(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）３９．９〜６０重量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド；
ｂ）６０〜３９．９重量％の式IaまたはIb
0003869855.tif 000017
［式中、Ｒaは水素またはＣ1−Ｃ6アルキルであり、ＲbはＣ1−Ｃ12アルキルである］
で示されるモノマー；
ｃ）０．１〜０．７重量％の式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ
0003869855.tif 000018
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は、各々独立して、水素、−ＳＯ2−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルフェニル、Ｃ1−Ｃ30アルキル、Ｃ1−Ｃ30アルキル−ＣＯ−または式−（ＣnＨ2n−Ｏ−）m−Ｒ8で示される基であり；
Ｒ3は水素または−ＳＯ2−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルフェニルであり；
Ｒ4およびＲ7はＣ1−Ｃ30アルキレンまたは式−（ＣnＨ2n−Ｏ−）m−Ｒ8で示される基であり；
Ｚは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＲ'＝ＣＨ2で示される基であり；
Ｒ8は直接の結合またはＣ1−Ｃ12アルキレンであり；
ｎは２〜６までの整数であり、ｍは１〜１０までの整数であり、ただし、全炭素原子数は３０以下である；
Ｒ9およびＲ10は、各々独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ−カルボニル、Ｃ1−Ｃ4アルキル−ＳＯ2−もしくはハロゲンであり、および
Ｒ11はＨであり、Ｒ12は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＲ'＝ＣＨ2、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−もしくはＣＨ2＝ＣＲ'−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で示される基であるか、またはＲ11は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＲ'＝ＣＨ2、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−もしくはＣＨ2＝ＣＲ'−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で示される基であり、Ｒ12はＨである；または、
Ｒ13はＨであり、Ｒ14は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ'＝ＣＨ2、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−もしくはＣＨ2＝ＣＲ'−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で示される基であるか、またはＲ13は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ'＝ＣＨ2、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＲ'−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−もしくはＣＨ2＝ＣＲ'−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で示される基であり、Ｒ14はＨである；ただし、式中の−ＣＯＯＨ基は各々遊離の形態または塩の形態であるか、もしくはそのＣ1−Ｃ20アルキルエステルであり、Ｒ'は水素またはメチルである；
で示されるプロトン感受性発蛍光団；および
ｄ）０〜２０重量％のジオレフィン性架橋成分
〔ａ）〜ｄ）の重量％の合計は１００％である〕からなる水不溶性コポリマー。
【請求項２】
Ｒaが水素であり、Ｒbが分枝Ｃ3−Ｃ8アルキルである、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項３】
Ｒaが水素であり、Ｒbがtert−ブチルであり、モノマーａ）のモノマーｂ）に対する比が５０重量部対５０重量部である、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項４】
Ｒaがメチルまたはエチルであり、Ｒbが直鎖Ｃ3−Ｃ8アルキルである、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項５】
Ｒaがメチルであり、Ｒbがｎ−ブチルである、請求項４に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項６】
式ＩＩの発蛍光団のＲ1およびＲ2が、各々独立して、水素または直鎖Ｃ12−Ｃ24アルキルである、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項７】
式ＩＩの発蛍光団のＲ4が直鎖Ｃ2−Ｃ16アルキレンまたは式−（Ｃ2Ｈ4−Ｏ−）m−Ｒ8（式中、Ｒ8およびｍは請求項１に定義した通りである）で示される基である、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項８】
式ＩＩＩの発蛍光団のＲ5およびＲ6が、各々独立して、直鎖Ｃ2−Ｃ12アルキルである、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項９】
発蛍光団が式
0003869855.tif 000019
もしくは
0003869855.tif 000020
に該当する、請求項１に記載の水不溶性コポリマー。
【請求項１０】
Ａ）透明支持体、および
Ｂ）請求項１に記載の水不溶性コポリマーの層
からなる、イオン強度非依存性ｐＨ値測定用の光センサー。
【請求項１１】
ポリマー層Ｂ）の厚さが０．１〜５００μｍである、請求項１０に記載のセンサー。
【請求項１２】
請求項１０に記載の光センサーを水性試料と接触させ、励起光で照射し、蛍光を測定し、検量線を考慮して測定蛍光強度からｐＨ値を計算する、蛍光法による水性試料のイオン強度非依存性、可逆的、光学ｐＨ値測定法。
【請求項１３】
水性試料がｐＨ６．５〜８．５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
水性試料のイオン強度が０．０５〜５モル／ｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
イオン強度が実質的に１，１−または１，２−塩により与えられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
水性試料が部分的または全体的に体液からなる、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ｐＨ感受性蛍光色素を含有するポリマー組成物、透明支持体上に膜の形で組成物を含有するイオン強度非依存性ｐＨ値測定光センサー、およびまた試験溶液のイオン強度とは非依存的に非常に正確なｐＨ値が測定できる蛍光法による光学的方法に関する。本法は、特に生理的溶液のｐＨ値の測定、特に血液のｐＨ値測定に適している。
指示薬のｐＫa値は溶液のイオン強度と共に変化し、その変化は指示薬の荷電の程度に依存することが知られている。例えば、既知の試験溶液で該センサーの検量線を作成した後、異なるイオン強度依存性を有する２つのセンサー（その中、１つは可能な限りイオン強度依存性が低い）の測定値間の差からコンピューターでイオン強度とｐＨ値を測定することがＤＥ−Ａ−３ ４３０ ９３５ですでに提案されている。該明細書に記載のほとんどイオン強度に依存しないセンサーは、正確には生理的ｐＨ範囲内にはなく、分解能が低い。これらのセンサーはポリマーマトリックスに埋め込まずに構築され、その結果、色素が直接試験溶液に接触するいう不利な点がある。センサーの蛍光色素（各場合共、同じである）は、架橋基によりガラス支持体の表面上に直接固定されており、一方のセンサーは、高い極性およびイオン強度依存性を得るために追加的電荷を有し、他方のセンサーは実質的に無極性で疎水性でイオン強度非依存性となるように調整されている。これらのセンサーの極めて大きな欠点は、蛍光色素が試験溶液の外部の影響に直接さらされ、物理的影響（例えば、色素の溶解、表面での析出）および化学的影響（色素の分解）の両方によりセンサーがすぐに使用不可能になることである。さらに、エバネセント域における励起に際して、エバネセント測定域と試料の蛍光発光との干渉を完全に避けることができず、これにより測定の正確さが低減する。一方、表面に結合している蛍光色素は直ちに試験溶液と接触するようになるから、これらのセンサーの応答時間は短い。感度は十分であると考えられる。
試験溶液のイオン強度に異なった応答をする２つのセンサーを用いた光学的ｐＨ測定法は、装置が高価であり、続いて余分の計算段階が必要である。
今回、極めて特異的なコポリマーであるアクリルアミドおよびメタクリルアミドを選択し、狭い濃度範囲の蛍光色素（これはポリマーマトリックスに埋め込まれている）を選択して組み合わせることにより、生理的ｐＨ範囲である６．５〜８．２においてイオン強度非依存的に非常に正確な光学的ｐＨ測定が可能となる光ｐＨセンサーを製造することが可能であることが見出された。これにより、イオン強度を除外するための第２の測定および計算段階が省略される。ｐＨ値測定が高精度であることは、特にヒト血液の分析において非常に重要である、なぜならこの測定は代謝性疾病の治療モニターなどに使用できるからである。従って、唯１つのセンサーを必要とするだけであるから、迅速かつ費用のかからない試験を行うのに有利である。結果として分析装置もまたより容易に小型化できる。
蛍光色素はこのポリマーマトリックスにより試料溶液による損傷または干渉影響から効果的に保護されているので、これらのセンサーの保存寿命および使用寿命は長い。このようなセンサーでは感度は低減せず、応答時間は驚くほど短い。
このポリマー組成物を用いて、マトリックスの、例えば親水性特性、疎水性特性、極性および／または誘電率を非常に正確に決めることが可能であり、これは選択した濃度範囲の発蛍光団と組み合わされており、その結果、特定のｐＨ値範囲内での測定がイオン強度非依存的となる。
応答時間および調整時間は、発蛍光団（fluorophore）の埋め込みにかかわりなく、光学的測定システムに必要とされる短い時間に対応し、これらのパラメーターは実質的に膜の厚さに依存している。
本発明は、
ａ）３９．９〜６０重量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド；
ｂ）６０〜３９．９重量％の式IaまたはIb
0003869855.tif 000002
［式中、Ｒaは水素またはＣ1−Ｃ6アルキルであり、ＲbはＣ1−Ｃ12アルキルである］
で示されるモノマー；
ｃ）ポリマーと混合されているか、または共有結合している０．１〜０．７重量％のプロトン感受性発蛍光団；および
ｄ）０〜２０重量％のジオレフィン性架橋成分〔ａ）〜ｄ）の重量％の合計が１００％である〕からなる水不溶性コポリマーに関する。
本発明の範囲内において、「水不溶性」は多くて０．１％以下の量が溶解し得ることを示す。一方、試験液と良好に接触させるために、コポリマーはいずれにしても湿潤可能でなければならない。
アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得る。Ｃ1−Ｃ12アルキルの例は直鎖または分枝鎖基である：メチル、エチル、およびプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルの種々の位置異性体。
モノマーａ）として好ましく使用されているモノマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドである。
好ましい水不溶性コポリマーは、Ｒaが水素であり、Ｒbが分枝Ｃ3−Ｃ8アルキルである場合に得られる。特に好ましいものは、Ｒaが水素であり、Ｒbが３級ブチルであり、モノマーａ）とモノマーｂ）の比が５０重量部対５０重量部である水不溶性コポリマーである。
別の群の好ましい水不溶性コポリマーは、Ｒaがメチルまたはエチルであり、Ｒbが直鎖Ｃ3−Ｃ8アルキルである場合に得られる。特に好ましくは、Ｒaがメチルであり、Ｒbがｎ−ブチルである。
適当なプロトン感受性蛍光色素は、例えば、キサンテンおよびベンゾキサンテン群由来であり、例えば、フルオレセイン、ハロゲン化フルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、セミナフトローダフルオル、２，３−ベンゾフルオレセイン、３，４−ベンゾフルオレセイン、ベンゾローダミンおよび置換誘導体の異性体、ベンゾクロモゲンおよび置換誘導体の異性体；例えばアクリジン、９−アミノ−６−クロロアクリジンなどのアクリジン；例えば７−ヒドロキシアクリドンおよび７−ヒドロキシベンズアクリドンなどのアクリドン；例えば８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸などのピレン；シアニン色素；および例えば７−ヒドロキシクマリンおよび４−クロロメチル−７−ヒドロキシクマリンなどのクマリンである。蛍光色素はポリマー骨格に結合するためにオレフィン的に不飽和な基と官能基化し得る。
好ましくは、発蛍光団は、ポリマーと混合されているか、または共有結合しているアクリジン、アクリドン、ローダミン、キサンテン、ベンゾキサンテン、ピレンおよびクマリンからなる群から選択される。
好ましくは、発蛍光団がポリマーに共有結合している水不溶性コポリマーである。
特に好ましくは、発蛍光団が式II、III、IV、ＶまたはVI
0003869855.tif 000003
0003869855.tif 000004
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は、各々独立して、水素、−ＳＯ2−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルフェニル、Ｃ1−Ｃ30アルキル、Ｃ1−Ｃ30アルキル−ＣＯ−または式（ＣnＨ2n−Ｏ−）m−Ｒ8で示される基であり；
Ｒ3は水素または−ＳＯ2−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルフェニルであり；
Ｒ4およびＲ7はＣ1−Ｃ30アルキレンまたは式−（ＣnＨ2n−Ｏ−）m−Ｒ8で示される基であり；
Ｚは二価の基−ＮＨ−ＣＯ−であり；
Ｒ8は直接の結合またはＣ1−Ｃ12アルキレンであり；
ｎは２〜６までの整数であり、ｍは１〜１０までの整数であり、ただし、全炭素原子数は３０以下である；
Ｒ9およびＲ10は、各々独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ−カルボニル、Ｃ1−Ｃ4アルキル−ＳＯ2−またはハロゲンであり、
Ｒ11はＨであり、Ｒ12は二価の基−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であるか、またはＲ11は二価の基−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｒ12はＨであるか；または、
Ｒ13はＨであり、Ｒ14は二価の基−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であるか、またはＲ13は二価の基−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ）−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ2−Ｃ12アルキレン−ＮＨ）−ＣＯ−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）1〜6−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｒ14はＨ（ただし−ＣＯＯＨ基は各々遊離形または塩の形である）またはそのＣ1−Ｃ20アルキルエステルである）］
で示される化合物である水不溶性コポリマーである。
アルキルそれ自体または例えばアルコキシおよびアルコキシカルボニルなどの他の基の構造成分としてのアルキルは、各場合におけるそれぞれの炭素原子数を考慮して、直鎖（すなわち、メチル、エチル、プロピルまたはブチル）または分枝（例えばイソプロピル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル）の対応する基または化合物に含まれる。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素であり、とりわけ塩素または臭素である。
二価基であるＺ、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14が生成する例は、アクリロイルアミン基−ＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ2、メタクリロイルアミン基−ＮＨＣＯＣ（ＣＨ3）＝ＣＨ2、および２−（メタクリロイルオキシ）−エチルアミノカルボニル基−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）＝ＣＨ2である。
好ましくは、式IIの発蛍光団のＲ1およびＲ2は、各々独立して、水素または直鎖Ｃ12−Ｃ24アルキルである。
また、好ましくは、式IIの発蛍光団のＲ4は直鎖Ｃ2−Ｃ16アルキレンか、または式−（Ｃ2Ｈ4−Ｏ−）m−Ｒ8（式中、Ｒ8およびｍは前記で定義した通りである）で示される基である。
別の群の好ましい水不溶性コポリマーは、式IIIの発蛍光団のＲ5およびＲ6が、各々独立して、直鎖Ｃ2−Ｃ12アルキルであるものにより形成される。
共重合し得る蛍光色素は、例えば、直接または架橋基を介して蛍光色素に結合しているエチレン的に不飽和な基（ビニル、クロトニル、メタリル）を含む。モノマーａ）およびｂ）は既知である。既知の共重合し得る蛍光色素は、例えば、３−または４−アクリロイルアミノフルオレセインである。
架橋基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−を含む蛍光色素をもつポリマーは、例えば、カルボキシルまたはヒドロキシル基を含む蛍光色素でエステル化することにより得られる。架橋基−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ2−Ｃ12アルキレン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−を含む蛍光色素をもつポリマーは、例えば、イソシアナート官能基化した蛍光色素およびヒドロキシル基含有ポリマーにより得ることが可能である。
上記の反応は、既知方法、例えば、適当な溶媒の非存在下または存在下、必要であれば冷却して、室温で、または加熱して、例えば約５℃〜約２００℃の温度範囲で、好ましくは約２０℃〜１２０℃で、必要であれば、密閉容器で、加圧下で、不活性ガス雰囲気下、および／または無水条件下で行い得る。
ポリマーの調製は既知方法に従って行い得る。
反応物はそれ自体を互いに、すなわち、溶媒または希釈剤を添加せずに、例えば溶融して反応させ得る。しかしながら、一般的に、溶媒または希釈剤または溶媒混合物の添加が良好である。このような溶媒および希釈剤の例として：水；例えば酢酸エチルなどのエステル；例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、tert−ブチルメチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、ジメトキシジエチルエーテル、テトラヒドロフランまたはジオキサンなどのエーテル；例えば、アセトン、メチルエチルケトンまたはメチルイソブチルケトンなどのケトン；例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコールまたはグリセロールなどのアルコール；例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはヘキサメチルリン酸トリアミドなどのアミド；例えば、アセトニトリルまたはプロピオニトリルなどのニトリル；および例えば、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシドがあり得る。
共重合し得る蛍光色素は、既知方法に従って製造し得、出発原料は市販されているか、または類似方法に従って製造できる。
式IIまたはIIIで示される化合物の１つの可能なる製造法は、
ａ）式IIcまたはIIIc
0003869855.tif 000005
で示される化合物において、酸性条件下でフタルイミド基を除去し、適当な場合には、第２段階で
ｂ）さらに反応生成物を塩化アクリル酸または塩化メタクリル酸と反応させ、または
ｃ）適当な場合には、酸性条件下で式IIcの出発原料の反応生成物からパラ−トルエンスルホニル基を除去する（Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7基は前記で定義した通りである）ことを含む。
保護基を除去する方法は既知であり、式IIおよびIIIで示される化合物の製造には類似の方法を使用し得る。
式IIcで示される化合物は、異なるアルキル化剤を用いた段階的なアルキル化、またはアルキル化剤または市販の３，６−ジアミノアクリジンというアシル化剤でのアルキル化といった既知方法で製造し得る。適当なアルキル化剤は、例えば、ジアルキル硫酸塩またはモノハロアルカン、特にクロロ−、ブロモ−およびヨード−アルカンである。適当なアシル化剤は、例えば、カルボン酸無水物および、特に、例えば塩化カルボン酸などのハロゲン化カルボン酸である。その反応は、例えばエーテル、アルキル化酸アミドおよびラクタムまたはスルホンなどの不活性な極性および非プロトン性溶媒の存在下、例えば５０〜１５０℃といった高温度で行い得る。便宜には、例えばアルカリ金属炭酸塩または３級アミン、特に立体的に込み合った３級アミンなどのハロゲン化水素受容体を加える。
式IIIcで示される化合物は、例えば、フタル酸無水物を２モル当量の３−モノアルキルアミノフェノールと反応させることにより得られる。別の可能な製造法は、３−モノアルキルアミノフェノールと１モル当量の２−ヒドロキシ−４−ジアルキルアミノ−２'−カルボキシ−ベンゾフェノンとの反応である。これらの反応は、例えばＵＳ−Ａ−４ ６２２ ４００に記載されている。
式IV、ＶおよびVIで示される化合物は、類似の方法で製造し得る。
反応条件はそれ自体既知である。それらは、例えば、適当な溶媒または希釈剤またはそれらの混合物の存在下、必要であれば冷却しながら、室温で、または加熱しながら、例えば約−１０℃から反応混合物の沸点の温度範囲で、好ましくは約０℃から約２５℃で、必要であれば、密閉した容器で、加圧下、不活性ガス雰囲気下および／または無水条件下で行い得る。特に有利な反応条件は、実施例に開示する。
好ましくは、コポリマーの平均分子量は２０００〜５０００００、特に１００００〜３５００００ダルトンであり、これは分子量が既知の標準的なポリマーを用いたゲル浸透法に従って測定した。
水不溶性のコポリマーは層の形で、例えば０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、特に好ましくは０．５〜５重量％の、ポリマーを基本とした架橋剤を用いて架橋し得る。適当な架橋剤は、例えばアクリル酸またはメタクリル酸エステルまたはポリオールアミド、好ましくはジオールからテトロール、またはポリアミン、好ましくはジアミンからテトラミンである。このような架橋剤は既知であり、文献に広く記載されている。ポリオールの例は、エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、ジエチレングリコール、１，１，１−トリヒドロキシメチルエタンまたはプロパン、ペンタエリトリトールおよびジペンタエリトリトールである。ポリアミンの例は、エチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、ジエチレントリアミンおよびトリエチレンテトラミンである。他の既知の架橋剤は、例えば、ジビニルベンゼンである。例えば、アルキレン−ビス−ジアルキルマレイミジル化合物は、例えばエチレン−ビス−（ジメチル）マレイミジルにも適当である。
本発明は、
Ａ）透明支持体
Ｂ）水不溶性コポリマーの層［これは
ａ）３９．９〜６０重量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド；
ｂ）６０〜３９．９重量％の式IaまたはIb
0003869855.tif 000006
［式中、Ｒaは水素またはＣ1−Ｃ6アルキルであり、ＲbはＣ1−Ｃ12アルキルである］
で示されるモノマー；
ｃ）ポリマーと混合されているか、または共有結合している０．１〜０．７重量％のプロトン感受性蛍光団；および
ｄ）０〜２０重量％のジオレフィン性架橋成分〔ａ）〜ｄ）の重量％の合計は１００％である〕からなる］からなる組成物およびイオン強度非依存性ｐＨ値測定用の光センサーに関するものである。
好ましい上記のコポリマーおよび蛍光色素は、同様にセンサーに適用する。
発蛍光団をポリマーと混合したセンサーは、原則的に一度きりの使用に適している。ポリマー膜に浸透性で親水性の保護層を施すのであれば、これらのセンサーおよび、また、一般的に、ポリマー結合発蛍光団のついたセンサーであって膜上に保護層を持つものは、反復して、または連続測定に使用し得る。
支持体の幾何学形は幅広く変化し得る；それは、例えば繊維状、柱状、球状、立方形または正六面体であり得る。さらに、継続測定または連続測定を行うフローシステムが可能である。平面センサーが好ましい。支持体は透明である。それは例えば、ポリカーボネート、ポリエステル（例えばポリエチレンテレフタレート）、ポリアミド、またはポリアクリル酸またはポリメタクリル酸などの無機ガラスまたは透明プラスチックであり得る。
平面センサーは、例えば四角、方形または球形などのあらゆる外形であり得る。表面積が０．０１〜約５０ｃｍ2、より有利には、０．０２〜１０ｃｍ2であり得る。センサーの測定面は表面積が５ｍｍ2以下であり、好ましくは２ｍｍ2か、それ以下であり得る。測定面はセンサーの完全に被覆された表面の一方に正確に一致する。有利には、両面にあるが部分的に分離している被覆を使用し得る。
センサーは１つまたはそれ以上の部分的に分離した膜層を含み得る；後者の場合、平行測定を、同一または異なる試験試料を用いて行い得る。
好ましくはポリマー層Ｂ）の厚さは０．１〜５００μｍ、特に好ましくは１〜１００μｍである。
このような層の製造は、例えば有機溶媒に組成物を溶解し、次いで型をとり薄膜を形成し、最後に溶媒を除去するといったそれ自体既知の方法でなし得る。
層の製造に可能な別の方法は、被覆技術で既知の工程である。例は、スピン被覆、噴霧またはナイフ適用性であり、スピンカースティング法が好ましい。適当な溶媒は、アルコール、エーテル、エステル、酸アミドおよびケトンを含む。特に適当なものは易揮発性溶媒、特にテトラヒドロフランである。
まず最初に組成物を溶解し、成形し、続いて溶媒を再び蒸発させるというこれらの工程に加えて、組成物が熱可塑性物質であるので、熱成形工程も可能である。適当な工程には、熱可塑性プラスチック工程で既知の押出し、射出成形、圧縮または吹込み工程を含む。
層は透明またはわずかに不透明である。好ましくは透明である。
接着を改善するために、支持体を接着促進剤で事前に処理し得る。同目的のために、表面上に官能基を作製するために支持体をプラズマ処理することも可能である。接着を特に良くするために共重合可能な基を表面に施すことも可能である。既知のガラスの接着促進剤は、例えばトリエトキシ−グリシジルオキシシラン、３−アジドプロピル−トリエトキシシランおよび３−アミノプロピル−トリエトキシシランである。このように処理した表面は、例えばＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−６−（４'−アジド−２'−ニトロフェニルアミノ）−ヘキサン酸塩を用いてさらに修飾し得る。
本発明は、また、Ａ）透明支持体
Ｂ）水不溶性コポリマーの層［これは
ａ）３９．９〜６０重量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド；
ｂ）６０〜３９．９重量％の式IaまたはIb
0003869855.tif 000007
［式中、Ｒaは水素またはＣ1−Ｃ6アルキルであり、ＲbはＣ1−Ｃ12アルキルである］
で示されるモノマー；
ｃ）ポリマーと混合されているか、または共有結合している０．１〜０．７重量％のプロトン感受性発蛍光団；および
ｄ）０〜２０重量％のジオレフィン性架橋成分〔ａ）〜ｄ）の重量％の合計は１００％である〕からなる］からなる光センサーを水性試験試料と接触させ、励起光で照射し、蛍光を測定し、検量線を利用して測定した蛍光強度からｐＨ値を計算する、蛍光法による水性試料のイオン強度非依存性、可逆光学的ｐＨ値測定法にも関する。
コポリマーおよび蛍光色素に関する上記の好ましい事項は同様にセンサーに適用する。
詳細な実験方法は以下の通りである；既知ｐＨの試料で検量線を作成した後、未知の組成物の試験溶液に接触している蛍光強度を測定し、測定した蛍光強度に関するｐＨを検量線から直接に決定する。
センサーを検量用溶液および試験試料と接触させる。これは手で（例えばピペッティングにより）または適当な自動フローシステムを用いてなし得、センサーはフローセルの定位置に取り付け得る。このようなフローセルは当業者には既知であり、当面の目的に簡単な方法で適用し得る。
ＵＶランプ（例えば水銀蒸気ランプ、ハロゲンランプ）、レーザー、ダイオードレーザーおよび発光ダイオードは、蛍光の励起用の光源として使用し得る。フィルターを用いて、蛍光色素が最大吸収をもつ波長の光を選別することが便宜であり得る。センサーにより発光された蛍光は、例えばレンズ系を用いて回収でき、次いで、例えば２次電子増幅器またはホトダイオードなどの検出器に伝える。レンズシステムはまた、蛍光照射が支持体の端または解析試料を介して、透明支持体を通過して測定されるように調節されている。有利には、照射は二色性鏡を用いたそれ自体既知の方法で屈折させる。センサーの蛍光は、好ましくは、検量線用溶液または試料溶液と接触している間に測定する。
測定は、連続照射を用いて光定常的な条件下で行い得るが、必要であれば、時間刻みにできる。これは、例えば、持続の限られたレーザーパルスまたは光源強度の調節によりなし得る。
応答時間は３０秒以内であり得、最初の測定は約５分以下の後にすでに可能である。センサーは高い貯蔵安定性により、さらに特徴づけられる。
好ましくは、工程にはｐＨが６．５〜８．５、特に好ましくはｐＨ値が６．７〜７．８の試験溶液を使用する。
試験溶液のイオン強度は、好ましくは０．０５〜５モル/l、特に好ましくは０．０５〜１モル/lである。
試験溶液は、無機または有機酸の塩を含み得る。例は、クエン酸、乳酸または酢酸の塩、またはリン酸、塩酸および硫酸の塩、または炭酸塩である。
好ましくは、試験溶液は実質的に１，１−または１，２−塩を含む。１，１−塩の例は、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＮＨ4Ｃｌである。１，２−塩の例は、例えば
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に記載したように、ＣａＣｌ2、ＭgＣｌ2およびＫ2ＳＯ4である。
好ましくは、試験溶液は部分的または全体的に体液からなる。特に好ましくはそれらは部分的または全体的に血液からなる。
測定は単一の測定として、または連続的に行い得る。
本発明は、蛍光法による水性試験溶液のｐＨ値のイオン強度非依存的な光学測定のための、上記の光センサーの使用に関する。
下記の実施例は本発明を説明する。
実施例Ａ  官能基化蛍光色素の調製
実施例Ａ１  ４−アクリロイルアミドフルオレセイン（１０１）の製造
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４−アミノフルオレセイン５gをアセトン２００mlに懸濁し、１０分間かけて塩化アクリロイル１．４mlのアセトン２ml溶液を滴下して加える。懸濁液を室温で３時間撹拌する。結晶を濾別し、アセトンおよびエーテルで洗浄し、乾燥させる。融点＞２００℃をもつ化合物（１０１）５．７gが得られる。質量分析−ＦＤ：４０２。
実施例Ａ２  化合物（１０２）の製造
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トリエチレングリコールモノクロロヒドリン２９mlおよびアジ化ナトリウム２０gを溶媒なしで１１０℃で一晩撹拌する。反応混合物をエーテルで希釈し、濾別する。溶媒を蒸発させ、濾液を１１０−１１５℃の高真空下で濃縮する。化合物１０３が８６％の収率で得られる。
ｂ）
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７ＮａＨ（ペンタンで洗浄する）８．２gを乾燥テトラヒドロフラン１５０mlに懸濁する。化合物（１０３）３０gを５℃で滴下して加える。混合物をさらに３０分間撹拌し、続いてα−ブロモ酢酸tert−ブチルエステル３８mlのテトラヒドロフラン６０ml溶液と反応させる。混合物を一晩撹拌し、エーテルを蒸発させ、有機層を水で３回および塩溶液で１回洗浄し、乾燥させる。残った油状物を１４０℃から１５０℃の高真空下で蒸留する。化合物（１０４）が得られる。高速原子衝撃質量分析：２９０［Ｍ＋Ｈ］+。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．４５ppm（９Ｈ、ｓ、ｔ−Ｂｕ）；４．０３（２Ｈ、ｓ、ＯＣＨ2ＣＯＯ）。
ｃ）
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化合物（１０４）のアジド基を水素で定量的に還元し、触媒として５％ Ｐｄ/Ｃおよび溶媒として１，４−ジオキサンを使用する。化合物（１０５）が得られる。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．４５ppm（９Ｈ、ｓ、ｔ−Ｂｕ）；２．２（２Ｈ、ブロード、ＮＨ2）；２．９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、ＣＨ2Ｎ）；４．０３（２Ｈ、ｓ、ＯＣＨ2ＣＯＯ）。
ｄ）
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化合物（１０５）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、０℃で１．５当量のＮＥｔ3および１．５当量の塩化アクリロイルで処理する。透明な溶液を５時間撹拌し、次いで水、塩溶液および水で洗浄する。有機層を乾燥させる。残った油状物を溶出液としてＣＨ2Ｃｌ2を用いてシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。収率は化合物（１０６）が７４％である。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．４５ppm（９Ｈ、ｓ、ｔ−Ｂｕ）；４．０３（２Ｈ、ｓ、ＯＣＨ2ＣＯＯ）；５．１０（１Ｈ、ｍ、ＣＨ＝Ｃ）；６．０５−６．３５（２Ｈ、ｍ、Ｃ＝ＣＨ2）。
ｅ）
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化合物（１０６）のtert−ブチルエステルを６時間かけて室温でトリフルオロ酢酸およびＣＨ2Ｃｌ2の１：１混合物を用いて除去する。反応生成物（１０７）を精製せずに次の段階に直接使用する。
ｆ）酸（１０７）を室温で３時間テトラヒドロフラン中で１当量のカルボニルジイミダゾールで処理する。テトラヒドロフラン中の０．９当量の４−アミノフルオレセインをその溶液に加え、混合物を室温で７２時間撹拌する。反応混合物を乾燥させ、生成物を溶出液としてＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2を用いてシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。２０５℃（分解）の融点をもつ橙色の結晶の化合物（１０２）が３７％の収率で得られる。
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高速原子衝撃質量分析：５９１[Ｍ＋Ｈ]+、６１３［Ｍ＋Ｎａ]+、６２９[Ｍ＋Ｋ]+。
Ｂ）コポリマーの製造
実施例Ｂ１．真空および窒素に接続されている三方栓のついたアンプルにおいて、Ｎ，Ｎジメチルアクリルアミド２．１９g（２２．１mmol）、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミド２．８１g（２２．１mmol）、４−アクリロイルアミドフルオレセイン２００mg（実施例Ａ１由来の化合物１０１）およびアゾビスイソブチロニトリル２５mgをジメチルスルホキシド１５mlに溶解する。アンプル中の空気は、３回行う冷凍／冷凍サイクルにより窒素で置換する。アンプルを水浴中で２日間６０℃に維持する。アンプルの粘性含有物を温メタノール１００mlで希釈し、コポリマーを撹拌しながら水２ｌに注意深く滴下して注ぐことにより沈澱させる。コポリマーを濾過し、粗く乾燥させる。沈澱を２回以上反復する。このように精製した最終生成物を６０°の高真空下で乾燥させる。収率：３．６gまたは理論収率６９％、ガラス転移点Ｔg＝１５６℃、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミドの含量＝４５．７重量％（ＩＲ分光計で測定）、２５℃におけるクロロホルム０．５％溶液の固有粘度ηinh＝１．０７ｄｌ／ｇ。
実施例Ｂ２．実施例Ａ１の蛍光色素（１０１）１２５mgを加えること以外は実施例Ｂ１と方法は同じである。以下の特徴をもつコポリマーが得られる。収率４．４gまたは理論収率８６％、Ｔg＝１５２℃、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミドの含量＝５４．２重量％（ＩＲ分光計で測定）、２５℃におけるクロロホルム０．５％溶液の固有粘度ηinh＝１．３９ｄｌ/g、ＵＶ分光計で測定した色素含有量＝２．２重量％。
実施例Ｂ３．実施例Ａ１の蛍光色素（１０１）１５mgを加えること以外は実施例Ｂ１と方法は同じである。以下の特徴をもつコポリマーが得られる。収率３．４gまたは理論収率６８％、Ｔg＝１４９℃、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミド＝５８．７重量％（ＩＲ分光計で測定）、２５℃におけるクロロホルム０．５％溶液の固有粘度ηinh＝１．６８dl/g、ＵＶ分光計で測定した色素含有量＝０．２６重量％。
実施例Ｂ４．真空および窒素に接続されている三方栓のついたアンプルにおいて、Ｎ，Ｎジメチルアクリルアミド２．１９g（２２．１mmol）、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミド２．８１g（２２．１mmol）、実施例Ａ２の化合物１０２ ３５mgおよびアゾビスイソブチロニトリル２５mgをジメチルスルホキシド１５ml中に溶解する。アンプル中の空気は３回行なう冷凍／解凍サイクルにより窒素で置換する。アンプルを水浴中で５日間６０℃に維持する。アンプルの粘性含有物を温メタノール２５mlで希釈し、コポリマーを撹拌しながらエーテル１．５ｌに注意深く滴下して注ぐことにより沈殿させる。コポリマーを濾過し、粗く乾燥させる。沈殿を２回以上反復する。このように精製した最終生成物を５０°の高真空下で２日間乾燥させる。収率：４．０５gまたは理論収率８１％、ガラス転移点Ｔg＝１５１℃、Ｎ−tert−ブチルアクリルアミドの含有量＝５１．９重量％（ＩＲ分光計で測定）、２５℃におけるテトラヒドロフラン０．５％溶液の固有粘度ηinh＝１．３４dl/g、ＵＶ分光計で測定した色素含有量＝０．４４％。
実施例Ｂ５Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２．３１g（２３．２９mmol）、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチルアクリルアミド２．６９g（１９．０６mmol）および実施例Ａ１の蛍光色素（１０１）３５mgを加える以外は、実施例Ｂ４と方法は同じである。以下の特徴をもつコポリマーが得られる。収率３．７２gまたは理論収率７４％、Ｔg＝９０℃、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの含有量＝５５．７mol％（ＩＲ分光計で測定）、２５℃におけるクロロホルム０．５％溶液の固有粘度ηinh＝１．１７dl/g、ＵＶ分光計で測定した色素含有量＝０．６２重量％。
Ｃ  センサーの製造
実施例Ｃ１
ガラス物質（１８mmの直径のプレート）をまず最初に３０％水酸化ナトリウム溶液中で洗浄にし、次いで６５％硝酸で活性化する。次いで活性化されたプレートを３−アミノプロピルトリメトキシシランでシラン化する。シラン化したプレートを、ジメチルホルムアミド／ホウ砂緩衝液（５：１）中のＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−(４'−アジド−２'−ニトロフェニルアミノ)−ヘキサン酸塩の溶液中、室温で１時間反応させる。実施例Ｂ１のポリマー（５％）を２０°から２５°でメタノール中に溶解し、２０秒間５００回転／分のスピードでスピン塗布することにより薄膜の形でアジド基で官能基化したプレート上に適用し、１５分間照射し、次いで窒素雰囲気下６０°で１２時間乾燥させる。膜の層の厚さは約１μｍである。
実施例Ｃ２〜Ｃ５．実施例Ｃ１と方法は同じであり、実施例Ｂ２〜Ｂ５の対応するポリマーを使用する。
Ｄ  適用実施例
一般的な方法
センサーをフローセルに取り付ける。検量線用溶液および試料溶液をポンプで計量し、セルを通して移動させる。測定調整はサーモスタットで制御する。ハロゲンランプの光（白色光、励起波長４８０ｎｍ）を励起フィルターを通して伝え、二色性鏡に反射させ、レンズにより平面センサーの上に焦点をあてた。センサー（５２０ｎｍ）により放出される蛍光を同じレンズシステムで集め、発光フィルターおよび二色性鏡を用いてホトダイオードに向ける。検量線用溶液と試料溶液にセンサーが作用している間に、センサーの蛍光を記録する。ｐＨ値は測定値から直接に測定し得る。
下記の表１は、異なる膜の組成物を基礎として、ｐＨ範囲が６．７〜８．０における電解質のイオン強度のｐＨ依存性を説明する。
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