(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる単離された組み換えＢｂｋ蛋白。
【請求項２】
配列番号９又は１０で示されるＢｂｋ蛋白をコードしている、単離されたヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２に記載の単離されたヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号９又は１０に対応する配列を有するＢｂｋ蛋白をコードしている、単離されたＲＮＡ。
【請求項５】
配列番号９又は１０で示されるＢｂｋ蛋白をコードしているヌクレオチドを有する単離された組み換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記分子がベクターである、請求項５に記載の単離された組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された組み換えＤＮＡ分子で形式転換された宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が哺乳類の細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる単離された組み換えＢｂｋポリペプチドを産生するための方法であって、
（ａ）配列番号９又は１０で示されるＢｂｋ蛋白をコードしているヌクレオチドを含む単離された組み換えＤＮＡ分子であるベクターを構築する工程；
（ｂ）工程（ａ）の前記ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の宿主細胞を、前記宿主細胞による前記Ｂｂｋポリペプチドの発現を可能にする条件下に培養する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の宿主細胞により発現された前記Ｂｂｋポリペプチドを単離する工程；を含む方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が哺乳類の細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号９又は１０で示されるＢｂｋ蛋白を特異的にコードしている第二のヌクレオチド配列に対し、実質的に相補的な第一のヌクレオチド配列を含む、検出可能に標識されたヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
非アポトーシス細胞に、請求項６に記載の単離された組み換えＤＮＡ分子を導入し、アポトーシスを前記細胞に誘導するために有効な量のＢｂｋ蛋白を発現させることを特徴とする、細胞にアポトーシスを誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、全体的には細胞生理学の分野に関し、特にアポトーシスに関する。さらに詳しくは、本発明はアポトーシスに関連した新規な蛋白BbK；蛋白BbKをコードしている塩基配列；クローニングに関する産物および工程；BbKをコードしている遺伝子およびヌクレオチド配列の調製および発現；Bbkに対する特異性のある抗体；および上記のものの診断および治療への使用に関する。
背景技術
「アポトーシス」は活発な生理学的経過による細胞自殺に関係する（Kerr, J. F.等、Br. J. Cancer 26：239-257（1972）；Wyllie, A. H. Nature 284：555-556（1980）。アポトーシスで死ぬ細胞は、細胞の萎縮と核の凝縮および断片化とを含む特徴的な形態変化を受ける。アポトーシスは、形態形成、免疫系の成熟、および組織中の細胞分裂により絶えず新生している細胞数を制限している組織ホメオスタシスなどの発生過程に重要な役割を果たす（Ellis, R. E.等、Annu. Rev. Cell, Biol. 7：663-698（1991）；Oppenheim, R. W.等、Neurosci. 14：453-501（1991）；Cohen, J. J.等、Annu. Rev. Immunol. 10：267-293（1992）；Raff, M. C., Nature 356：397-400（1992））。アポトーシスは腫瘍形成に対する重要な細胞防護装置である（Williams, G. T.、Cell 65：1097-1098（1991）；Lane, D. P. Nature 362：786-787（1993））。アポトーシス経路における欠点は、悪性疾患の開始または進行の一因となることである。ある条件の下では、細胞は、発癌遺伝子または細胞を増殖させる他の遺伝子の強行な発現に反応してアポトーシスになる（Askew, D.等、Oncogene 6：195-1922（1991）；Evan, G. I.等、Cell 69：119-128（1992）；Rao, L.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7742-7746（1992）；Smeyne, R. J.等、Nature 363：166-169（1993））。種々の退行性の病気は異常なアポトーシスを含み、未熟または不適切な細胞死を生じることがある（Barr, P. J.等、Biotechnology 12：487-493（1994））。ある種のウイルスによる増殖性感染は、アポトーシスに対抗するウイルス遺伝子産物による宿主細胞の死の抑制によるといってよく（Rao, L.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7742-7746（1992）；Ray, C. A.等、Cell 69：597-604（1992）；White, E.等、Mol. Cell. Biol. 12：2570-2580（1992）；Vaux, D. L.等、Cell 76：777-779（1994））、アポトーシスの阻害はウイルス感染の進行（すなわち細胞溶解性対潜伏感染性）を変えることができる（Levine, B.等、Nature 361：739-742（1993）。HIV感染が引き金となるTリンパ球の広範なアポトーシスは、少なくとも一部は、AIDSに関連した免疫系の機能不全によるといってよい（Gougeon, M.等、Science 260：1269-1270（1993））。正常および病理学的な細胞周期事象におけるアポトーシスの役割は、Holbrook, N. J.等編の、Cellular Aging and Cell Death（細胞の加齢と細胞死）ワイリ・リス（Wiley-Liss）有限出版社、ニューヨーク（1996））に総説されている。
bcl-2遺伝子産物は、アポトーシスによる細胞死の有力なサプレッサーとして徹底的に研究されてきた。bcl-2遺伝子は最初、ヒトB細胞のろ胞性リンパ腫に頻発するt（14：18）転座中断点において同定された（Bakhshi, A.等、Cell 41：899-906（1985）；Cleary, M. L.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82（1985）：Tsujimoto, Y.等、Science 229：1390-1393（1985））。この転座は、免疫グロブリンH鎖の遺伝子座との並置によるbcl-2遺伝子発現の構造的な活性化をもたらす。この病気においてbcl-2は、通常ではこれらの細胞の蓄積を制限するはずのアポトーシスを不当に抑制することにより発癌遺伝子として機能する（McDonnell, T. J.等、Cell 57：79-88（1989）；Hockenbery, D.等、Nature 348：334-336（1990））。その結果B細胞は、リンパ腫の不活性な段階の間に、制御されない増殖というよりはむしろ死の失敗により蓄積する。
Bcl-2の抗アポトーシス活性はB細胞に限らない。Bcl-2の異所性の発現が、多数の細胞系統において種々の刺激により引き起こされるアポトーシスを抑制することができることを、数多くの研究が証明した（Vaux, D. L.等、Nature 335：440-442（1988）；Sentman, C. L.等、Cell 67：879-888（1991）；Strasser, A.等、Cell 67：889-899（1991）；Hockenbery, D. M.等、Cell 75：241-251（1993）。Bcl-2は、成長因子の除去、DNAの損傷、発癌遺伝子の発現、酸化性のストレス、およびウイルス感染により誘導される細胞死を妨げる。殆どすべての系においてBcl-2がアポトーシスを妨げる能力は、Bcl-2が、死のプログラムを実行するための機構と密接に結びついていることを示唆する。この考え方は、種にまたがるBcl-2機能の保存によってさらに支持される。線虫C. エレガンス（C. elegans）におけるced9遺伝子は、発生中の虫のある種の細胞系統におけるプログラムされた死を抑制する機能がある（Ellis, H. M.等、Cell 44：817-829（1986））。Bcl-2は遺伝子導入された虫においてCed9を補足するため、Ced9はBcl-2と機能的に相同物であると思われる（Vaux, D. L.等、Science 258：1955-1957（1991））。Bcl-2は、バキュロウイルス感染により誘導されたアポトーシスを抑制するBcl-2の能力によって証明されたように、昆虫細胞でも同様に機能することができる（Alnemri, E. S.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7295-7299（1992））。Bcl-2が細胞死を妨げる分子機構はよくわかっていない。
Bcl-2と有意の配列相同性を示すその他の細胞遺伝子も同定されており、調べた限りでは、これらの遺伝子もまたアポトーシスによる細胞死のレギュレーターとして機能するらしい。Bcl-2の関連物の一つであるBcl-Xは、Bcl-2遺伝子に対するDNAハイブリッド形成の低い厳格性により単離された（Boise, L. H.等、Cell 74：597-608（1993））。Bcl-XのRNAは特異的にスプライスされ、Bcl-XLと命名された長い型と、短い内部欠損を持つBcl-XSと命名されたより短い型とを産生する。Bcl-XLはBcl-2とよく似ており、細胞死を抑制する機能があるが、欠損した型のBcl-XSは、Bcl-2による防御を阻害することができ、「優性ネガティブ」な種類として機能するのかもしれない。第二のBcl-2の関連物であるBaxは、Bcl-2との免疫共沈降物中に見い出される蛋白として生化学的に同定された（Oltvai, Z. N.等、Cell 74：609-619（1993））。対応するcDNAの単離は、Bax蛋白がBcl-2と実質的に同一の配列を示すことを明らかにした。BaxはBcl-2とヘテロダイマーを形成し、アポトーシスを誘導し、Bcl-2機能の負のレギュレーターとして機能するらしい。Baxの異所性の発現が、Bcl-2の発現によりもたらされるアポトーシスへの防御を妨げることが示された。
二つの付加的な細胞性のBcl-2関連物、Mcl-1およびA1（Kozopas, K. M.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3516-3520（1993）；Lin, E. Y.等、J. Immunol. 151：1979-1988（1993））は、最初、特異的な刺激に対する反応、すなわちホルボールエステルで誘導した骨髄性白血病細胞（Mcl-1）の分化、およびネズミ骨髄細胞のGM-CSF処理（A1）おいて誘導されたmRNAとして単離された。Mcl-1またはA1のどちらがアポトーシスを調整することができるのかはまだわかっていない。
これらの細胞性のBcl-2関連物に加えて、DNAウイルスにコードされている多数のBcl-2相当物が同定された。エステンバーウイルスBHRF-1の遺伝子産物は、Bcl-2と相同な配列を含むことが知られ、続いてアポトーシスのサプレッサーとして機能することが示された（Henderson等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：8479-8488（1993））。同様に、豚コレラウイルスLMW5-HL遺伝子は、Bcl-2と構造的に類似した蛋白をコードしている（Neilan, J. G.等、J. Virol. 67：4391-4394（1993））。アデノウイルスE1bの19kDの蛋白は、Bcl-2と機能的には同等であるらしいが、一次配列の相同性は非常に限定されている（White, E.等、Mol. Cell. Biol. 12：2570-2580（1992））。これらの遺伝子は感染された細胞のアポトーシスを防ぐことにより、ウイルスDNAの複製を確実にする機能があるらしい。関連のないDNAウイルスが、見かけ上Bcl-2の活動を模して機能する遺伝子を進化させたという発見は、Bcl-2がアポトーシスの重要なレギュレーターの代表であるという結論を支持する。
bakと命名したBcl-2の関連遺伝子の単離および特性決定は、1994年10月11日出願の同時係属米国出願第08/321,071号に記載されており、それは1994年8月９日出願の米国出願第08/287,427号の一部継続出願であり（そこではbakはbcl-yと言及されている）、その開示は本文中に参考文献として取り入れられている。異所性Bakの発現は、サイトカインの除去によるIL-3依存性細胞株の死を加速し、Bcl-2によって与えられるアポトーシスに対する防護に対抗する。さらに、Bakの強制的な発現は、血清を除去された線維芽細胞のアポトーシスを誘導するに十分であり、Bakが細胞死の機構を直接活性化するか、またはそれ自体が細胞死の機構の一成分である可能性を高めている。
細胞性Bcl-2に関連した周知の遺伝子は、分析された限りでは別の発現パターンを有しており、従って異なる組織において機能するのかもしれない。細胞死のプログラムは全ての組織において適切な位置にあり、異なるBcl-2関連遺伝子に調整されているかもしれない。Bcl-2の発現は成熟した免疫系の維持に必要ではあるが、他の系においてアポトーシスによる細胞死を支配するかもしれない他の遺伝子を同定することが望ましい。薬学発展の見地から、臨床上の設定に応じてアポトーシスを活性化または抑制する薬剤を同定または開発することが望ましいであろう。
発明の開示
本発明者は驚くべきことに新規物質の組成物を発見し、単離および特性決定し、かつ本文中の数多くの態様に記載した。本文中では「Bbk」と命名されているが、それはBcl-2群の一員と考えられ、特に、細胞にアポトーシスを誘導することができ、細胞においてBcl-2および関連した細胞死のサプレッサーの機能に対抗することができる。完全な長さのヒトBbkのcDNAの単離は、推測されたBbkのアミノ酸配列がBcl-2と相同性を共有することを示した。BbkのmRNAはヒトの一次組織に広く発現されていると考えられる。Bbkはヒトの組織および／または腫瘍細胞におけるアポトーシスの重要なレギュレーターである。
Bbkの発現は、正常なラット線維芽細胞（Rat1）および、HeLa細胞およびBT549細胞を含むヒト腫瘍細胞株において発現された場合には、アポトーシスを促進する。Rat1細胞におけるBakとBbkとの共同した発現はアポトーシスの誘導を妨げず、それらが互いに結合する能力はアポトーシスを促進する能力を阻害しないことを示唆している。それらの共同発現は、細胞死の協同の誘導をもたらすといってよい。Bbkのアポトーシス機能は周知の生存蛋白、Bcl-2、Bcl-xL、およびエステンバーウイスルBHRF 1の協同発現により逆転することが可能である。生存蛋白に対するBbkの比を増やすと、アポトーシスを促進する蛋白、Bikを用いて先に示されたように、アポトーシスを取り戻すかもしれない。
本発明は、従って、アポトーシスに関連した蛋白、Bbk、クローニングに伴う産物および工程、Bbk遺伝子の調整および発現；Bbkに特異性をもつ抗体；およびBbkのヌクレオチド配列かまたはその部分に対応するヌクレオチドプローブに関する。Bbkポリペプチドは、それ自身に対しての抗体産生に有用である。抗体およびプローブは、例えば、心臓組織、肺組織、腫瘍細胞、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓を含むヒトの全ての組織からの細胞を含めた生物学的標本における、Bbkの検出および単離に有用である。
本発明はさらに、Bbkの、種の相同関係およびウイルスの相同関係に関する。
本発明は、cDNAとヒト細胞に存在するBbkをコードするゲノム断片との同定、特徴決定、および配列決定に関する。
本発明によれば、Bbkをコードしている遺伝学的配列が提供される。本発明はまた、かかる遺伝学的配列を含んでいる発現ベクター、かかる発現ベクターにより形質転換された宿主、および遺伝子工学によるかまたは組み換えによるBbkの産生法を提供する。
本発明はまた、Bbkを特異的に認識する抗体を提供する。
BbkのcDNAおよび組み換え蛋白は、Bbkを特異的に認識する抗体の作成のために有用である。かかる抗体は、生物学的標本におけるBbkの検出および単離に有用である。このBbk蛋白はまた、アポトーシスのレギュレーターとしても有用である。
EBVで形質転換したB細胞の株から小さなcDNAが単離された。Bbk蛋白のアミノ酸配列は、Bcl-2領域と配列の相同性を共有する。
本発明はさらに、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニングを用いての、種々のヒト腫瘍細胞株からのBbkの部分的なクローンの単離法に関する。
本発明はさらに、不適切な細胞増殖または不適切な細胞死によってそれぞれ特徴づけられる退行性の病気に苦しんでいる個体において、アポトーシスを誘導または抑制するための方法に向けられる。不適切な細胞増殖によって特徴づけられる退行性の病気は、例えば炎症性の症状、リンパ腫を含む癌、遺伝子型による腫瘍、等を含む。不適切な細胞死によって特徴づけられる退行性の病気は、例えば自己免疫疾患、後天性免疫不全疾患（AIDS）、放射線療法または化学療法による細胞死、等を含む。
本発明はまた、Bbk蛋白の存在を検出するための方法および、退行性の疾患の診断のための方法に関しており、これらの疾患は、正常な細胞集団において期待されるBbkの発現レベルと比較して、Bbkの発現または突然変異のレベルの増減を伴う。
本発明はさらに、Bbkの発現を監視することによって、Bbkの発現レベルの増減に関連した退行性の病気の進行を監視する方法に向けられる。
本発明はまた、病気／退行性の病気が、Bbkの異常な発現と関連しているかどうかを決定するための方法および、遺伝子導入マウスおよび／または同型接合ヌルマウスのような動物モデルにおいて、Bbkの過発現または発現の損失の影響を測定するための方法に関する。病気／退行性の病気がBbkの異常な発現と関連しているかどうかを決定するための方法は、例えばノーザンおよび／またはウエスタンブロットや、当業者等に容易に選択され使用される他の分析法により、病気の組織におけるBbkの発現を正常な組織と比べて分析する方法を含む。
本発明は、治療用に使用するためのBbkのハイブリッドに関する。
本発明はまた、各々不適切な細胞増殖の安定化（すなわちアポトーシスの誘導）のため、または不適切な細胞死の安定化（すなわちアポトーシスの抑制）のため、および／またはいずれの場合でも正常な細胞行動を取り戻すために、不適切な細胞増殖またな不適切な細胞死を特徴とする退行性の病気を患っている個体に、このBbk蛋白、突然変異蛋白、またはハイブリッドを与えることにより、アポトーシス効果を調整する方法に関する。第３図は、胎児および成体の健康な種々の組織において発現された、BbkのmRNAのレベルを示す。
本発明はさらに、例えばBH1およびBH2のようなペプチドを含んでいるBbkの機能的な断片や、本発明者によってBbkと、Bcl-2およびBaxを含む他のアポトーシス関連蛋白との間に認められた、他の相同な領域を含めた、機能上の等価物に関する。
一つの特別の局面においては、本発明はBbk分子の中央部の短い部分配列に同定されマッピングされた、新規な蛋白領域に向けられる。本発明者が「Bbk BH3領域」と命名したこの新規な蛋白領域は、BbkのBakとの相互作用およびBbkの細胞を殺す機能のいずれにも本質的なものである。先を切断された、Bbk BH3領域を含んでいるBbk種は、それ自体がトランスフェクション分析において、細胞を殺すに十分である。
Bbk BH3領域は、1995年５月１２日出願の米国出願第08/440, 391号に記載されたBakにおいて最初に記載されたGD領域と、25%より少ない同一性しか共有しない（そこではBH3がGD領域として命名されている）。しかしながらGD領域についてBakで観察されたように、BbkにおけるBbk BH3領域エレメントの突然変異は、細胞を殺す機能および蛋白と結合する機能を弱める。従って、Bbk BH3領域は、多数の細胞死調節分子の活動に対し、鍵となる重要な蛋白／蛋白相互作用の調整に責を担っている。
従って一つの局面において本発明は、Bbk BH3領域を含んでいるペプチドの精製および単離と、その分子構造および／または機能を模し、細胞のアポトーシスの状態を誘導または調整するために有用な分子とに向けられている。Bbk BH3領域の機能を混乱させる化合物には、アポトーシス調整薬剤としての実用性がある。従って、もう一つの局面において、本発明はBbk BH3領域の機能を混乱させることのできる薬剤に向けられている。かかる薬剤は、Bbk BH3領域に結合する分子、Bbk BH3領域と他の蛋白との相互作用を妨げる分子、および何らかの方法で変化させたBbk BH3領域を含んでいる分子を含むが、それらに限定されない。本発明は、Bbk BH3領域の機能を混乱させることによりアポトーシスを調整する分子の同定法を提供するが、それには付加的な期待される態様が含まれる。
他の局面においては、本発明はBbk BH3領域を含んでいるペプチドのクローニング、調製、および発現；Bbk BH3領域に対する特異性のある抗体；およびBbk BH3領域またはその部分をコードしているヌクレオチド配列、に関係する産物および方法に関する。Bbk BH3領域を含んでいるペプチドは、それらに対する抗体の製造に有用である。かかる抗体は、例えば、心臓組織、肺組織、腫瘍細胞、脳組織、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓などのヒトの全ての組織からの細胞を含む生物学的標本における、Bbk BH3領域を含んでいる蛋白の検出および単離や、かかる生物学的標本中のおよび標本からのBbk BH3領域を含んでいる蛋白のアポトーシス活性の調整に有用であり、本発明の付加的な局面を構成している。
もう一つの局面において本発明は、遺伝配列を含んでいる発現ベクター、かかる発現ベクターで形質転換した宿主、および本発明の組み換えBbk BH3領域ペプチドを産生するための方法を提供する。
本発明はさらに、それぞれ不適切な細胞増殖または不適切な細胞死によって特徴づけられる退行性の病気を患っている個体の、細胞および／または組織におけるアポトーシスの誘導または抑制のための方法に向けられている。不適切な細胞増殖によって特徴づけられる退行性の病気は、例えば、炎症性の症状、前立腺過形成のようなリンパ腫を含む癌、遺伝子型腫瘍等を含む。不適切な細胞死によって特徴づけられる退行性の病気は、例えば、自己免疫疾患、後天性免疫不全疾患（AIDS）、放射線療法または化学療法による細胞死、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経退化疾患等を含む。
本発明はまた、Bbk BH3領域ペプチドの存在を検出する方法や、退行性の病気の診断、すなわち、どの病気がBbk BH3領域を含んでいる蛋白の発現レベルの増減と関連しているかを、かかる蛋白の正常細胞集団において期待される発現レベルと比較する、診断方法に関する。
本発明は、Bbk BH3領域を含んでいるペプチドの治療用の使用に関する。
本発明はまた、各々不適切な細胞増殖を安定化させる（すなわちアポトーシスの誘導）または不適切な細胞死の安定化（すなわちアポトーシスの抑制）のために、及び／又はそれぞれの場合に細胞の正常な行動を回復するために、それぞれ不適切な細胞増殖または不適切な細胞死によって特徴づけられる退行性の病気を患っている個体への、Bbk BH3領域ペプチドを含んでいるペプチドまたはそれらの突然変異体の投与による、細胞のアポトーシス状態の調整法に関する。
本発明はまた、Bbkの存在を測定するため、並びに種同族体およびウイルス同族体を含めた同族体の同定および単離のために使用できる、ヌクレオチドプローブに向けられている。
本発明のこれらの目的と局面とは、以下の説明から当業者らには明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図：  酵母の二ハイブリッド系（クロンテク（Clontech）マニュアルより改変）の特徴。
第1（A）図：  GAL1上流活性化配列（UAS）と相互作用するDNA結合領域（bd）および転写を刺激する転写活性化領域（ad）を示す酵母GAL4蛋白の概略説明図。
第1（B）図：  蛋白Xと融合したGAL4 bdは、GAL1 UASに結合することができるが、活性化領域を欠くため転写を刺激することはできない。蛋白Yと融合したGAL4 adも、プロモーターに局在することができないため転写を刺激することはできない。
第1（C）図：  GAL4 bd／蛋白X融合体とGAL1 UASとの相互作用および、それとGAL4 ad／蛋白Yとのさらなる相互作用が、GAL4機能の再構成および転写の刺激を可能にする。
第２図：  クローンBbkのヌクレオチド配列および推定読み取り枠（ORF）。［配列番号：9-μ］矢印は、二ハイブリッド分析により単離されたいくつかの関連クローンの開始点を示す。いくつかのクローンで同定されたAAGの挿入位置も示す。
第３図：  ヒト胎児および成体の組織のノーザンブロット分析（クロンテク）。ブロットを、32Pで標識したBbk DNA（上のパネル）および対照としてのβ-アクチンDNAとハイブリッド形成させた。大きさのマーカーは製造業者の規定どおりである。
第４図：  Bbk蛋白の発現。
第４（A）図：  ウサギ網状赤血球溶解物における35Sで標識したBbkのin vitroにおける翻訳。ルシフェラーゼ蛋白の翻訳を含む対照を、SDSゲル電気泳動により回収し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。染色前の蛋白分子量マーカー（アマーシャム（Amersham））のゲル移動度を示す。
第４（B）図：  トランスフェクトした細胞におけるBbkの発現。ヘマグルチニン（HA）エピトープを付けたBaxまたはBbkの発現プラスミドを、COS7細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトの48時間後に溶解物を調製した。トランスフェクトされていないCOS7細胞の溶解物がネガティブコントロールとして含まれている。蛋白を、SDSゲル電気泳動および抗HAモノクローナル抗体12CA5（ベーリンガー・マンハイム）を用いた細胞溶解物のウエスタンブロットにより検出した。BaxおよびBbk蛋白を矢印で示す。
第５図：Rat1細胞の生存能力に対するBbk発現の影響。細胞を、β-ガラクトシダーゼの発現プラスミドで表示したプラスミドを（pRcCMV／β-gal、0.16μg）用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している生細胞および死細胞を同定した。三重実験からの値を平均し、SEMを表すエラーバーと共にプロットした。
第5（A）図：  Rat1細胞における、ベクター（0.42μg pRcCMV）、Bak（0.21μg pcDNA1／HABak＋0.21μg pRcCMV）、Bbk（0.21μg pcDNA3／HABbk＋0.21μg pRcCMV）、またはBak＋Bbk（0.21μg pcDNA3／HABak＋0.21μg pcDNA3／HABbk）の過渡的発現の影響。
第5（B）図：  Rat1細胞におけるアポトーシスのBbk誘導に対する、生存蛋白Bcl-2（0.21μg pcDNA3／HABbk＋0.21μg pRcCMV／Bcl-2）、Bcl-xL（0.21μg pcDNA3／HABbk＋0.21μg pRcCMV／Bcl-xL）、またはエステンバーウイルスBHRF1（0.21μg pcDNA3／HABbk＋0.21μg pRcCMV／BHRF1）の影響。
第６図：  HeLa細胞およびBT549細胞の生存能力に対するBbk発現の影響。
第6（A）図：  HeLa細胞を、pRcCMV／βgal（0.16μg）に、ベクター（0.42μg pRcCMV）、Bak（0.21μg pcDNA1／HABak＋0.21μg pRcCMV）、またはBbk（0.21μg pcDNA3／HABbk＋0.21μg pRcCMV）を加えてトランスフェクトした。染色された細胞を記録し、第５図に記したようにプロットした。
第6（B）図：  BT549細胞をパネル（A）に記したようにトランスフェクトした。
第７図：  BbkとBcl-2群のメンバーとの相互作用。BbkのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合蛋白を大腸菌において産生し、グルタチオンアガロースで精製した。精製したBbkまたはCST対照蛋白を、35Sで標識したin vitroで翻訳した（IVT）HAを付けたBak、Bax、Bik、またはFlagを付けたBcl-xLとインキュベートした。複合体をグルタチオンアガロースゲル上に捕獲し、SDSゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーにより視覚化した。捕獲された複合体を、投入されたIVT物質のアリコートと比較した。
第８図：  BbkとBcl-2群のメンバーのBH2およびBH3領域の配列の位置合わせ。
第8（A）図：  Bak［配列番号13］、Bax［配列番号14］、Bik［配列番号15］、Bcl-2［配列番号16］、およびBcl-xL［配列番号17］のBH２領域の配列が、Bbk［配列番号12］の相当する領域と位置合わせされている。少なくとも三つの蛋白で同一または保存されている残基を囲んである。黒色の囲みは同一の残基を示し、灰色の囲みは保存された残基を示す。番号づけは、各々の配列の最初に示したアミノ酸の位置を示す。
第8（B）図：  Bak［配列番号19］、Bax［配列番号20］、Bik［配列番号21］、Bcl-2［配列番号22］、およびBcl-xL［配列番号23］のBH3領域の配列が、Bbkの相当する領域と位置合わせされている。濃淡および番号づけはパネル（A）に記した通りである。
第９図：  Rat1細胞におけるBbk［配列番号18］の欠損および点突然変異の分析。
第9（A）図：  Rat1細胞を、pRcCMV／βgal（0.16μg）に、ベクター（0.42μg pRcCMV）、完全な長さのBbk（0.42μg pcDNA3／HABbk）、またはBbkの欠損突然変異体（0.42μg pcDNA3／HAΔ1-105、または0.42μg pcDNA3／HAΔ142-249）を加えてトランスフェクトした。染色された細胞を記録し、第５図に記したようにプロットした。
第9（B）図：  Bbk BH3領域のアラニン点突然変異体（PM-LVLEE［配列番号25］、PM-V［配列番号26］、PM-L［配列番号27］、PM-EE［配列番号28］）を、野性型のBbk BH3領域［配列番号24］と比較した。アラニンの置換は輪郭を描いた箱で示してあり、濃淡は第８図に記した通りである。
第9（C）図：  パネル（B）に示したアラニン点突然変異体（各々0.42μgのpcDNA3／HAPM-LVLEE、pcDNA3／HAPM-V、pcDNA3／HAPM-L、pcDNA3／HAPM-EEに0.16μgのpRcCMV／βgalを加えたもの）をRat1細胞にトランスフェクトし、パネル（A）に記したようにベクター対照プラスミドまたは野性型Bbkでトランスフェクトした細胞と比較した。染色された細胞を記録し、第５図に記したようにプロットした。
第10図：  Rat1細胞の生存能力に対するBbk BH3領域の発現の影響。Rat1細胞を、pRcCMV／bβgal（0.16mg）に、ベクター（0.42mg pRcCMV）、完全な長さのBbk（0.42mg pRcCMV／HABbk）、またはBbk BH3領域（0.42mg pRcCMV／HABbkBH3）を加えたものでトランスフェクトした。染色された細胞を記録し、第５図に記したようにプロットした。
第11図：酵母の二ハイブリッド系で分析したBbkの点突然変異体とBakとの相互作用。Bakのおとりプラスミド（pAS2／BakΔC）を、Bbkのアラニン点突然変異体（pACT／PM-LVLEE、pACT／PM-V、pACT／PM-L、pACT／PM-EE）および野性型Bbk（pACT／Bbk）のGal4活性化領域融合体を発現しているプラスミドと共に、酵母に同時形質転換した。ポジティブな対照として、p53のおとり（pVA3）およびSV40 T抗原（pTD1）を発現している、製造業者（クロンテク）の供給によるプラスミドを、上記のように同時形質転換した。ネガティブな対照として、pACT／Bbkを、おとりとしてGal4活性化領域のみを発現するpAS2と同時形質転換した。製造業者（クロンテク）により記述されている液体培養分析法を用い、各形質転換より三つの別個のコロニーを、β-ガラクトシダーゼ活性について三重に分析した。三つのコロニーの各々の三重の測定値の平均の、さらに平均を取り、相互に作用する蛋白の各組について一つの値を出した。データを、β-ガラクトシダーゼの単位として（Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics（分子遺伝学実験）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、プランビュー（Planview）、ニューヨーク（1972））、SEMを表すエラー  バーと共にプロットした。
発明の詳細な説明
ここで用いる技術的および科学的の用語は、別段の定義をしない限り、当業者によって普通に理解される意味をもつものとする。当業者に公知のいろんな方法論についてここで参照が行われる。参照が行われたそのような公知の方法論を記載した刊行物およびその他のものは、その全文が記載されたものとしてそれら全体が参照により本特許に包含される。組み換えDNA技術の一般的原則を記載した標準的文献はたとえば次のようである。Sambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York（1989）；McPherson, M. J., Ed., Directed Mutagenesis：A Practical Approach. IRL Press, Oxford（1991）；Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford（1992）；Austen, B. M. and Westwood, O. M. R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford（1991）。当業者に公知の適当な材料及び／又は方法は、如何なるものでも本発明を実施するのに使用することができる。ただし好ましい材料及び／又は方法を述べることとする。以下の説明や例で参照される材料、試薬などは、別段の記載のない限り商業的に入手可能である。
本発明は最も一般的には、Bak蛋白と特異的に結合し不死化ヒト腫瘍細胞を死滅させる能力にもとづいて「Bak結合死滅剤（Bak binding killer）」蛋白または「Bbk」とよばれる新規な蛋白に関するものである。したがって本発明は、BbkまたはBbk突然変異体のアミノ酸配列、そのようなアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、その遺伝子配列、それと形質転換した宿主および組み換えBbkを含む発現ベヒクル、ならびにそのような形質転換宿主発現で得られたアンチセンスRNAを含むものである。さらに本発明はBbk及び／もしくはそのフラグメントまたはBbk突然変異体に対する抗体をも包含するものである。
本発明によれば、そのような蛋白配列の遺伝子工学的方法は、ペプチドをコード化する能力がある遺伝子配列のクローニングにより、およびそのような遺伝子配列の発現により行われる。ここで用いたような「遺伝子配列」という用語は、核酸分子（好ましくはDNA）を表わすものと意図されている。蛋白をコード化できる遺伝子配列は、種々の原料から誘導される。これらの原料にはゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびそれらの組み合わせが含まれる。ゲノムDNAまたはmRNAの好ましい原料は、ヒトの組織たとえば心臓、肺、腫瘍細胞、胎盤、肝臓、骨格筋および膵臓である。ついでmRNAは、公知の技術によってcDNAを製造するために用いることができる。プローブは、公知の方法でBbkのヌクレオチド配列にもとづいて合成することができる。
本発明のBbk蛋白またはゲノムDNAは、天然に存在するイントロンを含んでいてもいなくてもよい。さらにそのようなゲノムDNAは、Bbk蛋白配列の5'プロモーター領域及び／又は3'転写末端領域との会合によって得ることができる。またそのようなゲノムDNAは、Bbk蛋白mRNAの5'-非翻訳領域をコード化する遺伝子配列及び/又は3'-非翻訳領域をコード化する遺伝子配列との会合で得ることもできる。宿主細胞が、mRNAと蛋白の発現と関連した転写の及び/又は翻訳の調節シグナルを認識できる限り、天然の遺伝子の5'及び/もしくは3'-非転写領域ならびに/又はmRNAの5'-及び／もしくは3'-非翻訳領域は保持されそして転写と翻訳調節に用いることができる。Bbk蛋白遺伝子DNAは、公知の方法（たとえばBerger, S. L., et al., Eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press（1987）参照）によってヒトの組織から抽出し精製することができる。
またmRNAは、蛋白を生産し発現するどんな細胞からも単離することが可能であり、公知の方法（たとえばBerger, S. L., et al., Eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press（1987）参照）によってcDNAの製造に用いることができる。用いられるmRNA試料は、好ましくは、大量の蛋白を生産する細胞からの単離により天然に、または特定の配列のmRNA試料を精製するのに通常用いられる技術たとえば蔗糖勾配遠心分離やPCRを含めた技術により試験管内で、そのようなBbk蛋白をコード化するmRNAに精製されるであろう。ついでcDNAは、たとえば逆転写により製造することができる。このcDNAはついで適当なプライマーを用いるPCRにより増幅することができる。
ベクターの中へクローニングするために、そのような適当なDNA試料（ヒトのゲノムDNAかまたはcDNA）はそれぞれランダムにシアリングされるかまたは酵素で分解され、そして適当なベクターに連結されて組み換え遺伝子（ゲノムまたはcDNA）ライブラリーとなる。Bbk蛋白またはその機能的均等物をコード化するDNA配列は、たとえば平滑末端連結またはスタッガー末端連結、適当な末端を得るための制限酵素消化、好ましからぬ結合を避けるための適当なアルカリホスファターゼ処理としての付着末端の装填、適当なリガーゼによる連結、のような通常の技術によりDNAベクターの中へ挿入することができる。そのような操作の技術はたとえばSambrook, J., et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York（1989）に開示されており、当業者によく知られている。
Bbk蛋白クローンを含むライブラリーはスクリーニングすることができ、そしてBbkクローンはBbk蛋白DNAを特異的に選択する如何なる手段、たとえば（a）この蛋白のDNAに特異的な配列を含む適当な核酸プローブとのハイブリダイゼーション、（b）問題のクローンとハイブリダイゼーションをおこなう天然のmRNAが試験管内で翻訳されるハイブリッド-選択翻訳分析とそれにつづく翻訳生成物の特性化、または（c）もしクローン化した遺伝子配列それ自体がmRNAを発現可能であれば、翻訳Bbkまたはクローン含有宿主により生産されたフラグメント生成物の免疫沈殿、のような手段で同定することができる。
クローンをこの蛋白と同定するのに使用可能な蛋白に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、Bbk蛋白のアミノ酸配列の知識からデザインすることができる。本明細書におけるペプチド中のアミノ酸残基の配列は、一般に使用されている3文字コードまたは1文字コードを用いて表示する。これらの3文字コードや1文字コードは教科書、たとえばBiochemistry, 2ed., Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY（1975）に記載されている。アミノ酸配列を水平式に表示するときは、アミノ末端を左端としカルボキシ末端を右端とする。ペプチド中のアミノ酸残基はハイフンで分離してある。このハイフンは、単に配列の表示を明らかにするためのものである。
遺伝暗号は縮退的であるため、特定のアミノ酸を暗号化するのに１つよりも多いコドンを用いることができる（Watson, J. D., In：Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA（1977）, pp. 356-357）。ペプチドフラグメントを分析して、最低の縮退度をもつオリゴヌクレオチドによってコード化できるアミノ酸の配列を同定する。これは好ましくは、単一のコドンだけでコード化されているアミノ酸を含有する配列を同定することにより達成される。
時にはアミノ酸配列が単一のオリゴヌクレオチド配列によってのみコード化されることもあるが、アミノ酸配列はしばしば1セットの類似のオリゴヌクレオチドでコード化される。重要なことは、このセットの構成要素のすべてが同一のペプチドフラグメントをコード化可能であるようなオリゴヌクレオチド配列を含んでおり従ってそのペプチドフラグメントをコード化する遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を潜在的に含んでいるにもかかわらず、このセットの中のただ１つの構成要素だけが遺伝子の配列をコード化するエクソンと同等のヌクレオチド配列を含んでいるのである。この構成要素は当該セットの中に存在しそして例えセットの中の他の構成要素が存在してもDNAとハイブリッド化可能であるので、ペプチドをコード化する遺伝子をクローン化するために単一のオリゴヌクレオチドを用いるといった同様の方法で未分画のオリゴヌクレオチドのセットを用いることが可能である。
遺伝暗号を用いて（Watson, J. D., In：Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA（1977））１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドをアミノ酸配列から同定することができ、その各々は存在するBbkまたはフラグメント蛋白をコード化することができる。特定のオリゴヌクレオチドが実際に配列をコード化した現実の蛋白を構成する可能性は、特定のコドンが真核生物細胞中で（特定のアミノ酸をコード化するために）現実に用いられるような異常な塩基対関係および頻度を考慮することにより予測可能である。そのような「コドン使用頻度の規則」はLathe, et al., J. Molec. Biol., 183：1-12（1985）に開示されている。Latheの「コドン使用頻度の規則」を用い、Bbk蛋白配列をコード化可能な理論的に「もっとも可能な」ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチド配列または1セットのオリゴヌクレオチド配列が同定される。
（そのような単一オリゴヌクレオチドまたは1セットのオリゴヌクレオチドと相補的な）Bbk蛋白遺伝子のフラグメントをコード化可能な適当な単一オリゴヌクレオチドまたは1セットのオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られている方法で合成することができ（たとえばS. A. Narang, Ed., Synthesis and Application of DNA and RNA, Academic Press, San Diego, CA参照）、そして当業者に公知の技術でクローン化Bbk蛋白遺伝子を同定し単離するためのプローブとして用いることができる。核酸のハイブリダイゼーションとクローンのハイブリダイゼーションは、次の文献に開示されている。すなわちManiatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,（1982）；Berger, et al., Eds., Gnide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego, CA,（1988）；Sambrook, J., et al., Molecular Cloning；A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York（1989）；およびHames, et al., Eds., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC.（1985）。これらの文献は参照により本明細書に包含される。ついで、このようなハイブリダイゼーションが可能であることが見出されている上記の遺伝子ライブラリーの構成要素は、それらが含んでいる配列をコード化するBbk蛋白の程度と性質を決定するために分析される。
所望のBbkまたは配列をコード化したフラグメント蛋白DNAの検出を促進するために、上記のDNAプローブを検出可能基または標識で標識化する。そのような検出可能な基または標識は、検出可能な物理的または化学的性質をもつ如何なる物質であってもよい。そのような物質は核酸ハイブリダイゼーションの領域でよく開発されており、一般的にそのような方法で有用な標識のほとんどが本発明において使用可能である。特に有用なものは、たとえば12P、3H、14C、35S、125I、などのような放射性標識である。適切なシグナルを与えそして充分な半減期をもつ放射性標識であれば、如何なるものでも用いることができる。オリゴヌクレオチドはたとえば「ニックトランスレーション」によるか、たとえばRigby, et al., J. Mol. Biol. 113：237（1977）に記載の良く知られている方法によるか、またはたとえばDeen, et al., Anal. Biochem. 135：456（1983）に記載のT4 DNAポリメラーゼ置換合成により、放射性標識化することができる。
あるいはポリヌクレオチドはまた、ビオチンのような非放射性マーカー、酵素または蛍光性もしくは化学発光性の基で標識化したときは、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。たとえば次を参照。Leary, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80：4045（1983）；Renz, et al., Nucl. Acids Res. 12：3435（1984）；およびRenz, M., EMBO J. 6：817（1983）。
すなわちBbk蛋白配列の実際の同定は、そのようなペプチドをコード化可能な理論的に「もっとも可能性のある」DNA配列またはそのような配列の1セットの同定を可能ならしめるものである。この理論的配列と相補的なオリゴヌクレオチドを構成することにより（または「もっとも可能性のある」オリゴヌクレオチドの1セットと相補的なオリゴヌクレオチドの1セットを構成することにより）、Bbk蛋白遺伝子を含むクローンの同定と単離のためのプローブとして機能することのできるDNA分子（または1セットのDNA分子）を得ることができる。
Bbk蛋白遺伝子をクローンする別の方法において、発現ベクターを使用しDNA（または更に望ましくはBbk蛋白を発現可能な細胞からつくったcDNA）を発現ベクターの中へクローニングすることによって、ライブラリーが作製される。ついでこのラブラリーを、たとえばBbk蛋白に対する抗体でライブラリーをスクリーニングすることによってBbk蛋白を発現する構成要素のためにスクリーニングする。
したがって上記の方法は、Bbk蛋白またはそのフラグメントをコード化できる遺伝子配列を同定することが可能である。それらの遺伝子配列をさらに特性化するために、そして組み換え蛋白を製造するためには、これらの配列がコード化する蛋白を発現することが望ましい。そのような発現は、Bbk蛋白の特性をもつ蛋白を発現するこれらのクローンを同定する。そのような特性は、抗体をBbk蛋白に特異的に結合させる能力、およびBbk蛋白に結合可能な抗体の生産を引き出す能力を包含できる。
Bbk蛋白もしくは機能的均等物またはそれらの突然変異体の発現には、適当な宿主により認識できる転写または翻訳シグナルが必要である。たとえば上記の方法で得られた配列をコード化したクローン化Bbk、好ましくは二本鎖の形のものは、発現ベクター中の転写発現を制御する配列に機能的に結合し、そして原核生物または真核生物の宿主細胞の中へ導入されて組み換えBbk蛋白またはその機能的均等物を生成する。配列をコード化するBbkの何れの鎖（ストランド）が転写発現を制御する配列と機能的に結合するかによって、BbkアンチセンスRNAまたはその機能的均等物を発現することも可能である。
異なる宿主におけるBbkの発現は、そのBbkの性質を変化させ得るところの異なる翻訳後の修飾をもたらす。本発明は、原核生物または真核生物におけるBbk蛋白もしくはその機能的均等物またはBbk突然変異体の発現を含むものであり、特に真核生物発現が好ましい。
好ましい原核生物宿主は、E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratiaなどの細菌を含む。もっとも好ましい原核生物宿主はE. coliである。その他の腸内細菌たとえばSalmonella typhimuriumやSerratia marcescensおよび種々のPseudomonas種もまた用いることができる。そのような条件下では、蛋白はグリコシル化されないであろう。原核生物宿主は、レプリコンと両立が可能であり、かつ発現プラスミド内の配列の制御が可能でなければならない。
原核生物細胞（たとえばE. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomycesなど）の中でBbk蛋白（もしくはその機能的均等物）またはBbk突然変異体を発現するためには、Bbkコード化配列を機能的原核生物プロモーターに機能的に連結することが必要である。そのようなプロモーターは、構成的であるかまたは更に好ましくは調節可能（すなわち誘導可能または抑制可能）である。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージラムダのintプロモーター、pBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpBR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターなどがあげられる。誘導的原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージラムダの主要な右と左のプロモーター（PLおよびPR）、E. coliのtrp, recA, lacZ, lacIおよびgalプロモーター、B. subtilis（Gilman, M. Z., et al., Gene 32：11-20（1984））のα-アミラーゼ（Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162：176-182（1985））ならびにシグマ-28-特異的プロモーター、Bacillus（Gryczan, T. J., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., N Y（1982））ならびにStreptomycesプロモーター（Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 203：468-478（1986））があげられる。原核生物プロモーターは、Glick, B. R.,（J. Ind. Microbiol. 1：277-282（1987））；Cenatiempo, Y.（Biochimie 68：505-516（1986））；およびGottesman, S.（Ann. Rev. Genet. 18：415-442（1984））によって総説が発表されている。
原核生物細胞における適切な発現はまた、遺伝子コード化配列のリボソーム結合部位上流の存在が必要とされる。そのようなリボソーム結合部位は、たとえばGold, L., et al.,（Ann. Rev. Microbiol. 35：365-404（1981））に開示されている。
特に好ましい真核生物宿主は、生体内、動物内または組織培養内における哺乳動物の細胞を含む。哺乳動物細胞培養の一般原則は公知であり、たとえばButler, M. and Dawson, M., Eds., Cell Culture LabFax, Bios Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK and Academic Press, Inc., San Diego, CA, Publishers（1992）およびそこで引用された参照文献に記載されている。
真核生物宿主におけるBbkの発現には、そのような宿主における機能調節領域、好ましくは真核生物調節系を用いることが要求される。真核生物宿主の性質に応じて、広範な種類の転写および翻訳調節配列が用いられる。転写および翻訳調節シグナルもまた、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルス、ヘルペスウイルスなどのような真核生物細胞に感染するウイルスのゲノム配列から誘導することができる。好ましくはこれらの調節シグナルは、宿主細胞中の高いレベルの発現が可能な特定の遺伝子と関連している。
転写が翻訳と連結していない真核生物においては、そのような調節領域は、クローニングした配列がそのようなメチオニンを含むか否かに応じて開始メチオニン（AUG）コドンを供給するか又はしない。一般にそのような領域は、宿主細胞内のRNA合成の開始を行わせるに充分なプロモーター領域を含んでいる。翻訳可能なmRNA生成物をコード化する異種の哺乳動物の遺伝子からのプロモーターが好ましく、そしてアクチン、コラーゲン、ミオシン、などのプロモーターのような強力なプロモーターが、もし宿主細胞内でもプロモーターとして機能するならば、特にそれらのプロモーターが用いられる。好ましい真核生物プロモーターはたとえば次のようである。すなわちマウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamer, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1：273-288（1982）；ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight, S., Cell 31：355-365（1982））；SV40初期プロモーター（Benoist, et al., Nature（London）290：304-310（1981）；およびHCMVプロモーター（Boshart, et al., Cell 41：521（1985））；イーストにおけるイーストgal4遺伝子プロモーター（Johnston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：6971-6975（1982））；Silver, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：5951-5955（1984）または解糖遺伝子プロモーターが用い得る。
広く知られているように真核生物mRNAの翻訳は、最初のメチオニンをコード化するコドンで開始される。この理由により、Bbk蛋白またはその機能的均等物をコード化するDNA配列と真核生物プロモーターの間の連結は、メチオニンをコード化することができる介在コドンを全く含んでいないことが確実であることが好ましい。そのようなコドンの存在は、もしAUGコドンが、DNA配列をコード化するBbkと同じリーディングフレーム内にあるならば融合蛋白の、そしてもしAUGコドンが配列をコード化するBbkと同じリーディングフレーム内にないならばフレームシフト突然変異の生成をもたらす。
もし所望ならば、Bbkの融合生産物を構成することができる。たとえばBbkまたはそのフラグメントをコード化する配列は、特定の宿主の中からの蛋白の分泌または蛋白の画分化をおこさせるシグナル配列と連結することができる。そのようなシグナル配列は、該シグナル配列がその次の削除を受け入れるように、特定のプロテアーゼ部位と共にまたはそれなしにデザインすることができる。
転写開始調節シグナルは、抑制化または活性化を行わせるように選択可能であり、したがって機能的に連結した遺伝子の発現を調整することができる。温度に敏感な、すなわち温度の変化により発現が抑制もしくは開始されるような、または代謝物質のような化学的調整が行われるような調節シグナルは興味あるものである。さらに、Bbk mRNAおよびアンチセンスRNAが転写可能な形で、ただし異なるプロモーターまたはその他の転写調節要素と共につぎのように、すなわちBbk mRNA発現の誘導がアンチセンスRNA発現の抑制を伴い及び/又はBbk mRNA発現の抑制がアンチセンスRNA発現の誘導を伴うようにして、行われる構築もまた興味あるものである。
BbkアンチセンスRNA配列の発現が望ましいときは、翻訳シグナルは必要でない。
もし所望ならば、Bbk蛋白をコード化する配列への非転写及び/又は非翻訳3'領域は、上記のクローニング方法によって得ることができる。この3'-非転写領域は、その転写末端調節配列要素のために保持することができ；この3'-非翻訳領域は、その翻訳末端調節配列のために又は真核生物細胞でのポリアデニル化を行うこれらの要素のために保持することができる。自然の発現調節シグナルが宿主細胞内で充分に機能しないときは、宿主細胞内の配列機能部分は置き換えることができる。
本発明のベクターはさらに、たとえばエンハンサー配列のような他の機能的に連結する調節要素、または機能的連結遺伝子において組織もしくは細胞タイプの特異的発現をおこなうDNA要素をも含む。
哺乳動物細胞の本発明のDNA構築物による形質転換のためには、Bbk DNA構築物を宿主細胞染色体DNAの中へ挿入するのが望ましいかまたは染色体外の形で存在させるようにするのが望ましいのかによって、多くのベクター系がある。
もし配列をコード化したbbk DNAおよび機能的に連結したプロモーターが、自律的複製不能な直線的分子または閉鎖共有環状分子であり得るところの非複製DNA（またはRNA）分子として真核生物細胞受容体の中へ導入されたならば、そのときはBbk蛋白の発現は導入配列の経過的な発現によって起こり得る。
遺伝子的に安定な形質転換体はベクター系または形質転換系と共に構築され、それによってbak DNAが宿主染色体の中へ組み込まれる。そのような組み込みは細胞内で新たにおこるか、または好ましい態様においては、たとえば染色体内へのDNA配列の組み込みを促進するレトロウイルスベクター、トランスポゾンその他のDNA要素と一緒に宿主染色体の中へ機能的にそれ自体を挿入するベクターと共に形質転換によって援助をうける。哺乳類宿主細胞染色体の中へ所望の遺伝子配列の組み込みが可能なベクターが用いられる。
導入されたDNAを染色体の中へ安定して組み込まれた細胞はまた、染色体内に発現ベクターを含む宿主細胞の選択のできる１つまたはそれより多いマーカーの導入によっても選択される。たとえばそのようなマーカーは生物致死剤抵抗たとえば抗生物質や銅そのほかの重金属に対する抵抗性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきDNA遺伝子配列へ直接連結するか、または共トランスフェクションにより同じ細胞の中へ導入することができる。
他の実施態様においては、導入された配列は、受容体宿主内での自律的複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターの中へ取り込まれる。この目的のためには、以下に示すように広範囲の種類のベクターの何れもが使用できる。
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するときの重要な因子は、たとえば次のようである。すなわち、ベクターを含有する受容体が、ベクターを含まない受容体細胞を容易に認識可能かつそれから選択可能であること；特定の宿主で必要なベクターのコピーの数；および異なる種の宿主細胞の間でベクターが「往復運動」できることが望ましいか否か。
好ましい真核生物プラスミドはたとえば、ウシのパピローマウイルス、ワクシニアウイルス、SV40から導かれたものや、酵母では2-ミクロンサークルなどを含むプラスミドまたはそれらの誘導体などがある。そのようなプラスミドは当業者に公知であり［Botstein, et al., Miami Wntr. Symp. 19：265-274（1982）；Broach, J. R., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces：Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470（1981）；Broach, J. R., Cell 28：203-204（1982）：Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10：39-48（1980）；Maniatis, T.,"Gene Expression". In：Cell Biology：A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Academic Press, NY, pp. 563-608（1980）］、商業的に入手可能である。たとえば、クローンされた遺伝子の発現を始動するためにMSV-LTRを用い、そしてプラスミドコピー数を増幅させかつプラスミドの宿主細胞染色体内へ組み込ませるためにヘルパーウイルスと共トランスフェクションが可能な哺乳動物発現ベクター系が文献に記載されている（Perkins, et al., Mol. Cell Biol. 3：1123（1983）, Clontech. Palo Alto, California）。
構築物を含んだベクターまたはDNA配列がひとたび発現のために製造されたならば、そのDNA構築物はたとえばトランスフェクションのような種々の適当な手段の何れかにより適当な宿主細胞の中へ導入される。ベクターの導入後は、ベクター含有細胞の生育のために選択された選択的培地の中で受容体を生育させる。クローン化した遺伝子配列の発現は、Bbk蛋白の生産、またはこの蛋白のフラグメントの生産をもたらす。発現は、形質転換細胞中で連続的に行われるか、または制御的たとえば後で形質転換細胞の分化を誘発するような発現（たとえば神経芽細胞腫細胞などへのブロモデオキシウラシルの投与による）が行われる。
発現蛋白は、たとえば抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、などの通常の条件を用いて単離され精製される。
Bbkは、当業者に公知の適当な条件下で形質転換宿主細胞を生育させて精製することができる。その細胞を採取し崩壊させて全細胞蛋白を抽出する。ついでこの細胞をたとえば、セファローズやアガロースのようなサイジングカラムの上におき、正確な分子量の蛋白を採取する。Bbkの予測分子量は26.7kDであり、それはSDSポリアクリルアミドゲルでの約37kDの分子量の延長線上にある。
抗Bbk抗体を用いることにより更に精製を行うことができる。そのような抗体は、正確なおよその分子量の細胞蛋白のセットからBbk蛋白を免疫沈殿するのに用いることができる。そのような抗体はたとえば、図2に示すような配列やその配列のサブ配列にしたがって合成したポリペプチドに対して生育することができる。その他にこの抗体は、他の蛋白の配列と同様にBbk配列を含む溶融蛋白に対して生育することもできる。免疫沈殿後にBbk蛋白を抗体から取出して、実質的に純粋なBbk蛋白の試料を得る。
アンチセンスRNA配列はペプチド核のmRNAを転写した鎖の反対側の鎖にみられる配列なので、本発明のbbk DNAコード化配列はBbkアンチセンスRNA遺伝子配列を得るのに用いることができる。アンチセンスDNA鎖はまた発現ベクター内のプロモーターと機能的に連結でき、それによりこのベクターとの形質転換は形質転換細胞の中のBbkアンチセンスRNAの発現ができる宿主を生じる。アンチセンスRNAとその発現は、高度に特異的なやりかたでbbk遺伝子の転写または翻訳を阻害または抑制するような方法で内在性bbk DNAまたはRNAと相互作用させるのに用いることができる。遺伝子発現をブロックするためにアンチセンスRNAプローブを用いることはたとえばLichtenstein, C., Nature 333：801-802（1988）に記載されている。
Bbk BH3領域を含むBbkフラグメント組成物の同定、評価及び用途
Bbkの公知の生物学的活性のために必要にして充分と考えられるBbk分子内の新規な領域が同定されている。ここに「Bbk BH3領域」として表示されるこの領域は細胞致死機能を仲介するのに充分であり、またBakとの物理的相互作用のためにも充分であろう。Bbk BH3領域配列の突然変異は、Rat1線維芽細胞内のBbk蛋白のアポトーシス活性を減少させることが示されている。これらの実験は、Bbk BH3領域はBbk蛋白の細胞致死およびBbk結合活性のために必要であることを示している。これらの観察は、Bbk BH3領域を含むメカニズムによりアポトーシスを調整または調節することを示唆している。本発明に通暁しているものならば分かるように、Bbk BH3領域を含む配列は細胞内でのアポトーシスの調整に有用である。同様に、Bbk BH3領域と結合可能な化合物や組成物は、細胞内のアポトーシス活性の調整用の薬剤として有用である。
ここで用いられているように、「Bbk BH3領域」とは、BbkとBakの相互作用およびBakの細胞致死機能に必須であることが示されBbk内で最初に同定された蛋白領域であり、そしてその構造及び/又は機能を模倣できるペプチド及び/又は分子である。好ましい実施態様においては、本発明はつぎのアミノ酸配列をもつペプチドを含む。
0004005636.tif 000002
これは125-137Bbkのアミノ酸残基およびその機能的均等物と対応している。「機能的均等物」とは、Bbk BH3領域と実質的に類似の生物学的活性または免疫学的特性をもつペプチドを意味するもので、そのような活性や特性をもった「フラグメント」、「変異体」、「類似体」、「同族体」、または「化学的誘導体」を含むことを意図している。なおBbk BH3領域の機能的均等物は同じアミノ酸配列をもっておらず、そして通常のまたは通常でないアミノ酸の同類または非同類のアミノ酸配列が可能である。
ここで「同類（conservative）」のアミノ酸置換として述べたことは、類似の側鎖をもつアミノ酸残基との相互交換性を意図するものである。たとえばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族側鎖をもつアミノ酸を構成し、セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸を構成し、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有側鎖をもつアミノ酸を構成し、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプロファンは芳香族側鎖をもつアミノ酸を構成し、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは塩基性の側鎖をもつアミノ酸を構成し、アスパラギン酸およびグルタミン酸は酸性の側鎖をもつアミノ酸を構成し、そしてシステインおよびメチオニンは含硫側鎖をもつアミノ酸を構成する。特定のグループのうちの１つのアミノ酸を、同じグループの他のアミノ酸と交換することは、同類の置換とみなされる。好ましい同類置換グループは、アスパラギン-グルタミン、アラニン-バリン、リジン-アルギニン、フェニルアラニン-チロシン、およびバリン-ロイシン-イソロイシンを含む。
本発明の追加的実施態様においては、つぎのアミノ酸配列をもつペプチドが提供される。
0004005636.tif 000003
これらは図9に示すアラニンの点突然変異体に対応し、それらもまた顕著なBbk細胞致死機能を示す。ここに開示したBbk BH3領域はユニークにもBbkのBak結合活性と細胞致死作用の両方をもっている。
Bbk BH3領域の機能的重要性は、他のBcl-2ファミリーメンバーまたはそれ以外のまだ同定されてない細胞蛋白との１つまたはそれより多い蛋白-蛋白相互作用を仲介する能力に関連しているようである。本発明者は特定の理論に拘束されるものではない。しかしながらその作用メカニズムとは無関係に、Bbk内のBbk BH3領域はこれらの蛋白-蛋白相互作用を仲介するために中心的な重要性がある。
Bbk BH3領域仲介蛋白-蛋白相互作用を仲介する能力のある薬剤は、Bbk BH3領域を含むペプチド、さらにはBbk BH3領域を含む蛋白またはBbk BH3領域の突然変異体を包含するであろう。ここで用いた「突然変異体」は、天然に存在するペプチドやアミノ酸の配列とは少なくとも一つのアミノ酸が異なっているところのアミノ酸配列をもつペプチドを意味する。突然変異体は、天然に存在するBbk BH3領域ペプチドまたは天然に存在する蛋白と同様の生物学的および免疫学的活性をもつであろう。しかしながら、突然変異体の生物学的および免疫学的活性は異なっているかまたは欠如しているかも知れない。たとえば、Bbk BH3領域突然変異体は、天然に存在するBbk BH3領域ペプチドに特徴的な生物学的活性を欠如しているかも知れないが、しかしBbk BH3領域に対する抗体を育成するかもしくはBbk BH3領域に対する抗体の検出や精製をするための抗原として有用であり得るし、あるいは天然に存在するBbk BH3領域ペプチドの機能のアゴニスト（拮抗的または非拮抗的）、アンタゴニストもしくは部分的アゴニストとして有用であり得る。
Bbk BH3領域仲介の蛋白-蛋白相互作用の調整はまた、Bbk BH3領域ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストによっても行われ得る。Bbk BH3領域を含む蛋白の機能のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するペプチドライブラリー、化合物ライブラリー、およびその他の情報バンクのスクリーニングは、たとえばBbk BH3領域のホモ二量化またはヘテロ二量化を結合するBbk BH3領域を阻害または増大させる潜在的アゴニストまたはアンタゴニストの能力を検出するための検査によって達成される。
たとえば高処理能力スクリーニングアッセイが、Bbk BH3領域の蛋白結合機能を調節する化合物を同定するために用いることができる。そのようなスクリーニングアッセイは、Bbk BH3領域で仲介される蛋白/蛋白相互作用に影響を与えることによるアポトーシスを加速しまたは阻害する化合物の同定を促進する。たとえば、Bbk BH3領域とBakの相互作用を阻害する化合物の試験管内スクリーニングは、試験をおこなう１つ以上の化合物の存在下に標識Bbk BH3領域ペプチドプローブで培養を行ったBakで被覆したマルチウエルプレートを含む。相互作用を特異的に中断させる分子は原則として、Bbk BH3領域の「リガンド」またはBak内の「レセプター」と結合できる。どちらの種類の化合物も、アポトーシス調節剤の候補となるであろう。
すなわち本発明は、マルチプレートウエルをBakで被覆し、その被覆したマルチプレートウエルを、検査すべき薬剤の存在下に標識Bbk BH3領域ペプチドプローブで培養することから成るところのアポトーシスの調整可能な薬剤のスクリーニング方法を提供するものである。ここでBakとBbk BH3領域の相互作用の中断は、その薬剤がアポトーシスを調整可能であることを示す。この方法で同定された薬剤もまた本発明が意図する実施態様である。
適当な標識は、たとえば酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物のような検出可能標識を含む。当業者はこれ以外の適当な標識を知っているであろうし、また通常の実験を用いてそれらを確かめることが可能であろう。さらにまた、これらの標識をペプチドへ結合することは当業者にとって標準的な技術を用いて行う。
Bbk BH3領域へ直接結合する薬剤の高速スクリーニングは、固定化したまたは「タグをつけた」組み合わせライブラリーを用いることができる。そのようなライブラリーと特異的に結合する薬剤は、Bbk/Bak相互作用をブロックする能力をテストするための候補である。上述のように、そのような薬剤は、Bbk（及び/又はBbk/Bak）機能を直接阻害することにより、または内在性のBcl-2（またはその他のBcl-2ファミリーメンバー）の効果的活性を増大することによりアポトーシスの抑制剤として機能するであろう。そのような薬剤は、「退行性の疾患」（degenerative disorder）やその後の虚血性傷害における異常なアポトーシスの抑制に有用であろう。
本発明のBbk BH3領域ペプチドに対する抗体は、蛋白のBbk BH3領域ファミリーのメンバーであり得る構造的に関連する免疫交差反応性蛋白をコード化したcDNA含有クローンを同定するためのcDNA発現ライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。cDNAおよびmRNA発現ライブラリーのスクリーニングは当業界で公知である。同様に、Bbk BH3領域ペプチドに対する抗体は、この領域に関連する免疫交差反応性蛋白を同定もしくは精製するために、または患者から得られたたとえばリンパ球のような組織もしくは細胞中の細胞群もしくは細胞内にBbk BH3領域を含む蛋白の量を検出もしくは決定するために用いられる。そのような測定方法のための公知の方法としては、細胞抽出物を免疫沈殿させついで免疫組織化学的方法でPAGE in situ検出を行うことやELISA方法が含まれ、これらの全ては当業界で公知である。
本発明によるアポトーシスの調整は、ここで開示するBbk BH3領域を含む蛋白をコード化したヌクレオチド配列の全部もしくは一部に相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオチドを用いる方法を含む。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、標的配列への特定のハイブリダイゼーションの持続を提供するヌクレオチド付加、削除、置換および転位を含む。Bbk BH3領域を含む蛋白をコード化したmRNA種に特異的にハイブリッド化可能な、そしてmRNA種の転写及び/又はコード化されたポリペプチドの翻訳を防ぐような可溶性のアンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドは、本発明の相補的アンチセンスポリヌクレオチドとして期待される。Bbk BH3領域を含む蛋白の製造は、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドによって阻害され、そしてそのようなアンチセンスポリヌクレオチドはアポトーシス、老化などを阻害しそして/又は形質転換表現型の細胞を逆転させることができる。外因性の発現カセットは、トランスフェクション化物またはトランスジェニック細胞のアンチセンスポリヌクレオチドを製造するのに用いることができる。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、試験管内での細胞の培養培地または生体内での腸液（たとえば循環器系を経由して）のような標的細胞の外部環境への可溶性オリゴヌクレオチドとして投与することができる。アンチセンスポリヌクレオチドとその用途は当業者に公知であり、たとえばMelton, D. A., Ed. Antisense RNA and DNA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（1988）に記載されている。
本発明によって同定された薬剤の予測される生物学的活性は、Bbk/Bak機能のメカニズムに関して行われた仮定に応じて変化する。たとえば、Bbk BH3領域と強固に結合する薬剤は、Bbk（および多分Bbk/Bak）機能を阻害するものと予測される。Bbk（及び/又はBbk/Bak）が活性細胞死滅の調節分子であると仮定すれば、Bbk BH3領域と強固に結合する薬剤はBbk機能を阻害するであろう。したがってそのような薬剤は、Bbkが実際のアポトーシス効果をもつような条件下では抗アポトーシス活性を示すであろう。このグループの薬剤は、たとえば虚血からおこる神経変性疾患や傷害を含めた過剰のもしくは不適切な細胞死滅で特徴づけられる疾患の治療に有用であろう。
Bbk BH3領域ペプチドの疑似ペプチド（Peptidomimetics）もまた本発明により提供され、Bbk BH3領域を含む蛋白の機能をブロックし、またはBbk BH3領域仲介の相互作用を阻害することによるアポトーシスの調整のための薬物として機能することができる。薬化学において疑似ペプチドとは、模倣されたペプチドと同様の性質をもつ非ペプチド薬物として一般に理解されている。疑似ペプチドデザインの原則と実際は当業界で公知であり、たとえばFauchere, J., Adv. Drug Res. 15：29（1986）；およびEvans, et al., J. Med. Chem. 30：1229（1987）に記載されている。治療的に有用なペプチドと構造的に類似する疑似ペプチドは、同等の治療的または予防的効果を生じるものとして使用することができる。そのような疑似ペプチドは典型的には、生体内での化学的な故障に対する抵抗性のような望ましい性質に変換可能な結合で任意に置き換えられた１つ以上のペプチド結合をもっている。そのような結合としては-CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH-, -COCH2, -CH（OH）CH2および-CH2SO-のようなものが含まれる。疑似ペプチドは優れた薬理学的性質（生物学的半減期、吸収率など）、異なる特異性、高い安定性、生産経済性、少ない抗原性などをもっており、これらは治療剤としてのそれらの用途をとくに望ましいものとする。
Bbk BH3領域単独を含むかまたは公知の方法によるアジュバントとの結合状態のペプチドにより動物の免疫すると、Bbk BH3領域ペプチドに特異的な抗体を生産することができる。通常の製法で得られた抗血清は、この目的のために利用できる。たとえばウサギのような哺乳動物は、Bbk BH3領域を含むペプチドで免疫することができ、その結果それに対するポリクローナル抗体の形成を誘発する。モノクローナル抗体もまた公知の方法を用いて生成することができる。そのような抗体は、本発明によってBbk BH3領域を含むペプチドの存在と量を調べるために用いることができる。
本発明のBbk BH3領域ペプチドは、放射線免疫検定法および酵素免疫検定法を含む標準的なアッセイによりBbkやその他の蛋白の検出に用いることができる。
Bbk BH3領域を含むペプチドの精密な化学構造が、多くの因子に応じて変化することは当業者により認められている。たとえば、特定の蛋白はその分子内にイオン化可能なカルボキシル基およびアミノ基があるので、酸性もしくは塩基性の塩または中性の状態で得ることができる。そこで本発明の目的のためには、天然に存在するペプチドの治療的および診断的活性を保持するところのBbk BH3領域を含むペプチドは如何なるタイプのものでも本発明の範囲内にあるものと意図されている。
ここで使った「実質的に相同（substantially homologous）」という用語は、たとえば約65℃の温度で約0.1倍のクエン酸ナトリウム-塩化ナトリウム緩衝液（SSC）という厳しい条件下で、Bbkをコード化した第一のDNA配列を、前者をコード化した第二のDNA配列にハイブリダイズする能力を意味するものである。「実質的にも純粋」という用語は、用いる蛋白や分子が如何なる他の検出可能な生物学的構成成分も本質的に含有してないことを意味している。Bbkのような分子の「フラグメント」とは、Bbk蛋白の生物学的活性をもつ分子の如何なる変種をも表わすことを意味するものである。分子の「変種（variant）」とは、構造が実質的に類似しているかまたは分子全体もしくはそのフラグメントに対する生物学的活性もしくは免疫学的特性が実質的に類似している分子を表わすことを意味している。すなわち、もし二つの分子が類似の活性をもっているときは、たとえそれら分子の組成または二級、三級もしくは四級構造が他で見られるものと同一でなくても、さらにたとえアミノ酸残基の配列が同一でなくても、それらの分子は本明細書で該用語を使っているように変種であるとする。分子の「類似体（analog）」とは、分子全体かまたはそのフラグメントが機能において実質的に類似している分子を表わすことを意味するものである。ここで用いているように、ある分子がもし通常はその分子の一部分でない追加的な化学的部分（chemical moieties）を含んでいるときは、別の分子の「化学的誘導体」と呼ばれる。そのような部分は、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期、などを改善することがある。これらの部分はまた分子の毒性を軽減したり、分子の望ましからぬ副作用を低減もしくは弱化したりすることがある。そのような効果を仲介する部分はたとえばRemington's Pharmaceutical Sciences（1980）に記載されている。そのような部分を分子に結合させる方法は当業界において公知である。「調整する（modulate）」という用語は、本発明の目的のための以下のようなことを意図するものである。すなわち、本発明のBbk蛋白やその活性フラグメントやその機能的均等物の投与によるアポトーシスの誘発及び/又は、不適当な細胞増殖もしくは不適当な細胞死を安定化するため、好ましくは正常な細胞の性質を保持するために、たとえばT細胞の死滅をもたらすAIDSを含めた不適当な細胞死で特徴づけられるところの不適当な細胞成長たとえばリンパ腫、遺伝子型腫瘍、ガンもしくは不全を招来するいろんな退行性の疾患に罹患している個体の特定の細胞に対するBbkハイブリッドもしくはBbk突然変異体の投与または上述のいずれかをコード化したcDNA含有のベクターの投与によるアポトーシスの抑制もしくは誘発を意図するものである。
「投与」という用語は、治療薬剤が細胞膜を通って所望の細胞の中へ到達するような投与形態の何れをも表わすものとする。投与部位と細胞は、治療すべき特定の退行性の疾患の理解に基づいて当業者に公知のものの中から選択される。また投与量、投与頻度および治療コースの長さは、治療すべき特定の退行性の疾患に基づいて当業者によって決定され最適化することができる。投与の特定の態様もまた当業者により容易に選択することができ、治療剤が細胞膜を経由するという必要性によりたとえば経口、静脈内、皮下、筋肉内、などが含まれる。本発明の治療剤は、Bbk蛋白及び/又はその機能的均等物及び/又はBbkハイブリッドまたはBbk突然変異体及び/又は上述のものをコード化したcDNA含有ベクターであることができる。「治療剤」という用語は、これらのBbk蛋白、フラグメント、機能的均等物及び/又はそれらのハイブリッドや突然変異体さらには上述のものの何れかをコード化するcDNA含有ベクターを表わすものとする。本発明の治療剤は単独で、またはその他の適当な薬物及び/又は治療コースと配合して及び/又は同時に投与することができる。「退行性の疾患」という用語は、不適当な細胞増殖または不適当な細胞死または場合によりその両方によって特徴づけられるあらゆる疾患を、本発明の目的のために意味する。「不適当な細胞増殖」という用語は、正常の集団における特定細胞型の増殖とくらべて、細胞の数が統計的に顕著に増大することを意味している。細胞が、たとえば急性の肺障害後の肺組織の線維芽細胞の存在のように不適当な場所に存在及び/又は持続するような不全もまたここに含まれる。たとえばそのような細胞は、滲入と転位という性質をもち高度に逆生性（anaplastic）であるガン細胞をも含むものである。そのような細胞はたとえば腫瘍細胞のようなガン細胞を含むが、但しそれらに限定されるものではない。「不適当な細胞死」という用語は、正常の集団における特定細胞型の存在とくらべて、細胞の数が統計的に顕著に減少することを意味している。そのような不十分な表現は、たとえば不適当なT細胞の死をもたらすAIDS（HIV）や、不適当な細胞死で特徴づけられる自己免疫疾患を含めた特定の退行性の疾患に起因するようである。「自己免疫疾患」という用語は、自己抗原に対する免疫応答に起因する疾患を表わすものとする。そのような疾患は、自己抗原を含有する組織内の免疫複合体や免疫的に有効な細胞でひきおこされる炎症障害と結合した自己抗原に対する細胞仲介免疫や循環性自己抗体の存在により特徴づけられる。そのような疾患は、全身製エリテマトーデス（SLE）や関節リュウマチを含むものである。
「抑制」という用語は、不適当な細胞死で特徴づけられる退行性の疾患に罹患している個体におけるアポトーシスを抑制するために効果的なBbkハイブリッドまたはそのBbk突然変異体を含有する治療剤の一定量の投与で得られる結果を、本発明の目的のために意味するものとする。アポトーシスの抑制は、特定の影響を受けた細胞のタイプの数が安定しているかまたは正常の細胞集団で観察される範囲内の水準まで数が増大するときに得られる。「安定」という用語は、統計的に顕著な細胞数の減少が、治療コースの開始時に観察された細胞数とくらべて治療中の個体においてはもはや観察されないといった状態を表わす。「誘発」という用語は、本発明の目的のために、不適当な細胞増殖で特徴づけられる退行性の疾患に罹患している個体の細胞内でアポトーシスを誘発するのに効果的な本発明のBbkを含有する治療剤の一定量の投与で選られる結果を意味するものである。アポトーシスの誘発は、細胞数が安定しているかまたは正常な細胞集団で観察される範囲内の水準まで細胞数が減少するときに得られる。当業者は、アポトーシスの誘発が得られているか否かを容易に決定することができる。
「Bbkハイブリッド」という用語は、本発明の目的のために、本発明のBbk蛋白、そのフラグメント、及び/又はその機能的均等物または突然変異体と、Bbk単独の活性とくらべて高いか、低いかまたは中間のアポトーシス誘発または抑制活性をもつ蛋白を製造するため、たとえばBcl-2、Bax、c-myc、LMW5-HL、Bbk、Bcl-XL、Bcl-XS、BHRF-1、Mcl-1、A1およびced9、それらのフラグメント及び/又はそれらの機能的均等物を含む遺伝子でコード化した他のアポトーシス関連蛋白とのハイブリッド蛋白である蛋白を意味するものである。そのようなハイブリッドはたとえば、bbk cDNAのコード化領域の前半とcDNAのコード化領域の後半をbcl-2、bax、bcl-xL、bcl-xSまたはそれらの逆と融合することによって製造することができる。さらには、bcl-2、bax、bcl-xL、またはbcl-xSのセグメントをbbk cDNAへ付加しまたは置き換えることによって、治療価値のあるキメラ遺伝子産物を製造することができる。当業者は、公知の方法を使ってこれらのハイブリッドを容易に製造しかつ用いることができる。当業者は、公知のスクリーニング方法や本明細書に記載の方法を使って、特定のハイブリッドが増大、減少もしくは中間のアポトーシス誘発を示すかまたは抑制活性を示すかを容易に決定することができる。本発明の目的のために、「正常な細胞の性質」という用語は、アポトーシスが正常に進行しているような細胞を意味している。正常な細胞の性質は、器官機能を阻害したり腫瘍に発展し得るような老化、損傷または異常細胞を除去することができる生体において観察される。正常に進行するアポトーシスは、直ちには致死的でない侵害刺激に対する共同細胞応答を表わす。
本発明の目的のために、「患者」または「個体」という用語は、退行性の疾患に罹患しているところのヒトや哺乳動物を含めた動物を意味する。本発明の目的のために、「Bbk突然変異体」という用語は、一つ以上のアミノ酸または対応するヌクレオチドの置換による本発明のBbk蛋白の逆（アポトーシス抑制）活性をもつBbkの変異体をあらわす。本発明の目的のために、「アポトーシス関連蛋白」という用語は、たとえば腫瘍細胞および確立されたヒトの細胞系を含むヒトの組織ならびに哺乳動物を含むその他の動物からの特にアポトーシス誘発を示すところの天然に存在するもの並びに単離された組換え生産による蛋白（すなわち合成Bbk）の両方を表わす。この用語は、本明細書に開示されるポリペプチドの生物学的または免疫学的特性を保持した、天然または合成のBbkの部分的フラグメントのような天然に存在するアミノ酸数より少ない数をもつフラグメントを含む単離された天然のBbkの類似体、同族体、突然変異体または誘導体の如何なるものをも包含する。この用語はまた、本発明のBbk蛋白の生物学的および免疫学的特性を保持している１つ以上のフランキングアミノ酸と共に、単離された天然存在Bbk蛋白またはその類似体もしくは同族体の配列を含んでいる如何なるペプチドをも包含するものである。
Bbkやその機能的均等物、フラグメント、ハイブリッド、または突然変異体に対して生育された抗体の構築と同定
以下の記載において、免疫学での当業者のよく知られている種々の方法論について参照が行われる。免疫学の一般原則を述べた標準的な参考文献は、たとえば次のようなものである。Catty, D., Antibodies, A Practical Approach, Vol. 1, IRL Press, Washington, DC（1988）；Klein, J., Immunology：The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, New York（1982）；Kennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York（1980）；Campbell, A., “Monoclonal Antibody Technology”In：Burdon, R., et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier, Amsterdam（1984）；およびEisen, H. N., In：Davis, B. D., et al., Microbiology, 3d ed., Harper & Row, Philadelphia（1980）。
抗体は、もしそれが分子と特異的に反応可能であってそこで分子と抗体が結合するならば、分子と「結合可能」であるといわれる。「エピトープ」という用語は、抗体により認識され結合されることのできるハプテンの該部分を表わすと定義される。抗原は１つまたはそれ以上のエピトープをもつことができる。「抗原」は、その抗原のエピトープと結合可能な抗体を生産するために動物に誘発することができる。上に示した特定の反応とは、抗原は、他の抗原によって喚起されるかもしれない多くの他の抗体とではなく、対応する抗体と高度に選択的な状態で反応することを示すことを意味するものである。
ここで使った「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）という用語は、抗原と結合可能な完全な分子やそのフラグメント（たとえばFabやF（ab）2フラグメント）を含むものを意味する。FabおよびF（ab）2フラグメントは、完全な抗体のFcフラグメントを欠如しており、循環から一段と迅速にクリアされ、そして完全な抗体の非特異的組織結合が少ない（Wahl, et al., J. Nucl. Med. 24：16-325（1983））。
本発明の抗体は、Bbkペプチド上に存在する1つ以上のエピトープまたはこのBbk上のイディオタイプに対する特異性をもっている。本発明の抗体は、もし免疫原として本発明のBbkポリペプチドまたはそのフラグメントと共に作製されるのならばポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。これらの両方のタイプの抗体は、ここに記載の用途に利用することができる。
本発明の抗体は、ヒトの組織標本中のこのBbk蛋白の存在の検出にもちいることができる。このBbk蛋白は、標本をこの検出可能的に標識した適当な抗体の画像化有効量と接触させそして標識を検出することにより標本内のBbk蛋白の存在を確認することで検出することができる。検出は生体内での画像化（imaging）により行うことができる。このBbk蛋白はまた、本発明にしたがった適当な抗体を用いることによりたとえばRIAやELISAなどの公知の免疫アッセイ技術によって検出することもできる。
本発明の抗体は、種々の公知方法のいずれかによって製造される。たとえばBbk蛋白を発現する細胞は、Bbk蛋白と結合可能なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘発するために動物に投与することができる。たとえばBbk蛋白やそのフラグメントは、化学的に合成しHPLCで精製して、不純物を実質的に含まないようにする。ついでその製品は、高度の特異的活性のポリクローナル抗血清を製造するために動物に導入される。
ポリクローナル抗体は、たとえばマウス、ウサギもしくはヤギのような適当な動物のいずれかの中で生成させることができる。Bbk免疫原的ペプチドまたはそのフラグメントは、それ自体を、またはKeyholeのリンペットヘモシアニン（KLH）のような適当な免疫活性担体と連結させたものを注射することができる。つぎを参照のこと。Catty, D., Ed., Antibodies, A Practical Handbook, Vols. I and II, IRL Press, Washington, DC（1988）。
モノクローナル抗体は、当業者がよく理解している技術を使用し種々の方法で製造することができる。たとえばモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術をもちいて製造することができる。Kohler, et al., Nature 256：495（1975）；Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6：511（1976）；Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6：292（1976）；Hammerling, et al., In：Monoclonal Antibodies and T-Cel1 Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp.563-681（1981）；Roger, H. Kennett, et al., Eds., Monoclonal Antibodies-Hybridomas：A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press,（1980）。一般にこのような方法は、動物をBbk蛋白またはそのフラグメントで免疫化することを含むものである。そのような動物の脾臓細胞を抽出し、そして適当な骨髄腫細胞系と融合させる。いかなる適当な骨髄腫細胞系も本発明において用いることができる。融合の後は、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地で選択的に保持し、ついでWands, et al., Gastroenterol. 80：225-232（1981）に記載のようにして限定希釈によってクローン化する。つぎにそのような選択で得られたハイブリドーマ細胞を、Bbk蛋白と結合可能な抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイを行う。
上述の方法を用いることにより、このBbk蛋白のエピトープを認識する抗体を製造することが可能な追加の細胞系を得ることができる。
たとえば、このBbk蛋白を検出可能なモノクローナル抗体を生産する追加的のハイブリドーマが容易に製造できそして最小のスクリーニングで単離できる。このBbk蛋白上で見られるエピトープに特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、まずたとえばBalb/cマウスのようなハイブリドーマ生産可能動物をフロインドのアジュバントで最初の皮下注射により免疫化し、ついで数日の間にブースター注射をおこなうことによって最も効果的に製造される。融合は当業者に公知の技術のいずれかを用いて行うことができる。このペプチドに特異的なモノクローナル抗体を製造するのはどちらのハイブリドーマであるかを決めるためのスクリーニングは、単純明解でありかつ標準的なELISAまたはRIA形式で行うことができる。たとえばRIAスクリーニング形式においては、モノクローナル抗体を製造するハイブリドーマからの腹水液または培養上澄み液を125Iと反応させる。ここで述べたものと同様な特異性のmAbsを分泌する他のハイブリドーマの単離は、抗イディオタイプスクリーニングの技術により行われる。Potocmjak, et al., Science 215：1637（1982）。簡単に言えば、抗イディオタイプ（anti-Id）抗体とは、抗体の抗原結合部位と一般的に関連したユニークな決定因子を認識する抗体である。Id抗体は、mAbの原料として同一の種と遺伝子タイプ（すなわちマウス株）の動物を、抗Idが製造されたBbk蛋白またはそのフラグメントに対して生育させたmAbで免疫化することで製造できる。免疫化された動物は、これらのイディオタイプ決定因子（抗Id抗体）への抗体を製造することにより免疫化抗体のイディオタイプ決定因子を認識しそれに応答するであろう。
このmAbでのイディオタイプ決定因子に特異的な抗Id抗体を用いることにより、そのイディオタイプを所有する他のB細胞やハイブリドーマクローンを同定することが可能である。２つのクローンの抗体生産物間のイディオタイプの同等性は、２つのクローンの抗体生産物が同様の抗原エピトープを認識するので、高い可能性がある。
抗Id抗体はまた、他の動物においても免疫応答を誘発する「免疫原」として用いることができ、いわゆる抗-抗Id抗体を生産する。この抗-抗Idは、抗Idを誘発するもとのmAbとエピトープ的に同等である。
すなわちmAbのイディオタイプ的決定因子への抗体を用いることによって、同等の特異性のある抗体を発現するその他のクローンを同定することができる。
したがってこのBbk蛋白に対して生産されるmAbsは、たとえばBALB/cマウスのような適当な動物における抗Id抗体を誘発するのに用いられる。そのように免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、抗Id mAbsを分泌する抗Idハイブリドーマを製造するのに用いられる。さらに抗Id mAbsは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような担体とカップリング可能であり、別のBALB/cマウスの免疫化に用いることができる。これらのマウスからの血清は、抗原エピトープに特異的なもとのmAbの結合性質をもつ抗-抗Id抗体を含有しているであろう。すなわち抗Id mAbsは、評価されるエピトープと構造的に類似したところの該抗Id mAbs自身のイディオタイプのエピトープあるいは「イディオトープ」をもっている。
複製のためには、本発明のハイブリドーマ細胞を試験管内または生体内で培養する。高力価のmABsの生体内生産による製造は、現在のところ好ましい製造法である。簡単に言えば、個々のハイブリドーマからの細胞を、プリスタン処理した（pristane-primed）BALB/cマウスに腹腔内注射して、所望のmAbsを高濃度で含有する腹水液を得る。IgMやIgGアイソタイプのMAbsは、当業者によく知られているカラムクロマトグラフィーを用いて、その腹水液または培養上澄み液から精製することができる。
本発明において特に興味のあるものは、ヒトから生産した抗体、またはヒトでは抗原的でないかもしくは長期間にわたって受容体の循環系血清に保持されているような組換えもしくはその他の技術によって「ヒト化した」（すなわちヒトにおいては非免疫原的な）ところの抗体である。
ヒト化された抗体はたとえば、抗体の免疫原的部分を、対応はしているが但し非免疫原的の部分（すなわちキメラ抗体）で置き換えることによって製造することができる［Robinson, et al., International Patent Publication PCT/US86/02269；Akira, et al., European Patent Application 184,187；Taniguchi, M., European Patent Application 171,496；Morrison, et al., European Patent Application 173,494；Neuberger, et al., PCT Application WO86/01533；Cabilly, et al., European Patent Application 125,023；Better, et al., Science 240：1041-1043（1988）；Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84：3439-3443（1987）；Liu, et al., J. Immunol. 139：3521-3526（1987）；Sun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84：214-218（1987）；Nishimura, et al., Canc. Res. 47：999-1005（1987）；Wood, et al., Nature 314：446-449（1985）；Shaw, et al., J. Natl. Cancer Inst. 80：1553-1559（1988）］。「ヒト化」されたキメラ抗体についての一般的な総説はMorrison, S. L.（Science 229：1202-1207（1985）およびOi, et al., BioTechniques 4：214（1986）に記載がある。
適当な「ヒト化」された抗体はまた次の文献の記載により製造することができる。Jones, et al., Nature 321：552-525（1986）；Verhoeyan, et al., Science 234：1534（1988）；およびBeidler, et al., J. Immunol. 141：4053-4060（1988）。
本発明のBbk蛋白、そのフラグメント、そのハイブリッド、Bbk突然変異体またはそれらの抗体は、ヒトの組織標本におけるBbk蛋白の検出のためのイムノアッセイにおいて用いることができる。たとえば、本発明のBbkに対する抗体は、ヒトの組織標本におけるBbk蛋白の検出のために使用できる。このイムノアッセイは競合的でもサンドイッチ的でもよくまたは公知のものでもよく、それらのすべては抗体-抗原免疫複合体の形成に依存している。これらのアッセイは当業者によく知られている。
アッセイの目的のために、抗体や抗原を免疫化したり標識化したりすることができる。固定化のために抗体/抗原を結合可能でかつ本発明で使用可能な多くの担体がある。よく知られている担体としてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱などがあるがこれに限定されるものではない。本発明の目的のためには、担体の性質はある程度まで可溶性であるかまたは不溶性であることができる。当業者は、日常の実験手段を用いて抗体や抗原を結合させるに適当な多くの他の担体を知っているであろうし、また確認することができるであろう。
本発明の特定の実施態様によっては、1つ以上の抗体または抗原ペプチドを、たとえば酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、または生物発光化合物のような検出可能な標識とカップリングさせる。
当業者ならば、抗体もしくは抗原ペプチドと結合するための他の適当な標識を知っているであろうし、または通常の実験手段を用いてそれらを確認することができるであろう。さらにはこれら標識の抗体や抗原との結合は、当業者に通常知られている標準的技術を用いて行うことができる。
抗体あるいは抗原ペプチドは酵素と結合することができる。逆にこの酵素は、あとでその基質に露出させておくと、たとえば分光光度的または蛍光光度的手段によって検出可能な化学的部分を生じるような方法で基質と反応する。検出可能的に標識するために使用可能な酵素の例としては、アミレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロ燐酸デヒドロゲナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトーシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-燐酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼなどがある。
抗体または抗原の存在はまた、放射性同位元素で抗体や抗原を標識することによって検出することができる。放射性同位元素の存在は、ガンマーカウンターやシンチレーションカウンターの使用といった手段によって決定することができる。特に有用な同位元素は3H,125I,32P,35S,14C,51Cr,36Cl,57Co,59Fe,75Se、および152Euである。
蛍光化合物で抗体または抗原を標識することによって抗体または抗原の存在を検出することができる。蛍光的に標識された抗体または抗原ペプチドを適当な波長の光に露出すると、色素の蛍光のためにその存在が検出できる。最もふつうの蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタールアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体または抗原が検出可能に標識できる他の方法は、化学発光化合物とカップリングさせることである。化学発光物質でタグされた抗体または抗原ペプチドの存在は、化学反応の経過において生じる化学発光の存在を検出することで決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダキソール、アクリジニウム塩、および蓚酸エステルである。
同様に、生物発光化合物もまた、抗体または抗原ペプチドの標識に用いることができる。生物発光は、生物学系に見られそして触媒蛋白が化学発光反応の効率を増進させる特殊なタイプの化学発光である。生物発光結合パートナーの存在は、発光の存在を検出することで決定される。標識の目的のために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびアクオリンである。
本発明のアッセイに用いられる抗体または抗原ペプチドは、キットの作製のために理想的に組み合わされる。そのようなキットは、バイアルやチューブのような1つ以上の容器を密閉して受け入れる仕切りのある担体手段から成り、各々の容器はこの方法で使用される別々の要素の１つから成っている。
たとえば、容器の一つは、不溶性かまたは部分的可溶性の担体に結合した第一の抗体から成っている。第二の容器は、凍結乾燥の形態または溶液の第二の検出可能的に標識した第二の抗体から成っている。容器はまた、凍結乾燥の形態または溶液の第三の検出可能的に標識した第三の抗体から成っている。そのようなキットはサンドイッチアッセイで用いることができる。
さらに担体もまた、複数の容器を含んでおり、各々の容器は異なるそして所定量のBbkペプチドを含んでいる。後者は、未知量のBbk蛋白を含む標本から得られた結果を訂正するために用い得る標準曲線をつくるのに用いることができる。
画像化は、試験管内または生体内で行うことができる。試験管内での画像化は、既に述べた標識で行うことができる。生体内での画像化は、診断的に有効な標識化抗体で行うことができる。「診断的に有効」という用語は、検出可能なように標識した抗体の投与量が、背景のシグナルと比較してBbkの蛋白存在部位の検出ができるのに充分であることを意味する。
一般的に、診断のために検出可能に標識した抗体または抗原の用量は、個々の医師によって調節されるべき患者の年齢、状態、性、病気の程度状態、ときには逆適応症（counterindication）その他の要因などを考慮することにより変動する。用量は0.01mg/kgから2,000mg/kg、好ましくは0.1mg/kgから1,000mg/kgと変動し得る。
「診断的に標識された」という用語は、診断的に検出可能な標識が抗体に付着していることを意味する。
当業者に公知の、多くの異なった画像標識および標識方法がある。本発明で用いられる標識のタイプの例としては、放射性同位元素や常磁性同位元素がある。
診断的な生体内画像化のためには、入手可能な検出器具のタイプが、与えられた放射性核種を選択するための重要な因子である。選ばれた放射性ヌクレオチドは、与えられたタイプの器具について検出可能である崩壊のタイプをもっていることが必要である。一般的にいって、診断画像を可視化するどんな普通の方法も、本発明では用いることができる。
生体内診断法のための放射性核種を選択するときのもう一つの重要な因子は、放射性ヌクレオチドの半減期が、標的によって最大限に摂取されるときでもなお検出可能なくらいに充分長いこと、そして宿主に対する有害な放射が最小限になるように充分短いことでる。理想的には、生体内画像化に用いる放射性核種は、粒子の放出がなく、ただし通常のガンマーカメラで容易に検出できる140-200keVの範囲という多数の光子を生じることである。
生体内診断のためには、放射性ヌクレオチドは、中間の機能基を用いて直接または間接的に抗体または抗原と結合することができる。抗体または抗原に金属イオンとして存在する放射性同位元素と結合するためにしばしば使用される中間機能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）である。免疫グロブリンに結合可能な金属イオンの代表例は99mTc,123I,111In,131I,97Ru,67Cu,67Ga,72As,89Zrおよび201Tlである。
本発明の方法で用いられる抗体はまた、生体内診断の目的のために常磁性同位元素で標識することもできる。この方法のために（磁気共鳴画像［MRI］技術におけるように）特に有用な元素は157Gd,55Mn,162Dy,52Crおよび56Feである。
投与のための画像化抗体の製剤としては、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液などがある。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油たとえばオリーブ油、および注射可能な有機のエステルたとえばオレイン酸エチルエステルがある。水性の担体の例としては水、アルコール/水溶液、乳濁液もしくは懸濁液、たとえば食塩水や緩衝化した媒体、非経口的なベヒクル、たとえば食塩溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸塩化したリンゲルまたは固定化した油がある。静脈内用のベヒクルの例としては、液状で栄養的な補充液、電解質補充液たとえばリンゲルのデキストロースをベースとしたもの、その他がある。保存剤やその他の添加物もまた存在してもよく、たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性のガス、その他がある。一般的にはつぎを参照のこと。Remington's Pharmaceutical Science, 16th ed., Mac Eds. 1980。
もちろん発現されたBbkは細胞内蛋白である。したがって当業者は、本発明の抗体を用いる生体内診断および治療方法は、そのような抗体が細胞の中のBbkを検出できるなんらかのメカニズムを必要とすることを認識するであろう。そのような方法の１つは、抗体またはそのフラグメントを、細胞膜を通して細胞自体の中へ導入することである。これはたとえば、標的細胞が受容体部位を含んでいるリガンドへ抗体を付着させることにより達成できる。すなわち抗体は、リガンドと一緒に細胞膜を通ってかまたは細胞膜の中へ輸送することができる。適当なリガンドの例としては、レセプター結合で受容体依存性のサイトカインや成長因子などがある。適当な成長因子の例としては、上皮成長因子（EGF）、腫瘍成長因子アルファー（TGF-α）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン、ならびにインスリン様成長因子１および２（IGF-1およびIGF-2）がある。適当なサイトカインの例としては、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン、IL-1およびIL-2がある。栄養素やビタミン類を細胞の中へ運ぶレセプターがあることもまた知られている。これらの栄養素は、本発明においてリガンドとしての用途に適当であり、その例としては葉酸塩、ジヒドロ葉酸塩、テトラヒドロ葉酸塩およびビタミンB12がある。
担体リガンドの選択は、当業者に知られている種々の因子に依存するであろう。その例としては、リガンドの動力学とそのレセプター、および全輸送のそれがあり、これは活性的に輸送されるリガンドに好ましいように受動的または活性的なものが含まれる。抗体をリガンドに付着させる手段もまた一定の限度内で変化し、そしてそのような付着はリガンド-レセプターの親和性を損なうようには変えてはならないことを留意して、たとえば共有結合またばイオン結合であり得る。
そのような応用のために適当なレセプターの例としては、レセプターエンドサイトーシスに必要なすべての情報を含んでいることが知られている低密度リポ蛋白（LDL）のレセプター（Davis, et al., J.Cell Biol. 107（613）：Abstr. No. 3112（1988））そして公知の脳に特異的のレセプター、たとえばドーパミンのレセプターがある。この点に関して、リガンドそれ自体は、本発明の抗体が結合したレセプターに特異的なフラグメントまたは抗体であり得ることは認められるであろう。
さらに当業者は、リガンド-レセプター相互作用をあまり阻害せず、そして細胞膜を通ってより容易に輸送され得る本発明の抗体フラグメント（たとえばFabまたはF（ab'）2フラグメント）を用いることが特に望ましいことを見出すであろう。単一鎖の抗体は、当業者ならば認めるようにこれらおよびその他の理由によって好ましいことが証明され得る。
抗体が上述のように細胞膜の中へまたは細胞の中へ輸送されるとき、Bbk蛋白上の抗原部位に抗体が結合するときに標識が比較的一段と効果的になるような方法で抗体を診断的または治療的に標識することが好ましい。これはたとえば、抗原-抗体複合体の生成の結果として活性または検出可能となる標識を用いることによって達成され得る。あるいは、抗体それ自体は、抗原-抗体複合体生成が抗体で配座の変化を誘発するような方法で標識化して、これまで未露出かまたは充分に露出してない標識を露出するかまたはもっと充分に露出することができる。上記の判定基準のすべておよびその他のものは、本発明の内容を実施する上で当業者にとって認識されるであろう。
抗体を標的地帯へ特異的に到達させるために、膜の中に本発明の抗体をもつリポソームを用いることもまた可能である。これらのリポソームは、抗体のほかに、標的部位で作用するもの、たとえば薬剤のような治療剤、放射性同位元素、レクチンおよび毒素を含有するように作製することができる。
医薬組成物
治療的に有効な量の本発明のBbk蛋白やその機能的均等物、フラグメント及び/又はハイブリッド及び/又は突然変異体、ならびに上記の1つ以上をコード化したcDNAを含有するベクターは、不適切な細胞死または不適切な細胞増殖で特徴づけられる退行性の疾患に罹患、している患者の治療に有用である。
Bbkのハイブリッドは種々のBbkハイブリッド、たとえばBcl-2, ced-9, Bcl-XL, Bcl-XS, Bax, Mcl-1, c-myc, LMW5-HL, BHRF-1, Bak, BikおよびAlを含む。そのようなハイブリッドは、Bbk単独の活性と比較すると、高いか、低いか、または中間のアポトーシス誘発または抑制活性をもっている。これらのハイブリッドは、当業者により容易に選択され、製造され、そして利用される。すなわち、本発明による医薬組成物は、治療的に有効な量の本発明のBbk蛋白やその機能的均等物、フラグメント及び/又はハイブリッド及び/又は突然変異体を含有するものであり、そして当業者に公知の医薬的に許容される担体及び/又は賦形剤の1つ以上を任意に含有することができる。投与、用量および頻度、ならびに投与期間の長さは、当業者によって、特定の患者のために容易に最適化することができる。たとえば、本発明の医薬組成物は、上述のように滅菌した水性または非水性の懸濁液または乳濁液、たとえば静脈投与のための溶液として処方することができる。
治療上の応用
プログラムされた細胞死とは、細胞が健康な組織や臓器の正常な発達において核の縮合やフラグメント化をうけるプロセスをいう。このプロセスは、新しい細胞の成長と古い細胞の除去の間のバランスを保つために必須のもである。アポトーシスが適切に行われない時は、細胞を早期に死滅させるかまたは予定した時期に死から防ぐかによって、様々な疾患が発展する。
本発明のアポトーシス関連Bbk蛋白やその機能的均等物、フラグメント及び/又はハイブリッド及び/又は突然変異体、また前記のものをコード化したcDNAを含むベクターは、不適切な細胞死や不適当な細胞増殖で特徴づけられる退行性の疾患の治療に有用である。特定の疾患は、あるタイプの細胞ではアポトーシスを誘発するのに望ましく、いっぽう他のタイプのものではアポトーシスを抑制するといったような異なるタイプの細胞を含むことができる。たとえば、本発明のBbk突然変異体蛋白を投与することにより（または肺組織細胞にそのBbk突然変異体蛋白の発現をおこすことにより）急性の肺傷害に罹患している患者の肺組織細胞内のアポトーシスを抑圧し、いっぽうでは本発明のBbk蛋白の投与による（または線維芽細胞にBbk蛋白発現を生じさせることによる）炎症応答に起因するところの肺に存在するであろう線維芽細胞内でアポトーシスを誘発することは望ましいことであろう。
本発明の治療剤は、それが細胞膜を通過せねばならぬという要件とともに上述のようにして投与することができる。この治療剤は単独で投与することも可能であるし、または特定の疾患の治療のために当業者に公知の他の治療剤と共にもしくはその治療の途中に投与することも可能である。たとえば本発明の治療剤は、たとえば放射線治療、化学療法、ならびにたとえばトポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤およびやホルモンアンタゴニストのような抗ガン剤による治療といった古典的な治療もまた受けているガン患者にアポトーシスを誘発させるために投与することができる。さらに本発明の治療剤はまた、遺伝子治療と併せて投与することも可能である。たとえば本発明の治療剤は、ニュートロフィンホルモン（neutrophic homones）を補充するための遺伝子治療を併用して受けている患者であって、中枢神経系の退行性の疾患に罹患している患者に投与することができる。
早期移行アポトーシス（不適切な細胞死）は、たとえばAIDS、化学療法および照射、ならびに組織の萎縮を含めた退行性の疾患に関連する多くの障害の原因となる。AIDSの患者においては、リンパ細胞はHIV感染の無症候期においてすら活性化され、そしてこれらの細胞はアポトーシスによって早期に死滅する。このような疾患は、Bbk突然変異体蛋白の投与によて治療することができる。
上述したような特定の標的細胞または組織への本発明の種々の蛋白の投与は、種々の公知の方法によりそして本明細書の教示にしたがってこれらの蛋白をコード化したヌクレオチド配列の標的細胞または組織による発現とおなじく蛋白それ自体の投与をも含むことを意図していることは当業者は認めるであろう。
不適切な細胞増殖により特徴づけられる退行性の疾患は、ガン、自己免疫不全、組織肥大そしてたとえば肺傷害を含めた急性の組織傷害からおこる炎症を含めての炎症性疾患を包含するものである。これらの疾患は、本発明のBbk蛋白またはその機能性均等物の投与によって治療することができる。
ガンは、DNA内の変化が細胞の異常蓄積をおこさせたときに発生する。細胞分裂と細胞死を比べた速度が、ガンがどれだけ早く成長するかを決定する。あるガン細胞は正常細胞よりもゆっくりと分裂するが、ガンは長い細胞生命期間のためになおも増大することができる。アポトーシスは遺伝子的障害のある細胞を除去するので、悪性の変換を防ぐための効果的な方法である。欠損アポトーシスは、分裂細胞を蓄積させることにより、そしてまた高い悪性ポテンシャルの遺伝子突然変異体の除去を阻害することによってガンの発達を促進することができる。本発明のBbk蛋白やその機能的均等物、フラグメントおよびハイブリッドを含めた本発明の治療剤、ならびに１つ以上の前述のものをコード化したcDNAを含むベクターは、アポトーシスを誘発させるために患者に投与することができる。
多くのタイプのガン、すなわちガン腫、肉腫および白血病/リンパ腫、たとえば胸部、大腸、頭部、頚部などを含めた臓器のガン腫瘍、扁平上皮ガン腫、アデノガン腫のようなガン腫；軟骨肉腫、メラノ肉腫、などの肉腫；ならびに急性リンパ腫白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、などのリンパ腫瘍および白血病を、本発明の治療剤の投与によって治療することができる。本発明の治療剤をもちいて治療できる他のものとしてはたとえば真菌性感染症がある。
本発明の治療剤は、自己免疫性疾患の治療にもちいることができる。ランダムな遺伝子組替えや体細胞超突然変異は、自己反応性のTおよびBリンパ球をその生涯を通じて潜在的に生成することができる。正常な条件下では、自己抗原と結合した未熟なリンパ球はアポトーシスにより死滅する。しかしながら、これらリンパ球の除去の不足は、自己免疫の素因となる。
本発明の治療剤は、自己免疫不全に罹患している患者に投与して、たとえばエリテマトーデスにかかっている患者の自己反応性Tリンパ球にアポトーシスを誘発させることができる。本発明の治療剤の投与によりアポトーシスを抑制または誘発させて治療できる他の自己免疫性疾患としてはたとえば、慢性関節リュウマチ、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、インスリン抵抗性糖尿病、アレルギー性鼻炎、喘息、機能性自律神経異常症、若年性インスリン依存性糖尿病、アジソン病、特発性副甲状腺機能低下症、自然性不育症、早発卵巣障害、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少製紫斑病、特発性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、慢性関節リュウマチ、およびシェーグレン症候群がある。
本発明の治療剤は、アポトーシス誘発による急性肺傷害から生じる炎症の治療にもちいることができる。この疾患のプロセスは、肺胞壁における爆発的炎症応答で始まる。生じた組織破壊の余波において、線維芽細胞、毛管およびそれらの結合組織産物を含む肺胞空間の広範囲の繊維増殖がおこる。Fukuda, Y., et al., Am. J. Pathol. 126：171-182（1987）。前述の全身性除去の重要なメカニズムはアポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死である。
本発明の治療剤はまた、臓器の機能障害や疾患をもたらす老化途中の早期のまたは過剰な細胞損失に起因する退行性の疾患を治療するのに用いることができる。そのような退行性の疾患は、ニューロンの死滅をもたらす老化やその他の因子による中枢神経系の退行性の疾患を含む。Bbk突然変異体蛋白またはそのハイブリッドを含有する本発明の治療剤は、そのような退行性の疾患に罹患している患者に投与してアポトーシスを抑制することができる。さらに本発明の治療剤は、たとえば神経成長因子を含んでいる神経栄養性ホルモンをコード化している遺伝子を提供するために、遺伝子治療と同時に投与することができる。本発明の治療剤を利用しての治療に適合した他の健康条件としては、たとえばアルツハイマー病がある。
当業者は、本発明の治療剤を用いて治療できる不適切な細胞死または不適当な細胞増殖またはその両方で特徴づけられるその他の退行性の疾患を容易に同定することができる。本発明の治療剤は、標的細胞に投与されるBbk蛋白それ自体ならびにそのフラグメント、機能的均等物及び/又はハイブリッド及び/又は突然変異体を含むことができる。あるいは、本発明の治療剤は、前述のものの1つ以上をコード化したcDNAを含むベクターで標的細胞を感染させることによって投与することもできる。本発明の治療剤は、所望の標的細胞タイプに特異的な標的細胞表面上のレセプターを選択することなどによって下記のような所望標的細胞に投与することができる。本発明の治療剤は、単独かまたは他の許容される薬物療法と併用して投与することができる。本発明の治療剤はさらに、治療している特定の退行性の疾患に特異的な他の許容される療法と併用して投与することもできる。たとえば、本発明の治療剤は、化学療法剤、遺伝子治療、などと併用して投与することができる。それがBbk蛋白それ自体であっても、又はその蛋白をコード化したベクターであっても、本発明の治療剤は細胞膜を通過しなければならない。
Bbk蛋白またはそのフラグメントを細胞膜または細胞自体へ導入するための1方法は、標的細胞がレセプター部位を含んでいるリガンドへ蛋白を付着させることによるものでる。このようにして蛋白は、リガンドと共に細胞膜の中へまたは細胞膜を通過して輸送されることができる。
担体リガンドの選択は、ここに記載しそして当業者には公知のように、種々の因子に依存するであろう。適当な組織特異的なレセプターはたとえば次のようである。脳：神経成長因子レセプター（NGF-R）；胸：プロラクチンレセプター；胃：ガストリンレセプター；皮膚：メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター（MSH-R）；肝臓：アシアログリコプロテインレセプター；甲状腺：甲状腺刺激ホルモンレセプター（TSH-R）；卵巣：黄体化ホルモンレセプター（LH-R）；睾丸：ヒト絨毛ゴナドトロピンレセプター（hCG-R）；T細胞：T細胞レセプター；B細胞：CD19；肺ヒアルロン酸レセプターCD44イソ型4V（J. Cell. Biol. 124, 7182, 1994）。これに関し該リガンドは、本発明のBbk蛋白が抱合されているであろうレセプターに特異的な抗体またはフラグメントであることが認められるであろう。
リガンドとレセプターの相互作用をあまり阻害せず、そして細胞膜を通してもっと容易に輸送されるところの、本発明による活性Bbkフラグメントを用いることが望ましいであろう。
上記のように蛋白が細胞膜を通してまたは細胞の中へ輸送され、そしてリガンドが抗体であるときは、たとえばここに抗体輸送の文章の中で述べたのと類似の手段によって蛋白が結合したときに標識が比較的にもっと効果的になるような方法で蛋白を診断的または治療的に標識することが好ましいであろう。
標的地帯へ本発明のBbk蛋白を特異的に伝達するため、膜内に本発明の蛋白をもつリポソームを利用することもまた可能である。これらのリボソームは、Bbk蛋白に加えて、標的部位で遊離される薬物、放射性同位元素、レクチンおよびトキシンを含む他の治療剤をも含有するように製造することができる。
診断または治療目的のために、ヌクレオチド配列（およびそれらの機能的均等物及び/又はハイブリッド及び/又は突然変異体）をコード化したBbkを投与するために好ましい方法は、ウイルスベクターを用いることである。遺伝子の導入のための適当なウイルスベクターの例は、たとえばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、アデノウイルス誘導体（たとえば次を参照：Erzurum, et al., Nucleic Acids Res. 21：1607-12（1993）；Zabner, et al., Nat. Genet. 6：75-83（1994）；Davidson, et al., Nat. Genet. 3：219-223（1993））、アデノ関連ウイルス（AAV）（すなわち次を参照：Flotte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10613-7（1993））およびヘルペスウイルスベクター（すなわち次を参照：Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13：503-15（1993））のようなレトロウイルス（総説はMiller, et al., Methods Enzymol. 217：581-599（1993）に記載）である。その他の適当なウイルスは、当業者によって容易に選択され使用することができる。DNA伝達の他の方法はたとえば、リポソーム仲介遺伝子導入（Alton, et al., Nat. Genet. 5：135-42（1993）；Nabel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：11307-11（1993））である。
哺乳動物細胞の中へ遺伝子を導入するためのウイルスベクターの使用の総説も、たとえば次のようなものがある。Varmus, Science 240（4858）：1427（1988）；Eglitis, et al., BioTechniques 6,7：608（1988）；Jaenisch, Science 240（4858）：1468（1988）；およびBernstein, et al., Genet. Eng.（N.Y.）7：235（1985）。
本発明の目的のために、弱毒ウイルスまたはレトロウイルス株を用いることは好ましいであろう。すなわち、たとえばCD4依存メカニズムによって神経細胞へ入る（Funke, et al., J. Exp. Med. 165：1230（1987））ところのHIV-2ST（Kong, et al., Science 240（4858）：1525（1988））またはHIV-2UCI（Evans, et al., Science 240（4858）：1523（1988））のような弱毒化細胞変性をもつ本発明のレトロウイルスのDNA配列のためのベクターとして用いることができる。HIV感染の神経生物学はたとえば、Johnson, et al., FASEB J. 2（14）：2970（1988）に記載されている。当業者は、通常の方法でウイルスに公知の罹患性をもつところの異なる細胞集団を標的することができる。たとえばCD4は、前脳内の最高濃度で（Maddon, et al., Cell 47：333（1986））ヒトの脳内に変異転写産物をもつことが知られている。特定の細胞タイプへのレトロウイルス遺伝子発現を標的する可能な方法は、Boris-Lawrie and H. Temin Curr. Opin. Genet. Dev. vol. 3, p. 102-9（1993）に総説がある。
理想的には遺伝子伝達系の選択は、いかなる副作用もなしに、組織に適切な方法で適切なレベルの遺伝子発現と共に、効果的かつ安定した遺伝子導入という目的を念頭において、当業者により行われるであろう。たとえば次を参照のこと。Wolff, et al., Rheum. Dis. Clin. North Am. 14（2）：459（1988）。中枢神経系標的への伝達に関しては、たとえばHIVのような多くのウイルスベクターが、血液と脳のバリヤーを通過できるという長所をもっている（Johnson, et al., FASEB J. 2（14）：2970（1988））。
診断上の応用
本発明のBbk蛋白やそのフラグメント、機能的均等物、またはハイブリッドもしくは突然変異体に対して育成された抗体は、ヒトの組織標本中のBbk蛋白を検出したりBbk蛋白の発現と関連する退行性の疾患を診断するために用いることができる。このような抗体はまたさらに、Bbk蛋白の発現に関連した退行性の疾患の進行を監視するために用いることもできる。
ヒト細胞のいかなる源も、本発明の診断試験での使用に適当である。これらの細胞は、たとえば心臓、肺、腫瘍細胞、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓や膵臓のような如何なるヒトの組織からでも単離することができる。細胞標本からの蛋白の抽出は、当業者に公知の多くの方法の如何なるものによっても行うことができる。たとえば細胞を、機械的手段により洗浄剤で溶菌することができる。所望に応じ、酵素的消化によるまたは沈殿による細胞製剤から、核酸を除去することができる。そのような手段は当業者に公知である。
抗体は、ここに記載の方法によりBbk蛋白と免疫反応性なものが製造できる。ついで適切な抗体を、bbkの天然遺伝子生産物を用いてスクリーニングすることができる。
細胞標本から抽出した蛋白は、抗体-抗原複合体形成に適当な条件下に抗体と接触させることができる。一般にそのような条件は、生理的条件である。蛋白抽出物は、ニトロセルロース濾紙またはミクロタイタープレートのような固形の支持体と結合することができる。
抗体は一般に、適切な条件下にたとえば呈色反応生産物を生成するような酵素複合体、蛍光標識または放射性標識といった標識をもっている。抗体や抗体標識は、本明細書に記載されておりそして当業者に公知である。または、もし抗体が標識されないときは、第一の抗体と反応する別の種からの第二の抗体によって検出することができる。適当なアッセイ技術、標識および検出手段は本明細書に記載されている。
試験標本に並行した標本を、対照として用いる。対照標本は、好ましくは試験標本と同じようにして細胞から抽出した当量の蛋白から成っている。蛋白の量は、たとえばローリーまたはブラッドフォード法のような公知の技術を用いて容易に決定することができる。対照標本の製造に用いる細胞は、試験標本を採取したヒト間が罹患していた退行性の疾患には罹患してない正常人から単離した試験細胞と同じ細胞タイプの細胞、確立された正常細胞系から単離した試験標本と同じ細胞タイプの細胞、および試験細胞の細胞タイプとは異なる細胞タイプの試験されている人間からの細胞の中から選択することができる。
試験標本はまた、公知の方法にしたがってbbk遺伝子から転写した高いレベルのmRNAに対してスクリーニングすることもできる。たとえばB細胞から抽出したRNAを用いてもよいし、または全細胞RNAからmRNAを単離してもよい。このmRNAは、たとえば大抵のmRNAの3'末端のポリ（A）領域に結合するオリゴ（dTセルロース）上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。当業者には公知のように、製造およびアッセイの間はリボヌクレアーゼ活性を最小にすることが必須である。
DNAプローブは、bbk遺伝子の配列をコードした如何なる蛋白からも選択することができる。好ましくは、RNAが検出できるように、遺伝子の5'または第一エクソンの配列からプローブを選択する。そのプローブは、好ましくはbbk配列のすくなくとも15個のヌクレオチドをもっている。ハイブリダイゼーションを行うためには、一本鎖のプローブが望ましい。すなわち、もしもプローブが二本鎖であれば、変性をおこなって一本鎖にすべきである。変性方法は公知であり、たとえばアルカリまたは加熱処理がある。ついでプローブを、ホモローガスなRNA-DNAハイブリッドが形成され安定であるような条件下に細胞標本から誘導したRNAと接触させることができる。そのような条件は、当業者に公知である。ハイブリッドの検出手段はたくさんあって良く知られているが、大抵は一本鎖のDNAを分解するヌクレアーゼと放射性標識したプローブを用いている。公知方法以外の方法もまた用いることができる。
対照標本は、抗体診断試験に用いる上記の細胞源の何れからでも誘導することができる。好ましくは、標本および対照は、類似の条件下で並行して製造されるべきである。
本発明の診断方法および組成物は、疾患ないし退行性の疾患がBbk突然変異体の発現のために異常Bbk発現と連結しているかどうかを決定し、またたとえばトランスジェニックマウス及び/又はホモ接合体のないマウスのような実験動物におけるBbkの発現の損失または過剰発現の効果を決定するのに有用である。疾患ないし退行性の疾患が異常Bbk発現と連結しているかどうかを決定する方法としては、たとえばノーザン及び/又はウエスタンブロット法によって、または当業者が容易に選択かつ使用可能な他のアッセイ法によって、正常組織とくらべての疾患組織内のBbk発現の分析などがある。疾患ないし退行性の疾患が異常Bbk発現と連結していることがいったん決定されたならば、その疾患ないし退行性の疾患は個人個人で診断可能である。
以下の例は説明のために提供されるものであり、限定のためではない。
実施例
Ａ．材料と方法
１．酵母菌二ハイブリッド分析．  酵母菌二ハイブリッド系の各成分はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタログナンバー：Ｋ１６０５-１、Ｋ１６０５-Ｄ、ＨＬ４００６ＡＥ）から入手した。これらには、ＧＡＬ４結合領域融合ベクターｐＡＳ２、酵母菌株Ｙ１９０とＹ１８７及びヒトリンパ球ｃＤＮＡ活性化領域ライブラリーが含まれていた。Ｂａｋを、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，2d Ed.,Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｎｖｉｅｗ、ＮＹ（１９８９））を用いてこのｐＡＳ２ベクター内にサブクロン化した。Ｂａｋとのフレーム内融合を引き起こすために、ｐＡＳ２ベクターを、ＮｄｅＩで熟成し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片により断端を鈍化し、次に再結合して改質した。このＢａｋ遺伝子をｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ（１９９４年８月９日に出願されたの米国特許出願第０８／２８７，４２７号（ｂａｋはここではｂｃｌ-ｙと称している）の一部継続として、１９９４年１０月１１日に出願された同時係属中の米国出願特許第０８／３２１，０７１号に記載されている）から、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで熟成し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片により鈍化し、次にＳｍａｌで熟成され子ウシ腸ホスファターゼで処理され末端燐酸塩を除去しておいた改質ｐＡＳ２ベクターに結合することで除去した。このＢａｋ／Ｇａｌ４結合領域融合ベクター（ｐＡＳ２／ＢａｋΔＣ）は、ＧＡＬ４リーディングフレームがクロン化接合点を介してＢａｋオープンリーディングフレーム内に保持されていることを実証するために、クローン化融合点に沿いＤＮＡ配列させた。二ハイブリッド分析、β-ガラクトシダーゼ  フィルター検定及び疑似ポジティブの検出を、製造業者の使用説明書に従い、Ｂａｋ／ＧＡＬ４結合領域おとり、リンパ球ｃＤＮＡ  ＧＡＬ４活性化領域ライブラリーを用いて実施した。正のクローンからのプラスミドＤＮＡｓを、製造業者の説明にあるように単離し、大腸菌内に形質転換させた。バクテリアのクローンは更に制限酵素分析法とＤＮＡ配列化により解析した。
２．付加的なプラスミド構築物
すべてのプラスミド構築物を、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｎｖｉｅｗ．ＮＹ（１９８９））を用いて作製した。ｐｃＤＮＡ３／ＨＡを発生させるために、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ  タグ（ＭＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＳ）をポリリンカー  クローン化領域のＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩとの間に挿入して哺乳類発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の改質形を作製した。この二ハイブリッドスクリーン（ｐＡＣＴ／Ｂｂｋ）で得られたＢｂｋ遺伝子をＸｈｏＩ断片上のＧＡＬ４活性化領域プラスミドから除去し、上記のｐｃＤＮＡ３／ＨＡベクターのＸｈｏＩ位内にサブクローン化してｐｃＤＮＡ３／ＨＡＢｂｋを引き出した。これにより、ＨＡタグを有するＢｂｋと、ＢｂｋのＮ-末端にＨＡタグが生ずるＨＡタグとＢｂｋのフレーム内融合をもたらす。
欠失突然変異体、Δ１-１０５はこの二ハイブリッドスクリーンから直接的に得られ、完全な長さのＢｂｋに類似した手法でサブクローン化してｐｃＤＮＡ３／ＨＡΔ１-１０５を作製した。突然変異体、ｐｃＤＮＡ３／ＨＡΔ１４２-２４９を、ｐｃＤＮＡ３／ＨＡＢｂｋをＰｆｌＭＩ及びＸｂａＩで熟成することによりヌクレオチド３３８-９５８の間の配列を除去し、続いてこの欠失した配列を、Ｂｂｋヌクレオチド３３８-４７６に相当する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）発生のＰｆｌＭＩからＸｂａＩのＤＮＡ断片で置換することにより作製した。アミノ酸１４１の後にフレーム内終止遺伝暗号が組み入れられた。
アラニン点突然変異体、ｐｃＤＮＡ／ＨＡＰＭ-ＬＶＬＥＥ（Ａ残基で置換されたＬ125Ｖ129Ｌ132Ｅ134Ｅ135）、ｐｃＤＮＡ／ＨＡＰＭ-Ｖ（Ｖ129はＡ残基で置換されている）、ｐｃＤＮＡ／ＨＡＰＭ-Ｌ（Ｌ132はＡ残基で置換されている）、ｐｃＤＮＡ／ＨＡＰＭ-ＥＥ（Ｅ134Ｅ135はＡ残基で置換されている）を、ヌクレオチド３３８-４７６（ＰｆｌＭＩ断片）間の野生型Ｂｂｋ配列を、指定の位置にアラニン遺伝暗号を組み入れたＰＣＲ発生ＰｆｌＭＩ断片で置換することで作成した。アラニン点突然変異性を所有するＢｂｋ遺伝子類をｐｃＤＮＡ／ＨＡベクターから除去し、再度ｐＡＣＴのＸｈｏＩポリリンカーにクローン化してｐＡＣＴ／ＰＭ-ＬＶＬＥＥ、ｐＡＣＴ／ＰＭ-Ｖ、ｐＡＣＴ／ＰＭ-Ｌ及びｐＡＣＴ／ＰＭ-ＥＥを作製した。これらのプラスミドは、Ｂｂｋ突然変異体と酵母二ハイブリッド分析に使用するＧａｌ４活性化領域との間にフレーム内融合を発生する。
Ｂｂｋアミノ酸残基１１７-１６６を発現し、Ｂｂｋ  ＢＨ３領域を包囲するプラスミド、ｐＲｃＣＭＶ／ＨＡＢｂｋＢＨ３は、以下に述べるようにして構成した。アミノ酸残基１１７-１６６をコード化するＢｂｋ遺伝子の断片を、ＰＣＲ（アミノ酸１６６の後に終止遺伝暗号を組み入れる）と、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片により鈍化されたｐｃＤＮＡ３／ＨＡ（上記参照のこと）のＸｈｏＩ位へのクローン化により作製した。次にこのＨＡタグ／Ｂｂｋ  ＢＨ３融合遺伝子をＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ断片上で除去し、ｐＲｃＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄII／ＸｂａＩ位内にサブクローン化した。このクローン化の結果、ＨＡタグと哺乳類細胞移入に使用するＢｂｋ  ＢＨ３領域のフレーム内融合が生じる。野生型Ｂｂｋをコード化した対象プラスミドを、同時にｐｃＤＮＡ３／ＨＡＢｂｋからＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ断片を除去（上を参照のこと）し、続いてｐＲｃＣＭＶのＨｉｎｄII／ＸｂａＩ位内にサブクローン化することで構成した。
ＢｂｋのグルタチオンＳ-転移酵素融合（ＧＳＴ-Ｂｂｋ）を、ＢｂｋのＥｃｏＲＩ断片に対するＢｇｌIIをプラスミドｐＧＥＸ２ＴＫ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ位に対するＢａｍＨＩ内にサブクローン化することで作製した。ＢｂｋのＥｃｏＲＩ断片に対するこのＢｇｌIIを数段階で作製した。まずＢｂｋの開始メチオニンを、ｐｃＤＮＡ３／ＨＡＢｂｋのＢｓｕ３６Ｉ断片に対するＢｇｌIIを二重鎖オリゴヌクレオチド接着体で置換することにより除去した。この改質ｐｃＤＮＡ３／ＨＡＢｂｋプラスミドのＸｂａＩ位を、次にＥｃｏＲＩリンカーを用いてＥｃｏＲＩ位に転換した。
Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ-ｘL、Ｂｃｌ-２及びエプステインバーウイルスＢＨＲＦ１を発現する他のプラスミド類は既に記載されている（Ｂｏｙｄ．Ｊ．Ｍ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：１９２１（１９９５）：Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ．Ｔ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（２２）：５５８９（１９９５）：１９９４年８月９日に出願された米国特許出願第０８／２８７，４２７号の（ｂａｋはここではｂｃｌ-ｙと称している）一部継続であり、１９９４年１０月１１日に出願された米国特許出願第０８／３２１，０７１号同）。
３．ノーザンブロット分析法
ヒト胎児及び成人の多因子組織ノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、供給者のプロトコールに従い、Ｂｂｋ及びβ-アクチンの全コード化領域を取り囲む32Ｐ-標識化プローブに逐次ハイブリッドした。
４．生体外翻訳
35Ｓ-メチオニン標識化蛋白を、製造業者の手順に従い、ＴｎＴ  Ｔ７／Ｔ３と連結した網状赤血球溶解物系（Ｐｒｏｍｅｒｇａ）を用いて生体外で合成した。翻訳生成物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけた。このゲルを固定化し、Ｘ線蛍光撮影増進溶液（Ａｍｐｌｉｆｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベートし、乾燥し、−７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。
５．ウエスタンブロット分析法
ＣＯＳ７細胞を１０％ウシ胎児血清とＬ-グルタミンを加えたＤＭＥＭ中で培養した。細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてプラスミドＤＮＡを２μｇをトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間で細胞溶解物を作製した。この細胞の抽出物の一部（約１００ｍｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準法（Ｈａｒｌｏｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８））によりナイロン膜に移行させた。このブロットを抗-ＨＡエピトープモノクロナール抗体１２ＣＡ５（Ｋｌｏｄｚｉｃｊ．Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９４：５０８-５１９（１９９１））で培養し、次にＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて二次抗体で検出した。
６．過渡的トランスフェクション分析．
Ｒａｔｌ、ＨｅＬａ及びＢＴ５４９細胞を１０％のウシ胎児血清、４ｎＭのＬ-グルタミン、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３７℃、７％ＣＯ2下で培養した。トランスフェクションの２４時間前に細胞を、２４ウエルの組織培養皿内に３．５×１０4細胞／ウエルの割合で塗布した。大腸菌β-ガラクトシドをコード化するプラスミド（ｐＲｃＣＭＶ／βｇａｌ、０．１６μｇ）を図形説明で定義したように、対象のプラスミドの全体量０．４２μｇと混合した。このプラスミド混合物を２５μｌのＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に加え、続いて２７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ溶液（２５μｌのＯＰＴＩＭＥＭで希釈した２μｌのストック溶液）と混合した。室温で３０分インキュベートした後、このプラスミド混合物を２００μｌのＯＰＴＩＭＥＭで希釈し、ＯＰＴＩＭＥＭで一度リンスしておいた細胞に加えた。通常の成長条件下に４時間置いた後、この細胞に２５０μｌのＤＭＥＭ、２０％のウシ胎児血清、４ｍＭのＬ-グルタミンを供給してから、通常の条件下に２４時間成長させた。次に細胞を燐酸緩衝の食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．２％グルタルアルデヒド、２％のパラフォルムアルデヒド、４９．２ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．３）により４℃で５分間固定化し、ＰＢＳで２回洗浄した。８０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２０ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4、１．３ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌのＸ-Ｇａｌ（ヂメチルホルムアミドで調合した２０ｍｇ／ｍｌストック溶液から希釈）、３ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6、３ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6／３Ｈ2Ｏによる１-４時間のインキュベーション後に、β-ガラクトシド発現細胞を青色細胞として同定した。死滅した青色細胞が円形であるのに対し、生きてる青色細胞は平らな形態を保持するものとして同定される。
７．生体外蛋白相互作用．
ＢｂｋのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ融合蛋白（ＧＳＴ-Ｂｂｋ）を、プラスミドｐＧＥＸ２ＴＫ-Ｂｂｋからの大腸菌内に発現させ、グルタチオン  アガロースを使用した親和性クロマトグラフィ（Ｓｍｉｔｈ．Ｄ．Ｂ．とＪｏｈｎｓｏｎ．Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ  ６７：３１-４０（１９８８））により精製にした。35Ｓ-メチオニン標識ＨＡ-エピトープを付けＢａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ及びＦｌａｇ-エピトープ（Ｋｏｄａｋ）付加のＢｃｌ-ｘLを、ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に転写／翻訳連結系を用いて生体外発現させた。標識化蛋白類を、０．２５％のＮＰ-４０、１４２．５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ（緩衝液Ａ）を含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）の中で、１０％のグルタチオン  アガロースにより透明化の前処理を行った。ＧＳＴ-Ｂｂｋを加え（最終濃度が１-３μＭ）、この混合物を４℃で６０分間インキュベートした。蛋白複合体を１０％のグルタチオン  アガロースで捕捉し、緩衝液Ａで２回、ＮＰ-４０を含有しない緩衝液Ａで１回洗浄した。蛋白を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液中、１００℃で５分間インキュベートしてビーズから溶出させ、４-２０％のＳＤＳ-ポリアクリルアミド  ゲル（Ｎｏｖｅｘ）に載荷した。電気泳動に続いて、ゲルを固定化し、Ｘ線蛍光撮影増強溶液（Ａｍｐｌｉｆｙ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベートした。ゲルを乾燥し、−７０℃でオートラジオグラフィにかけた。
８．液体培養β-ガラクトシダーゼ検定法．
Ｂｂｋ／Ｂａｋと突然変異体Ｂｂｋ／Ｂａｋの相互作用の親和性を、製造業者のプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により記述されるように、ｏ-ニトロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）を基質とした液体β-ガラクトシダーゼ検定法を用いて定量化した。分析に使用するプラスミドは、図示説明に述べているとおりものである。
Ｂ．結果
１．酵母二ハイブリッド分析によるＢａｋ-相互作用性蛋白の同定．
Ｂａｋは多くの細胞中に発現されているのが知られている（１９９４年８月９日に出願された米国特許出願第０８／２８７，４２７号（ｂａｋはここではｂｃｌ-ｙと称している）の米国特許出願の一部継続出願であり、１９９４年１０月１１日に出願された米国特許出願第０８／３２１，０７１号：Ｋｉｅｆｅｒ．Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３６（１９９５））。Ｂａｋの過剰発現は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）による死を誘発する。アポトーシスのレギュレーターまたはエフェクターがＢａｋに結合すると考えられた。それ故、Ｂａｋと相互作用する蛋白を、酵母二ハイブリッド系を使用して同定化した（Ｕ．Ｓ特許  Ｎｏ．５，２８３，１７３）。この方法論の原理は図１に要約されている。
ＧＡＬ４は、二つの明確な領域、すなわちＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域（図１Ａ）を有す酵母転写性活性化蛋白である。ＤＮＡ結合性領域はＧＡＬ４プロモーター中の特定のＤＮＡ配列要素に結合するので、転写を刺激する機能のあるこのプロモーターに近接する転写活性化領域を引き寄せる。、これらの領域は分離可能であることが証明されており、二つの領域が分離した場合は転写を刺激する機能が働らかない。しかし、この二つの分離した領域間にリンクが生じると、転写性活性化を回復できる。相互作用を起こすことが知られている非相同蛋白（図１のＢ、Ｃの蛋白Ｘ及びＹ）にこれらの領域が融合しているハイブリッド蛋白としてＧＡＬ４領域を発現することにより、このようなリンクを形成することができる。図１に示すシナリオでは、ＧＡＬ４結合性領域は、蛋白ＸをＧＡＬ４プロモーターに近付ける役割を果たし、それに続く蛋白Ｙとの相互作用により、転写を刺激できるプロモーターにＧＡＬ４活性化領域を近付ける。ＧＡＬ４プロモーター、即ちＧＡＬ４  ＤＮＡ配列要素を含有するプロモーターは、選択性のマーカー遺伝子（ＨＩＳ３のような）及びリポーター遺伝子（ｌａｃＺのような）の転写を指示するのに使用できる。
上述の、新規の相互作用性蛋白の同定と単離、並びにそれと相互作用することが知られている蛋白の相互作用の研究に利用できる。前者の場合、対象蛋白をＧＡＬ４結合性領域に融合し、ＧＡＬ４活性化領域融合として発現される相互作用性蛋白を捕捉する"おとり（bait）"として使用する。ここに記述する実験では、ＧＡＬ４  ＤＮＡ-結合性領域／Ｂａｋ融合蛋白を、エプスタイン・バールウイルス-形質転換化ヒトＢリンパ球（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｃＤＮＡライブラリーから作成したＧＡＬ４活性化領域融合として発現されたＢａｋ-相互作用性蛋白を単離するおとりとして使用した。二ハイブリッド分析、相互作用するクローンの選択、β-ガラクトシダーゼ  フィルター検定及び疑似ポジティブの確認は、製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の仕様書に従って実施した。
２．高結合力のＢａｋ-結合クローン、ｂｂｋの配列解析
最も強力に結合する１１種のクローン（β-ガラクトシダーゼ  フィルター検定の青色の強度から判定）を、同遺伝子の様々の長さのクローンになるようにＤＮＡ配列化することで確定した。制限酵素分析を使用して、これらクローンの近似サイズを確定した。クローンｂｂｋはこれらクローンの内で最大であったので、頂部と底部の双方の鎖を選択して網羅的にＤＮＡ配列を決定した。クローンｂｂｋの配列を図２に示す。１１種のクローンの内６種はｂｂｋと同じ配列開始点を有するが、他方では様々の長さ（クローンｂｂｋのヌクレオチド３３、１５１、１７８、２４２及び３６４まで）の欠失がある５種のクローンも存在する。１１種のクローンの内の３種は、ポリアデニル化（ポリＡ）末端の存在により決定された完全な３'末端を有す。その他のクローン中にポリＡ末端が存在しないことは、この領域でのこの遺伝子のＡＴリッチ特性によりｃＤＮＡ合成中に異常なプライミングが生じるせいのように思える。それでも、残りのクローンは、真の３'末端の３０の塩基内にある３'末端を持つ（１０の塩基を欠くクローンｂｂｋを含む）。
ｂｂｋの配列を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎｂａｎｋデータデースと比較した。この解析により、ｂｂｋに対して有意な相同性（毒性合計Ｐ（Ｎ）値が５．５ｅ-２６以下）を持つ発現化配列タッグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡ（受け入れナンバー：Ｈ２６５１６、Ｈ４２８３９、Ｈ５９０２５、Ｈ５９８９６、Ｈ５９８９７、Ｈ７２００４、Ｈ７２００５、Ｈ８９８５７、Ｈ９０７０２、Ｒ０２５５６、Ｒ０２６７４、Ｒ０７８４９、Ｒ０７９０１、Ｒ３６５４３、Ｒ３８４６３、Ｒ５８３６５、Ｒ７８８８３、Ｒ７８９７７、Ｒ８５６２２）が確定された。また、これらのｃＤＮＡはｂｂｋの終点のいくつかの塩基内で開始し、終了するので、ｂｂｋはほぼ完全の長さのクローンであることが示唆される。
Ｂｂｋは、ヌクレオチドナンバー５１で始まりヌクレオチドナンバー７９９で終わる２４９のアミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコード化している。このＯＲＦは、ＢｂｋにＮ-末端融合したＧＡＬ４活性化領域により予測されるそれと同じ枠にある。予測される開始メチオニン遺伝暗号を囲むこの配列は、Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ．Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５（１９８７））に一致し、Ｇａｌ４活性化領域とＢｂｋ  ＯＲＦの間に存在する非翻訳化ｂｂｋ配列内に追加的なメチオニンまたはフレーム内終止遺伝暗号は存在しない。従って、Ｂｂｋ遺伝子の真のＯＲＦは同定されたと考えられる。数種のＥＳＴクローン並びに二ハイブリッド分析により単離された数種のクローンは、Ｂｂｋのヌクレオチド１５７と１５８の間にＢｂｋでは認められない３種の付加的ヌクレオチド（ＡＡＧ）を有すことは注目に価する。これらのヌクレオチドは、交互スプライス部位の使用の結果として、導入されるのであろう。この推定コード領域にこれら３種のヌクレオチドが加わったことで、予測されたオープンリーディングフレームは保持され、３６位置にアルギニン残基を導入するのに役立つことになろう。推定Ｂｂｋ  ＯＲＦを用いる蛋白データベースの解析により、限定された相同性のみの配列が確定された。このように、アポトーシス関連蛋白Ｂａｋと相互作用する新規な蛋白を、二ハイブリッド系を使用して同定することができる。
３．胎児及び成体の組織におけるＢｂｋ  ｍＲＮＡの発現．
ノーザンブロット分析を実施して、ＢｂｋメッセンジャーｍＲＮＡの発現パターンとサイズを決定した。Ｂｂｋをプローブとした胎児及び成体の組織のノーザンブロット（図３）は、Ｂｂｋが約０．８-１．２ｋｂの単一ｍＲＮＡ種であることを示している。このメッセンジャーサイズは、完全な長さのクローンが単離されたという見解と一致する。またノーザンブロット分析は、ＢｂｋはＢａｋの分布（Ｋｉｅｆｅｒ．Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３６（１９９５））に大体において類似した分布をもって多種多様な組織内に発現されることを示しており、ＢｂｋとＢａｋが細胞内で一緒に複合化されるという考えを支持している。
４．生体外及びトランスフェクトされた細胞におけるＢｂｋの発現
Ｂｂｋの推測されるアミノ酸配列は、ＭＷ２６．７ｋＤの蛋白を予測する。Ｂｂｋクローンを、Ｔ７プロモーターを用いた生体外発現用及びヒトのシトメガロウイルス即時型早期プロモーターを用いた哺乳類発現用に、酵母菌二ハイブリッドベクターからｐｃＤＮＡ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にサブクローン化した。この蛋白を検出するために、Ｂｂｋ配列を、そのアミノ末端において、インフルエンザ赤血球凝集素抗体（ＨＡ）から誘導した１４アミノ酸分節に融合した。この短いペプチドは、モノクロナール抗体１２ＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が"付加された"蛋白の免疫学的的検出を可能とする、特徴が良く知られたエピトープを提供する。ウサギ網状赤血球溶解物中のＢｂｋクローンの生体外転写／翻訳により、ｃＤＮＡ配列プラスＨＡタグとクローン化で導入される非特異性アミノ酸との概念的翻訳から予測されるサイズと近似的に一致する約３７ｋＤの分子量に（図４Ａ）相当し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動可動性を有する蛋白が作製される。ＨＡ-付加Ｂｂｋを発現するこのｐｃＤＮＡ３ベクターをＣＯＳ７細胞内にトランスフェクトした。細胞溶解物をトランスフェクション後４８時間で調合し、抗-ＨＡモノクロナール抗体によるウエスタンブロットによって分析した。適度のサイズのＨＡ-付加Ｂｂｋ蛋白がＣＯＳ７細胞抽出物中に検出された（図４Ｂ）。この結果は、単離されたＢｂｋ  ｃＤＮＡによりコード化されたこの蛋白は生体外及び生体内のいずれでも発現できることを証明している。
５．Ｂｂｋの発現はＲａｔ１、ＨｃＬａ及びＢＴ５４９細胞内で細胞死を加速する
ｐｃＤＮＡ３ベクターから発現されたＨＡ-付加Ｂｂｋクローンを、β-ガラクトシダーゼを発現するプラスミドと共に正常ラット線維芽細胞（Ｒａｔ１細胞）及びヒト腫瘍系統ＨｃＬａとＢＴ５４９内に共トランスフェクトして、細胞生存能力に及ぼすＢｂｋ発現の効果を決定した。このような細胞死滅検定は既に記載されており（Ｍｉｕｒａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７５：６５３（１９９３）：Ｂｏｙｄ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：１９２１（１９９５）：Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａ１．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（２２）：５５８９（１９９５）：１９９５年５月１２日に出願された同時係属米国特許出願第０８／４４０，３９１号）、細胞内への対象の遺伝子をトランスフェクション体用マーカーとしてのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子と共トランスフェクションすることからなる。細胞生存能力に及ぼすトランスフェクトされた遺伝子生成物の効果は、トランスフェクション２４時間後のベクター対照細胞に対する青色細胞（β-ガラクトシダーゼがポジティブ）を計算することにより測定する。不活性または抗-アポトーシス遺伝子生成物はベクター対照の細胞に似た平坦な（生きてる）青色細胞の数で明示されると同時に、損傷遺伝子生成物は青色細胞数の全体的減少または円形（死滅した）の青色細胞の頻度増加として観察できる。図５Ａの結果は、Ｒａｔ１細胞にＢｂｋ発現プラスミドがトランスフェクトされた時の、青色細胞の数の減少を明確に示している。即ち、結合相手のＢａｋと同様に、Ｂｂｋは細胞の死滅を誘発できるように思われる。ＢａｋとＢｂｋのいずれも、Ｒａｔ１細胞に単独に発現された時、アポトーシスを誘発できる。特定の理論に束縛される意図はないが、このことは、Ｂａｋ／Ｂｂｋ相互作用はアポトーシスの誘発に必ずしも必要ではないか、またはヒト蛋白と機能的に相互作用できるＢａｋ及びＢｂｋのラット相同体が存在すること、を示唆している。あるいは、これら二つの蛋白間の相互作用が調節機能に作用して、それらのアポトーシス  ポテンシャルを調整できるのかもしれない。図５Ａのデータは、ＢａｋとＢｂｋの共発現はアポトーシスの誘発を妨げないことを証明しており、その相互結合能力はアポトーシスを促進する能力を阻害しないことを示唆している。しかし、ＢａｋとＢｂｋはそれぞれ細胞死滅の有力なプロモーターであるので、それらの共発現が結果としてアポトーシスの協力的誘発をもたらすか否かを検定で決定することはできなかった。
Ｂｂｋのアポトーシス機能は、周知の生存蛋白、Ｂｃｌ-２、Ｂｃｌ-XL及びエプスタイン・バールウイルスＢＨＲＦ１の共発現により逆転されることがある（図５Ｂ）。アポトーシス関連蛋白、Ｂａｋ及びＢｉｋにより促進された細胞死滅の程度も、同様に、生存蛋白（図示していない）の存在下において減少する。これらの生存蛋白に対するアポトーシス-促進蛋白、Ｂｉｋの比率を増加すると、Ｂｉｋ細胞毒性を回復できる。この観察は、アポトーシス促進蛋白を適切に設定すれば生存蛋白の作用を実際に抑制できることを示唆している。従って、この細胞死滅促進蛋白を用いて、生存がＢｃｌ-２関連細胞生存蛋白類の一つの作用に依存しているような細胞内では、アポトーシスを誘発することができるであろう。
アポトーシスを誘発するＢｂｋの性能は、腫瘍細胞系統、ＨｅＬａ及びＢＴ５４９においても明白である（図６Ａ、Ｂ）。Ｂｂｋにより誘発されるアポトーシスの程度は、ＢＴ５４９細胞内のＢａｋのそれと匹敵するが、ＨｅＬａ細胞ではＢｂｋは細胞死滅の誘発の面でＢａｋより若干有効性は低い。Ｂｂｋは細胞死滅を誘発できるが、ヒト腫瘍細胞はＢｂｋのアポトーシス機能に対して様々な程度の感受性が変化を表すように思われる。しかし、Ｂｂｋ-誘発アポトーシスに対して感受性が低い細胞は、Ｂｂｋによる治療後の通常の抗癌療法に対してより鋭敏になる。従って、Ｂａｋとに結合し、種々の細胞型においてアポトーシスを誘発する新規蛋白がここに確認された。
６．ＢｂｋはＢａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ-XLと生体外で相互作用を起こす
Ｂｃｌ-２系統の細胞生存メンバーによるＢｂｋ誘発アポトーシスの逆転は、これらの蛋白がＢｂｋと相互作用できることを示唆している。ＢｂｋがＢａｋのみと相互作用するのか、またはこれがアポトーシスに関与することが知られている他の蛋白にも結合できるのかを決めることが望まれた。グルタチオンＳ-転移酵素（ＧＳＴ）-Ｂｂｋ融合蛋白を大腸菌内に発現し、グルタチオン-アガロース上で精製した。ＦＬＡＧエピトープ（Ｋｏｄａｋ）を付加したＢｃｌ-XL並びにＨＡ-付加のＢａｋ、Ｂａｘ及びＢｉｋを生体外翻訳により放射性に標識化し、続いてＧＳＴ-ＢｂｋまたはＧＳＴのみとインキュベートした。複合体類をグルタチオン-アガロース上に単離し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで解析した。図７は、ＢｂｋはＢａｋ、Ｂｃｌ-XL及びＢａｘと相互作用するがＢｉｋとはしないことを明確に示している。ＧＳＴ単独では生体外で翻訳した材料の何れとも複合化しないので、これら相互作用は特異的なものである。従って、ＢｂｋはＢｃｌ-２系統のいくつかのメンバーと相互作用できるようである。Ｂｂｋは細胞死滅プロモーター、Ｂａｋとの相互作用により単離されるという事実はあるが、Ｂｃｌ-XLとのその相互作用により立証されるように、ＢｂｋはＢｃｌ-２系統の細胞死滅誘発メンバーと独占的には相互作用する様子は見られない。しかし、ＢＨ３領域をＢｃｌ-２系統メンバーと共有する新規の死滅誘発蛋白であるＢｉｋ（Ｂｏｙｄ．Ｊ．Ｍ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：１９２１（１９９５））とＢｂｋが相互作用できないことは注目に値する。
７．ＢｂｋはＢｃｌ-２蛋白系統と配列相同性を共有する
ＢｂｋがＢｃｌ-２系統の内の数種と相互作用し、かつＢｂｋがアポトーシスに関係する機能を共有するという観察結果により、Ｂｂｋはさらに配列相同性も共有し得るという可能性が示唆された。上記の実施したデータベース検索ではＢｃｌ-２系統メンバーに対していかなる配列相同性も明らかにならなかったが、細心の視覚的検査によりＢｃｌ-２及び関連系統メンバーのＢＨ２領域に対して高度に相同性であるモチーフが確認された（図８Ａ）。アンカーとしてＢＨ２領域を使用したＢｂｋ  ＯＲＦのＢｃｌ-２系統メンバーに対するアライメントでは、Ｂｃｌ-２のＢＨ１領域に対してなんら相同性が現れなかったが、新規に定義したＢＨ３領域（１９９５年５月１２日に出願された同時係属米国特許出願第０８／４４０，３９１号（この中でＢＨ３はここではＧＤ領域と称されている））に対してはある相同性（図８Ｂ）を示す。従って、ＢｂｋはＢｃｌ-２蛋白系統の新規の死滅促進メンバーであるように思われる。
８．Ｂｂｋ誘発アポトーシスはそのＢＨ３様領域により媒介される
ＢａｋのＢＨ３領域が細胞死滅の誘発にとって必要かつ十分であることは既に示されている（１９９５年５月１２日に出願された同時係属米国特許出願第０８／４４０，３９１号（この中でＢＨ３はＧＤ領域と称されている））。ＢｂｋはＢａｋ  ＢＨ３領域に対して弱い相同性を共有するので、この領域がＢｂｋに同様な機能を提供するか否かを決定することが望まれた。この理論を試験するために、推定ＢＨ３領域に侵入する一連の削除を実施し、それをＲａｔ-１細胞死滅検定で試験した。図９Ａの結果は、これら突然変異体の二つ、△１-１０５（アミノ酸残基１０６に対するＮ-末端の欠失）、△１４２-２４９（アミノ酸残基１４２で始まるＣ-末端の欠失）、は依然としてアポトーシスを誘発する性能を保持することを示している。これらの結果は、Ｂｂｋ分子の多くの部分（ＢＨ２領域を含む）はＢｂｋの細胞毒活性にとり欠くことができないことを示唆している。更にこれらのデータは、アミノ酸１０６から１４１の間の領域を、Ｂｂｋが細胞死滅を誘発するのに必要なものとして確定している。興味あることに、この領域は推定ＢＨ３領域（残基１２５-１３７）と一致している。この領域がＢｂｋの細胞毒性にとり必要であることを明確に証明するために、維持されたいくつかの残基を突然変異させたのアラニン  スキャニング突然変異体（図９Ｂ）を４種作製し、Ｒａｔ１細胞中でアポトーシスを誘発させる能力を試験した。図９Ｃに示す結果は、ＢＨ３要素に五つのアラニン置換を含むＰＭ-ＬＶＬＥＥはそのアポトーシス誘発能力を完全に消失していることを明示している。ＰＭ-ＬＶＬＥＥにおける細胞毒性の廃止が合成の失敗によるものではないことを証明するために、野生型Ｂｂｋのレベルに比較できる発現レベルで作製されたＣＯＳ７細胞において、その発現を確認した。従って、ＢｂｋのＢＨ３領域はそのアポトーシス機能にとり絶対的に必要であることを、このデータは支持している。残りの突然変異体、ＰＭ-Ｖ、ＰＭ-Ｌ及びＰＭ-ＥＥは、Ｂｂｋ-誘発アポトーシスに要求されるＢＨ３残基をより正確に定めるように構成された一または二重のアラニン突然変異性である。図９Ｃのデータは、これらの置換の各々は細胞死滅の誘発を減少するが廃止はしないことを論証しており、突然変異を受けた残基の全てがＢｂｋ細胞毒性にとって部分的に必要であることを指摘している。ここでも、これら突然変異体の各々は、野生型Ｂｂｋのレベルに比肩できるレベルでＣＯＳ７内に発現されていた。
また、Ｂｂｋ  ＢＨ３領域がアポトーシスを誘発するに十分であるのか否かを決定するために、Ｂｂｋのアミノ酸１１７-１６６のみを発現しているプラスミド（残基１２５-１３７の間にＢｂｋ  ＢＨ３領域を含む）をＲａｔ１細胞にトランスフェクトした。図１０の結果は、Ｂｂｋ  ＢＨ３領域を取り囲むこの５０のアミノ酸ペプチドの発現はアポトーシスを誘発するに充分であること示している。従って、ＢｂｋのＢＨ３領域は、アポトーシスの誘発にとり必要かつ充分なものであるという点でＢａｋ  ＢＨ３領域の機能と類似性があるようである。
９．Ｂｂｋによるアポトーシス誘発はＢａｋに結合するその能力に相関する
１９９５年５月１２日に出願された同時係属米国特許出願第０８／４４０，３９１号では、Ｂｂｋ  ＢＨ３領域がその細胞毒性、並びにＢｃｌ-２系統の抗-アポトーシス  メンバーであるＢｃｌ-ｘLに結合する能力を支配していることが立証されている。Ｂｂｋ  ＢＨ３領域はＢａｋ  ＢＨ３領域に類似した様式でアポトーシス機能を誘発する能力を共有しているように見えるので、Ｂｂｋ  ＢＨ３領域がＢｂｋ／Ｂａｋ相互作用を媒介するか否かを決定することは興味深いことであった。この可能性を試験するために、Ｂｂｋのアポトーシス誘発領域を確定するのに上記に使用したアラニン突然変異体（ＰＭ-ＬＶＬＥＥ、ＰＭ-Ｖ、ＰＭ-Ｌ、ＰＭ-ＥＥ）を、おとりとしてＢａｋを含む、酵母二ハイブリッド系で使用するために、Ｇａｌ４活性化領域に融合した。この検定では、β-ガラクトシダーゼの発現レベルが、この二つの蛋白の間の相互作用の親和性及び／または安定性の尺度であり、高レベルであれば強い相互作用を示し、低いレベルであれば弱い相互作用を示す。図１１は、アポトーシスを誘発する能力を喪失したＢｂｋ突然変異体であるＰＭ-ＬＶＬＥＥが、低レベルのβ-ガラクトシダーゼ（ネガティブ参照値に比較できる）により立証されるように、Ｂａｋに結合する能力も喪失していることを示している。中位レベルのアポトーシス  ポテンシャルを保持した突然変異体（ＰＭ-Ｖ、ＰＭ-Ｌ、ＰＭ-ＥＥ）はＢａｋとの中位レベルの相互作用を保持している。Ｂｂｋ細胞毒性とＢａｋに対するＢｂｋの結合性との間の直接的相関性は、更に、アポトーシスの誘発にとりＢｂｋ／Ｂａｋ相互作用が必要であるという仮説をも支持するものである。言い替えれば、ＢｂｋのＢＨ３領域と相互作用も起こして細胞死滅を遂行するＢｂｋの更なる結合相手が存在する可能性が残っている。
この明細書で言及した全ての刊行物は、個々刊行物のそれぞれが特別に及び個別に参照文献に含めるように指摘されたかのような程度まで、参照することにより本明細書に組み入れられる。本発明は更なる改変が可能であり、本出願は、本発明が関係する技術範囲内において周知または通例の実施の内に入るような本明細書からの新らしい発展を含む発明のいかなる変形、使用法または採用をもカバーするものであり、添付した請求の範囲の請求項のみにより限定されるべきものであることは言うまでもない。
配列表
(1)書誌的事項
(i)出願人：ガロー．グレゴリー  ジェイ．
(ii)発明の名称：アポトーシスに関連した蛋白ＢＢＫ
(iii)配列の総数：２８
(iv)通信住所
(A)受信人：ヘイル  アンド  ドール  ＬＬＰ
(B)所在地：１４５５  ペンシルバニア  アベニュー，Ｎ．Ｗ．
(C)都市名：ワシントン，Ｄ．Ｃ．
(E)国名：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：２０００４
(v)コンピュータ読取形式：
(A)ミディアムタイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi)出願の表示：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)先の出願の表示：
(A)出願番号：ＵＳ  ０８／６３２，５１４
(B)出願日：１９９６年５月２９日
(C)分類：
(ix)代理人情報
(A)代理人氏名：ウィクソン，ヘンリー  エヌ．
(B)登録番号：３２，０７３
(C)参照番号：１０４３２２．１８８
(x)電気通信情報
(A)電話番号：（２０２）９４２−８４５９
(B)ＦＡＸ番号：（２０２）９４２−８４８４
(2)配列番号：１に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１：
0004005636.tif 000004
(2)配列番号：２に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２：
0004005636.tif 000005
(2)配列番号：３に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：３：
0004005636.tif 000006
(2)配列番号：４に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：４：
0004005636.tif 000007
(2)配列番号：５に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：５：
0004005636.tif 000008
(2)配列番号：６に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：６：
0004005636.tif 000009
(2)配列番号：７に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：７：
0004005636.tif 000010
(2)配列番号：８に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：８：
0004005636.tif 000011
(2)配列番号：９に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：９５８塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(xi)配列：配列番号：９：
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(2)配列番号：１０に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：９５８塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
(xi)配列：配列番号：１０：
0004005636.tif 000013
(2)配列番号：１１に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：２４９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１１：
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(2)配列番号：１２に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１４アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１２：
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(2)配列番号：１３に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１４アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１３：
0004005636.tif 000016
(2)配列番号：１４に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１４アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１４：
0004005636.tif 000017
(2)配列番号：１５に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１５アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１５：
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(2)配列番号：１６に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１４アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１６：
0004005636.tif 000019
(2)配列番号：１７に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１４アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１７：
0004005636.tif 000020
(2)配列番号：１８に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１８：
0004005636.tif 000021
(2)配列番号：１９に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：１９：
0004005636.tif 000022
(2)配列番号：２０に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２０：
0004005636.tif 000023
(2)配列番号：２１に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２１：
0004005636.tif 000024
(2)配列番号：２２に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２２：
0004005636.tif 000025
(2)配列番号：２３に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２３：
0004005636.tif 000026
(2)配列番号：２４に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２４：
0004005636.tif 000027
(2)配列番号：２５に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２５：
0004005636.tif 000028
(2)配列番号：２６に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２６：
0004005636.tif 000029
(2)配列番号：２７に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２７：
0004005636.tif 000030
(2)配列番号：２８に関する情報：
(i)配列の特質：
(A)配列の長さ：１３アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：２８：
0004005636.tif 000031
【図１Ａ】
0004005636.tif 000032
【図１Ｂ】
0004005636.tif 000033
【図１Ｃ】
0004005636.tif 000034
【図２Ａ】
0004005636.tif 000035
【図２Ｂ】
0004005636.tif 000036
【図３】
0004005636.tif 000037
【図４Ａ】
0004005636.tif 000038
【図４Ｂ】
0004005636.tif 000039
【図５Ａ】
0004005636.tif 000040
【図５Ｂ】
0004005636.tif 000041
【図６Ａ】
0004005636.tif 000042
【図６Ｂ】
0004005636.tif 000043
【図７】
0004005636.tif 000044
【図８Ａ】
0004005636.tif 000045
【図８Ｂ】
0004005636.tif 000046
【図９Ａ】
0004005636.tif 000047
【図９Ｂ】
0004005636.tif 000048
【図９Ｃ】
0004005636.tif 000049
【図１０】
0004005636.tif 000050
【図１１】
0004005636.tif 000051