつ充填し、‐２０℃の冷凍庫にて凍結させた。一週間後、容器を１０℃の水に水浴させることにより溶解させ、容器よりサンプリングその活性を測定した。次式、活性残存率（％）＝（凍結溶解後の活性／凍結前の活性）×１００にて活性残存率を求めた。生菌数は，市販のマッコンキー寒天培地「ダイゴ」（日本製薬製）に凍結前と凍結融解後の菌体液を適切に希釈し、１００μｌ播き、寒天培地上にコンラージ棒でよく広げた後、３０℃２日間培養、生育してきたコロニー数を数えて求めた。次式、生存率（％）＝（凍結溶解後の生菌数／凍結前の生菌数）×１００にて生存率を求めた。凍結解凍後の生存率と活性残存率を、表１に示す。
【００１５】
0003961869.tif 000002
【００１６】
酵素活性測定方法
サンプリングした菌体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。
各画分液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）により適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定する。ＨＰＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用する。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出する。
【００１７】
【表１】
0003961869.tif 000003
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、高濃度に存在、有用物質を生産する遺伝子組換え微生物を凍結殺菌することにより有用な物質を変性、失活させることなく完全に死滅化することが可能である。