(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−ＧｌｙのテトラペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシン。
【請求項２】
老化防御効果を与える物質としての、一般式Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−ＧｌｙのテトラペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシン。
【請求項３】
活性主成分と薬理学的に許容される担体とを含有する老化防御効果を与える薬理学的組成物であって、前記活性主成分が、有効量のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド又はその塩を含有する組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記塩が、アミノ基の塩を含有する組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、前記塩が、酢酸塩、塩酸塩およびシュウ酸塩からなる群から選択される組成物。
【請求項６】
請求項３に記載の組成物であって、前記塩が、カルボキシ基の塩である組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、およびトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される組成物。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１項に記載の組成物であって、非経口投与に適した形態である組成物。
【請求項９】
請求項３〜７の何れか１項に記載の組成物であって、鼻内投与に適した形態である組成物。
【請求項１０】
請求項３〜７の何れか１項に記載の組成物であって、経口投与に適した形態である組成物。
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載のテトラペプチドまたは請求項３〜１０の何れか１項に記載の組成物の使用であって、医薬を製造するための使用。
【請求項１２】
請求項１もしくは２に記載のテトラペプチドまたは請求項３〜１０の何れか１項に記載の組成物の使用であって、早発性老化を防止するための医薬を製造するための使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、前記防止は、スーパーオキシドディスムターゼ活性の増大、脂質過酸化物参加生成物の減少、およびメエラトニン産生の増大を含んでなる使用。
【請求項１４】
請求項１もしくは２に記載のテトラペプチドまたは請求項３〜１０の何れか１項に記載の組成物の使用であって、アスピリン誘導性気管支喘息の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項１５】
請求項１１〜１４の何れか１項に記載の使用であって、前記組成物が前記テトラペプチドの塩を含有し、該塩がアミノ基の塩である使用。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用であって、前記塩が、酢酸塩、塩酸塩および蓚酸塩からなる群から選択される使用。
【請求項１７】
請求項１５に記載の使用であって、前記塩がカルボキシ基の塩である使用。
【請求項１８】
請求項１５に記載の使用であって、前記塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、およびトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される使用。
【請求項１９】
局所投与に適した形態である、請求項３〜７の何れか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、医薬の分野に関し、生物の早発性老化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｅｉｎｇ）を防止するための老化防御物質として使用し得る。
【０００２】
生物の老化の主たる機序には、フリーラジカルによって引き起こされた分子的な損傷の増加、抗酸化防御系の機能的な障害、骨端の生理的機能の疾患などがあることが知られている（１，２，３）。
【０００３】
【発明の背景】
特許請求の範囲に記載された本発明のテトラペプチドは、生物活性、すなわち老化防御活性を示すので、同様の用途を有する物質として、抗酸化特性を有する一群の化合物を挙げなければならない。周知のラジカルプロセスの阻害剤である、イオノール（Ｉｏｎｏｌ）食物サプリメント（２、６−ジ−tert−ブチル−４−メチルフェノール）は、老化の進行が早いことが特徴であるマウスの系統ＬＡＦ１の寿命の増大を促進した（４）。しかしながら、２、６−ジ−tert−ブチル−４−メチルフェノール（ジブノール）に基づく医薬品は、塗布剤の形で製造されており、多くは、泌尿器科の癌患者の治療に用いられている（５）。食餌にエトキシヒン（ｅｔｈｏｘｙｈｉｎ）抗酸化剤（サントヒン）を加えると、ＣＨ３系統のマウスの寿命が延びた（６）。ビタミンＢ６の構造類縁体であり、低毒性の水溶性抗酸化剤である、２−エチル−６−メチル−３−オキシピリジンクロルハイドレートによっても、実験動物の寿命の増加が促進される（７，８）。２−メルカプトエタノールアミン、ブチルヒドロキシトルオール（ｂｕｔｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｏｌ）、システイン、３−ヒドロキシピリジン、セントロフェノキシン、乳酸、グルコン酸、及びグルタチオンによっても、実験動物の寿命の僅かな延びが促進された（９，１０）。しかしながら、これらの化合物は薬学的調製物ではなく、老化防御物質として医薬には用いられていない。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅの投与によっても、実験動物の寿命が延びた（１１，１２，１３）。しかしながら、動物がこれらのビタミンを過剰摂取すると、臓器とシステムの機能に好ましくない影響を及ぼし、ビタミン過剰症の著しい進行が引き起こされ得る。ビタミンと野菜の物質から組成される調製物であるβ−カテコールは、抗酸化活性を示すことが知られている（１４）。老化の促進を示すＳＡＭ−Ｐ８系統のマウスに該調製物を投与することによって、前記動物の生存率が増加した。しかしながら、その老化防御作用の機序は、未だ十分に研究されていないので、臨床試験への導入は制限されている。早老性のＳＡＭ系統のマウスに、カルノシン（β−Ａｌａ−Ｈｉｓ）を増量した食餌を７ヶ月間与え続けると、それらの死亡率が減少した（１５）。しかしながら、カルノシンは薬学的調製物ではないので、その老化防御特性は未だ十分に研究されていない。骨端ホルモンであるメラトニンの付与により、マウスの平均寿命が若干増加した（１６）。メラトニンの効果にはその抗酸化特性が関連している（１７）。しかしながら、高い胚死亡率に関して選択されたキイロショウジョウバエ（ＨＥＭ株）にメラトニンを与えても、抗酸化効果を伴うにもかかわらず、老化防御効果を得ることはできなかった。メラトニンは薬学的調製物ではなく、生物的に活性な食物添加物の形で製造される。
【０００４】
ノボカイン含有薬物であるジェロバイタルは、老化防御物質として使用される。この調製物の副作用は、心臓血管系機能に対して生じ得る負の影響、そのアレルギー効果、場合によっては、睡眠障害、不安感、筋肉及び関節の痛みに存する。
【０００５】
【発明の開示】
特許請求に記載の発明は、老化防御活性を示し得る、ペプチド由来の新規生物活性化合物を得ることを目的とする。
【０００６】
特許請求に記載のペプチド化合物（テトラペプチド）には、構造的類縁体は存在しない。
【０００７】
本発明では、一般式Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−ＧｌｙのテトラペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシンの権利が請求されている。
【０００８】
本発明によれば、以下のアミノ酸配列Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙを有するテトラペプチドＬ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシンは、抗酸化防御系の指標の刺激によって、及び拡散性神経内分泌系の構造体におけるメラトニンの合成過程によって、生物活性、すなわち、老化防御活性を示す。
【０００９】
前記ペプチドは、溶液中での古典的なペプチド合成法によって得られる（１９）。
【００１０】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの老化防御活性を、実験的な試験に記載した。ラットで松果体外のメラトニンの合成を調べることによって、及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）で抗酸化防御の指標、寿命、及び生殖期間の長さを分析することによって、老化防御活性の研究を行った。
【００１１】
本発明において、老化防御活性を示し得る前記薬学的物質は、その活性主成分として、有効量の式Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ）のテトラペプチド又はその塩を含有する。
【００１２】
本発明において、老化防御活性を示し得る前記薬理学的物質は、アミノ基の塩（酢酸塩、塩酸塩、及びシュウ酸塩）又はカルボキシル基の塩（金属塩−ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、亜鉛、マグネシウムの塩、並びにその他の有機及び無機の陽イオン−アンモニウム、トリエチルアンモニウム）を含有し得る。
【００１３】
本発明において、薬理学的物質とは、非経口、鼻内、経口投与、又は局所適用のためのものを意味する。
【００１４】
老化防御活性を示す特許請求の範囲に記載の薬理学的物質は、抗酸化防御系の指標、及び拡散性神経内分泌系の構造体におけるメラトニンの合成過程を刺激し、それによって老化プロセスを阻害し、寿命の増加を促進することができる。
【００１５】
本願で使用する「老化防御物質」という概念は、早発性老化を防止することによって老化を阻害し、寿命を延長せしめる物質であって、抗酸化防御系を刺激し、拡散性神経内分泌系の構造体における代謝過程の調節に影響を及ぼすことを必要とする物質を意味する。
【００１６】
本願で使用する「薬理学的物質」という概念は、早発性老化における老化防御物質として予防及び／又は治療の目的で医薬に使用し得る前記テトラペプチド又はその塩を含有する任意の剤形の使用を意味する。
【００１７】
本願で使用する「有効量」という概念は、その活性と毒性の量的指標に応じて、また、入手し得る知見との関連で、当該剤形において有効であるはずの活性主成分の量を用いることを意味する。
【００１８】
本願で使用する「薬学的組成物」という概念は、前記調製物の様々な剤形を意味する。
【００１９】
本発明に適合する薬学的組成物を得るためには、薬剤学で受容されている調合方法に従って、活性成分として、提示した前記テトラペプチド又はその薬学的に適用可能な誘導体と薬学的担体とを撹拌する。
【００２０】
前記担体は、投与（例えば、非経口、鼻内、又は経口）に好適な調製物の剤形に応じて様々な形態であり得る。
【００２１】
経口投与に好ましい用量で組成物を調製するために、公知の薬理学的成分を全て使用し得る。
【００２２】
非経口（鼻内）投与の場合には、安定させ、又は無菌性を維持するのに役立つ他の成分を含んでもよいが、前記担体は滅菌水を含有するのが通常である。
【００２３】
本発明において、前記方法は、予防又は治療のために、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、病気の経過の特徴と重症度に応じて、治療効果が得られるのに必要な期間（１０〜４０日）、少なくとも１日１回、特許請求の範囲に記載の薬理学的物質を患者に与えることを包含する。
【００２４】
本発明において、前記テトラペプチドは、病気の経過の特徴と重症度に応じて、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与すると活性を示すが、より少ない（より多い）用量も使用し得る。
【００２５】
【産業上の適用】
式：Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ）のテトラペプチドの合成例（例１）によって、前記テトラペプチドの毒性及び生物活性の試験例（例２〜８）によって、さらに前記テトラペプチドの臨床適用の結果を示して、その薬理学的特性を実証し、且つ予防及び／又は治療的効果を達成し得ることを立証する例（例９，１０）によって、本発明を説明する。
例１．Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの合成例
１．産物名：Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−グリシン。
２．構造式：Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ
【化１】
0003902406.tif 000002
【００２６】
３．分子式（イオン対なし）：Ｃ４Ｈ２２Ｎ４０９
４．分子量（イオン対なし）：３９０
５．イオン対：アセテート
６．外観：無臭の白色非晶質粉末
７．合成方法：以下のスキームに従って、古典的な合成法により、前記ペプチドを溶液中に得る。
【００２７】
【化２】
0003902406.tif 000003
【００２８】
Ｚ−ベンジルオキシカルボニル基；
ＢＯＣ−ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル基；
ＯＳｕ−Ｎ−オキシスクシンイミドエステル；
ＯＢｚｌ−ベンジルエステル；
ＤＣＣ−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；
ＨＯＢＴ−Ｎ−オキシベンゾトリアゾール
溶媒として、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを用いた。アスパラギン酸の付加によって、トリエチルアミンを用いる塩化法によるα−ＣＯＯＨ基の保護が与えられた。ＢＯＣ保護基の除去は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液によって行い、Ｚ保護基の除去は接触水素化によって行った。前記産物の抽出と精製は、調製用の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム法によって実施した。
【００２９】
既製産物の特性：
0003902406.tif 000004
【００３０】
合成例
１．ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（Ｉ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミル（β−ベンジル）アスパラギン酸塩
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミン酸のＮ−オキシスクシンイミドエステル（ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＳｕ）４．３ｇ（０．０１００ｍｏｌ）を、２０ｍＬのジメチルホルムアミド中に溶解し、１．７２ｍＬ（０．０１２５ｍｏｌ）のトリエチルアミン及び２．８０ｇ（０．０１２５ｍｏｌ）のβ−ベンジルアスパラギン酸塩を添加する。室温で、２４時間以内の間、該混合物を撹拌する。その後、０．５Ｎ（１５０ｍＬ）の硫酸で産物を沈殿させ、酢酸エチル（３×３３ｍＬ）で抽出し、０．５Ｎの硫酸（２×２０ｍＬ）、水、５％の重炭酸ナトリウム溶液（１×２０ｍＬ）、水、０．５Ｎの硫酸（２×２０ｍＬ）、水で洗浄し、該溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥する。酢酸エチルをろ過し、真空中４０℃で除去する。Ｐ２Ｏ５上真空中で残渣を乾燥させる。その結果、５．６８ｇ（〜１００％）のオイルを得る。Ｒｆ＝０．４２（ベンゾール−アセトン  ２：１、Ｓｏｒｂｉｆｉｌ板、８〜１２μｍのシリカゲル、ＵＶと塩素／ベンジジンで展開）。
【００３１】
２．ＴＦＡ  Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（ＩＩ）、（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテート  トリフルオロ酢酸
２０ｍＬのジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合液（３：１）に、５．６８ｇ（〜０．０１ｍｏｌ）のＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミル（β−ベンジル）アスパラギン酸塩（Ｉ）を溶解する。２時間したら、溶剤を４０℃下で除去し、別のジクロロメタン（２×１０ｍＬ）を添加してこれを繰り返し、ＮａＯＨ上真空中で残渣を乾燥する。５．８０ｇ（〜１００％）のオイルを得る。Ｒｆ＝０．６３（ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水、１５：１０：３：１２）。
【００３２】
３．Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（ＩＩＩ）、Ｎ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル（β−ベンジル）アスパラギン酸塩
１０ｍＬのジメチルホルムアミドに、５．６５ｇ（０．０１ｍｏｌ）の（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパラギン酸塩トリフルオロ酢酸（ＩＩ）を溶解し、２．８０ｍＬ（０．０２ｍｏｌ）のトリエチルアミン及びＮ−カルボベンゾキシアラニルのＮ−オキシスクシンイミドエステル４．１４ｇ（０．０１３ｍｏｌ）を添加する。室温で、２４時間以内の間、該反応混合物を撹拌する。０．５Ｎの硫酸（１５０ｍＬ）で産物を沈殿し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、０．５Ｎの硫酸（２×２０ｍＬ）、水、５％の重炭酸ナトリウム溶液（１×２０ｍＬ）、水、０．５Ｎの硫酸（２×２０ｍＬ）、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で該溶液を乾燥させる。酢酸エチルをろ過し、真空中４０℃下で除去し、酢酸エチル／ヘキサン系の中で残渣を再結晶化する。産物をろ過し、Ｐ２Ｏ５上真空中で乾燥する。収率は、４．１０ｇ（６６％）である。融点（Ｔｍｌ）は１５４℃である。Ｒｆ＝０．４８（ベンゾール−アセトン、１：１）、Ｒｆ＝０．７２（ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水、１５：１０：３：１２）。
【００３３】
４．Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（ＩＶ）、Ｎ−カルボベンゾキシアラニル（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルチルグリシンベンジルエステル
グリシントシル酸ＴｏｓＯＨ’Ｈ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌのベンジルエステル１．０１ｇ（３ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬのテトラヒドロフラン中に懸濁し、撹拌しながら０．４ｍＬ（３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した後５分してから、１．２８ｇ（２ｍｍｏｌ）のＮ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパラギン酸塩（ＩＩＩ）と０．２７ｇ（２ｍｍｏｌ）のＮ-オキシベンゾトリアゾールを添加する。該混合物を０℃に冷却する。その後、テトロヒドロフラン５ｍＬ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．４２ｇ（２ｍｍｏｌ）の０℃に冷却した溶液を添加する。この温度で２時間以内の間、該混合物を撹拌し、一晩室温で放置する。ジシクロヘキシル尿素の残渣をろ過して除去し、溶剤を真空中で除去し、３０ｍＬの酢酸エチル中に残渣を溶解する。１Ｎの硫酸、水、５％の重炭酸ナトリウム溶液、水、１Ｎの硫酸、水で溶液を洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥する。溶媒を真空中で除去し、酢酸エチル／ヘキサン系の中で産物を再結晶化する。収率は１．３０ｇ（８２％）である。Ｔｍｌ＝１４６〜１４８℃。Ｒｆ＝０．７５（ベンゾール−アセトン、２：１）。
【００３４】
５．Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｖ）、アラニル−グルタミル−アスパルチル−グリシン
１．２５ｇのＮ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル（β−ベンジル）アスパルチルグリシンベンジルエステル（ＩＩＩ）を、メタノール−水−酢酸系（３：１：１）中、Ｐｄ／Ｃ上で水素化する。ベンゾール−アセトン（２：１）とアセトニトリル−酢酸−水（５：１：３）系の中でのＴＬＣ法によって、反応の進行をモニターする。反応終了後、触媒をろ過し、ろ過物を真空中で除去し、水−メタノール系の中で残渣を再結晶化する。ＫＯＨ上真空中で産物を乾燥させる。収率は５２０ｍｇ（９５％）である。Ｒｆ＝０．７３（アセトニトリル−酢酸−水、５：１３）。精製のため、４ｍＬの０．０１％トリフルオロ酢酸の中に、３９０ｍｇの産物を溶解し、５０×２５０ｍｍ  Ｄｉａｓｏｒｂ−１３０−Ｃ１６Ｔ ７μｍの逆相ＨＰＬＣカラムにかける。使用したクロマトグラフはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ，１２６  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ，１６８  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅである。クロマトグラフィーの条件は、Ａ：０．１％ＴＦＡ；Ｂ：５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ、勾配は８０分でＢ０→５％。サンプルの容量は５ｍＬであり、検出は２１５ｎｍで行い、１９０〜６００ｎｍで走査し、流速は１０ｍＬ／分である。５４．０〜６６．０分以内に、画分を選択する。真空中、４０℃を超えない温度で、溶媒を除去し、１０ｍＬの１０％酢酸溶液を用いて、これを複数回（５回）繰り返す。最後に、２０ｍＬの脱イオン水中に残渣を溶解し、凍結乾燥する。結果として、無臭の非晶質白色粉末形態の精製産物が２９０ｍｇ得られる。ＩＲＡ陰イオン体で、又は（ＯＨ−）型の類似物質で処理することによって、得られた酢酸塩の形態のペプチドは、遊離型に転換させる。その後、引き続き、等量の対応する酸（塩酸又はシュウ酸）を添加することによって、アミノ基の塩を得る。得られた水溶液を凍結乾燥し、既製産物（ｒｅａｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）として分析する。
【００３５】
対応するカルボキシル基の塩を得るためには、算出した量の対応する金属の水酸化物（ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｚｎ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２、ＮＨ４０Ｈ）の水溶液を遊離のテトラペプチドに加える。トリエチルアンモニウム塩を得るために、トリエチルアミンを塩基として用いて、同じように該処理を行う。
【００３６】
６．既製産物の分析
・ペプチド含有量は、Ｓｕｒｅｌｃｏ  ＬＣ−１８−ＤＢカラム、４．６ｘ２５０ｍｍ、勾配ＬＣ−１８−ＤＢ、Ａ：０．１％ＴＦＡ；Ｂ：５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ；勾配は３０分でＢ０→２０％のＨＰＬＣ法によって確定する。流速は１ｍＬ／分である。２２０ｎｍで検出、１９０〜６００ｎｍで走査、サンプル容量は２０μＬである。ペプチド含量は９８．４５％。
・アミノ酸分析は、テスターＡＡＡ“Ｔ−３３９”Ｐｒａｇｕｅ上で実施する。６ＮのＨＣｌ中、１２５℃で、２４時間以内の間、加水分解を行う。
Ｇｌｕ      Ａｓｐ    Ａｌａ    Ｇｌｙ
1.02        1.00      1.01      1.00
・ＴＬＣ：単一、Ｒｆ＝０．７３（アセトニトリル−酢酸−水、５：１：３）。Ｓｏｒｂｆｉｌ板、８〜１２μｍシリカゲル、塩素／ベンジジンで展開。
・水分含量：５％（乾燥による質量減少による重量分析による、１００℃で２０ｍｇ）。
・０．００１％溶液のｐＨ：４．３７（電位差測定よる）。
・比旋光度：［α］ρ２２：−３２°（ｃ＝１、Ｈ２０）、“Ｐｏｌａｍａｔ  Ａ”，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉβ  Ｊｅｎａ。
【００３７】
例２．Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの毒性試験
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの一般毒性の試験は、“薬理学的物質の安全性についての前臨床評価に関する規則”（ＧＬＰ）に従って実施した。
【００３８】
試験の目的は、許容され得る前記調製物の毒性を明らかにし、生物の様々な臓器及びシステムにおける病理的変化の段階及び特徴を評価すること、並びに毒性量に関連する効果と薬物投与期間との相関関係を同定することに存する。
【００３９】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの急性毒性は、Ｋｅｒｂｅｒに従って決定した。標準的な管理体制下で飼育し、動物施設の条件下において標準的な食料を与えられた２０〜２３ｇの体重を有する６６匹の雄の白色非近交系マウスに対して、前記調査を実施した。各々１１匹になるように、前記動物を無作為に６つの同じグループに分配した。前記薬物を、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇの用量（臨床検査に推奨される治療的用量を数千倍超過する用量）で０．２５ｍＬ、前記動物の筋肉内に単回投与した。対照動物には、同量の塩化ナトリウムを投与した。
【００４０】
７２時間以内に、さらに、その後１４日経過しても、何れのグループの動物も死亡しなかった。前記動物の一般的な状態、行動、運動活性、毛及び皮膚外皮、又は生理的分泌物の変化は記録されなかった。
【００４１】
従って、臨床試験に推奨される治療的用量を数千倍超える用量のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、急性毒性反応を引き起こさず、このことから、該調製物を広く治療に適用できることが確認される。
【００４２】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの亜急性毒性試験は、１５０〜２５０ｍｇの体重を有する６０匹の白色非近交系ラットに対して実施した。０．５ｍＬの塩化ナトリウム溶液中、１μｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの用量で、９０日間、実験動物に前記薬物を毎日単回投与した。対照動物群には、同量の塩化ナトリウムを投与した。
【００４３】
全試験期間中、前記動物を毎日監視した。前記動物の行動、食料及び水の消費、毛髪性外皮及び粘膜の状態を記録した。前記動物の体重を毎週測定した。薬物投与の前、３０日目、６０日目、及び９０日目に、末梢血の形態的組成と特性を調べた。実験の終了時に、血液の生化学的指標と凝固学的指標を調査した。
【００４４】
特許請求の範囲に記載の方法によって得られるＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの慢性毒性は、これを体重１５０〜２５０ｍｇのラットに長期投与することによって調べた。０．５ｍＬの塩化ナトリウム溶液中、１μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇの用量で、６ヶ月の間、前記動物の筋肉内に前記薬物を毎日単回投与した。前記動物の行動、それらの食料及び水の消費、毛髪性外皮及び粘膜の状態を記録した。実験の最初の３ヶ月間は毎日、その後は１月に一度、動物の体重を測定した。薬剤投与の開始から３ヶ月後と実験の終了時に、血液学的及び生化学的研究を行った。心臓血管系、肝臓、膵臓、腎臓、副腎の機能を計測した。前記薬物投与の最後に、脳及び脊髄、心臓、大動脈、肺、肝臓、腎臓、内分泌及び免疫系の臓器の様々な切片の状態を計測する目的で、数匹の動物を病理形態学的な検査に供した。
【００４５】
前記動物の一般的な状態、末梢血の形態的及び生化学的指標、内臓の形態的状態、心臓血管系及び呼吸器系の状態、肝臓及び腎臓の機能の評価は、病理的なの変化を全く示さなかった。
【００４６】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの亜急性及び慢性毒性試験によって、治療的用量の１００〜１０００倍を超える用量で前記薬剤を長期投与する場合でも、副作用がないことが確認される。
【００４７】
例３．高い胚死亡率に関して選択されたＨＥＭ株のキイロショウジョウバエにおける老化速度とフリーラジカルプロセスに対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
高い老化速度に関して選択された第２齢のＨＥＭ株のキイロショウジョウバエの幼生に、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えた（２０）。ＨＥＭ株は、その胚段階での特有の死亡率の動態を特徴とし、これには、卵が孵化した初日での６５％から４日目には９５％にまで至る初期の胚の致死的な結果の増大、平均寿命の短縮（２９日）、及び過酸化脂質酸化強度の上昇などが存する。
【００４８】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、培地重量の０．００００１％の割合という極めて低い用量で加えた。キイロショウジョウバエに対する様々な物質の影響に関する文献に記載されている用量は、通常０．００１〜０．０１％の範囲であった。これより低い用量では、通常いかなる効果も生じない。
【００４９】
生化学的なパラメーターは、１４日齢のハエで調べた。それらのカタラーゼ活性と組織の化学発光強度を分析した（２１，２２，２３）。カタラーゼは抗酸化防御の基本的な酵素である。その活性の程度は、生物の耐酸化的ストレス能の指標となる。過酸化水素によって誘導されるルミノール依存性化学発光は、組織中の活性酸素形態の段階を反映する。このため、化学発光強度の減少は、生物の耐酸化的ストレス能の増加を示す。
【００５０】
得られた結果を表１に示す。調べた指標は、性別によって著しく異なることが明らかとなったので、雌と雄のデータを別個に示す。
【００５１】
示されているデータは、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドが、対照と比較して、実験用の雄及び雌のハエにおけるカタラーゼ活性の著しい上昇を促進することを示す。
【００５２】
化学発光の程度によって決定される組織の総抗酸化活性は、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響下において、雌だけで増大した。
【００５３】
【表１】
0003902406.tif 000005
【００５４】
表２は、異なる実験群での寿命分析の結果を示している。
【００５５】
【表２】
0003902406.tif 000006
【００５６】
表２に示されているように、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、顕著な老化防御効果を与える。雌では、これは、平均寿命を有意に伸長し（Ｐ＜０．００１）、老化速度（Ｒ）を低下させる（Ｐ＜０．００１）。雄では、老化速度を僅かに減少させる（Ｐ＜０．０５）。
【００５７】
例４．高い胚死亡率に関して選択されたＨＥＭ株のキイロショウジョウバエの生殖機能に対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
培地重量の０．００００１％の用量（およそ０．０１５ｍｇ／１００ｍＬになる）で前記調製物を培地に加えることによって、第２〜第３幼生期の段階で、キイロショウジョウバエに対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響が発揮された。１日目に孵化したハエを５対ずつ試験管の中に入れ、３〜６日毎に新鮮な培地に移し変えた。
【００５８】
以下の因子を考察した。
・生きた雌を含む（最初の量の）試験管の割合（表３では、生きた培養物の割合）。
・子孫が得られた（生きた培養物の数の）試験管の割合（表３では、生殖力のある培養物の割合）。
【００５９】
各実験用変異種につき、７５対の親を分析した。稔性指数間の差異は、２ｘ２調整表についてのＦｉｓｃｈｅｒの正確な基準によって確定した（２４）。
【００６０】
前記実験の結果を表３に示す。各実験用変異種につき、生きた培養物と生殖力のある培養物の割合が示されている。該表に示されているように、テトラペプチドで処理された生殖力のある培養物の割合は、１９日目から、対照についての同様の割合と比べて高くなる。Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド誘導体変異種中での生殖力のある培養物の割合は、３２日齢の対照と比較して明白に高くなる（Ｐ＜０．０５）ことが実証されている。
【００６１】
直線回帰の係数を表４に示す。該表に示されているように、対照の回帰直線の係数は、実験用のものとは有意に異なる。
【００６２】
対照の係数「ａ」（直線の傾きを反映している）は、実験用変異種の回帰係数より１．８倍高い。
【００６３】
このように、対照変異種では、生殖力のある培養物の割合は、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド変異種と比較して２倍早く減少することが実証されている。テトラペプチドを与えていない培養物では生殖期間は３０日となり、前記調製物で処理した培養物では４７日であった。Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、生殖期間を１．５倍延長することが記されている。
【００６４】
寿命について得られたデータを、同様に分析した。回帰分析のデータを表５に示す。
【００６５】
該表からわかるように、生きた培養物（すなわち、生きた雌が存在する培養物）の割合は、対照に比べて、平均１．５倍早く減少する。算出された寿命の中央値（すなわち５０％の個体が死亡する齢）と実際に得られた寿命（すなわち、異なる実験条件での最大寿命）を表６に示す。
【００６６】
該表に示されているように、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドで処理した変異種では、寿命の中央値の増加と並んで、（老化速度が高いキイロショウジョウバエの系統において）１００日という最高記録を破る寿命の延びが達成された。
【００６７】
【表３】
0003902406.tif 000007
【００６８】
【表４】
0003902406.tif 000008
【００６９】
【表５】
0003902406.tif 000009
【００７０】
【表６】
0003902406.tif 000010
【００７１】
例５．性的活性が低い雄に関して選択された低活性（ＬＡ）株のキイロショウジョウバエにおける老化速度とフリーラジカルプロセスに対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
ＬＡ株のキイロショウジョウバエで、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドによってもたらされるカタラーゼ活性、過酸化脂質酸化（ＬＰＯ；ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の産物の含量、寿命、及び老化速度に対する影響を研究した。１日齢のハエを試験管に入れた（性が同一の個体を各試験管に１０匹）。死亡した個体の数を考慮に入れて、２日毎に、それらを新鮮な培地に移した。平均寿命と最大寿命を決定した。老化速度は、Gomperz式のパラメーターによって算出した。
【００７２】
培地重量の０．００００１％の用量で（約０．０１５ｍｇ／１００ｍＬに相当）、第３期の幼生にＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えた。一般的に認められている方法によって、１４日齢の成体のハエのホモジネート中のカタラーゼ活性を概算した。続けて繰り返しながら、実験を行った。
【００７３】
統計的な処理の基本的手法として、回帰及び分散分析を用いた。差の信頼性は、最少関連多様性の方法によって確認した。
【００７４】
雌では、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、平均寿命に何ら変化をもたらさないが、最大寿命（ＬＳｍａｘ）を増加させることが記された。同時に、該物質は、雄のＡＬＳを有意に伸長した。生存率曲線とゴンペルツチャートの解析によって、雌では、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドが、第１のタイプの老化防御物質（対照と比べてＡＬＳとＬＳｍａｘが増加するが、老化速度は変化しなかった）として役立つことが示された。しかしながら、雄では、第３のタイプの老化防御物質（ＡＬＳは増加したが、ＬＳＭＡＸは変化せず、これに加えて、老化速度の増加傾向が観察された）として作用した。同時に、それらの性差を考慮せずに、ハエの生存率を解析することによって、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響下では、ＬＳｍａｘは顕著に伸長することが証明された。
【００７５】
雄にＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えると、カタラーゼ活性が有意に増加したのに対して、雌では、ＬＰＯ産物の含量が顕著に減少した。性差の抑制によって、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの高い抗酸化活性が確かめられた。
【００７６】
【表７】
0003902406.tif 000011
【００７７】
【表８】
0003902406.tif 000012
【００７８】
このように、ハエにＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えると、老化阻害効果を示した。
【００７９】
【表９】
0003902406.tif 000013
【００８０】
例６  環境に対する低適応性に関して選択された環境適応（ＥＡ）株のキイロショウジョウバエにおける老化速度とフリーラジカルプロセスに対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
ＥＡ株のキイロショウジョウバエを、カタラーゼ活性、組織化学発光、及び寿命に対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響を研究するためのモデルとした。
【００８１】
１日齢のハエを試験管に入れた（性が同一の個体を各試験管に１０匹）。死亡した個体の数を考慮に入れて、５〜７日毎に、それらを新鮮な培地に移した。平均寿命と最大寿命を決定した。老化速度は、ゴンペルツ式のパラメーターによって算出した。
【００８２】
培地重量の０．００００１％の用量で（約０．０１５ｍｇ／１００ｍＬに相当）、第３期の幼生にＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えた。一般的に認められている方法によって、７日齢の成体のハエのホモジネート中のカタラーゼ活性と化学発光の強度を概算した。続けて繰り返しながら、実験を行った。
【００８３】
統計的な処理の基本的手法として、回帰及び分散分析を用いた。差の信頼性は、最少関連多様性の方法によって確認した。
【００８４】
調査の結果が表１０〜１３に示されている。
【００８５】
【表１０】
0003902406.tif 000014
【００８６】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、ルミノール依存性の化学発光に対して影響を与えることが記されている（表１４）。この指標の減少は、ハエの抗酸化防御系の活性化の証左となる。この場合、組織の抗酸化防御強度の上昇は、おそらく、グルタチオン、トコフェロールなどの低分子内在性抗酸化物の活性化を伴う。
【００８７】
平均寿命と最大寿命の伸長は、生存性が減少し、老化が加速した対照の場合のみに観察された。表記のデータが示しているように、これは、まさに調べたテトラペプチドが正確な老化防御効果を発揮するケースである。
【００８８】
【表１１】
0003902406.tif 000015
【００８９】
【表１２】
0003902406.tif 000016
【００９０】
【表１３】
0003902406.tif 000017
【００９１】
【表１４】
0003902406.tif 000018
【００９２】
例７  「野生型」Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ株のキイロショウジョウバエの寿命に対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
本研究では、「野生型」Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ株のキイロショウジョウバエを用いた。
【００９３】
５０〜６０℃まで冷やした、昆虫を増殖するための培地の中に、溶液形態のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを導入した後、注意深く攪拌し、試験管の中に入れた。
【００９４】
対照と実験用集団の発育をともに同一の条件にするために、対照用の培地中には、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド溶液に使用したのと同じ量の塩化ナトリウムを加えた。用いた全ての物質の濃度は、生殖用に与えた培地の重量に対する比率によって計算した。
【００９５】
４日齢の雌のハエを、７２時間、雄とランダムに選択して交配させた後（各試験管当たり１つのつがい）、親のつがいを試験管から取り除いた。新しい世代の形成には全て、５０〜８０のつがいの子孫を使用した。
【００９６】
研究用集団（それぞれ、９０個体の両性からなる）の寿命（ＬＳ）を調べた。孵化後直ちに、ハエを試験管の中にランダムに入れた。
【００９７】
慣用的な方法によって算出した平均値（ＡＬＳ）と標準誤差を、寿命分布パラメーターとして用いた。スチューデントのｔ基準を適用して、平均値を相互に比較した。
【００９８】
表１５は、全ての実験及び対照群に対する寿命分布特性（平均値及びこれらの平均値の標準誤差）の結果を示している。
【００９９】
実験的研究には、６つの濃度のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド：培地重量の０．０１×、０．１×、１×、５×、７．５×、及び１２．５×１０−６％を選択した。
【０１００】
雄に与えたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、４つの低い方の濃度（０．０１〜５×１０−６％）で、有意な老化防御効果を発揮した。実験群のＡＬＳは、統計的に有意な上昇を示した。雄のＡＬＳの相対的伸長度は、３．３〜１０．８％であった。
【０１０１】
雌に対して行った実験では、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、０．０１×１０−６％と０．１×１０−６％の濃度のみで、老化防御効果が得られ、それぞれ、１３．４％（Ｐ＜０．００４）と１１．８％（Ｐ＜０．０３）だけ、ＡＬＳが有意に増加した。
【０１０２】
極低濃度で与えられたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの効果は、得られたデータによって示されているように、前例がない。キイロショウジョウバエにＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えても、それらの段階における発育の持続期間は変化しないことが認められるはずであり、これは、一般的に、調べた前記物質によって、老化毒性効果がもたらされないことを反映していた。
【０１０３】
【表１５−１】
0003902406.tif 000019
【０１０４】
【表１５−２】
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【０１０５】
例８  骨端切除後のラットでのメラトニンの松果体外合成に対するＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの影響
本研究は、体重１３０〜１４０ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットに対して行った。全ての数の動物（２３）を５つのグループに分けた。第１のグループ（対照）は、無処置の動物からなった。第２〜５のグループの動物には、骨端切除（ＥＥ；ｅｐｉｐｈｙｓｅｃｔｏｍｙ）を施した。手術から３週間後（２１日目）に、第２と第３のグループの動物は、その後の１０日間、０．５ｍＬの用量で塩化ナトリウムを皮下注射した。第４と第５グループの動物には、同一のスキームに従って、０．５μｇの用量のＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを投与した。
【０１０６】
動物の屠殺とそれらの臓器の単離は、ネンブタール麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ）を使用して、日中、午前１０時から正午１２時までに行った。第１、第２、及び第４グループの動物は、最後の薬物投与から３日目（手術後及び実験の開始から３３日目）に屠殺したのに対して、第３及び第５グループの動物は、１２日目（骨端切除から４２日目）に屠殺した。調べたのは、拡散性神経内分泌系（ＤＮＥＳ）の主要臓器：胃、甲状腺、及び膵臓であった。
【０１０７】
手術（骨端切除）は、考案した手法に従って、エーテル麻酔下で行った。頭の正中線に沿って、１〜１．５ｃｍ長の切開を行った。頭蓋冠を剥がし、直径０．５ｃｍの中空の錐（本実験用の特別の金属のチューブで作成されている）で、洞交会部上に穴を開けた。眼用鉗子によって、頭蓋の開口部から骨端を抽出した。骨断片によって冠状鋸の穴を被覆した。皮膚の切開は、絹の糸で縫合した。
【０１０８】
光学顕微鏡観察のために、抽出した臓器の断片をブエン酸性液で２４時間固定し、電子顕微鏡のためにカルノフスキー法に従って固定した。光学顕微鏡のための試料の脱水とパラフィン充填、及び超微細構造検査用のイーポン混合液は、一般的に認められている手法に従って調製した。ポリ−Ｌ−リシンフィルム（Ｓｉｇｍａ）で覆われた顕微鏡のスライド上に、パラフィン切片（７μｍ）を置いた。ウラニル酢酸とクエン酸鉛で、ＬＫＢ−７Ａマイクロトーム（ＬＫＢ）によって作成した極めて薄い切片（１００ｎｍ）を対比染色した。
【０１０９】
組織学的及び免疫組織化学的検査は、Ｊｅｎａｍｅｄ−２顕微鏡（Ｚｅｉｚｚ）で行った。電子顕微鏡による検査は、電子ＪＥＭ−１００Ｓ顕微鏡（ＪＥＯＬ）で行った。
【０１１０】
染色のために、ヘマトキシリン−エオシンを与えた。グリメリウスの組織化学的銀メッキ法（２５）に従って、幽門及び胃底切片中に存在するＡＰＵＤ細胞の全集団を顕現させた。
【０１１１】
腸クロム親和性細胞（ＥＣ細胞）の免疫組織化学的暴露は、セロトニンに対するマウスの単クローナル抗体（Ｄａｋｏ、１：１５の力価）を与えることによって行った。マウスの免疫血清グロブリンを顕現させるために、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（ＡＢＰ）法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｋｉｔ）に従って、単クローン抗体を同定した。
【０１１２】
定量的研究は、立体学と形態計測の基本原則に従い（２６）、ＭｏｒｐｈｏｓｔａｒとＣｏｌｑｕａｎｔ（Ｉｍｓｔａｒ）の許可を得た応用コンピュータープログラムを使用して、顕微鏡のインプリントのコンピューター解析システムによって行った。
【０１１３】
１０の視野において、腸内分泌（ＥＮＤ）の定量的密度（ＮＥＮＤ／１ｍｍ２）とセロトニン陽性細胞（Ｎｓｅｒ／１ｍｍ２）を概算した。試験領域（Ｓ）は、５ｍｍ２であった。
【０１１４】
得られたデータの統計的な処理には、Ｍａｎｎ／ＷｈｉｔｎｅｙによるノンパラメトリックＵ基準を用いた。
【０１１５】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを与えられた骨端切除ラットで行ったＤＮＥＳの機能的な形態学的研究の結果は、前記調製物が組織及び細胞の代謝を刺激することを示した。
【０１１６】
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの投与は、骨端切除を行った動物中のＤＮＥＳ細胞の構造的及び機能的な組織化に対して補償的な効果を示すことが記載された。該効果は、骨端切除の影響を完全に抑制することによって、薬物投与の終了から３日以内に発現され、１２日間、すなわち、調べた全ての臓器に関して実験を終えるまで持続した。
【０１１７】
得られたデータは、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの効用の主要点は胃のＥＣ細胞（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドは、ここでセロトニンとメラトニンの松果体外合成を促進する（表１６））であり、このように、実際に、抽出された骨端を完全に補償することを確認している。
【０１１８】
従って、実験的な本研究の結果は、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドが全く毒性を示さず、抗酸化防御指標を正常化し、様々な組織のメラトニン産生構造体中の代謝プロセスを制御することを証明した。
【０１１９】
【表１６】
0003902406.tif 000021
【０１２０】
前臨床実験で明らかとなったＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの特性は、老化防御物質として、その証明された予防的及び／又は治療的な用途を提供する。
【０１２１】
前記提示されたテトラペプチドの臨床試験で得られた結果の例は、その薬理学的な特性を実証し、本発明を医学的に実施し得ることを確認している。
【０１２２】
例９  抗酸化防御系に障害を有する患者における早発性老化を防止するためのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを含有する薬理学的物質の付与の効力
加齢と関連する病気（高血圧疾患、虚血性心疾患、慢性胃炎、非インスリン依存性糖尿病）、及び血中の抗酸化防御指標の減少を有する１４人の患者（３４〜６９才）に、調査すべき薬理学的物質を与えた。
【０１２３】
注射溶液の形態で、１０日間、１注射当たり１０μｇの単回１日用量で、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを含有する物質を筋肉内投与した。
【０１２４】
薬物を投与した場合、スーパーオキサイドディスムターゼ活性の著しい上昇と脂質過酸化産物の含量の減少が観察された（表１７）。
【０１２５】
【表１７】
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【０１２６】
治療の結果は、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを含有する薬理学的物質が生物体の抗酸化防御系を回復させる効果を有することを証明している。
【０１２７】
例１０  メラトニン合成の障害を有する患者における早発性老化を防止するために与えられたＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを含有する薬理学的物質の効力
アスピリン気管支喘息を患っている３９〜６３才の患者１１人に、前記薬理学的物質を与えた。本疾病の主たる特徴は、アセチルサリチル酸及び他の非ステロイド系抗炎症物質への不寛容による窒息性発作に存する。Ｎ−アセチル−５−メトキシキヌレナミン（Ｎ−ＡＭＫ）（アセチルサリチル酸の化学構造の類縁体）は、生物中で、骨端ホルモンであるメラトニンの代謝過程において形成されることが知られている。メラトニン合成、従って、内在性のＮ−ＡＭＫのレベルは、アスピリン気管支喘息の患者では著しく減少しており、これは、基礎的なメラトニン代謝物である６−サルファトオキシメラトニンの尿への排泄が低くなることによって確認される。
【０１２８】
これは、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを含有する薬理学的物質を用いて生物中のメラトニン含量を補正することによって、アスピリン気管支喘息を治療する新しい病原性アプローチを具体化した。
【０１２９】
注射用溶液の形態で、１０日間毎朝、１０μｇの用量で、前記物質を筋肉内投与した。
【０１３０】
グルココルチコイドの吸入及び経口投与を含む永続的な抗喘息療法に伴う悪化の減退又は病気の回復期にある患者を治療した。
【０１３１】
治療前、治療中、及びその後毎月、患者は、咳、痰の排出、激しい息づかい、胸詰まり、喘鳴、窒息性発作、身体的活動の不能、冷気、及び臭いに対する不寛容のような徴候によって、その健康状態を主観的に評価した。治療直後とその後７ヶ月、患者によって報告された分析（彼らの健康状態の動態、作業の可否、心理状態、睡眠障害、服用した抗喘息薬の１日の用量に関するデータが含まれる）に基づいて、前記調製物によってもたらされた臨床的効果を評価した。
【０１３２】
治療開始前と薬物の最終投与直後に、以下のパラメーター：肺活量（ＶＢＣ）、１回換気量（ＴＶ）、総肺容量（ＴＬＣ）、努力呼吸容量（ＦＶＢＣ）、最大容量呼気率（ＭＶｅｘｈＲ）、最大容量呼気率／５０％及び７５％努力ＶＢＣ（ＶＢＣ５０及びＶＢＣ７５）、努力呼気容量／秒（ＦＥＶ１）を参照して、全ての患者で、外部呼吸機能を評価した。これらのパラメーターは、初期値に対する百分率として測定した。さらに、ｃｍ水中で表した気管支樹の比伝導性を測定した。ベロテックを用いた吸入後１５分以内に、テスト全体を繰り返した。ベロテック吸入後のＭＶＲ、ＶＢＣ５０、及びＶＢＣ７５の動態を、初期値の百分率で評価した。治療前の全患者のＦＥＶ１指数は、正常値の８０％未満であった。
【０１３３】
「ＤＲＧ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ」キット（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、免疫発酵法に従って、治療前、治療直後、及び治療後１０日以内に、日中（午前９時〜午後２１時）と夜（午後２１〜午前９時）に採取した尿中の６−サルファトオキシメラトニン（基礎的なメラトニンの代謝物）含量を測定した。
【０１３４】
調査の結果、検査を行った薬理学的物質で治療された患者の圧倒的多数で、治療の終わりまでに臨床状態の改善が観察されることが確認された。日中の喘息症状、身体的作業の不能、強い臭い、及び冷気に対する不寛容の頻度の減少、並びに睡眠の回復も記録された。患者の主観的な検査によって、気管支閉塞の徴候である肺の喘鳴が減少し、又は完全に消失することが明らかとなった。治療終了直後の外部呼吸機能の検査によっては、ＶＢＣ、ＭＶｅｘｈＲ、ＦＥＶ１、ＴＶ／ＴＬＣに本質的な変化は全く示されなかった。しかしながら、テトラペプチドを含有する薬理学的物質を与えられた患者は、末梢気管支のレベルで、ベロテックに対する反応の改善を示した。尿中への６−サルファトオキシメラトニンの排出が増加し、夜だけでなく、昼間にもメラトニンの産生が増加することが証明された。
【０１３５】
【参考文献−１】
0003902406.tif 000023
【０１３６】
【参考文献−２】
0003902406.tif 000024
【０１３７】