(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（a） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（b） 該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されていてもよく、プライマー中のその他の塩基は前記染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的である、検出方法。
【請求項２】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（a） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（b） 該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ） 該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼが、二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡポリメラーゼが、ピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）の工程の前に、試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片を増幅させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
染色体又はその断片を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群のすくなくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、予め標識されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）工程を単一の容器で行い、該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群のすくなくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（a） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（b） 特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されていてもよく、プライマー中のその他の塩基は前記染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的である、検出方法。
【請求項１５】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（a） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（b） 特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ） 試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ） 特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１８】
該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
ＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡポリメラーゼが、ピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
染色体又はその断片を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かを、野生型用プライマー及び／又は変異型用プライマーを用いた各増幅産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
該各プライマーの少なくとも１つ又は検出用プローブが、予め標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該各プライマーの少なくとも１つ又は検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）工程を単一の容器で行い、特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かを、野生型用プライマー及び／又は変異型用プライマーを用いた各増幅産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、プライマー中のその他の塩基は塩基多型検出の対象である染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的である、キット。
【請求項２７】
該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換された、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
３’末端の３番目の相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核酸配列の変異または多型の検出方法並びにそれに用いられるプライマー及び検出用キットに関する。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。
背景技術
遺伝子の塩基多型は、個体間において、薬物代謝における副作用および薬物での治療失敗の原因の一つとして考えられている。また、塩基多型は、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。さらに、塩基多型は多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら塩基多型の解析は、臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類は精神医学患者および自殺志願者を対象とした臨床研究に特に推奨される（ＧｒａｍおよびＢｒｓｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ，１９９０，第８７〜９６頁；Ｂａｌａｎｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第３６巻、第５５１〜５５４頁、（１９８９））。上記のような理由から、原因となる変異型遺伝子の同定と、それに続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため、多大な労力と時間が必要である。また核酸配列決定法は、近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のプライマーのうちの一方のプライマーとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用プライマーと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用プライマーとを用いる。変異型用プライマーは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用プライマーをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用プライマーを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用プライマーを用いた場合には、プライマーの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので、伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用プライマーを用いた場合には増幅が起きず、変異型用プライマーを用いた場合に増幅が起きる。従って、各プライマーを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を検出することができる。
また点突然変異を含む核酸配列を予め増幅しておき、各プライマーにおいて増幅核酸を用いて伸長反応が起きるか否かでの判定を行ってもかまわない。この方法を塩基多型の分析に応用することも可能である。
上記のような原理によれば、従来法により明確に塩基多型の検出が行えるように思われるが、実際には、点突然変異の場合には野生型用プライマーと変異型用プライマーとはわずか１塩基の相違があるのみであり、変異型用プライマーを用いて野生型遺伝子を伸長もしくは増幅した場合、及び野生型用プライマーを用いて変異型遺伝子を伸長もしくは増幅した場合にも、ある程度の反応（即ち、伸長もしくは増幅）が起きることが多く、明確な判定が困難となる場合が少なくない。また、上述のようなミスマッチのプライマーを用いた場合に伸長または増幅が起きるか否かは、用いる機器の種類やその他の微妙な条件によって左右され、再現性も低い。従って、ミスマッチのプライマーを用いた場合に反応が完全に起こらないようにするためには、反応時の温度条件等を極めて厳密に制御する必要があり、かなり困難な作業になる。しかも、Ｔａｑポリメラーゼのように３’エキソヌクレアーゼ活性が欠損したＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を実施した場合、伸長反応時に取り込みエラーがあってもそれを校正することができず、新たなエラーを含んだ伸長反応を行う場合がある。
一方、正確な伸長反応が可能である３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた場合の条件設定は、更に困難である。特に、プライマーの３’末端の配列がミスマッチの場合、本来伸長反応が起こらないことを期待しているにもかかわらず、校正機能によりミスマッチの塩基が削除され、伸長反応が起こってしまう可能性がある。
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の塩基多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法において、野生型用プライマーが変異型遺伝子とハイブリダイズする際及び変異型用プライマーが野生型遺伝子とハイブリダイズする際に、プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドを塩基多型部位に対応させることにより、厳密な反応条件の制御を行わなくとも、ミスマッチのプライマーの伸長または増幅反応を完全に阻害することができ、したがって容易に明確な判定が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．  核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応する、検出方法。
項２．  核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項１に記載の検出方法。
項３．  該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中のプライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている項２に記載の検出方法。
項４．  核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  該プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、項１に記載の検出方法。
項５．  該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、項４に記載の検出方法。
項６．  ＤＮＡポリメラーゼが、二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有する項１に記載の方法。
項７．  ＤＮＡポリメラーゼが、ピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来である項１に記載の方法。
項８．  （ａ）の工程の前に、試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片を増幅させる工程を含む、項１に記載の方法。
項９．  染色体又はその断片を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である項８に記載の方法。
項１０．      該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群のすくなくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、項１に記載の方法。
項１１．      該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、予め標識されている項１０に記載の方法。
項１２．      該各プライマーの少なくとも１つまたは検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている項１０に記載の方法。
項１３．      （ａ）工程を単一の容器で行い、該各プライマーが伸長されたか否かを、野生型用プライマー及び変異型用プライマーからなる群のすくなくとも１種から伸長した産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、項１に記載の方法。
項１４．      核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応する、検出方法。
項１５．      核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項１４に記載の検出方法。
項１６．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている項１５に記載の検出方法。
項１７．      核酸試料中に含まれる一塩基多型を検出する方法であって、該方法が、
（ａ）  試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させる工程、
（ｂ）  特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する工程を含み、
該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、
該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、項１４に記載の検出方法。
項１８．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とする、項１７に記載の検出方法。
項１９．      ＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有する項１４に記載の方法。
項２０．      ＤＮＡポリメラーゼが・ピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来である項１４に記載の方法。
項２１．      染色体又はその断片を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である項１４に記載の方法。
項２２．      特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かを、野生型用プライマー及び／又は変異型用プライマーを用いた各増幅産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、項１４に記載の方法。
項２３．      該各プライマーの少なくとも１つ又は検出用プローブが、予め標識されている項２２に記載の方法。
項２４．      該各プライマーの少なくとも１つ又は検出用プローブが、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団からなる群から選ばれる少なくとも１種によって標識されている項２２に記載の方法。
項２５．      （ａ）工程を単一の容器で行い、特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かを、野生型用プライマー及び／又は変異型用プライマーを用いた各増幅産物の配列に特異的な検出用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出する、項１４に記載の方法。
項２６．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応するキット。
項２７．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項２６に記載のキット。
項２８．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項２７に記載のキット。
項２９．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、項２６に記載のキット。
項３０．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、項２９に記載のキット。
項３１．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応するキット。
項３２．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項３１に記載のキット。
項３３．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、項３２に記載のキット。
項３４．      野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び検出用プローブを含む一塩基多型検出用試薬キットであって、該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、項３１に記載のキット。
項３５．      該各プライマーの３’末端の３番目の塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる塩基とした、項３４に記載のキット。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、「塩基多型」とは、染色体またはその断片中のある部位において、個体間で２種以上の塩基が存在することをいい、一方を野生型、それとは異なる塩基を有するものを変異型という。また「塩基多型部位」とは、野生型と変異型が存在している塩基多型の位置をいう。
本発明において、染色体又はその断片を単に核酸ということがある。「野生型核酸」とは、塩基多型部位を含む核酸であって、該部位が野生型の塩基を有するものを意味する。「変異型核酸」とは、塩基多型部位を含む核酸であって、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。より好ましくは、「変異型核酸」とは、塩基多型部位を含む核酸であって、該部位が野生型の塩基とは異なる塩基で置換されているものをいう。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。
「野生型用プライマー」とは、野生型の塩基多型部位にハイブリダイズすることができるプライマーを意味する。また、「変異型用プライマー」とは、変異型の塩基多型部位にハイブリダイズすることができるプライマーを意味する。
「野生型用プローブ」とは、野生型用プライマーによって伸長または増幅した産物を特異的に検出するプローブである。また、「変異型用プローブ」とは、変異型用プライマーによって伸長または増幅した産物を特異的に検出するプローブである。
試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されず、ミトコンドリア等も含まれる。該標的核酸の例としては、ＡＩｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）遺伝子、糖尿病としてＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ）が挙げられる。
核酸を複製する場合、一本鎖に変性した標的核酸にプライマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型としてプライマー伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成されて複製できる。
本発明において、プライマーが伸長されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する方法とは、核酸試料中の特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマーと、１種又は２種の変異型用プライマーを同時又はそれぞれ別々に用いて伸長反応を行うことにより多型を検出する方法である。
また、特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する方法とは、特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、フォワードプライマーに相当する野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを同時にまたはそれぞれ別々に用いて、リバースプライマーと共に増幅反応を行うことにより多型を検出する方法である。
本発明に用いられる各プライマーは、各プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが塩基多型配列のヌクレオチドと対応するように設計されている。
即ち、図１において、ある塩基多型部位において野生型の塩基が“Ｇ”、変異型の塩基が“Ｔ”であり、塩基多型部位の３’側の塩基がＧの場合には、野生型核酸を伸長または増幅するための野生型用プライマーは５’−−−−−−−−Ｇｇ３’、変異型用プライマーは５’−−−−−−−−Ｔｇ３’となる。このように設計した場合、野生型用プライマー／野生型核酸及び変異型用プライマー／変異型核酸の組合せにおいて、各プライマーは核酸と完全に一致する為伸長または増幅は起こる。一方、野生型用プライマー／変異型核酸及び変異型用プライマー／野生型核酸の組合せにおいてはプライマーの３’末端より２番目の塩基が相補的でない（ミスマッチしている）ため、伸長または増幅が起こらない。特に、本発明者らは、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、３’末端にミスマッチがあれば、認識／除去するが、３’末端は相補的な為エキソヌクレアーゼ活性は働かず、またＤＮＡポリメラーゼ反応も起こらないことを見出した。
このように、本発明の方法では、野生型用プライマー／変異型核酸及び変異型用プライマー／野生型核酸の組合せでは核酸鎖の伸長または増幅が完全に阻害され、一方、野生型用プライマー／野生型核酸及び変異型用プライマー／変異型核酸の組合せでは、核酸鎖の伸長または増幅が起きる。したがって、本発明の方法によれば、従来法のように偽陽性を生じることなく、標的核酸中の多型を明確に検出することができる。
本発明は、上述したようなプライマーに加えて、ミスマッチの部分を更にもう１カ所導入した野生型用プライマー及び変異型用プライマーを提供する（図１中の野生型用プライマー２及び変異型用プライマー２を参照）。即ち、本発明に用いられる上記野生型用及び変異型用プライマーは、各プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、塩基多型部位のヌクレオチドと対応するように設計され、さらに、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖（図１中“下鎖”）の塩基と相補的でない塩基になるように設計してもよい（以下この部位を「人為的ミスマッチ部位」という。）。図１中の野生型用プライマー２及び変異型用プライマー２においては、各プライマーの３’末端から３番目の塩基が人為的ミスマッチ部位である場合を示しており、該位置のプライマーがハイブリダイズする鎖（図１中“下鎖”）の塩基が“Ｔ”である場合に、野生型核酸を伸長または増幅するための野生型用プライマーは５’−−−−−−−Ｘ１Ｇｇ３’、変異型用プライマーは５’−−−−−−−Ｘ２Ｔｇ３’（Ｘ１，Ｘ２はＴの相補塩基であるＡ以外の塩基、即ち、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであって、同一または相異なっていてもよい。）となる。
このように設計した場合、野生型用プライマー／野生型核酸及び変異型用プライマー／変異型核酸の組合せにおいて、各プライマーは少なくとも３’末端から２番目の配列までは一致する為伸長または増幅反応は起こる。一方、野生型用プライマー／変異型核酸及び変異型用プライマー／野生型核酸の組合せにおいては、プライマーの３’末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長または増幅反応が起こらない。３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼはミスマッチを認識除去する活性を有するが、３’末端は相補的な為エキソヌクレアーゼも働かず、誤った伸長反応を起こすことがない。このことにより、野生型用プライマーが変異型核酸と結合すること、及び変異型用プライマーが野生型核酸と結合することが、より効果的に妨げられることを見出した。
更に、本発明のプライマーは、３’末端から２番目の塩基は塩基多型部位の予想されるヌクレオチドに対応する塩基配列であり、更に、３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でなく、且つ該相補的でない塩基は、各々のプライマーにおいて異なる塩基とする様設計された野生型用プライマー及び変異型用プライマーであってもよい。即ち、図１の野生型用プライマー２及び変異型用プライマー２においてＸ１，Ｘ２が相異なる塩基を有する場合を意味する。
例えば、その３’末端から２番目の塩基が塩基多型部位の予想されるヌクレオチドになるようにプライマーを設計し、野生型用プライマーは野生型核酸の該塩基に対応する塩基、及び変異型用プライマーは変異型核酸の該塩基に対応する塩基を配置させる。さらに、各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの塩基の中のある位置において、プライマーがハイブリダイズする鎖の核酸配列中の塩基がＴである場合、例えば、野生型用プライマーは、Ａ以外のＴ、変異型用プライマーは、Ａ及びＴ以外のＣまたはＧと設計する。この人為的ミスマッチの組み合わせは以下の通りである。
0003937136.tif 000002
このようなプライマーを使用すれば、野生型用プライマーが変異型核酸と結合すること、及び変異型用プライマーが野生型核酸と結合することがより妨げられるとともに、下記の検出のためのプローブにおいても、野生型検出用プローブと変異型検出用プローブ間において、塩基多型部位と人為的ミスマッチの部位で更にもう一塩基異なる結果、２塩基異なることとなり、より正確な検出が可能となった。
本発明におけるプライマーの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基であり、上記人為的ミスマッチ部位は、該プライマー中に少なくとも１つ存在する。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。野生型用プライマー及び変異型用プライマーがハイブリダイズする鎖は、上鎖または下鎖どちらでもよい。
３’末端から３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基連続のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。一方、他の部分に用いた場合は、プライマーの非連続的な２カ所のミスマッチにより鋳型へのハイブリダイゼーションそのものが妨げられ、結果として伸長反応を抑制できる。
本発明における、プライマーの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型用プライマーと、１種又は２種の変異型用プライマーを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてプライマーが伸長する。
該伸長反応は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。また、該プライマーが伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、予め増幅しておくことも可能である。
本発明における、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型用プライマーと、１種又は２種の変異型用プライマーを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてフォワードプライマー（野生型用プライマーまたは変異型用プライマー）とリバースプライマーの間で増幅される。
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁（１９９１））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻、第１６９１頁（１９９２））、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、第３２７０頁（１９９３））などが挙げられる。
なかでもＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の標的核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
本発明の特定の一塩基多型部位を含む染色体又は断片が増幅されたか否かによって塩基多型を検出する方法では、野生型核酸を増幅できる野生型用プライマーと、変異型核酸を増幅できる変異型用プライマーをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
野生型用プライマーを用いて標的核酸を伸長または増幅反応を行った場合、標的核酸が野生型であれば伸長または増幅されるが、変異型では伸長または増幅されない。逆に、変異型用プライマーを用いて標的核酸を伸長または増幅反応を行った場合、標的核酸が変異型であれば伸長または増幅されるが、野生型であれば伸長または増幅されない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型用プライマーを用い、他方は変異型用プライマーを用い、伸長または増幅反応が起ったか否かを調べることにより、標的核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型核酸（野生型遺伝子）と変異型核酸（変異型遺伝子）が共に存在するから野生型用プライマーを用いた場合も変異型用プライマーを用いた場合も伸長または増幅反応が起きる。
また、本発明の伸長工程及び増幅工程において、単一の容器中で野生型用プライマー及び変異型用プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼと共に作用させてもよい。即ち、１つの試料中に含まれる核酸に野生型用プライマー及び変異型用プライマーを同時にＤＮＡポリメラーゼと共に作用させ、伸長または増幅反応を行い、以下に示すように野生型用プローブ及び変異型用プローブを伸長または増幅された産物にハイブリダイズさせることによって、標的核酸が野生型が変異型を調べることができる。
本発明のプライマーを使用することにより、伸長又は増幅反応時の温度、濃度等の条件を極めて厳密に制御する必要がなくなり、より緩和な条件で反応を行っても、より正確な検出を行うことが可能となる。
例えば、伸長又は増幅反応において、プライマーを標的核酸にアニールさせる温度は、これまでの方法では、±０．１℃の精度で制御する必要がある場合も少なくなかったが、本発明のプライマーを使用した場合±１℃以上の誤差があっても検出結果の正確性には影響を受けない。
ＤＮＡポリメラーゼ
本発明の伸長反応又は増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常該反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼが使用できる。
好ましくは、二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有するものがよい。増幅反応によく用いられるサーマス・アクエティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ等は、３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないため、増幅反応を行った場合、正確に鋳型配列の相補鎖を合成できなかった時もそのまま増幅反応を続けるため、増幅核酸断片に予想外の変異を含有する可能性が否定できないためである。
より好ましくは、伸長反応の正確性が優れているピロコッカス・スピーシーズ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＤＮＡポリメラーゼがよい。
伸長または増幅条件
伸長または増幅の条件としては、使用するＤＮＡポリメラーゼやプライマーの配列によっても異なるが、通常されている条件であれば特に限定されない。本発明によれば、上述のごとく、各プライマーを標的核酸にアニールさせる温度は、±０．１℃の精度で制御する必要はなく、±１℃以上の誤差があっても行うことができる。
検出
上記伸長反応又は増幅反応によって得られた産物から、塩基多型を検出する方法としては、特に制限はなく通常採用されている方法、例えば塩基配列の配列決定、ハイブリダイゼーションや制限酵素の利用によるもの等により好ましく行い得る。
例えば、ハイブリダイゼーションを利用する場合、該各プライマーを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に該標識を検出することによって、行うことができる。または、リバースプライマーを標識しておいてもよい。または、下記に示される検出用プローブを標識しておいてもよい。または、それらは１種または２種以上の標識剤で標識されていてもよい。
酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
ハプテンとしては、ビオチンなどが挙げられる。
放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
抗原としてはジゴキシゲニン、抗体としては抗ジゴキシゲニンが挙げられる。
該標識は、プライマーの伸長反応に影響を与えることがなければプライマーのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５’部位である。
具体的には、野生型用プライマー及び変異型用プライマーによって伸長、増幅された産物を特異的に捕捉することができる野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブを、公知の方法に従い、マイクロタイタープレートなどの固相に結合させる。次に、伸長又は増幅した産物を変性させ、該検出用プローブが結合したマイクロタイタープレートに添加する。野生型用プライマーによって伸長、増幅された産物は野生型検出用プローブにのみ結合し、変異型検出用プローブには結合しない。また、変異型用プライマーによって、伸長、増幅された産物は変異型検出用プローブにのみ結合し、野生型検出用プローブには結合しない。その後、プライマーに結合している標識を検出することによって、試料に含まれている染色体又はＤＮＡ断片の塩基多型を検出することができる。
野生型検出用プローブまたは変異型検出用プローブは、同じものであっても、野生型用プライマーまたは変異型用プライマーの伸長または増幅産物にそれぞれ特異的であってもよい。
本発明の方法では、塩基多型部位に加えて、人為的ミスマッチの部位においても野生型用プライマーと変異型用プライマーで異なっている場合には、野生型検出用プローブまたは変異型検出用プローブは、塩基多型部位及び人為的ミスマッチ部位に特異的にハイブリダイズすることができるように設計することが好ましい。このことにより、野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ間において２塩基の相違が見られることとなるため、塩基多型部位のみ相違している場合と比較して、より明確にそれぞれの伸長／増幅産物を検出することが可能である。したがって、試料を野生型用、変異型用の２つに分けることなく両プライマーで同時に伸長／増幅反応を行い、特異的に野生型検出用プローブと変異型検出用プローブで測り分けることも容易である。具体的には、１つの試料中に含まれる核酸に野生型用プライマー及び変異型用プライマーを同時にＤＮＡポリメラーゼと共に作用させ、伸長または増幅反応を行う。その後、得られた産物を変性させ、２つに分け、野生型用プローブ及び変異型用プローブにハイブリダイズさせることによって、標的核酸が野生型か変異型を調べることができる。野生型用プライマーと変異型用プライマーに異なる標識を用いた場合には、１つのプレートのウエルで行うことができる。
検出用プローブの長さとしては、特に制限されないが、１０〜１００塩基程度、好ましくは、１５〜５０塩基程度、より好ましくは、１８〜３５塩基程度である。
検出方法の条件も特に限定されず、例えば、日本臨床検査自動化学会会誌、第２０巻、第７２８頁（１９９５年）に記載の方法に従って行うことができる。
キット
本発明において、キットとしては、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットを含むものであり、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーにおいて、
・該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応する、
・該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換されている、または
・該各プライマーの３’末端より２番目の塩基が、塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応し、該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる
という特徴を有する。
増幅によって検出する場合には、更に、リバースプライマーを含んでいてもよい。
また、検出の際に、プローブを使用する場合には、本発明のキットは更に、検出用プローブを含んでいてもよい。
本発明で使用する検出用プローブは、野生型と変異型を共に検出できるものであってもよいが、好ましくは、野生型と変異型を各々検出するために各型検出用プローブを用意するのがよい。その場合、各検出用プローブは塩基多型部位を含むことが好ましい。
更に、伸長または増幅に用いる該各プライマーの３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、染色体又はその断片中の該プライマーがハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基に置換され、且つ該相補的でない塩基は、各プライマーにおいて異なる場合には、野生型検出用プローブまたは変異型検出用プローブは、野生型用プライマーまたは変異型用プライマーの伸長または増幅産物を特異的に検出することができるように設計することが好ましい。このことにより、その検出用プローブ間においては、塩基多型部位と人為的ミスマッチの部位で更にもう一塩基異なることとなるため、より特異的な検出が可能となる。
また、該各プライマーまたは検出用プローブは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
このように、本発明の方法では、野生型用プライマー／変異型核酸及び変異型用プライマー／野生型核酸の組合せでは核酸鎖の伸長が完全に阻害され、一方、野生型用プライマー／野生型核酸及び変異型用プライマー／変異型核酸の組合せでは核酸鎖の伸長が起きる。したがって、本発明の方法によれば、従来法のように偽陽性を生じることなく、標的核酸中の塩基多型を明確に検出することができる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１  ＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）遺伝子の塩基多型検出
（１）ＡＣＥ遺伝子２３５０番の多型を検出するプライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）および配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー４と示す）および配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー５と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
プライマー１はヒトＡＣＥ遺伝子の野生型核酸の配列を有し、その３’末端が塩基多型部位であって野生型のヌクレオチド（Ａ）を有し、プライマー２はヒトＡＣＥ遺伝子の変異型核酸の配列を有し、その３’末端が塩基多型部位であって変異型のヌクレオチド（Ｇ）を有し、プライマー３はヒトＡＣＥ遺伝子の野生型核酸の配列を有し、３’末端から２番目が塩基多型部位であって野生型のヌクレオチド配列（Ａ）を有し、プライマー４はヒトＡＣＥ遺伝子の変異型核酸の配列を有し、３’末端から２番目が塩基多型部位であって変異型のヌクレオチド（Ｇ）を有する。プライマー５はプライマー１〜４のいずれとも対になるリバースプライマーである。
（２）ＰＣＲ法によるＡＣＥ遺伝子多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出した３種類のＤＮＡ溶液（野生型のホモ（Ａホモ）、変異型のホモ（Ｇホモ）、ヘテロ型）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＣＥ遺伝子多型を解析した。
（ａ）試薬及び増幅条件
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
プライマー１〜４のいずれか            ５ｐｍｏｌ
プライマー５                          ５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                          ２．５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                      ２．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                  １μｌ
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ    ０．２Ｕ
抽出された各ＤＮＡ溶液                １００ｎｇ
増幅条件
９４℃・２分
９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃、３０秒（３５サイクル）
６８℃・２分
（ｂ）検出
得られたＰＣＲ産物を常法に従ってアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色して増幅産物のバンドを検出した。その結果、下記表２に示すような結果が得られた。
0003937136.tif 000003
上記のように、ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼとプライマーの３’末端から２番目の部位に塩基多型配列を含むプライマー（プライマー３及びプライマー４）によって試料の遺伝子型を明確に判定することができた。
実施例２  ＡＤＤ（Ａｌｐｈａ  Ａｄｄｕｃｉｎ）遺伝子の塩基多型（Ｇｌｙ４６０Ｔｒｐ）の検出
（１）ＡＤＤ遺伝子のエキソン１０、２４６番目の多型を検出するプライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号６〜１３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ６〜１３と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
オリゴ６（配列番号６）及びオリゴ７（配列番号７）は野生型（Ｇ）／変異型（Ｔ）で共通のヌクレオチド配列（多型部位を含まない）を有し、オリゴ６がセンス鎖、オリゴ７がアンチセンス鎖であり、いずれも伸長／増幅反応のプライマーとして使用される（ヒトＡＤＤ遺伝子と相同な配列）。オリゴ８（配列番号８）及びオリゴ９（配列番号９）はオリゴ６とオリゴ７による増幅産物をそれぞれ検出するためのプローブとして使用され、オリゴ８は野生型（Ｇ）、オリゴ９は変異型（Ｔ）の検出に使用される（オリゴ８：ヒトＡＤＤ遺伝子の塩基多型（Ｇｌｙ４６０Ｔｒｐ）の野生型配列と相同な配列、オリゴ９：ヒトＡＤＤ遺伝子の塩基多型（Ｇｌｙ４６０Ｔｒｐ）の変異型配列と相同な配列）。オリゴ１０（配列番号１０）は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ａ→Ｔ）を有し、オリゴ１１（配列番号１１）は３’末端から２番目に変異型（Ｔ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ａ→Ｃ）を有し、それぞれオリゴ７と組み合わせて増幅反応のプライマーとして使用される。オリゴ１２（配列番号１２）とオリゴ１３（配列番号１３）はそれぞれオリゴ１０とオリゴ７およびオリゴ１１とオリゴ７の増幅産物を検出するためのセンス鎖のプローブとして使用される。なお、オリゴ７、１０、１１は必要により標識して使用される。また、オリゴ８、９、１２および１３は５’末端には特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法により５位にリンカーアームを有するウリジンが導入されている。
（２）ＰＣＲ法およびハイブリダイゼーション法によるＡＤＤ遺伝子多型の解析
▲１▼ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出した３種類のＤＮＡ溶液（野生型のホモ（Ｇホモ、Ｇ／Ｇ）、変異型のホモ（Ｔホモ、Ｔ／Ｔ）、ヘテロ型（Ｇ／Ｔ））をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＤＤ遺伝子多型を解析した。
（ａ）試薬及び増幅条件
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ６、１０および／または１１のいずれか  ５ｐｍｏｌ
オリゴ７（５’をビオチンにより標識）        ５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                                ２．５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ２．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                        １．２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ        ０．２Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液                              １００ｎｇ
増幅条件
９４℃・５分
９４℃・１５秒、６０℃・３０秒、６８℃、３０秒（３５サイクル）
６８℃・２分
（ｂ）ハイブリダイゼーション法による検出
オリゴ８、９、１２、１３を各々５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２の溶液の２．５ｐｍｏｌ／ｍｌに調製し、ポリスチレン製マイクロプレート（ＭｉｃｒｏＦＬＵＯＲ  Ｂ、ダイナテック社製）に、１ウェルあたり１００μｌずつ分注し、１５時間程度室温に放置することで、マイクロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰ、０．５％  ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥させた。
（ａ）の各増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ  ＮａＯＨで増幅反応液中の増幅されたＤＮＡを変性させ、各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮａＮ３の溶液１００μｌに加えて、上記の検出用捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５５℃で３０分間振盪させた。これによって、増幅されたＡＤＤ遺伝子断片が固定化されたプローブによって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
次に、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）、１％  ＳＤＳに置換し同様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５５℃で２０分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼを標識したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ製：ＤＯ３９６）を５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１％  ＢＳＡの溶液で２０００倍に希釈した溶液１００μｌと置換し、３７℃で１５分間振盪させた。これによって、捕捉されたＤＮＡのビオチンにアルカリ性ホスファターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合した。２５０μｌの５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：Ｌｕｍｉｐｈｏｓ４８０；Ｌｕｍｉｇｅｎ社）５０μｌを注入し、３７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測定した（単位ｋｉｌｏｃｏｕｎｔ／ｓｅｃｏｎｄ，ｋｃｐｓ）。
これらの工程はすべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌  第２０巻、第７２８頁（１９９５年）を参照）により自動で行われ、所要時間は約２．５時間であった。
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上記のように、プライマーの３’末端から２番目の塩基に多型塩基、および３番目に人為的な変異を含むプライマー２種を単独または混合して増幅し、それぞれの増幅産物に特異的で、相互に２塩基の相違のある２種の検出用オリゴを使用することで遺伝子型を明確に判定することができた。
産業上の利用の可能性
上述したように、本発明により、標的核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、偽陽性が生じないので、遺伝子増幅法の条件をそれほど厳密にしなくても再現性良く結果が得られ、機種の違い等によって判定結果が異なることはなくなった。また、本発明の方法によれば、従来法では困難であったホモ接合とヘテロ接合の識別も可能になった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の検出方法における伸長または増幅を示す図である。
図２は、本発明の実施例２で使用したオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図１】
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【図２】
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