(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸糖部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドである化合物であって、前記糖の２’位は、式：２’−Ｏ−ＮＨＲ1
［式中、Ｒ1は、Ｈ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、リポ酸残基、レチノール酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択される］を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】
核酸糖部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドである化合物であって、前記糖の２’位は、式：２’−Ｏ−Ｎ＝Ｒ3
［式中、Ｒ3は、ピリドキサール残基、ピリドキサール−５−ホスフェート残基、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール、および複素環式アルキルアリールからなる群より選択される］
を有することを特徴とする化合物。
【請求項３】
式ＩＩＩ：
0003903392.tif 000015
［式中、Ｒ1は、Ｈ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、リポ酸残基、レチノール酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択され；
Ｘは、独立して、ヌクレオチド塩基またはその類似体または水素であり；
Ｙは、独立して、リン含有基であり；および
Ｒ2は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］
を有する化合物。
【請求項４】
式ＩＶ：
0003903392.tif 000016
［式中、Ｒ3は、ピリドキサール残基、ピリドキサール−５−ホスフェート残基、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール、および複素環式アルキルアリールからなる群より選択され；
Ｘは、独立して、ヌクレオチド塩基またはその類似体または水素であり；
Ｙは、独立して、リン含有基であり；および
Ｒ2は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］
を有する化合物。
【請求項５】
前記化合物が２’−Ｏ−アミノアデノシンである、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が２’−Ｏ−アミノグアノシンである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が２’−Ｏ−アミノシチジンである、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が２’−Ｏ−アミノウリジンである、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
２’−Ｏ−アミノヌクレオシドを合成する方法であって、
３’および５’−保護アラビノヌクレオシドを、３’−および５’−保護２’−アラビノスルホニルヌクレオシドの形成に適した条件下でスルホニル化試薬と接触させ；
有機強塩基の存在下で、３’−および５’−保護２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドの形成に適した条件下で、前記２’−アラビノスルホニルヌクレオシドからスルホニル基をＮ−ヒドロキシ−フタルイミドで置き換え；
２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドの形成に適した条件下で、フッ素含有試薬を用いて前記フタロイルリボヌクレオシドを脱保護し；そして
前記２’−Ｏ−Ｎ−アミノヌクレオシドの形成に適した条件下で、前記２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドを、アルキルアミン、ヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジンおよびＮ−アルキルヒドラジンからなる群より選択される試薬と接触させる、
の各工程を含む方法。
【請求項１０】
前記スルホニル化試薬が無水トリフルオロメタンスルホン酸である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記スルホニル化試薬が塩化トリフルオロメタンスルホン酸である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記有機強塩基が、１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エンである、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記フッ素含有試薬が、フッ化テトラブチルアンモニウムおよび三フッ化水素トリエチルアミンからなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記アルキルアミンが水性メチルアミンである、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎ−アルキルヒドラジンがＮ−メチルヒドラジンである、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は新規なヌクレオシド類似体、これら類似体の化学合成及びそのポリヌクレオチドへの導入に関する。
以下は、ヌクレオシド、及びオリゴヌクレオチドの化学修飾に関する簡略な記載である。本概要は完璧を期すものではなく、以下に述べる本発明の理解のためだけのものである。本概要は、以下に記載される研究のすべてが特許請求される本発明の先行技術であることを容認するものではない。
塩基及び糖のヌクレオシド修飾は、天然に存在する多種多様なＲＮＡで発見されてきた（例、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ；Ｈａｌｌ、１９７１「核酸の修飾されたヌクレオシド」コロンビアユニバーシティプレス、ニューヨーク；Ｌｉｍｂａｃｈ等、１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３に概説されている）。核酸におけるこれらヌクレオシド修飾の生物学的意義、構造及び熱力学的な性質、及びヌクレアーゼ抵抗性を理解しようとして、何人かの研究者が、種々の塩及び糖を修飾してヌクレオシド、ヌクレオチド及びホスホルアミダイトを化学合成し、それらをオリゴヌクレオチドに導入してきた。
ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎ、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０，５４３は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを安定化させるためのヌクレオシド修飾の用途を概説している。
Ｕｓｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８７及びＷＯ９５／１３３７８は、酵素的核酸分子のヌクレアーゼ安定性を高めるための糖、塩基及び骨格部分の修飾の用途を記載している。
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５は、酵素的核酸分子のヌクレアーゼ安定性を高めるための糖、塩基及び骨格部分の修飾の用途を記載している。
Ｇｒａｓｂｙ等、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０６，１００３は、「ＲＡＮの構造及び機能に関する研究における合成オリゴリボヌクレオチド類似体の応用例」を概説している。
ＥａｔｏｎとＰｉｅｋｅｎ、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４，８３７は、ＲＮＡ分子のヌクレアーゼ安定性を高める糖、塩基及び骨格部分の修飾を概説している。
ＨｉｌｄｂｒａｎｄとＬｅｕｍａｎｎ、１９９６，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５，１９６８は、２−アミノピリジンヌクレオシド誘導体の合成方法を記載している。
Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ、１９８１，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１，１〜２８は、アルコール（ＲＯＨ）をアミノオキシアルコール（ＲＯＮＨ2）へ変換する方法を記載した。
Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ（同上）によって記載された方法は、糖及び二糖類の変換に応用されている（Ｇｒｏｃｈｏｗｓｋｉ等、１９７６，５０，Ｃ１５；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９７６，６８２；Ｊ．Ｂｕｌｌ．Ｐｏｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，３５，２２５；Ｔｒｏｎｃｈｅｔ等、１９８２，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，６５，１４０４；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９０，２０４）。
Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ（同上）によって記載された方法はまた、３’−Ｏ−ＮＨ2ヌクレオシド及び５’−Ｏ−ＮＨ2ヌクレオシドの合成に応用されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．，２４，１６７；Ｂｕｒｇｅｓｓ等、１９９４，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９１５；Ｋｏｎｄｏ等、１９８５，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，１６，９３；Ｖａｓｓｅｕｒ等、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，４００６；Ｔｒｏｎｃｈｅｔ等、１９９４，１３，２０７１；Ｐｅｒｂｏｓｔ等、１９９５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０，５１５０）。
上記参考文献に開示された情報が今回特許請求される発明と異なっているのは、それらが本発明に特許請求されるようなメトキシヌクレオシドの合成方法を開示及び／又は考察していないからである。
発明の概要
本発明は構造式Ｉを有する新規ヌクレオシド類似体に関する：
0003903392.tif 000002
ここで、Ｒ１は独立的にＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ3（Ｒ3はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、Ｃ−Ｒ3（Ｒ3はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、ハロ、ＮＨＲ4（Ｒ4はアルキル（Ｃ１−２２）、アシル（Ｃ１−２２）、置換された又は置換されてないアリール）、又はＯＣＨ2ＳＣＨ3（メチルチオメチル）であり；Ｘは２−フルオロピリジン−３−イル、ピリジン−２−オン−３−イル、ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−３−イル、２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン−５−イル、２−アミノピリジン−５−イル及びピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−５−イルからなる群より独立的に選択されるヌクレオチド塩基であり；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的にＤＭＴ又はリン含有基である。
１つの好ましい実施形態では、本発明は構造式ＩＩを有する新規ヌクレオシド類似体を特徴とする：
0003903392.tif 000003
ここで、Ｒ１は独立的にＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ3（Ｒ3はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、Ｃ−Ｒ3（Ｒ3はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、ハロ、ＮＨＲ4（Ｒ4はアルキル（Ｃ１−２２）、アシル（Ｃ１−２２）、置換された又は置換されてないアリール）、又はＯＣＨ2ＳＣＨ3（メチルチオメチル）であり；Ｘは２−フルオロピリジン−３−イル、２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン−５−イル及び２−アミノピリジン−５−イルからなる群より独立的に選択されるヌクレオチド塩基であり；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的にＤＭＴ又はリン含有基である。
本発明はさらに核酸の糖部分を含むヌクレオシド又はヌクレオチドに関するものであって、上記糖の２’位は２’−Ｏ−ＮＨＲ１なる式を有し、ここでＲ１は独立的にＨ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、リポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド又はエステルである。本発明はまた核酸の糖部分を含むヌクレオシド又はヌクレオチドに関するものであって、上記糖の２’位は；２’−Ｏ−Ｎ＝Ｒ３なる式を有し、ここでＲ３は独立的にピリドキサール残基、ピリドキサール−５−リン酸残基、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール又は複素環式アルキルアリールである。
本発明は構造式ＩＩＩを有する新規ヌクレオシド類似体を特徴とする：
0003903392.tif 000004
ここで、Ｒ１は独立的にＨ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、リポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド又はエステルであり；Ｘは独立的にヌクレオチド塩基又はその類似体又は水素であり；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的に保護基又はリン含有基である。
１つの好ましい実施形態では、本発明は構造式ＩＶを有する新規ヌクレオシド類似体を特徴とする：
0003903392.tif 000005
ここで、Ｒ３は独立的に独立的にピリドキサール残基、ピリドキサール−５−リン酸残基、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール又は複素環式アルキルアリールであり；Ｘは独立的にヌクレオチド塩基又はその類似体又は水素であり；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的に保護基又はリン含有基である。
ある好ましい実施形態では、本発明は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含む核酸触媒を特徴とし、このＬ−ヌクレオチドは構造式Ｖを有する：
0003903392.tif 000006
ここで、Ｘは、修飾されてもされなくてもよい核酸塩基又は水素であり；Ｙはリン含有基であり；Ｒ１はＨ、ＯＨ又は他の２’修飾体であり；Ｒ２は保護基又はリン含有基である。
「保護基」とはポリヌクレオチド合成の後に除去し得る及び／又は固相ポリヌクレオチド合成で化学反応しない（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）基のことである。
「リン含有基」は、ジチオエート、ホスホルアミダイト及び／又はオリゴヌクレオチドの部分のような形態でリンを含み得る。
ある好ましい実施形態では、本発明は化学式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体の合成方法を特徴とする。
「アルキル」基とは、直鎖、分岐鎖及び環式アルキル基を含む、飽和の脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、それは炭素数１〜７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキルである。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。置換される場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、ＮＯ2又はＮ（ＣＨ3）2、アミノ又はＳＨである。
「アルケニル」基という用語は、直鎖、分岐鎖及び環式の基を含めて少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含んでいる不飽和の炭化水素基を指す。好ましくは、アルケニル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、それは炭素数１〜７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていても置換されていなくてもよい。置換される場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、ＮＯ2、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ3）2、アミノ又はＳＨである。
「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖及び環式の基を含めて少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含んでいる不飽和の炭化水素基を指す。好ましくは、アルキニル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、それは炭素数１〜７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルケニルである。アルキニル基は置換されていても置換されていなくてもよい。置換される場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2又はＮ（ＣＨ3）2、アミノ又はＳＨである。
「アリール」基とは、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する芳香族の基を指し、炭素環式アリール、複素環式アリール及び二アリール基を含み、そのいずれもが場合により置換されていてもよい。アリール基に付く好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアミノ基である。
「アルキルアリール」基とは、（上記に記載された）アルキル基と（上記に記載された）アリール基が共有結合したものを指す。
「炭素環式アリール」基とは、芳香環の環原子がすべて炭素原子である基のことである。この炭素原子は場合により置換されている。
「複素環式アリール」基とは、芳香環の環原子として１〜３のヘテロ原子を有する基のことであり、環原子の残りは炭素原子である。適切なヘテロ原子には、酸素、イオウ、窒素があり、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルといったものを含み、いずれも場合によっては置換される。
「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指し、ここでＲはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである。
「エステル」とは、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’を指し、ここでＲ’はアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである。
別の好ましい実施形態では、本発明は構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体、２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ−メチルヌクレオシド又はそれらの組み合わせをポリヌクレオチドへ導入することを特徴とする。上記の新規ヌクレオシド類似体は酵素的にポリヌクレオチドへ導入され得る。例えば、バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用することにより、上記の新規ヌクレオシド類似体は１つ又はそれ以上の位置でＲＮＡへ導入され得る（Ｍｉｌｌｉｇａｎ等、１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８０，５１）。別法では，新規ヌクレオシド類似体は固相合成を利用してポリヌクレオチドへ導入され得る（ＢｒｏｗｎとＢｒｏｗｎ、１９９１，「オリゴヌクレオチドと類似体：実践アプローチ」１頁，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，オックスフォードユニバーシティプレス，ニューヨーク；Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２６７７；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９９６，「生物有機化学：核酸」３６頁，Ｓ．Ｍ．Ｈｅｃｈｔ編，オックスフォードユニバーシティプレス，ニューヨーク）。
構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド及び／又は２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドへの選択的導入のための基礎単位として、ヌクレオチド、ヌクレオチド−３−リン酸及び／又はホスホルアミダイトの化学合成に利用し得る。上記のオリゴヌクレオチドは，アンチセンス分子，２−５Ａアンチセンスキメラ、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）として、又は酵素的核酸分子として利用し得る。オリゴヌクレオチドはまた、ＲＮＡ又はＤＮＡの合成及び／又は配列決定のプローブ又はプライマーとして利用し得る。
構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体又はそれらの組み合わせは、独立的に又は組み合わせて、抗ウィルス、抗癌又は抗腫瘍剤として利用し得る。上記の化合物は、独立的に又は他の抗ウィルス、抗癌又は抗腫瘍剤と組み合わせて利用し得る。
「アンチセンス」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ等、１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６）反応によって標的ＲＮＡと結合し、標的ＲＮＡの活性を変える、非酵素的核酸分子を意味する（概要はＳｔｅｉｎとＣｈｅｎｇ、１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１００４を参照のこと）。
「２−５Ａアンチセンスキメラ」とは，５’位がリン酸化された２’−５’結合性アデニレート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。上記キメラは配列特異的なやり方で標的ＲＮＡと結合して細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化し、次いで、標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ等、１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１３００）。
「トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）」とは、配列特異的なやり方で二本鎖ＤＮＡと結合し三重鎖ヘリックスを形成し得るオリゴヌクレオチドを意味する。このような三重ヘリックス構造の形成が標的遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎ等、１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５０４）。
本発明は１つ又はそれ以上のＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒に関する。このような置換は、単独で又は他のＤ−及びＬ−化学的置換とともに、その触媒活性を全く阻害することなく、核酸をヌクレアーゼによる分解から護るものである。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、これら核酸の細胞内半減期を増加させ、核酸触媒の全体的な有効性を改善する。こういった修飾はまた細胞による核酸触媒の効率的な取り込みとこれら核酸の細胞内における移送及び局在化を容易にし、インビトロ及びインビボにおける核酸触媒の効力を全体的に改善する役に立つのに利用され得る。
ここに用いられる「化学的置換」という用語は、核酸の触媒活性を全く阻害することなくそれをヌクレアーゼによる分解から保護する、塩基、糖及び／又はリン酸の修飾を指す。
１つの好ましい実施形態では、本発明は、構造式ＶのＬ−ヌクレオチドだけから成りＤ−ヌクレオチド残基をもたない核酸触媒（Ｌ−核酸触媒）を特徴とする。より特定すると、このＬ−核酸触媒は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はリボ−及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせである。別に、又はさらに、Ｌ−核酸触媒は、触媒活性を全く阻害されることなく、塩基、糖及び／又はリン酸骨格を単独に又は組み合わせて修飾されている。
別の好ましい実施形態では、本発明は少なくとも２つの構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を特徴とし、ここで上記置換は同じであっても異なっていてもよい。
また別の好ましい実施形態では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を特徴とし、ここで上記核酸は、別の核酸分子、好ましくは１本鎖の核酸、より好ましくはＲＮＡを切断し得る。
ある好ましい実施形態では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を特徴とし、ここでこの触媒は、ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム・モチーフの形状である。
別の態様では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を特徴とし、ここで上記核酸は、別々の核酸分子をライゲートさせる。
本発明はまた構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸分子触媒を特徴とし、ここで上記核酸分子は、アミド又はペプチド結合を切断又は形成する。
「ヌクレオチド」という用語は、当技術分野で認知されているように、天然の塩基及び当技術分野でよく知られている修飾された塩基を含むように用いられている。このような塩基は一般に糖成分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般は、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは修飾されていなくてもよく、又は糖、リン酸及び／又は塩基成分で修飾されていてもよい（例えば、ＵｓｍａｎとＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、同上；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８７を参照。これらはすべてここに援用する）。当技術分野では修飾された核酸塩基の幾つかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３、により最近要約された。酵素的核酸へその触媒活性に著しく影響することなく導入し得る塩基修飾の非制限的な例の幾つかは、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メモルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例、６−メチルウリジン）その他がある（Ｂｕｒｇｉｎ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。本発明の観点における「修飾された塩基」とは、１’位にあるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの同等物を意味する；このような塩基は酵素の触媒中心内部及び／又は基質結合領域において利用され得る。
酵素的核酸分子へ、その触媒作用に著しく影響することもそのヌクレアーゼ安定性及び効力を著しく高めることもなく導入し得る糖修飾を記載した当技術分野の例が幾つかある。酵素的核酸分子の糖修飾は当技術分野で詳細に記述されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，３４４，５６５〜５６８；Ｐｉｅｋｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５３，３１４〜３１７；ＵｓｍａｎとＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４〜３３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許番号５，３３４，７１１及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ等、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２）。上記の出版物は修飾の導入位置などを記載しており、ここに援用する。このような教示に照らして、同様の修飾がここに記載するように利用し得る。
好ましい実施形態では、本発明は、非ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を特徴とする。非ヌクレオチド置換は、例えば構造式ＶにおけるＬ−ヌクレオチド置換及び／又は非ヌクレオチド置換とは別に、標準的な非ヌクレオチド残基として対掌のエナンチオマー形においてなされる。ここで用いられる「非ヌクレオチド」という用語は、脱塩基性（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミノ、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質又はポリ炭化水素化合物のいずれかを含む。特定の例は、ＳｅｅｌａとＫａｉｓｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；ＣｌｏａｄとＳｃｈｅｐａｒｔｚ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ等、国際公開番号ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開番号ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ等、国際公開番号ＷＯ９５／１１９１０及びＦｅｒｅｎｔｚとＶｅｒｄｉｎｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００に記載されたものを含み，これらはすべてここに援用する。従って、好ましい実施形態では、本発明は、１つ又はそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を切断する酵素活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。「非ヌクレオチド」なる用語は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド単位のかわりに核酸鎖に導入することができ、糖及び／又はリン酸置換を含み、残った塩基がその酵素活性を示すことを可能にする、基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンのような通常認知されているヌクレオチド塩基を含まないという点で脱塩基性である。ここに用いられる「脱塩基性」又は「脱塩基性ヌクレオチド」なる用語には、塩基を欠く糖成分又は１’位に塩基のかわりに他の化学基を有する糖成分が包含される。
好ましい実施形態では、酵素的核酸は、非ヌクレオチド成分と結合した１つ又はそれ以上のＲＮＡストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅ）を含み、これがこの分子の酵素活性をもたらす。必要とされるＲＮＡ成分は本技術分野で知られており、例えばＵｓｍａｎ、同上、が参考になる。ＲＮＡとは少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。
本明細書で用いられているように、非ヌクレオチド含有酵素的核酸という用語は、リボザイムの一部分、例えば、限定されないが、二本鎖ステム部分、一本鎖の「触媒中心」配列、一本鎖のループ又は一本鎖の認識配列に置き換わる、少なくとも１つの非ヌクレオチド成分を含む核酸分子を意味する。上記の分子は、ヌクレオチド塩基配列特異的なやり方で別個のＲＮＡ又はＤＮＡ分子を切断（好ましくは、繰り返し切断）することができる。このような分子はまた、所望ならば、分子内で切断するように作用し得る。このような酵素的分子はほとんどすべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができる。
「Ｌ−ヌクレオチド」とは、天然に存在するＤ−エナンチオマーに対して反対の回転分散スペクトルを有するヌクレオチドを意味する（Ｒｏｓａｎｏｆｆ、同上）。ここに用いるエナンチオマーとは、Ｊａｃｑｕｅｓ等、１９９１，「エナンチオマー、ラセミ体及び分割」３頁〜、クリーガーパブリッシング社、フロリダ、アメリカ、によって定義される、お互いの鏡像体を示すものである。
Ｊａｃｑｕｅｓ等、１９９１，「エナンチオマー、ラセミ体及び分割」３頁〜、クリーガーパブリッシング社、フロリダ、アメリカは、キラリティ、ラセミ体及びエナンチオマーを定義している。３〜４頁によると、
「キラリティは有機化学者及び、実際は、ともかくも構造に関心のある全ての化学者によく知られている概念である。それには実に多くの含意があり、物質の物理的性質に影響するものから生物学的メカニズムに関連するものに及んでいる。こういった含意は“純粋”化学の境界を遠く越えている・・・
ある物体とその鏡像との非同一性の原因となる幾何学的性質がキラリティと呼ばれる。キラルな物体は、お互いが鏡像である２つのエナンチオモルフィックな（ｅｎａｎｔｉｏｍｏｒｐｈｉｃ）形態で存在する場合がある。このような形態は逆対称要素、即ち、対称の中心、平面及び変則軸を欠いている。これら逆対称要素の１つまたはそれ以上を有する物体はその鏡像に重ね合わせることができる、即ちそれらはアキラルである。あらゆる物体は上記カテゴリーの１つに属する；手、ヘリックス段階及びカタツムリの殻がいずれもキラルである一
方、立方体と球はアキラルである。
・・・上記の定義はすべて分子レベルでも正しい、つまりアキラルな分子とキラルな分子が存在する。後者は２つのエナンチオメリック（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ）な形態として存在する（エナンチオモルフィックという形容詞はより一般的には肉眼的な物体に適用される）。エナンチオマーという用語は、単一の分子、ホモキラル分子の集合体、又は１つのエナンチオマーを過剰に含み、その組成がそのエナンチオメリック純度ｐ又はｐと同等であるエナンチオメリック過剰度ｐｐによって定義されるヘテロキラルな集合体を指すために用いられる。
分子キラリティの最も昔から知られている例示は光学活性又は回転力という、光の偏光面の回転によって示される性質である。ある定まった化合物の２つのエナンチオマーは、絶対値が等しいが符号又は意味が反対である回転力を有する。一方がポジティブ又は右旋性であれば、他方はネガティブ又は左旋性である。符号の絶対的な指定は、それが波長、温度及び溶媒依存性である以上、恣意的であるが、相対的な指定はいつでも正しい。つまり、あるエナンチオマーは、ある波長で（＋）、別の波長で（−）になり得るが、この対となるエナンチオマーは必ずその対応する波長で反対の符号をとるのである。我々は、一対のエナンチオマーを指定するために、可能な限り（＋）及び（−）の符号を使うつもりだが、簡便のためにｄ及びｌ又はＤ及びＬを時々使用するだろう。
・・・キラルな物質の絶対配置がわかるのは、エナンチオメリックな構造をある定まった符号の光学活性サンプルに当てはめらたときである・・・Ｃａｈｎ、Ｉｎｇｏｌｄ及びＰｒｅｌｏｇの規則によって適用法が決められているアルファベットの符号使用（右ｒｅｃｔｕｓのＲと左ｓｉｎｉｓｔｅｒのＳ）によって絶対配置は指定される。しかしながら、ＲｏｓａｎｏｆｆのＤ及びＬ表記は依然として炭水化物に使用されている。これを光学活性の符号と混同しないよう注意すべきである。」（強調の追加）
Ｔａｚａｗａ等、１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４９９は、Ｌ−アデノシン残基のついたジヌクレオチドの合成を記載した。彼等はまたＬ−アデノシンダイマーが、脾臓及び蛇毒由来のホスホジエステラーゼ酵素による切断に対して「完全に」又は「極めて」抵抗性であることを報告した。
Ａｓｈｌｅｙ、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，９７３１によると、Ｌ−リボヌクレオチド｛（Ｌ）−ＲＮＡ｝だけからなるＲＮＡ分子は、相補的な（Ｄ）−ＲＮＡと安定的に相互作用し得るが、相補的な（Ｄ）−ＤＮＡとは不十分に相互作用する。彼はまたこの論文で、（Ｌ）−ＲＮＡが「精製リボヌクレアーゼＡとＬ細胞の全細胞抽出物の両方に対して抵抗性である」と述べている。
Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４，１１１２；Ｎｏｌｔｅ等、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４，１１１６はＤ−アデノシン及びＬ−アルギニンのリガンドと結合し得るＬ−オリゴヌクレオチドアプタマーを選別する方法を記載している。
ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒとＫｉｍ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３４８７９は、「天然の左右性を持たない（天然に又は野生型として存在するキラリティを持たない）で、他のキラルは高分子のリガンドとなる高分子（ペプチド、オリゴヌクレオチド、糖及び、ＲＮＡ−蛋白質複合体、蛋白質−脂質複合体のような高分子の複合体）」を同定する方法を記載している。上記及び本明細書の他の所で引用した出版物は、Ｌ−ヌクレオチド置換とその同類を含む、糖、塩基及び／又はリン酸修飾物を触媒作用を阻害することなくリボザイムへ導入するときの位置を決定するための一般的な方法及び戦略を記載していて、ここに援用される。このような教示に照らして、ここに記載するような同様の修飾を利用して、本発明の核酸触媒を修飾する。
「核酸触媒」なる句は、他の別個の核酸分子を、ヌクレオチド塩基配列特異的なやり方で繰り返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を含めて多種多様な反応を触媒し得る核酸分子を意味する。エンドヌクレアーゼ活性を有するこのような分子は、基質結合領域において、ある特定の遺伝子標的に対する相補性を有する場合があり、また、その標的のＲＮＡ又はＤＮＡを特異的に切断する酵素活性を有する。つまり、エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は分子内又は分子間でＲＮＡ又はＤＮＡを切断し、それによって標的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を不活化することができる。この相補性は、酵素的ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡ又はＤＮＡと十分ハイブリダイゼーションして切断が起こることを可能にするように機能する。１００％の相補性が好ましいが、５０〜７５％程度の低い相補性も本発明では有用であろう。この核酸は塩基、糖及び／又はリン酸基で修飾されてよい。酵素的核酸という用語は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム又はＤＮＡ酵素のような句と交換可能的に使用される。こういった用語はすべて酵素的活性を有する核酸分子を記載するものである。
ここで用いられる「核酸分子」は、ヌクレオチドを含む分子を意味する。この核酸は修飾された又は未修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又はその様々な混合物及び組み合わせより構成され得る。
「相補性」とは、塩基対相互作用の伝統的なワトソン−クリックタイプ又は他の非伝統的なタイプ（例えば、フーグスティーン［Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ］タイプ）のいずれかによって他のＲＮＡ配列と水素結合を形成し得る核酸を意味する。
本発明の好ましい態様では、酵素的核酸分子はハンマーヘッド又はヘアピン・モチーフの形で形成されるが、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、グループＩイントロン、（ＲＮＡガイド配列と結合した）ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ又はニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。上記ハンマーヘッド・モチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ等、１９９２，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８，１８３に、ヘアピン・モチーフについてはＨａｍｐｅｌ等、ＥＰ０３６０２５７、ＨａｍｐｅｌとＴｒｉｔｚ、１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，４９２９及びＨａｍｐｅｌ等、１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２９９にあり、デルタ肝炎ウィルス・モチーフの例はＰｅｒｒｏｔｔａとＢｅｅｎ、１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１６；ＲＮａｓｅＰ・モチーフについてはＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ等、１９８３  Ｃｅｌｌ  ３５，８４９及びＦｏｒｓｔｅｒとＡｌｔｍａｎ、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，７８３に、ニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡリボザイム・モチーフはＣｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９０  Ｃｅｌｌ  ６１，６８５〜６９６；ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８８２６〜８８３０；ＧｕｏとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９５  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，３６８）によって記載され、グループＩイントロンについてはＣｅｃｈ等、米国特許４，９８７，０７１に記載されている。上記の特定のモチーフは本発明を制限するものではなく、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的核酸分子において重要なことは、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１つ又はそれ以上と相補的である特定の基質結合部位を有するということ、及びそれが上記基質結合部位の内部又は周囲に、その分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することであることを当業者は認識するであろう。
本発明は所望される標的ＲＮＡのような標的に対して高い特異性を示す一群の酵素的切断薬剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、単一の酵素的核酸によって疾患又は病態への特定の治療が可能になるように、好ましくは標的の高度に保存された領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、要求されるように、特定の細胞へ外から輸送され得る。好ましいハンマーヘッド・モチーフでは、分子サイズが小さい（６０未満のヌクレオチド、好ましくは３０〜４０のヌクレオチド長）ために、治療コストを他のリボザイム・モチーフに比較して減らすことが可能になる。
治療用リボザイムは、標的ｍＲＮＡの翻訳が望まれない蛋白質のレベルを減少させるに十分なほど長く阻害されるまで細胞内で安定でなければならない。この時間は疾患の状態に依存して時間から日単位まで変化する。効果的な細胞内治療薬として機能するために、リボザイムはヌクレアーゼ抵抗性でなければならないのは明らかである。ＲＮＡの化学合成における諸改善（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３、２６７７；ここに援用する）によって、リボザイムを修飾してそのヌクレアーゼ安定性を高めるための能力が広がってきた。この研究の大部分はハンマーヘッド・リボザイム（ＵｓｍａｎとＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、１９９５  同上に概説されている）を用いてなされ、他の触媒的核酸モチーフへ容易に拡張され得る。
「酵素的部分」とはＲＮＡ基質の切断に必須であるリボザイムの部分を意味する。
「基質結合アーム」とは、その基質の一部分と相補的である（即ち、塩基対合することができる）リボザイムの部分を意味する。一般に、このような相補性は１００％であるが、所望ならばそれより少なくてよい。例えば、１４のうち１０ほどの塩基が塩基対合してもよい。このようなアームは一般に以下に論じるように図１に示される。つまり、上記アームは、リボザイムの内部に、相補的な塩基対合反応を介してリボザイムと標的ＲＮＡを一緒にするように意図された配列を含む；例えば、標準的なハンマーヘッド・リボザイムのステムＩ及びＩＩＩの内部にあるリボザイム配列が基質結合ドメインを構成する（図１参照）。
好ましい実施形態では、酵素的核酸分子は直接的に、陽イオン性脂質と複合させるか又はリポソーム内にパッケージされて、又は別の方法で、平滑筋細胞へ輸送される。このＲＮＡ又はＲＮＡ複合体は、生体高分子へ導入するか又はしない状態で、カテーテル、注入ポンプ又はステントの使用を介して、関連する組織へ局所的に投与され得る。ここに記載される方法を用いれば、標的核酸を切断する他の酵素的核酸分子を上記に記載したように誘導して利用し得る。本発明の核酸触媒の特定の例が以下の表及び図に提示されている。
Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、同上、は酵素的ＲＮＡ分子を輸送する一般的な方法を記載している。リボザイムは、限定されないが、リポソーム被包、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル及び生体癒着性ミクロスフェアのような他の担体への導入を含む、当業者に知られた種々の方法により細胞へ投与してよい。ある適応症に対しては、リボザイムは、上記の担体とともに又は担体なしで、細胞又は組織へエクスビボで直接輸送してもよい。別の方法では、ＲＮＡ／担体結合物は、直接注射するか又はカテーテル、注入ポンプ又はステントの使用を介して、局所的に投与され得る。他の輸送経路には、限定されないが、血管内、筋肉内、皮下又は関節注射、エアゾール吸入、経口（錠剤又は丸剤）、局所性、全身性、眼内、腹腔内及び／又は鞘内輸送がある。リボザイムの輸送及び投与に関するより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、同上、及びＤｒａｐｅｒ等、同上、に提供され、ここに援用されている。
「本質的に〜からなる」とは、活性リボザイムが実施例にあるのと同等な酵素の中心又は核、及び、標的部位での切断を起こすように標的核酸分子を結合し得る結合アームを含むことを意味する。この切断に干渉しない他の配列も存在してよい。
従って、ある態様では、本発明は遺伝子発現及び／又は細胞増殖を阻害するリボザイムを特徴とする。上記の化学的又は酵素的に合成された核酸分子は、特定の標的核酸分子の接近可能領域と結合する基質結合ドメインを含む。この核酸分子はまた標的の切断を触媒するドメインを含む。結合すると、この酵素的核酸分子は標的分子を切断し、例えば、翻訳及び蛋白質蓄積を妨害する。標的遺伝子が発現されないと、例えば細胞増殖が阻害される。
「患者」とは、外植された細胞又は細胞それ自身のドナー又はレシピエントである生物体を意味する。「患者」はまた酵素的核酸分子が投与され得る生物体を指す。好ましくは、患者は哺乳類又は哺乳類細胞である。より好ましくは、患者はヒト又はヒト細胞である。
本発明の新規ヌクレオシド類似体及び／又は上記類似体を含むポリヌクレオチドは、直接的に細胞へ加えられるか、陽イオン性脂質と複合させるか又はリポソーム内にパッケージされて、又は別の方法で、標的細胞へ輸送される。このヌクレオシド、核酸又は核酸複合体は、生体高分子へ導入するか又はしない状態で、注射、注入ポンプ又はステントを介して、エクスビボで又はインビボで、関連する組織へ局所的に投与され得る。
「酵素的部分」とはＲＮＡ基質の切断に必須であるリボザイムの部分を意味する。
「基質結合アーム」とは、その基質の一部分と相補的である（即ち、塩基対合することができる）リボザイムの部分を意味する。一般に、このような相補性は１００％であるが、所望ならばそれより少なくてよい。例えば、１４のうち１０ほどの塩基が塩基対合してもよい。このようなアームは一般に以下に論じるように図１−３に示される。つまり、上記アームは、リボザイムの内部に、相補的な塩基対合反応を介してリボザイムと標的ＲＮＡを一緒にするように意図された配列を含む；例えば、標準的なハンマーヘッド・リボザイムのステムＩ及びＩＩＩの内部にあるリボザイム配列が基質結合ドメインを構成する（図１参照）。
ここに用いる「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、２つ又はそれ以上のヌクレオチドを含む分子を意味する。
「未修飾のヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に結合したアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル塩基のうち１つを意味する。
「修飾されたヌクレオシド」とは、未修飾のヌクレオチド塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造に１つの修飾を含むヌクレオチド塩基を意味する。
様々なタイプの生物学的に関心のある高分子又はレポーター基とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートは実験手段として有用である。このようなとのコンジュゲートの化学合成のために当技術分野で知られている方法の大部分は、適当なスペーサーを使ってオリゴヌクレオチドの３’−及び／又は５’−末端へ関心対象である分子を合成後に付加する方法か、糖、塩基及び／又は骨格部分が修飾されたモノマーのヌクレオシドユニットを化学合成の間にオリゴヌクレオチドへ導入する方法のいずれかに基づいている。しかしながら、上記の方法には、低収率性及び冗長な合成スキームのような不都合な点が幾つかある。こういった問題を回避するためには、オリゴヌクレオチド及び付加すべき分子のいずれにも独自の官能基を用いることが必要である。上記官能基は、温和な条件下、好ましくは水性溶液において、定量的に反応することが可能であるものでなければならない。ここにおける主要な着想は、関心対象となる分子をコンジュゲートするときの連結基（ｔｅｔｈｅｒ）としても用いられる独自の官能基を持ったヌクレオシドの単量体ユニット（ホスホルアミダイト）を設計することである。
オキシム（アルデヒド又はケトンとヒドロキシルアミンの相互作用）又はオキサミド（カルボン酸とヒドロキシルアミンの相互作用）の形成は、上記の要求を満たす、第一選択とすべき有機反応であろう（Ｓａｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｋａｒｏ，Ｗ「有機官能基の製造法」第ＩＩＩ巻、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  Ｈ．Ｈ．編、アカデミックプレス社、１９８９，３７８〜５２３頁）。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、直接的に又は適切なスペーサーの利用を介して、この単量体ユニットに結合した１つ又はそれ以上のヒドロキシルアミノ官能基を有する。オリゴヌクレオチドにはアルデヒド基もヒドロキシルアミノ基もないので、ポリマーの鋳型としてオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）を用いて、オキシムの形成が選択的に生ずる。このアプローチを利用すれば、関心対象となるほとんどすべての分子（ペプチド、ポリアミン、補酵素、オリゴ糖、脂質、等）を、関心対象となる分子のアルデヒド基又はカルボン酸基を使ってオリゴヌクレオチドへ直接付加することが容易になるだろう。
計画１．合成後のオキシム結合形成
0003903392.tif 000007
計画２．オリゴヌクレオチドの化学的なライゲーション
0003903392.tif 000008
オキシム結合形成の利点：
・オキシム化反応が水中で進行すること
・定量的な収率
・広範囲のｐＨ（５〜８）における加水分解安定性
・オキシムの両親媒性によって弱酸又は弱塩基として作用し得ること
・オキシムが金属イオンと複合する強い傾向を示すこと
別の好ましい実施形態では、リボザイムのようなオリゴヌクレオチド中にあるアミノオキシの「連結基」は、カルボン酸基を有する様々な化合物（例、アミノ酸、ペプチド、「キャップ」構造、等）と反応して以下に示すようなオキサミドを形成する。
計画３．合成後のオキサミド結合形成
0003903392.tif 000009
好ましい実施形態では、本発明は、ａ）３’及び５’保護アラビノヌクレオシドを、無水トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸塩化物等のようなスルホン化試薬と、３’及び５’保護２’−アラビノスルホニルヌクレオシドの形成に適した条件下で接触させること；ｂ）上記２’−アラビノスルホニルヌクレオシドのスルホニル基を、１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エンのような強有機塩基の存在下、３’及び５’保護２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドの形成に適した条件下で、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドに置換すること；ｃ）上記Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドを、フッ化テトラブチルアンモニウム、三フッ化水素トリエチルアミン等のようなフッ素含有試薬によって、２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオチドの形成に適した条件下で、脱保護化すること；ｄ）上記２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドを、アルキルアミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン等）、ヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン及びＮ−アルキルヒドラジン（例えば、Ｎ−メチルヒドラジン等）からなる群より選択される試薬と、上記２’−Ｏ−アミノヌクレオシドの形成に適した条件下で接触させること、の各工程を含む、２’−Ｏ−アミノアデノシン、２’−Ｏ−アミノグアノシン、２’−Ｏ−アミノシチジン、２’−Ｏ−アミノウリジン等のような２’−Ｏ−アミノヌクレオシドの合成方法を特徴とする。
本発明の他の特徴及び利点は以下の好ましい実施形態の記載及び請求の範囲から明らかであろう。
好ましい実施形態の記載
図について先ず簡略に記載する。
図：
図１は、当技術分野で知られているハンマーヘッド・リボザイムドメインの概略図である。ステムＩＩは２塩基対以上の長さであり得る。各Ｎは、ここで用いられているように、独立して任意の塩基又は非ヌクレオチドである。
図２ａは、当技術分野で知られているハンマーヘッド・リボザイムドメインの概略図であり；図２ｂは、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６〜６００）によって基質と酵素部分に分割されたハンマーヘッド・リボザイムの概略図であり；図２ｃは、ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５〜５９１）によって２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図であり；図２ｄは、ＪｅｆｆｅｒｉｅｓとＳｙｍｏｎｓ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，１３７１〜１３７１）によって２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図である。
図３は、ヘアピン・リボザイムの一般構造の概略図である。ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４つの塩基対（即ち、ｎは１、２、３又は４である）で与えられ、ヘリックス５は、場合によっては、２又はそれ以上の塩基（好ましくは３〜２０の塩基、即ち、ｍは１〜２０又はそれ以上である）で与られる。ヘリックス２とヘリックス５は、１つ又はそれ以上の塩基（即ち、ｒは１塩基以上である）によって、共有結合してもよい。ヘリックス１、４又は５は、２又はそれ以上の塩基対（例えば、４〜２０塩基対）によって延長されてリボザイムの構造を安定化させることができ、好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例で、各Ｎ及びＮ’は独立的に通常の又は修飾された塩基であり、各ダッシュは塩基対合相互作用が可能な部分を示す。上記のヌクレオチドは糖、塩基又はリン酸部分で修飾されてよい。ヘリックス部分での完全な塩基対合は、必要とされないが、好ましい。ヘリックス１及び４は、塩基対合が幾つか維持されている限りは、いかなる大きさでもよい（即ち、ｏ及びｐは各々独立的に０から任意の数、例えば２０、である）。必須な塩基はこの構造の特定の塩基として示されているが、当業者は、１つ又はそれ以上の塩基を化学的に修飾（脱塩基、塩基、糖及び／又はリン酸修飾）し得るか、又は著しい効果をもたらすことなく別の塩基に置換し得ることを認めるであろう。ヘリックス４は、２つの分離した分子から、つまり結合ループを使わずに、形成され得る。結合ループは、存在するとき、塩基、糖又はリン酸が修飾された又はされていないリボヌクレオチドであってよい。「ｑ」は２塩基以上である。結合ループはまた非ヌクレオチドのリンカー分子で置換し得る。Ｈは、塩基Ａ、Ｕ又はＣを指す。Ｙはピリミジン塩基を指す。「−−−−−」は化学結合を指す。
図４は、当技術分野で知られているデルタ肝炎ウィルス・リボザイムドメインの一般構造図である。各Ｎは、独立して任意の塩基又はここで用いられているような非ヌクレオチドである。
図５は、自己切断的ＶＳ  ＲＡＮ・リボザイムドメインの一般構造図である。
図６は、本発明の幾つかの新規ヌクレオシド類似体の概略図である。１は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン；２は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン；３は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジン；４は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジン；５は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン；６は、３−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジンである。
図７は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の２）及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジン（図６の３及び図７の１１）モノマーの合成計画である。
図８は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の１及び図８Ｂの１３）及び３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン（図６の５及び図８Ｂの１２）モノマー合成の２つの合成計画である。
図９は、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オンの合成計画である。
図１０は、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−２−オンの合成計画である。
図１１は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成計画である。
図１２は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−３−デアザシチジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成計画である。
図１３は、２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルインドールの合成計画である。
図１４は、２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールの合成計画である。
図１５は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−ホスホルアミダイトの合成計画である。
図１６は、２’−Ｏ−アミノピリミジンヌクレオシド及びホスホルアミダイトの合成計画である。
図１７は、２’−Ｏ−アミノアデノシンヌクレオシド及びホスホルアミダイトの合成計画である。
図１８は、２’−Ｏ−アミノグアノシンヌクレオシド及びホスホルアミダイトの合計計画である。
図１９は、２’−Ｏ−アミノ基で様々な位置で置換されたハンマーヘッド・リボザイムの概略図である（Ａ）。（Ｂ）は、９Ａのリボザイムによって触媒されるＲＮＡ切断反応の速度を示す。
図２０は、Ｄ−ヌクレオチド及びＬ−ヌクレオチドの一般構造を示す。
図２１は、Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成計画（計画１）を示す。
図２２は、５’−Ｏ−シリル保護基を用いたＬ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成計画（計画２）を示す。
図２３Ａ）は、Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−ピリミジンホスホルアミダイトの合成計画、Ｂ）は、Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−プリンホスホルアミダイトの合成計画を示す。
図２４は、Ｌ−ヌクレオチドで置換されたハンマーヘッド・リボザイムの概略図である。
図２５は、Ｌ−ヌクレオチドで置換されたハンマーヘッド・リボザイムによって触媒されるＲＮＡ切断反応のグラフ図である。
ポリヌクレオチドの合成
例えばエンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸は、ヌクレオチド塩基配列特異的なやり方で他のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。このような酵素的ＲＮＡ分子はほとんどすべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ、インビトロで効率的な切断が達成される（Ｚａｕｇ等、３２４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９，１９８６；Ｋｉｍ等、８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７８８，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、３３４  Ｎａｔｕｒｅ  ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ、２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０，１９８８；及びＪｅｆｆｅｒｉｅｓ等、１７，Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７１，１９８９）。それらの基質特異性のために、トランス−切断リボザイムはヒト疾患の治療薬剤として有望である（ＵｓｍａｎとＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５〜２９４；ＣｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎとＭａｒｒ、１９９５  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３〜２０３７）。リボザイムは細胞性ＲＮＡの環境内部で特定のＲＮＡ標的を切断するように設計され得る。このような切断が起こるとｍＲＮＡは非機能的になり、そのＲＮＡから蛋白質が発現されなくなる。このようにして、ある疾患状態に関連した蛋白質の合成が選択的に阻害され得る。
天然に存在する酵素的ＲＮＡについて７つの基本的な種類が今日知られている。各々は生理的条件下でトランスにＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。表１はこれらリボザイムの特性の幾つかを要約する。一般に、酵素的核酸は先ず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断する分子の酵素的部分のごく近傍に位置している酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。従って、酵素的核酸は、先ず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的な塩基対合を介してそれに結合し、正確な部位に結合すると、標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的な切断によって、コードされる蛋白質の合成を指令するその能力が破壊される。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合して切断した後、そのＲＮＡから離れて別の標的を探し、新しい標的に対して繰り返し結合して切断し得る。
リボザイムの酵素的な性質が他の技術よりも有利なのは、治療効果をもたらすのに必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンス・オリゴヌクレオチドのそれより低いからである。この利点は、酵素的に作用するリボザイムの能力を反映している。つまり、単一のリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができるのである。さらに、リボザイムはきわめて特異的な阻害剤であり、その阻害特異性は、結合の塩基対合メカニズムだけでなく、この分子がそれに結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存している。つまり、この阻害はＲＮＡ標的の切断によるものであり、その特異性は、非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比率として定義される。この切断メカニズムは塩基対合に関係する要因以外の要因にも依存している。従って、リボザイム作用の特異性は同一のＲＮＡ部位に結合するアンチセンス・オリゴヌクレオチドのそれよりも高い。
本発明の好ましい態様の１つでは、酵素的核酸分子はハンマーヘッド又はヘアピン・モチーフの形で形成されるが、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン又は（ＲＮＡガイド配列と結合した）ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ、又はニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい（図４、５）。上記ハンマーヘッド・モチーフの例は、Ｄｒｅｙｆｕｓ、同上、Ｒｏｓｓｉ等、１９９２，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８，１８３に、ヘアピン・モチーフについてはＨａｍｐｅｌ等、ＥＰ０３６０２５７、ＨａｍｐｅｌとＴｒｉｔｚ、１９８９Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，４８２９、Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ等、１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，５３、ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３及びＨａｍｐｅｌ等、１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２９９にあり、デルタ肝炎ウィルス・モチーフの例はＰｅｒｒｏｔｔａとＢｅｅｎ、１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１６；ＲＮａｓｅＰ・モチーフについてはＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ等、１９８３  Ｃｅｌｌ  ３５，８４９；ＦｏｒｓｔｅｒとＡｌｔｍａｎ、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，７８３；ＬｉとＡｌｔｍａｎ、１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，８３５に、ニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡリボザイム・モチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９０  Ｃｅ１１  ６１，６８５〜６９６；ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８８２６〜８８３０；ＣｏｌｌｉｎｓとＯｌｉｖｅ、１９９３  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，２７９５〜２７９９；ＧｕｏとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）によって記載され、グループＩＩイントロンは、Ｇｒｉｆｆｉｎ等、１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；ＭｉｃｈｅｌｓとＰｙｌｅ、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２２６９８に、グループＩイントロンは、Ｃｅｃｈ等、米国特許４，９８７，０７１に記載されている。上記の特定のモチーフは本発明を制限するものではなく、本発明の酵素的核酸分子において重要なことは、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１つ又はそれ以上と相補的である特定の基質結合部位を有するということ、及びそれが上記基質結合部位の内部又は周囲に、その分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することであることを当業者は認識するであろう。
１００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は自動化された方法では困難であり、このような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明では、小さな核酸モチーフ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ハンマーヘッド又はヘアピン・リボザイム）が外からの輸送に利用される。上記分子の単純な構造は、ｍＲＮＡ構造の標的領域へこの核酸が侵入する能力を増加させる。
１００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は自動化された方法では困難であり、このような分子の治療コストはひどく高くなる。本発明では、小さな酵素的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド又はヘアピン構造の）が外からの輸送に利用される。上記分子の単純な構造は、ｍＲＮＡ構造の標的領域へこの酵素的核酸が侵入する能力を増加させる。
リボザイムのようなＲＮＡ分子は化学的に合成される。利用される合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、１９８７  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３；及びＷｉｎｃｏｔｔ等、１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７〜２６８４に記載されるような通常のＲＮＡ合成法に準じ、５’−末端のジメトキシトリチル及び３’−末端のホスホルアミダイトのような、通常の核酸保護基及び結合基を利用する。２．５μｍｏｌスケールに変更されたプロトコールに基づいて、アプライドバイオシステム社の３９４型シンセサイザーを用いて，５分間のアルキルシリル保護ヌクレオシド・カップリング工程及び２．５分間の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド・カップリング工程で、小規模合成を実施した。表２は、この合成サイクルで用いた試薬の量及び接触時間を要約する。ポリマー結合性５’−ヒドロキシルに対して、６．５倍過剰（０．１Ｍを１６３μＬ；１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイト及び２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍを２３８μＬ；５９．５μｍｏｌ）が各カップリングサイクルで使われた。トリチル分画の比色定量によって決定される、アプライドバイオシステム社の３９４型シンセサイザーの平均カップリング収率は９７．５〜９９％であった。アプライドバイオシステム社の３９４型シンセセイザー用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬に関しては、脱トリメチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり、キャッピングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）で実施され、酸化溶液は１６．９ｍＭヨウ素、４９ｍＭピリジン、ＴＨＦ中９％水（ミリポア）であった。Ｂ＆Ｊの合成グレードアセトニトリルは試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、アメリカンインターナショナルケミカル社より得た固体より調製した。
ＲＮＡの脱保護化は以下のように実施した。トリチル基がとれてポリマーに結合したオリゴリボヌクレオチドを合成カラムから４ｍＬのガラス製ネジ蓋バイアルへ移し、メチルアミン（ＭＡ）溶液に６５℃、１０分間懸濁した。−２０℃まで冷やした後、上澄液をポリマー支持体から除去した。支持体をＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ（３：１：１）溶液１ｍＬで３回洗浄し、渦状に撹拌してその上澄液を最初の上澄液に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む、この合わせた上澄液を白色粉末になるまで乾燥した。
塩基が脱保護化されたオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（Ｎ−メチルピロリジオン１．５ｍＬ、ＴＥＡ７５０μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦ１ｍＬの溶液を２５０μＬ、ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し、６５℃で１．５時間加熱した。完全に保護基がとれたオリゴマーを５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（９ｍＬ）で冷却した後、陰イオン交換によって脱塩化した。
脱保護化オリゴマーの陰イオン交換による脱塩化には、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で前洗浄したキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）５００（商標）陰イオン交換カートリッジ（キアジェン社）にこのＴＥＡＢ溶液をのせた。このカートリッジを５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後、２Ｍ  ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）でＲＮＡを溶出し、その後、白色粉末になるまで乾燥した。
Ｇ5をＵに、Ａ14をＵに（（Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．等、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，３２５２）からの番号付けによる）置換することによって不活性なハンマーヘッド・リボザイムを合成した。
段階的カップリングの平均収率は９８％より高かった（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２６７７〜２６８４）。
ヘアピン・リボザイムは１部分として合成するか、又は２部分として合成し、アニールし活性リボザイムを再構成する（ＣｈｏｗｒｉｒａとＢｕｒｋｅ、１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，２８３５〜２８４０）。
ＲＮＡは一般的な方法を用いたゲル電気泳動によって精製されるか又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２３２２５、このすべてをここに援用する）によって精製した後、水に再懸濁する。
リボザイムの有用性を高めるために、リボザイム構造に様々な修飾がなされ得る。このような修飾は、貯蔵寿命、インビトロの半減期、安定性及びこのようなリボザイムの標的部位への導入しやすさ、例えば細胞膜への浸透を高め、標的細胞を認識しそれに結合する能力をもたらす。
リボザイム活性の最適化
リボザイム活性はＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、同上に記載されたようなやり方で最適化され得る。詳細は繰り返さないが、これはリボザイム結合アーム（ステムＩ及びＩＩＩ、図２ｃを参照）の長さを変更すること、又は血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ修飾を施したリボザイムを化学的に合成することを含む（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ等、１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；ＵｓｍａｎとＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ等、国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ等、国際公開番号ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許番号５，３３４，７１１を参照のこと。これらは、酵素的ＲＮＡ分子の糖成分に対してなし得る種々の化学修飾について記載している）。細胞内での効力を高め、ステムＩＩの塩基を除去してＲＮＡ合成時間を短縮し化学的要求性を減少させるための修飾が望ましい（上記出版物はすべてここに援用する）。
ポリヌクレオチドの投与
Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５、は酵素的ＲＮＡ分子を輸送する一般的な方法を記載している。リボザイムは、限定されないが、リポソーム被包、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル及び生体癒着性ミクロスフェアのような他の担体への導入を含む、当業者に知られた種々の方法により細胞へ投与してよい。ある適応症に対しては、リボザイムは、上記の担体とともに又は担体なしで、細胞又は組織へエクスビボで直接輸送してもよい。別の方法では、ＲＮＡ／担体の組み合わせは、直接注射するか又はカテーテル、注入ポンプ又はステントの使用を介して、局所的に投与され得る。他の輸送経路には、限定されないが、血管内、筋肉内、皮下又は関節注射、エアゾール吸入、経口（錠剤又は丸剤）、局所性、全身性、眼内、腹腔内及び／又は鞘内輸送がある。リボザイムの輸送及び投与に関するより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、同上、及びＤｒａｐｅｒ等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９にあり、ここに援用されている。
実施例
以下に示すのは、本発明の構造式Ｉ〜Ｖのある化合物及びこれら化合物の１つ又はそれ以上を含むポリヌクレオチドの合成及び活性を示す実施例である。当業者は、以下の実施例に記載された温度、ｐＨ、イオン条件、反応時間及び溶媒条件のようなある種の反応条件が限定的なものではなく、合成に著しく影響せずに容易に変更し得ることを認めるだろう。
実施例１：塩基修飾されたヌクレオチドを含むリボザイムの合成
用いた合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５〜７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，５４３３〜５４４１及びＷｉｎｃｏｔｔ等、１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７〜２６８４に記載されるような通常のＲＮＡ合成法に準じ、５’−末端のジメトキシトリチル及び３’−末端のホスホルアミダイトのような、通常の核酸保護基及び結合基を利用する（化学物４，９，１３，１７，２２，２３）。段階カップリングの平均収率は９８％より高かった。これら塩基修飾されたヌクレオチドは、ハンマーヘッド・リボザイムだけでなく、ヘアピン、ＶＳリボザイム、デルタ肝炎ウィルス又はグループＩ又はグループＩＩイントロンに導入され得る。それゆえ、それらは任意の核酸構造における置換モチーフとして広く使用される。
実施例２：５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（２）の合成
図７を参考にして、ピリジン−２−オンＣヌクレオシド２（図６）は、２−（ベンジルオキシ）−５−ヨードピリジン（３）及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン４から５段階で、また、別の方法では、２，５−ジブロモピリジン（７）及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン４から７段階で製造された。中間体１’−Ｏ−酢酸誘導体９は、ヘミアセタール８の脱酸素化を成功させるのにきわめて重要であった。
Ｏ2カルボニルを欠くピリミジンヌクレオシド類似体２の合成をここに記載する。新規な水素結合様式を有する上記のピリミジンヌクレオシド類似体は、本質的な分子内水素結合相互作用を同定するための貴重なツールとして役立ち得る。１の２’−デオキシ類似体（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１，３２，３２９７〜３３００；Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，２２３２〜２２４３）及び１は、α及びβアノマーの混合物として記述される（Ｂｅｌｍａｓ等、１９８９  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ８，３０７）。リボ誘導体２は知られていないので、ここに記載する。
２（図７）を合成する試みにおいて、出願人は２−（ベンジルオキシ）−５−ヨードピリジン（３）（ＮａＨ／ＢｎＯＨ／ＤＭＦのような還元試薬を用いて２−ブロモ−５−ヨードピリジン（Ｈａｍａ等、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．１９８８，６１，１６８３〜１６８６）から合成される）を、約−７８度の温度を用いるような適切な条件下で、リチウムジアザプロピルアミン（ＬＤＡ）のような試薬を用いる金属化反応によって５−リチオ誘導体へ変換した。この中間体（５−リチオ誘導体）で５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボラクトン（４）のような、保護化されたＤ−リボノラクトンを縮合させると、α及びβラクトール５の混合物を１：８の比率で得た（収率４７％）。ヘミアセタール５、８及び９の接頭辞αが、基準Ｃ原子（２ではＣ４’；即ち，ピリジル成分はβ位にある）での配置に関するグリコシドＯＨ基の位置を指すことに留意すべきである。アノメリック配置の指定は、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるイソプロピリデンメチル基のΔδ値に基づいていた。以前の研究（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，２３６５〜２３６８；Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ａ．；Ｓｃｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｃ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，６４０４〜６４１２）から、１’−脱酸素化へのアプローチとしては、還元的１’−脱アセトキシル化のほうが１’−ＯＨを直接還元よりもずっと効率的であることが知られている。残念ながら、Ａｃ2Ｏ／ＤＭＡＰ／ＴＥＡのアセトニトリル溶液で５をアセチル化しても成功しなかった。1Ｈ  ＮＭＲによると、主要生成物がアセチル基を含まなかったからである。
室温のような温度で、アセトニトリル中トリエチルシラン（Ｅｔ3ＳｉＨ）／ＢＦ3・Ｅｔ2Ｏのような還元剤で５を還元したところ、２１％の収率で、Ｃ−ヌクレオシド６のα／β（１：１）混合物を生じた。６β及び６αは、溶出用にジクロロメタン中メタノールの５−１０％勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって、容易に分離できた。
６βは、ＴＢＡＦのような試薬を用いて脱ブロック化し、５’−シリルエーテル保護基を外し、酸でイソプロピリデン基を切断し、高収率で１２を得た。１２の1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3）2ＣＯ＋Ｄ2Ｏデータ：δ８．１９（ｄ，Ｊ6，4＝２．４，１Ｈ，Ｈ６），７．７９（ｄｄ，Ｊ4，3＝８．４，Ｊ4，6＝２．４，１Ｈ，Ｈ４），６．８０（ｄ，Ｊ3，4＝８．４，１Ｈ，Ｈ３），５．３７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），４．６４（ｄ，Ｊ1'，2'＝７．２，１Ｈ，Ｈ１’），４．１２（ｄｄ，Ｊ3'2'＝５．４，Ｊ3'，4'＝３．４，１Ｈ，Ｈ３’），３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．８８（ｄｄ，Ｊ2'1'＝７．２，Ｊ2'3'＝５．４，１Ｈ，Ｈ２’），３．７４（ｄｄ，Ｊ5'4'＝３．６，Ｊ5'5"＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５’），３．６９（ｄｄ，Ｊ5"4'＝４．２，Ｊ5"5'＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５”）。
遊離Ｃヌクレオシド２を高収率でもたらす、トリメチルシリルヨウ化物（ＴＭＳＩ）のジクロロメタン溶液を用いた１２のベンジルエーテル基の切断反応のような、様々なアプローチを用いてベンジル基を除去することによって、化合物２を得た。
ＰａｒｈａｍとＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２，２５７〜２６０）は、ごく低温（−１００℃）下で２，５−ジブロモピリジン（７）とｎ−ブチルリチウムとの間に起こる予想外の高度に選択的なハロゲン−リチウム交換反応について記載しており、ここでは５−ブロモ置換体だけが交換される。
出願人は７及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン４から出発する別のアプローチ（計画１）によって、２を合成した。ＴＨＦ中で約−１００℃で７を金属化し、リチウム化されたピリジンを保護化されたＤ−リボノ−１，４−ラクトン４で−１００℃において縮合させると、２つの副生成物（それぞれ、収率６％、１７％）とともに、予期したヘミアセタール８（収率４４％、α／β１：１２）が得られた。
８の製造方法：２，５−ジブロモピリジン７（１．７５ｇ，７．４ｍｍｏｌ）をアルゴン存在下乾燥ＴＨＦ（４６ｍＬ）に溶解し、溶液を−１００℃まで冷やした。ヘキサン中１．６Ｍのｎ−ＢｕＬｉ（５．０９ｍＬ，８．１４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した後、溶液を−１００℃で３０分間撹拌した。乾燥ＴＨＦ中のＤ−リボノ−１，４−ラクトン４（３ｇ，７ｍｍｏｌ）の溶液（１０ｍＬ）を５分間かけて滴下した後、混合物を４０分かけて室温にまで温めた。室温でさらに２０分間撹拌した後、塩化アンモニウム飽和水溶液で冷却した。混合液をエーテルで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥後、シロップ状になるまで蒸発させる。ヘキサン中酢酸エチルの３−１５％勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いると、最初に８（１．８ｇ，４４％）が溶出され、より遅い生成物（０．２３ｇ，６％）がこれに続いて溶出した。最後に、最も遅い生成物（０．７ｇ，１７％）が溶出した。
上記３つの生成物はいずれもヘミアセタール構造と一致する1Ｈ  ＮＭＲシグナルを示した。この結果は、７のリチウム化における選択性を示しているが、他の生成物が形成されたことは、競合的なハロゲン−リチウム交換反応も起こることを示唆している。５の還元と同じ手順を用いて８を脱酸素化すると、５の場合と同じように、α／βヌクレオシドの１：１混合物が低収率で得られた。一方、８のアセチル化は定量的な収率で進行し、９を得た（βアノマーだけが得られた）。０℃から室温でＥｔ3ＳｉＨ／ＢＦ3・Ｅｔ2Ｏ／ＣＨ2Ｃｌ2を用いて９を還元すると、８２％の収率で進行したが、再び選択性はなかった（１０α／１０β１：１）。アノマーの指定は、メチル基のΔδ以外に、α−アノマーに比較したβ−アノマーについてよく知られている１’−Ｈシグナルの上方シフトに基づいてなされた（Ｔａｍ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７９，４４，４８５４〜４８６２；Ｓｏｋｏｌｏｖａ等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８１，９３，１９〜３４）。１０βは、２工程で１１へ脱保護化された（１Ｍ  ＴＢＡＦ、次いで８０％酢酸で還流）。誘導体１１は、メトキシド及びベンジレートによる２−ブロモ置換基の置換に対してきわめて抵抗性であった。１２を高収率で得たのは、ＫＨ／ＢｎＯＨ／ＤＭＦ、１４０度で処理した場合だけであり、１２は、２−（ベンジルオキシ）−５−ヨードピリジン３から合成した化合物とあらゆる点で同一であった。この比較から、２，５−ジブロモピリジン７から得られる主要生成物が５−ピリジル位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）８であることが紛れもなく証明された。
５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンの合成：６αをＴＢＡＦで処置して５’−シリルエーテル保護基を外した後、イソプロピリデン基を酸で切断し、次いでトリメチルシリルヨウ化物（ＴＭＳＩ）のジクロロメタン溶液を用いてベンジルエーテル基を切断し、５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンを高収率で得る。
５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンの合成：１０αをＴＢＡＦで処置して５’−シリルエーテル保護基を外した後、イソプロピリデン基を酸で切断し、５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンを高収率で得る。
５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンの合成：２−ブロモ誘導体１１（５８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を鋼鉄性のオートクレーブの中に入れ、オートクレーブをアルゴンの連続流で洗浄した。ヨウ化銅（Ｉ）（７２０ｍｇ，２当量）を加え、オートクレーブをデュアー瓶（ＣＯ2−イソプロパノール）で冷却した。アンモニアがオートクレーブ中で濃縮される（約１５ｍＬ）間、この容器のアルゴン洗浄を継続した。次いでオートクレーブを速やかに閉じ、混合物を室温まで温め、１１５℃に熱した油浴槽に置き、２４時間撹拌した。次いでオートクレーブを前のように冷却し、開き、室温まで温め、アンモニアを蒸発させた。次に、暗色の混合物をメタノールに溶かし、濾過後、シロップ状のものになるまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／三塩化メタン）にかけて、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジン（図６の４）を得た（２３５ｍｇ、収率５２％）。
５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンの合成：５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジン（５８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を鋼鉄性のオートクレーブの中に入れ、オートクレーブをアルゴンの連続流で洗浄した。ヨウ化銅（Ｉ）（７２０ｍｇ，２当量）を加え、オートクレーブをデュアー瓶（ＣＯ2−イソプロパノール）で冷却した。アンモニアがオートクレーブ中で濃縮される（約１５ｍＬ）間、この容器のアルゴン洗浄を継続した。次いでオートクレーブを速やかに閉じ、混合物を室温まで温め、１１５℃に熱した油浴槽に置き、２４時間撹拌した。次いでオートクレーブを前のように冷却し、開き、室温まで温め、アンモニアを蒸発させた。次に、暗色の混合物をメタノールに溶かし、濾過後、シロップ状のものになるまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／三塩化メタン）にかけて、５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンを得た。
ここに報告した２つのアプローチはα／βアノマーを１：１の比率で生成したが、それらは、オリゴヌクレオチド基礎単位の合成のためにより大量のＣ−ヌクレオシド２を製造する有用な方法である。２も１１も、他のＣ−ヌクレオシドと同じように、薬剤的に有用な生物活性を示す可能性がある。
実施例３：３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン（１）及び３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（５）の合成
図８を参考にして、３を室温で還元することによってピリジン−２−オン−Ｃ−ヌクレオシド１３（図６の１）を合成し、次いで環化反応によって、化合物５及び８を得た。脱ブロック化の後に水素添加分解及び脱ベンジル化を行えば、化合物１３を得る。
ピリジン−２−オン−Ｃ−ヌクレオシド１３（図６の１）は、２−フルオロ−３−リチオピリジン（１）及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン２から７工程で製造された。β−リボフラノシド１２（図６の５）及び１３への成功するアプローチは、ヘミアセタール３のフラノース環の還元的開化とそれに続く分子内Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ環化反応にあった。
Ｏ4カルボニルを欠くピリミジンヌクレオシド類似体１２及び１３の合成はここに記載され、本質的な分子内水素結合反応の同定に利用され得る。
アメリック混合物としての１３の合成は、２，４：３，５−ジ−Ｏ−ベンジリデン−アルデヒド−Ｄ−リボース及び３−リチオ−２−フルオロピリジン（Ｂｅｌｍａｎｓ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８９，８，３０７〜３１５）から記載される。しかし、この方法は非効率的であり、要となる出発物質の製造中にリボースジチオアセタールが関与するために、大量製造に向いていなかった。さらに、鎖状の前駆体の酸触媒環化中にフッ素原子が加溶媒分解的に置換してしまうため、この経路では、２−フルオロピリジン誘導体１２は単離できなかった。
図８Ａを参考にして、出願人は、５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボラクトン（２）のような保護化されたＤ−リボノラクトンを用いて、３−リチオ−２−フルオロピリジンと縮合（−７８℃、その後室温、１８時間、ＴＨＦ）すると、ラクトール３の１：５α／β混合物を収率６３％で得た（計画１）。ヘミアセタール３の接頭辞αが、基準Ｃ原子（２ではＣ４’；即ち、ピリジル成分はβ位にある）での配置に関するグリコシドＯＨ基の位置を指すことに留意すべきである。アノメリック配置の指定は、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるイソプロピリデンメチル基のΔδ値に基づいていた。種々の溶媒に溶かしたＢＦ3・Ｅｔ2Ｏ又はＴＭＳＯＴｆの存在下、トリエチルシラン（Ｅｔ3ＳｉＨ）を用いて３を脱水素化しようとしたが、ヌクレオシド５の収率は低かった。さらに、所望されるβ−ヌクレオシドは混合物においていつでもマイナーなアノマーであった。アノマーの指定は、イソプロピリデンメチル基のΔδ以外に、α−アノマーに比較したβ−アノマーについてよく知られている１’−Ｈシグナルの上方シフトに基づいてなされた。
１’−ヒドロキシル基のより効率的及び／又は選択的な還元が中間体１’−ＯＡｃ誘導体を介して達成されることが実証された（即ち、４；Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，２３６５；Ｄｏｎｄｏｎｉ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，６４０４〜６４１２）。出願人は、Ａｃ2Ｏ／ＴＥＡ／ＤＭＡＰアセトニトリル溶液を用いれば３が定量的な収率でアセチル化され、４を生じる（１種のアノマーだけが生成した、その配置を決定するための試みはなされなかった）ことを見出した。Ｅｔ3ＳｉＨ／ＴＭＳＯＴｆジクロロメタン溶液で０℃〜室温において４を還元的に脱アセチル化すると、効率的に進行し、高収率の５（α／β１０：１）が得られた；溶媒がＥｔ3ＳｉＨの場合、α／β比は５：１であった。上記の結果は驚くべきものであった、なぜなら、同様の反応条件では、ピラジン（Ｌｉｕ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，５３２５〜５３２８）及びイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンラクトール（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，２３６５〜２３６８）の還元においては決まってβ選択的であると報告されていたからである。
十分量のβ−Ｃ−ヌクレオシドを得るために、出願人はさらにいくつかの異なる経路を研究した：３のメシル化は、適度な収率で１’−Ｏ−メシル誘導体をもたらした（計画２）。６をＬＡＨで処置しても、２−ピリジンＣ−ヌクレオシドについて報告されているようには、このスルホン酸塩を還元しなかった。より反応性に富むＬｉＥｔ3ＢＨも失敗した。より反応性に富む１’−Ｏ−Ｔｆ誘導体の製造が失敗したのはトリチル化の条件下でフラノース環が開いたためであったということは注目に値する。
Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ等（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８８，５３，３４７３〜３４７９）は、６−ピリジンラクトール誘導体のヘミアセタール環を水素添加分解によって開化するとアロ（ａｌｌｏ）及びアルトロ（ａｌｔｒｏ）の異性体が発生すると報告した。３とＮａＢＨ4の反応は定量的な収率で進行し、約１：１のアロ／アルトロ混合物７を与えた。これらエピマーは分離しなかったが、通常のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ条件［ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）／Ｐｈ3Ｐ／ＴＨＦ、還流］で処理し、５（α／β比１：２）及び３−（２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｌ−リキソ−フラノシル）−２−フルオロピリジン（８）を得た。後者は４’−オキシホスホニウム中間体の競合的形成より生じたものである。Ｙｏｋｏｙａｍａ等（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９４，２６５〜２６８）は、このような中間体が形成されるのは１’−ＯＨと２−ピリミジル塩基の水素受容部分とが水素結合するためであろうと考察した。７のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ環化が室温で行われると、より多くのリキソ誘導体８が、還流温度の場合よりも多く得られるということは注目に値する。このことは、１’−ＯＨとそのごく近傍にあるフッ素との間に水素結合が存在し、それが反応温度の上昇によって壊されることを示している。最近、同様のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ環化を重要な工程として用いるイミダゾールＣ−ヌクレオシドの効率的な合成法が報告された（Ｈａｒｕｓａｗａ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，４４０５〜４４１１）。５及び８の混合物をクロマトグラフィーで分離するのは困難だったので、まずＴＢＡＦで５’−脱シリル化し、次いでフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画した。典型的な手順では、７（７ｇ，１３ｍｍｏｌ）及びＰｈ3Ｐ（５．２５ｇ，２０ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解し、その混合物を加熱して還流させた。ＤＥＡＤ（３．１５ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を還流混合物に加え、１時間加熱を続けた。真空下で溶媒を除去し、酢酸エチルの９−１１％勾配ヘキサン溶液を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製する。溶媒を除去すると、５及び８の混合物５．６ｇ、８３％が得られた（図８Ｂ参照）。上記の混合物をＴＨＦ（７５ｍＬ）に溶かし、ＴＢＡＦの１ＭＴＨＦ溶液（２２ｍＬ，２当量）で１時間処理した。次いでこれを真空で濃縮し、シリカゲルのカラムにかけ、溶出用に酢酸エチルの１５−７０％勾配ヘキサン溶液を用いて、クロマトグラフィー処理した。最初にα−アノマー１０（０．５６ｇ，１９％）が溶出され、次いでβ−アノマー９（１．６ｇ，５４％）が溶出した。最後にリキソ誘導体１１（０．５６ｇ，１９％）が溶出した。β−アノマー９が７から２段階で４５％の収率で得られたのに対し、α−アノマー１０及びリキソ誘導体１１はいずれも１６％の収率で得られた。９は、８０％酢酸で煮沸することで遊離の２−フルオロヌクレオシド１２（融点１３４〜１３５℃、ＴＨＦより）へ変換され、次いでＢｎＯＫで２−（ベンジルオキシ）誘導体へ変換した（１２の1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）データ：δ８．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ６），８．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ４），７．３２（ｍ，１Ｈ，���５），４．９８（ｄ，Ｊ1'，2'＝５．６，１Ｈ，Ｈ１’），４．０５−３．９６（ｍ，３Ｈ，Ｈ２’，Ｈ３’，Ｈ４’），３．８４（ｄｄ，Ｊ5'4'＝３．０，Ｊ5'5"＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５’），３．７３（ｄｄ，Ｊ5"4'＝４．６，Ｊ5"5'＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５”）。ベンジル基の触媒的水素添加分解（Ｈ2，Ｐｄ−Ｃ）は、Ｃ１’−Ｏ４’結合も同時に切断した。トリメチルシリルヨウ化物（ＴＭＳＩ）を用いた脱ベンジル化はうまく実行され、シロップ状の３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（１３）を８３％の収率で得た［ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax３０２ｎｍ］。α−アノマー１０は９と同じようなやり方で脱保護化して１４を得た（融点１３４〜１３５℃、ＴＨＦより；１４の1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）データ：δ８．１２−８．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ６，Ｈ４），７．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），５．２６（ｄ，Ｊ1'，2'＝２．８，１Ｈ，Ｈ１’），４．３５−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’，Ｈ３’），４．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．８８（ｄｄ，Ｊ5'4'＝２．６，Ｊ5'5"＝１１．８，１Ｈ，Ｈ５’），３．６８（ｄｄ，Ｊ5"4'＝４．６，Ｊ5"5'＝１１．８，１Ｈ，Ｈ５”））。１４のフッ素をベンジレートで置換したところ、定量的な収率で無水誘導体１５を得た［融点１９５〜１９６℃，ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８６ｎｍ；１５の1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3）2ＣＯデータ：δ８．１０（ｄｄ，Ｊ6，5＝５．２，Ｊ6，4＝１．６，１Ｈ，Ｈ６），７．８０（ｄｄ，Ｊ4，5＝７．３，Ｊ4，6＝１．６，１Ｈ，Ｈ４），６．９５（ｄｄ，Ｊ5，6＝５．２，Ｊ5，4＝７．３，１Ｈ，Ｈ５），５．５９（ｄ，Ｊ1'，2'＝６．０，１Ｈ，Ｈ１'），５．３６（ｄ，ＪOH，3'＝７．２，１Ｈ，３’ＯＨ），５．０２（ｄｄ，Ｊ2'，1'＝６．０，Ｊ2'，3"＝５．２，１Ｈ，Ｈ２’），４．６４（ｔ，Ｊ3'，OH，＝５．４，１Ｈ，ＯＨ５’），３．９７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），３．６２（ｄｑ，Ｊ5'，4'＝２．２，Ｊ5'，5"＝１２．２，１Ｈ，Ｈ５’），３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５”），３．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’）］。この予想外の環化は、近傍の２’ヒドロキシル基によってフッ素原子の分子内求核性置換が起きたためと解釈される。１１の構造は、Ｈ４’とＨ３’（６％ＮＯＥ）及びＨ４’とＨ４（５％ＮＯＥ）との間に相互強化が観察されたＮＯＥ試験によって確認された。
出願人は、オリゴヌクレオチド合成の基礎単位の製造用出発物質としてのＣ−ヌクレオシド１２及び１３のβ−アノマーを大量合成するのに有用な方法を記載した。上記類似体はまた潜在的な抗ウィルス剤及び／又は抗癌剤としても興味がある。
実施例４：１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オン（７）の合成
図９を参照し、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オン（３）をＮｉｅｄｂａｌｌａ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３９，３６６８〜３６７１に準じて合成した。１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オン（５）は、誘導体３の標準的なＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ脱保護化によって、ほとんど定量的な収率で、製造された。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オン（６）は、ピリジン溶液中で５を標準的に脱メトキシトリチル化する（室温、一晩中）ことによって製造し、収率８３％であった。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オンは、標準的なシリル化法（Ｈａｋｉｍａｌａｈｉ等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８２，６０，１１０６〜１１１３）によって製造した。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オン（７）は、標準的なホスフィチル化法（Ｔｕｓｃｈｌ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，１１６５８〜１１６６８）によるホスフィチル化によって製造した。
実施例５：１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−２−オン（６）の合成
図１０を参照し、化合物６は、Ｍｕｒｒａｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５，３１１，４８７〜４９４に記載された方法によって製造した。
実施例６：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（５）の合成
図１１を参照し、化合物（５）は、Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン（２）のジメトキシトリチル化以外は、米国特許番号５，１３４，０６６に記載された方法によって製造した。上記の特許に開示された方法は所望の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン（３）を１０％の収率でしか与えなかった。それ故、２をジメトキシトリチル化する以下の方法が開発された。
化合物２（１．９５ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０ｍＬ）に対し、シム−コリジン（ｓｙｍｍ−ｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）（１．５３ｍＬ，１１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、硝酸銀（０．９９ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１０分間撹拌した後、塩化ジメトキシトリチルを加え、この反応混合物をさらに１時間撹拌した。その後、メタノール（１５ｍＬ）で冷却し、蒸発乾固した。残渣をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒は真空除去した。油状の残渣を、酢酸エチルの（３０−５０％）勾配ヘキサン溶液を溶離液として用いたシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、誘導体３を３ｇ（８８．８％）得た。
実施例７：２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルインドールの合成
図１３を参照し、Ｓｚａｒｅｋ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７５，６４８〜６４９の方法により、インドール及び２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（１）から、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）インドール（２）を合成した。５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシルインドール（３）は、標準的な脱保護化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）の後にトリチル化（ＤＭＴＣｌ／Ｐｙ）によって、中間体２から製造した。２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシルインドール（４）は、標準的なシリル化によって中間体３より製造した（収率３２％）。２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルインドール（５）は、３’−Ｏ−ホスフィチル化によって中間体４より製造した（収率８５％）。
実施例８：２−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールの合成
図１４を参照し、Ｋａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋ等、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．１９８０，３５ｃ，３０〜３５の方法により、ベンズイミダゾール及び１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（１）から１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ベンズイミダゾール（２）を合成した。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（３）は、標準的な脱保護化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）の後にトリチル化（ＤＭＴＣｌ／Ｐｙ）によって、中間体２から製造した。２’−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（４）は、標準的なシリル化によって中間体３より製造した（収率３２％）。２’−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（５）は、３’−Ｏ−ホスフィチル化によって中間体４より製造した（収率８５％）。
実施例９：３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−ホスホルアミダイトの合成
図１５を参照し、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の１）をＴＢＤＭＳｉ−Ｃｌ／ＤＭＦ、ＮＰＥＯＨ／Ｐｈ3Ｐ／ＤＥＡＤ／ＴＨＦ及びＴＦＡ、ＣＨＣｌ3で処理すると、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン（７）を得る。５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の２）をＴＢＤＭＳｉ−Ｃｌ／ＤＭＦ、ＮＰＥＯＨ／Ｐｈ3Ｐ／ＤＥＡＤ／ＴＨＦ及びＴＦＡ、ＣＨＣｌ3で処理すると、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン（８）を得る。
化合物７及び８は、上記の標準プロトコールを用いて、いずれも容易にホスホルアミダイトへ変換される。
本発明の新規類似体のホスホルアミダイトは以前に記載された合成、脱保護、精製及び検査方法（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，同上）を用いてポリヌクレオチドへ導入される。
実施例１０：４−ベンジルアミノ−１Ｈ−ピリジン−２−オン又はＨ4−ベンジル−３−デアザシトシン（図１２）
表題の化合物は、Ｈｕｎｇ，Ｎ．Ｃ．；Ｂｉｓａｇｎｉ，Ｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，７６５に記載された方法で、４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピリジン−２−オン（１）より製造した。
４−ベンジルアミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ーオン（３）又はＮ4−ベンジル−２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベンゾイル−３−デアザシチジン：ヘキサメチルジシラザン（５０ｍＬ）とトリメチルクロロシラン（５ｍＬ）の混合液に２（２．８ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）を懸濁し、３時間還流した。得られた２のトリメチルシリル誘導体の澄明溶液を蒸発乾固させた。乾燥アセトニトリル（４０ｍＬ）にこの澄明な油液を溶かし、これに１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｄ−リボフラノース（７．０６ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合液を０℃に冷却した。上記の撹拌された溶液にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（３．２５ｍＬ，１６．８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた後、反応混合物を室温まで温め、一晩放置した。その後、反応混合物を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄したジクロロメタンで希釈した。未反応物２の沈殿物は濾過によって分離した。次いで層を分離して有機層をブラインで洗浄した後、蒸発させた。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物３を５．５ｇ（６０％）得た。
４−アミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ーオン（４）又は２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベンゾイル−３−デアザシチジン：化合物４は、室温、エタノールにおいて３を触媒的水素添加分解（Ｐｄ／Ｃ）して製造した。
４−アセチルアミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ーオン（５）：化合物５は、誘導体４を無水酢酸ピリジン溶液において標準的にアセチル化することによって製造した。
４−アセチルアミノ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ーオン（６）：表記の化合物は、−１０℃、ピリジン−エタノール混液において、誘導体５の糖成分を２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で選択的に脱保護化することによって製造される。
４−アセチルアミノ−１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ーオン（７）：化合物７は上記記載の標準プロトコールを用いて製造される。
実施例１１：２’−Ｏ−アミノピリミジンヌクレオシド（図１６の８）の合成
２’−デオキシヌクレオシドの５’−Ｏ−ＮＨ2又は３’−Ｏ−ＮＨ2誘導体をＭｉｔｓｕｎｏｂｕ変換によって製造する合成法は、当技術分野でよく知られている。しかしながら、この方法を２’−Ｏ−ＮＨ2−リボヌクレオシドの製造に適用したところ、所望の化合物はごく低い収率（１０％未満）でしか得られなかった。出願人は、２’−Ｏ−ＮＨ2−リボヌクレオシド及びそのホスホルアミダイトを合成する新規の高度に効率的な方法を開発した。
３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ピリミジン（２）
図１６を参照し、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウラシル（２．４４ｇ，１０ｍｍｏｌ）のような１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ピリミジンを無水ピリジンで２度共蒸発して乾燥させ、無水ピリジンに再溶解した。上記の溶液を冷却（０℃）し、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルシロキサン（３．５２ｍＬ，１１．０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロエタン溶液１０ｍＬを撹拌しながら滴下した。反応液をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で冷却した後蒸発乾固した。残渣を塩化メチレンに溶かし、飽和ＮａＨＣＯ3及びブラインで洗浄した。有機層を蒸発乾固しトルエンとともに共蒸発させ、ごく微量のピリジンを除去し、化合物２を４．８ｇ（９８％）得た。これは、さらに精製せずに使用した。
２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−ウリジン（４）
氷冷した３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウラシル（４ｇ，８．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、無水スルホン化トリフルオロメタン（１．６６ｍＬ，９．８６ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合液を−５℃で３０分間撹拌した。次いでジクロロメタンで希釈し、冷１％酢酸水溶液、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発乾固した。得られた誘導体３を無水アセトニトリル（７０ｍＬ）に溶かした後、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１．７４ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）を加えた。激しく撹拌しながら、ＤＢＵ（１．６ｍＬ，１０．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）を滴下して加えた。３０分後、暗橙色の反応混合物をジクロロメタン（２５０ｍＬ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出（３ｘ２５０ｍＬ）した。得られた無色の有機層をブラインで洗浄した後蒸発乾固し、３．６ｇ（７０％）の化合物４を得た。
２’−Ｏ−フタルイミド−ウリジン（５）
２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−ウリジン（３ｇ，４．７５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、トリエチルアミン（１．３２ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）及び三フッ化水素トリエチルアミン（１．５５ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）を同時に加えた。１時間後、溶媒を真空除去し、残った残渣をジクロロメタンに溶かした後、３５℃で蒸発させた。この手順を３回繰り返した（出発物質の完全な変換が薄層クロマトグラフィーで示されるまで）。残渣をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発乾固して１．５６ｇ（８５％）の化合物５を得た。
２’−Ｏ−アミノウリジン（８）は、メチルアミン４０％水溶液で加水分解し、次いでエタノールから結晶化して得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミド−ウリジン（６）
化合物５（１．５ｇ，４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンを用いて数回蒸発乾固させた後、乾燥ピリジンに再溶解した後、塩化ジメトキシトリチル（１．２当量）を加えた後、反応混合液を無水条件下で一晩放置した。次いでメタノール（１５ｍＬ）で冷却し、蒸発させ、クロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発させた。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、酢酸エチル−ヘキサン混液（２：３）で溶出させ、対応する５’−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体６を１．９３ｇ（７０％）得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミドウリジン−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（７）
Ｔｕｓｃｈｌ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，１１６５８〜１１６６８）による６の標準的ホスフィチル化によって、ホスホルアミダイト７を７０％の収率で得た。
ホスフィチル化の一般方法：乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かした保護化ヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）の撹拌された氷冷溶液に、アルゴンブランケット下、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５当量）及び２−シアノエチルＮ’Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．２当量）をジクロロメタン（３ｍＬ）に前もって溶かした溶液をシリンジで滴下した。同時に、別のシリンジで、Ｎ−メチルイミダゾール（１当量）を加え、室温で２時間撹拌を続けた。その後、反応混合液を再び氷冷し、１５ｍＬの乾燥メタノールで冷却した。５分間の撹拌後、混合液を真空濃縮（４０℃未満）し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、１％トリエチルアミンを含む酢酸エチル−ヘキサン混液で溶出させ、対応する白色泡状のホスホルアミダイトを得た。
ホスホルアミダイトは、以前に記載された合成、脱保護、精製及び検査方法（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，同上）を用いて、リボザイム及び基質のような核酸分子へ導入された。段階的カップリングの平均収率は約９８％であった。
実施例１２：２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−Ｎ6−ｔ−ブチルベンゾイルアデノシン（図１７の５）及び２’−Ｏ−アミノアデノシンヌクレオシド（図１７の９）の合成
図１７を参照し、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１２ｍｍｏｌ）を、アラ−ウリジン誘導体で記載したように、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルシロキサン（４．２ｍＬ，１３．２ｍｍｏｌ）でシリル化した。生成物の無水ジクロロメタン冷溶液（−１０℃）をトリフルオロメタンスロホクロライド（１．５３ｍＬ，１４．４ｍｍｏｌ）で２０分間処理した。得られた溶液を無水ジクロロメタンで希釈し、１％の冷酢酸水溶液（０℃）、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固して誘導体２を得た。残渣を無水アセトニトリルに溶かし、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２．５４ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合液に、激しく撹拌しながら、ＤＢＵの無水アセトニトリル溶液（２．３３ｍＬ，１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、暗橙〜褐色の反応混合液をウリジン誘導体で記載したようにして処理した。得られた２’−Ｏ−フタルイミド誘導体４を無水ピリジンに溶かし、４−ｔ−塩化ブチルベンゾイルを加えた後、反応混合液を室温で一晩放置した。次いでメタノール（１５ｍＬ）で冷却し、溶媒を真空除去し、残渣をトルエンに溶かした後、蒸発乾固した。得られた油をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発乾固させた。残渣をシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、酢酸エチル−ヘキサン混液（１：２）で溶出させ、完全に保護化されたシンソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）５を３．５ｇ（アラ（ａｒａ）−Ａについて３５％）得た。
２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ6−t−ブチルベンゾイルアデノシン（６）
マルキェビチ（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ）基脱保護化を、対応するウリジン誘導体と同様に実施した。収率８６％。
２’−Ｏ−アミノアデノシン（９）は、メチルアミン４０％水溶液で加水分解し、次いでエタノールから結晶化して得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フタルイミド−Ｎ6−t−ブチルベンゾイルアデノシン（７）
２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ6−t−ブチルベンゾイルアデノシンの標準的なジメトキシトリチル化によって化合物７を収率７５％で得た。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フタルイミド−Ｎ6−t−ブチルベンゾイルアデノシン−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（８）
Ｔｕｓｃｈｌ等、同上、による標準的なホスフィチル化によってホスホルアミダイト８を収率７０％で得た。
実施例１３：２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−Ｎ6−ｔ−ブチルベンゾイルグアノシン（図１８の１１）及び２’−Ｏ−アミノグアノシンヌクレオシド（図１８の８）の合成
図１８を参照し、ここに援用するＨａｎｓｓｋｅ等、１９８４，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０，１２５に記載された方法を利用して、化合物１から出発して化合物４が合成される。次いで化合物８及び９は、図７に記載された工程を利用して化合物４から合成され得る。
実施例１４：２’−Ｏ−アミノ修飾で置換されたリボザイムによって触媒されるＲＮＡ切断反応
インビトロのＲＮＡ切断アッセイ：
基質ＲＮＡは、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳバイオケミカルズ）を用いて５’末端を標識する。切断反応はリボザイム「過剰」条件で実施する。ごく微量（１ｎＭ以下）の５’末端標識基質及び４０ｎＭ非標識リボザイムを変性し、２分間で９０℃まで加熱し、氷上１０〜１５分間急冷することにより別々に再生する。リボザイム及び基質を、３７℃で１０分間、５０ｍＭトリス塩酸及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液で別々に保温する。リボザイムと基質溶液を混合し、３７℃で保温することにより反応を開始する。一定の時間間隔で５μＬの部分標本を取り、反応は等量の２Ｘホルムアミド停止液と混合して抑止する。各標本は、２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。結果を定量化し、標的ＲＮＡの切断比率を時間に対してプロットする。
図１９Ａを参照し、４、７、９又は１５．１位に２’−Ｏ−アミノ置換基がついたハンマーヘッド・リボザイムは上記記載のように合成された。上記リボザイムの標的ＲＮＡ切断能力をアッセイした。図１９Ｂに示されるように、図１９Ａに示されたすべてのリボザイムは標的ＲＮＡの切断を触媒することができた。
実施例１５：Ｌ−ヌクレオチド置換を含む酵素的核酸の合成
合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，７８４５〜７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，５４３３〜５４４１；及びＷｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７（これら参考文献はすべてこのまま援用する）に記載されるような通常のＲＮＡ合成法に準じ、５’−ＯＨのジメトキシトリチル及び３’−ＯＨのホスホルアミダイトのような、通常の核酸保護基及び結合基を利用する。Ｌ−ヌクレオシドのホスホルアミダイトは、ハンマーヘッド・リボザイムだけでなく、ヘアピン、デルタ肝炎ウィルス、ＶＳ  ＲＮＡ、ＲＮａｓｅＰリボザイム、グループＩ、グループＩＩイントロン又は他の触媒的核酸に導入され得る。それ故、それらは核酸構造において広く使用される。
実施例１６：Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成（計画１）
図２１を参照し、（Ｖｉｓｓｅｒ等、Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ  １９８６，１０５，５２８〜５３７）に記載されたやりかたで、Ｌ−リボースを塩酸／メタノールの作用によって１−Ｏ−メチル−α，β−Ｌ−リボフラノシドへ変換した。この中間体をさらにＢｚ／Ｐｙによってベンゾイル化し、得られた１−Ｏ−メチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−リボフラノシドをアセトリシス法（Ａｃ2Ｏ／ＡｃＯＨ／Ｈ2ＳＯ4）にかけた。目標である１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−リボフラノシドは、Ｌ−リボースから約３０％の収率で単離され、Ｖｏｒｂｒｉｇｇｅｎ法（Ｖｏｒｂｒｉｇｇｅｎ等、１９８１，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１１４，１２３４）による収率５０〜７５％のＬ−リボヌクレオシド合成の出発物質として役立てた。
完全に保護されたリボヌクレオシドのリボース部分はＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ処理（Ｕｒｄ）及びＮａＯＨ／ジオキサン（Ｃｂｚ，Ａｂｚ，Ｇｉｂｕ）によって、脱保護化された。次いで、標準トリチル化、シリル化、２’および３’ーＯ−ＴＢＤＭＳｉ異性体の分割、及びホスフィチル化法によって、目標のホスホルアミダイトを得た。
上記ホスホルアミダイトは、以前に記載されたＲＮＡ合成及び脱保護化の一般的な方法（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、同上、そのままここに援用する）を用いてハンマーヘッド・リボザイムに導入した。２．５μｍｏｌスケールに変更されたプロトコールに基づいて、３９４型（ＡＢＩ）シンセサイザーを用いて、５分間の２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ保護化ヌクレオチド・カップリング工程及び２．５分間の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド・カップリング工程で、合成を実施した。ポリマー結合性５’−ヒドロキシルに対して、６．５倍過剰の０．１Ｍホスホルアミダイト溶液及び２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾールが各カップリングサイクルで使われた。
すべての分析的ＨＰＬＣ分析は、報告されているように（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、同上）、５０℃で、ヒューレットパッカードの１０９０ＨＰＬＣ、ＤｉｏｎｅｘのＮｕｃｌｅｏＰａｃ（商標）ＰＡ−１００カラム，４ｘ２５０ｍｍにて実施した。
ＣＧＥ分析は、ヒューレットパッカードの3DＣＥで、Ｊ＆ＷのμＰＡＧＥTM−５（５％Ｔ，５％Ｃ）ポリアクリルアミドゲル充填カラム、７５μｍＩ．Ｄ．ｘ７５ｃｍ、有効長５０ｃｍ、１００ｍＭトリスホウ酸塩、７Ｍ尿素、ｐＨ８．３及びＪ＆ＷのμＰＡＧＥTM緩衝液（１００ｍＭトリスホウ酸塩、７Ｍ尿素、ｐＨ８．３）を用いて実施した。サンプルは、３〜１０秒間に−１３ｋＶで電気力学的に注入され、−１３ｋＶで運転した後、２６０ｎｍで検出された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、パーセプティブ・バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）分光計によって決定された。
実施例１７：Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成（計画２）
上記の標準的な計画１は広く利用されている（Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、同上、及びＡｓｈｌｅｙ、同上）が、ある種の欠点がある；ａ）Ｌ−リボースが高価で、Ｌ−リボヌクレオシド合成に必要な重要な中間体、１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−リボフラノシドの収率が低いこと（約３０％）；ｂ）塩基保護に影響せずにリボース保護基を選択的に除去することが困難であること、及びトリチル化反応に用いられる中間体の単離が冗長になることのために、Ｎ−保護化５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体への変換があまり効率的ではないこと（典型的な収率は４０〜５０％である）。
上記の問題は合成の第一工程で５−Ｏ−基に直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護を導入することによって克服され得る。これには２つの目的がある：１）Ｌ−リボースの、グリコシル化の前駆体として役立つ５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−１，２，３−Ｏ−ベンゾイルリボフラノースへの効率的な変換が達成されること（計画１の３０％に対して６０％）；２）アシル型リボースに対する５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ基の直交性及び完全にブロックされたＬ−リボヌクレオシドの塩基保護によって、この基の選択的な除去と５’−ＯＨ中間体の効率的な単離、及び次の効率的な５’−トリチル化が可能になること。５’ーＯ−ＤＭＴ中間体からの２’，３’−保護基の除去及び目標の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ−保護化Ｌ−リボヌクレオシドの単離がずっと効率的になるのは、５’−Ｏ−ＤＭＴ基の親油性によるものである。
実施例１８：Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−ウリジン及びピリミジンホスホルアミダイトの合成
図２３Ａを参照し、Ｌ−アラビノースを、Ｈｏｌｙ、Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７２，４０７２〜４０８７の方法により、２−アミノ−β−Ｌ−アラビノフラノ［１’，２’：４，５］オキサリゾン（１）を介して２，２’−アンヒドロ−Ｌ−ウリジン（２）へ変換した。アジドリチウムを用いた２，２’アンヒドロ環の開化及び次の２’−アミノ−ウリジン４への還元は（Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７１，３６，２５０〜２５４；Ｈｏｂｂｓ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７９，４２，７１４〜７１９）に記載されたやり方で実施した。ヌクレオシド（４）の目標ホスホルアミダイト（６）への変換は、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５，４４３４〜４４４２に準じて達成した。
重要中間体４はまた、Ｄｉｖａｋａｒ等、１９８２，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ，１１７１による標準的な成分置換反応によって、２’−デオキシ−２’−アジド−シチジンへ変換され、ベンゾイル基でＮ４を保護し、トリチル化した後、ウリジンの場合と同じように、２’−Ｎ３官能基を２’−アミノへ還元した。さらに上記中間体は、ウリジンに対するフタロイル保護基導入及びホスフィチル化と同じ方法を用いて、ホスホルアミダイトへ変換した。
実施例１９：Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−プリンホスホルアミダイトの合成
図２３Ｂを参照し、Ａ及びＧのＬ−リボヌクレオシドが、上記の合成計画１及び２に示されたようにＬ−リボースより得られた。それらは暫定的な保護法を用いてＮ−保護化され（Ｔｉ等、ＪＡＣＳ  １９８２、１０４，１３１６〜１９）、その後マルキェビチ保護基で３’及び５’位を保護した。得られた中間体１をＣｒＯ3／Ｐｙによって酸化し、得られた２−ケト化合物を２’−キシロ誘導体２へ還元した。Ｒｏｂｉｎｓ等（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９２，１１，８２１〜８３４）の方法により、トリチル化及びＬｉＮ３による求核置換を施し、２’−Ｎ３−誘導体３を得た。３のアジド基をＰｈ3Ｐ／ＮＨ4ＯＨで還元した後、脱シリル化した。得られた２’−アミノヌクレオシド４は約６０％の収率で単離された。中間体４からホスホルアミダイト６への変換は、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、同上、による関連ピリミジン誘導体と同様の方法で実施した。
実施例２０：Ｌ−ヌクレオチドで置換されたリボザイムの触媒活性
ハンマーヘッド・リボザイムをいくつかの部位においてＬ−ヌクレオチドで置換した（図２４）。リボザイム触媒活性に対するＬ−ヌクレオチド置換の相対的な効果は、「材料と方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、同上、に記載された標準アッセイ条件のもとで検討された。
インビトロのＲＮＡ切断アッセイ：
基質ＲＮＡは［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳバイオケミカルズ）を用いて５’末端を標識する。切断反応はリボザイム「過剰」条件で実施する。ごく微量（１ｎＭ以下）の５’末端標準基質及び４０ｎＭ非標識リボザイムを変性し、２分間で９０℃まで加熱して別々に再生し、氷上１０〜１５分間急冷する。リボザイム及び基質を、３７℃で１０分間、５０ｍＭトリス塩酸及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液で別々に保温する。リボザイムと基質溶液を混合し、３７℃で保温することにより反応を開始する。一定の時間間隔で５μＬの部分標本を取り、反応は等量の２Ｘホルムアミド停止液と混合して抑止する。各標本は、２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。結果を定量化し、標的ＲＮＡの切断比率を時間に対してプロットする。
図２５を参照すると、１つ又はそれ以上の部位でＬ−ヌクレオチド置換したハンマーヘッド・リボザイムはいずれも標的ＲＮＡを切断する触媒活性を有していた。
上記及び本仕様に記載されたリボザイム、標的配列、リボザイムモチーフ及びＬ−ヌクレオチド置換位置の配列は非限定的な例であることを意味し、当業者は、他の核酸触媒モチーフ、標的配列及びＬ−ヌクレオチド置換（塩基、糖及びリン酸修飾）が標準的な技術を用いて容易に生成され、本発明の範囲内にあることを認知するだろう。
実施例２１：Ｌ−核酸触媒のインビトロ選択
インビトロ選択（発展）戦略（Ｏｒｇｅｌ、１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）は、ホスホジエステル結合及びアミド結合の切断及び結合のような、種々の反応を触媒することができる核酸触媒を含むＬ−ヌクレオチドを発展させるために利用され得る。記載され概説されてきたインビトロ選択を実行するための多くの異なるアプローチ（Ｊｏｉｃｅ、１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３〜８７；Ｂｅａｕｄｒｙ等、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５〜６４１；Ｊｏｙｃｅ、１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６７，９０〜９７；Ｂｒｅａｋｅｒ等、１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ等、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ、１９９３，ＴＩＢＳ  １７，８９〜９３；Ｋｕｍａｒ等、１９９５，ＦＡＳＥＢＪ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等、１９９６，同上；Ｎｏｌｔｅ等、１９９６，同上；Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、１９９６，同上；Ｂｒｅａｋｅｒ、１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，印刷中）のうち任意の１つ及び他の関連アプローチは、核酸触媒を含むＬ−ヌクレオチドを発展及び／又は選択するために利用され得るものであり、本発明の範囲内にある。
上記の例は非限定的であることを意味し、当業者は、本発明に記載したのと同様な戦略が他のヌクレオシド類似体の合成に容易に適用でき、本発明の範囲内にあることを認知するだろう。
応用例
構造式Ｉ〜Ｖの化合物、２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ−メチルヌクレオシドを用いて、オリゴヌクレオチドフラグメントの細胞輸送、ヌクレアーゼ抵抗、細胞移行及び局在化、化合的結合といった目的のために、種々のリガンドをオリゴヌクレオチドに付けることができる。構造式Ｉ〜Ｖの化合物の１つまたはそれ以上をリボザイムに導入するとその効能が増す場合がある。構造式Ｉ〜Ｖの化合物はまた潜在的な抗ウィルス薬として利用され得る。
リボザイム工学
上記に示された技術及び当技術分野で知られている技術（Ｚａｕｇ等、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９；Ｒｕｆｆｎｅｒ等、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，１０６９５；Ｂｅａｕｄｒｙ等、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，６５３４；ＭｃＣａｌｌ等、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５７１０；Ｌｏｎｇ等、１９９４，同上；Ｈｅｎｄｒｙ等、１９９４，ＢＢＡ  １２１９，４０５；Ｂｅｎｓｅｌｅｒ等、１９９３，ＪＡＣＳ，１１５，８４８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４４０１；Ｍｉｃｈｅｌｓ等、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，２９６５；Ｂｅｅｎ等、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，１１８４３；Ｇｕｏ等、１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．，１４，３６８；Ｐａｎ等、１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，９５６１；Ｃｅｃｈ、１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，２，６０５；Ｓｕｇｉｙａｍａ等、１９９６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３９２，２１５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、１９９４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４，１７１５；すべてここにそのまま援用する）を用いて、別個の標的ＲＮＡ又はＤＮＡをトランスで切断し得るように、配列、化学及び構造の異なる核酸触媒を工学処理することができる。
診断薬的な使用
本発明のリボザイムは病的な細胞内部の遺伝的浮動及び突然変異を検査する又は細胞内の特定ＲＮＡの存在を検出するための診断ツールとして利用することができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との緊密な関連性によって、分子の任意の領域にある、標的ＲＮＡの塩基対合及び三次元構造を変える突然変異が検出できる。本発明に記載した多くのリボザイムを使用することによって、インビトロばかりでなく細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能にとって重要なヌクレオチド変化を位置付けられる可能性がある。リボザイムを用いた標的ＲＮＡの切断は遺伝子発現を阻害し、特定の遺伝子産物の疾患進展における役割を（本質的に）明確化するのに役立つかもしれない。このようにすれば、他の遺伝的標的物が疾患の重要な仲介物として明確化されるかもしれない。このような実験は、複合的な治療法（例、種々の遺伝子を標的にした複数のリボザイム、既知の低分子阻害剤と組み合わせたリボザイム又はリボザイム及び／又は他の化学的又は生物学的分子を複合させた間欠的な治療）の可能性を供することによって、疾患進展に対するより良い治療につながるだろう。本発明のリボザイムの他のインビトロ使用は当技術分野でよく知られていて、関連する病態の原因となるｍＲＮＡの存在を検出することを含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法を用いてリボザイムで処置した後の切断産物の存在を決定することによって、検出される。
ある特定の例では、標的ＲＮＡの野生型又は突然変異型のいずれかのみを切断し得るリボザイムがアッセイに使われる。第一のリボザイムがサンプルに存在する野生型ＲＮＡを同定するのに用いられると、第二のリボザイムはサンプルの突然変異型ＲＮＡを同定するのに用いられる。反応対照（コントロール）として野生型ＲＮＡ及び突然変異型ＲＮＡの合成基質を２つのリボザイムによって切断し、反応におけるリボザイムの相対的な効率性と「非標的」ＲＮＡ種を切断しないことを実証する。合成基質由来の切断産物はまたサンプル集団における野生型及び突然変異型ＲＮＡの分析のサイズマーカーとして役立つ。従って、各分析は、２つのリボザイム、２つの基質及び１つの未知サンプルを必要とし、これらを６つの反応に組み合わせる。切断産物の存在は、各ＲＮＡの全長又は切断フラグメントが１レーンのポリアクリルアミドゲルで分析される、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて決定される。突然変異ＲＮＡの発現、及び標的細胞における所望の表現型変化が起こる推定リスクを洞察するためには、必ずしも結果を定量化する必要はない。この表現型の発生に意義がある蛋白質産物のｍＲＮＡが発現していれば、リスクを立証するに十分である。比較可能な非活性を有するプローブを両方の転写産物に用いれば、ＲＮＡレベルの定性的な比較に十分であり、初診のコストを減らすことになろう。野生型に対する突然変異型の比率が高いことは、ＲＮＡレベルを定性的又は定量的に比較しても、よりリスクが高いことに関連するのである。
表１
天然に存在するリボザイムの特徴
グループＩイントロン
・サイズ：約１５０〜１０００余りのヌクレオチド。
・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５’グアノシンを有する切断産物を生成する。
・活性構造のフォルディング及び維持を助けるために、ある場合には、蛋白質の補因子がさらに必要とされる［１］。
・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、葉緑体、ファージＴ４、らん藻類、その他において、介在配列として見出されている。
・主要な構造上の特徴は、系統発生比率、突然変異原性及び生化学的研究によってほぼ確立されている［２，３］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［４，５，６，７］。
・リボザイムのフォルディング及び基質ドッキングに関する研究が進行中［８，９，１０］。
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１１，１２］。
・このリボザイムは、結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ために標的ＲＮＡ切断に対して非特異的になる場合があるが、テトラヒメナのグループＩイントロンは、「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新しいβ−ガラクシダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されている［１３］。
ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＭＩＲＮＡ）
・サイズ：約２９０〜４００ヌクレオチド。
・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。
・ｔＲＮＡ前駆体を切断し、成熟ｔＲＮＡを形成する［１４］。
・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５’リン酸を有する切断産物を生成する。
・ＲＮａｓｅＰは原核生物及び真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブユニットは、細菌、酵母、げっ歯類及び霊長類から配列決定されている。
・内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することは、外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって可能である［１５，１６］。
・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１７，１８］。
グループＩＩイントロン
・サイズ：１０００余りのヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１９，２０］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ、及び３’−５’及び２’−５’分岐点（ｂｒａｎｃｈ  ｐｏｉｎｔ）を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。
・ＲＮＡの切断及び結合だけでなくＤＮＡ切断との関わりが実証された［２１，２２］唯一の天然リボザイム。
・主要な構造上の特徴は、系統発生比較によってほぼ確立されている［２３］。
・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２４］。
・力学的フレームワークは検討中である［２５］。
ニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡ
・サイズ：約１４４ヌクレオチド。
・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２６］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていない。
・このクラスは１種しか知られていない。ニューロスポラ属ＶＳ  ＲＮＡに見出されている。
ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと）
・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。
・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。
・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する植物病原体（ウィルソイド：ｖｉｒｕｓｏｉｄｓ）に見出されている。
・２つの結晶構造を含め、本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。
・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性が実証された。
・２つ又はそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている。
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。
ヘアピン・リボザイム
・サイズ：約５０ヌクレオチド。
・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと、切断部位の３’側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルス及びチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。
・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［２７，２８，２９，３０］。
・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはインビトロ選択による工学処理が可能である［３１］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３２］。
・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３３，３４］。
デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム
・サイズ：約６０ヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３５］。
・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていないが、切断部位の５’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を含む［３６］。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。
・環状のＨＤＶは活性があり、ヌクレアーゼ安定性が増加している［３７］。
0003903392.tif 000010
0003903392.tif 000011
0003903392.tif 000012
0003903392.tif 000013
0003903392.tif 000014
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
0003903392.tif 000017
【図２】
0003903392.tif 000018
【図３】
0003903392.tif 000019
【図４】
0003903392.tif 000020
【図５】
0003903392.tif 000021
【図６】
0003903392.tif 000022
【図７】
0003903392.tif 000023
【図８Ａ】
0003903392.tif 000024
【図８Ｂ】
0003903392.tif 000025
【図９】
0003903392.tif 000026
【図１０】
0003903392.tif 000027
【図１１】
0003903392.tif 000028
【図１２】
0003903392.tif 000029
【図１３】
0003903392.tif 000030
【図１４】
0003903392.tif 000031
【図１５】
0003903392.tif 000032
【図１６】
0003903392.tif 000033
【図１７】
0003903392.tif 000034
【図１８】
0003903392.tif 000035
【図１９Ａ】
0003903392.tif 000036
【図１９Ｂ】
0003903392.tif 000037
【図２０】
0003903392.tif 000038
【図２１】
0003903392.tif 000039
【図２２】
0003903392.tif 000040
【図２３Ａ】
0003903392.tif 000041
【図２３Ｂ】
0003903392.tif 000042
【図２４】
0003903392.tif 000043
【図２５】
0003903392.tif 000044