(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン交換液体クロマトグラフィーにより、ヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法において、１検体の測定に溶出力の異なる２種以上の溶離液を用い、Ｎ番目（Ｎは１以上の整数）の検体の測定後、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、Ｎ＋１番目の検体をインジェクションすることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
Ｎ＋１番目の検体中のヘモグロビンＡ１ａ及びＡ１ｂを分離する際に、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィーを用いてヘモグロビン類を測定する場合、一般的に、カチオン交換カラムを用い、溶離液の溶出力を変化させながらヘモグロビン（Ｈｂ）類の分離を行う（特公平８−７１９８号公報等参照）。通常、溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーで分離すると、ヘモグロビンＡ１ａ（以下ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下ＨｂＦという）、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、不安定型ＨｂＡ１ｃという）、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）、ヘモグロビンＡ０（以下ＨｂＡ０という）の順に溶出する。
【０００３】
一般に、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂから安定型ＨｂＡ１ｃの溶出までは溶出力の比較的弱い溶離液（第１液）が用いられ、ＨｂＡ０の溶出には、測定時間の短縮とカラムの劣化防止のために、第１液と比較して極端に溶出力の強い液（第２液）が用いられる。従来、複数検体を連続測定する場合においては、ＨｂＡ０を全て溶出させ１検体の測定が完了した後、第１液によってカラム内が平衡に達するのを待って、次の検体の測定に入ることが行われてきた。これは第１液によってカラム内が完全に平衡に達しないまま次の検体の測定に入ると、溶出順序が早い成分（ＨｂＡ１ａやＨｂＡ１ｂ）だけでなく、安定型ＨｂＡ１ｃの分離も悪くなると考えられていたためである。しかしながら、カラム内が第１液で完全に平衡に達するのを待ってから次の検体の測定に入ると、１検体の測定に長時間を要し迅速な連続測定の妨げとなるという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記に鑑み、複数検体を連続測定する場合において測定時間を短縮することが可能な、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーにより、ヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法において、１検体の測定に溶出力の異なる２種以上の溶離液を用い、Ｎ番目（Ｎは１以上の整数）の検体の測定後、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、Ｎ＋１番目の検体をインジェクションすることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【０００６】
請求項２記載の発明は、Ｎ＋１番目の検体中のヘモグロビンＡ１ａ及びＡ１ｂを分離する際に、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法である。
【０００７】
本発明においては、１検体の測定に溶出力の異なる２種以上の溶離液を用いる。溶出力の異なる溶離液としては、例えば、ｐＨまたは塩濃度のうち少なくとも一方が異なる緩衝液を用いることができる。溶出法としては、勾配溶出法、段階溶出法のどちらを用いてもよい。
【０００８】
１検体の測定に溶出力の異なる２種の溶離液を用いる場合においては、例えば次のような第１液および第２液を用いることができる。但し、溶離液の種類は、２種に限定されるわけではない。
【０００９】
ＨｂＡ０より前に溶出する成分を分離するための溶離液（第１液）のｐＨは、４．０〜６．０が好ましい。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグロビンが変成する可能性があり、ｐＨが６．０を超えるとヘモグロビンの陽電荷が減少し、カチオン交換樹脂に保持されにくく、分離能が低下するために好ましくない。また、第１液として、ｐＨが上記範囲内にあり、ｐＨが異なる２種以上の溶離液を用いてもよい。
【００１０】
ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液（第２液）は、カラムの耐久性の向上と測定時間短縮のために、実際にカラムを通過するときのｐＨがヘモグロビンの等電点（ｐＨ６．８）よりアルカリ性側になるように設定する。第２液のｐＨは、７．０〜１０が好ましく、より好ましくは７．５〜１０である。ｐＨが７．０より低いと、カラムを通過する時のｐＨが６．８以上に到達せず、１０よりも高いと充填剤が分解する恐れがあるためである。また、第２液として、ｐＨが上記範囲内にあり、ｐＨが異なる２種以上の溶離液を用いてもよい。
【００１１】
上記溶離液としては、例えば、リン酸系、ホウ酸系、炭酸系等の無機酸またはその塩の他、クエン酸系、β，β−ジメチルグルタル酸系、酢酸系、コハク酸系、フタル酸系、カコジル酸系、マレイン酸系等の有機酸またはその塩よりなる緩衝液を用いることができる。その他、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ等のＧｏｏｄ’ｓの緩衝液も使用できる。
【００１２】
上記緩衝液の濃度は、緩衝作用がある範囲であればよく、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００１３】
上記緩衝液には、適宜、無機塩類、カオトロピックイオン、ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒等を添加してもよい。
【００１４】
上記無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、１〜１５００ｍＭである。
【００１５】
上記カオトロピックイオンとは、水溶液に溶けると解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等がある。また、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン等がある。
【００１６】
上記ｐＨ調節剤としては、公知の酸または塩基を用いることができ、酸としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等がある。また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニッケル、水酸化アルミニウム、水酸化カドミウム等がある。これらの酸、塩類の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．００１〜５００ｍＭである。
【００１７】
上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等を用いることができる。緩衝液中の濃度としては、特に限定されないが、好ましくは１０〜８０％（ｖ／ｖ）である。
【００１８】
本発明はヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法に関するものであり、Ｎ番目（Ｎは１以上の整数）の検体の測定後、Ｎ＋１番目検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、Ｎ＋１番目の検体のインジェクションを行う。
【００１９】
上記Ｎ番目の検体の測定とは、Ｎ番目の検体のインジェクションを行った後、Ｎ番目の検体中のＨｂＡ０が完全に溶出するまでを意味する。また、上記のＮ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液とは、溶出力の異なる２種以上の溶離液のうち、１検体の測定の一番目に用いる溶離液である。
【００２０】
本発明において、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していないことは、例えば、カラムから流出する溶離液のｐＨあるいは電気伝導度を測定することにより確認することができる。
【００２１】
本発明においては、Ｎ＋１番目の検体中のヘモグロビンＡ１ａ及びＡ１ｂを分離する際にのみ、Ｎ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることがより好ましい。これは、Ｎ＋１番目の検体中のヘモグロビンＡ１ａ及びＡ１ｂを分離する際にＮ＋１番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることにより、ＨｂＡ１ａとＨｂＡ１ｂが充分に分離されずに溶出してしまうが、これらの成分の分離定量は臨床的に意義が認められておらず、分離されずにまとめて溶出しても特に問題はないためである。このことにより、安定型ＨｂＡ１ｃを分析する場合においても、より迅速に連続測定を行うことができる。
【００２２】
本発明で用いる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成され、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）を適宜付属してもよい。
【００２３】
本発明で用いる液体クロマトグラフにおいて、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。
【００２４】
本発明で用いる液体クロマトグラフにおいて、測定試料の検出は、４１５ｎｍの可視光を用いるのが好ましいが、特に限定されるわけではない。
【００２５】
上記測定試料としては、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いるのが好ましいが、特に限定されるわけではない。
【００２６】
上記試料試料の注入量としては、希釈倍率によって異なるが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。
【００２７】
本発明におけるカラムの充填剤としては、カチオン交換基をもち、粒径が０．１〜１０μｍのものを用いるのが好ましい。粒径が０．１μｍよりも小さいものは、圧力が高くなり、また、粒径が１０μｍよりも大きくなると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり、分離能が悪くなるためである。
【００２８】
上記カチオン交換液体グロマトグラフィーにおいて、充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子より成るものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００２９】
上記カチオン交換基は、公知のものでよく、特に制限はなく、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸機等のカチオン交換基が挙げられる。また、カチオン交換基は、複数種導入してもよい。
【００３０】
上記粒子の直径は、好ましくは、０．１〜１０μｍ、より好ましくは、０．２〜８μｍである。粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差／平均直径×１００）として、好ましくは、２０％以下、より好ましくは、１５％以下である。
【００３１】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子等が挙げられる。高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また、耐圧性、耐湿潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００３２】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する交換基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でイオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によっても本発明のカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合したあと、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に交換させてもよい。
【００３３】
更に、特公平８−７１９７号公報記載のように、架橋性重合体粒子を調製したあと、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合性粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００３４】
上記カラムの素材は、ステンレスなどの金属、ＰＥＥＫなどのプラスチック、ガラスを用いることができる。また、カラムの充填剤と接する部分をイナートな素材、例えば、ＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜で被覆してもよい。
【００３５】
上記充填剤の充填は、公知の任意の方法、例えば、スラリー充填法を用いるのが好ましい。充填剤粒子を溶離液などの緩衝剤に分散させ、スラリーとして、送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行うことができる。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３７】
（測定試料）
健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００３８】
（実施例１）
以下の条件で、上記試料の測定を行った。
0003975017.tif 000002
【００３９】
（比較例１）
測定条件を以下の通りにしたこと以外は、実施例１と同様に測定を行った。
・測定条件：測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを、３〜３．２分の間は溶離液Ｂを、３．２〜５分の間は溶離液Ａを流した。
【００４０】
（測定結果）
実施例１により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１に、比較例１により試料を測定して得られたクロマトグラムを図２に示した。
図１と図２を比較すると、比較例１では、測定時間が５分であるのに対し、実施例１では、測定時間は３．５分と短いにもかかわらず、両者は同等の分離能をもつことが分かる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂの成分を完全に分離せずまとめて溶出させることができるので、検体の連続測定において測定時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図
【図２】  比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図
【符号の説明】
１…ＨｂＡ１ａおよびＨｂＡ１ｂのピーク
２…ＨｂＦのピーク
３…不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４…安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５…ＨｂＡ０のピーク
【図１】
0003975017.tif 000003
【図２】
0003975017.tif 000004