(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の有する性分化の撹乱作用を評価する方法であって、
（１）性分化の撹乱作用を評価しようとする試料をメダカに投与する工程、
（２）メダカの遺伝子型の性を判定する工程、
（３）メダカの表現型の性を配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するメス特異的遺伝子の発現から判定する工程、および、
（４）（２）、（３）の結果より性分化が撹乱作用を受けたかどうかを判定する工程、
を包含することを特徴とする性分化の撹乱作用の評価方法。
【請求項２】
遺伝子型の性を孵化前のメダカの卵、あるいは孵化後５日以内のメダカの稚魚において判定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
表現型の性を孵化後５日以内のメダカの稚魚において判定する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
試料を孵化前のメダカの卵、あるいは孵化後５日以内のメダカの稚魚に投与する請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
遺伝子型の性が色素の発現とリンクした系統のメダカを使用することを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡの生成を指標に配列表の配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子の発現を調べることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載の方法により性分化の撹乱作用を評価することを特徴とする内分泌撹乱物質の検出方法。
【請求項８】
請求項１〜６いずれかに記載の方法により性分化の撹乱作用を評価するためのキットであって、配列表の配列番号５に示される塩基配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により内分泌撹乱物質の検出を行なうためのキットであって、配列表の配列番号５に示される塩基配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は医学、薬学、環境学、食品学の分野において化学物質の内分泌撹乱作用を迅速に評価する方法およびそれに関連する一連の技術に関する。
【０００２】
背景技術
内分泌撹乱物質は、しばしば環境ホルモンとも呼ばれており、環境中に放出された化学物質のうちホルモン類似作用あるいは抗ホルモン作用が見出されたものを総称して言う。内分泌撹乱物質の野生動物の生態系への影響としては、生殖能の変化、特にオスのメス化、生殖能の低下、孵化率の低下、子の生存率の低下、生殖行動の異常等が報告されている。また、ヒトの健康への影響としては、まだ証明はされていないが、精子数の減少、子宮内膜症、不妊、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌等が疑われている。
【０００３】
内分泌撹乱を引き起こすと考えられている物質（群）については、環境庁の「外因性内分泌撹乱化学物質問題に関する研究班」１９９７年７月の中間報告において報告されている。しかしながら、こうした物質は、今後の調査・研究の過程でさらに増えていくことが予想されている。
【０００４】
一方、内分泌撹乱作用の測定方法としては、インビトロ測定法とインビボ測定法の２通りの方法が知られており、前者では、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプター、あるいは甲状腺ホルモンレセプターとの結合活性を測定する方法や、ホルモン合成酵素系の阻害活性を測定する方法が知られている。後者では、出生後日齢の異なる個体の各種ホルモン産生および組織形成異常を測定する方法、カエルの変態異常を測定する方法、サカナの成熟異常を測定する方法等が知られている（アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７０巻、第１５号、第５２８Ａ〜５３２Ａ頁（１９９８））。
【０００５】
インビトロ測定法は、感度が良い、短時間に多検体のアッセイが可能などのメリットがあるが、あくまでもレセプターとの結合活性等を測定する方法であり、該測定法では本当に内分泌が撹乱されたのかどうかを調べることは出来ない。一方、ラット、カエル、サカナ等の動物を用いたインビボ測定法は、実際の内分泌への影響を直接調べる方法であり、生体への影響や環境への影響を調べる上で必要なことではあるが、感度が低い、複雑な操作を必要とする、多数のサンプルを調べるのに長時間を必要とする等の欠点がある。
【０００６】
例えば、サカナのメス特異的タンパク質である卵黄タンパク前駆物質ビテロジェニンのオスにおける発現をビテロジェニン抗体を用いて測定することによってオスのメス化をモニターし、内分泌撹乱作用を評価する系が構築されているが、該方法で一度に多検体を処理することは困難であり、また、成魚で評価するため撹乱作用を受けやすい稚魚での評価系に比べて感度が低いことが予想される。また、広大な飼育スペースや長期の飼育期間が必要となるという問題もある。さらには、評価するサカナの抗ビテロジェニン抗体が必要となる。
【０００７】
卵の孵化率や成魚の産卵数を指標とした評価方法、あるいは求愛行動などをモニターすることによる評価方法なども提案されている（Ｌｉｓａ Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７: ４９―５７， １９９８）が、実際に性分化が撹乱を受けたかどうかをみることは出来ない。
【０００８】
性分化が撹乱を受けたかどうかを調べるには一個体の遺伝子型の性と表現型の性の両方を判定し比較することによって可能である。例えば、稚魚あるいは卵の段階から環境ホルモンを投与し、飼育し、二次性徴に伴う表現型の性を判定し性転換を指標とした撹乱作用アッセイ系が提案されているが、例えばメダカの場合、遺伝子型の性は、ＰＣＲ法（Ｓｈｉｎｏｙａｍａ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｆｉｓｈ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ＭＥＤＡＫＡ １０： ３１―３１， １９９９）や、遺伝子型の性が色素発現とリンクした系統のメダカｄ−ｒＲ（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｚｏｏｌ． １２３: ５７１―５９４， １９５８）やＱｕｒｔ（Ｗａｄａ Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：  １２３―１２６，１９９８）で、判定することができるが、表現型の性を稚魚の段階でみるには組織切片を作製して生殖腺を顕微鏡観察する必要があり、多検体を処理するのは困難である。また、二次性徴に伴うヒレの形状による表現型の性の決定には少なくとも１ヶ月以上の飼育が必要であり、しかもその判定には習熟が必要である。また、この方法においても多検体の処理は困難である。このように、生体を利用したインビボアッセイは、評価を開始してから長時間を要する上に一度に多検体のアッセイを行うのは困難であるというのが実情である。しかし、化学物質の評価や、水環境の評価、水質汚染のモニター等を考えた場合、これら生体を用いたアッセイは必要であり、しかも、迅速かつ正確なアッセイ系の構築が求められている。
【０００９】
内分泌撹乱作用を調べるということは、化学物質が人体に及ぼす影響を評価する指標となると同時に、環境に放出された場合の生体への影響、生態系への影響、水質汚染のモニターの指標となりうる。しかしながら、従来の技術には上記したような欠点があり、内分泌撹乱作用を感度良く迅速に測定する方法が望まれている。
【００１０】
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、メダカの発生の初期において、表現型のメスに特異的に発現する遺伝子を単離同定することに初めて成功した。そして該遺伝子を用いてメダカの稚魚の段階で表現型の性を迅速に判定し、これを遺伝子型の性と比較することにより性分化の撹乱状態を調べることが可能であることを見出した。さらに、上記方法により試料の有する内分泌撹乱作用を迅速に測定することができることを見出し、化学物質、湖沼、河川や海など水環境等の試料の内分泌撹乱作用をインビボにて迅速に、かつ多くのサンプルを同時に評価する方法の構築に成功し、発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明を概説すると、本発明の第１の発明は、表現型の性にしたがってメス特異的に発現される遺伝子であって、配列表の配列番号１〜２１に示される塩基配列を有することを特徴とする遺伝子に関する。さらに、該配列に厳密な条件においてハイブリダイズする、ならびに該配列にイントロンが挿入されてなる遺伝子に関する。
【００１２】
本発明の第２の発明は、試料の有する性分化の撹乱作用を評価する方法であって、
（１）性分化の撹乱作用を評価しようとする試料をメダカに投与する工程、
（２）メダカの遺伝子型の性を判定する工程、
（３）メダカの表現型の性をメス特異的遺伝子の発現から判定する工程、および、
（４）（２）、（３）の結果より性分化が撹乱作用を受けたかどうかを判定する工程、を包含することを特徴とする性分化の撹乱作用の評価方法に関する。
【００１３】
本発明の第３の発明は、第２の発明の方法によって性分化の撹乱作用を評価することを特徴とする内分泌撹乱物質の検出方法に関する。
【００１４】
本発明の第４の発明は、第１の発明の遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【００１５】
本発明の第５の発明は、第２の発明の性分化の撹乱作用の評価方法を行うためのキットに関する。
【００１６】
本発明の第６の発明は、第３の発明の内分泌撹乱物質の検出方法を行うためのキットに関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明に適用される試料としては特に限定はなく、天然、あるいは人工的に合成された化学物質があげられる。これらの物質は単離された状態、もしくは混合物として本発明の方法に供することができる。さらに、環境由来の試料、例えば河川水、土壌等も本発明の方法の適用対象である。
【００１８】
本発明の方法に用いられる生物には、小型で実験室で取り扱いやすく、多くの卵を産み、世代時間も約３ヶ月と短く、近交化によって遺伝子構成の均一な株の樹立も可能であり、遺伝子の研究材料としては広く用いられているメダカが使用される。
【００１９】
メダカは孵化してから１週間程度は蒸留水の入った９６穴マイクロプレート中で飼育可能である。餌を与える必要もないので、餌による撹乱作用など、二次的な要因を排除した評価を行なうことが出来る。
【００２０】
また、メダカは真水から海水まで様々な塩分濃度の水中で飼育可能であり、さらに飼育可能な水温も０℃近くから３０℃程度と広く、様々な環境を想定した評価に用いることが出来る。
【００２１】
本発明に用いられるメダカに特に限定はなく、野生型のメダカや、遺伝子型の性が色素発現とリンクした系統のメダカであるｄ−ｒＲやＱｕｒｔ等を用いることができる。
【００２２】
性と密接にリンクしたｌｆ（ｌｅｕｃｏｐｈｏｒｅ  ｆｒｅｅ）ローカスがヘテロな系統のメダカであるＱｕｒｔは、メスＸlf／Ｘlfが無色であるのに対し、オスＸlf／Ｙ+は色素の発現によって卵の段階で黄色を呈するため、ＤＮＡを抽出することなく卵の段階で容易に顕微鏡下で遺伝子型の性を判定することができ（Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：  １２３―１２６，１９９８）、本発明に好適に使用される。
【００２３】
本発明の遺伝子型の性を判定する方法に特に限定はなく、例えば、性染色体を遺伝子解析することによって判定することが出来る。
【００２４】
メダカの場合、遺伝子型の性は性染色体Ｘ／Ｘがメス、Ｘ／Ｙがオスと受精時に決定されている。すなわち、遺伝子型の性は、この性染色体を遺伝子解析することによって判定できる。遺伝子解析の方法には特に限定はないが、例えば、性染色体上の遺伝子にハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーション法、性染色体上の遺伝子を増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲによって解析することが出来る。これらの方法で遺伝子型の性を判定する場合は、後述する表現型の性の判定において、同時にメス特異的遺伝子の発現をＲＮＡで解析する必要があるため、一個体からＤＮＡとＲＮＡの両方を調製する必要がある。このような場合は、稚魚を頭部で切断し、生殖腺などを含む腹部を中心とした部分は後で記述する表現型の性に従って特異的に発現される遺伝子の発現の判定に使用し、頭部からＤＮＡを抽出して遺伝子型の判定に使用する。あるいは、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡとＲＮＡを同時に調製してもよい。さらには、検体数が多い場合には、ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いると９６穴マイクロプレートで、多検体のＤＮＡの同時調製が可能である。
【００２５】
また、上記したメダカＱｕｒｔを用いた場合には、受精後２日目には遺伝子型の性に特異的な色素の発現の違いが認められ、この色素を検出することでＤＮＡを調製することなく、卵の段階で遺伝子型の性の判定を行なうことが出来る。
【００２６】
本発明の方法の表現型の性の判定に用いられる遺伝子としては、メダカにおいて表現型の性に特異的に発現するものが用いられ、例えばメダカの表現型のメスに特異的に発現する遺伝子が用いられる。さらに、早い段階で評価を行なう観点から、孵化後５日以内に特異的に発現するものが好適である。
【００２７】
該遺伝子としては、例えば、
（１）ベーシック  ヘリックス  ループ  ヘリックスモチーフを含有する転写因子  ＦＩＧα、
（２）伸長開始因子のキャップ結合サブユニット  ｅＩＦ−４、
（３）ＺＰドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子群、
（４）卵母細胞特異的ＲＮＡ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子  ４２Ｓｐ５０、４２Ｓｐ４３、
（５）キノンレダクターゼ遺伝子、
（６）分泌タンパク質をコードする未知の遺伝子群。
等が挙げられ、例えば、配列表の配列番号１〜２１で表される配列、あるいは該配列に厳密な条件においてハイブリダイズする配列を有するものが挙げられる。ハイブリダイゼーションにおける厳密な条件とは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T. Maniatis）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.）に記載されており、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブと共に６５℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
【００２８】
上記の遺伝子は、染色体上ではイントロンが挿入されて存在している。このようなイントロンの挿入された遺伝子も本発明の範囲に包含される。そのような遺伝子の例として、例えば、配列表の配列番号１の配列にイントロンが挿入された配列番号２２で表される塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号８の配列にイントロンが挿入された配列番号２３で表される塩基配列を有する遺伝子等が挙げられる。
【００２９】
上記遺伝子は、例えば以下のようにして単離することが出来る。
メダカにおける最初の性分化の兆候は孵化時、すなわち受精後約１０日目に、メスがオスの約２倍の生殖細胞を持つという現象に認められる（Ｓａｔｏｈ  Ｎ，  Ｅｇａｍｉ  Ｎ．  Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｅｘｐ  Ｍｏｒｐｈ  ２８：  ３８５−３９５，  １９７２）。これは、孵化直後からメスの生殖細胞の一部は有糸分裂を開始するのに対して、オスの生殖細胞は孵化後２ヶ月までは分裂しないためである。このような生殖細胞系列での性分化の違いを指標として、発生初期段階で、メスに特異的に発現している遺伝子群を同定することが可能である。メダカのオスとメスの間で発現する遺伝子の違いは、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって調べることが可能である。孵化前に遺伝子型のオス、メスを分け、孵化後にそれぞれからＲＮＡを抽出し、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって、メス特異的に発現する遺伝子を単離することができる。孵化前の遺伝子型のオスとメスの分別は、上記のメダカＱｕｒｔを使用した場合には、受精後２日目に色素遺伝子の発現を指標として容易に分別できる。
【００３０】
さらに、このようにして得られた遺伝子をプローブに用いて、公知の方法でゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、各々の遺伝子に対応するゲノム遺伝子を単離することが出来る。
【００３１】
上記の遺伝子は、該遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドを用いて検出することが出来る。本発明の遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドとしては、特に限定はなく、当該遺伝子、もしくはその一部を遺伝子増幅法によって増幅することが出来るプライマー、または当該遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブ等が挙げられる。
【００３２】
遺伝子増幅法としては、特に限定するものではないが、例えばＰＣＲ法、ＳＤA法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法（WO00/56877号公報）等が使用できる。
【００３３】
プライマー、プローブは上記の遺伝子の塩基配列をもとに任意に設計することができるが、その設計にあたってはプライマー、プローブが分子内で二次構造を形成しないような配列を選ぶとともに、プライマー、プローブと鋳型との融解温度（Ｔｍ値）が適当な温度になるよう注意することは言うまでもない。
【００３４】
プライマー、プローブのＴｍは、例えば、下記式：
Tm = 81.5 - 16.6 (log10[Na+]) + 0.41 (%G+C) - (600/N)
（式中、Ｎはプライマー、プローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはプライマー、プローブ中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００３５】
また、プライマー、プローブの鎖長が１８塩基より短い場合は、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量の４℃との積との和［(A+T) x 2 + (G+C) x 4］により推定することができる。
【００３６】
上記プローブの鎖長としては、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、１５塩基以上であることが好ましく、１８塩基以上であることが更に好ましい。
【００３７】
上記プライマーの鎖長には、特に限定はないが、例えば、１５〜４０塩基の鎖長のものを使用することが出来、特に１７〜３０塩基の鎖長のものを好適に使用することができる。
【００３８】
また、プライマーにおいては３’−末端付近はシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の割合が高くなるように設計することが望ましい。プライマーの設計には市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯTM  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用してもよい。
【００３９】
上記の遺伝子の検出が可能な範囲であれば、プライマー、プローブはその配列の一部に塩基の欠失、置換、挿入、あるいは付加などの変異を有していてもよい。なお、プライマーにおいては、プライマー伸長反応の効率に大きく影響を与えるプライマーの３’−末端付近については変異がないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめることが好ましい。さらに、プライマーの５’側に上記遺伝子の塩基配列とは無関係な適当な塩基配列、たとえばＲＮＡポリメラーゼの認識するプロモーター配列等を付してもよい。
【００４０】
プライマー、プローブは必要に応じて適当な修飾を施して使用することが可能である。ビオチンやジゴキシゲニンのようなリガンドや蛍光物質などを付したプライマー、プローブは増幅反応後の産物の検出を容易にする。
【００４１】
上記のプライマーを使用した遺伝子増幅反応の産物は、増幅反応後の反応液の一部をとって電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色することにより検出することができる。また、ハイブリダイゼーション法を利用して電気泳動を行うことなく増幅産物を検出することも可能である。上記の修飾を付したプライマーを使用した場合には、当該修飾に応じた適当な検出方法を使用することもできる。
【００４２】
上記のプライマー、プローブを含むキットを構築し、本発明の遺伝子の検出に用いることができる。このようなキットは増幅反応やハイブリダイゼーションに用いるための緩衝液や酵素を含むことができ、さらに簡便に検出を行うために細胞からの核酸試料の調製や増幅産物の検出に使用される試薬類を含んでいてもよい。
【００４３】
上記遺伝子の発現を検出する方法としては、特に限定はなく、例えば孵化後１〜５日目のメダカより調製したＲＮＡ中の、上記遺伝子より転写されたｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等によって検出することによって発現の検出が出来る。
【００４４】
メダカよりのＲＮＡの調製は、例えば、メダカの個体を直接ＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ社製）等で処理して行なうことができる。あるいは、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡと同時に調製することもできる。この場合、同時に得られたＤＮＡは、遺伝子型の性の判定に用いることが出来る。さらには、検体数が多い場合には、ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて９６穴マイクロプレートで、多検体のＤＮＡの同時調製が可能である。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、ゲノムＤＮＡ由来の増幅産物による擬陽性を排除する観点から、目的の遺伝子より転写されたｍＲＮＡをイントロンを挟んで増幅するようなプライマー対が望ましく、例えば、遺伝子５を検出する場合には、エキソン２中の配列を有するＦ１プライマー（配列番号３０）とエキソン８中の配列を有するＲ１プライマー（配列番号３１）の組合わせ、あるいはエキソン２中の配列を有するＦ２プライマー（配列番号３２）とエキソン７中の配列を有するＲ２プライマー（配列番号３３）の組合わせ等を使用することができる。
【００４６】
Ｆ１プライマーとＲ１プライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約７３０ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約１．１ｋｂｐであり、また、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約５９０ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約０．９ｋｂｐであり、ｍＲＮＡに由来する増幅産物とバックグラウンドであるゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を明確に区別することができる。
【００４７】
また、これらのプライマー対を用いた場合、まずＦ１及びＲ１プライマー対で１ｓｔＰＣＲを行なった後、Ｆ２およびＲ２プライマー対でＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なうことができ、この場合、更に高感度での検出が可能である。
【００４８】
遺伝子１を検出する場合には、エキソン１中の配列を有する８６３．３プライマー（配列番号２４）とエキソン３中の配列を有する８６３．１プライマー（配列番号２５）の組合わせ、あるいはエキソン１中の配列を有する８６３．３プライマー（配列番号２４）とエキソン４中の配列を有する１／１５プライマー（配列番号２６）の組合わせ等を使用することができる。８６３．１プライマーと８６３．３プライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約３００ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約１ｋｂｐであり、また、８６３．３プライマーと１／１５プライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約４００ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約４ｋｂｐであり、ｍＲＮＡに由来する増幅産物とバックグラウンドであるゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を明確に区別することができる。
【００４９】
また、遺伝子８を検出する場合には、エキソン３中の配列を有する６ａプライマー（配列番号２７）とエキソン７中の配列を有する６ｂプライマー（配列番号２８）の組合わせ、あるいはエキソン３中の配列を有する６ａプライマー（配列番号２７）とエキソン８中の配列を有する８．３プライマー（配列番号２９）の組合わせ等を使用することができる。６ａプライマーと６ｂプライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約５３０ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約１．３ｋｂｐであり、また、６ａプライマーと８．３プライマーを用いた場合、ｍＲＮＡに由来する増幅産物が約８８０ｂｐであるのに対し、ゲノムＤＮＡに由来する増幅産物は約２．２ｋｂｐであり、ｍＲＮＡに由来する増幅産物とバックグラウンドであるゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を明確に区別することができる。
【００５０】
また、ノーザンハイブリダイゼーションに用いられるプローブとしては、ゲノムＤＮＡ由来の増幅産物による擬陽性を排除する観点から、目的の遺伝子より転写されたｍＲＮＡをイントロンを挟んでハイブリダイズするようなプローブが望ましい。
【００５１】
上記遺伝子の発現は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて検出することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、スライドグラス等の固相担体に多数の異なる遺伝子、あるいはＤＮＡの断片を整列させて固定化した核酸固定化物である。ＤＮＡマイクロアレイは、試料より調製した核酸試料、好ましくは標識された核酸試料と接触させてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸試料中に存在する、マイクロアレイ上に固定化されたＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の存在を調べる目的で使用される。このようなマイクロアレイを使用して表現型の性にしたがって特異的に発現される複数の遺伝子の発現を同時にモニターすることも可能である。
【００５２】
さらに、上記遺伝子の発現は、該遺伝子から翻訳されるタンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。ここで用いられる抗体は、当該遺伝子が発現するタンパク質を認識できるものであれば特に限定はなく、公知の方法で作成されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が使用される。
【００５３】
試料の有する性分化撹乱作用は、上記の方法を用いて判定された表現型の性と遺伝子型の性を比較することで評価でき、該方法により、試料の有する内分泌撹乱作用の評価を行なうことが出来る。性分化の撹乱としては、特に限定するものではないが、表現型のメスにおいて特異的に発現する遺伝子が遺伝子型がオスである個体において発現する場合、表現型のメスにおいて特異的に発現する遺伝子が遺伝子型がメスである個体において発現しなくなる場合等が挙げられる。
【００５４】
試料の有する性分化撹乱作用は、例えば以下のようにして行なうことが出来る。
受精直後のメダカの卵を試験水中で飼育し、各々の個体の遺伝子型の性および表現型の性を上記した方法によって判定する。同一個体より得られた遺伝子型の性と表現型の性が異なる個体が性分化撹乱作用を受けた個体であり、このような個体の数を計測することにより試料の有する性分化撹乱作用を評価することが出来る。色素と遺伝子型の性がリンクした系統のメダカＱｕｒｔを使用する場合、通常、数％以下の確率で染色体転座により、遺伝子型の性と色素発現が逆転することもあるが、検体数を増やすことによって問題は解決される。また、同じく色素と遺伝子型の性がリンクした系統のメダカｄ−ｒＲでは、染色体転座は稀であり、該系統のメダカを使用する場合には、遺伝子型の性と色素発現の逆転は殆ど見られない。
【００５５】
本発明の性分化の撹乱作用を評価するためのキットは、本発明の方法を用いて性分化の撹乱作用を評価するためのキットであって、特に限定はないが、例えば上記した本発明の遺伝子の検出に用いることができるオリゴヌクレオチドを含むキットが挙げられる。このようなキットは増幅反応に用いるための緩衝液や酵素を含むことができ、さらに簡便に検出を行うために細胞からの核酸試料の調製や増幅産物の検出に使用される試薬類を含んでいてもよい。
【００５６】
本発明の内分泌撹乱物質の検出を行なうためのキットは、本発明の方法を用いて内分泌撹乱物質の検出を行なうためのキットであって、特に限定はないが、例えば上記した本発明の遺伝子の検出に用いることができるオリゴヌクレオチドを含むキットが挙げられる。このようなキットは増幅反応に用いるための緩衝液や酵素を含むことができ、さらに簡便に検出を行うために細胞からの核酸試料の調製や増幅産物の検出に使用される試薬類を含んでいてもよい。
【００５７】
本発明の方法によれば、従来、孵化してから１ヶ月以上後の二次性徴に伴うヒレの形態変化等によってしか判定できなかった表現型の性の判定を、孵化後５日目までの早い段階で行なうことが出来る。また、本発明は、格別な習熟も必要とせず、多検体の処理も可能な方法であり、天然、あるいは人工的に合成された化学物質、さらに、河川水、土壌等の環境由来の試料の内分泌撹乱作用を迅速簡便に評価に有効な方法である。
【００５８】
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１
サブトラクティブハイブリダイゼーションによるメス特異的遺伝子群の同定
成熟したＱｕｒｔ（Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：  １２３―１２６，１９９８）オス、メス各１尾を一組として、３Ｌのグリーンウォーター（精製水に緑藻のクロレラを添加した水）で水温２５℃、１４時間照明、１０時間暗条件にて飼育し、一日３〜５回、テトラミンを３〜５分で食べ切る量を与え、産卵させた。産卵後４日目の胚を、黄色色素遺伝子の発現を蛍光顕微鏡下で自家蛍光として捉えることによって遺伝子型のオスとメスに分別した。岩松の分類表（Ｉｗａｍａｔｓｕ  Ｔ．  Ｚｏｏｌ  Ｓｃｉ  １１：  ８２５−８３９，  １９９４）に従い、ステージ３７／３９（孵化２―３日前）、孵化後１日、５日、３０日の４ステージの試料からｍＲＮＡを調製し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてコピーキット（インビトロジェン社製）でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡは制限酵素ＡｌｕＩで切断後、リンカー（Ｗａｎｇ Ｚ． ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８： １１５０５―１１５０９， １９９１）を付加してから、ＰＣＲで増幅した。各ステージのオスとメスのｃＤＮＡでサブトラクティブハイブリダイゼーションを行い、残ったｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。このサブトラクション−ＰＣＲ増幅の工程を３回繰り返し、増幅した各ステージのオス、メスのｃＤＮＡをプラスミドにクローニングした（計８種のｃＤＮＡライブラリー）。各ライブラリーからランダムにクローンを選択して挿入断片を単離した後、もとのｃＤＮＡおよびサブトラクション−ＰＣＲ増幅の工程を３回繰り返したｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、各ステージにおいて性特異的に発現する遺伝子をスクリーニングした。オスに特異的に陽性反応を示すものはなく、オス特異的に発現する遺伝子群は単離できなかった。５日目、３０日目のメスのライブラリーから、メスに特異的に陽性反応を示すクローンとしてそれぞれ３、および４７クローンを得た。これらクローンの挿入断片をプローブとして、１日目、５日目、３０日目のオス、メスのｃＤＮＡ（もとのｃＤＮＡおよびサブトラクション−ＰＣＲ増幅の工程を３回繰り返したｃＤＮＡ）とハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果からこれら遺伝子群を３グループ、すなわち１日目、５日目、３０日目のメスに発現する遺伝子群として分類した。この内、１日目のメスに発現するものとして分類された２遺伝子（遺伝子１及び２）、５日目のメスに発現するものとして分類された１９遺伝子（遺伝子３〜２１について、塩基配列を決定した。決定された遺伝子１〜２１の塩基配列を配列表の配列番号１〜２１に示す。
【００６０】
決定された遺伝子配列をデータベースにてホモロジーサーチを行なったところ、遺伝子１（配列番号１）はマウスのベーシック  ヘリックス  ループ  ヘリックスモチーフを有する転写因子ＦＩＧα遺伝子、遺伝子２（配列番号２）はヒトの伸長開始因子のキャップ結合サブユニットｅＩＦ−４遺伝子、遺伝子３（配列番号３）はウサギのＺＰＡドメインをコードする遺伝子、遺伝子４（配列番号４）はキンギョのＺＰＢドメインをコードする遺伝子、遺伝子５（配列番号５）はコイのＺＰＣドメインをコードする遺伝子、遺伝子６（配列番号６）はゼブラフィッシュのＺＰＣドメインをコードする遺伝子、遺伝子７（配列番号７）はコイのＺＰＣドメインをコードする遺伝子、遺伝子８（配列番号８）はゼブラフィッシュのＺＰＣドメインをコードする遺伝子、遺伝子９（配列番号９）はゼブラフィッシュのＺＰＣドメインをコードする遺伝子、遺伝子１０（配列番号１０）はアフリカツメガエルの卵母細胞特異的ＲＮＡ貯蔵タンパク質をコードする４２Ｓｐ４２遺伝子、遺伝子１１（配列番号１１）はアフリカツメガエルの４２Ｓｐ５０遺伝子、遺伝子１２（配列番号１２）はラットのキノンレダクターゼ遺伝子とホモロジーを有していた。遺伝子１３〜２１（配列番号１３〜２１）は既知の遺伝子とホモロジーを有していなかったが、その配列の特徴から分泌タンパク質をコードする未知の遺伝子と考えられた。
【００６１】
次に、公知の方法でメダカの染色体ＤＮＡを調製し、ゲノムライブラリーを作成し、上記で得られた遺伝子１、遺伝子８をプローブとしてスクリーニングを行い、それぞれに対応するゲノム遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。遺伝子１に対応するゲノム遺伝子２２、遺伝子８に対応するゲノム遺伝子２３の塩基配列を、配列表のそれぞれ配列番号２２、２３に示す。
【００６２】
実施例２
１７β―エストラジオールによる性分化の撹乱作用の検出
成熟したＱｕｒｔオス、メス各１尾を一組として、３Ｌのグリーンウォーター（精製水に緑藻のクロレラを添加した水）で水温２５℃、１４時間照明、１０時間暗条件にて飼育し、一日３〜５回、テトラミンを３〜５分で食べ切る量を与え、産卵させた。これらペア５組より得た卵は直ちにシャーレにとり、カルキ抜きした水道水中で、ピンセットでほぐし、洗浄した後、さらに１ｐｐｂの１７β―エストラジオール（Ｅ２）水溶液（０．１％ジメチルスルホキシドを含む）に置き換え、超純水でよく洗浄した９６穴丸底マイクロプレート（コーニング社製、＃３７９７）に各ウェルに一個ずつ卵を分注して蓋をして２５℃インキュベーターで培養した。培養を開始して３日目に、蛍光顕微鏡（ニコン社製）で観察し、オスに特異的に発現する黄色色素を自家蛍光として捉えることによってオス、メスを判定した。さらに培養を続けると、産卵から７日目から９日目の間に稚魚が孵化した。産卵から１２日目（孵化から３〜５日目）に稚魚を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製，＃７０２１）に浸し、−８０℃で保存した。
稚魚からのＲＮＡの抽出は、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製、＃４００７１１）を用いて、Ｋｉｔに付属の分解液に検体を浸し、1.５ｍＬチューブの中でペレットミキサー（雨林製作所社製）を用いてホモゲナイズし、以下マニュアルに従って抽出した。抽出したＲＮＡは、ＴａＫａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）（宝酒造社製）に供し、プライマー対としてメス特異的に発現する遺伝子５（配列番号５）中の７２９ｂｐを増幅するＦ１プライマー（配列番号３０）およびＲ１プライマー（配列番号３１）を用いて１ｓｔ ＰＣＲを行なった。次に、その産物０．5μＬを鋳型とし、上記７２９ｂｐの内側の５９３ｂｐを増幅するプライマー対、Ｆ２プライマー（配列番号３２）およびＲ２プライマー（配列番号３３）を用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、該増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動に供した。結果を表１に示す。ここで遺伝子型は、顕微鏡判定の結果を、表現型はＲＴ−ＰＣＲによる雌雄判別の結果を示す。
【００６３】
【表１】
0003910067.tif 000002
【００６４】
対照実験区である溶媒（０．１％ＤＭＳＯを含む水）処理した卵から孵化した稚魚では、メス特異的遺伝子（遺伝子５）の発現は遺伝子型メスのみにみられオスにはみられず、遺伝子型の性と表現型の性は一致していた。一方、１ｐｐｂ １７β―エストラジオール処理したものでは、遺伝子型オス５匹中２匹に遺伝子５の発現が観察され、また遺伝子型メス５匹中の２匹で遺伝子５の発現が認められず、性分化が撹乱されていることが示された。
【００６５】
産業上の利用の可能性
本発明により、表現型の性にしたがってメス特異的に発現されるメダカの遺伝子が初めて提供され、該遺伝子の発現を指標にして、表現型の性を迅速簡便に判定する方法が提供された。本発明の方法によれば、従来孵化後１ヶ月経たないと判定不能であった表現型の性の判定が、孵化後５日以内の段階で判定でき、かつ短時間に多検体の判定も可能である。
【００６６】
また、性分化撹乱作用が疑われる試料をメダカに投与し、該メダカの表現型の性を本発明の方法によって判定し、その判定結果を遺伝子型の性と比較することにより、試料の性分化撹乱作用を迅速簡便に判定できる。
【００６７】
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO: 1: cDNA for gene 1
SEQ ID NO: 2: cDNA for gene 2
SEQ ID NO: 3: cDNA for gene 3
SEQ ID NO: 4: cDNA for gene 4
SEQ ID NO: 5: cDNA for gene 5
SEQ ID NO: 6: cDNA for gene 6
SEQ ID NO: 7: cDNA for gene 7
SEQ ID NO: 8: cDNA for gene 8
SEQ ID NO: 9: cDNA for gene 9
SEQ ID NO: 10: cDNA for gene 10
SEQ ID NO: 11: cDNA for gene 11
SEQ ID NO: 12: cDNA for gene 12
SEQ ID NO: 13: cDNA for gene 13
SEQ ID NO: 14: cDNA for gene 14
SEQ ID NO: 15: cDNA for gene 15
SEQ ID NO: 16: cDNA for gene 16
SEQ ID NO: 17: cDNA for gene 17
SEQ ID NO: 18: cDNA for gene 18
SEQ ID NO: 19: cDNA for gene 19
SEQ ID NO: 20: cDNA for gene 20
SEQ ID NO: 21: cDNA for gene 21
SEQ ID NO: 22: Genomic DNA for gene 1
SEQ ID NO: 23: Genemic DNA for gene 8
SEQ ID NO: 24: PCR primer 863.3
SEQ ID NO: 25: PCR primer 863.1
SEQ ID NO: 26: PCR primer 1/15
SEQ ID NO: 27: PCR primer 6a
SEQ ID NO: 28: PCR primer 6b
SEQ ID NO: 29: PCR primer 8.3
SEQ ID NO: 30: PCR primer F1
SEQ ID NO: 31: PCR primer R1
SEQ ID NO: 32: PCR primer F2
SEQ ID NO: 33: PCR primer R2
【配列表】
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0003910067.tif 000004
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