(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５として寄託されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ−ＴＹ２。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞株に、エプスタインバーウイルスを感染させた細胞。
【請求項３】
次の工程を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出方法。
（１）請求項１に記載の細胞株、またはこの細胞から誘導された細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の活性を測定し、対照と比較する工程
【請求項４】
対照が請求項２に記載の細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞株が受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５として寄託されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ−ＴＹ２である請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
次の工程を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
（１）請求項３に記載の方法により、被験化合物のＮＫ細胞の活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較してＮＫ細胞の活性を促進、または抑制する化合物を選択する工程。
【請求項７】
対照が請求項２に記載の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
次の構成要素を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング用キット。
（ａ）請求項１に記載の細胞株
（ｂ）ＮＫ細胞の活性を測定するための試薬
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＮＫ細胞株に関する。
背景技術
ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と省略する）は、インターフェロンやインターロイキン−２（ＩＬ−２と省略する）によって活性化され、腫瘍細胞等を傷害する。Ｔ細胞やＢ細胞による生体防御機構が、免疫応答の結果として機能するのに対して、ＮＫ細胞による防御機構はサイトカインによる活性化で動作する。つまり、ＮＫ細胞の防御機能には免疫応答の複雑なプロセスが不要である。そのため、ＮＫ細胞は、生体防御機構の最前線において重要な役割を担っていると考えられている。
したがって、ＮＫ細胞の活性化や増殖の調節によって、生体防御機構をコントロールすることができる可能性がある。しかしＮＫ細胞の機能については、明らかにされていない点も多い。
一方、リンパ球に含まれるＮＫ細胞は、腫瘍化するとリンパ腫を形成する。たとえば鼻腔原発性の血管中心性のＮＫリンパ腫（Ａｎｇｉｏｃｅｎｔｒｉｃ  ＮＫ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）は、アジア諸国に特徴的なリンパ腫である。一般に鼻腔原発性の血管中心性ＮＫリンパ腫は、各種抗がん剤に抵抗性を示し、予後が悪いことが多い。したがって、ＮＫ細胞の腫瘍化の機構を明らかにすることは、その治療方法の開発において、重要な課題と言える。
リンパ腫には、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ、以下、ＥＢＶと省略する）の感染の関与が指摘されている。たとえば、バーキットリンパ腫（以下、ＢＬと省略する）から樹立された細胞株を用いて、Ｂ細胞リンパ腫におけるＥＢＶゲノムの作用が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９４；６０６９−６０７３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＥＢＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＢＬ）ｌｉｎｅ  Ａｋａｔａ：ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＢＬ  ｃｅｌｌ  ａｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＥＢＶ．）。この報告では、ＥＢＶをＥＢＶ陰性のＡｔａｋａ細胞に導入すると、ＢＬの悪性表現型を誘導したことが明らかにされている。しかし、ＮＫ細胞においては、ＥＢＶの関連を確認した報告は無い。したがって、ＮＫ細胞の腫瘍化の機構を明らかにすることが望まれている。特に、ＥＢＶ陰性のＮＫ細胞株を得ることができれば、ＮＫ細胞に対するＥＢＶの作用を明らかにする上で重要な研究材料となると考えられる。
さて、ＮＫ細胞の活性化や増殖の調節、あるいはＮＫ細胞の腫瘍化機構など、ＮＫ細胞を対象とする研究を進めるには、ＮＫ細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）が有用である。細胞株があれば、共通の細胞を多くの研究者で容易に共有することができる。なにより、新鮮な血液に実験材料を求める必要が無くなるので、実験そのものを容易に行えるようになる。
本発明者らは、既にＮＫリンパ腫に由来する細胞株ＮＫ−ＹＳを樹立している（Ｂｌｏｏｄ  １９２：１３７４−１３８３，１９９８）。ＮＫ細胞株ＮＫ−ＹＳは、ＥＢＶ陽性の細胞株である。したがって、ＥＢＶの関与を明らかにするために、ＥＢＶ陰性の細胞株の樹立が望まれる。
先に記載したように、Ｂ細胞リンパ腫由来細胞株であるＡｔａｋａ細胞では、既にＥＢＶ陰性の細胞株の樹立が報告されている。Ｂ細胞においては、たとえばＥＢＶ陽性のリンパ腫由来細胞を長期継代培養することによってＥＢＶの脱落が生じ、その結果ＥＢＶ陰性の細胞株の樹立が可能となった。しかしＮＫ細胞においては、ＥＢＶ陰性細胞株を樹立する手法は知られていない。
発明の開示
本発明は、ＥＢＶ陰性のＮＫ細胞株、並びにその用途の提供を課題とする。
前記課題の解決を目的として、本発明者らは、様々なＮＫ細胞の分離とＥＢＶ感染の確認を繰り返した。その結果、鼻腔原発性リンパ腫患者に由来するＮＫ細胞をもとに、ＥＢＶ陰性の細胞株の樹立に成功した。また、このＮＫ細胞株を用いて、ＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出が可能となることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の細胞株、並びにこの細胞株を用いたＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出方法、およびスクリーニング方法である。
〔１〕エプスタインバーウイルス陰性のＮＫ細胞株。
〔２〕ヒト由来の細胞である〔１〕に記載の細胞株。
〔３〕白血病細胞に由来する〔１〕に記載の細胞株。
〔４〕白血病がリンパ腫である〔３〕に記載の細胞株。
〔５〕リンパ腫が、鼻腔の血管中心性のリンパ腫である〔４〕に記載の細胞株。
〔６〕鼻腔の血管中心性のリンパ腫が、ＮＫリンパ腫である〔５〕に記載の細胞株。
〔７〕エプスタインバーウイルス陽性の宿主に由来する〔１〕に記載の細胞株。
〔８〕ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ５６陽性である〔１〕に記載の細胞株。
〔９〕ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３４陰性である〔１〕に記載の細胞株。
〔１０〕受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５として寄託されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ−ＴＹ２。
〔１１〕〔１〕に記載の細胞株に、エプスタインバーウイルスを感染させた細胞。
〔１２〕次の工程を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出方法。
（１）〔１〕に記載の細胞株、またはこの細胞から誘導された細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の活性を測定し、対照と比較する工程
〔１３〕細胞株が受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５として寄託されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ−ＴＹ２である〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕次の工程を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
（１）〔１２〕に記載の方法により、被験化合物のＮＫ細胞の活性を調節する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較してＮＫ細胞の活性を促進、または抑制する化合物を選択する工程。
〔１５〕次の構成要素を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング用キット。
（ａ）〔１〕に記載の細胞株
（ｂ）ＮＫ細胞の活性を測定するための試薬
〔１６〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含む、ＮＫ細胞の活性を調節するための医薬。
また本発明は、〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を投与する工程を含むＮＫ細胞の活性を調節する方法に関する。あるいは本発明は、〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を投与する工程を含むＮＫリンパ腫の治療方法に関する。
本発明のＮＫ細胞株は、ＥＢＶ陰性であることを特徴とする。このような細胞株は、たとえば白血病細胞を、長期継代培養することによって得ることができる。白血病細胞は、ＮＫ細胞性のものであれば制限されない。また、ＮＫ細胞の由来も制限されない。望ましくは、ヒトリンパ腫患者に由来する細胞を用いる。中でも鼻腔原発性リンパ腫患者の末梢血から単離される単核球は、白血病細胞として好ましい。鼻腔原発性リンパ腫には、高い確率でＥＢＶ感染が認められることが報告されている。したがって、鼻腔原発性リンパ腫患者から樹立されたＥＢＶ陰性の細胞株を用いて、リンパ腫とＥＢＶの関連性を明らかにすることには大きな意義がある。単核球の培養には、ＩＭＤＭ培地（組み換えヒトＩＬ２、以下ｒｈＩＬ２と記載、１００単位（塩野義製薬、大阪、日本）、および１０％ウシ胎児血清加）等が用いられる。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２を含む湿潤大気で維持する。
本発明において、長期継代培養の条件は制限されない。たとえば４ヶ月、通常６ヶ月、好ましくは７ヶ月、あるいは８ヶ月の継代培養の後に、クローニングを行ってＥＢＶの存在を確認する。細胞のクローニングは、限界希釈法などの公知の手法によって行うことができる。
バーキットリンパ腫においては、ＥＢＥＲ−１遺伝子の導入により、ＥＢＶの脱落が起きることがＴａｋａｔａらにより報告されている（１９９９年の癌学会）。この方法を応用することによって、鼻腔原発性リンパ腫由来の細胞からＥＢＶの脱落を期待することもできる。
一般に、殺細胞作用（ＮＫ活性）を持つＴ細胞以外の細胞がＮＫ細胞と呼ばれている。しかし腫瘍細胞などの場合には殺細胞作用（ＮＫ活性）を持たないことがある。ＮＫ活性が見られない場合には、ＮＫ細胞に特徴的な細胞表面マーカーや細胞障害性分子の存在に基づいてＮＫ細胞であることを確認することができる。ＮＫ細胞であることを示す細胞表面マーカーの発現パターンの例を以下に示す。これらのマーカーは、市販の抗体を利用して公知の方法により免疫学的に検出することができる。
Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）    陰性
ＣＤ３                    陰性
ＣＤ５６                  陽性
ＮＫ受容体                陽性
ＮＫ受容体としては、ＣＤ９４、ＣＤ１５８ｃ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１５８ｃ、ＣＤ１５９、ＣＤ１６１、あるいはＮＫＧ２Ａ等のマーカー分子を示すことができる。これらのマーカーのうち、少なくとも１つの分子が陽性であれば、ＮＫ受容体陽性と判定される。通常は、複数のマーカーを指標として用いる。
また細胞障害分子には、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、ＴＩＡ−１、Ｆａｓ、Ｆａｓ−Ｌ、ＩＮＦ−γ、ＩＮＦ−α、あるいはＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ等が知られている。細胞障害分子においても、少なくとも１種の細胞障害分子が検出されれば、その細胞は細胞障害分子陽性と判定される。これらの細胞障害分子を認識する抗体は市販されている。したがって、免疫蛍光抗体法等の公知の方法に基づいて検出することができる。
本発明におけるＮＫ細胞とは、次の細胞群Ａまたは細胞群Ｂのいずれかに含まれる細胞を言う。
0003995248.tif 000002
クローニングされた細胞株のＥＢＶの存在は、たとえばＥＢＶゲノムの検出によって確認することができる。より具体的には、たとえば、細胞株のゲノムを適当な制限酵素で消化したＤＮＡを試料とするサザンブロット解析を行う。あるいは、ゲノムを対象とするｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析も有効である。更に、ＰＣＲによってＥＢＶゲノムの検出を行う方法を用いることもできる。サザンブロット解析用のプローブには、たとえばＥＢＶのターミナルリピートが用いられる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいては、ＥＢＥＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブとすることができる。サザンブロットやｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのプロトコルは公知である。
ＥＢＶの感染確認のために、細胞表面のＥＢＶ抗原（ＥＢＮＡ）を検出する手法を利用することもできる。ＥＢＮＡの検出はＥＢＶの存在を示すので、ＥＢＶ陽性細胞を簡単なアッセイ法で除くためのスクリーニング方法としては有効である。
本発明のＮＫ細胞株として、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５としてブダペスト条約に基づいて国際寄託されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ−ＴＹ２を示すことができる。
寄託の情報：
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
（ｂ）寄託日（原寄託日）  平成１３年５月２２日
（ｃ）受託番号  ７８６５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６５）
ＮＫ−ＴＹ２は、鼻腔原発性血管中心性リンパ腫患者の末梢血から単離された単核球を長期継代培養することによって、本発明者らが樹立したＥＢＶ陰性のＮＫ細胞株である。この患者はＥＢＶ陽性であった。ＮＫ−ＴＹ２の免疫学的表現形を以下に示す。このように、ＮＫ−ＴＹ２細胞は、元の白血病細胞の表現型をよく保存している。
ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ５６陽性
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３４陰性
解析の結果、ＮＫ−ＴＹ２は、以下のような特徴を有する細胞株であった。これらの特徴に基づいて、ＮＫ−ＴＹ２はＮＫ細胞であることが明らかである。
0003995248.tif 000003
本発明の細胞株の培養条件は、特に限定されない。したがって、細胞が死滅せずに生存または増殖できるような任意の条件下で培養することができる。例えば、培養温度は、一般的には３３〜３９℃で、好ましくは３７℃である。培養培地は、ウシ胎児血清、好ましくは非働化ウシ胎児血清（熱処理することにより、補体を不活化したウシ胎児血清）を３〜１０％（好ましくは１０％）含むＩＭＤＭ培地を用いる。通気は、５％ＣＯ２を含む空気とし、湿度は８０〜１２０％（好ましくは１００％）に保って培養を行う。
本細胞株の保存条件もまた、特に限定されない。例えば、１０％グリセリンあるいは１０％ジメチルスルホキシドおよび１０％血清を含む培地中に１０２〜１０１０、好ましくは１０４〜１０８、さらに好ましくは１０６個／ｍｌの細胞濃度で浮遊させた状態で、−８０℃あるいは液体窒素中で凍結保存することができる。好ましくは、１０％グリセリンおよび１０％血清を含む培地中で１０６個／ｍｌの細胞濃度で浮遊させた状態で、液体窒素中で凍結保存する。上記のように保存された細胞株は、例えば、３７℃の水浴で急速に溶解した後、１０倍量の１０％血清を含む培地を添加して攪拌し、遠心分離して回収した細胞を１０％血清を含む培地で培養することにより再び増殖させることができる。
本発明のＮＫ細胞株は、がん化のシステムを解明するための研究材料として有用である。本発明のＮＫ細胞株は、ＥＢＶゲノムが脱落しているのにもかかわらず、不死化された状態を維持している。このことは、本発明の細胞株がＥＢＶゲノムの機能の代わりとなる後天的な幾つかの変異を獲得していることを示している。したがって、本発明のＮＫ細胞株の解析を通じて、リンパ腫のがん化のシステムを明らかにできる可能性がある。より具体的には、本発明の細胞を用いて、たとえばｐ５３、ｐ１５、ｐ１６、ｐ２１、ＲＢ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−Ｘのような公知の癌関連遺伝子の発現レベルの変動や変異を解析することによって、リンパ腫におけるがん性変異を解明することができる。
たとえば本発明のＮＫ細胞株であるＮＫ−ＴＹ２においては、実施例で明らかにしているとおり、ｃ−ｍｙｃとｐ５３の発現の亢進が見られた。一方、ＮＫ−ＴＹ２は、ＥＢＶ陽性の細胞株であるＮＫ−ＹＳと比較して、ＩＬ−２やウシ胎児血清の依存性が低いことも観察されている。つまり、本発明の細胞株ＮＫ−ＴＹ２は、ＥＢＶ陰性である一方で、より悪性の形質を獲得している可能性が高いと考えられる。したがって、このような細胞レベルの変化が、リンパ腫のがん性変化において重要な条件を構成している可能性がある。つまり、ＥＢＶ陰性のＮＫ細胞株は、リンパ腫のがん性変化の機構を明らかにするための研究対象として有用である。
リンパ腫にはＥＢＶの関与が疑われていることは既に述べた。しかし、特に日本においては、多くの成人にＥＢＶの不顕性感染が見られるのにもかかわらず、白血病を発症するのはそのごく一部に過ぎない。したがって、ＥＢＶの感染のみで白血病の病態を説明することはできない。本発明のＮＫ細胞株はＥＢＶ陰性であることから、ＥＢＶの影響の無い実験を行うことが可能である。
あるいは、本発明のＮＫ細胞株による内皮に対する損傷の解析を通じて、リンパ腫の転移の過程を明らかにすることができる。より具体的には、抗ＮＫ受容体抗体や、各種の接着分子による、ＮＫ細胞株の内皮への損傷阻害を観察することにより、どのような因子がＮＫ細胞の内皮損傷に関与しているのかを明らかにすることができる。
また本発明のＮＫ細胞株であって、リンパ腫患者に由来するものは、リンパ腫の治療に有効な化合物の評価やスクリーニング方法に有用である。特に、鼻腔原発性リンパ腫のような予後の悪い患者から樹立された細胞株は、治療が困難とされている疾患の治療薬のスクリーニングを可能とする点において有用である。特に本発明のＮＫ細胞株が薬剤耐性を有する場合には、当該細胞株を材料としてＮＫリンパ腫の薬剤耐性機構を解明することができる。リンパ腫の治療においては、化学療法が重要な治療方法となる。したがって、リンパ腫の薬剤耐性機構の解明は、重要な研究課題である。
加えて本発明のＮＫ細胞株は、ＥＢＶ陰性であることから、ＥＢＶの分離増殖に利用することができる。たとえば、血液などの臨床検体を本発明のＮＫ細胞株に接種し、ＥＢＶの感染を確認することによって、臨床検体中のＥＢＶの存在を知ることができる。感染経験の無い成人のＥＢＶ感染は、伝染性単核球症の原因となる。したがって、臨床検体におけるＥＢＶの検出は、伝染性単核球症の診断において有用である。ＥＢＶを細胞に感染させることにより、ウイルスを増殖させて検出することができる。したがって、本発明のＮＫ細胞を用いたＥＢＶの検出方法は、高い感度を達成することができる。また、実際にＥＢＶを感染させることによって、感染性のウイルスの存在を確認することができる。
あるいは本発明のＮＫ細胞株には、ＥＢＶを感染させることができる。ＥＢＶを感染させたＮＫ細胞株によって、ＥＢＶの感染にともなう細胞形質の変化を解析することができる。このような解析は、ＮＫ腫瘍におけるＥＢＶの役割を明らかにするうえで重要な情報を与える。たとえば、本発明の細胞株を利用して、ＮＫ腫瘍細胞における悪性度へのＥＢＶの関与を検討することができる。本発明の細胞株の形質変化は、軟寒天中のコロニー形成能、ヌードマウスへの腫瘍形成能、あるいは培養液の血清濃度への感受性などの比較によって観察することができる。ＮＫ細胞株へのＥＢＶの感染は、細胞株の培養物にＥＢＶを接種することによって行われる。ＥＢＶは、ＥＢＶ感染細胞株のライセート、ＥＢＶ産生細胞の培養上清等から得ることができる。
更に、種々の遺伝子に欠損や変異を導入したＥＢＶの変異体を構築し、本発明の細胞に対する感染能や感染後の形質の変化を観察することによって、ＥＢＶの個々の遺伝子の働きを明らかにすることもできる。
その他にも、本発明のＮＫ細胞株を用いて、ＮＫ細胞に耐性を有する腫瘍細胞を取得することができる。たとえば、本発明のＮＫ細胞とともに腫瘍細胞を培養し、増殖が可能な腫瘍細胞を選択することにより、ＮＫ細胞に耐性の腫瘍細胞を取得することができる。こうして取得された腫瘍細胞と、ＮＫ細胞感受性の腫瘍細胞とを比較することによって、ＮＫ細胞耐性腫瘍細胞がＮＫ細胞による障害を逃れる機構を調べることができる。
また本発明のＮＫ細胞株は、ＮＫ細胞に由来する新規な生理活性物質を見出すための研究材料として有用である。生理活性物質としては、抗ウイルス活性物質、あるいは抗菌性物質などを挙げることができる。本発明のＮＫ細胞株はＥＢＶ陰性であることから、ＥＢＶに由来する物質によって産生が誘導される生理活性物質を排除し、ＮＫ細胞に特異的な生理活性物質を取得することができる。
更に本発明のＮＫ細胞株は、ＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出に有用である。本発明において、ＮＫ細胞の活性とは、ＮＫ細胞が備えている生理的な機能を言う。より具体的には、ＮＫ細胞の活性とは、細胞が増殖する活性や、ＮＫ細胞が各種の因子を産生する活性などを含む。たとえば、各種のサイトカインに対する本発明の細胞株の応答を観察することによって、ＮＫ細胞を制御しているサイトカインを特定することができる。加えて本発明の細胞株は、ＮＫ受容体の機能、あるいはＮＫ受容体を中心とするシグナル伝達システムを明らかにするための研究材料として有用である。
たとえばＮＫ細胞はＩＬ２依存性の細胞増殖を示すことが知られている。一方、ＩＬ２に基づくシグナル伝達に必要とされているＣＤ２５やＣＤ１２２は、通常ＮＫ細胞においては検出することができない。本発明のＮＫ細胞株はＩＬ２依存性の増殖を示すので、ＮＫ細胞のＩＬ２応答システムの解明に利用することもできる。
本発明に基づくＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出方法は、次の工程を含む。
（１）本発明のＮＫ細胞株、またはこの細胞から誘導された細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の活性を測定し、対照と比較する工程
前記本発明のＮＫ細胞株から誘導された細胞とは、本発明の細胞株から誘導された変異株や、何らかの遺伝子で本発明のＮＫ細胞を形質転換した細胞が含まれる。
本発明のＮＫ細胞の活性を調節する活性の検出方法において、ＮＫ細胞の活性の測定は、着目している活性の測定によって行うことができる。すなわち、たとえば増殖活性に与える影響であれば、細胞の増殖を観察することによって、本発明の検出方法を実施することができる。ＮＫ細胞の増殖は、３Ｈチミジンの取り込みを観察することによって測定することができる。
一方ＮＫ細胞のサイトカイン等の各種の因子を産生する活性に与える影響を調べるには、各因子を測定すればよい。あるいは、各因子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲなどによって測定することもできる。また本発明において対照としては、被験化合物を接触させなかった前記細胞や、あるいは前記細胞に対する作用が明らかな化合物を接触させた前記細胞を用いることができる。
前記本発明の検出方法によって、ＮＫ細胞の活性を調節する活性が検出された化合物を選択することによって、ＮＫ細胞の活性を調節する化合物のスクリーニングを行うことができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
（１）本発明のＮＫ細胞株、またはこの細胞から誘導された細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（２）前記細胞の活性を測定し、対照と比較する工程
（３）対照と比較してＮＫ細胞の活性を促進、または抑制する化合物を選択する工程。
たとえば本発明のＮＫ細胞の増殖、あるいは悪性化を抑制する化合物は、ＥＢＶではなくＮＫ細胞細胞に直接的に作用する化合物である。これに対してＥＢＶ陽性細胞に作用する化合物は、細胞に作用しているのか、あるいはその細胞に感染しているＥＢＶに作用しているのかを明らかにできない。したがって本発明のＮＫ細胞を利用したスクリーニング方法は、ＮＫ細胞に直接作用する化合物の選択に有用である。
本発明のスクリーニング方法において、被験化合物は特に制限されない。したがって、たとえば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物等を、本発明の方法によってスクリーニングすることができる。
ＮＫ細胞は、生体防御機構において重要な役割を有する細胞である。したがってその活性を調節する活性を有する化合物は、免疫機能の調節に用いることができる。ＮＫ活性の調節には、活性の促進と抑制が含まれる。たとえば、ＮＫ細胞の活性を促進する作用を有する化合物には、免疫機能の増強作用が期待できる。
逆に本発明のＮＫ細胞株の活性を抑制する化合物には、ＮＫリンパ腫の治療薬としての可能性が期待される。特に、鼻腔原発性リンパ腫のような予後の悪い患者から樹立された細胞株に対して、その増殖を抑制する化合物を取得することができれば、リンパ腫の新しい治療薬として有用である。たとえば、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ２５抗体などの、ＮＫ腫瘍に対する治療効果を評価することができる。治療効果の評価には、細胞死を指標とすることができる。
以上に記載した本発明のスクリーニング方法により単離され得る化合物は、ＮＫ細胞の活性を調節する化合物として用いられる。これらの化合物は、ＮＫ細胞の活性を促進する化合物、あるいはＮＫ細胞の活性を抑制する化合物が含まれる。ＮＫ細胞は、生体防御機構において重要な役割を担っていると考えられている。したがって、本発明の上記のスクリーニングは、ＮＫ細胞による生体防御機構を調節する化合物を評価したり、または該化合物を単離するために有用である。
本発明のスクリーニング方法に必要な前記ＮＫ細胞株、並びにＮＫ細胞の活性を検出するために必要な試薬を組み合わせて、ＮＫ細胞の活性を調節する活性を有する化合物のスクリーニング用キットとすることができる。本発明において、ＮＫ細胞の活性を検出するための試薬は、指標とする活性に応じて適宜選択することができる。たとえば、細胞の増殖を測定するには、３Ｈ標識したチミジンなどが用いられる。あるいは、ＮＫ細胞が産生する因子の産生レベルを測定するためには、指標とする因子の抗体を利用することができる。あるいは、その因子のｍＲＮＡを測定するためのプライマーやプローブを試薬として用いることができる。
本発明のスクリーニング用キットには、前記ＮＫ細胞株（またはこの細胞株から誘導された細胞）を培養するための培地、抗生物質やウシ胎児血清などの添加物、培養用の容器などを組み合わせることができる。
前記スクリーニング方法によって得ることができるＮＫ細胞の活性を調節する化合物をヒトや哺乳動物等、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  細胞株ＮＫ−ＴＹ２の樹立
患者の同意を得て、白血病発症後の患者の末梢血から、単核球を、フィコールハイパック法によって単離した。この患者は、４５歳の女性で、鼻腔原発性血管中心性のＮＫリンパ腫と診断された。患者の末梢血中には、ＣＤ２＋、ＣＤ３−、ＣＤ７＋、ＣＤ５６＋の異形リンパ球が出現しており、ＥＢＶは陽性である。
単離した患者単核球を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；サンコウ純薬（株）、東京、日本）を加えたイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；ギブコ、ダランドアイランド、ニューヨーク州）に浮遊させた。この細胞調製物は、ＣＤ５６陽性細胞９０％以上で構成されていた。単核球（１×１０６個）を、２５ｃｍ２培養フラスコ（ファルコン３０１３：ベクトンディッキンソン社、オクスナード、カリフォルニア州）においてｒｈＩＬ２  １００単位（塩野義製薬、大阪、日本）を含む１０％ＦＢＳを加えたＩＭＤＭ  ５ｍｌに接種した。このフラスコを、空気中に５％ＣＯ２を含む湿潤大気において３７℃で維持した。培地の半分を週に２回採取して、プラスチック試験管において１０００ｒｐｍで３分間遠心して、ペレットを新鮮な培地２．５ｍｌに再浮遊させた。この浮遊液を元の培養フラスコに戻した。
初代培養において、白血病細胞は培養の最初の７ヶ月間、徐々に増殖した。その後、増殖速度は加速し、初代培養の８ヶ月目には白血病細胞の総数は１×１０８個以上のレベルに達した。これらの細胞の一部を後の試験のために凍結保存した。初代培養の８ヶ月目、白血病細胞は安定な増殖を示した。限界希釈法を用いてクローニングし、細胞株ＮＫ−ＴＹ２を樹立した。この細胞株の細胞倍加時間は約７２時間（データは示していない）である。ＮＫ−ＴＹ２の増殖はＩＬ２に依存し、１０Ｕ／ｍＬ以上のＩＬ２存在下でよく増殖する（図１）。またウシ胎児血清（ＦＢＳ）にも依存し、５％以上のＦＢＳ存在下でよく増殖する（図２）。公知のＮＫ細胞（ＥＢＶ＋）であるＮＫ−ＹＳに比べて、ＮＫ−ＴＹ２のＩＬ２やＦＢＳへの依存性は低い。
［実施例２］  形態学的評価
患者の末梢血単核球細胞と、ＮＫ−ＴＹ２細胞の細胞遠心塗末標本を、メイ・グリュンワルドギムザ染色によって染色して、光学顕微鏡下で観察した。
その結果、光学顕微鏡によって評価したところ、ＮＫ−ＴＹ２細胞は、アズール顆粒を示さなかった。それらは、粗い染色質と顕著な核小体を有する大きい核を示し、好塩基性の豊富な細胞質を示した（図３）。ＮＫ−ＴＹ２細胞は、ペルオキシダーゼ染色に関して陰性であった（データは示していない）。
［実施例３］  フローサイトメトリー分析−１（細胞マーカー）
フローサイトメーター（ＦＡＣスキャン；ベクトン・ディッキンソン社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）による単色免疫蛍光によって、ＮＫ−ＴＹ２細胞を表面マーカーの発現に関して分析した。用いたフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体を以下に示す。フローサイトメトリー分析の全体を通して、ＦＩＴＣまたはＰＥ標識マウスＩｇＧを陰性対照として用いた。同時に、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ９２、およびＮＫＬについても、同じ方法にしたがって表面マーカーを解析し、結果を比較した。
ベクトンディッキンソン社製
Ｌｅｕ５ｂ（ＣＤ２）、Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、Ｌｅｕ１（ＣＤ５）、Ｌｅｕ９（ＣＤ７）、Ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８）、ＣＡＬＬＡ（ＣＤ１０）、ＬＦＡ１α（ＣＤ１１ａ）、Ｌｅｕ１５（ＣＤ１１ｂ）、ＬｅｕＭ５（ＣＤ１１ｃ）、ＬｅｕＭ７（ＣＤ１３）、ＬｅｕＭ３（ＣＤ１４）、ＬｅｕＭ１（ＣＤ１５）、Ｌｅｕ１１（ＣＤ１６）、Ｌｅｕ１２（ＣＤ１９）、Ｌｅｕ１６（ＣＤ２０）、ＣＲ２（ＣＤ２１）、ＩＬ２Ｒ（ＣＤ２５）、ＬｅｕＭ９（ＣＤ３３）、ＨＰＣＡ１（ＣＤ３４）、ＨＬｅ１（ＣＤ４５）、Ｌｅｕ１９（ＣＤ５６）、Ｌｅｕ７（ＣＤ５７）、ＴＣＲα／β、およびＳｍＩｇ（κ＋λ）
オルソディアグノスティックシステムズ社（ラリタン、ニュージャージー州）製  ＯＫＴ６（ＣＤ１）
コールターイムノロジー社（ヒアレー、フロリダ州）製
Ｂ１（ＣＤ２１）
イムノテック社（マルセイユ、フランス）製
ＬＦＡ３（ＣＤ５８）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＨＰ−３Ｂ１（ｋｐ４３；ＣＤ９４）、ＥＢ６（ＣＤ１５８ａ）、ＧＬ１８３（ＣＤ１５８ｂ）、ＦＥＳ１７２（ＣＤ１５８ｃ）、Ｚ２７．３．７（ＣＤ１５９）、１９１Ｂ８（ＮＫＲＰ１Ａ；ＣＤ１６１）、およびＺ１９９（ＮＫＧ２Ａ）
Ｔセルサイエンス社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）製
ＴＣＲγ／δ
また、インターロイキン受容体に対する未標識抗体として、以下に示す抗体を用いた。これらの未標識抗体を第一抗体として細胞に結合させた後、ＰＥ結合第二抗体によって染色して、フローサイトメーターによって分析した。
イムノテック社（マルセイユ、フランス）製
ＧＭ−ＣＳＦＲ（ＣＤ１１６）、ＩＬ４Ｒ（ＣＤ１２４）、ＩＬ６Ｒ（ＣＤ１２６）、
ファーミンゲン社（サンジエゴ、カリフォルニア州）製
Ｇ−ＣＳＦＲ（ＣＤ１１４）、ＩＬ２Ｒｂ（ＣＤ１２２）、ＩＬ３Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ５Ｒ（ＣＤ１２５）、ＩＬ７（ＣＤ１２７）
免疫表現型の結果を表１に要約した。ＮＫ−ＴＹ２細胞はＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ５６抗原を発現したが、検出可能なレベルの表面ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ３４抗原を示さなかった。末梢血からの白血病細胞はＣＤ２、ＣＤ７およびＣＤ５６を発現した。このように、ＮＫ−ＴＹ２細胞は、元の白血病細胞の表現型をよく保存していた。ＣＤ３３の発現は、培養中に誘導されたものと考えられる。
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［実施例４］  フローサイトメトリー分析−２（癌やアポトーシス関連遺伝子）
実施例３と同様にフローサイトメーター（ＦＡＣスキャン；ベクトン・ディッキンソン社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）による単色免疫蛍光によって、ＮＫ−ＴＹ２細胞をオンコジーンやアンチオンコジーンの発現に関して分析した。用いた抗体を以下に示す。同時に、ＮＫ−ＹＳ、ＴＩＭ９６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、およびＵ９３７についても、同じ方法にしたがって解析し、結果を比較した。
ＦＩＴＣ標識抗ｂｃｌ２抗体（ダコパッツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）製）
ＰＥ標識抗ｐ５３抗体（ファルミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）製）
抗ｂｃｌ６抗体（ダコパッツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）製）
抗ｂｃｌＸＬ抗体（ザイメドラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）
抗ｃ−ｍｙｃ抗体（オンコージェンサイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）製）
各細胞株は、Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍ  ｋｉｔ（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）製）で透過化処理した後、標準的な直接標識法、あるいは間接標識法により染色した。すなわち、まず室温で、試薬Ａ（固定化試薬）で細胞を固定し、試薬Ｂ（透過化試薬）で１５分間処理した。細胞を洗浄後、フローサイトメーターで分析した。間接標識の場合は、細胞にＦＩＴＣ標識した第２抗体（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）製）を１５分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄してフローサイトメーターで分析した。フローサイトメトリー分析の全体を通して、解析に用いた抗体と同じクラスのＦＩＴＣまたはＰＥ標識マウスＩｇＧを陰性対照として用いた。間接法の場合には、第１抗体のクラスに合わせた。
フローサイトメーターの分析結果を、図４（ｂｃｌ２，ｂｃｌＸＬ，ｂｃｌ６）、図５（ｐ５３）、および図６（ｃ−ｍｙｃ）に示した。ＮＫ−ＴＹ２は、ＮＫ−ＹＳ細胞と同様に、ｂｃｌ２、ｂｃｌＸＬ、およびｂｃｌ６蛋白質を発現していた。しかし、ｃ−ｍｙｃとｐ５３の発現レベルはＮＫ−ＹＳ細胞よりも高く、バーキットリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉやＲａｊｉと同じレベルであった。ｃ−ｍｙｃが活性化して、培養中に容易にＥＢＶゲノムが脱落することを示していた。これらの結果から、Ｃ−ｍｙｃとｐ５３の過剰発現が、ＮＫ−ＴＹ２細胞におけるＥＢＶゲノムの役割を果たしていることが示唆された。
Ｔａｋａｔａらは、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫由来Ａｋａｔａ細胞において、培養中にＥＢＶ陰性クローンの出現を報告した。このＥＢＶ陰性クローンの解析から、ＥＢＶがバーキットリンパ腫の悪性形質、アポトーシス抵抗性を付与することが明らかにされているが、同じにバーキットリンパ腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖にはＥＢＶが必ずしも必要でないことを示している。実際に日本人のバーキットリンパ腫においてはＥＢＶ陰性例が５０％認められる。
一方、鼻腔原発性血管中心性リンパ腫は前例にＥＢＶが検出されること、ＥＢＶ陽性ＮＫリンパ腫細胞株の培養中にＥＢＶが脱落したという報告は無いことから、ＥＢＶ陽性ＮＫリンパ腫の増殖にはＥＢＶが重要な役割を果たしていることが推測される。
［実施例５］  ＮＫ受容体の発現
ＮＫ−ＴＹ２、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ９２、およびＮＫＬについて、ＮＫ受容体の発現を解析した。ＮＫ受容体発現は間接的な染色法によって調べた。ＮＫ−ＴＹ２細胞はＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ分子を発現したが、ＣＤ１５８ａ、ｂ、ｃ、ＣＤ１５９、またはＣＤ１６１を発現しなかった。対照的に、ＮＫ−ＹＳ細胞は低レベルのＣＤ１５８ｂ、ｃ、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａを発現した（表２）。
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［実施例６］  染色体分析
細胞増殖の対数増殖期にあるＮＫ−ＴＹ２細胞にコルセミド０．０１ｍｇを３０分処置して増殖を停止させ、０．０７５  Ｍ  ＫＣｌによる低張処置を行った。細胞をメタノールと酢酸の３：１比混合液によって固定した。細胞浮遊固定液をスライドガラス上に滴下して、炎によって乾燥させた。従来のＧバンド形成法を用いて、核型を決定した。結果を図７に示した。
新鮮な白血病細胞は、分析した分裂中期細胞１１個中７個において、４７、Ｘ、−Ｘ、ａｄｄ（３）（ｐ２１）、ａｄｄ（４）（ｑ３１）、＋ａｄｄ（６）（ｑ１３）、＋７、ａｄｄ（９）（ｐ１３）、ｄｅｌ（１１）（ｑ１３ｑ２１）、ｄｅｒ（１７）ｔ（１；１７）（ｑ１２；ｑ２５）ｉｎｓ（１７；？）（ｑ２５；？）、−１８、＋２１、ｄｅｒ（２２）ｔ（１８；２２）（ｑ１１；ｐ１３）という複雑な核型を示した（データは示していない）。分析した細胞では、ｄｅｌ（Ｘ）（ｐ２２）、−ａｄｄ（４）、＋ａｄｄ（４）（ｑ３１）、−６、−ａｄｄ（９）、＋ａｄｄ（９）（ｐ１３）、−１０、ａｄｄ（１４）（ｑ２２）、−１５、＋１８、＋２２、−ｄｅｒ（２２）ｔ（１８；２２）、＋２ｍａｒのような、さらなる染色体異常を認めた。
Ｇバンド形成分析によって、ＮＫ−ＴＹ２細胞は、分析した分裂中期細胞１０個中１０個において、５０、Ｘ、−Ｘ、＋２、ａｄｄ（３）（ｐ２１）、ｄｅｒ（４）ｔ（４；９）（ｑ３５；ｑ１２）、ｄｅｌ（６）（ｑ１３）、＋ｄｅｌ（６）、＋Ｉ（７）（ｑ１０）、ａｄｄ（９）（ｐ２２）、ｄｅｌ（１１）（ｑ１３ｑ２１）、ｄｅｒ（１４；１６）（ｑ１０；ｐ１０）、ｄｅｒ（１７）ｄｕｐ（１７）（ｑ２１ｑ２５）ｔ（１；１７）（ｑ１２：ｑ２５）、＋１９、＋２１、＋ｍａｒという核型を示すことが示された（図７）。ＮＫ−ＴＹ２細胞は、元の白血病細胞において認められた−Ｘ、ａｄｄ（３）（ｐ２１）、ｄｅｌ（１１）（ｑ１３ｑ２１）、ｄｅｒ（１７）ｔ（１；１７）（ｑ１２；ｑ２５）という一般的な染色体異常を保存していた。
［実施例７］  Ｔ細胞受容体遺伝子のサザンブロッティング分析−１
Ｔ細胞受容体（ＴｃＲと省略する）βとγ鎖遺伝子の再配列は標準的な方法に従って評価した。ＮＫ−ＴＹ２細胞の５μｇ  ＤＮＡを標準的な方法に従って抽出して、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢａｍＨ  Ｉ、またはＢｇｌ  ＩＩによって消化し、０．６％アガロースゲルの中を電気泳動させて、ニトロセルロースフィルターに転写した。ヒト胎盤から抽出したＤＮＡを陰性対照として用いた。フィルターを３２Ｐ−標識Ｃβ２またはＪγプローブとハイブリダイズさせ、適当なストリンジェンシー条件で洗浄して、バンドをオートラジオグラフィーによって可視化した。ＬＡＤ、ＮＫ−ＹＳ、およびＪｕｒｋａｔの各種細胞株についても同様に分析し、結果を比較した。
ＮＫ−ＴＹ２細胞のＴｃＲβおよびＴｃＲγ鎖遺伝子は、生殖系列立体構造を示した（図８）。この知見は、皮膚病変から得た生検試料に関する知見と同一であった（データは示していない）。更にｇｄ＿鎖についても生殖系列構造であることが確認された。新鮮な白血病細胞の試料は限られているため、それらの細胞におけるＴｃＲβおよびＴｃＲγ鎖遺伝子の再配列は分析しなかった。
［実施例８］  Ｔ細胞受容体遺伝子のサザンブロッティング分析−２
実施例８と同様の操作により、ＮＫ−ＴＹ２細胞のＴｃＲγとＴｃＲδ鎖遺伝子の再配列を分析した。抽出したＤＮＡは、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、またはＫｐｎ  Ｉによって消化した。プローブには、ＪγおよびＪδ１のプローブを用いた。結果を図９に示した。ＴｃＲγとＴｃＲδに再構成バンドは認められなかった。
［実施例９］  ＥＢＶゲノムの検出
ＮＫ−ＴＹ２細胞、陽性対照としてのＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞株（ＬＡＤ）、そして陰性対照としてのＮＫ−ＹＳ、およびＪｕｒｋａｔ細胞からのＤＮＡ試料を標準的な方法に従って抽出した。ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｐｓｔ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、およびＢｇｌ  ＩＩによって消化し、電気泳動後にニトロセルロースフィルターにブロッティングした。これらのフィルターをＥＢＶターミナルリピートの３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて、適当なストリンジェンシーの条件で洗浄して、バンドをオートラジオグラフィーによって可視化した。
サザンブロッティング分析から、ＮＫ−ＴＹ２細胞ではＥＢＶターミナルリピートは検出されなかった（図１０）。一方、生検標本は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によってＥＢＥＲ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドによる染色陽性であった。したがって、ＮＫ−ＴＹ２細胞が培養プロセスにおいてＥＢＶゲノムを失ったことを示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＥＢＶ陰性のＮＫ細胞株が提供された。本発明の細胞株は、ＥＢＶ陰性であることから、ＥＢＶの影響を受けない実験条件を提供する。したがって、本発明の細胞株を用いることにより、ＮＫ細胞におけるＥＢＶ以外の原因によるがん化の機構を明らかにできる可能性がある。
本発明のＮＫ細胞株を用いて、ＮＫ細胞の活性を調節する化合物のスクリーニング方法が可能となる。ＮＫ細胞は、生体防御機構の中で重要な役割を有する細胞である。したがって、ＮＫ細胞の活性を調節する化合物は、生体防御機構の機能を調節する化合物として有用である。更に、ＥＢＶ陰性のＮＫ細胞を用いたスクリーニングによって、ＥＢＶではなく、ＮＫ細胞に直接作用する化合物を選択することができる。また本発明のＮＫ細胞を用いて、ＮＫ細胞によって産生される新規な生理活性物質のスクリーニングが可能である。加えて、本発明のＮＫ細胞株は、ＥＢＶをベクターとする外来遺伝子の導入実験に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＮＫ−ＴＹ２細胞のＩＬ−２依存性を示す図。図中、ＩＬ−２添加量は、−◆−；１Ｕ／ｍＬ、−■−；１０Ｕ／ｍＬ、−▲−；１００Ｕ／ｍＬ、縦軸は細胞数（×１０４）、横軸は培養日数（日）を示す。
図２は、ＮＫ−ＴＹ２細胞のウシ胎児血清（ＦＢＳ）依存性を示す図。図中、ＦＢＳ添加量は、−◆−；１％、−■−；５％、−▲−；１０％、縦軸は細胞数（×１０４）、横軸は培養日数（日）を示す。
図３は、メイ・グリュンワルドギムザ染色したＮＫ−ＴＹ２細胞の、光学顕微鏡写真（４００倍）。
図４は、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＴＹ２、およびＴＩＭ９６の、フローサイトメーターによる、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、およびＢＣＬ６の解析結果を示すグラフ。
図５は、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＴＹ２、ＴＩＭ９６、Ｒａｊｉ、およびＫ５６２の、フローサイトメーターによる、ｐ５３の解析結果を示すグラフ。
図６は、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＴＹ２、ＴＩＭ９６、Ｒａｊｉ、およびＤａｕｄｉの、フローサイトメーターによる、Ｃ−ＭＹＣ蛋白質の解析結果を示すグラフ。
図７は、ＮＫ−ＴＹ２細胞の染色体分析結果を示す写真。
図８は、Ｔ細胞受容体遺伝子のサザンブロッティング分析結果を示す写真。上がＣβ２プローブによる結果を、下がＪγプローブによる結果である。図中、Ｌ：ＬＡＤ細胞、ＹＳ：ＮＫ−ＹＳ細胞、ＴＹ２：ＮＫ−ＴＹ２細胞、Ｊ：Ｊｕｒｋａｔ細胞の結果を示す。
図９は、ＮＫ−ＴＹ２細胞のＴ細胞受容体遺伝子のサザンブロッティング分析結果を示す写真。右がＪδ１プローブによる結果を、左がＪγプローブによる結果である。
図１０は、ＥＢＶゲノムのサザンブロッティング分析による検出結果を示す写真。図中、Ｌ：ＬＡＤ細胞、ＹＳ：ＮＫ−ＹＳ細胞、ＴＹ２：ＮＫ−ＴＹ２細胞、Ｊ：Ｊｕｒｋａｔ細胞の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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