(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号４に示されたアミノ酸配列
又は
（ｂ）  配列番号４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する（ａ）からなる配列の変異体を含有することを特徴とするホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ−活性を有するタンパク質。
【請求項２】
ヒトから得られる、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のホスファチジルイノシトール−３−キナーゼをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項４】
組換えＤＮＡ分子である、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
（ａ）  配列番号３に示されたタンパク質をコードする配列、
（ｂ）  遺伝子コードの縮重の範囲内で（ａ）からなる配列に該当する核酸配列又は
（ｃ）  水性低塩緩衝剤中で５５℃で洗浄することによる緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）及び／又は（ｂ）からなる配列とハイブリッドする配列を含有する、請求項３記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも２０個のヌクレオチドの長さの、配列番号３で示された配列の断片を含有し、その際この断片はＰＩ３Ｋγに対して特異的な核酸配列を含有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸。
【請求項７】
請求項３から６までのいずれか１項記載の核酸の少なくとも１種のコピーを含有することを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項３から６までのいずれか１項記載の核酸又は請求項７記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする細胞。
【請求項９】
抗体の製造のための免疫原としての請求項１又は２記載のタンパク質又はこのタンパク質の断片の使用。
【請求項１０】
ＰＩ３Ｋγ特異性であることを特徴とする請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸７４２−７４６に示されたアミノ酸配列に相当するペプチド配列と結合する、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
該当する細胞中での請求項１又は２記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現強度を測定することによる、細胞中のホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ−活性を試験管内で測定する方法。
【請求項１３】
転写物水準及び／又はタンパク質水準に関する発現強度を測定する、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は新規のホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋγ）、これをコードする核酸、タンパク質と結合する抗体並びにこれらのタンパク質、核酸及び抗体の診断的及び治療的用途に関する。
ホスファチジルイノシトール−キナーゼは、特異的なホスホリパーゼの他に、膜脂質のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）からの細胞内伝達物質の生成を触媒する酵素グループに属する。この酵素の活性は、細胞外のエフェクター、例えばホルモン、成長因子及び神経伝達物質により調節される。ＰＩ依存性の伝達物質が重要な細胞機能、例えば細胞増殖、細胞内容物の分泌、飲食作用の経過、一定の細胞の指向性の運動、細胞骨格の制御された変化等のプロセスの調節に関与していることが推測される。ＰＩ−キナーゼ及びホスホリパーゼの生理学的意義に応じて、一連の疾患はこの酵素の機能の変化と関連している。
多様な実験結果から、ＰＩ３−キナーゼによる触媒反応の生成物のＰＩ，−３，４，５−トリホスフェートは、次に挙げる生理的細胞機能の調節の際に重要な役割があると推測される：
−  ＰＩ３−キナーゼによる細胞増殖及び細胞分化の調節
マイトジェン、例えば成長因子及びサイトカインは、一般に分裂可能な細胞におけるＰＩ３−キナーゼ活性の刺激を引き起こす。細胞の腫瘍形成トランスフォーメーションも測定可能なＰＩ３−キナーゼ活性の数倍の上昇を伴う（Varticovski et al., Biochim. Biophys. Acta 1226, 1-11（1994）, Berggren et al., Cancer Research 53, 4297 - 4302（1993）, Soldi et al., Oncogene 9, 2253 - 2260（1994））。ＰＩ３−キナーゼの阻害剤は、ＰＤＧＦにより刺激しされた正常な結合組織細胞又は平滑筋細胞及びｓｒｃ−スープラトランスフォーメーションした（src-supratransformierten）繊維芽細胞（腫瘍細胞）の増殖を阻止することができる（Berggren et al., Cancer Research 53, 4297 - 4302（1993）, Vlahos et al., J. Biol. Chem. 269, 5241 - 5248（1994））。ベルグレン他（Berggren et al.）は、エーテル−脂質類似体の腫瘍抑制効果は、主にＰＩ３−キナーゼに関する抑制作用に起因すると推定した。
神経細胞系統ＰＣ１２の分化は、ＰＩ３−キナーゼの阻害物質のウォルトマンニン（Wortmannin）により抑制される（Kimurea et al., J. Biol. Chem. 269, 18961 - 18967（1994））。この所見は、アルツハイマー患者の脳におけるＰＩ３−キナーゼ−活性の選択的損失が検出された臨床的試験でも同様に、神経組織の発達及び維持における酵素の本質的な機能を示唆している。
−  細胞骨格に依存するプロセスのＰＩ３−キナーゼによる調節
顕微鏡により見ることができる細胞の変化は、細胞骨格の関与のもとで頻繁に進行する。一連の結果は、このような現象が少なくとも部分的にＰＩ３−キナーゼ及びその酵素による産生物（ＰＩ３，４，５，Ｐ3、ＰＩ３，４Ｐ2及びＰＩ３Ｐ）により部分的に調節されることが示される。インシュリン又はＰＤＧＦにより誘導される表皮細胞の「膜の波打ち（membrane ruffling）」は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のウォルトマンニンにより抑制することができる
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好塩基性白血球は、ヒスタミン（炎症及びアレルギー症状の媒介物）を放出することができる。この分泌プロセスは細胞骨格の関与のもとに進行する。ヤノ他（Yano et al., J. Biol. Chem. 268, 25846 - 25856（1993））は、抗体により誘導されたヒスタミン分泌が、再度ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のウォルトマンニンにより抑制することができる、つまり３−ホスホリル化されたホスホイノシチドにより明らかに調節されることを証明することができた。
−  ＰＩ３−キナーゼの細胞内輸送プロセスへの関与
酵母突然変異体の研究は、この有機体中のＰＩ３−キナーゼ（Ｖｐｓ３４）の形態が、酵母小胞（Hefevacuole）の方向へのタンパク質の選択的分配に関与していることを示している（Schu et al., Science 260, 88 - 91（1993））。同様のメカニズムは、場合により、細胞内部から形質膜までのグルコース輸送タンパク質（ＧＬＵＴ  ４）のインシュリンにより刺激されたトランスロケーションを基礎としている（Kanai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 762 - 768（1993））。多様な器官中で重要なこの現象も、ウォルトマンニンにより阻害され、明らかにＰＩ３−キナーゼの関与のもとに進行している。
−  好中性顆粒球中のＯ2-産生の阻害
貧食された外来細胞を死滅させるために、顆粒球はスーパーオキシドアニオン（Ｏ2-）を産生する。この現象は化学誘引物質ｆＭＬＰにより刺激される。ｆＭＬＰにより誘導されたＯ2-産生のウォルトマンニンによる遮断は、身体の免疫応答に対して重要な現象に関するＰＩ３−キナーゼ種の調節機能を示唆している。
記載された結果は、重要な細胞機能の調節の際のＰＩ３−キナーゼ及び３−ホスホリル化されたイノシトール脂質の中心的意味を示唆している。疑いもなく、重大な疾患形成は、前記の細胞機能の後天的又は遺伝的欠陥がもとになっている。例として次のものが挙げられる：ガン、動脈硬化症、免疫異常症、皮膚疾患（例えば乾癬）、神経系の変質性疾患。
ＰＩ３−キナーゼが前記の細胞機能の調節の際に不可欠な要素であるため、若干の疾患形成は比較的高い確率でＰＩ３−キナーゼ種の機能不全に起因することができる。アルツハイマー疾患患者の脳中のＰＩ３−キナーゼについての臨床的研究、アレルギー誘導物質のヒスタミンの産生の際のＰＩ３−キナーゼの役割の発見、及びＰＩ３−キナーゼを阻害するエーテル脂質の制ガン作用（kanzerostatische Wirkung）がこの方向性を示唆している。
細胞生物学の中心的関係、細胞内の信号伝達のメカニズム及び関与する伝達物質を解明しなければならない。この研究は、細胞機能に医学的意味で選択的に影響を及ぼすことが最終的目標である。
本願明細書は、新規の種類のＰＩ３−キナーゼの同定、クローニング、発現及び特性決定を記載する。この新規の種類は、Ｇ−プロテイン−サブユニットにより活性化され、それにより今まで哺乳類の細胞からクローニングされた種のＰＩ３Ｋα（Hiles et al., Cell 70（1992）419 - 429）及びＰＩ３Ｋβ（Hu et al., J. Mol. Chell. Biol. 13,（1993）, 7677 - 7688）並びに酵母からのＰＩ３Ｋ−Ｖｐｓ３４（Schu et al., supra und Herman et al., Cell 64（1991）, 425 - 438）とは調節メカニズムの点で異なっている。一方で公知の酵素のＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβ並びに他方で本願発明による酵素のＰＩ３Ｋγの間の機能的な差異は、酵素の調節に関して重要なドメインにおける配列の差異に見出される。
本発明の対象は、従ってホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ活性を有するタンパク質であり、これは、
ａ）  配列番号２に示されたアミノ酸配列、
ｂ）  配列番号４に示されたアミノ酸配列、又は
ｃ）  （ａ）からの配列の変異体（Variant）を含有することを特徴とする。
有利に、本発明によるＰＩ３Ｋγはヒトから得られたタンパク質、つまり配列番号１及び配列番号２で示されるタンパク質、配列番号３及び配列番号４で示されるタンパク質又はこれらの天然由来のヒト変異体である。
本発明の対象は、配列番号１及び２もしくは配列番号３及び４に示されたアミノ酸配列の部分を有する新規のタンパク質でもある。有利に、本発明は、配列番号１及び２に示されたアミノ酸配列又は配列番号３及び４に示されたアミノ酸配列を含有するＰＩ３Ｋ（これはこの配列の変異体をも含有していてもよい）に関する。「変異体」の概念は、本発明の範囲内で、１個のアミノ酸又は短いアミノ酸断片の置き換え、削除及び／又は挿入により配列番号１及び２もしくは配列番号３及び４に示されたアミノ酸配列とは異なる配列と解釈される。
この「変異体」の概念には、ＰＩ３Ｋγの天然由来の対立遺伝子の変異並びに組換えＤＮＡ技術により得られ、その生物学的及び／又は免疫学的活性に関して、配列番号１及び２に示されたタンパク質もしくは配列番号３及び４に示されたタンパク質と本質的に一致するタンパク質が該当する。
本発明によるタンパク質は、有利に、アミノ酸水準
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に関して、配列番号１及び２に示されたアミノ酸配列又は配列番号３及び４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、特に有利に９０％、最も有利に９５％の相同を示すことにより優れている。
配列番号１及び２に示されたアミノ酸配列は、全ＰＩ３Ｋγである。このタンパク質は１０４９個のアミノ酸から構成され、約１２０ｋＤａの分子量を有する。配列番号３及び４に示されたアミノ酸配列は１０５０個のアミノ酸を有するＰＩ３Ｋγである。
ＰＩ３Ｋγのアミノ酸配列は、他の公知のＰＩ３Ｋの配列に対して１９〜３９％の相同、例えばヒトＰＩ３Ｋα（３６％の相同）、ヒトＰＩ３Ｋβ（３３．５％の相同）及び酵母からのＰＩ３Ｋ−Ｖｐｓ３４（２７．７％）を示す。このグループの酵素における最も高い保存領域は、４００Ｃ末端のアミノ酸残基であり、この残基は恐らくキナーゼドメインを含んでいる。このアミノ−末端領域において、ＰＩ３Ｋγと他の酵素との間の明らかな相同はなく、このことから、この領域が調節サブユニット及び適応サブユニットのｐ８５α及びｐ８５βに関するＰＩ３Ｋαとβ−酵素サブユニットとの結合に対して関与していることがわかる（Dhand et al., EMBO J. 13（1994）, 511 - 521）。
ＰＩ３Ｋγは細胞中で、アンチペプチド−抗血清の使用下で、１１０ｋＤａのタンパク質としてＵ９３７及びＫ５６２細胞の免疫沈降及びウエスタンブロット分析により検出される。ノーザンブロット分析は、異なる組織種における５．３ｋｂの長いｍＲＮＡを示した。
本発明のもう一つの対象は、本発明によるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ又はその一部をコードする核酸である。この核酸は、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。組換えＤＮＡ分子が有利である。
本発明のもう一つの対象は、
ａ）  配列番号１で示されるコードする配列、
ｂ）  配列番号３で示されるタンパク質をコードする配列
ｃ）  遺伝コードの縮重（Degeneration）の範囲内で（ａ）又は（ｂ）からなる配列に一致する核酸配列又は
ｄ）  緊縮ハイブリッダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）からなる配列とハイブリッドする配列を含有する核酸である。
緊縮ハイブリダイゼーション条件とは本発明の範囲内で、洗浄後に５５℃で、有利に６２℃で、特に有利に６８℃で水性の低塩−緩衝剤（例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中でなおハイブリダイゼーションが生じることと解釈される（Sambrook et al.,（1989）Molecular Clonig, A Laboratory Manual参照）。
本発明は、配列番号１又は配列番号３に示された配列の少なくとも２０個のヌクレオチドの長さの断片を含有する核酸にも関する。有利に、この断片はＰＩ３Ｋγに対して特異的なヌクレオチド配列を有する。この核酸は、有利に５０個までのヌクレオチドの長さの治療的に使用されるアンチセンス−核酸の製造のために適している。
本発明のもう一つの対象は、本発明による核酸又はその一部の少なくとも１つのコピーを含有するベクターである。このベクターは真核生物又は原核生物中で複製可能であることができる。これは宿主細胞のゲノム中へ組み込み可能なベクター、例えばバクテリオファージ−ラムダであるか、又は染色体外で存在するベクター（例えばプラスミド）であることができる。本発明によるベクターは、ベースベクター中へのＰＩ３ＫγＤＮＡのサブクローニングにより得ることができる。この種のベースベクター、特にタンパク質発現のために必要な要素を有するベクターは、当業者に周知である。
ＰＩ３Ｋγをコードする核酸のクローニングの場合、適当な宿主細胞中で発現する発現ベクターを製造することができ、その際、本発明によるタンパク質が生じる。有利な宿主細胞は、微生物、例えばE. coli又は酵母、より高等な細胞（例えば哺乳類の細胞又は昆虫の細胞）である。有利な発現ベクターは、例えば原核生物に対してプラスミド、バクテリオファージ、より高等な細胞に対して酵母ベクター又はウイルス性ベクター（例えばＳＶ４０、ワクシニア（Vaccinia）、バキュロウイルス（Baculoviren））である。ＰＩ３Ｋγをコードする核酸の発現に関して、特にサンブルックほか、（Sambrook et al.,（1989）, supra）に挙げられた方法が参照される。
ＰＩ３Ｋγの発現のために適した系の特別な例は、デーヴィスほか（Davis et al., Biotechnology 11（1993）, 933 - 936）が記載した方法によるバキュロベクター（Baculovektoren）の使用下でのＳｆ９−昆虫細胞中でのＧＳＴ−融合タンパク質としての発現である。
本発明のもう一つの対象は、本発明による核酸又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞である。この細胞は親核生物細胞でも、原核生物細胞でもあることができる。核酸を用いて細胞を形質転換させる方法は、一般的な先行技術であり、従ってここでは詳説しない。
同様に本発明のもう一つの対象は、抗体の製造のための免疫原としてのＰＩ３Ｋγタンパク質又はこのタンパク質の断片の使用である。この場合、抗体の製造は通常の方法で、完全ＰＩ３Ｋγタンパク質又はその断片を用いて試験動物を免疫し、引き続き生じたポリクロナール抗血清の獲得により行われる。ケーラー及びミルシュタイン
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の方法及びその継続発展方法により、試験動物の抗体産生細胞から、公知の方法で細胞融合によりモノクロナール抗体を得ることができる。同様にヒトのモノクロナール抗体を製造することができる。
従って、本発明のもう一つの対象は、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ−γに対して特異的であり、かつ他のホスファチジルイノシトール−３−キナーゼと交差反応を示さない、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ活性を有するタンパク質に対する抗体である。このような抗体は、例えば免疫原としてＰＩ３Ｋγ−特異的ペプチド配列（例えば配列番号１及び２の７４１〜７５５のアミノ酸から示されたアミノ酸配列もしくは配列番号３及び４の７４２〜７５６のアミノ酸から示されるアミノ酸配列に相当する）の使用により得ることができる。
ＰＩ３キナーゼγ、これをコードする核酸及びこれと結合する抗体の調製は、このタンパク質のエフェクターについての適切な探索の必要性を生じさせる。この物質についての作用点は、配列番号１及び２もしくは配列番号３及び４の１〜７００の範囲内で示されたアミノ酸配列の酵素の調節ドメインである。タンパク質のこの領域に関して阻害的又は活性的に作用する物質は、ＰＩ３Ｋγにより制御される細胞機能に選択的に影響を及ぼすことができる。従って、この物質は相当する疾病形成の治療の際に使用することができる。ＰＩ３Ｋγの欠如に起因する疾病形成は、ＰＩ３Ｋγをコードする核酸、及び、場合による活性化するＧ−タンパク質をコードする核酸と一緒に、ベクター、例えばウイルス性ベクターを用いて相応する目的組織へ導入する遺伝子治療を行うこともできる。
この結果は、ＰＩ３Ｋγ−活性の変化と因果関係のある疾病の適切な診断の必要性を生じさせる。この試験は、ＤＮＡ−水準、つまり遺伝子−水準もしくは転写物−水準を検出するために特異的な核酸プローブを用いるか、又はタンパク質水準の検出のためにＰＩ３Ｋγに対する抗体を用いて実施することができる。
従って、本発明は、活性成分としてＰＩ３Ｋγ−タンパク質、これと結合する抗体又はそれをコードする核酸を、調剤学的に常用の助剤、担持剤、充填剤及び希釈剤と一緒に含有する調剤学的組成物にも関する。
本発明による調剤学的組成物は、細胞増殖、受容体が介在する信号伝達、細胞膜の構造、ヒスタミンの放出、神経細胞の分化、グルコース輸送及び抗脂肪分解に影響を及ぼすために使用することができる。さらに、アルツハイマー疾患の治療との関連で使用することもできる。
本発明は次の実施例、図面及び配列表により詳説される。
図１は特異的抗体を介したヒト血液細胞中のＰＩ３Ｋγの検出を示す。
図２ａは昆虫細胞中のＰＩ３Ｋγの組換え発現を示す。
図２ｂは精製された組換えＰＩ３Ｋγの酵素活性の検出を示す。
図３はタンパク質ｐ８５α及びｐ８５βとのＰＩ３Ｋγの非相互作用を示す。
配列番号１は、ＰＩ３Ｋγをコードする遺伝子情報を含有する核酸配列。
配列番号２は、ＰＩ３Ｋγのアミノ酸配列。
配列番号３は、もう一つのＰＩ３Ｋγをコードする遺伝子情報を有する核酸配列。
配列番号４は、もう一つのＰＩ３Ｋγのアミノ酸配列。
例１
ＰＩ３Ｋγ  ｃＤＮＡの単離
新規のＰＩ３ＫをコードするｃＤＮＡ配列の単離のために、ヒト骨髄−ｃＤＮＡ−バンクを、複製連鎖反応（ＰＣＲ）の使用下で詳しく調査した。この場合、アミノ酸配列ＫＮＧＤＤＬＲ及びＨＩＤＦＧに相応する縮重したオリゴヌクレオチドプライマーが使用された。４０２ｂｐの長さのＤＮＡ断片が得られた。この断片をサブクローニングし、配列決定した。
プローブとしてこのＰＣＲ断片を使用しながら、多数のオーバーラップするクローンをヒトＵ９３７ｃＤＮＡ−バンクから単離した。最大のクローンは、１０４９個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする（配列番号２）明らかなリーディングフレームを有する配列番号１に示された核酸配列を含有する。ＰＩ３Ｋγとして表されるこのタンパク質は約１２０ｋＤａの分子量を有する。
ｃＤＮＡ−バンクから得られたもう一つのＰＩ３Ｋγ−配列は、配列番号３に示されており、１０５０個のアミノ酸を有するタンパク質（配列番号４）をコードする。
例２
プロテイン水準及び転写物水準ＰＩ３Ｋγの検出
ＰＩ３Ｋγに対するウサギのポリクロナール抗血清を、１５個のアミノ酸の長さの配列ＮＳＱＬＰＥＳＦＲＶＰＹＤＰＧのペプチド（配列番号２中の７４１〜７５５のアミノ酸もしくは配列番号４中の７４２〜７５６のアミノ酸に相当）を用いて免疫することにより製造した。この血清はタンパク質Ａクロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーによりアクチゲル（ステロゲン（Sterogene））と連結するペプチド抗原の使用下で精製した。
ＰＩ３ＫγはＵ９３７及びＫ５６２細胞の免疫沈降及びウエスタンブロット分析により、この抗血清の使用下で検出することができた（図１）。免疫沈降及びウエスタンブロットはHiles et al.（Cell 70（1992）419 - 429）の方法により実施した。第２の抗体としてセイヨウワサビ−ペルオキシダーゼ（Meerrettich-Peroxidase）及び抗−ウサギ−抗血清（sigma, 1:2000希釈）からなる抱合体を使用した。結合したペルオキシダーゼは化学ルミネセンスにより可視化される。
ヒトの膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳及び心臓からなる組織のノーザンブロット分析は、それぞれ５．３ｋｂの長さのｍＲＮＡの異なる濃度を示した。
例３
ＰＩ３Ｋγの組換体の発現
ＰＩ３ＫγをコードするＤＮＡをベクターｐＡｃＧ２Ｔ（Davis et al., Biotechnology 11（1993）, 933 - 936）中でクローニングした。生じた組換体のベクターｐＡｃＧ２Ｔ−ＰＩ３Ｋγは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と融合するコドン４からのＰＩ３Ｋγ−ｃＤＮＡを含有している。Ｓｆ９−細胞はｐＡｃＧ２Ｔ−ＰＩ３Ｋγ及び及び線状化されたバキュロウイルス−ＤＮＡ（BaculoGold, Pharmingen）を同時導入（cotransfizieren）した。個々の組換体のバキュロウイルスＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγプラークは精製され、増幅された。組換体のタンパク質の発現及び精製は、標準的方法（Dhand et al., EMBO J. 13（1994）, 511 - 521）の使用下で実施した。図２ａは組換体のＰＩ３ＫγＧＳＴ−融合タンパク質の発現又はＧＳＴ単独の発現は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での分離により示された。この検出はクーマシーブルーを用いる染色により行った。
図２ｂは、精製された組換体のＰＩ３Ｋγの酵素活性の検出を示す。基質として、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ、Ｓｐｕｒ１）、ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート（ＰＩ４−Ｐ、Ｓｐｕｒ２）及びホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート（ＰＩ４，５−Ｐ２、Ｓｐｕｒ３）を使用した。この試験の実施は、主にStephens et al.,（Cell 77（1994）、83 - 93）の方法によるがコール酸塩なしで実施した。ホスファチジルエタノールアミン３２０μＭ、ホスファチジルコリン１４０μＭ、ホスファチジルセリン３００μＭ、スフィンゴミエリン３０μＭ及び基質３２０μＭを有する音波処理された脂質小胞３０μｌを、酵素１０μｌ（０．１ｎｇ）に添加し、８分間氷上でインキュベートした。この試験は、２０μＭのＡＴＰ１０μｌに１０μＣｉγ（32Ｐ）ＡＴＰを添加することにより開始し、室温で１５分間インキュベートした。抽出された脂質を分離し、可視化した。３−ホスホリル化されたホスホイノシチドの同定は、脂質の脱アシルの後のアニオン交換−ＨＰＬＣにより確認された（Auger et al., Cell 57（1989）, 167 - 175）。
図２ｂは、基質がイノシトール環のＤ−３位置でホスホリル化されたことを示す。さらに、ＰＩ３Ｋγはウォルトマンニンによりナノモル濃度で阻害されたことが見出された。
例４
ＰＩ３Ｋγの調節
ｐ８５の調節サブユニット及び適応サブユニット（ｐ８５αもしくはｐ８５β）と、ＰＩ３Ｋγとの間の相互作用を検出するために、ヒトＰＩ３Ｋγ及びウシＰＩ３Ｋα（Hiles et al., supra）を例３に記載された方法によりＧＳＴ融合タンパク質として単独で又はｐ８５α又はｐ８５βと一緒にＳｆ９−昆虫細胞中で発現させた。細胞の溶解及び遠心分離の後に、グルタチオン−セファロースを上澄みに添加し、ＧＳＴ融合タンパク質を結合させた。この粒子を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。ＰＩ３Ｋγの検出は例２に記載したポリクロナールの抗ペプチド−抗体の使用下で行った。ｐ８５α、ｐ８５β及びウシＰＩ３Ｋαの検出のために、第１の抗体として特異的モノクロナールの抗体（Dhand et al., supra）、及び第２の抗体としてセイヨウワサビ−ペルオキシダーゼ及び抗−マウス−抗体（Dianova, 1:4000希釈）の相応する混合物を使用した。
図３から、ＰＩ３ＫγがＰＩ３Ｋαとは反対に、ｐ８５α又はｐ８５βサブユニットとは結合しないことが示される。従って、ＰＩ３ＫγはＰＩ３Ｋγの調節機構において異なっている。
ＰＩ３ＫγとＧ−タンパク質との間の相互作用を証明するために、精製したヒト組換えＰＩ３Ｋγ及びウシＰＩ３Ｋαをトランスデューシン種Ｇtβγと一緒にインキュベートした。この場合、ＰＩ３Ｋγのキナーゼ活性の明らかな増強が見られた。この刺激は、ＧＤＰ結合Ｇtαの添加により低減することができ、それによりこの相互作用の特異性が確認された。
それに対して、ＰＩ３Ｋαの酵素活性は、Ｇtβγの添加により刺激されなかった。酵素の同様の活性化は２０μＭのＡｌＣｌ3及び１０ｍＭのＮａＦの存在でＧαの添加により確認された。活性化種として複合体Ｇα−ＧＤＰ−ＡＩＦ4−が作用する。
活性測定は、例３に記載されたと同様に行った。キャンプス他（Camps et al.（Nature 360（1992）684 - 686）の方法によるウシ網膜から精製されたＧt−タンパク質は、酵素を添加する前に、脂質小胞と共に５分間（Ｇtβγ）又は２０分間（Ｇtβγ及びＧtα−ＧＤＰ）氷上でインキュベートした。
組換体のＰＩ３Ｋγとの結合試験は、調節タンパク質Ｒａｓがその活性のＧＴＰ結合形で酵素と会合することを示した。Ｒａｓは構成性の（konstitutiv）活性バージョンの形で、細胞を発ガン性に形質転換させることができる。従って、細胞増殖の調節の際のＰＩ３Ｋγの潜在的な重要性に対してさらに示唆される。
配列表
（１）  一般情報
（ｉ）  出願人：
（Ａ）名称：マックス−プランク−ゲゼルシャフト  ツール  フェルデルング  デル  ヴィッセンシャフテン
（Ｂ）住所：  ホフガルテンシュトラーセ  ２
（Ｃ）都市：  ミュンヒェン
（Ｅ）国：  ＤＥ
（Ｆ）郵便番号：  ８０５３９
（ｉｉ）  発明の名称：新規の形のホスファチジルイノシトール−３−キナーゼのクローニング、発現及び特性決定
（ｉｉｉ）  配列の数：４
（ｉｖ）  コンピュータ読込可能形態：
（Ａ）ディスクタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25（EPA）
（２）  配列番号：１の情報
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：４１３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の型：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｖ）起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４２３．．３５６９
（ｘｉ）配列の表示：配列番号：１
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（２）  配列番号：２の情報
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：１０４９塩基対
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列の表示：配列番号：２
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（２）  配列番号：３の情報
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：４１３７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の型：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｖ）起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４２３．．３５７２
（ｘｉ）配列の表示：配列番号：３
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（２）  配列番号：４の情報
（ｉ）  配列の特性：
（Ａ）長さ：１０５０塩基対
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列の表示：配列番号：４
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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