(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bifidobacterium 属の細菌又はこの属に近縁である細菌の不活性化培養物を含む第一の成分と、ネーティブなコンフォメーションにある糖タンパク質、ネーティブなコンホメーションにある炭水化物ポリマーとネーティブなコンホメーションにあるアラビノガラクタンタンパク質を含む大豆の植物細胞外マトリックスの抽出物を含む第二の成分を活性物質として含んでなるが、但し、不活性化細菌は植物細胞外マトリックスの抽出物中に分解される、ＵＶ照射誘発性の皮膚損傷に対抗するための局所適用の化粧組成物。
【請求項２】
ＵＶ照射誘発性の皮膚損傷が、免疫抑制、ＤＮＡ損傷（ヌクレオソームの形成）、細胞の生存能力の低下、前癌状態への形質転換、日焼け細胞の形成、又は早発性皮膚老化である、請求項１に記載の化粧組成物。
【請求項３】
免疫抑制が亢進したＩＬ−１０の発現により引き起こされる、請求項２に記載の化粧組成物。
【請求項４】
早発性皮膚老化が亢進したＭＭＰ−１の発現により引き起こされる、請求項２に記載の化粧組成物。
【請求項５】
活性物質の複合体が、Bifidobacterium 属に近縁である以下の細菌：Actinomycetaceae、Propionimycetaceae、Lactobacillaceae 及びコリネ型細菌の不活性化培養物からなる第一の成分を含むことで特徴づけられる、請求項１〜４の何れか１項に記載の化粧組成物。
【請求項６】
第二の成分が一次又は二次の植物細胞壁から誘導されることで特徴づけられる、請求項１〜５の何れか１項に記載の化粧組成物。
【請求項７】
不活性化した細菌培養物が以下の工程により得られる、請求項１〜６の何れか１項に記載の化粧組成物：（ａ）Bifidobacterium を適切な培地において嫌気性条件下で培養し、（ｂ）初期の定常期に達した後、細菌を低温殺菌により不活性化し、次いで（ｃ）従来の分離技術により採取し、生理ＮａＣｌ溶液で２〜３回洗浄し、及び（ｄ）回収したバイオマスを急速冷凍で保存し得る。
【請求項８】
第二の成分が以下の製造工程により得られる、請求項１〜７の何れか１項に記載の化粧組成物：（ａ）植物細胞を粉砕し、所望により抗酸化剤を含有し、さらに保存剤を含有する水溶液で洗浄し、（ｂ）所望の抗酸化剤を、保存剤を含有する水性の洗浄液で洗い流し、（ｃ）粉砕して洗浄した植物組織を非加水分解条件下で抽出し、及び（ｄ）従来の分離技術と最終濾過を使用することによって、抽出物から不溶性物質を除去する。
【請求項９】
（ａ）請求項７により得られる Bifidobacterium のバイオマスが、請求項８により得られる植物細胞外マトリックスの抽出物に、抽出物に対するバイオマスの比が好ましくは１ｌに０．４ｇであるように懸濁され、（ｂ）不活性化細菌を含有する懸濁液が、機械的分解により分解される、請求項１〜６の何れか１項に記載の化粧組成物。
【請求項１０】
機械的分解が細胞粉砕機中で実施される、請求項９記載の化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、表皮及び皮膚の細胞とその細胞外環境に対する改善された再生及び保護効果を有する化粧組成物に関する。それは、潜在的に有害な環境効果から皮膚を保護するために最適化された、有効成分の新規な活性複合体を含む。
【０００２】
本発明による活性複合体の本質的な成分は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の細菌又はこの属に近縁である細菌の不活性化及び分解培養物と、好ましくは大豆から調製した、植物細胞外マトリックス組成物からなる。
【０００３】
皮膚のＵＶ照射への曝露は、いずれも皮膚細胞の（永久の）損傷につながる、日焼け（炎症）、皮膚癌（メラノーマ）の誘発、皮膚の免疫細胞における早発性皮膚老化及び変化（免疫抑制）を含む、多様な生物学的効果を引き起こし得る。
【０００４】
ＵＶによる皮膚細胞の損傷は、ＵＶ誘発性の免疫抑制、ＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷、及びＤＮＡ損傷の蓄積のような、いくつかの機序により誘導される。
免疫抑制は、皮膚の免疫学的な不均衡状態である（Kripke, 1984; Baadsgard, 1991）。ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ）照射へ皮膚をさらすと、ハプテンに対するＴ細胞介在性の接触過敏症（ＣＨＳ）や Herpes simplex virus、Candida albicans 又はマイコバクテリウムのようなタンパク抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応が全身的に抑制されることが知られている（Otani et al., 1987; Giannini, 1986; Denkins et al., 1989; Jeevan et al., 1989）。特に、高度に特殊化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるランゲルハンス細胞（ＬＣ）は、接触アレルゲン、ウイルスアレルゲン、及びおそらくは皮膚腫瘍抗原に対する免疫応答の誘導に本質的な役割を担っている（Teunissen, 1992）。ＵＶＢ照射は、表皮内のＬＣ数を減少させることが示された。
【０００５】
Ratis et al., 1988 は、ＵＶＢへの曝露が少なくとも２種の異なる経路でＬＣに影響を及ぼすことを示した：
１．細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）と特にＣＤ８６の発現が有意に減少すること、及び
２．ＬＣの生存能力が低下し、アポトーシス細胞死を招くこと。
いずれの機序もＵＶＢ誘発性の免疫抑制効果に貢献する。
【０００６】
ＬＣ以外では、角化細胞（ＫＣ）がＵＶ誘発性の免疫抑制において重要な役割を担う。ＵＶ光は、その波長に依存して、ＫＣ由来の免疫調節性サイトカインの産生及び分泌に影響を及ぼす。特に、ＩＬ−１０の発現は、全身性の免疫抑制とヘルパーＴサブセットの差次的活性化の誘導において主要な役割を担うことが示された。Shreedar et al., 1988 は、照射されたＫＣのプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）放出が血清ＩＬ−４を誘導し、これがさらにＩＬ−１０の放出を誘導することを説明した。このように、ＵＶ曝露はサイトカインカスケードを活性化させ、全身性の免疫抑制をもたらす。
【０００７】
最近の試験結果は、ＵＶＡ照射も、表皮細胞の抗原提示機能を抑制し、それに伴って補助的刺激分子のＬＣ上での発現を抑制することで、酸化経路を介して免疫抑制に貢献することを示した（Iwai et al., 1999）。この効果は活性酸素種により介在されると仮定されている。
【０００８】
ＵＶ照射の免疫抑制的な特性は、アポトーシス又はプログラムされた細胞死の誘導のようないくつかの有害な効果の仲立ちになる。皮膚内のアポトーシス細胞は、「日焼け細胞」と呼ばれる（Daniels et al., 1961; Young, 1987）。日焼け細胞は、いくつかの特徴的な形態学的変化を示す：拡張した小胞体が液胞を形成し、染色質が消化され、核膜に沿って濃縮し、しばしば球体を形成し、アポトーシス性の日焼け細胞に最も多い特徴は、劇的な細胞の収縮である。
【０００９】
アポトーシスを調節するメディエーターをコードする数多くの遺伝子が同定されていて、その中で、腫瘍抑制遺伝子のｐ５３とアポトーシス阻害遺伝子のｂｃｌ−２は重要な役割を担うと考えられている。Wang et al., 1998 は、ＵＶＡとＵＶＢが２種の異なるシグナル伝達経路の引き金になることによってアポトーシスを始動させると仮定した。ＵＶＡが、脂質の過酸化（Kane et al., 1993）と膜透過性の破壊を引き起こす活性酸素種（主に一重項酸素）を産生し、ｂｃｌ−２発現のダウンレギュレーションを介した即時性アポトーシスを導くのに対し、ＵＶＢは、ピリミジンダイマーの形態でのＤＮＡ損傷の誘導と後続のｐ５３タンパク質の発現及び蓄積により特徴づけられる遅延型アポトーシスを引き起こす。
【００１０】
アポトーシスが免疫反応において重要な役割を担う可能性があるとする証拠が増えつつある（Lynch et al., 1995）。
日焼け止めとして使用されている従来のＵＶ皮膚保護剤は皮膚表面でＵＶＡ又はＵＶＢの照射を直接吸収する。提供される保護は、その陽光保護ファクター（Sun Protection Factor; ＳＰＦ）により表現され、これは紅斑が観察される最少量（最少紅斑量；Minimal Erythema Dose, ＭＥＤ）であり、使用者の皮膚のタイプにきわめて依存する。そのような日焼け止めの使用は、陽光に直接曝されている間にそれらがわずかな程度の保護しか提供しないという点で、限界がある。それらは再生効果が無く、皮膚におけるＵＶ誘発性の生化学的変化に相互作用することも、それを防ぐこともできない。
【００１１】
しかしながら、包括的な光保護にとって、特に早発性皮膚老化、光アレルギー、免疫抑制及び皮膚癌に対抗するには、皮膚におけるＵＶ誘発性の生化学的変化を逆転又は低下させることが必要である。
【００１２】
ＪＰ０５−０１７３６３は、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ビフィドバクテリア（Bifidobacteria）又はそれらの細胞壁により産生される、日焼けに関連した抗炎症効果について説明する。
【００１３】
ＵＶ曝露が２つの近接したＤＮＡのピリミジン分子の二量体化を引き起こし得ることは十分確かめられている。酵素制御された、細胞の内因性の除去修復系は、損傷頻度が生理学的な修復能力を超えない限りは、そのような損傷を修復することができる。老化しつつある皮膚や過剰なＵＶ照射後にあり得ることだが、その修復能力が不充分であると、修復されないままのＤＮＡをもった細胞が生き残る可能性がある。その結果、皮膚機能障害のような慢性的な皮膚損傷となり得て、結果的に、早発性の老化、前癌段階の細胞の発生、又は最終的には皮膚癌の発生をもたらす。
【００１４】
ＥＰ０  ０４３  １２８  Ｂ１及びＵＳ−Ａ４，４６４，３６２は、皮膚のＤＮＡ修復プロセスを促進し、Bifidobacteria 又はこの属に近縁である細菌の不活性化培養物を含有する化粧組成物を開示する。
【００１５】
動物並びにヒトにおける包括的な in vitro 及び in vivo 試験に基づいて、局所適用される上記の組成物がＵＶで損傷された細胞においてＤＮＡ修復率を有意に増加させることが確かめられた。上記の修復組成物は、皮膚におけるＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷を効果的に予防し得る薬剤が初めて提供されるという点で、当技術分野への重要な貢献である。
【００１６】
しかしながら、上記に論じたように、ＵＶ誘発性の皮膚損傷には、病態生理学的な反応のカスケードが関係し、ＤＮＡ損傷だけに限らない。この数年間で、細胞介在性免疫のＵＶ誘発性の抑制は、皮膚癌の発生や早発性皮膚老化を含む永久的な皮膚損傷の原因となるもう１つの重要な要因であることが明らかになった。
【００１７】
Fischer et al., 1988 は、光老化の分子機序を説明する。ＵＶＲ曝露は、角化細胞又は皮膚の線維芽細胞から放出されるサイトカインの刺激を生じる。これにより、プロテインキナーゼのシグナル伝達カスケードが活性化され、その結果、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導する転写因子ＡＰ−１の活性化を生じる。ＭＭＰは真皮内の細胞外マトリックスを分解する。ＥＣＭの損傷にはマトリックスの修復が続くが、これが不完全で、それにより皮膚の早発性の光老化を生じるのである。
【００１８】
このように、本発明の根底にある問題は、免疫学的レベルだけでなく内因性のＤＮＡ修復機序を促進することによって皮膚におけるＤＮＡレベルでの慢性のＵＶ誘発性の光損傷を最少化するか又は予防する点において有意に改善された特性を有する化粧組成物を提供することである。
【００１９】
Bifidobacteria の代謝物又は分画の全身又は経口投与が免疫調節に使用し得るとする報告（ＤＥ４０２  ８  ０１８、ＪＰ０１−２４２５３２、及びＪＰ０６−０５６６１８）はあるが、上記ＵＳ−Ａ４，４６４，３６２による記載のような組成物の局所適用がＵＶ誘発性の免疫抑制に効果を有するとする開示又は証拠はない。
【００２０】
予期せずに、植物細胞外マトリックス組成物において懸濁されて分解された、Bifidobacteria 又はこの属に近縁である細菌のバイオマスを含んでなる化粧組成物が、免疫抑制に抗して作用し、ＤＮＡ鎖の切断を防ぎ、皮膚細胞とその細胞外環境との平衡状態を回復させることによって、慢性のＵＶ誘発性の皮膚損傷に対して最適の保護を提供することが見出された。
【００２１】
参照により本明細書に組込まれているＥＰ０  ６６８  ０７２Ｂ１及びＵＳ５，５４７，９９７は、植物細胞外マトリックスの組成物と化粧用の使用を開示する。高等植物の一次細胞壁は植物細胞外マトリックスとして定義され得る。Roberts, 1990 によれば、一次植物細胞壁は、ヒドロキシプロリンリッチの糖タンパク質、反復プロリンリッチのタンパク質、アラビノガラクタンタンパク質、エクステンシン（extensins）、ナス科レクチン、グリシンリッチタンパク質、及びチオニン（thionins）のような多数のタンパク分画から構成され得る。一次細胞壁には、タンパク分画だけでなく、以下の成分も通常存在する：ペクチン、キシログリカン、アラビノキシラン、β１−３及びβ１−４グルカン、セルロース、カルロース（callose）及びリグニン（Roberts, 1989 を参照のこと）。
【００２２】
植物細胞壁は、構造的に複雑な多糖類とタンパク質のネットワークからなる。最近の研究は、細胞壁の巨大分子、及びそのフラグメントが細胞増殖、細胞及び組織の分化、及び病態発生の制御に関わる可能性があることを示した（Levy et al., 1992）。
【００２３】
植物及び動物の細胞の細胞外マトリックス間の類似性を捜しているうちに、ｃＤＮＡプローブと抗ヒトビトロネクチン抗体を使用して、ユリ、ソラマメ、大豆、及びトマト植物がビトロネクチンに近縁である５５ｋＤポリペプチドを含有することが示された。このことは、ビトロネクチン様の分子が、動物細胞に類似したやり方で細胞接着と遊走においてある役割を演じる可能性があることを示唆する（Sanders et al., 1991）。
【００２４】
大豆イソフラボンの多量曝露につながる大豆の多量消費は、癌のリスク軽減と関連づけられている。イソフラボンは、抗酸化、抗増殖、及び分化誘導能力のような多種多様な特徴を保有する。その免疫機能の役割は癌の予防においてますます重要になっている（Zhang et al., 1997）。
【００２５】
植物細胞外マトリックスを含有する化粧組成物は、コラーゲン架橋結合に対抗することによってＵＶ誘発性の早発性皮膚老化に対抗し、ヒトにおいて皮膚の硬さと弾性を改善することが示されたが、そのような植物マトリックス組成物が、局所適用されたとき、ＵＶ誘発性の免疫抑制に対して保護効果を有するという開示又は示唆はない。
【００２６】
上記に概説したように、驚くべきことに、植物細胞外マトリックスの組成物において分解された Bifidobacteria がＵＶ誘発性の皮膚変化に抗して最適な保護を提供することが見出された。このように、この組成物は、ＤＮＡ鎖の切断を防ぐことに加え、ＵＶ誘発性の免疫抑制にも対抗し、細胞外マトリックスの全体性を維持する。
【００２７】
この知見は予期されないものであり、個々の成分それぞれの既知特性に基づいて予測できるものではなかった。本発明により活性物質の複合体を組み合わせた調製物は、ＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷及び免疫抑制に対抗する優れた化粧組成物を提供する。この独特な活性プロフィールから見て、皮膚のＵＮ誘発性の早発性老化を予防する新たな包括的アプローチが提供される。
【００２８】
本発明の活性複合体の第一の成分は、参照により本明細書に組込まれているＥＰ０  ０４３  １２８Ｂ１及びＵＳ−Ａ４，４６４，３６２に記載されるような、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）(Reuter) 種のような Bifidobacteria 属の不活性化細菌、又は Bifidobacterium 属に近縁である他の非胞子性グラム陽性菌からなる。それは、代謝産物、細胞質分画、及び、ムレイン及び多糖類のような細胞壁の構成成分を含有する。
【００２９】
Bifidobacteria は、適切な培地において、例えばＥＰ０  ０４３  １２８  Ｂ１及びＵＳ−Ａ４，４６４，３６２に記載の条件下で、嫌気的に培養され得る。初期の定常期に達した後、細菌を低温殺菌（６０〜６５℃で約３０分）により不活性化する。従来の分離技術、例えば膜濾過又は遠心分離により細菌を採取し、滅菌生理ＮａＣｌ溶液に再懸濁し、再度分離させる。洗浄を２〜３回繰り返し、このバイオマスを回収し、急速冷凍で保存し得る。
【００３０】
使用し得る他の適切な出発材料は、例えば Bergery's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition (1975) （特に、５７６、５９９、６３３、及び６５９〜６６０頁を参照のこと）において、Actinomycetaceae、Propionibacteriaceae、Lactobacillaceae 及びコリネ型（coryneform）細菌として列挙されているような Bifidobacterium 属に近縁の細菌である。
【００３１】
本発明による活性物質複合体の第二の成分である、植物細胞外マトリックス組成物は、例えば、ケルプ、クズ、トウモロコシ、ニンジン、トマト、タバコ、インゲン豆、大豆、テンサイ、ジャガイモ、メロン及びペチュニアから調製され得る。特に好ましい供給源は大豆である。好ましい抽出法はＥＰ−０−６６８０７２の４頁４２行〜５ページ２７行に開示されている。
【００３２】
第二の成分を得るための特に好ましい方法の工程は以下に記載の通りである；（ａ）好ましくは、大豆由来の植物組織を粉砕し、抗酸化剤としてメタ重亜硫酸塩（Ｎａ2Ｓ2Ｏ5）を好ましくは４ｍＭの濃度で所望により含有する水溶液で洗浄する。この洗浄液は、さらに保存剤、例えばＰｈｅｎｏｎｉｐを好ましくは０．３〜０．４％の濃度で含有する。
（ｂ）所望の酸化剤を、保存剤、例えばＰｈｅｎｏｎｉｐを好ましくは０．３〜０．４％の濃度で含有する洗浄液で洗い落とす。
【００３３】
（ｃ）粉砕して洗浄した植物組織を、好ましくは０．３〜０．４％のＰｈｅｎｏｎｉｐを入れて保存した、好ましくは０．２Ｍ  ＣａＣｌ2（ｐＨ：約４）の溶液を用いて、非加水分解条件下で抽出する。植物組織の抽出溶液に対する比は、好ましくは１：１０（ｗ／ｖ）である．抽出は、約５℃の低温下で振盪させながら少なくとも２４時間継続させる。
（ｄ）不溶性の物質を、従来の分離技術、例えば遠心分離と、好ましくは０．４５μｍの膜を用いる最終濾過を使用して、抽出物から濾過する。
【００３４】
上記の抽出法により得られる、本発明により得られる植物細胞外マトリックス組成物は、実質的にネーティブなコンホメーションで以下の１つ又はそれ以上を含む：ヒドロキシプロリンリッチのタンパク質（エクステンシン）を含む、糖タンパク質；反復プロリンリッチのタンパク質、アラビノガラクタンタンパク質、及びレクチン；及び、ペクチン、キシログリカン、アラビノグリカン、グルカン、カルロース及びリグニンのような炭水化物ポリマー。
【００３５】
これらの植物細胞外マトリックス成分の抽出物における相対比は、抽出物の供給源、即ち使用される植物のタイプと、利用される抽出技術に依存する。例えば、クズ葉の抽出物は、ヒドロキシプロリンリッチの糖タンパク質をトウモロコシ由来の抽出物より多く含有する。しかしながら、いずれの場合でも、細胞外マトリックスの成分は実質的にネーティブなコンホメーションを有し、細胞外マトリックスの生物学的機能に介在し得るので、化粧組成物に有用である。
【００３６】
このように調製された、保存される水性緩衝液中の植物細胞外マトリックス組成物は、Bifidobacteria 又はこの属に近縁の細菌の不活性化バイオマスを再懸濁するために直接使用され得る。Bifidobacterium の不活性化培養物の植物細胞外マトリックス抽出物における濃度は、好ましくは０．１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの範囲（より好ましくは、０．４ｇ／ｌの範囲）である。この懸濁液は、超音波、細胞粉砕機のような機械的方法、高圧均質化、又は上記方法の組み合わせにより分解され得る。
【００３７】
本発明による活性複合体（即ち、植物細胞外マトリックス組成物の内在性部分としてホモジェナイズされた Bifidobacteria の不活性化培養物）は、当業者に周知の手段及び方法により、皮膚への局所適用のために設計される、乳化した、水性及び水−アルコール性の化粧用調製物に製剤化し得る。化粧組成物における好ましい投与量は０．１％〜１０％であるが、この範囲に限定されるものではない。特定の場合、本発明の活性複合体は、化粧用の担体なしに適用し得る。
【００３８】
本発明による化粧組成物の局所適用によって、ＵＶ照射により引き起こされるＤＮＡ損傷及び免疫抑制による永久的な細胞障害に対抗し、皮膚の光起因性の老化プロセスを遅延させることが可能であり、きわめて望ましい特質をもった化粧組成物が提供される。
【００３９】
以下の製剤は本発明の例示的な態様であるが、本発明の特許請求の範囲を限定するものでも、これら特定の製剤にそれを制限するものでもない。
【００４０】
【実施例】
実施例１：ボディローション
以下を含んでなる活性組成物を含有するボディローション（水中油型）：
【００４１】
【表１】
0003910394.tif 000002
混合物ａ）を約７０℃で溶かし、混合物ｂ）を約７０℃へ加熱し、撹拌しながら混合物ａ）へ加える。ローションが約３０℃に冷えるまで撹拌を続ける。次いで、組成物ｃ）及びｄ）を撹拌しながら加え、ローションをホモジェナイズする。
【００４２】
実施例２：ゲルローション
以下を含んでなる活性組成物を含有するゲルローション：
【００４３】
【表２】
0003910394.tif 000003
混合物ａ）を約５０℃で溶かす。混合物ｂ）を室温で分散させ、撹拌しながらａ）へ加える。次いで、それへ組成物ｃ）を撹拌しながら加える。
【００４４】
実施例３：クリーム
以下を含んでなる活性組成物を含有するクリーム（水中油型）：
【００４５】
【表３】
0003910394.tif 000004
混合物ａ）を約７０℃で溶かし、混合物ｂ）を同様に約７０℃へ加熱し、撹拌しながら混合物ａ）へ加える。クリームが約３０℃に冷えるまで撹拌を続ける。次いで、組成物ｃ）を撹拌しながら加え、クリームをホモジェナイズする。
【００４６】
実施例４：クリーム
以下を含んでなる活性組成物を含有するクリーム（油中水型）：
【００４７】
【表４】
0003910394.tif 000005
混合物ａ）を約８０℃へ加熱し、混合物ｂ）を同様に８０℃とし、撹拌しながらａ）へ加える。クリームが約３０℃に冷えるまで撹拌を続ける。ｃ）とｄ）を加える。クリームをローラーによりホモジェナイズする。
【００４８】
組み合わされた活性複合体は、個々の成分の既知効果から予測し得ることに関連すれば、予測し得ないほどに高い有効性を示した。
以下に記載の実験は、本発明による Bifidobacteria／植物細胞外マトリックス複合体の、ＵＶ照射誘発性の皮膚損傷に抗する有益な効果を明らかに示す。
【００４９】
試験１：角化細胞におけるＤＮＡ修復に対する影響
本発明の活性複合体のＤＮＡ修復に対する影響について研究するために、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（ロッシュから入手；１６４７２２９）を使用した。
アッセイ法の簡単な説明：
ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ゲンタマイシン（培地）において増殖させたヒト角化細胞（ＨａＣａＴ）を定常期においてトリプシン処理し、３ｘ１０5細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
【００５０】
・得られた細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェル（１．５ｘ１０4細胞／ウェル）を用いてマイクロタイタープレート上に播種した。
・ＦＣＳフリー培地を用いて本発明による活性複合体のサンプル希釈液（０．０１％；０．１％）を調製し、これら希釈液のいずれか５０μｌを適切なウェルへ満たした；対照として、ＦＣＳフリー培地だけを使用した。
【００５１】
・プレートを、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。
・次いで、上澄液を除去し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００５２】
・各ウェルの細胞へＰＢＳ  ５０μｌを加え、次いで照射した（２Ｊ／ｃｍ2ＵＶＡ＋０．２／ｃｍ2   ＵＶＢ）。
・上澄液を除去し、ＦＣＳフリー培地（１００μｌ／ウェル）に置換えた。
【００５３】
・ＢｒｄＵ溶液（１０μｌ／ウェル）を加えた後で、プレートをＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で１８時間インキュベートした。
・次いで、培地を除去し、細胞を洗浄して固定化した。
【００５４】
・次いで、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ抗体を周囲温度で２時間インキュベートした（抗体溶液  １００μｌ／ウェル）
・プレートを洗浄し、基質溶液（１００μｌ／ウェル）を加えた（約２０分）。
【００５５】
・１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4  ５０μｌ／ウェルを加えることによりアッセイを停止させ、４５０ｎｍでＯＤ値を読んだ（対照：６３０ｎｍ）。
図１に示すように、本発明の産物は、角化細胞のＵＶ照射後、ブロモデスオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のＤＮＡへの取込みを１８％まで増加する。ここでは、ＢｒｄＵレベルをＤＮＡ修復の直接の尺度とする。
【００５６】
試験２：ＵＶ照射後のＤＮＡフラグメント（ヌクレオソーム）の形成に対する影響
ＤＮＡフラグメントの形成を判定するために、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ロッシュから入手；１７７４４２５）を利用した。
アッセイ法の簡単な説明：
・ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ゲンタマイシン（培地）において増殖させたヒト角化細胞（ＨａＣａＴ）を定常期においてトリプシン処理し、３ｘ１０5細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
【００５７】
・得られた細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェル（１．５ｘ１０4細胞／ウェル）を用いてマイクロタイタープレート上に播種した。
・ＦＣＳフリー培地を用いて本発明による活性複合体のサンプル希釈液（０．０５％；０．１％）を調製し、これら希釈液のいずれか５０μｌを適切なウェルへ満たした；対照として、ＦＣＳフリー培地だけを使用した。
【００５８】
・プレートを、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。
・次いで、上澄液を除去し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００５９】
・各ウェルへＰＢＳ  ５０μｌを加え、次いでプレートを照射した（１Ｊ／ｃｍ2  ＵＶＡ＋０．１／ｃｍ2   ＵＶＢ）。
・上澄液を除去し、ＦＣＳフリー培地（１００μｌ／ウェル）に置換えた。次いで、プレートをＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で１８時間インキュベートした。
【００６０】
・その後、溶解試薬２００μｌで細胞を溶かし、２００ｘｇで１０分間遠心分離した。
・生じた上澄液をマイクロタイタープレートに満たし、抗ヒストン−ビオチン抗体及び抗ＤＮＡ−ＰＯＤ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ロッシュ；１７７４４２５））を使用して、ヌクレオソームを検出した。
【００６１】
・４０５ｎｍでＯＤ値を読んだ（対照：４９０ｎｍ）。
図２に示すように、本発明による活性複合体は、ＵＶ照射後のＤＮＡ二本鎖の切断（ヌクレオソーム）の形成を阻害する。
【００６２】
試験３：ＵＶ照射後の角化細胞の細胞生存能力に対する影響（ＭＴＴアッセイ）アッセイ法の簡単な説明：
・ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ゲンタマイシン（培地）において増殖させたヒト角化細胞（ＨａＣａＴ）を定常期においてトリプシン処理し、３ｘ１０5細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
【００６３】
・得られた細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェル（１．５ｘ１０4細胞／ウェル）を用いてマイクロタイタープレート上に播種した。
・ＦＣＳフリー培地を用いて本発明による活性複合体のサンプル希釈液（０。０１％，０．０５％，０．１％；０．５％）を調製し、これら希釈液のいずれか５０μｌを適切なウェルへ満たした；対照として、ＦＣＳフリー培地だけを使用した。
【００６４】
・プレートを、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。
・次いで、上澄液を除去し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００６５】
・各ウェルへＰＢＳ  ５０μｌを加え、次いでプレートを照射した（２Ｊ／ｃｍ2  ＵＶＡ＋０．２／ｃｍ2   ＵＶＢ）。
・上澄液を除去し、ＦＣＳフリー培地  １００μｌ／ウェルを加えた。
【００６６】
・次いで、プレートをＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で１８時間インキュベートした。
・各ウェルへＭＴＴ溶液１０μｌ（ＰＢＳ  ５ｍｇ／ｍｌ）を加え、プレートを３７℃で４時間インキュベートした（１０％  ＣＯ2）。
【００６７】
・上澄液を除去し、各ウェルへ酸性ＳＤＳ／ＤＭＳＯ溶液１００μｌを加えた。
・５７０ｎｍでＯＤ値を読んだ。
【００６８】
図３に示すように、本発明による活性複合体は、ＵＶ照射後の細胞生存能力の低下に対抗する。
【００６９】
試験４：角化細胞のＵＶ照射後のインターロイキン−１０発現に対する影響
アッセイ法の簡単な説明：
・ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ゲンタマイシン（培地）において増殖させたヒト角化細胞（ＨａＣａＴ）を定常期においてトリプシン処理し、３ｘ１０5細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
【００７０】
・得られた細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェル（１．５ｘ１０4細胞／ウェル）を用いてマイクロタイタープレート上に播種した。
・ＦＣＳフリー培地を用いて本発明による活性複合体のサンプル希釈液（０．０１％；０．１％）を調製し、これら希釈液のいずれか５０μｌを適切なウェルへ満たした；対照として、ＦＣＳフリー培地だけを使用した。
【００７１】
・プレートを、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。
・次いで、上澄液を除去し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００７２】
・各ウェルへＰＢＳ  ５０μｌを加え、プレートを照射した（２Ｊ／ｃｍ2  ＵＶＡ＋０．２／ｃｍ2   ＵＶＢ）。
・上澄液を除去し、ＦＣＳフリー培地  １００μｌ／ウェルを加えた。
【００７３】
・プレートをＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で１２時間インキュベートし、次いで培地を除去し、細胞を洗浄して固定化した。
・抗ＩＬ−１０抗体を３７℃で２時間インキュベートし、次いでプレートを洗浄した。
【００７４】
・抗マウス−ＩｇＧ−ビオチン抗体を３７℃で１時間インキュベートし、次いでプレートを再び洗浄した。
・プレートをストレプタビジン−ＰＯＤ複合体とともに３７℃で１時間インキュベートし、さらに洗浄した後、基質溶液（ＡＢＴＳ）を加えた。
【００７５】
・１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4  ５０μｌ／ウェルでアッセイを停止させ、４５０ｎｍでＯＤ値を読んだ（対照：６３０ｎｍ）。
図４は、本発明による活性複合体が、ＵＶ照射された角化細胞によるＩＬ−１０の発現を約３０％低下させ、従って全身の免疫抑制に対抗することを示す。
【００７６】
試験５：ヒト単球によるインターロイキン−１０の分泌に対する効果
インターロイキン−１０の分泌に対する影響をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅTMヒトＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ウィスバーデン、ドイツより入手）により判定した。
アッセイ法の簡単な説明：
・健常ボランティアから入手した末梢血からの単球及びリンパ球を密度勾配単離（ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐTM）により単離した。単球は、１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地における単球及びリンパ球の２時間のインキュベーションにより分離し、それにより単球は培養プレートに付着した。
【００７７】
・本発明による活性複合体（０．０１％及び０．００１％）を、リポ多糖類（ＬＰＳ）１０μｇで刺激した単球（１．７５ｘ１０5細胞／２００μｌ／ウェル）へ加えた。ＬＰＳ  １０μｇ／ｍｌで刺激した単球を陽性対照として役立てた。
【００７８】
・単球を１８時間培養した（３７℃，１０％  ＣＯ2）。
・細胞培養上澄液中のＩＬ−１０を市販のサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ウィスバーデン、ドイツから入手したＱｕａｎｔｉｋｉｎｅTMヒトＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ）により定量した。これは同一２検体で実施した。
【００７９】
ＵＶ照射は、単球により分泌されるＩＬ−１０により介在される全身の免疫抑制を生じる。このことに関連すると、本発明による活性複合体は、図５に示されるように、刺激された単球のＩＬ−１０分泌を用量依存的なやり方で減少させると示し得る。
【００８０】
試験６：ＵＶ照射後のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）に対する影響
ＭＭＰ−１  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔｒａｋ［アマーシャム・ファルマシア］から入手；ＲＰＮ  ２６２９）を使用して、ＵＶ照射後のＭＭＰ−１の発現を定量した。
アッセイ法の簡単な説明：
・ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ゲンタマイシン（培地）において増殖させたヒト角化細胞（ＨａＣａＴ）を定常期においてトリプシン処理し、３ｘ１０5細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
【００８１】
・得られた細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェル（１．５ｘ１０4細胞／ウェル）を用いてマイクロタイタープレート上に播種した。
・ＦＣＳフリー培地を用いて本発明による活性複合体のサンプル希釈液（０．１％；０．５％）を調製し、これら希釈液のいずれか５０μｌを適切なウェルへ満たした；対照として、ＦＣＳフリー培地だけを使用した。
【００８２】
・プレートを、ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。
・次いで、上澄液を除去し、各ウェルをＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００８３】
・各ウェルへＰＢＳ  ５０μｌを加え、次いでプレートを照射した（１Ｊ／ｃｍ2  ＵＶＡ＋０．１／ｃｍ2   ＵＶＢ）。
・上澄液を除去し、ＦＣＳフリー培地（１００μｌ／ウェル）を加え、次いで、プレートをＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で４８時間インキュベートした。
【００８４】
・次いで、抗ＭＭＰ−１でコートした試験プレートの適切なウェルへ、上澄液の１００μｌを加え、これを４℃で１８時間インキュベートした。
・プレートを洗浄し、検出溶液（５０μｌ／ウェル）並びに試験緩衝液（標準に対しては、試験緩衝液の代わりにＡＰＭＡ溶液を加える）５０μｌを加えた。
【００８５】
・少しの間振盪してから、プレートを４０５ｎｍで読んだ（Ａｂｓt=0）。
・３７℃で６時間インキュベーションした後に、プレートを再び４０５ｎｍで読んだ（Ａｂｓt=6）。
【００８６】
・活性ＭＭＰ−１の発現を以下の式を用いて算出した：
（Ａｂｓt=6−Ａｂｓt=0）ｘ１０００／ｈ2
図６に示すように、本発明による活性複合体は、ヒト角化細胞のＵＶ照射後のＭＭＰ−１発現を、対照に比較して、６８％まで低下させる。ＭＭＰ−１活性の低下は、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型の三重ヘリックスコラーゲンの加水分解的な開裂に抗した保護を表す。
【００８７】
上記試験の諸結果は、本発明による Bifidobacteria／植物細胞外マトリックス複合体がＵＶ誘発性の皮膚細胞損傷に対抗するのに特に効率的であることを明らかに示す。
【００８８】
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・Zhang, R., Y. Li, W. Wang: Nutrition and Cancer 29 (1):24-28, 1997
【図面の簡単な説明】
【図１】角化細胞におけるＤＮＡ修復に対する影響を示すグラフである。
【図２】ＵＶ照射後のＤＮＡフラグメント（ヌクレオソーム）の形成に対する影響を示すグラフである。
【図３】ＵＶ照射後の角化細胞の細胞生存能力に対する影響（ＭＴＴアッセイ）を示すグラフである。
【図４】角化細胞のＵＶ照射後のインターロイキン１０発現に対する影響を示すグラフである。
【図５】ヒト単球によるインターロイキン１０の分泌に対する効果を示すグラフである。
【図６】ＵＶ照射後のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１に対する影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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