(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース処理したものを電気泳動にかけることにより得られるヘリコバクター・ピロリ由来抗原であって、電気泳動により測定される分子量が６５ｋｄないし７０ｋｄであり、該ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中に該抗原に対応するＩｇＡ抗体が存在する、ヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項２】
前記分子量が約６８ｋｄである請求項１記載の抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項３】
胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース処理したものを電気泳動にかけることにより得られるヘリコバクター・ピロリ由来抗原であって、電気泳動により測定される分子量が７５ｋｄないし８６ｋｄであり、該ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中に該抗原に対応するＩｇＡ抗体が存在する、ヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項４】
前記分子量が約７８ｋｄである請求項３記載の抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項５】
胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース処理したものを電気泳動にかけることにより得られるヘリコバクター・ピロリ由来抗原であって、電気泳動により測定される分子量が約１３２ｋｄであり、該ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中に該抗原に対応するＩｇＡ抗体が存在する、ヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項６】
胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース処理したものを電気泳動にかけることにより得られるヘリコバクター・ピロリ由来抗原であって、電気泳動により測定される分子量が約１４０ｋｄであり、該ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中に該抗原に対応するＩｇＡ抗体が存在する、ヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片と、被検血液中の該抗原に対応する前記ＩｇＡ抗体との抗原抗体反応に基づく免疫測定により該被検血液中の前記ＩｇＡ抗体を測定する、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片を有効成分として含むヘリコバクター・ピロリ感染の診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) 由来の新規な抗原及びそれを用いたヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリは胃潰瘍及び十二指腸潰瘍の原因菌であることが確認されており、最近の研究では、胃癌にも関与することがわかっている。日本人の４０歳代以上の５０％以上がヘリコバクター・ピロリに感染していることもわかっている。従って、ある人がヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを診断することは、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍の診断を行ない、また、その人が将来的に胃潰瘍及び十二指腸潰瘍並びに胃癌に罹患する可能性を予測する上でも重要である。
【０００３】
従来、ヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かの診断は、患者の口にサイホン管を入れ、食道を経て胃にサイホン管を到達させ、このサイホン管で胃液を吸い上げ、胃粘膜に棲息する、該胃液中に含まれるヘリコバクター・ピロリ菌体が有する抗原を、該抗原に対する抗体を用いた免疫測定法により検出することにより行なわれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法では、患者の口から管を挿入して胃にまで到達させなければならないため、患者に与える苦痛が大きく、患者の胃粘膜を損傷する可能性が少なくなく、また、麻酔が必要となる等、医師の手間と技術を要する。さらに、この方法によれば、胃炎においても抗原が検出されるため、胃潰瘍である場合と胃炎である場合の区別がつかないという問題もある。
【０００５】
従って、本発明の目的は、患者に苦痛を与えることなく簡便に診断することができ、胃炎である場合を区別できる、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法及び該方法に用いられるヘリコバクター・ピロリ由来の新規な抗原を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の方法で調製される、ヘリコバクター・ピロリ由来の新規な抗原に対するＩｇＡ抗体がヒト血清中に存在することを見出し、血液中の該抗体を検出することによりヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを診断することができることに想到し本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース処理したものを電気泳動にかけることにより得られるヘリコバクター・ピロリ由来抗原であって、電気泳動により測定される分子量が６５〜７０ｋｄ、７５〜８６ｋｄ、約１３２ｋｄ又は約１４０ｋｄであり、該ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中に該抗原に対応するＩｇＡ抗体が存在する、ヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片を提供する。また、本発明は、上記本発明のヘリコバクター・ピロリ由来抗原又はその抗体結合性断片と、被検血液中の該抗原に対応する前記ＩｇＡ抗体との抗原抗体反応に基づく免疫測定により該被検血液中の前記ＩｇＡ抗体を測定する、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のヘリコバクター・ピロリ由来抗原を有効成分として含有するヘリコバクター・ピロリ感染の診断試薬を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上述のように、本発明のヘリコバクター・ピロリ由来抗原は、胃潰瘍患者又は十二指腸潰瘍患者の胃液中に存在するヘリコバクター・ピロリをリゾチーム処理し、次いでＮ−アセチルグルコサミニデース(N-acetylglucosaminidase) 処理したものを電気泳動にかけることにより得られるものである。なお、リゾチーム処理に先立ち、超音波破砕を行なうことが好ましい。本発明の抗原の好ましい調製方法は、下記実施例に具体的に記載されている。
【０００９】
なお、周知のように、抗原がその対応抗体と特異的に反応するためには、抗原全体が必要なのではなく、該抗体と結合する対応エピトープを含むその断片も該抗体と特異的に結合することが可能である。従って、上記した本発明の抗原の、上記対応ＩｇＡ抗体と特異的に結合することができる断片( 本明細書において「 抗体結合性断片」 という) も本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
本発明の抗原は４種類あり、電気泳動により測定される分子量はそれぞれ６５〜７０ｋｄ、７５〜８６ｋｄ、約１３２ｋｄ及び約１４０ｋｄである。下記実施例に具体的に記載するように、これらの抗原は、いずれも、該抗原が由来するヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトの血清中にその対応ＩｇＡ抗体が存在する。特に、分子量６５〜７０ｋｄ及び７５〜８６ｋｄの抗原は、その対応ＩｇＡ抗原が胃液中には存在せず、血清中にのみ存在する。そして、これらの対応ＩｇＡは、胃炎患者の胃液及び血清中には存在しない。従って、血液中に存在する、これらの対応ＩｇＡ抗体を測定することにより、ヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを診断することができる。なお、分子量６５〜７０ｋｄ及び７５〜８６ｋｄの抗原は、下記実施例で測定された分子量はそれぞれ６８ｋｄ及び７８ｋｄであるが、電気泳動の測定誤差により、それぞれ６５〜７０ｋｄ及び７５〜８６ｋｄの範囲に現れ得ると考えられる。
【００１１】
上記血清中の対応ＩｇＡ抗体は、上記本発明の抗原又はその抗体結合性断片と、被検血液中の該抗原に対応する前記ＩｇＡ抗体との抗原抗体反応に基づく免疫測定により測定することができる。免疫測定方法自体は周知であり、公知のいずれの方法をも適用することができる。すなわち、標識に基づいて分類すれば、酵素法、蛍光法、放射法、ビオチン法等があり、測定方式に基づいて分類すればサンドイッチ法、競合法、凝集法、比濁法等があるが、これらのいずれをも採用することができる。これらの各免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、当業者が容易に実施できるものである。例えば、酵素標識抗体を用いたサンドイッチ法( サンドイッチＥＬＩＳＡ) により免疫測定を実施する場合を説明すると、先ず、本発明の抗原又はその抗体結合性断片を、例えばマイクロプレートのウェルやガラズビーズ等の固相に不動化し、非特異的反応を防ぐためにウシ血清アルブミン( ＢＳＡ) 、カゼイン等のタンパク質でブロッキング後、被検試料を反応させ、洗浄後、酵素標識した抗ヒトＩｇＡ抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した抗ヒトＩｇＡ抗体をその標識酵素による酵素反応に基づいて測定する。なお、被検試料としては、血清及び血漿並びにその希釈物が好ましいが、ドライケミストリーのように全血を検体として用いることができる系を用いる場合には、全血であってもよい。なお、本明細書における「 測定」 とは、検出及び定量の両者を包含する。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１３】
(1)   抗原を含む試料の調製
典型的な胃潰瘍再発患者又は重度胃炎患者の胃液からヘリコバクター・ピロリを分離し、２００ｍｌのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）にウシ胎児血清( ＦＣＳ) ）を２０％溶解したものに植え、微好気性の環境で５日間、３７℃で培養した。これを10,000 rpmで２０分間遠心し、沈渣として得られた菌をリン酸バッファー( ＰＢＳ) で洗浄し、さらに10,000 rpmで２０分間遠心した。これにＰＢＳを２ｍｌ加え、３０秒の超音波破砕を３回行い、これにＮ−アセチルグルコサミニデースを１ｍｇとリゾチームを１ｍｇ加え、３７℃で１時間保温した。これに、これと等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー( ２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、４．６％ＳＤＳ（ラウリル流酸ナトリウム）、０．１２６Ｍ Tris-HCl(pH6.8)、１２％ブロモフェノールブルー) を加え、９５℃で５分間加熱し、氷中で急冷した。
【００１４】
(2)   電気泳動
上述のように調製した抗原含有試料をポリアクリルアミド電気泳動にかけた。用いた濃縮ゲルは4.5%ポリアクリルアミドゲル(0.125 M Tris-HCl (pH6.8), 0.1% SDS)であり、分離ゲルは１０％ポリアクリルアミドゲル(0.56 M Tris-HCl (pH8.8), 0.15% SDS)であり、用いた電気泳動用バッファーは0.192 M グリシン、0.025 M Tris, 0.1% SDSであった。１つのウェルにつき、上記試料３０μｌを入れ、１４ｍＡで３．５時間泳動した。また、蛋白質分子量マーカーとしてチトクロムＣ( １４ｋｄ) 、ラビット筋肉ホスホリダーゼ( ９７．４ｋｄ) 及びβ−ガラクトシダーゼ( １１６ｋｄ) を用いた。
【００１５】
(3)   ブロッティング
次いで、電気泳動後のゲルを転写用膜( イモビロンＰ( 商品名) ミリポア社製) にブロッティングした。ブロッティング装置はBIO RAD 社製TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELLを用い、ブロッティングバッファーとしては10％メタノール含有６×電気泳動用バッファーを用いた。ブロッティング装置にバッファーに浸した２枚のろ紙をひき、その上に親水化した転写用膜を載せた。その上に泳動後のゲルを載せ、さらにバッファーに浸した２枚のろ紙を載せて、１２０ｍＡで５０分間ブロッティングした。
【００１６】
(4)   ブロッティング後の転写膜上の蛋白の検出
ブロッティング後の転写膜を染色液（100 ％メタノールにクマジーを1 ％溶かしたもの）に１０分間浸し、脱染液( メタノール、酢酸、水を50：5 ：45で混合したもの) でバンドが見えるまで脱染色した。
【００１７】
(5)   バンドと患者血清又は胃液中のＩｇＡ抗体との反応
転写後の転写膜をＴＮ−ＴＸ(10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5% Triton X100(商品名))で親水化した。次いで、1 ％ＢＳＡ−ＴＮ−ＴＸ( ＴＮ−ＴＸにＢＳＡを1 ％溶解) で１時間ブロッキングした。次いで転写膜をＰＢＳ−Ｔ( ＰＢＳに0.05％になるようにTween 20( 商品名) を溶解したもの) で５分間洗浄を５回し、ＰＢＳ−Ｔに患者血清又は患者胃液を0.2 ％溶解したものに浸し、９０分間振った。転写膜をＰＢＳ−Ｔで５分間洗浄を５回した後、ＰＢＳ−Ｔにアルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（DAKO社製）が０．１％になるように溶解したものに浸し、1 時間静置した。次いで転写膜をＰＢＳ−Ｔで１５分間洗浄を1 回、5 分間洗浄を4 回した。次いで転写膜をＡＰバッファー(100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.3%５−ブロモ−４−クロロ−3 −インドリルホスフェート、0.6% NBT（ニトロブルーテトラゾリウム）) に４０分間浸した。軽く水洗し、風乾した。各バンドがアルカリ性ホスファターゼの酵素反応により着色したか否かを調べた。
【００１８】
(6)   結果
結果を下記表１に示す。なお、表中、「＋」の記号は、そのバンドが血清又は胃液中のＩｇＡ抗体と反応したことを示す。
【００１９】
【表１】
0003869556.tif 000002
【００２０】
表１に示されるように、分子量６８ｋｄ及び７８ｋｄの抗原は胃潰瘍患者の血清中に含まれるＩｇＡ抗体とのみ反応し、胃炎患者の血清及び胃液中のＩｇＡとは反応しなかった。また、分子量１３２ｋｄ及び１４０ｋｄの抗原は、胃潰瘍患者の血清及び胃液中に含まれるＩｇＡ抗体とのみ反応し、胃炎患者の血清及び胃液中のＩｇＡとは反応しなかった。従って、これら４種類の抗原に対応する、血清中のＩｇＡ抗体を測定することにより、ヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを診断することができる。なお、これらの４種類の抗原は、公知の文献には対応すると思われるものが記載されておらず、新規なものである。
【００２１】
【発明の効果】
本発明により、胃潰瘍患者の血清中に対応ＩｇＡ抗体が存在し、胃炎患者の血清及び胃液中に対応ＩｇＡ抗体が存在しないヘリコバクター・ピロリの新規な抗原が提供された。本発明の抗原は、従来の抗原と異なりその対応抗体が患者血清中に存在するので、血清中の該対応抗体を測定することによりヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを診断することができる。従って、従来のように患者の胃液を採取する必要がなく、このため患者に苦痛を与えることなく、かつ簡便にヘリコバクター・ピロリ感染の診断を行なうことができる。また、本発明の抗原に対応するＩｇＡ抗体は胃炎患者の血清中には存在しないので、胃潰瘍と胃炎の識別も可能である。従って、本発明は胃潰瘍及び十二指腸潰瘍並びに胃癌の診断及び予防に大いに貢献するものと期待される。