(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種または複数種のインフルエンザ抗原を含有する抗原調製物を収容する第一の容器；およびアジュバントとして有効な量のキトサンを収容する第二の容器を備えているキットの形態のワクチン組成物であって、前記キトサンが少なくとも８０％脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記第一の容器中の前記抗原調製物が、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザ抗原を含有している、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記第一の容器中の前記抗原調製物が、全インフルエンザウイルス調製物である、請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記第一の容器中の前記抗原調製物が、精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザ抗原を含有している、請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記の精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザ抗原が、１０−２５ナノメートルの範囲の半径を有するロゼットの形態で存在している、請求項３または４記載のワクチン組成物。
【請求項６】
粘膜への投与を適合している、請求項１−５のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
鼻内投与に適合している、請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項８】
経口投与に適合している、請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記キトサンが少なくとも８５％脱アセチル化されている、請求項１−８のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記キトサンが８８％から９０％脱アセチル化されている、請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記キトサンが水溶性である、請求項１−１０のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記キトサンが、５．５から６．５の範囲内のｐＨを有する溶液中に前記第二の容器中に存在している、請求項１−１１のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記キトサン溶液のｐＨが約５．８−６である、請求項１２記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記第一の容器および前記第二の容器が、投薬機の内容物を鼻内投与するための投薬機と連動するのに適合している、請求項１−１３のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記第一の容器および前記第二の容器が、同じ投薬装置中の分離されたチャンバーによって構成されている、請求項１−１４のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記第一の容器および前記第二の容器が、多筒シリンジの二つの筒によって構成されている、請求項１５記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物と組み合わされている、組成物を鼻内にデリバリーするのに適合している投薬装置を備えている薬剤製品。
【請求項１８】
前記投薬装置がエアロゾルデリバリー装置である、請求項１７記載の薬剤製品。
【請求項１９】
（ｉ）第一の容器から、一種または複数種の前記インフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調製物を、および
（ｉｉ）第二の容器から、アジュバントとして有効な量のキトサンを、別個に宿主（ヒトを除く）へと投与し、
前記抗原調製物とキトサンとが、請求項１−１３のいずれか一つの請求項に記載のものである、インフルエンザへの感染に対して宿主（ヒトを除く）を免疫化する方法。
【請求項２０】
（ｉ）第一の容器から、一種または複数種のインフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調製物を、および
（ｉｉ）第二の容器から、アジュバントとして有効な量のキトサンを、動物（ヒトを除く）に投与することによって、防御ＩｇＡ粘膜免疫応答とＩｇＧ全身性免疫応答とを向上させる方法であって、前記抗原調製物とキトサンとが、請求項１−１３のいずれか一つの請求項に記載のものである、防御ＩｇＡ粘膜免疫応答とＩｇＧ全身性免疫応答とを向上させる方法。
【請求項２１】
動物（ヒトを除く）に鼻内投与するときに、インフルエンザウイルス抗原の免疫応答を向上させる方法であって、請求項１−１３のいずれか一つの請求項に記載のキトサンを、分離された容器からインフルエンザウイルス抗原と共に同時投与する、インフルエンザウイルス抗原の免疫応答を向上させる方法。
【請求項２２】
１つの容器内のアジュバント組成物と共に、分離された容器から同時投与されるインフルエンザウイルス抗原の免疫応答を向上させるための、前記１つの容器内における前記アジュバント組成物の製造にキトサンを使用する方法であって、前記キトサンが、少なくとも８０％脱アセチル化されている脱アセチル化キチンであるところの方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、キットの形態のワクチン組成物に関するものであり、キットは、インフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調合物を収容する第一の容器と、粘膜アジュバントを収容する第二の容器とを備えている。また、本発明は、前記組成物を患者に投与することによって、インフルエンザに対して患者を免疫化する方法に関するものであり、特に鼻内投与したときに、インフルエンザウイルスと共に前記アジュバントを同時投与することによって、インフルエンザウイルス抗原の免疫原性を向上させる方法に関するものである。
最近のインフルエンザワクチンは、不活化全粒子、分離ワクチン（スプリットワクチン）、またはこの膜の糖タンパク質の赤血球凝集素（ヘマグルチニン：ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の精製調製物であるサブユニットワクチンのいずれかからなる。赤血球凝集素とノイラミニダーゼとは、防御抗体反応の対象となる抗原であり、赤血球凝集素が主要な防御抗原である。これらの非経口的に投与されるワクチン類の効能の評価は、大きく変動する。これらのワクチン類は、主として、気管下部へと浸出する循環性の抗赤血球凝集素ＩｇＧ抗体を引き出すことによって作用するものと考えられている。
Ｍ．Ｌ．クレメンツ（Clements）他の「臨床微生物学誌：J.Clinical Micorbiology」２４，１５７〜１６０頁、１９８６年において以前に報告されたところでは、分泌型ＩｇＡおよび血清ＩｇＧの双方が、インフルエンザウイルスへの免疫性に加わっている。更に、マウスにおいては、多数の刊行された研究で、インフルエンザへの感染に対する防御に、呼吸器系のＩｇＡが重要であることが示されてきた。また、インフルエンザへの局所的なＩｇＡの応答を刺激すると、これがしばしば血清応答よりも広い特異性を有しており、従って、ワクチンに存在している赤血球凝集素分子と異なる赤血球凝集素分子を有するウイルスに対して交差防御をもたらしうるために有利であることが、見いだされてきた。従って、局所的な分泌型および血清抗赤血球凝集素応答の双方を引き出すインフルエンザワクチンは、現在のワクチンよりも優れた免疫性をもたらすはずである。しかし、非経口的なワクチン投与（筋肉内、皮下等）は、その前に粘膜への暴露（例えば感染）が存在しなかった場合には、局所的な抗体の産生をひきだすのには有効ではない。この粘膜免疫系を刺激するためには、ワクチンを粘膜の表面に局所的に適用しなければならない。
インフルエンザワクチンを粘膜に投与することは、従来の非経口的な免疫化投薬方法と比べて多数の利点を有しうる。これらの利点の中で重要なのは、気管の局所的な粘膜免疫系を一層有効に刺激すること、および注射に伴う恐怖と不快感とを回避できるであろうことから、ワクチンの摂取速度が増加するであろうという見込みがあることである。従って、粘膜インフルエンザワクチンを開発するために、多くの試みがなされてきた。しかし、欠点は、不活化ワクチンを粘膜から投与した場合には、しばしば免疫原性が乏しいことである。例えば、クノーサカイ他（「ワクチン」１２：１３０３−１３１０頁、１９９４年）には、ヒトに不活化ワクチンを投与することで、強い粘膜および血清抗体反応が得られ、生ワクチンウイルスによる感染を予防するのに有効であったことが示されている。しかし、この結果を得るためには、クノーサカイ他は、商業的に利用可能な用量の３倍を投与しており、このアプローチは商業的に実行可能ではない。この問題を克服するための、経口的にまたは鼻内に投与されるインフルエンザワクチンの免疫原性を向上させるための相異なるアプローチとしては、コレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニットをアジュバントとして使用すること（Ｓ．タムラ他、「ワクチン」６、４０９頁、１９８８年参照）、種々のミクロスフィア中にワクチンをカプセル化すること（Ｚ．モルドボヌー（Moldoveanu）他、「J.Inf.Dis.」１６７、８５−９０頁、１９９３年参照）、および弱毒生株を使用すること（Ｈ．Ｆ．マーサブ（Maassab）他、「ワクチン」、プロトキンＳ．Ａ．およびモーティマーＦ．Ａ．ジュニア（編集）、Ｗ．Ｂ．ソーンダーズ  フィラデルフィア、第４３５頁、１９９３年）が挙げられてきた。しかし、現在まで、粘膜に投与されるインフルエンザワクチンの免疫原性を促進する実用的な方法は開発されてこなかった。
ここで本出願人が見いだしたところでは、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原のようなインフルエンザ抗原を、特定のキトサン誘導体と共に投与することによって、良好なＩｇＧおよび良好なＩｇＡ応答を達成することが可能である。更に詳しくは、本出願人がここで見いだしたところでは、ノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素抗原のようなインフルエンザ抗原と共にキトサンを同時に鼻内投与するか、あるいはインフルエンザ抗原の投与に先立って、キトサンを宿主に予め投与すると、良好な全身性および局所的な反応が生ずる。
キトサンは、Ｎ−アセチル基の大部分が加水分解によって除去されている、キチンまたはポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの誘導体である。
キトサンは、以前には薬剤調合物中で使用されてきており、欧州特許公開０４６００２０に粘膜吸収促進剤として開示されている。しかし、欧州特許公開０４６００２０には、キトサンが、ワクチン組成物中に投与された場合にアジュバントとしての作用をもたらしうることは、開示も示唆もされていない。
従って、本発明の第一の態様に係るキットの形態のワクチン組成物は、一種または複数種のインフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調合物を収容する第一の容器と、アジュバントとして有効な量のキトサンを含有する第二の容器とを備えている。
前記インフルエンザ抗原は、例えば、不活化された全インフルエンザウイルスであってよく、あるいは精製されたかまたは部分的に精製された抗原であってよい。他の実施形態においては、このインフルエンザ抗原は、担体分子中に、例えば融合蛋白質部分として存在していてよい。
好ましくは、この抗原調合物は、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原を含有している。更に特定的には、本抗原調合物は、好ましくは、不活化された全インフルエンザウイルス（ＷＩＶ）、または精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原を含有する組成物である。
精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ組成物を採用した場合には、この精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原が、ロゼットの形で存在していることが好ましい。好ましくは、このロゼットは、１０〜２５ナノメートルの範囲の半径を有する粒子である。これらのロゼットは実質的に脂質がないことが好ましく、更には、精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原調合物が全体として実質的に脂質がないことが好ましい。
本発明の組成物に使用するのに適した赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ調合物の例は、連合王国マーシーサイド、スペクのエバンスメディカルリミテッドが製造、販売する「フルブィリン（Fluvirin）」製品であり、またＳ．レンフリー（Renfrey）およびＡ．ワッツ（Watts）の「ワクチン（Vaccine）」１９９４年、第１２巻、８号、７４７〜７５２頁を参照。
全インフルエンザウイルスワクチンを、既知の方法で殺されたインフルエンザウイルス株から製造できる。この不活化された全ウイルス調合物は、上記した精製調合物に対する前駆体であることが理解されるであろう。
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、粘膜表面へのデリバリーに適合しており、最も好ましくは経口または鼻内へのデリバリーに適合している。
好ましくは、本発明の組成物で使用するキトサンは水溶性である。
このキトサンは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％脱アセチル化された脱アセチル化キチンであることも有利である。最も好ましくは、このキトサンは、少なくとも８５％脱アセチル化されており、特に好ましくは８８％−９０％脱アセチル化されている。
特定の脱アセチル化されたキトサンは、ノルウェイ国ドランメンのプロノヴァ  バイオポリマー社から入手できる「シー  キュアー（Sea Cure）Ｇ１２０」キトサン（ポリ  ヒドログルタミン酸  Ｄ−グルコサミン）である。キトサンのグルタミン酸誘導体の形態であるこのキトサンの脱アセチル化率は、８０％を越える。
本発明の他の態様においては、インフルエンザによる感染に対して宿主を免疫化する方法を提供し、この方法は、この宿主に対して、
（Ｉ）  第一の容器から、前述した一種または複数種のインフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調製物を投与し、および
（ＩＩ）第二の容器から、前述したアジュバントとして有効な量のキトサンを投与する。
第一の容器の内容物と第二の容器の内容物とは、実質的に同時に投与でき、即ち、同時にかあるいは互いに数分間の間に投与でき、あるいはこれらは所定の間隔を於いて投与できる。例えば、宿主にキトサンを予め投与し、続いて抗原調製物を投与できる。
第一の容器と第二の容器とは、完全に分離することができ、あるいは同じ塗布装置の分離されたチャンバーによって構成できる。これらの各容器が分離されている場合には、例えば、第一および第二のエアロゾル投薬機を備えるキットの形で設けることができ、あるいは第一および第二のシリンジの形で設けることができる。第一の容器と第二の容器とが同じ塗布装置の一部を構成している場合には、これらは、例えば多筒シリンジの２つの筒部によって形成できる。一方のチャンバー中にインフルエンザ抗原調製物を含有し、他方のチャンバー内にキトサン組成物を含有する、こうした塗布装置は、本発明の他の態様を構成している。
本発明の他の態様においては、
（Ｉ）  第一の容器から、前述した一種または複数種のインフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調製物を患者に投与し、
（ＩＩ）第二の容器から、前述したキトサンをアジュバントとして有効な量、患者に投与することによって、
防御粘膜免疫応答および全身性免疫応答を生じさせる方法を提供する。
本発明の更に他の態様においては、
（Ｉ）  第一の容器から、一種または複数種のインフルエンザウイルス抗原を含有する抗原調製物を患者に投与し、
（ＩＩ）第二の容器から、キトサンをアジュバントとして有効な量、患者に投与することによって、
防御ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身性免疫応答を生じさせる方法を提供し、ここで抗原調製物とキトサンとは前述したものである。
本発明の更に他の態様においては、前述したキトサンを、インフルエンザウイルス抗原と共に、分離された容器から投与することによって、インフルエンザウイルス抗原の免疫応答を向上させる方法を提供する。
本発明の組成物は、多数の経路からの投与のために提供できるが、しかし好ましくは粘膜投与のために提供するものであり、特には鼻内投与のために提供するものである。鼻内組成物は、エアロゾルまたは点滴剤として投与するために、例えば液状または乾燥粉末として調合できる。
点鼻剤として投与する組成物には、こうした組成物に通常含有されているタイプの一種以上の左薬、例えば防腐剤、粘度調整剤、浸透圧調整剤、緩衝剤等を含有させることができる。
また、本発明は、インフルエンザワクチン抗原とキトサンとの鼻内調合物を投薬する手段の提供を意図するものである。投薬装置は、例えば、エアロゾルデリバリー装置の形をとっていてよく、一回の用量のみを投薬し、あるいは複数回の用量を投薬するように設けられていてよい。従って、第一の容器と第二の容器とは、エアロゾル投薬装置に使用するのに適合していてよい。
前記抗原調製物は、患者に防御免疫応答を刺激するのに有効な量、患者に投与されるであろう。例えば、この抗原調製物は、一回以上の用量でヒトに対して投与することができ、各用量には、各ウイルス株から調整されたタンパク質が１〜２５０マイクログラム，一層好ましくは５〜５０マイクログラム含まれている。例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ調製物を、三種類のウイルス株、例えば２種のインフルエンザＡ型および１種のインフルエンザＢ型から調製した場合には、投与されるウイルスタンパク質の全用量は、３〜１５０マイクログラムの範囲内であってよい。
本発明を、図面と次の実施例を参照して説明するが、本発明はこれらには限定されない
【図面の簡単な説明】
図１は、不活化された全インフルエンザＡ／テキサス（ＷＩＶ）で免疫化されたマウスの、血清ＩｇＧ抗赤血球凝集素応答を示している。各棒は、五匹のマウスの幾何平均力価の対数を示す。各誤差棒は、前記幾何平均の一標準誤差を示す。
図２は、ＷＩＶで免疫化されたマウスの、鼻内ＩｇＡ抗インフルエンザＡテキサス／ＷＩＶ応答を示す。図１におけるように、各棒は、四匹のマウスの幾何平均力価を示し、誤差棒はこの幾何平均の一標準誤差を示す。
図３ａおよび図３ｂは、ＷＩＶで、免疫化したマウスの鼻内および肺性のＷＩＶ特異性抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した結果を示す。
例１
キトサン調合物の調製
グルタミン酸キトサンを．０．５％Ｗ／Ｖ塩化ナトリウム中に、室温で４８−６０時間攪拌することによって溶解させ、中程度の粘度の、８０％を越える脱アセチル化率を有する脱アセチル化されたキチンである、グルタミン酸キトサンの１％溶液を調製した。こうして得られた溶液のｐＨを、０．１ＭのＮａ2ＨＰＯ4を使用して、５．８−６．０に上昇させた。使用したグルタミン酸キトサンの等級は、ノルウェイ国ドランメンのプロノヴァ  バイオポリマー社による、商標名「シー  キュアー（Sea Cure）＋Ｇ２１０」（商品番号２７１５０２１０）の下に販売される中粘度等級品であった。
例２
インフルエンザ抗原調合物の調製
精製表面抗原（ＰＳＡ）
２Ａ．連合王国マーシーサイド、スペクのエバンスメディカルリミテッドから購入した、インフルエンザＡ／テキサス蛋白質を含有するインフルエンザ精製表面抗原（ＰＳＡ）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に加え、蛋白質濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。このＰＳＡは、幾らかのノイラミニダーゼを含有してはいるけれども、ほとんどすべてはスパイク蛋白質赤血球凝集素（ＨＡ）からなっている。
全インフルエンザウイルスワクチン（ＷＩＶ）
２Ｂ．Ａ／テキサス株の全インフルエンザウイルスワクチン（ＷＩＶ）を、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｉの蛋白質濃度まで加えた。
例３
キトサン／インフルエンザ混合剤の調製
グルタミン酸キトサン溶液とＰＳＡまたはＷＩＶ溶液との１：１の混合物を調製し、０．５％のグルタミン酸キトサンと０．５ｍｇ／ｍｌのインフルエンザ抗原とを含有する鼻内ワクチン組成物を得た。
また、これと同じ濃度のＷＩＶまたはＰＳＡを含有し、グルタミン酸キトサンを含有しない対照例の溶液も調製した。
例４
マウスの免疫化研究
前記各例に記載したようにして調製した各組成物を、次のようにして五匹の大人の（６〜８週間）雌のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる各群へと投与した。
0004010462.tif 000002
Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆの各群では、マウスに対して２０μｌの容量（鼻孔１つ当たり１０μｌ）で鼻内で免疫化した。Ｂ群とＤ群とのマウスは、上記した例３の調製物を与え、一方群Ｅと群Ｆの対照例のマウスは、それぞれ例２Ｂ、２Ａの調合物を与え、キトサンは与えなかった。群Ａと群Ｃとのマウスは、最初に例１のキトサン組成物を鼻孔１つ当たり５μｌ与え、次いで５分間の回復時間に続いて、それぞれ例２Ｂおよび２Ａのインフルエンザ調合物を鼻孔１つ当たり５μｌ与えた。採用した免疫化および試料採取計画を、表１に示す。
0004010462.tif 000003
各試料採取点１、２において、各群からのすべてのマウスから試料採取した。試料採取点３での試料採取を実施する際には、心臓穿刺に続いてマウスの頭部を除去し、マウスの鼻腔を１ｍｌのＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミンによって洗浄した。
抗体アッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
上記した免疫化計画によって刺激された免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴおよびイライザ技術を使用して、通常法で分析した。ここで、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血清ＩｇＧ抗Ａ／テキサス応答を測定し、これらの結果を下の表１と表２とに示す。また、このＥＬＩＳＡ技術を使用して、鼻内ＩｇＡ抗Ａ／テキサス応答を測定し、このアッセイの結果を下の表２と表３とに示す。すべてのアッセイにおいて、全インフルエンザワクチン（ＷＩＶ）を抗原として使用した。ＥＬＩＳＡの終点の力値は、背景対照（試料なし）を控除した後で、ＩｇＧの測定に対しては０．３ＯＤ単位の結果、ＩｇＡの測定に対しては０．１ＯＤ単位の結果をもたらす、試料希釈率として計算した。
結果
0004010462.tif 000004
鼻内ＩｇＡ抗ＷＩＶ応答
0004010462.tif 000005
鼻内および肺粘膜におけるＷＩＶに特異的な抗体分泌細胞（ＡＳＣ）
三回目の試料採取点において、五匹のマウスの各群の鼻粘膜と肺の実質組織とからリンパ球を分離した。各マウスから得たリンパ球をプールし、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗インフルエンザ抗体を分泌する細胞をアッセイした。これらの結果を、表３ａおよび３ｂに示す。表３ａおよび３ｂにおいて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した抗体分泌細胞は、１０7個の全細胞（リンパ球）に対する、陽性の細胞数として表現する。図３ａは、例２ＡのＰＳＡ調製物の鼻内および肺の免疫原性に対するキトサンの作用を示しており、一方、図３ｂは、例２ＢのＷＩＶ調製物の鼻内および肺の免疫原性に対するキトサンの作用を示している。図３ａおよび図３ｂの結果が示すように、キトサンは、ＰＳＡとＷＩＶとの双方に対してＩｇＡ  ＡＳＣ応答を向上させ、ＰＳＡについては一層大きな向上が観測された。ＩｇＧ  ＡＳＣが優勢であるときに、最も強いＡＳＣ応答が鼻粘膜内で生じた。肺の応答は、ＩｇＧ分泌細胞が優勢であった。
一般的には、キトサンを最初に投与したときよりも、ＰＳＡやＷＩＶをキトサンと調合したときの方が、ＰＳＡとＷＩＶとの双方について一層強いＡＳＣ応答が引き起こされた。ＩｇＧ  ＡＳＣ応答の場合には、ＰＳＡとキトサンとの双方を含有する調合物が、キトサンを最初に投与した場合に得られるよりも強い応答をもたらした。しかし、ＷＩＶとキトサンとの双方を含有する調合物によって引き起こされたＩｇＡＡＳＣ応答と、ＷＩＶに先立ってキトサンを投与して引き起こされたＩｇＡ  ＡＳＣ応答との間には、顕著な相違はなかった。
上記した結果に示されているように、インフルエンザ抗原とキトサンとを粘膜の経路を通して別々に投与することによって、良好な免疫応答を得ることができる。これによって、注射する投与に関連して起こる可能性のある問題を防止できるという利益がある。
上記した例は、本発明を単に例示するものであって、いかなる点でも本発明の範囲の制限を意図するものではなく、これは明細書に添付した請求の範囲のみによって規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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