(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有し、一方の鎖にＲＮＡを２つ含む２本鎖ＤＮＡのうち、ＲＮＡを含む鎖を切断することができることを特徴とするポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２２に示される塩基配列を有する核酸、当該核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸にコードされるポリペプチド。
【請求項２】
下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有し、一方の鎖にＲＮＡを２つ含む２本鎖ＤＮＡのうち、ＲＮＡを含む鎖を切断することができるポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号２３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号２２に示される塩基配列を有する核酸；
（ｄ）配列表の配列番号２２に示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｅ）前記（ｃ）記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を培養し、該培養物中より耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
プラスミドｐＰＦＵ２２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５４として寄託）を導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有し、一方の鎖にＲＮＡを２つ含む２本鎖ＤＮＡのうち、ＲＮＡを含む鎖を切断することができることを特徴とするポリペプチドを、一方の鎖にＲＮＡを２つ含む２本鎖ＤＮＡに作用させる工程を包含する核酸の切断方法：
（ａ）配列表の配列番号２３、３２、３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２３、３２、３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２２、３１、３６のいずれか１つに示される塩基配列を有する核酸、当該核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸にコードされるポリペプチド。
【請求項８】
下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有し、一方の鎖にＲＮＡを２つ含む２本鎖ＤＮＡのうち、ＲＮＡを含む鎖を切断することができることを特徴とするポリペプチドを、一方の鎖にＲＮＡを１つ含む２本鎖ＤＮＡに作用させる工程を包含する核酸の切断方法：
（ａ）配列表の配列番号２３または３２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２３または３２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２２または３１に示される塩基配列を有する核酸、当該核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸にコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はポリペプチド、さらに詳しくは、遺伝子工学において利用価値の高いリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドに関する。また、本発明は該ポリペプチドの遺伝子工学的生産に有用な遺伝子に関する。さらに、本発明は該ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。
背景技術
リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）にはエンド型とエキソ型が存在し、基質特異性も多様で、複雑な生理活性に関与している。リボヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、リボヌクレアーゼＨ、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＩＩ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＩＶ、リボヌクレアーゼＬ等の酵素が知られている。
リボヌクレアーゼＨ（本明細書に於いては、ＲＮａｓｅＨと称する場合もある）は１９６９年にＷ．Ｈ．ステイン及びＰ．ハウゼンにより仔ウシ胸腺から初めて単離された。現在、ＲＮａｓｅＨは種々の動物細胞、酵母等の真核生物及び大腸菌等の原核生物に広く存在する細胞性ＲＮａｓｅＨと、ＲＮＡ腫瘍ウイルスに存在するウイルス性ＲＮａｓｅＨとに分けられている。１種の細胞に数種のＲＮａｓｅＨ活性が存在しており、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋等の２価金属イオン要求性である。
大腸菌由来ＲＮａｓｅＨは１５５アミノ酸からなる分子量約１７ｋＤａの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド型で切断するという基質特異性を有する。生成したオリゴマーは５’末端にリン酸基を、３’末端に水酸基を有する。
大腸菌由来ＲＮａｓｅＨとしては、ＲＮａｓｅＨＩとＲＮａｓｅＨＩＩが同定されている。ＲＮａｓｅＨＩの生理的機能として、Ｃｏｌ  Ｅ１プラスミドの複製において、１）正常な複製開始点ではない箇所に結合したＲＮＡを分解し、正常な複製開始点を確保する、２）正常な複製開始点に特異的なＲＮＡプライマーの合成をすることが示されている。しかしながら、ＲＮａｓｅＨＩＩの機能は未だ不明である。
ＲＮａｓｅＨの重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵素は、大腸菌内での発現量が極めて低いことから、組換えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既にＢＲＬ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク及び宝酒造等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたＲＮａｓｅＨが供給されている。
これらの市販の組換えＲＮａｓｅＨは、大腸菌を宿主として生産されるものである〔金谷ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６４巻、第１１５４６−１１５４９頁（１９８９）〕。また、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも極めて高い安定性を有する好熱菌由来ＲＮａｓｅＨの大腸菌による製造法も報告されている〔金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム・要旨集（１９９０）、６９頁；特許第２５３３６７１号公報〕が、大腸菌を用いて産生された好熱菌ＲＮａｓｅＨの酵素活性は大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも低いものであった。
ＲＮａｓｅＨは、その基質特異性に基づき、下記に例示される様な用途を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されている。
１）ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型ｍＲＮＡの除去。
２）ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去。
３）ＲＮＡの断片化。
しかしながら、上述のように耐熱性を有するＲＮａｓｅＨは大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも生産性及び酵素活性が低いものしかなく、ＲＮａｓｅＨの用途拡大のため、大腸菌と同等もしくはそれ以上の生産性及び酵素活性を有する耐熱性ＲＮａｓｅＨの開発が望まれていた。
発明の目的
本発明の目的は、遺伝子工学において利用価値の高いＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、上記の事情を鑑み、耐熱性ＲＮａｓｅＨを得るために鋭意研究及び探索を行った結果、高いＲＮａｓｅＨ活性を有する耐熱性ＲＮａｓｅＨポリペプチドを見出した。更に、得られた耐熱性ＲＮａｓｅＨは遺伝子工学的手法による製造においても生産性がよいことも見出し、本発明を完成するに至った。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、耐熱性リボヌクレアーゼＨポリペプチドに関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有することを特徴とするポリペプチドに関する。
（ａ）配列表の配列番号９、１７、２３、３２，３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号９、１７、２３、３２，３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも７１％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
本発明の第２の発明は、耐熱性リボヌクレアーゼＨをコードする核酸に関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドをコードする核酸に関する。
（ａ）配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号８、１６、２２、３１、３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに示される塩基配列を有する核酸；
（ｄ）配列表の配列番号８、１６、２２、３１、３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；
（ｆ）配列表の配列番号８、１６、２２、３１、３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに示される塩基配列に少なくとも６９％の相同性を有する塩基配列である核酸。
本発明の第３の発明は組換えＤＮＡに関し、第２の発明の核酸を含んでなることを特徴とする。
本発明の第４の発明は形質転換体に関し、第３の発明の組換えＤＮＡにより形質転換されてなることを特徴とする。
本発明の第５の発明は耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、第４の発明の形質転換体を培養し、該培養物中より耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする。
第６の発明はプラスミドｐＲＨＢ１１、ｐＢＣＡ３Ｎｄ２、ｐＰＦＵ２２０、ｐＴＭ−ＲＮＨ、ｐＰＨＯ２３８、ｐＡＦＵ２０４、ｐＴＬＩ２０４又はｐＴＣＥ２０７のいずれか１つを導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドに関する。なお、これらのプラスミドを有する大腸菌株は、ブダペスト条約の下、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９４の受託番号の下、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
発明の詳細な説明
以下、本発明に関して具体的に説明する。
本明細書において、ＲＮａｓｅＨとは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド型で切断するという基質特異性を有する加水分解酵素であって、生成したオリゴマーが５’末端にリン酸基を、３’末端に水酸基を有するものをいう。
本発明において、ポリペプチドが耐熱性のＲＮａｓｅＨ活性を有するとは、特に限定するものではないが、６０℃以上の温度で１５分間保持した後においてもＲＮａｓｅＨ活性を有することを意味する。
耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性は、例えば、次のようにして測定することができる。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム  ファルマシア  バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製する。
次に、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにポリ（ｒＡ）溶液を、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようにポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製する。
このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定する。対照として、上記反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定する。その後、ＥＤＴＡ非添加で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めることにより、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求め、本発明の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を測定することができる。
また、活性測定しようとする酵素液１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ８．５）、０．０１％牛血清アルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌで反応を停止し、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、本発明の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を測定することもできる。
ＲＮａｓｅＨの１単位（ユニット）は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出することができる。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２
本発明のポリペプチドは、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。
すなわち、天然に存在するポリペプチドにはそれをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうる。しかし、このような変異が該ポリペプチドの活性や構造の保持に関して重要でない部分に存在する場合には、変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。
人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中のあるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）〕。
また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列あるいはプレ・プロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、あるいは活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を発現するポリペプチドである。
本発明により単離された、配列表の配列番号８、１６、２２、３１、３６、４６、５６又は５８に示される塩基配列の遺伝子には、それぞれ配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドがコードされており、該ポリペプチドは耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有している。そこから、活性には必須でないペプチド領域が削除さらたポリペプチドも、本願のポリペプチドに含まれる。
遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う場合には、目的のポリペプチドのアミノ末端、あるいはカルボキシル末端に該ポリペプチドの活性とは無関係のペプチド鎖が付加されることがある。例えば、目的のポリペプチドの発現量を上げるために、使用される宿主中で高発現されているポリペプチドのアミノ末端領域の一部を目的のポリペプチドのアミノ末端に付加した融合ポリペプチドが作製されることがある。あるいは、発現されたポリペプチドの精製を容易にするために、特定の物質に親和性を有するペプチドを目的のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に付加することも行われている。これらの付加されたペプチドは目的ポリペプチドの活性に悪影響をおよぼさない場合には付加されたままであってもよく、また、必要であれば適当な処理、例えば、プロテアーゼによる限定分解などによって目的ポリペプチドから除去できるようにすることもできる。
従って、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９）に１個以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、付加又は置換が生じたアミノ酸配列によって示されるポリペプチドであっても、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
また、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又は５９）に少なくとも７１％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
例えば、上記アミノ酸配列の相同性が、バチルス  カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来のリボヌクレアーゼＨＩＩ（配列表の配列番号９）と少なくとも４４％、バチルス  カルドテナックス由来のリボヌクレアーゼＨＩＩＩ（配列表の配列番号１７）と少なくとも４７％、ピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号２３）と少なくとも６９％、サーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号５９）と少なくとも５３％、アルカエオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号３７）と少なくとも５１％、サーモコッカス  リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号４７）と少なくとも６５％、サーモコッカス  セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号５７）と少なくとも７１％、ピロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号３２）と少なくとも７１％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
本発明のポリペプチドは、例えば、（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物からの精製、等の方法により製造することができる。
（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製
本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、例えば、ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）より購入可能なバチルス  カルドテナックス（ＤＳＭ４０６）、ピロコッカス  フリオサス（ＤＳＭ３６３８）やサーモトガ  マリティマ（ＤＳＭ３１０９）、アルカエオグロバス  フルギダス（ＤＳＭ４１３９）、サーモコッカス  リトラリス（ＤＳＭ５４７３）、サーモコッカス  セラー（ＤＳＭ２４７６）又は理化学研究所より購入可能なピロコッカス  ホリコシイ（ＪＣＭ９９７４）等が挙げられる。微生物の培養は、その微生物の生育に適した条件で行えばよく、好ましくは、目的のポリペプチドの発現量が高くなるような培養条件が用いられる。かくして菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法によって精製することができる。
上記菌株の培養にあたっては、通常、耐熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加える栄養源は該菌株が利用しうるものであればよい。炭素源としては、例えば、デンプン等が利用でき、窒素源としては、例えば、トリプトン、ペプトン、酵母エキス等が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩等の金属塩を微量元素として加えてもよい。また、例えば、海洋性の耐熱菌の場合、培地の調製に人工海水を用いることが有利である。
培養は静置培養又は撹拌培養で行なうことができるが、例えば、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５５巻、第２０８６−２０８８頁（１９９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。培養条件や培養時間は、使用する菌株、培地組成に応じ、ポリペプチドの生産量が最大になるように設定するのが好ましい。
ポリペプチドを採取するに当たっては、まず、無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液は、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などによって菌体を集め、ついで菌体を破砕することにより調製できる。菌体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素処理等のうちから目的酵素の抽出効果の高い方法を選べばよい。また、培養液上清中に該ポリペプチドが分泌されている場合には、硫安塩析法や限外濾過法等によって培養液上清中のポリペプチドを濃縮し、これを無細胞抽出液とする。かくして得られた無細胞抽出液からポリペプチドを単離するにあたっては、通常のタンパク質の精製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法を組み合わせて使用できる。
（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換体の培養物からの精製
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば配列番号８、１６、２２、３１、３６、４６、５６又は５８に示される塩基配列を有する核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。配列番号８に示される塩基配列からは配列番号９に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号１６に示される塩基配列からは配列番号１７に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号２２に示される塩基配列からは配列番号２３に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号３１に示される塩基配列からは配列番号３２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号３６に示される塩基配列からは配列番号３７に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号４６に示される塩基配列からは配列番号４７に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号５６に示される塩基配列からは配列番号５７に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号５８に示される塩基配列からは配列番号５９に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、それぞれ生成する。
さらに、本発明のプラスミドｐＲＨＢ１１、ｐＢＣＡ３Ｎｄ２、ｐＰＦＵ２２０、ｐＴＭ−ＲＮＨ、ｐＰＨＯ２３８、ｐＡＦＵ２０４、ｐＴＬＩ２０４又はｐＴＣＥ２０７のいずれか１つを導入した形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のポリペプチドを精製してもよい。
形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドは、ｌａｃプロモーターやＴ７ファージプロモーターの下流に本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌を通常の培養条件、例えば、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ  ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で対数増殖期まで培養後、１ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３７℃で培養することにより、培養菌体中にポリペプチドを発現させることができる。
培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を超音波で破砕し、さらに遠心分離して上清を集め、無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液は耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示す。さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを精製することができる。上記の精製過程において得られる部分精製品も、当然ながらＲＮａｓｅＨ活性を示す。なお、本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌で発現される本発明のポリペプチドは耐熱性を有しているため、精製手段として培養菌体及び／又は無細胞抽出液に対して、例えば、４０℃以上の温度で、約１０分間の熱処理を行って熱変性して不溶化した宿主由来のタンパク質を除去してもよい。また、この熱処理の温度や時間は、適宜、最適な温度及び時間を選択すればよい。
上記のように本発明のポリペプチドを、当該ポリペプチドをコードする核酸を保持する形質転換体を用いて常温、例えば、３７℃で発現させた場合でも、得られた発現産物はその活性、耐熱性などを保持している。すなわち、本発明のポリペプチドは、その本来の生産菌が生育する温度とは離れた温度において発現された場合にも、その固有の高次構造を形成し得る。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であり、具体的には、配列表の配列番号９、１７、２３、３２、３７、４７、５７又５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示され、かつ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする核酸（１）、配列表の配列番号８、１６、２２、３１，３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに記載の塩基配列で示される核酸（２）、および上記核酸（１）または（２）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるか、（１）または（２）の塩基配列に少なくとも６９％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％の相同性を有する塩基配列で、かつ耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする核酸（３）等である。
上記塩基配列の相同性は、コンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０）、ＢＬＡＳＴ（バージョン２．０）によって測定することができる。
本明細書における核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。上記核酸（２）がＲＮＡである場合は、例えば配列表の配列番号８記載の塩基配列においてＴをＵで置換した塩基配列で示される。
本発明の核酸は、例えば、次のようにして得ることができる。
まず、配列表の配列番号８、１６、２２、３１，３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに記載の塩基配列で示される核酸（２）は、本発明のポリペプチドの説明中に記載した方法で培養したバチルス  カルドテナックス（ＤＳＭ４０６）、ピロコッカス  フリオサス（ＤＳＭ３６３８）、サーモトガ  マリティマ（ＤＳＭ３１０９）、アルカエオグロバス  フルギダス（ＤＳＭ４１３９）、サーモコッカス  リトラリス（ＤＳＭ５４７３）、サーモコッカス  セラー（ＤＳＭ２４７６）又はピロコッカス  ホリコシイ（ＪＣＭ９９７４）より常法にしたがってゲノムＤＮＡを調製し、それを用いて作製したＤＮＡライブラリーから単離することができる。またこのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、配列表の配列番号８、１６、２２、３１，３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに記載の塩基配列で示される核酸を増幅することによっても取得できる。
また、本発明により提供される、本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列、例えば配列表の配列番号８、１６、２２、３１，３６、４６、５６又は５８のいずれか１つに記載の塩基配列を基に、本発明のポリペプチドと同様の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を取得することも可能である。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブに用いることにより、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、細胞から抽出したＤＮＡ、該ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物等からスクリーニングすることができる。あるいは上記の塩基配列から設計されたプライマーを使用したＰＣＲ等の遺伝子増幅法を用いることにより、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅することができる。また、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に合成することも可能である。かかる方法により、上記核酸（１）または（３）を得ることができる。
上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、それが目的の核酸の一部であることを確かめた上、該核酸断片、あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の核酸全体を取得することができる。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、１９８９年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）等に記載された条件でハイブリダイズ可能なことを意味し、例えば、以下の条件でハイブリダイズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子核酸を含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たな核酸について、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件などをいう。
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）
また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
本発明においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなくとも、それが耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりである。
すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（例えば、特公平７−１０２１４６号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列表の配列番号７記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作成することができる。該組換えＤＮＡの作成に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。
さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を作成することができる。形質転換体の作成に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリペプチドを産生させることにより、本発明のポリペプチドを大量に製造することが可能となる。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
好熱菌バチルス  カルドテナックス由来のＲＮａｓｅＨの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）０．２％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）１．５％を含む培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌにバチルスカルドテナックスＹＴ−Ｇ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ  ＹＴ−Ｇ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ４０６）を植菌し、６０℃で１４０分間振とう培養し、この培養液を前培養液とした。ついで、同組成の培地３１に前培養液３０ｍｌを接種し、通気量２．５１／分、攪拌数２５０回転／分、温度６０℃で５時間培養した。
培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分）し、集菌した。湿菌重量４０２ｇの菌体を１０ｍＭメルカプトエタノール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μＭ  ＰＡＰＭＳＦを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０００ｍｌに懸濁し、ＭＩＮＩ−Ｌａｂ（ＡＰＶ  ＧＡＵＬＩＮ／ＲＡＮＮＩＥ社製）にて菌体を破砕後、遠心分離で細胞残渣を除き、上清を回収した。
得られた上清液に終濃度が０．１％となるようにポリエチレンイミン溶液を加え、攪拌後、１時間放置し、遠心分離にて上清を回収した。この上清液に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離で得られた沈殿を１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。同緩衝液で平衡化した２８０ｍｌのＤＥ５２カラム（ワットマン社製）に透析試料を負荷し、非吸着画分を集めた。
さらに平衡化に用いた緩衝液４２０ｍｌで洗浄し、洗浄画分を集めた。ＤＥ５２カラムクロマトグラフィーでの非吸着画分と洗浄画分を混合し、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した２４０ｍｌのＰ−１１カラム（ワットマン社製）に負荷した。その後、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を透析チューブに入れ、固体のポリエチレングリコール２００００上に置き、４℃で脱水濃縮した。次に、５ｍＭメルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した３００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ−２００カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に、この酵素濃縮液を負荷した。平衡化に用いた緩衝液で溶出させ、活性画分を得た。１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した１５ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に活性画分を負荷し、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した５ｍｌのＨｉｔｒａｐ−ＳＰカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に負荷し、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。得られた活性画分を、再度５ｍＭメルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した３００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ−２００カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に負荷し、得られた活性画分をＲＮａｓｅＨ標品（酵素液）とした。
耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性は、次の方法により測定した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム  ファルマシア  バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｒＡ）溶液を、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。なお、酵素液を希釈した場合は、下記式の値を希釈率で補正した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２
実施例２
バチルス  カルドテナックス  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）バチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡの調製
バチルス  カルドテナックス  ＹＴ−Ｇ株（ＤＳＭ４０６）を６０ｍｌのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に植菌し、６５℃、２０時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し集菌した。得られた菌体を２ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に１２ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び１ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
次いで２．１ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌと２ｍｌのＣＴＡＢ−ＮａＣｌ溶液〔１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ナカライテスク社製）、０．７Ｍ  ＮａＣｌ〕を加えてよく混合し、６５℃で１０分間保温した。これに等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、１０分間遠心（１００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、更に１０分間遠心（１００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に０．６容の２−プロパノールを加え、生じた糸状の沈殿をガラス棒で巻き取った。これを７０％エタノール水溶液で洗浄し、風乾した後に０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な生物由来のＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列の間で保存されている部分の内、モチーフＩとモチーフＩＩＩ〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３８巻、第６０５−６０８頁（１９９９）〕をもとにしてオリゴヌクレオチドＢｓｕＩＩ−３（配列番号１）とオリゴヌクレオチドＢｓｕＩＩ−６（配列番号２）を合成した。
上記実施例２−（１）で調製したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩ−３及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩ−６をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラ  タック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、反応液にフェノール処理とエタノール沈殿を行ってＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＤＮＡの末端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
この形質転換体を培養し、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド２１−１２を得た。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子上流部分のクローニング
上記実施例２−（２）で得たプラスミド２１−１２の約０．４ｋｂの挿入断片の塩基配列を決定し、それをもとにオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ１（配列番号３）とオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ２（配列番号４）を合成した。
実施例２−（１）で調製したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し、得られたＢａｍＨＩ消化物とＳａｕ３ＡＩカセット（宝酒造社製）をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、これを鋳型としＲＮＩＩ−Ｓ２を１次ＰＣＲのプライマー、ＲＮＩＩ−Ｓ１を２次ＰＣＲのプライマーとして、タカラ  ＬＡ  ＰＣＲ  イン  ビトロ  クローニング  キット（宝酒造社製）に添付のプロトコールに従って操作を行った。フェノール処理とエタノール沈殿によって２次ＰＣＲ液からＤＮＡを精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてこのＤＮＡの末端を平滑化し、その後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１１９にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
この形質転換体を培養し、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＢ２５Ｎ１６を得た。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子全域のクローニング
実施例２−（３）で決定したプラスミド２１−１２の約０．４ｋｂの挿入断片の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ５（配列番号５）とオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ６（配列番号６）を合成した。
実施例２−（２）で調製したプラスミド２１−１２を鋳型に、ＲＮＩＩ−Ｓ５とＲＮＩＩ−Ｓ６をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして、２５サイクル行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧハイプライム（ロシュ  ダイアグノスティックス社製）でジゴキシゲニン標識した。
上記のジゴキシゲニン標識ＤＮＡをプローブとして、実施例２−（１）で調製したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）、ＳａｃＩ（宝酒造社製）による消化、及びＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩの２重消化をそれぞれ行い、得られた消化物とサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションと検出はＤＩＧルミネッセント  デテクションキット（ロシュ  ダイアグノスティックス社製）を添付のプロトコールに従って用いた。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩ消化では約４．５ｋｂのＤＮＡ断片、ＳａｃＩ消化では約５．８ｋｂのＤＮＡ断片、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩの２重消化では約１．３ｋｂのＤＮＡ断片がプローブとハイブリダイズした。
上記結果に基づき、バチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ消化してアガロースゲル電気泳動を行い、約４．５ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、１．３ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化したｐＵＣ１９（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
得られた形質転換体をハイボンドＮ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）にレプリカし、上記のジゴキシゲニン標識プローブを用いて、常法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。こうして得られた陽性クローンからプラスミドｐＲＨＢ１を調製した。
次に、ｐＲＨＢ１に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定し、それから予想されるアミノ酸配列を枯草菌のＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列と比較したところ、ｐＲＨＢ１中のＤＮＡは開始コドンから約４０ｂｐを欠いていることが予想された。そこで以下のようにして完全長のＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を構築した。
実施例２−（３）で調製したＢ２５Ｎ１６をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、約１６０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を、上記で調製したｐＲＨＢ１のＨｉｎｄＩＩＩ消化物にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製した。
次に、予想される開始コドン周辺の塩基配列をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｎｄｅ（配列番号７）を合成し、上記で得られた形質転換体から調製したプラスミドを鋳型とし、ＲＮＩＩ−ＮｄｅとＲＮＩＩ−Ｓ６をプライマーとして、ＰＣＲを行った。この時に約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅するプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＲＨＢ１１とした。
こうして得られたプラスミドｐＲＨＢ１１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）が見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号８に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に示す。
なお、プラスミドｐＲＨＢ１１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＲＨＢ１１と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５５として寄託されている。
（５）バチルス  カルドテナックス  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＲＨＢ１１又はｐＲＨＢ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁して超音波破砕し、遠心分離によって上清を得、これを菌体粗抽出液とした。
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ（ナカライテスク社製）、０．００３％ＢＳＡ（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ  ＭｎＣｌ２を加えて４０℃で保温し、これに１０μｌの１０倍希釈した菌体粗抽出液を加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、ｐＲＨＢ１を保持する大腸菌ＨＢ１０１から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに比べて、ｐＲＨＢ１１を保持する大腸菌ＨＢ１０１から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに明らかに２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、ｐＲＨＢ１１はＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含んでおり、このｐＲＨＢ１１を保持する大腸菌でＲＮａｓｅＨ活性を発現することが明らかになった。
（６）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例２−（４）で得られたｐＲＨＢ１１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を５２．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を集め、５０．０ｍｌの熱処理上清液を得た。
この溶液をバッファーＣ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分５１ｍｌをバッファーＣで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約２４０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分３．０ｍｌを２回に分けて５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、得られた溶出液７．０ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約３１０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分４．４ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２８０μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
ＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、０．０１％牛血清アルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、１０ｍＭ塩化マンガン、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応さた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌで反応を停止し、２６０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例３
バチルス  カルドテナックス  ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子断片のクローニング
バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＲＮａｓｅＨＩＩＩのアミノ酸配列〔Ｏｔａｎｉ  Ｎら、バイオケミストリー、第３８巻、第６０５−６０８頁（１９９９）〕について、他の生物由来のＲＮａｓｅＨＩＩＩのアミノ酸配列とのホモロジーを調べ、これらの間でよく保存されている領域のアミノ酸配列からＲＮａｓｅＨＩＩＩをコードする遺伝子を探索するためのプライマーＢｓｕＩＩＩ−１（配列番号１０）、ＢｓｕＩＩＩ−３（配列番号１１）、ＢｓｕＩＩＩ−６（配列番号１２）、ＢｓｕＩＩＩ−８（配列番号１３）を合成した。
実施例２−（１）で調製したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡ  ２００ｎｇを鋳型にし、１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−１及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−８をプライマーにして、５０μｌの容量で１回目のＰＣＲを行った。更にその反応液１μｌを鋳型として１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−３及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−６をプライマーに用いて１００μｌの容量で２回目のＰＣＲを行った。この２回のＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼには、タカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、１回目のＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、２５サイクル行い、２回目は３０サイクル行なった。
増幅して得られた約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
形質転換体を培養し、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＢＣＡ３２０４を得た。
（２）サザンハイブリダイゼーション法によるＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子のクローニング
実施例３−（１）で得られたｐＢＣＡ３２０４に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、得られた配列もとにプライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３（配列番号１４）及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３（配列番号１５）を合成した。このプライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３を用いて、ｐＢＣＡ３２０４を鋳型にし、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行った。そして、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧ  ＤＮＡ標識キット（ベーリンガー  マンハイム社製）で標識し、プローブを調製した。
実施例２−（１）で調製したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡ  ２０μｇをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ（すべて宝酒造社製）で、それぞれ完全消化した後、その半分量をアガロース電気泳動した。アガロースゲルからＤＮＡを０．４Ｎ  ＮａＯＨをもちいてナイロンメンブレンにトランスファーした後、１２０℃で３０分間固定した。次に、メンブレンを３０ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー〔４３．４ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１７．６ｇ／ｌクエン酸ナトリウム、１％ブロッキング剤（ベーリンガー  マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕の入ったシールドバック中で、６０℃、４時間プレインキュベーションした後、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファー５ｍｌの入ったシールドバック中で、６０℃、１６時間インキュベーションした。
次に、メンブランを５０ｍｌの０．１％ＳＤＳをふくむ２×ＳＳＣ（１７．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、７．７ｇ／ｌクエン酸ナトリウム）中、室温で２回、５０ｍｌの０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ（４．４ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１．９ｇ／ｌクエン酸ナトリウム）中、４５℃で２回洗浄した後、ＤＩＧ核酸検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて、プローブと相補的な配列を持った約８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、約４．５ｋｂのＰｓｔＩ断片、約１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を検出した。
ＰｓｔＩで完全消化したバチルス  カルドテナックス  ゲノムＤＮＡの残り半分量をアガロース電気泳動し、約４．５ｋｂのＰｓｔＩ断片をゲルから回収した。次に、このＤＮＡ断片と、ＰｓｔＩ消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化したプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎとをライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
プライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３を用いて、コロニーを鋳型にし、５０μｌの容量でＰＣＲを行ない、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。このＰＣＲには、タカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果、Ｎｏ．８８のコロニーに目的の遺伝子が含まれていることがわかった。
次に、このＮｏ．８８のコロニーからプラスミドを調製し、これを鋳型にプライマーＲＶ−Ｎ（宝酒造社製）およびＢｃａＲＮＩＩＩ−３又はプライマーＭ４（宝酒造社製）及びＲＮＩＩＩ−Ｓ３を用いてＰＣＲを行い、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子の全長が含まれているかどうかを調べた。その結果、増幅産物の鎖長よりＲＮａｓｅＨＩＩＩの全長が含まれていることが予想された。このプラスミドをｐＢＣＡ３Ｐ８８とした。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例３−（２）で得られたプラスミドｐＢＣＡ３Ｐ８８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩＩのＮ末端アミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１６に、また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１７にそれぞれ示す。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩＩを発現させるためのプラスミドの構築
実施例３−（２）に記載のプラスミドｐＢＣＡ３Ｐ８８を鋳型にし、上記で得られたＲＮａｓｅＨＩＩＩのオープンリーディングフレームの周辺の配列を参考として設定したＢｃａＲＮＩＩＩＮｄｅ（配列番号１８）及びＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）を用いて、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果増幅した約４ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ（宝酒造社製）で消化し、アガロース電気泳動を行い、約１．４ｋｂのＮｄｅＩ断片をゲルから回収した。得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩ消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化したｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）とライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
次に、ＮｄｅＩ断片中のＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子がｐＴＶ１１９Ｎｄベクターのｌａｃプロモーター下流につながったプラスミドをスクリーニングするため、コロニーを鋳型にし、プライマーＲＶ−Ｎ（宝酒造社製）およびＢｃａＲＮＩＩＩ−３（配列番号１５）を用いて、５０μｌの容量でＰＣＲを行ない、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果、Ｎｏ．２のコロニーがＮｄｅＩ断片中のＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子がｐＴＶ１１９Ｎｄベクターのｌａｃプロモーター下流につながったプラスミドを持つことが分かり、このプラスミドをｐＢＣＡ３Ｎｄ２とした。
さらに該プラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法で確認したところ、開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに変換したこと以外、ＰＣＲに起因する変異のないことを確認した。
なお、プラスミドｐＢＣＡ３Ｎｄ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＣＡ３Ｎｄ２と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５３として寄託されている。
（５）精製ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品の調製
実施例３−（４）で得られたｐＢＣＡ３Ｎｄ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３９．６ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を集め、３９．８ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分４５ｍｌをバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕２ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液５５．８ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１０５ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分を得た。
この画分７．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭになるように１Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーＢを添加し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供した。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩはＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分７．５ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、１９０μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩは、３３キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩＩをＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品とした。
上記で得られたＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
ＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、０．０１％牛血清アルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応さた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μで反応を停止し、２６０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例４
ピロコッカス  フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス  フリオサス  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２  ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４  ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地２ｌを２ｌ容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス  ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｉ，Ｙら、ＤＮＡ  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１９、日本国  独立行政法人  製品評価技術基盤機構  ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１９）と一部公開されているピロコッカス  フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。
得られた配列をもとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２０）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号２１）を合成した。
実施例４−（１）で得たピロコッカス  フリオサスＤＮＡ  ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲ行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例４−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２２に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５４として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例４−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例５
サーモトガ  マリティマ  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）サーモトガ  マリティマ  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、可溶性でんぷん１％、ジャマリンＳ・ソリッド３．５％、ジャマリンＳ・リキッド０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２  ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ３  ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地２ｌを２ｌ容のメディウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ３１０９）を接種して、８５℃、１６時間静置培養した。
次に、遠心分離によって培地３００ｍｌ相当分の菌体を集め、３ｍｌのＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に懸濁し、１５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液及び１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間保温した。
反応終了後、０．５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加えてよく混合した後、０．４ｍｌのＣＴＡＢ−ＮａＣｌ溶液〔１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ナカライテスク社製）、０．７Ｍ  ＮａＣｌ〕を加えてよく混合し、６５℃で１０分間保温した。これに１．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、５分間遠心（２００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、更にで５分間遠心（２００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に０．６容の２−プロパノールを加え、で５分間遠心（１００００×ｇ）して得られた沈殿を、７０％エタノール水溶液で洗浄し、風乾した後に２００μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
サーモトガ  マリティマ  ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことによりＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を得るため、サーモトガ  マリティマ  ゲノムＤＮＡの塩基配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｂｔｍ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）のうちＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子と同定されている部分の塩基配列をもとにして、オリゴヌクレオチド９１５−Ｆ１（配列番号２４）、９１５−Ｆ２（配列番号２５）、９１５−Ｒ１（配列番号２６）及び９１５−Ｒ２（配列番号２７）を合成した。
上記実施例５−（１）で調製したサーモトガ  マリティマ  ゲノムＤＮＡを鋳型として、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１又は９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２をプライマー対とし、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で１．５分を１サイクルとして、２５サイクル行った。反応終了後、各ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、約０．７ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片を抽出精製した。
９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１及び９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２のプライマー対で増幅したＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したｐＵＣ１９（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
この形質転換体を培養し、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを調製した。その結果、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１から増幅したＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＮｏ．１とＮｏ．２、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．３とＮｏ．４を得た。
また、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１及び９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２のプライマー対で増幅したＤＮＡをＮｃｏＩ（宝酒造社製）とＸｂａＩで２重消化し、ＮｃｏＩとＸｂａＩで２重消化したｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
この形質転換体を培養し、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを調製した。その結果、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１から増幅したＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＮｏ．５とＮｏ．６、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．７を得た。
なお、プラスミドＮｏ．７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＭ−ＲＮＨと命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５２として寄託されている。
（３）サーモトガ  マリティマ  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
プラスミドＮｏ．１〜７又はｐＵＣ１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で振盪培養した。６６０ｎｍにおける吸光度が０．５になったときに終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加え、更に１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集め、１ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。これを８０℃で１０分間熱処理し、遠心によって得た上清を菌体粗抽出液とした。
得られた菌体粗抽出液を用いて、実施例２−（５）に記載の方法で吸光度を測定した。
その結果、ｐＵＣ１９を保持する大腸菌ＪＭ１０９から調製した粗抽出液で反応させたときに比べて、プラスミドＮｏ．３、５、６及び７を保持する大腸菌ＪＭ１０９から調製した菌体粗抽出液は、ＭｎＣｌ２存在下で反応させたとき、明らかに２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、プラスミドＮｏ．３、５、６及び７はＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含んでおり、これらのプラスミドを保持する大腸菌でＲＮａｓｅＨ活性を発現することが明らかになった。
こうして大腸菌内でＲＮａｓｅＨ活性が発現していることが明らかとなったプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号５８に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５９に示す。このプラスミドＮｏ．７に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列にはＰＣＲ時に生じたと思われる塩基置換が１箇所みとめられ、その箇所のアミノ酸残基が変化していることが分かった。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例５−（２）で得られたプラスミドＮｏ．７（プラスミドｐＴＭ−ＲＮＨ）で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＴＭ−ＲＮＨを含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３１．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３２．０ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＣ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３２．５ｍｌをバッファーＣで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約２４０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、得られた溶出液３．５ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２９５ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このようにして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＴｍａＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＴｍａＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例２−（６）に記載の方法で酵素活性を測定した結果、ＴｍａＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例６
ピロコッカス  ホリコシイのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス  ホリコシイ  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２  ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４  ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地２ｌを２ｌ容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス  ホリコシイＯＴ３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、理化学研究所より購入：ＪＣＭ９９７４）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）は全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号２８、日本国  独立行政法人  製品評価技術基盤機構  ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号２８）の配列をもとにプライマーＰｈｏＮｄｅ（配列番号２９）及びＰｈｏＢａｍ（配列番号３０）を合成した。
実施例６−（１）で得たピロコッカス  ホリコシイＤＮＡ  １００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＰｈｏＮｄｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＰｈｏＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲ行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＨＯ２３８を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例６−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号３１に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号３２に示す。
なお、プラスミドｐＰＨＯ２３８で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＰＨＯ２３８と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９２として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例６−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＨＯ２３８を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３４．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３３．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３５．０ｍｌををバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕２Ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液３４．５ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５５ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
この画分４．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＢを添加し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約１６０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６．９ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を２回に分けて１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２４．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例７
アルカエオグロバス  フルギダスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス  フルギダス  ゲノムＤＮＡの調製
アルカエオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ４１３９）８ｍｌ相当分の菌体を集め、１００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）は全ゲノム配列が公開されており〔Ｋｌｅｎｋ，ＨＰら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３９０巻、第３６４−３７０頁（１９９７）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＡＦＯ６２１）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号３３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｂｔｍ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）。
そこで、このＡＦＯ６２１遺伝子（配列番号３３）の配列をもとにプライマーＡｆｕＮｄｅ（配列番号３４）及びＡｆｕＢａｍ（配列番号３５）を合成した。
実施例７−（１）で得たアルカエオグロバス  フルギダス  ３０ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＡｆｕＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｆｕＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＡＦＵ２０４を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例７−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号３６に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号３７に示す。
なお、プラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＦＵ２０４と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９１として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例７−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＡＦＵ２０４を含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分４０．０ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕２ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液４０．２ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２４０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃縮液を４回に分けて１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例８
サーモコッカス  リトラリス  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）サーモコッカス  リトラリス  ゲノムＤＮＡの調製
サーモコッカス  リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ５４７３）１１ｍｌ相当分の菌体を集め、５００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、１００μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に１００μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｆ１（配列番号３８）とオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｒ０（配列番号３９）を合成した。
上記実施例８−（１）で調製したサーモコッカス  リトラリス  ゲノムＤＮＡ溶液５μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｆ１及び１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｒ０をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、マイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例８−（２）で得た約０．５ｋｂの断片ＴｌｉＦ１Ｒ０の塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−１（配列番号４０）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｌｉＲＮ−２（配列番号４１）を合成した。さらに、表１に示す４８種類のプライマーを合成した。表１中のタグ配列を配列表の配列番号６０に示す。
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実施例８−（１）で調製したサーモコッカス  リトラリス  ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−１または２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−２と各２０ｐｍｏｌの表１記載の４８種類のプライマーとの組み合わせで２０ｍＭ  トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３０μＭ  ｄＮＴＰ混合物、２．５単位のタカラＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲは９４℃で３分インキュベートした後、９８℃で１０秒、５０℃で１０秒、７２℃で４０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物の一部をアガロース電気泳導し、シングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークエンスをおこない、ＲＮａｓｅＨＩＩの上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、約４５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＮ７にＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の上流が、約６００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＣ２５、約４００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｌｉＣ２６に下流が含まれていることがわかった。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子全域のクローニング
ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号４２に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号４３に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｌｉＮｄｅ（配列番号４４）及びＴｌｉＢａｍ（配列番号４５）を合成した。
実施例８−（１）で得たサーモコッカス  リトラリス  ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｌｉＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｌｉＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＬＩ２２３ＮｄおよびｐＴＬＩ２０４を作製した。
（５）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例８−（４）で得られたｐＴＬＩ２２３ＮｄおよびｐＴＬＩ２０４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。ｐＴＬＩ２０４のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４６に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号４７に示す。ｐＴＬＩ２２３Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＬＩ２０４とくらべて４８４番目のＴがＣに置きかわっていた。また、アミノ酸配列では１６２番目のフェニルアラニンがロイシンに置きかわっていた。
なお、プラスミドｐＴＬＩ２０４で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＴＬＩ２０４と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９３として寄託されている。
（６）サーモコッカス  リトラリス  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＴＬＩ２２３Ｎｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を１９６μｌのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にｐＴＬＩ２０４で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液を、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においてもＲＮａｓｅＨ活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。
（７）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例８−（４）で得られたｐＴＬＩ２２３Ｎｄで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＴＬＩ２２３Ｎｄを含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３８．７ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで２０分の遠心分離を行い、上清を集め、３７．２ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２２０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分３ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＡを添加し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＡで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約３２０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約１９８μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２６．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＴｌｉＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例９
サーモコッカス  セラー  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）サーモコッカス  セラー  ゲノムＤＮＡの調製
サーモコッカス  セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ２４７６）１１ｍｌ相当分の菌体を集め、実施例８−（１）の記載の方法によりゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｆ１（配列番号４８）とオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｒ０（配列番号４９）を合成した。
上記実施例９−（１）で調製したサーモコッカス  セラー  ゲノムＤＮＡ溶液５μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｆ１及び１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｒ０をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、増幅して得られた約５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた約５００ｂｐＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
形質転換体を培養し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｃｅＦ１Ｒ０を得た。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例９−（２）で得られたプラスミドｐＴｃｅＦ１Ｒ０塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−１（配列番号５０）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅＲＮ−２（配列番号５１）を合成した。
実施例９−（１）で調製したサーモコッカス  セラー  ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−１または２０ｐｍｏｌのＴｌｉＲＮ−２と各２０ｐｍｏｌの４８種類のプライマー（実施例８表１記載）との組み合わせで２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３０μＭｄＮＴＰ混合物、２．５単位のタカラＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲは９４℃で３分インキュベートした後、９８℃で１０秒、５０℃で１０秒、７２℃で４０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物のうちシングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン−１００（宝酒造社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークエンスをおこない、ＲＮａｓｅＨＩＩの上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、約４５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｃｅＮ２４にＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の上流が、約４００ｂｐのＰＣＲ増幅断片ＴｃｅＣ２９に下流が含まれていることがわかった。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子全域のクローニング
ＴｃｅＲＮａｓｅＨＩＩを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号５２に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５３に示す。上記塩基配列をもとにプライマーＴｃｅＮｄｅ（配列番号５４）及びＴｃｅＢａｍ（配列番号５５）を合成した。
実施例９−（１）で得たサーモコッカス  セラー  ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｃｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＴｃｅＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７を作製した。
（５）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例９−（４）で得られたｐＴＣＥ２６５ＮｄおよびｐＴＣＥ２０７の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。ｐＴＣＥ２０７のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号５６に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５７に示す。ｐＴＣＥ２６５Ｎｄのオープンリーディングフレームの塩基配列は、ｐＴＣＥ２０７とくらべて１４番目のＡがＧに置きかわっており、６９３から６９６番目が欠失していた。また、アミノ酸配列では５番目のグルタミン酸がグリシンに置きかわっており、２３１番目のフェニルアラニンが欠失していた。
なお、プラスミドｐＴＣＥ２０７で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＴＣＥ２０７と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９４として寄託されている。
（６）サーモコッカス  セラー  ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＴＣＥ２６５Ｎｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を２０３μｌのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にｐＴＣＥ２０７で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液を、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、いずれの形質転換体においてもＲＮａｓｅＨ活性が認められた。すなわち、塩基配列あるいはアミノ酸配列において置換、欠失があった場合でも本発明のポリヌクレオチドの活性があることが確認できた。
（７）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
実施例９−（４）で得られたｐＴＣＥ２６５Ｎｄで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＴＣＥ２６５Ｎｄを含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３９ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで２０分の遠心分離を行い、上清を集め、３７．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２２０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分３ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＡを添加し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＡで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約４１５ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６ｍｌをセントリコン−１０を用いた限外ろ過により濃縮し、約１７８μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２９．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＴｃｅＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＴｃｅＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、実施例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＴｃｅＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例１０
実施例２から実施例９において得られたバチルス  カルドテナックス（以下ＢＣＡとする）、ピロコッカス  フリオサス（ＰＦＵ）、サーモトガ  マリティマ（ＴＭＡ）、アルカエオグロバス  フルギダス（ＡＦＵ）、サーモコッカス  リトラリス（ＴＬＩ）、サーモコッカス  セラー（ＴＣＥ）、ピロコッカス  ホリコシイ（ＰＨＯ）のアミノ酸配列と塩基配列について、ホモロジー検索を行なった。検索プログラムは、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（宝酒造社製）のＭａｘｉｍｕｍ  ＭａｔｃｈｉｎｇとコンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）で算出した。
まず、ＤＮＡＳＩＳによりＰＦＵに対するＰＨＯ、ＡＦＵ、ＴＬＩ、ＴＣＥのアミノ酸配列の相同性はそれぞれ６９％、４５％、６５％、５８％、塩基配列の相同性はそれぞれ６８％、６０％、６５％、６１％であった。
次にコンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡで遺伝子データベースをＰＨＯ、ＡＦＵ、ＴＭＡに関して検索した。その結果、ＰＨＯのアミノ酸配列に対して、リボヌクレアーゼであると推定されているアミノ酸配列で最も相同性の高かったものは７０％、最も低かったものは２０％の相同性を有していた。また、ＡＦＵとは５０％、ＴＭＡとは３５％の相同性を有していた。同様に、ＡＦＵのアミノ酸配列に対して行なったところ、高かったものは５０％、低かったものは２５％、ＴＭＡとは３２％の相同性を有していた。同様に、ＴＭＡのアミノ酸配列に対して行なったところ、高かったものは５２％、低かったものは２２％の相同性を有していた。
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴで遺伝子データベースをＢＣＡ、ＰＦＵ、ＴＣＥ、ＴＬＩに関して検索した。その結果、ＢＣＡのリボヌクレアーゼＨＩＩのアミノ酸配列に対して、リボヌクレアーゼであると推定されているアミノ酸配列で最も相同性の高かったものは４３％、ＢＣＡのリボヌクレアーゼＨＩＩＩのアミノ酸配列で４６％であった。同様に、ＰＦＵのアミノ酸配列では６８％、ＴＣＥのアミノ酸配列では７０％、ＴＬＩのアミノ酸配列では６４％であった。
また、ＤＮＡＳＩＳによってＰＨＯとＡＦＵのアミノ酸配列の相同性を調べたところ５０％であった。上記のようにコンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡでも５０％であったため、ＤＮＡＳＩＳとコンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡでは相同性として表示される数値に大きな違いがないことがわかった。
実施例１１
各種ＲＮａｓｅＨの作用機作と性質
（１）Ｂｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩＩの作用機作
Ｂｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩＩとＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩの切断様式を比較するため以下のように基質を調製した。大腸菌Ｏ１５７熱抽出物を鋳型に３’側から３塩基がＲＮＡである５’端ＦＩＴＣ標識キメラプライマーＶＴ２−Ｒ２８０Ｎ３−Ｉ７（配列番号６１）とＤＮＡプライマーＶＴ２−Ｆ１１０（配列番号６２）を用いてＰＣＲを行い、２本鎖の一方の鎖にＲＮＡを３つ含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ産物よりマイクロコン−１００（ミリポア社製）によりプライマーを除去してＲＮａｓｅＨによる切断の基質とした。
次に、上記の基質０．３ｐｍｏｌを含む反応バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１％  ジメチルスルホオキシド、０．０１％  ウシ血清アルブミン、１００ｍＭ  酢酸カリウム、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．００２％  プロピレンジアミン）３９．２μｌを調製した。これにＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩ  ３０Ｕ／μｌ（宝酒造社製）または、実施例３−（５）で得られたＢｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩＩ精製標品をバッファーＡで１０倍希釈した溶液を０．８μｌ加え、５５℃で５分間及び１０分間で反応した。反応後、反応液の２μｌを１０％変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、切断されたＤＮＡ断片のサイズを確認した。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩの場合、１８ｂａｓｅと１９ｂａｓｅの位置にシグナルが現われ、経時的に１９ｂａｓｅのシグナルは減少した。また、プライマーが完全に除けていないために現われる２０ｂａｓｅのバックグランドも経時的に減少した。一方、Ｂｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩＩの場合、１９ｂａｓｅの位置にシグナルが現われ、プライマーのバックグランドの減少は見られなかった。
以上のことより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩは、２ケ所のＲＮＡ間で切断した。また、３’側のＲＮＡの５’側を切断した後、ＲＮＡがＤＮＡに結合しない状態で、さらに３’側のＲＮＡの５’側を切断する活性を有すると考えられる。一方、Ｂｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩＩは３’側のＲＮＡの５’側のみを切断し、ＲＮＡの３’側にＤＮＡが結合していない時には切断しないと考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩに比べ切断位置の選択性が高いと考えられる。
（２）Ｐｆｕ、Ｐｈｏ、Ａｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩの作用機作
Ｐｆｕ（パイロコッカス  フリオサス）、Ｐｈｏ（パイロコッカス  ホリコシイ）、Ａｆｕ（アルカエオグロバス  フルギダス）のＲＮａｓｅＨＩＩの切断様式を解析するため、以下のように基質を調製した。大腸菌Ｏ１５７熱抽出物を鋳型に３’側から３塩基がＲＮＡである５’端ＦＩＴＣ標識キメラプライマーＶＴ２−ＩＦ２０Ｎ３（配列番号６３）、２塩基がＲＮＡである５’端ＦＩＴＣ標識キメラプライマーＶＴ２−ＩＦ１９Ｎ２（配列番号６４）、１塩基がＲＮＡである５’端ＦＩＴＣ標識キメラプライマーＶＴ２−ＩＦ１８Ｎ１（配列番号６５）とＤＮＡプライマーＶＴ２ＩＲ２０（配列番号６６）を用いてＰＣＲを行い、２本鎖の一方の鎖にＲＮＡを３つ、２つ、あるいは、１つ含むＤＮＡ断片、ＶＦＮ３、ＶＦＮ２、ＶＦＮ１を得た。これらのＰＣＲ産物よりマイクロコン−１００によりプライマーを除去してＲＮａｓｅＨによる切断の基質とした。
次に、上記の基質０．３ｐｍｏｌを含む反応バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１％  ジメチルスルホオキシド、０．０１％  ウシ血清アルブミン、１００ｍＭ  酢酸カリウム、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．００２％  プロピレンジアミン）３９μｌを調製した。これに、各ＲＮａｓｅＨの精製標品３７．２Ｕ／μｌを１μｌ加え、５５℃で５分間及び１０分間反応した。反応後、反応液の２μｌを１０％変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、切断されたＤＮＡ断片のサイズを確認した。
ＶＦＮ３を基質にした場合、Ｐｆｕ、Ｐｈｏ、ＡｆｕのＲＮａｓｅＨＩＩに関して、１９ｂａｓｅの位置にシグナルが得られ、ＶＦＮ２を基質にした場合、Ｐｆｕ、Ｐｈｏ、ＡｆｕのＲＮａｓｅＨＩＩに関して、１８ｂａｓｅの位置にシグナルが得られ、ＶＦＮ１を基質にした場合、Ｐｆｕ、ＰｈｏのＲＮａｓｅＨＩＩに関して、１７ｂａｓｅの位置にシグナルが得られた。
以上のことより、Ｐｆｕ、Ｐｈｏ、ＡｆｕのＲＮａｓｅＨＩＩは３’側のＲＮＡの５’側を切断した。ＰｆｕとＰｈｏのＲＮａｓｅＨＩＩはＲＮＡが１つの場合でもＲＮＡの５’側を切断した。ＲＮＡが１つでも切断するＲＮａｓｅＨは報告されていない。切断された場合のシグナル強度はＲＮＡの数にかかわらず同様の強さを示し、ＲＮＡの数による切断効率に差がないことが示された。また、一旦現われたシグナルが経時的に減少したり、さらに短いシグナルが現われないことより、ＲＮＡの３’側にＤＮＡが結合していないと切断されないことが示された。
（３）ＢｃａとＴｍａ  ＲＮａｓｅＨＩＩのイオン要求性
実施例１で記載したＲＮａｓｅＨ活性測定法においてＭｎ２＋要求性でＭｇ２＋では全く活性を示さないＢｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩとＴｍａ  ＲＮａｓｅＨＩＩに関して、実施例１１−（２）に記載のＶＦＮ３を基質としてＭｇ２＋あるいは、Ｍｎ２＋存在下での切断を比較した。
基質０．３ｐｍｏｌを含む反応バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１％  ジメチルスルホオキシド、０．０１％  ウシ血清アルブミン、１００ｍＭ  酢酸カリウム、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．００２％  プロピレンジアミン）３９．２μｌ及び、基質０．３ｐｍｏｌを含むＭｎ＋反応バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１％  ジメチルスルホオキシド、０．０１％  ウシ血清アルブミン、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  塩化マンガン、０．００２％  プロピレンジアミン）３９．２μｌを調製した。これらにＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨＩ  ３０Ｕ／μｌ（宝酒造社製）または、実施例２−（６）で得られたＢｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩ精製標品をバッファーＡで１０倍希釈した溶液、または、実施例５−（３）で得られたＴｍａ  ＲＮａｓｅＨＩＩ菌体粗抽出液をバッファーＡで２５倍希釈した溶液を０．８μｌ加え、５５℃で５分間及び１０分間で反応した。反応後、反応液の２μｌを１０％変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、切断されたＤＮＡ断片のサイズを確認した。
Ｂｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩとＴｍａ  ＲＮａｓｅＨＩＩに関して、ともにＭｇ２＋、Ｍｎ２＋存在下のどちらにおいても１９ｂａｓｅの位置にシグナルが現われた。そのシグナルレベルは同レベルであった。
実施例１記載のＲＮａｓｅＨ活性測定法では全く活性を示さないＭｇ２＋存在下でＢｃａ  ＲＮａｓｅＨＩＩとＴｍａ  ＲＮａｓｅＨＩＩはＭｎ２＋の場合と同等の切断活性を示した。
以上のことより、基質の形状によっては切断にＭｎ２＋を要求せず、Ｍｇ２＋でも代替可能であり、Ｍｎ２＋やＭｇ２＋を要求する酵素と同一反応液で作用させられる可能性が示された。
（４）ＲＮａｓｅＨの耐熱性の検討
バチルス  カルドテナックス  ＲＮａｓｅＨとして実施例２−（５）、実施例３−（４）で得られたｐＲＨＢ１１、ｐＢＣＡ３Ｎｄ２、ピロコッカス  フリオサス  ＲＮａｓｅＨとして実施例４−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０、サーモトガ  マリティマ  ＲＮａｓｅＨとして実施例５−（２）で得られたｐＴＭ−ＲＮＨ、ピロコッカス  ホリコシイ  ＲＮａｓｅＨとして実施例６−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８、アルカエオグロバス  フルギダス  ＲＮａｓｅＨとして実施例７−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４、サーモコッカス  リトラリス  ＲＮａｓｅＨとして実施例８−（４）で得られたｐＴＬＩ２０４、ｐＴＬＩ２２３Ｎｄ、サーモコッカス  セラー  ＲＮａｓｅＨとして実施例９−（４）で得られたｐＴＣＥ２０７、ｐＴＣＥ２６５Ｎｄでそれぞれ形質転換された大腸菌を用いて耐熱性を調べた。すなわち、上記大腸菌を培養し、培養液から調製した素酵素抽出液を６０℃、１５分の条件で熱処理を行ない、実施例１と同様の方法でＲＮａｓｅＨ活性を調べた。その結果、どの菌株由来のＲＮａｓｅＨにおいてもＲＮａｓｅＨ活性が確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、遺伝子工学において利用価値の高いＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を提供される。また、本発明のＲＮａｓｅＨは耐熱性を有しており、工業的に有利なＲＮａｓｅＨの製造方法も提供される。
本発明によって、さまざまな用途で本発明のＲＮａｓｅＨを用いることが可能となった。
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【配列表】
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