(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
0003902283.tif 000007
で表される抗生物質ホルママイシン。
【請求項２】
サッカロスリックスMK27−91F2株（受託番号FERM P−16053として寄託）を培養し、培養物から請求項1に記載のホルママイシンを採取することを特徴とする抗生物質ホルママイシンの製造法。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｉ）で表される抗生物質ホルママイシンを有効成分とする抗真菌剤。
【請求項４】
請求項１に記載の式（Ｉ）で表される抗生物質ホルママイシンを有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】
請求項１に記載の式（Ｉ）の抗生物質ホルママイシンを生産する特性を持つサッカロスリックスMK27−91F2株（受託番号FERM P−16053）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗真菌活性を有する新規な抗生物質であるホルママイシン
（Ｆｏｒｍａｍｉｃｉｎ）に関し、また、ホルママイシンの製造法に関する。さらに本発明はホルママイシンを有効成分とする抗真菌剤及び抗腫瘍剤に関する。また、本発明は、ホルママイシンを生産できる特性を持つ新規な微生物サッカロスリックスＭＫ２７−９１Ｆ２株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真菌感染症の化学療法において、抗真菌剤としてアンホテリシンＢ、ピロールニトリン、グリセオフルビン等が使用されている。また、農業用殺菌剤としてカスガマイシン、ポリオキシン、バリダマイシン等が使用されている。また抗腫瘍性物質は、ブレオマイシン、アクラシノマイシン、マイトマイシン等が化学療法剤として使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
真菌感染症の化学療法において従来使用されている既知の化学療法剤はいまだ十分に満足とはいえず、また耐性菌の出現は重大な問題である。従来使用されている既知の抗真菌物質とは異なる化学構造の骨格を有し且つ優れた抗真菌活性と性質を示す新しい化合物の発見または創製は常に望まれており、そのための研究が行われている。農業用殺菌剤においても、耐性菌の出現は重大な問題である。従来使用されている既知の抗真菌性物質とは異なる化学構造の骨格を有し且つ優れた抗真菌活性と副作用の少ない新しい化合物の発見または創製が常に望まれており、そのための研究が行われている。
【０００４】
癌の化学療法において、癌細胞が多剤耐性になることは重大な問題である。また、副作用の少ない制癌剤が常に求められている。そのため、従来使用されている既知の抗腫瘍性物質と異なる化学構造の骨格を有し且つ優れた制癌活性と副作用の少ない新しい化合物の発見、創製が強く望まれており、それを目的とした研究が行われている。本発明は、上記の要望に応えることができる抗真菌活性及び抗腫瘍活性を持つ新規な抗生物質を提供することを目的にするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは有用な新規の抗生物質を発見すべく研究を行ってきた。その結果、新規な微生物として、サッカロスリックス属に属する菌株を分離することに成功し、またこの菌株が新しい構造骨格を有する抗生物質を産生していることを見い出した。この抗生物質をホルママイシンと命名してこれが各種の糸状菌に対し抗真菌活性を示し、また各種の癌細胞に対し増殖抑制効果を示すことを見い出した。さらに研究を続けホルママイシンを分析することにより、ホルママイシンの化学構造を決定した。そしてホルママイシンが新規化合物であることを確認し、後記の式（Ｉ）により表せることを知見した。
【０００６】
しかして、本発明は、サッカロスリックス属に属する微生物を培養して得られて本発明者らによりホルママイシン(Formamicin)と命名された抗生物質、およびその製造法について提供するものである。さらに、本発明はホルママイシンを有効成分とする抗真菌剤及び抗腫瘍剤を提供するものである。
【０００７】
すなわち、第１の本発明によると、次式（Ｉ）
0003902283.tif 000002
で表される抗生物質ホルママイシンが提供される。
【０００８】
第１の本発明による式（Ｉ）のホルママイシンの理化学的性状は、次の通りである。
【０００９】
第１の本発明による式（Ｉ）のホルママイシンの理化学的性状は、次の通りである。
（１）外観
無色結晶
（２）融点
201 〜202 ℃
（３）比旋光度
［α］D23  ＋15.5゜（ｃ 1、エタノール中)
（４）分子式
Ｃ44Ｈ72０13
（５）高分解能質量分析（ＨＲＦＡＢＭＳ：正イオンモード）
実験値  831.4859  (M+Na)+ 
計算値  831.4871
（６）紫外線吸収スペクトル（エタノール中)
0003902283.tif 000003
添付図面の図１に示す。
（７）赤外線吸収スペクトル
添付図面の図２に示す通りである。
【００１０】
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル
５００ＭＨｚにおいて重ベンゼン溶液中で室温にて測定したホルママイシンのプロトンＮＭＲスペクトルは、添付図面の図３に示す通り。
（９）炭素１３核磁気共鳴スペクトル
１２５ＭＨｚにおいて重ベンゼン溶液中で室温にて測定したホルママイシンの炭素１３ＮＭＲスペクトルは、添付図面の図４に示す通り。
（10）溶解性
ジメチルスルホキシド、エタノール、アセトンに可溶で水に不溶である。
（11）ＴＬＣ
シリカゲル６０Ｆ２５４(メルク社製)の薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)で展開溶媒としてクロロホルム：メタノール(9:1) で展開したときのＲｆ
値は、0.39である。
【００１１】
本発明による抗生物質ホルママイシンが前記の式（Ｉ）で示される化学構造を有することは、プロトンＮＭＲ、炭素１３ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析等の分析を詳細に検討することにより前記の通り決定された。
【００１２】
本発明による式（Ｉ）のホルママイシンは後記の生物学的性質を有する。
すなわち、ホルママイシンは、植物病原糸状菌を含む各種の糸状菌に対して抗真菌活性を示す。
【００１３】
試験例１  ホルママイシンの真菌に対する抗菌活性
各種の糸状菌に対するホルママイシンの抗真菌スペクトルは、１％グルコース加普通寒天培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果を表１に示す。
【００１４】
0003902283.tif 000004
【００１５】
試験例２  ホルママイシンの植物病原菌に対する抗菌活性
各種の植物病原菌に対するホルママイシンの抗真菌スペクトルは、ポテトスクロース寒天培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果を表２に示す。
【００１６】
0003902283.tif 000005
【００１７】
試験例３
各種の癌細胞の増殖に対するホルママイシンの５０％抑制濃度（ＩＣ50）の測定結果を表３に示す。
なお、癌細胞の増殖の50％抑制の濃度の測定法は、ＭＴＴ法（「Journal ofImmunological Methods」65，55〜60頁(1983)参照）を用いて行った。
【００１８】
0003902283.tif 000006
【００１９】
以上のように本発明による抗生物質ホルママイシンは癌細胞に対し増殖抑制活性を示した。
【００２０】
さらに第2の本発明によると、サッカロスリックスMK27−91F2株（受託番号FERM P−16053として寄託）を培養し、培養物から、請求項1に記載のホルママイシンを採取することを特徴とする、抗生物質ホルママイシンの製造法が提供される。
【００２１】
第２の本発明の方法で使用する抗生物質ホルママイシンの生産菌は、前述した理化学的性質および生物学的性質を有する抗生物質を生産する能力を有するものであれば、その種を問わず使用でき、広範な微生物から選ぶことができる。かかる微生物のうち、抗生物質ホルママイシンの生産菌の具体的な好適の一例は、本発明者らにより平成５年９月、微生物化学研究所において、東京都世田谷区の土壌より分離された放線菌で、 ＭＫ２７−９１Ｆ２の菌株番号が付された菌であ る。
【００２２】
以下にＭＫ２７−９１Ｆ２株の菌学的諸性質について記載する。
１．形態
基生菌糸はよく分技し、分断が認められる。気菌糸は、直状あるいは不規則な曲状に長く伸長し、円筒形〜長円形の胞子状に分断する。又、気菌糸が絡まり合い球状を呈する場合がある。胞子の表面は平滑で、その大きさは約0.3 〜  0.5 × 1.1〜1.9 ミクロンである。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子
は認められない。
【００２３】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［  ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニユアル（Container Corporation   of America のcolor harmony manual) を用いた。
【００２４】
（１）スクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地５、27℃培養）
うす黄茶［２ne, Mustard Gold］の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培養）
うす黄［２gc, Bamboo〜2ic, Honey Gold]の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
【００２５】
（４）チロシン寒天培地（ISP-培地７、27℃培養）
うす黄茶［２pg, Mustard Gold] の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。
（５）イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地２、27℃培養)
うす黄茶[3ic, Lt Amber］の発育上に、白〜茶白［３ba, Pearl]の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（６）オートミール寒天培地（ISP-培地３、27℃培養)
うす黄［２gc, Bamboo] の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
【００２６】
３．生理学的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0％、Ｌ−アスパラギン0.05％、りン酸水素二カリウム0.05％、ひも寒天 3.0％、pH7.0)を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、３７℃及び５０℃での生育は認められず、２０℃〜  ３０℃の範囲で生育した。生育至適温度は３０℃付近と思われる。
【００２７】
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ISP-培地４、２７℃培養）
培養後５日目頃よりスターチの加水分解を認め、その作用は中等度である。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ISP-培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培地７；いずれも２７℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
【００２８】
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地、ISP-培地９；２７℃培養）
Ｌ-アラビノース、Ｄ-キシロース、Ｄ-グルコース、Ｄ-フルクトース、イノシトールを利用して発育し、スクロース、ラフィノースは利用しない。ラムノース、Ｄ−マンニトールの利用の存否は判然としない。
（５）硝酸塩の還元反応（0.1 ％硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP-培地８、  ２７℃培養）
陰性である。
【００２９】
以上の性状を要約すると、ＭＫ２７−９１Ｆ２株は、その形態上、基生菌糸はよく分技し、分断を認める。気菌糸は直状あるいは不規則な曲状に長く伸長し、円筒形〜長円形の断片 又は胞子様の構造に分断する。輪生技、菌束糸、胞子の う及び運動性胞子は認められない。種々の培地で、うす黄〜うす黄茶の発育上に白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。メラニン様色素の生成、及び硝酸塩の還元反応はいずれも陰性であり、スターチの水解性は中等度である。
【００３０】
ところで、ＭＫ２７−９１Ｆ２株の菌体成分は、細胞壁の２，６−ジアミノピメリン酸がメソ型であった。全菌体中の還元糖はアラビノースを含まず、ガラクトースを含む。グリコレートテストの結果はアセチル型であった。又、ミコール酸は含有せず、リン脂質はＰII型（ホスファチジルエタノールアミンを含みホスフアチジルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）、主要なメナキノンはＭＫ−９（Ｈ4 ) であった。脂肪酸はi-16:0を主に含み、i-14:0、i-15:O、16:O、16:1、17:1及びi-16:1を含有した。
【００３１】
以上の結果より、ＭＫ２７−９１Ｆ２株はサッカロスリックス(Saccharothrix、文献，International Journal of Systematic Bacterlology，34巻，426-431 頁，1984年）属に属するものと考えられる。そごで、ＭＫ２７−９１Ｆ２株をサッカロスリックス・エスピー（Saccharothrix sp.)ＭＫ２７−９１Ｆ２とする。
なお、ＭＫ２７−９１Ｆ２株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成９年１月２８日、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０５３として受託された。
【００３２】
第２の本発明の方法においては、抗生物質ホルママイシンの製造は次の通り行われる。
【００３３】
すなわち、抗生物質ホルママイシンの製造は、抗生物質ホルママイシン生産菌を栄養培地中に接種して、２５〜３０℃、好ましくは２７℃の温度で好気的条件下に振とうしながら培養することによって行われ、抗生物質ホルママイシンを含む培養物が得られる。このような目的に用いる栄養培地としては、放線菌の使用しうるものが使用される。栄養源として、例えば市販されているポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、トーストソーヤ、硫酸アンモニウム等の窒素源が使用できる。また、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトースまたはデキストリン等の炭水化物あるいは油などの炭素源が使用できる。さらに食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を添加して使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加することができる。これらのものは、抗生物質ホルママイシン生産菌が利用し、抗生物質ホルママイシンの生産に役に立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
【００３４】
抗生物質ホルママイシンの生産には、サッカロスリックス属に属する抗生物質ホルママイシンの生産能を有する微生物が使用される。具体的には、本発明者らの分離したサッカロスリックスＭＫ２７−９１Ｆ２株が使用でき、このＭＫ２７−９１Ｆ２株は抗生物質ホルママイシンを生産することが、本発明者らによって明らかにされているが、その他の菌株については、抗生物質生産菌の単離の常法によって自然界より分離することが可能である。また、サッカロスリックスＭＫ２７−９１Ｆ２株を含めて、抗生物質ホルママイシンの生産菌を放射線照射その他の変異処理に付して、抗生物質ホルママインンの生産能を高める余地も残っている。さらに遺伝子工学的手法による抗生物質ホルママイシンの生産も可能である。
【００３５】
抗生物質ホルママイシンの製造のため、サッカロスリックス属に属する抗生物質ホルママイシン生産菌を適当な培地で好気的に培養するに当っては、培養温度は、抗生物質ホルママイシン生産菌の発育が実質的に阻害されずにこの物質を生産しうる範囲であれば、特に制約されるものでない。使用する生産菌に応じて培養温度は適当に選択できるが、好ましくは２５〜３０℃の範囲内の温度を挙げることができる。
【００３６】
ホルママイシン生産のための種母培地に接種するものとしては、寒天培地上、ＭＫ２７−９１Ｆ２株の斜面培養から得た生育物を使用できる。
【００３７】
このＭＫ２７−９１Ｆ２株の生育は通常３ないし７日で最高に達するが、一般に、充分な抗真菌活性が培地に付与されるまで培養を続ける。この培養液中のホルママイシンの力価の経時変化は、高速液体クロマトグラフィーあるいはアスペルギルス・フミガツスを被検菌とする円筒平板法により測定できる。
【００３８】
第２の本発明の方法においては、上記のようにして得られたホルママイシン生産菌の培養物からホルママイシンを採取する。ホルママイシンの採取法としては、微生物の生産する代謝物を採取する時に用いられる手段を適宜利用することからなる。例えば、水と混ざらない溶媒による抽出の手段、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィー等を単独または組み合わせて利用しホルママイシンを採取できる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。かくして前記した抗生物質ホルママイシンが得られる。
【００３９】
さらに、第３の本発明では、式（Ｉ）のホルママイシンを有効成分とする抗真菌が提供される。
【００４０】
また、第４の本発明によると、式（Ｉ）のホルママイシンを有効成分とする抗腫瘍剤が提供される。
【００４１】
この抗真菌または抗腫瘍剤においては、有効成分は製薬学的に許容できる常用の固体または液状担体、例えばエタノ一ル、水、でん粉等と混和できる。
【００４２】
さらに、第５の本発明では、前記の式（Ｉ）のホルママイシンを生産する特性を持つサッカロスリックスＭＫ２７−９１Ｆ２株が新規な微生物として提供される。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
抗生物質ホルママイシンの製造
寒天斜面培地に培養したサッカロスリックスＭＫ２７−９１Ｆ２株（ＦＥＲＭＰ−１６０５３）を、グリセロール 2.5％、酵母エキス 1.0％、肉エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、食塩 0.2％、硫酸マグネシウム0.05％、リン酸水素二カリウム0.05％、炭酸カルシウム0.32％を含む液体培地（ｐＨ 7.4に調整）を三角フラスコ（500 ml容）に110 mlずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌したものに接種し、その後30℃で３日間回転振とう培養した。これにより種母培養液を得た。
【００４４】
グリセロール 2.0％、デキストリン 2.0％、バクトソイトン 1.0％、酵母エキス 0.3％、硫酸アンモニウム 0.2％、炭酸カルシウム 0.2％を含む液体培地(pH 7.2 に調整）をジャーファーメンター（30リットル容、２基）に各15リットル入れ滅菌した後、上記種母培養液を２％量で接種し、２７℃で４日間培養した。
【００４５】
このようにして得られた培養液を遠心分離して菌体を分離した。菌体に６リットルのアセトンを加え、十分撹拌した後ろ過した。得られたアセトン抽出液は、減圧下でアセトンを溜去し約２リットルに濃縮し、酢酸エチル３リットルでホルママイシンを抽出した。ホルママイシンを含む酢酸エチル層を分離した後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。この抽出液を減圧下で濃縮し、ホルママイシンを含む暗褐色油状物を約5.3g得た。
【００４６】
得られた暗褐色油状物は、へキサン−アセトニトリル（１：１、200 ml）の混合溶液で分配を行った。ホルママイシンを多く含むアセトニトリル層（下層）を分離した。さらに、この分離したアセトニトリル溶液にへキサンを加え分配を行い、ホルママイシンを多く含むアセトニトリル層（下層）を分離した。再度、この分離したアセトニトリル溶液にヘキサンを加え分配を行った。ホルママイシンを多く含むアセトニトリル層（下層）を分離し、減圧下で濃縮し、ホルママイシンを含む褐色油状物を約1.9 g 得た。
【００４７】
得られたホルママイシンを含む褐色油状物を少量のエタノールに完全に溶かした後、エタノールで膨潤させたセフアデックスＬＨ−20（ファルマシア社）を充填したカラム（内径26mm×長さ250mm)によりゲルろ過クロマトグラフイーにかけた。ホルママイシンを含む画分を集め、減圧下で濃縮乾固することによりホルママイシンを含む褐色油状物を約 697mg得た。
【００４８】
ついで、このホルママイシンを含む褐色油状物を、遠心液液分配クロマトグラフィーを使って精製した。すなわち、ヘキサン−エタノール−水(100：85：15）にて上昇法により遠心液液分配クロマトグラフィーを行った。ホルママイシンは反転溶出区に溶出された。活性画分を集め、減圧下で濃縮乾固することによりホルママイシンを含む淡褐色油状物の約 159mgを得ることが出来た。このホルママイシンを含む油状物を、シリカゲルカラム（内径18mm×長さ300mm)にのせ、クロロホルム−酢酸エチルの展開液でクロマトグラフィーを行った。ホルママイシンを含む画分を集め、減圧下で濃縮乾固することにより無色油状のホルママイシン40.5mgを得た。このホルママイシンをジエチルエーテル中で結晶化し、無色板状結晶のホルママイシン23mgを得た。融点201 〜202 ℃。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はホルママイシンのエタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
【図２】図２は、ホルママイシンのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図３】図３はホルママイシンの重ベンゼン溶液中にて室温で測定した５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】図４はホルママイシンの重ベンゼン溶液中にて室温で測定した１２５ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。
【図１】
0003902283.tif 000008
【図２】
0003902283.tif 000009
【図３】
0003902283.tif 000010
【図４】
0003902283.tif 000011