(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）の蛋白質の有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと95％以上の相同性を有し、かつＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
ＤＮＡがラン藻(Cyanobacteria)に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項２または３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
ラン藻に属する微生物由来のＤＮＡがシネコシスティス(Synecocystis)属に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項２〜４いずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２〜５いずれかに記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項８】
宿主細胞がエシェリヒア・コリである、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７または８記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
請求項７または８記載の形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルマンノサミンを採取することを特徴とするＮ−アセチルマンノサミンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの製造法、および該形質転換体を用いたＮ−アセチルマンノサミンの製造法に関する。Ｎ−アセチルマンノサミンはＮ−アセチルノイラミン酸生合成の前駆体として重要な化合物である。
背景技術
Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼに関してはブタやラットにその存在が知られており、ブタ由来の酵素についてはその性質が調べられている〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７，３３６３（１９７０）〕。また、その遺伝子に関してはブタ由来の遺伝子〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６２９４（１９９６）〕が取得されている。しかしながら今まで、微生物におけるその活性については知られていない。
ラン藻の１種であるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）においては、そのゲノムの全配列は決定されている〔ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３，１０９（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，６３（１９９８）〕が、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子は特定されていない。
発明の開示
本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質を用いたＮ−アセチルマンノサミンの製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ゲノムＤＮＡの全配列が決定されているＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）の配列情報からブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼのアミノ酸配列と相同性のある配列を検索した結果、これまで特定されていなかった新規Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを微生物から初めて見出し、該ＤＮＡを取得することにより、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）  以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）（ａ）の蛋白質の有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
上記の１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
（２）  上記（１）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）  以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなるＤＮＡ：
（ａ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（４）  ＤＮＡがラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する微生物由来のＤＮＡである、上記（２）または（３）記載のＤＮＡ。
（５）  ラン藻に属する微生物由来のＤＮＡがシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属に属する微生物由来のＤＮＡである、上記（２）〜（４）いずれかに記載のＤＮＡ。
（６）  上記（２）〜（５）いずれかに記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（７）  上記（６）記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（８）  形質転換体がエシェリヒア・コリである、上記（７）記載の形質転換体。
（９）  上記（７）または（８）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
（１０）  上記（７）または（８）記載の形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルマンノサミンを採取することを特徴とするＮ−アセチルマンノサミンの製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のＤＮＡの調製
（１）データベース上での遺伝子の特定
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）のゲノムは全て決定されており〔ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３，１０９（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，６３（１９９８）〕、ＣｙａｎｏＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ／）などのデータベースにより相同性検索が可能である。
相同性検索に用いるＱｕｅｒｙとしてはＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子の配列であればいかなるものも用いることができるが、具体的には、ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼのアミノ酸配列〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６２９４（１９９６）〕などをあげることができる。
検索方法は利用できるものはどのような方法でも構わないが、ＧｅｎｂａｎｋあるいはＣｙａｎｏＢａｓｅでのホモロジー検索などを例示することができる。
（２）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡはラン藻に属する微生物より調製することができる。ラン藻に属する微生物としては、例えばシネコシスティスをあげることができ、具体的にはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株等をあげることができる。
ラン藻に属する微生物を公知の方法〔例えば、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１１，１（１９７９）〕により培養する。
培養後、公知の方法〔例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
本発明のＤＮＡを含む断片の取得は、上記（１）で特定されたゲノムの塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により行うことができる。
また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼイション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）およびｐＮｏＴＡＴ７（５プライム→３プライム社製）などをあげることができる。
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号２で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミドを保有する大腸菌として、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＹＰ１６をあげることができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
大腸菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
［２］本発明の蛋白質の調製
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］に記載の方法により取得した本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ  Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン社製〕、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］Ｎ−アセチルマンノサミンの調製
上記［２］記載の培養により得られた形質転換体の培養液および該培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを製造することができる。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
Ｎ−アセチルマンノサミンの生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１ｍモルのＮ−アセチルマンノサミンを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
Ｎ−アセチルマンノサミンの生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
Ｎ−アセチルマンノサミンの生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルマンノサミンの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
Ｎ−アセチルマンノサミンの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＡＴＰ、ＭｇＣｌ２等の無機塩等を添加することができる。
水性媒体中に生成したＮ−アセチルマンノサミンの定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）〕。
反応液中に生成したＮ−アセチルマンノサミンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  データベース上での相同性検索
ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼのアミノ酸配列〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６２９４（１９９６）〕をＱｕｅｒｙとして、ＧｅｎｂａｎｋのＢｌａｓｔ  ＳｅａｒｃｈおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）のゲノム配列のデータベースであるＣｙａｎｏＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ／）において相同検索（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈ）を行った。
その結果、該アミノ酸配列は、配列番号１記載のアミノ酸配列および配列番号２記載の塩基配列を有するｒｅｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎとの記載のあるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）由来の配列（ｓｌｒ１９７５）と高い相同性を示すことが明らかとなった。
実施例２  シネコシスティス由来の遺伝子発現株の造成
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）をＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１１  １（１９７９）に記載の方法で培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号３および４に記載のＤＮＡを用いて、実施例１で選択された遺伝子を含むＤＮＡ断片を、下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃−１分、４２℃−２分、７２℃−３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＹＰ１６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
実施例３．Ｎ−アセチルグルコサミンの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＹＰ１６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し３０℃で４時間培養した後、４０℃で３時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
終濃度６０ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、１００ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、４０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎ−アセチルマンノサミン、４ｍｍｏｌ／ｌ  ＡＴＰ、０．４％ナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に１３．７ｍｍｏｌ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンが生成蓄積していることを確認した。
ベクターのみを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＰＡＣ３１株ではＮ−アセチルグルコサミンの生成は認められなかった。
実施例４．Ｎ−アセチルマンノサミンの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＹＰ１６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。
該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で４時間培養した後、４０℃で３時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
終濃度６０ｍｇ／ｍｌ該湿菌体、１００ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、５００ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎ−アセチルグルコサミン、４ｍｍｏｌ／ｌ  ＡＴＰ、０．４％ナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に７０ｍｍｏｌ／ｌのＮ−アセチルマンノサミンが生成蓄積していることを確認した。
ベクターのみを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＰＡＣ３１株ではＮ−アセチルグルコサミンの生成は認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを遺伝子組換え手法により大量に生産することが可能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にＮ−アセチルマンノサミンを製造できる。
配列表フリーテキスト
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  １はＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ発現プラスミドｐＹＰ１６の造成工程を示す。
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー
ｓｌｒ１９７５：Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子
【図１】
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