(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号８，９，１０，１１，１２及び１３から成る群から選択される、単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１の単離ペプチドであって、配列識別番号８，９及び１０から成る群から選択される、単離ペプチド。
【請求項３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ５３と、請求項１の単離ポリペプチドとから成る、単離複合体。
【請求項４】
請求項１の単離ポリペプチドと、少なくとも一つのアジュバントを含むヘルパーＴ細胞増殖刺激用組成物であって、前記ポリペプチドが、配列識別番号８，９又は１０であるヘルパーＴ細胞増殖刺激用組成物。
【請求項５】
請求項１の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
【請求項６】
請求項５の単離核酸分子を含み、プロモーターに作動可能に連結された発現ベクター。
【請求項７】
配列識別番号８，９及び１０により規定されるポリペプチドからなる少なくとも二つの混合物を含むヘルパーＴ細胞増殖刺激用組成物。
【請求項８】
請求項７の組成物であって、アジュバントを更に含むヘルパーＴ細胞増殖刺激用組成物。
【請求項９】
発現用キットであって、以下のそれぞれの単離核酸分子が別個の容器に収納されて含まれる発現用キット：
（ｉ）請求項１の単離ペプチドをコードする単離核酸分子；及び
（ｉｉ）ＨＬＡ−ＤＲ５３分子をコードする単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項５の単離核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項１１】
請求項６の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１２】
ヘルパーＴ細胞の増殖を生体外で刺激する方法であって、生体外でＴ細胞含有サンプルを、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ５３と請求項２のペプチドからなる複合体を認識するヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するために十分な量の前記複合体と接触させる工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、前記複合体は細胞の表面上にある方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、前記各細胞は、前記サンプルと同一の被験者から採取される方法。
【請求項１５】
請求項１３の方法であって、前記細胞は非増殖性である方法。
【請求項１６】
請求項１３の方法であって、前記細胞は組換え細胞である方法。
【請求項１７】
請求項１２の方法であって、前記複合体は細胞表面から遊離した状態にある方法。
【請求項１８】
ヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するための薬剤であって、前記薬剤は、請求項２からなる少なくとも一つのペプチドを含有し、かつ、前記ペプチドとＨＬＡ−ＤＲ５３からなる複合体を形成し、そしてそれに対して特異的であるヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するに十分な所定量を、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性である被験者に投与することを特徴とする、薬剤。
【請求項１９】
請求項１８の薬剤であって、少なくとも一つのペプチドを局所的に投与することを特徴とする、薬剤。
【請求項２０】
請求項１８の薬剤であって、更に、前記少なくとも一つのペプチドに加え、少なくとも一つのアジュバントを含むことを特徴とする、薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、１９９６年１０月３日に出願され、現在では米国特許第                    号である出願番号第０８／７２５，１８２号の一部継続出願である、１９９７年９月１５日出願の出願番号第０８／９３７，２６３号の一部継続出願である、１９９８年４月１７日出願の出願番号第０９／０６２，４２２号の一部継続出願である。これら出願の全てが本明細書において参考文献として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌に関連する抗原に由来するＨＬＡ結合ペプチドに関する。これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
【０００３】
背景及び従来技術
感染症、癌、自己免疫疾患等の多くの病理的状態が、或る種の分子の不適切な発現によって特徴付けられることが明確に確立されている。従って、これらの分子は、特定の病理状態又は異常状態についての「マーカー」として機能する。診断用「標的」即ち、これらの異常状態を診断するために同定されるべき物質としてのそれらを利用する以外に、これらの分子は、診断および／又は治療薬を作り出すために使用可能な試薬として作用する。これの非限定的な一具体例は、特定のマーカーに対して特異的な抗体を産生するための癌マーカーの使用である。さらに別の非限定的な具体例は、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を産生するためのＭＨＣ分子と複合化するペプチドの使用である。
【０００４】
当然ながら、このような物質の調製には、これらを産生するために使用される試薬供給源が予め要求される。細胞からの精製は、それを実施する確実な方法から程遠い１つの面倒な方法である。別の好適な方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子の単離であり、次いで、この単離されたコードされた分子を使用して所望の分子を発現させる。
【０００５】
今日まで、たとえばヒトの腫瘍においてこのような抗原を検出するために二つのストラテジーが使用されてきた。これらは、それぞれ遺伝学的アプローチおよび生化学的アプローチと称される。遺伝学的アプローチは、たとえば、本明細書において参考文献として援用されるデ・プレーン（ｄｅＰｌａｅｎ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７５（１９８８）によって例示される。このアプローチでは、腫瘍から得られたｃＤＮＡライブラリーの数百プールのプラスミドを、ＣＯＳ細胞等のレシピエント細胞に、又は、その特定の抗原の発現についてテストされた腫瘍細胞系の抗原陰性改変体にトランスフェクトする。たとえば、本明細書において参考文献として援用されるオー・マンデルボイム（Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ）等，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６９（１９９４）によって例示される前記生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ−クラスＩ分子に結合したペプチドの酸溶出に次ぐ逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に基づくものである。抗原性ペプチドは、抗原提示が損なわれた変異細胞系の未提示（ｅｍｐｔｙ）ＭＨＣ−クラスＩ分子にそれらが結合した後に同定され、次いで細胞傷害性Ｔ−リンパ球との特異的な反応を誘発する。これらの反応には、ＭＴＴアッセイ、又は51Ｃｒ放出アッセイによって測定可能である、ＣＴＬ増殖の誘発、ＴＮＦ放出、及び標的細胞の溶解が含まれる。
【０００６】
抗原の分子的規定に対するこれら二つのアプローチには以下の欠点がある：第一に、それらは極めて面倒で、時間を費やし、コスト高であり、そして；第二に、それらは事前に規定された特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞系（ＣＴＬｓ）の樹立に依存する。
【０００７】
抗原の同定及び分子的規定に対してのこれら二つの公知のアプローチに固有の問題点は、これらの方法は、共に、ヒトの腫瘍におけるごく小数の新規な抗原を規定することにしか成功していないという事実によって最も顕著に示される。たとえば、ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｅｎ）等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）；ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）；クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４）；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３１１５−３５１９（１９９４）を参照のこと。
【０００８】
更に、記載された方法論は、考慮下にあるタイプの癌の、樹立されて恒久的な細胞系が入手可能であることに依存している。たとえば、エットゲン（Ｏｅｔｔｇｅｎ）等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１０：６０７−６３７（１９９０）によって示されているように、特定の癌からの細胞系の樹立は極めて困難である。また、いくつかの上皮細胞タイプの癌は、インビトロにおいてＣＴＬに対してたいした影響を受けず、慣習的な分析が不可能であることが周知である。これらの問題が、関連抗原を同定するための別の方法を開発することを当該分野に促してきた。
【０００９】
一つの重要な方法が、本明細書において参考文献として援用されるサヒン（Ｓａｈｉｎ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１８１０−１１９１３（１９９５）により記載されている。更に、米国特許第５，６９８，３９６号及び１９９６年１月３日に出願された出願番号第０８／４７９，３２８号もまた参照のこと。これら三つの文献すべてが本明細書において参考文献として援用される。要約すると、この方法は、原核生物ホスト中に於いてｃＤＮＡライブラリーを発現させるものである（これらのライブラリーは、腫瘍サンプルから得られる）。次に、高力価の体液応答を惹起する抗原を同定するべく、発現したライブラリーを、吸収され、そして希釈された血清によって免疫スクリーニングする。この方法論は、ＳＥＲＥＸ法（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）として既知である。この方法論は、過去に同定された腫瘍関連抗原の発現を確認するため、及び、新規な抗原を検出するために使用されてきた。上述で参照される特許出願およびサヒン（Ｓａｈｉｎ）等，ならびに、クルー（Ｃｒｅｗ）等，ＥＭＢＯ  Ｊ１４４：２３３３−２３４０（１９９５）（前出）を参照のこと。
【００１０】
このＳＥＲＥＸ方法論は食道癌サンプルに適用されており、抗原が今回同定され、そのコード化核酸分子が単離され、そしてクローニングされた。これは複数の特許出願における課題であり、これらの一部は本明細書において参考文献として援用される。その抗原および分離体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ）は、癌患者の血清中における抗体に対して反応することが見出された。又、この分子由来のペプチドがＨＭＣ分子と結合し、細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞両方との応答を誘発することも見出された。本発明のこれらの特徴は、以下の開示において見られる。
【００１１】
好適実施例の詳細な説明
例１
全ＲＮＡを、周知の方法を使用して、ウェルのスナップ凍結標本の食道の分化したａｑｕａｍｏｓ細胞癌から浸解させて抽出した。そのような方法の一例としては、たとえば、チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ），Ｊ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）を参照のこと。このＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを次に、製造業者の指示に従って、λＺＡＰファージベクター中にトランスフェクトさせた。このλＺＡＰライブラリーを、次に、Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトさせて、１．６ｘ１０6の一次単離株を得た。
【００１２】
次に、本明細書において参考文献として援用されるサヒン（Ｓａｈｉｎ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）のＳＥＲＥＸ方法論を使用した。要約すると、自己血清を、食道癌細胞由来のｃＤＮＡクローンを含まないλＺＡＰファージをトランスフェクトさせたＥ．Ｃｏｌｉ溶解物とこの血清を組み合わせることにより、自己血清からＥ．Ｃｏｌｉについて内因性である分子に対する抗体を除去した。
【００１３】
次いで、この除去済み血清を希釈し、そしてファージプラークを含有するニトロセルロース膜と混合させた。前記プラークを、室温で一晩インキュベートした。次に洗浄し、フィルターをアルカリフォスファターゼと共役させた結合ヤギ抗ヒトＦＣλ二次抗体とインキュベートさせて、次いで反応性ファージプラークを、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスファターゼおよびニトロブルーテトラゾリウムとインキュベーションすることにより可視化させた。全部で１３の陽性クローンを見出した。
【００１４】
例２
同定後、前記反応性クローンを、希釈クローニングを介してモノクローナルにサブクローン化させ、次いでヒト血清を使用してテストした。これらのクローンを、次いで精製し、インビトロで切除し、次いで製造業者の指示を使用して、ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドに変換させた。次に、インサートされたＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限マッピングを使用して異なるインサートを判定するために評価した。約５００〜約１．３キロベース対のサイズの範囲の８つの異なるインサートを同定した。これらのクローンを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ自動シーケンサーを使用して配列決定した。
【００１５】
表１にその結果を示す。一つの遺伝子は、４つのオーバラップするクローンによって示し、第２のものは３つのオーバラップするクローンによって示し、そして残りの６つのものは一つのクローンのみによって示した。
【００１６】
相同性検索によって、ＮＹ−ＥＳＯ−２，３，６，７と称されるクローンが既知であることが示された。エリセット（Ｅｌｉｓｅｔ）等，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１６：５３３−５４０（１）９３）；スプリッツ（Ｓｐｒｉｔｚ）等，Ｎｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１０３７３−１０３９１（１９８７）；ラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｓ）等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｓ ４：１７５−１８０（１９９３）；クロザット（Ｃｒｏｚａｔ）等，Ｎａｔｕｒｅ３６３：６４０−６４４（１９９３）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｈ１８３６８及びＤ２５６０６を参照のこと。これらクローンの内の二つ（ＮＹ−ＥＳＯ−３およびＮＹ−ＥＳＯ−６）は、様々な正常であるヒト組織中において発現されることが既に示されている。系統制限の証拠はまだ見つかっていない。ＮＹ−ＥＳＯ−６（ｃＤＮＡ）は、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子の３‘未翻訳領域であると考えられる。本明細書では報告されない実験に於いて、ＮＹ−ＥＳＯ−６の配列決定とサザンブロッティング分析によって、癌の転座又は点変異の証拠は示されなかった。これらのクローンの内の４つ、即ち、ＮＹ−ＥＳＯ−１，４，５及び８は、調べられたデータベース中の配列に対する強い相同性を示さなかったので、それ以上は調べられなかった。
【００１７】
【表１】
0003995884.tif 000002
【００１８】
例３
ＮＹ−ＥＳＯ１，４，５及び８クローンのｍＲＮＡ発現を評価するために研究を行った。これを行うために、３００−４００塩基対のｃＤＮＡセグメントを増幅し、かつ、プライマー融解温度を６５−７０℃の範囲とするように、各配列に対する特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。次に、市販の材料と標準プロトコールとを使用して逆転写ＰＣＲを行った。様々な正常細胞タイプ及び腫瘍細胞タイプをテストした。クローンＮＹ−ＥＳＯ−４及びＮＹ−ＥＳＯ−８は遍在しており、それ以上は研究しなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−５は、本来の腫瘍および正常食道組織中において高レベルの発現を示し、それが分化マーカーであったことを示唆した。
【００１９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、精巣において腫瘍ｍＲＮＡとして発現するが、正常な結腸、腎臓、肝臓又は脳組織中では発現しないことが判った。この発現パターンは、他の腫瘍拒絶抗原前駆体と一致している。
【００２０】
例４
上述したＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＮＹ−ＥＳＯ１に関して、遥かに完全に揃っている正常組織及び腫瘍組織について行った。表２，３及び４にこれらの結果を示す。要約すると、ＮＹ−ＥＳＯ１は、正常な精巣及び卵巣細胞中で高度に発現することが判った。少量のＲＴ−ＰＣＲ産生物が正常な子宮筋層中において見出されたが、子宮内膜では見出されず、その陽性の提示は一貫していなかった。正常な食道及び皮膚を含む、種々の細胞タイプの扁平上皮もまた陰性であった。
【００２１】
関連しない細胞系の腫瘍をテストした時、１１の黒肉腫細胞系の内、２つが強い発現を示し、６７の黒肉腫標本の内１６と、３３の胸部癌標本の内の６つと、４の膀胱癌の内の４つが強い発現を示した。その他の腫瘍タイプではまばらに発現があった。
【００２２】
【表２】
0003995884.tif 000003
【００２３】
【表３】
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【００２４】
【表４】
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【００２５】
癌患者の血清中における抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体の存在がＥＬＩＳＡによって測定可能であるか否かを確認するために更に別枠の実験を行った。
【００２６】
詳述すると、濃度１ｕｇ／ｍｌのコーティング緩衝溶液（１５ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3，３０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，ｐＨ９．６，０．０２％  ＮａＮ3）中の組換えＮＹ−ＥＳＯ−１を、マイクロウェルプレート（各ウェルにつき１０ｕｌの溶液）に吸着させ、その後、４℃で一晩保存した。これらのプレートを、燐酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、１０ｕｌ／ウェルの２％ウシ血清アルブミン／燐酸緩衝化生理食塩水でブロックした。洗浄後、２％ウシ血清アルブミン中の１０ｕｌ／ウェルの希釈血清を前記ウェルに添加した。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１０ｕｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリ燐酸共役体を、１：１５００の希釈率で添加した。この溶液を室温で１時間インキュベートし、その後、洗浄し、前記アルカリフォスファターゼについての基質の溶液を添加した（１０ｕｌ／ウェル）。室温で２５分間後、ウェルを、蛍光プレートリーダーで読み取った。それらの結果を下記の表に示す。
【００２７】
0003995884.tif 000006
【００２８】
腫瘍に於けるＮＹ−ＥＳＯ−１のｍＲＮＡの発現と、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対する免疫応答との間に相関性が存在するか否かを調べるために、６２の黒肉腫患者からのデータを比較した。その血清がＮＹ−ＥＳＯ１に対して反応性である（即ち、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を有している）患者はすべて、ＮＹ−ＥＳＯ−陽性腫瘍も有していたのに対して、ＮＹ−ＥＳＯ−１陰性腫瘍を有する患者であり、一方で、その血清中にＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を示したものはいなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性患者は、ある比率でその抗体を欠如していた。黒肉腫の内、約２０−４０％がＮＹ−ＥＳＯ−１を発現し、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有する患者のみが抗体を有していたことから、それらのデータは、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有する患者は高い確率で、そのタンパク質に対する抗体を産生することを示唆し、従って、診断に於いて有用な広範囲なアッセイと処理に対する応答性を示唆するものである。
【００２９】
例５
次に、ＮＹ−ＥＳＯ−１転写物のサイズを調べ、組織発現パターンを確認するためにノザンブロッティング分析を行った。オースベル（Ａｕｓｂｅｌ）等，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５）の方法を使用した。具体的には、各レーンにつき、２０ｕｇの全ＲＮＡを、ホルムアミドおよびホルムアルデヒドを含有する緩衝液に溶解させ、６５℃に加熱し、その後、３％ホルムアルデヒドで１．２％アガロースゲルにおいて分離させ、ニトロセルロース紙へ移した。次に、32Ｐ標識化プローブを使用してハイブリダイゼーションを行い、その後、高いストリンジェントで洗浄した。最終洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで６０℃で１５分間行った。
【００３０】
精巣および前述のアッセイに於いてＮＹ−ＥＳＯ−１に対し陽性であった黒肉腫細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）由来のＲＮＡは、約０．８〜０．９ｋｂのＲＮＡ転写物を示した。食道肉腫標本は、０．４−０．９ｋｂの範囲中でスミアを示し、部分的な減少を反映している。テストした別の組織又は細胞系由来のＲＮＡは転写体を示さなかった。
【００３１】
完全な転写物をコードするｃＤＮＡを得るために、プラークハイブリダイゼーションと、ハイブリダイゼーションプローブとして本来のｃＤＮＡクローンとを使用して、前記食道ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。３×１０5のクローンをスクリーニングした時、６つの陽性を見出した。三つの最も長いクローンを配列決定した。オープンリーディングフレームの分析は、これら三つのすべてが、全コード化領域と、可変サイズの５‘未翻訳領域とを含むことを示した。長さが７５５塩基対（ポリＡを除く）の最も長いクローンは、５４３ベース対のコード化領域と、５’末端の５３の未翻訳塩基と、３‘末端の１５１の未翻訳ベース対とを有している。配列識別番号１を参照のこと（図３も参照）。
【００３２】
この長いＯＲＦは、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の推定配列が１８０のアミノ酸であることを示した。この一つの免疫陽性クローンは、これらの内の１７３をコードする配列を含んでいた。推定分子量は１７，９９５ダルトンである。
【００３３】
分析は、Ｎ−末端部中にグリシン残基が多く存在する（最初の８０の内の３０と、残りの１００の内の４）ことを示している。親水性分析によって、疎水性配列と親水性配列とが交互に出現し、長いＣ−末端疎水性テール部で終結し（アミノ酸１５２−１７２）、その後、短い親水性のテール部が続く、前記分子のＮ末端半分中に親水性抗原性配列が存在することが示された。このパターンは膜貫通ドメインであることを示唆する。複数の潜在的なＮ−ミリストリル化部位と、３つの燐酸化部位が存在するが、Ｎ−グリコシル化部位の証拠は存在しない。
【００３４】
例６
黒肉腫細胞系「ＮＷ−ＭＥＬ−３８」は、１９９５年、悪性黒肉腫を患う患者から樹立された。その被験者から、血清サンプル、末梢血液リンパ球、及び腫瘍サンプルが採取され、本明細書に記載される研究が行われるまで凍結された。この患者に於ける抗腫瘍Ｔ細胞応答を評価することを見越して、この患者のＨＬＡ型は、ＨＬＡ−Ａ１及びＨＬＡ−Ａ２であると判定された。
【００３５】
この患者由来の黒肉腫が、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するか否かを決定するために、標準方法を使用して腫瘍サンプルと細胞系ＮＷ−ＭＥＬ−３８との両方から全ＲＮＡを単離した。次に、再び標準方法を使用して、２マイクログラムの前記全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に供した。
【００３６】
次に、前記ｃＤＮＡを下記のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
【００３７】
５‘−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴ  ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣ  ＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧ  Ｇ’−３‘（配列識別番号２）、及び
ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣ  ＴＴＧＧＣＴＴＡＧＣ  ＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣ  ＴＧ−３‘（配列識別番号３）。
【００３８】
これらのプライマーは、ヌクレオチド２７１〜５９９に渡る配列識別番号１のセグメントを増幅するはずである。
【００３９】
６０℃のアニーリング温度を使用して、増幅を３５サイクルに渡って実施した。そのＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色によって、１．５％アガロースゲルにおいて可視化させた。
【００４０】
その結果は、前記腫瘍と細胞系との両方が配列識別番号１を発現したことを示した。これらの細胞系および腫瘍サンプルを後の実験に使用した。
【００４１】
例７
次に、上述した前記単離ｃＤＮＡ分子を使用して組換えタンパク質を作製した。具体的には、前記ｃＤＮＡを、標準的方法を使用してＰＣＲ増幅し、次に、Ｈｉｓタグを含む市販のプラスミドベクター、即ちｐＱＥ９にクローニングした。ここでは詳述しない作業に於いては、第２のベクターであるｐＱＥ９Ｋも使用した。これは、アンピシリン耐性ではなくカナマイシン耐性がｐＱＥ９Ｋに付与されている点でＰＱＥ９とは異なる。
【００４２】
前記プラスミドベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換し、陽性の形質転換体を制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって同定した。組換えタンパク質の生成をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを使用して誘導させ、タンパク質を周知の手順に従って、Ｎｉ2+イオンクロマトグラフィーカラムで精製した。次に、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により分析したところ、このタンパク質は、約２２キロダルトンの分子量のタンパク質であると同定された。このことは、その配列から予想されるタンパク質のサイズと一致している。他の二つの形態の組換えタンパク質もまた同定された。これらは、配列認識番号１において報告された、アミノ酸１０−１８０およびアミノ酸１０−１２１から成る。それらは、上述のように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約１４ｋＤおよび２０ｋＤの分子量をそれぞれ有する。
【００４３】
ＮＹ−ＥＳＯ−１をバキュロウイルス中で発現させるためにさらなるセットの実験を行った。詳述すると、ＮＹ−ＥＳＯ−１のｃＤＮＡインサートを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩでの開裂によって、前記ｐＱＥ９ベクターから分離させた。このインサートを、次に、予め同じ酵素によって開裂させた市販のバキュロウイルスベクターにサブクローニングした。標準的方法を使用して陽性クローンを判定し、これらをレシピエントＳｆ９細胞へトランスフェクトさせた。次に、組換えウイルスを使用して、１０％ウシ胎仔血清を添加した標準媒体（ＩＰＬ−４１）を使用して昆虫細胞を感染させた。この作業の感染多重度は２０であった。組換えタンパク質の発現を前述したように判定した。このベクターにおいて生成された組換えタンパク質はＨｉｓタグを有することから、前述と同様に、Ｎｉ2+アフィニティカラムで精製した。前記タンパク質は、１０−１８０アミノ酸から成り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２０ｋＤの分子量を有している。
【００４４】
次に、別の真核生物トランスフェクト細胞を作製した。これを行うために、前記ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする配列を上述のｐＱＥ９ベクターから単離し、次に、真核発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。次に、１５０ｎｇの前述したプラスミドと、１５０ｎｇの、ＨＬＡ−Ａ２．１のｃＤＮＡ又は、ＨＬＡ−Ａ１のｃＤＮＡのいずれかを含有したプラスミドｐｃＤＮＡ １Ａｍｐに細胞サンプルを接触させることによって、このベクターをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトさせた。周知であるＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法を使用した。次に、それらの細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、その後、それらをＣＴＬ刺激アッセイでテストした。具体的には、そのアッセイは、本明細書において参考文献として援用されるトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３５：１４５−１４８（１９９２）に従った。簡単に説明すると、１００％ヒト血清を添加した１００ｕｌのＲＰＭＩ中の２５００のＣＴＬ（ＮＷ３８−ＩＶＳ−１、後述の例９を参照のこと）を、ＣＯＳ−７トランスフェクタントを含有するマイクロウェルに添加した（２０，０００細胞／ウェル）。２４時間後、５０ｕｌの上清を各ウェルから収集し、そしてＴＮＦ−αのレベルを標準的アッセイにより測定した。即ち、ＷＥＨＩ１６４クローンの１３の細胞に対する細胞傷害性について、ＭＴＴを使用してテストした。陽性の細胞を、以下の例に記載されるようにウエスタンブロット分析に使用した。
【００４５】
使用したＣＴＬは、本明細書において参考文献として援用されるクヌート（Ｋｎｕｔｈ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５１１−３５１５（１９８４）に従って調製されたＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１であった。具体的には、前記被験者から採取された１０5の自己由来ＮＷ３８  ＭＥＬ−１腫瘍細胞と、１０6の末梢血液リンパ球とを組み合わせた混合リンパ球Ｔ細胞培養物を作成した。サイトカインであるＩＬ−２を添加し、この混合培養物を、１週間３７℃でインキュベートした。腫瘍細胞を除去し、５ｘ１０5の腫瘍細胞の新たなアリコートをＩＬ−２と一緒に添加した。このプロセスを、51Ｃｒ標識化ＮＷ−ＭＥＬ−３８細胞に対してテストした場合において強力な応答が見出されるまで、毎週繰り返した。応答性Ｔ細胞を収集し、後の実験で使用するまで凍結させた。
【００４６】
例８
次に、上述した血清サンプル、更に、上述した細胞系であるＮＷ−ＭＥＬ−３８から採取された細胞溶解物、および前述したＣＯＳ−７トランスフェクタント（前述）、ならびに精製組換えタンパク質（これもまた前述）を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。血清サンプルを、患者の治療の様々な時点で採取した。その結果において相違はなかった。
【００４７】
これらのアッセイに於いて、１ｕｇの組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質、又はいずれかのタイプの５ｕｌの細胞溶解物をＳＤＳで希釈して５分間煮沸し、１５％のＳＤＳゲルで電気泳動した。ニトロセルロース（０．４５ｕｍ）上で一晩ブロッティングし、３％のＢＳＡによりブロッキングした後に、そのブロット物を血清とインキュベートさせて１：１０，０００と１：１００，０００とに希釈し、或いは、陽性コントロールとして、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するモノクローナル抗体と、１：５０に希釈した。前記モノクローナル抗体は、本明細書において参考文献として援用され、以下に詳述するチェン（Ｃｈｅｎ）等，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５９１５−５９１９（１９９６）に従って作成した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２−３週間の間隔で組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質による５回の皮下注射によって免疫した。前記免疫処方物は、アジュバント中に５０ｕｇの組換えタンパク質を含有していた。第１回目の注射は完全フロイントアジュバントを使用し、以降は不完全フロイントアジュバントを使用した。前記免疫化されたマウスから脾臓細胞を採取し、マウス黒肉腫細胞系ＳＰ２／０と融合させてハイブリドーマを作製した。代表的なハイブリドーマであるＥ９７８をｍＡｂｓの作成に使用した。
【００４８】
ハイブリドーマを一旦作成すると、それらをクローン化し、その上清をマイクロタイタープレート上で標準固相ＥＬＩＳＡを使用して組換えタンパク質をスクリーニングした。アッセイは、本明細書において参考文献として援用されるディッポルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：６１１４−６１１８（１９８０）に従った。組換えＮＹ−ＥＳＯ−１を使用して一連の陰性コントロールも実施した。上述のＥ．ｃｏｌｉによって生成された組換えタンパク質に結合された血清抗体を、１：１０，０００希釈率でアルカリフォスファターゼで標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して可視化し、次いでＮＢＴ−ホスファートで可視化した。未トランスフェクトＣＯＳ−７細胞もコントロールとして使用した。健常な個人由来の血清もコントロールとして使用した。
【００４９】
１：１００，０００もの低い血清希釈物に於いて組換えタンパク質に対する強い反応が見られ、ＮＷ−ＭＥＬ−３８の溶解物に対する反応もまた見出された。未トランスフェクトＣＯＳ−７細胞に対する反応は無く、健常な個人由来の血清も反応性を示さなかった。
【００５０】
例９
４つの形態のＮＹ−ＳＯ−１は、上述したもの、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ中で配列識別番号１によって生成された形態と、アミノ酸１０−１８０から成る形態と、アミノ酸１０−１２１から成る形態と、アミノ酸１０−１８０から成る、上述したバキュロウイルス系中で発現された形態のものである。各形態を前述のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡに使用した。全ての形態のタンパク質は、様々な患者から採取された抗体、又は前述したマウスモノクローナル抗体に対して同様に反応性であることが見出された。
【００５１】
例１０
上述したＣＯＳ−７トランスフェクタントのテスト、及びこの例において記載されるアッセイに於いて、細胞溶解性Ｔ細胞系である「ＮＷ３８−ＩＶＳ−１」を使用した。この「ＣＴＬ」は、前記腫瘍細胞系であるＮＷ−ＭＥＬ−３８を使用して、上述の末梢血液リンパ球のインビトロ刺激によって作成された。これは標準的方法を使用して行われた。
【００５２】
前記ＣＴＬを、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性である二つの異種性の細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−３７及びＭＺ−ＭＥＬ−１８）と、ＭＨＣクラスＩ陰性の細胞系（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）と、ＨＬＡ−Ａ２陽性ではあるが、ＮＹ−ＥＳＯ−１陰性である細胞系（ＮＥ−ＭＥＬ−１４５）、更に、コントロール細胞系であるＫ５６２及び自己由来のフィトヘマグルチニン刺激芽細胞（ｂｌａｓｔｓ）と共に、ＮＷ−ＭＥＬ−３８（これは、ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２陽性で、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性であった）との、細胞傷害性アッセイに使用した。種々のエフェクター／標的比率を使用して、51Ｃｒ標識化標的細胞の溶解が測定されたパラメータであった。図５にこれを示す。
【００５３】
その結果は、ＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１が、自己由来細胞系ＮＷ  ＭＥＬ−３８と、ＨＬＡ−Ａ２及びＥＳＯ−１陽性である前記異系細胞系の両方を溶解することを示した。従って、前記ＣＴＬは、異系物質に対して反応性であった。図６を参照のこと。
【００５４】
例１１
患者ＮＷ３８はＨＬＡ−Ａ１陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性であったので、どちらのＭＨＣ分子が提示分子であるかを判定するために実験を行った。
【００５５】
ＣＯＳ−７細胞における上述と同じ実験を行った。但し、これらの実験では、ＨＬＡ−Ａ１ｃＤＮＡ又はＨＬＡ−Ａ２ｃＤＮＡの両方ではなく、いずれか一方により形質転換された共形質転換の別々の群が得られることに留意した。これらの結果は、ＣＴＬ ＮＷ３８−ＩＶＳ−１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＨＬＡ−Ａ２のみとを含むＣＯＳ−７トランスフェクタントを溶解したことを示す。図６を参照のこと。この作業によって前記ＣＴＬの特異性もまた確認された。なぜなら、例９に記載したＮＹ−ＥＳＯ−１陰性細胞、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞は、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドにプロセッシングされることが既知の他の分子に対し陽性であったからである。
【００５６】
例１２
前記提示ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２であると同定された後、このモチーフを満たす全てのペプチドを同定するために、本明細書において参考文献として援用されるダマロ（Ｄ‘Ａｍａｒｏ）等，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１３−１８（１９９５）及びドレイフホウト（Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ）等，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−１２（１９９５）によって示されるモデルを使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するアミノ酸配列のスクリーニングを行った。それによって推定されるアミノ酸配列の全てに対応するペプチドを、標準的技術を使用して合成し、次に、それらを、本明細書において参考文献として援用されるクヌート（Ｋｎｕｔｈ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５１１−３５１５（１９８４）に従って、細胞傷害性アッセイに使用した。具体的には、細胞系であるＣＥＭＸ７２１．１７４．Ｔ２（以降「Ｔ２」）を使用した。なぜなら、これは、抗原をＭＨＣ複合化ペプチドにプロセッシングせず、従って、本明細書に記載されるタイプの実験に理想的であるからである。Ｔ２細胞のサンプルを標準的方法を使用して１００ｕＣｉのＮａ（５１Ｃｒ）Ｏ４で標識化し、３回洗浄し、その後、１０ｕｇ／ｍｌのペプチドおよび２．５ｕｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンとインキュベートさせた。インキュベーションを、室温で１時間行った。次に、応答細胞（１００ｕｌのＣＴＬ ＮＷ３８−ＩＶＳ−１の懸濁物）を、９０：１のエフェクター／標的率で添加し、５％のＣＯ２を含む３７℃の水飽和雰囲気中で４時間インキュベートした。その後、プレートを、２００×ｇで５分間遠心分離し、１００ｕｌの上清を除去して放射能を測定した。５１Ｃｒ放出の比率を、既知であるストラテジーに従って測定した。ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列識別番号４）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列識別番号５）及びＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列識別番号６）がＣＴＬの三つの最良の刺激物質であることが見出された。これに匹敵する結果が、前述したように、細胞系ＮＷ−ＭＥＬ−３８およびＳＫ−ＭＥＬ−３７およびＭＺ−ＭＥＬ−１９を標的として使用した場合において見出された。
【００５７】
例１３
配列識別番号１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＬＡ結合モチーフに対応するペプチド配列について分析した。これは、本明細書において参考文献として援用されるパーカー（Ｐａｒｋｅｒ）等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１６３（１９９４）に教示されているアルゴリズムを使用して行われた。下記の表に於いて、前記アミノ酸配列と、それが結合すると推定されるＨＬＡ分子と、配列識別番号１中の位置が示されている。得られた複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞応答を誘発させるはずである。これは、本明細書において参考文献として援用されるファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ）等，Ｊ．Ｅｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３０３８−３０４３（１９９４）によって教示されている下記の方法を使用して当業者により測定することが可能であろう。
【００５８】
【表５】
0003995884.tif 000007
【００５９】
例１４
別の関連するペプチドを更に同定するためにさらなる実験を行った。これらの実験に於いて、安定腫瘍細胞系、即ち、ＭＺ−ＭＥＬ−１９を使用した。この細胞系は、本明細書において参考文献として援用されるイェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１８７：２６５−２６９（１９９８）によって記載されている方法を使用して、ＭＺ１９と称される患者から樹立されていたものである。細胞溶解性Ｔ細胞系、即ち、ＭＺ２−ＭＥＬ  １９−ＩＶＳ−１もまた、ＭＺ−ＭＥＬ−１９と、上述の例７と、更に、前出のイェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）等の記載される方法を使用して樹立された。このＣＴＬは、前記自己由来細胞系をＨＬＡ−Ａ２規制的様式に溶解した。これは標準的な方法を使用して測定された。前出のダマロ（Ｄ‘Ａｍａｒｏ）等によって記載されたモデルを使用して、ＥＳＯ−１中のＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを満たすすべての配列を同定した。この方法によって２６のペプチドを同定した。標準方法を使用して全てを合成し、精製し、そして完全性をテストした。次に、これらのペプチドを合成し、下記の実験でテストした。ＭＺ１９−ＩＶＳ−１を、例１２に記載のＴ２細胞と共に使用した。配列識別番号４と５のペプチドがＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、ＣＴＬ  ＭＺ１９−ＩＶＳ−１によって認識され、ＣＴＬ  ＭＺ１９−ＩＶＳ−１は前記細胞を溶解した。このＣＴＬもまた、ＨＬＡ−Ａ２および下記のデカペプチドの複合体を認識した。
【００６０】
ＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ
（配列識別番号７）、これは、配列識別番号１の１５６−１６７の部位において見出される。
【００６１】
例１５
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドからなる複合体を認識するか否かを調べるためにさらなる実験を構成した。
【００６２】
腫瘍細胞系ＭＺ−ＭＥＬ−１９は、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性であるとして既に分類されている。従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１を、ＨＬＡ−ＤＲ５３の結合モチーフを教示している、本明細書において参考文献として援用されるフタキ（Ｆｕｔａｋｉ）等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：２９９−３０１（１９９５）を使用してスクリーニングした。全部で２８のペプチドが、理論的にはＨＬＡ−ＤＲ５３および抗原提示細胞のみに結合するとされた。
【００６３】
末梢血液リンパ球（「ＰＢＬ」）を、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性として型分類されていた、転移性黒肉腫を有する２人の患者から単離した。
【００６４】
この型分類は、標準的な市販される試薬を使用して行われた。一人の患者は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（対立遺伝子１５０１−０５，１６０１−１６０３，１６０５及び０７０１）、ＨＬＡ  ＤＲＢ４＊（対立遺伝子（０１０１−０１０３）及びＤＢＲ５＊（対立遺伝子０１０１）に対して陽性であると分類し、一方で第２の患者は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊（対立遺伝子１４０１，１４０７，１４０８及び０９０１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊（対立遺伝子０２０１−０２０３）及びＤＲＢ４＊（対立遺伝子０１０１−０１０３）に対して陽性であると分類した。ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊の全ての対立遺伝子を、本明細書において参考文献として援用されるボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）等，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：４−１８（１９９２）に従って、ＨＬＡ−ＤＲ５３と称する。
【００６５】
前記ＰＢＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔリンパ球を除去するために適切な抗体でコーティングされた磁気ビードで処理した。残りの細胞を、４ｘ１０6細胞／ウェルの割合で２４ウェルプレートに播種し、ウェルのプラスチックに２４時間付着させた。付着していない任意の数の細胞を除去し、残りの細胞を抗原提示細胞として使用した。これらの細胞を、５ｕｇ／ｍｌの抗癌マインターフェロン抗体で、一晩４℃で予めコーティングしておいた９６ウェルの平底ニトロセルロースプレート中で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）によって刺激した。細胞を３．５ｘ１０5細胞／ウェルの割合で播種した。
【００６６】
次に、前記細胞に，４ｕｇ／ウェルのテストペプチド、又は、コントロールとして２ｕｇ／ウェルの前記完全ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をパルス供給（ｐｕｌｓｅｄ）した。
【００６７】
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ヒト血清、Ｌ−アスパラギン（５０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アルギニン（２４２ｍｇ／ｌ）及びＬ−グルタミン（３００ｍｇ／ｌ）を、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２と共に添加して１００ｕｌの最終容量としたＲＰＭＩ１６４０培地に（１ｘ１０5）細胞／ウェルの割合で添加した。
【００６８】
この混合物を、水飽和雰囲気中で３７℃で４８時間インキュベートした。その後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で６回洗浄し、次に、ビオチン処理抗インターフェロンγ抗体を０．５ｕｇ／ｍｌで添加した。前記抗体を、３７℃で２時間インキュベートし、その後、プレートを標準試薬で１時間展開させた。基質である３−エチル−９−アミノカルバゾールを添加して、次いで５分間インキュベートし、陽性は赤色スポットで示された。赤色のスポット／ウェルは、ペプチドとＨＬＡ−ＤＲ５３からなる複合体、又はＨＬＡ−ＤＲ５３と組換えＮＹ−ＥＳＯ−１からプロセッシングされたペプチドからなる複合体を認識したＣＤ４＋Ｔリンパ球の出現頻度の指標である。コントロールとして、試薬のみ（即ち、ＣＤ４＋細胞のみ）および前記（細胞）系のみを使用してアッセイを行った。
【００６９】
下記のペプチドが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を感作して、γインターフェロンを放出させることが見出された。
【００７０】
ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ
ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ
ＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩ
（配列識別番号８−１０）。
【００７１】
これらの三つのペプチドは、Ａｌａ又はＳｅｒの三つの下流側残基の手前の、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，又はＬｅｕの固定残基であり、前出のフタキ（Ｆｕｔａｋｉ）等によって記載されたＨＬＡ−ＤＲ５３に結合するためのモチーフを満たす。
【００７２】
ＨＬＡ−ＤＲ５３に結合するさらなるペプチドを見出した。
【００７３】
これらのペプチドは以下のものである：
ＧＡＡＳＧＬＮＧＣＣＲＣＧＡＲＧＰＥ
ＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡ
ＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲＱ
（配列識別番号１１−１３）。
【００７４】
上記例は、食道癌関連抗原をコードする核酸分子の単離を記載するものである。本明細書において、「関連」という用語を使用する理由は、その関連する分子が、その抗原を発現する、食道癌、黒肉腫、乳癌、前立腺癌及び肺癌等のその他の癌により発現されることが明らかであるからである。
【００７５】
本発明は、記載した抗原をコードし、かつストリンジェントな条件下で基準配列である配列識別番号１にハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書において使用される、「ストリンジェントな条件」とは、米国特許第５，３４２，７７４号に詳述されているような条件、即ち、６５℃で１８時間のハイブリダイゼーション、次いで２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１時間の洗浄を４回、次いで０．２ｘＣＣＳでの最終洗浄であり、より好ましくは、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３０分間での最終洗浄であり、更に、同レベルのストリンジェンシーを提供する更なる条件、ならびによりストリンジェントな条件についていう。
【００７６】
本発明の一部はまた発現ベクターであり、これはプロモーターに作動可能連結（すなわち、作動可能に連結された）様式である本発明の核酸分子を組み込んだものである。このようなベクターの構築は、当業者に周知に範囲にあり、目的の分子をコードする真核細胞系、又は原核細胞株を生成するための細胞の形質転換又はトランスフェクションもまた同様である。この様式において使用され得る宿主細胞の具体例は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（たとえば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等である。Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞及びその他の細菌もまた使用され得る。
【００７７】
本発明の一部はまた、本来のペプチド形態および翻訳後修飾形態の両者の本明細書において記載される抗原、ならびに配列認識番号１によりコードされるタンパク質の、少なくとも１０−１２１アミノ酸であり、そして１０−１８０より少ないアミノ酸を含むタンパク質である。前記分子は、任意の翻訳後修飾無しで、抗原的となりうるのに十分な大きさであり、したがって、前駆体および翻訳後修飾形態との両方で、アジュバント（又はアジュバント無し）と組み合わせされて免疫原として有用である。これらのタンパク質は、前述したように、血清や血液等のサンプル中に抗体が存在するか否かを判定するのに使用することができる。この抗原を使用して生成された抗体もまた、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方のものを含めて、本発明の一部を構成するものであり、そして前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた同様である。これらは後述するように、全分子または部分として治療用又は診断用に使用することが可能である。Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）2‘等の反応性フラグメント、及びその他のフラグメント、更に、キメラであるヒト化抗体、組換え産生抗体等もまた本発明の一部を構成する。特に好適であるのは、完全な抗体であるが相補性決定領域である「ＣＤＲＳ」がヒトであるがＣＤＲがマウスであるキメラである。
【００７８】
開示から明らかなように、本発明のタンパク質及び核酸分子を診断用に使用することが可能である。本明細書に記載のＳＥＲＥＸ方法論は、疾病関連抗原に対する免疫反応を前提としている。従って、例えば、被験者の血清のような体液サンプルのテスト経るように、それ自身の抗体との反応性についてアッセイすることができる。反応性は、その疾病の存在の可能性の指標と見なされ、従って、当業者に周知であり、かつ本明細書において詳述する必要のない標準核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって抗原の発現をアッセイすることもまた可能であり得る。標準免疫アッセイを使用して、被験者の分子に対する抗体をアッセイすることも可能であろう。
【００７９】
配列識別番号１の分析は、その中に５‘非コード化領域及び３’非コード化領域がその内部に示されていることを示すであろう。本発明は、少なくともそのコード化セグメント、即ち、ヌクレオチド５４−５９３を含み、かつ、配列識別番号１のヌクレオチド１−５３および／又は５９４−７４７のいずれか又は全部を含みうるような単離核酸分子に関する。
【００８０】
更に分析すると、前述したように、前記分子は、細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発するペプチドにプロセッシングされることが明らかとなる。例７は、いかにこのタイプのモチーフ分析をＨＬＡ−Ａ２分子に関して行うことが可能であるかを示した。種々のＭＨＣ分子又はＨＬＡ分子のモチーフに関して多大な研究が行われており、それをここで適用することが可能である。従って、本発明の更に別の態様は、患者の腫瘍細胞の表面上でＨＬＡ分子に結合し得る１つ以上のペプチドが、その患者に対して、ＭＨＣ分子／ＨＬＡ分子に結合し、Ｔ細胞による溶解を誘発させるのに十分な量が投与される治療法に関する。ＨＬＡ−Ａ２分子について前述された例示は、使用され得るこの投与の唯一のタイプではない。上述したような他のＨＬＡ分子についての組み合わせのように、いかなる組み合わせのペプチドもまた使用可能である。単体で、又は組み合わせで使用可能であるこれらペプチド、及び完全なタンパク質又はその免疫反応性部分を、経静脈、皮内、皮下、経口、直腸、及び経皮投与等の任意の種類の標準投与方法でそれを必要とする被験者に投与することができる。標準製薬キャリア、例えばサポニン等のアジュバント、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキン等もまた使用することができる。更に、これらのペプチド及びタンパク質を、列挙された材料とワクチンに処方され得、樹状細胞、又は関連するＭＨＣ／ペプチド複合体を提示するその他の細胞も同様である。これらのペプチドはまた、本明細書において参考文献として援用されるダンバー（Ｄｕｎｂａｒ）等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６（１９９８）に記載されているもののような、４つのペプチド／ＭＨＣ／ビオチン複合体が、ストレプトアビジン又はアビジン分子に付着しているＨＬＡ／ペプチドの多重結合複合体を形成するために利用可能である。そのような複合体は、Ｔ細胞前駆物質の同定および／又は刺激に使用することが可能である。
【００８１】
同様に、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする前記核酸分子が、アデノウイルスベースのベクターのようなベクターに組み込まれ、それを、ヒト細胞のような真核細胞にトランスフェクト可能とする治療法も意図している。同様に、前記１つ以上のペプチドをコードする核酸分子をこれらのベクターに組み込み、次いでそれらを核酸ベースの治療法の主要な構成部分としてもよい。
【００８２】
これらのアッセイのいずれもまた、進行／緩解研究にも使用可能である。前記タンパク質のレベル、その発現等をモニタし、前述した方法のいずれか又は全部を使用するだけで、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現を含む異常性の経過をモニタすることができる。
【００８３】
これらの方法は、治療用レジメの有効性を追跡するのに使用可能であることが明らかであろう。その本質は、前述したアッセイのいずれかを使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質のベースライン値を採り、所与の治療剤を投与し、次いでＥＳＯ−１のレベルの変化を、その養生レジメの有効性の指標として観察して、その後のタンパク質のレベルをモニターできるということである。
【００８４】
前述したように、本発明は、とりわけ、ＮＹ−ＥＳＯ分子に対する「統合された」免疫応答の認識に関する。この一つの派生的利用法は、癌治療の経過をモニターする能力である。本発明の一部を構成するこの方法に於いて、その治療を必要とする被験者は、本明細書に記載のタイプのワクチン接種を受ける。そのようなワクチン接種によって、たとえば、その細胞上にＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞に対するＴ細胞応答を生じる。この応答はまた、恐らくは、Ｔ細胞による細胞の溶解による抗体誘発性タンパク質放出を生じる抗体反応も含む。従って、免疫応答をモニタすることによって、ワクチンの効果をモニタすることができる。前述したように、抗体力価又はＴ細胞係数値をワクチンによる改善の指標として採ることができ、又、その逆も可能である。従って、本発明の更に別の態様は、そのワクチン自身又は、ワクチンがその一部分である巨大分子に対して特異的である被験者における抗体レベルを決定することによって、その投与後のワクチンの有効性をモニタする方法に関する。
【００８５】
ワクチンの効果はまた、そのワクチンを接種した被験者のＴ細胞反応をモニターすることによっても決定することができる。これらのインビトロ刺激Ｔ細胞の前駆物質発生頻度を測定するために、多くのアッセイを使用することが可能である。それらのアッセイとしては、クロム放出アッセイ、ＴＮＦ放出アッセイ、ＩＦＮγ放出アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ等を含むがこれらに限定されない。前駆Ｔ細胞発生頻度の変化は、測定され得、そしてワクチンの有効性と関連付けられ得る。使用されるその他の方法は、ＭＨＣ／ペプチドの多重結合複合体の使用を含む。そのような複合体の一例は、本明細書において参考文献として援用されるダンバー（Ｄｕｎｂａｒ）等，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６（１９９８）のＨＬＡ／ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン四量体の系である。
【００８６】
癌等の疾病状態に関与するＮＹ−ＥＳＯ−１の同定はまた、上述した方法の他に多くの治療アプローチを示唆している。上述した実験は、タンパク質の発現に応答して抗体が産生されることを確証するものである。従って、本発明の更なる実施例は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の変異又は異常レベルによって特徴付けられる状態を、ヒト化抗体、抗体フラグメント等の抗体の投与を介して治療することに関する。これらは、適切な細胞増殖抑制性（ｃｙｓｔｏｓｔａｔｉｃ）又は細胞溶解性試薬によってタグ付加又は標識化することができる。
【００８７】
Ｔ細胞を投与することもまた可能である。尚、Ｔ細胞は、樹状細胞、リンパ球等の免疫反応性細胞、またはその他の免疫反応性細胞を使用して、インビトロで顕在化し、その後、治療中の被験者に再潅流させることが可能であることも留意のこと。
【００８８】
尚、Ｔ細胞および／又は抗体の作成は、好ましくは非増殖性に処理され、前述したエピトープ等の、応答のために関連Ｔ細胞又はＢ細胞を提示する細胞を投与することによってもまた達成することができることに留意のこと。
【００８９】
前記治療アプローチはまた、好ましくは長さが１０〜１００ヌクレオチドのアンチセンス分子が、「ニート（ｎｅａｔ）」に、又はリポソーム等のキャリア中で被験者に対して投与されて細胞中への導入を容易にし、次いでタンパク質の発現を抑制するアンチセンス治療法もまた含むものとすることができる。そのようなアンチセンス配列はまた、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニア）、既知のＢＣＧワクチン派生物等のバクテリア構築物などに組み込むことも可能である。
【００９０】
下記のコア配列を有し、
ＬＬＭＷＩＴ（配列識別番号１４）
第１のＬ残基に対して、好ましくはセリンである、少なくとも一つの残基末端を有し、最大三つの残基を有することが可能であり、セリンが、Ｌに連結されて−ＳＬ−を形成し、Ｃ末端の０−４に追加されるアミノ酸が、前述したように、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、これによってＣＴＬ反応を誘発させるするものとして定義される、ノナマー、デカマー、又はウンデカマーもまた本発明の一部を構成する。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する患者への投与によって治療用として、或いは診断用、即ち、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞が存在するか否か、又は関連するＣＴＬが存在するか否かを調べるためなどに使用することができる。
【００９１】
ＨＡＬ−Ａ２分子は、ＭＨＣクラスＩ分子であり、ペプチドとクラスＩ分子からなる複合体に応答するＴ細胞は、一般に、ＣＤ８+細胞である。別のサブセットのＴ細胞であるＣＤ４+細胞は、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子とペプチドからなる複合体に反応し、自己由来の培養樹状細胞によって提示される組換えＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＭＨＣ−クラスＩＩ制限ＣＤ４+Ｔ細胞が、黒肉腫患者において検出された。具体的には、本明細書には記載しない結果に於いて、ＣＤ４+Ｔ細胞が、周知の技術を使用して、ＰＢＬ又は血清サンプル由来の他の細胞から分離された。次いで、それらをＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をパルス処理された樹状細胞と混合した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が観察され、本明細書で議論された別の一面をもたらした。従って、本発明の更に別の態様は、これらのＣＤ４+Ｔ細胞と、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子に結合するペプチドと、それらの治療に於ける利用とに関する。
【００９２】
配列識別番号１４の前記コア配列によって規定されるペプチドの具体例は、配列識別番号７によって規定されるペプチドである。このペプチドは、示されているように、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合する。従って、それは、ＨＬＡ−Ａ２に対する「マーカー」であり、かつ前述したように、ＣＴＬの増殖を刺激するペプチド／ＭＨＣ複合体の成分でもある。
【００９３】
前記例が示すように、ＥＳＯ１は又、ＭＨＣクラスＩＩ分子、特にＨＬＡ−ＤＲ５３と複合化するペプチドにもプロセッシングされる。これらの分子は、Ｆｕｔａｋｉら．，前出によって記載されたモチーフ、即ち、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ又はＬｅｕ、それに続く、Ａｌａ又はＳｅｒの三つのアミノ酸を満たすものである。これらのペプチドは、少なくとも１８アミノ酸長でなければならず、好ましくは、２５アミノ酸長以下である。好ましくは、それらは、配列識別番号８，９，１０，１１，１２及び１３等のように、１８のアミノ酸から成る。これらのペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性細胞を同定するために作用する。更に、配列識別番号８，９及び１０等のペプチドの場合においては、前記例で示したように、これらはヘルパーＴ細胞の増殖を刺激するために使用することが可能である。ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドの上述した適用例の全ては、これらのクラスＩＩ制限ペプチドに適用可能である。更に、免疫応答の性質は、ＭＨＣ−クラスＩＩ／ペプチド複合体と比較して、ＭＨＣ−クラスＩ／ペプチド複合体では異なることから、免疫組成物等として、これら両方のタイプのペプチドを組み合わせて、組み合わされた免疫応答（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を発生させてもよい。このように、記載したすべての適用例は、クラスＩ制限ペプチドのみで、クラスＩＩ制限ペプチドのみで、又はこれらを組み合わせて使用することができる。
【００９４】
本発明のその他の特徴及び用途は、当業者にとって明白であり、ここでは記載する必要がない。
【００９５】
ここに使用した用語及び表現は、限定の用語ではなく記載の用語であり、これらの用語及び表現を使用するに当たって図示及び記載した特徴又はその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本発明の範囲内に於いて様々な改変が可能であると理解される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH
<120> ISOLATED PEPTIDES CORRESPONDING TO AMINO ACID SEQUENCE
OF NY-ESO-1, WHEREIN BIND TO MHC CLASS I AND MHC CLASS
II MOLECULES, AND USES THEREOF
<130> LUD 5466.4-P
<140> PCT/US99/06875
<141> 1999-03-24
<150> US 09/062,422
<151> 1998-04-17
<150> US 09/165,546
<151> 1998-10-02
<160> 14
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 752
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (54)..(593)
<220>
<223> strandedness:double
<220>
<223> topology:linear
<400> 1
atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gcc atg    56
Met
1
cag gcc gaa ggc cgg ggc aca ggg ggt tcg acg ggc gat gct gat ggc   104
Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Gly
5                  10                  15
cca gga ggc cct ggc att cct gat ggc cca ggg ggc aat gct ggc ggc   152
Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly Gly
20                  25                  30
cca gga gag gcg ggt gcc acg ggc ggc aga ggt ccc cgg ggc gca ggg   200
Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly
35                  40                  45
gca gca agg gcc tcg ggg ccg gga gga ggc gcc ccg cgg ggt ccg cat   248
Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro His
50                  55                  60                  65
ggc ggc gcg gct tca ggg ctg aat gga tgc tgc aga tgc ggg gcc agg   296
Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg
70                  75                  80
ggg ccg gag agc cgc ctg ctt gag ttc tac ctc gcc atg cct ttc gcg   344
Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala
85                  90                  95
aca ccc atg gaa gca gag ctg gcc cgc agg agc ctg gcc cag gat gcc   392
Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala
100                 105                 110
cca ccg ctt ccc gtg cca ggg gtg ctt ctg aag gag ttc act gtg tcc   440
Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser
115                 120                 125
ggc aac ata ctg act atc cga ctg act gct gca gac cac cgc caa ctg   488
Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu
130                 135                 140                 145
cag ctc tcc atc agc tcc tgt ctc cag cag ctt tcc ctg ttg atg tgg   536
Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp
150                 155                 160
atc acg cag tgc ttt ctg ccc gtg ttt ttg gct cag cct ccc tca ggg   584
Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly
165                 170                 175
cag agg cgc taagcccagc ctggcgcccc ttcctaggtc atgcctcctc           633
Gln Arg Arg
180
ccctagggaa tggtcccagc acgagtggcc agttcattgt gggggcctga ttgtttgtcg 693
ctggaggagg acggcttaca tgtttgtttc tgtagaaaat aaaactgagc tacgaaaaa  752
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> strandedness:single
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 2
cacacaggat ccatggatgc tgcagatgcg g                                31
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> strandedness:single
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 3
cacacaaagc ttggcttagc gcctctgccc tg                               32
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide
<400> 4
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu
1               5                  10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide
<400> 5
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1               5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide
<400> 6
Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr
1               5
<210>  7
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  7
Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu
1               5                   10
<210>  8
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  8
Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>  9
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  9
Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg
1               5                   10                  15
Leu Thr
<210>  10
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  10
Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly
1               5                   10                  15
Asn Ile
<210>  11
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  11
Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly
1               5                   10                  15
Pro Glu
<210>  12
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  12
Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met
1               5                   10                  15
Glu Ala
<210>  13
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> topology:linear
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence:peptide
<400>  13
Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His
1               5                   10                  15
Arg Gln
<210>  14
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<223> topology:linear
<400>  14
Leu Leu Met Trp Ile Thr
1               5
【図面の簡単な説明】
【図１】様々な組織タイプ中での、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原のＲＮＡの発現パターンを図示している
【図２】精巣と細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−１８中には見つかったが、その他様々な細胞及び組織サンプル中には見つからなかった、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を図示している
【図３】ＮＹ−ＥＳＯ−１の推定アミノ酸配列の推定修飾部位を図示している
【図４】アミノ酸末端中の親水性ドメインと、カルボキシル末端の近傍の長い疎水性ストレッチとを示す、ＮＹ−ＥＳＯ−１の親水性プロットである
【図５】ＨＬＡ−２陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性、これら両方に対して陽性、又はこれらのいずれに対しても陽性でない、様々な細胞を使用したＣＴＬ溶解研究の結果を示している
【図６】ＨＬＡ−Ａ２が配列識別番号１誘導ペプチドの提示のための提示分子であることを証明するデータを示している
【図１】
0003995884.tif 000008
【図２】
0003995884.tif 000009
【図３】
0003995884.tif 000010
【図４】
0003995884.tif 000011
【図５】
0003995884.tif 000012
【図６】
0003995884.tif 000013