(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マホガニー属樹木の頂芽又は腋芽を多芽体誘導培地で培養して、定芽及び／又は不定芽を多数有する多芽体を誘導し；
得られた多芽体を多芽体増殖培地に移植して増殖し；
増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植して静置培養することによりシュート伸長を促し；
次いで伸長したシュートを、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）を１．０〜３．０mg/l含有する改変ＭＳ培地で培養し、次いでＩＢＡを１．０〜３．０mg/l含有する改変Ｂ５培地に移植して更に培養して、発根させ、植物体を再生する；
ことを特徴とするマホガニー属樹木の大量増殖法。
【請求項２】
マホガニー属樹木の頂芽又は腋芽を多芽体誘導培地で培養して、定芽及び／又は不定芽を多数有する多芽体を誘導し；
得られた多芽体を多芽体増殖培地に移植して増殖し；
増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植して静置培養することによりシュート伸長を促し；
次いで伸長したシュートを、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）を１．０〜３．０mg/l含有する改変ＭＳ培地で培養し、次いでＩＢＡを１．０〜３．０mg/l含有する改変Ｂ５培地に移植して更に培養し、更に、ＩＢＡを１．０〜３．０mg/l含有する改変ＭＳ培地で培養して、発根させ、植物体を再生する；
ことを特徴とするマホガニー属樹木の大量増殖法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マホガニー属樹木、特にマホガニー属に属するＳｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ＫＩＮＧの組織培養による大量増殖法に関する。
背景技術
マホガニー属樹木は、世界の熱帯地域における主要造林木であるが、虫害による損失が深刻な問題となっている。近年、組織培養技術の発達により、耐病性、耐虫性を付与した新品種が多くの植物で作出されており、マホガニーにおいても耐虫性の付与が期待されている。また、有用老齢木の増殖を試みる際には、挿し木等の既存法を用いることができず、精英樹の増殖は困難とされている。
近年、幾つかの研究グループによって、これらの問題点の解決を目的として、組織培養技術を用いた研究がなされているが、成功例は今日まで４例のみである（Ｓ，Ｖｅｎｋｅｔｅｓｗａｒａｎ，Ｍ．Ａ．Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｓ，Ｆ．Ｓｕｌｔａｎｂａｗａ，Ｕ．Ｖ．Ｗｅｙｅｒｓ（１９８８）Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ｍａｈｏｇａｎｙｔｒｅｅ，Ｓｗｅｔｅｎｉａ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔｓ：１４７−１５３；Ｓ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ａ．Ｎ．Ｒａｏ（１９８８）Ｐｌａｎｔｌｅｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  Ｋｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｇａｒｄ．Ｂｕｌｌ．Ｓｉｎｇ．４１（１）：１１−１８；Ｅ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．Ｉｓｈｉｉ，Ａ．Ｓａｉｔｏ，Ｋ．Ｍｉｇｉｔａ（１９８９）Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｌｅｖｅｎｔｒｅｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｕ−Ａｍａｚｏｎ  ｆｏｒｅｓｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３（４）：２５２−２６１；及び近藤禎二，岡村政則（１９９４）オオバマホガニーの組織培養，林木の育種「特別号」’９４：４−５）。しかしながら、これらの方法は、無菌幼植物体を材料に用いたり、頂芽を材料に用いた場合にも、シュート再生、多芽体の誘導に止まり、植物の再生には至っておらず、成木からの幼植物体の再生及び大量増殖を達成することはできない。したがって、効率的な培養方法の開発が望まれている。
発明の開示
本発明の目的は、マホガニー属樹木、特にＳｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ＫＩＮＧの大量生産を可能にする大量増殖法を提供することにある。
本発明は、マホガニー属樹木の苗木、あるいは成木の大量生産を可能にする大量増殖法を開発することを目的として鋭意研究した結果、マホガニー属樹木の頂芽又は腋芽を培養して、定芽及び／又は不定芽を有する多芽体を誘導し、更に誘導した多芽体の誘導を効率よく増殖させることに成功した。特に、多芽体を誘導させるために用いる誘導培地と多芽体を増殖させるために用いる培地に、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）とベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を添加することにより、効率よく多芽体を誘導し、かつ増殖することが可能になり、更には多芽体を増殖させるために、液体旋回培養を用いることにより、多芽体の増殖率を向上させることができることを見出した。また、多芽体からシュートを伸長させるためにＩＢＡとＢＡＰを添加し、液体静置培養を用いることにより、効率よくシュート伸長を促すことができることを見出した。増殖したシュートをＩＢＡを添加した培地で培養することにより、更なるシュート伸長及び発根が可能になることを見出した。
即ち本発明は、
マホガニー属樹木の頂芽又は腋芽を多芽体誘導培地で培養して、定芽及び／又は不定芽を多数有する多芽体を誘導し；
得られた多芽体を多芽体増殖培地に移植して増殖し；
増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植して静置培養することによりシュート伸長を促し；
次いで伸長したシュートを発根培地に移植して発根させ、植物体を再生する；
ことを特徴とするマホガニー属樹木の大量増殖法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、苗及び成木の頂芽又は腋芽から多芽体を誘導、増殖させ、次いで得られた多芽体からシュートを伸長させ、これを発根させることにより、大量の幼植物体を効率よく生産することができる。
本発明で対象とするマホガニー属樹木としては、より具体的には、Ｓｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ＫＩＮＧを例示することができる。
本発明で用いる培養材料としては、苗木及び成木から採取した頂芽又は腋芽が用いられる。採取した頂芽又は腋芽は、通常の方法に従って、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後、培地中で培養する。
頂芽又は腋芽から多芽体を誘導するために用いる多芽体誘導培地としては、通常の基本培地が用いられる。基本培地としては、無機成分及び炭素源を必須成分とし、その他植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地が用いられる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、ヨウ素、ホウ素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物が用いられる。炭素源としては、炭水化物、例えばショ糖又はブドウ糖が用いられる。植物成長調節物質としては、オーキシン、サイトカイニンを用いられる。オーキシンとしては、例えば３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、カイネチン、ゼアチン、４−フェニルウレア（４−ＰＵ）等が挙げられる。ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばグリシン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。
実際に培養する際に用いられる培地としては、植物組織培養に用いられる培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．（１９６２），Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７）、Ｂ５培地（Ｇｒａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．（１９６８），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８）、ＷＰ培地（Ｌｌｏｙｄ，Ｇ．（１９８１），Ｉｎｔ．Ｐｌａｍｔ  Ｐｒｏｐ．Ｓｏｃ．３０：４２１−４２７）、ＢＴＭ培地（Ｃｈａｌｕｐａ，Ｖ．（１９８４）Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌｎｔ．（ｐｒａｈａ）２６：３７４−３７７）等が挙げられる。あるいはこれらの改変培地、例えば改変ＭＳ培地、改変Ｂ５培地、改変ＷＰ培地、改変ＢＴＭ培地などを用いてもよい。ここで改変培地とは、これらの基本培地の各成分の濃度を、例えば１／２、１／４等に変更した培地を指す。
特に、Ｂ５培地及びその改変培地が好ましい。定芽、不定芽の誘導及び成長を促進するため、ＢＡＰを０．０２〜１．０ｍｇ／ｌ、あるいはＢＡＰ０．０２〜１．０ｍｇ／ｌとともにＩＢＡを０．０２ｍｇ／ｌ以下含有する培地を用いることが好ましい。
次いで、得られた多芽体を多芽体増殖培地に移植することにより、効率よく増殖させることができる。
多芽体増殖培地としては、前記の基本培地を用いることができ、特に無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、ＩＢＡを０．０２〜０．２ｍｇ／ｌ及びＢＡＰを０．２〜２．０ｍｇ／ｌ含有する培地が好ましい。実際に培養する際には、ＩＢＡ及びＢＡＰをこのような量で含有するＢ５培地又はその改変培地を用いるのが好ましい。培養方法としては、固体又は液体培地を用いるのが好ましく、特に、液体旋回培養法を用いることが好ましい。具体的には、液体旋回培養法としては、６０〜１００ｒｐｍ、好ましくは７０〜８０ｒｐｍの旋回条件で行う培養法が好ましい。
次いで、増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植することにより、多芽体から効率よくシュートを伸長させることができる。
シュート伸長培地としては、前記の基本培地を用いることができ、特に無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、ＩＢＡを０．０２〜０．２ｍｇ／ｌ及びＢＡＰ０．２〜２．０ｍｇ／ｌ含有する培地が好ましい。より具体的には、ＩＢＡ及びＢＡＰをこのような量で含有するＢ５培地又はその改変培地を用いるのが好ましい。培養方法としては、固体又は液体培地を用いるのが好ましく、特に、液体静置培養法を用いることが好ましい。
次いで、伸長したシュートを、分割あるいは分割せずに発根培地に移植することにより、シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができる。
発根培地としては、前記の基本培地を用いることができ、特に無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、ＩＢＡを１．０〜５．０ｍｇ／ｌ含有する培地が好ましい。実際には、ＩＢＡをこのような量で含有するＢ５培地又はその改変培地が好ましい。
本発明では、伸長したシュートを、ＩＢＡを１．０〜３．０ｍｇ／ｌ含有する改変ＭＳ培地で培養し、次いでＩＢＡを１．０〜３．０ｍｇ／ｌ含有する改変Ｂ５培地に移植して更に培養して、発根させ、植物体を再生することが好ましい。ここで用いる改変ＭＳ培地及び改変Ｂ５培地は、ＩＢＡを特に２．５ｍｇ／ｌ含有するものが好ましい。またこれら改変ＭＳ培地及び改変Ｂ５培地での培養期間は、培養条件等によって変動し得るが、通常１５日〜１ケ月間であり、特に約１ケ月間が好ましい。培養条件としては、温度２３℃〜３０℃、湿度６０％〜１００％、照度３，０００ルックス〜９，０００ルックスが好ましい。
本発明では、上記した改変ＭＳ培地及び改変Ｂ５培地での培養後に、更にＩＢＡを１．０〜３．０ｍｇ／ｌ含有する改変ＭＳ培地で１５日〜１ケ月間、好ましくは約１ケ月間培養するのが好ましい。特にＩＢＡを２．５ｍｇ／ｌ含有する改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。改変ＭＳ培地での培養条件は上記と同様である。
上記した特定の改変培地で培養することによってシュートの発根率を高めかつ枯死率を低くすることができる。
本発明の組織培養によるマホガニー属樹木の大量増殖法の好ましい実施の形態の一つとしては、先ずマホガニー属樹木の頂芽又は腋芽を、ＢＡＰあるいはＢＡＰとともにＩＢＡを含有するＢ５培地又はその改変培地で培養して多芽体を誘導する。次いで、この多芽体を、ＩＢＡ及びＢＡＰを含有する多芽体増殖培地に移植して液体旋回培養法により培養して多芽体を増殖させ、次いで増殖した多芽体を、ＩＢＡ及びＢＡＰを含有するシュート伸長培地に移植して液体静置培養を行うことによりシュート伸長を促す。次いで得られるシュートを、ＩＢＡを含有する発根培地に移植して培養することにより、幼植物体を生産することができる。
実施例
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
インドネシアから入手したＳｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ苗木（高さ０．２〜２．０ｍ）を温室で成育させ、高さ１．０〜６．０ｍに成長させた後、材料を採取した。
（１）材料の殺菌
Ｓｗｉｅｔｅｎｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａの成木から頂芽を採取し、７０％エタノール中で３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウム中で６分間表面殺菌を行い、滅菌水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。
（２）多芽体の誘導
多芽体誘導培地としては、改変Ｂ５培地（全培地成分を半分量にしたＢ５培地）にショ糖３０ｇ／ｌ及び植物成長調節物質としてＩＢＡを０〜０．０２ｍｇ／ｌ、ＢＡＰを０．０２〜１．０ｍｇ／ｌ添加し、ｐＨを５．７に調整後、殺菌して用いた。培養温度は２６±２℃とし、１日当たり１６時間蛍光灯（３，０００〜９，０００ｌｕｘ）照明とした。培養１〜３ケ月後に多芽体が誘導された。
培地に添加したＩＢＡ及びＢＡＰの量と多芽体の形成数との関係を表１に示した。
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表１に示した結果から、特に、ＩＢＡ０．０２ｍｇ／ｌとＢＡＰ１．０ｍｇ／ｌを添加することが効果的であることが判る。
（３）多芽体の増殖
（２）で得られた多芽体を１個ずつの芽に分割し、多芽体増殖培地に移植した。培地には、ＩＢＡを０．０２〜０．２ｍｇ／ｌ、ＢＡＰを０．２〜２．０ｍｇ／ｌ添加した改変Ｂ５培地（前記（２）と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養温度は、２６±２℃とし、１日当たり１６時間蛍光灯（３，０００〜９，０００ｌｕｘ）照明とした。その結果、培養１〜２ケ月後には、約６倍の芽を得ることができた。
培地に添加したＩＢＡ及びＢＡＰの量と増殖した芽の数との関係を表２に示した。
0003934874.tif 000003
表２に示した結果から、特にＩＢＡ０．２ｍｇ／ｌとＢＡＰ０．２ｍｇ／ｌを添加することが効果的であることが判る。
（４）シュート伸長
（３）で増殖した多芽体をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、ＩＢＡを０．０２ｍｇ／ｌ、ＢＡＰを０．２〜２．０ｍｇ／ｌ添加した改変Ｂ５培地（前記（２）と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養温度は、２６±２℃とし、１日当たり１６時間蛍光灯（３，０００〜９，０００ｌｕｘ）照明とした。その結果、培養１ケ月後には、すべての芽を長さ約５〜１０ｍｍに伸長することができ、特に、ＩＢＡ０．２ｍｇ／ｌとＢＡＰ０．２ｍｇ／ｌを添加することが効果的であった。
（５）発根
（４）で得られた大量のシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、ＩＢＡを１．０〜５．０ｍｇ／ｌ、ゲルライトを２．８ｇ／ｌ添加した改変Ｂ５培地（前記（２）と同じ）をｐＨ５．７に調整し、殺菌して用いた。培養温度は、２６±２℃とし、１日当たり１６時間蛍光灯（３，０００〜９，０００ｌｕｘ）照明とした。その結果、培養１〜２ケ月後には、１８．５％の個体で発根が観察され、同時に３〜５ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができた。
培地に添加したＩＢＡの量と発根個体数との関係を表３に示した。
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表３に示した結果から、ＩＢＡ２．５ｍｇ／ｌを添加することが効果的であることが判る。
（６）発根
（４）で得られた大量のシュートを一本ずつに切り分け、以下の方法で培養した。
▲１▼  ＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変Ｂ５培地で、３ケ月間培養した。シュートは、１ケ月毎に、同組成の新しい培地に移植した。
▲２▼  ＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で３ケ月間培養した。シュートは、１ケ月毎に、同組成の新しい培地に移植した。
▲３▼  ＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で１ケ月間培養し、次いでＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変Ｂ５培地で１ケ月間培養し、更にＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で１ケ月間培養した。
▲４▼  ＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変Ｂ５培地で１ケ月間培養し、次いでＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で１ケ月間培養し、更にＩＢＡ０〜１０．０ｍｇ／ｌを添加した改変Ｂ５培地で１ケ月間培養した。
上記▲１▼〜▲４▼の培地には、ゲルライト２．８ｇ／ｌを添加した。
上記▲１▼〜▲４▼の培養は、いずれも培養温度２６±２℃、培養照度１日当たり１６時間蛍光灯（３，０００〜９，０００ｌｕｘ）、培養湿度６０〜９０％の条件で実施した。
上記▲１▼〜▲４▼の条件で培養した結果（発根率及び枯死率）を、それぞれ表４〜表７に示した。
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表４〜表７の結果から、▲３▼の方法で培養を行った場合、３ケ月後には７０．０％の個体で発根が観察され、同時に３〜１０ｃｍのシュートを伸長、２〜５枚の新葉を展開させることができ、特に、ＩＢＡ２．５ｍｇ／ｌを添加することが効果的であることが判る。
従って、ＩＢＡ２．５ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で１ケ月間培養した後、ＩＢＡ２．５ｍｇ／ｌを添加した改変Ｂ５培地で１ケ月間培養し、更にＩＢＡ２．５ｍｇ／ｌを添加した改変ＭＳ培地で培養することが、１種類の培地を継続的に使用するよりも、効果的であることが判る。
産業上の利用可能性
本発明によれば、マホガニー属樹木の組織培養用に供する無菌幼植物体、挿し木用に供する苗及び挿し穂を、試験管内で短期間に大量に生産することができ、マホガニー属樹木の苗の大量生産の可能性が高くなる。