(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする１５〜５０塩基のサイズの第１のプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする１５〜５０塩基のサイズの第２のプライマーとを用いて、ヒトから採取した被検ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物中のＣＡＧの反復数を調べることから成る、脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーのサイズが１８〜２５塩基である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲ産物中のＣＡＧの反復数は、該ＰＣＲ産物のサイズを測定することにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ産物中のＣＡＧの反復数は、該ＰＣＲ産物の塩基配列を決定することにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
被検ＤＮＡはゲノミックＤＮＡである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被検ＤＮＡはｃＤＮＡである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする核酸から成り、サイズが１５〜５０塩基である、請求項１ないし６の方法に用いられるプライマー。
【請求項８】
前記サイズが１８〜２５塩基である請求項７記載のプライマー。
【請求項９】
配列表の配列番号２に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする核酸から成り、サイズが１５〜５０塩基である、請求項１ないし６の方法に用いられるプライマー。
【請求項１０】
前記サイズが１８〜２５塩基である請求項９記載のプライマー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脊髄小脳変性症２型（以下、「ＳＣＡ２」ということがある）の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマーに関する。
背景技術
ＳＣＡ２は、小脳及び中枢神経系の他の領域に影響を与える、常染色体性優性神経変性症である。
最近、歯状赤核小脳委縮（dentatorubral-pallidoluysian atrophy(DRPLA)）等５種類の神経変性疾患において、原因遺伝子にはＣＡＧから成るトリプレットの反復数が正常な遺伝子よりも多く含まれていることが明らかになった。すなわち、これらの神経変性疾患患者の原因遺伝子では、ＣＡＧの反復数が３７〜１００回であるのに対し、正常な遺伝子では３５未満である。
ＳＣＡ２についても、原因遺伝子ではＣＡＧの反復数が増大していることが示唆されている（Trottier, Y. et al. Nature, 378, 403-406(1995)）。しかしながら、ＳＣＡ２の原因遺伝子は同定されておらず、その塩基配列も明らかではないので、ＳＣＡ２を遺伝子検査により診断することはできない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、ＳＣＡ２の原因遺伝子を検出する方法及びそのためのプライマーを提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＡＧ反復単位を５５個含む、32Ｐで標識された一本鎖ＤＮＡプローブ（以下、このプローブを「(CAG)55プローブ」ということがある）を用い、ＳＣＡ２患者及び健常人のゲノミックＤＮＡを各種制限酵素で切断してサザンブロットを行った結果、ＳＣＡ２患者においてのみ、2.5kbのTspEI断片が検出されることがわかった。なお、(CAG)55プローブは、ハイブリダイゼーションの条件を適正に設定することにより、ＣＡＧ反覆単位を約３５個以上有するＤＮＡ領域とのみ選択的に部分的にハイブリダイズする。上記2.5kbのTspEI断片をクローニングしてその部分塩基配列を決定した。一方、クローニングされたＤＮＡ断片をプローブとして用いて健常人のゲノミックＤＮＡをサザン分析することにより、正常な遺伝子が得られ、その塩基配列を決定した。ＳＣＡ２患者の遺伝子と正常遺伝子を比較したところ、ＣＡＧ反復単位の数が異なっており、かつその他はほとんど同一であった。ＣＡＧ反復を挟むようにプライマーを設定してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のサイズを測定することにより、ＰＣＲ産物中のＣＡＧ反復単位の数を決定した。ＳＣＡ２染色体３４種及び正常染色体２８６種についてＣＡＧ反復単位の数を測定したところ、ＳＣＡ２遺伝子ではＣＡＧ反復単位の数が全て３５個以上であったのに対し、正常遺伝子では１５〜２４個であった。従って、このＣＡＧ反復単位の数を測定することにより、ＳＣＡ２の遺伝子診断が可能である。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする１５〜５０塩基サイズの第１のプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする１５〜５０塩基のサイズの第２のプライマーとを用いて、ヒトから採取した被検ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物中のＣＡＧの反復数を調べることから成る、脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子の検出方法を提供する。また、本発明は、上記方法に用いられる、上記第１のプライマー及び第２のプライマーも提供する。
本発明により、ＳＣＡ２の遺伝子診断が初めて可能になった。従って、本発明はＳＣＡ２の診断に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＣＡ２の原因となる遺伝子の塩基配列を示す図である。
図２は、実施例に用いたゲノミックＤＮＡの提供者であるＳＣＡ２患者の人達の家系図である。
図３は、正常な対立遺伝子に由来するゲノミックＤＮＡ断片であるTsp-2の制限酵素地図を示す図である。
図４は、同じくTsp-2の塩基配列を、各プライマーのハイブリダイズ領域とともに示す図である。
図５は、正常遺伝子及びＳＣＡ２遺伝子中のＣＡＧ反復領域及びその直後の塩基配列を示す図である。
図６は、本発明の方法により測定された、正常遺伝子及びＳＣＡ２遺伝子中のＣＡＧ反復単位の数の分布を示す図である。
図７は、ＣＡＧ反復単位の数とＳＣＡ２の発病年令の相関関係を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
下記実施例において詳述するように、本発明によりＳＣＡ２の原因遺伝子の部分塩基配列が決定された。さらに、健常人の対応する遺伝子の部分塩基配列も決定された。これらを比較すると、ＳＣＡ２原因遺伝子と正常な遺伝子とでは、その中に含まれるＣＡＧトリプレットの反復回数が異なっていることが判明した。すなわち、下記実施例に詳述するように、多数のＳＣＡ２患者遺伝子及び健常人遺伝子について調査した結果、ＳＣＡ２遺伝子ではＣＡＧ反復単位の数が３５個ないし５５個であったのに対し、健常人では１５個ないし２４個であり、９４．４％の人は２２個であった。従って、このＣＡＧ反覆単位の数を調べることにより、ＳＣＡ２の診断を行なうことができることが明らかになった。
本発明により決定されたＳＣＡ２の発病に関与する遺伝子の塩基配列は図１に示されている。図１中、（ＣＡＧ）nで示される部分がＣＡＧトリプレットの反覆部分を示す。また、（CCG CCG CAG）の部分はＳＣＡ２遺伝子中に含まれる場合も含まれない場合もあり、また、正常遺伝子中には含まれない配列である。塩基が大文字で記載されている部分がデノミックＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方から決定された塩基配列の部分であり、小文字で記載されている部分がゲノミックＤＮＡから決定された塩基配列の部分である。なお、ゲノミックＤＮＡとｃＤＮＡで配列が異なっている部位の塩基配列は上下２段に示し、上側にｃＤＮＡから決定された配列が記載されている。
下記実施例で詳細に述べるように、細かい相違点は他にもあるものの、ＳＣＡ２遺伝子と正常な遺伝子との主な相違点は図１中、（ＣＡＧ）nで示されるＣＡＧ反覆単位の数である。従って、このＣＡＧ反覆単位の数を調べることにより、ＳＣＡ２の診断を行なうことができる。
本発明の方法では、このＣＡＧ反覆単位の数を調べるために、図１中のＣＡＧ反覆領域を挟む部分をＰＣＲで増幅する。このためには、ＣＡＧ反覆領域の上流及び下流にそれぞれプライマーを設定し、ＰＣＲを行なえばよい。
ＣＡＧ反覆領域の上流部分の塩基配列が配列表の配列番号１に、下流部分の塩基配列が配列番号２に記載されている。これらの領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なう。プライマーは、これらの領域中のどの領域とハイブリダイズするものであってもよい。プライマーのサイズは特に限定されないが、通常１５〜５０塩基、好ましくは１８〜２５塩基程度である。
これらのプライマーを用い、検体ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行なう。検体ＤＮＡとしては、ＳＣＡ２か否かを診断しようとする人から採取したＤＮＡであり、これは末梢血などから常法により容易に調製することができる。また、図１中のＣＡＧ反覆領域の上流及び下流域であって、塩基配列が大文字で記載されている部分にプライマーを設定した場合には、ゲノミックＤＮＡのみならず、ｃＤＮＡも鋳型として用いることができる。ＰＣＲの方法自体はこの分野において周知であり、そのためのキットも市販されているから容易に行なうことができる。下記実施例にもＰＣＲの詳細が記載されている。
次いで、増幅されたＰＣＲ産物中のＣＡＧ反覆単位の数を調べる。これは、例えば、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定することにより行なうことができる。あるいは、適当なマーカーとともにゲル電気泳動を行ない、ＰＣＲ産物のサイズを決定することにより行なうこともできる。後述の実施例では、ＣＡＧ反覆単位の数が少しずつ異なるＳＣＡ２遺伝子を作製し、これらをサイズマーカーとして用いてゲル電気泳動を行なうことによりＰＣＲ産物のサイズを決定し、ひいてはその中に含まれるＣＡＧ反覆単位の数を測定した。なお、ＰＣＲ産物中のＣＡＧ反覆単位の数を調べる方法はこれらに限定されるものではなく、ＣＡＧ反覆単位の数を測定することができる方法であればどのような方法を用いてもよい。さらに、ＣＡＧ反覆単位の数が約３５個以上か否かを識別するだけの方法でもよい。このような方法も本発明でいう「ＣＡＧ反覆単位の数を調べる」方法に包含される。例えば、上記した(CAG)55プローブのようなプローブを用い、該プローブが約３５個以上のＣＡＧ反覆単位を有するＤＮＡとのみ部分的にハイブリダイズする条件でＰＣＲ産物とハイブリダイズさせることもできる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、下記実施例は例示のためにのみ記載するものであり、如何なる意味においても限定的に解釈されてはならない。
参考例１  (CAG)55プローブの調製
ＣＡＧ反覆単位を５０個含むＤＲＰＬＡ遺伝子（Koide, R. et al., Nature Genet., 6, 9-13(1994)）をＤＲＰＬＡ患者のゲノミックＤＮＡから増幅し、プラスミドベクターpT7Blue T(p-2093)にサブクローニングした。p-2093は、(CAG)55及びその両端のフランキング配列を含む。すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA(CAG)55 CAT CAC GGA AAC TCT GGG CC-3'で表される配列を含む。一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA CA-3'及び5'-ビオチン-GGC CCA GAG TTT CCG TGA TG-3'を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2M N,N,N-トリメチルグリシン、0.1mM TTP, 0.1Mm dCTP, 0.1mM dGTP, 9.25MBqの[α-32P]dATP(222TBq/mmol),0.5mMずつの各プライマー、0.3ngのプラスミドＤＮＡ（p-2093）及び2.0UのTaq  ＤＮＡポリメラーゼ（日本国京都府の宝酒造社製）を含む全量１６μｌの溶液を用いて行った。最初に９４℃で２分間変性を行った後、９４℃、１分の変性、５４℃、１分のアニーリング、７２℃、３分の伸長を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間伸長を行った。
ストレプトアビジンを被覆した磁化ビーズ(Dynabeads M-280, Streptavidin;Dynal AS, Oslo, Norway)を用いて一本鎖(CAG)55プローブを調製した。すなわち、ＰＣＲ産物をストレプトアビジン被覆磁化ビーズに吸着させた後、５ｍＭ Tris-HCl(pH7.5)、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１Ｍ  ＮａＣｌを含む４０μｌの溶液でビーズを洗浄した。次いで５０μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で１０分間インキュベートすることにより、放射標識された非ビオチン化鎖をビオチン化鎖から分離した。得られた上清をプローブ液としてそのまま下記ハイブリダイゼーションに用いた。
なお、上記のようにして調製した一本鎖(CAG)55プローブを用いて、ＣＡＧ反復単位数が９、２２、４３、５１であるアンドロゲンレセプター遺伝子についてサザン分析を行ったところ、(CAG)55プローブはＣＡＧ反復単位が４３及び５１個の遺伝子とは強くハイブリダイズしたが、２２個の遺伝子とはほとんどハイブリダイズせず、９個の遺伝子とは全くハイブリダイズしなかった(K. Sanpei et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, Vo1.212, No.2, 1995, pp.341-346)。すなわち、このプローブを用いれば、ハイブリダイゼーション条件を適正に設定することにより、ＣＡＧ反復単位を多数（例えば３５個以上）含むＤＮＡとのみ特異的にハイブリダイズさせることが可能である。
実施例１  ＳＣＡ２遺伝子の塩基配列決定
図２には、ＳＣＡ２患者の家系図を示す。この家系図において、男性が四角、女性が丸で示されており、患者は黒く塗りつぶされており、健常人は白抜きで示されている。
これらのＳＣＡ２患者及び健常人から常法により採取した高分子量ゲノミックＤＮＡ（各１５μｇ）を１００ＵのTspEI（日本国大阪府の東洋紡績社製）で消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、該膜を上記(CAG)55プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、2.75 x SSPE(1 x SSPE=150mM NaCl, 10mM NaH2PO4, 1mM EDTA), 50%ホルムアミド、５ｘデンハルツ液、100ng/ml剪断サケ精子ＤＮＡ及び(CAG)55プローブ(6 x 106cpm/ml)を含む溶液中で６２℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、0.5% SDSを含む1 x SSC（150mM NaCl, 15mMクエン酸ナトリウム）で膜を６５℃で０．５時間洗浄した。次いで、ＭＳ増感スクリーンを用い、Kodak Bio Max MSフィルムに１６時間−７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。
その結果、全てのＳＣＡ２患者についてのみ、プローブとハイブリダイズした2.5kbpのTspEI断片が検出された。
そこで、一人のＳＣＡ２患者（図２中の７）からゲノミックＤＮＡを常法により抽出し、その２７０μｇをTspEIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけた。上記した2.5kbのTspEI断片を包含するデノミックＤＮＡ断片を、EcoRIで開裂したλZAPIIベクターにクローニングした。得られたゲノミックライブラリーを上記(CAG)55プローブを用い、上述したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。増大したＣＡＧ反復を含むゲノミッククローンTsp-1が単離された。
プローブを除去した後、ランダムプライム法により標識したTsp-1をプローブとして用いて上記ゲノミックライブラリーを再度スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは5 x SSC, 1 x デンハルツ液、１０％硫酸デキストラン、２０ｍＭリン酸ナトリウム、４００μｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡ及びTsp-1プローブを含む溶液中で４２℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.1 x SSC-0.1% SDS中で５２℃で０．５時間洗浄した。ＭＳ増感スクリーンを用い、膜をKodak Bio Max MSフィルムに−７０℃で２４時間オートラジオグラフィにかけた。その結果、正常な対立遺伝子由来のゲノミッククローンであるTsp-2が単離された。
Tsp-2の制限酵素地図を図３に示す。ＣＡＧ反復（白抜きボックス）は推定的な第１エクソン（黒塗りボックス）中にある。
また、Tsp-2のSmaI-ApaI断片（630bp）の塩基配列を決定した。これを図４及び配列表の配列番号３に示す。図４中、塩基が大文字で記載されている部分がゲノミックＤＮＡ及びｃＤＮＡ（後述）の両方から決定された塩基配列の部分であり、小文字で記載されている部分がゲノミックＤＮＡから決定された塩基配列の部分である。なお、ゲノミックＤＮＡとｃＤＮＡで配列が異なっている部位の塩基配列は上下２段に示し、上側にｃＤＮＡから決定された配列が記載されている。推定アミノ酸配列が塩基配列の下に記載されている。翻訳は、推定的第１エクソンの最も長いオープンリーディングフレーム中のＡＴＧコドンから始まった。
ヒト大脳皮質ｃＤＮＡライブラリー(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)をオリゴヌクレオチドＦ−１及びＲ−１をプローブとして用いてスクリーニングした。Ｆ−１及びＲ−１がハイブリダイズする部位は図４に示すように、ＣＡＧ反復領域を挟むように設定されている。ハイブリダイゼーションは、6 x SSC, 10 x デンハルツ液、0.5% SDS, 0.05%ピロリン酸ナトリウム、100ng/ml剪断サケ精子ＤＮＡ及び末端標識オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液中で５５℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.5% SDS及び0.05%ピロリン酸ナトリウムを含む6 x SSC中で５５℃で０．５時間洗浄した。両方のプローブとハイブリダイズするクローンFc-1が得られた。このｃＤＮＡの５’末端を同定するために、5'-RACE-Ready cDNA(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)を用いて5'-RACEを行った。プライマーＲ−１を第１のＰＣＲに用い、プライマーＲ−２（図４参照）を第２のＰＣＲに用いた。なお、forward側のプライマーとしてはいずれの場合もＦ−１（図４参照）を用いた。350bpの5'-RACE産物をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした(5'-RACE-1)。5'-RACE-1の同一性は、Fc-1，Tsp-1及びTsp-2の塩基配列とのオーバーラップにより確認した。塩基配列は二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により決定した。
さらに、ＳＣＡ２患者及び健常人からのゲノミックＤＮＡから得られたＦ−１（forward側）及びＲ−１（reverse側）をプライマーとして用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、プラスミドベクターpT7Blueにクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、健常人ではＣＡＧ反復領域の中に１個又は２個のＣＡＡが含まれているが、ＳＣＡ２患者ではこれが存在しない。また、ＳＣＡ２患者では、ＣＡＧ反復領域の直後にCCG CCG CAGが挿入されている場合がある。
実施例２  検体中のＣＡＧ反復単位数の測定
プライマーＦ−１及びＲ−１を用いて得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、ＣＡＧ反復単位の数を測定した。ＰＣＲは、10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 2.0mM MgCl2, 1.7M N,N,N-トリメチルグリシン、111KBqの[α-32P]dCTP(111Tbq/mmo1), 30μM dCTP,各200μＭのdATP, dGTP及びTTP，各0.25μＭの上記２種類のプライマー、200ngのゲノミックＤＮＡ並びに1.25UのTaq DNAポリメラーゼを含む全量１０μｌの溶液中で行った。まず、９５℃、２分間変性を行った後、９５℃、１分間の変性、６０℃、１分間のアニーリング及び７２℃、１分間の伸長からなるサイクルを３２回繰り返し、最後に７２℃、５分間の伸長を行った。ＳＣＡ２遺伝子のクローン化されたゲノミック領域を用いて得られた、種々のサイズのＣＡＧ反復単位を含む配列ラダー(sequence ladder)をサイズマーカーとして用いた。ＣＡＧ反復領域中にＣＡＡを含む正常な対立遺伝子の場合には、これらのＣＡＡ単位はＣＡＧ反復サイズに含めた。ＣＡＧ領域が増大しているＳＣＡ２対立遺伝子の場合、ＣＡＧ領域直後の上記挿入配列はＣＡＧ領域のサイズには含めなかった。
上記の方法により、健常人（２８６染色体）及び１０家系のＳＣＡ２患者（３４種のＳＣＡ２染色体）におけるＣＡＧ反復単位数を測定した。結果を図６に示す。図６中、白抜きの棒グラフが正常遺伝子についての結果を示し、黒塗りの棒グラフがＳＣＡ２遺伝子についての結果を示す。
図６から明らかなように、正常遺伝子ではＣＡＧ反復単位の数が全て２４個以下であるのに対し、ＳＣＡ２遺伝子では全て３５個以上であった。よって、本発明の方法により、ＳＣＡ２の遺伝子診断が可能であることが立証された。
さらに、上記で測定されたＣＡＧ反復単位数と、ＳＣＡ２の発病年令の相関関係を図７に示す。その結果、統計学的に負の相関が認められた。このことから、ＣＡＧ反復単位の数の増大がＳＣＡ２の発病と関係していることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明により、ＳＣＡ２の遺伝子検査が初めて可能になった。従って、本発明はＳＣＡ２の診断に大いに貢献するものと期待される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３５５
配列の型：核酸
鎖の数：２
配列
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配列番号：２
配列の長さ：２０５
配列の型：核酸
鎖の数：２
配列
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配列番号：３
配列の長さ：６２３
配列の型：核酸
鎖の数：２
配列
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配列番号：４
配列の長さ：２１３
配列の型：核酸
鎖の数：１
配列
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配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
配列
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配列番号：７
配列の長さ：７５
配列の型：核酸
配列
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配列番号：８
配列の長さ：７８
配列の型：核酸
配列
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配列番号：９
配列の長さ：７８
配列の型：核酸
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：７８
配列の型：核酸
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：７８
配列の型：核酸
配列
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配列番号．：１２
配列の長さ：７８
配列の型：核酸
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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