(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的修飾フォーミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むタンパク質の発現用ベクターであって、前記修飾が該タンパク質の残基９７５または９８１における截断であるベクター。
【請求項２】
前記タンパク質が非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質の全部または一部を更に含む融合タンパク質である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記融合が（ｉ）前記ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカードメイン内、（ｉｉ）前記ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位内、または（ｉｉｉ）前記ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメイン内、若しくは膜貫通アンカードメインと細胞質ドメイン間の連結部位にある請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記タンパク質が、ＦＶエンベロープタンパク質の細胞外ドメインおよび膜貫通アンカードメインの５′部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカードメインの３′部分および細胞質ドメインを含む請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記タンパク質がＦＶエンベロープタンパク質のＳＵドメインおよび切断部位の全部または一部を含み、ならびに非ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位の全部または一部およびＴＭドメイン（膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む）を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
前記タンパク質がＦＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインの全部または一部、細胞外ドメインおよび膜貫通アンカードメイン並びに非ＦＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインの全部または一部を含む請求項３に記載のベクター。
【請求項７】
フォーミーウイルスがヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）である請求項１乃至６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質がＭｕＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＦＢ２９、ＨＴＶおよびＳＩＶからなる群より選択されるレトロウイルス由来である請求項２乃至７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
前記タンパク質が、エンベロープタンパク質の細胞質ドメインの全部または一部が非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質の全部または一部で置換されているＨＦＶエンベロープタンパク質からなる請求項３、７または８に記載のベクター。
【請求項１０】
非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質がＭｕＬＶ細胞質ドメインの全部または一部からなる請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
ＭｕＬＶ細胞質ドメインがプロセシングされているまたはプロセシングされていない請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記タンパク質が、アミノ酸９８１で截断され、Ｃ末端でアルギニンおよび野生型ＭｕＬＶエンベロープタンパク質の残基６３４から残基６６５にわたるプロセシングされていないＭｕＬＶ細胞質ドメインに融合されている修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項１３】
ＦＶエンベロープタンパク質コード配列中に天然に存在するドナースプライシング部位、アクセプタースプライシング部位および両スプライシング部位から成る群より選択されるスプライシング部位の突然変異を含む請求項１または３に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載のベクターによって発現されるタンパク質。
【請求項１５】
請求項１乃至１３のいずれかに記載のベクターによって発現されるタンパク質または請求項１４に記載のタンパク質を含む偽型ウイルス粒子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の偽型ウイルス粒子の調製方法であって、（ｉ）組換えレトロウイルスベクターを補完細胞株に導入する工程、（ｉｉ）該偽型ウイルス粒子の産生を可能とする適当な条件下で該補完細胞株を培養する工程、および（ｉｉｉ）細胞培養から該偽型ウイルス粒子を回収する工程を含む前記調製方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の偽型ウイルス粒子または請求項１６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子によって感染された単離哺乳類細胞。
【請求項１８】
治療的または効果的な量の請求項１５に記載の偽型ウイルス粒子または請求項１６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１３のいずれかに記載のベクターを含む補完細胞株。
【請求項２０】
レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するベクターを更に含む請求項１９に記載の補完細胞株。
【請求項２１】
レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子がＭｕＬＶまたはＦＢ２９またはＳＩＶ由来である請求項２０に記載の補完細胞株。
【請求項２２】
ヒト２９３細胞である請求項２０または２１に記載の補完細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも１種の修飾フォーミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むタンパク質の発現用構築物、それによって得られるタンパク質、及び偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補完細胞系に関する。前記粒子を含有する医薬組成物及び疾病の治療方法にも関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
レトロウイルス科のサブグループであるフォーミーウイルス（ＦＶ）はそのユニークな複製法と遺伝子移入ベクターとしての潜在的用途により科学的関心を集めている（３５）。ＦＶは、例えばヒト集団にＦＶ抗体が存在せず、自然ＦＶ感染が良性経路を辿り、宿主細胞範囲が非常に広く、ＦＶゲノムの寸法によりパッケージング限度が拡がるなどのこのウイルス群の固有の性質により、遺伝子送達システムの開発に理想的なツールであり得ると記載されている（４，３０，３２）。しかし、このウイルス群の分子生物学情報は限られているため、特にマウスレトロウイルスに由来するもののように安全なパッケージング細胞系及びベクターは開発されていない（２７）。他えば、ＦＶゲノムは複雑な構造をもつ２本鎖ＤＮＡである。ＬＴＲ（長い末端反復配列）、パッケージング領域並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加え、ｅｎｖと３’ＬＴＲの間に位置するｂｅｌ１、ｂｅｌ２、ｂｅｌ３、ｂｅｔ、ｂｅｏ及びｂｅｓ等の数個の遺伝子も含む。ｅｎｖ遺伝子は１３０ｋＤａグリコシル化前駆物質をコードし、この前駆物質を切断すると、表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質を生じる（図１参照）。更に、ＦＶはスプライスしたｍＲＮＡからＧａｇタンパク質とは別にそのＰｏｌタンパク質を発現し、ＦＶゲノムパッケージング及び粒子アセンブリのメカニズムや、細胞外粒子に多量の逆転写ＤＮＡが存在する意味は殆ど分かっていない（１０，１８，３９）。他のユニークな特徴としては、Ｇａｇ前駆物質タンパク質の核局在（３１，４０）や、恐らくＥＲにＥｎｖ前駆物質タンパク質が保持される結果として主に細胞質内小胞に出芽すること（１３）などが挙げられる。
【０００３】
モロニーのレトロウイルス系遺伝子移入ベクターは現在主要なビークルであり、多種多様な細胞型に高い効率で安定に遺伝子を移入することができる（２０）。このベクター系の最大の欠点は、宿主細胞範囲が限られており、ヒト細胞に感染できない場合もある点である（（１）で報告）。最近、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（６，３８）又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質による偽型化を用いた数種の方法でこれらの欠点を克服できることが判明した。
【０００４】
しかし、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は産生細胞に高毒性であり、安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細胞系を作製することはできなかった（８，２２，３７）。
【０００５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明は少なくとも１種の修飾ＦＶエンベロープタンパク質を含むタンパク質の発現用構築物に関する。
【０００６】
本発明による好適ＦＶはヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）であるが、他のウイルス（例えばサルＦＶ）も使用できる。
【０００７】
修飾は、上記修飾ＦＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質の１もしくは数個のアミノ酸（ａａ）の突然変異、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１種又はその組み合わせから構成され得る。このような修飾は細胞質尾部（cytoplasmic tail）に導入するのが好ましい。有利には、修飾ＦＶエンベロープタンパク質はａａ９７５又はより好ましくは９８１で切断されている。切断（truncation）は終止コドンまで延びていてもよいし、あるいは場合により原ＦＶ  ｅｎｖタンパク質の１又は数個の残基を終止コドンの前に含んでいてもよい。更に、本発明の構築物は、成熟修飾ＦＶエンベロープタンパク質又はその前駆物質又は種々の起源の配列の融合により得られるキメラタンパク質を発現することができる。
【０００８】
特に好適な態様では、本発明で使用される修飾ＦＶ  ｅｎｖタンパク質は非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質の全部又は好ましくは一部を更に含む融合タンパク質である。適切な非ＦＶレトロウイルスの例としては、ニワトリレトロウイルス、ウシレトロウイルス、ネコレトロウイルス、マウスレトロウイルス（例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、特にモロニーＭｕＬＶ（ＭｏＭｕＬＶ）、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭｕＬＶ）、特にＦＢ２９株、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ））、霊長類レトロウイルス（例えばＧａＬＶ、ＶＳＶ、又は例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）もしくはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）等のレンチウイルス）が挙げられる。
【０００９】
特に好適な態様では、本発明によるタンパク質は、細胞質ドメインの全部又は一部が非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質、特にＭｕＬＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインの全部又は一部で置換されたＨＦＶタンパク質エンベロープから構成される。有利には、融合タンパク質はＭｕＬＶ細胞質ドメインを修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質と融合することにより構成される。本発明で使用されるＭｕＬＶ細胞質ドメインはプロセシングされていてもよいし、プロセシングされていなくてもよい。「プロセシングされている」とは、対応するレトロウイルスプロテアーゼにより通常認識される開裂部位を含むことを意味し、「プロセシングされていない」とはこのような部位を含まないか又は機能的でない（突然変異、欠失又は截断）ことを意味する。
【００１０】
本発明の好適構築物は、以下の文中でＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶと呼ぶ融合タンパク質を発現させることが可能な構築物である。
【００１１】
本発明の構築物は、ＦＶ  ｅｎｖタンパク質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位を突然変異させたものでもよい。
【００１２】
本発明の構築物は、修飾ＦＶ  ｅｎｖタンパク質をコードする配列を転写及び翻訳できるように調節エレメントを含み得る。特に、ＦＶ  ｅｎｖをコードする配列の上流に慣用組換え技術により適切なプロモーターを作動的に連結することができる。このようなプロモーターは原核、真核又はウイルスのいずれの起源でもよく、構成性でも調節性でもよい。このような調節エレメントは当業者に周知である。
【００１３】
本発明の構築物は修飾ＦＶ  ｅｎｖタンパク質を発現する細胞の検出及び単離を可能にする選択遺伝子を更に含んでもよく、このような態様も本発明の範囲内である。本発明の関連では、選択遺伝子は修飾ＦＶ  ｅｎｖタンパク質の発現を誘導して２シストロン転写物を生じるプロモーターの転写制御下に置いてもよいし、付加的プロモーター領域の制御下に置いてもよい。考えられる選択遺伝子は多数あり、例えば抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈＦｒ）遺伝子、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子又はキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【００１４】
本発明の構築物は任意の適当なベクター、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）又はプラスミドに挿入することができる。適当なベクターの選択肢は広く、当業者の能力の範囲内である。このようなベクターは組込み型でもよいし、そうでなくてもよい。複製適合性（competent ）ウイルス粒子を生じる可能性を減らすためには、構築物がレトロウイルスＬＴＲとパッケージング領域を欠損していると有利である。
【００１５】
本発明は上記発現構築物により発現される融合タンパク質及びＦＶ  ｅｎｖタンパク質を含む偽型（pseudotyped ）ウイルス粒子にも関する。ＦＶ  ｅｎｖタンパク質は天然ＦＶ  ｅｎｖタンパク質、その一部又はその修飾物から誘導することができる。好適態様では、偽型ウイルス粒子は本発明による構築物により発現される修飾ＦＶ  ｅｎｖタンパク質をその表面に含む。本発明の偽型ウイルス粒子は、組換えレトロウイルスベクターを補完（complementation ）細胞系にトランスフェクトすることにより作製することができる。このような技術は公知であり、多数の従来技術文献に記載されている。本発明で使用されるレトロウイルスベクターは、上記のような任意のレトロウイルスに由来する少なくとも５’ＬＴＲ、パッケージング領域及び３’ＬＴＲと、更に目的ポリペプチドを産生するためにリボザイム、アンチセンスＲＮＡ分子又はｍＲＮＡを発現することが可能な遺伝子を含む。非限定的な例としてサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮα、β又はγ）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＤＦＴＲ）、ジストロフィン、凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ等）、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＨＰＶ抗原）、抗体、イムノトキシン及び抗ＨＩＶ薬剤等の治療用ポリペプチドが特に有用である。
【００１６】
本発明の別の目的は、偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補完細胞系及び前記ウイルス粒子の製造方法を提供することである。
【００１７】
本発明の補完細胞系は任意の細胞、特に真核細胞に由来し得る。例えばマウス細胞系、医薬的に許容可能な細胞系（Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ等）又はヒト細胞系（例えば２９３）が考えられる。このような細胞系は本発明による構築物を第１の選択遺伝子とともにトランスフェクトすることにより作製することができる。その後、ＦＶ  ｅｎｖに対する抗体を用いる免疫検出、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）又は他の任意の方法により、ｅｎｖ産生能の最も高い細胞が高レベルのＦＶ  ｅｎｖタンパク質の発現に対してスクリーニングされる。あるいは、本発明の補完細胞系は、第１の選択遺伝子とは異なる第２の選択遺伝子と共に、より好ましくはＭｕＬＶ、ＦＢ２９又はＨＦＶのレトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を更に含んでいてもよい。好ましくは、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子はＬＴＲ及びパッケージング領域をもたない別個の発現ベクターに担持される。選択及びスクリーニング段階を繰り返し、ｇａｇ／ｐｏｌ発現産物をも発現するｅｎｖ産生クローンを選択する。
【００１８】
本発明の補完細胞系は組換えレトロウイルスベクターをパッケージングするために使用することができる。第１及び第２の選択遺伝子とは異なる第３の選択遺伝子又は潜在（musked）遺伝子（例えばＬａｃＺ）を発現する慣用レトロウイルスベクターを使用して力価を試験することができる。その結果、高力価の偽型ウイルス粒子を産生する細胞を選択し、安定な補完細胞系を提供するように培養することができる。細胞は通常実施されているように後記方法で一過性試験してもよい。
【００１９】
本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子の製造方法が提供される。このような方法は、（１）本発明の補完細胞系に組換えレトロウイルスベクターを導入する段階と、（２）前記偽型ウイルス粒子の産生を可能にする適切な条件下で前記補完細胞系を培養する段階と、（３）細胞培養物から偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む。
【００２０】
好ましくは、偽型ウイルス粒子は細胞培養物上清から回収されるが、細胞溶解工程も考えられる。慣用技術（例えばスクロース又はＣｌＣｓ勾配での超遠心分離）により偽型ウイルス粒子を更に精製してもよい。有利には、こうして製造した偽型ウイルス粒子は（好ましくはポリブレンの不在下で）多種多様の細胞に感染することができ、場合によってはヒト血清による失活を阻止することができる。
【００２１】
本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子に感染した哺乳動物宿主細胞も提供される。このような宿主細胞の非限定的な例としてはヒト上皮細胞、肺細胞、筋細胞、肝細胞、造血細胞、繊維芽細胞及びリンパ球が挙げられる。
【００２２】
本発明の感染性偽型粒子及び哺乳動物細胞はワクチン又は治療薬として種々の疾病の予防又は治療に利用できる。
【００２３】
本発明の別の目的は、治療又は予防に有効な量の本発明の偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を治療薬として含有する医薬組成物を提供することである。このような医薬組成物は慣用方法で製造することができる。特に、本発明の粒子又は哺乳動物細胞をキャリヤー、希釈剤、アジュバント又は賦形剤等の当該技術分野で周知の適当な物質と組み合わせることができる。医薬組成物の特定組成は例えば発現させようとする目的ポリペプチド、所望の作用部位、投与方法及び治療対象等の種々のパラメーターによって異なる。このような組成は当業者が通常の知識によって決定できる。
【００２４】
本発明の最後の態様によると、遺伝病又は任意の病原遺伝子により誘発される疾病（例えば癌又はウイルス誘発病）の治療方法も提供され、該方法は治療を必要とする対象に治療に有効な量の本発明の偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を投与することを特徴とする。
【００２５】
本発明の上記及び他の目的は以下の実施例及び添付図面から容易に理解されよう。但し、これらの態様は本発明の全範囲を網羅するものではない。
【００２６】
特に、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）粒子へのヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）エンベロープタンパク質の取込みは、一過性トランスフェクションパッケージングセルシステムで試験した。ここで、効率は低いが、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化できることを報告しておく。ＨＦＶ細胞質尾部を完全又は部分的に除去すると、ＨＦＶに仲介される感染性が失われるか又は低下し、ＭｕＬＶ粒子の偽型化におけるＨＦＶエンベロープ細胞質尾部の役割が予想された。ＨＦＶエンベロープ細胞質尾部に存在するＥＲ保持シグナルを突然変異させても偽型レトロウイルスベクターの相対感染性は増加しなかった。他方、プロセシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメインを截断ＨＦＶエンベロープタンパク質に融合したキメラエンベロープタンパク質は、ＭｕＬＶ粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みの増加の結果として高いＨＦＶ特異的感染性を示した。
【００２７】
以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。
【００２８】
【実施例】
全構築は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８２に記載されているような標準組換えＤＮＡ技術を使用することにより実施する。細胞系はＡＴＣＣ等の菌寄託機関から入手でき、標準条件で培養する（ＮＩＨ３Ｔ３：ＣＲＬ１６５８、Ｍｖ．１．Ｌｕ：ＣＣＬ６４、ＨＴ１０８０：ＣＣＬ１２１、ＢＨＫ２１：ＣＣＬ１０、ＱＴ２６：ＣＲＬ１７０８及び２９３：ＣＲＬ１５７３）。ＨＦＶ  ｅｎｖタンパク質の配列は既に公知である。
【００２９】
１．ＦＶ  ｅｎｖ発現構築物の作製
完全長ｅｎｖオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＨＦＶプロウイルスクローンｐＨＳＲＶ１（２８）の３０７６ｂｐ  ＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入することにより、ヒトＦＶ単離体（ＨＦＶ）のエンベロープ遺伝子の真核発現構築物を作製した。この構築物をｐＣＨＦＶ  ｗｔと名づけ、図１に示す突然変異及びキメラＨＦＶエンベロープタンパク質を作製するために使用した。要約すると、鋳型としてＨＦＶ及び／又はＭｕＬＶ  ｅｎｖ遺伝子と、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドでポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより截断又はキメラｅｎｖ構築物を作製した。突然変異体を上記基本ベクターに挿入し、配列決定して部位外の突然変異を排除した。３種の突然変異ＨＦＶエンベロープ構築物を作製した。ｐＣＨＦＶ  Δ１とｐＣＨＦＶ  Δ２はそれぞれａａ９７５又は９８１で截断されたＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする。ｐＣＨＦＶ  Δ２には、元のＨＦＶ  ｅｎｖ配列に存在しないＣ末端アルギニンを付加した。Ｆｌｕｇｅｌら（１１）により提案されているＨＦＶエンベロープドメイン構造に従い、截断の結果、細胞質ドメインは完全（ｐＣＨＦＶ  Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶΔ２）に除去された。最後に、ｐＣＨＦＶ  ＳＳＳ構築物はセリン残基により置換された膜貫通（ＴＭ）タンパク質の細胞質尾部のＣ末端に三重リシンモチーフ（ａａ９８４〜９８６）をもつＨＦＶエンベロープタンパク質を産生する。この配列モチーフはＨＦＶエンベロープのＥＲ保持に関与することが示されている（１３，１４）。
【００３０】
ＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロセシングされているか又はプロセシングされていない細胞質ドメインをコードする配列のＣ末端融合により合計６個のキメラエンベロープタンパク質を構築した（１６，１７）。ｐＣＨＦＶ  Δ１ＭｕＬＶＲ−、ｐＣＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶＲ−及びｐＣＨＦＶ  ＳＳＳＭｕＬＶＲ−は上記３種の突然変異とプロセシングされているＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４〜６４９）から構成される融合タンパク質をコードし、ｐＣＨＦＶ  Δ１ＭｕＬＶ、ｐＣＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶ及びｐＣＨＦＶ  ＳＳＳＭｕＬＶはＣ末端にプロセシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４〜６６５）を含むそれぞれの融合タンパク質をコードする。
【００３１】
ＭｕＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）、エコトロピック（ｐＨＩＴ１２３）及びアンホトロピック（ｐＨＩＴ４５６）ＭｕＬＶエンベロープの発現構築物はＡ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ（３３）から提供された。レトロウイルスベクターＳＦＧ  ＧＦＰＳ６５Ｔは、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧ（５，２２）のクローニング部位に挿入された緑色蛍光タンパク質のヒト化ＯＲＦ（７）（Ｍ．Ｖｏｇｅｌの寄贈品）を含み、ＭＦＧ．Ｓ  ＮＬＳ−ＬａｃＺ（２２）はＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎの寄贈品）を含む。ＶＳＶ−Ｇ  ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＶＧＬ−１（２９）（Ｊ．Ｒｏｓｅの寄贈品）からの１．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＩＴベクターに挿入することにより、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物を作製した。
【００３２】
２．種々のＨＦＶ  ｅｎｖタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性
ほぼ従来技術（３３）に記載されているようなｐＨＩＴパッケージングシステムを使用して組換えレトロウイルス粒子を作製した。要約すると、ＭｕＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）の発現構築物、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧ  ＧＦＰＳ６５Ｔ及び上記種々のエンベロープ発現構築物を２９３Ｔ細胞（９）に一過性同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８〜７２時間後にウイルス上清を回収した。同一プラスミドをトランスフェクトした各トランスフェクション産物からの上清をプールし、濾過（０．４５μｍ細孔寸法）し、最終濃度８μｇ／ｍｌまでポリブレンを加え、上清を直接使用するか又は使用まで−８０℃で保存した。レトロウイルス形質導入後にＧＦＰタンパク質を発現する標的細胞をＦＡＣＳｃａｎでＦＡＣＳ分析により同定し、ＬｙｓｉｓＩＩ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して陽性細胞の数を定量した。
【００３３】
ｐＣＨＦＶ  ｗｔ発現構築物を使用した初期実験によると、効率は低いが、ＨＦＶ  ｗｔエンベロープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化することができ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入できることが判明した（図２）。ＨＦＶエンベロープタンパク質は、発現細胞のＥＲへの保持を誘導するシグナル配列をその細胞質ドメインに含む（１３，１４）。従って、細胞質的に截断又は突然変異を含むＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする３種の構築物ｐＣＨＦＶ  Δ１、ｐＣＨＦＶ  Δ２及びｐＣＨＦＶ  ＳＳＳを試験し、ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメインとそのＥＲ保持が偽型効率に及ぼす影響を調べた。野生型タンパク質に既に観察されている低い偽型活性は、ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメインを完全（ｐＣＨＦＶ  Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶ  Δ２）に除去すると失われるか又は低下する（図２）。細胞質ＥＲ保持シグナルの突然変異（ｐＣＨＦＶ  ＳＳＳ）はＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞表面発現を増加することが従来示されている（１３）。しかし、このような突然変異タンパク質でウイルス粒子を偽型化しても、これらのウイルスの感染性は増加しなかった（図２）。
【００３４】
ＨＦＶ細胞質ドメインを除去又は修飾しても偽型ウイルスの感染効率を増加することはできなかったので、次に第２のアプローチを使用し、ＨＦＶ細胞質ドメインをＭｕＬＶ細胞質ドメインで置換するか又はＭｕＬＶ細胞質ドメインを修飾完全長ＨＦＶエンベロープと融合して所望の効果が得られるか否かを試験した。ＭｕＬＶエンベロープの細胞質ドメインはウイルス粒子内でＭｕＬＶプロテアーゼによりプロセシングされることが示された（１６，１７）。既にプロセシングされている形態のＭｕＬＶエンベロープタンパク質を細胞で発現させると、大きい多核シンシチウムが形成され、ウイルス感染性が低下した（２４，２６）。従って、上記３種の突然変異体とＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロセシングされているか（ＭｕＬＶＲ−）又はプロセシングされていない（ＭｕＬＶ）細胞質ドメインのＣ末端融合タンパク質を作製し、これらのキメラエンベロープタンパク質で偽型化した粒子の感染性をＮＩＨ３Ｔ３細胞で試験した。興味深いことに、１種の突然変異体であるＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶタンパク質で偽型化したウイルスは野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子よりも１０〜２０倍高い活性を示した（図２）。ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶタンパク質による感染性のこの増加はＮＩＨ３Ｔ３即ちマウス細胞に特異的ではなく、ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で被覆したウイルス粒子を感染させることができないウズラ繊維芽細胞系ＱＴ−６でも同様の結果が得られた（図２）。これらの細胞において、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子の感染性はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化した粒子よりも一貫して高かった。分析した他の全タンパク質は、どちらの細胞系でも野生型ＨＦＶエンベロープよりも低いか又は同等の相対感染性をもつ偽型ウイルスを生じた（図２）。更に、プロセシングされているＭｕＬＶ細胞質ドメインを含むキメラＨＦＶエンベロープタンパク質をＬ９２９細胞でレトロウイルスベクターにより発現させると、プロセシングされていないＭｕＬＶ細胞質ドメインをもつ対応するタンパク質よりも高い融合活性を示した（データは示さず）。この結果は、ＭｕＬＶエンベロープの細胞質ドメインがキメラエンベロープタンパク質として発現されるときにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）等の外来エンベロープタンパク質の融合活性を制御できることを示すデータ（３６）に一致する。更に、種々のエンベロープタンパク質で偽型化した核局在β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするレトロウイルスベクターを含む上清を種々の種の細胞系で力価測定した（表１）。より詳細に説明すると、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清の系列希釈液で感染させる２４時間前に標的細胞（１×１０4 細胞／ウェル）をプレーティングした。感染から４８時間後に青いフォーカスの数を２回数え、力価を計算した。２回測定の値は３倍の範囲であった。表に示す結果は、指定細胞系で全て同一トランスフェクションからの無細胞上清を用いて独立して２回実施した力価測定の代表値であり、２回の実験で再現性のある相対力価が得られた。偽型粒子を含む上清をＮＩＨ３Ｔ３細胞中で６回まで力価測定し、再現性のある結果を得た。ＨＦＶ  ｗｔエンベロープ���ンパク質又はＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶキメラタンパク質で偽型化したレトロウイルス粒子は、マウス細胞以外にヒト、ミンク及びハムスター由来の細胞にも感染させることができた（表１）。ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクターの力価は、使用した標的細胞に依存して野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した場合の力価よりも８〜３５倍高かった。
【００３５】
【表１】
0003954151.tif 000002
【００３６】
３．ＨＦＶ特異的抗血清によるＨＦＶ  ｅｎｖ偽型粒子の感染性の中和
種々のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性がＨＦＶエンベロープに特異的であることを確認するために、偽型粒子を標的細胞に加える前に抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清と共にプレインキュベートした（３）。アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したウイルス粒子をＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートした場合の感染性は、これらのウイルスを標準熱不活化ヒト血清（図３）又はモックインキュベートしたウイルス粒子（データは示さず）と共にプレインキュベートした場合に比較して低下しなかった。他方、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質又はＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶキメラで偽型化した粒子の感染性は、ＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートすると完全に失われたが、ヒト対照血清と共にプレインキュベートした場合には失われなかった（図３）。ＨＦＶエンベロープ特異的感染性のこの中和は、ＮＩＨ３Ｔ３（図３Ａ）及びＱＴ−６（図３Ｂ）細胞で観察された。ＨＦＶエンベロープタンパク質のバキュロウイルス発現ＳＵドメインに対するウサギ血清を使用した実験でも、ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したウイルス粒子の同様の特異的中和が得られた（データは示さず）。
【００３７】
４．ＨＦＶ  ｅｎｖタンパク質の発現及び粒子取込み
一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の放射性免疫沈降分析（ＲＩＰＡ）により、種々のＨＦＶエンベロープタンパク質の発現及びＭｕＬＶ粒子への取込みを測定した。ＤＮＡ（ｐＨＩＴ６０、ＳＦＧ  ＧＦＰＳ６５Ｔ及び種々のｅｎｖ構築物）の添加から４８時間後に細胞を［35Ｓ］メチオニンで約２０時間代謝標識した。上清中に存在するウイルス粒子を溶解バッファーで可溶化する前に２０％スクロースクッションで２５０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化した。次に、試料を免疫沈降させた。ウイルス粒子とその対応する細胞溶解物をＨＦＶ特異的チンパンジー血清又は抗ＭｕＬＶ  ｇａｇハイブリドーマ上清で免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。ペレット化ウイルス又は細胞溶解物からの免疫沈降物中のＨＦＶ特異的バンドはＨＦＶ  ｅｎｖ発現構築物をトランスフェクトした試料でしか観察されず、ＭｕＬＶアンホトロピックエンベロープタンパク質を発現する試料又はモックトランスフェクト培養物では観察されなかった。ＨＦＶ  ｅｎｖをトランスフェクトした細胞の細胞溶解物の免疫沈降物には１３０及び１１０ＫＤの２つの主要なＨＦＶエンベロープ前駆物質バンドが観察された（１２，２１）。更に、より長時間暴露後にはプロセシングされている〜９０ＫＤ  ＳＵ及び〜４５〜５０ＫＤ  ＴＭタンパク質に対応する２つのバンドを観察することができた。種々のＨＦＶ突然変異体をトランスフェクトした細胞試料におけるＴＭタンパク質の見掛寸法は種々異なり、個々のタンパク質のＴＭ部分が修飾されたことを示した。ＨＦＶ  ＳＳＳＭｕＬＶＲ−及びＨＦＶ  ＳＳＳＭｕＬＶは細胞発現の明白な低下を示したが、それ以外は、トランスフェクトした細胞における種々のエンベロープタンパク質の定常状態レベルには並の差異しか観察されなかった。ペレット化ウイルス粒子の免疫沈降物には両者エンベロープ前駆物質タンパク質とプロセシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質も検出された。他方、一般に前駆物質タンパク質に対するプロセシングされているタンパク質の相対比はウイルス粒子免疫沈降物のほうが細胞溶解物よりも高かった。
【００３８】
興味深いことに、ウイルス粒子の個々の免疫沈降物におけるプロセシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質の量と、対応する偽型粒子の相対感染性（図２）の間に良好な相関を観察することができた。最高の相対感染性をもつ偽型粒子を生じたＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープはＲＩＰＡでも最強のＳＵ及びＴＭバンドを示した。粗ウイルスペレット又は抗ｇａｇハイブリドーマ上清で免疫沈降させた沈降物で個々のウイルス粒子調製物中のＭｕＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の量を測定した処、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶエンベロープトランスフェクションを除く全試料で同様であった。この試料は粒子会合ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の有意低下を示し、この調製物には他のウイルスペレットよりも少数のＭｕＬＶ粒子しか存在しないことを示した。従って、各ウイルス粒子当たりのプロセシングされているＨＦＶ  ＳＵ及びＴＭタンパク質の相対量は、ウイルス粒子調製物をＨＦＶ特異抗体で免疫沈降させた沈降物から予想されるよりも更に高いと思われる。この現象の一因として、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子の感染性が他のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子よりも高い結果、これらの粒子がＨＦＶ  ｅｎｖタンパク質を発現しないトランスフェクト細胞により多量に吸収されるためであると考えられる。この結果、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子は上清から除去され得る。更に、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇで偽型化したＭｕＬＶ粒子とは対照的に、ＨＦＶで偽型化したウイルスはポリブレン等のポリカチオンの不在下で感染性の低下を全く示さなかった（３０）。従って、一過性トランスフェクションによりＨＦＶエンベロープで偽型化したレトロウイルスベクターの相対力価は、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇで偽型化した場合よりも過小評価されると思われる。但し、これらの現象を更に詳細に解明するには、ＨＦＶエンベロープで偽型化したウイルスによる感染に耐性のＨＦＶエンベロープを安定的に発現する細胞系を使用して更に進んだ実験を行う必要がある。
【００３９】
５．ＦＶ  ｅｎｖ遺伝子に配置したスプライスドナー及びアクセプター部位の失活
更に、ＨＦＶエンベロープＯＲＦ（６３１０〜９２７６位）内に位置する内部ＨＦＶプロモーター（５’ＬＴＲの転写始点に対して８４１９位）から誘導されるＢｅｌ−１及びＢｅｔ転写産物は、ｅｎｖタンパク質のＴＭサブユニットのコーディング領域内のスプライスドナー（ＳＤ、９１１９位）及びスプライスアクセプター（ＳＡ、９２３７位）部位を有効に利用する。あるいは、これらのＳＤ及びＳＡ部位を利用してＨＦＶ  ｅｎｖタンパク質をコードするｍＲＮＡをスプライスすると、潜在的エンベロープ／ｂｅｌ融合タンパク質が得られる。〜１７０ＫＤは免疫沈降によりＨＦＶ感染細胞で検出することができ、ｍＲＮＡはＨＦＶに感染したヒト繊維芽細胞からの全ｍＲＮＡのＲＴ（逆転写酵素）ＰＣＲにより検出することができる。ＳＤ（９１１９位）をＧＴ→ＧＧ突然変異により失活させると、１７０ＫＤエンベロープ融合タンパク質は消失するが、１３０ＫＤエンベロープ前駆物質タンパク質の発現は変わらない。ｅｎｖ／ｂｅｌ融合タンパク質の生物学的機能とウイルス力価に及ぼす偽型ＭｕＬＶ粒子の影響については現在のところ不明である。上述のＧＦＰ発現ＭｕＬＶレトロウイルスベクターを用いた予備実験は、相対感染性に及ぼす影響を何ら示さない。
【００４０】
要約すると、ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを製造するためのシステムを作製した。ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインを前進的に欠失させると、遺伝子移入とウイルス粒子へのＨＦＶ  ｅｎｖ  ＳＵ及びＴＭサブユニットの取込みが低下するので、ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインはＭｕＬＶ粒子の偽型化に少なくとも部分的に関与していた。１種の欠失突然変異体であるＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶエンベロープにプロセシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメインを付加すると、ＨＦＶ野生型エンベロープタンパク質に比較して感染性が１０〜２０倍増加し、偽型粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みが増加した。レトロウイルス力価は、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化することにより達せられる力価の８〜３５倍であった。標的細胞型によっては、遺伝子移入効率がＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクターと同等以上のものもあった。野生型ＭｕＬＶエンベロープタンパク質の場合には、ウイルス粒子へのエンベロープの特異的取込みにおける細胞質ドメインの役割は不明である。細胞質尾部欠失突然変異体にうちには粒子会合エンベロープタンパク質が減少するものもあり（１５）、また、突然変異エンベロープタンパク質によっては粒子会合の低下を殆ど〜全く示さないものもあった（２５，２６）。本発明の結果は、エンベロープタンパク質の粒子会合、少なくともＭｕＬＶ粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みの増加におけるＭｕＬＶ  ｅｎｖ細胞質ドメインの役割を裏付けるものである。
【００４１】
最近、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇ（６，３８）又はＧＡＬＶエンベロープ（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質でＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを偽型化した結果、ウイルス安定性が増加し、宿主細胞範囲が広がり、所定の細胞型の形質導入効率が増加した。ＦＶの宿主範囲が広く、ヒト血清による失活を阻止し（３０）、ポリカチオンの不在下で種々の起源の細胞に有効に感染できる（未公開資料及び（３０））ため、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターは種々の細胞型に遺伝子を有効に導入するための有用な新規ツールになるであろう。ＶＳＶ−Ｇは産生細胞に高毒性であり、最近まで安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細胞系を作製することはできなかった（８，２２，３７）が、ＨＦＶ  Δ２ＭｕＬＶエンベロープの一過性発現の結果、２９３Ｔ細胞で明白な毒性は生じなかった（データは示さず、（１９））。
【００４２】
参考資料
【００４３】
【表２】
0003954151.tif 000003
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＦＶエンベロープ発現構築物の模式図である。ＨＦＶ（白部分）及びＭｕＬＶ（影部分）エンベロープのＴＭ成分の細胞外、膜間及び細胞質ドメインを（１１，２４）に従って示す。模式図の下に野生型ＨＦＶ及びＭｕＬＶタンパク質のアミノ酸配列も示す。ＨＦＶエンベロープ構築物のアミノ酸位置を目盛りに示す。ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメインでＥＲ保持（１３）関与する配列モチーフの位置を黒部分として示し、突然変異配列を斜線部分として示す。ＭｕＬＶエンベロープタンパク質の完全長細胞質ドメインにおけるＭｕＬＶプロテアーゼの切断部位は２本の逆向き矢印により示す。
【図２】種々のエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより作製した種々の偽型ＭｕＬＶ粒子をＮＩＨ３Ｔ３（グレーの棒）又はＱＴ−６（黒の棒）細胞に感染させた。形質導入から４８時間後にＧＦＰ発現細胞の百分率をＦＡＣＳ分析により定量した。ＧＦＰ発現細胞の平均蛍光はモック感染細胞の１００〜３００倍であった。偽型化に使用した各エンベロープ構築物をグラフのｙ軸に示す。各構築物のＧＦＰ発現細胞の平均百分率を対応する標準偏差と共にｘ軸に示す。各構築物を２〜６回試験した。
【図３】ＨＦＶエンベロープ特異的感染性の中和を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりｙ軸に示すような種々のエンベロープタンパク質で偽型化合たＭｕＬＶ粒子を作製した。ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）又はＱＴ−６（Ｂ）細胞に加える前に、上清（１ｍｌ）を抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清（１：６０）（黒の棒）又は健康な個体からのヒト血清（１：６０）（グレーの棒）と共に３７℃で１時間インキュベートした。４時間後に上清を吸引し、新鮮な成長培地に交換した。形質導入から４８時間後に図２の説明に記載したようにＧＦＰ発現細胞の百分率を測定した。実験は中和性サル血清及びこれに抗ＨＦＶ表面ウサギ血清（データは示さず）を加えて２回実施し、その結果、ＨＦＶエンベロープ偽型レトロウイルスベクターの感染性に同様の相対阻害が生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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