(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板上面部に設けた複数の穴を有し、該穴は前記基板表面からの深さ、または前記基板表面での直径を異にして容積の異なる少なくとも二つのものとされた細胞培養部と、該細胞培養部の上面を覆う半透膜と、該半透膜上部に設けた前記細胞培養部を覆う培養液交換部を有する細胞培養容器とを備え、前記細胞培養容器への細胞培養液の供給手段と、前記細胞培養部内の前記穴に収納された細胞を長期観察することのできる顕微光学手段と、を具備して、前記細胞培養部の前記穴の細胞濃度に応じた細胞の反応を観察できることを特徴とする一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項２】
前記基板上面部に設けられた複数の穴を連通するとともに前記穴に収納された細胞が通過できる大きさとされた流路が前記基板上面部に付加された請求項１記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項３】
前記細胞培養部の穴の径は１マイクロメートル以上，１ｍｍ以下、深さは１００マイクロメートル以下であることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項４】
前記細胞培養容器は光学的に透明な材質でできていることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項５】
前記半透膜は、アビジンおよびビオチンを用いた結合によって基板の上面に固定されていることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項６】
前記半透膜は分子量１００００以上、０．２マイクロメートル以下のポアサイズの光学的に透明な半透膜であることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項７】
前記細胞培養容器には廃液排出手段が具備されており、前記培養液の供給手段より培養液交換部に供給される培養液が半透膜を介して細胞培養部穴内の廃液と交換され、廃液が廃液排出手段により排出されるようにしたことを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項８】
前記細胞培養容器には容器内に残留した気体を排出するための弁が配設されていることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項９】
前記培養液の温度を制御するための手段が具備されていることを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１０】
前記細胞培養部の穴に収納された細胞の一つを捕捉し、前記流路を通して前記細胞培養部の他の穴に移動させる手段を具備することを特徴とする請求項２の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１１】
前記細胞培養部の穴に収納された細胞の一つを捕捉し、前記流路を通して前記細胞培養部の他の穴に移動させる手段が光ピンセット手段であることを特徴とする請求項１０の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１２】
前記細胞培養部の穴に収納された細胞の一つを捕捉し、前記流路を通して前記細胞培養部の他の穴に移動させる手段が超音波を用いる手段であることを特徴とする請求項１０の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１３】
前記細胞培養部の穴に収納された細胞の一つを捕捉し、前記流路を通して前記細胞培養部の他の穴に移動させる手段が電場を用いる手段であることを特徴とする請求項１０の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１４】
前記細胞培養部の穴に試薬を散布し、試薬を回収するピペットを具備することを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１５】
前記顕微光学手段の光路上にフィルターを入れることにより、細胞を蛍光観察できるようにしたことを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１６】
画像データを取得する手段と、前記画像データにより前記細胞培養部の穴に収納された特定の細胞の形状を認識する手段と、前記特定の細胞を視野の中央に維持するためにステージの位置、対物レンズの焦点深さを制御する手段と、を有することを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１７】
前記細胞培養部の穴の中の細胞数を計測する手段を有することを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【請求項１８】
前記細胞培養部の穴の中に半透膜を貫通して導入でき、前記穴内部の特定の細胞を回収したり、あるいは、試薬や封入材を注入するピペットを具備することを特徴とする請求項１または２記載の一細胞長期培養顕微観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は一細胞長期培養顕微観察装置に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微生物や細胞を用いたバイオテクノロジーの研究分野において、特定の細胞の状態を顕微鏡観察しながら、１細胞単位で培養することのできる、細胞の長期培養顕微観察装置とこれを用いた方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の生物学、医学、薬学の分野では、細胞の状態の変化、あるいは細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。しかしながら、実際には細胞の集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。これらの問題を解決するべく、同調培養の手法が開発されているが、培養された細胞の由来が全く同一の一細胞からではないことから、培養前の由来細胞各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、実際に刺激に対する応答の結果を解析するときに、そのゆらぎが細胞反応機構自体が普遍的に持つ応答ゆらぎに由来するものなのか、細胞の違い（すなわち遺伝情報の違い）に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。また、同様の理由から細胞株についても、一般には完全に一細胞から培養したものではないため、刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは難しかった。さらにまた、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触によるものの２種類がある。従来、バイオテクノロジーの研究分野において細胞の観察を行う場合は、大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出して顕微鏡にセットし、観察を行っていた。あるいは、顕微鏡全体をプラスチックの容器で囲い温度を管理し、その中に小さい別の容器を用い二酸化炭素濃度、及び湿度を管理しつつ、顕微鏡観察を行っていた。このとき、細胞を培養しながら、古くなった培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定にする方法として多数の提案がなされている。たとえば特開平１０−１９１９６１に開示されている方法では、循環ポンプが、基材表面に対する培地のレベルを基材の上端縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルとの間で上げ・下げ操作し、上記低レベルに下がると培地を供給し、上記高レベルに上がると培地を排出する機構によって栄養状態を一定に保っている。また、特開平８−１７２９５６では、培養容器内に、新たな培地を培養容器に導入する導入管と、培養容器の培地を外部に排出する排出管と、培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管の各一端を挿入し、前記導入管、排出管及び気管の夫々の管路に培養容器内への菌の侵入を阻止するフィルターを設けており、培養槽の栄養状態を一定に保つ構成になっている。
【０００３】
しかし、これらの提案にもかかわらず、培養細胞の溶液環境と、細胞間の物理的接触を制御しながら培養する方法は知られていない。また、培養する場合、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術は知られていない。そして、細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術も知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことから明らかなように、従来の技術では、細胞の培養を行う場合、細胞群から培養を開始するため、完全に同一の遺伝子を持つ細胞株ではなかった。また、従来の技術では、培養を行うときに特定の細胞同士を選別し、その相互作用あるいは濃度を制御しながら培養を行うことは難しかった。さらに、従来の技術では培養槽の培養液を交換することで溶液環境を一定に保つ工夫をしていたが、培養槽内で培養中の特定の細胞の環境を速やかに変化させ、その応答を観察することは難しかった。
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点を解消し、特定の一細胞に由来する細胞群を培養することや、細胞を培養する過程で相互作用させる細胞を特定しながら培養観察すること、細胞濃度を一定にしたまま細胞を培養している細胞群の中の特定の細胞のみにシグナル物質等の薬剤などの細胞と相互作用する物質を散布し、その細胞と他の細胞との変化の違いを観察すること等を可能とする新しい技術手段を提供することを課題としている。また、この出願の発明は、特定の状態にある細胞のみを回収し、その細胞の遺伝子、発現ｍＲＮＡ等の解析、あるいは生化学的測定を行うことを可能とする新しい手段を提供することを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、基板と、該基板上面部に設けた複数の穴を有し、該穴は前記基板表面からの深さ、または前記基板表面での直径を異にして容積の異なる少なくとも二つのものとされた細胞培養部と、該細胞培養部の上面を覆う半透膜と、該半透膜上部に設けた前記細胞培養部を覆う培養液交換部を有する細胞培養容器とを備え、前記細胞培養容器への細胞培養液の供給手段と、前記細胞培養部内の前記穴に収納された細胞を長期観察することのできる顕微光学手段と、を具備して、前記細胞培養部の前記穴の細胞濃度に応じた細胞の反応を観察できることを特徴とする一細胞長期培養顕微観察装置を提供する。
【０００７】
そして、上記の装置について、この出願の発明はさらに具体的な特徴のある形態についても提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
【００１１】
まず、明確にしておかねばならないことは、この出願の発明において規定されている「一細胞」との表現は、一細胞のみを取扱うということに限定されてはいない。細胞培養部の穴においては複数個体の細胞が培養されてよいのであって、この出願の発明が特徴としていることは、このような複数個の培養であっても、単一の特定の細胞の培養経緯等を制御し、かつ観察することを可能としていることにある。「一細胞」との規定はこのことを意味している。
【００１２】
また、「長期」との規定いついても、絶対的基準として理解されるものでなく、個々の細胞の種類に応じた相対的な規定であって、しかも、従来の方法に比べてより長期での培養経緯等の制御と観察が可能とされていることとして理解されるべきである。
【００１３】
この出願の発明においては、以上のことが前提とされている。
図１は、この出願の発明の長期培養顕微鏡観察装置の基本構成の一例を示したものである。この図１に沿って説明すると、この出願の発明の長期培養観察装置は、微生物や細胞を培養し、その培養液を交換できるようにした培養容器１０５を備えている。そして、この培養容器１０５内に送られる培養液の成分や温度、雰囲気、気体の種類、濃度等を調節しながら培養液を提供する培養液の供給・廃棄系と、培養容器１０５内の細胞を経時的に観察し、ビデオやパソコン等に記録する顕微観察光学系を備えている。
【００１４】
より具体的に例示説明すると、細胞が培養される培養容器１０５には、容器内に残留した空気等の気体を排出するための気体排出弁１０４が設けられており、培養容器１０５が培養液で満たされる構造になっている。培養容器１０５の底面の大きさは顕微観察に適した大きさである。また、この培養容器１０５は、ステージ１０７の上に乗っている。
【００１５】
培養液供給・廃棄部について説明すると、培養容器１０５に複数の種類や、濃度の異なる培養液を供給する機能を有する培養液供給装置１２１から供給された培養液はまずヒーター１２２により液温調節され、チューブにより導かれて溶存気体交換装置１２３により空気等の溶存気体の成分が調整される。次いでポンプ１２４により流速を調節され、チューブ１２５を介して培養容器１０５に送られる。
【００１６】
培養容器１０５には、もう一つのチューブ１２６が配置されており、培養容器１０５内の溶液はチューブ１２６を通り廃液溜め１２８にポンプ１２７の吸引により送られる。ここで、ポンプ１２４とポンプ１２７は、観察するときには同じ流速で培養容器１０５の培養液の供給と排出を行うが、気体排出弁１０４が閉じた状態では、ポンプ１２４とポンプ１２７のいずれか一方を省略することができる。廃液溜め１２８にはヒーターが取り付けられて培養液の温度を調節できるようにし、ポンプによりチューブを通して培養液溜めに空気等を送ることにより、培養液中の空気を飽和した状態にすることもできる。
【００１７】
廃液溜め１２８には培養液溜めをチューブにより連結し、弁を開閉することによって培養液を培養液供給装置１２１等の供給装置に循環させることもできる。この場合、チューブの途中にフィルターを配設して廃液中の余分な成分を除去するようにしてもよい。
【００１８】
図１に示された基本構成での光学系では、上下二方向より試料を照射することができるようにしている。上部の光源１０１より照射された光は、フィルター１０２により特定の波長に調整されコンデンサレンズ１０３によって集光されて、培養容器１０５に照射される。照射された光は、透過光として対物レンズ１３１での観察に用いられる。培養容器１０５内部の透過光像は、ミラー１１３によってカメラ１１５に誘導され、カメラの受光面に結像する。従って、培養容器１０５および培養容器底面で実際に細胞を培養する細胞培養部基板１０６の素材は、光学的に透明な素材であることが望ましい。具体的には、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、あるいはシリコン基板等の固体基板を用いる。また、特にシリコン基板を用いる場合は波長９００ｎｍ以上の波長の光を観測に用いる。下部の光源１１０より照射された光はフィルター１１１により波長選択された後に、ダイクロイックミラー１１２によって対物レンズ１３１に誘導されている。培養容器１０５内部の蛍光観察の励起光として用いられる。培養容器１０５から発した蛍光は再度対物レンズ１３１によって観測され、フィルター１１４によって励起光をカットした後の蛍光と透過光のみをカメラ１１５で観察することができる。このとき、フィルター１０２、１１１、１１４の組み合わせを調整することで、透過光のみをカメラ１１５で観察したり、あるいは蛍光のみを観察したり、透過光像と蛍光像を同時に観察することもできる。光路内には、レーザー光源１０８で発生させたレーザー光を可動ダイクロイックミラー１０９によって対物レンズ１３１に導入する機構も備わっている。このレーザーを光ピンセットとして用いる場合には、可動ダイクロイックミラーを移動させることで、培養容器１０５内でのレーザーの集束位置を動かすことが可能である。また、カメラで得られた画像データは画像処理解析装置１１６によって解析され、その他培養容器１０５に付属した温度計測器の温度を観測した結果などさまざまな解析結果を基に可動ダイクロイックミラー１０９や、培養容器１０５が載っている温調機能付ステージの位置を制御するためにＸ−Ｙ−Ｚ方向に自在に移動させるステージ移動用モーター１３２を駆動することができる。これによって細胞の形状を認識したり、認識後にその細胞を追跡し、つねに画像の中心に位置させたり、対物レンズとの距離を調節することで画像のピントを特定の細胞に合わせたりすることが可能である。あるいは、一定時間の周期で可動ダイクロイックミラー１０９や、培養容器１０５が載っている温調機能付ステージ１０７を制御したり、一定間隔ででステージ移動用モーター１３２を駆動することが出来る。
【００１９】
図２は、図１に例示した培養容器の配置を例示したものであり。図３および図５は、この図２のＡ−Ａ断面を例示したものである。
この図２に示した培養容器２０２には、前記と同様に、気体排出弁２０１、培養液供給のためのチューブ２０３と廃液の排出のためのチューブ２０４が設けられて、また培養容器２０２の底部には、図１における細胞培養部基板１０６と同じ、細胞培養部基板２０５が配設されている。
【００２０】
培養容器２０２については、たとえばガラス製とすることができるが、ガラス以外にも、ポリプロピレン、ポリスチレン等の樹脂製であって、光学的に透明な各種の容器を用いることができる。
【００２１】
また、シリコン基板等の固体基板を用いて波長９００ｎｍ以上の近赤外光で観察することもできる。
図３の断面図は、細胞培養のためのこの出願の発明の培養容器とこれに備えられた構成について例示している。
【００２２】
前記図１の培養液供給装置１２１から送液された培養液は、図３のチューブ３０２を介して培養容器３０１の液交換部３０１Ａに溜められる。そして、この液交換部３０１Ａに溜められた新鮮な培養液は、細胞培養部３０６内の古くなった培養液と半透膜３０４を介して交換される。
【００２３】
細胞培養部３０６は、基板３０５に設けた複数の穴によって構成されている。この穴の上面には半透膜３０４がシールされている。従って穴３０６内に封入された細胞は、この穴から出ることができず、また培養液部からバクテリア等の雑菌が入らないような構造になっている。
【００２４】
この穴の大きさは、細胞１個の大きさよりも大きいことが必要である。従って、細胞を培養する場合は、細胞の大きさにもよるが、一般にその大きさはたとえば、その開口径が３ｍｍ以下で、深さが３００μｍ以下とすることができる。より好ましくは、この出願の発明の所期目的の効果的な達成のためには、開口径が１μｍ〜１ｍｍの範囲、さらに好ましくは１０μｍ〜５０μｍの範囲にあるものとし、深さが１００μｍ以下とする。また、これらの開口径と深さは培養する細胞の大きさ、種類によって適宜に調節される。
【００２５】
また培養容器３０１の液交換部３０１Ａの高さについても、培養液の拡散を考えると、穴の深さよりｈが大きいことが望ましい。
そしてまた細胞培養部基板の厚みは、１００倍の対物レンズを用いて顕微観察、光トラップを行う場合には、開口数の高い対物レンズを用いることから、肉厚の薄い基板を用いる必要がある。たとえば基板がホウ珪酸ガラスである場合、０．３ｍｍ以下の厚さの基板を用いる必要がある。
【００２６】
細胞培養部３０６を構成する穴は、前記のとおり複数あってよく、この穴の中で、目的とする細胞が培養されることになる。
培養液の廃液は、液交換部３０１Ａよりチューブ３０３により抜き出されることになる。細胞培養部３０６の穴は、その深さが非常に浅いので、培養液の交換は速やかに行われ、チューブ３０３より古い培養液が排出されることになる。
【００２７】
半透膜３０４については、細胞が通りぬけられず、外界のバクテリア等が入らない程度の大きさの微細孔を持つものとする。この出願の発明においては、より具体的には、半透膜は、分子量ＭＷ１００００以上で、０．２μｍ以下のポアサイズの光学的に透明なものであることが好ましい。
【００２８】
半透膜３０４は、上記のように、細胞が通りぬけられない程度のポアサイズを有していることから、培養容器３０１の液交換部が３０１Ａから雑菌が入ってくることも、細胞培養部３０６の穴から細胞が液交換部３０１Ａに流れ出してしまうこともない。
【００２９】
基板３０５と培養容器３０１とは、たとえば図３に例示したように、シリコンシール等の接着シール３０７によって密着させる。これによって、液交換部３０１Ａから培養液が漏れ出ることが防止される。そして、細胞培養部３０６の穴の上部以外では、基板３０５に対して、半透膜３０４が密着シールされて隙間がないようにする。これは、細胞培養部３０６が複数の穴によって構成される場合、一つの穴と別の穴の間で細胞が移動することができないようにするためである。
【００３０】
このような基板３０５と半透膜３０４との密着のための手段としては、たとえばアビジンとビオチンとの結合を利用した方法が有効である。図４はこの結合を例示した概要断面図である。半透膜４０１としてセルロース膜を、細胞培養部の基板４０２にガラスを用いた場合、半透膜４０１と基板４０２との間では、半透膜４０１の−ＯＨ基を部分的に−ＣＨＯ基に変換し、これをアミノ基が修飾されたビオチンと−（ＣＯ）−ＮＨ−結合させる。このようにして半透膜４０１表面にビオチン４０４が修飾される。他方、ガラス基板４０２表面にシランカップリング剤によりアミノ基を表面に修飾し、その後、−ＣＨＯ基を持ったビオチンと反応させることで、半透膜と同様に基板４０２表面にビオチンを修飾することができる。ここでアビジン４０３を添加し、ビオチン−アビジン結合で細胞培養部基板４０２に半透膜４０１を接着させる。
【００３１】
このようにして、細胞培養部４０５の穴の部分を除いて、半透膜４０１と基板４０２の各々の表面に結合配設したビオチン（４０４）が、アビジン４０３を介して相互に結合して密着するようにしている。これに優れたシール効果が実現される。
【００３２】
図５は、基板５０１に設けた細胞培養部５０２の穴での細胞５０３の培養の状況を例示した概要図である。この出願の発明による培養によれば、たとえば６０倍の対物レンズを使用した場合でも、通常のプレパラートと同様に、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡で、細胞培養部５０２の穴の中の細胞５０３を観察することができる。なお、図５においては、半透膜５０４も示されている。
【００３３】
また、図５では、椀状の穴を例示しているが、その形状は、方形、多角形等の各種であってよい。
細胞培養部としての穴は、たとえば図６のように均一ないしは略均一の大きさのものとして、基板６０１上に、複数の細胞培養部６０２として所定の等間隔のパターンで配置させることができる。また、図７のように、基板７０１上に大きさが段階的に異なる穴としての細胞培養部７０２、７０３、７０４、７０５、７０６を設けてもよい。図８は、この大きさの異なる細胞培養部８０２、８０４の穴での細胞８０３、８０５の培養の状況を例示した概要図である。このとき、ともに穴内の細胞数は１であるが細胞数を穴の容積で割った細胞濃度は異なる。このように穴の容積をコントロールすることで同一の細胞数で、異なる濃度での細胞の反応を観察することができる。
【００３４】
そして、細胞培養部としての穴の配置パターンや配置数、さらには穴の大きさやその形状については適宜に定めてよいことは言うまでもない。
この出願の発明によれば、たとえば細胞培養部の穴の大きさ（直径）を変えることにより目的対象としている細胞の平均自由行程の大きさを変えたり、同じ大きさ（直径）の穴に入れる目的対象細胞の数を変えることにより細胞密度を変化させたりすることが可能となる。また、細胞培養のための穴の形状を変えて、その形状の細胞に与える影響、効果を観察することもできる。
【００３５】
また、この出願の発明によれば、たとえば図９に例示したように、ガラス等の基板９０１に、細胞培養部９０２としての複数の穴と、この穴を連結し、細胞１個がかろうじて通ることのできる細い流路としての溝９０３を、基板９０１の表面に設けてもよい。この流路としての溝９０３を設けることにより、たとえば細胞の移動速度や走行性等を測定することができる。あるいは光ピンセット等の微粒子捕捉手段を用いて、流路を介して細胞を隣接した別の細胞培養部穴に移すことができる。光ピンセットを用いることで、細胞を分離、選択したり、穴の中で特定の細胞同士を相互作用させたり、穴の中の細胞数を制御することが可能である。
【００３６】
図１０は、このような細胞移動の操作を例示した平面概要図である。基板１００１には、細胞培養部１００２としての穴と、これらを連結する流路としての溝１００３を設け、細胞培養部１００２の穴Ａから別の穴Ｂに、光ピンセット１００５手段によって細胞１００４を溝１００３を通して移動可能としている。この場合の光ピンセット１００５手段は、これまでによく知られている手段であって、レーザー集束光を対象細胞に照射することによって細胞を捕捉し、捕捉した状態のまま、レーザー集束光の移動により細胞を移動可能とする手段である。
【００３７】
このような光ピンセット１００５の手段によれば、たとえば図１１に例示したように、基板１１０１に設けた細胞培養部１１０２の穴と、細胞溜め１１０４の穴とを流路としての溝１１０３で連通させて構造において、細胞溜め１１０４の穴から特定の細胞を光ピンセットにより細胞培養部１１０２の穴にもってくることができ、逆に細胞培養部１１０２の穴から、細胞溜め１１０４の穴へ特定の細胞を移行ないし捨てることもできる。あるいはまた、図１２に例示したように、細胞培養部基板１２０１上に、１細胞精製培養系を組むこともできる。この場合は、まず、試料導入部１２０２に細胞を外部から導入し、この中の１細胞を光ピンセット等の捕捉手段を用いて溝を移動させ、細胞培養用穴１２０４に誘導する。この溝の途中には細胞トラップ用穴１２０３が置かれており、１２０２から細胞が泳いで穴１２０４に進入するのを防いでいる。次に、穴１２０４で１細胞から培養され増殖した細胞群から、再び特定の状態の細胞１つを取り出し、これを同様に捕獲手段を用いて溝を移動させて、第２の培養用穴１２０６に誘導する。途中には、同様に細胞トラップ用穴１２０５がある。穴１２０６で培養された細胞は、増殖してある一定の状態になったとき、細胞観察用穴１２０８に、細胞運搬用溝１２０７を経て運搬され、観察等がなされる。
【００３８】
図１３は、図２で示した実施例とは異なる別の培養容器の一例を示したものである。この例では、外部からピペット１３０７を導入して、半透膜１３０４を貫通させ、穴１３０６中の細胞を選択的に回収する。そのため、培養容器１３０１は上面が開放されており、容器中に満たされた培養液１３１３の上にはミネラルオイル１３１２を張ることで、雑菌の混入を防いでいる。チューブ１３０２を通じて矢印１３１１の方向の流れで導入される培養液の量は、矢印１３１７の方向に吸引される溶液の量より少なくなっており、液面高さ調節部１３１５を用いることで、この液面高さが溶液出口１３１６より低くなると、空気が吸引され溶液の吸引が止まり、液面の高さが上がって出口１３１６を塞ぐと再び培養液が吸引され、結果として液面の高さが一定に保たれる。この例では、液面高さ調節部を培養容器１０５とは別途設置することにより、液面の波紋が光学観察に影響を与えないようにしている。ここでピペット１３０７は、細胞を吸引するために用いることも出来るが、特定の穴や溝を塞ぐために、充填剤を注入したり、特定の細胞を半透膜を貫通して細胞培養部に導入することに用いることもできる。たとえば、図１２で示した１細胞精製培養系の試料導入部１２０２に特定の試料を導入する場合に用いることができる。このときは、ピペットによって導入された細胞は、他の細胞等が半透膜の破れから侵入する前に、光ピンセット等の捕獲手段によって、半透膜でシールされた穴まで溝を通って動かせば、コンタミの問題なく実験することが出来る。また、本実施例でピペット１で１細胞単位で特定の状態の細胞を回収できることから、この１細胞の遺伝子多型解析、ｍＲＮＡ発現解析等も行うことが出来る。
【００３９】
図１４は、特定の穴１４０２中の細胞に、誘導等をかけるため試薬を導入する実施例を示している。この場合のピペットは二重構造をしており、内側のピペット１４１１から溶液を放出し、外側のピペット１４１２から吸引を行う。これによって、内側のピペット１４１１から放出された溶液は、その出口近傍にのみ分布し、外側のピペット１４１２からの吸引によって、外側のピペット１４１２から外の領域には溶液が漏れ出ない構造になっている。したがって、このピペットを特定の穴の近傍に持ってゆくことで、特定の細胞のみに作用を与えることができる。
【００４０】
なお、この発明の前記のとおりの光ピンセット等の捕捉移動の手段による細胞の移動で、細胞培養部の穴内での特定細胞の濃度を制御することや、相互作用する細胞の特定、相互作用期間の制御等が可能となるが、細胞の捕捉と移動のための手段は、上記の光ピンセットに限られることはない。たとえば超音波を用いる手段であってもよいし、電場を利用する手段であってもよい。
【００４１】
図１５には、細胞培養部基板１５０１に複数の電極１５０１、１５０５、１５０８を導入した実施例の一つを示している。細胞は溶液中でその表面状態に応じて、特異的な電荷を持つことから、たとえば電極１５０２に正の電荷を印加すると、反対の電荷を持つ細胞１５１１を穴１５０３まで引き寄せることができる。この手法を用いることで、穴１５０３、１５０６、１５０９それぞれに、負の電荷の強さに応じた細胞が集まることになる。また、電極１５０５、１５０８に負の電荷を印加すれば、細胞は各穴の間を移動することができなくなる。
【００４２】
また、図１６には、細胞培養部基板１６０１に電極１６０２、１６０３を配置し、超音波振動子１６０４、１６０５を配置した実施例の一つを示している。この例では、細胞を操作する非接触力として電界１６１１、超音波輻射圧１６１２を用いている。電界は細胞の持つ表面電荷に応じた外力を細胞に与え、また、超音波輻射圧は細胞のサイズおよび硬さに応じた外力を細胞に及ぼす。このとき用いる超音波の振動数は超音波による気泡（キャビテーション）発生を抑制するため１ＭＨｚ以上の周波数を用いることが望ましい。この実施例では、具体的に、超音波輻射圧と電場を互いに直交する異なる方向に作用させることで、細胞の持つ電荷とサイズに応じた細胞分布を２次元に展開することができる。また、この例では電界による外力と超音波による外力を１つの基板上で組み合わせることで細胞の種類に応じた分離を行ったが、電界、超音波による外力をそれぞれ単独で用いて細胞の運搬に用いても良い。これによって光ピンセットで用いたような細胞ハンドリングが可能である。
【００４３】
そして、この出願の発明においては、細胞培養部としての穴中の細胞数を計測する手段を備えることができ、さらには、細胞培養部の穴に、半透膜を貫通して導入でき、穴内部の特定の細胞を回収したり、あるいは、穴内に試薬や封入材を注入もしくは回収することのできるピペットを備えることもできる。その他細部の実施上の形状については以上の例示説明に何ら限定されることなしに、各種各様のものが可能とされることは言うまでもない。
【００４４】
たとえば以上のとおりのこの出願の一細胞長期培養顕微観察装置においては、たとえば次のような優れた効果が得られることになる。
（１）特定の細胞を隔離し、長時間観察することができる。
【００４５】
（２）培養液の種類、温度を培養途中に自由に変えることができる。
（３）培養する容器の容積、形状を自由に設定することができる。
（４）培養する細胞の数を培養途中に正確に制御することができる。
【００４６】
（５）培養している容器に他の雑菌は入ってこない。
この出願の上記装置を用いることにより、たとえば図１７に例示したように、大腸菌の成長観察においては、各世代間での成長速度、分裂する長さに差はなく、２倍の長さになると分裂することが確認される一方で、図１８のように、成長には細胞培養部の穴の大きさ、つまり容積への依頼性が確認された。図１８で、largr は２×１０-7ｍｌを、small は２×１０-9ｍｌを示している。
【００４７】
また、図１９のように、世代による分裂時間と、初期菌数による分裂時間には相違があり、１回目の分裂では分裂開始に時間がかかり、１細胞の場合には複数細胞の場合よりも分裂開始に時間がかかることが確認された。
【００４８】
このようなことは、一細胞レベルでの長期培養と顕微観察を可能とするこの出願の発明の装置と方法とによってはじめて可能とされるのである。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、従来技術の問題点を解消し、特定の一細胞に由来する細胞群を培養することや、細胞を培養する過程で相互作用させる細胞を特定しながら培養観察すること、細胞濃度を一定にしたまま細胞を培養する培養している細胞群の中の特定の細胞のみにシグナル物質等の薬剤などの細胞と相互作用する物質を散布し、その細胞と他の細胞との変化の違いを観察することなどを可能とする新しい技術手段が提供される。また、この出願の発明により、特定の状態にある細胞のみを回収し、その細胞の遺伝子、発現ｍＲＮＡ等の解析、あるいは生化学的測定を行うことを可能とする新しい手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の基本構成の一例を示す模式図である。
【図２】図１で示した１細胞培養部の装置構成を示す模式図である。
【図３】図２で示した１細胞培養部のＡ−Ａ断面を示す模式図である。
【図４】基板と半透膜の接着方法の一例を示す模式図である。
【図５】細胞培養部の細胞捕獲の様子を示す模式図である。
【図６】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図７】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図８】図７で示した大きさの異なる基板表面の穴の断面構造を示す模式図である。
【図９】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図１０】光ピンセットを用いて図９で示した穴の間で細胞を運搬する手段を説明する模式図である。
【図１１】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図１２】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図１３】細胞培養部の装置構成の一例を示す模式図である。
【図１４】細胞培養部の装置構成の一例を示す模式図である。
【図１５】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図１６】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図である。
【図１７】大腸菌の世代間の成長速度、分裂長さの観察結果を例示した図である。
【図１８】大腸菌の成長についての容積依存性の観察結果を例示した図である。
【図１９】大腸菌の分裂について、世代による分裂時間と、初期菌数による差の観察結果を示した図である。
【符号の説明】
１０１、１１０  光源
１０２、１１１  フィルター
１０３、１１４  コンデンサレンズ
１０４  気体排出弁
１０５  培養容器
１０６  細胞培養部基板
１０７  温調機能付ステージ
１０８  レーザー光源
１０９  可動ダイクロイックミラー
１１２  ダイクロイックミラー
１１３  ミラー
１１５  カメラ
１１６  画像処理解析・記録装置
１２１  培養液供給装置
１２２  ヒーター
１２３  溶存気体交換装置
１２４、１２７  ポンプ
１２５、１２６  チューブ
１２８  廃液溜め
１３１  対物レンズ
１３２  ステージ移動用モーター
２０１  気体排出弁
２０２  培養容器
２０３、２０４  チューブ
３０１  培養容器
３０１Ａ  液交換部
３０２、３０３  チューブ
３０４  半透膜
３０５  細胞培養部基板
３０６  細胞培養部
３０７  接着シール
４０１  半透膜
４０２  細胞培養部基板
４０３  アビジン
４０４  ビオチン
４０５  細胞培養部
５０１  細胞培養部基板
５０２  細胞培養部
５０３  細胞
５０４  半透膜
６０１  細胞培養部基板
６０２  細胞培養部
７０１  細胞培養部基板
７０２、７０３、７０４、７０５、７０６  細胞培養部
８０１  細胞培養部基板
８０２、８０４  細胞培養部
８０３、８０５  細胞
９０１  細胞培養部基板
９０２  細胞培養部
９０３  溝
１００１  細胞培養部基板
１００２  細胞培養部
１００３  溝
１００４  細胞
１００５  光ピンセット
１１０１  細胞培養部基板
１１０２  細胞培養部
１１０３  溝
１１０４  細胞溜め
１２０１  細胞培養部基板
１２０２  試料導入部
１２０３、１２０５  細胞トラップ用穴
１２０４、１２０６  細胞培養用穴
１２０７  溝
１２０８  細胞観察用穴
１３０１  培養容器
１３０２、１３０３  チューブ
１３０４  半透膜
１３０５  細胞培養部基板
１３０６  穴
１３０７  接着シール
１３０８  ピペット
１３１１、１３１４、１３１７  培養液の流れ
１３１２  ミネラルオイルの膜
１３１３  培養液
１３１５  液面高さ調節部
１３１６  溶液出口
１４０１  細胞培養部基板
１４０２  穴
１４０３  細胞
１４０４  半透膜
１４１１  溶液放出ピペット部
１４１２  溶液吸引ピペット部
１４１３  ピペット放出液の流れ
１４１４  ピペット吸引液の流れ
１５０１  細胞培養部基板
１５０２、１５０５、１５０８  電極
１５０３、１５０６、１５０９  穴
１５０４、１５０７  溝
１５１０  細胞の動く方向
１５１１、１５１２  細胞
１６０１  細胞培養部基板
１６０２、１６０３  電極
１６０４、１６０５  超音波振動子
１６１１  電場の向き
１６１２  超音波輻射圧の向き
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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