(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードする遺伝子：
(a)配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された改変されたアミノ酸配列からなり、且つ腫瘍細胞成長抑制活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝子：
(a)配列番号：３で示される塩基配列からなるDNAおよびこれと相補的な塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号：３で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ腫瘍細胞成長抑制活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
配列番号：２で示される塩基配列のDNAからなる遺伝子。
【請求項４】
請求項１に記載のアミノ酸配列からなる組換え蛋白質。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のDNAからなる組換えDNA。
【請求項６】
請求項５に記載のDNAを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養して産生される組換え蛋白質を採取する組換え蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に結合する抗体。
【請求項１０】
以下の(a)又は(b)の蛋白質を有効成分とする腫瘍細胞成長抑制剤：
(a)配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された改変されたアミノ酸配列からなり、且つ腫瘍細胞成長抑制活性を有する蛋白質。
【請求項１１】
配列番号：２で示される塩基配列または配列番号：３で示される塩基配列を遺伝子検出のための配列番号：２で示される塩基配列または配列番号：３で示される塩基配列の一部断片からなるプローブ又はプライマー。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプローブ又はプライマーを用いて、配列番号：２で示される塩基配列または配列番号：３で示される塩基配列を遺伝子検出する遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの疾患の予防、診断及び治療の指針として有用な遺伝子、より詳しくはヒトＮｉｐ３遺伝子と高い相同性を有する新規なヒト遺伝子に関し、該遺伝子のｃＤＮＡ解析、ｃＤＮＡ染色体へのマッピング、ｃＤＮＡの機能解析等により、該遺伝子を用いた遺伝子診断並びに新しい治療法、例えば癌に対する治療法の開発に利用可能な遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでのヒト遺伝子の解析の結果から、インスリン受容体やＬＤＬ受容体等の各種受容体、細胞の増殖・分化に関わるもの、プロテアーゼ、ATPase、スーパーオキシドディスムターゼのような代謝酵素等の、医薬品開発にとって有用な素材となると考えられる多くの遺伝子が見つかっている。しかしながら、ヒト遺伝子の解析とそれら解析された遺伝子の機能及び解析遺伝子と各種疾患との係わりについての研究はまだ始まったばかりであり、不明な点が多く、更なる新しい遺伝子の解析、該遺伝子の機能の解明、該遺伝子と疾患との係わりの研究、惹いては該遺伝子の利用による遺伝子診断、該遺伝子やその発現蛋白の医薬用途への応用研究等が当業界で望まれている。
【０００３】
Ｎｉｐ３は、細胞死を抑制する分子であるアデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤとヒトＢｃｌ−２蛋白（Boyd, J.M., et al., Cell, 79, 341-351 (1994)）と相互作用しあう細胞質性の蛋白であると報告されている。このアデノウィルスＥ１Ｂの１９ｋＤ蛋白は、ウィルス感染或は外部刺激によって誘導された細胞死を防ぐ作用を有することが、相ついで報告されている（Rao, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 7742-7746 (1992), Debbas, M. and White, E., Genes Dev., 7, 546-554 (1993)）。
【０００４】
また、細胞性ガン原遺伝子Ｂｃｌ−２発現蛋白の活性は、Ｅ１Ｂ１９ｋＤによって証明された細胞死抑制作用に類似している（Tarodi, B., et al., Int. J. Oncol., 3, 467-472 (1993); Huang, D.C.S, et al., Oncogene, 14, 405-414 (1997)）。これらの蛋白の各々の高レベルの発現は、成長因子の欠乏、放射線照射、グルココルチコイドや様々な細胞毒性を有する薬物によって誘導されるアポトーシスを抑制する。そしてこの２つの細胞死抑制蛋白は、機能的に同等であり、アポトーシスを抑制する能力において区別し得ないようである（Huang, D.C.S, et al., Oncogene, 14, 405-414 (1997)）。
【０００５】
ボイドらは、Ｅ１Ｂと相互作用をする蛋白質を検出するために、酵母ツーハイブリッド・スクリーニング法（Boyd, J.M., et al., Cell, 79, 341-351 (1994)）を用いて、１９ｋＤと相互作用する蛋白（Ｎｉｐ１、Ｎｉｐ２、Ｎｉｐ３）と同様に、関連している蛋白をコードする３つのｃＤＮＡ（ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ２、ＢＮＩＰ３）を単離した。ボイドらは、Ｅ１Ｂとこれらの蛋白との直接的な相互作用を証明し、それらの３つの全てにおいて、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ分子に類似のＢｃｌ−２蛋白にあるいくつかのモチーフとも相互作用することを示した。この結果より、Ｅ１Ｂ１９ｋＤとＢｃｌ−２の両者は、異なる物質であるけれども、ある共通の細胞性蛋白と相互作用することによって、細胞の生存を促進することが示唆された。Ｎｉｐ蛋白の生理学的な役割は、未だ不明であるが、それらは抗アポトーシス機能或はアポトーシスを誘導する機能のどちらかを有すると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｎｉｐホモローグをコードする新たな遺伝子、即ちヒトＮｉｐ相同遺伝子を提供することにある。該新たなヒトＮｉｐ相同遺伝子が提供できれば、各細胞でのその発現レベルやその構造、機能を解析でき、またその発現物の解析等により、之等の関与する疾患、例えば癌を含むアポトーシスに関連する病態の解明や診断、治療等が可能となると考えられる。
【０００７】
また、本発明は、上記新規なヒト遺伝子に顕著な相同性を有し、構造的並びに遺伝子発現パターンにおける共通性及びその生物学的機能の類似性により、上記遺伝子のファミリーと認識される一連の新規な関連遺伝子を提供することをも、目的としている。かかる遺伝子が提供できれば、該遺伝子によってコードされる特定領域に相当するアミノ酸配列を有する新規なペプチド及び該ペプチドを有効成分とする医薬を提供することも可能である。
【０００８】
本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ね、以下の知見を得、ここに所望のＮｉｐホモローグをコードする新規な遺伝子ＢＮＩＰ３Ｌのクローニングに成功すると共に、各種癌細胞中への該遺伝子の導入によって、それらが癌細胞の成長抑制作用を有することを見出した。
【０００９】
即ち、本発明者らは、ヒト胎盤組織より抽出したｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これをベクターに組込んでライブラリーを構築し、該ライブラリーでトランスフォームした大腸菌コロニーを寒天培地上に形成させ、該コロニーをランダムにピックアップして９６ウェルマイクロプレートに移し、ヒト遺伝子を含む多数の大腸菌クローンを登録した。
【００１０】
登録した各クローンを少量培養後、ＤＮＡを抽出精製し、抽出したｃＤＮＡを鋳型としてデオキシターミネーター法により４種の塩基特異的に停止する伸長反応を行ない、自動ＤＮＡシークエンサーにより、遺伝子の５’末端から約４００塩基配列を決定した。かくして得られた塩基配列情報について、公知のヒトＮｉｐ遺伝子に類似性を有する新規な遺伝子を検索した。
【００１１】
上記ｃＤＮＡ解析方法については、本発明者のひとりである藤原らによって詳述されている（藤原  力, 細胞工学, 14, 645-654 (1995)）。遺伝子解析によって得られた候補遺伝子は、公知のヒト遺伝子との類似性（相同性）より、その遺伝子産物、即ち蛋白質がどのような機能を有するかを類推することがおよそ可能である。更に、その候補遺伝子を発現ベクターに組込み、リコンビナントを作製して、酵素活性や結合活性等の機能を調べることができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことを特徴とするヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子、該アミノ酸配列をコードする、配列番号：２で示される塩基配列を含むことを特徴とするヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子、並びに配列番号：３で示される塩基配列であることを特徴とするヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子が提供される。
【００１３】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138, 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。また、本明細書において用いられる「ペプチド」なる用語は、その構成アミノ酸数には限定なく、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド及びマクロペプチド乃至蛋白質を包含する。
【００１４】
本発明により提供される遺伝子の利用によれば、該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することができ、該ペプチドを有効成分として含有する医薬、特に、アポトーシスのレギュレーションに起因する各種疾患及び病態処置等、例えば癌に対して使用可能な医薬も提供することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＧＥＮ−５５１Ｄ１２」と名付けられたクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号：３に示される通りである。該遺伝子は、配列番号：１に示すアミノ酸でコードされるヌクレオチド（核酸）のオープンリーディングフレームを有しており、後記実施例に示されるように、ＢＮＩＰ３遺伝子産物とは、Ｎ末端蛋白及びサイズにおいて異なるが、一部領域において高い相同性を持ち、特に膜貫通領域はＢＮＩＰ３との間でよく保存されている。従って、本発明者らはこの新たに単離した遺伝子を、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子と命名した。以下、本発明のヒトＮｉｐ相同遺伝子であるＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子を、「ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子」ということがある。
【００１６】
ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子は、各種組織に発現されるＮｉｐ相同ヒト遺伝子である。該遺伝子が発現する２１９アミノ酸のペプチドからなる予想蛋白は、膜貫通領域を含んでいる。該遺伝子ｃＤＮＡの各種癌細胞への導入によれば、該細胞の有意な成長抑制を生じる一方、該遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡやベクターＤＮＡの導入によれば、そのような効果は示されない。かかる構造的特徴、生理活性、遺伝子発現パターン等を考慮すれば、本発明ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子は、癌抑制因子としての作用を有する膜蛋白の産生遺伝子であると考えられ、これは腫瘍細胞の成長抑制に重要な役割を果たしていると考えられる。
【００１７】
本発明ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子のファミリー遺伝子とは、本発明遺伝子の発現産物であるヒトＢＮＩＰ３Ｌに配列相同性を有する遺伝子産物を発現し得、構造的特徴及び遺伝子発現パターンにおける共通性、生物学的機能における類似性等を有することから、ひとつの遺伝子ファミリーと認識され得る一連の関連遺伝子をいう。尚、上記配列相同性は、通常、アミノ酸配列全体の約５０％以上が同一であることをいう。
【００１８】
本発明遺伝子は、例えば配列番号：１の具体例で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子又は配列番号：２で示される塩基配列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として例示される。しかしながら、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有する遺伝子や上記特定の塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であることができる。
【００１９】
即ち、本発明遺伝子には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された改変されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれらを行ない得る位置は、改変された蛋白質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の機能を有する同効物であること、具体的には腫瘍細胞成長抑制活性を保持することを前提として、特に制限されるものではない。
【００２０】
尚、上記アミノ酸配列の改変（変異）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然の遺伝子（例えば本発明実施例に従って得られる具体例遺伝子）に基づいて人為的に行なわせることもできる。本発明遺伝子には、このような改変の原因及び手段を問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子が包含される。
【００２１】
上記人為的改変手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕、それらの組合せ方法等を例示できる。
【００２２】
また、本発明遺伝子の態様として例示される、配列番号：２で示される塩基配列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子の塩基配列は、上記アミノ酸配列（配列番号：１）の各アミノ酸残基をコードするコドンの一つの組合せ例である。本発明遺伝子は、この組合せに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを選択し、これらを組合わせた各種の塩基配列を有することも勿論可能である。上記コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００２３】
更に、本発明遺伝子は、例えば配列番号：３として示される具体例のように、一本鎖ＤＮＡの塩基配列として表示されるが、本発明はかかる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオオチドやこれらの両者を含むコンポーネントも当然に包含するものであり、ｃＤＮＡ等のＤＮＡに限定されることもない。
【００２４】
加えて、本発明の遺伝子は、前述したとおり、配列番号：３に示される塩基配列と配列相同性を有する塩基配列からなるものをも包含する。かかる遺伝子としては、ストリンジェントな条件で、配列番号：３で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、且つ洗浄しても、これより脱離しないものを挙げることができる。
【００２５】
本発明遺伝子は、本明細書に記載の具体的配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照〕。
【００２６】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより、目的とする本発明遺伝子を得ることができる〔その方法については例えばProc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)等参照〕。
【００２７】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示され、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離、精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従うことができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されており、本発明遺伝子の取得は、それら市販の各種ｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc.）等を利用して行なうこともできる。
【００２８】
本発明遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対する特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示することができる。
【００２９】
ここでプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できるが、勿論、既に取得された本発明遺伝子そのものやその断片を利用することもできる。また、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマーやアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００３０】
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法も好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、殊に ５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等が好適に採用できる。該ＰＣＲ法に用いられるプライマーは、本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、常法に従い合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離、精製は、前述した常法、例えばゲル電気泳動法等に従うことができる。
【００３１】
上記で得られる本発明遺伝子や各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕等に従って、より簡便には市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００３２】
上記の如くして得られる本発明遺伝子は、例えばその一部又は全部の塩基配列を、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の検出に利用することができる。かかる検出は通常の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situ ハイブリダイゼーション等の細胞レベルでのそれら測定法、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕、その他の公知の各種方法により、いずれも良好に実施し得る。
【００３３】
尚、ＰＣＲ法において用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できるものである限り何等限定されず、本発明遺伝子の配列情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常、該プライマーは、２０〜３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。
【００３４】
このように、本発明遺伝子には、本発明に係わるＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子検出用の特異プライマー及び／又は特異プローブとして利用できるＤＮＡ断片もまた包含される。
【００３５】
尚、本発明遺伝子を利用する遺伝子治療或は処置においては、必ずしも本発明遺伝子の全て、即ち全配列からなる遺伝子が必要とされる訳ではなく、本発明に係わる遺伝子の所望機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前述した改変体或は一部配列からなる遺伝子を使用することができる。
【００３６】
本発明遺伝子（ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子）の利用によれば、一般の遺伝子工学的手法により、該遺伝子産物（ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白）乃至これを含むペプチド（以下「本発明ペプチド」ということがある）を容易に大量に安定して製造することができる。該遺伝子工学的手法によれば、所望の本発明ペプチドは、例えば実施例に具体的に示されるヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子及びその配列情報を利用して、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)等参照〕に従い、組換え蛋白として得ることができる。
【００３７】
即ち、本発明ペプチドは、所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより製造することができる。
【００３８】
従って、本発明は、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び該宿主細胞の培養による本発明ペプチドの製法（遺伝子工学的手法）をも提供するものである。
【００３９】
ここで宿主細胞には、真核生物及び原核生物のいずれも包含される。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23, 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77, 4216 (1980)〕等がよく用いられているが、これらに限定される訳ではない。
【００４０】
脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)〕等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 1 (1983)〕等を利用できる。本発明遺伝子の発現ベクターとしては、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく例示できる。該ベクターの具体例としては、例えば分子量２６０００のＧＳＴドメイン（S. japonicum由来）を有するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等を例示できる。
【００４１】
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。これらを宿主とする場合、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に所望遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターも利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトファン(trp) プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を使用できる。
【００４２】
かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により目的の蛋白が生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４３】
上記により、形質転換体の細胞内、細胞外乃至細胞膜上に目的とする組換え蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。
【００４４】
本発明ペプチド（組換え蛋白）は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987) 等参照〕により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。特に好ましい方法としては、本発明ペプチドの特異抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。
【００４５】
尚、本発明ペプチドをコードする所望遺伝子の設計に際しては、配列番号：２で示されるヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子を利用することができる。該遺伝子は、所望により、前記したように各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも勿論可能である。また、配列番号：１に含まれるヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス等の前記した各種方法を採用できる。
【００４６】
本発明ペプチドは、また、そのアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することもできる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明ペプチドの合成はそのいずれによることもできる。
【００４７】
上記ペプチド合成法に採用できる縮合反応は、常法に従うことができる。具体的には、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等に従うことができる。
【００４８】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択できる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００４９】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキルエステル等として、保護することができる。
【００５０】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行なう必要はない。
【００５１】
更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。
【００５２】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明ペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って実施できる。
【００５３】
かくして得られる本発明ペプチドは、前記した各種の方法にて、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜その精製を行ない得る。
【００５４】
本発明ペプチドは、ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白（本発明ペプチドに包含される）の特異抗体を作成するための免疫抗原としても利用できる。該抗原の利用により、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を収得することができる。該抗体の製造方法は、当業者によく理解されるところであり、これら常法に従うことができる〔続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）等参照〕。かくして得られる抗体は、例えばＢＮＩＰ３Ｌ蛋白の精製、該蛋白の免疫学的手法による測定乃至識別等に有利に利用できる。
【００５５】
本発明ペプチドは、またこれを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。
【００５６】
該医薬品として有用な本発明ペプチド中には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩が包含される。更に上記塩には、本発明ペプチドと適当な有機酸乃至無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びナプシレート等を例示できる。
【００５７】
本発明範囲にはまた、本発明ペプチドの薬学的有効量を活性成分とし、これを適当な無毒性医薬担体乃至希釈剤と共に含む医薬組成物乃至医薬製剤が含まれる。
【００５８】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤乃至賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用することができる。
【００５９】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、各種形態が治療目的に応じて選択できる。その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態を例示できる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【００６０】
錠剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
【００６１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或は二重錠乃至多層錠とすることができる。
【００６２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００６３】
カプセル剤は、常法に従い、通常有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調整される。
【００６４】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシル等を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤等の助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【００６５】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液等への調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油等の植物油等を使用でき、また注入可能なエステル類、例えばオレイン酸エチル等を配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤等を添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理等により実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【００６６】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライド等を使用できる。
【００６７】
ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト及びオリーブ油等の植物油等を使用できる。
【００６８】
経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【００６９】
尚、上記の如くして調製される薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品等を含有させることもできる。
【００７０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【００７１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件等に応じて広範囲より適宜選択されるが、一般的には、投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約１〜１０ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子が提供される。該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、その構造及び機能を解析でき、また、該遺伝子によりコードされるヒト蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらを利用して、その発現物を解析する等により、之等の関与する疾患、例えばアポトーシスに関連する各種疾患、特に癌、の病態解明や診断、治療等が可能となる。
【００７３】
また、本発明によれば、各種癌細胞の成長抑制作用を有し、各種癌の疾患や病態の処置等に有用なペプチド及び該ペプチドを有効成分とする医薬も提供される。
【００７４】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００７５】
【実施例１】
ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子（ＧＥＮ−５５１Ｄ１２遺伝子）
（１）ヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を使用して、製品の使用指示書に従い、ヒト胎盤ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。選択したクローンの配列決定は、自動化ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM３７７、パーキンエルマー社製）及びＡＬＦ  ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）によって行なった。公知の配列との相同性を検索するために、ＦＡＳＴＡプログラムを使用した（Person,W. R. and Lipman, D. J.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1435-1441 (1988)）。
【００７６】
その結果、上記ｃＤＮＡライブラリーより、ヒトＢＮＩＰ３遺伝子と高い相同性を有する一つのクローンＧＥＮ−５５１Ｄ１２を選択した。このクローンの１２６５塩基のｃＤＮＡ挿入部は、２１９アミノ酸をコードする６５７ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームを含んでいた（GenBank accession No. AB004788）。
【００７７】
ＧＥＮ−５５１Ｄ１２クローンの遺伝子配列とＢＮＩＰ３のそれとを比較すると、該クローンのオープン・リーディング・フレームの配列によりコードされる遺伝子産物のコドン３５−２１９番目に相当する配列（配列番号：１に示す３５−２１９アミノ酸配列）と、ＢＮＩＰ３の同コドン１７−１９６番目の配列は、６５％同一であり、よく保存されていたが、上記遺伝子産物のＮ末端部分（配列番号：１に示す１−３４アミノ酸配列部分）は、ＢＮＩＰ３のそれとはサイズ及びアミノ酸配列において異なっていた。上記一部領域（コドン３５−２１９）における高い相同性があることから、本発明者らは上記遺伝子（上記クローン即ちＧＥＮ−５５１Ｄ１２の有する遺伝子）を「ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子」と命名し、その発現蛋白を「ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白」と命名した。
【００７８】
ＰＳＯＲＴプログラムによると、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子によりコードされる１８８−２０８番目のアミノ酸残基は、膜貫通領域（Nakai, K. and Kanehisa, M., Genomics, 14, 897-911(1992)）に相当していると推定できた。この推定膜貫通領域は、ＢＮＩＰ３とＢＮＩＰ３Ｌ蛋白との間でよく保存されていた。
【００７９】
（２）ノーザンブロット分析
ランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング法によって標識したヒトｃＤＮＡクローンをプローブとして、正常ヒト組織における本発明遺伝子の発現を、ノーザンブロット分析により評価した。
【００８０】
ノーザンブロット分析は、製品仕様書に従い、ヒトＭＴＮブロット（Human  Multiple Tissue Nothern blot ; クローンテック社製、パロ・アルト、カリフォルニア、米国）を用いて実施した。
【００８１】
即ち、ＧＥＮ−５５１Ｄ１２クローンｃＤＮＡクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して得られたインサート部分のＤＮＡを、〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識してプローブとした。
【００８２】
ブロッティングは、６時間プレハイブリダイズ後、４２℃で１２時間、５０％ホルムアミド／５×ＳＳＰＥ／１０×デンハルツ溶液／２％ＳＤＳ溶液（１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有）の溶液中でハイブリダイズすることにより実施した。
【００８３】
２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳにて室温下にて４０分洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて５０℃下に２０分間で２回洗浄した。フィルターは−７０℃下に１２時間、Ｘ線フィルム(コダック社製)に対して露光した。
【００８４】
その結果、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子と命名した本発明遺伝子は、試験した１６の正常ヒト組織（心臓(heart)、脳(brain)、胎盤(placenta)、肺(lung)、肝臓(liver)、骨格筋(skeletal muscle)、腎臓(kidney)、膵臓(pancreas)、脾臓(spleen)、胸腺(thymus)、前立腺(prostate)、精巣(testis)、卵巣(ovary)、小腸(small intestine)、大腸(colon)及び末梢血白血球(peripheral blood leukocyte)）の全てにおいて発現していた。
【００８５】
（３）ＦＩＳＨ法によるコスミド・クローンと染色体の局在
ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子を含む染色体クローンを使用して、公知の方法（Inazawa, J., et al., Genomics, 17, 153-162 (1993)）に従って、ＦＩＳＨ法を実施した。
【００８６】
即ち、別途合成したＧＥＮ−５１１Ｄ１２ｃＤＮＡクローンを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断して得られたインサート部分のＤＮＡをプローブとして用いて、コスミド・ベクターｐＷＥＸ１５〔ストラタジェン社より入手〕に構築したヒト染色体のコスミド・ライブラリーを常法（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., pp.3.1-3.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York(1989))に従ってスクリーニングした。
【００８７】
その結果、２つの独立したコスミド・クローンを単離した。各コスミド・クローンをＦＩＳＨ試験のためのプローブとして用い、染色体の座位決定を、各染色体の標準Ｇバンドのパターンを比較することによって確認した。各コスミドによって試験された１００の分裂中期の細胞標本で、特異的なシグナルを染色体バンド８上の短いアーム上に呈した。シグナル・ポジションは、Ｇバンドのパターンによって、８ｐ２１として決定された。他の染色体上に特異的なシグナルは検出できなかった。
【００８８】
(４)コロニー形成アッセイ
本発明遺伝子は、(1)大腸、肺、前立腺、肝を含む多種の癌においてＬＯＨ（ヘテロ接合性消失、loss of heterozygosity）が検出されている染色体８ｐ２１にマップされ、そして(2)その遺伝子産物は、アポトーシスを抑制する蛋白であるＢｃｌ−２と相互作用するＮｉｐ３に対して有意な類似性を示すことが明らかとなったので、以下、本発明ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子が細胞の増殖及び細胞死のいずれかに重要な役割を演じるかどうか調べるためにコロニー形成アッセイを行なった。
【００８９】
ａ）使用癌細胞株
コロニー形成アッセイのために以下の癌細胞株を用いた。
【００９０】
ヒト子宮頚癌細胞株Ｄ９８／ＡＨ２から誘導されたＤ９８ＨＢ２−４、Ｄ９８ＨＢ２−９、Ｄ９８Ｖ１及びＤ９８Ｖ２（Benham, F.J. and Harris, H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4016-4019 (1979) 、大腸癌細胞株ＳＷ４８０(ＡＴＣＣ No．ＣＣＬ２２８：Leibovitz, A., et al., Cancer Res., 36, 4562-4569 (1976)）及び神経膠芽腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇ(ＡＴＣＣ No．ＣＲＬ１６９０：Stein, G.H., J. Cell Physiol., 99, 43-54 (1979)）。
【００９１】
Ｄ９８ＨＢ２−４及びＤ９８ＨＢ２−９は、高レベルのＢｃｌ−２を発現するために調製されたプラスミドで形質転換させた。Ｄ９８Ｖ１及びＤ９８Ｖ２は、低レベルのＢｃｌ−２を発現するために作成されたベクター・プラスミド(pUC-CAGGS, Niwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki, J., Gene, 108, 193-200 (1991))で形質転換させた。
【００９２】
尚、上記Ｄ９８ＨＢ２−４、Ｄ９８ＨＢ２−９、Ｄ９８Ｖ１及びＤ９８Ｖ２の各細胞は、大阪大学医学部バイオメディカル教育研究センター遺伝医学部門恵口豊助教授より分与を受けた。
【００９３】
ｂ）発現ベクターの構築
ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白を発現するために調製されたプラスミドは、ＣＭＶプロモーターとハイグロマイシン（シグマ社製）抵抗性を与える遺伝子を有するｐＣＥＰ４ベクター（インビトロゲン社製、サンディエゴ市、カルフォルニア州）の中にＢＮＩＰ３ＬｃＤＮＡの全体のコード領域（６５７塩基）をクローニングすることによって構築した。
【００９４】
センス鎖（ｐＣＥＰ４／ＢＮＩＰ３ＬＳＳ）を発現するために調製したプラスミドとアンチセンス鎖（ｐＣＥＰ４／ＢＮＩＰ３ＬＡＳ）を発現するために調製したアンチセンス・プラスミドの２つを構築した。アンチセンス・プラスミドは反対方向に同じ６５７塩基のＢＮＩＰ３ＬｃＤＮＡを挿入することによって構築した。
【００９５】
ｃ）コロニー形成アッセイ
２５ｃｍ2フラスコ（２×１０5細胞／フラスコ）に上記６種の癌細胞株の各々を播いて、２４時間後にＢＮＩＰ３ＬｃＤＮＡのセンス鎖を含むＢＮＩＰ３Ｌ発現ベクター（ｐＣＥＰ４／ＢＮＩＰ３ＬＳＳ）で形質転換させた。
【００９６】
その方法は次の通りである。即ち、トランスフェクションの前日に各細胞株を２×１０5細胞／２５ｃｍ2フラスコとなるように播種した。培地としては、Ｄ９８ＨＢ２−４、Ｄ９８ＨＢ２−９、Ｄ９８Ｖ１及びＤ９８Ｖ２の各細胞については、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（日研生物医学研究所）を使用した。ＳＷ４８０細胞については、１０％ＦＢＳ添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’Ｌ−１５培地（ギブコＢＲＬ）を使用した。Ｔ９８Ｇ細胞については１０％ＦＢＳを添加した最小必須培地（ＭＥＭ、ギブコＢＲＬ）を使用した。
【００９７】
次いで、(1)ＯＰＴＩ−ＭＥＮ（ギブコＢＲＬ）２５０μｌにトランスフェクションするＤＮＡ５μｇを混ぜたもの及び(2)ＯＰＴＩ−ＭＥＮ２５０μｌにTransＩｔTM−ＬＴ１  ２５μｇを混ぜたものの２つを用意し、両者を混和後、２０分間放置した。各細胞（１．５ｍｌの各培地、血清入り）に、上記(1)及び(2)の混合物を加え、６時間、３７℃で培養した。６時間後、混合物の入った培地を新しい培地に代え、導入した遺伝子の発現を待つために２４時間、３７℃で培養を続けた。その後、１：８に希釈し、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下に１４日間培養した。
【００９８】
２週間後にメタノールで固定後、ギムザ染色液でコロニー数を計数した。
【００９９】
コントロールとして、ｐＣＥＰ４ベクターのみ、或はＢＮＩＰ３ＬｃＤＮＡを逆方向にもったプラスミド（ｐＣＥＰ４／ＢＮＩＰ３ＬＡＳ）で６つの細胞株の全てを形質転換させた。
【０１００】
５μｇのプラスミドＤＮＡと２５μｇのTransｌTM−ＬＴ１（パン・ベラ・コーポレーション社製）とを各形質転換に使用し、各形質転換は各々２回行なった。
【０１０１】
本発明遺伝子による形質転換体とコントロール（ベクターのみ）とを比較した各フラスコにおけるコロニー（各試験に対して８０と２００コロニー）のフラクション（％）を表１に示した。尚、表１中のコロニーの数（％）は２回の独立した試験の平均値を示している。
【０１０２】
【表１】
0003903294.tif 000002
【０１０３】
上記試験の結果、表１に示されるように、ハイグロマイシン抵抗性クローンの数は、コントロールのベクターで形質転換した細胞やアンチセンスｃＤＮＡを発現するために調製されたプラスミドで形質転換された細胞より、センス鎖ｃＤＮＡで形質転換されたＤ９８ＨＢ２−９又はＤ９８Ｖ２細胞を含むディシュにおいて有意に少なかった。これらの２つの細胞株を含む６つの癌細胞株におけるコロニー形成アッセイの結果は、表１に示すとおり、試験した細胞株の全てにおいて、アンチセンスｃＤＮＡやベクターのみを導入したものに較べて、センスｃＤＮＡを誘導したものが、コロニー数において劇的な減少を示すことを明らかにしている。即ち、センス鎖プラスミドで形質転換した形質転換体は、コントロールと比較すると７．０〜２６．９％にコロニー数が低下していた。
【０１０４】
ボイドら（Boyd, J.M., et al., Cancer Res., 52, 5368-5372 (1992)）は、アデノウィルス１９ｋＤａＥ１Ｂを「オトリ」として、酵母ツーハイブリッド・スクリーニング・システムを用いて、３つの蛋白（Ｎｉｐ１、Ｎｉｐ２、Ｎｉｐ３と命名）を単離したが、それらの間には有意な配列相同性は存在しなかった。しかし、イン・ビトロとイン・ビボでの結合アッセイによると、各Ｎｉｐ蛋白がＥ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白とＢｃｌ−２蛋白とに結合すると報告している。これらＮｉｐ蛋白は細胞死を抑制することにおいて不完全であるＥ１Ｂ蛋白の変異体と結合していなかったので、Ｎｉｐ蛋白が細胞死を抑制する経路において重要な役割を演ずると考えられた。ボイドらの結果は、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ或はＢｃｌ−２が、抗アポプティク活性において共同して働くかもしれないことを示唆した。
【０１０５】
しかしながら、それらの生理学的な機能は明瞭になっていないので、それらが、抗アポプティック活性に抑制的に作用し、ある種の成長抑制因子の代わりとして作用するかもしれない可能性は、排除することはできない。
【０１０６】
Ｂｃｌ−２は、細胞死を抑制するメンバー（Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1）と細胞死を誘導するメンバー（Bax, Bak, Bcl-XS, Bad, Bid）からなるアポトーシス調節遺伝子産物の一員に属しているが、これらはお互いに二量体を形成し、細胞内にあるプロ・アポプティク蛋白と抗アポプティック蛋白との相対的な量で、細胞死に対するその感受性を決定する（Kroemer, G., Nature Med., 3, 614-620 (1997)）と報告されている。またファミリーに属さない他のＢｃｌ−２結合蛋白も報告されている（Fernandez-Sarabia, M.J. and Bischoff, J. R., Nature, 366, 274-275 (1993); Wang, H. G., et al., Oncogene, 9, 2751-2756 (1994); Takayama, S., et al., Cell, 80, 279-284 (1995); Wang, H. G., et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 7063-7068 (1996))。
【０１０７】
Ｎｉｐ蛋白の生理学的な役割は未だに不確かであり、抗アポプティク作用、或はアポトーシスを誘導する作用のどちらを有することができるのか、更にＮｉｐ蛋白が、Ｂｃｌ−２と相互作用した時、どのように機能するのかは、いまだ改名されていない。しかもヒトＮｉｐ相同遺伝子については、未だ単離・解析されておらず、該遺伝子の解明が当業界で待ち望まれていた。
【０１０８】
本発明者らは、上記実施例に示されるようＥ１Ｂ関連蛋白の一つであるＮｉｐ３に対して配列相同性を持つ一つの蛋白をコードする新規な遺伝子ＢＮＩＰ３Ｌのクローニングを行い、該ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子のｃＤＮＡの特定を行った。その結果、本発明遺伝子でコードされる推定アミノ酸配列を有するＢＮＩＰ３Ｌ蛋白とＮｉｐ３蛋白の両蛋白は、高く保存された推定上の膜貫通領域を含んでいることが判明した。全てのＮｉｐ蛋白は核エンベロープ／小胞体に局在しており、Ｎｉｐ３もまたミトコンドリア膜に存在する（Boyd, J. M. , et al., Cell, 79, 341-351 (1994)）。同様に、Ｂｃｌ−２蛋白はミトコンドリア膜や核膜及び小胞体に局在している（Akao, Y., et al., Cancer Res., 54, 2468-2471 (1994)）。またＥ１Ｂ１９ｋＤ蛋白は、形質転換試験によって核エンベロープ／小包体領域で発現することが認められている（Boyd, J. M. , et al., Cell, 79, 341-351 (1994)）。ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白の細胞における局在部位は未だ決定されていないが、もしこの蛋白がＢｃｌ−２と関連するならば、膜に存在していると考えられる。
【０１０９】
ＦＩＳＨによって、本発明ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子が染色体８ｐ２１に局在することが判った。一方では、アレリック体の喪失が大腸、肺、前立腺、肝臓を含む各種組織の癌腫において検出されている（Emi, M., et al., Cancer Res., 52, 5368-5372 (1992); Emi, M., et al., Genes Chrom. Cancer, 7, 152-157 (1993); Bova, G. S., Cancer Res., 53, 3869-3873 (1993); Ohata, H., et al., Genes Chrom. Cancer, 7, 85-88 (1993); Fujiwara, Y., et al., Cancer Res., 53, 1172-1174 (1993); Fujiwara, Y., et al., Genes Chrom. Cancer, 10, 7-14 (1994); Macoska, J. A., et al., Cancer Res., 54, 3824-3830(1994))。
【０１１０】
更に上記実施例に示す、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子を癌細胞中に導入して行なったコロニー形成アッセイの結果より、ＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子産物の一時的な過剰発現が、癌細胞の有意な成長抑制を起すことが判明した。即ち、本発明のＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子の発現蛋白が持つ特徴として、癌細胞の細胞成長抑制作用が証明された。
【０１１１】
本発明によれば、ヒトＮｉｐ３遺伝子(ＢＮＩＰ３遺伝子)と高い相同性を有する新規なヒトＢＮＩＰ３Ｌ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ＢＮＩＰ３Ｌ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、アポトーシスの調製異常に関連した各種疾患の機能の解析や、これら関連する疾患の診断等を行なうことができ、またこれら疾患、特に癌の治療及び予防を行なうこともできる。
【０１１２】
【配列表】
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【０１１３】
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