(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類から選ばれる化合物の１種又は２種以上を配合してなる美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【請求項２】
酸化型グルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類から選ばれる化合物の１種又は２種以上と、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とを併用してなる美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【請求項３】
アミノ酸が、タウリン，γ−アミノ酪酸，ピログルタミン酸，グリシン，アラニン，アスパラギン酸，グルタミン酸から選ばれた１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【請求項４】
酸化型及び還元型グルタチオンのアルキルエステルのアルキル基の炭素数が１〜１２である請求項１〜請求項３に記載の美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【請求項５】
酸化型及び還元型グルタチオンのアルキルエステルのアルキル基の炭素数が１〜６である請求項１〜請求項３に記載の美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【請求項６】
化粧料であることを特徴とする請求項１〜請求項５に記載の美白用または皮膚老化防止用の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、皮膚の色黒，シミ，ソバカス、或いは日焼けによる色素沈着を改善し、また抗酸化作用及びこれに基づく皮膚の老化を防止又は予防し、かつ皮膚刺激性が低く安全でさらに安定である皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、酸化型及び還元型グルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類から選ばれた１種又は２種以上を配合してなる皮膚外用剤、或いは酸化型グルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類から選ばれた１種又は２種以上と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とを併用してなる皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
還元型グルタチオンは、生体内の酸化還元系に関与し生体内で活性酸素種を捕捉する抗酸化作用、ＳＨ酵素などいろいろの酵素を活性化すると共に、補酵素としても作用すること、またメルカプツール酸抱合等の解毒反応にも関与し、さらにチロシナーゼの活性及び生合成を阻害することが知られている。そのため、還元型グルタチオンを配合した皮膚外用剤は、老化防止作用と美白作用を合わせ持つ有効な製剤として期待されている。
【０００３】
また、酸化型グルタチオンは、生体内でＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを水素供与体として、グルタチオンリダクターゼの作用を受けて還元型グルタチオンに変化し、生理活性を発揮することが知られている。
【０００４】
しかしながら、酸化型或いは還元型グルタチオン（以下グルタチオン類と略す）は、水溶性の性質を有しているために、経皮透過性及び細胞膜透過性が低く、有効な美白作用及び抗酸化作用を発現させるためにはかなり高濃度を外用剤基剤中に配合する必要があった。そこで、グルタチオン類の分子中のカルボキシル基を低級アルコールでアルキルエステル化することにより脂溶性を付与し、配合した皮膚化粧料が提案されている（特公昭４８−１５０５）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、皮膚刺激性や副作用の問題がなく、安全且つ安定で、非常に優れた美白効果及び老化防止効果を発揮する皮膚外用剤を提供することを目的とする。すなわち、美白効果及び老化防止効果を有するグルタチオン類の経皮及び細胞膜透過性を高めて、表皮基底層に有効に到達させることを可能とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従って本発明においては、グルタチオン類の経皮及び細胞膜透過性を高めるため、グルタチオン類誘導体の検討を行った。その結果、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を配合することにより、これらの経皮及び細胞膜透過性は顕著に高まり、同一配合量におけるチロシナーゼ活性或いは生合成阻害作用及び抗酸化作用が驚くほど向上することを見出した。従って皮膚外用剤基剤に対する前記グルタチオン類のエステルの配合量は少量でよく、外用剤の製剤安定性に及ぼす影響も小さく、さらに皮膚刺激の発生等安全性上の問題もない。
【０００７】
本発明で用いられる、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類は、式（１）及び式（２）で表される化合物で、
【０００８】
【化１】
0004002313.tif 000002
【化２】
0004002313.tif 000003
ＡＡは、上記エステル類と塩を形成するアミノ酸であり、Ｒ1は炭素数１〜１２のアルキル基、Ｒ2は水素基若しくは炭素数１〜１２のアルキル基である。
【０００９】
エステル類と塩を形成するアミノ酸は、水溶性及び生理学的相溶性の面からグリシン，アラニン，アスパラギン酸及びグルタミン酸のような天然のα−アミノ酸、ピログルタミン酸，γ−アミノ酪酸及びタウリンが例示される。
【００１０】
また、アルキルエステルを形成するアルキル基の炭素数は、１〜１２が好ましく、水溶性及び脂溶性の面から１〜６が特に好ましい。またアルキル基若しくはアルケニル基は直鎖状であっても分岐を有してもかまわない。
【００１１】
本発明で用いられる、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類は、例えば特表平６−５０９８１７に記載された方法で製造することができる。すなわち、グルタチオンアルキルエステルを水中でアミノ酸で処理した後、減圧下で溶媒を除去し、得られた反応生成物をアルコールで沈殿させて単離することによって製造することができる。このようにして得られた塩は、そのままでも、冷エタノール又は他の有機溶媒で洗浄して用いてもよい。さらに、この塩において、結晶水若しくはエタノールを含んでもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
上記の酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を通常の皮膚外用剤基剤中に配合して皮膚外用剤とする。配合量は、製剤中の有効濃度や製剤の安定性等を考慮して０.００１〜１０重量％程度が適当である。外用剤の形態としては、ローション，乳剤，クリーム，軟膏等、種々の形態をとることができる。また、化粧水，美容液，乳液，クリーム等の老化防止用及び美白用化粧料としても提供することができる。
【００１３】
また、酸化型グルタチオンのエステルを配合した場合は、水素供与体であるＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨと併用することにより、前記の生理活性がさらに高められることを見出した。
【００１４】
【作用】
本発明で用いる酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類のメラニン色素白色化作用、チロシナーゼ活性阻害作用及びチロシナーゼ生合成阻害作用について以下に示す。作用を測定した化合物を表１にまとめて示した。比較のため、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンを用いて同様に作用の測定を行った。
【００１５】
【表１】
0004002313.tif 000004
【００１６】
メラニン色素白色化作用は、グルタチオン類を精製水に溶解した後、適当量の培地にて希釈して試料とした。マウスＢ16メラノーマ細胞の懸濁液（細胞数５０,０００程度）に添加し、３日間培養を行った後、細胞を分離し、測色して評価した。グルタチオン類を添加せず同様に処理した系を対照としてＬ値の差を求め、図１に示した。グルタチオンを添加した系と比較して、グルタチオンアルキルエステルのアミノ酸との塩類を添加した系では、Ｌ値の差が３倍以上大きくなっており、グルタチオンアルキルエステルをアミノ酸塩として配合することにより、細胞膜透過性が向上しメラニン色素白色化作用が顕著に上昇した。
【００１７】
チロシナーゼ活性阻害作用は、グルタチオン類を精製水に溶解して試料とし、酵素溶液としてチロシナーゼ（５０，０００units，シグマ社製）を精製水で６００倍希釈したものを用い、チロシン５０ｍｇを精製水１００ｍｌに溶解して基質溶液として評価した。グルタチオン類は、最終濃度が１．０μＭ〜１００ｍＭの範囲で段階的に変化するように添加した。
【００１８】
酵素反応は、試料溶液２ｍｌ，１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｍｌ，基質溶液０．５ｍｌ，酵素溶液０．５ｍｌを混合し、３７℃にて１時間インキュベートして行わせた。反応後４７５ｎｍにおける吸光度（Ａs）を測定した。さらに試料溶液の代わりに精製水を添加した系，及び基質溶液の代わりに精製水を添加した系において同様に反応させ、それぞれの場合における吸光度（Ａb及びＡ0）を測定した。チロシナーゼ活性阻害率は数式(1)により求めた。
【００１９】
【数１】
0004002313.tif 000005
【００２０】
チロシナーゼ生合成阻害作用の評価は次のようにして行った。グルタチオン類の水溶液をマウスＢ16メラノーマ細胞（細胞数５０，０００程度）に添加し、３日間培養を行った後、以下の方法により細胞中のチロシナーゼ活性を測定した。すなわち、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｍｌに１．０重量％のドーパ水溶液０．５ｍｌ及び培養細胞液０．５ｍｌを混合し、３７℃にて１時間インキュベートした後、４０５ｎｍにおける吸光度（Ａs）を測定した。対照として溶媒の精製水のみを同様に添加して培養し、同様に培養細胞液とドーパ水溶液とをインキュベートして吸光度（Ａb）を測定し、数式(2)によりチロシナーゼ生合成阻害率を求めた。グルタチオン類は、最終濃度が１．０μＭ〜１００ｍＭの範囲で段階的に変化するように添加した。
【００２１】
【数２】
0004002313.tif 000006
【００２２】
各試料について、ドーズレスポンス曲線を作成し、５０％阻害濃度（ＩＤ50）を求めて、表２にまとめて示した。表２において、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類のチロシナーゼ活性阻害作用及びチロシナーゼ生合成阻害作用についてのＩＤ50は、エステル化していないグルタチオン類の場合の１／２１１から１／６２及び１／８５から１／２９となり、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を添加することにより、同一濃度で添加した場合、チロシナーゼ活性阻害作用及びチロシナーゼ生合成阻害作用は大幅に向上する。
【００２３】
【表２】
0004002313.tif 000007
【００２４】
酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類の活性酸素種による細胞傷害防御作用は、ヒト線維芽細胞に活性酸素種を曝露し、その際の細胞生存率を指標として評価できる。培養したヒト線維芽細胞に、グルタチオン類のエステルを作用させた後、洗浄し、ヒポキサンチン-キサンチンオキシダーゼ系にて活性酸素種（スーパーオキシド及びヒドロキシラジカル）を曝露した。曝露後の細胞生存率はＭＴＴ還元法により測定した。
【００２５】
なおＭＴＴ還元法は、細胞のミトコンドリア内に存在する脱水素酵素が基質に作用して生じるＮＡＤＨにより、系に添加したＭＴＴ（2-(4,5-ジメチル−2-チアゾリル)-3,5-ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド）のテトラゾリウム環が開環することを利用する測定方法である。テトラゾリウム環の開環により青色のフォルマザンが生成するので、これを５６０ｎｍにおける吸光度測定により定量する。
【００２６】
その結果、図２に示すように、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類で処理した場合は、７０〜８５％の良好な細胞生存率を示した。これに対し、エステル塩化していないグルタチオン類で処理した場合は、３０％未満の低い細胞生存率を示した。
【００２７】
【実施例】
さらに、本発明について実施例により詳細に説明する。
【００２８】
0004002313.tif 000008
(１)〜(５)の油相成分を混合し７５℃に加熱して溶解，均一化する。一方(６)〜(８)の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱し、前記の油相成分を添加して予備乳化する。(９)を添加した後ホモミキサーにて均一に乳化し、(10)を加えてｐＨを調整する。冷却後４０℃にて、(12)，(13)の成分を(10)に溶解して添加，混合，均一化する。
【００２９】
上記乳液に配合した酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を、表３に示す。また還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンとＮＡＤＰＨ或いはＮＡＤＨを配合したものを比較例とした。
【００３０】
【表３】
0004002313.tif 000009
【００３１】
皮膚の老化防止効果（しわ発生防止効果）
ヘアレスマウス５匹を一群とし、各群について本発明の実施例及び比較例をそれぞれ１日１回背部に塗布し、１Ｊ／平方ｃｍ／週のＵＶＡを５０週間照射し、しわの発生状況を経時的に肉眼観察により評価した。しわの発生状況は、「発生せず；０点」，「微小なしわがわずかに発生；１点」，「軽微なしわが明確に発生；２点」，「中程度のしわが発生；３点」，「深いしわが発生；４点」として点数化し、各群の平均点を算出した。その際、精製水を塗布した群を対照とした。
【００３２】
使用試験
皮膚の弾性の低下及びシミ，ソバカス，日焼け等の色素沈着を主な症状として有するパネラー２０名を一群とし、各群にそれぞれ実施例及び比較例をブラインドにて顔面及び手に使用させ、皮膚弾性及び色素沈着の変化を観察し、評価した。使用期間は４月から１０月の６カ月間とした。皮膚弾性については、「上昇」，「やや上昇」，「変化なし」，「低下」の４段階で、美白効果については、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の３段階にて評価をし、各評価を得たパネラー数にて結果を示した。
【００３３】
【表４】
0004002313.tif 000010
【００３４】
皮膚の老化防止効果の結果を表４に示した。老化防止効果測定結果より、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を配合した実施例においては、いずれもしわの発生が顕著に抑制されており、ＵＶＡを５０週間照射した後においても、各群とも微小なしわの発生を認めただけであった。これに対してエステル塩としないグルタチオン類を配合した比較例３〜６においては、対照に比べ若干のしわ発生抑制効果は認められるが、いずれにおいても明確なしわの形成が見られ、形成されたしわはほぼ中程度の深さにまで達していた。
【００３５】
【表５】
0004002313.tif 000011
【００３６】
表５に示した使用試験結果から明らかなように、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を配合した実施例を使用したパネラーは全員皮膚弾性の上昇及び色素沈着の改善が認められた。これに対し、比較例３〜６を使用したパネラーは、弾性がやや上昇したパネラーもいるが、明確に上昇の認められたパネラーはおらず、美白効果に関しても、はっきりと改善が認められたパネラーはおらず、４０〜５０％のパネラーで変化を認めなかった。以上の結果より、酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を配合することにより、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンを配合した場合と比較して、老化防止効果及び美白効果が飛躍的に向上していることがわかる。
【００３７】
なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み、痒み等の皮膚刺激やアレルギー反応等の皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また、乳化状態の悪化や配合成分の沈降，変質等も認められなかった。
【００３８】
実施例８  液状皮膚外用剤
(１)グリセリン                                       ２０．０(重量％)
(２)プロピレングリコール                             １０．０
(３)ポリオキシエチレン(５ＥＯ)硬化ヒマシ油             ２．０
(４)精製水                                           ６１．７
(５)エタノール                                         ５．０
(６)パラオキシ安息香酸メチル                           ０．３
(７)還元型グルタチオンエチルエステルタウリン塩         １．０
(１)〜(７)の成分を順次添加し、混合，均一化する。
【００３９】
実施例９  美容液
(１)グリセリン                                         ５．０(重量％)
(２)プロピレングリコール                               ４．０
(３)還元型グルタチオンメチルエステル                   １．０
γ−アミノ酪酸塩
(４)精製水                                           ７９．９
(５)エタノール                                       １０．０
(６)パラオキシ安息香酸メチル                           ０．１
(１)〜(６)の成分を順次添加し、混合，均一化する。
【００４０】
実施例１０  Ｗ／Ｏ乳化型クリーム
(１)ミツロウ                                           ３．０(重量％)
(２)吸着精製ラノリン                                   ５．０
(３)スクワラン                                       ２０．０
(４)固形パラフィン                                     ２．０
(５)マイクロクリスタリンワックス                       ５．０
(６)アジピン酸ヘキシルデシル                         １０．０
(７)セスキオレイン酸ソルビタン                         ３．５
(８)ポリオキシエチレン(５０ＥＯ)硬化ヒマシ油           １．０
(９)１，３−ブチレングリコール                         ５．０
(10)還元型グルタチオンエチルエステルピログルタミン酸塩 １．０
(11)精製水                                           ３９．３
(12)パラオキシ安息香酸メチル                           ０．２
(13)エタノール                                         ５．０
(1)〜(8)の油相成分を混合し７５℃に加熱して溶解，均一化する。一方(9)〜(11)の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱し、前記の油相成分に添加してホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後４０℃にて、(12)の成分を(13)に溶解して添加，混合，均一化する。
【００４１】
実施例  Ｏ／Ｗ型乳剤性軟膏
(１)白色ワセリン                                     ２５．０(重量％)
(２)ステアリルアルコール                             １５．０
(３)ラウリル硫酸ナトリウム                             １．０
(４)パラオキシ安息香酸ブチル                           ０．３
(５)精製水                                           ５７．７
(６)酸化型グルタチオンイソプロピルエステル             ０．９５
アスパラギン酸塩
(７)ＮＡＤＰＨ                                         ０．０５
(１)〜(４)の油相成分を混合し７５℃に加熱して溶解，均一化する。７５℃に加熱した(５)に油相成分を添加して乳化する。冷却後４０℃にて、(６)，(７)の成分を添加，混合，均一化する。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明により、少量の酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類を配合することにより、非常に優れた美白効果及び老化防止効果を発揮する皮膚外用剤を提供することができる。本発明に係る皮膚外用剤においては、有効成分であるグルタチオン類が良好に表皮，真皮及び表皮基底層のメラノサイトに到達でき、低濃度の配合で優れた老化防止効果及び美白効果を示す。従って、皮膚刺激性や感作性の発現するおそれがない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類と、グルタチオン類のメラニン色素白色化作用を示す図である。
【図２】本発明で用いる酸化型及び還元型のグルタチオンのアルキルエステルとアミノ酸との塩類、グルタチオン類の活性酸素種による細胞傷害防御作用を示す図である。
【符号の説明】
１．作用例１
２．作用例２
３．作用例３
４．作用例４
５．作用例５
６．作用例６
７．作用例７
８．比較例１
９．比較例２
【図１】
0004002313.tif 000012
【図２】
0004002313.tif 000013