(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に成膜された金属薄膜上に検出目標であるターゲット生体成分に対して吸着反応性を示す生体成分をプローブ生体成分膜として成膜し、このプローブ生体成分膜に対して検体中に含有されるターゲット生体成分を吸着反応させることで、吸着反応が発生した部位のレジスト効果を高め、次いでエッチングを実施し、残留した吸着反応が発生した部位を検知することによりターゲット生体成分の検出を行うことを特徴とする生体成分検出方法。
【請求項２】
プローブ生体成分膜の生体成分が、ターゲット生体成分に対する抗体、もしくは、ターゲット生体成分に対する抗体を含有する生体成分であって、プローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分との吸着反応が、抗原−抗体反応であることを特徴とする請求項１記載の生体成分検出方法。
【請求項３】
プローブ生体成分膜の生体成分が特定の塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドであり、ターゲット生体成分が一本鎖ヌクレオチドであり、プローブ生体成分膜とターゲット生体成分との吸着反応がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の生体成分検出方法。
【請求項４】
基板が、金属基板、無機質基板、もしくは樹脂基板あるいはそれらの複合基板のいずれかであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの生体成分検出手法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、生体成分検出方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、特定生体成分の検出、特に、遺伝子の特定塩基配列の検出を行う生体成分検出方法に関するものであり、ハイブリダイゼーション、または、抗原−抗体反応により検出したい生体成分に対して特別な標識を施すことなく、簡便に高感度に検出することを実現する、新しい生体成分検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明の課題】
従来、タンパク質、脂質、および、酵素ＤＮＡなどの生体成分を検出する方法においては、抗原−抗体反応、ＤＮＡハイブリダイゼーションといった生体分子における特異的な反応が利用されている。
【０００３】
このような反応の利用において、従来では、放射性同位体元素を生体成分の標識剤とする方法が採られていたが、この手法は、高感度ではあるが、被爆汚染や廃棄物処理などの問題があり、今日ではその利用対象は限定されている。
【０００４】
その代替方法として蛍光色素や電気化学活性物質を利用した標識法が提案され、広く利用されている。この方法では、抗原−抗体反応やＤＮＡハイブリダイゼーションによって生じる蛍光、化学発光、電気化学応答の変化を検出する測定手法が一般となっている。
【０００５】
例えば、ビオチン標識したデオキシヌクレオチドをニックトランスレーションおよびランダムプライマー法等の方法によりヌクレオチドにビオチン標識し、ハイブリダイズさせたときにアルカリフオスフアターゼで標識したアビジンとヌクレオチドのビオチンが結合し、アルカリフォスファターゼの発色により特定塩基配列の遺伝子を検出している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ、１３巻、７４５頁、１９８５年）。また、ビオチン標識した抗体と発色性のユーロピウム錯体を用いて、ガラス基板上におけるタンパク質の検出が行われている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６巻、１４９７頁、１９９０年）。
【０００６】
このような発色検出には、ビオチン標識の他に、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アロフイコシアニン等の蛍光色素を直接生体分子に標識する方法もあり、放射性同位体元素を用いる方法に代わり、高感度に生体成分の検出を実現している。
【０００７】
また、電気化学活性物質を標識することで、電極表面に固定された生体分子の反応を電気化学的に検出する方法も提案されている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１９巻１０４６７頁、１９９７年、または、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２巻、１３３４頁、２０００年）。
【０００８】
近年、特に遺伝子解析の分野において、以上の方法の応用より、チップ上に細かくヌクレオチドを配列させたＤＮＡマイクロアレイが開発され、アフィメトリックス社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐやナノゲン社のＮａｎｏＣｈｉｐに代表される高処理能力を有する遺伝子解析装置が市販されるようになった。蛋白などを対象としたプロテインチップに関する技術開発は、ＤＮＡマイクロアレイに対して遅れをとっているものの、スライドガラス上に牛血清アルブミンをコーティングすることで１万を越えるタンパク質をスポットし検出するなどの様々な技術開発が行われている（Ｓｃｅｉｎｃｅ、２８９巻、１７６０頁、２０００年）。
【０００９】
しかしながら、これらの従来法での検出においては、検体の生体分子に対し、何らかの方法により、蛍光色素を標識しなくてはならない。これは、生体から抽出した微量の貴重な試料においても同様であり、測定者の高い技量が要求される。また、生体分子の標識、ハイブリダイゼーションもしくは抗原−抗体反応、および、未反応の標識生体分子の洗浄からなる一連の操作は極めて複雑であり、簡便な手法の開発が求められていた。さらに、検体試料自身に蛍光色素を標識しているため、未反応試料の洗浄不十分がバックグラウンドノイズの原因となること、さらには、蛍光の光消光による測定誤差などが解決すべき課題として残されている。
【００１０】
そこで、これらの蛍光色素標識による技術的課題を解決するため、色素標識をしない測定方法が提案されている。
【００１１】
ひとつには、貴金属薄膜基板上に生体分子を固定化し、抗原一抗体反応やハイブリダイゼーションを表面プラズモン共鳴により検出する方法がある。この方法においては、抗原一抗体反応やハイブリダイゼーションにより変化する貴金属薄膜上での生体分子の膜厚変化を、表明プラズモン共鳴の変化として検出する（例えば、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２６巻、５４１頁、１９９７年、または、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５１巻、４１頁、２０００年）。表面プラズモン共鳴を利用した検出方法を利用した製品としては、ビアコア社からＢＩＡＣＯＲＥが、また、日本レーザー電子社からＳＰＲ−ＭＡＣＳが市販されている。
【００１２】
また、貴金属微粒子存在下でのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成で生じる貴金属微粒子の重合反応を分光学的により測定する手法（例えば、特開平０７−２２７２９９）やサイファージェン・バイオシステムズ社によって開発された質量分析計を用いた測定手法が知られている。
【００１３】
以上のとおり、従来、生体分子を検出するための各種の技術やマイクロアレイ技術が知られているが、解決すべき課題は少なくない。前述のとおり、蛍光色素を標識する場合には、測定操作の煩雑さや定量性の低下といった問題がある。表面プラズモン共鳴を利用した検出では標識操作を必要としないものの、検出感度の低さや、マイクロアレイヘの適用が困難であるなどの問題がある。特に、技術的な課題として考えられているのは、これまで開発された技術のほとんどが高価な測定システムを必要とし、マイクロアレイの単価が高額であるという点であり、膨大な検体数を対象とする遺伝子診断などの分野に対するシステム導入は困難が伴うということである。
【００１４】
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、蛍光色素などの標識操作を施すことなく、簡便に、しかも安価に生体分子を検出することのできる、新しい生体分子検出方法を提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１に、基板上に成膜された金属薄膜上に検出目標であるターゲット生体成分に対して吸着反応性を示す生体成分をプローブ生体成分膜として成膜し、このプローブ生体成分膜に対して検体中に含有されるターゲット生体成分を吸着反応させることで、吸着反応が発生した部位のレジスト効果を高め、次いでエッチングを実施し、残留した吸着反応が発生した部位を検知することによりターゲット生体成分の検出を行うことを特徴とする生体成分検出方法を提供する。
【００１６】
また、この出願の発明は、第２に、プローブ生体成分膜の生体成分が、ターゲット生体成分に対する抗体、もしくは、ターゲット生体成分に対する抗体を含有する生体成分であって、プローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分との吸着反応が、抗原−抗体反応であることを特徴とする生体成分検出方法を、第３に、プローブ生体成分膜の生体成分が特定の塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドであり、ターゲット生体成分が一本鎖ヌクレオチドであり、プローブ生体成分膜とターゲット生体成分との吸着反応がハイブリダイゼーションであることを特徴とする生体成分検出方法を、第４に、基板が、金属基板、無機質基板、もしくは、樹脂基板あるいはそれらの複合基板のいずれかであることを特徴とする生体成分検出手法を提供する。
【００２１】
以上のとおりこの出願の発明の遺伝子検出方法は、前処理過程が非常に煩雑な色素標識検出法ではなく、蛋白やヌクレオチドを予め基板上に固定化しておき、生体から抽出した生体分子に対して何も処理を施さずに、特定の抗原もしくは抗体を有する蛋白、または、特定塩基配列を持つヌクレオチドを、エッチングレートの差により検出することを特徴としたものである。
【００２２】
この出願の発明によれば、検体となる生体分子の標識や過度の洗浄、あるいは、分離操作による標識されていない生体分子の除去などの従来法のような複雑な処理をすることが無く、操作は簡便であり、安価に特定の抗原もしくは抗体、または特定塩基配列を持つ生体分子を解析することが可能となる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
【００２４】
この出願の発明である生体成分検出方法においては、まず、金属やセラミックス、さらにはガラスやプラスチックなどの基板上に金属薄膜を成膜する。次に、金属薄膜上に、検出目標であるターゲット生体成分に対して吸着反応性を示す生体成分をプローブ生体成分膜として成膜する。
【００２５】
そして、このプローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分とを吸着反応させることで、吸着反応が発生した部位の膜厚が厚くなることから、吸着反応が発生した部位のレジスト効果が高まる。したがって、ウェット方式あるいはドライ方式のエッチングを行うことで、吸着反応が発生した部位が基板上に残留する。この出願の発明である生体成分検出方法においては、吸着反応が発生した部位の残留を検知することにで、ターゲット生体成分の検出を行う。
【００２６】
この出願の発明である生体成分検出方法において、プローブ生体成分膜の生体成分は、ターゲット生体成分に対する抗体、もしくは、ターゲット生体成分に対する抗体を含有する生体成分であって、プローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分とを吸着反応が、抗原−抗体反応とすることで、上記の原理により吸着反応部位を基板上に残留させ、ターゲット生体成分である抗原を検出することができる。
【００２７】
また、プローブ生体成分膜の生体成分が、特定の塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドであり、また、ターゲット生体成分が一本鎖ヌクレオチドであってもよく、プローブ生体成分膜とターゲット生体成分とがハイブレダイゼーションであること利用して、上記の原理により吸着反応部位を基板上に残留させ、ターゲット生体成分である抗原を検出することができる。
【００２８】
そして、この出願の発明である生体成分検出方法において、基板としては、金属基板、無機質基板、あるいは樹脂基板のうちの各種のものであってよい。その材料としては、たとえば、ガラス、シリコン、セラミックス、ステンレス、ポリカーボネート系樹脂、アクリル系樹脂等が例示される。また、これらの基板上に成膜される金属薄膜としては、たとえば、金、白金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、鉄。クローム、錫、亜鉛等の各種のものであってよく、これらは合金、あるいはＩＴＯのような導電性の酸化物の形態であってもよい。
【００２９】
以上で説明した生体成分検出方法において用いられる生体成分検出用マイクロアレイは、基板と、基板上に成膜された金属薄膜と、金属薄膜上に成膜されたプローブ生体成分膜とから構成される。ここで、プローブ生体成分膜は、検出目標であるターゲット生体成分に対して吸着反応性を示す生体成分である。
【００３０】
上記の生体成分検出方法により、プローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分とを吸着反応させることで、吸着反応が発生した部位のレジスト効果を高めておき、次いで、ウェットエッチング等のエッチングを施すことにより吸着反応が発生した部位を残留させ、吸着反応が発生した部位を検知することによりターゲット生体成分の検出を行う。
【００３１】
前述のとおり、プローブ生体成分膜と検体中に含有されるターゲット生体成分とを吸着反応を、抗原−抗体反応、または、ハイブレダイゼーションとすることで、これらの反応により形成される分子膜が分子レジストとして作用することから、ウェットエッチングの実施により吸着反応が発生した部位が基板上に残留する。
【００３２】
基板上に残留した吸着反応が発生した部位の検知は、例えば、基板に対して照明光を照射し、ＣＣＤカメラなどの撮像装置により撮像された透過光像から行うことができる。透過光像の濃淡から、残留した部位の膜厚を知ることが可能であり、すなわち、生体成分の定量的評価を行うことができる。
【００３３】
そして、この出願の発明においては、金属薄膜の表面に、プローブ生体成分とともに、水酸基、カルボキシル基等の官能基を持つ有機分子、さらにはアルブミン等の膜をあらかじめ吸着させておくことにより、ターゲット生体成分の金属薄膜上への非特異的な吸着、すなわち、検出生体成分がプローブ生体成分をスポットしていない金属薄膜の部位に対して吸着することを防ぎ、選択的な生体成分検出を可能としてもいる。
【００３４】
たとえばメルカプト酢酸（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）を用いて、メルカプト基（ＨＳ−）でこれを金属薄膜上に吸着させることで、その分子膜表面をＣＯＯ−の負電荷とし、これによって、負電荷を有する検体ＤＮＡ等の成分の金属薄膜上への吸着を防ぎ、目的のプローブＤＮＡ等の部位に対してのみ選択的に吸着させることができる。この方法によれば前記のエッチング手段と併用することで高感度での検出が可能になる。
【００３５】
この出願の発明は、以上の特徴を持つものであるが、以下に実施例を示し、さらに具体的に説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【００３６】
【実施例】
＜実施例１＞
図１は、この出願の発明である生体成分検出方法における生体成分検出の手順について示した概要図である。
【００３７】
まず、基板（１）上に、金属薄膜（２）を形成する。次いで、金属薄膜（２）上に、プローブ生体成分膜としてＤＮＡ単分子（３）を集積化し、ＤＮＡ単分子膜（４）を成膜する。このとき、ＤＮＡ単分子（３）の末端には、例えば、チオール基（ＳＨ基）が付加されており、ＤＮＡ単分子（３）は金属薄膜（２）上に膜状に集積される。または、金属基板（２）上を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ＬｙｓｉｎまたはＣｙｓｔａｍｉｎｅなどのＤＮＡと結合する分子で修飾しておくことで、ＤＮＡ単分子（３）を金属薄膜（２）上に膜状に集積してもよい。
【００３８】
そして、検体中に検出目標となるターゲットＤＮＡ単分子が存在する場合には、ＤＮＡ単分子膜（４）においてハイブリダイゼーション反応が発生する。ハイブリダイゼーション反応が発生した部位（５）においては、ＤＮＡ分子が２本鎖となることから、膜厚が増し、すなわち、レジスト効果が高くなる。このようにして形成されたマイクロアレイ（６）をエッチング溶液に数十秒間浸漬することでエッチングを行い、ハイブリダイゼーション反応が発生した部位（５）のみが残留する。ハイブリダイゼーション反応が発生した部位（５）を検出することで、検体中にターゲットＤＮＡ単分子が存在することがわかる。
【００３９】
この出願の発明である生体成分検出方法においては、プローブ生体成分、および、ターゲット生体成分に対してマーカー分子を修飾する必要がない。また、金属薄膜に残留した部位を検出するために、共焦点顕微鏡や電気化学測定装置といった高価かつ煩雑な操作が必要な測定機器を必要としない。例えば、図１に示したように、照明装置（７）によりマイクロアレイ（６）の下面を照射し、その透過光をＣＣＤカメラ（８）で撮影することで、金属薄膜に残留した部位を検出が可能となる。
【００４０】
チップ自体も、基板にカバーガラスを用いるなど、安価な材料で作成することが可能であり、大量の検体を対象とする試験にも容易に対応可能である。
【００４１】
以下に、この出願の発明である生体成分検出方法の有効性を示すために行われた実験について示す。
▲１▼試料基板：カバーガラス上に金薄膜（膜厚５０ｎｍ）を形成した。金薄膜とガラスの密着性を高めるためにクロム膜（〜１ｎｍ）を介在させた。
▲２▼ＤＮＡ：以下の３０塩基のＤＮＡを用いた。
【００４２】
プローブＤＮＡ：
５´ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴ３´(末端チオール基)
▲３▼ターゲットＤＮＡ：
５´ＡＴＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧ３´
▲４▼試料は以下の手順で作成した。
１）金薄膜基板を濃硫酸中に浸漬し、表面を洗浄する。
２）１μＭのプロープＤＮＡ溶液（０．５Ｍ  リン酸緩衝液：ｐＨ７．０）を基板上に滴下し、１２時間室温で放置する。
３）洗浄溶液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．４）で洗浄する。
４）１０μＭのターゲットＤＮＡ溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ：ｐＨ７．４）  およびＤＮＡの入っていない緩衝溶液をそれぞれＤＮＡ単分子膜上に滴下し、１６時間放置する。
５）洗浄溶液で洗浄後、窒素ガスを吹き付けて乾燥する。
▲５▼測定は以下の手順で行った。
１）試料基板をエッチャント溶液（０．５ｇＩ2、２ｇＮＨ4Ｉ  ｉｎ  ｌＯｍｌＨ2０、１５ｍｌ  ｅｔｈａｎｏｌ）に２０秒間浸漬し、水で洗浄する。
２）照明光を裏面より照射し、透過光をＣＣＤカメラで撮影する。
【００４３】
図２は、エッチング前とエッチング後のマイクロアレイの様子を、照明光を裏面より照射し、透過光をＣＣＤカメラで撮像した画像である。エッチング前においては、図２（Ａ）に示すような金属光沢のある金薄膜が基板上に存在している。エッチング後においては、ＤＮＡを修飾していない部位の金薄膜はほとんど除去されている様子が図２（Ｂ）から確認できる。また、２本鎖ＤＮＡとなった部位では明確な金薄膜の残存が観察された。
【００４４】
以上のとおり、この出願の発明である生体成分検出方法がＤＮＡマイクロアレイ検出手段として有用であることが示された。
＜実施例２＞
実施例１において、試料作成の手順１）、２）、３）が終了した後に、１ｍＭのメルカプト酢酸水溶液中に基板を浸漬し、１時間室温で放置した。次いで、洗浄溶液（１０ｍＭ  Ｎａｃｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．４）で洗浄した。
【００４５】
これによって、プローブＤＮＡ成分が吸着されている金薄膜部位には、メルカプト基部分で吸着結合し、負電荷ＣＯＯ-をもつ分子鎖膜が形成された。このものは、負電荷を有する検体ＤＮＡの金薄膜表面上への非特異的吸着を防ぐのに有効であることが確認された。
【００４６】
【発明の効果】
この出願の発明によって、以上詳しく説明したとおり、蛍光色素などの標識操作を施すことなく、簡便に、しかも安価に生体分子を検出することのできる、新しい生体分子検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明である生体成分検出方法における生体成分検出の手順について示した概要図である。
【図２】この出願の発明である生体成分検出方法の実施例における実験結果について示した画像である。
【符号の説明】
１  基板
２  金属薄膜
３  ＤＮＡ単分子（プローブ生体成分）
４  ＤＮＡ単分子膜（プローブ生体成分膜）
５  ハイブリダイゼーション反応が発生した部位（吸着反応が発生した部位）
６  マイクロアレイ
７  照明装置
８  ＣＣＤカメラ
【図１】
0004017420.tif 000002
【図２】
0004017420.tif 000003