(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性部位を同定すべきＲＮＡの解析対象塩基配列及び該ＲＮＡの２次構造を数値化した数値列を記憶するとともに、該解析対象塩基配列に対して人為的に生成可能なすべての変異塩基配列からなる集合及びそれら変異塩基配列にかかるＲＮＡの２次構造を数値化した数値列からなる集合を独立に検索可能に記憶するメモリユニット、制御ユニット、同定された機能性部位の変異塩基の位置ｉ及び機能性部位を同定すべきＲＮＡと変異塩基配列にかかるＲＮＡとの２次構造における違いＣ（ｉ）を表示する表示ユニットを少なくとも含む、ＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステムであって、
ａ）  前記メモリユニットから読み出された解析対象塩基配列に対して、構成する各塩基をもとの塩基とは異なる３とおりの塩基に順に置換した単塩基多型の変異塩基配列を人為的に生成する手段、
ｂ）  前記メモリユニットから前記解析対象塩基配列並びに前記変異塩基配列を読み出し、該解析対象塩基配列又は該変異塩基配列を有する各ＲＮＡの２次構造を予測する機能モジュールと、予測された各２次構造をループ構造とステム構造からなる木構造として表現し、該木構造におけるノード及びのランクに基づいて一意的に数値列に変換する機能モジュールとを用いて、該解析対象塩基配列又は該変異塩基配列を有するＲＮＡの２次構造を数値化する手段、
ｃ）  ｂ）で得られた解析対象塩基配列にかかる数値列（Sa(n)）と各変異塩基配列にかかる数値列（Sb(m)）を順次比較して、相同部分を一致させるように整列させ、以下の式を用いて、一致しない部分の距離をノードのランクの差をとることにより算出して２次構造の違いを数値の違いとしてそれぞれ取得する、構造間距離(d(n,m))を算出する手段、
（式２）
d(n,m)＝
min｛d(n-1,m-1)＋Costs(n,m),d(n,m-1)＋Costs(0),d(n-1,m)＋Costs(0)｝
但し、上記式２中、
（式１）
Costs(n,m)＝｜Sa(n)−Sb(m)|
Costs(0)=1
である。
ｄ）  ｃ）において前記２次構造の違いとして取得された構造間距離(d(n,m))をもって定義される、前記解析対象塩基配列のＲＮＡと前記各変異塩基配列のＲＮＡの間の２次構造の違いＣ（ｉ）（但し、変数ｉは、前記変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを表す。）が、該２次構造の違いＣ（ｉ）の平均値Ｃａより標準偏差σ以上大きい場合に、該変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であるとして同定する手段、および
ｅ）  ｄ）において同定された機能性部位の塩基の位置ｉ及び２次構造の違いＣ（ｉ）を表示ユニットに出力する手段、
前記制御ユニットは、前記ａ）〜ｅ）の各手段を含むものであることを特徴とする、ＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステム。
【請求項２】
前記ｄ）における数値の違いＣ（ｉ）が、Ｃ（ｉ）の平均値Ｃａより標準偏差１．６５σ以上大きい場合に、該変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であるとして同定する手段であることを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＲＮＡの機能性部位を同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡはリボヌクレオチドが連結した鎖状分子である。生体内において、リボヌクレオチドを構成する塩基には、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｃ（シトシン）および、Ｇ（グアニン）の４種類が存在する。生体内におけるＲＮＡは、主に蛋白質合成において次のような重要な役割を果たしている。
mＲＮＡ：蛋白質合成において、ゲノムの塩基配列情報に基づいて蛋白質を構成するアミノ酸配列を指示する(messenger RNA;mRNA)
tＲＮＡ：蛋白質合成において、蛋白質を構成するアミノ酸をｍＲＮＡの遺伝暗号にしたがって運ぶ(transfer RNA;tRNA)
【０００３】
蛋白質合成において、ＲＮＡの塩基配列情報が単にアミノ酸配列をコードするのみならず、ＲＮＡ自身が高次構造を形成することで複雑な機能を持つことが知られている。ＲＮＡが有する、アミノ酸配列をコードする機能以外の機能に必要な領域を機能性部位(functional region)と言う。たとえば翻訳開始領域のｍＲＮＡの二次構造が、蛋白質への翻訳過程を制御する要因となっていることが指摘されている。このような機能は、アミノ酸配列をコードするための遺伝暗号とは異なる機能である。
【０００４】
また、特定の構造を有するＲＮＡは、塩基配列を認識して切断する酵素のような作用を有する。このような作用を有するＲＮＡは、リボザイムと呼ばれている。スプライシングにおいてリボザイムが果たす役割も重要視されている。真核細胞においては、ゲノムの塩基配列が転写された後に、遺伝子を構成するエキソンが選択的に連結されて成熟ｍＲＮＡを生成する。この過程をスプライシングと呼ぶ。リボザイムを構成するＲＮＡの立体構造、そしてリボザイムによって切断されるＲＮＡの立体構造のいずれもが、スプライシングに影響を与える重要な要因となる。このような機能も、アミノ酸配列をコードする遺伝暗号とは異なる機能である。
【０００５】
塩基配列のデータから、それがＲＮＡの段階でどのような機能を持ち得るかを同定することは、医学、薬学的な研究を進める上で重要である。ＲＮＡの機能性部位を予測する従来の技術として、対象の塩基配列に対応する複数の系統に渡る塩基配列を集めて比較するという方法がある。たとえば以下に示すように塩基配列を整列(alignment)させ、比較することで、共通する塩基部位を抽出する。以下の例では、大文字で示した配列が、４つの種の間で保存された配列として抽出される。
種１  ...auuGCCggAUA...
種２  ...acgGCCauAUA...
種３  ...ucuGCCguAUA...
種４  ...uucGCCuaAUA...
【０００６】
抽出された塩基配列を含む部位は、進化的に保存されている部位であるため、これらの部位は機能性部位である可能性が高いと考えられる。アミノ酸配列においてはコドンの縮重があるため、塩基配列が相違していても翻訳アミノ酸配列が保存されている可能性がある。一方アミノ酸配列とは無関係に、ＲＮＡの塩基配列において保存性の高い領域は、ＲＮＡの機能性部位として重要である可能性が高い。
この方法は、多数の種に渡った多くのＲＮＡ塩基配列情報の集積を必要とする。したがってそれらの配列を得るための生物実験には多大な時間と労力が必要となる。
【０００７】
単なる塩基配列の比較ではなく、塩基配列情報に基づいてＲＮＡの高次構造を予測することによってＲＮＡの機能性部位を見出すことが試みられている。たとえばZuckerは、塩基配列情報に基づいて、ＲＮＡの立体構造を予測するためのアルゴリズムを確立した(M. Zucker & P. Stiegler Nucleic Acids Research 9, 133-148, 1981)。
【０００８】
またShapiroは、ＲＮＡをステムとループから構成された木構造として表現し、二つの木構造の違いを数値的な差で表した。 (Shapiro, B.A. and Zhang, K., Comparing multiple RNA secondary structures using tree comparisons, CABIOS, 6(4), 309-318, 1990.)。更にHofackerらは、ＲＮＡの二次構造間の距離をグラフの差に基づいて評価する手法を用いた(Automatic detection of conserved RNA structure elements in complete RNA virus genomes. Nucleic Acids Res. Aug 15;26(16):3825-36, 1998.)。
【０００９】
このような手法を用いてＲＮＡの立体構造を比較すれば、単なる塩基配列の比較に基づく解析方法に比べて、より特異的に機能性部位を推定できるはずである。しかし立体構造を比較するためには、やはり実際に塩基配列情報を得なければならない。公知のＲＮＡの機能性部位の推定方法は、あくまでも実際に存在する塩基配列間の比較によって共通構造を見出し、それを機能性部位として同定するための方法であった。つまり、機能性部位の推定のためにＲＮＡ塩基配列情報の集積を必要とする点においては、塩基配列を比較する方法と同じ課題を有している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＲＮＡの塩基配列情報の集積を必要としない、ＲＮＡの機能性部位を同定するための新規な方法の提供を課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＲＮＡの有する機能と高次構造の関連に着目した。ＲＮＡは、塩基間の相補的結合に基づいて、特徴的な高次構造を形成することが知られている。そしてＲＮＡの機能は、そのＲＮＡが形成する高次構造によって維持されていると考えられる。
このような事実に基づいて、本発明者らは、解析対象の塩基配列に対して変異を与え、得られた変異塩基配列における高次構造の変化の度合いを指標として、変異を与えた部位の機能的重要性を予測することができるのできると考えた。そして、このような理論に基づいて予測されたＲＮＡの機能性部位が、既知の方法によって確認された機能性部位と一致することを確認して本発明を完成した。
【００１２】
更に本発明者らは、この解析方法を一塩基置換によってもたらされる変異がＲＮＡの機能性部位に与える影響の評価に応用できることを見出した。より具体的には、突然変異を一塩基の置換に限定し、その時の高次構造が変化する度合いを測ることで、ある１つの塩基がＲＮＡの構造と機能に及ぼす影響を知ることができる。このような解析に基づいて、単塩基置換を評価することも可能となる。
【００１３】
すなわち本発明は、以下のＲＮＡ機能性部位を同定するための方法、コンピュータープログラム、並びにそのための装置に関する。あるいは本発明は、本発明によるＲＮＡ機能性部位を同定するための方法を応用した、ＲＮＡの機能に影響を与える単塩基多型の同定方法に関する。
【００１４】
本発明［１］は、
機能性部位を同定すべきＲＮＡの解析対象塩基配列及び該ＲＮＡの２次構造を数値化した数値列を記憶するとともに、該解析対象塩基配列に対して人為的に生成可能なすべての変異塩基配列からなる集合及びそれら変異塩基配列にかかるＲＮＡの２次構造を数値化した数値列からなる集合を独立に検索可能に記憶するメモリユニット、制御ユニット、同定された機能性部位の変異塩基の位置ｉ及び機能性部位を同定すべきＲＮＡと変異塩基配列にかかるＲＮＡとの２次構造における違いＣ（ｉ）を表示する表示ユニットを少なくとも含む、ＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステムであって、
ａ）  前記メモリユニットから読み出された解析対象塩基配列に対して、構成する各塩基をもとの塩基とは異なる３とおりの塩基に順に置換した単塩基多型の変異塩基配列を人為的に生成する手段、
ｂ）  前記メモリユニットから前記解析対象塩基配列並びに前記変異塩基配列を読み出し、該解析対象塩基配列又は該変異塩基配列を有する各ＲＮＡの２次構造を予測する機能モジュールと、予測された各２次構造をループ構造とステム構造からなる木構造として表現し、該木構造におけるノード及びのランクに基づいて一意的に数値列に変換する機能モジュールとを用いて、該解析対象塩基配列又は該変異塩基配列を有するＲＮＡの２次構造を数値化する手段、
ｃ）  ｂ）で得られた解析対象塩基配列にかかる数値列（Sa(n)）と各変異塩基配列にかかる数値列（Sb(m)）を順次比較して、相同部分を一致させるように整列させ、以下の式を用いて、一致しない部分の距離をノードのランクの差をとることにより算出して２次構造の違いを数値の違いとしてそれぞれ取得する、構造間距離(d(n,m))を算出する手段、
（式２）
d(n,m)＝
min｛d(n-1,m-1)＋Costs(n,m),d(n,m-1)＋Costs(0),d(n-1,m)＋Costs(0)｝
但し、上記式２中、
（式１）
Costs(n,m)＝｜Sa(n)−Sb(m)|
Costs(0)=1
である。
ｄ）  ｃ）において前記２次構造の違いとして取得された構造間距離(d(n,m))をもって定義される、前記解析対象塩基配列のＲＮＡと前記各変異塩基配列のＲＮＡの間の２次構造の違いＣ（ｉ）（但し、変数ｉは、前記変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを表す。）が、該２次構造の違いＣ（ｉ）の平均値Ｃａより標準偏差σ以上大きい場合に、該変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であるとして同定する手段、および
ｅ）  ｄ）において同定された機能性部位の塩基の位置ｉ及び２次構造の違いＣ（ｉ）を表示ユニットに出力する手段、
前記制御ユニットは、前記ａ）〜ｅ）の各手段を含むものであることを特徴とする、ＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステム。
また、本発明［２］は、
前記ｄ）における数値の違いＣ（ｉ）が、Ｃ（ｉ）の平均値Ｃａより標準偏差１．６５σ以上大きい場合に、該変異塩基配列における変異を有する塩基の位置ｉを、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であるとして同定する手段であることを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステム。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、上記工程ａ）−ｄ）を含むＲＮＡの機能性部位を同定する方法に関する。
本発明において機能性部位(functional region)とは、ＲＮＡが有する、アミノ酸配列をコードする機能以外の機能に必要な領域を言う。たとえば遺伝情報の発現制御機構が、ＲＮＡが作り出す高次構造によって支えられている例が公知である。
【００１６】
具体的には、大腸菌の熱ショック応答がＲＮＡポリメラーゼのσサブユニットの一種であるσ32のmRNAにおける翻訳開始領域の二次構造の安定性によって制御されていることが明らかにされている。この制御機構は、転写されたｍＲＮＡの二次構造がAUG翻訳開始コドンやリボソーム結合部位に影響を与える例である。
【００１７】
さらに、骨格筋や中枢神経系に症状が現れるミトコンドリア病では、多くの場合、ミトコンドリアDNA上のtRNA遺伝子内の特定の位置の塩基置換が原因であると言われている。ＤＮＡの点変異でなぜミトコンドリアの異常が起こるのか、なぜ点変異の種類により臨床症状が変わるのかなどといった問題はほとんど明らかにされていない。点変異がｔＲＮＡの構造変化を引き起こしリボソーム上でのコドン対合能を低下させることが示唆されており、本発明はこのようなＲＮＡの構造変化が直接的な形質の原因となっている例を予測するための有用な手段と成り得る。
【００１８】
また、ｍＲＮＡの高次構造の安定性はタンパク質への翻訳効率と密接に関わっている。したがってｍＲＮＡの塩基配列のどの部分への変異がｍＲＮＡの高次構造の保持にとって重要であるかを本発明によって予測することで、特定の遺伝子の翻訳効率を制御できる可能性がある。例えばＲＮＡウィルスの翻訳の抑制等といった、非常に重要な技術として本発明を応用できる可能性がある。
【００１９】
ＲＮＡの遺伝暗号がＲＮＡの一次構造（すなわち塩基配列）に依存しているのに対して、ＲＮＡの遺伝暗号以外の機能はＲＮＡの高次構造に依存している。したがって、機能性部位は、特定の高次構造の維持に必要な部位と考えることができる。つまり、機能性部位は、ＲＮＡが特定の高次構造を維持するのに必要な塩基配列を含む領域と定義することもできる。
【００２０】
また本発明の機能性部位とは、次のように定義することもできる。ＲＮＡは、ヌクレオシドなどの低分子物質や蛋白質などの高分子物質と特異的に結合し、特定の反応を触媒することなどを通して生体内で重要な役割を果たしていると考えられている。したがってＲＮＡの機能性部位とは、このような役割のために不可欠な構造部位と定義することもできる。機能性部位に障害（変異）を持つＲＮＡは、本来の生体内機能を発揮できないため、何らかの異常の原因となる可能性がある。
【００２１】
上記工程ａ）において、機能性部位を同定すべきＲＮＡは、任意のＲＮＡであることができる。本発明において、機能性部位を同定すべきＲＮＡの塩基配列を、解析対象塩基配列と言う。したがって、たとえば以下に示すような塩基配列情報を、解析対象塩基配列とすることができる。
実際に取得されたｃＤＮＡの塩基配列に基づく塩基配列情報、
ゲノムの解析によって予測された仮想遺伝子を構成する塩基配列情報、
人為的に構築した遺伝子の塩基配列情報、
融合蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報、および
キメラ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報等
【００２２】
塩基配列をＤＮＡに求めるときには、そのまま本発明の解析を進めても良いし、あるいはＲＮＡの塩基配列とした上で解析を進めることもできる。一般にＲＮＡの塩基配列を表現する際には、それに対応するＤＮＡの塩基配列を用いることが多い。本明細書でも、これに従い、ＲＮＡの塩基配列はそれを転写するＤＮＡの塩基配列で表現することがある。塩基配列情報が成熟ＲＮＡに由来するものでありさえすれば、ＲＮＡの塩基配列に変換することにより、本発明の解析対象塩基配列とすることができる。ＤＮＡの塩基配列は、塩基tを塩基uに置換することによりＲＮＡの塩基配列へ変換される。
【００２３】
本発明は、解析対象塩基配列に対して、塩基配列に変異を有する少なくとも１つの変異塩基配列を人為的に生成する工程を含む。本発明において、変異塩基配列とは、解析対象塩基配列に任意の変異を含む塩基配列を言う。本発明における変異を与える方法や、変異の種類は限定されない。より具体的には、解析対象塩基配列に対して、塩基の置換、欠失、挿入、あるいは付加による変異を与えることによって、変異塩基配列を生成することができる。
【００２４】
これらの変異を導入する塩基は、単一であっても良いし複数の塩基を変異の対象とすることもできる。さらに、塩基の置換、欠失、挿入、あるいは付加による変異が、いずれか一つである場合のみならず、複数種の変異が導入された変異塩基配列を生成することもできる。また塩基の置換、挿入、あるいは付加による変異を与える場合には、１〜４種類の塩基の任意の塩基を用いることができる。たとえば置換においては、ある塩基に対して最大で３とおりの置換が考えられる。本発明における変異は、３とおりの置換を全て生成することもできるし、１または２とおりの塩基へ置換することもできる。
【００２５】
特に特定の１塩基を３とおりの塩基に置換することによって生成される３種類の塩基配列は、本発明における望ましい変異塩基配列である。解析対象塩基配列を構成する全ての塩基について、このような変異塩基配列を生成することによって、解析対象塩基配列が変異によって取りうる全ての構造を比較することができる。置換による変異はＲＮＡの長さの変化を伴わない。そのため、各塩基が構造に与える影響を、他の要因の影響の無い条件の元で比較することができる。
【００２６】
本発明において、好ましい変異塩基配列は、より少ない領域に限局された変異を含む塩基配列である。本発明の解析の目的は、ＲＮＡの機能性部位を同定することである。本発明は、変異によってもたらされる立体構造の変化を指標としていることから、変異塩基配列における変異部位は、より限局された領域に配置することが望ましい。変異部位を限局することによって、結果的に、より正確なＲＮＡの機能性部位の同定が期待できる。
【００２７】
たとえば、解析対象塩基配列における１あるいは数個の特定の塩基配列に変異を与えることによって得ることができる、複数の変異塩基配列は、本発明における好ましい変異塩基配列である。変異を与えるための塩基の数は、少なくとも１、たとえば１〜１０、あるいは１〜５、更には１〜２を示すことができる。
【００２８】
本発明において、解析対象塩基配列に変異を与えるための特定の１塩基として、単塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism、以下ＳＮＰｓと省略する）であることが明らかにされている塩基を選択することができる。ＳＮＰｓは、一塩基の挿入、欠失、置換による多型を言う。ヒトゲノムの中で最も出現頻度が高い多型であることから、疾患の診断や治療の研究対象としてＳＮＰｓは注目されている。
なお遺伝学的には、核酸の塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異が、特に多型と呼ばれている。集団とは、地理的な隔離や亜種によって区別される集団を意味する。例えば日本人では１％に満たない変異であっても、他の人種で１％以上の頻度で見出されれば、変異ではなく多型である。
【００２９】
遺伝子領域における塩基配列の変異は、スプライシングの異常やｍＲＮＡの立体構造の変化を等を通じて遺伝子の翻訳異常につながる可能性がある。ＳＮＰｓはヒトのゲノム上で３００〜６００塩基に一つの割合で存在すると推測されている。そして、実際に膨大な数のＳＮＰｓが次々と明らかにされつつある。これらのＳＮＰｓには、それぞれ、ＲＮＡの立体構造の変化に影響を与えるもの、翻訳アミノ酸配列に変化を与えるもの、そして遺伝的な変化に結びつかないものが含まれているはずである。本発明の機能性部位の同定方法を利用すれば、膨大な数のＳＮＰｓの中から、ＲＮＡの機能性部位に影響を与える可能性があるＳＮＰｓを容易に同定することができる。したがって、本発明における変異を与える塩基として、ＳＮＰｓであることが明らかにされた塩基は、望ましい塩基の一つである。
【００３０】
次いで、解析対象塩基配列と、それに基づいて生成された変異塩基配列のそれぞれについて、各塩基配列を有するＲＮＡの高次構造を予測し、数値化する。高次構造は、二次構造以上の高次構造を含む。一般に二次構造は、ＲＮＡを構成する塩基配列において、相補的な塩基対間での結合によって形成されるステムとループから成る平面内に配置可能な構造を言う。一方、三次構造は、ＲＮＡの二次構造の各部位が空間内で相互作用することで形成される立体構造のことを言う。三次構造は、二次構造に依存している。ただし三次構造の変化の原因の全てを、二次構造の変化のみで説明することはできない。しかし、二次構造の変化は、多くの場合三次構造の変化を伴う。したがって、二次構造の変化を予測することは、三次構造の変化を予測することに他ならない。
【００３１】
ＲＮＡの塩基配列に基づいて立体構造を予測する方法は公知である。たとえば、Zuckerの二次構造予測プログラムは、与えられた塩基配列とエネルギーパラメータに基づいて、エネルギーを最小にするようなＲＮＡの二次構造を総当り的に発見するアルゴリズムを利用している。
【００３２】
またShapiroの方法では、ＲＮＡをステムとループから構成された木構造として表現し、さらに、塩基対の長さを考慮している。彼らは、これらの構造間の距離として、独自に、Tree Edit Operationと呼ばれる操作を定義し、二つの木構造の間を入れ替えることができる最小のTree Edit Operationのステップ数を構造間の距離として定義した (Shapiro, B.A. and Zhang, K., Comparing multiple RNA secondary structures using tree comparisons, CABIOS, 6(4), 309-318, 1990.)。
更にHofackerらは、ＲＮＡの二次構造の各塩基を、それを囲んでいる塩基対の数で評価して、全体の構造をMountain Plotと呼ばれる二次元グラフで表し、構造間の距離をそれらのグラフの差で評価する手法を用いた(Automatic detection of conserved RNA structure elements in complete RNA virus genomes. Nucleic Acids Res. Aug 15;26(16):3825-36, 1998.)。
【００３３】
ＲＮＡの二次構造を予測するアルゴリズムとして、Zuckerの手法の他に、Vienna RNA packageの手法も公知である(Hofacker et. al., Monatsh. Chem. 125: 167-188 1994.)。この手法は、Zuckerと同様に、ダイナミックプログラミングの手法を用いている。そして塩基対間で結合が生じる確率を考慮することで、予測精度の向上を図った。
これらの二次構造の予測アルゴリズムは、数百塩基程度の短いＲＮＡ分子であれば、高い信頼度でその二次構造を予測することができる。また予測に必要な計算時間は、通常、数秒程度に過ぎないので、本発明に利用することができる。
【００３４】
更に、ＲＮＡの三次構造の計算を目的とするソフトウエアも公知である。たとえばInsightやAmberといった三次構造の計算用のソフトウェアは、分子動力学法(MD)を用いて三次元構造を計算するためのソフトウエアである(Pearlman et. al., AMBER 4.0, University of California, San Francisco. 1991.)。MDは、多体系の運動方程式を差分法によって数値的に解く手法である。これらのソフトウエアを用いた三次構造の解析は、まず、X線結晶解析やNMR等の実験的手法により、目的の物質の初期構造としての立体構造を測定し、そこに原子や分子を追加しつつMDを用いて計算するという工程を含む。
これらの三次構造の予測手法を本発明に応用する場合、対象のＲＮＡを結晶化させ、NMRなどでその三次構造を実験的に確認しておく必要がある。これが可能であれば、突然変異を入れた場合の三次構造を計算機で計算し、その構造の変化を数値化することで、二次構造の予測方法と同様に本発明の方法に利用することができる。
【００３５】
本発明において予測された高次構造は数値化され、比較される。たとえば上記のような方法によって、高次構造を数値として比較することができる。より具体的には、実施例に示したような、ＲＮＡの二次構造を構成する木構造に着目した比較解析方法は、本発明における高次構造の数値化および比較のための方法として好ましい。この方法は、木構造として表現した二次構造を配列に変換しそれらを整列させ比較することで二次構造間の距離を計算するアルゴリズムに基づいている。
【００３６】
上記工程ｂ）で得られた数値を比較して、高次構造の違いを数値の違いとして取得することができる（工程ｃ）。更に工程ｃ）において取得される前記数値に有意な差が見られた場合に、変異塩基配列における変異を有する個所を、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であると同定することができる（工程ｄ）。
【００３７】
本発明において、変異を加えた時に解析対象塩基配列の構造から変化する程度が有意な差を越えた場合、変異を与えた部位が機能性部位であると判断される。本発明において、有意性は、たとえば次のようにして判断される。
まず、解析対象塩基配列に変異を与えることによって生じる構造間の距離の分布が正規分布であると考える。そしてその平均および標準偏差に基づいて、有意差を検定することにより、有意な差を与える変異個所を見出すことができる。このようにして有意な差の原因となる変異を同定する工程を、実施例に示した。実施例においては、有意水準３０％、あるいは１０％で有意差があると判断した。本発明においては、構造の違いを数値として表現しているため、各塩基の変異によってもたらされる構造の相違を定量的に比較することができる。
【００３８】
機能性部位におけるＳＮＰｓは、なんらかの機能異常の原因となることが予測される。ＲＮＡにおける、機能異常の原因となる変異には、進化的に許容されない変異も含まれる。進化的に許容されない変異は、多くの場合致死的な異常の原因となる可能性もある。したがって、ＲＮＡにおける機能性部位を見出すことは、生理機能に与える影響に基づいてＳＮＰｓを分類する上で重要な情報を与える。逆に有意な差を越えないような部位におけるＳＮＰｓは、有害な表現型の原因とならないと予測される。
【００３９】
本発明は、上記ＲＮＡの機能性部位の同定方法を実施するためのプログラムを提供する。本発明のプログラムは、次の工程をコンピュータに実行させるためのソースコードで構成される。本発明のプログラムは、このプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録手段に格納することができる。
ａ）機能性部位を同定すべきＲＮＡの解析対象塩基配列に対して、塩基配列に変異を有する少なくとも１つの変異塩基配列を人為的に生成する工程、
ｂ）解析対象塩基配列を有するＲＮＡの高次構造と、変異塩基配列を有するＲＮＡの高次構造を数値化する工程、
ｃ）ｂ）で得られた数値を比較して、高次構造の違いを数値の違いとして取得する工程、および
ｄ）ｃ）において前記数値に有意な差が見られた場合に、変異塩基配列における変異を有する個所を、解析対象塩基配列の機能性部位の一部であると同定する工程
【００４０】
本発明において、工程ａ）では、解析対象塩基配列として入力された塩基配列をもとに、変異塩基配列を生成する。変異塩基配列については、既に述べたとおりである。たとえば、解析対象塩基配列として入力された全ての塩基について、もとの塩基とは異なる３種類の塩基に置換した塩基を有する塩基配列を変異塩基配列として生成する。このような変異塩基配列を生成するためのプログラムを実施例に示した。
【００４１】
図３に、実施例に用いた一塩基置換を付加する場合の変異配列作成プログラムの流れ図を示す。このプログラムでは、塩基配列の全塩基に対してＳＮＰｓを想定し、各塩基に対して、その塩基を他の三通りの塩基に置換した配列を作成し、メモリに格納する。
【００４２】
本発明において、上記工程ｂ）や工程ｃ）には、既に述べたような公知のアルゴリズムを応用することができる。これらのアルゴリズムに基づいて、コンピュータ上で実際に塩基配列を解析するためのプログラムも公知である(M. Zucker & P. Stiegler Nucleic Acids Research 9, 133-148, 1981)。なお、ＲＮＡの高次構造計算プログラムは多くのものが知られているが、本発明では、任意の高次構造計算プログラムを適用することができる。用いる高次構造計算プログラムに応じて、高次構造の構造の類似度を数値化するために適当な距離関数の定義を行う。
【００４３】
加えて本発明は、前記ＲＮＡの機能性部位を同定するための方法を実現するためのシステムを提供する。すなわち本発明は、以下の手段を含む、ＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステムに関する。
ａ）機能性部位を同定すべきＲＮＡの解析対象塩基配列に対して、塩基配列に変異を有する少なくとも１つの変異塩基配列を人為的に生成する手段、
ｂ）解析対象塩基配列を有するＲＮＡの高次構造と、変異塩基配列を有するＲＮＡの高次構造を数値化する手段、
ｃ）ｂ）で得られた数値を比較して、高次構造の違いを数値の違いとして取得する手段、および
ｄ）ｃ）において前記数値に有意な差が見られた場合に、変異塩基配列における変異を有する個所を、解析対象塩基配列の機能性部位の一部として同定する手段
【００４４】
本発明によるＲＮＡの機能性部位を同定するためのシステムは、たとえば前記本発明のプログラムをコンピュータに実行させることにより、実現することができる。たとえば手段ａ）は、上記プログラムを実行したコンピュータに、本発明における解析対象塩基配列を入力する手段、与えられた解析対象塩基配列にプログラムにしたがって変異を与えて変異塩基配列を生成するための手段、そして生成された変異塩基配列を格納する手段とで構成される。
【００４５】
解析対象塩基配列は、通常、キーボードや各種の記録媒体から本発明のシステムに読みこむことができる。あるいは、ネットワークを介して他のコンピュータや、ネットワーク上の情報格納デバイスから読み込むこともできる。更には、シーケンサが生成する塩基配列情報を、解析対象塩基配列として本発明のシステムに直接読みこませることもできる。
【００４６】
読みこんだ塩基配列がＤＮＡの情報である場合には、自動的にＲＮＡの塩基配列情報に変換させることもできる。塩基配列がＤＮＡであることは、塩基tの存在を検知することにより確認することができる。たとえばZuckerの構造計算プログラムは、ＤＮＡの塩基配列をＲＮＡの塩基配列に変換した上で構造計算の対象とするステップを装備している。しかし、この後に行う高次構造の解析結果に影響を与えることが無ければ、必ずしもＲＮＡの塩基配列情報に変換する必要は無い。
【００４７】
本発明のためのプログラムが動作するコンピュータの制御ユニットは、与えられた解析対象塩基配列にプログラムにしたがって変異を与えて変異塩基配列を生成する。変異を与える方法は、パラメーターとして任意に設定することができる。たとえば実施例においては、解析対象塩基配列を構成する全ての塩基に対して変異を与えている。この他、たとえば解析対象塩基配列における特定のＳＮＰｓが機能性部位に与える影響を評価するために、特定の塩基に対してのみ変異を与えるように、プログラムを修正することもできる。制御ユニットによって生成された変異塩基配列は、メモリユニットに格納される。
【００４８】
本発明のシステムにおいて、手段ｂ）解析対象塩基配列を有するＲＮＡの高次構造と、変異塩基配列を有するＲＮＡの高次構造を数値化する手段は、たとえば次のような手段によって構成することができる。本発明のプログラムが動作するコンピュータの制御ユニットは、前記手段ａ）が生成した塩基配列情報をメモリユニットから読み出し、プログラムとして与えられたアルゴリズムに基づいて、高次構造を予測し、数値化するための手段として機能する。その結果生成された数値は、メモリユニットに格納される。
【００４９】
更に本発明のシステムにおいて、手段ｃ）：手段ｂ）で得られた数値を比較して、高次構造の違いを数値の違いとして取得する手段は、たとえば次のような手段によって構成することができる。本発明のプログラムが動作するコンピュータの制御ユニットは、メモリユニットに格納された高次構造に対応する数値を順次読み出して、解析対象塩基配列に基づいて生成された数値と比較する手段として機能する。比較の結果は、メモリユニットに数値として格納される。
【００５０】
そして本発明のシステムにおいて、手段ｄ）：手段ｃ）において前記数値に有意な差が見られた場合に、変異塩基配列における変異を有する個所を、解析対象塩基配列の機能性部位の一部として同定する手段は、たとえば次のような手段によって構成することができる。本発明のプログラムが動作するコンピュータの制御ユニットは、メモリユニットに格納された比較結果の数値を順次読み出して、プログラムとして与えられた判断基準と比較し、有意な差が見出されたかどうかを判定する手段として機能する。判定の結果、有意差ありと判定された組み合せを構成する変異塩基配列における変異部位は、解析対象塩基配列を有するＲＮＡにおいて、機能性部位であると同定される。
【００５１】
本発明のシステムは、判定結果に基づいて、以下のような情報を出力することができる。
１． 解析対象塩基配列において、機能性部位として同定された塩基、およびその有意水準。（表１）
２． 解析対象塩基配列において、高次構造への影響が少ないと推定される塩基、およびその有意水準。
３． 解析対象塩基配列を構成する各塩基に変異を与えた場合の高次構造の変化レベル。（たとえば図７。これらの情報は、表形式の数値データとしても、またグラフとしても出力することができる。）
４． 解析対象塩基配列と、各塩基に変異を有する変異塩基配列によって構成される高次構造そのもの（たとえば図６や図１０など）。例えば、Zuckerのアルゴリズムを用いる場合は二次構造が、またInsightを用いる場合は三次構造が得られる。
５． 解析対象塩基配列と、各塩基に変異を有する変異塩基配列によって構成される高次構造を数値化する工程で得られる高次構造の表現形式（たとえば図６や図１０など）。例えば、本発明で用いた二次構造を木構造として表現することで数値化する方法の場合、各変異塩基配列が構成する高次構造の木構造表現を出力することができる。この種の情報を参照することで、変異が構造にどのような影響を及ぼしたのかを確認することができる。
【００５２】
これらの情報は、画面への表示、あるいは紙への出力など、任意の形で出力することができる。本発明の解析システムをネットワーク上で運用する場合には、ネットワークを介して異なるコンピュータの画面に結果を出力することもできる。あるいは,出力結果をデータファイルとして異なるコンピュータに伝送することもできる。
【００５３】
図１は本発明のシステムのハードウエア構成であり、図２は本発明の手法の流れ図である。
（１）入力ユニットからＲＮＡ塩基配列が入力される。（ステップ１）
（２）制御ユニットは、ハードディスクの変異配列作成プログラムに基づいて、配列の各塩基に対して突然変異を付加した配列の集合を作成し、メモリに格納する。（ステップ２）
（３）制御ユニットは、任意の高次構造計算プログラムに基づいて、メモリ内に格納された配列の集合の高次構造を計算し、それらを再びメモリに格納する。（ステップ３）
（４）制御ユニットは構造距離計算プログラムに基づいて、高次構造の構造の類似度を数値化するための距離関数を用い、メモリ内に格納された高次構造の集合間の距離を計算する。（ステップ４）
（５）このようにして入力された塩基配列の各塩基に突然変異が与えられた場合に元の高次構造が変化する程度を数値化して算出し、その結果を表示ユニットへ表示する。（ステップ５）
【００５４】
【実施例】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、本明細書において引用された文献は、全て本明細書の一部として組込まれる。
【００５５】
本発明の実施例として、ヒトのU2snRNAの塩基配列を用いて、他の種の塩基配列情報との比較を行うことなく、その機能性部位及びＳＮＰｓの重要度の予測を行った例を示す。U2 snRNAはタンパク質の情報を持たないＲＮＡであり、イントロンのスプライシングにおいて重要な機能を果たしていると考えられている。
配列番号：５に、ヒトのU2snRNAの塩基配列を示した。この配列に対して、まず１２番目の塩基gをaに（配列番号：６）、また１５７番目の塩基gをaに（配列番号：７）人為的に置換した配列を作成した。
これらの３種類の塩基配列からZuckerのアルゴリズムを用いて二次構造を計算した結果を図４に示す。図４から明らかなように、１２番目の塩基の変異（２）は大きく全体の二次構造を変化させているのに対し、１５７番目の塩基の変異（３）はほとんど構造変化を引き起こしていないことが分かる。
以下の実施例では、このような過程を全ての塩基の、全ての塩基置換について実施し、それぞれの場合における構造の変化を数値化し、それに基づいて機能性部位の評価とＳＮＰｓの評価を行う。
【００５６】
図２は、本発明によるＲＮＡ機能性部位予測手法の流れ図である。
ステップ１では、解析対象塩基配列を入力する。ここでは、ヒトのU2snRNAの塩基配列（配列番号：１）を入力として与える。
ステップ２では、突然変異を付加した塩基配列を作製する。この実施例では、付加する突然変異を一塩基置換に限定するものとする。一つの塩基について、３通りの一塩基置換が存在するので、ここでは、図５に示すように、それぞれの塩基を自分自身以外の３通りの塩基に置換したものを全ての塩基について作成する。ここでは、U2snRNAの配列が１８７塩基対から成るので、各塩基を３通りに置換した、計187*3=561種類の塩基配列を作成する。この時用いた変異配列作成プログラムの流れ図を図３に示した。
【００５７】
ステップ３では、作成した全ての塩基配列について高次構造を計算する。本実施例では、高次構造として二次構造を考え、高次構造計算プログラムとしてMichael Zuckerの二次構造予測アルゴリズムを用いた(M. Zucker & P. Stiegler Nucleic Acids Research 9, 133-148, 1981)。Zuckerの二次構造予測プログラムは、与えられた塩基配列とエネルギーパラメータに基づいて、エネルギーを最小にするようなＲＮＡの二次構造を総当り的に発見するものである。
【００５８】
ステップ４では、二次構造の構造間距離計算プログラムとして、図６、および図１０に示すような、木構造として表現した二次構造を配列に変換しそれらを整列させ比較することで二次構造間の距離を計算するアルゴリズムを用いた。ここで、木構造とは、単一ノード、または複数の木構造を左右に順序づけられた子供として持つノードからなる構造として再帰的に定義する。また、木構造のルートノードとは、そのノードを子供とするノードが存在しない木構造の中の唯一のノードを指す。さらに、ノードのランクとは、ノードの直下にある子供ノードの数を指す。木構造の各ノードは、ＲＮＡの二次構造のループ構造に対応し、各ノードを結ぶパスはステム構造に対応する。
木構造は、それに含まれる全てのノードのランクを、ルートノードから、親から子供、左から右の順で、順番に並べた配列によって一意に表すことができる。この配列表現は、ＲＮＡの二次構造の構造的な特徴を数値列として持っており、二次構造間の比較は、この配列間の比較へと帰着される。
【００５９】
配列間の比較は、ダイナミックプログラミングの手法によって行う。
配列Sa(n)とSb(m)の間の距離d(n,m)は、式１のように、二つのノードの間のコストを各ノードのランクの差の絶対値として定義し、一方のノードしかない場合のコストを１と定義した時に、式２のように、コストを最小にするように配列を整列させた時のコストの総和として定義される。
【００６０】
【数１】
（式１）
0003903420.tif 000002
【数２】
（式２）
0003903420.tif 000003
【００６１】
この過程により、二つの木構造の相同な部分が一致するように配列を整列させ、一致しない構造間の距離をノードのランクの差をとることで算出することで、二つの木構造間の距離を算出したことになる。
【００６２】
図７は、本発明で述べた手法をU2snRNAに対して実施した場合に得られる、各塩基位置と、その塩基に変異を与えた場合の構造変化の程度をグラフとして示した図である。本手法の流れ図の図２におけるステップ５の段階で、このグラフに基づいて、機能性部位の予測とＳＮＰｓの評価を行う。これらの評価手法を以下に解説する。
【００６３】
各塩基に人工的に変異を加えた時に元の構造から変化する距離をc(i)で表す。ここで変数iは塩基の位置を表し、U2snRNAの場合は、i=1,2,3…187の値をとる。C(i)≠0であるようなc(i)の値の分布が正規分布に従うと仮定した時、NをC(i)≠0であるような塩基iの総数を表すものとすると、これらの平均値Caと標準偏差σは以下のように定められる。
【数３】
（式３）
0003903420.tif 000004
【００６４】
【数４】
（式４）
0003903420.tif 000005
この時、c(i)が以下のような値をとるような塩基iを構造を大きく変化させる部位、若しくは、構造に影響しない部位であると判断する。
【００６５】
【数５】
（式５）
0003903420.tif 000006
有意水準10%で、塩基iは構造に影響しない
【００６６】
【数６】
（式６）
0003903420.tif 000007
有意水準30%で、塩基iは構造に影響しない
【００６７】
【数７】
（式７）
0003903420.tif 000008
有意水準30%で、塩基iは構造を変化させる
【００６８】
【数８】
（式８）
0003903420.tif 000009
有意水準10%で、塩基iは構造を変化させる
これらのうち、構造を変化させるような塩基の存在する部位を機能性部位と判断し、このような部位におけるＳＮＰｓはＲＮＡの機能を妨げる可能性があると評価する。一方で、構造を変化させない塩基へのＳＮＰｓは、機能に与える影響が低いと評価するものとする。
【００６９】
図７は、c(i)の値をグラフ化したものであり、加えて、平均値Ca及び、これらの判断基準となる値もあわせて記している。図７から、5'端から数えて10から30、50から60、100から110塩基までの部位に変異を与えた場合に構造を変化させてしまうことが読み取れる。図７において、これらの領域に丸を付けて示した。一方、150から180塩基までの部位は変異を与えても比較的構造が変化しないことが分かる。これらの結果は、図４に示した12番目及び157番目の変異の場合における構造変化の結果と合致しており、構造変化の定量的な評価が正しく行われていることが分かる。
【００７０】
あるいはc(i)の値から、変異の有無によって所定の有意差を示した塩基を有意水準ごとに抽出することもできる。表１にこのようにして抽出された塩基の位置情報を示した。
【表１】
0003903420.tif 000010
【００７１】
すなわち、図７のグラフを読み取ることで、10-30、50-60、100-110などの塩基部位への変異(ＳＮＰｓ)の方が、150-180の塩基部位への変異(ＳＮＰｓ)よりも、機能に対する影響が大きく、おそらく致死的である可能性が高いことが予想される。また、同様にして、10-30の塩基部位は、比較的柔軟な構造部位となっているのに対して、150-180の塩基部位は安定でしっかりした構造を形成していることが分かる。
次に、これらの予測結果を、実際のＲＮＡ塩基配列や構造の観測から得られる情報と比較し、予測結果の妥当性を検討する。
【００７２】
図８に、複数種（ショウジョウバエ、線虫、シロイヌナズナ、アフリカツメガエル等25種）の天然のU2snRNAから、塩基配列間での相同性比較により、各塩基部位における種間保存率を計算した結果を示す。保存割合が1に近いほど、その塩基が全ての種において保存されている傾向が強いことを意味している。これを見ると、10-30、50-60、100-110などの塩基部位は非常に保存されている割合が高く、150-180の塩基部位はそれほど保存されていないことが見て取れる。この事実は、図７のグラフから判断される機能性部位への変異の付加は進化的に許容されてこなかったことを示しており、この部位へのＳＮＰｓが致死的になるであろうという本発明による予測結果は妥当であったと考えることができる。
【００７３】
さらに、生物的実験によると（Madhani HD, Guthrie C, Annu. Rev. Genet. 28: 1-26, 1994.）、U2snRNAを構成する四つのヘアピン部位（図４（１）に示す）のうち、ヘアピンIはスプライシング過程の初めの段階ではヘアピン構造を保っているが、後に、ヘアピン構造が大きく開き、U6snRNAとの間で相補的な塩基間の結合を行うことが知られている。この事実は、ヘアピンIに相当する10-30の塩基部位が柔軟な構造を形成しているという本発明による予測結果に合致している。また、他の実験によると、ヘアピンIVにはＲＮＡ結合タンパクが結合することが知られている(Scherly, D. et.al., Nature, 345, 502-506, 1990.).。これは、ヘアピンIVに相当する150-180の塩基部位が比較的安定な構造を形成していることに対応すると考えられ、本発明による予測結果の妥当性を示している。
【００７４】
ところで、ヒトのU2snRNAをコードする遺伝子はDNA上の複数箇所に存在することが知られている。それらのほとんどの配列は相同であるが、一つの遺伝子では、5'端から４７番目に位置する塩基Uが欠けている(Hausner,T.P., Giglio,L.M. and Weiner,A.M., Evidence for base-pairing between mammalian U2 and U6 small nuclear ribonucleoprotein particles, Genes Dev. 4(12A), 2146-2156, 1990.)。
一方で、本手法から得られる図７より、47番目の塩基の構造変化距離はc(47)=0であることが読み取れる。すなわち、本手法から有害ではないであろうと予測されたＳＮＰｓの位置に実際に変異を持ち、なおかつ正常な機能を保持しているＲＮＡが存在していることから、本手法はＳＮＰｓやその他の突然変異の評価にも有用であると考えられる。
【００７５】
次に、ＳＮＰｓが実際の疾患の原因となっていると考えられているヒトのミトコンドリア病について、本手法を適用した実施例を示す。
ミトコンドリア病は高頻度に見られる遺伝病のひとつであり、筋と中枢神経に症状が表れ、さらに痙攣、痴呆などの症状が表れることが多い。その患者はミトコンドリアのtRNA遺伝子に変異をもつ場合が多く、さらに、変異を持つtRNAの種類によって症状が異なることが知られている (Schon EA et.al., J. Bioenerg. Biomembr. 29: 131-149, 1997.)。
【００７６】
本実施例では、リジンのtRNA(tRNA-Lys)を対象とする。tRNA-Lysの塩基配列を、配列番号：８に示した。tRNA-Lysでは、その5'端から19番目に位置する塩基gのaへの変異と、48番目に位置する塩基gのaへの変異がそれぞれミトコンドリア病の患者で同定されている (Verma, A. et.al., Pediatric Research 42(4): 448-454, 1997.)(Tiranti, V. et.al., Neuromuscular Disorders 9(2): 66-71, 1999)。
U2snRNAの場合と全く同様に、図２の過程により計算された、各塩基に変異を与えた場合の構造変化の程度を表すグラフを図９に示す。図９より、ミトコンドリア病の患者で同定された変異の位置における構造の変化距離は、ともに３であり、これらの位置へのＳＮＰｓは安全であるとは言えないと判断される。
このように、実際に疾患を引き起こすようなＳＮＰｓの予測手法としても、本手法が有効であることが確認できた。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、一つの解析対象塩基配列に基づいて、その塩基配列における機能性部位を同定することができる。たとえば種の間で保存された塩基配列を機能性部位として同定する公知の方法では、複数の種の相同遺伝子の塩基配列を明らかにするする必要があった。しかも、機能性部位の同定にあたっては、ある程度塩基配列が相違するものも求められることから、解析に必要な塩基配列情報の集積には困難が伴う。これに対して単一の塩基配列に基づいて、その機能性部位を同定することができる本発明の方法は、はるかに容易に実施することができる。
【００７８】
また本発明は、単塩基置換が機能性部位に与える影響を評価する方法として有用である。ゲノムの構造が明らかにされつつある現在、ＳＮＰｓのＲＮＡの機能性部位に与える影響の予測は、重要な研究課題のひとつである。莫大な情報量となるヒトのＳＮＰｓについて、ＲＮＡの機能性部位に与える影響を評価するには、解析能力に優れた方法が必須である。本発明によれば、他の種の相同遺伝子の情報の有無とは無関係に、特定のＳＮＰｓについて、ＲＮＡの機能性部位に与える影響を、容易に評価することができる。更に本発明による評価結果に基づいて、ＲＮＡの機能に与える影響の大きさにしたがって、ＳＮＰｓを分類することができる。
【００７９】
あるいは、ある遺伝子を構成する全塩基のそれぞれについて塩基を置換し、塩基の置換が高次構造に与える影響を評価することによって、ＲＮＡ上の機能性部位を高い解像度で特定することができる。本発明の解析を通じて明らかにされたＲＮＡの機能性部位に対して、次々と明らかにされてくるＳＮＰｓの情報を重ね合わせることで、機能性部位に影響を与える可能性があるＳＮＰｓを容易に同定することができる。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のハードウエア構成を示す模式図である。
【図２】本発明のＲＮＡ機能性部位予測のフローチャートである。
【図３】本発明で使用する塩基に対する突然変異付加プログラムの一例を示すフローチャートである。
【図４】ヒトのU2 snRNA (1)、および 12番目の塩基をgからaに (2)、157番目の塩基をgからaに (3) それぞれ置換した場合の塩基配列から計算された二次構造を示す図である。ヒトのU2 snＲＮＡのヘアピンI〜IVの位置も示した。
【図５】本発明において、一塩基置換の突然変異を人為的に付加する過程を示す図。
【図６】本発明で使用する高次構造間の距離の算出方法の一実施例を示す模式図である。
【図７】本発明によって、ヒトのU2snＲＮＡの機能性部位を予測した結果を示すグラフである。縦軸は変異によって生じた二次構造の変化の距離、横軸は5'末端を１とする塩基の位置を示す。変異によって有意な差を生じた塩基、および有意な差を生じなかった塩基に対応するプロットを丸で囲んで示した。
【図８】複数種のU2snＲＮＡの塩基配列間での相同性比較を行うことで得られる、各塩基位置における種間での保存割合を示すグラフである。
【図９】本発明をヒトのミトコンドリアのtRNA-Lysに適用した場合に得られる結果を示すグラフである。縦軸は変異によって生じた二次構造の変化の距離、横軸は5'末端を１とする塩基の位置を示す。
【図１０】ヒトのU2 snRNAを構成する塩基のうち、１２番目と１５７番目の塩基に変異を与えた場合に得られる二次構造と、この構造に対応する木構造。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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