(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
Ｍ Ｐ−（ＲＣＯＯＸ）n （Ｉ）
〔式中、Ｍはパラジウムまたは白金であり、
Ｐはポルフィリン部分であり、
ＲＣＯＯＸは上記ポルフィリン部分に共有結合している活性化カルボン酸エステル基であり、
ＸはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、チオフェニルエステル、アリールエステル、およびビニルエステルから選択される活性エステル結合剤に由来する基であり、
Ｒはそれぞれの場合に独立して化学結合またはリンカー基であり、そして
n は１から４である〕
を有する活性化金属ポルフィリン誘導体の製造方法であって、下記の一般式（ＩＩ）：
Ｍ Ｐ−（ＲＣＯＯＨ）m （ＩＩ）
〔式中、Ｍ、ＰおよびＲは上に定義した通りであり、m はポルフィリン部分に共有結合しているカルボン酸基の数である〕
を有する金属ポルフィリンを有機溶媒中でカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミド、チオフェニルエステル、アリールエステル、およびビニルエステルから選択される活性エステル結合剤と反応させ、活性化金属ポルフィリン誘導体（Ｉ）を得る、上記方法。
【請求項２】
下記の一般式（Ｉ）：
Ｍ Ｐ−（ＲＣＯＯＸ）n （Ｉ）
〔式中、Ｍはパラジウムまたは白金であり、
Ｐはポルフィリン部分であり、
ＲＣＯＯＸは上記ポルフィリン部分に共有結合している活性化カルボン酸エステル基であり、
ＸはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、チオフェニルエステル、アリールエステル、およびビニルエステルから選択される活性エステル結合剤に由来する基であり、
Ｒは化学結合またはリンカー基であり、そして
n は１から４である〕
を有する活性化金属ポルフィリン誘導体。
【請求項３】
金属ポルフィリン結合体の製造方法であって、請求項２に記載の活性化金属ポルフィリンまたは請求項１に記載の方法によって得られる活性化金属ポルフィリンを少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子に結合し、活性化カルボン酸エステル基と第一級アミノ基の間に少なくとも１個の結合を形成させる、上記方法。
【請求項４】
請求項２に記載の金属ポルフィリン誘導体（Ｉ）または請求項１に記載の方法によって得られる金属ポルフィリン誘導体（Ｉ）がその活性化カルボン酸エステル基の少なくとも１つを介して少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子に結合している、金属ポルフィリン結合体。
【請求項５】
請求項４に記載の結合体または請求項３に記載の方法によって得られる結合体の、検出方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性化金属ポルフィリン誘導体の製造方法、および該方法により得られる新規な活性化金属ポルフィリン誘導体に関する。さらに本発明は、金属ポルフィリンと、少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子、特に生体分子との結合体に関する。このような結合体は生物物質(biological substance)の検出のための手順、特にイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される。
【０００２】
【従来の技術】
ポルフィリンとは、ピロールがメチレン架橋によって結合されて、キレート形成性内部空洞を有する環状結合体構造を形成している、置換されたテトラピロール構造体である。ポルフィリンは、ヘミンおよびヘミンタンパク質（ヘモグロビン、ミオグロビンシトクロム）クロロフィル等の多数の生物色素および合成色素中に見いだされる。
【０００３】
ポルフィリンは強い発光性を示す。Ｐｔ−金属ポルフィリンおよびＰｄ−金属ポルフィリンは適切な溶媒中で室温でりん光を発することが知られている。ポルフィリンおよび金属ポルフィリンの幾つかの用途が先行技術で知られている。EP-A-0 071 991およびEP-A-0 127 797は、蛍光イムノアッセイにおいて標識としてポルフィリンを使用する手順を開示する。EP-A-0 127 797においては、1 個のカルボン酸基を有するポルフィリン誘導体を水溶性カルボジイミド誘導体と接触させ、得られた生成物を次に抗体と接触させることにより、ポルフィリンを抗体と結合させている。EP-A-0 071 991においては、カルボジイミド、イソブチルクロロホルメート／ジオキサン、グルタルアルデヒドまたは無水コハク酸／ピリジン／カルボジイミドを介して金属ポルフィリンバクテリオクロロフィルｂを種々の生体分子に結合させている。
【０００４】
Mantrovaらの刊行物 (Anal. Biochem. 219 (194), 109-114)においては、りん光イムノアッセイにおける金属ポルフィリン抗体結合体の使用が開示されている。金属ポルフィリンの抗体への結合は、EP-A-0 127 797に記述されているように実施される。
【０００５】
しかし、先行技術で公知の金属ポルフィリン結合体の不利な点は、in situ 用途、すなわち組織抽出物中の細胞性巨大分子および形態学的に完全な分子の検出に適さないという事実にある。また、先行技術により公知である、生体分子に標識基を結合させるための一連の他の方法は、in situ 用途に使用できる金属ポルフィリン結合体の製造には適さないことが判明した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明が解決すべき問題は、in situ 用途に適した金属ポルフィリン結合体の製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この課題は、下記の一般式（Ｉ）：
Ｍ  Ｐ−（ＲＣＯＯＸ）n         （Ｉ）
〔式中、Ｍはパラジウムまたは白金であり、
Ｐはポルフィリン部分であり、
ＲＣＯＯＸは上記ポルフィリン部分に共有結合している活性化カルボン酸エステル基であり、
Ｒはそれぞれの場合に独立して化学結合またはリンカー基であり、そして
n は１から４である〕
を有する活性化金属ポルフィリン誘導体の製造方法であって、下記の一般式（ＩＩ）：
Ｍ  Ｐ−（ＲＣＯＯＨ）m         （ＩＩ）
〔式中、Ｍ、ＰおよびＲは上に定義した通りであり、m はポルフィリン部分に共有結合しているカルボン酸基の数である〕
を有する金属ポルフィリンを有機溶媒中でカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび活性エステル結合剤と反応させ、活性化金属ポルフィリン誘導体（Ｉ）を得る、上記方法により解決される。
【０００８】
驚くべきことに、少なくとも１個、通常は１〜４個のカルボン酸基を有する金属ポルフィリンをカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび活性エステル結合剤と反応させることにより活性化することができ、そしてこれにより、少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子への結合に適した金属ポルフィリン活性エステル誘導体が得られることが判明した。特に、この金属ポルフィリン活性エステル誘導体を少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子と反応させて得られる結合体は、検出手順（例えば生物物質を検出するための手順）に用いた場合、驚くべき有利な点を示す。これらの結合体は、特にin situ 測定（例えば、免疫組織化学的測定、免疫細胞化学的測定またはハイブリダイゼーション測定）において驚くほど高いりん光量子収量を示す。対照的に、他の方法で（例えば水溶液中で）製造された金属ポルフィリンと生物物質との結合体は、in situ 測定において陽性の結果を全くもたらさなかった。
【０００９】
本発明の方法においては、異なるポルフィリン構造体のカルボン酸基をカルボジイミド、好ましくはジシクロカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび活性エステル結合剤の混合物と反応させる。通常、この混合物を室温で一晩反応させる。これにより白色のジシクロ尿素の結晶の沈殿物が副生成物として形成される。本発明の活性エステルは、有機溶媒、好ましくは水との反応による活性エステルの加水分解を避けるため二回蒸留ＤＭＦ等の無水有機溶媒中で製造される。これらの活性エステルは−２０℃で保存することができ、それらの活性は少なくとも７か月間保持される。
【００１０】
ポルフィリン出発物質（ＩＩ）は数個の、通常は４個までのカルボン酸基を有することができるので、活性化カルボン酸基の数は調節できる。これは、ポルフィリン（ＩＩ）と他の試薬のモル比を変えることにより達成できる。好ましくは、活性化されるべきカルボン酸基(n) とカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾチアゾールと活性エステル結合剤とのモル比は約１：１：１：１である。より好ましくは、２〜３個の活性化カルボン酸エステル基を有する活性化金属ポルフィリン誘導体が得られるようにモル比を選択する。本発明により定義される活性化カルボン酸基の数ｎは統計上の平均数であって、したがって必ずしも整数ではないことに留意すべきである。
【００１１】
一般式（Ｉ）においてＲは活性化カルボン酸エステル基をポルフィリン構造に結合させている化学結合またはリンカー基を表す。例えば、リンカー基は脂肪族、脂環式および／または芳香族炭化水素基であってよく、それらはヘテロ原子を含んでもよい。好ましくは、リンカー基はヘテロ原子を含みうるＣ1〜Ｃ20アルキレン基、アリーレン基、およびアラルキレン基またはアルカリーレン基である。より好ましくは、Ｒは化学結合、Ｃ1〜Ｃ5アルキレン基、またはフェニレン基である。
【００１２】
本発明の方法のために、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、そして最も好ましくは４個のカルボン酸基を有する金属ポルフィリン出発物質（ＩＩ）が用いられる。適切なポルフィリンの具体例は、４個のプロピオン酸基または４個の酢酸基をそれぞれ有するPt-またはPd-コプロポルフィリンおよびウロポルフィリンである。適切なポルフィリンのさらに別の例は、２個のプロピオン酸基を有するPd-またはPt-メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリンおよびシトポルフィリンである。適切なポルフィリンのさらなる例は、当業者に公知である。
【００１３】
金属ポルフィリン、特にPt-ポルフィリンおよびPd-ポルフィリンの合成については、参照としてここに組み入れるJ.W. Buchler著、The porphyrins, Structure and Synthesis、パートB (1978), 第10章および D. Dolphin (編)、Synthetis and Properties of metallo-porphyrins, Academic Press Inc., London, pp. 390-483、特に pp. 471-474に言及されている。
【００１４】
適切な金属ポルフィリンの特に好ましい例は、Pd-またはPt-3,8,13,18-テトラメチル-21H,23H-ポルフィン-2,7,12,17-テトラプロピオン酸（図１）およびPd-またはPt-メソ-テトラ（4-カルボキシフェニル）ポルフィン（図２）である。
【００１５】
本発明の方法は、有機性の、そして好ましくは水を含まない溶媒中で実施される。本発明に使用されるカルボジイミドは、有機溶媒に可溶性のカルボジイミドである。ジクロロヘキシルカルボジイミド等のジクロロカルボジイミドが好ましい。
【００１６】
本発明に使用される活性エステル結合剤は、好ましくはＤＭＦ等の有機溶媒に可溶性の物質である。適切な活性エステル結合剤の具体例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、チオフェニルエステル、アリールエステル、およびビニルエステルである。
【００１７】
本発明の別な主題は、下記の一般式（Ｉ）：
Ｍ  Ｐ−（ＲＣＯＯＸ）n         （Ｉ）
〔式中、Ｍ、Ｐ、ＲＣＯＯＸおよびn は先に定義した通りである〕を有する活性化金属ポルフィリン誘導体である。好ましくは、n は２または３である。
【００１８】
本発明の活性化金属ポルフィリン誘導体は、第一級アミノ基を修飾するのに十分な試薬であることが示された。この修飾手順は、本発明の活性化金属ポルフィリンが少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子と結合している金属ポルフィリン結合体の製造方法を含む。この方法によって、活性化カルボン酸エステル基と第一級アミノ基との間に少なくとも１つの結合が形成される。生体分子またはポリマー等の異なる分子を活性化金属ポルフィリンに結合することができる。例えば、生体分子は生体アミン、ホルモン、ビタミン、代謝生成物、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、糖、脂質、細胞性およびウイルス性成分、細胞並びにウイルスからなる群より選択することができる。生体分子の具体例は、チラミン、アリルアミン修飾ヌクレオチド、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントおよびアビジンである。ポリマーの一例としてはアミノ修飾ポリビニルアルコール(PVA-NH2) が挙げられる。
【００１９】
活性化金属ポルフィリンを少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子に結合させると、カルボン酸基が脂肪族鎖に結合しているポルフィリンの活性エステルは、カルボン酸エステル基が芳香族基に結合しているポルフィリンの活性エステルよりも反応性に富むことが見いだされた。さらに、複数（好ましくは２〜３）の活性エステル基を有する活性化ポルフィリンは、特定のポルフィリンのモノエステル化合物よりも反応性に富むことが見いだされた。
【００２０】
タンパク質等の生体分子の標識のためには、２〜３個のエステル基を有する金属ポルフィリン誘導体の使用が特に好ましい。なぜなら、モノエステル誘導体に較べ、上記誘導体の場合にタンパク質に対するポルフィリンの比（Ｆ／Ｐ比）が最も高くなり、またアビジン／抗体への干渉がより少なくなるからである。さらに、結合手順はタンパク質濃度をあまり高くせずに、例えばタンパク質濃度を5 mg/mlまでにして（例えば、1 mg/ml のアビジン濃度または2 mg/mlのIgG 濃度で）実施すべきであることが判明した。タンパク質は好ましくはポルフィリンジ−またはトリ−活性エステルの３〜６倍過剰で結合させる。反応温度は、活性化金属ポルフィリン誘導体の反応性に依存し、活性エステル基が脂肪族鎖に結合しているポルフィリン誘導体の場合には０〜４℃の範囲が適切であり、活性エステル基が芳香族鎖に結合しているポルフィリン誘導体の場合には30〜40℃の範囲が適切である。
【００２１】
本発明のさらに別の主題は、金属ポルフィリン誘導体（Ｉ）がその活性化カルボン酸エステル基の少なくとも１つを介して少なくとも１個の第一級アミノ基を有する分子に結合している、金属ポルフィリン結合体である。本発明の結合体は、生物物質を検出するための手順に使用される。この手順は一般にりん光による上記結合体の検出を含む。好ましくは、りん光は10から200 μsまで、好ましくは50から150 μsまでの本発明の化合物の減衰時間による時間分解測定(time-resolved measurement)によって検出される。
【００２２】
時間分解測定により金属ポルフィリン結合体のりん光を検出する場合は、特異的バックグラウンド蛍光の有利な点を利用することができる。この検出方法においては、発光のゲート化(gated) 検出と組み合わせてパルス励起を用いることができる。時間分解顕微鏡検査を適用する場合は、金属ポルフィリン結合体の寿命は一般に、望ましくないバックグラウンドシグナルの不在下で特異的りん光が検出されうるように選択される。
【００２３】
本発明の金属ポルフィリン結合体を用いる場合は、10〜100 μsまでの範囲（例えば約50μs)にある励起光のパルス長が適切である。一連のパルスの反復期間は100 μs程度に短くすることが可能である。例えば100〜500 μsで、好ましくは約250 μsである。検出ウインドウ(window)は、例えば約１〜100 μsの長さを有し、例えば生物自己蛍光物質と共に用いる場合は好ましくは5 〜10μsの範囲にある遅延時間と組み合わせて約10μsであり、または膜上のハイブリダイゼーションアッセイに使用する場合は１μs 未満である。
【００２４】
より具体的には、本発明の結合体はイムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび特異的沈殿アッセイ等の他の種類のアッセイに用いることができる。
【００２５】
本発明の結合体は、組織片、全細胞、および中期調製物、等の自己蛍光環境におけるin situ および／またはin vitro測定に特に適している。自己蛍光環境の他の例は、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン膜、等の自己蛍光膜である。
【００２６】
本発明の結合体はin situ 用途において抗原または核酸を検出するための幾つかの異なるアプローチに用いることができる。１つは、西洋ワサビペルオキシダーゼによるビオチンまたは金属ポルフィリンで標識したチラミド(tyramide)の沈殿に基づく酵素的方法である。ビオチン沈殿物は金属ポルフィリンで標識したアビジンにより検出することができる。さらに、金属ポルフィリンで標識した抗体またはアビジンを用いる従来の免疫蛍光技法が適用可能である。
【００２７】
チラミドに基づく方法を用いると、異なる顕微鏡を用いる連続および時間分解励起／検出の両方において良好な感受性が得られる。培養細胞中のハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡおよび中期調製物上のコスミドプローブほど小さい標的を、集積(integrating) カメラを使用せずに可視化できることが判明した。特異的シグナルは、ビチチン法で染色するよりも直接金属ポルフィリンで標識したチラミドによって一層強く染色される。しかし、直接法は特に組織片を用いた場合バックグラウンドの増大をも示す。しかし、このバックグラウンドはウシ血清アルブミンを添加することにより減少させることができる。
【００２８】
従来の免疫蛍光技法もまた適用することができる。集積カメラを使用することなく、培養細胞中の２８ＳｒＲＮＡおよび中期調製物上の（中間）反復プローブ（(middle) repetitive probe)等の相対的に豊富な標的のみを可視化することができる。これを達成するためには、抗体／アビジンの多重ラウンドの適用が好ましい。in situ ハイブリダイゼーション用途のためには、ビオチニル化抗ハプテン抗体および金属ポルフィリン標識アビジンにより検出することができるハプテン標識プローブ（例えばジゴキシゲニン標識プローブ）を用いると最善の結果が得られる。通常、上記の標的を可視化するには抗体と共に３〜４回インキュベーションすることが好ましい。集積カメラを使用すると、これらの多層アプローチの感受性は例えばコスミドプローブが検出できるほど向上する。
【００２９】
さらに、金属ポルフィリン標識抗体および金属ポルフィリン標識ＤＮＡプローブの適用、等の他の免疫化学的方法が、免疫組織化学的用途、免疫細胞化学的用途およびin situ ハイブリダイゼーション用途に適切である。
【００３０】
本発明の結合体の別な用途は酸素イメージング(oxygen imaging)である。WilsonおよびCerniglia, Cancer Res. 52 (1992), 3988-3993 に、りん光イメージングによる腫瘍の位置決定およびその酸素化状態の評価が記述されている。Vanderkoiiら（Biochemistry 29, (1990), 5332-5338）は、励起状態のトリプレットプローブからの遅延発光を用いたミトコンドリアにおける酸素勾配の検討を開示している。これらの測定は、腫瘍またはミトコンドリア等の組織環境における酸素圧分布の像を作ることを可能とするりん光の酸素依存性クエンチング（消光）に基づいている。本発明の結合体を用いた場合、先行技術の結合体を用いた場合にくらべ一層優れた結果が得られる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
さらに、以下の実施例および図面により本発明を詳細に説明する。
【００３２】
【実施例】
〔実施例１〕  ＰｔＰ−およびＰｔｃＰ−ＮＨＳエステルの調製
等モル量のＣＯＯＨ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Aldrich)、ＤＣＣ（ジシクロカルボジイミド、Pierce）およびＨＢＴＯ（１−ヒドロキシベンゾチアゾール、Aldrich)を無水ＤＭＦ中で反応させることにより、Ｐｔ−メソ−テトラ（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（ＰｔＰ；図２）およびＰｔ−3,8,13,18-テトラメチル-21H,23H-ポルフィン-2,7,12,18-テトラプロピオン酸（ＰｔｃＰ；図１）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）誘導体を合成した。室温で一晩インキュベートして尿素沈殿物を形成させた。ＮＨＳエステル誘導体はそれ以上精製しないで使用した。反応経路を図３に示す。
【００３３】
下記のＮＨＳ誘導体を調製するための試薬の量はそれぞれ以下の通りであった。
【００３４】
【表１】
0003934205.tif 000002
【００３５】
〔実施例２〕  ＰｔＰおよびＰｔｃＰ標識抗体結合体の調製
2-1.  ヤギ抗ＤＩＧ  ＩｇＧ  ＰｔＰ結合体の調製
ヤギＩｇＧ抗ＤＩＧ抗血清の全ＩｇＧ画分をまず硫酸アンモニウム沈降により精製し、次いで溶離液として１x NHS 緩衝液を用いてSuperdex 200カラム (Pharmacia)により精製した。ＩｇＧをＰｔＰ−ＮＨＳまたはフルオレセイン−ＮＨＳを用いて標識した。ＰｔＰで標識する場合は、１x NHS 緩衝液中でＩｇＧ濃度を 2 mg/ml (13.33 μM)として33、83、132若しくは220 μM PtP-2.5-NHS または47、83、140若しくは210 μM PtP-1-NHS を用いてＩｇＧを標識した。反応を氷上で16時間進行させた。精製は、溶離液としてPBSEを用いてSephadex G50fを用いたゲル濾過により実施した。
【００３６】
【表２】
0003934205.tif 000003
【００３７】
0003934205.tif 000004
によるタンパク質の活性
【００３８】
2-2.  ヤギ抗マウス抗体ＰｔｃＰ結合体の調製
Ａ．1 mgまたは434 μl のヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧ（Pierce, 抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ、アフィニティー単離抗体、10 mM リン酸塩 pH 7.6および0.25 M NaClを含む緩衝液中2.3 mg/ml)を 1.4または2.5 μlの PtcP-3-NHS (DMF中17.7 mM)で処理した。反応を氷上で２時間進行させ、ゲル濾過（Seph. G50f, PBSE) により精製した。典型的なＩｇＧの収率は >95%であった。
【００３９】
Ｂ．1 mgまたは770 μl のヤギ抗マウスＩｇＧ（Pierce、アフィニティー単離ＩｇＧの F(ab')2フラグメント、10 mM リン酸塩 pH 7.6および0.25 M NaClを含む緩衝液中1.3 mg/ml)を 2.3μlの PtcP-3-NHS エステルで処理した。反応を氷上で２時間進行させ、ゲル濾過（Seph. G50f, PBSE) により精製した。F(ab')2の収率は93.2%であった。
【００４０】
Ｃ．ヤギ抗マウス（ＧａＭ）抗血清の全ＩｇＧ画分をＰＢＳ(pH 7.7)に対して透析し、タンパク質濃度 1.8 mg/ml (12μM)で標識した。1 ml (±0.5 ml)のＩｇＧに１または2.5 μlの PtcP-3-NHS を添加した。反応を氷上で1.5時間進行させ、ゲル濾過（Seph. G50f, PBSE) により精製した。典型的なＩｇＧの収率は >85%であった。
【００４１】
【表３】
0003934205.tif 000005
【００４２】
1 上記の方法Ａ、ＢまたはＣ。
0003934205.tif 000006
3 百分率で表したタンパク質の活性はＧａＭ  ＥＬＩＳＡアッセイで得られた
0003934205.tif 000007
の値である。
【００４３】
すべてのＰｔＰまたはＰｔｃＰ標識抗体をＩＨＣおよびＩＳＨアッセイで試験した（実施例８）。モノクローナル抗体をＧａＭ結合体で検出するか、またはＤＩＧ標識プローブをヤギ抗ＤＩＧ−ＰｔＰ結合体で検出した。ＤＭ顕微鏡を用いた連続蛍光（緑または紫励起）の結果、特異的蛍光は全く観察されなかった。ラット抗ヤギＦＩＴＣ結合体を第３／第２層として用いることにより、これらの抗体は特異的に結合していたが検出されなかったことが判明した。また、ＰｔＰ結合体を用いて共に標識したフルオレセイン化抗体は良好な標識およびマウスＩｇＧまたはＤＩＧ−プローブの特異的（かつ感度のよい）検出の両方を示した。
【００４４】
〔実施例３〕  アビジン−Ｄ結合体
Vectorより入手したアビジン−Ｄをアビジンの供給源として使用した。これは等電点が±7.5 で、炭水化物を全く含んでいない。
【００４５】
ＵＶ／ＶＩＳ分光法により、またはアビジン濃度を測定するＢＣＡ試薬（Pierce) を分光計による397 nm (PtP)または380 nm (PtcP) における測定と組み合わせて用いて、Ｆ／Ｐ比を測定した。
【００４６】
Ｆ／Ｐ比を計算するための式は下記の通りである。
アビジン−Ｄ−ＰｔＰ：    1.1 A397/(A280 - 0.4 A397)
アビジン−Ｄ−ＰｔｃＰ：  1.7 A380/(A280 - 0.3 A380)
【００４７】
3.1.  アビジン−ＰｔｃＰおよびアビジン−ＰｔＰ結合体の調製
アビジン−Ｄを1 x NHS 緩衝液で 2 mg/mlの溶液として標識した(30μM)。標識はPtP-1/2.5-NHS およびPtcP1、2 または3-NHS を用いて実施し、氷上で16時間進行させた。標準的ゲル濾過により精製を行なった。
【００４８】
5 x NHS 緩衝液
この緩衝液は、0.25 M リン酸ナトリウム pH 8.0、0.5 M NaClおよび25 mM EDTA pH 8.0を含有する。
1. 500 mlの0.5 M リン酸ナトリウム pH 8.0を用意する。
2. 100 mlの5 M NaClおよび50 mlの0.5 M EDTA pH 8.0を添加する。
3. 120℃で20分間オートクレーブにかける。
4.  オートクレーブにかけた二重蒸留水を用いて容量を１リットルに調整する。
下記の結合体が得られた。
【００４９】
【表４】
0003934205.tif 000008
【００５０】
ＰｔｃＰ標識から、２倍過剰のＰｔｃＰを用いて作成した結合体をすべてプールし、Centricon30 カットオフフィルターを用いて濃縮した（アビジン−ＰｔｃＰ  Ａ、3.9 mg/ml、Ｆ／Ｐ 2.2）。また、すべての４倍過剰サンプル（アビジン−ＰｔｃＰ  Ｂ、1.1 mg/ml、Ｆ／Ｐ 3.2）および８倍過剰サンプル（アビジン−ＰｔｃＰ  Ｃ、0.33 mg/ml、Ｆ／Ｐ 7.1）をプールした。
【００５１】
上記３つのＰｔｃＰ結合体をビオチンＥＬＩＳＡアッセイで試験した。試験データは、ＰｔｃＰ結合体Ａは８２％、Ｂは６８％およびＣは４３％の初期活性（OD490/ng アビジン）を保持することを示した。
【００５２】
3.3.  アビジン−ＰＶＡ−ＰｔＰ結合体
ＰｔＰおよびビオチン標識ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の調製
1. 11.5 mgのPVA-NH2 (1/3 OH = NH2; DMSO 中 0.4 ml)に 50 μlのトリエチルアミン(TEA) を加え、そして0.5 mlのPtP-1-NHS エステル (7 mM) + 50μl の10 mM ビオチン-LC-NHS エステル (Pierce, DMSOに溶解）を加えて PtP1B15 (NHSエステルの15% が１個のビオチンを含有していた）を得るか、または0.5 mlのPtP-2.5-NHS エステル (2.2 mM) + 25μl の10 mM ビオチン-LC-NHS エステル (DMSOに溶解）を加えて PtP2B20を得た。60℃で18時間インキュベートした。
【００５３】
2.  各サンプルに4 mlの二重蒸留水を加えた後、１サンプルあたり２枚の Centricon 100フィルター(Amicon)を用いて標識化ＰＶＡ分子を精製した。1 x TEを用いて100 kDa より大きい生成物を洗浄した。これらの生成物を Sorval 遠心機を用いて4 ℃で3 x 90分間3000 rpmで遠心した。収量は PtP1B15（非常に暗く着色）が2 x 50μlで、PtP2B20（オレンジ色）が2 x 500 μlであった。モノNHSエステルを用いた場合、ジNHSエステルを用いた場合よりも多くの生成物が <100 kDaとなるように思われた。100 kDa より大きいビオチニル化ＰＶＡは、100 kDa未満のＰＶＡよりも優れた結果をもたらすことが判明した。
【００５４】
ＰｔＰ−ＰＶＡ−アビジン−Ｄ結合体の調製
3.  ＰｔＰ／ビオチン標識ＰＶＡの100 kDaより大きい生成物をアビジン−Ｄで処理して、アフィニティー化学によりアビジン−ＰＶＡ−ＰｔＰ結合体を調製した。このために、100 μlの 4 x SSPE に溶解した0.5 mgのアビジン−Ｄを100μl の PtP1B15に加えるか、または200 μlの 4 x SSPE に溶解した1 mgのアビジン−Ｄを1 mlの PtP2B20に加えるかした。サンプルを30℃で2 時間反応させ、その後PBSE (PBS + 2 mM EDTA)を用いて両方のサンプルの容量を1.5 mlとした。両サンプルの色は褐色であった。
【００５５】
4.  Centricon 100 フィルターを用いて、サンプルを未結合アビジン−Ｄから精製した（3 x 90分、3000 rpm、外液PBSE）。アビジン−Ｄを用いた試験は１％未満の収率を示すのみであり、この方法によりすべての未結合アビジン−Ｄが除去されることを示していた。収量は以下の通りであった：
ＡＰＰ１：  0.2 mlのアビジン-PtP1B15、暗褐色に着色
ＡＰＰ２：  1.0 mlのアビジン-PtP2B20、オレンジ色に着色
100 kDa 未満の生成物は微かな色（ＡＰＰ１）を示すか、または殆ど色を示さなかった（ＡＰＰ２）。
【００５６】
４．  ＥＬＩＳＡの実験
４．１．  抗ＤＩＧ  ＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡの目標は、ポルフィリン標識ヤギＩｇＧ抗ＤＩＧ（ＧａＤＩＧ）抗体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）結合活性を調べることである。ＤＩＧをプレートにコーティングし、このプレートを、各種のＧａＤＩＧ結合体の逐次希釈液とともに、未標識ＧａＤＩＧの同様の逐次希釈液を１００％対照として使用してインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヤギＩｇＧ抗体とともにインキュベートすることによって、質量単位ＩｇＧあたりの、結合（＝免疫活性）ヤギＩｇＧの量を測定した。ＨＲＰを、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いて分析によって測定した。
１．  ９６ウェルのプレート（Greiner）を、ＤＩＧ標識ウサギＩｇＧ（１：５００）を０．１M炭酸Ｎａ（ｐＨ１０）へ溶解した１０μg/ml溶液１５０μlで、３７°Ｃにて２時間コーティングする。ＴＮＴ（５０mM Tris HCl（ｐＨ７．４）、０．１５M NaCl、０．０５％Tween 20）でプレートを３回洗浄する。
２．  １５０μlのＴＮＢ（５０mM Tris HCl（ｐＨ７．４）、０．１５M NaCl、０．５％（w/v）ブロッキング剤（Boehringer Manheim））とともに、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。
３．  １００μlのＧａＤＩＧ結合体とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする（未標識ＧａＤＩＧを１００％対照とする）。５０μg/mlのＩｇＧからスタートした場合、ＴＮＢによる２倍の逐次希釈液で最良の結果が得られた。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
４．  １２５μlのウサギ抗ヤギ抗体−ＨＲＰ結合体（Sigma、１：２５００）のＴＮＢ希釈液とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
５．  ０．０３％のＨ2Ｏ2 を含有する、ＯＰＤをＯＰＤ緩衝液（０．１M クエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ５．３））へ溶解した０．４mg/ml溶液１５０μlとともに、室温で少なくとも３０分間インキュベートする。５０μlの０．１８M Ｈ2ＳＯ4で反応を停止させる。４９２nmで光学濃度（ＯＤ）を読みとる。
【００５７】
４．２  ＧａＭ  ＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡの目標は、ポルフィリン標識ヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧ（ＧａＭ）抗体のマウスＩｇＧ結合活性を調べることである。マウスＩｇＧをプレートにコーティングし、このプレートを、各種のＧａＭ結合体の逐次希釈液とともに、未標識ＧａＭの同様の逐次希釈液を１００％対照として使用して、インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヤギＩｇＧ抗体とともにインキュベートすることによって、質量単位ＩｇＧあたりの、結合（＝免疫活性）ヤギＩｇＧの量を測定した。ＨＲＰを、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いて分析によって測定した。
１．  ９６ウェルのプレート（Greiner）を、マウスＩｇＧ（Sigma）を０．１M炭酸Ｎａ（ｐＨ１０）へ溶解した１０μg/ml溶液１５０μlで、３７°Ｃにて２時間コーティングする。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
２．  １５０μlのＴＮＢとともに、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。
３．  １００μlのＧａＭ結合体とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする（未標識ＧａＭを１００％対照とする）。５０μg/mlのＩｇＧからスタートした場合（抗血清の全ＩｇＧ分画を使用した場合）も、１０μg/mlのＩｇＧからスタートした場合（抗血清のアフィニティ単離ＩｇＧ分画を使用した場合）も、ＴＮＢによる２倍の逐次希釈液で最良の結果が得られた。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
４．  １２５μlのウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Sigma、１：２５００）のＴＮＢ希釈液とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
５．  ０．０３％のＨ2Ｏ2を含有する、ＯＰＤをＯＰＤ緩衝液へ溶解した０．４mg/ml溶液１５０μlとともに、室温で少なくとも３０分間インキュベートする。５０μlの０．１８M Ｈ2ＳＯ4で反応を停止させる。４９２nmで光学濃度（ＯＤ）を読みとる。
【００５８】
４．３  ビオチンＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡの目標は、ポルフィリン標識アビジンＤのビオチン結合活性を調べることである。ビオチン化ＢＳＡをプレートにコーティングし、このプレートを、各種のアビジンＤ結合体の逐次希釈液とともに、未標識アビジンＤの同様の逐次希釈液を１００％対照として使用して、インキュベートした。ＨＲＰ標識抗アビジンＤ抗体とともにインキュベートすることによって、質量単位アビジンＤあたりのアビジンＤの結合量を測定した。ＨＲＰを、ＯＰＤを用いて分析によって測定した。
１．  ９６ウェルのプレート（Greiner）を、ビオチン化ＢＳＡ（２０mg/mlの原液；ＢＳＡは、Pierceから入手した５mg/mlのビオチン−ＬＣ−ＮＨＳで、３０°Ｃにて２時間２０mg/mlにて標識し、ＤＭＳＯに溶解して５０mg/mlの原液とした）を０．１M炭酸Ｎａ（ｐＨ１０）へ溶解した１０μg/ml溶液１５０μlで、３７°Ｃにて２時間コーティングする。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
２．  １５０μlのＴＮＢとともに、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。
３．  １００μlのアビジンＤ結合体とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする（未標識ＧａＭを１００％対照とする）。２００μg/mlのアビジンＤからスタートした場合、ＴＮＢによる２倍の逐次希釈液で、最良の結果が得られた。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
４．  １２５μlのヤギ抗アビジンＤ−ＨＲＰ（Vector、１：４００）のＴＮＢ希釈液とともに、３７°Ｃで１時間インキュベートする。ＴＮＴでプレートを３回洗浄する。
５．  ０．０３％のＨ2Ｏ2を含有する、ＯＰＤをＯＰＤ緩衝液へ溶解した０．４mg/ml溶液１５０μlとともに、室温で少なくとも３０分間インキュベートする。５０μlの０．１８M Ｈ2ＳＯ4で反応を停止させる。４９２nmで光学濃度（ＯＤ）を読みとる。
【００５９】
６．    ＰｔＰならびにＰｔｃＰで標識したチラミドの調製
６．１  ＤＣＣ／ＨＢＴＯ法（比較）
ＰｔＰのカルボキシル基を、チラミン（Ｔｙｒ）のアミノ基と反応させた。ＰｔＰ−（ＣＯＯＨ）4 （８mM）を、新たに開封したＤＭＳＯ中で、１、２……４倍過剰量のＤＣＣ、ＨＢＴＯ、ならびに、０、１……４倍過剰量のチラミンと反応させた。
チラミドは、リンパ球のＣＤ４を検出することによって８ならびに８０μMの濃度について調べた。チラミド非含有の対照は、どのリンパ球でも、比較的高いバックグラウンドを示した。どのＰｔＰ−Ｔｙｒでも、特異的な検出結果は観察されなかった。
次に、同じ方法を用いて、ＰｔＰ−（ＣＯＯＨ）2 （Ｔｙｒ）2 を調製した。この場合、反応はＤＭＦ中で行い、２工程、すなわち、（１）ＤＣＣならびにＨＢＴＯとの反応（ＰｔＰ：ＤＣＣ、ＨＢＴＯ＝２：１）、ならびに（２）チラミンとの反応（ＰｔＰ：Ｔｙｒ＝２：１）に分けて実施した。最初の反応は、インキュベーション時間を各種変更して実施した。得られたチラミドを、２０μMで、リンパ球染色体へのin situハイブリダイゼーションによって調べた。結果は得られなかった。
【００６０】
６．２  混合無水物法（比較）
ＰｔＰを、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、エチルクロロホルメート（ＥＣＦ）、ならびにチラミンと反応させた。溶媒としてはＤＭＦを使用した。ＰｔＰ：ＴＥＡ、ＥＣＦ、あるいはＴｙｒは、２：１とした。得られたチラミドを、２０μMで、リンパ球染色体へのin situハイブリダイゼーションによって調べた。結果は得られなかった。
６．３  ＤＣＣ／ＨＢＴＯ  ＮＨＳ法（本発明）
実施例１にしたがって、ＰｔＰ−ならびにＰｔｃＰ−ＮＨＳエステルを調製し、次にＤＭＦ  ＋  ０．３〜１０％のＴＥＡ中でチラミンと反応させた。インキュベーションは、４２°Ｃで一晩、あるいは、５０°Ｃで４時間行った。サンプルを、−２０°Ｃで保存し、フィルターアッセイで調べた。マウスＩｇＧは、１ng  １：３  １００fgの０．１％ＢＳＡ溶液として、ハイボンドセクストラ（hybond Cextra）に滴下した。ＴＮＢを抗体のブロッキング／希釈に使用し、ＴＮＴをインキュベーション工程間の洗浄に使用して、ヒツジ抗マウス−ＤＩＧ結合体（１：２５００）ならびにヒツジ抗ＤＩＧ−ＨＲＰ結合体（１：１０００）によってｍＩｇＧを検出した。チラミドの検出は、ｐＨ８．０／０．００３％Ｈ2 Ｏ2 、ならびに５０μMの濃度で実施した。調製したチラミドのすべてで、±１０ｐｇが検出された（吸収）。
調製したチラミドは、以下のとおりである。
【００６１】
0003934205.tif 000009
フィルター試験では、複数のチラミドで標識したＰｔ−ポルフィリンの感度の方が、単一のチラミドで標識したＰｔ−ポルフィリンの感度より良好であった。
【００６２】
７．  ＰｔＰならびにＰｔｃＰで標識したＤＮＡプローブの調製
Ｐｔ−ポルフィリンＮＨＳエステルによるＤＮＡの標識を、２つの方法を使用して行った。
７．１  ＰｔＰ／ＰｔｃＰ−ｄＵＴＰを用いたニックトランスレーション。
７．２  アリルアミン−ｄＵＴＰを用いたニックトランスレーションを行い、次に、ＰｔＰ／ＰｔｃＰ−ＮＨＳエステルとのインキュベーションを行う方法。
Ｐｔ−ポルフィリン−ｄＵＴＰの調製
アリルアミン−ｄＵＴＰに、５倍過剰量のＰｔＰ−１−ＮＨＳエステルあるいはＰｔｃＰ−１−ＮＨＳエステルを加え（全：１ｘＮＨＳバッファー、１０−２５％ＤＭＦ）、３７°Ｃで、１−４時間インキュベートした。
ＰｔＰ−ｄＵＴＰならびにＰｔｃＰ−ｄＵＴＰを、薄層クロマトグラフィーで精製した。キーセルゲル（Kieselgel）ＨＰＴＬＣ（２５４nm）プレートを固相として使用し、７０％エタノール、３０％Ｈ2Ｏを溶離剤として使用した。Ｒｆ値は、以下のとおりであった。
ＰｔＰ−２．５−ＮＨＳ（インキュベーション後）Ｒｆ＝０．９５
ＰｔＰ−ｄＵＴＰ（１  ＰｔＰ／ｄＵＴＰ）            ０．８０−０．８５
アリルアミン−ｄＵＴＰ                              ０．２
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド                        ０．８５
【００６３】
ＮＨ2 標識ＤＮＡの調製ならびにＰｔ−ポルフィリン−ＮＨＳを用いた標識
ＤＮＡプローブを、第一アミノ基で標識した。この際、標準的なニックトランスレーションを行った。ニック混合物は、特に、下記のもの、すなわち、５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ならびに５４μMのアリルアミノｄＵＴＰ（１／５０  ２．７mMの原液）を含有しするものとした。ＤＮＡは、エタノール沈殿によって精製、濃縮した。ペレットを１ｘＮＨＳバッファーに溶解し、ＰｔＰ／ＰｔｃＰ−ＮＨＳエステルと反応させた。プローブを、ゲル濾過によって精製し、さらに、ＤＮＡ担体の存在下でエタノール沈殿させた。
【００６４】
８．  免疫組織化学／免疫細胞化学的アッセイ（ＩＨＣ）、ならびに in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の実験
８．１  チラミド利用型ＩＨＣ
Ｐｔ−ポルフィリン標識アビジンＤを用いた抗原の免疫化学的検出を行うために、ビオチンチラミド（ＢＴ）によるＨＲＰの検出を、２種のアッセイで調べた。まず、ポリマー−ラットＩｇＡ複合体を注射しておいたラットから得た４μｍのラットの肝臓のクリオスタット切片で、ビメンチンを免疫学的に染色した。切片は、アセトンで室温にて１０分間固定した後、マウスＩｇＧ抗ビメンチン（AmershamＲＰＮ１１０２、ＴＮＢで１：４０に希釈）とともに３７°Ｃで１時間インキュベートし、ＴＮＴで３ｘ５分間洗浄し、ＴＮＢに１：２５０で希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体−アビジン複合体とともに３７°Ｃで３０分間インキュベートした。ＴＮＴで３ｘ５分間洗浄した後、０．１５MのＮａＣｌ中でスライド標本を洗浄した。次に、０．５mlのチラミド検出液を加え、室温で３０分間インキュベートした。検出バッファーは、２０μM ＢＴ、０．２M Tris HCl（ｐＨ７．５）、１０mM イミダゾール、０．００１％Ｈ2Ｏ2を含むものとした。ＰｔＰあるいはＰｔｃＰで標識したアビジンＤで、ビオチン化チラミドを検出した（３７°Ｃで３０分間インキュベーション、ＴＮＢで希釈）。次に、サンプルを、ＴＮＴ中で室温にて３ｘ５分間洗浄し、脱水し、Vectashield（登録商標）中に包埋した。
１％ホルムアルデヒドで固定したヒト単核白血球で、各種のＣＤマーカーを検出した。ＣＤ４、９、１３、１４、１９（Dakopatts, Beckton and Dickinson）に対するマウスＩｇＧモノクローナル抗体を、細胞のサイトスピン調製物上でインキュベートした。その後、スライド標本を、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−アビジン複合体とともにインキュベートした。抗体のインキュベーションならびに洗浄は、それぞれ、ＴＮＢならびにＴＮＴ中で実施した。検出は、組織切片に関して記載したのと同様にして実施した。
【００６５】
８．２  チラミド利用型りん光in situ ハイブリダイゼーション（ＰＨＩＳＨ）
チラミド利用型ＰＨＩＳＨの標的として、ヒト分裂中期標本を使用した。メタノール／酢酸で固定したリンパ球調製物をスライド標本に滴下し、２分間乾燥し、７０％酢酸に浸漬した。このスライド標本を一晩乾かした。次に、このスライド標本を、ＲＮａｓｅＡ（Promega）を２ｘＳＳＰＥへ溶解した０．１mg/ml 溶液（Sambrookら、Molecular Cloning.  A Laboratory Manual、第２版、１９８９、Cold Spring Harbor Laboratory Press, B.13を参照のこと）で、３７°Ｃにて１５分間処理し、ＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄し、０．０１M ＨＣｌで３７°Ｃにて５分間１回洗浄した。次に、０．０５％（w/v）ペプシン（Sigma）／０．０１M ＨＣｌ中で３７°Ｃにて１０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で室温にて１０分間後固定した。スライド標本は、ＰＢＳ中で２回洗浄した後、一連のアルコール処理で脱水し、乾燥させた。
【００６６】
コンプレキシティー（複雑度）の低いプローブ（プラスミド）と、コンプレキシティーの高いプローブ（コスミド、染色体ライブラリー）の両方を使用した。プラスミドプローブ（２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的なもの）は、変性し、５０％のホルムアミド、２ｘＳＳＰＥ、１０％の硫酸デキストラン、０．３−１ng/μlのプローブ、５０ng/μlのニシン精子ＤＮＡを含有する混合物中でハイブリダイズした。染色体ライブラリーとコスミドプローブは、５０％のホルムアミド、２ｘＳＳＰＥ、１０％の硫酸デキストラン中で８０°Ｃで１０分間インキュベートすることによって変性した。この混合物は、さらに、１０倍過剰量（ライブラリー）、あるいは５０倍過剰量（ライブラリー以外）のヒトＣｏｔ１ＤＮＡ（Boehringer）を含有するものとした。このプローブを、混合物を３７°Ｃで６０分間インキュベートすることによって、Ｃｏｔ１ＤＮＡにプレアニールした。スライド標本は、８０°Ｃで２分間インキュベートすることによって変性し、７０％ＥｔＯＨ（−２０°Ｃ）中で２分間洗浄してから脱水した。次に、プレアニールしたプローブ／Ｃｏｔ１混合物を加え、１０ng/μlの標識プローブならびに１００−５００ng/μlのヒトＣｏｔ１ＤＮＡを含有する同じ混合物中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、３７°Ｃで１６−２０時間実施し、その後、スライド標本を、２ｘＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma）中で、室温で１回、６０°Ｃで２ｘ５分間洗浄し、さらに、０．１ｘＳＳＰＥ中で、６０°Ｃにて５分間ずつ２回洗浄した。
【００６７】
ニックトランスレーションによって、ビオチン化したあるいはジゴキシゲニンで標識したプローブを調製し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Vector、ＴＮＢの５μg/ml溶液）あるいはヒツジ抗ジゴキシゲニン−ＨＲＰ（Boehringer、ＴＮＢに１：２００で溶解）を用いて免疫化学的に検出した。より良い結果が得られたのは、マウス抗ビオチン（Sigma、１：５０）＋ウサギ抗マウス−ＨＲＰ（DAKO、１：１５０）（ビオチン化プローブの場合）、あるいはマウス抗ＤＩＧ−ビオチン（Sigma、１：２００）＋ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Vector、１：１００）を用いた２工程免疫プローブ検出法の場合であった。抗体は、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、ＴＮＴ中で３ｘ５分間洗浄した。チラミドの検出は、検出用混合物に２０％w/vの硫酸デキストランを加えた以外は、組織切片について記載したのと同様にして実施した。プローブとしてライブラリーを使用する場合には、基質バッファー中の硫酸デキストランの濃度を５％（w/v）に下げた。最後に、高頻度反復配列特異的なプローブ（たとえば、動原体特異的プローブ）を使用する場合には、硫酸デキストランのかわりに１０％ＰＶＡ（Ｍｗ：  ７２kDa）を加えた。
【００６８】
スライド標本は、最後にＴＮＴで洗浄した後、１０ng/μlの青色の蛍光を発するＤＮＡ対比染色用のジアミノプロピジウムヨウ素（ＤＡＰＩ）を含有するＴＮＴ中で室温にて１０分間インキュベートし、その後、一連のアルコール処理で脱水した。このスライド標本を、Vectashield  (登録商標) あるいは Merckoglas  (登録商標) （キシレンで１：１に希釈、３７°Ｃにて３０分以上重合）に包埋した。
【００６９】
８．３  通常のＰＨＩＳＨ
ハイブリダイゼーション、ならびにハイブリダイゼーション後の洗浄は、上述のようにして行った。プラスミドプローブのプローブ濃度は、５−１０ng/μlに上げ、コスミドのハイブリダイゼーションは２０ng/μl  ＋  １μg/μlのＣｏｔ１−ＤＮＡで実施した。
【００７０】
通常、分裂中期標本でＰＨＩＳＨ信号を可視化する際には、３ないし４工程の免疫化学的アプローチが使用されてきた。プローブは、ニックトランスレーションによってフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、Ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、あるいはエストラジオール−１１−ｄＵＴＰで標識し、マウス抗ＤＩＧ（Sigma、１：２００）、ウサギ抗ＦＩＴＣ（DAKO、１：１００）、あるいはウサギ抗エストラジオール（Boehringer、１：２５０）で免疫学的に検出し、３工程のアプローチの際には、スライド標本を、ヒツジ抗マウス−ビオチン結合体（Boehringer、１：２００）あるいはヤギ抗ウサギ−ビオチン結合体（Sigma、１：４００）とともにインキュベートしてから、アビジンＤ−ＰｔＰ／ＰｔｃＰとともにインキュベートした。いずれの場合も、希釈にはＴＮＢを使用し、インキュベーションは３７°Ｃで３０分間実施した。各工程の間には、スライド標本をＴＮＴで３ｘ５分間洗浄した。
【００７１】
ビオチン化したプローブは、（１）アビジン−ＰｔｃＰ、（２）ヤギ抗アビジンＤ−ビオチン結合体（Vector、１：１００）、（３）アビジン−ＰｔｃＰによって検出した。いずれの場合も、希釈には、ＴＮＢを使用し、インキュベーションは、３７°Ｃで３０分間実施した。各工程の間には、スライド標本をＴＮＴで３ｘ５分間洗浄した。
【００７２】
ジゴキシゲニンで標識したプローブも、４工程のアプローチで検出した。マウス抗ＤＩＧ−ビオチン結合体とともにインキュベートした後、ビオチン化したプローブについて記載したのと同様にして、スライド標本を３層でインキュベートした。
【００７３】
スライド標本は、最後にＴＮＴで洗浄した後、１０ng/μlのＤＡＰＩを含有するＴＮＴ中で室温にて１０分間インキュベートし、その後、一連のアルコール処理で脱水した。このスライド標本を、Vectashield  (登録商標) に包埋した。
【００７４】
８．４  ｍＲＮＡの検出
各種のin vitroで培養した細胞系統を使用して、各種のｍＲＮＡを検出した。
・  Ｒａｔ９Ｇ細胞（ヒトＣＭＶ−ＩＥＡ遺伝子の一部を包含）
・  ＨｅｌａＸ１細胞（ルシフェラーゼ遺伝子を包含）
・  Ｈｅｌａ細胞
培養液を捨てた後、顕微鏡用スライド標本ガラス上で生育させた細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒド、５％酢酸、０．９％ＮａＣｌ中で室温にて２０分間固定した。次に、細胞を７０％エタノールで洗浄し、この溶液中で４°Ｃにて貯蔵した。
【００７５】
このスライド標本を一連のエタノール処理で脱水し、 Histoclear(登録商標) あるいはキシレン中で室温にて１０分間洗浄して脂質を除去した。スライド標本は、１００％エタノール中で洗浄した後、９０％ならびに７０％のエタノールで再度含水させた。その後、０．０１M HCl中で洗浄し、０．１％ペプシン／０．０１M HCl中で３７°Ｃにて１分間インキュベートし、二回蒸留水中で短時間洗浄した後、一連のエタノール処理で脱水した。
【００７６】
ハイブリダイゼーション混合物（６０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（上掲のManiatisら、Ｂ．１３参照）、１０％硫酸デキストラン、ならびに５ng/μlのＤＩＧ標識プローブ）を加えた。プローブと標的は、８０°Ｃで２．５分間変性し、３７°Ｃで１６−２０時間にわたってハイブリダイズさせた。スライド標本は、２ｘＳＳＣ中で室温にて５分間洗浄してカバーガラスを取り外し、６０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ中で３７°Ｃにて３ｘ５分間洗浄した。
上述のようにして、免疫化学的検出を行った。
【００７７】
８．５  Technovit(登録商標)８１００に包埋したラット肝臓切片でのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ）の検出
生検で採取した肝臓を、２％パラホルムアルデヒド中で室温にて２時間固定してから、しょ糖中で一晩インキュベートした。次に、この肝臓を、Technovit ( 登録商標)８１００に包埋した。４μmの切片を切り出し、エタノール／エーテル（１：１）で清浄化したスライドガラスに載置し、このスライド標本を４°Ｃで保存した。
【００７８】
スライド標本は、３７°Ｃで２時間乾燥させ、０．１M トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）／０．１％ＣａＣｌ2 へ溶解させたトリプシン（Boehringer）の０．０１％溶液で、３７°Ｃにて５分間処理した。ＰＢＳ中で、１０分間ずつ２回洗浄した後、このスライド標本を、ＴＮＢ中で３７°Ｃにて１５−３０分間インキュベートし、その後、ウサギ抗ラットＧＳＴＰポリクローナル抗体を加えた（ＴＮＢで１：１５０に希釈）。３７°Ｃで２時間インキュベートした後、スライド標本をＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄し、ヤギ抗ウサギ抗体−ＨＲＰ結合体（Sigma、ＴＮＢで１：２００に希釈）で３７°Ｃにて３０分間処理した。ＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄した後、上述のようにして、ＰＶＡあるいは硫酸デキストランを使用せずにＢＴ反応を実施し、室温に３０分間置いた後、ＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄し、沈着したビオチンを、アビジンーＰｔＰ（ＴＮＢへの３０−５０μg/ml溶液）で免疫化学的に検出した（３７°Ｃにて３０分間）。ＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄した後、切片を一連のエタノール処理で乾燥させ、Merckoglas (登録商標) に包埋した。
【００７９】
９．  ビオチンチラミド利用型免疫組織化学／免疫細胞化学的アッセイ、ならびに in situハイブリダイゼーションアッセイ
９．１  ラット肝臓切片（Technovit (登録商標)８１００に包埋）でのＧＳＴＰの検出  切片を、プラスチック（Technovit (登録商標)８１００）に包埋した。顕微鏡に装着した各種のフィルターセットを使用して、切片の自己蛍光を観察した。ＧＳＴＰタンパク質を、２工程の方法、すなわち、まずウサギ抗ＧＳＴＰ抗体を使用し、次に、ヤギ抗ウサギ抗体−ＨＲＰ結合体を使用することによって、免疫化学的に検出した。ビオチン−チラミド結合体と反応させた後、沈着したビオチンを、アビジン−ＰｔＰで染色した。結果から、ＧＳＴＰは、時間分解顕微鏡を使用すると、Ｐｔ−ポルフィリン標識アビジンによって容易に検出することができ、バックグラウンドが完全な黒色となることがわかった。信号／ノイズ比は、フルオレセインで標識した抗体の場合に得られる結果よりもはるかに高いものであった。
【００８０】
９．２  Ｒａｔ９Ｇ細胞での、ＲＮＡのＰＨＩＳＨによるＣＭＶ−ｍＲＮＡの検出
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期抗原に対して特異的な７kb のプラスミドプローブであるｐＳＳをジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、シクロヘキシミドで刺激したＲａｔ９Ｇ細胞の１０−３０％に存在するＣＭＶ−ｍＲＮＡを検出する際のプローブとして使用した。ハイブリダイズしたプローブを、ヒツジ抗ＤＩＧ抗体−ＨＲＰ結合体（１：１００に希釈）で免疫化学的に検出した後、ビオチンと反応させた。沈着したビオチンを次いでアビジン−ＰｔＰで染色した。
シグナルは、約２０％の細胞において観察された。シグナルは、通常の蛍光ＤＭ顕微鏡(Leica)を用いて肉眼で、およびＣＣＤカメラ(CH250, Photometrics Ltd., Tucson, USA)を用いた時間分解顕微鏡の両方の方法によって可視化した。
【００８１】
１０．  ＰｔｃＰ標識アビジンＤを使用した、ビオチンチラミド利用型ＩＨＣならびにＩＳＨ
１０．１  ヒト分裂中期標本でのＰＨＩＳＨ
各種の標的サイズに応じたプローブを使用して、Vectashield (登録商標) に包埋したサンプルの時間分解ＰＨＩＳＨを実施した（１０．１−１０．４）。プローブとしては、ヒトサテライトＩＩＩＤＮＡあるいはαリピートに対して特異的な、各種の染色体動原体特異的プローブを使用し、また、２８Ｓリボソーム遺伝子に対して特異的なプローブ、各種のコスミド、ならびに染色体ライブラリーも使用した。
【００８２】
上記プローブは、いずれも、容易に検出が可能であった。信号は、ＤＭ顕微鏡あるいは時間分解蛍光定量法に適した他の顕微鏡を使用して、蛍光によって見ることが可能であった。
【００８３】
第２染色体の短いアーム（カルバモイル−Ｐ−シンセターゼ−アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ−ジヒドロオロターゼ（ＣＡＤ）遺伝子）、あるいはＸ染色体（デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子）に対して特異的なコスミドを使用して、各種の免疫学的方法を、ＢＴとアビジン−ＰｔＰ／ＰｔｃＰの組み合わせについて調べた。
ビオチンプローブ標識を使用した場合、マウス抗ビオチン（Sigma）ならびにウサギ抗マウス−ＨＲＰ結合体（DAKO）を使用した場合に特に良好な結果が得られた。ジゴキシゲニンプローブ標識を使用した場合、マウス抗ＤＩＧ−ビオチン結合体（Sigma）ならびにストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（Vector）を使用した場合に特に良好な結果が得られた。
【００８４】
こうした方法を用いると、ヒト分裂中期標本の任意の標的を検出することが可能であった。感度は、フルオレセインあるいはローダミンで標識したプローブ／抗体を用いる通常の免疫学的手法の場合より良好であった。
コピー数の多い標的（たとえば、動原体プローブ）は、ＢＴ中で、１０％（w/v）のＰＶＡ（７２kDa）とともにインキュベートし、他のプローブは、ＢＴ中で、１５−２５％（w/v）の硫酸デキストランとともにインキュベートした。こうした手順としたのは、信号の光学解像度を確保するためである。
【００８５】
１０．２  時間分解蛍光定量法による二重ハイブリダイゼーション
ヒト分裂中期標本で、二重ＩＳＨ実験を実施した。ローダミン−４−ｄＵＴＰ（Boehringer）で標識した、第１染色体（ｃ＃１）に対して特異的なプラスミドｐＵＣ１．７７（第１染色体のバンド１ｑ１２上に位置するヒトサテライトＩＩＩＤＮＡに対して特異的な１．７７kbのインサートを含むｐＵＣプラスミド）を、ＤＩＧ標識２８ＳｒＤＮＡプローブと同時ハイブリダイズした。ＤＩＧプローブを、ＨＲＰ標識抗ＤＩＧＦａｂフラグメントで検出し、ＢＴで染色し、沈着したビオチンを、アビジン−ＰｔｃＰで検出した。
【００８６】
連続的に蛍光を観察した結果、第１染色体、ならびにすべてのアコセントリックな（acocentric）染色体の短いアーム（２８ＳｒＤＮＡ遺伝子）も陽性に染色されていた。最後にＰｔｃＰで染色した標的は、ローダミンで染色した標的より、濃赤色が強かった。時間分解蛍光定量法（レーザー顕微鏡）を行うと、２８Ｓの信号がなおもはっきり見えていたのに対し、第１染色体の信号は、もはや検出されなかった。このことから、ＰｔｃＰの信号がなおも時間分解されており、この顕微鏡の使用時には、バックグラウンドが良好に差し引かれていることがわかる。
【００８７】
１０．３  ｍＲＮＡの検出
各種のｍＲＮＡ配列を、時間分解ＩＳＨならびにＢＴシステムで検出した。HelaX1細胞を使用したところ、ＤＩＧ標識プローブをＨＲＰ標識抗ＤＩＧＦａｂフラグメントと組み合わせて使用したＢＴ／アビジン−ＰｔｃＰによって、ｒＲＮＡ、ヒト延長因子（ＨＥＦ）−ｍＲＮＡ、ならびにルシフェラーゼ−ｍＲＮＡが成功裡に検出された。
【００８８】
１０．４  アビジン−ＰｔｃＰ、アビジン−ＰｔＰ、ならびにアビジン−ＰＶＡ−ＰｔＰの比較
ラットの肝臓のクリオスタット切片のビメンチン染色を使用して、各種のアビジン−Ｐｔポルフィリン結合体を比較した。モノクローナル抗体とともにインキュベートした後、スライド標本をウサギ抗マウス−ＨＲＰ結合体（DAKO）とともにインキュベートし、さらに、ＢＴとともにインキュベートした。沈着したビオチンを、アビジン−ＰｔｃＰ、アビジン−ＰｔＰ、ならびにアビジン−ＰＶＡ−ＰｔＰで検出した。ＰＶＡ結合体を使用した場合に、最大の特異的信号が得られた。スライド標本は、いずれも、緑色ならびに紫色を励起することによって観察した。ＰｔＰならびにＰｔｃＰのいずれでも、紫色の励起の方が効率が良かったた。レーザー顕微鏡を使用する場合には、ＰｔＰ標識結合体の方がよい結果が得られた。これは、ＰｔＰの方が、ＰｔｃＰより、５１４nmの光を多く吸収するからである。
【００８９】
１０．５  Merckoglas (登録商標) に包埋したサンプルでのＰｔＰチラミドならびにＰｔｃＰチラミド利用型ＩＨＣならびにＩＳＨ
ＰｔＰチラミドならびにＰｔｃＰチラミドは、Merckoglas (登録商標) に包埋したラット肝臓組織切片でのビメンチン染色でも、有用であった。時間分解顕微鏡を用いると、信号がさらに良好に検出された。
【００９０】
１１．  ＰｔｃＰで標識した免疫反応性物質を用いた通常のＩＨＣならびにＩＳＨ
１１．１  Ｃ＃１８プローブ、２８Ｓプローブ、ならびにコスミドｑ２プローブを用いたヒト分裂中期標本での時間分解ＩＳＨ
各種の標的サイズに応じたプローブを使用して、アビジン−ＰｔｃＰ結合体の性能を観察した。標的のサイズは、数百kb（Ｃ＃１８プローブ）、５０−２００kb（２８Ｓプローブ、Ｃ＃２２の±２０kbからＣ＃１５の±１００kbまで、ｒＤＮＡ遺伝子の数に依存する）から、±３０kb（コスミドプローブ、ｑ２に局在するＣＡＤ遺伝子に対して特異的なプローブ）までとした。
【００９１】
ビオチン、ＤＩＧ、フルオレセイン、あるいはエストラジオール（Ｅ２）で標識したプローブを使用して、単一層ないし多層の各種の免疫化学的方法について調べた。
0003934205.tif 000010
【００９２】
結果：
結果は、ＤＭ顕微鏡（連続緑色励起）、ＣＣＤ撮像装置（連続緑色励起）、あるいはレーザー顕微鏡（時間分解しつつ５１４nmで励起）のいずれかを使用して観察した。
１層：  各標的のいずれも、ほとんど可視化されなかった。Ｃ＃１８プローブとＣＣＤカメラとの組み合わせでのみ、多少の結果が得られた。
２層：  Ｃ＃１８プローブと２８Ｓプローブが、ＤＭ顕微鏡でわずかに染色された。ＣＣＤによる撮像では、平均すると、１０個のアコセントリックな（acocentric）染色体のうち７つで検出が可能であった。コスミドプローブは、この方法では検出できなかった。
３層：  ＢＩＯプローブで得られた結果は、２層法よりも悪かった。フルオレセインで標識した抗体を使用した場合にも、同様の結果であった。ＤＩＧプローブについては、バイオＳＰＡ（bioSPA）、シグマ（Sigma）、ダコ（DAKO）、ならびにベーリンガー（Boehringer）から入手した各種のビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を調べた。ヒツジ抗マウスＦ（ａｂ’）2 ビオチン結合体（Boehringer）で最良の結果が得られた、２層法と比べて高強度の信号が得られた。ＣＣＤによる撮像では、平均すると、１０個のアコセントリックな（acocentric）染色体のうち９．５個が検出可能であった。また、ＤＩＧ、ＦＬＵ、Ｅ２で標識したプローブでも、同様の感度が得られた。コスミドプローブは、これらのプローブでは検出できなかった。
４層：  （コスミド以外の）いずれのプローブも、この方法を用いると容易に検出され、最も染色強度の高い信号が見いだされたのも、この方法を用いた場合であった。コスミドプローブは、ＤＭ顕微鏡では検出されなかったものの、ＣＣＤによる撮像を行った場合にも、レーザー顕微鏡（カメラなし）を使用した場合にも検出された。
【００９３】
１１．３  ｍＲＮＡの検出
ＨｅｌａＸ１細胞を使用して、２層法とＤＭ顕微鏡（連続緑色ならびに紫色励起）を用いて２８ＳｒＲＮＡ分子を検出した。２８Ｓプローブが検出可能であった。
【００９４】
１２．  パラジウムコプロポルフィリン
１２．１  ＰｄｃＰ−ジ−ＮＨＳ、ならびにアビジン−ＰｄｃＰの調製
ＰｄｃＰ−ジ−ＮＨＳエステルの調製
パラジウムコプロポルフィリン（ＰｄｃＰ）のジ−ＮＨＳエステルの調製を以下のようにして行った。６．２mgのＰｄｃＰを０．８mlの乾燥ＤＭＦに溶解し、３４μl のＤＣＣ（１００mg/ml ＤＭＦ溶液）、２２μlのＨＢＴＯ（１００mg/ml ＤＭＦ溶液）、１９μlのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００mg/ml ＤＭＦ溶液）を加えた。室温で１６時間インキュベートした後、ＰｄｃＰ−２−ＮＨＳ（７．１mMＤＭＦ溶液）を−２０°Ｃで保存した。
【００９５】
１２．２  アビジン−ＰｄｃＰ結合体の調製
２．５mgのアビジンＤを、１ｘＮＨＳバッファー（１５μM）中で、１mg/ml溶液として標識した。ＰｄｃＰ−２−ＮＨＳを、濃度が４５あるいは９０μM（３ならびに６倍過剰）となるまで加え、氷上で４時間反応させた。標準的なゲル濾過によって精製を行った。染色された結合体が得られた。いずれの場合についても、ＰｄｃＰ標識の一部が、低分子量生成物として保持され、アビジンと反応することはなかった。これらの結合体を±０．７５mg/ml ＰＢＳＥ溶液として−２０°Ｃで保存した。
次に、０．５mgのアビジンＤを、１ｘＮＨＳバッファー（１５μM）中で、１mg/ml溶液として標識した。ＰｄｃＰ−２−ＮＨＳを、濃度が１５０、５２５、あるいは７５０μM（１０、３５ならびに５０倍過剰）となるまで加え、３０°Ｃで１時間反応させた。標準的なゲル濾過によって精製を行った。さらに強度に標識されたアビジンが得られた。標識の強度は、ＰｄｃＰ−２−ＮＨＳが過剰となるほど増大した。これらの結合体を±０．３mg/ml ＰＢＳＥ溶液として−２０°Ｃで保存した。
【００９６】
ビオチン化ＢＳＡの逐次希釈液を滴下することにより（１μlの０．５μg/μl溶液から開始）、各結合体のそれぞれについて、ブロット上の最適希釈率を求めた。ＴＮＢ中に３０分浸漬した後、ニトロセルロースブロットを、アビジン−ＰｔｃＰＡ．０５の各種希釈液を対照として使用し、ＰｄｃＰで標識したアビジンの各種ＴＮＢ希釈液とともにインキュベートした。ＴＮＴ中で３ｘ５分間洗浄し、ブロットをヤギ抗アビジンＤ  アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体（Vector：ＴＮＢで１：１５００に希釈）とともにインキュベートした。ＴＮＴ中で３×５分間洗浄し、二回蒸留水中で短時間ゆすいだ後、フィルターをＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Rockland）中でインキュベートした。
【００９７】
アビジン−ＰｄｃＰ    ３倍過剰  １：250   −→  １：50（ＩＨＣ／ＩＳＨ）
アビジン−ＰｄｃＰ    ６倍過剰  １：150   −→  １：30（ＩＨＣ／ＩＳＨ）
アビジン−ＰｄｃＰ  １０倍過剰  １： 80   −→  １：15（ＩＨＣ／ＩＳＨ）
アビジン−ＰｄｃＰ  ３５倍過剰  １： 80   −→  １：15（ＩＨＣ／ＩＳＨ）
アビジン−ＰｄｃＰ  ５０倍過剰  １： 50   −→  １：10（ＩＨＣ／ＩＳＨ）
【００９８】
１２．３  ＰｄｃＰ標識アビジンＤを使用したビオチンチラミド利用型ＩＨＣならびにＩＳＨ
Vectashield (登録商標) 中に包埋したサンプルを使用して、アビジン−ＰｄｃＰ結合体を２種のアッセイ法で調べた。アッセイの一方は、Ｈｅｌａ細胞中での２８ＳｒＲＮＡの検出で、ｐ１−ローダミンと２８Ｓ−ＤＩＧを用いた二重ハイブリダイゼーションを行った。時間分解ＤＭ顕微鏡観察を、ＣＣＤカメラならびに連続紫色励起と組み合わせて使用し、核内のｐ１の信号と、核小体ならびに細胞質中のＰｄｃＰの信号（２８ＳｒＲＮＡ）を観察した。このことから、時間分解ＤＭ顕微鏡と組み合わせて、Ｐｄコプロポルフィリンを標識として使用すると、（自己）蛍光が十分に低減することがわかる。
【００９９】
次に、ラットの肝臓のクリオスタット切片でビメンチンを検出した。連続緑色励起のみを使用した。各アビジン−ＰｄｃＰ結合体を調べ、その際には、アビジン−ＰｔｃＰを陽性の対照として使用した。最良の結果が得られたのは、３倍ならびに５０倍過剰量の結合体を用いた場合であったが、他の３例の結合体によっても、動脈、静脈、ならびに胆管の上皮細胞にビメンチンが特異的に検出された。得られた信号は、アビジン−ＰｔｃＰで得られた信号に匹敵するものであった。
【０１００】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の出発化合物として用いられる好ましい金属ポルフィリン（ＰｔｃＰ）の式を示す。
【図２】本発明の出発化合物として用いられる別の好ましい金属ポルフィリン（ＰｔＰ）の式を示す。
【図３】本発明の方法を実施するための反応経路を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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