(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化１】
0003878239.tif 000012
（式中、Ｒは水素原子又は金属イオンを表し、Ｒ’はＧ、Ｍ、Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｍ又はＭ−Ｇ−Ｍ（Ｍは次式II：
【化２】
0003878239.tif 000013
（Ｒは前記と同様である。）で示されるＤ−マンニュロン酸を表し、Ｇは次式III:
【化３】
0003878239.tif 000014
（Ｒは前記と同様である。）で示されるＬ−グルロン酸を表し、各単糖間の結合はα−又はβ−１，４結合である。）を表す。）
で示される化合物のうちの少なくとも１つであるアルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含む高脂血症又は動脈硬化の予防治療剤。
【請求項２】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理したものである請求項１記載の高脂血症又は動脈硬化の予防治療剤。
【請求項３】
アルテロモナス属に属する微生物がアルテロモナス・エスピーNo.1786である請求項２記載の高脂血症又は動脈硬化の予防治療剤。
【請求項４】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、単独又はいずれかの組み合わせにより用いられるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の高脂血症又は動脈硬化の予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含む循環器系疾患予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コレステロールは、アセチル-CoAよりメバロン酸やスクアレンなどの中間体を経て、20数段階の複雑な反応により生合成される。その複雑な反応においてHMG-CoA （ヒドロキシメチルグルタリル-CoA）還元酵素は律速酵素として知られ、その阻害剤として発見されたコンパクチンはコレステロール低下剤として実用化されている。そして、ACAT（アシル-CoA：コレステロールアシルトランスフェラーゼ) も同様にコレステロール代謝における律速酵素として注目され、その阻害剤の開発が進められている。そのACAT阻害剤は、腸管に働けば食事からのコレステロール吸収を阻害し、食事性の高コレステロール血症に効力を発揮するだけでなく、血管壁のマクロファージに働けば、泡沫化を抑制して動脈硬化の予防にプラスに作用すると考えられている。すなわち、ACAT阻害剤は、抗高脂血症剤及び抗動脈硬化剤として一度に期待される臨床的に非常に意義深い新薬である。その例として、アミド基をもつもの（アミド剤）、尿素骨格をもつもの（ウレア剤）、イミダゾール基をもつもの（イミダゾール剤）の３つに大別することができるが、オリゴ糖の例はない。さらに、ACAT阻害剤の中には組織（臓器）ターゲッティングという安全性の問題も残されている。例えば、ACAT阻害剤の投与により掻痒感、発疹、頭重、頭痛、めまい、食欲不振、下痢、腹部満腹感、便秘、悪心・嘔吐、心窩部不快感、筋肉痛、胆石形成等の副作用を生ずる場合がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含む循環器系疾患予防治療剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の基づいて鋭意研究を行った結果、アルギン酸オリゴ糖又はその塩が循環器系疾患予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含む循環器系疾患予防治療剤である。
【０００５】
ここで、アルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理したものが挙げられ、アルテロモナス属に属する微生物としてはアルテロモナス・エスピーNo.1786 が挙げられる。
また、アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、単独又はいずれの組み合わせにより用いてもよい。
【０００６】
さらに、アルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、次式Ｉ：
【０００７】
【化４】
0003878239.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒは水素原子又は金属イオンを表し、Ｒ’はＧ、Ｍ、Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｍ又はＭ−Ｇ−Ｍ（Ｍは次式II：
【０００９】
【化５】
0003878239.tif 000003
【００１０】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＤ−マンニュロン酸を表し、Ｇは次式III:
【００１１】
【化６】
0003878239.tif 000004
【００１２】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＬ−グルロン酸を表し、各単糖間の結合はα−又はβ−１，４結合である。）を表す。）
で示される化合物のうちの少なくとも１つが挙げられる。
【００１３】
「少なくとも１つ」とは、上記各種アルギン酸又はその塩を、前記と同様に単独又はいずれかの組み合わせにより用いることができることを意味する。例えば、上記式Ｉにおいて、Ｒ’がＧ又はＭであるものを単独で用いることはもちろん、Ｒ’がＧ−Ｇ、Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍなどの２糖又は３糖の２種以上を組み合わせて用いてもよく、さらに、２糖のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と３糖のアルギン酸カリウムオリゴ糖との組み合わせなどのように、異なるアルギン酸オリゴ糖の塩を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
循環器系疾患としては、高脂血症（例えば高コレステロール血症、高中性脂肪血症など）又は動脈硬化（例えばアテローム性動脈硬化など）が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の循環器系疾患予防治療剤に含まれる有効成分であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩に、アルテロモナス属に属する微生物が生産するアルギン酸又はその塩の分解酵素、即ちアルギン酸リアーゼを作用させて得ることができる。アルギン酸とは、Ｄ−マンニュロン酸とＬ−グルロン酸を構成糖とする多糖類の一つであり、その塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム又はこれらの混合物が挙げられる。また、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ糖、アルギン酸カルシウムオリゴ糖又はこれらの混合物等が挙げられる。
【００１６】
先ず、本発明の循環器系疾患予防治療剤に含まれる有効成分であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩を得るために用いられるアルギン酸リアーゼを生産する微生物について説明する。
かかる微生物としては、アルテロモナス属に属する微生物が挙げられ、アルテロモナス・エスピー No.1786を例示することができる。
【００１７】
アルテロモナス・エスピー No.1786は、魚介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブトガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性質及び生理学的性質は下記の表１に示す通りである。
【００１８】
【表１】
0003878239.tif 000005
【００１９】
上記表１に示す菌株の性質に基づいて清水らの方法〔海洋微生物研究法、学会出版センター、 228〜239 (1985)参照〕に従って同定を試みた結果、上記微生物 (本菌株) は、アルテロモナス属に属することが判明した。尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-11685として寄託されている。
【００２０】
上記表１に示す性質を有する菌株を培養し、得られた培養物から通常の精製手法によってアルギン酸リアーゼを分離精製する。
培地としては、例えば、アルギン酸ナトリウム（1.00％）、硫酸ナトリウム（1.00％）、塩化カリウム（0.08％）、硫酸マグネシウム（７水和物）（1.24％）、リン酸水素二カリウム（３水和物）（0.01％）、塩化アンモニウム（0.10％）、クエン酸鉄アンモニウム（0.01％）及び塩化カルシウム（0.15％）を含む培地組成が挙げられる。
【００２１】
培養は、例えば、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (各々25℃、２日) 後、本培養 (25℃、１日) を行う。
このようにして上記微生物を培養することによって、アルギン酸リアーゼが蓄積された培養上清又は微生物を含む培養物が得られる。次に、該培養物を材料にして、蛋白質の分離、精製に用いられる方法によりアルギン酸リアーゼを得ることができる。例えば、上記培養液から分画分子量500,000 限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とするほか、更に、該粗アルギン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて精製を行ってもよい。各種クロマトグラフィーとしては、疎水、ゲルろ過、イオン交換、逆相、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の純度及びその分子量の確認のため、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法やゲル濾過法等を用いることもできる。
【００２２】
このようにして得られたアルギン酸リアーゼの酵素的性質は次の通りである。▲１▼作用：アルギン酸又はその塩を基質として上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼを反応させた時、反応生成物であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の二重結合に由来する特異吸収波長である230nm における吸光度の増加、及び生じるオリゴ糖による還元力の増加が確認された。
【００２３】
▲２▼至適ｐＨ：上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼは、ｐＨ7.０〜7.５の範囲で相対活性量が高く、相対活性量が最大になるｐＨ7.０が至適ｐＨである。▲３▼至適温度及び熱安定性：上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼは、45〜55℃の範囲で高く、相対活性量が最大になる50℃が至適温度であった。また、室内での濃縮を行っても失活しなかった。
【００２４】
▲４▼酵素活性：下記組成の反応液を用い、アルギン酸ナトリウムとアルギン酸リアーゼを50℃にて10分間反応させ、生成したオリゴ糖量をネルソン・ソモギー法により測定することにより、アルギン酸リアーゼの酵素活性を測定できる。この酵素活性は、１分間に１μmoleのマンニュロン酸に相当するアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を生成する酵素量を１単位として示す。酵素活性測定には、アルギン酸カリウムを用いても良い。
【００２５】
（反応液の組成)
・0.５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬製) を含む0.05Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ7.０) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.45ml
・酵素液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.05ml
尚、本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩を製造するためには、上記本菌株を通常の変異手段を適用して得られる変異株であってアルギン酸リアーゼ産生能を有する菌株を培養して得られるアルギン酸リアーゼも使用することができる。次に、原料のアルギン酸又はその塩に、前記アルギン酸リアーゼを反応させてアルギン酸オリゴ糖又はその塩を得る。
【００２６】
尚、この場合、アルギン酸又はその塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応時のｐＨが7.０〜7.５の条件で行うのが好ましく、50℃、ｐＨ7.０の条件で行うのが更に好ましい。
本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、末端が４，５−不飽和ウロン酸であり、Ｄ−マンニュロン酸及びＬ−グルロン酸を構成糖とするオリゴ糖であり、例えば、次式Ｉ：
【００２７】
【化７】
0003878239.tif 000006
【００２８】
（式中、Ｒは水素原子又は金属イオンを表し、Ｒ’はＧ、Ｍ、Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｍ又はＭ−Ｇ−Ｍ（Ｍは次式II：
【００２９】
【化８】
0003878239.tif 000007
【００３０】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＤ−マンニュロン酸を表し、Ｇは次式III:
【００３１】
【化９】
0003878239.tif 000008
【００３２】
（Ｒは前記と同様である。）
で示されるＬ−グルロン酸を表し、各単糖間の結合はα−又はβ−１，４結合である。）を表す。）
で示される化合物のうちの少なくとも１つが挙げられる。
【００３３】
また、前記式(I)、(II)及び(III) において、Ｒは水素原子又は種々の金属イオンを表す。金属イオンとしては、例えば、Na、K 、Ca1/2 、Mg1/2 、Cu1/2 、Zn1/2 、Fe1/2 、Fe1/3 などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
以上のようにして得られるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の活性成分は、そのまま本発明の循環器系疾患予防治療剤として用いることができ、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥しておくことができる。
【００３５】
本発明の循環器系疾患予防治療剤は、高脂血症又は動脈硬化に対する予防及び治療を目的として用いることができる。また、投与する方法は経口により行い、その投与形態としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。また、その投与量は動物か人間かによって、また、年齢及び健康状態により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明の循環器系疾患予防治療剤の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与される有効量は、配合量として全量の0.001 〜20重量％、好ましくは0.01〜20重量％であり、１日１回から数回に分けて２日以上投与される。
【００３６】
本発明の循環器系疾患予防治療剤を経口投与する場合、剤形により乳糖や澱粉等の賦形剤を含有させることもでき、他の薬剤（ビタミン剤）との併用も可能である。
本発明において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩が循環器系疾患予防治療剤として有効であることを裏付ける薬理試験、及び毒性試験を以下に述べる。
【００３７】
〔試験例１〕循環器系疾患予防治療試験
動物（ラット）を用い、本発明の循環器系疾患予防治療剤としての効果を調べるため、以下の試験を行った。
自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ系，６週齢）を試験動物として用いた。オリゴ糖（３％のアルギン酸カリウムオリゴ糖）を餌中に加えて投与した群（オリゴ糖群，６匹）とオリゴ糖を加えない群（対照群，６匹）に分けて飼育した。５週間後、それぞれのラットの肝臓を摘出し、ACAT活性を測定した。
【００３８】
ACAT活性は、肝臓ミクロソーム分画において、Oleoyl-coenzyme A を基質として添加し、酵素反応後生成したOleoyl cholesterolをHPLCで分離・定量することにより求めた。
その結果、対照群の活性が210.7 ±17.8pmol/min/mg protein であるのに対し、オリゴ糖群が133.3 ±12.4pmol/min/mg protein となった。この値の間は、統計処理の結果、p ＜0.01で有意な差として認められた。
【００３９】
この結果により、アルギン酸オリゴ糖にACAT阻害作用が認められた。
従って、本発明の循環器系疾患予防治療剤は、高脂血症又は動脈硬化の予防治療に有効であると考えられる。
【００４０】
〔試験例２〕毒性試験
アルギン酸の分解物を用いてマウスに対する急性毒性試験を行った。
OECD化学物質毒性試験指針（1987）に準拠したマウスにおける急性経口毒性試験において、５週齢のＩＣＲ系雌雄マウスを使用し（１群10匹）、マウス胃ゾンデを用いて強制単回投与した。投与日では投与１時間以内及び５時間目おける死亡例及び死亡率を記録し、更に投与後１〜14日目における死亡例及び死亡率を記録した。なお、アルギン酸の分解物を投与しない群を対照群とした。
【００４１】
結果を表２（雄）及び表３（雌）に示す。表２及び表３より、アルギン酸の分解物の単回投与による致死量は雌雄ともに2,000mg/kg以上であるものと認められた。
【００４２】
【表２】
0003878239.tif 000009
【００４３】
【表３】
0003878239.tif 000010
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕  アルギン酸塩オリゴ糖の調製
(1) アルギン酸リアーゼの調製
(培地組成)
・アルギン酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1.00％
・硫酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1.00％
・塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.08％
・硫酸マグネシウム（７水和物）・・・・・・・・・・・・・・・・1.24％
・リン酸水素二カリウム（３水和物）・・・・・・・・・・・・・・0.01％
・塩化アンモニウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.10％
・クエン酸鉄アンモニウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.01％
・塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.15％
上記組成の培地を用い、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (25℃、２日) 後、本培養 (25℃、１日) を行った。その結果、酵素活性が培養液１ml当たり、0.90単位であるアルギン酸リアーゼ培養液が生産された。
上記培養液から分画分子量500,000 限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とした。
【００４６】
(2) アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の製造
アルギン酸ナトリウム (10.0kg) を90L の脱塩水に溶解後、上記(1) で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,000U)を加え、40℃で６時間攪拌しながら反応させた。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖粉末を4.２kg得た。
【００４７】
(3) アルギン酸カリウムオリゴ糖の製造
アルギン酸カリウム (10.0kg) を90L の脱塩水に溶解後、上記(1) で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,000U)を加え、40℃で６時間攪拌しながら反応させた。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸カリウムオリゴ糖粉末を4.２kg得た。
【００４８】
尚、同様にしてアルギン酸カリウムとアルギン酸ナトリウムとの混合物を用いれば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖とアルギン酸カリウムオリゴ糖との混合物が得られる。
【００４９】
(4) アルギン酸カルシウムオリゴ糖の製造
(2)及び(3)で得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖及びアルギン酸カリウムオリゴ糖を、酢酸カルシウムをはじめとする各種の水溶液のカルシウム塩と一緒に電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マイクロアシライザー) で処理した。
その結果、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖（4.2 kg) からアルギン酸カルシウムオリゴ糖が3.3kg得られた。
【００５０】
〔参考例１〕
本参考例は、本発明のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の重合度の分析例を示すものである。
重合度の決定は、マス分析及びＮＭＲ分析により行った。マス分析には、ジャスコインタナショナル（株）製の液体クロマトグラフ質量分析装置を用い、ＮＭＲ分析には日本電子（株）製を用いた。
【００５１】
次に、実施例１で調製したアルギン酸ナトリウムオリゴ糖をDEAE GLASS（ナカライテスク社製）を用いたNaClによる０〜0.25M グラジエント溶出による高速液体クロマトグラフィー（HPLC) に供し、フラクションコレクターで分画した。この溶出パターンを図１に示す。230nm に吸収のある画分１〜８（以下、それぞれ「Ｐ１」、「Ｐ２」、・・・「Ｐ８」とする）を回収し、それぞれの画分を同じ条件で再クロマトすると、表４記載のようなオリゴ糖（Ｐ１〜Ｐ６、Ｐ７−１〜Ｐ７−６及びＰ８の画分）が得られた。
【００５２】
なお、表４において「Ｐ７−１」〜「Ｐ７−６」とは、Ｐ７が６画分に分画されたものを意味する。
これらのオリゴ糖をマス分析に供した結果、表４に示すようなｍ／ｚのピークが検出され、そのｍ／ｚ値よりそれぞれ重合度を推定した。さらに、ＮＭＲ分析を行ったところ、図２に示すように本発明のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の構造が示された。図２中、「△」は４，５−不飽和ウロン酸を表し、Ｍ及びＧは、それぞれ式(II)で示されるＤ−マンニュロン酸、式(III) で示されるＬ−グルロン酸を表す。また、本参考例では、式(I) 、(II)及び(III) 中、Ｒがナトリウムである化合物を用いた。なお、アルギン酸カリウムオリゴ糖及びアルギン酸カルシウムオリゴ糖の構造も同一の構造であった。また、各単糖間の結合は、α−又はβ−１，４結合である。
【００５３】
【表４】
0003878239.tif 000011
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、循環器系疾患予防治療剤が提供される。本発明の循環器系疾患予防治療剤は、安全でかつ安定である。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖のHPLCの結果を示す図である。
【図２】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の構造を示す図である。
【図１】
0003878239.tif 000015
【図２】
0003878239.tif 000016