(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン交換ゲルを充填したカラムを用いるリポ蛋白質の陰イオン分析方法において、陰イオン交換ゲルに吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に、過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含む溶離液を使用して高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及びカイロミクロン（ＣＭ）を分析する、陰イオン分析方法。
【請求項２】
陰イオン交換ゲルを充填したカラムを用いるリポ蛋白質の陰イオン分離方法において、陰イオン交換ゲルに吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に、過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含む溶離液を使用して高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及びカイロミクロン（ＣＭ）を分離する、陰イオン分離方法。
【請求項３】
リポ蛋白質を陰イオン交換ゲルに吸着させる際に使用する水溶液が過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含むものであり、かつ、陰イオン交換ゲルに吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に使用する溶離液に含まれる前記陰イオンのイオン強度が該水溶液中の該陰イオン以上のイオン強度であることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンは、過塩素酸イオン、ヨウ素イオン及びチオシアン酸イオンからなる群から選ばれる１種類の陰イオンであることを特徴とする、請求項１から３いずれかの方法。
【請求項５】
前記ゲルは、その表面に孔を有しない非孔性であることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項６】
溶離液の塩濃度を段階的に変化させて、カラムから高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及びカイロミクロン（ＣＭ）を分離溶出することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】
本願発明は、組織抽出液、血清、血漿などの試料中に含まれるリポ蛋白質の分析又は分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポ蛋白質は、コレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質及びアポ蛋白質が会合した複合体である。リポ蛋白質はその比重により、高密度リポ蛋白質（以下「ＨＤＬ」と記載する）、低密度リポ蛋白質（以下「ＬＤＬ」と記載する）、中間型リポ蛋白質（以下「ＩＤＬ」と記載する）、超低密度リポ蛋白質（以下「ＶＬＤＬ」と記載する）、そしてカイロミクロン（以下「ＣＭ」と記載する）などに分類される。
【０００３】
ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの比重は、それそれ０．９３０ｇ／ｍＬ以下、０．９３０から１．００６ｇ／ｍＬ、１．００６から１．０１９ｇ／ｍＬ、１．０１９から１．０６３ｇ／ｍＬ、１．０６３から１．２１０ｇ／ｍＬであり、その直径は、それぞれ７５から１２００ｎｍ、３０から８０ｎｍ、２５から３５ｎｍ、１８から２５ｎｍ、１２から９ｎｍである（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２８、ｐ１０、１９８６年）。
【０００４】
ここでＩＤＬは、ＶＬＤＬがＬＤＬに代謝される過程で生じる、ＶＬＤＬレムナントを初めとする中間体が主要成分と考えられており、また、ＣＭがリポ蛋白リパーゼの働きにより水解を受け比重が増加するとＩＤＬ分画に含まれるようになるとの報告もある（多田紀夫、高脂血症（南江堂）、ｐ２０９、１９９１年）。また一方でＩＤＬは、健常人では見られないリポ蛋白質であり、冠動脈疾患の進展を反映するとの報告があり、その分離・分析は臨床診断上重要になりつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来からリポ蛋白質を分離し分析する方法として、超遠心分離法、アガロースゲルディスク電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、ゲルろ過カラムによる分離法、イオン交換カラムによる分離法が知られている。
【０００６】
超遠心分離法では、遠心分離後の試料の入ったチューブの底からペリスターポンプで試料を抜き取り、オンラインでコレステロール酵素液を混合し、反応し、検出する方法により、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを分離検出することが出来る（Ｂｙｕｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２８、ｐ１８１、１９８６年）。しかしながら、この方法では超遠心分離器が必須で、分離自体に時間を要するため、当然に迅速分析が出来ないという課題がある。
【０００７】
アガロースゲル電気泳動及びセルロースアセテート膜電気泳動では、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬは分離可能であるが、ＬＤＬとＩＤＬ、ＩＤＬとＶＬＤＬの分離は出来ず、この結果ＩＤＬの分析を実施し得ないという課題がある。
【０００８】
ゲルろ過カラムによる分離法については、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを分離分析し得るという報告（Ｏｋａｚａｋｉら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＡＡＣＣ）、ｐ５３１、１９９７年）はあるが、ＩＤＬを分離・分析可能な方法は報告されていない。
【０００９】
陰イオン交換カラムによる分離法では、表面が親水性に富んだリポ蛋白質に対してダメージを最低限に押さえたゲル担体にジエチルアミノエチル基を導入したカラムを用いた報告（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７１６、ｐ５７、１９９８年）があるが、ＩＤＬの分離・分析については報告されていない。
【００１０】
本出願人は様々な検討を行った結果、陰イオン交換ゲル充填したカラムを用いる、特殊な装置が不要で、しかも迅速かつ簡便にリポ蛋白質を分離・分析できる本願発明を完成するに至った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
カオトロピックアニオンには、水溶液中で水の構造を乱し、疎水結合を弱める効果（カオトロピック効果）があり、その効果は、チオシアン酸イオン＞ヨウ素イオン＞過塩素酸イオン＞硝酸イオン＞臭素イオン＞塩素イオン＞酢酸イオン＞フッ素イオン＞硫酸イオンの順に弱くなる（生化学辞典（第２版）、東京化学同人、ｐ２５０、１９９０年；生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ−分離精製、東京化学同人、ｐ２７、１９７６年）。イオン交換カラムを用いる分離・分析では、塩濃度の低い水溶液で平衡化したカラムに試料を導入し、目的とする複数種の物質をゲルに吸着させた後、溶離液の塩濃度を上げてカラム内のイオン強度を上げ、イオン強度の順に吸着した物質を分離溶出する。目的とする物質が蛋白質の場合には、溶離液に塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等のカオトロピック効果の弱いイオンを用いるのが普通である。これは、カオトロピック効果により水の構造が乱れ、蛋白質表面の高次構造を歪めてしまうのを回避するためである。カオトロピック効果の強い物質を使用すると、例えば酵素では前記高次構造の歪みによって活性が低下することさえある。
【００１２】
リポ蛋白質は、コレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質及びアポ蛋白質が会合した複合体であり、該会合によってその高次構造が形成されていることから、従来のイオン交換カラムを用いる分離・分析に関する報告（ＩＤＬを含めたリポ蛋白質の分離・分析を報告するものではない）では、溶離液のイオン強度を上げるためにカオトロピック効果の弱い塩化ナトリウムを使用しているに過ぎない（例えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７１６、ｐ５７、１９９８年；特開平９−１２６２９号公報、特開平７−８９９８４号公報）。また本願発明者の検討によっても、陰イオン交換カラムを用い、吸着したリポ蛋白質を溶出させるために用いる溶離液中のカオトロピック効果の弱い塩化ナトリウム濃度を徐々に上げても、リポ蛋白質の良好な分離は実現できなかった。ところが、カオトロピック効果の強い過塩素酸ナトリウムを用いて溶離液のイオン強度を上げたところ、ＩＤＬやＶＬＤＬを含むリポ蛋白質が良好に分離されたのである。これは、カオトロピック効果の強い陰イオンを含む溶離液によってリポ蛋白質がゲル表面に非特異的に吸着することが抑制された結果と考えられる。
【００１３】
上記のようにして完成された本願請求項１の発明は、陰イオン交換ゲル充填したカラムを用いるリポ蛋白質分析方法において、吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に、過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含む溶離液を使用する分析方法である。
【００１４】
また本願請求項２の発明は、陰イオン交換ゲルを充填したカラムを用いるリポ蛋白質の分離方法において、吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に、過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含む溶離液を使用する分離方法である。
【００１５】
本願請求項３の発明は、前記請求項１又は２の発明に係り、リポ蛋白質を吸着させる際に使用する水溶液が過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含むものであり、かつ、吸着したリポ蛋白質をカラムから溶出させる際に使用する溶離液に含まれる前記陰イオンのイオン強度が該水溶液中の該陰イオン以上のイオン強度であることを特徴とする。本願請求項４の発明は、前記請求項１から３いずれかの発明に係り、前記リポ蛋白質が、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及び／又はカイロミクロン（ＣＭ）を含むことを特徴とする。
【００１６】
本願請求項５の発明は、前記請求項１から３いずれかの発明に係り、前記過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンが、過塩素酸イオン、ヨウ素イオン及びチオシアン酸イオンからなる群から選ばれる１種類の陰イオンであることを特徴とする。そして本願請求項６の発明は、前記請求項１又は２の発明に係り、前記ゲルが、その表面に５００ｎｍ以上の孔を有するか、１８ｎｍ以下の孔を有するか又は孔を有しないものであることを特徴とする。本願請求項７の発明は前記請求項４の発明に係り、溶離液の塩濃度を段階的に変化させて、カラムから高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及び／又はカイロミクロン（ＣＭ）を分離溶出することを特徴とする。以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１７】
本願発明では、シリカ系、ポリマー系等のゲルが特に制限なく使用できるが、その直径については、リポ蛋白質の良好な分離・分析を実現するためには１から１００ミクロン程度のものが好ましい。ゲルは、陰イオン交換のため、その表面に陰イオン交換基を有するが、本願発明ではジエチルアミノエチル基、トリメチルアミノエチル基、アミノ基等の、プラスチャージを有する陰イオン交換基を有するゲルを、分離・分析に導入するリポ蛋白質の推定量を十分に吸着し得る量、使用すれば良い。
【００１８】
本願発明はイオン交換クロマトグラフィーの原理に基づいてリポ蛋白質を分離・分析するものであるため、本願発明に従えば、通常はカラムからＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの順でリポ蛋白質は溶出する。ところが、１００ｎｍ程度の細孔径を持つゲルを充填したカラムを用いると、サイズ排除クロマトグラフィー的な要因によって、リポ蛋白質はＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬの順に溶出することになる。ここで、サイズ排除クロマトグラフィーでは分子量が近似したＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを分離することができないため、イオン交換クロマトグラフィーの原理に基づく本願発明による分離が影響を受ける可能性が生じる。そこで本願発明においては、径が５００ｎｍ以上か、又は１８ｎｍ以下の細孔を有するゲルを使用することが、上記サイズ排除クロマトグラフィー的な要因による影響を排除するうえで好ましいが、より好ましくは、いわゆる非多孔性といわれる細孔を有していないゲルを使用する。非多孔性のゲルであれば、前記したサイズ排除クロマトグラフィー的な要因がないからである。もっとも本願発明では、１００ｎｍ程度の細孔径を持つゲルを使用できないということではない。かかるゲルを使用する場合には、上記したサイズ排除クロマトグラフィー的な要因による影響が少なくなるように、カラム内の陰イオン交換基の数（量）を多くし、かつ、カラムの体積を小さくする等すれば良い。
【００１９】
上記の条件に適合する、市販されているゲルの一例を例示すると、ジエチルアミノエチル基を持つポリマー系のもの（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ、商品名、東ソー（株）製、非多孔性；ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、商品名、東ソー（株）製、細孔径は１００ｎｍ程度）；ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ、商品名、三
菱化学（株）製、細孔径は３０ｎｍ程度）がある。
【００２０】
上記したゲルは、通常のカラムに充填して使用する。カラムは例えばガラス、ステンレス等の金属、更には樹脂で製造した通常のものを使用することができる。その体積についても、前記した１００ｎｍ程度の細孔径を有するゲルを使用する場合には特別の注意が必要となるが、特に制限はない。
【００２１】
本願発明で用いるカオトロピック効果の強い陰イオンは、過塩素酸イオン以上の効果を有するものである。具体的には、過塩素酸イオン、ヨウ素イオン、チオシアン酸イオンが例示できる。実際には溶離液に過塩素酸、ヨウ素、チオシアン酸等を５０から２００ｍＭ程度となるように加えれば良い。なおこれらは、１種のみを使用しても良いし、２種類以上を混合して使用しても良い。
【００２２】
本願発明は、例えば試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、及び／又はＣＭをカラムから分離溶出するものである。従って、分離溶出したリポ蛋白質をそれぞれ検出すれば、各リポ蛋白質の定量分析も可能となる。なお本願発明は、必ずしも上記５種類のリポ蛋白質のそれぞれを分離・分析するためだけに使用されるものではなく、例えば試料中に上記のうちの２種類のリポ蛋白質しか含まれない場合には、それら２種類のリポ蛋白質の分離・分析のために、そして例えば試料中にＩＤＬしか含まれない場合であっても、該ＩＤＬを他の成分から分離し分析するために使用できる。
【００２３】
本願発明によるリポ蛋白質の分離・分析は、例えば以下のようにして実施される。まず、陰イオン交換ゲルを充填したカラムを、塩濃度の低い水溶液で平衡化する。この平衡化のための水溶液には、そのｐＨをリポ蛋白質が安定なｐＨ６．５から８．５の範囲に保つための緩衝作用を持たせることが好ましい。緩衝作用を与えるためには、トリス（ヒドロキシル）アミノメタン、Ｎ−２−ヒドロキシルエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンサルフォニック酸等、適当な緩衝剤を使用すれば良い。
【００２４】
次に、平衡化したカラムにリポ蛋白質を含む試料を導入し、試料中のリポ蛋白質をゲルに吸着させる。導入する試料の量は、該試料が例えば血清試料であれば、１から３０μＬ程度とすることが例示できる。またリポ蛋白質の吸着に際しては、前記平衡化に使用したのと同一の水溶液を用いる。
【００２５】
次に、ゲルに吸着した各リポ蛋白質をゲルから分離させ、カラムから溶出させる。このリポ蛋白質の分離溶出は、カラムに溶離液を導入してカラム内の水溶液の塩濃度を高める（イオン強度を高める）ことにより行う。例えば、好ましくは平衡化に用いた水溶液と同一の緩衝剤を用いて同一のｐＨに調整した、該水溶液より高いイオン強度を有する、過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンを含むように前記剤を５０から２００ｍＭ程度添加した溶離液をカラムに導入するのである。ここで、溶離液に添加されるカオトロピック効果の強い陰イオンは、リポ蛋白質の分離分析を可能とする役割とともに、溶離液のイオン強度を高めるという役割をも果たす。従って溶離液の塩濃度は、例えば主に過塩素酸イオン以上のカオトロピック効果を有する陰イオンそのもののみによって高めても良いし、例えば硝酸ナトリウム等を用いることによって主にカオトロピック効果の弱い陰イオンによって高めても良いし、また例えばカオトロピック効果を有する陰イオンとカオトロピック効果の弱い陰イオンの両方によって高めても良い。このように本願発明では、溶離液がカオトロピック効果の高い陰イオンを好ましくは５０から２００ｍＭ程度含むことのみを特徴とするものである。
【００２６】
カラム内の塩濃度を高める方法は、通常の液体クロマトグラフィーで実施されているような、段階的に塩濃度を高める方法や連続的に塩濃度を高める方法のいずれであっても良い。連続的に塩濃度を高める方法には塩濃度を直線的に高めるリニアグラディエント法、徐々に一定時間における塩濃度の高まる幅を少なくしていくコンベックスグラディエント法、徐々に一定時間における塩濃度の高まる幅を大きくしていくコーンケーブグラディエント法が知られているが、本願発明ではいずれの方法であっても良く、またこれら方法を組み合わせることもできる。具体的に例えば、塩濃度を１０ｍＭから５００ｍＭの範囲で高める場合において、３０分程度で段階的に塩濃度を高めるグラディエント法が例示できる。迅速かつ正確なリポ蛋白質の分離・分析を行うために好ましい塩濃度の高め方として、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬが溶出するまではゆるやかに塩濃度を高め、その後、ＣＭをステップグラディエント法で溶出することが例示できるが、接近して溶出するＬＤＬとＶＬＤＬの良好なる分離を実現するためには、カオトロピック効果の強い陰イオンの濃度を直線的に高め、これによって溶離液のイオン強度を高めてリポ蛋白質を分離溶出させるリニアグラディエント法の採用が特に好ましい。
【００２７】
また溶離液の塩濃度を段階的に高めることは、ＩＤＬの分離が良好となるため、ＣＭと他のリポ蛋白質との分離を行う上で、とりわけＣＭとＬＤＬ，ＶＬＤＬとの分離を行う上で好ましい方法である。具体的には、カラム当たりの交換基容量が０．１ｍ当量程度の場合には、ＨＤＬは過塩素酸ナトリウム濃度１００ｍＭ程度の溶離液で、ＬＤＬは過塩素酸ナトリウム濃度１２０ｍＭ程度の溶離液で、ＩＤＬは過塩素酸ナトリウム濃度１４０ｍＭ程度の溶離液で、ＶＬＤＬは過塩素酸ナトリウム濃度１６０ｍＭ程度の溶離液で、ＣＭは過塩素酸ナトリウム濃度５００ｍＭ程度の溶離液で、順次溶出することができる。
【００２８】
前記した例におけるカラムの平衡化は、カオトロピック効果の強い陰イオンを含む水溶液で行うこともできる。この場合は、１０から１００ｍＭ程度となるように過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等を加えた前記平衡化のための水溶液を用いることが好ましい。このように、平衡化に用いた水溶液にカオトロピック効果の強い陰イオンが含まれている場合には、同一の水溶液を溶離液としてカラムに導入し続けることにより、吸着したリポ蛋白質を分離溶出させることもできる。しかしながら発明者が知見している限りでは、この場合はリポ蛋白質の分離溶出に長い時間がかかり、しかも各リポ蛋白質の分離も不十分になることがあるため、分離溶出に当たっては前記のように溶離液のイオン強度を平衡化のために使用した水溶液のそれと比較して高めることが好ましい。このためにもカオトロピック効果の強い陰イオンを含む水溶液でカラムを平衡化する際には、１０から１００ｍＭ程度で平衡化しておくことが好ましいのである。
【００２９】
本願発明にて使用する陰イオン交換ゲル充填カラムは、好ましくはカラムあたりのイオン交換容量が０．１から１．０ミリ当量のものである。このようなカラムであれば、塩濃度が２００から６００ｍＭ程度の溶離液によって各リポ蛋白質をカラムから分離溶出することが可能となり、カオトロピック効果の強い陰イオンのみで吸着したリポ蛋白質を分離溶出することができるからである。むろん、イオン交換容量が前記以上のカラムを用いることもできるが、例えば１０ミリ当量程度のカラムの場合、ＬＤＬを分離溶出させるためには溶離液の塩濃度で２０００ｍＭ程度が必要となり、これをカオトロピック効果の強い陰イオンのみで達成すると、カラムからの分離溶出の際にリポ蛋白質の高次構造が強すぎるカオトロピック効果によって歪められる可能性があるからである。このために溶離液中のカオトロピック効果の強い陰イオンは２００ｍＭ程度を上限とするのが好ましいのであるが、この範囲でリポ蛋白質の分離溶出を行えれば溶離液に他の塩（カオトロピック効果の強いもの）を加える必要がなくなり、溶離液の調整を簡略化することができる。
【００３０】
以上の操作により、カラムからは、リポ蛋白質が分離溶出される。つまり、この段階でリポ蛋白質の分離は達成される。従って、カラムからの溶出液を分取することにより、各分離されたリポ蛋白質を得ることが可能である。
【００３１】
リポ蛋白質の分析は、上記のように分離溶出された各リポ蛋白質に対し、従来から実施されているリポ蛋白質分析法を適用することで実施できる。例えば、リポ蛋白質の構成成分であるコレステロール、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質等に着目し、これらのいずれかに特異的な酵素を用いることで分離されたそれぞれのリポ蛋白質を分析することが例示できる。具体的にコレステロールは、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを作用させ、その結果発生する過酸化水素の量を測定することにより分析することができ、トリグリセライド（中性脂肪）は、リポプロテインリパーゼとリポプロテインオキシダーゼを作用させ、その結果発生する過酸化水素の量を測定することにより分析でき、そしてリン脂質は、ホスホリパーゼとコリンオキシダーゼを作用させ、その結果発生する過酸化水素の量を測定することにより分析できる。またこれらの分析は、市販の酵素試薬を使用することにより、容易に実施可能である。かかる市販の試薬として、例えば、コレステロール分析用試薬であればデタミナーＬＴＣ（商品名、協和メディクス（株）製）、コレスカラーリキッド（商品名、東洋紡（株）製）、ピュアオートＳ  ＣＨＯ−Ｎ（商品名、第一化学薬品（株）製）、コレステロールＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）が市販されている。例えばトリグリセライド分析用試薬であれば、デタミナーＴＧ（商品名、協和メディクス（株）製）、ピュアオートＳ  ＴＧ−Ｎ（商品名、第一化学薬品（株）製）、トリグリセライドＥテストワコー（商品名、和光純薬（株）製）が市販されている。そして例えばリン脂質分析用試薬であれば、デタミナーＰＬ（商品名、協和メディクス（株）製）、リン脂質テストワコー（商品名、和光純薬（株）製）が市販されている。
【００３２】
以上に例示したように、リポ蛋白質の分析のために酵素反応を利用する場合には、カラムからの溶出液の全部又は一部を酵素液を混合して反応させ、分析すれば良いが、該酵素反応には溶出液の一部のみを供して使用する酵素の量を軽減することが好ましい。特に、後述するような液体クロマトグラフィー装置における検出部にて、カラムからの溶出液を分取することなくオンライン分析する場合、使用する酵素量を軽減する意義は大きい。
【００３３】
上記のような分析試薬を使用する以外にも、前記したような酵素を固定化した膜を過酸化水素電極上に設置した酵素センサーを使用することも可能である。また更に、例えば脂質成分の存在下で蛍光を発するｃｉｓ−パリナリン酸等を用いることもできる。
【００３４】
本願発明の分離・分析方法は、試料を導入する試料注入部、陰イオン交換ゲルを充填した陰イオン交換カラム、カオトロピック効果の強い陰イオンを含んだ溶離液を入れた容器、溶離液をカラムに送液するポンプ、カラムから分離溶出されたリポ蛋白質を測定する検出系を有する検出部、等で構成した装置により実施することができる。むろん、これらに加え、試料注入部やポンプ等を制御する制御手段や、検出部で得られたクロマトパターンを解析し数値化するための演算手段を付加すれば、自動的に試料中のリポ蛋白質を分離・分析する装置を提供することできる。リポ蛋白質の分離・分析を連続的に行う場合には、前記試料注入部として、複数の試料を載置して一定時間ごとに一定量試料を自動的かつ連続的にカラムに導入できるオートサンプラーを用いれば良い。
【００３５】
前記したように、リポ蛋白質の分離溶出にあたりカラム内のイオン強度を高める操作は、例えばカオトロピック効果の強い陰イオンを低濃度含む溶液と高濃度含む溶液の２種類を有し、それぞれの溶液を指定した流量でカラムに導入することの可能なポンプを使用したり、これら各溶液がそれぞれポンプを介してカラムに導入されるような流路を構成し、それぞれの流路に電磁弁を配置したうえで、該電磁弁の開閉を制御することにより、カラムに導入される溶離液中のカオトロピックイオン濃度を制御することにより自動的に行うことができる。
【００３６】
後述する実施例では、アクリルアミドディスク電気泳動において、ＭＩＤＢＡＮＤが確認された患者検体およびＭＩＤＢＡＮＤが確認されなかった健常人検体について検討を行った。アクリルアミドディスク電気泳動においては、患者検体において、健常人では確認されないピークが、健常人血清におけるＶＬＤＬピークとＬＤＬピークの間に見られることが知られており、そのピークはＭＩＤＢＡＮＤと呼ばれる。
【００３７】
ＭＩＤＢＡＮＤについては、詳細な解析は行われていないが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動のリポ蛋白分析において、Ｚｈａｏ  Ｓ．−Ｐ．ら（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２５，ｐ．６４１−６４９，１９９５年）は、ＶＬＤＬを比重の軽いフラクションＶＬＤＬ１と比重の重いフラクションＶＬＤＬ２とに分け、その性質を解析した結果によると、ＶＬＤＬ１とＬＤＬの間にＶＬＤＬ２が検出される。ＶＬＤＬ２はコレステロール含量が多いリポ蛋白質であり、健常人ではその量が少ないことから、ＭＩＤＢＡＮＤの主成分はＶＬＤＬ２と考えられる。またＶＬＤＬ１はコレステロール含量の少ないＶＬＤＬ分画である。
【００３８】
本発明の実施例では、検出系にコレステロール酵素液を用いているため、ＶＬＤＬ１は検出感度が低く、ＶＬＤＬ２即ちＭＩＤＢＡＮＤは検出しやすい。実際に実施例１において、ＭＩＤＢＡＮＤが含まれる患者検体では本発明でＶＬＤＬが確認され、ＭＩＤＢＡＮＤを含まない健常人検体ではＶＬＤＬピークが確認されていない。
【００３９】
市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ；商品名、東ソー（株）製）を用いて本願発明の分離・分析方法を実施したところ、硝酸ナトリウムを添加した溶離液による比較例に比べ、過塩素酸ナトリウム又はチオシアン酸ナトリウムを添加した溶離液による本願発明の方法では、良好なリポ蛋白質の分離が達成できた。また他のカラム（ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ；商品名、三菱化学（株）製）を用い、塩化ナトリウムを添加した溶離液による比較例に比べ、過塩素酸ナトリウムを添加した溶離液による本願発明の方法では、良好なリポ蛋白質の分離が達成できた。
【００４０】
また実施例では、３０ｎｍ程度の細孔径を有する多孔性ゲル（ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ；商品名、三菱化学（株）製）においてもリポ蛋白質の分離は達成できたが、非多孔性ゲル（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ；商品名、東ソー（株）製）では、より良好なリポ蛋白質の分離が達成できた。
【００４１】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により更に詳細に説明するが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
【００４２】
図１の装置を用いて実施例１から３及び比較例を行った。図１において、酵素液３は市販のコレステロール分析試薬（コレステロールＥテストワコー；商品名、和光純薬（株）製）であり、溶離液Ａ、Ｂ（それぞれ１、２）はポンプ（ＣＣＰＭ−ＩＩ；商品名、東ソー（株）製）６へ送られる前にデガッサー４（ＳＤ−８０２２；商品名、東ソー（株）製）で溶存する気体成分を除去した。なお溶離液Ａ、Ｂは、ミキサー（スタティクミキサＡ；商品名、東ソー（株）製）により均一に混合されカラムへと送られる。上記酵素液は、エアートラップ５（エアートラップＧ；商品名、東ソー（株）製）を経由してポンプ７（ＤＰ−８０２０；商品名、東ソー（株）製）へ送られる。なおポンプ７には０．２ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍの抵抗管を２本直列に接続した。
【００４３】
カラム１０としては２種類のカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−ＮＰＲ；商品名、東ソー（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ（以下カラム１とする）又はＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ；商品名、三菱化学（株）製、カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍ（以下カラム２とする））を用い、カラムの前にはフィルター９（フィルターＳ（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩ用フィルター）；商品名、東ソー（株）製）を配置した。オートサンプラー１７は市販のもの（ＡＳ−８０２０；商品名、東ソー（株）製）であり、カラムオーブン１１（ＣＯ−８０２０；商品名、東ソー（株）製）は設定温度を２５℃とした。
【００４４】
カラムからの溶出液はスプリッター（マイクロスプリッターＰ−４５０；商品名、ＵＰＣＨＵＲＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＩＮＣ．製）によって２分割し、半分量のみに対して酵素液をオンラインで加え、反応コイル１３（サイズ０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍ）に導いた。リアクター恒温器（ＣＯ−８０２０；商品名、東ソー（株）製）は設定温度３７℃とした。検出器１５（ＵＶ−８０２０；商品名、東ソー（株）製）は、測定波長が６００ｎｍである。
【００４５】
本実験で使用した試料は、同意を得た脂質代謝異常の患者から取得した血清（１検体）と健常人から取得した血清（１検体）である。試料導入量は、カラム１を用いた実験では１０μＬとし、カラム２を用いた実験では７μＬとした。溶離液の流速は、カラムからの溶出液が０．６ｍＬ／分で一定となるようにした。
【００４６】
参考例
上記した健常人血清、患者血清について、市販のリポ蛋白質分析用アクリルアミドディスク電気泳動キット（リポフォー；商品名、（株）常光製）による分析を行った。この市販試薬キットは、スダンブラックＢによる、脂質前染色キットである。分析はキットに添付されたマニュアルに従い、アクリルアミドディスク電気泳動を行った後、ゲルをデンシトメータでグラフ化した。健常人血清に関する結果及び患者血清に関する結果を図６及び図７に示す。
【００４７】
健常人血清ではＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬの３つのピークが確認でき、患者血清ではＶＬＤＬ、ＭＩＤＢＡＮＤ、ＬＤＬ及びＨＤＬの４つのピークが確認できた。
【００４８】
ＭＩＤＢＡＮＤは前述したように、コレステロール含量が多いＶＬＤＬ分画（ＶＬＤＬ２）が主成分である。アクリルアミドディスク電気泳動でのＶＬＤＬの主成分は、コレステロール含量の少ないＶＬＤＬ分画（ＶＬＤＬ１）と考えられる。
【００４９】
これらのことと実施例１から、ポリアクリルアミド電気泳動においてＭＩＤＢＡＮＤが検出される患者検体において本発明でＶＬＤＬが検出され、ポリアクリルアミド電気泳動においてＭＩＤＢＡＮＤが検出されずコレステロール含量の少ないＶＬＤＬだけが確認される健常人検体においては、本発明でＶＬＤＬのピークがはっきりとは確認できないことと一致する。
【００５０】
実施例１
図８及び図９は、カラム１、溶離液Ａ（５０ｍＭトリス（ヒドロキシル）アミノメタン（以下「Ｔｒｉｓ」と記載する。）＋１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下「ＥＤＴＡ２Ｎａ」と記載する。）ｐＨ７．５）及び溶離液Ｂ（５０ｍＭＴｒｉｓ＋１ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａ＋１０００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いた場合の、健常人血清に関する結果（図８）及び患者血清に関する結果（図９）である。
【００５１】
カラムの平衡化は溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の混合液で行い、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２０分にかけては溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の比率から溶離液Ａ８０％と溶離液Ｂ２０％の比率までのリニアグラディエントとし、２０分から２５分にかけては溶離液Ａ８０％と溶離液Ｂ２０％の比率（固定）とした。そして２５分から３０分までは溶離液Ｂ１００％の比率（固定）とし、３０分以降は、溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の比率（固定）としてカラムを平衡化し、４５分ごとに連続して試料を導入した。
【００５２】
カラム１と過塩素酸ナトリウムが添加された、即ちカオトロピック効果の強い陰イオンを含む溶離液を用いた分離・分析においては、前記参考例で得られた結果と同じ結果が得られた。すなわち、健常人血清においてＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭの３つの明確なピークが確認できたが、後述する比較例の結果と比べ、特にＬＤＬピークが鋭くなるなど、リポ蛋白質の分離が改善されていることがわかる。また患者血清においては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの明確なピークが確認された。後述する比較例に比べ分離が大きく改善されていることがわかる。
【００５３】
実施例２
図１０は、カラム１、溶離液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋１００ｍＭチオシアン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）及び溶離液Ｂ（５０ｍＭＴｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋１００ｍＭチオシアン酸ナトリウム＋５００ｍＭ硝酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いた場合の患者血清に関する結果である。
【００５４】
カラムの平衡化は溶離液Ａ１００％で行い、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２０分にかけては溶離液Ａ１００％から溶離液Ａ７５％と溶離液Ｂ２５％の比率までのリニアグラディエントとし、２０分から２５分にかけては溶離液Ａ７５％と溶離液Ｂ２５％の比率（固定）とした。そして２５分から３０分までは溶離液Ｂ１００％の比率（固定）とし、３０分以降は、溶離液Ａ１００％とした。
【００５５】
カラム１とチオシアン酸ナトリウムが添加された、即ちカオトロピック効果の強い陰イオンを含む溶離液を用いた分離・分析においても、患者血清においてＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭのピークを確認できることが分かる。
【００５６】
実施例３
図１１及び図１２は、カラム２、溶離液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ７．５）及び溶離液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋１０００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いた場合の、健常人血清に関する結果（図１１）及び患者血清に関する結果（図１２）である。
【００５７】
カラムの平衡化は溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の混合液で行い、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２０分にかけては溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の比率から溶離液Ａ８０％と溶離液Ｂ２０％の比率までのリニアグラディエントとし、２０分から２５分にかけては溶離液Ａ５５％と溶離液Ｂ４５％の比率（固定）とした。そして２５分から３０分までは溶離液Ｂ１００％の比率（固定）とし、３０分以降は、溶離液Ａ８８％と溶離液Ｂ１２％の比率（固定）でカラムを平衡化し、４５分ごとに連続して試料を導入した。
【００５８】
カラム２と過塩素酸ナトリウムが添加された、即ちカオトロピック効果の強い陰イオンを含む溶離液を用いた分離・分析においても、前記参考例で得られた結果と同じ結果が得られた。すなわち、健常人血清においてＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭの３つのピークが確認できたが、後述する比較例の結果と比べ、特にＬＤＬピークが鋭くなるなど、リポ蛋白質の分離が改善されていることがわかる。また患者血清においては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの４つのピークが確認された。後述する比較例に比べ分離が改善されていることがわかる。
【００５９】
比較例１
図２及び図３は、カラム１、溶離液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ７．５）及び溶離液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ硝酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いた場合の、健常人血清に関する結果（図２）及び患者血清に関する結果（図３）である。なおカラムの平衡化は溶離液Ａ８５％と溶離液Ｂ１５％の混合液で行い、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２０分にかけては溶離液Ａ８５％と溶離液Ｂ１５％の比率から溶離液Ａ６０％と溶離液Ｂ４０％の比率までのリニアグラディエントとし、２０分から２５分にかけては溶離液Ａ６０％と溶離液Ｂ４０％の比率（固定）とした。そして２５分から３０分までは溶離液Ｂ１００％の比率（固定）とし、３０分以降は、溶離液Ａ８５％と溶離液Ｂ１５％の比率（固定）としてカラムを平衡化し、４５分ごとに連続して試料を導入した。
【００６０】
本比較例の結果から、同一のカラム（カラム１）を用いた場合であっても、溶離液中にカオトロピック効果の強い陰イオンが含まれていない場合、前記実施例の結果と比較して、健常人血清中のＨＤＬ、ＬＤＬ及びＣＭは分離・分析可能であったものの、患者血清のクロマトパターンは健常人血清のクロマトパターンと類似しており、患者血清中のＶＬＤＬのピークを同定することはできなかった。
【００６１】
比較例２
図４及び図５は、カラム２、溶離液Ａ（２０ｍＭリン酸水素２ナトリウム＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ７．０）及び溶離液Ｂ（５０ｍＭリン酸水素２ナトリウム＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いた場合の、健常人血清に関する結果（図４）及び患者血清に関する結果（図５）である。なおカラムの平衡化は溶離液Ａ７５％と溶離液Ｂ２５％の混合液で行い、溶離液のグラディエントの設定は、試料導入時から２０分にかけては溶離液Ａ７５％と溶離液Ｂ２５％の比率から溶離液Ａ５５％と溶離液Ｂ４５％の比率までのリニアグラディエントとし、２０分から２５分にかけては溶離液Ａ５５％と溶離液Ｂ４５％の比率（固定）とした。そして２５分から３０分までは溶離液Ｂ１００％の比率（固定）とし、３０分以降は、溶離液Ａ７５％と溶離液Ｂ２５％の比率（固定）でカラムを平衡化し、４５分ごとに連続して試料を導入した。
【００６２】
本比較例では、健常人血清及び患者血清のいずれの場合にも、比較例１の場合に比べ更にリポ蛋白質の分離が不十分で、リポ蛋白質のピークと同定するのも困難であった。
【００６３】
（実験例）
実験に用いた装置は図１３に示す。溶離液A（１８）は５０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ  ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（１９）は５０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ+５００ｍＭ  過塩素酸ナトリウム  ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（２１）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（２２）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（２３）はＡＳ−８０２１（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（２６）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（２５）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２０ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（２４）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（２７）はコレステロールＥテストワコー（和光純薬製）を、反応液ラインの洗浄液（２８）は純水を用いた。コレステロール反応液と洗浄液の切り替えに３方電磁弁（２９）を設置し、ポンプ直前にエアートラップ（３０）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（３１）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、デガッサー（２０）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（３２）０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（３３）は、０．５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｍとした。検出器（３４）はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて１．４ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．７ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブン（２６）の温度は２５℃とし、反応コイル（３３）は３７℃に保温した。検出器（３４）は６００ｎｍで検出した。溶離液のグラディエントパターンは、０分から４．９分はＢの組成を１５％から３２％にリニアーグラディエントを行い、４．９分から５．９分はＢの組成を３２％に固定、５．９分から６．３分はＢの組成を１００％に固定、６．３分以降はＢの組成を１５％に固定した。８．３分サイクルで試料をオートサンプラー（２３）にてインジェクションした。試料注入量は３μＬとした。測定中は３方電磁弁（２９）をＯＮとし、コレステロール酵素液（２７）を流し、測定終了後、３方電磁弁（２９）をＯＦＦとし洗浄水を流してから装置を停止した。
【００６４】
実施例４
患者検体１、２、３を測定した。患者検体３については、４℃に一晩保存して上層に明らかにＣＭの層が確認された検体である。図１４，１５，１６に測定した結果を示した。
【００６５】
実施例５
患者検体１、２について、超遠心分離機にて、比重１．００６ｇ／ｍＬ以下のＶＬＤＬとＣＭを含んだフラクション、比重１．００６〜１．０１９ｇ／ｍＬのＩＤＬを含んだフラクション、比重１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬのＬＤＬを含んだフラクション、比重１．０６３ｇ／ｍＬ以上のＨＤＬを含んだフラクションに分けて、各フラクションを分析した。
【００６６】
患者検体１から得られたフラクションの結果を図１７，１８，１９，２０に示した。ＶＬＤＬ及びＣＭのフラクション（図１７）では１０．４０分にメインピークが、ＩＤＬのフラクション（図１８）では９．３７分にメインピークが、ＬＤＬのフラクション（図１９）では８．７３分にピークが、ＨＤＬのフラクション（図２０）では６．８６分にピークが確認された。これらのことから、患者検体１（図１４）の６．７６分のピークはＨＤＬ、８．６１分のピークはＬＤＬ、１０．１７分のピークはＶＬＤＬであることがわかる。ＩＤＬはＬＤＬとＶＬＤＬの間に溶出する。
【００６７】
患者検体２から得られたフラクションの結果を図２１，２２，２３，２４に示した。ＶＬＤＬ及びＣＭのフラクション（図２１）では１０．１６分にメインピークが、ＩＤＬのフラクション（図２２）では９．５０分にメインピークが、ＬＤＬのフラクション（図２３）では８．９９分にピークが、ＨＤＬのフラクション（図２４）では７．９８分にピークが確認された。これらのことから、患者検体１（図１５）の６．４３分と７．９０分のピークはＨＤＬ、９．０６分のピークはＬＤＬ、１０．１６分のピークはＶＬＤＬであることがわかる。ＩＤＬはＬＤＬとＶＬＤＬの間に溶出する。
【００６８】
実施例６
患者検体３について、超遠心分離機にて、比重１.０６３ｇ／ｍＬにて浮上係数４００以上のＣＭを取得した。このＣＭフラクションを本発明にて分析した（図２５）。１１．３６分にピークが検出された。このことから、患者検体３のクロマト（図１６）の１１．３３分のピークはＣＭであることが確認された。実施例５の結果を考えると、患者検体３（図１６）の５．４７分と７．１３分のピークはＨＤＬ、８，２４分のピークはＬＤＬ、１０．１２分のピークはＶＬＤＬと言える。また、患者検体２（図１５）の１２・０６分のピークは本実施例の結果から、ＣＭであると言える。
【００６９】
（実験例）
実験に用いた装置は図１３に示す。溶離液A（１８）は５０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（１９）は５０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ+５００ｍＭ  過塩素酸ナトリウム  ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（２１）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（２２）はスタティックミキサーＢ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（２３）はＡＳ−８０２１（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（２６）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（２５）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２０ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（２４）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（２７）はコレステロールＥテストワコー（和光純薬製）を、反応液ラインの洗浄液（２８）は純水を用いた。コレステロール反応液と洗浄液の切り替えに３方電磁弁（２９）を設置し、ポンプ直前にエアートラップ（３０）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（３１）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、デガッサー（２０）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（３２）０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（３３）は、０．５ｍｍＩ．Ｄ．×３１ｍとした。検出器（３４）はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブン（２６）の温度は２５℃とし、反応コイル（３３）は３７℃に保温した。検出器（３４）は６００ｎｍで検出した。溶離液のステップグラディエントパターンは、０分から３．５分はＢの組成を２０．５％に固定、３.５分から７分はＢの組成を２４．５％に固定、７分から９分はＢの組成を２７．５％に固定、９分から１２分はＢの組成を３２．５％に固定、１２分から１３分はＢの組成を１００％に固定、１３分から２０分はＢの組成を２０．５％に固定した。２０分ごとに試料を注入した。試料は、０．０５％の牛血清アルブミン溶液で２倍希釈し、７μＬを注入した。測定中は３方電磁弁（２９）をＯＮとし、コレステロール酵素液（２７）を流し、測定終了後、３方電磁弁（２９）をＯＦＦとし洗浄水を流してから装置を停止した。
【００７０】
実施例７
健常人血清および患者検体を測定した。図２６，２７に測定した結果を示した。
【００７１】
実施例８
健常人血清および患者検体について、超遠心分離機にて、比重１．００６ｇ／ｍＬ以下のＶＬＤＬとＣＭを含んだフラクション、比重１．００６〜１．０１９ｇ／ｍＬのＩＤＬを含んだフラクション、比重１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬのＬＤＬを含んだフラクション、比重１．０６３ｇ／ｍＬ以上のＨＤＬを含んだフラクションに分けた。ＶＬＤＬとＣＭを含んだフラクションについては、さらに、比重１．０６３ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数Ｓｆ４００以上のＣＭフラクションと４００未満のＶＬＤＬフラクションに分けた。各フラクションを分析した。
【００７２】
健常人血清から得られたフラクションの結果を図２８，２９，３０，３１，３２に示した。ＨＤＬフラクション（図２８）では６．２８分にメインピークが、ＬＤＬフラクション（図２９）では１０．４８分にメインピークが、ＩＤＬフラクション（図３０）では１３．５１分にメインピークが、ＶＬＤＬフラクション（図３１）では１５.４３分にメインピークが確認された。ＣＭフラクション（図３２）ではピークは検出できなかった。
【００７３】
これらの結果から、健常人血清の（図２６）の６．４０分のピークはＨＤＬ、１０．２６分のピークはＬＤＬ、１３．６４分のピークはＩＤＬ、１５．４１分のピークはＶＬＤＬであることが分かる。
【００７４】
患者血清から得られたフラクションの結果を図３３，３４，３５，３６，３７に示した。ＨＤＬフラクション（図３３）では６．２０分にメインピークが、ＬＤＬフラクション（図３４）では１０．３１分にメインピークが、ＩＤＬフラクション（図３５）では１２．１６分と１３．４８分にメインピークが、ＶＬＤＬフラクション（図３６）では１５.３９分にメインピークが、ＣＭフラクション（図３７）では１８．２７分にピークが確認された。
【００７５】
これらの結果から、患者血清の（図２７）の６．２４分のピークはＨＤＬ、１０．４２分のピークはＬＤＬ、１３．３１分のピークはＩＤＬ、１５．５０分のピークはＶＬＤＬ、１８．２３分のピークはＣＭであることが分かる。
【００７６】
【発明の効果】
本願発明は、陰イオン交換カラムを用いたリポ蛋白質分析方法において、カオトロピック効果が過塩素酸イオンと同じかそれより強い陰イオンを含む溶離液を使用する、脂質代謝異常、動脈硬化を診断等する上で重要なリポ蛋白質（ＨＤＬ，ＬＤＬ，ＩＤＬ，ＶＬＤＬ，ＣＭ）の分離・分析方法を提供するものである。
【００７７】
本願発明は、実施に当たっては通常の液体クロマトグラフィー装置を適用することが可能であるため、新たに特別な装置を導入する必要がなく、また、同一の装置及びカラムを繰り返し用いて多数の試料を次々と分離・分析に供することが可能である。
【００７８】
このように本願発明の分離・分析方法によれば、特にその分離・分析が近年ますます重要視されるようになったリポ蛋白質の分離・分析を迅速かつ正確に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例及び比較例で使用した測定装置の構成を示すものである。
【図２】比較例１における健常人血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図３】比較例１における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図４】比較例２における健常人血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図５】比較例２における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図６】参考例における健常人血清のアクリルアミドディスク電気泳動の結果であり、横軸は試料の泳動における移動距離を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図７】参考例における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質を示す。
【図８】実施例１における健常人血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図９】実施例１における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図１０】実施例２における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図１１】実施例３における健常人血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図１２】実施例３における患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。図中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭは、それぞれ高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質、カイロミクロンを示す。
【図１３】実施例４−６で使用した測定装置の構成を示す図である。
【図１４】実施例４の患者検体１の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１５】実施例４の患者検体２の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１６】実施例４の患者検体３の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１７】患者検体１のＶＬＤＬおよびＣＭフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１８】患者検体１のＩＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１９】患者検体１のＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２０】患者検体１のＨＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２１】患者検体２のＶＬＤＬおよびＣＭフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２２】患者検体２のＩＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２３】患者検体２のＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２４】患者検体２のＨＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２５】患者検体３のＣＭフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２６】実施例７の健常人血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２７】実施例７の患者血清の測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２８】実施例８の健常人血清ＨＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２９】実施例８の健常人血清ＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３０】実施例８の健常人血清ＩＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３１】実施例８の健常人血清ＶＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３２】実施例８の健常人血清ＣＭフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３３】実施例８の患者血清ＨＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３４】実施例８の患者血清ＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３５】実施例８の患者血清ＩＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３６】実施例８の患者血清ＶＬＤＬフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３７】実施例８の患者血清ＣＭフラクションの測定結果（クロマトグラム）であり、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【符号の簡単な説明】
１；溶離液Ａ、２；溶離液Ｂ、３；酵素液、４；デガッサー、５；エアートラップ、６・７；送液ポンプ、８；ミキサー、９；フィルター、１０；カラム、１１；カラムオーブン（恒温器）、１２；抵抗管、１３；反応コイル、１４；リアクター（恒温器）、１５；検出器、１６；スプリッター、１７；オートサンプラー、１８；溶離液Ａ，１９；溶離液Ｂ、２０；デガッサー、２１；溶離液用ポンプ、２２；ミキサー、２３；オートサンプラー、２４；フィルター、２５；カラム、２６；カラムオーブン、２７；コレステロール反応液、２８；洗浄液、２９；３方電磁弁、３０；エアートラップ、３１；反応液用ポンプ、３２；抵抗管、３３；反応コイル、３４；検出器
【図１】
0003922028.tif 000002
【図２】
0003922028.tif 000003
【図３】
0003922028.tif 000004
【図４】
0003922028.tif 000005
【図５】
0003922028.tif 000006
【図６】
0003922028.tif 000007
【図７】
0003922028.tif 000008
【図８】
0003922028.tif 000009
【図９】
0003922028.tif 000010
【図１０】
0003922028.tif 000011
【図１１】
0003922028.tif 000012
【図１２】
0003922028.tif 000013
【図１３】
0003922028.tif 000014
【図１４】
0003922028.tif 000015
【図１５】
0003922028.tif 000016
【図１６】
0003922028.tif 000017
【図１７】
0003922028.tif 000018
【図１８】
0003922028.tif 000019
【図１９】
0003922028.tif 000020
【図２０】
0003922028.tif 000021
【図２１】
0003922028.tif 000022
【図２２】
0003922028.tif 000023
【図２３】
0003922028.tif 000024
【図２４】
0003922028.tif 000025
【図２５】
0003922028.tif 000026
【図２６】
0003922028.tif 000027
【図２７】
0003922028.tif 000028
【図２８】
0003922028.tif 000029
【図２９】
0003922028.tif 000030
【図３０】
0003922028.tif 000031
【図３１】
0003922028.tif 000032
【図３２】
0003922028.tif 000033
【図３３】
0003922028.tif 000034
【図３４】
0003922028.tif 000035
【図３５】
0003922028.tif 000036
【図３６】
0003922028.tif 000037
【図３７】
0003922028.tif 000038