(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物を骨病態モデル動物として使用する方法。
【請求項２】
骨病態モデル動物が、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか１以上の骨病態を呈することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
骨病態モデル動物が、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認されたことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ホモ体であることを特徴とする１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ラットであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項９記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項９記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レギュカルチン遺伝子導入トランスジェニック非ヒト動物、詳しくは、レギュカルチン遺伝子が導入され体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物や、かかるトランスジェニック非ヒト動物を用いるレギュカルチンの製造方法や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法や、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法等に関する。また本発明は、骨粗鬆症に代表される骨病態のモデル動物、より詳しくは、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認され、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨病態を呈する骨病態モデル動物や、該骨病態のモデル動物を用いた骨粗鬆症に代表される骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチドホルモンが細胞膜の受容体に結合し、細胞内にその情報を伝達する仕組みの中で、Ｃａ2+は主役を演じている。細胞内にはＣａ2+を結合する多くのタンパク質が存在するが、その作用を増幅するタンパク質として、カルモジュリンは重要な役割を果たしており、Ｃａ2+はこのカルモジュリンに結合し、細胞機能の調節に関与する各種の酵素を活性化することが解明されている（Science, 202, 19-27, 1984）。また、Ｃａ2+がプロテインキナーゼＣやその他のＣａ2+結合タンパク質（酵素も含む）に作用することも知られている（Science, 233, 305-312, 1986）。レギュカルチンも、本発明者らによりラット肝細胞質から単離されたＣａ2+結合蛋白質である。
【０００３】
レギュカルチンは、分子量が３３３８８のＣａ2+結合タンパク質で、そのＣａ2+結合定数が４．１９×１０5Ｍ-1を示し、６〜７個の高親和性Ｃａ2+結合部位を持ち、α−ヘリックス構造を３４％含む、肝臓に顕著に存在する等電点ｐＩ５．２０の酸性蛋白質である。レギュカルチンは、カルモジュリンや他の多くのＣａ2+結合タンパク質にみられる部位ＥＦハンド構造（領域）を含まない特異なタンパク質で、例えば、Ｃａ2+を結合することにより、カルモジュリンはα−ヘリックス含量が増加し、その構造が堅固になるが、レギュカルチンはα−ヘリックス含量が減少する。また一方、細胞機能調節において、レギュカルチンは、カルモジュリンによる酵素活性化を阻害し、プロティンキナーゼＣの活性化をも阻害することが明らかになっている。このように、レギュカルチンは、シグナリングの制御タンパク質として機能するなど多くの知見が蓄積されている（FEBS Lett,
327, 251-255, 1993）。
【０００４】
レギュカルチン遺伝子は、ラットにおいてＸ染色体（Xq 11.1-12）に存在し、ヒトにおいてもＸ染色体に位置する。レギュカルチン遺伝子は、ラットやヒトの他、サル，マウス，イヌ，ウシ，ウサギ，ニワトリ等の高等動物に見い出されているが酵母にはなく、高度に分化されたタンパク質をコードするものと考えられている。レギュカルチンｃＤＮＡはクローニングされており、その全構造も決定されている（特開平７−１２３９８５号公報）。ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡは、全アミノ酸をコードする塩基対が０．８９７ｋｂであり、２９９のアミノ酸を翻訳する。また、マウス肝やヒト肝のレギュカルチンｃＤＮＡの塩基配列も決定されており、ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡと比較して、それぞれ９４％と約８９％のホモロジーを有している。レギュカルチンｍＲＮＡの発現は、ヒト，ラット，マウス，ウシ，ニワトリ等の肝臓においてみられ、これらの肝臓にはレギュカルチンタンパク質の存在も確認されている。
【０００５】
レギュカルチンは、多機能性を有する細胞内Ｃａ2+シグナリングの制御蛋白質として特徴を有する蛋白質であり、細胞機能調節に関与する重要な蛋白質であることが知られている（Life Sciences 66, 1769-1780, 2000、Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 1-6, 2000）。また、生体内における肝臓や腎臓におけるレギュカルチンの発現が肝障害（Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994）や腎障害（Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995）時に低下することが動物実験的に明らかにされており、レギュカルチンと病態成因との関連が示唆されている。そして、ＧＯＴ、ＧＰＴ等の既存の肝機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するレギュカルチンの血清中の濃度を測定することにより、肝疾患患者血清を鑑別する方法、すなわち、肝疾患患者の血清ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、その測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用であることも知られている（特開平１０−２６６２３号公報）。
【０００６】
他方、骨組織は、骨細胞と基質からなり、１／３はコラーゲンを主成分とする有機質、２／３はカルシウム−リンの骨塩である無機質からできており、構造上は緻密質と海綿質と皮質に分けられ、例えば長骨の骨幹は緻密質、骨端は皮質で囲まれた海綿質から構成されている。骨は一旦形成された後は全く変化しない構築物ではなく、骨形成と骨吸収のバランスの上にその構造および量は維持されている。従って、加齢あるいはその他の原因によりそのバランスが崩れると、種々の骨疾患を発症する。骨疾患のうち、カルシウム塩が骨から血液中に溶出してゆく骨吸収の異常亢進によって起きるものとしては、骨髄腫やリンパ腫などが原因で起こる悪性高カルシウム血症、局所性骨吸収によりもたらされる骨ぺージェット病、骨の絶対量が減少しているが骨の質的な変化を伴わない骨粗鬆症等が挙げられる。これらの疾患は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因となることが知られており、現在、これらの疾患は高齢人口の増加に伴い社会問題化している。
【０００７】
その他、高カルシウム血症、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、骨減少症などの骨疾患、糸球体腎炎、糸球体硬化症、慢性腎炎、腎不全などの腎臓疾患、悪性腫瘍、乾癬症あるいはそれらの合併症などの病態モデル動物として利用することができ、これらの病態機序の解明および疾患の治療方法の検討、ならびに治療薬のスクリーニングを行うことが可能な、外来性２５−水酸化ビタミンＤ３２４−水酸化酵素遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が知られている（特開平１１−９１４０号公報）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
レギュカルチンタンパク質は、肝臓に特異発現される他、腎臓，心臓，大脳（神経細胞）にも低レベルで発現し、細胞内のＣａ2+シグナリング関連細胞機能の調節に関与し、その発現が低下すると生理的異常を来たす特異な多機能性蛋白質であり、これまでラットの肝臓から単離した蛋白質や抗レギュカルチンモノクローナル抗体を用いて、その機能解析が行われ、上記のカルシウムシグナルの制御因子としての役割の他、細胞内カルシウム輸送酵素の調節や、プロテアーゼの活性化因子としての役割や、細胞核のカルシウム輸送の調節、細胞核ＤＮＡ分解における役割、肝再生時の細胞核機能における役割等の細胞核機能の調節や、腎尿細管カルシウム再吸収における役割など、多くの生体調節におけるレギュカルチンの機能的役割が本発明者により明らかにされている。
【０００９】
本発明者は、レギュカルチンの種々の機能的役割の解明についての研究過程で、レギュカルチンが他の数多くのＣａ2+結合タンパク質とは異なる特異的作用を有する点に着目し、カルシウムが関与する各種細胞の機能調節は、生体内におけるレギュカルチンの発現量とカルモジュリンをはじめとする他の数多くのＣａ2+結合タンパク質の発現量とのバランスの上に成立していると考え、レギュカルチンの発現量と他の数多くのＣａ2+結合タンパク質の発現量とのバランスが崩れた場合に、生体に生じる変化・影響を調べることにした。本発明の課題は、元来高等動物の肝臓等に発現しているレギュカルチンを過剰に発現させ、他の数多くのＣａ2+結合タンパク質とのバランスを崩した場合に、生体にどのような変化・影響が生じるかを調べるためのツールであるレギュカルチン過剰発現モデル動物を提供することにある。
【００１０】
また従来、骨粗鬆症に代表されるカルシウム骨代謝に係り、高齢化や特に女性において多発する骨病態の予防、治療薬剤開発には、卵巣摘出ラットが用いられるが、卵巣摘出動物は外科的摘出手術を要し、さらに骨量減少を起こさせるまでに３ヶ月以上の飼育が必要で、研究経費が高額になるばかりでなく技術的、時間的な制約も多かった。また臨床面において見られる他の骨病態モデル動物として炎症性（リュウマチ）関節炎骨病態モデル動物があるが、これは薬物投与により発症させるため、他の副作用を伴い生理的に問題があった。本発明の課題は、また、上記問題を解決することができる、卵巣摘出等の外科的摘出手術を要することなく、さらに骨量減少を起させるまでの飼育期間が不要であり、副作用を伴うなどの生理的な問題がない、骨粗鬆症に代表される骨病態のモデル動物を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレギュカルチンｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチン蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡを単離し、このラットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦを切り出し、発現ベクター（pCXN2）に導入し、この遺伝子発現ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを発生させ、その産仔の組織からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によってレギュカルチンｃＤＮＡが組み込まれているラットを確認したところ、２９匹の産仔からレギュカルチンｃＤＮＡを発現するホモ体のラット５匹（雄４匹、雌１匹）が作出され、かかるトランスジェニックラットの体重の増加が有意に抑制されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
また、本発明者は、外見上何ら骨病態を呈していない上記レギュカルチン遺伝子導入によりレギュカルチン過剰発現能を獲得した形質転換ラットについて、偶々、動物研究用ｐＱＴＣ（Peripheral Quantitative Computed Tomography）骨密度測定装置による骨の形態学的（骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ）測定評価、及び骨成分の生化学的（カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるＤＮＡ量）測定評価を実施したところ、特に大腿骨において形態学的にも生化学的にも、骨量、骨密度の減少による骨吸収（骨塩溶解）による骨組織の脆弱化、骨形態変化、および尾骨成長遅延などの顕著な骨病態を呈することを見い出し、このレギュカルチン過剰発現病態モデルラットの形質が継代的に安定しており、商業的生産に耐えるものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物を骨病態モデル動物として使用する方法（請求項１）や、骨病態モデル動物が、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか１以上の骨病態を呈することを特徴とする請求項１記載の方法（請求項２）や、骨病態モデル動物が、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認されたことを特徴とする請求項１又は２記載の方法（請求項３）に関する。
【００１４】
また本発明は、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項３記載の方法（請求項４）や、骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項３記載の方法（請求項５）や、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ホモ体であることを特徴とする１〜５のいずれか記載の方法（請求項６）に関する。
【００１５】
さらに本発明は、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法（請求項７）や、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ラットであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法（請求項８）に関する。
【００１６】
そしてまた本発明は、請求項１〜８のいずれか記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項９記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【００１７】
本発明はまた、骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項９記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１１）や、骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１２）に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ここで、レギュカルチンを過剰発現するとは、野生型の非ヒト動物のレギュカルチン発現量に比べて有意に多量のレギュカルチンを発現することをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等を挙げることができるが、中でもラットが好ましい。モデル動物としてよく用いられているマウスでは臓器が小さく病態の解析には限界があることもあるが、例えば血圧測定などラットにおいてはこれが可能になり、病態解明や遺伝子治療のための動物実験的手段としてきわめて有用となる。
【００１９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，チキンβ−アクチンプロモーター，レギュカルチン遺伝子，ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列された直鎖ＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。例えば、マーカー遺伝子，サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，チキンβ−アクチンプロモーター，ｃＤＮＡ挿入サイト，ラビットβ−グロビンポリＡシグナル等を有する発現ベクター（pCXN2）にレギュカルチン全長ｃＤＮＡを導入したものを用いると、効率よくトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【００２０】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、レギュカルチン遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物、特に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラットレギュカルチン遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができるが、レギュカルチン遺伝子の由来としては、ラットの他、マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等特に制限されるものではない。
【００２１】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことから、実験モデル動物として特に好ましい。また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物として、体重の増加が野生型の非ヒト動物に比べて有意に抑制された、すなわち体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物を好適に挙げることができる。レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物が、かかる体重増加抑制能を有することは全く予想できなかったことであり、この新たな知見はレギュカルチンが肥満防止剤としての有用性をもつ可能性があることを示唆している。かかる新たな知見からして、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現することを特徴とする体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物ということもできる。
【００２２】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、大脳機能障害発症性，インスリン非依存性糖尿病発症性，腎性高血圧発症性，尿細管再吸収障害発症性等のレギュカルチン過剰発現に起因する症状や疾病のうち少なくとも１以上の症状や疾病を発現するトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。大脳機能障害は、大脳の記憶維持メカニズム上必要とされるＣａ−カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素の活性化を、過剰発現したレギュカルチンが抑制して、神経細胞内の神経伝達を制御することにより発症するものと考えられ、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、記憶などの大脳機能の障害（アルツハイマー等の痴呆症）の実験モデル動物として有用である。また、レギュカルチンは、肝臓や腎臓において発現し、ホルモンの細胞内情報伝達の制御を行っており、レギュカルチンの過剰発現により、肝臓と腎臓の機能を調節するホルモンの作用発現が障害され、肝臓においては、インスリンの働きを抑制することからインスリン非依存性糖尿病を誘発し、腎臓においては、レニン−アンジオテンシン系に関係した腎性高血圧、さらに電解質代謝に関連した尿細管再吸収障害を誘発するものと考えられ、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン非依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害等の実験モデル動物として有用である。
【００２３】
本発明の体重増加抑制能を有するモデルラット等のモデル動物の樹立方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いた方法を挙げることができる。例えば、レギュカルチン（ＲＣ）トランスジェニックラットを創製する方法としては、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレギュカルチンのｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチンタンパク質の全長をコードするｃＤＮＡを単離後、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を切り出し、発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるいは２細胞期胚を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法等により、レギュカルチンｃＤＮＡが組み込まれていることを確認する方法等を挙げることができる。
【００２４】
本発明のレギュカルチンの製造方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはホモ体のトランスジェニック非ヒト動物を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、ホモ体のレギュカルチントランスジェニックラットから肝臓を取り出し、そのホモジネートから文献（Chem. Pharm. Bull. 26, 1915-1918, 1978）記載の方法に準じて、レギュカルチンを単離・精製することができる。また、レギュカルチンの増収を目的として、トランスジェニック非ヒト動物にカルシウム、カルチトニン、インスリン、エストロゲン等を投与することもできる。
【００２５】
本発明のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、上記レギュカルチン過剰発現に起因する疾病としては、大脳機能障害，インスリン非依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害等を例示することができる。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における体重増加の程度や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる組織，器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織、器官又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュカルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
【００２６】
上記組織や器官としては、肝臓，腎臓尿細管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。このように、上記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病、例えば大脳機能障害，インスリン非依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害等の予防・治療薬をスクリーニングすることができ、かかるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬も本発明の範疇に含まれる。
【００２７】
本発明のレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、レギュカルチン発現低下に起因する疾病としては、動脈硬化，心筋梗塞等を例示することができる。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における体重減少の程度や、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる組織，器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュカルチンの発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
【００２８】
上記組織や器官としては、肝臓，腎臓尿細管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。このように、上記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチン発現低下に起因する疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞等の原因物質をスクリーニングすることができ、かかるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質は、レギュカルチンの生体内における作用・役割をより一層明らかにする上で有用であり、また、これら原因物質に結合する物質等その作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の予防・治療薬を開発することができる可能性があることからしても有用であり、かかる原因物質も本発明の範疇に含まれる。
【００２９】
次に、本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であって、骨病態を呈するモデル動物であれば特に制限されるものではなく、かかる骨病態モデル動物として、レギュカルチン遺伝子が導入された上述の本発明のトランスジェニック非ヒト動物を好適に例示することができる。したがって、以下本発明の骨病態モデル動物や骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法について説明するが、より詳細には、上述の本発明のトランスジェニック非ヒト動物に関する記載や、本発明のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法等に関する記載を参照することができる。なお、本発明において、骨病態とは、骨粗鬆症に代表されるカルシウム骨代謝異常等により、骨量の減少、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨やその成長が正常でない状態をいう。
【００３０】
上記本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価、及び／又は、骨成分の生化学的測定評価、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の測定評価により選抜・確認された、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか１以上の骨病態を呈する骨病態モデル動物が好ましく、上記骨の形態学的測定評価には、動物研究用ｐＱＴＣ（Peripheral Quantitative Computed Tomography）骨密度測定装置（Bone Vol.29, No.2, August 2001; 101-104）を特に有利に用いることができる。また、骨成分の生化学的測定評価は、後述する実施例に記載されているような、この分野における常法により実施することができる。なお、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価には、大腿骨等の骨自体が必要な、供試動物をそのまま骨病態モデル動物として使用できないことから、上記選抜・確認された骨病態モデル動物とは、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価に供した動物と同腹の動物又はその子孫をいう。
【００３１】
本発明の骨病態モデル動物は、例えば前記のように、本発明者が作製したラットレギュカルチン発現ベクターから切り出され、リニアライズされたＤＮＡフラグメントを別途調整した受精卵卵胞細胞にマイクロインジェクション法で注入し、卵細胞を培養後、発生が進み異常が認められない胚を仮親の卵管内に移植し、生まれた産仔について、特に動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置による骨の形態学的測定評価、及び骨成分の生化学的測定評価の結果を行うことにより、選抜・確認することができ、これらの中でも、骨病態の表現形質が継代的に安定し、商業的生産に適したものが好ましい。また、本発明の骨病態モデル動物としては、ホモ体であるレギュカルチントランスジェニック骨病態モデル動物を好ましく例示することができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことから、骨変化等の骨病態の表現形質がより強く現れることから好ましい。さらに、本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチン遺伝子がＸ染色体上にあり、雄よりも雌において骨変化等の骨病態の表現形質がより顕著に現れることから、雌ラット等の雌の骨病態モデル動物を好ましく例示することができる。
【００３２】
本発明の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、上記本発明の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とするスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、被検物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質などの他に、例えば哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清などや、各種植物の抽出成分等が用いられる。例えば、被検化合物を本発明の骨病態モデル動物に経口的又は非経口的に投与し、該骨病態モデル動物における、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ等の骨の形態学的測定評価や、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量等の骨成分の生化学的測定評価を実施することにより、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治療薬をスクリーニングすることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。
【００３３】
また、本発明の骨病態の予防・治療薬としては、上記本発明のスクリーニング方法により得られる骨病態の予防・治療薬であれば特に制限されるものではなく、これら予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［ラットＲＣｃＤＮＡ調製］
（ＲＮＡの調製）
ウイスター系雄性ラット（３週齢）から肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液（４Ｍグアニジニウムチオシアネート，２５mMクエン酸ナトリウム（pH７．０），０．５％サルコシル，０．１Ｍ２−メルカプトエタノール，２Ｍ酢酸ナトリウム）でホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール混液で抽出し、４℃、１０，０００×ｇで２０分遠心した。水層にイソプロパノールを加え、−２０℃で放置し、ＲＮＡを沈澱させた。回収した沈澱はジエチルピロカーボネート処理した０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに通し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
【００３５】
（ｃＤＮＡライブラリーの作製）
精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）に５０ｕｎｉｔのMoloney-Murine Leukemiaウイルス逆転写酵素とオリゴ（ｄＴ）18プライマーリンカーを添加し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。さらに合成した１本鎖ｃＤＮＡに大腸菌リボヌクレアーゼＨとＤＮＡポリメラーゼＩを添加し、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにEcoRIアダプターを付加し、XhoI，EcoRIで消化したファージ発現ベクター（λZAPII）と連結した。さらにパッケージングエキストラクトを用いてファージにパッケージングしｃＤＮＡライブラリーのファージを作製した。
【００３６】
（ＲＣｃＤＮＡクローンの選抜）
ラット肝のｃＤＮＡライブラリーのファージ約１×１０6個を大腸菌と混合し２０個の寒天プレートに植菌した。４２℃で３時間半インキュベートした後、プレートに１０mMイソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシドで処理したニトロセルロース膜をのせ、３７℃で３時間半インキュベートした。ニトロセルロース膜はブロッキングした後、抗ＲＣウサギ血清（×２００）と室温で２時間インキュベートした。膜は洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を加えインキュベートした。これを発色液（０．３５mMニトロブルーテトラゾリウム，０．４mM５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）に浸し発色させ、ＲＣｃＤＮＡ陽性プラークを同定した。
【００３７】
（プラスミドベクターへのサブクローニング）
ファージベクターλZAPIIは、その配列中にプラスミドベクターであるpBluescriptの塩基配列を含み、λZAPIIにクローニングされたＲＣのｃＤＮＡ断片はこのpBluescriptに挿入されている。また、pBluescriptの両端にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在している。そこで同定したプラークよりファージを単離し、Ｒ４０８ヘルパーファージとともに大腸菌ＳＵＲＥに感染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を含むpBluescriptを大腸菌内で合成させ、ヘルパーファージの形で大腸菌体外に放出させた。このファージ液をさらに大腸菌ＳＵＲＥに感染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を有するプラスミドとして菌内で複製させた。この大腸菌を５０μｇ／mlアンピシリン含有のＬＢプレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
【００３８】
（ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定）
Sequenaseシステム（US Biochemical社製）を用いてｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した。すなわちプラスミドＤＮＡをEcoRIで切断し、断片はアルカリ変性処理した後、プライマーを加えアニーリングした。これに３５Ｓ ｄＣＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、Sequense用酵素液を添加した後４等分し、各々にｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを加え、３７℃５分間インキュベートした。これらはアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、塩基配列を読み取った。配列番号１にレギュカルチンｃＤＮＡの全塩基配列を示す。また、得られたアミノ酸配列も配列番号２に示す。これから計算されるレギュカルチンの分子量は３３，３８８であった。この値は精製したレギュカルチンをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により算出した分子量と一致した。
【００３９】
実施例２［トランスジェニックラットの創製］
（導入遺伝子の構築）
実施例１で得られたラットレギュカルチン全長ｃＤＮＡを含むプラスミド、ＲＣ−９００（glycerol stock；ＲＣ−Ｆ）、ベクターpBluescript SK（−）より、ＯＲＦ全てを含むＤＮＡ断片をPstIを用いて切り出した（図１Ａ）。この切り出したPstIフラグメントをpBluescript II KS(+)のPstIサイトに組み込んだ（図１Ｂ）。次にEcoRIで切り出し、得られたEcoRIフラグメント（図２Ａ）を、発現ベクターpCXN2（クロンテック社）（Gene 108, 193-199, 1991）のEcoRIサイトに導入し（図２Ｂ）、ラットレギュカルチン発現ベクターRC/ pCXN2を調製した。このRC/pCXN2をSalIとSfiIとMluIで切断し、リニアライズされた３．６ｋｂｐのフラグメントを得た（図３）。
【００４０】
（トランスジェニックラットの作製）
ラットの前核期受精卵への上記リニアライズされた３．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメント溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で実施した。４週齢のスプラーグ−ドーリー(SD, Sprague-Dawley)系雌ラットを明暗サイクル１２時間（明時間 ４：００〜１６：００)、温度約２３℃、湿度約５５％で飼育し、膣スメア法により雌の性周期を観察してホルモン処理日を選択した。雌ラットに１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本全薬社製「ＰＭＳゼンヤク」）を腹腔内投与して過剰排卵処理を行い、その４８時間後に１５０ＩＵ／ｋｇのヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（三共エール薬品（株）社製「プべローゲン」）を腹腔内投与した後、雄との同居により交配を行わせ、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
【００４１】
この様にして調製したウイスターラットの受精卵の雄性前核に、前記３．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメント溶液（５ｎｇ／μｌ濃度）を顕微注入した。ＤＮＡフラグメントが注入された卵を、ＣＯ2インキュベーター内でｍ−ＫＲＢ（ｍ−クレブスリンガー緩衝液）培地を用いて１晩培養した。翌日２細胞へと発生が進み、異常の認められない２細胞期胚を９匹の仮親（精管結紮雄と交配させた偽妊娠雌ラット）の卵管内に１匹あたり２０〜３０個程度を移植し、２９匹の産仔を得た。４週齢まで生存した２７匹の産仔の尾よりＤＮＡを採取し、採取したＤＮＡをプライマーhuRC-1；GGAGGCTATGTTGCCACCATTGGA（配列番号３）、プライマーhuRC-2；CCCTCCAAAGCAGCATGAAGTTG（配列番号４）を用いてＰＣＲ法により検定した（図４）。その結果、合計５匹（雄４匹、雌１匹）のラットに導入遺伝子の存在を確認した。そのうち５匹が次世代に導入遺伝子を伝えた。
【００４２】
実施例３［体重増加抑制能］
実施例２で得られたトランスジェニックラット（ヘテロ体）の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジェニックラット（ホモ体）を得た。また、ホモ体であることは、ラット尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の組み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体のｃＤＮＡ量の２倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。かかるホモ体のトランスジェニックラットを用いて体重増加抑制能について調べた。３〜４週齢の野生型ＳＤラットとトランスジェニックラット（ホモ体）それぞれ８匹ずつの体重の平均値を表１に示す。Student's t test, Ｐ＜０．０１、平均値±標準誤差で表し有意差が認められ、レギュカルチン遺伝子の過剰発現により、体重増加が抑制されることを確認することができた。
【００４３】
【表１】
0003949520.tif 000002
【００４４】
実施例４［骨病態モデル動物］
（ＳＤ系ホモタイプ骨病態モデルラット）
実施例２で得られたトランスジェニックラット（ヘテロ体）の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジェニックラット（ホモ体）を得た。また、ホモ体であることは、ラット尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の組み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体のｃＤＮＡ量の２倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。外見上骨病態を呈していない上記ホモ体のトランスジェニックラットの中から、継体的に安定して生存している雌雄のラットを、試験区のＳＤ系骨病態モデルラット（ホモ体）として用い、骨の形態学的測定評価（骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ）と骨成分の生化学的測定評価（カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるＤＮＡ量）を行った。また、対照区として雌雄のＳＤ系野生型正常ラットを用いた。なお、各測定評価において、試験区・対照区とも、ラットは各群５匹を使用し、各測定値は平均値±標準誤差で示し、統計的有意差検出は、Student's t-testを用いて行い、Ｐ＜０．０１（１％）以下を有意差ありとした。
【００４５】
（骨の形態学的測定評価）
５〜６週齢の雌雄のＳＤ系骨病態モデルラット（試験区）及びＳＤ系野生型正常ラット（対照区）をエーテル麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に供するまで７０％エタノール溶液中に完全に浸して保存したものを標本とした。この標本を動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置（XCT Reserch SA+：Stratec Medizintecnik GmbH Pforzhein Germany）を用いて、骨幹端部においては遠位骨端（成長軟骨板）から２．０ｍｍの部位よりスライス幅０．５ｍｍずつで５箇所のスキャンを行った。また、骨長の約１／２の部位を骨幹部とし、１ヶ所スキャンを行った。スキャンの結果を図５（試験区；上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）と図６（対照区；上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）に示す。スキャン後、各群骨幹部と骨幹端部の骨密度、骨強度、骨幹部組織の皮質骨厚、及び骨幹部組織の皮質骨外膜周囲長が自動的に算出・表示された。結果をそれぞれ表２〜表５に示す。なお、表６に、上記ｐＱＴＣ測定における測定パラメーターと解析パラメーターを示す。
【００４６】
ｐＱＴＣ測定の結果、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは骨密度が減少し、特に雌において顕著であった（表２）。骨強度においては、雄の正常ラットと比較して雄の骨病態モデルラットでは骨強度が減少していたが、雌においては骨幹部、骨幹端部ともに骨病態モデルラットで骨強度が正常ラットの約４０〜４５％にまで減少することが明らかになった（表３）。骨幹部（皮質骨）組織の皮質は、雄雌共に、正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質骨厚が有意に減少していた（表４）。骨幹部（皮質骨）組織の皮質外膜周囲長は、雄においては２群間で有意な差は認められなかったが、雌においては、正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質外膜周囲長が有意に減少した（表５）。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【表５】
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【００５１】
【表６】
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【００５２】
（骨成分の生化学的測定評価）
５〜６週齢の雌雄のＳＤ系ホモタイプ骨病態モデルラット（試験区）及びＳＤ系野生型正常ラット（対照区）をエーテル麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に供するまで７０％エタノール溶液中に完全に浸して保存したものを標本とした。この標本から、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）に分けて、カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるＤＮＡ量の測定を行った。
【００５３】
骨組織中のカルシウム量（ｍｇ／ｇ骨乾燥重量）の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、それぞれ６４０℃で２４時間灰化し、重量を測り、その後６Ｎ塩酸に溶解して骨カルシウム量を原子吸光度にて測定した。骨組織中のカルシウム量をｍｇ／ｇ骨乾燥重量で表した結果を表７に示す。表７からもわかるように、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは骨カルシウム量が有意に減少していたが、特に雌において骨カルシウム量の減少が顕著であった。
【００５４】
【表７】
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【００５５】
骨組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、それぞれ氷冷した６．５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌに浸し、小片にカットし、テフロン乳棒のついたPotter-Elvehjemホモジナイザーにて均質とし、超音波装置にて６０秒間かけて破壊した。６００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、得られた上清を酵素活性の測定に使用した。アルカリ性ホスファターゼ活性はWalterとSchuttの方法（Bergmeyer HU (ed) Methods of enzymatic analysis, Vol.1-2,Academic Press, New York, PP856-860, 1965）に準じて測定した。また、タンパク質の濃度はLowryらの方法（J. Biol. Chem., 193, 265-273, 1951）に準じて測定した。骨組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性を遊離したｐ−ニトロフェノールのμｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質として表した結果を表８に示す。表８から、正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質骨）においては雄でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇しており、また骨幹端部（海綿骨）においては雌でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇していた。
【００５６】
【表８】
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【００５７】
骨組織中のＤＮＡ量の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、それぞれ氷冷した６．５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌに浸し、小片にカットした後、氷冷した０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液４．０ｍｌにて２４時間振り混ぜた。アルカリ抽出後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清をＤＮＡ量の測定に使用した。ＤＮＡ量はCeriottiの方法（J. Biol. Chem., 214,39-77,1955）に準じて測定した。骨組織中のＤＮＡ量をｍｇ／ｇ骨組織湿重量として表した結果を表９に示す。表９から、正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質骨）においては雌でＤＮＡ量が有意に減少しており、また骨幹端部（海綿骨）においては雌雄ともにＤＮＡ量が有意に減少していた。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
以上のように、本発明の骨病態モデル動物においては、大腿骨組織の明らかな骨変化が見い出され、この骨変化は、大腿骨の骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）の両部において、形態学的並びに生化学的（骨成分）に認められ、骨組織が骨吸収（骨塩溶解）を引き起こし、骨形成も障害されていることに基づくことが明らかになった。特に、雄（male）よりも雌（female）において、その骨変化は顕著であった。また、本発明の骨病態モデル動物においては、骨病態の発現形質が継体的に安定していることも確認されている。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト動物、特にレギュカルチントランスジェニックラットは、肝障害、腎障害、糖尿病、心筋梗塞、高血圧、アルツハイマーなどＣａ2+シグナリングが関与する成人病、生活習慣病、老人病など病態評価用実験モデル動物として有用である。また、レギュカルチンは細胞内Ｃａ2+シグナリングに関連した細胞機能を調節しており、本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト動物はかかるレギュカルチンを過剰発現することから、臓器特異的な病態（肝癌、心筋梗塞、大脳痴呆症）の修復・改善のための遺伝子治療薬開発のためのモデル動物として有用な手段になりうる。また、本発明の骨病態モデル動物は、骨粗鬆症等の骨疾患治療のための病態モデル動物として、骨病態機構の解明や新薬の開発を目的とした前臨床試験等に有利に用いることができる。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のトランスジェニックラット作製用発現ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦ部分を切り出す過程を示す図である。
【図２】本発明のトランスジェニックラット作製用発現ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤＮＡのＯＲＦ部分を発現ベクターpCXN2に導入する過程を示す図である。
【図３】本発明のトランスジェニックラット作製用のリニアライズされた導入遺伝子断片調製の過程を示す図である。
【図４】本発明のトランスジェニックラット中のレギュカルチン遺伝子のＰＣＲによる確認におけるプライマーの位置を示す図である。
【図５】動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置を用いた、本発明の骨病態モデルラットの大腿骨組織（骨幹端部及び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
【図６】動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置を用いた、対照のＳＤ系野生型正常ラットの大腿骨組織（骨幹端部及び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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