(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の検出方法において、
a)  水溶液中に可溶である、１−チアントレンカルボン酸、２−チアントレンカルボン酸、及びクロルプロマジン、並びにこれらの塩及び誘導体から選択される有機標識であって電気化学発光を発生させることができる有機標識に付着したバイオ分子に試料を接触させ、
b)  水性条件下、アミン共反応物の存在下で電極を用いて該標識に酸化ポテンシャルを適用し、
c)  放出した電気化学発光を測定することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記標識が置換多環有機標識である、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
前記共反応物が第三級アミンである、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４】
前記共反応物がトリプロピルアミンである、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオ分子が、抗体、抗原、またはＤＮＡプローブである、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項６】
前記標識が前記共反応物を含む、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項７】
前記標識がクロルプロマジンである、請求の範囲６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識が、置換ジフェニルアントラセンまたはチアントレンである、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項９】
クロルプロマジンを含む可溶性有機標識に電極を用いて酸化的条件を適用し、それにより水性条件下で電気化学発光を発生させることを含んでなる電気化学発光の発生方法。
【請求項１０】
前記方法が添加した共反応物の非存在下で行われる請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法がＴＰＡの非存在下で行われる請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１２】
発生した電気化学発光を測定することを更に含んでなる請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識がバイオ分子に付着している請求の範囲９に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオ分子が分析物に特異的に結合する請求の範囲１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオ分子が、抗体、抗原、またはＤＮＡプローブである、請求の範囲１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識がＲｕ（ｂｐｙ）32+の発光波長から区別される発光波長を有する、請求の範囲１または９に記載の方法。
【請求項１７】
(a) １−チアントレンカルボン酸、２−チアントレンカルボン酸、及びクロルプロマジン、並びにこれらの塩及び誘導体から選択される水溶性有機化合物；及び(b) アミン共反応物を含んでなる電気化学発光標識であって、該電気化学発光標識が、抗体、抗原及びＤＮＡプローブからなる群から選択されたバイオ分子に付着していることを特徴とする、上記標識。
【請求項１８】
前記電気化学発光標識が電極に存在する、請求の範囲１７に記載の電気化学発光標識。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、発電化学発光法、および水溶液中に存在する改質炭化水素および芳香族複素環式化合物とトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）およびペルオキシジスルフェート（Ｓ2Ｏ82-）、および特に同時分析および内部リファレンシング（referencing）を提供するものなどの共反応物との組成物に関する。更に詳細には、本発明は、発電化学発光に用いられる、置換ジフェニルアントラセン、チアントレン、およびプロマジンなどの場合によってはＮおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子で置換された環炭素を有する、置換基を有する多環有機発光化合物を提供する。
関連出願
本願は、１９９４年８月２６日出願のAllen J. BardとXiaso-Hong Xuの名前での固体表面上の核酸の発電化学発光検出用のバイオセンサーおよびその方法という標題の先願連続番号０８／２９６，６３０号明細書の一部継続出願である。
発明の背景
発光標識は、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ヌクレオチド、糖類、イムノアッセイ、ＤＮＡプローブアッセイ、および蛍光および分離アッセイにおける目的とする分析物の細胞補体（cells compliments）などの様々なバイオアナライト（bioanalytes）を標識するのに用いられてきた。特に興味深いものは、電気化学反応工程により発光するように作成することができる標識である。電気化学的励起の結果として発光する標識は、それらが感度が良く且つ危険性がない特性を有するため有利である。
これらの標識の利点を利用する一つの分析手法は、発電化学発光（ＥＣＬ）である。ＥＣＬは、Ａ-およびＤ+、典型的にはラジカルイオンによって表される発電レドックス反応種の間のエネルギー的な電子遷移反応から生じ、可視領域で放射する励起状態（Ａ●またはＤ●）を形成する。
Ａ  ＋  ｅ-  →  Ａ-  ＥA-    (1)
Ｄ  −  ｅ-  →  Ｄ+  ＥD    (2)
Ａ-  ＋  Ｄ+  →  Ａ  ＋  Ｄ●（またはＡ●  ＋  Ｄ）    (3)
Ｄ●  →  Ｄ  ＋  ｈν    (4)
FaulknerとBardは、Electroanalytical Chemistry, Vol. 10, p. 1, 1977において、この種の非水系の幾つかの例を提供している。
A.W. KnightとG.M. Greenwayは、Analyst, 1994, 119, 879において、水の酸化および還元によって付与される電位範囲が限定されても水溶液中に発生させることができるＥＣＬ前駆体について論じている。ＥＣＬは、トリス（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（II）（Ｒｕ（ｂｐｙ）32+）と、下記のような酸化−還元機構によって酸化したとき適当な還元剤を発生することができる共反応物（ＸＹz）との同時酸化によって得ることができる。
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−  ｅ-  →  Ｒｕ（ｂｐｙ）33+    (5)
ＸＹz  −  ｅ-  →  ＸＹz+1    (6)
Ｒｕ（ｂｐｙ）33+＋  ＸＹz  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+＋ＸＹz+1    (6a)
ＸＹz+1  →  Ｘx＋  Ｙy  （ｘ＋ｙ＝ｚ＋１）    (7)
Ｒｕ（ｂｐｙ）33+＋  Ｘx  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+●ＸX+1    (8)
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+●  →  Ｒｕ（ｂｐｙ）32+  ｈν    (9)
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+は、これらの工程図の典型的な前駆体（Ｄ）であり、アミンとの化学発光（ＣＬ）反応、並びにシュウ酸塩（ＸＹzがＣ2Ｏ42-であり、ＸxがＣＯ2-●である場合）、および脂肪族アミン、例えばトリス−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ；ＸＹzがＰｒ3Ｎであり、ＸxがＰｒ3Ｎ+の脱プロトン化から生じるラジカルである場合）のような多数の異なる共反応物を用いるＥＣＬの検討に用いられてきた。これらのＥＣＬ工程図では、共反応物は、方程式(6)により電極で、または方程式(6a)によるエミッターにより溶液中で酸化することができる。方程式(8)の反応工程図に対する代替法としては、シュウ酸塩とＴＰｒＡについて前記したように下記の方程式(10)および(11)の順序によって励起状態を発生させることもできる。
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+  ＋  ＸX  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）3+＋  ＸX+1    (10)
Ｒｕ（ｂｐｙ）3+  ＋Ｒｕ（ｂｐｙ）33+  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+●＋  Ｒｕ（ｂｐｙ）32+    (11)
シュウ酸塩共反応物については、方程式(7)の反応工程図は炭素−炭素結合の開裂を伴うが、ＴＰｒＡ共反応物については、この工程はα−炭素からプロトンが失われることを伴うと考えられる。これらのＥＣＬ反応は、
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+およびシュウ酸塩のいずれの測定にも用いられてきた。
これらの酸化−還元の例を補足すると、ペルオキシジスルフェートおよびＲｕ（ｂｐｙ）32+は、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）−水溶液（１：１容積比）では、開始反応物が酸化されるよりも、むしろ還元されるときには、この工程図の類似した反転（還元−酸化機構、方程式(12)−(14)の後に(9)）を行なう。この場合には、Ｓ2Ｏ82-を還元すると、強力な酸化剤ＳＯ4-●が形成される。
Ｒｕ（ｂｐｙ）32-  ＋  ｅ-  →  Ｒｕ（ｂｐｙ）3+    (12)
Ｓ2Ｏ82-＋  ｅ-  →ＳＯ4-●  ＋  ＳＯ42-    (13)
Ｒｕ（ｂｐｙ）3+  ＋  Ｓ2Ｏ82-  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+  ＋  ＳＯ4-●  ＋  ＳＯ4-2-    (13a)
Ｒｕ（ｂｐｙ）3+  ＋  ＳＯ4-●  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+●  ＋  ＳＯ42-    (14)
シュウ酸塩およびＴＰｒＡについての方程式(10)および(11)に類似していることにより、ペルオキシジスルフェートを用いる励起状態を生成させるための方程式(14)の代替式は、
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+  ＋  ＳＯ4-●  →
Ｒｕ（ｂｐｙ）33+  ＋  ＳＯ42-    (15)
に続いて前記方程式(11)となる。
これらの共反応物分析の感度および選択性により、最近、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+／ＴＰｒＡ系の商業的応用がなされるようになっている。例えば、電気化学発光性のルテニウム−およびオスミウム−含有標識が、液体媒質中の目的とする分析物の検出および定量法に用いられてきた。米国特許第５，３１０，６８７号、第５，２３８，８０８号、および第５，２２１，６０５号明細書。これらの特許明細書は参照することにより本明細書に取込まれるものである。また、ルテニウム含有標識を挿入した溶液相ＤＮＡの検出への発電化学発光（ＥＣＬ）測定法の適用も記載されている（Carter, M.T.ら、（1990）, Bioconjugate Chem., 2:257-263）。このような適用により、許容可能な分析技法が提供されるが、同時分析および内部リファレンシングを行なうことができる系を提供する必要がしばしばある。本発明は、現存する系の代わりに、または、と共に用いられる追加の電気化学発光系を提供する。
発明の要約
本発明は、新規な標識において、1)  エミッターが水溶液に可溶性でなければならない、2)  発光波長がＲｕ（ｂｐｙ）32+●の発光波長と異なるものでなければならない、3)  酸化または還元電気化学は、水の酸化および還元によって付与された比較的狭い電位範囲内で進行しなければならない、および4)  酸化または還元中間体が発電共反応物中間体（electrogenerated coreactant intermediate）と反応して、励起状態を形成することができなければならない、ことを特徴とする新規標識に関する。
本発明の目的は、これらの四個（４）の特性を有する、少なくとも１個のヘテロＮまたはＳ原子から選択された環炭素置換を有することができる置換基を有する多環有機発光化合物、例えば芳香族多環化合物を提供することである。置換基を有するジフェニルアントラセン、チアントレンおよびプロマジンが、発電化学発光用のこのような試薬系の例である。
本発明のもう一つの目的は、環炭素置換を有することがあり、生物分析用途においてＲｕ（ｂｐｙ）32+に補助標識を提供する芳香族多環化合物のような置換基を有する多環有機発光化合物を提供することである。
本発明の目的は、同時分析を行なうことができるようにする標識−共反応物組成物を提供することである。
本発明の更にもう一つの目的は、(1)発光波長がＲｕ（ｂｐｙ）32+●の発光波長と異なる発光標識を有する少なくとも１個の第一のバイオ分子を提供し、(2)ルテニウムまたはオスミウム含有標識を有する第二のバイオ分子分析物を提供し、(3)少なくとも１個の共反応物を加え、(4)標識したバイオ分子分析物および共反応物を電気化学反応または励起に暴露し、生成する発光を測定して、存在する各種のバイオ分子分析物を検出することによる、複数の分析物を検出する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、バイオ分子のＥＣＬ分析（すなわち、イムノアッセイ、ＤＮＡプローブ）のため、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）−水溶液（１：１、容積比）中で、トリ−ｎ−プロピルアミンの存在下にて９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホン酸ナトリウム水溶液の陽極酸化、および共反応物としてペルオキシジスルフェート（Ｓ2Ｏ82-）の存在下でのＤＰＡＳの陰極還元を伴う組成物を提供することである。９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホン酸ナトリウムがＴＰｒＡの存在下で酸化され、またはＳ2Ｏ82-により還元されると、ＤＰＡＳ蛍光に特徴的な青色のＥＣＬ発光が生じる。この発光とＲｕ（ｂｐｙ）32+についての発光とをスペクトル分離することにより、ＤＰＡＳが生物分析用途におけるＲｕ（ｂｐｙ）32+に対する補助標識となる。
更にもう一つの目的は、バイオ分子のＥＣＬ分析（すなわち、イムノアッセイ、ＤＮＡプローブ）を目的とする発電化学発光（ＥＣＬ）用の水溶液中で共反応物としてトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）の存在下で１−および２−チアントレンカルボン酸（１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨ）を提供することである。
更にもう一つの目的は、共反応物（ＴＰｒＡ）を加えることなくクロルプロマジンを酸化して、新規な自己消滅反応によりＥＣＬ発光を生成するＥＣＬ工程図を提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的、利点および顕著な特徴は、下記の詳細な説明、非制限的例および添付図面から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、６×９ｍｍＰｔガーゼ（５２メッシュ）電極でのｐＨ７．５のリン酸ナトリウム中における１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳの存在下での水のバックグラウンド酸化のサイクリックボルタモグラムを示す。掃引速度、１００ｍＶ／秒。
図２ａ〜２ｃは、６×９ｍｍＰｔガーゼ（５２メッシュ）電極でのｐＨ７．５リン酸ナトリウム緩衝液中の、(b)１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳおよび０．１５Ｍ  ＴＰｒＡの、(a)サイクリックボルタンメトリー中の発光を示す。掃引速度、１００ｍＶ／秒。(c)直径が１．５ｍｍのＰｔ電極でのｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中の０．０５Ｍ  ＴＰｒＡのサイクリック・ボルタモグラム。掃引速度、２００ｍＶ／秒。
図３は、直径が１．５ｍｍのＰｔ電極でのＭｅＣＮ中の０．９２ｍＭ  ＤＰＡＳのサイクリック・ボルタモグラムを示す。支持電解質、０．１Ｍ  ＴＢＡＢＦ4。掃引速度、２００ｍＶ／秒。
図４は、ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中での０．１５Ｍ  ＴＰｒＡを含む溶液についてのＤＰＡＳ  ＥＣＬ強度対濃度の対数−対数プロットである。
図５は、ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中での１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳおよび０．１５Ｍ  ＴＰｒＡの溶液についての蛍光およびＥＣＬスペクトルを示す。ＥＣＬ発光は、０．０Ｖ（対ＳＣＥ、８秒）から＋１．２Ｖ（２秒）、−１．４Ｖ（２秒）までの後、０．０Ｖに復するように６×９ｍｍＰｔガーゼ（５２メッシュ）電極を繰り返しパルスによって変更することによって生じた。光はこの順序では正のパルスで生じ（負のパルスは電極のクリーニング用であった）、２分間積分して、スペクトルを生成させた。いずれのピーク強度も４３０ｎｍである。
図６は、直径が１．５ｍｍのＰｔ電極でのＭｅＣＮ−水溶液（１：１容積比）中の１１ｍＭ  （ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8のサイクリックボルタモグラムを示す。支持電解質、０．２Ｍ  ＴＥＡＰ；掃引速度、１００ｍＶ／秒。
図７は、直径が１．５ｍｍのＰｔ電極でのＭｅＣＮ中での０．９３ｍＭ  ＤＰＡＳのサイクリックボルタモグラムを示す。支持電解質、０．１Ｍ  ＴＢＡＢＦ4；掃引速度、２００ｍＶ／秒。
図８は、直径が２．０ｍｍのＰｔ電極でのＭｅＣＮ−水溶液（１：１容積比）中の１．１ｍＭ  ＤＰＡＳおよび２５ｍＭ  （ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8の還元についてのＥＣＬ発光を示す。支持電解質、０．２Ｍ  ＴＥＡＰ；掃引速度、１００ｍＶ／秒。
図９は、図８と同じ溶液についての蛍光およびＥＣＬスペクトルを示す。ＥＣＬ発光は、直径が２．０ｍｍのＰｔ電極に−２．２Ｖ（対ＳＣＥ）までパルスを加え、５秒間の発光を積分することによって発生した。いずれのピーク強度も４３０ｎｍである。
図１０ａ〜１０ｃは、(a)直径が１．５ｍｍのＰｔ電極、掃引速度が２００ｍＶ／秒でのｐＨ８．５のリン酸ナトリウム緩衝液中での２．０ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨのサイクリック・ボルタモグラム、(b)掃引を−０．３５Ｖからの代わりに＋０．１５Ｖから行なったこと以外は(a)と同じ条件下での１．４ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨのサイクリック・ボルタモグラム、および(c)直径が１．５ｍｍのＰｔ電極、ＭｅＣＮ、０．１Ｍ  ＴＢＡＢＦ4中で掃引速度が２００ｍＶ／秒での２．０ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨのサイクリック・ボルタモグラムを示す。
図１１ａ〜１１ｂは、直径が６ｍｍのＰｔ電極、掃引速度が１００ｍＶ／秒でのｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中の５．２ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨおよび０．１５Ｍ  ＴＰｒＡの(a)サイクリック・ボルタモグラム（ボトム）、および(b)同時発光を示す。
図１２ａ〜１２ｂは、図１１と同じ条件での０．２６ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨおよび０．１５Ｍ  ＴＰｒＡの(a)サイクリック・ボルタモグラム、および(b)同時発光を示す。
図１３は、０．０５Ｍ  ＴＰｒＡの存在下での２．０ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨのサイクリック・ボルタモグラムを示す。他の条件は、図１０ａと同じである。
図１４は、リン酸ナトリウム緩衝液中での１×１０-5Ｍ  ２−ＴＨＣＯＯＨ、０．１５Ｍ  ＴＰｒＡについてのピークＥＣＬ強度対ｐＨを示す。
図１５は、０．１５Ｍ  ＴＰｒＡを含むｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中でのピークＥＣＬ強度対２−ＴＨＣＯＯＨの対数−対数プロットを示す。
図１６ａ〜１６ｂは、０．１５Ｍ  ＴＰｒＡを含むｐＨ８．５のリン酸ナトリウム緩衝液中で測定した９．１ｍＭ  １−ＴＨＣＯＯＨ(a)および２０ｍＭ  ２−ＴＨＣＯＯＨの蛍光およびＥＣＬスペクトルを示す。ＥＣＬ発光は、１−ＴＨＣＯＯＨに対して４０分間および２−ＴＨＣＯＯＨに対して２０分間溶液を攪拌しながら、ＳＣＥに対して＋１．４Ｖ（０．５秒）および−０．５Ｖ（２秒）の間で６×９ｍｍのＰｔガーゼ（５２メッシュ）電極を交互にパルスを加えることによって発生した。ピーク蛍光強度は、２−ＴＨＣＯＯＨについては４８０ｎｍであり、１−ＴＨＣＯＯＨについては５０５ｎｍである。ピークＥＣＬ強度はいずれの異性体についても５７０ｎｍである。これらの強度は、比較のために拡大してある。同じＴＨＣＯＯＨ濃度（２０ｍＭ）および捕捉時間では、２−ＴＨＣＯＯＨ発光の強度は１−ＴＨＣＯＯＨの強度の約６〜７倍である。
図１７ａ〜１７ｂは、直径が６ｍｍのＨＯＰＧ、掃引速度が５０ｍＶ／秒での０．０１Ｍ  ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の０．９８ｍＭ  ＣＰＺのサイクリック・ボルタモグラム、および(b)最初の酸化の後に逆に掃引すること以外は(a)と同じ系および条件についてのサイクリック・ボルタモグラムを示す。
図１８ａ〜１８ｂは、ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中で直径が６ｍｍのＨＯＰＧ電極、掃引速度が２００ｍＶ／秒で測定した１．０ｍＭ  ＣＰＺについての(a)サイクリック・ボルタモグラムおよび(b)同時発光を示す。
図１９は、ＤＰＡＳおよびＲｕ（ｂｐｙ）32+の発光スペクトルを示す。
図２０は、２種類のＥＣＬ発光を測定するための装置を示す。
図２１ａ〜２１ｃは、励起電圧、および強度ランプ（intensity ramps）を示す。
発明の詳細な説明
本発明において、発電化学発光組成物の要件は、1)  エミッターが水溶液に可溶性でなければならない、2)  発光波長がＲｕ（ｂｐｙ）32+●の発光波長と異なるものでなければならない、3)  酸化または還元電気化学は、水の酸化および還元によって付与された比較的狭い電位範囲内で進行しなければならない、および4)  酸化または還元中間体が発電共反応物中間体（electrogenerated coreactant intermediate）と反応して、励起状態を形成することができなければならない、ことである。これらの基準を満足することによって、新規な組成物を現存するＲｕ（ｂｐｙ）32+系と独立してまたは共に用いることができる。ルテニウム標識と共に用いることができる標識は、置換基を有する多環性の有機発光化合物、例えば芳香族多環化合物であって、環炭素を少なくとも１個のヘテロ原子Ｎおよび／またはＳで置換することができるもの、それらの異性体およびそれらの塩である。好ましい多環化合物としては、置換ジフェニルアントラセン、チアントレン、およびプロマジンが挙げられるが、これらに限定されず、また発電化学発光用に用いられる。
本発明による好ましい標識は、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+（φF約０．０５、ピーク発光６２０ｎｍ）と比較して高い蛍光効率と短波長発光（φF＝０．８７、ピーク発光４２８ｎｍ）を有する水性媒質中での一重項ケトンからの蛍光強い励起状態エネルギー受容体であるＤＰＡＳである。
0003989019.tif 000002
従って、ＤＰＡＳは、前記の基準を満足し、ＤＰＡＳをエミッターとして、ＴＰｒＡを共反応物として水性媒質中に含む酸化−還元工程図から生じる青色のＥＣＬ発光を生じる。また、ＭｅＣＮ−水溶液（１：１容積比）中でペルオキシジスルフェート（Ｓ2Ｏ82-）を共反応物として用いる還元−酸化工程図におけるＤＰＡＳのＥＣＬも、前記の基準を満足する。
もう一つの好ましい態様は、チアントレン（ＴＨ）の２種類のカルボン酸誘導体、すなわち１−および２−チアントレンカルボン酸（１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨ）、およびそれらの異性体を包含する。
0003989019.tif 000003
チアントレンは、前記の非水性イオンの消滅工程図の下記の方程式(1)〜(4)においてＥＣＬ（４３４ｎｍにおけるピーク強度）を生成することが知られている。ＴＨのそのカルボン酸誘導体への誘導体形成により、水溶液中で必要な溶解度が得られ、これらの誘導体は、ＴＰｒＡを共反応物として有する酸化−還元工程においてＥＣＬ発光を生じた。しかしながら、青色のＥＣＬ発光を有するチアントレンとは異なり、これらの化合物のＥＣＬスペクトルは蛍光スペクトルから著しく赤色シフトしている。
0003989019.tif 000004
本発明によるもう一つの好ましい態様は、構造的にＴＨに関連しているクロルプロマジン（ＣＰＺ）による水性ＥＣＬを包含する。ＣＰＺの蛍光、化学発光および電気化学は検討されてきたが、ＥＣＬ用途へのその使用に関しては検討されていない。McCreeryは、ＣＰＺの酸化および（Cheng, H.Y.；Sackett, P.H.；McCreery, R.L., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 962）に記載されているカチオンラジカルの各種の反応を検討し、更に最近になり、その研究を拡張して、クロルプロマジンカチオンラジカルと、（Deputy, A.；Wu, H.P.；McCreery, R.L., J. Phys. Chem., 1990, 94, 3620）および（Deputy, A.L., McCreery, R.L., J. Electroanal. Chem., 1989, 285, 1.）に記載のドパミン、メトキシプロマジン（Deputy, A.L.；McCreery, R.L., J. Electroanal. Chem., 1989, 285, 1.）およびヒドロキノン（Deputy, A.L.；McCreery, R.L. J. Electroanal. Chem., 1989, 285, 1.）との反応を考察した。また、クロルプロマジンの（Mellinger, T.J.；Keeler, C.E., Anal. Chem., 1964, 36, 1840；Mellinger, T.J.；Keeler, C.E., Anal. Chem., 1963, 35, 554；Ragland, J.B.；Kinross-Wright, V.J., Anal. Chem., 1964, 36, 1356；およびUdenfriend, S.；Duggan, D.E.；Vasta, B.M.；Brodie, B.B., J. Pharmacol. Expt. Thera., 1957, 120, 26）
0003989019.tif 000005
（分析用途（Takahashi, D.M., J. Pharm. Sci., 1980, 69, 184）および（Clark, B.J.；Fell, A.F.；Milne, K.T.；Pattie, D.M.C.；Williams, M.H., Anal. Chim., Acta, 1985, 170, 35）を含む）に記載の蛍光、および（Nakano, M.；Sugioka, K.；Nakano, H.；Takyu, C.；Inaba, H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 130, 952）および（Trush, M.A.；Reasor, M.J.；Wilson, M.E.；Van Dyke, K., Chem. -Biol. Interact., 1979, 28, 71）に記載の化学発光も検討された。ＴＰｒＡを用いる酸化−還元工程における発光に加えて、ＣＰＺは共反応物を加えることなく酸化したときにも発光する。恐らくは、ＣＰＺ側鎖上の第三アミンが内部共反応物として作用し、「自己消滅」ＥＣＬ反応の最初の例を提供しているものと思われる。
試薬
ＭｅＣＮは、ヘリウム雰囲気下にてVacuum Atmospheresグローブボックス中に開封せずに移し、或いは受領したまま使用した。ＭｅＣＮ中で行なわれる実験のため、それぞれの実験の前に密封したセルにグローブボックス中で充填した。テトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＡＢＦ4、エレクトロメトリー級）は、酢酸エチル：ペンタン（２回、１：１容積比）または酢酸エチル：ジエチルエーテル（３回、９：１容積比）から再結晶した後、真空下、１００℃で乾燥することによって精製した。テトラエチルアンモニウムペルクロレート（ＴＥＡＰ、８％水、で加湿したエレクトロメトリー級）、トリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ、９８％）、チアントレン（９７％）、クロルプロマジン塩酸塩（９８％）、一塩基性リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ，９９％）、およびペルオキシピロ硫酸アンモニウム（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8，９９％は納入したものをそのまま使用した。
緩衝液
Milli-Q水（Millipore Corp.、ベッドフォア、ワシントン州）を用いて調製した０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液は、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏが０．１０ＭおよびＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏが０．０５Ｍであった。ＴＰｒＡを含む緩衝溶液は、０．１５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏを用いてＴＰｒＡの塩基性を相殺したことを除き、同様にして調製した。これらの緩衝溶液のｐＨを、濃リン酸（Ｈ3ＰＯ4）または４Ｍ  ＮａＯＨで調整した。
装置
プロトン検出を行なわないサイクリック・ボルタンメトリーはBAS 100A Electrochemical Analyzer（Bioanalytical Systems、ウェスト・ラファイエット、インディアナ州）またはPrinceton Applied Research（PAR）製の１７３／１７５型ポテンシオスタット／ユニバーサル・プログラマー（プリンストン、ニュージャージー州）、およびOmnigraphic 20000 X-Yレコーダー（Bausch and Lomb-Houston Instrument Division、オースチン、テキサス州）を用いることによって得た。同時プロトン検出を伴うサイクリック・ボルタモグラムは、PAR 173/175をHanamatsu R928-P光電子増倍管を備えたHanamatsu C1230プロトンカウンター（ブリッジウォーター、ニュージャージー州）と一緒に用いて記録した。光電子増倍管は、水冷したProducts For Research, Inc.製TE308TSRF型の−１０℃に保持した冷蔵室に収容されていた。水ジャケットの１０℃までの一次冷却は、MGW Lauda RMS6型冷蔵装置（Brinkmann Instruments Co.,ウェストバリー、ニューヨーク州）を用いて行なった。ＥＣＬ強度対電位をプロットするため、プロトンカウンターからの出力を、電位掃引中にＸ−ＹレコーダーのＹ軸に供給した。
ＥＣＬ強度対濃度、およびＥＣＬ強度対ｐＨデーターは、Perkin-Elmer製のプロトタイプのＥＣＬ分析装置（Perkin-Elmer Corp.、ノールウォーク、コネチカット州、QPCR System 5000型、Leland, J.K.；Powell, M.J., J. Electrochem. Soc., 1990, 137, 3127に記載の装置と類似のもの）を用いて得た。この装置に、Digital DECステーション316SXパーソナル・コンピューターを取り付けた。
蛍光およびＥＣＬスペクトルは、荷電結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびスペクトロメーター（１ｍｍ入り口スリット）を前記と同様にDell System 200パーソナル・コンピューター（オースチン、テキサス州）に結合したものを用いて記録した。異なるパルス順序を用い、ＴＰｒＡ／ＴＨＣＯＯＨおよびＴＰｒＡ／ＤＰＡＳ実験についてはＣＣＤ検出器を−１１０℃に保持し、Ｓ2Ｏ82-／ＤＰＡＳ実験については−１００℃に保持したことを除いて、同じ手続きを行なった。蛍光スペクトルの励起は、長波（３６６ｎｍ）ＵＶランプ（UVP, Inc.、サン・ガブリエル、カリフォルニア州、UVGL-25型、Fisher Scientific、ピッツバーグ、ペンシルバニア州より発売）をセルの隣に、スペクトロメーターの入り口スリットに直角に固定することによって行なった。
セルおよび電極
特に断らない限り、総ての電気化学およびＥＣＬ実験は、従来の三極セル配置を用いた。Ｐｔディスク作用電極は、それぞれの実験を行なう前に水に懸濁した０．０５μｍアルミナ（Buehler, Ltd.）でフェルトパッド（Buehler, Ltd.、レイク・ブラフ、イリノイ州）上で研磨した。
Perkin-Elmer装置用のセルは改質して、1)  薄層フローセルが１個の作用電極（Ａｕ）と２個の正方形（５×５ｍｍ）の対向電極（いずれもＡｕ）を用い、2)  ２個の対向電極をフローセル中の作用電極の上方および側面に配置し、作用電極から光電子増倍管が直接見えるようにし、3)  Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を、セルに対して下流の流路に組み込む代わりにフローセルの側の区画に配置する。この装置の電極は、それぞれの実験の前に、プログラムしたポテンシャルパルス順序と組み合わせて市販のクリーニング溶液（IGEN Inc.、ロックビル、メリーランド州）を用いて、電気化学的に清掃した。
プロトン検出を行なわないサイクリック・ボルタンメトリー実験については、ＣＰＺ態様では、高度に配向した熱分解黒鉛（ＨＯＰＧ、Union Carbide、クリーブランド、オハイオ州）作用電極（それぞれの実験に対して新たに露出した材料を有する直径が６ｍｍのディスク）、Ｐｔワイヤーの対向電極および最近記載された配置のＡｇ擬似参照電極（ＡｇＱＲＥ）を用いた。Xu, X.；Bard, A.J., Langmuir, 1994, 10, 2409を参照されたい。他の総ての化合物に対する同様な実験では、ガラスに封入された直径が１．５ｍｍのＰｔディスク作用電極をＰｔワイヤー対向電極およびＡｇＱＲＥと組み合わせて用いた。
ＤＰＡＳ／ＴＰｒＡ  ＥＣＬスペクトルおよび発光対電位掃引では、６×９ｍｍのＰｔガーゼ・フラッグ（５２メッシュガーゼ、Aldrich）作用電極、ＡｇＱＲＥ、および輪状（直径９ｍｍ、厚み０．５ｍｍ）のＡｕ箔対向電極を用いた。２−ＴＨＣＯＯＨ  ＥＣＬスペクトルも、この配置を用いた。ガーゼ作用電極は、それぞれの実験の前に、濃硝酸に浸漬した後、水で洗浄してブンゼンバーナーの炎で加熱することによって清掃した。
ＤＰＡＳ／Ｓ2Ｏ82-ＥＣＬスペクトルおよび発光対電位掃引では、ガラスに封入した直径が２．０ｍｍのＰｔディスク作用電極を、Ｐｔワイヤー対向電極およびＡｇＱＲＥと組み合わせて用いた。
ＣＰＺのＥＣＬ発光対電位掃引では、プロトンの検出を行なわないＣＰＺについて前記したものと同じ電極および配置を用いた。２−ＴＨＣＯＯＨについてのＥＣＬ発光対電位では、作用電極を直径が６ｍｍのＰｔディスクとしたことを除き、同じ配置を用いた。
フェロセンに対する非水電位リファレンシングは、溶液に標準物質を直接加えることによって行なった。飽和カロメル電極（ＳＣＥ）に対する水溶液の電位リファレンシングは、電位対ＳＣＥが知られている対ＡｇＱＲＥデーターを得ることによって行なった。定性的比較のためには、フェロセンＥ●対ＳＣＥは（主として、液体接続電位の差により）、溶媒／支持電解質系によって＋０．３０７〜＋０．５６Ｖまで変化する。
例１
ＤＰＡＳは、Catalani, L.H.；Wilson, T.；Bechara, E.J., H. Photochem. Photobiol., 1987, 45, 273に記載のCatalaniおよび共同研究者らの手順の変法に従って合成した。従って、９，１０−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ、９８％）１ｇをニトロベンゼン（９９％）７ｍｌに懸濁させ、生成する黄色懸濁液を窒素の定常流下、氷浴中で１０℃に冷却した。激しく攪拌しながら、発煙硫酸（２７〜３３％遊離ＳＯ3）０．２５ｍｌを滴加して暗緑色懸濁液を生成させ、これを最初に５０℃で４時間攪拌した後、室温で一晩攪拌した。次に、暗緑色溶液を、氷浴中で１０Ｍ  ＮａＯＨで中和して油状の短黄色残渣を生成させた。この懸濁液で濡らしたｐＨ試験紙が、最初から深紅色になる代わりに最初は橙赤色に変化したとき、水５０ｍｌを混合物に加えた後、最後にＮａＯＨを加えてｐＨを７．０とした。次いで、追加の水を加えて総量を約２５０ｍｌとし、ニトロベンゼンを水蒸気蒸留（懸濁液を煮沸することによって影響される）によって除去した。ニトロベンゼンの大半は最初の流出物７５ｍｌと共に除去され、蒸留を継続して懸濁液の容積を約５０ｍｌとした。次いで、黄色懸濁液をビーカーに移して、攪拌しながらホットプレート上で沸騰させ、全容積を約１０ｍｌまで減少させた。黄色スラリーをブッフナー漏斗（濾紙を用いて）上で濾過し、生成する固形生成物を風乾して、粗製の黄色生成物０．９４ｇを得た。粗生成物を、Dowex 1x2-100イオン交換樹脂（５０〜１００乾燥メッシュ、３×１ｃｍ）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィ、および水性メタノール（分光光度分析級）中で３６．５％ＨＣｌから混合した）０〜０．５Ｍ  ＨＣｌのグラディエントで溶出することによって精製した。このようにして、粗製の黄色生成物０．３５ｇをメタノール１０ｍｌに攪拌および音波処理を行ないながら溶解した。粗生成物中に含まれる未反応ＤＰＡはメタノールにごく僅かしか溶解しないので、遠心分離によって分離した。上清をカラムに適用し、生成物を約５ｍｌのメタノールで溶出した後、０．２５Ｍ  ＨＣｌ／メタノールを約５ｍｌ、続いて０．５Ｍ  ＨＣｌ／メタノールで溶出した。９個の２０ｍｌ画分を集め、水６０ｍｌをそれぞれの画分に加えた。画分１〜５は曇りおよび／または沈澱形成を示し、冷蔵庫で一晩冷却した。次に、固形生成物を、遠心分離、および微細な焼結ガラスフリット上で濾過することによって分離した。フリットを通る液体の流れが目詰まりにより停止したら、緑色がかったゼリー様スラリーをガラスペトリ皿に移して、一片の濾紙で被覆し、周囲条件下で数日間風乾させた。乾燥したならば、薄黄緑色ＤＰＡＳ・５Ｈ2Ｏ１１０ｍｇを剃刀の刃でペトリ皿から擦り落とし、1Ｈ  ＮＭＲおよびマススペクトル分析法によって特性決定した。
ＤＰＡＳ・５Ｈ2Ｏの水溶液を、必要量の固形生成物を数滴のメタノールに溶解した後、水溶液に移すことによって調製した。０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中の水性ＤＰＡＳの最大溶解度は、約１×１０-5Ｍである。この低濃度では、図１に示されるような水のバックグラウンド酸化より上では、陽極電流はＤＰＡＳについては観察することができない。しかし、１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳを０．１５Ｍ  ＴＰｒＡの存在下で酸化するときには、酸化波と一致する発光が起こり、図２ａ〜２ｂに示されるようにＴＰｒＡ酸化および水のバックグラウンド酸化に重ね合わされる。比較のために、ＤＰＡＳを含まない０．０５Ｍ  ＴＰｒＡの酸化を図２ｃに示す。酸化電流はＴＰｒＡの存在下での１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳだけで観察されるということは、ＴＰｒＡまたは中間体によるＳＰＡＳ+の還元によってＤＰＡＳが再生されるため、触媒電流が増大することを示している。この触媒作用については、反応の繰り返し順序は前記の方程式の工程(5)、(6a)、(7)、(8)または(10)および(11)、および(9)であって、Ｒｕ（ｂｐｙ）33+/2+/+がそれぞれＤＰＡＳ+/0/-によって置換され、ＸＹzがＴＰｒＡであり、ＸxがＰｒ2ＮＣＨ・Ｅｔであり、ＹyがＨ+であるものと類似している。ＤＰＡＳ濃度は１×１０-5Ｍと低くても、この発光は暗室で観察すると可視の青色であり、ＴＰｒＡまたはＤＰＡＳが存在しなければ発光は見られない。
ｐＨの関数としてのＥＣＬ強度に関しては、低めのｐＨでは若干強めの発光が記録されたが、これらの差が実験上の散乱の半以外である条件は見られなかった。ＤＰＡＳ／ＴＰｒＡ系については、１回の掃引の後に電極が不動態化し、電極をクリーニングしなければ引き続く発光の観察が妨げられる。この挙動は、ＤＰＡＳの酸化の後に化学反応の生成物が電極を不動態化することを示唆している。電極は機械的に、またはパルスを加えて数秒間水をバックグラウンド還元（対ＳＣＥ−１．４Ｖ）することによってクリーニングすることができ、その後ではＥＣＬを再度酸化時に観察することができる。
ＤＰＡＳの酸化は、図３に示される化学的可逆性の欠如によって明らかなように、下記の化学反応によって複雑になっている。１０Ｖ／秒程度の掃引速度で持続するこの挙動は、水またはＯＨ-がＤＰＡＳ-を攻撃して生成物を形成することによるものと思われる。これらの溶液から微量の水を除外する目的で特別の注意を払ったが、ＤＰＡＳに関連した水和の５個の水がＤＰＡＳ+に対する親核攻撃の十分な供給源を提供するものと思われる。水を除外するための試みにおいてこれらの溶液に中性アルミナを添加しても、電気化学には大きな変化は生じなかった。界面活性剤を用いてＤＰＡＳ+を安定化することにより、またはＤＰＡのポリスルホン化によってＥＣＬ発光強度を増加させる試みは成功しなかった。
３．２×１０-8Ｍ程度の濃度のＤＰＡＳについてのPerkin-Elmer分析装置の感度範囲に亙ってＥＣＬ強度対濃度の較正曲線を、図４に示す。最適条件下では、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+は約６０倍希釈した濃度でも同様な発光強度で検出することができる。ＣＣＤカメラを用いると（および検出器感度を補整すると）、高めの濃度５×１０-6Ｍでは、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+の発光はＤＰＡＳ発光より約１００倍強い。ＤＰＡＳについてのＥＣＬ発光が蛍光効率（ＤＰＡＳについてはφF＝０．８７、およびＲｕ（ｂｐｙ）32+については約０．０５）に基づけばＲｕ（ｂｐｙ）32+よりも強いことが予想されるので、ＤＰＡＳについてＥＣＬ強度が低めであることは、ＤＰＡＳ+を消費する競争化学反応（親核攻撃など）の存在を示唆する。
図５は、１×１０-5ＭのＥＣＬおよび蛍光スペクトルを示す。蛍光およびＥＣＬスペクトルが類似していることから、ＥＣＬ発光はＤＰＡＳ●から生じることが示唆される。超波長におけるスペクトルの間の若干の不一致はＥＣＬの際の競争化学反応によって形成された他の生成物からの発光によるものであることができる。
例２
ＭｅＣＮ−水中のＲｕ（ｂｐｙ）32+／Ｓ2Ｏ82-系の電気化学およびＥＣＬは、既に考察されており、Ｓ2Ｏ82-の還元ＣＶは図６に示されている。ここで、反応の不可逆性は、前記方程式(13)に示した工程によるものである。これらの条件下では、気体状Ｈ2を生成する水のバックグラウンド還元の開始（示されていない）は、約−１．０Ｖで起こる。
本発明では、ＤＰＡＳの陰極還元は、共反応物としてのＳ2Ｏ82-の存在下で起こり、ＥＣＬを生じる。ＭｅＣＮ中のＤＰＡＳの還元は図７に示されており、図３に示したＤＰＡＳの酸化と比較したこのカップル（ＤＰＡＳ0/-）の可逆性は、ＤＰＡＳ-がＭｅＣＮ中ではＤＰＡＳ+より著しく安定であることを示している。図７の小さな前置波は、この波の電流は掃引速度（ν）と共に直線的に増加し、更に負のカップルについては０．１〜１０Ｖ／秒の範囲でν1/2と共に増加するので、吸着したＤＰＡＳによるものと思われる。この還元は水のバックグラウンド還元によく現れるので、バックグラウンドを上回る陰極電流がないことはＭｅＣＮ−水（１：１容積比）溶液では明らかである。しかしながら、Ｓ2Ｏ82-の存在下で水のバックグラウンド還元に掃引すると、図８に示されるようにＤＰＡＳ（フェロセンからＳＣＥの電位への近似的変換を行なった後）ＤＰＡＳの還元に相当する電位で明るい青色発光が観察される。Ｓ2Ｏ82-またはＤＰＡＳが存在しない場合には、発光は見られない。この結果は、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+／Ｓ2Ｏ82-系において電位を十分負に掃引してＲｕ（ｂｐｙ）32+を還元し、前記方程式(12)〜(15)に示された反応の順序により励起状態を生成するまで、発光は見られないという結果と矛盾しない。この工程を改質して、ＤＰＡＳ+/0/-をそれぞれＲｕ（ｂｐｙ）33+/2+/+の代わりに用いることによってＤＰＡＳについてＥＣＬ反応を記載することができる。
図９に示されるように、ＤＰＡＳ発光についての青色のＥＣＬスペクトルは蛍光スペクトルと調和し、図５に示されたＴＰｒＡによるＤＰＡＳの酸化−還元についてのＥＣＬおよび蛍光スペクトルとも調和する。図９における副生成物からの発光の寄与が小さいことから、バックグラウンド還元中でもＤＰＡＳ-の安定性が一層優れていることが明らかである。ＥＣＬ系のエネルギー論の考察において、関連する半反応の標準電位（電子移動反応の自由エネルギーを生じる）および発光状態のエネルギーについての言及が見られる。ＤＰＡＳおよびＴＰｒＡの酸化について、これらは下記の通りである。
ＤＰＡＳ+●  ＋  ｅ-  →  ＤＰＡＳ    Ｅ●＝約＋１．３Ｖ、対ＳＣＥ
Ｐｒ2ＮＣ+ＨＥｔ  ＋ｅ-  →  Ｐｒ2ＮＣ・ＨＥｔ
Ｅ●＝約−１．１Ｖ、対ＳＣＥ30
ＤＰＡＳ●（一重項）  →  ＤＰＡＳ  ＋  ｈν    Ｅs＝２．９ｅＶ
約０．１ｅＶのエンタルピーを補正するＤＰＡＳ+●とＰｒ2ＮＣ・ＨＥｔとの間の電子移動反応のエンタルピーは−２．３ｅＶであり、一重項ＤＰＡＳ●を生成するのに要するものより十分に低いので、これは「エネルギー欠損」反応として分類される。この種の他の反応との場合と同様に、励起した一重項は三重項−三重項消滅（Ｔ−経路）によって形成されるものと思われる。参加ＤＰＡＳ／シュウ酸塩系は「エネルギーが十分」であるが、共反応物としてシュウ酸塩を用いた実験については発光は見られなかった。
還元的経路エネルギー論は半反応に相当する。
ＤＰＡＳ  ＋  ｅ-  →  ＤＰＡＳ-・    Ｅ●＝約−１．９Ｖ、対ＳＣＥ
ＳＯ4-・  ＋ｅ-  →ＳＯ42-    Ｅ●＝約＋３．２Ｖ、対ＳＣＥ
この場合には、ＤＰＡＳ-・とＳＯ4-・との間の電子移動反応は、一重項ＤＰＡＳ●を直接生成するのに十分である（Ｓ−経路）。１×１０-5Ｍ  ＤＰＡＳについての発光強度は、ＤＰＡＳ／Ｓ2Ｏ82-還元についてのものであるので、ＤＰＡＳ／ＴＰｒＡ酸化についてとほぼ同じである。
例３および４
１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨは、ｎ−ブチルリチウムのエーテル性溶液の代わりに１．６Ｍ  ｎ−ブチルリチウム／ヘキサンを用いたことを除き、Gilman, H.；Swayampati, D.R., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 208に記載のGilmanとSwayampatiの手順に従って合成した。
水溶液中での２−ＴＨＣＯＯＨの酸化は、図10aに示されるように＋１．０Ｖ付近で起こる。０．０Ｖおよび＋０．５Ｖの広汎な陽極工程並びに−０．２Ｖの更に顕著な陰極工程はこのｐＨでの水溶液中でのＰｔ電極における酸化物形成および還元に特徴的であり、２−ＴＨＣＯＯＨが存在しない場合に掃引に現れる。これらの工程は、図10bに示されるように−０．１５Ｖより負では電位を反復しない場合には除くことができる。図10aおよび10bに示される（および５０Ｖ／秒間での同様な掃引で見られる）化学的不可逆性は、酸化された２−ＴＨＣＯＯＨが水溶液中で不安定であり、何んらかの生成物に速やかに変換されることを示している。これとは対照的に、乾燥ＭｅＣＮ中での同様な実験（図10c）は、酸化生成物が安定であることを示している。これは、酸化された酸の分解が、ＣＯ2を失う脱カルボキシル化の様な他の可能性とは異なり水との反応によることを示している。
チアントレン（ＴＨ）ＭｅＣＮ中での酸化では、Kexzthelyi, C.P.；Tachikawa, H.；Bard, A.J. J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 1522に記載されている安定なラジカルカチオンを生成するので、ＴＨＣＯＯＨの酸化は同様な方法で進行する。
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Ｈ2ＯおよびＯＨ-のような親核試薬は硫黄においてＴＨ+を攻撃することが知られており、これにより溶液中では例えばスルホキシドとなるものと思われる。
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１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨはいずれも、図１１および１２に２−ＴＨＣＯＯＨについて示されているように共反応物としてＴＰｒＡの存在下でリン酸ナトリウム緩衝水溶液中で酸化すると、ＥＣＬ発光を生じる。
（１−ＴＨＣＯＯＨの挙動は、ピーク発光強度が２−ＴＨＣＯＯＨの６〜７分の１であることを除き、同じである。）ＴＰｒＡまたは酸が存在しない場合には、発光は見られない。陽極電流は脱プロトン化酸の酸化によって抑制されるが、電気化学は、この工程がＴＰｒＡについての広汎な不可逆性の酸化波（図2c）および水のバックグラウンド酸化（図１）と一致するので複雑である。図１１における電位の関数としての２個の異なる発光ピークは、２種類の異なる電極工程からの寄与を示唆している。第一のピークは、（Ｒｕ（ｂｐｙ）33+の代わりに２−ＴＨ+ＣＯＯ-を用いた）前記の方程式(6a)によるＴＰｒＡの均一酸化に関連した反応によるものと考えられ、第二のピークは方程式(6)による電極でのＴＰｒＡの直接不均一酸化から生じる。この仮定は、２−ＴＨＣＯＯＨ濃度を低くして、(6a)の二次反応を遅くして、余り重要でなくすることによって記録した図１２の結果によって支持される。図１２の条件下では、均一工程からの発光はＴＰｒＡの不均一酸化によって抑制された発光の小さな肩として現れる。第二の発光ピークにおける負のシフトは、ＴＰｒＡを枯渇させる均一酸化反応(6a)の不活性による更に負の電位の電極でのＴＰｒＡの高濃度に基づいて説明することができる。
２−ＴＨＣＯＯＨをＴＰｒＡの存在下で酸化すると、ＴＰｒＡが存在しない場合の同じ２−ＴＨＣＯＯＨ濃度と比較して陽極電流はほぼ２倍になる（図１０ａおよび１３を比較されたい）。これは、（この系についての(6a)または(8)〜(9)と同様に）ＴＰｒＡまたは中間体による均一還元によりＴＨＣＯＯＨ（または何んらかの生成物）の触媒作用による再生と矛盾せず、図１１の第一の発光ピークがＴＰｒＡの均一酸化による共反応物前駆体の生成によるという仮定を支持している。
図１４では、１×１０-5Ｍ  ２−ＴＨＣＯＯＨのピーク発光強度はｐＨと共に増加する。ここで見られる傾向と、ｐＨ７．５付近にピークを示すＲｕ（ｂｐｙ）32+／ＴＰｒＡ系についての傾向との差は、Ｈ+がＴＰｒＡの分解反応だけでなく、２−ＴＨＣＯＯＨの生成物からの発光に関連した反応にも関与することを示唆している。２−ＴＨＣＯＯＨのピーク発光強度は、図１５に示されるようにｐＨ７．５では、４桁の大きさの濃度と共に直線的に変化する。
１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨの蛍光およびＥＣＬスペクトルを、図１６に示す。１−ＴＨＣＯＯＨおよび２−ＴＨＣＯＯＨの蛍光の最大値は、それぞれ５０５ｎｍおよび４８０ｎｍにある。比較のため、ＮｅＣＮ中でのチアントレンの蛍光の発光最大値は４３４ｎｍにある。それぞれの酸のＥＣＬ最大値は５７０ｎｍにあり、それぞれ蛍光スペクトルと比較して長波長へ大きくシフトしている。これらの最適条件下では、２−ＴＨＣＯＯＨ発光は暗闇に慣れた目には可視である。
ＴＨＣＯＯＨの蛍光およびＥＣＬスペクトルの差は、ＥＣＬ発光の少なくとも一部は元の酸の励起状態とは異なる何んらかの種からのものであることを示唆している。一つの可能性は、酸が酸化時に脱カルボキシル化することであるが、これは幾つかの理由から考えられない。1)  脱カルボキシル化が起これば、発光はＴＨまたはＴＨＣＯＯＨのいずれかに特徴的であると予想されるが、そうではない。2)  ＴＨが脱カルボキシル化によって生成すれば、水溶液中では溶解度が低いため電極上に沈澱するはずであるが、この証拠は見られない。3)  非水条件下（乾燥ＭｅＣＮ）では、酸化した酸は、図１０ｃに示される戻り波によって明らかなようにボルタンメトリー時間スケールでは安定である。ＴＨカチオンラジカルについての硫黄の位置での水による親核攻撃を説明する電気化学的研究を考察すると、ＴＨＣＯＯＨ酸では同様な反応が起こり得ることが示唆される。また、ＴＨＣＯＯＨのＥＣＬの結果とアントレンについて観察した結果との間には平行値が存在する。アントレンの場合には、同様な赤色シフトしたＥＣＬ発光がラジカルカチオンの発生時に観察され、アントラセンラジカルカチオンとＭｅＣＮ溶媒中の微量の水との反応によって形成されるアントラノール（ケトンアントロンのエノール型）からの発光によると考えられる。恐らく、１−および２−ＴＨＣＯＯＨから観察される発光は、酸化された酸と水との反応によって形成される同様な中間体から起こるものであろう。これらの酸のＥＣＬスペクトルは同じピーク波長を有するが、蛍光スペクトルについてはピークは異なる。発光中間体のエネルギーは、カルボン酸官能基の位置によるよりは添加された親核試薬によってより大きく影響される。
例５
クロルプロマジンの酸化のサイクリック・ボルタモグラム（図１７）は、酸化が２種類の異なる工程として進行することを示している。これらの第一は、擬似可逆性であり、第二の物は不可逆性である。図１７ａ〜１７ｂに見られる第一の陽極波について異常に鋭いピークは、ＣＰＺの吸着によるものと考えられてきた。同様に、図１７ｂの陰極戻り波の肩は、吸着工程である。図１７ｂに示されるように第一の酸化の後に掃引を逆転すると、可逆性が増加するが（図１７ａと比較して）、これは第二の酸化からの生成物がＣＰＺの酸化型と反応することを示唆している。
リン酸ナトリウム緩衝溶液において高めのｐＨでＣＰＺを酸化すると、図１８ａに示されるように電気化学が変化する。第一の酸化はこの場合には不可逆性であり、電気化学は、第一の酸化波の肩、電流増加、および第二の波の拡幅によって明らかなように、図１７の電気化学より通常は複雑である。ＴＰｒＡ酸化の場合と同様に、第二の参加工程の分析は、水のバックグラウンド酸化と一致するので複雑になる。しかしながら、（共反応物を添加しない場合には）図１８に示されるように、ＥＣＬ発光は予想外のものが得られる。ホトルミネッセンススペクトルと比較するためのこの工程のＥＣＬスペクトルの証明は、発光強度が低いことおよび電極の汚れによって阻害される。また、４５０〜６００ｎｍの特定の狭い波長範囲についての干渉フィルターを用いるピーク発光の波長を決定する試みは成功しなかった。図１７の条件下では（５０ｍＭ  ＴＰｒＡを加えてもまたは加えなくとも）発光は見られず、電気化学は余り複雑ではなく、電極の汚れも起きない。
McCreeryによる初期の機械学的作業は、ＣＰＺのモノ酸化形態は、硫黄の位置で水による親核攻撃によって水溶液中ではスルホキシドに転換されることを示した。従って、ＣＰＺの第一の酸化は三環系に関与し、第二の酸化は（ＴＨＣＯＯＨおよびＴＰｒＡの酸化と同様の）側鎖上の第三アミンに関与している。次いで、アミンは、前記の方程式(6)〜(7)のＴＰｒＡを用いて見られたものと同様の反応を行ない、強力な還元剤を生成し、これが環系と反応して、発光励起状態を生じるものと思われる。この「自己−消滅」ＥＣＬ工程は、方程式(5)〜(8)に示されるように進行し、ＣＰＺの三環部分はＲｕ（ｂｐｙ）32+に取って代わり、共反応物Ｘ（側鎖上の第三アミン）に共有的に結合するものと思われる。自己−消滅は、分子内または分子間工程によって進行することができる。ＣＰＺ発光は、酸化したＣＰＺと水との反応によって形成した生成物からのものである。ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中の０．１１ｍＭ  ＣＰＺについては、バックグラウンドを上回る８０ｃ／ｓのピーク発光強度を記録した。１．１ｍＭ  ＣＰＺについては、ピーク強度は８５０ｃ／ｓであった。
例６
試料のＥＣＬ検出測定における変動をなくするため、内部標準法を用いる。内部標準法では、一定量のリファレンスを試料に添加する。励起時に、試料およびリファレンスのＥＣＬ強度を同時に測定する。ＥＣＬ強度の比率は、この測定法での通常の変動によっては影響されない。内部標準は、マトリックス効果、温度変化、励起電圧変化などを補正するのに有用である。マトリックスがリファレンスシグナルおよび試料に精確に同じ方法で作用する場合にだけ内部標準は有効である。この評価法の使用は、２種類の蛍光物質の発光を測定することができる装置デザインおよびＥＣＬ法に限定されている。適当なリファレンス蛍光物質の選択が、この手法を行なう上で重要である。リファレンス蛍光物質の選択は、試料およびリファレンスの発光スペクトルの相対的位置によって変化する。この例では、ＤＰＡＳがリファレンス蛍光物質の理想的な候補であり、この発光は試料発光物質Ｒｕ（ｂｐｙ）32+から十分離れているからである。図１９に発光スペクトルを示す。ＤＰＡＳの発光中心波長である４３０ｎｍは、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+の発光中心波長である６２０ｎｍから充分に離れている。
２種類のＥＣＬ発光は、光学フィルターを使用して波長によって分割することができる。光学的配置を図２０に示す。ホイールは、電気化学セルとＰＭＴとの間に設置された２個の光学フィルターから構成されている。このホイールはＲｕ（ｂｐｙ）32+発光の観察のための長路フィルターと、ＤＰＡＳ発光を観察するための短路フィルターを有する。光学ホイールの回転は、励起電位に同期されている。励起時には、２種類のＥＣＬ発光が観察される。励起電圧ランプは２つの期間に分割される。図２１ａ〜２１ｃ。第一期中に、光学ホイールは電極上の長路フィルターが配置される。試料からの発光を測定する。リファレンスからの発光を濾過する。第二期中に、光学ホイールには、電極上に短路フィルターが配置される。リファレンスからの発光を測定し、試料を濾過する。試料シグナルは、第一期におけるＥＣＬ発光の面積を積分することによって得られる。リファレンス試料は、第二期の面積から得られる。内部標準化は試料シグナル対リファレンスシグナルの比率を測定することによって行なう。濃度変化に関係しないあらゆる変化が試料およびリファレンスの両方で観察される。次にシグナル比を用いて、試料の濃度を測定する。
例７
ＥＣＬ検出法は、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの定量に好適である。ＥＣＬ強度は、目的とする特定のＤＮＡ分析物の濃度に比例する。ＥＣＬ検出の前のＤＮＡの振幅における変動を、内部標準を用いて少なくすることもできる。
本発明の特定の態様をここに例示し、説明して来たが、本発明はこれらの例示および説明に限定されるべきではない。変化および改良を取り入れ、下記の請求の範囲内の本発明の一部として具体化することができることは明らかである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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