(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の１位のＣｙｓから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
【請求項２】
配列番号２の−３０位のＭｅｔから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列からなる請求の範囲１に記載のポリペプチドまたはその塩。
【請求項３】
配列番号４の１位のＣｙｓから５９８位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
【請求項４】
配列番号４の−３０位のＭｅｔから５９８位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列からなる請求の範囲３に記載のポリペプチドまたはその塩。
【請求項５】
請求の範囲１から４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドまたはその塩。
【請求項６】
癌マーカー、骨疾患マーカー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドまたはその塩。
【請求項７】
請求の範囲１から６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１の９１番目のＴから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列からなる請求の範囲７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１の１番目のＡから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列からなる請求の範囲７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号３の９１番目のＴから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列からなる請求の範囲７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号３の１番目のＡから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列からなる請求の範囲７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求の範囲７から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
癌マーカー、骨疾患マーカー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする、請求の範囲７から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求の範囲７から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１５】
請求の範囲１４に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項１６】
請求の範囲１５に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドを培養培地から回収する工程、を含有する該ポリペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項１７】
請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１８】
下記の工程を含む、請求の範囲１７に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドの検出または定量方法、
（ａ）ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、
（ｂ）ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程。
【請求項１９】
請求の範囲１７に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法。
【請求項２０】
請求の範囲１７に記載の抗体を含むことを特徴とする、癌または骨疾患の診断用キット。
【請求項２１】
下記の工程を含む請求の範囲７から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドのｍＲＮＡの検出または定量方法、
（ａ）ｍＲＮＡと該ポリヌクレオチドとを接触させる工程および、
（ｂ）ｍＲＮＡと該ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程。
【請求項２２】
請求の範囲２１に記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載が関連する癌または骨疾患の検出方法。
【請求項２３】
請求の範囲２１記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する方法。
【請求項２４】
請求の範囲７から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キット。
【請求項２５】
下記の工程を含む、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドの結合物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程。
【請求項２６】
請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、該ポリペプチドの結合物質のスクリーニング用キット。
【請求項２７】
下記の工程を含む、BMP-２またはBMP-４と請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドとの結合活性調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドと、BMP-２またはBMP-４を接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドと、BMP-２またはBMP-４の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程。
【請求項２８】
請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドおよび、BMP-２またはBMP-４を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項２９】
下記の工程を含む、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質とを接触させる工程および、
（ｂ）該ポリペプチドの発現量の変化を、請求の範囲１７または２０のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程。
【請求項３０】
請求の範囲２９に記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項３１】
請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させた非ヒトノックアウト動物。
【請求項３２】
請求の範囲１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現または変異させた非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨細胞の分化抑制に関与するコルジンと類似構造を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドに対する相補的ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドのリガンド、該ポリペプチドを利用した物質のスクリーニング方法、並びに該ポリペプチドおよび該ポリヌクレオチドの癌マーカーおよび骨疾患マーカーとしての用途に関する。
背景技術
骨芽細胞の働きで骨が再生する現象、即ち、骨形成は、脊椎動物の生体維持などに重要な現象である。骨形成に関与する因子としては、これまでにホルモンではエストロゲン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＨＴ）が、増殖因子では骨形成因子（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が、その他薬剤では活性化ビタミンＤ、カルシウム製剤、ビタミンＫ２などが知られている。ＢＭＰはＴＧＦ−βファミリーに属する一群の液性因子であり、２０種類近くの遺伝子が存在することが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７，６３４（２０００）．）。その中でもＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４に関しては、骨分化調節活性があることが多数報告されている。一方、骨関連疾患の新規治療薬として期待されているＢＭＰは、異所性形成シグナルとしての作用を有する唯一のサイトカインである。ＢＭＰは、実際に骨折や骨欠損時の修復反応の際起こる、いわゆる軟骨性の仮骨から新生骨に置換されることによって起こる骨形成（軟骨内骨化）に有用であると考えられている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７４，４４８（１９９６）．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９（５），６５１（１９９４）．）。また、多分化能を有する間葉系幹細胞は、培養条件により脂肪細胞、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化すること（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３（１９９９）．）、ＢＭＰ−２で間葉系幹細胞を処理することにより骨分化が誘導されること（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１３，６８１（１９９１）．）が報告されている。従って、骨分化誘導活性を有するＢＭＰが、骨形成が関与する疾患である関節リウマチ、変形性関節症、あるいは骨粗鬆症に関与していることが考えられ、実際、ＢＭＰを使用した遺伝子治療も試られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７，７０９（２０００）．）。しかし、それらの疾患におけるＢＭＰの作用機構に関しては詳細な解析がされておらず、その解明が待望されていた。
ＢＭＰは、その受容体を介して繊維芽細胞から骨芽細胞への分化が誘導されることが、アルカリンホスファターゼ活性を指標に既に見出されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１７２，２９５（１９９０）．）。ＢＭＰの作用が、スペマンスオーガナイザーによって分泌されるタンパク質であるコルジンにより抑制されること（Ｎａｔｕｒｅ，３８２，５９５（１９９６）．）、また、コルジンがＢＭＰ受容体に結合するのではなく、ＢＭＰそのものに結合してアンタゴニストとして作用することが見出された（Ｃｅｌｌ，８６，５８９（１９９６）．）。最近、コルジンはそのアミノ末端にシグナルペプチドおよびシステインに富む４つの繰り返し構造（ＣＲ１からＣＲ４）を有しており、その特徴的な構造（モチーフ）を介してＢＭＰと結合することが、明らかにされた（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７，８２１（２０００）．）。また、コルジンと相同性の高い分泌タンパク質としてキエリンが報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍy  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９７（１０），５２９１−５２９６（２０００）．）。現在、キエリン以外にもコルジン様タンパク質が存在する可能性が示唆されている。しかし、その実態は明らかではなく、ＢＭＰの作用機構を解析する上でも、新規タンパク質の発見が待望されていた。
一方、癌は生体内のほとんどの組織で発症する疾患で、これまでに癌化の標的遺伝子である癌遺伝子および癌抑制遺伝子が数多く発見され、ヒト癌化機構は特定の遺伝子レベルで多段階的に描かれている。しかしながら、発癌機構は完全に解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。また、耳下腺癌、食道癌、十二指腸癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、小腸癌、直腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌においては、その原因遺伝子はまだ同定されていない。上記の状況の下、癌の発症に関わる新規遺伝子の同定および同遺伝子を用いた癌の診断方法が待望されていた。また、癌細胞は、脱分化状態で増殖をすることをその特徴としていることから、癌細胞の分化を調節する因子および薬剤を抗癌剤として使用する試みは数多くなされている。しかし、すべての癌を制御できるものはなく、新しい分化調節活性を有する因子や薬剤の発見が待望されていた。
発明の開示
本発明は、癌および骨疾患の診断に有用な新規ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの提供を課題とする。さらに、当該ポリベプチドおよびその阻害剤を用いた、癌および骨疾患の治療薬を提供する。
本発明者らは、骨細胞の分化抑制に関与する新規遺伝子の単離を目的として、鋭意研究を行なった結果、コルジン様新規ポリペプチド（Ｃ０７８３）をコードする新規な遺伝子を見出した。更に研究を進めた結果、該遺伝子の発現が各種癌組織中で増減していることを見出し、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが癌マーカーとして有用であることを確認した。更に研究を進めた結果、該遺伝子が、幹細胞が骨に分化する際発現上昇が認められることおよび該タンパク質がＢＭＰと結合して骨分化調節因子としての活性を有することを確認し本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２の１位のＣｙｓから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
（２）配列番号２の−３０位のＭｅｔから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有する（１）に記載のポリペプチドまたはその塩；
（３）配列番号４の１位のＣｙｓから５９７位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
（４）配列番号４の−３０位のＭｅｔから５９７位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
（５）（１）から（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加から選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、癌マーカーであるかまたはＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドまたはその塩；
（６）癌マーカー、骨疾患マーカー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチド；
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（８）配列番号１の９１番目のＴから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列を含有する（７）記載のポリヌクレオチド；
（９）配列番号１の１番目のＡから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列を含有する（７）記載のポリヌクレオチド；
（１０）配列番号３の９１番目のＴから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列を含有する（７）記載のポリヌクレオチド；
（１１）配列番号３の１番目のＡから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列を含有する（７）記載のポリヌクレオチド；
（１２）（７）から（１１）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、癌マーカーであるかまたはＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１３）（７）から（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（１４）癌マーカー、骨疾患マーカー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする（７）から（１１）または（１３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（１５）配列番号１または３に記載の塩基配列中の連続した５から６０塩基と同一配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体オリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド；
（１６）（７）から（１３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
（１７）（１６）に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体；
（１８）（１７）に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドを培養培地から回収する工程、を含有する該ポリペプチドまたはその塩の製造法；
（１９）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（２０）下記の工程を含む、（１９）に記載の抗体を用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドの検出または定量方法、
（ａ）ポリペプチドと該抗体とを接触させる工程および、
（ｂ）ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程；
（２１）（１９）に記載の抗体を用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法；
（２２）（１９）に記載の抗体を含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キット；
（２３）下記の工程を含む（７）から（１３）または（１５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドのｍＲＮＡの検出または定量方法、
（ａ）ｍＲＮＡと該ポリヌクレオチドとを接触させる工程および、
（ｂ）ｍＲＮＡと該ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程；
（２４）（２３）に記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法；
（２５）（２３）に記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（５）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する方法；
（２６）（７）から（１３）または（１５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法；
（２７）（７）から（１３）または（１５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キット；
（２８）下記の工程を含む、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドの結合物質のスクリーニング方法、
（ａ）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程および、
（ｂ）該ポリペプチドと被検物質との結合を検出する工程；
（２９）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、該ポリペプチドの結合物質のスクリーニング用キット；
（３０）（２８）に記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合物質；
（３１）ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４である（３０）に記載の結合物質；
（３２）下記の工程を含む、（３０）または（３１）のいずれかに記載の結合物質と（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドとの結合活性調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドと（３０）または（３１）のいずれかに記載の結合物質を接触させる工程および、
（ｂ）該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程；
（３３）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドおよび（３０）または（３１）のいずれかに記載の結合物質を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリーニング用キット；
（３４）（３２）に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質；
（３５）下記の工程を含む、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質とを接触させる工程および、
（ｂ）該ポリペプチドの発現量の変化を、（２０）または（２３）のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程；
（３６）（３５）に記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング用キット；
（３７）（３５）に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質；
（３８）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させた非ヒトノックアウト動物；
（３９）（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現または変異させた非ヒトトランスジェニック動物；
（４０）（１９）記載の抗体，（３０）記載の結合物質、（３４）記載の結合活性調節物質または（３７）記載の発現調節物質を含有してなる医薬；
に関する。
本発明のポリペプチドは、「配列番号２に記載の１位のＣｙｓから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号２に記載の−３０位のＭｅｔから６５５位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３１５位のＧｌｙから３７２位のＧｌｎまでの５８アミノ酸残基を欠損した「配列番号４に記載の１位のＣｙｓから５９７位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号４に記載の−３０位のＭｅｔから５９７位のＡｒｇで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」も包含する。「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、または酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、「配列番号２または４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、癌マーカーであるかまたは／およびＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドまたはその塩」も包含する。このポリペプチドは癌マーカーであるかまたはＢＭＰ結合活性を有する。１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、５０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下のアミノ酸残基を意味している。さらに、本発明のポリペプチドは、欠失、置換または付加によっても生物学的活性を有しており、癌マーカーとしての機能を有するかまたはＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドであり、配列番号２または配列番号４で表わされるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
本明細書において「癌マーカー」とは、癌細胞または癌組織を検出するに使用される物質である。ある種のｍＲＮＡまたはタンパク質が、癌疾患においてその発現が増加または減少する場合に、「癌マーカー」となりえる。「癌」としては、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、白血病、大腸癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌などが例示される。「癌マーカー」は癌を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクオチド、ポリペプチドおよび抗体などを使用することができる。
本明細書において「癌治療薬」とは、癌を治療するのに用いられる物質である。本発明のポリペプチドが各種癌細胞や癌組織において発現が増加または減少することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは各種癌の治療に有用であると考えられる。
本明細書において、「ＢＭＰ結合活性」とは、各種ＢＭＰへの結合性を有することであり、好ましくはＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４への結合性を有することである。
また、本発明のポリペプチドがＢＭＰとの結合活性を有することおよびＢＭＰが骨分化誘導活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などはＢＭＰに関連すると考えられる骨疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの「骨疾患マーカー」および「骨疾患治療薬」として有用であると考えられる。「骨疾患マーカー」とは、骨疾患を検出するのに使用される物質である。ある種のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が増加または減少する場合に、骨疾患マーカーとなり得る。「骨疾患マーカー」は骨疾患を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクオチド、ポリペプチドおよび抗体などを使用することができる。「骨疾患治療薬」とは、骨疾患を治療するのに使用される物質である。本発明のポリペプチドがＢＭＰとの結合活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは骨分化誘導活性を調整することにより、ＢＭＰに関連すると考えられる骨疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの治療に有用であると考えられる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、本発明のポリヌクレオチドとしては「配列番号１の９１番目のＴから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号１の１番目のＡから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号３の９１番目のＴから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号３の１番目のＡから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」が例示される。また、本発明のポリヌクレオチドには、「本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、癌マーカーであるかまたは／およびＢＭＰ結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」も包含される。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは「配列番号１の９１番目のＴから２０５５番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号３の９１番目のＴから１８８１番目のＧで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」である。
ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）のみからなる配列は除外される。
本明細書において「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号１または配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
本発明のポリヌクレオチドは、「配列番号１または３に記載の塩基配列中の連続した５から６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド」を包含する。その様なポリヌクレオチドは、配列番号１または３のいずれかに記載の塩基配列中の連続した塩基で、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個などからなる塩基配列と同一配列のオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体オリゴヌクレオチドも包含される。「誘導体オリゴヌクレオチド」としては、例えば、オリゴヌクレオチド中のりん酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合またはＮ３'−Ｐ５'ホスホアミダイト結合などに変換された誘導体オリゴヌクレオチド、リボースとりん酸ジエステル結合がペプチド結合に変換された誘導オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピオニルウラシルまたはＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピオニルシトシンまたはフェノキサジン修飾シトシンなど置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２'−Ｏ−プロピルリボースまたは２'−メトキシエトキシリボースなどで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。その様なポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子マーカー、ＰＣＲ用のプライマー、ハイブリダイゼーション用のプローブとして有用である。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いた本発明ポリペプチドの製造法が含まれる。また、ノックアウト動物やトランスジェニック動物も本発明により提供される。これら改変動物は、ヒトを除く哺乳類であれば、いずれの動物でもよく、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類が例示される。
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。
本明細書において「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部またはその断片、誘導体、結合体、修飾体なども包含される。好ましくは、本発明のポリペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
本発明のポリペプチドの「検出または定量」は、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成することができる。そのような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが挙げられる。
本発明の抗体を用いて、癌および／または骨疾患を検出することができる。本発明のポリペプチドは癌マーカーおよび骨疾患のマーカーとなり得ることから、前述のポリペプチドの検出または定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を用いることにより達成することができる。
本発明はまた、本発明の抗体を含むことを特徴とする癌および／または骨疾患の診断用キットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬として本発明のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは癌マーカーであるかあるいはＢＭＰ結合活性を有することから、前述の癌および骨疾患の検出方法に基づき、本発明のポリペプチドを免疫学的に測定することができる。
本発明のポリペプチドのｍＲＮＡの「検出または定量」は、ｍＲＮＡの測定を行う分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。そのような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。
本発明のｍＲＮＡの測定方法により、癌および／または骨疾患を検出することができる。本発明のポリペプチドは癌マーカーおよび骨疾患マーカーとなり得ることから、前述のｍＲＮＡの検出または定量と同様な分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部、標準試薬およびポリヌクレオチドの一部または全部を含む、癌および／または骨疾患の診断用キットに関する。本発明のポリヌクレオチドは、癌マーカーおよび骨疾患マーカーとなり得ることから、前述の癌または骨疾患の検出方法に基づき、ポリヌクレオチドを分子生物学的に測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドを用いて、ＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列中の連続した５から６０個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよび誘導体オリゴヌクレオチドなどを適宜調製し、当該分野で周知なアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて、このポリペプチドのＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法を提供することができる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの結合物質に関する。「結合物質」とは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する任意の物質をいう。このような結合物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられる。
本発明の「結合物質のスクリーニング方法」は、当技術分野で公知となっている技術を適宜適応することにより行うことができ、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「結合物質のスクリーニング用キット」には、少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部が含まれる。このキットを用いて、前述の本発明の結合物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、「結合活性調節物質」に関する。「結合活性調節」とは、本発明のポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、「結合活性」は、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）により評価される。「結合活性調節物質」とは、本発明のポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられる。
本発明の「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「結合活性調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれている。本発明のキットを用いて、前述の結合活性調節物質をスクリーニング方法に基づき、結合活性調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
また、本発明は、「発現調節物質」に関する。発現量とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質またはｍＲＮＡが発現される量を意味する。発現量は、本発明の抗体を用いた、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法方法などの免疫学的測定方法などを含む適切な方法により本発明のタンパク質を測定することまたは本発明のｍＲＮＡ測定方法、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法により本発明のポリペプチドのｍＲＮＡを測定することにより評価することができる。「発現調節」とは、上記の免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質またはｍＲＮＡレベルでの発現量を増加または減少させることを意味する。「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される、本発明のポリペプチドのタンパク質またはｍＲＮＡレベルでの発現量を増加または減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが例示される。
本発明の「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「発現調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれている。本発明のキットを用いて、前述の発現調節物質をスクリーニング方法に基づき、発現調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
本発明の「医薬」とは、少なくとも、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、結合物質、結合活性調節物質または発現調節物質を含有していればよく、特定の疾患、例えば、癌、骨疾患などの予防または治療に用い得る。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明ポリヌクレオチドの調製、本発明ポリペプチドの調製、組換えベクター、形質転換体、製造方法、抗体、本発明ポリペプチドの定量方法、免疫学的検出方法、ｍＲＮＡの定量方法、ｍＲＮＡの翻訳抑制方法、結合物質、結合物質スクリーニング方法、結合活性調節物質、結合活性調節物質スクリーニング方法、発現調節物質、発現調節物質スクリーニング方法、スクリーニング用キット、ノックアウト動物、トランスジェニック動物、癌または／および骨疾患の検出方法、遺伝子診断用キット、医薬について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。
（１）本発明のポリヌクレオチドの取得
ヒト間葉系幹細胞、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺由来のヒト正常細胞、または、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸、結腸由来のヒト癌細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載された方法、あるいは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ストラタジーン社製）などを用いる方法が挙げられる。また、ヒト癌細胞由来株ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２２；結腸腺癌由来株）から調製したｍＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）などのｃＤＮＡ合成キットなどによりｃＤＮＡを合成することもできる。
本発明のＤＮＡの両末端にＥｃｏＲ  Ｉリンカーを付与した後、クローニングベクター、例えば、ｐＳｐｏｒｔ  １（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲ  Ｉサイトに挿入する。本発明のプラスミドを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン社製）を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。作製したｃＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクローンを以下の方法で選択する。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーより、常法または市販のキット、例えば、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いた方法によりプラスミドを調製する。
上記で調製したｃＤＮＡライブラリーからコルジンのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを選択する。そのようなＤＮＡ断片は、各コルジンのアミノ酸配列がよく保存されている領域を２ヶ所以上見出し、該領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対応する縮重プライマーを設計し、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法により増幅することで得られる。縮重プライマーの作製方法は、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９５）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ザ・プロトコールシリーズ「ｃＤＮＡクローニング」（１９９６）（井上純一郎、仙波憲太郎編；羊土社）およびＳｃｉｅｎｃｅ，２４１，４２（１９８８）．などに記載の方法が挙げられる。ＰＣＲ法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９８９）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法が挙げられる。
このようにしてＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を適当なプラスミドに挿入し、サブクローニングする。サブクローニングは、増幅したＤＮＡ断片をそのままあるいは制限酵素やＤＮＡポリメラーゼで処理した後、常法によりプラスミドベクターに組み込むことにより行うことができる。そのようなベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）．）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバゲン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、ｐＮｏＴＡＴ７（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５ｐｒｉｍｅ社製）などが例示できる。
サブクローン化されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列をスクリーニングすることにより、既知のコルジンのアミノ酸配列とホモロジーを有するが、完全には一致しないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を選択することができる。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガーらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）．）あるいは３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）などの塩基配列分析装置で解析することができる。このようにして選択したＤＮＡ断片をプローブとし、上記で作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション解析を行うことにより、既知のコルジンとホモロジーを有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得することができる。プローブは、該ＤＮＡ断片を32Ｐなどの放射性同位体、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素などで標識したものを使用することができる。ハイブリダイゼーションは、通常用いられる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法で行うことができる。
ハイブリダイゼーションにより取得されたｃＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素で消化した後、常法によりプラスミドベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガーらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）．）あるいは３７３ＡＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）などの塩基配列分析装置を用いて塩基配列を分析することで目的とするＤＮＡを取得することができる。
このようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられ、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。配列番号１のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したプラスミドをあげることができる。
得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み発現プラスミドを構築し、該発現ベクターを適した宿主に導入することにより形質転換体を得ることができる。該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとしてｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）．；特開平３−２２９７９）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）などを用いることができる。
該発現ベクターの宿主への導入方法としてはＤＮＡを導入する方法であればいずれの方法も用いることができる。宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．；Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）に記載の方法が例示される。
宿主としては発現ベクターに対応する適当な細胞または組織を用いることが可能で、例えば、動物細胞などが挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＮａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）およびそのサブラインＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１、ＨＣＴ−１５（ヒト大腸癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２５）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）などが例示されるが、好ましくは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１細胞およびＨＣＴ−１５細胞を用いる。
本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＹＴ培地、ＢＥＭ培地などが用いられる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、Ｄ-ＭＥＭ培地、ＲＰＩＭ培地などにウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したものなどが用いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよく、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシン（ＩＰＴＧ）などを用いることができる。
培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、ＦＣＳ、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。培養はｐＨ６．０〜８．０、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下などの条件で行う。
所望のＤＮＡはコルジンが有する骨細胞の分化誘導抑制活性を指標にし、該形質転換体によって産生されたタンパク質をスクリーニングすることによって選択することができる。骨細胞の分化誘導抑制活性とは、骨細胞の細胞増殖速度の上昇をもたらし、該細胞の形態変化を抑制させる活性を指す。該活性は、例えば、顕微鏡による骨細胞の形態学的観察や、骨細胞の分化マーカー、例えば、アルカリフォスファターゼ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３，４３０８−４３１４（１９８３）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９，５４２−５４４（１９７８）．）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ）やＩ型コラーゲンを測定することにより検出することが可能である。アルカリフォスファターゼは、例えば、細胞を超音波破砕により破壊し、細胞抽出液を得て、これをアルカリフォスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルフォスフェート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加後、一定時間反応させ生成したｐ−ニトロフェノール（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）の量を分光光度計により定量方法などにより測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性が増加していれば、該ＤＮＡは骨細胞の分化誘導に関与する新規なコルジンをコードしていると考えることができる。
以上のようにして、ヒト間葉系幹細胞、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺由来のヒト正常細胞、または、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸、結腸由来のヒト癌細胞において、骨細胞の分化誘導に関与する、コルジン活性を有する新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得することができる。
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、配列番号２記載のアミノ酸配列と比較して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡを取得することができる。即ち、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウシ、サルなど由来のｃＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、目的のＤＮＡを取得することができる。
スクリーニングされた新規コルジンポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても目的のＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成はりん酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、ホスホン酸エステル法などの方法により行うことができ、ＡＢＩ  ３９２（アプライドバイオシステムズ社製）などの市販の合成機器を用いて行うこともできる。
また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
（２）本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）などに記載された方法を用い、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードする全長ＤＮＡを基に、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列は、宿主の発現に最適なコドンとなるようにしたものを調製する。該ＤＮＡは該ポリペプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片または全長ＤＮＡは適当な発現ベクターのプロモーターの制御下に挿入し、組換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。該組換えベクターはそれに適合した宿主に導入することにより、本発明のポリペプチドを産生する形質転換体を得ることができる。
宿主としては、大腸菌属などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの多細胞真核生物など目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。発現ベクターは、宿主において自立複製または染色体中への組込みが可能で、新規コルジン遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
新規コルジン遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規コルジン遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＵＣ１９（インビトロジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）、ｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）などを例示することができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰLプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーターなどの大腸菌やファージに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたＰｔｒｐｘ２プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７、ｌｅｔプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガーノ（ＳＤ：Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば６〜１８塩基、に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主としては、例えば、  宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などの原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株およびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株などが、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株などが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株などが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株などが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株などが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株などが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、りん酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法などがあげられる。
（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーターなどが挙げられる。
宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種およびＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種などが挙げられる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍy  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法などが挙げられる。
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）などを用いることができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーターおよびメタロチオネインのプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）およびＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）およびＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）およびＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）。
（ｉｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）などが、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡなどが挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．などに記載の方法が用いられる。
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクターおよび昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりポリペプチドを発現することができる。
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞などが挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）などが、Ｔ．  ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｃｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）などを挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）なども用いることができる。
（ｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる場合
宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどを挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーターなどを挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻などの植物細胞が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）などを挙げることができる。
（ｖｉ）培養方法
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、形質転換体または培養液より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育または栽培し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規コルジン活性を有するポリペプチドを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規コルジン活性を有するポリペプチドを製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵などを挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規コルジン活性を有するポリペプチドを該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規コルジン活性を有するポリペプチドを製造することができる。
宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規コルジン活性を有するポリペプチドを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクトおよび塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
培養方法は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行う。培養温度、培養時間および培養液のｐＨは、各種宿主に適した範囲に設定し、通常１５〜４０℃、５時間〜７日間、ｐＨ３．０〜９．０で培養を行う。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行うことができる。また、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
形質転換体が植物細胞や組織である場合、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモンを添加した培地を用いることができる。
形質転換体が動物細胞や組織である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）などを添加した培地などが用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ2存在下などの条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Ｇｒａｃｅ'ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）などを用いることができる。
（ｖｉｉ）製造方法
本発明のポリペプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリペプチドを単離・精製することにより製造することができる。本発明のポリペプチドの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。
本発明のポリペプチドが溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離する。本発明のポリペプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体をＳＴＥ溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
本発明のポリペプチドの分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などを含んでいてもよい。
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合せて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによっても行うことができる。
本発明のポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞または菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧなどが例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、本発明のポリペプチドとプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドとＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。
本発明のポリペプチドは、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）などのペプチド合成機器により化学合成することができる。
本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドのコルジン活性は、公知の測定法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８，９８９３−９８９８（１９８３）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，５８−６５（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，４３３−４４０（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７０，６３０−６４６（１９８９）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７４，１４−２５（１９８９）．、特開平６−１８１７５９）に準じて測定することができる。
（３）変異型ポリペプチドの作製方法
本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ  ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．などに記載の方法に準じて調製することができる。
（４）本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリペプチドの全長、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチド含むポリペプチドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）や牛チログロブリン（ＢＴＧ）などに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスターなどを用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））などに従って作製することができる。
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーを単独または組み合わせることで行うことができる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
モノクローナル抗体は、（ｉ）で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従って作製することができる。
本発明のポリペプチド、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）．、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）．）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）．）などが用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ  ８−アザグアニンを含む正常培地（１．５ｍＭ  グルタミン、５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ジェンタマイシンおよび１０％  ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地））で継代し、細胞融合を行う３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０7個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で調製した抗体産生細胞と（ｂ）で調製した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３ｇリン酸二ナトリウム、０．２１ｇリン酸一カリウム、７．６５ｇＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０8当たり、ポリエチレングリコール溶液（２ｇ  ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ  ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０-4Ｍ  ヒポキサンチン、１．５×１０-5Ｍ  チミジンおよび４×１０-7Ｍ  アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ2存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））などに記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
（５）本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法
本発明ポリペプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドに対する抗体を直接または間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックスなどに結合した標識体を用いることにより該ポリペプチドまたはその部分ペプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、125Ｉなどの放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法などが例示される。
また、そのような測定方法として、ウェスタンブロット法および免疫組織染色なども例示される。
さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドを定量することもできる。
（６）ｍＲＮＡの定量方法
本発明のポリヌクレオチドより調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量することで本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
正常あるいは疾患モデル動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどでｍＲＮＡを定量する場合、必要によって抗癌剤などの薬剤などを投与し、一定時間経過後に、血液、脳、胃、腎臓などの臓器または組織を単離し、細胞を調製する。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法などでｍＲＮＡを定量・解析することができる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体からのｍＲＮＡを定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法などでｍＲＮＡを定量・解析することができる。
（７）遺伝子構造の同定
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列と、データベースに登録されているヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造をスクリーニングすることができる。本発明のポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用の常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）．）を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域が挙げられる。
（８）癌の検出方法
癌または癌転移検出方法としては、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリペプチドと反応する異なるエピトープを認識する２種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法や125Ｉなどの放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと該ペプチドを認識する抗体を用いる競合ＲＩＡ法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病患者の癌細胞においてその発現が増加し、小腸癌、直腸癌、大腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌患者の癌細胞においてその発現が減少していることから、この検出法は、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌などの診断に利用することができる。
また、本遺伝子の多型を調べることにより、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、直腸癌、大腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌の診断や予後の予測に利用できる。
さらに、本遺伝子の多型と、本遺伝子が発現している臓器（脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺）における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の診断にも利用できる。本遺伝子の多型解析は、本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンブロット法、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる（臨床検査，４２，１５０７−１５１７（１９９８）．、臨床検査，４２，１５６５−１５７０（１９９８）．）。
（９）骨疾患検出方法
骨疾患方法としては、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリペプチドと反応する異なるエピトープを認識する２種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法や125Ｉなどの放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと該ペプチドを認識する抗体を用いる競合ＲＩＡ法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、関節リュウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの骨疾患の診断に利用することができる。
本発明のポリペプチドは、間葉系幹細胞が骨細胞に分化する際に発現が上昇していることから、本遺伝子の多型を調べることにより、骨疾患の診断や予後の予測に利用できる。
（１０）診断用キット
本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いたそれら癌および骨疾患の診断に利用することが可能である。また、本発明の抗体を用いて免疫学的手法によっても癌および骨疾患の診断を行なうことができる。従って、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。また、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。
（１１）ｍＲＮＡの翻訳抑制方法
本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。即ち、本発明のポリヌクレオチドを用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うことが可能である。
（１２）結合物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドは、本発明のポリペプチドに対する結合物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩と被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリペプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、例えば、ＢＭＰ等のＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質、ヒトまたはマウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。これらの被検物質を本発明のポリペプチドに添加し、骨芽細胞分化誘導活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを用いるか、組換え型ポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いるか、または本発明のポリペプチドに結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、または、ＢＭＰ−４によるアルカリンホスファターゼ活性上昇に対する脱抑制活性など）を測定してスクリーニングすることができる。
まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリペプチドとしては、上記した本発明のポリペプチドまたは本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリペプチドが適している。本発明のポリペプチドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には、通常、相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したポリペプチドの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７，１９５５５〜１９５５９（１９９２）．に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、本発明の結合物質スクリーニング方法において、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリペプチドもしくはその部分ペプチドであってもよいし、該ポリペプチドを含有する細胞またはその細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。本発明のポリペプチドを含有する細胞としては、本発明のポリペプチドを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞上清画分としては、細胞の培養上清に含まれる画分のことをいう。
本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質をスクリーニングするためには、適当なポリペプチド画分と、標識した試験物質が必要である。ポリペプチド画分としては、天然型のポリペプチド画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリペプチド画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した試験物質としては、3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識した、例えば、ＢＭＰなどのＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質を挙げることができる。
具体的には、本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質のスクリーニング方法を行なうには、まず本発明のポリペプチドを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング方法に適したバッファーに懸濁することによりポリペプチド標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などのリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種タンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍlの該ポリペプチド溶液に、一定量、好ましくは、５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍの3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識した試験物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、好ましくは４℃から３７℃で、２０分から２４時間、好ましくは３０分から３時間で行なう。反応後、ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験物質を本発明のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質として選択することができる。
本発明のポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、該ポリペプチドを介する細胞刺激活性、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性または、ＢＭＰ−４によるアルカリンホスファターゼ活性上昇に対する脱抑制活性などを公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ポリペプチドを含有する細胞をマルチウェルプレートなどに培養する。結合物質のスクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、試験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質、例えば、アラキドン酸などの生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
（１３）結合物質スクリーニング用キット
本発明のポリペプチドまたはその塩に結合する結合物質スクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドもしくはその塩、本発明の部分ペプチドもしくはその塩、本発明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリペプチドを含有する細胞上清画分などを含有するものである。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）結合物質スクリーニング用試薬
スクリーニング溶液および洗浄溶液としてＨａｎｋ'ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ａ）本発明のポリペプチドを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％  ＣＯ2で２日間培養したもの。
（ｂ）標識被検物質
市販の3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識した被検物質した溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、測定用緩衝液にて１μＭに希釈して用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｃ）非標識被検物質
標識物質と同じものを１００〜１０００倍濃度で調製したもの。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２Ｍ  ＮａＯＨ（１％  ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
本発明のポリペプチドまたはその塩に結合することができる結合物質としては、例えば、脳および肺などに特異的に存在する物質などが挙げられ、具体的には、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンドリレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのαおよびβ−ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニンおよびＢＭＰなどのＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質などが用いられる。
（１４）結合活性調節物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドは、本発明のポリペプチドに対する結合活性調節物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。本発明のポリペプチドとＢＭＰ−２やＢＭＰ−４に例示される結合物質との結合活性調節物質、すなわち、結合性を変化させる物質のスクリーニング方法としては、本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する組換え体発現系を構築し、バイオアッセイ系または結合アッセイ系を用いることによって、結合物質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる物質、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などを効率よくスクリーニングすることができる。このような物質には、（ａ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化またはｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質を接触させた場合および（ｉｉ）本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質および被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩との結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の場合において、該ポリペプチドと結合物質との結合量を、例えば、細胞刺激活性などを測定することにより比較することを特徴とする。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法として、具体的には、（ａ）標識したＢＭＰ−２やＢＭＰ−４に例示される結合物質を本発明のポリペプチドなどに接触させた場合、および、標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質をスクリーニング方法、（ｂ）本発明のポリペプチドなどを含有する細胞または細胞培養液と標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該細胞または細胞培養液における該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、（ｃ）本発明のポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリペプチドなどと標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法などが挙げられる。
（１５）結合活性調節物質のスクリーニング用キット
ＢＭＰ−２やＢＭＰ−４に例示される結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞または本発明のポリペプチドを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）結合活性調節物質のスクリーニング用試薬
スクリーニング用溶液および洗浄用溶液としてＨａｎｋ'ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌したものを、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ａ）本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％  ＣＯ2、で２日間培養したもの。
（ｂ）標識被検物質
市販の3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識した被検物質した溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、測定用緩衝液にて１μＭに希釈して用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｃ）非標識被検物質
標識物質と同じものを１００〜１０００倍濃度で調製したもの。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２Ｍ  ＮａＯＨ（１％  ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
（１６）発現調節物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドあるいは（４）記載の抗体を用いることにより、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現調節物質のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体などに含まれる本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量あるいはタンパク質量を測定することにより、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現調節物質のスクリーニングを行うことができる。
（１７）発現調節物質のスクリーニング用キット
本発明のポリペプチドの発現調節物質またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリペプチドを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（１８）免疫学的定量方法に基づくスクリーニング用キット
本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、126Ｉなどの放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドとそれを特異的に認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法などが例示される。従って、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。
（１９）分子生物学的定量方法に基づくスクリーニング用キット
本発明のポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドから調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。
具体的には、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどに対して、薬剤、例えば、抗癌剤などなどを投与し、一定時間経過した後、血液、特定の臓器、例えば、脳、胃、腎臓など、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例えば、当該分野において周知の抽出方法によりｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量、または周知のノーザンブロット法により解析することもできる、または（ｉｉ）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。
（２０）非ヒトノックアウトおよび非ヒトトランスジェニック動物の作製
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウスなどの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍｃｅｌｌ)において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６（６１１０），２９５（１９８７）．、Ｃｅｌｌ，５１（３），５０３（１９８７）．などに記載の公知の相同組換えの手法により、Ｎａｔｕｒｅ、３５０（６３１５），２４３（１９９１）．などに記載のような不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法などの手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基の置換、欠失、挿入などの変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性などを改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモーターを利用して、該領域での目的遺伝子欠失（Ｃｅｌｌ，８７（７），１３１７（１９９６）．）やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に臓器特異的な目的遺伝子欠失（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５（１９９７）．）などが知られている。従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御または任意の欠失、置換、付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有する非ヒトノックアウトまたは非ヒトトランスジェニック動物を作製することが可能である。
このようなノックアウトおよびトランスジェニック非ヒト動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。従って、本発明のノックアウトおよびトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬などの評価用モデルとして非常に有用である。
（２１）医薬
本発明の抗体、結合物質、結合調節物質または発現調節物質を含有する医薬は、治療薬として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質またはその塩とは、結合物質、結合活性調節物質および発現調節物質であり、具体的には、（ａ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化またはｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などを増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合活性を増強あるいは減少させる物質、あるいは（ｃ）本発明のポリペプチドの発現量を増強あるいは減少させる物質である。
該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。本発明のポリペプチドなどに対するアゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のポリペプチドなどに対するアンタゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を増強する物質は、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を減少させる物質は、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。また、本発明のポリペプチドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の予防および／または治療剤本発明のポリペプチドは前述のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる発現調節物質は、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。該物質を本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含むＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどの等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのアルコール類、ポリソルベート８０やＨＣＯ−５０など非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどの安定剤、ベンジルアルコール、フェノールなどの保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。該物質またはその塩の１回の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであり、非経口的に投与、例えば、注射剤の場合は、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
実施例
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。
実施例１
コルジンと相同性を有する新規ポリペプチド（Ｃ０７８３）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト間葉系幹細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）５Ｘ１０7個から、ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを調製し、全ＲＮＡ５００μｇを得た。得られた全ＲＮＡをＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡからクローニング用ｃＤＮＡ断片を調製した。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ３μｇをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）12-18ｐｒｉｍｅｒおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈを用いてセカンドストランドｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで処理し、平滑末端をもつｃＤＮＡを生成した後、ＥｃｏＲ  Ｉ（Ｎｏｔ  Ｉ）ＡｄａｐｔｅｒをＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いて５'および３'両末端に付加した。アダプターを付加したｃＤＮＡはＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いて５'末端をりん酸化した後、ｃＤＮＡ  ｓｉｚｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎｓで約５００ｂｐ以上のｃＤＮＡ断片を回収した。ベクターｐｌａｓｍｉｄ  ｐＳｐｏｒｔ  １（インビトロジェン社製）を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で処理し、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いて５'末端をりん酸化した後、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いて得られたｃＤＮＡ断片を組み込んだ。得られた組換えプラスミドＤＮＡをエタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）によりＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン社製）に導入し形質転換体を作製した。
形質転換体をＳ．Ｏ．Ｃ．培地（インビトロジェン社製）１ｍｌ中、３７℃で１時間培養し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
その結果、ｃＤＮＡライブラリーとして約１００万個（挿入率９５％）のアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。
得られた形質転換体を別のＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、コロニー約１０００個からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがってプラスミドを調製した。ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたｃＤＮＡはＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＭｅｇａＢＡＣＥ）（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ＭｅｇａＢＡＣＥ  ５００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）によりｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。コルジンとのアミノ酸配列比較のための至適アラインメントは、遺伝子情報処理ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア社製）を用いて、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）．）により実施した。
その結果、既知のコルジンアミノ酸配列とホモロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号５）を有するクローンを得た。
該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがってｃＤＮＡ断片を得た。該ｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（６０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ，２０ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社製）で32Ｐで標識した。32Ｐ標識したｃＤＮＡ断片をプローブとして用いコロニーハイブリダイゼーション解析を行った。
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ（クロンテック社製）を５０枚のＬＢプレートにプレート当たり約１×１０4コロニーとなるように塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。そのようにして得られたコロニーをＤＮＡブロッティング用ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写した後、溶解溶液（１０％  ＳＤＳ）、変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、中和溶液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０（１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む））および２×ＳＳＣで順次処理し、風乾した。転写したＤＮＡは該ナイロン膜に紫外線照射することにより膜上に固定した。
上記で調製した標識プローブをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）に添加し、該溶液にＤＮＡを固定したナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で室温にて５分、１×ＳＳＣで５０℃にて３０分、０．５×ＳＳＣで室温にて５分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フイルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フイルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００Ｇで画像解析を行った。シグナルが検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダイゼーションを繰り返し行った。得られた単一クローンコロニーからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＭｅｇａＢＡＣＥ）（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ＭｅｇａＢＡＣＥ  ５００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により全塩基配列を決定した。
その結果、６８５個のアミノ酸よりなるポリペプチド（配列番号２；以下、Ｃ０７８３）をコードするｃＤＮＡ断片（配列番号１）を含むｃＤＮＡを得た。Ｃ０７８３はアミノ末端の１位のＭｅｔから３０位のＡｓｎまでの領域が、予想されるシグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＳＰ）領域で、５０位のＣｙｓから３５７位のＣｙｓにはコルジンのシステインリッチ（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ：ＣＲ）領域と類似性を有する５つの領域（アミノ末端から順に、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４およびＣＲ５）が存在し、ヒトのコルジンのＣＲ領域と２０〜３１％の相同性を有していた（図１）。
実施例２
ヒト正常組織におけるＣ０７８３ｍＲＮＡの発現
実施例１で得られたｃＤＮＡライブラリーのうちＣ０７８３をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがってＣ０７８３を含むｃＤＮＡ断片を得た。得られたｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（６０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ，２０ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社製）で32Ｐで標識した。このようにして調製した32Ｐ標識ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いノーザンブロット解析を行った。
上記で調製した標識プローブをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）に添加し、該溶液にＨｕｍａｎ  Ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡ  Ｂｌｏｔｓ  １２  Ｍａｊｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（サワディーテクノロジー社製）を浸漬し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で室温にて５分、１×ＳＳＣで５０℃にて３０分、０．５×ＳＳＣで室温にて５分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フイルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フイルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００Ｇで画像解析を行った。
その結果、Ｃ０７８３のｍＲＮＡは、約３．８ｋｂの大きさで、脳および肺での発現が観察された。
実施例３
ヒト癌組織におけるＣ０７８３ｍＲＮＡの発現
ヒト由来各種臓器の正常組織および腫瘍組織における当該遺伝子の発現量を調べた。
ヒト由来の２４種の癌組織および対応する正常組織から抽出した全ＲＮＡを固定したナイロン膜４８−Ｄｏｔ  Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ（ＨＡＴＤｔ−Ｉ）（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を、ハイブリダイゼーションバッファー（０．５Ｍ  りん酸バッファー、ｐＨ７．２；１％（ｗ／Ｖ）  ＢＳＡ、１ｍ  ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、７％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを含む）に浸し、６５℃で１時間の予備ハイブリダイゼーションを行った。次に、実施例２と同様にして調製したＣ０７８３ｃＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で消化し、Ｃ０７８３を含むｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（６０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ，２０ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社製）で32Ｐで標識することにより標識プローブを調製した。該標識プローブを添加したハイブリダイゼーションバッファーに、予備ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、該ナイロン膜を２×ＳＳＣで室温にて５分、１×ＳＳＣで５０℃にて３０分、０．５×ＳＳＣで５０℃にて３０分順次洗浄した後、風乾した。このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フイルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フイルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００Ｇで画像解析を行った。１８ＳリボソームＲＮＡを対照区とし、該ナイロン膜をデハイブリダイズ後、添付の１８ＳリボソームＲＮＡプローブを用いて上記と同様に操作し、解析を行った。対照区の解析結果に対する試験区の解析結果の発現量比を算出し、比率が０．０１以上の場合を高発現とした。
その結果、正常組織においては、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱および前立腺、癌組織においては、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸および結腸でＣ０７８３遺伝子は高発現していた。
また、対照区の解析結果を基に各組織での発現量を補正した後、正常組織に対応する癌組織での発現量比を算出し、各種癌組織における発現量を解析した（図２）。
その結果、Ｃ０７８３遺伝子の発現量は耳下腺、腎臓、胃、リンパ節、食道、尿管の癌組織で増加が、小腸、直腸、結腸の癌組織で減少が観察された。
実施例４
ヒト間葉系幹細胞におけるＣ０７８３ｍＲＮＡの発現
ヒト間葉系幹細胞を、骨細胞に分化誘導した際のＣ０７８３ｍＲＮＡの発現変化を解析した。
ヒト間葉系幹細胞Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）をＨｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を用いて培養した。該細胞培養液に試験区としてｈｕｍａｎ  ＩＬ−１βＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を最終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌになるよう添加したもの、ｈｕｍａｎ  ＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を最終濃度で１０ｎｇ／ｍｌになるよう添加したもの、ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（ＦＧＦ−２）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を最終濃度で１０ｎｇ／ｍｌになるよう添加したものおよび対照区として無添加のものをそれぞれ調製し、３７℃、５％  ＣＯ2中で１日間または４日間培養を行った。各培養細胞から細胞を回収し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従い全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡを得た。得られた全ｍＲＮＡ１０μｇを１％  アガロースゲル（５．５％  ホルマリンを含む）電気泳動で分画後、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写した。該ナイロン膜をハイブリダイゼーションバッファー（０．５Ｍ  りん酸バッファー，ｐＨ７．２；１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ，１ｍ  ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，７％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを含む）に浸し、６５℃で１時間の予備ハイブリダイゼーションを行った。次に、実施例２と同様にして調製したＣ０７８３ｃＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（宝酒造社製）で消化し、Ｃ０７８３を含むｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（６０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ，２０ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社製）で32Ｐで標識することにより標識プローブを調製した。該標識プローブを添加したハイブリダイゼーションバッファーに、予備ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、該ナイロン膜を２×ＳＳＣで室温にて５分、１×ＳＳＣで５０℃にて３０分、０．５×ＳＳＣで室温にて５分順次洗浄した後、風乾した。このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フイルム社製）共にイメージングプレートカセット（富士写真フイルム社製）に装着し、オートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００Ｇで画像解析を行った。
各シグナル強度を測定し、対照区の解析結果に対する試験区の解析結果の比率を算出した。
その結果、Ｃ０７８３の発現量は骨芽細胞分化誘導活性を有するＩＬ−１βおよびＦＧＦ−２処理区で増加したが、軟骨細胞分化誘導活性を有するＩＧＦ−Ｉ処理区で変化しなかった（図３）。Ｃ０７８３はＩＬ−１βおよびＦＧＦ−２処理により発現誘導され、ＩＧＦ−Ｉ処理により発現誘導されないことから、骨芽細胞分化に関与していることが示唆される。
実施例５
Ｃ０７８３の欠損変異体の同定
実施例１で得られたＣ０７８３ｃＤＮＡの一部を含む配列番号３で示されるｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（６０００  Ｃｉ／ｍ  ｍｏｌ，２０ｍＣｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社製）で32Ｐで標識することにより標識プローブを調製した。実施例１と同様にして、該標識プローブおよびヒト脳ｃＤＮＡライブラリーＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ（クロンテック社製）を用いてコロニーハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、シグナルが検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダイゼーションを繰り返し行った。得られた単一クローンコロニーからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＭｅｇａＢＡＣＥ）（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ＭｅｇａＢＡＣＥ  ５００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により全塩基配列を決定した。
その結果、Ｃ０７８３のアミノ酸配列のうち３１５位のＧｌｙから３７２位のＧｌｎまでの５８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号４）をコードするｃＤＮＡクローン（配列番号３）を単離した（図４）。
実施例６
Ｃ０７８３の哺乳類動物細胞での発現
ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（シグマアルドリッチジャパン社製）より３×ＦＬＡＧペプチドをコードする塩基配列をＰＣＲ法により増幅し、クローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入し、プラスミドｐＣＲ−ＦＬＡＧを構築した。
次に、実施例１で得られたｃＤＮＡ断片から、配列番号１で示されるＣ０７８３をコードする塩基配列をｐＣＲ−ＦＬＡＧのＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位に挿入することにより、カルボキシ末端に３×ＦＬＡＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を付加したベクターを構築した。このプラスミドを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化し、発現ベクターｐＬＸＳＮ（クロンテック社製）のＸｈｏ  Ｉ部位に挿入することによりＣ０７８３発現ベクターｐＬＸＮＳ−Ｃ０７８３ＦＬＡＧを構築した。
ｐＬＸＮＳ−Ｃ０７８３ＦＬＡＧの宿主としてＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）を用いた。
１０％（ｗ／ｖ）  ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を分注した３５ｍｍのマルチディッシュに、ＨＥＫ２９３細胞を１×１０5細胞／ウェルになるよう添加し、５％  ＣＯ2中３７℃で１６時間培養を行った。該細胞培養液に２μｇのｐＬＸＮＳ−Ｃ０７８３ＦＬＡＧおよび３μｌのＦｕｇｅｎｅ（ロシュダイアグノスティックス社製）を添加し、５％  ＣＯ2中３７℃で２４時間培養を行った。その後、培地を交換し、さらに５％  ＣＯ2中３７℃で２４時間培養を行った。
Ｃ０７８３の発現はＬａｅｍｌｉの方法に従いウェスタンブロット法で解析を行った。
形質転換ＨＥＫ２９３細胞の培養上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイロン膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識（シグマアルドリッチ社製）を添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で１時間静置した後、該ナイロン膜を洗浄液で１０分間の洗浄を３回行った。該ナイロン膜とＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜およびＸ線フィルムＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（コダック社製）をＸ−オマット  カセッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。形質転換していないＨＥＫ２９３細胞の培養上清を同様に処理したものを対照区とした。
その結果、予想される８５Ｋｄの大きさにシグナルが検出され、Ｃ０７８３が培養上清に分泌されるタンパク質であることが確認された。
実施例７
Ｃ０７８３のバキュロウイルスでの発現
バキュロウイルスでの発現にはＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作を行った。
実施例６で作製したＣ末端に３×ＦＬＡＧ付加したＣ０７８３をコードするｃＤＮＡ断片を、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＦａｓｔＢａｃ１のＸｈｏ  Ｉに挿入し、ｐＦａｓｔＢａｃ−Ｃ０７８３ＦＬＡＧを構築した。該組換えプラスミドをＭａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ１０Ｂａｃ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓに導入し、バキュロウイルスゲノム（ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡ）へ転移することにより組換えｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを構築した。該組換えｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡをＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＳｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）細胞に導入し、組換えバキュロウイルスを得た。該バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞培養液２ｍｌを１×１０6個／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞培養液５０ｍｌに添加し、２８℃で４０時間培養を行った。該細胞培養液を遠心分離し上清画分に組換えＣ０７８３ＦＬＡＧを得た。
Ｃ０７８３ＦＬＡＧの発現は実施例６と同様にウェスタンブロット法により確認した。
培養上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイロン膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識（シグマアルドリッチ社製）を添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で１時間静置した後、該ナイロン膜を洗浄液で１０分間の洗浄を３回行った。該ナイロン膜とＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜およびＸ線フィルムＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（コダック社製）をＸ−オマット  カセッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。組換えウイルス非感染Ｓｆ９細胞の培養上清を同様に処理したものを対照区とした。
その結果、予想される８５Ｋｄの大きさにシグナルが検出され、Ｃ０７８３が培養上清に分泌されるタンパク質であることが確認された。
実施例８
Ｃ０７８３とＢＭＰの結合
実施例７で調製したバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞培養液２ｍｌを１×１０6個／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞培養液５０ｍｌに添加し、２８℃で４０時間培養を行った後、該細胞培養液を遠心分離し得られた上清画分１ｍｌに抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースアフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社製）３０μｌを添加し、室温で１時間振とう反応を行った。組換えウイルス非感染Ｓｆ９培養上清１ｍｌにＮ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＦＬＡＧ−ＢＡＰ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（シグマアルドリッチ社製）１μｇを加えたものを対照区、また、組換えウイルス非感染Ｓｆ９培養上清１ｍｌをネガティブな対照区として同様に処理して用いた。反応後の各アガロースゲル溶液を３等分し、ＢＭＰ結合試験を行った。
１つ目の各ゲル画分に１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡを含む生理食塩水１ｍｌにｈｕｍａｎ  ＢＭＰ−２（サワデーテクノロジー社製）０．１μｇを溶解したＢＭＰ−２溶液を、２つ目の各ゲル画分に１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡを含む生理食塩水１  ｍｌにｈｕｍａｎ  ＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）０．１μｇを溶解したＢＭＰ−４溶液を、３つ目の各ゲル画分に１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡを含む生理食塩水１ｍｌのみを添加し、室温で１時間振とう反応を行った後、該アガロースゲルを生理食塩水１ｍｌにて６回洗浄を行った。各種ＢＭＰとの結合性はウェスタンブロット法により解析を行った。
ＢＭＰ−２を処理した各アガロースゲルをＳＤＳで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイロン膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、抗ＢＭＰ−２ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４；５％（ｖ／ｖ）  スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で１時間静置した後、該ナイロン膜を洗浄液で１０分間の洗浄を３回行った。洗浄後のナイロン膜を、ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液中に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、該ナイロン膜を洗浄液で１０分間の洗浄を３回行った。該ナイロン膜とＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜およびＸ線フィルムＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（コダック社製）をＸ−オマット  カセッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。
ＢＭＰ−４を処理した各アガロースゲルについても同様に処理を行ってナイロン膜を調製し、抗ＢＭＰ−４マウスモノクローナル抗体であるａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ−４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用いてＢＭＰ−４との結合性を調べた。
その結果、Ｃ０７８３がＢＭＰ４およびＢＭＰ２と結合性を有するタンパク質であることが確認された。
実施例９
Ｃ０７８３の骨分化阻害活性
実施例７においてＣ０７８３とＢＭＰが直接結合することが示されたので、Ｃ０７８３の骨分化への作用を検討した。検討にはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、レチノイン酸およびＣ０７８３を用い、細胞の骨分化を定量するために骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの酵素活性を測定した。
マウス胎児細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２  ｃｌｏｎｅ８細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２６）を１０％  ＦＣＳを含むＭｉｎｉｍｕｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）  ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（１×）  ｌｉｑｕｉｄ（インビトロジェン社製）を用いて培養し、２４ウェルディッシュ（コーニング社製）に４Ｘ１０4細胞／ウェルになるよう分注した後、３７℃で１６時間培養を行った。該細胞培養液の培地を５％  ＦＣＳを含むＭｉｎｉｍｕｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）  ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（１×）  ｌｉｑｕｉｄ（インビトロジェン社製）に交換し、さらに３７℃で６時間培養を行った。
対照区は無添加、試験区はＣ０７８３、レチノイン酸、レチノイン酸＋Ｃ０７８３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２＋Ｃ０７８３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−４＋Ｃ０７８３で各種被験物質を組合わせ、最終濃度でＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は４００ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は２００ｎｇ／ｍｌ、レチノイン酸（シグマアルドリッチ社製）は１０-8ＭおよびＣ０７８３は８００ｎｇ／ｍｌになるよう細胞培養液に添加し、３７℃で３日間培養を行った。該細胞培養液の培地を、同濃度同被験物質を含むＭｉｎｉｍｕｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）  ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（１×）  ｌｉｑｕｉｄに交換し、さらに３７℃で３日間培養を行った。
上記細胞培養液から培地を除去した後、破砕溶液（２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２％  ＮＰ−４０（Ｖｉｓｙｓ社製））２００μｌおよびＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）より添付のマニュアルに従って調製したアルカリフォスファターゼ基質溶液２００μｌを添加し、３７℃で３０分間反応を行った。該反応液に、反応停止液（０．４Ｎ  ＮａＯＨ）を４００μｌ添加し、４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー  Ｅｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
その結果、Ｃ０７８３を添加することにより、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４による骨芽細胞への分化誘導活性の阻害が確認された（図５）。
産業上の利用の可能性
本発明により、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌細胞等の消癌細胞の癌マーカーおよび治療薬、関節リュウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの骨疾患マーカーおよび治療薬であるコルジン様新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫学的検出法、該抗体を含む癌診断用キット、該ポリペプチドのｍＲＮＡの定量法、該ポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング法、該ポリペプチドとリガンドとの結合性を変化させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドとＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４との結合性を変化させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの発現を変動させる物質のスクリーニング法、ノックアウト動物、トランスジェニック動物、本発明の抗体、リガンド、リガンドとの結合性を変化させる物質、または発現を変動させる物質を含有する医薬が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｃ０７８３ポリペプチドの構造を表した模式図である。
アミノ配列の第−３０位から第−１位が、予想されるシグナルペプチド領域（ＳＰ；Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、第２０位から第３２７位が、Ｃｈｏｒｄｉｎのシステインリッチ領域（ＣＲ；Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）と類似性を有する５つの領域で、アミノ末端側から順にＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４およびＣＲ５で表しており、第３３１位から第６５５位が、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子と類似する領域（ｖＷＦ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ；ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子様領域）を示している。
第２図は、各種癌組織およびそれに対応する正常組織におけるＣ０７８３ポリペプチドｍＲＮＡの発現量を表している。
脳、耳下腺、甲状腺、肺、食道、胃、小腸、十二指腸、直腸、結腸、腎臓、副腎、胆嚢、リンパ節、精巣、前立腺、膀胱、尿管における癌細胞およびそれに対応する正常細胞におけるノーザンブロット解析を行い、正常細胞でのＣ０７８３ポリペプチドｍＲＮＡの発現量を１とした相対的な発現量で示している。
第３図は、骨分化誘導時におけるＣ０７８３ポリペプチドｍＲＮＡの発現量の変動を表している。
骨分化誘導活性を有するＩＬ−１βおよびＦＧＦ−２、軟骨細胞分化誘導活性を有するＩＧＦ−Ｉを処理したヒト間葉系幹細胞のノーザンブロット解析を行い、対照区（無処理区）でのＣ０７８３ポリペプチドｍＲＮＡの発現量を１とした相対的な発現量で示している。
第４図は、Ｃ０７８３欠損型ポリペプチドの構造を表した模式図である。
Ｃ０７８３欠損型ポリペプチドは６２７個のアミノ酸よりなる分泌蛋白質である。第１図のＣ０７８３ポリペプチドの３１５位から３７２位の５８個のアミノ酸残基が欠損しており、Ｃ０７８３ポリペプチドの機能上重要と考えられる５番目のシステインリッチ領域ＣＲ５（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍｅｉｎ５）およびｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子様領域の一部が欠損している。
第５図は、Ｃ０７８３の骨分化誘導活性（アルカリフォスファターゼ活性）を表している。
骨分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を指標とし、Ｃ０７８３とＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびレチノイン酸（ＲＡ）を処理した場合の骨分化誘導活性を示している。対照区（無処理）でのアルカリフォスファターゼ活性を１とした相対的な活性で示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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