(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルディセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）ＭＦ−２０００８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１４９）の培養菌糸体を９０〜９５℃の熱水で抽出してなる熱水抽出物を含有してなることを特徴とする抗潰瘍剤。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、すぐれた薬理、健康効果を有する組成物に関するものであり、更に詳細にはコルジセプス・シネンシス菌由来の医薬品タイプ及び／又は飲食品タイプの組成物に関する。
従来の技術
冬虫夏草は、子のう菌類（Ascomycota）、核菌網（Pyrenomycetes）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Clavicipitaceae又はHypocreacea）、冬虫夏草属（Cordyceps）に属し、完全時代と不完全時代とを有する微生物である。
冬虫夏草は、その子実体が、不老長寿の妙薬として、あるいはまた滋養強壮の妙薬として、古来より珍重されてきた。このようにして従来より漢方薬として重用されてきた冬虫夏草は、通常、子実体を粉末化し、これを服用するものである。
これに対して本発明は、特定の冬虫夏草の菌糸体を培養し、得られた培養菌糸体を熱水で抽出したものであるが、このような熱水抽出物に強心作用及び抗疲労作用があることは従来全く知られていない。
発明が解決しようとする課題
本発明は、強心作用、降圧作用、鎮咳作用又は抗疲労作用にすぐれた薬剤又はこれらの作用を有する飲食品を新たに開発する目的で、しかも安全性重視の面から長期間投与にも充分耐えるよう天然物由来の物質を開発する目的でなされたものである。
課題を解決するための手段
上記課題を解決するために各方面から検討した結果、漢方薬に着目し、冬虫夏草、特にコルジセプス・シネンシスに着目し、そして更に研究の末、その培養菌糸体、しかもその熱水抽出物におだやかな強心作用及び抗疲労作用があることを発見し、この新知見に基づき更に研究の結果、遂に本発明を完成した。以下、本発明を詳述する。
図面の説明
図１は、菌糸体熱水抽出物のラット右心房筋収縮力に対する効果を示す。
図２は、菌糸体熱水抽出物のラット右心房収縮間隔時間に対する効果を示す。
図３は、菌糸体熱水抽出物のラットの腺胃に発生した潰瘍のulcer index(cm)を示す。
図４−１は、ラット初代培養肝細胞の3Ｈ−チミジン取り込みを、図４−２は、同じく3Ｃ−バリンの取り込み量を示す。
図５は、菌糸体熱水抽出物のラット胃酸分泌量の抑制効果を示す。
本発明を実施するには、冬虫夏草に属するコルジセプス・シネンシスの菌糸体を培養し、培養菌糸体を取得する必要がある。本発明においては、コルジセプス・シネンシス  ＭＦ−２０００８（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＭＦ−２０００８）が有用であり、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所（現、特許生物寄託センター）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１４９として寄託されている。
培養は、麦芽エキス、イーストエキストラクト、ペプトン、バレイショ煮出汁、ブドウ糖、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類、蛋白質類、及び必要あれば昆虫等寄主の成分を加えた培地を用い、液体ないし固体培養によって充分に増殖せしめる。
大量培養の場合は、液体培養、しかも通気撹拌培養を行うのが好ましく、ｐＨ４〜７、培養温度１５〜３２℃、好ましくは２０〜３０℃、５０〜５００rpm、好ましくは１００〜３００rpm程度にゆっくり撹拌しながら３日〜１０日培養するのが好ましい。
培養終了後、培養物（菌糸体）を熱水抽出する。熱水抽出は、加水し、必要あれば培養物を粉砕した後、６０〜１００℃、好ましくは８５〜１００℃、更に好ましくは９０〜９５℃に加熱し、抽出する。この際、必要あれば撹拌してもよい。水の量に格別の限定はないが、乾燥菌体１ｇ当り好ましくは１ml〜１Ｌとするのがよい。
得られた熱水抽出物は、抽出残渣を除去した後、液状部をそのまま、あるいはその処理物を本発明組成物の有効成分として使用する。処理物としては、液状部の濃縮物、ペースト状物、乾燥物及び／又は液状部の希釈物が広く包含される。また、飲食品に使用する等、場合によっては、抽出残渣を除去することなく、熱水抽出物をそのまま使用すること及びその処理物を使用することも可能である。
本菌糸体の熱水抽出物（処理物も包含する）は、後記する実施例からも明らかなように、おだやかな強心作用、降圧作用、鎮咳作用及び抗疲労作用を有するので、本発明に係る組成物は、これらの作用を使用した飲食品、特定保健用食品、健康飲料、健康食品、栄養食品その他各種タイプの飲食品として用いることができるほか、強心剤、降圧剤、鎮咳剤又は抗疲労剤等医薬品としても用いることができる。
飲食品タイプの組成物として使用する場合には、本有効成分である熱水抽出物（その処理物）をそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。本有効成分を用いる本発明に係る組成物は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、健康ドリンクに製剤化すると好適である。
医薬品タイプの組成物として使用する場合、本有効成分は、種々の形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年令、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は、成人に対して１回約０．１mg乃至１，０００mgを投与することができる。
本発明に係る有効成分は、天然起源でありしかも永年にわたって漢方薬として使用されていたものを起源とするため、毒性は全くないか又は極めて低く、卓越した安全性を示し、ラットに対して１日当り５００mg経口投与したが急性毒性は全く認められなかった。したがって飲食品タイプの組成物として使用する場合は、予防用、保健用、通常の飲食品として使用する場合のいずれにおいても、有効成分の使用量に格別の限定はないし、医薬として使用する場合も、患者に応じて上記範囲内に適宜使用すればよい。また、本有効成分は多量に服用しても格別の急性毒性を示さないので、必要あれば上記範囲よりも多量に使用しても差し支えない。
以下、本発明の製造例及び実施例について詳述する。
製造例１
Ｍ２０Ｙ２培地（１Ｌ中の組成：麦芽エキス（Oxoid）２０ｇ、酵母エキス（Difco）２ｇ；pH５．５）を３Ｌ容三角フラスコ４６本に１Ｌずつ分注し、オートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌した。
これらの滅菌培地に、Cordyceps sinensis MF-20008（中華人民共和国福建省三明真菌研究所より入手）（FERM BP-5149）のＭ２０Ｙ２寒天スラント培養菌糸体を１白金耳接種し、２５℃、１８０rpmの条件で５日間旋回振とう培養を行い、４６本のフラスコ培養から培養物４６Ｌを得た。
培養物４６Ｌを遠心分離し、分離した菌糸体を凍結乾燥して３２３．６ｇの乾燥菌糸体を得た。この乾燥菌糸体をステンレス製容器に入れ、これに精製水７Ｌを加え、ポリトロンで粉砕した後、９０〜９５℃で２時間撹拌しながら加熱し抽出した。抽出後、濾過により抽出残渣を取り除き、そのろ液を凍結乾燥して、淡黄色粉末１３０ｇを得た。
製造例２
製造例１と同様に、Ｍ２０Ｙ２培地１５０mlを５００ml容三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後Cordyceps sinensis MF-2008の凍結保存菌１mlを接種し、２５℃、１８０rpmで５日間振盪培養を行った。これを種菌として、以下の１５０Ｌ培養を行った。
Ｄ培地（１Ｌ中の組成：蔗糖４０．０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ４．０ｇ、アスパラギン ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4 ２．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．０ｇ、ＣａＣＯ3 ０．２５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．１ｇ、酵母エキスＢ−２４．０ｇ、ｐＨ５．６）１５０Ｌを、１５０Ｌファーメンターに無菌濾過処理後投入し、先の種培養液１５０mlを接種し、２５℃、ｐＨ５．５、ＤＯ ５０％に制御し、１５７rpmで撹拌しながら、３日間培養を行った。この間、発生する泡は、シリコン消泡剤投入により処理した。培養により得られた１５０Ｌ培養液を、クラリファイアーにより菌体分離処理を行い、菌体の水懸濁液を得た。これを、９０から９５℃の間で、２時間保持することによる加熱抽出処理を行った後、クラリファイアーによる清澄化を行い、上清液を得た。これを０．４５μｍ及び０．２２μｍ無菌フィルターを用い濾過し、淡黄色の熱水抽出液８０Ｌ（固形物乾重量８００ｇ）が得られた。
実施例１
製造例１において製造した冬虫夏草（MF-20008）培養菌糸体（乾燥菌体）、及びその熱水抽出物（淡黄色粉末）について、経口投与によるマウス遊泳疲労試験を行った。
使用動物として、雄のＩＣＲマウス（５−７週令）を用い、これらを第１群〜第３群に分け、以下の条件で抗疲労試験を行った。
投与方法：冬虫夏草菌糸体熱水抽出物および菌糸体をＣＲＦ−１粉末飼料にそれぞれ２．５％および５％混合した粉末飼料を１６日間連続摂取させた。
群構成：各群２０匹
（１）対照群          ：ＣＲＦ−１粉末飼料
（２）熱水抽出物投与群：２．５％熱水抽出物混合飼料
（３）菌糸体投与群    ：５％菌糸体乾燥物混合飼料
試験スケジュール：投与開始１５日目に強制遊泳試験を実施した。
投与開始１６日目に全採血し、全血分析および血清分析用試料とした。
（１）遊泳疲労試験は、３６Ｌの水槽（４９cm×３３．５cm×深さ２２cm）内に水温１７℃の水をはり、１０mlの中性洗剤を添加した遊泳槽の中でマウスを強制的に遊泳せしめて行い（荷重なし）、５秒間鼻先が水没した時点を遊泳試験の終点とした。得られた結果を下記表１に示す。
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上記結果に基づき、Aspin-Welchの検定による有意差検定を行った結果、第１群と第２群間には、危険率１％で、群間に有意な差が認められた。しかし第１群と第３群間には、危険率５％で、群間に有意な差が認められなかった。
遊泳疲労試験は、動物個体における総合的な反応の変化による抗疲労作用を評価するために常用される試験のひとつであるので、上記結果は、本発明において使用する有効成分が卓越した持久的運動能力の増加及び抗疲労作用を有することを科学的に立証したものにほかならない。
（２）上記遊泳疲労試験に用いたマウスの全血分析のため、投与開始１６日目に全採血し、血小板数（×１０，０００／mm2）、血色素量（ｇ／dl）、赤血球数（×１０，０００／mm2）、白血球数（／mm2）、ヘマトクリット（％）について分析を行った。
全血分析結果を、下記表２に示す。これらの結果から明らかなように、すべての項目において、対照群との間に危険率５％では、有意な差は認められなかった。（Student-testを用いる。但し、第３群血小板数のみはAspin-Welch testを用いた。）
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（３）供試マウスについて、試験期間中における体重測定を行い、平板体重（ｇ）の推移を下記表３（マウス強制遊泳試験：体重変化）に示した。
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実施例２
製造例１において製造した冬虫夏草（ＭＦ−２０００８）菌糸体の熱水抽出物について、ＳＤラットから摘出した右心房、右心室乳頭筋、大動脈、気管支を用いて、角尾らの方法（Kurokawa M. and Tsunoo A., J. Physiol., 407, 135-153, 1988；Tsunoo A. et. al., J. Physiol., 433, 163-181, 1991）に従い、その効果を試験し、有効性を確認した。
（１）心筋標本
熱水抽出物を適用して、雄ラット右心房に対する心筋の収縮力及び収縮間隔時間をそれぞれ測定した。
雄ＳＤラット（３８０〜４５０ｇ）からペースメーカー機能を保持したまま右心房を摘出した。右心房標本は容積０．８mlの横型かん流槽に固定し、収縮力を等尺性に記録した。かん流液は９５％酸素、５％炭酸ガスで平衡させたクレブス液、または以下の組成を持ち、通気させた塩溶液（塩化ナトリウム１４０mM、塩化カリウム５mM、塩化カルシウム２．６mM、塩化マグネシウム１．３mM、グルコース１０mM、ＨＥＰＥＳ５mM）を使用した。かん流液は３６〜３７℃に保ち、流速は３〜４ml／分とした。
その結果、菌糸体の熱水抽出物（５０〜１００μｇ／ml）は右心房筋の収縮力を対照の９±３％（平均±標準偏差、ｎ＝５）増加させた。ペースメーカーによる自動収縮の間隔時間を対照の１４±１０％（ｎ＝４）延長させた。図１および図２に、それぞれ右心房筋の収縮力増加および収縮間隔時間の延長の時間経過を示す。
図１及び図２の太い棒線の期間、抽出物溶液（６０μｇ／ml）を適用した。縦軸は対照（適用前）を１とした相対収縮力値を示す。横軸は時間で、抽出物溶液が入った時点を０とし、それより前はマイナス値で示した。
上記からも明らかなように、熱水抽出物による右心房自動収縮に対する有効性が確認された。更に、右心室乳頭筋を摘出し上記と同様にかん流槽に固定し白金線を通して電気刺激（２Hz）を与え、自動収縮を起こさない右心室乳頭筋の電気刺激による収縮に対する同抽出物の有効性を測定した。その結果、同抽出物（３０〜１００μｇ／ml）は、右心室乳頭筋の電気刺激による張力を、対照の１３±１％（ｎ＝３）増加させた。
（２）大動脈標本
熱水抽出物を適用して、雄ＳＤラット大動脈に対する作用及び５０mMカリウムを適用した場合に生じる抑制作用を測定した。
雄ＳＤラットから大動脈を摘出し、螺旋状切片標本を作成した。標本は上記と同じ条件でかん流槽に固定した。刺激用の５０mMカリウム液は塩化ナトリウムを塩化カリウムに置換して作製した。
その結果、菌糸体熱水抽出物（５０〜１００μｇ／ml）は、静止状態にある大動脈に対し著名な効果をおこさなかった。しかし、５０mMカリウムにより引き起こされる持続性収縮を弛緩させた。５０mMカリウムによる収縮張力を１００％とした場合、それの張力を２〜１２％（ｎ＝５）低下させた。
（３）気管支標本
熱水抽出物を適用して、雄ＳＤラット気管支の電気刺激による収縮に対する同抽出物の効果、及び５０mMカリウムによる収縮に対する同抽出物の効果を測定した。
雄ＳＤラットから気管支を摘出し、螺旋状標本を作成した。標本は上記と同じ条件でかん流槽に固定した。刺激用５０mM塩化カリウム液も同様に作製した。電気刺激は、かん流槽内の白金線を通して３０秒間隔で行った。
その結果、菌糸体熱水抽出物（５０〜１００μｇ／ml）は、電気刺激による一過性収縮を対照の２３〜６５％（ｎ＝３）抑制した。また、５０mMカリウムによる持続性収縮を弛緩させた。５０mMカリウムによる収縮の張力を１００％とした場合、それの９〜１３％（ｎ＝３）張力を低下させた。これはテオフィリン（５０μＭ）と同等またはそれ以上の弛緩効果であった。
（１）〜（３）の結果から明らかなように、菌糸体熱水抽出物は、▲１▼おだやかな持続性の心筋収縮力増強作用を持ち、かつ収縮間隔の延長をもたらす。▲２▼血管拡張作用を有し、全身の血流量増加をもたらす。▲３▼気管支の一過性および持続性収縮を抑制することから、気道抵抗の低下をおこし肺換気の効率増加をもたらす、と考えられる。すなわち、本発明に係る組成物には、強心作用、降圧作用及び鎮咳作用があることが科学的データから確認された。
実施例３
製造例１で製造した冬虫夏草菌糸体の熱水抽出物（凍結乾燥品）を、ラットを用いて水浸拘束ストレス潰瘍試験を行い、抗ストレス作用について検討した。
・使用動物
Sprague-Dawley系雄性ラット（日本チャールズ・リバー）を５週令で購入し、約１週間の予備飼育を行った後、６週令で使用した。
・投与方法
冬虫夏草熱水抽出物を、５０mg／mlの濃度に注射用蒸留水に溶解した後、おおよその一日使用量分ずつに分注し、凍結して保存した（−２０℃）。使用時、室温で融解して使用した。control群には注射用蒸留水を使用した。投与は、ラット用金属胃ゾンデを用いて経口投与を行った。投与用量、投与液量及び投与スケジュールは、表４中に示した。投与液量は最新の体重より算出し、投与は原則として午前９時〜１２時に行った。
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・水浸拘束ストレス潰瘍試験（ストレス負荷はday 10-11、overnight）
水浸拘束ストレスをかける約１２時間前より、ラットは絶食させた。絶食後、ラットをストレスケージに入れ、剣上突起の下まで水に浸けた。水浸拘束時間は、１５時間であった。ストレス負荷終了後、ラットを麻酔下に屠殺し、噴門部上部と十二指腸部を結紮して胃を摘出した。生理食塩液を胃内に注入後、胃をホルマリン液に浸け、その約１５分後に胃を開き、腺胃に発生した潰瘍の長さを測定した。測定後、胃はホルマリン固定を行い、病理組織学的検査により次の基準で潰瘍のスコアーを付け評価した。
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結果を図３及び表５に示す。
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実施例４
抗疲労作用の指標の一つとして、冬虫夏草の培養菌糸体熱水抽出物のラット初代培養肝細胞に対するＤＮＡ合成、タンパク質合成促進作用活性を検討した。
・ウシ小腸上皮粘膜由来の肝細胞成長因子を含む抽出液の調製及びその特徴
ウシ小腸上皮粘膜よりメタノール可溶成分を抽出したものは、ゲル濾過の結果低分子を主に含んでいるので、低分子画分（ＬＭＷ）と呼ぶ。一方、ウシ小腸上皮粘膜をメタノールで抽出した残渣をＰＢＳで抽出したものは、タンパク性の高分子を主に含んでいるので、高分子画分（ＨＭＷ）と呼ぶ。
ラット初代培養肝細胞にＬＭＷを加えると、インスリンの存在下で、ＤＮＡ、タンパク質合成を促進する。ＬＭＷとＨＭＷを組み合わせて加えると、ＤＮＡ、タンパク質合成がＨＭＷの活性の分だけ相加的に上昇する。すなわち、ＬＭＷがこのアッセイ系で主な活性を示し、ＨＭＷは相加的な作用を持つ。冬虫夏草熱水抽出物は、抽出法から低分子画分を含むものであるため、ラット初代培養肝細胞を用いて、１％ＨＭＷ及び１×１０-7Ｍインスリン存在下で冬虫夏草熱水抽出物を加え、ＤＮＡ及びタンパク質合成促進作用を3Ｈ−チミジン及び14Ｃ−バリンの取り込み量を指標として測定した。
・結果
冬虫夏草菌糸体の熱水抽出物を、インスリン、ＨＭＷ存在下でラット初代培養肝細胞系に加えた場合、明らかにＤＮＡ、タンパク質の合成を促進した。結果をそれぞれ図４−１及び図４−２に示す。インスリン、ＨＭＷを除いた場合には顕著な活性は見られなかった。インスリンのみを加えた場合でも活性は見られないので、インスリン及びＨＭＷの存在下でＤＮＡ及びタンパク質を合成するものと思われる。
実施例５
製造例１で製造した冬虫夏草（MF-20008）菌糸体の熱水抽出物をラットに投与して、ラット胃酸分泌量の抑制効果を検討した。
ラットは、ＳＤ系ラット雄（日本チャールズ・リバー株式会社）を５週令で予備飼育を４日間行った後、一般状態で健康なものを使用した。
冬虫夏草菌糸体熱水抽出物投与群と対照群を設定し、１群動物数は４匹とした。
投与検体の調製は、精製水（和光純薬工業株式会社：Lot No. YLE9566）で冬虫夏草菌糸体熱水抽出物を１００mg／mlに溶解し凍結保存したものを用いた。
投与方法は、精製水、検体を、所定濃度の投与液を金属層ゾンデを用いて経口投与した。投与時間は毎日午前９時とし、１２日目は幽門結紮直後に十二指腸内に投与した。
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胃液分泌の測定方法は以下のようにして行った。
ラットを１７時間絶食後、エーテル麻酔下で開腹し、幽門部を結紮した。４時間後に動物を頚椎脱臼で致死せしめ、胃を摘出して貯留している胃液を採取した。胃液を３，０００rpmで５分間遠沈し、胃液量（ml／ラット）、胃液酸度（mEq／ｌ）及びｐＨを測定した。酸度はｐＨメーターを用い、0.01N NaOHでpH７．０まで滴定した。また胃液量及び酸度より１時間当たりの酸排出量（μEq／hr）を算出した。被験物質は幽門結紮直後に十二指腸内に投与した。
結果を図５に示す。
実施例６
製造例１で得た熱水抽出物粉末１００ｇ、糖類１５０ｇ、蜂蜜１５ｇ、アスコルビン酸１ｇ、クエン酸０．５ｇ、香料適量に水を加えて１kgとし、これを９５℃で２０分間殺菌し、１００mlずつ無菌的にビンに充填して、飲食品タイプの健康ドリンクを製造した。
実施例７
製造例１で得た熱水抽出物粉末の２０％水溶液２００ｇ、酢酸トコフェロール５ｇ、硝酸チアミン１０ｇ、ニコチン酸アミド２０ｇ、無水カフェイン５０ｇ、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて３０Ｌとし、殺菌した後３０mlずつ無菌的にビンに充填して、医薬品としての健康ドリンクを製造した。
実施例８
（１）製造例１で製造した物質            ５０ｇ
（２）ラクトース                        ９０ｇ
（３）コンスターチ                      ２９ｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム            １ｇ
（１）、（２）及び（３）（但し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたり有効成分（１）を５０mg含有する錠剤１０００個を製造した。
発明の効果
本発明によって、天然物由来の安定性がすぐれしかもおだやかな強心作用、降圧作用、鎮咳作用及び抗疲労作用を併有する組成物が、天然物由来でありながら培養法を採用することにより安定的且つ工業的に供給される。
規則第１３規則の２の寄託された微生物への言及
１．ＭＦ−２０００８
イ  当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名  称  通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名  〒３０５  日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
ロ  イの寄託機関に寄託した日付
平成６年（１９９４年）６月２９日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した寄託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１４９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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