(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素（グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ）及びそれをコードする塩基配列を有するＤＮＡに関するものである。より詳しくはヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン等の硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基を選択的に硫酸化するヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ及びそのＤＮＡによってコードされるポリペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパラン硫酸は、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基（Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基又はＬ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の二糖の繰り返し構造（４ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１→４ＧｌｃＮＡｃα１）を基本骨格とし、そのヘキスロン酸残基の２位の一部及びＮ−アセチルグルコサミン残基の２位と６位の一部のそれぞれに硫酸基を有するグリコサミノグリカンの一種である。
【０００３】
グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素の遺伝子がクローニングされることにより、硫酸基受容体となるグリコサミノグリカンに対する該酵素の基質特異性についての情報を得ることが可能となり、グリコサミノグリカンの構造と機能の関係を研究する上で有用なアプローチが提供されると考えられる。グリコサミノグリカンの生合成、その中でもヘパリン／ヘパラン硫酸の生合成には多くの硫酸化のプロセスがあることが知られており（木幡陽、箱守仙一郎、永井克孝編、グリコテクノロジー▲５▼、57(1994)、講談社サイエンティフィク発行）、この硫酸化には様々なグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素が関与しているものと考えられる。ヘパリン／ヘパラン硫酸に硫酸基を転移するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸Ｎ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳＮＳＴ」と略記することもある）、ヘパラン硫酸２−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ２ＳＴ」と略記することもある）及びヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ６ＳＴ」と略記することもある）が単離されており、上記硫酸基転移酵素のうちのＨＳＮＳＴ及びＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡのクローニングがされている。
【０００４】
本発明者らは既に硫酸基供与体である3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸から、硫酸基受容体であるヘパラン硫酸に含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を選択的に転移するヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素をチャイニーズハムスター、マウス及びヒト由来の培養細胞から精製した（J. Biol. Chem.,270,4172-4179(1995)）。しかしながら、該酵素のｃＤＮＡのクローニングはまだなされていなかった。また、マウス及びニワトリ由来の該酵素はこれまでに得られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ヘパラン硫酸に含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基に選択的に硫酸基を転移する酵素を大量に得ることはヘパラン硫酸の構造解析研究において重要な手段を提供することになるので、当該酵素のｃＤＮＡのクローニングは非常に重要である。すなわち、本発明は当該酵素のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、当該酵素を簡便な方法により大量に入手する手段を提供し、それにより硫酸化多糖の構造−機能の関係の解明に寄与することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリンのＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基を選択的に硫酸化するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素、すなわちＨＳ６ＳＴのポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを鋭意検索し、該酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡのクローニングに成功し、該ＤＮＡによりＨＳ６ＳＴが発現することを確認して本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の性質を有する硫酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードする塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。硫酸基供与体は好ましくは3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸である。
▲２▼基質特異性：
ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリンのＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基には硫酸基を転移するが、コンドロイチン及びコンドロイチン−４−硫酸の上記水酸基には硫酸基を転移しない。
▲３▼至適反応ｐＨ：
ｐＨ６〜７
▲４▼至適イオン強度：
塩化ナトリウムを用いた場合、０．１〜０．３Ｍ。
▲５▼阻害及び活性化：
ジチオスレイトール、アデノシン-3',5'-ジリン酸で酵素活性が阻害され、プロタミンにより酵素活性が上がる。
【０００８】
上記ＤＮＡは好ましくは、チャイニーズハムスター、マウス、ニワトリ又はヒト由来である。
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【０００９】
本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配列、配列番号４のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配列、配列番号５のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配列、配列番号７のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配列又は配列番号９アミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１０】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡの塩基配列によってコードされるグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチドを提供する。
【００１１】
なお、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコードするポリペプチドを含むグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素を便宜的にヘパラン硫酸６−Ｏ硫酸基転移酵素又はヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼと称することもあるが、これは該酵素の基質がヘパラン硫酸に限られることを意味するものではない。例えば本酵素は、ＣＤＳＮＳ−ヘパリン中のＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基にも選択的に硫酸基を転移する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明のグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（本発明ＤＮＡ）
本発明ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素は、例えば、本発明者らによってチャイニーズハムスターの卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞：ATCC CCL61等）、マウス乳癌由来細胞（ＦＭ３Ａ細胞：国立衛生試験所ＪＣＲＢ細胞バンク  JCRB0701等）及びヒト骨肉腫由来細胞（ＭＧ６３：ATCC CRL1427等）等の培養細胞から精製されたヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（特開平８−３３４８３号公報）であり、下記のような理化学的性質を有する。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。すなわち、上記硫酸基受容体のＮ−硫酸化グルコサミンの６位の水酸基以外には実質的に硫酸基を転移しない。硫酸基供与体としては活性硫酸（３’ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸；以下「ＰＡＰＳ」とも記載する）が好適には挙げられる。ヘキスロン酸残基には実質的に硫酸基を転移しない。
▲２▼基質特異性：
ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン（Completely Desulfated, N-Sulfated Heparin：完全脱硫酸化後、グルコサミン残基をＮ−硫酸化したヘパリン）のＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基には硫酸基を転移するが、コンドロイチン及びコンドロイチン−４−硫酸の上記水酸基には硫酸基を転移しない。また、一般にＮＤＳ−ヘパリン（N-Desulfated Heparin：Ｎ−脱硫酸化したヘパリン）のように、グルコサミンの２位に硫酸基を有しないヘパリン又はヘパラン硫酸には硫酸基をほとんど転移しない。したがって、本発明酵素の硫酸基受容体としては、グリコサミノグリカンのグルコサミン残基の２位が硫酸化されたＮ−硫酸化グルコサミン（元々、Ｎ−硫酸基を有するヘパラン硫酸に含まれるものを含む）が必要であると考えられる。
▲３▼至適反応ｐＨ：
本酵素はｐＨ６．０〜７．０の範囲、特にｐＨ６．３付近で高い硫酸基転移活性を有する。ｐＨ４．７以下ではほとんど活性を有しない。
▲４▼至適イオン強度：
本酵素の活性は、反応環境下のイオン強度の変化に伴って変化し、ＮａＣｌの場合、０．１〜０．３Ｍ、特に０．１５Ｍ付近で最も高い活性を示す。この範囲を超えてＮａＣｌ濃度が増加すると活性は徐々に低下し、０．５Ｍでは活性は極めて低くなる。
▲５▼阻害及び活性化：
本酵素の活性は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アデノシン−３’，５’−ジリン酸（３’，５’−ＡＤＰ）で阻害され、プロタミンにより上がる。一般に、ＤＴＴ１ｍＭ存在下で活性は半減し、約０．０２５ｍｇ／ｍｌ以上のプロタミンにより、プロタミン非存在下と比して１０倍程度活性が上がる。
【００１３】
また、本酵素は一般に下記の理化学的性質も有する。
▲６▼ミカエリス定数：
ＣＨＯ細胞由来の本酵素は、本酵素に対して、硫酸基の受容体としてヘパラン硫酸を、供与体としてＰＡＰＳを用いたときのＰＡＰＳに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、約４．４×１０-7Ｍである。
▲７▼その他：
ＣＨＯ細胞の培養液から得られる本酵素の活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析すると、４５ｋＤａ及び５２ｋＤａの分子量のバンドが認められる。また、本酵素をＮ−グリカナーゼ処理したものをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した結果、３８ｋＤａ及び４３ｋＤａの分子量のバンドが認められる。
【００１４】
上記の理化学的性質は、J. Biol. Chem. 270, 4172-4179(1995)に記載の方法に従って測定することができる。
本発明ＤＮＡは、本発明により初めて単離されたＤＮＡであり、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードしているのであればその塩基配列は特に限定はされない。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてに１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基を硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基に転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１５】
すなわち、配列番号２のアミノ酸配列は、硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を選択的に転移する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は転位を有するポリペプチドをコードする、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有するＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細書における「アミノ酸の数個」とは該酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示す。また、好ましくは、相同性が８５％以上、さらに好ましくは９０％以上となる程度の数を示す。該酵素の活性の測定方法は公知であり（例えば、J. Biol. Chem. 270, 4172-4179(1995)）、当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００１６】
本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分配列、配列番号４のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分配列、配列番号５のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分配列、配列番号７のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分配列、又は配列番号９のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分配列をコードするＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいがこれに限定はされない。上記の「部分配列を有するＤＮＡ」とは、例えばＨＳ６ＳＴのポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズしＨＳ６ＳＴのＤＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる又はそれによってコードされるポリペプチドがＨＳ６ＳＴ活性を有するあるいはＨＳ６ＳＴと同様の抗原性を有するＤＮＡを示す。上記ハイブリダイズの条件は、後記実施例記載の１次スクリーニング又は２次スクリーニングと実質的に同一の条件である。なお、配列番号５のアミノ酸配列においては、それぞれ、アミノ酸番号１８のアミノ酸はチロシン又はアスパラギン、アミノ酸番号１３２のアミノ酸はセリン又はプロリン、アミノ酸番号１３４のアミノ酸はアラニン又はグリシン、アミノ酸番号１３７のアミノ酸はスレオニン又はセリン、アミノ酸番号１４５のアミノ酸はスレオニン又はイソロイシン、アミノ酸番号１４７のアミノ酸はロイシン又はバリンであることが好ましい。
【００１７】
本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより具体的には、配列番号１又は配列番号３に示す全塩基配列又はその部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基番号１１２〜１３４１及び配列番号３における塩基番号２〜７０９の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
配列番号１に示す塩基配列においては、ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端部には３つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれている。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、Ｋｏｚａｋの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-292）による真核細胞の翻訳開始部位の共通配列（ＴＣＣ（Ａ又はＧ）ＣＣＡＴＧＧ）と比較すると、４個の塩基が保存されている。第２番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、上記配列の塩基が７個、第３番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は６個保存されている。
【００１９】
ところで、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J. Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。さらに、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様に、ＨＳ６ＳＴについても、複数のＡＴＧコドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドンであっても、上記の硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含されるものである。
【００２０】
配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、４１０アミノ酸残基からなり、分子量４８，２４３Ｄａ、Ｎ−結合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロット（図２）から、Ｎ末端から１７〜３１番目のアミノ酸残基に渡る長さ１５残基の１つの顕著な疎水性部分が認められ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有することが予想される。
【００２１】
尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
また、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ＨＳ６ＳＴをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００２２】
また、本発明ＤＮＡは、ＨＳ６ＳＴのポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を有していてもよく、またＨＳ６ＳＴのポリペプチドの一部分をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００２３】
ところで、一般にグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素では、チャイニーズハムスターとヒトとの間でアミノ酸配列に高い相同性を有することが知られており、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドも、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約７０％以上と想定される。従って、本発明で具体的に開示しているＤＮＡがコードするポリペプチドと高い相同性を有するポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包含される。上述のようにＨＳ６ＳＴのポリペプチドは膜貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＨＳ６ＳＴのポリペプチドの部分もまた本発明に包含される。このようなポリペプチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３４〜４１０などが挙げられる。
【００２４】
＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法
以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発明によりＨＳ６ＳＴのポリペプチドの一部のアミノ酸配列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明のＤＮＡを増幅することによって取得することも可能であり、また、特に、以下の各工程からなるｃＤＮＡクローニングにより製造することも可能である。
(1)精製したヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドの一部のアミノ酸配列を決定する。
(2)上記アミノ酸配列に基づいて対応する塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを作製する。
(3)培養細胞より抽出したＲＮＡから上記プライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することによって前記硫酸基転移酵素の１次プローブを製造する。
(4)上記１次プローブによって培養細胞又は生体組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてｃＤＮＡ断片を得る。
(5)上記ｃＤＮＡ断片を２次プローブとして培養細胞又は生体組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
【００２５】
スクリーニングによって、通常には、上記硫酸基転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選択する。
しかし、本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。
【００２６】
以下に、本発明のＤＮＡを製造する方法の一例を具体的に説明する。
（１）ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＨＳ６ＳＴ）のアミノ酸配列の決定
(i)ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素の精製
ＨＳ６ＳＴは、例えばチャイニーズハムスター、マウス又はヒト由来の培養細胞、ヒト脳組織等ＨＳ６ＳＴを発現する細胞又は組織から、通常のタンパク質の精製方法、および本酵素の基質又は阻害剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせることによって精製することが可能である。具体的には、J. Biol. Chem. 270,(8),4172-4179,(1995)に記載された方法に従って行うことができる。
【００２７】
(ii)ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列の決定
精製したＨＳ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知られているので、この糖鎖を除去するために精製ＨＳ６ＳＴをＮ−グリカナーゼなどの糖鎖分解酵素で消化し、脱グリコシル化されたＨＳ６ＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等で分離し、ポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; ＰＶＤＦ)膜やニトロセルロース膜などに転写する。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルー(ＣＢＢ)やアミドブラックなどのタンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを切り出して断片化に用いる。
【００２８】
断片化の方法は特に限定はされないが、上記タンパク質バンドにタンパク質分解酵素を接触させるなど、公知の方法でタンパク質を断片化することができる。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎなどが挙げられる。ゲルからバンドを切り出し、タンパク質分解酵素に接触させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで分離してもよい。簡便な操作としては、Clevel and, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Laemmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 の方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出して別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含む緩衝液を、挿入したゲルに乗せてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、色素マーカーの先端が分離ゲルにはいる直前に電源を切ることによって泳動を一時中断し、約３０分間酵素消化を行い、その後電気泳動を再開するという方法である。この方法によれば酵素消化と消化後のペプチド断片の分離が単一工程でできるため好ましい。断片化によって生じたペプチドをＰＶＤＦ膜やニトロセルロース膜などに転写した後、ＣＢＢ又はアミドブラックなどを用いてペプチドを染色し、ペプチドのバンドを切り出す。タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドを含むＰＶＤＦ膜やニトロセルロース膜などは、公知の方法でペプチドのアミノ末端配列決定を行うことが可能である。具体的にはモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド  バイオシステムス(Applied Biosystems)社製）などを用いてアミノ酸の配列を分析することが好ましいがこれに限定はされない。なお、業者に依頼してアミノ酸配列を決定してもらうことも可能である。
【００２９】
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合成
ＨＳ６ＳＴの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重が少ない部位を用いることが好ましい。このようなプライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配列番号１５、１７；アンチセンスプライマー：配列番号１６、１８）。
【００３０】
（２）ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの調製とプローブの作成
▲１▼全ＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkなど）で得ることができる。材料は、ＨＳ６ＳＴのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定はされないが、取り扱いの容易さ、および増殖可能な点で例えばチャイニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（例えばATCC CCL61等）、マウス由来のＦＭ３Ａ細胞（例えば国立衛生試験所ＪＣＲＢ細胞バンク  JCRB0701等）、ヒト由来のＭＧ６３細胞（例えばATCC CCL1427等）等の培養細胞が好ましい。培養細胞の中でも特にＣＨＯ細胞が本酵素が強く発現し、酵素活性も比較的高いため好ましい。上記培養細胞の培養に用いる培地は特に制限されないが、大量の細胞を効率よく得るには、スピナーフラスコなどによる浮遊細胞の培養に適した培地が好ましい。具体的にはＣＨＯ細胞を使用する場合には浮遊培養用のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ギブコ製）などの市販の培地を用いてもよい。上記のような培地を用いてスピナーフラスコを使用して通常の培養細胞と同様にして培養すればよい。培養は、炭酸ガスインキュベーター中で行うことが好ましく、インキュベーター中の炭酸ガス濃度が５〜７％、空気が９５〜９３％となるように調整することが好ましい。また、温度は３７〜３８℃程度に調整することが好ましい。
【００３１】
全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得ることができるが、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)で調製することが好ましい。
【００３２】
▲２▼ポリ(A)+ＲＮＡの調製
ポリ(A)+ＲＮＡは、上記のようにして得られた全ＲＮＡから、オリゴｄＴ(oligo-(dT))セルロースカラムクロマトグラフィーなどによって精製することができる。
【００３３】
▲３▼ＰＣＲ法によるＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの増幅
上記ポリ(A)+ＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、ＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌの前述のオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５サイクル繰り返して行う。
【００３４】
このようにして得られた部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）断片をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブ（１次プローブ）として用いられる。また、このＰＣＲ産物は通常の方法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクター（ストラタジーン製）へサブクローニングして塩基配列の決定を行うことが好ましい。
【００３５】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成
(i)ｃＤＮＡの合成と組換えＤＮＡの作成
ｃＤＮＡは、ポリ(A)+ＲＮＡを鋳型とした逆転写酵素反応により通常の方法を用いて合成することができる。合成する際は市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー）を用いると、ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡをクローニングベクターに連結することもできる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より簡便にｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明実施例においてもＣＨＯ細胞及びヒト胎児脳由来のλｇｔ１１ライブラリーを用いている。クローニングベクターに結合した状態のこれらの組換えＤＮＡを宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用されているがこれに限定はされない。トランスフェクションは通常、組換えＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験管中でファージ外殻に入れて（in vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、市販されているパッケージング用のキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン(Stratagene)製等）を用いてパッケージングを行うことも可能である。パッケージングした組換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に対する耐性の性質があってはならず、また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えば、λｇｔ１１クローニングベクターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８等の大腸菌株を選択すればよい。組換えＤＮＡや組換えプラスミドが導入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得等によりスクリーニングすることが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、生育したコロニーを選択すればよい。生育した大腸菌（組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラスミドにブルースクリプトを用いた場合は、指示菌とともに軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持するファージプラークはβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
【００３６】
(ii)ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片クローニング
次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーを、上記１次プローブを用いてハイブリダイゼーションにより選択することができる。ハイブリダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい（１次スクリーニング）。選択された陽性クローンからファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによりＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を切り出すことができる。当該ｃＤＮＡ断片は、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定することができるが、ＨＳ６ＳＴの場合、後記実施例に示すように、オープンリーディングフレームの全領域をコードするものを得ることが極めて難しいことが判明している。しかしながら、当該ｃＤＮＡ断片を上記１次プローブの作成と同様な手法を用いて例えば放射線又は蛍光標識し、再度、２次プローブとして以下の２次スクリーニングにより完全長ｃＤＮＡを得ることが可能である。このようなｃＤＮＡ断片の例として、ＣＨＯ細胞のｃＤＮＡライブラリーから得られるＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片の塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号３に、アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。本明細書中における部分的ｃＤＮＡとは、上記ｃＤＮＡ断片のように、プローブを用いてスクリーニングを行って得られたＤＮＡのうち、塩基配列を決定するとオープンリーディングフレームの全領域をコードしておらず、更に当該ＤＮＡをプローブとして他のＤＮＡを得るためにプローブとして使用することができるＤＮＡを指称する。
【００３７】
(iii)ＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニング
前述のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、ＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを、２次プローブを用いてハイブリダイゼーションにより選択することができる（２次スクリーニング）。ハイブリダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよいが、使用するｃＤＮＡライブラリーは１次スクリーニングで使用したものと同じである必要はない。選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによりＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定する。
【００３８】
例えば、上述の１次スクリーニングにより得られたＣＨＯのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を２次プローブとして用いて、ヒト胎児脳のｃＤＮＡを保持するλｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングすることにより得られ、決定されたヒト由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。上記の様にある生物種のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を２次プローブとして使用し、別の生物種のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって別の生物種のＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得ることが可能である。また、同種の生物種のｃＤＮＡライブラリーを用いることによりその生物のＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得ることも当然可能である。
【００３９】
＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコードされるグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチド
本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチドも提供する。本明細書において、上記のポリペプチドの「部分」とは、ＨＳ６ＳＴ活性を有する、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有する部分を意味する。本ポリペプチドは単独であってもよいし、他のポリペプチドと融合していてもよい。
【００４０】
ところで、哺乳類の生体内で発現しているＨＳ６ＳＴはその構造中に糖鎖を有するため、ＨＳ６ＳＴのポリペプチドとＨＳ６ＳＴは明確に区別される。
このようなポリペプチドは、例えば、後記のポリペプチドの製造方法によって得ることができ、また、上記の活性ないし機能の有無を判定することは当業者に公知の方法（例えばJ. Biol. Chem., 270(8),4172-4179(1995)）によって行うことができる。
【００４１】
＜４＞本発明ＤＮＡを利用したＨＳ６ＳＴのポリペプチド又はＨＳ６ＳＴの製造方法
上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取することによって、ＨＳ６ＳＴのポリペプチド又はＨＳ６ＳＴを製造することができる。
【００４２】
本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて形質転換を行うことによって得ることができる。細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるＨＳ６ＳＴのポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にＨＳ６ＳＴのポリペプチドのみを得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるＨＳ６ＳＴのポリペプチドに糖鎖の付加がなされる。そのため、糖鎖も含むＨＳ６ＳＴの形態で得ることが可能である。
【００４３】
本製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＸＮ２(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)又はｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（イーストマン  コダック(Eastman Kodak)製）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４４】
本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００４５】
培養物からの本発明ポリペプチドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００４６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞チャイニーズハムスターのヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素の調製およびアミノ酸配列の分析
J. Biol. Chem.,270,4172-4179(1995)に記載の方法により精製したＨＳ６ＳＴを得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行うために、２８μｇのＨＳ６ＳＴを１０％トリクロロ酢酸により沈殿させ、アセトンで２回洗浄した。この沈殿は、５％（Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノールを含むローディングバッファーで１００℃、３分間還元およびＳＤＳ化した後、Laemmli（Laemmli, U. K.(1970) Nature 227, 680-685）の方法に従って１０％のポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を、１０％メタノールを含有するｐＨ１１の１０ｍＭ  ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルフォン酸（ＣＡＰＳ）溶液中、２００ｍＡで２時間３０分、ＰｒｏＢｌｏｔｔのＰＶＤＦ膜（アプライド バイオシステム製）に転写した。転写したタンパク質をAebersoldらの方法（Aebersold, R.H., Leavitt, J., Saavedra, R.A., Hood, L.E., and Kent, S.B.H.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,6970-6974）に従ってPonceau Sで染色した。４５ｋＤａの領域のバンドを切り出し、Iwamatsuの方法（Iwamatsu, A.(1992) Electrophoresis 13, 142-147）を改変した方法によってＰＶＤＦ膜上で変性させＳ−カルボキシメチル化した。膜に転写されたタンパク質は、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル、１ｍｇ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む８Ｍ  グアニジン塩酸塩溶液３００μｌ中で室温で１時間還元した。そこに３ｍｇのヨード酢酸を含む１Ｎ  ＮａＯＨ溶液１２μｌを加え、暗所に１５分間置いた。この膜を蒸留水で洗浄し、その後０．１％  ＳＤＳを含有する２％アセトニトリルで洗浄した。膜上のＳ−カルボキシメチル化したタンパク質は、１ｍｇのメチオニンを含む１００ｍＭの酢酸に溶解した０．５％  ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ−４０）  ３００μｌ中で室温で３０分間インキュベートし、１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルで洗浄した。膜を細かく切断し、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０．３ＵのＮ−グリカナーゼで３７℃１５時間処理した。その後、ｉｎ  ｓｉｔｕ逐次的消化を、１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含むｐＨ９．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に酵素：基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶解したエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃにより３７℃で１５時間行い、続いて１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含むｐＨ７．５の２０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムと２５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ７．８の反応液中に酵素：基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶解したエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎにより４０℃で２４時間行うことにより行った。この消化産物を回収してフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物を溶解し、逆相カラム（０．３×１５０ｍｍ）でキャピラリーＨＰＬＣを行った。ペプチドの溶出は流速３．３μｌ／ｍｉｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．０５２％  ＴＦＡを含む８０％  アセトニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収し、ＰＶＤＦ膜の小片にブロットした。アミノ酸配列決���はモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス(Applied Biosystems)）で行った。表１に結果を示す。
【００４７】
【表１】
0003964982.tif 000002
【００４８】
＜２＞ＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
（１）ＰＣＲ用プライマーの作成
上記ペプチドの１と２に基づいて、末端および内部のプライマーのデオキシイノシン置換を有する縮重オリゴヌクレオチド（図１）を作成した（鋳型ＤＮＡ配列を持つプライマー２ｓ（配列番号１５）、５ｓ（配列番号１７）、鋳型の相補的配列を持つプライマー２ａ（配列番号１６）、５ａ（配列番号１８））。
【００４９】
（２）ＰＣＲ反応
ＣＨＯ細胞からオリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロースクロマトグラフィーを使用する常法により採取したポリ(A)+ＲＮＡを逆転写反応の鋳型として、オリゴｄＴ及びランダムヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡの一本鎖を合成し、これをＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲは、各１００ｐｍｏｌのプライマー２ｓと５ａの混合物（又は２ａと５ｓ）、５μｌの逆転写反応液、それぞれ０．２５ｍＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer）製）を含む混合液５０μｌで行った。増幅は以下のように行った。解離反応は９５℃で１分、アニーリングは４６〜６２℃で１分、伸長反応は７２℃で２分とし、３サイクルごとに４８℃までアニーリングの温度のみを２℃ずつ低くし、最終的にはアニーリングの温度が４６℃の条件で１１サイクル行った。その後、さらに１５分間伸長反応を行った。この操作によって生じた増幅物質をアガロースゲル電気泳動により解析すると、増幅された約３３０ｂｐのＤＮＡのバンドが検出された。３３０ｂｐのＰＣＲ産物を常法によりアガロースゲル電気泳動し、ＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡとしてＤＮＡ断片を回収した。
【００５０】
＜３＞チャイニーズハムスターのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片の取得
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成
２ｓと５ａをプライマーとしてＰＣＲを行って得られた、１次プローブとするＤＮＡ断片はＪｅｔｓｏｒｂ（ゲノメッド(Genomed)製）を使って回収した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使い平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したこのＤＮＡを、アルカリホスファターゼ処理をしたブルースクリプト(Bluescript)プラスミド（ストラタジーン(Strategene)製）ＤＮＡのＥｃｏＲＶ消化断片と結合し、ＪＭ１０９を用いて、青と白の色による選択によりサブクローン化した。サブクローンは配列決定により確認した。その結果、このＰＣＲ産物にはペプチド２及び５の他にペプチド４がコードされることが明らかとなった。
【００５１】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した放射線ラベルした一次プローブは、プライマー２ｓおよび５ａ、鋳型としてサブクローン化された約３３０ｂｐのＤＮＡ、ならびに[α-32P]ｄＣＴＰ（アマシャム(Amersham)製）を含む最終量２５μｌの溶液で増幅したＰＣＲ産物から調製した。ＰＣＲは、９５℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、最終のサイクルではさらに７２℃での伸長時間を１５分延長することにより行った。
【００５２】
（２）ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローンの１次スクリーニング
ＣＨＯ細胞のｃＤＮＡライブラリーであるλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを構築した。具体的には、ＲＮＡ抽出キット（ファルマシア製）を使用し、培養したＣＨＯ細胞から全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴ−ラテックス（Oligotex dT30、ロシュ製）を使用してポリＡ−ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化したλｇｔ１１（ファルマシア製）への結合はＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア製）で行った。逆転写反応はランダムオリゴヌクレオチドプライマー及びｏｌｉｇｏｄＴを使用して行った。結合したＤＮＡはStratagene Gigapack II（ストラタジーン製）を用いてファージにパッケージングした。宿主のＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８細胞に上記で調製したｃＤＮＡを保持するファージを感染させた。プレート１枚当たり２〜４×１０4個のプラークが形成されるようにまき、約８×１０5個のプラークをスクリーニングした。λｇｔ１１ライブラリーから生じたプラークを転写したＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜をアルカリ固定法により固定し、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、０．５％  ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で３時間プレハイブリダイズした。32Ｐラベルした１次プローブを上記バッファー中に加え、５０℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、５５℃で１×ＳＳＰＥ、１％  ＳＤＳ、さらに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラフィーにより１個の陽性クローンを検出した（１次スクリーニング）。
【００５３】
（３）チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片の塩基配列
１個の陽性クローンからのブルースクリプト プラスミドを、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージとＥ．ｃｏｌｉ ＳＯＬＲを使用するストラタジーンのｉｎ ｖｉｖｏ ＤＮＡ切り出し法(Stratagene in vivo excision protocol)により切り出した。ＳＯＬＲに導入されたブルースクリプトプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いて精製した。導入されたｃＤＮＡのうち、０．７ｋｂｐのクローンの塩基配列が決定された（ＥｃｏＲＩで処理して得られる断片の塩基配列を配列番号３に示す）。塩基配列はSequenaseバージョン２．０を含むｄＧＴＰ／ｄｅａｚａＧＴＰキット（U.S.バイオケミカル(Biochemical)製）を使用して確かめた。塩基配列はコンピュータソフトウェアのジェネティックス-マック(GENETYX-MAC:ソフトウェアデベロプメント社製)により編集、解析した。このクローンはオープンリーディングフレームの一部を有していることが明らかとなった。
【００５４】
＜４＞ヒトＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定
上記ＣＨＯ細胞から得られたＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで処理して得られた断片を２次プローブとして上記と同様の手法を用いてヒト胎児脳のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８をスクリーニングした。その結果、１７個の陽性クローンが検出された（２次スクリーニング）。
【００５５】
１．７ｋｂｐと２．０ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列を決定し（配列番号１）、さらにこの配列からコードされたアミノ酸配列を予測した（配列番号２）。アミノ末端の配列に４つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれた。最初のＡＴＧコドンの上流域−６の場所に終止コドンのＴＧＡ配列が存在した。最初のＡＴＧコドンから開始するオープンリーディングフレームからは４１０アミノ酸残基の４８，２４３Ｄａで２カ所の糖結合可能域を持つタンパク質が予想された。このアミノ酸配列のハイドロパシープロットにより、ＨＳ６ＳＴアミノ末端領域の１７番目から３１番目までの１５アミノ酸残基が明確な疎水領域であるタイプIIの膜タンパク質であることが判明した（図２）。このアミノ酸配列を上記チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴの部分アミノ酸配列とその相当する部分で比較すると、その相同性は、９７．４％であった（図３）。チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴ断片との相同性のある部分はヒトのＨＳ６ＳＴの膜貫通領域よりも細胞外寄りに位置し、この位置（アミノ酸番号３４）から塩基配列で終止コドンまでの領域の分子量を算出すると、４４，３８９Ｄａとなった。この数値は、チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴをＮ−グリカナーゼ処理した際の分子量とほぼ一致する。
【００５６】
＜５＞マウスＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定
上記ＣＨＯのｃＤＮＡライブラリーから得られた２．０ｋｂｐのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを２次プローブとして上記と同様の手法を用いてマウス脳のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８をスクリーニングした。その結果、２個の陽性クローンが検出された（２次スクリーニング）。
【００５７】
１．７ｋｂｐと２．１ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列から、マウスＨＳ６ＳＴの全塩基配列を決定し（配列番号６）、さらにこの配列からコードされたアミノ酸配列を予測した（配列番号７）。このアミノ酸配列を上記ヒト由来のＨＳ６ＳＴの部分アミノ酸配列とその相当する部分で比較すると、その相同性は、９０％以上であった。
【００５８】
＜６＞ニワトリＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定
上記ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーから得られた２．０ｋｂｐのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを２次プローブとして上記と同様の手法を用いてニワトリ胚肢芽のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８をスクリーニングした。その結果、１１個の陽性クローンが検出された（２次スクリーニング）。
【００５９】
陽性クローンのうち、１．６ｋｂｐと１．７ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列から、ニワトリＨＳ６ＳＴの全塩基配列を決定し（配列番号８）、さらにこの配列からコードされたアミノ酸配列を予測した（配列番号９）。このアミノ酸配列を上記チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴの部分アミノ酸配列とその相当する部分で比較すると、その相同性は、９０％以上であった。
【００６０】
また、既に知られているＣＨＯ由来のＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡ（J. Biol. Chem.,272,21, 13980-13985(1997)）をプローブとして使用し、上記手法と同様にマウス脳のｃＤＮＡライブラリーから、ＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡの取得を試みた。マウス脳のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８をスクリーニングした結果、４個の陽性クローンが検出され（２次スクリーニング）、１．９ｋｂｐ、１．２ｋｂｐ、１．３ｋｂｐ及び１．４ｋｂｐのそれぞれのクローンの塩基配列からマウスのＨＳ２ＳＴの全塩基配列を決定した（配列番号１９）。
【００６１】
またさらに、ヒト由来のＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡ（日本結合組織学会  1997年6月5,6日）をプローブとして使用し、上記手法と同様にニワトリ胚肢芽のｃＤＮＡライブラリーからＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡの取得を試みた。ニワトリ胚肢芽のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８をスクリーニングした結果、８個の陽性クローンが検出され（２次スクリーニング）、陽性クローンのうち、１．８ｋｂｐと２．３ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列からニワトリのＨＳ２ＳＴの全塩基配列を決定した（配列番号２０）。マウス及びニワトリのＨＳ２ＳＴは、ＣＨＯ及びヒト由来のＨＳ２ＳＴと塩基配列で８０％以上、アミノ酸配列で９０％以上の高い相同性を示した。
【００６２】
＜７＞ヒト由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの発現
（１）ＨＳ６ＳＴ発現プラスミドの構築
ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクターにｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築した。単離したヒト由来のオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡを哺乳動物の発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（イーストマン  コダック製）のHindIII/EcoRI部位に導入した組換えプラスミドであるｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴを構築した。このプラスミドは酵素などの活性を有さないタグとしての配列であるＦＬＡＧとＨＳ６ＳＴの融合タンパク質を発現するように構築されている。
【００６３】
（２）ＣＯＳ−７細胞中でのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡのトランジェント（一過性）な発現
ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を用いた。
【００６４】
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴをトランスフェクトした細胞を６７時間培養し、この細胞からHabuchi, H., Habuchi, O., and Kimata, K. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4172-4179に記載の方法に従って細胞抽出液を調製した。この細胞抽出液を３０分間４℃、１０，０００×ｇで遠心処理した後、上清画分のＨＳ６ＳＴ及びＨＳ２ＳＴ活性を調べた。対照としてｃＤＮＡを含まないｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞と何もトランスフェクトしないＣＯＳ−７細胞を用いた。単離したヒト由来のｃＤＮＡを含むベクターをトランスフェクトすると、ＨＳ６ＳＴ活性は何もトランスフェクトしない対照の約７倍に上がっていた（表２）。なお、これらの活性の測定はHabuchi, H., Habuchi, O., and Kimata, K. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4172-4179及びKobayashi, M., Habuchi, H., Habuchi, O., Saito, M., and Kimata, K. (1996) J. Biol. Chem. 271, 7645-7653に記載の方法に従って行った。
【００６５】
【表２】
0003964982.tif 000003
【００６６】
表で示したように、上記で単離されたｃＤＮＡを発現させるベクターを保持する細胞のＨＳ６ＳＴ活性は対照のｃＤＮＡを保持しないプラスミドを導入した細胞の約７．５倍であった。これに対してＨＳ２ＳＴ活性の増加は起こらなかった。これらの結果から、単離されたｃＤＮＡがＨＳ６ＳＴ活性を持つタンパク質をコードしていることが証明された。また、ＨＳ６ＳＴを導入した細胞を培養した後の培地中のＨＳ６ＳＴ活性は、対照と比較して約３．７倍に増加していた。しかし、この培地のＦＬＡＧに対するアフィニティカラムへの吸着画分にはＨＳ６ＳＴ活性が見られなかった。従って、上記培地中にはＦＬＡＧとの融合タンパク質の形態ではなく、細胞膜貫通領域で切断され、ＦＬＡＧを結合していないＨＳ６ＳＴの細胞外領域のみが、ＨＳ６ＳＴ活性を有する遊離体として可溶化された形態となっていることが示唆された。
【００６７】
＜８＞チャイニーズハムスター卵巣細胞ポリ(A)+ＲＮＡのノザンブロットによるＨＳ６ＳＴ発現の解析
チャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株ＣＨＯから抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡをｐＨ７．０の５０％  ホルムアミド（Ｖ／Ｖ）、６％  ホルムアルデヒド（Ｖ／Ｖ）、２０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファーで６５℃、１０分間変性し、６％ホルムアルデヒド（Ｖ／Ｖ）を含む１．２％アガロースゲルで電気泳動を行った。５０ｍＭのＮａＯＨで２０分間処理した後、２０×ＳＳＣ（酢酸ナトリウム／塩化ナトリウム緩衝液）で４５分間中和し、ゲル中のＲＮＡをHybond N+ナイロン膜に一晩転写し、５０ｍＭのＮａＯＨで５分間固定した。膜上に固定されたＲＮＡを４２℃で３時間、５０％  ホルムアルデヒド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中でプレハイブリダイズした。ハイブリダイズは32Ｐラベルしたプローブ(1×106cpm/ml（上記＜３＞で得られたチャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理して得られた断片）)を含む上記緩衝液で行った。この膜は５０℃で１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳにより洗浄した後、同温度で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳにより洗浄した。この膜を−８０℃で１４時間、増感膜を用いてＸ線フィルムに感光させた。その結果、４．０ｋｂのバンドが得られた。
【００６８】
＜９＞インシチュハイブリダイゼーションによるニワトリ胚におけるＨＳ６ＳＴ発現の確認
孵卵２〜５日のニワトリ胚を４％のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水で常法に従って固定した。配列番号６記載の塩基配列のうち、PstI-EcoRI断片（塩基番号945〜塩基番号1679からなる断片）を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行い、デゴキシジェニンで標識したＲＮＡを合成してプローブとした。このプローブを発生段階の異なるニワトリ胚にハイブリダイズさせた後、アルカリホスファターゼを付加した抗ディオキシジェニン抗体を反応させ、更にアルカリホスファターゼの基質を添加して発色させることによりｍＲＮＡの発現部位を観察した。
【００６９】
その結果、ＨＳ６ＳＴ遺伝子は脳の神経上皮、頭部の神経冠細胞、肢芽、尾芽などで強く発現していることが判明した。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、ヘパラン硫酸及びヘパリンに含まれる６位が硫酸化されていないＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基に硫酸基を選択的に転移するヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＨＳ６ＳＴ）のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られる。また更に該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片から発現されるポリペプチドが得られる。
【００７１】
本発明により、ＨＳ６ＳＴのポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られたので、ＨＳ６ＳＴを工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。
【００７２】
【配列表】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＳ６ＳＴを酵素処理して得られたペプチド断片とそれを基に合成されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【図２】  ヒト由来のＨＳ６ＳＴのアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロット。
【図３】  １次スクリーニングで得られたチャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片とヒト由来のＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの相当部分との比較。両配列間の記号の「＊」及び「．」はそれぞれ一致及び相違することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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