(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのペプチド又はたんぱく質を含有する５０，０００乃至２００，０００ダルトンの分子量を有する架橋されていない低分子量ヒアルロン酸又はその塩の凍結乾燥された屈曲性を有する紙状の医薬製剤。
【請求項２】
たんぱく質が成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）及び表皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群の少なくとも１つから選択される請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
さらに、抗生物質を含有する請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
５０，０００乃至２００，０００ダルトンの分子量を有する架橋されていない低分子量ヒアルロン酸又はその塩とペプチド又はたんぱく質の水溶液を紙状に凍結乾燥させることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤を製造する方法。
【請求項５】
傷治療用の薬剤を製造するために請求項１に記載の医薬製剤を使用する医薬製剤の使用方法。
【請求項６】
局部的に投与可能なペプチド又はたんぱく質の予め定めた投与量を正確に得るための医薬製剤を製造する方法であって、５０，０００乃至２００，０００ダルトンの分子量を有する架橋されていない低分子量ヒアルロン酸又はその塩とペプチド又はたんぱく質の水溶液を紙状に凍結乾燥させることを特徴とする医薬製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、薬剤組成物として有用な、少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する低分子量ヒアルロン酸またはその塩の凍結乾燥した柔軟な、可撓性のあるかつ連続するマトリクスに関する。
背景技術の説明
ヒアルロン酸（ＨＡ）はグルクロン酸およびＮ−アセチル−グルコサミンの反復ユニットの直線状重合体からなる自然発生のグリコサミノグリカンである。分子量は出所に依存して広い範囲にわたつて変化することができる。ＨＡは、商業規模の抽出に十分に高い濃度において、動物の幾つかの組織、および雄鶏のとさかのごとき幾つかの器官に存在する。かかる組織は広い範囲の分子量をみそして抽出、純化および殺菌工程の複雑な系列中に、高い分子量鎖が多少弱められてかなり狭い分子量範囲を有する最終製品を生じる。
この点において最終製品の特性を決定する重要なパラメータは現在料中のＨＡの分子量分布、純化および殺菌過程中のＨＡ鎖の劣化度および低分子量ＨＡを除去する有効性である。
市場で入手し得るヒアルロン酸は約４００００００ダルトンの平均分子量を有するヘアロン（スウェーデン国、ウプサラに所在のカビ・フアーマシア社の登録商標）である。この製品は米国特許第４，１４１，９７３号明細書に略述されたように製造されかつ超高純度の製品である。眼科用途におけるＨＡの粘弾性製品の使用および化学的に変性されたＨＡの調製を含む、かかる製品の調製に関しては多数の参考文献がある。
ＨＡは遅緩解放調合剤において公知でありそして国際特許出願公開第ＷＯ９０／０５５２２号公報においてＨＡは、例えば、ＧＨまたはＩＧＦ用の結合たんぱく質とともに遅緩解放担体として記載されている。
米国特許第４，７７２，４１９号明細書には実際的には非膨張の水−膨張可能な状態でありそして、架橋かつ派生されたＨＡまたはその塩に基礎を置いた成形物品は少なくとも６５重量％の乾燥物質含量を有しておりそして１００Ｎ／ｃｍ2より大きい引っ張り強さが開示されている。ＨＡは高い分子量、すなわち、３００００００Ｄａからなっている。物品は凍結乾燥により製造され得る。ペーパー状の構造またはセロフアン状構造の薄いシートが得られた。物品は組織の癒着および融合を防止するのに使用され得る。
低分子量のヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）は酸または酵素加水分解およびその後の分別により製造され得る。これらの方法は当該技術において知られている。
ＬＭＷＨＡは薬剤活性剤用担体としてかつまたはそれ自体薬剤活性として知られている。
ヨーロツパ特許第１３８，５７２号明細書には５００００〜１０００００のＭｗを有するＨＡからなる製品が傷治療に有用であると記載されそして５０００００〜７３００００のＭｗを有するＨＡは眼球内および関節内注入に有用である。目薬において、薬物担用体としてのＨＡの断片、例えば、ＥＧＦがまた開示されている。
ヨーロッパ特許第１９７，７１８号明細書において３００００〜７３００００間の異なるＭｗを有するＨＡは眼科および皮膚科の分野において有用である。ＥＧＦを有するＬＭＷＨＡが例として記載されている。化粧および皮膚疾患用水とともに５００〜８０００００のＭｗを有するＨＡが英国特許第２，２２８，７３６号明細書から公知である。
米国特許第５，０７９，２３６号明細書には骨関節症および関節機能の治療用のＭｗ５００００〜２０００００を有するＨＡが開示されておりそして日本国特許第１，２９０，６３１号明細書には関節炎、糖尿病網膜症の治療用のＭｗ５００００〜３００００００を有するＨＡが記載されている。
国際特許出願公開第ＷＯ９３／１６７３２号公報および同第ＷＯ９３／１６７３３号公報はＨＡまたはその断片（例えば＜７５００００）および、例えば抗炎症性ＮＳＡＩＤ、ジクロフエナツク、ナプロクサン、抗ガン剤、とくに皮膚に局所的にで有用な薬物を開示している。
英国特許第２，２３５，２０４号明細書にはヒアルロン酸が真空中で凍結乾燥されているとき化粧品に使用のための水溶性フイルムまたはシートが形成されることが開示されている。使用されるヒアルロン酸は水中で粘性溶液を付与する１２０００００の分子量を有する。マグネシウム−Ｌ−アスコルビルフオスフェートを含有する層は顔マスク用の化粧用シートとして使用されている。この組成物に関しては、皮膚の湿りけ、皮膚の張りおよび皮膚を白くする作用が示された。
ヨーロツパ特許第５２２，４９１号明細書はヒアルロン酸およびポリペプチドからなる凍結乾燥された組成物を開示しており、該ポリペプチドはその組成物の再組成後注入により投与される。
発明の開示
本発明の組成物は薬物の投与に使用されるとき予期しない好都合な効果を付与する低分子量のヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなっている。
柔軟で、可撓性がありかつ連続しそして好ましくは層の形式であるマトリクス製造のために、分子内の特別な結合力および相互作用を必要とする。高分子量を有するＨＡは低分子量ヒアルロン酸の分子構造と比較され得ない分子の特殊な構造を有する。当業者は低分子量ヒアルロン酸が凍結乾燥されるときどのように反応し得るかを予測することができなかつた。
薬物を局部に投与するとき、問題は如何に多くの薬物が一定の時間中に解放されるかを知ることであり、その結果患者は常に時間単位当たりの正しい投与量を受ける。
潰瘍に滴下状に薬物を付与するとき、合計量が良好に定められるが全体表面上にわたって定められた量で行なう薬物の投与に困難がありそしてこの方法は通常臨床的介護を必要とする。
薬物をペーストベースにおいて付与するとき、薬物の正確な量を計算しかつ塗布するのは困難である。舌下または頬用組成物に関する困難は例えばベースの親水性特性による安定の問題または解放時間の計算である。
架橋されないペプチドまたはたんぱく質およびＬＭＷＨＡの水溶液を凍結乾燥するときケーキの形式の網目紙または濾過紙のごとき構造で形成されることを見出した。その「紙」は多孔性で、中実かつ同質である。この「紙」は所望の形状に切断させることができ、引き裂くことが可能でそして容易に取り扱われる。この「紙」については面積当たりの薬物の正確な量を知ることができる。これは「紙」の面積を知れば、投与量を正確に知ることができることを意味する。。
この「紙」を局部的に、舌下でまたは頬に塗布するとき、薬物の全体量が迅速に解放されることを見出した。
薬物は安定でありかつ貯蔵中この調合剤内の活性を維持する。
本発明の調合剤は人間に塗布されるとき生物学的適合性がありかつ異なる種類の潰瘍の治療のための完全な手段である。
「紙」または「ケーキ」は潰瘍に直接塗布され得る。又は口中に付与することができる。薬物はそれにより膿汁または唾液により迅速に解放される。
薬物が低分子量ＨＡとともに凍結乾燥されるとき高い濃度で存在し得ることを見出した。
本発明はかくして少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する低分子量ヒアルロン酸またはその塩の凍結乾燥された、柔軟な、可撓性かつ連続するマトリクスに関する。
低分子量ヒアルロン酸の分子量は好ましくは５００００および２０００００Ｄａの間である。
本発明はまた少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する凍結乾燥された低分子量ヒアルロン酸を特徴とした層の形式の薬剤組成物に関する。薬物は例えばＧＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩまたはＥＧＦまたはその混合物にすることができる。ＧＨは成長ホルモンまたはその作用的類似物を意味し、ＩＧＦはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方ともインシユリン状成長因子またはその作用的類似物を意味し、そしてＥＧＦは表皮性成長因子またはその作用的類似物を意味する。
抗生物質が傷に塗布されるとき成長ホルモンまたは成長因子と混合され得る。
作用的類似物にはペプチドまたはたんぱく質と同一の生物学的活性を有しかつペプチドまたはたんぱく質と少なくとも６５％の均質性を有する物質を意味する。
本発明はまた、低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなる水溶液を層に凍結乾燥することを特徴としたマトリクスまたは薬剤組成物の製造方法に関する。この凍結乾燥および薬剤物品のさらに他の製造は殺菌されねばならない。
本発明はまた層の形状に凍結乾燥させた低分子量ヒアルロン酸をペプチドまたはたんぱく質用の担体として使用する方法に関する。
この使用方法は好ましくは薬物の正確な投与のためである。
本発明はまた傷治療用の医薬品の製造のために本発明の薬剤組成物を使用する方法に関しそして層を形成するために低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなる水溶液を凍結乾燥することを特徴とする局部的に投与可能なペプチドまたはたんぱく質の予め定めた投与量を正確に獲得する方法に関する。
低分子量は１００００００Ｄ以下かつ好ましくは５００００および２０００００Ｄの間を意味する。
層は１〜４０ｍｍの間にすることができかつ好ましくは２〜１２ｍｍである。ＧＨは１〜２００ＩＵ／ｍｌの濃度にすることができかつ好ましくは５〜１２０ＩＵ／ｍｌである。
ｐＨは凍結乾燥する前に水溶液中で６．０ないし８．２間にすることができる。
成長ホルモンはここでは本発明の有用性のために例として使用されるが、請求の範囲による保護の範囲を制限しない。
たんぱく質の安定性
たんぱく質の安定性はたんぱく質の化学的および物理的特性に依存する。
種々の劣化経路は脱アミノ反応、酸化、分裂および凝集として知られている。
脱アミノ反応および酸化はたんぱく質の最初の構造の変化からなる共通の化学的反応である。脱アミノ反応はとくに水溶液中で発生するが、溶液の低い温度および低いｐＨが脱アミノ反応を抑制する。
種々の形状の凝集はたんぱく質の物理的不安定性を生じる。凝集物は溶融可能または溶融不能にすることができそして両形状の結合は共有であるかまたは非共有にすることができる。
凝集物はオパールのような光彩を放っている溶液を付与することができるが化学的にのみ示され得る非目視凝集にすることもできる。たんぱく質調合剤の共有凝集の阻止はかかる方法が不可逆でありかつ加えて免疫原性である不活性の種の生成を生ずるので重要である。
主構造の変化はまたたんぱく質の自己関連、凝集、の原因となる配座変化を生じる。
幾つかの条件下で発生する非共有凝集は沈殿および活性の損失となり得る。
しかしながら、これらの劣化反応を監視することにより、薬物（例においてＧＨ）が十分な生物学的活性を維持することを間接的に立証することができる。（ブリストウ・エーエフ氏等著、フアームヨーロツパ、ヒト成長ホルモン、１９９１年３月号、第３巻、第１頁乃至第４９頁）
方法
密度評価による等電焦点合わせ（ＩＥＦ）
ＩＥＦは脱アミノ反応の範囲がそれにより評価され得る方法である。
ｈＧＨ成分の分離は２つの電極間に確立されかつ担体両性電解質により安定化されたｐＨ勾配で行なわれる。たんぱく質はそれらが勾配において等電点でそれら自体整列するまで移動し、その点においてたんぱく質は正味の全体の電荷を持たずそしてそれゆえ移動が停止するとき凝縮する。かくして分離は電荷により得られる。帯電したｈＧＨ形状の相対的な分布はコーマシー・ブルー着色ポリペプチドの密度走査により定量される。
単量体のより高いパーセンテージ、より少ない脱アミノ反応。ポリペプチドの大きさ分布（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ソマトロピン、ｈＧＨの製造においてたんぱく質は、ＳＤＳ−たんぱく質の負に帯電された分子複合体を発生するためにナトリウムドデシルサルフエート（ＳＤＳ）により変性された。分離は次いでＳＤＳの存在においてポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中の電気泳動によつて分子の大きさに応じて得られた。ｈＧＨの相対的なポリペプチドの大きさ分布が銀着色ポリペプチド帯片の密度走査により定量された。
目視検査
溶液の外観はＰｈ．Ｅｕｒ．２ｎｄ  Ｅｄ．にしたがつて目で検査された。目盛りはＩ〜ＩＶであり、そしてＩは最も明瞭である。
実施例
例１
約１５００００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸をＮａ−ヒアロロネートから製造した。２．５１ｇのＮａ−ヒアロロネート（スウェーデン国に所在のフアーマシア・エービー製）をアルゴン雰囲気中で５００ｍｌの水に溶解させた。
１６ｍｌのＨＣｌを添加させそして混合物をその後２２〜２３℃で２時間攪拌した。ｐＨは＜１であつた。溶液を０．５ＭＮａＯＨによりｐＨ７．０に中和した。その後０．３７ＭＨＣｌを添加させそして溶液をアルゴン雰囲気中で４５℃で５時間攪拌させた。ｐＨ７．０が次いで０．５ＭＮａＯＨにより達成された。
溶液を蒸留水により透析管を使用することにより透析させた。使用された管は遮断１２〜１４×１０3Ｄにより１３０８８５／１０３０Ｍであつた。
ヒアルロン酸の分子量を溶液中で分析しかつヒアルロン酸を凍結乾燥した。
凍結乾燥は−５℃〜−５０℃で回転凍結乾燥中において３０時間行われた。
例２
水中で１５００００の分子量を有するヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）を各ｍｌ６．５ｍｇ ＬＭＷＨＡと１１０ ＩＵ ＧＨを含むように成長ホルモン（スウェーデン国所在のフアーマシア社のジエノトロピン（登録商標）ＧＨ）と混合させた。１０ｍｌの溶液をカバー付きの直径７０ｍｍのペトリ皿内に配置させた。溶液を以下のスキームにしたがつて凍結乾燥した。
凍結：３時間中に０〜５℃
２６時間中に−４５℃
第１乾燥：０．１ｍバールで２８時間中に−３０℃
第２乾燥：０．１ｍバールで５〜６時間中に＋２５℃
１ケ月５〜８℃で貯蔵後ケーキを２ｍｌの蒸留水中に溶解させかつ分析させた。以下の結果が得られた（表１）。
0004017660.tif 000002
例３
１５００００の分子量を有するヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）を以下の方法において成長ホルモン（スウェーデン国所在のカビ・フアーマシア社製のジエノトロピン（登録商標）ＧＨ）と混合させた。すなわち、６５ｍｇのヒアルロン酸を２．６５ｍｌのジエノトロピン（登録商標）、７６ＩＵ／ｍｌと混合させかつ蒸留水により１０ｍｌに希釈させ、その結果各ｍｌは６．５ｍｇのＬＭＷＨＡおよび２０．１ＩＵのＧＨを含む。１０ｍｌの溶液をカバー付きの７０ｍｍ径の直径を有するペトリ皿に分配させた。溶液を例２に記載されたように凍結乾燥させた。
凍結乾燥されたケーキは屈曲されかつ切断され得るフイルタペーパーのごとくである。直径は６．０ｃｍでかつ厚さは０．５ｃｍである。
１ｃｍ2のケーキが７．１ＩＵのジエノトロピン（商標）および２．３ｍｇのヒアルロン酸、１５００００ダルトンを含むように調合された。
１ｃｍ2のケーキが切断されかつ分析される。表２を参照。
0004017660.tif 000003
本発明の調合に関する結果は低分子量ヒアルロン酸の凍結乾燥マトリクス中の薬物が３０℃において少なくとも１ケ月間室温で貯蔵され得ることを確認した。この結果は、たんぱく質かつとくにＧＨは通常不安定でかつかかる長期間にわたつて室温で貯蔵することができないので、意外であつた。
生物学的分析評価、比濁分析により、面積単位当たりのＧＨの量が測定された。成長ホルモンがケーキ中に均一に（同質に）分散されたことが見出された。
これらの結果は、凍結乾燥された低分子量ヒアルロン酸で調合された成長ホルモンの貯蔵後に劣化が僅かに観察されるかまたは観察されないので、成長ホルモンが十分な生物学的活性を維持することを間接的に示す。