(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号５、６、７、８、９、１６、１７、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列であるペプチド。
【請求項２】
平滑筋細胞増殖抑制能を有する、ヒト組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）のＣ末端領域（アミノ酸番号254番目のリジンから276番目のメチオニンの領域）_ペプチドの類似体ペプチドを含有する平滑筋細胞増殖抑制剤であって、該Ｃ末端領域がヒトＴＦＰＩのＮ末側より少なくともクニッツ３までの領域を除去して得られるものであり、該類似体ペプチドが、
（Ａ）Ba1-Xa1-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4（ただし、Ba1、Ba2、Ba3、Ba4、Ba5、Ba6、Ba7、Ba8及びBa9はLys、ArgまたはHisから選ばれる塩基性アミノ酸；Xa1、Xa2、Xa3及びXa4は任意のアミノ酸）で表される１３個のアミノ酸配列_からなるペプチド及び
（Ｂ）Ile-Phe、Ile-Phe-Val、Ile-Phe-Val-Xaa、Ile-Phe-Val-Xaa-Asn及びIle-Phe-Val-Xaa-Asn-Met（式中、XaaはLysまたはGln）_よりなる群から選ばれた少なくとも２個の連続した疎水性アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド
を含有し、当該（Ａ）のペプチドのＣ末側に当該（Ｂ）のペプチドが直接または数個のアミノ酸配列を介在して結合されていることを特徴とするペプチドであるか；または
配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
（Ａ）のペプチド中の当該１３個のアミノ酸配列が、Lys-Xa1-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4で表される請求項２に記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
（Ａ）のペプチド中の当該１３個のアミノ酸配列が、Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ileである請求項３に記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
該類似体ペプチドが、配列表配列番号１、５、６、７、８、９、１６、１７、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列である請求項２から４のいずれかに記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
平滑筋細胞の増殖に伴う動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄及び平滑筋肉腫の治療または予防に有効な請求項２から５のいずれかに記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
当該血管形成術が、経皮経管的血管形成術、粥腫切除術、レーザー切除術、ステント留置術のいずれかである請求項６に記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
当該血管形成術が、経皮経管的血管形成術である請求項６または７に記載の平滑筋細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は平滑筋細胞の増殖を抑制可能な新規なペプチドに関する。また、本発明は、当該ペプチドを含有する平滑筋細胞増殖抑制剤に関する。
背景技術
平滑筋細胞は生体内では大動脈の血管中膜、消化管、肺などに存在するが、平滑筋細胞の病的な増殖を伴う疾患として、動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄、及び平滑筋肉腫などが知られている。
まず、動脈硬化は動脈壁の肥厚、改築、硬化、機能低下を示す局在性の動脈病変の総称で、病理学的には、細小動脈硬化、中膜石灰化、粥状動脈硬化の３つに分類される。この中でも、粥状動脈硬化は虚血性心疾患や脳卒中、脳梗塞の原因となることから、臨床上最も重要な問題となっている。粥状動脈硬化が冠状動脈にできた場合、内腔を狭窄して狭心症を引き起こし、また粥状動脈硬化巣が破綻すれば血栓を形成して不安定狭心症や心筋梗塞などの重篤な疾病を招来する。脳動脈に粥状動脈硬化が発生した場合には脳梗塞あるいは脳内出血を起こす原因となる。また、下肢支配動脈（腎下部大動脈から大腿動脈）の場合は閉塞性動脈硬化症を引き起こす。このように粥状動脈硬化は重大な疾病の原因となっている。
粥状動脈硬化の発生メカニズムはRussel Rossの"Injury to Response"
説が今日広く受け入れられている［Ross, R., Nature, 362, p801（1993）］。即ち、血管の内皮細胞は傷害を受けたり、あるいは高脂血症、ウイルス感染、高血圧などの刺激を受けると平滑筋の増殖を促進する種々の増殖因子を産生する。その結果、平滑筋が増殖して内膜の肥厚を生ずる。
動脈硬化の内科的治療法として、危険因子の治療薬としての高脂血症剤、抗圧剤の投与、発症原因を抑える治療薬としての抗酸化剤、抗血小板剤、血管拡張剤、抗凝固剤等の投与が実施されている現状であるが、これらは臨床的に十分な効果をあげているとは言いがたい。
一方、動脈硬化を原因として起こる狭心症や心筋梗塞症に対して、近年、経皮経管的血管形成術や粥腫切除術（アテレクトミー）、レーザー切除術、ステント留置術等の外科的治療法が試みられ、ある程度の成功を収めている。特に、経皮経管的血管形成術（Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty；ＰＴＣＡ）は血流確保を目的として広く用いられている。ＰＴＣＡは冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）よりも簡便であり、繰り返して行うことが容易で、高齢者でも術後の合併症が少ないことなどから狭心症に対する根治的治療法として急速に普及し、昨今では狭心症の治療法の１つとして定着している［Landau, C., N. Engl. J. Med., 330, p981（1994）］。
しかし、これらのＰＴＣＡやアテレクトミー等の血管形成術において、手技の改善、器具の改良、新たな手法の開発が行われてきたにも拘わらず依然として重要な問題が未解決のまま残されている。その問題とは、術後３〜５カ月で25〜49％の患者に見られる再狭窄である。この再狭窄はＰＴＣＡやＣＡＢＧ等の再治療を必要とすることから、患者生活への負担、保険財政の圧迫を考慮すると非常に深刻な問題である。再狭窄を抑制する目的で各種薬剤投与が行われているが、現状では十分な効果をあげているとは言えない。
再狭窄の発症機序については検討段階ではあるが、血管平滑筋細胞の内膜における増殖が原因であることが近年の研究で示されている［Hanke, H. et al., Circulation Res., 67, p651（1990）］。つまり、再狭窄は、バルーンカテーテルなどにより物理的に破壊された血管壁構造を修復すべく開始された血管平滑筋細胞の増殖反応に歯止めがかからず、過剰な増殖が起きたことによるものと推定されている。そこで狭窄部位の平滑筋細胞の増殖を抑制することによって再狭窄を治療しようとする試みがなされ始めた。例として、ヘパリンによる臨床試験［Ellis, S.G. et al., Am. Heart J., 117, p777（1989）］、アスピリンとジピリダモールの併用による臨床試験［Schwartz, L. et a1., N. Engl. J. Med., 318, p1714（1988）］などが挙げられるが、いずれも再狭窄を抑制するに十分な効果は得られていない。
また、虚血性心疾患の原因である過度の狭窄、あるいは閉塞を起こした冠動脈に対しては、前述の冠動脈血管形成術の他に、自己の他の部位の血管（内胸動脈、胃大網動脈、大伏在静脈などが主として用いられる）を移植する手術、すなわち冠動脈バイパス術によって血行を再建する方法も臨床的に用いられている。冠動脈バイパス術においても、移植した血管（グラフト）の内膜肥厚がしばしば発生し、移植された血管の内腔を狭窄することにより血行を障害することから、臨床的に問題視されている。この内膜肥厚の形成にも平滑筋細胞の増殖とそれに起因する細胞外基質の産生が中心的な役割を果たしているとされており［堀江  俊伸，日本臨床，52, p1010（1994）］、平滑筋細胞の増殖を防ぐことにより、長期にわたるグラフトの開存性が確保されるものと期待されている。また、冠動脈以外にも、形成外科の分野などにおいて、四肢の外科的損傷の際、損傷された血管の代替として自己血管の移植が一般的に行われている。この場合にも、特に正常血管との吻合部において平滑筋細胞の増殖に起因する内腔狭窄が発生する例が多いことが知られている。
また、上記のように血管を移植する際、自己の他の部位の血管の代わりに人工的に作製された血管（以下、人工血管）を代用することも行われている。この人工血管は、冠動脈のみならず他の血管にも用いられる。例えば、四肢切断後の損傷血管の代替、人工透析患者におけるAVシャント術用の血管の代替などにも使用される。ところが、人工血管においても、正常な血管との吻合部にしばしば内膜肥厚が生じ、血流の障害となることが知られている［進藤  俊哉他，人工臓器，22, p459（1993）］。自己血管、人工血管のいずれにおいても、平滑筋細胞の増殖を効果的に抑制しうる薬剤はまだなく、その開発が待ち望まれている。
また、平滑筋細胞由来の悪性腫瘍である平滑筋肉腫は、子宮、消化管に多く、他に後腹膜、皮下軟部組織にも発生し、破壊、浸潤性に増殖し、転移は血行性で肺に多い。平滑筋肉腫の治療にあたっては現在外科的切除と一般的な抗癌剤の投与が併用されているが、一般的な抗癌剤は副作用が多く、平滑筋細胞特異的に増殖を抑制する薬剤の開発が期待されている。
発明の開示
このような状況において本発明者らは、動脈硬化、ならびに経皮経管的血管形成術や他の血管形成術後の再狭窄を顕著に防止する薬剤を見いだすために、バルーン傷害により作製した血管内膜肥厚モデル動物と培養血管平滑筋細胞を用いて、再狭窄を促進させる重要な因子とその阻害因子の検索を行った。その結果、組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）が平滑筋細胞の増殖を抑制する全く新規な作用があることを見いだした（特願平7-245548号）。
ＴＦＰＩは外因系血液凝固反応を阻害する働きを持つことで知られている生体内の糖蛋白質である［Broze, G. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, p1886（1987）］。蛋白構造的には、一般的にクニッツ領域と呼ばれる構造が３つ並び（アミノ末端側からクニッツ１、クニッツ２、クニッツ３と呼ぶ）、さらにそのカルボキシル末端側に塩基性アミノ酸に富む領域（以下Ｃ末端領域と呼ぶ）がみられる。クニッツ１は血液凝固因子のひとつである活性化第VII因子と結合してそのプロテアーゼ活性を中和し、クニッツ２はやはり血液凝固因子のひとつである活性化第Ｘ因子と結合してそのプロテアーゼ活性を中和し、これらの作用により血液凝固反応を初期の段階で効果的に阻害しているものと考えられている。Ｃ末端領域は陰性荷電を持つグリコサミノグリカン、中でもヘパリンに強く結合することが知られている。ヒトＴＦＰＩは276個のアミノ酸からなり、分子量は約42,000である。
本発明者らは、ＴＦＰＩの平滑筋細胞増殖抑制効果に注目し、引き続き検討を重ねた結果、（i）Ｃ末端領域を欠くＴＦＰＩ（Ｃ末端領域欠損型ＴＦＰＩ）には平滑筋細胞増殖抑制効果が全くみられないこと、（ii）ＴＦＰＩのＣ末端領域のアミノ酸配列と同様の配列を持つ合成ペプチドに強い効果が認められることから、この平滑筋細胞増殖抑制効果はＴＦＰＩのＣ末端領域によって担われていることを発見した。そしてさらに、当該Ｃ末端領域ペプチドの類似体について検討を重ねた結果、（Ａ）塩基性アミノ酸に富むアミノ酸配列からなるペプチド及び（Ｂ）少なくとも２個の連続した疎水性アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含有し、当該（Ａ）のペプチドのＣ末側に（Ｂ）のペプチドが直接または数個のアミノ酸配列を介在して結合されていることを特徴とするペプチドが、平滑筋細胞増殖抑制能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、上記ペプチドを有効成分とした平滑筋細胞の増殖を抑制しうる新親な製剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、平滑筋細胞の増殖に伴う動脈硬化、経皮経管的血管形成術や他の血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄及び平滑筋肉腫を効果的に予防または治療しうる薬剤を提供することを目的とするものである。
【図面の簡単な説明】
図１．全長型ＴＦＰＩまたはＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩを添加した際の平滑筋細胞増殖抑制効果を示す。
図２．３種のＴＦＰＩのＣ末端領域ペプチドを添加した際の平滑筋細胞増殖抑制効果を示す［ペプチド１：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号２５４番目のリジンから２７６番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭで表される２３アミノ酸残基のペプチド，ペプチド２：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号２５４番目のリジンから２６４番目のバリンに相当する、アミノ酸配列がＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶで表される１１アミノ酸残基のペプチド，ペプチド３：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号２６５番目のリジンから２７６番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭで表される１２アミノ酸残基のペプチド］。
図３．各種濃度のＴＦＰＩのＣ末端領域ペプチド（ペプチド１）による平滑筋細胞増殖抑制効果を示す。
図４．各種の合成ペプチドによる平滑筋細胞増殖抑制効果を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明のペプチドは、（Ａ）塩基性アミノ酸に富むアミノ酸配列からなるペプチド及び（Ｂ）少なくとも２個の連続した疎水性アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含有し、当該（Ａ）のペプチドのＣ末側に（Ｂ）のペプチドが直接または数個のアミノ酸配列を介在して結合されていることを特徴とするペプチドである。
（Ａ）のペプチドにおける塩基性アミノ酸としては、リジン（LysまたはＫと称することもある）、アルギニン（ArgまたはＲと称することもある）またはヒスチジン（HisまたはＨと称することもある）が挙げられる。塩基性アミノ酸の数は、（Ａ）の配列において、例えば13個のアミノ酸配列からなるペプチドの場合、少なくとも４個以上含まれていることが必要である。さらに、当該13個のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、９個の塩基性アミノ酸が含まれていれば、極めて優れた平滑筋細胞増殖抑制能を有する。
１３個のアミノ酸中９個が塩基性アミノ酸である（Ａ）のペプチドの一例として、Ba1-Xa1-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4（ただし、Ba1、Ba2、Ba3、Ba4、Ba5、Ba6、Ba7、Ba8及びBa9はLys、ArgまたはHisから選ばれる塩基性アミノ酸；Xa1、Xa2、Xa3及びXa4は任意のアミノ酸）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。さらに、当該ペプチドの塩基性アミノ酸の具体的一例としては、Lys-Xa1-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。さらに、（Ａ）のペプチドの具体的一例として、Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ileのアミノ酸配列が挙げられる。
一方、（Ｂ）のペプチドにおける疎水性アミノ酸は、下記のアミノ酸から選ばれるものである。
フェニルアラニン（PheまたはＦと称することもある）
イソロイシン（IleまたはＩと称することもある）
ロイシン（LeuまたはＬと称することもある）
メチオニン（MetまたはＭと称することもある）
プロリン（ProまたはＰと称することもある）
バリン（ValまたはＶと称することもある）
トリプトファン（TrpまたはＷと称することもある）
チロシン（TyrまたはＹと称することもある）
（Ｂ）のペプチドは、少なくとも２個の連続した上記の疎水性アミノ酸を含有していれば特に限定されるものではないが、Ile-Pheを含有することが好ましい。疎水性アミノ酸を３個含有する場合は、Ile-Phe-Valを含有することが好ましい。
さらに、（Ｂ）のペプチドの具体的一例として、Ile-Phe-Val-Xaaで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、Ile-Phe-Val-Xaa-Asnで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、さらに、Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Metで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有するものが挙げられる。当該Xaaの一例としては、LysまたはGlnが挙げられる。
また、本発明のペプチドの具体的一例として、組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）を構成するアミノ酸配列のうち、Ｃ末端領域アミノ酸よりなるペプチドが挙げられる。Ｃ末端領域アミノ酸とは、一般にクニッツ３領域よりカルボキシル末端側（クニッツ３領域は含まない）の領域で、ヒトＴＦＰＩおよびウサギＴＦＰＩの場合、Ｃ末端より３７アミノ酸残基、ラットＴＦＰＩの場合、Ｃ末端より３０アミノ酸残基からなる塩基性アミノ酸に富む直鎖状のペプチドの領域を指すが、本発明の目的とする平滑筋細胞増殖を抑制する効果が得られる限り、ＴＦＰＩのＣ末端領域のアミノ酸配列の一部が欠損、置換、挿入、追加等した類似体も本発明に含まれる。
ＴＦＰＩのアミノ酸配列については、ヒト［Wun, T.-C. et al., J. Biol. Chem., 263, p6001（1988）］、サル［Kamei, S. et al., J. Biochem., 115, p708（1994）］、ウサギ［Wesselschmidt, R. L. et al., Nuc. Acids Res., 18, p6440（1990）：Warn-Cramer, B. J. et al., Nuc. Acids Res., 20, p3642（1992）］、ラット［Enjyoji, K. et al., J. Biochem., 111, p681（1992）］等が報告されているが、本発明において使用されるＣ末端領域のペプチドは、ヒトに投与する際には、免疫的拒絶反応を最小に抑えるために、かつ治療効果を上げるために、ヒトＴＦＰＩのアミノ酸配列を参考にすることが好ましい。
当該Ｃ末端領域アミノ酸配列としては、ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号254番目のリジンから276番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［式中、Ｎ：アスパラギン（Asn）、Ｅ：グルタミン酸（Glu）、Ｑ：グルタミン（Gln）、Ａ：アラニン（Ala）、Ｖ：バリン（Val）、Ｍ：メチオニン（Met）、Ｉ：イソロイシン（Ile）、Ｆ：フェニルアラニン（Phe）、Ｋ：リジン（Lys）、Ｒ：アルギニン（Arg）、Ｔ：トレオニン（Thr）、Ｙ：チロシン（Tyr）；ペプチド１；配列表配列番号１）で表される23アミノ酸残基のペプチドが一例として挙げられる。
さらに、ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号253番目のイソロイシンから276番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ（ペプチド20；配列表配列番号20）で表される24アミノ酸残基のペプチドが一例として挙げられる。
また、ペプチド１のＣ末側から３番目のLysをGln（グルタミン）に置換されたＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＱＮＭ（ペプチド５：配列表配列番号５）はペプチド１よりさらに優れた平滑筋細胞増殖抑制能を有する。
本発明の平滑筋細胞増殖抑制能を有するペプチドを含有する製剤は、平滑筋細胞の増殖に伴う動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄及び平滑筋肉腫の治療または予防に有効な薬剤となりうる。当該血管形成術としては、経皮経管的血管形成術、粥腫切除術、レーザー切除術、ステント留置術などが挙げられる。
本発明のペプチド含有製剤は、生体内での半減期を延長する目的、生体内への吸収力や患部局所への集中性を向上させる目的など、医薬品としての効果を高めるためにその一部が化学的に修飾された類似体、具体的には、Ｎ末端のアミノ基やＣ末端のカルボシキル基、アミノ酸の側鎖の化学修飾体、糖や脂質を付加または混合したもの、他の化合物や蛋白質との融合体なども本発明に含まれる。
本発明ペプチドの製造方法は特に限定されないが、化学合成法あるいは遺伝子組換え技術によって製造されるものが含まれる。また、何らかの化学的処理、または適当なプロテアーゼを用いて、血漿中から精製された天然のＴＦＰＩまたは遺伝子組換え技術によって製造されたＴＦＰＩより、該ペプチドを切り出し、これを採取、精製して用いることもできる。
本発明のペプチド含有製剤の薬効を最大限に維持するためには、凍結乾燥法などの方法を用いて乾燥した状態で密封保存しておく方が好ましい。その際、公知の適当な賦形剤または安定化剤と混合してもよい。
また、本発明のペプチド含有製剤は、安全性が確認される限り高脂血症治療剤、降圧剤、抗酸化剤、抗血小板剤、血管拡張剤、抗凝固剤等の他の薬剤と併用してもよい。
本発明のペプチドを含有する薬剤は、薬学的に有効な担体などを調合されて好適に製剤化され、ドラッグデリバリーカテーテル等を介して血管患部へ直接投与する方法、ステントやバルーン等の表面へ塗布して血管患部へ投与する方法、ボーラスもしくは連続的に静脈および動脈内へ注入する投与法などが選択される。また、溶解せず粉末を直接患部に投与する方法、または乾燥した状態でステントやバルーンなどの血管拡張器具の表面に塗布する方法も選択できる。さらに、本発明のペプチド含有製剤は、溶液状態または固形状態で経口投与する方法も選択される。一方、本発明のペプチドを発現するべく作られた遺伝子を、適当な遺伝子発現ベクターに組み込んで直接患部の平滑筋細胞に導入し、当該ペプチドを患部で過剰発現させる方法も選択可能である。
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に必ずしも限定されるものではない。
実施例
実施例１．全長型ＴＦＰＩおよびＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩの調製
本実施例で使用するＴＦＰＩは亀井ら（特願平5-188746号）や円城寺の報告［Biochemistry, 34, p5725（1995）］に記載した方法に従い、ヒトＴＦＰＩのcDNAを導入したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株の培養上清から、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（HTFPI-K9（微工研菌寄14467号））を結合させたゲルとヘパリンゲル（Phamacia-LKB）によるアフィニティークロマトグラフィーを行って精製した。培養上清中には全長型ＴＦＰＩとＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩが存在しているが、ヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーの溶出を塩化ナトリウムの濃度勾配溶出で行うことによって、この両者を分離精製することが出来る。Ｃ末端領域欠損型ＴＦＰＩは0.4〜0.5mol/l、全長型ＴＦＰＩは0.8〜0.9mol/lの塩化ナトリウム濃度で溶出される。アミノ酸配列分析やSDS-PAGE等の分析の結果、この方法で得られた全長型ＴＦＰＩは分解を受けていない分子であることが確認され、一方、Ｃ末端領域欠損型ＴＦＰＩはヒトＴＦＰＩのＮ末端から249番目のアミノ酸であるリジンと250番目のアミノ酸であるグリシンの間のペプチド結合が開裂されて生じた分子、すなわちＣ末端から27アミノ酸残基のペプチドが欠失した分子であった。
実施例２．平滑筋細胞増殖抑制作用におけるＴＦＰＩのＣ末端領域の関与
平滑筋細胞はクラボウ社から購入したヒト大動脈由来血管平滑筋細胞を用いた。平滑筋細胞の継代培養は牛胎児血清を10％含むダルベッコ変法イーグル培地（以下、ＤＭＥと称す）で行った。なお、以下の実験には継代数６の平滑筋細胞を用いた。
ＤＭＥに懸濁した平滑筋細胞を、5000個／ウェルの細胞密度で48ウェル培養プレート（岩城硝子株式会社製）に播種し、37℃のＣＯ2インキュベーターにて培養した。播種の２日後、50μg/mlの全長型ＴＦＰＩまたは50μg/mlのＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩを含むＤＭＥ、対照としては何も含まないＤＭＥの３種の培地に交換し、以後２日毎に新鮮な同培地にて培地交換しながら37℃のＣＯ2インキュベーター内にて培養を継続した。培地量はウェルあたり0.3mlとした。播種して９日後、付着した細胞をトリプシン／EDTA溶液で剥離した後、血球計算板を用いて１ウェルあたりの細胞数を計測した。図１は各群３ウェルの細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである。全長型ＴＦＰＩを添加した群では対照に比べて有意に（スチューデントｔ検定：ｐ＜0.05）細胞数が少なく、平滑筋増殖抑制効果がみられた。一方、Ｃ末端領域欠損型ＴＦＰＩにはこの効果がみられていないことから、平滑筋細胞の増殖を抑制するためにはＴＦＰＩのＣ末端領域が必要であることが示された。ちなみに、サイトトックス96細胞毒性測定キット（プロメガ社製）を用いて全長型ＴＦＰＩに細胞毒性があるかどうかを検討した結果、細胞毒性はみられなかったことから、全長型ＴＦＰＩの平滑筋細胞増殖抑制効果は細胞毒性によるものではなかった。
実施例３．ヒトＴＦＰＩのＣ末端領域ペプチドの調製
ＴＦＰＩのＣ末端領域のペプチド及びその類似体の平滑筋細胞増殖抑制効果を確認するため、以下に示す構造を持つペプチドを化学合成した。
ペプチド１：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号254番目のリジンから276番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ（配列表配列番号１）で表される23アミノ酸残基のペプチド。
ペプチド２：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号254番目のリジンから264番目のバリンに相当する、アミノ酸配列がＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶ（配列表配列番号２）で表される11アミノ酸残基のペプチド。
ペプチド３：ヒトＴＦＰＩのアミノ酸番号265番目のリジンから276番目のメチオニンに相当する、アミノ酸配列がＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ（配列表配列番号３）で表される12アミノ酸残基のペプチド。
以下、ペプチド１のアミノ酸配列の一部が欠損、置換、挿入、付加等施されたペプチドを合成した
0003930050.tif 000002
0003930050.tif 000003
なお、上記アミノ酸配列式中、記号は次のように定義される［Ａ：アラニン（Ala）、Ｅ：グルタミン酸（Glu）、Ｆ：フェニルアラニン（Phe）、Ｉ：イソロイシン（Ile）、Ｋ：リジン（Lys）、Ｌ：ロイシン（Leu）、Ｍ：メチオニン（Met）、Ｎ：アスパラギン（Asn）、Ｑ：グルタミン（Gln）、Ｒ：アルギニン（Arg）、Ｓ：セリン（Ser）、Ｔ：スレオニン（Thr）、Ｖ：バリン（Val）、Ｙ：チロシン（Tyr）］。
これらのペプチドの化学合成は、パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ社製４３１Ａペプチドシンセサイザーを使用し、同装置のプロトコルに従って、FastMocTM固相合成法にて実施した。例えば、上記ペプチド１と３の合成に際しては、0.25mmolのFmoc-L-Met-レジン、ペプチド２の合成に際しては0.25mmolのFmoc-L-Val-レジン（いずれもパーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ペプチドのＮ末端に向かって順次アミノ酸を結合させた。その他のペプチドも同様にして作製した。結合反応において、アミノ酸として、パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ社製のFmoc保護アミノ酸をそれぞれ１mmol用いた。得られたペプチドの脱保護とレジンからの切り出しはパーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ社のプロトコル「Introduction to Cleavage Techniques」に記載された方法にて実施した。
次に、脱保護とレジンからの切り出しを行った粗結晶から蒸留水でペプチドを抽出し、凍結乾燥によって粗ペプチドを得た。これを、パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ社製Brownlee逆相カラム（直径10mm、長さ250mm）を用い、0.1％トリフルオロ酢酸溶液と、0.09％トリフルオロ酢酸を含む70％アセトニトリル溶液で濃度勾配（０→100％）をかけることによって精製した。
実施例４．ヒトＴＦＰＩのＣ末端領域ペプチドによる平滑筋細胞増殖抑制作用
実施例２と同様に細胞を播種し、播種の２日後、各濃度のＣ末端領域ペプチドを添加したＤＭＥに交換し、同じ培地での培地交換を２日毎に行いながら37℃のＣＯ2インキュベーター内にて培養を行った。培地量はウェルあたり0.3mlとし、対照としては何も含まないＤＭＥを用いた。播種して９日後、実施例２と同様に１ウェルあたりの細胞数を計測した。図２は各群３ウェルの細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである。ヒトＴＦＰＩのＣ末側23アミノ酸残基に相当するペプチド１を20μg/ml添加した群では対照に比べて有意に（スチューデントｔ検定：ｐ＜0.05）細胞数が少なかった。従って、ペプチド１単独で有効な平滑筋増殖抑制剤となりうることが示された。
一方、ペプチド１のＮ末側11アミノ酸に相当するペプチド２およびペプチド１のＣ末側12アミノ酸に相当するペプチド３は、20μg/ml添加しても全く増殖抑制効果がみられなかった。これらの事実より、ペプチド２あるいはその一部のアミノ酸配列と、ペプチド３あるいはその一部のアミノ酸配列の両者が同一分子中に共存して初めて、平滑筋細胞増殖抑制効果が発揮されるものと推測された。
実施例５．ペプチド１の濃度依存的平滑筋細胞増殖抑制効果
平滑筋細胞はクラボウ社から購入したヒト大動脈由来血管平滑筋細胞を用いた。培地は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、５％牛胎児血清を含む、クラボウ社製Humedia-SG培地を使用した。なお、以下の実験には継代数６の平滑筋細胞を用いた。
Humedia-SGに懸濁した細胞を、2500個／ウェルの細胞密度で48ウェル培養プレート（岩城硝子株式会社製）に播種し、37℃のＣＯ2インキュベーターにて培養した。播種の翌日、各濃度のペプチド１を含むHumedia-SG培地に交換（１ウェルあたりの培地量0.3ml）し、以後２日ごとに新鮮な同培地に交換しながら、37℃で培養を継続した。播種して９日後、実施例２と同様に１ウェルあたりの細胞数を計測した。図３は、各群４ウェルの細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである。
ペプチド１は、培地中の濃度で約３〜５μＭ以上存在すると有意な平滑筋細胞増殖抑制作用を発揮することが明らかとなった。ただし、本検討においては極めて増殖因子が豊富な培地を用いており、一般に平滑筋細胞増殖用培地としてしばしば用いられる10％ＦＣＳ含有ＤＭＥなどを用いた場合や、実際に生体内に投与した場合においては、より少ない量で、有意な平滑筋細胞増殖抑制効果を発揮しうる可能性がある。
実施例６．各種ペプチドによる平滑筋細胞増殖抑制効果
実施例５と同様に細胞を播種し、翌日、終濃度20μＭとなるように実施例３で作製した各種ペプチドを添加したHumedia-SG培地にて培地交換して37℃にて培養を続けた。播種して10日後、実施例２と同様に１ウェルあたりの細胞数を計測した。図４は、各群４ウェルの細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである。なお、いずれのペプチドを添加した群においても、死細胞率は全体の５％以下であった。
グラフ中に示されている事実より、以下の結論が導かれる。
（1）ペプチド１とペプチド２＋３との比較
ペプチド２＋３は、ペプチド１のＮ末端側11残基に相当するペプチド２とペプチド１のＣ末端側12残基に相当するペプチド３の等量混合物（各20μＭ）である。ペプチド１が平滑筋細胞の増殖を極めて強く抑制しているのに対し、ペプチド２＋３は全く増殖抑制効果は見られなかった。この結果から、平滑筋細胞増殖抑制効果を発揮するためには、ペプチド２中に存在する特定のアミノ酸配列と、ペプチド３中に存在する特定のアミノ酸配列の両者が同一分子中に存在することが必須であることが明らかとなった。
（2）ペプチド１とペプチド７〜９との比較
ペプチド７、８、９は、ペプチド１のＮ末端から数えて14番目のアミノ酸Alaから、17番目のアミノ酸Gluにかけての４残基の領域（Ala-Tyr-Glu-Glu）が欠失、またはアミノ酸が置換された改変体である。この領域を欠失、または任意のアミノ酸で置換しても、ペプチド１と同様の増殖抑制効果を有することから、ペプチド１のＮ末側13個のアミノ酸配列及びＣ末側６個のアミノ酸配列が平滑筋細胞増殖抑制に密接に関与しているとが明らかになった。
（3）ペプチド１とペプチド４との比較
ペプチド４は、ペプチド１のＮ末側の塩基性アミノ酸に富む13個のアミノ酸配列をＣ末端に、一方、疎水性アミノ酸が多く含まれるＣ末側６個のアミノ酸配列をＮ末端に配置したペプチドである。このペプチド４には全く平滑筋細胞増殖抑制効果が認められないことから、塩基性アミノ酸に富む領域をＮ末端側に、そのＣ末側に疎水性アミノ酸に富む領域を配置することが必須要件であることが明らかになった。
（4）ペプチド１とペプチド10との比較
ペプチド10は、ペプチド１のＮ末端側に存在する塩基性アミノ酸に富む領域のアミノ酸配列を、より塩基性アミノ酸の含有量が少なくなるように設計されたペプチドである。具体的には、ペプチド１のＮ末側１２アミノ酸を血小板第４因子のヘパリン結合部位であるＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳに置換されたものである。ペプチド１においては、塩基性アミノ酸に富むＮ末端13アミノ酸の領域中、塩基性アミノ酸は９個存在するが、ペプチド10においては４個である。塩基性アミノ酸を４個に減らすことにより、ペプチド１に比べて平滑筋細胞増殖抑制効果は大きく減弱するが、それでもなお、対照群に比べ統計学的に有意な平滑筋細胞増殖抑制効果を保持していることが示された（スチューデントt検定による。危険率５％以内）。従って、塩基性に富む領域にはアミノ酸13個中少なくとも４個以上の塩基性アミノ酸が含まれることが必要であることが明らかになった。
（5）ペプチド１とペプチド６との比較
ペプチド６は、ペプチド１のＣ末端側６残基の領域（Ile-Phe-Val-Lys-Asn-Met）内の疎水性アミノ酸、Ile、Phe、Val、Metが、他の疎水性アミノ酸であるロイシン（Leu）に置換されたペプチドである。ペプチド１に比べて増殖抑制効果は1/3程度減弱したが、なお強い増殖抑制効果を保持していることが示された。この事実より、ペプチドのＣ末端側の疎水性アミノ酸は、ペプチド１のアミノ酸配列にのみ限定されるものではなく、任意の疎水性アミノ酸に置換しうること、さらに当該Ｃ末端側の疎水性アミノ酸が平滑筋細胞増殖抑制効果に重要な役割を担っていることが明らかになった。
（6）ペプチド１とペプチド11〜20との比較
ペプチド20は、ペプチド１のＮ末端に疎水性アミノ酸であるIleが付加されたペプチドである。この１個のアミノ酸の付加により、ペプチド１で見られた増殖抑制効果がさらに高まったことから、より強い平滑筋細胞増殖抑制効果を持つペプチドを設計する場合には、塩基性に富む領域のＮ末端にIleなどの疎水性アミノ酸を少なくとも１個付加することが望ましい。
ペプチド11〜19は、ペプチド20のＣ末端のアミノ酸を種々欠損させたペプチドである。詳細には、ペプチド19〜14はペプチド20から１残基ずつアミノ酸を欠失させていった形のペプチドであり、また、ペプチド13〜11は、ペプチド14から更にＣ末端をそれぞれ４残基、６残基、８残基欠失させたペプチドである。これらを比較検討した結果、ペプチド20からＣ末端を４残基欠失させたペプチド16は、強い増殖抑制効果を保持しているが、５残基欠失させたペプチド15は、ほとんどその効果が失われることが認められた。
（i）上記（2）の検討結果より、ペプチド１のＮ末端から数えて14番目のアミノ酸Alaから17番目のアミノ酸Gluにかけての４残基の領域（Ala-Tyr-Glu-Glu）は増殖抑制効果に全く寄与していないこと、また、（ii）上記（5）の検討結果より、ペプチド１のＣ末側６アミノ酸中の疎水性アミノ酸が平滑筋細胞増殖抑制の重要な役割を担っていることより、Ｃ末端側に少なくとも２個連続した疎水性アミノ酸が存在していることが必要であることが明らかになった。
（7）ペプチド１とペプチド５との比較
ペプチド５は、ペプチド１のＣ末端から３番目に存在する塩基性アミノ酸であるLysを非親水性のアミノ酸であるGlnに改変したペプチドである。このアミノ酸置換によって、ペプチド１の増殖抑制効果はさらに高められた。すなわち、優れた平滑筋増殖抑制効果を発揮するためには、ペプチド１のＣ末端から３番目に存在するLysをGlnに置換することが好ましい。
産業上の利用可能性
本発明のペプチドは優れた平滑筋細胞増殖抑制効果を有しており、平滑筋細胞の増殖に伴う病的状態、例えば、動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄及び平滑筋肉腫の予防ならびに治療剤として有効である。本発明のペプチドを用いて該薬剤を製造する場合、以下のような利点が得られる。
（i）ヒト血漿を原料として、あるいは遺伝子組換え技術を用いて生産する必要がなく、化学合成法によって安価かつ大量に合成することができる。また、ヒト血漿や遺伝子組換えに用いる宿主に由来する病原体の混入の危険性がなく、極めて安全な製剤を製造することができる。
（ii）本発明のペプチドを、平滑筋細胞増殖抑制効果のみを持つペプチドで構成することによって、その他の領域に起因する不必要な生理的作用や未知の副作用を排除することができ、より高濃度・大量投与が可能となる。例えば、ＴＦＰＩ全長の分子を投与した場合に発生すると予想される出血性の副作用を排除することができる。
（iii）本発明のペプチドのアミノ酸配列を適宜改変することによって、あるいは適当な化学修飾技術などを利用して、より効果の高い薬剤を創製しうる。また、経口投与可能な薬剤として製剤化するなど、投与法の選択範囲を拡げることが可能となる。
配  列  表
配列番号：１
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000004
配列番号：２
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000005
配列番号：３
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000006
配列番号：４
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000007
配列番号：５
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000008
配列番号：６
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000009
配列番号：７
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000010
配列番号：８
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000011
配列番号：９
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000012
配列番号：１０
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003930050.tif 000013
配列番号：１１
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000014
配列番号：１２
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000015
配列番号：１３
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000016
配列番号：１４
配列の長さ：１８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000017
配列番号：１５
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000018
配列番号：１６
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000019
配列番号：１７
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000020
配列番号：１８
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000021
配列番号：１９
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000022
配列番号：２０
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源  ヒト組織因子凝固系インヒビター
配列
0003930050.tif 000023
【図１】
0003930050.tif 000024
【図２】
0003930050.tif 000025
【図３】
0003930050.tif 000026
【図４】
0003930050.tif 000027