(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列における変異の存在および同一性を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該第１のポリヌクレオチドのサンプルを提供する工程；
ｂ）該変異を含む可能性のある該第１のポリヌクレオチドの領域を選択する工程；
ｃ）該選択された領域を、鋳型生成増幅反応に供し、該選択された領域を含む第１の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型を生成する工程；
ｄ）該変異を含む可能性のある該鋳型の領域を選択する工程；
ｅ）標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第１のファミリーを、以下、
ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、少なくとも２つのプライマーのセット、
ｉｉ）２つのワトソン−クリック対合塩基の少なくとも２つの異なるセットを含む、少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸、および
ｉｉｉ）第１のターミネーターおよび第２のターミネーターを含む、２つの型のフラグメントターミネーター；
を含むフラグメント生成反応によって同時に該鋳型の両鎖から生成する工程であって、
ここで、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーが、該鋳型鎖の該選択された領域に隣接し；
ここで、該第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、そして該第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し；
ここで、該型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識され；
ここで、該第１のターミネーターおよび該第２のターミネーターが、非ワトソン−クリック対合であり；
ここで、該第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、そして該第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され；
ここで、該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識、該第１のヌクレオチド標識、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識の各々が、互いに全て識別可能であり；
ここで、該フラグメントの第１のファミリーが、該フラグメントの３’末端で該第１のターミネーターまたは該第２のターミネーターのいずれかによって終結され；そして
ここで、該フラグメントの第１のファミリーが、該第１のターミネーターまたは該第２のターミネーターのいずれかによって示される、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖の該選択された領域の一部分の可能な各塩基で終結する少なくとも１つのフラグメントを含む、工程；
ｆ）該フラグメントに存在する該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識、該第１のヌクレオチド標識、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識を検出することによって該第１のポリヌクレオチドの該選択された領域における該塩基の位置および同一性を決定する工程；ならびに
ｇ）決定された前記塩基の位置および同一性を、第２のポリヌクレオチドからの塩基の位置および同一性と比較して、それによって、前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域における該塩基の位置および同一性を決定する工程の後に、該第１のポリヌクレオチドの該選択された領域と該第２のポリヌクレオチドの対応する領域との間のヌクレオチド配列における変異の存在および同一性を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域が、該第１のポリヌクレオチド上に複数の不連続の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鋳型生成増幅反応が、前記選択された領域をＰＣＲに供することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型生成増幅反応が、前記選択された領域をＲＴ−ＰＣＲに供することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型が、鎖あたり約５０〜５０，０００ヌクレオチドの二本鎖の核酸鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された領域を鋳型生成増幅反応に供した後に、他の増幅反応成分を除去するために前記鋳型を精製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フラグメント生成増幅反応が、前記選択された領域をＰＣＲに供する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記フラグメント生成増幅反応が、前記選択された領域をＲＴ−ＰＣＲに供する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型鎖の前記選択された領域が、鎖あたり約１００〜１０００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターミネーターが２’−３’−ジデオキシターミネーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のターミネーターがピリミジンヌクレオチドを含み、前記第２のターミネーターがプリンヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のターミネーターおよび前記第２のターミネーターが、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ：ｄｄＴＴＰおよびｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のターミネーターおよび前記第２のターミネーターが、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ：ｄｄＵＰおよびｄｄＧＴＰ：ｄｄＵＴＰからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のプライマー標識、前記第２のプライマー標識、前記第１のヌクレオチド標識、前記第１のターミネーター標識および前記第２のターミネーター標識が、蛍光標識、蛍光エネルギー移動標識、ルミネッセンス標識、化学ルミネッセンス標識、リン光標識およびフォトルミネッセンス標識からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１のヌクレオチド標識で標識された前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの一部分が、標識されていないヌクレオチド三リン酸の総濃度の約１％〜約１０％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域中の前記塩基の位置および同一性を決定する工程の前に、前記フラグメント生成反応から標識された反応生成物を精製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のポリヌクレオチドの前記対応する領域の配列が、以下の工程：
ａ）該第２のポリヌクレオチドのサンプルを提供する工程；
ｂ）前記変異を含む可能性のある前記第１のポリヌクレオチドの領域に対応する該第２のポリヌクレオチドの領域を選択する工程；
ｃ）該第２のポリヌクレオチドの該対応する領域を、鋳型生成増幅反応に供し、該対応する領域を含む第２の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型を生成する工程；
ｄ）標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーを、以下、
ｉ）第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む少なくとも２つのプライマーのセット、
ｉｉ）２つのワトソン−クリック対合塩基の少なくとも２つの異なるセットを含む、少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸、
ｉｉｉ）第３のターミネーターおよび第４のターミネーターを含む、２つの型のフラグメントターミネーター；
を含むフラグメント生成反応によって同時に該鋳型の両鎖から生成する工程であって、
ここで、該第３のプライマーおよび該第４のプライマーが、該鋳型鎖の該選択された領域に隣接し；
ここで、該第３のターミネーターおよび該第４のターミネーターが非ワトソン−クリック対合であり；
ここで、該フラグメントの第２のファミリーの各々が、該フラグメントの３’末端で該第３のターミネーターまたは該第４のターミネーターのいずれかによって終結され；そして
ここで、該フラグメントの第２のファミリーが、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖の該選択された領域の一部分の、該第３のターミネーターまたは該第４のターミネーターのいずれかによって示される、各々可能な塩基で終結する少なくとも１つのフラグメントを含む、工程；
ｅ）該第２のポリヌクレオチドの該対応する領域において少なくともいくつかの該塩基の位置および同一性を決定する工程、
によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のポリヌクレオチドの前記対応する領域の配列が、前記第１のポリヌクレオチドの選択された領域における塩基の位置および同一性を決定する工程と同時に決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第１のファミリーを生成する工程、および前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーを生成する工程が、１つの反応において実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、そして前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、そしてここで、該第３のプライマー標識および該第４のプライマー標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、そして前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、そしてここで、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識および該第２のヌクレオチド標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、ここで、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第２のヌクレオチド標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識、該第２のヌクレオチド標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列における変異の存在および同一性を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該第１のポリヌクレオチドのサンプルを提供する工程；
ｂ）該変異を含む可能性のある該第１のポリヌクレオチドの領域を選択する工程；
ｃ）該選択された領域を、鋳型生成増幅反応に供し、該選択された領域を含む第１の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型を生成する工程；
ｄ）該変異を含む可能性のある該鋳型の領域を選択する工程；
ｅ）標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第１のファミリーを、以下、
ｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む少なくとも２つのプライマーのセット、
ｉｉ）２つのワトソン−クリック対合塩基の少なくとも２つの異なるセットを含む、少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸、および
ｉｉｉ）第１のターミネーターおよび第２のターミネーターを含む、２つの型のフラグメントターミネーター；
を含むフラグメント生成反応によって同時に該鋳型の両鎖から生成する工程であって、
ここで、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーが、該鋳型鎖の該選択された領域に隣接し；
ここで、該第１のターミネーターおよび該第２のターミネーターが、非ワトソン−クリック対合であり；
ここで、該フラグメントの第１のファミリーの各々が、該フラグメントの３’末端で第１のターミネーターまたは第２のターミネーターのいずれかによって終結され；そして
ここで、該フラグメントの第１のファミリーが、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖の該選択された領域の一部分の、該第１のターミネーターまたは該第２のターミネーターのいずれかによって示される、各々可能な塩基で終結する少なくとも１つのフラグメントを含む、工程；
ｆ）該選択された領域における該塩基の位置および同一性を決定する工程；ならびに
ｇ）決定された前記塩基の位置および同一性を、第２のポリヌクレオチドからの塩基の位置および同一性と比較して、それによって、前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域における塩基の位置および同一性を決定する工程の後に、該第１のポリヌクレオチドの該選択された領域と該第２のポリヌクレオチドの対応する領域との間のヌクレオチド配列における変異の存在および同一性を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、そして前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、そしてここで、該第１のプライマー標識および該第２のプライマー標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、そして前記第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、そして前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識され、そしてここで、該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識および該第１のヌクレオチド標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、前記第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、そして前記第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識され、ここで、前記第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、そして前記第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第１のヌクレオチド標識、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法
【請求項３６】
前記第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識され、前記第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、そして前記第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識、該第１のヌクレオチド標識、該第１のターミネーター標識および該第２のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域が、該第１のポリヌクレオチド上に複数の不連続の配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記鋳型生成増幅反応が、前記選択された領域をＰＣＲに供する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記鋳型生成増幅反応が、前記選択された領域をＲＴ−ＰＣＲに供する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型が、鎖あたり約５０〜５０，０００ヌクレオチドの二本鎖の核酸鎖を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記選択された領域を鋳型生成増幅反応に供した後に、他の増幅反応成分を除去するために前記鋳型を精製する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記フラグメント生成増幅反応が、前記選択された領域をＰＣＲに供する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記フラグメント生成増幅反応が、前記選択された領域をＲＴ−ＰＣＲに供する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記鋳型鎖の前記選択された領域が、鎖あたり約１００〜１０００ヌクレオチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記ターミネーターが２’−３’−ジデオキシターミネーターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のターミネーターがピリミジンヌクレオチドを含み、かつ前記第２のターミネーターがプリンヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のターミネーターおよび前記第２のターミネーターが、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ：ｄｄＴＴＰおよびｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１のターミネーターおよび前記第２のターミネーターが、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ：ｄｄＵＴＰおよびｄｄＧＴＰ：ｄｄＵＴＰからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のプライマー標識、前記第２のプライマー標識、前記第１のヌクレオチド標識、前記第１のターミネーター標識および前記第２のターミネーター標識が、蛍光標識、蛍光エネルギー移動標識、ルミネッセンス標識、化学ルミネッセンス標識、リン光標識およびフォトルミネッセンス標識からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
第１のヌクレオチド標識で標識された前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの一部分が、標識されていないヌクレオチド三リン酸の総濃度の約１％〜約１０％を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のポリヌクレオチドの選択された領域中の塩基の位置および同一性を決定する工程の前に、前記フラグメント生成反応から標識された反応生成物を精製する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの一部分、前記第１のターミネーターおよび前記第２のターミネーターの１つ以上が標識され、そしてここで、前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域における前記塩基の位置および同一性を決定する工程が該標識を検出する工程によって達成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のポリヌクレオチドの前記対応する領域の配列が、以下の工程：
ａ）該第２のポリヌクレオチドのサンプルを提供する工程；
ｂ）前記変異を含む可能性のある前記第１のポリヌクレオチドの領域に対応する該第２のポリヌクレオチドの領域を選択する工程；
ｃ）該第２のポリヌクレオチドの該対応する領域を、鋳型生成増幅反応に供し、該対応する領域を含む第２の複数の二本鎖ポリヌクレオチド鋳型を生成する工程；
ｄ）標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーを、以下、
ｉ）第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む少なくとも２つのプライマーのセット、
ｉｉ）２つのワトソン−クリック対合塩基の少なくとも２つの異なるセットを含む、少なくとも４つの型のヌクレオチド三リン酸；および
ｉｉｉ）第３のターミネーターおよび第４のターミネーターを含む、２つの型のフラグメントターミネーター；
を含むフラグメント生成反応によって同時に該鋳型の両鎖から生成する工程であって、
ここで、該第３のプライマーおよび該第４のプライマーが、該鋳型鎖の該選択された領域に隣接し；
ここで、該第３のターミネーターおよび該第４のターミネーターが非ワトソン−クリック対合であり；
ここで、該フラグメントの第２のファミリーの各々が、該フラグメントの３’末端で該第３のターミネーターまたは該第４のターミネーターのいずれかによって終結され；そして
ここで、該フラグメントの第２のファミリーが、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖の該選択された領域の一部分の、該第３のターミネーターまたは該第４のターミネーターのいずれかによって示される、各々可能な塩基で終結する少なくとも１つのフラグメントを含む工程；
ｅ）該第２のポリヌクレオチドの対応する領域において少なくともいくつかの該塩基の位置および同一性を決定する工程、
によって決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２のポリヌクレオチドの前記対応する領域の配列が、前記第１のポリヌクレオチドの前記選択された領域における塩基の位置および同一性を決定する工程と同時に決定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第１のファミリーを生成する工程、および前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーを生成する工程が、１つの反応において実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、そして前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、そしてここで、該第３のプライマー標識および該第４のプライマー標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、そして前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、そしてここで、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識および該第２のヌクレオチド標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第４のプライマーが第４のプライマー標識を有し、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、ここで、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第２のヌクレオチド標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１のプライマーが第１のプライマー標識を有し、前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、前記第３のプライマーが第３のプライマー標識を有し、前記第２のプライマーが第２のプライマー標識を有し、前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第１のファミリーの生成において前記型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第１のヌクレオチド標識で標識され、前記標識された直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントの第２のファミリーの生成において該型のヌクレオチド三リン酸の１つの少なくとも一部分が、第２のヌクレオチド標識で標識され、前記第１のターミネーターが第１のターミネーター標識で標識され、前記第２のターミネーターが第２のターミネーター標識で標識され、前記第３のターミネーターが第３のターミネーター標識で標識され、そして前記第４のターミネーターが第４のターミネーター標識で標識され、そしてここで、該第１のプライマー標識、該第２のプライマー標識、該第３のプライマー標識、該第４のプライマー標識、該第１のヌクレオチド標識、該第２のヌクレオチド標識、該第１のターミネーター標識、該第２のターミネーター標識、該第３のターミネーター標識および該第４のターミネーター標識が互いに全て識別可能である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景）
ヒトゲノム中の個人のＤＮＡ配列の変異は、特定の疾患または状態を直接生じるか、または特定の個人に対して特定の疾患または状態の素因を与えることが公知である。そのような変異はまた、多くの疾患の重篤度または進行を変化させる。さらに、ＤＮＡ配列は、集団の中で変動する。従って、ヒトゲノムにおけるＤＮＡ配列変異の決定は、正確な診断を行うため、適切な治療を見出すため、および疾患の病原論および状態の有病割合におけるゲノム変異と環境因子との間の関係を理解するために、有用である。
【０００２】
ヒトゲノム中に、いくつかのタイプのＤＮＡ配列変異が存在する。これらの変異としては、挿入、欠失および反復配列のコピー数の差が挙げられる。しかし、ヒトゲノムにおける最も一般的なＤＮＡ配列変異は、単一塩基対置換である。これらの変異は、変異対立遺伝子が少なくとも１％の集団での頻度を有する場合、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）という。
【０００３】
ＳＮＰは、ＤＮＡ配列変異とヒト疾患および状態との間の関係を研究するにおいて特に有用である。なぜなら、ＳＮＰは、安定であり、頻繁に生じ、そして反復配列のような他のゲノム変異よりも、より低い範囲割合を有するからである。さらに、ＳＮＰを検出する方法は、他のより一般的でないＤＮＡ配列変異を検出する方法よりも、自動化および大規模研究での使用に、より容易に受け入れられる。
【０００４】
ＳＮＰを位置決めし得るか、または同定し得る多数の方法が、開発されている。これらの方法としては、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）、蛍光標識化ｄｄＦ、変性フィンガープリンティング（ＤｎＦ１ＲおよびＤｎＦ２Ｒ）、一本鎖高次構造多型分析、変性勾配ゲル電気泳動、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮａｓｅ切断、化学的切断、アレイを使用するハイブリダイゼーション配列決定および直接的ＤＮＡ配列決定が挙げられる。
【０００５】
ＳＮＰを位置決めするか、または同定する公知の方法には、特定の不利な点が付随する。例えば、いくつかの公知の方法は、特定の塩基変化または配列内のこれら塩基変化の正確な位置を同定しない。他の公知の方法は、同時に多くのサンプルを分析することが受け入れられないか、またはプールしたサンプルの分析することが受け入れられない。なお他の公知の方法は、各変異の検出のために、異なる分析条件を必要とする。さらに、いくつかの公知の方法は、遺伝子型決定アッセイにおいて既知のＳＮＰを定量するために使用され得ない。さらに、多くの公知の方法が、スループットにおいて過剰な限定を有する。
【０００６】
従って、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間でのヌクレオチド配列の変異（ヒト個体のゲノム中のＳＮＰの存在を含む）の存在および同一性を決定する新規の方法が必要である。好ましくは、この方法は、プールされたサンプル中の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間でのヌクレオチド配列の変異の存在および同一性を決定し得る。さらに好ましくは、この方法は、２つ以上の変異が、個体中の同一の対立遺伝子上または異なる対立遺伝子上に存在するか否か決定し得、そして集団において変異が生じる頻度を決定するために使用し得る。さらに好ましくは、この方法は、高度の正確性で、同時に大多数のサンプルをスクリーニングし得る。
【０００７】
（要旨）
１つの実施態様において、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間でのヌクレオチド配列の変異の存在および同一性を決定する方法を提供する。この方法は、第１に、第１のポリヌクレオチドのサンプルを提供し、変異を含む可能性のある第１のポリヌクレオチドの領域を選択する工程を包含する。次に、選択された領域を、選択された領域を含む複数の２本鎖ポリヌクレオチド鋳型を生成する、鋳型生成増幅反応に供する。次に、標識された、直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントのファミリーを、一セットのプライマーを使用するフラグメント生成反応によって、鋳型の両方の鎖から同時に、生成する。フラグメントのファミリーの各々を、フラグメントの３’末端のターミネーターによって終結させる。フラグメントのファミリーは、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖のその部分の可能な塩基の各々で終結する少なくとも１つのフラグメント（ターミネーターによって表される）を含む。次に、第１のポリヌクレオチドの選択された領域中の少なくともいくつかの塩基の位置および同一性を、フラグメント中に存在する標識を使用して決定する。次に、決定された塩基の位置および同一性を、第２のポリヌクレオチドからの塩基の位置および同一性と比較し、それによって、第１のポリヌクレオチドの選択された領域と第２のポリヌクレオチドの対応する領域との間のヌクレオチド配列の変異の存在および同一性を同定する。
【０００８】
（説明）
本発明は、少なくとも２つのポリヌクレオチドの間の、１つ以上のポリヌクレオチド配列の差異の、存在、位置または同一性、あるいはそれらの組み合わせを決定する方法を包含する。他の使用の中で、本発明の方法は、ヒトゲノム中に存在する単一ヌクレオチド多型性を、位置決めし得、そして同定し得る。さらに、本発明の方法は、以前には未同定であった個体間のゲノム変異、個体と集団との間のゲノム変異、および集団間のゲノム変異を発見し得る。また、本発明の方法は、集団内のゲノム変異の頻度または分布を決定し得る。さらに、本発明の方法は、集団中に見出された特定のゲノム変異と、その集団内の特定の表現型とを関係付け得る。なおさらに、本発明の方法は、個体および集団におけるゲノム変異の対立遺伝子分布を決定し得る。
【０００９】
より具体的には、本発明の方法は、２つのポリヌクレオチドの間のポリヌクレオチド配列変異についての以下のタイプの情報を提供し得る。第１に、本発明の方法は、１つ以上のさらなるポリヌクレオチドとは異なる、第１のポリヌクレオチドの選択された領域における全てのヌクレオチドの位置を同定し得る。第２に、本発明の方法は、ポリヌクレオチドにおいて、どのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されたかを同定し得る。第３に、本発明の方法は、配列中の所定の位置において生じ得る各ヌクレオチド変化を有する、ポリヌクレオチド分子の割合を決定し得る。第４に、２つの異なるポリヌクレオチドが、複数のポリヌクレオチドの差異を有する場合、本方法は、どの差異がともに生じるかについての情報を提供し得る。
【００１０】
本発明の方法は、公知の方法に対して、いくつかの組み合わせた利点を有する。一般に、本発明の方法は、より多くのタイプの情報を提供し、より広範に適用可能であり、そして実行するのがより簡単である。特に有利なことには、本発明の方法は、既知および未知の変異を、同時に同定および定量し得、そして２つのポリヌクレオチド集団の間の全ての変異の位置、同一性および頻度を決定し得る、単一の技術である。さらに、本発明の方法は、２つ以上の遺伝子変異が、個体中の同一の対立遺伝子または異なる対立遺伝子に存在するのか否かを決定し得、そして集団における変異の発生頻度を決定するために使用され得る。
【００１１】
さらに、本発明の方法は、任意の供給源由来の、任意のタイプのポリヌクレオチドについて使用され得る。ＳＮＰの位置および同一性を決定することに加え、本発明の方法を使用して、置換、欠失、挿入、複数のヌクレオチドに関する拡大および縮小、ならびに短縮した分子およびキメラ分子を含む、ポリヌクレオチド変異の存在およびタイプを決定し得る。さらに、本発明の方法は、ヘテロ接合性の損失のようなポリヌクレオチドの１つのコピーの損失に関連するか、または余分な染色体のコピーが存在する条件のようなポリヌクレオチドさらなるコピーの獲得に関連する、二倍体生物における配列の相対的なコピー数における変化を同定し得る。
【００１２】
さらに、集団での研究において、本発明の方法を使用して、複数の個体から採取されたサンプルから構成される単一のプールされたサンプルの分析によって、各ポリヌクレオチド変異の頻度を決定し得る。最後に、本発明の方法を使用して、特定のポリヌクレオチド変異の存在または非存在に依存する、ある因子の影響を受けやすいか、またはある因子に対して耐性である集団の割合を推定し得るか、あるいはプールされた細菌の培養物中のような、長時間の間に生じる集団中のポリヌクレオチド変異を検出し得る。また、本発明の方法を、自動化し得る。
【００１３】
本発明の方法は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドのサンプルを提供する工程を包含する。次に、少なくとも１つの配列変異の存在、位置または同一性を決定すべき第１のポリヌクレオチドの１つ以上の特定の領域を、選択する。次に、選択された領域を鋳型生成増幅反応に供する。好ましい実施態様において、生成された鋳型を精製し、他の増幅反応成分を取り除く。
【００１４】
次に、標識された、直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントのファミリーを、一セットのプライマーを使用するフラグメント生成反応によって、鋳型の両方の鎖から同時に、生成する。この反応によって生成されるフラグメントのファミリーは、プライマーによって隣接される両方の鋳型鎖の、可能な塩基の各々の３’末端でジデオキシターミネーターによって終結されるフラグメント（ジデオキシターミネーターによって表される）を含む。
【００１５】
最後に、第１のポリヌクレオチドから選択された鋳型の領域中の各塩基の位置および同一性を、フラグメント中に存在する標識を使用して同定する。位置および同一性を、既知の参照配列と比較するか、または本発明の方法を使用して第２のポリヌクレオチドから生成された標識された直鎖状のポリヌクレオチドのファミリーより決定される対応する情報と比較する。この比較は、第１のポリヌクレオチドと参照配列との間、または第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の、１つ以上の配列の差異の、存在、位置または同一性についての情報を生じる。本発明の方法を、ここにおいて、より詳細に考察する。
【００１６】
（１）サンプルポリヌクレオチドの供給：）
鋳型増幅の前に、目的のポリヌクレオチド（単数または複数）を、使用される、選択された増幅方法について適切な質および量で、得なければならない。いくつかの適切なサンプルが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳまたはＣｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳのような供給者から購入し得る。さらに、種々の供給源から適切なポリヌクレオチドサンプルを得るための市販のキットが、とりわけＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、ＵＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ；および５’−３’Ｐｒｉｍｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、ＵＳから購入可能である。さらに、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを含む増幅方法のための、種々の供給源からポリヌクレオチドを得るための一般的な方法が、当業者に周知である。
【００１７】
有利なことに、本発明の方法は、複数のサンプルより得られたポリヌクレオチドの同時の分析を可能にする。２つ以上のポリヌクレオチドサンプルが、分析前にプールされるならば、ポリヌクレオチドサンプルは、好ましくは、等比において混合される。
【００１８】
（２）分析のための１つ以上のポリヌクレオチドの領域の選択）
次に、少なくとも１つの配列変異の存在、位置または同一性を決定する、第１のポリヌクレオチドの１つ以上の特定の領域を選択する。本開示において使用される場合、「領域」とは、同一のポリヌクレオチド上の複数の不連続の配列を含むことが理解されるべきである。領域選択は、同一のポリヌクレオチドまたは関連するポリヌクレオチドについての既知の配列情報に基づき得るか、あるいは当業者に周知の技術を使用して配列決定された参照ポリヌクレオチドの目的の領域に基づき得る。
【００１９】
（３）選択された領域の増幅：）
一旦、領域が選択されると、その領域を、当業者に公知である技術に従って、増幅反応に供し、鋳型を生成する。本開示において使用される場合、「鋳型（単数または複数）」は、同一のポリヌクレオチド上の不連続の配列から生成された複数の鋳型を含むことが理解されるべきである。好ましい実施態様において、この増幅反応によって生成される鋳型は、鎖あたり約５０ヌクレオチドと５０，０００ヌクレオチドとの間の２本鎖の核酸鎖を含む。本開示に関して当業者に理解されるように、鋳型は、分析されるポリヌクレオチドについての任意の適切な増幅方法によって生成され得るが、特定の好ましい実施態様において、分析されるポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、増幅方法は、ＰＣＲであり、増幅されるポリヌクレオチドがＲＮＡの場合は、ＲＴ−ＰＣＲである。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを実行するための適切なキットは、とりわけＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳ；およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、ＵＳを含む多数の業者から市販されている。
【００２０】
（４）鋳型精製：）
好ましい実施態様において、増幅反応によって生成される鋳型を、当業者に公知である技術に従って、他の増幅反応成分から精製する。例えば、増幅反応混合物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロース電気泳動に供して、予想されたサイズを有する鋳型を、エタノールまたはイソプロパノール沈殿、膜精製あるいはカラム精製によって、他の増幅反応成分から精製する。精製後、鋳型を溶液（好ましくは、滅菌され、ヌクレアーゼを含まない、１８メガオームの水、または０．１×ＴＥ）中に保つべきである。
【００２１】
（５）標識された、直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントのファミリーの生成：）
次に、増幅によって生成された鋳型を使用して、一セットのプライマーを使用するフラグメント増幅反応によって、各鋳型の両方の鎖から同時に、標識された、直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントのファミリーを生成する。フラグメント生成反応は、プライマーによって隣接される鋳型鎖の全長にわたる単一のポリヌクレオチド配列を含むというよりもむしろ、増幅されるポリヌクレオチドフラグメントがプライマーによって隣接される両方の鋳型鎖由来のフラグメントのファミリーを含み、そしてこのフラグメントのファミリーが３’末端のジデオキシターミネーターによって終結し、そしてジデオキシターミネーターに対応する可能な塩基の各々で終結するということを除いて、増幅反応に類似する。
【００２２】
本開示に関して当業者に理解されるように、他の等価な手順もまた適切であるが、好ましい実施態様において、フラグメント生成反応を以下のように行う。第１に、鋳型内に存在するポリヌクレオチド配列の領域を、分析のために選択する。次に、選択された領域に隣接する一対のプライマーを合成する。好ましい実施態様において、正方向プライマーと逆方向プライマーとの対の間の、その各々の３’末端からのポリヌクレオチド長は、約５０と２０００ヌクレオチド長との間である。特に好ましい実施態様において、正方向プライマーと逆方向プライマーとの対の間の、その各々の３’末端からのポリヌクレオチド長は、約１００と１０００ヌクレオチド長との間である。
【００２３】
次に、鋳型、プライマー対、溶媒、一セットの４つの２’デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、一対の２’−３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、緩衝液、二価カチオン、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの検出可能な標識剤を含む反応混合物を作製する。この反応混合物を、０．２ｍｌまたは０．５ｍｌチューブのような適切な反応容器へ、あるいは９６ウェルのサーモサイクリング反応プレートのウェル中に添加する。この方法を使用して、多数のポリヌクレオチドを、最初の鋳型生成増幅反応においてプールされたサンプルを有するか、または鋳型生成増幅反応によって生成された鋳型をプールするかのいずれかによって、同一の物理的位置において同時に分析し得る。多数のポリヌクレオチドが、いずれかの選択肢によって同時に分析されている場合、反応混合液は、各ポリヌクレオチドに特異的な鋳型を含む。しかし、明らかに、時間を節約するために、２つのポリヌクレオチドを、別々の物理的位置において同時にもまた、分析し得る。次に、各反応に、エバポレーションバリア（例えば、ミネラルオイルまたはパラフィンワックスビーズ）をかぶせ、そして反応混合液を、適切な温度範囲で適切な時間にわたり、サイクルさせる。
【００２４】
より具体的には、反応混合物は、約１と３μｌの間の容量の、滅菌した、ヌクレアーゼを含まない、１８メガオームの水または０．１×ＴＥ緩衝液を含む溶媒中に配置される、約１ｐｇと２００ｎｇの間の、より好ましくは１００と１５０ｎｇの間の鋳型を含む。合成されたプライマーの対を、約２０μｌの全反応容量について、１反応あたり、約１と５０ピコモルとの間の最終濃度において、この反応混合液に添加する。
【００２５】
この反応混合液は、およそ等濃度の４つのｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを、さらに含む。しかし、例えば、分析される鋳型において５つより多い連続するチミジン残基が存在する場合、結果を改善するために、ｄＴＴＰの代わりに、ｄＵＴＰが有利に使用され得る。各ｄＮＴＰは、好ましくは、約１μモル濃度と１ｍモル濃度との間の濃度を有する。好ましい実施態様において、４つのｄＮＴＰの各々の濃度は、約２０と２００μモル濃度との間である。
【００２６】
反応混合物は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰ（またはｄｄＴＴＰの代わりにｄｄＵＴＰ）からなる一セットの２’−３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸ｄｄＮＴＰの２つの非ワトソン−クリック−対合塩基を、さらに含む。適切な対としては、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ：ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰが挙げられる。好ましくは、２つのｄｄＮＴＰの１つは、ピリミジンヌクレオチドでなければならず、他方は、プリンヌクレオチドでなければならない。特に好ましい実施態様において、ｄｄＮＴＰ対は、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰまたはｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰのいずれかであり、このいずれの対も、プライマーの３’末端の間に存在する鋳型配列全体についての完全な配列情報を生じる。
【００２７】
ｄｄＮＴＰの各々が、約０．０１μＭと１０ｍＭとの間の濃度で、最初は存在する。好ましい実施態様において、各ｄｄＮＴＰの濃度は、約１００μＭと５００μＭとの間である。フラグメント生成反応において使用されるｄｄＮＴＰの対の濃度は、本開示に関して当業者に理解されるように、ポリメラーゼの基質として使用されるｄｄＮＴＰの効率に依存する。
【００２８】
反応混合液はまた、反応混合液のｐＨを、約２０℃から９８℃の範囲の温度にわたって、約６．０から１０．０の範囲のｐＨにわたって維持するのに十分な緩衝能力を有する緩衝液を含む。好ましい実施態様において、緩衝液は、約１０ｍＭと５００ｍＭとの間の、好ましくは約５０ｍＭと３００ｍＭとの間の濃度のＴｒｉｓである。
【００２９】
反応混合液は、少なくとも１つの二価カチオンを、さらに含む。好ましい実施態様において、二価カチオンは、約０．５ｍＭと１０ｍＭとの間の最終濃度の、より好ましくは約１．５ｍＭと３．０ｍＭとの間の最終濃度の塩化マグネシウム塩である。約０．１ｍＭと２０ｍＭとの間の濃度の塩化マグネシウム塩もまた、適切であるとして使用され得る。
【００３０】
反応混合液は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼをさらに含む。選択されたポリメラーゼは、好ましくは、熱安定性であるべきであり、最小のエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ分解活性を有するべきであり、そして合成中のＤＮＡ鎖中へのｄｄＮＴＰの取り込みについての良好な効率および忠実度を有するべきである。ポリメラーゼの適切な濃度は、反応あたり約０．１と１００単位との間であり、より好ましくは反応あたり約１と１０単位との間の濃度である。適切なポリメラーゼは、とりわけＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳおよびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。
【００３１】
好ましい実施態様において、反応混合液は、収量または効率を改善し、ポリメラーゼの安定性を増強し、そしてアーチファクトを軽減するための、さらなる物質を含む。例えば、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）または７−デアザＧＴＰのような他のｄＮＴＰまたは補充されるｄＮＴＰを、ｄＧＴＰの代わりに、約０．１ｍＭと２０ｍＭとの間の濃度で使用して、フラグメント生成反応において生じ得るコンプレッション、どもり（ｓｔｕｔｔｅｒ）または停止を軽減し得る。また、例えば、界面活性剤および還元剤を添加して、ポリメラーゼを安定化し得る。さらに、グリセロール、ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、アセトニトリル、およびイソプロパノールのような有機溶媒を反応混合液に添加して、プライマーのアニーリングのストリンジェンシーを改善し得る。存在する場合、有機溶媒は、好ましくは、容量で約０．１％と２０％との間の濃度を有する。
【００３２】
本開示に関して理解されるように、上記に考察した反応混合液成分に加えて、フラグメント生成反応によって生成される反応産物が、標識されたプライマー、標識されたジデオキシターミネーターまたは標識された終結しないデオキシヌクレオチド、あるいはこれらの組み合わせの取り込みによって（分析されるサンプルの数およびタイプ、ならびにサンプルがプールされた供給源に由来するか否かに依存する）、少なくとも１つの検出可能な標識を含むことが必須である。標識が本方法に適合可能であり、多数の標識の検出が標識のお互いの識別を可能にし、そして反応産物が標識によって測定され得る限り、他のタイプの標識が適切であるが、標識のタイプの中で、蛍光標識、蛍光エネルギー移動標識、ルミネッセンス標識、化学ルミネッセンス標識、リン光標識およびフォトルミネッセンス標識が、本発明の方法の実行のために適切である。好ましい実施態様において、標識は、蛍光標識であるか、または、蛍光エネルギー移動標識のいずれかである。
【００３３】
蛍光色素のような広範な種々の蛍光標識が、この方法における使用のために適切である。適切な蛍光標識は、標識剤へのその取り込みについて化学的に安定であるべきであり、そしてこの方法の実行の間の分解に耐性であるべきである。さらに、蛍光標識は、反応産物が分析される場合、反応産物の移動に対して、ほんのわずかの影響のみを有するべきである。さらに、蛍光標識は、励起および発光について、良好な量子効率を有するべきであり、そして、そのそれぞれの発光の間で最低限５ナノメートルを有するその発光波長において、お互いにスペクトル分離され得る場合、励起波長と発光波長との間のスペクトル分離は、少なくとも１０ナノメートルであるべきである。励起波長は、好ましくは、約２６０ｎｍと２０００ｎｍとの間であり、そして発光波長は、好ましくは、約２８０ｎｍと２５００ｎｍとの間である。さらに、蛍光標識は、好ましくは、プライマー、ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰに付着され得るべきである。
【００３４】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）およびその誘導体、シアニンおよびその誘導体、およびユーロピウムキレート剤のファミリー由来の蛍光化合物である。適切な蛍光色素標識が、とりわけＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ．ＵＳおよびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳから市販されている。同様に、適切なエネルギー移動対（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＢｉｇ  ＤｙｅｓTM）が、市販されている。さらに、付着されたエネルギー移動対を有する注文生産のプライマーが、とりわけ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から得られ得る。
【００３５】
ポリメラーゼがプライマーとともに機能することを可能にするように、そのプライマーの３’ＯＨ基が曝露されたままである限り、反応混合液中で使用されるプライマーを、１つ以上の標識を用いて、その５’末端においてか、または内部において標識し得る。正方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方が、同一の標識を用いて標識され得るが、正方向プライマーおよび逆方向プライマーが、お互いに区別され得る異なる標識を用いて標識されることが好ましい。
【００３６】
本開示に関して、当業者に理解されるように、適切な標識されたプライマーを、任意のいくつかの方法によって調製し得るか、または購入し得る。例えば、蛍光ホスホロアミダイトを使用して、プライマーの５’末端を標識し得るか、またはプライマーを内部標識し得るかのいずれかである。１級アミンを、標準的なＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて標識し得るか、または１級アミンと反応性の他種の蛍光色素を、プライマー合成時にプライマー中に導入し得る。さらに、スルフヒドリル基のような他の反応性の種を、プライマー中に導入し、そして適切な反応性を有する蛍光色素と結合し得る。本方法における使用のための色素標識したプライマーの代表的な濃度は、２０μｌ反応容量について約１ピコモルと５０ピコモルとの間である。
【００３７】
反応混合液中で使用されるジデオキシターミネーター三リン酸を標識する。標識されたｄｄＮＴＰは、フラグメント生成反応におけるポリヌクレオチド鎖合成を終結し、そして反応産物において鎖終結が生じる塩基の同定を可能にする。
【００３８】
ｄｄＮＴＰ対の各メンバーは、異なって標識されるべきであり（例えば、異なる蛍光団を有する）、その結果ｄｄＮＴＰ対の各メンバーが、別々に検出、識別および測定され得る。さらに、標識されたｄｄＮＴＰ対の各メンバー（例えば、ｄｄＡＴＰおよびｄｄＣＴＰ）は、実行される各フラグメント生成反応について異なって標識されたサブセットを有し得（例えば、それぞれｘ１ｄｄＡ、ｘ２ｄｄＡ．．．ｘｎｄｄＡ、およびｙ１ｄｄＣ、ｙ２ｄｄＣ．．．ｙｎｄｄＣ、ここでｘ１、ｘ２．．．ｘｎおよびｙ１、ｙ２．．．ｙｎの各々は、対応するｄｄＮＴＰに結合した異なる標識を示す）、反応産物のさらなる同定を可能にする。適切な標識としては、とりわけフルオレセイン、ローダミン１１０、ローダミン６Ｇおよびカルボキシローダミンが挙げられる。適切な標識されたｄｄＮＴＰは、とりわけＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｒｐ．から市販されている。
【００３９】
好ましい実施態様において、本方法における使用のための蛍光標識されたｄｄＮＴＰの濃度は、約１０μＭと１ｍＭとの間の、より好ましくは約１０μＭと３００μＭとの間である。しかし、ｄｄＮＴＰの対の標識されたｄｄＮＴＰの各タイプの濃度は、お互いに等しい必要はない。むしろ、濃度は、反応産物の長さ、シグナル強度および利用されるポリメラーゼについての基質としてのそれぞれのｄｄＮＴＰの効率について、当業者に公知の技術に従って、好ましくは最適化される。
【００４０】
さらに、反応混合液中で使用されるデオキシヌクレオチド三リン酸を同様に標識して、反応産物を生成した反応混合液を同定し得る。このことは、異なる識別可能な標識を用いて異なるフラグメント生成反応において使用される全ての標識されたｄＮＴＰを標識しながら、同一の標識を用いて単一のフラグメント生成反応において使用される全ての標識されたｄＮＴＰを標識することによって、達成される。使用される場合、標識されたｄＮＴＰは、ｄＮＴＰの全量のある部分のみを構成する。使用される場合、標識されたｄＮＴＰは、好ましくは、標識されていないｄＮＴＰの約１％から１０％の濃度の割合で存在する。好ましい実施態様において、ｄＮＴＰは、蛍光標識される。
【００４１】
一旦、反応混合液を、適切な容器中に配置すると、当業者に公知の技術（例えば、温度のサイクルを使用する標準的なＰＣＲ技術）に従って、フラグメント生成反応を達成する。このフラグメント生成反応は、プライマーを越えた全ての位置において３’末端でのジデオキシターミネーターによって終結する標識された相補的ＤＮＡ鎖のファミリーを含む標識された一セットの反応産物を生成する（鋳型鎖中の１つのヌクレオチドは、ターミネーター対の１つに対応する塩基を含む）。
【００４２】
例示のみのために、サイクリング条件を達成するために必要とされる代表的な時間および温度は、鋳型鎖の融解のための、１０秒〜２分間の、９０℃〜９８℃の範囲の温度；プライマーを、その対応する標的鎖とアニールするための、１秒〜６０秒の範囲の間隔の４０℃〜６０℃の温度範囲；ならびにＤＮＡポリメラーゼの作用によってプライマーを伸張するための、３０秒〜１０分の範囲の間隔の５０℃〜７５℃の温度範囲。これらのサイクルを、十分な量の検出可能に標識された反応産物を得るために十分な回数（一般に、約１０回と６０回との間）繰り返す。好ましい実施態様において、フラグメント生成反応を、９５℃で３０秒、５０℃で５秒、および６０℃で４分での２５サイクルを使用して行う。しかし、本開示に関して当業者に理解されるように、最適な時間および温度は、プライマー長、プライマー配列、分析されるポリヌクレオチド配列および利用されるＤＮＡポリメラーゼに依存する。
【００４３】
（６）反応産物の分析：）
鋳型の両方の鎖から、標識された、直鎖状のポリヌクレオチドフラグメントのファミリーを生成した後、第１のポリヌクレオチドから生成されたこれらの標識された反応産物を、標識を使用して同定し、そして同一性を既知の参照配列と比較するか、または同一性を第２のポリヌクレオチドから生成された標識された反応産物と比較して、第１のポリヌクレオチドと参照配列との間、あるいは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の配列変異を決定する。このことは、以下のように達成される。
【００４４】
第１に、好ましくは、標識された反応産物を、当業者に周知である方法によって（例えば、エタノール沈殿による）、他の反応混合液成分から精製する。次に、精製された標識された反応産物を、適切な指示を用いて、適切なプロセスによって分析する。そのような分析のために使用されるプロセスおよび指示は、フラグメント生成反応方法において利用される標識を検出し得、そして標識間を識別し得なければならず、そして異なる長さの一本鎖ＤＮＡの鎖の間の１塩基の差異を識別し得、そして分解し得なければならない。
【００４５】
例えば、精製され標識された反応産物を、適切なローディング剤と組み合わせ得、次に、標準的なポリヌクレオチド配列決定の条件と類似の条件下での変性電気泳動を使用して分析し得る。要約すると、反応産物を、水または他の適切な緩衝液中に溶解し、そしてホルムアミドと混合する。次に、溶液を９５℃で約１〜５分間加熱することによって変性し、そして迅速に４℃まで冷却する。次に、変性した反応産物を、適切な器械にロードして、そして変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動または変性キャピラリー電気泳動あるいは他の適切な方法を使用して分析する。ここで、使用される器械は、反応産物における標識を検出しそして識別し得る。電気泳動に使用される分離マトリクスは、一本鎖ＤＮＡまたは変性ＤＮＡの一塩基分解をし得るものでなければならない。適切な器械が、とりわけＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、ＬｉＣｏｒ、Ｉｎｃ．、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳおよびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。さらに、適切な注文生産の器械もまた（例えば、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ、ＷＩ、ＵＳからのＳＣＡＦＵＤ）入手可能である。両方のタイプの器械は、蛍光反応産物の検出によって生じるパターンの分析のため、および検出および分析をされる各サンプルについて生じるデータを比較するためのソフトウェアを有する。
【００４６】
一旦、標識された反応産物が分析されると、これらは、参照配列、または分析される第２のポリヌクレオチド由来の類似の反応産物と比較され、そして第１のポリヌクレオチドと参照配列との間、あるいは第１のポリヌクレオチドと第２の分析されるポリヌクレオチドとの間の変異を決定し得る。さらに、複数の分析の結果、ならびにサンプルの供給源および表現型を、さらなる分析および相関関係のためのデータベース中の蓄積する。さらに、本開示に関して当業者に理解されるように、２つより多いポリヌクレオチド配列を、本方法を使用して、単一の反応混合液中で同時に分析し得る。
【００４７】
（７）反応産物中へ取り込まれた標識の解釈：）
本発明の方法によって産生される標識された反応産物の好ましい検出様式は、この方法において使用される標識を検出して、標識間を識別する。この標識は、２つの異なる機能を提供する。
【００４８】
第１に、供給源識別標識を使用して、異なる、識別可能に標識されたプライマーまたは標識された終結しないｄＮＴＰあるいはその両方を反応産物中に取り込むことによって、反応産物によって示される配列の供給源を同定する（ここで同一の標識は、単一の供給源またはプール由来の反応産物中に取り込まれる）。次に、これらの標識からのシグナルの同定は、反応産物配列が由来する供給源またはプールの決定を可能にする。
【００４９】
第２に、供給源識別標識と異なる標識である塩基同定標識を使用して、異なる、識別可能に標識されたジデオキシターミネーターの反応産物への取り込みによって、反応産物の末端塩基を同定する。
【００５０】
これら２つのタイプの標識の使用は、以下の例を参照してより良好に理解される。第１の例において、フラグメント生成反応において使用される正方向プライマーは、赤色標識（Ｒ）を有し、そしてフラグメント生成反応において使用される逆方向プライマーは、青色標識（Ｂ）を有する。さらに、ジデオキシターミネーターの対のｄｄＧＴＰメンバーは、緑色標識（Ｇ）を有し、そしてジデオキシターミネーターの対のｄｄＴＴＰメンバーは、黄色標識（Ｙ）を有する。さらに、終結しないｄＣＴＰの一部は、第１のサンプル由来の鋳型を含むフラグメント生成反応についてオレンジ色の標識（Ｏ）を有し、そして第２のサンプル由来の鋳型を含むフラグメント生成反応について紫色の標識（Ｐ）を有する。表１は、２つのフラグメント生成反応の予想される結果を提供し、そしてこの例において予測される標識される反応産物の分布を示す。
【００５１】
【表１】
0003949378.tif 000002
従って、上記の例から理解され得るように、末端塩基の位置を鋳型鎖の長さの知識と組み合わせた反応産物の長さの分析から同定し得る一方で、各反応産物を、そのサンプル供給源、鋳型鎖および終結する塩基について同定し得る。上記の例において、その中にオレンジ色、赤色、および緑色を有するピークは、それらがオレンジ色を含むために第１のサンプル由来の反応産物より生じ、それらが赤色を含むために鋳型鎖を含む正方向プライマー由来であり、そしてそれらが緑色を含むために塩基Ｇによって各々が終結する。
【００５２】
各ピークを生成する反応産物の標識およびお互いのその相対的位置を考慮することによって、鋳型の正方向鎖の配列および鋳型の逆方向鎖の配列の両方を決定し得る。反応産物が由来するサンプルを、その標識によって同定し得、そして第１のサンプル由来のポリヌクレオチドと第２のサンプル由来のポリヌクレオチドとの間の配列変異を決定し得る。さらに、２つのサンプル由来の標識された反応産物より生成される相対的なピークの強度を分析することにより、変異の発生の相対的頻度の推定値を、決定し得る。
【００５３】
第２の例において、単一の対立遺伝子上または２つの対立遺伝子上のポリヌクレオチド変異の位置を決定する。この目的のために、フラグメント生成反応を、全く標識していないｄＮＴＰを用いて行うが、フラグメント生成反応において使用される正方向プライマーは、赤色標識（Ｒ）を有し、そしてフラグメント生成反応において使用される逆方向プライマーは、青色標識（Ｂ）を有する。さらに、ジデオキシターミネーターの対のｄｄＧＴＰメンバーは、緑色標識（Ｇ）を有し、そしてジデオキシターミネーターの対のｄｄＴＴＰメンバーは、黄色標識（Ｙ）を有する。表２は、予想される結果を提供し、そしてこの例において予測される標識される反応産物の分布を示す。
【００５４】
【表２】
0003949378.tif 000003
既知の配列の参照により、種々の反応産物由来のピークが、正方向鎖または逆方向鎖のいずれに由来するか決定され得る。次に、正方向鎖および逆方向鎖から生じる結果としての産物、ならびにその相対強度および色を比較すると、変異が１つの対立遺伝子に存在するか、または変異が２つの対立遺伝子に存在するかの決定が可能となる。
【００５５】
（実施例１：本発明の方法を使用して、個体由来の単一のＤＮＡサンプルからＳＮＰを位置決めおよび同定する）
本発明の方法を使用して、ヒト成長ホルモン転写活性化因子（ＧＨＤＴＡ）およびヒト成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子の両方を含むＤＮＡ領域中の、２つの異なる単一ヌクレオチド多型性を、位置および同一性を決定した。この方法を、２人の異なる個人由来のＤＮＡにおいて別々に行った。１人の個体は、遺伝子座１および２の両方において、ホモ接合型Ａであった。他の個体は、遺伝子座１においてホモ接合型Ｇであり、遺伝子座２においてホモ接合型Ｔであった。この方法を以下のように行った。
【００５６】
第１に、各個体からの、ＧＨＤＴＡおよびＧＨ１遺伝子を含む領域にわたる２．７ｋｂの鋳型を、標準的な方法によるＰＣＲを使用して、別々に調製した。次に、フラグメント生成反応を行った。反応混合液は、蛍光標識した２’−３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸ターミネーター対を含んだ。２つの反応を、各サンプルについて行った。１つの反応を、対ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰ（「Ａ／Ｃ反応」）を使用して行い、そして別の反応を、対ｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰ（「Ｇ／Ｔ反応」）を使用して行った。
【００５７】
各反応混合液は、製造業者の指示に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅTM  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔからの成分を含んだ。この成分は、以下の成分の１／１０量を含んだ：２０μｌの５×反応緩衝液、１０μｌのｄＮＴＰ混合液、２０μｌの脱イオン水、１０μｌのＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅTM、１２０〜１５０ｎｇの鋳型、ならびに２０ピコモルの各正方向プライマーおよび逆方向プライマー（プライマーの５’末端の間の鋳型の２７２塩基対配列におよんだ）。Ａ／Ｃ反応はまた、１μｌのローダミン６Ｇ標識したｄｄＡＴＰおよび１μｌのＲＯＸ標識したｄｄＣＴＰを含んだ。Ｇ／Ｔ反応はまた、１μｌのローダミン１１０標識したｄｄＧＴＰおよび１μｌのＴＡＭＲＡ標識したｄｄＴＴＰを含んだ。
【００５８】
ワックスビーズオーバーレイを使用して、サーモサイクリングの間のエバポレーションを防いだ。フラグメント生成反応において使用されたサイクルは、９６℃３．５分間の最初の変性、５０℃１５秒間のアニーリング、および６０℃４分間の伸張から構成された。次に、６０℃１０分間の最後の伸張を有する、９６℃３０秒間、５０℃１５秒間、および６０℃４分間からなるさらなる３０サイクルを行った。
【００５９】
サイクリングの後、反応混合液を４℃まで冷却した。ワックスオーバーレイを取り除き、そして反応産物を１．５ｍｌチューブに移した。次に、ＤＮＡを、２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および６８μｌの−２０℃の１００％エタノールを添加することによって、沈殿した。そのチューブを−２０℃で１０分間冷却し、次に５分間１３，５００×ｇで遠心分離した。
【００６０】
次に、エタノールをペレットから吸い出し、そのペレットを、３００μｌの−２０℃の８０％エタノールで洗浄し、そして５分間１３，５００×ｇで遠心分離した。エタノールを吸い出し、そのペレットを、手短に乾燥し、次に、４μｌの脱イオン水中に再懸濁した。Ａ／ＣおよびＧ／Ｔ組について、それぞれＴＡＭＲＡまたはＲＯＸで標識した２μｌの内部標準ＭａｐＭａｒｋｅｒTM４００（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｕｒｆｒｅｅｓｂｏｒｏ、ＴＮ）を添加した。サンプルをボルテックスし、次に、３７℃で１０分間加熱し、ペレットを完全に溶解した。サンプルを手短に遠心分離し、反応産物をチューブの底部に運んだ。
【００６１】
反応産物を含む２μｌの各サンプルを、０．５ｍｌ分析チューブ中の１０μｌの脱イオンホルムアミドに添加し、そして隔壁でふたをした。このチューブをボルテックスして、手短に遠心分離した。次に、このサンプルを９５℃で５分間変性して、そして迅速に４℃まで冷却した。
【００６２】
次に、反応産物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、４１ｃｍの非コートカラムおよびＰＯＰ４ゲルを用いて分析した。分析のための実行モジュールは、５ｋＶでの３０秒間の動電的注入、および色素のセットのために適切なスペクトルＣＣＤモジュールを使用する１５ｋＶ、６０℃、２４分間の電気泳動を包含した。これらの条件を利用して、蛍光標識した反応産物を分解した。データを、製造業者の指示に従って、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＧｅｎｅＳｃａｎ７分析ソフトウェアを使用して処理した。Ａ／Ｃ反応について、緑色（ｄｄＡローダミン６Ｇ）および赤色（ｄｄＣ  ＲＯＸ）に対応するチャンネルを、サンプルデータのために利用し、そして黄色（ＴＡＭＲＡ）チャンネルを内部標準のために利用した。Ｇ／Ｔ反応について、青色（ｄｄＧローダミン１１０）および黄色ｄｄＴＴＰ（ＴＡＭＲＡ）チャンネルを、サンプルデータのために利用し、そして赤色（ＲＯＸ）チャンネルを、内部標準のために利用した。
【００６３】
各反応について得られた結果を、プライマーによって隣接される領域中において、個体の各々について既知のＤＮＡ配列と比較した。この比較は、ＳＮＰの適切な位置と同一性を実証した。このことは、本発明の方法を使用して、個体由来のＤＮＡサンプルから、複数のＳＮＰを位置決めおよび同定し得ることを実証する。
【００６４】
（実施例ＩＩ：本発明の方法を使用して、プールした鋳型混合物由来のＳＮＰ、およびプールしたゲノムＤＮＡサンプル由来のＳＮＰを位置決めおよび同定する）
本発明の方法をさらに使用して、プールした鋳型の混合物中のＳＮＰ、およびプールしたゲノムＤＮＡの混合物中のＳＮＰを、位置決めおよび同定した。第１に、実施例Ｉに開示されるように各々を得た、２．７ｋｂ鋳型のプールした混合物を、以下の鋳型比における１５０ｎｇ／μｌの総ＤＮＡを使用して作製した：１：０；４０：１；２０：１；１０：１；１：１；１：１０；１：２０；１：４０；０：１。これらプールした鋳型混合物の各々を、さらに実施例Ｉにおいて開示されるように、本発明の方法に供した。１つの反応を、ｄｄＡＴＰ：ｄｄＣＴＰターミネーター対を使用して実行し、そして別の反応を、ｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰターミネーター対を使用して実行した。反応産物を、実施例Ｉのように分析した。
【００６５】
結果は、たとえ反応混合液がプールした鋳型を含んでいても、そしてたとえ鋳型が、他の対立遺伝子を有する鋳型を用いて４０分の１まで希釈されても、本発明の方法によって、ＳＮＰの位置および同一性が決定されたことを実証した。さらに、各対立遺伝子に対応するピークの相対的強度は、反応混合液中の各対立遺伝子の比率を正確に表した。このことは、プールした鋳型混合液中のＳＮＰの頻度を、本発明の方法を使用して決定し得ることを示す。
【００６６】
第２に、異なるＳＮＰ遺伝子型を有する実施例Ｉにおける同一の２人の個体由来のゲノムＤＮＡの混合物を、１：０；４０：１；２０：１；１０：１；１：１；１：１０；１：２０；１：４０；０：１の比でプールした。次に、このプールしたゲノムＤＮＡを使用して、２．７ｋｂの鋳型を得た。プライマーを使用して、そしてｄｄＧＴＰ：ｄｄＴＴＰターミネーター対を使用し、これらすべてが異なり、明確に同定可能な蛍光色素を用いて蛍光タグ化されることを除いて、実施例Ｉにおいて開示される本発明の方法に従い、鋳型の１２０ｎｇの総アリコートを、精製しそして処理した。
【００６７】
結果は、２つの鋳型の各々について明確に同定可能なパターンを生じた。２つの色を付けたフラグメントが現れ、そしてそのシグナル強度は、プールした混合物中で見出されたＳＮＰの比率とともに変化する。すなわち、ＳＮＰ１（Ｇ）対立遺伝子とＳＮＰ２（Ｔ）対立遺伝子との比率またはＳＮＰ１（Ａ）対立遺伝子とＳＮＰ２（Ａ）対立遺伝子との比率が増加したか、または減少した場合、対応するフラグメントにおけるターミネーターに関連するシグナルもまた同様に、増加または減少した。
【００６８】
放射標識によって生成される着色していないｄｄＦパターンと対照的に、このサンプルは、本発明の方法から生じるパターンが、異なるＳＮＰを容易に位置決めおよび同定し得ることを実証する。なぜなら、このターミネーターは、その色の差異によって選択的に同定され得る異なる蛍光色素が付けられているからである。さらに、たとえ鋳型がプールされていても、またはたとえＳＮＰを含むプールされた鋳型を生成するために、ゲノムＤＮＡのプールが使用されても、そしてたとえＳＮＰを含む鋳型が、ＳＮＰを含まない鋳型を用いて１：４０まで希釈されたとしても、ＳＮＰより生じる反応産物は、容易に同定された。
【００６９】
本発明は、特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に考察されたが、他の実施態様が可能である。従って、添付の特許請求の範囲および趣旨は、本明細書に含まれる好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。