(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子ＶＩＩＩおよび凝固因子ＩＸよりなる群から選択される血漿蛋白質の水性溶液の最終薬剤製品であって、該溶液における酸素の濃度を該溶液を不活性ガスにさらして２００ｐｐｍ未満に減少させ、および／または該溶液が酸化防止剤を含有すること、ならびに該溶液は少なくとも５５０ｍｇ／ｍＬの濃度のショ糖をさらに含有することを特徴とする最終薬剤製品。
【請求項２】
不活性ガスをさらに含む請求の範囲第１項に記載の最終薬剤製品。
【請求項３】
不活性ガスが窒素である請求の範囲第２項に記載の最終薬剤製品。
【請求項４】
酸化防止剤がグルタチオン、アセチルシステインおよびメチオニンよりなる群から選択される化合物またはその混合物である請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の最終薬剤製品。
【請求項５】
血漿蛋白質が、全長組換因子ＶＩＩＩおよび全長組換因子ＶＩＩＩの欠失誘導体よりなる群から選択される組換因子ＶＩＩＩである請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の最終薬剤製品。
【請求項６】
因子ＶＩＩＩ活性が５０〜２５，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である請求の範囲第５項に記載の最終薬剤製品。
【請求項７】
因子ＶＩＩＩの比活性が少なくとも１，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇである請求の範囲第５項に記載の最終薬剤製品。
【請求項８】
凝固因子ＶＩＩＩおよび凝固因子ＩＸよりなる群から選択される血漿蛋白質の水性溶液における長期安定性を向上させる方法であって、該溶液が少なくとも５５０ｍｇ／ｍＬの濃度のショ糖をさらに含有し、該溶液をその最終容器内に不活性ガス雰囲気下で貯蔵することを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、凝固因子（coagulation factor）ＶＩＩＩおよび因子ＩＸよりなる群から選択される血漿蛋白質の水性溶液における最終薬剤製品に関するものであり、溶液における酸素の濃度を減少させかつ／または溶液が酸化防止剤を含有し、溶液はさらに少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の炭水化物を含有する。このようにして、蛋白質活性は少なくとも６か月間にわたる貯蔵の後にも実質的に保持することができる。さらに本発明は最終薬剤製品の製造方法、並びに水溶液における凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸの長期安定性の向上方法にも関するものであり、溶液は少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の炭水化物を含有し、溶液は酸素減少雰囲気下で最終容器内に貯蔵される。
発明の背景
医薬工業では一般に蛋白質の安定性が問題となる。しばしば、これはたとえば凍結乾燥のような各種の乾燥過程で蛋白質を乾燥させることにより解決されている。その後、蛋白質は乾燥した形態で分配および貯蔵される。乾燥もしくは凍結乾燥の前の溶液、乾燥された物質および再編成された生成物は、全て乾燥過程および貯蔵もしくは取扱いに際し、活性の実質的損失を回避すべく安定性でなければならない。凍結乾燥法は高価かつ時間のかかる工程であって、生産物の収率を低下させる。したがって市販製品を製造する際にこの工程を回避できれば極めて有利である。さらに患者は必ず乾燥蛋白質を使用前に溶剤にて再編成せねばならず、これは患者にとって不便である。
血友病は何世紀にもわたり知られた遺伝病であるが、各種の形態（すなわち血友病Ａおよび血友病Ｂ）を区別することが可能になったのは最後の４０年以内に過ぎない。血友病Ａは最も頻度の高い形態である。これは１０，０００人の誕生男性当たり１人または２人の発生率にて男性にのみ罹患する。この病気は、生物学上活性な凝固因子ＶＩＩＩ（アンチヘモフィリック  ファクター）、すなわち血漿中に一般に存在する蛋白質の強度の減少レベルもしくは不存在によって生ずる。血友病Ａの臨床的徴候は強度の出血傾向であり、因子ＶＩＩＩ濃厚物での処置が導入される前には問題とする患者の平均年齢は２０才未満であった。血漿から得られる因子ＶＩＩＩの濃厚物は約３０年間にわたり入手しうる。これは血友病患者の処置の状況を相当に改善し、正常な生活を送る可能性を与えた。
低濃度のたとえば因子ＶＩＩＩのような蛋白質を含む処方物は一般に精製、無菌製造、包装および投与の際に活性を失う。この問題は一般に、活性蛋白質の損失を相当に減少させるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加により解決される。ＨＳＡは精製、無菌製造および凍結乾燥の際に一般的な安定化剤として機能する［ワング等、ジャーナル・オブ・パレンテラル・サイエンス・アンド・テクノロジー、第４２巻、Ｎｏ．２Ｓ、補遺１９８８、参照］。因子ＶＩＩＩを安定化するためのＨＳＡの使用も公知であって、現在では市販の高度に精製された全ての因子ＶＩＩＩ生産物にて使用される。しかしながら、ＨＳＡの使用はコスト高であり、組換ＤＮＡ技術により製造される治療蛋白質へのＨＳＡの添加を回避することが望ましい。さらに処方賦形薬としてのＨＳＡの使用はしばしば、蛋白質特性化につき多くの最も強力かつ鋭敏な分析法の使用を制限する。
ＨＳＡを使用せずに各種の蛋白質を安定化すべく数種の溶液が提案されている。たとえばファルマシア社に係るＷＯ−Ａ−９４／２６２８６号は、直ちに使用しうる因子ＶＩＩＩ溶液の安定性を向上させる手段として、酸素濃度を減少させることを提案している。さらに、たとえば二糖類もしくは糖アルコールのような炭水化物も、低純度にて慣用の因子ＶＩＩＩ製品を含有する溶液を安定化すべく従来使用されている。たとえば、オクタファルマ社に係る特許明細書ＷＯ−Ａ−９１／１０４３９号は、因子ＶＩＩＩもしくは因子ＩＸを含有すると共に０．１〜０．９モル／Ｌの濃度にて天然もしくは合成の二糖類を含む注射溶液を開示している。
二糖類もしくは糖アルコールのような炭水化物も、ウィルスを失活させるための熱処理に際し、因子ＶＩＩＩ組成物を安定化するべく従来使用されている。たとえばグリーン・クロスに係る特許明細書ＥＰ−Ｂ−０  １１７  ０６４号は、少なくとも１，５００ｍｇ／ｍＬの糖アルコールもしくは二糖類安定化剤、好ましくはソルビトールもしくは蔗糖の存在を開示している。この方法は３０〜８０℃にて３〜２４時間にわたり或いは９０℃にて１分間行うことができる。糖アルコールもしくは二糖類を、熱処理後にたとえば限外濾過により除去する。ベーリングウェルケに係る特許明細書ＥＰ−Ａ−０  ０１８  ５６１号は、アミノ酸および２０〜６０％（ｗ／ｗ）の単糖類、オリゴ糖もしくは糖アルコールの存在を開示している。これは、溶液の比重を１と仮定して５００〜１，５００ｍｇ／ｍＬの蔗糖もしくはアルコールに相当する。この方法は３０〜１００℃にて１分間〜４８時間行うことができる。オクタファルマ社に係る特許明細書ＷＯ−Ａ−９４／１７８３４号は、蛋白質とジアルキルホスフェートもしくはトリアルキルホスフェートとを含有する組成物を５５〜６７℃にて５〜３０時間にわたり熱処理して脂質エンベロプを欠失したウィルスを失活させることを開示している。この組成物はさらに安定化剤、たとえば蔗糖、ソルビトールまたは短鎖の中性アミノ酸をも含有することができる。
クアドラント・ビオリソーシスに係るＷＯ−Ａ−８７／００１９６号は、室温での乾燥に際し蛋白質および他の巨大分子を変性しないよう防止するためのトレハロースの使用を開示している。その実施例は、試験した化合物（主として抗生物質および酵素）が乾燥過程に際し安定化されるだけでなく、比較的高い周囲温度にて長期貯蔵に対しても安定化されることを示す。因子ＶＩＩＩもしくは因子ＩＸに関する情報もなければ、減少濃度の酸素を含む水溶液についても情報が存在しない。
クアドラント・ホールジングス・ケンブリッジに係るＷＯ−Ａ−９１／１８０９１号には、糖類が生物学的物質もしくは有機化合物を安定化させるための限られた用途しか持たないと述べられている。特に、たとえば蔗糖のような非還元性糖は極めて劣った長期安定性を与えると述べられている。この問題を解決すべくＷＯ−Ａ−９１／１８０９１号は或る種の糖もしくは糖誘導体の使用を開示しており、これらは結晶化せずに乾燥することができ、トレハローズの作用を再現しうる非還元性ポリヒドロキシ化合物である。より詳細には糖もしくは糖誘導体は、（ｉ）糖アルコールおよび他の直鎖ポリアルコールから選択されたポリヒドロキシ化合物の非還元性グリコシド或いは（ｉ）ラフィノーズ、スタキオースおよびメレチトースから選択された非還元性オリゴ糖から選択される。因子ＶＩＩＩもしくは因子ＩＸに関する情報も存在しなければ、減少濃度の酸素を含む水溶液に関する情報も存在しない。
蛋白質をアルブミンの添加なしに長期の貯蔵寿命にて処方すると共に患者に安定溶液として分配しうれば血漿蛋白質の使用および製造が容易化されよう。さらに、患者にとってこの種の溶液は最終薬剤製品の取扱いを容易化させるであろう。患者は再編成なしに、最終薬剤製品の内容物を直接投与（たとえば注射）することができる。
発明の要点
すなわち因子ＶＩＩＩ溶液は、約２日間未満の時間にわたり各種の安定化剤を含有する溶液を熱処理してウィルス失活させる。しかしながら、短時間にわたり高温度にかけられた蛋白質を安定化させる技術は、数か月もしくは数年間にわたり低温度もしくは周囲温度にて貯蔵する際の安定性に直接移行させることができない。これは、一般に添加される蔗糖もしくは糖アルコールが熱処理前の工程にて故意に或いは不可避的に除去されるので特に当てはまる。これについてはシュビン等、アルツナイム・フォルシュンク／ドラグ・リサーチ、第３９（ＩＩ）巻、第１０号、第１３０２〜１３０５頁（１９８９）が参照される。さらに、処方物の無菌製造における製造可能性も考慮せねばならない。
驚くことに本発明者等は、凝固因子ＶＩＩＩもしくは因子ＩＸを含有する直ちに使用しうる水性溶液の貯蔵安定性を高比率の炭水化物の存在により劇的に向上させうることを突き止めた。さらに、高比率の炭水化物を含有する因子ＶＩＩＩ水性溶液は、炭水化物の濃度を低下させる中間工程なしに直接に無菌濾過しうることも驚異的である。
したがって本発明は、凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸよりなる群から選択される血漿蛋白質の水性溶液における最終薬剤製品に関し、溶液における酸素の濃度を減少させおよび／または溶液が酸化防止剤を含有し、さらに溶液は少なくとも６か月間にわたり貯蔵した後に蛋白質活性を実質的に保持するため少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の炭水化物を含有することを特徴とする最終薬剤製品に関するものである。
蛋白質活性は、炭水化物の濃度が４５０ｍｇ／ｍＬから最終薬剤製品の一般的な（保存）条件下での飽和点に至る範囲であれば、高度に保持される。好適には、炭水化物の濃度は５５０ｍｇ／ｍＬから最終薬剤製品の通常の条件下での飽和点に至る範囲である。好ましくは、炭水化物の濃度は６５０ｍｇ／ｍＬから最終薬剤製品の通常の条件下での飽和点に至る範囲である。各炭水化物に関する飽和濃度はたとえば温度、イオン強度、ｐＨおよび存在すれば他の賦形薬によって影響を受ける。
血漿蛋白質溶液における炭水化物の高濃度は、従来知られた血漿蛋白質製品と比較し、極めて向上した貯蔵安定性を有する最終薬剤製品をもたらす。たとえば本発明の最終薬剤製品は、蛋白質活性を実質的に保持しながら少なくとも６か月間にわたり貯蔵される。本発明において、実質的に保持される活性は、初期値の７０〜１３０％の範囲、好ましくは初期値の８０〜１２０％の範囲の活性に関係する。後者の範囲は、凍結乾燥ヒト凝固因子ＶＩＩＩの効能に関する試験の要件と一致する。たとえばヨーロッパ・ファルマコピア（１９９４）、第２７５頁には、活性を標識値の８０〜１２０％の範囲内に保持せねばならないと述べられている。好適には、本発明の最終薬剤製品は少なくとも１２か月間、好ましくは少なくとも１８か月間にわたり貯蔵されると共に、因子ＶＩＩＩ活性を実質的に維持する。より好ましくは、本発明の最終薬剤製品は少なくとも２４か月間にわたり貯蔵される。
血漿蛋白質溶液における炭水化物の高濃度も、蛋白質活性の低下を回避しうると従来予想されるよりも高い温度での貯蔵を可能にする。すなわち、本発明の最終薬剤製品は０〜４０℃の範囲の温度で貯蔵することができる。本発明の最終薬剤製品は好適には２〜３０℃の範囲の温度、好ましくは４〜２０℃の範囲の温度で貯蔵される。本発明の最終薬剤製品は１０〜２５℃の範囲の温度にて長期間にわたり貯蔵することさえ可能である。
最終薬剤製品は、最終容器内の安定な一般に注射しうる水性溶液に関する。すなわち、最終薬剤製品は直に使用しうる安定な水性溶液で構成される。最終薬剤製品は、１つもしくはそれ以上の無菌濾過工程および必要に応じ１つもしくは以上のウィルス失活工程を含む精製の後に得られる。本発明にて適する容器はたとえば小壜、注射器および注射装置である。
発明の詳細な説明
本発明の炭水化物は任意の医薬上許容しうる天然もしくは合成の炭水化物、たとえば単糖類、二糖類、オリゴ糖、多糖類もしくは糖アルコールまたはその混合物から選択することができる。天然産の二糖類の例は蔗糖（サッカロース）、トレハロース、マルトース、セロビオースおよび乳糖である。多糖類の例は澱粉およびその誘導体、並びにセルロースおよびその誘導体である。糖アルコールはヒドロキシ基を有し、各種の単糖類の還元により得られる。たとえばソルビトールはグルコースの還元により得られ、マニトールはマンノースから得られる。
本発明の炭水化物は好適には天然もしくは合成の二糖類および糖アルコール並びにその混合物よりなる群から選択される。より好適には炭水化物は、これが凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ分子の分解の危険性を減少させるため非還元性である。非還元性炭水化物の例は蔗糖、トレハロース、マニトール、ソルビトール、ガラクチトールおよびキシリトールである。好ましくは、非還元性炭水化物は蔗糖もしくはソルビトールまたはその混合物である。より好ましくは、炭水化物は蔗糖である。
さらに本発明は最終薬剤製品の製造方法にも関するものであり、この方法においては血漿蛋白質を水性溶液と混合し或いは血漿蛋白質を最終精製工程から緩衝剤水性溶液により溶出させる。その後、血漿蛋白質を含有する得られた水性溶液に炭水化物を添加する。炭水化物は、炭水化物の濃度が最終薬剤製品にて少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加される。好適には、血漿蛋白質を含有する水溶液における炭水化物の濃度は４５０ｍｇ／ｍＬから最終薬剤製品に通常の条件下での飽和点に至る範囲であり、好ましくは５５０ｍｇ／ｍＬ〜飽和点の範囲、より好ましくは６５０ｍｇ／ｍＬ〜飽和点の範囲である。
次いで血漿蛋白質と炭水化物とを含有する水性溶液を無菌濾過する。その後、炭水化物を含有する無菌血漿蛋白質溶液を最終容器に分配した後、血漿蛋白質溶液の濃度を減少させる。無菌濾過後の２工程は逆順序でも行うこともでき、すなわち炭水化物を含有する無菌血漿蛋白質溶液の酸素濃度を先ず最初に減少させた後、血漿蛋白質溶液のその最終溶液に分配する。
１具体例において、酸素の濃度は、水溶液を不活性ガス雰囲気にかけ、または圧力を低下させ、或いは先ず最初に圧力を低下させ、次いで不活性ガスを導入することにより減少される。好ましくは、この過程は数サイクルで反復される。この方法により、溶液における得られる酸素の濃度は、周囲雰囲気が空気で構成される場合よりも相当に低い。すなわち、この方法により、溶液における酸素濃度は血漿蛋白質活性の実質的損失なしに低レベルまで減少させることができる。溶液における酸素濃度は２００ｐｐｍ未満、好適には５０ｐｐｍ未満、好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは２ｐｐｍ未満とすることができる。使用する容器内の酸素含有量は、好ましくは容器を不活性ガス雰囲気にかけることにより、同様に低レベルまで減少させて維持することができる。
血漿蛋白質と炭水化物とを含有する水性溶液は好適にはたとえば窒素、アルゴンもしくはヘリウムのような不活性ガスの下で貯蔵されて酸素の低濃度を実質的に維持する。好ましくは不活性ガスは非貴不活性ガス、より好ましくは窒素である。
さらに酸素の低濃度は、酸化防止剤を水性溶液に添加しても実質的に維持することができる。すなわち他の具体例においては、無菌濾過工程の前に酸化防止剤を添加し、さらに不活性ガス雰囲気に水溶液を晒すことにより、または圧力を低下させることにより、或いは先ず最初に圧力を低下させ、次いで不活性ガスを導入することにより（好ましくは数サイクル反復）酸素の濃度を減少させる。
さらにあまり好適でない他具体例においては無菌濾過工程前に、他の手段により酸素濃度を減少させることなく酸化防止剤を水性溶液に添加する。
酸化防止剤はグルタチオン、アセチルシステイン、メチオニン、トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールもしくはフェノール性化合物から選択することができる。好ましくは酸化防止剤はグルタチオン、アセチルシステインおよびメチオニンよりなる群から選択される少なくとも１種の化合物である。酸化防止剤の濃度および全量は使用する化合物に依存する。したがって、濃度もしくは量は一般に示すことができない。しかしながら、使用する場合は酸化防止剤の全量を医薬上許容しうる量とすることが重要である。
たとえばＥＤＴＡおよびクエン酸のような錯生成剤も、これらがたとえば因子ＶＩＩＩの連鎖を結合する金属イオンよりも強力な不安定化金属イオンに対する親和性を示せば、処方物を安定化すべく小濃度で存在させることもできる。
さらに本発明は、水性溶液における血漿蛋白質の長期安定性の向上方法にも関し、この方法においては溶液が少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の炭水化物をさらに含有し、溶液を酸素減少雰囲気下に（好ましくは不活性ガス雰囲気下に）その最終容器内に貯蔵する。好適には血漿蛋白質は因子ＶＩＩＩであり、最終容器に貯蔵される水性溶液の炭水化物の濃度は４５０ｍｇ／ｍＬから最終薬剤製品の通常の条件下での飽和点に至る範囲、好ましくは５５０ｍｇ／ｍＬから飽和点に至る範囲、より好ましくは６５０ｍｇ／ｍＬから飽和点に至る範囲である。
本発明は主として凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸよりなる群から選択される血漿蛋白質に適用しうるが、これはたとえばアンチスロンビンＩＩＩのような他の血漿蛋白質についても有利に使用することができる。以下、本発明を因子ＶＩＩＩに関し一層詳細に説明する。
溶液のｐＨは好適には６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
好ましくは非イオン型表面活性剤を溶液中に存在させる。存在させる場合、非イオン型表面活性剤は好ましくはたとえばポロキサマーのようなブロックコポリマーまたはたとえばポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される。
存在させる場合、非イオン型表面活性剤は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い濃度で使用すべきである［バン・アンド・リー、ジャーナル・オブ・ファーマスーチカル・サイエンス、第６３巻、第１３６〜１３７頁（１９７４）参照］。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される。
水性溶液は塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムをも０．１Ｍより性大、好ましくは０．２５Ｍより大の濃度にて含有することができる。
水性溶液は好適には緩衝剤を１ｍＭより大、好ましくは１０〜９５ｍＭの濃度にて含有する。緩衝剤は好ましくはＬ−ヒスチジン、リジンおよびアルギニンよりなる群から選択されるアミノ酸またはその混合物である。より好ましくは緩衝剤はＬ−ヒスチジンである。
最終薬剤製品は好ましくは、
（ｉ）１０〜５０，０００ＩＵ／ｍＬの組換凝固因子ＶＩＩＩと、
（ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと、
（ｉｉｉ）好適には０．１Ｍより大、好ましくは０．２５Ｍより大の濃度における塩化ナトリウムと、
（ｉｖ）好ましくは０．５ｍＭより大の濃度におけるカルシウム塩、たとえば塩化カルシウムもしくはグルコン酸カルシウムと、
（ｖ）１ｍＭより大の濃度における緩衝剤、たとえばＬ−ヒスチジンと、
（ｖｉ）少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬの濃度における二糖類もしくは糖アルコール、好ましくは蔗糖もしくはソルビトールとを含有する水性溶液からなっている。
ヒト血漿から得られる因子ＶＩＩＩ濃縮物は、アンダーソン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第２９７９〜８３頁（１９８６年９月）により記載されたように数種の断片化された充分活性な因子ＶＩＩＩを含有する。最も小さい活性形態は１７０ｋＤａの分子量を有し、金属イオン架橋により合体された９０ｋＤａおよび８０ｋＤａの２本の鎖で構成される。
スエーデン国、ストックホルムのファルマシアＡＢ社は組換因子ＶＩＩＩ生産物を開発し、これは治療因子ＶＩＩＩ濃厚物における１７０ｋＤａ血漿因子ＶＩＩＩ型に相当する。トランケート組換因子ＶＩＩＩ分子はｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱと呼ばれ、支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により血清フリーの培地における細胞培養過程で産生される。ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱの比活性は全蛋白質１ｍｇ当たり約１５，０００ＩＵ  ＶＩＩＩ：Ｃである。ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱの構造および生化学については、ファルマシアＡＢ社に係るＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号に記載されている。
本発明において、因子ＶＩＩＩは血漿因子ＶＩＩＩもしくは組換因子ＶＩＩＩのいずれであってもよい。因子ＶＩＩＩが組換因子であれば、これは全長因子ＶＩＩＩとすることができ、好ましくは全長因子ＶＩＩＩの欠失誘導体である。より好ましくは欠失誘導体は組換因子ＶＩＩＩ  ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）である。この点に関し、欠失誘導体はＢ−ドメインの全体もしくは１部が欠損している凝固因子ＶＩＩＩとして規定される。
因子ＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との結合はカルシウム（または他の二価の金属イオン）の存在に依存する。ここではカルシウムを塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）として添加したが、たとえばグルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウムもしくはグリセプト酸カルシウムのような他の塩も、好ましくは０．５ｍＭより大の濃度で使用することができる。
本発明は広範な種類の因子ＶＩＩＩ生産物につき有利に使用することができる。すなわち本発明を使用して、既にそのキャリヤ蛋白質すなわちフォン・ウィルブランド因子（ｖＷｆ）との結合により安定化された血漿因子ＶＩＩＩをさらに安定化させることもできる。しかしながら本発明の利点は、高度に精製された因子ＶＩＩＩ生産物につき一層顕著となる。何故なら、これら生産物は精製度の低い、たとえばｖＷｆを含有する生産物よりも不安定であるからである。すなわち、少量のｖＷｆを含有する或いはｖＷｆを全く含有しない因子ＶＩＩＩ生産物は分解する傾向がずっと大である。したがって本発明は、好適には少なくとも２：１、より好ましくは少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも１００：１の因子ＶＩＩＩ：Ｃ（ＩＵ）とｖＷｆ：Ａｇ（ＩＵ）との比を示す因子ＶＩＩＩ生産物につき使用される。より好ましくは本発明の因子ＶＩＩＩ生産物はｖＷｆを含有しない。本発明の最終薬剤製品における因子ＶＩＩＩの比活性は好適には少なくとも１，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇであり、より好ましくは少なくとも３，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇである。本発明の最終薬剤製品における因子ＶＩＩＩの比活性は好ましくは少なくとも５，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇである。
最終薬剤製品における因子ＶＩＩＩ活性は１０〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは５０〜２５，０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは１００〜１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲とすることができる。
本発明は、アルブミンの添加なしに安定化されている因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸの最終薬剤製品につき有利に使用される。
以下、各種の炭水化物を含有する水溶液につき安定性データを示すことにより、限定を意図せずに以下の実施例により本発明をさらに説明する。
実験
組換因子ＶＩＩＩ  ＳＱの作成
組換因子ＶＩＩＩ  ＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）の作成は、実質的に特許ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号、実施例１〜３に記載されたように行った。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞ライン（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）を、ｒ−ＶＩＩＩＳＱ遺伝子を含有する発現ベクターおよびジヒドロホレート−レダクターゼ遺伝子を含有する発現ベクターでエレクトロポレートした。選択培地での選択の後、生存コロニーをメトトレキセートの段階的増加量における増殖により増幅させた。得られたコロニーからの上澄液を個々に因子ＶＩＩＩ活性につきスクリーニングした。産生クローンを選択し、これを次いで所定培地における血清フリーの懸濁増殖に適合させ、最後に大規模発酵過程を行った。所定時間の後に上澄液を集め、下記するようにさらに精製した。
清澄させた状態調節培地をｐＨ調整し、Ｓ−セファロースＦＦカラムに施した。洗浄の後、因子ＶＩＩＩを５ｍＭのＣａＣｌ2を含有する塩緩衝液で溶出させた。
免疫吸着を免疫親和性樹脂で行い、ここでリガンドは因子ＶＩＩＩの重鎖に指向するモノクローナル抗体（８Ａ４）とした。カラムに充填する前にＳ−溶出液を０．３％のＴＮＢＰと１％のオキトキシノール９とで処理した。カラムを平衡化させ、洗浄し、次いで因子ＶＩＩＩを０．０５ＭのＣａＣｌ2と５０％のエチレングリコールとを含有する緩衝液で溶出させた。
ｍＡｂ−溶出液をＱ−セファロースＦＦカラムに充填し、免疫親和性工程にて溶出緩衝液と平衡化させた。洗浄の後、因子ＶＩＩＩを０．０５ＭのＬ−ヒスチジンと４ｍＭのＣａＣｌ2と０．６ＭのＮａＣｌとで溶出させた（ｐＨ６．８）。
Ｑ−溶出液をゲル濾過カラム（スーパーデックス２００ｐ．ｇ．）に施した。平衡化および溶出を、Ｌ−ヒスチジンと塩化ナトリウムと塩化カルシウムとポリソルベート８０とを含有する処方緩衝液で行い（下記実施例１参照）、以下の各実施例による組成物を得た。
ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱのバルク材料を最終精製工程から受入れた。因子ＶＩＩＩの活性および不活性成分の濃度を、炭水化物を含有する適する緩衝液での希釈により調整した。次いで溶液を無菌濾過（０．２２μｍ）し、分配すると共に溶液を減圧にかけ、次いで不活性ガスを数サイクルにわたり導入して脱酸素化した。
凝固因子ＶＩＩＩの活性（因子ＶＩＩＩ：Ｃ）を色素基質分析［コーテスト因子ＶＩＩＩ、クロモゼニックスＡＢ社、メルンダール、スエーデン国］により評価した。活性化された因子Ｘ（Ｘａ）を、因子ＶＩＩＩが補因子として作用する固有の経路により発生させた。次いで因子Ｘａをスロンビン抑制剤Ｉ−２５８１の存在下で合成色素基質（Ｓ−２２２２）を使用してスロンビンによる基質の加水分解を防止することにより決定した。反応を酸で停止させ、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）の遊離に比例するＶＩＩＩ：Ｃを試薬ブランクに対し４５０ｍＭにて光学的に測定した。因子ＶＩＩＩ：Ｃの単位は国際単位（ＩＵ）として現され、これはＷＨＯにより確立されたカレント・インターナショナル・コンセントレート・スタンダード（ＩＳ）により規定される。方法の相対的標準偏差（ＲＳＤ）は７％である。
実施例１
組換因子ＶＩＩＩ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）を実験の項で説明した方法により作成した。実施例で使用した因子ＶＩＩＩは高度に精製され、すなわち５０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇより大の比活性を有すると共に、アルブミンの添加なしに安定化される。
この実施例における組成物は全て次のものを含有した：
ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ、ＩＵ／ｍＬ        １２５
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ／ｍＬ                ３
塩化ナトリウム、ｍｇ／ｍＬ              １８
塩化カルシウム、ｍＭ                      ３．４
ポリソルベート８０、ｍｇ／ｍＬ            ０．２
小壜における分配容積は１ｍＬとし、ヘッドスペースは窒素を含有し、ｐＨは約７とした。
実施例１の貯蔵試験で用いた安定化剤はＰｈ．Ｅｕｒ．品質とした。
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実施例２
組換因子ＶＩＩＩ（ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ）を実験の項で説明した方法により作成した。これら実施例で使用した因子ＶＩＩＩは高度に精製され、すなわち５，０００ＩＵ／全蛋白質ｍｇより大の比活性を有し、アルブミンの添加なしに安定化させた。
この実施例における組成物は全て次のものを含有した：
ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ、ＩＵ／ｍＬ        ５００
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ／ｍＬ                ３
塩化ナトリウム、ｍｇ／ｍＬ              １８
塩化カルシウム、ｍＭ                      ３．４
ポリソルベート８０、ｍｇ／ｍＬ            ０．２
小壜における分配容積は１ｍＬとした。
実施例２の貯蔵試験に使用した安定化剤はＰｈ．Ｅｕｒ．品質とした。
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