(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低レベルの血清ＨＤＬを示すかまたは低レベルの血清ＨＤＬを示す危険性のある哺乳動物において高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させるための薬学的組成物を調製するための、全長のコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）の使用であって、
キャリアが、該全長ＣＥＴＰに結合される、
使用。
【請求項２】
前記全長のＣＥＴＰが、実質的に精製されたＣＥＴＰである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記全長のＣＥＴＰが、ヒトＣＥＴＰである、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４】
前記全長のＣＥＴＰが、ウサギＣＥＴＰである、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記全長のＣＥＴＰが、前記哺乳動物のネイティブなＣＥＴＰである、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記全長のＣＥＴＰが、前記哺乳動物のネイティブなＣＥＴＰとは異なる、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記キャリアが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
さらにアジュバントの使用を包含する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬学的組成物が繰り返し投与のためのものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
低レベルの血清ＨＤＬを示すかまたは低レベルの血清ＨＤＬを示す危険性のある哺乳動物において高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させるための薬学的組成物であって、
全長のコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）を含み、
キャリアが、該全長ＣＥＴＰに結合されている、
薬学的組成物。
【請求項１２】
前記全長のＣＥＴＰが、実質的に精製されたＣＥＴＰである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記全長のＣＥＴＰが、ヒトＣＥＴＰである、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記全長のＣＥＴＰが、ウサギＣＥＴＰである、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記全長のＣＥＴＰが、前記哺乳動物のネイティブなＣＥＴＰである、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記全長のＣＥＴＰが、前記哺乳動物のネイティブなＣＥＴＰとは異なる、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記キャリアが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドからなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
さらにアジュバントを包含する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
繰り返し投与のための、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、免疫治療分野に関し、より詳細には、コレステロールエステル転移タンパク質（CETP）に対する免疫応答を刺激する方法に関する。
発明の背景
血液コレステロールレベルは、アテローム性動脈硬化心臓疾患の危険性に直接に関連し、心臓発作を導くと長く考えられてきた。より最近に、血液コレステロールが、実際に、２つの一次的な形態から構成されることが認められた：高密度リポタンパク質（HDL）および低密度リポタンパク質（LDL）。疾患の危険性に関連するのではなく、高いHDLレベルは明かに逆の徴候である。実際、今日の研究は、HDLがアテローム性動脈硬化症に対する防御において直接の作用を有し、アテローム性動脈硬化症斑の症状の緩解さえも促進し得ることが示された。
多数の因子が、身体でのコレステロールレベル調節に関与する。コレステロールエステル転移タンパク質（CETP）は、HDLから非常に低い密度のリポタンパク質（VLDL）およびLDLへのコレステロールエステル（CE）の運搬に応答し得る酵素である。VLDLは最終的にLDLに変換される。CETPは、プロ-と抗-アテローム原性（anti-atherogenic）リポタンパク質画分との間で脂質成分の変換を特異的に加速する。特に、血漿中のCETPレベルとHDLコレステロールレベルとの間で強い逆の相関関係（inverse correlation）が存在する。CETP活性レベルは、食事性または遺伝性高コレステロール血症を罹患した個体において上昇される。CETP活性の増大したレベルは、HDLのより低いレベルをもたらす。逆に、CETP遺伝子中の変異に起因するCETP活性の不全を伴う個体は、著しく上昇されたHDLレベルを有する。
より高等な生物の免疫系は、ウイルス、細菌、および寄生虫のような有害な外来物質による侵襲に対して、個体を防御する手段として開発された。免疫系の細胞は、個体自身の身体から（「自己」物質と呼ばれる）と、外来物質または抗原とを区別し得る。外来物質が身体に侵入すると、免疫系は応答を増す。外来物質を特異的に認識して結合する抗体が産生される（抗体または体液性応答）。さらに、T細胞は、外来物質に抵抗するために動員される（T細胞または細胞性応答）。自己として認識される物質は、特定病理学的条件下（原発性自己免疫疾患）以外は、通常はこのような応答を刺激しない。内因性タンパク質の存在が、それ自身有害であるときでさえ、免疫系は、その物質が自己として認識されれば、リギュレーターとして作用し得ない。
アテローム性動脈硬化症の予防におけるHDLの潜在的に有用な効果のために、血清中のそのレベルを増大するために使用され得る方法の必要性が存在する。このような方法は、理想的に特異的かつ確実であり、そして可能な限り身体の侵襲がないべきである。本発明は、この必要性を満たし、かつ関連する利点をも提供する。
発明の要旨
本発明は、CETPの機能を阻害する免疫応答を刺激することによって、哺乳動物でHDLコレステロールを増加する方法を提供する。このような免疫応答は、このような応答を刺激し得るエピトープを有する、CETPまたはCETPのフラグメント（まとめて、「CETPペプチド」と呼ぶ）で免疫することによって誘導され得る。ペプチドは、免疫原性を増大させるために、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）またはオボアルブミンのようなキャリアに結合体化（conjugated）され得る。アジュバントもまた投与され得る。
１つの実施態様では、抗体応答を惹起するために使用されるCEPTのフラグメントは、約10から20アミノ酸の長さであり、そしてウサギまたはヒトCETPの配列と相同な配列を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、トキソイド結合体化ペプチド（実線）、遊離ペプチド（破線）、または生理食塩水（点線）のいずれかで免疫された動物についての、免疫期間中の抗CETPペプチド力価を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
図２は、トキソイド結合体化ペプチド（実線）、遊離ペプチド（破線）、または生理食塩水（点線）のいずれかで免疫された動物についての、免疫期間中のCETP活性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
図３は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、CETP活性を示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線）あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を示す。
図４は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、HDL-コレステロールレベルを示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線）あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を示す。
図５は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、LDL-コレステロールレベルを示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線）あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を示す。
図６は、免疫した動物にコレステロール食を与えた後の時間の関数として、LDL/HDL-コレステロール比を示す。動物を、トキソイド結合体化ペプチド（実線）あるいは遊離ペプチド（破線）のいずれかで免疫した。エラーバーは標準偏差を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、CETPレベルを低下させるために身体自身の免疫系を利用する方法を提供し、それにより、有用なHDLコレステロールレベルを増大させる。本発明は、血液中、より詳細には血清中のHDLを上昇させる有効な方法を提供する。HDLレベルを増大するために身体自身の免疫系を利用することによって、本発明は、望ましくない副作用を有する、薬剤の繰り返し投与に関連する問題を回避する。
本発明に従って、CETPペプチドを、抗CETP免疫応答を誘発するような様式で、適切な個体に投与する。CETPペプチドは、抗体または体液性応答を刺激し得るエピトープを有するように選択され得る。あるいは、CETPペプチドは、細胞性応答、またはその他の免疫応答を刺激し得る。CETPペプチドは、B細胞エピトープを有するように選択され得、その配列はそのエピトープを特異的に認識して結合する抗体の産生を刺激し得る。あるいは、T細胞またはより一般的な免疫応答を刺激する、CETPペプチドが選択され得る。
HDLコレステロールの低い血清レベルを示すか、または示す危険性のある個体は、このような治療に特に適切である。血清HDLレベルは、当該分野で周知の方法を用いて測定され得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Warnick,G.R.J.Lipid.Res.,19:65（1978）を参照のこと。）。約30-35mg/dlより少ない血清HDLは、低いと考えられる。このレベルを下回る血清HDLレベルを示す被検体は、本発明の処置に特に適している。
投与されるべきタンパク質またはペプチドは、そのタンパク質またはペプチドがB細胞および／またはT細胞エピトープを有する限り、CETPタンパク質の全体または部分であり得る。本明細書中で使用されるように、「CETPペプチド」は、全長のCETPアミノ酸配列およびそのフラグメントの両方を包含することが意図される。ペプチドは、哺乳類CETP配列に対応するか、または相同である配列を有し得る。ペプチドは、CETP活性を阻害する抗体を誘導し得る限り、ある程度天然配列と異なり得る。
CETPは、そのアミノ酸配列に基づく55kDのタンパク質であるが、翻訳後の修飾によって、66-74kDの見かけの分子量を有する。ヒトCETP mRNA配列は、Genbank（寄託番号M30185）で入手可能である。ウサギCETP mRNA配列は、Genbank（寄託番号M27486）で入手可能である。Genbank配列は、ヒトおよびウサギCETPの完全なアミノ酸配列を得るために、MacVectorソフトウエアプログラム（I.B.M.New Haven,Connecticut）を用いて翻訳された。
CETPおよびそのペプチド誘導体は、「自己」抗原として認識され得るので、キャリアが、それらの免疫原性を増大するために使用され得る。このようなキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、このような化合物は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、オボアルブミン、ジフテリアトキソイド（Wako BioProducts）、および破傷風トキソイド（Connaught）を包含する。CETPペプチドは、当該分野で周知の方法によって、このようなキャリアと結合体化され得る。Current Protocols in Molecular Biology、Ausebell,Brent,Kingston,Moore,Seidman,SmithおよびStrul1編（1987）、または、製造者の使用説明書を参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用される。ペプチドの免疫原性もまた、アジュバントの投与によって増大され得る。種々のアジュバントが周知であり、入手可能である。Antibodies:A Laboratiry Manual、HarlowおよびLane編（1988）を参照のこと。これは本明細書中に参考として援用される。
CETPペプチドの投与によって誘導される抗CETP応答の程度は、種々のアッセイを用いてモニターされ得る。例えば、競合形式（competitive format）のイムノアッセイが、抗CETP抗体または抗CETP抗血清を使用して実施され得る。あるいは、被検体個体のCETPの活性レベルは、例えば、3H-コレステロールオレイン酸エステル転移アッセイを用いてモニターされ得る。Lausuncion,M.A.ら、Biochem J.,270:441-449（1990）。CETP活性の減少は、抗CETP応答の直接の指標である。
以下の実施例は、本発明を例示し、限定することを意図しない。
実施例１
CETPペプチド免疫原の投与
ヒト、ウサギ、およびウサギ／ヒトCETPの部分に対応するペプチドを、標準的なペプチド合成プロトコールに従って調製した。以下のペプチド配列を調製した：
H-Cys-Asp-Ser-Gly-Arg-Val-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-Asp-OH（配列番号1）
H-Cys-Asp-Ala-Gly-Ser-Val-Arg-Thr-Asn-Ala-Pro-Asp-OH（配列番号2）
H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH（配列番号3）。
第１のペプチド（配列番号1）は、本明細書中に参考として援用されるSmithおよびBarakat,Med.Sci.Res.,21:911-912（1993）からのヒトCETPペプチド配列（シグナルペプチドを含まない131-142残基）から得る。第２のペプチド（配列番号2）は、対応するウサギ配列であり、そしてヒトとは３アミノ酸のみ異なる。
第３のペプチド（配列番号3）は、ヒトおよびウサギの両方に共通し、そして中和性である抗CETPモノクローナル抗体によって認識されるエピトープである。Tall,A.R.,J.Lipids Res.,34:1255-1257（1993）。
ペプチドは、前出のCurrent Protocols in Molecular Bioligyの方法によって、オボアルブミンに結合体化した。四匹のニュージーランドシロウサギ（約四ヶ月齢）のうち二匹に、PBS中の100マイクログラムオボアルブミン結合体化ヒトペプチド（配列番号1）およびCFAを筋肉内注射し、そして二匹に、等量のヒト／ウサギペプチド（配列番号3）を注射した。これらの動物に、一ヶ月間隔で２回、フロイントの不完全アジュバント（IFA）中の同じペプチドで追加免疫した。
実施例２
トキソイド結合体化CETPでの免疫
メスのニュージーランドウサギの３つの群（群あたり３匹）を、トキソイド結合体化ペプチド、遊離ペプチド、または生理食塩水のいずれかで免疫した。免疫は、免疫期間中合計４回の免疫について、７週間毎に一度投与した。各免疫は、各動物の背中に10カ所、皮内注射によって投与した。各免疫原をIFAに乳化し、各動物の各々の部位に、免疫ごとに、動物あたり100μgのエマルジョンまたは1mlを与えた。
トキソイド結合体化ペプチドおよび遊離ペプチドに使用されるペプチドは同じであった：H-His-Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ser-OH（配列番号3）。トキソイド結合体化ペプチドのペプチドを、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのいずれかと結合体化した。両方のトキソイド結合体化ペプチドを、トキソイド結合体化ペプチド群の動物に投与した。ジフテリアトキソイド結合体化ペプチドおよび破傷風トキソイド結合体化ペプチドを、キャリア誘導免疫抑制を避けるために代替免疫で投与した（例えば、本明細書中に参考として援用されるGaur,A.,Int.Immunol.,2:151（1990）を参照のこと）。
免疫期間の前、期間中、および８週間後に、全動物に通常の食餌を与えた。最後の免疫の８週間後に、トキソイド結合体化ペプチドおよび遊離ペプチド群の動物を、1%コレステロールを含有する食餌に切り替え、そし思い出させた（remined on）。全ての動物を、血液サンプリングの前の14時間以外は、実験中、食物および水を自由に摂取させた。
抗CETPペプチド力価を、ELISAアッセイによって測定した。簡単には、KLHに結合体化されたペプチドを、マイクロタイタープレートに被覆し、そのプレートを希釈した血清とともにインキュベートし、そして結合した抗体をヤギ-α-ウサギーHRP抗体で検出した。抗CETPペプチド力価を、最大応答の50%を与える希釈物の相対物（reciprocal）として示した。
有意な抗CETPペプチド力価（１０3を超える）が、免疫期間中のトキソイド結合体化ペプチド群において生産された。逆に、遊離ペプチド群および生理食塩水群の動物は、有意な抗CETPペプチド力価を生産しなかった。免疫期間中の得られたCETPペプチド力価は、図１に要約する。
CETP活性を、最初の免疫の前（採血前期間）および実験を終了するまで測定した。CETP活性は、公知の方法を用いてヒト血清由来のHDLおよび標識した3H-コレステロールオレイン酸エステルを単離することにより測定した（例えば、本明細書中に参考として援用される、Lasuncion,M.A.,Biochem.J.,270:441（1990）を参照のこと）。3H-HDL（3000cpm）を、VLDLおよび50mM Tris、150mM NaCl、2mM EDTA（pH7.4）の総容量50μl中の2.5μl試料血清とともに、37℃で１時間インキュベートした。反応を、450μlのヒト血清を用いて停止し、そしてリンタングステン酸およびMgC12によって沈澱させた。上清および再懸濁した沈澱をシンチレーションカウンターで計数し、そして結果を、生理食塩水群の平均パーセント転移に対して標準化した、転移された3H-コレステロールエステルのパーセントである、CETP活性の比として示した。
CETP活性の有意な減少が、トキソイド結合体化群の動物について見出された。免疫期間中のCETP活性を、図２に要約する。
トキソイド結合体化ペプチド群の動物由来の精製抗体は、CETP活性を42%まで阻害した。比較すると、生理食塩水群の動物由来の精製抗体は、CETP活性を2%未満しか阻害しなかった。CETPと反応することが知られているモノクローナル抗体TP-2は、CETP活性を52%まで阻害した（例えば、Whitlock,M.E.,J.Clin.Invest.,84:129（1989）を参照のこと）。従って、トキソイド結合体化ペプチド群の動物によって産生されたCETPに対する抗体は、その群において生じるCETP活性の減少をもたらす。抗体は、周知のHPLC高容量プロテインAカラムクロマトグラフィー法を用いて血清から精製された。
総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、およびトリグリセリドレベルを、採血前期間、免疫期間、および免疫後を通じて測定した。LDLコレステロールを、Friedwald,Ley and Fredrickson方程式に従って、評価した（本明細書中に参考として援用される、Friedwald,W.T.,Clin Chem.,18:499（1972）を参照のこと）。
採血前期間の間および動物に通常の食餌を与えた間は、群中のコレステロールまたはトリグリセリドレベルにおいて有意な差は検出されなかった。これらの期間中の総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、およびトリグルセリドレベルを、表１に要約する。
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動物を、1%コレステロール食に切り換えたときに、総コレステロール、LDL-コレステロール、およびCETP活性は、普通食の動物に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群および遊離ペプチド群の動物の両方において有意に増加した。コレステロール食の前および後の、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、総トリグリセリド、HDL-トリグリセリド、CETP活性、および抗CETPペプチド力価を、表２に要約する。
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コレステロール食の動物についてのCETP活性は、遊離ペプチド群の動物に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意に低かった。このような動物のCETP活性を、コレステロール食の時間の関数として、図３に要約する。
コレステロール食の動物についてのHDL-コレステロールレベルは、遊離ペプチド群に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意に高かった。このような動物のHDL-コレステロールレベルを、コレステロール食の時間の関数として、図４に要約する。
コレステロール食の動物についてのLDL-コレステロールレベルは、遊離ペプチド群に比較して、トキソイド結合体化ペプチド群について有意差がなかった。このような動物のLDL-コレステロールレベルを、コレステロール食の時間の関数として、図５に要約する。
コレステロール食の動物についてのLDL/HDL-コレステロールレベル比は、トキソイド結合体化ペプチド群に比較して、遊離ペプチド群について有意に高かった。このような動物のLDL/HDL-コレステロールレベル比をコレステロール食の時間の関数として、図５に要約する。
この結果は、トキソイド結合体化ペプチドで免疫した動物は、コレステロール食を摂取した動物において、HDL-コレステロールレベルを上昇することを示す。低HDL-コレステロールレベルは、LDL-コレステロールレベルに関係なく、アテローム性動脈硬化症の危険性の増大に関連する。従って、CETPに対する免疫は、HDL-コレステロールレベルを上昇することによって、アテローム性動脈硬化症の危険性を減少し得る。
本発明は、本明細書中で好ましい実施態様を参考にして記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなく実施され得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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