(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（MTH1）を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、MTH1欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をMTH1阻害剤として選択することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤を開発するための技術分野に属し、特に、抗癌剤となり得る酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がん治療において化学療法は重要なアプローチの一つであり、現在臨床で用いられている抗癌剤は50種以上にものぼるが、未だ充分ではなく、新しい抗癌剤の開発が日夜続けられている。抗癌剤の効率的な開発のためには、本格的な薬理学的試験や臨床試験の前に、学術的検討から明らかにされた知見に基づき、抗癌剤の候補となり得る各種の生理活性物質を予めスクリーニングすることのできる系を確立することが必要である。
【０００３】
酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（一般に、MTH1またはNUDT1と略称される。本明細書においてもMTH1と略称することがある）は、酸化されたプリンヌクレオシド三リン酸（8-oxo-dGTP，2-OH-dATP，2-OH-ATP等）を一リン酸に分解する活性を有することから、酸化核酸前駆体が複製や転写の際にゲノムDNAやRNAに取り込まれる結果引き起こされる突然変異や翻訳エラーを回避することにより遺伝情報の維持に重要な役割を持つと考えられている。事実、Mth1ノックアウトマウスでは肝細胞がんを始めとする複数の臓器の自然発癌頻度の増加が認められている（T. Tsuzuki, Y. Nakabeppu他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11456-11461 (2001)（非特許文献１）。一方、MTH1は、脳腫瘍細胞において８−オキソデオキシグアノシン（８−oxo-dG）の細胞内蓄積の上昇とともに高発現することも認められている（T. Iida, Y. Nakabeppu他、Neuro-Oncology, April, 73-81 (2001)）。これらの事実から、MTH1は遺伝情報の維持から腫瘍発生を抑制するのみならず、酸化ストレスを受けた細胞の機能障害や細胞死の回避に関わる可能性が示唆される。
【０００４】
したがって、MTH1を阻害する薬剤は癌細胞の持つ酸化ストレス抵抗性を抑制することが予想され、他の抗癌剤との併用によりその抗癌剤の用量の軽減や、放射線療法時の照射線量の軽減、さらにこれらの療法に抵抗性の癌の化学療法及び放射線療法に応用できるものと期待されるが、そのような薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができる系は未だ見出されていない。特に、MTH1は、試験管内では酸化プリンヌクレオシド二リン酸のような物質により効率よく阻害されることは知られているが、酸化プリンヌクレオシド二リン酸は細胞膜を透過できないために薬剤としては使用できない。すなわち、MTH1を阻害する薬剤を判別するにあたり、無細胞スクリーニング系を用いることは、細胞膜透過性を有しない薬剤が得られるという問題がある。
【非特許文献１】
T. Tsuzuki, Y. Nakabeppu他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11456-11461 (2001)
【非特許文献２】
T. Iida, Y. Nakabeppu他、Neuro-Oncology, April, 73-81 (2001)
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（MTH1）を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいアッセイ系を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、MTH1が発現しないと細胞死に陥る細胞系に着目し、これを利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。
かくして、本発明に従えば、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（MTH1）を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となり、Mth1欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をMTH1阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明が対象とする酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素MTH1は、哺乳動物における核酸の酸化損傷の防御機構に関与する酵素の1種であり、そのcDNAと遺伝子は本発明者らによりクローニングされ、大腸菌のMutT蛋白質の配列とホモロジーを有することからMTH1（mutT homolog 1）と命名された（H. Oda, Y. Nakabeppu他、Nucleic Acids Res., 27, 4335 (1999)）。
【０００８】
本発明者らは、このMth1遺伝子が欠損したノックアウトマウスを用いて各種臓器の自然発癌性に関する研究を行なう（前記の非特許文献１）とともに、MTH1欠損ノックアウトマウスの胎仔の線維芽細胞にヒトMTH1（ｈMTH1）を強制発現させた細胞株を樹立し、過酸化水素負荷条件下の細胞の機能障害や細胞死に注目して解析を行なった。その結果、hMTH1強制発現株は非発現株と比較して有意に高い生存率を示すことを見出し、この現象がMTH1（ヒトMTH1）を阻害する薬剤の当否判別に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。
【０００９】
以下、本発明に従うMTH1阻害剤のスクリーニング法において用いられる細胞株の由来するMTH1欠損ノックアウトマウスの作製法、その胎児線維芽細胞株およびhMTH1過剰発現株の樹立法、ならびに、該細胞株を用いるスクリーニング法に沿って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではなく、当業者であれば同等の材料と手法を用いて同等のものを作製できることは勿論である。
【００１０】
MTH1欠損マウスの作製
MTH1が欠損したノックアウトマウスは、ES細胞と遺伝子ターゲッティングを用いる常法に従って作製することができ、その1例は本発明者らによる上記文献（非特許文献１）にも記載されているが、以下のとおりである：
マウス129SV系由来の遺伝子ライブラリー（Stratagene社より購入、 Cat. No. 946313）よりMth1遺伝子を単離しその構造を解析した。Mth1遺伝子は約 7 kbp の大きさで 5 つのエクソンより成り、第１，第２の２つのエクソンは ５' 側非翻訳領域で、開始コドンは第３エクソンに含まれていた。ヒト、マウス及び大腸菌を含む３種の細菌由来のMutT様蛋白質間でアミノ酸配列がよく保存されている領域が認められるが、その部分はマウスの遺伝子上でエクソン３と４に分かれてコードされていた。第３エクソンをG418耐性遺伝子カセット（Deng, C., Thomas, K. R.およびCapecchi, M. R., Mol. Cell. Biol. 13: 2134-2140 (1993)参照）と置換したターゲティングベクターを構築した。ベクターの両端には、ネガティブ選別用にHSVのチミジンキナーゼ遺伝子（Rancourt, D. E., Tsuzuki, T. and Capecchi, M. R., Genes Dev. 9: 108-122 (1995)）を配置した。
【００１１】
このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によりES細胞に導入し、G418・ガンシクロビル耐性クローンの中からMth1の対立遺伝子の片方にG418耐性遺伝子カセットが挿入されたMth1ヘテロ欠損細胞クローン（Mth1+/-）を選択した。なお、用いたES細胞は、CCE細胞株（E. J. Robertson博士より分与：Robertson, E. J. Tetracarcinomas and Embrionic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, NY (1987)参照）であり、このCCE細胞は研究目的であれば無償配布されている。同等のES細胞は、例えば、ATCCよりCRL-11632としても入手することができる。
上述のMth1+/- ES細胞をマウスの胚盤胞に導入して得られたキメラマウスをBDF1マウス（日本クレア社より購入）と交配し、Mth1+/- マウスを樹立した。Mth1+/- マウスはC57BL6マウスと12世代戻し交配を行い、その遺伝的背景を純化した。
【００１２】
MTH1ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株（Mth1-/- MEF）の樹立
MTH1欠損ノックアウトマウスからその胎仔線維芽細胞株の樹立化は、当該分野で既知の細胞培養の手法に従い次のように実施することができる：
12世代戻し交配したMth1+/- マウスの雄と雌を交配し、妊娠17.5日目のマウスを開腹、無菌的に子宮から１個体づつ胎仔を摘出した。Mth1-/-マウス胎仔より約8mm×8mmの皮膚を剥離、切除し、培養シャーレに移す。少量の培地中（DMEM (低グルコース)、10%ウシ胎仔血清）で組織片をはさみでミンチし、シャーレの培養面に広げ、CO2インキュベーター中で静置する。
1時間後、組織片が剥がれないように注意深く培地を添加し、数日間培養する。組織片より移行して増殖してきた繊維芽細胞を0.05％トリプシン−EDTAで剥がして回収し、新しいディッシュに移して3日おきに継代培養を継続する。30世代以上の継代の後にコロニー形成率（plating efficiency）が30％を超えた段階で株化したものとみなした。T2およびT5の２つの独立の株を樹立した。
【００１３】
ヒトMTH1を過剰発現するMth1-/-MEFの樹立
以上のようにして得られるMTH1ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株Mth1-/-MEF（T2およびT5）に、ヒトMTH1 cDNAをサブクローニングした発現ベクター（pcDEBΔ：hMTH１）をリポフェクション法により導入し、ハイグロマイシンB耐性細胞クローンを複数分離した。単一細胞由来のコロニー形成を２回繰り返し、純化したクローンについて抗MTH1抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりヒトMTH1の発現を確認し、２つのクローン（T2:hMTH1およびT5:hMTH1）を樹立した。コントロールとしてpcDEBΔのみを導入したT2:vectorおよびT5:vectorを樹立した。なお、上記の発現ベクター（pcDEBΔ：hMTH１）や抗MTH1抗体については、文献（Kang, D.,およびTakeshige, K.他、J. Biol. Chem. 270, 14659-14665 (1995)）に詳述されている。また、ヒトMTH1 cDNAはTHE I.M.A.G.E. CONSORTIUMから入手できる。
【００１４】
MTH１阻害剤のスクリーニング法
本発明に従えば、以上のようにして樹立したMTH1欠損ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞（Mth1-/-MEF）を利用して、MTH1を阻害する薬剤をスクリーニングすることができる。すなわち、Mth1-/-MEFにヒトMTH1を強制発現させた細胞に、MTH1阻害剤の候補となる被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をMTH1阻害剤として選択する。
実際の操作に当たっては、ヒトMTH1を過剰発現するMth1-/-MEFを対数増殖期から適当な条件で培養（一般的には、37℃、5％CO2存在下に24時間程度）した後、被験物質を添加して適当時間（例えば1〜5時間）培養し、その後、異なる濃度の過酸化水素（H2O2）を添加し、さらに培養（一般的には24時間程度）し、細胞の生存率を測定または観察し、その細胞死が有意に認められたときに被験物質をMTH1阻害剤として選択する。用いる培地は、特殊なものではなく標準的なMEM培地でよい。また、細胞毒性の効果を軽減するためにピルビン酸を加えてもよいが、本発明のアッセイ系は一般にピルビン酸を添加しなくても測定できる。
【００１５】
本発明のスクリーニング法において細胞の生存率を測定または観察する手段は、特に限定されるものではなく、細胞死を判定するための各種の手法、例えば、代謝酵素活性測定法、コロニー形成法、細胞分染法による顕微鏡観察、生合成能測定法などを用いることができる。このうち、代謝酵素活性測定法は、96穴マイクロプレートなどを用いて多数の検体を比較的簡単に測定できることから好ましい。代謝酵素活性測定法の例としては、Cell count kit WST-8 (Dojindo：株式会社同仁化学研究所製)が挙げられ、これは、テトラゾリウム塩が細胞内脱水素酵素により還元されて生じる水溶性のホルマザンの吸光度を測定することにより生細胞数を検出するタイプの測定法の1種である。
【００１６】
【実施例】
本発明の特徴を更に具体的に示すために以下に実施例を記す。実施例１は、本発明のスクリーニング法の背景となる現象を明らかにするものであり、MTH1ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞株は非発現株と比較して過酸化水素負荷後に有意に高い細胞生存率を有し、この系においてはMTH1が存在しないと細胞死が起こることを示すものである。実施例２は、MTH1ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトMTH１を強制発現させた細胞株は、そのMTH1活性が、特定の物質の存在により阻害され、したがって、そのような阻害物質を選別し得るのに使用できることを示すものである。
【００１７】
実施例１：過酸化水素感受性試験
対数増殖期のT5:vector（ヒトMTH1非発現株：既述）とT5:hMTH細胞（ヒトMTH1強制発現株）を96穴マイクロプレートに50%飽和になるように播種し（3x103 cells/100μl/well）、37℃、5% CO2存在下に24時間培養した。用いた培地はMEM (Invitrogen 11095-080)である。次に、異なる濃度のH2O2（10μl/well）を培地に添加し、さらに24時間培養した。Cell count Kit WST-8 (Dojindo)を10 μl/well添加し、90分から120分後に培養液の２つの吸光度の差（A450nm−A620nm）を測定した。未処理細胞の吸光度の値を1.0として相対生存率を求めた。
その結果を図１に示す。この系では、MTH１が存在しないと細胞死が起こることが理解される。
【００１８】
実施例２：MTH１阻害剤
MTH1阻害剤として硫酸銅（CuSO4）を用いた。試験管内ではMTH1の8−oxo−dGTP分解活性は17μMのCu2+の存在下で50％阻害されることが知られており（Porter, D. W., Nakabeppu他、Carcinogenesis 18 (9), 1785-1791 (1997)）、本発明で用いるMTH1ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞のMTH1活性が、そのような阻害物質によって阻害されるか否かを調べた。
対数増殖期のT5:hMTH細胞を96穴マイクロプレートに50%飽和になるように播種し（3ｘ103 cells/100μl/well）、37℃、5% CO2存在下に24時間培養した。培地はMEM (Invitrogen 11095-080)である。次に、MTH1阻害剤（CuSO4）を最終濃度50μMで培地に添加し２時間培養した。その後、異なる濃度のH2O2（10μl/well）を培地に添加し、さらに24時間培養した。Cell count Kit WST-8 (Dojindo)を10μl/well添加し、90分から120分後に培養液の２つの吸光度の差（A450nm−A620nm）を測定した。H2O2未処理細胞の吸光度の値を1.0として相対生存率を求めた。
測定結果を図２に示す。図２に示されるように、MTH1阻害剤の存在により細胞死が認められる。
【００１９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の方法を用いれば、MTH1を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、無細胞スクリーニング系におけるような細胞膜透過性を有しない薬剤を選別するという問題も回避される。かくして、本発明は、MTH1阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて抗癌剤や癌治療法の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられるMTH1ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞株が非発現株と比較して過酸化水素負荷条件下に有意に高い細胞生存率を有することを示す。
【図２】本発明で用いられるMTH1ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトMTH1を強制発現させた細胞株がMTH1阻害剤により細胞死を起こすことを示す。
【図１】
0003910525.tif 000002
【図２】
0003910525.tif 000003