(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０、ＴＥＥＰＯＬ ＨＢ７およびＳＰＡＮ８５からなる群から選択される安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックポリマー界面活性剤、テトロニックポリマー界面活性剤、およびポリエチレングリコールからなる群から選択されるミセル形成試薬、および
（ｃ）スクアレン、スクアラン、エイコサン、プリスタン、テトラテトラコンタン、トリアコンタン、グリセリン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油
のうちの２つからなり、免疫刺激ペプチド成分を欠き、安定な水中油型乳剤として製剤化された、マイクロ流動化された抗原製剤と混合されている、ヒトまたは家畜または農業的に重要な動物においてＭＨＣクラスＩ制限細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を誘導するための組成物。
【請求項２】
抗原が、ウイルス、寄生体または腫瘍抗原である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
抗原が、ＨＩＶ抗原：ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖ；Ｂ型肝炎表面抗原：Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２、ＨＢｃ ＡｇおよびＨＢｅ Ａｇ；インフルエンザ抗原：ＨＡ、ＮＰおよびＮＡ；Ａ型肝炎表面抗原；ヘルペスウイルス抗原：ＥＢＶ ｇｐ３４０、ＥＢＶ ｇｐ８５、ＨＳＶ ｇＢ、ＨＳＶ ｇＤ、ＨＳＶ ｇＨ、ＨＳＶ 初期蛋白質生成物、サイトメガロウイルス抗原：ｇＢ、ｇＨおよびＩＥ蛋白質ｇＰ７２；呼吸器シンシチウムウイルス抗原：Ｆ蛋白質、Ｇ蛋白質およびＮ蛋白質；およびヘルペスパピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６およびＥ７；および腫瘍抗原からなる群から選択されるウイルス抗原である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗原が、ＣＳ蛋白質およびスポロゾイト表面蛋白質２からなる群から選択されるマラリア抗原である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
抗原が、癌ＣＥＡ、癌関連ムチン、癌Ｐ２１、癌Ｐ５３、メラノーマＭＰＧ、メラノーマｐ９７、ＭＡＧＥ抗原、癌Ｎｅｕオンコゲン生成物、癌ｐ５３遺伝子生成物、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原および突然変異ｐ２１ｒａｓ蛋白質からなる群から選択される腫瘍抗原である請求項２記載の組成物。
【請求項６】
植物油がオリーブ油またはピーナッツ油である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、およびＴＷＥＥＮ８０からなる群から選択される安定化界面活性剤、および
（ｂ）スクアレン、スクアラン、エイコサン、プリスタン、テトラテトラコンタン、トリアコンタン、グリセリン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０またはＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、および
（ｂ）スクアランである生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、および
（ｂ）プリスタン、コレステロールまたはオリーブ油である生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、およびＴＷＥＥＮ８０からなる群から選択される安定化界面活性剤、および
（ｂ）プルロニックＬ１２１、プルロニックＬ６２ＬＦ、プルロニックＬ１０１、プルロニックＬ６４、テトロニック１５０１、テトロニック１５０Ｒ１、テトロニック７０１、テトロニック９０１、テトロニック１３０１、テトロニック１３０Ｒ１およびＰＥＧ１０００からなる群から選択されるミセル形成試薬
からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、および
（ｂ）プルロニツクＬ１２１であるミセル形成試薬
からなる、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）スクアレン、スクアラン、エイコサン、プリスタン、テトラテトラコンタン、トリアコンタン、グリセリン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油；および
（ｂ）プルロニックＬ１２１、プルロニックＬ６２ＬＦ、プルロニックＬ１０１、プルロニックＬ６４、テトロニック１５０１、テトロニック１５０Ｒ１、テトロニック７０１、テトロニック９０１、テトロニック１３０１、テトロニック１３０Ｒ１およびＰＥＧ１０００からなる群から選択されるミセル形成試薬
からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）スクアランである生物的分解性および生物的適合性である油、および
（ｂ）プルロニックＬ１２１であるミセル形成試薬
からなる、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０、ＴＥＥＰＯＬ ＨＢ７およびＳＰＡＮ８５からなる群から選択される安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックポリマー界面活性剤、テトロニックポリマー界面活性剤、およびポリエチレングリコールからなる群から選択されるミセル形成試薬、および
（ｃ）スクアレン、スクアラン、エイコサン、プリスタン、テトラテトラコンタン、トリアコンタン、グリセリン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油
を含んでなり、免疫刺激ペプチド成分を欠き、安定な水中油型乳剤として製剤化された、マイクロ流動化された抗原製剤と混合されている、ヒトまたは家畜または農業的に重要な動物においてＭＨＣクラスＩ制限細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を誘導するための組成物。
【請求項１５】
前記抗原製剤が本質的に前記安定化界面活性剤、前記ミセル形成試薬、および前記油からなる請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
抗原が、ウイルス、寄生体または腫瘍抗原である請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
抗原が、ＨＩＶ抗原：ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖ；Ｂ型肝炎表面抗原：Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２、ＨＢｃ ＡｇおよびＨＢｅ Ａｇ；インフルエンザ抗原：ＨＡ、ＮＰおよびＮＡ；Ａ型肝炎表面抗原；ヘルペスウイルス抗原：ＥＢＶ ｇｐ３４０、ＥＢＶ ｇｐ８５、ＨＳＶ ｇＢ、ＨＳＶ ｇＤ、ＨＳＶ ｇＨ、ＨＳＶ 初期蛋白質生成物、サイトメガロウイルス抗原：ｇＢ、ｇＨおよびＩＥ蛋白質ｇＰ７２；呼吸器シンシチウムウイルス抗原：Ｆ蛋白質、Ｇ蛋白質およびＮ蛋白質；およびヘルペスパピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６およびＥ７；および腫瘍抗原からなる群から選択されるウイルス抗原である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
抗原が、ＣＳ蛋白質およびスポロゾイト表面蛋白質２からなる群から選択されるマラリア抗原である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
抗原が、癌ＣＥＡ、癌関連ムチン、癌Ｐ２１、癌Ｐ５３、メラノーマＭＰＧ、メラノーマｐ９７、ＭＡＧＥ抗原、癌Ｎｅｕオンコゲン生成物、癌ｐ５３遺伝子生成物、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原および突然変異ｐ２１ｒａｓ蛋白質からなる群から選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
植物油がオリーブ油またはピーナッツ油である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、およびＴＷＥＥＮ８０からなる群から選択される安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックＬ１２１、プルロニックＬ６２ＬＦ、プルロニックＬ１０１、プルロニックＬ６４、テトロニック１５０１、テトロニック１５０Ｒ１、テトロニック７０１、テトロニック９０１、テトロニック１３０１、テトロニック１３０Ｒ１およびＰＥＧ１０００からなる群から選択されるミセル形成試薬；および
（ｃ）スクアラン、エイコサン、プリスタン、トリアコンタン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項１４記載の組成物。
【請求項２２】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、およびＴＷＥＥＮ８０からなる群から選択される安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックＬ１２１であるミセル形成試薬；および
（ｃ）スクアランである生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックＬ１２１、プルロニックＬ６２ＬＦ、テトロニック１５０１、テトロニック１５０Ｒ１、およびＰＥＧ１０００からなる群から選択されるミセル形成試薬；および
（ｃ）スクアランである生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックＬ１２１であるミセル形成試薬、および
（Ｃ）スクアラン、エイコサン、プリスタン、トリアコンタン、コレステロールおよび植物油からなる群から選択される生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
前記マイクロ流動化された抗原製剤が、本質的に
（ａ）ＴＷＥＥＮ８０である安定化界面活性剤、
（ｂ）プルロニックＬ１２１であるミセル形成試薬；および
（ｃ）スクアランである生物的分解性および生物的適合性である油
からなる、請求項２１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本願はＳｙａｍａｌ・ＲａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉとＷｉｌｌｉａｍ・Ｈ．Ｒａｓｔｅｔｔｅｒの「細胞毒性Ｔ−リンパ球応答の誘導」と題する１９９１年７月２５日出願の米国第０７／７３５０６９号の部分継続出願である。本発明はヒト、家畜または農業的動物における細胞毒性Ｔ−細胞が介在する応答を誘導するために有用な方法と組成物に関する。
細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬｓ）は各種ウイルス感染症および新生物または癌の増殖に応答して宿主を防御する主たる機構であると信じられている。これらの細胞は、感染または形質転換した細胞上の各種分子（クラスＩＭＨＣ分子と呼ばれる）とともに抗原フラグメントを認識することによって感染または形質転換細胞を除去する。ＣＴＬ類は実験的には特定の細胞内に或る種の可溶性抗原を細胞質へ負荷して誘導しうる。可溶性抗原単独での免疫は一般に特異的細胞毒性Ｔ−リンパ球誘導のためには不十分である。
ＣＴＬ応答を誘導しうる方法の一つは問題となる抗原の必須成分を非転移性（良性の）感染剤のゲノムに導入するために組換え技術を用いることを含む。この戦略の目的は宿主を緩和で、自己限定的な感染症に罹患させることによって所望のエピトープに対して抗原特異的細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を起こさせるものである。ワクチニア、ポリオ、アデノ−およびレトロ−ウイルスならびにリステリアおよびＢＣＧのような細菌を用いるキメラベクターの記載がある。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、８５・Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、３１０５，１９８８は、ＨＩＶｇｐ１６０エンベロープ遺伝子を発現する組換えワクチニアウイルスの使用を細胞毒性Ｔ−リンパ球誘導の実現性ある手段として記載している。
細胞が介在する応答を誘導しうる第２の方法はアジュバントの使用を含む。アジュバントの使用を論じた文献は豊富であるが、それらの文献で細胞が介在する免疫が誘導されたかどうか、およびその細胞が介在する免疫が細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を含んでいたかどうかは明らかではない。けれども、下記のものはこの領域における多数の出版物の代表的なものである。
Ｓｔｏｖｅｒら、３５１・Ｎａｔｕｒｅ・４５６、１９９１（本願に対する先行技術とは認められない）はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えＢＣＧを用いるβ−ガラクトシダーゼに対するＣＴＬ応答を記載する。不完全フロインド・アジュバントとβ−ガラクトシダーゼを用いるとこの応答は検出されなかった。
Ｍｉｔｃｈｅｌｌなど、８・Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ・Ｏｎｃｏｌｏｇｙ・８５６、１９９０（本発明に対する先行技術とは認められない）は、転移メラノーマ患者に、「ＤＥＴＯＸ」と命名したアジュバントと同種異系のメラノーマ溶解液を６週間の期間にわたって５回投与する処置を記載している。一部の患者に細胞溶解性Ｔ−細胞の増加が観察された。著者らは細胞毒性Ｔ−リンパ球製造水準の強化の必要性を記載し、アジュバントとインターロイキン２とによる混合療法ならびに存在するであろう癌特異的Ｔ−サプレッサー細胞の水準を減少するためにサイクロホスファミドによる前処置を提案している。ＤＥＴＯＸはＳａｌｍｏｎｌｅｌｌａ・ｍｉｎｎｅｓｏｔａからの解毒エンドトキシン（モノホスホリル・リピドＡ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｐｈｌｅｉの細胞壁骨格、スクアレン油および乳化剤を含む。
ＡｌｌｉｓｏｎとＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１１・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ・４２７、１９９０（本発明に対する先行技術とは認められない）はヒトワクチン類に「使用を認可」されている唯一のアジュバントはアルミニウム塩（明礬）のみであり、これは細胞が介在する免疫を十分に引き出すものではないと指摘する。ＡｌｌｉｓｏｎとＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓは「それ故、フロインドの完全なアジュバントの効果を持つが、肉芽腫のような各種の副作用を持たないアジュバントを開発する必要がある」と述べている。彼らは続けて、例えば、可能な戦略が３種あり、リポソームの使用；免疫刺激性複合体（サポニンまたはクィルＡ（炭水化物側鎖２個を持つトリテルペノイド）、コレステロールおよびホスファチジルコリンを含むＩＳＣＯＭｓ）と呼ばれて馬のインフルエンザワクチンで使用を認可されている（Ｍｏｒｅｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ａｄｕｖａｎｔｓ・ａｎｄ・Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ・Ｐｒｅｓｓ、１５３）アジュバントの使用；およびスクアレンまたはＳｑｕａｌａｎｅ（プルロニク剤含有または不含）およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の乳剤（ＳＡＦ）の使用であると述べている。ＳＡＦは「サブユニットの抗原は細胞毒性Ｔ−細胞（ＣＴＬ）応答を引き出すことはできないと思われて来た」にも拘らず、マウスで細胞が介在する免疫を引き出すと言っている。
Ｔａｋａｈａｓｈｉら、３４４・Ｎａｔｕｒｅ・８７３、１９９０はマウスでの単回皮下免疫でＩＳＣＯＭの使用による１クラスＩの限定ヘルパーおよび細胞毒性Ｔ−リンパ球の誘導を記載している。彼らは彼らが意図した標的に対してフロインドのアジュバント、不完全なフロインドのアジュバントおよび燐酸塩緩衝食塩水は細胞毒性Ｔ−リンパ球活性を誘導しなかったと述べている。彼らは、他の型の外来性の可溶性蛋白抗原での結果とは対照的に、ＩＳＣＯＭを用いて外来性の無傷な蛋白で免疫化することによって抗原特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８+ＣＤ４-ＣＴＬを感作できることを示したと述べている。また、彼らは記載した実験はＨＩＶ蛋白を含むＩＳＣＯＭを用いることによってヒトＣＴＬを引き出すことができるであろうことおよびＩＳＣＯＭを基礎とするワクチンは久しく求められていたゴールであるＣＴＬと抗体の誘導を精製蛋白により達成しうるかもしれないことを示唆すると述べている。
ＢｙａｒｓとＡｌｌｉｓｏｎ、５・Ｖａｃｃｉｎｅｓ・２２３、１９８７はムラミルジペプチド含有または不含のＴＷＥＥＮ８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣ・Ｌ１２１およびスクアレンまたはＳｑｕａｌａｎｅを含むＳＡＦ−１の使用を記載し、彼らの資料はムラミルジペプチド含有製剤はヒトおよび動物ワクチンに用いられるであろうことを示すと示唆した。アジュバントのブースター投与をムラミルジペプチド不含で行った。ムラミルジペプチドはムラミルジペプチド不含のアジュバントの使用よりも明瞭に抗体の生産を増加すると言われている。細胞介在免疫はＴ−ヘルパー細胞誘導を測定する皮膚検査での遅延型過敏性として測定された。このような過敏性はアジュバント内にムラミルジペプチドを入れた時には、より強力に、また、より持続した。同様なアジュバントはＡｌｌｉｓｏｎら、米国特許４７７０８７４号（ここにはムラミルジペプチドとプルロニクポリオールとの組合は卵アルブミンに対する強力な細胞介在性および体液性の応答を引き出すために必須であると記載されている）；Ａｌｌｉｓｏｎら、米国特許４７７２４６６；Ｍｕｒｐｈｙ−Ｃｏｒｂなど、２４６・Ｓｃｉｅｎｃｅ・１２９３、１９８９（ここにはアジュバントとムラミルジペプチドとの組合せの使用が免疫応答の体液性および細胞性部門を強化するであろうと述べられている）；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、８７・Ｖａｃｃｉｎｅｓ・５６、１９８７（ここには遅延型過敏性により、抗原に対するＴ−細胞の増殖性応答により、インターロイキン−２の生産により、また、特異的遺伝子的に限定されて免疫抗原を持つ標的細胞の溶解によって、示される細胞介在性免疫がＳＡＦ（ムラミルジペプチド含有）によって引き出されると述べられている）；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ・ｏｆ・Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ・Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｖａｃｃｉｎｅ・ａｄｊｕｖａｎｔｓ・ａｎｄ・Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ・ｏｆ・Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ・Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、１９１〜２０１、１９８７；Ｍｏｒｇａｎら、２９・Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｖｉｒｏｌｏｇｙ・７４、１９８９；Ｋｅｎｎｅｙら、１２１・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｍｅｔｈｏｄｓ・１５７、１９８９；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、９５・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｍｅｔｈｏｄｓ・１５７、１９８６（ここではアルミニウム塩および鉱油の乳剤が抗体生産を増加するが細胞介在性免疫は増加しないことが示され；ムラミルジペプチド製剤が細胞介在性免疫を引き出すことが示されている）；Ｂｙａｒｓら、８・Ｖａｃｃｉｎｅ・４９、１９９０（本願に対する先行技術とは認められない。ここではこのアジュバント製剤がインフルエンザヘムアグルチニン抗原に対する体液性応答を顕著に増加するが、細胞介在性反応増加の程度は低いことを述べられている）；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、２８・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・２７９、１９９１（本願に対する先行技術とは認められない；ムラミルジペプチドの機能はサイトカイニンの発現誘導と主な組織適合性（ＭＨＣ）遺伝子の発現増加であること；他のアジュバントより優れた抗体と細胞応答が得られること、および、ヒトにおいても同様な戦略が有効であるかどうか確認する望みがあることを述べている）；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ・Ａｄｖａｎｃｅｓ・ｉｎ・Ｖａｃｃｉｎｅ・Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ・４０１、１９８８（ここにはＳＡＦを用いる細胞介在性免疫を記載している）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、４・Ａｄｖａｎｃｅ・Ｄｒｕｇ・Ｄｅｌｉｖｅｒｙ・Ｒｅｖｉｅｗｓ・２２３、１９９０（ワクチンの製剤に用いられる各種アジュバントの総説である）；ＡｌｌｉｓｏｎとＢｙａｒｓ、９５・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｍｅｔｈｏｄｓ・１５７、１９８６（ここにはアジュバントへのムラミルジペプチドの添加がモノクロナールイムノグロブリンとウイルスの抗原を含む各種抗原に対する細胞介在性応答を顕著に増加することを述べている）；およびＭｏｒｇａｎら、２９・Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｖｉｒｏｌｏｇｙ・７４、１９８９（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスのワクチン生産へのＳＡＦ−１の使用を記載する）。
Ｋｗａｋら、Ｉｄｉｏｔｙｐｅ・Ｎｅｔｗｏｒｋｓ・ｉｎ・Ｂｉｏｌｏｇｙ・ａｎｄ・Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１６３頁、１９９０（本願に対する先行技術とは認められない）はヒトのＢ−細胞リンパ腫イディオタイプのためのアジュバントとしてムラミルジペプチド不含のＳＡＦの使用を記載している。特に、プルロニクＬ１２１の乳剤、Ｓｑｕａｌａｎｅおよび０．４％ＴＷＥＥＮ−８０の燐酸塩緩衝食塩水をイディオタイプとともに投与した。彼らは「アジュバントの添加は体液性応答・・・をさらに増加し、同様に細胞性応答の誘導も加速するであろうと述べている。
他の免疫学的製剤はリポゾーム（Ａｌｌｉｓｏｎら、米国特許４０５３５８５と４１１７１１３）；環状ペプチド（Ｄｒｅｅｓｍａｎら、米国特許４７７８７８４）；フロインドの完全アジュバント（Ａｓｈｅｒｓｏｎら、２２・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・４６５、１９７２；Ｂｅｒｍａｎら、２・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ・５３９、１９６７；Ａｌｌｉｓｏｎ、１８・Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ・７３、１９７３；およびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ・Ｆａｃｔｏｒｓ・Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ・Ｈｏｓｔ・Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ・２４７、１９７３）；ＩＳＣＯＭｓ（Ｌｅｔｖｉｎら、８７・Ｖａｃｃｉｎｅｓ・２０９、１９８７）；鉱油、界面活性剤とＴＷＥＥＮ８０で形成した非イオン性ブロックポリマー剤を含むアジュバント（ＨｕｎｔｅｒとＢｅｎｎｅｔｔ、１３３・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・３１６７、１９８４；Ｈｕｎｔｅｒら、１２７・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・１２４４、１９８１）；殺菌したマイコバクテリア含有または不含の鉱油と乳化剤からなるアジュバント（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒなど、１４１・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・１７２０、１９８８）；およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体および組換え蛋白（前出）に共有結合したムラミルジペプチドのような他のアジュバント類を含む。
発明の要約
出願人はヒトおよび家畜または農業的に重要な動物でＣＴＬ応答を誘導しうる安全で有利な方法と組成物を発見した。この方法は動物に対して毒性を殆どまたは全く持たず、その存在が所期の細胞性応答を減じうる免疫刺激ペプチド（たとえば、ムラミルジペプチド）を含んでいない抗原製剤を使用するものである。加えるに、この方法は使用が簡単で現存する細胞を組換えＤＮＡ技術により免疫原とするために徹底的な生体内研究を必要としない。免疫刺激ペプチドまたはその均等物を欠く抗原製剤の使用によりＣＴＬ応答が誘導できることは期待されなかったので、この発見は驚異的である。出願人のこの発見は、この抗原製剤を広範な病状においてまたは予防剤として使用することを可能にする。この抗原製剤投与は、例えば、ＨＩＶ感染症またはインフルエンザの処置を例とし、細菌感染症、癌、寄生体感染症などのようなものにも拡張できる、ＣＴＬ応答が重要なウイルス病の処置に使用することができる。予防剤として、適当な抗原を含む抗原製剤は殊にＨＩＶ感染症などの前記ウイルス疾患の予防および例えば原発性腫瘍切除後のような癌の危険性のある患者の予防に有用である。
そこで、本発明の第一の側面はヒトまたは家畜（たとえば猫または犬）または農業的に重要な動物（たとえば馬、牛または豚）におけるＢ−細胞リンパ腫抗原または卵アルブミンを除く抗原に対するＣＴＬ応答を誘導する方法として特徴付けられる。この方法はＣＴＬ応答を期待する抗原を提供する段階、および安定化界面活性剤、ミセル形成試薬、および生物的分解性および生物的適合性ある油を含むか、これらのみから構成されるかまたは実質的にこれらのみで構成される非毒性抗原製剤を提供する段階を含む。この抗原製剤は好ましくは免疫刺激ペプチド成分を欠くか、またはその成分を所期の細胞反応が減少しないために十分な低濃度に持つ。この製剤は好ましくは安定な水中油型乳剤として提供される。即ち、各種成分の各々は少なくとも１ケ月、好ましくは１年以上乳剤が相の分離なしにエマルジョン状態を保つように選ばれる。この方法では抗原および抗原製剤を互いに混合（好ましくはマイクロ流動化により）して混合物とし、その混合物を、動物にＣＴＬ応答を誘導するに十分な量、動物に投与する。この投与は一回のみ必要である。
「安定化界面活性剤」は乳剤の各成分を安定な乳剤に保つような界面活性剤を意味する。この界面活性剤にはポリソルベート、８０（ＴＷＥＥＮ）（ソルビタン−モノ−９−オクタデセノエート−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル；ＩＣＩ・Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ製造）、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ６０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３〜１２、ＴＥＥＰＯＬ・ＨＢ７およびＳＰＡＮ８５を含む。これらの界面活性剤は通常、約０．０５から０．５％、好ましくは約０．２％の量で提供される。
「ミセル形成試薬」は他の成分とともに形成した乳剤をミセル的構造を形成するように安定化できる試薬を意味する。この試薬は注射部位にいくらかの刺激を生じてマクロファージを集め、細胞性応答を強化するのが好ましい。このような試薬の例にはポリマー界面活性剤、ＢＡＳＦ・Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ・Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎが記載する、例えば、参考のために引用するＳｃｈｍｏｌｋａ、５４・Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０、１９７７およびＨｕｎｔｅｒなど、１２９・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４４、１９８１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ・Ｌ６２ＬＦ、Ｌ１０１、およびＬ６４、Ｌ１２１、ＰＥＧ１０００およびＴＥＴＲＯＮＩＣ・１５０１、１５０Ｒ１、７０１、９０１、１３０１および１３０Ｒ１を含む。この試薬の化学構造は業界ではよく知られている。この試薬は好ましくはＨｕｎｔｅｒとＢｅｎｎｅｔｔ、１３３・Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・３１６７、１９８４の定義による親水−親油バランス（ＨＬＢ）値が０と２の間を持つものを選ぶ。この試薬は、好ましくは０．００１および１０％の間、最も好ましくは０．００１および５％の間の量で提供される。
油は水中油型乳剤中の抗原の保持を促進するように、すなわち、乳剤が室温（約２０℃から２５℃）で形成されるかまたは乳剤の温度が室温まで冷却される時に好ましくは６５℃未満の溶融温度を持ち、所望の抗原のための基剤を提供するように選ばれる。このような油の例にはスクアレン、Ｓｑｕａｌａｎｅ、ＥＩＣＯＳＡＮＥ、テトラテトラコンタン、グリセリンおよびピーナッツ油または他の植物油を含む。油は好ましくは１および１０％の間、最も好ましくは２．５および５％の間の量で提供される。この油は、生体が油を時間を経て分解でき、この油の使用で肉芽腫のような副作用が現れないように生物的分解性と生物的適合性があることが重要である。
前記製剤には、ペプチド成分、特にムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が含まれていないことが重要である。このようなペプチドは正常なヒト製剤投与につき約２０マイクログラムより大きい量を提供されればＣＴＬ応答の誘導を阻害する。明らかに体液性免疫系を刺激するが、そのようなペプチドはこの抗原製剤に全く不在であるのが好適である。即ち、出願人はこのペプチドは体液性応答を強化しうるが、細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を期待する時には不都合であることを発見したのである。
他の関連する側面では、抗原製剤を前記三成分の２種だけから造り、これを卵白アルブミン（または他のアルブミン、例えばＨＳＡ、ＢＳＡおよび卵白アルブミン）を除く所望の抗原（この語は蛋白、ポリペプチドとその免疫原性フラグメントを含む）と共に用いて前記動物またはヒトにＣＴＬ応答を誘導する。
出願人は前記製剤はヒトでの使用には先行製剤（ＩＳＣＯＭ、ＤＥＴＯＸおよびＳＡＦを含む）よりも明瞭に有利であると信ずるものである。これらの製剤とは異なり、本製剤はミセル形成試薬を含み、ペプチド、細胞壁骨格または細菌細胞成分を持たない。また、本製剤は先行製剤では起きないか、または先行製剤に比較して明瞭に強化されたＣＴＬ応答を誘導する。
「非毒性」は処置した動物またはヒトに抗原製剤の副作用が殆どまたは全く観察されないことを意味する。医療または動物医療分野の当業者はこの用語が広い意味を持つことを認識するであろう。例えば、実質的に健康な動物またはヒトでは僅かな毒性のみが許されるが、一方、末期的疾患（約３年以下の余命）を病んでいるヒトでは実質的に更に強い毒性も許される。
好ましい態様では、抗原製剤は本質的に界面活性剤、試薬および油のうちの２種または３種からなる。この方法は本質的にヒトまたは動物への混合物（抗原プラス抗原製剤）の単回投与からなる。このヒトまたは動物はウイルスに感染し、ウイルス感染症の１種またはそれ以上の症状（一般に当該分野の医師が診断するものであるが）を患っている。そして抗原製剤はヒトまたは動物に非毒性である。
他の好適な態様では、抗原をＨＩＶ抗原の抗原性部分であるｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖ；マラリア抗原であるＣＳ蛋白質とスポロゾイト表面蛋白質２；Ｂ型肝炎表面抗原であるＰｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２、ＨＢｃ・ＡｇおよびＨＢｅ・Ａｇ；インフルエンザ抗原であるＨＡ、ＮＰおよびＮＡ；Ａ型肝炎表面抗原；ヘルペスウイルス抗原であるＥＢＶ・ｇｐ３４０、ＥＢＶ・ｇｐ８５、ＨＳＶ・ｇＢ、ＨＳＶ・ｇＤ、ＨＳＶ・ｇＨ、ＨＳＶ初期蛋白質生成物、サイトメガロウイルス・ｇＢ、サイトメガロウイルス・ｇＨおよびＩＥ蛋白質・ｇＰ７２；呼吸シンシチウムウイルス抗原であるＦ蛋白質、Ｇ蛋白質およびＮ蛋白質；および腫瘍抗原、癌ＣＥＡ、癌関連ムチン、癌Ｐ２１、癌Ｐ５３、メラノマＭＰＧ、メラノーマｐ９７および癌Ｎｅｕオンコゲン生成物、癌ｐ５３遺伝子生成物、ＭＡＧＥと呼ばれているメラノーマ抗原および各種悪性腫瘍で出現する突然変異ｐ２１・ｒａｓ蛋白質から選ばれる。
関連する側面では、本発明は本質的に前記抗原製剤と混合した抗原を含み、または構成され、または実質的に構成される組成物として特徴付けられ、この抗原が前述の抗原部分から選ばれるものである。
他の関連する側面では、本発明はＨＩＶウイルスに感染した患者、マラリアに罹患した患者、インフルエンザに罹患した患者、肝炎に罹患した患者、癌に罹患した患者、ヘルペスウイルスに感染した患者または呼吸器シンシチウムウイルスに感染した患者に適当な抗原（たとえば前述のものから選ばれたもの）を前記抗原製剤の一つと混合して含む組成物を投与することによって処置する方法として特徴付けられる。
本発明の特徴と有利性は下記の好適な態様の記載および請求項から明らかとなろう。
好適な態様の記載
まず、図面を簡単に説明する。
図面
図１Ａ〜１Ｃは各種卵白アルブミン製剤によるＣＴＬ誘導と比較する資料のグラフ表示である。Ｅ：Ｔは全図面でエフェクター対標的の比率を示す。
図２Ａおよび２Ｂは各種β−ガラクトシダーゼ製剤によるＣＴＬ誘導を比較する資料のグラフ表示である。
図３はリポソーム内および抗原製剤内の卵白アルブミンによるＣＴＬ誘導を比較する資料のグラフ表示である。
図４および５はＣＴＬ誘導に対するＣＤ４およびＣＤ８細胞除去の効果を示す資料のグラフ表示である。
図６はプルロニクおよびＴＷＥＥＮおよび抗原の混合物によるＣＴＬ誘導を示す資料のグラフ表示である。
図７はスクアランおよびＴＷＥＥＮおよび抗原の混合物でのＣＴＬ誘導を示す資料のグラフ表示である。
図８はスクアランおよびプルロニクおよび抗原の混合物によるＣＴＬ誘導を示す資料のグラフ表示である。
図９は各種抗原製剤でのサルにおける抗−ｇｐ１２０ＩＩＩｂ抗体の誘導のグラフ表示である。そして
図１０Ａ〜１０Ｂはワクチニア−ｇｐ１２０およびｇｐ１２０−ＡＦで免疫したサルでのｇｐ１２０−特異的ＣＴＬ応答を比較する資料のグラフ表示である。
抗原製剤
本発明で有用な抗原製剤を既に一般的に記述した。当業者には均等な製剤が容易に製造され、ＣＴＬ応答の誘導において均等な性質を持つことを期待できることが理解されよう。このような製剤は下記実施例に記載するのと均等な技術を用いて容易にその性質を検定される。
以下に燐酸塩緩衝食塩水（Ｉｍｅｄ・ＳＴＰ）中のスクアラン（０．６％ＴＷＥＥＮ８０）約１５％および（０．００４５〜３．７５％プルロニク）を含む抗原製剤（ＡＦ）を使用する本発明の実施例を記載する。特に、ＡＦ乳剤は水１ｍＬにつきスクアラン１５０ｍｇ、ポロクサマー４０１（ＰＬＵＲＯＮＩＣ・Ｌ１２１）０．０４５〜３７．５ｍｇ、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）６ｍｇ、塩化カリウム０．１８４ｍｇ、一塩基性燐酸カリウム０．５５２ｍｇ、塩化ナトリウム７．３６ｍｇ、二塩基性燐酸ナトリウム（無水）３．３ｍｇ、ｐＨ７．４を含んでいた。この乳剤を標準的な技術（ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓＭ１１０Ｆ型）を用いて１１〜１４０００ｐｓｉの逆圧モジュールで徐々に常圧まで戻し、冷却し、湿潤氷中に閉じ込めてマイクロ流動化した。
他の例では、抗原をマイクロ流動化したスクアラン（Ｓ）、プルロニク（Ｐ）およびＴＷＥＥＮ８０（Ｔ）混合物と混合し、各々最終濃度スクアラン５％、ＴＷＥＥＮ８０・０．２％およびプルロニク０．００１５〜１．２５％とした。抗原特異的免疫応答誘導に対して必要な副成分を測定するために、スクアラン−ＴＷＥＥＮ８０、プルロニク−ＴＷＥＥＮ８０またはスクアラン−プルロニクを三成分混合物でのと同濃度で製造した。ＣＴＬ誘導に対する各成分の効果を測定するために個別にプルロニク、スクアランまたはＴＷＥＥＮ８０を製造した。ＴＷＥＥＮ８０をＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによる置換体を製造してｏｖａ系におけるＣＴＬ誘導に対する種々のＴＷＥＥＮ誘導体の効果を測定した。３成分製剤内のスクアランのＥｉｃｏｓｏｎｅまたはＴｒｉａｃｏｎｔｏｎｅによる置換体および同じ三成分製剤内の共重合体プルロニクのＰＥＧ１０００、プルロニク・Ｌ６２ＬＦおよびＴｅｔｒｏｎｉｃｓ１５０１および１５０Ｒ１による置換体を製造した。二成分製剤として、各種の組合せによる類似体を混合し、ｏｖａ特異的ＣＴＬ誘導を検定した。これらはコレステロール−ＴＷＥＥＮ８０、スクアラン−ＴＷＥＥＮ２０、Ｐｒｉｓｔａｎｅ−ＴＷＥＥＮ８０混合物である。安定性研究用に、スクアラン−ＴＷＥＥＮ８０のマイクロ流動化混合物をデキストロースと混合して最終濃度５％とした。全ての場合、添加剤の組合せはマイクロフルイダイザー中で混合して安定な乳剤を造った。ある実験では二成分製剤をＣＴＬの代わりに種々の濃度のＭＤＰと混合し、体液性応答を誘導させた。表１は本研究中に用いた種々の全製剤のリストを記載する。
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シンテックスのアジュバント製剤（マイクロ流動化；ＳＡＦｍ）をアジュバントの対照として用いた。これは２個の部分からなる。部分Ｉはスクアラン５％、プルロニク１．２５％およびＴＷＥＥＮ８０・０．２％（基剤またはＩ−ＳＡＦ）の最終濃度を含む燐酸塩緩衝食塩水からなる。部分ＩＩはミコバクテリウム細胞壁成分の誘導体の一つであるＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｔｈｒ−ＭＤＰ）からなる。免疫化の目的で、抗原をミクロ流動化基剤（部分Ｉ）と混合して均質な乳剤を得た。ＭＤＰを加えてＳＡＦｍとし、軽く振り混ぜた。混合物中のＭＤＰ濃度をＣＴＬ誘導のために最適な濃度があるかどうか測定するために変更した。アジュバントの対照としてマウスを製造者の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって明礬と混合した可溶性抗原または完全フロインド・アジュバント（ＣＦＡ）で免疫した。
ＳＴＰ抗原製剤を用いてマウスの細胞毒性Ｔ−リンパ球応答を誘導する。当業者はこのようなマウスのモデルは均等な実験または処置が同様にヒト、家畜または農業的動物における細胞毒性Ｔ−リンパ球誘導することの指標となることを認識するであろう。所期の細胞応答を起こすために有用な抗原製剤と抗原の量は過度の実験なしに当業者公知の標準的な操作によって実験的に測定できる。それで、この混合物による処置の副作用の削減を望むなら、当業者は所期の抗原に対する免疫を誘導してＣＴＬ応答を引き出すため、ヒト、家畜または農業的動物に投与する混合物の最低水準を決定できる。通常の使用において、混合物を多数の標準的な操作のどれか一つによって注射するが、殊に好適なのは乳剤が数日または数週間の期間の間安定な形で残存できる部位への筋肉内注射である。
方法
下記実施例では特に記載のない限り、下記の材料と方法を使用した。
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）マウスをＨａｒｌｅｎ・Ｓｐｒａｇｕｅ（Ｓａｎ・Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。
抗原
卵白アルブミン（ｏｖａ、ＶクラスＩＩ；Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を未処理のまま用いた。未処理のβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ、ＶＩクラスＩＩ；ＢＲＬ）を１Ｍ−ＮａＯＨ中で２分間煮沸してアルカリ消化物を得た。組換えｇｐ１２０はＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
腫瘍細胞およびトランスフェクタント
使用した腫瘍細胞はＩａ-ラインＥＬ４（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｈ−２b、胸腺腫）およびＰ８１５（ＤＡＢ／２、Ｈ−２d、肥満細胞腫）である。ｏｖａ産生ＥＬ４形質転換体であるＥＧ７−ｏｖａの誘導は以前にＭｏｏｒなど、５５・Ｃｅｌｌ・７７７、１９８８により記載されている。β−ｇａｌ産生形質転換体であるＰ１３．１は燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中、１０7個のＰ８１５細胞にＰｓｔＩでリネアライズしたｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・ＬＫＢ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ・Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）１０ｍｇおよびＰｖｕＩでリネアライズしたｐＳＶ・ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、１・Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．３２７、１９８２）１ｍｇでエレクトロポレーションし、続いて抗生物質Ｇ４１８の４００μｇ／ｍＬ中での選別により誘導した。Ｃ３−４形質転換体はＢＡＬＢ／ｃハイブリドーマＩａｍ６６２からβ−ｇａｌ遺伝子をＩｇＭ重鎖の第３および第４エクソンに融合したβ−ｇａｌ遺伝子をコードするプラスミド（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅなど、３０・Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ・２９６、１９８９）をトランスフェクトして誘導した。３Ｔ３繊維芽細胞１５−１２を発現するｇｐ１６０ＩＩＩｂはＮＩＨ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＧｅｒｍａｉｎ博士によって提供された。ＫbでトランスフェクトしたＬセルラインは豪州Ｍｏｎａｓｈ大学のＣａｒｂｏｎｅ博士により提供された。ＤdおよびＬdでトランスフェクトしたＬセルラインはセントルイスのワシントン大学のＴｅｄ・Ｈｅｎｓｅｎ博士により提供された。
免疫
マウスをＭｏｏｒｅら、（前出）、およびＣａｒｂｏｎｅら、Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．１６９：６０３、１９８９）に記載のように細胞質ローディング後に、静脈内に脾細胞２５×１０6個の懸濁液２００μＬで免疫した。ｏｖａ−抗原製剤またはβ−ｇａｌ−抗原製剤免疫のため、各蛋白質抗原をマウス当り３０μｇ足パッドと尾ベースに皮下注射した。各注射はミクロ流動化抗原製剤（標準的操作に従って製造したもの）６７μＬおよび蛋白質抗原３０μｇの最終容積２００μＬから構成される。最終容積はＨＢＳＳで造られる。Ｗｈｉｔｔａｋｅｒマニュアル参照（Ｗｅｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。ＭＤＰは０から３００μｇの間の濃度で提供される。記載のあるとき、マウスはＣＦＡまたは明礬の総容積２００μＬ中の可溶性抗原で免疫した。
エフェクター集団の試験管内刺激
正常または少なくとも１４日前に感作した免疫マウスの脾臓細胞（３０×１０6）をｏｖａ応答用にはＥＧ７−ｏｖａ１．５×１０6（２００００ラドで照射）またはβ−ｇａｌ応答用にはＣ３−４細胞１．５×１０6個（２００００ラドで照射）を２４穴板で７％ＣＯ2／空気中で３７℃でインキュベートした。全ての組織培養はＩＭＤＭ培地＝１０％牛血清（ＦＣＳ）、グルタミン２ｍＭ、ゲンタマイシンおよび２×１０-5Ｍ−２−メルカプトエタノールを添加したＷｈｉｔｔａｋｅｒ・Ｍａｎｕａｌ（Ｗｅｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）参照＝から構成される完全培地中で行った。試験管内枯渇試験のために、生体内感作または試験管内刺激脾臓細胞をモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）ＲＬ．１７２（抗−ＣＤ４）またはｍＡｂｓ３．１６８（抗−ＣＤ８）でＣＤ４+またはＣＤ８+細胞の除去の為に処理した（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら、１２５・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６６５、１９８０およびＣｅｒｅｄｉｇら、３１４・Ｎａｔｕｒｅ・９８、１９８５）。ｍＡｂ・ＲＬ．１７２およびｍＡｂ・３．１６８は、Ｓｃｒｉｐｐｓ・Ｃｌｉｎｉｃ・ａｎｄ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡのＪｏｎａｔｈａｎ・Ｓｐｒｅｎｔ博士により提供された。
正常または少なくとも２１日前に感作した免疫マウスの脾臓細胞（３０×１０6）を１５−１２細胞１．５×１０6（細胞１０8当り２００μｇマイトマイシン Ｃで４５分間処理）またはＢａｌｂ／ｃマウスの主ＣＴＬエピトープを含む１８ＩＩＩｂペプチド５００μｇと１０％プレスクリーンＦＣＳ（ＩＣＮ・Ｆｌｏｗ；ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ・Ｍｅｓａ、ＣＡ）、２ｍＭ−グルタミン、ゲンタマイシンおよび２×１０-5Ｍ−２−メルカプトエターノールを含む完全ＩＭＤＭ培地（Ｉｒｖｉｎｅ・Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ・Ａｎａ、ＣＡ）中でインキュベートした。ペプチドによる試験管内刺激のために脾臓細胞を５％ＣｏｎＡ上澄液を含む完全ＩＭＤＭ中で培養した。
枯渇試験では、生体内感作または試験管内刺激脾臓細胞をＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞（２２、２３）の除去のためにｍＡｂｓ・ＲＬ．１７２（抗−ＣＤ４）またはｍＡｂｓ・３．１６８（抗−ＣＤ８）で低毒性兎コンプレメント（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｔｄ．、Ｈｏｒｎｂｙ・Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）の存在下に処理した。ｍＡｂｓ・ＲＬ．１７２およびｍＡｂｓ・３．１６８はＳｃｒｉｐｐｓ・Ｃｌｉｎｉｃ・ａｎｄ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡのＪｏｎａｔｈａｎ・Ｓｐｒｅｎｔ博士からの供与品である。
細胞毒性検定
標的細胞（１×１０6）は［51Ｃｒ］クロム酸ナトリウム１００μＣｉで６０分間標識した。ペプチドパルス標的のために、１ｍｇ／ｍＬペプチドＨＢＳＳ溶液５０μＬを、標的を51Ｃｒで標識する間に加えた。洗浄後、１０4標識標的およびエフェクター細胞の連続希釈物をＲＰ１０の２００μＬ中、３７℃で４時間インキュベートした。上澄液１００μＬを集め、特異的溶解を、溶解百分率＝１００×｛（ＣＴＬによる放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）｝として測定した。細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）不在時の自然放出は全ての実験で界面活性剤による最大放出の２５％以下であった。
マウスおよびサルにおける抗体応答の測定
Ｕ字底９６穴板（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の各穴をｏｖａまたはｇｐ１２０の１５０ｎｇの５０μＬＨＢＳＳで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。マウスでの抗−ｇｐ１２０および抗−ｏｖａ抗体応答の測定のために、板を１％ＢＳＡで１時間ブロックした。各穴に連続希釈した血清を２５μＬ容加え、２時間インキュベートした。板を洗い、ＨＲＰＯ（ＳＢＴ、Ａｌａｂａｍａ）に複合した羊の抗−マウスＩｇＧの１％ＢＳＡ溶液の１：１０００希釈５０μＬを各穴に加えた。１時間インキュベーションした後、板を洗い、基質１００μＬを各穴に加えた。ＯＤ405を１０分から１５分後に測定した。サルの抗−ｇｐ１２０抗体応答測定のためには、全段階は板のブロックと血清の希釈に５％正常羊血清のＨａｎｋの平衡塩溶液を用いたことを除いて同一である。
ペプチド合成
卵白アルブミンのアミノ酸配列２５３〜２７６（配列表第１番：ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲ；各アミノ酸の表現には標準的１字コードを用いる）に対応する合成ペプチド（ｏｖａ・２５３〜２７６）、ミエリン塩基性蛋白質のアミノ酸配列８４〜１０２（配列表第２番：ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ）（ＭＢＰ・８４〜１０２）およびｇｐ１２０ＩＩＩｂのアミノ酸配列３０８〜３２２に対応する合成ペプチド（１８ＩＩＩｂ・配列）をＡｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４３０Ａ合成機を用いる固相ペプチド合成により製造した。ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルで結合したアスパラギン、グルタミンおよびアルギニンを除くアミノ酸は予め製造した対称無水物を経て結合した。結合効率はＫａｉｓｅｒら、３４・Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．・５９５、１９７０の方法に従ってニンヒドリン反応によって監視した。ペプチドはＨＦで担体からＴａｍら、２１・Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６４４２、１９８３に記載の「ロウ−ハイ」操作に従って外し、ペプチドを１０％酢酸で樹脂から抽出した。凍結乾燥後、ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５柱で脱塩し、ペプチドの標品をＶｙｄａｃ分取Ｃ−１８カラム上、逆相クロマトグラフィーによるＨＰＬＣで精製した。精製ペプチド（９８％）はＨＢＳＳに溶かして最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとし、所期の濃度まで完全培地で希釈した。
ＣＮＢｒ消化
蛋白質の標品（たとえば、β−ガラクトシダーゼ）を１００ｍＭトリフルオロ酢酸溶液内で１００倍過剰モルのシアノーゲンブロマイドで処理した。撹拌しつつ反応を室温（約２０℃）で１８時間進行させた。予定の反応時間後、ペプチドフラグメントを反応物からＳＥＰ−ＰＡＫ・Ｃ−１８装置（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、９５％アセトニトリルを用いて溶出してペプチドフラグメントを反応物から分離し、凍結乾燥した。
アルカリ消化
蛋白質標品（たとえば、β−ガラクトシダーゼ）を１Ｎ−ＮａＯＨで処理し、２分間煮沸し、得られたペプチドフラグメントを反応物からＳＥＰ−ＰＡＫ・Ｃ−１８装置（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、９５％アセトニトリルを用いて溶出して分離し、凍結乾燥した。
実施例１：クラスＩ制限ＣＴＬ感作
Ｍｏｏｒｅら、１１３・ＵＣＬＡ・Ｓｙｍｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８９およびＣａｒｂｏｎｅとＢｅｖａｎ、１７１・Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ・３７７、１９９０は可溶性ｏｖａを細胞質に負荷した脾臓細胞で免疫したマウスはｏｖａ特異的なクラスＩ制限ＣＴＬ応答に感作されることを証明した。ｏｖａ発現ＥＬ４形質転換体ＥＧ７−ｏｖａを生体内感作脾臓性リンパ球の試験管内刺激のために用い、またｏｖａ特異的ＣＴＬ介在毒性の標的に用いた。この研究はまたＥＧ７−ｏｖａ形質転換体またはｏｖａを細胞質的に負荷した脾臓細胞により誘導されたＣＤ８+エフェクターはＨ−２Ｋb、溶解ＥＧ７−ｏｖａのコンテクスト中のペプチドｏｖａ２５８〜２７６により示される決定基を認識し、およびｏｖａ２５８〜２７６で覆われたＥＬ４細胞を殺すことを証明した。それで、外来性クラスＩ制限ＣＤ８+Ｔ細胞経路が可溶性抗原で誘導できるかどうかを評価するために、前記の系を用いてある抗原製剤が可溶性抗原をクラスＩ制限経路にもたらし得るかどうかを検討した。
ａ）ｏｖａ
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを種々量を変えたｏｖａ（マウス当り３０μｇ〜１ｍｇ）で抗原製剤の存在または不在下に１回免疫した。マウスには尾ベースに皮下注射した。免疫後少なくとも２週間後に、免疫したマウスから脾臓細胞を取り、ＥＧ７−ｏｖａ形質転換体で試験管内で刺激した。１ｍｇ用量で３０μｇまでのｏｖａ濃度は有効であった。それ故、ＣＴＬ研究は３０μｇのｏｖａ感作マウスからの脾臓細胞でルーチンに行った。ＥＧ７−ｏｖａでの試験管内培養５日後に、プライミングを、ＥＧ７−ｏｖａを溶解することのできるｏｖａ特異性エフェクターの存在下で評価した。
１ｍｇまでの可溶性ｏｖａのＨＢＳＳを注射したマウスはＣＴＬプライミング（感作）の証拠を示さなかった（図１Ａ）。しかし、前記抗原製剤（各図中、ＡＦで示す）中の３０μｇのｏｖａで免疫したマウスは明瞭な形質転換体特異的ＣＴＬ応答を示した（図１Ｃ）。さらに、ｏｖａ−ＡＦで免疫した脾臓細胞によって殺されるＥＧ７−ｏｖａの範囲はｏｖａ−負荷脾臓細胞で免疫したマウスのものと同程度であった（図１Ｂ）。
生体内でのＣＴＬ感作の特異性が抗原特異的であることはβ−ガラクトシダーゼ免疫マウスからの脾臓細胞がＥＧ７−ｏｖａで刺激したときに試験管内で二次的なＣＴＬ応答が示されなかったことから証明された。ｏｖａ特異的ＣＴＬ誘導は観察されなかった。
ｂ）β−ガラクトシダーゼ
他の可溶性蛋白質抗原であるβ−ｇａｌを用いても同様な結果を得た。β−ｇａｌ−特異的ＣＴＬ応答を検定するために用いた標的はβ−ｇａｌ−発現Ｃ３−４形質転換体から誘導したＢＡＬＢ／ｃである。可溶性β−ｇａｌでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫は背景的ＣＴＬ応答を与えた。ゆえに、特異的なＣＴＬ応答を測定するために、少なくとも８週後まで脾臓性リンパ球を取出しを延期し、照射Ｃ３−４形質転換体の存在下に５日間培養した。
図２Ｂは３０μｇのβ−ガラクトシダーゼのＡＦ溶液が形質転換体に対する強力な特異的ＣＴＬ応答を誘導したことを示す。エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率３：１では、β−ｇａｌ−ＡＦで免疫したマウスは特異的殺Ｃ３−４作用の約８０％を示した。しかし、ＨＢＳＳ中のβ−ｇａｌで同じＥ：Ｔ比率で免疫したマウスから単離したエフェクターでは同標的２０％を殺したのみであった（図２Ａ）。ＥＬ４もＰ８１５もクラスＩＩＭＨＣ遺伝子生成物を発現せず、溶解は同遺伝子型の制限を示すので、これらのｏｖａおよびβ−ｇａｌ特異的エフェクターはクラスＩＭＨＣ制限をされている。
抗原製剤の有用性を証明するために、可溶性ｏｖａを２種のリポソーム内にカプセル化してマウスを免疫したが、一方はｐＨ感受性リポソームであった。１週間後、脾臓細胞を試験管内で前記のように刺激し、51Ｃｒ−標識ＥＧ７−ｏｖａまたはＥＬ４でテストした。図３はリポソーム内のｏｖａは実質的なＣＴＬ誘導のためにマウスをプライム（感作）できなかったことを証明する代表的な結果を示す。同様な結果はｏｖａが明馨中で免疫する時にも観察された。
実施例２：ＣＴＬによるエピトープの認識
ＣａｒｂｏｎｅとＢｅｖａｎ（前記）はＣ５７ＢＬ／６マウスにＥＧ７−ｏｖａ形質転換体により、および細胞質的にｏｖａ−負荷脾細胞により誘導されたＣＴＬはペプチドｏｖａ２５８〜２７６で覆ったＥＬ４細胞を認識することを証明した。ＡＦ中の可溶性卵白アルブミンが同様なＣＴＬ応答を誘導するかどうか判定するために、免疫マウスから脾臓細胞を調製し、試験管内でＥＧ７−ｏｖａで刺激した。エフェクターをペプチドｏｖａ２５３〜２７６またはミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ８４−１０２）から誘導した対照ペプチドで覆ったＥＬ４細胞について検定した。結果はｏｖａ−ＡＦはＣＴＬを形質転換体または細胞質的に負荷されたｏｖａにより感作されたものと同様な特異性で感作することを証明した（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）。ｏｖａ−ＡＦで感作したエフェクター細胞は効果的にＥＧ７−ｏｖａおよびｏｖａペプチド５０μｇ／１０8細胞で覆った非形質転換ＥＬ４細胞を溶解したが、ＭＢＰペプチド５０μｇ／１０8細胞で覆ったＥＬ４細胞は溶解しなかった。
β−ガラクトシダーゼ系で、ＣａｒｂｏｎｅおよびＢｅｖａｎ（前出）はβ−ｇａｌ発現形質転換体および細胞質的の可溶性β−ガラクトシダーゼを負荷した脾細胞はＣＴＬを誘導し、β−ｇａｌ発現形質転換体とアルカリ消化β−ガラクトシダーゼで覆った非形質転換体Ｐ８１５細胞を溶解したことを示した。可溶性β−ガラクトシダーゼはＡＦ中で免疫した時に同様な特異性を持つＣＴＬを誘導する（図２）。
実施例３：ＣＴＬエフェクターはＣＤ８+Ｔ細胞である
可溶性蛋白質抗原がＡＦ中、ＣＤ８+エフェクターＴ細胞を誘導することは、以下の様にして示された。免疫マウスからの脾細胞を照射形質転換体と試験管内で５日間培養した。その後、細胞を取り、ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞をモノクロナール抗−ＣＤ４または抗−ＣＤ８抗体プラス補体を用いて除いた。枯渇集団は次にｏｖａ系内の51Ｃｒ−ＥＧ７−ｏｖａまたはβ−ｇａｌ系内の51Ｃｒ−Ｐ１３．１に対してテストした。図４に示す資料はｏｖａ系ではＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇は全エフェクター細胞集団によってもたらされる細胞溶解活性をなくすことを示した。しかし、ＣＤ４+Ｔ細胞集団の枯渇はＥＧ７−ｏｖａの溶菌について何の効果も示さなかった。
同様に、β−ｇａｌ系内では、ＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇はβ−ｇａｌ−抗原製剤で免疫した脾臓細胞の細胞溶解活性をなくした（資料は提示していない）。
実施例４：ＡＦ中の可溶性ｏｖａはＣＤ８+Ｔ細胞をプライム（感作）する
ｏｖａ−ＡＦが生体内でＣＤ８+Ｔ細胞を感作し、試験管内二次応答に必須であることを証明するために正常マウスおよびｏｖａ−ＡＦ免疫マウスの脾臓からＣＤ４+とＣＤ８+集団を除いた。これらの処理集団を次に試験管内でＥＧ７−ｏｖａ単独またはｏｖａ−ＡＦ免疫マウスからのＣＤ４+とＣＤ８+Ｔ細胞との組合せで、またはｏｖａ−ＡＦ免疫マウスからのＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞および正常マウスからのＣＤ４+またはＣＤ８+細胞との種々の組合せで刺激した。図５は感作ＣＤ８+細胞が二次的な試験管内ＣＴＬ応答の発生の為に必須であることを示す。また、これらの資料は効果的な試験管内二次ＣＴＬ応答のために、ＣＤ４+Ｔ細胞が必要であることを示す。ＣＤ４+細胞は感作のためには不要である。
前記実施例は可溶性蛋白質に対するクラスＩ制限ＣＴＬ応答の誘導についての抗原製剤の効果を示す。抗原製剤は可溶性抗原で誘導したＣＴＬ感作に関与し、形質転換体および可溶性ｏｖａまたはβ−ｇａｌで細胞質的に負荷した脾細胞により誘導されるのと同様な活性を示す。卵白アルブミン系では、ＥＧ７−ｏｖａ、細胞質的に負荷したｏｖａ−脾細胞およびｏｖａ−ＡＦは（ａ）クラスＩ制限ＣＤ８+ＣＴＬ；（ｂ）ｏｖａ２５３〜２７６合成ペプチドで感作された標的を認識するＣＴＬ；および（ｃ）唯１回の免疫後の長寿命ＣＴＬを誘導した。β−ガラクトシダーゼ系では、β−ｇａｌ−ＡＦはβ−ｇａｌ発現形質転換体Ｃ３−４を認識し、またアルカリ消化β−ｇａｌで感作した非形質転換Ｐ８１５細胞を認識するＣＴＬを誘導する。これはβ−ガラクトシダーゼを細胞質的に負荷した脾臓細胞での免疫により誘導されたＣＴＬについての観察に類似している。ｏｖａ−特異的ＣＴＬの抗原製剤による誘導は独特である。なぜならｐＨ感受性リポソーム内に入れたｏｖａも明礬（資料未提示）内でも生体内でＣＴＬ感作を誘導できなかったのであるから。
これらの実施例は上で用いた抗原製剤およびその均等物はヒトでの治療および各種の癌腫およびウイルス疾患におけるＣＴＬ誘導のためのワクチン開発において有用である。
実施例５：
これはＨＩＶからの可溶性ｇｐ１２０によりクラスＩ制限ＣＴＬ感作をするために前出ＡＦの使用を示す特別の例である。
ｇｐ１６０ＩＩＩＢを発現するセルライン（１５−１２）をＢａｌｂ／ｃ繊維芽細胞−由来３Ｔ３セルラインに造った。これはＮａｔｉｏｎａｌ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・ｏｆ・Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ．Ｄ．のＲｏｎ・ＧｅｒｍａｉｎおよびＪａｙ・Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ両博士から入手した。ｇｐ１６０発現セルラインは、生体内で感作した脾臓性リンパ球を試験管内で刺激し、またｇｐ１６０特異的ＣＴＬ誘導のための標的とするために用いた。多数の実験で、主ＣＴＬエピトープを含む１８ＩＩＩｂペプチドを試験管内刺激のために用いた。培養物におけるペプチド再刺激のために、ＩＬ−２を培地に加えた。Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当りＡＦ含有または不含の１μｇ−ｇｐ１２０で１回免疫した。マウスの尾ベースに皮下注射した。脾臓細胞を免疫マウスから３週後に取り、照射ｇｐ１６０形質転換体または１８ＩＩＩｂペプチドで試験管内で刺激した。試験管内で５日間培養後、ｇｐ１６０形質転換体を溶解できるが非形質転換セルラインは溶解できない特異的エフェクターの存在によって感作を評価した。一部の実験では、ｖａｃ：ｇｐ１６０感染Ｐ８１５細胞を標的として用いた。結果を表４Ａに示す、ここにＣＴＬ応答はＡＦおよびｇｐ１２０で強化される。注目すべきはｇｐ１２０系では、ｇｐ１２０特異的ＣＴＬ誘導（ＡＦ中、１μｇのｇｐ１２０で１回免疫後）のための至適ＡＦ製剤は全くまたは最少のプルロニクを含むものである。しかし、マウスを高濃度のプルロニク（３．７５％）を含むＡＦ中に５μｇのｇｐ１２０で複数回免疫した時、かなりのＣＴＬ誘導が見られた（資料未提示）。
以下の実施例は１種または２種の成分のみを用いる本発明の抗原製剤の使用を示す。これらの実施例はＣＴＬ−応答は前記三成分の中の２種のみでも誘導できることを示す。
実施例６：ＣＴＬ誘導のために必要な必須成分の決定
前記成分の全てが抗原特異的ＣＴＬ誘導に必要かどうかを決定するために、マウスを前記ＡＦに存在する３成分の２個の種々の組合せのマイクロ流動化製剤中の卵白アルブミンで免疫した。使用した二成分組合せは以下の通り：ＰＢＳ中のスクアラン／ＴＷＥＥＮ、ＰＢＳ中のスクアラン／プルロニクまたはＰＢＳ中のプルロニク／ＴＷＥＥＮ。マウスが一成分系中に製剤化されたｏｖａで免疫した時、すなわち、ＰＢＳ中のスクアラン、ＰＢＳ中のプルロニクまたはＰＢＳ中のＴＷＥＥＮのみである他の群の組合せも含めた。
前記三成分抗原製剤は：０．３００ｇＴＷＥＥＮ８０（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＩ）、１．８７５ｇプルロニク・Ｌ１２１（ＢＡＳＦ、ＮＪ）と７．５ｇスクアラン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＩ）から構成され、ＰＢＳで５０ｍ１とする。
二成分製剤は：
スクアラン／ＴＷＥＥＮ：０．３００ｇＴＷＥＥＮ８０および７．５ｇスクアランで、ＰＢＳで５０ｍＬとする。
プルロニク／ＴＷＥＥＮ：１．８７５ｇプルロニク・Ｌ１２１および０．３００ｇＴＷＥＥＮ８０で、ＰＢＳで５０ｍＬとする。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ／スクアラン：１．８７５ｇプルロニック・Ｌ１２１および７．５ｇスクアランで、ＰＢＳで５０ｍＬとする。
三成分でｐｌｕｒｏｉｃ濃度の異なる製剤は：
スクアランとＴＷＥＥＮ濃度は前記と同じで、プルロニク濃度を変化させた。
５１ｍＬ容積に対して、
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標品を次にマイクロ流動化装置、１１０Ｔ型、Ｍｉｃｒｏｆｌｉｕｄｉｃｓ・・Ｃｏｒｐで処理し、ビンに入れ、使用時まで４℃に貯蔵した。
卵白アルブミン（ｏｖａ、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を秤量し、ＨＢＳＳ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、前出）で０．３ｍｇ／ｍＬ溶液とした。貯蔵０．３ｍｇ／ｍＬ溶液を二成分製剤と下記量で混合した：卵白アルブミン０．３ｍｇ／ｍＬ溶液５部、二成分製剤３．３部およびＨＢＳＳ１．７部。同様にβ−ｇａｌおよびＨＩＶｇｐ１２０はＡＦと混合した。
製剤は混和して注射まで氷浴に保存した。全溶液とも注射直前に混合した。
各マウスにｏｖａ３０μＬを含む製剤２００μＬをテイルベースに皮下注射した。マウスは脾臓を取り出す前に少なくとも２から４週間休ませた。
免疫２週後、脾臓細胞を調製して試験管内で照射ＥＧ７−ｏｖａで刺激した。５日間培養後ｏｖａ特異的ＣＴＬの存在を51Ｃｒ−ＥＧ７−ｏｖａに対するテストまたは51Ｃｒ−ＥＬ４に対する４時間の51Ｃｒ放出検定によって測定した。図６〜８に示す資料はマイクロ流動化二成分系内に製剤化した卵白アルブミンはｏｖａ特異的ＣＴＬを生体内に感作できることを証明した。
我々はさらに蛋白質抗原と混合した時にＣＴＬを誘導する能力に対する各成分の相対的な寄与も評価した。免疫の目的で可溶性抗原をマイクロ流動化添加剤と混合して安定で均質な粒径２５０〜３００ｎｍの範囲の乳剤を得た。更にＣＴＬ誘導をもたらすスクアラン−ＴＷＥＥＮ８０−プルロニク（ＳＴＰ）製剤の成分を確定するために、マウスをスクアラン−ＴＷＥＥＮ８０（ＳＴ）混合物中、プルロニク−ＴＷＥＥＮ８０（ＰＴ）混合物中、またはスクアラン−プルロニク（ＳＰ）混合物中、また、対照としてはスクアラン（Ｓ）、ＴＷＥＥＮ８０（Ｔ）またはプルロニク（Ｐ）中のｏｖａで免疫した。別に、マウスをｏｖａ−ＳＡＦｍ（７０μｇのＭＤＰを含む）またはｏｖａ−明礬をアジュバント対照として免疫した。正の対照として、マウスを可溶性ｏｖａを細胞質的に負荷した脾臓細胞で免疫した。他の組合および置換体も用い、結果を表１に示す。この結果、ＳＴＰまたはＳＴとの組合における３０μｇのｏｖａはマウスにおけるクラスＩ制限ＣＴＬ応答を感作する。ＳＴＰ中のｏｖａまたはＳＴ中のｏｖａによるｏｖａ特異的ＣＴＬの感作は可溶性ｏｖａを細胞質的に負荷した脾臓細胞により誘導されるものより強いと思われる。ＰＴ中またはＳＰ中のｏｖａはマウスにｏｖａ特異的ＣＴＬ応答を誘導できたが、不十分であり弱かった。ＳＡＦｍとは異なり、ＭＤＰのＳＴ製剤への添加はマウスへのｏｖａ特異的ＣＴＬ誘導を妨げなかった（表２）。マウスをｏｖａを各成分であるＳ、ＰまたはＴと混合して免疫した時も、また、マウスがｏｖａ−ＳＡＦｍまたはｏｖａ−明礬で免疫した時にも、ｏｖａ特異的ＣＴＬ誘導は起きなかった。（ａ）ＨＢＳＳ中、（ｂ）ＳＡＦｍ中、または（ｃ）明礬吸着した１ｍｇまでのｏｖａで免疫したマウスにはｏｖａ特異的ＣＴＬは感作しなかった。
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実施例７：ｏｖａ特異的抗体生産のために必要な成分
マウスを２週間隔で３回ＨＢＳＳ、ＳＴＰ、ＳＴ、ＰＴまたはＳＰ中のｏｖａ３μｇで免疫した。ＳＡＦｍは強い抗体反応を誘導することが公知なので、正の対照として、マウスをｏｖａＳＡＦｍで免疫した。第２および第３免疫後７日にマウスを瀉血し、血清のｏｖａ特異的抗体応答をテストした。結果を表３に示す。これらはＳＴＰ、ＳＴまたはＳＡＦｍ中のｏｖａで免疫したマウスは３回の免疫後に同様な抗−ｏｖａ応答を示した。
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実施例８：ＨＩＶｇＰ１２０特異的ＣＴＬ誘導
ＨＩＶｇｐ１２０ＩＩＩＢを第３の抗原系として用いてＳＴＰまたは他の二および三成分製剤の変種体中のＣＴＬ誘導を測定した。マウスをＨＢＳＳ、ＳＴＰ、ＰＴまたはＳＰ中、１μｇのｇｐ１２０で免疫した。対照としてマウスをＳＡＦｍまたはＣＦＡ（完全フロインドのアジュバント）中の１μｇのｇｐ１２０ＩＩＩｂで免疫した（表４Ｂ）。免疫３週間後、脾臓細胞を調製して試験管内でマイトマイシン処理形質転換体細胞１５−１２または１８ＩＩＩｂペプチドで刺激した。培養５日後、得られたエフェクター細胞をワクチニア：ｇｐ１６０ＩＩＩＢに対してまたは非経口ワクチニア感染Ｐ８１５細胞を標的としてテストした。結果はｇｐ１２０−スクアラン−ＴＷＥＥＮ８０は満足にｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答をマウスに誘導した（表４Ａおよび４Ｂ）。けれども、ＣＦＡまたはＳＡＦｍはｇｐ１２０特異的ＣＴＬを誘導できなかった（表４Ｂ）。別の研究では、ｇｐ１２０はＳＴ中、０．００１５％から１．５％までの種々のプルロニクの用量でＣＴＬ誘導をテストした。
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実施例９：マウスにおけるｇｐ１２０特異的体液性応答の誘導
ｇｐ１２０特異的体液性応答の誘導するために、マウスをｇｐ１２０ＩＩＩｂ１μｇで３回２週間隔で免疫した。動物を瀉血し、固相ＥＬＩＳＡ検定でｇｐ１２０ＩＩＩｂを検出するＩｇＧ抗体の存在をテストした。実験１の結果はＳＴまたはＰＴ中のｇｐ１２０はｇｐ１２０−ＨＢＳＳ、ｇｐ１２０−ＳＡＦｍ（表５）またはｇｐ１２０−ＳＴＰよりも強い免疫原であることを証明する。しかし、実験２の結果、ＳＴまたはＳＴＰ中のｇｐ１２０（１．５％または３．７５％濃度のプルロニクを含む）は高力価の抗体応答を誘導できることを示す。
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実施例１０：サルにおけるｇｐ１２０特異的抗体応答
サル（１群２匹）をｇｐ１２０−ＳＡＦｍ、ｇｐ１２０−ＳＰＴ、ｇｐ１２０−ＳＴまたはｇｐ１２０−ＨＢＳＳで免疫した。対照として１群のサルをｇｐ１６０ＩＩＩｂを含む組換えワクチニアで免疫した。サルを２週間隔で免疫し、第２免疫後２週および３週に瀉血した。各サルの免疫前および免疫血清を抗−ｇｐ１２０活性をＥＬＩＳＡ中で材料と方法の項に記載したように順次に希釈した。資料（図９）はｇｐ１２０−ＳＴＰまたはｇｐ１２０−ＳＡＦｍで免疫したサルはサルにおける応答と同様に誘導したことを示す。ｇｐ１２０−ＳＴで免疫したサルの１匹はｇｐ１２０−ＳＡＦｍまたはｇｐ１２０−ＳＰＴ免疫群と同様な抗−ｇｐ１２０応答を示した。ｇｐ１２０−ＳＴで免疫したサル１匹は２回の免疫後にも強い抗−ｇｐ１２０応答を示さなかった。
実施例１１：サルにおけるｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答
サルをＡＦまたはＨＢＳＳ中の３０μｇ〜５０μｇのＨＩＶｇｐ１２０で複数回免疫した。対照としてワクチニア中の組換えｇｐ１６０で免疫した。予備実験の結果はｇｐ１２０−ＡＦで免疫したサルの１／２およびｇｐ１６０：ワクチニアで免疫したサルの１／２はｖａｃ：ｇｐ１６０感染自己標的細胞の優先的な殺細胞を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
他の態様は下記請求項中にもある。
配列表（１）  一般的情報
(i)  特許出願人：シャマル・ライチャウドゥリ
ウィリアム・エイチ・ラステッター
(ii)  発明の名称：細胞毒性Ｔ−リンパ球応答の誘導
(iii)  配列の数：２
(iv)  連絡先：
（Ａ）  名宛人：ライオン・アンド・ライオン
（Ｂ）  通り：ウエスト・シックスス・ストリート６１１番
（Ｃ）  市：ロサンジェルス
（Ｄ）  州：カリフォルニア
（Ｅ）  国：アメリカ合衆国
（Ｆ）  ＺＩＰ：９００１７
(V)  コンピューター解読書式
（Ａ）  媒体型：３．５”ディスケット，１．４４Ｍｂ
（Ｂ）  コンピューター：ＩＢＭ適合
（Ｃ）  オペレーティング・システム：ＩＢＭ  Ｐ．Ｃ．ＤＯＳ（バージョン５．０）
（Ｄ）  ソフトウエア：ワードパーフェクト（バージョン５．１）
(vi)  本出願のデータ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（Ｃ）  分類：
(vii)  優先権主張出願のデータ：
優先権主張出願の総数：以下の１通
（Ａ）  出願番号：Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．  ０７／７３５，０６９
（Ｂ）  出願日：１９９１年７月２５日
(viii)  弁理士／代理人情報
（Ａ）  氏名：ワーバーグ，リチャード・ジェイ
（Ｂ）  登録番号：３２，３２７
（Ｃ）  参照／整理番号：１９７／０７７
(ix)  電話連絡先情報：
（Ａ）  電話番号：（２１３）４８９−１６００
（Ｂ）  ファックス番号：（２１３）９５５−０４４０
（Ｃ）  テレックス：              ６７−３５１０
（２）  配列番号１の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号１：
0003939746.tif 000009
（２）  配列番号２の情報：
（ｉ）  配列の特徴
（Ａ）  長さ：９アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｃ）  鎖の数：１本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
(xi)  配列：配列番号２：
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【図１ａ】
0003939746.tif 000011
【図１ｂ】
0003939746.tif 000012
【図１ｃ】
0003939746.tif 000013
【図２ａ】
0003939746.tif 000014
【図２ｂ】
0003939746.tif 000015
【図３】
0003939746.tif 000016
【図４】
0003939746.tif 000017
【図５】
0003939746.tif 000018
【図６】
0003939746.tif 000019
【図７】
0003939746.tif 000020
【図８】
0003939746.tif 000021
【図９】
0003939746.tif 000022
【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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