(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を有する、分子間架橋ヘモグロビンから未修飾ヘモグロビン二量体を解離し分離する方法、
ａ）分子間架橋ヘモグロビンのヘモグロビン溶液と、水溶性無機塩および水溶性有機塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの解離剤を接触させて解離溶液を得る工程であって、ここで、溶解した解離剤の濃度が、解離溶液１リットル当り解離剤が少なくとも約１ｇ当量の規定度であり、該解離溶液のｐＨが約４．５〜約９．５であり、それにより未修飾ヘモグロビン二量体が形成される工程、及び
ｂ）該解離溶液中に分子間架橋ヘモグロビンを保持しながら、解離溶液から該未修飾ヘモグロビン二量体を分離する工程。
【請求項２】
ヘモグロビン溶液中のヘモグロビンの少なくとも一部分を重合化する請求項１記載の方法。
【請求項３】
解離溶液が、ナトリウム塩、Ｃａ+2塩、Ｍｇ+2塩及びＺｎ+2塩からなる群より選ばれた少なくとも１つの塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
解離溶液が、アミンの塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
アミン塩が、グアニジン塩又はトリエチルアミン塩である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ヘモグロビン溶液を緩衝液と接触させる工程をさらに有する請求項１記載の方法。
【請求項７】
ヘモグロビン溶液を２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノールを用いて緩衝化する請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヘモグロビン溶液を安定化剤と接触させる工程をさらに有する請求項１記載の方法。
【請求項９】
安定化剤がエチレンジアミン四酢酸である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
解離溶液を濾過することにより、解離溶液から未修飾ヘモグロビンを分離する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
解離溶液から未修飾ヘモグロビンを分離した後、生理的に許容できる緩衝液を用いて架橋ヘモグロビンを洗浄し、生理的に許容できるヘモグロビン代用血液を製造する工程をさらに有する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を有する、分子間架橋ヘモグロビンから未修飾ヘモグロビン二量体を解離し濾過して生理的に許容できる代用血液を製造する方法、
ａ）分子間架橋ヘモグロビンのヘモグロビン溶液と、水溶性無機塩および水溶性有機塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの解離剤を接触させて解離溶液を得る工程であって、ここで、溶解した解離剤の濃度が、解離溶液１リットル当り解離剤が少なくとも約１ｇ当量の規定度であり、該解離溶液のｐＨが約４．５〜約９．５であり、それにより未修飾ヘモグロビン二量体が形成される工程、
ｂ）該解離溶液中に分子間架橋ヘモグロビンを保持しながら、解離溶液から該未修飾ヘモグロビン二量体を濾過する工程、及び
ｃ）生理的緩衝液を用いて分子間架橋ヘモグロビンを洗浄し、生理的に許容できる代用血液を製造する工程。
【請求項１３】
緩衝液が乳酸ナトリウム及びＮ−アセチル−Ｌ−システインを含有する請求項７記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を有する、分子間架橋ヘモグロビンから未修飾ヘモグロビン二量体を解離し、濾過し、そして洗浄する方法、
ａ）分子間架橋ヘモグロビンのヘモグロビン溶液を、水溶性無機塩および水溶性有機塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの解離剤、緩衝液及び安定化剤を混合して解離溶液を得る工程であって、ここで、溶解した解離剤の濃度が、解離溶液１リットル当り解離剤が少なくとも約１ｇ当量の規定度であり、該解離溶液のｐＨが約４．５〜約９．５であり、それにより未修飾ヘモグロビン二量体が形成される工程、
ｂ）解離溶液を濾過し、分子間架橋ヘモグロビンから該未修飾ヘモグロビン二量体を分離する工程、及び
ｃ）乳酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及び生理的電解質を含有する脱酸素化溶液を用いて該解離溶液を洗浄する工程。
【請求項１５】
以下の工程を有する、分子間架橋ヘモグロビンから未修飾ヘモグロビン二量体を解離し分離する方法、
ａ）分子間架橋ヘモグロビンのヘモグロビン溶液と、水溶性ナトリウム塩、Ｃａ+2塩、Ｍｇ+2塩、Ｚｎ+2塩及びアミン塩からなる群より選ばれた少なくとも１つの解離剤を接触させて解離溶液を得る工程であって、ここで、溶解した解離剤の濃度が、解離溶液１リットル当り解離剤が少なくとも約１ｇ当量の規定度であり、該解離溶液のｐＨが約４．５〜約９．５であり、それにより未修飾ヘモグロビン二量体が形成される工程、及び
ｂ）該解離溶液中に分子間架橋ヘモグロビンを保持しながら、解離溶液から該未修飾ヘモグロビンニ量体を分離する工程。
【請求項１６】
解離溶液が、マグネシウム塩を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
解離溶液が、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール及びエチレンジアミン四酢酸をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
解離溶液のｐＨが約５．５〜８．０である、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
血液の損失（例えば、急性出血からの又は外科手術の間）から生じる、貧血（例えば、悪性貧血又は鎌状赤血球貧血）により生じる、若しくはショック（例えば、容量欠乏ショック、アナフィラキシーショック、敗血症性ショック又はアレルギー性ショック）により生じる低酸素症を治療し、又は防止するために、代用血液が必要とされている。
これらの役割のための血液及び血液画分の代用血液としての使用は、不利な点を伴っている。例えば、全血の使用は、しばしば、肝炎生産ウイルス及びＡＩＤＳ生産ウイルスの伝達のリスクをともない、それは患者を完全に回復させることができるが又患者を死亡させることもできる。さらに、全血の使用は、免疫血液学的な問題及びドナー間の不適合性を避けるために血液型及び交差試験を必要とする。
代用血液としてのヘモグロビンは、浸透活性並びに酸素輸送及び酸素転移の能力を有している。しかしながら、水溶性ヘモグロビンは、四量体（分子量６８，０００）型と二量体（分子量３４，０００）型の間で平衡して存在している。ヘモグロビン二量体は、腎臓により排出され、一般的に２〜４時間の血漿半減期を有するこのような溶液を持つヘモグロビン溶液の急性血管内排出を生じる。
ヘモグロビンを分子的に修飾することによりヘモグロビン溶液の特有の限界を克服することに努力が向けられてきた。ヘモグロビンの分子内的な及び分子間的な架橋は、一般的に腎臓の排除量を減少させ、血管内維持時間を増加させる。
しかしながら、一般的に、架橋されたヘモグロビンの溶液には、かなりの未修飾四量体ヘモグロビン画分がなお含まれている。この未修飾四量体ヘモグロビンは二量体ヘモグロビンに転換され、次に生体から排出され得るため、架橋ヘモグロビン代用血液について平均の血管内維持時間を減少させる。さらに、標準的な濾過等の分離のための既知の方法では、未修飾四量体ヘモグロビンと修飾四量体ヘモグロビンを十分に区別できない。
従って、架橋ヘモグロビン代用血液の調製における最近の進歩にもかかわらず、代用血液の平均血管内維持時間を改良し、重大なレベルのヘモグロビンの腎臓排出を防ぐために、分子内的に及び／又は分子間的に架橋されたヘモグロビン代用血液の溶液から効果的に未修飾ヘモグロビンを分離する方法の必要性が依然として存在し続けている。
発明の要約
本発明は、ヘモグロビン溶液中の架橋ヘモグロビンから未修飾ヘモグロビンを分離する方法に関する。この方法は、少なくとも１つの解離剤（dissociation agent）とヘモグロビン溶液を接触させ、未修飾四量体ヘモグロビンが解離され、ヘモグロビン二量体が形成された解離溶液（dissociation solution）を得ることを含む。次に、解離溶液中に架橋されたヘモグロビンを保持したまま、ヘモグロビン二量体を解離溶液から分離する。
本発明の利点としては、改良された血管内維持時間、ヘモグロビンの有意量の腎臓排出及びそれらに関連した副作用の低下又は除去、適切な膨張圧、並びに高血圧作用の減少を有する代用血液を提供することが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による修飾ヘモグロビン代用血液から未修飾ヘモグロビンを分離する方法の概要の流れ図を表わしている。
図２は、溶液における、本発明の方法により処理された、修飾ヘモグロビン重合体の分子量分布を表わしている。
発明の詳細な説明
本発明のヘモグロビン（Ｈｂ）溶液に合うＨｂは、ヒト及びウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の他の脊椎動物由来の新しい、古い又は旧式の血液から得ることができる。さらに、BI0/TECHNOLOGY,12:55-59（1994）に記載のトランスジェニック的に生産されたＨｂ等のトランスジェニック的に生産されたヘモグロビン及びNature, 356:258-260（1992）に記載の組換え的に生産されたヘモグロビン等の組換え的に生産されたヘモグロビンも本発明のＨｂ溶液に適当である。
血液は、生きた又は屠殺されてすぐのドナーから集めることができる。赤血球由来のヘモグロビンを得るための適当な方法の例は、ラウシュら（Rausch et al）の、発行済みの米国特許第５，０８４，５５８号明細書及び第５，２９６，４６５号明細書に記載されている。
ヘモグロビンを、この技術分野で公知であるような洗浄及び溶菌の好適な方法により、赤血球、又は組換え型細菌から得る。
適当なヘモグロビン溶液は解離Ｈｂの水溶液からなり、該解離Ｈｂは、修飾四量体Ｈｂ及び／又は重合化Ｈｂに加えて、未修飾Ｈｂを含む。
本明細書で定義されるように、未修飾ヘモグロビンは、水溶液中で解離し、Ｈｂ二量体になることができる解離していない四量体中のヘモグロビンであり、解離Ｈｂ二量体である。さらに、Ｈｂ二量体は解離してＨｂサブユニット（単量体）になることができる。未修飾ＨｂはＨｂ溶液内で遊離（重合化されていない）していてもよく及び／又はＨｂ溶液内で分子間で架橋され、重合体鎖になっていてもよい。
本明細書で定義されるように、架橋ヘモグロビンは、修飾及び／又は重合化されるものである。Ｈｂ重合体鎖に含まれる未修飾Ｈｂについて、分子間で架橋されていない二量体はどれも、本発明の方法により解離し、分離することができる。
本明細書で定義されるように、修飾ヘモグロビンは、Ｈｂ四量体の水溶液中での有意な解離を妨げるために分子内架橋され、Ｈｂ二量体になるＨｂである。
重合化ヘモグロビンにおいて、Ｈｂ四量体は分子間架橋され、Ｈｂ重合体鎖を形成する。ヘモグロビン重合体は、修飾ヘモグロビン、未修飾ヘモグロビン、又はそれらの組み合わせを含むことができる。この方法において、もしＨｂ二量体が他のＨｂ四量体に分子間的に結合しないならば、水溶液中において、重合体鎖内の未修飾Ｈｂ四量体からＨｂ二量体を解離することができる。
本発明の方法においては、少なくとも１つの解離剤を水溶液中のヘモグロビンと接触させ、解離溶液を調製する。適当な解離剤は、それを未修飾ヘモグロビン四量体にさらした時に、未修飾Ｈｂ四量体中のＨｂ二量体間の水素結合の少なくとも一部分を破壊し、未修飾Ｈｂ四量体を解離し、独立したα1β1及び／又はα2β2Ｈｂ二量体を生じさせるような水溶液内の濃度において、水溶性の薬剤である。また、Ｈｂ二量体は、さらに解離しＨｂサブユニット（α1、α2、β1及びβ2）を形成しても良い。
解離溶液は、一般的に、ある濃度に溶解した、解離溶液１Ｌ当たり約１ｇｍ当量又はそれ以上の解離剤の規定度若しくはそれ以上の規定度を有する解離剤を含む。好ましくは、解離溶液内の解離剤濃度は、約１．４Ｎより大きい。
解離剤は、水溶液中では、イオン性又は強く分極していなければならない。適当な解離剤の例としては、水溶解性無機塩（例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及び亜鉛塩）、水溶解性有機塩（例えば、トリエチルアミン塩酸塩）、及び水溶解性有機アミン（例えば、グアニジン）が挙げられる。好ましい解離剤としては、無機塩、又はＣａ+2、Ｍｇ+2又はＺｎ+2のような多価金属カチオンを少なくとも１つ含む塩である。
本明細書に定義されるように、水溶解性は、その物質が室温で水に十分に溶解し、そしてＨｂと接触させた時に、未修飾Ｈｂ四量体中のＨｂ二量体間の水素結合の少なくとも一部分を破壊するのに十分な程度の濃度の溶液が得られることを意味する。
Ｈｂ溶液と接触させる前に解離剤を水溶液中に溶解させても良く、又は逆に、水溶性Ｈｂ溶液と接触した後に解離剤が続いて溶解するように、解離剤は粉体状又は粒子状の固体でも良い。
解離剤かＨｂ溶液のいずれか一方を他方に添加し、若しくはそれらを共に添加することができる。比較的低い剪断条件下で解離剤及びＨｂ溶液を混合する。
適当なヘモグロビン溶液の例としては、ボンハード（Bonhard）の、発行済みの米国特許第３，８６４，４７８号明細書に記載される安定化２，３−ジホスホグリセレートレベルを有する解離剤；マザー（Mazur）の、発行済みの米国特許第３，９２５，３４４号明細書、又はボンセンら（Bonsen et al.）の、発行済みの米国特許第４，００１，２００号明細書、第４，００１，４０１号明細書及び第４，０５３，５９０号明細書、又はモリスら（Morris et al.）の、発行済みの米国特許第４，０６１，７３６号明細書、又はスキャノン（Scanon）の、発行済みの米国特許第４，４７３，４９６号明細書に記載される架橋ヘモグロビン；ドクジ（Doczi）の、発行済みの米国特許第３，９９１，１８１号明細書、又はシモンズら（Simmonds et al.）の、発行済みの米国特許第４，４０１，６５２号明細書、又はコッセら（Kothe et al.）の、発行済みの米国特許第４，５２６，７１５号明細書に記載の無血漿性ヘモグロビン；ウォング（Wong）の、発行済みの米国特許第４，０６４，１１８号明細書に記載の多糖に結合したヘモグロビン；ボンハードら（Bonhard et al.）の、発行済みの米国特許第４，１３６，０９３号明細書に記載のピリドキサールリン酸と縮合したヘモグロビン；ボンハードら（Bonhard et al.）の、発行済みの米国特許第４，３３６，２４８号明細書に記載のジアルデヒド結合ヘモグロビン；アジサカら（Ajisaka et al.）の、発行済みの米国特許第４，３７７，５１２号明細書に記載のイヌリンと共有結合するヘモグロビン；イワシタら（Iwashita et al.）の、発行済みの米国特許第４，４１２，９８９号明細書、又はイワサキら（Iwasaki et al.）の、発行済みの米国特許第４，６７０，４１７号明細書、又はノーら（Nho et al.）の、発行済みの米国特許第５，２３４，９０３号明細書に記載のポリアルキレングリコール又はポリアルキレンオキシドと結合するヘモグロビン又はヘモグロビン誘導体；ボンハードら（Bonhard et al.）の、発行済みの米国特許第４，４３９，３５７号明細書に記載の無ピローゲン性及び無血漿性ヘモグロビン溶液；ティー（Tye）の、発行済みの米国特許第４，４７３，４９４号明細書に記載の無血漿性、無非ヘモ蛋白質性ヘモグロビン；ティー（Tye）の、発行済みの米国特許第４，５２９，７１９号明細書に記載の修飾した架橋無血漿性ヘモグロビン；ブッシら（Bucci et al.）の、発行済みの米国特許第４，５８４，１３０号明細書に記載の無血漿遊離性架橋ヘモグロビン；ワルダーら（Walder, et al.）の、発行済みの米国特許第４，５９８，０６４号明細書及び参考文献３４，２７１号に記載のα−架橋したヘモグロビン；ヒシア（Hsia）の、発行済みの米国特許第４，８５７，６３６号明細書に記載の安定アルデヒド重合したヘモグロビン；フェーラーら（Feller et al.）の、発行済みの米国特許第４，９２０，１９４号明細書に記載の硫酸化グリコサミノグリカンに共有結合したヘモグロビン；サーニー（Cerny）の、発行済みの米国特許第４，９００，７８０号明細書に記載の反応性アルデヒド成分を有する高分子量重合体と反応する修飾ヘモグロビン；ハイら（Hai et al.）の、発行済みの米国特許第５，１２８，４５２号明細書に記載のトリポリリン酸ナトリウムの存在下での架橋ヘモグロビン；ヒシア（Hsia）の、発行済みの米国特許第���，１８９，１４９号明細書に記載の安定、ポリアルデヒド重合化ヘモグロビン；クルガーら（Kluger et al.）の、発行済みの米国特許第５，２５０，６６５号明細書に記載のβ−架橋したヘモグロビン等が挙げられる。適当なＨｂ溶液のその他の例はラウシュら（Rausch et al.）の、発行済みの米国特許第５，２９６，４６５号明細書に記載されている。
好ましい態様において、発明の方法に用いられるヘモグロビンは、重合化ヘモグロビン代用血液の形である。重合化ヘモグロビン代用血液の適当な例は、ラウシュら（Rausch et al.）の、発行済みの米国特許第５，０８４，５５８号明細書及び第５，２１７，６４８号明細書に記載されている。
発明の方法において使用するのに好ましいＨｂ代用血液の組成は、０．５エンドトキシン単位／ｍＬ未満、酸素輸送／転移能力における十分な減少を起こさないメトヘモグロビン含有量、約１〜約２５ｇ  Ｈｂ／ｄｌの間の全ヘモグロビン濃度、生理的ｐＨ及び３５ｍｅｑ／Ｌ未満の塩素イオン濃度を有する無菌水溶液である。
「エンドトキシン」という用語は、細菌の細胞壁の外膜部分として生産される細胞接合性リポ多糖を示し、それは多くの条件下で毒性である。エンドトキシン単位（ＥＵ）は、1983年の米国薬局方会議（United States Pharmacopeial Convention）、3013頁により、０．１ナノグラムの米国参照標準（U.S. reference standard）ロットＥＣ−５に含まれる活性と定義されている。１バイアルのＥＣ−５は、１０，０００ＥＵを含む。
ｐＨ及び温度等の解離溶液内の条件は、Ｈｂの変性により生じるようなＨｂの酸素運搬及び放出能力を深刻に減少させない範囲内である。かかる適当な条件は、当該技術分野において古くから知られている。
解離溶液のｐＨは、Ｈｂ四量体解離が起こるのに必要な低さ、酸に誘導されたＨｂの変性を大きく妨げるのに必要な高さでなければならない。典型的に、ｐＨは、約４．５〜約９．５の間で維持される。解離溶液のｐＨは酸性であることが好ましい。
また、他の態様において、安定なｐＨ領域内、典型的には約４．５〜約９．５に解離溶液を維持するために、解離溶液は緩衝剤を含む。緩衝剤は、１以上の化合物からなることができる。
好ましい緩衝剤としては、５．５〜８．０の間のｐＨ領域を持つ２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ビス−トリス）が挙げられる。
固体（粉体若しくは粒子状）緩衝剤又は緩衝剤水溶液をＨｂ溶液に添加することにより、解離溶液を緩衝化することができる。さらに、緩衝剤を、Ｈｂ溶液と接触させる前に、解離剤の水溶液に添加することができる。
さらに他の態様において、解離溶液は、自動酸化によるメトヘモグロビンの形成を最少にするのに適切な量の安定化剤をさらに含有する。安定化剤の適切な量の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の０．１ｍＭ溶液である。
この方法に用いるヘモグロビン溶液を、典型的に、微生物成長又は生体負担（bioburden）を最小限に抑えることのできる条件下に維持する（例えば、温度を約０℃以上及び約２０℃未満に維持する）。温度を約１５℃以下に維持することが好ましい。温度を約１０℃〜約１２℃に維持することがより好ましい。
次に、解離溶液を濾過し、修飾Ｈｂ及び／又は重合化Ｈｂから解離Ｈｂ二量体を分離することによりＨｂ溶液を精製する。適当なフィルターとしては、濾液中で、約４０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの間のカットアウト分子量の成分を通す限外濾過装置が挙げられる。濾過の間、修飾四量体Ｈｂより直径の小さい、若しくは流体又は溶解しているＨｂ溶液の成分は、濾過物と共にフィルターを通過する。しかしながら、修飾Ｈｂ四量体及び重合化Ｈｂは、一般的に濃縮物（retentate）に残る。
５０，０００ダルトン限外濾過装置は、修飾Ｈｂ四量体又は重合化Ｈｂの収量を大きく損失させることなく、Ｈｂ溶液からＨｂ二量体を分離することができるので好ましい。
一つの態様においては、解離溶液を一度だけ濾過する。そのかわりに、前のフィルターからの濃縮物をさらに次のフィルターにより精製する、連続した一つずつのフィルターによって、解離溶液を精製することができる。
Ｈｂ濃縮物を図１に示すように連続的に１つ以上のフィルターを通して再循環することが好ましく、それによって、その時間中未修飾Ｈｂが解離溶液中に解離し続けるように、二量体を取り除き続ける。
他の態様においては、濾過の前及び／又は濾過の間に、水又は電解質の若しくは好ましくは解離剤の水溶液を解離溶液に添加し、少なくとも個々に、濾過の間に濾液として流失した分の埋め合わせを行う。水又は水溶液をバッチ方法で又は連続的に、フィルターを通した濾液量損失の速度と同じ速度で添加する。
本発明の方法に使用する水は、蒸留水、脱イオン水、注射用蒸留水（ＷＦＩ）及び／又は低発熱物質水（ＬＰＷ）でもよい。ＷＦＩは、注射用蒸留水に関する米国薬局方（U. S. Pharmacological Specifications）に見られる脱イオン化蒸留水であることが好ましい。ＷＦＩは、Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23（1991）に詳述されている。ＬＰＷは、０．００２ＥＵ／ｍＬ未満を含有する脱イオン水であることがより好ましい。
典型的に、解離剤を添加する前における、Ｈｂ溶液から取り除いた濾液の体積がＨｂ溶液の体積の約５００％に等しい時点で、Ｈｂ濃縮物中の修飾Ｈｂ及び重合体Ｈｂから約９９％又はそれ以上の未修飾Ｈｂを分離している。
次に代用血液としてＨｂ溶液を使用する際に、Ｈｂ濃縮物中のヘモグロビンを洗浄し、生理的緩衝液とダイアフィルトレーション（diafiltration）することにより、平衡化して代用血液の生理的許容能力を確実にする。適切な生理的緩衝液としては、ＷＦＩ中に生理的に許容できるレベルの電解質（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ2）を有する緩衝液が挙げられる。緩衝液が、１０，０００ダルトン限外濾過装置を用いた濾過等により脱発熱物質化され、脱酸素化されることが好ましい。
さらに、緩衝溶液としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、システイン、亜ジチオン酸ナトリウム又はアスコルビン酸塩等の溶解性非毒性還元剤を含有したものでも良く、それにより、化学的に代用血液中の酸素を除去し、メトヘモグロビン形成を減少させる。Ｈｂ代用血液について、メトヘモグロビン含有量が約２５％以上であると、典型的に酸素運搬能力においてかなりの減少を生じる。メトヘモグロビン含有量は約１５％未満であることが好ましい。Ｈｂ代用血液中のメトヘモグロビン含有量が約１０％以下であることがより好ましい。
また、解離緩衝液と同様に、実施例IIIに示すように、Ｈｂの酸素化により、未修飾ヘモグロビンのＨｂ二量体への解離が生じる。しかしながら、Ｈｂの酸素化は、また、メトヘモグロビン形成を促進する。
生理的緩衝液及び還元剤が単独に又は組み合わされて、バッチ方式で又は連続供給方式で、Ｈｂ濃縮物に添加できることは理解されている。
好ましい態様において、Ｈｂ溶液がヒト及び／又は他の脊椎動物に生理的に許容されるまで、生理的緩衝液に対してダイアフィルトレーションすることによりＨｂ濃縮物を洗浄する。
典型的には、ダイアフィルター（diafilter）を通してのダイアフィルトレーションの間に失う液量が、洗浄前のＨｂ濃縮液の初期の液量の約５倍又はそれ以上になるまで、ダイアフィルトレーションを続ける。より好ましい態様において、約１０倍の液量が交換されるまで、ダイアフィルトレーションを続ける。
さらに、この方法の使用の詳細は、未修飾Ｈｂを重合体Ｈｂ溶液から除去するために、実施例Ｉ及びIIに提供されている。
この方法において、安定重合化ヘモグロビン代用血液を調製する工程に関する構成部分は、滅菌製品を製造するために十分に衛生的な状態にされる。滅菌はこの技術分野で定義されているように、具体的には、その溶液が、USPXXII、セクション７１、１４８３−１４８８頁に規定される滅菌性に関する米国薬局方の基準に合致することをいう。さらに、処理流（process stream）にさらされる構成部分を、その処理流と反応しない又はその処理流を汚染しない材質で常に加工又は被覆するのが通例である。かかる材質としては、ステンレス鋼及びインコネル等の他のスチール合金を挙げることができる。
この方法で用いるポンプとしては蠕動型、膜型、ギア型、ピストン型又はロータリーローブ型ポンプがある。膜型ポンプはイリノイ州、バッファローグローブのブランルベム社（Branne Lubbem Inc.）のものが利用できる。好適なロータリーローブポンプとしては、ジョージア州、アトランタのアルビンポンプ社（Albin Pump Inc.）のアルビンＳＬＰ  １１０  Ｐ５１  Ｂ１衛生ローブロータリーポンプが挙げられる。また、ロータリーローブポンプはウィスコンシン州、ウォーキーショーのウォーキーショーポンプス（Waukesha Pumps）から得ることができる。
系１０の一つの態様として、修飾Ｈｂ四量体及び／又は重合体Ｈｂを含むＨｂ溶液から未修飾ヘモグロビンを分離するための方法を行うのに適当なものを、図Ｉに図示する。系１０はタンク１２、ポンプ１４、精製フィルター１６及びダイアフィルター１８を有する。ポンプ１４は、タンク１２上に吸引力をかけ、精製フィルター１６及び／又はダイアフィルター１８を通してＨｂ溶液を再循環させる。精製フィルター１６及びダイアフィルター１８は平行に又は連続した配置で作動させることができる。タンク１２は、タンク１２内で調製できる又はタンク１２内に移動される前に調製できるＨｂ溶液を含む。
それから、解離溶液を調製するために、Ｈｂ四量体を解離させてＨｂ二量体にするのに適切な量のＨｂ解離剤を、系１０中のＨｂ溶液と接触させる。一般的に解離剤は、解離剤供給機２０からタンク１２内に導入される。しかしながら、解離剤を系１０中の他の位置で添加できることが含まれる。また、解離剤をバッチ方式又は連続供給方式でＨｂ溶液に添加できることも含まれる。
それから、解離溶液中の解離剤及びＨｂ溶液を低剪断混合機、特に静置混合機２２により混合する。解離剤及びＨｂ溶液を、孔（示さず）を通してポンプ１２及び静置混合機２２によってタンク１２から解離溶液を再循環することにより混合する。
静置混合機２２は、典型的に、ポンプ１４の下流、精製フィルター１６の上流に位置するが、静置混合機２２は代わりに、系１０における他の部分に位置することができる。
それから、解離溶液中の未修飾ヘモグロビンは未修飾Ｈｂ四量体からＨｂ二量体への解離を始める。Ｈｂ二量体は、それぞれ約３２，０００ダルトンの分子量を有している。
それから、解離溶液を精製フィルター１６を通して再循環し、濾液中のＨｂ二量体を取り除き、Ｈｂ濃縮物中に修飾Ｈｂ及び重合体Ｈｂを保持させる。濾過間に、安定化四量体Ｈｂより直径の小さい、又は流体である解離溶液の成分を、濾液と共に精製フィルター１６を通す。適切な精製フィルターの例としては、約４０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン間の分子量カットアウトを有する限外濾過装置が挙げられる。
連続供給方式において、精製フィルター１６を通して濾液の損失の速度と同じ速度で、液体又は溶解した解離剤を連続して添加して埋め合わせる。他の態様においては、精製フィルター１６を通して排出される濾液の容量を濾過ポンプ２４により調節する。
典型的に、精製フィルター１６から排出された濾液の容量が系１０に解離剤を添加する前にタンク２２中に含まれるＨｂ溶液の容量の約５００％と等しくなる時に、Ｈｂ濃縮物からの未修飾Ｈｂの分離を完了する。
それから、他の態様において、Ｈｂ濃縮物を洗浄し、Ｈｂ濃縮物が代用血液として生理的に許容できるようにするため、生理的緩衝液を用いてダイアフィルトレーションによりＨｂ濃縮物を平衡化する。生理的緩衝液を、生理的緩衝液供給機２６からタンク１２内に導入する。しかしながら、生理的緩衝液を系１０のどの位置においても添加できることが含められる。また、生理的緩衝液をバッチ方式又は連続供給方式でＨｂ濃縮物に添加することができることも含められる。
好ましい生理的緩衝液としては、ＷＦＩ中の２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2（ｐＨ８）が挙げられる。
それから、静置混合機２２及びダイアフィルター１８を通してポンプ１４によって、タンク１２からＨｂ濃縮物及び生理的緩衝液を再循環することにより、Ｈｂ濃縮物をダイアフィルトレートする。ダイアフィルター１８は、静置混合機２２の下流、タンク１２の上流に位置する。代用血液が生理的に許容されるようになるまでダイアフィルトレーションを続ける。典型的に、ダイアフィルター１８を通してのダイアフィルトレーションにより、液量の損失が系１０におけるＨｂ濃縮物の初期容量の少なくとも５倍になったとき、代用血液は生理的に許容できるようになる。
Ｈｂ解離及びＨｂ濃縮物ダイアフィルトレーションの間、タンク１４においてＨｂ温度を約８℃〜１２℃に維持する。Ｈｂ温度を制御する良好な手段の例としては、エチレングリコール被覆化冷却系（図示せず）の使用を通じてタンク１４の外側を冷却することが挙げられる。
さらに本発明を説明するが、本発明は以下の実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例Ｉ
より高濃度の解離緩衝液を含む脱酸素化Ｈｂ溶液のダイアフィルトレーション
ラウシュら（Rausch et al.）の、発行済みの米国特許第５，０８４，５５８号明細書の実施例１に記載の方法により重合化Ｈｂ溶液を調製した。このＨｂ溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析し、このＨｂ溶液が約４５％のＨｂ二量体、約１５％の未修飾Ｈｂ四量体、及び未修飾四量体より大きな約４０％の重合化Ｈｂ分子から成ることが分かった。
１．５Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．１Ｍ  ビス−トリス及び０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）を含む解離緩衝液１ＬをＨｂ溶液１Ｌに添加した。次に、この混合物を１００ｋＤポリスルホン限外濾過装置（ミリポアカタログ番号：ＰＴＨＫ０００Ｃ５）を通して再循環させ、１Ｌの容積に混合物を濃縮した。次に、０．７Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０５Ｍビス−トリス及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）から成る解離緩衝液の１１容量を用いて、濃縮された混合物をダイアフィルトレーションした。次に、濾過したＨｂ溶液を洗浄し、ＷＦＩ中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ及び１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む脱酸素化緩衝液を用いて平衡化した。次に、得られるＨｂ溶液の分子量分布をＧＰＣにより分析した。
これらの分析の結果を図IIに示す。次に、Ｈｂ溶液は、約５％のＨｂ二量体、約１０％のＨｂ四量体及び四量体より大きい約８５％の重合化Ｈｂ分子から最終的に構成されることが分かった。
実施例II
より低濃度の解離緩衝液を含む脱酸素化Ｈｂ溶液のダイアフィルトレーション
０．７５Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０５Ｍビス−トリス及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む解離緩衝液１７０ｍＬを実施例Ｉの初期重合化Ｈｂ溶液１５ｍＬに添加し、次に、２倍濃度の解離緩衝液１５ｍＬを添加した。次に、Ｈｂ溶液をケミニアー社／ケニックス静置混合機を通じて再循環し、次に１００ｋＤ限外濾過装置（アミコン  ＹＭ  １００、カタログ番号１４４５１）によりダイアフィルトレーションし、２００ｍＬのＨｂ溶液を得た。
次に、Ｈｂ溶液を、解離緩衝液の容量を３回変化させてダイアフィルトレーションし、最後にＷＦＩ中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ及び１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む脱酸素化緩衝液で洗浄し、平衡化した。得られるＨｂ溶液の分子量分布をＧＰＣにより分析した。
これらの分析の結果を図IIに示す。次に、Ｈｂ溶液は、約１５％のＨｂ二量体、約１５％のＨｂ四量体及び四量体より大きい約７０％の重合化Ｈｂ分子から最終的に構成されることが分かった。次に、本発明の方法は、重合化Ｈｂ溶液中の未修飾ヘモグロビン含有量を減少させる効果があった。
実施例III
解離緩衝液を用いない酸素化及び脱酸素化Ｈｂ溶液の合成並びにダイアフィルトレーション
米国特許第５，２９６，４６５号明細書に記載されているように、ウシ全血のサンプルを集め、抗凝固剤のクエン酸ナトリウムを混合して血液溶液を得、次いでエンドトキシンレベルについて分析を行った。
それぞれの血液溶液サンプルを集めた後約２℃で維持し、次いで６００メッシュのふるいで濾過して大きな凝集物及び粒子を除いた。
プールを行う（pooling）前に、それぞれの血液溶液サンプルのペニシリンレベルを、ミシガン州デトロイトのディフコから購入した測定キットを用いての、「牛乳中ペニシリン迅速検出法（Rapid Detection of Penicillin Milk）」という名称の方法によって測定し、血液溶液サンプルのペニシリンレベルが０．００８単位／ｍＬ以下であることを確認した。
次いで、血液溶液サンプルをプールし、発熱性物質が除かれた（depyrogenated）クエン酸ナトリウム水溶液と混合して、ウシ全血中に、０．２重量％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を得た（以下、「０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液」）。
次いで、０．２％クエン酸ナトリウム血液溶液を、８００μｍ及び５０μｍのポリプロピレンフィルターに連続して通して、約５０μｍ以上の直径の、大きな血液溶液の残渣を除去した。
次いで、ＲＢＣを洗浄して、ＲＢＣから細胞外血漿性タンパク質、例えばＢＳＡ又はＩｇＧ、を分離した。血液溶液に含まれるＲＢＣを洗浄するために、まず最初に、ダイアフィルトレーションタンクに、ダイアフィルトレーションタンクにある血液溶液と同量の濾過済みの等張液を添加して希釈した。等張液はミリポアの（カタログ番号ＣＤＵＦ  ０５０  Ｇｌ）１０，０００ダルトン限外濾過膜で濾過された。等張液は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）中に、６．０ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、８．０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムから構成されるものであった。次いで、希釈された血液溶液を、０．２μｍのホローファイバー（マイクロゴン  クロスフロ  ＩＩ  マイクロフィルトレーション  カートリッジ（Microgon Krosflo II microfiltration cartridge））を用いてのダイアフィルターにより、もとの体積にまで濃縮した。同時に、補充として、０．２μｍのダイアフィルターによる濾過による減少速度と同じ速度で、濾過済み等張液を連続的に添加した。ダイフィルトレーションの間に、希釈された血液溶液の、明らかにＲＢＣより直径が小さい成分、又は血漿等の液体成分は、濾過によって０．２μｍのダイアフィルターの壁を通過した。ＲＢＣ、血小板及び希釈された血液溶液のより大きなかたまり、例えば白血球は、連続的な等張液の添加によっても残存し、そして透析された血液溶液を得た。
ＲＢＣの洗浄の間、希釈された血液溶液を約１０〜２５℃の温度に、ダイアフィルターの入口の液圧を約１２０Ｎ／ｍ2（２５ｐｓｉ）〜約１４０Ｎ／ｍ2（３０ｐｓｉ）に維持し、プロセスの効率化を図った。
ダイアフィルターによる濾過排出液の体積が、濾過済みの等張液による希釈前の血液溶液の体積の約６００％と等しくなった時点で、ＲＢＣの洗浄を終了した。
次いで、透析された血液溶液を、シャープレス  スーパー  セントリフュージ、モデル番号ＡＳ−１６、ナンバー２８リングダム（ringdam）付き、に対して毎分約４リットルの速度で連続的に供給した。遠心分離機の運転は血液溶液の供給と同時に行い、白血球及び血小板からＲＢＣを分離した。運転の間、ＲＢＣが重いＲＢＣ相に分離するのに充分な、その一方、白血球（ＷＢＣ）及び血小板の実質的な部分も軽いＷＢＣ相に分離するのに充分な回転数、具体的には約１５，０００ｒｐｍで回転させた。ＲＢＣ相の一画分とＷＢＣ相の一画分を別々に、連続的に運転の間に遠心分離機から抜き出した。
ＲＢＣの分離に続いて、ＲＢＣを溶液させてヘモグロビン含有溶液を得た。ＲＢＣの実質的な部分は、遠心分離機からＲＢＣを排出する際に、機械的に溶解させた。遠心分離機の中からのＲＢＣ相の流れに対して、ある角度を持っているＲＢＣ相排出ラインの壁に衝突した際に、ＲＢＣの細胞膜は破裂した。それによりＲＢＣからヘモグロビン（Ｈｂ）がＲＢＣ相へ放たれた。
次いで、溶解ＲＢＣ相を、排出ラインを経て静置混合機（６エレメント（elements）付きケニクス（Kenics）１／２インチ、ケミナー（Chemineer）社）へ流し出した。ＲＢＣ相の静置混合機への移し換えと同時に、等量のＷＦＩも静置混合機へ注入し、そこでＷＦＩをＲＢＣ相と混合させた。ＲＢＣ相とＷＦＩの静置混合機への注入速度は、それぞれ約４×１０-6ｍ3／秒（毎分０．２５リットル）である。
静置混合機内でのＲＢＣ相とＷＦＩの混合により、溶解ＲＢＣコロイドが得られた。次いで、静置混合機から、溶解ＲＢＣコロイドを、Ｈｂを非ヘモグロビンＲＢＣ成分から分離するのに適したシャープレス  スーパー  セントリフュージ（モデル番号ＡＳ−１６、シャープレス  ディビジョン  アルファ−レイバル  セパレーション（Alfa-Laval Separation）インコーポレイテッド）に移した。この遠心分離機を、溶解ＲＢＣコロイドを軽いＨｂ相と重い相に分離するのに充分な回転数で回転させた。軽い相は、ＨｂとさらにＨｂの密度とほぼ等しいかより小さい非ヘモグロビン成分から構成されていた。
遠心分離機から、０．４５μｍのミリポア  ペリコン  カセット（Millipore Pellicon Cassette）、カタログ番号ＨＶＬＰ  ０００  Ｃ５  マイクロフィルター、を通してＨｂ相を連続的に抜き出し、Ｈｂ精製用に用意された保持タンクに移した。次いで、細胞ストロマを保留分（retentate）とともにマイクロフィルターから保持タンクに戻した。精密濾過の間は、保持タンクの温度を１０℃以下に維持した。効率化を図るために、マイクロフィルター入口の液圧が初期の約４８Ｎ／ｍ2（１０ｐｓｉ）〜約１２０Ｎ／ｍ2（２５ｐｓｉ）に高まった時点で精密濾過を終えた。次いで、精密濾過を行ったＨｂをマイクロフィルターから精密濾過用タンクに移した。
次いで、精密濾過を行ったＨｂを、１００，０００  ミリポア  カタログ番号  ＣＤＵＦ  ０５０  Ｈ１  限外濾過膜に供給した。精密濾過を行ったＨｂに含まれる、Ｈｂの実質的な部分と水は１００，０００ダルトンの限外濾過膜を透過し、そしてＨｂの限外濾過物を得、一方、約１００，０００ダルトンを超える分子量のタンパク質等の、より大きな細胞の残渣は残存し、精密濾過用タンクに再循環されて戻された。同時に、補充として、限外濾過に伴う水の減少に対応して、ＷＦＩを連続的に加えた。大まかに言えば、細胞の残渣は、Ｈｂ、より小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素及び代謝中間体有機物以外の、すべての完全な細胞性成分及びその断片を含む。精密濾過用タンクのＨｂ濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満となるまで、限外濾過を続けた。Ｈｂの限外濾過の際、精密濾過用タンク内の温度や約１０℃に維持した。
Ｈｂの限外濾過物を限外濾過タンクに移し、次いで、ここで、Ｈｂの限外濾過物を３０，０００ダルトン  ミリポア  カタログ番号  ＣＤＵＦ  ０５０  Ｔ１  限外濾過膜に再循環させてより小さな細胞成分、例えば、電解質、補酵素、代謝中間体及び約３０，０００ダルトンに満たないタンパク質を除き、それにより、約１００ｇ  Ｈｂ／リットルの濃縮Ｈｂ溶液を得た。
次いで、濃縮Ｈｂ溶液を、限外濾過タンクから、並列（parallel）クロマトグラフィー用カラム（長さ２フィート、内径８インチ）の中の媒体に導き、高性能液体クロマトグラフィーによってＨｂを分離した。クロマトグラフィー用カラムには、Ｈｂと非ヘモグロビンタンパク質とを分離するのに適した陰イオン交換媒体が含まれていた。この陰イオンは交換媒体はシリカゲルから形成されていた。このシリカゲルは、γ−グリシドキシ  プロピルシランに曝されて活性エポキシド基が形成され、次いでＣ3Ｈ7（ＣＨ3）ＮＣｌに曝されて四級アンモニウム陰イオン交換媒体が形成されたものであった。シリカゲルを処理するこの方法は、ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、120:321-3133（1976）に記載されている。
それぞれのカフムを、最初の、Ｈｂの結合を促進させる緩衝液でクロマトグラフィー用カラムを洗浄して前処理とした。４．５２リットルの濃縮Ｈｂ溶液をそれぞれのクロマトグラフィー用カラムに注入した。濃縮Ｈｂ溶液の注入後、次いで、三種類の異なる緩衝液を連続的に導くことでクロマトグラフィー用カラムを洗浄し、カラム内でｐＨ勾配を付けることによってＨｂをクロマトグラフィー用カラムを通じて溶出させた。使用時のそれぞれの緩衝液の温度は約１２．４℃であった。クロマトグラフィー用カラムに注入する前に、予め緩衝液を１０，０００ダルトンの限外濾過膜に通しておいた。
この最初の緩衝液、２０ｍＭのトリス−ヒドロキシメチル  アミノメタン（トリス）（ｐＨは約８．４〜約９．４）によって、濃縮Ｈｂ溶液をクロマトグラフィー用カラム内の媒体に移し、Ｈｂを結合させた。ｐＨが約８．３の二番目の緩衝液、最初の緩衝液と三番目の緩衝液の混合物、は、次いで、混入している非ヘモグロビン成分をクロマトグラフィー用カラムから溶出させる一方、Ｈｂは留めるようなクロマトグラフィー用カラム内のｐＨに調整された。二番目の緩衝液による平衡化は、カラム１本当たり約５．９３×１０-5ｍ3／秒（毎分３．５６リットル）の流速で、約３０分間行った。二番目の緩衝液での溶出物は廃液として捨てた。次いで、三番目の緩衝液、５０ｍＭ  トリス（ｐＨは約６．５〜約７．５）、でクロマトグラフィー用カラムからＨｂを溶出させた。
次いで、Ｈｂ溶出物を、０．２２μのサルトブラン（Sartobran）カタログ番号５２３２５０７  Ｇ１ＰＨ  フィルターを通してタンクに導き、そこにＨｂ溶出物を集めた。Ｈｂ溶出物の最初の３〜４％とＨｂ溶出物の最後の３〜４％は廃液とした。
溶出物中のエンドトキシンが０．０５ＥＵ／ｍＬに満たず、そしてホスホリピドが３．３ナノモル／ｍＬに満たない場合、このＨｂ溶出物を続けて使用した。６０リットルの高純度溶出物、濃度は１００ｇ  Ｈｂ／Ｌ、に対して、９リットルの１．０Ｍ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．９）緩衝液を添加し、それにより１６０ｍＭのイオン強度のＨｂ溶液を得、Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性を低減させた。次いで、限外濾過膜、具体的には１０，０００ダルトンのミリポア  ヘリコン（Helicon）、カタログ番号  ＣＤＵＦ０５０Ｇ１  フィルター、に１０℃で再循環させて、Ｈｂの濃度が１１０ｇ／ＬとなるまでＨｂ溶液を濃縮した。
次いで、ヘキスト−セラネセ（Hoechst-Celanese）社  カタログ番号  Ｇ−２４０／４０）の０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルターフェイズトランスファーメンブレンに毎分１２リットルでＨｂ溶液を再循環させることで、Ｈｂ溶液のｐＯ2が、ＨｂＯ2の含有量で約１０％のレベルに減少するまで、そのＨｂ溶液を脱酸素化処理に付し、脱酸素化Ｈｂ溶液（以下、「脱酸素化−Ｈｂ」）を得た。同時に、チッ素ガスを毎分６０リットルの流速でフェイズトランスファーメンブレンの反対側に導いた。脱酸素化処理の間は、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃〜約３１℃の間に維持した。
脱酸素化処理の際にも、そしてそれに続くプロセスを通して、Ｈｂを低酸素環鏡下で維持して、Ｈｂによる酸素の吸収を極小化し、そして脱酸素化−Ｈｂ中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビン又はＨｂＯ2）の含有量を約１０％に満たない程度に維持した。
次いで、６０リットルの脱酸素化−Ｈｂを、１８０リットルの貯蔵緩衝液、０．２重量％のＮ−アセチルシステイン、３３ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、ｐＯ2が６．７×１０3Ｎ／ｍ2（５０ｔｏｒｒ）未満である、を用いて、限外濾過膜に通してダイアフィルトレーションを行い、酸化安定脱酸素化−Ｈｂを得た。脱酸素化−Ｈｂの混合の前に、１０，０００ダルトン  ミリポア  ヘリコン、カタログ番号ＣＤＵＦ０５０Ｇ１の発熱性物質除去フィルターを用いて、貯蔵緩衝液から発熱性物質を除いた。
限外濾過膜を通すことによる液体の減少とほぼ同じ速度で連続的に貯蔵用緩衝液を加えた。ダイアフィルトレーションは、限外濾過膜を通してのダイアフィルトレーションによる液体の減少量が、脱酸素化−Ｈｂの初期の量の約３倍になるまで続けた。この原料はこの時点で保存しても良い。
酸化安定脱酸素化−Ｈｂを重合化装置に移す前に、酸素を除去したＷＦＩを重合化リアクターに加えて重合化装置の酸素を除き、酸化安定脱酸素化−Ｈｂの酸化を防いだ。重合化装置に添加するＷＦＩの量は、酸化安定脱酸素化−Ｈｂを重合化リアクターに添加した時に約４０ｇ  Ｈｂ／Ｌの濃度のＨｂ溶液が生じる量であった。次いで、ＷＦＩを重合化装置に再循環させて、加圧したチッ素の反対側からの流れに対して、０．０５μｍのポリプロピレンマイクロフィルターフェイズトランスファーメンブレン（ヘキスト−セラネセ社  カタログ番号５ＰＣＭ−１０８、７．４ｍ2（８０平方フィート））を通す流れによりＷＦＩから酸素を除いた。フェイズトランスファーメンブレンを透過するＷＦＩとチッ素ガスの流速はそれぞれ、約３×１０-4〜３．３×１０-4ｍ3／秒（毎分１８〜２０リットル）、６．７×１０-4〜１×１０-3ｍ3／秒（毎分４０〜６０リットル）であった。
重合化装置のＷＦＩのｐＯ2が、約ｔｏｒｒ  ｐＯ2未満に減らされた後、重合化リアクターの頭部空間に、約３．３３×１０-4ｍ3／秒（毎分２０リットル）のチッ素を流して重合化リアクターをチッ素で覆った。次いで、酸化安定脱酸素化−Ｈｂを重合化リアクターに移した。
Ｈｂ溶液とＷＦＩの混合によって生じる、塩素濃度が約３５ｍＭ以下の、ｐＨ７．８のリン酸緩衝液１２ｍＭ中で重合化が行われた。
次いで、４２℃の加熱条件下、６エレメント付きケニクス１−１／２インチ静置混合機（ケミナー社）を通してＨｂ溶液を再循環させながら、酸化安定脱酸素化−ＨｂとＮ−アセチルシステインを、架橋剤のグルタルアルデヒドと、具体的にはＨｂを１ｋｇあたり２９．４ｇのグルタルアルデヒドを５時間かけて、穏やかに混合し、重合化Ｈｂ（ポリ（Ｈｂ））溶液を得た。
酸化安定脱酸素化−Ｈｂとグルタルアルデヒドを、静置混合機を通して再循環することにより、乱流条件下でグルタルアルデヒドと酸化安定脱酸素化−Ｈｂとが穏やかに均一に混合し、それにより、高濃度のグルタルアルデヒドを含む脱酸素化−Ｈｂのポケットが形成される可能性を低減させた。グルタルアルデヒドと脱酸素化−Ｈｂとを穏やかに均一に混合することで、（分子量が５００，０００ダルトンを超える）高分子量のポリ（Ｈｂ）の形成を抑え、さらに、重合化の間の、グルタルアルデヒドと脱酸素化−Ｈｂとの混合をより速くさせた。
加えて、Ｈｂの重合化の際にＮ−アセチルシステインが存在する効果として、Ｈｂの重合化の際にＨｂ分子内に架橋が明確に形成された。
重合化の後、重合化リアクターのポリ（Ｈｂ）溶液の温度を下げ、約１５℃〜約２５℃の間の温度とした。
次いで、限外濾過膜にポリ（Ｈｂ）溶液を通して再循環させ、ポリ（Ｈｂ）の濃度が約８５ｇ／Ｌに高まるまで、ポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮した。好ましい限外濾過膜としては、３０，０００ダルトン  フィルター（例えば、ミリポア  ヘリコン、カタログ番号ＣＤＵＦ０５０ＬＴ）である。
次いで、ポリ（Ｈｂ）溶液をその後、６６．７５ｇの水素化ホウ素ナトリウムと混合し、次いで、静置混合機を通して再循環を再び行った。具体的には、９リットルのポリ（Ｈｂ）溶液ごとに、０．２５Ｍの水素化ホウ素ナトリウム溶液を１リットル加え、流速を毎分０．１〜０．１２リットルとした。
ポリ（Ｈｂ）溶液に水素化ホウ素ナトリウムを添加する前に、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨをｐＨが約１０のｐＨに調整してアルカリ性にし、水素化ホウ素ナトリウムと水素ガスの発生を保護した。ポリ（Ｈｂ）溶液を、約２１５リットルの、発熱性物質と酸素が除かれた、ｐＨが約１０．４〜約１０．６の１２ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液とダイアフィルトレーションを行って、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨを調整した。重合化リアクターから、３０ｋＤの限外濾過膜を通してポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させてダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションによる、限外濾過膜を通すことによる液体の減少速度とほぼ同じ速度で、ポリ（Ｈｂ）溶液へのホウ酸ナトリウム緩衝液の添加を行った。ダイアフィルトレーションによる、限外濾過膜を通すことによる液体の減少量が重合化リアクター中のポリ（Ｈｂ）溶液の最初の量の約３倍の量となるまで、ダイアフィルトレーションを続けた。
ｐＨの調整の次に、水素化ホウ素ナトリウム溶液を重合化リアクターに添加し、ポリ（Ｈｂ）溶液中のイミン結合を還元してケトイミン結合として溶液中のポリ（Ｈｂ）を安定化させた。水素化ホウ素ナトリウムの添加の際に、重合化リアクター中のポリ（Ｈｂ）溶液を、静置混合機と０．０５μｍポリプロピレンマイクロフィルターフェイズトランスファーメンブレンを通して連続的に再循環させ、溶解している酸素と水素とを除いた。静置混合機を通して供給することにより、迅速にかつ効果的に水素化ホウ素ナトリウムとポリ（Ｈｂ）溶液とを混合する供給条件である、水素化ホウ素ナトリウムの乱流をも引き起こした。０．０５μｍフェイズトランスファーメンブレンを透過するポリ（Ｈｂ）溶液とチッ素ガスの流速はそれぞれ、約３．３×１０-5〜６．７×１０-5ｍ3／秒（毎分２．０〜４．０リットル）と約２×１０-4〜３×１０-4ｍ3／秒（毎分１２〜１８リットル）であった。水素化ホウ素ナトリウムの添加終了後、毎分７５回転で攪拌機の回転を続けている間、重合化リアクターでの還元は続いた。
水素化ホウ素ナトリウムの添加から約１時間後、重合化リアクターから３０，０００ダルトンの限外濾過膜を通して、安定ポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が１１０ｇ／Ｌとなるまで安定ポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させた。濾過され、酸素が除かれた、ＷＦＩ中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  ＮＡＣ、１１５ｍＭ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カリウム、及び１．３６ｍＭ塩化カルシウムが含まれたｐＨが小さい緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、３０，０００ダルトンの限外濾過膜を通しての、安定ポリ（Ｈｂ）溶液のダイアフィルトレーションにより、濃縮の後、ｐＨと安定ポリ（Ｈｂ）溶液の電解質を生理的なレベルに戻し、安定重合化Ｈｂ代用血液を得た。ダイアフィルトレーションは、限外濾過膜を経てのダイアフィルトレーションによる液体減少量が、濃縮Ｈｂ産物のダイアフィルトレーション前の量の６倍となるまで続けた。
ｐＨと安定ポリ（Ｈｂ）溶液の電解質を生理的なレベルに戻した後、次いで、濾過し、酸素が除かれたｐＨが小さい緩衝液を重合化リアクターに添加して、安定重合化ヘモグロビン代用血液を５．０ｇ／デシリットルの濃度に希釈した。次いで、希釈された代用血液を、重合化リアクターから静置混合機及び１００，０００ダルトンの精製用フィルターに通しての再循環により、濾過され、酸素が除かれた、ＷＦＩ中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  ＮＡＣ、１１５ｍＭ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カリウム、及び１．３６ｍＭ塩化カルシウムが含まれた緩衝液（ｐＨ７．８）に対してダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションは、代用血液中の、解離条件下でのＧＰＣによる修飾された四量体及び未修飾四量体の量が約１０％以下となるまで続けた。
精製用フィルターは、限定された浸透ライン（a restricted permeate line）を用いて低い膜間圧の条件下で実施した。修飾された四量体Ｈｂ及び未修飾四量体Ｈｂのほとんどが除かれた後、３０，０００ダルトンの限外濾過膜を通して、代用血液の濃度が１３０ｇ／リットルの濃度になるまで代用血液の再循環を続けた。
次いで、安定代用血液は、低酸素環境かつ酸素漏出の少ない好ましい容器に保存した。
次に、このＨｂ溶液をＧＰＣにより分析し、約３．５％のＨｂ二量体、３１％の未修飾Ｈｂ四量体及び約６５．５％の、未修飾四量体より大きい重合化Ｈｂ分子からなることが分かった。
補助酸素濃度計（Co-Oximeter）（コオキシメーター＃４８２型；マサチューセッツ州、レキシントンのインストルメンテイション研究所（Instrumentation Laboratory））により９５％酸素化Ｈｂバルブ（valves）が得られるまで、９８％酸素及び２％二酸化炭素からなる気体状混合物で酸素化カートリッジを通して２リットルのＨｂ溶液を酸素化した。
次に、ＷＦＩ中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ及び１．４ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む酸素化緩衝溶液の７容量を用い、１００ｋＤ限外濾過装置に対して酸素化Ｈｂ溶液をダイアフィルトレートした。この工程を通じて、Ｈｂ溶液をどの解離緩衝液とも接触させなかった。
次に、得られるＨｂ溶液の分子量分布をＧＰＣにより分析した。分子量分布は、０．５％二量体及び２．７％未修飾四量体及び約９６．８％の、未修飾四量体より大きい重合化Ｈｂであることが分かった。
次に、ダイアフィルトレーション前にＨｂ溶液を酸素化しないことを除いて、同じ重合化Ｈｂ溶液の他のサンプルで、この全工程を繰り返した。得られるＨｂ溶液の分子量分布はＧＰＣにより、２．２％二量体、２．５％未修飾四量体及び約９５．３％の、未修飾四量体より大きい重合化Ｈｂ分子であることが分かった。
これらの工程の結果により、同様にヘモグロビンの酸素化は、未修飾Ｈｂ四量体からＨｂ二量体への解離を促進することが示される。しかしながら、また酸素化は有害なメトヘモグロビンの形成も促進する。
実施例IV
分子量分析
解離条件下のヘモグロビン溶液についてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を行うことにより分子量を決定した。この分析方法は、サイズに基づいてヘモグロビン重合体の分離を行なうもので、より大きい分子はより小さい分子より速く溶出する。蛋白質分子量スタンダードと比較して、ヘモグロビン生成物の分子量と溶出時間との関連付けを可能にする。
この分析において、ヘモグロビン生成物の代表的なサンプルを分子量分布をみるために分析した。ヘモグロビン生成物を、５０ｍＭビス−トリス（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの移動相の内部で、４ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈サンプルをＨＰＬＣトーソーハースＧ３０００ＳＷカラムに注入した。流速は０．５ｍＬ／分であり、紫外線検出を２８０ｎｍで行った。
均等物
当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。これらの及び他の全てのそのような均等物は、下記請求の範囲の範疇に含まれるものである。
【図１】
0003950477.tif 000002
【図２】
0003950477.tif 000003