(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコースがα−結合したフコシド化合物と糖受容体とからα1-3フコシド結合を選択的に形成する作用を有するペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)由来で次の理化学的性質を有するα−フコシダーゼ。
（１）至適pHおよび安定pH：至適pHはpH約5。pH3〜7において25℃の処理を24時間行っても失活しない。
（２）至適温度：至適温度は50℃。
（３）分子量：約180,000（TSKゲルＧ3000SWによるゲルろ過法）。
【請求項２】
請求項１記載のα−フコシダーゼを用いることを特徴とするα1-3フコシド結合を有する糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なα−フコシダーゼおよびこれを用いたα1-3フコシド結合を有する糖質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フコース(Fuc)を含むオリゴ糖は、広く天然の糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質糖鎖の構成成分として存在している。特に、フコースがＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）に対してα1-3結合している構造が際だって多くみられる。例えば、糖鎖腫瘍抗原として知られているシアリルルイスＸ（sLeX）中、あるいは母乳中等にもFucα1-3GlcNAcという部分構造が存在している。そこでこのようなオリゴ糖の生理活性を詳細に研究し、且つ利用方法を研究するために、フコースを含むオリゴ糖の合成法の確立が求められている。
【０００３】
しかしながら、フコースを含む糖鎖の合成は、一部のものが化学合成または酵素合成によりなされているのにすぎない。
【０００４】
化学合成においては、種々のフコース含有オリゴ糖が合成されているが、いずれも工程数が長く、工業的生産には好ましくない。
【０００５】
α1-3フコシド結合を有する糖質の酵素合成法に関しては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)起源α−フコシダーゼを用いた転移反応による合成法についての報告がある（K. Ajisaka and M. Shirakabe, Carbohydr. Res., 224, 291-299(1992)および特開平4-99492）のみである。しかし、アスペルギルス・ニガー起源のα−フコシダーゼは有機溶媒に対して不安定である。通常、パラニトロフェニル−α−フコピラノシド(pNP-α-Fuc)などを糖供与体として酵素合成反応を行う場合には、この糖供与体は水よりも有機溶媒に溶解しやすいことから水と有機溶媒の混合溶媒を用いる場合が多い。したがって、有機溶媒に対して不安定であるということは、酵素合成反応において酵素を多く必要とするということにもなり、好ましい物性ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、α1-3フコシド結合を有する糖質を効率的に合成するための有機溶媒に対し安定なα−フコシダーゼ、および該酵素を用いた当該糖質合成法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討した結果、前記α1-3フコシド結合を有する糖質を選択的に合成でき、且つ有機溶媒に対し安定な新規のα−フコシダーゼ[EC3.2.1.51]を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、特許請求の範囲に記載の各請求項からなる。以下本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のα−フコシダーゼを産生する微生物としては、ペニシリウム属に属する菌などがあげられる。このうち、ペニシリウム・マルチカラーもしくはペニシリウム・シトリナムが好ましい。これらの微生物からα−フコシダーゼを得るには、公知の方法、すなわち、当該微生物を培養して、その培養液上清あるいは微生物菌体から取得する方法が適用できる。あるいは、市販酵素、例えば、ラクターゼ製剤等に混在したα−フコシダーゼを精製して用いることができる。
【０００９】
次にα1-3フコシド結合を有する糖質の製造法について述べる
α−フコシダーゼは本来加水分解酵素であるが、受容体濃度を高めると糖転移作用を触媒するようになる。糖供与体としては、フコイダン等の天然の糖質、パラニトロフェニル−α−フコピラノシド等の合成基質を用いることができるが、α−フコシル結合を非還元末端に持つ糖質であればいずれでもよい。糖受容体としては、グルコース（Glc）、Ｎ−アセチルグルコサミン、種々の糖、種々のアルコール類などのヒドロキシル基を持つ化合物を用いることができる。α1-3フコシド結合を有する糖質を合成する際は、フコース供与体とフコース受容体との量比は、1:0.1〜1:10であるが好ましくは1:0.2〜1:5である。尚、糖供与体と糖受容体とが同一化合物であっても何ら差し支えない。α1-3フコシド結合した糖質の製造には、精製した酵素を用いることが好ましいが、部分精製酵素あるいは培養液をそのまま、または培養液を粉末化した粗酵素を用いても何ら差し支えない。また、固定化酵素であっても構わない。
【００１０】
以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明するが本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００１１】
【実施例】
実施例１  酵素の精製
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)起源酵素標品ラクターゼＰ（ケイ・アイ化成社製）10gを10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)30mlに懸濁し、４℃で攪拌した。約12時間後遠心分離（10,000 x g,10分）を行い、上清を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化したQ-Sepharose FFカラム（5cm x 20cm）に添加した。ついで、1M塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)の濃度勾配によりα−フコシダーゼを溶出させた。流速は2ml/minであった。
【００１２】
▲１▼至適pHおよび安定pH
ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100μlを含む緩衝液(pH5.32〜8.25はリン酸緩衝液、pH3.34〜6.22は酢酸緩衝液、pH1.17〜3.72はグリシン緩衝液)1.5mlと5mM pNP-α-Fuc 500μlを混合し、37℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にした相対活性を図１に示す。pH5付近において高い酵素活性が認められた。
【００１３】
安定pHを調べるためにペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100μlを含む各pHの上記緩衝液1.5mlを25℃で保持した。24時間後、反応液100μl、0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.4mlおよびpNP-α-Fuc 500μlを混合し、37℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にした相対活性を図２に示す。
【００１４】
酵素活性はpH3〜7において25℃の処理を24時間しても失活しなかった。
【００１５】
▲２▼至適温度
ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100μlを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.5mlおよびpNP-α-Fuc 500μlを混合し、各温度で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にした相対活性を図３に示す。
【００１６】
図３から、ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシシダーゼの至適温度は50℃であった。
【００１７】
▲３▼分子量
TSKゲルＧ3000SW（東ソー社製）によるゲルろ過法ではペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシシダーゼの分子量は約180000であった。
【００１８】
▲４▼有機溶媒に対する安定性
ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼ100μlおよび有機溶媒を10,20あるいは30(v/v)%を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.5mlを37℃で保持した。３時間後、反応液100μl、0.1Mリン酸緩衝液(pH 5.33)1.4mlおよびpNP-α-Fuc 500μlを混合し、37℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にしたα−フコシダーゼの残存活性を表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
30%ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でアスペルギルス・ニガー起源α−フコシダーゼの３時間後の残存活性は約20%であったのに対し、ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼの３時間後の残存活性は約58%であった。また、20%ジオキサン中でのアスペルギルス・ニガー起源およびペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼの３時間後の残存活性はそれぞれ約14%および約55%であった。これらの結果から、本発明のα−フコシシダーゼの方がアスペルギルス・ニガー起源のα−フコシシダーゼよりも有機溶媒中での安定性は高いことが示された。
【００２１】
実施例２  ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3Glcの製造法
100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcを1mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)からなる溶液に溶解し、これに0.6単位のα−フコシダーゼ（ペニシリウム・マルチカラー起源）を加え、37℃で振盪した。20時間後、反応液を100℃で５分間加熱して酵素を熱失活させた。この反応液を活性炭カラム（2.7cm x 50cm）に供し、水−40%エタノール水溶液の濃度勾配により生成物を単離したところ、35.2mgのFucα1-3Glcを得た。活性炭カラムからの糖の溶出パターンを図４に、生成物の13Ｃ−ＮＭＲ(D2O, 125MHz)を図５に示す。
【００２２】
実施例３  ペニシリウム・シトリナム起源α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3Glcの製造法
100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcを1mlのＤＭＦおよび10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)からなる溶液に溶解し、これに6.8単位のペニシリウム・シトリナム（商品名「ヌクレアーゼアマノ（天野製薬社製）」）の酵素剤中に含まれるα−フコシダーゼを加え、37℃で振盪した。4.5時間後、反応液を100℃で５分間加熱して酵素を熱失活させた。その後、実施例２と同様に生成物を単離したところ、29.8mgのFucα1-3Glcを得た。
【００２３】
実施例４  ペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシシダーゼを用いるFucα1-3GlcNAcの製造法
100mgのpNP-α-Fuc及び500mgのGlcNAcを1mlのＤＭＳＯおよび５mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)からなる溶液に溶解し、これに4.7単位のα−フコシダーゼ（ペニシリウム・マルチカラー起源）を加え、37℃で振盪した。４時間後、反応液を100℃で５分間加熱して酵素を熱失活させた。この反応液を活性炭カラム（2.7cm x 50cm）に供し、水−30%メタノール水溶液の濃度勾配により生成物を単離したところ、43.2mgのFucα1-3GlcNAcを得た。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の有機溶媒に対して安定な新規のα−フコシダーゼを用いて、複合糖質糖鎖の重要な中間体であるFucα1-3Glc、Fucα1-3GlcNAcおよびその誘導体を
効率的に合成できる。
【００２５】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼのpH依存性を示す。○および□は、それぞれ酢酸緩衝液およびリン酸緩衝液を用いて測定したときの相対活性を示す。
【図２】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼのpH安定性を示す。○、□および△は、それぞれ酢酸緩衝液、リン酸緩衝液およびグリシン緩衝液を用いて測定したときの相対活性を示す。
【図３】本発明のペニシリウム・マルチカラー起源α−フコシダーゼの温度依存性を示す。
【図４】実施例２におけるフコシルオリゴ糖の溶出パターンを示す。
【図５】  Fucα1-3Glcの13Ｃ−ＮＭＲを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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