(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型と１-メトキシ-５-フェナジンメチルサルフェートとの反応によりスーパーオキシドアニオンラジカルを生成し、
これに発光物質を加えて化学発光反応させた化学発光量と、生薬またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様物質を含有の生薬を加えることにより分解したスーパーオキシドアニオンラジカルに応じて減少する化学発光量とを比較して、生薬中にＳＯＤ様物質がどの程度存在するかを判定する生薬中のＳＯＤ様物質測定方法において、
一定の発光量を放出するアデノシン３リン酸とルシフェリン・ルシフェラーゼの生物発光反応を利用して生薬の色の影響を補正し、
色補正後の真の生薬による発光抑制率からＳＯＤ相当濃度を求め、
そのＳＯＤ相当濃度と生薬濃度との関係から、生薬中のＳＯＤ様物質含有量を定量することを特徴とする生薬中のＳＯＤ様物質測定方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型の濃度を２．４×１０-5ｍｏｌ／Ｌとし、１-メトキシ-５-フェナジンメチルサルフェートの濃度を６．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌとしたことを特徴とする生薬中のＳＯＤ様物質測定方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記発光物質をルミノールとし、その濃度を５×１０-4ｍｏｌ／Ｌとしたことを特徴とする生薬中のＳＯＤ様物質測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生薬中に活性酸素の活動を抑制するのに重要な役割を果しているスーパーオキシドジスムターゼ（以下ＳＯＤと略称する）様物質が含有しているかどうかを簡便に精度良く測定する、生薬中のＳＯＤ様物質測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＳＯＤは体内で作られる酵素の一種で、成人病や現代病及び老化の原因となる活性酸素の活動を抑制するのに重要な役割を果していると言われている。
【０００３】
活性酸素は呼吸によって生まれ、体内に有害な物質が入ったときにそれを撃退する働きをしている。しかし、この活性酸素が多すぎると血管や筋肉を刺激して破壊して行く物質としても知られている。
【０００４】
生薬は天然物そのままか、または加工した後、薬物として応用したもので、ＳＯＤ様物質（ＳＯＤと同等の役割を果す物質）を含有している可能性がある。
【０００５】
現在、活性酸素と呼ばれているものは、（１）三重項状態の酸素（大気中の酸素、3Ｏ2）が１電子還元を受けて生じるＯ2-・（スーパーオキシドアニオンラジカル）、（２）3Ｏ2が２電子還元を受けて生じるＯ22-（過酸化イオン、水中では２Ｈ+を得てＨ2Ｏ2となる）、（３）Ｈ2Ｏ2のＯ−Ｏ結合が１電子還元を受けて生じる・ＯＨ（ヒドロキシラジカル）及び（４）3Ｏ2が何らかの方法または反応により励起されて生じる1Ｏ2の４種の反応性の高い酸素の分子種である。
【０００６】
これら４種の分子種の中でＯ2-・は、以下の反応式に示すように、ＳＯＤによって分解し、その分解量はＳＯＤ濃度に依存することが知られている。
【０００７】
0004006850.tif 000002
Ｏ2-・の測定法は、（１）チトクロームＣの還元法、（２）ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元法、（３）テトラニトロメタン（ＴＮＭ）の還元法、（４）エピネフリンの酸化法、（５）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ−ＮＡＤＨ）法、（６）ラクトペルオキシダーゼ法などで、これらの測定法はいずれも検出手段として、３４０〜５８８ｎｍに表れる吸収ピークの増加又は減少を吸光度により測定する方法である。また、最近になって検出手段として化学発光法を用いた方法が報告されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
生薬にはいろいろな有益成分が含有されており、その中にＳＯＤ様物質が含有されている可能性がある。しかし、今まで生薬中にＳＯＤ様物質が含有されているかどうかを簡便に、精度良く測定する方法が知られていなかった。
【０００９】
また、生薬中のＳＯＤ様物質を光学的に定量する方法において、特に高感度にＳＯＤを定量するために、検出手段として化学発光法を用いた時、生薬は着色しているものが多いために、その色の影響により正確にＳＯＤ様物質の定量ができない問題点があった。
【００１０】
さらに、生薬の中に存在するＳＯＤ様物質の量を定量的に評価する方法が知られていなかった。
【００１１】
この発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、生薬中に含有されているＳＯＤ様物質を高精度に定量することができる生薬中のＳＯＤ様物質測定方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明の生薬中のＳＯＤ様物質測定方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型と１-メトキシ-５-フェナジンメチルサルフェートとの反応によりスーパーオキシドアニオンラジカルを生成し、これに発光物質を加えて化学発光反応させた化学発光量と、生薬またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様物質含有の生薬を加えることにより分解したスーパーオキシドアニオンラジカルに応じて減少する化学発光量とを比較して、生薬中にＳＯＤ様物質がどの程度存在するかを判定する生薬中のＳＯＤ様物質測定方法において、
一定の発光量を放出するアデノシン３リン酸とルシフェリン・ルシフェラーゼの生物発光反応を利用して生薬の色の影響を補正し、色補正後の真の生薬による発光抑制率からＳＯＤ相当濃度を求め、そのＳＯＤ相当濃度と生薬濃度との関係から、生薬中のＳＯＤ様物質含有量を定量するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］が電子伝達体である１-メトキシ-５-フェナジンメチルサルフェート［１-ＭＰＭＳ］と反応して生成する１-ＭＰＭＳＨ2が、溶存酸素と反応してスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2-・）と過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を生成することが知られている。
生薬の測定は上記反応を利用して行う。
【００１６】
以下にこの発明の実施の形態について説明する。
【００１７】
１）反応時間
生薬の測定は反応式（２）に従って行う。
生薬＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋１-ＭＰＭＳ＋ルミノール→光  ……（２）
実験を開始するにあたって、反応式（２）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳの反応時間が生薬の測定感度に大きく影響するので、まずＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳの最適反応時間について検討した。
【００１８】
最適反応時間を求めるために行った実験は、生薬の影響を考慮するために、生薬を含まない緩衝液を用いて、反応式（３）に従って行った。
緩衝液＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋１-ＭＰＭＳ＋ルミノール→光  ……（３）
測定は、緩衝液にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１-ＭＰＭＳ及びルミノールを添加後、０秒、３０秒、６０秒、１８０秒、３００秒の反応を行った後、３０秒間の発光量を計測して評価した。
各試薬の濃度と液量及び発光計測時間等の実験条件は表１のとおりである。
【００１９】
【表１】
0004006850.tif 000003
【００２０】
図１は、種々の反応時間による発光量を示したものである。
反応時間が増加するにつれて発光量は徐々に減少する傾向であった。発光量が低いと測定範囲が狭くなるため、発光量はできるだけ大きい方が望ましい。従って、図１の結果から、反応時間は試薬混合直後に測定した方が良いことがわかった。
【００２１】
さらに電子伝達体である１-ＭＰＭＳが反応の律速になると考えられるので、緩衝液にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びルミノールを添加後、最後に１-ＭＰＭＳを添加して実験を行った。
【００２２】
２）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最適濃度
上記反応式（２）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度は生薬の測定感度に大きく影響すると考えられるので、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最適濃度について検討した。
【００２３】
最適濃度を求めるために行った実験も、生薬の影響を考慮するために、生薬を含まない緩衝液を用いて、反応式（３）に従って行った。
【００２４】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの最適濃度を求めるために行った時の各試薬の濃度、液量及び発光計測時間等の実験条件は表２のとおりである。
【００２５】
【表２】
0004006850.tif 000004
【００２６】
図２は、種々の濃度のＮＡＤ（Ｐ）Ｈと発光量の関係を示したものである。  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度の増加に伴って発光量は増加し、２．４×１０-3ｍｏｌ／Ｌでほぼ最大発光量に到達した。
【００２７】
発光量が低いと測定範囲が狭くなるため、発光量はできるだけ大きい方が望ましい。従って、図２の結果から、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度は最大発光量を与える２．４×１０-3ｍｏｌ／Ｌの濃度が最適値であることがわかった。
【００２８】
３）１-ＭＰＭＳの最適濃度
上記反応式（２）の１-ＭＰＭＳの濃度は生薬の測定感度に大きく影響すると考えられるので、１-ＭＰＭＳの最適濃度について検討した。
【００２９】
最適濃度を求めるために行った実験も、生薬の影響を考慮するために、生薬を含まない緩衝液を用いて、反応式（３）に従って行った。
【００３０】
１-ＭＰＭＳの最適濃度を求めるために行った時の各試薬の濃度、液量及び発光計測時間等の実験条件は表３のとおりである。
【００３１】
【表３】
0004006850.tif 000005
【００３２】
図３は、種々の濃度の１-ＭＰＭＳと発光量の関係を示したものである。
１-ＭＰＭＳ濃度の増加に伴って発光量は増加し、６．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌでほぼ最大発光量に到達し、徐々に減少する傾向を示した。
【００３３】
発光量が低いと測定範囲が狭くなるため、発光量はできるだけ大きい方が望ましい。従って、図３の結果から、１-ＭＰＭＳ濃度は最大発光量を与える６．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌの濃度が最適値であることがわかった。
【００３４】
４）ＳＯＤ様物質の評価方法
生薬中に含まれるＳＯＤ様物質の効果を評価するために、Ｏ2-・の分解に及ぼすＳＯＤ依存性について検討した。
Ｏ2-・の分解に及ぼすＳＯＤ依存性についての実験は、以下の反応式（４）に従って行った。
【００３５】
この実験においてもＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳの反応により発生するＯ2-・の分解による影響を最小限に抑えるために、各濃度に調製したＳＯＤ溶液にＮＡＤ（Ｐ）Ｈとルミノールを加えておき、これに１-ＭＰＭＳを最後に添加して、１-ＭＰＭＳを添加した直後から３０秒間の発光量を計測するようにした。
【００３６】
ＳＯＤ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋１-ＭＰＭＳ＋ルミノール→光  ……（４）
各試薬の濃度と液量及び発光計測時間は表４のとおりである。
【００３７】
【表４】
0004006850.tif 000006
【００３８】
図４は、種々の濃度のＳＯＤの発光量の関係を示したものである。
ＳＯＤ濃度の増加に伴い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳにより発生するＯ2-・の分解量が多くなり、その結果ルミノールの酸化が弱まり、発光量が減少することを示している。
【００３９】
図５は、ＳＯＤを含まないリン酸緩衝液のみの発光量を発光抑制率０％として、種々の濃度のＳＯＤを添加したときに得られた発光量から発光抑制率を計算し、プロットしたものである。
【００４０】
上記条件において、Ｏ2-・はＳＯＤ濃度が１×１０-4ｇ／ｍＬの時、ほぼ１００％分解することを示している。
【００４１】
［色補正］
生薬は着色しているものが多いため、生薬中のＳＯＤ様物質を化学発光量の減少量から測定しようとした場合、化学発光量の減少が生薬中に含まれるＳＯＤ様物質によるものか、色の影響によるものかの判定ができない。そのため色の影響を補正する必要がある。
【００４２】
アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）はルシフェリン、ルシフェラーゼと反応して一定量持続して発光することが知られている。（少なくとも３０秒間は安定）また、この発光反応はＯ2-・による発光阻害を受けないことから、以下の反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めた。
【００４３】
生薬＋ＡＴＰ＋ルシフェリン＋ルシフェラーゼ→光  ……（５）
実施例１  生薬（アセンヤク）の測定
アセンヤクの測定は反応式（２）に従って行った。
実際の測定では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳにより発生するＯ2-・の分解による影響を最小限に抑えるために、アセンヤクにＮＡＤ（Ｐ）Ｈとルミノールを加えておき、これに１-ＭＰＭＳを最後に添加して、１-ＭＰＭＳを添加した直後から３０秒間の発光量を計測するようにした。
アセンヤク濃度、各試薬の濃度、液量及び発光計測時間は表５のとおりである。
【００４４】
【表５】
0004006850.tif 000007
【００４５】
また、色の影響の補正は、上記反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めた。
【００４６】
図６は、アセンヤクの濃度に対する色の影響度合を示したものである。
図７は、色の影響を補正した後のアセンヤクの濃度に対する発光抑制効果を示したものである。
図８は、図７のアセンヤクの発光抑制率と図５のＳＯＤの発光抑制率を比較して、アセンヤク中に含まれるＳＯＤ様物質のＳＯＤ相当濃度を読み取り、アセンヤク濃度とＳＯＤ相当濃度の関係を示したものである。
【００４７】
図８は、アセンヤク濃度とＳＯＤ相当濃度が直線関係にあることを示していることから、アセンヤクによる発光抑制はアセンヤク中に含まれるＳＯＤ様物質によるものであることを示している。
また、その傾きが大きい程、生薬中に含まれるＳＯＤ様物質が多いことを示している。
【００４８】
従って、種々の生薬について同様の測定を行い、傾きを求めることにより、生薬中のＳＯＤ様物質の定量が可能となる。
【００４９】
実施例２  生薬（オウゴン）の測定
オウゴンの測定は、上記反応式（２）に従って行い、各試薬の濃度、液量及び発光計測時間は上記表５に示す条件で行った。
また、色の影響の補正は、上記反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めて行った。
【００５０】
図９は、オウゴンの濃度に対する色の影響度合を示したものである。
図１０は、色の影響を補正した後のオウゴンの濃度に対する発光抑制効果を示したものである。
図１１は、図１０のオウゴンの発光抑制率と図５のＳＯＤの発光抑制率を比較して、オウゴン中に含まれるＳＯＤ様物質のＳＯＤ相当濃度を読み取り、オウゴン濃度とＳＯＤ相当濃度の関係を示したものである。
【００５１】
図１１はオウゴン濃度とＳＯＤ相当濃度が直線関係にあることを示していることから、オウゴンによる発光抑制はオウゴン中に含まれるＳＯＤ様物質によるものであることを示している。
また、その傾きが大きい程、生薬中に含まれるＳＯＤ様物質が多いことを示している。
【００５２】
従って、種々の生薬について同様の測定を行い、傾きを求めることにより、生薬中のＳＯＤ様物質の定量が可能となる。
【００５３】
実施例３  生薬（カンゾウ）の測定
カンゾウの測定は、上記反応式（２）に従って行い、各試薬の濃度、液量及び発光計測時間は上記表５に示す条件で行った。
また、色の影響の補正は、上記反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めて行った。
【００５４】
図１２は、カンゾウの濃度に対する色の影響度合を示したものである。
図１３は、色の影響を補正した後のカンゾウの濃度に対する発光抑制効果を示したものである。
図１４は、図１３のカンゾウの発光抑制率と図５のＳＯＤの発光抑制率を比較して、カンゾウ中に含まれるＳＯＤ様物質のＳＯＤ相当濃度を読み取り、カンゾウ濃度とＳＯＤ相当濃度の関係を示したものである。
【００５５】
図１４は、カンゾウ濃度とＳＯＤ相当濃度が直線関係にあることを示していることから、カンゾウによる発光抑制はカンゾウ中に含まれるＳＯＤ様物質によるものであることを示している。
また、その傾きが大きい程、生薬中に含まれるＳＯＤ様物質が多いことを示している。
【００５６】
従って、種々の生薬について同様の測定を行い、傾きを求めることにより、生薬中のＳＯＤ様物質の定量が可能となる。
【００５７】
実施例４  生薬（ケイヒ）の測定
ケイヒの測定は、上記反応式（２）に従って行い、各試薬の濃度、液量及び発光計測時間は上記表５に示す条件で行った。
また、色の影響の補正は、上記反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めて行った。
【００５８】
図１５は、ケイヒの濃度に対する色の影響度合を示したものである。
図１６は、色の影響を補正した後のケイヒの濃度に対する発光抑制効果を示したものである。
図１７は、図１６のケイヒの発光抑制率と図５のＳＯＤの発光抑制率を比較して、ケイヒ中に含まれるＳＯＤ様物質のＳＯＤ相当濃度を読み取り、ケイヒ濃度とＳＯＤ相当濃度の関係を示したものである。
【００５９】
図１７は、ケイヒ濃度とＳＯＤ相当濃度が直線関係にあることを示していることから、ケイヒによる発光抑制はケイヒ中に含まれるＳＯＤ様物質によるものであることを示している。
また、その傾きが大きい程、生薬中に含まれるＳＯＤ様物質量が多いことを示している。
【００６０】
従って、種々の生薬について同様の測定を行い、傾きを求めることにより、生薬中のＳＯＤ様物質の定量が可能となる。
【００６１】
実施例５  生薬（セネガ）の測定
セネガの測定は、上記反応式（２）に従って行い、各試薬の濃度、液量及び発光計測時間は上記表５に示す条件で行った。
また、色の影響の補正は、上記反応式（５）に従って発光量を測定し色のみによる発光阻害率を求めて行った。
【００６２】
図１８はセネガの濃度に対する色の影響度合を示したものである。
図１９は色の影響を補正した後のセネガの濃度に対する発光抑制効果を示したものである。
図２０は、図１９のセネガの発光抑制率と図５のＳＯＤの発光抑制率を比較して、セネガ中に含まれるＳＯＤ様物質のＳＯＤ相当濃度を読み取り、セネガ濃度とＳＯＤ相当濃度の関係を示したものである。
【００６３】
図２０はセネガ濃度とＳＯＤ相当濃度が直線関係にあることを示していることから、セネガによる発光抑制はセネガ中に含まれるＳＯＤ様物質によるものであることを示している。
また、その傾きが大きい程、生薬中に含まれるＳＯＤ様物質量が多いことを示している。
【００６４】
従って、種々の生薬について同様の測定を行い、傾きを求めることにより、生薬中のＳＯＤ様物質の定量が可能となる。
【００６５】
上記実施例１〜実施例５において、実施例１の図８、実施例２の図１１、実施例３の図１４、実施例４の図１７及び実施例５の図２０に示される生薬濃度とＳＯＤ相当濃度との直線関係の傾きから、生薬中のＳＯＤ様物質の含有量は表６の順番であることが容易に判定できる。
【００６６】
【表６】
0004006850.tif 000008
【００６７】
【発明の効果】
この発明は、上述のとおり構成されているので、以下に記載する効果を奏する。
（１）生薬中のＳＯＤ様物質を精度良く、簡便に定量分析することができる。
（２）生薬濃度とＳＯＤ相当濃度との直線関係の傾きから、ＳＯＤ様物質の含有量が多い生薬を容易に検出することができる。
（３）各生薬の濃度とＳＯＤ相当濃度との直線関係の傾きから各生薬のＳＯＤ様物質の含有量の順番が容易に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施の形態にかかるＮＡＤ（Ｐ）Ｈと１-ＭＰＭＳの反応時間を示すグラフ。
【図２】実施の形態にかかるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図３】実施の形態にかかる１-ＭＰＭＳ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図４】実施の形態にかかるＳＯＤ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図５】実施の形態にかかるＳＯＤ濃度による発光抑制効果を示すグラフ。
【図６】実施例１にかかるアセンヤク濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図７】実施例１にかかる色補正後のアセンヤクによる発光抑制効果を示すグラフ。
【図８】実施例１にかかるアセンヤク濃度とＳＯＤ濃度との関係を示すグラフ。
【図９】実施例２にかかるオウゴン濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図１０】実施例２にかかる色補正後のオウゴンによる発光抑制効果を示すグラフ。
【図１１】実施例２にかかるオウゴン濃度とＳＯＤ濃度との関係を示すグラフ。
【図１２】実施例３にかかるカンゾウ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図１３】実施例３にかかる色補正後のカンゾウによる発光抑制効果を示すグラフ。
【図１４】実施例３にかかるカンゾウ濃度とＳＯＤ濃度との関係を示すグラフ。
【図１５】実施例４にかかるケイヒ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図１６】実施例４にかかる色補正後のケイヒによる発光抑制効果を示すグラフ。
【図１７】実施例４にかかるケイヒ濃度とＳＯＤ濃度との関係を示すグラフ。
【図１８】実施例５にかかるセネガ濃度と発光量との関係を示すグラフ。
【図１９】実施例５にかかる色補正後のセネガによる発光抑制効果を示すグラフ。
【図２０】実施例５にかかるセネガ濃度とＳＯＤ濃度との関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004006850.tif 000011
【図４】
0004006850.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0004006850.tif 000023
【図１６】
0004006850.tif 000024
【図１７】
0004006850.tif 000025
【図１８】
0004006850.tif 000026
【図１９】
0004006850.tif 000027
【図２０】
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