(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲ１の唯一の構造的および機能的に完全なＳＣＲ領域として、順番に並んだ、長相同性繰り返し配列Ａ（ＬＨＲ−Ａ）のＳＣＲ１、２および３から選択される１〜３個の短コンセンサス繰り返し配列（ＳＣＲ）からなり、少なくともＳＣＲ３を含み、ここに、ＳＣＲ１、２および３は、各々、成熟ＣＲ１の残基２〜５８、６３〜１２０および１２５〜１９１から成る、ことを特徴とする可溶性ポリペプチド。
【請求項２】
ＣＲ１の唯一の構造的および機能的に完全なＳＣＲ領域として、順番に並んだ、ＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１、２および３からなる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
式（Ｉ）：
ＮＨ2-Ｖ1-ＳＣＲ１-Ｗ1-ＳＣＲ２-Ｘ1-ＳＣＲ３-Ｙ1-ＯＨ     （Ｉ）
［式中、ＳＣＲ１は成熟ＣＲ１の２〜５８残基を表わし、ＳＣＲ２は成熟ＣＲ１の６３〜１２０残基を表わし、ＳＣＲ３は成熟ＣＲ１の１２５〜１９１残基を表わし、Ｖ1、Ｗ1、Ｘ1およびＹ1は結合または長さが１〜５残基であって、ＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］
で示される請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
式（III）：
ＮＨ2-Ｘ3-ＳＣＲ３-Ｙ3-ＯＨ                     （III）
［式中、ＳＣＲ３は請求項３で定義したとおり、Ｘ3およびＹ3は結合または長さが１〜５残基の、ＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］
で示される請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０または配列番号：３１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡポリマー。
【請求項７】
宿主細胞中、請求項６のＤＮＡポリマーの発現能を有する複製可能な発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の複製可能な発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項９】
組換え型宿主細胞中、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現し、生成物を回収することからなる請求項１に記載のＣＲ１ポリペプチドの製法。
【請求項１０】
有効な治療物質として用いるための請求項１記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリペプチドおよび種々の炎症および免疫障害を含む疾患の診断および治療における使用に関する。
正常な血清中に約１０％のグロブリンを含むが、補体系は外来抗原に対する免疫系の応答において重要である多くの異なる蛋白質からなる。補体系は、その第一成分が開裂した場合に活性化され、生成物は単独でまたは他の蛋白質と共に別の補体蛋白質を活性化し、その結果蛋白分解カスケードとなる。補体系の活性化は、血管透過性の増加、食細胞の走化性、炎症細胞の活性化、外来粒子のオプソニン作用、細胞の直接的破壊および組織破壊などの種々の応答につながる。補体系の活性化は、抗原-抗体錯体（古典的経路）、または例えば、病原菌の細胞壁に存在するリポ多糖（別の経路）により引き起こされる。
Ｉ型補体受容体（ＣＲ１）は、赤血球、単核細胞／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、ある種のＴ細胞、脾臓小胞樹状細胞、および糸球足細胞の膜上に存在することが判明している。ＣＲ１は補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体とも称する。ＣＲ１の１アロタイプの構造および一次配列は公知である（クリックスタイン（Klickstein）ら、１９８７，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（J.Exp.Med.）１６５：１０９５−１１１２；クリックスタインら、１９８８，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン１６８：１６９９−１７１７；アワーケイド（Hourcade）ら、１９８８，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン１６８：１２５５−１２７０；ＷＯ８９／０９２２０；ＷＯ９１／０５０４７）。これは３０個の短コンセンサス繰り返し配列（ＳＣＲ）からなり、その各々は約６０〜７０個のアミノ酸を含有する。各ＳＣＲには、平均６５個のアミノ酸のうち約２９個が保存されている。各ＳＣＲはジスルフィド結合中第３および第１ならびに第４および第２のハーフシスチンとのジスルフィド結合により三次元三重ループ構造を形成するとされている。ＣＲ１はさらに各７個のＳＣＲの４個の相同性繰り返し配列（ＬＨＲ）として配列している。リーダー配列に続いて、ＣＲ１分子は、Ｎ末端ＬＨＲ−Ａ、続く２個の繰り返し配列、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−ＣならびにＣ末端ＬＨＲ−Ｄとそれに続く２個の別のＳＣＲ、２５残基の推定トランスメンブラン領域および４３残基の細胞質テイルからなる。
予想されるＮ-末端グルタミン残基を有する成熟ＣＲ１分子（本明細書において、以後、残基１と称する）に基づいて、ＬＨＲ−Ａの初めの４個のＳＣＲ領域を、本明細書において、各々、２〜５８、６３〜１２０、１２５〜１９１および１９７〜２５２の成熟ＣＲ１からなると定義する。
アワーケイド（Hourcade）ら、１９８８，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（J.Exp.Med.）１６８：１２５５−１２７０は、ＣＲ１の分泌形態を産生すると予想されるヒトＣＲ１転写単位中に交互のポリアデニル化部位を観察した。この截形配列によりコードされるｍＲＮＡはＣＲ１の初めの８．５ＳＣＲからなり、Ｃ４ｂ結合領域を含むと考えられる約８０ｋＤａの蛋白質をコードする。この截形配列に対応するｃＤＮＡをＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、発現した場合、これは予想されるＣ４ｂ結合活性を示すが、Ｃ３ｂと結合しない（クライチ（Krych）ら、１９８９，ＦＡＳＥＢ Ｊ．３：Ａ３６８；クライチら，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス（Proc.Nat.Acad.Sci.）１９９１，８８，４３５３−７）。クライチらは、またいくつかのヒト細胞系において予想されるものと類似したｍＲＮＡを観察し、このようなＣ４ｂ結合活性を有するＣＲ１の截形溶解形態はヒトにおいて合成できると仮定している。
加えて、マクライデス（Makrides）ら（１９９２、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２６７（３４）２４７５４−６１）は、ＣＨＯ細胞中膜付着蛋白質としてＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１＋２および１＋２＋３＋４を発現した。
数個のＣＲ１の可溶性フラグメントも、ＤＮＡが発現されるトランスメンブラン領域を除去することにより組み換えＤＮＡ法により産生されている（ＷＯ８９／０９９２０号、ＷＯ９１／０５０４７号）。可溶性ＣＲ１フラグメントは機能的に活性で、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合でき、それらが含む領域によってファクターＩコファクター活性を示す。このような構造物は、好中球酸化破裂、補体媒介溶血現象、およびＣ３ａおよびＣ５ａ産生などのin vitro補体関連機能を阻害する。特定の可溶性構造物、即ちプラスミドｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃもまた逆受身的アルチュス反応においてin vivo活性を示し（ＷＯ８９／０９２２０号、ＷＯ９１／０５０４７号；イー（Yeh）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）１４６：２５０）、局所貧血後心筋炎症および壊死を阻害し（ＷＯ８９／０９２２０号、ＷＯ９１／０５０４７号；ワイズマン（Weisman）ら、サイエンス（Science）１９９０，２４９：１４６−１５１１；デューペ・アール（Dupe,R.）ら、トロンボシス＆ヘモンスタシス（Thrombosis ＆ Haemostasis）（１９９１）６５（６）６９５）、移植後の生存率をのばす（プルート＆ボルリンガー（Pruitt ＆ Bollinger）、１９９１，ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（J.Surg.Res.）５０：３５０；プルート（Puitt）ら、１９９１，トランスプランテーション（Transplantation）５２；８６８。さらに、ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃをＰ−アニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）と共に配合するとｓＣＲ１単独と類似した抗溶血活性が得られ、これにより補体阻害剤ｓＣＲ１と血栓溶解物質とを組み合わせるのが可能であると示されている（ＷＯ９１／０５０４７号）。
ＣＲ１の一部に対応する可溶性ポリペプチドは、抗溶血活性を含む補体阻害機能を有することが判明している。
本発明によると、ＣＲ１の構造的および機能的に完全なＳＣＲ領域として、順番に並んだ、長相同性繰り返し配列Ａ（ＬＨＲ−Ａ）のＳＣＲ１、２、３および４から選択された１〜４の短コンセンサス繰り返し配列（ＳＣＲ）からなり、少なくともＳＣＲ３を含む可溶性ポリペプチドが得られる。
好ましい態様において、ポリペプチドは、ＣＲ１の構造的および機能的完全ＳＣＲ領域として、順番に並んだ、ＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１、２、３および４またはＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１、２および３からなる。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における残基の添加、欠失または保存的置換による変化（アレリック変異を含む）では、ポリペプチドの生物活性が保持されるが、このような変形も本発明に含まれる。保存的置換は、アミノ酸側鎖の荷電およびサイズ特性を保持することを意味し、例えばアルギニンをヒスチジンで置換する。
一態様において、本発明のポリペプチドは以下のように表わされる：
ＮＨ2-Ｖ1-ＳＣＲ１-Ｗ1-ＳＣＲ２-Ｘ1-ＳＣＲ３-Ｙ1-ＯＨ       （Ｉ）
［式中、ＳＣＲ１は成熟ＣＲ１の２〜５８残基を表わし、ＳＣＲ２は成熟ＣＲ１の６３〜１２０残基を表わし、ＳＣＲ３は成熟ＣＲ１の１２５〜１９１残基を表わす。Ｖ1、Ｗ1、Ｘ1およびＹ1は結合または好ましくは１〜５残基の長さの好ましくはＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］。
式（Ｉ）の好ましい具体例において、Ｗ1、Ｘ1およびＹ1は成熟ＣＲ１のそれぞれ５９〜６２、１２１〜１２４および１９２〜１９６残基を表わし、Ｖ1は所望によりそのＮ−末端でメチオニンと結合していてもよい成熟ＣＲ１の残基１を表わす。
別の態様において、本発明のポリペプチドは以下のように表わされる：
ＮＨ2-Ｖ2-ＳＣＲ１-Ｗ2-ＳＣＲ２-Ｘ2-ＳＣＲ３-Ｙ2-ＳＣＲ４-Ｚ2-ＯＨ      （II）
［式中、ＳＣＲ１、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３は前記定義のとおり、ＳＣＲ４は成熟ＣＲ１の１９７〜２５２残基を表わし、Ｖ2、Ｗ2、Ｘ2、Ｙ2およびＺ2は結合または好ましくは１〜５残基の長さの好ましくはＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］。
式（II）の好ましい具体例において、Ｗ2、Ｘ2、Ｙ2およびＺ2は成熟ＣＲ１のそれぞれ５９〜６２、１２１〜１２４、１９２〜１９６および２５３残基を表わし、Ｖ２は任意にそのＮ−末端でメチオニンと結合した成熟ＣＲ１の残基１を表わす。
式（II）の一の具体例において、アルギニン２３５はヒスチジンと置換している。
式（II）の好ましい具体例において、残基２３５はアルギニンである。
さらに別の態様において、本発明のポリペプチドは以下のように表わされる：
ＮＨ2−Ｘ3−ＳＣＲ３−Ｙ3−ＯＨ                   （III）
［式中、ＳＣＲ３は前記定義のとおり、Ｘ3およびＹ3は結合または好ましくは１〜５残基の長さの好ましくはＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］。
式（III）の好ましい具体例において、Ｘ3は所望によりそのＮ−末端でメチオニンに結合していてもよい成熟ＣＲ１の１２２〜１２４アミノ酸を表わし、Ｙ4は成熟ＣＲ１の１９２〜１９６アミノ酸を表わす。
さらに別の態様において、本発明のポリペプチドは以下のように表わされる：
ＮＨ2-Ｘ4-ＳＣＲ３-Ｙ4-ＳＣＲ４-Ｚ4-ＯＨ          （IV）
［式中、ＳＣＲ３およびＳＣＲ４は前記定義のとおり、Ｘ4、Ｙ4およびＺ4は結合または好ましくは１〜５残基の長さの好ましくはＣＲ１中の天然のインタードメイン配列由来のアミノ酸の短結合配列を意味する］。
式（IV）の好ましい具体例において、Ｘ4は所望によりそのＮ−末端でメチオニンに結合していてもよい成熟ＣＲ１の１２２〜１２４アミノ酸を表わし、Ｙ4およびＺ4はそれぞれ成熟ＣＲ１の１９２〜１９６および２５３アミノ酸を意味する。
別の態様において、本発明は本発明のＣＲ１ポリペプチドの製法を提供する。該方法は組み換え体宿主細胞中に前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現し、生成物を回収することからなる。
特に、該方法は以下の工程からなる：
ｉ）  宿主細胞中で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターを調製し；
ii）  前記ベクターで宿主細胞を形質転換し；
iii）  前記形質転換された宿主細胞を前記ＤＮＡポリマーの発現ができる条件下で培養して前記ポリペプチドを産生し、
iv）  前記ポリペプチドを回収する。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーも本発明に含まれる。
本発明の方法は、例えば、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラ・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual.）第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８９）およびＤＮＡクローニング，第Ｉ、IIおよびIII巻［ディー・エム・グローバー編（D.M.Glover ed.,ＩＲＬプレス社）］に記載されているような通常の組み換え技術により行うことができる。
本発明はまた適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチド単位の縮合によりＤＮＡポリマーを調製する方法を提供する。
調製法は化学的、酵素的、または２つの方法の組み合わせにより、in vitroまたはin vivoで適宜行われる。したがって、ＤＮＡポリマーは適当なＤＮＡフラグメントを、ディー・エム・ロバーツ（D.M.Roberts）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）１９８５，２４，５０９０〜５０９８に記載されているような通常の方法により酵素で結紮することにより調製される。
ＤＮＡフラグメントは、必要なヌクレオチド配列を含有するＤＮＡを適当な制限酵素で化学合成法、酵素重合法、またはこれらの方法の組み合わせにより消化することにより得られる。
制限酵素での消化は、適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で、０．１〜１０μｇのＤＮＡを用いて行われる。
ＤＮＡの酵素重合は、in vitroでＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ（Klenow）フラグメント）などのＤＮＡポリメラーゼを用いて、必要に応じてヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む適当な緩衝液中で、１０℃から３７℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で行われる。
ＤＮＡフラグメントの酵素による結紮は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを用いて、適当な緩衝液中、４℃から３７℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で行われる。
ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学合成は、通常のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミジト化学により、「ケミカル・アンド・エンザイマティック・シンセシス・オブ・ジーン・フラグメント−ア・ラボラトリー・マニュアル」（“Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments−A Laboratory Manual”（エッチ・ジー・ガッセンおよびエイ・ラング（H.G.GassenおよびA.Lang）編，バーラグ・ケミー（Verlag Chemie），ウェインハイム（Weinheim）（１９８２）または他の科学出版物、例えば、エム・ジェイ・ガイト、エッチ・ダブリュ・ディー・マッテス、エム・シン、ビー・エス・スポロートおよびアール・シー・チトマス（M.J.Gait,H.W.D.Matthes M.Singh,B.S.SproatおよびR.C.Titmas），ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research），１９８２，１０，６２４３；ビー・エス・スポロートおよびダブリュ・バンワース（B.S.SproatおよびW.Bannwarth），テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters），１９８３，２４，５７７１；エム・ディー・マッテウチおよびエム・エッチ・カルサー（M.D.MatteucciおよびM.H.Caruthers），テトラヘドロン・レターズ１９８０，２１，７１９；エム・ディー・マッテウチおよびエム・エッチ・カルサー、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Journal of the American Chemical Society），１９８１，１０３，３１８５；エス・ピー・アダムス（S.P.Adams）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー，１９８３，１０５，６６１；エヌ・ディー・シンハ・ジェイ・ビールナット・ジェイ・マックマンナスおよびエッチ・コエスター（N.D.Sinha,J.Biernat,J.McMannusおよびH.Koester），ヌクレイック・アシッド・リサーチ，１２，４５３９；およびエッチ・ダブリュ・ディー・マッテスら、ＥＭＢＯジャーナル，１９８４，３，８０１に記載されているような固相技術を用いて行われる。好ましくは、自動ＤＮＡ合成器（例えば、アプライド・バイオシステム３８１Ａシンセサイザー（Applied Biosystems 381 A Synthesiser））を用いる。
ＤＮＡポリマーは好ましくは２以上のＤＮＡ分子（両方一緒になってポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む）を結紮することにより調製される。
ＤＮＡ分子は適当な制限酵素での必要なコーディング配列を担うベクターの消化により得られる。
ＤＮＡ分子の正確な構造およびこれを得る方法は所望の生成物の構造に依存する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の構築の適当な方法は当業者が常時行っていることである。
特に、特定の宿主細胞のコドン使用を考慮しなければならない。コドンをハイレベルのイー・コリにおける発現についてデベレックス（Devereux）ら、（１９８４）ヌクレイック・アシッド・リサーチ，３８７に示されている方法を用いて最適化する。
組み換え宿主細胞中でポリペプチドをコードするＤＮＡポリマーの発現は、宿主細胞中ＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターにより行うことができる。該発現ベクターは新規であり、本発明に含まれる。
複製可能な発現ベクターは本発明にしたがって、宿主細胞と適合するベクターを開裂させて完全レプリコンを有する直線状ＤＮＡセグメントを得、前記直線状セグメントを、結紮条件下で、前記直線状セグメントと共にポリペプチドをコードする１以上のＤＮＡ分子と結合することにより調製される。
直線状セグメントおよび１以上のＤＮＡ分子の結紮は、所望により同時にまたは順次行う。
このように、ＤＮＡポリマーを所望により前もって形成するかまたはベクターの構築中に形成する。ベクターの選択は、一部、大腸菌のような原核、またはマウスＣ１２７、マウス骨髄腫、チャイニーズハムスター卵巣細胞、カビ、例えば糸状菌または単細胞「酵母」またはショウジョウバエなどの昆虫細胞である宿主細胞により決定する。宿主細胞はトランスジェニック動物であってもよい。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミッドおよび例えばバクロウイルスまたはワクシニア由来の組み換えウイルスを包含する。
ＤＮＡポリマーは例えばマウスＣ１２７細胞中のウシ乳頭腫ウイルスベクター等のフラグメントまたはチャイニーズハムスター卵巣細胞中の増幅されたベクターを発現する安定な形質転換哺乳類細胞系の単離用にデザインされたベクター中に組み立てられる（ＤＮＡ・クローニング第II巻、ディー・エム・グローバー（D.M.Glover）編，ＩＲＬ・プレス１９８５；カウフマン・アール・ジェイ（Kaufmann, R.J.），モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）５，１７５０−１７５９，１９８５；パブラキス・ジー・エヌおよびハマー・ディー・エッチ（Pavlakis G.N.およびHamer, D.H.）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス（ＵＳＡ）８０，３９７−４０１，１９８３；ゲッゼル・ディー・ヴイ（Goeddel,D.V.）ら、ヨーロッパ特許出願第００９３６１９号，１９８３）。
複製可能な発現ベクターの調製は、通常どおり適当なＤＮＡの制限用、重合用および結紮用酵素を用いて、例えば前記サムブルックらにより記載された方法により行われる。重合および結紮は、ＤＮＡポリマーの調製に関して既に記載したようにして行う。制限酵素での消化は適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で、０．１〜１０μｇのＤＮＡを用いて行う。
組み換え宿主細胞は、本発明にしたがって、宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターを用いて形質転換条件下で調製する。適当な形質転換条件は通常のものであり、例えば、前記サムブルックらまたは“ＤＮＡクローニング”第II巻，ディー・エム・グローバー編，ＩＲＬプレス社，１９８５に記載されているものである。
形質転換条件の選択は、宿主細胞により決定される。従って、イー・コリなどの細菌宿主をＣaＣl2の溶液（コエン（Cohen）ら，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス，１９７３，６９，２１１０）またはＲbＣl、ＭnＣl2、酢酸カリウムおよびグリセロールを含む溶液で処理し、つぎに３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパンスルホン酸、ＲbＣlおよびグリセロールで処理するかまたは例えばバイオ−ラッド・ラボラトリース（Bio-Rad Laboratories），ＵＳＡ，カリフォルニア州，リッチモンド（エレクトロポレーターの製造業者）により記載されているようにエレクトロポーレーションにより処理する。培養物中の哺乳動物細胞をベクターＤＮＡの細胞上へのカルシウム共沈およびカチオン性リポソームを用いることにより形質転換する。
本発明は本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞にもおよぶ。
形質転換された宿主細胞のＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での培養は、通常、例えば前記サムブルックら、および“ＤＮＡクローニング”に記載されているように行う。このように、好ましくは細胞に栄養分を供給し、４５℃より低い温度で培養する。
蛋白質生成物を宿主細胞にしたがって通常の方法により回収する。このように、宿主細胞がイー・コリなどの細菌であり、蛋白質が細胞内に発現される場合、これは物理的、化学的または酵素的に溶解し、タンパク質生成物は得られたリゼートから単離される。宿主細胞が哺乳類である場合、生成物は通常栄養培地から単離される。
宿主細胞がイー・コリなどの細菌である場合、培養から得られる生成物は最適の機能活性のためにフォールディングが必要である。これは蛋白質が封入体として発現される場合に最も起こりやすい。重要と考えられる単離およびフォールディング法は多くある。特に、汚染蛋白質との凝集物の形成を最少にし、ポリペプチドのミスフォールディングを最少にするためにポリペプチドをフォールディング前に部分的に精製するのが好ましい。このように、特異的に封入体を単離し、続いてフォールディング前にさらに精製することによる汚染イー・コリ蛋白質の除去は該方法の重要な態様である。
フォールディング法は、ポリペプチドの中間体折畳み状態の凝集を最少にするように行われる。従って、とりわけ、塩の種類および濃度、温度、蛋白質濃度、酸化還元緩衝液濃度およびフォールディング期間を慎重に考慮する必要がある。特定のポリペプチドに関する厳密な条件は一般に予想できず、実験により決定しなければならない。
封入体からの蛋白質のフォールディングに利用できる方法は数多くあり、これらは当業者には周知である。該方法では一般に、たとえば５０ｍＭ２−メルカプトエタノールで高濃度の変性剤、たとえば８Ｍ尿素または６Ｍグアニジン塩酸塩の存在下に封入体中の全てのジスルフィド結合を切断する。次の段階は、これらの試薬を除去して、蛋白質のフォールディングを行うことである。ジスルフィド結合の形成には、酸化的環境が必要であり、これは種々の方法、例えば、空気、または適当な酸化還元系、例えば還元および酸化グルタチオンの混合物を取り入れることにより得られる。
好ましくは、封入体は、メルカプトエタノールの存在下に８Ｍ尿素を用いて可溶化し、１回目の汚染蛋白質の除去の後、冷緩衝液を添加することにより、蛋白質をフォールディングする。好ましい緩衝液は、１ｍＭ還元グルタチオンおよび０．５ｍＭ酸化グルタチオンを含有する２０ｍＭエタノールアミンである。フォールディングは、１〜５℃の範囲の温度で１〜４日の期間行うのが好ましい。
沈殿または凝集が観察される場合、凝集蛋白質は種々の方法、例えば、遠心分離または硫酸アンモニウムなどの沈殿剤での処理などにより除去できる。これらの方法のいずれかを採用した場合、モノマーポリペプチドが主な可溶性生成物である。
細菌細胞が蛋白質を分泌する場合、フォールディングは通常必要でない。
本発明のポリペプチドは、以下に列挙する多くの補体媒介性または補体関連病（これに限定されない）および障害の治療または診断において有用である。
補体が関与する病気および障害
神経障害
多発性硬化症
卒中
ギラン・バレー症候群
外力性脳障害
パーキンソン病
アレルギー性脳炎
アルツハイマー病
不適当または望ましくない補体活性化の障害
血液透析合併症
超急性同種移植片拒絶反応
異種組織移植拒絶反応
角膜移植片拒絶反応
ＩＬ−２療法中のインターロイキン−２誘起性毒性
発作性夜間ヘモグロビン尿症
炎症性障害
自己免疫疾患の炎症
クローン病
成人呼吸窮迫症候群
火傷および凍傷を含む熱傷
ぶどう膜炎
乾癬
喘息
急性膵炎
虚血後再潅流
心筋梗塞
風船様血管形成
アテローム性動脈硬化症（コレステロール誘起性）および再発狭窄症
高血圧
心肺バイパスまたは腎血液透析におけるポストポンプ症候群
腎虚血
腸管虚血
感染症または敗血症
多器官不全
敗血症性ショック
免疫合併症および自己免疫疾患
慢性関節リウマチ
全身紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）
ＳＬＥ腎炎
増殖性腎炎
糸球体腎炎
溶血性貧血
重症筋無力症
生殖障害
抗体または補体媒介性不妊症
傷の治癒
本発明はまた、治療上有効量の前記ポリペプチド、および医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明は治療を必要とする患者に治療上有効量の本発明のポリペプチドを投与することからなる炎症または不適切な補体活性化と関連した病気または障害の治療法も提供する。
前記方法において、患者は好ましくはヒトである。
病気または障害の治療に関するポリペプチドの有効量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
投与用に、ポリペプチドは適当な医薬または治療組成物中に処方される。このような組成物は、典型的には治療上活性量の該ポリペプチドおよび食塩水、緩衝食塩水、デキストロースまたは水などの医薬上許容される賦形剤または担体を含有する。組成物はまた、特定の安定化剤、例えばマンノースおよびマンニトールを含む糖類、注射組成物用局所麻酔剤、例えばリドカインを含んでもよい。
さらに、本発明のポリペプチドの、炎症または不適切な補体活性化に付随する病気または障害の治療用医薬の製造における使用が提供される。
補体活性化を阻害し、同時に血栓融解療法を提供するために、本発明は、さらに治療上有効量の血栓融解剤を含む組成物を提供する。血栓融解剤の有効量は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。好ましい血栓融解剤は、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼ分子およびその誘導体、フラグメントまたは接合体を包含する。血栓融解剤は、可逆的に他の試薬と融合してハイブリッド分子（ＥＰ−Ａ−０２９７８８２およびＥＰ１５５３８７）を形成する１またはそれ以上の鎖、例えばプラスミンに結合したウロキナーゼ（ＥＰ−Ａ−０１５２７３６）、水溶性ポリマーに結合したフィブリン溶解性酵素（ＥＰ−Ａ−０１８３５０３）からなっていてもよい。血栓融解剤は、またプラスミノーゲン活性化因子のムテイン（ＥＰ−Ａ−０２０７５８９）からなっていてもよい。好ましい具体例において、血栓融解剤は、アメリカ合衆国特許第４，２８５，９３２号に記載されているようなin vivoで可逆的に遮断されたフィブリン溶解性酵素からなっていてもよい。最も好ましい酵素は、アメリカ合衆国特許第４，８０８，４０５号に記載のｐ−アニソイルプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ活性化因子錯体であり、スミスクライン・ビーチャム．ファーマシューティカルズ（SmithKline Beecham Pharmaceuticals）からエミナーゼ（EMINASE）（一般名；アニストレプラーゼ、ＡＰＳＡＣとも称せられる；。モンク（Monk）ら、１９８７，ドラッグズ（Drugs）３４：２５−４９参照）の商標で市販されている。
本発明の治療組成物の単独または組み合わせの投与経路は、標準的経路、例えば静脈内注入または注射を包含する。活性補体阻害剤および血栓融解剤を一緒に、またはいかなる順序でも連続して投与してもよい。
本発明はまた、血栓症の治療、特にヒトまたはヒト以外の動物における急性心筋梗塞の治療法も提供する。この方法は、この治療を必要とするヒトまたは動物に、有効量の本発明のポリペプチドおよび有効量の血栓融解剤を投与することからなる。
本発明のポリペプチドおよび血栓融解剤の、ヒトまたは動物における血栓症の治療用医薬の製造における使用も提供される。このような方法および使用は、ＷＯ９１／０５０４７に記載されているようにして行われる。
本発明はさらにヒトまたはヒト以外の動物における成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療法を提供する。この方法は、有効量の本発明のポリペプチドを患者に投与することからなる。
本発明は、また、有効量の本発明のポリペプチドを投与することからなる、移植を受けたヒトまたはヒト以外の動物における超急性同種移植片または超急性異種移植片拒絶反応を遅らせる方法を提供する。このような投与は、患者に対してか、または埋込前に移植組織に適用することによる。
本発明は、さらに、局所的または非経口、例えば静脈内経路により、有効量の本発明のポリペプチドを投与することによる、ヒトまたはヒト以外の動物における傷の治療法を提供する。
実施例において用いた一般的方法
（ｉ）ＤＮＡ開裂
制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの開裂は、補足緩衝液を用いて製造業者の指示にしたがって行う。緩衝条件が両方の酵素に関して適当な場合、二重消化を同時に行う。そうでなければ、二重消化を連続して行う。この場合最低の塩濃度を必要とする酵素を消化物に最初に添加する。一旦消化が完了したら、塩濃度を変えて、第二の酵素を添加する。
（ii）平滑末端ＤＮＡフラグメントの産生
ＤＮＡフラグメントの陥没した３'末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて、サムブルックら（１９８９））により記載されているようにして満たす。
（iii）ＤＮＡ精製／濃縮および分析
蛋白質汚染物、ヌクレオシドの除去は、フェノール／ＣＨＣl3を用い、続いてエタノールで沈殿させることにより行う。ＤＮＡを水平アガロースゲル電気泳動により分析する。両方法はサムブルックら（１９８９））により記載されている。
（iv）ＤＮＡフラグメントの単離
１．  ＤＥＡＥ  ＮＡ４５膜上でのＤＮＡ精製
必要なＤＮＡフラグメントの上方およびすぐ下のアガロースに切れ込みを入れることによりＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから精製する。ＴＥ（１０ｍＭ Ｔris pＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸漬しておいた、シュライヒャーおよびシューエル（Schleicher＆Schuell）（アンダーマン（Anderman），グレート・ブリテン）から入手したＮＡ４５膜を切り込みに挿入し、ＤＮＡフラグメントが下方の膜にトラップされ、分子量の大きなＤＮＡが上方の膜にトラップされるまでゲルに電流を再びかける。下方の膜をゲルから除去し、ＤＮＡを０．０５Ｍアルギニン／1Ｍ ＮaＣl中に７０℃で２時間溶出する。ＤＮＡを次に、サムブルックら（１９８９））により記載されているようにしてエタノール沈殿法により濃縮する。
２．  電気溶出
ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取り、ＤＮＡを単方向性電気溶出器（ＩＢＩリミテッド，イングランド，ケンブリッジ）を用いて、製造業者の指示にしたがって電気溶出により抽出する。
３．  ゲル精製
ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取り、製造業者の指示に従って（キアゲン社（QIAGEN Inc.），ＵＳＡ）ＱＩＡＥＸゲル抽出キットを用いて抽出する。
（ｖ）プラスミド調製
プラスミドＤＮＡの大規模なプラスミド調製を、サムブルックら（１９８９）により記載されているようにしてＣsＣlを用いて、またはMagic Maxipreps（プロメガ・コーポレーション（Promega Corporation），アメリカ合衆国，マジソン）を用いて製造業者の指示に従って行う。ミニプラスミド調製は、サムブルックら（１９８９））により記載されているようなアルカリ溶解法またはMagic Minipreps（プロメガ・コーポレーション，アメリカ合衆国，マジソン）を用いて製造業者の指示に従って行う。
（vi）プラスミドＤＮＡのイー・コリ中への導入
１．  プラスミドを、サムブルックら（１９８９）により記載されているようにして、塩化カルシウムを用いてコンピテントにしておいたイー・コリＨＢ１０１またはイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（スチューディアおよびモファット（StudierおよびMoffat），１９８６）中に形質転換する。
２．  別法として、プラスミドをジーン・パルサーおよびバイオラドのパルス・コントローラー（バイオ−ラッド・ラボラトリース，アメリカ合衆国，ケンブリッジ）を用いたエレクトロポレーションにより、イー．コリＤＨ１（ロー（Low），１９６８）またはイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入する。
（vii）オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理
５'突出部を有するオリゴヌクレオチドまたはアニールしたオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてサムブルックら（１９８９）により記載されているようにしてキナーゼ処理する。
（viii）オリゴヌクレオチドのアニールおよび結紮
等モル濃度の相補オリゴヌクレオチドを１０ｍＭＴris pＨ８．５，５ｍＭのＭgＣl2中で混合し、１００℃で５分間静置し、次に非常にゆっくり室温まで冷却することによりアニールする。接着末端を有するアニールしたオリゴヌクレオチドをベクターまたは他の相補的接着末端を有するオリゴヌクレオチドとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてサムブルックら（１９８９）により記載されているようにして結紮する。
（ix）ＤＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅
結紮反応から得たＤＮＡフラグメントまたはアガロースゲルから切断し、精製したＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡフラグメントの５'末端と相補的な２つのプライマーからＰＣＲにより増幅する。約０．１〜１μｇの結紮反応物またはアガロースゲルからの精製ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔris pＨ８．３（２５℃）、５０ｍＭ ＫＣl、０．１％ゼラチン中で混合し、ＭgＣl2濃度を１．５ｍＭから６ｍＭに変えて、各反応に対して適した濃度を見つける。両方のプライマーを添加して最終濃度を２μＭにし、各ｄＮＴＰを添加して最終濃度を０．２ｍＭにする。最終反応容積は、７５μｌまたは１００μｌのいずれかで、これを鉱油で覆い、蒸発を防ぐ。次に熱サイクルをサーマルサイクラー、例えばハイベイドサーマルリアクターで開始する。用いる条件の典型的例としては、９４℃で７分、４５℃で２分、４５℃で５分未満保持し、次に５単位のＴaq  ＤＮＡポリメラーゼ（商業的に、例えばＧibcoより購入）を添加する。ＤＮＡフラグメントを温度を７２℃で２分、９４℃で１分および４５℃で２分、合計３５回循環させることにより増幅する。
（ｘ）二重鎖法を用いたＤＮＡ配列決定
配列決定は、「シーケナーゼTM（ＳequenaseTM）」（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレーション（United States Biochemical Corporation）を用いて、基本的に製造業者の注意書に記載のとおりに行う。
（xi）ＤＮＡ配列分析および操作
配列の分析を、デベレックス（Devereux）ら（１９８４）により記載されているように、デジタルＶＡＸコンピューターでＧＣＧパッケージプログラムを用いて行う。
（xii）オリゴヌクレオチドの産生
１．  オリゴヌクレオチドをジーン／アセンブラー・プラス（ファーマシア・エルケイビイ・バイオテクノロジー（Ｐharmacia ＬＫＢ Biotechnology），イングランド，ミルトンキーンズ）または３８１Ａシンセサイザー（アプライド・バイオシステム（Applied BioSystem））を用いて製造業者の指示にしたがって合成する
２．  ファーマシア（Pharmacia）により推奨されるＭonoＱを用いるかまたは、合成オリゴヌクレオチドの回収を電気泳動により変性ポリアクリルアミドゲルを介して行う場合はＵＶシャドーイング法により行う。オリゴヌクレオチドを１２％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上に負荷し、オリゴヌクレオチドがゲルのほぼ２／３の長さを移動するまで１５００Ｖで動作させる。ＤＮＡを手提げ長波長紫外線ランプを用いて可視化し、ＤＮＡバンドを切り取る。オリゴヌクレオチドをＳepＰak Ｃ１８逆相カラム（ウォーターズ（Waters））を用いてサムブルックら（１９８９）により記載されているように回収する。
（ｘiii）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）
通常、ノベックス・システム（Novex system）（ブリティッシュ・バイオテキノロジー（British Biotechnology）を用いて製造業者の指示にしたがってＳＤＳ  ＰＡＧＥを行う。アクリルアミド濃度が１４％、１６％、４〜２０％または１０〜２７％のプレパックゲルは最も頻繁に用いられるものの一つである。蛋白質分子量標準（ＬＭＷキット、ファーマシア）を含む電気泳動用サンプルを通常１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ含有緩衝液（５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含むかまたは含まない）中で希釈し、ゲルに適用する前に室温にて約０．５から１時間放置する。
（ｘiv）コドン使用の変更
同じコドンのランダムでない使用は、イー・コリにおいて実証され、最適でないか又は微小コドンを（特に遺伝子の５'末端に）含有する遺伝子からの蛋白質産生は、そのようなコドンを有しない遺伝子からよりも有効でないという説を指示する証拠がある（例えばチェンおよびイノウエ（ChenおよびInouye），１９９０）。イー・コリ（ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージの一部として供給、デベレックス（１９８４））において高度に発現された遺伝子から作成したコドン使用表を用いてイー・コリにおける発現に最適のコドンを決定する。全ての構築物の最初の３０個のコドン全てを高レベルの発現に関して最適化する。７個のアミノ酸に関するコドン：ａｒｇ、ｇｌｙ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、ａｌａを全コーディング配列にわたって最適化する（制限酵素部位と適合する場合）。
（ｘｖ）ベクターｐＢＲＯＣ４１３の構築
プラスミドｐＴ７−７（タボー（Tabor），１９９０）はｐＢＲ３２２などのヌクレオチド２０６５〜４３６２に対応するＤＮＡを含有し、ｐＢＲ３２２は第３のプラスミドＣolＫの存在下に接合プラスミドにより移動できる。
ＣolＫによりコードされる移動蛋白質はｐＢＲ３２２のヌクレオチド２２５４のｎｉｃ部位で作用し、この地点から移動を開始する。ｐＴ７−７をＬspＩおよびＢglIIで消化し、突出した５'末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋める。プラスミドＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し、平滑末端を結紮し、エレクトロポレーションによりイー・コリＤＨ１中に形質転換する。得られたプラスミドｐＢＲＯＣ４１３（第１図）をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により同定する。
ｐＢＲＯＣ４１３におけるφ１０プロモーターのすぐ上流のＬspＩ部位からｐＴ７−７のヌクレオチド４３４のＢglII部位の欠失によりｐＢＲ３２２のヌクレオチド２０６５〜２２９７に対応するＤＮＡが除去される。ｎｉｃ部位および隣接する配列はしたがって除去されｐＢＲＯＣ４１３が固定される。
（ｘvi）溶血検定
ポリペプチドの抗溶血活性をウサギ抗体（ダイメディックス・コーポレーション（Diamedix Corporation），アメリカ合衆国，マイアミより入手）で感作したヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を測定することにより評価する。０．１Ｍ Ｈepes／０．１５Ｍ ＮaＣl pＨ７．４緩衝液中で１：１２５に希釈したヒト血清は補体源であり、基本的にダシイーおよびルイス（Dacie＆Lewis）（１９７５）に記載されたようにボランティアのプールから調製する。簡単には、血液を３７℃に５分間加温し、血餅を除去し、残存する血清を遠心分離により清澄化する。血清フラクションを少量のアリコートに分割し、−１９６℃で貯蔵する。アリコートを必要ならば解凍し、使用直前にＨepes緩衝液中で希釈する。
感作ヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を、以下のようにして、ｖ字底マイクロタイタープレートフォーマットを用いた標準的溶血検定を用いて測定する。５０μｌのＨepes緩衝液（濃度範囲０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には０．０１〜１００μｇ／ｍｌ）中希釈した試験蛋白質を５０μｌの希釈した血清と共に３７℃で１５分間培養する。１００μｌの予め加温した感作ヒツジ赤血球を１時間３７℃で添加し、最終反応容積を２００μｌにする。サンプルを３００ｇ、４℃で１５分間スピンさせ、平底マイクロタイタープレートの上清１５０μｌに移し、４１０ｎｍでの吸光度を測定する。これは各試験用液中の溶解量を反映する。最大溶解を、赤血球と共に阻害物質の非存在下に血清を培養することにより測定し、これから基底溶解度（赤血球を緩衝液と共に培養することにより測定する）を引く。阻害物質による基底溶解を、阻害物質を赤血球と共に培養することにより評価し、これを試験サンプルから差し引く。阻害率を、全細胞溶解のフラクションとして表わし、ＩＨ５０は、溶解の５０％阻害を与えるのに必要な阻害物質の濃度を表わす。
（ｘvii）Ｃ３ａＲＩＡ試験
補体経路の活性化の後、アナフィラトキシン、Ｃ３ａおよびその分解生成物Ｃ３ａ des Ａrgの放出を測定することができる。両方の生成物は、アメルシャム・インターナショナル・ピーエルシー（Amersham International plc）（Ｕ．Ｋ．）から購入した競合的放射免疫検定（ヒト補体Ｃ３ａ des Ａrg［１２５Ｉ］試験、コードＲＰＡ５１８）を用いて測定できる。
（ａ）チモサンＡによる別の活性化
補体の別の経路を酵母からの複合炭水化物であるチモサンＡ（シグマ社（Sigma）、カタログ番号Ｚ-４２５０）で活性化する。チモサンＡをＨepes緩衝液（０．１Ｍ Ｈepes／０．１５Ｍ ＮaＣl pＨ７．４）中またはＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１Ｍ ＮaＣl pＨ７．４）中で５０ｍｇ／ｍｌにし、微細懸濁液が形成されるまで撹拌する。血清（溶血試験（方法（ｘvi））に関して記載したようにして調製）を、Ｈepes緩衝液中で１５分間３７℃で以下に示す容積を用いて希釈した種々の濃度の補体阻害物質と共に予備培養する。次にチモサンＡをサンプルに添加する前に数秒間撹拌し、その後サンプルを更に３０分間３７℃で培養する。チモサンＡを次に約１１，０００ｇで３０秒間外界温度で撹拌させる。典型的には１００μｌの上清を等容積のキット中の沈殿溶液に添加して、得られた上清をアメルシャム（Amersham）より供給されている技術報告書に記載されているようにして、Ｃ３ａ des Ａrg ＲＩＡキットを用いて試験する。各サンプルを、２回ずつ試験し、サンプルの計数が標準曲線上にあるために有用な上清の希釈度は、１／５０〜１／１００である。ＥＤＴＡまたはＦuthanは、技術書において指示されているようにどの溶液または試験管中でも用いなかった。
各サンプルを、１分間、ＬＫＢ−Ｗallac １７２７ Ｃlinigamma上で計測する。データをＣlinigammaに供給されているＲＩＡ検定用ＲiaＣalcプログラムを用いて処理する。データーを基本的にアメルシャムの技術書に記載されているようにして、データに合う非直線回帰により得られる標準曲線を用いて計算する。
ミニチュア試験を基本的に前記のとおりにして行う；ただし血清の活性化のために合計容積を少なくして行う。
0003939747.tif 000002
ミニチュア試験においては、活性化の後、典型的には２５μｌのサンプルが沈殿する。試験キット試薬の添加を５０μｌから１０μｌに減らす。これにより、試験を個別の着脱可能な壁を有するＵ字底マイクロタイタープレート中で行うことができる。試験を技術書に記載されているようにして等張食塩水中最終希釈度まで調節した容積を用いて行う。この例においては、２００μｌの食塩水を添加して、プレートを約２５００ｇで１２分間４℃で回転させる。各ウェルからの上清を慎重に吸引により除去し、沈殿をさらに３００μｌの等張性食塩水で洗浄する。プレートを次に再び約２５００ｇで５分間４℃で回転させ、上清を捨てる。ウェルを次にＣlinigamma上で各１０分間計数する。データを前記のように処理する。
各阻害物質濃度での最大活性化の阻害率（％）を測定するために、各実験に関して多くの対照実験を行う。対照実験としては以下のものが挙げられる：最大活性化（Ａ）即ち、血清＋チモサンＡのみ、基底活性化（Ｂ）即ち、血清＋緩衝液のみ、および阻害物質の存在下での基底活性化（Ｃ）即ち、血清＋阻害物質のみ。活性化基底値を、一般に最大活性化から引く。同様に、阻害物質の存在下での活性化基底値を阻害物質の存在下での活性化血清の値から引く。これらの値を次に、以下の式を用いて、各阻害物質濃度での阻害率（％）を決定するために用いる：
0003939747.tif 000003
［式中、Ｄは、阻害物質およびチモサンＡの存在下での活性化の値を意味する］ＩＣ５０を最大活性化を５０％減少させるのに要する阻害物質濃度と定義する。
（ｂ）熱凝集ＩｇＧによる古典的経路活性化法
ＩgＧによる古典的活性化法を以下のようにして行う。ヒトγ−グロブリン（シグマ社、カタログ番号Ｇ−４３８６）を０．１Ｍ Ｈepes／０．１５Ｍ ＮaＣl pＨ７．４中で１４ｍｇ／ｍｌにし、６０℃で１時間加熱する。熱凝集ＩgＧのサンプルを少量のアリコートとして、必要になるまで−８０℃で貯蔵する。熱凝集ＩgＧを用いてチモサンＡの標準またはミニチュア試験に関して記載したように同容積を用いて血清を活性化する。阻害物質の血清を用いた予備培養を１５分間３７℃で行い、続いて、熱凝集ＩgＧを添加する。培養をさらに３７℃で４５分間続ける。サンプルを次に通常またはミニチュア試験を用いて直接Ｃ３ａレベルに関して試験する。
（ｘviii）Ｃ５ａＲＩＡ試験
補体経路の活性化に続いて、アナフィラアトキシンＣ５ａおよびその分解生成物Ｃ５ａ des Ａrgの放出を測定する。両方の生成物は、アメルシャム・インターナショナル・ピーエルシー（Ｕ．Ｋ．）から購入した競合的放射免疫検定（ヒト補体Ｃ３ａ des Ａrg［125Ｉ］試験、コードＲＰＡ５２０）を用いて測定できる。
補体の別の経路をＣ３ａＲＩＡ試験（方法（ｘvii））に関して記載したようにしてチモサンＡで活性化する。試験は、Ｃ３ａ試験に関して記載したようにして、Ｃ５ａ des−Ａrg  ＲＩＡキット中に装備されている試薬を用いてミニチュア化した形態で行う。
実施例中のアミノ酸のナンバリングは、対応する成熟ＣＲ１蛋白質に関連する。
実施例１  ＳＣＲ１＋２をコードするプラスミドｐＤＢ１０１０−Ｄ１１の構築
一般論
成熟ヒト補体受容体１のアミノ酸１に対応し、アミノ酸１２４で終わるＳＣＲ１＋２に関するＤＮＡ配列を、遺伝子の５'末端がＮdeＩ部位を含有するようにデザインする。この部位は、ＡＴＧコドンを含み、ｍＲＮＡの翻訳の開始に必要な開始メチオニンを与え、これにより遺伝子はｐＢＲＯＣ４１３のＳhine−Ｄalgarnoリボソーム結合配列から最適な距離を置いた場所に位置する。遺伝子の３'末端は、ＨindIII部位の前の２個の停止コドン上で完結する。
ｐＢＲＯＣ４１３を切断することなく、商業上入手可能な制限エンドヌクレアーゼを同定する。エンドヌクレアーゼにより認識される制限部位の配列を、全ての３つの解読フレーム中に翻訳する。イー・コリ発現に関してほとんど用いられないコドンを含有する部位を捨てる。残る部位をＳＣＲ１＋２をコードするＤＮＡと適合させる。制限部位がＤＮＡ中に適合してコーディング配列を保存し、ほとんど用いられないコドンを添加しない場合、ＤＮＡ配列を変更してこの制限部位を含むようにする。１０個のユニークな制限部位をこのように同定して組み込む。イー・コリ中の蛋白質の細胞内発現を可能にするために、ＡＴＧコドンを成熟ＣＲ−１の１番目のアミノ酸に対するコドンのすぐ前の遺伝子の５'末端に添加する。コドンＡＴＧはｐＢＲＯＣ４１３等のベクター中へのクローニングに用いることができるＮdeＩ制限部位の一部である。成熟ＣＲ−１のプロリン１２４に対応するコドンをグルタミンをコードするものに変更し、これもまたＥcoＲＩを含む。
（ａ）プラスミドの構築
ＳＣＲ１＋２をコードするオリゴヌクレオチド（第１表１〜８）をオリゴヌクレオチドの対間の相補的８ｂｐ突出部により独特の方法で結紮できる４つの相補的塩基対８７〜１０１ｍｅｒとして合成する。オリゴヌクレオチドの４つの相補対を、Ａ対（oligos１＋２）、Ｂ対（oligos３＋４）、Ｃ対（oligos５＋６）、Ｄ対（oligos７＋８）と表わす。遺伝子の５'末端に対応するＡ対はＮdeＩ制限部位突出部を含有し、Ｄ対は３'末端にＨindIII制限部位突出部を含有する。１および２以外のオリゴヌクレオチドを使用前にファーマシア・モノＱカラム上で精製する。Ａ対のオリゴヌクレオチド２およびＤ対のオリゴヌクレオチド７を、キナーゼ処理していない相補オリゴヌクレオチド１および８でそれぞれアニールする前にキナーゼ処理する。オリゴヌクレオチド対ＢおよびＣをまずアニールし、キナーゼ処理する。キナーゼ処理したオリゴヌクレオチド対を（Ａ対（約０．１μｇ）をＢ対（約０．２μｇ）に、Ｃ対（約２μｇ）をＤ対（約４μｇ）に）結紮する。結紮したオリゴヌクレオチド（Ａ＋Ｂ）を、順次、（Ｃ＋Ｄ）と結紮してＳＣＲ１＋２をコードする遺伝子を形成する。
ＳＣＲ１＋２をコードするＤＮＡを、ＤＮＡの２本鎖と相補的な２個のオリゴヌクレオチド（第１表；１５および１６）を用いるＰＣＲにより増幅する。両方のオリゴヌクレオチドは６ｂｐのランダム配列とそれに続くＮdeＩまたはＨindIIIのいずれかの制限部位配列、それに続く遺伝子に対して相補的な１８ｂｐを含む適合していない５'末端を含む。ＰＣＲに続いて、約４００ｂｐのバンドを水平アガロースゲル電気泳動で可視化し、切断し、ＤＡＥＡ  ＮＡ４５膜上で精製する。ＤＮＡを次にＮdeＩまたはＨindIIIで切断し、同じ酵素で切断しておいたｐＢＲＯＣ４１３中に結紮する。ベクターを塩化カルシウムでコンピテントにしたイー・コリＨＢ１０１中に形質転換する。ミニプラスミド調製物を調製し、プラスミドＤＮＡをＮdeＩまたはＨindIIIで消化することにより分析する。正しい大きさの挿入物を含有するプラスミドをさらにＥcoＲＩ、ＨpaＩ、ＫpnＩおよびＳmaＩを用いた制限マッピングに付す。正しい制限地図を示すプラスミドを、ＳＣＲ１＋２をコードする遺伝子中の両鎖のＤＮＡ配列決定により分析する。プラスミドｐＤＢ１０１０−Ｄ１１はＳＣＲ１＋２をコードする遺伝子中に正しい配列を有することが確認された。
実施例２  ＣＲ−１のＭＱ１→Ｋ１９６（ＳＣＲ１＋２＋３）構築、発現、精製、フォールディングおよび形成
一般論
ＳＣＲ１＋２をコードするＤＮＡ（実施例１ａ）をＳＣＲ３をコードするＤＮＡと結紮することにより、ＳＣＲ１＋２＋３をコードするＤＮＡを構築する。
ＳＣＲ３に関する一般論は実施例９に示す。
成熟ＣＲ１のアミノ酸１２２に対応し、アミノ酸１９６で終結するＳＣＲ３コーディング単位を、該単位の５'末端がＳＣＲ２および３ならびにＮdeＩ部位５'とＥcoＲＩ部位との結合点にＥcoＲＩ部位を含むようにデザインする。該単位の３'末端はＨindIII部位の前の２個の停止コドンで終わる。ＳＣＲ３コーディング単位およびＳＣＲ１＋２コーディング単位を含有するプラスミドをＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化する。ＳＣＲ３コーディング単位を単離し、ＥcoＲＩ／ＨindIII切断ＳＣＲ１＋２含有プラスミド中のＳＣＲ１＋２コーディング単位の下流に挿入して、成熟ＣＲ１のアミノ酸１〜９６に対応する、ＳＣＲ１＋２＋３コーディング単位を含有するプラスミドを得る。ＳＣＲ３コーディング単位をＥcoＲＩ部位に添加することによりＣＲ１においてみられるアミノ酸（プロリン）の後の１２４位のグルタミンに対応するコドンを変換する。
（ａ）ＳＣＲ１＋２＋３をコードするプラスミドｐＤＢ１０１３−５−４の構築
ＳＣＲ３コーディング配列を含む３対のオリゴヌクレオチド（第１表；９〜１４）を合成する。オリゴヌクレオチドをまず対（９，１０；１１，１２；１３，１４）としてアニールし、真ん中の対をキナーゼ処理して３対が８塩基対の重複配列により互いに結紮されるようにする。この三量体分子の５'末端を、ＮdeＩ消化したＤＮＡと相補的になるようにし、ＨindIII消化したＤＮＡと相補的に、３'末端をＨindIII消化したＤＮＡと相補的になるようにする。これにより、該三量体が、ＮdeＩ／ＨindIII消化ｐＢＲＯＣ４１３中にクローンされてｐＢＲＯＣ４３５（第２図）を生成する。ｐＢＲＯＣ４３５の同一性は、制限酵素分析により調べ、ＤＮＡ配列決定により確認する。
ｐＢＲＯＣ４３５およびｐＤＢ１０１０−Ｄ１１（実施例１）由来のプラスミドＤＮＡを、両方ともＥcoＲＩおよびＨindIIIで切断し、ＳＣＲ３をコードするｐＢＲＯＣ４３５のＥcoＲＩ／ＨindIIIバンドをカットベクターｐＤＢ１０１０−Ｄ１１と同様にＤＥＡＥ  ＮＡ４５上で精製する。ＳＣＲコーディング単位を次にｐＤＢ１０１０−Ｄ１１中で結紮して、ｐＤＢ１０１３−５を得、これを次に塩化カルシウムコンピテントイー・コリＨＢ１０１中で形質転換する。得られたコロニーをＤＮＡのミニプラスミド調製物により分析し、続いて、制限マッピングを行う。ｐＤＢ１０１３−５−４（第２図）と称するコロニーの１つはＳＣＲ１＋２＋３コーディング単位を含有する。このプラスミドを次に遺伝子産物の発現に関して分析する。
（ｂ）ＳＣＲ１＋２＋３の発現
ｐＤＢ１０１３−５−４を塩化カルシウムコンピテントイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中で形質転換し、得られたコロニーをミニプラスミドＤＮＡ調製物の制限消化により分析する。１つのコロニーを１０ｍｌのＬブロスまたはＮＣＹＺＭ培地および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する万能緩衝液中に接種し、一夜３７℃、２２０ｒｐｍで増殖させる。一夜培養したもの（典型的には５ｍｌ）を用いて、各２Ｌの、５００ｍｌのＮＣＹＺＭ培地、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンを入れたコニカルフラスコに接種し、培養物を次に３７℃、２２０ｒｐｍでＡ６００が０．５吸光単位になるまで増殖させる。培養物を１ｍＭイソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘起し、同じ条件下で更に３時間増殖させる。培養物を遠心分離し（約８０００ｇ／１０分）、上清を捨てる。細胞ペレットを−４０℃で貯蔵する。Ｌブロスは１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）バクトイーストエキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮaＣlである。ＮＣＹＺＭ培地は、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸および０．２％（ｗ／ｖ）ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、pＨ７．０を含有するＬ−ブロスである。
（ｃ）可溶化封入体の単離
実施例２ｂに記載したのと同様の方法で調製したイー・コリＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＤＢ１０１３−５−４）（１リットル培養物）凍結細胞ペレットを４℃で２時間解凍し、つぎに５０ｍＭ Ｔris／５０ｍＭ ＮaＣl／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．０（３３ｍｌ）中に懸濁させる。懸濁液を１００ｍｌガラス製ビーカーに移し、超音波処理する（ヒートシステムズ−ウルトラソニックス（Heat Systems−Ultrasonics）Ｗ３８０；７０ワット、５０×５０％パルス、パルス時間＝５秒）。超音波処理物を直ちに遠心分離し（６０００ｇ／４℃／１０分）、上清を捨てる。封入体を含有するペレットをに２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５（１００ｍｌ）中に再懸濁させ、室温（約２３℃）で１時間静置する。溶解しなかった物質を全て除去するために、得られた溶液を遠心分離する（約２０００ｇ、４℃、１０分）。この回転上清を除去し、可溶化封入体生成物として、−４０℃で保持する。
（ｄ）可溶化封入体からのＳＣＲ１＋２＋３の精製
Ｓ−セファロースファーストフローのカラム（内径１６ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を調製し、ＦＰＬＣ（ファーマシア）システム中に連結する。カラムを２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノールpＨ８．５で平衡させる。実施例２ｃに記載したようにして調製した１０ｍｌの解凍、可溶化封入体をカラムにかけ、平衡化緩衝液でよく洗浄する。カラムを次に１Ｍ ＮaＣl（平衡緩衝液中）への直線的勾配で展開し、続いて、１Ｍ ＮaＣlおよび２Ｍ ＮaＣl（これも平衡緩衝液中）ですすぐ。全てのクロマトグラフィーは１．０ｍｌ／分、室温である。
クロマトグラフィー中に回収したフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ／蛋白質染色による分析より、実質的に全てのＳＣＲ１＋２＋３ポリペプチドがカラムに吸収され、１Ｍ ＮaＣl含有緩衝液により解離することがわかる。適当なフラクションを−４０℃で貯蔵する。
続くブラッドフォード（Bradford）蛋白質検定およびウシ血清アルブミン標準を用いたピークフラクションの蛋白質含量試験により、これは２．８ｍｇの蛋白質を含有することがわかる。
（ｅ）フォールディング
実施例２ｄに記載したのと同様の方法で精製し、−４０℃で貯蔵したたＳ−セファロース精製ＳＣＲ１＋２＋３を解凍し、セファデックス（Sephadex）Ｇ２５（Ｐ１０）を用いて０．０５Ｍ蟻酸中へ０．４ｍｌを緩衝液交換する。緩衝液交換溶液の２８０ｎｍでの吸光度は０．５２と測定され、ε＝３４０００および適当な希釈に関する補正因子を用いて、元の調製物（緩衝液交換前）蛋白質濃度を計算すると０．６ｍｇ／ｍｌである。
この図に基づいて、１．７ｍｌ Ｓ−セファロース精製蛋白質を０．８５ｍｌの２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ２−メルカプトエタノール／１Ｍ ＮaＣl pＨ８．５で希釈して、０．４ｍｇ／ｍｌの溶液を得、これに関してフォールディングを行う。
フォールディングは、いずれのときも冷希釈液を用いて連続希釈により行う。
ｔ＝０時において、ＳＣＲ１＋２＋３（０．４ｍｇ／ｍｌ）を３０ｍｌポリスチレンユニバーサルコンテナ中０．８ｍｌの２０ｍＭ Ｔris／１Ｍ尿素／５ｍＭ ＥＤＴＡ／３ｍＭ ２−メルカプトエタノールpＨ８．０（「希釈液」）に添加する。溶液を穏やかに撹拌してよく混合し、冷所（約２〜３℃）中で蓋をして静置する。
１時間目に、１．６ｍｌの希釈液を添加して混合する。
２時間目に、３．２ｍｌの希釈液を添加して混合する。
４時間目に、６．４ｍｌの希釈液を添加して混合する。
溶液を更に２０時間冷所に静置し、限外濾過（ＹＭ５、アミコン・リミテッド（Amicon Ltd）により約１．４ｍｌにする。これをセファデクスＧ２５（ＰＤ１０）を用いて冷所中０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3（２．５ｍｌ）中に緩衝液交換する。溶出液を分割し、−４０℃で保存するか、凍結乾燥する。
ＳＣＲ１＋２＋３を含有する生成物をＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて蛋白質染色により分析する。非還元および還元（２-メルカプトエタノール５％（ｖ／ｖ））サンプルの両方において、１つの主要なバンドが存在する。還元バンドの分子量は、Ｍrとして知られる非還元蛋白質標準体と比較すると、約２４，０００である。非還元蛋白質（バンド）は還元蛋白質（バンド）より若干速い移動度を有する。
生成物を機能的溶血試験で抗体感作ヒツジ赤血球を用いて分析する（方法（ｘvi））。生成物は、ＩＨ５０が約０．４μｇ／ｍｌで赤血球の補体媒介融解の濃度に依存した阻害を示す。
（ｆ）フォールディング
調製、フォールディング、処理および分析を以下の事項を除いて実施例２ｅと全く同様に行う：
（１）  フォールディングの希釈剤は２０ｍＭメタノールアミン（ＰＨ１０．０）である。
（２）  フォールディングした溶液を限外濾過して最終容積を１．５５ｍｌにする。
（３）  ＩＨ５０値を約０．６とする。
（４）  生成物の回収率は約１００パーセントである。
（ｇ）ＳＣＲ１＋２＋３Ｎ末端配列の決定
プラスミドＰＤＢ１０１３−５−４を含有する成長イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のサンプル１ｍｌを、実施例２ｂに記載したようにして１ｍＭ ＩＰＴＧで誘起した３時間後に除去する。これらのサンプルをエッペンドルフ遠心管中でスピンさせ、得られたペレットをそれぞれ２００μｌの還元緩衝液（１００ｍＭ Ｔris pＨ６．８／２００ｍＭジチオトレイトール／４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーおよび２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に再懸濁し、５分間煮沸する。２５μｌのサンプルを１４％ポリアクリルアミドゲルにかける。電気泳動が完了したら、サートブロット・エレクトロブロティング（Sartoblot electroblotting）装置（サートリウス（Sartorius））を用いて、０．８ｍＡ／ｃｍ2で１時間４０分、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）トランスファー緩衝液を用いて蛋白質をＰroＢlott膜（アプライド・バイオシステム）に移す。トランスファー後、ＰroＢlott膜を２０秒間染色し（０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブルー（Coomassie Blue）Ｒ−２５０／４０％（ｖ／ｖ）メタノール／１％（ｖ／ｖ）酢酸）、５０％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて脱色する。Ｍr約２３，０００蛋白質に対応するバンドを切断し、Ｎ−末端配列を、アプライド・バイオシステム４７７Ａ・プロテイン・シーケンサー（Protein Sequencer）中ブロットカートリッジを用いて、決定する。
最初の２０個のアミノ酸の配列は、残基３が用いた配列決定法では同定できない以外は、予想される配列と一致することが見いだされた。
実施例３  発酵容器からのＳＣＲ１＋２＋３の発現および精製
（ａ）  プラスミドｐＤＢ１０１３−５−４を有するイー・コリの発酵
イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）：ｐＤＢ１０１３−５−４を、１ｍｌの培養物を含有するバイアルを解凍することにより、液体窒素中の貯蔵物から回収し、これを用いて７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌの種培地（ＮＣ−ＹＺＭ）を接種する。第一および第二シード段階発酵を５００ｍｌシェークフラスコ中で、ＮＣＹＺＭ培地の１００ｍｌを用いて行う。第一および第二シード発酵条件は以下のとおりである：３７℃、偏心距離５０ｍｍのオービタルシェーカー上２３０ｒｐｍ。第一シード培養時間は２時間である。第一シード培養物を用いて第二シード発酵培地に０．１％（ｖ／ｖ）で接種する。第二シードを１４．５時間培養する。
１５リットルのバイオラフィット（Biolafitte）発酵槽２個を、それぞれ、１０リットルのＮＣＹＺＭ培地および０．０１％（ｖ／ｖ）ダウ・コーニングＤＣ１５１０消泡剤を用いてバッチ処理をを行う。容器＋培地を、１２１℃までの蒸気を用いて４５分間滅菌する。マイクロフィルトレーション（０．２μｍ）により滅菌したアンピシリンを無菌的に最終濃度が１５０μｇ／ｍｌになるように容器の培地に添加する。発酵槽に３％（ｖ／ｖ）のレベルでプールした第二種培養から接種する。最終段階の培養条件は、３７℃、撹拌４００ｒｐｍ、空気流５ｌ／分（０．５ｖｖｍ）である。接種前、０時間目およびそれ以降３０分ごとに無菌的に最終段階の発酵のサンプルをとる。サンプルを、光学密度（６００ｎｍ）の増加に関してモニターする。ＯＤ６００が≧０．５になったら、ＩＰＴＧを添加して最終濃度を１ｍＭにする。発酵物をさらに３時間培養する。
細胞を７０００ｇを用いた遠心分離を２５分行うことにより回収する。総細胞収率（湿潤重量）は４９．８グラムであった。
（ｂ）封入体単離
基本的に実施例２に記載したようにして、２３ｇ（湿潤重量）の細胞ペレットからの封入体を単離し、可溶化する。
（ｃ）変性ＳＣＲ１＋２＋３の精製
実施例３ｂからの可溶化封入体の容積は約８００ｍｌである。この粘稠溶液に、ＳＰ−セファロースＦＦ（１００ｍｌゲルベッド、水洗し、吸引乾燥する）を添加する。混合物を激しく撹拌し、１時間室温で静置する。上清を傾瀉し、−４０℃で貯蔵する。残ったスラリーを再懸濁して均質な懸濁液を得、ガラスジャケット（内径４１．５ｍｍ）中に注ぎ、充填したベッド中に沈殿させる。この充填したベッドを４℃で低圧クロマトグラフィーシステムに連結し、０．０２Ｍ Ｔris／８Ｍ尿素／０．０５Ｍ ２−メルカプトエタノール／０．００１Ｍ ＥＤＴＡ pＨ８．５で平衡化する。溶出液のＡ280が最低になったら、緩衝液を１Ｍ ＮaＣlを追加した平衡緩衝液に交換する（段階的に）。単一のＡ280ピークが９０ｍｌの容積（約１Ｖtに等しい）で溶出される。溶液は無色透明で、緩衝液交換したサンプルのＡ280測定（ε＝２５，０００を用いる）により約３００ｍｇの目的蛋白質が含まれていることがわかる。ＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて蛋白質染色により、目的蛋白質は存在する主要なバンドであることがわかる。９０ｍｌの生成物を−４０℃で貯蔵する。
（ｄ）フォールディングおよび精製
１８ｍｌの前記生成物（表示値６０ｍｇ）を１２ｍｌの０．０２Ｍ Ｔris／８Ｍ尿素／１Ｍ ＮaＣl／０．０５Ｍ ２−メルカプトエタノールpＨ８．５で希釈する。生成物（３０ｍｌ）を５ｍｌのアリコートにして１分間隔で９３０ｍｌの新たに調製した、冷０．０２Ｍエタノールアミン／０．００１Ｍ ＥＤＴＡに撹拌しながら添加し、１時間、４℃で静置する。次に還元グルタチオンを１ｍＭになるように添加し（９．６ｍｌの０．１Ｍ ＧＳＨを添加することによる）、酸化グルタチオンを０．５ｍＭになるように添加する（９．６ｍｌの０．０５Ｍ ＧＳＳＧを添加することによる）。溶液は透明で、冷所に約７０時間静置する。溶液を次にＹＭ１０膜を用いて限外濾過して最終残存容積を約１０ｍｌとする。この残存物は白濁している。これを９０ｍｌの０．１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4／１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4 pＨ７．０（緩衝液Ａ）と室温で混合し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。上清を傾瀉し、ＳＣＲ１＋２＋３蛋白質を上清のブチルトーヨーパール６５０Ｓ（Butyl Toyopearl 650S）上でのクロマトグラフィーにより単離する。
ブチルトーヨーパール６５０Ｓのカラム（Ｖt〜１２ｍｌ）を緩衝液Ａで平衡させる。１００ｍｌの上清をカラムに適用し、カラムを緩衝液Ａで洗浄する。これを次に１００％緩衝液Ａから１００％０．１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4 pＨ７．０の直線的勾配を用いて展開させる。全てのクロマトグラフィーは室温、３０ｃｍ／時で行う。
主要なＡ２８０ピークが勾配中に溶出される。ピークのフラクションを、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて蛋白質染色により分析する。ピークの最も濃縮されたフラクションは基本的に純粋なＳＣＲ１＝２＋３を含有し、溶血試験において活性であった（方法（ｘvi））ＩＨ５０〜０．３μｇ／ｍｌ）。これを−４０℃で貯蔵する。
実施例４  ブチルトーヨーパールで精製したＳＣＲ１＋２＋３の処方
実施例２および３に記載したバッチと同様の方法で発現し、フォールドし、精製し、基本的に実施例３ｄに記載したようにして硫酸アンモニウム処理およびブチルトーヨーパールクロマトグラフィーによりさらに精製したＳＣＲ１＋２＋３を以下のようにして使用可能な生成物に処方する。
３つのこのようなブチルトーヨーパール生成物をプールして、最終容積を約３１ｍｌにする。３１ｍｌを全てセファデクスＧ２５カラムを用いて０．０５Ｍ蟻酸（０．２μｍ濾過「ミリ（Milli）Ｑ」水を用いて調製）中に緩衝液液交換する。すべてのクロマトグラフィーは５０ｃｍ／時、４℃で行う。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターし、Ｖoフラクションを単一のフラクションとして集める。このフラクションを分割して凍結乾燥する。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ／染色およびＣ８逆相ＨＰＬＣの両方による凍結乾燥前のＶoプールの分析により、これが基本的に純粋な目的蛋白質であることがわかる。プールは、抗溶血活性（ＩＨ５０約０．３μｇ／ｍｌ）を示し、エンドトキシン含量は低い（＜１ｎｇ／ｍｇ）。
凍結乾燥したアリコートの１つは１０ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝塩溶液中に可溶性で、溶血試験において補体阻害活性を示す（方法（ｘvi））；ＩＨ５０＝０．３μｇ／ｍｌ。
別の凍結乾燥したアリコートを試験して、ジスルフィド結合パターンを決める。６個の正しい（コンセンサスＳＣＲモチーフにより予想されるような）ジスルフィドが検出される。
実施例５  Ｃ３ａ放出により測定される補体の古典的経路のＩgＧ媒介活性化に関するＳＣＲ１＋２＋３の効果
熱凝集ＩgＧ活性化血清の阻害を、方法（ｘvii）に記載したようにして行う。熱凝集ＩgＧは補体の古典的経路を活性化する。異なる濃度（典型的には４〜１０００μｇ／ｍｌ）の阻害剤を血清と共に熱凝集ＩgＧの存在下に培養し、各濃度での活性化の阻害率（％）を測定する。ＳＣＲ１＋２＋３のＩＣ５０は約２２μｇ／ｍｌと測定され、これはＳＣＲ１＋２＋３が補体の古典的経路を阻害できることを示す。
実施例６  Ｃ３ａ放出にしたがって測定される補体の別の経路のチモサンＡ媒介活性化に関するＳＣＲ１＋２＋３の効果
チモサンＡ活性化血清の阻害を、方法（ｘvii）に記載したようにして行う。異なる濃度（典型的には１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲）のＳＣＲ１＋２＋３を血清と共にチモサンＡの存在下に培養し、各濃度での活性化の阻害率（％）を測定する。数回の異なる実験からＩＣ５０は２０〜４０μｇ／ｍｌと測定され、これはＳＣＲ１＋２＋３が補体の別の経路を阻害できることを示す。
実施例７  Ｃ５ａ放出にしたがって測定される補体の別の経路のチモサンＡ媒介活性化に関するＳＣＲ１＋２＋３の効果
チモサンＡ活性化血清の阻害を、方法（ｘvii）に記載したようにして行い、方法（ｘviii）に記載されているようにして分析する。異なる濃度（典型的には４〜７００μｇ／ｍｌの範囲）のＳＣＲ１＋２＋３を血清と共にチモサンＡの存在下に培養し、各濃度での活性化の阻害率（％）を測定する。数回の異なる実験からＩＣ５０は約２０〜３０μｇ／ｍｌと測定され、これはＳＣＲ１＋２＋３が補体の別の経路を阻害できることを示す。
実施例８  精製し、フォールドし、処方したＳＣＲ１＋２＋３のエンドトキシン含量測定
最終生成物ＳＣＲ１＋２＋３のバッチを基本的に前記実施例４に記載したとおりにして調製し、カブトガニ変形細胞溶解物（ＬＡＬ）（アトラス・バイオスキャン・リミテッド（Atlas Bioscan Ltd.）のゲル−クロット反応に基づいた方法を用いてエンドトキシン含量について測定する。試験の感度は０．１２５ＥＵ／ｍｌで、これをＬＡＬキットに付いている標準イー・コリエンドトキシンから調製した二倍希釈シリーズに対する滴定によりチェックする。
１０倍希釈の〜１．３ｍｇ／ｍｌのＳＣＲ１＋２＋３蛋白質ストックを、１０μｌのＬＡＬに１０μｌのサンプルを添加することにより、ＬＡＬに関するその効果に関して４回試験する。３７℃で１時間後、混合物をクロッティングまたは残存する液体のいずれかに関して試験する。（少なくとも０．１２５ＥＵのエンドトキシンを含有する液はこのＬＡＬ調製物を凝結させる）。干渉に関する試験のための同時に行う試験の結果も考慮して、ＳＣＲ１＋２＋３蛋白質調製物のエンドトキシン含量は＜１２．５ＥＵ／ｍｌであり、約＜１ｎｇ／ｍｇ蛋白質に等しい。
実施例９  ＣＲ−１のＭＲ１２２→Ｋ１９６（ＳＣＲ３）の発現、フォールディング、精製および処方
一般論
成熟ヒト補体受容体１のアミノ酸１２２に対応し、アミノ酸１９６で終結するＳＣＲ３に関する配列を該遺伝子の５'末端がＮdeＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むようにデザインする。この部位は、ｍＲＮＡ翻訳の開始に必要なメチオニンを誘導するＡＴＧ開始コドンを含み、遺伝子をｐＢＲＯＣ４１３のシン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）リボソーム結合部位から最適の距離を置いた位置におく。このコドンのすぐ後には成熟ヒト補体受容体のアルギニン１２２で始まるＳＣＲ３をコードする遺伝子が続く。遺伝子の３'末端はＨindIII部位の前の２個の停止コドンの前のリシン１９６をコードするコドンで終わる。
ＳＣＲ３をコードするＤＮＡを方法において記載したようにイー・コリにおける最適のコドンの使用のために修飾する。また、遺伝子を変更して、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が取り込まれるように変更する。これは以下の様にして行う。ｐＢＲＯＣ４１３を切断しない市販の制限エンドヌクレアーゼを同定する。これらの制限エンドヌクレアーゼ部位のＤＮＡ配列を次に全部で３個の解読フレーム中に翻訳し、コドンの使用を調べる。イー・コリによりほとんど使用されないコドンを含む部位を捨てる。残った部位をその翻訳された配列に関して調べ、該配列がＳＣＲ３と合えば、制限部位は該配列中に取り込まれている。
（ａ）  ＳＣＲ３をコードするプラスミドｐＢＲＯＣ４３５の構築
プラスミドｐＢＲＯＣ４３５の構築は実施例２ａに記載したとおりである。
（ｂ）  ｐＢＲＯＣ４３５からのＳＣＲ３の発現
ｐＢＲＯＣ４３５をイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中にエレクトロポレーションにより形質転換し、得られたコロニーをミニプラスミドＤＮＡ調製物の制限消化により分析する。１つのコロニーを１０ｍｌのＬブロスまたはＮＣＹＺＭ培地および５０〜７５μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する万能緩衝液中に接種し、一夜３７℃、２２０ｒｐｍで増殖させる。典型的には４ｍｌの一夜培養物を各２Ｌの、５００ｍｌのＮＣＹＺＭ培地、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンを入れたコニカルフラスコに接種するのに用い、培養物を次に３７℃、２３０ｒｐｍでＡ600が０．５吸光単位になるまで増殖させる。培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘起し、同じ条件下で更に３時間増殖させる。培養物を遠心分離（約８０００ｇ／１０分）に付し、上清を捨てる。細胞ペレットを−４０℃で貯蔵する。
（ｃ）  可溶化封入体の単離
実施例９ｂに記載したイー・コリ（ＮＣＹＺＭ中３リットル培養物）凍結細胞ペレットを室温で２時間で解凍し、つぎに５０ｍＭ Ｔris／５０ｍＭ ＮaＣl／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．０（９０ｍｌ）中に再懸濁させる。懸濁液を２００ｍｌガラス製ビーカーに移し、超音波処理する（ヒート・システム-ウルトラソニックＷ３８０（Heat Systems-Ultrasonics W380）；７０ワット、５０×５０％パルス、パルス時間＝５秒）。超音波処理物をただちに遠心分離し（６０００ｇ／４℃／１０分）、上清を捨てる。封入体を含有するペレットをに２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１．０ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５（３００ｍｌ）中に静かに混合物にピペットで移して再懸濁させる。混合後、溶液を、室温（約２３℃）で１時間静置する。溶解しなかった物質を全て除去するために、得られた溶液を遠心分離する（約２０００ｇ、４℃、１０分）。このスピンの上清を除去し、可溶化封入体生成物として、−４０℃で貯蔵する。
（ｄ）  可溶化封入体からのＳＣＲ３の精製
Ｓ−セファロースファーストフローのカラム（ファーマシア）（内径３２ｍｍ、高さ３２ｍｍ）を調製し、２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノールpＨ９．０で平衡させる。実施例９ｃと同様にして調製した、２００ｍｌの解凍し、可溶化した封入体をカラムにかけ、平衡化緩衝液でよく洗浄する。カラムをＦＰＬＣシステムに連結し、段階的に０．１、１．０、２．０ＭのＮaＣl勾配（平衡緩衝液中）で展開する。全てのクロマトグラフィーは２．０ｍｌ／分、室温である。
クロマトグラフィー中に回収したフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析／蛋白質染色により、実質的に全てのＳＣＲ３ポリペプチドがカラムに結合しないことがわかる。他の多くの蛋白質はカラムに吸収されるが、０．１Ｍおよび１．０Ｍ ＮaＣl含有緩衝液により解離されない。未吸着フラクション中のＳＣＲの純度は約８０％である。
（ｅ）  ＳＣＲ３のフォールディング
実施例９ｄに記載したのと同様の方法で精製し、−４０℃で貯蔵したたＱ−セファロース精製ＳＣＲ３を解凍し、冷溶液を用いて。連続希釈によりフォールドする。ｔ＝０で、１００ｍｌの２０ｍＭ Ｔris／１Ｍ尿素／５ｍＭ ＥＤＴＡ／３ｍＭ ２−メルカプトエタノールpＨ８．０（希釈液）を１００ｍｌのＳＣＲに添加する。この段階で、溶液は濁る。溶液を穏やかに撹拌してよく混合し、冷所（約２〜３℃）中で蓋をして静置する。１時間目に、２００ｍｌの希釈液を添加して混合し、最終溶積を４００ｍｌにする。２時間目に、４００ｍｌの希釈液を添加して混合し、最終溶積を８００ｍｌにする。４時間目に、８００ｍｌの希釈液を添加して混合し、最終溶積を１．６１にする。溶液をさらに２０時間冷所に静置する。溶液は透明になり、これを分割して−４０℃で貯蔵する。
（ｆ）  ＳＣＲ３のフォールディング
実施例９ｅと同様にして調製した５０ｍｌのＳＣＲ３を解凍し、２０００Ｄａカットオフ膜（アミコン（Amicon））を用いて限外濾過して３．５ｍｌにする。２．５ｍｌの濃縮物をセファデクスＧ２５（ＰＤ１０）を用いて０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3（３．０ｍｌ）中に緩衝液交換する。続くモル消衰係数１１０００を用いた蛋白質含量の分析によると、このサンプルは約０．２４ｍｇ／ｍｌを含有する。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ／蛋白質染色によるこの物質の分析によると、蛋白質の純度は約８０％である。２−メルカプトエタノールで還元したサンプルは低い電気泳動移動度を有し、これはＳＣＲ３中にジスルフィド結合が存在することを示すものである。
このサンプルの溶血試験（方法（ｘvi））における分析によると、ＩＨ５０は約１０〜２０μｇ／ｍｌである。
（ｇ）  発現されたＳＣＲ３のＮ末端配列の決定
実施例９ｆのようにして調製し、０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3中に配合した２００μｌのＳＣＲ３をドライアイス／エタノール浴中６０分間、８００μｌの冷アセトンで沈殿させる。サンプルを次にエッペンドルフ遠心管中で回転させ（約１００００ｇ／２０分）、得られたペレットを加熱しながら、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含有するサンプル緩衝液中に再懸濁する。３０μｌのサンプルを４から２０％ＳＤＳ−含有ポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気泳動に付す。電気泳動が完了したら、エレクトロブロッティング装置を用いて、２００ｍＡで２時間、１０％メタノール／９０％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）トランスファー緩衝液中ＣＡＰＳを用いて蛋白質をＰroＢlott膜（アプライド・バイオシステム）に移す。トランスファー後、製造業者の指示にしたがって、ＰroＢlott膜を染色し（０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブルー）、脱色し、すすぎ、風乾する。膜の断片を切り取り、Ｎ−末端配列決定に用いる。
主なバンドの最初の２０個のアミノ酸の配列は、残基５（同定されず）以外はＳＣＲに関して予想されるものと一致する。
（ｈ）  ＣＲ３の調製、フォールディングおよび配合
調製およびフォールディングは、実施例９ａ〜ｅに記載したのと全く同様に行う。４００ｍｌのフォールドしたＳＣＲ３を４℃で３０ＫＤａカットオフフィルター（アミコン）を通して限外濾過する。限外濾液のサンプルを２通りの方法で処理する。
１．  ５０ｍｌを２ＫＤａカットオフ膜を用いて限外濾過して最終容積を３．５ｍｌにし、セファデクスＧ２５（ＰＤ１０）カラムを用いて０．０５Ｍ蟻酸（６．７ｍｌ）中に緩衝液交換する。２８０ｎｍでの吸光度により測定されたＳＣＲ３の合計量は０．６ｍｇである。ＳＤＳ ＰＡＧＥ／蛋白質染色による分析によると、この蛋白質の純度は約９５％である。サンプルを凍結乾燥し、−４０℃で貯蔵する。
２．  １００ｍｌの限外瀘液をＨＣｌでpＨ５．５に調節する。サンプルを１．５ｍｌ／分でＭono Ｓカラム（１ｍｌ）に適用し、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔris ＨＣｌ pＨ５．５）でよく洗浄する。カラムを次に段階的勾配（０．１、１．０および２．０Ｍ ＮaＣl（平衡化緩衝液中））で展開する。全てのクロマトグラフィーは１．０ｍｌ／分、室温である。
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／蛋白質染色による、クロマトグラフィー中に集められたフラクションの分析によると、１Ｍ ＮaＣlで解離する主要なバンドは、約９５％の純度のＳＣＲ３を含有する。
実施例１０  ＣＲ−１のＭＲ１２２−Ｓ２５３（ＳＣＲ３＋４）の発現、フォールディング、精製および配合
（ａ）  ＳＣＲ３＋４をコードするプラスミドｐＤＢ１０１９の構築
ＳＣＲ３＋４をコードするＤＮＡをプラスミドｐＢＲＯＣ４３５（実施例２）およびｐＤＢ１０１８−１（実施例１１）（それぞれ、ＳＣＲ３およびＳＣＲ１＋２＋３＋４をコードする遺伝子を担う）から構築する。ＳＣＲ４コーディング単位をｐＤＢ１０１８−１から切断し、ｐＢＲＯＣ４３５中のＳＣＲ３コーディング単位の末端に結紮する。
ｐＤＢ１０１８−１をＳpeＩおよびＨindIIIで消化し、１％アガロースゲル上で分離する。ＳＣＲ４（〜２４５ｂｐ）をコードするバンドをゲルから切断し、ＱＩＡＥＸ抽出キットを用いて精製する。プラスミドｐＢＲＯＣ４３５もＳpeＩおよびＨindIIIで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、アガロースから切断し、ＱＩＡＥＸ抽出キットを用いて精製する。ＤＮＡをコードするＳＣＲ４を次にカットｐＢＲＯＣ４３５プラスミド中に結紮して、ｐＤＢ１０１９を得る。このＤＮＡをＣaＣl2でコンピテントにしたイー・コリＨＢ１０１を形質転換するのに用いる。形質転換体をＥcoＲＩおよびＨindIIIを用いた制限分析により分析する。正しい大きさの挿入物を有するクローンを発現の研究に用いる。
（ｂ）  ｐＤＢ１０１９−１ＣからのＳＣＲ３＋４の発現
ＣaＣl2でコンピテントにしたイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中にｐＤＢ１０１９を形質転換し、得られたコロニーをミニプラスミドＤＮＡ調製物の制限消化により分析する。プラスミドｐＤＢ１０１９−１Ｃは正しい大きさの挿入物を担うと同定される。ｐＤＢ１０１９−１Ｃをになうイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の１つのコロニーを１０ｍｌのＮＣＹＺＭ培地および７５μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０の万能緩衝液中に接種し、一夜３７℃、２４０ｒｐｍで増殖させる。次に一夜培養物を用いて、５００ｍｌのＮＣＹＺＭ培地、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンを入れた８個の２Ｌコニカルフラスコに接種する（各フラスコにつき５ｍｌ）。培養物を３７℃、２４０ｒｐｍでＡ600が０．５吸光単位になるまで増殖させる。この時点で培物を１ｍＭＩＰＴＧで誘起し、同じ条件下でさらに３時間増殖させる。培養物を遠心分離し（約８０００ｇ／１０分）、上清を捨てる。細胞ペレットを−４０℃で貯蔵する。
（ｃ）  ＳＣＲ３＋４の単離、精製、フォールディングおよび配合
用いた方法は一般的にＳＣＲ１＋２＋３＋の調製に関して既に記載した方法に従う。
２１個の培養物由来の細胞ペレットからの可溶化封入体の単離は、実施例２ｃに記載したように行う。可溶化しつのようせきは２００ｍｌである。
汚染（宿主）イー・コリ蛋白質のいくつかを、バッチプロセスまたはカラムクロマトグラフィーのいずれかにおいて、実施例２ｄに記載したのと同様のシステムを用いて、Ｓ−セファロース上に吸着させることにより調製物から除去する。未吸着フラクション中に存在する蛋白質は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／染色により、著しい量のＳＣＲ３＋４蛋白質を含有することが示される。これらのフラクションの約半分をＹＭ１（アミコン）膜を用いて限外濾過して約３５〜４０ｍｌにする。この残存物を測定すると、約０．３ｍｇ蛋白質／ｍｌ（β＝２１，０００を用いた緩衝液交換サンプルのＡ２８０測定に基づく）を含有する。１０．５ｍｌのこの残存物を３２５ｍｌの冷２０ｍＭエタノールアミンと混合し、４℃で１時間静置する。次に還元グルタチオンを１ｍＭになるように添加し（３．４ｍｌの１００ｍＭ ＧＳＨの添加による）、酸化グルタチオンを０．５ｍＭになるように添加する（３．４ｍｌの５０ｍＭ ＧＳＳＧの添加による）。溶液を混合し、４℃で〜７２時間静置する。溶液は透明である。溶液を次にＹＭ１膜を用いて限外濾過して残存物を５ｍｌとする。この残存物を２分割し、セファデクスＧ２５（ＰＤ１０カラム）を用いて２０ｍＭエタノールアミンまたは５０ｍＭ蟻酸中に緩衝液交換する。
蟻酸ＳＣＲ３＋４生成物を逆相ＨＰＬＣおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて蛋白質染色により分析すると、主要な１種の蛋白質しか示さない（純度＞９０％）。Ａ280測定を用いて蛋白質濃度を測定すると、０．３ｍｇ／ｍｌである。生成物は溶血試験において（方法（１６））活性であり、ＩＨ５０値は約３０μｇ／ｍｌである。
実施例１１  ＣＲ−１のＭＱ１−Ｓ２５３の構築、発現、精製、フォールディングおよび形成（ＳＣＲ１＋２＋３＋４）
一般論
ＳＣＲ１＋２をコードするプラスミドを作り、ＳＣＲ３を取り込み、最後にＳＣＲ４を添加することにより２個の構築物を調製する。この２個の構築物はコンセンサスＳＣＲ１〜４およびＳＣＲ１〜４のＲ２３５Ｈ突然変異をコードする（実施例１２）。
ＳＣＲ４をコードするＤＮＡをＳＣＲ１＋２＋３をコードする構築物（実施例２）上に添加することにより、ＳＣＲ１＋２＋３＋４コーディング単位を含有するプラスミドを構築する。ＤＮＡ操作の便宜のために、ＳＣＲ４の前のリンカー領域をコードするＤＮＡの前のＳＣＲ３の最後の１７個のアミノ酸をコードするＤＮＡを合成することにより、ＳＣＲ４ＤＮＡコーディング単位を形成する。このＤＮＡはＳＣＲ４の前のリンカー領域をコードするＤＮＡの前の成熟ＣＲ−１のＴ１７５に対応するＳＣＲ１＋２＋３コーディング構築物のＳpeＩ部位で始まり、２個の停止コドンおよびＨindIII部位の前のＳ２５３に対応するコドンで終わる。前の構築物に関して、ＳＣＲ４をコードするＤＮＡを、実施例１において既に記載したように最適化したコドンの使用および制限部位に関して変更する。ＤＮＡのこの単位を、ＳＣＲ１＋２＋３＋４をコードする構築物を得るためにあらかじめＳpeＩおよびＨindIIIで切断したＳＣＲ１＋２＋３をコードするプラスミドと結紮する。
（ａ）  ＳＣＲ１＋２＋３＋４をコードするプラスミドｐＤＢ１０１８の構築
独特の方法で、オリゴヌクレオチドの対間の相補的な８ｂｐ突出部を介して結紮できる６８〜９０ｍｅｒの３個の相補的対としてオリゴヌクレオチド（第１表；ＳＣＲ４をコードするｏｌｉｇｏ２１〜２６）を合成する。オリゴヌクレオチドの３個の相補的対をペアＥ（ｏｌｉｇｏ２１、２２）、ペアＦ（ｏｌｉｇｏ２３、２４）およびペアＧ（ｏｌｉｇｏ２５、２６）で表わす。遺伝子の５'末端に対応するペアＥは、ＳpeＩ制限部位突出部を含有し、ペアＧは、３'末端にＨindIII制限部位突出部を含有する。２２および２４以外の全てのオリゴヌクレオチドを変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動と、それに続く逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８）により精製する。オリゴヌクレオチド２２、２３、２４および２５を、その相補的オリゴヌクレオチドとアニールする前に、キナーゼ処理する。オリゴヌクレオチドをペアＥをペアＦとペアＧと結紮して、ＳＣＲ４の一部およびＳＣＲ４の全部をコードする遺伝子（本明細書において以下簡便のためにＳＣＲ４遺伝子と称する）を形成する。
ＳＣＲ４をコードするＤＮＡを、まず２本鎖ＤＮＡと相補的な２個のオリゴヌクレオチド（第１表；ｏｌｉｇｏ１７および１８）を用いてＰＣＲにより増幅する。オリゴヌクレオチドは両方とも遺伝子に相補的な１８ｂｐの前のＳpeＩ（ｏｌｉｇｏ１７）またはＨindIII（ｏｌｉｇｏ１８）制限部位のいずれかの配列の前の６ｂｐのランダム配列を含有するを含有する５'アンマッチ末端を含有する。ＰＣＲ後、約２５０ｂｐのバンドを水平アガロースゲル電気泳動で視覚化し、切断し、ＤＥＡＥ ＮＡ４５膜上で精製する。このＤＮＡを、その５'末端（第１表；ｏｌｉｇｏ１９、ｏｌｉｇｏ２０）で４個のヌクレオチドにより内側に予め移動させたプライマーを用いた第二のＰＣＲ増幅に用いる。これらのｏｌｉｇｏはＳpeＩおよびＨindIII制限部位を含有するが、各制限部位の末端以降には２個のヌクレオチドしか含まない。ＰＣＲの後、約２５０ｂｐのバンドを水平アガロースゲル電気泳動で視覚化する。このバンドを切断し、ＱＩＡＥＸアガロースゲル抽出キットを用いて精製する。
ＳＣＲ４に関するＤＮＡをキナーゼ処理の後それ自身と平滑末端で結紮する。形成されたマルチマーを水平アガロースゲル電気泳動で視覚化し、バンドを切断し、ＱＩＡＥＸアガロースゲル抽出キットを用いて精製する。ＤＮＡを次にＳpeＩおよびＨindIIIで切断し、予め同じ酵素で切断したｐＤＢ１０１３−５−４中に結紮して、ｐＤＢ１０１８を得る（第３図）。ベクターを塩化カルシウムでコンピテントとしたイー・コリＨＢ１０１中に形質転換する。ミニプラスミド調製物を得、プラスミドＤＮＡを、ＮdeＩ、ＨindIII、ＳtuＩ、ＳpeＩおよびＫpnＩでの消化により分析する。正しい制限地図を有するプラスミドをＳＣＲ４をコードする遺伝子中の両鎖のＤＮＡ配列決定により分析する。２つのプラスミドをさらに研究するために選択する。ＭＱ１−Ｓ２５３（コンセンサスＳＣＲ１〜４）をコードするｐＤＢ１０１８−１およびＭＱ１−Ｓ２５３のＲ２３５Ｈ突然変異をコードするｐＤＢ１０１８−６である。ｐＤＢ１０１８−１およびｐＤＢ１０１８−６によりコードされる２個のポリペプチドのアミノ酸配列を第２表に示す。
最初の残基をＡＴＧ開始コドンのＡとすると、ＤＮＡ配列決定により、ｐＤＢ１０１８−６の残基６００がＧからＡに変わっていることがわかる。これはサイレント突然変異であり、この位置でのアミノ酸を変更しない。
（ｂ）  ｐＤＢ１０１８−１からのＭＱ１−Ｓ２５３の発現
実施例１１ａに記載したようにして構築したｐＤＢ１０１８−１を塩化カルシウムコンピテントイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換する。１つのコロニーを１０ｍｌのＮＣＹＺＭ培地および７５μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する万能緩衝液中に接種し、一夜３７℃、２３０ｒｐｍで増殖させる。３ｍｌの一夜培養物用いて５００ｍｌのＮＣＹＺＭ培地、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンを入れた８個の各２Ｌのコニカルフラスコに接種し、培養物を３７℃、２３０ｒｐｍでＡ600が０．５吸光単位になるまで増殖させる。培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘起し、同じ条件下で更に３時間増殖させる。培養物を遠心分離し（約７０００ｇ／１０分／４℃）、上清を捨てる。細胞ペレットを−４０℃で貯蔵する。
（ｃ）  可溶化封入体の単離
実施例１１ｂに記載したようにして調製したイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＤＢ１０１８−１）（１リットル培養物に等しい）凍結細胞ペレットを０〜４℃で２時間かけて凍結させる。ペレットを５０ｍＭ Ｔris／５０ｍＭ ＮaＣl／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１．０ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．０中に懸濁させる（ペレット１リットルにつき３０ｍｌ）。各懸濁液を１００ｍｌガラス製ビーカーに移し、超音波処理する（ヒート・システム−ウルトラソニックＷ３８０；７０ワット、５０×５０％パルス、パルス時間＝５秒）。超音波処理物をプールし、ただちに遠心分離し（６，０００ｇ／４℃／１０分）、上清を捨てる。封入体を含有するペレットを２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５（４００ｍｌ）中に再懸濁させ、室温（約２３℃）で１時間静置する。
（ｄ）  可溶化封入体からのＭＱ１−Ｓ２５３の精製
脱イオン化水で洗浄し、吸引乾燥した３０ｍｌのＳ−セファロースＦＦを実施例１１ｃに記載した封入体溶液に添加し、３０秒間激しく震盪する。Ｓ−セファロース混合物を室温（２３℃）で１．５時間静置し、次に上清を捨てる。残存するスラリーをカラム（内径４．１ｃｍ）に充填する。カラムを２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５を用いて６０ｃｍ／時、４℃で平衡化する。ＭＱ１−Ｓ２５３蛋白質を１Ｍ ＮaＣlを含有する平衡緩衝液を用いて溶出する。クロマトグラフィー中に集めたフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ／蛋白質染色による分析から、実質的にすべての目的蛋白質がカラムに吸着され、１Ｍ ＮaＣl洗浄により解離されることがわかる。適切なフラクションを−４０℃で貯蔵する。
（ｅ）  フォールディングおよび配合
モル消衰係数２５０００および５０ｍＭ蟻酸中で測定したＡ280値に基づいて、実施例１１ｄに記載したようにしてＳ−セファロース精製したフォールドしていない蛋白質６０ｍｇを以下のようにしてフォールドし、配合する：
８．０ｍｌの溶液（蛋白質６０ｍｇに相当）を２２ｍｌの冷２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１Ｍ ＮaＣl／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５で希釈して、３０ｍｌの２．０ｍｇ／ｍｌ溶液を得る。３０ｍｌを一定速度で撹拌しながら９３０ｍｌの新たに調製した冷（０〜４℃）２０ｍＭエタノールアミン中に速やかに希釈する。溶液を０〜４℃で１時間静置する。還元グルタチオンを１ｍＭになるように添加し（９．６ｍｌの１００ｍＭストックの添加による）、酸化グルタチオンを０．５ｍＭになるように添加する（９．６ｍｌの５０ｍＭストックの添加による）。溶液を０〜４℃でさらに４８時間静置し、次に撹拌細胞（アミコン）およびＹＭ１０膜（アミコン、表示値１０，０００Ｄａ分子量カットオフ）を用いて限外濾過して約２９ｍｌとする。この限外濾過残存物をセファデクスＧ２５（内径２６ｍｍ；高さ２４５ｎｍ Ｖt１２３ｍｌ）および流速５０ｃｍ／時を用いて緩衝液交換して、最終容積を４０ｍｌにする。蛋白質に関するモル消衰係数２５，０００を用いて、５１ｍｇの蛋白質を回収する。精製した蛋白質のＩＨ５０値（方法（ｘvi）参照）は約２μｇ／ｍｌである。
（ｆ）  ＳＣＲ１＋２＋３＋４の精製および配合
基本的に実施例１１ｅに記載したようにして調製した５０ｍＭ蟻酸中フォールドしたＳＣＲ１＋２＋３＋４（表示値２５ｍｇ）を凍結乾燥する。凍結乾燥物を２０ｍＭエタノールアミン（１０ｍｌ）中に再溶解して、白濁溶液を得る。１０ｍｌを次に９０ｍｌの０．１ｍＭ ＮaＨ2ＰＯ4／１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4 pＨ７．０に添加し、よく混合し、遠心分離（４０００ｒｐｍ／２０分）により清澄化する。上清（１００ｍｌ）を傾瀉し、ブチルトーヨーパール上でクロマトグラフィーに付す（実施例３ｄにおいてＳＣＲ１＋２＋３に関して記載したのと全く同じ）。１００％の１Ｍ ＮaＣl含有緩衝液で溶出するピークＡ280フラクションをプールし、セファデクスＧ２５をもちいて５０ｍＭ蟻酸中に緩衝液交換する。Ｖoプール（２９．５ｍｌ）を分割して凍結乾燥する。
蛋白質の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて蛋白質染色およびＣ８逆相ＨＰＬＣにより調べると、蛋白質の純度は＞９５％と測定される。凍結乾燥したアリコートの一つを０．１Ｍ Ｈepes／０．１５Ｍ ＮaＣl pＨ７．４中４ｍｇ蛋白質／ｍｌとなるように再溶解する。生成物は、溶血試験（方法（ｘvi））において活性を示し、ＩＨ５０の計算値は０．３μｇ／ｍｌである。
他の凍結乾燥したアリコートを調べてジスルフィドブリッジパターンを蛋白溶解消化およびアミノ酸配列決定によるペプチド同定を用いて決定する。８個の正しいジスルフィド結合（コンセンサスＳＣＲモチーフに基づいて予想される）が全て検出される。
実施例１２  精製ＭＱ１−Ｓ２５３（Ｒ２３５Ｈ）の発現、単離、フォールディングおよび処方
（ａ）  ＭＱ１−Ｓ２５３（Ｒ２３５Ｈ）の発現
ｐＤＢ１０１８−６（実施例１１ａに記載したとおりに調製）を塩化カルシウムコンピテントイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換する。１つのコロニーを１０ｍｌのＮＣＹＺＭ培地および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する万能緩衝液中に接種し、一夜３７℃、２２０ｒｐｍで増殖させる。一夜培養物（約３ｍｌ）を５００ｍｌのＮＣＹＺＭ培地、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを入れた各２Ｌのコニカルフラスコに接種するのに用い、培養物を３７℃、２２０ｒｐｍでＡ600が０．５吸光単位になるまで増殖させる。培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘起し、同じ条件下で更に３時間増殖させる。培養物を遠心分離し（約８０００ｇ／１０分／４℃）、上清を捨てる。細胞ペレットを−４０℃で貯蔵する。
（ｂ）  可溶化封入体の単離および未フォールドＭＱ１−Ｓ２５３（Ｒ２３５Ｈ）の精製
実施例１２ａに記載したイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＤＢ１０１８−６）（２リットル培養物）凍結細胞ペレットを４℃で２時間解凍し、次に５０ｍＭ Ｔris／５０ｍＭ ＮaＣl／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．０（６６ｍｌ）中に再懸濁させる。懸濁液を２５０ｍｌガラス製ビーカーに移し、超音波処理する（ヒート・システム−ウルトラソニックＷ３８０；７０ワット、３０×５０％パルス、パルス時間＝５秒）。超音波処理物をただちに遠心分離し（６０００ｇ／４℃／１０分）、上清を捨てる。封入体を含有するペレットを２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ pＨ８．５（２００ｍｌ）中に激しく撹拌しながら再懸濁させ、室温（約２３℃）で１．５時間静置する。水洗し、吸引乾燥したＳ−セファロース（約２５ｍｌの充填したゲルベッドに相当）を２００ｍｌの可溶化封入体に添加し、混合物を激しく撹拌してセファロースビーズをよく湿らせる。混合物を室温で１．５時間静置する。上清（約１５０ｍｌ）を傾瀉して捨てる。残存するスラリーを撹拌により再懸濁させて均質な懸濁液にし、３２ｍｍ（内径）のガラスジャケット中に注ぎ、沈殿させる。ゲルベッドを低圧クロマトグラフィーシステムに結合し、２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノールpＨ８．５を用いて４℃でＡ280ベースラインが安定化するまで平衡化する。カラムを次に１Ｍ ＮaＣlを含有する平衡緩衝液で展開する。全てのクロマトフィーは約１ｍｌ／分である。クロマトグラフィー中に集めたフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ／蛋白質染色による分析から、大部分のＭＱ１−Ｓ２５３（Ｒ２３５Ｈ）ポリペプチドがカラムに吸着され、１Ｍ ＮaＣl含有緩衝液での洗浄により解離され、物質の純度は約９０％である。
サンプルのプールを５０ｍＭ蟻酸中にセファデクスＧ２５カラムを用いて緩衝液交換して、いくつかの検定を行う。
ＭＱ１−Ｓ２５３（Ｒ２３５Ｈ）含有フラクションのプールのアミノ酸分析によると、総蛋白質含量は約１２０ｍｇである。
（ｃ）  ＳＣＲ１＋２＋３（Ｒ２３５Ｈ）のフォールディングおよび配合
５０ｍＭ蟻酸中の蛋白質に関するＡ280値およびモル消衰係数２５，０００に基づいて、実施例１２ｂに記載したＳ−セファロースで精製したフォールドしていない蛋白質２０ｍｇを以下のようにしてフォールドし、処方する：
５．２ｍｌの蛋白質溶液（２０ｍｇに相当）を４．８ｍｌの冷２０ｍＭ Ｔris／８Ｍ尿素／５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール／１Ｍ ＮaＣl pＨ８．５で希釈して、１０ｍｌの２．０ｍｇ／ｍｌ溶液を得る。
１０ｍｌを一定速度で撹拌しながら３１０ｍｌの新たに調製した冷（０〜４℃）２０ｍＭエタノールアミン中に速やかに希釈する。溶液を０〜４℃で１時間静置する。還元グルタチオンを１ｍＭになるように添加する（２．５６ｍｌの１２５ｍＭ ＧＳＨの添加による）。つぎに酸化グルタチオンを０．５ｍＭになるように添加する（３．２ｍｌの５０ｍＭ ＧＳＳＧの添加による）。溶液を冷所（２〜３℃まで）でさらに４８時間静置する。溶液を次に、撹拌細胞およびＹＭ１０膜（表示値１０，０００Ｄａ分子量カットオフ）を用いて限外濾過して約２ｍｌとする。溶液は透明である。限外濾過細胞を約２ｍｌの２０ｍＭエタノールアミンで洗浄し、洗浄液および限外濾過残存物をプールして最終溶液を３．７ｍｌとする。
２．２ｍｌのこの溶液ををセファデクスＧ２５（ＰＤ１０）を用いて３．２ｍｌの５０ｍＭ蟻酸中に緩衝液交換する。緩衝液交換した物質を生成物とみなし、−４０℃で貯蔵する。生成物のアリコートの分析によると、これは１．６ｍｇ／ｍｌの蛋白質を含有し、非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥによる分析からＭｒ〜２８，０００の１本の主なバンドが存在し、バンド（ＭＱＸＮＡＰＥ）のＮ−末端配列決定は予想される配列と一致する。さらに、調製物のＩＨ５０値（方法（ｘvi）参照）は約１μｇ／ｍｌである。
図面の説明
第１図プラスミドｐＢＲＯＣ４１３。ｂｌａはアンピシリン耐性遺伝子を表わし、φ１０はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびｒｂｓはリボソーム結合部位を表わす。φ１０およびｂｌａに関する矢印は翻訳の方向を示す。ポリリンカー部位を示す。プラスミドは一定比率に合わせて描かれておらず寸法はおよそである。
第２図は、ｐＤＢ１０１０−Ｄ１１およびｐＢＲＯＣ４３５からのＳＣＲ１＋２＋３をコードするプラスミドｐＤＢ１０１３−５−４の構築を示す。プラスミドの大きさはおよそであり、一定比率に合わせて描かれていない。
第３図は、ＳＣＲ１＋２＋３をコードするｐＤＢ１０１８のｐＤＢ１０１３−５−４からの構築を示す。プラスミドの大きさはおよそであり、一定比率にに合わせて描かれていない。
実施例または一般的方法における引例
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６．  サムブルック・ジェイ、フリッシュ・イー・エフおよびマニアティス・ジェイ（Sambrook J., Fritsch E.F.およびManiatis J.）（1989）．Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd Edition．コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbour Laboratory Press）．
７．  スチューダー・エフ・ダブリュおよびモファット・ビー・エイ（Studier F. W.およびMoffat B.A.）（1986）．ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）189：113．
８．  タボー・エス（Tabor S.）（1990）．Expression using the T7 RNA polymerase／promoter system．In Current Protocols in Molecular Biology（エフ・エイ・アウスベル、アール・ブレント、アール・イー・キングストン、ディー・ディー・モアー、ジェイ・ジー・シードマン、ジェイ・エイ・スミスおよびケイ・ストルール編（F.A. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A.Smith and K. Struhl, eds）pp.16.2.1-16.2.11グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Greene Publishing and Wiley-Interscinence），ニューヨーク．
第１表
ＯＬＩＧＯ １＝配列番号：１
ＯＬＩＧＯ ２＝配列番号：２
ＯＬＩＧＯ ３＝配列番号：３
ＯＬＩＧＯ ４＝配列番号：４
ＯＬＩＧＯ ５＝配列番号：５
ＯＬＩＧＯ ６＝配列番号：６
ＯＬＩＧＯ ７＝配列番号：７
ＯＬＩＧＯ ８＝配列番号：８
ＯＬＩＧＯ ９＝配列番号：９
ＯＬＩＧＯ １０＝配列番号：１０
ＯＬＩＧＯ １１＝配列番号：１１
ＯＬＩＧＯ １２＝配列番号：１２
ＯＬＩＧＯ １３＝配列番号：１３
ＯＬＩＧＯ １４＝配列番号：１４
ＯＬＩＧＯ １５＝配列番号：１５
ＯＬＩＧＯ １６＝配列番号：１６
ＯＬＩＧＯ １７＝配列番号：１７
ＯＬＩＧＯ １８＝配列番号：１８
ＯＬＩＧＯ １９＝配列番号：１９
ＯＬＩＧＯ ２０＝配列番号：２０
ＯＬＩＧＯ ２１＝配列番号：２１
ＯＬＩＧＯ ２２＝配列番号：２２
ＯＬＩＧＯ ２３＝配列番号：２３
ＯＬＩＧＯ ２４＝配列番号：２４
ＯＬＩＧＯ ２５＝配列番号：２５
ＯＬＩＧＯ ２６＝配列番号：２６
第２表  ｃＤＮＡ構築物から得られるアミノ酸配列
実施例の蛋白質から得られる全配列は以下のとおりである：
ＣＲ１のＭＱ→Ｋ１９６は配列番号：２７
ＣＲ１のＭＲ１２２→Ｋ１９６は配列番号：２８
ＣＲ１のＭＱ１−Ｓ２５３は配列番号：２９
ＣＲ１のＭＱ１−Ｓ２５３のＲ２３５Ｈ突然変異体は配列番号：３０
ＣＲ１のＭＲ１２２−Ｓ２５３は配列番号：３１
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
（ii）発明の名称：新規化合物
（iii）配列の数：３１
（iv）連絡先
（Ａ）受取人：スミスクライン・ビーチャム・コーポレート・パテンツ（SmithKline Beecham Corporate Patents）
（Ｂ）通り名：グレートバーグ，ユー・トリー・ボトム・ロード
（Ｃ）都市名：エプソン
（Ｄ）州名：サリー州
（Ｅ）国名：英国
（Ｆ）郵便番号：ＫＴ１８  ５ＸＱ
（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパティブル
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１．２５
（vi）現出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人情報
（Ａ）名称：バレンチノ，ジル・ビー
（Ｂ）登録番号：Ｇ．Ａ．２６７５８
（Ｃ）レファレンス番号：Ｐ３０４２３
（ix）電話連絡情報：
（Ａ）電話：０７３７３６４１５８
（２）配列番号：１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0003939747.tif 000004
（２）配列番号：２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003939747.tif 000005
（２）配列番号：３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0003939747.tif 000006
（２）配列番号：４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0003939747.tif 000007
（２）配列番号：５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0003939747.tif 000008
（２）配列番号：６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0003939747.tif 000009
（２）配列番号：７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0003939747.tif 000010
（２）配列番号：８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0003939747.tif 000011
（２）配列番号：９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0003939747.tif 000012
（２）配列番号：１０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
0003939747.tif 000013
（２）配列番号：１１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
0003939747.tif 000014
（２）配列番号：１２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
0003939747.tif 000015
（２）配列番号：１３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１３
0003939747.tif 000016
（２）配列番号：１４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
0003939747.tif 000017
（２）配列番号：１５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
0003939747.tif 000018
（２）配列番号：１６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
0003939747.tif 000019
（２）配列番号：１７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１７：
0003939747.tif 000020
（２）配列番号：１８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
0003939747.tif 000021
（２）配列番号：１９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
0003939747.tif 000022
（２）配列番号：２０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
0003939747.tif 000023
（２）配列番号：２１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
0003939747.tif 000024
（２）配列番号：２２についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
0003939747.tif 000025
（２）配列番号：２３についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
0003939747.tif 000026
（２）配列番号：２４についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
0003939747.tif 000027
（２）配列番号：２５についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
0003939747.tif 000028
（２）配列番号：２６についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
0003939747.tif 000029
（２）配列番号：２７についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
0003939747.tif 000030
0003939747.tif 000031
（２）配列番号：２８についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメントの型：内部
（xi）配列の記載：配列番号：２８：
0003939747.tif 000032
（２）配列番号：２９についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（xi）配列の記載：配列番号：２９：
0003939747.tif 000033
0003939747.tif 000034
（２）配列番号：３０についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（xi）配列の記載：配列番号：３０：
0003939747.tif 000035
0003939747.tif 000036
（２）配列番号：３１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１３３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３１：
0003939747.tif 000037
【図１】
0003939747.tif 000038
【図２】
0003939747.tif 000039
【図３】
0003939747.tif 000040