(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＡ）：
【化１０】
0003961601.tif 000012
〔式中、Ｘは、Ｃ2-10アルキレンであり；Ｒ1 及びＲ2 は、独立に、Ｃ12-20 脂肪族カルボン酸のアシル残基であり；そしてＲ3 は、−（ＣＨ2)−ＣＨ（ＮＨ2)−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 基である〕で示される、複合体。
【請求項２】
式（IIＡ）：
【化３】
0003961601.tif 000013
〔式中、Ｘは、Ｃ2-10アルキレンであり；Ｒ1 及びＲ2 は、オレオイルであり；そしてＲ3 は、−（ＣＨ2)−ＣＨ（ＮＨ2)−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 基である〕で示される、複合体。
【請求項３】
ペプチドＣｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 、又はアミノ基が保護されているその誘導体。
【請求項４】
１）請求項１又は２記載の少なくとも１つの複合体及びポリヌクレオチドを含む、あるいは、
２）請求項１又は２記載の少なくとも１つの複合体、ポリヌクレオチド、並びに、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは前記複合体以外のトランスフェクション能を有する分子を含む、細胞をトランスフェクションするための組成物。
【請求項５】
１）請求項１又は２記載の少なくとも１つの複合体を含む、あるいは、
２）請求項１又は２記載の少なくとも１つの複合体、並びに、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは前記複合体以外のトランスフェクション能を有する分子を含む、細胞をトランスフェクションするための組成物。
【請求項６】
ポリヌクレオチドで細胞株をトランスフェクションするためのベクターとしての請求項１又は２記載の複合体、並びに場合により、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは前記複合体以外のトランスフェクション能を有する分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
遺伝子導入技術（Gene transfer technology）は、相当重要な分野になってきている。外因性遺伝子の細胞への導入（即ち、トランスフェクション）は、遺伝子調節及び組換えタンパク質の産生から遺伝子治療にわたる、多くの重要な科学的及び医学的な応用を産んでいる。
【０００２】
ウイルスは、遺伝子の導入に対する種々の細胞性障壁を迂回すべく進化しており、実際トランスフェクションのために選択されるベクターになっている。レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスは、今や治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残っており、ウイルスの大規模な産生は、困難であり時間がかかる。
【０００３】
これら種々の理由により、ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系が開発されている。例えば、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987)に基づくトランスフェクション法がある。このトランスフェクション法の発見により、更に多くのカチオン性脂質が合成され、幾つかは、実験室用のトランスフェクション試薬として市販されている：ＤＯＧＳ（トランスフェクタム（Transfectam)（登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リポフェクタミン（Lipofectamine)（登録商標））、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ（登録商標））。
【０００４】
しかし非ウイルス性遺伝子送達系（non-viral gene delivery systems)の処方の重要な進歩にもかかわらず、合成系のトランスフェクション効率は通常ウイルス性ベクターより低いため、より効率的な方法の必要性が今も存在する。更には、未だインビボで多くの問題が発生し、生体液中の非ウイルス系の安定性が低いため、インビボのトランスフェクションを高レベルで再現性よく行うことができない。
【０００５】
ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションは、例えば、宿主細胞又は生物で、通常ならその細胞又は生物で発現しないタンパク質を発現させるために使用することができる。例えば、プラスミドと呼ばれる自己複製ＤＮＡ分子を、通常ならそのプラスミドを含まない細胞中に、その細胞でマーカー遺伝子産物を発現させるために、又は後でその細胞から回収される組換えタンパク質のような目的のタンパク質を発現させるために、導入することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.（Cold Spring Harbor, 1989）ch. 1.を参照）。細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは治療にも使用することができる。例えば、ひとたび細胞又は細胞核に入ったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリック型塩基対形成により標的の一本鎖核酸分子に結合するか、又はフーグスティーン型塩基対形成により二本鎖核酸に結合し、こうして幾つかの機作（正常の転写、スプライシング、若しくは翻訳に必要な因子の結合を妨害すること；ＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡの酵素的分解を誘発すること；又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合した反応性基により標的を破壊すること）の１つにより標的の機能を破壊する（Zamecnic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 280-284参照）。その他の治療的応用には、遺伝子治療又はＤＮＡに基づくワクチン接種がある。
【０００６】
タンパク質及び他のアニオン性高分子は、治療及びスクリーニングの目的で細胞中に導入される。例えば、免疫原性タンパク質を細胞中に導入することにより免疫化は増強され、そのため、タンパク質はより効率的なプロセスにより細胞の表面に提示され、こうして免疫原性応答は増強されることとなる。細胞の内側で作用する負に荷電したアニオン性高分子は、疎水性細胞膜を通して、その作用を発揮する細胞質中に輸送される。ＤＮＡの転写を増強又は妨害する因子は、目的の遺伝子の転写を確認するためのスクリーニング試験に使用することができる。これらの転写アッセイを、特定の高分子（例えば、細胞レセプター）に対する化合物の作用を測定するためのスクリーニングに使用することは非常によく知られている。
【０００７】
本発明により、塩基性の膜障害性ペプチドに脂質との複合体を形成させると、ポリヌクレオチド及びアニオン性高分子に結合し、細胞のトランスフェクションに使用することのできる、新規な化合物が生じることが判った。したがって、１つの局面で本発明は、脂質と塩基性の膜障害性ペプチドとの複合体であり、かつトランスフェクション能を有する（transfection competent）分子である、新規な化合物に関する。
【０００８】
「複合体」という用語は、ペプチドに化学結合した（例えば、脂質に存在するか若しくは結合している硫黄原子と、ペプチドに存在するか若しくは結合している硫黄原子との間に形成されるジスルフィド結合；又は脂質に存在するか若しくは結合しているカルボキシル基と、ペプチドのアミノ基との間に形成されるアミド結合による）脂質よりなる化合物を意味する。
【０００９】
本明細書で使用される「脂質」という用語は、直鎖、分岐鎖、飽和又は不飽和の脂肪族カルボン酸及びリン脂質を含む。脂肪族カルボン酸の例としては、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及び（ＣＨ3(ＣＨ2)n)2 ＣＨＣＯＯＨ（式中、ｎは、３〜１９の整数である）がある。リン脂質の例としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミン類がある。
【００１０】
「塩基性ペプチド」という用語は、少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含有するペプチドを意味する。このような塩基性アミノ酸の例としては、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、リシン、アルギニン、オルニチン及びｐ−アミノフェニルアラニンのような、天然及び非天然のジアミノ−モノカルボン酸がある。
【００１１】
「膜障害性ペプチド」という用語は、膜の障壁機能を乱す細胞溶解性又は抗菌性ペプチドを意味する（G. Saberwal and R. Nagaraj, BBA 1197: 109-131, 1994)。塩基性の細胞溶解性ペプチドの例としては、メリチン（melittin）、溶血素（hemolysin)、マストパラン（mastoparan）、ボンボリチン（bombolitin）、クラブロリン（crabrolin)及びこれらの誘導体がある。塩基性の抗菌性ペプチドの例としては、セクロピン（cecropins)、マガイニン（magainins)、グラミシジンＳ（gramicidin S）及びチロシジン（tyrocidine）並びにこれらの誘導体又は類似体がある。「類似体」という用語は、元のペプチドが関与する生物学的活性を実質的に変化させることなく、１以上のアミノ酸残基が、欠失しているか、又は別のアミノ酸で置換されているペプチドのことをいう。「誘導体」という用語は、末端カルボキシル基が、エステル化されて、特にメチルエステル及びエチルエステルのような低級アルキルエステルを形成するか；又はアミド（低級アルキルアミド又はジ−低級アルキルアミド）若しくはヒドラジドに変換されているペプチドのことをいう。「低級」という用語は、１〜６個の炭素原子を含有する基を意味する。
【００１２】
したがって、１つの局面で本発明の新規な化合物は、式（Ｉ）：
【００１３】
【化４】
0003961601.tif 000002
【００１４】
〔式中、Ｒは、直鎖若しくは分岐鎖の、飽和若しくは不飽和脂肪族カルボン酸の炭化水素部分、又は自由原子価結合を有するリン脂質部分であり；Ｒ3 は、１個又は２個の炭素原子で自由原子価結合を有する塩基性膜障害性ペプチドであり；そしてｎは、１又は２である〕で示される化合物である。
【００１５】
好適には、ｎは１である。特に好適な化合物は、式（ＩＡ）：
【００１６】
【化５】
0003961601.tif 000003
【００１７】
〔式中、Ｘは、Ｃ2-10アルキレンであり；Ｒ1 及びＲ2 は、独立に、Ｃ12-20 脂肪族カルボン酸のアシル残基であり；そしてＲ3 は、上記と同義である〕で示される複合体である化合物である。
【００１８】
「Ｃ12-20」という用語は、１２〜２０個の炭素原子の数を意味する。アシル残基Ｒ1 及びＲ2 は、直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和残基であってよい。このような残基の例としては、ラウロイル、パルミトイル、ステアロイル及びオレオイルがある。好適には、Ｒ1 及びＲ2 はオレオイルである。Ｘは、好適には、エチレン、プロピレン又はデカメチレンである。
【００１９】
別の好適な局面としては、本発明は、式（II）：
【００２０】
【化６】
0003961601.tif 000004
【００２１】
〔式中、Ｒ、Ｒ3 及びｎは、上記と同義である〕で示される新規な化合物に関する。
【００２２】
式（II）の化合物において、ｎは、好適には１である。最も好適な化合物は、式（IIＡ）：
【００２３】
【化７】
0003961601.tif 000005
【００２４】
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＸは、上記と同義である〕で示される化合物である。
【００２５】
最も好適には、Ｒ3 は、−（ＣＨ2)−ＣＨ（ＮＨ2)−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 基である。
【００２６】
別の局面で本発明は、上記に定義した新規な化合物、即ち、脂質と塩基性の膜障害性ペプチドとの複合体、並びに少なくとも１つのこのような化合物、ポリヌクレオチド又は任意の他のアニオン性高分子、及び、場合により、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質、及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体（即ち、式（Ｉ）又は（II）の化合物）以外の別の公知のトランスフェクション能を有する分子を含む組成物の製造方法に関する。更に別の局面で本発明は、脂質と塩基性の膜障害性ペプチドとの複合体、並びにヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質、及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体（例えば、式（Ｉ）又は（II）の化合物）以外の別の公知のトランスフェクション能を有する分子を含む組成物に関する。本発明は更に、ポリヌクレオチド又は他の任意のアニオン性高分子で細胞をトランスフェクションするための担体としての、この新規な化合物の用途に関する。本発明の複合体化合物と、場合により、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外のトランスフェクション能を有する分子はポリヌクレオチド又は他のいかなるものであってもよいアニオン性高分子で細胞をトランスフェクションするためのベクターとして使用される。
【００２７】
本発明により提供される化合物は、式Ｒ3 ＮＨ2 のペプチドを、式Ｒ−ＣＯＯＨの脂質と反応させるか、又は式Ｒ3 ＳＨのペプチドを、式Ｒ−ＳＹ（式中、Ｙは、２−ピリジンチオのような脱離基である）の脂質と反応させることにより、調製することができる。これらの反応は、それ自体既知の方法で行うことができる。
【００２８】
したがって、式Ｒ3 ＮＨ2 のペプチドと、式Ｒ−ＣＯＯＨの脂質とのカップリングは、ペプチド結合を生成するための既知の方法と同様に、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような縮合試薬の存在下で適切な溶媒中で上記化合物を反応させることにより行うことができる。
【００２９】
式Ｒ3 ＳＨのペプチドと、式Ｒ−ＳＹの化合物との反応は、両方の反応物を可溶化する適切な溶媒又は溶媒混合物中で行うことができる。式Ｒ−ＳＹの化合物は、有機溶媒（例えば、クロロホルム）に溶解することができる。ペプチドＲ3 ＳＨは、単一相の反応系の形成を達成するために、適切には、アセトニトリルのような適量の水混和性有機溶媒を含有する水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に溶解する。
【００３０】
式Ｒ−ＣＯＯＨ及びＲ−ＳＹの化合物は、既知であるか、又は既知の方法（例えば、Biochim. Biophys. Acta 862, 435-439 (1986)に記載されるような）により調製することができる。例えば、式（III)：
【００３１】
【化８】
0003961601.tif 000006
【００３２】
〔式中、Ｒ1 及びＲ2 は、オレオイルであり；そしてＸは、エチレン、プロピレン又はデカメチレンである〕で示される化合物、及び式（IV）：
【００３３】
【化９】
0003961601.tif 000007
【００３４】
〔式中、Ｒ1 及びＲ2 は、オレオイルであり；Ｘは、エチレンであり；そしてＹは、２−ピリジンチオである〕で示される化合物は、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥ、Ｎ−ドデカニル−ＰＥ及びＮ−ＰＤＰ−ＰＥ（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA）として市販されている。
【００３５】
式（Ｉ）又は（II）の化合物を使用して、任意のアニオン性高分子を細胞中にトランスフェクションすることができる。アニオン性高分子は、１分子当たり少なくとも１つの負の電荷を含有する高分子である。本発明によりトランスフェクションすることができるアニオン性高分子の例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のような、ポリヌクレオチド；及びリボ核タンパク質及び免疫化に使用されるタンパク質（例えば、ウイルス性タンパク質）のようなタンパク質を含む。本発明の用途のためのＤＮＡの例としては、プラスミド及び遺伝子（特に、嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（ＣＦＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＨＬＡＢ７のような遺伝子治療プロトコールが既に着手されているもの）；並びに、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ及びα−１アンチトリプシンのようなリポーター遺伝子がある。ＤＮＡの他の例としては、アンチセンス、アプタマー（aptamer)又は「三重らせん」試薬として使用される、オリゴデオキシヌクレオチド及びこれらの類似体がある。ＲＮＡの例としては、リボザイム又はオリゴリボヌクレオチドアンチセンス分子がある。
【００３６】
トランスフェクションされる細胞の性質は、厳密に限定されるものではない。この細胞は、原核又は真核細胞、哺乳動物又は植物細胞であってよい。
【００３７】
本発明の複合体（例えば、式（Ｉ）又は（II）の化合物）を使用する細胞のトランスフェクションにおいて、細胞を、適量のこのような化合物の存在下でアニオン性高分子に接触させる。所定量のアニオン性高分子に対する適量の複合体（例えば、式（Ｉ）又は（II）の化合物）は、これらの各電荷に依存する。複合体とトランスフェクションする分子との間の＋／−電荷比は、一般に０．１〜１０、好適には０．５〜５の間で変化する。「＋／−電荷比」の値は、Ｒ3 基のアミノ酸上の正に荷電した基の数を、トランスフェクションする分子の負の電荷の数で割ることにより計算される。トランスフェクションする分子が、例えばポリヌクレオチドである時、負の電荷の数は、基本骨格中の負に荷電したリン酸の数を意味する。これらの範囲内の最適比は、トランスフェクションされる細胞に依存し、本発明が属する分野の当業者には容易に確認することができる。
【００３８】
細胞の数に対するアニオン性高分子の量は、１０4 個の細胞をトランスフェクションするためのアニオン性高分子の量が、０．１ng〜１０μg 、好適には０．２μg 〜２μg である。アニオン性高分子がＤＮＡである時、インビトロで１０4 個の細胞をトランスフェクションするのに好適なＤＮＡの量は、０．１μg 〜１０μg である。インビボで細胞をトランスフェクションする場合、ＤＮＡの好適な量は、０．１μg 〜１ｇである。
【００３９】
本発明の好適な局面において、トランスフェクションは更に、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質、及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外の別の公知のトランスフェクション能を有する任意の分子の存在下で行われる。任意の従来のヘルパー脂質を使用することができる。ヘルパー脂質は、トランスフェクション能を有する分子と一緒に使用されると、細胞への高分子の送達を増加させることが知られているリン脂質である。ヘルパー脂質の例としては、ホスファチジルコリン若しくはホスファチジルエタノールアミン又はその混合物のような、リン脂質がある。好適なヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのような、ホスファチジルエタノールアミン類である。任意の従来の短鎖リン脂質を使用することができる。短鎖リン脂質は、脂肪酸残基を含有し、その脂肪酸残基が、６〜１２個の炭素原子をその基本骨格に含有する、リン脂質である。短鎖リン脂質の例としては、２個のＣ6-12脂肪酸残基を有するホスファチジルコリンがある。好適な短鎖リン脂質は、ジカプリル−及びジカプリロイルホスファチジルコリンである。
【００４０】
トランスフェクション能を有する分子の例としては、J.B. Behr (Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)) 並びにX. Gao及びL. Huang（Gene Ther. 2:710-722 (1995))に記載されたようなカチオン性脂質；A.V. Kabanov及びV.A. : Kabanov（Bioconjugate Chem. 6:7-20 (1995)）に記載されたようなポリカチオン；ペプチド及びポリマー並びにF.D. Ledley (Human Gene Therapy 6:1129-1144 (1995)）に記載されたような他の非ウイルス性遺伝子送達系を含む。
【００４１】
ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外のトランスフェクション能を有する任意の分子は、適切にはリポソーム、ミセル、有機性若しくは水性分散液、又は有機性若しくは水性溶液の形である。式（Ｉ）の化合物とヘルパー脂質との間の最適分子比は、０．１〜５０、好適には１〜１０である。ヘルパー脂質と短鎖リン脂質との間の最適分子比は、２〜２０である。式（Ｉ）又は（II）の化合物と追加するトランスフェクション能を有する分子との間の最適分子比は、０．１〜１０である。本発明の複合体化合物は、その化合物を少なくとも１つ含む組成物、あるいは、それと、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外の別の公知のトランスフェクション能を有する分子を含む組成物とすることができる。この組成物は、その成分が、水性若しくは有機性溶液、水性若しくは有機性分散液、又はリポソーム若しくはミセルの形態である。この組成物は、固体、液体、半固体又はエーロゾルの形態であってよい。
【００４２】
トランスフェクションのため、適量の本発明の複合体（例えば、式（Ｉ）又は（II）の化合物）を、適切には水溶液中で、トランスフェクションする分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）に添加する。場合により、ヘルパー脂質、及び所望であれば、次に、リポソーム、混合ミセルの形で、又は水性若しくは有機性溶液、若しくは水性若しくは有機性分散液として、短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外の別の公知のトランスフェクション能を有する任意の分子を添加する。あるいは、トランスフェクションする分子である、ポリヌクレオチド又は任意の他のアニオン性高分子は、本発明の複合体化合物、ヘルパー脂質、及び所望であれば、短鎖リン脂質及び／又はカチオン性脂質若しくは本発明の複合体以外の別の公知のトランスフェクション能を有する任意の分子を含む組成物に添加することができる。この組成物は、固体、液体、半固体又はエーロゾルの形であってよく、好ましくはリポソーム、ミセルの形で、又は水性若しくは有機性溶液、若しくは水性若しくは有機性分散液として存在してよい。
【００４３】
動物又はヒトの患者の細胞をトランスフェクションするために、この組成物は、経口、非経口（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内）、経皮、肺内、鼻内、直腸内、眼内、心室内、血管内（カテーテル）及び腫瘍内（intratumoral）経路により投与することができる。更にこの組成物は、皮膚表面への高速密着投与（high velocity impaction administration）により投与することができる。トランスフェクションの進行は、当業者に知られている適切な試験プロトコールにより測定することができる。
【００４４】
ペプチドＣｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 は新規であり、また、本発明の一部である。これは、例えば以下に記載されるように固相ペプチド合成により、当該分野で既知の方法により調製することができる。
【００４５】
下記の実施例により、更に本発明を説明するが、これにより本発明を限定するものではない。
【００４６】
【実施例】
実施例１
ａ）ペプチドＲ3 ＳＨの調製
Atherton and Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach（IRL Press Oxford 1989)に記載される方法により、Tenta Gel S RAM 樹脂( ０．２２mmol/g）〔Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany 〕から出発して、Milligen９０５０合成機で連続フロー固相合成を行った。α−アミノ保護には、塩基−不安定Ｆｍｏｃ基を使用した。側鎖は、以下の保護基で保護した：Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）及びＴｒｐ（Ｂｏｃ）。１当量のＴＰＴＵ（Knorr et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930)及びＤＩＰＥＡでＦｍｏｃ−アミノ酸（２．５当量）を活性化した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンでＦｍｏｃ脱保護を行った。Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−アミド  Tenta Gel S 樹脂（１．１ｇ）を、８６％ＴＦＥ、１０％ＥＤＴ、４％Ｈ2 Ｏの混合物（２０ml）で３時間処理した。この反応混合物を濃縮して、ジエチルエーテル中に注ぎ入れて、濾過により沈殿物を回収し、水から凍結乾燥した。粗生成ペプチドを分取用ＨＰＬＣにより精製した。均質なＣｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 ・５ＴＦＡを得た。
【００４７】
ｂ）式（II）の化合物の調製
上記段落ａ）で得られた均質なペプチド（３４．６mg、１０μmol)を、１００mMリン酸緩衝液（pH６．５）１ml及びアセトニトリル１mlの混合物に溶解した。この溶液に、クロロホルム２．８ml中の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−〔３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート〕１０．６mgを添加した。混合物を室温で１時間静置して、エバポレーションにより有機溶媒を除去した。残った溶液を、２．５mlの体積まで水で希釈して、Pharmacia Biotech ＰＤ−１０カラムに通した。水３．５mlで生成物を溶出して、凍結乾燥した。Ｒ1 及びＲ2 が、オレオイルであり、そしてＲ3 が、−（ＣＨ2)−ＣＨ（ＮＨ2)−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＮＨ2 基である、式（IIＡ）の化合物２８．９mgを得た。ＩＣＰ−ＭＳ：Ｍ＝３７２２。
【００４８】
実施例２
ａ）実施例１ｂ）で得られた化合物１．１mgをトリフルオロエタノールに可溶化して、クロロホルム中のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１．１mgと混合した。この混合物を減圧下で乾燥して、残ったフィルム状物を３０mMトリスＣｌ緩衝液（pH８．５）１mlで再水和した。
ｂ）プラスミドＤＮＡ（１０μg ）を、３０mMトリスＣｌ緩衝液（pH８．５）４００μl に希釈した。次に段落ａ）で得られた生成物２０μl を添加して穏やかに混合した。次にこの混合物を細胞に添加した。
【００４９】
表１は、実施例２により処方した実施例１ｂで得られた化合物、並びに２つの市販のトランスフェクションベクターであるＤＯＴＡＰ及びリポフェクタミン（Lipofectamine)の、同じトランスフェクション条件を使用した種々の細胞株でのトランスフェクション効率を示す。
【００５０】
実施例２により処方した実施例１ｂで得られた化合物を使用する、種々の細胞株のトランスフェクション効率に及ぼすＤＮＡ用量の影響を表２に示す。データは、高用量のＤＮＡ及び実施例１ｂで得られた化合物が、明らかな毒性なく細胞に適用しうることを示している。
【００５１】
表１：実施例１ｂの化合物とＤＯＰＥ、又はカチオン性脂質の混合物による種々の細胞株のトランスフェクション。本実施例の始めに記載したとおりに処方したβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドで、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は、ウェル当たりのμ単位として表す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
表２：ＤＮＡ用量を増加した時の実施例１ｂの化合物とＤＯＰＥとの混合物による種々の細胞株のトランスフェクション。本実施例の始めに記載したとおりに処方したβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドで、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は、ウェル当たりのμ単位として表している。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
実施例３
ａ）実施例１ｂ）で得られた化合物１．０mgをトリフルオロエタノールに溶解して減圧下で乾燥した。次にこのフィルム状物を１０mMトリスマレイン酸緩衝液（pH６）１mlで再水和した。
ｂ）プラスミドＤＮＡ溶液（１mg/ml)１０μl を滅菌した純水１９０μl で希釈した。段落ａ）で得られた生成物１００μl を添加して穏やかに混合した。次にこの混合物を細胞に添加した。
【００５６】
表３は、上述のとおり処方した実施例１ｂの化合物、並びに２つの市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ及びＤＯＳＰＥＲの、同じトランスフェクション条件を使用した種々の細胞でのトランスフェクション効率を示す。データは、実施例１ｂの化合物が、ＤＯＳＰＥＲ及びＤＯＴＡＰよりも、各々３〜４０及び２５〜５００倍大きくルシフェラーゼ活性を媒介することを示した。更には、懸濁培養細胞株ＷＥＨＩ  ２３１．７を低いレベルながらトランスフェクションできたのは、実施例１ｂの化合物のみであった。
【００５７】
表３：実施例１ｂの化合物又はカチオン性脂質による種々の細胞株のトランスフェクション。６ウェルプレートで増殖させた細胞を、本実施例の始めに記載したとおりに処方したルシフェラーゼをコードするプラスミド（ウェル当たり２μg ＤＮＡ）でトランスフェクションした。４８時間後ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、細胞タンパク質１mg当たりの光単位として表した。バックグラウンドは、各測定から差し引いた。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
実施例４
ａ）実施例１ｂ）で得られた化合物１．０mgをトリフルオロエタノールに溶解して減圧下で乾燥した。次にこのフィルム状物を１０mMトリスマレイン酸緩衝液（pH６）１mlで再水和した。
ｂ）プラスミドＤＮＡ溶液（１mg/ml)１０μl を滅菌した純水２００μl で希釈した。段落ａ）で得られた生成物３９μl 及びポリエチレンイミン水溶液（０．４５mg/ml)１４μl を添加した。この混合物を水で３００μl に調整し、穏やかに混合し、次に２９２ＥＢＮＡ細胞に添加した。
ｃ）プラスミドＤＮＡ溶液（１mg/ml)１０μl を滅菌した純水２００μl で希釈した。段落ａ）で得られた生成物５２μl を添加して、水で３００μl に調整した。この混合物を穏やかに混合して、次に２９２ＥＢＮＡ細胞に添加した。
ｄ）プラスミドＤＮＡ溶液（１mg/ml)１０μl を滅菌した純水２００μl で希釈した。ポリエチレンイミン水溶液（０．４５mg/ml)５６μl を添加して、水で３００μl に調整した。この混合物を穏やかに混合し、次に２９２ＥＢＮＡ細胞に添加した。
【００６０】
表４は、本実施例の始めに記載したとおりに処方した、実施例１ｂの化合物、ポリエチレンイミン及びその混合物のトランスフェクション効率を示す。データは、混合物が、実施例１ｂの化合物及びポリエチレンイミンよりも、各々２５０及び２５倍大きくルシフェラーゼ活性を媒介することを示している。
【００６１】
表４：実施例１ｂの化合物、ポリエチレンイミン又はその混合物による２９３ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション。６cmシャーレで増殖させた細胞を、本実施例の始めに記載したとおりに処方した、ルシフェラーゼをコードするプラスミド（ウェル当たり１μg ＤＮＡ）でトランスフェクションした。４８時間後ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、シャーレ当たりの相対光単位として表した。
【００６２】
【表４】
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