(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有し、エンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質。
【請求項２】
下記の特性を有するエンドグルカナーゼ：
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する。
ｉｉ）ファミリー４５に属する。
ｉiｉ）リゾプス属由来である。
ｖi）セルロースバインディングドメインがＮ末端側に存在する。
【請求項３】
配列番号１の４７番のSerがAlaに、９２番のSerがGlyに、１３０番のAsnがAspに、それぞれ置換されたアミノ酸配列を有する改変タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼまたは請求項３に記載の改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２のＤＮＡ配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
コドンが最適化された配列番号１３のＤＮＡ配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、酵母または糸状菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主細胞および／またはその培養物から請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼまたは請求項３に記載の改変タンパク質を採取する工程を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼまたは請求項３に記載の改変タンパク質の製造法。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼまたは請求項３に記載の改変タンパク質を含んでなる、セルラーゼ調製物。
【請求項１４】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１５】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１６】
セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的とした減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項１７】
着色されたセルロース含有繊維の色の澄明化を行う方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項１９】
セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維がごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状、安定化された液体状で含んでなる、洗剤添加物。
【請求項２１】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる、洗剤組成物。
【請求項２２】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２３】
古紙の脱インキ方法であって、古紙を、脱インキ薬品の存在下、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２４】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のエンドグルカナーゼ、請求項３に記載の改変タンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２５】
下記の特性を有する酵素。
ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。
ｂ）エンドグルカナーゼ活性を示す。
ｃ）１ｍｇタンパク質量／ｌ以下の濃度で精製セルロース繊維の毛羽を完全に除去できる。
【請求項２６】
ｐＨ８．５における精製セルロース繊維の毛羽除去活性が至適ｐＨにおける毛羽除去活性の５０％以上を有する、請求項２５に記載の酵素。
【請求項２７】
１ｍｇタンパク質量／ｌ以下の濃度で精製セルロース繊維の毛羽を完全に除去できる、請求項３に記載の改変タンパク質。
【請求項２８】
ｐＨ８．５における精製セルロース繊維の毛羽除去活性が至適ｐＨにおける毛羽除去活性の５０％以上を有する、請求項３に記載の改変タンパク質。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、エンドグルカナーゼ酵素およびそれを含んでなるセルラーゼ調製物、並びにそのセルラーゼ調製物によるセルロース含有繊維、紙、パルプ、および畜産飼料の処理方法に関するものである。
背景技術
セルロース含有繊維を、その繊維に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観を改善するために、あるいは着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている（ヨーロッパ特許第３０７，５６４号）。
また、近年、木材パルプ由来のセルロースを有機溶媒に溶解し、紡糸する精製セルロース繊維であるリヨセルが、その高い強度、吸水度等の性質、さらには環境汚染を起こしにくいその製造法から、注目を集めてきた。しかし、リヨセルは製造工程中に毛羽が生じるために、そのままでは繊維としての商品価値は低いものとされている。そこで、製造工程中に生じる毛羽をセルラーゼにより除去する方法が提案されてきた。
ここでセルロース含有繊維とは、天然セルロース、例えば、木綿、麻や、再生セルロース、例えば、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、そして精製セルロース、例えば、リヨセル、のようなセルロース系繊維素材から製造された繊維と、この繊維から製造された織物、編み物などの布帛、更にそれから縫製された衣料などをも含む。またさらに、セルロース系繊維素材と他の素材、例えば、合成繊維、羊毛、絹などをも含む繊維、布帛、縫製物も含まれる。
現在、セルロース含有繊維の処理には主に木材不朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）やフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。これらセルラーゼは複数のセルラーゼ成分の混合物である。それらの実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を奏するには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。
上記のセルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼを含む調製物によって改善されつつある。例えば、エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、ＷＯ８９／０９２５９号、ＷＯ９１／１７２４３号、ＷＯ９８／０３６４０号、およびＷＯ９４／２１８０１号で公表されている。特に、ＷＯ９１／１７２４３号には、フミコーラ由来の精製された４３ｋＤエンドグルカナーゼ成分（ＥＧＶ）が、従来の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の約１００倍ものジーンズ脱色活性を有することが開示されている。また、ＷＯ９８／０３６４０号には、フミコーラ由来のエンドグルカナーゼ成分であるＮＣＥ４が、従来の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の２５倍のジーンズ脱色活性、１００倍ものリヨセル毛羽取り活性を有することが開示されている。しかしながら、精製セルロース繊維（例えば、リヨセル）に生じる強靭な毛羽を除去するために、工業的実用化レベルに見合うセルラーゼ調製物を提供するためには、更に高活性のエンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ調製物が必要とされている。
一般に、セルロース含有繊維の繊維加工には精練、漂白、染色、シルケット加工等があり、いずれもアルカリ条件下で行わている。しかしながら、上記に示したエンドグルカナーゼを多量に含むセルラーゼ調製物にあっては、トリコデルマ由来のものは酸性領域に至適ｐＨを有し、フミコーラ由来のものは中性領域に至適ｐＨを有する。そのため、それらの使用の際には緩衝液の添加等によるｐＨ調整を行い、上記繊維加工とは別工程で行う必要がある。
よって、アルカリ条件下で作用するエンドグルカナーゼ成分があれば、上記繊維加工と同一の工程で処理でき、工程の短縮化が可能となる。その結果、大幅なコストの低減化を可能なものとすることが考えられる。
一方、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のセルラーゼがアルカリ条件下において活性を保持し得ることが、特開昭６０−２２６５９９号、特開昭６４−４０６６７号、特開昭６４−２６７７９号、特開平７−９０３００号において開示されている。これらの開示はいずれも衣類の洗濯すすぎに用いる洗浄剤の提供を目的として、リゾプス培養調製物を用いたものである。しかし、これらリゾプス培養調製物は活性が極めて低いために、とうてい実用化レベルに見合うものではない。
多くの場合、高活性なセルラーゼ調製物は、前述のように、多量なエンドグルカナーゼを含む調製物として提供される。そしてその製造方法としては、ＷＯ９１／１７２４３号、ＷＯ９８／０３６６７号、およびＷＯ９８／１１１２３９号において公開されているように、遺伝子組換えの技術を用いて、目的のエンドグルカナーゼ成分を宿主細胞において大量に発現させる方法が知られている。そして、これらの方法において好ましい宿主細胞としては、不完全菌類に属する糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等が挙げられている。特に工業レベルでの酵素の生産を考慮した場合、不完全菌類に属するこれらの糸状菌は極めて優良な宿主となる。
しかしながら、異種由来の遺伝子を、これらの不完全菌類に属する糸状菌において発現させる際、その塩基配列上の特性が異なる（遺伝子のコドン使用頻度が違う）等の理由で、大量発現が妨げられる場合が多い。特に、接合菌類に属するリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来の遺伝子を、前述の不完全菌類に属する糸状菌において大量に発現させた例はなく、大量発現の技術が求められていたと言える。
このような背景のもと、近年、目的遺伝子を宿主細胞のコドン使用頻度に合わせて最適化することにより、宿主細胞内での大量発現を実現する技術が構築されつつある。宿主内において遺伝子を大量発現するために最適なコドン使用については、その天然の宿主細胞において比較的よく発現している遺伝子のコドン使用を調査することによって推定される。このことは不完全菌類に属する糸状菌、アスペルギルス・ニージュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のコドン使用頻度に関するＬｌｏｙｄらの報告（Ａｎｄｒｅｗ  Ｔ．Ｌｌｏｙｄ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｍ．Ｓｈａｒｐ，１９９１．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ  ｅｔ．２３０，２８８−２９４）からも明らかである。しかし、既存のＤＮＡ配列より、好適なコドン使用についての情報が得られたとしても、すぐにそれが目的遺伝子の大量発現につながるわけではない。特に制御が複雑な糸状菌においては、好適なコドン使用を有する配列から発現に最適な一つの配列を選択することが求められていた。
発明の概要
本発明者等は、今般、新規な高活性エンドグルカナーゼ酵素およびその遺伝子を接合菌であるリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、およびファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）から単離した。そして、これらの酵素が精製セルロース繊維の毛羽除去処理において極めて強い活性を示し、しかも、アルカリ条件下においても強い活性を保持しているとの知見を得た。得られたエンドグルカナーゼ酵素は、今までにセルロース含有繊維の高い毛羽除去活性をもっているものとして知られているフミコーラ由来のＥＧＶ（ＷＯ９１／１７２４３号）やＮＣＥ４（ＷＯ９８／０３６４０号）に比べて、中性領域において１０〜２０倍、アルカリ性領域において２０〜５０倍もの驚くべき強い活性を有している。
また、一般に低温、アルカリ性条件で作用させる洗剤組成物として利用した場合にも、綿の毛羽除去処理において強い活性を保持しているとの知見を得た。例えば、これら高活性エンドグルカナーゼは、洗剤用途として強い毛羽除去活性を示すものとして知られているフミコーラ由来のＥＧＶ（ＷＯ９１／１７２４３号）やＮＣＥ４（ＷＯ９８／０３６４０号）に比べて、２〜２０倍もの強い活性を有している。
本発明者らは、さらに驚くべきことに、これらのエンドグルカナーゼ酵素のアミノ酸配列はそのセルロースバインディングドメイン（セルロース結合領域；ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）内の保存された共通配列であるグルタミン−システイン−グリシン−グリシンの次にリジン残基が存在するか、あるいは同じく共通配列であるアスパラギンの次にリジン残基が存在するという全く新規な特徴的な配列を有していることを見出した。
更にカタライティックドメイン（触媒領域；ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）のＮ末端側近傍のリンカー領域の一部分に精製セルロース繊維の毛羽除去に必要と思われる全く新規で特徴的な配列を見いだした。
本発明者らは、更に、そのセルロースバインディングドメインがＮ末端側にあるという糸状菌由来のファミリー４５に属するエンドグルカナーゼとしては全く新しい構造を有しているということも見出した。
従って、本発明は、精製セルロースに対して非常に高いエンドグルカナーゼ活性を示し、かつアルカリ条件下で高い活性を示す酵素およびその遺伝子の提供をその目的とする。
また、本発明は良好な特性を有するセルラーゼ調製物の提供をその目的としている。
さらに本発明は、上記酵素を用いたセルロース含有繊維、紙、パルプ、および畜産飼料の効率的で安価な処理法の提供をその目的としている。
そして、本発明による酵素は、下記の特性を有するものである。
ａ）エンドグルカナーゼ活性を示す。
ｂ）１ｍｇタンパク質量／ｌ以下の濃度で精製セルロース繊維の毛羽を完全に除去できる。
本発明の別の態様によるエンドグルカナーゼ活性を有する酵素は、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、エンドグルカナーゼ活性を示すその改変タンパク質、またはそれらの相同体である。
さらに、本発明によるエンドグルカナーゼ活性を有する酵素の遺伝子は、上記エンドグルカナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１３に記載のヌクレオチド配列）を含んでなるものである。
さらに、本発明によるセルラーゼ調製物は、上記のエンドグルカナーゼ活性を示す酵素を含んでなるものである。
さらにまた、本発明によるセルロース含有繊維等の処理法は、本発明によるエンドグルカナーゼ活性を示す酵素または本発明によるセルラーゼ調製物とセルロース含有繊維等とを接触させる工程を含んでなるものである。
発明の具体的説明
定義
本発明においてアミノ酸は３文字表記法に従って記載した。
本発明において「任意のアミノ酸残基」とは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む意味で用いられる。
本発明において「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ配列のみならずＲＮＡ配列をも含む意味で用いられる。
微生物の寄託
リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＣＰ９６００１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８９の受託番号のもと、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に１９９７年４月２１日付けで寄託されている。
ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＣＰ９９００１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９０の受託番号のもと、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年７月２日付けで寄託されている。
ファイコマイセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）ＣＰ９９００２株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９１の受託番号のもと、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年７月２日付けで寄託されている。
エンドグルカナーゼ活性を示す酵素
本発明による酵素は、精製セルロース繊維、特にリヨセル等の毛羽除去加工において、従来知られている高活性エンドグルカナーゼに比べ、活性が高く、またアルカリ条件下においても作用する点で有利な性質を有する。本発明による酵素の高い活性は、精製セルロース繊維に所望の作用を提供するのに少量のセルラーゼ調製物が必要とされるにすぎない点で酵素の現実的な使用を可能にする。さらに、アルカリ条件下においても作用する性質は、現在不可能とされているアルカリ条件下での精製セルロース繊維の毛羽除去加工を可能にする。よって、本発明による酵素によれば、繊維加工の工程を短縮化し、コストの低減化を実用化できるものと考えられる。
リヨセルは精製セルロース繊維の一種として欧州化繊協会（ＣＩＲＦＳ）で正式に命名された名称であるが、一般製品ではアコーディス・ファイバーズ社の登録商標名として「テンセル」と呼ばれている。リヨセルは木材パルプ由来のセルロースを有機溶媒に溶解し、紡糸する繊維であるため、精製セルロース繊維と呼ばれているが、広義の意味では再生セルロース繊維に分類される。再生セルロース繊維に分類されるビスコース、レーヨン、ポリノジックなども精製セルロース繊維と同様に木材パルプ由来のセルロースから作られ、精製セルロース繊維と同じ結晶構造を有することから、本発明による酵素は再生セルロース繊維にも精製セルロース繊維に作用させた場合と同様な効果が得られる。
本発明の第一の態様によれば、前記ａ）およびｂ）の特性を有する酵素が提供される。
より詳細な酵素の性質は次の通りである。
▲１▼  作用および基質特異性
本発明による酵素は、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ  ＥＣ３．２．１．４であり、具体的にはβ−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解するものである。基質としては精製セルロース繊維、例えば、リヨセル、に特異的に作用し、極めて低い濃度（０．２〜１．０ｍｇタンパク質量／ｌ）でテルセルの毛羽を完全に除去できる。
ここで「精製セルロース繊維の毛羽除去活性」とは、実施例Ａ４またはＡ５に記載の方法により評価される活性をいう。
また「精製セルロース繊維の毛羽を完全に除去できる」とは、茶色に染色した後毛羽出し加工したニットリヨセル生地を酵素を用いることによって毛羽除去処理したときに、目視評価で全く毛羽が見えない状態を言う。具体的には、その毛羽除去処理した生地を分光測色計（ミノルタ社製  ＣＭ−５２５ｉ）を用い、実施例Ａ６の条件でＬ＊ａ＊ｂ＊表色系のＬ＊値（明度）を測定したときにＬ＊値が２４．５以下になるような生地の状態を言う。ここで、毛羽出し加工する前の茶色の生地とは分光測色計（ミノルタ社製  ＣＭ−５２５ｉ）によってＬ＊値が２４〜２６の範囲内で、ａ＊値（色度）が４．７〜５．１の範囲内で、ｂ＊値（色度）が７．２〜７．９の範囲内に入る色のものをいう。また、このリヨセル生地は糸番手４０／１、ゲージ３０”＊２４Ｇで紡いだニットスムースを用い、スミフィックス（住友化学株式会社製）を用いて上記記載の茶色に反応染色させたものをいう。具体的なニットリヨセル生地の製品としては０Ｔ７４４０ニットスムース（豊島株式会社製）が挙げられる。また、毛羽出し加工においては、この色の生地を使用した場合、Ｌ＊値が約３０になるまで毛羽を出させる必要がある。
▲２▼  至適ｐＨおよび安定ｐＨ
本発明によるエンドグルカナーゼをｐＨ８．５において精製セルロース繊維に作用させた場合の毛羽除去活性は、至適ｐＨにおける毛羽除去活性の５０％以上である。
リゾプス・オリゼー由来のエンドグルカナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適ｐＨは約５であるが、ｐＨ４〜８において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適ｐＨは約５であるが、ｐＨ５〜９において高い活性を有している。
ムコール・サーシネロイデス由来のエンドグルカナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適ｐＨは約６であるが、ｐＨ５〜８において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適ｐＨはｐＨ５〜６であるが、ｐＨ５〜９において高い活性を有している。
ファイコマイセス・ニテンス由来のエンドグルナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適ｐＨは約６であるが、ｐＨ５〜８において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適ｐＨは約６であるが、ｐＨ５〜８において高い活性を有している。
▲３▼  至適温度および温度安定性
リゾプス・オリゼー由来のエンドグルカナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適温度は５５〜６０℃であるが、４５〜６５℃において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適温度は約５５℃であるが、４５〜６０℃において高い活性を有している。
ムコール・サーシネロイデスのエンドグルカナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適温度は４５〜５５℃であるが、４０〜６０℃において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適温度は約５０℃であるが、約４５〜５５℃において高い活性を有している。
ファイコマイセス・ニテンス由来のエンドグルナーゼは、ＣＭＣａｓｅ活性での至適温度は４５〜５５℃であるが、約４０〜６０℃において高い活性を有している。また、リヨセル毛羽除去活性での至適温度は約５０℃であるが、約４５〜５５℃おいて高い活性を有している。
▲４▼  分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量は、リゾプス・オリゼー由来のものは約４０ｋＤａ、ムコール・サーシネロイデス由来のものは約４１ｋＤａ、ファイコマイセス・ニテンス由来のものは約４５ｋＤａであることができる。
▲５▼  Ｎ末端配列
リゾプス・オリゼー由来のＮ末端配列は配列番号１４のアミノ酸配列であることができる。ムコール・サーシネロイデス由来のＮ末端配列は配列番号１５のアミノ酸配列であることができる。ファイコマイセス・ニテンス由来のＮ末端配列は配列番号１６のアミノ酸配列であることができる。
▲６▼  セルロースバインディングドメイン
一般に、セルラーゼにはセルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）がセルロースに結合する領域として存在することが知られている。さらに糸状菌由来のセルロースバインディングドメインには次のような共通配列が保存されていることが確かめられている（Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ａ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：４４３−４５０，１９９５）。
0004017824.tif 000002
（上記配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸を示すが、２０、２１、２２、２３、２４、３０、および３１位のＸａａは存在しなくてもよい。）
この配列において保存された共通配列であるＧｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの次にはＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、ＳｅｒやＡｓｎなどであるのが通例であるが、Ｌｙｓである例はない。また、保存された共通配列であるＡｓｎの次にはＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＴｙｒやＡｌａなどであるのが通例であるが、やはりＬｙｓである例はない。本発明者らは、ＲＣＥＩ、ＩＩ、ＩＩＩとＰＣＥＩのセルロースバインディングドメインにおいては、共通配列であるＧｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの次にはＬｙｓであり、ＭＣＥＩ、ＩＩのセルロースバインディングドメインにおいては、共通配列であるＡｓｎの次にはＬｙｓであるという全く新しいアミノ酸配列を見いだした。
本発明による酵素はアミノ酸配列（Ｉ）からなるセルロースバインディングドメインを有することができる。
0004017824.tif 000003
（上記配列中、Ｘａａはそれぞれ任意のアミノ酸残基を示すが、２０、２１、２２、２３、２４、３０、および３１位のＸａａはそれぞれ存在しなくてもよい。好ましくは２４位のＸａａは存在しない。１１位および３３位のＸａａのいずれか一方はＬｙｓを表し、他方はＬｙｓ以外のアミノ酸残基を表す。）
セルロースバインディングドメインは、好ましくは、アミノ酸配列（ＩＩ）からなることができる。
0004017824.tif 000004
（上記配列中、Ｘａａはそれぞれ任意のアミノ酸残基を示すが、２０、２１、２３、２９、および３０位のＸａａはそれぞれ存在しなくてもよい。）
好ましくは、アミノ酸配列（ＩＩ）における１１位および３２位のＸａａのいずれか一方はＬｙｓを表し、他方はＬｙｓ以外のアミノ酸残基を表すことができる。
セルロースバインディングドメインは、更に好ましくは、アミノ酸配列（ＩＩＩ）からなることができる。
0004017824.tif 000005
（上記配列中、
Ｘ１は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎを表し、
Ｘ２は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＧｌｙを表し、
Ｘ３は、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒを表し、
Ｘ４は、ＬｙｓまたはＩｌｅを表し、
Ｘ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＭｅｔを表し、
Ｘ６は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを表し、
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＴｈｒを表し、
Ｘ８は、ＳｅｒまたはＡｌａを表し、
Ｘ９は、ＳｅｒまたはＰｈｅを表し、
Ｘ１０は、ＬｙｓまたはＶａｌを表し、
Ｘ１１は、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、またはＧｌｙを表し、
Ｘ１２は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、またはＡｌａを表し、
Ｘ１３は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表すか、あるいは存在せず、
Ｘ１４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＡｓｎを表すか、あるいは存在せず、
Ｘ１５は、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを表し、
Ｘ１６は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐを表し、
Ｘ１７は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表し、
Ｘ４およびＸ１５のいずれか一方がＬｙｓを表し、他方はＬｙｓ以外のアミノ酸残基を表す。）
リゾプス属由来の本発明による酵素は、アミノ酸配列（ＩＶ）からなるセルロースバインディングドメインを有することができる。
0004017824.tif 000006
（上記配列中、
Ｘ２１は、ＬｅｕまたはＡｌａを表し、
Ｘ２２は、ＧｌｙまたはＴｙｒを表し、
Ｘ２３は、ＡｓｎまたはＡｓｐを表し、
Ｘ２４は、ＡｓｎまたはＡｓｐを表し、
Ｘ２５は、ＬｙｓまたはＶａｌを表し、
Ｘ２６は、ＶａｌまたはＡｓｐを表し、
Ｘ２７は、ＳｅｒまたはＴｙｒを表し、
Ｘ２８は、Ｐｒｏを表すか、あるいは存在せず、
Ｘ２９は、Ａｓｐを表すか、あるいは存在せず、
Ｘ３０は、ＡｓｐまたはＰｒｏを表し、
Ｘ３１は、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し、
Ｘ３２は、ＬｅｕまたはＶａｌを表す）
アミノ酸配列（ＩＶ）のセルロースバインディングドメインは、好ましくは、配列番号２２、２３、および２４のいずれかのアミノ酸配列であることができる。
ムコール属由来の本発明による酵素は、アミノ酸配列（Ｖ）からなるセルロースバインディングドメインを有することができる。
0004017824.tif 000007
（上記配列中、
Ｘ４１は、ＧｌｙまたはＳｅｒを表し、
Ｘ４２は、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し、
Ｘ４３は、ＧｌｕまたはＡｓｐを表し、
Ｘ４４は、ＳｅｒまたはＡｌａを表し、
Ｘ４５は、ＶａｌまたはＬｙｓを表し、
Ｘ４６は、ＧｌｕまたはＬｙｓを表し、
Ｘ４７は、ＧｌｙまたはＡｓｐを表し、
Ｘ４８は、ＬｅｕまたはＩｌｅを表す。）
アミノ酸配列（Ｖ）のセルロースバインディングドメインは、配列番号２６または２７のアミノ酸配列からなることができる。
ファイコマイセス属由来の本発明による酵素は、配列番号２８のアミノ酸配列からなるセルロースバインディングドメインを有することができる。
▲７▼  リンカー領域およびカタライティックドメイン
エンドグルカナーゼにはカタライティックドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ：ＣＡＤ）がセルロースを切断する領域として存在することが知られている。さらに、カタライティックドメインとセルロースバインディングドメインを架橋するアミノ酸領域はリンカー領域と呼ばれている。ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼにはカタライティックドメインの上流域に（ＳｅｒまたはＴｈｒまたはＡｌａ）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−（ＴｒｐまたはＴｙｒまたはＰｈｅ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（ＣｙｓまたはＡｌａ）（配列番号２９）という共通配列が保存されていることが確かめられている。本発明ではこの共通配列の上流域、すなわちリンカー領域の特定部分を欠失させることにより、リヨセル毛羽除去活性が失われることを見出し（実施例Ｄ９）、さらにその領域内に接合菌由来の６種のエンドグルカナーゼに共通な新規配列（Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）（配列番号３０）が存在することを発見した。
本発明による酵素はアミノ酸配列（ＶＩ）からなるリンカー領域の一部分を有することができる。
0004017824.tif 000008
（上記配列中、Ｘａａはそれぞれ任意のアミノ酸残基を示し、Ｘ５１およびＸ５２はそれぞれＳｅｒまたはＴｈｒを表し、好ましくは、Ｘ５１およびＸ５２はＳｅｒを表す。）
リンカー領域の一部分は、好ましくは、アミノ酸配列（ＶＩＩ）からなることができる。
0004017824.tif 000009
（上記配列中、
Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表し、好ましくは、３位のＸａａはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌを表し、８位のＸａａはＡｌａ、Ｐｈｅ、またはＬｙｓを表し、
Ｘ５１およびＸ５２はそれぞれＳｅｒまたはＴｈｒを表し、好ましくは、Ｘ５１およびＸ５２はＳｅｒを表し、
Ｘ６１はＬｙｓまたはＳｅｒを表し、
Ｘ６２はＩｌｅまたはＶａｌを表す。）
リンカー領域の一部分は、更に好ましくは、配列番号３３、３４、３５、３６および３７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることができる。
本発明による酵素は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、セルロースバインディングドメイン、リンカー領域、およびカタライティックドメインを有することを特徴とする。
ここで、「リンカー領域の一部分」とはリンカー領域内に位置し、カタライティックドメインのＮ末端近傍に存在する領域を言う。具体的には、リンカー領域の一部分のＣ末端のアミノ酸残基は、カタライティックドメイン内に保存されている（ＳｅｒまたはＴｈｒまたはＡｌａ）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−（ＴｒｐまたはＴｙｒまたはＰｈｅ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（ＣｙｓまたはＡｌａ）（配列番号２９）という共通配列中のＡｓｐから６〜１４アミノ酸残基、好ましくは、７〜１１アミノ酸残基、更に好ましくは９アミノ酸残基、上流に位置している。
▲８▼  由来
本発明による酵素は、接合菌類、具体的には、リゾプス属（例えば、リゾプス・オリゼー）、ムコール属（例えば、ムコール・サーシネロイデス）、およびファイコマイセス属（例えば、ファイコマイセス・ニテンス）、の微生物から得ることができる。
本発明の別の態様によれば、アミノ酸配列（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかからなるセルロースバインディングドメインを含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を示す酵素が提供される。
本発明の別の態様によれば、アミノ酸配列（ＶＩ）または（ＶＩＩ）からなるリンカー領域の一部分を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を示す酵素が提供される。
本発明の別の態様によれば、アミノ酸配列（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかからなるセルロースバインディングドメインおよびアミノ酸配列（ＶＩ）または（ＶＩＩ）からなるリンカー領域の一部分を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を示す酵素が提供される。
本発明の別の態様によれば、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素として下記の特性を有するエンドグルカナーゼが提供される。
ｉ）ファミリー４５に属する。
ｉｉ）糸状菌由来である。
ｉｉｉ）セルロースバインディングドメインがＮ末端側に存在する。
「ファミリー４５に属する」エンドグルカナーゼは、カタライティックドメイン内に（ＳｅｒまたはＴｈｒまたはＡｌａ）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−（ＴｒｐまたはＴｙｒまたはＰｈｅ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（ＣｙｓまたはＡｌａ）（配列番号２９）の共通配列を有するエンドグルカナーゼをいう（ＮｉｃｅＳｉｔｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＤＯＣ００８７７  ｏｒ  ＰＳ０１１４０、ＰＲＯＳＩＴＥ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｏｍａｉｎｓ）。
「糸状菌由来のファミリー４５に属する」エンドグルカナーゼとしては、今まで、ＥＧＶやＮＣＥ４、ｅｇｌ５（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２１９−２２８，１９９４）等が知られているが、これらは全てセルロースバインディングドメインがＣ末端側にある（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２６：１６４−１６７，１９９８）。しかしながら、本発明による接合菌由来の６種のエンドグルカナーゼはファミリー４５に属し、セルロースバインディングドメインがＮ末端側にあるという全く新規な構造であった。
本発明における「ファミリー４５に属する」エンドグルカナーゼとしては、具体的には、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を含んでなるエンドグルカナーゼ活性を示す酵素、エンドグルカナーゼ活性を示すその改変タンパク質、またはそれらの相同体であって、依然としてカタライティックドメイン内にある（ＳｅｒまたはＴｈｒまたはＡｌａ）−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−（ＴｒｐまたはＴｙｒまたはＰｈｅ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（ＣｙｓまたはＡｌａ）（配列番号２９）からなる共通配列が保持されているものが挙げられる。また、セルロースバインディングドメインおよび由来の例としては前記したものが挙げられる。
本発明の別の態様によれば、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素として、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質が提供される。以下、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、それぞれエンドグルカナーゼＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、およびＰＣＥＩと呼ぶ。
本発明は、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのみならず、その改変タンパク質も包含するものである。本発明において、改変タンパク質とは、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列において、１個または複数個（例えば、１〜数十個、具体的には、１〜約５０個、好ましくは、１〜約３０個、更に好ましくは、１〜約９個）のアミノ酸の付加、挿入、削減、欠失、または置換などの改変が生じたタンパク質を含んでなるタンパク質であって、依然としてエンドグルカナーゼ活性を保持するものを意味するものとする。
改変タンパク質としては、後述するように、アスパラギン結合型（Ａｓｎ型）糖鎖が付加しないように改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。
改変タンパク質としては、セルロースバインディングドメインが改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。改変タンパク質としては、セルロースバインディングドメインがアミノ酸配列（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかを表すように改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列（セルロースバインディングドメイン以外の領域が改変されていてもよい）からなるタンパク質が挙げられる。セルロースバインディングドメインにおける改変の数は、１〜約２８個、好ましくは、１〜約１７個、であることができる。
改変タンパク質としては、リンカー領域の一部分が改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。改変タンパク質としては、また、リンカー領域の一部分がアミノ酸配列（ＶＩ）または（ＶＩＩ）を表すように改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列（リンカー領域の一部分以外の領域が改変されていてもよい）からなるタンパク質が挙げられる。リンカー領域の一部分における改変は１〜約６個、好ましくは、１〜約４個、であることができる。
改変タンパク質としては、セルロースバインディングドメインおよびリンカー領域の一部分が改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。改変タンパク質としては、また、セルロースバインディングドメインが配列（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかを表すように改変され、かつリンカー領域の一部分が配列（ＶＩ）または（ＶＩＩ）を表すように改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載の改変アミノ酸配列（セルロースバインディングドメインおよびリンカー領域の一部分以外の領域が改変されていてもよい）からなるタンパク質が挙げられる。セルロースバインディングドメインにおける改変の数は、１〜約２８個、好ましくは、１〜約１７個、であることができる。リンカー領域の一部分における改変は１〜約６個、好ましくは、１〜約４個、であることができる。
改変タンパク質としては、更にまた、セルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）およびリンカー領域の一部分以外の領域が改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載のタンパク質が挙げられる。セルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）およびリンカー領域の一部分以外の領域における改変の数は、１〜約３０個、好ましくは、１〜約１５個であることができる。このうちカタライティックドメインにおける改変の数は、１〜約２０個、好ましくは、１〜約１０個であることができる。
改変タンパク質としては、更にまた、セルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）、リンカー領域の一部分、およびカタライティックドメイン（ＣＡＤ）以外の領域が改変された配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載のタンパク質が挙げられる。セルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）、リンカー領域の一部分、およびカタライティックドメイン（ＣＡＤ）以外の領域の改変の数は、１〜約１０個、好ましくは１〜約５個、であることができる。
配列番号１、３、５、７、９、および１１の配列中のセルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）、リンカー領域の一部分、およびカタライティックドメイン（ＣＡＤ）の位置（アミノ酸残基番号）は下記の通りである。
0004017824.tif 000010
0004017824.tif 000011
さらに、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその改変タンパク質のみならず、その相同体をも包含するものである。本発明において、相同体とは、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ヌクレオチド配列）と「限定された条件下でハイブリダイズする」遺伝子（ヌクレオチド配列）によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。ここで、「限定された条件下」とは、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列、またはその改変タンパク質のアミノ酸配列、の一部または全部の配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるプローブと相同体をコードする遺伝子とがハイブリダイズする一方で、このプローブが、ＷＯ９８／０３６４０号に記載のエンドグルカナーゼＮＣＥ４遺伝子およびＷＯ９８／５４３３２号に記載のエンドグルカナーゼＳＣＥ３遺伝子とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する（なお、ここで、ＤＮＡ量は、ＮＣＥ４遺伝子、ＳＣＥ３遺伝子、相同体をコードする遺伝子とも同量使用することとする）。より具体的には、プローブとして標識化した配列番号２に記載のＤＮＡ配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、前記プローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ、６Ｍ尿素添加０．５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ；１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
本発明による酵素は、例えば、実施例Ａ１〜３に記載のように微生物から単離・精製することにより得ることができる。
本発明による酵素は、また、後述のように遺伝子組み換え技術により本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離・精製することによっても得ることができる。
本発明による酵素には、前記のセルロースバインディングドメインやリンカー領域の一部分と任意のカタライティックドメインとからなる組み換え酵素も含まれる。このような組み換え酵素は、例えば、Ｔｏｍｍｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｒｉｏｌ．１７７：４３５６−４３６３，１９９５に記載される方法に従って製造できる。
エンドグルカナーゼ遺伝子
本発明によれば、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質、またはそれらの相同体をコードするヌクレオチド配列が提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、よって、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質、またはそれらの相同体をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
本発明によるヌクレオチド配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明によるヌクレオチド配列の典型的な取得方法としては、ムコール・サーシネロイデスやファイコマイセス・ニテンス由来の染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法などが挙げられる。
以下、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ、ＲＣＥＩＩ、ＲＣＥＩＩＩ、ＭＣＥＩ、ＭＣＥＩＩ、およびＰＣＥＩ並びにそれらの遺伝子をさらに説明する。
（１）エンドグルカナーゼＲＣＥＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＲＣＥＩは、配列番号１に記載される１〜３１５番のアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号１の−２３〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＲＣＥＩの改変ペプチドの一種として本発明に包含されるものである。この−２３〜−１番までのアミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドと考えられる。よってその一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号２に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１０１５〜１０１７番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、７０〜７２番のヌクレオチド配列は３１５残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
（２）エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩは、配列番号３に記載される１〜３４３番の配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号１の−２３〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩの改変ペプチドの一種として本発明に含まれるものである。この−２３〜−１番までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に、本発明によれば、配列番号３のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号４に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号４に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１０９９〜１１０１番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、７０〜７２番のヌクレオチド配列は３４３残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
（３）エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩは、配列番号５に記載される１〜３３７番の配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号１の−２３〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩの改変ペプチドの一種として本発明に含まれるものである。この−２３〜−１番までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に本発明によれば、配列番号５のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号６に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号６に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１０８１〜１０８３番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、７０〜７２番のヌクレオチド配列は３３７残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
（４）エンドグルカナーゼＭＣＥＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＭＣＥＩは、配列番号７に記載される１〜３１６番のアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号７の−２２〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＭＣＥＩの改変ペブチドの一種として本発明に包含されるものである。この−２２〜−１番までのアミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドと考えられる。よってその一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に本発明によれば、配列番号７のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＭＣＥＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号８に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１０１５〜１０１７番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６７〜６９番のヌクレオチド配列は３１６残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
（５）エンドグルカナーゼＭＣＥＩＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＭＣＥＩＩは、配列番号９に記載される１〜３６５番の配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号９の−２２〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＭＣＥＩＩの改変ペプチドの一種として本発明に含まれるものである。この−２２〜−１番までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に、本発明によれば、配列番号９のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＭＣＥＩＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１１６２〜１１６４番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６７〜６９番のヌクレオチド配列は３６５残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
（６）エンドグルカナーゼＰＣＥＩおよびその遺伝子
本発明によるエンドグルカナーゼＰＣＥＩは、配列番号１１に記載される１〜３２７番の配列を有するエンドグルカナーゼ活性を有する酵素である。上記タンパク質のＮ末端には、更に配列番号１１の−１９〜−１番までのアミノ酸配列またはその一部が付加されることがあるが、この配列が付加されたポリペプチドはエンドグルカナーゼＰＣＥＩの改変ペプチドの一種として本発明に含まれるものである。この−１９〜−１番までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持するその部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
更に本発明によれば、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするエンドグルカナーゼＰＣＥＩ遺伝子が提供される。その典型的配列は、配列番号１２に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号１２に記載されるヌクレオチド配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、１０３９〜１０４１番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、５８〜６０番のヌクレオチド配列は３２７残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
発現ベクターおよび形質転換された微生物
本発明においては、配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質、またはそれらの相同体をコードするヌクレオチド配列を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、即ち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡ配列の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーターおよびターミネーターおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、および、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼ酵素を発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
更に、本発明によれば、上記の本発明における発現ベクターにより得られた酵母形質転換体が産生するエンドグルカナーゼ酵素が、本発明における好適な用途に使用できる活性を示さなかった場合に、それを改善する方法が提供される。本発明における好適な用途に使用できる活性として、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ちの処理に有意に利用できる活性が挙げられる。
酵母細胞において異種タンパク質を発現させた場合、時として、過グリコシル化（過剰な糖鎖の付加）が起きることがＶａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ，Ｊ．Ｎ．ら（Ｖａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ，Ｊ．Ｎ．，１９８７，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，６０−６４）によって報告されている。従って、このような酵母細胞において所望の活性を有するタンパク質を発現させる場合、糖鎖付加に対する制御が必要な場合が生じる。本発明においては、その一例として、アスパラギン結合型（Ａｓｎ型）糖鎖認識部位を有するエンドグルカナーゼ酵素を、それをコードするＤＮＡ配列の改変により、Ａｓｎ型糖鎖が付加しない変異型エンドグルカナーゼ酵素として上記酵母細胞にて発現する方法が提供される（実施例Ｂ９、Ｃ６、Ｃ１０、Ｅ４参照）。
配列番号１、３、５、７、９、および１１に記載のエンドグルカナーゼ酵素のＡｓｎ型糖鎖が付加しない変異型エンドグルカナーゼへの改変は、Ａｓｎ型糖鎖認識部位Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／ＴｈｒにおけるＡｓｎ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒの他のアミノ酸への置換、具体的には、ＡｓｎのＡｓｐまたはＧｌｎへの置換、ＳｅｒまたはＴｈｒのＡｌａ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕへの置換、あるいはＸａａのＰｒｏへの置換であることができる。
実施例Ｃ１０およびＣ１１に示されるように、セルロースバインディングドメインに近接する糖鎖認識部位を改変することにより酵素活性を大きく改善することができる。従って、Ａｓｎ型糖鎖が付加しない変異型エンドグルカナーゼ酵素としては、下記のアミノ酸配列からなるものが挙げられる：
配列番号１の４５番または４７番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号１の改変アミノ酸配列、
配列番号３の４５番または４７番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号３の改変アミノ酸配列、
配列番号５の４４番または４６番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号５の改変アミノ酸配列、
配列番号７の５０番または５２番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号７の改変アミノ酸配列、
配列番号９の９９番または１０１番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号９の改変アミノ酸配列。
Ａｓｎ型糖鎖が付加しない変異型エンドグルカナーゼ酵素としては、また、下記のアミノ酸配列からなるものが挙げられる：
配列番号１の４５番または４７番のアミノ酸残基、および９０番または９２番のアミノ酸残基および／または１３０番または１３２番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号１の改変アミノ酸配列、
配列番号３の４５番または４７番のアミノ酸残基、および９２番または９４番のアミノ酸残基、１１９番または１２１番、１２２番または１２４番、および／または１５８番または１６０番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号３の改変アミノ酸配列、
配列番号５の４４番または４６番のアミノ酸残基、および４９番または５１番のアミノ酸残基、１２１番または１２３番および／または１７１番または１７３番のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された配列番号５の改変アミノ酸配列。
更に具体的には、Ａｓｎ型糖鎖が付加しない変異型エンドグルカナーゼ酵素としては、下記のアミノ酸配列からなるものが挙げられる：
配列番号１の４７番のＳｅｒがＡｌａに、９２番のＳｅｒがＧｌｙに、１３０番のＡｓｎがＡｓｐに、それぞれ置換された配列番号１の改変アミノ酸配列、
配列番号３の４７番のＳｅｒがＡｌａに、９２番のＡｓｎがＧｌｎに、１２１番のＳｅｒがＬｅｕに、１２２番のＡｓｎがＡｓｐに、１５８番のＡｓｎがＡｓｐに、それぞれ置換された配列番号３の改変アミノ酸配列、
配列番号５の４４番のＡｓｎがＡｓｐに、１２１番のＡｓｎがＬｙｓに、それぞれ置換された配列番号５の改変アミノ酸配列、
配列番号７の５２番のＳｅｒがＧｌｙに置換された配列番号７の改変アミノ酸配列、
配列番号９の１０１番のＳｅｒがＧｌｙに置換された配列番号９の改変アミノ酸配列。
また、上記のように糖鎖付加を制御する場合、例えば、既存の変異処理技術を用いて、糖鎖付加能力を限定した（または、欠失した）宿主酵母細胞を用いることもできる。
本発明における上記エンドグルカナーゼ酵素の最も好適な製造方法として、不完全菌類に属する糸状菌における発現方法が提供される。不完全菌類に属する糸状菌において上記エンドグルカナーゼ酵素を発現させる場合、宿主糸状菌のコドン使用に合わせたコドン最適化遺伝子を用いることが望ましい。本発明においてコドン最適化遺伝子とは、あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、宿主糸状菌において高頻度で使用されるコドンの情報をもとに置換し、得られるＤＮＡ配列を有する遺伝子を意味する。
また、本発明における最も好適なコドン最適化遺伝子として、イントロン認識配列を含まない（または、極力含まない）遺伝子が挙げられる。ここでのイントロン認識配列とは、不完全菌順に属する糸状菌においてイントロンと認識され得るＤＮＡ配列を意味する。より具体的には、ＧＴＡＧＮ、ＧＴＡＴＮ、ＧＴＡＡＮ、ＧＴＡＣＧＮ、ＧＴＧＴＮ、ＧＣＡＣＧＮ、ＧＴＴＣＧＮ等のＤＮＡ配列を意味する。これらのＤＮＡ配列を含まないことは、目的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの安定性の向上につながる。
さらに本発明においては、このコドン最適化遺伝子を全合成し、発現ベクターに組み込んで宿主糸状菌を形質転換することにより、工業的に好ましい生産量を得ることができる。本発明における宿主糸状菌は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属またはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するものであることができる。さらにそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられる。
また、本発明において用いられるコドン最適化遺伝子の一例として、コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子が挙げられる。本遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼＲＣＥＩをコードするコドン最適化遺伝子であり、その典型的配列は、配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列の一部または全部を有するものである。配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列は、１６〜１８番のＡＴＧで始まり、１０３０〜１０３２番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、８５〜８７番のヌクレオチド配列は３１５残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明の別の態様によれば、上記の本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、その改変タンパク質、または相同体を含んでなるセルラーゼ調製物が提供される。本発明によるセルラーゼ調製物は、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、その改変タンパク質、または相同体を、セルラーゼ調製物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されてよい。また、本発明におけるセルラーゼ調製物はいずれか適当な形状、例えば粉末または液体状、あるいは造粒による顆粒状、に調製することができる。
さらに本発明によれば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか、毛羽立ちを低減するか、肌触りが悪くなる速度を低減するか、またはごわ付きを低減する方法が提供される。この方法は、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素、またはセルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
更に本発明によれば、着色セルロース含有繊維の澄明化をもたらす方法であって、エンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる方法、ならびに、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす方法、すなわち、着色セルロース含有繊維にストーンウオッシュの外観を与える方法が提供される。そして、この方法は、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物により着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
本発明による上記方法は、洗濯中にセルロース含有繊維を処理することにより実施できる。しかしながら、繊維の処理は、場合によって、ソーキングまたはすすぎ中に、繊維が浸漬されているかまたは浸漬されうる水に、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物を添加することによって実施されてもよい。
接触温度、エンドグルカナーゼ酵素の量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えばセルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するかまたは毛羽立ちを低減する場合、４５〜５５℃程度の温度で、０．２〜１ｍｇ／ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼ酵素を使用することにより処理することができる。
また、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的とした減量加工の場合、４５〜５５℃程度の温度で、５〜１００ｍｇ／ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。
更に、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす場合、４５〜５５℃程度の温度で、２〜１０ｍｇ／ｌのタンパク濃度のエンドグルカナーゼを使用することにより処理することができる。
また、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物を洗剤組成物中で用いることにより、粒質土壌除去、色彩明澄化、脱毛羽立ち、脱ピリングおよび手粗さ軽減に関し、それらを改善することができる。
本発明による洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性または双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。更に、本発明による洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯＳ），アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）および天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としてはアルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、スクロース、およびグルコースの脂肪酸エステル、並びにポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
本発明によるエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物は古紙に作用させることにより、脱インキが可能であることが見出された。これより、古紙から再生紙をつくる過程において本発明によるエンドグルカナーゼ酵素による処理で、残インキ繊維を大幅に減少させ、古紙の白色度を向上させることができる。本発明に用いられる古紙としては、例えば、機械パルプ、化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級ないし中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が挙げられる。また、本発明に言う脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品をいい、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３などのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系またはノニオン系界面活性剤、オレイン酸等の補集材、助剤としてｐＨ安定剤、キレート剤、分散剤等が挙げられる。
また、本発明によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素による処理で有意に改善できることが見出された。したがって、本発明によれば、パルプのろ水性の改善方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含んでなる方法が提供される。本発明で処理できるパルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理および他の高収率パルプが挙げられる。
また、本発明によるエンドグルカナーゼを動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。したがって、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素またはセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含んでなる方法が提供される。
実  施  例
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
エンドグルカナーゼ活性
以下において、エンドグルカナーゼ活性とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。さらに、「ＣＭＣアーゼ活性」は、セルラーゼ酵素とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）溶液を一定時間インキュベーション後、遊離してくる還元糖量を測定し、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
実施例Ａ１：リゾプス．・オリゼーからのエンドグルカナーゼ酵素の単離精製  リゾプス・オリゼーＣＰ９６００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８９）を、培地（６．０％  コーンスチープリカー、３．０％  小麦フスマ、１．０％  グルコース、０．５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％  ＣａＣＯ３）中、２８℃で振とう培養した。３日間培養の後、菌体を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液８０ｍｌを最終濃度１．２５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．２５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速３．４ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度を１．２５Ｍから０．２５Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が０．７５Ｍのときに得られた画分の一部にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められた。そこでこの画分５０ｍｌを分取した。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を１５０回繰り返し行なうことにより、培養上清液１２ｌを処理し、活性画分７．５ｌを得た。
ここで得られた活性画分７．５ｌを最終濃度１．２５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した。そのうち１９０ｍｌを、あらかじめ１．２５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速２．８ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、１．２５Ｍ硫酸アンモニウム溶液、１．１２５Ｍ硫酸アンモニウム溶液をステップワイズで流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで流した。次に脱イオン水約２０ｍｌで溶出した画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められたので、プールした。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を４０回繰り返し行なうことにより、前工程での活性画分７．５ｌを処理し、活性画分８００ｍｌを得た。
次に、この活性画分８００ｍｌを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて１０倍希釈し、８．０１の溶液とし、そのうち２３ｍｌをあらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィー（ファルマシアバイオテク社製）に流速０．９ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）と緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．２）のリニアグラジエントにより流速０．９ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。そして、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた画分を分取した。このＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィーによる分画を３５０回繰り返し行ない、精製エンドグルカナーゼ酵素ＲＣＥＩとして単離した。このＲＣＥＩはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示し、その分子量（ＭＷ）は約４０ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＰＵ−１２．５Ｌ型パジェル（アトー株式会社製）を使用し、泳動および染色はゲルに添付の製品取扱説明書の方法に従った。分子量スタンダードは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量スタンダードＬｏｗレンジ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。
実施例Ａ２：ムコール・サーシネロイデスからのエンドグルカナーゼ酵素の単離精製
ムコール・サーシネロイデスＣＰ９９００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９０）を培地（３．０％  コーンスチープリカー、３．０％  小麦フスマ、３．０％  グルコース、０．５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％  ＣａＣＯ３）中、２８℃で振とう培養した。３日間培養の後、菌体を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液１２０ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速３．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０．３Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が０．６Ｍのときに得られた画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められた。そこでこの画分６４．３ｍｌを分取した。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を１４回繰り返し行なうことにより、培養上清液１７１０ｍｌを処理し、活性画分９００ｍｌを得た。
ここで得られた活性画分のうち３００ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製し、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速３．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液、０．９Ｍ硫酸アンモニウム溶液をステップワイズで流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで流した。次に脱イオン水約３０ｍｌで溶出した画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められたので、プールした。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を３回繰り返し行なうことにより、前工程での活性画分９００ｍｌを処理し、活性画分９０ｍｌを得た。
次に、この活性画分９０ｍｌを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて１０倍希釈し、９００ｍｌの溶液とし、そのうち１５０ｍｌをあらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィー（ファルマシアバイオテク社製）に流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）と緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．２）のリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。そして、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた画分を分取した。このＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィーによる分画を６回繰り返し行ない、精製エンドグルカナーゼ酵素ＭＣＥＩとして単離した。このＭＣＥＩはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示し、その分子量（ＭＷ）は約４１ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＰＵ−１２．５Ｌ型パジェル（アトー株式会社製）を使用し、泳動および染色はゲルに添付の製品取扱説明書の方法に従った。分子量スタンダードは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量スタンダードＬｏｗレンジ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。
実施例Ａ３：ファイコマイセス・ニテンスからのエンドグルカナーゼ酵素の単離精製
ファイコマイセス・ニテンスＣＰ９９００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９１）を、培地（２．０％  コーンスチープリカー、３．０％  小麦フスマ、２．０％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、１．０％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％  ＣａＣｌ２、０．０１％  アデカノール）中、２８℃、２２０ｒｐｍでＪａｒ培養を行なった。３日間培養の後、菌体を除去した培養上清液を分子量５０００カットの膜にて１０倍に限外ろ過濃縮を行なった。
この限外ろ過濃縮液１２０ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラットラボラトリーズ社製）に流速３．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０．３Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が０．３Ｍのときに得られた画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められた。そこでこの画分６６ｍｌを分取した。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を１０回繰り返し行なうことにより、限外ろ過濃縮液１２００ｍｌを処理し、活性画分６６０ｍｌを得た。
ここで得られた活性画分のうち１６５ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製し、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速３．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液、０．７５Ｍ硫酸アンモニウム溶液をステップワイズで流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで流した。次に脱イオン水約３０ｍｌで溶出した画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められたので、プールした。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を４回繰り返し行なうことにより、前工程での活性画分６６０ｍｌを処理し、活性画分１２０ｍｌを得た。
次に、この活性画分１２０ｍｌを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて１０倍希釈し、１２００ｍｌの溶液とし、そのうち１００ｍｌをあらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィー（ファルマシアバイオテク社製）に流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）と緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．２）のリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。そして、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた画分を分取した。このＭｏｎｏＳ  ＨＲ  ５／５陽イオンクロマトグラフィーによる分画を１２回繰り返し行ない、精製エンドグルカナーゼ酵素ＰＣＥ  Ｉとして単離した。このＰＣＥ  ＩはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示し、その分子量（ＭＷ）は約４５ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＰＵ−１２．５Ｌ型パジェル（アトー株式会社製）を使用し、泳動および染色はゲルに添付の製品取扱説明書の方法に従った。分子量スタンダードは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量スタンダードＬｏｗレンジ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。
実施例Ａ４：洗濯堅牢度試験機によるＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩの精製セルロース繊維への作用の評価
実施例Ａ１〜３で得られた精製エンドグルカナーゼ酵素ＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩの、精製セルロース繊維の代表例であるリヨセルの毛羽除去活性を以下のように評価した。
あらかじめ染色されたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製）を界面活性剤およびゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製  ９ｃｍ×１０ｃｍ、重量約２ｇ）を筒状に縫い、下記の条件で各種酵素による毛羽除去処理を行った。この処理により筒状の生地の内側にある毛羽が完全に除去されるのに要するＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩのタンパク濃度を算出した。
各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度は、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍｌ．Ｄ．Ｘ７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した各種エンドグルカナーゼのＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出した。スタンダードとしては、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同じくＨＰＬＣ分析したものを用いた。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードはＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。また、精製ＮＣＥ４はＷＯ９８／０３６４０号記載の方法に従い、フミコーラ・インソレンス培養液から単離精製した。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：ＲＣＥＩは５５℃、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩは５０℃で反応させた。
時間：６０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ５（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
ｐＨ６（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともに約１６ｇのゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の第１表に示されるとおりであった。
0004017824.tif 000012
実施例Ａ５：洗濯堅牢度試験機による各ｐＨにおけるＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩの精製セルロース繊維への作用の評価
あらかじめ染色されたリヨセル（豊島株式会社製）生地を界面活性剤およびゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、下記の条件でＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩによるリヨセルの毛羽除去処理を行なうことにより、形成された毛羽が完全に除去されるのに要する各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度を各ｐＨにおいて算出した。最も強い活性を示すｐＨ領域での活性値を１００とし、各ｐＨにおける活性値はその相対活性によって、グラフに示した。また、対照として、ＷＯ９８／０３６４０号で開示されているフミコーラ・インソレンス由来のエンドグルカナーゼ成分である精製ＮＣＥ４を同様に評価した。
各種エンドグルカナーゼのタンパク濃度は、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した各種エンドグルカナーゼのＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出した。スタンダードとしては、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同じくＨＰＬＣ分析したものを用いた。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードはＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：ＮＣＥ４、ＲＣＥＩは５５℃、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩは５０℃で反応させた。
時間：６０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：４〜６（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
７〜９（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液）
９〜１０（１０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともに約１６ｇのゴムボールを４個加えた。
その結果は、図１に示されるとおりであった。図から明らかなように、ＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩの至適ｐＨは５〜７であり、ｐＨ５〜８の範囲で至適ｐＨにおける活性の７０％以上の活性を有していた。一方、対照であるＮＣＥ４の至適ｐＨは５であり、ｐＨ６．２以上では至適ｐＨにおける活性の３０％以下の活性しかなかった。ＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩがアルカリ条件下において優位に高活性であることがこの結果より明らかである。
実施例Ａ６：ＲＣＥＩによるデニム染めセルロース含有繊維の脱色活性の評価
実施例Ａ１で得られた粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼ酵素ＲＣＥＩを用いて糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理をした。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製  全自動洗濯機ＳＣＷ５１０１）
温度：５５℃
時間：６０分
ｐＨ：６．２（６．７ｍＭリン酸緩衝液）
処理液には、セルラーゼ調製液とともにゴムボールを適当量加えた。
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製  ＣＭ−５２５ｉ）を用いた。まず、観察条件設定において光源をＤ６５、観察条件を２°視野にすることによって、製品のマニュアルに従い、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系のＬ＊値（明度）の校正を行なった。次に、この条件での各種サンプルのＬ＊ａ＊ｂ＊表色系のＬ＊値を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ＊値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ＊値を求め、このΔＬ＊値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ＊値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ＊値＝７となるのに必要なエンドグルカナーゼのタンパク濃度を算出した。
タンパク濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。
その結果は、次の第２表に記載の通りであった。
0004017824.tif 000013
実施例Ａ７：ＲＣＥＩの各種繊維に対する減量加工試験
あらかじめ絶対乾燥重量を測定してある各種セルロース含有繊維（１５ｃｍ×１０ｃｍ）を下記の条件で酵素処理した。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：５５℃
時間：６０分
ｐＨ：６（１０ｍＭ酢酸緩衝液）
処理液には、ＲＣＥＩ調製液（タンパク濃度８．０ｍｇ／Ｌ）とともにステンレスビーズ（株式会社大栄科学精器製作所）を適当量加えた。タンパク濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。
酵素処理の前後で布の絶対乾燥重量を測定し、重量減少率を算出した。その結果は、下記の表に示される通りであった。
0004017824.tif 000014
実施例Ｂ１：ＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩの部分アミノ酸配列
（１）  Ｎ末端アミノ酸残基の同定
実施例Ａ１〜３において得られた精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、Ｍｏｄｅｌ  １７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（パーキンエルマ社製）でカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：Ｃ８  ２２０×２．１ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、５％アセトニトリル〜０．０８５％ＴＦＡ、７０％アセトニトリルグラジェント）、目的タンパク質を更に純化した。これをプロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。得られた配列は以下の通りであった。
ＲＣＥＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１４）：
0004017824.tif 000015
0004017824.tif 000016
ＭＣＥＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１５）：
0004017824.tif 000017
ＰＣＥＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１６）：
0004017824.tif 000018
（２）ペプチドマッピング
上記（１）において精製されたＲＣＥＩタンパク質を凍結乾燥後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。タンパク質に対し約１／１００モル量のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し、３７℃、４８時間反応させた。この分解産物を、前述ＨＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：Ｃ１８  ２２０×２．１ｍｍ、０．１％  ＴＦＡ、５％アセトニトリル〜０．０８５％  ＴＦＡ、３５％アセトニトリルグラジェント）、５種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシーケンサーにより決定した。その結果は以下に示されるとおりであった。
0004017824.tif 000019
0004017824.tif 000020
実施例Ｂ２：ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡの単離は、以下の様にして行った。
リゾプス・オリゼーは３０ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ポリペプトン（和光純薬社製）、２％スクロース）で３０℃、４０時間培養し、ムコール・サーシネロイデスは３０ｍｌのＹＰＤ液体培地（０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２．４％  ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％スクロース）で３０℃、１８時間培養し、ファイコマイセス・ニテンスは３０ｍｌのＹＰＤ液体培地（０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２．４％ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％スクロース）で３０℃、４８時間培養した。各培養液はガラスフィルターによって菌体を集菌した。得られた各菌体を凍結乾燥し、ブレンダーにて細かく破砕した後、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液８ｍｌに溶解した。これに１０％  ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液４ｍｌを加え、６０℃、３０分間保温した。その後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を１２ｍｌ加え、激しく振とうした。遠心後、水層を別の容器に移し、これに１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え、水中に１時間以上放置した。遠心後、水層を別の容器に移し、２．５容のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を乾燥させた後、５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）溶液を５μｌ加え、３７℃、１時間保温し、更に２０ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）溶液５０μｌを加え、３７℃、１時間保温した。その後、３ｍｌのポリエチレングリコール溶液（２０％  ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿を５００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出を２回行い、エタノール沈殿をした。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解して試料とした。
実施例Ｂ３：ＰＣＲ法による長鎖プローブの作製
（１）ＰＣＲ法による目的ＤＮＡ断片の増幅
ＤＮＡプローブとして、リゾプス・オリゼーの全ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法により増幅したロングプローブを作製した。
各プライマーとして、Ｎ末端およびペプチドＬＥ−５の＊で示したアミノ酸に対応するＤＮＡを合成した。作製した合成オリゴヌクレオチドの配列は以下に示される通りであった。
0004017824.tif 000021
ＰＣＲ反応は以下の条件で行った。まず、リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーとしてＲｈ−ＮおよびＲｈ−４．３ａを各１μＭ加えたもの、Ｒｈ−ＮおよびＲｈ−４．３ｂを各１μＭ加えたものの２組のチューブを作製し、これらを、ｄＮＴＰ存在下、９５℃、２分間熱変性を行った。その後、Ｔａｑポリメラーゼ（リコンビナントＴａｑ、宝酒造社製）を加え、９４℃１分間、４５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を２５回繰り返した後、７２℃で１０分間インキュベートした。このＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供した結果、プライマーとしてＲｈ−ＮおよびＲｈ−４．３ｂを用いた場合のみ、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅していた。
（２）ＰＣＲ産物のサブクローニング
前述約８００ｂｐのＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて回収し、これをｐＴ７ブルーＴベクター（ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ、ノバジェン社製）に、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。得られた連結混合物で大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ＪＭ１０９、宝酒造社製）を形質転換した。得られた形質転換体を培養した後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載される方法によりプラスミドＤＮＡを回収した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｃｋ，ｉｎ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ１．２５−１．３２．）。得られたプラスミドＤＮＡを複数の制限酵素によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐの断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択した。目的のＰＣＲ産物がサブクローニングされたプラスミドをｐＲＤ０５とした。
（３）ｐＲＤ０５の塩基配列の解析
塩基配列解析は以下の様に進めた。
塩基配列解析装置は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーＩＩ（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲルは、ハイドロリンクロングレンジャー（ＦＭＣ社製）として入手可能なアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、尿素、および過硫酸アンモニウム）はＡ．Ｌ．Ｆグレードの試薬（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作製条件、反応条件、および泳動条件の各々は、各説明書の詳細を参照し、設定した。
テンプレートＤＮＡ、ｐＲＤ０５をアルカリ変性後、オートリードシーケンシングキット添付のユニバーサルおよびリバーズプライマーとアニーリングさせ、伸長反応を行った。反応産物をシーケンサーで解読したところ、それぞれ約４００ｂｐの塩基配列が判明した。これらの結果から、後記するＲＣＥ１−０１〜０６と呼ぶＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを作製し、ｐＲＤ０５に対して反応させ、さらに解読を進めた。その結果、ｐＲＤ０５の挿入断片の全塩基配列が解読された。解読された塩基配列はをアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が、実施例Ｂ１において示されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩの部分アミノ酸配列の一部と一致した。よってこのプラスミドｐＲＤ０５に含まれる挿入ＤＮＡを以降のスクリーニングのプローブとして用いることとした。
0004017824.tif 000022
実施例Ｂ４：ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓａｕ３Ａ  Ｉライブラリー）の作製
リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ  Ｉにより消化し、アガロースＬＥ（ナカライデスク社製）を用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ゲノムＤＮＡが、９〜２３ｋｂｐの範囲で限定的に分解されたことを確認した後、このＤＮＡ断片を定法に従い、抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクター（ストラタジーン社製）に連結した。これをエタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液に溶解し、この全量をギガパックＩＩパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた５×１０４個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。
実施例Ｂ５：ＲＣＥＩ遺伝子のクローニング
（１）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
まず、実施例Ｂ３において得られたプラスミドｐＲＤ０５をＢａｍＨ  Ｉで分解した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これをＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）により標識化した。
次に、実施例Ｂ４に従って得られたゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓａｕ３Ａ  Ｉライブラリー）をナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン、アマシャム社製）にうつしとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでＤＮＡを固定し、５倍濃度ＳＳＣ（１×ＳＳＣ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットの方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。ラベルの洗浄は前述キット添付の説明書の方法に従った。まず、０．４％  ＳＤＳ、６Ｍ尿素添加０．５倍濃度ＳＳＣで４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に２倍濃度ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を２回行った。プローブの洗浄を行ったナイロン膜を、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、２個のファージクローンを得た。
（２）ファージＤＮＡの調製
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株にファージを感染させ、１８時間後ファージ粒子を集めた。これら粒子を、Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．１５  ６７３７，１９８７）に準じてプロテイナーゼＫおよびフェノール処理を行った後、エタノール沈殿により、ファージＤＮＡを分離した。
（３）目的遺伝子のサブクローニング
２種のファージＤＮＡを複数の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７，１９７５）により、ナイロンメンブランにうつしとり、実施例Ｂ５（１）と同様にハイブリダイゼーションした。その結果、２種のファージＤＮＡは、複数の制限酵素の切断によっても共通のハイブリダイゼーションのパターンを示した。また、２種のファージＤＮＡをＸｂａ  Ｉで切断した場合に、約３．５ｋｂｐの一本のバンドに共通にハイブリダイズした。このため、このバンドを回収し、プラスミドｐＵＣ１１９のＸｂａ  Ｉサイトにサブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＲＣＥＩ−Ｘｂａとした。
実施例Ｂ６：ＲＣＥＩ遺伝子の塩基配列の決定
塩基配列の決定を実施例Ｂ３（３）と同様の方法により行った。即ち、テンプレートＤＮＡとして実施例Ｂ５において得られたプラスミドｐＲＣＥＩ−Ｘｂａを用い、プライマーとしてＲＣＥ０１〜０６のＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを用いて反応を行い、解析した。それらの結果より、更に下記のＲＣＥ１−０７〜０９と呼ぶＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを作製し、各々とプラスミドｐＲＣＥＩ−Ｘｂａを反応させ解析し、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の全塩基配列を決定した。
0004017824.tif 000023
実施例Ｂ７：ＲＣＥＩ遺伝子の発現
（１）ＲＣＥＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＣＥＩ遺伝子の開始コドンのすぐ上流および終止コドンのすぐ下流にＢｇｌ  ＩＩサイトを以下のように部位特異的変異により導入した。
まず、下記の２種の合成オリゴヌクレオチドｐＩＮ−ＢｇｌおよびｐＩＣ−Ｂｇｌを変異導入用プライマーとして作製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（和光純薬社製）を用いてそれぞれの５’末端を予めリン酸化しておいた。
次に、ミュータジェンＭ１３  インビトロミュータジェネシスキット（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、バイオラッドラボラトリー社製）を用いて部位特異的変異導入を行った。即ち、プラスミドｐＲＣＥＩ−Ｘｂａで大腸菌ＣＪ２３６株を形質転換した後、ヘルパーファージＭ１３  ＫＯ７を感染させ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を得た。このｐＲＣＥＩ−Ｘｂａ  ｓｓＤＮＡとリン酸化したプライマーｐＩＮ−Ｂｇｌ、ｐＩＣ−Ｂｇｌをアニーリングさせた後、ポリメラーゼ反応により二本鎖化し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩ−Ｂｇｌとした。
0004017824.tif 000024
（２）ＲＣＥＩ遺伝子の酵母における発現
ＲＣＥＩ遺伝子を酵母において発現させるために、ＷＯ９７／００７５７号明細書に記載される宿主−ベクター系を用いて、以下の検討を行った。
即ち、実施例Ｂ７（１）において得られたプラスミドｐＲＣＥＩ−ＢｇｌをＢｇｌＩＩで切断し、ＲＣＥＩ遺伝子を回収した。これを、プラスミドベクターｐＹ２８３１のＢａｍＨ  Ｉサイト、即ちグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターの下流に作動可能に連結し、プラスミドｐＹＲＣＥＩを得た。このプラスミドにより上記明細書に従って酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＳ−１６１株（ＭＡＴａ，ｔｒｐｌ，ｕｒａ３）を形質転換し、エンドグルカナーゼＲＣＥＩが発現可能な形質転換体を得た。
実施例Ｂ８：酵母において発現したＲＣＥＩの評価
（１）ＲＣＥＩが発現した酵母の培養
実施例Ｂ７において得られたプラスミドｐＹＲＣＥＩによる酵母の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのウラシルを添加したＳＤ液体培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、２％グルコース）にて、３０℃、２４時間培養した。この前培養液を終濃度１％となるように、５０μｇ／ｍｌのウラシルおよび１％カザミノ酸を添加したＳＤ液体培地にシードし、３０℃、３６時間間培養した。培養後、遠心分離により酵母菌体を除去し、これを粗酵素液として種々の解析に用いた。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定
実施例Ｂ８（１）において得られた粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量が約１００〜２００ｋＤのスメアなバンドとして検出された。
（３）ＲＣＥＩが発現した酵母の評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｂ８（１）において得られた粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、ＲＣＥＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果は、下記の表に示される通りであった。
0004017824.tif 000025
（４）ＲＣＥＩが発現した酵母の評価（リヨセル毛羽除去活性）
実施例Ｂ８（１）において得られた粗酵素液を透析した後、実施例Ａ４と同様にｐＨ６、５５℃におけるリヨセル毛羽除去活性を測定した。また、コントロールとして、ＲＣＥＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果、ＲＣＥＩ遺伝子組み換え株の０．５ｍｌブロス／ｍｌによる処理は、まったく毛羽除去活性を示さなかった。また、コントロールも同様に、０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液による処理は、まったく毛羽除去活性を示さなかった。
実施例Ｂ９：変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩの発現
実施例Ｂ８において、酵母で発現させたエンドグルカナーゼＲＣＥＩは、ＣＭＣアーゼ活性は示すものの、リヨセル毛羽除去活性は示さなかった。また、実施例Ｂ８（２）において測定された分子量は、予想される分子量より大きいものであった。
酵母において異種タンパク質を発現させた場合、時として過グリコシル化（過剰な糖鎖の付加）が起きることがＶａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌら（Ｖａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ，Ｊ，Ｎ．，１９８７，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，６０−６４）によって報告されている。実施例Ｂ８におけるエンドグルカナーゼＲＣＥＩを酵母において発現させた場合においても同様の現象がおきていると考えられた。そこで、リヨセル毛羽除去活性を示すエンドグルカナーゼＲＣＥＩを酵母において発現させるため、アスパラギン結合型（Ａｓｎ型）糖鎖認識部位のアミノ酸を置換した変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子を作出した。
（１）ＲＣＥＩ遺伝子への部位特異的変異導入
Ａｓｎ型糖鎖の認識部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、酵母および哺乳動物の糖タンパク質において共通であることが、Ｌｅｈｌｅら（Ｌｅｈｌｅ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｂａｕｓｅ，Ｅ．１９８４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７９９，２４６−２５１）によって報告されている。
エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子には、この配列が３カ所あり、配列番号１のアミノ酸配列上のそれぞれ４５番目、９０番目、および１３０番目の位置のアスパラギン残基に糖鎖が結合すると考えられた。Ａｓｎ型糖鎖の付加されない変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩを酵母において発現させるために、ＲＣＥＩ遺伝子に部位特異的変異導入を行った。
部位特異的変異処理は、実施例Ｂ７（１）の方法に従った。即ち、まず、３種の合成オリゴヌクレオチド  下記のｐＩＲＩ−Ｓ４７Ａ、ｐＩＲＩ−Ｓ９２Ｇ、およびｐＩＲＩ−Ｎ１３０Ｄを変異導入用プライマーとして作製し、５’末端を予めリン酸化した。
次に、プラスミドをｐＲＣＥＩ−Ｂｇｌで大腸菌ＣＪ２３６株を形質転換し、ヘルパーファージを用いてｓｓＤＮＡを得た。このｓｓＤＮＡとプライマーを前述キットを用いてアニーリング、ポリメラーゼ反応により、二本鎖化し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入することで変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩ−ＮＬＣＤとした。
0004017824.tif 000026
（２）変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩの酵母における発現
変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の酵母における発現を、実施例Ｂ７（２）の方法に準じて行った。即ち、実施例Ｂ９（１）において得られたプラスミドｐＲＣＥＩ−ＮＬＣＤｌをＢｇｌＩＩで切断し、変異型セルラーゼＲＣＥＩ遺伝子を回収した。これを、プラスミドベクターｐＹ２８３１のＧＡＰプロモーターの下流のＢａｍＨＩサイトに作動可能に連結し、プラスミドｐＹＩ−ＮＬＣＤを得た。このプラスミドを用いて、酵母ＭＳ−１６１株を形質転換し、変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩが発現した形質転換体を得た。
実施例Ｂ１０：酵母において発現した変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩの評価
（１）変異型ＲＣＥＩが発現した酵母の培養
実施例Ｂ９において得られたプラスミドｐＹＩ−ＮＬＣＤによる酵母の形質転換体を、実施例Ｂ８（１）と同一の条件にて培養し、上清を粗酵素液とした。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定
実施例Ｂ１０（１）において得られた粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量が約４０〜４５ｋＤのスメアなバンドとして検出された。
（３）変異型ＲＣＥＩが発現した酵母の評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｂ１０（１）において得られた粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果は、下記の表に示される通りであった。
0004017824.tif 000027
（４）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩのリヨセルの毛羽除去の評価
実施例Ｂ１０（１）において得られた粗酵素液を透析した後、実施例Ａ４と同様にｐＨ６、５５℃におけるにリヨセル毛羽除去活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して同様の評価を行った。
その結果、変異型ＲＣＥＩ遺伝子組み換え株から得られた０．１ｍｌブロス／ｍｌの反応液で処理を行った場合、８０％の毛羽が除去されていた。一方、コントロールは０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液で処理を行ったが、まったく毛羽は除去されていなかった。
この結果から、ＲＣＥＩを酵母においてリヨセル毛羽除去活性を示すように発現させるためには、Ａｓｎ型糖鎖認織部位に糖鎖が付加されないようにアミノ酸を置換する必要があることが確かめられた。また、毛羽を完全に除去するのに必要なタンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の染色の程度で測定した。その結果、実施例Ａ１に示した方法により精製したエンドグルカナーゼＲＣＥＩと、酵母で発現させた変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩとでほぼ同等であった。
（５）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩの各ｐＨにおけるリヨセルの毛羽除去の評価
実施例Ｂ１０（１）において得られた粗酵素液を用いて、実施例Ａ５と同様にｐＨ４〜９におけるリヨセル毛羽除去活性を測定した。
その結果は、図２に示されるとおりであった。図から明らかなように、変異型ＲＣＥＩの至適ｐＨは７〜８であり、ｐＨ５．２〜８．６の範囲で至適ｐＨにおける活性の８０％以上の活性を有していた。酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩが、リゾプス・オリゼーより精製したＲＣＥＩとほぼ同様のｐＨ特性を示すことが明らかとなった。
実施例Ｃ１：リゾプス・オリゼーにおけるＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子の検索
リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡ中のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子を検索するために、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。
まず、実施例Ｂ２に従って得られたリゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡ約１０μｇを複数の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ等）で各々切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）に従って、メンブランにうつしとり、前述実施例と同一の条件にてハイブリダイゼーションした。その結果、リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡ上には、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の他に少なくとも２種類の相同な遺伝子が存在することが明らかになった。ＲＣＥＩ遺伝子を含め、これら３種類の遺伝子は、特にゲノムＤＮＡをＳａｃＩで切断した場合のハイブリダイゼーションにおいて、それぞれ一本のバンドとして検出された。そのため、約３ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子をＲＣＥＩＩ遺伝子、約１０ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子をＲＣＥＩＩＩ遺伝子として、以降のクローニングを行った。
実施例Ｃ２：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡライブラリー（ＲＣＥＩＩ遺伝子クローニング用）の作製
リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡをＳａｃＩにより消化し、アガロースＬＥを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２〜４ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従い、抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩベクター（ストラタジーン社製）に連結し、実施例Ｂ４と同様にパッケージングを行った。得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させた。この方法により得られた１×１０５個のファージライブラリーを用いてＲＣＥＩＩ遺伝子のクローニングを行った。
（２）ＲＣＥＩＩ遺伝子のクローニング
実施例Ｃ２（１）で得られたライブラリーと、実施例Ｂ３で得られた長鎖プローブを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーションは、実施例Ｂ５と同様の条件にて行い、３個のファージクローンを得た。
得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させ、実施例Ｂ５（２）の方法に従ってＤＮＡを調製し、Ｓａｃ  Ｉで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）の方法に従って、ナイロンメンブランにうつしとり、ハイブリダイゼーションした。その結果、３種のファージＤＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡと同一のサイズの共通の約３ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを回収し、プラスミドｐＵＣ１１８のＳａｃ  Ｉサイトにサブクローニングを行い、得られたプラスミドをｐＲＣＥＩＩ−Ｓａｃとした。
実施例Ｃ３：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子の塩基配列の決定
塩基配列の決定は、実施例Ｂ３（３）と同様に行った。即ち、テンプレートＤＮＡとして実施例Ｃ２において得られたプラスミドｐＲＣＥＩＩ−Ｓａｃを用い、プライマーとして実施例Ｂ３（３）において作成したＲＣＥ  ０３、０４、および０５のＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを用いて反応を行い、解析した。この結果から、新たなＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを作製し、ｐＲＣＥＩＩ−Ｓａｃに対して反応させ、さらに解読を進めた。得られた結果から、さらに次のプライマーを作製して解読を進め、ＲＣＥＩＩの塩基配列を決定した。
0004017824.tif 000028
実施例Ｃ４：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子の発現
（１）ＲＣＥＩＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＣＥＩＩ遺伝子の開始コドンのすぐ上流および終止コドンのすぐ下流にＢｇｌ  ＩＩサイトを部位特異的変異により導入した。部位特異的変異導入の方法は実施例Ｂ７（１）に従った。
まず、下記の合成オリゴヌクレオチドｐＩＩＣ−Ｂｇｌを変異導入用プライマーとして新たに作製し、先に実施例Ｂ７（１）にて合成したｐＩＮ−Ｂｇｌと共に５’末端をリン酸化した。
次に、プラスミドｐＲＣＥＩＩ−Ｓａｃを大腸菌ＣＪ２３６株にて一本鎖化した後、リン酸化したプライマーと反応させ、変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩＩ−Ｂｇｌとした。
0004017824.tif 000029
（２）ＲＣＥＩＩ遺伝子の酵母における発現
ＲＣＥＩＩ遺伝子の酵母における発現を実施例３７（２）の方法にしたがって行った。即ち、実施例Ｃ４（１）において得られたプラスミドｐＲＣＥＩＩ−ＢｇｌをＢｇｌＩＩで切断し、エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子を回収した。これを、プラスミドベクターｐＹ２８３１のＢａｍＨ  Ｉサイト、即ちグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターの下流に作動可能に連結し、プラスミドｐＹＲＣＥＩＩを得た。このプラスミドにより、ＷＯ９７／００７５７号明細書に従って、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＳ−１６１株（ＭＡＴａ，ｔｒｐｌ，ｕｒａ３）を形質転換し、エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩが発現し得る形質転換体を得た。
実施例Ｃ５：酵母において発現したエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩの評価
（１）ＲＣＥＩＩが発現した酵母の培養
実施例Ｃ４において得られたプラスミドｐＹＲＣＥＩＩによる酵母の形質転換体を実施例Ｂ８（１）と同一の条件にて培養し、上清を粗酵素液とした。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定
実施例Ｃ４（１）において得られた粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量が約１００〜２００ｋＤのスメアなバンドとして検出された。
（３）ＲＣＥＩＩが発現した酵母の評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｃ４（１）において得られた粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、ＲＣＥＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
0004017824.tif 000030
（４）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩＩのリヨセルの毛羽除去の評価
実施例Ｃ５（１）において得られた粗酵素液を透析した後、実施例Ａ４と同様にｐＨ６、５５℃におけるリヨセル毛羽除去活性を測定した。また、コントロールとして、ＲＣＥＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果、ＲＣＥＩＩ遺伝子組み換え株の０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液による処理は、まったく毛羽除去活性を示さなかった。また、コントロールも同様に、０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液による処理は、まったく毛羽除去活性を示さなかった。
実施例Ｃ６：変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩの発現
実施例Ｃ４において、酵母において発現させたエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩはＣＭＣアーゼ活性は示すものの、リヨセル毛羽除去活性は示さなかった。また、実施例Ｃ４（２）において測定された分子量は、予想される分子量より大きいものであった。これは、ＲＣＥＩの場合と同様に、アスパラギン結合型（Ａｓｎ型）糖鎖の過剰付加によるものと考えられた。そこで、リヨセル毛羽除去活性を示すエンドグルカナーゼＲＣＥＩＩを酵母において発現させるため、Ａｓｎ型糖鎖認識部位のアミノ酸を置換した変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子を作出した。
（１）ＲＣＥＩＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＣＥＩＩ遺伝子には、Ａｓｎ型糖鎖の認識部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が５カ所あり、配列番号３のアミノ酸配列上のそれぞれ４５番目、９２番目、１１９番目、１２２番目、および１５８番目の位置のアスパラギン残基に糖鎖が結合すると考えられた。Ａｓｎ型糖鎖の付加されない変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩを酵母において発現させるために、ＲＣＥＩＩ遺伝子に部位特異的変異導入を行った。
部位特異的変異処理は、実施例Ｂ７（１）の方法に従って行った。即ち、まず、下記に示す４種の合成オリゴヌクレオチドｐＩＲＩＩ−Ｓ４７Ａ、ｐＩＲＩＩ−  Ｎ９２Ｑ、ｐＩＲＩＩ−Ｓ１２１Ｌ：Ｎ１２２Ｄ、およびｐＩＲＩＩ−Ｎ１５８Ｄを変異導入用プライマーとして作製し、５’末端を予めリン酸化した。
次に、プラスミドをｐＲＣＥＩＩ−Ｂｇｌで大腸菌ＣＪ２３６株を形質転換し、ヘルパーファージを用いてｓｓＤＮＡを得た。このｓｓＤＮＡとプライマーを前述キットを用いてアニーリング、ポリメラーゼ反応により、二本鎖化し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入することで変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩＩ−ＡＱＬＤＤとした。
0004017824.tif 000031
（２）変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩの酵母における発現
変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩ遺伝子の酵母における発現は、実施例Ｂ７（２）の方法に従って行った。即ち、実施例Ｃ６（１）において得られたプラスミドｐＲＣＥＩＩ−ＡＱＬＤＤ  ｌをＢｇｌＩＩで切断し、変異型エンドグルカナーＲＣＥＩＩ遺伝子を回収した。これをプラスミドベクターｐＹ２８３１のＧＡＰプロモーターの下流のＢａｍＨ  Ｉサイトに作動可能に連結し、プラスミドｐＹＩＩ−ＡＱＬＤＤを得た。このプラスミドを用いて酵母ＭＳ−１６１株を形質転換し、変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩが発現した形質転換体を得た。
実施例Ｃ７：酵母で発現させた変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩの評価
（１）変異型ＲＣＥＩＩが発現した酵母の培養
実施例Ｃ６において得られたプラスミドｐＹＩＩ−ＡＱＬＤＤによる酵母の形質転換体を、実施例Ｂ８（１）と同一の条件にて培養し、上清を粗酵素液とした。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定
実施例Ｃ７（１）において得られた粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量が約４５ｋＤのスメアなバンドとして検出された。
（３）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩＩの評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｃ７（１）において得られた粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
ＣＭＣアーゼ（Ｕ／ｍｌ）
異変型ＲＣＥＩＩ遺伝子組み換え株      ０．２１０
コントロール                          ０．０００
（４）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩＩのリヨセルの毛羽除去の評価
実施例Ｃ７（１）において得られた粗酵素液を用いて、実施例Ａ４と同様にｐＨ６、５５℃におけるリヨセル毛羽除去活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果、変異型ＲＣＥＩＩ遺伝子組み換え株の０．２ｍｌブロス／ｍｌの反応液で処理を行った結果、６０％の毛羽が除去されていた。一方、コントロールは０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液で処理を行ったが、まったく毛羽が除去されていなかった。
以上より、ＲＣＥＩと同様に、ＲＣＥＩＩを酵母においてリヨセル毛羽除去活性を示すように発現させるためには、Ａｓｎ型糖鎖認識部位に糖鎖が付加されないようにアミノ酸を置換する必要があることが確かめられた。また、毛羽を完全に除去するために必要なタンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の染色の程度で測定した結果、実施例Ａ１の方法により精製したエンドグルカナーゼＲＣＥＩと、酵母で発現させた変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩとにおいてほぼ同等であった。
実施例Ｃ８：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡ  ライブラリー（ＲＣＥＩＩＩ遺伝子クローニング用）の作製
リゾプス・オリゼーのゲノムＤＮＡをＳａｃ  Ｉにより消化し、アガロースＬＥを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約１０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従い、抽出し、精製した。このＤＮＡ断片を、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクターに連結し、実施例Ｂ４と同様にパッケージングを行い、得られたファージを大腸ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた１×１０５個のファージライブラリーを用いてＲＣＥＩＩＩ遺伝子のクローニングを行った。
（２）ＲＣＥＩＩＩ遺伝子のクローニング
実施例Ｃ８（１）で得られたライブラリーと、実施例Ｂ３で得られた長鎖プローブを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーションは、実施例Ｂ５と同様の条件にて行い、２個のファージクローンを得た。
得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させ、実施例Ｂ５（２）の方法に従ってＤＮＡを調製した。このＤＮＡを複数の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、実施例Ｂ５（３）の方法に従って、ナイロンメンブランにうつしとり、ハイブリダイゼーションした。その結果、２種のファージＤＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡと同一のサイズの共通のバンドが検出され、特にＳａｃ  Ｉの切断により約１０ｋｂｐ、ＢａｍＨ  Ｉの切断により約２ｋｂｐの大きさの一本のバンドを示した。そこで、ＢａｍＨ  Ｉによる切断で得られた約２ｋｂｐのバンドを回収し、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨ  Ｉサイトにサブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍとした。
実施例Ｃ９：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩ遺伝子の塩基配列の決定
塩基配列の決定は、実施例Ｂ３（３）と同様に行った。即ち、テンプレートＤＮＡとして実施例Ｃ８において得られたプラスミドｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍを用い、プライマーとして、キット添付のリバースプライマーおよびＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーＲＣＥ−０６を用いて反応を行いて解析した。得られた結果から、新たなＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを作製し、ｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍに対して反応させ、更に解読を進めた。この手法を更に繰り返すことにより、ＲＣＥＩＩＩの塩基配列を決定した。作製したＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーは以下の通りであった。
0004017824.tif 000032
実施例Ｃ１０：エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩ遺伝子の発現
（１）ＲＣＥＩＩＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＣＥＩＩＩ遺伝子の開始コドンのすぐ上流および終止コドンのすぐ下流にＢａｍＨ  Ｉサイトを以下のようにＰＣＲ法により導入した。まず、下記に示される合成オリゴヌクレオチドｐＩＩＩＣ−Ｂａｍ１およびｐＩＩＩＣ−Ｂａｍ２を変異導入用プライマーとして新たに作製した。先に実施例Ｃ８において得られたプラスミドｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍをテンプレートとして、ｐＩＩＩＣ−Ｂａｍ１およびｐＩＩＩＣ−Ｂａｍ２を用いてＰＣＲを行い、変異ＤＮＡを得た。この変異ＤＮＡをＢａｍＨＩにより切断し、得られたＤＮＡ断片を回収し、プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングを行った。得られた変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍ２とした。
0004017824.tif 000033
ＲＣＥＩＩＩ遺伝子には、Ａｓｎ型糖鎖の認識部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が４カ所あり、配列番号５のアミノ酸配列上のそれぞれ４４番目、４９番目、１２１番目、および１７１番目の位置のアスパラギン残基に糖鎖が結合すると考えられた。そこで、酵母においてリヨセル毛羽除去活性を示すように発現させるために、４４番目のＡｓｎ型糖鎖認識部位に糖鎖を付加されないようにアミノ酸を置換したものと、４４番目と１２１番目の両方のＡｓｎ型糖鎖認識部位に糖鎖を付加されないようにアミノ酸を置換したものの２種の変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子の作製を行った。
部位特異的変異処理は実施例Ｂ７（１）の方法に従って行った。即ち、まず、下記に示す２種の合成オリゴヌクレオチドｐＩＲＩＩＩ−Ｎ４４Ｄ、およびｐＩＲＩＩＩ−Ｎ１２１Ｋを変異導入用プライマーとして作製し、５’末端を予めリン酸化した。次に、プラスミドをｐＲＣＥＩＩＩ−Ｂａｍ２で大腸菌ＣＪ２３６株を形質転換し、ヘルパーファージを用いてｓｓＤＮＡを得た。このｓｓＤＮＡとプライマーを前述キットを用いてアニーリング、ポリメラーゼ反応により、二本鎖化し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入することで変異ＤＮＡを得た。ここで、４４番目のアミノ酸のみが置換された変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩＩＩ−Ｄとし、４４番目と１２１番目のアミノ酸の両方が置換された変異導入プラスミドをｐＲＣＥＩＩＩ−ＤＫとした。
0004017824.tif 000034
（２）変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩの酵母における発現
変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子の酵母における発現を実施例Ｂ７（２）の方法に従って行った。即ち、上記（１）において得られた２種のプラスミドｐＲＣＥＩＩＩ−Ｄ、ｐＲＣＥＩＩＩ−ＤＫをそれぞれＢａｍＨＩで切断し、変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子を回収した。これらを、プラスミドベクターｐＹ２８３１のＧＡＰプロモーターの下流のＢａｍＨ  Ｉサイトに作動可能に連結し、２種のプラスミドｐＹＩＩＩ−Ｄ、ｐＹＩＩＩ−ＤＫを得た。これらプラスミドを用いて酵母ＭＳ−１６１株を形質転換し、変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩが発現した形質転換体を得た。
実施例Ｃ１１：酵母において発現した変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩＩＩの評価
（１）変異型ＲＣＥＩＩＩが発現した酵母の培養
実施例Ｃ１０において得られた２種のプラスミドｐＹＩＩＩ−Ｄ、ｐＹＩＩＩ−ＤＫによる酵母の形質転換体を、実施例Ｂ８（１）と同一の条件にて培養し、上清を粗酵素液とした。
（２）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩＩＩの評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｃ１１（１）において得られたｐＹＩＩＩ−ＤＫによる酵母の形質転換体の粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
ＣＭＣアーゼ（Ｕ／ｍｌ）
異変型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子組み換え株      ０．４７２
コントロール                            ０．０００
（３）酵母で発現させた変異型ＲＣＥＩＩＩのリヨセルの毛羽除去の評価
実施例Ｃ１１（１）において得られたｐＹＩＩＩ−ＤとｐＹＩＩＩ−ＤＫによる酵母の形質転換体２種の粗酵素液を透析した後、実施例Ａ４と同様にｐＨ６、５５℃におけるリヨセル毛羽除去活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
その結果、変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子組み換え株（ｐＹＩＩＩ−Ｄ形質転換株）は０．２ｍｌブロス／ｍｌの反応液による処理により６０％の毛羽が除去され、変異型ＲＣＥＩＩＩ遺伝子組み換え株（ｐＹＩＩＩ−ＤＫ形質転換株）は０．２ｍｌブロス／ｍｌの反応液による処理により８０％の毛羽が除去された。一方、コントロールは０．５ｍｌブロス／ｍｌの反応液で処理を行ったが、まったく毛羽が除去されていなかった。この結果より、セルロースバインディングドメインに最も近傍にあるＡｓｎ型糖鎖認識部位だけに糖鎖を付加されないようにアミノ酸を置換したものでも、リヨセルの毛羽除去活性を示すようになることが示唆された。
実施例  Ｄ１：  エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現（Ｉ）
（１）ＲＣＥＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＣＥＩ遺伝子の開始コドンのすぐ上流の配列を、フミコーラ・インソレンスにおける発現に適するようにＰＣＲ法を用いて変異導入を行った。まず、下記に示される合成オリゴヌクレオチドｐＲＩＮ−Ｂｇｌを変異導入用プライマーとして新たに作製した。先に実施例Ｂ７（１）において得られたプラスミドｐＲＣＥＩ−Ｂｇｌをテンプレートとして、ｐＲＩＮ−Ｂｇｌおよび、実施例Ｂ７（１）において得られた合成オリゴヌクレオチドｐＩＣ−Ｂｇｌを用いてＰＣＲを行い、増幅した約１ｋＢの断片をｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンした。得られた変異導入プラスミドをｐＨＲＣＥＩ−Ｂｇｌ−１１とした。
尚、変異導入の際に作製したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す。
0004017824.tif 000035
（２）プラスミドｐＪＲＩＤ０１の作製
ａ）プラスミドｐＭ２１−ｍ−Ａ１の作製
フミコーラ・インソレンスにおけるＲＣＥＩ遺伝子の発現ベクターｐＪＲＩＤ１５の構築は、以下の様にして行った。まず、ＷＯ９８／０３６６７（ＰＣＴ／ＪＰ９７／０２５６０）に従って得られるプラスミドｐＭ２１に、合成オリゴヌクレオチドｐＭＮ−Ｂａｍを用いて部位特異的変異導入を行った。得られた変異導入プラスミドをｐＭ２１−ｍ−Ａ１とした。尚、変異導入の際に作製したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す。
0004017824.tif 000036
ｂ）プラスミドｐＪＤ０１の作製
まず、プラスミドｐＭ２１−ｍ−Ａ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、ＷＯ９８／０３６６７に従って得られるプラスミドｐＭＫＤ０１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。最後にこれらのＤＮＡ断片を連結し、得られたプラスミドをｐＪＤ０１とした。
ｃ）プラスミドｐＪＲＩＤ０１の作製
プラスミドｐＪＤ０１をＢａｍＨＩによって消化した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化した。次に前述（１）で得られたプラスミドｐＨＲＣＥＩ−Ｂｇｌ−１１をＢａｍＨＩによって消化し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。そして、これらを作動可能に連結し、得られたプラスミドをｐＪＲＩＤ０１とした。
（３）プラスミドｐＪＲＩＤ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１をＷＯ９８／０３６６７に記載の方法に従って、プラスミドｐＪＲＩＤ０１で形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す株を５０株選抜した。
実施例Ｄ２：エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現（ＩＩ）
（１）プラスミドｐＪＲＩＤ０１による形質転換体の培養及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価プラスミドｐＪＲＩＤ０１による形質転換体５０株をＷＯ９８／０３６６７に記載の方法に従って、（Ｎ）培地で、３７℃、４日間培養した。得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したが、親株と比較して増加しているタンパク質バンドは検出されなかった。
（２）プラスミドｐＪＲＩＤ０１による形質転換体のリヨセル毛羽除去活性による評価
前述（１）において得られたプラスミドｐＪＲＩＤ０１による形質転換体５０株の培養上清を用いてリヨセル毛羽除去活性を測定した。方法は、実施例Ａ４に従い、ｐＨ６、５５℃において測定した。その結果、形質転換体は、いずれも非形質転換体である親株とほぼ同等のリヨセル毛羽除去活性しか示さなかった。
実施例Ｄ３：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現（Ｉ）
実施例Ｄ２の結果より、リゾプス・オリゼー由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子は、フミコーラ・インソレンスにおいてほとんど発現しなかった。これは、接合菌類に属するリゾプス由来の遺伝子のコドン使用が、不完全菌類に属するフミコーラ由来の遺伝子と大きく異なるためだと考えられた。図３は、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のコドン使用を示したものであるが、ＲＣＥＩは、コドンの３番目の文字としてＡやＴを比較的多く使用している。これに対してフミコーラ由来のセルラーゼ遺伝子、ＮＣＥ１（特開平８−５６６６３号に記載）、ＮＣＥ２  （特開平８−１２６４９２号に記載）及びＮＣＥ４  （ＷＯ９８／０３６４０号に記載）は、コドンの３番目の文字としてＧやＣを多く使用する（図４〜図６）。従って、リゾプス由来のＲＣＥＩ遺伝子をフミコーラにおいて発現させるためには、コドン使用をフミコーラ型に最適化する（より具体的には、コドンの３番目の文字としてＡやＴが用いられている場合、コードするアミノ酸を変えない範囲でこれをＧやＣに書き換える）必要があると考えられた。さらに、目的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの安定性を向上させるために、コドンの３番目の文字を単にＧやＣに書き換えるだけでなく、イントロン認識配列（より具体的には、ＧＴＡＧＮ、ＧＴＡＴＮ、ＧＴＡＡＮ、ＧＴＡＣＧＮ、ＧＴＧＴＮ、ＧＣＡＣＧＮ、ＧＴＴＣＧＮ等のＤＮＡ配列）を含まないような配列を選択する必要があると考えられた。そこで、これらの条件をみたすようなコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子を設計し、後述のようにこれを全合成した。
（１）コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の全合成
ａ）プラスミドｐ１２−ＢＩの作製
まず、以下の配列を有する２本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−０１：
0004017824.tif 000037
ＲＣＥＩ−０２：
0004017824.tif 000038
次に、これらを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、ＬＡ  ＰＣＲキット（宝酒造社製）を使用した。ＲＣＥＩ−０１、ＲＣＥＩ−０２  各１μＭに、ｄＮＴＰ、バッファーを加え、９４℃  １０分間インキュベートした後、５分間氷冷した。その後、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼを加え、９４℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  １分４５秒間のサイクル反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間インキュベートした。増幅した約２００ｂｐのＤＮＡを実施例Ｂ３の方法に従い、ｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンした。得られたプラスミドをｐ１２−ＢＩとした。
ｂ）プラスミドｐ１２３−６の作製
まず、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−Ｐ３３５−Ｘｈｏ−Ｃ：
0004017824.tif 000039
次に、実施例Ｄ３（１）ａ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。テンプレートＤＮＡとしてプラスミドｐ１２−ＢＩを１μｇ、プライマーとしてＲＣＥＩ−０１、ＲＣＥＩ−Ｐ３３５−Ｘｈｏ−Ｃを各１μＭ用いた。実施例Ｄ３（１）ａ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行ったところ、約３００ｂｐのＤＮＡが増幅した。この約３００ｂｐのＤＮＡをｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンし、得られたプラスミドをｐ１２３−６とした。
ｃ）プラスミドｐ３４−６の作製
まず、以下の配列を有する２本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−０３：
0004017824.tif 000040
ＲＣＥＩ−０４：
0004017824.tif 000041
次に、これらを用いてＰＣＲ反応を行った。実施例Ｄ３（１）ａ）の方法に従い、ＲＣＥＩ−０３、ＲＣＥＩ−０４各１μＭに、ｄＮＴＰ、バッファーを加え、同様の条件で反応を行った。増幅した約３００ｂｐのＤＮＡをｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンし、得られたプラスミドをｐ３４−６とした。
ｄ）プラスミドｐ３４５６−１８の作製
まず、以下の配列を有する２本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−Ｐ３４−６−Ｎｃｏ−Ｃ：
0004017824.tif 000042
ＲＣＥＩ−Ｐ３４−６−Ｓａｃ−Ｃ：
0004017824.tif 000043
次に、実施例Ｄ３（１）ａ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。テンプレートＤＮＡとしてプラスミドｐ３４−６を１μｇ、プライマーとしてＲＣＥＩ−０３、ＲＣＥＩ−Ｐ３４−６−Ｎｃｏ−Ｃを各１μＭ用いた。実施例Ｄ３（１）ａ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行ったところ、約４００ｂｐのＤＮＡが増幅した。この約４００ｂｐのＤＮＡ断片を前述セファグラスバンドプレップキットを用いて回収し、更にこのＤＮＡ断片をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。
即ち、テンプレートＤＮＡとして先に回収した約４００ｂｐのＤＮＡ断片を約２０ｎｇ、プライマーとしてＲＣＥＩ−０３、ＲＣＥＩ−Ｐ３４−６−Ｓａｃ−Ｃを各１μＭ用い、実施例Ｄ３（１）ａ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行ったところ、約５００ｂｐのＤＮＡが増幅した。増幅した約５００ｂｐのＤＮＡをｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンし、得られたプラスミドをｐ３４５６−１８とした。
ｅ）プラスミドｐ７８−２の作製
まず、以下の配列を有する２本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−０７：
0004017824.tif 000044
ＲＣＥＩ−０８：
0004017824.tif 000045
次に、これらを用いてＰＣＲ反応を行った。実施例Ｄ３（１）ａ）の方法に従い、ＲＣＥＩ−０７、ＲＣＥＩ−０８各１μＭに、ｄＮＴＰ、バッファーを加え、同様の条件で反応を行った。増幅した約３００ｂｐのＤＮＡをｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンし、得られたプラスミドをｐ７８−２とした。
ｆ）プラスミドｐ６７８−８の作製
まず、以下の配列を有する２本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
ＲＣＥＩ−Ｐ７８−２−ＳａｃＮ：
0004017824.tif 000046
0004017824.tif 000047
次に、実施例Ｄ３（１）ａ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。テンプレートＤＮＡとしてプラスミドｐ７８−２を１μｇ、プライマーとしてＲＣＥＩ−Ｐ７８−２−ＳａｃＮ、ＲＣＥＩ−Ｈ−Ｃを各１μＭ用いた。実施例Ｄ３（１）ａ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行ったところ、約４００ｂｐのＤＮＡが増幅した。この約４００ｂｐのＤＮＡをｐＴ７ブルーＴベクターにサブクローンし、得られたプラスミドを  ｐ６７８−８とした。
ｇ）プラスミドｐ１８−の作製
まず、プラスミドｐ３４５６−１８をＸｈｏＩおよびＳａｃＩによって消化し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐ６７８−８をＳａｃＩおよびＫｐｎＩによって消化し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、さらに連結混合物をアガロースゲル電気泳動に供し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、予めＸｈｏＩおよびＫｐｎＩによって消化したプラスミドｐ１２３−６に連結し、プラスミドｐ１８−を得た。
（２）コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の塩基配列の解析
塩基配列の解析は、実施例Ｂ３（３）と同様に行った。即ち、テンプレートＤＮＡとして実施例Ｄ３（１）ｇ）において得られたプラスミド  ｐ１８−１を用い、プライマーとして新たに作製した下記の配列を有するＲＣＥ−Ｈ０１〜Ｈ０８のＦＩＴＣ標識シーケンシングプライマーを用いて反応を行い、解析した。
その結果、プラスミドｐ１８−１上のコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の全塩基配列を解析できた。コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子は、配列番号１３の塩基配列を有し、本配列より推定されるアミノ酸配列は、配列番号１に記載のエンドグルカナーゼＲＣＥＩのアミノ酸配列と完全に一致した。
0004017824.tif 000048
（３）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１の作製
実施例Ｄ１（１）で得られたプラスミドｐＪＤ０１をＢａｍＨＩによって消化した後、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化した。次に、実施例Ｄ３（１）ｇ）で得られたプラスミドｐ  ｐ１８−１をＢａｍＨＩによって消化し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。そして、これらを作動可能に連結し、得られたプラスミドをｐＪＩ４Ｄ０１とした。
（４）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１をＷＯ９８／０３６６７に記載の方法に従って、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１で形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す株を５０株選抜した。
実施例  Ｄ４：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現（ＩＩ）
（１）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換体の培養及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換体５０株をＷＯ９８／０３６６７に記載の方法に従って、（Ｎ）培地で、３７℃、４日間培養した。得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換体のうち５株において、エンドグルカナーゼＲＣＥＩと推定される分子量約４０ｋＤのタンパク質バンドが検出された。
（２）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換体のリヨセル毛羽除去活性による評価
前述（１）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約４０ｋＤのタンパク質の発現が確認された５株のうち、特に発現が顕著な２株（１−１８、２−１５株）の培養上清を用いて、リヨセル毛羽除去活性を測定した。コントロールとして非形質転換体である親株由来の培養上清液を用いた。方法は、実施例Ａ４に従い、ｐＨ６、５５℃の反応条件で各種培養上清液でリヨセルの毛羽除去処理を行なうことにより、形成された毛羽が完全に除去されるのに要する培養上清液量を求めた。結果を下記の表３に示した。
0004017824.tif 000049
実施例Ｄ５：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現（ＩＩＩ）
（１）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
実施例Ｄ４において得られたプラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換株（２−１５株）と親株から得られた培養上清を、それぞれＦＰＬＣシステム（ファルマシアバイオテク社製）を用いてカラムクロマトグラフィーに供した（カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＲＰＣ３ｍｌ、０．１％ＴＦＡを含む５％〜６０％アセトニトリルグラジェント）。その結果、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換株（２−１５株）より得られた培養上清中に、親株にない新規のピークが検出された。
（２）組み換えエンドグルカナーゼＲＣＥＩのＮ末端アミノ酸残基の同定
前述、実施例Ｄ４、Ｄ５より、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のコドンを最適化した結果、フミコーラ・インソレンスにおいて、組み換えエンドグルカナーゼＲＣＥＩが大量発現したと考えられた。そこで、大量発現したタンパク質がコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。
まず、実施例Ｄ５（１）に従い、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１による形質転換株（２−１５株）をＦＰＬＣシステムに供し、得られた新規のピークを分取した。次に、本ピークを遠心濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ゲル使用）に供した。タンパク質をマルチフォーＩＩ電気泳動装置（ファルマシア社）を用いて、タンパク質ををＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に電気的にうつしとり、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。その後、目的のバンド（４０ＫＤ）を切り出し、これをプロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（パーキンエルマー社）に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を１６残基決定した。得られた配列を以下に示す。
0004017824.tif 000050
このＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１の塩基配列から推定されるエンドグルカナーゼＲＣＥＩタンパク質のアミノ酸配列と一致した。
従って、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のコドンを最適化した結果、フミコーラ・インソレンスにおいて、組み換えエンドグルカナーゼＲＣＥＩが大量発現したことが確認された。
実施例Ｄ６：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のアスペルギルス・ニガーにおける発現（Ｉ）
（１）アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ  Ｐ−５８８６株からのｎｉａＤ変異株の取得
アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ  Ｐ−５８８６株の胞子を、６％の塩素酸塩を含む最少寒天培地（０．２％グルタミン酸ナトリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％塩化カリウム、０．００１％硫酸鉄、３％ショ糖、１．５％寒天、ｐＨ５．５）に塗布し、３０℃にて保温した。約５日間培養した後、コロニーを形成したものを塩素酸耐性株とした。これら耐性株をグルタミン酸塩、硝酸塩または亜硝酸塩をそれぞれ単一の窒素源として含む最少培地に植菌し、窒素源要求性の検討を行った。その結果、グルタミン酸ナトリウム、亜硝酸塩を単一の窒素源として含む最少培地では生育できるが、硝酸塩では生育できない塩素酸耐性株が存在し、これらをｎｉａＤ変異株候補とした。
ｎｉａＤ変異株候補の内の３株について菌体内のニトレートレダクターゼ（硝酸還元酵素＝ｎｉａＤ遺伝子産物）活性の測定を行った。これら３株を液体培地（０．２％グルタミン酸ナトリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％塩化カリウム、０．００１％硫酸鉄、３％ショ糖）で３０℃、６０時間振とう培養して得られた湿菌体０．２ｇを２ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、ホモジナイズ・超音波により破砕し、不溶画分を遠心によって除いた上清をサンプルとした。サンプル液５０μｌに対し蒸留水１０００μｌ、０．２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）７５０μｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌＦＡＤ１００μｌ、２ｍｇ／ｍｌＮＡＤＰＨ１００μｌ、２２．５ｍｇ／ｍｌ硝酸ナトリウム１０００μｌを加え、３７℃で反応させた。反応させたサンプルに対し、１％スルファニルアミド（３Ｎ塩酸にて溶解）５００μｌ、０．０２％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン５００μｌを加えて発色させ、Ａ５４０を測定することによりニトレートレダクターゼ活性の検出を試みたが、これら３株にはニトレートレダクターゼ活性は検出されなかった。そこで、これら３株をｎｉａＤ変異株と結論し、この内の１株をＮＩＡ５２９２株と命名し、以下の実験に供した。
（２）アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ  Ｐ−５８８６株のｎｉａＤ遺伝子の取得
ａ）プローブの作製
アスペルギルス・ニガーＮＲＲＬ４３３７株をＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で培養した。得られた菌体より公知の方法（特願平８−５３５２２）によって抽出した全ＤＮＡを鋳型にし、Ｕｎｋｌｅｓ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１１１，１４９−１５５（１９９２）に記載のアスペルギルス・ニガーのｎｉａＤ遺伝子の塩基配列をもとに作製した、配列番号１０６および１０７の合成ＤＮＡプライマーをプライマーにしてＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を行った。反応液１００μｌあたり染色体ＤＮＡ０．５μｇ、プライマー各１００ｐｍｏｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ（ニッポンジーン社）を含み、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃２分間の温度条件で２５サイクル反応させたところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅された。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定をしたところ、既に報告されているアスペルギルス・ニガーのｎｉａＤ遺伝子の塩基配列と１００％一致し、このＤＮＡ断片がｎｉａＤ遺伝子に由来することが明らかとなった。そこでこの約８００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用いることとした。
0004017824.tif 000051
ｂ）アスペルギルス・ニガーの染色体ＤＮＡのサザン解析
アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ  Ｐ−５８８６株をＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で培養した。得られた菌体より公知の方法（特願平８−５３５２２）によって抽出した全ＤＮＡを制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ）で完全消化した後、アガロースゲル電気泳動により分画し、モレキュラー・クローニング（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、１９８２年）に記載の方法に従ってナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマジャム社）上にブロットした。このナイロン膜に対し、前出の８００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブにしてサザンハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブの標識・シグナルの検出には、アマシャム社のＥＣＬダイレクトＤＮＡラベリング・検出システムを用い、条件は添付のマニュアルに従った。その結果ＳａｌＩで消化した際の約６．５ｋｂｐの位置等にシグナルが検出された。
ｃ）ｎｉａＤ遺伝子の単離
アスペルギルス・ニガーＦＥＲＭ  Ｐ−５８８６株の全ＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで部分分解した後、アガロースゲル電気泳動により分画し、９−２３ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を定法により抽出、回収した。回収したＤＮＡ断片をλＤＡＳＨＩＩのＢａｍＨＩサイトに連結し、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩ  Ｇｏｌｄによりパッケージングを行い、大腸菌に感染させることによりライブラリーを作製した。
前出の８００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用い、アマシャム社のＥＣＬダイレクトＤＮＡラベリング・検出システムを使用してプラークハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得た。得られた陽性クローンについて２次スクリーニングを実施し、陽性クローンを純化した。
陽性クローンよりファージＤＮＡを調製し、約６．５ｋｂｐ  ＳａｌＩ断片が挿入されていることを確認した。このＤＮＡに対してサザン解析を行い、ｎｉａＤ遺伝子が含まれるより小さなＤＮＡ断片として、約４．８ｋｂｐのＳａｃＩ断片を見出し、この断片の制限酵素地図を作製した。さらにこのＳａｃＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８にサブクローン化した。得られたプラスミドをｐｎｉａＤ−Ｓａｃとした。このＳａｃＩ断片を適宜制限酵素で小断片化した後にプラスミドｐＵＣ１１８にサブクローン化し、これを鋳型にして塩基配列を決定し、単離したＤＮＡ断片内におけるｎｉａＤ遺伝子の位置を特定した。
（３）アスペルギルス・ニガーＮＩＡ５２９２株の形質転換
アスペルギルス・ニガーＮＩＡ５２９２株を液体培地（２％可溶性澱粉、１％ポリペプトン、０．２％酵母エキス、０．５％リン酸二水素ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム）で２８℃、２４時間振とう培養した。菌体をガラスフィルターで集菌し、酵素溶液（１ｍｇ／ｍｌβ−グルクロニダーゼ（シグマ社）、５ｍｇ／ｍｌノボザイム２３４（ノボ・ノルディスク社）、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、０．８Ｍ塩化カリウム）に懸濁して、３０℃で穏やかに１．５時間加温した。プロトプラスト化した細胞をガラスフィルターでろ過し、通過画分を遠心により集菌してＳＴＣバッファー（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．２Ｍソルビトール）で２回洗浄した後、ＳＴＣバッファーに懸濁した。続いてプロトプラストとプラスミドＤＮＡを混合して、氷上に２０分間静置した後、さらにＰＥＧ液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化カルシウム、６０％ポリエチレングリコール４０００）を加えて氷上にもう２０分間静置し、ＤＮＡをプロトプラスト内に導入した。プロトプラストはＳＴＣバッファーにて数回洗浄した後、１．２Ｍソルビトールと０．８％アガーを含むツァペック培地（０．２％硝酸ナトリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％塩化カリウム、０．００１％硫酸第二鉄、３％ショ糖）に懸濁し、１．２Ｍソルビトールと１．５％アガーを含むツァペック寒天培地に重層して、３０℃で培養した。約５日間培養した後、コロニーを形成したものを形質転換体として選択した。
実施例Ｄ７：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のアスペルギルス・ニガーにおける発現（ＩＩ）
（１）プラスミドｐＳＡＥＸ１１の作製
アスペルギルス・ニガーにおいて作動可能なアミラーゼプロモーターを有する発現ベクターを以下のようにして構築した。
ａ）プラスミドｐＡＭＹＩの作製
まず、ＷＯ９７／００９４４号に従って得られるプラスミドｐＡＭＹを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉで消化し、得られた約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで消化したｐＵＣ１１９に連結した。得られたプラスミドをｐＡＭＹＩとした。
ｂ）プラスミドｐＡＭＹＩへの部位特異的変異導入
アミラーゼ遺伝子の開始コドンのすぐ上流にＢａｍＨＩサイトを部位特異的変異により導入した。部位特異的変異導入の方法は実施例Ｂ７（１）に従った。
まず、下記の合成オリゴヌクレオチドｐＡＭＢＭを変異導入用プライマーとして新たに作製し、５’末端をリン酸化した。次に、プラスミドｐＡＭＹＩを大腸菌ＣＪ２３６株にて一本鎖化した後、リン酸化したプライマーと反応させ、変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＡＭＹ−Ｂａｍとした。
0004017824.tif 000052
ｃ）プラスミドｐＳＡＥＸ１１の作製
まず、プラスミドｐＡＭＹ−Ｂａｍを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで消化し、得られた約０．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に、Ｃｕｌｌｅｎらの報告（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｇｅｎｅ．５７、２１−２６）に従って得られるプラスミドｐＤＨ２５をＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉで消化し、得られた約４．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。両者を連結し、得られたプラスミドをｐＳＡＥＸ１１とした。
（２）プラスミドｐＡＮＲ２２、ｐＡＮＨ４２の作製
リゾプス由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子及び、全合成によって作製されたコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子をアスペルギルス・ニガーにおいて発現させるために、発現ベクターｐＡＮＲ２２、ｐＡＮＨ４２を構築した。
ａ）プラスミドｐＡＮＲ２１、ｐＡＮＨ４１の作製
まず、リゾプス由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子断片として、プラスミドｐＨＲＣＥＩ−Ｂｇｌ−１１を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで消化し、得られた約１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子断片として、プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１をＢａｍＨ  Ｉで消化し、得られた約１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐＳＡＥＸ１１をＢａｍＨ  Ｉで切断し、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のＢｇｌ  ＩＩ断片及びコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のＢａｍＨ  Ｉ断片とそれぞれ連結した。得られたプラスミドをそれぞれｐＡＮＲ２１、ｐＡＮＨ４１とした。
ｂ）プラスミドｐＡＮＲ２２、ｐＡＮＨ４２の作製
まず、プラスミドｐＡＮＲ２１、ｐＡＮＨ４１を制限酵素ＸｂａＩで切断した、次に、実施例Ｄ６記載のプラスミドｐｎｉａＤ−Ｓａｃを制限酵素ＸｂａＩで切断し、約４．８Ｋｂｐの断片を得た。この断片にはｎｉａＤ遺伝子上流部の制限酵素ＳａｃＩの認識部位の直後に存在する制限酵素ＸｂａＩの認識部位から、ｎｉａＤ遺伝子下流部の制限酵素ＳａｃＩの認識部位の直後に存在するｐＵＣ１１８に由来する制限酵素ＸｂａＩの認識部位までが含まれている。この４．８Ｋｂｐの断片をプラスミドｐＡＮＲ２１、ｐＡＮＨ４１のＸｂａＩサイトにそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをｐＡＮＲ２２、ｐＡＮＨ４２とした。
実施例Ｄ８：コドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のアスペルギルス・ニガーにおける発現（ＩＩＩ）
（１）プラスミドｐＡＮＲ２２、ｐＡＮＨ４２によるアスペルギルス・ニガーＮＩＡ５２９２株の形質転換
実施例Ｄ６記載の方法により、プラスミドｐＡＮＲ２２及びｐＡＮＨ４２、及びコントロールとしてベクターのみによって、アスペルギルス・ニガーＮＩＡ５２９２株を形質転換した。ツアペック寒天培地上の形質転換体をそれぞれ約５０株をＳＭＰＮ液体培地（３％  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈ，０．７％  Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１％  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，０．３％  ＮａＣｌ）にて２８℃で３日間培養した。培養上清液は透析した後、実施例Ａ４に従い、ｐＨ６、５５℃の反応条件でリヨセルの毛羽除去を行ない、毛羽除去の度合を調べた。結果を下記の表４に示した。プラスミドｐＡＮＨ４２による形質転換体の培養液はリヨセル毛羽除去活性を示したが、ベクターのみ、もしくはプラスミドｐＡＮＲ２２によって形質転換された株の培養液は全くリヨセル毛羽除去活性を示さなかった。
0004017824.tif 000053
実施例Ｄ９：リンカー領域の一部分を欠失させたコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子のフミコーラ・インソレンスにおける発現
（１）プラスミドｐＪＩ４Ｄ０１内のＲＣＥＩ遺伝子部分のリンカーの一部（配列番号１３に記載の３３１番目の塩基であるＧから４０５番目の塩基であるＣまで）をＰＣＲを用いることにより欠失させ、このプラスミドをｐＪＩ４Ｄ１０とした。
（２）プラスミドｐＪＩ４Ｄ１０による形質転換体の培養及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
プラスミドｐＪＩ４Ｄ１０による形質転換体３０株をＷＯ９８／０３６６７に記載の方法に従って、（Ｎ）培地で、３７℃、４日間培養した。得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、プラスミドｐＪＩ４Ｄ１０による形質転換体のうち５株において、欠失ＲＣＥＩと推定される分子量約３０〜３５ｋＤのタンパク質バンドが検出された。
（３）プラスミドｐＪＩ４Ｄ１０による形質転換体のリヨセル毛羽除去活性による評価
前述（２）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約３０〜３５ｋＤのタンパク質の発現が確認された５株のうち、特に発現が顕著な１株（３−１３株）の培養上清を用いて、リヨセル毛羽除去活性を測定した。コントロールとしてＲＣＥＩのリンカー領域の一部分を欠失させていない２−１５株由来の培養上清液を用いた。方法は、実施例Ａ４に従い、ｐＨ６、５５℃の反応条件で各種培養上清液０．１ｍｌでリヨセルの毛羽除去処理を行なうことにより、形成された毛羽の除去される度合いを調べた。結果を下記の第５表に示した。
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実施例Ｅ１：ムコール・サーシネロイデスにおけるＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子の検索
ムコール・サーシネロイデスのゲノムＤＮＡ中のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子を検索するために、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。
まず、実施例Ｂ２に従って得られたムコール・サーシネロイデスのゲノムＤＮＡ約１０μｇを複数の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ等）で各々切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）に従って、メンブランにうつしとり、前述実施例と同一の条件にてＲＣＥＩ遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ムコール・サーシネロイデスのゲノムＤＮＡ上には、少なくとも１種類の相同な遺伝子が存在することが明らかになった。この遺伝子は、特にゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合のハイブリダイゼーションにおいて、一本のバンドとして検出された。そのため、約４．５ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子をＭＣＥＩ遺伝子として、以降のクローニングを行った。
実施例Ｅ２：エンドグルカナーゼＭＣＥＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡライブラリー（ＭＣＥＩ遺伝子クローニング用）の作製
ムコール・サーシネロイデスのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥアガロースを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約３〜６．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従い、抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０ベクター（ストラタジーン社製）に連結し、実施例Ｂ４と同様にパッケージングを行った。得られたファージを大腸菌ＮＭ５１４株に感染させた。この方法により得られた１×１０４個のファージライブラリーを用いてＭＣＥＩ遺伝子のクローニングを行った。
（２）ゲノムＤＮＡからのＭＣＥＩ遺伝子のクローニング
実施例Ｅ２（１）で得られたライブラリーと、ＲＣＥＩ遺伝子プローブを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーションは、実施例Ｂ５と同様の条件にて行い、６個のファージクローンを得た。
得られたファージを大腸菌ＮＭ５１４株に感染させ、実施例Ｂ５（２）の方法に従ってＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）の方法に従って、ナイロンメンブランにうつしとり、ハイブリダイゼーションした。その結果、６種のファージＤＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡと同一のサイズの共通の約４．５ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを回収し、プラスミドｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングを行い、得られたプラスミドをｐＭＣＥＩ−Ｅｃｏとした。この約４．５ｋｂｐの塩基配列の決定は、実施例Ｂ３（３）と同様に行い、解読された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が、実施例Ｂ１において示されたエンドグルカナーゼＭＣＥＩのＮ末端アミノ酸配列と一致した。しかしながら、この配列にはイントロンが含まれていることが推察されたため、ＲＴ−ＰＣＲによりＭＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの単離を行なった。
（３）ＲＴ−ＰＣＲによるＭＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの単離と塩基配列決定
ムコール・サーシネロイデスを３０ｍｌの液体培地（３．０％コーンスチープリカー、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２．４％ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％スクロース）で３０℃、１８時間培養し、ガラスフィルターによって菌体を集菌した。得られた各菌体を凍結乾燥し、スパーテルにて細かく破砕した。全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（和光純薬工業社製）を用いて単離した。まず、菌体粉末にＩｓｏｇｅｎ  ５ｍｌを入れ、３０秒間Ｖｏｒｔｅｘし、５０℃、で１０分間保温した。その後、室温で５分間放置した。次に、０．８ｍｌのクロロホルムを加えて、激しく振とうした。遠心後、水層を別の容器に移し、これに２ｍｌの４Ｍ  ＬｉＣｌ加えて混合し、−７０℃で１５分放置した。その後、遠心し、上清液を除いた後、沈殿を１．６ｍｌの水で溶解し、次に１．６ｍｌのイソプロパノールを加えて混合し、４℃、３０分放置する。遠心後、上清液を除き、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、沈殿を１．６ｍｌの水で溶解した。この液をエタノール沈殿し、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、０．４ｍｌの水に溶解し、これを全ＲＮＡとした。
次に、ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡアイソレーションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。まず前記で調製した０．２ｍｌの全ＲＮＡに１０ｍｌのエリューションバッファーを加え、さらに５ｍｌのオリゴｄＴ溶液を加えた。上清液を除いた後、とのオリゴｄＴをハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで２回で洗浄の後、６８℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。この溶液をエタノール沈殿し、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、１５μｌの水に溶解し、これをｍＲＮＡ画分とした。
次に、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡからのＭＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの調整は、Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を用いた。すなわち、前記において決定したゲノム由来のＭＣＥＩ遺伝子配列から推定されるＮ末端およびＣ末端のプライマーとして以下の様な配列のオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、前に調整したｍＲＮＡのうち１μｌを鋳型とし、ＭＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。
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ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、Ｃ末端のプライマーを加えて、逆転写酵素によって、反応させた後、Ｔａｑポリメラーゼ（リコンビナントＴａｑ、宝酒造社製）、Ｎ末端のプライマーを加え、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃２分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、約１．１ｋｂｐと１．０ｋｂｐの２断片であった。これをｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし、それぞれの断片の塩基配列を実施例Ｂ３（３）の方法に従い、決定した。この塩基配列とゲノムの塩基配列を比較し、イントロンを決定した。この解析の結果、ムコール・サーシネロイデスにはＮ末端側とＣ末端側の一部の遺伝子配列が同一な２種のエンドグルカナーゼが発現していることが確かめられた。そこで、短い塩基配列（約１．０ｋｂｐ）にコードされるエンドグルカナーゼをＭＣＥＩ、長い塩基配列（約１．１ｋｂｐ）にコードされるエンドグルカナーゼをＭＣＥＩＩと命名した。
実施例Ｅ３：エンドグルカナーゼＭＣＥＩ遺伝子の発現
（１）ＭＣＥＩ遺伝子への部位特異的変異導入
ＲＴ−ＰＣＲにより、作製したＭＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡには１ヶ所の変異が入っていたため、それを部位特異的変異により元に戻した。このｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされているＭＣＥＩプラスミドをｐＭＣＥＩ−ＥｃｏＲＩと命名した。また、ＭＣＥＩ遺伝子には、Ａｓｎ型糖鎖の認識部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が１カ所あり、配列番号７のアミノ酸配列上の５０番目の位置のアスパラギン残基に糖鎖が結合すると考えられた。ＲＣＥＩの場合と同様に、アスパラギン結合型（Ａｓｎ型）糖鎖の過剰付加により、リヨセル毛羽除去活性が阻害されることが考えられたため、Ａｓｎ型糖鎖認識部位のアミノ酸を置換した変異型エンドグルカナーゼＭＣＥＩ遺伝子を部位特異的変異により作出した。
部位特異的変異処理は、実施例Ｂ７（１）の方法に従って行った。即ち、下記に示す１種の合成オリゴヌクレオチドｐＩＭ１−Ｓ５２Ｇを変異導入用プライマーとして作製し、５’末端を予めリン酸化した。次に、プラスミドｐＭＣＥＩ−ＥｃｏＲＩで大腸菌ＣＪ２３６株を形質転換し、ヘルパーファージを用いてｓｓＤＮＡを得た。このｓｓＤＮＡとプライマーを前述キットを用いてアニーリング、ポリメラーゼ反応により、二本鎖化し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入することで変異ＤＮＡを得た。この変異導入プラスミドをｐＭＣＥＩ−Ｇとした。
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（２）変異型ＭＣＥＩ遺伝子の酵母における発現
変異型ＭＣＥＩ遺伝子の酵母における発現を実施例Ｂ７（２）の方法にしたがって行った。即ち、実施例Ｅ３（１）において得られたプラスミドｐＭＣＥＩ−ＧをＥｃｏＲＩで切断し、変異型ＭＣＥＩ遺伝子を回収した。これを、プラスミドベクターｐＹ２８３１のＥｃｏＲＩサイト、即ちグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターの下流に作動可能に連結し、プラスミドｐＹＭＣＥＩを得た。このプラスミドにより、ＷＯ９７／００７５７号明細書に従って、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＳ−１６１株（ＭＡＴａ，ｔｒｐｌ，ｕｒａ３）を形質転換し、エンドグルカナーゼＭＣＥＩが発現し得る形質転換体を得た。
実施例Ｅ４：酵母で発現させた変異型エンドグルカナーゼＭＣＥＩの評価
（１）変異型ＭＣＥＩが発現した酵母の培養
実施例Ｅ３において得られたプラスミドｐＹＭＣＥＩによる酵母の形質転換体を、実施例Ｂ８（１）と同一の条件にて培養し、上清を粗酵素液とした。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定
実施例Ｅ４（１）において得られた粗酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量が約４５ｋＤのスメアなバンドとして検出された。
（３）変異型ＭＣＥＩが発現した酵母の評価（ＣＭＣアーゼ活性）
実施例Ｅ４（１）において得られた粗酵素液を用いて、ＣＭＣアーゼ活性を測定した。また、コントロールとして、変異型ＭＣＥＩ遺伝子が導入されていないベクターＤＮＡのみによって形質転換された株の培養液を同様に処理して用いた。
0004017824.tif 000057
（４）酵母で発現した変異型ＭＣＥＩの精製
実施例Ｅ４（１）において得られた粗酵素液５００ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積２５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）に流速３．０ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０．３Ｍずつのステップワイズ溶離法により流速５．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出して、分画した。このうち、硫酸アンモニウム濃度が０．６Ｍのときに得られた画分にリヨセルの毛羽除去活性が強く認められた。そこでこの画分５０ｍｌを分取した。このＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｓｕｐｐｏｒｔ疎水クロマトグラフィーによる分画を２回繰り返し行なうことにより、培養上清液１０００ｍｌを処理し、活性画分１００ｍｌを得た。
ここで得られた活性画分１００ｍｌを最終濃度１．５Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調製し、あらかじめ１．５Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させたＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ疎水クロマトグラフィー（ゲル体積５ｍｌ、バイオラッドラボラトリーズ社製）にアプライした。次に、１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を流した。次に脱イオン水を流し、溶出した画分を１ｍｌずつ分画し、リヨセルの毛羽除去活性が強く認められた画分をプールした。この画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてほぼ単一なスメアなバンドを示し、その分子量（ＭＷ）は約４５ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＰＵ−１２．５Ｌ型パジェル（アトー株式会社製）を使用し、泳動および染色はゲルに添付の製品取扱説明書の方法に従った。分子量スタンダードは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量スタンダードＬｏｗレンジ（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。
（５）精製された変異型ＭＣＥＩのリヨセル毛羽除去の評価（リヨセル毛羽除去比活性）
実施例Ｅ４（４）において得られた変異型ＭＣＥＩ精製酵素液を用いて、実施例Ａ４の方法と同じように下記の条件でリヨセルの毛羽除去活性を評価した。すなわち、実施例Ａ４の方法で毛羽立たせたリヨセルニットの生地（豊島株式会社製９ｃｍ×１０ｃｍ、重量約２ｇ）を下記の条件でリヨセルの毛羽除去処理を行なうことにより、形成された毛羽が完全に除去されるのに要する変異型ＭＣＥＩのタンパク濃度を算出した。
変異型ＭＣＥＩのタンパク濃度は、ＴＳＫｇｅｌ  ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した各種エンドグルカナーゼのＵＶ２８０ｎｍでのピーク面積から算出した。スタンダードとしては、プロテインアッセイキット（バイオラットラボラトリー社製）によりあらかじめタンパク濃度を測定しておいた精製ＮＣＥ４を同じくＨＰＬＣ分析したものを用いた。プロテインアッセイキットにおけるタンパク濃度測定のスタンダードはＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
0004017824.tif 000058
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともに約１６ｇのゴムボールを４個加えた。
その結果は、下記の第６表に示されるとおりであった。実施例Ａ２に示した方法により精製したエンドグルカナーゼＭＣＥＩと、酵母で発現させた変異型エンドグルカナーゼＭＣＥＩとでは酵素濃度あたりのリヨセル毛羽除去活性がほぼ同等であった。
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（６）酵母で発現させた変異型ＭＣＥＩの各ｐＨにおけるリヨセルの毛羽除去の評価（ＭＣＥＩのリヨセル毛羽除去活性におけるｐＨプロファイル）
実施例Ｅ４（１）において得られたＭＣＥＩ粗酵素液を用いて、実施例Ａ５の方法に従って５０℃の条件で、ｐＨ４〜１０におけるリヨセルの毛羽除去活性を評価した。
その結果は、図２に示されるとおりであった。図から明らかなように、変異型ＭＣＥＩの至適ｐＨは５〜６であり、ｐＨ５〜８の範囲で至適ｐＨにおける活性の６０％以上の活性を有していた。実施例Ａ２においてムコール・サーシネロイデスより精製したＭＣＥＩと同様に、酵母で発現させた変異型ＭＣＥＩが精製ＮＣＥ４に比べてアルカリ条件下において優位に高活性であることがこの結果より明らかである。
実施例Ｆ１：ファイコマイセス・ニテンスにおけるＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子の検索
ファイコマイセス・ニテンスのゲノムＤＮＡ中のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ遺伝子の相同体遺伝子を検索するために、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。
まず、実施例Ｂ２に従って得られたファイコマイセス・ニテンスのゲノムＤＮＡ約１０μｇを複数の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ等）で各々切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）に従って、メンブランにうつしとり、前述実施例と同一の条件にてＲＣＥＩ遺伝子とコドン最適化ＲＣＥＩ遺伝子の２種をプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。その結果、ファイコマイセス・ニテンスのゲノムＤＮＡ上には、コドン最適化ＲＣＥＩ遺伝子と相同な遺伝子が少なくとも１種類存在することが明らかになった。
この遺伝子は、特にゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断した場合のハイブリダイゼーションにおいて、一本のバンドとして検出された。そのため、このおおよそ１５〜１９ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子をＰＣＥＩとして、以降のクローニングを行った。
実施例Ｆ２：エンドグルカナーゼＰＣＥＩ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡライブラリー（ＰＣＥＩ遺伝子クローニング用）の作製
ファイコマイセス・ニテンスのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにより消化し、Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥアガロースを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、９〜２３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従い、抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクター（ストラタジーン社製）に連結し、実施例Ｂ４と同様にパッケージングを行った。得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた１．６×１０４個のファージライブラリーを用いてＰＣＥＩ遺伝子のクローニングを行った。
（２）ゲノムＤＮＡからのＰＣＥＩ遺伝子のクローニング
実施例Ｆ２（１）で得られたライブラリーと、コドン最適化ＲＣＥＩ遺伝子プローブを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーションは、実施例Ｂ５と同様の条件にて行い、６個のファージクローンを得た。得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させ、実施例Ｂ５（２）の方法に従ってＤＮＡを調製し、Ｘｂａ  Ｉで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これを実施例Ｂ５（３）の方法に従って、ナイロンメンブランにうつしとり、ハイブリダイゼーションした。その結果、６種のファージＤＮＡにおいて、共通の約２．３ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを回収し、プラスミドｐＵ１１９のＸｂａ  Ｉサイトにサブクローニングを行い、得られたプラスミドをｐＰＣＥＩ−Ｘｂａとした。この約２．３ｋｂｐの塩基配列の決定は、実施例Ｂ３（３）と同様に行い、解読された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が、実施例Ｂ１において示されたエンドグルカナーゼＰＣＥＩのＮ末端アミノ酸配列と一致した。しかしながら、この配列にはイントロンが含まれていることが推察されたため、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの単離を行なった。
（３）ＲＴ−ＰＣＲによるＰＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの単離と塩基配列決定
ファイコマイセス・ニテンスを３０ｍｌの液体培地（３．０％コーンスチープリカー、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２．４％ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％スクロース）で３０℃、４８時間培養し、ガラスフィルターによって菌体を集菌した。得られた各菌体を凍結乾燥し、スパーテルにて細かく破砕した。全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（和光純薬工業社製）を用いて単離した。まず、菌体粉末にＩｓｏｇｅｎ  ５ｍｌを入れ、３０秒間Ｖｏｒｔｅｘし、５０℃、で１０分間保温した。その後、室温で５分間放置した。次に、０．８ｍｌのクロロホルムを加えて、激しく振とうした。遠心後、水層を別の容器に移し、これに２ｍｌの４Ｍ  ＬｉＣｌ加えて混合し、−７０℃で１５分放置した。その後、遠心し、上清液を除いた後、沈殿を１．６ｍｌの水で溶解し、次に１．６ｍｌのイソプロパノールを加えて混合し、４℃、３０分放置する。遠心後、上清液を除き、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、沈殿を１．６ｍｌの水で溶解した。この液をエタノール沈殿し、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、０．４ｍｌの水に溶解し、これを全ＲＮＡとした。
次に、ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡアイソレーションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。まず前記で調製した０．２ｍｌの全ＲＮＡに１０ｍｌのエリューションバッファーを加え、さらに５ｍｌのオリゴｄＴ溶液を加えた。上清液を除いた後、このオリゴｄＴをハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで２回で洗浄の後、６８℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。この溶液をエタノール沈殿し、沈殿を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、１５μｌの水に溶解し、これをｍＲＮＡ画分とした。
次に、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡからのＰＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡの調整は、Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を用いた。すなわち、前記において決定したゲノム由来のＰＣＥＩ遺伝子配列から推定されるＮ末端およびＣ末端のプライマーとして以下の様な配列のオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、前に調整したｍＲＮＡのうち１μｌを鋳型とし、ＰＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。
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ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、Ｃ末端のプライマーを加えて、逆転写酵素によって、反応させた後、Ｔａｑポリメラーゼ（リコンビナントＴａｑ、宝酒造社製）、Ｎ末端のプライマーを加え、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃２分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、約１．０ｋｂｐの１断片であった。これをｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、この断片の塩基配列を実施例Ｂ３（３）の方法に従い、決定した。この塩基配列とゲノムの塩基配列を比較し、イントロンを決定した。この解析の結果、ファイコマイセス・ニテンスＰＣＥＩ遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。
実施例Ｇ１：洗剤として配合した場合のフミコーラ・インソレンスによって発現されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩの毛羽除去作用の評価
実施例Ｄ４で得られたフミコーラ・インソレンスによって発現されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩの、セルロース含有繊維の毛羽除去活性を以下のように評価した。すなわち、実施例Ｄ４で調製したフミコーラ・インソレンスによって発現させたコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩの培養上清液を用いて、界面活性剤およびゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた綿ニット生地（６ｃｍ×８ｃｍ）の毛羽除去処理を下記の条件にて行なった。形成された毛羽が完全に除去されるのに要する培養上清液量を求めた。コントロールとしては非形質転換体である親株由来の培養上清液を用いた。
試験機械：ラウンダーメーター（Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｍｅｔｅｒ）Ｌ−１２（株式会社大栄科学精器製作所製）
温度：４０℃
時間：６０分
反応液量：４０ｍｌ
反応ｐＨ：ｐＨ８．５（１０ｍＭトリス緩衝液）
（ノニオン性界面活性剤）
ノニポール１００（三洋化成工業社製）  ０．１５ｇ／ｌ
（アニオン性界面活性剤）
シャボン玉ベビー粉石鹸（シャボン玉石鹸社製）０．５５ｇ／ｌ
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
その結果は、下記の第７表に示されるとおりであった。
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実施例Ｇ２：フミコーラ・インソレンスによって発現されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩの古紙脱インキの評価
実施例Ｄ４で調製したフミコーラ・インソレンスによって発現されたコドン最適化エンドグルカナーゼＲＣＥＩの培養液の遠心分離上清をさらに０．４５ミクロンの精密濾過をおこなった後、全量を凍結乾燥し粗酵素粉末を得た。本粗酵素粉末は１９２０単位／ｇのＨＥＣ活性を有していた。本粗酵素の酵素脱インキ能力を評価するために下記の酵素脱インキ試験を実施した。新聞紙をシュレッダーにより裁断した後、５重量％の濃度となるよう５０℃  ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、１０分浸漬し新聞紙を膨潤させた。この後、５０℃に保温したＪＩＳ標準離解機を用い３万回の攪拌を行い新聞紙の離解を行った。本離解物に粗酵素粉末３ｍｇ／離解物ｇ（１００ｎｋａｔ／ｇ離解物）及び９ｍｇ／離解物ｇ（３００ｎｋａｔ／ｇ離解物）相当の酵素溶液を投入し十分に攪拌し１２０分間６０℃で保温した。この後、酵素反応した離解物を標準離解機により１０００回転攪拌し均一な離解物を得た。得られた離解物を１容量を、４容量の水道水で希釈後、脱インキ剤（Ｒａｉｓａｐｏｎ１０４．１ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（２００ｍｇ／Ｌ）を添加しｖｏｉｔｈ  ｆｌｏｔａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌに供し５０度で５分間フローテーションを行い浮上するインキを除去した。この後、手すきシートを調製、乾燥させ得られた古紙のＩＳＯ白色度を白色度計により及び残存インキ面積をＭｉｎｏｌｔａ社製Ｑｕｉｃｋ  Ｓｃａｎ  ３５の測定を実施した。以上の手順により、酵素処理をしないもの、酵素処理したサンプル２実験区（１００ｎｋａ／ｇ、３００ｎｋａｔ／ｇ）より得た３サンプルの分析結果を  第８表に示した。この結果より、酵素実験区より得た古紙の白色度が無処理の古紙の白色度に比較しいずれもまさることから、ＲＣＥＩの古紙脱インキへの有効性が確認された。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、ＰＣＥＩ、およびＮＣＥ４のリヨセル毛羽除去における反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
図２は、変異型エンドグルカナーゼＲＣＥＩ、ＭＣＥＩ、およびＮＣＥ４のリヨセル毛羽除去における反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
図３は、ＲＣＥＩ遺伝子におけるコドンの使用頻度を示したコドン表である。
図４は、ＮＣＥ１遺伝子におけるコドンの使用頻度を示したコドン表である。
図５は、ＮＣＥ２遺伝子におけるコドンの使用頻度を示したコドン表である。
図６は、ＮＣＥ４遺伝子におけるコドンの使用頻度を示したコドン表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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