(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母における異種オープン構造短鎖ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）Yap3プロテアーゼ活性を欠く酵母を培養すること、前記酵母を、当該ポリペプチ鎖において10から70アミノ酸を有し、且つその構造において0から3のジスルフィド結合を有する異種ポリペプチドをコードするDNA配列に可働的に結合された酵母プロモーターを含むハイブリッドベクターで形質転換すること、および
（ｂ）前記ポリペプチドを単離すること、
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドが10から55アミノ酸を当該ポリペプチド鎖において有する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドが10から50アミノ酸を当該ポリペプチド鎖において有する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドが15から40アミノ酸を当該ポリペプチド鎖において有する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドが25から35アミノ酸を当該ポリペプチド鎖において有する方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドが１のジスルフィド結合をその構造に有する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、当該酵母がS．セレビシアエである方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、当該酵母プロモーターが、MFα1プロモーター；CYC1プロモーター；ガラクトース誘導性プロモーターGAL1、GAL7およびGAL10；解糖酵素プロモーターTPIおよびPGK；TRP1プロモーター；CUP1プロモーター；PHO5プロモーター；ADH1プロモーター；並びにHSPプロモーターからなる群より選択される方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れか１項に記載の方法であって、当該ハイブリッドベクターが、異種ポリペプチドをコードする当該DNA配列に対して適切なリーディングフレームにおいて結合されたプレ配列(シグナル)またはプレプロ配列の何れかであるリーダー配列をコードするDNA配列を含む方法。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか１項に記載の方法であって、当該異種ポリペプチドがGRPP(グリセチン関連ポリペプチド)、グルカゴン、GLP-1（グルカゴン様ペプチド１）およびGLP-2（グルカゴン様ペプチド２）、GLP-1（7-36）、GLP-1(7-35)-(R36A)、GLP-2(F22Y)、GLP-2-(A19T+34Y)、GLP-2-(A2G)およびGLP-2-(A19T)および１から３アミノ酸の変更、付加および／または欠失を有するその他の類似体からなる群より選択される方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、遺伝学的に修飾された酵母細胞において、3以下のジスルフィド結合および／または塩基アミノ酸残基の豊富な構造を有するペプチド並びにオープン構造単鎖ポリペプチド類(open structured short chain polypeptides)を含む短鎖ポリペプチド類（例えば、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類およびそれらの機能的類似体類等）を製造するための新規方法、前記遺伝学的に修飾された酵母細胞、並びに前記酵母細胞を製造するための方法に関する。
発明の背景
異種タンパク類をコードするDNA配列を含有する適切な発現ベクターで酵母を形質転換した後の、該酵母における前記異種タンパクの発現は、多くの種類のポリペプチド類、例えば、グルカゴン、グルカゴン様タンパク類、およびそれらの機能的類似体類等に関して既に成功されている。酵母類、特にサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)は、その安定した産生量と安全性のために、薬学的な価値評価の高いポリペプチド類の製造に好ましいホスト微生物である。
しかしながら、その発現生成物が、所望するポリペプチドの種々の前駆体類（異なる長さのアミノ酸鎖を有する）の不均一な混合物であると判明することが多くの場合にある。PEP4遺伝子産物により活性化される多くのプロテアーゼが、酵母タンパクの分解の原因である。pep4-3突然変異等のPEP4遺伝子における突然変異は、細胞性のタンパク分解を減少するために使用されることが多く、それによって問題の異種タンパク類の品質および産生量が改善され得る。EP 341215は、カルボキシペプチダーゼyscα活性を欠いた酵母菌株を、異種タンパクであるヒルジンの発現に使用することを記載している。野生型酵母菌株類は、翻訳後の、主要発現産物上での内因性酵母プロテアーゼの活性により、C末端配列の異なる複数の種類の脱硫酸化ヒルジンの混合物を産生してしまう。カルボキシペプチダーゼyscα活性を欠く酵母変異菌株類は、異種タンパク類のC末端からアミノ酸を除去することができないので、完全なタンパク類を生じ得ることが証明されている。
プロテアーゼA,B,Yおよび／またはS活性を欠如した酵母菌株の使用により可能になることは、外因性遺伝子産物類を無作為なタンパク分解を部分的に減少することのみである。
酵母において異種タンパクを産生する場合に直面するもう一つの問題は、産生量が低いことであり、おそらくこれは、該タンパクにおける内部の部位での異常なプロセッシングにより引き起こされた、細胞内区画と形質膜の両者におけるタンパク分解性プロセッシングによるものであり、その例には、ヒト副甲状腺ホルモンの分泌(Gabrielsenら、Gene 90:255-262,1990; Rokkonesら、J.Biotechnol.33:293-306、1994)およびS.セレビシアエからのβ-エンドルフィンの分泌(Bitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330-5334、1984)がある。幾つかのポリペプチド類、例えば、β-エンドルフィン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド類等のような、アミノ酸が約10から約55以下の短鎖で、且つジスルフィド結合数が少数以下であり、および／または塩基性アミノ酸類に富むポリペプチド類は、短鎖オープン構造と安定性のない構造であることから、異種ホストにおいて発現された場合には、細胞内および細胞外タンパク分解性の浸食の影響を特に受け易く、これは非同種産物であることに帰着する。
WO 95/23857は、１７ジスルフィド結合でクロスリンクされ、且つ約66kDの分子量を有する非常に大きなキャリア型タンパクである組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）を、酵母アスパルチルプロテアーゼ3(Yap3p)タンパク分解活性のレベルを低下させた酵母細胞において生産することを開示するものであり、これにより望ましくない45kD rHA断片が減少し、且つ、該ハプロイドΔyap3酵母菌株により生産されたrHAは、対応するハプロイドYAP3野生型酵母菌株により産生されたrHAに比較して、30%から50%に増加した産生量で得られる。
以前に、ボウボンナイスら（Bourbonnaisら、Biochimie 76:226-233、1994）は、インビトロにおいて、YAP3プロテアーゼ遺伝子産物が、Kex2P基質特異性に部分的に重なるが、独特の基質特異性を有していることを示しており、且つYap3pが、プロソマトスタチンの推定されるプロセッシング部位に存在するアルギニン残基に対して専らＣ末端を開裂するということを示している。更に、カウレイら（Cawleyら、J.Biol.Chem.271:4168-4176、1996)は、インビトロにおいて、ウシプロインスリン等の多くのプロホルモン基質に対する、1つおよび2つの塩基性残基プロセッシング部位(mono-and paired-basic residue processing sites)のYap3pによる開裂の特異性および相対的な有効性を決定した。
本発明の目的は、約55以下のアミノ酸、好ましくは10-50のアミノ酸、より好ましくは15-40、或は好ましくは25-35のアミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは１以下のジスルフィド結合をその構造に有する分泌性ポリペプチド類を酵母発現系において産生するための改良方法を提供することである。ポリペプチド類の好ましい例は、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド類、CRF並びに、先端を切断したおよび／またはC末端若しくはN末端の先端を切断したおよび／またはN末端を伸長した形態のコカイン・アンフェタミン・調節・転写物(CART)である。好ましくは、本発明のプロペプチド類の産生量は、非常に増加され、例えば、従来の酵母発現系における前記ポリペプチド類の産生量と比較すると2倍以上になる。
多くの場合、可能な遺伝学的欠損が、例えば、製造規模の持続的な発酵の間に、ハプロイド酵母培養物に表現型を有して発現されるようになることと、該産生量が増加し得ることから、ディプロイド酵母培養における異種ポリペプチド類を産生することは有利なことである（Fuら、Biotechnol.Prog.,12: 145-148,1996; Meadら、Biotechnol.Letters, 8:391-396,1986）。
上記の基準を満たす他のポリペプチド類を製造するために本発明の方法を使用することも、当業者には明白であろう。そのようなポリペプチドの例は、インスリンおよびインスリン類似体類、副腎皮質刺激ホルモン類、アンギオテンシノゲン、心房性ナトリウム利尿ペプチド類、ジノルフィン、エンドルフィン類、ガラニン（galanin）、ガストリン、ガストリン放出ペプチド類、神経ペプチドY断片類、パンクレアスタチン、膵臓のポリペプチド類、セクレチン、血管作動性腸内ペプチド、成長ホルモン放出因子、メラノサイト刺激ホルモン、ニューロテンシン、副腎性ペプチド、甲状腺ホルモンおよび関連ペプチド類、ソマトスタチンおよび関連ペプチド類、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチドトロピン放出因子（CRF；cf.本明細書中の配列認識番号：3)、サイモシン、およびウロテンシン；並びに、これらの同種または異種関連ペプチド類および断片類、並びに他のポリペプチド類（例えば、EEID-CART55-102、ここに記載した配列認識番号：２を参照されたい）であり、55以下のアミノ酸、好ましくは10-50のアミノ酸、更に好ましくは15-40のアミノ酸、或は25-35アミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ０から３のジスルフィド結合、好ましくは１以下のジスルフィド結合をその構造に有しているという判定基準を満たしさえすればよい。
本発明の概要
上記に特定された目的は、本発明に従った方法、即ち、Yap3プロテアーゼ(Yap3p)またはその相同体の活性を低下され、且つ55以下のアミノ酸、好ましくは10-50のアミノ酸、好ましくは15-40或は25-35のアミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3ジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有しするポリペプチド類（例えば、グルカゴンまたはグルカゴン様ペプチド類）をコードするＤＮＡ配列に可働的に結合された酵母プロモーターを具備するハイブリッドベクターを用いて形質転換された酵母を培養することと、前記ポリペプチド類を単離することとを具備する方法により達成される。好ましくは、該酵母細胞は、YAP3遺伝子の切断によりYap3p活性を欠いている。
YAP3を切断した酵母菌株を使用して、1-70のアミノ酸、好ましくは1-40、より好ましくは10-30のアミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ1以下のジスルフィド結合をその構造に有するポリペプチド類（例えば、グルカゴンを含むグルカゴン前駆体遺伝子、GRPP、GLP-1、GLP-2およびそれらの機能的な類似体によりコードされるポリペプチド類）を産生することは、結果として、相当するYAP3野生型酵母菌株からの産生量に比較して約２倍、時には10倍に産生量を顕著に改善する。YAP3を切断した酵母菌株を使用して、55以下のアミノ酸、好ましくは10-50のアミノ酸、好ましくは15-40或は25-35のアミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有する異種ポリペプチド類等［例えば、グルカゴンを含むグルカゴン前駆体遺伝子、GRPP、GLP-1、GLP-2およびそれらの機能的な類似体、若しくはCRF(例えば、配列認識番号：3を参照されたい)、または先端を切り取ったおよび／またはＮ末端を伸長した形態のCART類、好ましくは、ここで配列認識番号：2として示すEEID-CART55-102によりコードされるポリペプチド類］を産生することは、結果として、該異種ペプチドの産生量を、相当するYAP3野生型酵母菌株から得られる産生量の約２倍、時には10倍に顕著に改良できることが明らかになった。本発明の方法を異種ペプチド類の産生に使用することのもう一つの利点は、選択された産物のタンパク分解性浸食の程度が低下するために、均一性が改善されることである。
本発明ではまた、ディプロイドのYAP3切断酵母を本発明の方法に使用することにより、結果として分泌された異種ポリペプチドの産生量レベルが有意に増加され、これは、相当する野生型ハプロイド酵母からの産生量レベルに比較して約2倍、時には9倍の産生量で得られることが可能になることが明らかになった。
適切な該酵母は、機能的なYAP3遺伝子を欠いたS.セレビシアエ(S.cerevisiae)である。しかしながら、他の酵母類も同等のプロテアーゼ類(即ち、Yap3pの相同物)を含有している可能性があり、例えば、WO 95/23857およびクラークら(Clercら、J.Chromat.B.662:245-259、1994)に示されるようなピチア(Pichia)およびクルイベロミセス(Kluyveromyces)等の種類などがそれである。一般的に、翻訳産生物の配列が、Yap3pに対して50%以上で相同する配列を有する場合に、その遺伝子を遺伝子相同物と見なす。コマノおよびフラー(KomanoおよびFuller、Proc.Natl.Acad.Sci、USA 92: 10752-10756、1995)は、Yap3pに対して密接に関連(53%で一致)した、S.セレビシアエに由来するMkc7アスパルチルプロテアーゼ類を同定した。サッカロミセスの他のアスパルチルプロテアーゼは、PEP4、BAR1およびオープンリーディングフレームの遺伝子産生物、YAP3オープンリーディングフレームと部分的に相同な配列［YAP3-リンク(GenBank acc. No.X89514:pos.25352-26878によりコードされる)、YIV9(Swiss Prot acc.No.P40583)およびアスパルチルプロテアーゼ(IV)(GenBank acc.No.U28372: pos,326-2116にコードされる)］を含む。近年の許容された酵母ゲノム命名法に従うと、ここで使用される該酵母遺伝子は、YAP3、YAP3リンク、YIV9、NO4およびMKC7と命名され、これらは、酵母オープンリーディングフレームYLR120C、YLR121C、YIR039C、YDR349CおよびYDR144Cに夫々相当する。更に、オープンリーディングフレームYGL259Wの遺伝子産物は、該酵母アスパルチルプロテアーゼ類中に含まれる。
酵母類の例は、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・クルイベリ(Pichia Kluyveri)、ヤルロウイア・リポリチダ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ・sp.,カンジダ・ウチリス(Candida sp.,Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ゲオトリクム・sp.,(Geotrichum sp.,)およびゲオトリクム・フェルメンタンス(Geotrichum fermentans)を含む。
プロテアーゼの活性を除去する適切な方法は、プロテアーゼをコードするホスト遺伝子を切断し、それにより調節領域および／またはコード領域を含むプロテアーゼ遺伝子の全部分若しくは一部分を欠失させた非回復菌株を製作する方法と、或いは、該活性を、従来の突然変異誘発方法若しくは特異的点突然変異の導入により低下または除去する方法により可能である。該プロテアーゼのダウンレギュレーションに適切な他の方法には、アンチセンスおよび／またはリボザイム構築物を該酵母に導入する方法が含まれる［例えば、アトキンスら（Atkinsら、Antisense and Developmet 5:295-305,1995)およびナスラら(Nasrら、Mol.Gen Genet 249:51-57、1995）の方法］。本発明の方法において使用される酵母菌類におけるYAP3遺伝子を切断する１つの好ましい方法は、ローステイン（Rothstein:Method in Enzymol、194:281−301、1991)により記載されている。
ここで使用される「グルカゴンまたはグルカゴン様ペプチド類」の表現は、ヒトオリジン若しくは他の動物に由来するもの、並びに組換え体または半合成供給物であってもよく、且つ該表現にはグルカゴンファミリーの全構成物が含まれ、例えば、GRPP(グリセンチン関連ペプチド：glicentine related polypeptide)、グルカゴン、GLP-1(グルカゴン様ペプチド1)およびGLP-2(グルカゴン様ペプチド2)等であり、GLP1(7-36)等の先端を切断したおよび／またはＮ末端を伸長した形態、並びにGLP-1(7-35)R36A、GLP-2 F22Y、GLP2 A19T+34Y、GLP-2 A2GおよびGLP-2 A19T等の類似物および1から3のアミノ酸の置換、添加および／または欠失を有する他の類似物も含まれる。本発明に従うポリペプチドの発現に使用されるcDNAは、酵母における発現のために最適化された形態のコドンを含んでいる。
本記述およびクレームでは、IUPAC-IUB委員会により承認された規定(1974)に従ったアミノ酸の１文字および３文字暗号を使用している（生化学的命名法、生化学的命名法IUPAC-IUB委員会の仮説的規定および推奨を参照されたい：Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature、第２版、Maryland、1975)。
本発明の更なる側面は、55以下のアミノ酸、好ましくは10から50のアミノ酸、より好ましくは15から40、或いは好ましくは20から30アミノ酸、最も好ましくは25から35アミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列を含有するハイブリッドベクターで形質転換された酵母細胞の培養物であって、前記ポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列が、酵母プロモーターおよびリーダー配列(プロ配列若しくはプレプロ配列)をコードするポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列と、および／または該酵母において前記ポリペプチドを発現し且つ分泌するために必要不可欠な他のポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列と、可働的に結合しており、且つ前記酵母細胞の培養物は、該細胞が、好ましくは該YAP3遺伝子を切断することにより、低下されたYap3p活性を有することを特徴とし、且つ前記酵母細胞の培養物がハプロイドまたはポリプロイド、好ましくはジプロイド酵母細胞である培養物である。
本発明のもう一つの側面は、酵母細胞の培養物を提供することであって、55以下のアミノ酸、好ましくは10-50のアミノ酸、好ましくは15-40、或いは好ましくは20-30のアミノ酸、最も好ましくは25-35アミノ酸を有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、該酵母における発現と分泌とを引き起こす分泌シグナルをコードする第2のポリヌクレオチド配列とを含有し、且つ該酵母細胞のYap3プロテアーゼ活性が低下されていることを特徴とする培養物を提供することである。好ましい該酵母細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含有するハイブリッドベクターで形質転換されたジプロイド酵母細胞であり、並びに好ましい該酵母細胞は、Yap3p活性を欠いており、これは、YAP3遺伝子を切断することにより都合よく得ることが可能である。
55以下のアミノ酸、好ましくは10-50アミノ酸、好ましくは15-40、若しくは好ましくは25-35アミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有するポリペプチド類をコードするDNAは、適切なホストに導入するための広範囲に多様な他のDNA配列類と連結させてもよい。連結し同伴させるDNAは、ホストの性質、そのホストへの該DNAの導入方法、およびエピソープ維持またはホスト染色体（単数若しくは複数）の一体化が望まれるかどうかに依存するであろう。
一般的に、該DNAは、プラスミド等の発現ベクターに、発現に適切な配向且つ正確なリーディングフレームで、導入される。該ベクターは、続いて該ホスト中に、標準的な技術により導入され、且つ一般的には、形質転換されたホスト細胞を選択することが必要不可欠であろう。
一体化が望まれる場合には、該DNAは、酵母一体化プラスミドベクター、例えば、pJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242(Jones & Prakash、Yeast 6:363,1990)またはpDP6(Fleigら、Gene 46: 237,1986)に、発現に適切な配向で且つ正確なリーディングフレームで導入され、これは、何れかの非必須酵母遺伝子類、トランスポゾン配列またはリボソーム遺伝子類等の相同配列と近接(flank)する。好ましい該フランキング(flanking)配列は、酵母プロテアーゼ遺伝子または選択的マーカーとして使用される遺伝子である。次に該DNAは、該フランキング配列に生じた相同的組換えにより、ロスステイン(Rothstein、Method in Enzymol,194:281-301,1991)およびクレッグら(Creggら、Bio/Technol.11:905-910,1993)により示される標準技術を使用して、ホスト染色体(単数または複数)に一体化される。
本発明の組換えDNAにより形質転換されたホスト細胞を、続いて、十分な時間、且つここに開示された技術における当業者に公知の適切な条件の下で培養することにより、本発明の方法に従って産生されるべきポリペプチド類（好ましくは、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、CEFおよびEEID-CART55-102またはそれらの機能的な類似物等のポリペプチドを例とする）の発現および分泌が可能になり、且つ公知の方法により回収することが可能になる。
有効な酵母プラスミドベクターには、POT(Kjeldsenら、Gene 170:107-112,1996)およびYEp13、YEp24(Rose and Broach,Methods in Enzymol. 185:234-279,1990)並びにpGプラスミド類(Schenaら、Methods in Enzymol. 194:289-398,1991)が含まれる。
S.セレビシアエを形質転換する方法には、スフェロプラスト形質転換、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔法が含まれ、これらについては酵素学の方法（Methods in Enzymol.Vol.194,1991)を参照されたい。好ましい形質転換は、ここに例として記載される。
S.セレビシアエの適切なプロモーター類は、MFα1プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター類(GAL1、GAL7およびGAL10プロモーター等)、解糖酵素プロモーター類(TPIおよびPGKプロモーター類を含む)、TRP1プロモーター、CYCIプロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、ADH1プロモーター、およびHSPプロモーターを含む。ピチア属の適切なプロモーターは、AOXI(メタノール利用)プロモーターである。
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化のために適切なシグナルを含む真核生物遺伝子の3’フランキング配列(3’flanking sequence)である。適切な3’フランキング配列は、例えば、使用される発現調節配列に自然に結合している遺伝子等、即ちプロモーターに一致してもよい。
本発明のポリペプチドの分泌物の発現を提供するために使用されるDNA構築物は、酵母プロセッシングシグナルにより該ポリペプチドに結合されたリーダー配列を含むDNA配列を具備する。該リーダー配列は、シグナルペプチド(「プレ配列」)を小胞体を横切るタンパクの翻訳のために含み、且つ更なる配列(「プロ配列」)を可働的に含み、これらは該ポリペプチドが周囲の培地中に放出される以前に、酵母細胞内で切断されても、されなくてもよい。有効なリーダー配列は、マウスαアミラーゼ、S.セレビシアエのMFα1、YAP3、BAR1、HSP150のシグナルペプチド、およびS.クルイベリのMFαシグナルペプチド類、並びにＳ．セレビシアエMFα1、YAP3、PRC、HSP150およびＳ．クルイベリのMFαのプレプロ配列、並びにWO 92/11378、WO 90/10075およびWO 95/34666において記載された合成リーダー配列類である。更に、本発明の方法に従い産生されるべきポリペプチド類は、WO 95/35384に記載されるようなN末端の伸長を伴なって提供されてもよい。
本発明はまた、Yap3p活性の低下を有する酵母を製造する方法に関するものであって、a）YAP3遺伝子の一部分を有し、且つ酵母細胞への形質転換に適切なハイブリッドプラスミドを提供するステップと、b）YAP3の断片を欠失することによりYAP3遺伝子を切断し、且つ代わりにURA3遺伝子を導入してΔyap3::URA3遺伝子切断プラスミド得るステップと、c)酵母Δura3欠失突然変異体を提供するステップと、d）前記突然変異体を前記プラスミドを用いて形質転換するステップと、およびe）ウラシルを除いた培養液においてΔyap3::URA3欠失変異体類を選択するステップとを具備する方法に関する。更に本発明は、アンチセンス技術を使用してYap3p活性を低下した酵母を製造する方法に関する。
更に、本発明の方法に従って製作されるべきポリペプチド類は、都合よくN末端またはC末端のタグと組み合わされて発現されてもよく、或は前駆体若しくは融解タンパクとして発現されてもよく、発現される該ポリペプチドの全長は、総合して55または70アミノ酸よりも大きいものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドpS194の構造を示す。
図２は、プラスミドpME834およびpME1389の構造を示す。
図３は、ヒトグルカゴン発現プラスミドpMT703の制限地図である。
図４は、ヒトGLP-1(7-37)発現プラスミドpLaC253の制限地図である。
図５は、ヒトGLP-2発現プラスミドpKV210の制限地図である。
図６は、HO(同株性)エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子と、YEp13プラスミドに挿入されたUra3pとを含有するpME973プラスミドの制限地図である。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様を以下の表１に示している。当該技術の認識を有しているならば、当業者が、他のポリペプチド類［55以下のアミノ酸、好ましくは10-50アミノの酸、好ましくは15-40、或は好ましくは25-35のアミノ酸をそのポリペプチド鎖に有し、且つ0から3のジスルフィド結合、好ましくは1以下のジスルフィド結合をその構造に有するポリペプチド］、並びにそれらの機能的な類似物を、本発明の方法により、同様な構築物を使用して産生できることは明白であろう；
0003998717.tif 000002
ここで使用されるＳ．セレビシアエ菌株類の遺伝子学的な背景は以下の通りである：
E11-3C  MATα YAP3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 URA3
SY107   MATα YAP3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3
ME1487  MATα Δyap3::URA3 pep4-3 Δtpi::LEU2 Ieu2 Δura3
ME1656  MATα Δyap3::ura3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3
ME1684  MATa Δyap3::URA3::Δylr121c pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3
ME1695  MATα Δyap3::ura3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3
ME1719  MATa/α Δyap3::URA3/Δyap3::ura3 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3
MT663   MATa/α YAP3/YAP3 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 URA3/URA3 HIS4/his4
更に本発明を以下の例により説明するが、これらにより保護範囲が制限されるものではない。前述の説明および以下の例に開示される特徴は、両者とも独立して、およびその何れかを組合わせた中に存在してもよく、それを多様化した形態の本発明を実現するための物質であってもよい。
例１
Δyap3::URA3遺伝子切断
Δura3欠失突然変異体を以下の通りに構築した：
pJJ244(URA3遺伝子の1.2kbのHindIII断片を含有するpUC18)をStylを用いて消化し、クレノウポリメラーゼを用いて挿入し、自己連結した。pS194と称する得られたプラスミドは、URA3遺伝子の84bpのStyl-Styl断片欠失を含む(c.f.図１)。
Δyap3::URA3遺伝子切断プラスミドpME1398は以下の通りに構築した：
pME768のYAP3遺伝子を含む2.6kbのSacl-Pstl断片(Egel-Mitaniら、Yeast 6: 127-137、1990)は、pIC19Rの2.6kbのSacl-PstI断片(Marshら、Gene 32: 481-485、1984)に挿入された。得られたプラスミドはpME834である。pME834を、HindIIIを用いて消化し、0.7kbのYAP3断片の欠失を形成し、URA3遺伝子の1.2kb HindIII断片(Roseら、Gene 29:113-124、1984)をその代わりに挿入した。得られたプラスミドはpME1389である。プラスミドpME834およびpME1389を、図式の形態で図２に示している。
S.セレビシアエ菌株E11-3C(MATα YAP3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 URA3)［cf.ATCC 20727、US pat.4766073］を直線化したpS194(Bsgl消化)を用いて形質転換して、Δura欠失変異体を作製した。最小平板に含有される5-FOA(5-フルオロ-オロチン酸)上で選択することにより、SY107と称するΔura3変異株が得られた。
菌株SY107(MATα YAP3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3)を次に、予めSallおよびSaclにより切断したpME1389を用いて形質転換し、Δyap3::URA3の3kb断片を形質転換のために単離した。Δyap3::URA3欠失変異体類を、ウラシルを除いた最小平板上で選択した。URA3形質転換体類は、PCRおよびサザンハイブリダイゼーションにより特徴を得て、YAP3位置におけるΔyap3::URA3断片の正しい一体化を確認した。ME1487をΔyap3::URA3欠失変異体(MATα Δyap3::URA3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3)として単離した。
例２
Δyap3/Δyap3切断菌株の構築
ME1487に、EMS(メタン-スルホン酸エチルエステル)を使用して突然変異を起こし、ura3変異体を5-FOAを含有する平板上で選択した。選択された単離菌の1つであるME1656を、続いて図６に示したpME973による一過性の形質転換により交配型転換(mating type switch：HerskowitzおよびJensen、Methods in Enzymol. 194: 132-146、1991)に供した。pME973は、HO(同株性)エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子と、YEp13プラスミド(RoseおよびBroach、Methods in Enzymol. 185: 234-279、1990)に挿入されたURA3とを含有する。一過性の形質転換から、ME1695はハプロイド菌株として選択され、これは、MATαからMATaに転換され、且つ以下の遺伝学的な背景を有している：MATa Δyap3 ura3 pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3。
ME1695を次に、ME1487を用いた極微操作(ShermanおよびHicks、Methods in Enzymol、194: 21-37、1991)により交差し、その結果、Δyap3/Δyap3ディプロイドを得た。得られたディプロイド類から、ME1719を以下の遺伝子学的背景を有した菌株として選択した：
MATa/α Δyap3::ura3/Δyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura。
例３
Δyap3::URA3::Δylr121c二重切断菌株(double disruption strain)
YAP3およびYLR121Cをコードする密接に連結された２つの遺伝子の１ステップ遺伝子切断菌株(one-step gene disruption strain)を作製するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
P1      長さ57bp:YLR121C/URA3プライマー
5'-GAT CGA ACG GCC ATG AAA AAT TTG TAC TAG CTA ACG AGC AAA GCT TTT CAA TTC AAT-3'
P2      長さ57bp:YAP3/URA3プライマー
5'-CCA GAA TTT TTC AAT ACA ATG GGG AAG TTG TCG TAT TTA TAA GCT TTT TCT TTC CAA-3'
P1およびP2は各々、YLR121CおよびYAP3のコード領域の範囲内の配列に夫々一致する40ヌクレオチドと、HindIII部位(AAGCTT)と、URA3遺伝子(YEL021W)に近接する(flanking)配列に一致する12ヌクレオチドとを含有する。P1およびP2をテンプレートとしてURA3遺伝子を用いたPCRに使用した。得られた1248bpPCR断片は、YAP3またはYLR121Cコード領域に由来する40ヌクレオチドと近接するURA3選択性マーカーを含有する。このPCR断片は次に、ME1655に形質転換され、Δyap4::URA3::Δylr121c欠失変異体が選択され、例１に記載される通りの特徴を有していた。ME1684は、以下の遺伝子学的背景を有するΔyap3::URA3::Δylr121c変異体として単離された。
MATα Δyap3::URA3::Δylr121c pep4-3 Δtpi::LEU2 leu2 Δura3
例４
酵母への形質転換
酵母コンピテント細胞を作製するために、酵母ハプロイド菌株SY107およびME1487、またはディプロイドME1719菌株を、100ml YPGGE培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グリセロール、2%ガラクトース、1%エタノール)に培養し、OD600＝0.2にした。細胞は2000rpmで5分間、遠心することにより回収し、10mlのH2Oを用いて1度洗浄した。細胞を、10ml SED(1Mソルビトール、25mM Na2EDTA、pH8、6.7mg/mlジチオスレイトール)に再懸濁し、30℃で、15分間、インキュベートした。細胞を、遠心および10mlのSCE(1Mソルビトール、0.1Mクエン酸Na、10mM Na2EDTA、pH5.8)+2mgノボザイムSP234(Novozyme SP234)中への再懸濁し、30分間、30℃でインキュベートした。遠心により細胞を回収し、10ml 1.2Mソルビトールにより洗浄を1回行い、続いて10ml CAS(1Mソルビトール、10mM CaCl2、10mMトリス-HCl、pH7.5)により洗浄した後に、細胞を遠心により回収し、最終的に2ml CAS中に再懸濁した。コンピテント細胞をエッペンドルフチューブの1本当たりに100μlを添加した状態で、-80℃で凍結した。
以下のように、形質転換を行った：凍結されたコンピテント細胞(100μl)を急速に温め、1μgのプラスミドDNAを添加した。細胞を室温で15分間、インキュベートし、1ml PEG溶液(20%ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2、10mMトリス-HCl、pH7.5)を添加した。30分後、室温で、細胞を2000rpm、15分間の遠心により回収し、100μl SOS(1Mソルビトール、1/2vol.YPGGE、0.01%ウラシル、7mM CaCl2)に再懸濁した。30℃での2時間のインキュベーションの後、細胞を遠心し、0.5ml 1Mソルビトールに再懸濁した。細胞を次に、6mlの上層寒天(2.5%寒天を含有したYPD)を伴なったYPD平板(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース、2%寒天)上に塗沫した。平板は30℃で3日間から5日間、形質転換が現われるまでインキュベートした。
例５
異種タンパク発現プラスミド
以下の例で使用された酵母大腸菌シャトルベクターは異種タンパク発現カセットを含有し、これは、リーダー配列をコードするDNA配列(POTプラスミド中のS.セレビシアエのTPIプロモーターおよびTPIターミネーターの間に可働的に位置する当該異種ポリペプチドがこれに続く)を含む(Kjeldsenら、1996、op. cit.)。このリーダー配列は、MFα１プレプロー配列とその修飾体である。例を以下に示す：
0003998717.tif 000003
例６
グルカゴンの発現
ヒトグルカゴン発現プラスミドpMT703(cf.図3)を、３つの菌株、例えば、YAP3切断ハプロイド菌株ME 1487(Δyap3)、YAP3切断ディプロイド菌株ME1719(Δyap3/Δyap3)およびYAP3野生型菌株SY107(YAP3 WT)等中に形質転換した。形質転換体は、炭素減としてのグルコース利用によりYPD平板(1% w/v酵母抽出物、2% w/vペプトン、2%グルコース、2%寒天)上で選択した。ME1532およびYES1746は、夫々にME1487(Δyap3)およびME1719(Δyap3/Δyap3)から得たpMT703形質転換体であるのに対し、ME1530は、SY107(YAP3 WT)から得られたpMT703ので異質転換体である。形質転換体は、5ml YPD液体培地中において30℃、3日間、200rpmでの振盪を行いながら培養した。培養上清を、2500rmp、5分間の遠心の後に回収し、1mlの上清を逆相HPLCにより分析した。表3に示した産生レベルは、2つの独立して単離した形質転換体からの培養物の平均値(Exp.1)であり、または3つの形質転換体の混合物からの値(Exp.2)であり、これらは、ハプロイドYAP3野生型レベルが100%となるように標準化した。HPLC分析により、ME1532またはYES1746が、ME1530に比較して約4倍から6倍多くのグルカゴンを産生したことを示した。
グルカゴン検出のためのHPLCの設定
HPLCカラム：    4×250mm Novo Nordisk YMC-OdDMeSi C18 5μm
カラム温度：    50℃
溶出速度：      1ml/min
HPLC溶媒：
A：             0.2M Na2SO4中の10%(v/v)アセトニトリル、0.04M H3PO4エタノールアミンを用いてpH2.3に調整。
B：             水中の50%(v/v)アセトニトリル
注入量：        150μl
グルカゴンを、23.6から32.9%のアセトニトリルを用いて40minでHPLCカラムから溶出した。
0003998717.tif 000004
例７
GLP-1(7-37)の発現
ヒトGLP-1(7-37)発現プラスミドpLaC253(cf.図４)を、ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)およびSY107(YAP3 WT)中に形質転換した。形質転換体を選択し、例6に記述の通りに分析した。ME1535およびYES1823は、夫々、ME1487(Δyap3)およびME1719(Δyap3/Δyap3)から得られたpLaC253形質転換体であるのに対して、ME1534は、SY107(YAP3 WT)から得られたｐLaC253の形質転換体である。表4に示した産生レベルは、２つの独立して単離された形質転換体からの培養物の平均値(Exp.1)、または3つの形質転換体の混合物からの値(Exp.2)とし、これらは、ハプロイドYAP3野生型レベルが100%となるように標準化した。HPLC分析により、ME1535またはYES1823がMB1530に比較して約2倍から3倍多くのGLP-1(7-37)を産生したことを示した。
GLP-1(7-37)検出のためのHPLCの設定
例6に記載した通りに行ったが、但し、GLP-1を31.2%から41.2%のアセトニトリルを用いて40minでHPLCカラムから溶出した。
0003998717.tif 000005
例８
GLP-2の発現
ヒトGLP-2発現プラスミドpKV210(cf.図５)をME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)およびSY107(YAP3 WT)中に形質転換した。形質転換体を選択し、例６に記載の通りに分析した。ME1615およびYES1827は、ME1487(Δyap3)およびME1719(Δyap3/Δyap3)から、夫々得られたpKV210形質転換体であるのに対して、ME1614は、SY107(YAP3 WT)から得られたpKV210形質転換体である。表５に示した産生レベルは、2つの独立して単離された形質転換体からの培養物の平均値(Exp.1)であり、または3つの形質転換体の混合物からの値(Exp.2)であり、これらは、YAP3野生型レベルが100%となるように標準化した。HPLC分析により、ME1615またはYES1827が、ME1614に比較して約6倍から11倍多くのGLP-2を産生したことを示した。
GLP-2検出のためのHPLCの設定
HPLCカラム：    Vydac 214 TP54カラム
溶出速度：      1ml/min
HPLC溶媒：
A：             0.1% TFA
B：             アセトニトリル中の0.07% TFA
GLP-2を、20から80%アセトニトリル中の0.07%のTFAを用いて60minでHPLCカラムから溶出した。
0003998717.tif 000006
例９
CRF1-41(配列認識番号:３)の発現
ヒトコルチコトロピン放出因子(CRF1-41)発現プラスミドpKV241［図５におけるMFα1-プレ-プロ(1-81)MAKR-GLP2がMFα1-プレ-プロ(1-81)MAKR-CRF1-41により置換されているpKV210に等しい］を、ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)およびSY107(YAP3 WT)中に形質転換した。形質転換体を選択し、例6に記述する通りに分析した。ME1813およびYES1810は、夫々、ME1487(Δyap3)およびME1719(Δyap3/Δyap3)から得られたpKV241形質転換体であるのに対して、ME1812は、SY107(YAP3 WT)から得られたpKV241形質転換体である。表６に示した産生レベルは、３つの形質転換体の混合物の値(Exp.2)であり、これらは、ハプロイドYAP3野生形レベルが100%となるように標準化した。HPLC分析を例8のように行い、ME1813またはYES1810が、ME1812に比較して約8倍から9倍多くのCRF1-41を産生した。
0003998717.tif 000007
例１０
EEID-CART55-102(配列認識番号:２)の発現
ヒトコカインおよびアンフェタミン調節転写(EEID-CART55-102)発現プラスミドpSX637［図５におけるMFα1-プレ-プロ(1-81)MAKR-GLP2がMFα1-プレ-プロ(1-81)MAKR-EEID-CART55-102により置換されているpKV210に等しい］のN末端伸長(EEID)断片を、ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)およびSY107(YAP3 WT)中に形質転換した。形質転換体を選択し、例６に記載の通りに分析した。ME1817およびYES1820は、夫々、ME1487(Δyap3)およびME1719(Δyap3/Δyap3)から得られたpSX637形質転換体であるのに対して、ME1816は、SY107(YAP3 WT)から得られたpSX637形質転換体である。表７に示される産生レベルは、３つの形質転換体の混合物の値(Exp.2)であり、これらは、ハプロイドYAP3野生形レベルが100%となるように標準化した。HPLC分析を例8のように行い、ME1817またはYES1820が、ME1816に比較して約2倍から3倍多くのEEID-CART55-102を産生した。
0003998717.tif 000008
例１１
表８は、異なるプレ-プロ-配列(リーダー類)を有した発現プラスミドにより形質転換されたME1487(Δyap3)における、ヒトグルカゴン、GLP-1(1-37)、およびGLP-2の発現レベルのデータを示している。発現プラスミドは、図５に記載される通り、但し詳細は表８に示した。発現産生量を、MT663(YAP3/YAP3)形質転換体において得られた産生量を100%とするために標準化した。
0003998717.tif 000009
配列表
配列認識番号：１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列認識番号：１：
0003998717.tif 000010
配列認識番号：２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列認識番号：２：
0003998717.tif 000011
配列認識番号：３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：４１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列認識番号：３：
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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