(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシジルメタクリレートと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重量比（グリシジルメタクリレート／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が５／９５〜２０／８０となるように重合して得られた共重合体、または、アクロレインと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重量比（アクロレイン／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が５／９５〜１０／８０となるように重合して得られた共重合体からなることを特徴とする酵素修飾剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素修飾剤に関するものである。さらに詳しくは、温度の変化により水溶性あるいは水不溶性の可逆形態をとることのできる酵素修飾剤に関する。本発明のこのような酵素修飾剤は、水媒体中から容易に分離回収することができ、また核酸と酵素を含む混合液から酵素を選択的に除去することができ、従って核酸の精製にも使用することができるものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体触媒である酵素反応が種々の産業分野にて利用されるようになっており、たとえば繊維の風合いや手触りの向上のために酵素処理が行われていたり、製紙の分野ではパルプの処理に用いられたりしている。従来、繊維、パルプなど固体状の基質を処理する場合に用いられる酵素の多くは、水溶液に可溶な状態の酵素によるものであって、通常アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素を用いて実施されている。
これら酵素は、一般的に比較的高価であり、それを効率良く再使用できれば経済的であるばかりでなく、また酵素処理液から酵素を分離・回収することは、水質汚染などの環境問題を解決することからも重要である。しかしながら、酵素処理後、酵素のみを反応液から回収することは技術的に非常に困難である。また、プロテアーゼなど蛋白質分解酵素のような酵素は酵素同士の反応や失活が起こり易いという問題もある。
特開平６−３４１０６７には、水溶性共重合体に固定化した酵素、具体的には、水溶性共重合体であるメチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体にアミラーゼなどの酵素を結合した状態のもので繊維を処理することが開示されている。  また特開平６−２４０２９７には水溶性共重合体であるメチルビニルエーテルと無水マレイン酸にタンパク質分解酵素とそれ以外の消化酵素を結合して洗浄用助剤として用いることが開示されている。
しかしこれらの方法によれば、酵素と水溶性共重合体の結合が不十分であり、かつ酵素活性が少ないという問題がある。従ってこれらの方法では、水溶性カルボジイミドやグルタルアルデヒドのような比較的高価な結合用試薬を多量に用いることが必須であり、経済性の点で問題があるのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来の技術的課題を解決するためになされたもので、高価な結合用試薬を用いることなく効率的に酵素を分離でき、酵素反応効率および耐久性にも優れた温度応答性を有する酵素修飾剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（ａ）エポキシ基含有重合性モノマーであるグリシジルメタクリレート、もしくは、アルデヒド基含有重合性モノマーであるアクロレインと、（ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、特定の重量比で重合して得られた共重合体（以下、「特定共重合体」という）からなることを特徴とする酵素修飾剤を提供するものである。
本発明において酵素修飾剤とは、酵素と混合し、反応させることによって酵素と強固に結合し酵素表面を容易に修飾できるものを示す。以下、本発明について詳細に説明する。
【０００５】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
特定共重合体を形成するエポキシ基含有重合性モノマーは、グリシジルメタクリレートである。また、アルデヒド基含有重合性モノマーは、アクロレインである。エポキシ基含有重合性モノマーの使用量は、全モノマーの１〜４０重量％、好ましくは２〜２０重量％である。エポキシ基含有重合性モノマーの使用量が１重量％より少ないと酵素に結合する効率が不十分となり、また４０重量％より多いと低温にしても溶解しにくくなる。アルデヒド基含有重合性モノマーの使用量は、全モノマーの１〜２０重量％、好ましくは２〜１５重量％である。アルデヒド基含有重合性モノマーの使用量が１重量％より少ないと酵素に結合する効率が不十分となり、また２０重量％より多いと分子量が１０００以下に低下しやすくなる。
【０００６】
一方、特定共重合体の形成に使用されるＮ−イソプロピルアクリルアミドの使用量は、全モノマーのうち４０重量％以上、好ましくは４０〜９９重量％とする必要がある。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの使用量が４０重量％より少ないと温度応答性はなくなり修飾した酵素を不溶化して分離し難くなる傾向がみられる。
本発明においては、特定共重合体には温度応答性に悪影響しない範囲で、親水性または疎水性の他の重合性モノマーを全モノマーの例えば２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下共重合することもできる。他の重合性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物、スチレン、エチルビニルベンゼン、α−メチルスチレン、フルオロスチレン、ビニルピリジンなどの芳香族モノビニル化合物、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル化合物、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジエン化合物、酢酸ビニルなどのビニルエステル化合物、Ｎ−メチロールアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチレンビスアミドなどのアミド化合物、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどのシアン化ビニル化合物、スチレンスルホン酸塩、イソプレンスルホン酸塩などのスルホン化重合性化合物、４−メチル−１−ペンテン、その他のα−オレフィン化合物などを挙げることができる。
【０００７】
本発明における共重合体の重合方法は、何れの方法でもよいが、好ましくはラジカル重合で、溶液重合、乳化重合、懸濁重合いずれでも良い。最も好ましい方法は溶液重合であり、重合溶媒としては、少なくとも一種以上の有機溶剤を含む必要がある。
有機溶剤の具体例としては、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、トルエンなどが挙げられ、これらは一種または二種以上の組み合わせで用いられる。本発明においては重合中共重合体が析出しない範囲で有機溶剤に水を組み合わせることもできる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤が使用でき、アゾイソブチロニトリルのようなアゾ系開始剤、ベンゾイルパーオキサイドなどの有機過酸化物を使用することができる。
重合後、水を添加した後減圧蒸留などの方法により脱溶剤して２０℃以下冷却することにより共重合体水溶液を得ることができる。
【０００８】
本発明の酵素修飾剤は、水系媒体中において温度の変化により可溶性と不溶性の可逆形態を有する温度応答性のある共重合体である。本発明の共重合体の酵素修飾剤は、低温側では可溶性であり、高温領域では不溶性となり沈澱する温度応答性を有するものである。溶解性が変化する温度は、特定共重合体の製造に使用するＮ−イソプロピルアクリルアミドの量、その他の重合性モノマーの種類と量によってコントロールすることができる。
従って、本発明の酵素修飾剤で修飾した酵素は、水系媒体の温度の調整により、水系媒体に不溶とし、遠心分離操作により沈降させることができ上清と沈降物とを分離することができ、実用的には２０℃以下で酵素修飾剤の８０重量％以上が水系媒体に溶解し、５０℃以上では酵素修飾剤の８０重量％以上が水系媒体に不溶化する酵素修飾剤が好ましい。
本発明の酵素修飾剤で酵素を修飾する場合には、酵素修飾剤が水系媒体に溶解し、かつ酵素の活性に悪影響しない温度条件下で混合し反応させることによって達成できる。
酵素を本発明の酵素修飾剤で修飾する利点としては、酵素が回収再利用できるという点の他、ｐＨ、熱などに対する耐久性が向上する点が挙げられる。
酵素を共重合体で修飾することにより未修飾の酵素と比較して酸、アルカリに対する耐久性と高温での耐熱性が向上する。
【０００９】
本発明の酵素修飾剤で修飾することのできる酵素としては、どのような酵素も使用することができ、例えばアミノペプチターゼ、キモトリプシン、パパイン、ウロキナーゼ、ウレアーゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、プロテアーゼ、グルコースフォスファターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、リゾチーム、セルラーゼ、インベルターゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、各種制限酵素（エンドデオキシリボヌクレアーゼ）などの加水分解酵素、リシンラセマーゼ、ＵＤＰガラクトースエピメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、乳酸ラセマーゼ、リシンアミノムターゼなどの異性化酵素、グリシンメチルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リシンアセチルトランスフェラーゼ、グルタミルトランスフェラーゼ、フォスフォリラーゼ、ヘキソキナーゼ、フォスフォグリセロムターゼ、グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチターゼ、クレアチンホスホキナーゼなどの転移酵素、アルコールデハイドロゲナーゼ、アルデヒドデハイドロゲナーゼ、フマレートリダクターゼ、ラクテートデハイドロゲナーゼ、グルコースデハイドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ニコチネートデハイドロゲナーゼ、ハイドロキシルアミンオキシダーゼ、グルタチオンデハイドロゲナーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼなどのような酸化還元酵素、オルニチンデカルボキシラーゼ、リシンデカルボキシラーゼ、エノラーゼ、トリプトファンシンセターゼ、アデニレートシクラーゼなどのリアーゼ、ｔＲＮＡシンセターゼ、アセチルＣｏＡシンセターゼ、グルタミンシンセターゼなどのリガーゼを挙げることができる。
【００１０】
本発明では、酵素を修飾することにより温度の制御で不溶化して溶液から分離除去できる特徴を有するため、核酸と混在する酵素を除去する目的にも使用することができる。具体的には、微生物や組織、細胞、血液など生体組織を超音波処理などの処理により無細胞化した後、本発明の酵素修飾剤を該酵素修飾剤が溶解する条件の温度で添加し、酵素を酵素修飾剤で修飾する。その後、本発明の酵素修飾剤が水不溶となる条件にかえることにより、酵素を核酸と分離することができる。このように、本発明の酵素修飾剤は短時間で核酸の精製が可能となるため、遺伝子解析におけるＰＣＲ法などへ応用できる。
【００１１】
（実施例）
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド９０ｇとグリシジルメタクリレート１０ｇとをメタノール１５０ｇに溶解し重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル１ｇを加え７０℃で１０時間重合した。重合転化率は９９％であった。
次いで水４００ｇ添加し、減圧蒸留によりメタノールおよび残留モノマーを除去した後、ｐＨ調整剤と調整水を添加して固形分濃度１０％、ｐＨ＝７の共重合体（特定重合体（１））水溶液を得た。
得られた特定重合体（１）の温度応答性を測定したところ３０℃以下では透明で溶解し、３５℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的であった。
得られた特定重合体水溶液１００μＬに、ｐＨ７のリン酸緩衝液１０ｍＬに１０ｍｇ溶解したセルラーゼ（Tricoderma reesei、Sigma 製）の溶液１ｍＬを添加し、４℃、２時間混合して共重合体とセルラーゼを結合し、修飾された酵素を得た。その後、再度５０℃に昇温して修飾された酵素を析出させた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを廃棄した後、２０℃のｐＨ７のリン酸緩衝液２ｍＬ添加し再溶解した。その後また５０℃に昇温することにより修飾された酵素を析出させ遠心分離した後、上清を廃棄し再び２０℃のｐＨ７の緩衝液１ｍＬを添加し溶解させた。
２回の水不溶化−可溶化操作の後のセルラーゼを、Ｌｏｗｒｙ法で定量したところ、セルラーゼの回収率は８０％であった。またカルボキシメチルセルロースを基質としてセルラーゼの活性を測定したところ相対活性７９％であった。
これらの結果を表１に示す。
【００１２】
実施例２〜３および比較例１〜３
実施例１において、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭと略す）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡと略す）、アクリルアミド（ＡＡｍと略す）を表１に示した組成に変更する以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
0003873316.tif 000002
回収率：実施例１で記載したセルラーゼの２回洗浄後の回収率
相対活性：未修飾酵素の活性に対する修飾酵素の活性
−    ：測定不能
【００１４】
実施例４
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド９５ｇとアクロレイン５ｇとをメタノール１５０ｇに溶解し、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル２ｇを加え７０℃で２０時間重合した。重合転化率は９８％であった。
次いで、水４００ｇを添加し、減圧蒸留によりメタノールおよび残留モノマーを除去した後、ｐＨ調整剤と調整水を添加して固形分濃度１０重量％、ｐＨ＝７の共重合体（特定重合体（２））水溶液を得た。
得られた特定重合体（２）の温度応答性を測定したところ３０℃以下では透明で溶解し、３５℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的であった。得られた特定重合体（２）水溶液１００μＬに、ｐＨ７のリン酸緩衝液１０ｍＬに１０ｍｇ溶解したセルラーゼ（Tricoderma reesei、Sigma 製）の溶液１ｍＬを添加し、４℃、２時間混合して共重合体とセルラーゼを結合し、修飾された酵素を得た。その後、５０℃に昇温して修飾された酵素を析出させた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを廃棄した後、２０℃のｐＨ７のリン酸緩衝液２ｍＬ添加し再溶解した。その後また５０℃に昇温することにより修飾された酵素を析出させ遠心分離した後上清を廃棄し、再び２０℃のｐＨ７の緩衝液１ｍＬを添加し溶解させた。
２回の水不溶化−可溶化操作の後のセルラーゼを、Ｌｏｗｒｙ法で定量したところ、セルラーゼの回収率は８９％であった。またカルボキシメチルセルロースを基質としてセルラーゼの活性を測定したところ相対活性８７％であった。
これらの結果を表２に示す。
【００１５】
実施例５〜６および比較例４〜６
実施例４において、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭと略す）、アクロレイン（ＡＬと略す）、メタクリル酸（ＭＡＡと略す）を表２に示した組成に変更する以外は、実施例４と同様の操作を行った。結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
0003873316.tif 000003
回収率：実施例１で記載したセルラーゼの２回洗浄後の回収率
相対活性：未修飾酵素の活性に対する修飾酵素の活性
−    ：測定不能
【００１７】
試験例１
（１）ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１重量％牛胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培養懸濁液１ｍＬ当り５０万の細胞となった時点で、１ｍＬの培養懸濁液をサンプリングチューブに取り、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。細胞に対し１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.２を添加した後、超音波処理により無細胞化し、試料とした。
（２）実施例１で合成した固形分濃度１０重量％、ｐＨ＝７の特定共重合体（１）水溶液または実施例４で合成した固形分濃度１０重量％、ｐＨ＝７の特定共重合体（２）水溶液１００μＬを上記（１）で調製した試料に添加し、４℃で２時間酵素と特定共重合体とを結合した後、５０℃に昇温し修飾酵素を不溶化し沈澱させた。その後３０分間遠心分離を行い脂質など水不溶性物質と共に酵素などのタンパク質を沈降させて、精製された核酸を含む上清を得た。以上のように精製された核酸に制限酵素を作用させた結果、制限酵素による反応は阻害されなかった。
【００１８】
試験例２
試験例１（１）で得た無細胞化したＫ５６２細胞溶解液を、それぞれ０.５ｍＬ、３本の２ｍＬ遠心チューブに取り、ｐＨ５の１０ｍＭリン酸緩衝液で２ｍＬまで希釈した。この希釈液の中にエイズウィルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡをチューブ１、２、３に、０分子、１０分子、５０分子分それぞれ加えた。ボルテックス後、各チューブに実施例１で合成した固形分濃度１０重量％の特定共重合体（１）水溶液を２μＬ添加し、２８℃で５分間回転攪拌した（１０ｒｐｍ）。
また、実施例４で合成した固形分濃度１０重量％お特定共重合体（２）水溶液についても特定共重合体（１）と同様な操作をおこなった。
次いで、５０℃に昇温して共重合体を析出させた後３,０００ｒｐｍで３分間遠心し、核酸のみを上清とし回収した。上澄をピペットで別の遠心チューブに移し取り、２５μＬのポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応溶液を加えて、ＰＣＲ反応を行った。
【００１９】
ＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりである。
0003873316.tif 000004
であって、これらをアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマニュアルに従って合成し、ＨＰＬＣで精製品を得た。
なお、ＰＣＲ反応はPERKIN ELMER CETUS 社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行った。
９４℃    ０.５分
５５℃    １.０分
７２℃    １.５分
３０サイクル
７２℃    ７分
上記１回目のＰＣＲ法による増幅反応の生成物を５μＬ取り、同様なプログラムでＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応を行った。その時のＰＣＲ法の反応液の組成はプライマー  ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１を使用した以外は同様に行った。
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応増幅産物を２重量％のアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムプロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。その結果を表３にまとめて示す。
この結果により、本発明の酵素修飾剤で修飾された酵素を用いることにより、ＤＮＡのみ回収することができるためＰＣＲ法に利用できることがわかった。
【００２０】
【表３】
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【００３０】
【発明の効果】
本発明の酵素修飾剤は、高価な結合用試薬を用いることなく、酵素と混合し反応させることによって酵素を修飾することができる。また、本発明の酵素修飾剤で修飾された酵素は、温度をコントロールするのみで不溶化し反応系から分離できるため再利用が可能となる。
また、本発明の酵素修飾剤で修飾された酵素はｐＨ、熱の変化、酸、アルカリに対しても耐久性が増すという効果もある。
さらに、本発明の酵素修飾剤を用いることにより核酸の精製が効率よくできる効果もあるため遺伝子解析におけるＰＣＲ法などへも応用できる。