(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させる能力を有する微生物あるいはその処理物をα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルに作用させ、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させるα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法であって、前記微生物が、ピリメリア（Ｐｉｌｉｍｅｌｉａ）属、又はベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属に属する菌株であり、微生物のα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させる能力を発現、あるいは増大させる誘導源としてイソバレロニトリルを用いることを特徴とするα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法に関する。
【０００２】
α−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸は、家畜、特に家禽の飼料に含硫アミノ酸類の不足を補う目的で添加される飼料添加物である。
【０００３】
【従来の技術と問題点】
α−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の工業的製法としてはα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの硫酸による加水分解法が知られている。しかし、硫酸を用いた方法は多量の硫安が副生しα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の回収と精製工程も複雑となる。
【０００４】
一方、最近、ニトリル化合物を微生物の作用により加水分解し対応する酸に変換するいくつかの方法が提案されており、α−ヒドロキシニトリルからのα−ヒドロキシ酸の製造方法に関しては例えば、パチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属またはプレビバクテリジウム属の微生物によるラクトニトリルおよびヒドロキシアセトニトリルからの対応する酸の生産［特公昭５８−１５１２０号公報参照］、トルロプシス属酵母による対応するα−ヒドロキシニトリルからの光学活性なＬ−α−ヒドロキシバレリアン酸およびＬ−α−ヒドロキシイソカプロン酸の生産［Fukuda Y.,et al.J.Ferment.Technol. 51 393(1973）参照］、コリネバクテリウム属の微生物を用いたグリコロニトリル、ラクトニトリルおよびアセトンシアンヒドリンの加水分解による対応するα−ヒドロキシ酸の生産  ［特開昭６１−５６０８６号公報参照］およびアルカリゲネス属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、コリネバクテリウム属、アシネトバクター属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属またはキャンデイ ダ属に属する微生物によるα−ヒドロキシニトリルからの光学活性なα−ヒドロキシ酸の生産［特開平２−８４１９８号公報参照］などが示されている。しかし、微生物を用いたα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製法に関する報告はカセオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、アースロバクター属の微生物［特開平４−４０８９８号公報参照］のみに示されている。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】
本発明者らはこのような従来の製造方法に対し、硫安の生成がなく、エネルギー的にも工業的に有利なα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法の開発を目的として、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルからα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を生産する能力を有する微生物の探索を広範囲に行った結果、ピリメリア（Ｐｉｌｉｍｅｌｉａ）属、及びベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属に属する微生物に目的とする変換活性を見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させる能力を有する微生物あるいはその処理物をα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルに作用させ、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させることを特徴とするα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法である。
【０００７】
本発明で使用する微生物は、ピリメリア（Ｐｉｌｉｍｅｌｉａ）属、又はベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属に属する菌株であればいずれも使用することが出来るが、具体的な例として例えば、ピリメリア  テレバサ（Ｐｉｌｉｍｅｌｉａ  ｔｅｒｅｖａｓａ）ＩＦＯ  １４５５６、ベイジェリンキア  インディカ  サブスピシーズ  インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｄｉｃａ）ＩＦＯ  ３７４４等を挙げることができる。さらに、本発明で使用可能な微生物は、
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、
アクチノマヅラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、
キタサトスポラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）属、
アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、
ロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、
クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、
アクチノポリスポラ（Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、
アクチノシンネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）属、
アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、
アミコラタ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属、
サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、
ノカルヂオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属、
プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、
ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、
ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、又は
ロドスピリリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属
に属する菌株であればいずれも使用することが出来るが、具体的な例として例えば、パントエア  アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｍｅｒａｎｓ）ＮＨ−３（ＦＥＲＭ−Ｐ１１３４９）、
アクチノマヅラ  クレメーラ  サブスピシーズ  クレメーラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｃｒｅｍｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｅａ）ＩＦＯ  １４１８２、
キタサトスポラ  セタエ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｅｔａｅ）ＩＦＯ１４２１６、
アクロモバクター  セロシス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｅｒｏｓｉｓ）ＩＦＯ  １２６６８、
セルロモナス  フラビジェナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ）ＩＦＯ  ３７５４、
クレブシェラ  フェナウモニエ  サブスピシーズ  フェナウモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＨ−３６（ＦＥＲＭ−Ｐ１１７３９）、
アクチノポリスポラ  ハロフィラ（Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ  １４１０６、
アクチノシンネマ  ミラム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）ＩＦＯ  １４０６４、
アクチノプラネス  ロバタス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｌｏｂａｔｕｓ）ＩＦＯ  １２５１３、
アミコラタ  アウトトロフィカ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）ＩＦＯ  １２７４３、
サッカロポリスポラ  レクチヴィルグラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｖｉｒｇｕｌａ）ＩＦＯ  １２１３４、
ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＩＦＯ  １３８０９、
ノカルヂオイデス  フラバス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）ＩＦＯ  １４３９６、
プロビデンシア  スタアルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）ＩＦＯ  １２９３０、
ミクロバクテリウム  ラクチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ  １４１３５、
ロドバクター  セフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  １２２０３、
ロドスピリリウム  ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）ＩＦＯ  ３９８６等を挙げることができる。
本発明は、上記微生物の変異株を用いることもできる。これらは公知の微生物であり、発酵研究所（ＩＦＯ）、工業技術院微生物工業技術研究所から容易に入手することができる。
【０００８】
次に本発明の一般的実施態様について説明する。本発明に使用される微生物の培地としては、通常資化し得るグリコース、グリセロール等の炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素源、塩化マグネシウム、塩化第二鉄などの無機栄養素を含有する培地か、これらの培地に酵母エキス、肉エキスなどの天然培地を添加したものを用いることができる。誘導源として各々の微生物に適したイソバレロニトリル、イソブチロニトリル、ベンゾニトリルなどのニトリル化合物、またはアセトアミド、プロピオアミドなどのアミド化合物等を用いることもある。
【０００９】
培養条件は、微生物が生育する条件であれば良いが、例えばｐＨ２〜１２、温度５〜５０℃の範囲が望ましく、更に好ましくは好気性条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜５０℃の範囲で選べばよく、培養日数は数時間から１０日程の範囲で活性が最大となるまで培養すればよい。
【００１０】
反応方法は液体培地または平板培地上にて培養した菌体を採取し、必要に応じ固定化菌体、粗酵素、固定化酵素などの菌体処理物を調製し、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルなどの適当な溶媒に溶かしたα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルと水、緩衝液などとの二相系による反応、またはα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶かして直接菌体または菌体処理物の懸濁液中に混合して行うことができる。
【００１１】
反応条件としては、菌体使用量０．０１〜７０重量％、α−ヒドロキシ−４−メチルチオニトリル濃度０．１〜８０重量％で基質は反応媒体中で完全に溶解しなくてもよい。反応温度は反応が進行する温度であればよいが１〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、反応ｐＨは３〜１２、好ましくは６〜１０で５分から１００時間程度反応させればよい。かくしてα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルは、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロ酪酸に変換、蓄積される。
【００１２】
生成物の単離は濃縮、イオン交換、電気透析、抽出、晶析などの公知の方法を利用して行うことができる。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によれば、α−ヒドロキシ−４−メチルチオニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロ酪酸に変換する能力を有する微生物を用いることにより、常温、常圧という温和な条件下で反応を進行させ、副生物として硫安を生成しないα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の工業的に有利な製法を提供することができる。
【００１４】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例１】
（Ａ）培養
表１に示す菌体を下記により培養した。
【００１６】
0003976355.tif 000002
さらに、誘導剤としてイソバレロニトリル0.2 ％を添加した。
【００１７】
２）培養条件
斜面培地から１白金耳の菌体を採り、上記液体培地６ｍｌ／２１ｍｍ試験管に接種し、３０℃で４８時間好気条件下に振盪培養した。
【００１８】
（Ｂ）反応
液体培地から菌体を遠心分離により集菌して各々の菌体を０．０５リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。菌体を1.5 ｍｌの同様の緩衝液に再懸濁し終濃度５０ｍＭのα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを添加し３０℃で２４時間、振盪しながら反応を行った。反応終了後、各々の反応液を遠心分離し菌体を除去し、遠心上清中のα−ヒドロキシ酸は液体クロマトグラフィー（カラム；UNISIL-PAC 5C18-250A、キャリア；０．１％リン酸：アセトニトリル＝９：１、カラム温度；４０℃、検出；２１０ｎｍ）により定量した。
【００１９】
結果を表１に示した。
【００２０】
【表１】
0003976355.tif 000003