(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示すＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１７４〜１３７０、１４４６〜１７４１、１８００〜２２４２、２２９７〜２８８０、２９３２〜３１３４、３１８１〜３３２４、３３８０〜３５１５、及び３５６２〜３６２８からなる塩基配列をこの
順に含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８０７〜２０００，２０６１〜２３５３，２４１２〜２８５４，２９１５〜３４９８，３５５４〜３７５６，３８０６〜３９４９，３９９６〜４１３１，４１８０〜４２４６からなる塩基配列をこの順に含むＤＮＡ。
（ｃ）前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｂ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号１７に示す塩基配列からなる請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２１又は配列番号２５に示す塩基配列からなる請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡがベクターに挿入された組換えベクター。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡがグルタミナーゼを発現可能な形態で導入された微生物の形質転換体。
【請求項８】
糸状菌又はエシェリヒア属細菌である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７または８に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中にグルタミナーゼを生成させることを特徴とするグルタミナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規なグルタミナーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。本発明のグルタミナーゼは、グルタミンを呈味性のよいグルタミン酸に変換する食品加工用酵素等として利用できる。
【０００２】
背景技術
醤油、味噌、その他の蛋白加水分解物を含む天然調味料の製造に、麹菌が利用されている。例えば、醤油は、製麹および発酵の２段階を経て製造される。主として、製麹段階において、麹菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌）が生産する酵素によって原料が分解される。その際、醤油の呈味性をよくするためには、諸味中のグルタミン酸の量を増加させることが重要である。
グルタミン酸は、２つの経路で生成される。第一は、プロテアーゼ及びペプチダーゼによる蛋白質からのグルタミン酸の放出であり、第二は、グルタミナーゼ（グルタミン アミドヒドロラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｍｉｄｏｈｙｄｏｒｏｌａｓｅ））によって触媒されるグルタミンの加水分解によるグルタミン酸の生成である。
醤油製造においてグルタミン酸は原料蛋白中の含有率に対して遊離率が低く、この原因として麹菌のグルタミナーゼ活性の不足が挙げられる。そこで、固体麹においてプロテアーゼ高活性株とグルタミナーゼ高活性株との細胞融合によるプロテアーゼ及びグルタミナーゼの高活性菌株の育種も行われている（Ｕｓｈｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，５１（４），１０５１（１９８７）、特公平３−７３２７１号公報等）。
グルタミナーゼは、種々の細菌や動物由来のもの（Ｗａｋａｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８２，Ｎｏ．６，５９２−５９７（１９９６）、Ｃｈｕｎｇ−Ｂｏｋ，Ｍｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２４，１９３−２００（１９９７）、Ｄｕｒａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３４，４５３−４６５（１９９６））についてはよく研究されてきた。一方、麹菌のグルタミナーゼについては研究が遅れていたが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の一菌株から菌体外グルタミナーゼ及び菌体内グルタミナーゼが精製され、それらの性質が調べられている（Ｙａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．２，１３７−１４３（１９８８））。
これらのグルタミナーゼはいずれも分子量約１１３，０００であり、ほぼ同様の性質を有している。
また、アスペルギルス・オリゼＨＧ株由来のグルタミナーゼのＮ末端アミノ酸配列（福岡県工業技術センター 生物食品研究所 平成８年度研究概要、１９９７年）、及びアスペルギルス・オリゼ由来のグルタミナーゼのＮ末端領域内部のアミノ酸配列（愛知県食品工業技術センター 平成７年度年報（研究報告書）、第３〜４頁、１９９６年）が、それぞれ精製された酵素について決定されている。
ところで、麹菌は、蛋白質を菌体外に分泌する能力に優れており、組換え蛋白質の生産のための宿主として注目されており、いくつかの酵素で実用化されている。
発明の開示 上述したように、麹菌は、遺伝子組換え技術の材料として成果が得られており、そのグルタミナーゼも一部研究されてきたが、未だ研究し尽くされたとは言い難く、さらなる研究が望まれている。また、麹菌のグルタミナーゼをコードする遺伝子は単離されていない。
【０００３】
本発明は上記現状に鑑みなされたものであり、麹菌由来のグルタミナーゼをコードする遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者は、アスペルギルス・オリゼからグルタミナーゼを精製し、その部分アミノ酸配列を決定し、得られた情報に基づいてグルタミナーゼをコードするＤＮＡを単離することに成功し、本発明に至った。さらに、アスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼをコードするＤＮＡを単離することにも成功した。
【０００４】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１７４〜１３７０、１４４６〜１７４１、１８００〜２２４２、２２９７〜２８８０、２９３２〜３１３４、３１８１〜３３２４、３３８０〜３５１５、及び３５６２〜３６２８からなる塩基配列をこの順に含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８０７〜２０００，２０６１〜２３５３，２４１２〜２８５４，２９１５〜３４９８，３５５４〜３７５６，３８０６〜３９４９，３９９６〜４１３１，４１８０〜４２４６からなる塩基配列をこの順に含むＤＮＡ。
（ｃ）前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｂ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）配列番号１又は配列番号１７に示す塩基配列を有する（２）のＤＮＡ。
（５）配列番号２１又は配列番号２５に示す塩基配列を有する（２）のＤＮＡ。
（６）前記（２）のＤＮＡがベクターに挿入された組換えベクター。
（７）前記（２）のＤＮＡがグルタミナーゼを発現可能な形態で導入された微生物の形質転換体。
（８）糸状菌又はエシェリヒア属細菌である（７）の形質転換体。
（９）前記（７）の形質転換体を培地で培養し、培養物中にグルタミナーゼを生成させることを特徴とするグルタミナーゼの製造法。
【０００５】
本明細書において、「グルタミナーゼ活性」とは、少なくともＬ−グルタミンをＬ−グルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性をいい、さらにＤ−グルタミンをＤ−グルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有していてもよい。また、Ｌ−アスパラギン及びＤ−アスパラギンをそれぞれＬ−アスパラギン酸とアンモニア、Ｄ−アスパラギン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有していてもよく、Ｌ−γ−グルタミル化合物のグルタミル基の転移反応や加水分解反応を触媒する活性を有していてもよい。
本発明のグルタミナーゼとして、本明細書においては２種類の態様を開示しているが、これらの一方、又は両方及びこれらの同等物を総称して、「本発明のグルタミナーゼ」ということがある。また、本発明のグルタミナーゼをコードするＤＮＡを、グルタミナーゼ遺伝子ということがある。
尚、本発明のグルタミナーゼは、公知の麹菌由来のグルタミナーゼと酵素学的性質上区別できるものであり、新規なグルタミナーゼであると考えられる。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のグルタミナーゼ
本発明のグルタミナーゼは、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）の培養物から、例えば以下のようにして精製することにより得られる。
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）を小麦フスマで培養し、得られたフスマ麹を緩衝液に浸漬して、酵素粗抽出液を調製する。この酵素粗抽出液を凍結融解し、不溶性画分を除去して上清を取得する。この上清を硫酸アンモニウム分画し、５５％飽和硫安で沈殿せず、８５％飽和硫安で沈殿する画分を取得する。この両分から硫酸アンモニウムを除去し、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーで分画することにより、精製されたグルタミナーゼを取得することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる樹脂としては、ＤＥＡＥ−トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）（東ソー（株））が、疎水性クロマトグラフィーに用いる樹脂としてはフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（ファルマシア社）が、ゲル濾過クロマトグラフィーに用いる樹脂としてはスーパデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）（ファルマシア社）が、それぞれ例示される。これらの精製操作は、繰り返して行ってもよい。
グルタミナーゼの各精製工程において、目的とする両分はグルタミナーゼ活性を指標として選択される。グルタミナーゼ活性は、ハートマンらの変法（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，８５３−８６３（１９６８））（ハイドロキサメイト法）で測定することができる。
上記のようにしてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のフスマ麹から取得されるグルタミナーゼの酵素学的性質を、公知のアスペルギルス・オリゼ由来のグルタミナーゼ（Ｙａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ，６６，Ｎｏ．２，１３７−１４３（１９８８））、及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルタミナーゼ（Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，８６，Ｎｏ．６，４４１−４４６（１９９１））の酵素学的性質と併せて表１に示す。
【０００７】
【表１】
0003918431.tif 000002
【０００８】
上記酵素学的性質、特に基質特異性の著しい相違から、本発明のグルタミナーゼは、公知のアスペルギルス・オリゼ由来のグルタミナーゼとは異なる新規なものである。
本発明のグルタミナーゼは、上記のようにアスペルギルス・オリゼの培養物から精製することによって得られるが、後述のアスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ遺伝子を適当な宿主で発現させることによっても、製造することができる。
後述するように、アスペルギルス・オリゼ由来のグルタミナーゼは、同グルタミナーゼ遺伝子の塩基配列から、配列番号２においてアミノ酸番号１〜６７０で表されるアミノ酸配列を有すると予想される。このアミノ酸配列から計算される分子量は約７６，０００であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分子量の測定値との比較から、本発明のグルタミナーゼは糖タンパク質であることが予想される。
また、本発明のグルタミナーゼの他の態様は、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のグルタミナーゼである。アスペルギルス・ニジュランス由来のグルタミナーゼは、アスペルギルス・ニジュランスの培養物から上記と同様にして精製することによって、あるいは、アスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼ遺伝子を適当な宿主で発現させることによって製造することができる。アスペルギルス・ニジュランス由来のグルタミナーゼは、同グルタミナーゼ遺伝子の塩基配列から、配列番号２２においてアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列を有すると予想される。
本発明のグルタミナーゼは、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有する限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含んでいてもよい。
【０００９】
＜２＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、例えば、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）ゲノムＤＮＡから次のようにして取得することができる。
精製されたグルタミナーゼの部分アミノ酸配列を決定し、得られるアミノ酸配列情報を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）の菌体より調製したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行う。後記実施例において決定された部分アミノ酸配列を、配列番号３〜１０に示す。これらの配列のうち、配列番号３は、グルタミナーゼタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列であり、その他の配列はグルタミナーゼの内部のアミノ酸配列である。尚、配列番号５、８に示すアミノ酸配列は、グルタミナーゼ遺伝子から予想されるグルタミナーゼのアミノ酸配列には存在していなかった。また、配列番号７に示すアミノ酸配列において３番目のＡｌａ及び９番目のＴｈｒは、グルタミナーゼ遺伝子から予想されるグルタミナーゼのアミノ酸配列ではそれぞれＴｈｒ及びＳｅｒであり、ペプチドシークエンサーによる読み誤りであると考えられる。
ゲノムＤＮＡは、Ｇｏｍｉらの方法（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５（１９８９））により取得することができる。プライマーとして、配列表の配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いると、上記ＰＣＲによって約２３０ｂｐのＤＮＡ断片が得られる。次に、上記のようにしてＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片をＤＮＡプローブに用いて、λファージをベクターとするアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のゲノムＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを取得する。
上記のようにして得られたクローン断片のうち、約４．８ｋｂの長さの領域（ＸｈｏＩ断片）のうち、約４ｋｂについて塩基配列を決定した結果を配列表配列番号１に示す。配列番号１において、塩基番号１２３４〜１２８４がコードするアミノ酸配列は、配列番号３に示すグルタミナーゼタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１７のアミノ酸配列に、それぞれ相当する。また、配列番号４、６、７、９及び１０に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２６１８〜２６４７、２７６２〜２８０３、２８０４〜２８４８、２９５７〜２９８６、２５７６〜２６０５がコードするアミノ酸配列に、それぞれ相当する。
以上のことから、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡは、グルタミナーゼ遺伝子であることが明らかである。
配列番号１の塩基配列と後述のグルタミナーゼｃＤＮＡの塩基配列との比較から、配列番号１に示す塩基配列は、８つのエキソン（それぞれ塩基番号１１７４（又は１１３５）〜１３７０、１４４６〜１７４１、１８００〜２２４２、２２９７〜２８８０、２９３２〜３１３４、３１８１〜３３２４、３３８０〜３５１５、及び３５６２〜３６２８）を含み、これらのエキソンは６９０残基からなるアミノ酸配列をコードすることがわかった。このアミノ酸配列を、配列番号１及び２に示す。該アミノ酸配列と、配列番号３に示すグルタミナーゼタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列との比較から、配列番号２においてアミノ酸番号−２０〜−１は、シグナルペプチドであり、アミノ酸番号１〜６７０が成熟タンパク質であると推定される。尚、開始コドンは、塩基番号１１７４〜１１７６のＡＴＧであると推定されるが、塩基番号１１３５〜１１３８のＡＴＧである可能性も否定できない。以上のことから、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡは、プロモーター及びグルタミナーゼ（シグナルペプチドを含む）をコードする領域を含んでいることが強く示唆される。
本発明のＤＮＡは、本発明のグルタミナーゼをコードする限り、配列番号１に示す塩基配列においてイントロンを除去したもの、すなわち、塩基番号１１７４〜１３７０、１４４６〜１７４１、１８００〜２２４２、２２９７〜２８８０、２９３２〜３１３４、３１８１〜３３２４、３３８０〜３５１５、及び３５６２〜３６２８からなる塩基配列をこの順に含むＤＮＡであってもよい。このようなＤＮＡは、例えば、上記グルタミナーゼ遺伝子のｃＤＮＡとして取得することができる。
グルタミナーゼｃＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ又はその一部（例えば前記の約２３０ｂｐのプローブ）を用いたハイブリダイゼーション等によって取得することができる。
また、ｃＤＮＡを鋳型とし、例えば配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ、さらに配列番号１５及び１６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとする３'−ＲＡＣＥによって、グルタミナーゼｃＤＮＡを取得することができる。アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ高生産株から得られたｃＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１７に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１７及び１８に示す。このｃＤＮＡの塩基配列を実施例２で得たゲノム遺伝子のコード領域の配列と比較した結果、ｃＤＮＡ（配列番号１７）の塩基番号５４の「Ｃ」は、ゲノム遺伝子（配列番号１）では「Ｇ」（塩基番号１２２７）であることを除き、一致した。このｃＤＮＡとゲノム遺伝子の塩基配列の相違は、株間における遺伝子配列の相違によるものと推定される。
本発明のＤＮＡは、本発明に係るグルタミナーゼをコードするものであればよく、配列番号１又は配列番号１７に示す塩基配列を有するＤＮＡの他、５'末端側の不要な部分を除いたものも含まれる。使用する目的によっては、成熟タンパク質のみをコードするものであってもよい。また、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換したものも本発明のＤＮＡに含まれる。さらに、本発明のＤＮＡは、コードされるグルタミナーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタミナーゼをコードするものであってもよい。ここで、「複数」とは、アミノ酸残基のグルタミナーゼタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜５０個、最も好ましくは２〜１０個である。
後述するように、配列番号２に示すアスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼのアミノ酸配列と配列番号２２に示すアスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼのアミノ酸配列は、約７３％の相同性を有しており、成熟タンパク質部分では約１７０アミノ酸残基が異なっている。
上記のようなグルタミナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるようにグルタミナーゼ遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、グルタミナーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びグルタミナーゼをコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のグルタミナーゼ活性を調べることにより、グルタミナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するグルタミナーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１７４〜１３７０、１４４６〜１７４１、１８００〜２２４２、２２９７〜２８８０、２９３２〜３１３４、３１８１〜３３２４、３３８０〜３５１５、または３５６２〜３６２８からなる塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ、または配列番号１７に示す塩基配列のうち、塩基番号１〜２０７０からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、グルタミナーゼタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、つまり、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件のことをいう。
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグルタミナーゼ活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
また、本発明のＤＮＡは、アスペルギルス属の他の種に属する微生物、例えばアスペルギルス・ニジュランスの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することもできる。具体的には、アスペルギルス・ニジュランス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の染色体ＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって取得することができる。ハイブリダイゼーション用のプローブは、上記アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・ニジュランス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の菌体より調製したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲ用プライマーとしては、配列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして後記実施例で得られたアスペルギルス・ニジュランスＡ２６のグルタミナーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号２１に示す。また、アミノ酸配列を配列番号２２に示す。アスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼ遺伝子とアスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ遺伝子との相同性は、遺伝子全体では約５８％、コード領域では約６８％、コードされるアミノ酸配列では約７３％であった。
また、グルタミナーゼｃＤＮＡは、アスペルギルス・ニジュランスのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号２３及び２４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、取得することができる。アスペルギルス・ニジュランスＡ２６から得られたｃＤＮＡの塩基配列の一例を配列表配列番号２５に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２５及び２６に示す。
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１〜６６９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。また、本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８０７〜２０００，２０６１〜２３５３，２４１２〜２８５４，２９１５〜３４９８，３５５４〜３７５６，３８０６〜３９４９，３９９６〜４１３１，４１８０〜４２４６からなる塩基配列をこの順に含むＤＮＡ、及び、同ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
本発明のＤＮＡは、以下に示す実施例においては、上記のようにして得られたものであるが、その塩基配列が明らかとなったので、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）もしくはアスペルギルス・ニジュランスＡ２６、又はアスペルギルス・オリゼもしくはアスペルギルス・ニジュランスの他の菌株のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション等により、容易にクローニングすることができる。
【００１０】
＜３＞本発明のＤＮＡの利用
本発明のＤＮＡは、麹菌等の糸状菌の育種、あるいはグルタミナーゼの製造に利用することができる。例えば、本発明のＤＮＡを、糸状菌細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、グルタミナーゼ活性を増大させることができる。また、本発明のＤＮＡを適当な宿主で発現させることにより、グルタミナーゼを製造することができる。このようにして得られる麹菌等の糸状菌又はグルタミナーゼは、醤油、味噌、その他蛋白加水分解物を含む調味料等の製造に利用することができる。
本発明のＤＮＡを導入する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）等のアスペルギルス属、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のニューロスポラ属、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。
上記のような糸状菌に本発明のＤＮＡを導入するためのベクターとしては特に制限されず、糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼに用いられるものとしては、ｐＵＮＧ（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，４２５−４３１（１９９５））、ｐＭＡＲＧ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，，４０，３２７−３３２（１９９３））、ｐＵＳＣ（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２５４９−２５５５（１９８７））等が挙げられる。ｐＵＮＧはアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０，４３２−４３８（１９９６））のｎｉａＤ-（硝酸資化能欠損）を相補するマーカーを、ｐＭＡＲＧはアスペルギルス・オリゼＭ２−３（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（９），２５４９−２５５５（１９８７））のａｒｇＢ-（アルギニン要求）を相補するマーカーを、ｐＵＳＣはアスペルギルス・オリゼＮＳ４（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７））のｓＣ-（ＡＴＰスルフリラーゼ欠損）を相補するマーカーを、それぞれ有している。
これらのベクターのうち、ｐＵＮＧ及びｐＭＡＲＧは、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター及びα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢのターミネーター）を有しており、該プロモーターの下流に本発明のＤＮＡ（配列番号１において塩基番号１１３６〜４７７７又は１１７７〜４７７７を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモーター制御下でグルタミナーゼを発現させることができる。また、ｐＵＳＣはプロモーターを含んでいないので、これを用いる場合は、本発明のＤＮＡを挿入したｐＵＣ１９等のプラスミドとｐＵＳＣとの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主糸状菌に導入することによって、本発明の遺伝子を発現させることができる。前述したように、配列番号１に記載の塩基配列中にはプロモーターが含まれる可能性が高いため、本発明のＤＮＡをプロモーターを含めて上記ベクターに挿入しても、グルタミナーゼを発現し得ると考えられる。
また、以下の文献に記載されているベクター、プロモーター及びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。表２中、プロモーターは遺伝子がコードする酵素名で示してある。
【００１１】
【表２】
0003918431.tif 000003
【００１２】
糸状菌の形質転換は、上記文献に記載されている方法の他、公知の方法を採用することができる。具体的には、例えばアスペルギルス・オリゼは以下のようにして形質転換することができる。
ＤＰＹ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）に菌体（分生子）を植菌し、３０℃で２４時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ、ＣＡＬＢＩＯ ＣＨＥＭ社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分をよく切る。この菌体を、試験管に入れ、酵素液（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製）、または０．５％ノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍｅ、ノボノルディスク社製）及び０．５％セルラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ、ヤクルト社製）、０．６Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、５０ｍＭ リンゴ酸、ｐＨ５．５）を加え、３０℃で３時間程度穏やかに振盪する。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、良好であれば氷中に保存する。
上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、プロトプラストを含む濾液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、３５ｍＭ ＮａＣｌ2、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置く。これを０℃、２，５００ｒｐｍで８分遠心した後、緩やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａで洗浄し、適量の緩衝液Ａに懸濁する。
１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下のＤＮＡ溶液（５〜１０μｇ）を加え、２０〜３０分氷中に置く。緩衝液Ｂ（ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置する。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、２，０００ｒｐｍで８分遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガーに加えて、下層培地（１．２Ｍソルビトールを含有し、マーカーに応じて調製した選択培地）に重層し、３０℃で培養する。生育した菌体を選択培地に植え次いで、形質転換体であることを確認する。さらに、菌体から組換えＤＮＡを調製し、制限酵素解析又はサザン解析等によって、本発明のＤＮＡが導入されていることを確認しておくことが好ましい。
上記のようにして得られる形質転換体を、使用するプロモーターに適した条件で培養することによって、グルタミナーゼ遺伝子が発現し、グルタミナーゼが生成する。
本発明の遺伝子を導入しグルタミナーゼ活性の向上した形質転換株の培養物は、蛋白質分解酵素の存在下、蛋白質に作用させることにより、グルタミン酸ナトリウム含有量が高く、うま味の強い蛋白加水分解物を得ることができる。作用させる蛋白質としては、例えば大豆、小麦、小麦グルテン等であり、さらに脱脂大豆あるいは膨化や可溶化等の加工をされた種々の蛋白質あるいはこれらの種々の原料からの分離蛋白質でもよい。
形質転換株の培養物を蛋白質に作用させる条件としては、たとえば０．２〜５０％濃度の原料に形質転換株の培養物を蛋白質分解酵素存在下で混合し、５〜６０℃にて４時間〜１０日間反応させればよい。
反応終了後、未反応の原料蛋白質、菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除去すればよい。また、必要に応じて減圧濃縮、逆浸透法などにより濃縮を行い、濃縮物は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理により、粉末化または顆粒化することができる。かくして外部からグルタミン酸ナトリウムを添加することなく、グルタミン酸ナトリウム含有量が高く、呈味性の強い蛋白加水分解物を得ることができる。
発明を実施するための最良の形態 以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１３】
実施例１ アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼの精製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）株を小麦フスマで培養し、培養物からグルタミナーゼの精製を行った。精製工程においてグルタミナーゼ活性は、ハートマンらの変法（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，８５３−８６３（１９６８））（ハイドロキサメイト法）で測定した。すなわち、１２５μｌ ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン、５０ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ 還元グルタチオン溶液に、酵素溶液２５μｌを添加して３７℃で１時間保温した後、３Ｎ塩酸、１２％トリクロロ酢酸溶液、及び５％ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ溶液（０．１Ｎ ＨＣｌに溶解）を等量つつ混合した溶液を１２５μｌ添加して５２５ｎｍの吸収を測定した。活性は３７℃で１分間に１μｍｏｌのＬ−グルタミン酸γ−モノハイドロキサメイトを生成させる酵素活性を１ｕｎｉｔとした。
（１）培養 小麦フスマ（日清製粉製）６００ｇ、リン酸カリウム１２ｇ、蒸留水６００ｍｌをよく攪拌した後、直径１５ｃｍの腰高シャーレ６組に１６０ｇずつ入れ、１２０℃で２０分間オートクレープすることによって培地を作製した。
胞子を十分に形成したアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のスラントに滅菌水５ｍｌを注ぎ、攪拌して胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に散布した。胞子を接種した培地をよく混和し、３０℃で１４日間培養した。途中、培養２４時間目に培地を攪拌して手入れを行った。
（２）酵素の抽出 上記のようにして作製したフスマ麹を３倍量の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）、０．１ｍＭ ＥＰＮＰ（１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）プロパン）、１ｍＭ ＥＤＴＡに浸漬し、４℃で１６時間静置後、ガーゼ濾過及び遠心分離（４℃、３０分間、７，５００ｒｐｍ）により得られた上清を酵素粗抽出液とした。
（３）硫安沈殿による分画 酵素粗抽出液を−８０℃で凍結し、４℃で徐々に融解した後、不溶性画分を濾過によって除去した。これに硫酸アンモニウムを添加し（１０１０ｇ／２，８８０ｍｌ）、５５％飽和硫安溶液とした。これを４℃で４時間攪拌後、遠心分離（４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間）して沈殿を除いた。この上清にさらに硫酸アンモニウムを添加（７０３ｇ／３，１８０ｍｌ）し、８５％飽和硫安溶液とした。この溶液を４℃で１６時間攪拌した後、生じた沈殿を遠心分離（４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間）により回収し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｌに溶解した。これを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過した。
（４）脱塩 あらかじめ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した脱塩用カラム（ファルマシア社製ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、５ｍｌ×５）に、上記（３）で得た濾液１００ｍｌのうち５ｍｌを供し、同緩衝液で溶出した。この脱塩操作は、濾液１００ｍｌを５ｍｌづつ２０回に分けて行った。活性画分を合わせて３００ｍｌ回収し、限外濾過により５０ｍｌに濃縮、脱塩した。
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー あらかじめ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（トヨパール）６５０Ｍ（東ソー（株）製）２５０ｍｌを充填したカラムに、上記で得た試料を吸着させ、カラム体積の４倍量の同緩衝液で洗浄した。洗浄後、緩衝液のＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．５Ｍにカラム体積の８倍量で直線的に増加させて溶出した。溶出液中に回収された活性画分３４０ｍｌは、限外濾過にて１２ｍｌに濃縮、脱塩した。
（６）疎水性クロマトグラフィー 次に、ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（フェニルファロース）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ファルマシア社）を用いたＦＰＬＣシステム（ファルマシア社）にて、吸着クロマトグラフィーによる分画を行った。このクロマトグラフ操作は、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ活性画分の蛋白質量から、２回に分けて行った。あらかじめ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したカラムに、１Ｍ硫酸アンモニウムを添加したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ活性画分のうち６ｍｌを吸着させた後、カラム体積の４倍量の同緩衝液で洗浄した。洗浄後、緩衝液の硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍにカラム体積の１６倍で直線的に減少させて溶出した。溶出液のうち活性画分３００ｍｌを限外濾過および遠心濃縮（セントリプレップ１０、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）社）により、１０ｍｌに濃縮、脱塩した。
（７）ゲル濾過クロマトグラフィー 上記の試料を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ファルマシア社）を用いたＦＰＬＣシステムにて、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画を行った。このクロマトグラフ操作は、試料の蛋白質量から５回に分けて行った。あらかじめ４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したカラムに、上記で得た活性画分のうち２ｍｌを供し、同緩衝液で溶出して活性画分を回収した。このゲル濾過クロマトグラフィーは、２回繰り返して行った。
（８）精製の結果 以上の精製フローにより、５００μｇの精製グルタミナーゼを得た。精製酵素の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）により決定したところ、８，２９０であった。精製諸工程における総蛋白質量、総活性、比活性、収率、純度（酵素粗抽出液の純度を１とする）を表３にまとめた。
【００１４】
【表３】
0003918431.tif 000004
【００１５】
（９）グルタミナーゼの部分アミノ酸配列の決定 ５００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．１）、６Ｍグアニジン、２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、精製グルタミナーゼ９７μｇにＤＴＴ２６３μｇを加え、窒素置換した後、５０℃で３時間保温した。その後、遮光して室温で１晩還元反応を行った。さらにヨード酢酸２９００μｇを添加して室温にて３０分間反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ファルマシア社）カラムにて脱塩した。脱塩した試料を遠心濃縮機ＶＣ−９６０（タイテック（ＴＡＩＴＥＣ）社）にて濃縮後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．５）及び１μｇリジルエンドペプチダーゼ（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社）を添加して３７℃で１３時間限定分解を行った。反応後、生成したペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃ18、バイダック社（Ｖｙｄａｃ）社）にて分取し、それぞれペプチドシークエンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）に供し、グルタミナーゼ内部の部分アミノ酸配列を決定した。一方、リジルエンドペプチダーゼ処理を行わずにペプチドシークエンサーに供し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を以下に示す。
Ｎ末端 ：ＡＳＴＦＳＰＡＲＰＰＡＬＰＬＡＶＫ（配列番号３）
Ｎｏ．５２：Ｙ（Ｇ／Ｐ）（Ｎ／Ｖ）（Ｔ／Ｐ）ＹＡＭ（Ｒ／Ｓ）ＤＩ（配列番号４）
Ｎｏ．５５：ＶＱＹ（Ｔ／Ｇ）ＥＹＤＸＹ（配列番号５）
Ｎｏ．５９：ＤＮＤＹＬＳＱＨＹＰＩＬＮＫ（配列番号６）
Ｎｏ．６７：ＷＴＡＹＬＶＥＤＴＩＹＰＡＮＱ（配列番号７）
Ｎｏ．６２．５：ＶＬＬＱＳＡＩＥＧＨ（配列番号８）
Ｎｏ．６３：ＧＩＩＧＩＱＡＭＡＶ（配列番号９）
Ｎｏ．６２：ＸＩＬＫＦＸＹＸＸＱ（配列番号１０）
上記配列において、「Ｘ」は不明のアミノ酸を、「／」はその前後のいずれかのアミノ酸であることを表す。
【００１６】
実施例２ アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼのゲノムライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションによりグルタミナーゼ遺伝子を単離した。
（１）ＰＣＲによるプローブの作製 アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の菌体から、Ｇｏｍｉらの方法（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５（１９８９））に準じて、以下に示すようにしてゲノムＤＮＡを調製した。
スラント２本分のアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の胞子を０．８５％ＮａＣｌに懸濁し、ＹＰＤ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）１Ｌに植菌し、３０℃で２４時間培養した。菌体をガーゼで濾過して集め、直ちに液体窒素で凍結し、液体窒素で冷却しながらホモジナイザー（１８０００ｒｐｍ、１５分）又は乳鉢で粉砕した。これに、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ８．０を１００ｍｌ入れ、プロテイナーゼＫを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、、５０℃で４時間インキュベートした。この溶液を、フェノール処理、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理を２回づつ行った。これらの有機溶媒による処理は、溶液と有機溶媒を穏やかに混合し、水層を分取することによって行った。
上記のようにして蛋白質を除去した溶液に、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で一晩放置した後、０℃、１０，０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿をリンスした後、ＴＥ緩衝液に穏やかに溶解させた。この溶液に、ＲＮａｓｅ Ａ １０μｇ／ｍｌを加え、３７℃で３０分インキュベートしてＲＮＡを分解した。続いて、１／２最のフェノールを加えて混合し、３７℃で１０分放置した後、１／２量のクロロホルムを加えて混合し、０℃、１０，０００ｒｐｍで２０分遠心し、水層を分取した。これにジエチルエーテルを加えて混合した後、０℃、１０，０００ｒｐｍで５分遠心し、ジエチルエーテル層を除去することにより、溶液に残存するフェノールを除いた。得られた水層に、５００μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と５ｍｌエタノールを加え、−８０℃で１時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿を得た。この沈殿をリンスした後、５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、少量のクロロホルムを添加して冷蔵保存した。
上記のようにして得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記部分アミノ酸配列（Ｎｏ．５２及びＮｏ．６７）に基づいて合成した下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより、グルタミナーゼ遺伝子の部分配列を取得し、これをハイブリダイゼーション用プローブに用いた。これらのプライマーの配列は、アスペルギルス・ニジュランスのコドン使用頻度（Ａｎｄｒｅｗ，Ｔ．Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０，２８８−２９４（１９９１））を参考にして設計した。
（５'末端用プライマー）
ＴＡＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＡＴＣ（配列番号１１）
（３'末端用プライマー）（配列番号１２）
ＴＴＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＡＡＴ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＡＡ ＧＴＡ ＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃ １分、５３℃ １分、７２℃ １．５分の反応を３５サイクル行った。これにより約２３０ｂのグルタミナーゼ遺伝子断片を取得した。
（２）アスペルギルス・オリゼゲノムライブラリーのスクリーニング 上記のＰＣＲ反応で得た遺伝子断片をプローブとして、アスペルギルス・オリゼゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。
アスペルギルス・オリゼゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで約１０ｋｂに切断し、λファージベクター（λ ＤＡＳＨ ＩＩ、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られた組換えＤＮＡをインビトロ・パッケージング処理して、λファージライブラリーを得た。
上記λファージライブラリーを用いて、直径１５ｃｍのシャーレ１枚あたり約５，０００個のプラークを形成させた。プラークを形成させたプレートは１０枚作製し、プレート１枚に対して各々２枚ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）にブロッテイングした。すなわちプレート上にナイロンメンブレンを１枚目は３分間、２枚目は５分間静置した後、変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）をしみ込ませた濾紙上で７分間静置した。次に、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））をしみ込ませた濾紙上に３分間、さらに同溶液をしみ込ませた別の濾紙上に３分間静置して中和し、さらに２×ＳＳＣ中で３分間静置した後、風乾した。乾燥後、０．４Ｍ ＮａＯＨをしみ込ませた濾紙上で２０分間静置し、５×ＳＳＣ中で１分間振とうした後、風乾した。
上記のナイロンメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ）に浸し、４２℃で２時間保温した。また、ＰＣＲで得たプローブは、ランダムラベルキット（ベーリンガーマンハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ）社）を用いて［32Ｐ−γ］−ＣＴＰで標識した。標識したプローブは１００℃、３分間保温した後、直ちに氷中に移してＤＮＡ二本鎖を変性させてから、プレハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、４２℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。
上記ナイロンメンブレンについて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分の洗浄を２回、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分の洗浄を２回行った。洗浄後、イメージングプレート（フジックス（ＦＵＪＩＸ）社）にコンタクトし、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（ＦＵＪＩＸ）で検出した。その結果、約５０，０００個のプラークより２１個のポジティブシグナルを検出した。
２１個のポジティブプラークを各々回収して、さらに２次スクリーニングを行った。２次スクリーニングでは、直径１０ｃｍのシャーレに約５０個のプラークを形成させ、以下１次スクリーニングと同様の手順でハイブリダイゼーションを行った。２次スクリーニングでは４種のポジティブプラークを検出した。さらに２次スクリーニングと同様の手順で３次スクリーニングを行い、最終的に４種のポジティブクローンを得た。
これらの４種のクローンの塩基配列を決定した結果、いずれも同じ配列を含んでいた。これらのうちの１つのＸｈｏＩ断片の塩基配列、及びこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
上記ＸｈｏＩ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３４９５が付され、１９９８年９月９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４９０が付与されている。
【００１７】
実施例３ アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼｃＤＮＡのクローニング
アスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ高生産株を、ＤＰＹ培地５０ｍｌで３０℃、４８時間培養した。菌体をガーゼで濾過して集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、グアニジン−塩化セシウム超遠心法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９））にて全ＲＮＡ ０．２ｍｇを得た。この全ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｍＲＮＡを精製し、さらにｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（宝酒造（株））にてｃＤＮＡを合成した。本キットの使用により、得られたｃＤＮＡの５'末端にはＣＡカセットアダプター配列が、３'末端にはオリゴｄＴ−ＲＡ配列が連結される。
上記のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型として、グルタミナーゼゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて合成した下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲおよび３'−ＲＡＣＥにより、グルタミナーゼｃＤＮＡを増幅した。
（５'末端用プライマー）
ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＣ（配列番号１３）
（３'末端用プライマー）
ＧＣＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＧＧ ＴＴＣ Ｇ（配列番号１４）
（３'−ＲＡＣＥ用５'末端用プライマー）
ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＧＣ（配列番号１５）
（３−'ＲＡＣＥ用３'末端用プライマー）
ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＣＴＣ（配列番号１６）
それぞれのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分の反応を３０サイクル行った。配列番号１３及び１４のプライマーを用いたＰＣＲにより約１５００ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号１５及び１６のプライマーを用いた３'−ＲＡＣＥにより約７８０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
これらのＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１７に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１７及び１８に示す。
【００１８】
実施例４ グルタミナーゼｃＤＮＡのエシェリヒア・コリにおける発現
グルタミナーゼｃＤＮＡの上流にｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターあるいはＴｒｐプロモーターを連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のマルチクローニングサイトに挿入する。得られた組換えプラスミドでエシェリヒア・コリＤＨ５αを常法により形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天培地で選択する。得られた形質転換体を、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で３７℃で一晩培養する。この培養液１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地に移し、３７℃で培養する。３時間後、ＯＤが０．６に達したところでＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭとなるように添加してｌａｃプロモーターを誘導し、さらに３７℃で４時間培養する。培養後、集菌し、菌体を緩衝液に懸濁した後、超音波破砕してタンパク質封入体を得る。このタンパク質封入体を変性剤溶液（８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した後、不溶性画分を遠心によって除去する。可溶化したタンパク質溶液の尿素濃度を徐々に低下させることによって、タンパク質の巻き戻しを行うことができる。
上記グルタミナーゼｃＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入し、得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３４９６が付され、１９９８年９月９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６４９１が付与されている。
【００１９】
実施例５ アスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼ遺伝子の クローニング
（１）ＰＣＲによるプローブの作製 実施例１及び２で決定したアスペルギルス・オリゼのグルタミナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・ニジュランスＡ２６の菌体より調製したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡは、Ｇｏｍｉらの方法（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５（１９８９））に準じて実施例２と同様にして調製した。
ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号１の塩基番号１９５２〜１９７９および２８３９〜２８６８の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
（５'末端用プライマー）
ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＴＧ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＡＧ Ｔ（１９５２〜１９７９）（配列番号１９）
（３'末端用プライマー）
ＧＣＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＧＧ ＴＴＣ ＧＣＣ（２８３９〜２８６８）（配列番号２０）
ＰＣＲ反応は、９５℃で３分熱変性した後、９４℃ １分、３７℃ １分、７２℃ １分の反応を３０サイクル行った。これにより、約９００ｂのグルタミナーゼ遺伝子断片を取得した。
（２）アスペルギルス・ニジュランスのゲノムライブラリーのスクリーニング 上記のＰＣＲ反応で得た遺伝子断片をプローブとして、アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。
アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーは、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）より購入した。本ライブラリーを用いて、直径１０ｃｍのシャーレに寒天培地を作成し、その上にナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）を上乗せした。ナイロンメンブレン上に埴菌し、１枚あたり約５０個のコロニーを形成させた。コロニーを形成させたプレートは３０枚作成し、各々からナイロンメンブレンを回収した。これらを変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ）をしみ込ませた濾紙上で７分間静置した。次に、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））をしみ込ませた濾紙上に３分間、さらに同溶液をしみ込ませた別の濾紙上に３分間静置して中和し、さらに２×ＳＳＣ中で３分間静置した後、風乾した。乾燥後、０．４Ｍ ＮａＯＨをしみ込ませた濾紙上で２０分間静置し、５×ＳＳＣ中で１分間振とうした後、風乾した。
上記ナイロンメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ）に浸し、６５℃で２時間保温した。また、ＰＣＲで得たプローブは、ランダムラベルキット（ベーリンガーマンハイム（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社））を用いて［32Ｐ−γ］−ＣＴＰで標識した。標識したプローブは１００℃、３分間保温した後、直ちに氷中に移してＤＮＡ二本鎖を変性させてから、プレハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、６５℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。
上記ナイロンメンブレンについて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分の洗浄を２回、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分の洗浄を２回行った。洗浄後、イメージングプレート（フジックス（ＦＵＪＩＸ）社）にコンタクトし、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（ＦＵＪＩＸ）で検出した。その結果、約１５００個のコロニーより４個のポジティブシグナルを検出した。
これらの４種のクローンの塩基配列を決定した結果、いずれも同じ配列を含んでいた。これらのうちの１つのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の塩基配列、及びこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２１に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２２に示す。
上記ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３５０９が付され、１９９８年９月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２０が付与されている。
【００２０】
実施例６ アスペルギルス・ニジュランスのグルタミナーゼｃＤＮＡの クローニング
アスペルギルス・ニジュランスＡ２６をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％，Ｇｌｕｃｏｓｅ ２．５％，Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ*０．１％）５０ｍｌで３７℃、２１時間振盪培養した。菌体を濾紙上にて回収し、最少培地（ＮａＮＯ3 ０．６％，ＫＨ2ＰＯ4 ０．１５２％，ＫＣｌ ０．０５２％，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５２％，Ｇｌｕｃｏｓｅ １％，Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ*０．１％，Ｂｉｏｔｉｎ ２×１０−５％，Ａｇａｒ １．５％）の入ったプレート上で３７℃、２４時間培養した。（＊：Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％，ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８８％，ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０４％，ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．０１５％，Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０．０１％，（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．００５％）
プレート上より菌体を回収し、液体窒素にて凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡの調製を行い、さらにＴｏｔａｌ ＲＮＡより、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。ｍＲＮＡよりｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ及びｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーの作成を行った。
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、アスペルギルス・ニジュランスゲノムＤＮＡ配列よりデザインした下記のプライマーを用いて、ＰＣＲによるグルタミナーゼｃＤＮＡのクローニングを行った。
（５'末端用プライマー）
ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＡ ＴＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＴＣ（配列番号２３）
アンチセンス側プライマー（３'末端用プライマー）
ＧＧＣ ＴＡＴ ＡＡＣ ＴＧＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＴＡ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＡＣ（配列番号２４）
ＰＣＲの反応条件は、９４℃ ５分間の熱変性後、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ２分の反応を３０サイクルで行った。その結果、約２３００ｂｐの増幅断片が見られ、全長のグルタミナーゼｃＤＮＡの取得に成功した。このＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２５に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２６に示す。上記アスペルギルス・ニジュランス グルタミナーゼｃＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＴＡクローニング部位に挿入し、得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３５７５が付され、１９９９年３月１１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７９が付与されている。
【００２１】
実施例７ グルタミナーゼの製造
プロモーター配列を含むグルタミナーゼ遺伝子を、マーカー遺伝子ｓＣを含むベクターに連結し、形質転換用のプラスミドとした。本プラスミドＤＮＡ１０μｇにより形質転換を行った。
ＤＰＹ培地に分生子を植菌し、３０℃で２４時間激しく振とう培養した。培養液を滅菌したガーゼで濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分を良く切った。この菌体を試験管にいれ、酵素液２０ｍｌ（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製））を加え、３０℃で３時間穏やかに振とうした。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、氷中に保存した。
上記酵素反応液をミラクロスでろ過して菌体残さを除去し、プロトプラストを含むろ液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍ ソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置いた。これを０℃、１，５００ｒｐｍで５分遠心したのち、穏やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａ１０ｍｌで２回洗浄し、１ｍｌの緩衝液Ａに懸濁した。
１００μｌのプロトプラスト懸濁液に１０μｌのＤＮＡ溶液（１０μｇ）を加え、３０分間氷中に置いた。緩衝液Ｂ（６０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置した。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、１，５００ｒｐｍで５分遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁した。
上記懸濁液をあらかじめ分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガー培地に加えて、Ｍ培地（１．２Ｍソルビトール、０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、０．００２％硫酸第一鉄、２％グルコース、ｐＨ５．５）に重層し、３０℃で培養した。生育した菌体１株をＭ培地に植えついで、形質転換体であることを確認した。さらに菌体から組換えＤＮＡを調製し、サザン解析によって本発明のＤＮＡが少なくとも２コピー存在することを確認した。
上記で得られた形質転換体を小麦フスマで培養し、その抽出液についてグルタミナーゼ活性を測定した。小麦フスマ（日清製粉製）１６０ｇ、リン酸カリウム３．２ｇ、蒸留水１６０ｍｌをよく攪拌した後、直径１５ｃｍの腰高シャーレに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブすることによって培地を作成した。
胞子を十分形成した形質転換体のスラントに滅菌水１０ｍｌを注ぎ、攪拌して胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に散布した。胞子を接種した培地を良く混和し、３０℃で１４日間培養した。途中、培養２４時間目に培地を攪拌して手入れを行った。
上記のようにして作成したフスマ麹を３倍量の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）、０．１ｍＭ ＥＰＮＰ（１，２−エポキシ−３−（ρ−ニトロフェノキシ）プロパン）、１ｍＭ ＥＤＴＡに浸漬し、４℃で１６時間静置後、ガーゼ濾過および遠心分離（４℃、１５分間、１０，０００ｒｐｍ）により得られた上静を酵素粗抽出液とした。
本酵素粗抽出液のグルタミナーゼ活性を測定した。まお、対照としてマーカ遺伝子のみ含むベクターＤＮＡで形質転換して得られた形質転換体についても同様に酵素粗抽出液を得、グルタミナーゼ活性を測定した。
【００２２】
【表４】
0003918431.tif 000005
その結果、本発明の遺伝子を導入した株において顕著な活性上昇が認められ、導入したグルタミナーゼが発現、生成したことが明らかとなった。
【００２３】
産業上の利用可能性
本発明により、麹菌由来のグルタミナーゼをコードする新規な遺伝子を提供される。本遺伝子は、麹菌の育種、グルタミナーゼの製造、及び醤油などの調味料の製造に利用することができる。
【配列表】
Sequence Listing
<110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.)
<120> 新規グルタミナーゼ、その遺伝子及びその製造法
（A Novel Glutaminase, its Gene and a Method of Producing It）
<130> B-481AYOP849
<141> 1999-05-12
<150> JP 10-134080
<151> 1998-5-15
<150> JP 10-258974
<151> 1998-9-11
<150> JP 10-292443
<151> 1998-10-14
<150> JP 11-89157
<151> 1999-03-30
<160> 26
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 4013
<212> DNA
<213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> CDS
<222> join(1174..1370,1446..1741, 1800..2242, 2297..2880, 2932..3134, 3181..3324, 3380..3515, 3562..3628)
<220>
<221> intron
<222> (1371)..(1445)
<220>
<221> intron
<222> (1742)..(1799)
<220>
<221> intron
<222> (2243)..(2296)
<220>
<221> intron
<222> (2881)..(2931)
<220>
<221> intron
<222> (3135)..(3180)
<220>
<221> intron
<222> (3325)..(3379)
<220>
<221> intron
<222> (3516)..(3561)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1174)..(1233)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1234..1370, 1446..1741, 1800..2242, 2297..2880, 2932..3134, 3181..3324, 3380..3515, 3562..3628)
<400> 1
ctcgagagac tccttgccac ctgatactat cacaattgtc ggtcacacgc gactggctac 60
tactacttcg taggcaccgt agtatacccc agtctcttta ggatggcaat accttgttgt 120
atagatgttg tagtcatgta ggattccctg gagattccct gatcggacgg caagagtgac 180
cccacttcca agtattgact ccatctcagc tcgatgtatc actttcctgt ttagggcacg 240
ggagcatcac tgacggctct ctgcctcagg ccatgattgt ttcttttgtc aattcgactt 300
ctccaaatcg agctgcagat ctgtcgaccc catcccagtt gatgcagtag ctcggctacc 360
ggaagagatt tattcttagt cccttgttgg gattgggatt caccctcgct tctgtttctc 420
accgtattta tatcgcgcaa tgagattgat ccggatataa aatgtctgtg atgcactctt 480
tctcacgcac cgaggtaatc aatatcatat gctttcccct catatcactg ccgaaaagac 540
taactcggtc taccccatag tcaccagcca ctagcgcttc ttgggcctct ccttgtttgc 600
tcagtggatc taaagccaag actatcatgg ttagtgtcgg gttgtcttca ttagatcgtc 660
tgcagcccca gagtgtatcg gcttaggact ggtcgagccc gacgcggcta aggataaggt 720
acatactccc actctatcga cccttgcttg ttaatctccg atcttgtctc ctgtccaatt 780
gtcgggcttc tcctggaatt ccaggtttct ttcacctgtc gggcagccgg atcgaggccg 840
catgaattgc tcccccacag agactgacag gtcaggcgat attgggggag tcacaatcat 900
gcgcgccccc attccgcatt ccgtttctcg accctcatgc agcgtgctaa acttccatag 960
tccctcctga attgtctgcc ctgccctccg gtatgcgggc tggaccaact atataagtgt 1020
gcctaacatt ccttcagcat tcttcaggcc cacattctcg ggggcacgtt ttttggcgga 1080
tctcgatcct actctttcat tctttgaaga aacctggaat tattacgtgt ataaatgaag 1140
gatgtaccct gtgtgaatcc ctcaatacgg atc atg atg cat ttc ctc tcg ttc  1194
Met Met His Phe Leu Ser Phe
-20                 -15
tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtg tct tac gcg gga gct gcg tca aca   1242
Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr
-10                  -5                   1
ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg ccc ttg gct gtc aaa tcg ccg   1290
Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro
5                  10                  15
tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc aca gat ggc ggt aat gga ggg   1338
Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly
20                  25                  30                  35
tac ctg gcc ggc caa tgg cct acc ttc tgg tt  gtgagtagtc            1380
Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe Trp Phe
40                  45
ccgagctgta gaaatgaaga catccatctt gatgtacatt ggctaaacca cgtccctcgt 1440
ggcag c ggc cag gtg acc ggc tgg gcg ggt cag atc cgg gtc gat aat   1488
Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn
50                  55                  60
tcg acc tac aca tgg atg ggg gcg atc cct aac acc cct acg gtg aac   1536
Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn
65                  70                  75
cag aca tcc ttc gag tac acc tcg acg tcg agc gtg ttc acg atg cgt   1584
Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg
80                  85                  90
gtt ggg gat atg gtg gaa atg aaa gtg aaa ttc ctg tcc cct atc aca   1632
Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr
95                 100                 105
cca gat gat ctc cgg aga cag tcg ctt gtg ttt tcc tat ctg gac gta   1680
Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val
110                 115                 120
gat gtc gaa tcg atc gac ggc aaa gcg cat gac ata cag gtg tac gca   1728
Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala
125                 130                 135                 140
gac att tca gca g gtaagcaaga cgacaaccca cctggaacag tgcaaatatc     1781
Asp Ile Ser Ala
catctaaccg ggtcttag aa tgg gcg tcc ggg gac cga aac gcc att gcg    1831
Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala
145                 150                 155
cag tgg gac tat ggt gtc aca gat gat ggc gtt gcc tat cac aag gtt   1879
Gln Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val
160                 165                 170
tac cgc caa acg cag ctg ctg ttt tcc gaa aac act gag cag gcc gaa   1927
Tyr Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu
175                 180                 185
tgg ggc gag tgg tac tgg gcc aca gac gac caa gat ggt ctg agc tac   1975
Trp Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr
190                 195                 200
cag tcc gga ccg gat gtt gat gtg cga ggg gca ttc gca aag aac gga   2023
Gln Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly
205                 210                 215
aag ttg gcg aat tcg gat gat aaa aat tat cgt gca atc tcg acc aat   2071
Lys Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn
220                 225                 230                 235
tgg ccc gtg ttt gcc ttc tcc cgc gat ctt ggc tcg gtg aag acg tct   2119
Trp Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser
240                 245                 250
gct ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag gac agt gcc ata cag   2167
Ala Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln
255                 260                 265
tac agt ggg aaa cct gaa ggg aca act gtg atg cct tca ctc tgg aag   2215
Tyr Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys
270                 275                 280
agc tac ttc agc act gcg act gct gcg gtaagtggcc cactgctgtt         2262
Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala
285                 290
tcggacctag aacataatct gaccatctat gtag ctt gag ttc ttc cat cat     2314
Leu Glu Phe Phe His His
295
gat tat gct gct gca gct gca cta tcg aag gat ctc gat gac cgg ata   2362
Asp Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile
300                 305                 310
tcc aag gat tcc att gat gcc gct ggc cag gac tac ctg aca atc acc   2410
Ser Lys Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr
315                 320                 325                 330
tcc ctc acg gtc cgt caa gtc ttt gct gcc gtg caa ttg acc ggc acg   2458
Ser Leu Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr
335                 340                 345
ccc gag gac ccc tac atc ttc atg aag gag atc tcg tcc aat ggc aac   2506
Pro Glu Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn
350                 355                 360
atg aac act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac ccg atc ttt ttg tac   2554
Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr
365                 370                 375
acc aat ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag cca atc tat gag att   2602
Thr Asn Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile
380                 385                 390
caa gag aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc atg cac gat att gga   2650
Gln Glu Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly
395                 400                 405                 410
acc cac tac ccg aac gcc acg ggc cat cct aag ggc gac gac gag aaa   2698
Thr His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys
415                 420                 425
atg cca ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc atg gcc ctt gcc tac   2746
Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr
430                 435                 440
gcc cag aag gcc aag gac aac gac tat ctt tca cag cac tat ccc atc   2794
Ala Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile
445                 450                 455
ctc aac aaa tgg aca aca tac ctc gtc gag gat tct att tac ccg gcg   2842
Leu Asn Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala
460                 465                 470
aac cag atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg cta gc  gtaagtgata    2890
Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala
475                 480                 485
tacatacacg acacaggcgg tgatactaat agtatgtaca g a aac cag acc aac   2944
Asn Gln Thr Asn
490
ctg gca ttg aag gga atc att gga atc cag gca atg gct gtg atc agc   2992
Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser
495                 500                 505
aat acg aca gga cac ccg gac gat gcc tcc aac cac tcc agc att gcc   3040
Asn Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala
510                 515                 520
aag gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta gct cac gat gcc   3088
Lys Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala
525                 530                 535
aat cct ccg cat aca acg ctg tcg tac gga gcg aac gag act cat g     3134
Asn Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His
540                 545                 550
gtcagttagc cgctccgggt gcacttataa tactgacttt ctccag  gg ctt ctg    3188
Gly Leu Leu
555
tac aat ctg tat gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg gtt cct cag   3236
Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln
560                 565                 570
tcg gtc tat gac atg caa aac acc ttc tat ccg acg gtg aag gag aag   3284
Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu Lys
575                 580                 585
tat gga gtg ccg ctc gat act cga cac gtg tac act aag g             3324
Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys
590                 595                 600
gtaagctcga tatgttcttt ctaatgtttg acattgaata ttgacttgtc cccag  cg  3381
Ala
gat tgg gag ctt ttc aca gct gcg gtt gcg tcg gag agt gtc cga gac   3429
Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp
605                 610                 615
atg ttc cac cag gcg ctc gcg acg tgg atc aac gag aca ccg acc aac   3477
Met Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn
620                 625                 630                 635
cgt gcc ttt acg gat ctc tat gat acc caa act gga aa  gtaagtgttt    3525
Arg Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn
640                 645
gccaaggggc tgcttgggcc ttgctgacca atatag t tat ccg gcg ggc att     3577
Tyr Pro Ala Gly Ile
650
acg ttc att gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta att   3625
Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile
655                 660                 665
ctc tagagtcgtt tcattgtata ttgattttat tcgcttctgg gcgcgagtgg        3678
Leu
670
agacacttgc ttactttgtt tccaatttta ttattaccgt ggctatggga ccagattgac 3738
cgttgttaat agcgtacctc atacatagca tttttattct gcaaatagtg ttgttgtatt 3798
tgggtctcca ataataatgc gttcgtagac gatgctccaa aggaactatc tggtctgcaa 3858
gctgcttata tcaagcatat ataaagatct acgtatccag tcgtgcttat ccaagtggct 3918
ctggccatct accgcagatc gtaagtggac tcgaccgagc catcccacgc atcaaaagcg 3978
cgaataagat ctacaaagtc agcaatcata ctcct                            4013
<210> 2
<211> 690
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 2
Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser
-20                 -15                 -10                  -5
Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu
1               5                  10
Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly
15                  20                  25
Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe
30                  35                  40
Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn
45                  50                  55                  60
Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn
65                  70                  75
Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg
80                  85                  90
Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr
95                 100                 105
Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val
110                 115                 120
Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala
125                 130                 135                 140
Asp Ile Ser Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln
145                 150                 155
Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr
160                 165                 170
Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp
175                 180                 185
Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln
190                 195                 200
Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys
205                 210                 215                 220
Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp
225                 230                 235
Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala
240                 245                 250
Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr
255                 260                 265
Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser
270                 275                 280
Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr
285                 290                 295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys
305                 310                 315
Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu
320                 325                 330
Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu
335                 340                 345
Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn
350                 355                 360
Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn
365                 370                 375                 380
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu
385                 390                 395
Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His
400                 405                 410
Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro
415                 420                 425
Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln
430                 435                 440
Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn
445                 450                 455                 460
Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln
465                 470                 475
Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu
480                 485                 490
Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn
495                 500                 505
Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys
510                 515                 520
Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn
525                 530                 535                 540
Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu
545                 550                 555
Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro
560                 565                 570
Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu
575                 580                 585
Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp
590                 595                 600
Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met
605                 610                 615                 620
Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg
625                 630                 635
Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly
640                 645                 650
Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu
655                 660                 665
Ile Leu
670
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 3
Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val
1               5                  10                  15
Lys
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> Xaa=Gly or Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> Xaa=Asn or Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> Xaa=Thr or Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> Xaa=Arg or Ser
<400> 4
Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Met Xaa Asp Ile
1               5                  10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> Xaa=Thr or Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> Xaa is uncertain
<400> 5
Val Gln Tyr Xaa Glu Tyr Asp Xaa Tyr
1               5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 6
Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn Lys
1               5                  10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 7
Trp Thr Ala Tyr Leu Val Glu Asp Thr Ile Tyr Pro Ala Asn Gln
1               5                  10                  15
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 8
Val Leu Leu Gln Ser Ala Ile Glu Gly His
1               5                  10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 9
Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val
1               5                  10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> misc_feature
<222> (1,6,8,9)
<223> Xaa is uncertain
<400> 10
Xaa Ile Leu Lys Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Gln
1               5                  10
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 11
taccccaaca cctatgctat gcgcgatatc                                  30
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 12
ttggttcgcc ggataaatag tatcttcgac caagta                           36
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 13
gatcatgatg catttcctct cgttctgtc                                   29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 14
gcaaagtcat ccgtagagat ctggttcg                                    28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 15
ggcgaaccag atctctacgg atgactttgc                                  30
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 16
ctgatctaga cctgcaggct c                                           21
<210> 17
<211> 2269
<212> DNA
<213> Aspergillus oryzae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2070)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(2070)
<400> 17
atg atg cat ttc ctc tcg ttc tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtg tct   48
Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser
-20                 -15                 -10                  -5
tac gcc gga gct gcg tca aca ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg   96
Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu
-1   1               5                  10
ccc ttg gct gtc aaa tcg ccg tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc   144
Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly
15                  20                  25
aca gat ggc ggt aat gga ggg tac ctg gcc ggc caa tgg cct acc ttc   192
Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe
30                  35                  40
tgg ttc ggc cag gtg acc ggc tgg gcg ggt cag atc cgg gtc gat aat   240
Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn
45                  50                  55                  60
tcg acc tac aca tgg atg ggg gcg atc cct aac acc cct acg gtg aac   288
Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn
65                  70                  75
cag aca tcc ttc gag tac acc tcg acg tcg agc gtg ttc acg atg cgt   336
Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg
80                  85                  90
gtt ggg gat atg gtg gaa atg aaa gtg aaa ttc ctg tcc cct atc aca   384
Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr
95                 100                 105
cca gat gat ctc cgg aga cag tcg ctt gtg ttt tcc tat ctg gac gta   432
Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val
110                 115                 120
gat gtc gaa tcg atc gac ggc aaa gcg cat gac ata cag gtg tac gca   480
Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala
125                 130                 135                 140
gac att tca gca gaa tgg gcg tcc ggg gac cga aac gcc att gcg cag   528
Asp Ile Ser Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln
145                 150                 155
tgg gac tat ggt gtc aca gat gat ggc gtt gcc tat cac aag gtt tac   576
Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr
160                 165                 170
cgc caa acg cag ctg ctg ttt tcc gaa aac act gag cag gcc gaa tgg   624
Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp
175                 180                 185
ggc gag tgg tac tgg gcc aca gac gac caa gat ggt ctg agc tac cag   672
Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln
190                 195                 200
tcc gga ccg gat gtt gat gtg cga ggg gca ttc gca aag aac gga aag   720
Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys
205                 210                 215                 220
ttg gcg aat tcg gat gat aaa aat tat cgt gca atc tcg acc aat tgg   768
Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp
225                 230                 235
ccc gtg ttt gcc ttc tcc cgc gat ctt ggc tcg gtg aag acg tct gct   816
Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala
240                 245                 250
ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag gac agt gcc ata cag tac   864
Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr
255                 260                 265
agt ggg aaa cct gaa ggg aca act gtg atg cct tca ctc tgg aag agc   912
Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser
270                 275                 280
tac ttc agc act gcg act gct gcg ctt gag ttc ttc cat cat gat tat   960
Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr
285                 290                 295                 300
gct gct gca gct gca cta tcg aag gat ctc gat gac cgg ata tcc aag   1008
Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys
305                 310                 315
gat tcc att gat gcc gct ggc cag gac tac ctg aca atc acc tcc ctc   1056
Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu
320                 325                 330
acg gtc cgt caa gtc ttt gct gcc gtg caa ttg acc ggc acg ccc gag   1104
Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu
335                 340                 345
gac ccc tac atc ttc atg aag gag atc tcg tcc aat ggc aac atg aac   1152
Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn
350                 355                 360
act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac ccg atc ttt ttg tac acc aat   1200
Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn
365                 370                 375                 380
ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag cca atc tat gag att caa gag   1248
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu
385                 390                 395
aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc atg cac gat att gga acc cac   1296
Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His
400                 405                 410
tac ccg aac gcc acg ggc cat cct aag ggc gac gac gag aaa atg cca   1344
Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro
415                 420                 425
ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc atg gcc ctt gcc tac gcc cag   1392
Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln
430                 435                 440
aag gcc aag gac aac gac tat ctt tca cag cac tat ccc atc ctc aac   1440
Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn
445                 450                 455                 460
aaa tgg aca aca tac ctc gtc gag gat tct att tac ccg gcg aac cag   1488
Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln
465                 470                 475
atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg cta gca aac cag acc aac ctg   1536
Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu
480                 485                 490
gca ttg aag gga atc att gga atc cag gca atg gct gtg atc agc aat   1584
Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn
495                 500                 505
acg aca gga cac ccg gac gat gcc tcc aac cac tcc agc att gcc aag   1632
Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys
510                 515                 520
gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta gct cac gat gcc aat   1680
Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn
525                 530                 535                 540
cct ccg cat aca acg ctg tcg tac gga gcg aac gag act cat ggg ctt   1728
Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu
545                 550                 555
ctg tac aat ctg tat gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg gtt cct   1776
Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro
560                 565                 570
cag tcg gtc tat gac atg caa aac acc ttc tat ccg acg gtg aag gag   1824
Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu
575                 580                 585
aag tat gga gtg ccg ctc gat act cga cac gtg tac act aag gcg gat   1872
Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp
590                 595                 600
tgg gag ctt ttc aca gct gcg gtt gcg tcg gag agt gtc cga gac atg   1920
Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met
605                 610                 615                 620
ttc cac cag gcg ctc gcg acg tgg atc aac gag aca ccg acc aac cgt   1968
Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg
625                 630                 635
gcc ttt acg gat ctc tat gat acc caa act gga aat tat ccg gcg ggc   2016
Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly
640                 645                 650
att acg ttc att gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta   2064
Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu
655                 660                 665
att ctc tagagtcgtt tcattgtata ttgattttat tcgcttctgg gcgcgagtgg    2120
Ile Leu
670
agacacttgc ttactttgtt tccaatttta ttattaccgt ggctatggga ccagattgac 2180
cgttgttaat agcgtacctc atacatagca tttttattct gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                                   2269
<210> 18
<211> 690
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae
<400> 18
Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser
-20                 -15                 -10                  -5
Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu
-1   1               5                  10
Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly
15                  20                  25
Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe
30                  35                  40
Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn
45                  50                  55                  60
Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn
65                  70                  75
Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg
80                  85                  90
Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr
95                 100                 105
Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val
110                 115                 120
Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala
125                 130                 135                 140
Asp Ile Ser Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln
145                 150                 155
Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr
160                 165                 170
Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp
175                 180                 185
Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln
190                 195                 200
Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys
205                 210                 215                 220
Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp
225                 230                 235
Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala
240                 245                 250
Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr
255                 260                 265
Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser
270                 275                 280
Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr
285                 290                 295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys
305                 310                 315
Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu
320                 325                 330
Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu
335                 340                 345
Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn
350                 355                 360
Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn
365                 370                 375                 380
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu
385                 390                 395
Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His
400                 405                 410
Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro
415                 420                 425
Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln
430                 435                 440
Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn
445                 450                 455                 460
Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln
465                 470                 475
Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu
480                 485                 490
Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn
495                 500                 505
Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys
510                 515                 520
Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn
525                 530                 535                 540
Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu
545                 550                 555
Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro
560                 565                 570
Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu
575                 580                 585
Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp
590                 595                 600
Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met
605                 610                 615                 620
Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg
625                 630                 635
Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly
640                 645                 650
Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu
655                 660                 665
Ile Leu
670
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 19
gacgaccaag atggtctgag ctaccagt                                    27
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 20
gcaaagtcat ccgtagagat ctggttcgcc                                  30
<210> 21
<211> 6191
<212> DNA
<213> Aspergillus nidulans
<220>
<221> CDS
<222> join(1807..2000, 2061..2353, 2412..2854, 2915..3498, 3554..3756, 3806..3949, 3996..4131, 4180..4246)
<220>
<221> intron
<222> (2001)..(2060)
<220>
<221> intron
<222> (2354)..(2411)
<220>
<221> intron
<222> (2855)..(2914)
<220>
<221> intron
<222> (3499)..(3553)
<220>
<221> intron
<222> (3757)..(3805)
<220>
<221> intron
<222> (3950)..(3995)
<220>
<221> intron
<222> (4132)..(4179)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1807)..(1863)
<220>
<221> mat_peptide
<222> join(1864..2000, 2061..2353, 2412..2854, 2915..3498, 3554..3756, 3806..3949, 3996..4131, 4180..4246)
<400> 21
gatatccaat gtctagggcg tacggcattc tgaaatgatc cgtgtactgc acgaatactc  60
catactacgt accacaagat tgaacaccct attatcaaac ttcgagagtc tgctgggcgt  120
ataactgctg ggtggcgaac cgcgaaatta ttatacctta ggaggctccg gtctcaacgt  180
gtaagcacta acgaaccctg gtccgctatg ctgtgcaagt atcagcacct cagcttgcag  240
cgttcgccta cttaatccgt aacccgagga ccggaccggc aagactcgat tgtcccatgt  300
gctctgtacc tgcgtggatg gcactcccag catctgctgt gccaaacgaa gcggatcgct  360
ccaagcctgt tcgtccgaca acattcgcct tcacggcgag gccgaaacgg atctctgtgt  420
gtccatagcc atttcagcct tctgtttatg cgttatatgt gctgaggata tacgccgagc  480
cgcagggggg caagtagtgg gttaatgacg ggacctccgc atttctcttt gaatctggct  540
gttagcgtgt cacttggctc gggttgggct gggtcatgca cggatctgca tcaagtcagt  600
ctcttgtgat gtacgctgat ccggtgatgt acatatgagg ggtagaagat actcggggca  660
gacactgact ttgtatggtg ggaacgatgt cacacaatgc aggcacagac atccagccaa  720
cacctttgta cagagtatgc aaacaatgag ttggccagtc ggttgccagg attctcgttg  780
cagcgcagga cagccaagag aagaaccaga gagatgaggg caatatctaa tccagtctct  840
tgcatggtcc tctcccgcgt cattccgtac tggaatgtga ggggccgtat gtggaaatat  900
tgcttgggat gacaaagggc gtgaagagtg aagggtttct tcaagtgctg gacggaagag  960
tagggaggac tttgagcatg gcactttcct cttagggtac tctccagtcc cacgttttcg  1020
cctcgctcct cgctctccaa ctcctctatt ttcccacaaa acacttctct ccttcgtatg  1080
ctcctgctct gaatcagctt ggaaccctct cataaccctc cggggggggg gcccgcgttc  1140
gttgataacc catgctacca tggcaaatga ccttactgac ggcgtaacag atctacttcg  1200
cttggtcgaa cttcatgctt atttctaagc ttggttacta taggctcccg cgccgttttg  1260
ggttgatcct ccctggtcag tcgtatttca aaccgttctg cagagtagcg gtggagcata  1320
caagaaatac tcatgattga ttcttatagg agcggatctc ctctgtggag tatacaccca  1380
atttcaaacc cctgttccct tcgctcgatt ggctattttc tttcgttttc catgtgtata  1440
gtggcgacgg catgcgctgg tgcagataga atgatcggtc agacgacatt attcgagaaa  1500
gttatgccta tgcatgtgca gatgcttctg cctcgattcg aaagagtcta gacagggctt  1560
tccacatgct ggcaccaaga gtccactcct agaattctat aaagaaacct tcatccgcct  1620
ggaatgcaag atatatccac tgtacagccg tgcctagcat tccgctgccc attcccaagg  1680
cccacattgc tgctcgatta tttgtcactc cttgaaattg cttcataatt ctcctgttgt  1740
tgagtctttt aaacggggcc tattagaagg gggttgcacg gctgaggatc acctacccag  1800
atcaat atg cgt act ttt cta cta ggc atc ctg tgc gca ccc ctg gct     1848
Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala
-19             -15                 -10
atc ctt aca gga gcc gca tcg act ttt tct cca gca cgc cct ccg gct    1896
Ile Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala
-5                   1               5                  10
ctt cct cta gcg gtc aaa tct ccg tac ttg agt act tgg ctg ccg gcg    1944
Leu Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala
15                  20                  25
ggg aaa gac ggc ggc aat gga ggc tac ctt gca ggg gaa tgg cca gcg    1992
Gly Lys Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala
30                  35                  40
ttc tgg ga  gtgagtgcta tgaacctggc ataacaatta cagagagctg            2040
Phe Trp Glu
45
aaaaagaatc attgttatag a ggc caa ata aca gga tgg gct ggc ctt att    2091
Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile
50                  55
cgt gtg gat ggc cag gtc tat aca tgg atg ggc ctt cca ggc tca gcc    2139
Arg Val Asp Gly Gln Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala
60                  65                  70
act gtg aac cag act gcg tat gag tac act tca acg aag agc att ttc    2187
Thr Val Asn Gln Thr Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe
75                  80                  85
acc atg cat att ggt gat atg gta gag atg aag ata acc ttc ctt tca    2235
Thr Met His Ile Gly Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser
90                  95                 100
cca att aca ccg aat gat ctt cga cgg cag tcc cta gtg ttt tcg tat    2283
Pro Ile Thr Pro Asn Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr
105                 110                 115                 120
ctt gac gtg agt gtc acc tca ctc gac ggc cag tcc cac agt gta cag    2331
Leu Asp Val Ser Val Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln
125                 130                 135
gtg tac gct gac ata tca gct g gtgagtttac ctggacatac ttcagccaag     2383
Val Tyr Ala Asp Ile Ser Ala
140
tgaaaaacca ttattgattg ttccctag  aa ttt gcg tct ggc gac cgt tcc     2434
Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser
145                 150
gcc ata gca caa tgg aac tat ggt gtt acc agt gac ggc gta gcc tat    2482
Ala Ile Ala Gln Trp Asn Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr
155                 160                 165
cat aag atc tat cgc cag acg ccg ctc cta ttc tct gag cat aga gac    2530
His Lys Ile Tyr Arg Gln Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp
170                 175                 180
caa gct gaa tgg ggt gat tgg tac tgg gca act gac aat gta gca gga    2578
Gln Ala Glu Trp Gly Asp Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly
185                 190                 195
ctc act tac cag gct ggt cca gat gtt gat gtc cgg gaa gct ttt gcg    2626
Leu Thr Tyr Gln Ala Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala
200                 205                 210                 215
cgc aat gga aag cta acc aat aac aac gac gtc aac tac aga gct atc    2674
Arg Asn Gly Lys Leu Thr Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile
220                 225                 230
tcc aac aac tgg ccg gtg ttt ggt ttt gcc cat gac ctt ggg tct atc    2722
Ser Asn Asn Trp Pro Val Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile
235                 240                 245
agc tct tct act aag gtg ctt ttc tca ata ggg cta acc cag cga gag    2770
Ser Ser Ser Thr Lys Val Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu
250                 255                 260
gca atc cag tat agc ggg aac tct tcc acc ctt tct cct ttg cct gct    2818
Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala
265                 270                 275
ctg tgg acg agc tat ttc agc act gcc ttg gat gcc gtgagtgctc         2864
Leu Trp Thr Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Leu Asp Ala
280                 285                 290
cccgtgtaga agctagacac cctgggactt actcaaaaac cctattttag ctt gac     2920
Leu Asp
ttc ttc cac cat gat tat cag aag tca aac tct ctt tct tca gat ctt    2968
Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu
295                 300                 305
gat cgg cga att gca caa gat tcc gtt gcc gct gcc ggt cac gac tac    3016
Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr
310                 315                 320                 325
ctt acc att aca tcc ctc agc att cgt caa gct ttc gct gca acc cag    3064
Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln
330                 335                 340
ctg tgt ggg cca gca aat gat ccg tat ctc ttt atg aaa gaa atc tcc    3112
Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser
345                 350                 355
tcc aac ggc aac atg aac acg gta gat gtg atc ttc cct gct cat ccc    3160
Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro
360                 365                 370
gtc ttc tta tac aca aac cca gca ctg ctt aaa tat ctc ctg cgc cca    3208
Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro
375                 380                 385
cat ttg gag atc cag gag tct gga aat tac ccc aac tcc tat gct atg    3256
His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met
390                 395                 400                 405
cat gat atc ggt gct cat tac cct aac gct aca ggc cat ccg gat ggc    3304
His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly
410                 415                 420
aat gac gag cca atg ccg ttg gag gag tgc ggt aat atg gtg atc atg    3352
Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met
425                 430                 435
gct cta gca tat gcg cag aag gcc ggg gac aca gcg tac ctg gaa agc    3400
Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser
440                 445                 450
cac tac aca ata ctg aga cgt tgg acg gac tac ttg atc gaa gat tct    3448
His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser
455                 460                 465
ctt tat ccg gcg aac caa ata tcg aca gat gat ttc gca ggt cca ttg gc 3498
Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala
470                 475                 480                 485
gtacgtccct actggcgtat aggtgcttct caaaccaaac taatggcgtc tctag a     3554
aat caa acc aac ctc gcc ctg aag gga atc atc ggt atc gag gcc atg    3602
Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met
490                 495                 500
tct gtc atc gct agc ctg aca gga gac tct gat gat aag atg aat ctc    3650
Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu
505                 510                 515
acc aat tac gcc cac gat tac atc gaa aaa tgg ctg att ttg gga att    3698
Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile
520                 525                 530
gca cgt aac aca acg tat ccg cat aca aca ttg tcg tac gga tca aac    3746
Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn
535                 540                 545                 550
gag tct cat g gtttgtgtac tcctcactgt gatgcttggc caatactgat          3796
Glu Ser His
tgttccaag  ga ctc ctg tac aac ctt tac gca gat cgc gag cta ggc      3843
Gly Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly
555                 560                 565
ttg aac ctg gtc ccg caa tct gtg tat gac atg cag agc aac ttc tac    3891
Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr
570                 575                 580
ccg aca atc aag ggt caa tac gga gtg cca ctg gat acc cgc cat caa    3939
Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln
585                 590                 595
tac acg aaa g gtatgtggcc atctactcgt cgcggctgta taattgacgg          3989
Tyr Thr Lys
600
tctcag  gt gat tgg gag ctc ttc acg gcg gca gtc gca tca gta agc     4036
Gly Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser
605                 610                 615
aca cga gac atg ttc atc aaa cta ctt gcc cag tgg ata aac gag acg    4084
Thr Arg Asp Met Phe Ile Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr
620                 625                 630
cca acg aac cgt cca ctt acg gat ctc tat gac act gta acc gga ga     4131
Pro Thr Asn Arg Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp
635                 640                 645
gtaagtgtac ctacctaaac ctaggagacg ctttgctgat tcactcag c tac cca     4186
Tyr Pro
ccg gta gtt ttc atc gct cga cct gtc atg ggc gcg gca ttc act ttg    4234
Pro Val Val Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu
650                 655                 660                 665
ttg ctt ctc gac tgaaattctt tccaggtaca tacatgcttt atcaggacaa        4286
Leu Leu Leu Asp
aagagcggct aggcggtcca ttcccagtat ttgtgttaga tgtgatatat atggtcgtgt  4346
ttaagttgtg taatattgtg tggtagtata tagcatcagt tatagccttt ttcaatccct  4406
ctgggtagct gaaagtgatg tactatgaat gcagatctgt agagcttgca ttgatactag  4466
tcaacatatt catagtgtta cataggcaag acgacgagaa ccaatgcagt cttttgcttc  4526
tgcatttctt ccgttaaacc gaatttatac cgtcatcaga ttatcgcgtc agttgtctag  4586
tactaacctt gtacctcaaa ggtctgaggt ttgttgttcc gcagcgtccc atgcatcaaa  4646
ggcccggatc agatctgtga tacttagcta cccagctcgt gcaacgatga agaagaccta  4706
ccataataca gcatcatcgc ctcgaggtga gcatcaatgc caactctttc atccacagtg  4766
tggatattca acgcacggcc ctcgcgcgcg ggactccagc ggtaaatgtt tggcgatagg  4826
ttccagtaaa gcctggtatc cgtgttgccg gtggtgatgt ccccaccaac aacgacagtt  4886
ttgcctttca gacttggaac agactcgaag accgagcggg cgacaccggc aaaccgtgcc  4946
caaacgggac ttgtatcgat atcagtaggg ctaacggggg ctggctcgag aggagaattt  5006
agggtcgaga gcgtgagatg accactgctt gccacttcac tgctgatctc gtccttgttg  5066
gtatccaaga atctggacca ggtcaaattg aacttctcta caatgggctc tatgatcttc  5126
tccgctcggt cttggagcat cttcggggtt tggtgcaatg cgatgcgata attcacgaca  5186
gcggtgatct tttccggaag cgcgttgctc tttatgcctc cattgaatat atccgctgcc  5246
tgggacgact ggagagtgaa tcgaacgctt tctccacgag acctagcaat tgcttcggcc  5306
gttgctgcct gatcatccga gtcaagcgca gaagcaagcc agtcctccac atattcagga  5366
gaatggcgga cctggcactc aaacactcgg cgagaagggt gattagaccc taaaatgggc  5426
gtgaaaatgt caagctcagt attctctagc ttgtaaataa tttccgacat tatgccgacc  5486
ccggtatgtc tgggcggaac ggaactatgg ccaccaggga cagcgagggt aaggacgatc  5546
gtgacggcgc ctttctcgcc aacatccggg agcgcgtaaa tcacactctc gtcctcaaat  5606
tcctctccag cggaagataa cgatgagcga agggtggtga taccgccacc tccttcgtca  5666
aggatgaatt ctactccatc tttcccatat ctttcctcca gaaccggagc gattcgcgca  5726
gcaccaatat acccttgtgc ctcctcgtcg aatccaaacg ccaggacaat cggtcgagat  5786
ggcgtccagt tctgagatag gagatcctcg gctacagaga gaagaccgat aaggccgttt  5846
ttgcagtcgc tgcttcctcg tccccagaga aactcgccat caaaataccc tgagaaggga  5906
ggatgcgtcc agtctgaggc atcgttaata gggaccacat cttgatgagc cgtaaagaga  5966
aggggctttc tcttttctac agtttccgag ggaggttcaa gtgttattat aagattgaag  6026
cggttgacgt gctcgatctt ggctttggag tagctgtctc aggttagttt tgggaagaga  6086
gatcctgagc tgggaaggat acgcgggtga cgcgagggtc attgaagtaa ggaggaaaag  6146
ggtaggtgag ctcacacaag aggaaagagc ccagcaagaa gctta                  6191
<210> 22
<211> 688
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 22
Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu
-19             -15                 -10                  -5
Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro
1               5                  10
Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys
15                  20                  25
Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp
30                  35                  40                  45
Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln
50                  55                  60
Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr
65                  70                  75
Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe Thr Met His Ile Gly
80                  85                  90
Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn
95                 100                 105
Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val
110                 115                 120                 125
Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile
130                 135                 140
Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn
145                 150                 155
Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln
160                 165                 170
Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp
175                 180                 185
Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly
190                 195                 200                 205
Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr
210                 215                 220
Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val
225                 230                 235
Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val
240                 245                 250
Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly
255                 260                 265
Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe
270                 275                 280                 285
Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys
290                 295                 300
Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser
305                 310                 315
Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile
320                 325                 330
Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro
335                 340                 345
Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val
350                 355                 360                 365
Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala
370                 375                 380
Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly
385                 390                 395
Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro
400                 405                 410
Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu
415                 420                 425
Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala
430                 435                 440                 445
Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp
450                 455                 460
Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser
465                 470                 475
Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu
480                 485                 490
Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr
495                 500                 505
Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr
510                 515                 520                 525
Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro
530                 535                 540
His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr
545                 550                 555
Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser
560                 565                 570
Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr
575                 580                 585
Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu
590                 595                 600                 605
Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile
610                 615                 620
Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu
625                 630                 635
Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe
640                 645                 650
Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp
655                 660                 665
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 23
gcttcataat tctcctgttg ttgagtc                                     27
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 24
ggctataact gatgctatat actaccacac                                  30
<210> 25
<211> 2298
<212> DNA
<213> Aspergillus nidulans
<220>
<221> CDS
<222> (88)..(2151)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (145)..(2151)
<400> 25
gcttcataat tctcctgttg ttgagtcttt taaacggggc ctattagaag ggggttgcac 60
ggctgaggat cacctaccca gatcaat atg cgt act ttt cta cta ggc atc ctg 114
Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu
-15
tgc gca ccc ctg gct atc ctt aca gga gcc gca tcg act ttt tct cca   162
Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro
-10                  -5              -1   1               5
gca cgc cct ccg gct ctt cct cta gcg gtc aaa tct ccg tac ttg agt   210
Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser
10                  15                  20
act tgg ctg ccg gcg ggg aaa gac ggc ggc aat gga ggc tac ctt gca   258
Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala
25                  30                  35
ggg gaa tgg cca gcg ttc tgg gaa ggc caa ata aca gga tgg gct ggc   306
Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly
40                  45                  50
ctt att cgt gtg gat ggc cag gtc tat aca tgg atg ggc ctt cca ggc   354
Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly
55                  60                  65                  70
tca gcc act gtg aac cag act gcg tat gag tac act tca acg aag agc   402
Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser
75                  80                  85
att ttc acc atg cat att ggt gat atg gta gag atg aag ata acc ttc   450
Ile Phe Thr Met His Ile Gly Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe
90                  95                 100
ctt tca cca att aca ccg aat gat ctt cga cgg cag tcc cta gtg ttt   498
Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe
105                 110                 115
tcg tat ctt gac gtg agt gtc acc tca ctc gac ggc cag tcc cac agt   546
Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser
120                 125                 130
gta cag gtg tac gct gac ata tca gct gaa ttt gcg tct ggc gac cgt   594
Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg
135                 140                 145                 150
tcc gcc ata gca caa tgg aac tat ggt gtt acc agt gac ggc gta gcc   642
Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala
155                 160                 165
tat cat aag atc tat cgc cag acg ccg ctc cta ttc tct gag cat aga   690
Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg
170                 175                 180
gac caa gct gaa tgg ggt gat tgg tac tgg gca act gac aat gta gca   738
Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala
185                 190                 195
gga ctc act tac cag gct ggt cca gat gtt gat gtc cgg gaa gct ttt   786
Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe
200                 205                 210
gcg cgc aat gga aag cta acc aat aac aac gac gtc aac tac aga gct   834
Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala
215                 220                 225                 230
atc tcc aac aac tgg ccg gtg ttt ggt ttt gcc cat gac ctt ggg tct   882
Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser
235                 240                 245
atc agc tct tct act aag gtg ctt ttc tca ata ggg cta acc cag cga   930
Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg
250                 255                 260
gag gca atc cag tat agc ggg aac tct tcc acc ctt tct cct ttg cct   978
Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro
265                 270                 275
gct ctg tgg acg agc tat ttc agc act gcc ttg gat gcc ctt gac ttc   1026
Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp Phe
280                 285                 290
ttc cac cat gat tat cag aag tca aac tct ctt tct tca gat ctt gat   1074
Phe His His Asp Tyr Gln Lys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp
295                 300                 305                 310
cgg cga att gca caa gat tcc gtt gcc gct gcc ggt cac gac tac ctt   1122
Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu
315                 320                 325
acc att aca tcc ctc agc att cgt caa gct ttc gct gca acc cag ctg   1170
Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu
330                 335                 340
tgt ggg cca gca aat gat ccg tat ctc ttt atg aaa gaa atc tcc tcc   1218
Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser
345                 350                 355
aac ggc aac atg aac acg gta gat gtg atc ttc cct gct cat ccc gtc   1266
Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val
360                 365                 370
ttc tta tac aca aac cca gca ctg ctt aaa tat ctc ctg cgc cca cat   1314
Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His
375                 380                 385                 390
ttg gag atc cag gag tct gga aat tac ccc aac tcc tat gct atg cat   1362
Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His
395                 400                 405
gat atc ggt gct cat tac cct aac gct aca ggc cat ccg gat ggc aat   1410
Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn
410                 415                 420
gac gag cca atg ccg ttg gag gag tgc ggt aat atg gtg atc atg gct   1458
Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala
425                 430                 435
cta gca tat gcg cag aag gcc ggg gac aca gcg tac ctg gaa agc cac   1506
Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His
440                 445                 450
tac aca ata ctg aga cgt tgg acg gac tac ttg atc gaa gat tct ctt   1554
Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu
455                 460                 465                 470
tat ccg gcg aac caa ata tcg aca gat gat ttc gca ggt cca ttg gca   1602
Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala
475                 480                 485
aat caa acc aac ctc gcc ctg aag gga atc atc ggt atc gag gcc atg   1650
Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met
490                 495                 500
tct gtc atc gct agc ctg aca gga gac tct gat gat aag atg aat ctc   1698
Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu
505                 510                 515
acc aat tac gcc cac gat tac atc gaa aaa tgg ctg att ttg gga att   1746
Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile
520                 525                 530
gca cgt aac aca acg tat ccg cat aca aca ttg tcg tac gga tca aac   1794
Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn
535                 540                 545                 550
gag tct cat gga ctc ctg tac aac ctt tac gca gat cgc gag cta ggc   1842
Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly
555                 560                 565
ttg aac ctg gtc ccg caa tct gtg tat gac atg cag agc aac ttc tac   1890
Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr
570                 575                 580
ccg aca atc aag ggt caa tac gga gtg cca ctg gat acc cgc cat caa   1938
Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln
585                 590                 595
tac acg aaa ggt gat tgg gag ctc ttc acg gcg gca gtc gca tca gta   1986
Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val
600                 605                 610
agc aca cga gac atg ttc atc aaa cta ctt gcc cag tgg ata aac gag   2034
Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu
615                 620                 625                 630
acg cca acg aac cgt cca ctt acg gat ctc tat gac act gta acc gga   2082
Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly
635                 640                 645
gac tac cca ccg gta gtt ttc atc gct cga cct gtc atg ggc gcg gca   2130
Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala
650                 655                 660
ttc act ttg ttg ctt ctc gac tgaaattctt tccaggtaca tacatgcttt      2181
Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp
665
atcaggacaa aagagcggct aggcggtcca ttcccagtat ttgtgttaga tgtgatatat 2241
atggtcgtgt ttaagttgtg taatattgtg tggtagtata tagcatcagt tatagcc    2298
<210> 26
<211> 688
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 26
Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu
-15                 -10                  -5
Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro
-1   1               5                  10
Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys
15                  20                  25
Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp
30                  35                  40                  45
Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln
50                  55                  60
Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr
65                  70                  75
Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe Thr Met His Ile Gly
80                  85                  90
Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn
95                 100                 105
Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val
110                 115                 120                 125
Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile
130                 135                 140
Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn
145                 150                 155
Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln
160                 165                 170
Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp
175                 180                 185
Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly
190                 195                 200                 205
Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr
210                 215                 220
Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val
225                 230                 235
Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val
240                 245                 250
Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly
255                 260                 265
Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe
270                 275                 280                 285
Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys
290                 295                 300
Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser
305                 310                 315
Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile
320                 325                 330
Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro
335                 340                 345
Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val
350                 355                 360                 365
Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala
370                 375                 380
Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly
385                 390                 395
Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro
400                 405                 410
Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu
415                 420                 425
Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala
430                 435                 440                 445
Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp
450                 455                 460
Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser
465                 470                 475
Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu
480                 485                 490
Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr
495                 500                 505
Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr
510                 515                 520                 525
Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro
530                 535                 540
His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr
545                 550                 555
Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser
560                 565                 570
Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr
575                 580                 585
Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu
590                 595                 600                 605
Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile
610                 615                 620
Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu
625                 630                 635
Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe
640                 645                 650
Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp
655                 660                 665