(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に、呈色指示薬を含む少なくとも一つの反応層及び基質を含む少なくとも一つの展開層がこの順に設けられており、前記展開層中にシリコン系界面活性剤又はフッ素系界面活性剤から選ばれた少なくとも一種の界面活性剤を含む乾式分析要素。
【請求項２】
前記シリコン系界面活性剤が下記一般式(１)〜(４)で表される化合物から選ばれた少なくとも一種である請求項１に記載の乾式分析要素。
【化１】
0003910102.tif 000006
ここで、Ｚは、一般式―Ｒ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ―（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲで表される有機基を表す。
【請求項３】
前記フッ素系界面活性剤が一般式ＣnＦ2n+1−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mＨで表される化合物の少なくとも一種である請求項１に記載の乾式分析要素。ここで、それぞれ独立に、ｍは５〜７の整数、ｎは６〜１４の整数を表す。
【請求項４】
界面活性剤を含有する基質緩衝液及び補酵素溶液からなる分析キットにおいて、前記界面活性剤がシリコン系界面活性剤又はフッ素系界面活性剤から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする分析キット。
【請求項５】
前記シリコン系界面活性剤が下記一般式(１)〜(４)で表される化合物から選ばれた少なくとも一種である請求項４に記載の分析キット。
【化２】
0003910102.tif 000007
ここで、Ｚは、一般式―Ｒ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ―（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲで表される有機基を表す。
【請求項６】
前記フッ素系界面活性剤が一般式ＣnＦ2n+1−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mＨで表される化合物の少なくとも一種である請求項４に記載の分析キット。ここで、それぞれ独立に、ｍは５〜７の整数、ｎは６〜１４の整数を表す。
【請求項７】
人体から採取した血小板を含む血液検体の分析方法において、前記血液検体に混合される界面活性剤がシリコン系活性剤又はフッ素系界面活性剤から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする血液分析方法。
【請求項８】
前記シリコン系界面活性剤が下記一般式(１)〜(４)で表される化合物から選ばれた少なくとも一種である請求項７に記載の血液分析方法。
【化３】
0003910102.tif 000008
ここで、Ｚは、一般式−Ｒ−(Ｃ2Ｈ4Ｏ)a−(Ｃ3Ｈ6Ｏ)bＲで表される有機基を表す。
【請求項９】
前記フッ素系界面活性剤が一般式ＣnＦ2n+1−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mＨで表される化合物の少なくとも一種である請求項７に記載の血液分析方法。ここで、それぞれ独立に、ｍは５〜７の整数、ｎは６〜１４の整数を表す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、人体から採取した血小板を含む血液検体の分析方法、その方法を利用した乾式分析要素及び分析キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
人体から採取した血液を検体として被検物質を分析し、人の病気を診断する方法は古くから行なわれているが、この分析方法は大きく２つに分けられる。即ち、設計した分析に必要な試薬類と検体を水中に添加して水溶液とし、この液中で反応を起こさせる湿式法と、試薬類を予め乾燥状態で保持した層（例えばゼラチン層）に検体を供給して層中で反応を起こさせる乾式法である。
【０００３】
乾式法では、例えば酵素活性を測定する場合は、下塗りされた透明なポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）上に試薬類を予め乾燥状態で保持した一又はそれ以上の層を設け、その上にポリエステル紡績糸で作られたトリコット編み物等を圧着させて展開層を設けた分析要素を使用する。
【０００４】
展開層は、供給された検体を均一に横方向及び縦方向に拡散させるために重要な役割を果たす。即ち、上記湿式法では液の攪拌により実現している試薬と検体の均一な接触を、展開層中における検体の均一な拡散で実現している。
【０００５】
このような乾式分析要素の一つに、検体中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定するのに適した分析要素がある。この分析要素は、水浸透性層に乳酸又はその塩と酸化型ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ＋）とを含み、生成する還元型ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤＨ）を呈色試薬等により検出する。
【０００６】
しかし、このような乾式分析要素を使用して検体中のＬＤＨを定量分析する際に、検体の処理方法によって測定値がばらつく（高値化する）場合があり、その対策が望まれていた。
【０００７】
一方、湿式法においては、設計された分析に必要な試薬を溶解した水溶液と血液検体とを混合して反応を起こさせる。湿式法においても、検体の処理方法によって測定結果がばらつくことがあり、対策が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、人体から採取した血小板を含む血液検体を分析して被検物質を検出する血液分析方法において、検体の処理方法の違いによる測定結果のばらつきを解消した血液分析方法、その方法を利用した乾式分析要素、及び分析キットを提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、全血から血漿を得るための遠心分離の操作が不十分だと血漿検体中に血小板が残存し、これが乾式分析要素あるいは試薬水溶液中に存在する界面活性剤で破壊されることが原因である事を発見し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の上記課題は、前記血液検体に混合される界面活性剤が実質的に血小板を破壊しない界面活性剤から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする血液分析方法、その方法を使用した乾式分析要素、及び分析キットにより達成された。以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、検体の分析方法を乾式法と湿式法に分けて説明する。
(１)  乾式法：
本発明の分析方法は、検体中のＬＤＨ、ＧＯＴ、ＡＣＰ等を検出するための乾式分析要素に適用できるが、以下、便宜上ＬＤＨ分析用乾式分析要素を例として説明する。
【００１１】
検体中のＬＤＨを定量測定するための乾式分析要素の基本構成は、例えば特公平５−６０３６０に開示されているがこれに限られず、下塗りがされた光透過性で水不透過性のプラスチックベース（例えばＰＥＴベース）上に、呈色試薬を含む水浸透性を設け、その上に本願発明の特徴である界面活性剤、乳酸塩、電子伝達剤及びＮＡＤ＋とを含有する展開層を設けてもよい。
【００１２】
一例として、図１に示す層構成及び含有試薬が挙げられる。
【００１３】
ここで、ＮＴＢは、３,３'−(３,３'−ジメトキシ−４,４'−ビフェニレン)ビス［２−(ｐ−ニトロフェニル)−５−フェニルテトラゾリウムクロライド］である。
【００１４】
本発明に係る乾式分析要素で使用する界面活性剤としては、実質的に血小板を破壊しない界面活性剤から選ばれた少なくとも一種である。ここで、「実質的に血小板を破壊しない界面活性剤」とは、「検体の均一な展開を実現する量を展開層に添加しても、ＬＤＨ（一般的には被検物質）の測定値の高値化が許容範囲内である界面活性剤」を意味する。いかなる界面活性剤であっても、添加量が少なければ血小板の破壊は防げるであろうが、一方、展開層内における検体の均一な展開を実現できなければ、結局本発明に係る乾式分析要素とは成り得ないからである。
【００１５】
また、血液検査方法において使用する界面活性剤が血小板を破壊するか否かが、血液検査の結果と密接な関係を有することは、後に示す実施例及び参考例から明らかである。
【００１６】
このような界面活性剤としては、シリコン系界面活性剤又はフッ素系界面活性剤から選ばれた少なくとも一種であり、シリコン系界面活性剤から選ばれた少なくとも一種であることがより好ましい。
【００１７】
シリコン系界面活性剤としては、下記一般式 (１)〜(４)で表されるポリエーテル変性シリコン系界面活性剤から選択されたものが好ましい。
【００１８】
【化４】
0003910102.tif 000002
【００１９】
ここで、Ｚは、一般式−Ｒ−(Ｃ2Ｈ4Ｏ)a−(Ｃ3Ｈ6Ｏ)bＲで表される有機基を表す。
【００２０】
具体例としては、信越化学工業(株)製の変性シリコーンオイルＫＦ３５１、ＫＦ３５２、ＫＦ３５３あるいはＫＦ３５４Ｌ等が挙げられる。これらの中では、ＫＦ３５３が好ましい。
【００２１】
フッ素系界面活性剤としては、下記一般式で表される化合物から選ばれたものが好ましい。
ＣnＦ2n+1−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mＨ
ここで、それぞれ独立に、ｍは５〜７の整数、ｎは６〜１４の整数を表す。
【００２２】
上記一般式で表されるフッ素系界面活性剤の具体例としては、ＰＯＥ（１０）パーフルオロアルキル（商品名Ｆ１４２Ｄ；大日本インキ社製）及びＰＯＥ（６）パーフルオロアルキルトキシレート（商品名Ｆ１４０５；大日本インキ社製）が挙げられる。
【００２３】
添加量は、０．１〜２ｇ／ｍ2、好ましくは０．３〜１．２ｇ／ｍ2であり、また、上記二種の界面活性剤を任意の比率で混合して使用することができる。
【００２４】
本発明に係る乾式分析要素を用いた分析の対象となる被検物質としては、ＬＤＨの他に、ＧＯＴ、ＡＣＰ等が挙げられる。これらも、血小板が破壊されることにより、検体中の被検物質が増加するためである。これらを検査するための乾式分析要素は、例えば特公平４−６４０号公報、特開昭６３−８８０００号公報に開示されている。
【００２５】
(２)  湿式法：
次ぎに、本発明の血液分析方法を湿式法に適用した場合について説明する。
【００２６】
湿式法では、分析に必要な試薬類は水溶液として提供される。この水溶液中には、例えば微量の試薬をピペットで滑らかに採取することを目的として界面活性剤が添加されている。この界面活性剤の種類によっては、上記乾式法において説明した理由により、血液検体の処理法によって測定値がばらつく（高値化する）ことがある。
【００２７】
湿式法において使用できる界面活性剤も、上述した界面活性剤から選択できる。ただ、湿式法においては乾式法のように展開層中における血液検体の均一な展開を考慮する必要はないので、選択幅が広くなる。
【００２８】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
実施例１
(１)  ＬＤＨ定量用の乾式スライドの作成
ゼラチン下塗りされている、平滑な１８０μｍの無色透明ＰＥＴフィルム上に、下記組成の水溶液を、乾燥後の厚さが４０μｍになるように塗布し、乾燥して、反応層を設けた。
ゼラチン                            ２０．０ｇ／ｍ2
ＮＴＢ                                ０．８ｇ／ｍ2
界面活性剤                            ０．８ｇ／ｍ2
ｐＨ＝６となるように希ＮａＯＨで調整した。
【００３０】
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ，オーリン社製）を用いた。また、ＮＴＢは、３,３'−(３,３'−ジメトキシ−４,４'−ビフェニレン)ビス［２−(ｐ−ニトロフェニル)−５−フェニルテトラゾリウムクロライド］を表す。
【００３１】
次ぎに、上記フィルムの全面に約３０ｇ／ｍ2の供給量で水を供給して湿潤させた後、軽く圧力をかけながら、５０デニール相当のポリエステル紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編み物布地を積層し、乾燥させて展開層を設けた。
【００３２】
次ぎに、上記展開層の上に、下記組成の水溶液を各々の成分が下記の量となるように塗布し、乾燥させて、本発明に係るＬＤＨ定量用の乾式分析要素を作成した。
【００３３】
精製水                                  １００．０ｇ／ｍ2
ポリアクリルアミド（分子量２０万）          ２．０ｇ／ｍ2
乳酸リチウム                                １．０ｇ／ｍ2
ジアホラーゼ                                ０．５ＫＵ／ｍ2
ＮＡＤ＋                                     ０．５ｇ／ｍ2
トリヒドロキシアミノメタン                  ５．０ｇ／ｍ2
界面活性剤(１)（ＨＬＢ＝１０）              ０．５ｇ／ｍ2
界面活性剤(２)（ＨＬＢ＝１６）              ０．５ｇ／ｍ2
ｐＨ＝８となるように希ＨＣｌ溶液で調整した。
【００３４】
ここで、界面活性剤(１)としてはＫＦ３５３、界面活性剤(２)としてはＫＦ３５４（いずれも、信越化学社製のポリエーテル変性シリコン）を使用した。ポリシロキサンの側鎖に、有機基としてポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンアルキル基が導入されている化合物である。
【００３５】
上記のＬＤＨ定量用の乾式分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍのチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に記載されたスライド枠に収めて、ＬＤＨ定量用の乾式スライド(１)を作成した。
【００３６】
(２)  ＬＤＨ活性の測定
標準血清に多血小板血漿を添加して、血小板数が１０万、２０万及び５０万個／μＬとなるように調整した検体を、上記(１)で得た乾式スライド(１)に１０μＬ点着した。その後、３７℃にて５分間インキュベートしながら、およそ１０秒おきに５４０ｎｍにおける反射濃度を富士ドライケム５０００（富士写真フイルム製）により測定した。点着１分後及び５分後における反射濃度の差から、ＬＤＨ活性を算出した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0003910102.tif 000003
【００３８】
実施例２
展開層に塗布する液中の界面活性剤(１)として、ＰＯＥ（１０）パーフルオロアルキルエトキシレート（Ｆ１４０５；大日本インキ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＬＤＨ定量用の乾式スライド(４)を作成した。このスライドを用いて、実施例１の(２)と同様の方法でＬＤＨ活性を測定し結果を表１に示す。
【００３９】
実施例３
特公平４−６４０号公報の実施例４に記載された処方に従い、但し、界面活性剤としてトリトンＸ−１００の代わりに前記ＫＦ３５３を用いて、ＧＯＴ定量分析フィルムを作成し、実施例１と同様の評価を行った。結果は実施例１と同様、３種の検体において、高値化は許容範囲内であった。
【００４０】
実施例４
下記組成の基質緩衝液（Ｒ１）及び補酵素溶液（Ｒ２）を作成した。
Ｒ１：
緩衝剤    ジエタノールアミン        ｐＨ＝９．０
Ｌ−乳酸リチウム                    ７０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤                          ０．８％
（界面活性剤としては、前記シリコン系界面活性剤ＫＦ３５３を使用した）
Ｒ２：
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
ＮＡＤ＋                            ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４１】
先ず、３ｍＬのＲ１と８０μＬの血液検体を混合し、３７℃で５分間インキュベートした。３７℃のこの混合液に８００μＬのＲ２を添加して反応を開始させた。反応開始後１分後及び２分後に、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定して、予め作成した検量線を用いて検体中のＬＤＨの活性を算出した。血液検体としては、上記実施例１の(２)で調整した３種の検体を使用した。結果は、実施例１と同様、３種の検体において、高値化は許容範囲内であった。
【００４２】
比較例１
展開層に塗布する液中の界面活性剤(１)としてポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＨＬＢ＝１１）、界面活性剤(２)としてポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル（ＨＬＢ＝１８）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＬＤＨ定量用の乾式スライド(２)を作成した。このスライドを用いて、実施例１の(２)と同様の方法でＬＤＨ活性を測定した。結果を表１に示す。
【００４３】
比較例２
展開層に塗布する液中の界面活性剤(１)としてポリオキシエチレン（１２）オレイルルエーテル（ＨＬＢ＝１１）、界面活性剤(２)としてポリオキシエチレン（４０）オレイルエーテル（ＨＬＢ＝１８）（日本エマルジョン社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＬＤＨ定量用の乾式スライド(３)を作成した。このスライドを用いて、実施例１の(２)と同様の方法でＬＤＨ活性を測定した。結果を表１に示す。
【００４４】
比較例３
展開層に塗布する液中の界面活性剤としてポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤（エマレックス ５０５、エマレックス ５１２、エマレックス ５２０；日本エマルジョン社製）、ＰＯＥ高級アルコール系エーテル界面活性剤、又はアニオン系界面活性剤（デオキシコール酸Ｎａ；和光純薬社製、又はニッコール ＯＳ−１４；日光ケミカルズ社製）をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして、ＬＤＨ定量用の乾式スライドを作成した。このスライドを用いて、実施例１の(２)と同様の方法でＬＤＨ活性を測定したところ、比較例１と同様の結果を得た。
【００４５】
比較例４
界面活性剤として前記シリコン系界面活性剤ＫＦ３５３の代わりにＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテルを用いた以外は実施例４と同様にして基質緩衝液と補酵素溶液を調整し、以下、実施例５と同様の方法で評価した。結果は比較例１と同様、血小板濃度の高い検体において高値化が著しかった。
【００４６】
参考例
以下の方法により、種々の界面活性剤について、血小板を破壊する程度を調べた。結果を表２に示す。○は破壊せず、×は破壊したことを表す。
(１)  ＬＤＨ活性の評価：
界面活性剤を無添加、又は濃度が０．６％となるように添加した多血小板血漿を検体として、自動分析機日立７１７０を用いて、ＪＳＣＣ標準化対応法（ＬＤＨＩＩ−ＨＡテストワコー；和光純薬）３７℃でＬＤＨ活性を測定した。表２において、「ＬＤＨ活性」は、界面活性剤を添加しない検体の活性値を１００とした時の、０．６％添加した検体の活性値である。
(２)  血小板の破壊の評価：
多血小板血漿に０．８％となるように界面活性剤を添加し、血小板の状態を電子顕微鏡で観察した。界面活性剤が血小板を破壊して、血小板中の成分を外部に排出するか否かで判断した。
【００４７】
【表２】
0003910102.tif 000004
【００４８】
上記実施例、比較例及び参考例の結果から、ＬＤＨ活性の測定精度と、界面活性剤が血小板を破壊する程度の間に相関があることが判る。なお、以下に表２に記載した化合物の一般式を示す。
【００４９】
【化５】
0003910102.tif 000005
【００５０】
【発明の効果】
本発明の血液分析方法、乾式分析要素及び分析キットにより、血小板を含む試料中の検体を、試料の処理方法によらず、正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の乾式分析要素の一つである、ＬＤＨ測定用乾式分析要素の概念図である。
【図１】
0003910102.tif 000009