(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に急速に生長する植物の部分で使用でき、発現されるキメラ遺伝子であって、Ｈ３．３型植物ヒストン遺伝子の非コード５’領域の最初のイントロン（イントロン１）に相当するイントロンを少なくとも一つ含み、該イントロンが、配列番号６または配列番号７に示す配列からなるＤＮＡであることを特徴とする前記キメラ遺伝子。
【請求項２】
前記キメラ遺伝子が、植物ヒストン遺伝子のプロモーター配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３】
プロモーター領域が、請求項１に記載のイントロンと同じ植物ヒストン遺伝子由来であることを特徴とする請求項２に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４】
前記キメラ遺伝子が、除草剤耐性遺伝子をさらに含み、植物に除草剤耐性の増強を付与することができることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項５】
除草剤耐性遺伝子が、細胞内コンパートメントで除草剤耐性遺伝子の翻訳産物の蓄積を可能とするシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と融合していることを特徴とする請求項４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
シグナルペプチド領域が、プラスチッドコンパートメントで除草剤耐性遺伝子の翻訳産物の蓄積を可能とすることを特徴とする請求項５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
シグナルペプチド配列が、転写方向で、プラスチッドへポリペプチドを輸送させるシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の少なくとも一つのシグナルペプチド配列を含み、場合によっては、最初のシグナルペプチドがタンパク質分解酵素によって開裂されたときに産生される植物遺伝子の成熟Ｎ末端の配列の一部を含み、更に場合によっては、プラスチッドのサブコンパートメントに該ポリペプチドを輸送させるシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の第２のシグナルペプチドを含むことを特徴とする請求項６に記載のキメラ遺伝子。
【請求項８】
除草剤耐性遺伝子が、標的がＥＰＳＰＳである除草剤に活性を有する酵素をコードすることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項９】
除草剤耐性遺伝子が、グリホセートに活性を有する酵素をコードすることを特徴とする請求項８に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１０】
植物の形質転換のためのベクターであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする該ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含むことを特徴とするアグロバクテリウム属の種の株。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換された植物細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞から得られる形質転換植物又は植物の部分。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子の構築方法であって、請求項１に記載のイントロン、プロモーター配列、シグナルペプチド、及び少なくとも一つのトランス遺伝子を単離し、並びにトランス遺伝子の転写方向に上記順序でそれらを組立てることを特徴とする該方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、転写された植物遺伝子から単離された調節（制御）成分の使用、該調節成分を含む新規なキメラ遺伝子の使用、及び植物を形質転換するための該遺伝子の使用に関する。
１種以上の遺伝子成分の発現に係わる種々の表現型特性を植物のゲノム中に組み込み、それによってこれらのトランスジェニック植物に有利な農学特性を付与することができる。該特性としては、非限定的に、植物に有害な植物保護生成物に対する耐性、食事療法用又は薬理用物質の製造を挙げることができる。これらの種々の特性をコードする遺伝子成分の単離及び特性決定に加えて、適切な発現が確実に行われるようにしなければならない。この適切な発現は、質的レベルの場合も量的レベルの場合もあり得る。質的レベルは、例えば空間レベル：特定の組織における優先的発現又は時間レベル：誘発性発現のレベルであり、量的レベルは、導入された遺伝子の発現産物の蓄積量のレベルである。この適切な発現は、大部分、特に量的及び質的成分に関してトランスジーン（変異遺伝子）に係わる調節遺伝子成分の存在に依存する。科学文献においては、この適切な調節を確実にする主要成分のうちでは、単一又は組み合わせ同種又は異種プロモーター成分の使用が広く記載されている。トランスジーンの下流の調節成分は、トランスジーンの発現の質及び量に関する該成分の役割を予想せずに、トランスジーンの転写プロセスを停止させ得る境界を設定するという目的のためのみに用いられた。
本発明は、調節成分として植物遺伝子から単離されたイントロン１の使用、イントロン１を含む新規なキメラ遺伝子の使用、及び植物を形質転換させるための該遺伝子の使用に関する。本発明は、植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子中で調節成分として作用し、特に植物の急速に成長する領域中でキメラ遺伝子の翻訳産物を発現させ得る、単離されたＤＮＡ配列に関する。該配列は、キメラ遺伝子の転写方向に、植物のヒストン遺伝子の非コード５′領域の第１イントロン（イントロン１）のような少なくとも１つのイントロンを含む。より特定的に言えば、本発明は、調節成分としてのイントロン１と同じ植物遺伝子から単離されたプロモーターとの同時使用に関する。該同時使用により、遺伝子を調節するためのこれらの成分の制御下に、量的及び質的なトランスジーンの適切な発現が可能になる。本発明を用いることにより得られるこの適切な発現は、農産物の病原性物質に対する耐性、植物に有害な植物保護生成物に対する耐性、食事療法用又は薬理用物質の製造のような特性に関連し得る。特に、植物の急速成長領域でキメラ遺伝子の発現産物を質的及び量的に優先的に発現させることにより、トランスジェニック植物に高除草剤耐性を付与することができる。除草剤耐性を得るための該遺伝子のこの特定の適切な発現は、プロモーター調節成分と、調節成分として「Ｈ３．３−様」タイプのヒストン遺伝子の少なくとも１個のイントロン１とを同時使用することにより得られる。そのような発現パターンは、上記特性の全てに関して、高除草剤耐性の付与に用いられる調節成分によって得ることができる。本発明はさらに、これらの遺伝子を用いて形質転換された植物細胞、これらの細胞から再生された形質転換植物、及びこれらの形質転換植物を用いた交配由来の植物に関する。
農産物の保護に用いられる植物保護生成物のうち、浸透性（systemic）生成物は、それらが施用後に植物中で運搬され、なかには、急速に成長する部分、特に茎及び根の先端に蓄積され、除草剤の場合には、感受性植物を劣化させ、最終的に破壊させるものもあることを特徴とする。このタイプの挙動を示す数種の除草剤の場合、一次作用モードは公知であり、該モードは、標的植物の正常な生育に必要な化合物の生合成経路に係わる酵素の不活化に起因する。これらの生成物の標的酵素は、種々のサブ細胞コンパートメントに存在し得るが、公知生成物の作用モードを観察すると、該酵素はしばしばプラスチドコンパートメントに存在することが示される。
この除草剤群に属する生成物に対する感受性植物の耐性、及びその一次標的は公知であり、それらは、植物のゲノムに、この遺伝子の発現産物の除草剤による阻害特性に関して変異させるか又は変異させていない、任意の植物遺伝子起源の標的酵素をコードする遺伝子を安定に導入することにより得ることができる。別の方法は、感受性植物のゲノムに、植物の生育に対して不活性且つ無毒性の化合物中に除草剤を代謝し得る酵素をコードする植物遺伝子起源の遺伝子を安定に導入することを含む。後者の場合には、除草剤の標的を特性決定する必要はない。
処理された植物中でのこのタイプの生成物の分散及び蓄積モードがわかれば、これらの生成物が蓄積する植物の急速成長領域における該生成物の優先的発現及び蓄積を可能にするように、これらの遺伝子の翻訳産物を発現させることができるのは有利である。さらに、これらの生成物の標的が細胞質以外の細胞コンパートメントに存在する場合、これらの遺伝子の翻訳産物を、適切なコンパートメント、特にプラスチドコンパートメント中に耐性付与タンパク質を誘導し得るポリペプチド配列を含む前駆体の形態で発現させ得ることは有利である。
この方法を示す例としては、ホスホノメチルグリシンファミリーの広域浸透性除草剤であるグリホサート、スルホサート（sulfosate）又はホサメチン（fosametine）を挙げることができる。該除草剤は、実質的に、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ，ＥＣ  ２．５．１．１９）のＰＥＰ（ホスホエノールピルベート）に対する競合的阻害剤として作用する。植物に該除草剤を施用すると、該除草剤は植物中で運搬され、急速に成長する部分、特に、茎及び根の先端に蓄積され、感受性植物を劣化させ、破壊に至らせる。
これらの生成物の主要標的であるＥＰＳＰＳは、プラスチドコンパートメントに存在する芳香族アミノ酸の生合成経路の酵素である。この酵素は、１個以上の核遺伝子によりコードされ、細胞質前駆体の形態で合成され、次いで、プラスチド中に運搬され、そこで成熟形態で蓄積される。
植物のグリホサート及び該生成物ファミリーに対する耐性は、植物のゲノムに、植物又は細菌由来のＥＰＳＰＳ遺伝子を、該遺伝子産物のグリホサートに阻害特性に関して変異させるか又は変異させずに安定に導入することにより得られる。グリホサートの作用モードがわかれば、この遺伝子の翻訳産物を、プラスチドや生成物が蓄積する植物の急速成長植物領域中でグリホサートが高度に蓄積されるように発現させ得ることは有利である。
例えば、米国特許第４，５３５，０６０号から、ＥＰＳＰＳをプラスチドコンパートメントに挿入した後で、植物のゲノム中に、ＥＰＳＰＳの競合的阻害剤（グリホサート）に対する耐性を高める少なくとも１つの変異を保有する該酵素をコードする遺伝子を導入することにより、植物に、上記タイプの除草剤、特に、Ｎ−ホスホノメチルグリシン又はグリホサートに対する耐性を付与することは公知である。しかし、これらの方法には、農業条件下にこれらの生成物で処理したこれらの植物を使用する際にさらに信頼性を高めるための改良を加える必要がある。
本明細書において、「植物」とは、光合成し得る分化した多細胞生物体を意味し、「植物細胞」とは、植物を起源とし、カルスのような未分化組織、又は胚、植物の一部若しくは種子のような分化組織を構成し得る細胞を意味するものとする。「調節成分としてのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのイントロン１」とは、コード部分の上流に位置するか又は転写遺伝子の構造部分に対応する長さが異なる単離ＤＮＡ配列を意味するものとする。除草剤耐性遺伝子とは、除草剤による阻害特性に関して任意に１つ以上の変異を有する除草剤の標的酵素、又は除草剤を、植物に対して不活性且つ無毒性である化合物に代謝し得る酵素をコードする任意の植物遺伝子を起源とする任意の遺伝子を意味するものとする。植物の急速に成長する領域とは、実質的な細胞の増殖座である領域、特に頂点領域を意味するものとする。
本発明は、これらの生成物に対する耐性遺伝子を含む新規なキメラ遺伝子を用いて形質転換した細胞を再生させることにより、処理された植物の急速成長領域に蓄積する除草剤に対する耐性が高められた形質転換植物の作出に関する。本発明の主題はさらに、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する耐性遺伝子を含む新規なキメラ遺伝子を用いて形質転換した細胞を再生させることによる、該除草剤に対する耐性が高められた形質転換植物の作出に関する。さらに本発明は、これらの新規なキメラ遺伝子、これらの植物の急速成長部分における耐性が良好であるためにより耐性が高められた形質転換植物、及びこれらの形質転換植物を用いた交配由来の植物に関する。植物のヒストンの新規なイントロン１、及び上記キメラ遺伝子を構築するための調節領域としての該イントロンの使用も本発明の主題である。
より特定的に言えば、本発明の主題は、転写方向順に、プロモーター成分、シグナルペプチド配列、ホスホノメチルグリシンファミリー生成物に対して耐性の酵素をコードする配列、及び調節成分を含む、特にＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する高耐性を植物に付与するキメラ遺伝子であり、該調節成分は、その起源である遺伝子中の初期配向に対して任意の配向の植物ヒストン遺伝子のイントロン１のフラグメントを含み、それによって前記除草剤の蓄積領域における除草剤耐性タンパク質の優先的発現及び蓄積を可能にすることを特徴とする。
本発明のイントロン１が由来するヒストン遺伝子は、例えば、コムギ、トウモロコシ又はコメのような単子葉植物か、又は好ましくは、例えば、アルファルファ、ヒマワリ、ダイズ、西洋アブラナ、好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのような双子葉植物由来である。「Ｈ３．３−様」タイプのヒストン遺伝子を用いるのが好ましい。
シグナルペプチド配列には、転写方向順に、ポリペプチドのプラスチドへの運搬を誘導するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の少なくとも１つのシグナルペプチド配列、第１のシグナルペプチドをタンパク質分解酵素で切断したときに生成する植物遺伝子の成熟Ｎ末端部位配列の一部、及びポリペプチドのプラスチドのサブコンパートメントへの運搬を誘導するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の第２のシグナルペプチドを含む。該シグナルペプチド配列は、ヨーロッパ特許出願ＰＣＴ５０８９０９号に記載の、リブロース−１，５−ビスリン酸カルオキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）の小型サブユニット遺伝子由来であるのが好ましい。この特定の遺伝子の役割は、プラスチドコンパートメントに、最大効率で、好ましくは天然形態で、成熟ポリペプチドを発現させることである。
本発明のキメラ遺伝子に用い得るコード配列は、任意の植物遺伝子起源の除草剤耐性遺伝子由来である。該配列は、特に、グリホサートに対する耐性を有する変異ＥＰＳＰＳの配列であってよい。
ヨーロッパ特許出願ＰＣＴ５０７６９８号に記載のプロモーター成分は、単一、重複又は組み合わせ形態の植物中で天然に発現した遺伝子、即ち、例えば、ノパリン合成遺伝子のような細菌由来の遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写体のようなウイルス由来の遺伝子、好ましくは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小型サブユニット由来の遺伝子若しくは植物のヒストン遺伝子由来の遺伝子、好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子のような植物由来の遺伝子中の任意の起源のものであってよい。「Ｈ４」タイプのヒストン遺伝子を用いるのが好ましい。
本発明のキメラ遺伝子は、上記必須部分の他に、プロモーター領域とコード領域の間及びコード領域とイントロン１の間の非翻訳中間領域（リンカー）を含み得、該領域は任意の植物遺伝子起源のものであってよい。
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明をいくつかの態様：本発明のイントロンの単離、植物の遺伝子形質転換及びこれらのイントロンを用いて形質転換した植物の異種遺伝子発現の改良された特性における該イントロンの使用に限定するものではない。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｉｏｌｏｇｙ」は、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）により出版されたＦ．Ｍ．ＡｕｓｕｂｅｌらのＣＰＭＢの第１巻及び第２巻を引用したものである。
実施例１：
１．  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳフラグメントの作成
（ａ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳ遺伝子〔Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０，４３７−４４２〕配列から、それぞれ以下の配列：
0003961566.tif 000002
を有する２つの２０マーオリゴヌクレオチドを合成した。これら２つのオリゴヌクレオチドは、収斂配向の、公表配列のそれぞれ１５２３〜１５４３及び１７３７〜１７１７位に対応する。
（ｂ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（変種コロンビア）由来の全ＤＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号：６９７０−１）から得た。
（ｃ）５０ｎｇ（ナノグラム）のＤＮＡを３００ｎｇのオリゴヌクレオチドと混合し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００装置を用い、供給業者により推奨された増幅用の標準媒体条件下に３５回の増幅サイクルにかける。得られた２０４ｂｐのフラグメントは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳフラグメントを構成する。
２．  ＢＭＳトウモロコシ細胞系由来のｃＤＮＡライブラリーの構築
（ａ）濾過した細胞５ｇを液体窒素中で粉砕し、Ｓｈｕｒｅらにより記載された方法に以下の変更を加えて全核酸を抽出する：
−  溶解緩衝液のｐＨをｐＨ＝９．０に調製する；
−  イソプロパノールで沈降させた後、ペレットを水に入れ、溶解させた後、２．５Ｍ  ＬｉＣｌに調製する。０℃で１２時間インキュベーションした後、４℃で１５分間３０,０００ｇで遠心してペレットを再溶解させる。次いで、ＬｉＣｌ沈降段階を繰り返す。再溶解したペレットは全核酸のＲＮＡ画分を構成する。
（ｂ）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載のようにオリゴ−ｄＴセルロースカラム上のクロマトグラフィーにかけて、ＲＮＡ画分のＲＮＡ−ポリＡ＋画分を得る。
（ｃ）ＥｃｏＲＩ合成末端を有する二本鎖ｃＤＮＡの合成：
該合成は、該合成に必要なＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の「コピーキット」の形態の種々の試薬の供給業者の手順に従って行う。
それぞれ以下の配列：
0003961566.tif 000003
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド及び部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを、平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡと連結する。
このアダプターの連結により、二本鎖ｃＤＮＡに結合したＳｍａＩ部位と、二本鎖ｃＤＮＡの各末端が付着性形態のＥｃｏＲＩ部位が形成される。
（ｄ）ライブラリーの形成：
各末端に付着性の合成ＥｃｏＲＩ部位を有するｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断したλ  ｇｔ１０バクテリオファージｃＤＮＡに連結し、供給業者であるＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの手順に従って脱リン酸化する。
連結反応から得られたアリコートをキャプシド封入抽出物：供給業者の指示によるＧｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでキャプシド封入し、細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃ６００ｈｆｌを用いて該ライブラリーを滴定する。そのようにして得られたライブラリーを増幅し、上記供給業者の指示に従って保存する。該ライブラリーはＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液由来のｃＤＮＡライブラリーを構成する。
３．  ＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液から得たｃＤＮＡライブラリーの、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブでのスクリーニング踏襲する操作は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”の操作とする。要約すると、約１０6個の組み換えファージを平均密度１００／ｃｍ2でＬＢプレート上に播種する。溶解（ｌｙｓｉｓ）プラークを、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手したＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上で二重に複製する。
ＤＮＡを１６００ｋＪ  ＵＶ処理によってフィルターに固定した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ使用）。フィルターを６×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／０．２５［ｌａｏｕｎａ］脱脂粉乳中で６５℃で２時間プレハイブリダイズした。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブを、供給元の指示に従いランダムプライミングを行なうことにより32Ｐ−ｄＣＴＰで標識した（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手したＫｉｔ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ使用）。得られた比活性は断片１μｇ当たり約１０8ｃｐｍである。１００℃で５分間変性後、プローブをプレハイブリダイゼーション培地に添加し、ハイブリダイゼーションを５５℃で１４時間継続する。フィルターを、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲＳフィルム及びＡｍｅｒｓｈａｍから入手した増感紙Ｈｙｐｅｒｓｃｒｅｅｎ  ＲＰＮを用いて−８０℃で４８時間Ｘ線間接撮影する。フィルター上の陽性スポットを、該スポットを得たプレートと位置合わせすることによって前記プレートから、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとのハイブリダイゼーションに関して陽性の応答を示すファージに対応する区域を収集することができる。播種、転写、ハイブリダイゼーション及び回収を行なうこのステップを、連続的に精製されたファージのプレートのあらゆるスポットがハイブリダイゼーションにおいて１００％陽性であると判明するまで繰り返す。その後、独立のファージ１個当たりの溶解プラークを稀釈λ培地（トリス−Ｃｌ  ｐＨ＝７．５；  １０ｍＭ  ＭｇＳＯ4；  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ；  ０．１％ゼラチン）中に回収する。得られた溶解ファージは、ＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液由来の陽性ＥＰＳＰＳクローンである。
４．  ＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液由来のＥＰＳＰＳクローンのＤＮＡの調製及び解析
ＯＤ  ２（６００ｎｍ／ｍｌ）において２０ｍｌのＣ６００ｈｆ１細菌に約５×１０8個のファージを添加し、これを３７℃で１５分間インキュベートする。得られた懸濁液を１ｌ容の三角フラスコ内で２００ｍｌの細菌用増殖培地で稀釈し、回転振盪機で２５０ｒｐｍで振盪する。約４時間振盪後、高密度で存在する細菌の溶解に対応して生起する培地の清澄化によって溶解を観察する。次に、上清を“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に述べられているように処理する。得られたＤＮＡはＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液由来のＥＰＳＰＳクローンに対応する。
１〜２μｇの上記ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、０．８％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上で分離する（ＣＰＭＢ参照）。最終的な証明は、精製ＤＮＡがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを実際に示すことの確認によって行なう。電気泳動後、ＤＮＡ断片を“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に記載されているサザン法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手したＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上に転写する。フィルターを、先の第３節に述べた条件に従い、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズさせる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示し、かつ最長のＥｃｏＲＩ断片を有するクローンは約１．７ｋｂｐのゲル推定寸法を有する。
５．  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１クローンの製造
１．７ｋｂｐ挿入部分を有するファージクローンから得た１０μｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上で分離する（ＣＰＭＢ参照）。１．７ｋｂｐ挿入部分を含むゲル片をＢＥＴ染色によってゲルから切り出し、得られた切片をβ−アガロースで、製造元Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの指示に従い処理する。１．７ｋｂｐ断片から精製したＤＮＡを、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に記載されている連結法に従い、ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）由来のＤＮＡと１２℃で１４時間連結する。このようにして得られた連結混合物２μｌを用いて１アリコートのエレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１ＯＢを形質転換し、この形質転換は次の条件を用いるエレクトロポレーションによって行なう。コンピテント細菌と連結培地との混合物を、予め０℃に冷却した０．２ｃｍ厚のエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）内に導入する。エレクトロポレーター（Ｂｉｏｒａｄ社商標）を用いる場合の物理的エレクトロポレーション条件は、２５００Ｖ、２５μＦ及び２００Ωである。これらの条件の下で、平均コンデンサー放電時間は約４．２ミリ秒である。次に、細菌を１ｍｌのＳＯＣ培地（ＣＰＭＢ参照）中に取り、これを１５ｍｌ容のＣｏｒｎｉｎｇ管に入れて、回転振盪機で２００ｒｐｍで１時間振盪する。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＬＢ／寒天培地上への播種後、３７℃で一晩増殖させた細菌クローンのミニ調製を“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に記載されている操作に従って行なう。ＥｃｏＲＩでのＤＮＡ消化、及び０．８％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上での電気泳動による分離（ＣＰＭＢ参照）後、１．７ｋｂｐ挿入部分を有するクローンを保存する。最終的な証明は、精製ＤＮＡがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを実際に示すことの確認によって行なう。電気泳動後、ＤＮＡ断片を“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に記載されているサザン法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手したＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上に転写する。フィルターを、先の第３節に述べた条件に従い、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズさせる。１．７ｋｂｐ挿入部分を有し、かつＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズするプラスミドクローンを比較的大規模に調製し、細菌の溶解の結果得られるＤＮＡを“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”に述べられているようにＣｓＣｌ勾配上で精製した。精製ＤＮＡをＰｈａｒｍａｃｉａキットで、製造元の指示に従い、かつプライマーとして同じ製造元が指定する順方向及び逆方向Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いて部分的に配列決定した。得られた部分配列は約０．５ｋｂｐにわたる。成熟タンパク質の領域の推定アミノ酸配列（約５０アミノ酸残基）は、米国特許第４��９７１，９０８号に開示された成熟トウモロコシＥＰＳＰＳの対応するアミノ酸配列と１００％の同等性を示す。ＢＭＳトウモロコシ細胞懸濁液から得られる、ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡの１．７ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片に対応するこのクローンをｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１と命名した。このクローンの完全配列は、Ｐｈａｒｍａｃｉａキットの操作を用いること、及び約２５０ｂｐ毎に相補的であり、また逆方向に向くオリゴヌクレオチドを合成することにより、両鎖において得られた。得られた１７１３ｂｐクローンの完全配列を、配列番号１に示す。
６．  クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５の製造
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の配列解析、特に推定アミノ酸配列のトウモロコシ由来アミノ酸配列との比較は、トウモロコシＥＰＳＰＳの成熟部分のＮＨ2末端アラニンをコードするＧＣＧコドン（米国特許第４．９７１，９０７号）の上流での９２ｂｐの配列延長を示している。同様に、トウモロコシＥＰＳＰＳの成熟部分のＣＯＯＨ末端アスパラギンをコードするＡＡＴコドン（米国特許第４．９７１，９０７号）の下流には２８８ｂＰの延長が観察される。これら二つの延長部分のうち、ＮＨ2末端延長部分はプラスチド配置前のシグナルペプチドの配列の一部に対応するかもしれず、またＣＯＯＨ末端延長部分はｃＤＮＡの非翻訳３′領域に対応するかもしれない。
米国特許第４，９７１，９０８号に開示されたトウモロコシＥＰＳＰＳのｃＤＮＡの成熟部分をコードするｃＤＮＡを得るべく、次の操作を行なった。
ａ）  非翻訳３′領域の除去：  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２の構築
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１を制限酵素ＡｓｅＩで切断し、この切断によって得られた末端を、ＣＰＭＢに記載された操作に従いＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素ＳａｃIIでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたＤＮＡを１％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上での電気泳動によって分離した（ＣＰＭＢ参照）。
０．４ｋｂｐの挿入部分「ＡｓｅＩ−平滑末端／ＳａｃII」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第５節に述べた操作に従って精製した。クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１のＤＮＡをクローニングベクターｐＵＣ１９のポリリンカーに位置する制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、この切断の結果得られた末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素ＳａｃIIでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたＤＮＡを０．７％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上での電気泳動によって分離した（ＣＰＭＢ参照）。
３．７ｋｂｐの挿入部分「ＨｉｎｄIII−平滑末端／ＳａｃII」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第５節に述べた操作に従って精製した。
上記二つの挿入部分を連結し、２μｌの連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１ＯＢを、先の第５節に述べたように形質転換した。
様々なクローンのプラスミドＤＮＡ含有率を、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１に関して述べた操作に従い解析した。保持されたプラスミドクローンのうちの或るものは、約１．４５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII挿入部分を有する。このクローンの末端の配列は、挿入部分の５′末端がｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の対応する末端に厳密に対応し、３′末端は次の配列
0003961566.tif 000004
を有することを示している。
下線を付した配列はＣＯＯＨ末端アミノ酸のアスパラギンのコドンに対応し、次のコドンは翻訳終結コドンに対応する。下流のヌクレオチドはｐＵＣ１９のポリリンカーの配列成分に対応する。ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の配列を成熟トウモロコシＥＰＳＰＳの翻訳終結部位まで含み、その後にｐＵＣ１９のポリリンカーの配列をＨｉｎｄIII部位まで含むこのクローンを、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２と命名した。
ｂ）  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２の５′末端の修飾：  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５の構築
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２を制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した。これらの操作の結果得られたＤＮＡを０．８％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上での電気泳動によって分離した（ＣＰＭＢ参照）。１．３ｋｂｐのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ挿入部分を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第５節に述べた操作に従って精製した。得られた挿入部分を、各等モル量の、配列
0003961566.tif 000005
を有する二つの部分相補的オリゴヌクレオチドの存在下、並びに制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化したプラスミドｐＵＣ１９由来のＤＮＡの存在下に連結した。
２μｌの連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１ＯＢを、先の第５節に述べたように形質転換した。様々なクローンのプラスミドＤＮＡ含有率を、先の第５節に述べた操作に従い解析後、約１．３ｋｂｐの挿入部分を有するクローンの一つを後の解析用に保存した。保持されたクローンの５′末端の配列は、この領域のＤＮＡ配列が次のような配列であることを示している。即ち、ｐＵＣ１９のポリリンカーの配列のＥｃｏＲＩ部位からＢａｍＨＩ部位までに、クローニングの際に用いたオリゴヌクレオチドの配列が続き、これに、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２に存在する配列の残りの部分が続く配列である。このクローンをｐＲＰＡ−ＭＬ−７１３と命名した。このクローンは成熟ＥＰＳＰシンターゼのＮ末端アラニンコドンの上流に、ＮｃｏＩ部位に含まれるメチオニンコドンＡＴＧを有する。更に、Ｎ末端のアラニン及びグリシンコドンが保存されているが、これらは第三の可変塩基に修飾を受けており、即ち最初のＧＣＧＧＧＴがＧＣＣＧＧＣとなっている。
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１３を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、この切断の結果得られた末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素ＳａｃＩでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたＤＮＡを０．８％  ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル上での電気泳動によって分離した（ＣＰＭＢ参照）。１．３ｋｂｐの挿入部分「ＨｉｎｄIII−平滑末端／ＳａｃＩ」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第５節に述べた操作に従って精製した。得られた挿入部分を、制限酵素ＸｂａＩで消化し、かつこの切断の結果得られた末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することにより平滑化したプラスミドｐＵＣ１９由来のＤＮＡの存在下に連結した。次に、制限酵素ＳａｃＩでの切断を行なった。２μｌの連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１ＯＢを、先の第５節に述べたように形質転換した。様々なクローンのプラスミドＤＮＡ含有率を、先の第５節に述べた操作に従い解析後、約１．３ｋｂｐの挿入部分を有するクローンの一つを後の解析用に保存した。保持されたクローンの末端の配列は、ＤＮＡ配列が次のような配列であることを示している。即ち、ｐＵＣ１９のポリリンカーの配列のＥｃｏＲＩ部位からＳａｃＩ部位までに、クローニングの際に用いたオリゴヌクレオチドの配列から先に示したオリゴヌクレオチド１の４ｂｐ  ＧＡＴＣＣが欠失したものが続き、これに、ＨｉｎｄIII部位までのｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２に存在する配列の残りの部分、及びｐＵＣ１９のポリリンカーの配列のＸｂａＩ部位からＨｉｎｄIII部位までが続く配列である。このクローンをｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５と命名した。
７．  成熟トウモロコシＥＰＳＰＳをコードするｃＤＮＡの作製
突然変異誘発ステップは総て、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手したＵ．Ｓ．Ｅ．突然変異誘発キットを製造元の指示どおりに用いて実施した。この突然変異誘発系の原理は次のとおりである。プラスミドＤＮＡを熱変性させ、これを、一方では突然変異誘発オリゴヌクレオチドをモル過剰量で存在させ、他方ではポリリンカーに存在するユニークな制限酵素部位の排除を可能にするオリゴヌクレオチドをモル過剰量で存在させて組み換える。再結合ステップ後、相補的鎖の合成を、用意した適当な緩衝液中でＴ４  ＤＮＡリガーゼ及び遺伝子３２のタンパク質の存在下にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを作用させることによって行なう。合成産物を、その部位が突然変異誘発によって消失したと推定される制限酵素の存在下にインキュベートする。得られたＤＮＡでの形質転換には、特にｍｕｔｓ突然変異を示す大腸菌株を宿主として用いる。液体培地中での増殖後、プラスミドＤＮＡ全体を調製し、先に用いた制限酵素の存在下にインキュベートする。これらの処理後、大腸菌ＤＨ１ＯＢ株を、形質転換する宿主として用いる。単離クローンのプラスミドＤＮＡを調製し、導入した突然変異の存在を配列決定によって調べる。
Ａ）  トウモロコシＥＰＳＰＳの、ＥＰＳＰシンターゼ活性の競合的阻害剤である生成物に対する耐性に先天的に影響しない部位または配列修飾：  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５からの内部ＮｃｏＩ部位の排除
ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５の配列を、Ｎ末端アラニンコドンＧＣＣの第一の塩基を１位とすることにより任意に番号付けする。この配列は１２１７位にＮｃｏＩ部位を有する。部位修飾オリゴヌクレオチドは、配列
0003961566.tif 000006
を有する。
先に挙げた参考文献に従い配列決定すると、突然変異誘発後の配列は用いたオリゴヌクレオチドの配列に対応する。ＮｃｏＩ部位は実際に排除され、この領域におけるアミノ酸への翻訳はｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５に存在する最初の配列を保存する。
このクローンをｐＲＰＡ−ＭＬ−７１６と命名した。
このクローンの１３４０ｂｐ配列を、配列番号２及び３に示す。
Ｂ）  トウモロコシＥＰＳＰＳの、ＥＰＳＰシンターゼ活性の競合的阻害剤である生成物に対する耐性の向上を可能にする配列修飾
次のオリゴヌクレオチドを用いた。
ａ）  Ｔｈｒ  １０２→Ｉｌｅ突然変異
0003961566.tif 000007
ｂ）  Ｐｒｏ  １０６→Ｓｅｒ突然変異
0003961566.tif 000008
ｃ）  Ｇｌｙ  １０１→Ａｌａ及びＴｈｒ  １０２→Ｉｌｅ突然変異
0003961566.tif 000009
ＡＴＴＧ−３′
ｄ）  Ｔｈｒ  １０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ  １０６→Ｓｅｒ突然変異
0003961566.tif 000010
配列決定を行なってみると、突然変異誘発後に得られる三つの突然変異断片の配列は親ＤＮＡ  ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１６の配列と、用いた突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列に対応する突然変異誘発領域以外同等である。これらのクローンを、Ｔｈｒ  １０２→Ｉｌｅ突然変異によって得られたものはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１７、Ｐｒｏ  １０６→Ｓｅｒ突然変異によって得られたものはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１８、Ｇｌｙ  １０１→Ａｌａ及びＴｈｒ  １０２→Ｉｌｅ突然変異によって得られたものはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１９、Ｔｈｒ  １０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ  １０６→Ｓｅｒ突然変異によって得られたものはｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０と命名した。
ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０の１３４０ｂｐ配列を、配列番号４及び５に示す。
１３９５ｂｐのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII挿入部分を、本明細書では以後「トウモロコシＥＰＳＰＳの二重突然変異体」と呼称する。
実施例２：  キメラ遺伝子の構築
本発明によるキメラ遺伝子の構築を、次の要素を用いて行なう。
１）  「Ｈ３．３様」の遺伝子を２個有する、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のゲノムクローン（コスミドクローンｃ２２）を、Ｃｈａｒｂｅｔ等（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉｏｌ．  ２２５，  ｐｐ．５６９−５７４，１９９２）が述べているようにして単離した。
２）  第１イントロン
コスミドクローンｃ２２を制限酵素ＤｄｅＩで消化し、次いで末端を平滑化したＤＮＡ断片を創出するべく大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで製造元の指示に従い処理し、その後ＭｓｅＩで切断することによって４１８塩基対のＤＮＡ断片を精製する。精製ＤＮＡ断片を、次の配列
アダプター１：
0003961566.tif 000011
を有する合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結する。
連結生成物を、ＳｍａＩで消化したｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号第Ｐ２２５１号）中へクローン化する。「第１イントロン」と呼称するこのクローンを配列決定によって確認する（配列番号６）。
３）  第２イントロン
コスミドクローンｃ２２を制限酵素ＡｌｕＩ及びＣｆｏＩで消化することによって４９４塩基対のＤＮＡ断片を精製する。精製ＤＮＡ断片を、次の配列
アダプター２：
0003961566.tif 000012
を有する合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結する。
連結生成物を、ＳｍａＩで消化したｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号第Ｐ２２５１号）中へクローン化する。「第２イントロン」と呼称するこのクローンを配列決定によって確認する（配列番号７）。
４）  ｐＲＡ−１
このプラスミドの構築はフランス特許第９，３０８，０２９号に開示されている。このプラスミドは、大腸菌β−グルコロニダーゼ遺伝子の合成、及びノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ポリアデニル化部位の合成を調節するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属由来のヒストンプロモーターＨ４Ａ７４８を有するｐＢＩ１０１．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号第６０１７−１号）の誘導体である。即ち、構造「Ｈ４Ａ７４８プロモーター−ＧＵＳ遺伝子−ＮＯＳ」を有するキメラ遺伝子が得られる。
５）ｐＣＧ−１
このプラスミドは、ｐＲＡ−１のＨ４Ａ７４８プロモーターとＧＵＳコード領域の間に上記イントロンＮｏ．１を含む。このプラスミドは、ＢａｍＨＩとＳｍａＩによるコスミドクローンＣ２２の消化で得られる。４１８塩基対のイントロンＮｏ．１は、ＢａｍＨＩとＳｍａＩによって消化されたｐＲＡ−１に直接連結される。
即ち、“Ｈ４Ａ７４８プロモーター−イントロンＮｏ．１−ＧＵＳ遺伝子−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
６）ｐＣＧ−１３
このプラスミドは、ｐＲＡ−１のＨ４Ａ７４８プロモーターとＧＵＳコード領域の間に上記イントロンＮｏ．２を含む。このプラスミドは、ＢａｍＨＩとＳｍａＩによるコスミドクローンｃ２２の消化によって得られる。４９４塩基対のイントロンＮｏ．２を、ＢａｍＨＩとＳｍａＩによって消化したｐＲＡ−１に直接連結させる。
即ち、“Ｈ４Ａ７４８プロモータ−イントロンＮｏ．２−ＧＵＳ遺伝子−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
７）ｐＣＧ−１５
このプラスミドは、ｐＣＧ−１のＨ４Ａ７４８プロモーターとＧＵＳコード領域の間の上記ＧＵＳコード配列の前にイントロンＮｏ．１だけを含む。このプラスミドは、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIによるｐＣＧ−１の消化、次に平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片による処理によって得られる。
このベクターを再連結し、“イントロンＮｏ．１−ＧＵＳ−ＮＯＧ”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
８）ｐＣＧ−１８
このプラスミドは、ｐＣＧ−１３のＧＵＳコード配列の前に上記イントロンＮｏ．２だけを含む。このプラスミドは、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩによるｐＣＧ−１３の部分消化、次に、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼ断片による処理によって得られる。
次にこのベクターを再連結し、“イントロンＮｏ．２−ＧＵＳ−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子を得るために、酵素消化でチェックする。
９）ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４
トウモロコシ二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｔｈｒ１０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６→Ｓｅｒ）を含むクローニングカッセトの作出による、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０への“ｎｏｓ”ポリアデニル化シグナルの付加。平滑末端を作出するために、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０をＨｉｎｄIIIで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理する。第２の消化をＮｃｏＩで行い、ＥＰＳＰＳ断片を精製する。次に、ＥＰＳＰＳ遺伝子を、精製ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２（ノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含むクローニングカセット）と連結し、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４を得る。精製した有用なベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−１２を得るために、後者を前もってＳａｌＩで消化し、クレノーＤＮＡポリメラーゼで処理し、次にＮｃｏＩによる２回目の消化を行うことが必要であった。
１０）ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５
プラスミド上で標的化されたＥＰＳＰＳ遺伝子を含むクローニングカセットの作出による、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４からの最適化されたシグナルペプチド（ＯＳＰ）の添加。ｐＲＰＡ−ＲＤ−７（欧州特許出願公開第６５２２８６号）をＳｐｈＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次にＳｐｅＩで消化し、ＯＳＰ断片を精製する。ＮＣｏＩで前もって消化し、クレノーＤＮＡポリメラーゼで処理し、３′突出部分を除去し、次にＳｐｅＩで消化したｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４に、このＯＳＰ断片をクローンする。次にこのクローンを配列決定し、ＯＳＰとＥＰＳＰＳ遺伝子の間の正しい翻訳融合を確認する。それから、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５を得る。
１１）ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９６
このプラスミドにおいて、ｐＣＧ−１の“イントロンＮｏ．１＋Ｅ．ｃｏｌｉからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位（“ＮＯＳ”）を含む２キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９６を得るために、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩによるｐＣＧ−１の消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理を行う。二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）の最適化シグナルペプチドとノパリン合成酵素ポリアデニル化部位（“ＮＯＳ”を含む２キロベースＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩとＮｏｔＩによる消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼの処理によってｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のｐＣＧ−１に連結する。
“Ｈ４Ａ７４８プロモーター−ＯＳＰ−トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
１２）ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９７
このプラスミドにおいて、ｐＣＧ−１の“Ｅ．ｃｏｌｉからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）及びノパリン合成酵素ボリアデニル化部位（“ＮＯＳ”）を含む２キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９７を得るために、ＥｃｏＲＩによるｐＣＧ−１の消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理を行い、次にＳｍａＩで切断する。最適化シグナルペプチド、二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）、及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位（“ＮＯＳ”）を含む２キロベースＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩとＮｏｔＩによる消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼでの処理によってｐＲＰＡＡ−ＲＤ−１２５から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のｐＣＧ−１に連結する。
“Ｈ４Ａ７４８プロモーター−イントロンＮｏ．１−トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
１３）ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９８
このプラスミドにおいて、ｐＣＧ−１３の“Ｅ．ｃｏｌｉからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位（“ＮＯＳ”）を含む２キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９８を得るために、ＥｃｏＲＩによるｐＣＧ−１３の消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理を行い、次にＳｍａＩで切断する。最適化シグナルペプチド、二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｉｌｅ102＋Ｓｅｒ106）、及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位（“ＮＯＳ”）を含む２キロベースＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩとＮｏｔＩによる消化、続いて、平滑末端ＤＮＡ断片を作出するために、製造業者の指示に従い、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼでの処理によってｐＲＰＡＡ−ＲＤ−１２５から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のｐＣＧ−１３に連結する。
“Ｈ４Ａ７４８プロモーター−イントロンＮｏ．２−ＯＳＰ−トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子−ＮＯＳ”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
実施例３：リポーター遺伝子活性の発現
１）形質転換と再生
Bevan M.（1984）Nucl.Acids Res.,12,8711-8721によって記載の方法により、Escherichia coli  ＨＢ１０１中の“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２０１３を用い、３親交差により、カタログ（Clontech ＃6027-1）から得られるAgrobacterium tumefaciens LBS 4404の非腫瘍遺伝子株に、ベクターを導入する。
Arabidopsis thaliana L.-エコタイプＣ２４の根移植片を用いる形質転換技術を、Valvekens D.ら、（1988）Proc.Natl.Acad.Sci USA,85,5536-5540に記載の方法により行った。簡単にいえば、３工程が必要である。即ち、２，４−Ｄとカイネチンを補充したガンボルグＢ５培地上でのカルス形成の誘導、２ｉＰとＩＡＡを補充したガンボルグＢ５培地上での芽の形成、ホルモン無含有ＭＳ上での根付きと種子の形成。
２）植物中のＧＵＳ活性の測定
ａ−組織化学的観察
１０日目の遺伝子移入植物の組織化学的スポット（Jerfferson R.A.ら、（1987）EMBO J.,6,3901-3907）は、イントロンを含まないプラスミド（ｐＲＡ−１）と比較して、イントロン配列を含むプラスミド（ｐＣＧ−１及びｐＣＧ−１３）のために組織特異的である組織化学的パターンの強度の増加を示す。特に、ｐＣＧ−１とｐＣＧ−１３のスポットのパターンは同じであり、構築物ｐＲＡ−１と比較して、導管組織並びに分裂組織、葉及び根のスポットの強度の増加を示す。イントロンＮｏ．１（ｐＣＧ−１５及びｐＣＧ−１８）の配列だけを含む構築物は、頂端分裂領域にだけ非常に鮮明な組織化学的スポットを示す。
ｂ−蛍光測定
１２植物からのロゼットの花芽と葉芽の抽出物において蛍光によって測定したＧＵＳ活性（Jefferson R.A.ら、（1987）EMBO J.,6,3901-3907）は、Ｈ４Ａ７４８プロモーターの活性は、イントロンＮｏ．１と２の影響下で増大していることを示す。構築物ｐＲＡ−１と比較すると、ｐＣＧ−１とｐＣＧ−１３のＧＵＳ活性は、花芽で少なくとも６倍、ロゼットの葉で２０倍、根で２６倍大きい。
制御配列として使用した“Ｈ３．３様”タイプのArabidopsisヒストン遺伝子のイントロンＮｏ．１と２は、キメラ遺伝子の発現の活性の増加を誘導することを上記測定は明白に示す。
実施例４：除草剤に対する遺伝子移入植物の耐性
１）形質転換と再生
Bevan M.（1984）Nucl.Acids Res.,12,8711-8721によって記載の方法により、Escherichia coli  ＨＢ１０１中の“ヘルパー”プラスミドｐＲＫ２０１３を用い、３親交差により、カタログ（Clontech ＃6027-1）から得られるAgrobacterium tumefaciens LBS 4404の非腫瘍遺伝子株に、ベクターを導入する。
タバコの葉移植片を用いる形質転換技術は、Horsh R.ら、（1985）Science,227,1229-1231に記載の方法に基づく。葉移植片からのＰＢＤ６タバコ（起源ＳＥＩＴＡ−Ｆｒａｎｃｅ）の再生を、スクロース３０ｇ／Ｌ、カナマイシン２００μｇ／ｍＬを含むMurashigeとSkoog（MS）基礎培地で３つの連続的工程で行う。即ち、最初の工程は、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）０．０５ｍｇとベンジルアミノプリン（ＤＡＰ）２ｍｇ／Ｌを含む、スクロース３０ｇを補充したＭＳ培地上で１５日間の発芽の誘導である。この工程で形成される新芽は、スクロース３０ｇ／Ｌを補充するがホルモンを含まないＭＳ培地上で１０日間培養することによって発育させる。次に生育した新芽を回収し、１／２に希釈した（塩、ビタミン及び糖の含量の半分を有するが、ホルモンを含まない）ＭＳ根用培地で培養する。約１５日後、根の生えた若芽を土壌に植える。
２）グリホセートに対する耐性の測定
２０個の形質転換植物を再生させ、構築物ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９６、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９７、及びｐＲＰＡ−ＲＤ−１９８の各々のために、温室に移した。これらの植物を温室で、５−葉段階で、ラウンドアップという商品名で市販の除草剤の水懸濁液で処理した（ヘクタール当り活性物質グリホセート０．８ｋｇに対応）。
結果は、処理３週間後、注目した植物毒性値の観察に対応する。これらの条件下、構築物で形質転換した植物は平均して、許容できる耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９６）又は良好な耐性（ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９７とｐＲＰＡ−ＲＤ−１９８）を有するが、非形質転換対照植物は完全に破壊されることが観察される。
これらの結果は、グリホセートへの耐性をコードする同一の遺伝子のために、本発明のキメラ遺伝子の使用によって改善がなされることを明白に示す。
本発明の形質転換植物は、導入されたキメラ遺伝子の発現に対応する表現形質を有する系列とハイブリッドを産生させるために親として用いることができる。
【配列表】
配列番号:1
配列
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配列番号:2
配列
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配列番号:3
配列
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配列番号:4
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