(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質を産生する能力を有するラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株（FERM P-10730）を培養し、培養した菌体を回収し、回収した菌体を洗浄して洗浄菌体を調製し、前記洗浄菌体にアルカリ金属塩溶液を加えることにより、または、前記洗浄菌体を破砕して沈殿した膜画分に界面活性剤含有溶液を加えることにより、表層蛋白質を抽出し、得られた表層蛋白質の粗抽出液を透析し、表層蛋白質を沈殿として回収し、回収した沈殿を乾燥させて、表層蛋白質を得ることにより製造され、
分子量が約３３kDaであり、
配列表の配列番号１に表されるアミノ酸配列を有し、
前記菌に由来し、上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項３】
上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質を産生する能力を有するラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株（FERM P-10730）を培養し、培養した菌体を回収し、回収した菌体を洗浄して洗浄菌体を調製し、前記洗浄菌体にアルカリ金属塩溶液を加えることにより、または、前記洗浄菌体を破砕して沈殿した膜画分に界面活性剤含有溶液を加えることにより、表層蛋白質を抽出し、得られた表層蛋白質の粗抽出液を透析し、表層蛋白質を沈殿として回収し、回収した沈殿を乾燥させて、表層蛋白質を得ることを特徴とする、請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な蛋白質及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ラクトバチルス属に属する菌に由来し、上皮細胞接着活性を有する新規な蛋白質及びラクトバチルス属に属する菌から菌体表層蛋白質を抽出することを特徴とする当該蛋白質の製造方法に関する。本発明の蛋白質は、上皮細胞を培養容器に効率よく接着させ、増殖させるための培養用基材等として非常に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
現在、培養細胞は生物学的、医学的研究に幅広く用いられている。細胞培養を行う際、特に、新規な細胞株を樹立する場合や凍結保存した細胞を新たに培養する場合等には、細胞の培養容器への接着性が重要となる。中でも、上皮細胞は、培養容器の表面に接着して初めて増殖することのできる付着依存性（anchorage-dependent）の細胞であるため、通常の培養容器を用いた場合には、細胞の接着性が低く、細胞の増殖が遅れ、培養が効率的に行われないことが知られている。
従って、従来より、細胞、特に上皮細胞の培養容器への接着性を向上させるため、動物組織に由来するコラーゲンやゼラチン等の細胞接着性蛋白質を培養容器の表面にコーティングすることが一般的に行われており、コーティングを施された容器が市販されている。尚、コラーゲンは、動物の結合組織に含まれ、上皮細胞と結合組織とを接着させる役割を持つ細胞接着性の蛋白質であり、Ｉ型〜Ｖ型等のいくつかのタイプに分かれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、現在のところ、コラーゲンには遺伝子工学的手法等を利用した大量調製方法がなく、入手が比較的困難な動物組織から分離精製しなければならず、その調製は手間、コスト面ともに負担が大きい。また、コラーゲンの市販品は非常に高価であり、日常的に細胞培養に用いることは一般的ではない。
他の細胞接着性蛋白質としては、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン等が知られているが、いずれも動物組織に由来するものであり、コラーゲン以上に高価であり、細胞培養に用いることは一般的ではなかった。
【０００４】
従って、本発明者らは、上記の従来技術の課題を解決すべく、細胞接着性を有し、しかも、簡単かつ安価に製造することができる新規な蛋白質を提供することを目的として鋭意研究を重ねた。その結果、ラクトバチルス属に属する菌の菌体表層蛋白質中に細胞接着活性を有する新規な蛋白質が存在すること、さらに、それを容易にかつ安価に製造する方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質を産生する能力を有するラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株（FERM P-10730）を培養し、培養した菌体を回収し、回収した菌体を洗浄して洗浄菌体を調製し、前記洗浄菌体にアルカリ金属塩溶液を加えることにより、または、前記洗浄菌体を破砕して沈殿した膜画分に界面活性剤含有溶液を加えることにより、表層蛋白質を抽出し、得られた表層蛋白質の粗抽出液を透析し、表層蛋白質を沈殿として回収し、回収した沈殿を乾燥させて、表層蛋白質を得ることにより製造され、分子量が約３３kDaであり、配列表の配列番号１に表されるアミノ酸配列を有し、前記菌に由来し、上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質である。
本発明はまた、前記蛋白質に対する抗体である。
本発明はまた、上皮細胞に対する接着活性を有する蛋白質を産生する能力を有するラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株（FERM P-10730）を培養し、培養した菌体を回収し、回収した菌体を洗浄して洗浄菌体を調製し、前記洗浄菌体にアルカリ金属塩溶液を加えることにより、または、前記洗浄菌体を破砕して沈殿した膜画分に界面活性剤含有溶液を加えることにより、表層蛋白質を抽出し、得られた表層蛋白質の粗抽出液を透析し、表層蛋白質を沈殿として回収し、回収した沈殿を乾燥させて、表層蛋白質を得ることを特徴とする、前記蛋白質の製造方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明において使用することができるラクトバチルス属に属する菌は、特に限定されないが、培養細胞の由来する動物の腸内に定着する菌種、菌株から選択することがより望ましい。
ヒト細胞の培養に利用し得るラクトバチルス属に属する菌としては、特に限定されないが、好ましいものの例として、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）又はラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）等を挙げることができる。
これらの中でも、ラクトバチルス・アシドフィルス、特にラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株が好ましい。このラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０７３０として、平成元年５月１８日に寄託されている。
また、ラクトバチルス・ガセリ、特にラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５株は好ましい。このラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３５として、平成８年３月２７日に寄託されている。
また、ラクトバチルス・クリスパタス、特にラクトバチルス・クリスパタスＪＣＭ５８０８株が好ましい。
また、ラクトバチルス・ジョンソニ、特にラクトバチルス・ジョンソニＳＢＴ１８３９株が好ましい。このラクトバチルス・ジョンソニＳＢＴ１８３９株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ−Ｐ１５５３４として、平成８年３月２７日に寄託されている。
【０００７】
また、本発明の蛋白質の接着の対象となる細胞は特に限定されないが、培養において接着性が特に重要とされる上皮細胞に対しては利用価値が高く、ほとんどの上皮細胞に対して利用可能である。また、ラクトバチルス属に属する菌は動物の腸内に生息していることから、本発明の蛋白質は腸管上皮細胞の培養には有効である。
尚、本発明の細胞接着活性を有する蛋白質は、その活性画分のみでなく、その活性画分を含むもの、例えばラクトバチルス属に属する菌の菌体から菌体の表層蛋白質のみを分離したもの等も包含する。即ち、本発明の細胞接着活性を有する蛋白質は、ラクトバチルス属に属する菌の菌体から抽出した菌体表層蛋白質、及びそれを精製して得られる蛋白質の両者を包含する。
【０００８】
本発明の蛋白質は、例えば下記の方法により製造することができる。
最初に、ラクトバチルス属に属する菌を培地において一晩培養し、遠心分離により菌体を回収する。ラクトバチルス属に属する菌の好ましい菌種または菌株は上記した通りである。培地としては、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、ＢＬＡ培地、ＧＰＶ培地等が挙げられ、培養は、３７℃において、１６時間程度行うことが好ましい。遠心分離は、５０００rpmで、１５分程度行うことが好ましい。
次に、回収した菌体をイオン交換水に懸濁した後、遠心分離により菌体を再回収することを繰り返し、洗浄菌体を調製する。この場合の遠心分離は、５０００rpmで、１５分程度行うことが好ましく、それを３〜４回繰り返すことが好ましい。
【０００９】
次に、このようにして得られた洗浄菌体から表層蛋白質を抽出する。表層蛋白質の抽出には、アルカリ金属塩を用いる方法、又は菌体を破砕した後、膜画分を得て界面活性剤を用いる方法等、公知の方法を利用することができる。
このうち、アルカリ金属塩を用いる方法の場合には、１Ｍ以上の高濃度のアルカリ金属塩溶液をあらかじめ作製しておき、洗浄菌体に加え、氷冷しながら激しく攪拌することにより抽出を行うことが好ましい。アルカリ金属塩は、特に限定されないが、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
次に、これを７０００rpm程度で２０分間程度遠心分離を行うことにより、上清にラクトバチルス属に属する菌の表層蛋白質の粗抽出液を得ることができる。
次に、得られた粗抽出液をイオン交換水に対して透析し、表層蛋白質を沈殿として析出させるとともに、低分子の不純物を除去する。透析は、分子量画分６０００〜８０００の透析膜を用いることが好ましい。
次に、析出した表層蛋白質を、遠心分離を行うことにより回収し、イオン交換水で数回遠心洗浄した後、凍結乾燥を行うことにより、本発明の蛋白質の乾燥標品を得ることができる。
【００１０】
また、菌体を破砕した後、膜画分を取得して界面活性剤を用いる方法の場合には、例えば、最初に、上記のようにして調製した洗浄菌体に、Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液（５０μg/ml）を加え、３７℃で３０分間静置することにより、細胞壁を溶解させプロトプラスト化する。次に、これを３０００rpmで２０分間の遠心分離で集めた後、蒸留水を加えることにより、菌体を破裂させる。菌体の破砕は超音波処理、フレンチプレス等の物理的処理によっても行うことができる。破砕後の菌液を５０００rpmで１０分間の遠心分離を行って、沈殿する未破砕の菌体を除去した後、１５０００rpmで３０分間の遠心分離により膜画分を沈殿させる。沈殿した膜画分から表層蛋白質を界面活性剤を用いて抽出する。この時用いる界面活性剤は特に限定しないが、後に透析して除去することを考えると、０.５〜２％のＣＨＡＰまたはオクチルグルコシド等が望ましい。
次に、得られた粗抽出液をイオン交換水に対して透析し、表層蛋白質を沈殿として析出させるとともに、低分子の不純物を除去する。透析は、分子量画分６０００〜８０００の透析膜を用いることが好ましい。
次に、析出した表層蛋白質を、遠心分離を行うことにより回収し、イオン交換水で数回遠心洗浄した後、凍結乾燥を行うことにより、本発明の蛋白質の乾燥標品を得ることができる。
【００１１】
また、このようにして抽出された本発明の菌体表層蛋白質を、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の通常の精製法により精製することにより、本発明の蛋白質の活性画分を得ることができる。
【００１２】
このようにして製造された本発明の蛋白質を、蒸留水に溶解させ、常法によって市販のポリスチレン製ディッシュ、プレート等の培養容器にコーティングすることにより、容易に細胞培養用の基材を得ることができる。尚、本発明の蛋白質を培養容器にコーティングする際の濃度は、コーティング溶液（通常、５Ｍ塩化リチウム溶液）１mlあたり本発明の蛋白質を０.１〜１０mgとすることが望ましい。
【００１３】
本発明の蛋白質は、例えば、以下の方法により同定することができる。
まず、上皮細胞を細胞培養用の培地においてコンフリュエントに達するまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞をはがした後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて遠心洗浄し、再びＰＢＳに懸濁する。一方、本発明の蛋白質の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質を分子量別に分離した後、ブロッティング装置を用いてニトロセルロース膜に分離した蛋白質を移行させ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で、４℃において一晩ブロッキングする。ブロッキング後の膜に、ＰＢＳに懸濁した上皮細胞を重層し、３７℃において１時間緩やかに振盪すると、細胞接着活性を持つ蛋白質に上皮細胞が接着する。続いて、膜をＰＢＳで洗浄した後、３％パラホルムアルデヒド溶液により接着した細胞を固定し、４０％アミドブラック溶液に浸漬した後、メタノールにて脱色すると、細胞が接着した蛋白質のみが染色され、それにより同定することができる。
【００１４】
また、このように同定される本発明の蛋白質が、細胞接着因子として作用していることの証明は、抗体を利用して行うことができる。
抗体は、本発明の蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、クマシーブリリアントブルー溶液にて染色した後、ゲルを切り出すことにより、精製した細胞接着性蛋白質を用いて作製することができる。
抗体の作製は公知の方法を利用して行うことができる。本発明の蛋白質を塗布した細胞培養容器に、腸管細胞の懸濁液と、上記のようにして取得した抗体とを添加する。また、対照として抗体を添加しない細胞培養容器を準備する。抗体を添加した細胞培養容器の細胞接着性が低下すれば、本発明の表層蛋白質中の細胞接着性蛋白質に抗体が先に結合し、細胞接着性が失われたと考えることができ、本発明の蛋白質が培養容器中で細胞接着の役割を果たしていることが証明される。
【００１５】
尚、本発明の蛋白質は、イオン交換、ゲル濾過等の公知のカラムクロマトグラフィーにより精製することができるが、本発明の蛋白質に対する抗体を利用すると、より簡単に精製することができる。
この場合、抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。最初に、得られた抗体を臭化シアン活性化セファロース４Ｂのような蛋白質固定化用担体に固定化することにより、抗体カラムを作製し、ＰＢＳ中に溶解させた上記の表層蛋白質をこのカラムに負荷する。カラムを洗浄した後、抗体に結合している蛋白質を適当な溶出液にて溶出することにより、目的の精製蛋白質を得ることができる。このようにして得られた精製蛋白質も、表層蛋白質の場合と同様の操作により、細胞培養用の基材とすることが可能であり、表層蛋白質より少量の蛋白質で、高い細胞接着効果を得ることが可能である。しかし、一般的な細胞培養には、表層蛋白質で十分であり、経済的にも有利である。
【００１６】
このようにして製造した本発明の蛋白質に腸管上皮細胞を接種すると、従来の培養基材と比較して、細胞を効率よく接着させ、増殖させることができ、培養の期間を短縮することができる。特に、初代培養細胞等では接着率が著しく高まり、細胞株の樹立に有用である。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単に例示を目的としたものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（本発明の蛋白質の製造）
前培養したラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株を、５ＬのＭＲＳ培地に３％接種し、３７℃において２４時間培養した。この培養菌体を７０００rpm、２０分の遠心分離により回収し、イオン交換水を用いて菌体を遠心洗浄した。得られた洗浄菌体に、３倍量の５Ｍ塩化リチウム溶液を加え、氷冷しながら３０分間激しく攪拌することにより、表層蛋白質を抽出した。続いて、遠心分離を行って、菌体破砕物を分離し、表層蛋白質抽出液を得、透析膜（分子量画分6,000以下）を用いて、イオン交換水に対して透析した。沈殿した表層蛋白質を遠心分離により回収し、凍結乾燥を行うことにより、表層蛋白質の凍結乾燥標品を得た。
【００１９】
試験例１
（細胞接着活性の確認）
実施例１で得られた凍結乾燥標品（透析沈殿画分）と、上清に可溶化している蛋白質（透析可溶画分）から得た凍結乾燥標品（比較品）を、それぞれ、５Ｍ塩化リチウム溶液に溶解させ、０.００１〜１０mg/mlまでの各濃度の溶液を調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬ重層した。４℃で一晩静置することにより、各表層蛋白質をコーティングした後、ＰＢＳで２回洗浄した。
一方、小腸由来の細胞ＨＣＴ−８を、ＲＰＭＩ１６４０培地にてコンフリュエントに達するまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理にて、細胞を培養容器から剥がした後、ＰＢＳで、１０００rpm、５分間の遠心洗浄を３回繰り返し、ＰＢＳに懸濁した。この細胞懸濁液を上記のプレートに重層し、３７℃において１時間静置した後、プレートを洗浄した。接着している細胞の数を顕微鏡で観察するとともに、ヘキソサミニダーゼ活性で測定した。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、透析沈殿画分には、透析可溶画分に比べて、強い細胞接着活性が認められた。
【００２０】
試験例２
（活性画分の同定及び分子量測定）
実施例１で得られたラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株の表層蛋白質乾燥標品２.５μgを、２００μＬのサンプルバッファーに溶解させ、そのうちの７μＬを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。分子量別に分離された蛋白質を、ブロッティング装置（ＴＥＦＣＯ社）を用いてニトロセルロース膜に移行させ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で４℃、一晩ブロッキングした。一方、小腸由来の細胞ＨＣＴ−８をＲＰＭＩ１６４０培地にてコンフリュエントに達するまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理にて、細胞を培養容器から剥離した後、ＰＢＳで１０００rpmで５分間の遠心洗浄を３回繰り返し、ＰＢＳに懸濁した。この細胞懸濁液をブロッキング後の膜に重層し、３７℃において１時間軽く振とうして細胞を接着させた。続いて、この膜をＰＢＳで洗浄した後、３％パラホルムアルデヒド溶液にて接着した細胞を固定し、４０％アミドブラック溶液に浸漬した後メタノールにより脱色することにより、接着した細胞の染色を行なった。同様の手順を用いて、その他のラクトバチルス属に属する菌の菌株である、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス及びラクトバチルス・ジョンソニについても試験を行った。結果を図２に示す。
図２に示されるように、これら全てのラクトバチルス属に属する菌株に、細胞接着性蛋白質が存在することが明らかとなった。例えば、ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株には、分子量３３kDa付近に、細胞が強く接着する蛋白質が存在するが、この蛋白質をＬＡ５と命名した。
【００２１】
試験例３
（細胞接着性試験）
試験例２の方法に従い、十二指腸由来のＨｕｔｕ−８０、大腸由来のＣａｃｏ−２及び胃由来のＫＡＴＯIIIの各上皮細胞に対する、ラクトバチルス・アシドフィルスに由来する本発明の蛋白質の細胞接着性試験を行った。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、いずれの細胞を用いた場合でも、本発明の蛋白質（ＬＡ５）が細胞接着性の蛋白質として染色された。即ち、本発明の蛋白質（ＬＡ５）は、多くの上皮細胞に対して接着性を持ち、上皮細胞の培養に有効であることが確認された。
【００２２】
実施例２
（ポリクローナル抗体の作製）
本発明の蛋白質の乾燥標品２.５μmを２００μmのサンプルバッファーに溶解させ、そのうちの７μＬを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。クマシーブリリアントブルー溶液にて染色した後、本発明の蛋白質（ＬＡ５）を切り出し、電気的に溶出させることにより精製した。精製した本発明の蛋白質（ＬＡ５）を用いて、Balb/c系マウスに免疫した。免疫は１週間おきに４回行い、初回の免疫はフロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）、以降の免疫はフロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）と混合して行った。最終免疫終了後、腹水型のガンを起こすＭｅｔｈＡ細胞をマウス腹腔に注射した。１週間後、腹腔にたまった腹水を採取し、本発明の蛋白質（ＬＡ５）に対するポリクローナル抗体を得た。
【００２３】
試験例４
（ポリクローナル抗体による本発明の蛋白質の細胞接着性試験）
実施例２で得られた本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いて、本発明の蛋白質の細胞接着性試験を行った。
即ち、本発明の表層蛋白質（ＬＡ５）を塗布したマイクロプレートを用いて、試験例１の方法に従い、ＨＣＴ−８細胞の接着性試験を行った。その際、実施例２で得られた蛋白質（ＬＡ５）に対するポリクローナル抗体を３〜５０倍の希釈率になるように細胞懸濁液に添加し、プレートに重層した。結果を図４に示す。
比較のために、免疫していない通常マウスの抗体（腹水）を添加した場合についても同様の細胞接着性試験を行った。結果を図５に示す。
さらに、ラクトバチルス・アシドフィルスの全菌体に対するポリクローナル抗体を添加した場合についても、同様の細胞接着性試験を行った。結果を図６に示す。
図４〜６から明らかなように、本発明の蛋白質（ＬＡ５）に対する抗体を添加すると、通常のマウスの抗体を添加した場合や、ラクトバチルス・アシドフィルスの全菌株に対するポリクローナル抗体を添加した場合と比較して、細胞の接着性が大きく低下した。このことより、本発明の蛋白質は培養容器中で細胞接着活性を持つ蛋白質であることが確認された。
【００２４】
試験例５
（Ｎ末端アミノ酸配列の決定）
実施例１で得られたラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株由来の分子量３３kDの蛋白質について、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。
即ち、実施例１において５Ｍ塩化リチウムにて抽出した表層蛋白質を、１０％ゲルを用いて、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥＦＣＯ−ＣＥＬＬ ＴＣ−１６；ＴＥＦＣＯ社製、及び４９１ ＰＲＥＰ ＣＥＬＬ；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて泳動を行い、活性画分である３３kDの蛋白質を溶出回収した。回収された精製蛋白質を、再度分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル、Ｃ−８０８；ＴＥＦＣＯ社製）に供した後、ＣＡＰＳバッファー（pH１１）にて、５０Ｖ、６０分の条件下、ＰＶＤＦ膜（０３０５６；ＴＥＦＣＯ社製）にトランスブロットした。得られた膜上の蛋白質（４μｇ相当）を、４０％メタノールに溶解したクマシ−ブリリアントブルーにて染色した後、４０％メタノールにて脱色し、染色されたバンドを切り出し、風乾した。切り出したバンドについて、プロテインシークエンサー（４７６Ａ；パーキンエルマー社製）にて、そのプロトコールに従い、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列表の配列番号１に示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、ラクトバチルス属に属する菌由来の細胞接着活性を有する新規な蛋白質、及びラクトバチルス属に属する菌から菌体表層蛋白質を抽出することを特徴とする当該蛋白質の製造方法が提供される。
本発明の新規な蛋白質は、細胞、特に上皮細胞を培養容器に効率よく接着し、増殖するための培養用基材等として非常に有用である。
従って、本発明の新規な蛋白質は、新規細胞株を樹立する場合や、凍結保存した細胞を新たに培養する場合等、医薬の生産、検査、生化学試薬等、生物学や医学等の幅広い分野の研究における利用が大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクトバチルス・アシドフィルス表層蛋白質を透析した後の沈殿画分（本発明）と可溶画分（比較）の細胞接着性を示す。
【符号の説明】
○：透析沈殿画分
●：透析可溶画分
【図２】ラクトバチルス属に属する各菌種から得た細胞接着性蛋白質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量を示す。
【符号の説明】
レーン１：分子量マーカー
レーン２：菌体表層蛋白質
レーン３：細胞接着性蛋白質
【図３】各種上皮細胞に対する本発明の蛋白質の細胞接着性を示す。
【符号の説明】
レーン１：分子量マーカー
レーン２：菌体表層蛋白質
レーン３：細胞接着性蛋白質
【図４】本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体による、ラクトバチルス・アシドフィルスの細胞接着阻害効果を示す。
【図５】通常マウスの抗体による、ラクトバチルス・アシドフィルスの細胞接着阻害効果を示す。
【図６】ラクトバチルス・アシドフィルス全菌体に対するポリクローナル抗体による、ラクトバチルス・アシドフィルスの細胞接着阻害効果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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