(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
作用：次の反応を触媒する。
３α−ヒドロキシステロイド  ＋  ＮＡＤ+   →３−ケトステロイド  ＋  ＮＡＤＨ
基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコール酸、リトコール酸に作用する。
至適温度：４５℃
至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）
ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ
分子量：２５，０００（ゲルろ過法）
２５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【請求項２】
シュードモナス属に属し、下記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養物より３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする３αーヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの製造法。
作用：次の反応を触媒する。
３α−ヒドロキシステロイド  ＋  ＮＡＤ+   →３−ケトステロイド  ＋  ＮＡＤＨ
基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコール酸、リトコール酸に作用する。
至適温度：４５℃
至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）
ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ
分子量：２５，０００（ゲルろ過法）
２５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＫｍ値の低い新規な３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその製造法に関するものである。
胆汁酸は、生体内では肝臓でコレステロールより合成され、一次胆汁酸であるコール酸、ケノデオキシコール酸が生成する。しかし、これらは腸内細菌により更に代謝され、デオキシコール酸、リトコール酸等の二次胆汁酸やウルソデオキシコール酸等の二次胆汁酸となって存在している。
胆汁中に分泌された、これらのコール酸は、一般に腸管により再吸収され、門脈を経て肝臓にもどる腸肝循環を営んでいるが、肝外側副血行、肝臓での輸送障害、胆汁うっ滞などを起こす病態で血清中に漏出してくる。このため、血清胆汁酸は肝胆道疾患のスクリーニングや経過観察に有用なマーカーとなっている。
上記胆汁酸は３αにＯＨ基を有しており、この水酸基を酸化する酵素、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが測定に利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.50)の存在は古くから知られており、１９５２年には該酵素がテストステロンで誘導されたシュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）で生産されることが報告されている。また、該酵素は既に市販されている。更に、該酵素の起源としては、ノカルディア（Nocardia）属由来の酵素（特開昭620151199 号公報) 、セルロモナス・ツルバータ(Cellulomonas turubata) 由来の酵素（特公平3-23154 号公報) が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、血清胆汁酸の濃度レベルは低く、正常値は１０μＭ以下、肝胆道疾患でも５０μＭ程度に過ぎない。このため、胆汁酸を精度良く測定するには胆汁酸に対するＫｍ値の低い３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが求められていた。
【０００４】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス（Pseudomonas)に属する微生物から、胆汁酸に対するＫｍ値の低い３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである。
作用：次の反応を触媒する。
３α−ヒドロキシステロイド  ＋  ＮＡＤ+   →３−ケトステロイド  ＋  ＮＡＤＨ
基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコール酸、リトコール酸に作用する。
至適温度：４５℃
至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）
ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ
分子量：２５，０００（ゲルろ過法）
２５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【０００６】
また、本発明はシュードモナス属に属し、上記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養物より３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの製造法である。
【０００７】
本発明の酵素の起源は、上記性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生するものであれば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良い。好ましくは、上記性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生しうるシュードモナス（Pseudomonas)属細菌であって、好適な例としては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＴＥ３６２０が挙げられる。シュードモナス・プチダＴＥ３６２０の菌学的性質は以下の通りである。
【０００８】
（ａ）形態
（１）菌形：短かん菌
（２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ
（３）細胞の多形性：無し
（４）運動性：有り
（５）胞子の有無：無し
（ｂ）各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で黄白色のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁状（Entire）であり、クッション状（Pulvinate ）である。表面は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。
（２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。沈さはないが、菌環を若干認めた。
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育する。ゼラチン液化力は弱い。
（４）リトマスミルク：アルカリ性に変化する。ミルクは固化しない。
【０００９】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：            陰性（−）
（２）硝酸塩の還元：            陽性（＋）
（３）脱窒反応：                      −
（４）ＭＲテスト：                    −
（５）ＶＰテスト：                    −
（６）インドールの生成：              −
（７）硫化水素の生成：                −
（８）デンプンの分解：                −
（９）ゼラチンの分解：                −
（１０）チロシンの分解                ＋
【００１０】
（１１）クエン酸の利用：
koser の培地                      ＋
Christensen の培地                ＋
（１２）無機窒素源の利用
硝酸ナトリウム                    −
硫酸アンモニウム                  ＋
グルタミン酸ナトリウム            ＋
（１３）色素の生成：            キングＢ培地中で蛍光色素を生成する。
（１４）ウレアーゼ                    −
（１５）オキシダーゼ                  ＋
（１６）カタラーゼ                    ＋
（１７）β−ガラクトシダーゼ          −
（１８）アルギニンジヒドロラーゼ      ＋
（１９）リジンカルボキシラーゼ        −
（２０）オルニチンカルボキシラーゼ    −
（２１）トリプトファンデアミナーゼ    −
（２２）β−グルコシダーゼ            −
【００１１】
（２３）生育の範囲：
0003997441.tif 000002
（２４）酸素に対する態度：        好気性（２５）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：Ｏ（酸化）
【００１２】
（２６）糖から酸およびガスの生成
0003997441.tif 000003
【００１３】
（２７）有機化合物の利用
Ｄ−グルコース                      ＋
Ｌ−アラビノース                    ＋
Ｄ−マンノース                      ＋
Ｄ−マンニトール                    −
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン      −
マルトース                          −
グルコン酸カリウム                  ＋
ｎ−カプリン酸                      ＋
アジピン酸                          −
ｄｌ−リンゴ酸                      ＋
酢酸フェニル                        ＋
【００１４】
上記菌学的性質同定のための実験法は、主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学会出版センター（１９８５年）によって行った。また分類同定の基準として「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９８４年）を参考にした。
以上の文献および菌学的性質を参考にすると、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に属すると考えられ、それぞれシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＴＥ３６２０と命名した。本菌は微生物寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６００７として寄託されている。
【００１５】
本発明の酵素を製造するにあたっては、上記３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物から３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取することにより製造できる。３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの生産誘導として、コール酸等の３α−ヒドロキシステロイドを添加しておくことが望ましい。
【００１６】
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、菌体内および菌体外に３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが生産蓄積される。
本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１７】
次に本発明の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、２５℃で約５分予備加温する。
０．９６ｍｌ  ５０ｍＭ      グリシン・ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．０
０．０２ｍｌ  ２０ｍＭ      ＮＡＤ+ 
０．０１ｍｌ  酵素溶液
次に基質溶液（１００ｍＭ  コール酸ナトリウム）０．０１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に℃で制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵素希釈液を加え、上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。上記条件下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によって３α−ヒドロキシステロイドに対するＫｍ値の小さい３α−ヒドロ  キシステロイドデヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例１
０．２％硝酸ナトリウム、０．２％硫酸アンモニウム、０．０５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸二カリウム、０．１％リン酸一カリウム、０．２％コール酸ナトリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、ｐスードモナス・プチダＴＥ３６２０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６００７）を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体を超音波破砕後、硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−５０によるゲルろ過により比活性１７．５Ｕ／ｍｇにまで精製した。得られた３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは下記の特性を有していた。
【００２０】
作用：下記の反応を触媒した。
３α−ヒドロキシステロイド  ＋  ＮＡＤ+   →３−ケトステロイド  ＋  ＮＡＤＨ
【００２１】
【表１】
0003997441.tif 000004
【００２２】
本酵素はＮＡＤ+ のみ利用し、ＮＡＤＰ+ は利用しなかった。
【００２３】
【表２】
0003997441.tif 000005
【００２４】
至適ｐＨ：
５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、５０ｍＭ  グリシン−ＮＡＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜９．５）、５０ｍＭ  リン酸二ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８〜１１）、５ｍＭ  ＡＰＢ（ｐＨ１１〜１１．５）中での酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す通りであって、至適ｐＨは１０〜１１であった。
【００２５】
安定ｐＨ：
０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．２〜７．８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８〜１１）中で、酵素を２５℃、１６時間保存し、残存活性を測定した。その結果は第２図に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ６〜９であった。
【００２６】
至適温度：
各温度における酵素活性を測定した。その結果は第３図に示す通りであって、至適温度は４５℃であった。
【００２７】
熱安定性：
本発明の酵素をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で１０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は第４図に示す通りであって、４０℃まで安定であった。
【００２８】
0003997441.tif 000006
【００２９】
比較例１
本発明の酵素の性質を既知の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの性質と比較した。
【００３０】
【表３】
0003997441.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図１】
0003997441.tif 000008
【図２】
0003997441.tif 000009
【図３】
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【図４】
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