(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中のトロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルを測定することを特徴とする脱髄疾患の検出方法。
【請求項２】
トロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルの測定を免疫学的測定法により行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トロンビン−アンチトロンビンIII複合体、トロンビン及びアンチトロンビンIIIの少なくとも一つと特異的に反応する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を含む脱髄疾患診断用の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の検出方法及び該方法に使用するための診断用キットに関する。より詳細には、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の再燃時の早期診断、脱髄疾患のそれと紛らわしい各種神経疾患に対する鑑別診断等に使用できる検出方法及び該方法に使用するための診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
脱髄疾患は、神経の軸索を取り巻き、軸索の絶縁体として興奮伝導を促進する機能を有する髄鞘が傷害される神経疾患であり、これに属するものとしては多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等が挙げられる。これらの脱髄疾患の多くは緩解、再燃を繰り返すが、再燃時を早期に予想するための診断方法としてはこれまで有力なものがないのが実状であった。またこれらの疾患はいずれも他の神経疾患との鑑別診断が容易でなく、そのような鑑別診断に有用な方法が求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の再燃時の早期診断、脱髄疾患とそれと紛らわしい各種神経疾患との間の鑑別診断等に使用できる検出方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らが上記疾患の動物モデルとされる、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)を用いて鋭意検討したところ、血液等の検体中のトロンビン−アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）のレベルが脱髄疾患の臨床症状発現に先立ち上昇し、検体中のＴＡＴのレベルを測定することにより脱髄疾患を早期に診断することができることが見出された。また、ＴＡＴのレベルは脱髄疾患の病状の回復とともに低下し、従ってＴＡＴのレベルを測定することにより脱髄疾患の病勢を診断することができることも見い出された。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
【０００５】
従って本発明は、体液中のトロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルを測定することを特徴とする脱髄疾患の検出方法を提供するものである。
【０００６】
上記本発明の方法の好ましい態様においては、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルの測定を免疫学的測定法により行い、例えばトロンビン−アンチトロンビンIII複合体、トロンビン及びアンチトロンビンIIIの少なくとも一つと特異的に反応する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を使用して行う。従って免疫学的測定は、例えば、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体に対する抗体を使用して、あるいはトロンビンに対する抗体とアンチトロンビンIIIに対する抗体とを組み合わせて使用して行うことができる。
【０００７】
また本発明の別の形態として、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体、トロンビン及びアンチトロンビンIIIの少なくとも一つと特異的に反応する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を含む脱髄疾患診断用の診断キットが提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の検出方法の診断対象となる脱髄疾患は、神経の軸索を取り巻き、軸索の絶縁体として興奮伝導を促進する機能を有する髄鞘が障害される神経疾患である。髄鞘が障害される状態を脱髄と称し、脱髄は髄鞘が選択的に障害され軸索が正常に保たれる一次性脱髄と、軸索の障害に続発して髄鞘が障害される二次性脱髄とに分類され、さらに一次性脱髄は原因不明の特発性脱髄と、パポバウイルス感染、アルコール中毒等に伴う栄養障害等を原因とすることが知られている症候性脱髄に分けられる。本発明の方法はこれらのいずれの種類の脱髄により起こる脱髄疾患も診断対象とし得る。
【０００９】
代表的な脱髄疾患としては、自己免疫を原因とすると考えられている多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ＡＤＥＭの一亜型と考えられる脊髄神経根神経障害(myeloradiculoneuropathy)、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー等の白質ジストロフィー等が挙げられ、いずれも本発明の検出方法の適用対象となり得る。本発明は、これらのうち特にＭＳ及びＡＤＥＭの診断に有用である。
【００１０】
本発明の検出方法においては、対象となるヒト患者を含む脊椎動物から採取した体液中のＴＡＴのレベル（濃度）を測定する。使用できる体液としては、血液、その分画である血漿及び血清、脳脊髄液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の検出方法において測定対象となるＴＡＴは、トロンビンとアンチトロンビンIII（ＡＴIII）との複合体であり、公知の生体物質である。この血中レベルは血中で急速に消失するトロンビンのレベルに代えて測定することができ、トロンビン形成、即ち血液凝固活性、血栓形成傾向等の指標として使用できるものとして知られていたものである。
【００１２】
ＴＡＴの測定方法は特に限定されるものではないが、通常は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により測定することが好ましく、免疫学的測定法によればＴＡＴを高感度で特異的に定量できる。そのような免疫学的測定法の原理自体は公知のものでよく、レーザーイムノアッセイ等の非標識イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等の標識イムノアッセイのいずれによっても行うことができる。感度、測定の容易さ等の点から通常は標識イムノアッセイにより測定するのが好ましい。標識イムノアッセイの方法も特に制限されるものではなく、例えば液相中での抗原抗体反応を利用する液相法、固相に結合した第一の抗体と標識された第二の抗体を使用するいわゆるサンドイッチ法、固相に検体中のＴＡＴを吸着させ、これを抗体で測定する方法等いずれも使用できる。
【００１３】
免疫学的測定法に使用する抗体も各種のものから選択でき、例えば、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、即ちトロンビンやＡＴIIIには反応しないが、ＴＡＴにのみ特異的に反応する抗体、トロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応し、かつＴＡＴ中のトロンビンあるいはＡＴIIIに特異的に反応する抗体等いずれのものを使用してもよい。例えばＴＡＴに特異的に結合する抗体を用いれば、直接ＴＡＴのみを捕捉することができる。またトロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応し、かつＴＡＴ中のトロンビンあるいはＡＴIIIに特異的に反応する抗体を使用した場合は、トロンビンあるいはＡＴIII及びＴＡＴの両方を捕捉し、さらにＴＡＴを形成する他方の結合相手に特異的に反応する抗体（即ち、抗ＡＴIII抗体あるいは抗トロンビン抗体）で結果としてＴＡＴのみを捕捉することができる。抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。
【００１４】
標識イムノアッセイに使用される標識も公知のものから任意に選択することができ、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等を使用することができる。
【００１５】
前述の通り血中のＴＡＴレベルはこれまでにも凝固活性、血栓形成傾向等の指標として測定されており、ＴＡＴを特異的に高感度で測定するための各種免疫学的方法の変法（特表平７−５０８１０３号、日本特許第２５６９３８３号、特開平３−４８１５８号等）、及びトロンビン、ＡＴIII、ＴＡＴ等に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（特開平７−５９５９０号、特開平８−１２００００号、特開平９−２３４０６８号等）等が提案され、またＴＡＴの安定化方法（日本特許第２６４５７７４号等）等の周辺技術も各種提案されている。ＴＡＴレベルの測定自体は当業者に周知の技術やこれらの文献に記載された技術、材料を用いて行うことができる。
【００１６】
以下、固相に結合される第一抗体と、標識された第二抗体または標識され得る第二抗体とを用いたいわゆるサンドイッチ法（特公平６−４１９５２号等参照）によるＴＡＴの測定についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
上記サンドイッチ法に使用する第一抗体及び第二抗体は、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、トロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応する抗体等から選択することができる。
【００１８】
この方法では、例えば、ＴＡＴを含む検体を固相に固定された第一抗体と接触させ、次いで標識物質で標識された第二抗体と接触させることにより検体中のＴＡＴと第一抗体と標識物質で直接標識された第二抗体とを反応させて第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相からなる複合体を形成させる。そして前記複合体から遊離の第二抗体を分離し、前記複合体中または分離された第二抗体の標識物質を検出することにより検体中のＴＡＴを測定する。
【００１９】
また、形成された第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相の前記複合体に、第二抗体に特異的に結合する標識された抗イムノグロブリン抗体を接触させることにより前記複合体と標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、その標識物質を検出することにより検体中のＴＡＴを測定することもできる。第二抗体を直接標識する方法に比べ、入手の容易な標識された抗イムノグロブリン抗体を使用する方法がより簡便である。なお、この方法で使用する抗イムノグロブリン抗体は、第二抗体を製造するために使用した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識する抗体である。
【００２０】
上記のようなサンドイッチ法において、第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体の複合体形成順序は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である（「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。
【００２１】
また第一抗体を固定する固相としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が好ましい。
【００２２】
これらの固相に第一抗体を固定する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等、固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を使用することができる。操作が簡便なことから物理的吸着（いわゆるコーティング）が特に好ましい。
【００２３】
また、第一抗体を固定した固相の表面には、第一抗体が結合していない表面部分が残存している場合があり、その部分に検体中のＴＡＴや他の分子種が結合すると正確な測定結果が得られない場合がある。従って、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して第一抗体が結合していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取した血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白等が挙げられ、またブロッキング物質として市販されている材料を使用することもできる。
【００２４】
また、固相に固定された第一抗体に検体中のＴＡＴを結合させた後に、固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等が挙げられる。
【００２５】
第二抗体または該抗体に免疫学的親和性を有する抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される標識物質としては、前記の通り、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、放射性同位体（125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ等) 、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）等が挙げられるが、通常タンパク質を標識するのに使用することが可能なものであれば特に限定されない。尚、ここで標識物質とは、ビオチン等のようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００２６】
前記の抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素で標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）等から適宜選択することができる。
【００２７】
標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、第二抗体またはイムノグロブリン抗体がペルオキシダーゼ等の酵素で標識されている場合、前記の抗原抗体反応後、酵素の基質（ペルオキシダーゼの場合、過酸化水素水及びオルトフェレンジアミン、テトラメチルベンジジン等の発色基質（クロモゲン））を加え、酵素反応による生成物の発色の程度を吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、抗体がビオチンで標識されている場合、抗原抗体反応後、例えばペルオキシダーゼ等の酵素で標識されたビオチン結合性物質（例えば、ストレプトアビジン）を添加し、このビオチン結合性物質とビオチンを介して酵素を抗体に結合させ、その後、上記と同様に酵素活性を測定することができる。標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、抗原抗体反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００２８】
本発明の検出方法のＴＡＴレベル測定においては、検体中のＴＡＴの濃度は、予め既知濃度のＴＡＴ標準液を用いてＴＡＴ濃度と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを比較することにより定量することができる。
【００２９】
上記のような測定方法においてはＴＡＴを含む検体は予め精製されている必要はない。
【００３０】
上記のような測定方法により、前記のようなヒト体液中のＴＡＴレベルを測定してその変化を観察すると、以下の実施例において具体的に明らかにするように、多発性硬化症のような脱髄疾患を発症あるいは再燃した場合、その臨床症状発現に先立ってＴＡＴレベルが上昇し、臨床症状発現前約２〜１５日程度の時点において正常のレベルの約３〜５０倍程度、より特定すれば約５〜２０倍程度になる。従って本発明の検出方法によれば脱髄疾患を臨床症状発現前に早期に診断することができる。また、臨床症状発現後のＴＡＴのレベルは脱髄疾患の病状の回復とともに低下し、従ってＴＡＴのレベルにより脱髄疾患の病勢を診断することもできる。
【００３１】
尚、いかなる理論にも拘束されるものではないが、脱髄疾患においてＴＡＴレベルの顕著な上昇が認められるのは、血管内皮の異常と血液凝固系の活性化が該疾患の病態に深く関与しているためと考えられる。
【００３２】
さらに本発明の別の形態として、上記の本発明の検出方法を上記に説明したような免疫学的測定法により実施するための診断用キットが提供される。
【００３３】
本発明の診断用キットは、ＴＡＴ、トロンビン及びＡＴIIIの少なくとも一つを特異的に認識する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を構成成分として含むＴＡＴの免疫学的測定用の試薬からなるものである。
【００３４】
上記に説明したようなサンドイッチ法によりＴＡＴを検出する場合には、上記のような抗体から選択される、固相に結合される第一抗体と、標識物質で標識されているかまたは標識され得る第二抗体とを構成成分として含む。このようなキットにおいて第一抗体を予め固相に固定したものを使用すれば、診断過程において固相に抗体を固定する操作を省くことができる。
【００３５】
このような本発明の診断用キットを用いて、例えば、固相に固定した第一抗体にＴＡＴを含む検体を接触させ、次いでペルオキシダーゼ等により標識された第二抗体と接触させることによって、第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相からなる複合体を形成させ、その複合体に含まれる標識物質（例えばペルオキシダーゼ）を検出することにより、検体中のＴＡＴ濃度を測定することができる。
【００３６】
前記キットには、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度のＴＡＴ標準品、標識物質の検出試薬、第二抗体を標識する試薬、第二抗体を検出する試薬（標識された抗イムノグロブリン抗体等）等を必要に応じて加えることができる。また、これらの成分の他に、前記のようなブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を含むものとしてもよい。
【００３７】
また、これらの成分は、それぞれ別の容器に収容しておき、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００３８】
本発明の診断用キットを用いてヒトの体液中のＴＡＴを測定すると、健常人においてはそのレベルは低値であるが、脱髄疾患に罹患した患者においてはその臨床症状が発現する前に高いレベルを示し、脱髄疾患の早期の診断、特に再燃時の早期の診断を簡便に行うことができる。また、脱髄疾患とそれと紛らわしい各種神経疾患との間の鑑別診断等を簡便に行うことが可能となる。さらにＴＡＴレベルは脱髄疾患の病勢の指標ともなり得るので、前記キットは脱髄疾患の病勢の評価を簡便に行うのにも有用である。
【００３９】
上記のキットの具体例として、例えば下記の構成成分を含む診断用キットが挙げられる。
【００４０】
▲１▼  標識抗トロンビン抗体原液（ペルオキシダーゼで標識した、トロンビン及びＴＡＴの双方を認識できる抗トロンビン抗体原液）１００μｌ
▲２▼  希釈用溶液（終濃度がそれぞれ５％及び０．０１％となるように牛血清アルブミン及びチメロサールを含む）１０ｍｌ入りバイアル１本
▲３▼  抗ＴＡＴ抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート１枚
▲４▼  洗浄液原末用ＰＢＳ錠剤（１００ｍｌの蒸留水に溶解した場合１００ｍｌのＰＢＳが得られるもの）１個
【００４１】
▲５▼  クエン酸燐酸緩衝液原末用錠剤（６０ｍｌの蒸留水に溶解した場合６０ｍｌの０．１Ｍのクエン酸燐酸緩衝液、ｐＨ５が得られるもの）１個
▲６▼  オルトフェニレンジアミン末１０ｍｇ入りバイアル１本
▲７▼  ＴＡＴ標準血漿末（ＴＡＴを１００μｇ／Ｌ含む３００μｌの血漿を凍結乾燥したもの）バイアル１本
▲８▼  複数の健常人から集めた正常対照血漿末（血漿３００μｌ相当）入りバイアル１本
【００４２】
上記のキットを使用した実際の患者検体のＴＡＴレベルの測定は、例えば以下のように行うことができる。
【００４３】
脱髄疾患の患者で現在緩解期にある患者、あるいは脱髄疾患が疑われる患者の検体（静脈血９容に０．１１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液１容を加え、混和後約３０００ｒｐｍで１０分遠心分離して採取した血漿）５０μｌを抗ＴＡＴ抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れる。別に正常対照血漿末▲８▼に蒸留水３００μｌを加えて作製した溶液の５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れる。同様にＴＡＴ標準血漿末▲７▼に蒸留水３００μｌを加えて作成した溶液、及びこれを希釈用溶液▲２▼を用いて２倍連続希釈して作製した、ＴＡＴ標準血漿末▲７▼の２倍、４倍及び8倍希釈溶液のそれぞれの５０μｌも９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れ、各プレートを２０〜２５℃で１時間インキュベートし、その後各ウェル中の反応液を全量吸引除去する。そして洗浄液原末用ＰＢＳ錠剤▲４▼を用いて作ったリン酸緩衝溶液を約０．３ｍｌずつ各ウェルに加え、その後吸引する洗浄操作を三回行った後、直ちに標識抗トロンビン抗体原液▲１▼を全量８ｍｌの希釈用溶液▲２▼に加えて泡立てないように混和したものを５０μｌずつ各ウェルに加える。２０〜２５℃で１時間インキュベートした後、クエン酸燐酸緩衝液原末用錠剤▲５▼で作製したクエン酸燐酸緩衝液にオルトフェニレンジアミン末▲６▼を全量入れて完全に溶解した後、市販の過酸化水素水１０μｌを添加し混和したものを５０μｌずつ各ウェルに加える。１０分後に２Ｍの硫酸を各ウェルに２０μｌずつ添加して反応を停止した後、４９２ｎｍで反応液の吸光度を測定する。標準液（▲８▼の希釈液）から求めた値で検量線を作り、これより検体の濃度を読みとる。陰性対照としては、正常対照血漿末▲８▼から得られた値を用いる。検量線は３重測定を行って作成する。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００４５】
実施例
脱髄疾患の代表的疾患とされる多発性硬化症の動物モデルとして確立された、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE、臨床免疫学イラストレイテッド、pp. 112-117, Brostoff, Scadding, Male, Roitt編、広瀬俊一、狩野庄吾、多田富雄 監訳、南江堂 1994)を使用してＴＡＴのレベルを観察した。
【００４６】
ＥＡＥの作成は以下のようにして行った。即ち、疾患を誘発するための感作物質としては、モルモットミエリン塩基性タンパク質（guinea pig myelin basic protein, GPMBP）と結核菌体（Mycobacterium tuberculosis, MTB）含むフロイントの完全アジュバントとを用い、動物としては４週齢のLewisラットを用いた。各ラットの足底に５μｇのGPMBPと２００μｇのMTBを含む上記アジュバントとを注射して感作を行った。
【００４７】
感作日を０日として毎日ラットの症状を観察し、無症状は０、尾の緊張低下を１、下肢の緊張低下を２、下肢の麻痺を３、上肢の麻痺を４、死亡を５として症状を数値化して記録した（臨床スコア）。同時に、クエン酸を抗凝固剤として用い、感作された動物から日を追って採血して血漿を調製し、そのＴＡＴレベルを測定した。
【００４８】
血漿は、静脈血９容に０．１１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液１容を加え、混和後約３０００ｒｐｍで１０分遠心分離して血漿を採取することにより調製した。
【００４９】
ＴＡＴの測定にはヘキストジャパン社から販売されているキット、エンザイグノストTAT microを用い、添付されている説明書に記載された方法に従って行った。概略は以下の通りである。抗トロンビン抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、上記キットに添付されたＴＡＴ標準血漿及びＴＡＴコントロール血漿、並びに検体のそれぞれの５０μｌを入れ、軽く振盪した。付属のカバーシールで各ウェルを覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。その後カバーシール除去し、各ウェルの反応液を吸引した後、添付の洗浄液を各ウェルに約０．３ｍｌずつ加え、再度吸引する洗浄操作を三回繰り返した。その後添付のペルオキシダーゼ標識ＡＴIII抗体液の２００μｌを標識抗体希釈液１バイアルに加えて作製した標識抗体液を１００μｌずつ各ウェルに加えた。再度各ウェルを付属のカバーシールで覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。カバーシールを除去し、各ウェルの反応液を吸引した後、添付の洗浄液を各ウェルに約０．３ｍｌずつ加え、再度吸引する洗浄操作を三回繰り返した。添付の基質緩衝液１０ｍｌを添付のクロモゲン（1,2-フェニレンジアミン塩酸塩）の１バイアル(250μg)に加え溶解して作製したクロモゲン溶液を、各ウェルに１００μｌずつ加えた。再度添付のカバーシールで各ウェルを覆い、遮光して２０〜２５℃の温度で３０分間インキュベートした。カバーシールを取り除き、添付の反応停止液を各ウェルに１００μｌずつ加えた後、精製水をブランクとして４９２ｎｍにおける各反応液の吸光度を測定した。説明書の記載に従って、標準血漿、コントロール血漿を使用して得た値から標準曲線及び精度を求め、説明書に記載されている条件を満たしていることを確認した後、検体についての測定値を求めた。結果を表１及び図１に示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
ＴＡＴレベル値は感作後８日目から明らかに上昇した。この時期は症状の発現が始まった日の平均値９．６日より早かった。また、ＴＡＴレベル値は症状の改善とともに低下した。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の検出方法によれば、脱髄疾患を臨床症状発現前に早期に診断することができ、また他の神経疾患に対する鑑別診断を行うことができる。さらには本発明の検出方法によれば脱髄疾患の病勢を診断することもできる。また本発明の診断キットによれば、上記の脱髄疾患の早期の診断、鑑別診断、病勢の診断を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ラットに感作物質を投与して脱髄疾患を誘起した際の感作後経過日数とＴＡＴ（トロンビン−アンチトロンビンIII複合体）レベル測定値及び数値化した症状（臨床スコア）の関係を示すグラフである。
【図１】
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