(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と特異的に結合可能な異なるプローブの固定領域の配置面を有するプローブ担体の製造方法において、
前記固定領域の形成に必要なプローブを、各プローブごとに中空部材の内部に固定する工程と、
該プローブが固定された中空部材のそれぞれを各端部を揃えて各中空部材が概ね平行となるように束ね、得られた束内の各中空部材間に結着材を充填し固化させて固定部を形成する工程と、
該固定部を、該固定部内に配置された中空部材の軸方向と交叉する面で切断して、該切断による切断面に各中空部材の中空部が開口した面を形成して前記固定領域の配置面を得る工程
とを有し、
前記結着材の各中空部材間への充填が、遠心力を利用して行われることを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質を検出するためのプローブを固定したプローブ担体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子ＤＮＡの塩基配列の解析、あるいは、同時に多項目に関し、高信頼性で遺伝子診断などを行う際、目的とする塩基配列を有するＤＮＡを複数種のプローブを用いて選別することが必要となる。この選別作業に利用されるプローブ複数種を提供する手段として、ＤＮＡマイクロチップが注目を浴びている。また、薬剤等のハイスループット・スクリーニングやコンビナトリアル・ケミストリーにおいても、対象となるタンパク質や、薬物の溶液を多数（例えば、９６種、３８４種、１５３６種）を並べ、秩序立ったスクリーニングを行うことが必要となる。その目的で多数種の薬剤を配列するための手法、その状態での自動化されたスクリーニング技術、専用の装置、一連のスクリーニング操作を制御し、また結果を統計的に処理するためのソフトウェア等も開発されてきている。
【０００３】
これら並列的なスクリーニング作業は、基本的に、評価すべき物質に対して、選別する手段となる既知のプローブを多数並べてなる、いわゆるプローブ・アレイを利用することで、同じ条件の下、プローブに対する作用、反応などの有無を検出するものである。一般的に、どのようなプローブに対する作用、反応を利用するかは予め決定されており、従って、ひとつのプローブ・アレイに搭載されるプローブ種は、例えば、塩基配列の異なる一群のＤＮＡプローブなど、大きく区分すると一種類の物質である。すなわち、一群のプローブに利用される物質は、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、合成された化学物質（薬剤）などである。多くの場合、一群をなすプローブ複数種からなるプローブ・アレイを用いることが多いが、スクリーニング作業性質によっては、プローブとして、同一の塩基配列を有するＤＮＡ、同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、同一の化学物質を多数点並べ、アレイ状とした形態を利用することもあり得る。これらは主として薬剤スクリーニング等に用いられる。
【０００４】
一群をなすプローブ複数種からなるプローブ・アレイでは、具体的には、異なる塩基配列を有する一群のＤＮＡ、異なるアミノ酸配列を有する一群のタンパク質、あるいは異なる化学物質の一群について、その一群を構成する複数種を、所定の配列順序に従って、アレイ状に基板上などに配置する形態をとることが多い。なかでも、ＤＮＡプローブ・アレイは、遺伝子ＤＮＡの塩基配列の解析や、同時に、多項目について、信頼性の高い遺伝子診断を行う際などに用いられる。
【０００５】
基板上にプローブ複数種をアレイ状に固定する一つの方法として、米国特許(USP)5,424,186号公報に記載される、光分解性の保護基とフォトリソグラフイーを用いた担体上でのDNAの逐次伸長反応により、互いに異なる塩基配列を有するDNAプローブをアレイ状に作製する手法を挙げることができる。この手法を利用すると、例えば、１ｃｍ2当たり10000種類以上の配列が異なるＤＮＡを搭載したＤＮＡプローブ・アレイの製造も可能でなる。なお、この手法では、逐次伸長反応によりＤＮＡを合成する際、４種の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）毎に、それぞれ専用のフォトマスクを用いてフォトリソグラフイー工程をおこない、アレイの所定箇所に何れかの塩基を選択的に伸長させることで、所望の塩基配列を有する複数種のＤＮＡを所定の配列で基板上に合成する。
【０００６】
前記の手法とは別な方法として、プローブ用のＤＮＡを予め合成、精製し、場合によってはその塩基長を確認した上で、各ＤＮＡをマイクロディスペンサーのようなデバイスにより基板上に供給し、プローブ・アレイを製造する手法も提案されている。ＰＣＴ公開公報ＷＯ95/355O5号には、キャピラリーを用いて、ＤＮＡをメンブラン上へ供給する手法が記載されている。この手法を適用すると、原理的には、１ｃｍ2当たり1000個程度のＤＮＡアレイの製造が可能である。基本的には、各プローブ毎に一本のキヤピラリー状ディスペンス・デバイスでプローブ溶液を基板上の所定位置へ供給し、その作業を繰り返すことで、プローブ・アレイを製造する手法である。
【０００７】
その他の手法として、基板上においてＤＮＡの固相合成を行う際、各伸長段階毎に、インクジェット法により合成に必要な物質の溶液を基板上に供給する手法も提案されている。例えば、欧州特許公告公報EP 0 703 825B1号には、ＤＮＡの固相合成において利用される、ヌクレオチドモノマー、ならびに、アクティベ−ターをそれぞれ別のピエゾ・ジェット・ノズルより供給することにより、それぞれ所定の塩基配列を有するＤＮＡ複数種を固相合成する方法が記載されている。このインクジェット法による供給（付与）は、上記キャピラリーを用いた溶液の供給（付与）に比べ、供給量の再現性など信頼性も高く、また、ノズルの構造も微細化が可能なものであり、プローブ・アレイの高密度化には適した特徴を有している。
【０００８】
また、特開平11-187900号公報には、プローブを含む液体をバブルジェットヘッドにより液滴として固相に付着させて、プローブを含むスポットを固相上に形成する方法が開示されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、大量生産に好適な構成を有するプローブ担体及びその製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明のプローブ担体の製造方法によれば、異なるプローブの固定領域の配置面を有するプローブ担体において、各プローブの固定領域が、開口部を有する輪状部材の少なくとも内壁面に設けられ、各輪状部材が、各輪状部材間に結着剤が充填されて固定されることで前記配置面が形成されているプローブ担体を提供することが可能となる。
【００１１】
すなわち、本発明にかかるプローブ担体の製造方法は、異なるプローブの固定領域の配置面を有するプローブ担体の製造方法において、前記固定領域の形成に必要なプローブを、各プローブごとに中空部材の内部に固定する工程と、該プローブが固定された中空部材のそれぞれを各端部を揃えて各中空部材が概ね平行となるように束ね、得られた束内の各中空部材間に結着材を充填し固化させて固定部を形成する工程と、該固定部を、該固定部内に配置された中空部材の軸方向と交叉する面で切断して、該切断による切断面に各中空部材の中空部が開口した面を形成して前記固定領域の配置面を得る工程と、を有し、前記結着材の各中空部材間への充填が、遠心力を利用して行われることを特徴とするものである。
【００１２】
上記の固定部の形成のために各中空部材間への結着剤の充填は、遠心力を利用して効果的に行うことができる。
【００１３】
本発明によれば、プローブ担体の新規な形態及びその製造方法を提供することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のプローブ担体における各プローブの固定領域は輪状部材の有する開口部内の内壁から形成される。そのような構成の一例を図１に示す。図１（ａ）は、輪状部材２の開口部２ａが開口する面の平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）に示したプローブ担体のＸ−Ｘでの断面図である。
【００１５】
プローブ担体１は輪状部材２の開口部２ａの開口の開口面が平面状に配置された面を有し、各開口部２ａの内壁面２ｃにプローブが固定されており、少なくともこの内壁面２ｃによってプローブの固定領域が形成されている。
【００１６】
輪状部材２は、例えば、繊維、ガラス、樹脂などから構成することができる。
【００１７】
プローブを固定した輪状部材の多数を効率的に得るという点からは、軸方向に中空部が伸びている管状部材や中空部材の内部にプローブを固定した後、その軸方向に交叉する方向で所定の厚さで切断して多数の断片を得る方法が好ましい。図１に示した例では、各輪状部材は、中空部材の軸方向に垂直な面で切断された概ね平行に相対する一対の切断面を有するものとして形成されている。この切断面の少なくとも１つをプローブ担体のプローブ固定領域の配置面として用いることができる。
【００１８】
一方、各輪状部材間には結着材３が充填されており、各輪状部材を含む一体化された層４を形成している。なお、図１の例では、層４はこれを支持する基体５上に積層結合されているが、層４自体で機械的強度を得ることができるようであれば、基体５の使用を省略することもできる。
【００１９】
図１に示すプローブ担体は、例えば以下の方法により製造することができる。まず、管状部材や中空糸などの中空部材の内部にプローブを含む溶液を充填して、その内壁部にプローブを固定する。
【００２０】
中空部材としては、水浄化や人工肺、人工肝臓等にも用いられるポリプロピレン膜、ポリエチレン膜、銅アンモニアセルロース再生膜等を使用可能であり、押出し成型等により製造可能である。
【００２１】
プローブ担体の形成に必要なプローブごとにこのような固定操作を行う。中空部材の内部に必要な液体を通すことで、必要に応じて用いられる固定用の試薬や洗浄液の中空部材内への供給を行う。プローブの固定操作は公知の方法によって行うことができる。例えば、中空部材の中空部にプローブを含む液体を注入し、中空部材の中空部内壁とプローブとを接触させてこれらを反応させる。プローブの中空部内壁への固定には、例えば後述する各種の反応基を利用した化学反応や、物理的な吸着など種々の方法が利用できる。中空部材の中空部内を適宜洗浄して、プローブが内壁面に固定された中空部材を得ることができる。
【００２２】
こうして得られたプローブが固定された中空部材一方の端部を閉鎖してから遠心処理用の容器内に、各中空部材が軸方向に平行に配置し、かつ各端部を揃えて束ねてた状態で収容する。この時、中空部材の束内での中空部材の配置は、最終的に切断して得られる切断面にプローブの固定領域の所定の配置が得られるように行われる。
【００２３】
図２（ａ）に遠心処理用の容器６内に中空部材７を配置した図を示す。この状態で、容器６の中心軸を回転半径上におく状態で容器６をこの回転半径での円軌道に沿って回転させて中空部材の束の端部方向（図２（ａ）の矢印方向に遠心力を生じさせる。そして、この遠心力を利用してポリウレタン等からなる結着材（ポッティング材）を矢印方向に移動させ、中空部材７間に充填する。次に、遠心力を停止させると結着材は流動後の位置で固化し、図２（ａ）に示すように固定部８を得ることができる。
【００２４】
中空部材の固定部形成側の端部は、中空部材の中空部と外周部との仕切りを構成する側壁部が通気性である場合には樹脂などで閉鎖（目止め）して使用することが好ましい。また、中空部材の側壁部が通気性を有するものでない場合でも、結着材の中空部への流入を確実に防止するには固定部形成側の端部を閉鎖しておくことが好ましい。
【００２５】
結着材の固化が終了した時点で回転を停止し、中空部材７が平行固定された固定部８の所定位置を中空部材の軸方向と交叉する面、例えば垂直な面で所定の厚みで切断して断片化する。この切断によって生じる切断面に、図１に示す中空部が開口した輪状部材２の配列面を得ることができる。すなわち、図１に示す各輪状部材２は中空部材７を所定の厚さで輪切りされた状態として形成される。そして、この断片を多数得ることで、プローブ固定領域の所定配置を有するプローブ担体を得ることができる。
【００２６】
以上説明した本発明にかかるプローブ担体の製造方法によれば、中空部材の多数を固定した固定部の切断により多数の断片を得ることで、同一構成のプローブ担体を大量に製造することが可能である。更に、各輪状部材間は結着材で充填されており、この部分が空隙として残存した場合に、この空隙に、洗浄液、標的物質を含む試料溶液、各種試薬などが侵入することによる不都合が生じることがない。
【００２７】
本発明において、担体に固定されるプローブは、特定の標的物質に対して特異的に認結合可能なものである。更に、このプローブには、特定の標的を認識し得るオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有するプローブ機能を有する分子、および分散した位置に表面固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有する分子の集団の両方をいい、しばしばリガンドと呼ばれる分子も含まれる。また、プローブ及び標的は、しばしば交換可能に使用され、リガンド−抗リガンド（レセプターと呼ぶこともある）対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。本発明におけるプローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはその類似物を含み得る。
【００２８】
また、担体上に支持されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドの一部にリンカーを介して担体との結合部を有するもので、担体との結合部において担体表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における担体と結合部のオリゴヌクレオチドの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲において限定されない。
【００２９】
また、本発明の方法により製造されるプローブ担体に採用されるプローブは、その使用目的に応じて、適宜選択されるものであるが、本発明の方法を好適に実施する上では、プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖、ポリ糖のいずれかであることが好ましく、必要に応じてこれらの２種以上を組合せて用いることができる。
【００３０】
本発明においては、これらのプローブの複数種を、それぞれ独立した領域、例えばドット状スポットとして担体表面（中空体や管状担体の内壁面の表面を含む）に固定したものをプローブ担体といい、所定の間隔で配列されたものをプローブ・アレイという。
【００３１】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート、スルフォニルクロリド（−ＳＯ2Ｃｌ）基、アルデヒド（ホルミル基；−ＣＨＯ）基、ヒドラジン、ヨウ化アセトアミドなどの有機官能基を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理を施してもよい。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、プローブ担体の有するプローブの固定領域の所定の配置を、中空部材を固定した固定部を所定の厚さで輪切りにすることで得ることができ、大量生産に適した構成のプローブ担体を提供することができる。更に、各プローブの固定領域を形成する輪状部材の間には結着材が充填されており、この部分が空隙として残存した場合に、この空隙に、洗浄液、標的物質を含む試料溶液、各種試薬などが侵入することによる不都合が生じることがない。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は本発明にかかるプローブ担体の構成を示す図である。
【図２】（ａ）は中空部材の固定部を形成するための装置の概要を示す図であり、（ｂ）は固定部の構成を示す図である。
【符号の説明】
１    プローブ担体
２    輪状部材
２ａ    開口部
２ｃ    内壁面
３    結着材
４    一体化層
５    基体
６  容器
７  中空部材
８  固定部
【図１】
0003937742.tif 000002
【図２】
0003937742.tif 000003