(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）主培養に異種蛋白質を発現することができる酵母菌株の前培養を接種し、
ｂ）接種直後から、１時間当たり培養液１リットル当たり０.７〜１.４ｇのグルコースを連続的に一定速度で供給し、
ｃ）好気的培養条件を確保し、
ｄ）２日後培養を終了させ、そして最後に
ｅ）発酵培養から異種蛋白質を単離する
ことからなる、該異種蛋白質をコードする遺伝子とＡＤＨ IIプロモーターとを含む発現ベクターを有する酵母の培養により、異種蛋白質を生産する方法。
【請求項２】
工程ｂ）で、１時間当たり培養液１リットル当たり０.９〜１.３ｇのグルコースを連続的に一定速度で供給する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）で、１時間当たり培養液１リットル当たり１.１ｇのグルコースを連続的に一定速度で供給する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前培養及び主培養の培地が、前培養培地に１％のグルコースを添加することを除いて同等である請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前培養培地に添加した１％のグルコースが接種の時点でほとんど完全に消費されている請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
好気的培養条件が少なくとも２０％飽和の酸素分圧により確保される請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記培地が一つ又はそれより多い複合成分例えばコーンスティープ、大豆ミール又は酵母エキスを含有する請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエー株である請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
サッカロミセス・セレビシエー株がＹ７９株である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
酵母菌株がクルイフェロミセス・ラクチス株である請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
異種蛋白質がヒルジン、ミニプロインスリン、レプチン又はそれらの誘導体である請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
異種蛋白質がヒルジン、ミニプロインスリン、レプチン又はそれらの誘導体のアミノ酸配列を有する融合蛋白質である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は異種蛋白質（heterologous proteins）を高収得量で生物工学的に生産するための酵母ＡＤＨ IIプロモーター系を使用する新規な方法に関する。
【０００２】
元来は蛭、ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）から分離されたポリペプチドのヒルジンは、広い治療的可能性を有する高度に特異的なトロンビン阻害剤である（F.Markwardt, Biomed.Biochim.Acta 44巻 (1985年) p.1007〜1013)。しかしながらこの物は形質転換された微生物を使用する組換え体経路によってのみ必要とする量を製造することが可能である。このような情況において、酵母サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）が正確に折りたたまれ且つ完全な活性を有するヒルジンの製造のための宿主生物として適当であることが見出された（EP A1 168 342, EP A1 200 655)。
【０００３】
ヒルジンは少なくとも１０,０００ＡＴＵ／ｍｇ（抗トロンビン単位／ｍｇ）の比活性を有するペプチド様トロンビン阻害剤を意味すると理解され、この物はヒルド・メディシナリス種の既知のイソヒルジンから誘導され、そしてこれらイソヒルジンの本質的な構造特徴、特に３つのジスルフィドブリッジの特徴的な結合を示す（J.Dodt等, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366巻 (1985年) p.379〜385)（例えば、EP A1 158 564, EP A1 168 342, DE 34 45 517, EP A2 193 175, EP A1 200 655, EP A1 158 986, EP A1 209 061, DE 33 42 199, EP A1 171 024が参照される)。
特に、これらの中で、ヒルジンは EP A1 171 024, EP A1 158 986及び EP A1 209 061に記述されたようなヒルジンであると理解される。
【０００４】
アルコールデヒドロゲナーゼのイソ酵素II（ＡＤＨ II）の遺伝子は酵母細胞内で厳密に制御されている。ＡＤＨ II遺伝子の生産物はグルコースのような発酵性炭素源を発酵培地に添加すると見いだされない。
ＡＤＨ IIプロモーターを誘導する条件は例えば４％のグルコース濃度を使用して出発する振盪フラスコ又は発酵槽中の簡単な好気性バッチ式方法によっても達成することができる。増殖がグルコースによって起こる場合、いわゆるクラブトリー効果の結果酵素ＡＤＨ Ｉの助けによりエタノールが最初に形成され、このエタノールも次に、グルコースが一旦完全に消費されると付加的な炭素源として使用される。グルコースが分解された後エタノール分解酵素ＡＤＨ IIが誘導され、そしてヒルジンの発現が開始される。
【０００５】
概して、このようなバッチ発酵は工業的応用のために希求される高い空間／時間収率をもたらさない。発酵は古典的抗生物質発酵において実現されたように、例えばある細胞濃度が確立された後、次に生産物（例えば二次代謝産物のペニシリン）を最適な生理的条件下で高収率で形成させるように炭素源を増殖制限的な方式でフィードする制限フィード−バッチ法により増殖相と生産相とに分けるのが望ましいことである〔Biotechnology of Industrial Antibiotics (E.J.Vandamme編集, Marcel Dekker, New York, 1984年刊) p.45〜140に所載の Hersbach等：The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation〕。
【０００６】
それが制御される方法のため、ＡＤＨIIプロモーター系がパン酵母サッカロミセス・セレビシエーにおける異種蛋白質の生物工学的製造のために使用される（Price等：Methods of Enzymology (1990年) 185巻, p.308〜318)。この関係において、発酵は酵母細胞の増殖に依存して、炭素源としてのグルコースの自然消失に基づいている。グルコース欠如の下で生産物形成が開始され、そして発酵の終了まで継続する。しかしながら生産物の収得量は希望したよりも少ないように思われる。
【０００７】
T▲o▼ttrup等（Biotechnol.Bioeng., 35巻, p.339〜348, 1990年）はヒトインシュリン結合蛋白質の細胞内生産のための改変された発酵方法を記述しており、この方法は系の最適な誘導を確実にするため、グルコースのフィーディングとそれに続くエタノールのフィーディングを包含している。これらの研究者は発酵の全期間を通じてグルコースを一定の速度で連続的にフィードすることによりバッチ法と比較して液量関連生産物収得量をほぼ倍増することに成功した。グルコースフィードを特定の時点からエタノールフィードに置き換えることにより最終的にはさらに倍増を達成した。この結果から培養液中にグルコースなしか又は２０ｍｇ／リットルより少ない極めて低いグルコース濃度においても、ハイブリッドプロモーターはなおグルコース又は解糖系の代謝産物により部分的に抑制されると結論した。完全な誘導はエタノールの添加によってのみ達成される。
【０００８】
Price等の文献に記述された発現系を欧州特許明細書 0 324 712 B1（実施例１参照）に述べられたヒルジン遺伝子生産物の製造に使用する場合、本発明者等は意外なことに、エタノールの連続的又は非連続的添加の結果として、増加した細胞増殖が同様の大きさの生産物タイターと関連して認められたため、特異的なバイオマス基準の生産物収得量が減少することを観察した。
エタノールの直接添加を研究室スケールで研究した。増殖が進行する間エタノールをバッチ培養に追加的に供給するとエタノールはバイオマスを増加するが、供給しない培養に比較して生産物濃度に何ら増加が認められない結果となった。
【０００９】
同様にエタノールを単一炭素源として使用して行った研究室培養は測定精度の限度内で何ら特別な収得量（光学濃度又はバイオマスに基づいて）を与えなかったが、グルコースを使用する対照培養のそれよりは高かった（同じく実施例２参照）。このことからエタノールは、れ自体ではＡＤＨ IIのインデューサーではないと結論できるであろう。
【００１０】
同様に、制御されたモデルを援用するグルコースフィーディング（増加する細胞濃度によりフィーディング速度を追随すなわち増加する）により抑制解除された増殖を作り、そしてクラブトリー効果によるエタノール形成を回避し、次いで順に、第二段階においてグルコースの律動添加とその後のクラブトリー効果の結果としての高水準のエタノール形成とにより一層強力に発現を誘導する試みは生産物収得量に何らの増加を与えなかった。
【００１１】
驚くべきことに、異種蛋白質を高収得量で生物工学的に製造する目的で酵母ＡＤＨ IIプロモーター系を使用ためのする簡単で自己制御的であり、そしてとりわけ工業的スケールで実施することができる発酵方法を今回見出した。この方法はグルコースが最初は存在しない発酵培養（主培養）に炭素源としてグルコースを連続的に計量添加することを含む。発酵が進む際、種々の相を最適の誘導および生産物形成が達成されるように経過させる。従来技術例えば既に引用した Price等の文献の記載に照らしてみる場合、酵母におけるＡＤＨ IIプロモーター系を使用する異種遺伝子発現の誘導は極めて注目すべきことであり、なぜなら Price等はＡＤＨ IIプロモーターはグルコースの顕著な枯渇があった後においてのみ抑制解除されると述べているからである。
【００１２】
本発明者等の系においては、主培養に接種した直後少量のグルコースを一定の速度で連続的にフィードすると高い比生産性と関連して最適の生産物収得量を達成することができた。フィーディングによる培養液量の増加は、この場合培養が終了した時点で実際のグルコースフィーディング速度の２５％までの低下に導くことができた。当初は低い細胞数すなわち増殖が抑制されるためグルコースは過剰に存在し、クラブトリー効果の結果としてエタノールが形成される。特定の時間が経過すると、グルコースは単一炭素源としてもはや十分量とはいえないほど細胞濃度が高くなり、グルコース及びエタノールによる混合された増殖が起こる。最初に形成されたエタノールも消費し尽くされ、そしてさらなる（抑制された）増殖がグルコースにより限定される後においてのみ、ＡＤＨ IIプロモーターが作動し始めそして生産物形成が始まる。このようにして生産物収得量はバッチ法に比べて約３倍にすることができた。
【００１３】
この結果本発明は酵母における異種蛋白質の生物学的発酵の方法に関し、この方法においては主培養に異種蛋白質を発現することができる酵母菌株の前培養を接種し、接種後直ちに少量のグルコース、例えば１時間当たり培養液１リットル当たり０.７〜１.４ｇ、好ましくは０.９〜１.３ｇ、そして極めて特に好ましくは１.１ｇのグルコースを一定の速度で連続的に供給し、発酵の全期間酸素分圧を飽和の２０％より下に落とさないことにより好気的培養条件を確保にし、発酵を２日後に終了し、そして最後に異種蛋白質を発酵培養液から単離する。
【００１４】
本発明はさらに前節に記述した方法に基づく一方法に関し、この方法においては前培養及び主培養の培地は前培養の培地に１％のグルコースを添加することを除いて同等であり、このグルコース添加は主培養への接種の時点でほぼ完全に消費されているのが好ましく、そして一つ又はそれより多い複合成分例えばコーンスティープ、大豆ミール又は酵母エキスを含有する。この関連において、用語「ほぼ完全に消費された」は＜１００ｍｇ／リットルのグルコース濃度を意味する。
前記方法に使用する酵母菌株はサッカロミセス・セレビシエー、好ましくはＹ７９株（EP 0 324 712参照）、さもなければクルイフェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）の諸株とすることができる。
【００１５】
この方法により製造することができる異種蛋白質は、例えばヒルジン、ミニプロインスリン（例えば EP 0 347 781に記述されたような）、レプチン（例えば Zhang等、Nature 372: p.425〜32, 1994に記述されたobese遺伝子の生産物)、又は前述の蛋白質の誘導体又は前述の蛋白質及び／又は誘導体を含む融合蛋白質である。この場合、用語「誘導体」は、とりわけ機能的なすなわち生物学的に活性のスターティング蛋白質の断片又は新規な、特に有利な生物学的特性を有する変異種を意味する。
【００１６】
実施例  １
酵母におけるヒルジンの組換え体生産のための発現ベクターの調製
ベクターｐα ＡＤＨ２（Price等の報文の図２Ａ参照）はｃＤＮＡの３′末端方向に向かってＳｐｅ１制限酵素切断部位に隣接する、プラスミドにとって特異な酵素Ｎｃｏ１の認識部位を有する。
前述のベクターのＤＮＡをＫｐｎ１及びＮｃｏ１と反応させると、２つのＤＮＡ断片が得られ、これはゲル電気泳動により互いに分離される。２つの断片の大きい方を単離し、そしてこの物とプラスミドＰαｆ Ｈｉｒ１７（EP 0 324 712 B1）から酵素Ｋｐｎ１による部分的消化及び酵素Ｎｃｏ１による完全消化により単離したＫｐｎ１／Ｎｃｏ１ヒルジン断片とをＴ４リガーゼ反応中で反応させた。
ＨＢ−１０１株の市販のコンピテントなＥ.ｃｏｌｉ Ｋ１２細胞をライゲーション用混合物を用いて形質転換し、そして形質転換培養を２５ｍｇ／リットルのアンピシリンを含有するＮａ寒天平板に接種する。平板を３７℃で一晩培養し、そして翌朝平板からコロニーを釣菌し、これを使用して一晩培養を開始する。各々についてプラスミドＤＮＡを培養物の細胞から分離し、制限分析により試験する。望ましい様式で組み込まれたヒルジン遺伝子を含む正しいプラスミドＤＮＡを EP 0 324 712 B1の記述に従ってサッカロミセス・セレビシエーＹ７９株を形質転換するために使用する。
これにより前述の方法を展開するために使用される発現系が得られる。
【００１７】
実施例  ２
異なる炭素源を使用する酵母におけるヒルジンの組換え体製造のための研究室培養の比較
異なる炭素源を、その他の条件を同じにした研究室の発酵槽を使用して試験する。前培養及び主培養の段階の培地組成は次の通りである。
酵母エキス                   １％
ペプトン                     ２％
炭素源    （各々の場合炭素含量に基づいて同じ量）
アデニン                     ８０ｍｇ／リットル
ウラシル                     ８０ｍｇ／リットル
ｐＨ                         ５.０
主培養に２％の前培養を接種し、４８時間培養する。
次表の結果はエタノール及びグルコースを炭素源として使用して得られた。
【００１８】
【表１】
0003902822.tif 000002
【００１９】
実施例  ３
グルコースをフィードするか又はしない発酵による酵母におけるヒルジンの組換え体製造の比較
ａ) グルコースをフィードする発酵（フィード−バッチ法）
一つ又はそれより多い複合成分例えばコーンスティープ、大豆ミール、酵母エキスなどを含み、グルコース又は他の炭素源例えばスクロースが添加されていない１６００リットルの培養培地を全容積３６００リットルの発酵槽中で１２１℃、２０分間殺菌する。
これを冷却した後、約１２時間増殖（光学濃度Ａ540nm＝3.5±0.5）させて極めて低いグルコース残量のみを含む前培養物約２００リットルを接種する。前培養物の培地はグルコース１％を添加したことを除いて主培養のそれと同じである。
この主培養の段階の接種の直後に、１時間当たり２ｋｇのグルコースを２０％水溶液として、連続殺菌を確実に行う装置を経て、一定速度で、培養が終了するまで計量添加する。
発酵中、好気的条件が確保されなければならない。ｐＯ2≧２０％の酸素分圧が維持されるべきである。
４８±２時間後、発酵が完了し、そして０.２２５±０.０２５％のベンザルコニウムクロリド、例えば０.４５±０.０５％の RDodigen 226（水中アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドの混合物の50％溶液）を添加して終了させる。
その後、培養液からヒルジンを単離する後処理を開始する。
最終液量（培地＋コンデンセート＋前培養＋計量添加グルコース−通気による水分損失）は２３００±５０リットルである。
ｂ) バッチ法
バッチ法は、下記事項を除いてａ）に記述したフィード−バッチ法と同じである。
・接種前、培地は複合成分の外に４％のグルコースを含有する。
・さらにグルコースの計量添加は行わない。
・最終液量は１８００±５０リットルのみに止まる。
ｃ) 結果の比較
【００２０】
【表２】
0003902822.tif 000003