(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子を誘導発現可能に導入した大腸菌を培養し、タンパク質を産生する方法において、誘導生長期に該外来遺伝子発現誘導をかけることにより、可溶化したタンパク質を取得することを特徴とする方法。
【請求項２】
１２〜２５℃程度の温度で遺伝子発現誘導を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶化した状態で遺伝子組換えタンパク質を発現させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子産物を活性のある組換えタンパク質として得るためには、元の細胞を宿主として用いるのが最も自然であるが、種々の理由から、他の宿主細胞を用いて発現を行うことが多い。その場合の大きな問題点は、組換えタンパク質は検出されるものの、可溶化せずに活性のない状態で発現することが多いことである。
【０００３】
宿主としては、翻訳後の修飾系や産生されたタンパク質のフォールディング機構などで相違点が多いものの、最も手軽で大量の組換えタンパク質が得られるために大腸菌での発現系がはじめに試されることが多い。
【０００４】
この発現系では、組換えタンパク質をタグや融合タンパク質と共に発現させ、発現後の精製や可溶化の利便が図られているが、（1）異種タンパク質発現系を含んだベクターを宿主細胞に導入したものを前培養する、（2）前培養を本培養の培地に希釈して植え継いで対数増殖期になるまで培養を行う、（3）遺伝子誘導発現剤を培地に加えて短時間の誘導発現を行う、といった従来行われてきた発現条件では、可溶化させることが困難な場合が多い。
【０００５】
そこで、（I）本培養、特に誘導後を低温度で行うこと、（II）遺伝子誘導発現剤を用いないか、又は用いても低濃度にすること、（III）適当な宿主、発現ベクター等を選択すること等が検討されているが、未だ可溶化した状態の組換えタンパク質を効率良く得ることは困難である（例えば、非特許文献1及び2参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
サムブルック・ジェイ（Sambrook, J.）及びディー．ダブリュー．ラッセル（D.W. Russell）著，「分子クローニング（Molecular Cloning）：実験マニュアル（A Laboratory Manual）」，（米国），第3版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press），2001年
【０００７】
【非特許文献２】
塚越規弘編集，生物化学実験法45「組換えタンパク質生産法」，学会出版センター，2001年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、インクルージョンボディーを形成せずに、可溶化した状態で効率よく異種タンパク質を得る方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、遺伝子を導入した宿主細胞を誘導生長期（「誘導期」ともいう。）に外来遺伝子発現を誘導し、更に必要に応じて生育速度を抑制した状態で誘導発現を行うことにより、組換えタンパク質を効率良く可溶化した状態で得られることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、下記のタンパク質を産生する方法を提供するものである。
【００１１】
１．外来遺伝子を誘導発現可能に導入した宿主を培養し、タンパク質を産生する方法において、誘導生長期に該外来遺伝子発現誘導をかけることを特徴とする方法。
【００１２】
２．12〜25℃程度の温度で遺伝子発現誘導を行うことを特徴とする上記項1に記載の方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の組換えタンパク質を得る方法は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子が導入された宿主細胞に対して誘導期に誘導をかけ、必要に応じて生育速度を抑制した状態で誘導発現を行うことを特徴とする方法である。
【００１４】
本発明における外来遺伝子が導入された宿主細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、外来遺伝子をベクターに導入し、該ベクターを宿主細胞に導入することが挙げられる。
【００１５】
本明細書中、外来遺伝子とは目的とするタンパク質をコードし、宿主細胞とは異なる細胞由来の遺伝子をいう。外来遺伝子は、公知の方法により、又は市販の遺伝子、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリー等から得ることができる。
【００１６】
ベクターとしても公知のものが使用でき、例えば、pGEX4T-1、pET32a、pET43.1a、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等の大腸菌由来のプラスミド、pUB110、pTP5等の枯草菌由来のプラスミド、YEp13、YEp24、YCp50等の酵母由来のプラスミド、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。
【００１７】
遺伝子をベクターに組み込む方法は公知の方法が使用でき、遺伝子の種類、ベクターの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、上記の遺伝子を制限酵素で切断し、ベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結させ、組換えベクターを得ることが挙げられる。
【００１８】
また、ベクターには、必要に応じてプロモーター、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボゾーム結合配列（SD配列）等を含有させてもよい。選択マーカーとしては、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が上げられる。
【００１９】
本発明の形質転換体は、宿主細胞に上記の組換えベクターを導入することにより得ることができる。ベクターの宿主細胞への導入方法も限定されず、宿主細胞の種類、用いるベクターの種類等に応じて、適宜選択することができる。例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を挙げることができる。
【００２０】
宿主としては、外来遺伝子又はそれによりコードされるタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌類、酵母等を挙げることができる。
【００２１】
得られた形質転換体を培養する培地は、宿主細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、一般に使用されているYM培地、Nutrient Agar培地、LB培地等が挙げられる。必要に応じてアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００２２】
本発明では、形質転換体を培養する際に、形質転換体を細胞濃度として600nmにおける吸光度（OD600）で0.20程度以下、好ましくは0.05以下の誘導生長期濃度に希釈して培地にまくなどして、誘導生長期の形質転換体に対して誘導をかけることが必要である。誘導生長期に誘導をかけることにより、目的とするタンパク質を可溶化した状態で得ることができる。
【００２３】
誘導剤としては、公知のものを使用することができ、宿主細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
また、プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養する場合は、必要に応じて、誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤としては、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）、インドール酢酸等で誘導可能なプロモーターを有するベクターを用いて形質転換した場合、IPTG、インドール酢酸等の誘導剤を培地に添加してもよい。
【００２５】
本願発明における形質転換体を培養する際には、12〜25℃程度、好ましくは21〜25℃程度の低温で宿主細胞の生育を抑制させた条件で行うのが好ましい。このような条件下で宿主細胞を増殖させることによって、更に効率良く目的とするタンパク質を可溶化した状態で得ることができる。
【００２６】
このようにして得られた宿主細胞から、公知の方法により組換えタンパク質を得ることができる。例えば、宿主細胞内に生産される場合には、化学処理剤、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して細胞を破砕すればよいし、宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去すればよい。
【００２７】
得られたタンパク質を単離精製する方法も、公知の方法を使用することができる。一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、組換えタンパク質を単離精製することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳述に説明する。
【００２９】
実施例1
Methylosinus trichosporium OB3b株のゲノムDNAをテンプレートとして、メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子（アクセッション番号X55394）のαサブユニットをBamHＩ、EcoRＩのタグをそれぞれPCRプライマーの端に付けて、PCR増幅した。
【００３０】
大腸菌発現用ベクターpET43.1a（+）（Novagen社）のBamHＩ、EcoRＩサイトに、前記のPCR産物をクローニングし、エレクトロポーレーションによりBL21（DE3）pLysS株にトランスフォーメーションした。
【００３１】
PCR法にてインサートを含むシングルクローンをセレクトした後、アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地に植菌し、一晩37℃にてプレ培養した。
【００３２】
アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地100mlに対し、プレ培養した大腸菌を0.5ml以下（OD600 0.02程度）に植菌し、本培養を行った後、直ちに、IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）を終濃度0.2mMになるように加え、25℃で14〜18時間培養した。
【００３３】
集菌後、BugBuster（Novagen）にて溶菌し、可溶画分を回収した。
【００３４】
非誘導菌体、誘導菌体、可溶画分をそれぞれSDS-pageポリアクリルアミド電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパクが可溶画分にも検出され、αサブユニットを含むタンパク質のほぼ100%が可溶化されたことがわかった。
【００３５】
実施例2
Methylosinus trichosporium OB3b株のゲノムDNAをテンプレートとして、メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子（アクセッション番号X55394）のβサブユニットをBamHI、SmaIのタグをそれぞれPCRプライマーの端に付けて、PCR増幅した。
【００３６】
大腸菌発現用ベクターpGEX4T-1（アマシャムバイオテク社）のBamHI、SmaIサイトに、前記のPCR産物をクローニングし、エレクトロポーレーションによりBL21（DE3）pLysS株にトランスフォーメーションした。
【００３７】
PCR法にてインサートを含むシングルクローンをセレクトした後、アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地に植菌し、一晩37℃にてプレ培養した。
【００３８】
アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地100mlに対し、プレ培養を0.5ml以下（OD600 0.02程度）植菌し、本培養を行った後、直ちに、IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）を終濃度0.1mMになるように加え、21℃で14〜18時間培養した。
【００３９】
集菌後、BugBuster（Novagen）にて溶菌し、可溶画分を回収した。
【００４０】
非誘導菌体、誘導菌体、可溶画分をそれぞれSDS-pageポリアクリルアミド電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパクが可溶画分にも検出され、βサブユニットを含むタンパク質のほぼ100%が可溶化されたことがわかった。
【００４１】
実施例3
Methylosinus trichosporium OB3b株のゲノムDNAをテンプレートとして、メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子（アクセッション番号X55394）のγサブユニットをBamHI、SmaIのタグをそれぞれPCRプライマーの端に付けて、PCR増幅した。
【００４２】
大腸菌発現用ベクターpGEX4T-1（アマシャムバイオテク社）のBamHI、SmaIサイトに、前記のPCR産物をクローニングし、エレクトロポーレーションによりBL21（DE3）pLysS株にトランスフォーメーションした。
【００４３】
PCR法にてインサートを含むシングルクローンをセレクトした後、アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地に植菌し、一晩37℃にてプレ培養した。
【００４４】
アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地100mlに対し、プレ培養した大腸菌を0.5ml以下（OD600 0.02程度）植菌し、本培養を行った後、直ちに、IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）を終濃度0.1mMになるように加え、21℃で14〜18時間培養した。
【００４５】
集菌後、BugBuster（Novagen）にて溶菌し、可溶画分を回収した。
【００４６】
非誘導菌体、誘導菌体、可溶画分をそれぞれSDS-pageポリアクリルアミド電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパクが可溶画分にも検出され、γサブユニットを含むタンパク質のほぼ100%が可溶化されたことがわかった。
【００４７】
実施例4
Methylosinus trichosporium OB3b株のゲノムDNAをテンプレートとして、メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子（アクセッション番号X55394）のαサブユニットをBamHI、EcoRIのタグをそれぞれPCRプライマーの端に付けて、PCR増幅した。
【００４８】
大腸菌発現用ベクターpET43.1a（+）（Novagen社）のBamHI、EcoRIサイトに、前記のPCR産物をクローニングし、エレクトロポーレーションによりHMS174（DE3）pLysS株にトランスフォーメーションした。
【００４９】
PCR法によるインサートを含むシングルクローンをセレクトした後、アンピシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地に植菌し、一晩37℃にてプレ培養した。
【００５０】
カルベニシリン50μg/ml, クロラムフェニコール40μg/mlを含むLB培地100mlに対し、プレ培養した大腸菌を0.5ml以下（OD600=0.02程度）に植菌し、本培養を行った後、直ちに、IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）を終濃度1.0mMになるように加え、25℃で14〜18時間培養した。
【００５１】
集菌後、BugBuster（Novagen）にて溶菌し、可溶性画分を回収した。さらに可溶性画分より、MagExtractor His-tag（TOYOBO）にて、ヒスチジン結合部位を含む誘導タンパクを回収した。
【００５２】
非誘導菌体、誘導菌体、可溶性画分、およびMagExtractor精製物をそれぞれSDS-pageポリアクリルアミド電気泳動にて分析したところ、非誘導菌体及び誘導菌体では、総タンパク質の1%以下しか検出されなかった。また、αサブユニットを含むタンパク質のバンドが、可溶性画分には1%程度、MagExtractor 精製物には10%程度それぞれ総タンパク質中に検出された。
【００５３】
通常の発現精製後は、透析過程で沈殿を生じることが多いが、可溶化されたタンパク質は、透析（MOPS, pH7.0, 25mM）を用いた透析でも沈殿を生じなかった。即ち、誘導されたタンパクは、発現レベルが低いものの非常に可溶化を保持しやすい形で発現しているものと推定される。
【００５４】
また、同タンパク質透析溶液を還元後、ESRを0〜400mTの範囲で測定したところ、2価鉄に由来するバンドが検出され、また、ナフタレン酸価反応においても、β-ナフトールに由来する呈色が観察されたので、sMMOの活性は発現されていることが定性的に示唆された。
【００５５】
本実施例により、非常に貴重なタンパク質を発現させる場合には、本発明の方法を用いることにより、発現したタンパク質が容易でしかも効率良く回収でき、更には可溶化状体が保持されやすいことが示された。
【００５６】
比較例1
IPTGを加える際の濁度を、通常の誘導条件であるOD600 0.3、培養条件を37℃とした以外は、実施例1と同様に実験を行ったところ、可溶化画分に誘導タンパクは検出されなかった。
【００５７】
比較例2
IPTGを加える際の濁度を、通常の誘導条件であるOD600 0.3、培養条件を37℃とした以外は、実施例2と同様に実験を行ったところ、可溶化画分に誘導タンパクは検出されなかった。
【００５８】
比較例3
IPTGを加える際の濁度を、通常の誘導条件であるOD600 0.3、培養条件を37℃とした以外は、実施例2と同様に実験を行ったところ、可溶化画分に誘導タンパクは検出されなかった。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の組換えタンパク質を得る方法によれば、遺伝子を導入された宿主細胞の誘導期に誘導をかけ、更に低温で培養を行うことにより、更に効率良く可溶化した状態で組換えタンパク質を得ることができる。