(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有することを特徴とする精子低温傷害防止液。
【請求項２】
前記長鎖アルコールがラウリルアルコールである請求項１記載の精子低温傷害防止液。
【請求項３】
前記脂質が、植物性油脂または動物性油脂である請求項１または２に記載の精子低温傷害防止液。
【請求項４】
前記脂質が、オリーブ油、大豆油、卵黄、牛乳、レシチンのいずれかである請求項１または２に記載の精子低温傷害防止液。
【請求項５】
前記脂質が、α−トコフェロールである請求項１または２に記載の精子低温傷害防止液。
【請求項６】
前記精子低温傷害防止液は、超音波処理されている請求項１ないし５のいずれかに記載の精子低温傷害防止液。
【請求項７】
炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンとを含有することを特徴とする細胞低温傷害防止液。
【請求項８】
前記長鎖アルコールがラウリルアルコールである請求項７記載の細胞低温傷害防止液。
【請求項９】
前記脂質が、植物性油脂または動物性油脂である請求項７または８に記載の細胞低温傷害防止液。
【請求項１０】
前記脂質が、オリーブ油、大豆油卵黄、牛乳、レシチンのいずれかである請求項７または８に記載の細胞低温傷害防止液。
【請求項１１】
前記脂質が、α−トコフェロールである請求項７または８に記載の細胞低温傷害防止液。
【請求項１２】
前記細胞低温傷害防止液は、超音波処理されている請求項７ないし１１のいずれかに記載の細胞低温傷害防止液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精子の低温保存に有用な傷害防止液もしくは細胞の低温保存に有用な傷害防止液に関するものである。特に、豚精子の低温保存に有効な精子低温傷害防止液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、精子の低温保存のための傷害防止液として、アルコール類には細胞の凍結傷害を防止する効果のあるものがいくつか知られており、その代表的なものがグリセリンである。また、精子の低温保存のための傷害防止液として、卵黄やその成分等も用いられており、これらは、急速冷却によって生じるコールドショック防止効果も有することが知られている。また、ナフタレンやＢＨＴ（２，６−ジ−tert−ブチル−p−クレゾール）等の芳香族化合物が、精子のコールドショックを防止し、その生理的機能を傷害防止する作用を有することも知られている（Bamba, K. and Miyagawa, N., Cryobiology, 29, pp. 533-536, 1992）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の傷害防止液はいずれも保護性能が十分とはいえず、特に、ＢＨＴは精子の運動性を抑制する作用が高く、精子の生理的機能を損なう可能性があった。
従って本発明の目的は、精子の生理的機能を実質的に保持したまま低温保存するために有用な傷害防止液を提供することにある。また、本発明の別な目的は、動物、植物などの細胞の生理的機能を実質的に保持したまま低温保存するために有用な傷害防止液を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するものは、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有する精子低温傷害防止液である。
また、上記目的を達成するものは、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンとを含有する細胞低温傷害防止液である。
そして、前記長鎖アルコールがラウリルアルコールであることが好ましい。また、前記脂質が、例えば、植物性油脂または動物性油脂である。また、前記脂質は、例えば、オリーブ油、大豆油、卵黄、牛乳、レシチンのいずれかである。また、前記脂質が、α−トコフェロールであることが好ましい。そして、前記精子低温傷害防止液は、超音波処理されていることが好ましい。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の精子低温傷害防止液は、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有している。このため、精子を２〜３℃に急速冷却することによるコールドショックを加えた後にも、精子の生理的機能を実質的に保持することができる。
本発明の傷害防止液により好適に冷却保存できる精子としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ等の哺乳類動物由来の精子を挙げることができる。特に、豚精子に対して有効である。
【０００６】
炭素数１０〜１４の長鎖アルコールは、デシルアルコール（炭素数１０）、ウンデシルアルコール（炭素数１１）、ラウリルアルコール（炭素数１２）、ドデシルアルコール（炭素数１３）、ミリスチルアルコール（炭素数１４）である。また、長鎖アルコールは、側鎖を有するものでもよいが、直鎖アルコールが好適である。なお、炭素数９のノニルアルコールでは、本発明の効果は得られなかった。
【０００７】
また、脂質としては、オリーブ油、大豆油などの植物性油脂、卵黄、牛乳、レシチン、スクワランなどの動物性油脂、ミネラルオイルなどの鉱物性油脂、流動パラフィン、α−トコフェロールが使用できる。特に、α−トコフェロールが好ましい。
【０００８】
精子低温傷害防止液は、長鎖アルコールおよび脂質を希釈液に添加し、超音波処理することにより製造することができる。
希釈液としては、ＢＴＳ希釈液（Pursel, V. G. and Johnson, L. A., J. Anim. Sci., 40, pp. 99-102, 1975，成分（ｍｇ／１００ｍｌ）：Ｄ−グルコース：３７００；クエン酸ナトリウム：６００；ＮａＨＣＯ3，ＥＤＴＡ−２Ｎａ：１２５；ＫＣｌ：７５；抗生物質：１０（例えば、ゲンタマイシン、アミカシンなどのアミノ糖系抗生物質、硫酸ジべカシンなどが使用される）を用いることが好ましい。
【０００９】
本発明の傷害防止液における炭素数１０〜１４の長鎖アルコール濃度は、０．０１〜０．１％程度、脂質は、０．１〜１％程度が好ましい。特に、傷害防止液における有効成分である炭素数１０〜１４の長鎖アルコール濃度は、０．０２％程度、脂質は、０．４％程度が好ましい。
【００１０】
本発明の低温障害防止液は、例えば、採取した精液の精子濃度を例えば１ｍｌあたり約４×１０8個程度になるように調節し、さらに本発明の傷害防止液を適宜の濃度となるように添加して、約２〜１０℃、好ましくは５℃程度の低温で保存する場合に特に有効である。精液の精子濃度の調節には、精漿や生理食塩水等を希釈液として用いることができる。精液の希釈方法としては、例えば、濃厚部精液と希薄部精液とを分画採取し、希薄部精液を１２００×Ｇ程度で１５分間遠心分離して得た精漿を用いて濃厚部精液を希釈する方法を挙げることができる。上記の濃度調整工程は、２０〜３０℃、好ましくは２５℃で行えばよい。
【００１１】
本発明者は、長鎖アルコールを試験管にとり、さまざまな基本希釈液を加えて超音波処理して溶解させた。豚精液（４億／ｍｌ）は１：１で希釈後、２〜３℃に急速に冷却し１０分間放置してコールドショック（ＣＳ）処理をし、精子活力と頭帽形態を調べた。ラウリルアルコール（ＬＡ）は脂質を含まないＢＴＳ希釈液に加えた場合は毒性のみを示したが、脂質を同時に添加した希釈液では極めてすぐれたＣＳ防止効果を示した。精子に害作用のない植物性油脂（オリーブ油、大豆油）、動物性油脂（卵黄、牛乳、レシチンなど）あるいはアルファ（α−）トコフェロールとＬＡの組合わせでほぼ同等の効果が認められた（組合せの例；０．４％オリーブ油＋０．０２％ＬＡ）。ＬＡと同様の効果が炭素数１０〜１４のアルコールで認められたが、９では無効であった。
これより、長鎖アルコールは少量の脂質と組み合わせることによりその毒性がマスクされ低温傷害防止効果が得られることが分かった。
【００１２】
界面活性剤Orvus Es Paste（ＯＥＰ）は卵黄を含む希釈液に添加すると精子の耐凍性が向上することが知られているが、その界面活性による害作用と低温傷害防止作用のバランスをとる問題があるため使用できる希釈液は限られている。それに対して長鎖アルコールでは毒性をマスクするための脂質はごく微量ですむ利点があり、精子の生存性を向上させる作用が期待できる卵黄、牛乳、トコフェロールの組合せによりＬＡの毒性をマスクすると共に低温傷害防止効果を付与できる点でその応用が期待できる。豚精子の５℃保存や凍精保存でもＬＡの有効性が確認された。
【００１３】
次に、本発明の細胞低温傷害防止液について説明する。
本発明の細胞低温傷害防止液は、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンを含有する。このため、細胞を２〜３℃に急速冷却することによるコールドショックを加えた後にも、細胞の生理的機能を実質的に保持することができる。
【００１４】
本発明の傷害防止液により好適に冷却保存できる細胞としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ等の哺乳類動物由来の精子、卵子、赤血球、血小板、幹細胞などを挙げることができる。特に、精子、特に豚精子に対して有効である。
炭素数１０〜１４の長鎖アルコールは、デシルアルコール（炭素数１０）、ウンデシルアルコール（炭素数１１）、ラウリルアルコール（炭素数１２）、ドデシルアルコール（炭素数１３）、ミリスチルアルコール（炭素数１４）である。また、長鎖アルコールは、側鎖を有するものでもよいが、直鎖アルコールが好適である。
【００１５】
また、脂質としては、オリーブ油、大豆油などの植物性油脂、卵黄、牛乳、レシチン、スクワランなどの動物性油脂、ミネラルオイルなどの鉱物性油脂、流動パラフィン、α−トコフェロールが使用できる。特に、α−トコフェロールが好ましい。最も好ましいのは、ｄｌ−α−トコフェロールである。
【００１６】
血清アルブミンとしては、牛血清アルブミンが好適である。この血清アルブミンを添加することにより、細胞の運動生を向上できるとともに、試験管壁に細胞が付着することを抑制でき、作業性が良好となる。
細胞低温傷害防止液は、長鎖アルコールおよび脂質を希釈液に添加し、超音波処理することにより製造することができる。
【００１７】
希釈液としては、ＢＴＳ希釈液（Pursel, V. G. and Johnson, L. A., J. Anim. Sci., 40, pp. 99-102, 1975，成分（ｍｇ／１００ｍｌ）：Ｄ−グルコース：３７００；クエン酸ナトリウム：６００；ＮａＨＣＯ3，ＥＤＴＡ−２Ｎａ：１２５；ＫＣｌ：７５；抗生物質：１０（例えば、ゲンタマイシン、アミカシンなどのアミノ糖系抗生物質、硫酸ジべカシンなどが使用される）を用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の傷害防止液における炭素数１０〜１４の長鎖アルコール濃度は、０．０１〜０．１％程度、脂質は、０．１〜１％程度が好ましい。特に、傷害防止液における有効成分である炭素数１０〜１４の長鎖アルコール濃度は、０．０２％程度、脂質は、０．４％程度が好ましい。また、血清アルブミン濃度としては、０．２〜１％程度が好ましい。
【００１９】
【実施例】
（１）精液採取
大ヨークシャー種、ランドレース種、デュロック種から手掌圧迫法により濃厚部精液と希薄部精液を分画採取した。精液を採取した後、約３０℃で保温して２時間以内に下記の操作に供した。
【００２０】
（２）精子濃度調整
濃厚部精液の精子濃度をトーマ血球計算板で測定した後、希薄部精液を１２００×Ｇで１５分間遠心分離して得た精漿を加え、精子濃度が４×１０cells／ｍｌになるように調整した。
【００２１】
（３）傷害防止液による処理
基本希釈液にはＢＴＳ（Pursel, V. G. and Johnson, L. A., J. Anim. Sci., 40, pp. 99-102, 1975，成分（ｍｇ／１００ｍｌ）：Ｄ−グルコース：３７００；クエン酸ナトリウム：６００；ＮａＨＣＯ3，ＥＤＴＡ−２Ｎａ：１２５；ＫＣｌ：７５；ゲンタマイシン：１０）を用いた。
ＢＴＳに炭素数１０〜１４の長鎖アルコール濃度が、０．０２％、脂質濃度が、０．４％となるように添加し、超音波処理し、溶解（分散）させて、本発明の精子低温障害防止液を作成した。
そして、本発明の精子低温障害防止液を、３７℃で原精液と１：１の割合となるように希釈した。３７℃で５分間インキュベートする間に１分間にわたり手で激しく振盪撹拌した。
【００２２】
（４）コールドショック
３７℃の精液１ｍｌをガラス製小試験管（１０×６０ｍｍ）にとり、直接２〜３℃の恒温水槽に移し、１０分間インキュベートすることによりコールドショックを与えた。
【００２３】
（５）精子の評価
コールドショックの前後に精子運動率と頭帽正常率は以下の方法で調べた。精子運動率：無水カフェイン（約２０μｇ／ｍｌ）を塗布したスライドガラスの上に精液１０μｌをとり、カバーグラス（１８×１８ｍｍ）で覆い、３７℃に温度制御した位相差顕微鏡下で運動精子の割合を判定した。頭帽正常率：精液を３７℃の１％（ｖ／ｖ）ホルマリン含有ＢＴＳ溶液で希釈し、位相差顕微鏡（×７５０）下で観察した。各区ごとに２００個の精子を観察し、正常頭帽と異常頭帽の精子とに分類し、正常頭帽精子の割合（％）を頭帽正常率とした。
上記の方法を用いていくつかの実験を行った。
【００２４】
（実験１）
長鎖アルコールとして、ラウリルアルコールを、脂質として、卵黄ＰＣを用いた。比較例として、ナフタレン、デカン、卵黄ＰＣと０．２％ＯＥＰの併用したものと比較した。なお、ナフタレンは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してＢＴＳに２％（ｖ／ｖ）となるように添加した。原精液は等量のナフタレン添加ＢＴＳ液と３７℃で５分間インキュベートした。ナフタレンの精子処理濃度は０．５ｍＭとした。その結果は、図１に示す通りであった。
【００２５】
（実験２）５℃保存への利用性の検討
卵黄、ミルク、オリーブ油、トコフェロールとラウリルアルコールを組み合わせた希釈液で５℃の保存性をＢＨＴ法と比較した。卵黄とミルクはそれらの脂肪が０．４％となるように添加した。その結果は、図２に示す通りであった。
処理方法はコールドショック同様に希釈後、ＢＴＳでさらに２倍希釈して約２時間をかけて５℃に冷却して１０日間保存した。
いずれの添加区も無添加区比較して運動率、頭帽正常率は有意に高くなり、生存率ではα−トコフェロール区で有意に高くなった。油脂の中でも特にα−トコフェロールとの組み台わせが優れており、ＢＨＴ処理区と匹敵する保存性を示した。これは、両者の抗酸化作用が関与しているためと考えられる。
【００２６】
（実験３）  各種長鎖アルコールの効果
次に油脂はオリーブ油に固定して、各種アルコールを組み合わせてコールドショック防止効果を比較した。その結果は、図３に示す通りであった。
その結果、炭素数１０〜１５のアルコールが運動性、頭帽の両指標で無添加区に比較して有意に高い値を示した。特に炭素数１１〜１４のものが優れており、芳香族化合物で最も保護効果のすぐれているナフタレンに比較しても頭帽正常率は有意に高い値を示した。
【００２７】
（実験４）  凍結保存への利用性
豚精液の凍結保存にＢＦ５希釈液が広く用いられるが、この希釈液には表面活性剤のORVUS ES PASTE（ＯＥＰ）が０．５％添加されている。本実験ではＯＥＰを除いたＢＦ５を基本希釈液として用い、原法どおりの０．５％のＥＰ添加区と無添加区を対照に、各種濃度のラウリルアルコール添加区との比較を行った。凍結は最終濃度で２．５％グリセリン存在下でぺレット法により行った。その結果は、図４に示す通りであった。これより、ラウリルアルコールを０．０５％添加した区と０．５％ＯＥＰ区がいずれの指標でも無添加区より有意に高い値を示した（生存率は５％の危険率）。
【００２８】
以上の結果などより、ラウリルアルコールは、さまざまな油脂（オリーブ油やその他の植物油、各種中性脂肪、卵黄、レシチン、ミルク、トコフェロール、スクワラン、ミネラルオイル、流動パラフィンなど）と組み合わせることによりすぐれたコールドショック防止効果を示すことがわかった。
また、炭素数９から１５の直鎖アルコールとオリーブ油との組み合わせでコールドショック防止効果が認められ、特に炭素数１１から１４のアルコールの効果が高いことがわかった。
さらに、ラウリルアルコールとα−トコフェロールとの組み合わせで、５℃での保存性が高まることがわかった。
【００２９】
次に、細胞低温障害防止液の実施例を説明する。
基本希釈液にはＢＴＳ（Pursel, V. G. and Johnson, L. A., J. Anim. Sci., 40, pp. 99-102, 1975，成分（ｍｇ／１００ｍｌ）：Ｄ−グルコース：３７００；クエン酸ナトリウム：６００；ＮａＨＣＯ3，ＥＤＴＡ−２Ｎａ：１２５；ＫＣｌ：７５；ゲンタマイシン：１０）を用いた。
【００３０】
ＢＴＳにラウリルアルコール濃度が、０．０２％、α−トコフェロール濃度が、０．４％、牛血清アルブミン濃度が０．３％となるように添加し、超音波処理し、溶解（分散）させて、本発明の細胞低温障害防止液を作成した。
そして、本発明の細胞低温障害防止液を、上述した実施例と同様に調整した原精液に、３７℃で原精液と１：１の割合となるように希釈した。３７℃で５分間インキュベートする間に１分間にわたり手で激しく振盪撹拌した。
３７℃の精液１ｍｌをガラス製小試験管（１０×６０ｍｍ）にとり、直接２〜３℃の恒温水槽に移し、１０分間インキュベートすることによりコールドショックを与えた。
【００３１】
そして、上述した精子の評と同じ方法を用いて、牛血清アルブミンを添加しないものと比較したところ、牛血清アルブミンを添加したものの方が細胞の運動生が良好であった。また、試験管壁に付着する細胞数も少なく、作業性も良好であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の精子低温傷害防止液は、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有している。このため、精子を２〜３℃に急速冷却することによるコールドショックを加えた後にも、精子の生理的機能を実質的に保持することができる。
本発明の細胞低温傷害防止液は、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンを含有する。このため、細胞を２〜３℃に急速冷却することによるコールドショックを加えた後にも、細胞の生理的機能を実質的に保持することができる。さらに、血清アルブミンを含有するので、細胞の運動生を向上できるとともに、調整に使用する器具、例えば、試験管壁に細胞が付着することを抑制でき、作業性が良好となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例の精子低温障害防止液と比較例の精子低温障害防止液とを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例の精子低温障害防止液と比較例の精子低温障害防止液とを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例の精子低温障害防止液と比較例の精子低温障害防止液とを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例の精子低温障害防止液と比較例の精子低温障害防止液とを用いた実験の結果を示すグラフである。
【図１】
0003947265.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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