(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列を増幅する方法であって、以下の工程（a）および（b）を包する方法：
（a）１つ以上のローリングサークル複製プライマーを、１つ以上の増幅標的サークル（ATC）と混合してプライマーATC混合物を生成する工程、および該プライマーATC混合物中で該増幅標的サークルと該ローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該プライマーATC混合物をインキュベートする工程であって、
ここで、該増幅標的サークルはプライマー相補部分を含む１本鎖の、環状DNA分子であり、ここで該プライマー相補部分は、少なぐとも１つのローリングサークル複製プライマーに相補的である、工程、および
（b）DNAポリメラーゼを該プライマーATC混合物と混合してポリメラーゼATC混合物を生成する工程、および該増幅標的サークルの複製を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程であって、該増幅標的サークルの複製が縦列配列DNAを形成させる工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、追加の増幅操作をさらに包含し、
前記の追加の増幅操作は、
（i）工程（b）と同時かまたはその後に行われ、
（ii）ネストした連結媒介ローリングサークル複製、二次DNA鎖置換、および転写からなる群より選択され、そして
（iii）二次縦列DNAまたは縦列配列RNAの形成を生じる方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
少なくとも１つの前記ローリングサークル複製プライマーが、標的分子と相互作用する特異的結合分子にカップリングしているか、または、
少なくとも１つの該増幅標的サークルが、標的分子と相互作用する特異的結合分子に束縛されている方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、さらに以下の（２）または（３）の１以上を含む方法:
（２）前記標的分子を含む、固体状態サンプルの使用、
（３）前記特異的結合分子を該標的分子に接触させる工程。
【請求項５】
前記標的分子が一次増幅標的サークルである請求項３に記載の方法であって、ここで該一次増幅標的サークルが、
（i）開環プローブ（OCP）を一次標的サンプルと混合してOCP標的サンプル混合物を生成する工程、および該OCP標的サンプル混合物中で、該開環プローブと一次標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該OCP標的サンプル混合物をインキュベートする工程であって、
ここで、該一次標的配列は、5'領域および3'領域を含み、そして
該開環プローブは、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の、線状DNA分子であり、ここで該左標的プローブ部分は、該一次標的配列の該3'領域に相補的であり、そして該右標的プローブ部分は、該一次標的配列の該5'領域に相補的である、工程、
（ii）リガーゼを該OCP標的サンプル混合物と混合して連結混合物を生成する工程、および該開環プローブの連結を促進する条件下で該連結混合物をインキュベートし、該一次増幅標的サークルを形成させる工程、
によって形成される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、前記追加の増幅操作が、工程（b）と同時またはその後に、
（c−１）RNAポリメラーゼを前記ATC混合物と混合する工程、および前記縦列配列DNAの転写であって縦列配列RNAを形成させる転写を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程、または
（c−２）二次DNA鎖置換プライマーを該ポリメラーゼATC混合物と混合し、かつ
（i）該縦列配列DNAと該二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーションおよび（ii）該ポリメラーゼATC混合物における該縦列配列DNAの複製であって二次縦列配列DNAを形成させる複製、を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程
を包含する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記追加の増幅操作が、
前記（c−２）の工程、および
（d）RNAポリメラーゼを前記ATC混合物と混合する工程、および前記二次縦列配列DNAの転写であって縦列配列RNAを形成させる転写を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程、
を包含する方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法は、少なくとも１つの以下:（１）核酸折り畳み操作、（２）縦列配列DNAに存在する多数の異なる配列を別々におよび同時に検出する工程を包含する複合検出操作、
（３）少なくとも２つの増幅標的サークルの示差増幅、および（４）プライマー伸長配列決定、を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAの形成の後に、プライマー伸長配列決定工程を包含し、かつ該プライマー伸長配列決定工程は、
（i）識別混合物を形成する工程であって、１つ以上の識別プライマーが、該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる工程、
（ii）工程（i）と同時またはその後に、少なくとも２つの異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを該識別混合物と混合する工程であって、前記の各異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドは、異なるタグ化分子にカップリングした異なる鎖終結ヌクレオチドトリホスフェートを含む工程、
（iii）該識別プライマーへの該タグ化鎖終結ヌクレオチドのテンプレートに基づいた付加を促進する条件下で該識別混合物をインキュベートする工程であって、該識別プライマーへの該タグ化鎖終結ヌクレオチドの付加によって、該タグ化鎖終結ヌクレオチドと前記の縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAとの会合を生じる工程、および
（iv）タグ化鎖終結ヌクレオチドの、前記の縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAとの会合を検出する工程、を包含する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、
（i）（a）識別プローブおよび多数の縮重プローブを、（１）前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（２）該識別プローブおよび縮重プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合してプローブ混合物を生成する工程であって、ここで各縮重プローブは、3'ブロッキング基を有する、工程、
（i）（b）リガーゼと該プローブ混合物を混合して縮重連結混合物を生成する工程、および該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる該縮重プローブの１つへの該識別プローブの連結を促進する条件下で該縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、ここで該識別プローブに連結する該縮重プローブは連結した縮重プローブである、工程、
（i）（c）該連結した縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程であって、該連結プローブの１つ以上が縮重プローブへ連結することにより該識別プライマーが形成され、該識別プライマーが形成されることにより、該識別混合物が形成される工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、該識別混合物の形成が、工程（i）（c）に続いて、以下の工程（i）（d）、（i）（e）、および（i）（f）をさらに含み、かつ工程（i）（d）、（i）（e）、および（i）（f）がこの順に１回以上行われる方法：
（i）（d）（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）該縮重プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、多数の縮重プローブを該連結混合物と混合して、二次プローブ混合物を生成する工程、
（i）（e）リガーゼを該二次プローブ混合物と混合して二次縮重連結混合物を生成する工程、および該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる縮重プローブの１つへの該連結された縮重プローブの連結を促進する条件下で該二次縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、ここで、該連結された縮重プローブに連結された該縮重プローブが、連結された二次縮重プローブである、工程、
（i）（f）該二次縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、該識別混合物の形成が、（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（２）該識別プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で識別プライマーを該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合する工程を包含する方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、組合せ多色コーディング検出操作を包含し、
該組合せ多色コーディング検出操作は、前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAに存在する多数の異なる配列を、（i）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（ii）検出プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、組合せ多色コーディングを用いて標識される前記検出プローブのセットを該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合することによって、別々にそして同時に検出する工程を包含する方法。
【請求項１４】
核酸配列を増幅する方法であって、以下の工程（a）〜（b）を包含する方法：
（a）１つ以上の異なる開環プローブ（OCP）を、１つ以上の標的配列を含む標的サンプルと混合してOCP標的サンプル混合物を生成する工程、および該開環プローブと該OCP標的サンプル混合物中の該標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該OCP標的サンプル混合物をインキュベートする工程、
（b）リガーゼを該OCP標的サンプル混合物と混合して連結混合物を生成する工程、および増幅標的サークル（ATC）を形成するために開環プローブの連結を促進する条件下で該連結混合物をインキュベートする工程、
（c）ローリングサークル複製プライマーを該連結混合物と混合してプライマー-ATC混合物を生成する工程、および該増幅標的サークルと該プライマー-ATC混合物中の該ローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該プライマー-ATC混合物をインキュベードする工程、および
（d）DNAポリメラーゼを該プライマーATC混合物と混合して、ポリメラーゼ-ATC混合物を生成する工程、および該増幅標的サークルの複製を促進する条件下で該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であって、ここで、該増幅標的サークルの複製が、縦列配列DNAを形成させる工程。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、追加の増幅操作をさらに含み、前記の追加の増幅操作は、
（i）工程（d）と同時にまたはその後に行われ、
（ii）ネストした連結媒介ローリングサークル増幅、二次DNA鎖置換、および転写からなる群より選択され、そして
（iii）二次縦列配列DNAまたは縦列配列RNAを形成させる方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、少なくとも１つの標的配列としての一次増幅標的サークルの使用をさらに包含し、
該一次増幅標的サークルは、
（i）一次開環プローブを一次標的サンプルと混合して一次OCP-標的サンプル混合物を生成し、該一次開環プローブと該一次OCP-標的サンプル混合物中の一次標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該一次OCP-標的サンプル混合物をインキュベートする工程であって、
該一次標的配列は5'領域および3'領域を含み、
該一次開環プローブは、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖線状DNA分子であり、
該左標的プローブ部分は、該一次標的配列の該3'領域に相補的であり、該右標的プローブ部分は、該一次標的配列の該5'領域に相補的である工程、
（ii）リガーゼを該一次OCP-標的サンプル混合物と混合して、一次連結混合物を生成し、該一次開環プローブの連結を促進する条件下で該一次連結混合物をインキュベートして該一次増幅標的サークルを形成させる工程、
によって形成される方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法であって、
前記標的配列はそれぞれ、5'領域および3'領域を含み、
前記開環プローブはそれぞれ、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖線状DNA分子であり、該スペーサー部分はプライマー相補部分を含み、そして同一の開環プローブの該左標的プローブ部分および該右標的プローブ部分はそれぞれ、同一の標的配列の該3'領域および該5'領域にそれぞれ相補的であり、
少なくとも１つの前記標的配列は、該5'領域と該3'領域との間に位置する中央領域をさらに含み、
前記開環プローブの該左標的プローブ部分も任意の該開環プローブの該右標的プローブ部分のいずれも該標的配列の該中央領域に相補的でなく、そして
工程（a）は、インキュベーションの前に、前記OCP-標的サンプル混合物が該一つ以上の開環プローブ、該一つ以上のギャップオリゴヌクレオチド、および該標的サンプルを含むように一つ以上のギャップオリゴヌクレオチドを該標的サンプルと混合する工程をさらに包含し、各ギャップオリゴヌクレオチドは、5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の線状DNA分子を含み、かつ、少なくとも１つの該標的配列の該中央領域の全部または部分に相補的である方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法であって、ここで少なくとも１つの前記標的配列が、標的分子と相互作用する特異的結合分子にカップリングしている方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法であって、少なくとも１つの前記ローリングサークル複製プライマーが、標的分子と相互作用する特異的結合分子にカップリングしている方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法であって、前記標的分子が、固体状態サンプルの一部である方法。
【請求項２１】
請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法であって、該方法は、追加の増幅操作を含み、そしてここで該追加の増幅操作は、工程（d）と同時かまたはその後に、
（e）RNAポリメラーゼを前記ポリメラーゼ-ATC混合物と混合する工程、および前記縦列配列DNAの転写を促進する条件下で該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であって、該縦列配列DNAの転写が縦列配列RNAを形成させる工程、または
（e）二次DNA鎖置換プライマーを該ポリメラーゼ-ATC混合物と混合する工程、および（i）該縦列配列DNAと該二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーションおよび（ii）該ポリメラーゼ-ATC混合物において該縦列配列DNAの複製を促進する条件下で、該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であって、該縦列配列DNAの複製が二次縦列配列DNAを形成させる工程、を包含する方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法であって、該方法は、少なくとも１つの以下:（３）特異的結合分子を該標的分子に接触させる工程、（４）核酸折り畳み操作、（５）前記縦列配列DNAに存在する多数の異なる配列を別々におよび同時に検出する工程を包含する複合検出操作、（６）少なくとも２つの該増幅標的サークルの示差増幅（１３）該標的配列の少なくとも１つとしての、親和性部分およびオリゴヌクレオチド部分をそれぞれ含む１つ以上のレポーター結合剤の使用、ならびに（１８）１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドの使用を包含する方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法であって、組合せ多色コーディング検出操作をさらに包含し、ここで、該組合せ多色コーディング検出操作は、前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAに存在する多数の異なる配列を、
（i）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（ii）検出プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、組合せ多色コーディングを用いて標識される該検出プローブのセットを該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合することによって、別々におよび同時に検出する工程を包含する方法。
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれかに記載の方法であって、該方法は、縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAの形成の後に、プライマー伸長配列決定を包含し、該プライマー伸長配列決定は、
（i）識別混合物を形成する工程であって、一つ以上の識別プライマーが、該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる、工程、
（ii）工程（i）と同時にかまたはその後に、少なくとも２つの異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを該識別混合物と混合する工程であって、各異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドは、異なるタグ分子にカップリングした異なる鎖終結ヌクレオチドトリホスフェートを含む、工程、
（iii）該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該識別プライマーへのテンプレートに基づく付加を促進する条件下で該識別混合物をインキュベードする工程であって、該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該識別プライマーへの付加が、該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAとの会合を生じる、工程、および
（iv）該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAとの会合を検出する工程、を包含する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、
（i）（a）識別プローブおよび多数の縮重プローブを前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合して、（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）該識別プローブおよび縮重プローブとのハイブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ混合物を生成する工程であって、各縮重プローブが、3'ブロッキング基を有する工程、
（i）（b）リガーゼを該プローブ混合物と混合して縮重連結混合物を生成する工程、および該識別プローブの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる縮重プローブの１つへの連結を促進する条件下で該縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、該識別プローブに連結した該縮重プローブは、連結した縮重プローブである工程、
（i）（c）該連結した縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程、を包含し、
該識別プローブが一つ以上の縮重プローブへ連結することによって、該識別プライマーが形成され、該識別プライマーの形成が識別混合物を形成させる方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、工程（i）（c）に続いて、以下の工程（i）（d）、（i）（e）、および（i）（f）をさらに包含し、かつ工程（i）（d）、（i）（e）、および（i）（f）が、この順に１回以上行われる方法：
（i）（d）前記多数の縮重プローブを前記連結混合物と混合して、（１）前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）縮重プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で二次プローブ混合物を生成する工程、
（i）（e）リガーゼを該二次プローブ混合物と混合して、二次縮重連結混合物を生成する工程、および該識別プローブの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズされる縮重プローブの１つへの該連結された縮重プローブの連結を促進する条件下で、該二次縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、該連結された縮重プローブに連結した該縮重プローブが二次連結縮重プローブである工程、
（i）（f）該二次縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法であって、該識別混合物の形成が、（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）識別プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、識別プライマーを前記縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合する工程を包含する方法。
【請求項２８】
１つ以上の標的分子を選択的に検出するためのキットであって、該キットは、
（a）１つ以上の増幅標的サークル、ここで、該増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む１本鎖の環状DNA分子であり、そして
（b）１つ以上の増幅標的サークルのプライマー相補部分に相補的である相補部分を含む１本鎖の線状核酸分子を含むローリングサークル複製プライマーを含み、
ここで、（１）各増幅標的サークルは、特異的結合分子に束縛されているか、または（２）該ローリングサークル複製プライマーは、特異的結合分子にカップリングしているかのいずれかであり、該特異的結合分子は、少なくとも１つの該標的分子と相互作用する、キット。
【請求項２９】
１つ以上の前記増幅標的サークルの部分に適合する適合部分を含む１本鎖の線状核酸分子を含む二次DNA鎖置換プライマーをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
識別プローブおよび多数の縮重プローブをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
識別プライマーをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
それぞれが5'領域および3'領域を含む１つ以上の標的配列に関連する核酸配列を選択的に増幅するためのキットであって、下記（a）、（b）、および（c）を含むキット:
（a）それぞれ、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の線状DNA分子である１つ以上の開環プローブであって、
該スペーサー部分は、プライマー相補部分を含み、該左標的プローブ部分は、少なくとも１つの該標的配列の該3'領域に相補的であり、該右標的プローブ部分は同一の標的配列の該5'領域に相補的である、開環プローブ、
（b）１つ以上の該開環プローブの該プライマー相補部分に相補的である相補的部分を含む１本鎖線状核酸分子を含むローリングサークル複製プライマー、
（c）（１）１つ以上の該開環プローブの部分に適合する適合部分を含む１本鎖の線状核酸分子を含む二次ＤＮＡ鎖置換プライマー、および（２）親和性部分および該標的配列の１つを含むオリゴヌクレオチド部分をそれぞれ含む１つ以上のレポーター結合剤、の１方または両方。
【請求項３３】
１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３２に記載のキットであって、ここで、少なくとも１つの前記標的配列が、前記5'領域と前記3'領域との間に位置する中央領域をさらに含み、
ここで、前記開環プローブの前記左標的プローブ部分も、該開環プローブの前記右標的プローブ部分のいずれも該中央領域に相補的でなく、そして
各ギャップオリゴヌクレオチドは、5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の線状DNA分子を含み、
ここで各ギャップオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの該標的配列の該中央領域の全部または一部と相補的であるキット。
【請求項３４】
識別プローブおよび多数の縮重プローブをさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
識別プライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
開示される発明は、一般に核酸の検出のためのアッセイの分野にあり、そして特に核酸の増幅および配列決定の分野にある。本発明はまた、ローリングサークル増幅の分野にある（例えば、Lewin、「Genes II」（J. Wiley and sons, 1985）525頁を参照のこと）。
多くの方法が開発されており、これらは、核酸の検出に基づく極めて感度の良い診断アッセイの実行を可能にする。これらの方法のほとんどは、標的またはプローブの指数関数的な増幅を利用する。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、連結鎖反応（LCR）、自己維持（self-sustained）配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、鎖置換増幅（SDA）、およびQβレプリカーゼでの増幅（BirkenmeyerおよびMushahwar, J. Virological Methos, 35:117-126（1991）;Landegren, Trends Genetics, 9:199-202（1993））が含まれる。
これらの方法の全てが、約100標的分子の実施上の検出限界を有しつつ、良好な感度を提供する一方、これらの全てが、定量的な測定において比較的精度の低いことに悩まされる。この精度のなさは、診断アッセイが複数のフォーマットで、つまりいくつかの異なる標的配列の同時検出のために設計されたフォーマットで実行される場合、それ自体が最も劇的に顕著になる。
実際の診断への適用において、多くの標的について同時にアッセイすることが望ましい。このような複合アッセイは、代表的には５つ以上の標的を検出するために用いられる。これらのアッセイにおける標的についての正確な定量的データを得ることがまた望ましい。例えば、ウイルス血症は、HIV-1およびＣ型肝炎のようなウイルスについての疾患状態に相関され得ることが実証されている（Lefrereら、Br. J. Haematol., 82（2）:467-471（1992）, Gunjiら、Int. J. Cancer, 52（5）:726-730（1992）, Hagiwaraら、Hepatology, 17（4）:545-550（1993）,Luら、J. Infect. Dis., 168（5）:1165-8116（1993）, Piatakら、Science, 259（5102）:1749-1754（1993），Guptaら、Ninth International Conference on AIDS/Fourth STD World Congress, June 7-11, 1993, Berlin, Germany, Sakselaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91（3）:1104-1108（1994））。ウイルス負荷（load）を正確に定量するための方法は有用である。
複合アッセイにおいて、異なる標的の定量的測定は、標的配列の真の比を反映するとこが特に望ましい。しかし、複合的、指数関数的核酸増幅法を用いて得られるデータは、せいぜい半定量的である。多くの因子が関与している:
１．複合アッセイが、異なる標的配列に対して異なるプライミング事象を包含する場合、これらの事象の相対的効率は、異なる標的について変化し得る。これは、用いられる種々のプライマー間での安定性および構造の差に起因する。
２．産物鎖再生の速度が異なる標的に対して異なる場合、プライミング事象との競合の程度は、全ての標的に対して同一ではない。
３．複数の連結事象を包含する反応（例えば、LCR）については、各標的配列に対する連結事象の相対的効率における小さいが、有意な差が存在し得る。連結事象は多数回繰り返されるので、この効果は増幅される。
４．逆転写（3SR、NASBA）またはクレノウ鎖置換（SDA）を包含する反応については、重合の進行度の程度は、異なる標的配列間で異なり得る。
５．異なる複製可能RNAプローブを包含するアッセイについては、各プローブの複製効率は、通常同一ではなく、従って、プローブは、Qβレプリカーゼによって触媒される複製反応において不均等に競合する。
６．増幅の１サイクルにおける収量の比較的小さい差は、数回のサイクルの後に、増幅収量の大きな差を生じる。例えば、25増幅サイクルで、そして１サイクルあたり10%の収量差（つまり１サイクルあたり２倍対1.8倍増幅）を伴うPCR反応においては、収量は2.025=33,554,000対1.825=2,408,800である。25サイクル後の全収量差は、14倍である。増幅の30サイクル後には、収量差は、20倍より多い。
従って、複合アッセイにおいて可変のそしておそらくは誤差を有するシグナルを生じる可能性の低い増幅方法についての必要性が存在する。
それゆえ、サンプル中の標的配列の量に比例する増幅収量を伴う診断的核酸増幅方法を提供することが、開示される発明の目的である。
検出効率が標的配列の構造に依存しないサンプル中に存在する特定の標的核酸配列を検出する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
測定されるシグナルレベルが、サンプル中の標的配列の量に比例し、そして異なる標的配列について測定されるシグナルレベルの比が、サンプル中に存在する異なる標的配列の量の比に実質的に適合するサンプル中に存在する、特定の標的核酸配列の量を決定する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
異なる標的核酸配列について測定されるシグナルレベルの比が、サンプル中に存在する異なる標的核酸配列の量の比に実質的に適合する単一のサンプル中の複数の特定の標的核酸配列の量を検出および決定する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
インサイチュで標的核酸配列の単一のコピーの存在を検出する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
標的遺伝子エレメントの個々の対立遺伝子を表す標的核酸配列の存在を検出する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
サンプル中の目的の複数の分子の相対的な量を検出し、そして決定する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
標的核酸配列の配列を決定するための方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。
標的核酸配列の混合物中に存在する配列の範囲を決定する方法を提供することは、本発明の別の目的である。
発明の要旨
開示されるのは、特定の標的配列または分析物の存在に基づく核酸配列を増幅するための組成物および方法である。サンプル中の特定の核酸または分析物を、高い特異性および感度を伴って検出するために、本方法は有用である。本方法はまた、固有の低レベルのバックグラウンドシグナルを有する。本方法の好ましい実施態様は、DNA連結操作、増幅操作、および必要に応じて検出操作からなる。DNA連結操作は、特別に設計された核酸プローブ分子を環状にする。この工程は、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションに依存し、そしてサンプル中に存在する標的配列の量に比例して環状のプローブ分子を形成する。増幅操作は、環状化されたプローブのローリングサークル複製である。ローリングサークル複製を用いた増幅の単一ラウンドは、各サイクルが標的配列のコピー数の２倍化に限定されるPCR複製および他の増幅技術の単一サイクルよりも数オーダー大きい環状化プローブ配列の大きな増幅を生じる。ローリングサークル増幅はまた、連結操作とは独立に行われ得る。核酸タグを特定の結合分子（例えば、抗体）に結合することによって、核酸タグの増幅は、サンプル中の分析物を検出するために用いられ得る。これは、増幅標的サークルが、レポーター結合分子上の増幅可能なタグとして作用するか、または増幅標的サークルが、レポーター結合分子の一部であるローリングサークル複製プライマーを用いて増幅される場合の分析物の検出のために好ましい。必要に応じて、さらなる増幅操作が、ローリングサークル複製によって生成されるDNAにおいて行われ得る。
増幅に続いて、増幅された配列は、核酸のための従来の検出システム（例えば、蛍光標識の検出、酵素結合検出システム、抗体媒介標識検出、および放射標識の検出）のいずれかを用いて検出および定量され得る。増幅された生成物は、サンプル中に存在する標的配列の量に直接比例するので、定量的測定は、サンプル中の標的配列の量を信頼性を有して表す。本方法の主要な利点は、連結操作が対立遺伝子区別（allelic discrimination）を得るために操作され得ること、増幅操作が等温性であること、および増幅反応が直線的であり、そして高度に進行する酵素によって触媒されるので、シグナルが厳密に定量的であることである。複合アッセイにおいて、DNA複製のために用いられるプライマーオリゴヌクレオチドは、全てのプローブについて同一であり得る。
増幅に続いて、増幅された配列のヌクレオチド配列は、従来の手段によるか、または増幅された標的配列のプライマー伸長配列決定によるかのいずれかで決定され得る。プライマー伸長配列決定の２つの好ましい態様が開示される。単分子セグメント増幅および配列決定（USA-SEQ）（単一ヌクレオチドプライマー伸長配列決定の一形態）は、識別ヌクレオチドの同定に基づく特定のそして同定可能なヌクレオチドの組み込みによる増幅された標的配列中での単一ヌクレオチドの識別を含む。単分子セグメント増幅およびCAGE配列決定（USA-CAGESEQ）（縮重プローブプライマー伸長配列決定の一形態）は、増幅された標的配列にハイブリダイズした識別プライマーへの縮重プローブの逐次的付加を含む。複数のプローブの付加は、3'末端の除去可能なケージの存在によって防止される。縮重プローブの付加の後、このケージは除去されそしてさらに縮重したプローブが付加され得るか、または最後の操作として、識別プライマーの末端の隣のヌクレオチドまたは最後に付加された縮重プローブがUSA-SEQにおけると同様に識別されてその同一性を決定する。開示されるプライマー伸長配列決定法は、標的配列の混合物中の複数の異なる配列の存在を同定するために有用である。
開示される方法は、標的核酸配列の単純で、定量的で、そして一定の増幅および検出を提供する２つの特徴を有する。第一に、標的配列は、不定のプライマー結合配列を有する小さな診断プローブを介して増幅されることである。このことにより、プライミングおよび複製反応が、非常に異なる標的配列を有するプローブ間でさえも一定になる。第二に、増幅が、サイクルではなく、逐次的な等温性の複製：ローリングサークル複製で起こることである。このことにより、増幅がより複雑ではなくそして出力においてより一定になる。
さらに開示されるのは、ローリングサークル複製を含む、目的の分子の複合検出のための組成物および方法である。本方法は、高い特異性および感度を伴いつつ、サンプル中の複数の特定の核酸を同時に検出するために有用である。本方法はまた、固有の低レベルのバックグラウンドシグナルを有する。本方法の好ましい形態は、会合操作、増幅操作、および検出操作からなる。会合操作は、一つ以上の特別に設計されたプローブ分子（全部または部分的のいずれかで核酸）の目的の標的分子への会合を含む。この操作は、プローブ分子をサンプル中に存在する目的の標的分子に会合させる。増幅操作は、環状核酸分子（増幅標的サークルと呼ばれる）のローリングサークル複製であり、これらの環状核酸分子はプローブ分子の一部かまたはプローブ分子にハイブリダイズされる。ローリングサークル複製を用いる単一ラウンドの増幅は、各サイクルが標的配列のコピー数の２倍化に限定されるPCR増幅および他の増幅技術の単一サイクルよりも、数オーダー大きい増幅標的サークルの大きな増幅を生じる。核酸タグを特定の結合分子（例えば、抗体）に結合することによって、核酸タグの増幅は、サンプル中の分析物を検出するために用いられ得る。
ローリングサークル複製に続いて、増幅された配列は、複数の異なる標的分子を表す複数の異なる増幅標的配列の別々の、同時の、そして定量的な検出を可能にする組合せ多色コードプローブを用いて検出され得る。増幅された生成物は、サンプル中の標的配列の量に直接比例するので、定量的な測定は、サンプル中の標的配列の量を信頼性を有して表す。本方法の主要な利点は、非常に多くの異なる標的分子が、同時に検出され得ることであり、そしてサンプル中の種々の標的分子の量の差が、正確に定量され得ることである。DNA複製工程が等温性であり、そして増幅反応が直線的であり、そして高度に進行する酵素によって触媒されるのでシグナルは厳密に定量的であることもまた有利である。
開示される方法は、複数の標的分子の単純で、定量的で、そして一定の検出を提供する２つの特徴を有する。第一に、増幅が、サイクルではないが、逐次的な等温性の複製:ローリングサークル複製で起こることである。このことにより、増幅がより複雑ではなくそして出力においてより一定になる。第二に、組合せ多色コードは、多くの異なる標的分子の感度の良い同時検出を可能にすることである。
【図面の簡単な説明】
図１は、標的配列にハイブリダイズする開環プローブの一例の線図である。この線図は、標的配列と右および左標的プローブとの間の関係を示す。
図２は、ギャップオリゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした開環プローブの一例の線図である。この線図は、標的配列、ギャップオリゴヌクレオチド、ならびに右および左標的プローブとの間の関係を示す。
図３は、標的配列にハイブリダイズしそして連結した開環プローブの線図である。この線図は、開環プローブが、どのように位相幾何学的に標的配列にロックされるかを示す。
図４は、標的配列を含む核酸に位相幾何学的にロックされた開環プローブのローリングサークル増幅の線図である。
図５は、開環プローブの一例の線図である。開環プローブの種々の部分は、異なる中塗りによって示される。
図６は、縦列配列DNA（TS-DNA）ならびに開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの右および左標的プローブの一部に対応するTS-DNAの部分にハイブリダイズするように設計されたアドレスプローブの線図である。TS-DNAは、配列番号２、そしてアドレスプローブは配列番号３である。
図７は、TS-DNAの捕捉および検出の線図である。捕捉は、固体状態検出器に結合したアドレスプローブへのTS-DNAのハイブリダイゼーションによってもたらされる。検出は、捕捉されたTS-DNAへの二次検出プローブのハイブリダイゼーションによってもたらされる。開環プローブの種々の部分に対応するTS-DNAの部分は、異なる中塗りによって示される。
図８は、連結媒介ローリングサークル複製およびその後の転写（LM-RCT）の一例の線図である。上段に図示されるのは、ギャップオリゴヌクレオチドおよび開環プローブであり、プライマー相補部分ならびにそれぞれ標的配列にハイブリダイズされた右および左標的プローブ部分に隣接するプロモーター部分を有している。下段に図示されるのは、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの連結されていないコピーにハイブリダイズしたローリングサークル複製産物である。このハイブリダイゼーションは、転写のための２本鎖基質を形成する。
図９は、増幅されたシグナルの生成のための開環プローブおよびLM-RCTを利用する複合抗体アッセイの一例の線図である。図示されているのは、３つのレポーター抗体であり、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドをDNAタグとして有する。下段に図示されるのは、結合したレポーター抗体に結合したDNAタグのみの増幅である。
図10は、特定の増幅された核酸の複合検出のための２つのスキームの線図である。上段に図示されるのは、増幅された核酸への異なる標識を有する検出プローブのハイブリダイゼーションである。下段に図示されるのは、ある形態で結合した異なる可能な増幅産物のためのアドレスプローブを有する固体状態検出器への増幅された核酸のハイブリダイゼーションである。
図11Aおよび11Bは、二次DNA鎖置換の一例の線図である。図11Aの上段に図示されるのは、ギャップオリゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした開環プローブである。図11Aの下段に図示されるのは、二次DNA鎖置換プライマーにハイブリダイズしたローリングサークル複製産物である。図11Bに図示されるのは、複数のプライマーから開始される二次DNA鎖置換である。図11Bは、ローリングサークル複製と同時に行われる二次DNA鎖置換を図示する。
図12は、増幅されていない第一開環プローブを標的配列として用いてネストされた（nested）RCAの一例の線図である。上段に図示されるのは、ギャップオリゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした第一開環プローブ、ならびに第一開環プローブにハイブリダイズした二次開環プローブである。下段に図示含されるのは、二次開環プローブのローリングサークル複製産物である。
図13は、鎖置換カスケード増幅の一例の線図である。図示されているのは、４つのTS-DNAの生成の合成およびテンプレート関係である。TS-DNA-1は、ローリングサークル複製プライマーによって開始されるローリングサークル複製によって生成される。TS-DNA-2およびTSONA-4は、二次DNA鎖置換プライマー（P2）によって開始される二次DNA鎖置換によって生成される。TS-DNA-3は、三次DNA鎖置換プライマー（P1）によって開始される鎖置換二次DNA鎖置換によって生成される。
図14は、反対の鎖の増幅の一例の線図である。図示されているのは、DNA合成が進行するにつれての反応の５つの異なる段階である。TS-DNA-2は、二次DNA鎖置換プライマーによって開始されるTS-DNAの二次DNA鎖置換によって生成される。ローリングサークル複製が、新たなTS-DNA配列を作製するにつれ、二次DNA鎖置換プライマーは、新たに合成されるDNAにハイブリダイズし、そしてTS-DNA-2の別のコピーの合成を開始する。
図15は、ギャップ配列を含む開環プローブの線図である。線図の下半分は、開環プローブおよび識別プライマーの配列間の好ましい関係を示す。
図16A、16B、および16Cは、３つの異なる核酸サンプルに関して行った単分子セグメントの増幅および配列決定（USA-SEQ）の結果を示す線図である。大きな円は、固体状態支持体上にドットされた標的サンプルを示す。小さい円は、個々のTS-DNA分子であって、サンプル中の標的核酸の位置でインサイチュで増幅され、プライマー伸長配列決定に供されたものを表す。図16Aは、野生型配列についてホモ接合性であるサンプルの代表例である（シスチンの組込みによって示される）。図16Bは、野生型および変異体についてヘテロ接合性であるサンプルの代表例である（シスチンおよびアデニンの組込みを生じる同数のTS-DNA分子によって示される）。図16Cは、ホモ接合体であるが、体細胞性変異を有するいくつかの細胞を含むサンプルの代表例である。
図17Aおよび17Bは、反復配列の異なる量を有する２つの標的配列に対する開環プローブの関係の一例の線図である。開環プローブの左標的プローブおよび右標的プローブの、２つの異なる標的配列へのハイブリダイゼーションが示される
0003974941.tif 000002
充填配列は、ギャップスペースの反対側の標的配合列中の配列に相補的なヌクレオチドであり、これは左および右標的プローブの間のギャップスペースを充填して開環プローブを増幅標的サークルへ連結させる。線図に示される配列は、実施例10に記載されるアッセイに関する。図17Aにおいて、標的配列は、配列番号24であり、左標的配列は、配列番号25のヌクレオチド76〜96であり、右標的配列は、配列番号25のヌクレオチド１〜24であり、そして充填配列は、配列番号25のヌクレオチド97〜128である。図17Bにおいて、標的配列は、配列番号23であり、左標的配列は、配列番号18のヌクレオチド２〜21であり、右標的配列は、配列番号25のヌクレオチド１〜24であり、そして充填配列は、配列番号18のヌクレオチド22〜51である。
図18A、18B、18C、18D、および18Eは、一連の核酸サンプルを含むスライドおよび単分子セグメント増幅およびケージ配列決定（USA-CAGESEQ）の間のマスクを有するサンプルの列の適用範囲を示す線図である。
図19は、USA-CAGESEQに供されたスライド上のサンプルの第一カラムに組み込まれたヌクレオチドを示す線図である。標的配列に対応するサンプルは、図17Aに示される。
図20は、USA-CAGESEQに供されたスライド上のサンプルの第一のカラムに組み込まれたヌクレオチドを示す線図である。標的配列に対応するサンプルは、図17Bに示される。
図21A、21B、22A、22B、23A、23B、24A、および24Bは、TS-DNAにハイブリダイズされた識別プローブおよび縮重プローブから形成された識別プライマーを示す。図は、５つのスライドおよび各スライドからの５つのサンプルドットの単一カラムを表すTS-DNAを示す。各列において、上部（より短い）配列は、識別プライマーであり、そして下部（より長い）配列は、TS-DNAの一部分である。識別プライマーの下線を付していない部分は、識別プローブを示す。識別プライマーの下線を付した部分は、一つ以上の縮重プローブの識別プローブの末端への逐次的な連結によって形成された。太字のヌクレオチドは、プライマー伸長の間に識別プライマーに付加されたヌクレオチドである。図21A、21B、22A、および22Bに示されるTS-DNA配列は、図17Aに示される標的配列に関連し、そして配列番号19のヌクレオチド１〜60に対応する。図21A、21B、22A、および22B中の識別プライマー配列は、配列番号25のヌクレオチド76〜125の種々の部分に対応する。図23A、23B、24A、および24Bに示される配列は、図17Bに示される標的配列に関し、そして配列番号26のヌクレオチド１〜58に対応する。図23A、23B、24Aおよび24B中の識別プライマー配列は、配列番号18のヌクレオチド１〜50の種々の部分に対応する。
図25Aおよび25Bは、ペプチド核酸（親和性部分として）およびローリングサークル複製プライマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなるレポーター結合分子の線図である。親和性部分は、標的DNAにハイブリダイズすることが示される。図25Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。
図26Aおよび26Bは、標的DNAに位相幾何学的にロックされた連結された開環プローブにハイブリダイズするレポーター結合分子の線図である。レポーター結合分子は、ペプチド核酸（親和性部分として）およびローリングサークル複製プライマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなる。図26Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。
図27Aおよび27Bは、化学的に連結したトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド（親和性部分として）およびオリゴヌクレオチド部分としてのローリングサークル複製プライマーからなるレポーター結合分子の線図である。親和性部分は、標的DNAにハイブリダイズすることが示された。PSは、親和性部分と標的DNAとの間の化学的連結を作製するソラレン誘導体を示す。図27Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。
図28Aおよび28Bは、標的DNAに位相幾何学的にロックされた連結した開環プローブにハイブリダイズするレポーター結合分子の線図である。レポーター結合分子は、化学的に連結したトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド（親和性部分として）およびオリゴヌクレオチド部分としてのローリングサークル複製複製プライマーからなる。PSは、親和性部分と標的DNAとの間の化学的連結を作製するソラレン誘導体を示す。図28Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。
図29Aおよび29Bは、抗体（親和性部分として）およびローリングサークル複製プライマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなるレポーター結合分子の線図である。親和性部分は標的抗原に結合することが示される。図29Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。
発明の詳細な説明
開示された組成物および方法は、標的核酸配列の一致しそして定量的な増幅および検出を可能にする、特定の材料および手順を使用する。これらの材料および手順は、以下に詳細に記載される。
開示された方法のいくつかの主要な特徴は以下の通りである：
１．連結操作は、対立遺伝子区別（allelic discrimination）を得るために、特に、ギャップ充填工程を使用して操作し得る。
２．増幅操作は、等温である。
３．シグナルは、厳密に定量的であり得る。なぜなら、増幅操作の特定の実施態様において、増幅は線形であり、そして高度に進行する酵素によって触媒される。複合アッセイにおいて、DNA複製に用いられるプライマーは、全てのプローブについて同一である。
４．改変されたヌクレオチドまたは他の部分は、DNA複製またはDNA転写の間に取り込まれ得る。
５．増幅産物は、反復DNA分子であり、そして検出に有用である、任意に選択されたタグ配列を含み得る。
Ｉ．材料
Ａ．開環プローブ
開環プローブ（OCP）は、一般的には50〜1000ヌクレオチド、好ましくは約60〜150ヌクレオチド、そして最も好ましくは約70〜100ヌクレオチドを含む、線状一本鎖DNA分子である。OCPは、5'リン酸基および3'水酸基を有する。これは、末端がDNAリガーゼを用いて連結されること、またはギャップ充填操作において伸長されることを可能にする。OCPの部分は、OCPをRCAおよびLM-RCAのために有用にする特異的な機能を有する。これらの部分を、標的プローブ部分、プライマー相補体部分、スペーサー領域、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分という（図５）。標的プローブ部分およびプライマー相補体部分は、開環プローブに必要とされるエレメントである。プライマー相補体部分は、スペーサー領域の一部分である。検出タグ部分、二次標的配列部分、およびプロモーター部分は任意であり、そして存在する場合、スペーサー領域の一部である。アドレスタグ部分は任意であり、そして存在する場合、スペーサー領域の一部であり得る。一般的に、開環プローブは、スペーサー領域の一部として存在するプライマー相補部分とともに、5'末端から3'末端に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサー領域、左標的プローブ部分、および3'水酸基を含む、一本鎖の線状DNA分子である。OCPの特定の部分に対応しないスペーサー領域のセグメントは、任意に選択された配列であり得る。OCPは自己相補的である配列を全く有さないことが好ましい。この条件は、ミスマッチまたはギャップを伴わずに、６より長いヌクレオチド長の相補的領域が存在しない場合に満たされると考えられる。プロモーター部分を含むOCPが、転写ターミネーター（例えば、８以上のひと続きのチミジンヌクレオチド）が類似している配列を全く有さないこともまた好ましい。
開環プローブは、連結および複製される場合、開環プローブに相補的な配列の複数の反復を含む長いDNA分子を生じる。この長いDNA分子を、本明細書中では縦列配列DNA（TS-DNA）という。TS-DNAは、標的プローブ部分、プライマー相補体部分、スペーサー領域、ならびに開環プローブ上に存在する場合、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分に相補的な配列を含む。TS-DNA中のこれらの配列を、標的配列（これは、もとの標的配列に適合する）、プライマー配列（これは、ローリングサークル複製プライマーの配列に適合する）、スペーサー配列（スペーサー領域に相補的である）、検出タグ、二次標的配列、アドレスタグ、およびプロモーター配列という。
特に好ましい実施態様は、20ヌクレオチドの左標的プローブおよび20ヌクレオチドの右標的プローブを含む、70〜100ヌクレオチドの開環プローブである。左標的プローブおよび右標的プローブは、５ヌクレオチドのギャップ（これは、単一のペンタヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチドによって充填される）を残して標的細胞にハイブリダイズする。
１．標的プローブ部分
各OCP上に二つの標的プローブ部分が（OCPの各末端に一つ）存在する。標的プローブ部分は、各々、標的プローブと標的配列との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のためには、各標的プローブ部分について10〜35ヌクレオチド長が好ましく、標的プローブ部分については15〜20ヌクレオチド長が最も好ましい。OCPの3'末端の標的プローブ部分を、左標的プローブといい、そしてOCPの5'末端の標的プローブ部分を、右標的プローブという。これらの標的プローブ部分を、本明細書中で、左および右標的プローブ、または左および右プローブともいう。標的プローブ部分は、標的核酸配列に相補的である。
標的プローブ部分は、標的配列に相補的であり、その結果、ハイブリダイゼーションすると、右標的プローブ部分の5'末端および左標的プローブ部分の3'末端は、これらが連結のための基質として作用するという目的で、標的配列中の隣接ヌクレオチドに対して塩基対合する（図１）。必要に応じて、標的プローブ部分の5'末端および3'末端は、ギャップスペースによって隔てられるような方法でハイブリダイズし得る。この場合、OCPの5'末端および3'末端は、１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチド（ギャップオリゴヌクレオチドという）が用いられる場合、またはギャップスペースが連結操作の間に充填される場合にのみ、連結され得る。ギャップオリゴヌクレオチドは、ギャップスペース中の標的配列にハイブリダイズして、連続したプローブ／標的ハイブリッドを形成する（図２）。ギャップスペースは、所望される任意の長さであり得るが、一般的には、10ヌクレオチド以下である。ギャップスペースは、約３〜10ヌクレオチド長であることが好ましく、ギャップスペースが４〜８ヌクレオチド長であることが最も好ましい。あるいは、ギャップスペースは、DNAポリメラーゼを用いて、連結操作の間に充填され得る（実施例３を参照のこと）。このようなギャップ充填操作を用いる場合、３〜５ヌクレオチド長のギャップスペースが最も好ましし。別の代替法として、ギャップスペースは、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドによって、DNAポリメラーゼを用いて充填されたギャップの残りに、部分的に架橋され得る。
２．プライマー相補体部分
プライマー相補体部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部分である。プライマー相補体部分は、ローリングサークル複製プライマー（RCRP）に相補的である。各OCPは、単一のプライマー相補体部分を有するべきである。これは、ローリングサークル複製が、連結されたOCP上の単一部位で開始するのを可能にする。プライマー相補体部分およびコグネイトプライマーは、互いに相補的である限り、任意の所望の配列を有し得る。一般に、プライマー相補体の配列は、OCPの任意の他の部分と割く類似しないように選択され得る。プライマー相補体部分は、プライマー相補体部分とプライマーとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチド長が好ましく、16〜20ヌクレオチド長のプライマー相補体部分が最も好まししい。プライマー相補体部分は、OCPのスペーサー領域内の任意の場所に位置し得る。プライマー相補体部分は、右標的プローブに隣接することが好ましく、右標的プローブ部分およびプライマー相補体部分は、好ましくは３〜10ヌクレオチドによって隔てられ、そして最も好ましくは６ヌクレオチドによって隔てられる。この位置は、DNA複製の間に連結されていない開環プローブから任意の他のスペーサー配列（例えば、検出タグおよび二次標的配列）が生じることを防ぐ。
３．検出タグ部分
検出タグ部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部分である。検出タグ部分は、検出プローブの相補的部分の配列に適合する配列を有する。これらの検出タグ部分は、ローリングサークル複製の間に増幅される場合、検出プローブの相補的部分に相補的な検出タグ配列を有するTS-DNAを生じる。存在する場合、OCP上に１つ、２つ、３つ、または３つより多くの検出タグ部分が存在し得る。OCPは、２つ、３つ、または４つの検出タグ部分を有することが好ましい。最も好ましくは、OCPは、３つの検出タグ部分を有する。一般に、OCPは、60以下の検出タグ部分を有することが好ましい。OCPの大きさを除いて、OCP上に存在し得る検出タグ部分の数に対する基本的制限はない。複数の検出タグ部分が存在する場合、それらは同じ配列を有し得るか、または異なる配列を有し得、各異なる配列は異なる検出プローブに対して相補的である。OCPは同じ配列を有する検出タグ部分を含み、その結果、それらは単一の検出プローブに対して全て相補的であることが好ましい。いくつかの複合検出法のためには、OCPが６までの検出タグ部分を含むこと、および検出タグ部分が異なる配列を有し、その結果、各検出タグ部分が異なる検出プローブに相補的であることが好ましい。検出タグ部分は、各々、検出タグと検出プローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜20ヌクレオチド長の検出タグ部分が最も好ましい。
４．二次標的配列部分
二次標的配列部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部である。二次標的配列部分は、二次開環プローブの標的プローブの配列に適合する配列を有する。これらの二次標的配列部分は、ローリングサークル複製中に増幅される場合、二次開環プローブの標的プローブに相補的である二次標的配列を有する、TS-DNAを生じる。存在する場合、OCP上に１つ、２つ、または２つより多くの二次標的配列部分が存在し得る。OCPは、１つまたは２つの二次標的配列部分を有することが好ましい。最も好ましくは、OCPは１つの二次標的配列部分を有する。一般的に、OCPは、50以下の二次標的配列部分有することが好ましい。OCPの大きさを除いて、OCP上に存在し得る二次標的配列部分の数に対する基本的な制限はない。複数の二次標的配列部分が存在する場合、これらは同じ配列を有し得るか、またはこれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は異なる二次OCPに相補的である。OCPは同じ配列を有する二次標的配列部分を含み、その結果、それらが二次OCPの単一の標的プローブ部分に全て相補的であることが好ましい。二次標的配列部分は各々、二次標的配列とそのコグネイトOCPの標的配列プローブとの間の、特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、20〜70ヌクレオチドの長さが好ましく、30〜40ヌクレオチド長の二次標的配列部分が最も好ましい。本明細書で使用されるように、二次開環プローブは、標的プローブ部分が別の開環プローブまたは増幅標的サークルにおける二次標的配列適合するかまたは相補的である、開環プローブである。二次開環プローブは、それ自身別の二次開環プローブの標的プローブ部分に適合するかまたは相補的である、二次標的配列を含み得ることが意図される。この様式で互いに関連する二次開環プローブを、本明細書中では、ネストされた開環プローブという。
５．アドレスタグ部分
アドレスタグ部分は、標的プローブ部分または開環プローのスペーサー領域のいずれかの一部分である。アドレスタグ部分は、アドレスプローブの相補的な部分の配列に適合する配列を有する。このアドレスタグ部分は、ローリングサークル複製中に増幅される場合、アドレスプローブの相補的部分に相補的であるアドレスタグ配列を有するTS-DNAを生じる。存在する場合、OCP上に１つまたは１つより多くのアドレスタグ部分が存在し得る。OCPは１つまたは２つのアドレスタグ部分を有することが好ましい。最も好ましくは、OCPは１つのアドレスタグ部分を有する。一般的に、OCPは50以下のアドレスタグ部分を有することが好ましい。OCPの大きさを除いて、OCP上に存在し得るアドレスタグ部分の数に対する基本的な制限はない。複数のアドレスタグ部分が存在する場合、それらは同じ配列を有し得るかまたはそれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は、異なるアドレスプローブに相補的である。OCPは、同じ配列を有するアドレスタグ部分を含み、その結果それらは単一のアドレスプローブに全て相補的であることが好ましい。好ましくは、アドレスタグ部分は、標的プローブ部分の全てまたは一部、および任意の介在ギャップスペースの全てに重複する（図６）。最も好ましくは、アドレスタグ部分は、左および右の両方の標的プローブ部分の全てまたは一部に重複する。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜20ヌクレオチド長のアドレスタグ部分が最も好ましい。
６．プロモーター部分
プロモーター部分は、RNAポリメラーゼプロモーターの配列に対応する。プロモーター部分は、開環プローブ中に含まれて、その結果、転写産物がTS-DNAから生成し得る。任意のプロモーターの配列が用いられ得るが、複雑な必要条件を伴わないRNAポリメラーゼのための単純なプロモーターが好ましい。プロモーターは、標的核酸配列を含む試料中に存在し得る、任意のRNAポリメラーゼによって認識されないこともまた好ましい。好ましくは、プロモーター部分は、T7またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターの配列に対応する。T7およびSP6 RNAポリメラーゼは、特定のプロモーター配列について高度に特異的である。この特徴を有するRNAポリメラーゼに特異的な他のプロモーター配列もまた、好ましい。なぜなら、プロモーター配列は、一般的に、特異的RNAポリメラーゼによって認識されるため、OCPのプロモーター部分についてのコグネイトポリメラーゼは、転写増幅に用いられるべきであるからである。多数のプロモーター配列が既知であり、そして適切なRNAポリメラーゼに特異的な任意のプロモーターが用いられ得る。プロモーター部分は、OCPのスペーサー領域内の任意の場所に位置し得、そしていずれの方向でも存在し得る。好ましくは、プロモーター部分は、左標的プローブに直接隣接し、そして転写を、開環プローブの3'末端の方向に向かって進めるように方向付ける。この方向は、TS-DNAに相補的である転写産物を生じ、このことは、TS-DNAおよび転写産物の独立した検出を可能にし、そして転写がローリングサークル複製に干渉するのを防ぐ。
Ｂ．ギャップオリゴヌクレオチド
ギャップオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズした開環プローブの末端の間のギャップスペースをカバーする標的配列の部分の全てまたは一部分に相補的であるオリゴヌクレオチドである。ギャップオリゴヌクレオチドの例および標的配列および開環プローブへのその関連を、図２に示す。ギャップオリゴヌクレオチドは、その5'末端にリン酸基を有し、そしてその3'末端に水酸基を有する。これは、開環プローブへの、または他のギャップオリゴヌクレオチドへのギャップオリゴヌクレオチドの連結を容易にする。ハイブリダイズした開環プローブの末端の間のギャップスペースは、単一のギャップオリゴヌクレオチドで充填され得るか、またはこれは複数のギャップオリゴヌクレオチドで充填され得る。例えば、２つの３ヌクレオチドのギャップオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチドのギャップスペースを充填するために用いられ得るか、または３ヌクレオチドのギャップオリゴヌクレオチドおよび４ヌクレオチドのギャップオリゴヌクレオチドは、７ヌクレオチドのギャップスペースを充填するために用いられ得る。ギャップオリゴヌクレオチドは、密接に関連する標的配列間を区別するために特に有用である。例えば、複数のギャップオリゴヌクレオチドは、標的配列の異なる対立遺伝子改変体を増幅するために用いられ得る。変化が生じる標的配列の領域を開環プローブによって形成されるギャップペース中に配置することによって、単一の開環プローブは、ギャップオリゴヌクレオチドの適切なセットを用いて、各々の個々の改変体を増幅するために用いられ得る。
Ｃ．増幅標的サークル
増幅標的サークル（ATC）は、環状一本鎖DNA分子であり、一般的に、40〜1000ヌクレオチド、好ましくは、約50〜150ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約50〜100ヌクレオチドを含む。ATCの部分は、ATCをローリングサークル増幅（RCA）に有用にする特定の機能を有する。これらの部分を、プライマー相補体部分、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分という。プライマー相補体部分は、増幅標的サークルの必要とされるエレメントである。検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分は、任意である。一般的に、増幅標的サークルは、プライマー相補体部分を含む一本鎖環状DNA分子である。ATCの特定の部分に対応しないATCのセグメントは、任意に選択された配列であり得る。ATCは、自己相補的である配列を全く有さないことが好ましい。ミスマッチまたはギャップを伴わない６より大きなヌクレオチド長の相補的な領域が存在しない場合、この条件を満たすと考えられる。プロモーター部分を含むATCが、転写ターミネーター（例えば、８以上のひと続きのチミジンヌクレオチド）に類似の配列を全く有さないこともまた好ましい。連結された開環プローブは、一種のATCであり、そして本明細書中で用いられる用語、増幅標的サークルは、連結された開環プローブを含む。ATCは、連結されたOCPについて本明細書中に記載されたのと同様の様式で用いられ得る。
増幅標的サークルは、複製される場合、増幅標的サークルに相補的な配列の複数の反復を含む、長いDNA分子を生じる。この長いDNA分子を、本明細書中で縦列配列DNA（TS-DNA）という。TS-DNAは、プライマー相補体部分に相補的な配列を含み、そして存在する場合、増幅標的サークル、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分上である）。TS-DNAにおけるこれらの配列を、プライマー配列（これは、ローリングサークル複製プライマーの配列に適合する）、スペーサー配列（スペーサー領域に相補的）、検出タグ、二次標的配列、アドレスタグ、およびプロモーター配列という。増幅標的サークルは、特定の結合分子のためのタグとして有用である。
Ｄ．ローリングサークル複製プライマー
ローリングサークル複製プライマー（RCRP）は、OCPまたはATCのプライマー相補体部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、RCRPの相補的な部分という。RCRPの相補的な部分およびコグネイトプライマー相補体部分は、それらがお互いに相補的である限り、任意の所望の配列を有し得る。一般的に、RCRPの配列は、OCPまたはATCの任意の他の部分に著しく相補的でないように選択され得る。ローリングサークル複製プライマーの相補的な部分は、プライマーとプライマー相補体部分との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般的に、これは10〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは、16〜20ヌクレオチド長である。
ローリングサークル複製プライマーはまた、OCPまたはATCのいずれの部分にも相補的ではないさらなる配列をRCRPの5'末端に含むことが好ましい。この配列を、RCRPの非相補的な部分という。RCRPの非相補的な部分は、存在する場合、DNA複製中に鎖置換を容易にするために作用する。RCRPの非相補的な部分は、任意の長さであり得るが、一般的には、１〜100ヌクレオチド長、そして好ましくは、４〜８ヌクレオチド長である。ローリングサークル複製プライマーはまた、それをエキソヌクレアーゼ消化に耐性にする、改変されたヌクレオチドを含み得る。例えば、プライマーは、プライマーの5'末端でのヌクレオチド間の、３または４のホスホロチオエート結合を有し得る。このようなヌクレアーゼ耐性プライマーは、過剰な非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの選択的分解を可能にする。さもなければこれらは、増幅された核酸に対する、検出プローブ、アドレスプローブ、および二次OCPのハイブリダイゼーションに干渉し得る。ローリングサークル複製プライマーは、鎖置換カスケード増幅における三次DNA鎖置換プライマーとして用いられ得る。
Ｅ．検出標識
RCAおよびRCTを用いて増幅された核酸の検出および定量を補助するために、検出標識は、増幅された核酸に直接取り込まれ得るか、または検出分子に結合し得る。本明細書で使用する場合、検出標識は、増幅された核酸と直接的または間接的に会合し得、そして測定可能で検出可能なシグナルを、直接的または間接的のいずれかで生じる任意の分子である。核酸に取り込まれる、または核酸もしくは抗体プローブに結合するための多くのこのような標識は、当業者に公知である。RCAおよびRCTにおける使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン（FITC）5,6-カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド（Texas red）、ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル（NBD）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、およびシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7を含む。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（5-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシサクシンイミドエステル）およびローダミン（5,6-テトラメチルローダミン）である。組合せ多色コードのための好ましい蛍光標識は、FITCおよびシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7である。これらの蛍光の吸収極大および放出極大は、それぞれ:FITC（490 nm;520 nm）、Cy3（554 nm;568 nm）、Cy3.5（581 nm;588 nm）、Cy5（652 nm;672 nm）、Cy5.5（682 nm;703 nm）、およびCy7（755 nm;778 nm）であり、従って、それらの同時検出を可能にする。蛍光標識は、種々の市販の供給源（Molecular Probes, Eugene, OR and Research Organics, Cleveland, Ohioを含む）から入手可能である。
標識されたヌクレオチドは、検出標識の好ましい形態である。なぜなら、それらは合成中にRCAおよびRCTの産物に直接取り込まれ得るからである。増幅されたDNAまたはRNAに取り込まれ得る検出標識の例は、BrdUrd（HoyおよびSchimke, Mutation Research 290:217-230（1993））、BrUTP（Wansickら、J. Cell Biology 122:283-293（1993））、およびビオチン（Langerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633（1981））またはジゴキシゲニン（Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364（1992））のような適切なハプテンで改変されたヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログを含む。適切な蛍光で標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン-イソチオシアネート-dUTP、シアニン-3-dUTP、およびシアニン-5-dUTP（Yuら、Nucleic Acids Res., 22:3226-3232（1994）である。DNAの好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、BrdUrd（BUDR三リン酸、Sigma）であり、そしてRNAの好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン-16-ウリジン-5'-三リン酸（ビオチン-16-dUTP、Boehringher Mannheim）である。フルオレセイン、Cy3、およびCy5は、直接標識のためにdUTPに結合し得る。Cy3.5およびCy7は、ビオチンで標識したプローブまたはジゴキシゲニンで標識したプローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として入手可能である。
増幅された核酸に取り込まれる検出標識（例えば、ビオチン）は、続いて、当該分野で周知の鋭敏な方法を用いて検出され得る。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体（Tropix, Inc.）（これは、ビオチンに結合し、続いて適切な基質（例えば、化学発光基質CSPD:3-（4-メトキシスピロ-[1,2,-ジオキシエタン-3-2'-（5'-クロロ）トリシクロ[3.3.1.13.7]デカン]-4-イル）フェニルホスフェート二ナトリウム;Tropix, Inc.）の化学発光によって次に検出される）を用いて検出され得る。
増幅されたRNAの検出における使用のために好ましい検出標識は、アクリジニウム-エステル標識したDNAプローブ（GenProbe, Inc., Arnoldら、Clinical Chemistry 35:1588-1594（1989）に記載される）である。アクリジニウム-エステル標識した検出プローブは、洗浄を伴わないで、増幅されたRNAの検出を可能にする。なぜなら、ハイブリダイズしていないプローブはアルカリで破壊され得るからである（Arnoldら、（1989））。
これらの検出標識の２つ以上を組み合わせた分子はまた、検出標識と考えられる。任意の公知の検出標識は、開示されたプローブ、タグ、および方法で、開示された方法を用いて増幅された核酸を標識および検出するために用いられ得る。検出標識によって生じるシグナルを検出および測定するための方法はまた、当業者に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーションカウンティングまたは直接的可視化によって検出され得る;蛍光分子は、蛍光分光光度計で検出され得る;燐光分子は、分光光度計によって検出され得るかまたはカメラで直接可視化され得る;酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出または可視化によって検出され得る;抗体は、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出され得る。このような方法は、増幅および検出の開示された方法において直接用いられ得る。本明細書中で用いられる場合、検出分子は、増幅された核酸と相互作用し、そして一つ以上の検出標識が結合された分子である。
Ｆ．検出プローブ
検出プローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物上の検出タグに相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的な部分は、検出プローブと検出タグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく、16〜20ヌクレオチド長の検出プローブの相補的な部分が最も好ましい。検出プローブは、上記の任意の検出ラベルを含み得る。好ましい標識は、ビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子ビーコンである。分子ビーコンは、検出プローブがハイブリダイズされた場合にのみ蛍光部分が蛍光を発する蛍光部分で標識された検出プローブである（TyagiおよびKramer, Nature Biotechnology 14:303-308（1996））。このようなプローブの使用は、標識検出の前にハイブリダイズしていないプローブを除去する必要性を排除する。なぜなら、ハイブリダイズしていない検出プローブは、シグナルを生成しないからである。これは、複合アッセイに特に有用である。
好ましい形態の検出プローブ（本明細書中では折り畳み（collapsing）検出プローブという）は、２つの別々の相補的な部分を含む。これは、各検出プローブがTS-DNAにおける２つの検出タグにハイブリダイズするのを可能にする。このようにして、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分の間で架橋を形成する。TS-DNAにハイブリダイズしている多数の折り畳み検出プローブの協同作用（combined action）は、架橋したTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離の伸長したTS-DNAよりもずっと小さな容量を占め、そして検出プローブ上に存在する検出標識はどんなものでも含む。この結果は、各TS-DNA争についてのコンパクトでそして別々の検出可能なシグナルである。折り畳みTS-DNAは、インサイチュハイブリダイゼーション適用および複合検出の両方に有用である。なぜなら、それは検出可能なシグナルがぴっちりとパックされる場合ですら空間的に隔てられるのを可能にするからである。折り畳みTS-DNAは、組合せ多色コードでの使用に特に好ましい。
TS-DNA折り畳みはまた、リガンド／リガンド結合対（例えば、ビオチンおよびアビジン）またはハプテン／抗体対の使用を通じて達成され得る。実施例６に記載のように、ヌクレオチドアナログ（BUDR）は、ローリングサークル複製中にTS-DNAに取り込まれ得る。BUDRに特異的なビオチン化抗体およびアビジンが添加される場合、TS-DNAの架橋が形成され、アビジン-ビオチン-抗体結合体によって架橋され、そしてTS-DNAは折り畳まれてコンパクトな構造になる。折り畳み検出プローブおよびビオチン媒介折り畳みはまた一緒に用いられて、TS-DNAを折り畳み得る。
Ｇ．アドレスプローブ
アドレスプローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物上のアドレスタグに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的な部分は、アドレスプローブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく、12〜18ヌクレオチド長のアドレスプローブの相補的な部分が最も好ましい。好ましくは、アドレスプローブの相補的な部分は、OCPの標的プローブ部分の全てまたは一部に相補的である。最も好ましくは、アドレスプローブの相補的な部分は、OCPの左標的プローブ部分および右標的プローブ部分のいずれかまたは両方の一部、ならびに任意のギャップオリゴヌクレオチドまたはギャップ充填操作において作製されるギャップ配列の全てまたは一部に相補的である（図６を参照のこと）。アドレスプローブは、単一の相補的な部分または複数の相補的な部分を含み得る。好ましくは、アドレスプローブは、直接的にまたはスペーサー分子を介してのいずれかで、固体状態の支持体に結合される。アドレスプローブと固体状態の支持体とのこのような組み合わせば、固体状態の検出器の好ましい形態である。
Ｈ．DNA鎖置換プライマー
二次DNA鎖置換に用いられるプライマーを、本明細書中ではDNA鎖置換プライマーという。DNA鎖置換プライマーの一つの形態（本明細書中では二次DNA鎖置換プライマーという）は、OCPまたはATCの配列の一部に適合する配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、二次DNA鎖置換プライマーの適合部分という。この二次DNA置換プライマーの適合部分は、TS-DNA中の配列に相補的である。二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は、TS-DNAの任意の配列に相補的であり得る。しかし、これが用いられる場合、ローリングサークル複製プライマーまたは三次DNA鎖置換プライマーのいずれかに適合する、相補的なTS-DNA配列ではないことが好ましい。これは、プライマーの相互のハイブリダイゼーションを妨げる。二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は、標的配列の全てまたは一部に相補的であり得る。この場合、二次DNA鎖置換プライマーの3'末端ヌクレオチドは、標的配列におけるギャップ配列に相補的であることが好ましい。二次DNA鎖置換プライマーの3'末端におけるヌクレオチドは、標的配列のギャップ配列における最後のヌクレオチド（すなわち、標的配列のギャップ配列における5'ヌクレオチド）に相補的になることが最も好ましい。二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は、プライマーとその相補体との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般的には、これは12〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは18〜25ヌクレオチド長である。
二次DNA鎖置換プライマーはまた、OCPまたはATCの任意の部分に適合しないさらなる配列をそれらの5'末端に含むことが好ましい。この配列を、二次DNA鎖置換プライマーの非適合部分という。二次DNA鎖置換プライマーの非適合部分は、存在する場合、DNA複製中の鎖置換を容易にするために作用する。二次DNA鎖置換プライマーの非適合部分は、任意の長さであり得るが、一般的には１〜100ヌクレオチド長、そして好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。
DNA鎖置換プライマーの別の形態（本明細書中では三次DNA鎖置換プライマーという）は、OCPまたはATCの配列の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分という。この三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、TS-DNAにおける配列に適合する。三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、OCPまたはATCにおける任意の配列に相補的であり得る。しかし、それは二次DNA鎖置換プライマーに適合する、相補的なOCPまたはATC配列でないことが好ましい。これは、プライマーの相互のハイブリダイゼーションを妨げる。好ましくは、三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、OCPのスペーサー部分の一部に相補的な配列を有する。三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、プライマーとその相補体との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般的には、これは12〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは、18〜25ヌクレオチド長である。三次DNA鎖置換プライマーはまた、OCPまたはATCのいずれの部分にも相補的でないさらなる配列をそれらの5'末端に含むことが好ましい。この配列を、三次DNA鎖置換プライマーの非相補的な部分という。三次DNA鎖置換プライマーの非相補的な部分は、存在する場合、DNA複製中の鎖置換を容易にするために作用する。三次DNA鎖置換プライマーの非相補的な部分は、任意の長さであり得るが、一般的には、１〜100ヌクレオチド長、そして好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。ローリングサークル複製プライマーは、好ましい形態の三次DNA鎖置換プライマーである。
DNA鎖置換プライマーはまた、エキソヌクレアーゼ消化に対してそれらを抵抗性にする、改変されたヌクレオチドを含み得る。例えば、プライマーは、プライマーの5'末端におけるヌクレオチドの間の３つまたは４つのホスホロチオエート結合を有し得る。このようなヌクレアーゼ耐性プライマーは、過剰の結合されていないOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの選択的分解を可能にする。さもなければこれらは、増幅された核酸への、検出プローブ、アドレスプローブ、および二次OCPのハイブリダイゼーションに干渉し得る。DNA鎖置換プライマーは、二次DNA鎖置換および鎖置換カスケード増幅（両方とも以下に記載される）に用いられ得る。
I．識別プローブ
識別プローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。識別プローブは、OCPまたは増幅標的サークル（例えば、USA-SEQおよびUSA-CAGESEQ）のローリングサークル増幅後のプライマー伸長配列決定操作において用いられることが意図される。識別プローブは、プライマー伸長配列決定操作における識別プライマーとして直接用いられ得るか、またはそれらは他の識別プローブまたは縮重プローブと組み合わされて識別プライマーを形成し得る。本明細書中で用いられる場合、識別プライマーは、プライマー伸長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドである。OCPまたはATC中（および、それゆえ、増幅された標的配列中）の配列に対する識別プローブの関係は、好ましくは、OCPまたはATC中の配列に対する識別プライマー（これは識別プローブから形成される）の関係によって決定される。
識別プローブの相補的な部分は、識別プローブとTS-DNAとの間のハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜40ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜30ヌクレオチド長の識別プローブの相補的な部分が最も好ましい。識別プローブの好ましい使用は、増幅された標的配列のプライマー伸長配列決定のための識別プライマーを形成することである。この目的のために、識別プローブは、配列決定されるべきである増幅された標的配列の部分のTS-DNA5'にハイブリダイズするべきである。
プライマー伸長配列決定操作（例えば、USA-CAGESEQ）のために、識別プローブのネストされたセットは、配列が決定されるべきである、増幅された標的配列の領域のちょうど5'にハイブリダイズするように設計されることが好ましい。従って、例えば、識別プローブのセットは、各プローブが、標的配列の20ヌクレオチド領域に相補的であるように設計され得、各20ヌクレオチド領域は先の領域から１ヌクレオチドだけずれている。この好ましい関係は、以下に示され得る:
0003974941.tif 000003
プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97であり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列番号25のヌクレオチド80〜99であり、そして標的（3'〜5'に示す）は配列番号19のヌクレオチド19〜60である。このようなネストされたセットにおける識別プローブの数は、プライマー伸長配列決定操作において用いられる縮重プローブの長さに等しいことが好ましい。
識別プローブの3'水酸基は、他のオリゴヌクレオチドへの所望でない連結を防ぐ目的で可逆的にブロックされることもまた好ましい。このようなブロックされたプローブは、識別プローブへのさらなるプローブ（例えば、縮重プローブ）の制御された連結反応を可能にする。例えば、USA-CAGESEQ（縮重プローブプライマー伸長配列決定の１形態）は、可逆的にブロックされた識別プローブを使用して継続的な、そして制御された、識別プローブに対する縮重プローブの付加を可能にする。オリゴヌクレオチドにおける3'水酸基を可逆的にブロックする任意の公知の手段は、ブロックされた識別プローブを生成するために用いられ得る。可逆的なブロッキングエレメントの好ましい形態は、下記のケージ構造である。ブロックされた識別プローブとして有用なケージ化オリゴヌクレオチドは、以下に記載される。
J．変性プローブ
変性プローブは、OCPまたは増幅標的サークル（例えば、USA-SEQおよびUSA-CAGESEQ）のローリングサークル増幅に続くプライマー伸長配列決定操作における使用が意図されるオリゴヌクレオチドである。変性プローブは識別プローブと結合し、識別プライマーを形成する。これは識別プローブおよび変性プライマーをTS-DNAにハイブリダイズし、そして識別プローブと識別プローブに隣接してハイブリダイズする任意の変性プローブとを共に連結することにより、達成される。この目的のために、完全なセットの変性プローブが共に使用されることが好ましい。これは変性プローブの少なくとも１つが、ハイブリダイズされる識別プローブに直接隣接するTS-DNAの一部に相補的であることを保証する。この好ましい関係は、以下のように例示され得る。
0003974941.tif 000004
識別プローブおよび変性プローブは共に、配列番号25のヌクレオチド80〜104を表し、そして標的（３'→５'で示される）は配列番号19のヌクレオチド19〜60である。下線部の配列は変性プローブを表し、これは識別プローブ（上段の、下線のない部分）に連結されている。
変性プローブの完全なセットが、変性プローブを含むプライマー伸長配列決定操作において使用されることが好ましい。本明細書中で使用されるように、変性プローブの完全なセットは、全てが同一の長さであるオリゴヌクレオチドのセットをいい、そこでは全ての可能なヌクレオチド配列が表される。そのようなプローブの数は式４Nで記載され、ここで４はDNA中（またはRNA中）に見出される４種のヌクレオチドを表し、そしてNはセットにおけるオリゴヌクレオチドの長さを表す。従って、３ヌクレオチド長の変性プローブの完全なセットは64の異なるオリゴヌクレオチドを含み、そして４ヌクレオチド長の変性プローブの完全なセットは256の異なるオリゴヌクレオチドを含み、そして５ヌクレオチド長の変性プローブの完全なセットは1024の異なるオリゴヌクレオチドを含む。そのようなネストされたセットにおける識別プローブの数は、変性プローブプライマー伸長配列決定において使用される変性プローブの長さに等しいことが好ましい。変性プローブのセットは、１つの識別プローブと共に、または識別プローブのセットと共に、使用され得る。そのような識別プローブのセットが、上記のネストされたセットを表すことが好ましい。
プライマー伸長操作において、変性プローブのセット中のただ１つの変性プローブが、増幅される標的配列にハイブリダイズされる所定の識別プローブに隣接して、ハイブリダイズする。識別プローブにハイブリダイズされた標的配列の領域に隣接（すなわち、３'側）するヌクレオチド配列は、どの変性プローブがハイブリダイズするかを決定する。識別プローブに直接に隣接してハイブリダイズされた変性プローブのみが、識別プローブに連結されるべきである。この理由のために、配列決定されるべき標的配列の領域が、識別プローブにハイブリダイズされる領域に隣接することが好ましい。好ましくは、この領域はTS-DNAにおけるギャップ配列である（充填されたギャップスペースの全部または一部を表す）。ギャップ充填連結の使用は、RCAにおいて増幅される標的核酸における、配列多様性の潜在的な、予期される、または公知の領域を表す、TS-DNA中のギャップ配列の存在を可能にする。
変性プローブは、識別プローブと、または他の変性プローブと結合されて、識別プライマーを形成し得る。本明細書中で使用されるように、識別プライマーは、プライマー伸長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドである。
変性プローブの３'ヒドロキシルが、他のオリゴヌクレオチドとの望ましくない連結を防ぐために可逆的にブロックされていることが、また好ましい。そのようなブロックされたプローブは、さらなる変性プローブの変性プローブへの制御された連結を可能にする。例えば、USA-CAGESEQは、可逆的にブロックされた変性プローブを使用して、変性プローブの識別プローブへの連続的かつ制御された付加を可能にする。オリゴヌクレオチド中の３'ヒドロキシルを可逆的にブロッキングする任意の公知の方法が、ブロックされた変性プローブを生成するために使用され得る。可逆的ブロッキング要素の好ましい形態は、以下に記載されるケージ構造（cage structure）である。ブロックされた変性プローブとして有用なケージされた（caged）オリゴヌクレオチドは、以下に記載される。
識別プローブのネストされたセットが使用される場合、それらは一連のプライマー伸長配列決定操作に使用されて、隣接ヌクレオチドの同一性を決定し得る。上に例示される識別プローブのセット、および５量体変性プローブの完全なセットを使用することで、標的配列中の強調されたヌクレオチドは、１つの変性プローブが各識別プローブに連結されている場所で同定され得る:
0003974941.tif 000005
プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97であり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列番号25のヌクレオチド80〜99であり、そして標的（３'→５'で示される）は配列番号19のヌクレオチド19〜60である。強調されたヌクレオチドは、識別プローブと変性プライマーとの連結により形成される識別プライマーに隣接（すなわち、３'側）するヌクレオチドを表す。さらなるヌクレオチドの同一性は、さらなる変性プローブを、識別プローブに既に連結された変性プローブに連結することにより決定され得る。このプロセスは、実施例10に例示される。変性プローブの長さが、ネストされたセットにおける識別プローブの数に等しいことが好ましい。
K．識別プライマー
識別プライマーは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写物の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。識別プライマーは、増幅標的サークル（例えば、USA-SEQおよびUSA-CAGESEQ）のローリングサークル増幅に続くプライマー伸長配列決定操作における使用が意図される。好ましくは、識別プライマーは、OCPの左側標的プローブ部分の全部または一部を表すTS-DNA中の標的配列の一部に相補的である。第２のTS-DNAとの使用のために、識別プライマーが、OCPの右側標的プローブ部分を表す第２のTS-DNA中の標的配列の一部に相補的であることが好ましい。そのような識別プライマーはまた、好ましくは、左側標的プローブ部分に隣接するスペーサー領域の一部に相補的である。従って、好ましい識別プライマーは、OCPの５'末端を表すTS-DNAの隣接セグメントに相補的である。この好ましい関係は、TS-DNAにおけるギャップ配列の、プライマー伸長配列決定を可能にする。識別プライマーとOCPとの間の、この好ましい関係の例は、実施例15に示される。しかし、識別プローブは、増幅された核酸における任意の所望の配列に相補的であり得る。
一般に、識別プライマーは、連結されていない識別プライマー、２以上の識別プローブの組合せ（すなわち、共に連結された識別プローブ）、または１以上の識別プローブと１以上の変性プローブとの組合せ（すなわち、共に連結された識別プローブおよび変性プローブ）であり得る。従って、識別プローブは、プライマー伸長配列決定操作における識別プライマーとして直接使用され得るか、あるいは他の識別プローブと、または変性プローブと結合されて、識別プライマーを形成し得る。本明細書中で使用されるように、識別プライマーは、プライマー伸長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドである。識別プライマーがブロックされた３'ヒドロキシルを有するプローブから作製され、そして得られた識別プライマーがブロックされている場合、ブロックはプライマー伸長操作に先立って除去されなければならない。
識別プライマーの相補的部分は、識別プライマーとTS-DNAとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。この目的のために、10〜40ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜30ヌクレオチド長の識別プライマーの相補的部分が最も好ましい。増幅された標的配列のプライマー伸長配列決定におけるプライマーとしての識別プライマーの使用が好ましい。この目的のために、識別プライマーは、配列決定されるべき増幅された標的配列のTS-DNA５'側部分にハイブリダイズするべきである。配列決定されるべき増幅された標的配列の部分が、ギャップ配列を表すことが好ましい。そのようなギャップ配列は、好ましくは、OCPが標的核酸にハイブリダイズするときに形成されるギャップスペースの反対側の標的核酸の部分に存在する、公知の、予期される、または潜在的な配列改変体を集合的に表す。この目的のために、ギャップスペースがギャップ充填連結操作においてDNAポリメラーゼにより充填されることが好ましい。
L．ケージされたオリゴヌクレオチド
ケージされたオリゴヌクレオチドは、それらの３'末端にケージされたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。ケージ構造は、３'ヒドロキシルがヌクレオチド付加および連結反応に加わることを防ぐ、除去可能なブロッキング基である。ケージされたオリゴヌクレオチドは、本明細書中に開示される増幅、検出、および配列決定操作における使用のための上記プライマーおよびプローブとして有用である。多くのケージ構造が公知である。ケージ構造の好ましい形態は、光への曝露によるそれらの除去を可能にする、光に不安定な構造である。オリゴヌクレオチドの３'末端を可逆的にブロッキングするために有用なケージ構造の例は、以下により記載される:Metzkerら，Nucleic Acids Research 22:4259-4267（1994）、BurgessおよびJacutin, Am. Chem Soc. 要約集第211巻,要約281（1996）、Zehaviら，J. Organic Chem. 37:2281-2288（1972）、Kaplanら，Biochem. 17:1929-1935（1978）、およびMcCrayら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7237-7241（1980）。ケージされたオリゴヌクレオチドにおける使用のためのケージされたヌクレオチドの好ましい形態は、Metzkerらにより記載される。最も好ましいケージ構造は、３'-0-（2-ニトロベンジル）基であり、それは紫外光への曝露に不安定である（Pillai, Synthesis 1-26（1980））。このケージ構造の除去は、好ましくは、ケージされたヌクレオチドを含む物質を、３〜10分間トランスイルミネーターを使用して長波長紫外光（好ましくは354nm）で照射することにより、達成される。
開示されかつ公知であるケージ構造は、保護されたケージされたヌクレオチドを使用するための公知でありかつ確立されたオリゴヌクレオチド合成方法論（下に記載される）を適用することにより、またはオリゴヌクレオチド合成に続いてケージ構造を付加することにより、オリゴヌクレオチドに取り込まれ得る。
上記のように、ケージされたオリゴヌクレオチドは、識別プローブまたは変性プローブとして使用され得る。ケージされたオリゴヌクレオチドはまた、複製プライマー（例えば、増幅反応におけるプライマーの全集団または一部のいずれかのための、ローリングサークル複製プライマー）としても使用され得る。これは、機能的な（すなわち、伸長可能な）プライマーのプールを、反応または増幅操作の特定の時点で増加することを可能にする。例えば、異なる長さのTS-DNAを生成するために異なるローリングサークル複製プライマーを使用する場合（以下のセクションIIBを参照のこと）、１つのローリングサークル複製プライマーは、ケージされたオリゴヌクレオチドであり得る。
M．ペプチド核酸クランプ
ペプチド核酸（PNA）は、ペプチド骨格を有する核酸の改変された形態である。ペプチド核酸は、DNAと極度に安定なハイブリッドを形成し（Hanveyら，Science 258:1481-1485（1992）;Nielsenら，Anticancer Drug Des. 8:53-63（1993））、そしてPCR反応の特異的なブロッカーとして使用されている（Orumら，Nucleic Acids Res., 21:5332-5336（1993））。PNAクランプは、OCPの左側標的プローブ部分および右側標的プローブ部分の両方の部分中の配列に相補的であるが、連結されたOCPの任意のギャップオリゴヌクレオチドまたは充填されたギャップスペースの配列に相補的ではないペプチド核酸である。従って、PNAクランプは、不合理に連結された、すなわち標的に指向されていない様式で連結された、OCPの連結接合部のみにハイブリダイズし得る。PNAクランプは、クランプとその相補鎖との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般にこれは７〜12ヌクレオチド長であるが、好ましくは８〜10ヌクレオチド長である。PNAクランプは、不合理に連結されたOCPの複製を防ぐことにより、ローリングサークル増幅におけるバックグラウンドシグナルを減少させるために使用され得る。
N．オリゴヌクレオチド合成
開環プローブ、ギャップオリゴヌクレオチド、ローリングサークル複製プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、増幅標的サークル、DNA鎖置換プライマー、および任意の他のオリゴヌクレオチドが、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドを生成または合成する方法は、当該分野において周知である。そのような方法は、標準的な酵素消化後のヌクレオチドフラグメント単離（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）第５、６章）を参照のこと）から、純粋な合成法、例えば、MilligenまたはBeckman System 1 Plus DNA合成機（例えば、Millingen-Biosearch, Burlington, MAのModel 8700自動合成機、またはABI Model 380B）を用いるシアノエチルホスホルアミダイト法による合成法まで広がり得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成法はまた、Ikutaら，Ann. Rev. Biochem. 53:323-356（1984）（ホスホトリエステルおよびホスファイト-トリエステル法）およびNarangら，Methods Enzymol., 65:610-620（1980）（ホスホトリエステル法）に記載される。タンパク質核酸分子は、Nielsenら，Bioconjug. Chem. 5:3-7（1994）に記載される方法のような、公知の方法を使用して作製され得る。
本明細書中に記載される多くのオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸の特定の部分に相補的であるように設計され、その結果、安定なハイブリッドがそれらの間に形成され得る。これらのハイブリッドの安定性は、LesnickおよびFreier, Biochemistry 34:10807-10815（1995）、McGrawら，Biotechniques 8:674-678（1990）、およびRychlikら，Nucleic Acids Res. 18:6409-6412（1990）に記載される方法のような、公知の方法を用いて計算され得る。
O．固体状態検出器
固体状態検出器は、それらにアドレスプローブまたは検出分子を結合した固体基質または支持体である。固体状態検出器の好ましい形態は、アレイ検出器である。アレイ検出器は、そこに複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子がアレイ、格子、または他の組織的な様式で結合した固体状態検出器である。
固体状態検出器における使用のための固体基質は、そこにオリゴヌクレオチドを結合し得る任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリフマル酸プロピル（polypropylfumerate）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基質は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、不織布、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有し得る。固体基質のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準96ウェルタイプである。
固体基質上で固定されたアドレスプローブは、固体状態検出器上のRCAおよびRCTの産物の捕捉を可能にする。そのような捕捉は、続く検出工程を妨げ得る反応成分を洗い去る、好都合な手段を提供する。異なるアドレスプローブを固体状態検出器の異なる領域に付着させることにより、異なるRCAまたはRCT産物が、固体状態検出器上の異なる位置、従って診断的な位置で捕捉され得る。例えば、マイクロタイタープレート複合アッセイにおいて、96までの異なるTS-DNA（各々が異なる標的配列を介して増幅された）に特異的なアドレスプローブは、各々が異なるウェル中で、マイクロタイタープレート上に固定され得る。捕捉および検出は、TS-DNAに対応する標的配列がサンプル中に存在した、TS-DNAに対応するそれらのウェルの中でのみ起こる。
固体基質へのオリゴヌクレオチドの固定のための方法は、良く確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合法を用いて基質に結合され得る。例えば、適切な付着法は、Peaseら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91（11）:5022-5026（1994）、およびKhrapkoら,Mol Biol（Mosk）（USSR）25:718-730（1991）により記載される。カゼイン被覆スライド上の３'アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Stimpsonら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383（1995）により記載される。固体基質にオリゴヌクレオチドを付着させる好ましい方法は、Guoら，Nucleic Acids Res. 22:5456-5465（1994）により記載される。
RCAおよびRCTアッセイにおいて有用ないくつかの固体状態検出器は、固体基質に付着された検出抗体を有する。そのような抗体は、目的の分子に対して特異的であり得る。次いで、目的の捕捉された分子は、第二のレポーター抗体の結合により、続いてRCAまたはRCTにより、検出され得る。固体状態検出器における抗体のそのような使用は、RCAアッセイが、抗体を生じ得る任意の分子の検出のために開発されることを可能にする。固体基質へ抗体を固定するための方法は、良く確立されている。固定は、例えば、アミノ化された表面、カルボキシル化された表面、またはヒドロキシル化された表面への、標準的な固定化学を用いる付着により達成され得る。付着剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン-ビオチン、光架橋剤、エポキシド、およびマレイミドである。好ましい付着剤はグルタルアルデヒドである。これらの、および他の付着剤は、付着におけるそれらの使用法と同様に、Protein immobilization: fundamentals and applications, Richard F. Taylor編（M. Dekker, New York, 1991）、JohnstoneおよびThorpe, Immunochemistry In Practice（Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987）209-216頁および241-242頁、およびImmobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermansonら編（Academic Press, New York, 1992）に記載される。抗体は、固体基質内に存在する反応性の側部基に抗体上の遊離アミノ基を化学的に架橋することにより基質に付着され得る。例えば、抗体は、架橋剤としてグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを使用して、遊離のアミノ基またはカルボキシル基を含む基質に化学的に架橋され得る。この方法では、遊離の抗体を含む水溶液が、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下、固体基質と共にインキュベートされる。グルタルアルデヒドとの架橋のために、反応物は、0.1Mカコジル酸ナトリウム（pH7.4）のような緩衝化溶液中２容量％のグルタルアルデヒドと共にインキュベートされ得る。他の標準的な固定化学は、当業者に公知である。
P．固体サンプル
固体サンプルは、そこに標的分子または標的配列を結合または接着している、固体基質または支持体である。標的分子または標的配列は、好ましくは、標的サンプルまたはアッセイサンプル中に送達される。固体サンプルの好ましい形態は、アレイサンプルである。アレイサンプルは、そこに複数の異なる標的サンプルまたはアッセイサンプルをアレイ、格子、または他の組織的な様式で結合または接着している、固体サンプルである。
固体サンプルにおける使用のための固体基質は、そこに標的分子または標的配列を結合または接着し得る、任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリフマル酸プロピル（polypropylfumerate）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基質は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、スライド、繊維、不織布、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有する。固体基質のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュおよびガラススライドである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準96ウェルタイプである。
固体基質上で固定された標的分子および標的配列は、固体基質上に局在される標的特異的TS-DNAの形成を可能にする。そのような配置は、続く検出工程を妨げ得る反応成分を洗い去る好都合な手段を提供し、そして複数の異なるサンプルを同時にアッセイする好都合な方法を提供する。診断的TS-DNAは、異なるサンプルが接着する各部位に個々に形成され得る。固体サンプルを形成するための標的配列または他のオリゴヌクレオチド分子の固定のために、上記の方法が使用され得る。標的分子がタンパク質の場合、タンパク質は、抗体の固定について一般的に上記されるように固体基質上に固定され得る。
固体基質の好ましい形態は、そこに256までの別々の標的またはアッセイサンプルが小さな点のアレイとして接着しているガラススライドである。各点は、好ましくは直径0.1〜2.5mmであり、最も好ましくは直径およそ2.5mmである。そのような微少アレイは、例えば、Schenaら，Science 270:487-470（1995）により記載される方法を使用して製造され得る。簡潔には、微少アレイは、プリントチップを備えたアレイマシンによって、ポリ-L-リジン被覆顕微鏡スライド（Sigma）上に製造され得る。チップは、例えば、96-ウェルのマイクロタイタープレートからの１μlのDNAサンプル（0.5mg/ml）と共にロードされ、そして所望の間隔で複数のスライド上に１スライドあたり約0.005μlで配置される。次いで、プリントされたスライドは、湿潤チャンバー内で２時間再水和され、100℃で１分間急速乾燥（snap-dry）され、0.1%SDS中ですすがれ、そして50％1-メチル-2-ピロリドンおよび50%ホウ酸から成る緩衝液中に調製された0.05%無水コハク酸で処理され得る。次いでスライド上のDNAは、例えば、使用の直前に90℃で２分間、蒸留水中で変性され得る。微少アレイ固体サンプルは、例えば、コンピュータ制御XYステージおよび顕微鏡対物レンズを有するレーザー蛍光スキャナによって、スキャンされ得る。混合ガス、多線レーザーは、複数の蛍光物質の連続的な励起を可能にする。
Q．レポーター結合剤
レポーター結合剤は、オリゴヌクレオチドに結合されるか、または束縛される（tethered）、特異的結合分子である。特異的結合分子は、レポーター結合剤の親和性部分をいい、オリゴヌクレオチドはレポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分をいう。本明細書中で使用されるように、特異的結合分子は特定の分子または部分と特異的に相互作用する分子である。特異的結合分子と特異的に相互作用する分子または部分は、本明細書中において、標的分子をいう。標的分子という用語が、別々の分子の両方、および、特異的結合分子と特異的に相互作用するタンパク質のエピトープのような分子の部分をいうことが理解される。抗体、レセプター/リガンド対のメンバーのいずれか、および特異的結合親和性を有する他の分子が特異的結合分子の例であり、レポーター結合分子の親和性部分に有用である。抗体である親和性部分を有するレポーター結合分子は、本明細書中において、レポーター抗体をいう。増幅標的サークルの束縛により、または標的配列のそのような特異的標的分子への結合により、特異的結合分子のその特異的標的への結合が、ローリングサークル増幅でのATCまたは標的配列の増幅により検出され得る。この増幅は、非常に少数の結合された特異的結合分子の高感度の検出を可能にする。特定の標的分子と特異的に相互作用するレポーター結合分子は、標的分子に特異的であると言われる。例えば、特定の抗原に結合する抗体である親和性部分を有するレポーター結合分子は、その抗原に特異的であると言われる。この抗原は標的分子である。レポーター結合剤はまた、本明細書中において、レポーター結合分子をいう。図25、26、27、28、および29は、レポーター結合分子およびその使用のいくつかの好ましいタイプの例を示す。図29は、親和性部分として抗体を使用するレポーター結合分子を示す。
レポーター結合分子の特別な形態（本明細書中においてレポーター結合プローブという）は、特異的結合分子としてオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を有する。レポーター結合プローブは、特定の核酸配列のために設計され、そしてそれを検出するために使用される。従って、レポーター結合プローブのための標的分子は、核酸配列である。レポーター結合プローブのための標的分子は、より大きな核酸分子内のヌクレオチド配列であり得る。レポーター結合分子という用語が、レポーター結合プローブを包含することが理解される。レポーター結合プローブの特異的結合分子は、レポーター結合プローブと標的分子との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。この目的のために、10〜40ヌクレオチド長が好ましく、レポーター結合プローブの特異的結合分子が16〜25ヌクレオチド長であることが最も好ましい。レポーター結合プローブの特異的結合分子は、ペプチド核酸であることが好ましい。上記のように、ペプチド核酸はDNAと安定なハイブリッドを形成する。このことは、ペプチド核酸特異的結合分子を有するレポーター結合プローブが、続く増幅および検出操作の間、標的配列に堅固に接着し続けることを可能にする。この有用な効果はまた、Gasparroら，Nucleic Acids Res. 1994 22（14）:2845-2852（1994）により記載される三重らせん化学結合技術を使用することにより、オリゴヌクレオチド特異的結合分子を有するレポーター結合プローブでも得られ得る。簡潔には、レポーター結合プローブの親和性部分は、標的配列にハイブリダイズされた場合、三重らせんを形成するように設計される。これは、一般に知られるように、好ましくは、主としてホモプリンの標的配列か、または主としてホモピリミジンの標的配列のいずれかを選択することにより達成される。レポーター結合プローブの親和性部分を構成する、適合オリゴヌクレオチド配列は、選択される標的配列に相補的であり、従って、それぞれ、主としてホモピリミジンであるか、または主としてホモプリンである。レポーター結合プローブ（Gasparroらにより記載される三重らせんプローブに対応する）は、化学的に連結したソラレン誘導体を含む。標的配列へのレポーター結合プローブのハイブリダイゼーションに際して、三重らせんが形成される。三重らせんを低波長紫外線に曝露することにより、ソラレン誘導体が、標的配列へのプローブの架橋を媒介する。図25、26、27、および28は、レポーター結合プローブであるレポーター結合分子の例を示す。
レポーター結合プローブ中の特異的結合分子はまた、Landegrenら，Science 241:1077-1080（1988）により記載されるDNAプローブから改変される連結可能なDNAプローブのような、２つの部分を有するDNA分子であり得る。そのようなプローブを使用する場合、プローブの親和性部分は、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチド部分の標的媒介性連結により構築される。従って、そのようなレポーター結合プローブの親和性部分を形成するために使用される成分は、切形のレポーター結合プローブ（標的配列の一部にハイブリダイズする切形の親和性部分を有する）、および切形のレポーター結合プローブに連結され得るように標的配列の隣接部にハイブリダイズする連結プローブである。連結プローブはまた、両者が標的配列にハイブリダイズされる場合、切形のレポーター結合プローブから分離され得る（すなわち、隣接していない）。次いで、それらの間に生じる空間は、第２の連結プローブにより、またはギャップ充填合成により充填され得る。開示される方法における使用のためには、切形の親和性部分は、標的媒介性連結を可能にするに十分長いが、連結プローブへの連結の不存在下において、続く増幅操作の間、標的配列への切形のレポーター結合プローブの安定なハイブリダイゼーションを防ぐのに十分に短いことが好ましい。この目的のために、標的配列と未連結の切形のレポーター結合プローブとの間のハイブリッドを除去するために設計される特定の工程が、連結操作に続いて使用され得る。
１つの実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、標的配列と呼ばれる配列を含み、それはOCPのための標的配列として作用する。標的配列の配列は、任意に選択され得る。複数のレポーター結合剤を使用する複合アッセイにおいては、各レポーター結合剤のための標的配列が、非特異的標的の検出の可能性を制限するために、実質的に異なることが好ましい。あるいは、いくつかの複合アッセイにおいて、関連配列と共に標的配列を使用することが望まれ得る。異なるギャップスペースを充填するために異なる独特のギャップオリゴヌクレオチドを使用することにより、そのようなアッセイは、より多くの標的配列を増幅しそして検出するために、１つまたはいくつかのOCPを使用し得る。オリゴヌクレオチド部分は、任意のいくつかの確立された結合反応により親和性部分に結合し得る。例えば、Hendricksonら，Nucleic Acids Res., 23（3）:522-529（1995）は、オリゴヌクレオチドを抗体に結合させるための適切な方法を記載する。
別の実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマー配列と呼ばれる配列を含み、それはATCのためのローリングサークル複製プライマーとして作用する。このことは、生じるTS-DNAがレポーター結合剤に結合される場合の、付加されたATCのローリングサークル複製を可能にする。このために、TS-DNAは、標的分子の部位において効果的に固定される。好ましくは、次いで固定されたTS-DNAが、検出に先立ってインサイチュで折り畳み得る。ローリングサークル複製プライマー配列の配列は、任意に選択され得る。複数のレポーター結合剤を使用する複合アッセイにおいては、各レポーター結合剤のためのローリングサークル複製プライマー配列は、非特異的標的の検出の可能性を制限するために、実質的に異なることが好ましい。あるいは、いくつかの複合アッセイにおいては、関連配列と共にローリングサークル複製プライマー配列を使用することが望まれ得る。そのようなアッセイは、多数の標的分子を検出するために、１つまたは少しのATCを使用し得る。レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分がローリングサークル複製プライマーとして使用される場合、オリゴヌクレオチド部分は、オリゴヌクレオチド部分と増幅標的サークルのプライマー相補的部分との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般に、これは10〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは16〜20ヌクレオチド長である。図25、26、27、28、および29は、そのオリゴヌクレオチド部分がローリングサークル複製プライマーである、レポーター結合分子の例を示す。
別の実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製のための鋳型として作用する、増幅標的サークルを含み得る。複数のレポーター結合剤を使用する複合アッセイにおいては、各レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分を含むATCのアドレスタグ部分および検出タグ部分は、各レポーター結合剤の独特な検出のために、実質的に異なることが好ましい。しかし、複合アッセイにおいて使用される全てのATCにおいて、同一のプライマー相補部分を使用することが望ましい。ATCは、束縛ループ（tether loop）の周囲にATCをループさせることにより、特異的結合分子に束縛される。このことは、ATCがローリングサークル複製の間、親和性部分に結合された状態で、自由に回転することを可能にする。束縛ループは、ループを形成し得かつ特異的結合分子に結合し得る任意の物質であり得る。直鎖状ポリマーは、束縛ループのために好ましい物質である。
束縛されたATCを有するレポーター結合剤の好ましい生成方法は、ATCの周囲の特異的結合分子に結合したオリゴヌクレオチドの端部を連結することにより、束縛ループを形成することである。オリゴヌクレオチドは、公知の技術を使用して、特異的結合分子に結合し得る。例えば、Hendricksonら（1995）は、オリゴヌクレオチドを抗体に結合するための適切な方法を記載する。この方法は、オリゴヌクレオチドを任意のタンパク質に結合させるために、一般に有用である。連結を可能にするために、束縛ループの２つの半部を含むオリゴヌクレオチドは、一方の自由末端が５'末端でありそして他方の自由末端が３'末端であるように逆方向で、特異的結合分子に結合するべきである。束縛オリゴヌクレオチドの末端の連結は、束縛されるべきATCにおける隣接配列への束縛ヌクレオチドの末端のハイブリダイゼーションにより、媒介され得る。この方法において、束縛オリゴヌクレオチドの末端は、標的配列を含むATCを有する、開環プローブの標的プローブ部分に類似する。
束縛されたATCを有するレポーター結合剤の別の好ましい生成方法は、特異的結合分子上のオリゴヌクレオチド束縛ループにハイブリダイズされる間に、開環プローブを連結することである。これはLM-RCAの連結操作に類似する。この場合において、標的配列は、特異的結合分子に結合する両端を有するオリゴヌクレオチドの部分である。この方法では、単一の束縛オリゴヌクレオチドの両端が、特異的結合分子に結合する。これは、上に記載されるような公知の結合技術を使用して、達成され得る。
束縛ループの末端は、適切な活性化基によって誘導体化され得る、官能基を有する任意の特異的結合分子に結合し得る。特異的結合分子がタンパク質または同様の官能基を有する分子である場合、束縛末端の結合は、タンパク質付着の公知の方法を使用して、達成され得る。多くのそのような方法は、Protein immobilization: fundamentals and applications Richard F. Taylor編（M. Dekker, New York, 1991）に記載される。
レポーター結合剤の親和性部分として有用な抗体は、商業的に得られ得、または良く確立された方法を使用して生産され得る。例えば、JohnstoneおよびThorpe、30-85頁は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を生産するために有用な一般的方法を記載する。書籍全体は、アッセイ系における抗体の使用のための、多くの一般的技術および原理を記載する。
Ｒ．DNAリガーゼ
任意のDNAリガーゼが、開示される増幅方法における使用に適切である。好ましいリガーゼは、優先的に、二本鎖DNAのニックでホスホジエステル結合を形成するリガーゼである。すなわち、有意な率で一本鎖DNAの遊離末端を連結しないリガーゼが好ましい。耐熱性リガーゼが特に好ましい。以下のような多くの適切なリガーゼが公知である:T4 DNAリガーゼ（Davisら、Advanced Bactenal Genetics-A Manual for Genetic Engineering（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980））、E.coli DNAリガーゼ（Panasnkoら、J. Biol. Chem. 253: 4590-4592（1978））、AMPLIGASE▲Ｒ▼（Kalinら、Mutat. Res., 283（2）: 119-123（1992）;Winn-Deenら、Mol Cell Probes（England）7（3）:179-186（1993））、Taq DNAリガーゼ（Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193（1991）、Thermus thermophilus DNAリガーゼ（Abbott Laboratories）、Thermus scotoductus DNAリガーゼ、およびRhodothemus marinus DNAリガーゼ（Thorbjarnardottirら、Gene 151:177-180（1995））。T4 DNAリガーゼは、DNA:RNAハイブリッドに含まれるDNA末端を連結するその能力のために、RNA標的配列を含む連結に好ましい（Hsuihら、Quantitative detection of HCV RNA using novel ligation-dependent polymerase chain reaction, American Association for the Study of Liver Diseases（Chicago, IL, November 3-7, 1995）。
リガーゼにより触媒される非標的指向連結の頻度は、以下のように決定され得る。LM-RCAは、標的配列の存在下で、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドを用いて行われ得る。次いで、非標的指向連結産物は、このような連結されたプローブ由来のTS-DNAを捕獲するために、ギャップオリゴヌクレオチドを伴わずに連結された開環プローブに特異的なアドレス（address）プローブを用いることにより検出され得る。標的指向連結産物は、ギャップオリゴヌクレオチドを伴って連結された開環プローブに特異的なアドレスプローブを用いることにより検出され得る。これらのアドレスプローブのそれぞれを含む領域と共に固体状態検出器を用いることにより、標的指向連結産物および非標的指向連結産物の両方が検出され、そして定量され得る。生成された標的指向および非標的指向TS-DNAは、連結操作の特異性の尺度を提供する。標的指向連結はまた、Barany（1991）に議論されるように評価され得る。
Ｓ．DNAポリメラーゼ
RCAのローリングサークル複製工程に有用なDNAポリメラーゼは、プライムされた（primed）一本鎖サークルのローリングサークル複製を行わなければならない。このようなポリメラーゼを、本明細書中ではローリングサークルDNAポリメラーゼと呼ぶ。ローリングサークル複製について、DNAポリメラーゼは、鋳型鎖に相補的な鎖に置換し得（鎖置換と呼ばれる）、そして5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くことが好ましい。鎖置換は、連結されたOCPの複数縦列コピーの合成を生じるために必要である。5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は、存在すれば、合成鎖の破壊をもたらし得る。開示された方法における使用のためのDNAポリメラーゼは、高度に進行することもまた好ましい。開示された方法における使用のためのDNAポリメラーゼの適合性は、ローリングサークル複製を行うその能力を評価することにより容易に決定され得る。好ましいローリングサークルDNAポリメラーゼは、バクテリオファージφ29 DNAポリメラーゼ（Blancoらの、米国特許第5,198,543号および同第5,001,050号）、ファージM2 DNAポリメラーゼ（Matsumotoら、Gene 84: 247（1989））、ファージφPRD1 DNAポリメラーゼ（Jungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8287（1987））、VENT▲Ｒ▼DNAポリメラーゼ（Kongら、J.Biol.Chem. 268:1965-1975（1993））、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント（Jacobsenら、Eur.J.Biochem. 45:623-627（1974））、T5 DNAポリメラーゼ（Chatterjeeら、Gene 97: 13-19（1991））、PRD1 DNAポリメラーゼ（ZhuおよびIto, Biochim. Biophys. Acta. 1219: 267-276（1994））、改変T7 DNAポリメラーゼ（TaborおよびRichardson, J.Biol.Chem. 262: 15330-15333（1987）;TaborおよびRichardson, J.Biol.Chem. 264: 6447-6458（1989）;SequenaseTM（U.S.Biochemicals））、およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素（KaboordおよびBenkovic, Curr. Biol. 5: 149-157（1995））である。φ29 DNAポリメラーゼが最も好ましい。
鎖置換は、鎖置換因子（例えば、ヘリカーゼ）の使用により容易にされ得る。鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を行い得る任意のDNAポリメラーゼは、このDNAポリメラーゼが、このような因子の非存在下でローリングサークル複製を行わないとしても、開示される方法における使用のために適切であると考えられる。RCAにおいて有用な鎖置換因子として、BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Tsurumiら、J.Virology 67（12）: 7648-7653（1993））、アデノウイルスDNA結合タンパク質（Zijderveldおよびvan der Vliet, J.Virology 68（2）: 1158-1164（1994））、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8（BoehmerおよびLehman, J.Virology 67（2）: 711-715（1993）;SkaliterおよびLehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91（22）: 10665-10669（1994））、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB; RiglerおよびRomano, J.Biol.Chem. 270: 8910-8919（1995））、およびウシ胸腺ヘリカーゼ（Siegelら、J.Biol.Chem. 267: 13629-13635（1992））が挙げられる。
ローリングサークル複製を行うポリメラーゼの能力は、FireおよびXu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4641-4645（1995）および実施例１に記載されるアッセイのような、ローリングサークル複製アッセイにおいてポリメラーゼを使用することにより決定され得る。
DNAポリメラーゼの別の型は、ギャップ充填合成工程（例えば、ギャップ充填LM-RCA（実施例３を参照のこと））が使用される場合に使用され得る。ギャップを充填するためにDNAポリメラーゼを使用する場合、DNAポリメラーゼによる鎖置換は所望でない。このようなDNAポリメラーゼを、本明細書中ではギャップ充填DNAポリメラーゼと呼ぶ。他に示されなければ、ローリングサークルDNAポリメラーゼまたはギャップ充填DNAポリメラーゼと特定することなく本明細書中で言及されるDNAポリメラーゼは、ローリングサークルDNAポリメラーゼであって、ギャップ充填DNAポリメラーゼでないと理解される。好ましいギャップ充填DNAポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ（Studierら、Methods Enzymol. 185: 60-89（1990））、DEEP VENT▲Ｒ▼DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）、改変T7 DNAポリメラーゼ（TaborおよびRichardson, J.Biol.Chem. 262: 15330-15333（1987）;TaborおよびRichardson, J.Biol.Chem. 264: 6447-6458（1989）; SequenaseTM（U.S.Biochemicals））、およびT4 DNAポリメラーゼ（Kunkelら、Methods Enzymol. 154: 367-382（1987））である。特に好ましいギャップ充填DNAポリメラーゼの型は、Thermus flavus DNAポリメラーゼ（MBR, Milwaukee, WI）である。最も好ましいギャップ充填DNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメント（Lawyerら、PCR Methods Appl. 2（4）: 275-287（1993）, Kingら、J.Biol.Chem. 269（18）:13061-13064（1994））である。
ポリメラーゼのギャップを充填する能力は、ギャップ充填LM-RCAを行うことにより決定され得る。ギャップ充填LM-RCAは、標的配列にハイブリダイズする場合にギャップスペースを形成する開環プローブを用いて行われる。連結は、ギャップスペースがDNAポリメラーゼで充填される場合にのみ起こり得る。ギャップ充填が生じる場合、TS-DNAが検出され得、さもなければ、DNAポリメラーゼまたは反応条件がギャップ充填DNAポリメラーゼに有用でないと結論づけられ得る。
Ｔ．RNAポリメラーゼ
インビトロで転写を行い得、そしてプロモーター配列が同定されている任意のRNAポリメラーゼは、開示されたローリングサークル転写方法において使用され得る。複雑な要求を有さない安定なRNAポリメラーゼが好ましい。特定のプロモーター配列（SchenbornおよびMeirendorf, Nucleic Acids Research 13: 6223-6236（1985））に高度に特異的な、T7 RNAポリメラーゼ（Davanlooら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2035-2039（1984））およびSP6 RNAポリメラーゼ（ButlerおよびChamberlin, J.Biol.Chem. 257: 5772-5778（1982））が最も好ましい。この特徴を有する他のRNAポリメラーゼもまた好ましい。プロモーター配列は、一般的に特定のRNAポリメラーゼにより認識されるので、OCPまたはATCは、使用されるRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を含むべきである。多くのプロモーター配列が公知であり、そして同定されたプロモーター配列を有する任意の適切なRNAポリメラーゼが使用され得る。RNAポリメラーゼのプロモーター配列は、確立された技術を用いて同定され得る。
上記の物質は、開示された方法を行うのに有用なキットとして、任意の適切な組合せで共にパッケージされ得る。
II．方法
開示されたローリングサークル増幅（RCA）法は、環状一本鎖DNA分子の複製を含む。RCAにおいて、ローリングサークル複製プライマーは、環状OCPまたはATC分子にハイブリダイズし、続いて、鎖置換DNAポリメラーゼを用いてOCPまたはATC分子のローリングサークル複製を行う。増幅は、単一反応サイクルでのローリングサークル複製間で起こる。ローリングサークル複製は、OCPまたはATC配列の縦列反復を含む大きなDNA分子を生じる。このDNA分子を、縦列配列DNA（TS-DNA）と呼ぶ。ローリングサークル複製をまた、本明細書中では単分子セグメント増幅（USA）とも呼ぶ。用語「単分子セグメント増幅」は、一般的に、目的の個々の核酸セグメント（例えば、標的配列）の増幅を強調するために本明細書中で使用される。
好ましい実施態様である、連結媒体ローリングサークル増幅（LM-RCA）法は、複製の前に連結操作を含む。連結操作において、OCPは、存在する場合、そのコグネイト標的核酸配列にハイブリダイズし、続いてハイブリダイズされたOCPの末端を連結して、共有結合により閉じた一本鎖OCPを形成する。連結後、ローリングサークル複製プライマーはOCP分子にハイブリダイズし、続いて鎖置換DNAポリメラーゼを用いて環状OCP分子のローリングサークル複製を行う。一般的に、LM-RCAは、以下の工程を包含する:
（ａ）開環プローブ（OCP）と標的サンプルとを混合する工程、OCP-標的サンプル混合物を得る工程、および開環プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、OCP−標的サンプル混合物をインキュベートする工程、
（ｂ）リガーゼとOCP−標的サンプル混合物とを混合する工程、連結混合物を得る工程、および開環プローブの連結を促進する条件下で連結混合物をインキュベートして、増幅標的サークル（ATC）を形成する工程、
（ｃ）ローリングサークル複製プライマー（RCRP）と連結混合物とを混合する工程、プライマー-ATC混合物を得る工程、および増幅標的サークルとローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、プライマー-ATC混合物をインキュベートする工程、
（ｄ）DNAポリメラーゼとプライマー-ATC混合物とを混合する工程、ポリメラーゼATC混合物を得る工程、および増幅標的サークルの複製を促進する条件下で、ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であって、ここで増幅標的サークルの複製は、縦列配列DNA（TS-DNA）の形成をもたらす、工程。
開環プローブは一本鎖線状DNA分子であり、これは5'末端から3'末端に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、プライマー相補部分、スペーサー領域、左標的プローブ部分、および3'水酸基を含み、ここで左標的プローブ部分は標的配列の5'領域に相補的であり、そして右標的プローブ部分は標的配列の3'領域に相補的である。
左および右の標的プローブ部分は、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドにより充填される中央のギャップを伴ってまたは伴わずに、標的核酸配列の２つの末端にハイブリダイズする。一般的に、ギャップオリゴヌクレオチドを使用するLM-RCAは、LM-RCA反応において、（１）5'領域と3'領域との間に位置する中央領域を有する標的配列、およびOCPを使用すること（ここで、開環プローブの左標的プローブ部分も開環プローブの右標的プローブ部分も、標的配列の中央領域に相補的でない）、ならびに（２）１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドと標的サンプルとを混合すること（その結果、OCP-標的サンプル混合物は、開環プローブ、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチド、および標的サンプルを含み、ここで、各ギャップオリゴヌクレオチドは、5'リン酸基および3'水酸基を含む一本鎖線状DNA分子からなり、各ギャップオリゴヌクレオチドは、標的配列の中央領域の全てまたは一部に相補的である）により行われ得る。
Ａ．連結操作
開環プローブ（必要に応じて、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドの存在下で）は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、DNA、RNA、またはその両方を含むサンプルとインキュベートされ、次いで、連結されて共有結合により閉じた環を形成する。連結された開環プローブは、増幅標的環の形態である。この操作は、Nilssonら、Science, 265: 2085-2088（1994）により記載される南京錠（padlock）プローブの連結と類似している。この連結操作は、後の増幅を、標的配列の存在に依存させる。連結操作に適切なリガーゼは上述されている。連結条件は、一般的に公知である。大部分のリガーゼは、Mg++を必要とする。リガーゼの２つの主な型（ATP依存リガーゼおよびNAD依存リガーゼ）が存在する。ATPまたはNADは、リガーゼの型に依存して、連結間に存在すべきである。
リガーゼおよび連結条件は、一本鎖末端の連結の頻度を限定するように最適化され得る。このような連結事象は、標的配列の存在に依存しない。AMPLIGASE▲Ｒ▼触媒連結（60℃で起こる）の場合、一本鎖DNA末端を有する1,000,000分子のうち１分子のみが連結されると評価される。これは、リガーゼ連鎖反応においてこのリガーゼを用いて示される非特異的増幅のレベルに基づく。いずれのより高い非特等異的連結頻度も、リガーゼ連鎖反応において、非常に高いバックグラウンド増幅を引き起こす。この評価値を用いて、連結結合部に正しく配置されたギャップオリゴヌクレオチドを有する、非特異的に連結された開環の生成についての適切な頻度が算出され得る。２つの連結事象が関連するので、AMPLIGASE▲Ｒ▼を用いるこのような事象の頻度は、1,000,000のうち１の平方、または１×1012のうち１であるべきである。50μlの典型的な連結反応に使用されるプローブの数は２×1012である。従って、正しいギャップオリゴヌクレオチドを含む非特異的連結環の数は、反応あたり約２個であると予想される。
RNAが検出される場合、逆転写操作を行って、DNA標的配列を作製することが好ましい。このような操作の使用の例は、実施例４に記載される。あるいは、RNA標的配列は、DNA:RNAハイブリッド基質に対して連結を行い得るリガーゼを使用することにより、直接検出され得る。これについて好ましいリガーゼは、T4 DNAリガーゼである。
Ｂ．複製操作
特定の連結および増幅標的環により形成される環状開環プローブは、ローリングサークル複製の基質として作用する。この反応は、２つの試薬:（ａ）ローリングサークル複製プライマー（これは、OCPまたはATCのプライマー相補部分に相補的である）、および（ｂ）ローリングサークルDNAポリメラーゼの添加を必要とする。DNAポリメラーゼは、所望の限り進行する進行的ローリングサークル重合反応においてプライマー伸長および鎖置換を触媒し、増幅標的環または開環プローブに相補的な配列の約1000までの縦列コピーを含む、100,000ヌクレオチドまでまたはそれより長い分子を生じる（図４）。この縦列配列DNA（TS-DNA）は、OCPの場合、交互の標的配列およびスペーサー配列からなる。TS-DNAのスペーサー配列は、元の開環プローブにおける左標的プローブと右標的プローブとの間の配列の相補物であることに留意のこと。好ましいローリングサークルDNAポリメラーゼは、バクテリオファージφ29のDNAポリメラーゼである。
ローリングサークル複製間に、反応において生じるDNAを標識するために、ブロモデオキシウリジン三リン酸のような放射性または修飾ヌクレオチドをさらに含み得る。あるいは、ビオチン化ヌクレオチドのような結合部分を提供する、適切な前駆体を含み得る（Langerら、（1981））。
ローリングサークル増幅は、複数の連結されたOCPまたはATCを含むアッセイにおいて異なる長さのTS-DNAを生成するように操作され得る。これは、単一のアッセイにおいて検出され得る異なる標的の数を増やすのに有用であり得る。異なる長さのTS-DNAは、いくつかの手段で生成され得る。１つの実施態様において、異なるクラスのOCPまたはATCのスペーサー領域の塩基組成は、特定のヌクレオチドがリッチであるように設計され得る。次いで、リッチにされたヌクレオチドに相補的な少量のジデオキシヌクレオチドが、ローリングサークル増幅反応に含まれ得る。いくらかの増幅の後、ジデオキシヌクレオチドは、相補ヌクレオチドについてリッチにされたOCPまたはATCのクラスのTS-DNA産物の伸長を終結させる。他のOCPまたはATCは、相補ヌクレオチドについてリッチにされていないので、ほとんど終結されないようであり、そして平均して、より長いTS-DNA産物を生成する。
別の実施態様において、２つの異なるクラスのOCPまたはATCは、異なるプライマー相補部分と共に設計され得る。これらの異なるプライマー相補部分は、異なるローリングサークル複製プライマーに相補的であるように設計される。次いで、２つの異なるローリングサークル複製プライマーは、単一のローリングサークル増幅反応において（しかし、著しく異なる濃度で）共に使用される。高濃度のプライマーは、有利なキネティックスによりローリングサークル複製を即座にプライムするが、一方、低濃度のプライマーは、不利なキネティックスによりプライミングが遅延される。従って、高濃度のプライマーについて設計されたOCPまたはATCのクラスのTS-DNA産物は、低濃度のプライマーについて設計されたOCPまたはATCのクラスのTS-DNA産物より長い。なぜならより長い時間の間で複製されたからである。別の選択として、ローリングサークル複製プライマーのうちの１つは、ケージ（caged）オリゴヌクレオチドであり得る。この場合、２つのローリングサークル複製プライマーは、類似の濃度であり得る。ケージローリングサークル複製プライマーは、ケージ構造が取り除かれるまで、ローリングサークル複製を支持しない。従って、第１に、非ケージ（uncaged）ローリングサークル複製プライマーは、複製操作が始まると、そのコグネイト増幅標的環（単数または複数）の増幅を始め、第２に、ケージローリングサークル複製プライマーは、ケージの除去の後にのみ、そのコグネイト増幅標的環（単数または複数）の増幅を始める。各ローリングサークル複製プライマーから生成されるTS-DNA量は、異なる有効な複製時間に比例して異なる。従って、ローリングサークル複製プライマーのそれぞれの型を用いて生成されたTS-DNA量は、ケージプライマーを用いて制御され得る。このようなケージプライマーの使用は、ケージプライマーが、（低濃度よりむしろ）、ケージから出されるとすぐにローリングサークル複製を効率的に開始するのに十分な濃度で、提供され得るという利点を有する。
Ｃ．改変およびさらなる操作
１．増幅産物の検出
現在の検出技術は、多くの場合において不必要なRCAの第２のサイクルを行う。従ってRCAの第１のサイクルの産物を直接検出するように進め得る。検出は、以下に記載のように、１次標識または２次標識により達成され得る。
（ａ）１次標識
１次標識は、RCAにおけるローリングサークル複製またはRCTにおける転写の間に、標識部分（例えば、蛍光ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジン）を組み込むことからなる。例えば、100ヌクレオチド毎に４アナログの頻度で、シアニン色素UTPアナログ（Yuら、（1994））を組み込み得る。インサイチュで増幅された核酸を検出するための好ましい方法は、BrdUrdを伴う増幅間にDNAを標識し、続いて組み込まれたBUDRにビオチン化抗BUDR抗体（Zymed Labs, San Francisco, CA）を結合させ、、続いてビオチン部分にストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（Life Sciences, Inc.）を結合させ、最終的に、フルオレセイン-トリアミド（DuPont de Nemours＆Co., Medical Products Dept.）による蛍光を発光させることである。
（ｂ）検出プローブでの２次標識
２次標識は、適切な分子プローブ（検出プローブと呼ばれる）を用いて増幅DNAまたはRNAを検出することからなる。例えば、開環は、公知の任意の配列のいくつかの反復（検出タグと呼ばれる）を含むように設計され得る。２次ハイブリダイゼーション工程は、これらの検出タグに検出プローブを結合させるために使用され得る（図７）。検出プローブは、例えば、酵素、蛍光部分、または放射性同位元素を用いて、上記のように標識され得る。開環プローブあたり３つの検出タグ、および各検出プローブあたり４つの蛍光部分を用いることにより、TS-DNAにおける開環検出プローブ反復毎に計12の蛍光シグナルを得ることができる。これは、RCAにより増幅される連結した開環プローブ毎に計12,000の蛍光部分を生じる。
（ｃ）複合化（multiplexing）およびハイブリダイゼーションアレイ検出
RCAは、異なる開環プローブのセットを用いることにより容易に複合化され、各セットは、独特の標的への結合のために設計された異なる標的プローブ配列を有する。それぞれの標的に対して設計された標的プローブ配列は異なるが、プライマー相補部分は変化しないままであり得、従ってローリングサークル複製のためのプライマーは、全ての標的に対して同一のままであり得ることに留意のこと。それらの標的を見出し得るこれらの開環プローブのみが、TS-DNAを生じる。RCAにより生成されたTS-DNA分子は、高分子量および低複雑度であり;この複雑度は開環プローブの長さである。所定のTS-DNAを、固体状態の検出器における固定位置に捕獲するための２つの代替が存在する。１つは、それぞれの独特の開環プローブに対する独特のアドレスタグ配列を、開環プローブのスペーサー領域内に含ませることである。所定の開環プローブから生じたTS-DNAは、特定のアドレスタグ配列に対応する配列を含む。第２のかつ好ましい代替は、アドレスタグとしてTS-DNAに存在する標的配列を使用することである。
（ｄ）組合せ多色コーディング
複合検出の好ましい形態は、異なる波長で蛍光を発するか、または異なって発色するかのいずれかの標識の組合せの使用を含む。ハイブリダイゼーションプローブの検出のための蛍光の利点のうちの１つは、いくつかの標的が同一のサンプルで同時に視覚化され得ることである。組合せストラテジーを用いて、スペクトルにより分解可能な発蛍光団の数より多い標的が識別され得る。プローブ蛍光は、完全に存在しないか（−）または単位量で存在する（＋）かのいずれかであるので、組合せ標識は、複合様式でプローブを標識するための最も単純な方法を提供し；従って、画像分析は自動化をより受け入れやすく、そして多くの実験的な人為産物（例えば、蛍光の差別な光退色および励起源出力スペクトルの変化の効果）が避けられる。
標識の組合せは、異なる検出プローブ、および励起により、これらの検出プローブが関連する異なる検出分子を同定するためのコードを確立する。この標識スキームを、組合せ多色コーディング（CMC）と呼ぶ。このようなコーディングは、Speicherら、Nature Genetics 12: 368-375（1996）により記載される。組み合わせた場合、別々に検出され得る任意の数の標識が、組合せ多色コーディングに使用され得る。組合せにおいて、２、３、４、５、または６つの標識が使用されることが好ましい。６つの標識が使用されることが最も好ましい。使用される標識の数は、式２N-1（ここで、Ｎは標識の数である）に従って形成され得る、独特の標識の組合せの数を確立する。この式に従って、２つの標識は３つの標識組合せを形成し、３つの標識は７つの標識組合せを形成し、４つの標識は15の標識組合せを形成し、５つの標識は31の標識組合せを形成し、そして６つの標識は63の標識組合せを形成する。
組合せ多色コーディングについて、異なる検出プローブの群が１セットとして使用される。このセットにおける各型の検出プローブは、特定かつ独特の蛍光標識の組合せにより標識される。複合プローブを割り当てられたそれらの検出プローブについて、標識は、各検出プローブ分子を全ての必要とされる標識で標識することにより達成され得る。あるいは、所定の型の検出プローブのプールは、それぞれ必要とされる標識のうちの１つにより標識され得る。プールを組み合わせることにより、検出プローブは、群として、その型の検出プローブに必要とされる標識の組合せを含む。これは、単純な例で例示され得る。７つの異なる型の検出プローブ（それぞれは、異なる検出タグに相補的であり、そして１から７と名付けた）で開始すると、独特同定は、７つの組合せに使用される３つの異なる標識を必要とする。任意にこの組合せを割り当てると、１つのコーディングスキームは以下の通りである：
0003974941.tif 000006
示され得るように、検出プローブ７は、３つの異なる標識（Ａ、Ｂ、およびＣ）で標識されなければならない。これは、それぞれの個々の検出プローブ７分子に対する標識Ａ、Ｂ、およびＣにより達成され得る。これは、上記の第１の選択である。あるいは、検出プローブ７の３つのプールは、別々に標識され得、１つのプールは標識Ａで、１つのプールは標識Ｂで、そして１つのプールは標識Ｃで標識される。各プールにおいて、個々の検出プールは、単一の型の標識で標識される。プールの混合は、必要とされる３つの全ての標識を集合的に含む、検出プローブ７の溶液をもたらす。異なる数のプローブを必要とする検出プローブの標識は、類似の様式で達成され得る。
もちろん、上記の２つの型の標識スキームは組み合わされ得る。これは、異なる標識で複合標識された同一の型の検出プローブ分子と組み合わせた複合標識を有する検出プローブ分子をもたらす。これは、上記の例を用いて例示され得る。検出プローブ７型の２つのプールは、別々に標識され得、１つのプールは標識ＡおよびＢの両方で、そして１つのプールは標識Ｃのみで標識される。プールの混合は、必要とされる３つの全ての標識を集合的に含む、検出プローブ７の溶液をもたらす。組合せ多色コーディングは、実施例７および８においてさらに例示される。
各検出プローブが単一の標識で標識される場合、標識の組合せはまた、異なる検出プローブに相補的な検出タグのコードされる組合せで、OCPまたはATCを用いることにより作製され得る。このスキームにおいて、OCPまたはATCは、特異的な標識コードに必要とされる標識の組合せを表す検出タグの組合せを含む。上記の例を用いて、１セットの７つのOCPまたはATC（１から７と呼ばれる）は、１セットの３つの検出タグ配列（dtA、dtB、およびdtCと呼ばれる）から選択された１、２、または３つの検出タグを含む。各検出タグ配列は、標識Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つに対応し、各標識は３つの検出プローブのうちの１つに結合しており、これらは、それぞれdpA、dpB、およびdpCと呼ばれる。得られたコーディングスキームの例は以下の通りである：
0003974941.tif 000007
ハイブリダイゼーションは、全ての異なる標識検出プローブ（dpA、dpB、およびdpC）のプールを用いて行われ得た。この結果は、OCP7から生成されたTS-DNAが、３つ全ての検出プローブにハイブリダイズし、その結果、TS-DNAを３つ全ての標識で標識したことであった。対照的に、OCP 4から生成されたTS-DNAは、例えば、検出プローブdpAおよびadBにのみハイブリダイズし、従って、OCP 4由来TS-DNAを標識ＡおよびＢのみで標識した。このコーディングおよび検出方法が好ましい。このコーディングスキームの使用は、実施例７および８に例示される。
上記のように、ローリングサークル増幅を操作して、複合連結OCPまたはATCを含むアッセイにおいて異なる長さのTS-DNAを生成し得る。得られた異なる長さのTS-DNAは、単にそれらが生じる検出シグナルの大きさに基づいて区別され得る。従って、同じセットの検出プローブを用いて、２つの異なるセットの生成されたTS-DNAを区別し得る。このスキームにおいて、２つの異なるTS-DNA（それぞれは、異なるサイズであるが、同じ色コードを割り当てられた）は、ハイブリダイズした検出プローブにより生成されるシグナルの大きさにより区別される。この方法で、計126の異なる標的が、63の組合せを有するコードを用いて、単一の固体状態のサンプルに対して区別され得る。なぜならこのシグナルは、２つの特色（低振幅および高振幅）で機能するからである。従って、例えば、ガン遺伝子変異の検出のために、63プローブの低振幅シグナルセットを使用し得、そして腫瘍サプレッサーp53変異の検出のために63プローブの高振幅シグナルセットを使用し得る。
Speicherらは、スペクトル間隔350〜770nmで配される１セットの蛍光および対応する光学フィルター（これは、全ての可能な蛍光対間の高度な識別を与える）を記載する。この蛍光セット（組合せ多色コーディングに好ましい）は、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルイノドール（DAPI）、フルオレセイン（FITC）、およびシアニン色素Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7からなる。この好ましいセットの任意のサブセットもまた使用され得る（ここで、組合せはほとんど必要とされない）。これらの蛍光について、最大吸収および最大発光は、それぞれ以下の通りである:DAPI（350nm;456nm）、FITC（490nm；520nm）、Cy3（554nm；568nm）、Cy3.5（581nm；588nm）、Cy5（652nm；672nm）、Cy5.5（682nm；703nm）、およびCy7（755nm；778nm）。これらの蛍光の励起および発光スペクトル、励起係数、および量子収率は、Ernstら、Cytometry 10:3-10（1989）、Mujumdarら、Cytometry 10: 11-19（1989）、Yu,Nucleic Acids Res. 22: 3226-3232（1994）、およびWaggoner, Meth. Enzymology 246: 362-373（1995）により記載される。これらの蛍光は全て、75Wキセノンアークにより励起され得る。
選択性を達成するために、５〜16nmの範囲の帯域幅を有するフィルターが好ましい。シグナル識別を増幅するために、蛍光は、それらの最大スペクトルから離れた波長で、励起および検出の両方がなされ得る。発光帯域幅はできるだけ広く作製され得る。低ノイズ検出器（例えば冷却CCDカメラ）について励起帯域幅の制限は、達成され得るシグナル対ノイズ比にほとんど効果を有さない。好ましい蛍光セットを用いた使用のための好ましいフィルターのリストは、Speicherらの表１に列挙される。アークランプにより発光された赤外光が検出器に達するのを防ぐことは重要である；CCDチップはこの領域で極めて感度が高い。この目的のために、適切なIR遮断フィルターを、CCD窓の直ぐ前の画像パスに挿入して、画質の損失を最小にし得る。次いで、画像解析ソフトウェアを使用して、蛍光ドットのスペクトルサインを計数し、そして解析し得る。
組合せ多色コーディングにおける個々のシグナルの識別は、増幅間に生成されたTS-DNAを折り畳むことにより増強され得る。上記のように、これは、好ましくは、折り畳み検出プローブ、ビオチン-抗体結合体、または両方の組合せを用いて達成される。折り畳んだTS-DNAは、直径が0.3ミクロン以下の空間を占め得る。これに基づいて、100万までの別々のシグナルが、2.5mmサンプルドットにおいて検出され得ることが期待される。このような識別はまた、定量的シグナル検出のために大きなダイナミックレンジをもたらす。例えば、２つの別々のシグナルが同じサンプルドットにおいて検出される場合、１：500,000までの２つのシグナル比が検出され得る。従って、異なる型のシグナル（例えば、多色コード）の相対数は、広い範囲にわたって決定され得る。これは、例えば、特定の標的配列がゲノムDNAサンプルにおいてホモ接合体またはヘテロ接合体であるか否か、標的配列が遺伝したかまたは体細胞変異を表すか、およびゲノムDNAサンプル（例えば、腫瘍サンプル）の遺伝的不均一性の決定を可能にすると期待される。第１の場合では、ホモ接合体標的配列は、ヘテロ接合性標的配列のシグナルの数の２倍を生じる。第２の場合では、遺伝した標的配列は、ホモ接合体またはヘテロ接合体のシグナルに等価な多くのシグナル（すなわち、多くのシグナル）を生じるが、一方、体細胞変異は、サンプルの供給源に依存する、より少ない数のシグナルを生じる。第３の場合では、特定の標的配列を有する、サンプルが由来する細胞の相対数が決定される。特定の標的配列を有するサンプルにおける細胞が多いほど、シグナルが大きくなる。
（e）標的配列群の検出
複合RCAアッセイは、遺伝子の変異（ここで、多くの異なる変異が特定の疾患に関連するか、または複数の遺伝子の変異が関与する）の検出に特に有用である。例えば、ハンチントン舞踏病の原因となる遺伝子が同定されているが、この遺伝子の異なる部分の広範囲の変異が、羅患した個体間に生じる。挙げ句の果てに、個体が多くのハンチントン変異の１つ以上を有するかを検出するための単一の試験がまだ発明されていなかった。単一のLM-RCAアッセイは、任意の数の標的配列の群のうちの１つ以上のメンバーの存在を検出するために使用され得る。これは、例えば、この群における各標的配列に対する開環プローブ（および、所望であれば、関連するギャップオリゴヌクレオチド）を設計することにより達成され得る。ここで、各開環プローブの標的プローブ部分は異なるが、全ての開環プローブのプライマー部分および検出タグ部分の配列は同一である。開環プローブの全ては、同じOCP-標的サンプル混合物中におかれ、そして同じプライマーおよび検出プローブが、TS-DNAを増幅および検出するために使用される。標的配列のいずれかが標的サンプルに存在する場合、その標的に対するOCPが環に連結され、そして環は増幅されてTS-DNAを形成する。OCPのいずれかの増幅から生じたTS-DNAに対する検出タグは同一であるので、OCPのいずれかの連結から生じたTS-DNAが、このアッセイにおいて検出される。検出は、標的配列群のうちの少なくとも１つのメンバーが標的サンプルに存在することを示す。これは、単一のチューブまたはウェルでの複数の標的配列に関連した形質の検出を可能にする。
ポジティブな結果が見出される場合に、関与する特定の標的配列は、複合アッセイを用いることにより同定され得る。これは、群の各OCPに、さらなる異なる検出タグを含ませることにより容易にされ得る。このようにして、それぞれの異なる標的配列を表す、それぞれの異なるOCPから生成されたTS-DNAは、個々に検出され得る。このような複合アッセイは、最初のポジティブな結果が見出される場合にのみ行われる必要があることで便利である。
上記のスキームはまた、多くの標的配列について等しく多くのアッセイを行う必要なくスクリーニングするために、標的配列の任意の選択された群を用いて使用され得る。最初のアッセイは、上記のように行われ得、それぞれは、標的配列の異なる群にハイブリダイズするように設計されたOCPの異なる群を使用する。次いで、どの標的配列が存在するかを決定するためのさらなるアッセイが、TS-DNAを生じるそれらの群にのみ行われ得る。このような群のアッセイは、所望であれば、さらにネストされ得る。
（f）RCAを用いたインサイチュ検出
インサイチュハイブリダイゼーション、および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）として知られるその最も強力な履行は、細胞遺伝学において根本的に重要である。RCAは、以下に示すように、FISHを使用するために適応され得る。
開環プローブは、顕微鏡スライド上の標的上で連結され、ローリングサークル複製の間、蛍光前駆体と共にインサイチュでインキュベートされる。ローリングサークルDNAポリメラーゼは、連結した開環プローブを、元々ハイブリダイズしていた位置から変える。しかしながら、環は、DNAがニックを入れられなければ、染色体上にトポロジー的にトラップされたままである（Nilssonら,（1994））。残留クロマチンの存在は、染色体に沿った環の拡散を遅延し得る。あるいは、固定法が、この拡散効果を最小限にするために改変され得る。この拡散は、染色体に沿った２方向のいずれかへ等しく起こる可能性を有し、それゆえ、正味の拡散置換（net diffusional displacement）は、10分間のインキュベートの間、比較的小さくなり得る。この時間の間、ローリングサークル複製は、約2,500ブロモデオキシウリジン部分を含む約25,000ヌクレオチドの直線分子（これは、ビオチン化抗BUDR IgG（Zymed Labs, Inc.）および蛍光標識アビジンで検出され得る）を生じるはずである。この取り込みのレベルが、顕微鏡を基盤としたCCDシステムを用いた画像記録を容易にするはずである。拡散はまた、TS-DNAが標的鎖の相補物とハイブリダイズし得るはずであるので、限定され得る。
インサイチュ検出の好ましい方法は、以下に示すような、レポーター結合試薬単分子ローリング増幅（RBAURA）である。RBAURAにおいて、レポーター結合試薬が使用され、ここで、オリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。一旦レポーター結合試薬が標的分子と結合すると、増幅標的環（amplification target circle）は、レポーター結合試薬のローリングサークル複製プライマー配列にハイブリダイズし、続いてRCAによるATCの増幅が起こる。生じるTS-DDNAは、レポーター結合試薬のローリングサークル複製プライマー配列をその一端に有し、従って、TS-DNAを標的分子のその部位へ固定する。以下に記載された、ペプチド核酸プローブ単分子ローリング増幅（PNAPURA）およびロックされた（locked）抗体単分子ローリング増幅（LAURA）は、RBAURAの好ましい形態である。
インサイチュ検出のためのTS-DNAの局在はまた、上記の折り畳み（collapsing）検出プローブを使用したTS-DNAの折り畳み、ビオチン-抗体コンジュゲート、またはその両方によって増強され得る。複合的なインサイチュ検出は、以下のように行われ得る：ローリングサークル複製は、非標識ヌクレオチドを用いて行われる。次いで、種々のTS-DNAが、各独特の標的配列またはTS-DNA中の各独特の検出タグに特異的な検出プローブを用いた標準的な多色FISHを用いて検出される。あるいは、そして好ましくは、上記の組合せ多色コードが、複合インサイチュ検出に使用され得る。
（g）酵素結合検出
標識ヌクレオチドの組み込みによって標識された増幅核酸は、確立した酵素結合検出システムで検出され得る。例えば、ビオチン-16-UTP（Boehringher Mannheim）の組み込みによって標識された増幅核酸は、以下のように検出され得る。核酸を、増幅核酸中に存在する標的配列（または、その相補物）に相補的な相補的DNAオリゴヌクレオチド（アドレスプローブ）とのハイブリダイゼーションによって、固体ガラス表面上に固定する。ハイブリダイゼーション後、ガラススライドを洗浄し、そしてアルカリフォスファターゼ-ストレプトアビジンコンジュゲート（Tropix,Inc.,Bedford,MA）と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジュゲートは、増幅核酸上のビオチン部分へ結合する。過剰な酵素コンジュゲートを取り除くためスライドを再び洗浄し、そして化学蛍光基質CSPD（Tropix,Inc.）を添加し、そしてカバーガラススリップで覆う。次いで、スライドをBiorad Fluorimagerで画像化し得る。
（h）核酸の折り畳み
上記に記載されたように、TS-DNAまたはTS-RNA（これらは伸長した核酸分子として生成される）は、コンパクトな構造へと折り畳まれ得る。同じ折り畳み手順が、あらゆる伸長した核酸分子で行われ得ることがまた理解されるべきである。例えば、ゲノムDNA、PCR産物、ウイルスのRNAまたはDNA、およびcDNAサンプルはすべて、開示された折り畳み手順を用いてコンパクトな構造に折り畳まれ得る。折り畳まれるべき核酸が基体上に固定されることが好ましい。核酸を折り畳む好ましい手段は、１つ以上の折り畳みプローブと、折り畳まれるべき核酸とをハイブリダイズすることによる方法である。折り畳みプローブは、折り畳まれるべき核酸中の配列に各々相補的な多数の部分を有するオリゴヌクレオチドである。これらの部分は、折り畳みプローブの相補的な部分として言及され、ここで各々の相補的な部分は、折り畳まれるべき核酸中の配列に相補的である。折り畳まれるべき核酸中の配列は、折り畳み標的配列（collapsing target sequence）として言及される。折り畳みプローブの相補的な部分は、折り畳みプローブと折り畳み標的配列との間の、特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを指持するあらゆる長さであり得る。この目的のために、折り畳みプローブの相補的部分は、10〜35ヌクレオチド長が好ましく、16〜20ヌクレオチド長であることが最も好ましい。折り畳みプローブの少なくとも２つの相補的部分が、折り畳まれるべき核酸上で分離されている折り畳み標的配列、または別々の核酸分子に存在する折り畳み標的配列に相補的であることが好ましい。これは、各々の検出プローブが、核酸サンプル中の少なくとも２つの別々の折り畳み標的配列にハイブリダイズすることを可能にする。このように、折り畳みプローブは、折り畳まれるべき核酸の異なる部分との間の架橋を形成する。核酸にハイブリダイズする多くの折り畳みプローブの結合作用は、架橋した核酸の折り畳みネットワークを形成するようである。折り畳まれた核酸は、遊離の伸長した核酸よりずっと小さな体積を占め、そして核酸にハイブリダイズするどんな検出プローブまたは検出標識も含む。この結果は、伸長した核酸より容易に検出され得るコンパクトで別々な核酸構造である。折り畳まれている核酸は、近接してパッケージされている場合でも、検出可能なシグナルが空間的に分離するのを可能にするので、インサイチュハイブリダイゼーション適用および複合的検出の両方に有用である。折り畳み核酸は、組合せ多色コードを用いた使用に特に好ましい。
折り畳みプローブはまた、上記のあらゆる検出標識を含み得る。これは、別々の検出プローブまたは他の核酸検出手段が利用されない場合、折り畳まれた核酸の検出を可能にする。好ましい標識は、ビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子信号（beacon）である。分子信号は、蛍光部分で標識した検出プローブであり、ここで、蛍光分子は、検出プローブがハイブリダイズした時だけ蛍光を発する。このようなプローブを使用すると、ハイブリダイズしていない検出プローブはシグナルを発しないので、標識検出前にハイブリダイズしていないプローブを除去する必要性を除く。これは、複合アッセイに特に有用である。
TS-DNAの折り畳みはまた、リガンド／リガンド結合対（例えばビオチンおよびアビジン）またはハプテン／抗体対の使用を通じて成し遂げられ得る。実施例６に記載のように、ヌクレオチドアナログであるBUDRは、ローリングサークル複製の間にTS-DNAへ組み込まれ得る。BUDRおよびアビジンに特異的なビオチン化抗体を添加した場合、アビジン−ビオチン−抗体コンジュゲートにより架橋されたTS-DNAが架橋ネットワークを形成し、そしてTS-DNAはコンパクトな構造に折り畳まれる。ビオチン誘導体化核酸は、cDNA合成、PCR、および他の核酸増幅技術のような多くの共通の核酸複製操作において形成され得る。ほとんどの場合、ビオチンは、ビオチン誘導体化ヌクレオチドの組み込みまたはビオチン誘導体化プライマーの使用のいずれかによって、合成された核酸中に組み込まれ得る。折り畳みプローブおよびビオチンで媒介された折り畳みはまた、核酸を折り畳むために共に使用され得る。
２．ネストされたLM-RCA
RCA後、１回のLM-RCAが、第１のRCAで産生されたTS-DNA上で行なわれ得る。この新しい回のLM-RCAは、二次開環プローブとして言及される新しい開環プローブを用いて行われ、これは、第１回目で生成されたTS-DNA中の標的配列と相補的な標的プローブ部分を有する。このような新しい回のLM-RCAが行われる場合、その増幅は、本明細書中でネストされたLM-RCAとして言及される。ネストされたLM-RCAは特に、LM-RCAのインサイチュハイブリダイゼーション適用に有用である。好ましくは、二次OCPの標的プローブ部分は、第１のRCAで生成されたTS-DNAのスペーサー配列中の二次標的配列に対して相補的である。この二次標的配列の相補物は、第１のRCAで使用されるOCPまたはATCのスペーサー部分に存在する。二次OCPとTS-DNAとを混合した後、連結およびローリングサークル増幅は、LM-RCAとして行われる。各々の連結した二次OCPは、新しいTS-DNAを生じる。例えば、第１回目においてOCPの２つの二次標的配列部分を有することにより、新しい回のLM-RCAが、第１のRCAで産生されたTS-DNA中のすべてのOCPまたはATC反復に対する２つの二次TS-DNA分子を生じる。このように、ネストされたLM-RCAの増幅収率は、約2,000倍となる。従って、RCAの２つのサイクルを用いるすべての増幅は、1000×2000=2,000,000である。ネストされたLM-RCAは、RCA、LM-RCA、２次DNA鎖置換、鎖置換カスケード増幅または転写のような、本明細書に記載のあらゆるDNA複製または転写操作に従い得る。
一般的に、ネストされたLM-RCAは、以下の第１のRCAを包含する：
（ａ）二次開環プローブとポリメラーゼ混合物とを混合する工程、OCP-TS混合物を得る工程、そしてそのOCP-TS混合物を、二次開環プローブと縦列配列DNAとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程、
（ｂ）リガーゼとOCP-TS混合物とを混合する工程、二次連結混合物を得る工程、そして二次連結混合物を、二次増幅標的環を形成するために二次開環プローブの連結を促進する条件下でインキュベートする工程、
（ｃ）ローリングサークル複製プライマーと二次連結混合物とを混合する工程、二次プライマー−ATC混合物を得る工程、そして二次プライマー−ATC混合物を、二次増幅標的環とローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程、
（ｄ）DNAポリメラーゼと二次のプライマー−ATC混合物とを混合する工程、二次ポリメラーゼ−ATC混合物を得る工程、そして二次ポリメラーゼ−ATC混合物を、二次増幅標的環の複製を促進する条件下でインキュベートする工程であって、ここで、二次増幅標的環の複製は、ネストされた縦列配列DNAの形成をもたらす、工程。
エキソヌクレアーゼ消化工程は、ネストされたLM-RCAを行なう前に添加され得る。これは、二次開環プローブの標的プローブ部分が、第１の開環プローブの標的プローブ部分と同じである場合、特に有用である。連結したいずれのOCPも、連結したOCPが遊離末端を有さないので消化されない。第１回目のLM-RCA間のTS-DNAにハイブリダイズしたOCPを消化する好ましい方法は、少なくとも約４つのホスホロチオエート結合を、５’末端でヌクレオチド間に含んでいる特別なローリングサークル複製プライマーを使用することである。次いで、ローリングサークル複製の後に、反応混合物をエキソヌクレアーゼ消化に供する。これらのホスホロチオエート結合を切断できない５’エキソヌクレアーゼを使用することによって、TS-DNAにハイブリダイズしたOCPのみが消化され、TS-DNAは消化されない。増幅の第１サイクルの間に生成されるTS-DNAは、５’末端のホスホロチオエート結合によって保護されているのでエキソヌクレアーゼによって消化されない。この目的のための好ましいエキソヌクレアーゼは、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼである。T7遺伝子６エキソヌクレアーゼは、二次開環プローブを添加する前に90℃で10分間加熱することにより不活性化され得る。
エキソヌクレアーゼ消化の使用によって、ネストされたLM-RCAは、第１回目のLM-RCAで使用される同じ標的配列を用いて行なわれ得る。これは、例えば、一般的に以下のようになされ得る。第１回目のLM-RCAの後、連結していない開環プローブおよびTS-DNAにハイブリダイズしたギャップオリゴヌクレオチドは、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼで消化される。エキソヌクレアーゼは、90℃で10分間加熱することによって不活性化される。次いで、第２の開環プローブが添加される。このスキームにおいて、第２の開環プローブは、同じ起源の標的配列と相補的であるが、異なる（任意の）スペーサー領域配列を含む標的プローブ部分を有する。次いで第２回目のLM-RCAが行われる。この第２回目において、第２の開環プローブの標的は、第１のサイクルによって生じたTS-DNA中に含まれる反復標的配列を含む。この手順は、ネストされたLM-RCA後に得られる増幅DNA中の元の標的配列を保存するのに有利である。
ネストされたLM-RCAはまた、増幅されていない連結したOCPまたはATPで行なわれ得る。この場合、LM-RCAは、ATCまたは標的依存性連結OCPのいずれかを用いて行なわれ得る。これは、インサイチュ検出に対して特に有用である。インサイチュ検出のために、第１の増幅していないOCP（その標的配列にトポロジー的にロックされている）は、ネストされたLM-RCAに供し得る。第１のOCPは増幅しないことによって標的配列にハイブリダイズしたままであり得るが、一方LM-RCAは、第１のOCPにトポロジー的にロックされた二次のOCPを増幅する。これは、図12に図示している。
３．二次DNA鎖置換および鎖置換カスケード増幅
二次DNA鎖置換は、TS-DNAを増幅するための別の方法である。二次DNA鎖置換は、二次DNA鎖置換プライマーをTS-DNAにハイブリダイズし、そしてDNAポリメラーゼがこれらのプライムされた部位からDNAを合成することによって成し遂げられる（図11）。二次DNA鎖置換プライマーの相補物は、TS-DNAの各々の反復で生じるので、二次DNA鎖置換は、RCTで得られる増幅レベルと類似するかまたはより大きなレベルを生じ得る。二次DNA鎖置換の産物は、二次縦列配列DNAまたはTS-DNA-2として言及される。
二次のDNA鎖置換は、RCAを行なって、TS-DNAをポリメラーゼ−ATC混合物中で生成し、次いで二次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物とを混合し、二次DNA鎖置換混合物を得、そして二次DNA鎖置換混合物を、縦列配列DNAの複製を促進する条件下でインキュベートすることによって成し遂げられ得る。二次DNA鎖置換プライマーは、初めに記載されたような生成されたTS-DNAに対して用いられるOCPまたはATCの一部と相補的である。二次DNA鎖置換プライマーは、ローリングサークル複製プライマー、またはもし使用するならば、三次DNA鎖置換プライマーと相補的ではないことが好ましい。
二次DNA鎖置換はまたローリングサークル複製と同時に行われ得る。これは、ローリングサークル複製のために混合物をインキュベートする前に、二次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物とを混合することによって成し遂げられる。同時ローリングサークル複製および二次DNA鎖置換のために、ローリングサークルDNAポリメラーゼが、両方の複製に使用されることが好ましい。これは、最適条件が使用されることを可能にし、そして図11Bに示されるように下流で合成された他の鎖の置換を生じる。二次DNA鎖置換は、本明細書中に開示されるあらゆるDNA複製操作（例えば、RCA、LM-RCA、またはネストされたLM-RCA）に従い得る。
二次DNA鎖置換の効率を最適化するために、十分な濃度の二次DNA鎖置換プライマーはあらゆる残存する未連結OCPおよびTS-DNAへの結合のために存在し得るギャップオリゴヌクレオチドより優れて競合する（outcompete）ために、伸長（growing）TS-DNA鎖の十分に迅速なプライミングを得るために使用されることが好ましい。一般的に、これは、二次DNA鎖置換プライマーが、TS-DNA上の二次DNA鎖置換プライマーのハイブリダイゼーションのための一本鎖部位の濃度と比較して、非常に大過剰である場合に成し遂げられる。二次DNA鎖置換プライマーの濃度の最適化は、YoungおよびAnderson、「Quantitative analysis of solution hybridization」Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach（IRL Press,1985）47-71頁によって記載されているような方法を用いた、ハイブリダイゼーションキネティクスの解析によって助けられ得る。例えば、φ29DNAポリメラーゼが、ローリングサークルDNAポリメラーゼとして使用されると仮定すれば、TS-DNAは、１秒間に約53ヌクレオチドの速度で生成され、そして、ローリングサークルDNAポリメラーゼは、19秒間に約10コピーの増幅標的サークルを生成する。80nMの濃度（LM-RCA連結操作に使用するための典型的な濃度）で存在するOCP駆動（driver）DNA（連結していないOCP）に対する、理論的溶液ハイブリダイゼーションキネティクスの解析、および800nMの濃度で存在する二次DNA鎖置換プライマー駆動DNAに対する理論的溶液ハイブリダイゼーションキネティクスの解析から、二次DNA鎖置換プライマーは、30秒間でそれらの10コピーと結合するが、一方連結していないOCPは、30秒間に１部位もハイブリダイズしない（８％の部位が充填している）ことが示される。DNAポリメラーゼの濃度が、比較的高い（例えば100から1000nMの範囲）場合、ポリメラーゼは、ハイブリダイズした二次DNA鎖置換プライマー上の利用可能な各３’末端でDNA合成を開始し、そしてこれらの伸長TS-DNA-2分子は、連結していないOCP分子によるあらゆるハイブリダイゼーションをブロックする。あるいは、二次DNA鎖置換の効率が、TS-DNA増幅前の連結していない開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの除去によって改善され得る。二次DNA鎖置換において、二次DNA鎖置換プライマーの濃度は、一般的に500nMから5000nMであることが好ましく、そして700nMから1000nMが最も好ましい。
二次DNA鎖置換プライマーが伸長される時、DNAポリメラーゼは、次のハイブリダイズした二次DNA鎖置換分子の５’末端に作動し、そしてその５’末端を置換する。この様式において、伸長DNAポリメラーゼの縦列が、TS-DNA鋳型上に形成される。ローリングサークル反応が続く限り、新しい二次DNA鎖置換プライマーおよび新しいDNAポリメラーゼが、ローリングサークルの伸長末端でTS-DNAに添加される。TS-DNA-2の生成と、鎖置換による溶液中へのその遊離を図11に図示的に示す。
一般的に、二次DNA鎖置換は、RCAと同時にまたはそれに続いて、二次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ-ATC混合物とを混合し、そして縦列配列DNAと二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーション、および縦列配列DNAの複製の両方が促進されるような条件下で、ポリメラーゼ−ATC混合物をインキュベートすることによって行われ得、ここで、縦列配列DNAの複製は二次縦列配列DNA形成をもたらす。
二次DNA鎖置換が、三次DNA鎖置換プライマーの存在下で行われる場合、TS-DNA配列の指数的増幅がおこる。二次DNA鎖置換のこの特別な、好ましい形態は、鎖置換カスケード増幅（SDCA）と呼ばれる。図13に示されたSDCAにおいて、二次DNA鎖置換プライマーは、上記のようにTS-DNAの複製をプライムしてTS-DNA-2を形成する。次いで、三次DNA鎖置換プライマー鎖は、TS-DNA-2にハイブリダイズし、そしてTS-DNA-2複製をプライムしてTS-DNA-3を形成する。隣接する伸長TS-DNA-3鎖によるTS-DNA-3の鎖置換は、TS-DNA-3を二次DNA鎖置換プライマーとのハイブリダイズに利用可能にする。これは、TS-DNA-4（TS-DNA-2と同等である）を生じる他の回の複製をもたらす。次に、TS-DNA-4は、三次DNA鎖置換プライマーによってプライムされるDNA複製のための鋳型となる。このカスケードは、反応が止まるか、または試薬が限界になるまでこの様式を続ける。この反応は、DNAをほぼ指数的速度で複製するが、統計学的に分布したプライミングの誤り、および反応中に生じるDNAネットワークの大きな大きさに関係する立体障害事象があるので、キネティクスは、正しくは指数的ではない。SDCAの好ましい形態において、ローリングサークル複製プライマーは、三次DNA鎖置換プライマーとして作用し、従って、別々のプライマーに対する必要性が除かれる。この形態において、ローリングサークル複製プライマーは、伸長TS-DNA-2鎖上の伸長の迅速なプライミングを得るために十分に高濃度で使用されるべきである。SDCAの効率を最適化するために、二次DNA鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライマーの十分な濃度を使用して、その相補的TS-DNAへの結合についてTS-DNAより優れて競合するために、および二次DNA鎖置換プライマーの場合においては、あらゆる残存未連結OCPおよびTS-DNAへの結合のために存在し得るギャップオリゴヌクレオチドより優れて競合するために、伸長TS-DNA鎖の十分に迅速なプライミングを得ることが好ましい。一般的に、これは、二次DNA鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライマーの両方が、TS-DNA上のDNA鎖置換プライマーのハイブリダイゼーションのための一本鎖部位の濃度と比較して非常に大過剰な場合、成し遂げられる。例えば、二次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA、TS-DNA-3、TS-DNA-5などの一本鎖二次DNA鎖置換プライマー相補的部分の濃度と比較して過剰であることが好ましい。三次DNA鎖置換プライマーの場合において、三次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA-2、TS-DNA-4、TS-DNA-6などの一本鎖三次DNA鎖置換プライマー相補的部分の濃度と比較して過剰であることが好ましい。そのような過剰物は一般的に、増幅した相補的TS-DNAがハイブリダイズし得る前に、TS-DNA中でその相補物とハイブリダイズするプライマーとなる。プライマー濃度の最適化は、ハイブリダイゼーションキネティクスの解析によって助けられ得る（YoungおよびAnderson）。鎖置換カスケード増幅において、二次および三次DNA鎖置換プライマーの両方の濃度は一般的に、500nMから5000nMであることが好ましく、そして最も好ましくは、700nMから1000nMである。
二次DNA鎖置換プライマーの場合と同様に、DNAポリメラーゼの濃度が十分高い場合、ポリメラーゼは、DNA合成をハイブリダイズした三次DNA鎖置換プライマー上の利用可能な各３’末端で開始し、そしてこれらの伸長TS-DNA-3分子は、TS-DNA-2によるあらゆるハイブリダイゼーションをブロックする。三次DNA鎖置換プライマーが伸長して、TS-DNA-3を形成する場合、DNAポリメラーゼは、次のハイブリダイズした三次DNA鎖置換プライマー分子の５’末端に達し、そしてその５’末端を置換する。この様式において、伸長DNAポリメラーゼの縦列は、TS-DNA-2鋳型上で形成される。反応が続く限り、新しいローリングサークル複製プライマーおよび新しいDNAポリメラーゼが、TS-DNA-2の伸長末端で、TS-DNA-2に添加される。このハイブリダイゼーション／複製／鎖置換サイクルは、伸長TS-DNA-3上の一次DNA鎖置換プライマーのハイブリダイゼーションと共に繰り返される。TS-DNA生成のカスケード、および溶液中への鎖置換によるそれらの遊離が、図13に図示されている。
一般的に、鎖置換カスケード増幅は、RCAと同時にまたはRCAの後に、二次DNA鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物との混合、および縦列配列DNAと二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でのポリメラーゼ−ATC混合物のインキュベート、縦列配列DNAの複製（ここで、縦列配列DNAの複製が、二次縦列配列DNAの形成をもたらす）、二次縦列配列DNAと三次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーション、ならびに二次縦列配列DNAの複製（ここで、二次縦列配列DNAの複製が、三次縦列配列DNA（TS-DNA-3）の形成をもたらす）、によって行われ得る。
鎖置換カスケード増幅によって生じる増幅収率の例は、以下のように大まかに評価され得る。１秒あたり53ヌクレオチドで35分間行なわれるローリングサークル反応は、90ヌクレオチドの増幅標的環の1236コピーを生成する。従って、TS-DNA-1は1236の縦列反復を含む。これらの1236の縦列反復が伸長するにつれて、二次DNA鎖置換プライマーを用いたプライミングおよび合成は、遅延および誤ったプライミング事象を考慮して、少なくとも800のTS-DNA-2分子を生成し得る。これらの新しい分子は、１〜799反復の範囲で直線状に分布した長さを有する。次に、三次DNA鎖置換プライマーによるTS-DNA-2でのプライミング事象は、遅延および誤ったプライミング事象を考慮して、少なくとも500のTS-DNA-3分子を生成し得、そしてこれらの新しい分子は、１〜499反復の範囲で直線状に分布する長さを有する。次いで、二次DNA鎖置換プライマーによるTS-DNA-3上のプライミング事象は、遅延および誤ったプライミング事象を考慮して、少なくとも300のTS-DNA-4分子を生成し得、そしてこれらの新しい分子は１〜299反復の範囲で直線状に分布する長さを有する。これらの４つの増幅レベルのみの産物として計算された、保存的な全増幅収率は、元のOCPまたはATCの1.86×lO10反復であると評価される。従って、SDCAは、等温な35分間の反応で極めて高い増幅収率が可能である。
二次DNA鎖置換はまた、連続して行われ得る。第１回目の二次DNA鎖置換の後に、三次DNA鎖置換プライマーは、ポリメラーゼ−ATC混合物と混合され得、そしてポリメラーゼ−ATC混合物は、二次縦列配列DNAと三次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーションおよび二次縦列配列DNAの複製を促進する条件下でインキュベートされ得、ここで二次縦列配列DNAの複製は、三次縦列配列DNA（TS-DNA-3）を形成する。この回の鎖置換複製は、三次DNA鎖置換として言及され得る。しかしながら、ローリングサークル複製後のすべての回の鎖置換複製はまた、二次DNA鎖置換として集合的に言及され得る。
二次DNA鎖置換の改変された形態は、TS-DNAの増幅を生じ、反対鎖増幅（OSA）として言及される。OSAは、TS-DNA-2へのハイブリダイズを妨害するローリングサークル複製プライマーの特別な形態が使用されることを除いて、二次DNA鎖置換と同じである。これは、多くの方法で成し遂げられ得る。例えば、ローリングサークル複製プライマーは、ローリングサークル複製プライマーを二次DNA鎖置換の前に除くことが可能なその非相補的部分と結合したアフィニティータグを有し得る。あるいは、残存ローリングサークル複製プライマーは、ローリングサークル複製の開始後に、弱め（cripple）られ得る。OSAの使用のためのローリングサークル複製プライマーの１つの好ましい形態は、完全な塩基対ヌクレオチドのステムを含むヘアピンを形成するように設計される。そのステムは、５〜12塩基対を含み得、最も好ましくは、６〜９塩基対である。そのようなヘアピン形成ローリングサークル複製プライマーは、低温（40℃より低い）で弱いプライマーである。なぜなら、ヘアピン構造により、相補配列へのハイブリダイズが妨げられるから含である。ステムは、プライマーのOCPまたはATCへのハイブリダイゼーションを妨害するために、十分な数のヌクレオチドを、ローリングサークル複製プライマーの相補部位に含むべきである。一般的に、ステムは、ローリングサークル複製プライマーの相補部分の５〜24ヌクレオチドを含むことが好ましく、そして最も好ましくは、６〜18ヌクレオチドである。ステムの半分にローリングサークル複製プライマーの相補部分のヌクレオチドを含み、そしてもう半分のステムにローリングサークル複製プライマーの非相補部位のヌクレオチドを含む、ローリングサークル複製プライマーが最も好ましい。そのような配列は、ヘアピン形成ローリングサークル複製プライマーを使用する場合、OCPまたはATCの自己相補領域に対する必要性が除かれる。
ローリングサークル複製反応が開始されると、二次DNA鎖置換プライマーおよびローリングサークル複製プライマーは反応混合物へ添加され、そしてこの溶液は、ローリングサークル複製プライマーのヘアピン構造を壊すのに十分な、しかし依然として、増幅標的環のプライマー相補部分にハイブリダイズできる温度（典型的には、50℃より高い）で、短時間インキュベートされる。このインキュベーションは、ローリングサークル複製プライマーが、増幅標的環のプライマー相補部分にハイブリダイズすることを可能にする。次いで、溶液をローリングサークル複製のための適切な温度にし、そしてローリングサークルDNAポリメラーゼを添加する。ローリングサークル反応が進行するにつれて、TS-DNAが生成され、そしてTS-DNA長が伸長するにつれて、二次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA上で複数の鎖置換反応を伴う迅速なDNA合成を開始する。これらの反応は、TS-DNA-2（これはTS-DNAと相補的である。）を生成する。TS-DNA-2が、ローリングサークル複製プライマーに相補的な配列を含むが、一方、このプライマーは、この温度でのそのヘアピン構造のため、その反応温度でハイブリダイズも効率的なプライミングもできない。このように、ローリングサークル複製プライマーによる更なるプライミングがなく、そして生成される産物は、TS-DNAおよびTS-DNA-2のみである。反応は、ローリングサークル増幅停止と同時に止まり、そしてTS-DNAは完全に２本鎖になる。反応経過中、過剰な一本鎖TS-DNA-2が生成される。
OSAにおいて有用なローリングサークル複製プライマーの別の形態は、DNAとRNAとのキメラである。この実施態様において、ローリングサークルプライマーは、その３’末端にデオキシリボヌクレオチドを有し、プライマー残りの部分はリボヌクレオチドを有する。ローリングサークル複製プライマーは、５つまたは６つのデオキシリボヌクレオチドをその３’末端に有することが好ましい。リボヌクレオチドを有するローリングサークル複製プライマーの一部を作製することによって、プライマーは、DNAにハイブリダイズする場合、RNAse Hによって選択的に分解され得る。そのようなハイブリッドは、TS-DNA-2が合成されるようにOSAの間形成する。３’末端のデオキシリボヌクレオチドは、ローリングサークルDNAポリメラーゼがローリングサークル複製を開始することを可能にする。次いで、RNAse Hは、TS-DNA-2複製のプライミングを防ぐために、OSA反応物へ添加され得る。
OSAによって生成される増幅収率の例は、大まかに以下のように評価され得る。１秒間あたり53ヌクレオチドで45分間行われるローリングサークル反応は、90ヌクレオチドの増幅標的環の縦列1590コピーを生成する。従って、TS-DNA-1は、1590の縦列反復を含む。これらの1590縦列反復が伸長するにつれて、二次DNA鎖置換プライマーを用いたプライミングおよび置換反応は、1400までのTS-DNA-2を生成し、そして放出し、そしてそれらの新しい分子は、１〜1399反復の範囲で直線的に分布する長さを有する。計算から、45分後、１本鎖TS-DNA-2は、TS-DNA量を約700の因子分上回っていることが示された。OSAは、標的配列の逆相補物を含む１本鎖DNAを生成するために有用である。全増幅は、100万倍のオーダーであり得る。
二次DNA鎖置換が連結したOCPと共に使用される場合、連結していないOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドは、結合していないOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドと、TS-DNAへのハイブリダイゼーションのための二次DNA鎖置換プライマーとの間の競合を除くために、ローリングサークル複製の前に取り除かれ得る。以下に記載のように、二次DNA鎖置換が、ギャップ充填LM-RCAと共に使用される場合、例外がある。あるいは、二次DNA鎖置換プライマーの濃度を、TS-DNAへのハイブリダイゼーションのために結合していないOCPより優れて競合するように、十分高くし得る。これは、二次DNA鎖置換を、連結していないOCPの除去なしで行うことを可能にする。
二次DNA鎖置換によって生成されたDNAは、TS-DNAでの使用のために記載された、同じ標識、標識方法、および検出方法を用いて、標識および／または検出され得る。これらの標識および方法の大部分は、一般的に核酸での使用に適合可能である。好ましいDNAの標識方法は、標識ヌクレオチドを合成の間に組み込むことである。
４．複数の連結サイクル
AMPLIGASE▲Ｒ▼（Epicentre Technologies, Inc.）のような耐熱性DNAリガーゼを用いて、開環プローブ連結反応が、アニーリング温度（55℃）と融解温度（96℃）との間で何回もサイクル（cycle）され得る。このサイクリングは、サンプル中に存在する各標的配列に対する複数の連結を生じる。例えば８サイクルの連結が連結した環の数の約６倍の増加を提供し、そしてそれに近づける。好ましいサイクリングプロトコルは、Perkin Elmer 9600サーマルサイクラーで、96℃２秒間、55℃２秒間、そして60℃70秒間である。サイクル数が少ないままである場合、増幅応答の直線性（linearity）は、解決するはずがない。
８回の連結サイクル、二次蛍光タグ、そして配列（array）ハイブリダイゼーションを用いた予期される正味の増幅収率は、以下に示されるように計算され得る。
連結サイクリング収率：６
OSA収率:1,000,000
蛍光タグ／環数：５
20％配列ハイブリダイゼーション収率：0.2
正味の収率＝６×1,000,000×５×0.2＝6,000,000
100の標的分子×6,000,000＝６×108の表面上に結合した蛍光
５．RCA（RCT）後の転写
一旦、TS-DNAがRCAを用いて生成されると、TS-DNA中に包埋されたプロモーターからTS-DNAを転写することによりさらなる増幅が達成され得る。この組み合わせられたプロセス（転写を伴うローリングサークル複製（RCT）、または連結媒介性の、転写を伴うローリングサークル複製（LM-RCT）と呼ばれる）は、TS-DNAが作製されるOCPまたはACPが、そのスペーサー領域にプロモーター部分を有することを必要とする。次いで、プロモーター部分がOCPまたはATCの残りとともに増幅され、TS-DNAの各縦列反復中に包埋されたプロモーター（図８）を生じる。転写（ローリングサークル増幅のような）は、連続的に起こり得る（再開始を伴う）プロセスであるので、複数の転写物は、TS-DNA中に存在する複数のプロモーターのそれぞれから産生され得る。RCTを、連結したOCP配列増幅の別のレベルに効率的に付加する。
一般的に、RCTは、RCAを実施してポリメラーゼ-OCP混合物またはポリメラーゼ-ATC混合物内にTS-DNAを産生すること、次いでRNAポリメラーゼとポリメラーゼ-OCP混合物またはポリメラーゼ-ATC混合物とを混合すること、転写混合物を得ること、および転写混合物を縦列配列DNAの転写を促進する条件下でインキュベートすることにより達成され得る。OCPまたはATCは、RCTが作用するためのそのスペーサー領域中にRNAポリメラーゼのプロモーターの配列（プロモーター部分）を含まなければならない。転写工程は、一般的に、使用される特定のRNAポリメラーゼのインビトロ転写について確立された条件を用いて実施され得る。好ましい条件は実施例中に記載される。あるいは、転写は、ローリングサークル複製と同時に行われ得る。これは、ローリングサークル複製のために混合物をインキュベートする前に、RNAポリメラーゼを、ポリメラーゼ-OCP混合物またはポリメラーゼ-ATC混合物と混合することにより達成される。ローリングサークル複製と転写とを同時に生じるために、ローリングサークルDNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼは、同じ条件下で活性でなければならない。このような条件は、両方のポリメラーゼの活性のバランスを保つためおよび／または最大にするために最適化され得る。ポリメラーゼがそれらの最大活性に達する必要はなく、活性の間のバランスが好ましい。転写は、本明細書中に記載される任意のDNA複製操作（例えば、RCA、LM-RCA、ネストされたLM-RCA、二次のDNA鎖置換、または鎖置換カスケード増幅（strand displacement cascade amplification）の後に続き得る。
RCT中で生成された転写物は、TS-DNAを用いる使用について記載された同一の標識、標識方法、および検出方法を用いて標識および／または検出され得る。これらの標識および方法のほとんどは、一般的に、核酸を伴う使用に適合性である。RCT転写物を標識する好ましい方法は、転写の間に標識したヌクレオチド（最も好ましくは、ビオチン標識したヌクレオチド）の取り込みにより転写物を直接標識することである。
６．ギャップ充填（filling）連結
標的配列にハイブリダイズしたOCPにより形成されるギャップスペースは、通常、上記のような一つまたはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドにより占められる。このようなギャップスペースはまた、連結操作の間にギャップ充填DNAポリメラーゼによってもフィルインされ得る。あるいは、ギャップスペースは、一つまたはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドにより部分的に架橋され、ギャップの残りはDNAポリメラーゼを用いて充填される。この改変された連結操作は、本明細書中でギャップ充填連結と呼ばれ、そして連結操作の好ましい形態であるギャップ充填連結の原理および手順は、一般的に、ギャップLCR中で実施される充填および連結と類似である（Wiedmannら、PCR法および適用（Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1994）S51-S64頁；Abravayaら、Nucleic Acids Res.,23（4）:675-682（1995）;欧州特許出願第EP0439182号（1991））。LM-RCAの場合、ギャップ充填連結操作は通常の連結操作の代わりである。ギャップ充填連結は、接近した関連標的配列間の識別の手段を提供する。この一例を、実施例３に記載する。ギャップ充填連結は、異なるDNAポリメラーゼ（本明細書中においてギャップ充填DNAポリメラーゼと呼ばれる）を使用することにより達成され得る。適切なギャップ充填DNAポリメラーゼは、上記である。あるいは、一般的に、停止塩基（stop base）が使用される場合、DNAポリメラーゼは、ギャップを充填するために使用され得る。LCRのギャップ充填操作における停止塩基の使用は、欧州特許出願第EP0439182号に記載されている。ギャップおよび結合される隣接プローブの末端の設計の原理は、EP0439182に記載されるように、一般的に、本明細書中で記載されるギャップスペースおよび標的プローブ部分の末端の設計に適用可能である。
ローリングサークル複製を用いてギャップ充填DNAポリメラーゼの干渉を妨げるために、ギャップ充填DNAポリメラーゼは、ローリングサークル複製を実施する前に、抽出または中和抗体を用いる不活性化により除去され得る。このような不活化は、PCR前のTaq DNAポリメラーゼのブロックする抗体の使用と類似する（Kelloggら、Biotechniques 16（6）:1134-1137（1994））。
ギャップ充填連結もまた好ましい。なぜなら、上記のような鎖置換カスケード増幅（SDCA）に類似の指数関数的なOCP配列の増幅と適合性が高いからである。ローリングサークル複製の間にTS-DNAが形成される場合、反応物中に存在する連結されていないOCP分子はTS-DNAとハイブリダイズし、あらゆるOCP反復間にギャップスペースを残す。ハイブリダイズしたOCP分子は、二次DNA合成のプライマーとして作用する。
一般的に、ギャップ充填LM-RCAは、LM-RCA反応において、（1）OCPの開環プローブの左側標的プローブ部分および開環プローブの右側標的プローブ部分のいずれもが標的配列の中心領域（central region）に相補的ではない場合、5'領域と3'領域との間に配置された中心領域を有する標的配列を使用すること、および（2）ギャップ充填DNAポリメラーゼをOCP-標的サンプル混合物と混合することにより実施され得る。
７．組換え多色コーディングを伴う連結媒介性ローリングサークル増幅
多様な検出を含むローリングサークル増幅の好ましい形態は、組換え多色コーディングを伴う連結媒介性ローリングサークル増幅（LM-RCA-CMC）であり、これは、上記のLM-RCAとCMCとの両方の組み合わせである。LM-RCA-CMCにおいては、開環プローブおよび対応するギャップオリゴヌクレオチドが、多数の異なる標的配列の検出のために設計されている。試験されるDNAサンプルが、上記のように固体サンプルの中に組み込まれる。固体基体は、好ましくはガラスのスライドであり、そして好ましくは、固体サンプルはドット内に配置された256個までの個々の標的またはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個体サンプルを試験するため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるためのいずれかのために、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合、各固体サンプルはサンプルドットの同一の一セットを有し、そしてLM-RCAは、各固体サンプルについて異なるセットの開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチド（プローブセットと総称される）を用いて行われる。これは、単一のアッセイにおいて、大量の個体および標的配列をアッセイすることを可能にする。６個までの異なる標識を使用することにより、組合わせ多色コーディングを、単一の固体サンプル上で63個までの異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の基体を使用し、そして各固体の基体についてOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの別のセットを用いてLM-RCAを行う場合、同一の標識が各固体サンプルとともに使用され得る（しかし、各セットのOCP間の差異は異なる検出プローブの使用を必要とし得る）。例えば、10個のレプリカスライド（それぞれ256個の標的サンプルドットを有する）が、OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの10個の異なるセットを使用するLM-RCAに供され得る。ここで、各セットは63個の標的の組換え多色コーディングのために設計される。これは、630個の異なる標的配列の検出についてのアッセイを生じる。二つまたはそれ以上の異なる標的配列が標的またはアッセイサンプルのDNA中に接近して配置されている場合（例えば、同一の遺伝子の複数の接近して配置された変異が標的である場合）、接近して配置された標的配列の各々のためのOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドが、異なるプローブセット内に置かれることが好ましい。この目的のために、標識配列が、標的またはアッセイサンプル中のDNA分子上に相互に20ヌクレオチド以内に接近して配置されていることが考慮される。同一の遺伝子内の複数の標識が、異なるプローブセットで検出されることは必要でない。先に規定されるように、接近して配置されている標的配列が別々にプローブされることが単に好ましい。
ローリングサークル複製の後に、プローブ検出の反応混液が添加される（ここで、反応混液は、各OCPに特異的な色素の組み合わせを含む）。組合わせ多色コーディングにおける使用のためのこのような検出プローブの設計および組合わせは、先に記載されている。OCPが、組み合わせによりコードされる検出タグを有して設計され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にすることが好ましい。折り畳み検出プローブ（collapsing detection probe）が使用されることもまた好ましい。上記のように、折り畳みプローブは、二つの相補的な部分を含む。これは、各検出プローブがTS-DNA中の二つの検出タグにハイブリダイズすることを可能にする。この方法において、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分間で架橋を形成する。TS-DNAにハイブリダイズする多数の折り畳み検出プローブの組合わせられた作用は、架橋されたTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離の伸長されたTS-DNAよりもかなり少量の容積を占め、そして検出プローブ上に存在するどのような検出標識をも含む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であり、そして別々に検出可能なシグナルである。折り畳みの際に、プローブ結合は、各プローブ配列に基づいてプライオリー（priory）に設計された独特の色の組み合わせを捕捉する。
先に議論したように、ローリングサークル増幅が操作され、異なるOCPについて異なる長さのTS-DNAが産生され得る。このような生成物は、それらが生成する検出シグナルのサイズに基づいて簡単に識別され得る。従って、同一のセットの検出プローブが、生成されたTS-DNAの二つの異なるセットを識別するために使用され得た。このスキームにおいて、二つの異なるTS-DNA（各々のサイズのクラスが異なるが、同一のカラーコードを充てられている）は、ハイブリダイズした検出プローブにより産生されるシグナルのサイズにより識別された。この方法において、126個の異なる標的の全てが、63個の組み合わせを有するコードを使用して単一の固体サンプル上で識別され得る。なぜなら、シグナルは二つの特色のある低い振幅および高い振幅を生じるからである。従ってこの方法は、例えば、腫瘍遺伝子変異の検出のための63個のプローブの低い振幅シグナルのセットおよび腫瘍サプレッサーp53変異の検出のための63個のプローブの高い振幅シグナルのセットを使用し得た。
８．レポーター結合剤単分子ローリング増幅
レポーター結合剤単分子ローリング増幅（RBAURA）はRCAの１つの形態であり、ここでレポーター結合剤は増幅標的サークルの増幅のためのローリングサークル複製プライマーを提供する。RBAURAにおいて、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。RBAURAは、RCAが標的分子へのレポーター結合剤の会合に基づいて増幅されるシグナル（即ち、TS-DNA）を産生することを可能にする。レポーター結合剤の一部分である特異的なプライマー配列は、標的分子に対するレポーター結合剤の特異的な相互作用（レポーター結合剤の親和性部分を介する）とRCAとの関係を提供する。RBAURAにおいて、一旦、レポーター結合剤が標的分子に会合すると、増幅標的サークルはレポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列にハイブリダイズされ、RCAによるATCの増幅が続く。生じたTS-DNAは、レポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列の一端に組み込まれ、従って、TS-DNAを標的分子の部位に固定する。RBAURAは、インサイチュ検出に好ましいRCA法である。この目的のために、上記の折り畳み検出プローブ、ビオチン-抗体結合体、またはその両方を用いて、TS-DNAが折り畳まれることが好ましい。RBAURAは、任意の標的分子を使用して行われ得る。好ましい標的分子は、これはTS-DNAおよび増幅標的サークルのような増幅された核酸を含む拡散、抗原、ならびリガンドを含む。このような標的分子の使用例を、図25A〜29Bに示す。下記のペプチド核酸プローブ単分子ローリング複製（PNAPURA）および固定抗体単分子ローリング増幅（LAURA）はRBAURAの好ましい形態である。
（a）ペプチド核酸プローブ単分子ローリング増幅
PNAPURAにおいて、キメラPNA:DNA分子はレポーター結合プローブ（PNAレポーター結合プローブと呼ばれる）として使用される。PNAレポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。PNAレポーター結合プローブの親和性部分は、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするように設計されたペプチド核酸（好ましくは12〜20ヌクレオチド塩基長、そしてさらに好ましくは15〜18塩基長）である。PNAPURAにおいて、PNAレポーター結合プローブは最初に、標的配列にハイブリダイズすることを可能にされる（図25Aに示す）。一旦、PNAレポーター結合プローブが標的配列にハイブリダイズされると、増幅標的サークルはPNAレポーター結合プローブのローリングサークル複製プライマー配列にハイブリダイズされ（図25Bに示す）、RCAによるATCの増幅が続く。生じるTS-DNAは、PNAレポーター結合プローブのローリングサークル複製プライマー配列をその一端に組み込み、従って、TS-DNAを標的分子の部位に固定する。親和性部分の任意の形態を有するレポーター結合剤が、類似の様式において使用され得る。
好ましくは、PNAPURAは、固体の基体を用いて、そしてCMCとの組み合わせで行われる。この目的のために、試験されるべきDNAサンプルは、上記のような固体サンプル中に組み込まれる。固体の基体は、好ましくはガラスのスライドであり、そして好ましくは固体サンプルは、ドット内に配置された256個までの個々の標的またはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個々のサンプルを試験するため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるかのいずれかのために、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合において、各固体サンプルは同一のセットのサンプルドットを有し、そしてPNAPURAは、各固体サンプルについてPNAレポーター結合プローブおよび増幅標的サークル（プローブセットと総称される）の異なるセットを使用して行われる。これは、単一のアッセイにおいて、大量の個体および標的配列をアッセイすることを可能にする。６個までの異なる標識を使用することにより、組換え多色コーディングは、単一の固体サンプル上で63個までの異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の基体を使用し、そして各固体の基体についてPNAレポーター結合プローブおよび増幅標的サークルの異なるセットを用いてPNAPURAを行う場合、同一の標識が各固体サンプルとともに使用され得る（しかし、各セットのATC間の差異は異なる検出プローブの使用を必要とし得る）。例えば、10個のレプリカスライド（それぞれ256個の標的サンプルドットを有する）は、PNAレポーター結合プローブおよび増幅標的サークルの10個の異なるセットを使用するPNAPURAに供され得る。ここで、各セットは63個の標的の組換え多色コーディングのために設計される。これは、630個の異なる標的配列の検出のためのアッセイを生じる。二つまたはそれ以上の異なる標的配列が標的またはアッセイサンプルのDNA中に接近して配置されている場合（例えば、同一の遺伝子の複数の接近して配置されている変異が標的である場合）、接近して配置された標的配列の各々のためのPNAレポーター結合プローブが、異なるプローブセット内に置かれることが好ましい。この目的のために、標的配列が、標的またはアッセイサンプル中のDNA分子上に相互に20ヌクレオチド以内に接近して配置されていることが考慮される。同一の遺伝子内の複数の標的が、異なるプローブセットで検出されることは必要でない。先に規定されるように、接近して配置されている標的配列が別々にプローブされることが単に好ましい。
ローリングサークル複製の後に、プローブの反応混液が添加される。ここで、反応混液は、各ATCに特異的な色素の組合わせを含む）。組み合わせ多色コーディングにおける使用のためのこのような検出プローブの設計および組み合わせは、上に記載されている。ATCが、組み合わせによりコードされる検出タグを有して設計され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にすることが好ましい。折り畳み検出プローブが使用されることもまた好ましい。上記のように、折り畳みプローブは、二つの相補的な部分を含む。これは、各検出プローブがTS-DNA内の二つの検出タグにハイブリダイズすることを可能にする。この方法において、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分間で架橋を形成する。TS-DNAにハイブリダイズする多数の折り畳み検出プローブの組合わされた作用は、架橋されたTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離の伸長されたTS-DNAよりもかなり少量であり、そして検出プローブ上に存在するどのような検出標識をも含む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であり、そして別々の検出可能なシグナルである。折り畳みの際に、プローブ結合は、各プローブ配列に基づいてプライオリー（priory）に設計された独特の色の組み合わせを捕捉する。
（b）固定抗体単分子ローリング増幅
LAURAにおいて、共有結合された抗体およびオリゴヌクレオチドは、レポーター結合剤として使用される。レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。レポーター結合剤の親和性部分は、目的の標的分子に特異的な抗体である。レポーター結合剤は、従来のイムノアッセイにおけるような、標的分子に結合される（図29Aに示す）。従来のイムノアッセイとは異なり、この相互作用の検出は、ローリングサークル増幅により媒介される。結合および洗浄後、免疫複合体は、抗体を固定化するための適切な固定反応（例えば、メタノール-酢酸）を用いて適切な場所に固定される。従来のイムノアッセイにおけるように、結合していない抗体（この場合、レポーター結合剤の形態）を、洗浄することによって除去する。一旦、レポーター結合剤が標的分子に結合されると、増幅標的サークルはレポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列にハイブリダイズされ、RCAによるATCの増幅が続く。生じたTS-DNAは、レポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列を一端に組み込み、従って、TS-DNAを標的分子部位に固定する。
この方法の改変において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、DNAの代わりにペプチド核酸であり得る。標的分子へのレポーター結合剤の固定後、PNAは、PNAに相補的な部分を含むオリゴヌクレオチド（相補的部分と呼ばれる）および一本鎖のままである部分（プライマー部分と呼ばれる）にハイブリダイズされ得る。次いで、プライマー部分は、上記のようなLAURAおいてローリングサークルプライマーとして使用され得る。
好ましくは、LAURAを、固体の基体を用いて、そしてCMCとの組み合わせにおいて行う。この目的のために、試験されるDNAサンプルが、上記のような固体サンプルに組み込まれる。固体の基体は、好ましくはガラスのスライドであり、そして好ましくは、固体サンプルはドット内に配置された256個までの個々の標的またはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個体のサンプルを試験するため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるためのいずれかのために、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合、各固体サンプルはサンプルドットの同一のセットを有し、そしてLAURAは、各固体サンプルについてPNAレポーター結合剤および増幅標的サークル（プローブセットと総称される）の異なるセットを使用して行われる。これは、単一のアッセイにおいて、多数の個体および標的配列をアッセイすることを可能にする。６個までの異なる標識を使用することにより、組合わせ多色コーディングは、単一の固体サンプル上で63個までの異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の基体を使用し、そして各固体の基体についてレポーター結合剤および増幅標的サークルの別々のセットを用いてLAURAを行う場合、同一の標識が各固体サンプルとともに使用され得る（しかし、各セットのATC間の差異は異なる検出プローブの使用を必要とし得る）。例えば、10個のレプリカスライド（それぞれ256個の標的サンプルドットを有する）が、レポーター結合剤および増幅標的サークルの10個の異なるセットを使用するLAURAに供され得る（ここで、各セットは63個の標的の組合わせ多色コーディングのために設計する）。これは、630個の異なる標的配列の検出についてのアッセイを生じる。二つまたはそれ以上の異なる標的配列が標的またはアッセイサンプルのDNA中に接近して配置されている場合、上で議論されるように、接近して配置された標的配列の各々のためのPNAレポーター結合プローブが、異なるプローブセット内に置かれることが好ましい。
ローリングサークル複製の後に、プローブ検出の反応混液が添加される（ここで、反応混液は、各ATCに特異的な色素の組合わせを含む）。組合わせ多色コーディングの使用におけるこのような検出プローブの設計および組合わせは、先に記載されている。ATCが、組み合わせによりコードされる検出タグを有して設計され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にすることが好ましい。折り畳み検出プローブが使用されることもまた好ましい。上記のように、折り畳みプローブは、二つの相補的な部分を含む。これは、各検出プローブがTS-DNA中の二つの検出タグにハイブリダイズすることを可能にする。この方法において、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分間で架橋を形成する。TS-DNAにハイブリダイズする多数の折り畳み検出プローブの組合わされた作用は架橋されたTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離の伸長されたTS-DNAよりもかなり少量であり、そして検出プローブ上に存在するどのような検出標識をも含む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であり、そして別々に検出可能なシグナルである。折り畳みの際に、プローブ結合は、各プローブ配列に基づいてプライオリー（priory）に設計された独特の色の組み合わせを捕捉する。
９．プライマー伸長配列決定
増幅に続いて、増幅した配列のヌクレオチド配列を、従来の手段または増幅した標的配列のプライマー伸長配列決定のいずれかにより決定し得る。プライマー伸長配列決定はまた、本明細書中で鎖終結プライマー伸長配列決定（chain terminating primer extension sequencing）と呼ばれる。鎖終結プライマー伸長配列決定の好ましい形態（本明細書中で、一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長配列決定と呼ばれる）は、プライマーへの一本鎖終結ヌクレオチドの付加を含む（他のヌクレオチドは付加しない）。プライマー伸長配列決定のこの形態は、プライマーがハイブリダイズする領域にすぐ近くに隣接する核酸の識別（および確認）を可能にする。一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長配列決定の二つの好ましい形態が開示される。
（a）単分子セグメント増幅および配列決定
単分子セグメント増幅および配列決定（USA-SEQ）は、識別されたヌクレオチドの同一性に基づく特異的および同定可能なヌクレオチドの組み込みにより、増幅された標的配列内の一本鎖ヌクレオチドの識別を含む。単分子セグメント増幅および配列決定（USA-SEQ）において、個々の標的分子は、ローリングサークル増幅により増幅する。増幅に続き、識別プライマーを、識別されるべき標的配列内のすぐ近くの5'塩基にハイブリダイズし、そして一本鎖終結ヌクレオチドをプライマーの末端に付加する。識別された塩基の同一性は、どのヌクレオチドが加えられたかを決定する。独特の検出サインを有するヌクレオチド（例えば、異なる蛍光標識）を使用することによって、識別された塩基の同一性が決定され得る。識別プライマーは、予め形成された一本鎖の分子であり得るか、または、一つまたはそれ以上の識別プローブが増幅された標的配列へハイブリダイズすること、およびそれらを互いに連結して識別プライマーを形成することにより、形成され得る。
USA-SEQは標的配列の混合物における複数の異なる配列の存在を同定するために有用である。特に、標的配列が増幅されるサンプルが標的配列の異なる形態（即ち、標的配列の異なる対立遺伝子）を含む場合、次いでUSA-SEQはそれらの存在を同定し得るだけでなく、異なる形態の相対的な量の情報を提供し得る。各TS-DNA分子が単一の標的配列分子から増幅され、そして各TS-DNA分子は個々に検出され得るために、これは可能である。
プライマー伸長配列決定は、一般的に、以下のように実施され得る。本明細書中に開示される任意のローリングサークル増幅技術を用いる標的核酸配列の増幅後、識別プライマーは増幅された核酸（例えば、TS-DNA）にハイブリダイズする。増幅された核酸と識別プライマーとの混合物は、識別混合物と呼ばれる。識別プライマーは、識別される（すなわち、配列決定される）べきTS-DNA中のヌクレオチドに近接して（即ち、3'に）ハイブリダイズするように設計される。当然、標的配列がTS-DNA分子内で多数回反復されているので、多数の識別プローブが単一のTS-DNA分子にハイブリダイズする。次に、少なくとも２つの別々に標識された鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼが、識別混合物に添加される。これは、識別プライマーの末端への単一のヌクレオチドの付加を生じ、その同一性は識別されたヌクレオチド（即ち、識別プライマーの末端の後の最初の鋳型ヌクレオチドである）の同一性に基づく。最終的に、各TS-DNA分子について組み込まれたヌクレオチドの同一性が、蛍光顕微鏡によって決定される。この目的のために、組み込まれたヌクレオチドの検出の前にTS-DNAが折り畳まれることが好ましい。実施例９は、遺伝子サンプルにおける特定のヌクレオチドでホモ接合体またはヘテロ接合体を検出するためのUSA-SEQの使用の例を記載する。プライマー伸長配列決定が、任意の増幅された核酸における一つまたはそれ以上の特異的なヌクレオチド（標的核酸由来のヌクレオチドおよびOCPまたはATCのスペーサー領域において勝手に選択された配列として存在するヌクレオチドを含む）の同一性を決定するために使用され得ることが、特に企図される。後者の場合において、プライマー伸長配列決定は、増幅された特異的なOCPまたはATCを識別または同定するために使用され得る。他で記載したように、特異的な標的分子または核酸の存在に基づいて増幅される、特異的なOCPおよびATC（OCPまたはATCの最初のプール中に由来）の検出は、開示される増幅および検出方法について好ましい用途である。
好ましい鎖終結ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。他の公知の鎖終結ヌクレオチド（例えば、3'位に置換基を有するヌクレオチド）もまた、使用され得る。ジデオキシヌクレオチドの蛍光形態は、従来の鎖終結配列における使用に関して公知であり、任意のそれらは開示されたプライマー伸長配列決定に適切である。蛍光またはハプテン化した（haptenated）鎖終結ヌクレオチドの好ましい形態は、フルオレセイン-N6-ddATP、ビオチン-N6-ddATP、フルオレセイン-12-ddATP、フルオレセイン-12-ddCTP、フルオレセイン-12-ddGTP、フルオレセイン-12-ddUTP、リサミン-5-ddGTP、エオシン-6-ddCTP、クマリン-ddUTP、テトラメチルモダミン（tetramethylmodamine）-6-ddUTP、テキサスレッド（Texas Red）-5-ddATp（全てNEN Life Sciencesから入手可能）を含む。
（b）変性プローブプライマー伸長配列決定
変性プローブプライマー伸長配列決定は、増幅された標的配列にハイブリダイズした識別プライマーへの変性プローブの連続的な付加を含む。複数のプローブの付加は、３末端の除去可能なブロッキング基の存在により妨げられる。変性プローブの付加の後、ブロッキング基を除去し、そしてさらに変性プローブが付加され得るか、または最終的な操作の際に識別プローブの末端の次のヌクレオチド（即ち、最後に付加された変性プローブ）が、単一のヌクレオチドプライマー伸長配列について記載されたように識別され、その同一性が決定される。除去可能な3'末端ブロックの任意の形態を有する変性プローブが、プライマー伸長配列決定手順において使用され得ることが企図される。除去可能なブロッキング基の好ましい形態は、本明細書中に記載されるようなケージ構造である。各場合において、特定のブロッキング構造の除去のための特異的な条件を、適切に使用する。増幅および変性プローブプライマー伸長配列決定の好ましい形態は、単分子セグメント増幅およびCAGE配列決定（USA-CAGESEQ）である。
ブロックされた変性プローブ（即ち、変性プローブプライマー伸長配列決定であり、そのCAGESEQは好ましい形態である）を使用するプライマー伸長配列決定が、一般的に以下のように実施され得る。ひとつまたはそれ以上の識別プローブおよび多数の変性プローブが、配列決定されるべきDNAサンプルと混合され、識別混合物が形成される。配列決定されるべき核酸が、本明細書中で開示される任意のローリングサークル複製技術を用いて増幅された核酸であることが好ましい。この場合、配列決定されるべき核酸が、開環プローブのギャップ充填連結により形成される増幅された形態の増幅標的サークルを形成することがさらに好ましい。変性プローブプライマー伸長配列決定について、変性プローブの全てのセットが、上記のように使用されることがまた好ましい。識別プローブは標的核酸にハイブリダイズするように設計され、その結果、配列決定されるべき標的核酸の領域は識別プローブの3'末端の過ぎたところに位置される。識別混合物は、配列決定されるべき核酸への識別プローブおよび変性プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートされる。変性プローブの一つのみが、識別プローブに隣接する核酸配列と完全なハイブリッドを形成する。完全なハイブリッドの形成に好ましいインキュベーション条件が選択されることが好ましい。一旦、識別および変性プローブがハイブリダイズされると、識別混合物は連結に供される。これは、識別プローブおよび変性プライマーを結合する。最終的に、連結された変性プローブの3'末端に存在するブロッキング基が除去される。感光性のケージされたオリゴヌクレオチドを使用する場合、ケージ構造は適切な光への曝露により除去される。これは、連結された変性プローブの末端を、別の変性プローブの連結またはプライマー伸長のいずれかに有用にする。これらのハイブリダイゼーション、連結およびブロック除去工程は、本明細書中で変性プローブ連結のラウンドと呼ばれる。さらなる変性プローブ連結のラウンドが、ブロッキング構造の除去に次いで実施され得る。一連のプライマー伸長配列決定アッセイが同一のサンプルを用いて実施され、ここでプライマー伸長の前に異なる回数の変性プローブ連結のラウンドが実施されることが好ましい。識別プローブのネストされたセットが、プライマー伸長配列決定アッセイのセットのようなセットにおいて使用されることもまた好ましい。このようなセットのアッセイの使用が実施例10において示される。一旦、変性プローブ連結の全てのラウンドが実施されると（従って、識別プライマーが形成される）、識別混合物はプライマー伸長に供される。これについて、少なくとも二つの別々に標識された鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼが識別混合物に添加される。これは、識別プライマーの末端への単一のヌクレオチドの付加を生じ、その同一性は識別されたヌクレオチド（即ち、識別プライマーの末端の後の最初の鋳型ヌクレオチド）の同一性に基づく。最終的に、各標的核酸に対する各識別プライマーについて組み込まれたヌクレオチドの同一性が、蛍光顕微鏡により決定される。この目的のために、組み込まれたヌクレオチドの検出の前に核酸が折り畳まれることが好ましい。
実施例10は、USA-CAGESEQの例を記載する（ここで、識別プライマーのネストされたセットが、増幅された核酸の配列において変性プライマーの連続的な付加により伸長される）。この実施例中に示されるプライマー伸長配列決定操作の原理は、異なる数のサンプルおよび識別プローブ、異なる配置のサンプル、ならびにブロッキング構造の異なる形態の使用に同様に適用され得る。一連のアッセイが、サンプルドットの配列上（実施例10に示す）、サンプルの配列（例えば、マイクロタイターディッシュ）、または個々の反応容器において実施され得ることが意図される。特に、マルチウェルディッシュ（例えば、マイクロタイターディッシュ）の使用は、同一のディッシュ上で複数の別々の反応が容易に自動化されることを可能にする。複数のウェルの使用はまた、各ウェル中でのサンプルおよび識別プローブの選択において完全な自由を許容する。例えば、５個の別々に処理されたスライド（実施例10のような）を使用してプライマー伸長配列決定を実施するよりも、プライマー伸長配列決定サンプルおよび成分はウェル中に任意の適切な順番で配置され得る。実施例10の成分を使用して、例えば、同一の核酸サンプルの５個のウェル配列の側の５個がウェルを使用され、ここで、所定のカラム中の各ウェルは同一の識別プローブを有する。ウェルの第１のカラムは第１の識別プローブを有し、ウェルの第２のカラムは、第２の識別プローブを有するなどである。実施例10のように、各ケージ除去工程の前にマスクが下に移動され、一つのさらなる列を覆う。この配列を使用して得られた生じた配列を、交差して読まれ、次いで下方へ読まれる。
上記のように、TS-DNAまたはTS-RNAの特異的な部分は、プライマー伸長配列決定操作を用いて配列決定され得る。同一のプライマー伸長配列決定手順が任意の核酸分子上で実施され得ることがまた理解されるはずである。例えば、遺伝子DNA、PCR産物ウイルスRNAまたはDNA、およびcDNAサンプルは全て、開示されたプライマー伸長配列決定手順を用いて配列決定され得る。この目的のために好ましいプライマー伸長配列決定手順は、CAGE配列決定である。この目的のために、識別プローブおよび変性プローブが、全てUSA-CAGESEQに関連して先に記載されるように、（TS-DNAまたはTS-RNAよりもむしろ）目的の核酸サンプルにハイブリダイズさせられ、連結され、鎖終結プライマー伸長に供される。
D．接近した関連標的配列間の識別
開環プローブ、ギャップオリゴヌクレオチド、およびギャップスペースは密接に関連する標的配列（例えば、遺伝の対立遺伝子）を識別するように設計され得る。密接に関連する標的配列が単一のDNAで異なる場合、開環プローブが、開環プローブの一方の末端、またはギャップオリゴヌクレオチドの一方の末端に存在するこのヌクレオチドの相補体を有して設計されることが好ましい。ギャップ充填連結が使用される場合、ヌクレオチドの識別がギャップスペースの反対側に現れることが好ましい。これは、別（すなわち、対立遺伝子）のギャップオリゴヌクレオチドを必要とすることなく、連結されたOCPへの別の配列の組み込みを可能にする。ギャップ充填連結が、部分的にギャップを充填するギャップオリゴヌクレオチドとともに使用される場合、ヌクレオチドの識別が、ギャップオリゴヌクレオチドにより充填されていないギャップスペースの部分の反対側に現れることが好ましい。ハイブリッドの不安定性および酵素識別の組合された効果のために、どちらかの終端でのミスマッチを伴うギャップオリゴヌクレオチドの連結は非常に好ましくない。TS-DNAが生成される場合、それは正しい連結を導くギャップオリゴヌクレオチド配列のコピーを有する。ギャップオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子の不安定な塩基対を含むような特定の状況において関連する標的配列間のより優れた識別を生じ得る。連結操作の標的依存性を増強する開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの特徴は、一般的に、連結鎖反応を伴う使用のために開発されたこのような特徴に類似する。これらの特徴は、LM-RCAにおける使用のために開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。特に、欧州特許出願第EP0439182号は、LM-RCAにおける使用に適合され得るLCRにおいて標的依存性を増大するためのいくつかの特徴を記載する。欧州特許出願EP0439182に記載されるようなギャップスペースにおける停止塩基の使用は、ギャップ充填連結操作の標的識別を増大する好ましい形態である。
標的配列識別の好ましい形態が、開環プローブの二つのタイプを使用することにより達成され得る。これら二つのOCPは、図２に示されるようにわずかな改変を有して基本的に設計される。一つの実施態様において、両方の標的配列に対して同一である単一のギャップオリゴヌクレオチド（即ち、ギャップオリゴヌクレオチドは両方の標的配列に相補的である）が使用される。好ましい実施態様において、ギャップ充填連結操作が使用され得る（実施例３）。標的配列の識別は、相互に排他的な連結事象または伸長連結事象により生じ、このために二つの開環プローブの一方だけで十分である。好ましくは、識別ヌクレオチドは、各開環プローブの3'末端の最後から２番目のヌクレオチドに配置される。二つの開環プローブもまた、別の検出プローブおよび／またはアドレスプローブと結合するように設計された二つの異なる検出タグを含む。二つの検出プローブの各々は、異なる検出標識を有する。開環プローブの両方は、同一のプライマー相補部分を有する。従って、連結された開環プローブの両方が、単一のプライマーを用いて増幅され得る。配列ハイブリダイゼーションの際に、各検出プローブは、別の標的配列に対応する独特のシグナル（例えば、二つの別の蛍光色）を生じる。
Ｅ．RCAの最適化
１．アッセイバックグランド
バックグランドシグナルの潜在的な供給源は、非標的指向化連結事象による環状分子の形成である。バックグランドシグナルに対するこのような事象の寄与は、以下のような５つの戦略を、単独でまたは組合せで使用して最小化され得る：
（ａ）耐熱性DNAリガーゼ（例えば、AMPLIGASE▲Ｒ▼（Kalinら、（1992））またはT.thermophilus DNAリガーゼ（Barany（1991））の使用は、連結が高い温度（50℃〜75℃）で起こるので、非標的指向化連結事象の頻度を最少化する。
（ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションの場合において、標的配列への開環プローブの連結は、大規模な洗浄を可能にする。この洗浄は、非配列指向連結によって形成され得るいかなる環も除去するが、一方、標的上で連結された環は位相幾何学的にトラップされるので除去することが不可能である（Nilssonら、（1994）。
（ｃ）一つ以上のギャップオリゴヌクレオチド、またはギャップオリゴヌクレオチドとギャップ充填DNA合成との組合せの使用は、連結事象におけるさらなる特異性を提供する。ギャップオリゴヌクレオチドの使用は、非標的指向化連結の可能性を大いに減少する。アドレスプローブの相補的部分が、高度に弁別的な様式で連結接合部を架橋する捕獲ハイブリダイゼーション工程に結合されるギャップオリゴヌクレオチド、またはギャップ充填連結操作の使用は、以下におよび図６に示すように特に好ましい。
ギャップオリゴヌクレオチドの相補体（11ヌクレオチド）
0003974941.tif 000008
アドレスプローブの相補的部分（ハイブリダイズされた15ヌクレオチド）中括弧（｛｝）は、ギャップオリゴヌクレオチド（または、充填された場合ギャップ領域）に相補的な配列を標識する。示されるTS-DNAは、配列番号10であり、そして示されるアドレスプローブ配列は、配列番号4である。この系は、任意の長さのギャップオリゴヌクレオチドを用いて使用され得る。標的配列にハイブリダイズされる開環プローブの末端間のギャップが、所望のアドレスプローブの長さより大きい場合、アドレスプローブは、ギャップ配列と開環プローブ配列間の接合部のちょうど一方に重なり合うように設計され得る。ギャップ領域の反対に識別ヌクレオチドを配置するように開環プローブを設計することによって、単一のOCPは、標的配列に依存する種々の配列を有する連結された開環プローブを生成するためにギャップ充填LM-RCAにおいて使用され得る。
捕獲工程は、連結接合部位での特異的配列相互作用を介するアドレスプローブへの増幅されたDNAのハイブリダイゼーションを含み、これは、先に示されたようにギャップオリゴヌクレオチドの相補体を含む。Guoら、（1994）は、適切なスペサーを使用してガラススライド上に共有結合した15-merオリゴヌクレオチドが、増幅されたDNAをかなり高い効率で捕獲するために使用され得ることを示してきた。この系は、アドレスプローブを使用して増幅された核酸を捕獲することによって、増幅された核酸（TS-DNAまたはTS-RNA）の検出に適用され得る。上記の例において、正しい連結事象から生成されたLM-RCA増幅DNAのみが、固体状態検出器上に捕獲される。
必要に応じて、固体表面に標的配列を含む核酸を結合するために捕獲プローブ（Syvanenら、Nucleic Acid Res., 14:5037（1986））として当該分野において公知である付加的な固定化試薬が使用され得る。適切な捕獲プローブはビオチン化オリゴヌクレオチド（Langerら、（1981））または末端ビオチン基を含む。固定化は、連結反応前にまたは後に行われ得る。固定化は、非連結開環プローブならびに非特異的に連結された環の除去を可能にするのに作用する。
（d）分子内連結を促進する連結条件を使用すること。条件は、２つのOCPの縦列直鎖状連結よりもOCPの環状連結がはるかに頻繁に生じる場合に、容易に見出される。例えば、連結操作が行われる温度が、標的配列にハイブリダイズする時に標的プローブ左側部分および標的プローブ右側部分の最も安定でない融解温度（Tm）に近い場合、環状連結は促進される。連結が最も低いTmを有する標的プローブ部分のTmの近くで行われる場合、標的プローブ部分は結合／解離平衡にある。平衡では、シス（すなわち、同じOCPの他の標的プローブ部分との）結合の可能性は、トランス（すなわち、異なったOCPとの）結合の可能性よりはるかに高い。可能な場合、連結操作に対して適切な温度に近い融解温度を有する標的プローブ部分が設計されることが好ましい。しかし、耐熱性リガーゼの使用は、広範な連結温度の使用を可能にし、これは標的配列の選択においてより大きな自由度を可能にする。
（e）ペプチド核酸は、DNAと非常に安定なハイブリッドを形成し、そしてPCR反応の特異的なブロッカーとして使用されてきた（Orumら、Nucleic Acid Res., 21:5332-5336（1993））。特殊なPNAプローブが、本明細書においてはPNAクランプとして呼ばれる、非正統に連結されている（すなわち標的の非存在下で連結されている）OCPのローリングサークル増幅をブロックするために使用され得る。連結の間に１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドを使用することによって、ギャップ充填連結を使用することによって、またはギャップオリゴヌクレオチドとギャップ充填連結との組合せを使用することによって、非正統に連結された環はギャップ配列を欠失し、そしてそれらは、OCPの3'末端および5'末端の非正統な連結から得られる配列に相補的なPNAクランプを用いてブロックされ得る。これは、以下の図において示され、ここでPNAクランプllllrrrrが、接合部上に正確に位置決めされる。
0003974941.tif 000009
この図において、「Ｌ」および「ｌ」は、OCPの標的プローブの左側部分におけるヌクレオチドおよびPNAクランプにおけるその相補体を示し、そして「Ｒ」および「ｒ」は、OCPの標的プローブの右側部分におけるヌクレオチドおよびPNAクランプにおけるその相補体を示す。PNAクランプについての最も好ましい長さは、８〜10ヌクレオチドである。PNAクランプは、標的プローブ部分のいずれかで４〜５塩基対しか形成し得ないので、非連結OCPにハイブリダイズし得ず、そしてPNAクランプはまた、ギャップ配列が存在するので正確に連結されたOCPとハブリダイズし得ない。しかし、PNAクランプは非正統に連結されたOCPとは強くハイブリダイズし、そしてDNAポリメラーゼはハイブリダイズされたPNA分子と置換し得ないのでローリングサークル反応の進行をブロックする。これは、非正統に連結されたOCPの増幅を妨げる。
２．過剰な非連結OCPの除去
ファージT7の遺伝子６エキソヌクレアーゼは、TS-DNAまたはLM-RCT転写産物に結合し、そして検出プローブへのハイブリダイゼーションを干渉する過剰な開環プローブおよび過剰なギャップオリゴヌクレオチドの除去のための有用な手段を提供する。このエキソヌクレアーゼは、２本鎖構造の5'末端を根幹としてDNAを消化する。それは、PCR増幅後に一本鎖DNAの生成のために首尾よく使用されてきた（Hollowayら、Nucleic Acids Res. 21:3905-3906（1993）;Nikiforovら、PCR Methods and Applications 3:285-291（1994））。LM-RCAアッセイにおいて、この酵素は、ローリングサークルDNAポリメラーゼと一緒に、連結後に添加され得る。TS-DNAを分解から保護するために、ローリングサークル複製プライマーは、5'末端に３つまたは４つのホスホロチオエート結合を含み得、そしてこの分子をエキソヌクレアーゼに対して抵抗性にする（Nikiforovら、（1994））。過剰な開環プローブ分子はローリングサークルDNA産物と結合するので、エキソヌクレアーゼは、過剰な開環プローブ分子を分解する。このヌクレーアゼの使用は、捕獲プローブの必要性ならびに過剰なプローブを除去するための洗浄の必要性を排除する。非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドがTS-DNAと二本鎖転写鋳型を形成するために必要とされるので、一般に、このようなヌクレーアゼ消化は、LM-RCTを行う場合、使用されるべきではない。このヌクレーアゼ消化は、ネスティングされたLM-RCAが行われるべき場合、非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドを除去する好ましい方法である。
実施例
実施例１：開環プローブの標的媒介性連結および連結開環プローブのローリングサークル複製。
１．開環プローブの連結
5'リン酸を有する直鎖状オリゴヌクレオチドは、相補的な標的配列の存在下においてリガーゼによって効率的に連結される。特に、図１に示すように標的配列にハイブリダイズされた開環プローブ、および図２に示すように標的配列にハイブリダイズされたギャップオリゴヌクレオチドを有する開環プローブは容易に連結される。このような連結の効率は、LM-RCAによって測定され得る。
以下は、開環プローブの標的依存性連結の実施例である：
DNA試料（標的試料）を、95℃で３分間熱変性し、そして50μl当たり１単位の濃度で（ａ）DNAリガーゼ（AMPLIGASE▲Ｒ▼, Epicentre Technologies）および（ｂ）以下の5'リン酸化オリゴヌクレオチドの存在下、20mM Tris-HCl（pH8.2）、25mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM NAD、0.05％ Triton X-100からなる緩衝液中の連結条件（60℃で45分）下でインキュベートした：
0003974941.tif 000010
これにより、標的配列への開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（標的試料に存在する場合）、およびハイブリダイズされた開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの連結を生じる。
２．ローリングサークル複製の速度の測定
（ａ）  大きい鋳型上：7kb一本鎖ファージM13環
任意のDNAポリメラーゼによって媒介される一本鎖M13環上でのオリゴヌクレオチドプライムローリングサークル複製の速度を、Blancoら、J. Biol. Chem. 264:8935-8940（1989）によって記載されるアッセイを使用することによって測定し得る。φ29 DNAポリメラーゼによるプライム合成の効率は、一本鎖DNA結合タンパク質のGene-32タンパク質の存在下で約３倍に刺激される。
（ｂ）  小さい鋳型上：110ヌクレオチド連結開環プローブ
110塩基の一本鎖小環上のオリゴヌクレオチドプライムローリングサークル複製の速度を、実施例２で一般に記載されるφ29 DNAポリメラーゼを使用して測定した。５分のインキュベーション後、DNA産物の大きさは、約16キロベースである。この大きさは、１秒当たり53ヌクレオチドの重合速度に相当する。FireおよびXu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4641-4645（1995）によって記載されるように、同様なアッセイを使用して他のDNAポリメラーゼを用いる合成速度を測定し得、そして最適化し得る。110ヌクレオチドの一本鎖環を、FireおよびXuの34ヌクレオチドに置換することが望ましい。
φ29 DNAポリメラーゼは、110ヌクレオチド環状鋳型上で速い速度の重合のφ29ローリングサークル反応を提供する。１秒当たり50ヌクレオチドの観察速度で、35分の重合反応は約105,000塩基のDNA産物を産生する。これは、元の110塩基鋳型の954倍の増幅をもたらす。FireおよびYu（1995）は、細菌性DNAポリメラーゼによって触媒されるローリングサークル反応が、34ヌクレオチドのみの極小環状鋳型上で起こり得ることを示している。FireおよびYuの結果に基づいて、ローリングサークル複製を、90ヌクレオチド未満の環を使用して行い得る。
実施例２：LM-RCA、続いて転写（LM-RCT）を使用して変異オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）遺伝子の検出。
本実施例は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Hataら、J. Biochem. 103:302-308（1988））のエキソン９の114位置での変異型（ＧからＣへ）を含むヒトDNAの検出を記載する。アッセイのためのヒトDNAを、標準的フェノール手順を使用するバフィーコートからの抽出によって調製する。
１．２つのDNA試料（各々400ng）を、97℃で４分間熱変性し、そして２つの5'リン酸化オリゴヌクレオチド、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの存在下の連結条件でインキュベートする。
0003974941.tif 000011
T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）は、10mM Tris-HCl（pH7.5）、0.20M NaCl、10mM MgCl2、2mM ATPからなる緩衝液中でμl当たり５単位の濃度で存在する。
開環プローブの濃度は80nMで、そしてギャップオリゴヌクレオチドの濃度は100nMである。総容量は40μlである。連結を37℃で25分間行う。
２．上記の各反応液から25μlを取り、50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、1mM DTT、各々400μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、0.2μMの濃度で18塩基のローリングサークル複製プライマー  5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６）を含む緩衝液と等量で混和する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng）を添加し、そして反応混合物を30℃で30分間インキュベートする。
３．上記溶液に補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris-HCl（pH8.2）、2mMスペルミジン、18mM MgCl2、5mM GMP、1mMのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Tween-20、μl当たりの２単位のT7 RNAポリメラーゼ、反応液を37℃で90分間インキュベートする。
４．上記反応液に、10分の１容量の5M NaClを添加し、そして得られる溶液を等容量のExpressHyb試薬（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）と混合する。ハイブリダイゼーションを、増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAACCTCCATCACTAGT-3'（配列番号７）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのオリゴヌクレオチド有する2.5mmドットを含むガラススライド（Guoら、（1994））の表面と接触させることによって行う。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された変異遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは特異的に結合する。スライド表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAACCTCGATCACTAGT-3'（配列番号８）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのオリゴヌクレオチドを含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された野生型遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合する。ガラススライドを、（Guoら、（1994））に記載されたように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC（0.36Mクエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間２×SSC中でインキュベートする。スライドを、２×SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して530nmで映し出す。
実施例３：ギャップ充填LM-RCTを使用して変異オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）遺伝子の検出
本実施例は、ギャップ充填LM-RCTを使用してオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Hataら、（1988））のエキソン９の114位置での変異型（ＧからＣへ）を含むヒトDNAの検出を記載する。アッセイのためのヒトDNAを、標準的フェノール手順を使用するバフィーコートからの抽出によって調製する。本実施例において、２つの異なった開環プローブを遺伝子の変異型および野生型を検出するために使用する。ギャップオリゴヌクレオチドを全く使用しない。
１．２つのDNA試料（各々400ng）を、97℃で４分間熱変性し、そして以下の5'リン酸化開環プローブの一つの存在下でインキュベートする。
0003974941.tif 000012
このプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、開環プローブの末端間で７ヌクレオチドのギャップ間隔がある。
0003974941.tif 000013
このプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、開環プローブの末端間で７ヌクレオチドのギャップ間隔がある。
OCP標的試料混合物の各々を、Abravayaら、（1995）によって記載される伸長−連結混合物においてインキュベートする。反応液は、40μlの容量で、50mM Tris-HCl（pH7.8）、25mM MgCl2、20mM酢酸カリウム、10μM NAD、80nM開環プローブ、40μM dATP、40μM dGTP、１単位のThermus flavus DNAポリメラーゼ（3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠失する；MBR, Milwaukee, WI）、および4000単位のThermus thermophilus DNAリガーゼ（Abbott laboratoies）を含む。反応液を、サーマルサイクラーで85℃で60秒間、60℃で50秒間インキュベートする。サーマルサイクリングを決して行わない。これにより、標的配列への開環プローブのハイブリダイゼーション（標的配列が存在する場合）、T.flavus DNAポリメラーゼによるギャップ間隔の充填、およびT.thermophilusリガーゼによる連結を生じる。上記の開環プローブにおける識別ヌクレオチドは、最後から２番目のヌクレオチドである。T.flavus DNAポリメラーゼは、T.thermophilusリガーゼの熱安定性に適合する反応液において使用される。
２．上記反応液の各々から25μlを取り、50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、１mM DTT、各々400μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、そして0.2μMの濃度で18塩基のオリゴヌクレオチドプライマー5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６）を含む緩衝液と等量で混合する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng）を添加し、そして反応混合物を30℃で30分間インキュベートして、φ29 DNAポリメラーゼによって触媒されるローリングサークル増幅を行う。Thermus flavus DNAポリメラーゼは、30℃ではほとんど活性を有しないので、ローリングサークル複製に有意に干渉しない。所望ならば、PCRに先んじてTaqDNAポリメラーゼをブロックするための抗体（Kelloggら、Biotechniques 16（6）:1134-1137（1994））に機能上類似する中和抗体を添加することによって、ローリングサークル複製に先んじて、Thermus flavus DNAポリメラーゼを失活し得る。
３．上記の溶液の各々に補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris-HCl（pH8.2）、２mMスペルミジン、18mM MgCl2、5mM GMP、1mMのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Tween-20、１μl当たり２単位のT7 RNAポリメラーゼ、反応液を37℃で90分間インキュベートする。
４．T7RNAポリメラーゼによって生成されたビオチン化RNAを含む各溶液に、10分の１容量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量のExpressHyb試薬（Clontech laboratories, Palo Alto, CA）と混合する。ハイブリダイゼーションを、増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAAATTCTCCTCCATCA-3'（配列番号13）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのアドレスプローブを有する2.5mmドットを含むガラススライド（Guoら、（1994））の表面と接触させることによって行う。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された変異遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは特異的に結合する。スライド表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAAATTCTCCTCGATCA-3'（配列番号14）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのアドレスプローブを含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された野生型遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合する。ガラススライドを、（Guoら、（1994））に記載されるように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC（0.36Mクエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中で蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを２×SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して530nmで映し出す。
実施例４：オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）mRNAの逆転写、続いてギャップ充填LM-RCTを使用する変異cDNA検出
本実施例は、逆転写によって生成されたcDNAを使用してオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Hataら、（1988））のエキソン９の114位置での変異型（ＧからＣへ）を含むヒトmRNAの検出を記載する。アッセイのためのRNAを肝生検からTRIzol（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）抽出によって調製した。
１．OTCエキソン９cDNAを以下のように生成する：
肝生検試料を、40単位のRNaseインヒビター（Boehringher Mannheim）を含む0.5ml反応チューブ中で-80℃で保管し、そして全RNAを、TRIzol試薬（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）を使用して凍結試料から抽出し、そして10μl水に溶解する。４μlの25mM MgCl2、２μlの400mM KCl、100mM Tris-HCl（pH8.3）、８μlの2.5mM dNTP混合物（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、１μlのMuLV逆転写酵素（50単位，Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）、１μlのMuLV逆転写酵素プライマー（5'-TGTCCACTTTCTGTTTTCTGCCTC-3'；配列番号15）、２μlの水、および１μlのRNaseインヒビター（20単位）を含む19μl反応混合液を調製する。反応混合液を、１μlのTrizol精製RNA溶液に添加し、そして42℃で20分間インキュベートし、cDNAを生成した。
２．工程１からの２つの20μlcDNA試料を98℃で４分間熱変性し、そして２つの5'リン酸化プローブの存在下の連結条件下でインキュベートする：
0003974941.tif 000014
T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）を、10mM Tris-HCl（pH7.5）、0.20M NaCl、10mM MgCl2、２mM ATPからなる緩衝液中で、１μl当たり５単位の濃度で添加する。開環プローブの濃度は80nMで、そしてギャップオリゴヌクレオチドの濃度は100nMである。総容量は40μlである。連結を37℃で25分間行う。
３．上記の各反応液から25μlを取り、50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、１mM DTT、各々200μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、0.2μMの濃度で18塩基のローリングサークル複製プライマー  5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６）を含む緩衝液と等量で混合する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng）を添加し、そして反応混合液を30℃で30分間インキュベートする。
４．上記の溶液に、補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris-HCl（pH8.2）、２mM スペルミジン、18mM MgCl2、5mM GMP、１mMのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μM ビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Tween-20、１μl当たり２単位のT7 RNAポリメラーゼ。反応液を37℃で90分間インキュベートする。
５．T7RNAポリメラーゼによって生成されたビオチン化RNAを含む各溶液に、10分の１量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量のExpressHyb試薬（Clontech laboratories, Palo Alto,CA）と混合する。ハイブリダイゼーションを、増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGATGGAGGAGAAT-3'（配列番号17）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのアドレスプローブを有する2.5mmドットを含むガラススライド（Guoら、（1994））の表面と接触させることによって行う。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された変異遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは特異的に結合する。スライド表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAGGAGAAt-3'（配列番号９）を有する、２×1011分子の共有結合された29-merのアドレスプローブを含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された野生型遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合する。ガラススライドを、（Guoら、（1994））に記載されるように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC（0.36M クエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中で蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを、２×SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して530nmで映し出す。
実施例５：ローリングサークル増幅に結合される複合イムノアッセイ
本実施例は、レポーター抗体を使用する異なった標的分子の複合検出の実施例を記載する。検出されるシグナルを、レポーター抗体の標的配列部分のローリングサークル増幅によって生成する。
１．３つの異なったモノクロナール抗体（それぞれは、異なった標的分子に対して特異的である）は、独特の識別タグ（標的配列）として作用する３つの異なった任意のDNA配列（Ａ、Ｂ、Ｃ）に結合する。本実施例において、３つの抗体はマレイミド修飾され、そしてβ−ガラクトシダーゼ、hTSH、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）に対して特異的である。Hendricksonら、（1995）によって記載されたようにSATA化学を使用して抗体をアミノ化DNAオリゴヌクレオチドに結合する。各オリゴヌクレオチドは、50オリゴヌクレオチドの長さである。得られたレポーター抗体を、レポーター抗体Ａ、Ｂ、Ｃと各々名付ける。
２．標的分子に特異的な抗体（レポーター抗体ではない）を以下のようにマイクロタイターディッシュ上に固定化する：重炭酸ナトリウム中（pH9）の３つの抗体の各々の６μg/mlを含む50μl混合液をマイクロタイターディッシュのウェルに加え、一夜でインキュベートし、そしてPBS-BLA（10mM リン酸ナトリウム（pH7.4）、150mM 塩化ナトリウム、２％ BSA、10％β−ラクトース、0.02％ アジドナトリウム）で洗浄して、非吸着部位をブロックする。
３．１つまたは３つの標的分子（hTSH、hCG、およびβ−ガラクトシダーゼ）の組合せを含む溶液の連続的希釈液をウェルに添加する。一部のウェルを１つの標的分子、２つの標的分子の混合物、または３つ全ての標的分子の混合物に曝す。１時間のインキュベーション後、Hendricksonら、（1995）によって記載されたようにウェルをTBS/Tween洗浄緩衝液で３回洗浄する。
４．３つのレポーター抗体の適切に希釈された混合物（A+B+C）の50μlを、マイクロタイターディッシュの各ウェルに添加する。プレートを37℃で１時間インキュベートし、次いでTBS/Tween緩衝液で４回洗浄する。
５．各ウェルに、３対の開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの混合物を添加する。各対は、レポーター抗体の３つの標的配列部分の１つに特異的である。本実施例において、開環プローブは、汎用プライマー相補部分を含む49塩基の同様のスペーサー領域を有し、そして各末端に種々の18ヌクレオチド標的プローブ部分を有する。開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの各コグネートの対を、レポーター抗体の標的配列部分における特異的標的配列（Ａ、Ｂ、またはＣ）にハイブリダイズするように設計する。特に、開環プローブＡ’は、8ヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチドＡ’に相補的な８塩基によって分けられるタグ配列Ａにおける２つの18塩基配列に相補的な左側および右側標的プローブ部分を有する。開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチド対Ｂ’およびＣ’についても同様である。各開環プローブの濃度は、80nMであり、各ギャップオリゴヌクレオチドの濃度は120nMである。
６．T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）を、（10mM Tris-HCl（pH7.5）、40mM酢酸カリウム、10mM MgCl2、2mM ATP）からなる反応緩衝液中に、１μlあたり５単位の濃度で各マイクロタイターウェルに添加する。各ウェルの総容量は40μlである。連結を37℃で45分間行う。
７．各マイクロタイターウェルに、dTTP、dATP、dGTP、dCTP（各400μM）、汎用18塩基オリゴヌクレオチドプライマー 5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６）（0.2μMの最終濃度で）、およびφ29 DNAポリメラーゼ（50μlあたり160ngで）を含む20μlの補正溶液を添加する。
８．インキュベーション後、各ウェルに補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris-HCl（pH8.2）、２mM スペルミジン、18mM MgCl2、5mM GMP、１mMのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μM ビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）0.03％ Tween-20、１μlあたりの２単位のT7 RNAポリメラーゼ。反応液を37℃で90分間インキュベートし、ビオチン化RNAを生成する。
９．各ウェルに10分の１容量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量のExpressHyb試薬（Clontech laboratories, Palo Alto,CA）と混合する。ハイブリダイゼーションを、増幅されたRNAの混合物をカバースリップ下で、共有結合された３つの異なった31-merのオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ）の2×1011分子の３つの分離ドットを含むガラススライド（Guoら、（1994））の表面と接触させることによって行う。各オリゴヌクレオチドの最後の16塩基が、タグ配列Ａ、Ｂ、またはＣから生成される可能性のある増幅RNAの各々の、８塩基ギャップ配列を中心とする特異的セグメント（４塩基＋８塩基＋４塩基）に相補的である。ハイブリダイゼーションを、37℃で90分間行う。このガラススライドを、（Guoら、（1994））に記載されたように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC（0.36M クエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中で蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを２×SSCで３回洗浄し、そしてタグ配列ＡまたはＢまたはＣのいずれかが増幅されたかを決定するために表面結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して530nmで映し出す。
実施例６：LM-RCAを使用するオルニチントランスカルボミラーゼ（OTC）および嚢胞性線維症（CF）標的配列のインサイチュ検出
１．DNA試料を以下のように調製する：
リンパ球の試料をPBS中で２回洗浄し、1500RPMで５分間の遠心によって細胞を収集した。細胞を、10mM PIPES、pH7.6、100mM NaCl、0.3M スクロース、3mM MgCl2、および0.5％ Triton X-100で再懸濁した。次いで、細胞を氷上で15分間インキュベートし、1700RPMで５分間遠心分離し、２×105核/mlで再懸濁した。1.0×105核の試料（0.5ml）を、Cytospin遠心機でスライド（500gで５分、設定＃85）上に遠心分離した。次いで、スライドを、PBSで３分間２回リンスし、2M NaCl、10mM PIPES pH6.8、10mM EDTA、0.5％ Triton X-100、0-05mM スペルミン、および0.125mM スペルミジン中で撹拌して６分間一回リンスした。次いでスライドを、10×PBSで１分間、５×PBSで１分間、２×PBSで１分間、１×PBSで２分間、10％エタノールで１分間、30％エタノールで１分間、70％エタノールで１分間、そして95％エタノールで１分間リンスした。最後に、スライドを風乾し、そして次いで70℃での２時間ベーキングによって固定した。
２．以下のDNA分子を使用した：
0003974941.tif 000015
３．試料スライド上のDNAを２×SSCで５分間スライドを洗浄し、変性緩衝液（２×SSC、70％ホルムアミド、pH7.2）中で１分間そして予め加熱した大きなCoplin瓶中で71℃で45秒間インキュベートすることによって変性した。スライドを氷冷70％エタノール中で３分間、90％エタノール中で２分間、そして100％エタノール中で３分間洗浄することによって直ぐに加熱を停止した。
４．LM-RCAを以下のように行った：
３つの独立した反応液において、OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、そして試料スライド上で標的配列に連結した。
ａ．OTCおよびCF連結操作：以下の混合液の42μlを、２つのスライドの各々に配置した。
９μl   10×連結緩衝液（Ampligase）
５μl   BSA、２mg/ml ストック
９μl   OTCギャップオリゴ（15μM）  [最終1500nM]
９μl   CFギャップオリゴ（10μM）  [最終1000nM]
３μl   OTC OCP、（６μM ストック）  [最終=200nMolar]
３μl   CF OCP、（６μM ストック）  [最終=200nMolar]
15μl   Ampligase（５U/μl）  [最終=0.833U/μl]
38μl   H2O
反応液を50℃で120分間インキュベートした。
ｂ．OTC連結操作：以下の混合液の42μlを、スライドに配置した。
６μl   10×連結緩衝液（Ampligase）
3.5μl  BSA、２mg/ml ストック
６μl   OTCギャップオリゴ（15μM）  [最終1500nM]
２μl   OTC OCP、（６μM ストック）  [最終=200nMolar]
10μl   Ampligase（５U/μl）  [最終=0.833U/μl]
33μl   H2O
反応液を50℃で120分間インキュベートした。
ｃ．CF連結操作：以下の混合液の42μlを、スライドに配置した。
6μl   10×連結緩衝液（Ampligase）
3.5μl  BSA、２mg/ml ストック
６μl   CFギャップオリゴ（10μM）  [最終1000nM]
２μl   CF OCP、（６μM ストック）  [最終=200nMolar]
10μl   Ampligase（５U/μl）  [最終：0.833U/μl]
33μl   H2O
反応液を50℃で120分間インキュベートした。
全てのスライドを、20％ホルムアミドを有する２×SSC中で42℃で５分間を２回洗浄し、そしてホルムアミドを除去するために20mM Tris、pH7.5、0.075M NaClで２分間洗浄し、そして50mM Tris、pH7.5、40mM KOAc、10mM MgCl2、10mM DTT、100μg/ml BSAで３分間洗浄した。
増幅操作を、24μlの以下の混合液を各スライド上に配置することによって行った。
18.0μl  H2O  [総容量=100μl/４スライド]
20.0μl  BSAを有する５×φ29緩衝液  BSAは200μg/ml
16.0μl  dNTP（Ａ、Ｇ、およびＣ、各々2.5mM）
5.0μl   dTTP（2.5mM）
15.0μl  BUdR（2.5mM）
7.0μl   ローリングサークル複製プライマー（10μM）
3.0μl   遺伝子32タンパク質（1.37μg/μl）（最終41μg/ml）
16.0μl  φ29DNAポリメラーゼ（1:6希釈、16μl=768ng）
反応液を37℃の乾燥器で20分間インキュベートした。
次いで、全てのスライドを、20％ホルムアミドを有する２×SSC中で25℃で４分間を２回洗浄し、次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて37℃で４分間２回洗浄した。
５．増幅操作において生成したTS-DNAを折り畳み、そして以下のように検出した：
２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の抗BUDR-マウスIgG（７μg/ml）の溶液の50μlを各スライド上に配置し、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートした。次いでスライドを、37℃で２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて５分間３回洗浄した。次に、FITC-アビジン（６μg/ml）の溶液の50μlを、各スライド上に配置し、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートした。次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて37℃で５分間３回洗浄し、次いで室温で２×SSC、0.1μg/ml DAPI（50ml中に26μl）を用いて2.6分間インキュベートした。次にスライドを、室温で１×SSC、0.01％Tweenを用いて10分間洗浄し、次いで24μl抗退色薬（antifade）で覆った。最後にスライドを、DAPI核蛍光および分散蛍光シグナルについてCCDカメラを有する顕微鏡で調べた。
実施例７：LM-RCA-CMCを用いる複数の標的配列の複合検出
本実施例は、各々が５つの基本色を用いて31の異なる色の組み合わせを生じるように設計された、31の異なるOCPおよびギャップオリゴヌクレオチド対を用いる複合検出を例示する。
１．サンプルを含むスライドを以下のように調製する：
ポリ-Ｌ-リジンで覆った顕微鏡用スライドを調製し、そしてSchenaらによって記載された方法を用いて、上記のようにアレイ機（arraying machine）を用いてDNAをスポットする。サンプルDNAの各スポットの大きさは2.5mmである。DNAを、Schenaらによって記載された方法を用いて上記のように変性する。
２．31の異なるOCPおよび31の異なるギャップオリゴヌクレオチドを含む、ギャップオリゴヌクレオチドと開環プローブとの混合物を、設計しそして調製する。OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドを、各OCPおよびギャッププローブの対が目的の特異的標的配列に相補的な配列を含んだ状態で、対として設計する。31の各OCPのスペーサー領域は、５つの可能な検出タグ（1t、2t、3t、4t、および5tと呼ぶ）の独特の別の組み合わせを含む。組み合わせは、以下に示すスキームに従って略号化する。対のセットを以下のように呼ぶ：
0003974941.tif 000016
３．LM-RCAを以下のように行う：
OCPとギャップオリゴヌクレオチドとを、50μlの以下の混合物と共にサンプルスライド上でハイブリダイズさせ、そして標的配列に連結する。
1.5μl  10×連結緩衝液（アンプリガーゼ）
8.8μl  BSA、２mg/mlストック
15μl   31のギャップオリゴヌクレオチドの混合物（各々の最終濃度400 nM）
５μl   31のOCPの混合物（各々の最終濃度=100 nモル）
25μl   アンプリガーゼ（５U/μl）
82μl   H2O
反応物を52℃で60分間インキュベートする。
スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄し、20 mM Tris（pH7.5）、0.075 M NaClで２分間洗浄してホルムアミドを除去し、そして50mM Tris（pH 7.5）、40mM KOAc、10mM MgCl2、10mM DTT、100μg/ml BSAで３分間洗浄する。
増幅操作は、24μlの以下の混合物を各スライドに置くことにより行う。
18.0μl  H2O（総量=各４スライドに付100μl）
20.0μl  ５×φ29 BSA緩衝液  BSAは200μg/ml
16.0μl  dNTP（Ａ，Ｇ，およびＣ、各2.5 mM）
5.0μl   dTTP（2.5 mM）
15.0μl  BUdR（2.5 mM）
7.0μl   ローリングサークル複製プライマー（10μM）
3.0μl   遺伝子32のタンパク質（1.37μg/ml）（最終濃度41μg/ml）
16.0μl  φ29 DNAポリメラーゼ（１：６希釈、16μl＝768 ng）
反応物を37℃のオーブンで15分間インキュベートする。
次いで、全てのスライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回洗浄した。
４．各々が異なる標識を有しそして各々が５つの検出タグの一つに相補的である、５つの折り畳み検出プローブを、４×SSCの溶液中でスライド上でTS-DNAにハイブリダイズさせる。検出プローブは以下のように検出タグに対応する：
0003974941.tif 000017
次いで、全てのスライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回洗浄し、そして次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で４分間２回洗浄した。
５．増幅操作において生じたTS-DNAを、以下のようにさらに折り畳み、そして検出する：
２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の50μlの抗BUDRマウスIgG（7μg/ml）の溶液を各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗浄する。次に、２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中のAvidin DN（6μg/ml）溶液50μlを、各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗浄し、２×SSC、0.1％Tweenで室温で５分間洗浄し、そして次いで24μlの抗退色剤で覆う。最後に、スライドを蛍光走査装置中で適切なフィルター（例えば、Schenaらによって記載されるもの）を用いて走査する。画像分析ソフトウエアを用いて、蛍光点のスペクトルサインを計数しそして分析する。
実施例８：LM-RCA-CMCを用いる複数の標的配列の複合検出
本実施例は、ギャップオリゴヌクレオチドの対が各OCPに結合した、15の異なるOCPおよび30の異なるギャップオリゴヌクレオチドを用いる複合検出を例示する。OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドは、６つの基本標識色を使用して30の異なる色の組み合わせを生じるように設計される。
１．サンプルを含むスライドを以下のように調製する：
ポリ-Ｌ-リジンでコートした顕微鏡用スライドを調製し、そしてSchenaらによって記載された方法を用いて、上記のようにアレイ機を用いてDNAをスポットする。サンプルDNAの各スポットの大きさは2.5mmである。DNAを、Schenaらによって記載された方法を用いて上記のように変性する。
２．15の異なるOCPおよび30の異なるギャップオリゴヌクレオチドを含む、ギャップオリゴヌクレオチドと開環プローブとの混合物を、設計しそして調製する。OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドを、各OCPおよびギャッププローブの対が目的の特異的標的配列に相補的な配列を含んだ状態で、対として設計する。15の各OCPのスペーサー領域は、４つの可能な検出タグ（1t、2t、3t、および4tと呼ぶ）の独特の別の組み合わせを含む。さらなる検出タグを、OCPをギャップオリゴヌクレオチドに連結することにより生成する。これらは、ギャップオリゴヌクレオチドの対のいずれが所定のOCPに連結するかに依存して、２つの異なる検出タグを形成する。この組み合わせを、以下に示すスキームに従って略号化する。対のセットを以下のように呼ぶ：
0003974941.tif 000018
３．LM-RCAを以下のように行う：
OCPとギャップオリゴヌクレオチドとを、50μlの以下の混合物と共にサンプルスライド上でハイブリダイズさせ、そして標的配列に連結する。
1.5μl  10×連結緩衝液（アンプリガーゼ）
8.8μl  BSA、２mg/mlストック
15μl   30のギャップオリゴヌクレオチドの混合物（各々の最終濃度400 nM）
５μl   15のOCPの混合物（各々の最終濃度＝100 nモル）
25μl   アンプリガーゼ（５U/μl）
82μl   H2O
反応物を、52℃で60分間インキュベートする。
スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄し、20 mM Tris（pH 7.5）、0.075 M NaClで２分間洗浄してホルムアミドを除去し、そして50 mM Tris（pH 7.5）、40 mM KOAc、10 mM MgCl2、10 mM DTT、l00μg/ml BSAで３分間洗浄する。
増幅操作は、24μlの以下の混合物を各スライドに置くことにより行う。
18.0μl  H2O（総量＝各４スライドに付100μl）
20.0μl  ５×φ29 BSA緩衝液  BSAは200μg/ml
16.0μl  dNTP（Ａ，Ｇ，およびＣ、各2.5 mM）
5.0μl   dTTP（2.5 mM）
15.0μl  BUdR（2.5 mM）
7.0μl   ローリングサークル複製プライマー（10μM）
3.0μl   遺伝子32のタンパク質（1.37μg/ml）（最終濃度41μg/ml）
16.0μl  φ29 DNAポリメラーゼ（１：６希釈、16μl＝768 ng）
反応物を37℃のオーブンで15分間インキュベートする。
次いで、全てのスライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回洗浄した。
４．４つの折り畳み検出プローブ（各々が異なる標識を有し、かつ各々が４つの検出タグ（1t、2t、3t、および4t）の１つに相補的である）を、30の折り畳み検出プローブ（各々が２つの標識のうちの１つを有し、かつ各々がOCPとギャップオリゴヌクレオチドとの連結によって形成された検出タグの一つに相補的である）と共に、４×SSCの溶液中、スライド上で、TS-DNAにハイブリダイズさせる。検出プローブは以下のように検出タグに対応する：
0003974941.tif 000019
次いで、全てのスライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回洗浄し、そして次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で４分間２回洗浄した。
５．増幅操作において生じたTS-DNAを、以下のようにさらに折り畳み、そして検出する：
２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の50μlの抗BUDRマウスIgG（7μg/ml）の溶液を各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗浄する。次に、２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中のAvidin DN（6μg/ml）の溶液50μlを、各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。次いでスライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗浄し、２×SSC、0.1％Tweenで室温で５分間洗浄し、そして次いで24μlの抗退色剤で覆う。最後に、スライドを蛍光走査装置中で適切なフィルター（例えば、Schenaらによって記載されるもの）を用いて走査する。画像分析ソフトウエアを用いて、蛍光点のスペクトルサインを計数しそして分析する。
実施例９：単分子（unimolecular）セグメントの増幅および配列決定
本実施例は、単分子セグメントの増幅（すなわち、ローリングサークル増幅）、それに続く一つのヌクレオチドプライマー伸長配列決定を例示する。本実施例において、OCPを、既知の配列変異の領域においてギャップを残すために、標的核酸にハイブリダイズする。ギャップ充填連結を用いる増幅標的サークルの形成、および増幅標的サークルのローリングサークル増幅の後、増幅されたDNAを、独特に標識された鎖終結ヌクレオチドを用いる鎖終結プライマー伸長配列決定に供する。取り込まれた標識の検出により、目的のヌクレオチドが同定される。
嚢胞性線維症膜透過レギュレーターG542X変異座とハイブリダイズするように設計された開環プローブを、変異塩基を含む４塩基のギャップを残すために、設計する。ギャップを、ギャップ充填連結操作でDNAポリメラーゼにより満たし、それにより、標的嚢胞性線維症膜透過レギュレーターG542Xに存在する全ての配列を取り込む。
５’-リン酸化OCP（82塩基）の配列は以下である：
GAACTATATTGTCTTTCTCTGTTTTCTTGCATGGTCACACGTCGTTCTAGTACGCTTCTAACTTAGTGTGATTCCACCTTCT  （配列番号20のヌクレオチド１〜82）
このプローブの下線を引いた端は、以下に示されるような標的ヒトDNAとハイブリダイズする（標的配列を逆に示す、３’〜５’）：
0003974941.tif 000020
標的DNAは配列番号21である。左標的プローブは、配列番号20のヌクレオチド65〜82である。右標的プローブは、配列番号20のヌクレオチド１〜21である。標的DNAのギャップと逆方向の領域は、ｇ（野生型）またはｔ（変異型）のいずれかであるヌクレオチドを含む。識別された（interrogated）（すなわち、配列決定された）のは、このヌクレオチドの位置である。
１．結合DNAサンプルを含む顕微鏡用スライドを、Schenaらによって記載されたように調製する。
２．150nモルの開環プローブ、アンプリガーゼDNAリガーゼ、およびThermus flavus DNAポリメラーゼの存在下で、ギャップ充填連結を、上記のように（一般に、Abravayaら,Nucleic Acid Research 23：675-682（1995）に記載された条件を用いて）、ギャップが満たされそして迅速に連結されるように、dATPおよびcCTPの存在下で行う。反応を、22×40mmのカバーグラスで覆ったスライドを用いて（28μlの容量で）行い、そして58℃で１時間インキュベートする。充填反応により、塩基配列CCAAが野生型に、または配列CAAAが変異遺伝子に、それぞれ付加される。
３．スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄する。
４．スライドを、20mM Tris（pH 7.5）、0.075 M NaClで２分間洗浄する。
５．ローリングサークル複製を、30℃で15分間、以下の成分を含む緩衝液中でインサイチュで行う：50 mM Tris-HCl（pH7.5）、10 mM MgCl2、１mM DTT、それぞれ400μMのdCTP、dATP、およびdGTP、95μMのdTTP、380M BUDRトリホスフェート（SIGMA）、0.7μMの濃度の18ヌクレオチドのローリングサークル複製プライマー、ACGACGTGTGACCATGCA（配列番号22）、1000 nモルの濃度のT4ファージ遺伝子32タンパク質、および200 nMのφ29DNAポリメラーゼ。この反応で、遺伝子配列の忠実な複写を含む約400コピーのTS-DNAが生じる。
６．２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で５分間２回洗浄する。
７．スライドを、識別ヌクレオチドに隣接したTS-DNA（以下に太字のＮで示す）とハイブリダイズするように設計された20ヌクレオチドの識別プライマー、TAGTGTGATTCCACCTTCTC（配列番号20のヌクレオチド64〜83）とインキュベートする：
0003974941.tif 000021
このTS-DNAは配列番号22である。スライドを以下の条件で37℃で10分間インキュベートする：
25μlの50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、20 mM MgCl2、50 mM NaCl、５mM DTT、50μg/mlウシ血清アルブミン（Life Science, Inc.の分子生物学等級）、50μM蛍光ddATP、蛍光ddCTP、蛍光ddGTP、および蛍光ddTTP中の４ユニットのSequenaseDNAポリメラーゼ（Amersham-USB）。４つの蛍光ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、それぞれ異なる放出スペクトルを有し、そして標準的なDNA配列決定キット（Applied Biosystems, Inc.）から得られ得る。
配列DNAポリメラーゼは、たった一つのddNTPを取り込み、取り込まれたddNTPは識別ヌクレオチドに相補的である。これを以下に例示するが、ここで、識別ヌクレオチドがＴ（変異体型）である場合は、蛍光ddATPが取り込まれる：
0003974941.tif 000022
伸長プライマーは、配列番号20のヌクレオチド64〜84である。識別ヌクレオチドがＧ（野生型）である場合は、蛍光ddCTPが取り込まれる。
８．２×SSC中で25℃で５分間洗浄する。
９．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で４分間洗浄する。
10．50μl（カバーグラス下で）中で、２×SSC、2.8％BSA、およびO.12％ Tween-20中で、５μg/mlのビオチン化抗BUDR-マウスIgG（Zymed Labs）を用いて37℃で30分間インキュベートする。
11．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。
12．50μl（カバーグラス下で）中で、２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、５μg/mlのFITC-アビジンを用いて、37℃で30分間インキュベートする。
13．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。
14．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、室温で５分間洗浄する。
15．スライドの像を、適切なフィルターセットを備えた顕微鏡-CCDカメラシステムを用いて捕獲する。各TS-DNA（各々が複数の伸長プライマーを有する）はスライドの小さな領域を占める。取り込まれた蛍光ヌクレオチドは、各TS-DNAについて個々の蛍光点を生じる。蛍光放出色により、各蛍光点において特定の伸長位置に取り込まれたヌクレオチドが規定される。従って、野生型および変異配列の混合物を含むサンプルでは、各々の存在は、蛍光ddATP（変異型を示す）の蛍光放出色を有する蛍光点および蛍光ddCTP（野生型を示す）の蛍光放出色を有する蛍光点の存在により示される。点は、その折り畳みのために各TS-DNAによって占められた小さい領域により、明確でありそして識別され得る。
異種および同種サンプルについて予想された結果を、図16に示す。大きい環はスライド上の標的サンプル点に相当する。小さい環は、プライマー伸長配列決定に供されたサンプル中の標的核酸の位置でインサイチュで増幅された、個々のTS-DNA分子に相当する。実際のアッセイにおいて、一つのサンプル点中に個々に検出可能な数百または数千のTS-DNA分子が存在し、そして折り畳んだTS-DNAによって占められた領域はかなり小さい。より少ないおよびより大きいTS-DNAの点を、例示を明快にするために図16に示す。取り込まれたヌクレオチドは、その蛍光スペクトルにより同定され、そしてTS-DNAにおいて識別された位置に存在するヌクレオチドに基づく。図16Ａは、野生型配列（システインの取り込みにより示される）について同種であるサンプルの例である。サンプル中の全ての細胞は（従ってサンプル中の標的核酸のほとんどは）、サンプル中の全てのTS-DNA分子について取り込まれた同じヌクレオチドをもたらす同じ配列を有する。図16Ｂは、野生型および変異体（システインおよびアデニンの取り込みをもたらす等数のTS-DBNA分子により示される）についての異種のサンプルの例である。サンプル中の全ての細胞は（従ってサンプル中の標的核酸のほとんどは）、両方の配列（野生型および変異型で）の一つのコピーを有し、これにより２つの異なるヌクレオチドの取り込みが生じる；それぞれサンプル中のTS-DNA分子の半分。図16Ｃは、同種であるが体細胞変異を有する少数の細胞を含むサンプルの代表例である。サンプル中の細胞のほとんどは（従ってサンプル中の全ての標的核酸は）、同じ配列（野生型）、そしてごく少数の変異配列を有する。これは、ほとんどのTS-DNA分子について一つのヌクレオチドの取り込み、および少数のTS-DNA分子について異なるヌクレオチドの取り込みをもたらす。所定のヌクレオチドが取り込まれているTS-DNA分子の数の比は、サンプル中の対応する標的核酸の比の正確な基準である。体細胞変異のこのような感度の高い検出は、例えば、ほとんどが正常または感染されていない細胞であるサンプル中の少数のガン細胞または少数のウイルス感染細胞の検出に特に有用である。
実施例10：単分子セグメント増幅およびCAGE配列決定
本実施例は、単分子セグメント増幅（すなわち、ローリングサークル増幅）、それに続くケージしたオリゴヌクレオチドを用いる縮重プローブプライマー伸長配列決定を例示する。本実施例において、OCPを、既知の配列変化の領域にギャップを残すために、標的核酸にハイブリダイズさせる。ギャップ充填連結を用いる増幅標的環の形成、および増幅標的環のローリングサークル増幅後、識別プローブを増幅されたDNAにハイブリダイズさせる。次いで、縮重プローブを識別プローブに連結することにより識別プライマーを形成する。次いで、独特に標識された鎖終結ヌクレオチドを用いて、識別プライマーを、鎖終結プライマー伸長配列決定において伸長する。本実施例は、縮重プローブの整列された固体状態サンプルのハイブリダイズされた識別プローブへの連続的な付加の使用を例示する。取り込まれた標識の検出により、目的の領域においてヌクレオチド配列が同定される。
開環プローブ（OCP.96）の５'-リン酸を有する96塩基を、GT反復多型座にハイブリダイズするために設計する。プローブを、GT反復領域において標的DNAにハイブリダイズしたときにギャップを残すように設計する。ギャップ充填連結操作においてDNAポリメラーゼによってギャップを満たし、これにより全GT反復多型領域を連結されたOCPに取り込む。
OCP（96塩基）の配列は以下の通りである：
ATCTAGCTATGTACGTACGTGAACTTTTCTTGCATGGTCACACGTCGTTCTAGTACGCTTCTAACTTTTAACATATCTCGACATCTAACGATCGAT（配列番号25のヌクレオチド１〜96）
このプローブの下線を引いた端は、図17に示されるように標的DNAにハイブリダイズする。図17において、ギャップスペースは、「充填配列」として示される。図17Ａは、OCPのCAの10反復を有する標的DNAへのハイブリダイゼーションを示す。図17Ｂは、OCPの、CAの９反復を有する標的DNAへのハイブリダイゼーションを示す。示されるように、USA-CAGESEQは、DNAの高度な反復領域においてヌクレオチド配列を決定する有用かつ正確な方法である。
１．それぞれ変性DNAサンプルに結合した、それぞれ少なくとも一つの縦に配置された５つのカラムを含む５枚の顕微鏡用スライドを、Schenaらによって記載されたように調製する。各スライドは、各カラムのサンプル点の数が５である限り、１〜100の規則的に空間のあるDNAサンプルのカラムを含み得る。このスライドは、同一（または、少なくともDNAサンプルの同一の対を有する）でなければならない。結合DNAサンプルの配列のスライドの例を図18Ａに示す。各カラムの５つのサンプル点は同一（すなわち、これらは同じDNAサンプル由来）である。サンプル点の各カラムは、好ましくは異なるサンプルから作製される。
２ａ．スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、0.3M NaCl、0.5mM EDTA、および150nM OCP.96オリゴ中で、48℃で１時間インキュベートして、OCPのハイブリダイゼーションを達成する。次いで、スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM M KCl、および0.05％ Triton X-100中で２分間洗浄する。
２ｂ．アンプリガーゼDNAリガーゼおよびThermus flavus DNAポリメラーゼの存在下で、上記の条件（一般にAbravayaらによって記載された条件を用いて）を用いて、ギャップが満たされかつ迅速に連結されるように、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの存在下で、ギャップ充填連結を行う。22×44mmのカバーグラスで覆われたスライド（28μlの量）を用いて、54℃で45分間インキュベーションを行う。
３．スライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄する。
４．スライドを20mM Tris（pH7.5）、0.075M NaClで２分間洗浄する。
５．ローリングサークル増幅を、以下の成分を含む緩衝液中で、インサイチュで30℃、15分間行う：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、lmM DTT、それぞれ400μMのdCTP、dATP、dGTP、およびdTTP、95μMのdTTP、360μM BUDRトリホスフェート（SIGMA）、700nMの濃度の、18ヌクレオチドローリングサークル複製プライマー、ACGACGTGTGACCATGCA（配列番号22）、1000nモルの濃度のT4ファージ遺伝子32タンパク質、および200nMのφ29 DNAポリメラーゼ。この反応で、約400コピーの標的DNAの忠実なコピーを含むTS-DNAが生じる。
６．２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で５分間２回洗浄する。
７ａ．一つのスライド（スライド番号１）を、２×SSCおよび300nモルの最初の20ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ１）、TCTCGACATCTAACGATCGA（配列番号25のヌクレオチド76〜95、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュベートする。
７ｂ．別のスライド（スライド番号２）を、２×SSCおよび300nモルの第２の20ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ２）、CTCGACATCTAACGATCGAT（配列番号25のヌクレオチド77〜96、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュベートする。
７ｃ．別のスライド（スライド番号３）を、２×SSCおよび300nモルの第３の20ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ３）、TCGACATCTAACGATCGATC（配列番号25のヌクレオチド78〜97、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュベートする。
７ｄ．別のスライド（スライド番号４）を、２×SSCおよび300nモルの第４の20ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ４）、CGACATCTAACGATCGATCC（配列番号25のヌクレオチド79〜98、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュベートする。
７ｅ．別のスライド（スライド番号５）を、２×SSCおよび300nモルの第５の20ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ５）、GACATCTAACGATCGATCCT（配列番号25のヌクレオチド80〜99、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュベートする。
５つの識別プローブは、上記のようにネストされた対を構成する。これらと増幅されたTS-DNAとの関係を以下に示す：
0003974941.tif 000023
プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97であり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列番号25のヌクレオチド80〜99であり、そしてTS-DNAは（３'〜５'を示す）配列番号19のヌクレオチド19〜60である。
８．スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、150mM M KCl、および0.05％Triton X-100中で２分間洗浄する。
９．次いで、スライドを、５回の連続した縮重プローブ連結に供する。各回は、以下の工程を含む：
（a）５枚のスライドを、以下の成分を含む連結反応混合物と共にインキュベートする：
（i）ペンタマー縮重プローブの全ての対（すなわち、1,024の可能なペンタマー配列の全てを示すオリゴヌクレオチドの混合物）（各縮重プローブは40nモルの濃度で）、ここで各縮重プローブは、５'リン酸および３'末端（すなわち、３'末端一ブロック）で修飾されたヌクレオチドを有する。本実施例において、修飾ヌクレオチドは、以下の形態でケージしたヌクレオチドである：
２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）アデノシン
２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）グアノシン
２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）チミジン
２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）シトシン
これらのヌクレオチドは、Metzkerら、Nucleic Acids Research 22:4259-4267（1994）に記載されている。修飾塩基は３'水酸基を保護（すなわち、ブロック）し、そして縮重プローブがDNAポリメラーゼ伸長またはDNA連結に関与するのを不可能にする。
（ii）適切なDNAリガーゼ、好ましくはT4ファージDNAリガーゼ。
連結を、μl当たり８ユニットの濃度で、10mM Tris-HCl（pH7.5）、0.18M NaCl、12mM MgCl2、2mM ATP、および10％ポリエチレングリコールからなる緩衝液中で、T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）を用いて行う。総量は25μlである。連結は、32℃で40分間行う。
（b）プライマー伸長反応を、25μlで37℃で５分間、カバーグラスの下で、５ユニットのSequenaseDNAポリメラーゼ（Amersham-USB）、50mM Tris-HCl（pH7.5）、20mM MgCl2、50mM NaCl、５mM DTT、50μg/mlウシ血清アルブミン（Life Sciences,Incの分子生物学等級）、50M ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTPの存在下で、行う。この反応は、連結事象に関与できなかった全てのプライマーの３'末端をブロックする。スライドを、25℃で２×SSCで５分間洗浄して、連結されていない任意の縮重プローブを除去する。
これらの工程の後に、全ての識別プローブを縮重プローブに連結する。縮重プローブ連結の第１回目において、全てのスライドで、不明瞭な「マスク」がDNAのサンプル点の第１の列を覆っている（図18Ｂを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラムの第１のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、列１（照射されない）を除く全てのサンプル列の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。
縮重プローブ連結の第２回目のために、工程（a）および（b）を繰り返す。縮重プローブは、第１の列のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末端にケージ構造が残っているので、２列から５列のDNAサンプル点にのみ連結され得る。これらの工程の後に、２列から５列の識別プローブを２つの縮重プローブに連結する。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサンプル点の第１列および第２列を覆う（図18Ｃを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラムの第１および第２のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、列１および２（照射されない）を除く全てのサンプル列の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。
縮重プローブ連結の第３回目のために、工程（a）および（b）を繰り返す。縮重プローブは、第１列および第２列のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末端にケージ構造が残っているので、列３から５のDNAサンプル点にのみ連結され得る。これらの工程の後に、列３から５の識別プローブを、３つの縮重プローブに連結する。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサンプル点の列１、２、および３を覆う（図18Ｄを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラムの第１、第２、および第３のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、第４および第５のサンプル列の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。サンプル列１、２および３は照射されないので、ケージ構造は、これらのサンプル列中の縮重プローブから除去されない。
縮重プローブ連結の第４回目のために、工程（a）および（b）を繰り返す。縮重プローブは、列１、２、および３のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末端にケージ構造が残っているので、第４列および第５列のDNAサンプル点にのみ連結され得る。これらの工程の後に、第４列および第５列の識別プローブを４つの縮重プローブに連結する。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサンプル点の列１、２、３、および４を覆う（図18Ｅを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラムの第１、第２、第３、および第４のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、第５のサンプル列中の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。サンプル列１、２、３および４は照射されないので、ケージ構造は、これらのサンプル列中の縮重プローブから除去されない。
縮重プローブ連結の第５回目のために、工程（a）および（b）を繰り返す。縮重プローブは、列１、２、３、および４のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末端にケージ構造が残っているので、第５列のDNAサンプル点にのみ連結され得る。これらの工程の後に、第５列の識別プローブを５つの縮重プローブに連結する。次いで、スライドを、マスクなしでUV光に４分間曝して、全てのサンプル列の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。これは、連結されたプローブの全て（これらはこの時点で、識別プライマーであると考えられる）が、鎖終結プライマー伸長のための準備が整った状態のままにする。
図21Ａ、21Ｂ、23Ａ、および23Ｂは、上記の縮重プローブ連結の結果を表す。縮重プローブの識別プローブへの連結により形成された識別プライマー（上、列の標識に続くより短い配列）は、５つの各スライドの一つのカラムにおける５つのサンプル点全てについて、TS-DNA（各識別プライマーの下のより長い配列）にハイブリダイズしたことを示す。各スライドにおいて、成功した各列には一つの付加的縮重プローブが加えられていた。このプローブは、縮重プローブ連結の各回の間に、サンプル点の一つの付加的な列が首尾よく覆われたことの結果である。識別プライマーの下線のない部分は、識別プローブを表す。識別プライマーの下線部は、識別プローブの末端に連結した縮重プローブを表す。５枚のスライドの各セットで全ての識別プライマーを注意深く試験することによって、各末端が、TS-DNAの異なるヌクレオチドに隣接することが示される。これにより、ヌクレオチドの全長が別々に識別（すなわち、配列決定）されるのが可能になる。図21Ａおよび21Ｂは、通常の標的配列（すなわち、CAの10反復を有する）での結果を示す。図23Ａおよび23Ｂは、変異標的配列（すなわち、CAの９反復のみを有する）での結果を示す。
10．次いで、スライドを、25μlの量中、カバーグラス下で、以下の存在下で37℃で５分間行われる、鎖終結プライマー伸長に供する：５ユニットのSequenase DNAポリメラーゼ（Amersham USB）、50mM Tris-Cl（pH7.5）、20mM MgCl2、50mM NaCl、５mM DTT、50μg/mlウシ血清アルブミン（Life Sciences, Inc.の分子生物学等級）、50μMの蛍光ddATP、50μMの蛍光ddCTP、50μMの蛍光ddGTP、および50μMの蛍光ddTTP（各蛍光dNTPは、異なる放出スペクトルを伴うシグナルを生じ得る（Applied Biosystems, Inc.配列決定キット））。この反応において、一つの蛍光ヌクレオチドが各識別プライマーの末端に付加される。付加されたヌクレオチドの同一性は、テンプレートヌクレオチド（識別プライマーに隣接したヌクレオチド）の同一性に基づく。
11．２×SSC中で25℃で５分間洗浄する。
12．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で４分間洗浄する。
13．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、５μg/mlのビオチン化抗BUDR-マウスIgG（Zymed Labs）を用いて、50μl（カバーグラス下で）中で37℃で30分間インキュベートする。この反応は、スライド上でTS-DNA分子を小型の構造に折り畳む。
14．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間、３回洗浄する。
15．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、５μg/mlのFITC-アビジンを用いて、50μl（カバーグラス下で）中で37℃で30分間インキュベートする。これは各TS-DNA分子をフルオセインで標識する。
16．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。
17．２×SSC、0.01％ Tween-20中で、室温で５分間洗浄する。
18．各スライドの像を、適切なフィルターセットを備えた顕微鏡-CCDカメラシステムを用いて捕獲する。各蛍光ヌクレオチドの蛍光放出色により、各蛍光点における特定の伸長位置のヌクレオチドが定義される。各点は、一つのTN-DNAの分子に対応する。図22Ａ、22Ｂ、24Ａ、および24Ｂは、鎖終結プライマー伸長の結果を示す。この時点で、末端に付加された蛍光ヌクレオチド（太字）を有する識別プライマーは、５枚の各スライドの一つのカラムにおける５つのサンプル点の全てについて、TS-DNAにハイブリダイズすることを示す。各スライドにおいて、TS-DNAにおけるヌクレオチドのストレッチにおける異なるヌクレオチドを、鎖終結蛍光ヌクレオチドの取り込みのためのテンプレートとして用いる。従って、このストレッチにおける各ヌクレオチドが、別々に識別（すなわち、配列決定）される。図22Ａおよび22Ｂは、通常の標的配列（すなわち、CAの10反復を有する）での結果を示す。図24Ａおよび24Ｂは、変異標的配列（すなわち、CAの９反復のみを有する）での結果を示す。
19．配列を、各関連するサンプル点で取り込まれたヌクレオチドを順番に読むことにより５枚のスライドの全てから得られた蛍光点のデータから、組み立てる。図19および21は、５枚の各スライドの対応するカラムにおける各サンプル点についての取り込まれたヌクレオチドの概略を示す。図19は、通常の標的配列（すなわち、CAの10反復を有する）での結果を示す。図20は、変異標的配列（すなわち、CAの９反復のみを有する）での結果を示す。ヌクレオチドを、最初は、各スライドからの所定のカラムの第１のサンプル点から順番（すなわち、スライド１の列１のサンプル点、スライド２の列１のサンプル点、スライド３の列１のサンプル点、スライド４の列１のサンプル点、スライド５の列１のサンプル点）に読む。次のヌクレオチドを、各スライドからのカラムにおける第２のサンプル点から順番（すなわち、スライド１〜５の順番で列２における第２のサンプル点）に読む。ヌクレオチドの解読を、同じ様式で順番に列３、４、および５のサンプル点について続ける。サンプル点の関係は、この読む順番を導き、図22Ａ、22Ｂ、24Ａ、および24Ｂにおいて識別されたヌクレオチドの関係を注意深く試験することで見られ得る。図19に示すスライドから読まれた配列は、GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAATC（配列番号25のヌクレオチド105〜125）である。図20に示すスライドから読まれた配列は、GTGTGTGTGTGTGTGTGTCAATCTG（配列番号18のヌクレオチド30〜50）である。これら２つの配列の間のGT反復の数の差異は、容易に明らかである。
実施例11：ローリングサークル増幅に結合したヒトTSHについてのイムノアッセイ
本実施例は、捕獲抗体、およびレポーター抗体を用いる、ヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）の単一分子検出を記載する。レポーター抗体は、図29Ａに例示された形であり、ここで抗体はローリングサークル複製プライマーに結合する。検出されるシグナルを、レポーター抗体のローリングサークル複製プライマー部分によってプライムされるローリングサークル増幅により生成する。
１．Hendricksonらによって記載されたようなSATA化学を用いて、マレイミド修飾したhTSHに特異的なモノクローナル抗体を、28塩基オリゴヌクレオチドの５'末端５'-[アミノ]-TTTTTTTTTTGCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号27）に連結して、レポーター抗体を形成する。このオリゴヌクレオチドの3'末端の18ヌクレオチドは、以下に記載されるATCに相補的である。このオリゴヌクレオチドを、ローリングサークル複製プライマーとして以下の増幅操作のために用いる。
２．レポーター抗体により認識されるエピトープ由来の異なるエピトープに特異的なhTSH捕獲抗体を、２mm直径の小滴を用いて、派生スライドグラス（derivertized glass slides）（Guoら（1994））上の規定された位置に固定して、固体状態検出器を作製する。1.5マイクロリットルの小滴（重炭酸ナトリウム（pH ９０中に５μg/mlの抗体を含む）を、スライド上の規定された各位置に塗布し、一晩インキュベートし、次いでスライド全体をPBS-BLA（10mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、150mM塩化ナトリウム、２％BSA、10％βラクトース、0.02％アジ化ナトリウム）で洗浄して、吸収されなかった部位をブロックする。
３．hTSHの段階希釈液を、いくつかの同一の各スライドのカバーグラスの下に添加する。１時間のインキュベーション後、スライドをTBS/Tween洗浄緩衝液（Hendricksonら）で３回洗浄する。hTSHは、この時点でスライドガラスの表面に捕獲されている。
４．30マイクロリットルの適切に希釈されたレポーター抗体（ローリングサークル複製プライマーに結合した抗体）の混合物を、各スライドのカバーグラスの下に添加する。スライドを37℃で１時間インキュベートし、次いで２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20で、37℃で各洗浄について５分間、４回洗浄する。
５．ATCは、以下の配列の94塩基の閉環オリゴヌクレオチドである
５'-AAATCTCCAACTGGAAACTGTTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTCTAGTACGCTGATCTCAGTCTGATCTCAGTCATTTGGTCTCAAAGTGATTG-３'（配列番号28）。このATCオリゴヌクレオチドを、ATCをレポーター抗体のローリングサークル複製プライマー部位とハイブリダイズさせるために、スライドの表面上、カバーグラスの下で、50mM Tris-Cl（pH7.4）、40mM KOAC、10mM MgCl2からなる緩衝液中で30μlの量でインキュベートする。このハイブリダイゼーションを図29Ｂに示す。
６．インサイチュローリングサークル増幅を、カバーグラスの下で、30μlの以下の成分を含む緩衝液中で、30℃で12分間行う：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、それぞれ400μMのdCTP、dATP、dGTP、95μM dTTP、380μM BUDRトリホスフェート（SIGMA）、1000nモルの濃度のT4ファージ遺伝子32タンパク質、および200nMのφ29 DNAポリメラーゼ。この反応で、ATCの約350の縦列コピーが生じる。ローリングサークル複製プライマーがTS-DNA（５'末端で）に取り込まれているのでコピーは単一のTS-DNA分子として抗体に結合したままであり、そしてローリングサークル複製プライマーは抗体に結合したままである。
７．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20で、37℃で５分間３回洗浄する。
８．次いで、スライドを、50μl（カバーグラスの下で）の２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20、および５μg/mlビオチン化抗BUDRマウスIgG（Zymed Labs）中で、37℃で30分間インキュベートする。
９．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。
10．次いで、スライドを・、50μl（カバーグラスの下で）の２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20、および５μg/mlのFITC-アビジン中で、37℃で30分間インキュベートする。
11．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。
12．スライドを、１×SSC、0.01％Tween-20中で、室温で10分間洗浄する。
13．スライドの像を、蛍光検出のための適切なフィルターセットを備えた顕微鏡-CCDカメラシステムを用いて捕獲し、そして蛍光点の数を計数する。これは、サンプル中に存在するhTSHの存在および相対量を示す。なぜなら、各点は単一の折り畳んだTS-DNA分子を示し、そして各TS-DNA分子は、スライド上に捕獲された単一のhTSH分子を示すからである。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：エール  ユニバーシティ
（ii）発明の名称：単分子セグメントの増幅および検出
（iii）配列数：２８
（iv）連絡住所：
（A）名称：パトレア  エル.パブスト
（B）番地：ワン  アトランティック  センター  2800
ウエスト  ピーチツリー  ストリート  1201
（C）市：アトランタ
（D）州：ジョージア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：30306-3450
（Ｖ）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリース ＃1.0，バージョン ＃1.25
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：08/563,912
（B）出願日：1995年11月21日
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：60/016,677
（B）出願日：1996年5月1日
（C）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：パブスト，パトレア  エル．
（B）登録番号：31,284
（C）照会／記録番号：YU115CIP2PCT
（ix）電話回線情報：
（A）電話：（404）873-8794
（B）テレファックス：（404）873-8795
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：111塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号１：
0003974941.tif 000024
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：44塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号２：
0003974941.tif 000025
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：28塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号３：
0003974941.tif 000026
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：20塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号４：
0003974941.tif 000027
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：95塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号５：
0003974941.tif 000028
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：18塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号６：
0003974941.tif 000029
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号７：
0003974941.tif 000030
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号８：
0003974941.tif 000031
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号９：
0003974941.tif 000032
（2）配列番号10の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：23塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号10：
0003974941.tif 000033
（2）配列番号11の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：96塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号11：
0003974941.tif 000034
（2）配列番号12の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：96塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号12：
0003974941.tif 000035
（2）配列番号13の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号13：
0003974941.tif 000036
（2）配列番号14の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号14：
0003974941.tif 000037
（2）配列番号15の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：24塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号15：
0003974941.tif 000038
（2）配列番号16の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：95塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号16：
0003974941.tif 000039
（2）配列番号17の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号17：
0003974941.tif 000040
（2）配列番号18の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：51塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号18：
0003974941.tif 000041
（2）配列番号19の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：60塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号19：
0003974941.tif 000042
（2）配列番号20の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：86塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号20：
0003974941.tif 000043
（2）配列番号21の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：54塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号21：
0003974941.tif 000044
（2）配列番号22の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：39塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号22：
0003974941.tif 000045
（2）配列番号23の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：78塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号23：
0003974941.tif 000046
（2）配列番号24の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：80塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号24：
0003974941.tif 000047
（2）配列番号25の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：128塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号25：
0003974941.tif 000048
（2）配列番号26の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：58塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号26：
0003974941.tif 000049
（2）配列番号27の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：28塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号27：
0003974941.tif 000050
（2）配列番号28の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：94塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号28：
0003974941.tif 000051
【図１】
0003974941.tif 000052
【図２】
0003974941.tif 000053
【図３】
0003974941.tif 000054
【図４】
0003974941.tif 000055
【図５】
0003974941.tif 000056
【図６】
0003974941.tif 000057
【図７】
0003974941.tif 000058
【図８】
0003974941.tif 000059
【図９】
0003974941.tif 000060
【図１０】
0003974941.tif 000061
【図１１ａ】
0003974941.tif 000062
【図１１ｂ】
0003974941.tif 000063
【図１２】
0003974941.tif 000064
【図１３】
0003974941.tif 000065
【図１４】
0003974941.tif 000066
【図１５】
0003974941.tif 000067
【図１６】
0003974941.tif 000068
【図１７Ａ】
0003974941.tif 000069
【図１７Ｂ】
0003974941.tif 000070
【図１８Ａ】
0003974941.tif 000071
【図１８Ｂ】
0003974941.tif 000072
【図１８Ｃ】
0003974941.tif 000073
【図１８Ｄ】
0003974941.tif 000074
【図１８Ｅ】
0003974941.tif 000075
【図１９】
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【図２０】
0003974941.tif 000077
【図２１Ａ】
0003974941.tif 000078
【図２１Ｂ】
0003974941.tif 000079
【図２２Ａ】
0003974941.tif 000080
【図２２Ｂ】
0003974941.tif 000081
【図２３Ａ】
0003974941.tif 000082
【図２３Ｂ】
0003974941.tif 000083
【図２４Ａ】
0003974941.tif 000084
【図２４Ｂ】
0003974941.tif 000085
【図２５Ａ】
0003974941.tif 000086
【図２５Ｂ】
0003974941.tif 000087
【図２６Ａ】
0003974941.tif 000088
【図２６Ｂ】
0003974941.tif 000089
【図２７Ａ】
0003974941.tif 000090
【図２７Ｂ】
0003974941.tif 000091
【図２８Ａ】
0003974941.tif 000092
【図２８Ｂ】
0003974941.tif 000093
【図２９Ａ】
0003974941.tif 000094
【図２９Ｂ】
0003974941.tif 000095