(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含み、５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣ−３’の配列を有するオクタヌクレオチドを認識し切断することができる配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡであって、ゲル電気泳動による測定で７００ｂｐの長さを有し、受託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６９７０７のプラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２のＢａｍＨＩ切断によって得られる単離ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３】
受託番号ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９７０７で寄託されたプラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２である、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２または３に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項５】
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で、請求項２または３に記載のベクターで形質転換した宿主細胞を培養することを含む、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡならびに組換えＤＮＡからのこれら酵素の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
制限エンドヌクレアーゼは細菌に天然に存在する酵素群である。制限エンドヌクレアーゼが、混入する他の細菌成分から分離して精製されると、実験室で制限酵素を使用することによりＤＮＡ分子を精確なフラグメントに切断することができる。この性質を利用すると、ＤＮＡ分子を他と区別して同定することができ、また、それらの構成遺伝子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究において不可欠な道具であることが分かっている。制限エンドヌクレアーゼは生化学における「はさみ」であり、それによって遺伝子工学および分析が可能となる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識して結合することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼは、いったん結合すると、そのＤＮＡ分子を認識配列内、あるいは、認識配列の一端で切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対して親和性を有する。１００種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、今日までに調べた何百という細菌種の間で同定されている。
【０００４】
細菌は、種ごとにほんの少数の制限エンドヌクレアーゼを有する傾向にある。制限エンドヌクレアーゼは、典型的には、その起源である細菌に従って命名される。すなわち、例えば Neisseria lactamica  種は４種類の制限エンドヌクレアーゼを合成し、それらは、ＮｌａＩ、ＮｌａII、ＮｌａIII およびＮｌａＩＶと命名されている。これらの酵素は、各々、ＧＧＣＣ、ＧＡＴＣ、ＣＡＴＧおよびＧＧＮＮＣＣの配列を認識して切断する。他方、大腸菌 Escherichia coli ＲＹ１３は唯一の酵素ＥｃｏＲＩを合成し、これは、ＧＡＡＴＴＣの配列を認識する。
【０００５】
理論に縛られるつもりはないが、制限エンドヌクレアーゼは、自然界では細菌細胞の自己保護的な役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼにより、細菌は、そうでなければ破壊しあるいは寄生するであろうウィルスおよびプラスミドなどの外来ＤＮＡ分子による感染に抵抗することができる。制限エンドヌクレアーゼは、感染性のＤＮＡ分子の全長を走査し、認識配列が現れるごとにそのＤＮＡ分子を切断することにより、抵抗性を付与する。切断が生じると、多くの感染性遺伝子は無能になり、非特異的ヌクレアーゼによる分解をさらに受けやすいＤＮＡになる。
【０００６】
細菌の保護系の第二成分は、修飾メチラーゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに対して相補的であり、細菌自身のＤＮＡを保護し、外来性の感染ＤＮＡと区別することができる手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、その配列内のヌクレオチドのどれかをメチル基の付加により化学的に修飾する。メチル化の後、認識配列は、もはや制限エンドヌクレアーゼによる結合または切断を受けることはない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性により完全に修飾され、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して非感受的である。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断を受け易いのは、未修飾であり、従って同定可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、今日、通常の精製法で得られる場合と比べて、遺伝子のクローン化およびその遺伝子によりコードされる蛋白質の大量生産が可能となる。問題のクローン（制限エンドヌクレアーゼ遺伝子）を単離するための標準的方法は、該クローンが１０-3〜１０-4という低い頻度で現れるときに、複雑な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法により誘導されるクローン集団の中から該クローンを同定するための簡単で信頼性のある方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンは破壊され、一方、所望の数少ないクローンは生き残るように、その方法が選択的であるようにする。
【０００８】
タイプIIの制限−修飾系は、頻度の増加とともにクローン化されている。最初にクローン化された系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または選択手段として、バクテリオファージ感染が使用された（ＥｃｏＲII：Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178:717-719, (1980)；ＨｈａII：Mann et al., Gene 3:97-112, (1978)；ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507, (1981) ）。細菌中に制限−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ感染に対して抵抗することができるので、クローン化された制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原理的には、ファージにさらされているライブラリーから生存物として選択的に単離することができる。しかし、この方法の有用性はほんの限られたものであることが分かった。特に、クローン化された制限−修飾遺伝子は、選択的生存を授けるのに十分なファージ耐性を常に明示するとは限らないことが分かっている。
【０００９】
別のクローン化法としては、最初にプラスミド由来のものとして特性化された系を大腸菌クローン化用プラスミドに転移するものがある（ＥｃｏＲＶ：Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984)；ＰａｅＲ７：Gingeras and Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406, (1983)；Theriault and Roy, Gene 19:355-359, (1982)；ＰｖｕII：Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501-509, (1985)）。
【００１０】
第三の方法は、数が増大している系のクローン化に使用されているが、活性メチラーゼ遺伝子の選択に関与する（例えば、米国特許第．５，２００，３３３号およびＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13:6403-6421, (1985)参照）。制限および修飾遺伝子は、しばしば密接に結合しているので、両方の遺伝子は同時にクローン化されることが多い。しかし、この選択では、常に完全な制限系が得られるわけではなく、むしろ、メチラーゼ遺伝子のみを生じる（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, (1980)；ＢｃｎＩ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204 (1982) ；ＢｓｕＲＩ：Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119, (1983) ；およびＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem. 258:1235-1241, (1983) ）。
【００１１】
メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化するための別の方法は、ＤＮＡの損傷の比色分析法に基づく。メチラーゼをスクリーニングするときは、プラスミドライブラリーをＡＰ１−２００などの宿主大腸菌株内に形質転換する。メチラーゼの発現は、大腸菌株中で、ＭｃｒＡ+ 、ＭｃｒＢＣ+ 、またはＭｒｒ+ であるＳＯＳ反応を誘発する。ＡＰ１−２００株は、ＭｃｒおよびＭｒｒ系に対して温度感受性であり、大腸菌の損傷誘発ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、ｌａｃＺ遺伝子の限定温度での誘発に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換細胞は、Ｘ−ｇａｌを青色コロニーとして含むＬＢ寒天プレート上で検出される（Piekarowicz, et al., Nucleic Acids Res. 19:1831-1835, (1991)および Piekarowicz, et al., J. Bacteriology 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌株ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣおよびＭｒｒを欠いている。この系（「エンド−ブルー」法と言う。）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡを損傷してＳＯＳ反応を誘発すると、同種のメチラーゼの不存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子を検出することができる。ＳＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補ったＬＢ寒天プレート上に濃青色のコロニーを形成する（Xu et al., Nucleic Acids Res. 22:2399-2403 (1994) ）。
【００１２】
簡単なメチラーゼ選択法の場合は、種々の障害のために、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアーゼ）クローンが得られない場合がある。例えば、Lunnen, et al., Gene, 74(1):25-32 (1988)参照。制限−修飾遺伝子のクローン化に対して潜在的な障害は、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾による保護がまだなされていない宿主に導入しようとする際に見られる。メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一クローンとして一緒に導入する場合は、宿主ＤＮＡがエンドヌクレアーゼによって切断される前に、メチラーゼによって保護的に修飾されなければならい。従って、場合によっては、最初にメチラーゼ、次いでエンドヌクレアーゼと逐次遺伝子をクローン化することのみが可能である。
【００１３】
制限−修飾系のクローン化に対する別の障害は、大腸菌のいくつかの株がシトシンまたはアデニン修飾に対して逆に反応するという発見に見られる。それらの株は、メチル化シトシン（Raleigh and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074, (1986)）またはメチル化アデニン（Heitman and Model, J. Bact. 196:3243-3250, (1987) ；Raleigh, Trimarchi, and Revel, Genetics, 122:279-296, (1989); Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207-5219 (1991) ）を含むＤＮＡを破壊する系を有する。シトシンに特異的またはアデニンに特異的なメチラーゼ遺伝子は、これらの株の中では、単独でも、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒でも、容易にクローン化することができない。この問題を避けるために、これらの系が欠けている大腸菌の突然変異株（ＭｃｒＡ- およびＭｃｒＢ- またはＭｒｒ- ）を使用する必要がある。
【００１４】
第三の潜在的な困難性は、起源微生物および大腸菌の転写機構の違い（プロモーターおよびリボソーム結合部位の相違など）により、いくつかの制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子が大腸菌で発現しない可能性があるということである。メチラーゼ選択法では、メチラーゼが大腸菌で十分に発現し、その遺伝子を有するプラスミドの少なくともいくつかは完全に保護されることが必要である。
【００１５】
精製した制限エンドヌクレアーゼおよび（有用性の程度は小さいが）修飾メチラーゼは、実験室でのＤＮＡの特性化および再構成において有用な道具であるため、これらの酵素を多量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術により得るための商業上の誘因がある。そのような株は、精製作業を簡単にするとともに、商業的に有用な量で生産するための手段を提供するので、有用である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Frankia species （ＮＲＲＬ  １８５２８）から得ることが可能なＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、ならびに組換えＤＮＡからこれらの酵素を製造するための関連方法に関する。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼＦｓｅＩを発現する形質転換宿主にも関する。ＦｓｅＩは、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣ−３’を認識し、認識配列の第二の−ＧＣ−対の間を切断して４塩基の３’オーバーハングを残す酵素である（ＦｓｅＩ：Nelson et al., Nucl. Acid. Res. 18:2061-2064 (1990) ）。本発明に従って得られるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、常法によって作られる制限エンドヌクレアーゼ調製物中に通常存在する不純物を含まない。
【００１７】
メチラーゼ選択法では、メチラーゼクローンが得られなかったので、ＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化を行うための新規方法を立案した。ＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化の好ましい方法は、Frankia species 由来のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製してほぼ均一にし、その蛋白質のＮ−末端のアミノ酸配列を決定し、（１）ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端アミノ酸配列および（２）シトシンメチラーゼの保存アミノ酸配列に基づいて縮重ＤＮＡプライマーを合成し、これらのプライマーにより、エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの一部分をゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは次いで、Frankia species ＤＮＡから完全遺伝子を増幅し、それをｐＡＩＩ１７またはｐＲＲＳなどの発現ベクターにクローン化することにより発現させることができる。この構築物を、別の適合するプラスミド上に有する外来メチラーゼ（ＮｌａＩなど）またはＦｓｅＩメチラーゼによってＦｓｅＩ部位を予め修飾した宿主に導入する。
【００１８】
ＦｓｅＩメチラーゼをクローン化し、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを選択的に発現させるために、Frankia species 由来のＤＮＡを含むライブラリーを作製する。メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むクローンは、上記で得られた増幅ＤＮＡに対してハイブリッド形成することにより同定される。クローン化したＤＮＡは、配列分析を行ってエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのＤＮＡ配列を決定し、メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼを別々にFrankia species ゲノムＤＮＡから増幅して、適切な発現ベクター中にクローン化する。ＦｓｅＩの産生は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびＦｓｅＩまたはＮｌａＩメチラーゼ遺伝子のいずれかを含む宿主を増殖させ、適切な発現条件で誘発し、細胞を採取してＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製することにより行う。
【００１９】
本発明は、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡならびに該組換えＤＮＡから産生される酵素に関する。
【００２０】
Frankia species 由来のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローン化は、非常に困難であることが分かった。メチラーゼクローンは、たとえ、多くの異なるライブラリーを作製して大腸菌および Streptomyces の両方の宿主系でスクリーニングを行っても、標準的なメチラーゼ選択法では全く得られなかった。これは、ＦｓｅＩメチラーゼが大腸菌または Streptomyces において保護を与えるレベルで発現できなかったことによると考えられる。
【００２１】
従って、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは新規方法によってクローン化した。エンドヌクレアーゼ蛋白質は、ほぼ均一に精製し、その蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定を行った。Ｎ−末端領域のアミノ酸配列に基づく縮重ＤＮＡプライマーを合成した。さらに、シトシンメチラーゼのアミノ酸配列の保存アミノ酸モチーフを比較し、これらの保存アミノ酸配列に基づく縮重ＤＮＡプライマーを合成した。ＦｓｅＩ認識部位はＧおよびＣの塩基対のみを含むので、ＦｓｅＩメチラーゼは、シトシンメチラーゼでなければならず、シトシンメチラーゼの保存アミノ酸モチーフの何れかを含むべきである。（エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼがアデニンおよびシトシン塩基を認識し、それらの塩基のメチル化部位が未知であるとすると、遺伝子のクローン化には同じ方法が有効であるはずであるが、アデニンメチラーゼ保存モチーフに対しても同様に実施しようとするならば、プライマーのより多くの組み合わせが必要である。）ＦｓｅＩメチラーゼおよびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部の増幅を、ある種の縮重シトシンメチラーゼプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端に相補的な縮重プライマーと組み合わせて使用することにより行った。約１６５０ｂｐの増幅されたＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９中でサブクローン化し、配列分析を行った。このＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列とある領域で一致し、別の領域は、シトシンメチラーゼの保存モチーフと一致し、このＤＮＡフラグメントがＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部および相接するシトシンメチラーゼ遺伝子を表す（その結果、ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子であることを示す）ことが確認された。
【００２２】
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体をコードする配列が、最初の５個のアミノ酸コドンを除いて、偶然にも１６５０ｂｐＰＣＲ産物上に存在することが本発明によって初めて明らかにされたので、迅速クローン化法を試みた。合成ＤＮＡプライマーを合成し、これは、クローニングを容易にするためにＡＴＧ開始コドンに制限部位を有し、次いで、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼアミノ酸配列分析により決定された第２〜５番目のアミノ酸に対するコドンを有し（コドンは、大腸菌で高度に発現される遺伝子コドンを主に使用した。）、その後に１６５０ｂｐＰＣＲ産物から決定されるＤＮＡ配列に相補的な配列が続く。このプライマーを、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の３’であることが知られている（蛋白質の大きさに基づく）１６５０ｂｐＰＣＲ産物の配列に相補的なプライマーとともに使用してＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅させた。増幅させた産物をｐＡＩＩ１７発現ベクターに結合させ、別の適合するプラスミド上でクローン化したＮｌａＩメチラーゼ遺伝子によりＦｓｅＩ切断に対して予め保護した宿主に導入した。個々のクローンを調べ、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現するクローンをＦｓｅＩの産生に使用した。
【００２３】
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の最初と終わりをコードする配列の決定および／または確認のために、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子全体を含むクローンを、両方の遺伝子のＤＮＡ配列の決定を可能にするために増幅することなくFrankia species ＤＮＡから得た。こうすると、ＦｓｅＩおよび他の部位を修飾するメチラーゼを使用するよりも（ＮｌａＩメチラーゼは、大腸菌ＤＮＡを１０，０００部位以上でメチル化するが、ＦｓｅＩメチラーゼは１０〜２０部位でメチル化する。）、保護のためのＦｓｅＩメチラーゼの発現が可能になり、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの最初のアミノ酸配列の確認が可能になる。このために、Frankia species ＤＮＡのライブラリーをλ’ベクター系で作製して、９〜２３ｋｂFrankia species ＤＮＡ挿入体を含有するクローンを生成した。１６５０ｂｐ増幅産物をプローブとして使用して、エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を含むλ’クローンを同定した。これらのλクローンを精製し、それらのＤＮＡを抽出して制限酵素で消化し、Frankia species ＤＮＡとのサザンハイブリッド形成により同定されたフラグメントと同じ大きさのクローンからフラグメントを同定した。共にＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を含む２つのＫｐｎＩフラグメント（１．８ｋｂのものと７．０ｋｂのもの）および３．６ｋｂのＳａｃＩフラグメントをλ’クローンからｐＵＣ１９中にサブクローン化した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡのアミノ酸配列分析を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端の正確なヌクレオチド配列を決定した。そのＤＮＡ配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの２番目のアミノ酸残基がトレオニンであって、最初に蛋白質配列データから考えられたヒスチジンではないことを示すことが分かった。ヒスチジンであるという最初のアミノ酸配列の発表は、分析者から疑わしいとして報告されていた。その後の調査でトレオニン残基が示され、このトレオニン残基は、データに曖昧さがあったこの位置に対するアミノ酸配列分析データと一致する。すなわち、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性を発現した第一のクローンのｐＲＭＦｓｅＲ１は、第２番目のアミノ酸が不意に変異していたが、酵素機能には何ら顕著な影響はなかった。従って、たとえ非保存性のアミノ酸変化があっても、機能上活性なＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを生産することができることが分かった。
【００２４】
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子全体のＤＮＡアミノ酸配列は、１．８ｋｂおよび７．０ｋｂのＫｐｎＩならびに３．６ｋｂのＳａｃＩクローンから決定した。ＦｓｅＩメチラーゼは、ベクターｐＳＹＸ２０にクローン化した。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、ｐＳＹＸ２０ベクターでのその発現を容易にするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFrankia species ＤＮＡから増幅し、増幅された産物は適切な制限酵素で切断し、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断したｐＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主細胞内に形質転換した。個々の形質転換体を拾い上げ、所望の構築物の有無を分析した。
【００２５】
ＤＮＡプライマーは、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅するように設計した。前進（forward ）プライマーは次の要素を有していた：ＢａｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結合したフレーム内停止コドン、大腸菌認識強力リボソーム結合部位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのスペーサー配列、第２番目の位置の正しいトレオニンコドン、第５番目のアミノ酸のコドンの大腸菌優先コドンへの変更、およびＦｓｅＩＤＮＡ配列とのハイブリッド形成に適合する２４個のヌクレオチド。３’（逆進）プライマーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端でちょうどハイブリッド形成され、メチラーゼクローンとの重複が最小になるように設計された。クローン化を容易にするために、ＢａｍＨＩ部位をこのプライマーに導入した。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで切断し、予めＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化を行った発現ベクターｐＲＲＳに連結した。連結したベクターは、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子を有する大腸菌ＥＲ２４２７コンピテント細胞内に形質転換した。所望の大きさの挿入体を含むベクターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法により同定した。これらのクローンを対数増殖中期まで増殖させ、ＩＰＴＧで誘発した。次いで、細胞を遠心により採取し、音波処理緩衝液に再懸濁して、超音波処理により溶解した。抽出物を透明となし、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性を測定した。一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖させ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを下記に記載する標準的な蛋白質精製法により精製した。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本明細書に記載するＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を好ましくクローン化し、発現させる方法は、図１で説明するが、下記の工程を含む。
【００２７】
１．Frankia species を、富栄養培地を含むフラスコ中で増殖させ、細胞を溶解して、ゲノムFrankia species ＤＮＡを精製する。
【００２８】
２．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ蛋白を、New England Biolabs で開発された蛋白質精製法を組み合わせることにより、Frankia species 細胞からほぼ均一に精製する（実施例１参照）。精製したエンドヌクレアーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動においてほぼ均一であり、見掛けの分子量は２８，０００ダルトンであった。
【００２９】
３．エンドヌクレアーゼのアミノ末端配列は、Applied Biosystems４７０Ａ蛋白質配列分析装置（Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17:979-997,(1989) ）を使用して得られ、いくつかの縮重ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、その蛋白質アミノ酸配列に基づいて作製する。アミノ酸配列およびそれから誘導されるオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例で挙げる。
【００３０】
４．シトシンメチラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を比較し、ホモロジー領域を同定する（Wilson, Methods in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。縮重ＤＮＡプライマーを各タイプのシトシンメチラーゼ（５−メチルシトシン、α−Ｎ４シトシンおよびβ−Ｎ４シトシンメチラーゼ）のアミノ酸配列モチーフに基づいて合成する。合成したプライマーを実施例で列挙する。
【００３１】
５．シトシンメチラーゼプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマーと組み合わせて使用し、Frankia species ＤＮＡ由来のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の一部をＰＣＲ法により増幅する。エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の一部を増幅するために、シトシンメチラーゼプライマーおよびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマーの種々の組み合わせをＰＣＲ反応で試す。連結したエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子は、相対的位置に関する４つの可能な組み合わせで存在しうる。すなわち、相近（convergent）、相離（divergent ）、一列でエンドヌクレアーゼ第一（aligned endo first）、および一列でメチラーゼ第一（aligned methylase first ）である（Wilson, Nucleic Acids Research, 19:2539-2566, (1991)）。シトシンメチラーゼの３つの可能な型と組み合わせると、１２個の可能な遺伝子の組み合わせができる。全てを説明するためのプライマーの組み合わせを試す。約１．５ｋｂの顕著な増幅産物が、５−メチルシトシンモチーフ４前進プライマーおよびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端前進プライマーにより、相近遺伝子位置で認められ、５−メチルシトシンモチーフ１前進プライマーおよび同じＮ−末端エンドヌクレアーゼプライマーを用いると、１．６５ｋｂのあまり顕著でない産物が認められる。１．６ｋｂ産物を鋳型として使用すると、１．５ｋｂの産物がモチーフ４プライマーおよび同じＦｓｅＩＮ−末端プライマーにより増幅できる。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂ産物をベクターｐＵＣ１９にクローン化する。
【００３２】
６．工程５のＰＣＲ産物の両末端のＤＮＡ配列を決定する。ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、上記工程３で決定されたＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と一致する。また、増幅されたＤＮＡの他端から推定されるアミノ酸配列は、５−メチルシトシンメチラーゼのアミノ酸モチーフを含み、１．５ｋｂ産物が１．６５ｋｂ産物の内部サブセットであることが分かる。
【００３３】
７．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の過発現：
Ａ．一般的事項：制限遺伝子を過発現させる方法は数多い。ＤＮＡ配列および詳細な制限地図の情報は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過発現のための最良の方法を決定するのに役立つ。過発現の一つの方法は、ＰＣＲ法を使用してエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅するために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端およびその遺伝子のいくらか下流（３’）で直接ハイブリッド形成を行うプライマーを設計することを含む。得られるＤＮＡフラグメントは、ｐＡＩＩ１７などの発現ベクターの誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流に挿入することができる。あるいは、ｐＡＧＲ３上のＰtac （W. Jack, New England Biolabs  製）などの大腸菌が強く認識するプロモーターを制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始のすぐ前に挿入することにより過発現を行うことができる。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始および末端付近の都合のよい制限部位ならびにｐＡＧＲ３のプロモーター付近の適合する制限部位を見つけ、制限遺伝子をｐＡＧＲ３に移してＰtac プロモーターと結合させることにより行うことができる。使用することができる他の調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Fuller, Gene 19:43-54, (1982) ）およびｌＰＬ（Shimatake and Rosenberg, Nature 254:128, (1981) ）である。さらに、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346, (1974) ）をその遺伝子の前において発現を高めることもできる。制限エンドヌクレアーゼを過発現する安定クローンを得るために、宿主は、一般に、予め制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する。これは、本発明では、ＦｓｅＩメチラーゼまたは、すべてのＦｓｅＩ部位（および他の多くの部位）を修飾することによりＦｓｅＩ消化から保護する外来メチラーゼ（ＮｌａＩなど）のいずれにおいても別のプラスミドにクローン化することにより行う。使用するプラスミドは、発現ベクターに適合するものでなければならない。また、メチラーゼは、宿主のゲノムを過発現された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から保護するレベルで生産されなければならない。
【００３４】
前記遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌でより効率的に利用されるコドンを使用するために、部位特異的突然変異誘発または遺伝子自体の再合成により変えることができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151:389-409, (1981)）。
【００３５】
Ｂ．ＦｓｅＩの初期の迅速発現：合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計・使用してゲノムFrankia species ＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅し、Ｔ７発現ベクターであるＰＡＩＩ１７にクローン化する。上記の１６５０ｂｐＰＣＲ産物およびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列からのＤＮＡ配列情報を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに位置するＮｄｅＩ部位（−ＣＡＴＡＴＧ−）とともに構築することにより、Ｔ７発現ベクターであるＰＡＩＩ１７のＮｄｅＩ部位（その後に、アミノ酸配列から示されるようにＦｓｅＩの最初の５個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列が続く。）でのクローン化を容易にする。コドンの縮重問題のために、上記の１６５０ｂｐ産物の増幅に使用するプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ蛋白質配列のアミノ酸６をコードするコドンで開始したので、発現プライマーのベースとなるアミノ酸２〜５に対するＤＮＡ配列情報は得られなかった。従って、プライマー配列は、上記工程３において、最初の５個の位置に対するアミノ酸が、発現の高い大腸菌遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを使用して挿入されるように選択する。発現プライマーは、その後に、１６５０ｂｐＰＣＲ産物の配列と合致する２１個の塩基対配列が続く。シトシンメチラーゼモチーフ４の領域のＤＮＡ配列と合致させるためには、逆向プライマーを選択する。逆向プライマーであれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子全体が確実に存在し、Frankia species ＤＮＡ配列の１個の塩基対を変化させるだけで、都合のよいＳａｌＩ制限部位をこのプライマーに作り出すことができるからである。増幅されたＤＮＡは、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断し、予めＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したベクターｐＡＩＩ１７に連結する。連結したベクターを、誘発Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を有し、適合するベクターｐＳＹＸ２０上にあるＮａＩメチラーゼ遺伝子の発現によりＦｓｅＩ部位が予め修飾された適する宿主の大腸菌ＥＲ２４１７に導入する。個々の形質転換体を分析し、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現する形質転換体を使用して酵素の産生を行う。
【００３６】
８．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子（またはＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子）および過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンから、醗酵槽にて、適当な抗生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で増殖させることにより産生させることができる。その後、細胞を遠心により採取し、超音波処理により破砕して、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
【００３７】
９．精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な蛋白質精製法を組み合わせることにより精製する。
【００３８】
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのさらなる特性化およびそれらの酵素の別の発現：
１０．Frankia species ＤＮＡを、λ’IIまたは類似ベクター中でクローン化可能で、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよび／またはメチラーゼ遺伝子全体を含むフラグメントを生じるように切断するＳａｕ３ＡＩまたはそのアイソシゾマーなどの制限エンドヌクレアーゼで完全におよび／または部分的に消化する。
【００３９】
１１．消化されたＤＮＡをλファージクローニングベクターに連結する。得られる混合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージし、大腸菌株ＥＲ１４５８（ＮＥＢ＃４０１−Ｃ）などの適切な宿主の感染に使用する。感染ファージのタイターは、パッケージしたファージの一部を平板培養し、得られるプラークを計数することにより求める。
【００４０】
１２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージしたファージは、好ましくは、富栄養培地上でＥＲ１４５８（ＮＥＢ＃４０１−Ｃ）などの適切な大腸菌宿主の軟寒天における密度を変えて平板培養する。インキュベートした後、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を含むファージを、ＰＣＲにより得た１６５０ｂｐの遺伝子部分をプラークのニトロセルロースフィルターリフトに対するプローブとして使用し、ベントン−デイヴィス・サザンハイブリッド形成により同定する。陽性のプラークをプレートから取り出し、平板培養およびハイブリッド形成を連続して数回行うことにより精製する。陽性クローンを増殖させ、そのＤＮＡを精製する。
【００４１】
１３．Frankia species ＤＮＡのＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ領域における制限フラグメントの地図を、種々の制限酵素で消化したゲノムFrankia species ＤＮＡに対する１６５０ｂｐＰＣＲ産物プローブのサザンハイブリッド形成により作る。１８００ｂｐおよび７０００ｂｐのＫｐｎＩフラグメントならびに３６００ｂｐのＳａｃＩフラグメントはいくつかのλ’クローンに共通であり、Frankia species ゲノム地図は、続く工程での操作を容易にするために、λ’ベクターからｐＵＣ１９に移してサブクローニングする。
【００４２】
１４．配列分析：１６５０ｂｐ増幅産物を含むＤＮＡおよびその位置に隣接するＤＮＡの配列分析を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端での正確なＤＮＡ配列（４個の「欠けた」アミノ酸コドンおよびＡＴＧ開始コドンならびに最初の増幅産物には無いメチラーゼの開始部分の配列を含む）を決定する。エンドヌクレアーゼの２番目のアミノ酸は、最初の配列分析（工程３）とは異なることが分かった。このアミノ酸は、エンドヌクレアーゼのその後の発現で、正しいトレオニンに変わる。メチラーゼ遺伝子の推定上の開始および停止部分を、エンドヌクレアーゼの末端と同様に同定する。エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子は、１２個のヌクレオチドが重複することが認められる。
【００４３】
１５．ＦｓｅＩメチラーゼの発現：ＦｓｅＩメチラーゼを、ベクターｐＡＩＩ１７およびｐＲＲＳと適合性のあるベクターｐＳＹＸ２０にクローン化する。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、そのｐＳＹＸ２０ベクターでの発現を容易にするためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFrankia species ＤＮＡから増幅し、増幅産物を適切な制限酵素で切断して、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断したｐＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主細胞内に形質転換する。個々の形質転換体を拾い上げ、所望の構築物の有無を分析する。正しい構築物を有する一つの形質転換体をｐＲＭＦｓｅＭ１と命名する。
【００４４】
１６．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅するためのＤＮＡプライマーを設計した。前進プライマーは、ＢａｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結合したフレーム内停止コドン、大腸菌認識強リボソーム結合部位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのスペーサー配列、第２番目の正しいトレオニンコドン、５番目のロイシンに対するコドンの大腸菌優先コドンへの変更、およびハイブリッド形成のためのＦｓｅＩＤＮＡ配列と合致する２４個のヌクレオチドを有する。このプライマーは、ＨｉｎｆＩ発現の例に従う（Skoglund, et al., Gene 88:1-5 (1990)）。３’（逆向）プライマーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子のちょうど３’端でハイブリッド形成し、メチラーゼクローンとのオーバーラップを最小にする、すなわち宿主における２つのプラスミド間の相同組換えの可能性を最小にするように設計する。ＢａｍＨＩ部位は、クローニングを容易にするためにこのプライマーに導入する。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅する。増幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで切断し、予めＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化した発現ベクターｐＲＲＳに連結し、連結体を、ｐＳＹＸ２０上にあるＮｌａＩメチラーゼで予め修飾した大腸菌ＥＲ２４２７などの適切な宿主細胞内に形質転換する。所望の大きさの挿入物を含むベクターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法で同定する。これらのクローンを対数増殖中期まで増殖し、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘発する。次いで、細胞を遠心により採取して、超音波処理緩衝液に再懸濁し、超音波処理により溶解する。抽出物を透明にし、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性を測定する。ｐＲＲＳ  ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ構築物をｐＲＭＦｓｅＲ２と命名する。プラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２を含む一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖させ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用する。
【００４５】
１７．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは、過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびＮｌａＩメチラーゼ遺伝子またはＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子のいずれかを有する宿主細胞から、適切な抗生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で醗酵槽による増殖によって産生させることができる。その後、細胞を遠心によって採取し、超音波処理により破砕して、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を産生する。
【００４６】
１８．精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物をアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な蛋白質精製法の組み合わせにより精製する。
【００４７】
上記で概説した工程は、本発明を実施するための好ましい態様を表すが、上記の方法は、公知の方法に準じて変更することができることは、当業者であれば明らかである。
【００４８】
下記実施例により本発明の実施態様を説明するが、下記実施例は、現在好ましく実施されるものである。理解されるように、この実施例は説明のためのものであり、本発明は、特許請求の範囲で示した範囲を除けば、この実施例に限定されるものではない。
【００４９】
なお、表１は、アミノ酸配列の一文字コードの説明である。
【００５０】
【表１】
0003939375.tif 000002
【００５１】
実施例１
ＦｓｅＩ修飾メチラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローン化
１．ＤＮＡの精製：Frankia species のＤＮＡを得るために、５ｇの細胞ペーストを、２０ｍｌの２５％ショ糖、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で１０分間静かに攪拌することにより、再懸濁した。１０ｍｌの０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および新しく調製した６ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム／０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加し、その溶液を４℃で１６時間インキュベートした。溶液を５０ｍｌの平衡化フェノールで抽出し、水相を回収して、５０ｍｌのクロロホルムで２回抽出した。１／１０容の５Ｍ−ＮａＣｌおよび１容の２−プロパノールの添加によりＤＮＡを沈澱させ、遠心により集めた。ＤＮＡペレットを１時間風乾した後、１１ｍｌのＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁した。１０ｇのＣｓＣｌをＤＮＡ溶液に溶解し、０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液を添加した。ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液を、ベックマンＴｉ７０ローターで４４，０００ｒｐｍ、３６時間遠心した。遠心の後、ＤＮＡバンドを１７ゲージの針で引き上げ、ＣｓＣｌ−水−飽和２−プロパノールで４回抽出し、４容のＤＮＡ緩衝液で希釈し、等量の２−プロパノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心によって集め、７０％エタノールで２回洗浄し、風乾して２ｍｌのＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。
【００５２】
２．Frankia species （ＮＲＲＬ１８５２８）からのＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製：Frankia species 細胞を富栄養ブロスを含むフラスコ中で対数増殖中期まで増殖させることにより、ＦｓｅＩ制限酵素をＮＲＲＬ１８５２８から産生させることができる。細胞は、遠心により採取する。続く操作は全て、氷上または４℃で行った。２５ｇの細胞を５０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に再懸濁し、超音波処理により破砕した。抽出物を３ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌの添加により０．２ＭのＮａＣｌにし、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分遠心した。上清を、０．２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（緩衝液Ａ．２）で平衡化した１５ｍｌのヘパリン−セファロースカラムにロードした。カラムを４５ｍｌの緩衝液Ａ．２で洗浄した後、６０ｍｌの緩衝液Ａ．２と１．０ＭのＮａＣｌを含む６０ｍｌの緩衝液Ａとで形成されるＮａＣｌの直線勾配で洗浄した。３ｍｌづつの画分を集めた。制限酵素活性のピークが、０．８および０．９Ｍ−ＮａＣｌの間のカラムから溶離され、それをプールした。このヘパリン−セファロースプールを３容の緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａ．２中で平衡にした１ｍｌのホスホセルロースカラムにかけた。そのカラムを５ｍｌの緩衝液Ａ．２で洗浄した後、緩衝液Ａ中の０．２ＭのＮａＣｌ→１．０ＭのＮａＣｌ４０ｍｌの直線勾配で洗浄した。制限酵素活性のピークが０．５ＭのＮａＣｌで溶離され、プールした。ホスホセルロースのプールを Amicon Centricon −１０微小濾過装置で０．５６ｍｌに濃縮し、５ｍｌの緩衝液Ａで希釈した後、０．０５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化した１ｍｌのＭｏｎｏ−Ｑカラム（Pharmacia ）にかけた。０．０５→０．６Ｍ−ＮａＣｌの直線勾配の緩衝液Ａを使用すると、ＦｓｅＩ活性が０．２ＭのＮａＣｌで溶離された。最も純粋なＦｓｅＩを含むＭｏｎｏ−Ｑ画分を Amicon Centricon −１０装置で濃縮した。しかし、この結果、９０％以上の可溶性ＦｓｅＩ活性の損失があった。従って、Centricon −１０装置のフィルター膜を、０．０５ｍｌのＳＤＳ−蛋白質−ゲルローディング緩衝液中で煮沸して上清を回収し、 Matsudaira の方法（Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987）に前述した改良（Looney, et al., Gene 80:193-208, (1989) ）を加えて、電気泳動および電気ブロット法にかけた。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約２８ｋＤの蛋白質のバンドを切り取って逐次分解を行った（Waite-Rees et al., J. Bacteriol. 173:5207-5219, (1991)）。
【００５３】
３．アミノ末端ＦｓｅＩ蛋白質の配列：得られた約２８ｋＤの蛋白質のバンドをApplied Biosystems Model 470A 気相蛋白質配列分析器でのアミノ末端蛋白質配列分析にかけた（Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17:979-997,(1989) ）。得られた最初の２３個の残基の配列は、ＨＤＥＬＦＰＩＰＥＰＬＶＸＰＶＩＡＬＰＰＬＬＫ（配列番号１）であった。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ末端から得られるこのペプチド配列データを使用して一連のＰＣＲプライマーを構築した。
【００５４】
１）ＴＴＹ  ＣＣＮ  ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＧＡＲ  ＣＣ  １７−マー（配列番号２）；
２）ＧＡＧ  ＣＴＳ  ＴＴＣ  ＣＣＳ  ＡＴＣ  ＣＣＮ  ＧＡＲ  ＣＣ  ２３−マー（配列番号３）；
３）ＣＣＳ  ＧＴＳ  ＡＴＣ  ＧＣＳ  ＣＴＳ  ＣＣＳ  ＣＣ  ２０−マー（配列番号４）；
４）ＧＧＣ  ＴＣＳ  ＧＧＧ  ＡＴＳ  ＧＧＲ  ＡＡＮ  ＡＧＹ  ＴＣ  ２３−マー（配列番号５）；
５）ＧＧＣ  ＴＣＳ  ＧＧＧ  ＡＴＳ  ＧＧＲ  ＡＡＹ  ＡＡＹ  ＴＣ  ２３−マー（配列番号６）；
［式中、Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｈ＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｓ＝Ｇ，Ｃ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔである。］
プライマー１、２および３は前進プライマー、すなわちコーディング鎖プライマーであり、４および５は逆向プライマー、すなわち非コーディング鎖プライマーである。
【００５５】
４．シトシンメチラーゼ保存配列に合致するプライマー：多くのシトシンメチラーゼ遺伝子のアミノ酸配列が決定され、比較されている（Wilson, Methods in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。シトシンメチル化は、２つの型に区別される。シトシン環の５位の炭素（Ｃ５）におけるメチル化と４位の窒素（Ｎ４）におけるメチル化である。Ｎ４型は、αおよびβの２種類で現れる。それらは、同じモチーフを有するが、モチーフの順序が異なる。シトシンメチラーゼの各タイプの保存配列モチーフのいくつかとハイブリッド形成させるために、縮重ＤＮＡプライマーを設計した。以下に示す、いくつかの前進（コード化）方向のプライマーおよびいくつかの逆方向のプライマーである。
【００５６】
Ａ．５−メチル−シトシン
５’ＴＴＣ  ＧＣＮ  ＧＧＮ  ＡＴＨ  ＧＧＮ  ＧＧ  ３’（配列番号７），モチーフ１：ＦＡＧＩＧＧ（配列番号３７）
５’ＴＴＣ  ＴＣＮ  ＧＧＮ  ＧＣＮ  ＧＧＮ  ＧＧ  ３’（配列番号８），モチーフ１：ＦＳＧＡＧＧ（配列番号３８）
５’ＴＴＹ  ＴＣＮ  ＧＧＮ  ＴＧＹ  ＧＧＮ  ＧＧ  ３’（配列番号９），モチーフ１：ＦＳＧＣＧＧ（配列番号３９）
５’ＧＣＮ  ＧＧＮ  ＴＴＹ  ＣＣＮ  ＴＧＹ  ＣＡ  ３’（配列番号１０），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配列番号４０）
５’ＧＧＳ  ＧＧＮ  ＣＣＮ  ＣＣＮ  ＴＧＹ  ＣＡ  ３’（配列番号１１），モチーフ４：ＧＧＰＰＣＱ（配列番号４１）
５’ＴＧ  ＲＣＡ  ＮＧＧ  ＲＡＡ  ＮＣＣ  ＮＧＣ  ３’（配列番号１２），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配列番号４２）
５’ＴＧ  ＲＣＡ  ＮＧＧ  ＮＧＧ  ＮＣＣ  ３’（配列番号１３），モチーフ４：ＧＰＰＣＱ（配列番号４３）
５’ＣＣ  ＹＴＴ  ＮＡＣ  ＲＴＴ  ＹＴＣ  ３’（配列番号１４），モチーフ６：ＥＮＶＫＧ（配列番号４４）
５’ＡＲ  ＮＣＣ  ＹＴＴ  ＮＡＣ  ＲＴＴ  ＹＴＣ  ３’（配列番号１５），モチーフ６：ＥＮＶＫＧＸ（Ｘ＝ロイシン／フェニルアラニン（配列番号４５））
５’ＡＣ  ＳＧＧ  ＳＡＣ  ＳＧＣ  ＧＴＴ  ＳＣＣ  ３’（配列番号１６），モチーフ１０：ＧＮＡＶＰＶ（配列番号４６）
Ｂ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ  型
５’ＧＧＮ  ＴＣＮ  ＧＧＮ  ＡＣ  ３’（配列番号１７），モチーフ１：ＧＳＧＴ（配列番号４７）
５’ＴＡ  ＮＧＧ  ＮＧＧ  ＮＧＡ  ３’（配列番号１８），モチーフ４：ＳＰＰＹ（配列番号４８）
Ｃ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ  型
５’ＡＣＮ  ＴＣＮ  ＣＣＮ  ＣＣＮ  ＴＡ  ３’（配列番号１９），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４９）
５’ＡＣＮ  ＡＧＹ  ＣＣＮ  ＣＣＮ  ＴＡ  ３’（配列番号２０），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４９）
５’ＴＣＮ  ＣＣＮ  ＣＣＮ  ＴＡＹ  ＴＧＧ  ３’（配列番号２１），モチーフ４：ＳＰＰＹＷ（配列番号５０）
５’ＡＡ  ＮＧＧ  ＲＴＣ  ＮＡＧ  ＮＡＣ  ３’（配列番号２２），モチーフ１：ＶＬＤＰＦ（配列番号５１）
５’ＧＴ  ＮＧＴ  ＮＣＣ  ＮＧＡ  ＮＣＣ  ３’（配列番号２３），モチーフ１：ＧＳＧＴＴ（配列番号５２）
５’ＣＣ  ＣＡＴ  ＲＡＡ  ＮＧＧ  ＲＴＣ  ３’（配列番号２４），モチーフ１：ＤＰＦＭＧ（配列番号５３）
５’ＣＣ  ＲＡＡ  ＲＡＡ  ＮＧＧ  ＲＴＣ  ３’（配列番号２５），モチーフ１：ＤＰＦＦＧ（配列番号５４）
５’ＣＣ  ＮＧＣ  ＲＡＡ  ＮＧＧ  ＲＴＣ  ３’（配列番号２６），モチーフ１：ＤＰＦＡＧ（配列番号５５）
５．工程４のシトシンメチラーゼプライマーおよび工程３のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端領域に相補的なプライマーの種々の組み合わをＰＣＲ法で使用して、エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の一部を増幅する。典型的な反応では、親反応混合物を、テストする一つのプライマーを含むように調製し、それをアリコートに分けてもう一つのプライマーを添加する。ＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼの一部の増幅が成功した反応では、親反応混合物を、４０μｌの１０ｘ  Ｖｅｎｔ（登録商標）反応緩衝液、３０μｌの４ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液、４μｌ（８００ｎｇ）のFrankia species ＤＮＡ、２０μｌ（１０μＭのストック）の上記配列番号２のプライマー（ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマー）、２８６μｌのｄＨ2 Ｏ、４μｌのＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（２５単位／μｌストック）および４μｌのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（０．０２単位／μｌストック）を混合して作った。
【００５７】
次いで、その混合物を８個の４７．５μｌアリコートに分けた。プライマー配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６を使用して、第１のアリコートには２．５μｌのプライマー配列番号８（１０μＭのストック）を添加し、第２には２．５μｌのプライマー配列番号１０（１０μＭのストック）を添加し、以下同様に添加した。第８のアリコートには、コントロール反応として２．５μｌのｄＨ2 Ｏを添加した。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で３分間を１サイクル、続いて、９５℃で３０秒間、４６℃で３０秒間および７２℃で２分間を２５サイクルとした。１５μｌのＰＣＲ反応生成物を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分析した。プライマー配列番号８および配列番号１６を有する反応物では、種々の第二のプライマーにより多重バンドが認められた。プライマー配列番号２および配列番号１１を有する反応物では、約１．５ｋｂの顕著なバンドが認められた。プライマー配列番号２および配列番号１０では、同じ大きさで強度の弱い生成物が認められ、プライマー配列番号２および配列番号８では、約１．６５ｋｂの中位の強度のバンドが認められた。これらの大きさの生成物は、相近遺伝子配向に対する予想と一致する。
【００５８】
これらの生成物がＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼに由来するかどうかのテストとして、プライマー配列番号２および配列番号８の１．６５ｋｂの生成物をゲル精製し、ＰＣＲ鋳型として使用した。ゲル精製：配列番号２および配列番号８のＰＣＲ反応物３０μｌを１％ＬＭＰアガロースで電気泳動し、１．６５ｋｂのバンドをゲルから切り取り、６５℃で５分間溶融して５分間４０℃に冷却し、アガロースを１μｌ（１ｕ）のβ−アガロース（New England Biolabs #392）の添加により消化し、４０℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡを沈澱により回収し、７０％エタノールで洗浄して風乾し、ＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。ＰＣＲ反応を上記と同じ条件を使用し、次のプライマーの組み合わせにより行った。配列番号８のみの場合は１．６５ｋｂとは異なる大きさで弱いバンドが６本得られ、プライマー配列番号２のみの場合は生成物は得られず、プライマー配列番号２および配列番号８の場合は顕著な１．６５ｋｂのバンドが得られ、プライマー配列番号２および配列番号１１（内部５−メチルシトシンメチラーゼプライマー）の場合は顕著な１．５ｋｂのバンドが得られ、これらのバンドはＦｒａｎｋｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＤＮＡに由来するものであり、プライマー配列番号４（内部ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマー）および配列番号１１の場合は、約１．４５ｋｂの顕著なバンドが得られた。これらの結果は、最初に得られた１．６５ｋｂの生成物および１．５ｋｂの生成物が恐らくＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子に由来することを示した。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂの生成物は、上記と同様にゲル精製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでを作用させ、予めＳｍａＩで切断して牛の腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。次いで、連結混合物を大腸菌株ＥＲ２４２０に形質転換し、個々のコロニーに対して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロスプレート上で平板培養した。所望の構築物のクローンの同定を、ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、精製ＤＮＡを消化し、アガロースゲル電気泳動により分析することにより行った。
【００５９】
プラスミドクローンの分析：個々の形質転換体を、アンピシリンを含む１０ｍｌのＬ−ブロスに接種し、それに含まれるプラスミドを、BirnboinとDolyの方法（Nucleic Acids Res. 7:1513, (1979) ）から採用した下記のｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド精製法により得た。
【００６０】
ｍｉｎｉｐｒｅｐ法：各培養液を８０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨てて、細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのグルコース，ｐＨ８．０に再懸濁した。室温で１０分後、２．０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各チューブに添加し、そのチューブを攪拌して細胞を溶解した後、氷上に置いた。溶液がいったん透明になったら、３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを各チューブに添加して攪拌した。生成した沈澱を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間回転沈降させた。各上清を３ｍｌのイソプロパノールを含む遠心管に注入して混合した。室温で１０分後、そのチューブを１５，０００ｒｐｍで１０分間回転させて、沈澱した核酸をペレット化した。上清を捨ててペレットを室温で３０分間風乾した。乾燥したら、ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む５００μｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ−ＥＤＴＡに溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。ＤＮＡを、５０μｌの５Ｍ−ＮａＣｌ、次いで３５０μｌのイソプロパノールを添加することにより沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを５分間遠心することにより回転沈降させ、上清を捨ててペレットを乾燥させた後、１５０μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の最終溶液に再溶解した。次いで、プラスミドのｍｉｎｉｐｒｅｐを、種々の制限エンドヌクレアーゼによる消化により分析した。
【００６１】
６．ＤＮＡ配列：ＤＮＡ配列分析を、Circumvent（登録商標）ＤＮＡ配列分析キット（New England Biolabs ）を使用し、製造者の指示に従って行った。ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ調製物を鋳型として使用した。そのＤＮＡ配列は、続く操作で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をクローン化し、クローン化した遺伝子を大腸菌で発現させるためのベースとして使用するデータとなった。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂの両方のＰＣＲ産物の一端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端の蛋白質配列と密接に一致した。このＤＮＡ配列は、５’ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＡＴＣ  ３’（配列番号２７）であり、これをアミノ酸配列に翻訳すると、ＦＰＩＰＥＰＬＶＲＰＶＩＡＬＰＰＨＬＫＥＬＩ（配列番号２８）であることが分かった。ここで、下線のアミノ酸は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列データの結果と一致する。１．６５ｋｂの増幅産物の他端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、５−メチルシトシンメチラーゼの保存モチーフ１および４を含んでおり、ＤＮＡ配列は、５’ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ３’（配列番号２９）であり、これをアミノ酸配列に翻訳すると、ＦＣＧＡＧＧＭＴＬＧＦＭＱＡＧＦＱＰＩＬＳＩＤＨＤＬＰＳＩＥＴＨＲＡＮＦＰＧＭＳＩＣＴＤＩＲＤＦＶＤＦＰＳＡＤＶＶＶＧＧＰＣＱＧＦＳＲＬＧ（配列番号３０）であった。
【００６２】
７．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの過発現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＡＩＩ１７の誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流に挿入することによって過発現させると、リボソーム結合部位が強く認識された。これを達成するために、二つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡおよび蛋白質配列データを使用して作った。前進オリゴヌクレオチドプライマーは、エンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩクローニング部位を作る配列を含み、続いて、蛋白質配列によって示される第２、第３、第４および第５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含み（コドンの選択は、発現の高い遺伝子の最も普通に使用される大腸菌コドンに合致するように行った。）、続いて、１．６５ｋｂ増幅産物から得られるＤＮＡ配列に相補的な２１個の塩基を含んでいた。すなわち、５’ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ３’（配列番号３１）（ＣＡＴ  ＡＴＧはＮｄｅＩクローニング部位であり、下線は最初の５個のアミノ酸コドンである。）である。第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の３’端に約８００ヌクレオチドの配列を含み、一度増幅されたフラグメントのクローニングを促進するためのＳａｌＩ部位を作るように１個のヌクレオチドを変化させた。すなわち、５’ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ３’（配列番号３２）（下線がＳａｌＩ部位である。）である。これら二つのプライマーを、 Vent ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応において、鋳型としてのゲノム Frankia speciesＤＮＡとともに使用して、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅させた。バンドを上記と同様にゲル精製した。精製したＤＮＡを２０ＵのＮｄｅＩおよび２０ＵのＳａｌＩ／１ｘＮＥ緩衝液３で１時間消化した。インキュベートした後、消化物をフェノール：クロロホルムの１：１混合物で１回、クロロホルムで２回抽出し、２容のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心によりペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄し、脱水して２０μｌのＴＥに再懸濁した。精製したフラグメントの３μｌ（約０．０５μｇ）を、１７℃で４時間、４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼとともに全体積２０μｌでＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（約０．０５μｇ）で消化したＴ７発現ベクターｐＡＩＩ１７（S. Xu, New England Biolabs製）に連結した。〔ｐＡＩＩ１７は、Ｔ７プロモータの４ｂｐ下流のｌａｃオペレーター（Ｔ７ｌａｃという。）、ｌａｃＩq 遺伝子、アンピシリン耐性およびクローニング用の二つの制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（ＳａｌＩはＢａｍＨＩの代わりである。）を含むｐＢＲ３２２由来のＴ７発現ベクターである。ｐＡＩＩ１７はまた、標的遺伝子の発現の基底レベルをさらに低下させるために、Ｔ７プロモーターの上流にｒｒｎＢ転写終結因子の４個のコピーを含む。（ｐａＩＩ１７は、 W. Jackが New England BiolabsでｐＥＴ−１ｌａから構築した。）（Dubendorff, J. W. and Studier, F. W., J. Mol. Biol. 219:45-59, (1991) ）１０μｌの連結体を使用して、適合するプラスミドｐＮｌａＩＨ１４上に有するＮｌａＩメ���ラーゼ遺伝子で予め修飾したコンピテント大腸菌ＥＲ２４１７を形質転換した。〔ＮｌａＩメチル化認識部位ＧＧＣＣは、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位毎に２回現れるので、ＮｌａＩによるメチル化は、宿主ＤＮＡをＦｓｅＩ消化から保護する。ｐＮｌａＩＨ１４は、ｋａｎr およびＴｃr 遺伝子ならびにｐＳＣ１０１複製起点を有するコピー数が中位のプラスミドであるｐＳＹＸ２０から誘導される。Ｔｃr 遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子は、Ｔｃプロモーターから構成的に発現可能である。〕形質転換された細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−寒天上で平板培養した。プラスミドを、工程５で記載したように、プラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐ法を使用して、個々のコロニーから単離した。各ｍｉｎｉｐｒｅｐ５μｌのＮｄｅＩおよびＳａｌＩによる二重消化をｐＡＩＩ１７のＮｄｅＩおよびＳａｌＩによる二重消化と比較した。約１．５ｋｂの挿入物を含むクローンを選択してさらに特性化を行った。これらのクローンを、アンピシリンおよびカナマイシンを含む２００ｍｌのＬ−ブロスでＫｌｅｔｔ８０（対数増殖中期）まで増殖させて、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。誘導の２時間後に、細胞（約０．８ｇ）を遠心により採取し、３ｍｌの超音波緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、氷上で超音波処理した。超音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各抽出物４．５μｌを７５μｌのＤＮＡアッセイ混合物（１μｇの Adeno２ＤＮＡ／５０μｌのＮＥ緩衝液１）と混合した。このチューブの２５μｌを５０μｌのＤＮＡ混合物と別のチューブで混合した（１：２希釈）。別に逐次１：２希釈を３回行った。反応物は３０℃で１時間インキュベートした。各反応物２０μｌを１％アガロースゲルにかけた。テストした全てのクローンが、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を生じた。酵素力価は、１ｘ１０4 単位／ｇ細胞より大きいと推定された。これらのクローンの一つを選択してさらに特性化を行い、株をＮＥＢ＃９１８と命名し、プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ１と命名した。ＮＥＢ＃９１８の粗抽出物から生じたＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の力価を図４に示す。
【００６３】
８．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは、ＮＥＢ＃９１８をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有する富栄養培地を含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させることにより産生させることができる。培養物は、次いで、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加することにより誘発し、２〜４時間増殖を続ける。その後、細胞を遠心により採取する。
【００６４】
９．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮＥＢ＃９１８からの精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、上記工程２と同様に、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な蛋白質精製法を組み合わせることにより精製する。この精製により得られるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、非特異的なエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは含んでいなかった。
【００６５】
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの詳しい解析およびＦｓｅＩメチラーゼのクローン化：
１０．Frankia species ゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断：Frankia species ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで切断して、次のように部分消化を行った。ＮＥ緩衝液Ｓａｕ３ＡＩ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのビストリスプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０、２５℃）における５０μｇ／ｍｌのFrankia species ＤＮＡ４５０μｌを１００μｌのアリコート１本および５０μｌのアリコート７本に分けた。１００μｌのチューブに５単位のＳａｕ３ＡＩを添加して１μｇＤＮＡあたり１単位の酵素とした。第一のチューブから５０μｌを取り出して第二のチューブに移し、０．５単位のＳａｕ３ＡＩ／μｇとし、同様にして、続く各々のチューブのＳａｕ３ＡＩが、その前のチューブのＳａｕ３ＡＩ量の半分になるようにする。それらのチューブを３７℃で１時間インキュベートした後、フェノール／クロロホルムで抽出し、２容のエタノールで沈澱させ、乾燥して、３０μｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、各々の３μｌをアガロースゲル電気泳動により分析した。９〜２３ｋｂの範囲に消化物質を示すチューブをクローニング用のフラグメント源として選択した。個々の反応物を一緒にして、所望の９〜２３ｋｂの範囲のフラグメントを上述したように低融点アガロースからゲル精製し、クローンライブラリーの作製に使用した。
【００６６】
１１．Ｓａｕ３ＡＩライブラリー：Ｓａｕ３ＡＩゲノムライブラリーを、ベクターλ’（登録商標）ＩＩ（Stratagene）を使用して作製した。λ’ＩＩはλ置換ベクターであり、９〜２３ｋｂのＤＮＡフラグメントをクローン化するために使用することができる。上述したようにＳａｕ３ＡＩ部分消化されたFrankia species ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）を５００ｎｇのＢａｍＨＩ−切断λ’ＩＩアーム（０．５μｌ）と混合した。１０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２．５μｌの２ｘライゲーション混合物（１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．８、２０ｍＭのＭｇＣｌ2 、２０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ）を添加し、その混合物を１７℃で１６時間インキュベートした。２．５μｌのライゲーション反応物を、Gigapack II Plus（Stratagene）を使用し、製造者の指示に従って、感染性ファージ粒子にｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージした。室温で２時間インキュベートした後、パッケージされたファージを５００μｌのＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ4 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１％のゼラチン）および３滴のクロロホルムで希釈した。感染性ファージ粒子の力価を次のように測定した。パッケージされたファージ溶液２μｌを１９８μｌのＳＭで希釈した。その希釈されたファージの１μｌ、１０μｌおよび１００μｌアリコートを、ＥＲ１４５８細胞の新しい懸濁物（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600 ＝２．０における懸濁物）１００μｌに添加し、室温で１５分間インキュベートした後、４０℃で３ｍｌのトップアガーと混合し、富栄養プレートに播いた。トップアガーが固まった後、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。翌日プラーク数を数え、次の実験で使用するファージストックの力価を計算すると、５×１０4 ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００６７】
１２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージしたファージを上記と同様にプレーティングして、大腸菌ＥＲ１４５８の菌叢に十分分離したプラークを形成させた。約２５０、５００および１５００ファージのプレートを作った。これらのクローンのλ’ＩＩＳａｕ３ＡＩライブラリーからのニトロセルロースフィルタープラークリフトを、放射能標識した（Random Priming System I, #1550, New England Biolabs ）ゲル精製１．６５ｋｂＰＣＲ産物（Benton-Davis法、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Cold  Spring Harbor Laboratory Press, 1982, pp.320ff）をプローブとして行った。陽性の６個のプラークが同定され、全て、精製されたプラークであった。ＤＮＡを４個のファージの集密的プレートライセート（トップアガロース中）から調製し、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化した。４個とも、共通して１．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含み、これに１．６５ｋｂのプローブをハイブリッド形成させた。
【００６８】
１３．サザンハイブリッド形成：サザンブロットを次のように調製した。１μｇのFrankia species ゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＥａｇＩ、ＨｉｎｄIII 、ＫｐｎＩ、ＭｓｃＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩまたはＸｈｏＩで消化した。消化物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。ゲルを０．２５ＭのＨＣｌ（溶液を２回換える）で１５分間、次いで、０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ（溶液を２回換える）で各１５分、最後に１ＭのＮＨ4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨ（溶液を２回換える）で３０分間洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに移すために、孔径０．４５μｍのニトロセルロースのシートを１ＭのＮＨ4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで湿らし、ゲルと同じ大きさのものをゲルの一方の側に置いた。これを２インチの高さに積み重ねたペーパータオルの上に置き、別の２インチの高さのペーパータオルの束をその上に置いた。そのペーパータオルの束の上にガラス板を置き、そのガラス板の上に小さい重しを載せた。ＤＮＡを一晩トランスファーさせ、ニトロセルロースを８０℃で１時間乾熱処理した。
【００６９】
ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５０ｘ Denhardt （５ｇのフィコール、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳＡ／５００ｍｌのＨ2 Ｏ）、２０ｘＳＳＣ（１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム／１ｌのＨ2 Ｏ）、１０％のＳＤＳおよび１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリッド形成した。室温で１時間、プレハイブリッド形成した後、ラベルしたプローブ（上記と同様にラベルした１．６５ｋｂ増幅産物）を添加し、ハイブリッド形成の工程を６８℃で一夜行った。ブロットを、６５℃で１時間かけて、２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）および０．１％のＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）で洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに２４時間あてた。
【００７０】
このブロットおよびλクローンの消化パターンから、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ全体およびＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子のカルボキシル末端の一部を含む３．６ｋｂのＳａｃＩフラグメントが同定され、λファージの一つをｐＵＣ１９に入れてサブクローニングを行った。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子全体およびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキシ末端を含む７．０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントも、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りのアミノ末端部分を含む１．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントと同様に、ｐＵＣ１９に入れてサブクローニングを行った。
【００７１】
１４．ＤＮＡ配列分析：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列分析を、CircumventＤＮＡ配列分析キット（New England Biolabs ）および Sequenase２．０配列分析キット（United States Biochemicals）を使用し、製造者の指示に従って行った。種々のサブクローンを作り、合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成して、配列分析を行った。ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ製剤を鋳型として使用した。ＤＮＡ配列分析により、続く操作でＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子をクローン化し、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を再クローン化し、これらの遺伝子の大腸菌での発現を誘発するためのベースとして使用するためのデータが得られた。エンドヌクレアーゼの開始におけるＤＮＡ配列は、５’ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ３’（配列番号３３）であることが分かった。これは、アミノ酸配列：ＭＴＤＥＬＦＰＩＰＥＰＬＶ（配列番号３４）に翻訳される。すなわち、エンドヌクレアーゼの２番目のアミノ酸は、工程３のアミノ酸配列データから最初に考えられたヒスチジンではなく、トレオニンであることが分かった。メチラーゼ遺伝子の推定上の開始および停止コドンが、停止コドンがエンドヌクレアーゼの末端であると推定されたと同様に、同定された。エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の読み取り枠は１２個のヌクレオチドが重複することが認められた。ＦｓｅＩメチラーゼを適合するベクターで発現させて、宿主ゲノムをＦｓｅＩ切断から保護するためにＦｓｅＩメチラーゼを使用し、エンドヌクレアーゼを別に発現させて、２番目の位置に適切なトレオニンを挿入し、保護のためにＦｓｅＩメチラーゼを使用した。
【００７２】
１５．メチラーゼのクローン化：ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅してｐＳＹＸ２０でクローン化するために、２個のプライマーを設計した。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子は、VentＤＮＡポリメラーゼを使用して、Frankia species ゲノムＤＮＡら増幅した。約１１００ｂｐの増幅産物を上記と同様にゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、沈澱させて、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断したｐＳＹＸ２０ベクターに連結した。連結反応物を大腸菌株ＥＲ２４２７に形質転換し、個々の形質転換体をｍｉｎｉｐｒｅｐ法にかけて、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。正しい挿入物を有する形質転換体を単離した。
【００７３】
１６．エンドヌクレアーゼのクローン化：制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＲＲＳの、強力な誘発プロモーター（ＰｌａｃＵＶ５）および強く認識されるリボソーム結合部位のすぐ下流に挿入することにより発現させた。これを行うために、ＤＮＡおよび蛋白質配列データを使用して二つのオリゴヌクレオチドプライマーを作った。第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＢａｍＨＩ部位、続いてｌａｃＺ蛋白質の翻訳を停止するためのｌａｃＺ遺伝子と結合したフレーム内停止コドン、強いリボソーム結合部位、７個のヌクレオチドのスペーサー、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始コドン、第２番目のトレオニン（ヒスチジンではない）コドン、５番目のアミノ酸におけるロイシンに対するコドン使用の変更およびハイブリッド形成のためのFrankia species ＤＮＡに相補的な配列を含んだ。すなわち、５’ＴＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＴＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴＡＴＣ  Ｃ  ３’（配列番号３５）であった。逆向きプライマーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’端に位置し、クローニングのためのＢａｍＨＩ部位が加えられ、５’ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ３’（配列番号３６）であった。これら二つのプライマーを使用し、１０μｌの１０ｘ Vent 反応緩衝液、８μｌの４ｍＭｄＮＴＰ溶液、１μｌ（２００ｎｇ）のFrankia species ＤＮＡ、５μｌ（１０μＭストック）のプライマー（配列番号３５）、５μｌ（１０μＭストック）のプライマー（配列番号３６）、７１μｌのｄＨ2 Ｏ、０．５μｌの Vent ポリメラーゼ（２単位／μｌストック）を混合して、９５℃１分間、５６℃１分間および７２℃１分間で２５サイクル増幅することにより、Frankia species ゲノムＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。約７００ｂｐの増幅産物を上記と同様にゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、沈澱させ、予めＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化したｐＲＲＳベクターに連結した。連結反応物を、適合するプラスミドｐＳＹＸ２０に載せたＮｌａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾した大腸菌株ＥＲ２４２７に形質転換した。個々の形質転換体を分析すると、いくつかの発現ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼが認められた。酵素力価は、１×１０4 単位／ｇ細胞より大きいと推定された。これらのクローンの一つを選択してさらに解析を行い、その株をＮＥＢ＃９４３と命名し、プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ２と命名した。ＮＥＢ＃９４３は、１９９４年１０月１８日に受託番号６９７０７でＡＴＣＣに寄託した。ＮＥＢ＃９４３の粗抽出物から得られたＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図５に示す。
【００７４】
１７．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＮＥＢ＃９４３を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を有する富栄養培地を含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させることにより産生させることができる。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加することによりその培養物を誘発し、２〜４時間増殖を続ける。次いで、細胞を遠心により採取する。
【００７５】
１８．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮＥＢ＃９４３からの精製は、上記工程９におけるＮＥＢ＃９１８の場合と同様に行う。この精製により得られるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは含んでいなかった。
【００７６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン化して産生するための好ましい方法を説明する。クローン化計画に着手するときは、どの方法または条件を使用するとＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化がうまくいくか分からなかった。実際、メチラーゼ選択方法では、ＦｓｅＩメチラーゼ（またはエンドヌクレアーゼ）のクローンは得られなかった。図１および実施例１に記載した蛋白質配列分析、メチラーゼ比較、プライマー設計、ＤＮＡ増幅およびクローニング結果、ならびにクローンのＤＮＡ配列決定、マッピングおよび特性化は、ＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化および発現のための、以前には知られていなかった直接方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ａのつづき。
【図２】過発現クローンｐＲＭＦｓｅＲ１を作るためのベクターｐＡＩＩ１７に挿入されたＤＮＡの制限地図である。
【図３】過発現クローンｐＲＭＦｓｅＲ２を作るためのベクターｐＲＲＳに挿入されたＤＮＡの制限地図である。
【図４】ｐＡＩＩ１７由来プラスミドｐＲＭＦｓｅＲ１上のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌ＥＲ２４１７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】ｐＲＲＳ由来のプラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２上のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌ＥＲ２４２７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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