(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオン錯形成部に共有結合した特異的結合性ペプチドを含み、該ペプチドがソマトスタチン受容体に特異的に結合する式：
シクロ（Ｎ-ＣＨ3）-Ｐhe-Ｔyr-（D-Ｔrp）-Ｌys-Ｖal-Ｈcy．（CH2CO．X）
［式中、Ｘは、式：
（アミノ酸）n−Ｂ−（アミノ酸）m−Ｚ
で示される金属イオン錯形成部であり、
ここに、Ｂはシステイン、ホモシステイン、イソシステインまたはペニシルアミンであるチオール含有基であり；
（アミノ酸）nおよび（アミノ酸）mの各アミノ酸は、各々、独立して、チオール基を含まない一次アルファ−またはβ−アミノ酸であり；
Ｚは−ＯＨまたは−ＮＨ2であり；
ｎは２〜５の整数であり；
ｍは０〜５の整数を意味し；および
CH2CO．Xは、ホモシステインの側鎖硫黄原子に共有結合する］
で示される化合物。
【請求項２】
式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲ．アミド）
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＤ．アミド）
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＫ．アミド）
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＲ．アミド）
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫＫ．アミド）および
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＫＫＣ．アミド）
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を含む、哺乳動物の体内の部位をイメージするためのシンチグラフィーイメージング剤を製造するための試薬。
【請求項５】
放射性標識結合部がテクネチウム−９９ｍに結合する請求項４に記載の試薬を含むシンチグラフィーイメージング剤。
【請求項６】
請求項４に記載の試薬を、還元剤の存在下、テクネチウム−９９ｍと反応させることにより形成される錯体。
【請求項７】
還元剤が錫イオンである請求項６記載の錯体。
【請求項８】
請求項４に記載の試薬を、予め還元されたテクネチウム−９９ｍ錯体のリガンド交換によりテクネチウム−９９ｍで標識化することによって形成される錯体。
【請求項９】
放射性医薬製剤を製造するためのキットであって、所定量の請求項４に記載の試薬および該試薬をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を含有する密封バイアルからなることを特徴とするキット。
【請求項１０】
試薬を還元剤の存在下でテクネチウム−９９ｍと反応させることからなる請求項４に記載の試薬の標識法。
【請求項１１】
還元剤が第一錫イオンである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物の体内にある部位をイメージするための医薬の製造における請求項５に記載のシンチグラフィーイメージング剤の使用方法。
【請求項１３】
金属イオン錯形成部が金属イオンに結合する請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
金属がレニウム、亜鉛または錫である請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
金属イオン錯形成部がベータ粒子放出金属イオンに結合する請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
ベータ粒子放出金属がレニウム−１８６またはレニウム−１８８である請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
金属イオン錯形成部が転換電子放出金属イオンに結合する請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
転換電子放出金属が錫−１１７ｍである請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１またはアスタチン−２１１で放射性標識される請求項１記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１３に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１４に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１５に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１６に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１７に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１８に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１９に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項２８】
悪性または良性腫瘍を有するか、またはソマトスタチンレセプターを発現する新生物または転移腫瘍細胞を担持する動物を治療するための医薬の製造における請求項２０ないし２７に記載の医薬組成物の使用方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の化合物を含む、哺乳動物の体内にある部位を局在化するための診断薬を製造するための癌または腫瘍イメージング用試薬。
【請求項３０】
金属イオン錯形成部が常磁性金属イオンに結合する請求項２９に記載の試薬を含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用診断薬。
【請求項３１】
常磁性金属が鉄または銅である請求項３０記載の診断薬。
【請求項３２】
超常磁性粒子に結合した請求項２９に記載の試薬を含む癌または腫瘍イメージング用診断薬。
【請求項３３】
ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５またはヨウ素−１３１で放射性標識された請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする診断用イメージング剤。
【請求項３４】
請求項３０に記載の試薬と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３２に記載の試薬と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【請求項３７】
式：
0003918157.tif 000008
で示される化合物。
【請求項３８】
テクネチウム−９９ｍで放射性標識される請求項３７記載の化合物。
【請求項３９】
哺乳動物の体内にあるイメージされる部位が原発性または転移性のソマトスタチンレセプター発現腫瘍部位である請求項４記載の試薬。
【請求項４０】
所定量の請求項３７に記載の化合物および該化合物をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を含有する密封バイアルからなることを特徴とする癌または腫瘍イメージング用製品。
【請求項４１】
請求項３７に記載の化合物を、還元剤の存在下、テクネチウム−９９ｍと反応させることで形成される錯体。
【請求項４２】
還元剤が第一錫イオンである請求項４１記載の錯体。
【請求項４３】
請求項３７に記載の化合物を、予め還元されたテクネチウム−９９ｍ錯体のリガンド交換によりテクネチウム−９９ｍで標識することにより形成される錯体。
【請求項４４】
放射性医薬製剤を製造するためのキットであって、所定量の請求項３７に記載の化合物および該化合物をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を含有する密封バイアルからなることを特徴とするキット。
【請求項４５】
化合物を還元剤の存在下でテクネチウム−９９ｍと反応させることを特徴とする請求項３７に記載の化合物の標識法。
【請求項４６】
還元剤が第一錫イオンである請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物の体内にある部位をイメージするための医薬の製造における請求項３８に記載のテクネチウム−９９ｍ標識化合物の使用方法。
【請求項４８】
請求項３８に記載の化合物と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする癌または腫瘍イメージング用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、治療薬、放射線治療薬、放射線診断薬、および非放射性診断薬、ならびにかかる診断薬および治療薬の製造方法に関する。本発明は、哺乳動物細胞、特に、新生哺乳動物細胞または転移性哺乳動物細胞の表面で発現したソマトスタチンレセプターに特異的に結合する環状ペプチドにも関する。１つの態様において本発明は、哺乳動物体の部位をイメージするためのシンチグラフィーイメージング剤に関する。この態様では、イメージング剤は、テクネチウム−９９ｍ（Ｔc−９９ｍ）との錯体を形成する放射性標識結合性部分を介してＴc−９９ｍで標識化された、in vivoでのソマトスタチンレセプター発現性細胞に特異的に結合する特異的結合性ペプチドからなる。別の態様では、本発明は、放射性ヨウ素処理したイメージング剤を提供するものである。また、本発明は、放射性ヨウ素処理した薬剤、放射性金属−試薬錯体および非放射性金属−試薬錯体（全て、治療的利用性を有する）を含む治療薬を提供するものでもある。本発明は、本発明の診断薬および治療薬の診断的および治療的エンボディメントを製造するための試薬、その放射性標識したエンボディメントおよび非放射性金属錯体、該試薬の標識化方法、ならびに本発明の試薬の非放射性エンボディメントおよび本発明の放射性標識した診断薬および治療薬の好都合な製造のための他の成分からなるキットを提供するものである。
２．従来技術の説明
ソマトスタチンは、ヒトおよび他の哺乳動物における視床下部および膵臓によって内生的に産生されるテトラデカペプチドである。該ペプチドは、式：
0003918157.tif 000002
で示される［アミノ酸についての単一文字略語は、ジー・ズベイ（Ｇ．Ｚubay）、バイオケミストリー（Ｂiochemistry）（第２版）、１９８８年、（マクミラン・パブリッシング（ＭacＭillan Ｐublishing）：ニューヨーク）、第３３頁において見いだすことができる］。このペプチドは、in vivoで広範囲の種類の生物学的効果を発揮する。中枢神経系、視床下部、膵臓および胃腸管に対して生理学的に作用することが知られている。
ソマトスタチンは、膵臓からのインスリンおよびグルカゴンの放出を阻害し、視床下部からの成長ホルモン放出を阻害し、胃分泌物を減少させる。かくして、ソマトスタチンは、ヒトおよび他の動物の両方において、多くの病気および疾患の軽減のための臨床的および治療的用途を有する。しかしながら、天然ソマトスタチンは、in vivoでのその短い半減期により、限定された利用性を有するものであり、そこで、ペプチダーゼによって迅速に分解される。このために、改良されたin vivo安定性を有するソマトスタチン類似体は、従来技術において研究された。
フレイディンガー（Ｆreidinger）、Ｕ．Ｓ．特許第４，２３５，８８６号には、ヒトにおける多くの疾患の治療において有用な環状ヘキサペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
コイ（Ｃoy）およびマーフィー（Ｍurphy）、Ｕ．Ｓ．特許第４，４８５，１０１号には、合成ドデカペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
フレイディンガー、Ｕ．Ｓ．特許第４，６１１，０５４号には、ヒトにおける多くの疾患の治療に有用な環状ヘキサペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
ナット（Ｎutt）、Ｕ．Ｓ．特許第４，６１２，３６６号には、ヒトにおける多くの疾患の治療に有用な環状ヘキサペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
コイら、Ｕ．Ｓ．特許第４，８５３，３７１号には、合成オクタペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
コイおよびマーフィー、Ｕ．Ｓ．特許第４，８７１，７１７号には、合成ヘプタペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
コイら、Ｕ．Ｓ．特許第４，９０４，６４２号には、合成オクタペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
テイラー（Ｔaylor）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，０７３，５４１号には、小細胞肺癌の治療方法が開示されている。
ブラディ（Ｂrady）、欧州特許出願第８３１１１７４７．８号には、多くのヒト疾患の治療において有用な二環式ヘキサペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
ボーアー（Ｂauer）ら、欧州特許出願第８５８１０６１７．２号には、多くのヒト疾患の治療において有用なソマトスタチン誘導体が開示されている。
エック（Ｅck）およびモロー（Ｍoreau）、欧州特許出願第９０３０２７６０．５号には、治療用オクタペプチドソマトスタチン類似体が開示されている。
コイおよびマーフィー、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７０７４には、治療用のソマトスタチン類似体が開示されている。
シャリー（Ｓchally）ら、欧州特許出願ＥＰＡ ９１１０４８４４５．２には、治療用の環状ペプチドが開示されている。
ボジェン（Ｂodgen）およびモロー、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２７には、増殖性皮膚疾患の治療用組成物および治療方法が開示されている。
ソマトスタチンは、中枢神経系、視床下部、膵臓、および胃腸管を構成する細胞の細胞表面で発現した特異的なレセプターに結合することによってその効果を発揮する。これらの高親和性ソマトスタチン結合部位がこれらの組織から生じるほとんどの内分泌物活性腫瘍の細胞表面で豊富に発現されることが判明した。
医師が、非観血的手段を用いて、患者における病的状態の部位を位置確認することができることは、しばしば、臨床学的に好都合である。かかる病的状態としては、肺、心臓、肝臓、腎臓、骨および脳の疾患、ならびに癌、血栓症、肺塞栓症、感染、炎症およびアテローム硬化症が挙げられる。
核医学の分野では、少量の内部投与された放射性標識したトレーサー化合物（放射性トレーサーまたは放射性薬品と称される）の分布を検出することによって、ある種の病的状態が位置確認されるか、または、それらの程度が評価される。これらの放射性薬品の検出方法は、一般的に、イメージング方法または放射性イメージング方法として知られている。
放射性イメージングにおいて、放射性標識は、ガンマ線放出性放射性核種であり、放射性トレーサーは、ガンマ線検出用カメラを用いて位置確認される（このプロセスは、しばしば、ガンマシンチグラフィーと称される）。イメージした部位は、放射性トレーサーが病的部位に局在化するように選択される（陽性造影と称される）か、または、別法としては、該放射性トレーサーがかかる病的部位に特異的に局在化しないように選択される（陰性造影と称される）ので、検出可能である。多くの場合、in vivoで病的部位に特異的に局在化する放射性薬品として、放射性標識した特異的結合性化合物を用いるのが特に好都合である。
例えば、ソマトスタチンについての高親和性結合部位の発現は、ある種の腫瘍細胞についてのマーカーであり、ソマトスタチンとの特異的結合は、in vivoで、かかる腫瘍細胞を位置確認し、同定するのに活用され得る。
チロシンアミノ酸（ＴyrまたはＹ）を含有するように修飾したソマトスタチン類似体の標識化方法は、従来技術において知られている。
アルバート（Ａlbert）ら、ＵＫ特許出願第８９２７２５５．３号には、123Ｉで標識したオクトレオチドなどのソマトスタチン誘導体を用いる放射性イメージングが開示されている。
ベッカー（Ｂakker）ら、１９９０、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３１：１５０１−１５０９には、ソマトスタチン類似体の放射性ヨウ素処理およびin vivoで腫瘍を検出する際のその有用性が開示されている。
ベッカーら１９９１、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３２：１１８４−１１８９には、in vivoでの放射性イメージングのための放射性標識したソマトスタチンの有用性が開示されている。
ボマンジ（Ｂomanji）ら、１９９２、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３３：１１２１−１１２４には、転移性カルチノイドをイメージするためのヨウ素処理した（Ｔyr−３）オクトレオチドの使用が開示されている。
別法としては、放射性核種−キレート化基を含有するように該ペプチドを共有的に修飾することによるソマトスタチンの放射性標識化方法が従来技術に開示されている。
アルバートら、ＵＫ特許出願第８９２７２５５．３号には、アミノ末端に結合したキレート化基を介する111Ｉnで標識したオクトレオチドなどのソマトスタチン誘導体を用いる放射性イメージングが開示されている。
アルバートら、欧州特許出願ＷＯ ９１／０１１４４には、成長因子、ホルモン、インターフェロンおよびサイトカインに関連しており、放射性核種キレート化基に共有結合した特異的認識ペプチドからなる放射性標識したペプチドを用いる放射性イメージングが開示されている。
アルバートら、欧州特許出願第９２８１０３８１．１号には、アミノ末端結合キレート化剤を有するソマトスタチンペプチドが開示されている。
ファグリア（Ｆaglia）ら、１９９１、Ｊ．Ｃlin．Ｅndocrinol．Ｍetab．７３：８５０−８５６には、患者におけるソマトスタチンレセプターの検出が開示されている。
クウェックブーム（Ｋwekkeboom）ら、１９９１、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３２：９８１アブストラクト（Ａbstract）＃３０５には、ソマトスタチン類似体を111Ｉnで放射性標識することが開示されている。
アルバートら、１９９１、アブストラクトＬＭ１０、第１２回アメリカン・ペプタイド・シンポジウム（１２th Ａmerican Ｐeptide Ｓymposium）：１９９１には、111Ｉn標識したジエチレン−トリアミノ五酢酸誘導ソマトスタチン類似体についての使用が開示されている。
クレニング（Ｋrenning）ら、１９９２、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３３：６５２−６５８には、［111Ｉn］［ＤＴＰＡ］オクトレオチドを用いる臨床的シンチグラフィーが開示されている。
67Ｇa、99mＴc（Ｔc−９９ｍ）、111Ｉn、123Ｉ、125Ｉ、169Ｙbまたは186Ｒeを含む種々の放射性核種は、放射性イメージングに有用であることが知られている。ヒトにおける最適な放射性イメージングのためには、多くの因子を考慮しなければならない。検出効率を最大にするためには、１００〜２００keＶ範囲でガンマエネルギーを放出する放射性核種が好ましい。患者に吸収される放射量を最小にするためには、放射性核種の物理的半減期は、イメージング方法が許す限り短くあるべきである。実験がいつでもおよび何時でも行われるためには、臨床部位で常に利用可能な放射性核種の供給源を有するのが好都合である。Ｔc−９９ｍは、それが１４０keＶでガンマ線を放出し、６時間の物理的半減期を有しており、モリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍジェネレーターを用いてon-siteで容易に利用可能であるので、好ましい核種である。従来技術で用いられる他の放射性核種は、Ｔc−９９ｍよりもあまり好都合ではない。これは、かかる放射性核種の物理的半減期が長く、その結果、患者に吸収される放射量が多量になるためである（例えば、インジウム−１１１）。また、多くの不都合な放射性核種は、on-siteジェネレーターを用いて生成することができない。
Ｔc−９９ｍは、金属錯形成部によって好都合にキレート化される遷移金属である。Ｔc−９９ｍ結合能を有する放射性標識錯形成部は、種々の特異的結合性化合物に共有結合して、かかる特異的結合性化合物を放射性標識するための手段を提供することができる。これは、Ｔc−９９ｍの最も一般的に利用可能な化学種であるペルテクニタート（ＴcＯ4-）が、放射性薬品として有用であるのに非常に充分にはほとんどの特異的結合性化合物に直接結合することができないためである。Ｔc−９９ｍのかかる放射性標識錯体部分との錯形成は、典型的には、塩化第一スズなどの還元剤を用いるペルテクニタートの化学的還元を必要とする。
Ｔc−９９ｍを錯形成するためのキレート化剤の使用は、従来技術で知られている。
バーン（Ｂyrne）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，４３４，１５１号には、Ｔc−９９ｍについてのホモシステイン含有キレート化剤が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）、Ｕ．Ｓ．特許第４，４４４，６９０号には、２，３−ビス（メルカプトアセトアミド）プロパノアートに基づく一連のテクネチウム−キレート化剤が開示されている。
バーンら、Ｕ．Ｓ．特許第４，５７１，４３０号には、Ｔc−９９ｍについてのホモシステイン含有キレート化剤が開示されている。
バーンら、Ｕ．Ｓ．特許第４，５７５，５５６号には、Ｔc−９９ｍについてのホモシステイン含有キレート化剤が開示されている。
ノスコ（Ｎosco）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，９２５，６５０号には、Ｔc−９９ｍキレート化錯体が開示されている。
コンド（Ｋondo）ら、欧州特許出願公開第４８３７０４ Ａ１号には、メルカプト−Ｇly−Ｇly−Ｇly部分とのＴc−９９ｍ錯体の製造方法が開示されている。
欧州特許出願第８４１０９８３１．２号には、腎臓機能モニターリング剤としてのビスアミド，ビスチオールＴc−９９ｍリガンドおよびその塩が開示されている。
デーヴィソン（Ｄavison）ら、１９８１、Ｉnorg．Ｃhem．２０：１６２９−１６３２には、オキソテクネチウムキレート錯体が開示されている。
フリッツバーグら、１９８２、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．２３：５９２−５９８には、Ｎ，Ｎ'−ビス（メルカプトアセチル）−２，３−ジアミノプロパノアートに基づくＴc−９９ｍキレート化剤が開示されている。
バーンら、１９８３、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．２４：Ｐ１２６には、Ｔc−９９ｍについてのホモシステイン含有キレート化剤が開示されている。
ブリソン（Ｂryson）ら、１９８８、Ｉnorg．Ｃhem．２７：２１５４−２１６１には、過剰のリガンドに対して不安定であるテクネチウム−９９の中性錯体が開示されている。
ミスラ（Ｍisra）ら、１９８９、Ｔet．Ｌett．３０：１８８５−１８８８には、放射性標識のためのビスアミンビスチオール化合物が開示されている。
特異的結合性化合物を放射性標識するためのキレート化剤の使用は、当該技術分野で知られている。
ガンソウ（Ｇansow）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，４７２，５０９号には、Ｔc−９９ｍキレート−コンジュゲートしたモノクローナル抗体の製造および精製方法が開示されている。
スタヴリアノポーロス（Ｓtavrianopoulos）、Ｕ．Ｓ．特許第４，９４３，５２３号には、金属キレート化部分からなる検出可能な分子が開示されている。
フリッツバーグら、欧州特許出願第８６１００３６０．６号には、テクネチウム標識したイメージング剤の製造に有用な、ジチオール、ジアミノ、またはジアミドカルボン酸またはアミン錯体が開示されている。
アルバートら、ＵＫ特許出願第８９２７２５５．３号には、アミノ末端に結合したキレート化基を介して111Ｉnで標識したオクトレオチドなどのソマトスタチン誘導体を用いる放射性イメージングが開示されている。
アルバートら、欧州特許出願ＷＯ ９１／０１１４４には、成長因子、ホルモン、インターフェロンおよびサイトカインに関連しており、放射性核種キレート化基に共有結合した特異的認識ペプチドからなる放射性標識したペプチドを用いる放射性イメージングが開示されている。
フィッシュマン（Ｆischman）ら、国際特許出願公開ＷＯ９３／１３３１７には、キレート化部分に結合した走化性ペプチドが開示されている。
クウェックブームら、１９９１、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３２：９８１ アブストラクト＃３０５には、ソマトスタチン類似体を111Ｉnで放射性標識することが開示されている。
アルバートら、１９９１、アブストラクト ＬＭ１０、第１２回アメリカン・ペプタイド・シンポジウム（１２th Ａmerican Ｐeptide Ｓymposium）：１９９１には、111Ｉn標識したジエチレン−トリアミノ五酢酸誘導ソマトスタチン類似体のための使用が開示されている。
コックスら、１９９１、アブストラクト、第７回インターナショナル・シンポジウム・オン・ラジオファーマコロジー（７th Ｉnternational Ｓymposium on Ｒadiopharmacology）、第１６頁には、シンチグフィーによるin vivoでの内分泌腫瘍の放射性局在化におけるＴc−９９ｍ、131Ｉおよび111Ｉn標識したソマトスタチン類似体の使用が開示されている。
ある種の特異的結合性化合物のＴc−９９ｍによる標識化方法は、従来技術で知られている。
フナットウィッチ（Ｈnatowich）、Ｕ．Ｓ．特許第４，６６８，５０３号には、Ｔc−９９ｍタンパク放射性標識化が開示されている。
トールマン（Ｔolman）、Ｕ．Ｓ．特許第４，７３２，６８４号には、標的分子およびメタロチオネインのフラグメントのコンジュゲーションが開示されている。
ニコロッティ（Ｎicolotti）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，８６１，８６９号には、抗体などの生物学的分子とのコンジュゲートを形成する際に有用な二官能性カップリング剤が開示されている。
フリッツバーグら、Ｕ．Ｓ．特許第４，９６５，３９２号には、タンパクを標識するための種々のＳ保護したメルカプトアセチルグリシルグリシンをベースとしたキレート化剤が開示されている。
ショッチャット（Ｓchochat）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，０６１，６４１号には、少なくとも１つの「ペンデント（pendent）」スルフヒドリル基からなるタンパクの直接放射性標識化が開示されている。
フリッツバーグら、Ｕ．Ｓ．特許第５，０９１，５１４号には、タンパクを標識するための種々のＳ保護したメルカプトアセチルグリシルグリシンをベースとしたキレート化剤が開示されている。
グスタヴソン（Ｇustavson）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，１１２，９５３号には、タンパクを放射性標識するためのＴc−９９ｍキレート化剤が開示されている。
カシナ（Ｋasina）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，１７５，２５７号には、標的分子およびＴc−９９ｍキレート化基の種々の組合せが開示されている。
ディーン（Ｄean）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，１８０，８１６号には、二官能性キレート化剤を介するタンパクのＴc−９９ｍによる放射性標識化方法が開示されている。
サンドレハーゲン（Ｓundrehagen）、国際特許出願、公開ＷＯ８５／０３２３１には、タンパクのＴc−９９ｍ標識化が開示されている。
レノ（Ｒeno）およびボッティーノ（Ｂottino）、欧州特許出願８７３００４２６．１には、抗体をＴc−９９ｍにより放射性標識することが開示されている。
ブレマー（Ｂremer）ら、欧州特許出願第８７１１８１４２．６号には、抗体分子のＴc−９９ｍ放射性標識化が開示されている。
パック（Ｐak）ら、欧州特許出願ＷＯ ８８／０７３８２には、Ｔc−９９ｍによる抗体の標識化方法が開示されている。
ゲッドマンズ（Ｇoedemans）ら、ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０７４５６には、環状チオール化合物、特に、２−イミノチオランおよび誘導体を用いてタンパクを放射性標識することが開示されている。
ディーン（Ｄean）ら、国際特許出願、公開ＷＯ８９／１２６２５には、タンパクのＴc−９９ｍ標識化のための二官能性カップリング剤が開示されている。
シェマーカー（Ｓchoemaker）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９０／０６３２３には、金属結合領域からなるキメラタンパクが開示されている。
ソーンバック（Ｔhornback）ら、ＥＰＣ出願第９０４０２２０６．８号には、チオール含有化合物、特に、２−イミノチオランを用いる放射性標識したタンパクまたはペプチドの製造および使用が開示されている。
グスタヴソンら、国際特許出願、公開ＷＯ９１／０９８７６には、タンパクを放射性標識するためのＴc−９９ｍキレート化剤が開示されている。
ローデス（Ｒhodes）、１９７４、Ｓem．Ｎucl．Ｍed．４：２８１−２９３には、テクネチウム−９９ｍによるヒト血清アルブミンの標識化が開示されている。
カウ（Ｋhaw）ら、１９８２、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．２３：１０１１−１０１９には、Ｔc−９９ｍによる生物学的に活性な巨大分子を標識化するための方法が開示されている。
シュワルツ（Ｓchwartz）ら、１９９１、Ｂioconjugate Ｃhem．２：３３３には、ヒドラジノニコチンアミド基を用いるＴc−９９ｍによるタンパクの標識化方法が開示されている。
ペプチドを標識化する試みは、従来技術において報告された。
イージ（Ｅge）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，８３２，９４０号には、局在したＴ−リンパ球をイメージするための放射性標識したペプチドが開示されている。
モーガン（Ｍorgan）ら、Ｕ．Ｓ．特許第４，９８６，９７９号には、炎症部位のイメージング方法が開示されている。
フラナガン（Ｆlanagan）ら、Ｕ．Ｓ．特許第５，２４８，７６４号には、放射性標識キレート化部分および心房性ナトリウム排泄増加性因子誘導ペプチドの間のコンジュゲートが開示されている。
ランビィ（Ｒanby）ら、１９８８、ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２２７６には、放射性標識した化合物をフィブリンに共有結合させることからなる動物におけるフィブリン沈着物の検出方法が開示されている。
リーズ（Ｌees）ら、１９８９、ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１８５４には、動脈イメージングのための放射性標識したペプチドが開示されている。
モーガンら、国際特許出願、公開ＷＯ９０／１０４６３には、炎症部位のイメージング方法が開示されている。
フラナガンら、欧州特許出願第９０３０６４２８．５号には、１組の有機キレート化分子を介する合成ペプチドフラグメントのＴc−９９ｍ標識化が開示されている。
スタットル（Ｓtuttle）、ＰＣＴ出願、公開ＷＯ ９０／１５８１８には、ＲＧＤ含有オリゴペプチドのＴc−９９ｍ標識化が開示されている。
ロッドウエル（Ｒodwell）ら、１９９１、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３１１６には、「分子認識単位」と「エフェクタードメイン」とのコンジュゲートが開示されている。
コックス、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４５５９には、２つのシステイン残基を含有する放射性標識したソマトスタチン誘導体が開示されている。
ローデス（Ｒhodes）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／１２８１９には、金属イオン結合性ドメインからなるペプチドが開示されている。
ライル（Ｌyle）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／１５７７０には、Ｔc−９９ｍキレート化剤およびＴc−９９ｍで標識したペプチドが開示されている。
コフリン（Ｃoughlin）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／２１１５１には、放射性標識化標的分子のためのチオ尿素基からなる二官能性キレート化剤が開示されている。
ナイト（Ｋnight）ら、１９９０、第３７回アニュアル・ミーティング・オブ・ザ・ソサイエティ・オブ・ニュークリア・メディシン（３７th Ａnnual Ｍeeting of the Ｓociety of Ｎuclear Ｍedicine）、アブストラクト＃２０９には、Ｔc−９９ｍ標識したペプチドを用いる血栓イメージングが開示されている。
バビッチ（Ｂabich）ら、１９９３、Ｊ．Ｎucl．Ｍed．３４：１９６４−１９７４には、ヒドラジノニコチンアミド誘導体からなるＴc−９９ｍ標識したペプチドが開示されている。
ソマトスタチン、ソマトスタチンの誘導体、ソマトスタチンの類似体、またはソマトスタチンレセプターに結合し、ジスルフィドを形成するかもしくは該ジスルフィドがスルフヒドリル形に還元される少なくとも２つのシステイン残基を含有するペプチドを直接標識するための方法は、１９９３年７月６日付で発行された共有のＵ．Ｓ．特許第５，２２５，１８０号に開示されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
ペプチドを放射性標識するためのキレート化剤の使用、およびペプチドをＴc−９９ｍで標識するための方法は、従来技術で知られており、同時係属中のＵ．Ｓ．特許出願第０７／６５３，０１２号、第０７／８０７，０６２号、第０７／８７１，２８２号、第０７／８９３，９８１号、第０７／９５５，４６６号、第０８／０９２，３５５号および０８／０９５，７６０号に開示されている。
リスター−ジェイムズ（Lister-James）ら、１９９４、Ｊ．Ｎuclear Ｍedicine ３５：２５７Ｐ−２５８Ｐは、ｉｎ ｖｉｖｏにて腫瘍をイメージングするためのＴc−９９ｍ標識ソマトスタチン受容体結合ペプチドを開示する。
in vivoで腫瘍をイメージする際に用いるためにＴc−９９ｍまたは他の検出可能な放射性同位体で放射性標識した場合にシンチグラフィー剤として、ならびにレニウム−１８８などの細胞毒性放射性同位体で放射性標識した場合に放射線治療薬として、治療的に用いられるべき、増加したin vivo安定性を有する（慣用の製造を実施可能にし、規則的な容認を容易にするための）合成ソマトスタチン類似体が必要とされている。小さな合成ソマトスタチン類似体は、この要求を特異的に満たす本発明によって提供される。
発明の概要
本発明は、放射線治療用途を含む治療用途、および放射線診断用途、特に、シンチグラフィーイメージング用途を含む診断用途のための環状ペプチドからなるソマトスタチン類似体を提供するものである。天然ソマトスタチンと異なって、本発明の環状ペプチドは、ジスルフィド結合からなるものではない。本発明は、また、ペプチドが共有結合した金属イオン結合性部分を取り込んでいる環状ペプチドソマトスタチン類似体からなる環状ペプチド試薬を提供するものでもある。本発明は、シンチグラフィーイメージング剤、放射線診断薬および放射線治療薬である、かかる環状ペプチド、環状ペプチド試薬、および放射性標識した環状ぺプチド試薬を提供するものである。本発明のシンチグラフィーイメージング剤は、放射性同位体、好ましくは、テクネチウム−９９ｍで放射性標識した環状ペプチド試薬からなる。本発明の放射線治療薬は、細胞毒性放射性同位体、好ましくは、レニウム−１８６またはレニウム−１８８で放射性標識した環状ペプチド試薬からなる。かかる環状ペプチド、環状ペプチド試薬およびその放射性標識したエンボディメントの製造方法および使用方法を提供するものでもある。
本発明は、金属イオン錯形成部に共有結合した、哺乳動物体におけるソマトスタチンレセプターに特異的に結合する特異的結合性ペプチドからなる組成物を提供するものである。本発明の組成物は、式：
シクロ（Ｎ-ＣＨ3）-Ｐhe-Ｔyr-（p-Ｔrp）-Ｌys-Ｖal−Ｈcy．（CH2CO．Ｘ）
［式中、Ｘは、（アミノ酸）n−Ｂ−（アミノ酸）m−Ｚであり、ここで、Ｂは、システイン、ホモシステイン、イソシステインまたはペニシルアミンであるチオール含有部分であり、（アミノ酸）nおよび（アミノ酸）mは、各々独立して、チオール基を含まない一次アルファ−またはβ−アミノ酸であり、Ｚは、−〇Ｈまたは−ＮＨ2であり、ｎおよびｍは、各々独立して、それぞれ２〜５および０〜５の整数である］
で示される。
本発明の組成物を示す式において、用語「シクロ」と下線を引いたアミノ酸配列との組合せは、下線を引いたアミノ酸配列が、該配列の最初のアミノ酸のアミノ末端を該配列の最後のアミノ酸のカルボキシル末端に結合させてペプチド結合を介して環化されることを意味すると解されるであろう。「（ＣＨ2ＣＯ．Ｘ）」などの挿入用語が続く場合、該挿入用語は、括弧内の配列が下線を引いたアミノ酸配列におけるチオール含有アミノ酸のアミノ酸側鎖硫黄原子に共有結合して、スルフィド結合を形成することを意味すると解されるであろう。かくして、前記化学構造においては、−ＣＨ2ＣＯ．Ｘ基は、ホモシステインの側鎖硫黄原子に共有結合すると解されるであろう。かかる化学式の例は、実施例２において示す。
本発明の組成物の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。
本発明の組成物は、多くの診断目的および診断目的のための利用性を有する。
かくして、本発明の１つの態様は、過剰のソマトスタチンレセプターを有する哺乳動物体内の部位をイメージするための放射性標識したシンチグラフィーイメージング剤を製造するための試薬を提供するものである。かかる具体例では、金属イオン錯形成部は、放射性標識結合性部分からなり、該試薬は、該部分との錯形成を介して放射性標識との錯体を形成する。本発明のこの態様の１つの具体例では、シンチグラフィーイメージング剤は、還元条件下、試薬とＴc−９９ｍとで錯形成することによって形成される。
かくして、本発明は、本発明の試薬のＴc−９９ｍとの錯体であるシンチグラフィーイメージング剤および該試薬の放射性標識化方法からなるものでもある。本発明によって提供されるＴc−９９ｍ放射性標識した錯体は、還元剤の存在下、本発明の試薬をＴc−９９ｍと反応させることによって形成される。好ましい還元剤としては、限定されないが、ジチオナイトイオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンが挙げられる。本発明の錯体は、本明細書で提供されるような前還元したＴc−９９ｍ錯体のリガンド交換によって本発明の試薬をＴc−９９ｍで標識することによっても形成される。
シンチグラフィーイメージング剤を製造するための、本発明によって提供される試薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。好ましいイメージング剤は、この試薬のＴc−９９ｍ錯体からなる。
本発明は、Ｔc−９９ｍで放射性標識した本発明の試薬であるシンチグラフィーイメージング剤製造用キットを提供するものでもある。本発明によって提供される試薬をＴc−９９ｍで標識するためのキットは、予め決定された量の本発明の試薬および該試薬をＴc−９９ｍで標識するのに充分な量の還元剤を含有する密封したバイアルからなる。
第２の態様では、本発明は、本発明の組成物が、ヨウ素の放射性同位体、好ましくは、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５またはＩ−１３１で放射性標識されるイメージング剤を提供するものである。本発明は、本発明の試薬の放射性標識したヨウ素との錯体である放射性ヨウ素処理したイメージング剤を提供するものである。
放射性ヨウ素処理したイメージング剤の製造のための本発明によって提供された試薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。好ましいイメージング剤は、この試薬の放射性ヨウ素処理したエンボディメントからなる。
第３の態様では、常磁性金属イオンまたは粒子と錯形成した本発明の組成物である試薬からなる非放射性標識したイメージング剤を提供するものである。本発明のこの態様の具体例では、常磁性金属イオンは、金属イオン錯形成部と錯形成される。粒子、好ましくは、超常磁性金属粒子を用いる具体例では、本発明の組成物は、ヴァイスリーダー（Ｗeissleder）ら［１９９２、レイディオロジー（Ｒadiology）１８２：３８１−３８５］によって開示された方法を用いて、共有的にまたは会合的に超常磁性粒子に結合される。本発明は、磁気共鳴イメージングにおいて用いるかかるイメージング剤を提供するものである。これらの非放射性標識したイメージング剤の製造方法を提供するものでもある。
かかる非放射性標識したイメージング剤の製造のための本発明によって提供される試薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。好ましい非放射性標識したイメージング剤は、この試薬の第二鉄イオン錯体からなる。
本明細書では、治療薬も提供される。第４の態様では、本発明は、自体治療薬として金属イオンと錯形成しない本発明の組成物を提供するものである。本発明によって提供されるかかる治療薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。
第５の態様では、本発明は、本発明によって提供された組成物である治療薬を製造するための試薬からなる放射性標識した治療薬を提供するものである。かかる具体例では、金属イオン錯形成部がβ−粒子放出性または転換電子放出性放射性同位体と錯形成する本発明の組成物を提供するものである。β−粒子放出性放射性同位体の好ましい具体例は、レニウム−１８６およびレニウム−１８８である。好ましい転換電子放出性放射性同位体は、スズ−１１７ｍである。本発明は、ソマトスタチン−レセプター発現性病理学的細胞および組織、特に、新生細胞および転移性細胞の放射線治療のための本発明の組成物のかかる放射性同位体錯体を提供するものである。本発明の組成物のかかる治療的放射性同位体錯体の製造方法を提供するものでもある。
かかる放射線治療薬の製造のために準備される本発明の試薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。好ましい放射線治療薬は、この試薬とのβ−粒子放射性放射性またはコンバージョン電子放射性金属イオン錯体からなる。
本発明の放射線治療薬のもう１つの態様では、本発明は、本発明の組成物がヨウ素の放射性同位体、好ましくは、Ｉ−１２５もしくはＩ−１３１、または、アスタチン−２１１で放射性標識される放射線治療薬を提供するものである。本発明は、放射性標識治療薬自体、および当該試薬を放射性標識するための方法を提供するものでもある。
これらの治療用の放射性ヨウ素処理および放射性アスタチン処理した薬物の製造のために準備される本発明の試薬の好ましい具体例は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
で示される化合物である。好ましい放射線治療薬は、この試薬の放射性ヨウ素処理および放射性アスタチン処理したエンボディメントからなる。
銅、亜鉛またはレニウムなどの非放射性金属原子と錯形成した本発明の組成物である試薬からなる、非放射性標識した金属原子錯形成した薬物である治療薬が提供される。本発明のこの態様の具体例では、非放射性金属イオンは、金属イオン−錯形成部と錯形成される。本発明は、ソマトスタチンレセプターがある種の組織からなる細胞において過剰発現される病状を治療する際およびソマトスタチンレセプターを過剰発現する新生細胞を治療する際に使用するためのかかる治療薬を提供するものである。これらの非放射性標識した金属原子錯形成治療薬の製造方法も提供される。
非放射性標識治療薬を調製するのに提供される好ましい態様の本発明の試薬は、式：
シクロ（Ｎ−メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
の化合物である。
好ましい非放射性標識治療薬は、この試薬のレニウム錯体からなる。
本発明は、in vitroにおける化学合成により本発明の試薬のペプチドを製造する方法を提供する。好ましい態様において、ペプチドは固相ペプチド合成により合成される。
本発明は、該発明の診断および放射性診断薬ならびに治療および放射性治療薬の使用法を提供する。放射性標識された本発明の試薬の具体例、例えばＴc−９９ｍ標識のシンチグラフィーイメージング剤では、本発明の有効な診断または治療量の診断または放射性診断剤あるいは治療または放射性治療剤を投与する。放射性診断の態様において、放射性標識の局在化はガンマシンチグラフィーのような従来の方法体系を用いて検出される。非放射性診断態様において、本発明の常磁性金属標識診断剤の蓄積の部位の局在化は磁気共鳴イメージング方法体系を用いて達成される。本発明により得られるイメージング剤は、腫瘍をイメージングするという、特に一次および転移腫瘍部位（腫瘍細胞がソマトスタチン・レセプター（ＳＳＴＲ）を発現する）、特に従来の方法体系を用いる検出に対して臨床的になじまないかかる一次およびとりわけ転移腫瘍細胞をイメージングするという有用性を有する。加えて、本発明のイメージング剤は、例えば結核を患っている患者にて生じるような、オカルト疾患または病理学に伴うＴリンパ球蓄積の部位を検出するのに有用である。
本発明は、該発明のソマトスタチン類似体を用い、動物、好ましくはヒトにおける疾患または他の病気を緩和する方法を提供する。これらの疾患および病気は、糖尿病および糖尿病関連の網膜症、肝硬変および感染性肝炎、出血性潰瘍および他の胃腸出血、膵炎、中枢神経系障害、内分泌腺障害、アルツハイマー病、先端巨大症および他の疾患およびin vivoにて成長ホルモンが不適当なレベルまで生成することに関連する障害、および癌、特にその増殖が成長ホルモンの生成に依存するかまたはその生成によって影響される癌を包含するが、これらに限定されない。非放射性標識治療の具体例はまた、ＳＳＴＲ過剰発現のガストリノーマにより引き起こされる下痢のようなＳＳＴＲ過剰発現関連病の治療にて有用性を有する。本発明によって得られるソマトスタチン類似体の投与量は、前記したまたは他の疾患の治療に慣用的に用いられる天然ソマトスタチンの投与量と同じであるか、またはそのin vivoにおける半減期が長いため、本発明の化合物をより少量にて投与してもよい。
治療用途はさらに、腫瘍、ソマトスタチン・レセプターを発現する細胞を有する患者にて、新生物および転移悪性細胞の放射性治療切除を包含する。本発明の放射性治療剤の使用は、より慣用的な療法になじまない腫瘍および手術できない腫瘍についての一次的治療用途、ならびに手術に対して補足的な付随的療法、放射線療法または慣用的な化学療法を包含する。
本発明の放射性標識の具体例はまた、手術の間にソマトスタチン・レセプター発現腫瘍組織を同定するための手術用ガイドとしての有用性を有する。
本発明の個々の好ましい具体例は以下のある種の好ましい具体例の詳細な記載および請求の範囲から明らかになるであろう。
図面の簡単な記載
図１は、矢印で示される、後脚の腫瘍部位で高摂取量を示す、腫瘍担持ラット中の99mＴc−標識Ｐ５８７のイメージを示す。
好ましい態様の詳細な記載
本発明はソマトスタチン類似体であり、ジスルフィド結合を有しない環状ペプチドを提供する。かかるソマトスタチン類似体は、未変性ソマトスタチンと比べて、in vivoににおける安定性の向上を示した。これらの環状ペプチドはそれ自体、ヒトを含む哺乳動物における疾患および他の病気を緩和するための治療剤である。
本発明はさらに、放射性ヨウ素化または放射性アスタチン化されていてもよく、放射性治療および放射性診断の使用に有用な環状ペプチドを提供する。
本発明によって得られるこれらの環状ペプチドの別の具体例は、本発明の環状ペプチドが金属イオン錯形成基に共有結合している環状ペプチド試薬である。そのような環状ペプチド試薬は放射性診断薬または放射性治療薬を供給するための放射性標識能を有する。本発明の放射性標識剤を用いる放射性診断的使用の一例は、シンチグラフィーイメージングであり、ソマトスタチンレセプターを担持する腫瘍の位置および大きさを測定することができる。本発明の環状ペプチド試薬はまた、放射性治療薬として用いるには、レニウム−１８６またはレニウム−１８８のような細胞毒性放射性同位体で放射性標識されていることが有利である。本発明の環状ペプチド試薬はまた非放射性金属との錯体の調製において有用であり、該錯体は治療学的に有用である。
Ｔc−９９ｍを用いる標識化が本発明の有利な点である。というのも、この同位体の核特性および放射能特性により該同位体が理想的なシンチグラフィーイメージング剤とされるからである。この同位体は１４０ｋｅＶの単一の光子エネルギーおよび約６時間の放射能半減期を有し、99Ｍｏ−99mＴｃジェネレーターより容易に得られる。他の放射性核種をまた、本明細書にて開示されているようなプラクティスにて用いてもよい。
本明細書にて用いるシンチグラフィーイメージング剤なる語は、放射能検出手段（ガンマ・カメラ、ガイガー-ミュラー計数管およびシンチレーション検出器プローブを包含するが、これらに限定されない）によって検出することのできる放射性標識剤を包含するものである。
他方、本発明の放射性治療の具体例は、これらの限定されるものではないが、銅−６７、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびアスタチン−２１１、最も好ましくは、186Ｒeまたは188Ｒeを包含する細胞毒性の放射性同位体で標識化されているのが有利である。かかる態様は、限定されるものではないが、悪性または良性腫瘍の細胞の細胞表面におけるソマトスタチンレセプターの発現を介する、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体と結合しうるかかる腫瘍の増殖により特徴付けられる癌および他の疾患を包含する、動物、好ましくはヒトにおけるソマトスタチン関連疾患または他の病気の治療にて有用である。
本発明は診断剤および放射性診断剤、ならびに治療剤および放射性治療剤を調製するための試薬を提供する。本発明により得られる試薬は、哺乳動物の体内でソマトスタチンレセプター部位に結合する特異的結合のペプチドと共有結合した金属イオン−錯形成部からなる。
好ましくは、分子量が１０，０００ダルトン以下の小さな化合物が、商業上有利なのは明らかである。このような小さな化合物は容易に製造することができる。さらには、該化合物は免疫原性でなく、脈管構造を速やかに明瞭にすると考えられ、かくして良好かつより迅速なイメージングが可能となる。反対に、抗体またはそのフラグメントのような大きな分子、あるいは１０，０００ダルトンより大きな他の生物学的に誘導されたペプチドは製造に費用がかかり、免疫原性であり、血流を明瞭にするのが遅く、かくしてin vivoにおける速やかな診断を妨げることとなる。
その中に含まれる非ジスルフィド環状結合が、共有結合した放射性標識の結合部を放射性標識する条件下にあって安定していることは、本発明によって得られるソマトスタチン類似体の利点である。対照的に、例えば、未変性ソマトスタチンまたはジスルフィド結合を有するソマトスタチン類似体に共有結合したＴc−９９ｍ結合部へのＴc−９９ｍの結合は、生物学的活性の喪失を伴うジスルフィドの還元をもたらしうる。そのような生物学的活性の喪失はまた、未変性ソマトスタチンを用いてin vivoにて、またはジスルフィド結合を有するソマトスタチン類似体に起こり得る。本発明のソマトスタチン類似体の非ジスルフィド環状結合は安定した共有結合からなっているため、in vivoにて生物学的活性の同様な喪失に供されることはない。
本発明の目的のため、「特異的結合ペプチド」なる語は、過剰量のソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）分子により特定される哺乳動物の体内の標的部位に特異的に結合するいずれのペプチド化合物をも意味する。「特異的結合」が、ペプチドが標的部位より広い範囲に、組織の周辺にまで局在化することを意味することは当業者であれば理解するであろう。そのような特異的結合は、かかる特異的結合ペプチドからなる診断用イメージング剤にて有利である、というのも、該イメージング剤は投与すると哺乳動物の体内全体に散在し、試薬結合の放射能のかかる特異的局在化がin vivoにて標的を視覚決定できるからである。
本発明の特異的結合ペプチド含有の具体例として、アミノ酸の配列からなるものが挙げられる。本発明で用いるアミノ酸なる語は、Ｌ−およびＤ−、一次α−およびβ−アミノ酸、天然、修飾、置換、変性その他のすべてのアミノ酸を包含するものである。本発明の試薬の特異的結合ペプチドの例として、約５，０００ダルトン以下の分子量を有する特異的結合ペプチドが挙げられる。特に好ましい本発明の特異的結合ペプチドの具体例として、ＳＳＴＲ発現細胞、特に腫瘍細胞および活性化Ｔ−リンパ球細胞上のソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）に対して特異的かつ高親和力で結合するペプチドが挙げられる。本発明により得られる特異的結合ペプチドからなる試薬は、以下のアミノ酸配列（以下のペプチドのアミノ酸は、特記しない限り、Ｌ−アミノ酸である）を有するペプチドからなる試薬を包含するが、これらに限定されるものではない：
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＤ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＲＲ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫＫＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣ．Ｏrn．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣＫＤＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣ．Ｏrn．Ｄ．Ｏrn．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＧＣ．Ｏrn．Ｄ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＫＫＣ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＫＲＣ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＲＲＣ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＫＫＣＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＲＣＫ．アミド）
シクロ（Ｎ-メチル）ＦＹＷDＫＶ．Ｈcy．（CH2CO．ＧＫＣＲ．アミド）
（アミノ酸についての一文字略語は、Ｇ．Ｚbubay、１９８８、Ｂiochemistry、（第２版）、ＭacＭillan Ｐublishing、ニューヨークｐ．３３で見ることができる；他の略語は表Ｉの凡例にあるとおりである）。本発明により得られるこの列挙した試薬は例示であって、限定または排除することを意図するものではなく、当業者であれば、本明細書に開示のペプチドまたはその等価物の組み合わせからなる試薬が本発明のいずれかのキレート部に共有結合し、本発明の範囲内にあることがわかるであろう。
好ましい具体例において、本発明の試薬は、式：
0003918157.tif 000003
で示される。
本発明の試薬からなる特異的結合ペプチドは、in vitroにて化学合成できる。かかるペプチドは、一般に、有利には、ペプチドシンセサイザーで製造できる。本発明のペプチドは、本明細書に教示の技法（例えば、実施例２、サブセクションＯ）を用い、in vitroにおける化学合成の間に金属イオン錯形成部をペプチドに共有結合させて合成することができる。
本発明のシンチグラフィーイメージングの態様において、テクネチウム−９９ｍの錯体を本発明の試薬を用いて形成する。これを達成するために、好ましくは、Ｔc−９９ｍ過テクネチウム酸の塩のようなＴc−９９ｍを、還元剤の存在下、本発明の試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、第一錫および第一鉄イオンであり；最も好ましい還元剤は塩化第一錫のような錫の塩である。さらに好ましい具体例において、その還元剤は固相還元剤である。錯体およびそのような錯体の製造手段は、都合よくは、標識されるべき所定量の本発明の試薬および該試薬をＴc−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を含有する密封バイアルからなるキットの形態にて提供される。別法として、錯体は本発明の試薬とテクネチウムおよびトランスファーリガンド（例えば、タルトレート、シトレート、グルコネートまたはマンニトールなど）として知られている別の化合物の予め形成された不安定な錯体を反応させることにより形成してもよい。この方法はリガンド交換として知られており、当業者に周知である。本発明で有用なＴc−９９ｍ過テクネチウム酸塩の中には、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、またはアンモニウム塩もしくは低級アルキルアンモニウム塩が包含される。
本発明によればテクネチウム−９９ｍ標識のシンチグラフィーイメージング剤は、適量のＴc−９９ｍまたはＴc−９９ｍ錯体をバイアルに添加し、後記の実施例３に記載の条件下で反応に付すことにより調製できる。キットはまた、例えば、浸透圧を調節するための医薬上許容される塩、緩衝剤、保存剤などの慣用的医薬添加物質を含有してもよい。該キットの成分は、凍結または乾燥した液体形であってもよい。好ましい具体例において、キット成分は凍結乾燥した形態で提供される。本発明の放射性標識されたシンチグラフィーイメージング試薬は、後記の実施例３に記載の条件下で反応させることにより調製してもよい。
本発明により得られる放射性標識された試薬は適量の放射能を有して提供される。例えば、Ｔc−９９ｍ放射性錯体の形成において、一般に、１ｍｌ当たり約０．０１ミリキュリー（ｍＣi）から１００ｍＣiの濃度の放射能を含有する溶液中で放射性錯体を形成させるのが好ましい。
本発明により得られるイメージング剤は、器官、例えば腎臓などの障害を診断するために、該器官を視覚化するのに用いることができ、腫瘍、特に胃腸腫瘍、骨髄腫、小細胞肺癌および他のＡＰＵＤomas、骨髄チロイド癌および下垂体癌のような内分泌腺腫瘍、髄膜腫および星状細胞腫のような脳腫瘍、および前立腺、乳腺、結腸および卵巣の腫瘍をイメージすることができる。本発明にしたがって、Ｔc−９９ｍ標識のペプチド試薬を単一の単位注射用量にて投与する。本発明により得られるＴc−９９ｍ標識ペプチド試薬は、水性セイライン媒体のような静脈内注射用の慣用的媒体にて、または血漿媒体にて静脈内注射してもよい。一般に、投与すべき単位用量は、約０．０１ｍＣiないし約１００ｍＣi、好ましくは１ｍＣiないし２０ｍＣiの放射能を有する。単位用量で注射される溶液は約０．０１ｍｌないし約１０ｍｌである。静脈内注射した後、in vivoにおけるイメージングが、およそ２ないし３分で起こり得る。しかしながら、所望により、放射性標識された試薬を患者に注射した後、数時間またはそれより長い時間でさえ、イメージングを起こさせることができる。大抵、投与された用量のうち十分な量が１時間の約０．１の範囲内でイメージされる領域に蓄積し、シンチフォトを撮影することができる。本発明に従って、診断の目的でシンチグラフィーイメージングするいずれの慣用的方法も用いることができる。
ソマトスタチンレセプター結合環状ペプチドおよび本発明の環状ペプチド試薬の非放射性金属錯体は、ある種の腫瘍、特にソマトスタチンレセプターを発現する腫瘍の後退を促進するための治療薬として臨床的に用いてもよい。本発明のソマトスタチン類似体の環状ペプチドはまた、しばしば、ＡＰＵＤomasのようなある種の癌を伴うホルモン過剰分泌を減少させるのに用いることができる。治療薬として用いられる本発明のペプチドは、静脈内、筋肉内または口腔による投与を包含するいずれか適当な経路により、約０．１ないし約４９ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にある用量にて、いずれの許容される医薬担体中にて投与することができる。
本発明はまた、前記したようなある種の腫瘍の放射性療法に用いることができるレニウム−１８６またはレニウム−１８８のような細胞毒性の放射性同位体で放射性標識したペプチドを提供する。この目的のため、約１０ｍＣiから約２００ｍＣiの量の放射性同位体をいずれか適当な臨床的経路を介して、好ましくは静脈内注射により投与してもよい。
これらの化合物を製造し、かつ標識する方法を以下の実施例においてさらに詳しく説明する。これらの実施例は前記した方法のある種の態様および有利な結果を示しており、これらの実施例は例示として示されるものであり、何ら本願発明を限定するものではない。
実施例１
固相ペプチド合成
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆmoc）アミノ末端保護を用いて、アプライド・バイオシステムズ（Ａpplied Ｂiosystems）モデル４３１Ａペプチドシンセサイザーを用いた０．２５ミリモル（mmole）のスケールで行い、カルボキシル末端の酸にはｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）またはサスリン（Sasrin）（登録商標）樹脂、またはカルボキシル末端のアミドにはリンク（Ｒink）アミド樹脂を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ）でカップリングさせた。
Ｆmoc・Ｈcy（Ｓ−トリチル）およびＦmoc・Ｐen（Ｓ−トリチル）は、トリフルオロ酢酸中、トリフェニルメタノールでトリチル化し、つづいてＡthertonら（１９８９，Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthesis，ＩＲＬプレス：オックスフォード）に記載されているようにＦmoc誘導化に、さらには以下の実施例２のサブセクションＪに付すことにより適当なアミノ酸より調製した。Ｆmoc−Ｓ−（３−（ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）−アミノプロピル）システインを、メタノール性ナトリウムメトキシド中のＬ−システインおよび臭化Ｂoc−アミノプロピルより、つづいてpＨ１０のＯ−９−フルオレニルメチル−Ｏ'−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（Ｆmoc−ＯＳu）で処理することにより調製した。
２−ハロアセチル基を、ＳＰＰＳの間にカップリングされる最終残基としての適当な２−ハロ酢酸を用いるか、または樹脂に結合させたＮ−末端遊離アミノペプチドをＮＭＰ中の２−ハロ酢酸／ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮＭＰ中の２−ハロ無水酢酸／ジイソプロピルエチルアミンのいずれかで処理することにより導入した。
チオール含有ペプチドを、クロロアセチル含有の、チオール保護されたＴc−９９ｍ錯形成部とpＨ１０で０．５〜２４時間、室温で反応させ、つづいて所望により酢酸で酸性化し、該溶液を蒸発させて対応するペプチド−スルフィド付加物を得た（以下の実施例２のサブセクションＯにさらに詳細に記載されている）。脱保護および精製を前記のように慣用的に行い、キレーター−ペプチドの接合体を得た。
ＳasrinTM樹脂結合ペプチドを、ジクロロメタン中１％ＴＦＡ溶液を用いて切断し、保護ペプチドを生成した。
適当には、保護ペプチドの先駆体を、以下の実施例２、サブセクションＭにさらに詳細に記載されるように、ジフェニルホスホリルアジドを用いる、側鎖保護された、アミノ末端遊離アミンおよびカルボキシ末端遊離酸の反応により、アミノ−およびカルボキシ末端の間で環化した。
ＨＭＰまたはＲinkアミド樹脂結合生成物は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡおよび塩化メチレンからなり、所望により水、チオアニソール、エタンジチオールおよびトリエチルシランを含有してもよい溶液（１００：５：５：２．５：２の比）を用い、０．５〜３時間、室温で慣用的に切断し、保護された環化ペプチドを脱保護した。適当には、生成物をトリフェノールメタノール／ＴＦＡ中で再度Ｓ−トリチル化し、（Ｂoc）2Ｏを用いてＮ−Ｂoc基をペプチドに再度導入した。
粗ペプチドをＷaters Ｄelta-Ｐak Ｃ１８カラムおよびアセトニトリルで修飾した水中０．１％ＴＦＡでグラジエント溶出を用いる分取用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。カラム溶出の後、アセトニトリルを溶出したフラクションより蒸発させ、ついでそれを凍結乾燥した。そうして得られた各生成物の同一性を高速原子衝撃質量分光法（ＦＡＢＭＳ）または電子噴射分光法（ＥＳＭＳ）により確認した。
実施例２
シクロ（Ｎ−ＣＨ3）フェニルアラニル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−リジル−バリル−ホモセリン，Ｓ−２−アセチル−グリシル−グリシル−システイニル−リジンアミド（Ｐ５８７）の合成
Ａ．Ｎ−α−カルボベンゾキシ−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジン，Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミドエステルの合成
冷水浴で冷却されている１８０ｍＬの乾テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のＮ−α−カルボベンゾキシ−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルリジン（２３ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（７．１ｇ、６１．７ｍｍｏｌ）の混合物に、ジイソプロピルカルボジイミド（９．６６ｍＬ、６１．７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を一晩撹拌し、次いで、濾過し、濾液を蒸発させた。次いで、濾液の残渣を最小量の酢酸エチル、２００ｍＬのエーテルおよび２００ｍＬのヘキサンに再溶解した。標記化合物をこの混合物から沈殿させ、濾過により回収し、冷ヘキサンで洗浄し、乾燥して２８．１ｇ（５８．９ｍｍｏｌ、収率９７％）を得た。
Ｂ．Ｎ−α−カルボベンゾキシ−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
１５０ｍＬのＴＨＦ中のバリンメチルエステル（８．３８ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１２．７ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−α−カルボベンゾキシ−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジン，Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２３．９ｇ、５０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、さらに５０ｍＬのＴＨＦを添加した。２時間後、蒸発により溶媒を除去し、５０ｍＬの酢酸エチルを残渣に添加した。溶液を、２００ｍＬの５％クエン酸、２００ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和溶液、次いで、２００ｍＬの飽和ブラインで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。得られた油状物質を最小量の酢酸エチル、２００ｍＬのエーテルおよび２００ｍＬのヘキサンに溶解した。標記化合物を濾過により単離し、乾燥して２０ｇ（４０．５ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。
Ｃ．Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
１００ｍＬの酢酸エチル中のＮ−α−カルボベンゾキシ−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（１９ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）および酢酸（１ｍＬ）の溶液に、炭素上１０％パラジウム触媒（０．１９ｇ）を添加し、水素雰囲気下で一晩撹拌した。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、濾液を蒸発させ、１ｍＬの酢酸を含有する１００ｍＬのメタノールに残渣を再溶解した。この溶液に炭素上１０％パラジウム触媒（０．１９ｇ）を添加し、パー（Parr）の水素化装置を用いて、１平方インチあたり４５ポンドの圧力の水素下で２時間水素化した。反応混合物をセライトで再濾過し、濾液を蒸発させて１３．５６ｇの標記化合物（３７．７ｍｍｏｌ、収率９８％）を得た。
Ｄ．フルオレニルメトキシカルボニル−Ｄ−トリプトファン，Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの合成
冷水浴で冷却されている２５０ｍＬのＴＨＦ中のＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−トリプトファン半水和物（２５ｇ、８２．１ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（９．７８ｇ、８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（１３．３ｍＬ、８５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、濾液を蒸発させた。次いで、残渣をトルエンおよびヘキサンに再溶解した。濾過により標記化合物を単離し、乾燥して３４ｇ（６６．５ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。
Ｅ．フルオレニルメトキシカルボニル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
２００ｍＬのＴＨＦ中のＮ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（１３ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）の混合物に、フルオレニルメトキシカルボニル−Ｄ−トリプトファン，Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（１８．９ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）を添加した。ジイソプロピルエチルアミンを添加して反応混合物のｐＨを８に合わせ、反応物を２日間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発により除去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、５％クエン酸、飽和重炭酸ナトリウム、次いで、飽和ブラインで洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶液を濾過し、蒸発させ、残渣を酢酸エチルに再溶解した。この溶液から数回再結晶を行うことにより標記化合物を回収して１７．３ｇの生成物（２２．５ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。
Ｆ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシン，Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミドエステルの合成
冷水浴で冷却されている２５０ｍＬの乾ＴＨＦ中のＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシン（２５ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（６．６２ｇ、５７５．ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（９．０ｍＬ、５７．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、濾液を蒸発させた。次いで、残渣をトルエンおよびヘキサンに再溶解した。濾過により標記化合物を単離し、乾燥して２７．２ｇ（４９．７ｍｍｏｌ、収率９２％）を得た。
Ｇ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
フルオレニルメトキシカルボニル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（１７ｇ，２２．１ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジエチルアミンおよび４０ｍＬのＴＨＦで、室温において１．５時間処理した。次いで、反応混合物を蒸発させ、１００ｍＬのＴＨＦに再懸濁し、３回再蒸発させた。残渣を１２０ｍＬの乾ＴＨＦ中にとり、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシン，Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミドエステル（１２．３ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、２０ｍＬの乾ＴＨＦおよび４ｍＬのジイソプロピルアチルアミンを添加し、ｐＨ９の溶液を得た。一晩撹拌後、反応物を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に取った。酢酸エチル溶液を５％クエン酸、重炭酸ナトリウム飽和溶液、次いで、飽和ブラインで洗浄し、次いで、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発を行った。残渣を酢酸エチル、エーテルおよびヘキサン中に取り、標記化合物を沈殿させた。沈殿化合物を濾過により単離し、乾燥して１４．６ｇの標記化合物（１４．８ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。
Ｈ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−メチルフェニルアラニン，Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの合成
冷水浴で冷却されている１８０ｍＬの乾ＴＨＦ中のＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−メチルフェニルアラニン（２５ｇ、６２．３ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（７．５ｇ、６５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（１０ｍＬ、６４．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、濾液を蒸発させた。次いで、残渣をトルエンおよびヘキサン中に再溶解した。濾過により標記化合物を単離し、乾燥して２８．３ｇ（５７ｍｍｏｌ、収率９１％）を得た。
Ｉ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（１４ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を３５ｍＬのジエチルアミンおよび３５ｍＬのＴＨＦで、室温において１時間処理した。反応混合物を蒸発させ、１００ｍＬのＴＨＦに３回再懸濁し再蒸発させた。残渣を酢酸エチルおよびヘキサン中に取った。生成物Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルを沈殿させ、濾過により単離し、乾燥して９．７ｇ（１２．７ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルを３５ｍＬのＴＨＦに溶解し、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−メチルフェニルアラニン，Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（６．３５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、３ｍＬのジイソプロピル−エチルアミンを添加し、ｐＨ９の溶液を得た。一晩撹拌後、反応物を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に取った。ＥｔＯＡｃ溶液を５％クエン酸、重炭酸ナトリウム飽和溶液、次いで、飽和ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ、エーテルおよびヘキサン中に取り、標記化合物を沈殿させた。沈殿化合物を濾過により単離し、乾燥して１２．４ｇの標記化合物（１１．５ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。
Ｊ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチルホモシステインの合成
ａ．ドライアイス／エタノール浴で−７８℃に冷却されている約４００ｍＬの液体アンモニアに、少量の痕跡量のナトリウムを添加し、次いで、十分量のホモシステインを添加してナトリウム／アンモニア溶液の青色の発生を停止させ、５．７ｇ（２４８ｍｍｏｌ）のナトリウムおよび９．７５ｇ（３６．３ｍｍｏｌ）のホモシステインを消費させてナトリウム／アンモニア溶液の青色を１５分間維持した。塩化アンモニウム（０．５ｇ）を添加して最終的な青色を消し、次いで、反応物を冷浴から取り出し、アルゴンの流れの下でアンモニアを蒸発させた。フラスコを少し暖めて実質的にすべての残存アンモニアを追い出した。
残渣にトリフェニルメタノール（２３．６ｇ、９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷水浴で冷却した。２５０ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し、３０分後、混合物を蒸発させ、残渣をクロロホルムに３回再溶解し再蒸発させた。次いで、残渣を３００ｍＬの水に再溶解し、５％クエン酸および１Ｍ  ＫＯＨでｐＨを４に合わせた。生成物はゴム状物質として沈殿し、これを濾過により集めた。次いで、残渣をエーテルで分散してＳ−トリチル−ホモシステイン（７ｇ、１８．６ｍｍｏｌ、収率２６％）を得た。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／水からの再結晶により濾液から第２クロップを単離して２４．２ｇ（６４ｍｍｏｌ、８９％）を得た。
ｂ．１５０ｍＬのアセトン／水中のＳ−トリチル−ホモシステイン（２０ｇ、５３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸ナトリウム（１１．５ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、２００ｍＬのアセトン中のＯ−フルオレニルメチル−Ｏ'−（Ｎ−サクシンイミジル）カルボネート（１７．５ｇ、５２ｍｍｏｌ）を添加したが、これらの添加を１時間かけて行った。次いで、反応混合物を約２時間撹拌し、次いで、有機溶媒を蒸発させた。水性残渣に３００ｍＬの酢酸エチルを添加し、混合物を１Ｍ  ＨＣｌで酸性にした。有機相を分離し１Ｍ  ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＨＣｌ、次いで、０．２５Ｍ  ＨＣｌで順次洗浄し、次いで、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１００％クロロホルム→クロロホルム中３％メタノール）に供して標記化合物を得た（１９．４ｇ、３２ｍｍｏｌ、収率６２％）。
Ｋ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−ホモシステイン−Ｎ−メチル−フェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルの合成
フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（９．８ｇ、８．５ｍｍｏｌ）を、２８ｍＬのジエチルアミンおよび３０ｍＬのＴＨＦで、室温において１時間処理した。次いで、反応混合物を蒸発させ、１００ｍＬのＴＨＦに３回再懸濁し再蒸発させた。残渣を酢酸エチルおよびヘキサン中に取った。生成物Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステルを沈殿させ、濾過により単離し、乾燥して４．９ｇ（８．１ｍｍｏｌ、収率９５％）を得た。
−１５℃の冷却浴中の乾ＴＨＦ中のＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−ホモシステインの溶液に、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ；２．４７ｇ、９．７ｍｍｏｌ）および１．７ｍＬのジイソプロピルエチルアミン（９．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０分撹拌した。５０ｍＬの乾ＴＨＦ中のＮ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（７．４８ｇ）を添加し、次いで、さらに１．７ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応体積を蒸発により５０％に減じ、次いで、室温で２日間撹拌した。溶媒を蒸発により除去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、５％クエン酸、重炭酸ナトリウム飽和溶液、次いで、飽和ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。残渣をＥｔＯＡｃ、エーテルおよびヘキサン中に取り、標記化合物を沈殿させた。沈殿化合物を濾過により単離して１０．７ｇ（６．７７ｍｍｏｌ、収率８４％）を得た。
Ｌ．Ｓ−トリチル−ホモシステイン−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリンの合成
５０ｍＬのＴＨＦおよび４ｍＬの水中のＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−ホモシステイン−Ｎ−メチル−フェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン，メチルエステル（１０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）およびＬｉＯＨ・２Ｈ2Ｏの溶液を３日間撹拌した。さらに２５ｍｏｌ％のＬｉＯＨ・２Ｈ2Ｏを添加し、２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに再溶解した。次いで、この溶液を５％クエン酸。重炭酸ナトリウム飽和溶液、次いで、飽和ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ、エーテルおよびヘキサンに再溶解し、標記化合物を沈殿させ、濾過により単離し、乾燥した。得られた不純な生成物を、クロロホルム／クロロホルム中１０％メタノールを用いるシリカゲルクロマトグラフィーに供して３．４６ｇの純粋な標記化合物（４７ｍｍｏｌ、収率４１％）を得た。
Ｍ．シクロ−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルチロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリル−Ｓ−トリチル−ホモシステインの合成
１７４０ｍＬのＤＭＦに溶解したＳ−トリチル−ホモシステイン−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン（３．４２ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）の溶液を氷水浴で冷却し、１．１６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンおよびジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ；５．４ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を−２０℃で５日間インキュベーションし、さらに２５ｍｏｌ％のＤＰＰＡを添加し、次いで、さらに１００ｍｏｌ％のジイソプロピルエチルアミンを添加した。次いで、蒸発によりＤＭＦ溶媒を除去し、粗標記化合物を酢酸エチル、エーテルおよびヘキサンから結晶化して２．４３ｇ（１．９ｍｍｏｌ、６９％）を得た。
Ｎ．シクロ−Ｎ−メチルフェニルアラニル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−リジル−バリル−Ｓ−トリチル−ホモシステインの合成
シクロ−Ｓ−トリチル−ホモシステイン−Ｎ−メチルフェニルアラニン−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−Ｎ−ε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジル−バリン（２．３４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、１８．７ｍＬのＴＦＡ、２ｍＬのジクロロメタン、０．９４ｍＬの水、０．４７ｍＬのエタンジオールおよび０．３７ｍＬのトリイソプロピルシランで、室温で１時間処理した。ＴＦＡを蒸発により除去し、残渣をクロロホルムに再溶解し、３回再蒸発した。次いで、残渣を１０ｍＬのクロロホルムに溶解し、４００ｍＬの冷水に注いだ。粗生成物を沈殿させ、濾過により集め、Ｃ１８調製用逆相ＨＰＬＣカラム（水中３０％アセトニトリル→水中６０％アセトニトリルのグラジエントを使用、すべての溶媒は０．１％ＴＦＡを含有）により精製して標記化合物（１ｇ、１．２ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。高速原子衝突質量スペクトル分析法（ＦＡＢＭＳ）により、理論（平均）推定値８５５．０９に対して８５５のＭＨ+が得られた。
Ｏ．シクロ−Ｎ−メチルフェニルアラニル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−リジル−バリル−Ｓ−トリチル−ホモシステイン，Ｓ−２−アセチル−グリシル−グリシル−システイニル−リジンアミドの合成
シクロ−Ｎ−メチルフェニルアラニル−チロシル−Ｄ−トリプトファニル−リジル−バリル−ホモシステイン（２５０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）および２−クロロアセチル−グリシル−グリシル−Ｓ−トリチル−システイニル−リジルアミード（実施例１記載のごとくＳＰＰＳにより調製：２３８ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を７ｍＬのアセトニトリルおよび７ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム／０．５ＭＥＤＴＡ溶液，ｐＨ１０に溶解し、一晩撹拌した。次いで、反応混合物を蒸発乾固させ、上記実施例１に記載のごとくトリイソプロピルシランを含有するＴＦＡ中で脱保護を行った。次いで、標記化合物を逆相ＨＰＬＣにより精製して期待理論収率の９２．４％を得た。高速原子衝突質量スペクトル分析法により、理論（平均）推定値１２５７．７０に対して１２５８のＭＨ+が得られ、式：
0003918157.tif 000004
により示される。
実施例３
放射性標識のための一般的方法
実施例１のごとく調製した０．１ｍｇのペプチド試薬を０．１ｍＬの水、または０．９％の塩化ナトリウム、または１０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰＣＤ）、または５０：５０のエタノール：水、またはリン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）、または５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝５、６、または７．４）に溶解した。２００ｍＣｉまでを含有する１．０ｍＬのＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウムでグルコスキャンバイアル（Glucoscan vial）（イー・アイ・デュポン・ド・ネマース・インコーポレイテッド（E.I.DuPont de Nemours,Inc.）,Wilmington,DE）を復元することによりＴｃ−９９ｍグルセプテートを調製し、室温で１５分放置した。次いで、２５μｌのＴｃ−９９ｍグルセプテートを試薬に添加し、室温または１００℃で５〜３０分間反応を進行させ、次いで、０．２μｍのフィルターで濾過した。
下記条件を用いてＴｃ−９９ｍ標識ペプチド試薬の純度をＨＰＬＣにより決定した：  ５μｍ ｘ ４．６ｍｍ ｘ ２２０ｍｍのサイズを有するウォーターズ・デルタ−パック（Waters Delta-Pak）ＲＰ−１８分析用カラムに各放射性標識ペプチドを負荷し、次いで、１ｍＬ／分の流速の溶媒で溶離した。１００％溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）から開始し１００％溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／水）で終了する直線グラジエントを用いて１０〜２０分かけてグラジエント溶離を行った。統合された検出器に接続されたイン−ライン・ラジオメトリック・ディテクター（in-line radiometric detector）により放射活性化合物を検出した。これらの条件下で、Ｔｃ−９９ｍグルセプテートおよびＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウムは１ないし４分の間に溶離するが、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドはずっと遅くに溶離した。
以下の表は、本明細書記載の方法を用いて実施例１に従って調製したペプチドの成功したＴｃ−９９ｍ標識を説明する。
0003918157.tif 000005
ＨＰＬＣ法（Ｒtの後の上つき文字により示す）：
ウォーターズ−Ｉカラム、１０分で１００％溶液Ａ→１００％溶液Ｂ
アミノ酸の１文字略記はズベイ（Zubay）、上記文献、ｐ３３に見いだされる。下線は、誘導体基の結合アミノ酸の間のアミドまたはチオール結合の形成を示す。Ａｃｍはアセトアミドメチル；Ｏｒｎはオルニチン；ＦDはＤ−フェニルアラニン；ＹDはＤ−チロシン；ＷDはＤ−トリプトファン；Ａｐｃ＝Ｌ−Ｓ−（３−アミノプロピル）システイン；Ｈｃｙはホモシステイン。
シーヴァース（Seevers）ら（１９８２年、ケミ・レビュ（Chem.Rev.）第８２巻：５７５〜５９０頁）により記載されたようにして放射ヨウ素化および放射アスタチン化を行う。
本発明ペプチド試薬のそれぞれを、コットン（Cotton）ら（１９６６年、インオーガニック・ケミストリー（Inorg.Chem.）第５巻：９〜１６頁）により記載されたように調製された約１モル当量のテトラブチルアンモニウムオキソテトラ−ブロモレニウム酸（＋５）とジメチルホルムアミドまたはアセトニトリル／水に共溶解し、０．５〜５分間撹拌することにより非放射活性レニウム複合体を調製した。Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドについて上で説明したようにして逆相ＨＰＬＣによりレニウム複合体を単離し、ＦＡＢＭＳまたはＥＳＭＳにより特徴づけた。
Ｔｃ−９９ｍ標識と同じプロトコールを用いて、あるいはペプチドおよび過レニウム酸の溶液に還元剤を添加することにより、あるいは所望によりクエン酸塩のごときリガンド転移剤を用い、反応物を室温ないし１００℃の間で５ないし６０分の間インキュベーションすることにより、例えばＲｅ−１８６またはＲｅ−１８８を用いて放射活性レニウム複合体を調製する。
実施例４
ＡＲ４２Ｊラット・膵臓腫瘍細胞膜への［125Ｉ−Ｔｙｒ11］ソマトスタチン−１４の結合に対する阻害
本発明の種々のソマトスタチン受容体結合試薬のインビトロでのソマトスタチン受容体への結合能を、放射性標識したソマトスタチン類似体のソマトスタチン受容体含有細胞膜への結合に対するペプチド試薬により媒介される阻害についてのアッセイにおいて示した。
ソマトスタチン受容体を発現している膵臓腫瘍細胞系ＡＲ４２Ｊを、１０％ウシ・胎児血清（ＦＣＳ）および８ｍＭグルタミンを補足したダルベッコの改変必須培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ2加湿雰囲気下、３７℃で培養した。収穫した細胞を冷バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、次いで、ホモジナイズ物を３９０００ｇで１０分間、４℃において遠心分離した。ペレットをバッファーで１回洗浄し、次いで、氷冷１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁した。次いで、この細胞膜標品の同量の部分試料を、７５００００ｃｐｍ／ｍＬにおいて最終濃度０．５ｎＭ、比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの［125Ｉ−Ｔｙｒ11］ソマトスタチン−１４（アマーシャム（Amersham），Arlington Heights,IL）、および１０-11Ｍないし１０-0Ｍの範囲の最終濃度のペプチド本発明本発明ペプチド−レニウム複合体とともに、１％ウシ・血清アルブミン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０２ｍｇ／ｍＬバシトラシン、０．０２ｍｇ／ｍＬフェニルメチル−スルホニルフルオリドおよび２０００００ＩＵのトラシロール（Trasylol）を含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３０℃にて２５分インキュベーションした。
インキュベーション後、濾過用多岐管を用いてポリエチレンイミン洗浄したＧＣ／Ｆフィルター（ワットマン・リミテッド（Whatman Ltd.），英国Maidstone）でこの膜混合物を濾過し、フィルター上の残渣を５ｍＬの冷ＨＥＰＥＳバッファーで３回洗浄した。次いで、フィルターおよびフィルター洗液試料をガンマカウンターでカウントした。また、非特異的結合を評価するために、２００ｍｎの未標識ソマトスタチン−１４存在下で、本質的には説明したとおりにアッセイを行った。データ分析はデータのヒル・プロット（Hill plots）を含み、バイランド（Bylund）およびヤマシタ（Yamashita）（１９９０年、メソッズ・イン・ニューロトランスミッター・リレプター・アナリシス（Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis）、ヤマシタら編、ラベン・プレス（Raven Press）:N.Y.）により記載されたようにして阻害定数を求めた。本発明試薬でのこのアッセイを用いて得られた結果を以下に示す：
0003918157.tif 000006
これらの結果は、インビトロにて本発明ペプチド試薬が高親和性でソマトスタチン受容体に結合することを示す。
実施例５
ラットにおけるソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）発現腫瘍の局在化およびインビボでのイメージング
ラット・腫瘍細胞により発現されるソマトスタチン受容体のインビボでのイメージングを、本質的にはベッカー（Bekker）ら（１９９１年、ライフ・サイエンシズ（Life Sciences）第４９巻：１９５３〜１６０１頁）により記載されたようにして行った。
得られた腫瘍ブライ凍結物から融解されたＣＡ２０９４８ラット・膵臓腫瘍細胞を、０．０５ないし０．１ｍＬ／動物として、６週齢のルイス（Lewis）・ラットの後足の大腿部中に筋肉内移植した。腫瘍を０．５ないし２ｇにまで増殖させ、収穫し、その腫瘍ブライを用いてルイス・ラットの無処理のセットに２度目の移植を行った。この様式での継代を繰り返して、腫瘍を産生する動物の連続した世代を得た。インビボ研究に用いる腫瘍産生動物は、通常には、３ないし５代継代であり、０．２ないし２ｇの腫瘍を有していた。
腫瘍における放射性トレーサーの局在化の特異性を研究するために、選択されて動物にＳＳＴＲ−遮断量（４ｍｇ／ｋｇ）のオクトレオチドを放射性トレーサー注射前に皮下注射した（このプロトコールはバッカー（Bakker）らによって記載されており、腫瘍の111Ｉｎ−［ＤＴＰＡ］オクトレオチド取り込みが４０％低下する）。
３ないし４代継代したＣＡ２０９４８腫瘍を有するルイス・ラットを拘束し、０．２ｍＬ中３ないし８μｇのペプチドに相当する０．１５〜０．２０ｍＣｉの99mＴｃ−標識ペプチドを尾の背側から静脈注射した。
一定の時間で頸部脱臼により動物を屠殺し、検死を行った。得られた組織試料を秤量し、注射した量の一部についてガンマカウンターでカウントした。
選択した放射性標識ペプチドの９０分における生体分布の結果を表Ｉに示す。明らかに、99mＴｃ−Ｐ５８７、99mＴｃ−Ｐ６１７、99mＴｃ−Ｐ７２６および99mＴｃ−Ｐ７３６は多い腫瘍取り込みを示し、腫瘍／血液比は標的（腫瘍）組織における高い特異性の取り込みを示した。
図１は、腫瘍を有するラットにおける99mＴｃ−Ｐ５８７のイメージを示す。後足の腫瘍における多い取り込みが明確に観察される。
インビボにおいてソマトスタチン受容体に結合することが知られているソマトスタチン類似体であるオクトレオチドを注射して、あるいは注射せずに、ラットの腫瘍における99mＴｃ−Ｐ５８７取り込みを比較した。これらの実験において、99mＴｃ−Ｐ５８７投与前のオクトレオチド投与による受容体遮断によって放射性標識ペプチドの特異的な腫瘍への取り込みが７６％低下した。これらの結果により、インビボにおける99mＴｃ−Ｐ５８７の結合がＳＳＴＲ特異的であることが確認された。
0003918157.tif 000007
実施例６
Ｔｃ−９９ｍ標識Ｐ５８７でのヒト・ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）発現腫瘍のインビボにおけるイメージング
臨床試験において、Ｔｃ−９９ｍ標識したＰ５８７試薬を用いてＳＳＴＲ発現腫瘍を有するヒト・患者のシンチグラフイメージングを行った。
２７歳から６９歳までの範囲の４人の女性および６人の男性からなる全部で１０人の患者は、以前に、成長ホルモン分泌下垂体アデノーマ（４人の患者）、メラノーマ（１人の患者）、髄甲状腺ガン（１人の患者）、肺小胞カルシノーマ（ＳＣＬＣ；１人の患者）、非ホジキンリンパ種（１人の患者）または胃カルシノイド（１人の患者）であると診断されていた。これらの患者各人に、０．２〜０．５ｍｇあたり１０〜２２ｍＣｉのＴｃ−９９ｍ標識Ｐ５８７を静脈注射した。次いで、本明細書記載のごとく注射後４時間において各患者についてシンチグラフイメージングを行った。
ガンマ線カメラによるイメージングを注射と同時に開始する。最初の１０分にわたる動的研究結果（１０秒のイメージを得た）として腹側のイメージを得て、次いで、注射後１、２、３および４時間後に静的イメージとして得た。注射後約１０〜２０分後、および約１、２、３および４時間後に、５００００カウントまたは２０分（いずれか短時間のほう）で腹側のイメージを得た。
シンチグラフイメージング剤は血流からすみやかに除去され、注射３０分後で循環系中において注射量の１０％未満となった。このことにより、シンチグラフイメージング剤注射１５〜３０分後には腫瘍部位のイメージ獲得が可能となった。すべての知られた腫瘍ならびに後にコンピューターを用いた断層撮影法（ＣＡＴスキャン）を用いて確認された２種の未検出の転移性障害を本研究で検出した。
これらの結果により、本発明シンチグラフイメージング剤はインビボにおいてヒトのＳＴＲ発現性の初期および転移性腫瘍の検出において非常に効果的であることが示された。
上記開示は本発明の定の具体例を強調するものであり、本発明に対するすべての修飾または別の均等物は添付した請求の範囲に示した本発明の精神および範囲に属することが理解されるはずである。
【図１】
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