(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の回文塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡである翻訳枠調整リンカー。
【請求項２】
５’末端がリン酸化されている請求項１の翻訳枠調整リンカー。
【請求項３】
配列番号２の回文塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡである翻訳枠調整リンカー。
【請求項４】
５’末端がリン酸化されている請求項３の翻訳枠調整リンカー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、タンパク質をコードするＤＮＡ鎖の翻訳フレームを調整することのできるリンカーに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＤＮＡ断片の各種改変に不可欠なフレーム調整リンカーに関するものである。
背景技術
生体内においては、タンパク質はゲノムＤＮＡから転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から合成（翻訳）されるが、分子生物学や生命科学の研究分野においては、例えば任意のタンパク質の機能解析を目的として変異タンパク質を作成する場合、ｍＲＮＡの情報をＤＮＡに移し変えて２本鎖ＤＮＡとし、このＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）の塩基配列を操作し、変異ＤＮＡ断片から変異タンパク質を発現させる方法が一般的である。
欠失、あるいは付加変異ＤＮＡ断片を作成する場合には、通常、ＤＮＡの２カ所を制限酵素で切断して間の配列部分を欠失させたり、あるいは１カ所で切断して別の配列または塩基を挿入したりする。
しかしながら、ＤＮＡ鎖は３つの塩基のブロック（コドン）によって１アミノ酸残基をコードしているため、ＤＮＡを制限酵素で切断してある１部の配列または塩基を欠失させたり、あるいは切断箇所に別の配列または塩基を付加した場合には、コドンの粋（フレーム）が変化してしまい、変異を加えた部位からＣ末端側のタンパク質アミノ酸配列が全く別のものに変わってしまったり、あるいは途中に停止コドンが形成されてタンパク質合成が途切れてしまい、所望の変異タンパク質を得ることができない危険性がある。このため、ＤＮＡ鎖に欠失や付加といった変異を導入する場合には、変異導入の前後の配列の翻訳枠を一致させる必要がある。
一般的には、翻訳枠を一致させるため、２本鎖のオリゴヌクレオチドからなるリンカーＤＮＡを切断部位に連結する方法がとられている。しかしながら、用いた制限酵素の種類等に応じて、その都度各種のリンカーを準備する必要があり、またリンカーの選択は必ずしも容易ではなかった。このため、翻訳枠を一致させた変異ＤＮＡ断片の作製には多大な労力を必要とした。
発明の開示
この出願の発明は、前記のとおりの従来技術の事情に鑑みてなされたものであって、複数種の制限酵素認識部位を有し、これらの制限酵素の種類によって、あらゆる切断部位に対しても、前後の翻訳枠を一致させた状態で変異ＤＮＡ配列を作製することのできるフレーム調整リンカーを提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（４）の発明を提供する。
（１）配列番号１の回文塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡであるフレーム調整リンカー。
（２）５’末端がリン酸化されている前記発明（１）のフレーム調整リンカー。
（３）配列番号２の回文塩基配列からなる１本鎖ＤＮＡであるフレーム調整リンカー。
（４）５’末端がリン酸化されている前記発明（３）のフレーム調整リンカー。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明（１）のフレーム調整リンカーは、配列番号１の回文塩基配列からなる１本鎖のＤＮＡである。以下、この発明（１）のフレーム調整リンカーをＦＡＬ−１と記載することがある。図１はこのＦＡＬ−１の塩基配列、制限酵素認識配列（下線）、および翻訳枠（１，２，３）を示した。この図１に示したように、ＦＡＬ−１は、制限酵素ＮａｅＩおよびＮｇｏＭＩＶによって切断される配列”ＧＣＣＧＧＣ”が２つ連続している。また、このＦＡＬ−１は制限酵素ＢｂｅＩによって切断される配列”ＧＧＣＧＣＣ”を有してもいる。以下、このＦＡＬ−１の各制限酵素による切断について説明する。
ＮａｅＩによる切断
ＦＡＬ−１の左右の配列”ＧＣＣＧＧＣ”は、ＮａｅＩによって図２のとおりに切断され、その切断部は平滑末端となる。そして、切断後の左側と右側のそれぞれの断片はいずれも翻訳枠３で終わり、次は翻訳枠３で始まる。以下、このような切断後の配列の末端および開始の翻訳枠を（３，３）と記載する。
ＮｇｏＭＩＶによる切断
制限酵素ＮｇｏＭＩＶは、前記のＮａｅＩと同一の配列”ＧＣＣＧＧＣ”を認識するが、両者の切断部位は異なる。すなわち、ＦＡＬ−１の左右の配列”ＧＣＣＧＧＣ”は、ＮｇｏＭＩＶによって図３のとおりに切断される。この切断部は５’突出末端となり、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理することによって平滑末端化すると、図３に示したように、切り口は翻訳枠２で終わり、次は翻訳枠１で始まるようになる（２，１）。
ＢｂｅＩによる切断
ＦＡＬ−１の配列”ＧＧＣＧＣＣ”は制限酵素ＢｂｅＩによって図４のとおりに切断され、その切断部は３’突出末端となる。Ｋｌｅｎｏｗ断片によって平滑末端化すると、図４に示したように切り口は（１，２）となる。
以上のとおりのＦＡＬ−１における各制限酵素による切断部とその翻訳枠をまとめると、図５のとおりとなる。従って、このフレーム調整リンカーＦＡＬ−１をＤＮＡ断片の一端に連結（ライゲーション）し、３種類の制限酵素を選択して使用した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化することによって、翻訳枠１（ＢｂｅＩを使用）、翻訳枠２（ＮｇｏＭＩＶを使用）、翻訳枠３（ＮａｅＩを使用）のいずれのフレームでも３’末端のＤＮＡ断片を終えることができる。また、翻訳枠１（ＮｇｏＭＩＶを使用）、翻訳枠２（ＢｂｅＩを使用）、翻訳枠３（ＮａｅＩを使用）のいずれのフレームでもＤＮＡの５’末端を始めることができる。
次に、この出願の発明（２）のフレーム調整リンカー（ＦＡＬ−２〕を説明する。このＦＡＬ−２は配列番号２の回文塩基配列からなる１本鎖のＤＮＡである。このＦＡＬ−２は、図６に示したように、制限酵素ＳｍａＩによって切断される配列”ＣＣＣＧＧＧ”が２つ連続しており、さらに５’側に”Ｇ”、３’側に”Ｃ”を一つづつ有している。また、このＦＡＬ−２は制限酵素ＡｐａＩおよびＢｓｐ１２０１によって切断される配列”ＧＧＧＣＣＣ”を有してもいる。以下、このＦＡＬ−２の各制限酵素による切断について説明する。
ＳｍａＩによる切断
ＦＡＬ−２の左右の配列”ＣＣＣＧＧＧ”は、ＳｍａＩによって図７のとおりに切断され、その切断部は平滑末端となる。そして、このＦＡＬ−２の左側と右側のそれぞれの断片はいずれも翻訳枠３で終わり、次は翻訳枠３で始まる（３，３）。
ＡｐａＩによる切断
ＦＡＬ−２の配列”ＧＧＧＣＣＣ”は制限酵素ＡｐａＩによって図８のとおりに切断され、その切断部は３’突出末端となる。Ｋｌｅｎｏｗ断片によって平滑末端化すると、図８に示したように切り口は（１，２）となる。
Ｂｓｐ１２０１による切断
ＦＡＬ−２の配列”ＧＧＧＣＣＣ”は制限酵素Ｂｓｐ１２０１によって図９のとおりに切断され、その切断部は５’突出末端となる。Ｋｌｅｎｏｗ断片によって平滑末端化すると、図９に示したように切り口は（２，１）となる。
以上、ＦＡＬ−２における各制限酵素による切断部とその翻訳枠をまとめると、図１０のとおりとなる。従って、このフレーム調整リンカーＦＡＬ−２をＤＮＡ断片の一端に連結し、３種類の制限酵素を選択して使用した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化することによって、翻訳枠１（ＡｐａＩを使用）、翻訳枠２（Ｂｓｐ１２０１を使用）、翻訳枠３（ＳｍａＩを使用）のいずれのフレームでも３’末端のＤＮＡ断片を終えることができる。また、翻訳枠１（Ｂｓｐ１２０１を使用）、翻訳枠２（ＡｐａＩを使用）、翻訳枠３（ＳｍａＩを使用）のいずれのフレームでもＤＮＡの５’末端を始めることができる。
以上のとおり、この出願によって提供されるフレーム調整リンカーＦＡＬ−１およびＦＡＬ−２を様々に組み合わせて、しかも各リンカーの配列を認識する６種の制限酵素を適宜に選択することによって、あらゆる切断部位に対しても、前後の翻訳枠を一致させた状態で変異ＤＮＡ配列を作製することが可能となる。
なお、この発明のフレーム調整リンカーは、５’末端が予めリン酸化されているものであることが好ましい。これによって、ポリヌクレオチドキナーゼ等による５’−リン酸化処理を行わずとも、これらのリンカーをＤＮＡ断片にライゲーションすることができる。
産業上の利用可能性
この発明のフレーム調整リンカーは、例えば、生物学や医学等の基礎研究分野、あるいは製薬、食品加工等の研究開発分野等において有用な変異タンパク質作製のための変異ＤＮＡ断片の調製に利用される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、この発明のフレーム調整リンカーＦＡＬ−１の塩基配列、制限酵素認識配列（下線）、および翻訳枠（１，２，３）を示す。
図２は、ＦＡＬ−１を制限酵素ＮａｅＩによって処理した場合の切断部の配列を示す。
図３は、ＦＡＬ−１を制限酵素ＮｇｏＭＩＶによって処理し、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で処理した場合の切断部の配列を示す。
図４は、ＦＡＬ−１を制限酵素ＢｂｅＩによって処理し、さらにＫｌｅｎｏｗ断片で処理した場合の切断部の配列を示す。
図５は、ＦＡＬ−１における各制限酵素による切断部断面の翻訳枠をまとめて示す。
図６は、この発明のフレーム調整リンカーＦＡＬ−２の塩基配列、制限酵素認識配列（下線）、および翻訳枠（１，２，３）を示す。
図７は、ＦＡＬ−２を制限酵素ＳｍａＩによって処理した場合の切断部の配列を示す。
図８は、ＦＡＬ−２を制限酵素ＡｐａＩによって処理し、さらにＫｌｅｎｏｗ断片で処理した場合の切断部の配列を示す。
図９は、ＦＡＬ−２を制限酵素Ｂｓｐ１２０１によって処理し、さらにＫｌｅｎｏｗ断片で処理した場合の切断部の配列を示す。
図１０は、ＦＡＬ−２における各制限酵素による切断部断面の翻訳枠をまとめて示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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