(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌の菌株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを培養液から採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法であって、
前記菌株は、前記菌株細胞内のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、または前記菌株細胞内のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーターを改変することによって細胞中のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性が増幅された菌株であることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。
【請求項２】
グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である請求項１記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項３】
グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子がコリネバクテリウム属細菌由来である請求項１記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項４】
コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、配列番号７に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５６５〜６６１４からなる塩基配列を有する請求項３記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
背景技術
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
Ｌ−グルタミン酸は微生物菌体内でクエン酸回路の中間生成物であるα−ケトグルタル酸から生合成されるが、アンモニウムイオンを同化してα−ケトグルタル酸からＬ−グルタミン酸を生成する生合成経路は２つ存在する。一つは、高濃度のアンモニウムイオン存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）の触媒作用により合成される経路であり、もう一つは、Ｌ−グルタミン酸とアンモニウムイオンからグルタミンへの反応を触媒するグルタミンシンテターゼ（以下「ＧＳ」と略す）およびＧＳによって生成したグルタミン１分子とα−ケトグルタル酸１分子から２分子のＬ−グルタミン酸を生成する反応を触媒するグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸シンターゼとも呼ばれる。以下「ＧＯＧＡＴ」と略す）によって合成される経路（ＧＳ／ＧＯＧＡＴ経路）である。これまでＧＤＨ活性の増強によりＧＤＨ経路を強化した菌株によるＬ−グルタミン酸生産は報告されているが、ＧＳ／ＧＯＧＡＴ経路を強化した菌株によるＬ−グルタミン酸生産は知られていなかった。
発明の開示
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
本発明者らは、ＧＳ／ＧＯＧＡＴ経路にかかわる酵素のうちＬ−グルタミン酸生成を触媒するＧＯＧＡＴを強化した菌株によるＬ−グルタミン酸の製造法についての研究を行った結果、コリネバクテリウム属細菌に属し、ＧＯＧＡＴ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株が高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、コリネバクテリウム属細菌に属し、細胞中のＧＯＧＡＴ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を提供するものである。前記グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性は、細胞内のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって増幅することができる。また、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ活性は、該酵素をコードする遺伝子の発現調節配列の改変によっても増幅することができる。グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼとしては、例えばエシェリヒア属細菌又はコリネバクテリウム属細菌由来のものが挙げられる。
本発明はまた、コリネバクテリウム属細菌由来のグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であって、配列番号７に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５６５〜６６１４からなる塩基配列を有することを特徴とする遺伝子を提供する。
また、本発明は、コリネバクテリウム属細菌に属し、ＧＯＧＡＴ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを培養液から採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌
本発明にいうコリネバクテリウム属細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））を含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。このようなコリネバクテリウム属細菌のうち、以下に述べるようなＬ−グルタミン酸生産性細菌として知られているものが本発明においては、最も好ましいものである。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
具体的には、下記の菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム        ＡＴＣＣ  １３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム          ＡＴＣＣ  １５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ                    ＡＴＣＣ  １５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム                ＡＴＣＣ  １３０３２
コリネバクテリウム・グルタミカム                ＡＴＣＣ  １３０６０
ブレビバクテリウム・ディバリカタム              ＡＴＣＣ  １４０２０
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム        ＡＴＣＣ  １３８６９
コリネバクテリウム・リリウム                    ＡＴＣＣ  １５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ                ＡＴＣＣ  １７９６５
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム          ＡＴＣＣ  １４０６６
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム          ＡＴＣＣ  １４０６８
ブレビバクテリウム・ロゼウム                    ＡＴＣＣ  １３８２５
ブレビバクテリウム・フラバム                    ＡＴＣＣ  １３８２６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス              ＡＴＣＣ  １９２４０
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
上記のコリネバクテリウム属細菌を用いてＬ−グルタミン酸を生産するには次のいずれかの手段が有効である。
１．培地中のビオチン濃度を最適以下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）にする。
奥村真二、都河竜一郎、角田俊直、北井淳夫：日本農芸化学会誌，３６，１９７−２０３（１９６２）参照。
２．ビオチンが十分量存在する条件で培地に界面活性剤を添加する。
Ｉ．Ｓｈｉｉｏ，Ｈ．Ｏｔｓｕｋａ，Ｎ．Ａｔｓｕｙａ：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，３３３−３４０（１９６３）及びＫ．Ｔａｋｉｎａｍｉ，Ｈ，Ｏｋａｄａ，Ｔ．Ｔｓｕｎｏｄａ：Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７，８５３−８６３（１９６３）参照。
３．ビオチンが十分量存在する条件で培地にペニシリンを添加する。
米国特許第３，０８０，２９７号、特公昭３７−１６９５号及び渋川満、栗間理夫、岡部節三、大沢岳義：Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，１７，６１−６５（１９６８）参照。
または、上記のコリネバクテリウム属細菌から誘導された変異株を用いる方法によってもＬ−グルタミン酸を生産することが可能である。このような変異株としては、例えば、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１２４７５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２２、米国特許第５，２７２，０６７号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＪ１２４７６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２３、米国特許第５，２７２，０６７号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１２４７７（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２４、米国特許第５，２７２，０６７号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１２４７８（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２５、米国特許第５，２７２，０６７号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ２１４９２
等がある。
本発明では、上記に記載したようなＬ−グルタミン酸生産性菌株を用いることにことが最も好ましいものである。
（２）ＧＯＧＡＴ活性の増幅
細菌細胞中のＧＯＧＡＴ活性を増幅するには、ＧＯＧＡＴをコードする遺伝子断片を、コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをコリネバクテリウム属細菌に属し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。ＧＯＧＡＴは、大サブユニットと小サブユニットからなるヘテロオリゴマーであり、それぞれｇｌｔＢ遺伝子およびｇｌｔＤ遺伝子にコードされている。形質転換株の細胞内のＧＯＧＡＴをコードする遺伝子（以下、「ｇｌｔＢＤ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇する結果、ＧＯＧＡＴ活性が増幅される。
ｇｌｔＢＤ遺伝子は、コリネバクテリウム属細菌の遺伝子を用いることも、エシェリヒア・コリ等の他の生物由来の遺伝子を用いることも可能である。コリネバクテリウム属細菌のｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列は明らかではなかったが、エシェリヒア・コリＫ−１２（Ｇｅｎｅ、第６０巻、１〜１１頁、１９８７年）及び酵母（サッカロマイセス・セレビシエ、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８９２２１）のｇｌｔＢＤ遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから、これらのｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により、これらの微生物のｇｌｔＢＤ遺伝子を取得することが可能である。このようなプライマーとして、配列表配列番号３〜６に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。後記実施例で単離されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列を配列表配列番号７に示す。このブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのｇｌｔＢＤ遺伝子は、新規な遺伝子である。
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターとは、例えばコリネバクテリウム属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
ｐＡＭ  ３３０      特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ  １５１９    特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ  ６５５      特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ  ６１１              同      上
ｐＡＪ  １８４４            同      上
ｐＣＧ  １          特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ  ２          特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ  ４          特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ  １１                同      上
ＧＯＧＡＴをコードするｇｌｔＢＤ遺伝子とコリネバクテリウム属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ｇｌｔＢＤ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である
上記のように調製した組み換えＤＮＡをコリネバクテリウム属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
ＧＯＧＡＴ活性の増幅は、ｇｌｔＢＤ遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネバクテリウム属細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＢＤ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインパーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｇｌｔＢＤ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のｇｌｔＢＤ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＧＯＧＡＴ活性が増幅される。
ＧＯＧＡＴ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、ｇｌｔＢＤ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ｇｌｔＢＤ遺伝子の発現が強化されることによってＧＯＧＡＴ活性が増幅される。
（３）本発明の菌株を用いたＬ−グルタミン酸の生産
コリネバクテリウム属細菌に属し、ＧＯＧＡＴ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を用いてＬ−グルタミン酸を生産させるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを５〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間〜４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
（１）エシェリヒア・コリＫ−１２のｇｌｔＢＤ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２のｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Ｇｅｎｅ、第６０巻、１〜１１頁、１９８７年）。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２由来ＪＭ１０９株（宝酒造社製）の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｇｌｔＢＤ遺伝子を増幅した。
合成したプライマーの内、配列番号１は、Ｇｅｎｅ、第６０巻、６頁、１９８７年に記載されているｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列図の５７番目から９６番目の塩基に至る配列に相当するが、７７番目と７８番目の塩基ＡをＧに変更し、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を挿入している。配列番号２は、Ｇｅｎｅ、第６０巻、７頁、１９８７年に記載されているｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列図の６２６１番目から６２９０番目の塩基に至る配列に相当するが、６３８０番目の塩基ＴをＧに、６２８２番目の塩基ＡをＴに、６２８４番目のＡをＣに変更し、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を挿入した。尚、配列番号２に記載した塩基配列は、Ｇｅｎｅ、第６０巻、７頁、１９８７年に示された塩基配列図の６２６１番目から６２９０番目に至る塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。
エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体ＤＮＡの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件を用いた。
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素ＢａｍＨＩを反応させ、ＢａｍＨＩで切断したｐＭＷ２１９（ニッポンジーン製）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いで連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されているｇｌｔＢＤ遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをｐＭＷＧＯＧＡＴ３５と名づけた。
さらにｇｌｔＢＤ遺伝子が発現していることを確認するため、ｐＭＷＧＯＧＡＴ３５をｇｄｈとｇｌｔＢの欠損株でＬ−グルタミン酸要求性を示すエシェリヒア・コリＰＡ３４０株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．））にエレクトロポレーション法により導入したところ、ｐＭＷＧＯＧＡＴ３５を導入した形質転換株は、Ｌ−グルタミン酸要求性を示さなくなったことから、ｇｌｔＢＤ遺伝子が発現していることを確認した。
（２）エシェリヒア・コリＫ−１２株のｇｌｔＢＤ遺伝子およびコリネバクテリウム属細菌の複製起点を有するプラスミドの作成
エシェリヒア・コリＫ−１２株のｇｌｔＢＤ遺伝子およびコリネバクテリウム属細菌の複製起点を有するプラスミドｐＢＤ３５−４３の構築過程を図１に示した。具体的には、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））由来の複製起点（特開平５−７４９１号）を持つプラスミドｐＨＫ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）を用い平滑末端化した後、ＸｂａＩリンカー（宝酒造社製）を用いて、クローニングしたエシェリヒア・コリＫ−１２株のｇｌｔＢＤ遺伝子を挿入したブラスミドｐＭＷＧＯＧＡＴ３５のＸｂａＩサイトに挿入した。本プラスミドをｐＢＤ３５−４３と名付けた。（３）コリネバクテリウム属細菌野生型株ＡＪ１２０３６及びＡＪ１３０２９へのｐＢＤ３５−４３の導入と培養評価
コリネバクテリウム属細菌野生型株ＡＪ１２０３６（Ａｇｒｊｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，９３−１００（１９８７））及びＡＪ１３０２９を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐＢＤ３５−４３で形質転換し、形質転換株を得た。野生型株のＡＪ１２０３６にプラスミドｐＢＤ３５−４３を導入して得られた形質転換株ＡＪ１２０３６／ｐＢＤ３５−４３は、ビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１２０３６／ｐＢＤ３５−４３株の菌体を、グルコース  ８０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ３  ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、ビオチンおよびカナマイシンを添加していないこと以外は同じ組成の培地（以下、「ビオチン制限培地」という）に５％量接種し、３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてＡＪ１２０３６株を上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表１に示した。
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また、ＡＪ１３０２９にプラスミドｐＢＤ３５−４３を導入して得られた形質転換株ＡＪ１３０２９／ｐＢＤ３５−４３を用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１３０２９／ｐＢＤ３５−４３株の菌体を、グルコース  ３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ３  ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてＡＪ１２０２９株を上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。なお、ＡＪ１２０２９株はＷＯ９６／０６１８０に記載される、ビオチン活性抑制物質への温度感受性を示す株である。同株は１９９５年８月１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づいて寄託された。同株の受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−５１８９である。
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以上の結果から、ｇｌｔＢＤ遺伝子の導入してＧＯＧＡＴ活性を増強したコリネバクテリウム属細菌に属するＬ−グルタミン酸生産菌は、Ｌ−グルタミン酸収率が向上することが判明した。
実施例２
（１）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム属細菌を用いてグルタミン酸を製造するにあたり、ｇｌｔＢＤ遺伝子を増幅する際に、そのｇｌｔＢＤ遺伝子はコリネバクテリウム属細菌由来であることが好ましい。
大腸菌と酵母のｇｌｔＢ遺伝子産物間でアミノ酸配列の相同性の高い領域を選び、その配列から塩基配列を推定し、配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを合成した。一方、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄ  Ｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．４キロベースのＤＮＡ断片が増幅されていることが判明した。
得られたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを用いて両端の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＳａｎｇｅｒの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３，１６１（１９８０））に従って行った。決定された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して、大腸菌と酵母のｇｌｔＢ遺伝子から予想されるアミノ酸配列と比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢ遺伝子の一部であると判断した。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブとし、上記の方法で調製したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを定法によりＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断した断片について、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩで切断された約１４キロベースの切断断片がプローブＤＮＡとハイブリダイズすることが判明した。
そこで、定法により調製したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ断片をアガロース電気泳動し、約１０キロベース以上のＤＮＡ断片をガラスパウダーを用いて回収し、回収されたＤＮＡ断片と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で切断したベクターｐＭＷ２１９（ニッポンジーン製）はライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行った。形質転換株をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、約１，０００個の形質転換体を得た。
得られた形質転換体は、アルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した。プローブとして用いたＤＮＡ配列の中で塩基配列が決定している部分をもとに作製した配列番号５および配列番号６に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記プラスミドを鋳型として上記の条件でＰＣＲを行い、このプライマーを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型としてＰＣＲを行った時に増幅されるＤＮＡ断片と同じ約１．３キロベースの大きさの増幅断片が得られるプラスミドを保持する形質転換体を選択した。
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９  ｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列の決定
上記（１）により得られた形質転換体からアルカリ法により調製したプラスミドＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９染色体由来の約１４キロベースのＤＮＡ断片を含んでいた。上記の方法と同様にして、得られたプラスミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９染色体由来の約１４キロベースのＤＮＡ断片に含まれるｇｌｔＢＤ遺伝子の塩基配列決定を行った。
こうして決定された塩基配列のうち、ｇｌｔＢＤ遺伝子を含むＡａｔＩＩ断片の塩基配列を、配列表配列番号７に示す。この塩基配列から、２つのオープン・リーディング・フレームが推定された。これらの塩基配列により推定される翻訳産物のアミノ酸配列も配列表配列番号７に示した。すなわち、配列表配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる２つのタンパク質をコードする遺伝子が、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子である。このうち、塩基番号５６５〜５０９４がｇｌｔＢ遺伝子で、５０９７〜６６１４がｇｌｔＤ遺伝子である。ｇｌｔＢ遺伝子及びｇｌｔＤ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ順に配列番号８及び配列番号９に示す。なお、タンパク質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるＡＴＧに由来するため、タンパク質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られており、上記タンパク質の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号７に示されるＤＮＡは、すでに報告されている大腸菌および酵母等のｇｌｔＢＤ遺伝子と相同性を持つコリネバクテリウム属細菌では新規な遺伝子であることが判明した。
（３）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子およびコリネバクテリウム属細菌の複製起点を有するプラスミドの作成
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子の増幅効果を調べるために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子およびコリネバクテリウム属細菌の複製起点を有するプラスミドの構築を行った。具体的には、（１）により得られた形質転換体からアルカリ法により調製したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９染色体由来の約１４キロベースのＤＮＡ断片含むプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡａｔＩＩで切断し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し、取得された断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）を用い平滑末端化した後、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドｐＡＭ３３０由来の複製起点（特開昭５８−６７６９９号）を持つプラスミドｐＶＣ７の制限酵素ＳｍａＩサイトに挿入した。本プラスミドをｐＶＣＧＯＧＡＴと名付けた。尚、ｐＶＣ７は、以下のようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ用ベクターであるｐＨＳＧ３９９（Ｃｍｒ；Ｔａｋｅｓ  ｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６１，６３−７４，（１９８７）参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるｐＡＭ３３０を結合することによって構築した。ｐＡＭ３３０は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９から調製した。ｐＨＳＧ３９９を一箇所切断酵素であるＡｖａＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したｐＡＭ３３０と接続した。ｐＶＫ７は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、ｐＨＳＧ３９９由来のマルチプルクローニングサイトとｌａｃＺ’を保持している。
さらにｇｌｔＢＤ遺伝子が発現していることを確認するため、ｐＶＣＧＯＧＡＴをｇｄｈとｇｌｔＢの欠損株でＬ−グルタミン酸要求性を示すエシェリヒア・コリＰＡ３４０株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．））にエレクトロポレーション法により導入したところ、ｐＶＣＧＯＧＡＴを導入した形質転換株は、Ｌ−グルタミン酸要求性を示さなくなったことから、ｇｌｔＢＤ遺伝子が発現していることを確認した。
（４）コリネバクテリウム属細菌野生型株ＡＪ１２０３６へのｐＶＣＧＯＧＡＴの導入と培養評価
コリネバクテリウム属細菌野生型株ＡＪ１２０３６（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，９３−１００（１９８７））を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドｐＶＣＧＯＧＡＴで形質転換し、形質転換株を得た。野生型株のＡＪ１２０３６にプラスミドｐＶＣＧＯＧＡＴを導入して得られた形質転換株ＡＪ１２０３６／ｐＶＣＧＯＧＡＴは、ビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たＡＪ１２０３６／ｐＶＣＧＯＧＡＴ株の菌体を、グルコース  ８０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、クロラムフェニコール１０ｍｇ及びＣａＣＯ３  ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、ビオチンおよびクロラムフェニコールを添加していないこと以外は同じ組成の培地（以下、「ビオチン制限培地」という）に５％量接種し、３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてＡＪ１２０３６株にｐＶＣ７を上記の方法で導入した菌株を、上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３に示した。
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産業上の利用の可能性
本発明の方法により、コリネバクテリウム属細菌に属し、ＧＯＧＡＴ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることができ、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造することができる。さらに、コリネバクテリウム属細菌由来のｇｌｔＢＤ遺伝子が得られ、該遺伝子はコリネバクテリウム属細菌によるグルタミン酸の製造に用いることが可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＢＤ３５−４３の構築過程を示す図である。
【図１】
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