(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液をガラス繊維濾紙を用い、加圧又は減圧して濾過する方法において、被濾過血液がガラス繊維濾紙層に接触後少なくとも５秒間は血液入口側と濾過液出口側の圧力差を５０ｍｍＨｇ以下に保ち、その後、加圧又は減圧の程度を増加させて血液入口側と濾過液出口側の圧力差が、５０ｍｍＨｇを越えるようにするが、この圧力差は血液濾過中を通じて最大でも２００ｍｍＨｇ以下とすることを特徴とする血液濾過方法
【請求項２】
血液を濾過層に供給後所定の圧力差で吸引および／または加圧中に血液入口側と濾過液出口側の圧力差を追跡し、当該圧力差に応じてその後の吸引および／または加圧速度を調整することを特徴とする請求項１記載の血液濾過方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は全血から血漿または血清試料を調製する血液濾過方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の構成成分例えば代謝産物、蛋白質、脂質、電解質、酵素、抗原、抗体などの種類や濃度の測定は通常全血を遠心分離して得られる血漿または血清を検体として行われている。ところが、遠心分離は手間と時間がかかる。特に少数の検体を急いで処理したいときや、現場検査などには、電気を動力とし、遠心分離機を必要とする遠心法は不向きである。そこで、濾過により全血から血漿を分離する方法が検討されてきた。
【０００３】
この濾過方法には、ガラス繊維濾紙をカラムに充填し、カラムの一方から全血を注入し、加圧や減圧を行なって他方から血漿や血清を得るいくつかの方法が公知化されている（特公昭４４−１４６７３号公報、特開平２−２０８５６５号公報、特開平４−２０８８５６号公報、特公平５−５２４６３号公報等）。
【０００４】
しかし、全血から濾過により自動分析等による測定に必要な量の血漿または血清を得る方法に関しては血糖など一部の項目を除いては、いまだ試行の段階にあり、広く実用化されるに至っていない。
【０００５】
そこで、本発明者らは先に、微量な血液であっても血漿や血清を効率よく分離しうる血液濾過ユニットとして、濾材にガラス繊維濾紙と微多孔性膜を組み合わせるとともに濾材の血漿出口側にシール部材を設けて濾過材料の開口面積を狭めた血液濾過ユニットを完成した（特願平８−７６９２号）。
【０００６】
また、その吸引側に血漿受槽を設けたものも既に開発した（特願平８−９１６２１号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
一般に血液濾過は柔軟な血球が短時間で濾材表面を覆ってしまうので、血球を濾材内部に通さない表面濾過では血漿や血清の必要量を取得することが困難である。一方、血球をガラス繊維濾紙等の濾材では厚さ方向に浸透していくに従って血球をからめとっていく、いわゆる体積濾過が行われる。このガラス繊維濾紙等を用いた血液濾過では血球の漏出が早い時期から起こってしまうことがあり、また、濾過中に血球の破壊、すなわち溶血が起こりやすいという問題もあった。
【０００８】
濾過によって全血から血漿を得ようとする試みは従来からなされているが、いかにして血球の破壊、いわゆる溶血を起こさずに濾過をするかが大きな課題であり、これに関する技術は何例か開示されている。しかし、極く僅かな溶血が起こっても測定値に変動を生ずるＫイオンまで含めて正確に測定できるような濾過技術は提示されていない。
【０００９】
Ｋイオンの測定は臨床診断上最も重要な項目の一つであり、測定頻度も高い。血漿中のＫイオン濃度は健常者の場合約４ｍｅｑ／Ｌであるが、臨床診断上は僅か０．３ｍｅｑ／Ｌ程度のズレがあっても正確な判断には使えないほど測定精度の要求レベルが高い。血球内には血漿中に比べ４０倍の濃度のＫイオンが存在するので、臨床診断上実用できるレベルで血漿中のＫイオン濃度を測定するためには、血球の破壊や血球膜を通してのＫイオンの流入を防ぐことが必須要件なのである。
【００１０】
公知技術である、単独の多孔質膜やガラス繊維濾紙による血液濾過でも極く少量（数１０μｌ程度）の血漿を分離回収することは可能であったが、本願明細書において開示したように数１００μｌの血漿を分離しようとすれば、血球が濾過膜の孔の中にトラップされる際変形破壊を起こし、濾過で得られた血漿中のＫイオンが増加するので、精度の高い測定は不可能であった。
【００１１】
本願発明は、濾過により、溶血を起こさずに多量の血漿又は血清を得るという課題を解決することを目的とするが、このためには濾過の間、濾過ユニットの入口側と出口側の圧力差を管理することが極めて重要であるという発見に基づいてなされたものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討の結果、通常の吸引濾過では血液がガラス繊維濾紙の全面にゆきわたらないうちにガラス繊維濾紙の内部への浸透がはじまるため、血球の漏出がはやくなり、また、血球による目詰まりを生じやすくなっていた。この状態で必要血漿量を取るために吸引を続けると吸引力が強くなって血球破壊を起こしていることを見出した。そこで、本発明者らはさらに検討を続け、はじめ弱い吸引力で血液濾過を開始することによって血液をガラス繊維濾紙全面にゆきわたらせてから濾過を開始ししかも最大吸引力を抑制することによって、血球漏出や溶血の問題なく、必要量の血漿や血清を容易に短時間で取得できることを見出して本発明を完成するに至った。上記内容は加圧濾過を行なった場合も同様である。
【００１３】
すなわち、本発明は、血液をガラス繊維濾紙を用い、加圧又は減圧して濾過する方法において、被濾過血液がガラス繊維濾紙層に接触後少なくとも５秒間は血液入口側と濾過液出口側の圧力差を５０ｍｍＨｇ以下に保ち、その後、加圧又は減圧の程度を増加させて血液入口側と濾過液出口側の圧力差が、５０ｍｍＨｇを越えるようにするが、この圧力差は血液濾過中を通じて最大でも２００ｍｍＨｇ以下とすることを特徴とする血液濾過方法に関するものである。
【００１４】
また、上記方法において、血液を濾過層に供給後所定の圧力差で吸引および／または加圧中に血液入口側と濾過液出口側の圧力差を追跡し、当該圧力差に応じてその後の吸引および／または加圧速度を調整することによって、血液濾過の自動化を可能にし、あるいは半自動化して作業者の負担を軽減することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
血液濾過材料はガラス繊維濾紙のみでもよく、ガラス繊維濾紙に微多孔性膜等を組み合わせたものであってもよい。ガラス繊維濾紙は低密度のものと高密度のものがあり、体積濾過に使用されるものは主として低密度のものである。本発明で使用される濾過材料は低密度ガラス繊維濾紙のみでもよいが、その場合には血球漏出を生じないようガラス繊維濾紙の空間体積と供給血液量の関係に特に注意する必要がある。
【００１６】
前述のようにガラス繊維濾紙は２種類に分けられる。
【００１７】
第１のグループは、血液がガラス繊維濾紙の厚さ方向に浸透していくに従って血球を順次トラップしていく、いわゆる体積濾過作用を主目的とするものであり、これには密度が０．０５〜０．１３程度で、素繊維の直径が約１０μｍ以下と細く、保留粒子径が約０．６μｍ以上と大きく、かつ透水速度が約０．７ｍｌ／ｓｅｃ以上と大きいものである。市販品ではワットマン社製 ＧＦ／Ｄ、アドバンテック社製 ＧＡ−１００，ＧＡ−２００等がこのグループに含まれる。以下、このグループのガラス繊維濾紙を低密度ガラス繊維濾紙と称する。
【００１８】
第２のグループは、低密度ガラス繊維濾紙から漏出してきた血球の捕捉を主目的とするもので密度が約０.１４以上と高く、保留粒子径が約０.５μｍ以下と小さく、透水速度も約０．５ｍｌ／ｓｅｃ以下と小さいものである。市販品ではワットマン社製 ＧＦ／Ｂ,ＧＦ／Ｃ,ＧＦ／Ｆ、アドバンテック社製 ＧＣ−５０，ＧＦ−７５，ＧＢ−１４０，ＱＲ−１００等がこのグループに含まれる。以下、このグループのガラス繊維濾紙を高密度ガラス繊維濾紙と称する。
【００１９】
血液濾過材料の主体となるガラス繊維濾紙は低密度ガラス繊維濾紙のほうである。
【００２０】
ガラス繊維の表面を、特開平２−２０８５６５号公報、同４−２０８８５６号公報に記載された様な方法で、親水性高分子で処理することによって濾過をより速やかに円滑に行なうことができる。また、ガラス繊維濾紙の中にレクチン、その他の反応性試薬や改質剤を添加しておいたり、直接処理することもできる。ガラス繊維濾紙は複数枚と積層して用いることができる。
【００２１】
本発明で用いられる濾過材料は特開昭６２−１３８７５６〜８号公報、特開平２−１０５０４３号公報、特開平３−１６６５１号公報等に開示された方法に従って各層を部分的に配置された接着剤で接着して一体化することができる。
【００２２】
本方式により濾過し得る全血の量は、ガラス繊維濾紙中に存在する空間体積と全血中の血球の体積に大きく影響される。ガラス繊維濾紙の密度が高い（粒子保持孔径が小さい）と赤血球がガラス繊維濾紙の表面近傍にトラップされるので、表面からごく浅い領域でガラス繊維濾紙中の空間が閉塞状態になってしまうことが多い。従って、それ以上の濾過が進まず、結果として濾過、回収し得る血漿量も少なくなる。この際、回収血漿量を増やそうとして更に強い条件で吸引すると、血球の破壊、すなわち溶血が起きてしまう。つまり表面濾過に近いプロセスとなり、濾紙の空間体積利用効率は低い。
【００２３】
空間体積あるいは血漿濾過量に対応する指標として、透水速度が有効である。透水速度は、入口と出口をチューブに接続できるように絞った濾過ユニット中に一定面積のガラス繊維濾紙を密閉保持し、一定量の水を加えて一定圧力で加圧または減圧したときの、単位面積あたりの濾過量を速度で表したものであり、ｍｌ／ｓｅｃ等の単位を持つ。
【００２４】
具体例としては、濾過ユニット中に直径２０ｍｍのガラス繊維濾紙をセットし、その上に１００ｍｌの注射筒をたてて６０ｍｌの水を入れて自然流下させ、開始後１０秒と４０秒の間の３０秒間にガラス濾紙中を通り抜けた水の量をもって透水量とし、これから単位面積あたりの透水速度を算出する。
【００２５】
低密度ガラス繊維濾紙の厚さは、回収すべき血漿量とガラス繊維濾紙の密度（空隙率）及び面積から定められる。分析を乾式分析素子を用いて複数項目行なう場合の血漿の必要量は１００〜５００μｌであり、ガラス繊維濾紙の面積が１〜５ｃｍ2 程度が実用的である。この場合低密度ガラス繊維濾紙の厚さは１〜１０ｍｍ程度、好ましくは２〜８ｍｍ程度、より好ましくは３〜６ｍｍ程度である。この低密度ガラス繊維濾紙は１枚のほか複数枚、例えば１〜１０枚程度、好ましくは２〜６枚程度を積層して上記厚さとすることができる。
【００２６】
本発明の血液濾過材料では上記低密度ガラス繊維濾紙層の一部または全部に細断小片を使用することができる。１枚のガラス繊維濾紙の厚さは０．２〜３ｍｍ程度、通常０．５〜２ｍｍ程度である。これを径が１０〜３０ｍｍ程度、好ましくは１５〜２５ｍｍに細断して使用するのである。細断小片の形状は問うところではなく、正方形、長方形のほか三角形、円形等如何なる形状であってもよい。ガラス繊維濾紙の基本的に全部を使用する観点から円形にする場合には各辺が凹弧状になった小片を併用することになる。通常は４角形であり、長辺と短辺の比が１.０〜５.０程度、特に１.０〜２.５程度の範囲内にすることが好ましい。
【００２７】
細断は上記のサイズにできる市販の裁断機を使用して行えばよい。
【００２８】
細断小片の充填に際して繊維方向に特に注意する必要はない。
【００２９】
ガラス繊維濾紙の濾過液出口側には、さらに血球と血漿の分離を促進し、また、漏出血球を阻止するため微多孔性膜を配置することが好ましい。
【００３０】
この微多孔性膜は、表面を親水化されており血球分離能を有するものであり、実質的に分析値に影響を与える程には溶血することなく、全血から血球と血漿を特異的に分離するものである。この微多孔性膜は孔径がガラス繊維濾紙の保留粒子径より小さくかつ０.２μｍ以上、好ましくは０.３〜５μｍ程度、より好ましくは１〜３μｍ程度のものが適当である。また、空隙率は高いものが好ましく、具体的には、空隙率が約４０％から約９５％、好ましくは約５０％から約９５％、さらに好ましくは約７０％から約９５％の範囲のものが適当である。微多孔性膜の例としてはポリスルホン膜、弗素含有ポリマー膜、セルロースアセテート膜、ニトロセルロース膜等がある。また表面を加水分解、親水性高分子、活性剤などで親水化処理したものもある。
【００３１】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜としては、特表昭６３−５０１５９４号公報（ＷＯ ８７／０２２６７)に記載のポリテトラフルオロエチレンのフィブリル（微細繊維）からなる微多孔性のマトリックス膜（微多孔性層）、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（Ｗ.Ｌ.Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）、Ｚｉｔｅｘ（Ｎｏｒｔｏｎ社製）、ポアフロン(住友電工社製）などがある。その他に、ＵＳ ３２６８８７２（実施例３及び４）、ＵＳ ３２６０４１３（実施例３及び４）、特開昭５３−９２１９５（ＵＳ ４２０１５４８）等に記載のポリテトラフルオロエチレンの微多孔性膜、ＵＳ ３６４９５０５に記載のポリビニリデンフルオリドの微多孔性膜などがある。
【００３２】
これらの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の作成に当たっては、１種もしくは２種以上の弗素含有ポリマーを混合しても良いし、弗素を含まない１種もしくは２種以上のポリマーや繊維と混合し、製膜したものであつても良い。
【００３３】
構造としては、延伸しないもの、１軸延伸したもの、２軸延伸したもの、１層構成の非ラミネートタイプ、２層構成のラミネートタイプ、例えば繊維等の他の膜構造物にラミネートした膜等がある。
【００３４】
フイブリル構造又は一軸延伸もしくは二軸延伸した非ラミネートタイプの微多孔性膜は、延伸により、空隙率が大きくかつ濾過長の短い微多孔膜が作られる。濾過長が短い微多孔膜では、血液中の有形成分（主として赤血球）による目詰りが生じがたく、かつ血球と血漿の分離に要する時間が短いので、定量分析精度が高くなるという特徴がある。
【００３５】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は特開昭５７−６６３５９号公報(ＵＳ ４７８３３１５）に記載の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理又はコロナ放電処理）を微多孔膜層の少なくとも片面に施すことにより微多孔性膜の表面を親水化して、隣接する微多孔性膜との部分接着に用いられる接着剤の接着力を強化することができる。
【００３６】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、そのままでは、表面張力が低く乾式分析要素の血球濾過層として用いようとしても、水性液体試料ははじかれてしまって、膜の表面や内部に拡散、浸透しないことは、周知の事実である。本発明では、第１の手段として弗素含有ポリマーの微多孔性膜に親水性を付与し親水性を高める手段として、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の外部表面及び内部の空隙の表面を実質的に親水化するに充分な量の界面活性剤を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に含浸させることにより、前記の水性液体試料がはじかれる問題点を解決した。
【００３７】
水性液体試料がはじかれることなく膜の表面や内部に拡散、浸透、移送されるに充分な親水性を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に付与するには、一般に、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の空隙体積の約０．０１％から約１０％、好ましくは約０．１％から約５．０％、更に好ましくは０．１％から１％の界面活性剤で微多孔性膜の空隙の表面が被覆されることが必要である。例えば、厚さが５０μｍの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の場合に、含浸される界面活性剤の量は、一般に０．０５ｇ／ｍ2から２．５ｇ／ｍ2の範囲であることが好ましい。弗素含有ポリマーの微多孔性膜に界面活性剤を含浸させる方法としては、界面活性剤の低沸点（沸点約５０℃から約１２０℃の範囲が好ましい）の有機溶媒（例、アルコール、エステル、ケトン）溶液に弗素含有ポリマーの微多孔性膜を浸漬し、溶液を微多孔性膜の内部空隙に実質的に充分に行きわたらせた後、微多孔性膜を溶液から静かに引き上げ、風(温風が好ましい)を送り乾燥させる方法が一般的である。
【００３８】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜を親水性化処理に用いられる界面活性剤としては、非イオン性（ノニオン性）、陰イオン性（アニオン性）、陽イオン性（カチオン性）、両性いずれの界面活性剤をも用いることができる。
【００３９】
これらの界面活性剤のうちでは、ノニオン性界面活性剤が、赤血球を溶血させる作用が比較的低いので、全血を検体とするための多層分析要素においては有利である。ノニオン性界面活性剤としては、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、アルキルポリエーテルアルコール、ポリエチレングリコールモノエステル、ポリエチレングリコールジエステル、高級アルコールエチレンオキシド付加物（縮合物）、多価アルコールエステルエチレンオキシド付加物（縮合物）、高級脂肪酸アルカノールアミドなどがある。
【００４０】
ノニオン性界面活性剤の具体例として、次のものがある。
アルキルフェノキシポリエトキシエタノールとしては、
イソオクチルフェノキシポリエトキシエタノール：
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：オキシエチレン単位平均９〜１０含有）
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５：オキシエチレン単位平均５含有）
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール：
(ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−６３０：オキシエチレン単位平均９含有）
(ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−７１０：オキシエチレン単位平均１０〜１１含有）
(ＬＥＮＥＸ６９８：オキシエチレン単位平均９含有）
アルキルポリエーテルアルコールとしては、
高級アルコール  ポリオキシエチレンエーテル：
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−６７：ＣＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｏ．５９０３０−１５−８）
【００４１】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、その多孔性空間に水不溶化した１種又は２種以上の水溶性高分子を設けることによって親水化したものであってもよい。水溶性高分子の例として、酸素を含む炭化水素にはポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、窒素を含むものにはポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、負電荷を有するものとしてポリアクリル酸、ポリメタアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸などをあげることが出来る。不溶化は熱処理、アセタール化処理、エステル化処理、重クロム酸カリによる化学反応、電離性放射線による架橋反応等によって行えばよい。詳細は、特公昭５６−２０９４号公報及び特公昭５６−１６１８７号公報に開示されている。
【００４２】
ポリスルホンの微多孔性膜は、ポリスルホンをジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンあるいはこれらの混合溶媒等に溶解して製膜原液を作製し、これを支持体上に、又は直接凝固液中に流延し洗浄、乾燥して行うことにより製造することができる。詳細は特開昭６２−２７００６号公報に開示されている。ポリスルホンの微多孔性膜は、そのほか特開昭５６−１２６４０号公報、特開昭５６−８６９４１号公報、特開昭５６−１５４０５１号公報等のも開示されており、それらも使用することができる。ポリスルホンの微多孔性膜も弗素含有ポリマーと同様界面活性剤を含有させ、あるいは水不溶化した水溶性高分子を設けることによって親水化することができる。
【００４３】
その他の非繊維微多孔性膜としては、特公昭５３−２１６７７号、米国特許１,４２１,３４１号等に記載されたセルロースエステル類、例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート／ブチレート、硝酸セルロースからなるブラッシュポリマー膜が好ましい。６−ナイロン、６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多孔性膜でもよい。その他、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−９０８５９号等に記載された、ポリマー小粒子、ガラス粒子、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリマーで結合された連続空隙をもつ多孔性膜も利用できる。
【００４４】
非繊維微多孔性膜の有効孔径は０.２〜１０μｍ、好ましくは０.３〜５μｍ、特に有効なのは０．５〜３μｍである。本発明で非繊維微多孔性膜の有効孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−７０に準拠した限界泡圧法(バブルポイント法）により測定した孔径で示す。非繊維微多孔性膜が相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターである場合、厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっているのが普通で、液体通過経路の断面を円に近似したときの孔径は、自由表面の近くで最も小さくなっている。容積の通過経路における厚さ方向に関する最小孔径は、さらにフィルターの面方向について分布を持っており、その最大値が粒子に対する濾過性能を決定する。通常、それは限界泡圧法で測定される。
【００４５】
上に述べたように、相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターでは、厚さ方向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっている。本発明の分析素子の非繊維微多孔性膜としてこの種の膜を用いる場合には、出口側を、メンブランフィルターの光沢面とすることが好ましい。
【００４６】
本発明で使用される血液濾過材料には、低密度ガラス繊維濾紙と微多孔性膜に加えて第３の濾過材料を追加することができる。この第３の濾過材料の例としては、濾紙、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば、トリコット編）等、繊維質多孔性層を挙げることができる。これらのうち織物、編物等が好ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。この第３の濾過材料はガラス繊維濾紙と微多孔性膜の中間に配置することが好ましい。
【００４７】
好ましい微多孔性膜はポリスルホン膜、酢酸セルローズ膜等であり、特に好ましいのはポリスルホン膜である。本発明の血液濾過材料においてはガラス繊維濾紙が血液供給側に配置され、微多孔性膜が出口側に配置される。
【００４８】
微多孔性膜の厚さは０．０５〜０．３ｍｍ程度、特に０．１〜０．２ｍｍ程度でよく、通常は１枚の微多孔性膜を用いればよい。しかしながら、必要により複数枚を用いることもできる。
【００４９】
上記微多孔性膜の代わりにあるいは微多孔性膜に加えて前述の高密度ガラス繊維濾紙を使用することもできる。
【００５０】
高密度ガラス繊維濾紙層の厚さは０．２〜１ｍｍ程度、特に０.３〜０.７ｍｍ程度でよく、通常は１枚の高密度ガラス繊維濾紙を用いればよい。しかしながら、必要により複数枚を用いることもできる。
【００５１】
血液濾過材料は、要は濾過される血液が血液濾過材料を通過するように構成され、血液入口側と濾過液出口に圧力差を与えうる構造のものであれば如何なる濾過器に収容して使用しても差し支えない。
【００５２】
しかしながら、一般にはホルダーに収容して使用するのが簡便である。このホルダーは血液入口と濾過液出口が設けられており、一般に血液濾過材料を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製される。通常は、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられていて、一方は血液供給口として、場合により更に加圧口として、他方は吸引口として、場合により更に濾過された血漿または血清の排出口として使用される。濾過された血漿または血清の排出口を別に設けることもできる。ホルダーが四角形で蓋体を側面に設けた場合には血液供給口と吸引口の両方を本体に設けることができる。
【００５３】
血液濾過材料収納部の容積は、収納すべきろ過材料の乾燥状態および検体（全血）を吸収し膨潤した時の総体積より大きい必要がある。ろ過材料の総体積に対して収納部の容積が小さいと、ろ過が効率良く進行しなかったり、溶血を起こしたりする。収納部の容積のろ過材料の乾燥時の総体積に対する比率はろ過材料の膨潤の程度にもよるが、通常１０１％〜３００％、好ましくは１１０％〜２００％、更に好ましくは１２０％〜１５０％である。
【００５４】
また、ろ過材料と収納部の側壁面との間は密着していることが必要であり、全血を吸引した時にろ過材料を経由しない流路が出来ないように構成されている必要があることは勿論である。
【００５５】
血液濾過ユニットを組立てる際には濾過ユニット本体にガラス繊維濾紙、微多孔性膜等を入れて、ガラス繊維濾紙に細断小片を用いた場合には細断小片間の隙間がなくなる程度に押圧し、蓋体を装着すればよい。
【００５６】
一方、血液濾過ユニットの出口側および入口側に空間部を設けることによって血液の濾過材料内の流れを均一化して目詰まりや血球漏出の問題を改善することができる。このような構造の血液濾過ユニットにおいて細断小片層が血液入口側の表面層となる場合には細断小片が入口側空間部を埋めてしまわないようナイロンメッシュ等のスクリーン部材等を設けて空間部への進入を阻止するようにする。
【００５７】
血液濾過ユニットは、上記本体に蓋体が取付けられると、これらの血液入口と濾過液出口を除いて全体が密閉構造になる。
【００５８】
ホルダーの材料は熱可塑性あるいは熱硬化性のプラスチックが好ましい。例えば、ハイインパクトポリスチレン、メタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート、各種共重合体ポリマー等の透明あるいは不透明の樹脂が用いられる。
【００５９】
上記本体と蓋体の取付方法は、接着剤を用いた接合、融着等如何なる手段によってもよい。この際、上記本体と蓋体のいずれの周縁が内側に位置してもよく、あるいは突き合わせ状態であってもよい。また、上記本体と蓋体を螺合あるいはネジ等の手段で固着して組立分解ができる構造とすることもできる。
【００６０】
血液濾過材料の形状に特に制限はないが、原則として円形とする。この際、濾過材料をホルダー本体の内部断面よりやや大きめとし、濾過材料の側面から血漿が漏れることを防ぐことができる。
【００６１】
本発明の方法はこのような血液濾過材料を用いて血液を濾過する際に被濾過血液を供給後、厳密にはガラス繊維濾紙層に接触後少なくとも５秒間血液入口側と濾過液出口側の圧力差を５０ｍｍＨｇ以下に保つことを第１の特徴とする。この第１段階における圧力差は５０ｍｍＨｇ以下であるが、好ましくは３０ｍｍＨｇ以下であり、血液を自然に展開させるだけでもよい。一方、保持時間は５秒間以上であるが、好ましくは１０秒間以上である。
【００６２】
血液の供給量は血液濾過材料の体積の１．２〜５倍程度、好ましくは２〜４倍程度が適当であり、低密度ガラス繊維濾紙の体積ではその１．２〜３倍程度、好ましくは１．２〜２倍程度が適当である。
【００６３】
上記第１段階後は濾過液出口側からの吸引および／または血液入口側からの加圧によって血液濾過を促進する。この加、減圧手段はペリスタルあるいはシリンジを利用する方法が簡便である。その際に圧力差が最大でも２００ｍｍＨｇ以下とすることを本発明の第２の特徴とする。この最大圧力差は好ましくは１７０ｍｍＨｇ以下であり、特に好ましくは１５０ｍｍＨｇ以下に抑えるようにする。圧力差の下限は特になく、遅くても良いが、時間がかかるので実用的でなくなる。この点で圧力差が最低で５０ｍｍＨｇを越えるようにする。シリンジを用いる場合のピストンを移動させる距離はピストンの移動体積が濾過材料の体積の２〜５倍程度になるようにするのがよい。移動速度は１ｃｍ2当り１〜５００ｍｌ／ｍｉｎ程度、好ましくは２０〜１００ｍｌ／ｍｉｎ程度が適当である。
【００６４】
ところで、血液はヘマトクリット値に大きなバラツキがあり、それによって濾過抵抗（加減圧に伴う圧力差の上昇速度）が変わる。つまり、一定速度で加、減圧を加えていった場合、ヘマトクリット値の大きな血液では圧力差がどんどん上昇し、血漿や血清の必要量が得られる前に濾過材料の目詰まりによる濾過速度の急激な低下や多大な圧力差の付加による血球破壊を生じてしまう。一方、ヘマトクリット値の小さな血液では濾過速度が大きすぎて血球漏出を生じる。そこで、血液を濾過層に供給後一定の速度パターンで吸引および／または加圧して血液入口側と濾過液出口側の圧力差の経時変化を追跡し、当該圧力差から被濾過血液のヘマトクリット値を推定し、その後の吸引および／または加圧速度を調整することが望ましい。上記一定の速度パターンは通常は一定速度でよいが、同一の速度パターンを採用すれば一定速度でなくともよい。ヘマトクリット値に対応する吸引および／または加圧速度の調整は、ヘマトクリットが高い血液の場合は溶血を起こし易いので、吸引あるいは加圧の変化率を小さく保ち、かつ最大減圧度を低くする（濾過に要する時間を長くする）。低いヘマトクリットの血液では溶血は起こりにくくかつ濾過もし易いので、相対的に高い吸引または加圧で短時間処理すれば良い。
【００６５】
具体的には、以下の方法が挙げられる。ヘマトクリット値の異なる全血試料を用いて、吸引圧と吸引時間の最適なパターンを予め決めておく。実際の検体の濾過に際してはヘマトクリット値は判らないので、標準的な血液（例えばヘマトクリット値４５％）で設定した吸引パターンで吸引を開始し、その後の濾過の進行に伴う濾過圧の変動と基準値との差から検体のヘマトクリット値を推定して、予め決めた最適パターンに合致する吸引条件に合うように吸引圧や吸引時間を調整しながら濾過を行う。
【００６６】
加圧による濾過においても同様に調整できることはいうまでもない。
【００６７】
【実施例】
実施例１
(１)  ホルダーの作製
図２〜４に示す血液濾過ユニットを作製した。この濾過ユニットは組み立てた状態の縦断面図である図２に示すようにホルダー本体１０と蓋体２０からなっている。
【００６８】
ホルダー本体１０には血液濾過材料３０の収容室１１(直径２０．１ｍｍ)とその上縁から外方に形成されたフランジ１３が形成されている。一方、ホルダー本体１０の底部には周縁よりやや内側に段部を設けてそこから浅いロート状円板部１２が連設され、その中心から下方にノズル状血液供給口１４が延設されている。上記の段部は血液濾過材料３０の下面をホルダー本体１０のロート状円板部１２から隔離させて空間１５を形成するスペーサー１６として機能させている。図１及び図３に示されているように血液供給口１４の基部には４方にフラップ１７が形成されている。このフラップは血液を入れたサンプル管（図示されていない。）を嵌め込むことによって保持するものである。
【００６９】
蓋体２０の底面は中心に向かって同心円状の段２１が４段形成されて中央が凹みここが上部空間を形成している。この底面中央にはサイコロの５の目状に５つの突起２５が血液濾過材料の密着を阻止する手段として下方に突出形成されている。また、血漿受槽２２の中心と周壁の中間に両側を削ぎ落とした煙突状の血漿通路２４が上方に起立し、その頂部には血漿の噴出を阻止する庇２６が水平方向にせり出している。この庇２６は図３に示されているように大小２つの半円を組み合わされた形状をしており、周壁側の半円は血漿通路外壁と一致させ、中心側の半円は血漿通路内壁の延長線と一致させている。血漿通路２４の両側部には、血漿の液深を確保するため、血漿受槽２２の周壁面に達する仕切壁２７が形成されている。血漿受槽２２の上端は開放されており、これが吸引口２８となっている。蓋体２０の底部には外方に突出するフランジ２３が形成され、このフランジがホルダー本体のフランジ１３と超音波で接着される。フランジ２３のホルダー本体のフランジ１３と合わさる面にはリブ（図示されていない。）が形成されている。これは接着の際には超音波エネルギーをそこに集めて液密性を充分に確保した状態で接着されるようにしたものである。
【００７０】
(２)  濾過ユニットの作製
(１)のプラスチック製のホルダー(内径２０．１ｍｍ)のホルダー本体１０に、直径２０．３ｍｍの円板状に打ち抜いたガラス繊維濾紙（ワットマン社製，ＧＦ／Ｄ）６枚を重ねて入れ、その上に、直径２０．７ｍｍの円板状に打ち抜いた厚さ１７０μｍのポリスルホン多孔膜３３(富士写真フイルム社製 ＳＥ−２００）をのせた。蓋体２０をセットし、両者のフランジ１３と２３を超音波で溶着してシールした。ノズル状血液供給口１４に血液吸引用ノズルとしてフジクリーンチップ（富士写真フイルム社製）を装着して、濾過ユニットを完成させた。
【００７１】
(３)  血液の採取
男子健常者より、ヘパリン入り真空採血管（テルモ社製）を用いて静脈血１０ｍｌを採血した。この血液のヘマトクリットを測定したところ、４４％であった。この血液３ｍｌを容量４ｍｌのプラスチック製試験管に分取した。
【００７２】
(４)  吸引機
排気速度が可変のペリスタポンプと接続されている小型吸引機を作製した。小型吸引機のチューブの先端には、上記濾過ユニットの吸引面と気密状態で接続可能なシリコーンゴム製の吸引ピペットを取り付けた。チューブの途中に圧力モニター用のゲージを接続した。
【００７３】
(５)  血液の濾過
(３)で分取した血液に（２）の濾過ユニットの検体吸引ノズルを挿入し、濾過ユニットの他端を吸引機の吸引パッドに接続した。吸引ポンプの排気速度を調節し、３０秒後に減圧度が１００ｍｍＨｇに到達するようにしつつ吸引を続けた。１０秒後の減圧度は３０ｍｍＨｇであった。
【００７４】
(６)  血漿の回収
吸引に伴って濾過ユニットの貯留槽中に血漿が流出した。量は、３３０μｌであった。血漿の色は淡黄色であり、溶血液や赤血球の混入は観察されなかった。
【００７５】
(７)  濾過液中の溶血液の評価
濾過された血漿中の溶血液の程度を定量的に評価するために、富士ドライケム５５００臨床化学アナライザー（富士写真フイルム社製）を用いて、ＬＤＨを測定した。比較のため、ヘパリン採血液を定法に従い遠心分離して得た血漿についてもＬＤＨを測定した。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
0003903098.tif 000002
【００７７】
実施例２
実施例１と同様の実験を図１に示す各種吸引パターンで行なった。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
0003903098.tif 000003
【００７９】
表２の結果から、吸引開始当初の減圧度を低く保つことによって良質な血漿が得られることがわかる。
【００８０】
実施例３
実施例１と同様の実験において、減圧度をモニターしつつ吸引濾過を行なった。用いた血液のヘマトクリットは４３％であった。回収血漿量は３２０μｌであり、目視観察では溶血や血液の混入は全く認められなかった。
【００８１】
吸引パターンは次の通りに設定した。
吸引後の時間（秒）    ０    １０      ２０      ３０
減圧度（ｍｍＨｇ）    ０    ３０    １１０    １７０
吸引開始後１０秒間は低速で吸引し、後半２０秒を中速で吸引した。
【００８２】
得られた血漿の成分を日立７１５０で測定した。比較例として同じ血液を遠心分離して得た血漿についても同様に測定した。結果は表３の通りであった。
【００８３】
【表３】
0003903098.tif 000004
【００８４】
実施例４
実施例３と同様の実験において、減圧度を検出しその変化量をモニターし、減圧度が１７０ｍｍＨｇ到達する時間を吸引ポンプの作動系にフィードバックする機構を吸引機に組み込んで実験した。
【００８５】
ヘマトクリット値（Ｈｃｔ）が４８％の健常者のヘパリン加血液４０ｍｌを採取して以下の実験を行った。
【００８６】
健常者血液の場合は、減圧度が１５０ｍｍＨｇに到達するのに要する時間は２５秒以上であったがＨｃｔが５０％以上になると２５秒以下で１５０ｍｍＨｇに到達し、その関係はＨｃｔと逆に関係にあることが分かった。この関係を実験により求めた。
【００８７】
例えば、Ｈｃｔを５５％に調整した全血では１５０ｍｍＨｇに到達するのは２２．５秒であった。減圧度が１５０ｍｍＨｇに到達する時間を検出し、Ｈｃｔが高い検体の場合は減圧度は１７０ｍｍＨｇに保ちつつ吸引時間を長くするように設定した。
【００８８】
このようにした結果、Ｈｃｔが５０％を越える高Ｈｃｔ検体の場合でも質の良い血漿を必要量分離回収できるようになった。
【００８９】
【発明の効果】
本発明によりガラス繊維濾紙を用いて、血液から血球の漏出や溶血のない血漿や血清の必要量を容易にかつ確実に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  各種吸引パターンを示すグラフである。
【図２】  本発明の一実施例である血液濾過ユニットを組み立てた状態の縦断面図である。
【図３】  同上平面図である。
【図４】  上記血液濾過ユニットのホルダー本体の底面図である。
【符号の説明】
１０…ホルダー本体
１１…血液濾過材料収容室
１２…円板部
１３…フランジ
１４…血液供給口
１５…空間
１６…スペーサー
１７…フラップ
２０…蓋体
２１…段
２２…血漿受槽
２３…フランジ
２４…血漿通路
２５…突起（密着阻止手段）
２６…庇
２７…仕切壁
２８…吸引口
３０…血液濾過材料
３１…ナイロンメッシュ
３２…ガラス繊維濾紙フレーク層
３３…ポリスルホン多孔膜（微多孔性膜）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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