(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列で示される、請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターが図１１に記載の構造を有する組換えベクターｐｍｅｌＢ−ｎｉａであること、を特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の組換えベクターを麹菌に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴｍｅｌＢ−１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１３４）。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規チロシナーゼ遺伝子に関するものであり、詳細には、特に固体培養において高発現する麹菌由来の新規チロシナーゼ遺伝子に関するものである。本発明によれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅより新規に単離したチロシナーゼ遺伝子を利用することにより、チロシナーゼを効率的に生産できるだけでなく、清酒麹の褐変防止、醸造食品その他の飲食品の着色防止、着色防止物質の開発など、様々な産業分野での利用を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品が褐変する機構の一つにチロシナーゼによる、メラニン物質の生産があげられる。これは食品中のチロシンがチロシナーゼにより酸化されドーパ（ＤＯＰＡ）と呼ばれる物質に変化し、これが前駆体となってメラニンが合成されることによる。この反応には酸素が必要となるため、多くの場合食品が酸素にふれることにより、急速に褐変化が起こる。チロシナーゼによる食品の褐変化は、椎茸などのキノコ類からリンゴ、ナシなどの果実類まで多くの食品で見られる現象である。食品が褐変することは外観品質を著しく低下させることであり、褐変防止には多くの努力が払われてきている。
【０００３】
清酒醸造においても、米麹が褐変し、最終的に酒粕中に黒い米粒として存在する「黒粕」現象が大きな問題となっている。清酒発酵中は米麹は清酒もろみ中に存在するため、酸素が必要なチロシナーゼによる酸化反応は起こらない。しかしもろみを圧搾し、酒粕を分離した時点で酸素に接触することになり、チロシナーゼによる酸化反応が進行し、麹部分のみが黒く褐変する。現在ではこのような褐変反応を生じない、非褐変性の麹菌株を使用することにより黒粕を防止している。
【０００４】
このような褐変反応を遺伝子レベルで解析するため麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）が取得されている（Biochim.Biophys.Acta.,1261(1)、p.151、1995）。このｍｅｌＯ遺伝子には、チロシナーゼ活性を持つ蛋白がコードされており、確かにチロシナーゼ遺伝子であることが確認されている。しかしながら、本発明者らはこのｍｅｌＯ遺伝子の発現条件を検討した結果、本遺伝子は液体培養で強力に発現する遺伝子であり、固体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを明らかにした。これは米麹の褐変に関与するチロシナーゼはｍｅ１Ｏ遺伝子とは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。またこの新規チロシナーゼこそが、米麹の褐変現象はもとより味噌、醤油など麹を用いる食品の着色に大きく関与していると考えられる。従ってこれら醸造食品の褐変を防止するためには、ｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナーゼを単離して解析する必要がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、製麹等の固体培養でも褐変が依然として生じている現状に鑑み、ｍｅｌＯとは異なる固体培養で大量に発現するチロシナーゼ遺伝子を単離することである。そしてこの新規チロシナーゼ遺伝子を用いて、米麹の褐変防止など食品の褐変防止に広く利用することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、先ず、既に単離されているチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）の発現条件についての検討を行い、その結果、ｍｅｌＯ遺伝子は液体培養では大量に発現しているものの、固体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを確認した。
【０００７】
具体的には、ｍｅｌＯプロモーター下流にレポーター遺伝子として大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を連結したプロモーター解析用プラスミドを構築し、これを麹菌に導入して行った。すなわち、この遺伝子導入株を、様々な培養条件で培養し、菌体内のＧＵＳ活性を測定することにより、ｍｅｌＯプロモーター発現を定量化する。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高いＧＵＳ活性が得られたが、固体培養では１／１００程度の活性しか認められなかった。固体培養（麹培養）ではチロシナーゼ活性が認められ、褐変化現象も起こる。これらの結果は、固体培養ではｍｅｌＯとは異なる新規チロシナーゼ遺伝子が発現していることを示唆するものであった。
【０００８】
固体培養と液体培養で発現する遺伝子が異なる現象は、既にグルコアミラーゼ遺伝子で証明されている。すなわち、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）には２種類のグルコアミラーゼ遺伝子が存在する。１種類はグルコアミラーゼＡ遺伝子（ｇｌａＡ）であり、液体培養において発現し、固体培養ではほとんど発現しない。一方もう１種類のグルコアミラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）は固体培養でのみ大量に発現する。そしてこのｇｌａＢ遺伝子にコードされるグルコアミラーゼ蛋白は、糖含量が非常に高いなど固体培養での活性維持に非常に有用な性質を持っている。このように麹菌は、同じ活性を持つ酵素であっても、培養条件によって異なる遺伝子を発現させていることが明らかとなっている。チロシナーゼにおいても液体培養と固体培養では異なる遺伝子が発現されている可能性は非常に高い。
【０００９】
そこで、固体培養で発現しているチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、フスマ培養を行ったＡ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブライリーの塩基配列を網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データーベースとのホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからの糸状菌チロシナーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅの新規チロシナーゼ遺伝子を単離する。単離したチロシナーゼ遺伝子のノザン解析を行うことにより、本遺伝子が固体培養で特異的に発現している遺伝子であることを確認する。
【００１０】
また本遺伝子のアンチセンスＲＮＡ解析等を行うことにより、本遺伝子がチロシナーゼ活性を持つ蛋白をコードしかつ、米麹の褐変現象に関与していることを証明する。
以下に、本発明の詳細について述べる。
【００１１】
まずｍｅｌＯ遺伝子と米麹の褐変性を検討するため、ｍｅｌＯプロモーターの発現解析を行った。まずＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ１）（Ｈ. Ishidaら、J. Ferment． Bioeng．８６、 301-307、1998 ）のPstＩ、SalＩギャップに、melO遺伝子の開始コドンATG上流１１００ｂｐを挿入し、図９に示すようなプロモーター解析用プラスミドを構築する。このプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すればプロモーターの発現量が定量化できる。作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ  １０１３−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質乾換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＯプロモーター解析株として以下の検討を行った。このｍｅｌＯ解析株を液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が認められたのに対して、固体培養では４８Ｕ／ｍｇと非常に低い活性しか得られなかった。
【００１２】
更に、培養温度に対する影響についても検討した。固体培養で特異的に発現する遺伝子ｇｌａＢは、培養温度を４０℃以上の高温で培養すると発現誘導が認められ、実際の米麹培養においても培養後期に品温が４０℃以上にまで上昇する。しかしｍｅｌＯ遺伝子は、高温では発現が抑制され、逆に２０℃などの低温で発現誘導が認められた。これらの結果は、ｍｅｌＯ遺伝子は固体培養、特に麹培養においてほとんど発現していないことを示している。しかしながら、固体培養においてもチロシナーゼ活性は認められ、褐変現象も起こっている。これは固体培養で生産されるチロシナーゼはｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。
【００１３】
そこでフスマを用いた固体培養を行い、常法に従いｍＲＮＡを調製し、これよりｃＤＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡを網羅的に配列を決定し、ＥＳＴ情報を収集した。この中から、マッシュルームのチロシナーゼ遺伝子に対してホモロジーを示すクローンを抽出することができた。このＥＳＴクローンの配列を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムライブラリーからチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、ＥＳＴ配列情報から２種類のプローブを作成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとしてＰＣＲ反応を行う。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、抽出したＥＳＴクローンに対応したゲノムＤＮＡであることを確認する。
【００１４】
次に、このＤＮＡ断片をプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションにより目的（ポジティブ）クローンを抽出する。得られたポジティブクローンをテンペレートとして塩基配列を決定する。シーケンス解析用のプローブをいくつか作成することにより、プロモーター、ターミネーター領域を含むチロシナーゼ遺伝子の全塩基配列の決定に成功した。
【００１５】
チロシナーゼ遺伝子は、６つのイントロンに分断された７つのエキソンとして存在し、そのコーディング領域には６１６アミノ酸がコードされていた。ｍｅｌＯ遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは２４％であったが、マッシュルームのチロシナーゼなどで保存性の高い領域については、さらに高いホモロジーを示した。以上の結果より、この遺伝子はチロシナーゼ遺伝子である可能性が高く、ｍｅｌＢ遺伝子と命名した。
【００１６】
このｍｅｌＢ遺伝子の発現条件を検討するためノザン解祈を行った。ＤＰＹ培地を用いた液体培養と白米を用いた麹培養を行い、それぞれの培養物から常法に従いＲＮＡを抽出した。先のｍｅｌＢ遺伝子の一部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたＲＮＡには全くシグナルが認められないのに対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。これはｍｅｌＢ遺伝子が液体培養ではほとんど発現せず、固体培養（麹培養）で非常に強く発現していることを示すものである。
【００１７】
次に、ｍｅｌＢ遺伝子の機能を推定するため、本遺伝子の麹菌への導入を試みた。プロモーター、ターミネーターを含むｍｅ１Ｂ遺伝子（４．２ｋｂ）を麹菌の形質転換用ベクターｐＩＮ９３に挿入し、麹菌宿主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７）株に導入した。ｍｅｌＢ遺伝子を単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ株：工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１３４）を用いて麹を作成した所、宿主株に較べて高い褐変性を示した。次にこれらの麹の抽出液のチロシナーゼを比較した結果、ＴｍｅｌＢ株の活性は宿主株に比べて２倍に上昇していることが明らかとなった。
【００１８】
従って、我々が単離したｍｅｌＢ遺伝子には、チロシナーゼ活性を有する蛋白がコードされており、このチロシナーゼが麹菌の固体培養における褐変現象に強く関与していることが示された。このように本発明に係るｍｅｌＢ遺伝子は新規なものであって、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｍｅｌＢ遺伝子ということもあり、その塩基配列を配列表の配列番号２、及び、図面の図４、図５、図６に示す。）
【００１９】
本発明において、このようにして単離したｍｅｌＢ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、チロシナーゼ又はチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質にはチロシナーゼも包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列番号１（図１、図２、図３）に示される。
【００２０】
本発明によれば、このようにして製造した新規チロシナーゼ（又はその酵素活性を有するタンパク質）は、試薬として各方面で有効に利用することができ、他方、このようにして単離したｍｅｌＢ遺伝子については、これを遺伝子破壊、遺伝子発現抑制等を行うことによって、麹や各種飲食品の褐変を防止することができるし、また、このｍｅｌＢ遺伝子にコードされるチロシナーゼは上記のように試薬として利用するほか、そのインヒビターをスクリーニングすることにより、麹や各種飲食品の褐変防止剤を新たに開発することも期待される。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２１】
【実施例１】
ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度
先ず、ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度について、図９に示すプロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを構築し、これを用いて発現強度を測定した。
【００２２】
ＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ１）は、形質転換用マーカーであるＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218、p.99-104、1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451、1986）を含む。このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイト）に、ｍｅｌＯプロモーターを挿入し、得られたこのプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すれば、プロモーターの発現量が定量化できるのである。
【００２３】
そこで本例においては、先述のｐＮＧＳ１のＰｓｔ１／ＳａｌＩギャップに、ｍｅｌＯ遺伝子の開始コドンＡＴＧの上流１１００ｂｐを挿入し、構築されたプロモーター解析用プラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｏ−１０１３：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８として既に寄託されている）のｎｉａＤ変異株（硝酸資化能欠損株、Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  １０１３−ｎｉａＤ：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７として既に寄託されている）に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質転換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＯプロモーター解析株として、以下の検討を行った。
【００２４】
このｍｅｌＯ解析株について、液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が認められたのに対して、固体培養では４８Ｕ／ｍｇと非常に低い活性しか得られなかった。このことから、麹の褐変にはｍｅｌＯ遺伝子は関与していないと考えられ、麹には他のチロシナーゼ遺伝子が存在することが示唆された。
【００２５】
【実施例２】
ｍｅｌＢ遺伝子のクローニング
フスマ培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｍｅｌＯ遺伝子に相同性の高いクローンＪＺ４４９５を選択した。次にこのクローンをプローブとしてＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりｍｅｌＢ遺伝子をクローニングした。プローブとしては、２種類のオリゴＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを用いた。
【００２６】
上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、オリゴＤＮＡ＃１であって、その塩基配列は配列番号３（図７）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃２であって、その塩基配列は配列番号４（図８）に示される。
【００２７】
この方法により約１００００個のファージクローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズするクローンλＴＲ９９を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定し、本クローンが確かに目的のｍｅｌＢ遺伝子であることを確認した。
【００２８】
【実施例３】
ｍｅｌＢ遺伝子の塩基配列の決定
ポジティブクローンλＴＲ９９株をテンペレートとしてｍｅｌＢ遺伝子の全塩基配列の決定を行った。プロモーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分をあわせて４．２ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図４、図５、図６）。上記配列の内、１位置から１４３６位置までがプロモーター部分であり、１４３７位置から３６３５位置までがコーディング領域であり、３６３６位置から４１７４位置までがターミネーター部分である。
【００２９】
ｍｅｌＯ遺伝子とのホモロジー検索の結果から、ｍｅｌＢ遺伝子には６つのイントロンが存在し、そのコーディング領域は、２．２ｋｂｐであって（更に詳細には、１４３７位置のＡＴＧから３６３５位置のＧＣＣまでの２１９９ｂｐ）、塩基配列から推定されるタンパク質は６１６残基であることが明らかとなった（配列番号１：図１、図２、図３）。なお、ｍｅｌＯ遺伝子とｍｅｌＢ遺伝子の構造の比較を下記表１に示す。
【００３０】
0003903125.tif 000002
【００３１】
【実施例４】
ｍｅｌＢ遺伝子の発現強度
ｍｅｌＢ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度について、実施例１と同様にして、図１０に示すプロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを構築し、これを用いて発現強度を測定した。
【００３２】
ｐＮＧＳ１のＰｓｔＩ／ＳａlＩギャツプに、ｍｅｌＢ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流１．４ｋｂｐを挿入し、プロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを構築した。（図１０）このプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＢプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すればプロモーターの発現量が定量化できる。作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ  １０１３−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質転換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＢプロモーター解析株として以下の検討を行った。
【００３３】
このｍｅｌＢ解析株について、液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４５Ｕ／ｍｇと低い活性しか得られなかったのに対して、固体培養では２８５０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が得られた。また、液体培養では褐変が認められなかったのに対し、固体培養では褐変が認められた。このことから、麹の褐変にはｍｅｌＢ遺伝子が関与しているものと考えられた。
【００３４】
また、ノザン解析を行った。上記と同じ液体培養と固体培養（麹培養）を行い、それぞれの培養物から常法に従いＲＮＡを抽出した。ｍｅｌＢ遺伝子の一部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたＲＮＡには全くシグナルが認められなかったのに対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。
【００３５】
【実施例５】
ｍｅｌＢ遺伝子の麹菌への導入
得られたプロモーター、ターミネーターを含むｍｅｌＢ遺伝子（４．２ｋｂ）を麹菌の形質転換用ベクターｐＩＮ９３に挿入した、ｍｅｌＢ発現プラスミドｐｍｅｌＢ−ｎｉａを構築した（図１１）。このｐｍｅｌＢ−ｎｉａを麹菌宿主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７）株に常法に従い導入した。このようにして得た、ｍｅｌＢ遺伝子を単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ−１１株）をアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴｍｅｌＢ−１１と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１８１３４として寄託した。そして、この形質転換体（ＴｍｅｌＢ−１１株）を用いて麹を作成した。
【００３６】
その結果、遺伝子導入株では宿主株に比べて高い褐変性が観察された。このことから遺伝子導入株ではｍｅｌＢが強く発現していることが示唆された。
【００３７】
【実施例６】
ｍｅｌＢ遺伝子を利用した麹の褐変防止
ｍｅｌＢ遺伝子を抑制するために、まずｍｅｌＢのアンチセンス遺伝子を作成した。これをアスペルギルス・オリゼーＭ−ＮＳ４（国税庁醸造研究所より分与）に導入し、固体培養（麹培養）を行った。これにより通常のｍｅｌＢのｍＲＮＡがアンチセンス遺伝子のｍＲＮＡと結合し、蛋白を作れなくなる。その結果、アンチセンス遺伝子を導入した株の麹の褐変が抑制された。
【００３８】
また、次に上記の株にｍｅｌＢのパーシャル遺伝子を多コピー導入し、固体培養（麹培養）を行った。これによりタイトレーションが起こり、本来のｍｅｌＢの働きが弱くなる。その結果、やはり麹の褐変が抑制された。
これらのことから、ｍｅｌＢを抑制することにより、麹の褐変が抑制されることが分かった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の褐変性を持つチロシナーゼ（ｍｅｌＢ）を大量に生産することが可能となり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止、着色防止物質の開発など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００４０】
【配列表】
0003903125.tif 000003
0003903125.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規チロシナーゼ（ｍｅｌＢ）のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢの塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】オリゴＤＮＡ＃１を示す。
【図８】オリゴＤＮＡ＃２を示す。
【図９】解析用プラスミドｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを示す。
【図１０】解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを示す。
【図１１】ｍｅｌＢ発現用プラスミドｐｍｅｌＢ−ｎｉａを示す。
【図１】
0003903125.tif 000010
【図２】
0003903125.tif 000011
【図３】
0003903125.tif 000012
【図４】
0003903125.tif 000013
【図５】
0003903125.tif 000014
【図６】
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【図７】
0003903125.tif 000016
【図８】
0003903125.tif 000017
【図９】
0003903125.tif 000018
【図１０】
0003903125.tif 000019
【図１１】
0003903125.tif 000020