(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子構築物であって：
ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩＩ分泌シグナルと作動可能に連結した、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのｃｂｈ１プロモーターおよびｘｌｎ２プロモーターからなる群から選択される、プロモーター、ならびに
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで該遺伝子構築物は、該構築物で形質転換されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおけるβ−グルコシダーゼのレベルにおいて少なくとも４０倍の増加を引き起こす、
遺伝子構築物。
【請求項２】
前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  β−グルコシダーゼ遺伝子が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｂｇｌ１遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
前記遺伝子構築物は、前記構築物で形質転換されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおけるβ−グルコシダーゼのレベルにおいて少なくとも１２０倍の増加を引き起こす、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
遺伝子改変された微生物であって：
該微生物に導入された請求項１に記載の遺伝子構築物、
を含み、該遺伝子改変された微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物であり、該微生物と比較して少なくとも４０倍の、増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、遺伝子改変された微生物。
【請求項５】
前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物である、請求項４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項６】
前記遺伝子改変された微生物が、少なくとも約１２０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、請求項４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項７】
前記キシラナーゼ分泌シグナルが、前記遺伝子改変された微生物が由来する前記微生物に対してネイティブである、請求項４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項８】
β−グルコシダーゼを産生するための方法であって、以下の工程：
請求項１に記載の遺伝子構築物でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物を形質転換し、遺伝子改変された微生物を作製する工程；および
該遺伝子改変された微生物を使用して、形質転換される前の該微生物と比較して少なくとも４０倍の、増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記使用する工程が、前記遺伝子改変された微生物を使用して、少なくとも約１２０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、商業的に重要な酵素である、β−グルコシダーゼの産生を増強するための微生物の遺伝子改変に関する。本発明はまた、遺伝子構築物を含有する微生物によって産生されるβ−グルコシダーゼの量を劇的に増加させる、これらの遺伝子構築物に関する。
【０００２】
（２．関連分野の背景）
セルロースからエタノールを産生する能力は、供給原料の莫大な量の利用可能性、材料を燃焼または埋め立てすることを回避することの望ましさ、およびエタノール燃料のきれいさのために、大きな関心を集めてきた。社会のためのこのようなプロセスの利点は、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｍｏｎｔｈｌｙ、１９９６年４月号の記事に記載される。
【０００３】
このようなプロセスのための天然のセルロース供給原料は、「バイオマス」と呼ばれる。木材、農業の残渣、草本作物、および地方の固形廃棄物を含む、多くの型のバイオマスが、エタノール産生のための供給原料と考えられてきた。これらの材料は、主にセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンからなる。本発明は、セルロースからエタノールへの転換に適用され得る。
【０００４】
セルロースは、β１，４結合によって連結された、単糖であるグルコースのポリマーである。セルロースは、酸、酵素、または微生物による分解または脱ポリマー化に非常に抵抗性である。一旦セルロースがグルコースに転換されると、生じた糖は、酵母を用いてエタノールに容易に発酵される。このプロセスの困難なチャレンジは、セルロースをグルコースに転換することである。
【０００５】
セルロースをグルコースに転換するために研究された最も古い方法は、酸加水分解に基づく（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎによる総説、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９６−３０８（１９７８））。このプロセスは、濃縮されたか、または希釈された酸の使用を含み得る。濃縮された酸のプロセスは、高収量のグルコースを産生するが、酸の回収、必要とされる特定化された材料の構築、およびこの系において水を最小化することの必要性が、このプロセスの深刻に不利な点である。希釈した酸のプロセスは、化学的な回収の必要性を克服するために低レベルの酸を使用する。しかし、最大のグルコース収量はセルロースの約５５％のみであり、そして分解産物の高い程度の産生は、酵母によるエタノールへの発酵を阻害し得る。これらの問題は、この酸加水分解プロセスを商業化に到達させることを妨害してきた。
【０００６】
酸加水分解プロセスのこれらの問題を克服するために、セルロース転換プロセスは、より最近になって、セルラーゼ酵素を使用する酵素的加水分解に焦点を合わせてきた。セルロースの酵素的加水分解は、基質と水とを混合して、５％〜１２％のセルロースのスラリーを達成すること、およびセルロース１ｇｍあたり５〜５０国際単位（ＩＵ）のセルラーゼ酵素を添加することによって実行される。代表的には、加水分解は３５〜６０℃、ｐＨ４〜６にて１２〜１５０時間行われる。
【０００７】
多くの微生物がセルロースを加水分解する酵素を作り、これらの微生物には、木材腐朽真菌であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、堆肥の細菌であるＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；ならびに真菌Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＦｕｓａｒｉｕｍが含まれる。これらの微生物によって作られる酵素は、セルロースからグルコースへの転換に有用な３つの型の作用を有するタンパク質：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、およびβ−グルコシダーゼの混合物である。ＥＧ酵素およびＣＢＨ酵素は、集合的に、「セルラーゼ」と呼ばれる。
【０００８】
ＥＧ酵素は、ランダムな位置においてセルロースポリマーを切断し、ＣＢＨ酵素による攻撃にポリマーを曝露する。１つの例として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株は、少なくとも４つの別個のＥＧ酵素（ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩ、およびＥＧＶとして知られる）を産生する。
【０００９】
ＣＢＨ酵素は、セルロースポリマーの末端からセロビオースの分子を、連続して遊離させる。セロビオースは、グルロースの水溶性のβ−１，４−結合ダイマーである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって作られる２つの主要なＣＢＨ酵素（ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ）が存在する。
【００１０】
β−グルコシダーゼ酵素は、セロビオースをグルコースに加水分解する。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａは、１種類のβ−グルコシダーゼ酵素を作る。
【００１１】
β−グルコシダーゼによって触媒されるセルロース加水分解の最終段階は重要である。なぜなら、グルコースは、種々の酵母によって容易にエタノールに発酵され、一方セロビオースは発酵されないからである。加水分解の最後に残存しているいかなるセロビオースも、エタノールの収量の損失を示す。より重要なことに、セロビオースは、ＣＢＨ酵素およびＥＧ酵素の極度に強力なインヒビターである。セロビオースは、わずか３．３ｇ／Ｌの濃度で、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ＣＢＨ酵素およびＥＧ酵素の加水分解の速度を５０％減少させる。加水分解の速度の減少は、より高いレベルのセルラーゼ酵素の添加を必要とする。これは逆に、プロセス全体の経済性に悪影響を与える。従って、加水分解の間のセロビオースの蓄積は、エタノール産生のために極度に望ましくない。
【００１２】
セロビオースの蓄積は、酵素的加水分解において主要な問題であった。なぜなら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよび他のセルラーゼ産生微生物は、非常に少量しかβ−グルコシダーゼを作らないからである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって作られた全タンパク質の１％未満が、β−グルコシダーゼである。β−グルコシダーゼのこの少ない量は、セロビオースのグルコースへの加水分解能力の不足、および加水分解の間の１０〜２０ｇ／Ｌのセロビオースの蓄積を生じる。高いレベルのセロビオースは、適切な量のβ−グルコシダーゼが存在する場合よりも、必要とされるセルラーゼの量を１０倍増加させる。
【００１３】
セルラーゼ酵素におけるβ−グルコシダーゼの不足を克服するために、いくつかのアプローチが提案されている。
【００１４】
１つのアプローチは、ほとんどセルラーゼを産生しない微生物を使用してβ−グルコシダーゼを産生すること、および加水分解を増強させるためのセルラーゼ酵素に外部からこのβ−グルコシダーゼを添加することであった。最も成功したこのようなβ−グルコシダーゼ産生微生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓであった。これらの微生物由来のβ−グルコシダーゼは、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋから、Ｎｏｖｏｚｙｍ  １８８として市販されている。しかし、商業的なバイオマスのために必要とされる量は、エタノール操作をするにはあまりにも高価である。
【００１５】
β−グルコシダーゼの不足を克服するための第２のアプローチは、酵母によるグルコースの発酵と同時にセルロース加水分解を実行すること、いわゆる、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）プロセスである。ＳＳＦシステムにおいて、グルコースの発酵は、それを溶液から取り除く。グルコースは、β−グルコシダーゼの強力なインヒビターであり、ゆえにＳＳＦは、β−グルコシダーゼの効率を増大する試みである。しかし、ＳＳＦシステムは、まだ商業的に実行可能ではない。なぜなら、酵母にとっての操作温度である２８℃は、セルラーゼによって要求される５０℃の条件にとって低すぎる；妥協の温度である３７℃における操作は、効率が悪く、微生物汚染する傾向がある。
【００１６】
β−グルコシダーゼの不足を克服するための第３のアプローチは、酵素を過剰発現させるように遺伝子操作し、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによるその産生を増大させることである。このアプローチは、Ｂａｒｎｅｔｔ、Ｂｅｒｋａ、およびＦｏｗｌｅｒ、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、１９９１年６月、５６２〜５６７頁（本明細書中では、「Ｂａｒｎｅｔｔら」と呼ぶ）において；および、Ｆｏｗｌｅｒ、Ｂａｒｎｅｔｔ、およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ、ＷＯ９２／１０５８１、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」（本明細書中では、「Ｆｏｗｌｅｒら」と呼ぶ）でとられた。
【００１７】
ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらの両方は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ株Ｐ４０への複数コピーのβ−グルコシダーゼ遺伝子の挿入を記載する。両方のグループは、プラスミドｐＳＡＳβ−ｇｌｕを構築し、このプラスミドは、ゲノムＴ．ｒｅｅｓｅｉ  β−グルコシダーゼ遺伝子およびａｍｄＳ選択マーカーを含む形質転換ベクターである。このａｍｄＳ遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来であり、そして形質転換細胞がアセトアミドを唯一の窒素源として増殖することを可能にする酵素アセトアミダーゼをコードする。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉは、ａｍｄＳ遺伝子の機能的な等価物を含まず、従って窒素源としてアセトアミドを利用できない。形質転換細胞は、１０〜１５コピーのβ−グルコシダーゼ遺伝子を含み、そして非形質転換細胞よりも５．５倍より多いβ−グルコシダーゼを産生した。
【００１８】
ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらによって得られたβ−グルコシダーゼの産生の増強は、セルロース加水分解のためにβ−グルコシダーゼの不足を軽減するのに充分ではない。例えば、天然のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株によって作られるβ−グルコシダーゼの量は、セルロース加水分解の必要量に到達するには少なくとも１０倍増大させなくてはならない。
【００１９】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおいてタンパク質を過剰発現させる場合、１つのストラテジーは、目的の遺伝子をｃｂｈ１プロモーターまたはｃｂｈ１分泌シグナルに直接連結することである。ＣＢＨ１は、セルラーゼ誘導条件下で、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって産生される最も豊富なタンパク質であるので、ｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルは、遺伝子構築物中のそれらの後に配置された遺伝子によってコードされるタンパク質の転写および分泌を方向付けることにおいて、非常に効果的であると考えられる。このようなストラテジーは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよび他の微生物由来のタンパク質を過剰発現するために首尾よく使用されてきた（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ、Ｈａｙｅｓ、Ｈａｒｍａｎ、およびＰｅｎｔｔｉｌａ、１９９６、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２（６）：２１４５〜２１５１；Ｊｏｕｔｓｊｏｕｋｉ、ＴｏｒｋｋｅｌｉおよびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ、１９９３、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ  ｒｅｓｉｎａｅ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  Ｐ（ｇａｍＰ）ｇｅｎｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｂｙ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２２３〜２２８；Ｋａｒｈｕｎｅｎ、Ｍａｎｔｙｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ、およびＳｕｏｍｉｎｅｎ、１９９３、「Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  １．Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｉ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：５１５〜５２２）。
【００２０】
顕著な量の研究の努力にも関わらず、高レベルのβ−グルコシダーゼを充分に産生するための手段は存在しなかった。このようなプロセスは、セルロース由来の燃料アルコールの産生において前にある大きな工程である。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明者らは、現在達成可能なレベルよりもずっと高いレベルでβ−グルコシダーゼ酵素の産生を可能にする発見をした。高レベルのβ−グルコシダーゼは、セルロースのグルコースへの酵素的加水分解の効率を改善する。得られた、酵素の必要量の減少、セルロース転換の増加、加水分解時間の減少、またはこれらの利点の組み合わせは、セルロースをエタノールに転換するプロセス全体の費用を低減させる。
【００２２】
本発明者らは、遺伝子構築物が発現される組換え微生物によるβ−グルコシダーゼの産性を顕著に増加させる、その遺伝子構築物を発見した。この課題を達成する遺伝子構築物は、成熟β−グルコシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列およびキシラナーゼ分泌シグナルを含む。
【００２３】
本発明者らが認識する限り、以前に、キシラナーゼ分泌シグナルを成熟β−グルコシダーゼ酵素に連結することがβ−グルコシダーゼの産生を増大させたという報告は存在しなかった。さらに、本発明者らは、任意の非キシラナーゼ成熟タンパク質にキシラナーゼ分泌シグナルを連結することが、そのタンパク質の産生を増大させるという以前の報告を認識していない。本発明者らは、この驚くべきかつ報告されていない結果を発見した。キシラナーゼ分泌シグナルの使用が、ｃｂｈ１分泌シグナルの使用よりも、高いレベルのβ−グルコシダーゼを生じることは、さらに驚くべきことであった。キシラナーゼは、ＣＢＨ１よりもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって産生される全タンパク質のずっと少ない割合を含むので（それぞれ、５％および６０％）、ｃｂｈ１分泌シグナルがより効果的であることが予想される。キシラナーゼ分泌シグナルを成熟β−グルコシダーゼ酵素に連結することがβ−グルコシダーゼ産生を増大させる理由は分からないが、β−グルコシダーゼとキシラナーゼ分泌シグナルとの間の長さの類似性、または組換えβ−グルコシダーゼが細胞外への分泌について競合するに違いないキシラナーゼのより低い豊富さに関連があるのかもしれない。しかし、本発明の実施は、これらまたはいずれの他の特定の理由によっても限定されない。
【００２４】
本発明は、各々が組み換え手段によってβ−グルコシダーゼの発現の増強を開示した、ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらによって自明ではない。ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらの遺伝子構築物は、β−グルコシダーゼプロモーター、コード領域および分泌シグナルを含む。ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらによって使用された方法は、本発明者らによって教示される方法と同程度には有効でなく、そして本発明の遺伝子構築物を予測しない。
【００２５】
本発明の１つの局面において、β−グルコシダーゼ産生のために遺伝子改変された微生物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｅ）は、形質転換していない微生物においては存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を含む。この形質転換していない微生物から遺伝子改変された微生物は誘導され、このβ−グルコシダーゼ構築物はプロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を有し、ここでこの遺伝子改変された微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択され、そしてこの遺伝子改変された微生物は、この形質転換していない微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００２６】
別の局面において、本発明は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含むβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物を含み、ここでこのβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される、形質転換されていない微生物宿主中に導入され、そして発現される場合、この形質転換していない微生物宿主に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００２７】
本発明のなお別の局面において、β−グルコシダーゼを産生するために遺伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物は、形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物中には存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を含み、このβ−グルコシダーゼ構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで、この遺伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａは、この形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は、β−グルコシダーゼを産生するために遺伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物を含み、この微生物は、形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物中には存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を含み、このβ−グルコシダーゼ構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで、この遺伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物は、この形質転換していない微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００２９】
本発明のさらに別の局面において、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで、このβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物中に導入され、そして発現される場合、形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００３０】
本発明のなおさらに別の局面において、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで、このβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物中に導入され、そして発現される場合、形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。
【００３１】
以下の好適な実施態様の詳細な説明および付随する図面を考慮すると、本発明の他の局面はより良好に理解され、そしてその利点はより明白である。
【００３２】
（好適な実施態様の詳細な説明）
本発明の好適な実施態様を、最初に以下の用語を規定することにより記載する。
【００３３】
β−グルコシダーゼは、グルコースダイマーであるセロビオースをグルコースに加水分解する酵素である。β−グルコシダーゼを作る多くの微生物が存在し、そしてこれらの酵素の、構造（分子量、三次元配向、アミノ酸組成、および活性部位）および触媒活性（セロビオース加水分解の速度および動力学、および他の基質に対して作用する能力）を含む性質は変化する。しかし、すべての場合で、β−グルコシダーゼ酵素は、セロビオースをグルコースに加水分解し得る。これはまた、活性酵素がβ−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチドを含まない場合、成熟β−グルコシダーゼ酵素と称され得る。
【００３４】
本発明を実施するために好適なβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにより作られるβ−グルコシダーゼである。このβ−グルコシダーゼ酵素は、７４，０００の分子量（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合）であり、そして８．３の等電点（非変性等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合）を有する。
【００３５】
β−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼ酵素の産生をコードするＤＮＡの領域である。β−グルコシダーゼを産生するすべての微生物は、少なくとも１つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を保有する。天然のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼプロモーター、分泌シグナル、コード領域および転写ターミネーターを含む。β−グルコシダーゼを産生しない微生物は、一般に、活性なまたは機能的なβ−グルコルシダーゼ遺伝子を含まない。
【００３６】
β−グルコシダーゼ分泌シグナルは、β−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
【００３７】
β−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチドは、コードされたβ−グルコシダーゼ酵素のアミノ末端に存在するペプチド配列であって、微生物細胞からの成熟β−グルコシダーゼ酵素の搬出の間に次に除去される。この分泌シグナルは、プロペプチド、プレペプチドまたはその両者を含み得る。
【００３８】
成熟β−グルコシダーゼコード領域は、細胞外培養濾液から単離された場合、機能的β−グルコシダーゼ酵素をコードするために必要であるＤＮＡ配列を含むが、β−グルコシダーゼ分泌シグナルは含まない。
【００３９】
キシラナーゼは、キシランをキシロースに加水分解もする酵素である。キシラナーゼを作る多くの微生物が存在し、そしてこれら酵素の、構造（分子量、三次元配向、アミノ酸組成、および活性部位）および触媒活性（キシラン加水分解の速度および動力学、および他の基質に対して作用する能力）を含む性質は変化する。しかし、すべての場合で、キシラナーゼ酵素は、キシランをキシロースに加水分解し得る。これはまた、活性酵素がキシラナーゼ分泌シグナルペプチドを含まない場合、成熟キシラナーゼ酵素と称され得る。
【００４０】
いくつかの最も重要な市販のキシラナーゼは、ファミリー１１キシラナーゼとして分類される。キシラナーゼ酵素は、それが、必須の触媒残基として供される２つのグルタミン酸残基を含む、ファミリー１１に共通のアミノ酸を所有する場合、ファミリー１１に分類される。これらの残基は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩの番号付けによりアミノ酸８６および１７７である。ファミリー１１キシラナーゼに共通のアミノ酸は、Ｗａｋａｒｃｈｕｃｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：４６７−４７５（１９９４）に記載されている。
【００４１】
キシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼ酵素の産生をコードするＤＮＡの領域である。キシラナーゼを産生するすべての微生物は、少なくとも１つのキシラナーゼ遺伝子を保有する。天然のキシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼプロモーター、分泌シグナル、コード領域および転写ターミネーターを含む。キシラナーゼを産生しない微生物は、一般に、活性なまたは機能的なキシラナーゼ遺伝子を含まない。
【００４２】
キシラナーゼ分泌シグナルは、キシラナーゼ分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
【００４３】
キシラナーゼ分泌シグナルペプチドは、コードされたキシラナーゼ酵素のアミノ末端に存在するペプチド配列であって、微生物細胞からの成熟キシラナーゼ酵素の搬出の間に次に除去される。この分泌シグナルは、プロペプチド、プレペプチドまたはその両者を含み得る。
【００４４】
セルラーゼは、セルロースを、セロテトラオース、セロトリオースおよびセロビオースを含む、グルコースの短いβ１,４連結オリゴマーに加水分解する酵素である。しばしばセロビオヒドロラーゼまたはエンドグルカナーゼとして分類される、１つ以上のセルラーゼ酵素を作る多くの微生物が存在する。これらの酵素の、構造（分子量、三次元配向、アミノ酸組成、および活性部位）および触媒活性（キシラン加水分解の速度および動力学、および他の基質に対して作用する能力）を含む性質は変化する。しかし、すべての場合で、セルラーゼ酵素は、セルロースを、セロテトラオース、セロトリオースおよびセロビオースを含む、グルコースの短いβ１,４連結オリゴマーに加水分解し得る。
【００４５】
β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、β−グルコシダーゼを産生するために必要なエレメントを含む遺伝子をいう。これらは以下を含む。
【００４６】
ａ．成熟β−グルコシダーゼコード領域
好適な実施態様では、成熟β−グルコシダーゼコード領域は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を含む。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからの成熟β−グルコシダーゼコード領域のＤＮＡ配列は、Ｂａｒｎｅｔｔらの図１に見出され得る。
【００４７】
当業者は、天然の構造領域が、その機能を変化させることなく、１つ以上の核酸の置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを知っている。本発明の実施は、このような成熟β−グルコシダーゼコード領域に対する改変を含むが、これらに束縛されない。
【００４８】
ｂ．キシラナーゼ分泌シグナル
好適な実施態様では、キシラナーゼ分泌シグナルは、ファミリー１１のキシラナーゼ遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルを含む。
【００４９】
より好適な実施態様では、このファミリー１１キシラナーゼ遺伝子は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｘｙｌａｎａｓｅ遺伝子である。
【００５０】
なおより好適な実施態様では、このキシラナーゼ分泌シグナルは、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩ（ｘｌｎ１）遺伝子またはキシラナーゼＩＩ（ｘｌｎ２）遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルを含む。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｘｌｎ１およびｘｌｎ２分泌シグナルのＤＮＡ配列は、Ｔｏｒｒｏｎｅｎ、Ｍａｃｈ、Ｍｅｓｓｎｅｒ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｋａｌｋｋｉｎｅｎ、ＨａｒｋｋｉおよびＫｕｂｉｃｅｋ、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからの２つの主用なキシラナーゼ：酵素および遺伝子の両方の特徴付け」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４６１−１４６５、１９９２の図３および２にそれぞれ見出され得る（公開された、図の説明文における遺伝子同定を逆にする）。
【００５１】
当業者は、天然の分泌シグナルが、その機能を変化させることなく、１つ以上の核酸の置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを知っている。本発明の実施は、このようなキシラナーゼ分泌シグナルに対する改変を含み、そしてこれらに束縛されない。
【００５２】
ｃ．プロモーター
本発明の実施は、遺伝子構築物中のプロモーターの選択により束縛されない。しかし、好適なプロモーターは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、ｅｇ５、ｘｌｎ１およびｘｌｎ２プロモーターである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号Ｄ８６２３５の下に寄託されている。
【００５３】
当業者は、天然のプロモーターが、その機能を変化させることなく、１つ以上のヌクレオチドの置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを知っている。本発明の実施は、このようなプロモーターに対する改変を含み、そしてこれらに束縛されない。
【００５４】
ｄ．キシラナーゼ分泌シグナルと成熟β−グルコシダーゼコード領域との間のさらなる配列
実施例５、６および７に記載される遺伝子構築物は、図１−３に示されるように、ＤＮＡ配列の９つのさらなる塩基対を含む：最初の３つは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩ遺伝子の分泌シグナル後のグルタミン残基をコードし、そして残りの６つは、このキシラナーゼ分泌シグナルを、成熟β−グルコシダーゼコード領域に結合するために用いられた特有の制限部位の挿入および／または改変から得られる。これらのＤＮＡ配列は、キシラナーゼ分泌シグナルペプチドと成熟β−グルコシダーゼ酵素との間のさらなるアミノ酸の存在を生じる。これらのＤＮＡ配列は、これは天然または合成であり得るが、この構築物によりコードされるキシラナーゼ分泌シグナルに対応する成熟キシラナーゼタンパク質の１つ以上のアミノ酸をコードし得るか、またはこのキシラナーゼ分泌シグナルペプチドおよび成熟β−グルコシダーゼ酵素を連結するために必要な制限酵素部位の付加から得られ得る。本発明の実施は、このキシラナーゼ分泌シグナルと成熟β−グルコシダーゼコード領域との間のさらなるＤＮＡ配列の存在を包含するが、その存在により束縛されない。
【００５５】
ｅ．他のエレメント
この遺伝子構築物は、成熟β−グルコシダーゼコード領域のすぐ下流に転写ターミネーターを含む。本発明の実施は、転写ターミネーターの選択により束縛されず、そして任意の公知のコード領域のストップコドンの下流に（すなわち、３’末端において）ＲＮＡポリメラーゼによる転写の終結を指向するに十分な多量のＤＮＡを含み得る。実施例５〜７に記載の構築物中の成熟β−グルコシダーゼコード領域の下流に存在する転写ターミネーターは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｂｈ２遺伝子のストップコドンの３’側に１．９ｋｂのＤＮＡを含む。
【００５６】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ２転写ターミネーターの最初の５５３塩基対のＤＮＡ配列は、ＴＡＡストップコドンのすぐ下流（または３’）に位置し、Ｃｈｅｎ、ＧｒｉｔｚａｌｉおよびＳｔａｆｆｏｒｄ、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからのセロビオヒドロラーゼＩＩのヌクレオチド配列および推定一次構造」  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７４−２７８、１９８７の図２に見出され得る。
【００５７】
遺伝子構築物は、同一プラスミドベクター上の、この遺伝子構築物の上流または下流（すなわち、この構築物の５’または３’末端）に存在し得るか、または別のプラスミドベクター上のこの構築物と同時形質転換され得る、選択マーカーを含む。選択マーカーの選択は、当業者に周知であり、そして形質転換細胞に、この微生物によって通常代謝されない代謝物を利用する能力を付与するか（例えば、アセトアミダーゼをコードし、そして唯一の窒素源としてアセトアミド上で生育する能力を付与するＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｍｄＳ遺伝子）、または抗生物質耐性を付与する（例えば、ハイグロマイシン−ｂ−ホスホトランスフェラーゼをコードし、そしてハイグロマイシンに対する耐性を付与するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子）遺伝子（合成または天然）を含む。もし宿主株が、選択されたマーカーに対する機能的遺伝子を欠くならば、この遺伝子がマーカーとして用いられ得る。このようなマーカーの例は、ｔｒｐ、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｌｅｕなどを含む。従って、対応する宿主株は、選択されたマーカー、すなわち、ｔｒｐ、ｐｙｒ、ａｒｇ、ｌｅｕなどに対応する機能的遺伝子を欠如しなければならない。実施例５〜７に記載の遺伝子構築物中で用いられる選択マーカーは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターから発現されるＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子である。
【００５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ、「プラスミドがコードするハイグロマイシンＢ耐性：ハイグロマシインＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の配列、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるその発現」  Ｇｅｎｅ  ２５：１７９−１８８、１９８３の図４に見出され得；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｐｇｋプロモーターのＤＮＡ配列は、Ｖａｎｈａｎｅｎ、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ｉｌｍｅｎ、ＫｎｏｗｌｅｓおよびＰｅｎｔｔｉｌａ、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの３−ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｋ１）のプロモーター構造および発現」  Ｇｅｎｅ  １０６：１２９−１３３、１９９１の図２に見出され得る。
【００５９】
本発明の１つの好適な実施態様は、これまで記載されたβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物を含む。本発明の実施は、この構築物を作る方法により束縛されず、これは、アルカリ溶解によるＥ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの単離、プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼを用いた消化、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分離および単離、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いたＤＮＡフラグメントの連結、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡフラグメントの末端における特有の制限部位の挿入またはオリゴヌクレオチドリンカーの付加、ならびにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いたＤＮＡフラグメントの平滑化のような標準的な分子生物学の技法を含み得るが、これらに限定されない。
【００６０】
実施例１〜７は、このような遺伝子構築物を作製する手順を記載する。
【００６１】
本発明の別の好適な実施態様では、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物を微生物宿主中に導入し、そして発現して、遺伝子改変された微生物を生成する。得られる遺伝子改変された微生物は、非形質転換微生物宿主に対して増加したレベルのβ−グルコシダーゼを生成する。この遺伝子改変された微生物は、好ましくは、非形質転換微生物宿主に対して少なくとも約１０倍、より好ましくは、非形質転換微生物宿主に対して少なくとも約４０倍、そして最も好ましくは、非形質転換微生物宿主に対して少なくとも約１２０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する。
【００６２】
本発明は、当業者によく知られた微生物宿主中にβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物を導入する任意の方法を包含し、これには、細菌細胞の塩化カルシウム処理または細胞膜を弱める真菌プロトプラスト，細胞膜の融合を可能にするポリエチレングリコールの添加、エレクトロポーレーションによる細胞膜の脱極性化、または微粒子銃を用いたマイクロプロジェクタイルボンバードメントによる細胞壁および膜を通るＤＮＡの発射が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
実施例８は、粒子銃を用いて、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ胞子中に導入する手順を記載する。
【００６４】
非形質転換微生物宿主に対してβ−グルコシダーゼ産生の１０倍増強は、この株の天然の変動性を十分超える有意な増強を反映し、そして商業的に重要である。この方法によるβ−グルコシダーゼの増加の程度は１２６倍程高く、そして１０００倍以上に達し得た。β−グルコシダーゼ産生の増加の程度の測定は、実施例１１に記載のように、培養の増殖およびβ−グルコシダーゼ活性の測定による。本発明の遺伝子構築物は、約１０倍より大きい任意のレベルの増加を産生すると考えられる。酵素混合物のβ−グルコシダーゼの比活性（ＩＵ／ｍｇタンパク質）は、酵素混合物中のセルラーゼおよびその他のタンパク質の量を低下することにより増加し得ることが当業者に理解される。これは、酵素混合物の物理的および機械的分離によるか、または組換え手段によるセルラーゼまたはその他の遺伝子の欠失によってなされ得る。このような方法は、微生物によるβ−グルコシダーゼの実際の産生に影響がほとんどないかまたは全くない。しかし、これらの手順は、必要に応じて、本発明の実施に含まれ得る。
【００６５】
好適な実施態様では、微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓの種のメンバーである。これらの種は十分に適している。なぜなら、これらは、β−グルコシダーゼに加えてセルラーゼを産生するからである。さらに、以下のセルラーゼ産生株中へのＤＮＡ構築物の導入のための方法が公開されている：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａについて（Ｌｏｒｉｔｏ、Ｈａｙｅｓ、ＤｉＰｉｅｔｒｏおよびＨａｒｍａｎ、１９９３、「プラスミドおよびゲノムＤＮＡを用いるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍおよびＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｖｉｒｅｎｓの微粒子銃形質転換」  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ、ＶａｎＭｏｎｔａｇｕおよびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、１９９０、「高電圧電気パルスによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍの形質転換」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ、Ｒａｔｔｏ、ＳａｌｍｉｎｅｎおよびＫｎｏｗｌｅｓ、１９８７、「セルロース溶解性真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのための汎用形質転換系」、Ｇｅｎｅ  ６：１５５−１６４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓについて（Ｙｅｌｔｏｎ、ＨａｍｅｒおよびＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ、１９８４、「ｔｒｐＣプラスミドを用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４）、Ｆｕｓａｒｉｕｍについて（Ｂａｊａｒ、ＰｏｄｉｌａおよびＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、１９９１、「リン酸化トランス作用性因子を経由する植物シグナルによって誘導可能な真菌クチナーゼプロモーターの同定」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２−８２１２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓについて（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｋ、ＵＫ）およびＢａｃｉｌｌｕｓについて（Ｂｒｉｇｉｄｉ、ＤｅＲｏｓｓｉ、Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ、ＲｉｃｃａｒｄｉおよびＭａｔｔｅｕｚｚｉ、１９９０、「エレクトロポーレーションによるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのインタクト細胞の遺伝子形質転換」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８）。
【００６６】
これらの公開された形質転換方法において使用された遺伝子構築物は、実施例５〜７に記載されるものと、それらが、タンパク質コード領域（これは、選択マーカーをコードし得る）に連結されたプロモーターおよび転写ターミネーターを含むという点において類似する。殆どの場合、遺伝子構築物は、選択マーカー遺伝子に連結される。
【００６７】
Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓの形質転換のための公開された方法は存在しないが、他の糸状菌または細菌のための形質転換方法が、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓの株について、それについての形質転換方法が公開されたこれらの種の類似の形態および生理によって、最適化され得ると考えられる。さらに、エレクトロポレーションおよび粒子ボンバートメントのような形質転換方法を使用して、ＤＮＡを多くの異なる細胞型（哺乳動物細胞および植物細胞、細菌、酵母および真菌の細胞を含む）へと導入している。
【００６８】
好ましい実施態様において、その遺伝子改変された微生物が由来するキシラナーゼ分泌シグナルは、その微生物宿主にとってネイティブである（すなわち、キシラナーゼ分泌シグナルの供給源は、その遺伝子改変された微生物が由来する微生物宿主と同じ型の微生物宿主である）。
【００６９】
より好ましい実施態様において、その微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａである。
【００７０】
より好ましい実施態様において、その微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉである。
【００７１】
（実施例）
実施例１は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの株ＲｕｔＣ３０，Ｍ２Ｃ３８，ＢＴＲ４８からのゲノムＤＮＡの単離、およびそれらの株の遺伝子改変された誘導体を記載する。実施例２〜７は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの株Ｍ２Ｃ３８からの、ゲノムＤＮＡライブラリーの構築、種々の遺伝子のクローニング、およびいくつかの遺伝子構築物を記載する。実施例９および１１〜１５は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの株Ｍ２Ｃ３８、ＢＴＲ４８、およびＲｕｔＣ３０におけるβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物の形質転換および発現を記載する。
【００７２】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの株Ｍ２Ｃ３８およびＢＴＲ４８は、Ｉｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有の株であり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ３０に由来した（ＡＴＣＣ  ５６７６５，Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ  ａｎｄ  Ｅｖｅｌｅｉｇｈ，１９７９，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ」、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．１８１：  ２８９−３０１）。次いで、この株は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｑｍ６Ａ  に由来した（ＡＴＣＣ  １３６３１  Ｍａｎｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ，１９５７「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｉｎ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ａｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｓ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３：２６９−２７８）。
【００７３】
実施例１およびその後の実施例において、制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメントを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＰｈａｒｍａｃｉａから購入し、そしてそれら製造業者の推奨どおりに使用した。プルーフリーディング活性を有するＰｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をすべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、その製造業者のプロトコルに従って使用した。ハイグロマイシンＢを、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍから購入した。
【００７４】
（実施例１：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡの単離）
ゲノムＤＮＡを単離するために、５０ｍｌのＰｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に、無菌の播種ループを伴うＰｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒプレートから収集したＴ．ｒｅｅｓｅｉの胞子を播種した。この培養物を、２００ｒｐｍで、２〜３日間２８℃で振盪した。菌糸を、無菌のＧＦＡ微小ガラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上で濾過し、そして冷脱イオン水を用いて洗浄した。真菌のケーキ（ｃａｋｅ）を、液体窒素中で凍結させ、そして予め冷やした乳鉢および乳棒を用いて粉末へと粉砕し；粉末化したバイオマスの０．５ｇを、５ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．５および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に再懸濁した。その溶解物を遠心分離して（５０００ｇ、２０分、４℃）、細胞砕片をペレット化した。その上清を、緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ  ８．０）で飽和した１容量のフェノールで抽出し、続いて可溶性タンパク質を除くために１容量の緩衝液で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて抽出した。ＤＮＡを、０．１容量の３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２．５容量の冷９５％エタノールを添加することによって、その溶液から沈降させた。少なくとも１時間、−２０℃でインキュベートした後、そのＤＮＡを、遠心分離（５０００ｇ、２０分、４℃）によってペレット化し、１０ｍｌの７０％エタノールでリンスし、風乾し、そして１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。ＲＮＡを、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにまで添加したリボヌクレアーゼＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の添加および３７℃での１時間のインキュベーションによって消化する。１容量の緩衝液飽和フェノールおよび１容量の緩衝液飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）での連続的な抽出を用いて、そのＤＮＡ溶液から、リボヌクレアーゼを除去する。そのＤＮＡを再び、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２．５容量の冷９５％エタノールを用いて沈降させ、遠心分離によってペレット化し、７０％エタノールを用いてリンスし、風乾し、そして５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ  ８．０に再懸濁する。ＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍでその溶液の吸光度を測定することによって決定した（ｐ．Ｃ１、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９、本明細書以後Ｓａｍｂｒｏｏｋらと称する）。
【００７５】
（実施例２：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムライブラリーの構築）
２つのプラスミドライブラリーおよび１つのファージライブラリーを、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８から単離したゲノムＤＮＡを用いて構築した。これらのプラスミドライブラリーを、ベクターｐＵＣ１１９中に構築した（Ｖｉｅｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３，１９８７）。これは、以下のとおりである：  １０μｇのゲノムＤＮＡを、２０時間、３７℃で、１００μｌ容量の２ユニット／μｇのＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩの制限酵素中で、消化した。消化したＤＮＡを、０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で流した０．７５％のアガロースゲル上で分画し、そしてエチジウムブロミドで染色した。目的の遺伝子の大きさに対応するゲルスライス（公開された情報およびサザンブロットに基づく）を切り出し、そして電気溶出に供して、そのＤＮＡフラグメントを回収した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、６．２８−６．２９頁）。これらの富化されたＤＮＡ画分を、遺伝子ライブラリーを作製するために、４℃で１６時間、ベクター：インサートＤＮＡのモル比が２：１での２０〜５０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび５ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼを総容量１０〜１５μｌで含む連結反応においてｐＵＣ１１９へと連結した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１を連結反応物を用いて、Ｃｅｌｌ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、エレクトロポレートし、そして形質転換体を、７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上で選択した。
【００７６】
ファージライブラリーを、λベクターλＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）中に構築した。これは以下のとおりであった：ゲノムＤＮＡ（３μｇ）を、２ユニット／μｇ、１ユニット／μｇ、０．５ユニット／μｇおよび０．２ユニット／μｇのＢａｍＨＩを用いて、１時間３７℃にて消化して、大きさが９〜２３ｋＢのフラグメントを生成した。各消化物からのＤＮＡを、１容量のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いた抽出、続いて１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２５０μｌの９５％エタノール（−２０℃）での沈降によって、精製した。この消化したＤＮＡを、微小遠心分離によってペレット化し、０．５ｍｌの冷７０％エタノールを用いてリンスし、風乾し、そして１０μｌの無菌の脱イオン水中に再懸濁した。大きさが９〜２３ｋＢのＤＮＡフラグメントの富化は、アガロースゲル電気泳動によって確認した（０．０４ＭのＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の０．８％アガロース）。消化したＤＮＡ（０．４μｇ）を、４℃で一晩、５μｌの総容量中に２ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼおよび１ｍＭ  ＡＴＰを含有する反応液中において、ＢａｍＨＩを用いて予備消化した１μｇのλＤＡＳＨのアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。連結混合物を、ＧｉｇａＰａｃｋ（登録商標）ＩＩ  Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者のプロトコルに従って用いてファージ粒子へとパッケージングした。そのライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）を用いて力価決定し、そして３×１０5の独立クローンを含むことが見出された。
【００７７】
（実施例３：ｐＵＣ１１９ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ｃｂｈ２）遺伝子、およびβ−グルコシダーゼ（ｂｇｌ１）遺伝子のＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｍ２Ｃ３８クローンの単離）
組換えｐＵＣ１１９−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩライブラリー、組換えｐＵＣ１１９−ＢａｍＨＩライブラリーまたは組換えｐＵＣ１１９−ＥｃｏＲＩライブラリー由来のｃｂｈ１，ｃｂｈ２またはｂｇｌ１のクローンを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１形質転換体を、コロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定した。１〜３×１０4コロニーを、ＨｙＢｏｎｄTMナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ転写し；そのメンブレンをコロニー側を上にして、０．５Ｍ  ＮａＯＨ，１Ｍ  ＮａＣｌで５分間飽和したブロット紙（ＶＷＲ  ２３８）上に配置して、細菌細胞を溶解し、そしてそのＤＮＡを変性させ；次いで、そのメンブレンをコロニー側を上にして、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌで５分間飽和したブロット紙（ＶＷＲ  ２３８）上にそれらを配置することにより中和し；そのメンブレンを、３０分間風乾させて、次いでそのＤＮＡを、８０℃で２時間ベーキングすることによりそのメンブレンに、固定した。
【００７８】
32Ｐ標識したプローブを、総容量２０μｌ中に、１０〜５０ｎｇの標的ＤＮＡ、各々０．２ｍＭのｄ（ＧＣＴ）ＴＰ、０．５μＭのｄＡＴＰ、２０〜４０μＣｉのα−32Ｐ−ｄＡＴＰ、１０ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマーおよび０．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含む標識反応液中における、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩのフラグメントの富化されたプールからのｂｇｌ１、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２のコード領域の短い（０．７〜１．５ｋＢ）のフラグメントのＰＣＲ増幅によって、調製した。この反応を、６〜７サイクルの増幅に供した（９５℃、２分；５６℃、１．５分；  ７０℃、５分）。増幅した32Ｐ標識ＤＮＡを、０．５ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸および０．５ｍｇの酵母ｔＲＮＡを添加することによって沈降させた。このＤＮＡを、微小遠心分離によってペレット化し、１ｍｌ  ７０％エタノールで２回洗浄し、風乾し、そして１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。
【００７９】
組換えｐＵＣ１１９プラスミドが固定されたナイロンメンブレンを、熱シールしたバッグ中で１時間、６０〜６５℃にて、１００  μｇ／ｍｌの変性させ剪断したサケ精子ＤＮＡを有する１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．５中で予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、熱シールしたバッグ中にて、５０μｇ／ｍｌのみの変性させ、剪断したサケ精子ＤＮＡおよび５×１０6〜５×１０7ｃｐｍの変性したｂｇｌ１プローブ、ｃｂｈ１プローブまたはｃｂｈ２プローブを有する同じ緩衝液中で１６〜２０時間、６０〜６５℃にて、実施した。メンブレンを、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＳＤＳを用いて、６０℃にて１５分間、１回洗浄し、０．３Ｍ  ＮａＣＬ、０．５％  ＳＤＳを用いてそれぞれ６０℃にて１５分間、２回洗浄し、そして０．０３Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＳＤＳを用いて５５℃にて１５分間、１回洗浄した。メンブレンを、再度、熱シールしたバッグ中におき、そしてＫｏｄａｋ  ＲＰ  Ｘ線フィルムに１６〜４８時間、−７０℃にて曝露した。Ｘ線フィルムを、製造者のプロトコルに従って現像した。強力なシグナルまたは弱いシグナルを与えるコロニーを拾い、そして７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した２×ＹＴ培地中で培養した。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物から、アルカリ溶解方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１．２５−１．２８頁）を用いて単離し、そして制限消化、サザンハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８−９．４４頁）およびＰＣＲ分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１４．１８−１４．１９頁）により分析した。
【００８０】
ｂｇｌ１遺伝子を有するクローンを、公開されたｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔｔら）のｂｐ  ４６２−１４０３を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて調整された１．０ｋｂのｂｇｌ１プローブを用いる、ｐＵＣ１１９−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩライブラリー（実施例２）のコロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定した。ｂｇｌ１クローンである  ｐＪＥＮ２００を、単離した。これは、プロモーター、構造遺伝子および終結配列に対応する６．０  ｋｂのＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントを含んでいた。ｃｂｈ１遺伝子を有するクローンを、公開されたｃｂｈ１配列（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓｃｈｗｅｉｋａｒｔ，Ｌａｄｎｅｒ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｋｗｏｋ，ＭｙａｍｂｏおよびＩｎｎｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｏ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌｙａｓｅ  １  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｌ２７」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６９１−６９６，１９８３  本明細書以後、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒらと称する。）のｂｐ  ５９７−１３６１を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した０．７ｋｂのｃｂｈ１プローブを用いる、ｐＵＣ１１９−ＢａｍＨＩライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定した。ｃｂｈ１クローンであるｐＣＯＲ１３２を、単離した。これは、プロモーター（４．７ｋｂ）および１ｋｂのｃｂｈ１構造遺伝子に対応する５．７ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントを含んでいた。これから、ｃｂｈ１プロモーター（２．１ｋｂ）およびｃｂｈ１コード領域の５’末端（０．４ｋｂ）を含む２．５  ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＵＣ１１９中にサブクローニングして、ｐＣＢ１５２を生成した。ｃｂｈ２遺伝子を有するクローンを、公開されたｃｂｈ２配列（Ｃｈｅｎ，ＧｒｉｔｚａｌｉおよびＳｔａｆｆｏｒｄ、「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：  ２７４−２７８、  １９８７、本明細書以後、Ｃｈｅｎらと称する）のｂｐ  ５８０−２１１４を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した１．５ｋｂ  ｃｂｈ２のプローブを用いる、ｐＵＣ１１９−ＥｃｏＲＩライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションによって、同定した。ｃｂｈ２クローンであるｐＺＵＫ６００を単離した。これは、プロモーター（６００ｂｐ）、構造遺伝子（２．３ｋｂ）およびターミネータ−（１．９ｋｂｐ）に対応する４．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいた。
【００８１】
（実施例４：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｍ２Ｃ３８  ｃｂｈ１のターミネーター、キシラナーゼＩＩ（ｘｌｎ２）遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ｐｇｋ  ｐ）のクローニング）
ジゴキシゲン−１１−ｄＵＴＰ標識プローブを、ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いたランダムプライム標識により、そして製造者のプロトコルに従ってｃｂｈ１遺伝子、ｘｌｎ２遺伝子およびｐｇｋ遺伝子のＰＣＲ増幅したコード領域から調製した。ｃｂｈ１遺伝子、ｘｌｎ２遺伝子およびｐｇｋ遺伝子を含むゲノムクローンを、λＤＡＳＨライブラリーのプラークリフトハイブリダイゼーションによって同定した。目的の各遺伝子について、１×１０4のクローンをＮｙｔｒａｎ（登録商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ）ナイロンメンブレンに転写した。このファージ粒子を溶解し、そしてそのファージＤＮＡを、そのメンブレンをプラーク側を上にして、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、  １Ｍ  ＮａＣｌで飽和させたブロット紙（ＶＷＲ２３８）上に５分間置くことによって変性させ；次いで、そのメンブレンを、プラーク側を上にしてそのメンブレンを１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ  ７．５および１Ｍ  ＮａＣｌで５分間飽和させたブロット紙（ＶＷＲ２３８）上に置くことによって、中和し；そのメンブレンを、３０分間風乾させ、次いで、ＤＮＡを、８０℃で２時間ベーキングすることによってそのメンブレンに固定させた。このメンブレンを、熱シールしたバッグ中で、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、１％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性させ、剪断したサケ精子ＤＮＡの溶液中において、６５℃にて２時間予備ハイブリダイズした。次いで、このメンブレンを、熱シールしたバッグ中で、５０μｇ／ｍｌの変性させ、剪断したサケ精子ＤＮＡおよび０．５μｇのジゴキシゲン−ｄＵＴＰ標識したプローブを含む同じ緩衝液中において、６５℃にて一晩ハイブリダイズさせた。このメンブレンを、２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ中で室温にて１５分間、２回洗浄し、そして０．２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ中で６５℃にて１５分間、２回洗浄し、そして２×ＳＳＰＥ中で５分間、１回洗浄した。陽性にハイブリダイズしたクローンを、抗ジゴキシゲニン／アルカリホスファターゼ抗体結合体、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートおよび４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いた反応により製造者のプロトコルに従って、同定した。陽性にハイブリダイズしたクローンを、ジゴキシゲン−ｄＵＴＰ標識プローブを用いた２回のスクリーニングによってさらに精製した。個々のクローンを単離し、そしてファージＤＮＡを、ＣｓＣｌ勾配工程を、１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いた抽出に置き換えたことを除いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）２．１１８−２．１２１頁に記載されるように精製した。このＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよびｐＨ５．２、ならびに２．５容量の冷９５％エタノールを用いて沈降させた。沈降したファージＤＮＡを，０．５ｍｌの冷７０％エタノールを用いて洗浄し、風乾させ、そして５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中に再懸濁した。目的の遺伝子を含��制限フラグメントを、精製したファージＤＮＡの制限消化、およびλＤＡＳＨライブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じジゴキシゲン−ｄＵＴＰ標識したプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８−９．４４頁）によって同定した。このメンブレンをハイブリダイズさせ、そして陽性にハイブリダイズするフラグメントを、プラークリフトについて使用したのと同じ方法によって可視化した。一旦各λＤＡＳＨクローンからの所望の制限フラグメントが同定されると、その制限消化を繰り返し、そのフラグメントを、ＴＡＥ中にて０．８％のアガロースゲル上で分離し、そして所望のバンドを切り出した。このＤＮＡを、ゲルスライスから、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ  ＢａｎｄＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、製造者のプロトコルに従って用いて溶出した。ｃｂｈ１遺伝子を有するクローンを、公開されたｃｂｈ１配列（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら）のｂｐ  ４５−２２２０を含むｃｂｈ１プローブを用いたλＤＡＳＨライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーション（実施例２）によって同定した。ｃｂｈ１コード領域（０．５ｋｂ）およびｃｂｈ１ターミネーター（１．３ｋｂ）の３’末端を含む１．８  ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを、λＤＡＳＨ  ｃｂｈ１クローンから精製したファージＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングして、プラスミドｐＣＢ１Ｔａを作製した。ｘｌｎ２遺伝子を有するクローンを、公開されたｘｌｎ２配列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎ，Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｆａｇｅｒｓｔｒｏｍ，ＳｕｏｍｉｎｅｎおよびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ、「Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｅｎｄｏｘｙｌａｎａｓｅ  ＩＩ（ｐＩ  ９）ｇｅｎｅ  ｘｌｎ２」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：  ４９７−５０３、１９９３、本明細書中で以後Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎ  らと称する）のｂｐ  １００−７８３を含むｘｌｎ２プローブを用いたλＤＡＳＨライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーション（実施例２）によって同定した。ｘｌｎ２遺伝子のプロモーター（２．３ｋｂ）、コード領域（０．８ｋｂ）およびターミネータ−（２．６ｋｂ）を含む５．７  ｋｂ  ＫｐｎＩフラグメントを、λＤＡＳＨ  ｘｌｎ２クローンから精製したファージＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントを、ｐＵＣ１１９のＫｐｎＩ部位へサブクローニングして、プラスミドｐＸＹＮ２Ｋ−２を生成した。ｐｇｋ遺伝子を有するクローンを、公開されたｐｇｋ配列（Ｖａｎｈａｎｅｎ，Ｐｅｎｔｔｉｌａ，ＬｅｈｔｏｖａａｒａおよびＫｎｏｗｌｅｓ、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ（ｐｇｋ）ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１８１−１８６，１９８９）のｂｐ  ４−１５８６を含むｐｇｋ１プローブ���用いた、λＤＡＳＨライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーション（実施例２）によって同定した。ｐｇｋ遺伝子のプロモーター（２．９ｋｂ）、コード領域（１．６ｋｂ）およびターミネータ−（０．５ｋｂ）を含む５．０  ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、λＤＡＳＨ  ｐｇｋクローンから精製したファージＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントを、ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、プラスミドｐＧＫ５．０を作製した。
【００８２】
（実施例５：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶの構築）  本実施例は、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセロビオヒドロラーゼＩプロモーターおよび分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含有するベクターの構築を記載する。
【００８３】
β−グルコシダーゼ分泌シグナルを含まないｂｇｌ１コード領域（ｂｐ４７４−２６７９）を含むＤＮＡフラグメントを、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、コードされたβ−グルコシダーゼのＶａｌ３２の５’側のＳｐｈ１部位またはｂｇｌ１停止コドンの３’側のＫｐｎＩ部位のいずれかを含む、公開されたｂｇｌ１配列に相同なプライマーを用いて、ｐＪＥＮ２００鋳型からＰＣＲによって増幅した。この増幅されたフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＣＢ２１９Ｎに挿入し、ｐＢｇｓｔｒｆを生成した。ｐＣＢ２１９Ｎを作製するために、ｃｂｈ２ターミネーターフラグメントを、５’末端でＫｐｎＩ部位を含む、公開されたｃｂｈ２遺伝子３’非翻訳領域（Ｃｈｅｎら、１９８７）のｂｐ２２２６−２２４２に相同なプライマー、およびｐＵＣ順方向プライマー（カタログ番号１２２４、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（ｐＺＵＫ６００におけるｃｂｈ２の３’末端でＥｃｏＲＩ部位の下流にアニールする）を用いて、ｐＺＵＫ６００鋳型から増幅した。このフラグメントを、操作されたＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位で消化し、ｐＵＣ１１９の対応する部位に挿入し、ｐＣＢ２１９を生成した。ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター（カタログ番号３５３１０−０１０、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を、ｐＣＢ２１９の特有のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＣＢ２１９Ｎを生成した。ｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルを含有するフラグメントを、コードされたＣＢＨ１のＳｅｒ１９の３’側のＳｐｈＩ部位を含むｃｂｈ１特異的プライマー（公開されたｃｂｈ１配列のｂｐ２４９−２８４、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、１９８３）、およびｐＵＣ順方向プライマー（カタログ番号１２２４、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（ｐＣＢ１５２におけるｃｂｈ１の５’末端でＥｃｏＲＩ部位の上流にアニールする）を用いて、ｐＣＢ１５２から増幅した。ｃｂｈ１プロモーター＋分泌シグナルＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＢＲ３２２Ｌ（ＳｐｈＩ部位とＳａｌＩ部位との間の領域が、ＳｐｈＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩリンカーで置換されたｐＢＲ３２２の誘導体）において対応する部位に挿入し、ｐＢＲ３２２ＬＣＳを生成した。発現カセットを作製するために、ｂｇｌ１コード領域およびｃｂｈ２ターミネーターを、ｐＢｇｓｔｒｆから４．１ｋｂのＳｐｈＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして単離し、ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＢＲ３２２ＬＣＳに挿入した。ｃｂｈ１分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼの接合点で正確な読み枠を維持するために、得られたプラスミドｐＣＢＧｓｔｒｆを、特有のＳｐｈＩ部位で線状化し、そしてＳｐｈＩ部位を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。次いで、得られたプラスミドｐＣＢＧ１を、ｃｂｈ２ターミネーターの３’末端で特有のＮｏｔＩ部位を、ＸｈｏＩリンカー（カタログ番号１０７３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の付加により特有のＸｈｏＩ部位へ変換することによりさらに改変した。最終プラスミドｐＣＢＧ１−ｘｈｏは、発現カセットプラスミドである。
【００８４】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉについての選択マーカーとして使用されるＥ．ｃｏｌｉヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を、プラスミドｐＶＵ１００５（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、ＬｅｅおよびＢｅｄｂｒｏｏｋ、「Ａ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：２９９−３０２、１９８９）からＰｗｏポリメラーゼで増幅した。プライマーを、それぞれｈｐｈコード領域（公開されたｈｐｈ配列のｂｐ２１１−１２３６、ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ、「Ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  ｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」  Ｇｅｎｅ  ２５：１７９−１８８，１９８３）の５’末端および３’末端にＳｐｈＩ部位およびＫｐｎＩ部位を導入するように設計した。ＰＣＲ産物をＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてｐＵＣ１１９のポリリンカー領域における対応する部位に挿入した。得られたプラスミドｐＨＰＴ１００を、選択カセットの構築のための出発プラスミドとして使用した。２つの新規なリンカー領域を、プロモーターおよびターミネーターフラグメントのクローニングを容易にするために、このプラスミドに導入した。ｐＨＰＴ１００に残存するｐＵＣ１１９ポリリンカーのＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間に挿入したＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｃＩリンカーと同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＳｐｈＩリンカーを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳｐｈＩ部位との間に挿入した。この構築物を、ｐＨＰＴ１０２と称した。ｐｇｋプロモーターを増幅するために使用されるプライマー（Ｖａｎｈａｎｅｎ、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ｉｌｍｅｎ、ＫｎｏｗｌｅｓおよびＰｅｎｔｔｉｌａ、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ（ｐｇｋ１）  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」、Ｇｅｎｅ  １０６：１２９−１３３、１９９１）を、それぞれ、プロモーターの−９７０位および＋１位にＸｈｏＩ部位およびＳｐｈＩ部位を導入するように設計した。続いて、これらの部位を、ｐｇｋプロモーターをｐＨＰＴ１０２のＸｈｏＩ部位およびＳｐｈＩ部位に挿入してｐＨＰＴ１１５を生成するために使用した。１．３ｋｂのｃｂｈ１ターミネーターフラグメントを、ｂｐ１８７７−１８８２でＫｐｎＩ部位を含有するｃｂｈ１の３’非翻訳領域（公開されたｃｂｈ１配列のｂｐ１８６４−１８９９）にアニールするプライマー、およびｐＵＣ逆方向プライマー（カタログ番号１８４３２−０１３、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｐＣＢ１Ｔａにおけるｃｂｈ１の３’末端でＥｃｏＲＩ部位の下流にアニールする）を使用して、ｐＣＢ１ＴａからＰｗｏポリメラーゼによって増幅した。ｃｂｈ１ターミネーターＰＣＲ産物をＫｐ��Ｉで消化し、そしてｐＨＰＴ１１５の特有のＫｐｎＩ部位に挿入し、選択カセットプラスミドｐＨＰＴ１３６を生成した。
【００８５】
形質転換ベクターを作製するために、ｐＣＢＧ１−Ｘｈｏからの発現カセットを５．６ｋｂのＸｂａＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、そしてｐＨＰＴ１３６の選択カセットの上流の特有のＸｂａＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入した。最終形質転換ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶ（図１に示す）を、以下、実施例９に記載するように、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｍ２Ｃ３８に環状プラスミドとして導入した。
【００８６】
（実施例６：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＸＢＧ１−ＴＶの構築）  本実施例は、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩＩプロモーターおよび分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含有するベクターの構築を記載する。
【００８７】
β−グルコシダーゼコード領域（ｂｐ４７４−２６８０）を、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、公開されたｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔｔら）におけるｂｐ４７４のすぐ上流にＸｂａＩ部位を、およびｂｐ２６８０のすぐ下流にＫｐｎＩ部位を挿入するためのプライマーを用いて、ゲノムｂｇｌ１クローンｐＪＥＮ２００から増幅した。平滑末端化したＰＣＲ産物を、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＢＧｍ．ｓと称されるプラスミドを生成した。ＸｂａＩ部位を、Ｖａｌ３２で成熟β−グルコシダーゼの開始のすぐ上流にあるように操作したので、クローニングされたフラグメントは、β−グルコシダーゼ分泌シグナルを含まなかった。プラスミドｐＣＢｍ．ｓを、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして分泌シグナルを含まないｂｇｌ１コード領域を含む２．２ｋｂフラグメントを単離し、そしてプラスミドｐＣＢ２１９Ｎ（上記、実施例５に記載）におけるｃｂｈ２ターミネーターの上流のＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢＧ２Ｘを生成した。ｘｌｎ２遺伝子のプロモーターおよび分泌シグナルを含む２．３ｋｂフラグメント（ｂｐ−２１５０から＋９９、ここで＋１は、ＡＴＧ開始コドンを示す）を、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、公開されたｘｌｎ２配列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）のｂｐ１０３のすぐ下流のＮｈｅＩ部位を含むｘｌｎ２特異的プライマー、およびｐＵＣ逆方向プライマー（カタログ番号１８４３２−０１３、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｘｌｎ２遺伝子の５’末端でＫｐｎＩ部位の上流にアニールする）を用いて、ゲノムｘｌｎ２サブクローンｐＸＹＮ２Ｋ−２から増幅した。このｘｌｎ２  ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ（これをｐＸＹＮ２Ｋ−２からのｐＵＣ１１９ポリリンカーの一部として増幅する）およびＮｈｅＩで消化し、そしてプラスミドｐＢＲ３２２Ｌ（上記実施例５に記載）に挿入し、ｐＢＲ３２２ＬＸＮを生成した。次いで、ｐＢＲ３２２ＬＸＮのＥｃｏＲＩ部位を、クレノウで平滑化し、そしてＳｐｅＩリンカー（カタログ番号１０８６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を付加し、ｐＢＲ３２２ＳｐＸＮを生成した。ｐＢＧ２Ｘプラスミドを、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断し、そして４．２ｋｂフラグメント（ｂｇｌ１コード領域、続いてｃｂｈ２ターミネーターを含む）を単離した。このフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＢＲ３２２ＳｐＸＮに挿入した（ＮｈｅＩおよびＸｂａＩは、適合性の突出部を有する）。このクローニングは、成熟β−グルコシダーゼに直接的にキシラーゼ分泌シグナルの融合を生じ、完全発現カセットｐＸＢＧ−２を作製した。
【００８８】
上記実施例５に記載の選択カセットプラスミドｐＨＰＴ１３６におけるｃｂｈ１ターミネーターを、ｘｌｎ２転写ターミネーターを含む２．６ｋｂのＫｐｎＩフラグメントと置換した。ｘｌｎ２ターミネーターを、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、公開されたｘｌｎ２配列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）のｂｐ７８０のすぐ下流にＫｐｎＩ部位を導入するプライマー、およびｐＵＣ順方向プライマー（カタログ番号１８４３１−０１５、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｐＸＹＮ２Ｋ−２におけるｘｌｎ２遺伝子の３’末端の下流にアニールする）を用いて、ゲノムサブクローンｐＸＹＮ２Ｋ−２から増幅した。ｘｌｎ２ターミネーターＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化し、そしてｐＵＣ１１９中のｐｇｋ促進ｈｐｋ遺伝子を含有するｐＨＰＴ１３６由来の５．１ｋｂのＫｐｎＩフラグメントに連結して選択カセットプラスミドｐＨＰＴ１３６Ｘを生成した。
【００８９】
形質転換ベクターの構築は、選択カセット由来のｐｇｋプロモーターのすぐ上流への発現カセットの挿入を包含した。発現カセットプラスミドｐＸＢＧ２をＮｏｔＩで消化し、そして末端をクレノウを用いて平滑化し、次いでＳｐｅＩで消化した。選択カセットｐＨＰＴ１３６Ｘを、ＸｈｏＩでの消化、次いで、反応物を充填して平滑末端を作出し、次いでＸｂａＩで消化することにより、同様な様式で調製した。これらの２つのフラグメントの平滑−粘着連結を行い、ｐＸＢＧ２由来の６．５ｋｂのＳｐｅＩ／平滑化ＮｏｔＩフラグメントをｐＨＰＴ１３６ＸのＸｂａＩ／平滑化ＸｈｏＩフラグメントに連結した（ＳｐｅＩおよびＸｂａＩは、適合性の突出部を有する）。最終的な形質転換ベクターｐＸＢＧ−ＴＶ（図２に示す）を、以下、実施例９に記載するように、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｍ２Ｃ３８の形質転換の前に、その特有のＮｏｔＩで線状化した。
【００９０】
（実施例７：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶの構築）
本実施例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセロバイオヒドロラーゼ１プロモーター、キシラナーゼＩＩ分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含有するベクターの構築を記載する。
【００９１】
本実施例は、ｂｇｌ発現におけるｃｍｈ１プロモーターおよびｘｌｎ２分泌シグナルの組み合わせ効果を試験するために実施した。ｃｂｈ１プロモーターのｂｐ−１３９９から−２０４を含む１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｂｐ−１３９３から−１３８８に特有のＸｂａＩ部位を挿入するために、ｃｂｈ１プロモーター含有プラスミドｐＢＲ３２２ＬＣＳ（実施例５）を鋳型として用いてＰＣＲにより増幅した。この改変されたｃｂｈ１プロモーターフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＸＢＧ１（実施例６）においてｘｌｎ２プロモーターのｂｐ−１４００〜−１２１を置換して、新規な発現カセットプラスミドｐＣ／ＸＢＧ１を生成するために使用した。ｐＣ／ＸＢＧ１からの６．４ｋｂ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化し、続いてＮｏｔＩ部位をクレノウフラグメントで平滑化し、続いてＳｐｅＩで消化することによって単離した。次いで、このフラグメントを、ｐＨＰＴ１３６Ｘにおいてｈｐｈ選択カセットの上流に平滑／粘着連結により挿入した。このプラスミドは、ＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩ部位でクレノウで平滑化し、そしてＸｂａＩで消化しておいたものである。最終的な形質転換ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶ（受託番号２０９６１３、寄託日１９９８年２月３日、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ、Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５２  ＵＳＡ）（図３に示す）を、以下、実施例９に記載するように、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｍ２Ｃ３８の形質転換の前に、ｃｂｈ１プロモーターの５’末端およびｘｌｎ２ターミネーターの３’末端の特有のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位で線状化した。
【００９２】
（実施例８：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット）
実施例１に記載のように、各株からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロットのために、１μｇのＤＮＡを、少なくとも２時間、３７℃で３〜１０ユニットの制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして消化産物を０．０４ＭＴｒｉｓ酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で０．８％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡを、キャピラリー転移によりナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に転写した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８〜９．４４頁）。図４および５において、レーン２、４、６、８、１０、および１２は、消化されたＭ２Ｃ３８  ＤＮＡを含み、そしてレーン３、５、７、９、１１、および１３は、消化されたＲｕｔＣ３０のＤＮＡを含む。使用した制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨＩ（レーン２および３）、ＥｃｏＲＩ（レーン４および５）、ＸｂａＩ（レーン６および７）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン８および９）、ＳｓｔＩ（レーン１０および１１）およびＫｐｎＩ（レーン１２および１３）であった。両図において、レーン１は、λＨｉｎｄＩＩＩ分子サイズ標準（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５６１２−０１３）を含み、そしてレーン１４は、プローブを作製するために使用した１ｎｇの未標識フラグメントを含む。サザンブロットを、ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて調製されたジゴキシゲン−１１−ｄＵＴＰ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。図４において使用したプローブについての鋳型は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｘｌｎ２プロモーターおよび分泌シグナル（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）を含む２．３ｋｂフラグメントであった。図５において使用したプローブについての鋳型は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｂｇｌ２成熟コード領域（Ｂａｒｎｅｔｔら）のｂｐ５７４−２６７９を含む２．１ｋｂフラグメントであった。ポストハイブリダイゼーション洗浄後、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ複合体を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とのインキュベーション、続いて５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートおよび４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって可視化した。
【００９３】
（実施例９：マイクロプロジェクタイルボンバードメントによるＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ３０、Ｍ２Ｃ３８、およびＢＴＲ４８の形質転換）
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０、Ｍ２Ｃ３８、およびＢＴＲ４８の胞子を形質転換するために、バイオリスティックＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステム（ＢｉｏＲａｄ；Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用し、そして全ての手順を、製造業者により推奨されるように実施した。Ｍ−１０タングステン粒子（０．７μｍの直径中央値）をマイクロキャリアとして使用した。以下のパラメーターを、形質転換の至適化において使用した：破裂圧１１００ｐｓｉ、ヘリウム圧２９ｍｍＨｇ、ギャップ距離０．９５ｃｍ、マイクロキャリア移動距離１６ｍｍ、および標的距離９ｃｍ。ポテトデキストロール寒天培地（ＰＤＡ）上に１×１０6胞子を有するプレートを調製した。ボンバードメントプレートを、２８℃でインキュベートした。ボンバードメント４時間後、胞子を、８０ユニット／ｍｌのＨｙｇＢを補充した選択的ＰＤＡ培地の重層により、一次選択に供する。ボンバードメントプレートを２８℃でインキュベートする。形質転換体を、３〜６日増殖後に観察し得る；しかし、胞子形成を達成するためには、さらなるインキュベーションが必要である。
【００９４】
胞子形成が生じた後、二次選択プロセスを実施して、個々の形質転換体を単離する。胞子を、接種ループを用いてプレートから採集し、そして滅菌水中に再懸濁する。次いで、この懸濁液を、ガラス製マイクロファイバーで栓をした滅菌注射器で濾過する。これは、望ましくない菌糸を保持する一方で、胞子を通過させる。この懸濁液中の胞子の濃度の決定が必要であり、そして続く希釈液を、０．７５％Ｏｘｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ）およびＨｙｇＢ（４０ユニット／ｍＬ）を補充したＰＤＡプレート上にプレートして、１プレート当たり２０〜５０の胞子を得る。Ｏｘｇａｌｌはコロニー制限因子（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｒ）として作用し、それにより、これらの二次選択プレート上での個々のコロニーの単離を可能にする。単離されたコロニーは、２〜３日後に観察され得る。
【００９５】
（実施例１０：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０、ＲＣ３００、ＲＣ−３０２、Ｍ２Ｃ３８、ＲＭ４−３００、Ｒ４−３０１、ＲＭ４−３０２、ＢＴＲ４８、およびＲＢ４−３０１から単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析）
実施例１に記載のように、各株からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロットのために、１μｇのＤＮＡを、少なくとも２時間、３７℃で３〜１０ユニットのＫｐｎ１またはＸｂａ１で消化し、そして消化産物を０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で０．８％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡを、キャピラリー転移によりナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に転写した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８〜９．４４頁）。サザンブロットを、ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて調製したジゴキシゲン−１１−ｄＵＴＰ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。鋳型は、公開されたｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔｔら）のｂｐ１２１５−２４６４を含む１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントであった。ポストハイブリダイゼーション洗浄後、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ複合体を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とのインキュベーション、続いて化学発光試薬ＣＳＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）との反応、およびＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）への曝露によって可視化した。結果を表１に要約する。
【００９６】
【表１】
0004026108.tif 000002
（実施例１１：液体培養におけるβ−グルコシダーゼの産生）
本実施例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株により産生された酵素β−グルコシダーゼの量を決定するために使用した方法を記載する。
【００９７】
各培養物の増殖のためにＰＤＡプレートにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの個々のコロニーを移す。胞子形成は、培養物がβ−グルコシダーゼおよびセルラーゼを産生する能力を試験することにおいて使用される振盪フラスコの均一な接種に必要である。培養培地は、以下で構成される：
【００９８】
【化１】
0004026108.tif 000003
*微量元素溶液は、５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；１．４ｇ／ｌのＺｎＳＯ4・７Ｈ4Ｏを含む。
**５ｇ／ｌのグルコース  プラス  １０ｇ／ｌのＳｏｌｋａフロック（ｃｂｈ１または他のセルラーゼプロモーターを用いる場合）、１０ｇ／ｌのキシラン（ｘｌｎ２プロモーターを用いる場合）、またはβ−グルコシダーゼの発現を指示するプロモーターに適切な他の炭素供給源。この炭素供給源は、ｐＨ２〜７で水溶液として別々に滅菌され得、そして残りの培地に添加され得る。
【００９９】
１リットルのフラスコあたりの液体容量は、１５０ｍＬであり、最初のｐＨは、５．５であり、そしてそれぞれのフラスコを、接種前に１２１℃で３０分間、蒸気オートクレーブにより滅菌する。
【０１００】
非形質転換（すなわち、ネイティブ）細胞および形質転換細胞の両方について、芽胞を、実施例９に記載のようにＰＤＡプレートから単離し、そして１〜２×１０6個の芽胞を使用してそれぞれのフラスコに接種する。このフラスコを６日間、２８℃の温度で２００ｒｐｍで振盪する。分泌タンパク質を含む濾過物を、ＧＦ／Ａ  ガラス微小繊維フィルター（ｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅ  ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ｗｈａｔｍａｎ）を通した濾過により収集した。このタンパク質濃度は、標準としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  セルラーゼを用いるＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（カタログ番号５００−０００１）を用いて決定する。β−グルコシダーゼ活性は、実施例１６に記載のように決定する。
【０１０１】
形質転換体を、培養濾過物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）により分割された培養濾過物のβ−グルコシダーゼ活性のＩＵ／ｍｌにより決定する場合、非形質転換宿主株よりも少なくとも１０倍多くβ−グルコシダーゼ（ＩＵ／ｍｇ）を産生する能力についてスクリーニングした。
【０１０２】
（実施例１２：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０、ＲＣ−３００およびＲＣ−３０２によるβ−グルコシダーゼの産生）
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおけるタンパク質過剰発現のためのｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルを用いる以前の成功に基づき、成熟β−グルコシダーゼコード領域を、図１に示されそして実施例５に記載される遺伝子構築物（ｐＣＢＧ１−ＴＶ）におけるｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルの下流においた。このベクターを、微粒子銃（実施例９）によりＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ３０に導入し、得られた形質転換体ＲＣ−３００は、親株よりも７倍多くβ−グルコシダーゼ活性を生じた（表２）。この７倍の増加は、形質転換ベクターの１つのコピーの宿主染色体への組み込みから生じた（実施例１０、表１）。β−グルコシダーゼがｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルを用いて発現される構築物の１つのコピーから得られたβ−グルコシダーゼ活性における、より大きい増加は、この戦略がＢａｒｎｅｔｔら、およびＦｏｗｌｅｒらにより用いられた戦略よりも良好であることを示唆する。彼らの戦略は、構築物（ここでβ−グルコシダーゼは、それ自身のプロモーターおよび分泌シグナルから発現される）の１０〜１５コピーからのβ−グルコシダーゼ活性においてわずか５倍の増加しか生じなかった。しかし、β−グルコシダーゼ活性において得られた７倍の増加は、セルロース加水分解ためのβ−グルコシダーゼの不足を解消するにはまだ十分ではなかった。
【０１０３】
形質転換されていないＴ．ｒｅｅｓｅｉのＲｕｔＣ３０株を、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩ分泌シグナルに連結した成熟Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのβ−グルコシダーゼ酵素をコードするベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｖｂａ１）−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形質転換した（実施例９）。
【０１０４】
非形質転換株ＲｕｔＣ３０および得られたこの宿主由来の形質転換株（ＲＣ−３０２）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として１０ｇ／ＬのＳｏｌｋａ  フロックおよび５ｇ／Ｌのグルコースを用いて培養した。結果を表２に示す。
【０１０５】
非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１４ＩＵのβ−グルコシダーゼを産生した。
【０１０６】
ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＣ−３０２は、１９ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約１３６倍の改善を示し、このことはセルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。
【０１０７】
ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＣ−３０２は、ＣＢＨ１プロモーターおよびＣＢＨ１分泌シグナルを有する最良のＲｕｔＣ３０形質転換株よりも約１９倍多いβ−グルコシダーゼ活性を産生した。
【０１０８】
【表２】
0004026108.tif 000004
（実施例１３：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、Ｍ２Ｃ３８株およびＲＭ４−３０２株によるβ−グルコシダーゼの産生）
ｐＣＢＧ１−ＴＶベクター（β−グルコシダーゼがＣＢＨ１プロモーターおよび分泌シグナルから発現される）（図１および実施例５）を、微粒子銃によりＴ．ｒｅｅｓｅｉのＭ２Ｃ３８に導入した（実施例９）。得られた形質転換体ＲＭ４−３００は、親株よりも約７〜１２倍多くβ−グルコシダーゼ活性を産生した（表３）。
【０１０９】
非形質転換体のＴ．ｒｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８を、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩ分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼ酵素をコードするベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形質転換した（実施例９）。
【０１１０】
非形質転換株Ｍ２Ｃ３８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＭ４−３０２）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として１０ｇ／ＬのＳｏｌｋａフロックおよび５ｇ／Ｌのグルコースを用いて培養した。結果を、表３に示す。
【０１１１】
非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．３５ＩＵのβ−グルコシダーゼを産生した。
【０１１２】
ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＭ４−３０２は、１４．１ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約４０倍の改善を示し、このことはセルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。
【０１１３】
ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＭ４−３０２は、ＣＢＨ１プロモーターおよびＣＢＨ１分泌シグナルを有する形質転換体よりも約３倍多いβ−グルコシダーゼ活性を産生した。これは、ＣＢＨ１プロモーターおよび分泌シグナルが、加水分解におけるセロビオース産生を完全に抑制するためのβ−グルコシダーゼの十分な産生を導かなかったので、重大な差異である。
【０１１４】
【表３】
0004026108.tif 000005
（実施例１４：キシラン炭素供給源を用いる、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＭ２Ｃ３８株およびＲＭ４−３０１株によるβ−グルコシダーゼの産生）
非形質転換Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８を、キシラナーゼプロモーターおよび分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼをコードするベクターｐＸＢＧ１−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形質転換した（実施例９）。
【０１１５】
非形質転換株Ｍ２Ｃ３８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＭ４−３０１）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として５ｇ／Ｌのグルコースおよび１０ｇ／Ｌのキシランを用いて培養した。結果を、表４に示す。
【０１１６】
非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１６ＩＵのβ−グルコシダーゼを産生した。キシラナーゼＩＩプロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＭ４−３０１は、２０．４ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約１２７倍の改善を示し、このことは、セルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。
【０１１７】
【表４】
0004026108.tif 000006
（実施例１５：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、ＢＴＲ−４８株およびＲＢ４８−３０１株によるβ−グルコシダーゼの産生）
非形質転換Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＢＴＲ４８を、キシラナーゼプロモーターおよび分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼをコードするベクターｐＸＢＧ１−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形質転換した。
【０１１８】
非形質転換株ＢＴＲ−４８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＢ４８−３０１）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として５ｇ／Ｌのグルコースおよび１０ｇ／ＬのＳｏｌｋａフロックを用いて培養した。結果を、表５に示す。
【０１１９】
非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１６ＩＵのβ−グルコシダーゼを産生した。キシラナーゼＩＩプロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換体ＲＢ４８−３０１は、約２１．９ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約１３６倍の改善を示し、このことは、セルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。
【０１２０】
【表５】
0004026108.tif 000007
（実施例１６：酵素混合物のβ−グルコシダーゼ活性の測定）
酵素のβ−グルコシダーゼ活性を、以下のようにＧｈｏｓｅ、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７〜２６８（１９８７）の手順を用いて測定する。酵素のサンプルを、０．５ｍｌの容量に、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，８中で、いくつかの濃度に希釈する。希釈の都合のよい範囲は、サンプルの推定した活性の３〜２４倍である。例えば、１０ｕｎｉｔ／ｍｌのサンプルは、１：３０〜１：２４０に希釈するべきである。用いる希釈にかかわらず、クエン酸緩衝液の０．５ｍｌサンプルを、それぞれの酵素の試験管に添加する。基質を１５ｍＭ（５．１３ｇ／Ｌ）のセロビオースとして調製する。希釈酵素の保存液および基質を別々に５分間、５０℃に事前加熱し、次いで、基質の０．５ｍｌのアリコートを酵素の各試験管に添加する。これらの試験管を５０℃で３０分間インキュベートする。この反応を、５分間、沸騰水浴に各試験管を浸すことにより終止させる。次いで、この試験管をボルテックス混合し、そして酵素のそれぞれのサンプルにより産生された糖の量を、ＹＳＩグルコースアナライザーで測定し、酵素からの小さいバックグラウンドを考慮に入れる。
【０１２１】
β−グルコシダーゼ活性の単位を１分あたり産生されたグルコースのマイクロモル数で規定する。この活性を、０．１５〜１．５ｍｇ／ｍｌのグルコースを産生するそれぞれの希釈液からの平均値を用いて、式１に基いて計算する。
【０１２２】
Ａ＝Ｃ*Ｇ*Ｄ（１）
ここでＡ＝活性、β−グルコシダーゼ  ｕｎｉｔ／ｍｌ
（またはマイクロモル  グルコース／ｍｌ／分）
Ｃ＝１６．７マイクロモル／ｍｇ／分
Ｇ＝産生グルコース、ｍｇ／ｍｌ
Ｄ＝酵素希釈（次元なし）
（実施例１７：セルロース加水分解）
この実験の目的は、セルロースの加水分解増強における、形質転換されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにより産生されたβ−グルコシダーゼの有効性を実証することであった。
【０１２３】
この研究のためにもちいた酵素は、Ｉｏｇｅｎ  セルラーゼ（Ｉｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販のセルラーゼ酵素）、および実施例１１に記載の手順を用いて（その実施例に挙げた培地濃度レベルの２倍で）３０リットルの発酵容器中で増殖したＲＭ４−３０２の産物であった。酵素濃度を、Ａｍｉｃｏｎ  １０，０００ＭＷＣＯ膜を通過する限外濾過により増加させ、そしてＩｏｇｅｎ  セルラーゼと同じセルラーゼ活性に対して基準化した。これらの２つの酵素の活性を表６に示す。
【０１２４】
【表６】
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この研究に用いるセルロースは、前処理したカラスムギの外皮であり、Ｆｏｏｄｙら（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｔｏ  Ｆｕｅｌ  Ｅｔｈａｎｏｌ，１９９７年６月９日出願の米国特許出願、実施例６）の手順に従って調製した。
【０１２５】
０．５グラムの前処理カラスムギ外皮セルロースのサンプルを、４９．５グラムの０．０５モラーのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８とともに、２５ｍｌフラスコに添加した。
【０１２６】
この酵素をセルロース１グラムあたり１０ＦＰＵに対応する量でフラスコに添加した。得られたβ−グルコシダーゼ用量を表６に列挙する。
【０１２７】
両方の場合において、このフラスコを２５０ＲＰＭで振盪し、そして２４時間５０℃で維持した。この時、サンプルを採取し、不溶性セルロースを濾過除去し、そして標準的なＤｉｏｎｅｘパルス電流測定ＨＰＬＣ炭水化物分析方法を用いてグルコース濃度およびセロビオース濃度について分析した。この結果を表７に列挙する。
【０１２８】
Ｉｏｇｅｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（従来のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのセルラーゼ）は、セルロースのわずか４５％しかグルコースに転換しなかった。これは、エタノールプロセスには受容できない低さである。セロビオースのこの蓄積は、有意であり、セルロースの１３％を示した。
【０１２９】
増強されたβ−グルコシダーゼを伴うセルラーゼは、より良好に実施した。このセルロースのグルコースへの転換は、８４％に達した。この優れた能力の理由は、β−グルコシダーゼの豊富さによって、セロビオース蓄積が、無視できたことであった。
【０１３０】
【表７】
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（実施例１８：ＲｕｔＣ３０株およびＭ２Ｃ３８株におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉのｘｌｎ２およびｂｇｌ１遺伝子の比較）
サザンブロット分析を、成熟β−グルコシダーゼおよびキシラナーゼ分泌シグナルをコードする領域の内側および外側の両方を切断する６つの異なる制限酵素で消化したＭ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０のＤＮＡに対して実施し（実施例８）、２つの株の間に多型性が存在するか否かを決定した。図４および５に示すように、同一のバンドが成熟β−グルコシダーゼ酵素およびキシラナーゼＩＩプロモータープラス分泌シグナルをコードするＭ２Ｃ３８フラグメントから調製した標識プローブとハイブリダイズすることが見出され、このことは、２つの株の間のこれらの領域に多型性がなく、そして高い程度のＤＮＡ配列相同性があることを示す。
【０１３１】
実施例５〜７に記載される遺伝子構築物を作製するために必要なＭ２Ｃ３８  ＤＮＡ配列を同定およびクローニングするために使用されるプローブおよびプライマーは、以下を含むいくつかの異なるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ株由来の種々の遺伝子の公開されたＤＮＡ配列に基づいた：ＱＭ９４１４（ｐｇｋ、Ｖａｎｈａｎｅｎら、１９８９、およびｃｂｈ２、Ｃｈｅｎら）、ＱＭ９４１４誘導体ＶＴＴ−Ｄ７９１２５（ｘｌｎ２、Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）およびＬ２７（ｃｂｈ１、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら）、およびＲＬ−Ｐ３７株誘導体Ｐ４０株（ｂｇｌ１、Ｂａｒｎｅｔｔら）。Ｍ２Ｃ３８と同様に、これらの株のすべては、ＱＭ６ａ株に由来する（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｌｌｉｓｏｎ、ＲｅｙおよびＤｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎ、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ：ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ａｎｄ  ｘｙｌａｎａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：２１６７〜２１７４、１９９２）。
【０１３２】
ＲｕｔＣ３０は、Ｍ２Ｃ３８のＱＭ６ａ由来前駆体であるので、本発明者らは、実施例５〜７において記載されるβ−グルコシダーゼ発現ベクターを作製するために使用される遺伝子配列の単離のための、実施例２〜４に記載の記載される方法が、Ｍ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０の両方由来の同じ遺伝子配列の単離に等しく良好に機能することを確信している。上記の株系統およびサザンブロットデータに基づいて、本発明者らはまた、ＲｕｔＣ３０  ＤＮＡから調製された遺伝子構築物が、成熟β−グルコシダーゼ酵素およびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルをコードする、Ｍ２Ｃ３８  ＤＮＡから調製されたものと同一のＤＮＡセグメントを含むという、高程度の確信を有する。Ｍ２Ｃ３８  ＤＮＡから調製された構築物（実施例５〜７）は、Ｍ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０の両方において増強されたβ−グルコシダーゼ発現を生じるので（実施例１２〜１４）、本発明者らはまた、ＲｕｔＣ３０  ＤＮＡから作製される遺伝子構築物が、ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８の両方におけるβ−グルコシダーゼ活性の類似のレベルの増強を生じることを確信している。
【０１３３】
本発明は、現在のところ好ましい実施態様であると考えられる実施態様に関して記載しているが、本発明は、開示された実施態様に限定されないことが理解されるべきである。対照的に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改変および等価のアレンジを包含することが意図される。以下の特許請求の範囲は、そのような改変および等価な表現および機能のすべてを含むように最も広い解釈であるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶの制限地図、およびＣＢＨ１分泌シグナル／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。
【図２】  図２は、ベクターｐＸＢＧ１−ＴＶの制限地図、およびキシラナーゼＩＩ分泌シグナル／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。
【図３】  図３は、ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶの制限地図、およびキシラナーゼＩＩ分泌シグナル／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。
【図４】  図４は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離され、そしてＭ２Ｃ３８キシラナーゼプロモーターおよび分泌シグナルを含む標識したＤＮＡフラグメントを用いてプローブした、ゲノムＤＮＡのサザンブロットである。
【図５】  図５は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離され、そしてＭ２Ｃ３８成熟β−グルコシダーゼコード領域を含む標識したＤＮＡフラグメントを用いてプローブした、ゲノムＤＮＡのサザンブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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