(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離アミノ基を化学修飾したペプチド及び／又は蛋白質にトランスグルタミナーゼを作用させ、生成するアンモニア量を定量することにより、ペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミン量を測定することを特徴とする、グルタミンの測定方法。
【請求項２】
アミノ基修飾剤、トランスグルタミナーゼ、及びアンモニア定量剤を組み合わせてなる、ペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの測定方法及びその測定用試薬キットに関する。詳しくは、ペプチド及び／又は蛋白質にトランスグルタミナーゼを作用させ、生成したアンモニアを定量することにより、目的とするペプチド及び／又は蛋白質に構成アミノ酸として含まれるグルタミンを測定する方法、及び該方法を用いたペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの測定を簡便に行うことのできるグルタミン測定用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体において、細胞内や血液中に最も多く存在する遊離アミノ酸であり、栄養学的には非必須アミノ酸の一つであるグルタミンは、各臓器で活発に代謝され、肝臓でのアンモニア輸送系として合成、分解のほか、腸管粘膜上皮や免疫細胞のエネルギー源として、又、核酸合成の基質としての役割などが注目されている。即ち、増殖の盛んな細胞や組織においては、グルタミンは必須のアミノ酸として位置づけられ、その作用としては筋蛋白質の合成亢進、筋蛋白質の崩壊抑制、小腸粘膜の主要なエネルギー源、大腸粘膜の重要なエネルギー源、腸でのナトリウムと水分の吸収促進、膵増殖、抗オキシダント剤グルタチオンの合成、免疫細胞の発育と増殖促進、抗うつ作用、創傷治療促進などが考えられている。
【０００３】
従来より、これらの効果の一つ或いは複数を期待して、グルタミンを各種栄養組成物中に添加する試みがなされてきたが、グルタミンが非常に不安定な物質であるために、栄養組成物中では容易にその分解が起こり、有効な形態でグルタミンを栄養組成物中に含有させることは困難であった。しかしながら、最近、グルタミン残基を含むペプチドとして、グルタミンを栄養組成物中に安定な形態で含有させる技術（特開平２−１１９７６２号、特開平３−１４８２１６号、特開平３−２６４５２５号、特開平５−２３６９０９号）が開発され、又、グルタミン残基を高度に含有するペプチドを製造する技術（特開平５−６１２９８号）も開発されてきた。
【０００４】
一方、ペプチドや蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量を測定する方法については、酸による加水分解法、アルカリによる加水分解法、複数の蛋白質分解酵素を用いた加水分解法などにより、ペプチド或いは蛋白質をアミノ酸に分解したのち測定する方法や、ペプチドや蛋白質を希酸で処理し、アミド基を加水分解してアンモニアを遊離させ、遊離したアンモニアを測定する方法が従来用いられてきた。しかしながら、酸及びアルカリを用いた加水分解法では、酸及びアルカリに不安定なグルタミンは破壊されグルタミン酸となり、元来ペプチド或いは蛋白質を構成しているグルタミン酸と区別して定量することができず、この時遊離したアンモニア量からペプチドや蛋白質中のアミド基を定量する方法では、ペプチド或いは蛋白質を構成しともにアミド基を有するアスパラギンとグルタミンを区別して定量できない。又、蛋白質分解酵素を用いた加水分解法では、ペプチド或いは蛋白質によっては完全にアミノ酸に分解することが非常に困難であることから、グルタミン含量を正確に定量することは困難であるなどの問題点がある。同様に、希酸によりアンモニアを遊離する方法では、アスパラギンとグルタミンを区別して定量できない。
【０００５】
現在までに、ペプチドや蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるグルタミンを別個に定量しようとする試みは、P.E.Wilcox（Methods Enzymol. Vol.11, pp65-76(1967)）により報告されている。この報告では、乾燥した蛋白質を脱水メタノール中に懸濁し、これに無水酢酸を加えることによって蛋白質中のカルボキシル基をエステル化して乾燥し、まずエステル化した蛋白質を得る。このエステル化した蛋白質を、テトラヒドロフラン中で水素化ホウ素リチウムを用いて還元反応を行い、エステル化した蛋白質中のカルボキシル基を一級アルコール基に導く。次に、反応に用いた過剰の試薬を除去して蛋白質を取り出し乾燥し、更にこれを酸を用いた加水分解によってアミノ酸に分解し、生成したアミノ酸を測定するという方法を用いている。この方法では、アスパラギン酸及びグルタミン酸は各々対応する有機酸誘導体に、アスパラギン及びグルタミンは各々アスパラギン酸及びグルタミン酸として定量される。しかしながら、この方法は非常に複雑な操作と長時間を有し、なおかつ各反応における副反応の進行があり、定量性の点でも大きな問題点を有している。
【０００６】
又、ペプチド鎖中のグルタミンに特異的に作用するトランスグルタミナーゼ(EC 2.3.2.13）を用いた方法が、H.Toda and J.E.Folk （Biochim. Biophys. Acta, Vol.175,pp427-430(1969)）によって試みられている。この方法は、蛋白質を過ギ酸酸化することによって変性させ、変性させた蛋白質と放射活性標識したグリシンエチルエステルを基質としてトランスグルタミナーゼを作用させ、蛋白質中のグルタミン残基に放射活性標識したグリシンエチルエステルを転移させることによって、蛋白質中に取り込まれた放射活性を測定することによりグルタミン含量を測定しようとするものである。この方法では、蛋白質を過ギ酸によって酸化する時に副反応が進行し易く複雑な操作を必要とする問題点があり、又、放射活性標識物質を使用しなければならないなど、安全性の点でも問題点があった。なおかつトランスグルタミナーゼは、ペプチドや蛋白質のアミノ末端から少なくとも３番目以降に存在するグルタミンにのみ作用することが知られていることから、この方法では、ペプチドや蛋白質のアミノ末端或いはアミノ末端から２番目にグルタミンが存在する場合は定量することができないという大きな問題点もあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの簡便な特異的測定方法、及び該方法を利用したペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの簡便な測定用試薬キットを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の状況に鑑み鋭意研究を行った結果、ペプチド及び／又は蛋白質の遊離のアミノ基を化学修飾により保護した後トランスグルタミナーゼを作用させることによって、ペプチドや蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量と等モル量のアンモニアが生成することを見出し、この生成したアンモニア量を定量することによって、ペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミン量が測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
先ず、目的とするペプチド及び／又は蛋白質中の遊離アミノ基を化学的に修飾し保護する。化学的修飾法については、従来より知られているグアニジル化、アミジン化、アルキル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、トリフルオロアセチル化、アセトアセチル化、カルバミル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化等の他適宜利用可能であるが、修飾反応後アミノ基に導入される置換基の分子量が50以上となるものを用いることが特に好ましい。例えばフェニルイソチオシアネート、ダンシルクロリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−フタルアルデヒド、２−メトキシ−５−ニトロトロボン、カルボベンゾキシクロリド、２，４−ジニトロクロロベンゼン、２，４−ジニトロフルオロベンゼン等が挙げられる。ペプチドや蛋白質の遊離のアミノ基を化学修飾することによって、アミノ末端或いはアミノ末端から２番目にグルタミン残基が存在する場合においても、グルタミン残基がトランスグルタミナーゼの作用を受けるようになり、又、ペプチドや蛋白質自身が持つ、トランスグルタミナーゼの基質となり得るリジン残基の反応性を消失させることができる。
【００１０】
この化学修飾したペプチドや蛋白質を、純水或いは緩衝液に溶解し基質液とする。この時用いる緩衝液は、トランスグルタミナーゼの基質となる一級アミンを含むものであってはならない。さらに、作成した基質液との反応用の酵素液を作製し、目的とするペプチド及び／又は蛋白質よりアンモニアを遊離させる。この時の反応液（酵素液）は、0.01〜50mg/ml 、好ましくは0.1 〜100mg/mlの修飾したペプチド或いは蛋白質基質、及び0 〜750mM 、好ましくは10〜100mM のSH基還元剤（好ましくはジチオスレイトール）、及び0 〜300mM 、好ましくは1 〜50mMのカルシウムイオン、及び0.0001〜500 U/ml、好ましくは0.01〜5 U/mlのトランスグルタミナーゼ（尚、トランスグルタミナーゼの１U (u) の定義及び測定法は、J.E.Folk and S.I.Chung ; Methods Enzymol., Vol.113, pp358-357(1985) の方法に従う）を含み、pH 4〜9 、好ましくはpH 5.5〜8.5 で、5 〜50℃、好ましくは25〜40℃に保温して反応を行う。反応は該pHで緩衝能を持つ緩衝液中にて実施可能であるが、用いる緩衝液はトランスグルタミナーゼの基質となる一級アミンを含むものであってはならない。又、用いるトランスグルタミナーゼの起源については、特に限定されるものではないが、酵素活性の観点から哺乳動物由来のものがより好ましい。
【００１１】
酵素反応は、反応液中のアンモニア量を経時的に測定することによって監視し、反応液中のアンモニア量が増加しなくなるまで反応を継続する。具体的には、反応中経時的に反応液の一部を一定量分取して、分取した反応液中のアンモニア量を測定する。アンモニア量の測定にはインドフェノール法等の常法のほか、体外診断薬等として市販されているアンモニア測定用のキット試薬などを用いることができる。反応液中のアンモニア量が増加しなくなった時点で反応を終了し、反応液中のアンモニア量を測定し、試験値とする。また別に、ペプチド或いは蛋白質基質を含まない反応液を同様の条件下で同時間保温してアンモニア量を測定して空試験とする。試験値から空試験の値を引くことにより反応液中のアンモニアの測定値とする。検出された反応液中に生成したアンモニアのモル量は、用いたペプチド或いは蛋白質の構成アミノ酸として含まれるグルタミンのモル量と等しく、アンモニアの測定値を用いたペプチド或いは蛋白質の単位重量当たり或いはモル量当たりに換算することで、グルタミンの量を算出することができる。
【００１２】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１３】
【実施例１】
ペプチド中のグルタミン量の測定
合成ペプチド、Ｚ−Ｑ−Ｇ（シグマ社製：ペプチド試料(I) ）、Ｇ−Ｑ（ペニンシュラ・ラボラトリー社製：ペプチド試料(II)）、及びＱ−Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｎ（ペニンシュラ・ラボラトリー社製：ペプチド試料(III) ）のグルタミン量を測定した。ここで、Ｚはベンジルオキシカルボニル基、Ｑはグルタミン残基、Ｇはグリシン残基、Ａはアラニン残基、Ｋはリジン残基、Ｓはセリン残基、Ｎはアスパラギン残基を示す。各々のペプチド1mg を小試験管に分取し、これに、エタノール−トリエチルアミン−水−フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）（7:1:1:1 v/v ）を100 μl 加え、窒素ガス気流下、50℃で10分間反応させた。純水を25μl 加え撹拌後、2.5ml の n−ヘプタン−酢酸エチル（15:1 v/v）を更に加え、撹拌し、遠心分離して上清を捨てた。同様に、2.5ml の n−ヘプタン−酢酸エチル（7:1 v/v ）で２回洗浄し、真空下で乾燥することにより化学修飾ペプチドを得た。得られた２種の化学修飾ペプチドの全量、及びペプチド試料(I) 1mg を、各々別個に少量の純水に溶解して基質液を作製した。これにジチオスレイトール溶液、塩化カルシウム溶液、トランスグルタミナーゼ（モルモット肝臓由来：シグマ社製）溶液、トリス−酢酸緩衝液を添加して、総量1ml の反応液を作製した。反応液中には、修飾前のペプチドの重量に換算して1mg/mlの修飾したペプチド基質、50mMのジチオスレイトール、10mMのカルシウムイオン、及び0.2 U/mlのトランスグルタミナーゼ、0.1Mのトリス−酢酸緩衝液を含み、pHは８に調節した。この反応液を30℃に保温して反応を行った。酵素反応は、経時的に50μl の反応液を分取して、アンモニア測定キット（デタミナー−ＮＨ2 、協和メデックス社製）によってアンモニア量を測定し、監視した。生成するアンモニア量は反応開始後18時間で一定となり、その後増加しなかった。そこで、反応開始後18時間後の反応液中のアンモニアのモル量を測定して、用いた試料中のグルタミンのモル量とした。尚、対照としてペプチドを含まないものを用いて全く同様の操作を行い空試験を実施し、空試験の値を引くことにより測定結果を補正し、測定値とした。各ペプチド試料1mg 中のグルタミン含量の理論値と測定結果を表１に示す。
【００１４】
【表１】
0004002620.tif 000002
【００１５】
表１に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致しており、これは、本発明の方法によって、グルタミン残基がアミノ末端或いはアミノ末端から２番目に存在する場合においてもトランスグルタミナーゼが作用して、ペプチド中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量が正確に測定されていることを示す。
【００１６】
【実施例２】
蛋白質中のグルタミン量の測定（１）
酸化型牛インスリンＢ鎖（シグマ社製）1mg を、0.1Mの炭酸水素ナトリウム溶液750 μl に溶解し、1mg/mlのダンシルクロリド−アセトン溶液を75μl 添加混合した。この溶液を遮光して室温で３時間撹拌した後、10mMのトリス−酢酸緩衝液（pH８）で平衡化したセファデックスＧ−25カラム（φ1.4 ×16cm）に通して未反応試薬を除去した後凍結乾燥し、化学修飾酸化型牛インスリンＢ鎖を得た。得られた化学修飾酸化型牛インスリンＢ鎖の全量を、少量の純水に溶解して基質液を作製した。これにジチオスレイトール溶液、塩化カルシウム溶液、トランスグルタミナーゼ（モルモット肝臓由来：シグマ社製）溶液、トリス−酢酸緩衝液を添加して、総量1ml の反応液を作製した。反応液中には、修飾前の酸化型牛インスリンＢ鎖の重量に換算して1mg/mlの修飾した酸化型牛インスリンＢ鎖基質、50mMのジチオスレイトール、10mMのカルシウムイオン、及び0.2 U/mlのトランスグルタミナーゼ、0.1Mのトリス−酢酸緩衝液を含み、pHは８に調節した。この反応液を35℃に保温して反応を行った。酵素反応は、経時的に50μl の反応液を分取して、アンモニア測定キット（デタミナー−ＮＨ2 、協和メデックス社製）によってアンモニア量を測定し、監視した。生成するアンモニア量は、反応開始後24時間で一定となり、その後増加しなかった。そこで、反応開始後24時間後の反応液中のアンモニアのモル量を測定して、用いた試料中のグルタミンのモル量とした。尚、対照として酸化型牛インスリンＢ鎖を含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し、空試験の値を引くことにより測定結果を補正し、測定値とした。酸化型インスリンＢ鎖1mg 中のグルタミン含量の理論値と測定結果を表２に示す。
【００１７】
【表２】
0004002620.tif 000003
【００１８】
表２に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致しており、これは、本発明の方法によって、蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量が正確に測定されていることを示す。
【００１９】
【実施例３】
蛋白質中のグルタミン量の測定（２）
精製卵白リゾチーム（生化学工業社製）、牛乳β−ラクトグロブリンＡ及び牛乳β−カゼイン（シグマ社製）各々1mg を4Mの塩酸グアニジンを含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH９）1ml に溶解した。これに、20mM 2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を100 μl 加え、遮光して40℃で２時間反応を行った。反応液を、10mMのトリス−酢酸緩衝液（pH８）で平衡化したセファデックスＧ−25カラム（φ1.4 ×16cm）に通して未反応試薬を除去した後、凍結乾燥し化学修飾蛋白質を得た。得られた各化学修飾蛋白質の全量を、少量の純水に溶解して基質液を作製した。これにジチオスレイトール溶液、塩化カルシウム溶液、トランスグルタミナーゼ（モルモット肝臓由来：シグマ社製）溶液、トリス−酢酸緩衝液を添加して、総量1ml の反応液を作製した。反応液中には、修飾前の蛋白質の重量に換算して1mg/mlの修飾した蛋白質基質、50mMのジチオスレイトール、10mMのカルシウムイオン、及び0.2 U/mlのトランスグルタミナーゼ、0.1Mのトリス−酢酸緩衝液を含み、ｐＨは８に調節した。この反応液を37℃に保温して反応を行った。酵素反応は、経時的に50μl の反応液を分取して、アンモニア測定キット（デタミナー−ＮＨ2 、協和メデックス社製）によってアンモニア量を測定し監視した。生成するアンモニア量は、卵白リゾチームの場合は反応開始後30時間、牛乳β−ラクトグロブリンＡでは26時間、牛乳β−カゼインでは20時間で一定となり、その後増加しなかった。そこで、各蛋白質試料においてアンモニア量が一定となった時間の反応液中のアンモニアのモル量を測定して、用いた試料中のグルタミンのモル量とした。尚、対照として蛋白質を含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し、空試験の値を引くことにより測定結果を補正し、測定値とした。各蛋白質試料1mg 中のグルタミン含量の理論値と測定結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
0004002620.tif 000004
【００２１】
表３に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致しており、これは、本発明の方法によって、蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量が正確に測定されていることを示す。
【００２２】
0004002620.tif 000005
この構成キットでペプチド中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量を測定したところ、感度良く測定することができた。
【００２３】
0004002620.tif 000006
この構成キットで蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの含量を測定したところ、感度良く測定することができた。
【００２４】
0004002620.tif 000007
この構成キットで蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミン含量を測定したところ、感度良く測定することができた。
【００２５】
【発明の効果】
以上の結果より、化学修飾したペプチド及び／又は蛋白質にトランスグルタミナーゼを作用させ、生成したアンモニアを定量することにより、目的とするペプチド及び／又は蛋白質に構成アミノ酸として含まれるグルタミンを簡便に測定する方法、及び該方法を用いたペプチド及び／又は蛋白質中に構成アミノ酸として含まれるグルタミンの測定を簡便に行うことのできるグルタミン測定用試薬キットが提供される。本発明は又、従来用いられてきたペプチドや蛋白質のアミノ酸組成分析法及びアミド基定量法とを組み合わせることにより、蛋白質のより正確なアミノ酸組成についての情報を得ることができる。