(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好気性、グラム陰性、非運動性、無色、非胞子形成性、及びオキシダーゼ陽性であり、さらに以下の特性を有することを特徴とする深海由来低温細菌であるPsychrobacter pacificensis：
（１）細胞外器官として多数のフィムブリエ（繊毛）を生ずるが、鞭毛は生じない；
（２）ポリペプトンおよび酵母抽出物を含む寒天プレート上に、縁が欠けていない円形で凸状の、色がオフホワイトのコロニーを形成する；
（３）蛍光色素は全く形成されない；
（４）至適増殖には海水または約３％のＮａＣｌを必要とする；
（５）４℃で２０℃における増殖収率（ｇｒｏｗｔｈ ｙｉｅｌｄ）に匹敵する増殖収率を示し、約２５℃で至適増殖が起こり、限界増殖温度は３８℃である；
（６）グルコース、キシロースおよびアラビノースから酸が好気的に形成される；
（７）ウレアーゼ活性が陽性であるが、フェニルアラニンデアミナーゼおよびトリプトファンデアミナーゼについては陰性である；
（８）グルコース発酵、インドール産生、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解およびアルギニンジヒドロラーゼ生化学試験について陰性である；
（９）唯一の炭素およびエネルギー源としてＬ−ヒスチジンおよびＤＬ−リンゴ酸を利用する；
（１０）ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート、クエン酸、グルコン酸、プロピオン酸、Ｌ−セリンまたはｎ−吉草酸を利用しない；
（１１）１８：１ｗ９ｃが主要な脂肪酸であり、またＱ８が主要なキノンである；ならびに
（１２）ＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含有量は、ＨＰＬＣで測定すると４３〜４４モル％である。
【請求項２】
Psychrobacter pacificensis  NIBH  P2K6（FERM  BP-7106)である、請求項１記載の深海由来低温細菌であるPsychrobacter pacificensis。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、深海微生物を指標とした深海水の循環やその湧昇のモニタリングの技術に関し、より詳細には、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種からなる群より選択される細菌を種特異的に検出する技術、ならびにＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌を種特異的に検出する技術に関する。さらに、本発明は、深海水の循環やその湧昇のモニタリングの指標とし得る深海微生物に関し、より詳細には、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌に関する。
背景技術
日本近海の深海水は、グリーンランド沖で沈み込んだ密度の高い海水に端を発し、さらに南極海周辺での高密度海水の加入を経て日本海溝をはじめとする北太平洋海域へ流れ込む海洋大循環流により供給されていると推測されている。このような深海水は豊富な栄養塩類を含んでおり、湧昇海域では高い生物生産活動が見られるため、これを利用した深海水の利用が現在検討されている。
また、これまで利用されていなかった深海魚が、食料、餌料として用いられはじめている。
さらに、地球規模や地域規模での環境汚染問題に関連し、人間活動の結果放出または廃棄される二酸化炭素や放射性廃棄物、産業廃棄物等を日本近海の深海域に投棄することが検討されている。
しかし、これら深海水や深海域に関する知見が不足しているため、深海水が表層の生物活動に及ぼす影響の評価や二酸化炭素や放射性廃棄物、産業廃棄物等の深海投棄が深海の生物活動に及ぼす影響の評価が困難な状況にある。また、グローバルな深層海水の循環を知る上で有用な指標生物の報告もない。
発明の開示
本発明は、深海水や深海域を人為的に利用するにあたって生物学的な安全性評価を行う技術、具体的には、深海に固有に生息する微生物種の遺伝情報の特徴に基づき、該微生物およびその近縁種を種特異的に検出する技術の提供を目的とする。
本発明者らは、日本海溝深海水由来の新規低温細菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、本微生物を分子・細胞レベルにおいて特異的に検出することを可能にするオリゴヌクレオチドプローブを開発して、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、配列番号１の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを提供する。
また、本発明は、配列番号１の塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。オリゴヌクレオチドプローブはＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブのいずれであってもよい。配列番号１の塩基配列の一部としては配列番号２の塩基配列を挙げることができる。上記のプローブは、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種からなる群より選択される細菌を検出または同定するために使用することができる。また、上記のプローブは、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌を特異的に検出または同定するために使用することもできる。
さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種からなる群より選択される細菌を検出または同定する方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌を特異的に検出または同定する方法を提供する。
また、本発明は、好気性、グラム陰性、非運動性、無色、非胞子形成性、およびオキシダーゼ陽性であることを特徴とするＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓも提供する。Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓとしては、例えば、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１０６）を挙げることができる。
本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第１１−１４５３４２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ００／０２０４５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号２：合成ＤＮＡ（プローブＰｓｙｐａｃ４６９−４８７）
配列番号３：合成ＤＮＡ（プライマー３５９ｆ）
配列番号４：合成ＤＮＡ（プライマー８０３ｒ）
配列番号５：合成ＤＮＡ（プライマー８２１ｆ）
配列番号６：合成ＤＮＡ（プライマー１１０４ｒ）
配列番号７：合成ＤＮＡ（プライマー１１１１ｆ）
配列番号８：合成ＤＮＡ（プローブＥｕｂ３３８−３５５）
配列番号９：合成ＤＮＡ（プローブＣｏｎｔ）
配列番号１０：合成ＤＮＡ（プローブＵｎｉｖ１３９０−１４０７）
発明を実施するための最良の形態
本発明の新種の微生物、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、八丈島沖の日本海溝水深６，０００ｍの海水より、１気圧摂氏４度の低温培養条件下で優占的に出現した従属栄養性微生物である。Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓとしては、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ２、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ１３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１７およびＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１８の６種の株が本発明者らにより単離されている。なお、該微生物は、当初、本発明者らによりＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｕｓと命名されたが、その後、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに名称変更されて新種登録されている（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｔｒｅｎｃｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（２０００）８３５−８４６）。従って、上記Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｕｓとＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓとは、全く同一の微生物群を意味する。
上記菌株のうち、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６およびＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１８の分類学的性質を以下の表１、２および３にまとめる。なお、表１、２および３には、同時に単離された他の菌株や本菌の近縁種についても分類学的性質が記載されている。
0003873112.tif 000002
１：ノマルスキー光学系を用いた光学顕微鏡下。２：栄養素勾配を有する半固形寒天培地上。３：電子顕微鏡観察による。−：陰性。Ｆｌａｇｅｌｌａ★：鞭毛付着が時折観察された。ｗ：弱い、ぴくっとした動き。
0003873112.tif 000003
ａ）全ての種および菌株は、オキシダーゼ、カタラーゼ、４〜１５℃における増殖、６．５％ＮａＣｌに対する耐性、ならびに唯一の炭素およびエネルギー源としてのＬ−プロリンの利用について陽性であった。ｂ）Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：８４１−８４８のデータ。ｃ）Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：２０９−２１５のデータ。ｄ）ＡＰＩ  ２０  ＮＥテストによって決定した。化合物の利用性はＡＰＩ  ＩＤ  ３２  ＧＮテストを用いて推定した。ＰＮＰＧテスト：パラ−ニトロフェニル−（β）−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いたβ−ガラクトシダーゼについてのテスト。
★その他：グルコース発酵、インドール産生、エスクリンの加水分解、ゼラチンの加水分解、およびアルギニンジヒドロラーゼ。（ｄ
★★その他：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ｍ−ヒドロキシ−ベンゾエート、グリコーゲン、酢酸フェニル。以下の炭素およびエネルギー源は、いずれの種または菌株によっても利用されなかった：Ｎ−アセチルグルコサミン、アジピン酸、Ｌ−アラビノース、カプリン酸、Ｌ−フコース、２−ケト−グルコネート、５−ケト−グルコネート、（Ｄ）グルコース、（ミオ）イノシトール、イタコン酸、マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−メリビオース、（Ｌ）ラムノース、Ｄ−リボース、（Ｄ）サリシン、Ｄ−ソルビトール、スクロース。なお（）はＢｏｗｍａｎら（１９９６）が用いた基質の型を示す。表中の利用の記載において、（）は光学異性体の型を示す。表中のサイクロバクター・パシフィセンシスの欄における陽性菌株の頻度：＋，１００％；＋ｖ，６７％；−ｖ，３３％；−，０％。他のサイクロバクター種の欄における陽性菌株の頻度：＋，１００−９０％；ｖ＋，８９−１１％；ｖ−，１０−０％。ｗ：弱い反応。
ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６菌株は、サイクロバクター・パシフィセンシスの基準株であると規定された。
0003873112.tif 000004
Ｘ１−３：正確な二重結合の位置は決定されていない。Ｔｒ：ごく微量（＜０．１％）。
かっこ内の数字は標準偏差を示す（ｎ＝３）。★：基準株。
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、好気性、グラム陰性、非運動性、無色、非胞子形成性、オキシダーゼ陽性の長さ１．０−１．５μｍ、幅約１μｍの球桿菌である。これらの菌株は細胞外器官として多数のフィムブリエ（繊毛）を生ずるが、鞭毛は生じない。ポリペプトンおよび酵母抽出物を含む寒天プレート上に、縁が欠けていない円形で凸状の、色がオフホワイトのコロニーを形成する。蛍光色素は全く形成されない。至適増殖には海水または約３％のＮａＣｌを必要とするが、殆どの菌株はＮａＣｌ濃度が０または８％以上の場合は増殖しない。４℃では定常期に達するのに１〜２週間を要するが、これらの菌株は４℃で２０℃における増殖収率（ｇｒｏｗｔｈ  ｙｉｅｌｄ）に匹敵する増殖収率を示す。約２５℃で至適増殖が起こり、限界増殖温度は３８℃である。グルコース、キシロースおよびアラビノースから酸が好気的に形成される。これらの菌株はウレアーゼ活性が陽性であるが、フェニルアラニンデアミナーゼおよびトリプトファンデアミナーゼについては陰性である。この種はグルコース発酵、インドール産生、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解およびアルギニンジヒドロラーゼという生化学試験について陰性である。この種は唯一の炭素およびエネルギー源としてＬ−ヒスチジンおよびＤＬ−リンゴ酸を利用する。いくつかの菌株は酢酸、Ｌ−アラニン、３−ヒドロキシ−ブチレート、乳酸、マロン酸およびスベリン酸を利用するが、ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート、クエン酸、グルコン酸、プロピオン酸、Ｌ−セリンまたはｎ−吉草酸を利用する菌株はない。１８：１ｗ９ｃが主要な脂肪酸であり、またＱ８が主要なキノンである。ＤＮＡ  Ｇ＋Ｃ含有量は、ＨＰＬＣで測定すると４３〜４４モル％である。基準株は、日本国八丈島沖日本海溝の深度６，０００ｍの海水から４℃で単離したＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６である。この菌株は、財団法人醗酵研究所に寄託されている（ＩＦＯ  １６２７０）。また、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６  （ＩＦＯ  １６２７０）は工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１１年５月２１日付けで寄託された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１０６）。
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは新種であり（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｔｒｅｎｃｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（２０００）８３５−８４６）、その近縁種は南極域で多数分離されている（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
４６：８４１−８４８，Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：２０９−２１５）ことから、グローバルな深層海水の循環に関連した指標生物として有用であることがわかる。グローバルな深層海水の循環については、太平洋海域では定常的に南極から日本海溝に向け深層海水が流れていることが知られている（Ｓｔｏｍｍｅｌ，Ｈ．（１９５８）Ｄｅｅｐ−Ｓｅａ  Ｒｅｓ．５：８０−８２）。
本発明の新菌種であるＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、上述のように、深層水および深海域の新規な指標生物であり、従って、様々な目的において深層水および深海域のモニタリング技術に有用である。最近、深層水が富栄養性、低水温性、清浄性などの資源的価値を有する再生循環型の大型資源として注目されており（「海洋深層水の資源的価値とその利用」、月刊海洋、Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．３，１３３−１３８，１９９４）、例えば、水産分野では、餌料性プランクトンの培養、海藻培養、冷水性海産動物飼育、深海性生物飼育などが研究されている。また、エネルギー分野では、水温制御、冷房、淡水生産などが試みられている。このような深層水を資源として利用するためには、深層水を評価するための生物モニタリング技術が不可欠となる。さらに、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、産業廃棄物の深海域への廃棄処理に関連する深層水のモニタリング、深海魚の利用に関わる深海微生物のモニタリング、深層海水の地球規模での循環調査、深海水の湧昇域のモニタリング等において、有用な指標生物である。
また、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、有用物質を生産する微生物である可能性があり、例えば、キチン分解酵素（Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ，３月号，５−１２，１９９８，シーエムシー）、低温で活性のある低温性リパーゼやプロテアーゼ（洗剤として利用できる）等（東原孝規、「海洋微生物とバイオテクノロジー」清水潮編、技報堂出版、ｐｐ．５１−６７、１９９１）（Ｏｈｇｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ．Ｍａｒｇｅｓｉｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｃｈｉｎｎｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ｐｐ．１７−３４，１９９９）、ＥＰＡ、ＤＨＡ等（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１，７３０−７３７，１９８６）の有用脂肪酸を含有する脂質等の微生物生産に利用しうる。
配列番号１の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡは、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６から得られる。すなわち、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６の菌体から標準的な方法によりゲノムＤＮＡを抽出し、適切なプライマーを用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅する（Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｌ．（１９９１）１６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，ｐｐ．１１５−１７５．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ．Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。ＰＣＲ産物から過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、適切なプライマーを用いるサイクルシークエンス法により、精製ＰＣＲ産物の配列を直接決定することができる。その配列を配列番号１に示す。
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、本菌に特異的な塩基配列領域を抽出し、分子・細胞レベルでの検出を可能にするＤＮＡプローブを作製する。本菌に特異的な塩基配列領域としては、配列番号１の塩基配列の塩基番号４５８〜４７６の領域（大腸菌の配列に準じた場合は、塩基番号４６９〜４８７の領域）などを挙げることができる。この領域は対応する塩基長１０〜５０ｂｐ、好ましくは塩基長１５〜２５ｂｐのプローブを作製するとよい。好ましい一例として、以下の塩基配列を有するプローブを挙げることができる。
・５’ＴＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＧ３’（配列番号２）
プローブは、ホスホルアミド法（Ｂｅａｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１））またはトリエステル法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１））により合成することができる。あるいは、自動合成装置を使用してプローブを合成してもよい。
さらに、プローブは、アイソトープ、蛍光色素、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）などで標識するとよい。標識としては、Ｃｙ５（インドジカルボシアニン）やＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）等の蛍光色素やＤＩＧ（ジゴキシゲニン）等のハプテンを挙げることができる。
本発明のプローブを用いて、種々のハイブリダイゼーション法（サザンブロット法、ノーザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）など）により、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種を検出または同定することができる。Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓおよびＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａの近縁種としては、データベース上に記載されているが同定根拠が不明なＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａ（ＡＦＯ２５５５５、ＰＧＵ８５８７９、ＰＧＵ８５８７８、ＰＧＵ８５８７７、ＰＧＵ８５８７６）、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ（ＰＩＵ８５８８０）、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（ＰＳＵ８５８７４）等の菌株を挙げることができる。また、上述のような方法により、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌を種特異的に検出または同定することもできる。
配列番号２の塩基配列のプローブを用いて、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓを検出または同定する方法の一例について、以下に説明する。
パラフォルムアルデヒド等を用いて固定した微生物試料を、ゼラチン等有機被膜を形成させたスライドグラス上に塗沫し、微生物細胞をスライドグラスの有機被膜上に不動化する。エタノールで脱水、または微生物細胞を室温で一晩程乾燥させた後、微生物のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡと該ＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションを行い、洗浄処理により遊離または不完全結合ＤＮＡプローブを除去する。ここで、ハイブリダイゼーションの条件は特に限定されないが、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種を検出または同定する場合には、１〜２個のミスマッチを許す比較的穏和な条件で、好ましくは、フォルムアミドを添加しない４０〜４６℃で４時間以上の条件であり、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌を種特異的に検出または同定する場合には、１個のミスマッチをも許さない厳格な条件で、好ましくは、３０〜４０％程度のフォルムアミド存在下４４〜４８℃で４時間以上の条件である。通常の蛍光顕微鏡観察手法に準じて微生物細胞を観察し、対象とする微生物細胞に相補結合した蛍光標識ＤＮＡプローブの蛍光を検出する。コントロールとして、非特異的なＤＮＡプローブや対象とする微生物属種外の微生物を用い、上記実験を行う。対象とした微生物がＤＮＡプローブで標的とした微生物であった場合は、細胞内核酸と該ＤＮＡプローブとの相補結合により細胞全体が蛍光を発するので検出、同定ができる。
本発明のプローブは、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種の種特異的な検出、ならびにＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する細菌の種特異的な検出を可能にするばかりでなく、検出の迅速化と精度向上をもたらす点でも非常に有益である。
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ菌株の単離と１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定
日本海溝の表層および深海環境から単離した６７菌株より全部で１６菌株を選択した。このうち、１１菌株をモラキセラ菌に類似した細菌であると仮に同定した。異なる寒天培地、例えばポリペプトンおよび酵母抽出物を含有する人工海水に基づく１／２  ＴＺ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．４９，３５３−３６７）、Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）およびＮｉｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）等を用いてこれらの菌株を純化した。各菌株を２０℃でインキュベートして集菌し、ゲノムＤＮＡを得た。０．３％の寒天を含む１／２  ＴＺ半固形寒天培地を４℃での保存のために用いた。ガラス試験管に封入した乾燥菌体もまた長期保存のために４℃で保存した。
深海水から単離したモラキセラ菌に類似した菌株について、下記の直接配列決定によって１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を決定した。すなわち、菌体を遠心により集菌し、洗浄し、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）に再懸濁した。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、フェノール、およびクロロフォルム／イソアミルアルコール（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ８，４３２１−４３２５）を用いて標準的方法によってゲノムＤＮＡを抽出した。ほぼ完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を得るため、プライマー２７ｆおよび１５２５ｒ（Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｌ．（１９９１）１６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，ｐｐ．１１５−１７５．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ．Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）ならびに文献（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ  １２８，７０５−７１１）に記載のＰＣＲサイクルを用いて、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，ＵＳＡ）によってＰＣＲを実施した。ＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造）を用いてＰＣＲ産物から過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した。自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＬＦｒｅｄ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、適切なフォワードおよびリバースプライマー（Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｌ．（１９９１）、上記）を用いて、製造者の指示に従って、サイクルシークエンス法により精製ＰＣＲ産物を直接配列決定した。具体的には、上記プライマーは大腸菌番号系における３４２ｒ、３５９ｆ（５’−ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧ（配列番号３）；２０量体）、５１９ｒ、８０３ｒ（５’−ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＣＧＧ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  Ｃ（配列番号４）；１９量体）、８２１ｆ（５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  Ｇ（配列番号５）；１９量体）、１１０４ｒ（５’−ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＣＧＧ  ＧＡＣ（配列番号６）；１８量体）、および１１１１ｆ（５’−ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＣＡＡ（配列番号７）；１８量体）である。各１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域断片の配列を両方の鎖について決定し、ＧＥＮＥＴＹＸ  ソフトウエア（バージョン８；ソフトウエア開発株式会社）を用いて連結した。モラキセラ菌に類似した深海の菌株を除いて、標準種モラキセラ・ラクナータ菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ）ＡＴＣＣ  １７９６７を含む他の細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡを以前に記述された（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）上記）ように抽出し、増幅し、サブクローン化した。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（バージョン１．７１；４４）中の多重アラインメントプログラムを用いて配列を並べた。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  プロファイルアラインメントオプションを用いて、我々が決定した配列をアントワープ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ）のｒＲ��Ａ  ｗｗｗサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｒｒｎａ，ｕｉａ，ａｃ，ｂｅ／；４５）から得た公知の並置させた配列に合わせた。この並置したデータマトリックスから、空隙（ｇａｐ）があるすべての位置、すなわち未決定および曖昧な配列を除去した。Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を配列番号１に示す。
実施例２
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓの分類学的性質
実施例１に記載したように、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、八丈島沖の日本海溝水深６，０００ｍの海水より、１気圧摂氏４度の低温培養条件下で優占的に出現した従属栄養性微生物である。Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓとしては、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ２、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ１３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１７およびＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１８の６種の株が本発明者らにより単離されている。
上記菌株のうち、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｊ３、ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６およびＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ１８の分類学的性質を常法に従って調べた。その結果を、以下の表４、５および６にまとめる。なお、表４、５および６には、同時に単離された他の菌株や本菌の近縁種についても分類学的性質が記載されている。
0003873112.tif 000005
１：ノマルスキー光学系を用いた光学顕微鏡下。２：栄養素勾配を有する半固形寒天培地上。３：電子顕微鏡観察による。−：陰性。Ｆｌａｇｅｌｌａ★：鞭毛付着が時折観察された。ｗ：弱い、ぴくっとした動き。
0003873112.tif 000006
ａ）全ての種および菌株は、オキシダーゼ、カタラーゼ、４〜１５℃における増殖、６．５％ＮａＣｌに対する耐性、ならびに唯一の炭素およびエネルギー源としてのＬ−プロリンの利用について陽性であった。ｂ）Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：８４１−８４８のデータ。ｃ）Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：２０９−２１５のデータ。ｄ）ＡＰＩ  ２０  ＮＥテストによって決定した。化合物の利用性はＡＰＩ  ＩＤ  ３２  ＧＮテストを用いて推定した。ＰＮＰＧテスト：パラ−ニトロフェニル−（β）−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いたβ−ガラクトシダーゼについてのテスト。
★その他：グルコース発酵、インドール産生、エスクリンの加水分解、ゼラチンの加水分解、およびアルギニンジヒドロラーゼ。（ｄ
★★その他：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ｍ−ヒドロキシ−ベンゾエート、グリコーゲン、酢酸フェニル。以下の炭素およびエネルギー源は、いずれの種または菌株によっても利用されなかった：Ｎ−アセチルグルコサミン、アジピン酸、Ｌ−アラビノース、カプリン酸、Ｌ−フコース、２−ケト−グルコネート、５−ケト−グルコネート、（Ｄ）グルコース、（ミオ）イノシトール、イタコン酸、マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−メリビオース、（Ｌ）ラムノース、Ｄ−リボース、（Ｄ）サリシン、Ｄ−ソルビトール、スクロース。なお（）はＢｏｗｍａｎら（１９９６）が用いた基質の型を示す。表中の利用の記載において、（）は光学異性体の型を示す。表中のサイクロバクター・パシフィセンシスの欄における陽性菌株の頻度：＋，１００％；＋ｖ，６７％；−ｖ，３３％；−，０％。他のサイクロバクター種の欄における陽性菌株の頻度：＋，１００−９０％；ｖ＋，８９−１１％；ｖ−，１０−０％。ｗ：弱い反応。
ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６菌株は、サイクロバクター・パシフィセンシスの基準株であると規定された。
0003873112.tif 000007
Ｘ１−３：正確な二重結合の位置は決定されていない。Ｔｒ：ごく微量（＜０．１％）。
かっこ内の数字は標準偏差を示す（ｎ＝３）。★：基準株。
Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、好気性、グラム陰性、非運動性、無色、非胞子形成性、オキシダーゼ陽性の長さ１．０−１．５μｍ、幅約１μｍの球桿菌である。これらの菌株は細胞外器官として多数のフィムブリエ（繊毛）を生ずるが、鞭毛は生じない。ポリペプトンおよび酵母抽出物を含む寒天プレート上に、縁が欠けていない円形で凸状の、色がオフホワイトのコロニーを形成する。蛍光色素は全く形成されない。至適増殖には海水または約３％のＮａＣｌを必要とするが、殆どの菌株はＮａＣｌ濃度が０または８％以上の場合は増殖しない。４℃では定常期に達するのに１〜２週間を要するが、これらの菌株は４℃で２０℃における増殖収率（ｇｒｏｗｔｈ  ｙｉｅｌｄ）に匹敵する増殖収率を示す。約２５℃で至適増殖が起こり、限界増殖温度は３８℃である。グルコース、キシロースおよびアラビノースから酸が好気的に形成される。これらの菌株はウレアーゼ活性が陽性であるが、フェニルアラニンデアミナーゼおよびトリプトファンデアミナーゼについては陰性である。この種はグルコース発酵、インドール産生、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解およびアルギニンジヒドロラーゼという生化学試験について陰性である。この種は唯一の炭素およびエネルギー源としてＬ−ヒスチジンおよびＤＬ−リンゴ酸を利用する。いくつかの菌株は酢酸、Ｌ−アラニン、３−ヒドロキシ−ブチレート、乳酸、マロン酸およびスベリン酸を利用するが、ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート、クエン酸、グルコン酸、プロピオン酸、Ｌ−セリンまたはｎ−吉草酸を利用する菌株はない。１８：１ｗ９ｃが主要な脂肪酸であり、またＱ８が主要なキノンである。ＤＮＡ  Ｇ＋Ｃ含有量は、ＨＰＬＣで測定すると４３〜４４モル％である。基準株は、日本国八丈島沖日本海溝の深度６，０００ｍの海水から４℃で単離したＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６である。この菌株は、財団法人醗酵研究所に寄託されている（ＩＦＯ  １６２７０）。また、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ＮＩＢＨ  Ｐ２Ｋ６（ＩＦＯ  １６２７０）は工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１１年５月２１日付けで寄託された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１０６）。
なお、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓは、当初、本発明者らによりＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｕｓと命名されたが、その後、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに名称変更されて新種登録されている（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｔｒｅｎｃｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．
Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（２０００）８３５−８４６）。従って、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓが新種の微生物であることは、国際的に承認されている。
実施例３
作製プローブのデータベース検索結果
配列中２つまでのミスマッチを許す条件で、配列番号２の塩基配列をプローブ配列（「Ｐｓｙｐａｃ４６９−４８７」と命名する。）としてＲＤＰ‐ＤＢ（データベース）を検索したところ、Ｐｓｙｐａｃ４６９−４８７と一致するものは、該Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓを除き、現在種登録されている基準菌株（タイプスピーシズ）および明確な同定根拠が論文等に示されている菌株の中には存在しなかった。ただし、データベース中には、登録番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＡＦ０２５５５５（Ｐｉｎｈａｓｓら；３００ｂｐの部分配列；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａ）がミスマッチ０、Ｕ８５８７４（Ｂｏｗｍａｎｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３，３０６８−３０７８，１９９７；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、Ｕ８５８７６，Ｕ８５８７７，Ｕ８５８７８，Ｕ８５８７９（Ｂｏｗｍａｎｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３，３０６８−３０７８，１９９７；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａ）、Ｕ８５８８０（Ｂｏｗｍａｎｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６３，３０６８−３０７８，１９９７；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ）がミスマッチ１、Ｕ８５８７５（Ｂｏｗｍａｎｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３，３０６８−３０７８，１９９７；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ＡＦ０２５５７９（Ｐｉｎｎｈａｓｓｉら；４４２ｂｐの部分配列；表示はＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａｎｔ９）およびＡＦ０２５５７７（Ｐｉｎｎｈａｓｓｉら；５０１ｂｐの部分配列；表示はＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ａｎｔ７）がミスマッチ２として検出された。これらの配列データの元となった菌株の同定根拠は明確でなく、その中には該Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓが含まれている可能性が残されている。一方、見いだされた近似配列データの多くが南極域で得られた菌株からのものであることから、表示にあるように南極域での生息が既に確認されているＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびその近縁種に由来している可能性も否定できない。
以上の結果は、該Ｐｓｙｐａｃ４６９−４８７プローブの塩基配列が、既存菌株を網羅するＤＮＡデータベース上でＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種に相補性を示すのみで、本プローブが本二種の種特異的検出に極めて有効であることを示す。
実施例４
作製プローブのハイブリダイゼーション試験結果（１）
（１）微生物試料の調整
用いた微生物試料の属種株名は、表７に示した。この中で、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ菌株は、八丈島沖日本海溝の６０００ｍ深海水試料より４℃で培養可能な微生物として分離されたもので、表層海水中には全く見出されなかった（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２８，７０５−７１１，１９９７）。ＢａｃｉｌｌｕｓｍａｒｉｎｕｓはＭａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて好気条件下２０℃で、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃｕｓはＡＴＣＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ４番を用いて好気条件下３０℃で、培養した。これ以外の細菌は、１／２ＴＺ  液体培地（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．４９，３５３−３６７，１９９３）を用いて好気条件下１０〜２０℃で培養した。
培養された微生物は，最終濃度３％のパラフォルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定された。パラフォルムアルデヒドは、３ｘＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ：ＮａＣｌ：２４ｇ、ＫＣｌ：０．６ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．７２ｇ，ｐＨ７．４）中に１５％となるように予め溶解しておき，試料：パラフォルムアルデヒド＝４：１で混合して使用した。
（２）試料のＤＮＡプローブによる染色
この固定した微生物細胞を、あらかじめゼラチンを塗布した直径１１ｍｍの穴の開いたテフロンコートスライド上に吸着させ、エタノール脱水、または室温で一晩乾燥させた。その後、試料穴中にハイブリダイゼーション溶液（ＮａＣｌ：０．９Ｍ，リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）：５０ｍＭ，ＥＤＴＡ：５ｍＭ，ＳＤＳ：０．５％、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｆｉｎａｌｘ１０，Ｐｏｌｙ（Ａ）：１．０ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加した。上記のように調整したスライドグラスを、乾燥を防ぐために少量の３ｘＰＢＳを加えた５０ｍｌコニカルチューブ内に静置し、４２〜４５℃で３０分間のプレハイブリダイゼーションを行った。
５’末をＣｙ５，ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）またはＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）でラベル化した蛍光標識オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを作成し、上記ハイブリダイゼーション溶液にそれぞれのプローブを１ｎｇ／μｌとなるように添加し、４２〜４５℃で４時間半のハイブリダイゼーションを行った。未反応のオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡを除去するために、４４〜４５℃の洗浄溶液（ＮａＣｌ：０．９Ｍ，リン酸ナトリウム：０．５ｍＭ，ＳＤＳ：０．１％、ｐＨ＝７．０）中にスライドグラスを入れ，３０分間洗浄した。
用いたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブとしては、該Ｐｓｙｐａｃ４６９−４８７の他、ドメイン  Ｂａｃｔｅｒｉａ（旧称  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）の共通プローブであるＥｕｂ３３８−３５５（５’−ＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号８））やコントロール用のＣｏｎｔ（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ（配列番号９））を用いた。
（３）試料のＤＮＡ染色
ハイブリダイゼーション終了後，スライドグラスに終濃度５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液を加え、室温で１０分間反応させ、微生物細胞内に存在するＤＮＡの染色を行った。反応終了後、純水中にスライドグラスを浸し，１５分間洗浄した後、室温で乾燥した。
（４）試料の蛍光顕微鏡観察
乾燥させたスライドグラスの微生物試料上にＤＡＢＣＯ（ジアゾビシクロオプタン）溶液（１ｇ／１００ｍｌ（１０ｍｌ  ＰＢＳ＋９０ｍｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ））等の退色防止剤を加え，カバーグラスを載せ，油浸条件下で蛍光顕微鏡による観察を行った。必要に応じ、蛍光顕微鏡に取り付けた冷却ＣＣＤカメラで各々の色素に対する蛍光画像を取得し、画像を解析した。結果を表７に示す。
0003873112.tif 000008
以上の結果は、１〜２個のミスマッチを許す比較的穏和な条件でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌハイブリダイゼーションともいう）により、実際に作製したプローブがＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓおよびＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａに属する菌株に特異的に結合し、他の属種の菌株とは結合しないことを示す。
実施例５
作製プローブのハイブリダイゼーション試験結果（２）
（１）微生物試料の調整
用いた微生物試料の属種株名は、表８に示した。この中で、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ菌株は、八丈島沖日本海溝の６０００ｍ深海水試料より４℃で培養可能な微生物として分離されたもので、表層海水中には全く見出されなかった（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２８，７０５−７１１，１９９７）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｉｎｕｓはＭａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて好気条件下２０℃で、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃｕｓはＡＴＣＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ４番を用いて好気条件下３０℃で、培養した。これ以外の細菌は、１／２ＴＺ  液体培地（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．４９，３５３−３６７，１９９３）を用いて好気条件下１０〜２０℃で培養した。
培養された微生物は，最終濃度３％のパラフォルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定された。パラフォルムアルデヒドは、３ｘＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ＮａＣｌ：２４ｇ、ＫＣｌ：０．６ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．７２ｇ，ｐＨ７．４）中に１５％となるように予め溶解しておき，試料：パラフォルムアルデヒド＝４：１で混合して使用した。
（２）試料のＤＮＡプローブによる染色
この固定した微生物細胞を、あらかじめゼラチンを塗布した直径１１ｍｍの穴の開いたテフロンコートスライド上に吸着させ、エタノール脱水、または室温で一晩乾燥させた。その後、試料穴中にハイブリダイゼーション溶液（ＮａＣｌ：０．９Ｍ，リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）：５０ｍＭ，ＥＤＴＡ：５ｍＭ，ＳＤＳ：０．５％、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｆｉｎａｌｘ１０，Ｐｏｌｙ（Ａ）：１．０ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加した。上記のように調整したスライドグラスを、乾燥を防ぐために少量の３ｘＰＢＳを加えた５０ｍｌコニカルチューブ内に静置し、４６℃でプレハイブリダイゼーションを３０分間行った。
５’末をＣｙ５，ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）またはＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）でラベル化した蛍光標識オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを作成し、上記ハイブリダイゼーション溶液にそれぞれのプローブを１ｎｇ／μｌとなるように添加した。各々のオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの最適条件（下記参照）で４時間半ハイブリダイゼーションを行った。その後、未反応のオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡを除去するため、スライドグラスを洗浄溶液（ＮａＣｌ：０．９Ｍ，リン酸ナトリウム：０．５ｍＭ，ＳＤＳ：０．１％、ｐＨ＝７．０）中に入れ，４４℃で３０分間洗浄した。
用いたオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブとそのハイブリダイゼーション最適条件（括弧で示した）は、該Ｐｓｙｐａｃ４６９−４８７（３５％フォルムアミド溶液中４６℃）、ドメイン  Ｂａｃｔｅｒｉａ（旧称  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）の共通プローブである  Ｅｕｂａ  ３３８−３５５（５’−ＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ：配列番号８）（２０％フォルムアミド溶液中４６℃）、ユニバーサルプローブのＵｎｉｖ１３９０−１４０７（５’−ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡ：配列番号１０）（０％フォルムアミド溶液中４２℃）とした（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｎａｍｕｒａ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６，２２１１−２２１５，２０００）。また、非特異的吸着の有無を調べるため、コントロール用としてＣｏｎｔ（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ：配列番号９）（０％フォルムアミド溶液中４２℃）を用いた。
（３）試料のＤＮＡ染色
ハイブリダイゼーション終了後，スライドグラスに終濃度５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液を加え、室温で１０分間反応させ、微生物細胞内に存在するＤＮＡの染色を行った。反応終了後、純水中にスライドグラスを浸し，１５分間洗浄した後、室温で乾燥した。
（４）試料の蛍光顕微鏡観察
乾燥させたスライドグラスの微生物試料上にＤＡＢＣＯ（ジアゾビシクロオプタン）溶液（１ｇ／１００ｍｌ（１０ｍｌ  ＰＢＳ＋９０ｍｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ））等の退色防止剤を加え，カバーグラスを載せ，油浸条件下で蛍光顕微鏡による観察を行った。必要に応じ、蛍光顕微鏡に取り付けた冷却ＣＣＤカメラで各々の色素に対する蛍光画像を取得し、画像を解析した。結果を表８に示す。
0003873112.tif 000009
以上の結果は、１個のミスマッチをも許さない厳格な条件でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌハイブリダイゼーションともいう）により、実際に作製したプローブがＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓに属する菌株のみに特異的に結合し、他の属種の菌株とは結合しないことを示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明のオリゴヌクレオチドプローブにより、深層海水の循環を知る上で有用な指標生物としてのＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓを分子・細胞レベルで高感度、高精度に検出できる。深層海水の挙動解析やその影響評価のためには多数の微生物試料を扱う必要があるため、従来の培養法では洋上での煩雑な分離・培養操作および陸上での分類・同定作業に多大な労力と時間が必要であったが、既存のデータベースでその種特異性が確認された塩基配列からなる本発明のＤＮＡプローブを用いることにより、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌａｃｉｎｃｏｌａおよびこれらの近縁種の検出や同定、ならびにＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓの種特異的な検出や同定の迅速化、省力化を図ることができる。さらに、本発明の新規低温細菌Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｃｉｆｉｃｅｎｓｉｓにより、深層水や深海域の新規な指標生物が提供される。
【配列表】
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