(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（1）又は（2）
【化１】
0004026987.tif 000015
（式中、R1はＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるブチリル基またはＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるバレリル基を示し、Ｒ2は、非放射性低級アルキル基または放射性低級アルキル基を示す。）で表される光学活性なN-置換ピロリジン誘導体またはその塩。
【請求項２】
次の一般式（3）又は（4）
【化２】
0004026987.tif 000016
（式中、R1はＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるブチリル基またはＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるバレリル基を示し、Ｒ2は、非放射性低級アルキル基または放射性低級アルキル基を示す。）で表される光学活性なN-置換ピロリジン誘導体またはその塩。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかのトレーサー化合物の１種以上を有効成分とする中枢局所ブチリルコリンエステラーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、光学活性なN−置換ピロリジン誘導体と、これを含有する、中枢局所ブチリルコリンエステラーゼ（以下、「BChE」と略称する）をポジトロン断層撮影法（11Ｃ，18Ｆを用いる）もしくは核磁気共鳴撮影法（13Ｃ，Ｆを用いる）等により体外から非侵襲的に活性測定を行うための試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
脳内コリン作動性神経は記憶に深く関与しており、この神経系の障害がアルツハイマー痴呆症などにみられる記憶障害の原因であると考えられている。
アルツハイマー病において、剖検脳の研究からアセチルコリンエステラーゼはコリン作動性神経の脱落に伴い活性が低下するが、その近縁酵素であるBChE活性は増加するため (E.K.Perry et al., British MedicalJournal, 1978, 2, 1457-1459) 、その活性測定は痴呆や老化の診断、治療の評価や病態解明に大きく貢献する。従来、中枢局所の BChE 活性を測定する方法としては、死後の脳のホモジネートあるいは脳切片を組織化学的に染色し画像処理により測定する方法が知られている。しかしながら、これらの方法はいずれも死後の脳を対象としたものであり、生きているヒトや動物に適用することはできなかった。
【０００３】
一方、アセチルコリンエステラーゼに関しては、放射性同位元素で標識されたアナログを用いてポジトロン断層撮像法により測定する方法が報告されている（lrie  et  al., J．Nuc1．Med ．37, 649 −655, 1996 ）。従って、このような状況においては、死後の脳ではなく、生きているヒトや動物を対象としてin vivo でもBChE活性を測定することのできる新しい技術的手段の実現が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するために、第１には、次の一般式（１）又は（２）
【０００５】
【化４】
0004026987.tif 000002
【０００６】
（式中、Ｒ1 はＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるブチリル基またはＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるバレリル基を示し、Ｒ2 は、非放射性低級アルキル基または放射性低級アルキル基を示す。）
で表される光学活性な N- 置換ピロリジン誘導体またはその塩を提供する。また、この出願の発明は、第２には、次の一般式（３）又は（４）
【０００７】
【化５】
0004026987.tif 000003
【０００８】
（式中、Ｒ1はＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるブチリル基またはＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるバレリル基を示し、Ｒ2は、非放射性低級アルキル基または放射性低級アルキル基を示す。）で表される光学活性な N- 置換ピロリジン誘導体またはその塩を提供する。
【００１０】
そしてこの出願の発明は、第３には、前記第１または第２の発明のトレーサー化合物の１種以上を有効成分とする中枢局所ブチリルコリンエステラーゼ活性測定用試薬を提供する。
【００１１】
以上のとおりのこの出願の発明は、発明者らによる検討において、特定の性質を有するラジオトレーサーを用いて脳局所の放射能濃度を測定し、脳局所の BChE 活性を求めることができることを見出し、その知見に基づいて完成されたものである。すなわち、上記測定のための条件として、
１）脂溶性が高く容易に脳血液関門を通過して脳に入る、
２）脳内でBChEにより特異的に加水分解される、
３）加水分解により生成されるアルコール体は脂溶性が低く脳中に留まる、
４）脳外で生成されたアルコール体は脳に移行しない、
という性質を満たすことが必要であることから、これらの条件を満たす化合物について鋭意研究を重ねた結果、この出願の発明の新規な光学活性N−置換ピロリジン誘導体が見出された。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以上にその実施の形態について説明する。まずこの発明の前記の一般式（１）（２）（３）（４）で表される光学活性なN−置換ピロリジン誘導体においては、符号Ｒ1 は、ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるブチリル基またはＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3で表されるバレリル基である。
【００１３】
また、前記の符号Ｒ2 は、非放射性もしくは放射性のフッ素原子（Ｆ）等の置換基を適宜に有していてもよい低級アルキル基であるが、アルキル基の炭素数は６程度までのものが挙げられる。非放射性低級アルキル基を構成する炭素原子としては同位体13Ｃを有していてもよい。そして放射性低級アルキル基を構成する炭素原子としては14Ｃまたは11Ｃを、またフッ素原子としては18Ｆを有しているものとすることができる。
【００１４】
より具体的に例示すると、非放射性低級アルキル基としては、ＣＨ3 、ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2 、ＣＦ3 、ＣＨ2 ＣＨ2 Ｆ、13ＣＨ3 が、また、放射性低級アルキル基としては、14ＣＨ3 、11ＣＨ3 、ＣＨ2ＣＨ218Ｆが好適なものとして例示される。以上のとおりのこの出願の発明の光学活性なN−置換ピロリジン誘導体は、無機物、または有機物との塩、錯塩等であってもよい。
【００１５】
そして、この発明の以上の光学活性化合物は、公知の方法をはじめとして各種の方法により製造することができる。
たとえば、その代表例としての製造ルートは以下のように例示することができる。
なお、反応式中の数字は、後述の実施例における化合物の表示に対応している。
【００１６】
【化７】
0004026987.tif 000004
【００１８】
次に各工程について説明する。
工程(a)
N-tert-ブトキシカルボニルアルコール誘導体（(R)-7, および(R)-7 から光延反応によって導かれる(S)-７、(R)-および(S)-10）をピリジン存在化、塩化ブチリルあるいは塩化バレリルと、塩化メチレン等の溶媒中室温にて反応させることにより、対応する N-tert-ブトキシカルボニルブチルエステル誘導体（(R)-および (S)-8a 、(R)-および(S)-11）、ならびにN-tert- ブトキシカルボニルバレリルエステル誘導体（(R)-および (S)-8b ）が得られる。
工程(b)
N-tert-ブトキシカルボニルブチルエステル誘導体（(R)-および(S)-8a、(R)-および(S)-11）、および N-tert-ブトキシカルボニルバレリルエステル誘導体（(R)-および(S)-8b）を10当量の塩酸／酢酸エチル等にて室温処理することにより対応するアミノエステル誘導体（(R)-および (S)-9a 、(R)-および (S)-9b 、 (R)- および(S)-12）が得られる。
工程( c)
アミノエステル誘導体（R）- および (S)-9a 、(R)-および (S)-9b 、(R)-および(S)-12）を炭酸カリウムのような塩基存在下、あるいは塩基非存在下ヨウ化メチル（11C 、13C 、14C にて標識されたものを含む）を反応させて1-6 （R2=CH3, 11CH3,13CH3,14CH3）が得られる。
【００１９】
以上説明したとおりのこの出願の発明の光学活性なN−置換ピロリジン誘導体は、中枢局所BChEをポジトロン断層撮影法もしくは核磁気共鳴撮影法等により体外から非侵襲的に活性測定を行うのに有用な測定試薬もしくはその調製のための材料となるものである。つまり、この発明において提供される中枢局所ブチリルコリンエステラーゼ活性測定用試薬は、上記化合物のうちのトレーサー化合物の１種以上を有効成分としている。
【００２０】
そしてこの発明の非侵襲的ブチリルコリンエステラーゼ活性の測定方法では、上記トレーサー化合物を用い、このものの加水分解物をＣＴあるいはラジオトレーサーにより測定する。
ここでトレーサー化合物は、陽電子放出核種を持つものであることを意味している。
【００２１】
もちろん、この発明の上記光学活性化合物は、このトレーサー化合物としてだけでなく、脳内機序の解明や医薬品合成のための中間体等として有用であることは言うまでもない。
次に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。
【００２２】
【実施例】
＜実施例１＞
(R)-N-tert- ブトキシカルボニル-3- ヒドロキシピロリジン((R)-7) 1.0 g （5.3 ミリモル) を塩化メチレン10 ml に溶かし、ピリジン 790 mg （10ミリモル）を加える。塩化ブチリル850 mg（8 ミリモル）を加え、室温で14時間反応させる。
【００２３】
酢酸エチル100 mlを加えた後、有機層を水、5 % 塩酸水、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で順次洗浄する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残さをカラムクロマトグラフィー（シリカゲルC-200,  溶出液: ヘキサン: 酢酸エチル＝4:1 ）にて精製すれば、(R)-N-tert- ブトキシカルボニル-3- ブチリルオキシピロリジン((R)-8a)を油状物質として1.13 g（収率83% ）得る。その物性値は以下のとおりである。
【００２４】
【表１】
0004026987.tif 000005
【００２５】
＜実施例２＞
(R)-N-tert-ブトキシカルボニル-3- ブチリルオキシピロリジン ((R)-8a) 500 mg（1.95ミリモル）を酢酸エチル 5 ml に溶かし、4N塩酸／酢酸エチル 5 ml を氷冷下加える。
室温で1 時間反応させた後、酢酸エチルを減圧下、室温以下にて留去し、(R)-3-ブチリルオキシピロリジン塩酸塩を油状物質として380 mg（施光度;[a]D20+11.1 °(c=0.5, CHCl3), 1H NMR(CDCl3) δ:0.89(3H,t,CH3), 1.61(m,2H,CH2),  2.10-2.35(4H,m,CH2), 3.30-3.65(4H,m,2xCH2), 5.32(1H,m,CH), 9.95(2H,brs,HCl,NH) ; 13C NMR(CDCl3): 13.49(q), 18.06(t), 30.94 (t), 35.81(t),43.70(t), 50.15(t), 71.91(d), 172.84(s)）を得る。
【００２６】
塩酸塩300 mg（1.55ミリモル）をクロロホルム5 mlに溶かし、飽和したアンモニア／クロロホルム溶液5 mlを氷冷下に加える。
室温で5 分反応させた後、不溶物をろ過し溶媒を減圧留去して(R)-3-ブチリルオキシピロリジン((R)-9a)を油状物質として180mg （収率74% ）を得る。その物性値は以下のとおりである。
【００２７】
【表２】
0004026987.tif 000006
【００２８】
＜実施例３＞
(R)-3-ブチリルオキシピロリジン((R)-9a) 300 mg （1.91ミリモル）をアセトン5 mlに溶かし、炭酸カリウム200 mg, ヨウ化メチル0.24mlを加え室温で６時間反応させる。
不溶物をろ過し溶媒を減圧留去して得られた残さをカラムクロマトグラフィー（シリカゲルC-200,溶出液: エタノール: 酢酸エチル＝1:10）にて精製すれば、(R)-N-メチル-3- ブチリルオキシピロリジン(1a)を油状物質として 140 mg （収率 43%）を得る。その物性値は以下のとおりである。
【００２９】
【表３】
0004026987.tif 000007
【００３０】
＜実施例４＞
(R)-N-tert- ブトキシカルボニル-3- ヒドロキシピロリジン((R)-7) 500 mg（2.7 ミリモル）をテトラヒドロフラン 10 mlに溶かし、安息香酸685 mg（5.6 ミリモル）、トリフェニルホスフィン  1.47 g（5.6 ミリモル）、およびジエチルアゾジカルボキシラート 975mg（5.6 ミリモル）を加え室温で1 時間撹拌する。
【００３１】
反応液に酢酸エチル100 mlを加えた後、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で順次洗浄する。
有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残さをカラムクロマトグラフィー（シリカゲルC-200,  溶出液 :ヘキサン :酢酸エチル＝4 : 1 ）にて精製すれば、(S)-N-tert- ブトキシカルボニル-3- ベンゾイルオキシピロリジンを白色結晶として640 mg（収率 82%）（施光度; [α]D20+39.5 °(c=1.1, CHCl3); 融点,  65 ℃ ;元素分析: C16H21NO4.  計算値 (%) C, 65.96;H, 7.27;N, 4.81.実測値(%) C, 65.82;H, 7.47;N, 4.48. ;1H NMR(CDCl3)δ:1.45(9H,s,t-Bu),2.17(2H,m,CH2), 3.40-3.65(4H,m,2xCH2), 5.51(1H,m,CH), 7.40-7.60 (3H,m,aromatic protons), 7.90-8.10(2H,m,aromaticprotons) ）を得る。  ベンゾエート500 mg (1.7 ミリモル）をメタノール 5 ml に溶かし、2N水酸化ナトリウム2 mlを加え、室温にて1 時間反応させる。
【００３２】
反応混合物に酢酸エチル100mlを加え、水で洗浄する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残さをカラムクロマトグラフィー（シリカゲルC-200, 溶出液；ヘキサン：酢酸エチル＝1:1 ）にて精製すれば、 (S)-N-tert-ブトキシカルボニル-3- ヒドロキシピロリジン ((S)-7)を油状物質として290 mg（施光度; [α]D20+22.9 °(c=1, CHCl3), 収率 90%）得る。
【００３７】
＜実施例５＞
実施例４によって得られた(S)-N-tert--ブトキシカルボニル-3- ヒドロキシピロリジン（(S)-7）を用いて実施例１から３と同様の操作により(S)-N-メチル-3-ブチリルオキシピロリジン(2a)が得られる。
＜実施例６＞
(R)-3-ヒドロキシピロリジン((R)-7) から実施例１から３と同様の操作により(R)-N-メチル-3- バレリルオキシピロリジン(1b)を、また(S)-３- ヒドロキシピロリジン（(S)-7）から(S)-N-メチル-3- バレリルオキシピロリジン(2b)が得られる。
【００３８】
【表６】
0004026987.tif 000008
【００３９】
【表７】
0004026987.tif 000009
【００４０】
【表８】
0004026987.tif 000010
【００４１】
＜実施例７＞
(S)-N-tert--ブトキシカルボニル-2- ヒドロキシメチルピロリジン((S)-10)を用いて実施例１から３と同様の操作により(S)-N-メチル-2- ブチリルオキシメチルピロリジン(3a)を、また(R)-N-tert- ブトキシカルボニル-2- ヒドロキシメチルピロリジン((R)-10)から(R)-N-メチル-2- ブチリルオキシメチルピロリジン(4a)が得られる。
【００４２】
【表９】
0004026987.tif 000011
【００４３】
【表１０】
0004026987.tif 000012
【００４４】
【表１１】
0004026987.tif 000013
【００４９】
＜実施例８＞
(R)-3-ブチリルオキシピロリジン（(R)-9a）15mg (100 m モル)と[14C]CH3I(1 mCi) をアセトン中50-55 ℃にて20分反応する。過剰の無水塩酸を含む酢酸エチルを反応液に加えた後、溶媒を減圧留去する。残さを0.2ml のメタノ−ルに溶かしPTLC(Preparativethinlayer chromatography) にて精製する（展開溶媒 酢酸エチル／イソプロパノ−ル／アンモニア＝15／ 5／1 ）。
【００５０】
標品(1a)と同じRf値(0.8) で、放射活性を有する部分を集め、メタノ−ル／クロロホルム＝1 ／ 2にて抽出し、(R)-N-[14C] メチル-3- ブチリルオキシピロリジン(1c:R1=COCH2CH2CH3, R1=14CH3) が得られる。放射化学収率は[14C]MeIから計算して80% 以上である。
＜実施例９＞
(R)-3-ブチリルオキシピロリジン（(R)-9a）1mg を0.3ml のジメチルフォルムアミドに溶かした反応容器に[11C]MeIを加えて70℃で3 分加熱する。反応液をHPLC（高速液体クロマトグラフィ−）にてそのまま精製する（カラム：逆相MegapakSIL C18-10, 直径 7.5mm、長さ250mm : 溶出溶媒 : 20%アセトニトリル :80% 酢酸アンモニア−酢酸バッファ−(3mM, pH4.9)；flow rate ：6 ml／分） 。放射活性のあるピ−クを集め（ピ−クトップ 9.7 分）溶媒を留去し(R)-N-[11C] メチル-3- ブチリルオキシピロリジン(1d:R1=COCH2CH2CH3, R2=11CH3) が得られる。
【００５１】
一部をTLC ( シリカゲル、F-60-254, Merck 製）にスポットし、標品(1a)とともに酢酸エチル／イソプロパノ−ル／アンモニア＝15／5 ／1 にて展開し、ニンヒドリン発色および放射能定量により標識化合物のRf値と標品のRf値が一致することを確認した。
＜試験例１＞
ラット大脳皮質を摘出し、0.1Mリン酸バッファ−(pH 7.4)を用い100mg tissue／ ml のホモジネ−トを調製した。このホモジネ−ト200 μl14Cにて標識した実施例１１により得た化合物1cのリン酸バッファ−溶液 20 μl (1mCi)を加え、経時的にインキュベ−ションしてブチリルコリンエステラ−ゼによる加水分解速度をラジオTLC により定量した。
【００５２】
一方同じ反応系にブチリルコリンエステラ−ゼの特異的阻害剤である isoOMPAを加えて同じ実験を行なうと加水分解速度は著しく阻害され、その特異性は87% であった。また、エステル体と加水分解産物であるアルコール体のオクタノールー水系における分配係数はそれぞれ0.55と0.008 であり、エステル体は脂溶性で脳血液関門を通過しやすく、一方アルコール体は親水性で脳内に留まる性質を有している。
【００５３】
この発明の各種標識化合物を用いた相対反応速度と特異性を表１に示す。なお、トレーサー化合物１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、および４Ｃは、各々、一般式（１）（２）（３）（４）において、符号Ｒ1 はＣＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ3 を、符号Ｒ2 は、14ＣＨ3 を示す光学活性化合物を示している。いずれの化合物もブチリルコリンエステラーゼに対する特異性は高く、またその反応速度に関しては多様な値が得られ、測定の目的に応じて各種の化合物を選択できることが示され、これらの有効性が明らかになった。
【００５４】
【表１５】
0004026987.tif 000014
【００５５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したように、この出願の発明によって、死後の脳ではなく、生きているヒトや動物を対象としてin vivo でもBChE活性を測定することのできる試薬等として有用な、新規な光学活性N−置換ピロリジン誘導体が提供される。
【００５６】
そして、この出願の発明によって、これら光学活性化合物を用いての非侵襲的なBChE活性の測定が可能になる。