(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的系における還元プロセスを促進する方法であって、
（ａ）陰極を備える陰極区画および陽極を備える陽極区画を有してなり、陰極および陽極区画はカチオン選択性膜により分離されており、陰極および陽極は導電性材料により電力供給源に接続されている電気化学的バイオリアクター系を提供する工程、および
（ｂ）ニュートラルレッドを１〜１０００μＭの濃度で含んでなる陰極液および生物学的触媒を陰極区画内に配する工程
を含んでなり、該ニュートラルレッドの少なくとも一部が還元され、前記生物学的触媒として、アクチノバチルスコハク酸生成細菌およびメタン生成古細菌からなる群より選択される細胞を用いる方法。
【請求項２】
生物学的系における還元プロセスを促進する方法であって、
（ａ）陰極を備える陰極区画および陽極を備える陽極区画を有してなり、陰極および陽極区画はカチオン選択性膜により分離されており、陰極および陽極は導電性材料により電力供給源に接続されている電気化学的バイオリアクター系を提供する工程、および
（ｂ）ニュートラルレッドを１〜１０００μＭの濃度で含んでなる陰極液および生物学的触媒を陰極区画内に配する工程
を含んでなり、該ニュートラルレッドの少なくとも一部が還元され、前記生物学的触媒として、細胞を用い、該細胞がメタン生成古細菌である方法。
【請求項３】
生物学的系における還元プロセスを促進する方法であって、
（ａ）陰極を備える陰極区画および陽極を備える陽極区画を有してなり、陰極および陽極区画はカチオン選択性膜により分離されており、陰極および陽極は導電性材料により電力供給源に接続されている電気化学的バイオリアクター系を提供する工程、および
（ｂ）ニュートラルレッドを１〜１０００μＭの濃度で含んでなる陰極液および生物学的触媒を陰極区画内に配する工程
を含んでなり、該ニュートラルレッドの少なくとも一部が還元され、前記生物学的触媒として、細胞を用い、該細胞がＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓである、前記細菌がフマル酸エステルを還元してコハク酸エステルを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、いずれも１９９９年７月９日に出願された米国仮特許出願番号６０／０９２，１９０および６０／０９２，１９１への優先権を主張するものであり、それらをここで参照して本明細書の記載の一部とする。
【０００２】
連邦政府により援助された研究開発に関する陳述
本発明は、合衆国エネルギー省認可ＤＥ−ＦＧ０２−９３ＥＲ２０１０８により合衆国政府の支持を受けて成された。合衆国は本発明において所定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の背景
多くの商業的および工業的に重要な産物の製造において、微生物発酵および生体内転換反応が使用されることが増加してきている。廃物の微生物的発酵を通して、別のエネルギー源を開発することへの興味も増している。これらのプロセスの経済的可能性は、発酵または生体内転換反応の効率の最大限化に依存する。
【０００４】
細菌種は、成長および代謝のために、光および様々な有機および無機化学物質を含む種々のエネルギー源を利用することができる。これらのエネルギー源が用いられて電気化学的グラジエントが発生し、そのグラジエントが、代謝のための電子供与体を提供すると共に、膜電位およびプロトン駆動力を維持させる。生体系内のエネルギー系は、電子が基質から最終的電子受容体に運ばれ、その基質は電子によって酸化されて、電子受容体は電子によって還元される電子伝達プロセスにより駆動される。
【０００５】
微生物代謝において、電子の駆動力から生じるエネルギーは、初期電子供与体（第１の生化学的脱水素反応）と最終的電子受容体（例えば、最終的生化学的水素化反応）との間の電位エネルギー差（ΔＥ０’）に正比例する。
【０００６】
特定の微生物（例えば、エセリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびアクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ））は、無気呼吸プロセスにおいてフマル酸エステルをコハク酸エステルに還元するためにＨ２を電子供与体として用いて成長ことができる。これらの細菌は、［２Ｈ＋／Ｈ２］および［フマル酸エステル／コハク酸エステル］の連結された酸化還元半反応間のＥ０’差異により生じる電子駆動力から、遊離エネルギーおよび還元力を得る。
【０００７】
メタン生成古細菌は、Ｈ２またはＨＣＯＯＨ酸化を、メタンへのＣＯ２還元に結び付け得る厳格な嫌気性古細菌である。メタン生成は、［２Ｈ＋／Ｈ２］および［ＣＯ２／ＣＨ４］の半酸化還元反応間のＥ０’差異が比較的小さいので、他の無気呼吸プロセス（例えば、フマル酸エステル、硝酸エステルまたは硫酸エステル還元）よりもエネルギー生成が少ない。
【０００８】
微生物水素化酵素による水素酸化を、ＮＡＤ＋、シトクローム類およびキノン類を含む種々の生物学的電子キャリアの還元に、またはメチル−ビオロゲンおよびニュートラルレッド（ＮＲ）のような特定の人工酸化還元染料に結び付けることができる（アノウス（Ａｎｎｏｕｓ）ら著、１９９６年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５巻：８０４〜８１０頁、キム（Ｋｉｍ）ら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２４８〜２５４頁）。代謝物質パターンおよびＨ２生成に対する、電気化学的還元系を用いるまたは用いない、酸化還元染料の効果が、グルタミン酸エステル（ホンゴ（Ｈｏｎｇｏ）ら著、１９７９年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３巻：２０８３〜２９８６頁）、ブタノール（ギルバール（Ｇｉｒｂａｌ）ら著、１９９５年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６巻：１５１〜１６２頁、およびキムら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２６８〜２７２頁）、および酪酸エステル（シェン（Ｓｈｅｎ）ら著、１９６年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５巻：３５５〜３６２頁）の発酵を含む複数の微生物プロセスにおいて試験されている。
【０００９】
水素化酵素またはフマル酸還元酵素のような、細菌代謝に含まれる酸化還元酵素の特定の活性を、その生体内電子キャリア（例えばＮＡＤまたはメナンキノン）を用いて、または人工的酸化還元染料（例えば、ベンジルビオロゲン）を用いて測定することができる（セッキーニ（Ｃｅｃｃｈｉｎｉ）ら著、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３巻：８８９８〜８９０２頁、ディキー（Ｄｉｃｋｉｅ）ら著、１９７９年、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７巻：８１３〜８２１頁、ケムナー（Ｋｅｍｎｅｒ）ら著、１９９４年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６１巻：４７〜５４頁、ペトロブ（Ｐｅｔｒｏｖ）ら著、１９８９年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ．２６８巻：３０６〜３１３頁、およびビッセンバッハ（Ｗｉｓｓｅｎｂａｃｈ）ら著、１９９０年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５４巻：６０〜６６頁）。主要代謝最終産物としてコハク酸を生成する細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよび他の種）は、メナキノンのフマル酸エステル依存酸化を触媒するフマル酸還元酵素（ＦＲＤ）を有する。この反応は、成長および代謝機能を支持するために生物により用いられる膜内外プロトングラジエントの発生に連結される（コルトナー（Ｋｏｒｔｎｅｒ）ら著、１９９２年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４巻：８５５〜８６０頁およびビッセンバッハら著、１９９２年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８巻：６８〜７３頁）。大腸菌のフマル酸還元酵素は、４つの非同一サブユニット：ＦＲＤＡ、ＦＲＤＢ、ＦＲＤＣおよびＦＲＤＤからなる。サブユニットは２つのドメインに分類される：（ｉ）それはＦＲＤＡＢ触媒ドメインとＦＲＤＣＤ膜アンカードメインとであり、メナキノンを含む電子伝達およびプロトン転移反応に必須である（セッキーニら著、１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻：４５８７〜４５９２頁、ディキーら著、１９７９年、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７巻：８１３〜８２１頁、およびウエスタンベルグ（Ｗｅｓｔｅｎｂｅｒｇ）ら著、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５巻：１９５６０〜１９５６７頁）。サブユニットＦＲＤＡおよびＦＲＤＢは、可溶化膜製剤において触媒活性を維持する。
【００１０】
酸化還元染料を用いる電気化学的技術は、生物学的系の酸化−還元特性の検査に有用であり、生物学的エネルギー代謝についての情報を提供する（モレノ（Ｍｏｒｅｎｏ）ら著、１９９３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２巻：７９〜８６頁およびスチェタ（Ｓｕｃｈｅｔａ）ら著、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２巻：５４５５〜５４６５頁）。生物電気化学的系において有用な酸化還元染料は、電極と生物学的電子キャリアとの両方と容易に反応しなくてはならない。多くの生物学的電子キャリア、例えばＮＡＤ（ミヤワキ（Ｍｉｙａｗａｋｉら著、１９９２年、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：４７４〜４７８頁およびスルヤ（Ｓｕｒｙａ）ら著、１９９４年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．３３巻：７１〜７３頁）、ｃ−型シトクローム類（キシー（Ｘｉｅ）ら著、１９９２年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２９巻：７１〜７９頁）、キノン（サンチェズ（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら著、１９９５年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．３６巻：６７〜７１頁）、および酸化還元酵素、例えば、亜硝酸還元酵素（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら著、１９８７年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２６巻：１７３〜１７９頁）、硝酸還元酵素（ウィルナー（Ｗｉｌｌｎｅｒ）ら著、１９９２年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２９巻：２９〜４５頁）、フマル酸還元酵素（スチェタら著、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２巻：５４５５〜５４６５頁）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ミヤワキら著、１９９２年、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：４７４〜４７８頁）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ還元酵素（キムら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２７７１〜２７７６頁）および水素化酵素（シュレレス（Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ）ら著、１９９２年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２８巻：４７３〜４８２頁）が、酸化還元染料と電気化学的に反応する。
【００１１】
メチルビオロゲン（ＭＶ）（キムら著、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０巻：１２３〜１２８頁、ペキン（Ｐｅｑｕｉｎ）ら著、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６巻：２６９〜２７４頁、およびホワイトら著、１９８７年、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４３巻、１７３〜１７６頁）、ベンジルビオロゲン（エムデ（Ｅｍｄｅ）ら著、１９９０年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６巻：２７７１〜２７７６頁）、およびニュートラルレッド（ＮＲ）（ギルバールら著、１９９５年、ＦＥＭＳ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６巻：１５１〜１６２頁およびキムら著、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９巻：２１３〜２２０頁）のような、ＮＡＤの電位よりも低い酸化還元電位を有する特定の酸化還元染料が、生体内（インビボ）での生物学的酸化還元反応の速度の変化に関連付けられた。ホンゴおよびイワハラ（Ｉｗａｈａｒａ）（ホンゴら著、１９７９年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３Ａ：２０７５〜２０８１頁およびホンゴら著、１９７９年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３Ｂ：２０８３〜２０８６頁）は、陰極還元条件下に行われる細菌発酵においてΔＥ０’値が小さい酸化還元染料（例えば、ＭＶ、ベンジルビオロゲンおよびＮＲ）が、Ｌ−グルタミン酸エステルの終了の増加（約６％）に関係することを見つけた。ホンゴおよびイワハラの方法において、水から水素を発生させるのに充分に高い水準で電気を流すために白金電極を用いた。従って、ホンゴおよびイワハラの方法における増加した還元力の源は知られておらず、試験された染料が、特徴的な発酵を影響する機構も知られていなかった。アセトンーブタノール発酵へのＮＲの添加は、酸およびＨ２の生成低下、溶媒の生成増加（ギルバールら著、１９９５年、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６巻：１５１〜１６２頁、およびキムら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２７７１〜２７７６頁）、および電気エネルギー発酵条件下にさらに向上された効果に関連する（ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ）ら著、１９８７年、ａｂｓｔｒ．７９．Ｉｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ．１９４ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）。生体外（インビトロ）および生体内での酸化還元酵素を用いる多くの電気化学的触媒系のために電子媒介物質としてビオロゲン染料が用いられた（ジェームズ（Ｊａｍｅｓ）ら著、１９８８年、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２０巻：２１〜３２頁、キムら著、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０巻：１２３〜１２８頁、モレノら著、１９９３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２巻：７９〜８６頁、シュレレスら著、１９９２年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．２８巻：４７３〜４８２頁、およびホワイトら著、１９８７年、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４３巻、１７３〜１７６頁）。電気的還元力でＴｈｉｏｂａｃｉｌｕｓ ｆｅｒｒｅｏｘｉｄａｎｓを成長させるために還元された鉄を再生させるのに電気化学的系が用いられた（ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら著、１９８２年、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０巻：８１１〜８１６頁）。
【００１２】
外部電気化学的系に生化学的プロセスを結び付けることにより代謝を制御または変化させることが可能となり得る。生化学的系および電気化学的系を連結させることにより、細菌成長、生体内または生体外発酵または生体内転換反応のための電子供給源として電気を用いることができる。
【００１３】
可逆的生化学−電気化学連結により、微生物代謝または酵素触媒エネルギーを電気に変換させることができる。従来の電気化学的技術を用いて微生物エネルギーを電気的エネルギーに直接変換させる生物燃料電池が、記載されている（ローラー（Ｒｏｌｌｅｒ）ら著、１９８４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ：３〜１２頁およびアレン（Ａｌｌｅｎ）ら著、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９〜４０巻：２７〜４０頁）。有機または無機化合物の生物触媒酸化を、陽極と陰極との間の界面におけるオキシダントの化学的還元に結び付けることにより、化学的エネルギーを電気エネルギーに変換させることができる（ウィルナーら著、１９９８年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．４４巻：２０９〜２１４頁）。しかしながら、微生物細胞から電極への直接的電子伝達は、非常に低い効率でしか起こらないことが示された（アレンら著、１９７２年、ジェー．アール．ノリス（Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｒｉｓ）およびディー．ダブリュー．リボンズ（Ｄ．Ｗ．Ｒｉｂｂｏｎｓ）（編）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、６Ｂ巻：２４７〜２８３頁）。
【００１４】
電子伝達効率は、適当な酸化還元媒介物質を用いることにより向上させることができ（ベネット（Ｂｅｎｅｔｔｏ）ら著、１９８５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７巻：６９９〜１０５頁）、研究された微生物燃料電池の大部分が、酸化還元染料チオニンのような電子媒介物質を用いた（サーストン（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ）ら著、１９８５年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１巻：１３９３〜１４０１頁）。微生物燃料電池において、２種類の酸化還元連結が要求される：（１）電子媒介物質の還元の、微生物酸化的代謝への連結；および（２）電子媒介物質の酸化の、陰極表面上の電子受容体の還元への連結（電子受容体が大気酸素により再生される）（アルデリーヌ（Ａｒｄｅｌｅａｎｕ）ら著、１９８３年、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．１１巻：２７３〜２７７頁、およびデアルニー（Ｄｅａｌｎｅｙ）ら著、１９８４年、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ著：１３〜２７頁）。
【００１５】
正常微生物代謝または微生物燃料電池系により生成される遊離エネルギーは、主に、−ΔＧ＝ｎＦΔＥ０（ΔＧは自由エネルギーの変動、ｎは電子モル数、およびＦはファラデー定数（９６，４８７Ｊ／ボルト）の式に従う電子供与体と受容体との間の電位差（ΔＥ０’）により決められる（デアルニーら著、１９８４年、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ巻：１３〜２７頁）。主要電子供与体（ＮＡＤＨ）の代謝的酸化の、最終的電子受容体（例えば、細菌呼吸系における酸素またはフマル酸エステル）の還元への連結は、燃料電池またはバッテリー系における還元剤（電子供与体）の電気化学的半反応の、オキシダント（電子受容体）の半反応への連結に非常に類似している（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、１９８１年、第２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク）。酸化還元電位の低いＮＡＤＨ（Ｅ０’＝−０．３２ボルト）、ＦｄＨ２（Ｅ０’＝−０．４２ボルト）またはＦＡＤＨ２（Ｅ０’＝−０．１９ボルト）のような生物学的還元力供給源は、燃料電池の還元剤として作用することができるが、遊離エネルギー（すなわち、ＡＴＰ）生成に絶対的に必要な膜電位を維持するために非導電性でなくてはならないので、容易に電気に変わらない（ザウアー（Ｔｈａｕｅｒ）ら著、１９９７年、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．４１巻：１００〜１８０頁）。
【００１６】
微生物電子キャリアから電極への電子伝達が起こるためには、電子媒介物質が必要である（フルツ（Ｆｕｌｔｚ）ら、１９８２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１４０巻：１〜１８頁）。アレンら（１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９〜４０巻：２７〜４０頁）は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓまたは大腸菌により代謝的に生成された還元力を、チオニンのような電子媒介物質を用いることにより電気に変換することができる。タナカ（Ｔａｎａｋａ）ら（１９８５年、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５Ｂ巻：１９１〜１９７頁および１９８８年、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２巻：２３５〜２４０頁）は、電子媒介物質としてＨＮＱを用いてＡｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓにより光エネルギーを電気に変換し得ることを報告した。パーク（Ｐａｒｋ）ら（１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｔｅｃｈｎｉｑ１１巻：１４５〜１４８頁）は、炭素ポリマーと架橋されＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ細胞質膜に吸着されたビオロゲン染料を、細菌細胞から電極、または電極から細菌細胞への電子伝達を媒介し得ることを確認した。
【００１７】
代謝還元力を電気エネルギーに変換し、電気エネルギーを代謝還元力に変換するための改良された、より効率的な方法が、当該分野においてなお求められている。
【００１８】
発明の開示
本発明の一つの局面は、生物学的系における還元プロセスを促進する方法であって、（ａ）陰極を備える陰極区画および陽極を備える陽極区画を有してなり、陰極および陽極区画はカチオン選択性膜により分離されており、陰極および陽極は導電性材料により電力供給源に接続されている電気化学的バイオリアクター系を提供する工程、および（ｂ）適量のニュートラルレッドおよび生物学的触媒を陰極区画内に配する工程を含んでなる方法である。
【００１９】
本発明のもう一つの局面は、生物学的系を用いて電気を発生させる方法であって、（ａ）カチオン選択性膜で分離された陽極区画および陰極区画を含んでなり、各区画に電極を備え、電極が導線によりマルチメーターに接続されている電気化学的燃料電池系を提供する工程、（ｂ）細菌、古細菌、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される生物学的触媒ならびにニュートラルレッドを適当な濃度で含んでなる陽極液を陽極区画内に配する工程、（ｃ）適当な陰極液を陰極区画内に配する工程、および（ｄ）ニュートラルレッドの媒介により化学的還元力を電気に変換させる工程を含んでなる方法である。
【００２０】
本発明の目的は、電気化学的バイオリアクターまたは燃料電池において、生化学的還元力（例えば、ＮＡＤＨ）、生物学的エネルギー（ＡＴＰ）および電気エネルギーを相互変換させる方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、電気的に還元されたニュートラルレッドを用いて細胞成長または所望の産物の生成を促進する経済的な方法を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、生物学的還元力を電気に変換する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の利点は、ニュートラルレッドの存在下に細胞の成長もしくは発酵または酵素的転換を促進するために電気エネルギーを用い得ることである。
【００２４】
本発明のもう一つの利点は、ニュートラルレッドが、混合細菌集合を含む廃物からの電気エネルギーの発生を促進することである。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、明細書および請求の範囲を参考すると明らかとなる。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ニュートラルレッドを用いて化学的および電気的エネルギーの効率的な相互変換を達成するための方法を提供する。本発明の一つの局面は、発酵または酵素反応において、還元力の供給源として電気的エネルギーを用いる方法である。本発明のもう一つの局面は、ニュートラルレッドおよび細胞または酵素を用いて電気を生成する方法を含む。
【００２７】
本発明は、生物学的系における電子の流れを制御することを意図する方法においてニュートラルレッドを用いると、関連する米国特許６０／０９２，１９０および６０／０９２，１９１；パークおよびザイクス（Ｚｅｉｋｕｓ）著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１巻：２４０３〜２４１０頁、１９９９年；およびパークら著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．に開示されている多くの驚くべき利点が提供されるという発見に基づく。全てのこれらの文献を、参考としてその全体を取り込む。
【００２８】
発酵または酵素的生体内転換反応における最終産物収率を制御するための重要な因子は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比による電子分布の制御である。さらなる還元力（例えば、Ｈ２または電気化学的に生成された還元性等価物）が細菌に供給されると、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比および代謝の増加を期待することができる。しかしながら、電気からＮＡＤ＋への電子の効率的伝達は、適当な電子伝達物質を必要とする。
【００２９】
米国特許６０／０９２，１９０および６０／０９２，１９１に詳細に記載されているように、電気化学的バイオリアクター系における電気および代謝還元力の相互変換において用いるのに、ニュートラルレッドが特に優れた電子媒介物質であることがわかった。ニュートラルレッドは、電極において可逆的酸化還元連結を形成することができ、高度に陰性のＥ０’を有する。ニュートラルレッドについてのＥ０’値は、例えばＮＡＤＨを含む電子伝達連鎖における生理学的電子キャリアの値に非常に類似している。ニュートラルレッドが、電子伝達連鎖から電子を受け取る性能は、生物燃料電池系における電気生成を高める。ニュートラルレッドは、中性ｐＨにおいて可溶性であり、その酸化状態および還元状態の両方において安定であり、長期酸化還元サイクル中に分解しない。
【００３０】
米国特許６０／０９２，１９０および６０／０９２，１９１に開示されているように、ニュートラルレッドは比較的非毒性であり、研究用の細胞の細胞質膜に容易に吸着することができ、細胞質膜を通過する電子伝達のための電子団または電子シャトルとして機能する。ニュートラルレッドは、化合物の可逆的酸化または還元において電子媒介物質として機能し、細胞膜中のメナキノンの代用となることが示された。驚くべきことに、電気的に還元されたニュートラルレッドは、他の還元力供給源の不存在下でも、細胞における成長、プロトン転移および代謝産物生成を促進する。
【００３１】
本発明の一つの局面は、バイオリアクター系における還元プロセスを促進する方法であって、（ａ）陰極を備える陰極区画および陽極を備える陽極区画を有してなり、陰極および陽極区画はカチオン選択性膜により分離されており、陰極および陽極は導電性材料により電力供給源に接続されている電気化学的バイオリアクター系を提供する工程、および（ｂ）適量のニュートラルレッドおよび生物学的触媒を陰極区画内に配する工程を含んでなる方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、生物学的触媒は、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、単離無傷細胞質膜、可溶化細胞質膜、およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ補因子を有する酵素からなる群より選択される。生化学的および電気的エネルギーの相互変換の効率を最大にするために、生物学的触媒を陰極上に固定する。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、さらに、（ｃ）陽極液を陽極区画内に配する工程、（ｄ）陰極に適当な強さの電流を流して、陰極区画内の酸化されたニュートラルレッドの少なくとも一部を還元させる工程、および（ｅ）還元されたニュートラルレッドにより電子を酸化された基質または電子キャリアに伝達する工程を含む。
【００３４】
本発明の方法は、非常に用途が広く、微生物、植物もしくは動物の細胞、単離無傷細胞膜、可溶化細胞質膜、または補因子としてＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを利用する酵素の製剤を含む、任意の数の生物学的触媒を用いる用途に適合させることができる。最も好都合には、生物学的触媒は、実質的に純粋または混合された細胞の培地、または酵素製剤を含む。好ましくは、生物学的触媒は、酸化された基質の、コハク酸エステル、メタンまたはアルコール類のような商業的または工業的に重要な産物への還元を促進することができる。
【００３５】
生体触媒として全細胞を用いる場合、電気的に還元されたニュートラルレッドが、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋補因子を化学的に還元する、または電子団として作用することにより、細胞成長または還元された産物の生成を促進する。好ましくは、バイオリアクター系は、電気的に還元されたニュートラルレッドが、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋補因子を化学的に還元する、または電子団として作用することにより、細胞成長、ＡＴＰ合成または、還元された産物の生成を促進するものである。
【００３６】
以下の例において、電気的に還元されたニュートラルレッドが、バイオリアクター系におけるアクチノバチルスコハク酸生成細菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を用いる発酵反応でフマル酸エステルを還元してコハク酸を形成する反応を促進することが示される。コハク酸は多くの工業的用途を有する重要な発酵産物であるので、コハク酸収率の高い、より効率的な発酵プロセスを開発することに興味が注がれる。
【００３７】
バイオリアクター系においてグルコース培地上のアクチノバチルスコハク酸生成細菌の成長中に電気的に還元されたニュートラルレッドを含むと、化学的還元性ＮＡＤ＋によるフマル酸エステル還元が促進される。さらに、ニュートラルレッドは、電子媒介物質および電子団としてのその機能によりコハク酸生成を促進する。ニュートラルレッド（Ｅ０’＝−０．３２５ボルト）の電気的還元は、ＮＡＤ＋還元に化学的に連結され、これは、プロトン駆動力の発生およびコハク酸エステル生成に生化学的に連結される。ニュートラルレッドは、膜結合フマル酸還元酵素複合体においてメナキノン（Ｅ０’＝−０．０７３ボルト）を置き換えることにより機能するようである。好ましくは、還元されたニュートラルレッドは細胞成長を、ニュートラルレッドを欠く匹敵するバイオリアクター系と比べて、少なくとも１０％、２０％または、４０％以上までも増加させる。電気的に還元されたニュートラルレッドは、グルコースまたはフマル酸エステルの消費を、少なくとも２５％、５０％または１００％以上増加させることができる。コハク酸エステル生成は、ニュートラルレッドを欠く匹敵するバイオリアクター系において観察される生成水準と比較して、約１０％または２５％以上までも増加される。
【００３８】
同様に、電気的に還元されたニュートラルレッドは、メタン生成古細菌の成長およびメタン生成古細菌（Ｍｅｔａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈｅａ）によるメタンへのＣＯ２の還元の促進においてＨ２の代用となり得る。好ましくは、本発明の方法は、古細菌の成長またはメタン生成を、少なくとも約２５％、５０％、１００％または３００％以上までも増加させる。
【００３９】
広範囲の生体触媒を用いて本発明の方法により、電気化学的バイオリアクター系における細胞成長または還元生成物の形成を促進し得ることを期待するのは合理的である。この方法を種々の細菌、古細菌、植物細胞または動物細胞を用いて使用し得ることが想像される。
【００４０】
本発明の実施において酵素製剤も用い得ることが想像される。当業者に知られている標準的方法を用いて、所望の酵素を部分的に精製することができる。酵素を、天然源からまたはトランスジェニック発現宿主から単離する、または市販の販売元から得ることができる。
【００４１】
有用な酵素は、電気的に還元されたニュートラルレッドからの還元力を用いて所望の還元産物を形成することができる、または還元力をニュートラルレッドに伝えて所望の酸化産物を形成することができる酵素を含む。最も一般的には、この還元はＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨにより媒介される。本発明の実施において任意の酸化還元酵素を用い得ることを期待するのは理にかなっている。例えば、電気的に還元されたニュートラルレッド、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋、および酵素用の基質として作用し得るケトン、アルデヒドまたはカルボン酸を含んでなるバイオリアクター系において、単離されたアルコール脱水素酵素を用いて、アルコールのような、より還元された最終産物を形成することができる。有用な酵素のもう一つの例は、カルボン酸を還元された産物に転化するためにＮＡＤＰＨおよびＡＴＰを用いる、カルボン酸還元酵素である（米国特許５，７９５，７５９、ここで参考に取り込む）。当業者は、大部分の酵素触媒される反応が可逆的であり、本発明の方法により所望の酸化された基質を得るために酸化還元酵素を用いることが望まれる用途があり得ることを理解する。
【００４２】
本発明において用いられる電気化学的バイオリアクターにおいて、生体触媒およびニュートラルレッドが陰極上に固定されるのが好ましい。全細胞生体触媒の場合、細かく織られたグラファイトフエルト電極上の自己固定が起こることがわかった。生体触媒の固定は、任意の適当な方法により達成することができる。生体触媒を固定するための多くの技術は当該分野において知られている（例えば、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）およびスポカン（Ｓｐｏｋａｎｅ）のＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：工業的酵素学におけるバイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第２版、５１〜５９頁を参照されたい：これをここで参考に取り込む）。本発明の実施において生体触媒を固定化することを望む者は、電極と膜との間に生体触媒、共因子およびニュートラルレッドが挟まれるように、生体触媒、ニュートラルレッドおよびピリジンヌクレオチド共因子を電極と外側膜（例えば、ポリマー膜）との間に配して、そのようにすることができる。また、生体触媒、ニュートラルレッド、およびピリジンヌクレオチド共因子を、マトリクスポリマー中に埋め、電極上に被覆させることができる。
【００４３】
本発明の実施を望む当業者は、ここで開示の技術を用いて電気化学的バイオリアクターまたは燃料電池を容易に調製することができる。開示されたバイオリアクターおよび燃料電池への特定の修正は、当業者の能力に充分含まれることを理解すべきである。
【００４４】
電気化学的バイオリアクターまたは燃料電池において使用し得る陰極液および陽極液が、例において提供される。電気化学的バイオリアクターにおいて適しているとわかった陰極液は、細菌成長培地またはリン酸塩緩衝液（５０〜１００ｍＭ、ｐＨ７．０〜７．２）を含む。電気化学的バイオリアクターにおいて用いるための他の適当な陰極液緩衝液は、細胞または酵素を変性させないいかなる陰極液も含む。
【００４５】
塩水を含むリン酸塩緩衝液は、電気化学的バイオリアクターにおいて用いるのに適していることがわかった（１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ）。適当な陽極液は、細胞または酵素を変性しないいかなる陽極液も含み得る。
【００４６】
燃料電子については、ニュートラルレッド（１００μＭ）および、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の細菌細胞懸濁液が適当な陽極液であり、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）および５０ｍＭフェリシアニドが陰極液として適しているとわかった。
【００４７】
例に記載されている電気化学的バイオリアクター系および燃料電池系の両方において、陰極区画と陽極区画が、プロトンおよびカチオンのみを通過させるナフィオン（Ｎａｆｉｏｎ）カチオン性選択的膜隔壁により分離されていた。陰極区画と陽極区画を分離するために適している膜は、プロトンまたはカチオンのみを膜を通過させるいかなる膜でもあり得る。
【００４８】
以下の例に記載の電気化学的バイオリアクタ系において、電極は、細かく織られたグラファイトフエルトから作られる。織られたグラファイトフエルトは、大面積にわたって生体触媒を固定させる大面積電極を提供する利点を提供する。しかしながら、導電性ポリマーおよび金属材料を含む他の材料が電極に適していることがある。
【００４９】
電極は、白金導線を用いて電力供給源に、またはマルチメーターに接続した。電極を電力供給源またはマルチメーターに接続させるのに好適な他の材料は、導電性ポリマーまたは金属材料を含む。
【００５０】
以下に記載の電気的バイオリアクターにおいて、陽極と陰極との間の電流は約０．４〜約２．０ｍＡであり、電圧は約１．５Ｖである。本発明は、約０．００４〜約２００ｍＡの電流を用いて行い得ると考えられる。
【００５１】
燃料電池系において、陽極および陰極からの抵抗は約１０００オームである。本発明の実施において、約１０〜約１００００オームの抵抗を用い得ると考えられる。
【００５２】
ニュートラルレッドは、電気化学的バイオリアクターの陰極液に、および燃料電子系の陽極液に、約１００μＭの濃度で含まれる。本発明の実施において、約１〜１０００μＭのニュートラルレッド濃度が適していると予想される。
【００５３】
成長または休止細菌の細胞の代謝から誘導されるエネルギーを電気に変換する際の電子媒介物質としてニュートラルレッドを用いることもできる。
【００５４】
ニュートラルレッドを電子媒介物質として有しフェリシアニドを電子受容体として有する燃料電池系においてアクチノバチルスコハク酸生成細菌１３０Ｚ成長細胞を用いると、閉鎖回路構造において、生成される最大電流は２．１７ｍＡであり電位は＜１００ｍＶであった。２０時間培養後、燃料電池系を、閉鎖回路系から開放回路系に変換した。電位は、迅速に、理論的最大値である０．６８５ボルト（すなわち、ＮＲ間の酸化還元電位差）に達した。
【００５５】
触媒としてアクチノバチルスコハク酸生成細菌休止細胞を用いて得た電子媒介物質としてのチオニンとＮＲとの効果を比較すると、電子媒介物質としてＮＲを用いると、チオニンを用いるよりもかなり大きな電気が発生した。ＮＡＤＨ、ＮＲおよびフェリシアニドを電子供与体、電子媒介物質および電子受容体としてそれぞれ用いると、発生する電流はＮＡＤＨ濃度に比例していた。触媒としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＫ−１２を用いる系において、発生した電流および電圧は、触媒としてアクチノバチルスコハク酸生成細菌を用いて得られたものに類似していた。電流および電圧は、グルコース濃度の上昇と共に増加するとわかった。
【００５６】
燃料電池系における触媒として、嫌気性汚水スラッジも用いた。触媒として汚水スラッジを用いる燃料電子において発生した電圧よび電流は、大腸菌およびアクチノバチルス属を用いて発生したものに匹敵しており、２．２Ｋオームの外部抵抗での閉鎖回路系において１２０時間安定であった。
【００５７】
例に記載のもの以外の成長または休止細胞を、本発明の方法により、燃料電池系における触媒として用いて電気を発生させ得ることが予測される。生体触媒として選択される特定の細胞に依存して、電気の発生において用いられる還元力は、光、無機化合物もしくは有機化合物、または任意の他のエネルギー源を含むことができ、その細胞を成長または代謝に用いることができる。
【００５８】
生化学的および電気エネルギーのニュートラルレッド媒介相互変換を、多くの異なる用途に用いるために適合させ得ることが考えられる。例えば、ニュートラルレッド酸化還元を用いて、全細胞または酵素を利用するバイオセンサー系における電気的水準を検出することができる。
【００５９】
すなわち、本発明は、サンプル中の特定の有機または無機試験化合物の存在を検出する方法であって、（ａ）カチオン選択性膜で分離された陽極区画および陰極区画を有してなり、各区画に電極を備え、電極が導線によりマルチメーターに接続されている電気化学的燃料電池系を含むバイオセンサーを提供する工程、（ｂ）サンプルと、適当な濃度のニュートラルレッドと、微生物細胞および酵素を含んでなり試験化合物を酸化し得る生物学的触媒とを含んでなる陽極液を陽極区画内に配する工程、（ｃ）適当な陰極液を陰極区画内に配する工程、（ｄ）サンプル中に存在するいずれかの試験化合物の少なくとも一部を酸化させ、酸化されたニュートラルレッドの少なくとも一部を還元させる工程、（ｅ）還元されたニュートラルレッドから陰極に電子を運ぶ工程、および（ｆ）電流の発生を検出する工程を含んでなる方法を含む。
【００６０】
当該分野において知られている細胞または酵素バイオセンサーにおいて、化学物質（例えば、グルコース）の存在が膜系電極系において酵素（グルコースオキシダーゼ）を用いて検出される。グルコースおよびグルコースオキシダーゼの例において、酵素触媒された反応はＯ２を消費し、過酸化物を生成する。従って、サンプル中のグルコースの存在は、Ｏ２濃度の低下、および過酸化物濃度の増加に関連し、そのいずれも特定電極により検出される。本発明の方法により、発生した電流を直接測定することができる。ニュートラルレッド系において、未知の試験サンプル中の特定化合物が、生体触媒による化合物の酸化時に検出可能な電流を発生させるように化合物を酸化することができる細胞または酵素を用いて試験される。従って、化合物の濃度は、試験化合物の酸化時に発生する電気を測定することにより検出することができる。化合物を酸化することができる適当な生体触媒を選択することにより化合物を検出するように本発明の方法を適合させることは、特定化合物の検出を望む当業者の能力に充分含まれる。
【００６１】
ニュートラルレッドを用いるもう一つの重要な適用は、廃水中の化学的酸素要求量を測定する方法であって、（ａ）カチオン選択性膜で分離された陽極区画および陰極区画を有してなり、各区画に電極を備え、電極が導線によりマルチメーターに接続されている電気化学的燃料電池系を提供する工程、（ｂ）適当な濃度のニュートラルレッドと、生物学的触媒を含むまたは補足された廃水とを含んでなる陽極液を陽極区画内に配する工程、（ｃ）適当な陰極液を陰極区画内に配する工程、（ｄ）ニュートラルレッドの媒介により化学的還元力を電気に変換させる工程、および（ｅ）燃料電池系により発生した電流を測定する工程を含んでなる方法を提供する。
【００６２】
以下の非限定的例は、説明のみを意図するものである。
【００６３】
例
化学物質と結果の再現性
全ての化学物質は試薬グレードであり、ガスはＡＧＡケミカルズ（クリーブランド、オハイオ、アメリカ合衆国）から購入した。全ての個々の実験は、同一の結果を２〜３回繰り返した。
【００６４】
電気化学バイオリアクターシステム
ＥＣＢシステムＩ（稼動用量４０ｍｌ）が酵素的及び化学的還元試験のため使用された。ＥＣＢシステムＩＩ（稼動用量３００ｍｌ）が細胞の電気依存的な培養に使用された。嫌気的な条件を維持するため及び細菌を成長させるために特別に設計されたＥＣＢシステムはＭＳＵケミストリーデパートメントによりパイレックスガラスから作られた。ＥＣＢシステムはカチオン選択性隔膜（タイプＩ直径［φ］＝２２ｍｍ、タイプＩＩ直径［φ］＝６４ｍｍ）（ナフィオン、エレクトロシンセシス、ニューヨーク）；Ωｃｍ−２  ０．２５Ｎ  ＮａＣｌ中）によって仕切られている陽極と陰極に分けられた。化学物質と代謝産物はナフィオン膜を通りぬけることができない。プロトンとカチオンだけは通りぬけることができる。陽極と陰極の両方は細かく仕切られたグラファイトフェルトから作られた（厚さ６ｍｍ、有効な表面積０．４７ｍ２ｇ−１（エレクトロシンセシス、ニューヨーク、アメリカ合衆国）。プラチナワイヤー（［φ］Ω０．５ｍｍ、＜１．０Ωｃｍ−２；シグマ、セントルイス、ＭＯ、アメリカ合衆国）はグラファイトエポキシ（＜１．０Ωｃｍ−２；エレクトロシンセシス、ニューヨーク、アメリカ合衆国）を用いグラファイトフェルトに接着された。陽極と陰極間の電気抵抗は＜１ｋΩであった。両電極の重さはシステムＩは０．４ｇ（表面積０．１８８ｍ２）に、システムＩＩは３．０ｇ（表面積１．４１ｍ２）に調製された。陽極と陰極間の電流と電圧は正確なマルチメーター（フルケ  モデル  ４５、エヴェレット、ＷＡ、アメリカ合衆国）によって測定され、システムＩは０．３〜２．０ｍＡと１．５ボルトに、システムＩＩは１．０〜１０．０ｍＡと２．０ボルトにそれぞれ調整された。Ｈ２Ｏの電気化学半酸化はＮＲ（１００μＭ）の半還元と連結され、還元されたＮＲの酸化はフマル酸エステルの細菌学的な還元と連結された。電気化学的な条件下では生成されないＨ２はＮＲもしくはＭＶを還元するために用いられた。ＥＣＢシステムＩのテストのため、陰極の区画には細胞懸濁液、膜懸濁液もしくは可溶化膜を含ませ、陽極の区画には５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）と１００ｍＭ  ＮａＣｌを含ませた。ＥＣＢシステムＩＩにおける成長の研究のため、陰極の区画にはＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓとインキュベートされた成長培地を含ませ、陽極の区画には１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）と１００ｍＭ  ＮａＣｌを含ませた。
【００６５】
生物体と成長条件
Ａ．Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ型株１３０ＺはＭＢＩインターナチョナル（ランシング、ＭＩ、アメリカ合衆国）（１０，３９）に言及されている。細菌は他に言及がなげれば、ＣＯ２−Ｎ２（２０％−８０％、２０ｐｓｉ）ガス相下で５０ｍｌ培地を含むブチルゴムで栓をされた１５８ｍｌ血清ビンにて育てた。次を含む成長培地Ａ（二重滅菌水１リットルについて）：酵母抽出物、５．０ｇ；ＮａＨＣＯ３、１０．０ｇ；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、８．５ｇ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１２．５ｇ。培地のｐＨはオートクレーブ後７．０に調節された。別々にオートクレーブされたグルコース溶液（最終濃度６０ｍＭ）とフマル酸溶液（最終濃度５０ｍＭ）が無菌的にオートクレーブ後培地に加えられた。培地は同じ培地で育てられた培養物の５．０％（ｖ／ｖ）試料によって接種され、３７℃でインキュベートした。
【００６６】
細胞懸濁液の調製
細菌の培養、採取、洗浄は従来技術として記載されているように（３９）厳格な嫌気的Ｎ２条件下で行われた。１６時間培養されたＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓが４℃で遠心分離（５，０００ｘｇ．３０分間）によって採取され、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）１５００ｍｌを用い３回洗浄した。洗浄された細菌細胞は２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁された。この懸濁液はフマル酸エステルからコハク酸エステルへのＨ２依存的な及び電気依存的な還元のための触媒として用いられ、サイクリックボルタンメトリーおよび細胞内へのＮＲ吸収のために用いられた。
【００６７】
ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の電気化学的な還元
ＥＣＢシステムＩは１ｍＭ  ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋及び１００（ΩＭ  ＮＲもしくはＭＶを用いたＥＣＢシステムＩがＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の電気化学的な還元に使用された。電極電位及び電流が２．０ボルト及び１．０〜３．０ｍＡにそれぞれ調節された。Ａｇ／ＡｇＣｌと白金電極が反応が進行したかどうかを確認するため、反応物酸化還元電位を測定するために用いられた。一般に生化学的もしくは電気化学的な反応の酸化還元電位がＡｇ／ＡｇＣｌ電極（［Ａｇ／Ａｇ＋］のＥ０’＝＋０．１９６ボルト）もしくは比較電極として塩化水銀電極（［Ｈｇ／Ｈｇ＋］のＥ０’＝＋０．２４４ボルト）を用いることによって測定される。しかし、それは電位対天然水素電極（ＮＨＥ）として表わされなければならない。ＮＨＥは有機もしくは無機化合物の熱力学的な計算のために用いられる（例えばＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋のＥ０’が−０．３２ボルト及びＨ２／２Ｈ＋が−０．４２ボルト）。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用い測定される電位は測定される電位（Ｅ０’対ＮＨＥ＝Ｅ０（対Ａｇ／ＡｇＣｌ＋０．１９６）に＋０．１９６を加えることによって電位対ＮＨＥへ変換する。酸素は電流供給前１０分間酸素遊離窒素とともに泡立たせることによって５０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の酸化還元色素溶液からおよび反応物から追い出された。反応物中のＮＡＤＨ濃度は３４０ｎｍを分光測光法により測定した。そして、ミリモル吸光係数６．２３ｍＭ−１ｃｍ−１を用いることによって計算された。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ生成は各サンプリング時間における吸収スペクトルデータにより確認された。
【００６８】
精製された膜、可溶化された膜及び膜遊離細胞抽出物
細胞遊離抽出物が先行技術として記載されているように（ファンデルヴェルフら著，１９９７，Ａｒｃｈ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６７：３３２−３４２）４℃嫌気的Ｎ２雰囲気下で調製された。採取され洗浄された細胞は１ｍＭＤＴＴ及び０．０５ｍｇ／ｍｌジオキシリボヌクレアーゼを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁した。細胞は２０，０００ｐｓｉのフレンチプレスによって破砕された。細胞残さは３０分間４０，０００ｘｇの遠心分離を３回行うことによって取り除かれた。精製された膜は９０分間１００，０００ｘｇの遠心分離によって細胞遊離抽出物から得られた。上清を別の容器に静かに注がれた。そして、膜遊離細胞抽出物として取っておいた。茶色で透明な沈殿物は５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄された。そして、ホモジナイゼーションによって同緩衝液に再懸濁された。可溶化膜はトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００抽出による膜分画から得られた（レミレら著，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５：３９１〜３９７）。トライトンＸ−１００は最終濃度１％（ｖ／ｖ）に加えられた。そして、上清は３時間インキュベートされた。トライトン可溶化タンパク質は９０分間４℃１００，０００ｘｇで遠心分離によって不溶残さを取り除いた後再生された。
【００６９】
細胞及び膜に中性赤の結合
細胞及び精製膜の酸化還元色素の吸着が細胞もしくは膜懸濁液を３０分間３７℃で混合した後、溶液中ＮＲ及びＭＶ残基を測定することによって決定された。細菌細胞懸濁液（ＯＤ６６０、０〜３．０）と精製膜懸濁液（０〜１０ｍｇ／ｍｌタンパク質）が酸化還元色素吸着（結合等）を分析するために用いられた。ＮＲ溶液（５０μＭと２５μＭ）とＭＶ（１００μＭ）が色素の無傷の細胞もしくは膜への結合を測定するために用いられた。ＭＶ（１００μＭ）が細胞結合に用いられた。細胞と膜は１０分間１２，０００ｘｇの遠心分離及び２０分間１５０，０００超遠心分離のそれぞれによって反応混合液から取り除かれた。ＮＲ濃度は分光測光法による前決定された４００ｎｍ、ｐＨ７．２での換算曲線を用いることによって測定された。そして、ＭＶはｐＨ７．２、エレプシデン（Ｅｌｅｐｓｏｄｅｎ）１．５ｍＭジチオネートの添加によって還元した後、ミリモル吸光係数（５７８）９．７８ｍＭ−１ｃｍ−１を用いて決定された（リソロら著，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１１７２５〜１１７２９）。膜懸濁液のタンパク質の濃度はブラッドフォード試薬（バイオ−ラッド、ヘラクレス、ＣＡ、アメリカ合衆国）を用いた換算曲線（タンパク質濃度、ｍｇ／ｍｌ＝Ａ５９５ｘ１．３３２７）により決定された。
【００７０】
プロトン輸送の測定
プロトン輸送は無酸素Ｎ２雰囲気下で測定された。細胞懸濁液によるＨ２依存的プロトン輸送はフィッツ及びキピオンカによって記載されたように測定された（フィッツら著，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：３６９〜３７６）。電気依存的プロトン輸送はプロトン輸送の測定のために設計された電気化学バイオリアクター系において測定された。バイコールチップ（イオン交換できる硬い膜、バス、ウエスト  ラファイアティー、イン、アメリカ合衆国）の付いたチューブ（［φ］１０ｍｍＩＤ及び９０ｍｍ長）が陽極区画として用いられ、グラファイト棒が（［φ］７ｍｍ×７０ｍｍ）が陽極として用いられ、そして０．０５ｇグラファイトフェルト（表面積、０．０２３５ｍ２）陰極として用いられた。ｐＨ電極（オリオン８１０３ロス）は陰極分画に置かれ、プロトンパルスを記録され得る信号に変換するｐＨメータ（コーニング、１３０）を経由してレコーダ（リニア）に結合した。細胞懸濁液は１００ｍＭ  ＫＳＣＮ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  グリシルグリシンを含むＫＫＧ溶液（ｐＨ７．１）中で作られ、陰極に置かれた。陽極は陽極液として５０ｍＭ  ＫＣｌを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液を含有した。陰極と陽極分画の総用量及び稼動用量はそれぞれ３０ｍｌと５．５ｍｌであった。陽極と陰極の稼動電荷及び電流は電気的還元力及びＮＲを用いる実験において２．０ボルトと０．３〜０．３５ｍＡであった。細菌細胞はフマル酸−Ｈ２もしくはグルコースを含む培地Ａ中で１６時間培養した。細胞は嫌気下で２０℃で３０分間の５，０００ｘｇ遠心分離によって採取され、１００ｍＭ  ＫＣｌで２回洗浄された。細胞は電気依存的プロトン輸送を測定するために１００μＭ  ＮＲで緩和された。洗浄された細胞（ＯＤ６６０ｎｍ、１０）Ｎ２飽和１５０ｍＭ  ＫＣｌ中に再懸濁された。細胞懸濁液は３０分間室温で平衡化された。温置された細胞は２０℃で３０分間の５，０００ｘｇ遠心分離をして、ＫＫＧ溶液に再懸濁した。それからＨ２大気下で３０分間インキュベーションが続けられた。フマル酸添加に電気依存的なプロトン輸送を測定するために細胞懸濁液はＮ２大気下で陰極分画中のＨＯＱＮＯの存在下もしくは非存在下でインキュベートされ、２０分間２．０ボルトで電極電位で満たされた。
【００７１】
酵素アッセイ
酵素の活性測定は先行技術として記載されているように嫌気的Ｎ２大気下で行われた（ファンデルヴァルフら著、１９９７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：３３２〜３４２）。上記の膜遊離抽出物、精製膜、可溶化膜調製物はヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ及びフマル酸レダクターゼ活性を検定するために用いられた。フマル酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．）とヒドロゲナーゼ（ＥＣ２．１２．２．２．）活性はベックマン分光光度計を用いファンデルヴァルフ（１９９７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：３３２〜３４２）の記載のように測定した。ＢＶ２＋及びＮＲ＋ジアフォラーゼ活性はプロトン供与体としてＨ２の代わりにＮＡＤＨ（０．６ｍＭ）を用いてヒドロゲナーゼと類似の条件下で測定された（シュナイダーら著、１９８４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：７５〜８４）。ベンジルビオロゲン及びＮＲの酸化及び還元は５７８ｎｍ及び５４０ｎｍを分光測光法で測定した。ＮＡＤ（Ｈ）の酸化及び還元は３４０ｎｍを分光測光法で測定した。還元されたベンジルビオロゲンは先行技術として記載されているように調製された（リソロら著、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１１７２５〜１１７２９）。ベンジルビオロゲン（５７８）、ＮＲ（５４０）及びＮＡＤ（Ｈ）（３４０）のミリモル吸光係数はそれぞれ８．６５ｍＭ−１ｃｍ−１、７．ｍＭ−１ｃｍ−１及び６．２３ｍＭ−１ｃｍ−１であった。
【００７２】
フマル酸塩還元膜と可溶化膜の酵素分析
膜懸濁液（３．２５  ｍｇ／ｍｌ  タンパク質）と可溶化膜（３．２  ｍｇ／ｍｌ  タンパク質）が酵素源として用いられた。血清バイアル（５０ｍｌ）とＥＣＢシステムＩがフマル酸塩からコハク酸塩へのＨ２−依存及び電気的依存還元のためにそれぞれ用いられた。５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．２）中の嫌気的に調製された５０ｍＭ  フマル酸塩が反応物及び陰極液として用いられ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０）とともに１００ｍＭ  リン酸塩緩衝液が陽極液として用いられた。反応は酵素源を添加することによって開始され、３７℃に維持された。基質及び生成物の濃度はＨＰＬＣ（ゲラント（Ｇｕｅｒｒａｎｔ）ら、１９８２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：３５５〜３６０）によって分析された。細胞懸濁液及び膜中のフマル酸塩還元におけるＨＯＱＮＯの影響は以下の様に分析された。
【００７３】
細胞懸濁液（ＯＤ６６０＝４．２）と膜懸濁液（２．６５  ｍｇ／ｍｌ  タンパク質）が酵素源として用いられた。血清バイアル（５０ｍｌ）とＥＣＢシステムＩがフマル酸塩からコハク酸塩へのＨ２−依存及び電気的依存還元のためにそれぞれ用いられた。５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中の嫌気的に調製された５０ｍＭ  フマル酸塩が反応物及び陰極液として用いられ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＰＨ７．０）とともに１００ｍＭ  リン酸塩緩衝液が分析液として用いられた。２μＭ  ＨＯＱＮＯがメナキノンの阻害剤として用いられた。反応は酵素源を添加することによって開始され、３７℃に維持された。基質及び生成物の濃度はＨＰＬＣによって分析された。
【００７４】
サイクリック  ボルタンメトリー
直径３ｍｍの、電極として働く、グラスカーボン（ＢＡＳ、ウエスト  ラファイエット（Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、インディアナ、ＵＳＡ）、プラチナ  ワイヤー対電極（ＢＡＳ）、及びＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（ＢＡＳ）が２ｍｌの作用体積とともに電気化学的細胞中で用いられた。サイクリック  ボルタンメトリーはＩＢＭ  マイクロコンピューター  データ獲得システムにリンクしたサイクリック  ボルタンメトリック  ポテンシオスタット（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）（ＢＡＳ、モデル  ＣＶ５０Ｗ）を用いて行った。使用にさきがけて、作用電極は綿上でアルミナ／ウォータースラリーを用いて磨かれ、そして電気化学的細胞は徹底的に洗浄された。酸素は電気化学的測定の前に、１０分間酸素フリーＮ２を泡立たせることによって細胞懸濁液、膜懸濁液、又は可溶化膜懸濁液から取り除かれた。細菌懸濁液（ＯＤ６６０＝３．０）、膜懸濁液（２．５４  ｍｇ  タンパク質／ｍｌ）、及び可溶化膜（３．２  ｍｇ  タンパク質／ｍｌ）が酵素源として用いられた。使用されたスキャンレートは２５ｍＶ／ｓであり、電解質として用いられた５ｍＭ  ＮａＣｌを含む、−０．３から−０．８ボルトの範囲を超えた、５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液である。ＮＲ  μ１００  （Ｍ）及び５０ｍＭ  フマル酸塩がそれぞれ電子媒介物、電子受容体として用いられた。
【００７５】
増殖分析
培地中の懸濁された細胞の増殖は懸濁液を測定することによって決定され（６６０ｎｍにおける吸光度）、電極の上に吸光された細胞の増殖収量はタンパク質濃度を測定することによって決定された。タンパク質濃度は前もって決定された校正曲線（細菌濃度＝タンパク質濃度、ｍｇ／ｍｌ  ×  １．７５５６）を用いて、光学密度へ換算された。陰極、それは吸光された細菌におけるものであるが、はリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）３００ｍｌ中で３０分間、ゆっくりとした攪拌によって、３回洗浄された。細菌の溶解物は１Ｎ−ＮａＯＨを用い、１０分間、１００℃でアルカリ処理をすることによって電極から得られた。１０，０００  ×ｇ  及び４℃、３０分間遠心分離をすることによって、溶解物から細胞残さを取り除いた後、細菌溶解物のタンパク質濃度がブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬（バイオ−ラッド、ハークルス（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、及び前もって決定された校正曲線（タンパク質濃度、ｍｇ／ｍｌ＝Ａ５９５  ×  １．３３２７）を用いて決定された。
【００７６】
メタン細菌顆粒増殖及び代謝分析
脂肪酸−分解栄養共生物（ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｌｅｓ）及びメタン細菌の混合培地を含むメタン細菌顆粒がＭＢＩ  インターナショナル（ランシング（Ｌａｎｉｎｇ）、ミシガン）中の５０ｍＭ  酢酸塩、酪酸塩、及びプロピオン酸塩の混合物によって増殖させられたベンチ（ｂｅｎｃｈ）スケールの嫌気的泥反応装置から得られた（ウー（Ｗｕ）ら、１９９３年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：７９５〜８０３及びウーら、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：８０４〜８１１）。メタン細菌顆粒は有機化合物なしに調製されたＰＢＢＭ中で培養された（ケニーリー（Ｋｅｎｅａｌｙ）ら、１９８１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４６：１３３〜１４０）。培地はリン酸塩なし、ＮａＯＨによりｐＨ７．２に調製され、煮沸され、Ｎ２−ＣＯ２（８０：２０％）又はＨ２−ＣＯ２（８０：２０％）により脱気され、１５８−ｍｌ  ウィ−トン（Ｗｈｅａｔｏｎ）血清バイアル中に分注され、ブチルラバーストッパーによってシールされ、そしてオートクレーブにかけられた。リン酸塩、硫化物（０．０１％）、Ｎ２−ＣＯ２（８０：２０％）又はＨ２−ＣＯ２（８０：２０％）、及びビタミン溶液がオートクレーブにかけられた後、添加された。培地体積は４０ｍｌであり、血清バイアル中のイニシアルヘッドスペースガス圧は３０ｐｓｉに調製された。培地は３．０％（体積として；タンパク質濃度、１．９９５ｍｇ／ｍｌ）メタン細菌顆粒を接種され、３７℃でインキュベートされた。培地は電気的に還元されているためＮａ２Ｓが添加されなかった以外、培地の調製、接種、及び培養の全ての手順は、バイアル培養に用いられた手順と同様になされた。Ｎａ２Ｓ（２％）が、生成したＯ２を除去するための還元剤として陽極区画へ添加された。ＮＲ（１００（Ｍ）が電子媒介物として陰極区画へ添加された。陽極と陰極間の電流とポテンシャルは０．４ｍＡ及び２．０ボルトであった。ＣＯ２及びＣＨ４はカーボスフィア（ｃａｒｂｏｓｐｈｅｒｅ）カラム及びフレームイオン化検出器を備えたガスクロマトグラフを用いて分析された。インジェクターとカラムの温度はそれぞれ５０℃と１５０℃であり、キャリアー（Ｎ２）流速は４５ｍｌ／分であった。気体サンプルは圧力ロックシリンジにより除去された。ＣＯ２消費とＣＨ４生成はヘッドスペース中の全ガス組成のパーセンテージとして表される。
【００７７】
電流発生（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）のための細菌増殖と細胞調製
Ａ． ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １３０Ｚ及びＥ． ｃｏｌｉ  Ｋ−１２を培地Ａ（１０ｇ／ｌ  グルコース、５ｇ／ｌ  酵母抽出液、８．５ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び１０ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３）中で、嫌気的Ｎ２−ＣＯ２（８０：２０）雰囲気下、３７℃、１５０ｍｌ血清バイアル又はＮ２（１００％）雰囲気下、ｐＨコントローラー付燃料電池システム（ｆｕｅｌ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ）中で、それぞれ１６時間および２０時間嫌気的に増殖させた。両者のバイアル及び燃料電池試験のための接種物のサイズは３％（ｖ／ｖ）であった。休止細胞懸濁液は４℃、５０００ｘｇで遠心分離を行い、定常期培養物を採取することにより調製された。細胞は１００％Ｎ２雰囲気下で５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて２回洗浄された。洗浄細胞は５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁され、その後３０分間Ｎ２ガスを供給することによってＯ２を除去した。細胞濃度はＯＤ６６０  ３．０に調製された。
【００７８】
増殖又は定常細胞のための燃料電池システム
２つの区画（陽極及び陰極）の電気化学的細胞が細菌電流発生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のための燃料電池システムとして用いられた（図１）。スイッチ１及び２をオフにしたとき、開路が存在した。スイッチ１をオンにスイッチ２をオフにしたとき、閉路が形成された。スイッチ１をオフにスイッチ２をオンにしたとき、外部可変抵抗とともに閉路が形成された。電子媒介物として１００  ｕＭ  ＮＲ又は３００マイクロＭ  チオニンが用いられた。それぞれの区画のトータル及び作用体積はそれぞれ１，６００ｍｌ及び１，３００ｍｌであった。電極、１２ｇの細編グラファイトフェルト（０．４７  ｍ２／ｇ、エレクトロシンセーシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ニューヨーク）により作られたもの、がエポキシグラファイト（＞１．０  Ω  ｃｍ−２、エレクトロシンセーシス、ニューヨーク）を用いたプラチナワイヤー（直径＝０．５  ｍｍ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ）とともに精密多重メーター（フルーク（Ｆｌｕｋｅ）モデル  ４５、エヴェレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）、ＷＡ）に接続された。陽極と陰極区画はカチオン選択性膜隔壁（直径７０ｍｍ、ナフィオン（Ｎａｆｉｏｎ）、エレクトロシンセーシス、ニューヨーク）によって隔てられている。陽極と陰極間の燃料電池システム自体の電気抵抗はおよそ１，０００Ωであった。抵抗は電流発生をコントロールするための可変抵抗を用いて調整されたが、最大ポテンシャル又は電流発生を測定するためには調整されなかった。陽極と陰極間の電流と電圧は精密多重メーター（フルーク  モデル４５、エヴェレット、ＷＡ）により測定された。鉄（ＩＩＩ）イオン（ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムとして、  Ｅ０（＝＋０．３６  ボルト）−Ｏ２（Ｅ０’＝＋０．８２  ボルト）によって再酸化されたもの、の電気化学的半還元はニュートラルレッドに結合し又は逆に細菌の酸化的代謝に還元的に結合したチオニン半酸化に結合する。定常細胞を用いる該燃料電池システムにおいて、１００マイクロＭ  ＮＲ又は３００マイクロＭ  チオニンを含む５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）、及び５０ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩を含む１００ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の細菌の細胞懸濁液（ＯＤ６６０  ３．０）がそれぞれ陽極液、陰極液として用いられた。増殖細胞を用いる燃料電池システムにおいて、新鮮な細菌の接種を含む培地Ａは陽極液であり、陰極液は定常細胞の際と同様であった。実験中、陽極区画において、０．８ｍｌ／分のＮ２流速で操作される前に３０分間１００％  Ｎ２ガスを供給することによって完全な無酸素状態が維持された。Ｎ２ガス中に含まれる微量の酸素は純粋銅充填物が充填された炉中、３７０℃で除去された。陰極区画は一定の空気供給及び攪拌によって酸素化された。陽極区画は自動ｐＨコントローラー（ニュー  ブランスウィック  サイエンティフィック社（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．）、モデル  ｐＨ−４０、エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ）、ニュージャージー）を用いてｐＨ７．０に維持された。
【００７９】
ＮＡＤＨ酸化物に結合する化学色素化学酸化による電流発生
０．３ｇ細編グラファイトフェルト電極とカチオン選択性膜隔壁（Ω  ２０ｍｍ、ナフィオン、エレクトロシンセーシス）を備えた陽極と陰極区画を含んでなる小化学燃料電池システム（ｓｍａｌｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｅｌ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ）（全体積５０ｍｌ；作用体積  ３０ｍｌ）が用いられた。５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の１００マイクロＭ  ＮＲ溶液及び５０ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩を含む１００ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）がそれぞれ陽極液、陰極液として用いられた。ＮＡＤＨ添加前に３０分間Ｎ２ガスを供給することにより陽極区画から酸素を除去した。５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の濃縮ＮＡＤＨ溶液にはＯ２を除去するため前もってＮ２ガスを供給した。
【００８０】
サイクリック  ボルタンメトリー
直径３ｍｍの、電極として働く、グラスカーボン、プラチナ  ワイヤー対電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（全てＢＡＳ、ウエスト  ラファイエット、インディアナ）が３ｍｌの作用体積とともに電気化学的細胞中で用いられた。サイクリック  ボルタンメトリーはＩＢＭ  パーソナルコンピューター  データ獲得システムにリンクしたサイクリック  ボルタンメトリック  ポテンシオスタット（モデル  ＣＶ５０Ｗ、ＢＡＳ）を用いて行った。使用にさきがけて、作用電極は綿上でアルミナ／ウォータースラリーを用いて磨かれ、そして電気化学的細胞は徹底的に洗浄された。酸素は電気化学的測定の前に、１０分間酸素フリーＮ２を泡立たせることによって反応液から取り除かれた。使用されたスキャンレートは−０．３から−０．８ボルトの範囲を超えた、２５ｍＶ／ｓであった。５ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液が電解液として用いられた。１００μＭ  ＮＲ及び１００μＭ  ＮＡＤがそれぞれ電子媒介物、電子受容体として用いられた。
【００８１】
嫌気的泥を用いた電流の発生
嫌気的泥がイースト  ランシング  セウェイジ  トリートメント  プラント（Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ  ｓｅｗａｇｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｔ）（ＭＩ、ＵＳＡ）から得られた。新鮮な嫌気的泥は固体粒子を除くため、Ｎ２雰囲気下に１日置かれた。生体触媒及び陽極液には、上清（１，２００ｍｌ）が用いられた。それにはエネルギー源として３ｇ／Ｌ  グルコースが添加された。触媒は５０ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩を含む１００ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）であった。
【００８２】
結果
燃料電池による電気発生
微生物代謝酸化により発生される還元力を電気に変換するために用いられる電子媒介物質のＥ０’値は、微生物燃料電池中で生じ得る最大電気量の決めるのに重要である。これらの天然電子媒介物質（すなわち、ＮＡＤ＋およびメナキノン）を用いる人工的電子媒介物質（すなわち、ＮＲおよびチオニン）の化学的特性を表１に示す。ＮＲを用いて生じる電子駆動力は、化学的または微生物学的燃料電池において酸化還元染料をオキシダント（すなわち、フェリシアニド）に連結したときに、チオニンから生じる駆動力よりかなり大きい。この相違は、ＮＲおよびチオニンについてのＥ０’値の差によるものである。結果的に、フェリシアニド還元に連結されたＮＲまたはチオニン酸化から生じるΔＥ０は０．６４５ボルト（ＮＲ）および０．２９６ボルト（チオニン）である。これらのΔＥ０値は、これらの電子媒介物質を用いて燃料電池中で生じた理論的最大電位である。
【００８３】
行った実験の結果は、電子媒介物質として、チオニンよりもＮＲが優れていることを示しており、還元されたＮＲは、微生物燃料電池において電気を発生させるように電子を電極に与えることができる。図２は、化学的燃料電池において電子媒介物質としてＮＲを用いると、チオニンを用いるよりも高い電流を発生させ、発生した電流が用いられるＮＡＤＨ濃度に依存することを示している。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
矢印は、１ｍＭ（円）または３．５ｍＭ（四角）のＮＡＤＨの添加を示している。低いＮＡＤＨ濃度において、電流は全く低い。チオニン還元は、ＮＡＤＨを還元剤として用いる場合にＮＲ還元よりも迅速であったが、電極における媒介物質酸化速度は速度が制限されている。それは、電子媒介物質としてＮＲを用いると、より大きな電流が生じたからである。
【００８６】
ＮＡＤ＋の存在または不存在下におけるＮＲ溶液の周期的電圧電流図は、ＮＲ酸化（上方）および還元（下方）ピークが、ＮＡＤ＋の不存在下における１２回の走査サイクル中にシフトしなかったことを示している（図３Ａ）。いずれのピークも、ＮＡＤ＋添加により増加した（図３Ｂ）。ＮＡＤ＋は、より多くの電子を、電極からＮＲを通してＮＡＤに、およびＮＡＤＨからＮＲを通して電極に単方向に通過させることができる。
【００８７】
図４は、閉鎖回路（電流）（Ａ）および開放回路（電位）（Ｂ）構造において１００μＭのＮＲ（円）または３００μＭのチオニン（四角）を用いるグルコース（１０ｇ／Ｌ）燃料電池において大腸菌休止細胞によりグルコースから発生する電流および電位を比較している。矢印マーク（１）は、電子媒介物質の添加、および（２）は開放回路への変換を示している。用いた嫌気性条件下において、電子団としてチオニンを用いるよりも高い電流および電位水準がＮＲを用いて発生した。嫌気性条件下の対照実験において、Ｏ２はより優れた電子受容体である（すなわち、２つの電子媒介物質よりもＯ２がより高いポジティブＥ０’値を有する）ことから、電子伝達系を通してＮＲおよびチオニンがＮＡＤＨを酸化できないので、電流または電位の高い水準は検出されなかった。嫌気性条件下において、大腸菌は、通常、ＮＡＤＨ酸化を、フマル酸エステルからコハク酸エステル、アセチルＣｏＡからエタノール、またはピルビン酸エステルから乳酸エステルへの還元に連結させる。これらの反応は、燃料電池中のＮＲの存在により阻害され、これらの正常還元代謝最終産物の代わりに電気が発生する。
【００８８】
先の研究（アレンら著、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９〜４０巻：２７〜４０頁、およびサーストンら著、１９９５年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１巻：１３９３〜１４０１頁）は、電子媒介物質としてチオニンを用いる微生物燃料電池において、休止細胞がグルコースを奪われた場合に電流と電位の両方が低下することを示した。我々は、電子団としてＮＲを用いる燃料電池において異なるグルコース濃度から休止大腸菌細胞によりどの程度の最大電気生産性および安定低が生じ得るかを決めるために実験を行った。表２は、１２０オームの外部抵抗を用いるおよび用いない場合の、開放回路とそれに対する閉鎖回路における最大電気生産性および安定性に対するグルコース濃度の効果を示している。燃料電池により生じる最大電流、電位および電気エネルギーは、グルコース（すなわち、燃料）の濃度に比例していた。電子団としてＮＲを用いて、グルコースから得られた最大電流およびクーロン収率は、他の研究においてチオニンを用いて得られたものを大幅に越えていた（デアルニーら著、１９８４年、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ著：１３〜２７頁）。
【００８９】
電子媒介物質としてチオニンを用いる微生物燃料電池についての先の研究（ローラーら著、１９８４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ巻：３〜１２頁、ベネットら著、１９８５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７巻：６９９〜１０５頁）は、休止細胞懸濁液（すなわち、成長の終了後に集めた細胞）のみを用いて行った。ＮＲ（１００μＭ）を電子団として用いて、我々は、嫌気性条件下のグルコース（１０ｇ／Ｌ）微生物燃料電池におけるアクチノバチルスコハク酸生成細菌成長細胞（図５Ａ）および休止細胞（図５Ｂ）の電気的生産性（すなわち、電流および電位）を比較した。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
対照実験（図５Ａ）は、成長収率および速度（四角）が、電気を発生させた場合（三角）に、ＮＲの不存在の方が、ＮＲの存在の場合よりもかなり高いことを示した。発生した電流（中空円）および電位（中実円）は、細胞成長と共に増加した。成長細胞および休止細胞により発生した電位は、同様であったが、休止細胞により生じた電流は、成長細胞により生じたものよりもかなり高かった（約２倍）。グルコース水準が高い場合、単位時間当たり細胞タンパク質１ｍｇ当たりに生じた特定の電流を、成長細胞について１０時間（１．２３５ｍＡ／ｍｇタンパク質／時間）でおよび休止細胞について２時間（２．５９５ｍＡ／ｍｇタンパク質／時間）で計算した。２０時間（グルコースが除かれた後）において成長細胞により合計６８クーロンが発生し、休止細胞は４時間において９０クーロンを発生させた。
【００９２】
電気発生の存在または不存在下に、嫌気的に成長した大腸菌細胞を用いて同様の実験を行った。電気の発生は、成長収率、ＡＴＰ収率および代謝的生成を劇的に低下させる（表３）。表４は、指数期対定常期の大腸菌細胞による基質消費、成長および電気生成を比較する。これらのデータは、指数期細胞によるよりも、定常期細胞による方が、かなり大きな電気が生じることを示している。この結果は、電気発生になり得ない細胞成長に大きな還元力が要求されるので、予想されていた。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
【表４】
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【００９５】
電子団としてＮＲを用いる燃料電池中での電気発生のための触媒としての電位を試験するために、嫌気的スラッジを用いて実験を開始した。図６は、汚水スラッジにより生じる電流および電位に対するグルコース添加の効果、および閉鎖回路構造おいて生じる最大電流に対して開放回路構造において生じる最大電流を示す。番号を付した矢印は、２．２キロオーム抵抗での開放回路かた閉鎖回路への変換（１）；３ｇ／Ｌのグルコースの添加（２）；閉鎖回路から開放回路への変換（３）；および外部抵抗無しでの開放回路から閉鎖回路への変換（４）を示している。触媒として汚水スラッジを用いるグルコース燃料電池の電気的生産性を計算すると合計で３７０．８Ｃ（１６２．８２ＪのＧ）となった。
【００９６】
我々は、ここで、燃料としてグルコースを用いる微生物燃料電池において、チオニンよりも、ＮＲが優れた電子団または電子媒介物質として作用することを示した。さらに、我々は、休止細胞が成長細胞よりも大きな電気を発生し、汚水スラッジのような混合培地が、電子媒介物質としてＮＲを利用する燃料電池における電気発生のための強力な触媒であり得ることを示した。
【００９７】
図７は、電子団としてＮＲを用いる燃料電池における大腸菌またはアクチノバチルスコハク酸生成細菌の正常（Ａ）対電子的グルコース代謝（Ｂ）中に対して、電子媒介物質としてＮＲを用いる燃料電池における大腸菌（またはアクチノバチルスコハク酸生成細菌）代謝特性を説明する我々の作業モデルを要約する。細胞成長、ＡＴＰ合成および、還元された最終生成物の形成は、発生した電気量に対して低下する。ＮＲの存在下において、細胞成長は大きく低下し、ＮＡＤＨは、正常還元最終産物（すなわち、コハク酸エステル、乳酸エステルおよびエタノール）の製造の代わりにＮＲ−媒介電気発生により酸化される。細胞は、基質水準リン酸化（すなわち、酢酸キナーゼ）によりＡＴＰをさらに発生するが、電子伝達媒介リン酸化（すなわち、フマル酸還元酵素）によりＡＴＰを生じることができないので、よりゆっくり成長する。
【００９８】
ＮＲは、電子伝達の速度（電流）および電子伝達収率（クーロン収率）の両方を向上させるので、チオニンよりも電子媒介物質として優れている。ＮＲを用いる微生物燃料電池において生じる最も高い電流（＞１７ｍＡ）は、電子媒介物質としてチオニンを用いて以前に達成されていたよりもかなり高い（ローラーら著、１９８４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４Ｂ：３〜１２頁およびアレンら著、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９〜４０巻：２７〜４０頁）が、電気的にはなお低い。外部空間を含む離れた領域における電気通信を維持するような、低電力ＤＣ微生物燃料電池への適用の可能性がある。
【００９９】
本発明は、例示された実施形態に限定されないが、請求の範囲に入るような全ての修正および変更を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  電子団としてニュートラルレッド（ＮＲ）を用いる微生物燃料電池の模式図である。
【図２】  電子媒介物質としてＮＲ（Ａ）またはチオニン（Ｂ）を用いる化学的燃料電池におけるＮＡＤＨ酸化からの電流生成を示す図である。
【図３】  電極を１００μＭ  ＮＡＤ＋溶液に導入した後の連続サイクルにおける、ガラス状炭素電極を用いて得られる周期的電圧電流図である。
【図４】  大腸菌Ｋ−１２休止細胞およびニュートラルレッドまたはチオニンを用いるグルコース燃料電池中で得られる電流および電位を示す図である。
【図５】  アクチノバチルスコハク酸生成細菌成長または休止細胞を用いて得られる電流および電位水準を示す図である。
【図６】  触媒として嫌気性汚水スラッジおよび電子団としてＮＲ（１００μＭ）を用いるグルコース（３ｇ／Ｌ）燃料電池において発生する電流および電位を示す図である。
【図７Ａ】  正常（Ａ）または電気的（Ｂ）グルコース代謝下における細胞内のエネルギー流動の提案されたモデルを示す図である。
【図７Ｂ】  正常（Ａ）または電気的（Ｂ）グルコース代謝下における細胞内のエネルギー流動の提案されたモデルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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