(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（３）で表される新規物質JJ13。
【化３】
0004005325.tif 000006
【請求項２】
式（３）で表される新規物質JJ13を有効成分とする抗がん剤。
【請求項３】
ビソクラミス（Byssochlamys）属ニベア（nivea）種の菌を培養し、得られた培養物から採取することを特徴とする、請求項１記載の新規物質JJ13の製造方法。
【請求項４】
ビソクラミス  ニベア（Byssochlamys nivea）FERM BP-7722菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定構造を有するステロイド化合物を有効成分とする抗がん剤及び新規物質JJ13に関するものである。
【従来の技術】
抗がん剤に関しては、すでに多くのものが医薬として実用化されている。しかし、臨床において有用な抗がん剤はそれほど多くはなく、また、治療効果が認められる抗がん剤においても、その副作用が問題となっている。一般に化学物質の生理活性は、その化学構造に依存するところが大きいため、抗がん性を有する新規な化合物の出現が常に望まれている。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
がん細胞のみに選択的に作用する新規抗がん剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
前記目的の達成のために、種々の微生物代謝産物から検討した結果、特定構造を有するステロイド化合物がヒトの乳がん細胞に対して選択的な抗がん作用を有することを見出した。すなわち、本発明は、下記の式（１）で表されるステロイド化合物を有効成分とする抗がん剤を提供する。
【０００３】
【化４】
0004005325.tif 000002
【０００４】
（式中、R1は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R2は水素又はアルキル基を表し、
R3は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R4は水素又はアルキル基を表し、
R5はヒドロカルビル基を表し、
R6は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R7は水素、アルキル基又はアシル基を表す。）
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明におけるステロイド化合物のうち、下記の式（２）で表されるステロイド化合物が好ましく、
【０００６】
【化５】
0004005325.tif 000003
【０００７】
（式中、R1は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R2は水素又はアルキル基を表し、
R3は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R4は水素又はアルキル基を表し、
R5はヒドロカルビル基を表し、
R6は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R7は水素、アルキル基又はアシル基を表す。）
また、R2が1から18個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
R3が水酸基、又は1から18個の炭素原子を有するアルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R4が1から18個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
R5が1から18個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を表し、
R6が水酸基、又は1から18個の炭素原子を有するアルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R7が水素、又は1から18個の炭素原子を有するアルキル基又はアシル基を表すものがより好ましい。特に、下記の式（３）で表されるものが最も好ましい。
【０００８】
【化６】
0004005325.tif 000004
【０００９】
本発明におけるステロイド化合物は、該化合物の生産菌を培養し、培養物より分離生成することにより得ることができ、例えば特開平7-48397に記載される方法により得ることができる。本発明におけるステロイド化合物の生産菌としては、該化合物の生産能を有するものであればいずれも使用できる。好適に使用できるものとしては、ビソクラミス（Byssochlamys）属の菌が挙げられる。さらには、ビソクラミス属ニベア（nivea）種の菌を用いるのが好ましい。本発明においては、特に以下に示すByssochlamys nivea M#5187が有利に使用できる。
【００１０】
本発明におけるステロイド化合物（３）を生産する菌株は新たに桃の缶詰より分離した菌株であり、微生物の名称「Byssochlamys nivea M#5187」及び受託番号「FERM BP-7722」として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。この菌株の菌学的性状を以下に示す。
（a）ポテトデキストロース寒天培地で、30℃、2週間培養した場合
（集落性状）
発育は速やかで、集落の大きさは75 mmである。表面性状はクリーム色で、一部綿毛状となる。色素産生はしない。裏面は淡褐色から淡黄色である。37℃で発育は良好である。
（形態）
有性世代があり、子のう果は白色で球状であり、大きさは200〜350μmである。子のうは無色で球状であり、大きさは8〜12μmである。子のう胞子は無色で単細胞であり、楕円形であり、表面平滑であり、大きさは4〜5×2.5〜3μmである。
無性世代はPaecilomycesであり、分生子は亜球形で、大きさは3〜5×2.5〜4μmであり、厚膜胞子産生する。
（b）Malt Yeast 寒天培地で30℃、2週間培養した場合
（集落性状）
発育は速やかで、集落の大きさは85 mm以上である。表面性状はクリーム色で疣状隆起があり、平坦である。裏面は無色である。37℃で発育は良好である。
（形態）
有性世代があり、子のう果はクリーム色で球状であり、大きさは260〜290μmである。子のうは無色で球状であり、大きさは8〜12μmである。子のう胞子は無色で単細胞であり、楕円形であり、表面平滑であり、大きさは4〜5×3〜4μmである。
無性世代はPaecilomycesであり、分生子は無色でやや楕円形であり、大きさは3.5から5×4.5μmである。
厚膜胞子を多量に産生し、楕円形であり、大きさは6〜8μm、介在性、連鎖状もある。
（c）生理的性質
（生育温度範囲及び最適温度）
本菌株は、15〜42℃の範囲で生育し、温度は25〜37℃、至適温度は32℃である。なお、使用した倍地はポテトデキストロース寒天培地である。
（生育pH範囲及び最適pH）
pHは6.9〜7.5、至適pHは7.5である。なお、このpH測定は液体培地法（32℃）により行った。基礎培地には、Czapekブロスを緩衝液でpH調整したものを使用した。
（好気性、嫌気性の区別）
好気性である。
【００１１】
以上の形態的特徴及び培養上の性状を、
R. A. Samson & E. S. van Reenenn-Hoekstra:
Introduction to Food Borne Fungi 1988  pp.26-31
Ascomycetes,Byssochlamys
Centraalbureau voor Schimmelkultures,Baarn
に報告されている多くの既知菌株と比較検討した。
その結果、本菌株はByssochlamys niveaであることが明らかとなった。
【００１２】
本発明におけるステロイド化合物は、該化合物の生産菌を好適な培地で好気的に培養し、培養物から目的物を分離、精製することによって得ることができる。培地は、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有するものである。栄養源としては、従来から培養に利用されている公知のものが使用できる。具体的には、炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、玄米、油脂類などが使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、綿実粕、コーンステイープリカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、などの有機物ならびに硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機物が利用できる。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することができる。また、菌の発育を助け、本発明におけるステロイド化合物の生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。培養方法としては、好気的液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は、２０〜３０℃であるが、多くの場合２７℃付近で培養する。このようにしてステロイド化合物が蓄積した培養物から目的物質を単離精製する。
【００１３】
培養物からの採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈澱法等を単独で又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、培養液中に蓄積されたステロイド化合物（３）は、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等で抽出すると有機溶剤層に抽出される。ステロイド化合物（３）を更に精製するには、シリカゲル、アルミナ、等の吸着クロマトグラフィーあるいは合成吸着剤例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）、あるいはゲル濾過等のクロマトグラフィー例えばセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、あるいはＯＤＳカラムクロマトグラフィーやＨＰＬＣを適宜組み合わせて実施することができる。
さらに、採取されたステロイド化合物、例えば上記の式（３）のステロイド化合物を置換反応又は付加反応等の化学修飾することにより、本発明におけるステロイド化合物を得ることができる。
【００１４】
本発明におけるステロイド化合物は抗がん剤として、任意の投与経路で、また採用投与経路によって決まる剤型、例えば錠剤、カプセル、坐剤、溶液、シロップ、乳液等で投与することができる。薬剤としては、製薬上許容される担体あるいは希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ラクトース、コンスターチ、アルギン酸、スターチ、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテート等で希釈された形態が普通である。抗がん剤として本発明におけるステロイド化合物を実際に投与する場合には、これらを注射用蒸留水または生理食塩水に溶解して注射する方法が代表的なもののひとつとして挙げられる。具体的には、動物の場合には腹腔内注射、皮下注射、静脈または動脈への血管内注射および注射による局所投与などの方法が、ヒトの場合は静脈または動脈への血管内注射または注射による局所投与などの方法がある。本発明におけるステロイド化合物の投与量は、種々の状況を勘案して、連続的または間欠的に投与したときに総投与量が一定量を越えないように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、たとえば年齢、体重、性別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて変化することは言うまでもなく、また一定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針のもととして専門医の適量決定試験によって決定されなければならない。具体的には、成人１日あたり0.１〜１ｇ程度である。
【００１５】
【実施例】
（培養）
以下に示す前培養培地15mlを50ml容大型試験管に分注、殺菌後、本菌株を接種し、27℃にて72時間培養したものを種母とした。
グルコース  4 g
酵母エキス  4 g
麦芽エキス  10 g
チアミン塩酸塩  5 mg
リボフラビン  5 mg
ナイアシン  5 mg
ピリドキシン  5 mg
イノシトール  5 mg
パントテン酸カルシウム  5 mg
p-アミノ安息香酸  5 mg
ビオチン  2.5 mg
水  1L
pH 7.3
以下に示す生産培地を500ml容三角フラスコへ分注し、殺菌したものに上記種母2mlを添加し、27℃にて2週間、静置培養を行った。
玄米  9 g
酵母エキス  18 mg
酒石酸ナトリウム  9 mg
りん酸二水素カリウム  9 mg
水27 ml
【００１６】
（単離）
上記で得た菌体（フラスコ6本分）を80%アセトン水（450ml）で抽出し、遠心エバポレータでアセトンを除去した。さらに450mlの酢酸エチルで2回抽出し、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Wako C-200)に吸着させ、クロロホルム-メタノール (85 : 1)の混合溶媒で溶出した。得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィー（Sephadex LH-20）に供し、100%メタノールにより溶出した。さらに得られた画分を高圧液体クロマトグラフィー (Senshu-Pak ODS)に供し、80%メタノールにより溶出し、新規物質JJ13 を得た(1.2 mg)。得られた化合物は、下記の物理化学的性質を有するものであり、各種スペクトルデータの解析の結果、前記式（３）で示される化学構造を有することがわかった。
【００１７】
（JJ13の理化学的性質）
外観：白色粉末
融点：265〜268℃
比旋光度：[α]D25 +53 (c 0.69, CHCl3)
分子式：C32H50O7
高分解能FAB-MS  実測値：569.3456 (M+Na)+  計算値：569.3454
溶解性：メタノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサンに可溶、水に難溶
紫外線吸収スペクトル  λnm (ε) （メタノール中、図１に示す）：204 (3,010), 277 (120)
赤外吸収スペクトルcm-1（KBrディスク法、図２に示す）：3480, 1730
13C and 1H NMR データ（図３ａ及びｂに示す）：
0004005325.tif 000005
【００１８】
（抗がん作用の評価）
抗がん作用試験は、ヒトの乳がん細胞株であるHBC-4細胞及びMCF-7細胞、ラットの正常線維芽細胞株3Y1細胞を用いて評価した。
（１）HBC-4細胞
HBC-4細胞を、50 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.1μg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地にて、2×103 cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO2条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。同条件下で72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞障害活性を評価した。
（２）MCF-7細胞
MCF-7細胞を30 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.05μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、5×103 cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO2条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞増殖抑制活性を評価した。
（３）3Y1細胞
3Y1細胞を50 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.05μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、2×103 cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO2条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞増殖抑制活性を評価した。
評価した結果を図４に示す。JJ13はHBC-4細胞に対し、細胞障害活性を示し、MCF-7細胞に対しては細胞増殖阻害活性を示した。一方、3Y1細胞に対してはいずれの活性も示さなかった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のステロイド化合物を有効成分とする抗がん剤及び新規物質JJ13は、がん細胞のみに選択的に作用し、細胞障害活性あるいは細胞増殖抑制活性を示す。特に乳がん細胞に対して高い効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  JJ13の紫外線吸収スペクトルである。
【図２】  JJ13の赤外線吸収スペクトルである。
【図３ａ】  JJ13の13C NMRスペクトルである。
【図３ｂ】  JJ13の1H NMRスペクトルである。
【図４】抗がん作用の評価結果のグラフである。
【図１】
0004005325.tif 000007
【図２】
0004005325.tif 000008
【図３ａ】
0004005325.tif 000009
【図３ｂ】
0004005325.tif 000010
【図４】
0004005325.tif 000011