(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載の塩基配列、すなわち、
CAGCAATGAA TGGCTTTGCA TCCTTGCTTC GAAGAAACCA ATTTATCCTC CTGGTACTAT
TTCTTTTGCA AATTCAGAGT CTGGGTCTGG ATATTGATAG CCGTCCTACC GCTGAAGTCT
GTGCCACACA CACAATTTCA CCAGGACCCA AAGGAGATGA TGGTGAAAAA GGAGATCCAG
GAGAAGAGGG AAAGCATGGC AAAGTGGGAC GCATGGGGCC GAAAGGAATT AAAGGAGAAC
TGGGTGATAT GGGAGATCGG GGCAATATTG GCAAGACTGG GCCCATTGGG AAGAAGGGTG
ACAAAGGGGA AAAAGGTTTG CTTGGAATAC CTGGAGAAAA AGGCAAAGCA GGTACTGTCT
GTGATTGTGG AAGATACCGG AAATTTGTTG GACAACTGGA TATTAGTATT GCCCGGCTCA
AGACATCTAT GAAGTTTGTC AAGAATGTGA TAGCAGGGAT TAGGGAAACT GAAGAGAAAT
TCTACTACAT CGTGCAGGAA GAGAAGAACT ACAGGGAATC CCTAACCCAC TGCAGGATTC
GGGGTGGAAT GCTAGCCATG CCCAAGGATG AAGCTGCCAA CACACTCATC GCTGACTATG
TTGCCAAGAG TGGCTTCTTT CGGGTGTTCA TTGGCGTGAA TGACCTTGAA AGGGAGGGAC
AGTACATGTT CACAGACAAC ACTCCACTGC AGAACTATAG CAACTGGAAT GAGGGGGAAC
CCAGCGACCC CTATGGTCAT GAGGACTGTG TGGAGATGCT GAGCTCTGGC AGATGGAATG
ACACAGAGTG CCATCTTACC ATGTACTTTG TCTGTGAGTT CATCAAGAAG AAAAAGTAAC
TTCCCTCATC CTACGTATTT GCTATTTTCC TGTGACCGTC ATTACAGTTA TTGTTATCCA
TCCTTTTTTT CCTGATTGTA CTACATTTGA TCTGAGTCAA CATAGCTAGA AAATGCTAAA
CTGAGGTATG GAGCCTCCAT CATCATGCTC TTTTGTGATG ATTTTCATAT TTTCACACAT
GGTATGTTAT TGACCCAATA ACTCGCCAGG TTACATGGGT CTTGAGAGAG AATTTTAATT
ACTAATTGTG CACGAGATAG TTGGTTGTCT ATATGTCAAA TGAGTTGTTC TCTTGGTATT
TGCTCTACCA TCTCTCCCTA GAGCACTCTG TGTCTATCCC AGTGGATAAT TTCCCAGTTT
ACTGGTGATG ATTAGGAAGG TTGTTGATGG TTAGGCTAAC CTGCCCTGGC CCAAAGCCAG
ACATGTACAA GGGCTTTCTG TGAGCAATGA TAAGATCTTT GAATCCAAGA TGCCCAGATG
TTTTACCAGT CACACCCTAT GGCCATGGCT ATACTTGGAA GTTCTCCTTG TTGGCACAGA
CATAGAAATG CTTTAACCCC AAGCCTTTAT ATGGGGGACT TCTAGCTTTG TGTCTTGTTT
CAGACCATGT GGAATGATAA ATACTCTTTT TGTGCTTCTG ATCTATCGAT TTCACTAACA
TATACCAAGT AGGTGCTTTG AACCCCTTTC TGTAGGCTCA CACCTTAATC TCAGGCCCCT
ATATAGTCAC ACTTTGATTT AAGAAAAACG GAGCC
で示される塩基配列からなり、かつコレクチンタンパク質の発現をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
高いストリンジェンシー条件下にて、請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつコレクチンタンパク質、すなわち、(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域(ＣＲＤ)、(２)ネック領域、(３)コラーゲン様領域、および(４)システインを含むＮ末端領域を含むヒトコレクチンタンパク質をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるコレクチンタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列、すなわち、
Met-Asn-Gly-Phe-Ala-Ser-Leu-Leu-Arg-Arg-Asn-Gln-Phe-Ile-Leu-Leu-
Val-Leu-Phe-Leu-Leu-Gln-Ile-Gln-Ser-Leu-Gly-Leu-Asp-Ile-Asp-Ser-
Arg-Pro-Thr-Ala-Glu-Val-Cys-Ala-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Pro-
Lys-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Pro-Gly-Glu-Glu-Gly-Lys-His-
Gly-Lys-Val-Gly-Arg-Met-Gly-Pro-Lys-Gly-Ile-Lys-Gly-Glu-Leu-Gly-
Asp-Met-Gly-Asp-Arg-Gly-Asn-Ile-Gly-Lys-Thr-Gly-Pro-Ile-Gly-Lys-
Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Leu-Leu-Gly-Ile-Pro-Gly-Glu-Lys-
Gly-Lys-Ala-Gly-Thr-Val-Cys-Asp-Cys-Gly-Arg-Tyr-Arg-Lys-Phe-Val-
Gly-Gln-Leu-Asp-Ile-Ser-Ile-Ala-Arg-Leu-Lys-Thr-Ser-Met-Lys-Phe-
Val-Lys-Asn-Val-Ile-Ala-Gly-Ile-Arg-Glu-Thr-Glu-Glu-Lys-Phe-Tyr-
Tyr-Ile-Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Arg-Glu-Ser-Leu-Thr-His-Cys-
Arg-Ile-Arg-Gly-Gly-Met-Leu-Ala-Met-Pro-Lys-Asp-Glu-Ala-Ala-Asn-
Thr-Leu-Ile-Ala-Asp-Tyr-Val-Ala-Lys-Ser-Gly-Phe-Phe-Arg-Val-Phe-
Ile-Gly-Val-Asn-Asp-Leu-Glu-Arg-Glu-Gly-Gln-Tyr-Met-Phe-Thr-Asp-
Asn-Thr-Pro-Leu-Gln-Asn-Tyr-Ser-Asn-Trp-Asn-Glu-Gly-Glu-Pro-Ser-
Asp-Pro-Tyr-Gly-His-Glu-Asp-Cys-Val-Glu-Met-Leu-Ser-Ser-Gly-Arg-
Trp-Asn-Asp-Thr-Glu-Cys-His-Leu-Thr-Met-Tyr-Phe-Val-Cys-Glu-Phe-
Ile-Lys-Lys-Lys-Lys
で示されるアミノ酸配列、からなることを特徴とするコレクチンタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のコレクチンタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域(ＣＲＤ)、(２)ネック領域、(３)コラーゲン様領域、および(４)システインを含むＮ末端領域を含む、ことを特徴とするコレクチンタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体防御機構の解明に有用であり、また抗ウイルス活性などを含む生理活性を有することが期待され、医薬品用途への応用が可能であると考えられる、新規コレクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
コレクチンは、Ｃａ2+要求性の糖認識領域（CRD）及びコラーゲン様領域を有するタンパク質の総称であり、細菌、ウイルスを始め様々な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている。
【０００３】
これまでに見出されているコレクチンとして、マンナン結合タンパク質（MBP） 、サーファクタントタンパク質Ａ（SP-A）およびサーファクタントタンパク質Ｄ（SP-D）、コングルチニンなどを挙げることができる。これらのコレクチンは、図１（ａ）に示すような、（１）Ｃａ2+要求性の糖認識領域（CRD）、（２）ネック領域、（３）コラーゲン様領域、及び（４）システインを含むＮ末端領域の４種の特徴的な領域を含む基本構造から構成されていることが知られており〔Malhortraら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）、22巻、1437〜1445頁、1992年〕、この基本構造３個がコラーゲン様領域においてトリプルヘリックスを構成することによりサブユニットを形成し、さらにこのサブユニットが３量体、４量体、６量体等のオリゴマー構造を形成している。
【０００４】
脊椎動物では、細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌、ウイルスなどの侵入に対する最大の生体防御システムと考えられている。最近になって、コングルチニン等のレクチンによる非特異的な免疫応答への関与が示唆され、例えば、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしているとの報告がなされている〔Superら、ランセット（Lancet）、2巻、1236〜1239頁、1989年〕。さらに、宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、例えば、MBPの遺伝子上の変異に起因したMBPの血中濃度の低下によって、宿主が感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている〔Sumiyaら、ランセット、337巻、1569〜1570頁、1991年〕。
【０００５】
本発明者らのグループは、以前に、コングルチニンおよびマンナン結合タンパク質が、H1およびH3タイプのインフルエンザＡウイルスの感染や赤血球凝集活性を阻害することを見出した〔Wakamiyaら、グライココンジュゲイト・ジャーナル（Glycoconjugate J.）、８巻、 235頁、1991年；Wakamiyaら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ（Biochem. Biophys. Res. Comm.）、 187巻、1270〜1278頁、1992年〕。
【０００６】
その後さらに、コングルチニンをコードするcDNAクローンを取得し、コングルチニンと種々のサーファクタントタンパク質Ｄ遺伝子との間の強い関連性も見出されている〔Suzukiら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ、191巻、335〜342頁、1993年〕。
【０００７】
このように、コレクチンは、生体防御機構の解明における有用性及び生理活性医薬物質としての有用性などが期待される物質であるが、このファミリーに属するさらなる他分子種の存在についての報告はなされていないという現状にある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであり、特にヒトの体内で抗細菌、ウイルス活性などの生理活性を発揮することが期待される新規コレクチンを得ることを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
１）  配列番号：１で示される塩基配列からなり、かつコレクチンタンパク質の発現をコードするポリヌクレオチド、
２） 高いストリンジェンシー条件下にて、１）に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズでき、かつコレクチンタンパク質、すなわち、(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域（ＣＲＤ）、(２)ネック領域、(３)コラーゲン様領域、および(４)システインを含むＮ末端領域を含む、ヒトコレクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
３） ２）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるコレクチンタンパク質、
４）  配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるコレクチンタンパク質、ならびに
５） ４）に記載のコレクチンタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域(ＣＲＤ)、(２)ネック領域、(３)コラーゲン様領域、および(４)システインを含むＮ末端領域を含む、コレクチンタンパク質をその要旨とする。 また、本発明は、コレクチンに特徴的な構造を有し、従来報告されているものとは異なる新規のコレクチン遺伝子及びタンパク質を提供する。
【００１０】
上記のごとき、本発明によって提供される新規コレクチン遺伝子およびタンパク質において、特に、TTTTGATGGAGGCTCCATACC（配列番号：７）およびCTGCCAACACACTCATCGCTG（配列番号：８）で示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ反応の増幅産物であるプローブ、すなわち、Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe（配列番号：３）で示されるコレクチンタンパク質のコンセンサス配列と高い相同性を有する遺伝子クローンに基づいて作製されたプローブは、高いストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって、目的のコレクチンタンパク質をコードする２）に記載のポリヌクレオチドを取得する上で好ましい。
【００１１】
また、前記ポリヌクレオチドは、好ましくはcDNAである。
【００１２】
さらに、本発明のタンパク質は、ヒト由来であることが、ヒトの体内で抗細菌、ウイルス活性などを発揮できることが期待され、生理活性医薬物質としての有用性に鑑みて好ましい。従って、本発明のタンパク質は、ヒト由来のコレクチンタンパク質を企図するものであり、様々なヒト生体組織を検討したところ、有用と考えられるコレクチンタンパク質がヒト肝臓に発現されていることが示された。
【００１３】
上記２）における高いストリンジェンシー条件下とは、例えば、５×ＳＳＣ(２０×ＳＳＣ(３Ｍ NaCl、０.３Ｍ クエン酸ナトリウム)を４倍希釈することにより５×ＳＳＣを調製）、１％ブロッキング剤（ベーリンガー・マンハイム社製）、０.１％ Ｎ-ラウロイルサルコシン、０.０２％ ＳＤＳの溶液中で、６８℃にて１時間プレハイブリダイゼーション；cDNAプローブ(10 ng/ml)を含む５×ＳＳＣ、１％ブロッキング剤、０.１％ Ｎ-ラウロイルサルコシン、０.０２％ ＳＤＳの溶液中で、55℃にて16時間ハイブリダイゼーション：２×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳ溶液で５分間２回洗浄；55℃にて、０.５×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳ溶液で、15分間２回洗浄を行う一連の処理工程を含むハイブリダイゼーションが含まれるが、当該技術分野における知識に基づき、溶液濃度や温度、時間等の条件を適宜に変更することができる。
【００１４】
また、上記５）において、(４)システインを含むＮ末端領域には、システインが少なくとも１つ、好ましくは１つ含まれる。
【００１５】
そして、上記５）における、１または数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加とは、コレクチンタンパク質の親水性・疎水性、酸性・塩基性、含有基などに大幅な変化をきたさず、上記４種の領域（特に、(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域(ＣＲＤ)および(３)コラーゲン様領域）の各々が有する特徴を変えることが少ない範囲でのアミノ酸の欠失、置換および／または付加を称する。  これまでに報告されているコレクチンファミリーのタンパク質のアミノ酸配列とその構造に基づき、例えば(１)Ｃａ2+要求性の糖認識領域(ＣＲＤ)および(２)ネック領域において１〜10程度、(３)コラーゲン様領域において１〜100程度、好ましくは１〜15、ならびに(４)システインを含むＮ末端領域とシグナル配列において１〜20程度のアミノ酸の欠失、置換および／または付加が許容されると考えられる。
【００１６】
以下に、本発明の新規コレクチンに関して、実施例に沿って詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【００１７】
すなわち、ESTデータベースの検索（実施例１）、スクリーニング用プローブの作製（実施例２）、ヒト肝臓由来cDNAライブラリーのスクリーニング（実施例３）、新規コレクチンの塩基配列の決定（実施例４）、新規コレクチンのゲノミックサザン分析（実施例５）、新規コレクチンのヒトの種々の組織に対するノーザン分析（実施例６）、新規コレクチンの種々の動物種の組織についてのゲノミックサザン分析（実施例７）ならびに新規コレクチンの遺伝学的解析（実施例８）について以下に説明する。
【００１８】
実施例１：ESTデータベースの検索
既知のコレクチンすなわち、MBP、SP-A及びSP-Dのアミノ酸配列（図２及び３参照、図中、相同と認められるアミノ酸残基部分に囲みを付した）を比較することにより、分子間に保存性の高い領域の検索を行った。この結果、ヒトMBPのアミノ酸配列における第220番目から246番目までの27アミノ酸（図３、白抜文字部分）に保存性が高いことが明かとなったので、この領域に相当するコンセンサス配列をいくつか作成し、EST（Expressed Sequence Tags）データベースの検索を行った。ESTデータベースは、1996年10月11日に、676750件の配列を含むものを使用した。
【００１９】
その結果、相同性の高いアミノ酸配列を含むデータがいくつか得られた。得られたデータのアミノ酸配列についてGenBank/ESTデータベースの検索を行い、既知または未知物質のいずれであるかを判定した結果、コンセンサス配列として、Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe（配列番号：３）で示されるアミノ酸配列を用いたときに得られたデータの中に、相同性は高いが未知の塩基配列を含むデータ（登録番号：R29493）を得ることができた。これは、22週令のヒト胎児肝臓cDNAライブラリー由来のクローン（F1-1006D）で、5'末端側の326塩基の配列を示すデータであった。
【００２０】
そこで、このデータのもとになるクローンを保有しているPohang Institute of Science & Technology（韓国、Pohang）のHee-Sup Shin氏に当該クローンを分譲していただいた。このクローンのインサートサイズは約600 bpで、5'末端側は配列番号：４に示される塩基配列に引き続き組み込まれ、3'末端はXhoIサイトでプラスミドpSK(-)（pBluescriptIISK(-)）に組み込まれていた。
【００２１】
実施例２：スクリーニング用プローブの作製
上記クローンのインサートをEcoRI及びXhoIで切り出し、pUC18に組み込み、プライマー（ファルマシア社製、M13 Universal Primer（配列番号：５、5'-フルオレセイン-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'）及びM13 Reverse Primer（配列番号：６、5'-フルオレセイン-CAGGAAACAGCTATGAC-3'））で塩基配列を決定した。
【００２２】
この塩基配列から読取枠をコレクチンのアミノ酸配列に合わせて、そこから読み取ることができるアミノ酸配列に相当する塩基配列を抽出し、この一部分に相当するジゴキシゲニン（DIG）ラベルcDNAプローブ用プライマー（Reverse プライマー、配列番号：７及びForward プライマー、配列番号：８）を、アプライドバイオシステムズ社製392A DNA/RNAシンセサイザーを用いて作製した。DIGラベルは、PCR DIGプローブ合成キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。反応組成は以下のとおりである（クローン（F1-1006D）のインサートをEcoRI及びXhoIで切り出した DNA断片（4.4 ng/μl） : 12μl（52.8 ng）、10 x緩衝液: 5μl、25 mM MgCl2 : 5μl、dNTP（PCRラベリングミックス） : 2.5μl、20μM Reverseプライマー : 2.5μl、20μM Forward プライマー : 5μl、H2O : 18μl、Taq ポリメラーゼ : 0.5μl）。PCR反応は、アトー社製ザイモリアクターを用いて、92℃１分、55℃１分、72℃２分のサイクルを35回行った。
【００２３】
実施例３：ヒト肝臓由来cDNAライブラリーのスクリーニング
先ず、以下のようにファージcDNAライブラリーのタイトレーションを行った。mLB培地（10 mM MgSO4及び0.2％マルトースを含むLB培地（1 gトリプトン、0.5 gイーストエキストラクト、0.5 g NaCl/100 ml）で37℃にて16時間培養したEscherichia coli Y1090r- 0.2 mlと、SM 緩衝液（5.8 g NaCl、2 g MgSO4・7H2O、2 M Tris-HCl（pH 7.5） 25 ml、5 ml 2％ゼラチン/L）で段階希釈したcDNAライブラリー0.1 mlを37℃15分インキュベートし、その後2.5 mlのLB-TOP アガー（0.75％アガー/LB培地）に加え均一とし、90mmφLB培地プレート（岩城硝子社製）（1.5％アガー/LB培地）にまいた。15分間室温で固化させ、42℃にて５時間インキュベーションした。各プレートのプラークを計数後、ファージのタイターを計算により求めた。その結果、タイターは2.3 x 1010 pfu/mlであった。このようにタイトレーションを行ったcDNAライブラリーにつき、実施例２で作製したプローブを用いて以下の通りにスクリーニングを行った。
【００２４】
mLB培地で37℃にて16時間培養したEscherichia coli Y1090r- 0.6mlとSM 緩衝液で希釈したcDNAライブラリー1 x 105 pfuを、37℃にて15分間インキュベートし、その後7.5 ml LB-TOP アガロース（0.75％アガロース）に加えて均一とした。これを140 mm2のLB培地角プレート（日水製薬社製）にまいたものを１０枚作製し、15分間室温で固化させ、42℃にて５時間インキュベーションした。プラーク形成を確認後、次に、ナイロンメンブレンへの転写を行った。転写は、ナイトラン（Nytran）13N （シュライヒャーアンドシュウェル社製（Schleicher and Schuell Co.））を用いて行った。12.5 cm x 9.0 cmのフィルターを蒸留水に浸けて10分間湿らせた後、ワットマン3MM紙上において余分な水分を除去し、プラークを形成したプレート上にフィルターを置いた。２分間放置した後、フィルターを剥がし、10分間風乾させた。0.2 M NaOH/1.5 M NaClにより２分間ファージDNAを変性させ、0.4 M Tris-HCl（pH7.6）/ 2 x SSCで２分間中和し、2 x SSCで２分間洗浄を行った。その後、GS GENE LINKER（バイオラッド社製）で紫外線照射することによりメンブレンに固定した。ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は以下の様に行った。フィルターを2 x SSCで湿らせ、余分な水分をワットマン3MM紙で除去し、ハイブリダイゼーションバックに移しハイブリダイゼーション溶液（5 x SSC、1％ブロッキング剤、0.1％ N-ラウロイルサルコシン、0.02％ SDS）と68℃にて１時間プレハイブリダイゼーションを行った。続いて、バックからハイブリダイゼーション溶液を除き、そこへDIGでラベルしたcDNAプローブを10 ng/mlになるように調製したハイブリダイゼーション溶液を加え、55℃にて16時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、フィルターは室温にて2 x SSC/0.1％SDS溶液で５分間、２回洗浄し、55℃にて、0.5 x SSC/0.1％SDS溶液で15分間２回洗浄した。次にDIG緩衝液Ｉ（100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl（pH7.5））で１分間、SDSを除去し、DIG緩衝液II（1％ブロッキング剤、DIG緩衝液Ｉ）で30分間、フィルターのブロッキングを行った。DIG緩衝液Ｉで１分間洗浄し、次いでDIG緩衝液IIで抗DIGアルカリフォスファターゼ標識抗体（ベーリンガー・マンハイム社製）を5000倍希釈した溶液を加えて、30分間抗体反応を室温で行った後、室温でDIG緩衝液Ｉで15分間２回洗浄した。DIG緩衝液III（100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl（pH 9.5）、50 mM MgCl2）で３分間処理することによりＭｇ2+の濃度を高め、NBT/BCIP（和光純薬社製）をDIG緩衝液IIIに加えた溶液で発色させたところ、１３個の陽性クローンが得られた。これらのクローンに相当するプラークをプレートから切り出し、SM緩衝液1 mlを入れたチューブに加え、10分間撹拌した後SM緩衝液で段階希釈し、この希釈液0.1 mlとmLB培地で37℃16時間培養したEscherichia coli Y1090r-0.2 mlを混ぜ、37℃にて15分間インキュベートした。その後、混合液を2.5 ml LB-TOPアガロースに加えて均一とし、90mmφLB培地プレートにまいたものを10枚作製し、15分間室温で固化させ、42℃にて５時間インキュベーションし、いくつかのプラークを得、一次スクリーニングと同様にして二次スクリーニングを行った。
【００２５】
実施例４：新規ヒトコレクチンの塩基配列の決定
二次スクリーニングで得られた陽性クローンのうち適切と考えられる２クローン（HLI1-3M、HLI1-9）のプラークをプレートから切り出し、SM緩衝液 1 mlを入れたチューブに加えて撹拌した後、50μlをmLB培地で37℃16時間培養したEscherichia coli Y1090r- 50μlと共にmLB培地4.95mlに加え、37℃にて16時間培養した。クロロホルム1滴を加え、３分間撹拌した後、10,000 rpmで５分間遠心分離し、上清を得た。
【００２６】
得られた上清を鋳型とし、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2（宝酒造社製）を用い、PCRによりインサートDNAを増幅させた。PCRの反応組成は以下のとおりである（上清 : 11μl、10 x LA PCR 緩衝液 II（Ｍｇ2+不含） : 2.5μl、25 mM MgCl2 : 5μl、dNTPミックス : 8μl、20μM λgt11 Reverseプライマー（配列番号：９、5'-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3'） : 2.5μl、20μM λgt11 Forwardプライマー（配列番号：１０、5'-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3'） : 1μl、LA Taq ポリメラーゼ : 0.5μl、H2O : 全容量50μlになるように添加）。PCR反応は、アプライドバイオシステムズ社製ジーンAmp PCRシステム9600を用いて、98℃10秒、68℃５分のサイクルを30回行った。PCR産物は、1％アガロースゲル電気泳動にて確認後、ゲルからの切り出しにより精製した。精製には、ファルマシア社製Sephaglas BandPrep Kitを用いた。
【００２７】
切り出したDNA断片は、インビトロジェン社製TAクローニングキットのpCR2.1ベクターに組み込んだ。組換えたベクターは、インビトロジェン社製TAクローニングキットに含まれるTOP10F'細胞に形質転換した。形質転換体をLB培地（100μg/ml アンピシリン）で培養し、アルカリSDS法により各クローンにつき２種類（HLI1-3M-1、HLI1-3M-2、HLI1-9-1、HLI1-9-2）のプラスミドを抽出し、ファルマシア社製 オートリード・シーケンシング・キットおよび A.L.F.オートシーケンサーで塩基配列の決定を行った。プライマーはまずオートリード・シーケンシング・キット添付のM13 Universal Primer（配列番号：５）およびM13 Reverse Primer（配列番号：６）を用い、以後、明らかになった塩基配列をもとにFITC（ファルマシア社製 Fluore Prime）にてラベルした以下のプライマー（3MUO〜9R3）をDNA/RNAシンセサイザーを用いて作製し、全領域の配列を決定した。
【００２８】
3MU0 : 5'-フルオレセイン-TAATGGTAGCGACCGGCGCT-3'（配列番号：１１）、
3MU1 : 5'-フルオレセイン-AAACCAATTTATACTCCTGG-3'（配列番号：１２）、
3MU2 : 5'-フルオレセイン-AATATTGGCAAGACTGGGCC-3'（配列番号：１３）、
3MR1 : 5'-フルオレセイン-GATGAGTGTGTTGGCAGCAT-3'（配列番号：１４）、
3MR2 : 5'-フルオレセイン-GTATCTTCCACAATCACAGA-3'（配列番号：１５）、
3MR3 : 5'-フルオレセイン-TTAATTCCTTTCGGCCCCAT-3'（配列番号：１６）、
3MR4 : 5'-フルオレセイン-GCAAAAGAAATAGTACCAGG-3'（配列番号：１７）、
3MR5 : 5'-フルオレセイン-CATATCACCCAGTTCTCCTT-3'（配列番号：１８）、
9U1 : 5'-フルオレセイン-AGCAGGGATTAGGGAAACTG-3' （配列番号：１９）、
9U3 : 5'-フルオレセイン-CTGTGAGCGTCATTACAGTT-3' （配列番号：２０）、
9U4 : 5'-フルオレセイン-GGTTGTCTATATGTCAAATG-3' （配列番号：２１）、
9U5 : 5'-フルオレセイン-TATGGCCATGGCTATACTTG-3' （配列番号：２２）、
7U3 : 5'-フルオレセイン-ATCGCTGACTATGTTGCCAA-3' （配列番号：２３）、
9R1 : 5'-フルオレセイン-CAAGTATAGCCATGGCCATA-3' （配列番号：２４）、
9R2 : 5'-フルオレセイン-AACTGTAATGACGCTCACAG-3' （配列番号：２５）、
9R3 : 5'-フルオレセイン-CATTTGACATATGAACAACC-3' （配列番号：２６）
その結果、得られたcDNAクローンは配列番号：１に示される1295塩基を含み、831塩基のORF（転写解読枠）を有し、配列番号：２に示される277のアミノ酸をコードしていた。
【００２９】
この塩基配列決定における概略は、図４に示す通りである。図４（ａ）に得られたコレクチンのORFが示され、この中のG-X-Yはコラーゲン様領域を表すものである。また、図４（ｂ）に、上記各プライマー名、シーケンサーにより読み取られた塩基配列（矢印により表される）、ならびにM13 Universal Primer（Ｕで表される）およびM13 Reverse Primer（Ｒで表される）を示す。
【００３０】
図５及び６には、従来報告されている３種のコレクチンタンパク質のアミノ酸配列と、本発明のコレクチンタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２及び３と同様に、相同性を有するアミノ酸残基部分に囲みを付した。
【００３１】
さらに、この新規コレクチンタンパク質の配列の構造的特徴について調べたところ、図７の模式図の通り、既知のコレクチン同様、（ａ）システインを含むＮ末端領域、（ｂ）コラーゲン様領域、（ｃ）ネック領域及び（ｄ）糖認識領域により構成されていることが示された。
【００３２】
しかしながら、GenBankデータベースでDNA及びアミノ酸についての相同性の検索を行った結果によれば、得られたタンパク質の配列は、従来見出されているコレクチンとは異なる新規のコレクチンのものであることが明らかとなった。
【００３３】
実施例５：新規コレクチンのゲノミックサザン分析
実施例４において明らかにされたcDNA配列を有する新規コレクチンの遺伝子が、シングルコピー遺伝子であるかまたはマルチコピー遺伝子であるかを明らかにするために、ゲノミックサザン分析を行った。
【００３４】
胎盤より抽出したゲノムDNAの4μg相当量を、制限酵素のEcoRI、HindIII、BamHI、XbaIまたはSacIで消化し、0.7％アガロースゲルにて、100 mAで３時間電気泳動した。泳動終了後、ナイロンメンブレン（ナイトラン13N）に転写して、分析用のメンブレンを作製した。転写は、先ず、電気泳動後のゲルを100 mlの0.25 N HClに10分間浸し、蒸留水で３回洗浄した後、100 mlの変性液（1.5 M NaCl、0.5 M NaOH）に15分間２回浸し、100 mlの中和液（0.5 M Tris-HCl、3 M NaCl（pH 6.8））に30分間浸すことによって脱プリン化、変性及び中和の処理を施し、次いでバキュームブロッティングシステム（東洋紡エンジニアリング社製、VB-30）を用いて転写した。この際、メンブレンは、2 x SSCに５分間、次に20 x SSCに５分間浸漬して前処理したものを用い、パッドは、20 x SSCをしみこませておいたものを用いた。転写終了後、UV照射により固定処理を施した。
【００３５】
サザン分析のためのハイブリダイゼーション用プローブとしては、実施例４で得られた新規コレクチンのcDNA配列のORFに相当する部分を、前記のPCR DIGプローブ合成キットを用いてDIGラベルしたDNAプローブを用いた。ハイブリダイゼーションの前に、プローブは10分間煮沸し、５分間ドライアイス／エタノールで急速凍結処理しておいた。
【００３６】
先ず、転写後のメンブレンを2 x SSCに５分間浸し、ExpressHyb Hybridization Solution（クローンテック社製）10 ml中で68℃にて30分間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、前記凍結処理後のプローブをExpressHyb Hybridization Solutionで10 ng/mlとなるように希釈し、この溶液2 mlを用いて、68℃にて１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００３７】
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、2 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで室温にて５分間ずつ２回振盪し、続いて0.2 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで68℃にて15分間ずつ２回振盪しながら行った。SDSを除去するために、DIG緩衝液Ｉ（100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl（pH 7.5））50 mlで室温にて１分間２回洗浄し、次にDIG緩衝液II’（1.5％ブロッキング剤、DIG緩衝液Ｉ）50 mlで室温にて１時間ブロッキングを行った。次いで、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉで5000倍に希釈しておいた抗DIGアルカリホスファターゼ標識抗体10 mlで30分間処理し、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉを50 ml用い室温にて20分間、振盪しながら洗浄を２回行った。10 mlのDIG緩衝液IIIに室温にて３分間２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、DIG緩衝液IIIで100倍に希釈しておいたCSPD（登録商標、ベーリンガー・マンハイム社製、化学発光基質）を全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルム57（ポラロイド社製）上で感光させた。
【００３８】
この結果、図８の各レーンに示されるように、各制限酵素で処理したゲノムDNAより、それぞれ１〜２個のシグナルしか検出されないので、得られた新規コレクチン遺伝子がシングルコピー遺伝子であることが推測された。
【００３９】
実施例６：新規コレクチンのヒトの種々の組織についてのノーザン分析
本発明の新規コレクチンのmRNAの種々の組織における発現を調べるため、ノーザンハイブリダイゼーションにより解析を行った。
【００４０】
ハイブリダイゼーション用プローブとしては、得られた新規コレクチンのcDNA配列（配列番号：１）のORFに相当する部分を、DIG RNAラベリングキット（SP6/T7、ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてDIGラベルしたRNAプローブを用い、また、メンブレンは、Human Multiple Tissue Northern（MTN）Blot（クローンテック社製）を用いて実施した。このメンブレンは、ヒト（ａ）心臓、（ｂ）脳、（ｃ）胎盤、（ｄ）肺、（ｅ）肝臓、（ｆ）骨格筋、（ｇ）腎臓、及び（ｈ）膵臓から得られたポリA+ RNAをそれぞれ2μgずつ、1.2％ホルムアルデヒド変性アガロースゲルで電気泳動した後、電荷が改変されたナイロンメンブレンに転写し、UV照射により固定処理を施したものである。
【００４１】
以上のプローブとメンブレンを用いて、下記の工程に従ってハイブリダイゼーションを行った。先ず、2 x SSCにメンブレンを５分間浸し、10mlのハイブリダイゼーション溶液（5 x SSC、10 x デンハーツ溶液、10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）、50％ホルムアミド、0.5％SDS、0.1 mg/mlサケ精子DNA）中で65℃にて３時間プレハイブリダイゼーションを行い、プローブ（10分間煮沸し、５分間ドライアイス−エタノールで急速凍結処理しておいたもの）を1μg/mlになるようにハイブリダイゼーション溶液で希釈して、この溶液2 mlを用いて65℃にて18時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００４２】
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、2 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで室温にて５分間２回振盪し、続いて0.1 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで、68℃にて15分間２回、振盪しながら行った。SDSを除去するために、50 mlのDIG緩衝液Ｉで室温にて１分間２回洗浄し、次に50 mlのDIG緩衝液II’で、室温にて１時間ブロッキングを行った。次いで、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉで5000倍に希釈しておいた抗DIGアルカリホスファターゼ標識抗体を10 ml用いて30分間処理し、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉを50 ml用い室温にて20分間、振盪しながら洗浄を２回行った。10 mlのDIG緩衝液IIIに室温にて３分間２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、DIG緩衝液IIIで100倍に希釈しておいたCSPDを全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルム612（ポラロイド社製）上で感光させた。
【００４３】
この結果を図９に示すが、本発明のコレクチンの、1.2 kbp及び3.8 kbpのmRNAが、肝臓（レーンｅ）及び胎盤（レーンｃ）で発現されており、特に肝臓において多量に発現が認められ、胎盤では若干量発現していることが明らかとなった。
【００４４】
実施例７：新規コレクチンの種々の動物についてのゲノミックサザン分析
本発明のコレクチンの遺伝子が、他の動物種において保存されているか否かを明らかにするために、ゲノミックサザン分析を実施した。
【００４５】
ハイブリダイゼーション用プローブとしては、前記の新規コレクチンのcDNA配列のORFに相当する部分を、PCR DIGプローブ合成キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてDIGラベルしたDNAプローブを用い、メンブレンは、ZOO-BLOT（クローンテック社製）を用いて実施した。このメンブレンは、（ａ）ヒト（胎盤）、（ｂ）サル（Rhesus）（腎臓）、（ｃ）ラット（Sprague-Dawley）（腎臓）、（ｄ）マウス（Balb/c）（腎臓）、（ｅ）イヌ（腎臓）、（ｆ）ウシ（腎臓）、（ｇ）ウサギ（腎臓）及び（ｈ）ニワトリ（肝臓）から得られたゲノムDNAをそれぞれ4μgずつ、制限酵素EcoRIで処理し、アガロースゲルで電気泳動した後に、電荷が改変されたナイロンメンブレンに転写し、UV照射により固定処理を施したものである。
【００４６】
以上のプローブとメンブレンを用いて、下記の工程に従ってハイブリダイゼーションを行った。先ず、2 x SSCにメンブレンを５分間浸し、10mlのExpressHyb Hybridization Solution中で65℃にて30分間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、前記と同様に凍結処理されたプローブをExpressHyb Hybridization Solutionで10 ng/mlとなるように希釈し、この溶液2 mlを用いて、65℃にて１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００４７】
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、2 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで室温にて５分間２回振盪し、続いて0.2 x SSC、0.1％SDS溶液20 mlで68℃にて15分間ずつ２回振盪しながら行った。SDSを除去するために、DIG緩衝液Ｉで室温にて１分間２回洗浄し、次に50 mlのDIG緩衝液II’で、室温にて１時間ブロッキングを行った。次いで、0.2％Tween20を含むDIG緩衝液Ｉで5000倍に希釈しておいた抗DIGアルカリホスファターゼ標識抗体を10 ml用いて30分間処理し、0.2％ Tween20を含むDIG緩衝液Ｉを50 ml用い室温にて20分間、振盪しながら洗浄を２回行った。10 mlのDIG緩衝液IIIに室温にて３分間２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、DIG緩衝液IIIで100倍に希釈しておいたCSPDを全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルム57上で感光させた。
【００４８】
この結果を図１０に示すが、ニワトリ（レーンｈ）を除くすべてのレーンにおいてシグナルが認められることから、本発明のコレクチン遺伝子は、哺乳類において保存されていることが明らかとなった。
【００４９】
実施例８：新規コレクチンの遺伝学的解析
得られたコレクチンのDNA配列に基づき、既知のコレクチンとの遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、遺伝的系統樹を作成した。
【００５０】
解析の対象としたコレクチンは、ヒトMBP（マンナン結合タンパク質）、ヒトSP-A（サーファクタントタンパク質Ａ）、ラットMBP-A、ラットMBP-C、ラットSP-D、マウスMBP-A、マウスMBP-C、ウサギMBP、サルMBP-A、サルMBP-C、ウシSP-D、ウシMBP、ウシコングルチニン（bKg）、ウシコレクチン43(CL43)であり、GenBankデータベースからそれぞれのアミノ酸配列を検索し、得られたデータをもとにレクチンドメインを含む領域を用いてclustalw法でマルチプル・アラインメントを作成し、それらをもとにN-J法を用い、Phylip Version 3.57c packageプログラムを用いて遺伝的系統樹を作成した。
【００５１】
その結果を図１１に示すが、SP-D、ウシコレクチン43及びウシコングルチニンで１つのクラスターを形成し、さらにMBP及びSP-Aでそれぞれ別々にクラスターを形成していたが、本発明のコレクチン遺伝子はこれらのいずれのクラスターにも属していないことが示された。従って、本発明のコレクチンは、従来報告されているコレクチンとは遺伝的に異なるクラスターを形成するものと推測された。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によってコレクチンに特徴的な構造を有し、従来報告されているものとは異なる新規のコレクチン遺伝子及びタンパク質が提供される。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】従来報告されている主なコレクチンの基本構造及びタンパク質の概観を示す図である。
【図２】従来報告されている３種のコレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
【図３】図２と同様のアラインメントの後半部分を示す図である。
【図４】本発明の新規コレクチンの塩基配列を決定するために使用した各プライマーの名称と、シーケンサーにより読み取られた塩基配列を示す図（ｂ）及び得られたコレクチンのORFを示す図（ａ）である。
【図５】従来報告されている３種のコレクチンと、本発明の新規コレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
【図６】図５と同様のアラインメントの後半部分を示す図である。
【図７】従来報告されている３種のコレクチンと、本発明の新規コレクチンの基本構造、すなわち、（ａ）システインを含むＮ末端領域、（ｂ）コラーゲン様領域、（ｃ）ネック領域及び（ｄ）Ｃａ2+要求性の糖認識領域の比較を示す模式図である。
【図８】本発明の新規コレクチンのゲノミックサザン分析の結果を示す写真である。
【図９】本発明の新規コレクチンの臓器分布を示す、ヒトの種々の組織、すなわち、（ａ）心臓、（ｂ）脳、（ｃ）胎盤、（ｄ）肺、（ｅ）肝臓、（ｆ）骨格筋、（ｇ）腎臓及び（ｈ）膵臓に対するノーザン分析の結果を示す写真である。
【図１０】本発明の新規コレクチンの種間での保存性を示す、種々の脊椎動物、すなわち、（ａ）ヒト、（ｂ）サル、（ｃ）ラット、（ｄ）マウス、（ｅ）イヌ、（ｆ）ウシ、（ｇ）ウサギ及び（ｈ）ニワトリにおけるゲノミックサザン分析の結果を示す写真である。
【図１１】種々のコレクチンの遺伝的系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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