(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）：
【化１】
0003950600.tif 000019
［式（１）中、
Ｒは、エチル基であり；
Ａは、以下の式（２）：
【化２】
0003950600.tif 000020
からなるグループから選択され、ここにおいてｎは３−１０の整数である；そして
Ｂは、所望により１ないし３のハロゲンによって置換されていてもよいメチル基である。］
で表される構造を有する化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（３）：
【化３】
0003950600.tif 000021
で表される構造を有する化合物、パラチオンメチル、パラチオンおよびＥＰＮに反応性を示すモノクローナル抗体を製造することを特徴とし、ここで製造されるモノクローナル抗体が、式（３）の化合物に対する結合活性を１００％とした場合に、ＥＰＮ、パラチオンまたはパラチオンメチルのうち最も結合活性が弱い化合物に対しても少なくとも２５％の結合活性を有する、式（３）の化合物、パラチオンメチル、パラチオンおよびＥＰＮに反応性を示すモノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントの製造方法。
【請求項２】
以下の式（１）：
【化４】
0003950600.tif 000022
［式（１）中、
Ｒは、エチル基であり；
Ａは、以下の式（２）：
【化５】
0003950600.tif 000023
からなるグループから選択され、ここにおいてｎは３−１０の整数である；そして
Ｂは、所望により１ないし３のハロゲンによって置換されていてもよいメチル基である。］
で表される構造を有する化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体を抗原として用いることにより製造された、式（３）の化合物、パラチオンメチル、パラチオンおよびＥＰＮに反応性を示すモノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントであって、ここでモノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントが、式（３）の化合物に対する結合活性を１００％とした場合に、ＥＰＮ、パラチオンまたはパラチオンメチルのうち最も結合活性が弱い化合物に対しても少なくとも２５％の結合活性を有する、前記モノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項３】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０３２で寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体ＦＮＰ１６５又はその抗原と結合可能なそのフラグメントである、請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項４】
請求項２または３に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０３２で寄託されている、請求項４に記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項２または３に記載のモノクローナル抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、式（３）で表される化合物、ＥＰＮ、パラチオン、およびパラチオンメチルの免疫学的測定方法。
【請求項７】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０３２で寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体ＦＮＰ１６５又は抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、請求項６に記載の免疫学的測定方法。
【請求項８】
さらに、以下の式（１）：
【化６】
0003950600.tif 000024
［式（１）中、
Ｒは、エチル基であり；
Ａは、以下の式（２）：
【化７】
0003950600.tif 000025
からなるグループから選択され、ここにおいてｎは３−１０の整数である；そして
Ｂは、所望により１ないし３のハロゲンによって置換されていてもよいメチル基である。］
で表される構造を有する化合物、又は該化合物と高分子化合物もしくは標識物質との結合体を用いることを含む、請求項６または７に記載の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｏ−（３−メチル−４−ニトロフェニル）チオホスフェート（以下、本明細書中「フェニトロチオン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
フェニトロチオンは、以下の式（３）：
【０００４】
【化４】
0003950600.tif 000002
【０００５】
で表される構造を有する、有機リン系殺虫剤である。化学構造はパラチオンメチルに酷似しているが、人畜毒性は低い。高等動物の体内では容易に脱メチル化による解毒・代謝が起こるが、昆虫ではこの代謝が弱いのがその要因といわれている。稲作、果実、野菜、茶などの害虫に広く用いられている（農薬ハンドブック第２頁−第１０頁及び第５１０頁、１９９４年版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」  第２７９頁−第２８１頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【０００６】
また、フェニトロチオンに構造が類似する有機リン系殺虫剤の１種としてエチルパラニトロフェニルチオノベンゼンホスホエート（以下、「ＥＰＮ」と言う）が知られている。ＥＰＮはイネを初めとして、そのほか果樹、野菜の広範囲の害虫に対し有効で、残効性もある。作用特性としては、パラチオン同様、コリンエステラーゼの阻害が殺虫機構の主体である。残効に富み、このため種子粉衣剤として土壌害虫の防除に用いることができる。接触毒、食毒、ガス毒として作用するが、残効が長いのでニカメイガを対象とするときは食入防止効果が大きいので少し早めに使う。浸透性も若干ある。野菜のヨトウガ老熟幼虫に対して効力を示す。ニカメイガ第２世代、サンカメイガ第２、第３世代には使用しない（農薬ハンドブック  第６３頁−第６４頁及び第６１０頁、１９９８年版、日本植物防疫協会）。
【０００７】
さらに、Ｏ，Ｏ−ジエチル  Ｏ−４−ニトロフェニル  ホスフォロチオエート（以下、「パラチオン」と言う）もフェニトロチオンに構造が類似する有機リン系の殺虫剤である。日本では、昭和２７年に登録され、ほとんどの害虫にすぐれた効果を示し、当時、難防除害虫であったニカメイチュウ、シンクイムシ類の防除に成功した。しかし、人畜毒性が強く、散布時の中毒による死亡事故が続出したため、昭和４４年をもって、日本では製造中止となり、昭和４６年には登録が失効となった。諸外国では使用されている（「最新農薬の残留分析法」  第４７０頁−第４７２頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【０００８】
さらにまた、Ｏ，Ｏ−ジメチル  Ｏ−４−ニトロフェニル  ホスフォロチオエート（以下、「パラチオンメチル」と言う）もフェニトロチオンに構造が類似する有機リン系の殺虫剤である。パラチオンに近似しているが、パラチオンよりも不安定で分解しやすい。熱に対しても１３０℃以上では不安定である。殺虫力が室内施用ではパラチオンより強力であるが、圃場においてはやや劣り、パラチオンの６０％程度の効果と言われている。これは分解しやすく、残効性が少ないためと考えられる。毒性はパラチオンの１／３程度である。パラチオン同様、昭和４６年には登録が失効となっており、日本では使用されていない（「最新農薬の残留分析法」  第４７３頁−第４７５頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【０００９】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。フェニトロチオンについては、食品衛生法に基づき残留基準値が、米（０．２ｐｐｍ）、穀類（１−１０ｐｐｍ）、豆類（０．２ｐｐｍ）、果実（０．０５−２ｐｐｍ）、野菜（０．０５−０．５ｐｐｍ）、茶（０．２ｐｐｍ）、小麦（１ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  同上）。さらに、水質に関しても、水道法における水道水質基準の監視項目として基準値が０．００３ｍｇ／ｌ、環境基本法の環境基準の要監視項目として基準値が０．００３ｍｇ／ｌと定められている。さらに、環境庁による「ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る暫定指導指針」（１９９０年）において、フェニトロチオンのゴルフ場排水に係る暫定指導指針値が０．０３ｍｇ／ｌと定められている。当該指針値の性格は、ゴルフ場の使用農薬が外部に流出することによる水質汚濁を防止する観点から、上限値として定められている（最新  農薬の規制・基準値便覧  １９９５年版  ４８頁、（社）日本植物防疫協会）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、フェニトロチオンの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【００１０】
また、ＥＰＮについても残留基準値が、米（０．１ｐｐｍ）、果実、野菜、茶（０．１ｐｐｍ）、夏みかん果皮（０．５ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  第２４９頁−第２５１頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【００１１】
さらに、パラチオンについては食品衛生法に基づき残留基準値が、米及びばれいしょ（それぞれ不検出）、穀類、豆類、果実、野菜および茶（ぞれぞれ０．３ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  第４７０頁−第４７２頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【００１２】
さらにまた、パラチオンメチルについては食品衛生法に基づき残留基準値が、穀類、豆類およびいも類（０．１ｐｐｍないし１．０ｐｐｍ）、果実（０．２ｐｐｍないし１．０ｐｐｍ）、野菜（０．０５ｐｐｍないし１．０ｐｐｍ）、オイルシード（０．１ｐｐｍないし１．０ｐｐｍ）、ナッツ類（０．１ｐｐｍ）、茶（０．２ｐｐｍ）、ホップ（０．０５ｐｐｍ）等と定められている（「最新農薬の残留分析法」  第４７３頁−第４７５頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【００１３】
従来、例えば農作物中のフェニトロチオンは、穀類、豆類、種実類等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶し、ヘキサン−アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法が採用されている。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。フェニトロチオンの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。同様に、ＥＰＮ、パラチオン、パラチオンメチルについても簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【００１４】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【００１５】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＳＢＮ  ０−７２０４−４２００−１  （１９９０）  に記載されている。
【００１６】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、フェニトロチオンのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【００１７】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１８】
このように、フェニトロチオンについては、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明前には得られていなかった。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フェニトロチオンに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００２０】
本発明はその一態様において、フェニトロチオンに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
本発明は、また、フェニトロチオンに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明は、さらに、フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。当該結合体はフェニトロチオンに反応性を有する抗体を作製するための抗原となる。
【００２２】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用することを含む、フェニトロチオンの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、フェニトロチオン又はその部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、フェニトロチオンの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００２４】
本発明の対象となるフェニトロチオンは、以下の式（３）：
【００２５】
【化５】
0003950600.tif 000003
【００２６】
で表される化合物である。
本発明の抗体は、例えば、フェニトロチオンにスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【００２７】
【化６】
0003950600.tif 000004
【００２８】
［式（１）中、
Ｒは、メチル基またはエチル基であり；
Ａは、以下の式（２）：
【００２９】
【化７】
0003950600.tif 000005
【００３０】
からなるグループから選択され、ここにおいてｎは１−１０の整数である；そして
Ｂは、所望により１ないし３のハロゲンによって置換されていてもよいメチル基である。］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。
【００３１】
式（１）中、Ｒは好ましくはエチル基であり。Ａは好ましくはｎが３のトリメチレン基である。そして、Ｂは好ましくはメチル基である。
本発明の抗体は、フェニトロチオンと反応性を有することを特徴とするが、フェニトロチオンのみに特異的に反応する抗体のみならず、フェニトロチオンを含む一群の類似化合物に反応性を有する抗体を含む。
【００３２】
本発明の一態様において、有機リン系殺虫剤の内、数種類の殺虫剤を同時に測定できる抗体を作製するため、比較的構造の類似しているフェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン、パラチオンメチルに着目し、ハプテンの分子設計を試みた。これら４種類の農薬に共通の部分構造として、メチル基で置換されていてもよいニトロフェニル基、チオリン酸の骨格およびメトキシ基（又はエトキシ基）が挙げられる。抗原性の増大を図るため、全てのメトキシ基をエトキシ基で代替し、ニトロフェニル基、チオリン酸の骨格を残したハプテン構造をまず想定した。ついで、ハプテンの化学的安定性を増大させるため、チオリン酸の骨格に結合している１個のエトキシ基をアミド基に変換してそこにスペーサーアームを付加し、結果として式（１）で表される構造を有するハプテン化合物を合成した。
【００３３】
式（１）のハプテン化合物と高分子化合物との結合体は、後述の実施例に示すようにフェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチルの４種類の農薬を同時に測定できる抗体を産生するのに好適の免疫原となりうることが分かった。
【００３４】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、フェニトロチオンに反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるフェニトロチオンの免疫学的測定方法に関する。
【００３５】
フェニトロチオン誘導体の作製
式（１）で表されるフェニトロチオン誘導体は、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００３６】
まず、以下の式（Ｘ１）：
【００３７】
【化８】
0003950600.tif 000006
【００３８】
［式（Ｘ１）中、
Ｌ1及びＬ2はハロゲン原子であり（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味する）、同一であっても、又は異なっていてもよい；そして
Ｒは先に定義した通りである］
で表されるジハロゲン化チオリン酸エステルに、以下の式（Ｘ２）：
【００３９】
【化９】
0003950600.tif 000007
【００４０】
［式（Ｘ２）中、
Ｚはカルボキシル保護基であり；そして
Ａは先に定義した通りである］
で表されるエステル化合物を有機溶媒中、塩基の存在下で反応させて、以下の式（Ｘ３）：
【００４１】
【化１０】
0003950600.tif 000008
【００４２】
［式（Ｘ３）中、Ａ，Ｒ，ＺおよびＬ1（Ｌ2）は先に定義した通りである］
で表される化合物を合成する。
式（Ｘ２）で表されるエステル化合物は、公知の方法、例えば、Ｓｋｅｒｒｉｔらの文献（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１９９２，４０，１４６６−１４７０）に記載されている方法に従って、容易に合成することができる。
【００４３】
式（Ｘ３）の化合物の合成のための有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いることができる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、水素化ナトリウム、ピリジン、リチウムジイソプロピルアミド等を用いることができる。
【００４４】
反応は、マイナス７８℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から６０℃で、１時間から５０時間、好ましくは１時間から２４時間行う。
Ｚで示されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることができる。
【００４５】
次に、式（Ｘ３）の化合物と、以下の式（Ｘ４）：
【００４６】
【化１１】
0003950600.tif 000009
【００４７】
［式（Ｘ４）中、Ｂは先に定義した通りである］
で表される化合物とを、有機溶媒中、塩基の存在下で反応させることにより、以下の式（Ｘ５）：
【００４８】
【化１２】
0003950600.tif 000010
【００４９】
［式（Ｘ５）中、Ａ，Ｂ，ＲおよびＺは先に定義した通りである］
で表される化合物を合成する。
反応は、マイナス７８℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から８０℃で、１時間から４０時間、好ましくは１時間から２４時間行う。有機溶媒及び塩基は、上述した式（Ｘ３）の化合物を合成する場合と同様のものを使用することができる。
【００５０】
なお、式（Ｘ１）の化合物から式（Ｘ５）の化合物の合成は、式（Ｘ１）の化合物に式（Ｘ４）で表されるフェノール化合物を先ず反応させて、次に、式（Ｘ２）のエステル化合物を反応させることによって行ってもよい。
【００５１】
さらに、式（Ｘ５）の化合物からＺで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。
【００５２】
すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ５）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００５３】
また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ５）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００５４】
更に、Ｚがベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によっても行うことができる。
更にまた、Ｚがシリル基の場合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても行うことができる。
【００５５】
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００５６】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００５７】
フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたフェニトロチオン誘導体を適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。
【００５８】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ及びＢＳＡが好ましい。
【００５９】
フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．42 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって行うことができる。
【００６０】
活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。
【００６１】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【００６２】
カップリング反応後、反応液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００６３】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応において慣用されている化合物を使用することができる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００６４】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をフェニトロチオン誘導体に結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32Ｐ、125Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
【００６５】
ポリクローナル抗体の作製
フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、フェニトロチオン誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したもので、動物を免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。但し、ヒトは除く。
【００６６】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【００６７】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、フェニトロチオンと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
本発明においてフェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、約０．０１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの濃度でフェニトロチオンと反応した（実施例７、図１）。
【００６８】
モノクローナル抗体の作製
フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【００６９】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
（ａ）免疫用抗原として使用するフェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ  テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されている。
【００７０】
以下、本発明のフェニトロチオンに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００７１】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００７２】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５, １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））等を使用できる。
【００７３】
上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約３×１０3以上の細胞数を確保する。
【００７４】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学  ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【００７５】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００７６】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、フェニトロチオンに対する抗体活性を測定する。
【００７７】
さらに、測定によりフェニトロチオンに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【００７８】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗フェニトロチオンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【００７９】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【００８０】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗フェニトロチオンモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗フェニトロチオンモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００８１】
以上のようにして得られた抗フェニトロチオンモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００８２】
抗体によるフェニトロチオンの測定
本発明で使用する抗体によるフェニトロチオンの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００８３】
フェニトロチオンの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）まず、抗原であるフェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【００８４】
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）これに各種濃度のフェニトロチオンを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びフェニトロチオンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、フェニトロチオン−抗体複合体を生成させる。
【００８５】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のフェニトロチオンの量を決定することができる。
（ａ）工程において、抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【００８６】
抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【００８７】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したフェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。例えば、式（１）で表されている化合物でＲ、ＡまたはＢが相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のフェニトロチオン類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【００８８】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（フェニトロチオン誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、フェニトロチオン誘導体部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いることができる。
【００８９】
次いで（ｃ）工程において、フェニトロチオンを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びフェニトロチオンと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びフェニトロチオン−抗体複合体が生成する。
【００９０】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のフェニトロチオンに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００９１】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３７℃で約1時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いることができる。
【００９２】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から約１００００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００９３】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からフェニトロチオンの量を算出することができる。
【００９４】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００９５】
フェニトロチオンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のフェニトロチオンを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のフェニトロチオンの濃度を算出できる。
【００９６】
本発明のモノクローナル抗体ＦＮＰ１１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でフェニトロチオンの量を約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌから約１３ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる。またＦＮＰ１６５は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．２ｎｇ／ｍｌから約６ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例９、図２）。
【００９７】
あるいはフェニトロチオンの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
【００９８】
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
（ｃ）各種濃度のフェニトロチオンを含む試料及び、フェニトロチオン誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させる。
【００９９】
（ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のフェニトロチオンの量を決定する。
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【０１００】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のフェニトロチオン並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【０１０１】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製は、フェニトロチオン誘導体を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、フェニトロチオンを含む試料と混合する。
【０１０２】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したフェニトロチオン誘導体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）で表される化合物でＲ、ＡまたはＢが相違する化合物を各々抗体作製用と標識競合用として用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のフェニトロチオン類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。
【０１０３】
（ｃ）工程においてフェニトロチオンを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、フェニトロチオンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。フェニトロチオンを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えば６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を使用することができる。
【０１０４】
さらに、（ｄ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からフェニトロチオンの量を算出することができる。
【０１０５】
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【０１０６】
例えば、ＦＮＰ１１はフェニトロチオンの他にクロルチオンと高い反応性を示す。パラチオンメチルやパラチオンとは若干の交差反応性を示すが、フェンチオンとは全く反応しない。従って、ＦＮＰ１１を用いればより特異的にフェニトロチオンを測定することが可能である。
【０１０７】
一方、ＦＮＰ１６５はＦＮＰ１１より約１０倍反応性が高いものの、クロルチオン、パラチオンメチル、パラチオンとも反応性を示す（実施例１０、表１）。さらに、実施例１１において、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を詳細に検討したところ、ＦＮＰ１６５はフェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチルと比較的高い反応性を示した（表２）。一方、フェニトロチオン及びパラチオンの主要代謝物（フェニトロオクソン、３−メチル−４−ニトロフェノールおよびパラオクソン）とはほとんど交差反応性を示さなかった（表３）。また、６種の有機リン系殺虫剤（ダイアジノン、クロルピリホス、シアノホス、ホキシム、フェンスルホチオンおよびフェンチオン）とはいずれも交差反応性が１％以下であった（表４）。
【０１０８】
従って、本発明のモノクローナル抗体ＦＮＰ１６５を用いることにより、フェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチルの４種の有機リン系殺虫剤を一群の化合物として特異的に測定することが可能である。農作物や環境水等の試料中にこれら４種の有機リン系殺虫剤が存在しているかどうかを調べるための効率的なスクリーニング法として、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５は有効である。
【０１０９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１０】
【実施例】
実施例１  フェニトロチオン誘導体−１の合成
【０１１１】
【化１３】
0003950600.tif 000011
【０１１２】
（２）の合成
ジクロロチオリン酸エチル（１）１．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）と４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル１．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶解させ、炭酸カリウム４．３ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液をセライトでろ過して、濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４：１）で精製し、透明な油状物として１．６ｇ（収率５９％）の（２）を得た。
【０１１３】
（３）の合成
クロロチオリン酸誘導体（２）４．３ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）と３−メチル−４−ニトロフェノール２．４３ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム６．０ｇ（４３．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で３時間撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し、ろ液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=９：１）で精製し、２．５７ｇ（収率４２％）の（３）を得た。
【０１１４】
（４）の合成
ハプテンエステル（３）２．５７ｇ（６．６４ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４：１→１：１）で精製し、２．１ｇ（収率９５％）の（４）を得た。
【０１１５】
得られたフェニトロチオン誘導体−１の化学シフトデータを以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２９−１．４３（ｔ，３Ｈ）、１．７６−１．９２（ｍ，２Ｈ）
２．３８−２．５１（ｔ，２Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）
３．０９−３．２４（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．４７（ｍ，１Ｈ）
４．０７−４．２８（ｍ，２Ｈ）、７．１０−７．２６（重複，２Ｈ）
７．９８−８．０９（ｄ，１Ｈ）
実施例２  フェニトロチオン誘導体−２の合成
【０１１６】
【化１４】
0003950600.tif 000012
【０１１７】
（５）の合成
ジクロロチオリン酸エチル（１）４．３２ｇ（２４ｍｍｏｌ）と３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノール５．０ｇ（２４ｍｍｏｌ）をベンゼン１５０ｍｌに溶解させ、炭酸カリウム８．６ｇ（６０ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で２時間撹拌した。反応液をセライトでろ過して、濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン→ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４９：１→１９：１）で精製し、透明油状物として２６０ｍｇ（収率３％）の（５）を得た。
【０１１８】
（６）の合成
クロロチオリン酸誘導体（５）２６０ｍｇ（７４４μｍｏｌ）と６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ−ブチル１３０ｍｇ（６９５μｍｏｌ）のアセトニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム３００ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃以下で１時間撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し、ろ液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=１９：１→９：１→４：１）で精製し、２９０ｍｇ（収率７８％）の（６）を得た。
【０１１９】
（７）の合成
ハプテンエステル（６）２９０ｍｇ（５８０μｍｏｌ）を８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４：１→２：１→１：１）で精製し、２００ｍｇ（収率７８％）の（７）を得た。
【０１２０】
得られたフェニトロチオン誘導体−２の化学シフトデータを以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．３１−１．５０（重複，５Ｈ）、１．５０−１．７６（ｍ，４Ｈ）
２．３１−２．４２（ｔ，２Ｈ）、  ３．０２−３．２１（ｍ，２Ｈ）
３．２１−３．４０（ｍ，１Ｈ）、  ４．０９−４．２８（ｍ，２Ｈ）
７．５２−７．６７（重複，２Ｈ）、７．９１−８．００（ｄ，１Ｈ）
実施例３  フェニトロチオン誘導体−３の合成
【０１２１】
【化１５】
0003950600.tif 000013
【０１２２】
（８）の合成
油性の水素化ナトリウム（６０％）０．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ５０ｍｌに懸濁して、氷冷しながら３−メチル−４−ニトロフェノール３．１ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１５ｍｌを滴下した。３０分撹拌後にジクロロチオリン酸エチル（１）３．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。３時間撹拌して、反応液をセライトでろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=１９：１）で精製し、黄色油状物として３．６ｇ（収率６１％）の（８）を得た。
【０１２３】
（９）の合成
クロロチオリン酸誘導体（８）３．６ｇ（１２．２ｍｍｏｌ）と４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル２．６ｇ（１２．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル溶液１００ｍｌに溶解し、炭酸カリウム１．８ｇ（１３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１時間撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し、ろ液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=１９：１→９：１）で精製し、透明油状物として３．３９ｇ（収率５９％）の（９）を得た。
【０１２４】
（１０）の合成
ハプテンエステル（９）３．３ｇ（７ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌを加えて室温で２時間撹拌後に、再びＴＦＡを５ｍｌ添加して更に１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン=４：１→１：１）で精製し、白色結晶として２．５６ｇ（収率８８％）の（１０）を得た。
【０１２５】
得られたフェニトロチオン誘導体−３の化学シフトデータを以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
０．８７−１．０７（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．５３（重複，６Ｈ）
１．８１−１．９８（ｍ，２Ｈ）、１．９８−２．１３（ｍ，２Ｈ）
２．１５−２．３７（ｍ，１Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）
２．８８−３．０１（ｍ，２Ｈ）、３．１８−３．３４（ｍ，１Ｈ）
４．０７−４．２６（ｍ，２Ｈ）、７．１０−７．２２（重複，２Ｈ）
７．９６−８．１８（ｄ，１Ｈ）
実施例４  免疫用抗原及びスクリーニング用抗原の作製
実施例１ないし３で作製したフェニトロチオン誘導体−１ないし３をハプテンとして、各々３．５μｍｏｌをＤＭＳＯ  ５０μｌに溶解させた。次に、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  １０μｌに溶解したものを当該溶液に添加した。さらに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ２０μｌに溶解して添加し、室温にて１．５時間反応させた。その後、当該反応溶液に８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解したＫＬＨあるいはＢＳＡ各々１０ｍｇをさらに添加し、再び室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、ダルベッコのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」と言う）に対して透析し、フェニトロチオン誘導体１ないし３とＫＬＨとの結合体（以下、「フェニトロチオン誘導体１ないし３−ＫＬＨ」と言う）、フェニトロチオン誘導体１ないし３とＢＳＡとの結合体（以下、「フェニトロチオン誘導体１ないし３−ＢＳＡ」と言う）を各々調製した。
【０１２６】
実施例５  免疫感作
免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例４で調製したフェニトロチオン誘導体１ないし３−ＫＬＨ１００μｇを、各々ＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に接種した。１カ月後に初回免疫の１／４量を追加免疫し、その一週間後、マウスの尾静脈から採血し、抗血清を調製した。また、さらにその１０日後に追加免疫と同量を最終免疫した。
【０１２７】
実施例６  抗血清の力価の測定
実施例５で調製した抗血清の力価を、フェニトロチオン誘導体−ＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０１２８】
まず、ＰＢＳ（−）に溶解したフェニトロチオン誘導体−ＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で１晩静置することにより、固相化した。次に３００μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液｛１％ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝に置き換え、室温で１時間ブロッキングした。このウェルを洗浄液（６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄した後、抗体希釈液｛０．３％ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝で段階希釈した抗血清を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄液で３回洗浄した後、抗体希釈液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液｛３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン（１００μｇ／ｍｌ）、０．００６％  過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）｝で１０分間発色し、１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２９】
実施例７  抗血清のフェニトロチオンとの反応性
実施例６で活性の確認ができた抗血清について、フェニトロチオンに対する反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により評価した。
【０１３０】
まず実施例６と同様に固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレートへ、希釈液｛１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝で適当な濃度に希釈したフェニトロチオン溶液を５０μｌ／ウェルで加えた。その後、実施例６のＥＬＩＳＡ法において、抗体過剰域で得られる吸光度の７０％程度の吸光度を示すように希釈した抗体溶液を５０μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応させた。３回洗浄した後、実施例６と同様に２次抗体と反応させ、発色後４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１３１】
結果を図１に示す。ここで、阻害率は以下の式で計算した。
【０１３２】
【化１６】
0003950600.tif 000014
【０１３３】
フェニトロチオン誘導体１−ＫＬＨを用いて得られた抗血清は、フェニトロチオンと０．０１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲でフェニトロチオンと反応した。また、フェニトロチオン誘導体２および３−ＫＬＨを各々用いて得られた抗血清は、０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲でフェニトロチオンと反応した。
【０１３４】
実施例８  モノクローナル抗体の作製
細胞融合には、 フェニトロチオン誘導体１−ＫＬＨで免疫したマウスを用いた。最終免疫後３日目のマウスの脾臓細胞をＤＭＥＭ中に取り出し、ＤＭＥＭにて３回洗浄した。洗浄後、同様に洗浄したマウスのミエロ−マ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）となるように混合し、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈殿物を回収した。当該細胞沈殿物に予め３７℃に加温しておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００）１ｍｌを加え、細胞を融合した。次いで、ＤＭＥＭ  １０ｍｌを徐々に添加し、ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と言う）１ｍｌを更に添加することにより、融合を停止した。ＤＭＥＭにて１回洗浄後、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルのポリスチレンプレートに２×１０5細胞／ウェルで分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０ないし１４日間培養した。培養後、ウェル中の抗体活性の有無を、実施例６に示したＥＬＩＳＡ法および実施例７に示した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で、フェニトロチオンとの反応性を指標にスクリーニングした。
【０１３５】
フェニトロチオンとの反応性を認めたウェル中のハイブリドーマを、限界希釈法によって細胞クローニングし、モノクローナル抗体産生細胞とした。
このようにして、フェニトロチオンに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを３株（ＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５およびＦＮＰ２３２）分離した。これらから産生するモノクローナル抗体は、すべてＩｇＧ１だった。このうち、ＦＮＰ１６５を平成１０年１０月２９日に、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０３２で工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【０１３６】
実施例９  間接競合ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体ＦＮＰ１１及びＦＮＰ１６５のフェニトロチオンとの反応性
実施例８で得られた３株のハイブリドーマ細胞（ＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５およびＦＮＰ２３２）が産生するモノクローナル抗体を精製し、抗フェニトロチオン抗体、ＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５およびＦＮＰ２３２を得た（以後、モノクローナル抗体はこれらを産生するハイブリドーマと同一名称を用いる）。
【０１３７】
これらのモノクローナル抗体うちＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５について、フェニトロチオンとの反応性を、上述した実施例７と同様の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって検討した。
【０１３８】
結果を図２に示す。ＦＮＰ１１は２ｎｇ／ｍｌないし１３ｎｇ／ｍｌの測定範囲で、またＦＮＰ１６５は０．２ｎｇ／ｍｌないし６ｎｇ／ｍｌの測定範囲でフェニトロチオンと反応した。
【０１３９】
実施例１０  モノクローナル抗体とフェニトロチオン類縁化合物との交差反応性
得られたモノクローナル抗体ＦＮＰ１１及びＦＮＰ１６５について、フェニトロチオンの類縁化合物（有機リン系化合物）との交差反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により調べた。交差反応性は、類縁化合物未添加時の反応を５０％阻害する化合物の濃度を各々ＩＣ５０値として調べた。結果を表１に示す。
【０１４０】
【表１】
0003950600.tif 000015
【０１４１】
表１に示したように、ＦＮＰ１１はフェニトロチオンの他にクロルチオンと高い反応性を示した。パラチオンメチルやパラチオンとは若干の交差反応性を示したが、フェンチオンとは全く反応しなかった。一方、ＦＮＰ１６５はＦＮＰ１１より約１０倍反応性が高いものの、クロルチオン、パラチオンメチル、パラチオンとも反応性を示した。
【０１４２】
従って、ＦＮＰ１１を用いればより特異的にフェニトロチオンを測定することが可能であり、ＦＮＰ１６５を用いればフェニトロチオンやその類縁化合物を広範囲かつ高感度に測定することが可能である。
【０１４３】
実施例１１  モノクローナル抗体ＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５及びＦＮＰ２３２の有機リン系殺虫剤との交差反応性
実施例８で分離した３株のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（ＦＮＰ１１、ＦＮＰ１６５およびＦＮＰ２３２）とフェニトロチオンを含む４種の有機リン系殺虫剤（フェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチル）との交差反応性を間接競合ＥＬＩＳＡ法によって検討した。交差反応性は、有機リン系殺虫剤未添加時の反応を５０％阻害する化合物の濃度を各々ＩＣ５０値として、以下の表２に示した。
【０１４４】
【表２】
0003950600.tif 000016
【０１４５】
表２からわかるように、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５は、フェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチルと比較的高い反応性を示した。
また同様に、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５の、フェニトロチオン及びパラチオンの主要代謝物（フェニトロオクソン、３−メチル−４−ニトロフェノールおよびパラオクソン）との交差反応性を以下の表３に示した。
【０１４６】
【表３】
0003950600.tif 000017
【０１４７】
表３からわかるように、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５は、フェニトロチオン及びパラチオンの主要代謝物（フェニトロオクソン、３−メチル−４−ニトロフェノールおよびパラオクソン）とほとんど交差反応性を示さなかった。
【０１４８】
同様に、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５の、６種の有機リン系殺虫剤（ダイアジノン、クロルピリホス、シアノホス、ホキシム、フェンスルホチオンおよびフェンチオン）との交差反応性を調べた。６種の有機リン系殺虫剤の構造を以下の表４に示した。
【０１４９】
【表４】
0003950600.tif 000018
【０１５０】
表４中にも記載したように、これらの６種の有機リン系殺虫剤（ダイアジノン、クロルピリホス、シアノホス、ホキシム、フェンスルホチオンおよびフェンチオン）はいずれも交差反応性が１％以下であった。
【０１５１】
従って、本発明のモノクローナル抗体ＦＮＰ１６５を用いることにより、フェニトロチオン、ＥＰＮ、パラチオン及びパラチオンメチルの４種の有機リン系殺虫剤を一群の化合物として特異的に測定することが可能である。農作物や環境水等の試料中にこれら４種の有機リン系殺虫剤が存在しているかどうかを調べるための効率的なスクリーニング法として、モノクローナル抗体ＦＮＰ１６５は有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のフェニトロチオン誘導体を用いて得られた抗血清の間接競合ＥＬＩＳＡ法によるフェニトロチオンとの反応性を示す。
【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＦＮＰ１１及びＦＮＰ１６５の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるフェニトロチオンとの反応性を示す。
【図１】
0003950600.tif 000026
【図２】
0003950600.tif 000027