(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中にマグネシウムを２０ｐｐｍ（マグネシウムとして）以上添加して酵母を培養し鉄含有酵母を製造する方法において、該酵母がキャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母であり、鉄を培養液中に徐々に添加し、全鉄量として７００〜２０００ｐｐｍ添加することを特徴とする、鉄由来の沈殿物を抑えた、菌体内に鉄含量として２％以上を含有する酵母菌体の製法。
【請求項２】
鉄としての添加量が１０〜１５０ｍｇ／Ｌ／時間である請求項１記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、鉄化合物存在下で特にＣａｎｄｉｄａ属の食用酵母を培養することにより、鉄由来の沈澱物を抑え、かつ、酵母の菌体内に鉄含量として２％以上を含有する、健康食品用途向けの酵母の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の健康ブームの中で、栄養素としてのビタミンと共にミネラル、微量元素への関心が高まりつつある。このような中で鉄分は、日本人の場合カルシウムと並び不足していると言われているミネラルの１つである。特に成長期の子供や妊婦は要求量が増大するため、鉄欠乏性貧血症にかかりやすいと言われている。そこで飲み易く吸収され易い形の鉄分が要求されている。
【０００３】
鉄分はすでに加工食品等への添加が積極的に行われ、通常、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、コハク酸第一鉄等が使用されている。しかしながらこれらの化合物は、元々鉄臭さを有する物であり、その為添加量を制限せざるを得ないし、体内への吸収の点でも問題があった。そこで、最近注目されているのが酵母に鉄分を吸収させて、有機鉄の形にして鉄臭さを低減させたり、人間の体内への吸収性を高めた形で供給する試みである。
【０００４】
鉄含有酵母の製造方法としては、鉄化合物を含む培地で食用微生物を培養し、鉄を多量に含有する微生物菌体の製造法（特公昭６１−９８３５号公報）、鉄化合物の存在下に、糖類含有栄養培地中で酵母を培養する有機第一鉄含有補血剤組成物の製造法（特開昭５８−１０１６８６号公報）、炭素源及び窒素源を含有する培地に鉄化合物を添加して微生物を培養することにより、おおむね１％弱の鉄を含有していること、及び培地中のマグネシウムの濃度が１０ｍｇ／ｌ以下であることが必要な微生物菌体の製造方法（特開昭６２−１３４０８３号公報）が知られている。さらに、酵母を培養して得た菌体を有機化合物及び二価の水溶性鉄化合物を含有する水溶液に分散し、鉄分を蓄積せしめる二価鉄含有酵母菌体の製造法（特開平５−１７６７５８号公報）が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように従来の鉄含有菌体を得る方法は、予め鉄化合物を培地中へ添加した培地で微生物を培養、増殖せしめることにより鉄含有菌体を得るか、または予め鉄化合物を添加しない培地で微生物を培養、増殖させ、その後菌体を集菌し鉄化合物を添加して、菌体中に取り込ませて鉄含有菌体を得るものである。前者の方法は一般に鉄による増殖阻害があるため高濃度の鉄の添加ができない。さらに、添加した鉄化合物は培養中に、通気撹拌により比較的短時間の内に酸化が起こり、特に通常の必須の培地成分として添加される燐酸イオンとの間で、燐酸鉄等の不溶性の化合物となり、微生物の鉄分の取り込みを阻害するだけでなく、培養終了後の遠心分離等による菌体分離において、不溶物と菌体との沈降速度に大きな差がないため、菌体との分離が困難である。この不溶物の存在は鉄臭さや色さらに吸収性の面での障害になる。
一方、後者の方法は、鉄自体の微生物に対する増殖阻害効果を回避するための手段と考えられるが、燐酸と鉄の化合物は、両者の濃度及び接触時間に依存して増大するため、予め鉄を添加していない培地で培養した微生物菌体を集菌して、後から鉄化合物と接触させて鉄を取り込ませる方法においても、鉄の取り込みを容易にするためには、高濃度の燐酸及び鉄化合物を使用するため燐酸鉄等の生成とその除去が問題になった。
【０００６】
本発明者らは、これら欠点を解消した鉄含有酵母の製造方法を先に提案（特願平８−８２９９８号）したが、鉄の含量を例えば２ないし３％以上と更に増加するために、培地中に多量の鉄を添加した場合、鉄含量の高い酵母が取得されるものの、鉄が十分に菌体内に取り込まれず、鉄由来の化合物が沈澱として発酵槽の管壁、特に気液界面の管壁にこびりつくという問題点があった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる課題を解決するため鋭意研究の結果、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である酵母を、鉄を徐々に添加して培養すると、鉄の取り込み度合いが高くなり、鉄含量の高い菌体が得られると共に、鉄由来の沈澱物も極めて少なくなること、沈澱物が析出しても発酵槽に付着しにくいことを見いだし、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明は、鉄由来の沈澱物を抑えた、鉄を高含有、２％以上含有した酵母の製法を提供するものである。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に使用する酵母は、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母とする。高ＲＮＡ含有酵母とは、例えば特公昭５６−４６８２４号公報等に開示されているごとく、ＲＮＡを菌体重量当たり１２重量％以上生成蓄積させる能力をもつ酵母をいう。
【０００９】
本発明は、培地中にマグネシウムを２０ｐｐｍ（マグネシウムとして）以上、また、鉄を全鉄量として７００〜２０００ｐｐｍを培養液中に添加することにより実施される。
本発明に用いられるマグネシウムとしては、硫酸マグネスイウム、塩化マグネシウム等を例示することができる。マグネシウムの濃度は２０ｐｐｍ以上必要で、それ以下であると、対糖菌体収率の低下、さらには鉄の蓄積にも悪影響を及ぼす。
本発明に使用する鉄化合物については、適当な水溶性があれば、有機、無機いずれの物質であっても良い。この様な給源の具体例としてクエン酸第一鉄、フマル酸第一鉄、乳酸第一鉄等をあげることができる。この他通常の微生物培養において培地成分として使用される硫酸第一鉄、塩化第一鉄等も当然使用できる。以上のように種々の鉄化合物が使用可能であるが、工業規模の生産を考えると安価でしかも食添用の規格がある、硫酸第一鉄が最も好ましい。これらの添加量としては全鉄量として、７００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍである必要がある。７００ｐｐｍより少ないと鉄の蓄積量が２％未満となり、一方２０００ｐｐｍを越えると増殖阻害が現れはじめ、添加した鉄の蓄積効率が低下する。
【００１０】
本発明においては、鉄は、徐々に添加される。添加方法はいずれの方法でもよいが、作業の容易性から、一定の流速で添加する方法が好ましい。添加速度は、鉄としての添加量が１０〜１５０ｍｇ／Ｌ／時間、好ましくは２０〜１００ｍｇ／Ｌ／時間が望ましい。これより添加量が多いと、無機鉄化合物が発酵槽の内壁に付着し易くなり好ましくない。
【００１１】
菌株の培地組成として、炭素源としては通常微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム  硝酸塩等が使用される。燐酸、カリウム源も燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、塩化カリウム等が用いられる。その他微量金属としては、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩が有効である。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。
【００１２】
本発明に使用される菌体は、培養温度２０〜３３℃の範囲で生育可能であるが、鉄の蓄積には２１℃〜２４℃の比較的低温が好ましい。
培養ｐＨは３．５〜７．５、好ましくは４．０〜６．０であり、培養時間は炭素源の濃度により異なるが、通常２０〜３０時間である。
【００１３】
本発明において、キャンディダ・ウチリス（Candida utilis）ＣＳ−７５２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６）である高ＲＮＡ含有酵母を使用すると、燐酸の取り込み能力が高いため、燐酸鉄等の沈澱物を可溶化して鉄分をも吸収するため、高濃度の鉄化合物を添加した培地で培養を行っても、増殖阻害がほとんど見られない。
また、例えば特開昭６２−１３４０８３号公報に記載されているように、鉄高含有微生物を取得するためには培地中のマグネシウム濃度を低くする必要があることが公知であるが、本発明によると、マグネシウム濃度を公知例より高くすることにより、２％以上の鉄を含有した酵母が容易に製造できる。
【００１４】
本発明の特徴は、鉄を徐々に、特に一定の流速で添加し、鉄由来の沈澱物を抑える点にある。これは、培地中の燐酸と鉄が混ざり合って沈澱を生じる度合いを鉄の濃度をコントロールすることによって回避できたものと、本発明者らは推察している。
更に、鉄を徐々に添加することにより、添加した鉄の菌体への取り込み効率も改善されるという予期できない効果が奏され、菌体中にもほとんど低分子の鉄化合物を含まず、極めて良好な鉄高含有酵母が製造できる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明する。
尚、菌体濃度の測定は、培養液の一定量を取り、遠心分離機で菌体を２回水洗後、その一部を取って１０５℃、一夜乾燥させた後の重量から求めた。この菌体に取り込まれた鉄含量の測定は、菌体を湿式分解法で灰化した後、原子吸光法で行った。以下の実施例及び参考例における菌体濃度及び菌体内に取り込まれた鉄の濃度の測定はすべて同様の方法で行った。
【００１６】
実施例１  酵母の培養と鉄の蓄積
ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し１２１℃で１５分間殺菌した後、キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とう培養し種菌とした。これを３０ｌ容発酵槽に全量植菌した。培地としてはグルコース６．５％、燐酸一アンモニウム０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マンガン２ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐｍを用い、バッチ培養を行った。培養条件は、槽内液量１５Ｌ、培養温度３０℃、通気量１５Ｌ／分、撹拌４００ｒｐｍ、ｐＨ４．０（アンモニア添加による自動コントロール）にて行った。鉄は、硫酸第一鉄を合計の濃度として５０００ｐｐｍ（鉄として１０００ｐｐｍ）分を別の三角フラスコに入れて溶解し（硫酸第一鉄濃度で７．５％）、１２１℃、１５分間殺菌後、ペリスタリックポンプ（アトー製、ＳＪ１２１１）で２０〜６０ｍｇ／Ｌ／時間の速度で添加した。対照として、硫酸第一鉄５０００ｐｐｍ（鉄として１０００ｐｐｍ）を培地中に最初に添加したものを作成し、以下同様に培養した。
培養の終了は、グルコースが完全に消費された時点とした。
結果を表１に示す。
表１から明かな通り、徐々に添加する方法の方が菌体内の鉄含量が高く、しかも管壁に付着する無機鉄化合物の量も大幅に低下していることが分かる。
【００１７】
【表１】
0004005677.tif 000002
【００１８】
実施例２  菌体内に含まれる鉄含量
実施例１で得られた各々の培養液５０ｍｌを遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、日立工機製、ＳＣＲ１８Ｂ）し、沈澱物を蒸留水で１回洗浄した（これを初発菌体という。）。ついでこれを１％塩酸溶液４０ｍｌに懸濁してよく攪拌後５分間放置した。これを５０ｍｌにメスアップし、その中の２５ｍｌを取り、遠心分離し、沈澱物を１％塩酸溶液２５ｍｌ、蒸留水２５ｍｌでそれぞれ菌体を洗浄し、沈澱物を５０ｍｌにメスアップした（これを塩酸処理菌体という。）。各洗液を集めて１００ｍｌにメスアップした。
初発菌体、塩酸処理菌体、洗液は常法に従って湿式分解して鉄濃度を測定した。
測定結果を表２に示す。
表２から明かなように、鉄を徐々に添加することにより菌体内含量が向上するが、これら菌体内の鉄は塩酸抽出液でも菌体外に流出しない、良質のものが多いことが分かる。
【００１９】
【表２】
0004005677.tif 000003
【００２０】
【発明の効果】
以上説明してきた通り、本発明によると、鉄を徐々に、特に一定の流速で添加することにより、鉄由来の沈澱物を抑えるとともに、添加した鉄の菌体への取り込み効率も改善され、菌体中の鉄も極めて良好な状態である、鉄を２％以上含有した酵母が製造できる。