(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１または２で示されるピペリジン誘導体を構成成分とする薬物担体。
【化１】
0003930919.tif 000012
式１中、Ｒ1は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一または異なって、水素（ただし、Ｒ2及びＲ3が共に水素の場合は除く）、炭素数１〜２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。また分子内に不斉炭素が存在する場合、その化合物はラセミ体、光学活性体のいずれでも良い。
【化２】
0003930919.tif 000013
式２中、Ｒ1及びＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一または異なって、水素（ただし、Ｒ2及びＲ3が共に水素の場合は除く）、炭素数１〜２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。また分子内に不斉炭素が存在する場合、その化合物はラセミ体、光学活性体のいずれでも良い。
【請求項２】
前記薬物担体に診断および／または治療するための薬物を封入してなる請求項１に記載の薬物担体。
【請求項３】
前記担体の径が０.０２〜２５０μｍである微小粒子よりなる請求項１乃至請求項２に記載の薬物担体。
【請求項４】
前記担体が巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちの少なくとも一つから構成される請求項１乃至請求項４に記載の薬物担体。
【請求項５】
前記担体がリン脂質あるいはその誘導体、および／またはリン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、および／または安定化剤、および／または酸化防止剤、および／またはその他の表面修飾剤を含有する請求項１乃至請求項４に記載の薬物担体。
【請求項６】
前記診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体である請求項２乃至請求項５に記載の薬物担体。
【請求項７】
前記診断および／または治療するための薬物が、抗炎症剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤あるいはラジカルスカベンチャーである請求項２乃至請求項５に記載の薬物担体。
【請求項８】
前記診断および／または治療するための薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体である請求項２乃至請求項５に記載の薬物担体。
【請求項９】
前記診断および／または治療するための薬物が、オリゴおよび／または多糖、およびそれらの誘導体である請求項２乃至請求項５に記載の薬物担体。
【請求項１０】
前記診断および／または治療するための薬物が、タンパク質またはペプチドである請求項２乃至５に記載の薬物担体。
【請求項１１】
前記診断および／または治療するための薬物が、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の各種体内診断薬である請求項２乃至請求項５に記載の薬物担体。
【請求項１２】
下記式６、７または８で示されるピペリジン誘導体。
【化３】
0003930919.tif 000014
【化４】
0003930919.tif 000015
【化５】
0003930919.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なピペリジン誘導体およびそれを構成成分とする薬物担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小包を薬物担体としてドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳと称す）に応用しようとする研究が盛んに行われている。これら閉鎖小包は一般的にリン脂質あるいはその誘導体、またはステロールやリン脂質以外の脂質等を基本膜構成成分として調製される、しかしながら、これら基本構成成分のみでは、閉鎖小包同士の凝集、体内における滞留性の低下などの実際に応用していくうえでの様々な面での困難を克服することはできなかった。さらに、実際にＤＤＳ製剤として目的の部位に薬物に到達させることは非常に困難であった。
【０００３】
そこで、薬物封入率の向上および閉鎖小包の細胞接着性の向上を目的として、ステアリルアミン等のカチオン化脂質を少量配合することにより、閉鎖小包体の表面を生理的ｐＨ範囲でカチオン化する試みも行われている。特にＤＮＡを含むカチオン性のリポソームはＤＮＡの細胞中への移動、すなわち、トランスフェクションを促進することが知られているが、さらに導入効率、発現率、安全性の高いものが切望されている。しかし、カチオン化脂質として選択できる脂質は限られており、安全性が高く、高機能を発現する薬物担体用カチオン化脂質の開発が強く望まれている。現在のところ、そのようなカチオン化脂質としては、米国特許第４８９７３５５号、米国特許第５３３４７６１号、日本特許公報特開平２−２９２２４６号、日本特許公報特開平４−１０８３９１号が報告されているが十分な効果は得られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、効率良くかつ安全にＤＮＡを細胞中へ導入でき、またＤＮＡの細胞中への移動以外の目的、例えば血管内皮損傷部位、腎炎、腎ガン、肺炎、肺ガン、肝炎、肝ガン、膵ガン、リンパ腫などの患部に確実に、効率良くかつ安全に薬物のターゲッティングが行えＤＤＳ療法に有効な薬物担体の開発が強く望まれている。
【０００５】
従って本発明の目的は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体を細胞へ効率良くしかも安全にトランスフェクションを行える薬物担体、およびそれを形成しうるカチオン化脂質を提供することである。また本発明の目的は薬物、ペプチドおよびタンパク質を目的の部位に効果的に送達する薬物担体、およびそれを形成しうるカチオン化脂質および薬物担体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
（１）下記一般式１または２で示されるピペリジン誘導体を構成成分とする薬物担体。
【０００７】
【化６】
0003930919.tif 000002
【０００８】
式１中、Ｒ1は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一または異なって、水素（ただし、Ｒ2及びＲ3が共に水素の場合は除く）、炭素数１〜２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。また分子内に不斉炭素が存在する場合、その化合物はラセミ体、光学活性体のいずれでも良い。
【０００９】
【化７】
0003930919.tif 000003
【００１０】
式２中、Ｒ1及びＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ2及びＲ3は、同一または異なって、水素（ただし、Ｒ2及びＲ3が共に水素の場合は除く）、炭素数１〜２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。また分子内に不斉炭素が存在する場合、その化合物はラセミ体、光学活性体のいずれでも良い。
【００１１】
（２）前記薬物担体に診断および／または治療するための薬物を封入してなる上記（１）に記載の薬物担体。
（３）前記担体の径が０.０２〜２５０μｍである微小粒子よりなる上記（１）乃至（２）に記載の薬物担体。
（４）前記担体が巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちの少なくとも一つから構成される上記（１）乃至（３）に記載の薬物担体。
【００１２】
（５）前記担体がリン脂質あるいはその誘導体、および／またはリン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、および／または安定化剤、および／または酸化防止剤、および／またはその他の表面修飾剤を含有する上記（１）乃至（４）に記載の薬物担体。
（６）前記診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体である上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
（７）前記診断および／または治療するための薬物が、抗炎症剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤あるいはラジカルスカベンチャーである上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
【００１３】
（８）前記診断および／または治療するための薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体である上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
（９）前記診断および／または治療するための薬物が、オリゴおよび／または多糖、およびそれらの誘導体である上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
（１０）前記診断および／または治療するための薬物が、タンパク質またはペプチドである上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
（１１）前記診断および／または治療するための薬物が、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の各種体内診断薬である上記（２）乃至（５）に記載の薬物担体。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物は、いずれも新規化合物であり、一般式（１）で表される化合物は下記一般式（３）で表されるカルボン酸誘導体に、カルボン酸活性化剤を反応させてカルボキシル基における反応性誘導体に導き、ついで、下記一般式（４）で表されるアミン誘導体と反応させることによって製造することができる。また必要に応じ公知の方法により保護基を脱離させる。
【００１６】
【化８】
0003930919.tif 000004
【００１７】
式３中、Ｒ1は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、適当な保護基（例えばベンジルオキシカルボニル基）であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。
【００１８】
【化９】
0003930919.tif 000005
【００１９】
式４中、Ｒ2及びＲ3は、同一または異なって、水素（ただしＲ2及びＲ3が共に水素の場合は除く）、炭素数１〜２５のアルキル基またはアルケニル基を示す。
【００２０】
カルボン酸誘導体（３）とカルボン酸活性化剤との反応において、カルボン酸活性化剤としては、例えば塩化チオニル、五塩化リン、クロロギ酸エステル（クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル）、塩化オキサリル、カルボジイミド類（例えば、Ｎ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ））、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）などがあげられるが、カルボジイミド類とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４−ジメチルアミノピリジンまたはヒドロキシコハク酸イミドを併用してもよい。この反応は通常、例えば塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミドまたはこれらの混合溶媒などの存在下に行われる。反応温度は通常−１０℃〜５０℃である。
【００２１】
この反応において、カルボン酸活性化剤として、塩化チオニル、塩化オキサリルまたは五塩化リンを用いた場合は反応性誘導体として酸ハロゲン化物が得られ、カルボン酸活性化剤としてクロロギ酸エステルを用いた場合には反応性誘導体とした混合酸無水物が得られ、またカルボン酸活性化剤としてカルボジイミド類を用いた場合には反応性誘導体として活性エステルが得られる。
【００２２】
カルボン酸誘導体（３）のカルボキシル基における反応性誘導体とアミン誘導体（４）との反応は、該反応誘導体が酸ハロゲン化物である場合は例えば塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトンなどの溶媒中、脱酸剤（ピリジン、トリエチルアミン、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムなど）の存在下に無水または含水条件下に行なわれる。反応温度は−５０℃〜１００℃、好ましくは−１０℃〜３０℃である。該反応性誘導体が活性エステルまたは混合酸無水物である場合はカルボン酸誘導体（３）のカルボン酸活性化剤との反応で用いた溶媒と同様な溶媒中で行うことができる。この場合の反応温度は通常０〜３０℃で反応時間は通常１〜５時間である。
【００２３】
また、一般式（２）で示される化合物は、一般式（１）で示される化合物と同様にカルボン酸誘導体（５）とアミン誘導（４）を反応させることにより製造できる。または、一般式（１）で示される化合物を公知の方法に従い、アルキル化またはアルケニル化することにより製造することができる。
【００２４】
【化１０】
0003930919.tif 000006
【００２５】
式５中、Ｒ1及びＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ4は、水素、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基、Ｘは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ｍは、０または１であり、ｎは、０または１〜１０の整数を示す。
【００２６】
このように製造されるピペリジン誘導体（１）および（２）は、自体公知の分離、精製手段（例えば、クロマトグラフィー、再結晶）などにより単離採取することができる。
【００２７】
本発明の担体は、粒径が０.０２〜２５０μｍ、とりわけ０.０５〜０.４μｍの大きさが好ましい。また、その構造は様々な形態が考えられ、限定する必要はないが、特にその内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちより少なくとも一つ以上からなることが最も望ましい。
【００２８】
本発明において、薬物担体の構成成分としては、上記の形態を形成できるものであれば特にその配合に限定する必要はないが、その安全性や、生体内において安定性を考慮すると、リン脂質あるいはその誘導体、リン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、または安定化剤、酸化防止剤、その他の表面修飾剤の配合が望ましい。
【００２９】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらを常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
【００３０】
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
【００３１】
その他の表面修飾剤としては、親水性高分子やグルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
前記親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。その中でもポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
【００３２】
また前記親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させた誘導体を用いることによって、疎水性化合物部位を薬物担体（例えばリポソーム）の膜へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。本発明において具体的に用いることができる親水性高分子誘導体としては、ポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【００３３】
本発明において、薬物担体に封入する薬剤としては、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を用いることができる。
封入する薬剤の性質としては、基本的にはどの物質においても問題ないが、担体の表面が陽電荷を持つ特徴から、電気的に中性あるいはアニオン性である物質の方が高封入率が期待できる。
【００３４】
封入する治療するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねないがぎり特に限定されるものではない。具体的には、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗炎症剤、抗癌剤、酵素剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメデイエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、ラジカルスカベンチャー、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。
【００３５】
また、封入する診断するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねないがぎり特に限定されるものではない。具体的には、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等が挙げられる。
【００３６】
本発明の薬物担体は常法によって容易に得ることができるが、その一例を以下に示す。フラスコ内に一般式（１）乃至（２）で示されるピペリジン誘導体およびリン脂質等の他の担体構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、当該フラスコ内に薬物を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし封入されなかった薬物を除去することにより、薬物担体を分散液として得ることができる。また、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
【００３７】
【実施例】
次に実施例、試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例、試験例に限定されるものではない。
（実施例１）
Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミドの合成
１−（ベンジルオキシカルボニル）−４−（カルボキシメトキシ）ピペリジン１.１７ｇ、ジオクタデシルアミン２.０９ｇとベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェ−ト１.９５ｇのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍｌ）−塩化メチレン（２０ml）溶液に、氷冷下、トリエチルアミン１.２１ｇを加え、室温で一夜攪拌した。水を加え酢酸エチルで抽出し、有機層を順に希酸、水、希アルカリ、水で洗い、無水硫酸マグネウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、クロロホルム溶出画分より Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−（ベンジルオキシカルボニル）ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド３.１４ｇを得た（収率１００％、油状物質）。
【００３８】
水素雰囲気下、 Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−（ベンジルオキシカルボニル）ピペリジン−４−イル−オキシ）−アセトアミド１.８９ｇ、１０％パラジウム炭素５００mgのエタノール（１５ml）懸濁液を一夜攪拌した。触媒を濾過後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、５％メタノール−クロロホルム溶出画分よりＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド５４０mgを得た（収率３４％、無色結晶、融点８９−９０℃）。このものの機器分析デ−タは、下記の式（６）の構造を支持する。
【００３９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ppm）：４.１５（２Ｈ,ｓ），３.８２−３.７６（１Ｈ,ｍ），３.３９−３.０８（８Ｈ,ｍ），２.２１−１.９９（４Ｈ,ｍ），１.５８−１.４６（４Ｈ,ｍ），１.３４−１.１９（６０Ｈ,ｍ），０.８８（６Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.８０Hz）
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）  ６６４（Ｍ＋１）
【００４０】
【化１１】
0003930919.tif 000007
【００４１】
（実施例２）
Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミドの合成
Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド１.３３ｇ、ホルマリン（３７％）１７９mgとギ酸１mlの混合溶液を９０℃で２時間攪拌した。希酸を加え、減圧濃縮し、希アルカリを加え塩化メチレンで抽出し、有機層を順に希アルカリ、水で洗い、無水硫酸マグネウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、５％メタノール−クロロホルム溶出画分よりＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド１.２４ｇを得た（収率９２％、無色結晶、融点５０℃）。このものの機器分析デ−タは、下記の式（７）の構造を支持する。
【００４２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ppm）：４.１４（２Ｈ,ｓ），３.５２−３.４３（１Ｈ,ｍ），３.２８（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝８.００Hz），３.２３（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝８.００Hz），２.８０−２.７１（２Ｈ,ｍ），２.３７−２.１８（２Ｈ,ｍ），２.３１（３Ｈ,ｓ），２.０３−１.９３（２Ｈ,ｍ），１.７７−１.６４（２Ｈ,ｍ），１.６０−１.４６（４Ｈ,ｍ），１.３１−１.．２３（６０Ｈ,ｍ)，０.８８（６Ｈ,ｔ,Ｊ＝７.４Hz）
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）  ６７８（Ｍ＋１）
【００４３】
【化１２】
0003930919.tif 000008
【００４４】
（実施例３）
Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１,１−ジメチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミドの合成
Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド１.２４ｇの塩化メチレン（２０ml）溶液に、ヨウ化メチル７７９mgを加え、一夜還流攪拌した。反応溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、５％メタノール−クロロホルム溶出画分よりＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１,１−ジメチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド７３０mgを得た（収率４９％、無色結晶、融点２１４−２１７℃、再結晶アセトニトリル）。このものの機器分析データは、下記の式（８）の構造を支持する。
【００４５】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ppm）：４.２２（２Ｈ,ｓ），３.９３−３.８８（１Ｈ,ｍ），３.８３−３.６３（２Ｈ,ｍ），３.５５（３Ｈ,ｓ），３.４３（３Ｈ,ｓ），３.２７（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝８.０Hz），３.１０（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝８.０Hz），２.３４−２.２２（２Ｈ,ｍ），２.１５−２.０３（２Ｈ,ｍ），１.６０−１.４６（４Ｈ,ｍ），１.３３−１.１９（６０Ｈ,ｍ），０.８８（３Ｈ,ｔ,Ｊ＝７.８Hz）
【００４６】
【化１３】
0003930919.tif 000009
【００４７】
（実施例４）
実施例１で合成したＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミドを３μＭ、コレステロールを６μＭ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を２１μＭを容量１０mlのナス型フラスコに秤りとり１mlのクロロホルムにて完全に溶解する。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去しフラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。ついで０.５μＭのカルセインを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１mlをフラスコに加え、激しく浸透攪拌することにより、リポソーム（ＭＬＶ）分散液を得た。
【００４８】
（実施例５）
実施例４と同様にして、実施例２で合成したＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド３μＭ、コレステロール６μＭ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）２１μＭおよびカルセインを含むリポソーム分散液を得た。
【００４９】
（実施例６）
実施例４と同様にして、実施例３で合成したＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（１−ジメチルピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミド３μＭ、コレステロール６μＭ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）２１μＭおよびカルセインを含むリポソーム分散液を得た。
【００５０】
（試験例１）
カルセインの封入率の測定
カルセインのリポソームへの封入率は、次のように求めた。５０倍の希釈した調製したリポソーム懸濁液４０μｌを２.０mlの１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液に添加し、蛍光強度を測定する（励起波長４９０nm，蛍光波長５３０nm）。この時の蛍光強度をＦｔとする。つぎに１０mMＣｏＣｌ2水溶液を２０μｌ添加しリポソームに封入されなかったカルセインを消光させ、リポソームの内部に封入されたカルセインの蛍光を測定する。この時の蛍光強度をＦｉｎとする。さらに２０％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液を２０μｌ添加することにより、リポソームを破壊し、すべてのカルセインをＣｏ2+と結合させ消光させる。この時の蛍光強度を、Ｆｑとする。リポソームの保持効率は以下の式にて計算される。
【００５１】
保持効率（％）＝（Ｆｉｎ−Ｆｑ×ｒ）／（Ｆｔ−Ｆｑ× ｒ）×１００
【００５２】
式中のｒは、リポソーム懸濁液および薬物の添加に伴う反応液の体積変化を補正した値で本実験ではｒ＝（２.０＋０.０４＋０.０２＋０.０２）／２.０＝１.０４である。結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0003930919.tif 000010
【００５４】
（実施例７）
実施例１で合成したＮ,Ｎ−ジオクタデシル−２−（ピペリジン−４−イル−オキシ）アセトアミドを１０μＭ、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）を２０μＭ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を２０μＭ秤りとり、１mlのクロロホルム溶液Ａとする。クロロホルム溶液Ａの２０μｌを容量１０mlのナス型フラスコに取りさらに１mlのクロロホルムを加えた。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去しフラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。
β-galactosodaseの遺伝子を組み込んだプラスミドｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ（Invitrogen社）２０μｇを溶解した水溶液１mlをフラスコ内に加え、激しく浸透攪拌することによりＤＮＡ封入リポソームを得た。
【００５５】
（試験例２）
細胞の調製とトランスフェクション
細胞：大日本製薬株式会社より購入した、Ｃｏｓ―１細胞（ATCC No. CRL-1650）を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むIscove'ｓ modified Dulbecco's medium（IMDM）を用いて５％ＣＯ2，９５％Ｏ2，３７℃のインキュベータ中で継代培養した。
【００５６】
トランスフェクション：１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地（１ml）を添加した、６穴マルチウェルプレートに約２×１０4のＣｏｓ−１細胞を加え細胞培養を行った。約２４時間培養後ＦＣＳを含まない新鮮培地と交換し、０.２μｇのＤＮＡを含むリポソーム懸濁液を加える。１６時間培養後、１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地にて培地交換し、さらに４８時間培養した。細胞を、ホルムアルデヒドで固定し、β-galactosidaseの基質である、５-bromo-４chloro-３-indolyl-β-galactopyranoside（X-gal）を加え、β-galactosidaseを発現した細胞を同定した。発色した細胞の全体に対する割合は、画像処理により測定した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
（急性毒性）
ＩＣＲ系雄性マウス（５週齢）を用いて経口および静脈内投与により急性毒性試験を行った結果、本発明の化合物のＬＤ50はいずれも３２０mg/kg以上であり有効性に比べて高い安全性が確認された。
【００５９】
【発明の効果】
上述した通り、本発明により新規ピペリジン誘導体が供給される。本発明のピペリジン誘導体を構成成分とする薬物担体は、試験例に示されるように、従来の薬物担体に比べ細胞への薬物の導入効率が高いことが明らかとなった。
このような特徴から、薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入させた本発明の薬物担体は、治療および診断という目的に対して非常に効果的である。