(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能既知遺伝子と機能未知遺伝子のそれぞれの薬剤感受性パターンに基づいて機能未知遺伝子の機能を解析する方法であって、
(i)  以下の工程(a)〜(e)：
(a)  複数の機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）を真核細胞に導入して、各々の機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）をそれぞれ過剰発現する形質転換真核細胞を調製し、
(b)  前記(a)で調製した形質転換真核細胞とその親株細胞とについて、複数の薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）の各種濃度における生存率を測定し、
(c)  親株細胞の生存率を40%低減する薬剤濃度の値（IC40値）と、各々の形質転換真核細胞の生存率に対するIC40値とを測定し、
(d)  前記(c)における前者のIC40値に対する後者のIC40値の比を算出し、
(e)  前記(d)の比の対数値を算出する、
によって、全ての機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）について、各々の薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）に対する感受性の変化を示す対数値のリストを作成し、
(ii)  未知遺伝子（gx）を過剰発現する形質転換真核細胞について、前記(i)と同一の複数薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）の各種濃度における生存率から薬剤ごとのIC40値を測定し、
(iii)  前記(ii)のIC40値から、前記(i)の工程(e)で機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）の対数値を算出したのと同様の方法によって、未知遺伝子（gx）の対数値を算出し、
(iv)  未知遺伝子（gx）の対数値と、前記(i)で作成した対数値リストに含まれる全ての機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）の対数値との間の相関係数を算出し、
(v)  相関係数から帰結される有意な相関関係を示す機能既知遺伝子の機能が未知遺伝子（gx）の機能と関連するものと決定する、
ことを特徴とするDSPA（Drug-Sensitivity Pattern Analysis：薬剤感受性パターン解析）に基づく遺伝子機能の解析方法。
【請求項２】
既知遺伝子（gn）のnが50以上である請求項１の解析方法。
【請求項３】
薬剤（Dn）のnが40以上である請求項１または２の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の方法は、未知遺伝子の機能を解析する方法と、この解析に用いる遺伝子機能データベースおよびその作成方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ゲノム創薬や、各種有用タンパク質の遺伝子工学的製造のための遺伝子材料として有用な機能未知遺伝子の機能を解析する新しい方法と、この解析に用いる遺伝子機能データベースおよびその作成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
ヒトゲノム解析プロジェクトの結果、ヒトの全ての遺伝子配列がまもなく解明されようとしている。そして、近い将来には遺伝子が原因となる全ての疾患の原因遺伝子が明らかになると予想される。疾患原因遺伝子の同定は、疾患の正確かつ簡便な診断、あるいは有効な予防処置や治療に大いに貢献するものと期待されている。
【０００３】
しかしながら、既に数多くの原因遺伝子が同定されているにも係わらず、そのうちの大多数は治療薬の開発等に未だ活かされていない。原因遺伝子の機能（発現産物の機能）が未解明のためである。例えば、ノックアウトマウス等を用いて原因遺伝子と病態との関連性が明らかとなったとしても、その過程における遺伝子産物の作用機序が不明なため、遺伝子産物（標的タンパク質）に影響を及ぼす化合物（リード化合物）の探索や、その化合物を用いた薬剤の開発が不可能となっている。
【０００４】
従来、遺伝子機能の解析は研究者個人の才量に負うところが大きく、一つの遺伝子機能の解析に多大な労力と費用が費やされてきた。今後は、膨大な数の遺伝子産物の中から疾患原因遺伝子の発現産物に関係するものを同定することはますます困難になっていくと予想され、遺伝子機能解析の新しい方法の開発が強く求められている。
【０００５】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、機能未知遺伝子の機能を簡便かつ正確に解析する新規な方法と、この解析方法に用いる遺伝子機能データベースおよびこのデータベースの作成方法を提供することを課題としている。
【０００６】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、機能未知の遺伝子機能を解析するために使用するデータベースの作成方法であって、
(a) 複数の機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）を真核細胞に導入して、各々の機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）をそれぞれ過剰発現する形質転換真核細胞を調製し、
(b)  前記(a)で調製した形質転換真核細胞とその親株細胞とについて、複数の薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）の各種濃度における生存率を測定し、
(c)  親株細胞の生存率を40%低減する薬剤濃度の値（IC40値）と、各々の形質転換真核細胞の生存率に対するIC40値とを測定し、
(d)  前記(c)における前者のIC40値に対する後者のIC40値の比を算出し、
(e)  前記(d)の比の対数値を算出する、
工程を含み、全ての機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）について、薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）に対する感受性の変化を示す対数値のリストを作成することを特徴とする遺伝子機能データベースの作成方法を提供する。
【０００７】
このデータベース作成方法においては、既知遺伝子（gn）のnが50以上であること、薬剤（Dn）のnが40以上であることをそれぞれ好ましい態様としている。
【０００９】
さらにこの出願は、前記の作成方法によって作成された遺伝子機能データベースを用いて機能未知遺伝子（gx）の機能を解析する方法であって、
(i)  未知遺伝子（gx）を過剰発現する形質転換真核細胞について、複数の薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）の各種濃度における生存率から薬剤ごとのIC40値を測定し、
(ii)  前記(i)のIC40値から、請求項１(e)で機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）の対数値を算出したのと同様の方法によって、未知遺伝子（gx）の対数値を算出し、
(iii)  未知遺伝子（gx）の対数値と遺伝子機能データベースに含まれる全ての機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）の対数値との間の相関係数を算出し、
(iv)  相関係数から帰結される有意な相関関係を示す機能既知遺伝子の機能が未知遺伝子（gx）の機能と関連するものと決定する、
ことを特徴とするDSPA（Drug-Sensitivity Pattern Analysis：薬剤感受性パターン解析）に基づく遺伝子機能の解析方法を提供する。
【００１０】
さらにまた、この出願は、前記の解析方法によって機能解析された未知遺伝子（gx）の対数値を、遺伝子機能データベースに追加するデータベース作成方法をも提供する。
【００１１】
以下、各発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この出願の遺伝子機能データベースは、以下のステップ(a)〜(d)によって作成される。
ステップ(a)：
複数の機能既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）をそれぞれ過剰発現する形質転換真核細胞とその親株細胞とについて、複数の薬剤（D1,D2,D3,.....Dn）の各種濃度における生存率を測定する。
【００１３】
機能既知遺伝子は、その発現産物の機能が既に知られている遺伝子であり、その数は50以上、好ましくは100以上の遺伝子を使用する。これらの各遺伝子の全長cDNAを真核細胞用の発現ベクターに組み込み、この組換えベクターを真核細胞にトランスフェクションする。発現ベクターは、pRc-CMV、pcDNA3、pMSG等の公知のベクターを適宜に用いることができる。真核細胞は、マウス線維芽細胞NIH3T3、Ha-ras-NIH3T3等の細胞株を例示することができるが、これらの限定されるものではない。トランスフェクタントは、ベクターの薬剤耐性遺伝子の種類によって、適宜な選択薬剤を用いることによって選択することができる。さらに、各遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）を導入した細胞株全てについて遺伝子発現をウエスタン法やノーザン法によって調べ、最も高発現している株を選択する。
【００１４】
そして、これらの遺伝子導入細胞と、その親株細胞について、複数の薬剤の各種濃度における生存率を測定する。薬剤は、親株細胞の生存率に影響を及ぼすことが知られている薬剤または生理活性物質（サイトカイン等）であって、遺伝子導入に用いたベクターの保有する薬剤耐性遺伝子の対象薬剤以外のものであり、40種以上を使用する。
【００１５】
細胞の生存率は公知の各種方法によって測定することができるが、MTT色素法が好ましい。このMTT色素法は、成育細胞のミトコンドリアのコハク酸脱水素酵素によるMTT色素（tetrazorium salt 3-(4,5-dimethyl-thiasol-2-yl)-2,5-diphenyltetralin bromide）の代謝物formazanの発色を測定する方法（J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; J. Immunol. Methods 116: 151-158, 1989）であり、その迅速さと正確さから、細胞増殖測定法として使用されている。
ステップ(b)：
親株細胞の生存率を40%低減する薬剤濃度の値（IC40値）に対する既知遺伝子導入細胞のIC40値の比を算出する。例えば、後記実施例で作成した図２および図３のような生存率に対する濃度依存曲線からこのIC40値の比を算出する。
ステップ(c)：
既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）の全てについて、前記ステップ(b)で算出したの比の対数値を算出する。この対数値は、例えば、後記実施例で作成したような一覧表（表２）に入力される。
ステップ(d)：
前記ステップ(c)の対数値について、既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）間の相関係数を算出する。これらの相関係数ｒは、後記実施例で作成した一覧表（表３−１４）のとおりに表示することができ、ｔ検定によって有意性検定することができる。
【００１６】
以上の方法によって、機能既知の各遺伝子がそれぞれどのような遺伝子と機能的に関連するかについての情報を備えた遺伝子機能データベースが作成される。このデータベースは、コンピュータに入力され、後記の遺伝子機能解析方法に使用する。
【００１７】
次に、この出願によって提供される遺伝子機能解析方法について説明する。
【００１８】
この発明のDSPAによる遺伝子機能解析方法は、前記の遺伝子機能データベースを用いて機能未知遺伝子（gx）の機能を解析する方法であって、以下のステップ(i)〜(iii)によって構成される。
ステップ(i)
未知遺伝子（gx）を過剰発現する真核細胞について、複数の薬剤（D1,D2,D3, .....Dn）の各種濃度における生存率から薬剤ごとのIC40値を測定する。
【００１９】
未知遺伝子（gx）のcDNAを組み換えるベクター、真核細胞、薬剤の種類、生存率の測定は、前記の遺伝子機能データベースの作成ステップ(a)と同一とする。ステップ(ii)：
前記ステップ(i)のIC40値から、遺伝子機能データベースの既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）間の相関係数を算出したのと同様の方法（ステップ(b)〜(d)）によって、未知遺伝子（gx）と既知遺伝子（g1,g2,g3,.....gn）間の相関係数を算出する。
ステップ(iii)：
未知遺伝子（gx）と有意な相関係数を示す既知遺伝子の機能が未知遺伝子（gx）の機能と関連するものと決定する。
【００２０】
すわわち、相関係数ｒの算出におけるｔ検定の場合、t＝｛r2（n−2）／1−ｒ2｝｝1/2（nはデータ数）であるので、40種以上の薬剤に関するデータがあれば、相関係数ｒは0.4以上または-0.4以下で有意となるが、さらに好ましくは相関係数ｒが0.5以上または-0.5以下を基準とすることによって、各遺伝子間の関連性を明確に特定することができる。表３−１４に示した各遺伝子の場合、例えば遺伝子Ha-rasは、Ki-ras(r=0.71)、N-ras(0.56)、erbB2(0.53)と0.5以上の相関関係を示し、Cip-1(-0.55)、RhoA(-0.55)、C/EBPb(-0.50)と-0.5以下の相関関係を示しており、Ha-rasはこれらの遺伝子と機能的に関連することが分かる。未知遺伝子と既知遺伝子との間でこのような高い相関関係を示す場合には、既知遺伝子の機能が未知遺伝子の機能にも関連すると判定することができる。
【００２１】
なお、以上のステップ(ii)、(iii)はコンピュータによって迅速に処理することができる。また、この遺伝子機能解析方法によって新たに機能解析された機能未知遺伝子のデータを前記のデータベースに随時に追加していくことによって、より精度の高いデータベースに発展させることができる。
【００２２】
以上の遺伝子機能解析方法によって、機能未知の遺伝子機能を迅速に決定することが可能となり、その遺伝子産物の作用機序を高い精度で推定することが可能となる。すなわち、遺伝子の過剰発現はほとんどの場合、その産物に関連した分子に影響と及ぼす。影響を受けた分子はさらにその周辺の分子に影響を与え、その結果、シグナル伝達経路のような経路が活性化または不活性化される。そのような細胞は、その経路に関連する分子に作用する薬剤に対して異なる感受性を示す。あるいは同じ経路に作用するサイトカイン等の生理活性物質に対しても異なる感受性を示す。一方、既に機能的関係が知られている遺伝子（例えばp53とp21等）の場合には、同様の薬剤感受性を示すことが確認されている。シグナル伝達経路は主要なものは数十種類程度であり、それぞれに付随するマイナーな経路を含めても約100種類程度と推定されている。従って、機能既知の遺伝子（好ましくは100種類以上）の過剰発現による薬物感受性に対する影響の結果（または影響なしという結果）を互いの相関関係の値によってパターン化したデータベースを作成し、機能未知遺伝子の過剰発現の結果をデータベースと比較することによって、機能未知遺伝子産物の係わる経路を同定することが可能となる。そして、その経路を探索することによって、遺伝子産物の直接の採用機序を高い精度で解明することが可能となる。
【００２３】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
１．材料
機能既知遺伝子は、表３の左欄に示した遺伝子を対象とした。薬剤は、表１に示した薬剤を調査する最大濃度の100倍でDMSOに溶解して使用した。細胞は、NIH3T3またはras-NIH3T3培養細胞を使用した。
【００２５】
【表１】
0004002754.tif 000002
【００２６】
２．方法
(1)  遺伝子過剰発現細胞の調製
各々の機能既知遺伝子の全長cDNAを発現ベクター（pRc-CMV等）に組み込み、NIH3T3細胞に常法によりトランスフェクションした。G-418抵抗性を指標として形質転換細胞を単離し、各細胞の導入遺伝子発現をウエスタン法により調べ、高発現株を選択した。図１は、ウエスタン法による遺伝子発現の一例である。
(2)  MTT色素法による細胞生存率の測定
以下の手順で細胞生存率を測定した。
1)  96穴プレートの第2〜11列に50μlのDMEMを注入した。第12列は100μlを注入した。
2)  第1列には98μlのDMEMを注入した。
3)  第1列に薬剤を各2μlずつ添加した。
4)  第1〜9列において倍々希釈した。第9列から50μl採ったら、それは破棄した。プレートをCO2インキュベーターで保存した。
5)  細胞（各高発現細胞およびその親株細胞）をトリプシン溶液で培地から剥がし、10％CS-MDMEMでサスペンドして試験管に移し、細胞数（cells/ml）を計測した。
6)  細胞を希釈して1×105 cells/mlに調整し、プレートの第1〜11列に50μlの細胞浮遊液を加え、緩やかに撹拌した。
7)  プレートをCO2インキュベーターに移し、3〜4日間培養した。
8)  プレートの第１〜12列にＭＴＴ（5 mg/ml in PBS）を10μl加え、CO2インキュベーター内にて37℃で4時間培養した。
9)  反応停止溶液（0.04 N HCl in isopropanol）を150μl加え、よく混合し、室温で約2時間放置した。
10)  マイクロプレートリーダーで、MTT色素の代謝物formazanの発色を測定した。測定波長574nm、対照波長655nmとした。プレートの第10列および第11列は100％コントロール、第12列は0%コントロールとなる。
(3)  IC40値の比の対数値の算出
遺伝子高発現細胞とその親株の各種薬剤に対する感受性の指標としてそれぞれのIC40値を特定し、それぞれのIC40値の比を算出した。図２および図３は生存率に対する薬剤濃度依存曲線からIC40値の比を求めた例である。次いで、各遺伝子について、IC40値の比の対数値を算出した。表２は対数値の一覧表の一部である。
【００２７】
【表２】
0004002754.tif 000003
【００２８】
(3)  対数値による相関係数の算出
表２に示した対数値の一覧表において、それぞれの行でｔ検定による相関係数の算出を行った。図４はIkB-SRとIKK-DNおよびp16導入細胞の薬剤感受性比を対数プロットしたグラフであり、機能的に相関しているIkBとIKKの間には高い相関関係（r=0.75）が認められるのに対し、関連のないIkBとp16との間の相関係数は0.09と有意性を認めない。表３−１４は、全相関係数の一覧表を１２分割して示した。
【００２９】
【表３】
0004002754.tif 000004
【００３０】
【表４】
0004002754.tif 000005
【００３１】
【表５】
0004002754.tif 000006
【００３２】
【表６】
0004002754.tif 000007
【００３３】
【表７】
0004002754.tif 000008
【００３４】
【表８】
0004002754.tif 000009
【００３５】
【表９】
0004002754.tif 000010
【００３６】
【表１０】
0004002754.tif 000011
【００３７】
【表１１】
0004002754.tif 000012
【００３８】
【表１２】
0004002754.tif 000013
【００３９】
【表１３】
0004002754.tif 000014
【００４０】
【表１４】
0004002754.tif 000015
【００４１】
この表３−１４の結果から、正の相関（r＞0.5）を示す71組、負の相関（r＜-0.5）を示す17組の遺伝子が同定された。これらの遺伝子の組合せとその機能的関連の一部を表１５に示す。
【００４２】
【表１５】
0004002754.tif 000016
【００４３】
以上の方法により、機能既知遺伝子についての相関関係が明らかとなった遺伝子機能データベースが構築された。このデータベースを参照することによって、機能未知遺伝子の機能を簡便に解明することが可能となる。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ゲノム創薬や、各種有用タンパク質の遺伝子工学的製造のための遺伝子材料として有用な機能未知遺伝子の機能を解析する新しい方法と、この解析に用いる遺伝子機能データベースおよびその作成方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウエスタン法による高発現細胞の選択の一例である。
【図２】生存率に対する薬剤濃度依存曲線からIC40値の比を求めた一例である。
【図３】生存率に対する薬剤濃度依存曲線からIC40値の比を求めた別の例である。
【図４】機能的関係の高い遺伝子（IkB-SRとIKK-DN）、および関係の低い遺伝子（IkB-SRとp16）の薬剤感受性比を対数プロットしたグラフである。
【図１】
0004002754.tif 000017
【図２】
0004002754.tif 000018
【図３】
0004002754.tif 000019
【図４】
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