(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記の理化学的性質を有するＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ。
（１）酵素作用
基質としてグルコース、ヌクレオシドジリン酸類としてＡＤＰを用いた場合の酵素作用を以下に示す。
【化１】
0004001658.tif 000013
（２）基質特異性
基質としてグルコースを用いるに比べて１，５アンヒドログルシトールに対して高い特異性を示す。
（３）等電点
４．１±０．５（ｐＨ３．５〜１０のキャリアー・アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（４）分子量
５００００±５０００（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬを用いたゲルろ過にて）
（５）至適ｐＨ
至適ｐＨは７〜７．５にあった。
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ６．５〜１０．５の範囲で最も良好な安定性を示した。
（７）至適温度
至適温度は８０〜１００℃であった。
（８）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ０．５Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間熱処理した後残存活性を測定した結果、少なくとも９５℃まで安定であった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシドジリン酸類およびマグネシウムイオン存在下１，５アンヒドログルシトール（以下、１，５ＡＧと略す）の６位の水酸基をリン酸基に置換し１，５アンヒドログルシトール６リン酸（以下、１，５ＡＧ６Ｐと略す）とヌクレオシドモノリン酸を生成する反応を触媒し、かつ１，５ＡＧに対して高い基質特異性を有する新規なＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼに関し、診断用酵素分野に関する。
【０００２】
【従来技術】
１，５ＡＧはヒト髄液、血漿、血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下することが報告されている化合物であり（日本内科学会会誌８０巻、１１９８−１２０４、１９９１）、近年、糖尿病診断マーカーとして使用されている物質である。
【０００３】
従来、生体試料中の１，５ＡＧを測定する方法としてはガスクロマトグラフィー法（糖尿病、２５巻、１１１５−１１１８、１９８２）、ピラノースオキシダーゼを用いて測定する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報）、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを用いて測定する方法（特開平８−１０７７９６号公報）などが知られていた。
【０００４】
しかしながら、ガスクロマトグラフィー法は被検液の前処理として１，５ＡＧのラベル化が必要である上、測定に長時間を要し、多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。
またピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定法はピラノースオキシダーゼが基質としてピラノース類に広く作用するため１，５ＡＧを正確に測定することができなかった。
【０００５】
さらにＡＴＰをリン酸供与体として１，５ＡＧをリン酸化する酵素としてヘキソキナーゼ、グルコキナーゼが知られていたがヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼがグルコースに対して高い特異性を示し、１，５ＡＧに対してほとんど作用せず、現実的に１，５−ＡＧの測定は不可能であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は１，５ＡＧに対して高い特異性を持ち、同時に液状試薬として長期保存安定性を有する新規な酵素を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
まず、本発明者らは１，５ＡＧに対して特異的に作用する酵素を広く微生物からスクリーニングしたところ、超高度好熱菌サーモコッカス・リトラリス・ＡＴＣＣ５１８５０菌株の菌体内にヌクレオシドジリン酸類の１種であるＡＤＰの存在下１，５ＡＧをリン酸化して１，５ＡＧ６Ｐを生成する反応を触媒するＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（以下、ＡＤＰ−ＨＫと略す）を初めて見出し、特に基質としてグルコースを用いるに比べて１，５ＡＧに高い基質特異性を有することを見出した。
【０００８】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、基質としてグルコースを用いるに比べて１，５ＡＧに対して高い基質特異性を有し、ヌクレオシドジリン酸類およびマグネシウムイオン存在下、１，５ＡＧの６位の水酸基をリン酸基に置換し、１，５ＡＧ６Ｐとヌクレオシドモノリン酸類を生成する反応を触媒するＡＤＰ−ＨＫに関するものである。
【０００９】
まず、本発明ＡＤＰ−ＨＫの取得方法を述べる。本発明のグルコースを用いるに比べて１，５ＡＧに対して高い基質特異性を有するＡＤＰ−ＨＫは基質として１，５ＡＧに対して高い基質特異性を有する酵素であれば何ら限定されるものではなく、例えば超高度好熱菌サーモコッカス・リトラリス・ＡＴＣＣ５１８５０菌株由来のＡＤＰ−ＨＫが挙げられる。超高度好熱菌サーモコッカス・リトラリス・ＡＴＣＣ５１８５０菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣカタログ（１９ｔｈ、１９９６年）に記載されており、何人も入手可能である。
【００１０】
ＡＤＰ−ＨＫ生産菌の培養方法は例えば後述に記載する実施例と同様の培地を用いて通気することなく培養すればよく、培養温度は菌の生育する温度範囲で行えばよく、７０〜１１０℃、好ましくは８５〜１０５℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする酵素を採取すればよい。
【００１１】
ＡＤＰ−ＨＫは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ＡＤＰ−ＨＫの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
【００１２】
このようにして得られた粗製のＡＤＰ−ＨＫ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製されたＡＤＰ−ＨＫを得ることができる。例えばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＡＤＰ−ＨＫを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
【００１３】
次に、ＡＤＰ−ＨＫの１，５ＡＧを基質としたときの反応メカニズムはエッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ（１，５ＡＧ６ＰＤＨ）を用いて検討した。
この１，５ＡＧを基質としたときのＡＤＰ−ＨＫの反応は、下記反応式
【００１４】
【化２】
0004001658.tif 000002
【００１５】
にて表される。
また、１，５ＡＧ６ＰＤＨは、少なくとも下記反応式を触媒する酵素である。
【００１６】
【化３】
0004001658.tif 000003
【００１７】
で示される。
１，５ＡＧ６ＰＤＨとしては１，５ＡＧ６Ｐを基質とし、例えば補酵素として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型ＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）+ 〕を消費して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔還元型ＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+ 〕を生成する１，５ＡＧ６ＰＤＨであればなんら限定されるものではない。
【００１８】
またこの１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌であれば何ら限定されるものではなく，１，５ＡＧ６ＰＤＨを生産する能力を有するその変異株であってもよい。好ましくはエシェリヒア・コリ属に属する生産菌が考えられ、より好ましいものとしてエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）はＡＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ、１９９２年）カタログに記載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られた１，５ＡＧ６ＰＤＨが好ましい。
【００１９】
次いで１，５ＡＧ６ＰＤＨを得るに当たって好ましくはエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）を培養するものでこの培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャー等による通気培養である。この培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ６．５〜７．５、培養温度は２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間にて目的となる酵素を採取すればよい。
【００２０】
１，５ＡＧ６ＰＤＨは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。１，５ＡＧ６ＰＤＨの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
【００２１】
このようにして得られた粗製の１，５ＡＧ６ＰＤＨ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製された１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができる。例えばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
【００２２】
ＡＤＰ−ＨＫの１，５ＡＧを基質としたときの反応生成物は１，５ＡＧ６ＰＤＨが作用することから１，５アンヒドログルシトール６リン酸と判明し、１，５ＡＧを基質として用いた場合の反応式は
【００２３】
【化４】
0004001658.tif 000004
【００２４】
で示される。
つぎに本発明のＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質および酵素活性測定法を述べる。ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ        トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ        グルコース
２ｍＭ        ＡＤＰ
２ｍＭ        ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ      グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｇ６ＰＤＨ、東洋紡社製）
０．０２５％    ＮＢＴ
１ｍＭ          ＮＡＤＰ
１％            トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ      ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた場合の酵素作用を以下に示す。
【００２５】
【化５】
0004001658.tif 000005
【００２６】
（２）基質特異性
基質特異性はＡＤＰ、ＭｇＣｌ2 の存在下、各基質をＡＤＰ−ＨＫと反応させた後、ＡＤＰの変化量をショウデックス・アサヒパック（Ｓｈｏｗｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ）ＧＳ−３２０ＨＱカラム（昭和電気工業社製）を用いたＨＰＬＣ法にて測定した。その結果を表１に示す。表１より本発明ＡＤＰ−ＨＫは１，５ＡＧに対して最も高い基質特異性を示した。
【００２７】
【表１】
0004001658.tif 000006
【００２８】
Ａ：バチルス・ステアロサーモフィルス由来グルコキナーゼ（ファルマシア社製）
Ｂ：酵母由来ヘキソキナーゼ（オリエンタル酵母工業社製）
Ｃ：パイロコッカス・フリオサス由来ＡＤＰ−ＨＫ（特願平７−３４０４８２号公報）
（３）等電点
４．１±０．５（ｐＨ３．５〜１０のキャリアー・アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（４）分子量
５００００±５０００（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXLを用いたゲルろ過にて）
（５）至適ｐＨ
ｐＨ４．０〜５．０は酢酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．０〜６．５はクエン酸緩衝液（△−△）、ｐＨ６．５〜７．５はリン酸緩衝液（□−□）、ｐＨ７．５〜８．５はトリス−塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ８．５〜１０．５はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（▲−▲）を用いた。至適ｐＨの検討結果を図１に示す。図１より至適ｐＨは７〜７．５付近にあった。
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜５．０は酢酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．０〜６．５はクエン酸緩衝液（△−△）、ｐＨ６．５〜７．５はリン酸緩衝液（□−□）、ｐＨ７．５〜８．５はトリス−塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ８．５〜１０．５はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（▲−▲）を用いた。３７℃、６０分間処理でのｐＨ安定性の検討結果を図２に示した。図２よりｐＨ６．５〜１０．５の範囲で最も良好な安定性を示した。
（７）至適温度
至適温度の検討結果を図３に示した。図３より至適温度は８０〜１００℃であった。
（８）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＡＤＰ−ＨＫ０．５Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間熱処理した後の残存活性を測定した結果、８０％以上の残存活性から少なくとも９５℃まで安定であった（図４）。
（９）２価の金属イオンの影響
マグネシウムイオンの代わりに各種２価の金属イオンを添加して、酵素活性を測定し、その結果を表２に示した。表２より本発明ＡＤＰ−ＨＫはマグネシウムイオンによって最も活性化され、銅イオンにより阻害を受けた。
【００２９】
【表２】
0004001658.tif 000007
【００３０】
（１０）各種添加物の影響
活性測定法（ＭｇＣｌ2 を２ｍＭ含有）に基づき、その他の金属イオンおよび界面活性剤などの各種添加物の影響を表３に示した。表３より本発明ＡＤＰ−ＨＫはＥＤＴＡにより阻害を受けた。
【００３１】
【表３】
0004001658.tif 000008
【００３２】
（１１）ヌクレオシドジリン酸類に対する作用
ヌクレオシドジリン酸類としてＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰおよびＩＤＰを用いて活性測定を行った結果を表４に示す。表４より本発明ＡＤＰ−ＨＫはＡＤＰおよびＣＤＰに対して高い特異性を示した。
【００３３】
【表４】
0004001658.tif 000009
【００３４】
【発明の実施の形態】
次いで、本発明について実施例および参考例を挙げて詳細に述べるが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００３５】
【参考例１】
１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌の培養
エシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の培養
培地組成
０．５％            肉エキス
１．５％            ソルビトール
１．０％            トリプトン
１．５％            ビール酵母エキス
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア．コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の菌体懸濁液１ｍｌを移植し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０２８（ダウコーニング社製）を０．３％含む液体培地５ｌを１０ｌ容ジャー２ヶにおいて滅菌した後に種培養液を移植し、３７℃で培養液のｐＨを５ＮのＮａＯＨで６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌを得た。
【００３６】
１，５ＡＧ６ＰＤＨの精製
得られた培養液１０ｌを遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ・Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。
【００３７】
この破砕液を透析チューブを用いて５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＦＦ（ファルマシア社製）１２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５），３ＭのＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）５００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約１．２ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（５０Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で、一夜透析した後、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜１ＭのＮａＣｌ，２０％エチレングリコールのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ・Ｑ（ファルマシア社製）６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、均質な酵素標品を得た。
【００３８】
１，５ＡＧ６ＰＤＨの理化学的性質
（１）作用
１，５ＡＧ６ＰＤＨを補酵素の存在下脱水素し、組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式
【００３９】
【化６】
0004001658.tif 000010
【００４０】
で表される反応を触媒する。
（２）力価の測定法
１，５ＡＧ６ＰＤＨの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ      ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
１ｍＭ      ＮＡＤＰ
５ｍＭ      １，５ＡＧ６Ｐ
（ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕ−ｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１３．５×酵素の希釈倍率
（３）基質特異性
上記力価測定法を利用して、その反応液中の１，５ＡＧ６Ｐの代わりに、種々の基質を用いて、１，５ＡＧ６Ｐに対する相対活性を求めた結果を表５に示す。その結果、この酵素は少なくとも１，５ＡＧ６Ｐに基質特異性を示した。
【００４１】
【表５】
0004001658.tif 000011
【００４２】
（３）至適ｐＨ
ｐＨ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１０．５はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０付近であり、結果を図５に示した。
（４）ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜５．５はクエン酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．５〜７．０はビストリス塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９において安定であり、結果を図６に示した。
【００４３】
（５）至適温度
上記の力価測定法における測定法を利用して、その温度条件を変えて酵素反応を行った結果は図７に示す通りであって、その至適温度は３７〜５０℃であった。
（６）熱安定性
１，５ＡＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、１，５ＡＧ６ＰＤＨの残存活性を測定した結果、図８に示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であった。
【００４４】
（７）種々の物質による影響
上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、１，５ＡＧ６ＰＤＨの１，５ＡＧ６Ｐに対する酵素活性を測定した結果を表６に示す。
【００４５】
【表６】
0004001658.tif 000012
【００４６】
（８）分子量
７８０００±６０００（ＴＳＫｇｅｌ・Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）を用いたゲル濾過法による）
（９）等電点
４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−ｐＨ１０（ファルマシア製）を用いる電気泳動法により測定）
（１０）Ｋｍ値
１，５ＡＧ６Ｐに対するＫｍ値：２５ｍＭ
ＮＡＤＰに対するＫｍ値：０．０９ｍＭ
（１１）作用機序確認試験
１，５ＡＧ６Ｐ、ＮＡＤＰ、トリエチルアミン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５ＡＧ６ＰＤＨを含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５ＡＧ６Ｐに生成したカルボニル基を２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめヒドラゾンとして分離し、マススペクトルを測定することで生成物が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであることが確認された。
【００４７】
【実施例１】
サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ・ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＡＴＣＣ５１８５０菌株の培養
培地組成
０．１％            酵母エキス
０．５％            トリプトン
０．７２％          マルトース
２．３９％          ＮａＣｌ
０．４％            Ｎａ2 ＳＯ4 
０．０７％          ＫＣｌ
０．０２％          ＮａＨＣＯ3 
０．０１％          ＫＢｒ
０．０３％          Ｈ3 ＢＯ4 
１．０８％          ＭｇＣｌ2 
０．１５％          ＣａＣｌ2 
０．００２５％      ＳｒＣｌ2 
０．０２５％        ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％        Ｋ2 ＨＰＯ4 
０．１％            ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％      Ｎ（ＣＯＯＨ）3 
０．０００５％      ＭｎＳＯ4 
０．００１４％      ＦｅＳＯ4 
０．０００２％      ＮｉＣｌ2 
０．０００１％      ＣｏＳＯ4 
０．０００１％      ＺｎＳＯ4 
０．００００１％    ＣｕＳＯ4 
０．０００００１％  Ｎａ2 Ｗｏ4 
０．０００００１％  Ｎａ2 Ｍｏ4 
０．１％            システイン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５００ｍｌ溶三角フラスコ１本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにサーモコッカス・リトラリス・ＡＴＣＣ５１８５０株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２０ｌ／３０ｌジャーを滅菌した後、種培養液を移植し、緩やかに攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２０ｌを得た。
【００４８】
【実施例２】
ＡＤＰ−ＨＫの精製
得られた培養液２０ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２２０ｍｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００４９】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、２１０ｍｌ（酵素活性１２２Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．６５〜０．７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９６Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（７０）が得られた。この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（６０Ｕ）が溶出され、均質な酵素標品を得た。
【００５０】
【発明の効果】
１，５ＡＧに対して高い基質特異性を有し、１，５ＡＧの簡便かつ高精度の測定に用いることのできる新規なＡＤＰ−ＨＫを提供できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明ＡＤＰ−ＨＫの至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明ＡＤＰ−ＨＫのｐＨ安定性曲線を示す。
【図３】図３は本発明ＡＤＰ−ＨＫの至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明ＡＤＰ−ＨＫの熱安定性曲線を示す。
【図５】図５は１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適ｐＨ曲線を示す。
【図６】図６は１，５ＡＧ６ＰＤＨのｐＨ安定性曲線を示す。
【図７】図７は１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適温度曲線を示す。
【図８】図８は１，５ＡＧ６ＰＤＨの熱安定性曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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