(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量２０，０００〜４，０００，０００の２分子以上の担体が酵素を介して結合し、該担体に酵素が結合した複合体に、プローブ分子が結合したブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項２】
担体と酵素分子とが、担体上の官能基と酵素分子内の糖鎖を酸化して得られるアルデヒド基により結合している、請求項１に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項３】
担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β−ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１または２のいずれか１項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項４】
酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１または２のいずれか１項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項５】
プローブが抗体分子もしくはその機能性断片、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン、レセプター、およびアビジン類からなる群より選ばれる１種以上である、請求項１または２のいずれか１項に記載の酵素プローブ複合体。
【請求項６】
２種類以上のプローブを結合させた請求項１から５のいずれか１項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項７】
抗体分子もしくはその機能性断片が抗ＨＣＶコア抗原抗体、抗ガストリン放出ペプチド前駆体抗体およびそれらの機能性断片からなる群より選ばれる１種以上である、請求項５または６に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項８】
ブロック化酵素プローブ複合体の分子量が４４０，０００以上である請求項１から７のいずれか１項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに１項に記載のブロック化酵素プローブ複合体を含む免疫測定用キットまたは核酸検出試薬。
【請求項１０】
分子量２０，０００〜４，０００，０００の担体と酵素を結合させブロック体を形成するステップ、及びそのブロック体にプローブを結合させるステップからなる、請求項１から８のいずれか１項に記載のブロック化プローブ複合体を製造する方法。
【請求項１１】
担体と酵素分子の重量比が担体：酵素＝１：０．１〜１：２０で反応させてブロック体を形成させる請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブを酵素標識する技術に関するものであり、作製されたブロック化酵素プローブ複合体は酵素免疫測定法や免疫組織化学などの免疫反応を利用する免疫測定に広く用いられる。
【背景技術】
【０００２】
プローブを酵素によって標識した酵素標識プローブは、免疫学的な検出法あるいは測定法において広く、一般的に用いられてきた。例えば、プローブを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素で標識したものは、免疫組織化学や酵素免疫測定法などの検出の段階において使用可能である。【０００３】
免疫組織化学法や酵素免疫測定法は生体内の自己の抗原あるいは外来抗原を検出する方法として、長い間汎用されてきた。これらの免疫反応を利用した検出法は特異性と感度が高いため、生体内に存在する微量な物質を単離することなく、検出することができる。しかし、生体内には通常の免疫組織化学法や酵素免疫測定法では検出できないような微量の物質も数多く存在するため、それらを検出することを目的として、測定方法の感度を上昇させる方法が検討されてきた。【０００４】
例えば、癌マーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテインなどは正常人の血清中の濃度は５〜２０ｎｇ／ｍｌであるが、ヒトガストリン放出ペプチド前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）  などは正常人の血清中の濃度は１４ｐｇ／ｍｌ程度であり、ＰｒｏＧＲＰを測定するためには１０００倍ほどの感度が必要である。また外来抗原においても、Ｃ型肝炎ウイルスは、血中に存在するウイルス量が非常に少ないため、高感度な抗原検出法が望まれていた。その抗原を検出するためには、１００−１０００コピーのウイルスＲＮＡを検出する感度が必要で、蛋白質の濃度ではおよそ０．０３−０．３ｐｇ／ｍｌの感度が必要である。【０００５】
このような生体内に存在する微量な抗原あるいは物質を検出するために、免疫測定法の高感度化が測られてきた。この酵素免疫測定法の高感度化の検討については石川らが詳しく解説している（非特許文献１参照）。酵素免疫測定法の測定感度に影響を与える因子としては、測定系の種類、標識の検出感度、標識法の種類、免疫反応の時間、抗原と抗体の親和性などが考えられる。また実際にサンドイッチ法で抗原を測定する場合に高感度化に影響する条件としては、抗体の固相化条件、抗原の反応効率、酵素標識抗体の反応効率、標識抗体の固相への非特異吸着の軽減、標識抗体の添加量、免疫反応の時間、免疫反応の温度、ｐＨ、イオン強度、緩衝液の種類、抗原決定基の立体的位置と数などがあると考えられる。【０００６】
上記の検討に加えて、酵素免疫測定法の高感度化の方向として、検出段階における酵素と抗体の架橋に関する標識方法の改良が行われてきた。各種の標識抗体の調製法が知られており、特に石川らによって報告された標識抗体の調製法は、一般の診断薬に広く応用されている。これらに代表される方法は、主に抗体（ＩｇＧであれば、分子量約１５０，０００、Ｆａｂ’（分子量約４６，０００））であれば１分子に酵素を１〜数分子結合させるものであり、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（分子量：４０，０００）を３分子とＩｇＧを１分子結合させた結合体の総分子量は、４０，０００×３＋１５０，０００＝２７０，０００となる。また、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）（分子量：１００，０００）を３分子とＩｇＧを１分子結合させた結合体の総分子量は、１００，０００×３＋１５０，０００＝４５０，０００となる。しかしながら、石川らは、最も高感度に測定するには抗体、特にＦｃ部分を除去したＦａｂ’部分と酵素の１分子：１分子が望ましいことを述べ、抗体１分子に対して単一の酵素分子を共有結合させる方法が開発された（非特許文献２参照）。酵素と抗体の比率が１：１で結合した酵素抗体標識法の場合、たとえばＨＲＰを１分子とＦａｂ’を１分子結合させた結合体の総分子量は、４０，０００＋４６，０００＝８６，０００となる。このように、一般的に酵素標識体は総分子量２００，０００以下のものが用いられていることが多い。【０００７】
免疫測定法の高感度化の方向として、ステップ数を増加させてシグナルを上昇させる試みも各種行なわれてきた。たとえば、ビオチンとアビジンの高結合性を利用して、主に第二抗体にビオチンを数分子以上導入しておき、そのビオチン化第二抗体を被分析物と反応させた後、過剰量ビオチン化第二抗体を除去する。その後、アビジン化酵素を添加しビオチン化第二抗体−アビジン酵素のコンプレックスを形成させ、第二抗体に結合する酵素数を増加させて感度を高めるものである。アビジン酵素の代わりにアビジン−ビオチン酵素のコンプレックスも使用することが可能である。また、Ｂｕｔｌｅｒらはペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ抗体という抗体酵素複合体を記載している（非特許文献３参照）。Ｂｏｂｒｏｗらは、ペルオキシダーゼ標識第二抗体を被分析物と反応させ過剰量のペルオキシダーゼ標識第二抗体を除去した後、ビオチン−Ｔｙｒａｍｉｄｅを添加し、ペルオキシダーゼ標識第二抗体周辺のブロッキング蛋白にラジカルとなったビオチン−Ｔｙｒａｍｉｄｅを結合させ洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて酵素シグナルを増幅させている（非特許文献４参照）。しかしながら、これらの方法はステップ数が増加する、測定時間が長時間になるといった欠点を有する。【０００８】
抗体に結合させる酵素の分子数を増加させるため、ある担体に酵素を結合させ、その上でその酵素の結合した担体上に抗体を結合させる方法が報告されており、この方法によればステップ数を最小限として高感度化を行なうことができる（特許文献１参照）。この方法はアミノ基をもつ担体にマレイミド基またはチオール（ＳＨ）基を導入し酵素を結合させ、残った担体の少なくとも１つのアミノ基にマレイミド基を導入して、抗体を担体に結合させる方法である。この方法は担体を介して抗体と酵素を結合させるために、抗体と酵素を直接結合させるよりも多数の酵素が結合するため感度を上昇させることができるように思われる。しかしながら、発明者らは担体の分子量を５，０００〜５００，０００、好ましくは１０，０００〜３００，０００がよいと記載している。この場合、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを酵素とすると分子量は約４０，０００程度である。担体の分子量が５００，０００あるとしても、物理的にも空間的にも５００，０００の分子に結合できる４０，０００の分子の数は限られるのは当然であり、担体に結合可能な酵素の分子数にも限界がある。つまり、担体に酵素と抗体を結合させれば、担体中の官能基を酵素と抗体で分け合わなければならないため、酵素の数が少なくなりシグナルは低くなる。酵素を多く結合させれば抗体の結合空間が少なくなり、抗原との反応性が低下する。つまり、できるだけ抗体と酵素をたくさん同一担体上に結合させればよいのであるが、巨大分子の調製過程によっては凝集塊・沈殿などが生じ、測定時にバックグランドの上昇を引き起こし、結果として感度は低下することが多い。
【特許文献１】特開２０００−８８８５０
【非特許文献１】超高感度酵素免疫測定法、石川榮治、１９９３年、学会出版センター
【非特許文献２】Ｉｍａｇａｗａほか、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４巻；４００，１９８２
【非特許文献３】Ｂｕｔｌｅｒ，（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３巻；４８２〜５２３
【非特許文献４】Ｂｏｂｒｏｗ，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５，２７９−２８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは上記特許出願に記載された製造方法に従って酵素標識プローブを試験的に作製し、高感度が必要なＰｒｏＧＲＰの測定やＨＣＶ抗原の測定系に応用してみた。しかしながら、これらの生体内に存在する微量な物質を測定する系においては、従来のものより感度が高い酵素標識プローブを使用しても十分な感度が得られるわけではなかった。従って、本発明中の課題は高感度の測定系に使用できる、感度の高い酵素標識プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは高感度な酵素標識プローブを得るために検討を行った。その結果、２分子以上の担体を酵素を介して結合させ、かつ担体に酵素が結合しているブロック体を形成させた。そしてそのブロック体にプローブを結合させることにより、目的の高感度なブロック化酵素プローブ複合体を得ることに成功した。【００１１】
即ち、本発明は
（１）分子量２０，０００〜４，０００，０００の２分子以上の担体が酵素を介して結合し、該担体に酵素が結合した複合体に、プローブ分子が結合したブロック化酵素プローブ複合体。
（２）担体と酵素分子とが、担体上の官能基と酵素分子内の糖鎖を酸化して得られるアルデヒド基により結合している、（１）に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（３）担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β−ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡからなる群より選ばれる１種以上である、（１）または（２）に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（４）酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる群より選ばれる１種以上である、（１）または（２）に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（５）プローブが抗体分子もしくはその機能性断片、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン、レセプター、およびアビジン類からなる群より選ばれる１種以上である、（１）または（２）に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（６）２種類以上のプローブを結合させた（１）〜（５）のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（７）抗体分子もしくはその機能性断片が抗ＨＣＶコア抗原抗体、抗ガストリン放出ペプチド前駆体抗体およびそれらの機能性断片からなる群より選ばれる１種以上である、（５）または（６）に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（８）ブロック化酵素プローブ複合体の分子量が４４０，０００以上である（１）〜（７）のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体を含む免疫測定用キットまたは核酸検出試薬。
（１０）分子量２０，０００〜４，０００，０００の担体と酵素を結合させブロック体を形成するステップ、及びそのブロック体にプローブを結合させるステップからなる、（１）〜（８）に記載のブロック化プローブ複合体を製造する方法。
（１１）担体と酵素分子の重量比が担体：酵素＝１：０．１〜１：２０で反応させてブロック体を形成させる（１０）に記載の方法。【００１２】
また本発明の（１）の分子量２０，０００〜４，０００，０００の２分子以上の担体の結合は、酵素を介さない結合も含まれる。例えば官能基を有するリンカーや、タンパク質でも可能である。さらに担体、酵素、プローブのそれぞれの結合は、官能基を有するリンカー分子を介しているブロック化酵素プローブ複合体を含む。【００１３】
つまり本発明は、担体を酵素またはリンカーを介して結合させ、その分子に酵素およびプローブを結合させることにより、多くの酵素分子やプローブ分子を一分子中に有するブロック化酵素プローブ複合体である。【００１４】
本発明のブロック化酵素プローブ複合体は、担体に酵素を結合させてブロック体を形成し、このブロック体にプローブ分子を結合させて製造することができる。また、本発明のブロック化酵素プローブ複合体は、担体に酵素とプローブを結合させて結合体を形成し、この結合体を互いに結合させてブロック化しても製造することができる。【００１５】
本発明では、酵素により担体を結合させ、分子量を大きくすることにより、より多くの酵素またはプローブをそのブロック体に結合させることができる。また一方でブロック体の表面にプローブが結合しているため、立体障害がおこりにくく、プローブ分子サイズに関わらず作製可能である。また、ブロック化酵素プローブ複合体の最終的な産物としては、分子量４４０，０００以上のブロック化酵素プローブ複合体の効果が高く、さらに６６８，０００以上のものがより高感度となる。原則的にはブロック化酵素プローブ複合体の分子量の大きなものほど複合体一分子に結合している酵素の量が多くなり、感度が上昇する。本発明に記載された方法で分子量の大きなブロック化酵素プローブ複合体が作製できるが、さらに分子量の大きなブロック化酵素プローブ複合体を選択するためにはゲルろ過などの方法が利用できる。【００１６】
このブロック化後の分子量は、使用する担体、酵素、プローブの種類によって多少変動はあるものの、いずれも液体中でブロック化酵素プローブ複合体が沈殿あるいは沈降しない分子量であればよく、特に上限は規定されるべきものではない。参考値としては、Ｄｅｘｔｒａｎを担体として用いた場合には２０，０００，０００でも何ら問題なく（後述の実施例１および６）、４０，０００，０００〜１００，０００，０００でも問題は生じない。【００１７】
本発明は当初イムノアッセイ、免疫組織化学の分野において使用できる酵素プローブ複合体について検討する過程でなされたものであるが、他の分野に適用することに制限はない。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の酵素標識抗体は生体内に微量にしか存在しない抗原、蛋白質を検出する際に従来の酵素標識抗体では検出不可能であったものを検出可能にするものである。この酵素標識抗体を用いれば従来測定不可能であった抗原や蛋白質が測定可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明でいう担体とは、分子量２０，０００〜４，０００，０００のものであれば特別な制限はない。しかしながら、感度をより向上させるためには、多数の酵素が結合できるものが望ましいため、ある程度の分子量をもったものが望ましい。担体の例としては、多糖類や高分子量蛋白質やペプチドポリマーが挙げられ、それらの分子量が２０，０００〜２０，０００，０００、好ましくは２０，０００〜４，０００，０００、さらに好ましくは７０，０００〜２，０００，０００のものが適している。また、多糖類やペプチドポリマーを使用する場合、同じ分子量でも側鎖に富んだもののほうが、シグナルが高い傾向にある。【００２０】
本発明における多糖類の担体としては、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、可溶性でんぷんなどが例示される。また、本発明における高分子量蛋白質の担体としては、β−ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニンなどが例示される。また、本発明におけるペプチドポリマーの担体としては、ポリリジンのほか各種ペプチドポリマーが使用できる。【００２１】
本発明で使用されうる酵素には特別制限はないが、免疫測定法において一般的に使用されている西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどが適時使用される。酵素は２分子以上の担体又は担体とプローブ分子とに結合するため、２個以上の官能基、たとえば糖鎖とアミノ基、または２個以上のアミノ基、アミノ基とカルボキシル基、チオール基とアミノ基などをもつ酵素が望ましい。【００２２】
担体と酵素の結合には、どのようなリンカーや結合様式を用いてもよいが、担体と酵素の結合後、そのブロック体にプローブを結合させる必要性があるため、酵素または担体に官能基を残して置く必要性がある。【００２３】
たとえば、分子量２０，０００〜４，０００，０００の担体に存在するヒドラジン基、若しくは適当なリンカー分子を用いて担体に導入したヒドラジン基を介して酵素分子と結合させ、または適当なリンカー分子を用いて酵素分子に導入したヒドラジン基を介して該担体と結合させ、該酵素を介したブロックを作製できる。このブロック体中の担体又は担体に結合している酵素分子内の官能基を介してプローブ分子を結合させることによりブロック化酵素プローブ複合体を作製することができる。【００２４】
また適当なリンカー分子を用いて分子量２０，０００〜４，０００，０００の担体に導入したヒドラジン基と酵素分子内の糖鎖を酸化して得られるアルデヒド基を結合させて担体と酵素分子を結合し、さらに該酵素分子を介してブロック化したブロック体中の担体又は担体に結合している酵素分子内の官能基に結合させたリンカー分子を介してプローブ分子を結合させることにより、同様にブロック化酵素プローブ複合体を作製可能である。【００２５】
この場合、担体または酵素に導入するヒドラジン基をもつリンカー分子はヒドラジン基（−ＮＨＮＨ２）を有する硫酸ヒドラジンや塩酸ヒドラジンのようなヒドラジン塩類でもよいし、ヒドラジン基（−ＣＯ−ＮＨＮＨ２）を有するヒドラジド類あるいは官能基とヒドラジド基を有する物質でもよい。【００２６】
また担体または酵素分子とプローブ分子を結合させるリンカー分子はマレイミド基、スクシミジル基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を持つものであれば使用可能である。【００２７】
また、担体上のヒドラジン基などの官能基の数にもよるが、酵素を介したブロック化酵素を調製する際の担体の重量に対する酵素の重量は、０．２〜１０倍が望ましく、さらには、０．３〜５倍が望ましい。【００２８】
さらに一例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の糖鎖を酸化させ、ヒドラジン基を導入した分子量２０，０００以上のＤｅｘｔｒａｎに結合させ、酵素を介してブロック化酵素を調製する。担体上の残存ヒドラジン基及びＨＲＰの残存アミノ基にＮ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ）のようなリンカー分子を結合させ、ブロック化酵素表面にマレイミド基を導入させ、プローブ分子中またはプローブに導入したＳＨ基を反応させ、ブロック化酵素プローブ複合体を調製する。このようにブロック化酵素プローブ複合体を作製するために酵素の糖鎖を利用し、プローブの結合に残存ヒドラジン基や残存アミノ基を利用するものである。【００２９】
ブロック体とプローブの結合には、どのような架橋剤を用いてもよく、またどのような結合様式でもよい。好ましくは、水溶液中で安定性が高いヘテロ二官能性架橋剤もしくはホモ二官能性架橋剤が望ましい。【００３０】
プローブとしては、抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂｃ’）、Ｆａｂｃ’など）、各種レセプター、各種アビジン（アビジンＤ、ストレプトアビジンなど）、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、各種レクチン（コンカナバリンＡ、レンチルレクチン、インゲンマメレクチンなど）、各被分析核酸結合プローブなどが使用できる。【００３１】
抗体は、目的とする抗原あるいは被分析物と結合するものであればよい。抗体はペプシンやパパインといったプロテアーゼを用いて、Ｆ（ａｂ’）２やＦａｂといった断片を得ることができる。一般的に抗体の重鎖（Ｈ鎖）は、Ｓ−Ｓ結合により重鎖同士が結合しており、その結合は還元剤にて切断される。還元剤としては、システアミンやメルカプトエタノールなどがあげられ、Ｆ（ａｂ’）２もこのような還元剤でＦａｂ’に切断されチオール（ＳＨ）基が新たに生じる。本発明には、抗体のこれらの断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂｃ’）、Ｆａｂｃ’など）も使用することができる。【００３２】
本発明をさらに詳しくかつ非限定的に説明するために、以下に酵素プローブ複合体の製造方法およびそれらの性能について実施例を挙げる。
【実施例１】
【００３３】
担体としてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００を用いた酵素−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の調製
Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００（平均分子量２，０００，０００；アマシャム）０．３ｇを秤量し、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）６ｍｌに溶解する。過ヨウ素酸ナトリウム溶液を３ｍｌ添加混合し、室温で２時間静置反応させ、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５、アマシャム）をおこないボイド画分を分取し、ヒドラジン塩酸塩（和光純薬）を添加して、デキストランにヒドラジンを導入した。理論的には分子量２，０００，０００のデキストランには最大で２２，０００のヒドラジンが導入される。ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、東洋紡）１００ｍｇを秤量し、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液３ｍｌに混合溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を１．５ｍｌ添加混合し、室温で２時間静置反応させた。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）により脱塩後、先に得られた約１５０ｍｇのデキストランヒドラジドを添加混合して、室温で２時間反応させ、還元後、グリシンを０．１Ｍとなるよう添加し、４℃で４時間ずつ３回透析をおこない、ブロック化担体ＨＲＰ結合物を得た。このとき結合しなかったＨＲＰは１０％以下であったことから、回収率も含めてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００（平均分子量２，０００，０００）１分子に約１２−１６個のＨＲＰが結合したと考えられる。この結合物５ｍｇに、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させたＮ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ，同仁化学）１ｍｇを添加し室温で２時間反応させ、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）で過剰のＥＭＣＳを除去し、担体ＨＲＰ結合物にマレイミドを導入させた。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体３．５ｍｇ（ｃ１１−１０Ｆ（ａｂ’）２とｃ１１−１４Ｆ（ａｂ’）２を等量混合）のＦ（ａｂ’）２溶液に、０．１Ｍシステアミン塩酸塩を１／１０容量添加し、３７℃で９０分間インキュベーションおこないＦａｂ’とした。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）を行い、ボイド画分を分取しＦａｂ’を得た。このＦａｂ’とマレイミド基を導入した担体ＨＲＰ結合物を一晩４℃で反応させ、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ，１．６×６０ｃｍ、アマシャム）をおこない遊離のＦａｂ’を除去する。このとき、本発明のＨＲＰ−Ｆａｂ複合体はほぼボイド画分近傍に出現する。このとき遊離のＦａｂ’は、１０％以下であったことから、回収率も含めてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００（平均分子量２，０００，０００）１分子あたり約６−１０個のＦａｂ’が結合したと考えられる。この分取されたフラクションに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．５％になるように添加し４℃で保存した。このようにして調製されたＨＲＰ−Ｆａｂ複合体の４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から複合体のＨＲＰ濃度を求めた。
【実施例２】
【００３４】
担体としてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ７０を用いた酵素−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の調製
Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ７０（平均分子量７０，０００；アマシャム）０．３ｇを秤量し、実施例１と同様にＨＲＰ−Ｆａｂ複合体を得、４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から複合体中のＨＲＰ濃度を求めた。
【実施例３】
【００３５】
担体としてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００を用い、担体と酵素の量比を変えた酵素−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の調製
Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００（平均分子量５００，０００；アマシャム）０．３ｇを秤量し、実施例１と同様の担体（１５０ｍｇ）：酵素（１００ｍｇ）の重量比（０．６６）、担体１００ｍｇに対して酵素量を３倍量（３００ｍｇ）の重量比（２．００）および５倍量（５００ｍｇ）の重量比（３．３３）で担体−酵素結合物を調製し、その後実施例１と同様に抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体を結合させた。４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から複合体中のＨＲＰ濃度を求めた。
【実施例４】
【００３６】
担体としてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００を用いた酵素−抗ＰｒｏＧＲＰ抗体複合体の調製
Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００（平均分子量５００，０００；アマシャム）０．３ｇを秤量し、実施例１と同様に担体ＨＲＰ結合物を得た。この結合物５ｍｇに、ＤＭＦに溶解させたＥＭＣＳ  １ｍｇを添加し室温で２時間反応させた。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）で過剰のＥＭＣＳを除去し、担体ＨＲＰ結合物にマレイミドを導入させた。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体（２Ｂ１０）のＦ（ａｂ’）２溶液に、０．１Ｍシステアミン塩酸塩を１／１０容量添加し、３７℃で９０分間インキュベーションをおこないＦａｂ’とした。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）を行い、ボイド画分を分取しＦａｂ’を得た。このＦａｂ’とマレイミドを導入した担体ＨＲＰ結合物を一晩４℃で反応させ、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ，１．６×６０ｃｍ）をおこないボイド近傍の画分を分取し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．５％になるように添加し４℃で保存した。このようにして調製されたＨＲＰ−Ｆａｂ複合体の４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から複合体中のＨＲＰ濃度を求めた。【００３７】
＜比較例１＞
従来法を用いた酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体の調製
石川らによって報告された標識抗体の調製法は、一般の診断薬に広く応用されている。この方法（超高感度酵素免疫測定法、石川榮治、１９９３年、学会出版センター）を従来法として用いた。ＨＲＰ  ４ｍｇを秤量し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．６ｍｌに溶解した。ＤＭＦに溶解させたＥＭＣＳ  １ｍｇを添加し室温で２時間反応させた。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）で過剰のＥＭＣＳを除去し、ＨＲＰのアミノ基にマレイミドを導入させた。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−１０およびｃ１１−１４）の各々のＦ（ａｂ’）２溶液に、０．１Ｍシステアミン塩酸塩を１／１０容量添加し、３７℃で９０分間インキュベーションおこないＦａｂ’とした。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）を行い、ボイド画分を分取しＦａｂ’を得た。このＦａｂ’とマレイミドを導入したＨＲＰ結合物を一晩４℃で反応させ、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ，１．６×６０ｃｍ）をおこないＨＲＰ−Ｆａｂの画分を分取し、ＢＳＡを０．５％になるように添加し４℃で保存した。このようにして調製されたＨＲＰ−Ｆａｂ結合物の４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から結合物中のＨＲＰ濃度を求めた。【００３８】
＜比較例２＞
従来法を用いた酵素抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体の調製
比較例１と同様に、ＨＲＰのアミノ基にマレイミドを導入させた。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体（２Ｂ１０）のＦ（ａｂ’）２溶液に、０．１Ｍシステアミン塩酸塩を１／１０容量添加し、３７℃で９０分間インキュベーションおこないＦａｂ’とした。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にてボイド画分を分取し、Ｆａｂ’を得た。このＦａｂ’とマレイミドを導入したＨＲＰ結合物を一晩４℃で反応させ、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ，１．６ｘ６０ｃｍ）をおこないＨＲＰ−Ｆａｂの画分を分取し、ＢＳＡを０．５％になるように添加し４℃で保存した。このようにして調製されたＨＲＰ−Ｆａｂ結合物の４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から結合物中のＨＲＰ濃度を求めた。
【実施例５】
【００３９】
実施例１で調製した酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体のゲルろ過による分子量解析
実施例１で調製した酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（アマシャム）（１．６×６０）カラムを用いてゲルろ過をおこなった。このＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅカラムは、主に大分子量の分子やｓｍａｌｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅを分離するために使用される。ファルマシアＧｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅによれば、このカラム分画範囲は、多糖類で４×１０４〜２×１０７である。キャリアにはＰＢＳを用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でゲルろ過を行なった。４ｍｌ／２ｍｉｎずつ各フラクションを分取し、４０３ｎｍの吸光度を測定しＨＲＰの分子吸光係数よりＨＲＰ濃度（μｇ／ｍｌ）を求め、その後、各フラクションの反応性をＨＲＰ濃度換算で１μｇ／ｍｌに希釈し検討した。検定方法は以下のとおりである。【００４０】
９６穴マイクロプレートに抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−３＆ｃ１１−７等量混合）を４μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄後、０．５％カゼインを３５０μｌ加え２時間インキュベートした。組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を０ｆｍｏｌ／Ｌ、１２００ｆｍｏｌ／Ｌの濃度に調整したものをサンプルとして添加して、攪拌しながら室温で６０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（洗浄液）で６回洗浄を行なった後、２次抗体として、各フラクションをＨＲＰ濃度換算で１μｇ／ｍｌに希釈したものと、従来法で調製した酵素抗体をＨＲＰ濃度で１μｇ／ｍｌで２００μｌを加え、３０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。各々のゲルろ過フラクションのＨＲＰ濃度と上述した検定結果（コア抗原１２００ｆｍｏｌ／Ｌの吸光度と０ｆｍｏｌ／Ｌの吸光度の差）を表１および図１に示した。３種類の分子量マーカーの分子量は、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；６６８，０００、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ；４４０，０００、ＢＳＡ；６８，０００である。また、同時に測定した従来法で調製した酵素抗体１μｇ／ｍｌにおけるコア抗原０ｆｍｏｌ／Ｌ、１２００ｆｍｏｌ／Ｌの時の吸光度は、それぞれ０．０００、０．０５０であった。よって、従来法によるコア抗原１２００ｆｍｏｌ／Ｌの吸光度と０ｆｍｏｌ／Ｌの吸光度の差は０．０５０となった。図１より、分子量が大きくなるにつれコア抗原１２００ｆｍｏｌ／Ｌでの吸光度が上昇傾向にあることが確認された。【００４１】
【表１】
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フラクション１９以降では、従来法と比較してシグナルの上昇は３倍以下であったが、フラクション２〜１８ではシグナルの上昇は３倍以上であった。Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（分子量６６８，０００）はフラクション１７近傍に、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（分子量４４０，０００）はフラクション１８にピークを示したことから、分子量約４４０，０００以上で従来法よりも約５．９倍以上の優れた効果が確認され、分子量６６８，０００以上で従来法よりも約７．７倍以上の優れた効果が確認された。【００４２】
本実施例における担体Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００の平均分子量は２，０００，０００であり、この担体に分子量４０，０００のＨＲＰが１４分子結合し、さらにこのブロック化担体−酵素に分子量４６，０００の  Ｆａｂ’が８分子結合した酵素プローブ複合体の分子量は約２，９００，０００になる。これが、本実施例における酵素プローブ複合体の基本単位であると解される。【００４３】
一方、本実施例でのゲル濾過に用いたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅカラムの分画範囲は４×１０４〜２×１０７であるが、表１から明らかなように、ボイド画分を含む最初のフラクションも高い活性を示している。このボイド画分を含む最初のフラクションは、少なくとも２×１０７あるいはそれ以上の分子量を有する酵素プローブ複合体を含んでおり、本実施例における酵素プローブ複合体の基本単位の分子量は２，９００，０００であるから、ボイド画分を含む最初のフラクションに存する酵素プローブ複合体は、少なくとも２個以上の最小単位である酵素プローブ複合体が更に共有結合で結合してより分子量の大きい酵素プローブ複合体、すなわちブロック化酵素プローブ複合体を形成していると理解され得る。【００４４】
また、本実施例で用いた担体Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００にはその平均分子量２，０００，０００を下回る分子量のＤｅｘｔｒａｎや、それらの分解物も存在している。これらも本発明の酵素プローブ複合体あるいはブロック化酵素プローブ複合体の形成に関与するのは明らかであり、従って本実施例には、酵素プローブ複合体の基本単位の平均分子量である２，９００，０００以下の分子量を有する酵素プローブ複合体も含まれており、これらもまた本発明に他ならない。
【実施例６】
【００４５】
担体と酵素の量比を変えた場合の酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の反応性
実施例３で調製した酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体を用いて、それらの反応性を酵素濃度換算で２μｇ／ｍｌに希釈し検討した。検定方法は以下のとおりである。【００４６】
９６穴マイクロプレートに抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−３＆ｃ１１−７等量混合）を４μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄後、０．５％カゼインを３５０μｌ加え２時間インキュベートした。組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を０ｆｍｏｌ／Ｌ、２５．９ｆｍｏｌ／Ｌ、７７．８ｆｍｏｌ／Ｌ、２３３．３ｆｍｏｌ／Ｌ、７００ｆｍｏｌ／Ｌの濃度に調整したものをサンプルとして添加して、攪拌しながら室温で６０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で６回洗浄を行なった後、各酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体を酵素濃度換算で２μｇ／ｍｌに希釈したものを加え、３０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。【００４７】
担体：酵素の重量比０．６６、２．００および３．３３で調製した担体−酵素結合物を用いて作製した抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の反応性は、担体：酵素の重量比０．６６と比較して、重量比２．００のものが７７．６％、重量比３．３３のものが７０．５％であり、酵素量が多いほど反応性の低下が認められた。担体：酵素の重量比が２．００、３．３３あるいはそれ以上のものでも従来のものより十分に高感度の複合体が得られる。しかし、酵素が担体量よりも過剰量存在すると、一つの担体分子に酵素がたくさん結合するため最小単位である酵素−担体が多くできるが、担体−酵素−担体−酵素−担体−酵素といった最小単位体同士が酵素を介して結合しているものが少なくなることが推測される。すなわち、実施例５のゲルろ過解析でも述べたように、本発明の酵素プローブ複合体は、少なくとも２個以上の最小単位である酵素プローブ複合体が更に共有結合で結合してより分子量の大きい酵素プローブ複合体、すなわちブロック化酵素プローブ複合体を形成することにより、反応性が高くなったと理解され得る。
【実施例７】
【００４８】
実施例１および２で調製した酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体と従来法の酵素抗体を用いてのコア抗原の検出感度比較
９６穴マイクロプレートに抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−３＆ｃ１１−７等量混合）を４μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で洗浄後、０．５％カゼインを３５０μｌ加え２時間インキュベートした。吸引して０．５％カゼインを除去後、組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を２１８７０ｆｍｏｌ／Ｌから３倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、攪拌しながら室温で６０分間インキュベートした。洗浄液で６回洗浄を行ない、２次抗体として、実施例１および２で調製した酵素−抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素抗体をいずれもＨＲＰ濃度で換算して、２．５μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え３０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（１０ｍｇオルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸を５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。図２にその結果を示した。０ｆｍｏｌ／ＬとＯＤ０．０３０の差を検出限界と仮定すると、従来法の酵素抗体では約２６３ｆｍｏｌ／Ｌ、実施例２の酵素抗体複合体では約７５ｆｍｏｌ／Ｌ、そして実施例１の酵素抗体複合体では約１０ｆｍｏｌ／Ｌ（０．２ｐｇ／ｍｌ）が検出可能となった。つまり従来法と比較して３．５〜２６．３倍感度が上昇した。感度上昇によって、さらにＨＣＶ感染の有無の判断やウイルス定量の幅がひろがり、有用性が高くなった。
【実施例８】
【００４９】
２種類のモノクローナル抗体を一緒に結合させた酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体と別々に結合させた酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体を用いてのコア抗原の検出感度比較
実施例１または２では、２種類の抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体｛ｃ１１−１０Ｆ（ａｂ’）２とｃ１１−１４Ｆ（ａｂ’）２｝を一緒にブロック化担体酵素と反応させた。また、これら２種類のモノクローナル抗体を別々にブロック化担体酵素と反応させ、酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体を調製した。２種類のモノクローナル抗体を一緒に結合させたものと、ｃ１１−１０およびｃ１１−１４モノクローナル抗体単独で結合させたものは１μｇ／ｍｌの濃度で、またｃ１１−１０およびｃ１１−１４モノクローナル抗体単独で結合させたものを各々０．５μｇ／ｍｌずつ混合したもの（計１μｇ／ｍｌ）の反応性を検討した（図３）。【００５０】
９６穴マイクロプレートに抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−３＆ｃ１１−７等量混合）を４μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で洗浄後、０．５％カゼインを３５０μｌ加え２時間インキュベートした。吸引して０．５％カゼインを除去後、組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を２１８７０ｆｍｏｌ／Ｌから３倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、攪拌しながら室温で６０分間インキュベートした。洗浄液で６回洗浄を行ない、２次抗体として、２種類のモノクローナル抗体を一緒に結合させたもの、ｃ１１−１０およびｃ１１−１４モノクローナル抗体単独で結合させたもの、そしてｃ１１−１０およびｃ１１−１４モノクローナル抗体単独で結合させたものを各々同量混合したものを、いずれもＨＲＰ濃度で換算して計１μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え２０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（１０ｍｇオルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸を５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。【００５１】
ｃ１１−１０およびｃ１１−１４モノクローナル抗体単独で結合させたものよりも、それらを各々０．５μｇ／ｍｌずつ混合したものの反応性が若干向上（約１．２倍）したが、その混合したものよりも、２種類の抗体を一緒に結合させたものは約２−２．５倍反応性が向上した。よって、２種類以上のモノクローナル抗体およびその断片などのプローブを、ブロック化担体酵素と結合させることもより効果的である。
【実施例９】
【００５２】
モノクローナル抗体をブロック化担体酵素上の担体に特異的に結合させた酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体の反応性
ＨＲＰのアミノ基は非常に少なく、石川らがＨＲＰにアミノ基を利用してマレイミド基を導入するために検討した結果、１個からせいぜい３個以内である〔石川栄治  著；生物化学実験法２７、酵素標識法、学会出版センター〕。そのＨＲＰの少ないアミノ基を２−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅを用いてブロックした後、実施例３との同様な方法で、担体としてＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ５００を用い担体：酵素の重量比０．６６で担体−酵素結合物を調製した後、抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体を結合させた。４０３ｎｍの吸光度を測定し、ＨＲＰの４０３ｎｍの分子吸光係数から複合体中のＨＲＰ濃度を求めた。【００５３】
９６穴マイクロプレートに抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（ｃ１１−３＆ｃ１１−７等量混合）を４μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で洗浄後、０．５％カゼイン３５０μｌを加え２時間インキュベートした。吸引して０．５％カゼインを除去後、組換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を２１８７０ｆｍｏｌ／Ｌから３倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、攪拌しながら室温で６０分間インキュベートした。洗浄液で６回洗浄を行ない、標識抗体をＨＲＰ濃度で換算して計２μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え２０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（１０ｍｇオルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸を５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。比較として、実施例３と同様に、担体：酵素の重量比０．６６で担体−酵素結合物を調製した後、抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体を結合させたものを用いた。〔図４〕。【００５４】
図４より、アミノ基をブロックした酵素抗体複合体の反応性はブロックしていないものと比較してその約８８．１％の活性を示し、担体にのみ抗体が結合しても十分な反応性を示すことが確認された。本発明のブロック化酵素抗体複合体は、大過剰量の酵素を使用していないため、担体上・酵素上のいずれにも抗体が結合することが可能であるが、担体上にのみプローブである抗体が結合しても十分な反応性を示すと思われる。
【実施例１０】
【００５５】
実施例４で調製した酵素抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体複合体と従来法の酵素抗体を用いてのＰｒｏＧＲＰの検出感度比較
９６穴マイクロプレートに抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体（２Ｂ１０）を５μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で２回洗浄後、０．５％カゼインを３５０μｌ加え２時間インキュベートした。吸引によって０．５％カゼインを除去後、組換え体ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を８０００ｐｇ／ｍｌから３倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄液で５回洗浄を行ない、２次抗体として、実施例４で調製した酵素−抗ＰｒｏＧＲＰモノクローナル抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素抗体をいずれもＨＲＰ濃度で換算して、１．５μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌを加え３０分間インキュベートした。さらに洗浄液で６回洗浄し、基質溶液（１０ｍｇオルトフェニレンジアミン、過酸化水素）２００μｌを加え３０分間インキュベートした。５Ｎ硫酸を５０μｌを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（コロナＭＴＰ３２）で４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。図５にその結果を示した。横軸はＰｒｏＧＲＰの濃度、縦軸は４９２ｎｍの吸光度を示すものである。実施例４で調製した酵素抗体複合体が従来法で調製した酵素標識抗体と比較して著しくシグナルが高いことがわかった。０ｐｇ／ｍｌとＯＤ０．０２０の差を検出限界と仮定すると、従来法の酵素抗体では約１１５ｐｇ／ｍｌ、実施例３の酵素抗体複合体では約７ｐｇ／ｍｌが検出可能で、つまり従来法と比較して１６．４倍感度が上昇した。健常人血清中ＰｒｏＧＲＰ濃度は約１４ｐｇ／ｍｌ、カットオフ値は５０ｐｇ／ｍｌ前後である（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５  ８６，６９８−７０５）ことから、従来法では健常人検体や、肺小細胞がん患者検体の一部でＰｒｏＧＲＰを検出できないこととなる。本発明により、このように従来法では検出できなかった患者や健常人の検体中のＰｒｏＧＲＰも検出が可能となり、その有用性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体のゲルろ過による分子量解析の結果を示す。
【図２】酵素抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体複合体と従来法の酵素抗体を用いてのコア抗原の検出感度比較の結果を示す。
【図３】モノクローナル抗体１種類を担体−酵素複合体と結合させた場合と、モノクローナル抗体２種を担体−酵素複合体と結合させた場合の反応性を示す。
【図４】酵素のアミノ基をブロックしてプローブを結合させたものとアミノ基をブロックせずにプローブを結合させたものの反応性を示す。
【図５】酵素抗ＰｒｏＧＲＰ抗原モノクローナル抗体複合体と従来法の酵素抗体を用いてのＰｒｏＧＲＰの検出感度比較の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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