(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の一つまたはいくつかの有機物質を分離するためのクロマトグラフ法において、該サンプル物質を、少なくとも一つの連続的マクロポーラスマトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置に通し、該マクロポーラスマトリックスは、有機モノマーの水／油エマルジョンの高内相エマルジョン系の重合によって製造される架橋有機ポリマーを含み、該エマルジョンは、少なくとも７５重量％の水相を含み、該重合の結果、伝達性流動がマクロポーラスマトリックスを通過することができるオープンポーラス構造が生じ、そうして、該有機物質が互いにおよび／または液体から分離し、マクロポーラスマトリックスの孔は未改変であるか、または伝達性流動が妨害されないような方法で表面を改変することを特徴とする方法。
【請求項２】
有機物質が、クロマトグラフ装置において低い背圧で互いに分離し、理論的棚段数は広い範囲の線速度にわたって高く、物質の移動がマトリックス孔での伝達性流動によって駆動されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該エマルジョンが少なくとも９０重量％の水相を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフ装置が２以上のマトリックスを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
架橋有機ポリマーが、疎水性モノマーと架橋剤との遊離ラジカル重合によって製造されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
モノマーがスチレン／ジビニルベンゼンであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
モノマーがアルカンジオールアクリレートによって架橋される疎水性アクリレートまたはメタクリレートモノマーであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
マクロポーラスマトリックスの孔の直径が０．５〜１００μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
マクロポーラスマトリックスが、孔の直径が３〜２５μｍである球状の孔および孔の直径が０．５〜１５μｍである連結孔を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水／油エマルジョンの油相が溶媒を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポーラスマトリックスの孔の表面を、孔の閉塞や充填が生じないように薄層で改変して、伝達性流動がポーラスマトリックスを通過できるようにすることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
薄層が２μｍ未満であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
孔の表面をイオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドまたはアフィニティーリガンドで改変することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
孔の表面を物理的吸着または架橋可能な親水性ポリマーの共有結合によって改変することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
親水性ポリマーを、イオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドまたはアフィニティーリガンドによって誘導体化することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
有機物質が逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
有機物質がタンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、細胞またはウイルスなどの生物分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
装置がカラムであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも一つの連続的マクロポーラスマトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置において、マクロポーラスマトリックスが、有機モノマーの水／油エマルジョンの高内相エマルジョン系の重合によって製造される架橋有機ポリマーを含み、該エマルジョンが、少なくとも７５重量％の水相を含み、該重合の結果、伝達性流動がマクロポーラスマトリックスを通過することができるオープンポーラス構造が生じ、マクロポーラスマトリックスの孔は未改変であることを特徴とする装置。
【請求項２０】
少なくとも一つの連続的マクロポーラスマトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置において、マクロポーラスマトリックスが、有機モノマーの水／油エマルジョンの高内相エマルジョン系の重合によって製造される架橋有機ポリマーを含み、該エマルジョンが、少なくとも７５重量％の水相を含み、該重合の結果、伝達性流動がマクロポーラスマトリックスを通過することができるオープンポーラス構造が生じ、マクロポーラスマトリックスの孔は、伝達性流動が妨害されないような方法で表面が改変されていることを特徴とする装置。
【請求項２１】
該エマルジョンが少なくとも９０重量％の水相を含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２２】
クロマトグラフ装置が２以上のマトリックスを含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２３】
架橋有機ポリマーが、疎水性モノマーと架橋剤との遊離ラジカル重合によって製造されることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２４】
モノマーがスチレン／ジビニルベンゼンであることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
モノマーがアルカンジオールアクリレートによって架橋される疎水性アクリレートまたはメタクリレートモノマーであることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
マクロポーラスマトリックスの孔の直径が０．５〜１００μｍであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２７】
マクロポーラスマトリックスが、孔の直径が３〜２５μｍである球状の孔および孔の直径が０．５〜１５μｍである連結孔を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
水／油エマルジョンの油相が溶媒を含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２９】
ポーラスマトリックスの孔の表面を、孔の閉塞や充填が生じないように薄層で改変して、伝達性流動がポーラスマトリックスを通過できるようにすることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項３０】
薄層が２μｍ未満であることを特徴とする、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
孔の表面をイオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドまたはアフィニティーリガンドで改変することを特徴とする、請求項２９に記載の装置。
【請求項３２】
孔の表面を物理的吸着または架橋可能な親水性ポリマーの共有結合によって改変することを特徴とする、請求項２９に記載の装置。
【請求項３３】
親水性ポリマーを、イオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドまたはアフィニティーリガンドによって誘導体化することを特徴とする、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
装置がカラムであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、液体サンプル中の一つまたはいくつかの有機物質を、クロマトグラフ装置に該サンプル物質を通すことにより分離するクロマトグラフ法、およびその分離のためのクロマトグラフ装置に関する。特に、本発明は、クロマトグラフ装置での分離法および連続的マクロポーラス有機マトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置に関する。分離媒体は、高内相エマルジョン系の重合によって製造する。
【０００２】
現代のバイオ技術で広く使用されている分離技術の通常の型は、カラムクロマトグラフィーである。クロマトグラフ分離は、粒状ビーズから成るマトリックスを充填したカラムに液体を通すことにより行う。例えば種々のタンパク質の混合物であり得るサンプルをカラムの上から導入すると、カラムの中を流れとともに移動する。タンパク質または物質は、性質、例えば電荷、大きさ、疎水性などが異なるため、異なって遅延され、従って分離されるようにマトリックス上で遅延される。
【０００３】
分離は、迅速で、しかも異なる物質の互いの分解が十分に行える分離を得るためには、動力学が速く、バンドの広がりが小さいのが望ましい。これを達成するために、ビーズ内外での物質の拡散輸送は最少でなければならない。なぜならば、拡散輸送は、バンドの広がりを招き、従って、分解能の低下になるからである。バンドの広がりの影響は、流速の増加および粒径の増加とともに増大する。これらの影響のため、高性能クロマトグラフィー媒体の製造者らは、ビーズの大きさを小さくすべく努めている。しかし、小さいビーズは、他の問題を引き起こす。特に、より小さいビーズの充填は、充填床の粒子間の伝達性流動溝が狭くなるため、背圧はより高くなる。この背圧の増大を埋め合わせるために、より短いカラムの使用が可能であるが、それは一般に分離能の低下となり、あるいは、カラムおよび流体ポンプを、より高い圧力に耐えるように再設計することもできるが、これは、コストがかかる。また、粒状マトリックスから完全に充填されたカラムを作ることは困難かつ高価である。
【０００４】
ビーズ内外での拡散輸送に伴う問題を解決するために、連続的ポーラスプラグとして形作った固定床を使用することが示唆されている。WO 90/07965は、ポリマー鎖が互いに速状に接着し、束の間に隙間または溝が形成されるようにモノマーのバルク重合によって形成される連続した密着ゲルプラグを開示している。その後の発表で、この特許出願の発明者は、このプラグが、圧力をかけるとしぼむため、クロマトグラフィーには使用できないことを述べている。その代わりに、その発明者は、ゲルプラグを10〜15倍に圧縮することを勧めている。圧縮は、プラグの溝を不均一にし、非常に高い背圧を生じるであろう。
【０００５】
米国特許第5,334,310号は、直径が約200nm未満である小孔および直径が約600nmより大きい大孔を含む連続的マクロポーラスポリマープラグに関する。ポーラスプラグは、porogenの存在下でビニルモノマーをバルク重合することにより製造する。分離能が非常に高く、製造が容易であり、モノマー化学物質の選択における融通性が、カラムに含まれるプラグに対して挙げられる利点である。プラグにおける孔の構造が不規則であり、孔の中央サイズがかなり小さいために、このプラグもまた、比較的高い背圧で分離を生じる。
【０００６】
従って、さらに改善されたクロマトグラフ分離法およびそのためのクロマトグラフ装置に対する必要性がある。
【０００７】
すなわち、本発明の目的は、改善されたクロマトグラフ分離法および上記した欠点のない分離媒体を有するクロマトグラフ装置を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、クロマトグラフ分離法および速い動力学、高い効率、良好な機械的特性を有し、背圧の低い媒体を含む装置を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、大きい生物分子または凝集体の分離に特に適した分離法および媒体を得ることである。
【００１０】
本発明の目的は、請求の範囲に記載したクロマトグラフ分離法およびクロマトグラフ装置により達成される。本発明によれば、液体サンプル中の一つまたはいくつかの有機物質を分離するためのクロマトグラフ法が得られ、該方法では、少なくとも一つの連続的マクロポーラスマトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置に該サンプル物質を通す。マクロポーラスマトリックスは、有機モノマーの水／油エマルジョンの高内相エマルジョン系の重合によって製造される架橋有機ポリマーを含む。エマルジョンは、少なくとも75重量％の水相を含み、重合の結果オープンポーラス構造が生じ、伝達性（convective）流動がマクロポーラスマトリックスを通過することができ、それによって、該有機物質が互いにおよび／または液体から分離する。マクロポーラスマトリックスの孔は未改変であるか、または、伝達性流動が妨害されないような方法で表面を改変することができる。
【００１１】
さらに本発明によれば、少なくとも一つの連続的マクロポーラスマトリックスを分離媒体として含むクロマトグラフ装置が得られる。マクロポーラスマトリックスは、有機モノマーの水／油エマルジョンの高内相エマルジョン系の重合によって製造され、該エマルジョンは、少なくとも75重量％の水相を含み、該重合の結果、伝達性流動がマクロポーラスマトリックスを通過することができるオ−プンポーラス構造が生じる。マクロポーラスマトリックスの孔は未改変であるか、または、伝達性流動が妨害されないような方法で表面を改変することができる。
【００１２】
高内相エマルジョンのモノマーの重合によるマクロポーラスマトリックスの製造により、有機物質がクロマトグラフ装置において低い背圧で互いに分離し、広範囲の線流速にわたって理論的棚段数（plate number）が高く、物質輸送がマトリックス孔での伝達性流動によって駆動される方法が得られる。水とモノマーとの内相比が高い水／油エマルジョンの重合によるポリマー物質の製造は、かなり前から公知である。ドイツ特許第1160616号および同第1494024号は、水／油型の高内相エマルジョンの重合による、物質を単離するためのポーラスポリマーの製造を開示している。エマルジョンの水含量は98％まで可能である。
【００１３】
EP 60138は、密度が低く、吸光度が高い架橋ポリマー物質に関する。その物質は、水／油エマルジョンからのビニル重合によって製造され、該エマルジョンは、少なくとも90重量％の水を含む。これらの特許はいずれも、クロマトグラフィーに関するものではない。EP 288310は、ゲル物質を充填したポーラス架橋ポリマー物質を含む基質に関する。ポリマー物質は、EP 60138に記載の高内相エマルジョン法によって製造する。その基質はペプチド合成に使用するものであるが、クロマトグラフィーも可能な使用分野として言及されている。しかし、ペプチド合成はゲル上で行われ、架橋ポリマー物質の機能は、ゲルを包囲するための硬質な枠としてのものである。そのポリマー物質がクロマトグラフィーにおける固定相として使用できることの開示も実施例もない。そのような物質のプラグのカラムクロマトグラフィーにおける固定相としての利点に関する情報はほとんどない。これに対して、EP 60138に開示された発明は、連続マトリックスをクロマトグラフィーに対して使用する方法においては、機能しないであろう。なぜならば、そのゲル充填孔では、マトリックスでの伝達性流動が可能でないからである。EP 288310では、基質を粒状形で使用している。物質は粉砕してカラムに充填する。その場合、序論で述べた充填カラムに伴う欠点がやはり生じる。
【００１４】
本発明に係る方法およびクロマトグラフ装置での改善点は、マクロポーラス架橋有機ポリマーに関する。ポリマーは、いわゆるＨＩＰＥ法（高内相エマルジョン法）で製造する。この方法によれば、多量の水が油相であるモノマー相で乳化される。水相は、所望により、１以上の溶解した塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどを含むことができる。エマルジョンは、モノマー／水組成物に対して少なくとも75重量％の水を含み。好ましくは、エマルジョンは少なくとも90重量％の水相を含む。エマルジョンの重合の結果、非常にオープンで規則的な三次元構造の物質が得られる。そのポリマー構造では、泡様のオープンな孔構造が、球状の空洞によって作られ、球の間には連結孔を有し、その結果、連続した隙間または孔相がマトリックス全体に形成される。この構造は、固体含量が数％と低いが、機械的特性は非常に良好である。マトリックスのオープン構造により、高い流速においてすら、非常に低い背圧での伝達性流動が可能である。
【００１５】
本発明に係るクロマトグラフ装置のマトリックスに対して、例えば米国特許第5,334,310号でマトリックスの製造に対して使用されているporogenとのバルク重合は、クラスター集合体で構成されるより不規則な構造を生じる。こうして、しばしば、２種類の別々の孔である通過流動孔および分離孔が得られる。通過流動孔は、集合体間の隙間であり、分離孔は、集合体中の孔である。このマトリックスは機械的強度が低く、マトリックス含量は高くて少なくとも30体積％であり、背圧はかなり高くて、通常はＨＩＰＥ法によって製造されるマトリックスより10〜50倍高い。
【００１６】
高内相水／油エマルジョンを得るために、油相中のモノマーは疎水性でなければならない。マトリックスの架橋ポリマーは、通常は、疎水性モノマーと架橋剤との遊離ラジカル重合によって製造する。適切なモノマーは、１以上のアルケン基、すなわち置換または非置換のビニル基（一官能性、二官能性および多官能性ビニルモノマー）を含む。好ましいモノマーとしては、スチレンモノマーの誘導体；ビニルベンゼン；ドデシルメタクリレート、オクタデシルメタクリレート、パーフルオロアルキルアクリレートなどの疎水性アクリレートまたはメタクリレートモノマー；アクリルアミドの誘導体；およびグリシジルメタクリレートなどの官能基を含むモノマーが挙げられる。架橋剤としては、二または多官能性ビニルモノマー、例えばジビニルベンゼン；アルカンジオールアクリレートまたはメタクリレート、例えばエチレングリコールジメタクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、ヘキサンジオールジメタクリレートおよびトリメチロールプロパントリメタクリレートを使用することができる。
【００１７】
マクロポーラスマトリックスのクロマトグラフ品質は、孔の構造に依存する。孔の大きさの変化は、表面積、理論的棚段数、圧力−流動特性などに影響を及ぼす。乳化剤の選択および量は、孔の構造に対して重要である。エマルジョンには、常に、水および油相とともに逆エマルジョンを提供する乳化剤を含ませる（DE-A-1160616およびEP-A-60138を参照）。適切な乳化剤は、Ｃ10-25カルボン酸の糖アルコールとのモノエステルならびに親水性および疎水性の両方を含むブロックコポリマー、例えばソルビタンモノオレエートおよびポリエチレングリコールポリヒドロキシステアリン酸である。適切なエマルジョンに対する乳化剤の量は、通常は、油相に対して0.5〜30重量％の範囲内である。
【００１８】
孔の大きさに影響を及ぼす別の重要なパラメーターは、エマルジョンの水含量である。その含量が約90％〜95％に増加すると、孔の大きさが増大してよりオープンな構造のマトリックスになる。一般に、マトリックスの孔の直径は、約0.5〜100μmである。好ましくは、マクロポーラスマトリックスは、孔の直径が3〜25μm、最も好ましくは5〜25μmである球状の孔および孔の直径が0.5〜15μmである連結孔を含む。
【００１９】
エマルジョンは、モノマー、乳化剤および、油溶性のものを使用する場合は開始剤を混合することにより製造する。そうでない場合は、水溶性の開始剤を水に溶解する。油相が均一になると、水にゆっくり添加する。混合物は激しく攪拌する。エマルジョンを鋳型に入れ、好ましくは温度を上げて、重合を開始する。エマルジョンは、室温で製造できる。重合温度は、重合工程中に変えることができるが、温度は、エマルジョンが消えないように制御することが重要である。一般に、温度は、少なくとも10℃〜水の沸点および他の成分の沸点以下、通常は90℃以下を保持すべきである。適切には、エマルジョンを最初に一つの温度で保持して重合させ、その後、温度を上げて、生成物をさらに硬化させることができる。
【００２０】
重合は、通常のラジカル開始剤によって開始することができる。開始剤は、水溶性でも油溶性でもよい。開始剤の例としては、アゾ化合物（油溶性）、疎水性過酸化物（油溶性）、過安息香酸塩（油溶性）、過硫酸塩（水溶性）、種々のレドックス系、例えば、過酸化水素＋水（フェントン(Fenton)試薬、水溶性）またはアニリン＋過酸化ベンゾイル（油溶性）が挙げられる。
【００２１】
重合は、ＵＶ放射、γ線放射、電子ビーム放射などによっても開始できる。重合の後、ポリマーマトリックスを洗浄し、クロマトグラフ分離装置で使用する。分離装置は、種々の形状および様式にすることができる。装置は、マトリックスを含むホルダーの形状であってもよく、または、マトリックスを自ら支える形状であってもよい。ホルダーの例としては、カラム、充填ピペット先端、スポイト、螺旋形、チューブなどが挙げられる。自ら支える装置としては、例えば、スラブ形状、マイクロタイタープレート、および中空シリンダーが挙げられる。装置の好ましい実施態様は、一つまたはいくつかのマトリックスを含むカラムである。
【００２２】
液体は、ポンプ、吸引、遠心力または重力によりマトリックスを通過させることができる。
【００２３】
マトリックスは、鋳型で直接、所望の形態に形作ることができ、または、重合の後、切断したり、穴をあけたり、のこぎりでひいたりして所望の形、例えばプラグ、シリンダー、レンガ様、シート、平板、プレートまたはスラブに形作ることができる。
【００２４】
分離装置は、少なくとも一つのマトリックスを含むが、同一装置に２以上のマトリックスを使用して分離媒体の長さを延長したり、異なる機能を有するマトリックスを互いの上に重ねることが可能である。マトリックスの大きさは、装置の寸法に依存し、短い毛細管から、直径が1m、床高さが2mまでの非常に大きいカラムまで変わり得る。
【００２５】
マトリックスの適する形態はシリンダーであり、それを、空のカラムに挿入する。マトリックスの直径は、使用するカラムの直径よりもわずかに大きくすべきである。マトリックスをカラムに押し込み、カラム壁に対して確実に密着するようにする。そうすることにより、マトリックス全域にわたって流動が得られる。このマトリックス製造法は、毛細管カラム以外の全ての種類のシリンダーカラムに対して好ましい。一般には、米国特許第5,334,310に記載されているように、マトリックスをカラムで直接鋳造することは適切でない。なぜならば、ポリマーマトリックスは、洗浄中に収縮するからである。この結果、マトリックスとカラム壁との間に漏れが生じ得る。
【００２６】
本発明によれば、カラムそのものは通常のどんなカラムであってもよく、材料、形および大きさは広範囲で変えられる。カラムチューブは、実質的に硬質であるべきであり、例えば、ステンレス鋼もしくはチタンなどの金属、ガラスまたは硬質ポリマーから作ることができる。しかし、伝統的な粒状媒体に対して設計された普通のカラムのアダプターおよび拡散機は、サンプルをマトリックスの全域に対して分布させるためにマトリックスからの背圧を必要とするので、通常は、本発明の使用にあまり適さない。本発明に係るマトリックスは、多孔性が高く、背圧をほとんど生じない。サンプルのマトリックスでの放射状拡散は非常に限られているので、サンプルは、マトリックスの先端表面に入る前に、完全に分散していなければならない。そうでないと、流動は、マトリックス体積のより小さい部分を通過するのみである。カラムの上部における、中央の入口および拡散機コーンを有するアダプターは、サンプルをマトリックス全体に分散させるので、好ましい。底部では、アダプターをいわゆる環状拡散機にすることができ、所望により、支持ネットを有するものにする。アダプターの適切な配置は、PCT/SE95/00632に開示されている。
【００２７】
非常に狭いカラム、すなわち毛細管カラムの場合は、プラグをカラムで直接鋳造することが可能である。毛細管カラムとは、直径が約2mm未満であり、長さが約10〜10000cmであるカラムを意味する。毛細管カラムは、洗浄の後ですら重合物質に接着する毛細管材料から作ることができる。これにより、マトリックスと毛細管壁との間の隙間の形成が阻止され、流動が毛細管の横断面全体にわたって確実に通過する。すなわち、スチールから作った毛細管は、良好な接着性を付与し、マトリックスは、そのような毛細管において直接鋳造され、有機分子を分離することができるが、チタンから作った毛細管では、マトリックスと壁との間に隙間が形成され、従って、分離が損なわれることが分かった。
【００２８】
カラムはまた、例えばテフロン（登録商標）管材料から成る鋳型で作り、次の工程で、自由に位置する毛細管を収縮管材料に移動させ、および／またはポリマー樹脂を毛細管の周りに入れて、マトリックスとカラム壁との間に流動の通過が確実に生じないようにすることもできる。
【００２９】
本発明方法によれば、分離は、非常に低い背圧で、かつ高い理論的棚段数を有して行うことができる。低い背圧は、1000cm／時の線速度で0.02〜2バール／cmカラム長さを意味する。高い理論的棚段数とは、約2000〜100,000理論棚段数／mを意味する。
【００３０】
本発明のさらに別の実施態様は、マトリックス壁内に第二の孔構造を有するマトリックスを含むカラムでの分離である。この構造は、溶媒を水／油エマルジョンの油相に添加することにより製造する。作られる第二の孔構造の程度および大きさは、溶媒の選択によって制御する。この方法により、表面積は、例えば、10m2/g〜約500m2/gまで増加させることができる。クロマトグラフ性能は、いくつかの適用、例えばペプチドの逆相分離の場合は、第二の孔構造の導入によって改善されるが、材料の機械的安定性は低下する。２種類の溶媒を使用することができる。一方は、生成したポリマーに対する溶媒であり、生成したポリマー網を膨潤させることにより作用する。得られる孔は非常に小さく、通常は500Å未満である。他方は、モノマーに対する溶媒であるが、ポリマーを沈殿させ、いわゆるporogenである。重合中、porogenとポリマーとの間には相分離がある。得られる孔の大きさは、通常、500Å〜10000Åの範囲内である。本発明に係るマトリックスの製造に対する溶媒の選択は、懸濁法による多孔性粒子と比較して異なる。後者の場合は、いくつかの高級アルコールまたはカルボン酸を使用するのが普通である。しかし、これらのporogenは表面活性能を有し、エマルジョンの安定化を破壊する。高内相エマルジョンに対して適切なporogenは、脂肪族および芳香族炭化水素、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−ドデカンおよびトルエンである。
【００３１】
本発明に係る方法のさらに別の側面によれば、ポーラスマトリックスの孔は、孔に閉塞または充填が生じないように表面を薄層で改変して、伝達性流動がポーラスマトリックスを通過できるようにする。好ましくは、薄層は2μm未満であり、最も好ましくは0.0005〜0.5μmである。適切には、孔の表面をイオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドもしくはアフィニティーリガンドで改変し、または、架橋することのできる親水性ポリマーの物理的吸着もしくは共有結合により改変する。その場合、親水性ポリマーは、イオン交換リガンド、疎水性リガンド、キレーティングリガンドまたはアフィニティーリガンドによって誘導できる。適する親水性ポリマーとしては、とりわけ、フェニルデキストラン、アリルデキストラン、アガロースおよびそれらの誘導体、水溶性セルロース誘導体、澱粉誘導体、ならびに、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、ポリ（ヒドロキシエチルビニルエーテル）およびその誘導体、ポリエチレングリコール、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリアクリル酸、ポリ（ビニルＮ−ビロリドン）およびポリアクリルアミドなどの水溶性合成ポリマーが挙げられる。
【００３２】
本発明に係る方法および装置は、あらゆる種類の有機分子の分離に使用できるが、好ましくは、生物分子の分離、特に分子量が10,000,000ダルトン以上の大きい生物分子または集合体の分離に使用できる。なぜならば、マトリックスの大きい孔は、10,000,000ダルトンまでの分子量を有する非常に大きい分子ですら排除しないからである。そのような分子の例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、細胞またはウイルスが挙げられる。本発明に従って使用されるマクロポーラスマトリックスは、表面の疎水性が高く、逆層クロマトグラフィーに非常に適切である。しかし、上記したように、表面は改変することができ、その場合、マクロポーラスマトリックスは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの他の通常の液体クロマトグラフ法で使用することができる。
【００３３】
次に、本発明を以下の実施例により説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。実施例の結果は、図に示す。図１は、実施例５の５種類のペプチドのＲＰＣ分離に関する。図２は、実施例６の５種類のタンパク質のＲＰＣ分離に関する。図３は、実施例７の４種類のタンパク質のイオン交換クロマトグラフィー分離に関する。図４は、実施例１０の５種類のペプチドのＲＰＣ分離に関する。図において、AUは吸光度を意味する。
【００３４】
連続マトリックスの流動特性および棚段数
実施例１〜４：
マトリックスの合成
0.3gの開始剤２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を、Hypermer（登録商標）B261（ICI）およびソルビタンモオレエート（Fluka製のSPAN（登録商標）80）の界面活性剤とともに、13gのスチレンおよび13gのジビニルベンゼンから成る油相に溶解した。油相を、攪拌機を備えた500mlの反応器に移した。攪拌速度を500rpmにセットし、水をゆっくり添加した（2〜4ml／分）。水が全部添加されると、攪拌をさらに15分続けた。
【００３５】
次いで、粘性の高い水／油エマルジョンを、テフロン被覆した225mlの鋳型に移し、これを50℃で16時間加熱し、次いで、70℃でさらに24時間加熱した。重合した連続マトリックスを鋳型から取り出し、ゴム管材料とともにカラムに壁に沿って移した。加圧空気を使用して管材料を膨張させ連続マトリックスに対して押しつけた。マトリックスは最初に３カラム体積のアセトンで、次いでアセトン→水勾配により10カラム体積で、最後に３カラム体積の水で洗浄した。洗浄中、マトリックスは収縮するが、膨張した管材料により、洗浄工程中、マトリックスはカラムに対して確実にぴったりフィットしている。
【００３６】
次いで、マトリックスを、直径がカラムの直径よりも約0.05％大きい、寸法の異なる２個に切り取った。すなわち、
ａ）直径16mm、長さ50mm（16/50）
ｂ）直径35mm、長さ10mm（35/10）
形作ったマトリックスを、各々直径が16mmおよび35mmのカラムに押し入れた。国際特許出願SE95/00632に示されているように、流動分布の取り付けおよび設計は、高棚段数の達成にかなり重要である。
【００３７】
孔の大きさおよび固体含量の異なるマトリックスを、モノマー含量および乳化剤組成物を変えることにより作った。空洞および連結孔の大きさは、走査電子顕微鏡から推定した。
【００３８】
式Ｎ＝16（ｔr／ｗ）2／Ｌ（Ｎは棚段数であり、ｔrは溶離体積（ml）であり、ｗは基線でのピークの幅（ml）であり、Ｌはカラムの長さである。）を使用して、棚段数を、ＵＶモニターを備えたPharmacia FPLCTM液体クロマトグラフィー系において、0.5MのＮａＣｌを緩衝液として使用し、0.5MのＮａＣｌにおける50μｌのＮａＮＯ3のパルスから計算した。
【００３９】
マトリックスは一般に、非常に良好な流動特性および高い棚段数を示した。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
0003925872.tif 000002
【００４１】
空のカラムでの流動測定により、16/50のカラムの場合は、３バールで20,000cm／時の線速度が得られ、35/10のカラムの場合は、5000cm／時の線速度が得られた。
【００４２】
逆相連続マトリックスを使用したペプチド分離
【００４３】
実施例５：
水／油エマルジョンを実施例１と同様に作った。わずかに円錐形のＨＤＰＥ（高密度ポリエチレン）カラム（直径１cm）に、粘性の高いエマルジョンを充填し、次いで50℃で一夜、70℃でさらに24時間加熱した。カラムをアセトンおよび水で完全に洗浄した。
【００４４】
直径5.5mm、高さ10〜15mmのシリンダーをマトリックスから切り取り、ＨＲ5/5カラム（Pharmacia Biotech）に押し入れた。いくつかのシリンダーを同一のカラムにおいて互いの上におき、全長を5cmとした。そのカラムを、緩衝液Ａにおける0.125％のトリフルオロ酢酸水溶液および緩衝液Ｂにおける0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水の90/10混合物とともにFPLCTM液体クロマトグラフィー系に取り付けた。
【００４５】
12.5μlの５種類のペプチド（Val5アンギオテンシンII、アンギオテンシンIII、アンギオテンシンＩ、インスリンＢ鎖（以上、Sigma製）およびHGRF 1-29（Pharmacia Biotech製））を含む25μlのサンプル混合物をカラム上に充填した。サンプルを5％→45％勾配のＢ緩衝液で20カラム体積にわたって溶離した。流速は1ml／分であった。混合物は５つのピークに分離し、最後の３つは基線から分解したが、最初の２つは、互いに完全には分離しなかった。図１参照。
【００４６】
実施例６：
連続16/50カラムを実施例１と同様に作り、Pharmacia LKB HPLC系に取り付けた。0.5mgの５種類のタンパク質（リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、アルブミンおよぶｂ−ラクトグルブリン（以上、Sigma製））を含む100μlの混合物をカラムに載せて、18％→54％勾配のアセトニトリルにより２カラム体積で溶離した。流速は10ml/分であった。タンパク質は、十分分離した５つのピークに２分未満で溶離した。図２参照。
【００４７】
イオン交換連続マトリックスを使用したタンパク質の分離
実施例７：
連続マトリックスを含む16/50カラムを実施例1と同様に作った。２重量％にフェニルデキストラン（分子量500,000、置換度：0.2フェニル基／単糖）を含む水溶液をポンプにより4ml／分で16時間カラムに通した。カラムを４カラム体積の水で洗浄した。
【００４８】
Ｔ連結を通じて、2ml／分の2M水酸化ナトリウムおよび2ml／分の35％塩化グリシジルトリメチルアンモニウムを混合し、ポンプによりカラムに４時間通した。次いで、そのカラムを10カラム体積の純水および５カラム体積の1M塩化ナトリウムで洗浄した。
【００４９】
得られたイオン交換カラムのイオン容量は、5.6μmole Ｃｌ−／mlマトリックスであった。
【００５０】
動的容量は、FPLCTM液体クロマトグラフィー系および1mgのＢＳＡ／ml緩衝液（50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む、ｐＨ８）を使用して、ＢＳＡによるブレークスルー曲線を追跡することにより測定した。動的容量は、流速に依存しないことが分かった。300および1000cm／時の両方に対して5mgＢＳＡ／mlであった。
【００５１】
10mMのピペラジンにおける0.5mgのトランスフェリン、1.0mgのオボアルブミンおよび1.0mgのラクトグロブリン（ＡおよびＢ）を含む混合物（ｐＨ６）の分離を、0→0.3M勾配の塩化ナトリウムによる９カラム体積にわたる溶離を行うことにより行った。タンパク質は良好な分解能で分離し（図３）、その分解能は、300〜1500cm/時の広い流速範囲にわたって保持された。
【００５２】
連続ＲＰＣ媒体としてのアクリレートマトリックス
実施例８：
0.15gのV-65（登録商標）（アゾビス（ジメチルバレロニトリル）、1.1gのSPAN（登録商標）80、0.35gのHypermer（登録商標）B261を、250mlのビーカー中6.5gのオクタデシルメタクリレートおよび6.5gのエチレングリコールジメタクリレートに溶解した。130gの水を攪拌しながら10分間にわたって滴下した。直径が1cmのわずかに円錐形のＨＤＰＥカラムに粘性の高い内相エマルジョンを充填した後、50℃で一夜、70℃でさらに24時間加熱した。カラムをアセトンおよび水で十分に洗浄した後、直径5mmのプラグを、充填したＨＤＰＥカラムから切り取った。プラグをＨＲ5/5カラムに押し込み、実施例５と同様のペプチド分離を行うと、だいたい同じ分解能および選択性が得られた。
【００５３】
連続ＲＰＣ媒体としての過フッ素化マトリックス
実施例９：
4.8gのヘキサデカフルオロデシルメタクリレート、8.2gの工業的純度のジビニルベンゼン（60％）、0.15gのV-65、1.1gのソルビタンモノオレエートおよび0.35gの非イオン性ポリマー界面活性剤（Hypermer B261）の溶液を調製した。130gの水を10分間で添加し、400rpmのCollomixer攪拌機プロペラによって有機相中にて乳化した。粘性エマルジョンをＨＤＰＥ容器に注入し、50℃で24時間重合させた。固体のプラグが形成され、その上端および卞端を整えた。次いで、多孔性プラグを、アセトンおよび水により、ポンプで連続的にその材料に通すことにより洗浄した後、充填ＨＤＰＥカラムから直径5mmのプラグを切り取った。プラグをＨＲ5/5カラムに押し入れ、実施例５と同様のペプチド分離試験を行うと、だいたい同じ分解能および選択性が得られた。
【００５４】
ＲＰＣ媒体としての表面積の大きい連続マトリックス
実施例１０〜１１：
0.19gのSPAN 80、0.06gのHypermer B261、2.24gのジビニルベンゼン（65％）、2.24gのスチレン、0.05ｇのアゾビスジメチルバレロニトリルおよび有機溶媒を250mlのビーカーで混合し、46gの水を、磁気攪拌機で攪拌しながら滴下した。直径が1cmのわずかに円錐形のＨＤＰＥカラムに粘性の高い水／油エマルジョンを充填し、50℃で一夜、70℃でさらに24時間加熱した。カラムをアセトンおよび水で十分に洗浄した後、直径5.5mmのプラグをカラムから切り取った。
【００５５】
表面積の測定を、窒素吸着（ＢＥＴ法）によって行い、有機溶媒の添加により表面積が増大することが分かった。
【００５６】
【表２】
0003925872.tif 000003
【００５７】
プラグを実施例５と同様にＨＲ5/5カラムに押し入れ、同じペプチド分離を行うと、実施例１０および１１とも、実施例５の表面積の小さいマトリックスと比較して、改善された分解能が得られた。図４参照。
【００５８】
収縮材料中の連続マトリックス
実施例１２：
逆エマルジョンを、実施例１の方法に従って製造した。スポイトを使用して、直径5mm、長さ115mmのガラスカラムにそのエマルジョンを充填した。管材料を50℃で一夜、次いで70℃でさらに３時間加熱した。管材料をアセトンおよび水で洗浄すると、連続マトリックスチューブの直径が4.85mmに収縮した。マトリックスをテフロン被覆から取り出した後、収縮管材料ＦＩＴ−221（ELFA製の架橋ポリオレフィン）に入れ、120℃に加熱すると、マトリックスチューブの周りにぴったりフィットするように収縮した。マトリックスを含む収縮管材料を別の収縮管材料に入れて一端を密封した後、エポキシ鋳型（Sikema製のPermabond（登録商標）E27）を充填し、50℃で１時間硬化した。
【００５９】
硬化したエポキシ鋳型の強度は、マトリックスと管材料の内壁との間に漏れを生じることなく、1ml／分までの流動を可能とするのに十分であった。分離を実施例５と同様のペプチド混合物に対して行うと、分解能および選択性に関して同様の結果が得られた。
【００６０】
長い毛細管での連続マトリックス
実施例１３：
逆エマルジョンを、実施例１の方法に従って製造した。スポイトを使用して、長さ2100mmのスチール製毛細管（内径0.75mm）にそのエマルジョンを充填し、50℃で一夜、次いで70℃でさらに３時間加熱することにより重合させた。
【００６１】
次いで、連続マトリックスを含むスチール製毛細管を、0.1％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルで洗浄した。この毛細管で鋳造すると、マトリックスは、収縮することなく洗浄することができた。マトリックスの収縮は隙間を形成し、マトリックスと毛細管の内壁との間に流動の通過を引き起し、従って、分離の乱れが生じる。
【００６２】
SMARTTM液体クロマトグラフィー系（Pharmacia Biotech）において、実施例５と同様のペプチドを、アセトニトリルによる勾配溶離により分離すると、分解能は、実施例５で得られたよりもわずかに小さかった。カラムがたとえ非常に長くかつ狭くても、背圧は、1400cm／時の流速で30バールと比較的低いレベルをなおも保持した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実施例５の５種類のペプチドのＲＰＣ分離に関する。
【図２】実施例６の５種類のタンパク質のＲＰＣ分離に関する。
【図３】実施例７の４種類のタンパク質のイオン交換クロマトグラフィー分離に関する。
【図４】実施例１０の５種類のペプチドのＲＰＣ分離に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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