(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、胆汁酸又はその塩とを、アルブミンが存在する条件下で接触させ、前記生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの測定方法。
【請求項２】
アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上存在する条件下で実施する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルブミンを試薬として添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
更に、一般式（Ｉ）：
Ａ−（ＣＨ2）ｎ−ＣＨ3                                      （Ｉ）
（式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュークロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で表される化合物、又は一般式（II）：
Ｂ−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ2−ＳＯ3-                    （II）
〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基である〕で表される化合物の少なくとも１種を共存させる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が、血清又は血漿である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物であって、アルブミンと、胆汁酸又はその塩と、前記コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼとを含有することを特徴とする試薬組成物。
【請求項７】
膵臓由来コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、アルブミンと、胆汁酸又はその塩と、緩衝液とを含有する液状の請求項６記載の組成物。
【請求項８】
アルブミン及び緩衝液を含む液状第一試薬と、膵臓由来コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び緩衝液を含む液状第二試薬とからなる請求項６記載の組成物。
【請求項９】
更に、一般式（Ｉ）：
Ａ−（ＣＨ2）ｎ−ＣＨ3                                    （Ｉ）
（式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュークロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で表される化合物、又は一般式（II）：
Ｂ−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ2−ＳＯ3-                    （II）
〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基である〕で表される化合物の少なくとも１種を含有する請求項６又は７記載の組成物
【請求項１０】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物、又は一般式（II）で表される化合物の少なくとも１種を第一試薬及び／又は第二試薬に含有する請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
膵臓由来コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、アルブミンと、胆汁酸又はその塩と、緩衝液とを含有する組成物を含浸して乾燥した試薬領域を含有する、乾式分析要素。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物に関する。
背景技術
血漿又は血清中の各リピドフラクション中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、超低密度リポプロテイン（Ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＶＬＤＬとも称する）、低密度リポプロテイン（Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＬＤＬとも称する）、及び高密度リポプロテイン（Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＨＤＬとも称する）の４種類に分別されている。各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質とに大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、トリグリセリド、及びリン脂質から構成されている。このため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の両者について行われている。
日常的な臨床検査では、自動分析装置を使用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行われているが、リピドフラクションについては、試料の前処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われており、例えば、リンタングステン酸とマグネシウムイオン、デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパリンとカルシウムイオン若しくはマンガンイオン（Ｍ．Ｂｕｒｓｔｅｉｎ及びＨ．Ｒ．Ｓｃｈｏｌｎｉｃｋ，Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，１１，６７，１９７３；並びにＧ．Ｒ．Ｗａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５，５９６，１９７９）、又はポリエチレングリコールを添加してＬＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤としてリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とする。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤＬを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレステロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測定が可能となる。
また、免疫法（Ｃ−Ｃ．Ｈｅｕｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１，２５２，１９８５）においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤＬ含有コレステロールの測定を行うことができる。このように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間とを要するという欠点があった。
最近、これらの分画操作を必要としない測定法について報告が出されている（例えば、特公平６−１６７２０号、特公平７−３４７６０号、又は特開昭５８−１６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられている総コレステロール測定のための酵素法としては、コレステロールエステラーゼによりコレステロールエステルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロールに、コレステロールオキシダーゼを作用させ、溶存酸素を使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応により発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費される溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られていた。
例えば、前記の各特許公報の記載によれば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在がコレステロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界面活性剤が存在しないと活性を発現しないとされている。また、胆汁酸塩については、すでに当該酵素の精製の中で活性発現への関与が明らかとなっている（Ｊ．Ｈｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２４４，１９３７，１９６９；及びＫ．Ｂ．Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６８，５７，１９７５）。そして、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩には、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ、及びＬＤＬのみを溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロールの測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有されるコレステロールと酵素とを反応させることによって、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載されている。すなわち、まずはじめにＨＤＬ以外のリピドフラクションを反応させ、次いで、ＨＤＬフラクションと反応させて両者の差を読み取っている。
また、特公平７−３４７６０号公報には、前記と同様の系において、更に、コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼを使用する方法が記載されている。この方法では、ＬＤＬフラクション中に含有されるコレステロールの遊離がまず行われるので、測定シグナルは、はじめはＬＤＬフラクションのコレステロール含量に比例するが、反応開始から一定時間を経過した後の或る時間内（例えば、反応開始から２分経過後〜１５分経過後までの時間内）での吸光度変化量に限り、ＨＤＬコレステロール濃度に比例する特徴的な反応経過を示す。更に、抗ＬＤＬ抗体を反応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクションに対する特異性を向上させる工夫を行っている。
しかし、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反応時間が２０分以上必要であるなど、製造コストや測定操作上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なものであった。
他方、Ｈ．Ｓｕｇｉｕｃｈｉら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，７１７，１９９５）は自動分析機へ適応した新しい方法について報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾して高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させることで、ＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を形成させることができることが記載されている。この複合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいため、ＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随することになる。
本発明者等は、現在の臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装置による測定が主流である点に鑑み、ＨＤＬコレステロールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用いることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度に測定することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
発明の開示
従って、本発明は、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、胆汁酸又はその塩とを、アルブミンが存在する条件下で接触させ、前記生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの測定方法に関する。
また、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物であって、アルブミンと、胆汁酸又はその塩と、前記コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼとを含有することを特徴とする試薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、被検試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の、コール酸ナトリウム又はアルブミン添加効果を、酵素とＬＤＬとの反応経時変化で示すグラフである。
図２は、本発明による、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度の経時変化を示すグラフである。
図３は、本発明の試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図４は、本発明の試薬組成物とプール血清とを１０分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図５は、本発明と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
図６は、被検試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の、アルブミン添加効果を、酵素とＬＤＬとの反応経時変化で示すグラフである。
図７は、被検試料として血清を使用した場合における、アルブミン添加効果を、吸光度の経時変化で示すグラフである。
図８は、本発明による補助ブロッカー含有試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図９は、アルブミンを含まない補助ブロッカー含有試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図１０は、本発明（補助ブロッカー存在下）と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
図１１は、本発明（乾式測定系）と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明においては、生体試料として、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのまま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を、遠心操作などにより分画処理したり、抗体で処理する必要がない。
本発明においては、前記の生体試料をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応を阻害する化合物、すなわちブロッカーとして、アルブミンを用いる。
本発明において、被検試料が血液（血清又は血漿）由来の場合には、被検試料内に既にアルブミンが含まれている。しかしながら、試料由来のアルブミン濃度が、測定系、すなわち、試薬と試料とを混合させて測定を実施する系において、０．０１重量％以下の場合には、本発明による効果を十分に得ることができない。一方、試料由来のアルブミン濃度が十分に高い場合には、特に人為的に添加する必要はないが、更にアルブミンを添加しても何ら問題はない。
また、被検試料として、アルブミンを含まない精製リピドフラクションや他の生体液試料（例えば、ずい液又は組織抽出液）を用いる場合には、アルブミンを添加して共存させることが必要である。このようにアルブミンを添加する場合のアルブミン濃度は、好ましくは０．０１〜２０重量％、より好ましくは０．０３〜１０重量％である。添加するアルブミンの由来は特に限定されず、例えば、ウシ、ヒト、ヒツジ、ウマ等の哺乳動物由来の他、遺伝子工学的に産生されたものも使用することができる。
本発明において用いることのできるコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、特に限定されず、微生物由来あるいは哺乳動物由来の酵素等を用いることができ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることができる。なお、本発明者の見出したところでは、本発明において化学修飾していない酵素を用いる場合、特に化学修飾していないコレステロールエステラーゼを用いる場合には、その酵素の由来によって反応性が異なる。好ましくは、コレステロールエステラーゼとしては、ウシ又はブタ等の哺乳動物の膵臓由来のものを選択する方が効果的である。また、コレステロールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添加量も特に限定されないが、測定系において、例えば、好ましくは０．０５ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いる場合には、胆汁酸又はその塩を同時に用いるのが好ましい。その濃度は、測定系において、好ましくは０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜１．５ｍＭである。前記胆汁酸又はその塩の種類は、特に限定されることはないが、胆汁酸としては、例えば、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、又はリトコール酸などを挙げることができ、その塩としては、例えば、ナトリウム塩などを挙げることができる。水溶性が高い点で、胆汁酸塩、例えば、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、又はデオキシコール酸ナトリウムを使用することが好ましい。
また、本発明においては、補助ブロッカーとして、好ましくは、一般式（Ｉ）：
Ａ−（ＣＨ2）ｎ−ＣＨ3                                    （Ｉ）
（式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュークロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で表される化合物、又は一般式（II）：
Ｂ−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ2−ＳＯ3-                      （II）
〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基である〕で表される化合物の少なくとも１種を共存させることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ａがグルコシド基又はチオグルコシド基である場合には、ｎは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。グルコシド基は、好ましくはグルコピラノシド基、より好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシド基である。チオグルコシド基も、好ましくはチオグルコピラノシド基、より好ましくはβ−Ｄ−チオグルコピラノシド基である。Ａがグルコシド基である場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＯＤＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＨＤＧとも称する）を挙げることができる。また、Ａがチオグルコシド基である場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＯＴＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＨＴＧとも称する）を挙げることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ａがシュークロースオキシカルボニル基である場合には、ｎは好ましくは６〜１０、より好ましくは７〜９であり、この場合の化合物としては、具体的には、シュークロースモノカプレート（以下、ＳＭ−１０００とも称する）を挙げることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合には、ｎは好ましくは５〜９である。ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合の化合物としては、具体的には、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−８とも称する）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−９とも称する）、及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−１０とも称する）を挙げることができる。
前記一般式（II）で表される化合物としては、具体的には、３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳとも称する）及び３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯとも称する）を挙げることができる。
本発明においては、補助ブロッカー、すなわち、前記一般式（I）で表される化合物又は前記一般式（II）で表される化合物を単独で、又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
本発明において、補助ブロッカーは、水溶液として用いるのが好ましい。水溶液中の補助ブロッカーの濃度は、測定系において、好ましくは０．０１〜２．０重量％、好ましくは０．０２〜１．０重量％、より好ましくは０．０３〜０．５重量％である。補助ブロッカーの濃度が０．０１重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行うことができない。逆に、２．０重量％を越える濃度では、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特異性が全く見られなくなり、また補助ブロッカーの溶解性の点においても不都合である。
本発明によれば、被検試料（例えば、血清又は血漿）について測定前に予め遠心分離等の分画操作を行わなくても、アルブミン（ブロッカー）の存在下で、被検試料（例えば、血清又は血漿）と酵素とを接触（共存）させることによって、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害せずに進行させ、コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤及びペルオキシダーゼの存在下に生成するＨ2Ｏ2を発色させて、分光学的に比色測定することができる。
Ｈ2Ｏ2は、公知の方法で、例えば、適用な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができる。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定すればよい。
本発明によるＨＤＬコレステロール測定用試薬組成物は、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、アルブミンと、胆汁酸又はその塩とを含有する。本発明による測定用試薬組成物は、場合により、更に、補助ブロッカーとして前記一般式（Ｉ）又は前記一般式（II）で表される化合物の１種又はそれ以上を含有することもできる。
本発明による測定用試薬組成物は、好ましくは、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．０５〜１０ｕ／ｍｌと、コレステロールオキシダーゼ０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌと、アルブミン０．０１〜２０重量％、より好ましくは０．０２〜１０重量％と、胆汁酸又はその塩０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜１．５ｍＭと、場合により前記補助ブロッカー０．０１〜２．０重量％、より好ましくは０．０３〜０．５重量％を含有することができる。
本発明の測定用試薬組成物は、単一試薬として構成・使用することもできるし、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試薬系にもすることができる。２試薬系の場合、例えば、アルブミン、あるいはアルブミン及び補助ブロッカー１種又はそれ以上の化合物を、それぞれ単独又は共存して第一試薬あるいは第二試薬のどちらにも含ませることができ、第二試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ（及び場合により胆汁酸又はその塩）を含有させることができる。単一試薬、並びに第一試薬及び第二試薬の緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝液（例えば、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓなど）、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度は、好ましくは５〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜５００ｍＭ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコレステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との阻害が良好なｐＨ５．５〜７．５の範囲内で適宜選択することができる。
本発明による試薬組成物を用いて、ＨＤＬコレステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば以下のとおりである。
〔特異性の規定〕
0003869471.tif 000002
〔酵素反応及び発色反応）
0003869471.tif 000003
自動分析装置による測定では、本発明による液状の試薬組成物を用いて、主に前記反応式（２）で生成するＨ2Ｏ2を比色法によって測定し、多検体処理を行うことができる。本発明は、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）でも同様に用いることができる。すなわち、自動分析機による多検体処理とは別に、簡易測定法として個別の検査要求に対して、本発明を利用することができる。本発明を、ポリスチレン等の透明試験片による乾式測定系に適用し、反射式デンシトメトリ法による測定を行う場合には、適当な緩衝液中に調製した本発明による液状単一試薬組成物を、通常の透明試験片に含浸させ、乾燥させる常法によって製造することができる。また、展開層、試薬層及び反射層を含む乾式分析用要素は、試薬層に本発明による単一試薬組成物を含有させる常法によって製造することができる。更に、血液中の血球成分の分離膜あるいは分離層を別に設けた乾式分析用要素を用いると、血清用分離機器や血漿用分離機器を備えていない施設でも、血液をそのまま試料として直接に測定することができる。
本発明を実施する場合には、生成するＨ2Ｏ2は、直接に白金電極を用いるか、フェロセンなどの適当なメディエーターとペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、あるいは直接コレステロールオキシダーゼ反応時にフェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターを介して、生成する酸化電流の変化量を電気化学的に測定することもできる。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもできる。また、酵素反応により生成される化合物としては、前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（２）の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で測定してもよい。
以下の説明に限定されるものではないが、本発明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に際して、アルブミン、及び胆汁酸又はその塩の１種以上並びに場合により共存することのできる前記補助ブロッカーが、直接にリピドフラクションのアポリポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵素と相互作用するものと考えられる。
すなわち、各リピドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからなる脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いとアポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１、Ａ−１、Ｂ−１００、Ｂ−４８、Ｃ、又はＥなど）の差による物理化学的性質及び量的（各フラクション中に含まれる量）な違いによって識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパク質のタイプ（前者がＡ−１又はＡ−２であり、後者がＢ−１００、Ｃ又はＥである）の違いが明らかなため、従来、アポリポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴である。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定することができる。しかし、免疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点があった。
前記の特公平７−３４７６０号公報では、抗ＬＤＬ抗体や抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を使用し、胆汁酸群の界面活性剤と非イオン系界面活性剤及びコレステロールオキシダーゼの存在下に、膵臓由来のコレステロールエステラーゼによる反応の特異性を向上させる方法が開示されている。これらの抗体の使用は付加的とされているが、免疫複合体を形成する限り同様の不都合が生じる。抗体を使わない場合の反応条件の設定内容は、本発明の一部と類似しているが、アルブミン及び場合により胆汁酸又はその塩が共存することによる酵素反応特性の違いは、本質的なものであり、両発明が異なる反応機構によるものであることは、以下の説明により明らかである。
特公平６−１６７２０号公報によれば、まずはじめにＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの反応が、胆汁酸塩の存在下で進む。次いで非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の添加によってＨＤＬコレステロールとの反応がはじまるため、これら２相の反応で得られる吸光度変化の差を求めることにより、ＨＤＬコレステロール量を測定することができるものとされている。
また、特公平７−３４７６０号公報の開示内容によれば、胆汁酸群の界面活性剤と非イオン系界面活性剤の共存下に、前記特公平６−１６７２０号公報と同様に酵素反応は２相で経過することが示されている。まずはじめにＬＤＬコレステロールとの反応が進み、ＨＤＬコレステロールとの反応は、時間的に遅れて開始する。このため、好適に選択した、例えば、反応開始後２〜１５分の範囲内で、所定の時間域での吸光度変化はＨＤＬコレステロール濃度に比例するものとされている。
これに対して、本発明においては、アルブミン、及び胆汁酸又はその塩、更に場合により１種以上の補助ブロッカーを共存させることにより、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとが反応しない条件が存在し、したがって、反応開始から任意の時間における変化量は、全てＨＤＬコレステロール濃度に依存するということが判明した。本発明では、特にアルブミンと胆汁酸又はその塩と膵臓由来のコレステロールエステラーゼとの共存によって目的を達成することができる。膵臓由来のコレステロールエステラーゼは、その活性発現に胆汁酸又はその塩が必須であることはすでに述べたとおりである。この反応特異性は、例えば、血清から分離精製された各リピドフラクションとの反応性を比較することで簡単に調べることができる。また、より正確には、予め各リピドフラクションを分離することなく血清との反応を調べるために、反応液体クロマトグラフィー法を用いることにより、直接に検証することができる。酵素とＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応は、胆汁酸又はその塩の濃度に依存して変化し、濃度が高いほど反応が早い。
他方、一定濃度の胆汁酸又はその塩の存在下にアルブミンを添加すると、アルブミン濃度依存的に酵素反応は抑制を受けるが、酵素とＨＤＬコレステロールとの反応では抑制されないことがわかった。このように酵素反応に特異性を付与することができるアルブミンの効果は、他のタンパク質などでは認められない非常に特異的な性質であって、この性質は種を越えて維持されている。これら胆汁酸又はその塩による濃度依存的な酵素の活性化反応と、アルブミン濃度依存的なＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールに対する酵素活性抑制効果とは、相反する類似の挙動を示すことから、この現象は、酵素とＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応において、両者が競合的に働く相互作用部位の存在を示唆している。
本発明においては、酵素反応は、ＨＤＬコレステロール特異的に進行するため、１相で経過し、最も反応速度が大きい反応開始直後からＨＤＬコレステロール濃度依存的な反応変化量が得られる。従って、この点で、本発明は、前記公報記載の従来法における反応特性には見られない優れた性質を有することが理解される。また、好適には更に１種以上の補助ブロッカーが共存させることにより、例えば、使用可能なｐＨ条件を弱アルカリ側へ拡大させたり、使用アルブミン量を減少させることができる。当然のことながら、好適な条件からはずれる場合には、特異性も減少し、ＨＤＬコレステロールに次いでＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールとの反応が遅れて進行を始めることが、明らかであった。特に測定の迅速性が問われるドライケミストリーによる簡易検査では、１分以内数秒単位での計測が望まれるため、１液仕様で反応開始と同時に特異性が発揮できることは、本発明と従来法との間に本質的差異を認めるに十分な原理の違いが明らかである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例においては、特に断わらない限り、コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いた。
実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画
超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等（動脈硬化，６，３９，１９７８）の方法に準じて行った。具体的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製した。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。また比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水９７．５ｍｌに溶解して調製した。
１０ｍｌ容量の遠心管に上記の処理血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心管を１０℃で５００００ｒｐｍにて２０時間遠心した。遠心処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の比重液２ｍｌとを重層した。
この遠心管を５００００ｒｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収した。
各画分は生理的食塩水に一夜透析した後（冷蔵下）、冷蔵保存した。
実施例２：コール酸ナトリウムによる活性化反応とアルブミンによる抑制効果
１ｍＭ−ＥＳＰＴ、０．５ｍＭ−４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．２５ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）（以下、緩衝液Ｘと称する）１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。この緩衝液Ｘに実施例１で調製したＬＤＬフラクション１０μｌを添加し、発色の経時変化を波長５４６ｎｍで記録した。結果を図１に示す（図１の曲線ａ）。吸光度の変化はほとんど観察されなかった。
次に、前記緩衝液Ｘの代わりに、前記緩衝液Ｘに更に０．７５ｍＭコール酸ナトリウムを含む緩衝液（以下、緩衝液Ｙと称する）を用いて同様の測定を実施した。結果を図１の曲線ｂで示す。吸光度の変化が観察され、酵素とＬＤＬフラクション中のコレステロールとの反応は、コール酸ナトリウムで活性化されることがわかった。
続いて、前記緩衝液Ｘの代わりに、前記緩衝液Ｙに更に０．８％牛アルブミンを含む緩衝液（以下、緩衝液Ｚと称する）を用いて同様の測定を実施した。結果を図１の曲線ｃで示す。吸光度の変化はほとんどなく、酵素とＬＤＬフラクション中のコレステロールとの反応は、アルブミンの添加によって抑制されることがわかった。
実施例３：反応経時変化
緩衝液Ｚ１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。この緩衝液Ｚに、試料として、実施例１で調製したＨＤＬフラクション２０μｌ、ＬＤＬフラクション１０μｌ、ＶＬＤＬフラクション１０μｌ、又は正常プール血清１０μｌをそれぞれ加え、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。
結果を図２に示す。図２において、「ＨＤＬ」は試料としてＨＤＬフラクションを使用した場合の結果を示し、「ＬＤＬ」は試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の結果、「ＶＬＤＬ」は試料としてＶＬＤＬフラクションを使用した場合の結果、そして「血清」は試料として正常プール血清を使用した場合の結果をそれぞれ示す。ＨＤＬフラクションに比べ、ＬＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールに対する反応阻害が明らかであった。
実施例４：反応液体クロマトグラフィー法による血清リピドフラクションとの反応特異性
（１）酵素反応液の調製
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）０．７５ｍｌ（以下、Ａ溶液と称する）に、試料としてプール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。この溶液に、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１．６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）０．２５ｍｌ（以下、Ｂ溶液と称する）を添加した。Ｂ溶液を添加してから３７℃で５分間加温した後に、又は１０分間加温した後に、更に１Ｍトリスヒドロキシメタン水溶液７０μｌを添加して酵素反応を終了させることにより、反応混合液Ｍ１（すなわち、Ｂ溶液を添加してから５分間加温したもの）及び反応混合液Ｍ２（すなわち、Ｂ溶液を添加してから１０分間加温したもの）を得た。これとは別に、酵素反応前のコントロールとして、Ｂ溶液０．２５ｍｌに１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを先に加え、反応停止させてから、Ａ溶液０．７５ｍｌを添加したもの（反応混合液Ｍｃ）を調製した。これらの反応混合液を、以下に示す反応液体クロマトグラフィーにより分析した。各分析には前記反応混合液１００μｌを用いた。
（２）反応液体クロマトグラフィーによる分析
Ｗ．Ｍａｒｚら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９／１１，２２７６−２２８１，１９９３）の方法に従い、酵素反応前後の血清中リピドフラクションの挙動を調べた。すなわち、ゲル濾過用カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム：ファルマシア）を用いて、０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液として０．３ｍｌ／分の流速で試料を分離した。次に、分離したリピドフラクションを、７０μｌ／分の流速で流れている総コレステロール測定用酵素試薬（ヤトロン製）と合流させ、３７℃の恒温槽中で５分間加温した後、波長５８０ｎｍで吸光度変化を記録した。図３に、反応混合液Ｍ１のクロマトグラム〔曲線（ａ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｃのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を、図４に、反応混合液Ｍ２のクロマトグラム〔曲線（ｂ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｃのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を示す。なお、図４には、試料プール血清を精製水に換えて、反応混合液Ｍ１と同様に操作し調製した試薬盲検例のクロマトグラム〔曲線（ｄ）〕も併せて示す。
各フラクションの溶出位置は、予め、実施例１で調製した各リピドフラクションを前記溶出液で１００倍希釈したものを、試料として注入し、その結果から決定した。各リピドフラクションは、脂質複合体としての大きさにしたがい、高分子量のＶＬＤＬから溶出され、続いてＬＤＬ、ＨＤＬの順序でピークが出現した。
こうして得られたピークは、各リピドフラクション中に含有されている総コレステロール量を示しているため、被検試料での酵素反応の結果、認められた各ピークの変化は、各リピドフラクションに対する特異性と反応量とを直接示している。図３に示すように、５分間の酵素反応では、ＨＤＬのピークだけが消失したのに対し、図４に示すように、１０分間の反応では、更にＶＬＤＬ及びＬＤＬのピークも減少を始めることが判明した。従って、本発明においては、ＨＤＬコレステロールが特異的に反応した後、ＬＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロールが反応を始めることが明らかであった。
実施例５：実検体の測定
本発明の試薬組成物として、１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）〔＝試薬１〕２２５μｌと、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１．６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）７５μｌ〔＝試薬２〕との２試薬系の構成をとる試薬組成物を使用し、試料３μｌを用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も５分間とし、主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定を行った。血清検体１０例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を実施し、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。
両測定法の相関関係を図５に示した。本発明方法は、従来から常用されている沈殿法と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
実施例６：補助ブロッカーの相対反応性
１ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、実施例１で分画した各リピドフラクション（各１０μｌ）をそれぞれ加え、３７℃で５分間加温した。これに２ｍＭ−４−ＡＰと以下の表１に示す各補助ブロッカーの０．２％水溶液、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．０９％牛アルブミン、１．７ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
各リピドフラクションに対するｎ−ＯＴＧの反応性を１００％として、各化合物の相対反応性を求めた。結果を表１に示す。なお、ＶＬＤＬとＬＤＬに対する表示値は反応阻害率である。表１に示すとおり、本実施例による条件下では、他の化合物もＶＬＤＬ及びＬＤＬに対してはｎ−ＯＴＧと同程度の阻害率を有することがわかった。他方、ＨＤＬに対する反応特異性が認められることから、本発明方法において適応可能であることが確認された。
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実施例７：アルブミン添加効果
（１）ＬＤＬフラクションとの反応の場合
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として実施例１で調製したリピドフラクションＬＤＬ１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに３ｍＭコール酸ナトリウム、２ｍＭ−４−ＡＰ、０．３％アルブミン、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、１．７ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。また、対照試験として、アルブミンを添加しないこと以外は、前記と同様の操作を実施し、その吸光度（波長５４６ｎｍ）変化も記録した。それらの結果を図６に示す。図６において、「添加」はアルブミンを添加した場合を示し、「無添加」はアルブミンを添加しなかった場合を示す。酵素とＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応が、アルブミンの添加により、効率よく阻害されていることが確認された。
（２）血清との反応の場合
０．０８％牛アルブミン、０．０５％ｎ−ＯＴＧ、１ｍＭ−ＥＳＰＴ、０．５ｍＭ−４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．７５ｍＭコール酸ナトリウム、０．１３ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び１ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。これに予め、総コレステロール値（ヤトロン製，酵素法）とＨＤＬコレステロール値（第一化学製，沈殿法）とを測定した血清３例（血清Ａ〜血清Ｃ）について、それぞれ１０μｌを加え、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。また、同じ血清について、前記緩衝液の代わりに、前記緩衝液から牛アルブミンを除いた溶液を用いて、同様に記録した。また、血清を精製水に代えて、試薬盲検例も記録した。
結果を図７に示す。予め測定した血清の総コレステロール値及びＨＤＬコレステロール値は、それぞれ、血清Ａが２００ｍｇ／ｄｌ及び６６ｍｇ／ｄｌ；血清Ｂが１９８ｍｇ／ｄｌ及び９３ｍｇ／ｄｌ；そして血清Ｃが１０９ｍｇ／ｄｌ及び３８ｍｇ／ｄｌであった。図７において、曲線（１）〜（３）はアルブミン無添加の場合であり、曲線（４）〜（７）はアルブミン添加の場合である。曲線（１）及び（５）は、血清Ａの結果であり、曲線（２）及び（４）は、血清Ｂの結果である。また、曲線（３）及び（６）は、血清Ｃの結果である。曲線（７）は、試薬盲検例である。アルブミンを添加した条件では、反応開始からＨＤＬコレステロール値にしたがって吸光度変化を示すことが明らかであった。
実施例８：補助ブロッカーを使用した条件での、反応液体クロマトグラフィー法による血清リピドフラクションとの反応特異性
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）（以下、Ｄ溶液と称する）０．７５ｍｌに、試料としてプール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、０．３６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．５ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）（以下、Ｅ溶液と称する）０．２５ｍｌを添加し、５分間加温した。これに１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを添加して反応を止め、反応混合液Ｍ３を得た。また、前記Ｅ溶液の代わりに、Ｅ溶液から牛アルブミンを除いた溶液を使用して同様の操作を実施し、反応混合液Ｍ４を得た。更に、酵素反応前のコントロールとして、Ｅ溶液０．２５ｍｌへ１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを先に加え、反応停止させてから、Ｄ溶液０．７５ｍｌを添加したもの（反応混合液Ｍｏ）を調製した。
各反応混合液は、実施例４に示した反応液体クロマトグラフィー法により分析した。図８に、反応混合液Ｍ３のクロマトグラム〔曲線（ａ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｏのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を、反応混合液Ｍ４のクロマトグラム〔曲線（ｂ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｏのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を図９に示す。なお、図８には、試料としてプール血清を精製水に換えて反応混合液Ｍ３と同様に操作し調製した試薬盲検例のクロマトグラム〔曲線（ｄ）〕も併せて示す。
アルブミンを添加した時の反応では、ＨＤＬのピークだけが消失したのに対し、アルブミン無添加の反応では、更にＶＬＤＬ及びＬＤＬのピークも減少を始めることが判明した。従って、補助ブロッカー存在下においても、アルブミンの添加は、ＬＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を抑制し、ＨＤＬコレステロールとのみ特異的に反応させていることが明らかであった。
実施例９：補助ブロッカーを使った場合の実検体の測定
本発明の試薬組成物として、１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〔＝試薬１〕２２５μｌと、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、０．０９％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〔＝試薬２〕７５μｌとの２試薬系の構成をとる試薬組成物を用い、試料３μｌを用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も５分間とし、主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定を行った。血清検体７６例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を実施し、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。両測定法の相関関係を図１０に示す。本発明方法は、従来から常用されている沈殿法と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
実施例１０：乾式測定系での実検体の測定
本発明の試薬組成物として、５ｍＭ  ＥＳＰＴ，２ｍＭ  ４−ＡＰ，１ｍｇ／ｍｌペルオキシダーゼ，４％牛アルブミン，３ｍＭコール酸ナトリウム，１．４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．７６ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用し、透明基材（ポリスチレン製）上に前記試薬組成物２０μｌをスポットし、乾燥させた。試料５μｌを乾燥試薬組成物上にのせて、８分間アルミニウムブロック上で３７℃に加温した。発色物は、反射式デンシトメーター分析により測定した。血清検体１９例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を行い、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。両測定法の相関関係を図１１に示した。本発明法は、従来から常用されている沈殿法と傾き＝０．９７及び切片＝−６．１ｍｇ／ｄｌ，相関係数＝０．９０２と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
産業上の利用可能性
試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精度の測定を行うことができる。
以上、本発明を特定の態様に関して説明したが、当業者に自明の変形は本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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