(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁膜体、半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子解析電界効果デバイスであって、以下の構成：
（ａ）絶縁膜体は、窒化シリコン表面を有し、この表面に核酸プローブが固定化されているとともに、少なくとも１種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されていること；（ｂ）半導体基板は、前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること；および
（ｃ）参照電極は、前記試料溶液中に備えられていること；
を含んでなる遺伝子検出電界効果デバイスを用いて、遺伝子多型を解析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含まれている試料溶液とを接触させることにより、絶縁膜体上で前記核酸プローブと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせるステップ；
（ｂ）洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の前記目的遺伝子を除去するステップ；
（ｃ）伸長反応における酵素であるタックDNAポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）およ
び基質となるデオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステップ；
（ｄ）洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の酵素および基質を除去するステップ；および
（ｅ）緩衝液を絶縁膜体上に導入して、遺伝子検出電界効果デバイスの出力値を測定するステップ；
を含むことを特徴とする遺伝子多型解析方法。
【請求項２】
ステップ（ｅ）の出力値の測定は、野生型核酸プローブが固定化されている第１の遺伝子検出電界効果デバイスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化されていない第３の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値Ｖ１を測定し、また、変異型核酸プローブが固定化されている第２の遺伝子検出電界効果デバイスと前記第３の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値Ｖ２を測定し、Ｖ１がＶ２より大きいパターン（Ｖ１＞Ｖ２）、Ｖ１とＶ２とが同程度であるパターン（Ｖ１≒Ｖ２）およびＶ１がＶ２より小さいパターン（Ｖ１＜Ｖ２）の３種類のパターンに分類して表示する請求項１記載の遺伝子多型解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、遺伝子検出電界効果デバイスを用いた遺伝子多型解析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、高感度、かつ、高精度に遺伝子の検出解析が可能であり、しかも、遺伝子多型解析システムを従来よりも小型でコストをも抑えることのできる、新しい遺伝子多型解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、他の生物のゲノム塩基配列解読が急速に進展する中、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。これらのゲノム塩基配列情報をもとに、生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むものと考えられる。これらの新規分野発展の基礎となるのが、塩基配列情報に加えて、遺伝子の発現および機能情報である。遺伝子の機能および遺伝子の発現解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術として、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ（以下、両者を総称してＤＮＡマイクロアレイとする）が開発されている。しかし、現状のＤＮＡマイクロアレイの多くは、蛍光検出を基本原理としているので、レーザや複雑な光学系システムが必要となり、システムが大型化して高価であるという問題があった。
【０００３】
また、現在開発されているほとんどのＤＮＡマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションに基づく二本鎖ＤＮＡの検出を基本原理としており、反応の選択性があまり高くないため、遺伝子多型解析の精度に問題があった。特に医療の分野では、テーラーメイド医療の実現には、遺伝子多型、もしくは、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism, SNP
；以下、ＳＮＰと略記することがある）を高精度に、かつ、簡便に検出する必要がある。したがって、簡便性と高精度化の両方を満足させる技術が求められている。
【０００４】
これらの問題を解決する方法として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイがいくつか報告されている。たとえば、分子ワイヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、他端に核酸プローブを結合させ、目的遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づく酸化・還元標識と金属電極の電子の授受を電流変化として検出して、目的遺伝子を検出する方式が開発されている（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００５】
また、電気化学的活性のある標識剤として、Ferrocenylnaphthalene Diimideを用いて
、金属電極における酸化・還元電流を計測することにより、ハイブリダイゼーションを検出する方式が開発されている（非特許文献３）。さらに、電流検出方式ＤＮＡチップを用いて、Ｃ型肝炎の薬効検査システムが開発されている（非特許文献４）。この方式では、高価なレーザや複雑な光学系システム等を必要としないため、簡単で小型のシステムを構築することができる。
【０００６】
しかしながら、これら非特許文献１から４の方式の場合は、金属電極上での酸化・還元反応を検出の基本原理としているため、試料中に酸化物質あるいは還元物質（たとえば、アスコルビン酸等）が存在すると、酸化、または、還元に基づく電流が流れてしまい、遺伝子検出の妨害となって検出の精度が劣化するという問題があった。また、電流計測に伴
い、金属電極上で電極反応が進行する。電極反応は、不可逆で非平衡反応であるため電極の腐食、ガスの生成等が生じて、固定化した核酸の剥離や電流測定の安定性が損なわれたりするので、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化するという問題があった。
【０００７】
さらにまた、電界効果デバイスを用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出する試みも報告されている（非特許文献５）。これは、ＤＮＡ分子が溶液中で負電荷を有していることを利用し、電界効果を利用してハイブリダイゼーションによる電荷変化を検出するものである。しかしながら、基板上に形成されるＤＮＡプローブはもともと負電荷を有しているため、目的遺伝子のハイブリダイゼーションによる電荷の変化分は小さく、非特異的な吸着との区別ができないなど遺伝子検査のためには高感度化、精度向上が課題であった。また、一塩基多型（ＳＮＰ）のように２つの遺伝子間における、わずかの違い（一塩基の違い）を検出するには、感度および精度（選択性）が共に悪く、困難であった。
【非特許文献１】Nature Biotechnology, vol. 16, p27-31, 1998
【非特許文献２】Nature Biotechnology, vol. 16, p40-44, 1998
【非特許文献３】Anal. Chem., 72, p1334-1341, 2000
【非特許文献４】Intervirology, 43, p124-127, 2000
【非特許文献５】J. Phys. Chem. B., 101, p2980-2985, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、高感度、かつ、高精度に遺伝子の検出、解析が可能であり、しかも、遺伝子多型解析システムを従来よりも小型でコストをも抑えることのできる、遺伝子検出電界効果デバイスを用いた新しい遺伝子多型解析方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、以下の発明を提供する。
第１：絶縁膜体、半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子解析電界効果デバイスであって、以下の構成：
（ａ）絶縁膜体は、窒化シリコン表面を有し、この表面に核酸プローブが固定化されているとともに、少なくとも１種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されていること；（ｂ）半導体基板は、前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること；および
（ｃ）参照電極は、前記試料溶液中に備えられていること；
を含んでなる遺伝子検出電界効果デバイスを用いて、遺伝子多型を解析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含まれている試料溶液とを接触させることにより、絶縁膜体上で前記核酸プローブと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせるステップ；
（ｂ）洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の前記目的遺伝子を除去するステップ；
（ｃ）伸長反応における酵素であるタックＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）および基質となるデオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステップ；
（ｄ）洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の酵素および基質を除去するステップ；および
（ｅ）緩衝液を絶縁膜体上に導入して、遺伝子検出電界効果デバイスの出力値を測定するステップ；
を含むことを特徴とする遺伝子多型解析方法。
第２：上記ステップ（ｅ）の出力値の測定は、野生型核酸プローブが固定化されている第１の遺伝子検出電界効果デバイスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化されていない第
３の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値Ｖ１を測定し、また、変異型核酸プローブが固定化されている第２の遺伝子検出電界効果デバイスと前記第３の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値Ｖ２を測定し、Ｖ１がＶ２より大きいパターン（Ｖ１＞Ｖ２）、Ｖ１とＶ２とが同程度であるパターン（Ｖ１≒Ｖ２）およびＶ１がＶ２より小さいパターン（Ｖ１＜Ｖ２）の３種類のパターンに分類して表示する（８）記載の遺伝子多型解析方法。
【発明の効果】
【００１０】
この出願の発明によって、高感度、かつ、高精度に遺伝子の検出解析が可能であり、しかも、遺伝子多型解析システムを従来よりも小型でコストをも抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１２】
この出願の発明の特長は、この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスと分子生物学的反応とを組み合わせることにより、２つの遺伝子間における一塩基の違いを検出・解析、すなわち、遺伝子多型、もしくは、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）の検出・解析を高感度に、しかも高精度に行うことができることである。以下に、図
１から図１３に沿って、この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスを用いた高精度なＳＮＰ解析の方法を説明する。
【００１３】
図１は、この出願の発明の方法に用いる遺伝子検出電界効果デバイスの一実施形態を模式的に例示した断面図である。
【００１４】
図１に示したとおり、この出願の発明の遺伝子解析電界効果デバイス（１Ａ）は、少なくとも絶縁膜体（２）、半導体基板（３）、参照電極（４）が備えられている。
【００１５】
絶縁膜体（２）の一方の表面側には、核酸プローブ（５）が固定化されているとともに、少なくとも前記目的遺伝子を含む試料溶液（６）と接触されている。この核酸プローブ（５）は、検出・解析の対象である目的遺伝子（後述）と結合（ハイブリダイズ）することのできる、目的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有している。また、絶縁膜体（２）の他方の表面側には、半導体基板（３）が設置されていることを特徴とした構造を有している。なお、半導体基板（３）は、その機能を有するものであれば材質は特に制限されるものではなく、たとえば、p-Si4（シリコン）、ゲルマニウム等を使用することがで
きる。
【００１６】
また、この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）では、試料溶液（６）の中に参照電極（４）が備えられており、半導体基板（３）と電気的に接続されている。そして、必要に応じてゲート電極（７）を設け、電圧ＶＧを印加することもできる。
【００１７】
核酸プローブ（５）については、検出・解析の対象とする目的遺伝子と結合し、検出・解析することができるのであれば、その形態や長さ等は、特に制限されるものではないが、たとえば、天然オリゴヌクレオチド、人工オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ断片、ペプチド核酸等を用いることが好ましい。長さについては、通常３００個以下の塩基から構成されていることが好ましく、特に天然または人工オリゴヌクレオチドを使用する場合は、８０個以下の塩基からなる核酸断片であることがより好ましい。
【００１８】
上記絶縁膜体（２）は、二酸化シリコン（SiO2）、窒化シリコン（SiNまたはSi3N4）、またはこれと酸化シリコン（SiO2）、酸化アルミニウム（Al2O3）、酸化タンタル（Ta2O5
）等の材料を組み合わせて用いることができ、通常は半導体基板（３）表面の電気的特性を良好に保つため、酸化シリコン（SiO2）の上に、窒化シリコンを積層して二層構造とすることが好ましい。
【００１９】
上記絶縁膜体（２）表面に核酸プローブ（５）を固定化するためには、まず、核酸プローブ（５）の一端をアミノ基（NH2基）、チオール基（SH基）、ビオチン等で化学修飾す
る。たとえば、アミノ基で化学修飾した核酸プローブ（５）を用いる場合は、絶縁膜体（２）の表面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジン等で化学修飾して、絶縁膜体（２）表面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネート（PDC
）と反応させ、前記のアミノ基で化学修飾した核酸プローブ（５）を絶縁膜体（２）表面に固定化する。
【００２０】
また、チオール基で化学修飾した核酸プローブ（５）を絶縁膜体（２）表面に固定化する場合は、絶縁膜体（２）上に金薄膜を形成させ、チオール基と金との親和性を利用して、核酸プローブ（５）を固定化することもできる。さらにまた、ビオチンで化学修飾した核酸プローブ（５）を固定化する場合は、絶縁膜体（２）表面にストレプトアビジンを導入し、ビオチンとストレプトアビジンの親和性を利用して、核酸プローブ（５）を絶縁膜体（２）表面に固定化する。
【００２１】
実際の核酸プローブ（５）の固定化に際しては、絶縁膜体（２）表面にのみ核酸プローブ（５）を含む溶液を滴下、または、スポットし、絶縁膜体（２）上の官能基と化学反応を行わせて核酸プローブ（５）を固定化する。なお、核酸プローブ（５）は、金属電極を介して固定化されていてもよい。金属電極としては、たとえば、白金、金、銀、パラジウム、チタン、クロム等を使用することができる。
【００２２】
試料溶液（６）中には、検出・解析の対象となる目的遺伝子を含む多数の遺伝子が含まれている。そして、上記のとおり、この目的遺伝子の塩基配列と相補的塩基配列を有する核酸プローブ（５）が、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）の絶縁膜体（２）上に固定化されていることにより、適切な反応条件の下で目的遺伝子と核酸プローブ（５）が結合（ハイブリダイズ）されて二本鎖を形成させることができる。
【００２３】
そして、さらに、遺伝子の伸長反応を行うための試薬類（TaqポリメラーゼやdATP、dGTP、dCTP、dTTP等）を試料溶液（６）に導入するとともに、遺伝子検出電界効果デバイス
（１Ａ）に加熱操作および／または冷却操作等の温度コントロールを施すことにより、前記目的遺伝子と核酸プローブ（５）とがハイブリダイズして形成された二本鎖サンプルのみを効率よく伸長反応させることができる。つまり、試料溶液（６）中に含まれる目的遺伝子ではない遺伝子とは、固定化された核酸プローブ（５）とはハイブリダイズして二本鎖を形成することができないため、当然に伸長反応は促進されることはない。
【００２４】
上記の遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）における温度コントロール手段としては、たとえば、後述の図９の例示したとおり、ヒーター（１５）および温度センサ（１６）を集積化することで、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応の反応温度を最適値に制御することができ、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）の絶縁膜体（２）上でのハイブリダイゼーションおよび伸長反応を高精度に行わせることができる。
【００２５】
そして、反応に用いる緩衝溶液のｐＨの適切な条件下では、核酸は負に帯電している。したがって、上記のとおり二本鎖形成して伸長反応が促進されることにより、絶縁膜体（２）表面の負電荷が増大し、その結果、静電的相互作用によりシリコン等からなる半導体基板（３）表面におけるキャリア、すなわち電子（８）密度が変化する。この電子（８）密度の変化に伴う電気的信号を検出することで、高感度で、高精度にＳＮＰの解析を行う
ことができる。
【００２６】
なお、この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）の出力値は、この緩衝液のｐＨに依存しており、特にｐＨが７以下であるときには有意な差が得られ、また、高い信号／雑音比（Ｓ／Ｎ比）を得るためには、このｐＨを４以下とすることが好ましい。
【００２７】
図２は、半導体基板表面のキャリア密度変化を遺伝子検出電界効果デバイスのキャパシタンスーの変化として検出する一例を示した概念図である。
【００２８】
この図２は、参照電極と半導体基板（シリコン）の電気的端子をキャパシタンスメーターに接続し、ＶＣ電圧を掃引しながら数ヘルツから１メガヘルツまでの周波数の微小（５０ｍＶ程度）電圧を重畳させて印加時における、キャパシタンスー−電圧特性の変化の状態を例示している図である。
【００２９】
ｐ型シリコンを用いる場合は、ＶＧの変化により、半導体基板表面の空乏層容量が変化し、測定される全キャパシタンスーＣＣは、絶縁膜体の容量と半導体基板表面の空乏層容量との和となるため、図中の符号Ａに示した特性となる。半導体基板のシリコン中のエネルギーバンドがフラットになる電圧をフラットバンド電圧といい、キャパシタンスー電圧特性を特徴付ける指標になる。そして、符号Ａで示しているキャパシタンスー電圧特性のフラットバンド電圧をＶＦ１とする。絶縁膜体表面で核酸プローブと目的遺伝子がハイブリダイズして二本鎖を形成すると、表面の負電荷密度が増大するので、キャパシタンスー電圧特性は電圧軸に沿って正方向にシフトし、図中の符号Ｂに示した特性となる。この時のフラットバンド電圧をＶＦ２とすると、フラットバンド電圧のシフト量ΔＶＦ＝ＶＦ２−ＶＦ１（矢印Ｄ）は、絶縁膜体表面の電荷密度変化に依存するので、ΔＶＦを測定することにより、ハイブリダイゼーションを評価することができる。
【００３０】
さらに、絶縁膜表面で、ＤＮＡの伸長反応を行わせると、二本鎖の長さが長くなるため表面の負電荷がさらに増大する。つまり、キャパシタンスー電圧特性はさらに正方向にシフトし、図中の符号Ｃに示した特性になる。そして、この時のフラットバンド電圧をＶＦ３とすると、フラットバンド電圧のシフト量ΔＶＦ＝ＶＦ３−ＶＦ１（矢印Ｅ）は、伸長反応による電荷密度変化の指標になり、ハイブリダイゼーションのみの時のシフト量よりも大きいため、高感度測定が可能になる。
【００３１】
図３は、図１に例示した遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）において、半導体基板（３）であるｐ型シリコン（ｐ−Ｓｉ）の表面近傍にソース、ドレインとして、それぞれをソースｎ型領域（９）、ドレインｎ型領域（１０）を設けて、遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）を構成した遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）を模式的に例示した断面図である。なお、遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）を単に遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）と表記することがある。
【００３２】
図３に示したとおり、ソースｎ型領域（９）、ドレインｎ型領域（１０）間に電圧ＶＤを印加するためのドレイン電極（１１）を設け、その時に流れるソースｎ型領域（９）、ドレインｎ型領域（１０）間の電流ＩＤをドレイン電流計（１２）で測定する。核酸プローブ（５）は、ソースｎ型領域（９）、ドレインｎ型領域（１０）間の絶縁膜体（２）表面（以後、この領域を「ゲート絶縁膜体領域（２０１）」と記すことがある）に固定化する。試料溶液（６）中に検出解析すべき目的遺伝子が含まれ、遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）のゲート絶縁膜体領域（２０１）上に目的遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブ（５）が固定化されていると、目的遺伝子と核酸プローブ（５）が、ハイブリダイズして二本鎖を形成する。
【００３３】
そして、図１および図２の例と同様に、ハイブリダイズによる二本鎖形成によりゲート絶縁膜体領域（２０１）表面の負電荷が増大し、その結果、静電的相互作用により半導体基板表面における電子（８）密度が変化し、これに伴う電気的信号を検出する。
【００３４】
図４は、半導体基板表面のキャリア密度変化を遺伝子検出電界効果デバイスのゲート電圧ＶＧ−ドレイン電流ＩＤ特性変化として検出する一例を示した概念図である。ソース、ドレイン間に一定の電圧ＶＤを印加した状態で、ゲート電圧ＶＧに負の電圧を印加すると静電的相互作用により、ｐ型半導体基板表面から少数キャリアである電子がなくなり、多数キャリアである正孔が蓄積する。一方、ソース、ドレインは、ｎ型領域であるので、ソース、ドレイン間電圧ＶＤを印加すると、ソース、ドレインのどちらかに必ずｐｎ接合の逆方向電圧が印加されるため、ドレイン電流ＩＤは流れない（無視できるほど小さい）。
【００３５】
そして、徐々にゲート電圧ＶＧを増加していくと、電子が表面に誘起されて表面の電子密度が増加する。十分な大きさのゲート電圧ＶＧを印加するとソース、ドレインのｎ型領域は、半導体基板表面に誘起された電子の層で接続され、高い導電性を示してドレイン電流ＩＤが流れ出すこととなる。ドレイン電流ＩＤが流れ出すときのゲート電圧ＶＧを閾値電圧ＶＴといい、ＶＧ−ＩＤ特性を特徴づける指標となる。さらに、ゲート電圧ＶＧを正の方向に印加していくと、半導体基板表面の電子密度が増加して、ドレイン電流ＩＤは増加する。したがって、図４中の符号Ａ’に示した特性となり、この時の閾値電圧をＶＴ１とする。ゲート絶縁膜体表面で、核酸プローブと目的遺伝子がハイブリダイズして二本鎖を形成すると、表面の負電荷密度が増大するので、ＶＧ−ＩＤ特性は電圧軸に沿って、正方向にシフトし、図４中の符号Ｂ’に示した特性となる。この時の閾値電圧をＶＴ２とすると、閾値電圧のシフト量ΔＶＴ＝ＶＴ２−ＶＴ１（矢印Ｄ’）は、ゲート絶縁膜体領域表面の電荷密度変化に依存するので、ΔＶＴを測定することにより、ハイブリダイゼーションを評価することができる。さらに、ゲート絶縁膜体領域表面でＤＮＡの伸長反応を行わせると、二本鎖の長さが長くなるため表面の負電荷がさらに増大する。したがって、ＶＧ−ＩＤ特性はさらに正方向にシフトし、図４中の符号Ｃ’に示した特性になる。この時の閾値電圧をＶＴ３とすると、閾値電圧のシフト量ΔＶＴ＝ＶＴ３−ＶＴ１は伸長反応による電荷密度変化の指標になり、ハイブリダイゼーションのみの時のシフト量よりも大きいため、高感度な測定、すなわち検出が可能になる。
【００３６】
図５は、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）からなる遺伝子検出電界効果デバイス（１Ｂ）を２つ備え、また、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ｂ）それぞれに異なる核酸プローブ（５）を固定化させて、目的遺伝子（６０１）とハイブリダイズさせている状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は目的遺伝子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有する核酸プローブ（野生型）を固定化させた状態、（Ｂ）は目的遺伝子の塩基配列とは一塩基だけ異なる核酸プローブ（変異型）を固定化させた状態示している。
【００３７】
また、図６は、図５の例において、伸長反応を促進させた状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は目的遺伝子と核酸プローブが伸長している状態、（Ｂ）は目的遺伝子と核酸プローブの伸長反応が停止している状態を示している。なお、この図５および図６における基本的な構成は、図３の例と略同様である。
【００３８】
図５および図６に示したとおり、この出願の発明は、上記のとおりの遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）を少なくとも２つ以上備えて、これら遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）それぞれの絶縁膜体（２）上に、少なくとも２種類の核酸プローブ（５）が固定化されてなる遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）を用いることにより、ＳＮＰの解析を高感度に、また、高精度に行うことができる。
【００３９】
上記の少なくとも２種類の核酸プローブ（５）とは、解析の対象となる目的遺伝子（６
０１）の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型（正常型）核酸プローブ（５０１）と、前記目的遺伝子（６０１）の塩基配列とは非相補的な塩基配列を有する変異型核酸プローブ（５０２）を意味する。この変異型核酸プローブ（５０２）については、核酸プローブ（５）が絶縁膜体（２）上に固定化されている端部である固定化端部（５０３）の反対側の端部、つまり、核酸プローブ（５）が固定化されていない端部である非固定化端部（５０４）における塩基が、野生型核酸プローブ（５０１）の非固定化端部（５０４）における塩基と相異していることが好ましい。図５（Ｂ）の例では、変異型核酸プローブ（５０２）の非固定化端部（５０４）における塩基は「Ｇ」であり、この箇所に対応する目的遺伝子の塩基は「Ｔ」となっているため、結合は途中で停止し、二本鎖を形成することができない。一方、野生型核酸プローブ（５０１）の非固定化端部（５０４）における塩基は「Ａ」であり、この箇所に対応する目的遺伝子の塩基「Ｔ」とは相補的な関係にあり、結合して二本鎖を形成することができる。
【００４０】
そして、目的遺伝子（６０１）の塩基配列が含まれる試料溶液（６）を上記遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）からなる電界効果デバイス（１Ｂ）の絶縁膜体（２）上に導入して、ハイブリダイゼーションを行わせ、未反応の目的遺伝子（６０１）を緩衝溶液等で洗浄する。次いで、タックＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）等のＤＮＡ合成
酵素とともに、基質となるデオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）を用いて、ＤＮＡの伸長反応、あるいは、インターカレーター分子との反応等の分子生物学的反応工程を絶縁膜体（２）表面上で引き続き行わせ、未反応の酵素や基質を洗浄する。その結果、ＤＮＡ伸長反応等で生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用して、半導体基板（３）表面に静電的に誘起する電子（８）密度の変化を検出する。
【００４１】
表面電荷密度の変化を大きくして、高感度測定を実現するために、目的遺伝子（６０１）自身が持っている負電荷に加えて、核酸の伸長反応による負電荷の増大とその結果起こる信号のエンハンスメントやインターカレーターとの反応による正電荷の導入等により、ハイブリダイゼーションの現象を大きな信号／雑音比（Ｓ／Ｎ比）で検出できる。つまり、それぞれの遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）の出力を比較することにより解析の対象となる目的遺伝子（６０１）の遺伝子型（つまり、ＳＮＰ）を解析することができる。
【００４２】
また、絶縁膜体（２）表面に固定化する核酸プローブ（５）の塩基配列設計に際しては、上記のとおり、ミューテーション（変異）の位置を絶縁膜体（２）表面への固定化端部（５０３）とは反対側の端部である非固定化端部（５０４）に設定する。そして、目的遺伝子（６０１）のＳＮＰにおける野生型（正常型）に対応する野生型核酸プローブ（５０１）と変異型に対応する変異型核酸プローブ（５０２）とを別々に固定化させて、１種類の試料溶液（６）に対して、同時にハイブリダイゼーションを行わせ、伸長反応を行わせることにより、一塩基多型（ＳＮＰ）を高精度に測定することができる。
【００４３】
さらに、ハイブリダイゼーション時の温度を野生型核酸プローブ（５０１）、または、変異型核酸プローブ（５０２）の解離温度（Ｔｍ）に設定することにより、ハイブリダイゼーションの選択性を向上させることができ、伸長反応を行わせることで、反応の特異性をさらに高めることができ、より高精度のＳＮＰ解析が可能となる。
【００４４】
これは、ミューテーションの位置が端にあるミスマッチの変異型核酸プローブ（５０２）とのハイブリダイゼーションでは、塩基同士の親和性が低いため十分に結合されず、伸長反応が起こらないためである。一方、フルマッチの野生型核酸プローブ（５０１）では非固定化端部の塩基同士は水素結合で確実に二本鎖を形成するため、伸長反応が起こり、負電荷が増大する。これにより、静電的相互作用で半導体表面の電子（８）密度が変化し、これに伴う電気的特性の変化を測定することにより高精度にSNPを解析することができ
る。
【００４５】
つまり、この出願の発明における遺伝子多型解析方法は、特に出力値の測定については、野生型核酸プローブ（５０１）が固定化されている第１の遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）（遺伝子検出電界効果デバイス）と、絶縁膜体上にはいずれの核酸プローブが固定化されていない第３の遺伝子検出電界効果トランジスタ（図示せず）（遺伝子検出電界効果デバイス）との差動出力値Ｖ１、また、変異型核酸プローブ（５０２）が固定化されている第２の遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ’）（遺伝子検出電界効果デバイス）および前記第３の遺伝子検出電界効果トランジスタ（遺伝子検出電界効果デバイス）との差動出力値Ｖ２を測定し、この測定結果に基づいて、Ｖ１がＶ２より大きいパターン（Ｖ１＞Ｖ２）、Ｖ１とＶ２とが同程度であるパターン（Ｖ１≒Ｖ２）、Ｖ１がＶ２より小さいパターン（Ｖ１＜Ｖ２）の３種類のパターンに分類して表示することに基づいている。
【００４６】
図７は、金属電極（１３）を介して核酸プローブ（５）を絶縁膜体（２）に固定化させた状態を模式的に例示した断面図である。
【００４７】
金属電極（１３）は、前記のとおり、白金、金、銀、パラジウム、チタン、クロム等を使用することができ、これにより、前記の電子（８）の密度変化に伴う電気的特性の変化をより高精度に検出することができる。
【００４８】
さらに、図８は、インターカレーター（１４）を反応させた状態を模式的に例示した断面図である。
【００４９】
インターカレーター（１４）は、二本鎖核酸とのみ反応し、また溶液中ではイオン化し、正に帯電するため、この性質を利用して、インターカレーター（１４）を導入して、伸長反応により長く伸びた野生型核酸プローブ（５０１）が固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）の二本鎖核酸とより多く反応し、大きな信号変化が得られる。この信号変化を検出する。なお、インターカレーター（１４）としては、たとえば、Hoechst33258やエチジウムブロマイド、サイバーグリーン、ピコグリーン等を用いることができる。
【００５０】
図９は、別の実施形態を模式的に例示した断面図である。なお、基本的な構成等は、図３、図５または図６に示した例と略同様である。
【００５１】
この図９においては、図３、図５または図６に例示した遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）が形成された半導体基板（３）に、核酸の伸長反応を促進させるための温度コントロール手段として、ヒーター（１５）をヒーター用ｎ型領域として形成させ、また、温度センサ（１６）は温度センサ用ｐｎ接合として形成させている。この時、一つの半導体基板（３）に複数個のｐウェル（１７）を形成させて、前記ヒーター（１５）および温度センサ（１６）を集積化させている。遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）のゲート絶縁膜体領域（２０１）上には、野生型核酸プローブ（５０１）、変異型核酸プローブ（５０２）それぞれが固定化され、試料溶液（６）中の目的遺伝子（６０１）とハイブリダイゼーションおよび伸長反応を促進させて、高精度なＳＮＰ解析を行うことができる。その際、ヒーター（１５）および温度センサ（１６）とを作動させて、半導体基板（３）近傍の試料温度を、ハイブリダイゼーション時には４５℃、伸長反応時には６２℃に設定し制御した。このように遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）に、温度コントロール手段として、ヒーター（１５）および温度センサ（１６）を集積化することにより、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応時の温度を最適な値に設定することができ、より高精度の測定を行うことができる。
【００５２】
また、図１０は、図９の実施形態をアレイ化して、複数のＳＮＰ解析を行うことができる構造としたものを模式的に例示した断面図である。
【００５３】
図１０に例示したとおり、遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）が形成された各半導体基板（３）を核酸プローブ（５）の解離温度に対応させて、最適な温度に設定できるように、絶縁膜体（１９）の一面に設置し、この絶縁膜体（１９）を介して熱を効率的に放散させるようにする。さらに、各半導体基板（３）間の温度のクロストークを低減し、独立に温度制御可能にするためにシリコン、ポリシリコン等のような熱伝導性物質（２０）で、各遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）（シリコン基板（１８））を囲う構造とし、上記熱伝導性物質（２０）を介して、熱を効率的に放散させる。
【００５４】
目的遺伝子を含む試料溶液を遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）上に導入するために、上記絶縁膜体（１９）に開口部（２１）を設け、遺伝子検出電界効果トランジスタ（１Ｂ）の絶縁膜体（１９）が開口部（２１）に一致するようにアライメントする。さらに、銅板（２２）に接着したペルチエ素子（２３）を銅板（２２）の裏面に設けることにより、温度制御の精度を向上して、また冷却時の時間を短縮することができる。このような構造を有する遺伝子検出電界効果トランジスタアレイ（１Ｃ）を用いることにより、複数のＳＮＰにおいても、高精度な解析を並列的に行うことができ、ハイスループットの解析システムを構築することができる。
【００５５】
図１１は、遺伝子検出用電界効果デバイス（１Ａ）を用いた測定システムの一例を模式的に示した概念図である。
【００５６】
すなわち、図１１に示したとおり、上記のような特徴を有する遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）（または、遺伝子検出電界効果トランジスタ）をフローセル（２４）にマウントし、流路（２５）に接続する。流路（２５）には緩衝液（２８）および洗浄液（２９）がバルブ（３０）を介して接続されており、ポンプ（３１）を駆動して、緩衝液（２８）および洗浄液（２９）をフローセル（２４）に導入することができる。また、試料（２６）および伸長反応のための酵素タックＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）および基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTP等の試薬（２７）は分注器（３２）によりバルブ（３０）中に分注し、フローセル（２４）に導入して、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）（遺伝子検出用電界効果トランジスタ）と反応させることができる。
【００５７】
反応後、使用済みの液はポンプ（３１）により廃液ボトル（３３）に送られる。また、参照電極（３４）にはＡｇ−ＡｇＣｌ電極を用い、３ＭのＫＣｌ溶液（３５）を通過させて上記フローセル（２４）の下流で流路（２５）に接続し、液−液接合（３６）を形成させて、遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）（遺伝子検出用電界効果トランジスタ）と電気的に接続する。そして、反応後の遺伝子検出電界効果デバイス（１Ａ）（遺伝子検出用電界効果トランジスタ）の出力は、信号処理回路（３７）により処理／演算される。
【００５８】
図１２は、図１１にて例示したフローセル（２４）の構造を概略的に例示した図である。フローセル（２４）の中のプリント基板（３８）に遺伝子検出用電界効果デバイス（１Ａ）をマウントし、ワイヤー（３９）で電気的にプリント基板（３８）と接続させる。プリント基板（３８）には、ピン（４０）が設けられ、図１１に例示した信号処理回路（３７）と接続されている。試料溶液は流路（２５）により遺伝子検出用電界効果デバイス（１Ａ）（または、遺伝子検出用電界効果トランジスタ）に導入される。試料溶液が、信号伝導線となるワイヤー（３９）に接触しないように、ワイヤー（３９）部分を保護キャップ（４１）で保護する。保護キャップ（４１）の材料としては、絶縁性を有しているものであれば特に制限されるものではないが、たとえば、アクリル、ポリプロピレン、ポリカ
ーボネイト等が適しているため好ましい。
【００５９】
このような構成の遺伝子検出用電界効果デバイス（１Ａ）を用いた測定システムは、フロー方式の測定であるため、多数の試料を連続に自動的に処理することができ、高スループットの測定に有効である。
【００６０】
以上の例に沿って遺伝子多型（SNP）等を解析する際は、図１３に例示したとおりの以
下のステップで行われる。すなわち：
（１）洗浄液をフローセル中に導入；
（２）緩衝液をフローセル中に導入（洗浄液を置換）；
（３）電界効果デバイスの温度を核酸プローブの最適温度に設定；
（４）各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算；
（５）試料をバルブに分注して、ハイブリダイゼーション液でフローセルに導入；
（６）フローセル中でハイブリダイゼーション；
（７）緩衝液をフローセルに導入して、未反応の試料を除去；
（８）各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算；
（９）酵素タックポリメラーゼ（Taq polymerase）、および基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合液をフローセルに導入し伸長反応；
（１０）緩衝液を導入して未反応の酵素・基質を除去；
（１１）各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算；
（１２）フローセル中の試料温度を９５℃に設定；
（１３）洗浄液を導入して、フローセル中を洗浄；および
（１４）（１）に戻る。
【００６１】
なお、この図１３中の矢印は、出力電位を読み取るタイミングを示している。
【００６２】
以下に実施例を示し、さらに詳しく、この出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。
【実施例】
【００６３】
実施例１：FactorVII遺伝子におけるＳＮＰの検出解析
血液凝固遺伝子の一つであるFactorVII遺伝子には複数の一塩基多型（ＳＮＰ）が存在
することが知られている。そのうちの一つである−１２２部位のＳＮＰは、野生型（正常）がチミン（Ｔ）、変異型がシトシン（Ｃ）であることが知られている。このFactorVII
遺伝子−１２２部位のＳＮＰを検出するために、野生型および変異型それぞれに対応する１１塩基からなる２種類の核酸プローブを合成した。それらの塩基配列は以下のとおりであり、配列番号１は野生型核酸プローブを、配列番号２は変異型核酸プローブを示している。
野生型核酸プローブ：5'-CGTCCTCTGAA-3'（配列番号１）
変異型核酸プローブ：5'-CGTCCTCTGAG-3'（配列番号２）
本実施例においては、上記核酸プローブの３’末端側にＳＮＰ部位の塩基がくるように合成した。すなわち、野生型核酸プローブでは３’末端の塩基がアデニン（Ａ）であり、変異型核酸プローブではグアニン（Ｇ）となっている。その他の塩基配列は野生型、変異型ともにすべて同じであり、検出対象のFactorVII遺伝子にハイブリダイゼーションさせ
ることができる。一方、上記核酸プローブの５’末端側にはアミノ基を修飾して、ゲート絶縁膜体領域表面に固定化した。
【００６４】
また、本実施例における遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜には、窒化シリコンによる修飾処理されており、その表面をγ―アミノプロピルトリエトキシシランで化学修飾して窒化シリコン表面にアミノ基を導入した。そして、核酸プローブのアミノ基
と窒化シリコンのアミノ基を、たとえば、グルタルアルデヒド等のような２官能性試薬と反応させ、シッフ塩基による結合を形成することにより、核酸プローブを窒化半導体基板表面に固定化させた。
【００６５】
本実施例は、たとえば、前記図５にも例示したとおり、野生型核酸プローブを一つの遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体領域表面に固定化させ、変異型核酸プローブを他の遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体領域表面に固定化させて、あらかじめポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた試料を反応させた。
【００６６】
試料は、血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記ＳＮＰ部位を含む２０塩基長の領域を増幅した後、野生型核酸プローブ、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタに導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料を除去した。
【００６７】
野生型核酸プローブの塩基配列は、野生型試料の塩基配列に完全に相補的であるので、ＳＮＰ部位も含めて完全に相補鎖結合して二本鎖ＤＮＡを形成した。一方、変異型核酸プローブの場合は、３’末端の塩基がグアニン（Ｇ）であるため、野生型試料核酸上の塩基チミン（Ｔ）とは相補鎖結合しないため、３’末端が開いた形で二本鎖ＤＮＡを形成した。このため、野生型核酸プローブと変異型核酸プローブとで塩基配列が異なっているため、両者の解離温度（Ｔｍ）が異なり、ハイブリダイゼーション温度を制御することにより、二本鎖形成の選択性を高めることができた。
【００６８】
次に、酵素タックＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）および基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合液を試料中に導入して、温度を６２℃に設定してゲート絶縁膜体上で伸長反応を行った。前記図６に例示したとおり、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、野生型（正常型）の目的遺伝子を含む試料の導入により末端を含めて完全相補鎖の二本鎖を形成するため、伸長反応により二本鎖が合成された。この伸長反応により野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力が２０ｍＶ変化した。一方、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、３’末端の塩基が結合せず開いた形のため、伸長反応が起こらない。したがって、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、ほとんど変化しなかった（およそ、１ｍＶの変化）。
【００６９】
一方、変異型の目的遺伝子のみを含む試料を導入すると、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタのみで伸長反応がおき、その出力が１８ｍＶ変化した。この場合は、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、ほとんど変化せず、０．５ｍＶの変化を示した。野生型、変異型の両方の目的遺伝子を含む試料を導入した場合は、両方の遺伝子検出電界効果トランジスタの出力が変化し、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は１２ｍＶの変化を示し、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は１０ｍＶの変化を示した。
【００７０】
以上のことから、３’末端の塩基がＳＮＰ部位となるように核酸プローブを設計し、野生型と変異型の核酸プローブがそれぞれ遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体上に固定化され、目的遺伝子を含む試料溶液とハイブリダイゼーションを行わせ、引き続き伸長反応を行わせることにより、試料溶液中の遺伝子のＳＮＰを検出することができる。さらに、野生型と変異型の核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力変化の大きさを比較することにより、野生型のホモザイゴート（homozygote）、野生型と変異型のヘテロザイゴート（heterozygote）、変異型のホモザイゴートを識別することができ、遺伝子型（genotype）を検出することができることが確認された。
実施例２：FactorVII遺伝子におけるＳＮＰ検出において、ペプチド核酸（Peptide Nucleotide Acid, PNA）を用いた場合
上記の実施例１において、遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体領域上に固定化される核酸プローブとして、ペプチド核酸（Peptide Nucleotide Acid, PNA）を用いると、より安定性の高い二本鎖核酸が形成される。
【００７１】
そこで、本実施例では、基本的な特徴は、上記実施例１の場合と略同様であるが、核酸プローブとしてペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いた。
【００７２】
その結果、野生型ホモザイゴート（homozygote）を含む試料の場合、野生型ＰＮＡプローブを固定化したトランジスタの出力は２３ｍＶ変化したのに対して、変異型ＰＮＡプローブを固定化したトランジスタの出力は４ｍＶの変化であった。また、野生型と変異型のヘテロザイゴート（heterozygote）試料の場合、野生型、変異型ＰＮＡプローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、それぞれ１５ｍＶ、１３ｍＶであり、野生型、変異型ともに検出することができた。
【００７３】
さらに、変異型のホモザイゴート試料の場合、野生型ＰＮＡプローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、２ｍＶとほとんど変化を示さなかったのに対して、変異型ＰＮＡプローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、１９ｍＶの変化であった。
【００７４】
以上のとおり、核酸プローブとしてＰＮＡを用いることにより、野生型ホモザイゴート、野生型と変異型との混合ヘテロザイゴート、変異型ホモザイゴートを識別することができ、目的遺伝子の遺伝子型（genotype）を検出することができることが確認された。
【００７５】
これは、ＰＮＡは、負電荷を有するオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡ等と異なり、電荷を有しておらず中性のため、核酸プローブと目的遺伝子との間の静電反発が無く、ゲート絶縁膜体上で、強固な二本鎖核酸を形成することができる。また、核酸プローブを形成した遺伝子検出用電界効果デバイスと核酸プローブを形成しない参照用の遺伝子検出用電界効果デバイスを用いて差動測定を行う場合、電荷が中性のＰＮＡを用いると遺伝子検出用と参照用の電界効果デバイスの間でフラットバンド電圧や閾値電圧の変化が無く、高精度の差動測定を行うことができ、特に電荷検出型の遺伝子検出用電界効果デバイスには有効であることを意味する。
【００７６】
そして、本実施例のように遺伝子検出電界効果トランジスタと伸長反応を利用するＳＮＰ検出およびジェノタイピング（genotyping）では、ゲート絶縁膜体上への試料導入、ハイブリダイゼーション、伸長反応の各プロセスの進行中、常時電位計測を行い反応の進行をモニタリングすることができる。
【００７７】
したがって、反応の完了を電位変化から検出することができ、効率的にＳＮＰ検出およびジェノタイピングを行うことができる。また、本実施例では伸長反応に伴う塩基の合成を電荷の増加量として検出するため、核酸プローブと試料核酸の塩基長および伸長合成される塩基長を最適化することにより高感度に核酸を検出することができる。
実施例３：アルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子のＳＮＰ検出
アルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子には、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することが知られている。そのＳＮＰ部位が、３’末端の塩基となるように核酸プローブを設計した。野生型はＳＮＰ部位の塩基がチミン（Ｔ）、変異型はシトシン（Ｃ）であり、それぞれに対応する核酸プローブの塩基配列を以下に示した。なお、本実施例における野生型核酸プローブは配列番号３に示し、変異型核酸プローブ配列番号４に示した。
野生型核酸プローブ：5'-CATACACTA-3'（配列番号３）
変異型核酸プローブ：5'-CATACACTG-3'（配列番号４）
なお、本実施例は、基本的な構成や実験手順は、上記実施例１および実施例２と略同様である。
【００７８】
本実施例は、たとえば、前記の図７に例示したとおり、（Ａ）に示した野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタおよび（Ｂ）に示した変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタを用いた。本実施例では、遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体には金属電極を形成させ、上記核酸プローブの５’末端をチオール基で修飾し、直接金属電極と結合を形成させることにより、核酸プローブをゲート絶縁膜体領域表面に固定化させた。本実施例において、金属電極として、クロム薄膜の上に金を積層した構造を用いた。
【００７９】
試料は、血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記ＳＮＰ部位を含む１００塩基長の領域を増幅した後、野生型または変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタに導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、緩衝液で洗浄して未反応の試料を除去した。
【００８０】
本実施例で用いた試料は、野生型の目的遺伝子のみを含む試料であったため、野生型核酸プローブと完全相補鎖結合により二本鎖が形成された。一方、変異型核酸プローブは、３’末端にＳＮＰが存在するため相補鎖結合されず、３’末端が開いた形で二本鎖を形成された。
【００８１】
次に、上記の実施例１および実施例２と同様に、タックＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）および基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合液を試料中に導入し、温度を６２℃に設定してゲート絶縁膜体上で伸長反応を行った。
【００８２】
そして、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、上記のとおり野生型目的遺伝子のみを含む試料の導入により、末端を含めて完全相補鎖の二本鎖を形成するので、伸長反応が促進され、出力が２８ｍＶの変化を示した。一方、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、３’末端の塩基が結合されず開いた形のため、伸長反応が起こらず、出力はほとんど変化しなかった（３ｍＶの変化）。
【００８３】
本実施例の特徴は、伸長反応の後、二本鎖の核酸と反応するインターカレーターを導入した点である。インターカレーターは、分子生物学実験において蛍光色素として一般に用いられている。多くのインターカレーター分子は、溶液中でイオン化し、正に帯電する。つまり、この出願の発明においてのインターカレーターは、色素としての性質ではなく、電荷としての性質を利用した。本実施例では、インターカレーターとして、Hoechst33258を用いた。
【００８４】
すなわち、ハイブリダイゼーション、それに続く伸長反応の後、野生型および変異型核酸プローブそれぞれが、固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力電位を測定し、Hoechst33258をゲート絶縁膜体上に導入して反応させた。
【００８５】
そして、たとえば、前記図８に例示したように、インターカレーターであるHoechst33258は、二本鎖核酸とのみ反応して、伸長反応により長く伸びた野生型トランジスタの二本鎖核酸とより多く反応し、大きな信号変化が得られた。
【００８６】
本実施例の場合では、Hoechst33258との反応後、野生型トランジスタの出力電位は２７ｍＶ変化し、変異型トランジスタの出力電位は６ｍＶであった。これにより、ＳＮＰ検出
および野生型／野生型のホモ、変異型／変異型のホモ、野生型／変異型のヘテロの３種類の試料を識別する遺伝子型の検出を行うことができる。
【００８７】
Hoechst33258等のインターカレーターを用いる方法の大きな特長は、上記のとおり、インターカレーターは正の電荷を有しているため、負に帯電している核酸のハイブリダイゼーションおよび伸長反応に基づく出力変化と反対の極性の信号を出力する点である。インターカレーターは二本鎖核酸とのみ反応するので、非特異的にゲート絶縁膜体上に吸着した一本鎖核酸とは反応せず、ハイブリダイゼーション・伸長反応に基づく信号と、非特異的に吸着した一本鎖核酸の信号を分離して、ハイブリダイゼーション・伸長反応に基づく信号のみを選択的に検出できる。これにより、高い信号／雑音比（Ｓ／Ｎ比）でＳＮＰおよび遺伝子型を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、高感度、かつ、高精度に遺伝子の検出解析が可能であり、しかも、遺伝子多型解析システムを従来よりも小型でコストをも抑えることのできる、遺伝子検出電界効果デバイスを用いた新しい遺伝子多型解析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】この出願の発明に用いる遺伝子検出電界効果デバイスの一実施形態を模式的に例示した断面図である。
【図２】図１の遺伝子検出電界効果デバイスの検出原理を概略的に例示したグラフ図である。
【図３】遺伝子検出電界効果デバイスによる遺伝子検出電界効果トランジスタの一例を模式的に示した断面図である。
【図４】図３の遺伝子検出電界効果トランジスタの検出原理を概略的に例示したグラフ図である。
【図５】遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果トランジスタにおいて、一塩基異なる核酸プローブが固定化されている状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は野生型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを、（Ｂ）は変異型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
【図６】図５の遺伝子検出電界効果トランジスタにおけるそれぞれの伸長反応の状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は野生型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを、（Ｂ）は変異型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
【図７】遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果デバイスにおいて、金属電極を介して核酸プローブを固定化させた状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は野生型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを、（Ｂ）は変異型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
【図８】図７において、インターカレーターを核酸プローブに反応させた状態を模式的に例示した断面図であり、（Ａ）は野生型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを、（Ｂ）は変異型核酸プローブが固定された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
【図９】遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果トランジスタにヒーターと温度センサを集積化した状態を模式的に例示した断面図である。
【図１０】遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果トランジスタをアレイ化した実施形態を模式的に例示した断面図である。
【図１１】この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスを用いた測定システムの全体構成を模式的に例示した概略図である。
【図１２】この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスを搭載するフローセルを模式的に例示した断面図である。
【図１３】この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスによる測定プロトコルの概略的に例示した説明図である。
【符号の説明】
【００９０】
１Ａ  遺伝子検出電界効果デバイス
１Ｂ、１Ｂ’  遺伝子検出電界効果トランジスタ
１Ｃ  遺伝子検出電界効果トランジスタアレイ
２  絶縁膜体
２０１  ゲート絶縁膜体領域
３  半導体基板
４  参照電極
５  核酸プローブ
５０１  野生型核酸プローブ
５０２  変異型核酸プローブ
５０３  固定化端部
５０４  非固定化端部
６  試料溶液
６０１  目的遺伝子
７  ゲート電極
８  電子
９  ソースｎ型領域
１０  ドレインｎ型領域
１１  ドレイン電極
１２  ドレイン電流計
１３  金属電極
１４  インターカレーター
１５  ヒーター
１６  温度センサ
１７  ｐウェル
１８  シリコン基板
１９  絶縁膜体
２０  熱伝導性物質
２１  開口部
２２  銅板
２３  ペルチエ素子
２４  フローセル
２５  流路
２６  試料
２７  試薬
２８  緩衝液
２９  洗浄液
３０  バルブ
３１  ポンプ
３２  分注器
３３  廃液ボトル
３４  参照電極
３５  ３Ｍ  ＫＣｌ溶液
３６  液−液接合
３７  信号処理回路
３８  プリント基板
３９  ワイヤー
４０  ピン
４１  保護キャップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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