(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌綱無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）からなる宿主を、Aspergillus nidulans由来の菌が有する trpC遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、マーカー遺伝子としてのEscherichia coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と、アスペルギルス・ニガー（A. niger）由来のα−アミラーゼ遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換してなる、ＰＦ１０２２物質を産生する形質転換体。
【請求項２】
請求項１記載の形質転換体を培養する工程と、得られた培養物から生成物を取り出す工程からなる、ＰＦ１０２２物質の生産方法。
【請求項３】
糸状菌綱無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）からなる宿主を、Aspergillus nidulans由来の菌が有する trpC遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、マーカー遺伝子としてのEscherichia coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と、アスペルギルス・ニガー（A. niger）由来のα−アミラーゼ遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換することからなる、ＰＦ１０２２物質産生菌のＰＦ１０２２物質の生産性を向上させる方法。
【請求項４】
糸状菌綱無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）を、Aspergillus nidulans由来の菌が有する trpC遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、マーカー遺伝子としてのEscherichia coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と、アスペルギルス・ニガー（A. niger）由来のα−アミラーゼ遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換することからなる、形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、環状デプシペプチドであるＰＦ１０２２物質を産生する形質転換体、ＰＦ１０２２物質の生産方法、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させる方法、及び糸状菌綱に属する菌の形質転換方法に関する。
関連技術の記述
糸状菌綱に属する菌は、抗生物質、生理活性物質及び酵素等の多岐にわたる有用物質を、その代謝産物として産生する。従って、古くより、当該菌を大量に培養し、その産生物質を得るための方法が、検討され、開発されてきている。菌の産生物質を効率的に得るための一般的な手法の一例として、UV照射や変異誘導剤の使用等により、人工的に突然変異株を作出し、得られた突然変異体の中から、目的とする物質を多量に生産する株を選抜することからなる手法があげられる。
このような方法で新たに作出された菌株（以下、高生産性株ということがある）は、必ずしも、その親株と同一の培地や培養条件で、目的とする代謝産物を高い生産性で産生するとは限らない。従って、上記の手法で高生産性株を得ても、菌株毎に、それに見合った培地及び培養条件を検討することが必要とされている。特に、大型の発酵槽を用いる場合には、上述のように品種改良された高生産株を用いても、その培地及び培養条件によって、その発酵生産物の産生量に大きな差が生じる。そこで、目的とする代謝産物を効率よく得るには、高生産性株を培養するための培地組成、培地殺菌条件、通気攪拌量、培地および培養中のpH及び温度等を詳細に検討し、培養に関わる各種パラメーターを測定、分析し、その結果を踏まえてその発酵代謝を制御する必要がある。
発酵条件等の安定化や経済的な目的物質の入手のために、菌の培養の為の培地原料を限定することがある。しかし、当該培地原料を、菌に栄養として効率的に利用させるためには、その培地原料を、菌がその栄養として利用し得る物質に変えるための新規遺伝形質を、当該菌に付与する必要がある場合がある。そのような場合には、そのような新規遺伝形質の付与は、上記したような、通常の変異処理では困難である。このような理由から、遺伝子工学的な手法を用いて、特定の菌に特定の外来遺伝子を導入し、当該菌に新規遺伝形質を付与することからなる分子育種が期待されている。しかし、糸状菌綱に属する菌類に関しては、細菌や酵母等とは異なり、当該菌の形質転換に適した自立複製型のプラスミドが殆ど知られていないこと、多くが多核細胞であること、プロトプラスト形成及び再生頻度が著しく低いこと等により、形質転換が困難な場合が多い。実際、遺伝子工学的な手法による糸状菌綱に属する菌の形質転換は、一部の糸状菌、例えば、A. nidulams（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1470(1984)参照）、A. oryzae（Agrc. Biol. Chem., 51, 323(1987)参照）、A. niger（Curr. Genetics, 11, 499(1987)参照）を用いて行われているに過ぎない。
ところで、糸状菌綱中の無胞子不完全菌目に属するある種の菌は、例えば特開平３−３５７９６号公報（１９９１年２月１５日発行）に記載されているように、駆虫活性を有する環状デプシペプチド（即ち、ＰＦ１０２２物質）等の有用物質を産生することが知られている。従って、糸状菌綱に属する菌の形質転換方法を確立すれば、上記のＰＦ１０２２物質を産生する菌に、ＰＦ１０２２物質の産生に有利な新規遺伝形質を、遺伝子工学的手法で付与することが出来る。具体的には、ＰＦ１０２２物質を産生する菌に、ＰＦ１０２２物質の生産性を向上させ得る、その生合成に関与する物質をコードする遺伝子や、その培地原料の変更を可能とする、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子を導入し、その遺伝子によってコードされる新規遺伝形質を発行させることが出来る。得られた形質転換体を培養すれば、ＰＦ１０２２物質や導入された外来遺伝子によってコートされる物質（例えば、蛋白質やペプチド）が、多量に産生され得る。しかしながら、ＰＦ１０２２物質を産生する菌の形質転換方法は、上記した糸状菌網に属する菌が一般的に有するその形質転換の困難さに加え、その薬剤耐性度、形質転換体の選択のためのマーカー遺伝子及び外来遺伝子を稼働させるためのプロモーターが不明なこと等に起因して、これまでには開発されていない。
発明の開示
発明の概要
本発明者らは、ＰＦ１０２２物質を産生する菌（以下、単に、ＰＦ１０２２物質産生菌ということがある）の一つである。糸状菌綱無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株の形質転換方法について、鋭意検討した。その検討の結果、本発明者らは、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び目的遺伝子から構成されたプラスミドにより、前記菌が形質転換され得ることを見出した。更に、本発明者らは、Aspergillus nidulans由来の菌が有するtrpC遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、マーカー遺伝子としての、Escherichia coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子で構成される耐性遺伝子発現カセットに、目的遺伝子を連結して調製されたプラスミドを用いて、ＰＦ１０２２株を形質転換することに成功した。当該方法により得られた形質転換体を培養したところ、導入した目的遺伝子に由来する蛋白質（酵素）の大量発現が確認されると共に、ＰＦ１０２２物質の生産性の向上も確認された。本発明は、このような知見を基に完成された。
即ち、本発明は、ＰＦ１０２２物質を産生する宿主を、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び目的遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換してなる、ＰＦ１０２２物質を産生する形質転換体に関する。
また、本発明は、前記の形質転換体を培養する工程と、得られた培養物から生成物を取り出す工程からなる、ＰＦ１０２２物質の生産方法に関する。
更に、本発明は、ＰＦ１０２２物質を産生する宿主を、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び、ＰＦ１０２２物質の生合成に関与する物質をコードする遺伝子及び／又は宿主の栄養利用に関連する物質をコードする遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換することからなる、ＰＦ１０２２物質産生菌のＰＦ１０２２物質の生産性を向上させる方法に関する。
加えて、本発明は、糸状菌鋼無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株を、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び目的遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換することからなる、形質転換方法に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
発明の詳細な説明
本発明の形質転換体は、ＰＦ１０２２物質を産生する宿主を、特定のプラスミド用いて形質転換してなるものである。ここで、ＰＦ１０２２物質とは、環状デプシペプチドの一種であり、その性状は、特開平３−３５７９６号公報（１９９１年２月１５日発行）に詳述されているが、その概要を述べると以下の通りである：
（１）色及び形状：無色結晶、
（２）融点：１０４〜１０６℃
（３）分子式：Ｃ52Ｈ76Ｎ4Ｏ12
（４）マススペクトル（EI−MS）：m/z  ９４８（Ｍ+）、
（５）比旋光度：［α］D22−１０２°（ｃ0.1、メタノール）
（６）溶解性：メタノール、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム及びジメチルスルホキシドに溶解し、水には不溶、
（７）塩基性、酸性、中性の区別：中性物質、及び
（８）化学構造式：下記式（Ｉ）で示される：
0003910634.tif 000002
本発明の形質転換体を調製するために用いられる宿主は、ＰＦ１０２２物質を産生する菌（以下、ＰＦ１０２２物質産生菌ということがある）であれば、いずれでもよい。ＰＦ１０２２物質産生菌の例として、糸条菌綱無胞子不完全菌目に属するＰＦ１０２２株［工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３、〒３０５）に、１９８９年１月２４日に寄託され、現在、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１の受託番号が付されている］が挙げられる。ＰＦ１０２２株は、駆虫活性を有する前記ＰＦ１０２２物質を産生する菌であり、その性状は、特開平３−３５７９６号公報（１９９１年２月１５日発行）に詳述されているが、その菌学的性状の概要を述べると以下の通りである：
（１）生育：ポテト・デキストロース寒天培地、ポテト・キャロット寒天培地、麦芽エキス寒天培地及びオートミール寒天培地上で、２５℃にて良く生育するが、ツナペック・ドックス寒天培地、三浦寒天培地及びコーンミール寒天培地上では、２５℃での生育は悪い。また、３７℃では生育しない。
（２）形態：白色綿毛状菌糸を形成する。集落の裏面は、最初は白色乃至淡黄色であり、後に黒褐色の斑点を生じる。分生子などの特徴的形態は観察されない。
ＰＦ１０２２株は、他のカビに見られるように、その性状が変化しやすい。そのような、この菌株に由来する突然変異体、形質接合体あるいは遺伝子組換体であっても、ＰＦ１０２２物質を産生する限り、宿主として使用できることは、言うまでもない。
本発明で用いられる形質転換用プラスミドは、大腸菌で複製可能なクローニングベクター（pUCベクター、pTVベクター、pBluescript、pBR 322等）をその基体とし、それに加えて、宿主で機能するプロモーター、Ｎ末端より始まるマーカー遺伝子、目的遺伝子、及び宿主で機能するターミネーターで構成される。
本発明に用いるプロモーター及びターミネーターは、宿主に応じて選択されるが、宿主内でその機能を発揮するものである限り、特に限定されない。例えば、ＰＦ１０２２株を宿主として用いる場合には、プラスミドの構成要素としてのプロモーター及びターミネーターは、糸状菌綱に属する菌に由来のものを用いる。その例として、糸状菌綱に属する菌に由来する、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、ナイトレートレダクターゼ、オロチジン−５’−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素遺伝子の、プロモーター領域及びターミネーター領域があげられる。
本発明に用いるマーカー遺伝子は、形質転換がなされた菌株を選択するためのマーカーとして使用できる、ある種の形質をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。その例として、薬剤耐性遺伝子及び栄養要求性に関わる遺伝子が挙げられる。即ち、宿主として用いられた菌が感受性を有する、ある種の薬剤に対する耐性遺伝子、及び、宿主がある種の栄養要求性菌である場合に、その菌にその栄養を要求しない形質を付与する遺伝子が、マーカー遺伝子として用いられる。
薬剤耐性遺伝子の例として、E. coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、Streptomyces rimofaciens由来の菌が有するデストマイシン耐性遺伝子、及びStreptococcus hindustanus由来の菌が有するフレオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。また、栄養要求性に関わる遺伝子の例として、それぞれがアルギニン及びトリプトファン要求性に関わる、ArgB（John, M.A. and Peberdy, J.F., Enzyme Microbiol. Technol. 6, 386-389(1984)参照）及びtrpC（Yelton, M.M., Hamer, J. E. and Timberlake, W. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1470-1474(1984)参照）が挙げられる。
薬剤耐性遺伝子発現カセット、例えば、A. nidulans由来の菌が有するtrpC遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域とを用い、E. coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を糸状菌綱に属する菌で発現可能にしたhygrXbaI（D. Cullen et al., Gene, 57, 21-26(1987)参照）、知られており、本発明に係るプラスミドの調製に際し、このようなカセットを用いることもできる。このように構成された薬剤耐性遺伝子発現カセットを、他のプラスミド（例えば所望の酵素をコードする遺伝子を有するもの）に所定位置で結合させ、そのように調製されたプラスミドを用いて宿主を形質転換すると、所望の形質（例えば酵素）を発現する菌株を選択するために、当該カセット中の薬剤耐性遺伝子に由来する形質であるその薬剤耐性を、利用することができる。
本発明に用いる目的遺伝子は、特に限定されないが、その例として、形質転換体の培養における栄養利用に関与する、換言すれば、培地原料の変更を可能にする、物質を発現する遺伝子、具体的には、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等の酵素蛋白質をコードする遺伝子、宿主が生合成する有用物質、即ち本発明ではＰＦ１０２２物質、の生産性向上に寄与し得るその生合成に関連する物質をコードする遺伝子、及び、宿主が生合成する有用物質と同種又は異種の有用蛋白質、例えばペクチナーゼ、キチナーゼやペプチド、をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、生物由来であっても、化学合成したものであってもよい。
本発明に係る、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び目的遺伝子から構成されたプラスミドとして、例えば、前記した薬剤耐性遺伝子発現カセットであるhygrXbaIに、目的遺伝子としてのA. niger由来のα−アミラーゼ遺伝子を連結させてなるpAMY-Hygを用いることができる。そのようなプラスミドである、Escherichia coli JM109/pAMY-Hygは、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３、〒３０５）に、１９９６年６月１４日に寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５６９の受託番号が付されている。
本発明では、宿主の形質転換に際し、菌のプロトプラスト化、ポリエチレングリコール処理及び再生培地での培養の工程を含む方法を適用することが好ましい。具体的には、等張シュークロース溶液中で、菌体を、プロトプラスト化酵素溶液で処理し、プロトプラストを調製する。このプロトプラストに、本発明に係るプラスミドとポリエチレングリコールとを接触させ、当該プラスミドをプロトプラストに取り込ませる。得られたプロトプラストを、選択薬剤存在下あるいは宿主が要求する特定の栄養成分不存在下で、再生培地にて培養する。このようにして、マーカー遺伝子によって発現された形質、例えば薬剤耐性や栄養非要求性、を示す形質転換体が得られる。
特定の宿主を、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子及び目的遺伝子から構成されたプラスミドを用いて形質転換することによって調製された形質転換体は、その宿主が産生する物質と、遺伝子工学的手法で導入された目的遺伝子がコードする物質、例えば蛋白質やペプチド、を産生する。従って、適切な条件下に形質転換体を培養すれば、その宿主が産生する物質を高効率で得ることや、導入された目的遺伝子がコードする物質を得ることが可能である。
具体的には、本発明の形質転換体は、慣用の成分、例えば炭素源、窒素源、無機塩、増殖因子成分、を含む液体培地中で、好気的条件での培養法、振盪培養法、通気撹拌培養法及び深部培養法等の公知の培養法により、培養することができる。培地のｐＨは、例えば７〜８程度である。培養条件は、宿主の培養に採用される通常の条件でよい。例えば宿主が糸状菌綱に属するＰＦ１０２２株である場合、温度は１５〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃、培養時間は２４〜２４０時間程度で、形質転換体の培養を行うことができる。
本発明の形質転換体を培養することによって得られる、当該形質転換体が産生する物質、具体的には、ＰＦ１０２２物質やその他の蛋白質やペプチド、の培養物からの回収にあたっては、その産生物質の性状を考慮した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着カラムクロマト法、分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法及び沈澱法、を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
本発明の形質転換方法によれば、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ及びセルラーゼ等の、菌の栄養利用（換言すれば、培地原料の選択）に影響を与える物質をコードする遺伝子や、菌によるＰＦ１０２２物質の生合成に関与する物質をコードする遺伝子を、宿主（ＰＦ１０２２物質産生菌）に導入する事ができる。その結果、導入された遺伝子がコードする物質の大量生産や、ＰＦ１０２２物質の経済的且つ効率的な生産可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＡＭＹ−Ｈｙｇの構築方法を示すフローシートである。
図２は、形質転換体の培養上澄クロマト分画の、アミラーゼ活性測定結果を示すグラフである。
図３は、親株（宿主）の培養上澄クロマト分画の、アミラーゼ活性測定結果を示すグラフである。
実施例
以下に、実施例であって、発明がそれに限定されると考えるべきではないものを参照して、本発明を詳細に説明する。
実施例１  プラスミドpDH25（D. Cullen et al., Gene, 57, 21-26(1987)参照）によるＰＦ１０２２株の形質転換
ＰＦ１０２２株の種培地として、可溶性澱粉 2.0％、グルコース 1.0％、ポリペプトン 0.5％、小麦胚芽 0.6％、酵母エキス 0.3％、大豆粕 0.2％及び炭酸カルシウム 0.2％からなり、殺菌前pHが7.0であるものを使用した。
ＰＦ１０２２株を、前記種培地で、26℃にて48時間培養した。その後、3,000rpm、10分間の遠心分離により、菌糸体を集菌し、0.5Mシュークロース溶液で洗浄した。得られた菌糸体を、β−グルクロニダーゼ（シグマ社製）3mg/ml、キチナーゼ（シグマ社製）1mg/ml及びザイモラーゼ（生化学工業社製）1mg/mlを含む0.5Mシュークロース溶液中で、30℃にて２時間振盪することにより、プロトプラスト化させた。得られた混合物を濾過し、菌体残渣を除去した。SUTC緩衝液（0.5Mシュークロース、10mMトリス−塩酸（pH 7.5）、10mM塩化カルシウム）で２回遠心分離（2,500rpm、10分間、４℃）することにより、プロトプラストを洗浄し、次いで、SUTC緩衝液で107個／mlのプロトプラスト懸濁液を調製した。
プロトプラスト懸濁液に、当該懸濁液100μｌあたり10μｌの、1mg/ml濃度のプラスミドpDH25溶液、（TE、10mMトリス−塩酸（pH8.0）、1mM EDTA）を加え、得られた混合物を氷冷下に５分間放置した。その後、当該混合物に、ポリエチレングリコール（PEG 6000）溶液 400μｌを加え、得られた混合物を、氷冷下に更に20分間放置した。
SUTC緩衝液でPEG 6000を洗浄した後、以上のように処理したプロトプラストを、SUTC緩衝液に再度懸濁した。得られた懸濁液を、100μg／mlのハイグロマイシンＢを含むポテトデキストロース寒天培地（以下、ＰＤＡ培地と略す）に、ポテトデキストロース軟寒天培地と共に重層した。26℃にて５日間培養し、コロニーを生育させた。このようにして、形質転換体のコロニーを得た。
実施例２  プラスミドpDH25による形質転換体の、ハイグロマイシンＢ耐性の確認
実施例１では、300株の形質転換体が得られた。形質転換効率は、30個の形質転換体／１μｇのプラスミドpDH25であった。親株（ＰＦ−１０２２株）と、これら形質転換体のうちの10株を、前述のＰＤＡ培地で培養し、それらのハイグロマイシンＢに対する耐性を確認したところ、親株は、ハイグロマイシンＢが100μｇ／mlの濃度の培地で生育不能であったのに対し、試験に供された全ての形質転換体は、250μｇ／mlの濃度でハイグロマイシンＢに対する耐性を示した。
実施例３  プラスミドpAMY-Hygの構築
公知の方法によって得られた、A. oryzae由来の菌が有するタカアミラーゼ遺伝子（S. Wisel et al., Mol. Microbiol., 3, 3-14(1989)、M. J. Gines et al., Gene, 79, 107-117(1989)、S. Tada et al., Agric. Biol. Chem., 53, 593-599(1989)、及びTsukagoshi et al., Gene, 84, 319-327(1989)参照）をプローブとして用い、公知の方法により、A. nigerのα−アミラーゼ遺伝子を含む5.5kbpのEco RI断片（以下、amyBという）を単離した。この断片を、公知の方法により、pUC118のEco RI部位に連結し、プラスミドpAMYを調製した。
一方、プラスミドpDH25をEco RIで部分消化し、得られた断片にXba Iリンカーを連結させた。その後、得られた遺伝子を更にXbaIで消化した。このようにして、A. nidulans由来の菌が有するtrpC遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域と、E. coli由来の菌が有するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子で構成されるハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット（以下、hygrXbaIカセットという）を、3kbpのXab I断片として調製した。この断片を、公知の方法により、プラスミドpAMYのXba I部位に挿入し、プラスミドpAMY-Hyg（FERM BP-5569）を構築した（図１参照）。
実施例４  プラスミドpAMY-Hygによる形質転換によって得られた形質転換体のハイグロマイシンＢ耐性と、そのアミラーゼ活性及びＰＦ１０２２物質の生産性
実施例１に記載の方法に従い、プラスミドpAMY-Hygを用いてＰＦ１０２２株（FERM BP-2671）を形質転換した。得られた形質転換体のうち、10株について、実施例１に記載の方法に従い、そのハイグロマイシンＢ耐性を確認したところ、いずれも、200μｇ／ml濃度のハイグロマイシンＢ存在下でも生育可能であった。
次に、生産培地として、グルコース 2.0％、澱粉 5.0％、小麦胚芽 0.8％、大豆粕 1.3％、肉エキス0.38％、塩化ナトリウム0.13％及び炭酸カルシウム0.15％からなり、殺菌前pHが7.0であるものを調製した。この生産培地を使用し、前記形質転換体を、26℃で６日間培養した。
培養上澄のアミラーゼ活性を、アミラーゼテストワコー（和光純薬社製）のプロトコル、即ち、ヨードデンプン法、に従って測定した。具体的には、基質緩衝液として、0.25Mリン酸緩衝液（pH 7.0、400μｇ／mlの可溶性澱粉含有）を、発色試液として、0.01N沃素液を、それぞれ用いた。37℃にて、基質緩衝液に検体（培養上澄）を加えた。所定時間経過後、得られた混合物に発色試液と蒸留水を加え、得られた混合物を比色定量した。比色定量には、分光光度計Hitach iu-2000（（株）日立製作所製）を用いた。得られた測定結果から、caraway法にて、培養上澄のアミラーゼ活性を算出した。
その測定の結果、親株（ＰＦ−１０２２株）は、アミラーゼ活性が16単位／mlであったのに対し、形質転換体は、その約100倍のアミラーゼ活性を示した。特に、ＴＦ１０株は、34,171単位／ml、即ち親株の約1,500倍、のアミラーゼ活性を示した。また、形質転換体のＰＦ１０２２物質の生産性は、親株のそれの約120〜150％であり、親株に比べてその生産性が向上したことが確認された（表１参照）。
0003910634.tif 000003
形質転換体ＴＦ６株、ＴＦ７株及びＴＦ１０株と、親株のＰＦ１０２２株より、Horiuchiらの方法（H. Horiuchi et al., J. Bacteriol., 170, 272-278(1988)参照）に従って、染色体ＤＮＡを単離した。当該ＤＮＡを、制限酵素Bam HI又はEco RIで消化し、得られたＤＮＡ断片を、pAMY-Hygをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーション解析に供した。サザンハイブリダイゼーションは、ＥＣＬダイレクト核酸標識＆検出システムのキット（Amershem社製）に記載のプロトコルに従った。具体的には、次の条件下に、サザンハイブリダイゼーションを行った。
ＤＮＡ変性用溶液として、0.25N塩酸と、0.5M水酸化ナトリウム水溶液とを用いた。トランスファー・メンブランとして、Hybond-N+を用いた。キャピラリー・ブロッティングの際やその他の工程において、洗浄等のために、0.3Mクエン酸三ナトリウム−３Ｍ塩化ナトリウム溶液（pH 7.0）（20xSSC）を用いた。ブロッティング後には、0.4M水酸化ナトリウム水溶液を用い、トランスファー・メンブランをアルカリ固定した。プローブとしては、標識pAMY-Hygを用いた。ハイブリダイゼーションは、ブロッキング試薬を５％と塩化ナトリウムを0.5M含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を用いて、42℃で行った。ハイブリダイゼーション後のプローブの洗浄には、尿素を６Ｍとドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を0.4％含有する0.5xSSCと、それらを含有しない2xSSCとを用いた。検出のために、ルミノール酸化反応を用いて発光させ、それをオートラジオグラフィーにて検出した。
その結果、試験に供したすべての形質転換体のＤＮＡについては、プローブとして用いられたpAMY-HygとハイブリダイズするＤＮＡ断片が検出されたのに対し、親株のＤＮＡについては、そのようなＤＮＡ断片は検出されなかった。これは、形質転換体には、プラスミドpAMY-Hygに由来する遺伝子が導入されており、その結果として、形質転換体は、ハイグロマイシンＢ耐性の形質と高アミラーゼ活性を獲得したことを示すものである。
実施例５  形質転換体及び親株の培養上澄クロマト分画の分析
実施例４で得られたＴＦ１０株の培養上澄を、ミリポアフィルター（ミリポア社製、0.45μｍ）で濾過した。その濾液500μｌについて、FPLC装置（ファルマシアバイオテク社製、カラム：RESOURCE Q）にて、クロマト分析［緩衝液Ａ：50mM Tris-HCl(pH 7.0)、緩衝液Ｂ：50mM Tris-HCl(pH 7.0)、1M NaCl］を行った。
タカアミラーゼの溶出は、吸光度（OD280）でモニタリングすると共に、特定の画分についてアミラーゼ活性を測定することで確認した。その結果、NaCl濃度が0.2Mの画分に、タカアミラーゼが溶出していることが確認された（図２参照）。
一方、親株であるＰＦ１０２２株の培養上澄も、同様に分析したが、タカアミラーゼの溶出は確認されなかった（図３参照）。
また、タカアミラーゼの標準品のクロマト分析結果と比較することにより、ＴＦ１０株の培養上澄中の蛋白量を定量分析した。その結果、ＴＦ１０株の培養上澄には、５ｇ／ｌ（各画分の蛋白量の平均値）の濃度で、産生されたタカアミラーゼ酵素蛋白質が含有されていることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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