(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換を容易にするリポスペルミンまたはリポスペルミジンと複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡを含む、粘膜免疫応答を誘導するのに有効な量で患者の粘膜に投与される、患者に粘膜免疫応答を誘導するための組成物。
【請求項２】
粘膜投与が鼻である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
粘膜投与が経口である請求項１記載の組成物。
【請求項４】
粘膜投与が直腸である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
粘膜投与が膣である請求項１記載の組成物。
【請求項６】
リポスペルミンがジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１〜５いずれか記載の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡが病原体のエンベロープ抗原をコードする請求項１〜６いずれか記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、粘膜免疫に関する。具体的には、本発明は、患者の粘膜にリポスペルミンと複合体を形成させたＤＮＡを投与することにより患者における粘膜免疫応答を誘導する方法に関する。
背景技術
粘膜表面は、通常、再感染に対して長期的保護を提供する持続的粘膜免疫を伴う大抵の全身性病原体の主要進入経路の代表である（２５）。Ｓａｂｉｎ経口ポリオワクチンにより産生される長寿命免疫対Ｓａｌｋ非経口ワクチンにより提供される比較的短期間の保護（４８）および改良された安全面を伴う単回投与の経口コレラワクチン対古くからの多数回投与の非経口コレラワクチン（２７）という例が挙げられる。感染に対する最良の長期粘膜および全身性保護は、固有の宿主感染を刺激するが病気を誘導できない生の弱毒化病原体により提供される（２８）。クローン化した微生物で弱毒化変異を生じさせる現行の能力に係わらず、毒性または宿主毒性決定要因への復帰可能性についての懸念は、事実上ヒトへの使用のための粘膜免疫誘導剤としての生の弱毒化病原体の開発を阻害してきた（２９）。
例えば、１９９４年１１月のＮＩＨ主催のＨＩＶワクチンミーティングの最近のミーティングにおいて、ワクチン投与を受けていた新生レサス属アカゲザルにおいて、弱毒化ＳＩＶ（即ち、Ｎｅｆの欠失）がＡＩＤＳの発生原因であったことを報告したルス  ルプレヒト（Ruth Ruprecht）（２９）により、弱毒生ウイルスワクチンの提案者は打撃を受けた。弱毒化ＨＩＶは、ＨＩＶワクチンとしてＦＤＡの認可を将来的にも受けられそうにない。
世界保健機構（ＷＨＯ）は、２０００年までに少なくとも４０００万の人がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染するであろうと見積もっている。ウイルスの残忍さおよび進行性の病原性により、感染者の大部分が１０年以内に死ぬであろう。さらに、２１世紀に入った時には１０００万の死者になると見積もっている。ワクチン開発のための産業上の初期の多大な努力にも係わらず、商業上の開発者はほとんど残っていない。最近、ＡＩＤＳ  Research Advisory Program Committee（ＡＲＡＣ）が、２つの先導的サブユニットワクチン候補のフェーズIII臨床試験において続行しないという票決をした際に、ＮＩＨの国立ＨＩＶ  Ｖａｃｃｉｎｅは厳しい打撃を受けた。
ＨＩＶワクチンの開発のための現努力に伴う別の困難さは、ＨＩＶに対する粘膜免疫応答発生における研究不足である。疫学的データにより、すべてのＡＩＤＳのケースの７０〜８０％がＨＩＶの異性間伝染の結果であることを明らかに示している（３０〜３８）。男性よりも女性の方がＨＩＶによる有意に大きな感染リスクを負っているというアメリカ合衆国において、異性間伝染は、伝染の最も速い増大ルートである（３９、４０）。ＨＩＶの９０％が性的に世界中に伝染するので、全身性免疫は進入の粘膜部位での初期感染を阻害しそうにない。ランゲルハウス細胞、粘膜マクロファージ、Ｔ細胞および生殖管の精液中のＨＩＶ関連もしくはＨＩＶフリー細胞由来の上皮細胞の感染は、ＨＩＶ感染に対するワクチンの開発において、粘膜応答の誘導が全身性応答と少なくとも同じくらい重要であるという強力な論点である（３５〜３７、４１）。全身性免疫はめったに粘膜免疫を誘導しないけれども、粘膜免疫は同様にしばしば全身性免疫を提供する（３６、４１、４２、４３、４４、４５、４６）。ＨＩＶ伝染に対する一次防御を確立する際に、この鍵となる要素に対して一層の努力を捧げることが必須である。生きた弱毒ウイルスを用いる明確な危険性を伴い、粘膜免疫を誘導する見込みは困難である。
ワクチン研究の最近の開発としては、インフルエンザウイルス核蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する細菌のプラスミドを用いるマウスの筋肉の形質転換が、致死的ウイルスのチャレンジからマウスを保護する体液性応答および細胞性応答という結果を生じたという証拠を含む（１）。遺伝的免疫を獲得するための２つのインビボ形質転換方法が、すでに報告されている。より通常のアプローチにより、マウスの筋肉は裸のＤＮＡでの形質転換にとってユニークな標的であり（３）、種々の種の筋肉が特に裸のＤＮＡで形質転換されやすい（４〜１１）という発見を伴う。インフルエンザＡウイルスによるマウスの致死的チャレンジに対する保護ならびにインフルエンザＡウイルス（１、１３〜１５）およびＨＩＶ（１６、１７）に対する細胞傷害性リンパ球および中和抗体の誘導、その後の遺伝的ＩＭ免疫化は、多くの研究者により報告されている。保護免疫応答の印象的な誘導にも係わらず、この方法は、比較的大量のＤＮＡを必要とする不利な点を有する。今日まで有毒な副作用として報告されていないけれども、この大量のＤＮＡの必要性は、ＤＮＡそれ自体への抗体応答の可能性および自立性狼瘡様症候群の発生によりこの方法を制限するかもしれない。ボリスティック（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換を用いる遺伝的免疫へのより通常でないアプローチは、ＤＮＡ量の問題を克服するが、広範に利用できない機器を必要とする。具体的には、金またはタングステン粒子と複合体を形成したナノグラム量のＤＮＡを、微小弾丸砲撃により原形質膜を通して物理的に推進させる。両方法は、細胞性応答（２１、２２）および体液性応答（２２〜２４）を誘導する。しかし、前記遺伝性免疫のいずれの方法も粘膜免疫を誘導しない。
効果的な免疫戦略のための粘膜免疫の重要性にも係わらず、粘膜免疫を誘導するＦＤＡが唯一認可したワクチンは、Ｓａｂｉｎ生弱毒化経口ポリオワクチンである。ごく最近、粘膜免疫発生における別の開発は、通常の蛋白質抗原を用いる活性化ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシカルシフェロール〔１，２５（ＯＨ）2Ｄ３〕）の全身投与により、全身応答から粘膜応答へ変換することを示唆した（２）。従って、当該技術分野は、粘膜免疫応答を誘導する方法を活発に求めている。
本発明は、抗原に対するＤＮＡ配列を有する細菌のプラスミドを用いて粘膜の形質転換を促進することにより、病原体の抗原に対するインビボ粘膜免疫応答を誘導する方法を提供することにより、ワクチンの製造において非常に重要な要求を満たす。
発明の概要
本発明は、形質転換を容易にするリポスペルミンまたはリポスペルミジンと複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な所定量を患者の粘膜に投与することからなる、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡは、感染進行の間、感染細胞の表面に発現する抗原をコードすることができる。本発明の方法は粘膜細胞表面での抗原の発現が、天然の感染と似ているすべての粘膜要求性病原体に適用するべきである。ウイルス病原体のエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の方法において使用される合理的な選択である。
リポスペルミンおよびリポスペルミジンは、イオン荷電複合体を形成するＤＮＡ鎖のリン酸の酸素と３個以上のアミドの水素との配位が存在するカチオン基と共有結合した１個以上の疎水性鎖からなる二元機能性分子である。リポスペルミンの１つの好ましい例は、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。ジオタデシルアミドグリシルスペルミジンは、ＤＯＧＳと同様の構造を有するが、２個の非必須カチオン荷電を有する２個のアームの１個を欠失しているので、別の有望な候補である。
また、本発明は、リポスペルミンと複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物を提供する。より具体的には、本発明は、リポスペルミンと複合体を形成した、ＨＩＶのエンベロープ抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物を提供する。
図面の説明
図１は、５’および３’ＬＴＲ間のＨＩＶｅｎｖ挿入物を示すｐＨｅｎｖの環状地図を示す。この構築物では、Ｒｅｖは機能を有する。
図２は、ＨＩＶ−１NL4-3のＲＲＥおよびサイレント突然変異を生じるように設計した突然変異部位の図である。
［発明の詳細な説明］
本発明は、形質転換を容易にするリポスペルミンまたはリポスペルミジンと複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な量を患者の粘膜に投与することからなる、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。
抗原をコードするＤＮＡによりコードされる病原体抗原の発現が、細胞表面での病原体抗原の曝露という結果を生じ、病原体の複製サイクルの一部または病原体の細胞表面への最初の付着のいずれかに似ているので、本発明は、一般の病原体に対して適用できる。ウイルス病原体の例としては、特に、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ＲＳウイルス）、ピコルナウイルス（コクサッキーウイルス、ライノウイルス）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス）、ブニアウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルス）、フラビウイルス（デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、チクングニヤウイルス）およびコロナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌病原体の例としては、下記属の種が挙げられるが、これらに限定されない：特に、サルモネラ、赤痢菌、クラミジア、ヘリコバクター、エルシニア、ボルデテラ、シュードモナス、ナイセリア、ビブリオおよびヘモフィルス。
抗原をコードするＤＮＡ
粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡとは、感染進行中、感染細胞の表面に発現する抗原をコードできる。本発明の方法は、粘膜細胞の表面上の抗原の発現が天然の感染に似ているすべての粘膜要求性病原体に適用するべきである。細菌に対する初期免疫応答が、比較的少数の細胞表面抗原に対して存在するので、細菌性病原体の抗原をコードするＤＮＡを選択する工程は、同様に慣例的である。例えば、主な細菌免疫原は、表面構造上のエピトープである（１９１）。事実であると予想されるウイルス抗原の多くの例がある。他の微生物病原体抗原はこの特徴を共有すると予想される。本明細書で用いる場合、抗原は、免疫応答を引き出す分子である。
ウイルス病原体のエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、ｇｐ１６０ＨＩＶまたはその切断派生蛋白質であるｇｐ４１およびｇｐ１２０）は、本発明の方法において使用するための合理的な選択である。感染細胞の細胞表面上での提示により、ｇｐ１７等のエンベロープ関連蛋白質も正当な選択である。本発明の方法において有効な抗原のサブセットを定義する正当な用語は、「エンベロープおよびエンベロープ関連蛋白質」である。患者の免疫応答を引き出すこれらの蛋白質の特異的なエピトープは、エピトープマッピングおよび構造依存性分析等の慣例的な方法により選択できる。特に、中和抗体を引き出すエピトープが本発明の方法の重要な基礎である。これらの抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知のおよびさらに下記記載のクローニングおよび合成方法により得ることができる。
例えば、抗原をコードするＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス抗原をコードすることができる。より具体的な例として、抗原をコードするＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質をコードすることができる。エンベロープ抗原が、抗体および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬｓ）の主要誘導剤であると予想されるけれども、ＨＩＶのｇａｇ（すなわち、中間抗原）に対するＣＴＬｓの文献の証拠がある。好ましい抗原をコードするＤＮＡは、別々に発現したｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１（すなわち、ｇｐ１６０は、通常宿主のプロテアーゼにより切断されてｇｐ１２０およびｇｐ４１となる）を含む。ミリスチル化結合によりエンベロープに付着しているｇａｇ蛋白質の１つであり、ミリスチル化部位の近傍の中和抗体エピトープに関する文献の証拠があるｇｐ１７をコードするＤＮＡも含むことができる。抗原をコードするＤＮＡは、エンベロープの抗原断片およびエンベロープ関連蛋白質をコードすることができ、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質遺伝子のＶ３ループが挙げられる。
抗原をコードするＤＮＡは、開始コドン、停止コドンおよび膜アンカーを有することが必要である。従って、これらが存在しない場合または本発明の方法を最適化するために、抗原をコードするＤＮＡの配列を、１以上の方法で突然変異させ、発現する抗原の抗原性を保ったり高めたりすることが予想される。例えば、ｇｐ１６０切断部位の変異を、該蛋白質を未切断の状態に保つように行なうことができる。ｇｐ１２０に対して停止シグナルならびに膜アンカーを生じさせなければならない。また、実施例で詳細に記載されるように、ＨＩＶおよびＲＳＶ両方に対してｇｐ４１の公知の抗体促進ドメインを除去する。ウイルス単離物で見出された主な準種（quasispecies）を反映するように、エンベロープ糖蛋白質のＶ３領域の多くのバージョンを作製することができる。次いで、単一に転写されるＯＲＦをそれぞれ含む多数の遺伝子構築物の型でまたは複数に転写されるＯＲＦをそれぞれ含む１個もしくは数個の遺伝子構築物の型で、これらを投与することができる。この性質の遺伝子工学的操作は、当該技術分野において公知であり（１８８）、具体例が実施例に記載されている。
要約すると、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐ−Ａｌｔｅｒ−１キットを用いて、突然変異を導入し、このことは、所望の突然変異を選択するための抗生物質による選択を取り込むものである。所望の突然変異の確実な作製のためのｓｓＤＮＡ鋳型手法を用いることが必要である。キットのプロトコールから厳密に変えたことは、本発明者自身のヘルパーファージｓｓＤＮＡの作製である。Ｂｉｏｌａｂｓ社製のｓｓファージＤＮＡ単離キットおよび手法を用いて、精製ｓｓＤＮＡを調製する。別の厳密な変化は、形質転換のためのキットに添付されていたＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ  大腸菌をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のＸＬ  ｍｕｔＳ  大腸菌に替えたことである。ｍｕｔＳ変異を受けて作製されたＤＨ５α  大腸菌も好適に使用された。後者は、修復酵素を欠いている。前記方法の成分は、通常、他の抗原をコードするＤＮＡに適用される。
例えば、真核細胞形質転換および細胞表面上の抗原発現のためのＨＩＶエンベロープを含むプラスミドに取り込まれると予想される遺伝子工学の例としては、以下に挙げられる：１）ＨＩＶ  ＬＴＲの制御要素の除去およびＣＭＶ等のより強力なプロモーター支配下の置換、２）ｇｐ１２０が膜アンカーｇｐ４１から解離しないようにｇｐ１６０プロテアーゼ切断部位の除去、３）ｇｐ４１の５’末端に存在し、産物のアミノ酸配列に何の変化も生じないサイレント突然変異を導入することにより広範な二次構造を直鎖状構造へと形成するＲＰＥの変換および４）この許容力を破壊する点突然変異または欠失突然変異による初期促進ドメインの除去。これらの突然変異の例を、さらに実施例に記載する。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質に対して特異的変異が与えられるけれども、効率的な免疫構築物の作製に対する同じ考慮を、異なる抗原をコードするＤＮＡを用いる構築物の作製に適用することが理解される。
本発明の方法に用いられるベクターは、抗原をコードするＤＮＡに関連するプロモーターおよび制御配列を含むことができる。具体的には、ベクターは、大腸菌で複製可能な真核生物ベクターでなければならない。好ましいベクターは、微生物の複製起点、抗生物質耐性選択遺伝子、真核生物プロモーターおよびポリアデニル化遺伝子を含む。実施例で明らかに示すように、当業者により、前記特徴のすべてを共有しないが、形質転換は可能である他のベクターを設計することができる。
リポスペルミン／リポスペルミジン
本発明の方法に用いられる形質転換が容易なリポスペルミンおよびリポスペルミジンは、イオン荷電複合体を形成するＤＮＡ鎖のリン酸の酸素と３個以上のアミドの水素との配位が存在するカチオン基と共有結合した１個以上の疎水性鎖からなる二元機能性分子である。形質転換を容易にするために、リポスペルミン／リポスペルミジンが両方ともＤＮＡを保護して、形質転換対象細胞の細胞膜に対してより疎水性らしくすることが可能である。例えば、ＤＮＡの主溝または小溝に沿って疎水性アームに位置する電荷相互作用（実施例参照）は、高度に荷電したＤＮＡ巨大分子に対して疎水性の覆いを提供し、細胞の原形質膜の疎水性成分とＤＮＡを覆う疎水性表面との会合により細胞への進入を容易ならしめる。ＤＯＧＳを用いる分子モデルに基づき、ペプチド結合のアミノ基の水素および隣接アミド基の水素すべてが１つのリン酸の酸素に配位（すなわち、１．９１〜２．０Åの距離）しているようである。他の２つのアミド基の水素は用いられない。従って、複合体形成剤の構築におけるスペルミジンの使用は、より効果的でであろう。
リポスペルミンの１つの好ましい例は、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。ジオタデシルアミドグリシルスペルミジンは、ＤＯＧＳと同様の構造を有するが、２個の非必須カチオン荷電を有する２個のアームの１個を欠失しているので、別の有望な候補である。さらに、８〜２０個の炭素数の疎水鎖を有するリポスペルミンまたはリポスペルミジンも同様に、ＤＮＡの主溝および小溝と相互作用することが予想される。あまり好ましくはないけれど、リポスペルミンまたはリポスペルミジンは、一本鎖の疎水性側鎖（例えば、モノオクチル、モノオクタデシル、モノドデシル等）を有してもよい。
リポスペルミン対ＤＮＡの好ましいモルカチオン比は、約５：１である。または、約２〜約１０の範囲のモルカチオン比で、リポスペルミンはＤＮＡとの複合体を形成することができる。リポスペルミン／リポスペルミジンおよびＤＮＡ間のイオン相互作用は、コードされる抗原に係わらず同じであるので、ＤＮＡ−リポスペルミン／リポスペルミジン複合体形成に関する本発明の教訓は、本発明の抗原をコードするＤＮＡに適用できる。
従って、本発明は、リポスペルミンと複合体を形成する病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物も提供する。より具体的には、本発明は、リポスペルミンと複合体を形成するＨＩＶのエンベロープ抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物を提供する。プラスミドにおけるＤＮＡは、実施例に記載されている。前記したように、本発明の抗原をコードするＤＮＡは、感染の間、宿主細胞の表面または病原体の表面に存在し、宿主免疫系に曝露されたいかなる抗原もコードすることができる。かかる抗原の例としては、ウイルス学の教科書に記載されている（例えば、Fundamental Virology, 2nd. Ed., pp373-375（１８９）を参照）。
粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡを、複合体形成分子の助けなしで投与することもできる。例えば、実施例に記載のように活性型ビタミンＤ３とともに、ＤＮＡをボリスティックに投与することができる。要約すると、ＤＮＡを金粒子と複合体を形成させ、ヘリウム推進器を用いて原形質膜から推進させることにより、皮膚細胞に送達させる。活性型ビタミンＤ３を、裸のＤＮＡを含む金懸濁物中に包含させることにより同じ細胞に送達したり、同じ手段により該細胞内に推進させることができる。または、活性型ビタミンＤ３を、ジメチルスルフォキシド等の溶媒担体で局所適用することにより、形質転換皮膚細胞に送達することができる。このような手段において、粘膜免疫を誘導する可能性という見地から、皮膚は粘膜代用物として作用することができる。
粘膜免疫系
重要な間接的証拠により、共通の粘膜免疫系の存在が示唆される（４７、５０）。気管支関連リンパ組織における粘膜免疫誘導は、通常、腸関連リンパ組織における免疫の証拠を生じる。共通の要素は、種々の型の粘膜関連リンパ組織に対する親和性を有する移動性ＩｇＡ分泌プラズマ細胞の産生である。
上皮細胞を通して粘膜表面へのＪ鎖を含む重合ＩｇＡ（ｐＩｇＡ）の選択的輸送の機構は、決定されている。要約すると、上皮下プラズマ細胞に会合した、Ｊ鎖の関与を有する単体ＩｇＡ由来のｐＩｇＡは、分泌成分（ＳＣ）の膜型と相互作用する。ｐＩｇＡ−ＳＣ複合体は、先端膜と融合した内質小胞内にインターナリゼーションし、そして、Ｓ−ＩｇＡは、外分泌に放出される。参考文献４２を参照。
粘膜免疫化後、粘膜表面にＩｇＧが見出されるけれども、ＩｇＡは粘膜免疫において優位なＩｇである。このことは、ｐＩｇＡに対する最大の親和性を有するＩｇ受容体の存在に対して二次的である。この受容体は、粘膜上皮細胞の表面で発現しており、粘膜上皮細胞を通して粘膜表面にｐＩｇＡを能動輸送する（４７〜４９）。
粘膜投与
粘膜免疫を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡを患者の粘膜に投与する。従って、粘膜投与の具体例としては、鼻、経口、直腸および膣が挙げられる。鼻への投与は、十分実施された方法の中でも、鼻エアロゾル噴霧（実施例参照）またはネブライザーにより行なわれる。直腸および膣投与は、洗浄（圧注、浣腸等）、坐剤、クリーム、ゲル等を含む種々の方法により行なうことができる。鼻への投与に対しては、エアロゾル噴霧またはネブライザーを用いることができる。
予定された投与様式に依存して、本発明の化合物を、例えば、錠剤、坐剤、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁物、ローション、クリーム、ゲル等の固体、半固体または液体の調剤型で、好ましくは正確な調剤の１回の投与に好適な単位調剤型で医薬組成物に存在させることができる。前記したように、組成物は有効量のＤＮＡを含み、さらに他の医学剤、薬学剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含んでもよい。「薬学的に許容され得る」とは、生物学的ではなくそうでなければ好ましくない材料、すなわち、それが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれともいかなる好ましくない生物学的効果を生じさせることなく、または有害な方法で相互作用することなく、選択化合物とともに個体に投与してもよい材料を意味する。
経口投与に対しては、微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤および／または界面活性剤を含んでもよく、水もしくはシロップ状で、乾燥状態でカプセルもしくは香料袋（sachest）で、または非水溶液状もしくは懸濁剤が含まれる懸濁物状で、結合剤および潤滑剤を含んでもよい錠剤型で、または水もしくはシロップ中で懸濁状で存在してもよい。所望もしくは必要な場合、香料、保存料、懸濁剤、濃縮剤または乳化剤を含んでもよい。錠剤および顆粒は、好ましい経口投与型であり、これらは被覆されてもよい。かかる投与型を調製する実際の方法は公知であり、または、当業者にとって明らかであろう、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（１９０）を参照。
本発明の方法において、ＤＮＡをリポスペルミンと複合体を形成させ、１回の初回ワクチンとして患者に投与し、３週間〜３ヵ月の間隔で１回以上のブースターを行なう。この投与養生法の日常的最適化は、日常的最適化手順を用いて行なうことができる。
必要なＤＮＡの正確な量は、年齢、体重および患者の総合状態、用いる特定の処方、投与様式等に依存して患者間で変化する。従って、正確な量を特定することは不可能である。しかし、本明細書での教訓を示す日常的実験のみを用いて、当該技術分野において通常の知識を有する者により、適当な量を決定してもよい。従って、投与するＤＮＡ量は、いかなる有効量であってもよい。ヒト細胞はマウス細胞よりも形質転換しやすいかしにくいかを予想する理由は何もないので、ヒト免疫用量対マウス用量においてほとんど違いはない。具体的には、効果的な形質転換のための必要なＤＮＡの好ましい量は、約１０ｎｇ〜１０μｇである。ヒトおよびマウス間形質転換効率の変化は、用量の日常的調整により調節することができる。例えば、該量は、１．０ｎｇ〜１ｍｇの範囲とすることができる。１０μｇを超えるＤＮＡはいずれも、論理上取扱いが困難になり、毒性の危険が増大し実行不可能である。
以下の実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。記載されたプロコールは、ＨＩＶの免疫化という面において適用されるけれども、共有する粘膜免疫機構の力により他の病原体にも応用できる。記載されたプロコールは、用いられる具体的な物であるけれども、代わりに当業者に公知の他の手法を用いてもよい。
実施例
遺伝的免疫化
宿主の保護免疫応答に必須のウイルス蛋白質をコードする非複製、転写／翻訳−許容性ウイルスＤＮＡの形質転換によるウイルス複製を刺激する能力は、毒性復帰の可能性なしで弱毒生ワクチンの有利性を提供する。
遺伝的免疫化は、ワクチン分野にとって、ユニークな有利性を提供する。ＤＮＡは、調製および操作が容易である。真核細胞由来のプロモーター、シグナル配列および疎水性アンカーの多様性は、免疫応答を最大化するために構築することができる。有利な部位特異的突然変異は、比較的達成することが容易である。多集団ワクチン接種の間、現場では、ＤＮＡは安定であり、冷蔵を要しない。遺伝的免疫化は、弱毒微生物と同様に、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を産生する。しかし、ＨＩＶワクチンに対して最も重要な有利性は、１回の遺伝的免疫化で多数の配列多様性をもつ比較的容易な処方であり、配列のそれぞれが、保護応答の広いレパートリーの開発を伴い、通常細胞表面で発現する。主な不利な点は、比較的大量のＤＮＡを必要とすることである。
ＨＩＶ表現型の発現
ＨＩＶ−１による自然宿主の初期感染は、様々な臨床経過を生じる（１７７）。大半の場合（５０〜７０％）、１〜２週間続くウイルス血症を伴う倦怠感および熱の急性臨床症候群が、曝露後約２〜４週間に起こる（１６３〜１６４）。少数の患者では、この感染の急性相は不顕性である。時折、初期感染が非常に迅速にＡＩＤＳに進行することがある（６５）けれども、大抵の患者は、１ないし１０年以上の後、その後の様々なＡＩＤＳへの進行を伴う無症候相に入る（１６６）。この初期ウイルス血症相を、初期感染ウイルス遺伝型に対する効果的な免疫応答により制御できるであろう（１７１）。初期ウイルス血症相が宿主防御機構により初期に制御されるなら、初期の効果的な体液性および細胞性防御機構を超えて遂に優位性を獲得するのかという疑問が残る。
ＨＩＶの著しい特徴の１つは、特に、ウイルスエンベロープ糖蛋白質のｇｐ１２０およびｇｐ４１における突然変異性である。ＨＩＶにおける高い突然変異率は、ウイルスの７０Ｓ  ｓｓＲＮＡのｄｓプロウイルスＤＮＡへの変換における逆転写酵素による高エラー率の機能であると信じられている（ウイルスコピー当たり２個のエラーと概算される）。この高い突然変異率は、高度のＨＩＶ感染の個体間多様性を一部説明できる表現型発現変異型の能力を示唆する。
データの優位性により、ＨＩＶ−１によるほとんどの初期感染は、疾病の進行とともに高頻度で見出される合胞体誘導（ＳＩ）表現型に対して、非合胞体誘導（ＮＳＩ）表現型（すなわち、単細胞向性ウイルスは、同種異系の初期共培養またはＴ細胞誘導細胞において、合胞体を形成できない）を有する（１６３〜１７０）ことが示される。Ｈｏおよびその共同実験者（１７１）は、５名のセロコンバーターおよび２名の性パートナーのＰＢＭＣｓ由来のクローン化ＰＣＲ増幅ＤＮＡを用いて、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｎｅｆおよびｐ１７の特異的配列を注意深く調べた。予想されたように、最近のセロコンバーターからは、伝染者ではマイナーな種に相当する顕著なＨＩＶ配列同質性があったが、ＨＩＶ伝染者は実質的なＨＩＶ配列異質性を示した。驚くべきことにｇｐ１２０は、最大の配列同質性を示した（＞９９％類似性）。これらのデータは多数の研究で再現性があることを必要とするけれども、それらは、ＨＩＶ感染は、少なくとも性間伝染に対して以前に考えられていたよりもずっと大きく配列限定されていることを示唆する。第２に、疾病進行の間遺伝的変異性源としてＨＩＶの二次感染が排除されないけれども、後天性遺伝的変化の表現型発現は、少なくとも一部はＨＩＶ疾病の多様な臨床的進行に対して応答可能である。
後天性遺伝的変化の１つの発現は、ＮＳＩ変異体、ＳＩに対する単細胞向性変異体、Ｔ細胞株許容変異体由来の初期ＨＩＶ−１単離物の変化（すなわち、実質的にすべての単離物はＰＢＭＣｓで複製可能であるが、ＳＩ単離物のみがＴ細胞株で複製する）である。この機能的（ＮＳＩ対ＳＩ）トロピズム（単細胞向性対Ｔ細胞株許容性）に関する初期決定因子は、ウイルス表面上で十分曝露されたＨＩＶ−１の糖蛋白質であるｇｐ１２０の第３の可変領域（Ｖ３ループ）である（１７２）。Ｖ３ループは、その配列の中ほどに保存された４分子のＧＰＧＲモチーフを有する３４〜３７アミノ酸からなるジスルフィド結合したポリペプチドである（１７３）。配列の残りの部分は、高可変性であり、ｇｐ１２０の融合領域として単離された（５５）。別の研究グループ（１７５、１７６）は、いくつかのセリンプロテアーゼにより還元切断されたＶ３ループのアミノ酸の変化が、ＨＩＶ−１エンベロープ配列を発現するウイルス組み換えワクシニアウイルスにおいてＮＳＩの機能的表現型を与えることを示した。ＳＩ対ＮＳＩの機能的表現型を決定するこれらのＶ３ループのアミノ酸の変化を、表１に示す。
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表１．  ＨＩＶ表現型合胞体発現およびＶ３ループのアミノ酸配列の関係a
ＨＩＶに対する機能的免疫応答
ＨＩＶワクチンの設計を考慮してしばしば却下される重要な概念は、ウイルスまたはそのエンベロープ成分により保護および逆免疫応答の両方が引き起され得るということである。
１．ＨＩＶの中和
過去５年以上にわたって、ｐ１７ｇａｇ蛋白質内の１つ（５１）およびｇｐ１６０エンベロープ蛋白質内の多数を含むたくさんのＨＩＶ−中和エピトープ（抗体により結合され得る最小の数のアミノ酸残基として定義されるエピトープ、直鎖状または立体的のいずれか）またはドメイン（エピトープのクラスターを含む領域）が単離された。これらのドメインを、単離された特異的配列（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベースに従って数字を示したペプチド内のアミノ酸残基（５２）０、中和応答の特異性、ドメインの相対的免疫原性およびＣＤ４受容体結合を阻害する際のこれらの抗体の役割について表２に要約する。合成ペプチドを動物に免疫し、インビトロでＨＩＶ−１を中和する能力について超免疫血清を試験することにより、いくつかのドメインが同定された。この方法により、ｇｐ１２０内の残基２４７〜２６７（５３）、２９６〜３３１（５４〜５９）、４５１〜４７７（５４）および４９６〜５２５（６０）ならびにｇｐ４１内の残基５９３〜６０４（６１）、６０９〜６２５（５４）および７２１〜７４５（５４、６０、６２）すべてが、実験動物においてＨＩＶ−中和抗体の産生を刺激することが報告されている。しかし、これらのいくつかのペプチドは、１：４または１：８の力価でＨＩＶ−１を中和することができる抗体しか刺激しないので（５４）、研究者は、何が有意な中和応答の構成成分となるかを決定することに関して、いくらかの困難性を持っていた。同様に、ＣＤ４受容体と結合するｇｐ１２０に対する抗体効果もかなり興味深い。しかし、２つのドメインだけ実験を行なった。第２の保存ドメイン（表２のドメイン１）に対する抗体は、結合に関して何の効果もなかった（５３）が、認識されたＣＤ４受容体結合ドメインに対する抗体は、結合を効果的に阻害する（６３）。
ＨＩＶ感染者およびＨＩＶ感染チンパンジー由来の血清中のＨＩＶを中和する抗体の存在を確認する証拠も存在する。非常に多くの報告は、Ｖ３ループ（残基２９６〜３３１）に対する抗体に関する（５７、５８、６４、６５）。これらの抗体は、ＨＩＶ−１に対する型特異的中和応答を招くことを示した。型特異的抗体は、１つの株（すなわち、ＨＩＶIIIB、ＨＩＶMN、ＨＩＶRF等）を中和するが、群特異的抗体は、１以上の株を中和する。領域は超可変性であるが、残基３１１〜３１５に高度に保存されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列を含む（６６）。Ｖ３ループに対する免疫応答は、ループの超可変側（残基２９６〜３０９および３１７〜３３３）により複雑化される。ループに対する抗体の大部分は、超可変領域に対して濃縮され、従って、ループに対する抗体応答は型特異的であるように思われる（６７〜７１）。ＨＩＶMNは、ＨＩＶMNへの中和活性およびＨＩＶMNに対するすべての幾何学的平均力価を有するＨＩＶ感染患者の頻度という観点から、北アメリカにおいて最も普遍的に認識されるＨＩＶ株である（７２）。優位な抗体が直鎖状エピトープに対して型特異的であるけれども、これらの発見により、ＨＩＶMNのＶ３ループ、おそらく残基３１１〜３１５の保存配列を含む立体的エピトープに対するいくつかの群特異的中和応答が存在するかもしれないことが示唆される。Ｖ３ループに対する広いレパートリーのヒトｍＡｂｓを用いて、Zolla-Paznerは、感染ウイルスに結合する際の立体的影響に関して説得力のある主張を行なう。彼女のデータは、群−および型−特異的中和間の違いを鈍らせる。ＨＩＶ感染におけるＶ３ループ抗体の役割を、より詳細に後述する。Ｖ３の知見に伴う１つの妨害的な複雑性は、中和抗−Ｖ３−ループモノクーナルまたはポリクローナル抗体を用いて、インビトロでＨＩＶを処理した後に抗−Ｖ３−ループ耐性ウイルスが生じるという非常事態である。突然変異は、Ｖ３ループ内（７３〜７６）およびＶ３ループ外（７７、７８）の両方で起きることが可能である。実際、ＨＩＶ感染患者が以前の単離物特異的中和に耐性を示す変異体を産生可能であることが示された（７９）。１つの非Ｖ３−ループ変異体をシーケンスし、エンベロープ糖蛋白質のアミノ酸配列の変化は、Ｖ３ループ外ばかりでなくｇｐ４１のアミノ末端領域に属する領域である残基５８２のスレオニンのアラニンへの置換のみであった（７８）。この免疫選択的点突然変異は特異的中和エピトープの一部ではないことが、確信して示された（８０）。従って、エンベロープの他の領域は、Ｖ３ループと相互作用してもよく、それ故にワクチンの開発を複雑にする。また、インビボの中和逃避突然変異体は、ＨＩＶ感染チンパンジーにおいても記載され（８１）、非Ｖ３−ループ突然変異がＨＩＶ中和抗体からの逃避を招いた。ＨＩＶ感染の群−特異的中和は、いくつかの研究所で示唆された（８２〜８６）。これらの群−特異的抗体は、ＣＤ４またはいくつかの別のＨＩＶ受容体を介して感染を阻害する（８７〜８９）。
中和抗体ドメイン分析の興味深い面は、自然感染対担体に結合した合成ペプチドを介した実験的誘導の結果としての相対的免疫原性が、しばしば散在性であるという認識である（表２）。大量の抗体を誘導するｇｐ１２０およびｇｐ４１の免疫優位領域は、実験的免疫原としては比較的弱いが、自然感染の間、比較的少量の抗体を誘導するｇｐ１２０の免疫原は、担体と結合させた場合は抗体の強力な誘導剤である。このことにより、ワクチンの設計において重要であるかもしれない、組み換えウイルス蛋白質または合成ペプチド免疫原により産生され、感染の間進行する抗原の別の経路の存在が示唆される。遺伝的粘膜免疫化は、ウイルス感染に似ているので、機能的免疫応答がｄｅ  ｎｏｖｏのＨＩＶ感染由来のものをより正確に反映するようである。
また、中和領域の同定は、ＨＩＶに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の製造により、より容易になった。特異的ウイルス単離物を中和するいくつかの抗−Ｖ３ループｍＡｂｓ（９１、９２、１０８、１０９）ならびに細胞の細胞傷害性をも介する１つのｍＡｂ（９０）が製造された。これらは、たくさんのネズミｍＡｂｓ（ｍｕ−ｍＡｂｓ）（１０８、１０９）およびいくつかのヒトｍＡｂｓ（ｈｕ−ｍＡｂｓ）（９１、９２）を含む。また、アミノ酸残基４２３〜４３７（６３）、残基７２８〜７４５（１８６）およびＣＤ４＋結合ドメイン（９１）を含むＨＩＶエンベロープの他の領域に対するいくつかの中和モノクローナル抗体も記載されている。いくつかの追加の中和ｍＡｂｓが、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質と結合することが示された（９２、９３）。４つのｍＡｂｓの１つが中和活性を有し、ｇｐ４１に結合した（９２）。さらに、Hansenらによる報告（９４）は、Ｎ−またはＯ−結合のいずれかの３つの異なる炭水化物部分に対するｍＡｂｓが、ＨＩＶIIIBまたはインビトロでの患者単離物の両方を中和することが可能であったことを示唆する。Mullerらによる研究（９５）は、酵母マンナンに対するポリクローナル抗血清がＨＩＶの複製を阻害したことを示した。ＨＩＶの感染力におけるウイルス糖蛋白質の重要性は、いくつかの研究室ですでに報告されている（９６〜１０６）。従って、機能的グリコシル基の単純な阻害により、抗グリコシル抗体による中和効果を説明できる（９４、９５）。しかし、他のデータにより、エンベロープ糖蛋白質の二次および三次構造が、型特異的中和抗体よりも群特異的中和抗体の産生に有意に重要であることが示唆される。ＨＩＶの群特異的中和における炭水化物要求性は、グリコシル化対非グリコシル化ｇｐ１２０に対して惹起される抗体を比較することにより（１０７）、および非グリコシル化ｇｐ１２０から溶出される血清による中和特異性を比較することにより（１０８）示される。両方の場合において、炭水化物は、群特異的であるが型特異的でないＨＩＶの中和に対して必要である。さらに、最近の報告は、非グリコシル化組み換えＨＩＶにおけるジスルフィド結合を保有した５つの可変領域すべての除去により、中和抗体を産生できない免疫原を製造することを示す（１０７）。従って、抗体が炭水化物結合を妨害することにより特異的機能を妨害するかどうか、または、抗体が感染力に必須の天然の二次および三次構造を崩壊させることにより阻害するかどうかはわからない。ｇｐ１２０およびｇｐ４１の公知の機能的抗体ならびにＨＩＶセロネガティブｒＨＩＶワクチン由来のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＴＬｓにより認識されるエピトープの直線関係という面から、Ｎ−結合炭化水素構造の局在を研究した（２０）。
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２．ＨＩＶの抗体依存性促進
ウイルス感染力を促進する抗体が、多くのウイルスに関して記載されている（１１２〜１２６）。最も頻繁に引用される例は、デング熱ウイルス感染の促進である（１１２〜１１５）。単球およびマクロファージのＦｃ受容体にウイルスを結合させることにより、非中和抗体が、インビトロで感染ウイルス粒子の数を実質的に増大することができることが結果から示唆される（１１８）。デング熱感染において、存在する促進抗体の程度と疾病の重症度がおおよそ相関している（１１３）。このＦｃ受容体を介する機構に加え、フラビウイルスであるＷｅｓｔ  Ｎｉｌｅウイルスによる感染の促進は、細胞上の補体および補体受容体により仲介されることが可能であることが示された（１１９）。促進は、フラビウイルス（１１６〜１２２）、アルファウイルス（１２３）、狂犬病ウイルス（１２４）、シンドビスウイルス（１２５）およびコロナウイルス（１２６）を含む多くのウイルスに関してインビトロで示唆されている。有効でないワクチン接種により疾病の重症度が増大するという結果となった、いくつかの他のウイルスのインビボでの促進に関するいくつかの証拠がある。これらの中で最も顕著な例は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫を受けた小児（１２７〜１３０）またはＲＳＶに対する免疫を受けたコットンラット（cotton rats）（１３１）で起こった。他の例としては、不活化麻疹ワクチン（１３２、１３３）ならびにワクチン接種後抗原−抗体複合体形成により、より重症の関節炎に罹ったが恐らく有効でないヤギの関節炎および脳炎ウイルスワクチンが含まれる（１３４、１３５）。
１９８７年、最初に、レンチウイルス促進抗体がＨＩＶ感染に関して記載された（１１０）。その後の報告により、インビトロで機能する促進に関する２つの機構が同定された。第１は、補体蛋白質と結合したＨＩＶに対する抗体を含み（１５７、１５８）、ＣＤ４および補体受容体２型（ＣＲ２）の両方を産生する細胞を必要とする（１３９）。第２の機構は、ＨＩＶに対する抗体およびＦｃ受容体を産生する細胞を必要とする（１４０）。Ｆｃ機構は、一般に、補体を介する抗体依存性促進（Ｃ’−ＡＤＥ）に対する＞１００倍に対して２倍の促進しか有しないので、本願研究は、後者の現象に焦点を合わせる。
Ｃ’−ＡＤＥに関しては、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質が補体を活性化できること、およびＨＩＶに対する抗体がＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞上の補体成分Ｃ３の固定を増大させるように導くことが公知である（１４１）。この補体は、ＨＩＶをＣＲ２に結合させ、ｇｐ１２０が、ＨＩＶの細胞内への進入を介するＣＤ４受容体と相互作用するであろうよりも大きな見込みを生じる、ＣＤ４＋細胞表面に近接してＨＩＶの量を増大させるように作用することができる。Spearおよび彼の共同実験者は、Ｃ’−ＡＤＥが標的細胞へのＨＩＶ結合を増大させ、組み込まれたプロウイルスのコピー数を増大させるという結果を生じることを直接示した（１４１）。さらに、このグループは、３０％のＣＤ４リンパ球がＣＲ２受容体を産生し、このＣＤ４／ＣＲ２リンパ球が、ＨＩＶ感染の作用としてＣＤ４細胞減退の初期相の間、優先的に選択されることを示した（１４２）。
ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対するｈｕＭＡｂｓの製造を用いて、促進からウイルス中和を分離することが可能となった。ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対するいくつかのｈｕＭＡｂｓは、ＨＩＶ−１感染を促進することができるが、インビトロでＨＩＶ−１を中和しないことが示された（１４３）。感染を促進するｈｕＭＡｂｓの能力は、補体を活性化するｈｕＭＡｂｓの能力によっては決定されないし、ｈｕＭＡｂｓのＩｇＧサブクラスによっても決定されなかった（１４３、１４４）。これらの促進ｈｕＭＡｂｓは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１膜貫通糖蛋白質の直鎖ドメインにマップされた。今日まで同定された６つの促進ｈｕＭＡｂｓの中で、５つがアミノ酸残基５７９〜６１３（１４４、１４５）、ｇｐ４１の初期免疫優性ドメイン（１４６〜１４８）にマップされる。６つのうちの１つは、別の免疫優性ドメインにマップされる（１４３、１４５）。これらの結果により、ＨＩＶ−１のエンベロープにはわずかの促進ドメインのみが存在し、これらのドメイン、ＨＩＶ−１のエンベロープの免疫優性領域は保存されていることが示唆される。最近広がったこれらの発見は、ＨＩＶの第１および初期促進ドメインと相同なＴＭ蛋白質領域が、促進抗体の形成を誘導する類似の許容力を有することを示すことにより、ＳＩＶにも範囲を広げた（１５０）。データは、ＳＩＶmac251由来の合成ペプチド（ａａ６０３〜６２２）を用いる前免疫化が、組み換えｇｐ１６０ＳＩＶワクチンの有益な効果を抑制する抗体の産生を刺激したこと（１５０）をインビボで示す。エンベロープ糖蛋白質に対する体液性応答が、宿主に対して損傷を与えるかもしれないということを示唆するいくつかのレンチウイルスワクチンからのさらなる証拠がある。例えば、ＳＩＶエンベロープ糖蛋白質組み換えワクチンは、大抵はその後のウイルスチャレンジからサルを保護しなかった（１５１、１５２）が、ＨＩＶに対する類似のエンベロープに基づく組み換えワクチンは、チンパンジーのＨＩＶ感染を予防するとにおいては、大抵は有効でなかった（１５３〜１５５）。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）において、バキュロウイルス組み換えエンベロープ糖蛋白質ワクチンは、その後にＥＩＡＶでチャレンジしたウマで明らかに疾病を悪化させてしまった（１５６）。最近、Gardnerら（１５７）は、ＳＩＶ感染レサス属アカゲザル由来の血清によるレサス属アカゲザルの受動免疫により、６頭のかかる動物のうち５頭がチャレンジ６ヵ月以内で死亡するという明らかな疾病の促進されたコースに導くことを報告した。その研究において、ＥＬＩＳＡにより、受動免疫の失敗およびａａ６０３〜６２２ペプチドに対するより高度の抗体レベル間の直接の相関があった（１５８）。研究者は、インビトロでＦＩＶに対する促進感染（１６１）、インビボでＳＩＶmacに対する類似の受動免疫化の失敗（１６２）を報告したけれども、これらのデータは、ＳＩＶに関するPutkonenらにより（１５９）およびネコ免疫不全（ＦＩＶ）モデルにおいて（１６０）報告された受動免疫実験とは異なっている。従って、すべてのワクチン製剤において促進能力を考慮することが賢明である。ＨＩＶおよびＳＩＶ促進は、デング熱に比べて比較的弱いけれども、ワクチン受容者を保護するための成功または失敗間の相違を意味するであろう（１５０）。
インビボでの粘膜免疫応答の誘導
遺伝的免疫原として用いた形質転換ＤＮＡは、ｐＨｅｎｖ、すなわち、ＮＩＨ  ＡＩＤＳリファレンスプログラムから独自に得た全ＨＩＶ−１エンベロープゲノム、機能的なｔａｔおよびｒｅｖトランスアクティベーター配列ならびに対応するＬＴＲ  ＴＡＲおよびＲＲＥ配列を含む９６００ｂｐのｐＢＲ３２２に基づくプラスミドであった。図１は、環状のプラスミドマップを詳細に示す。形質転換の際のこのプラスミドは、ＨＩＶ−１pNL4-3のｅｎｖ蛋白質を効率良く発現し、ＣＤ４発現細胞と広範な細胞融合を生じることが示された（１８０）。無関係なＤＮＡ対照免疫原として、ｐＡＣＹＣ１７７を用いた。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロスで生育させた大腸菌ＪＭ１０９で、プラスミドを製造し、ＯＤ600nm＝０．５０で細胞を集めた。Ｍａｇｉｃ  Ｐｒｅｐカラム（Promega Corp.）での精製を用いるＳＤＳ溶解手法を用いて、ＤＮＡを細胞ペレットから集めた。プラスミドＤＮＡを、ＴＥ緩衝液を用いて７０℃で溶出させ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中、−７０℃で沈殿させた。精製したプラスミドＤＮＡを、アガロース電気泳動ゲルで、公知の制限エンドヌクレアーゼ加水分解部位に対するサイズにより調べた。ｐＨｅｎｖＤＮＡは、３７０８、５８１８、７２９３および９５２０ｂｐ断片を生じる４つのＨｉｎｄIII部位ならびに６６２５および７９６５ｂｐ断片を生じる２つのＸｈｏＩ部位を含む９６００ｂｐのＤＮＡからなっていた。３９４０ｂｐの対照プラスミドであるｐＡＣＹＣ１７７は、１つのＢａｍＨＩ部位ならびに９６５ｂｐおよび２３０５ｂｐの２つのＳｔａＩ断片を含む。ＤＮＡの濃度は、ＯＤ＼｜ａ＼｜ａ１（５０μｇ，２６０ｎｍ＼｜，１ｃｍ）＝１に基いた。
動物
Ｈａｒｌａｎインダストリーズから入手した５ないし６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを、各５匹のマウス群にランダムに分けた。該群を、ＤＮＡ免疫化プラス無関係なＤＮＡ免疫化および無作為な動物対照という３つのクラスにアレンジした。表３は、免疫経路、免疫原の組成、投与量、免疫回数および全ＤＮＡ用量曝露を詳細に示す。表４は、転写成分ＨＩＶ−１ｅｎｖ配列を含むＤＮＡを用いる形質転換の結果としてマウスの血清中に検出される抗体応答をまとめたものである。裸のＤＮＡ（１００μｇ）は、１回のＩＭ曝露で５匹中２匹の動物で、２または３回のＩＭ曝露で５匹中３匹の動物でＨＩＶ特異的血清ＩｇＧ応答を生じた。裸のＤＮＡ（１０μｇ）は、１、２または３回のＩＭ曝露で４０％の動物でＨＩＶ特異的応答を起こした。裸のＤＮＡ（１μｇ）は、ＩＭ曝露でＨＩＶ特異的免疫応答を起こさなかった。群の曝露当たり１０μｇで、最高の平均ＩｇＧ力価が生じた。ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）と複合体を形成したＤＮＡ（１０μｇまたは１μｇ）は、１、２または３回の曝露後８０％のＩＭ処理動物で、ＨＩＶ特異的免疫応答を生じ、３回の曝露を受けた群で最高の平均力価が生じた。ＤＯＧＳと複合体を形成した１０μｇのＤＮＡのエアロゾル曝露は、１回の曝露で２０％のマウスで、２または３回曝露したマウスの４０％で、全身的ＨＩＶ特異的免疫応答を起こした。１μｇのＤＮＡ複合体を用いるエアロゾルは、１または２回の曝露後２０％のマウスで、および３回目の曝露後８０％のマウスで、平均力価ｆ  １：８５０を有するＨＩＶ特異的ＩｇＧ応答を起こした。
表３は、粘膜投与の結果を示す。
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表３．５ないし６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＤＮＡ免疫感作の一覧表。３週間毎に免疫原への曝露。ＩＭ＝両側の腱の筋肉間の筋肉内の分割投与量（１００μｌ）。ＮＡ＝小分割量で１００μｌの最終容量まで投与された鼻へのエアロゾル。裸のＤＮＡは水中のｐＨｅｎｖ−ＤＮＡを指す。ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）を、Promega Corporation（Transfectam▲Ｒ▼IBF-Sepracor,France）から入手し、製造者の指示に従って５：１のモルカチオン荷電過剰で、ＤＮＡと複合体を形成させた。複合体を調製し、免疫感作前にすぐに使用した。ｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡを無関係の対照ＤＮＡとして用いた。
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表４．ＤＮＡ免疫感作に対する血清抗体抗−ＨＩＶｅｎｖの応答。
ＨＩＶ−１のｅｎｖ蛋白質に対する抗体の血清力価を、ドット−ブロット手法により定量した。ＨＩＶ−１IIIBで感染させたＨ９細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて１０6細胞／１００ｍｌで溶解し、遠心分離により細胞の破片を除去した。ＲＩＰＡ溶解液のＴｒｉｓ生理食塩水での１：１００希釈物の１００ｍｌを、ニトロセルロース膜に吸着させ、ウシ血清アルブミンで過剰の部位をブロックした。マウス血清の連続希釈液を、各ドットブロットとともにインキュベートし、ＴＥ緩衝液で３回洗浄した。過剰のアルカリフォスファターゼ結合免疫グロブリン型抗−マウス抗体を用いて、特異的ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの力価を決定し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、Pierce Chemical Company）で発現させ、４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いて、９６ウエル  プレートＦｌｏｗ比色計で定量した。対照を超える平均光学密度±１  Ｓ．Ｄ．を生じる最高希釈として、力価のカットオフを報告する。
セロコンバートした動物におけるウエスタンブロット免疫反応性を決定した。ウエスタンブロットは、４日間の受動拡散転移により成されたニトロセルロースへの転移を伴うＨＩＶ−１IIIB感染Ｈ９細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調製された。アルブミンでブロックしたストリップをニトロセルロースシートから調製し、２００μｌのマウス血清の１：４０希釈物で１時間インキュベートした。アルカリフォスファターゼ結合抗−マウス抗体を用いて検出を行い、５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリフォスフェート  ｐ−トルイジン／ニトロ−ブルー  テトラゾリウムクロリド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Pierce Chemical Company）を用いて発現させた。ニューヨーク血液センターのFred Princeから入手したＨＩＶＩＧを、ヒト陽性対照として用いた。ｇｐ１２０の末端の１２個のアミノ酸に対した作製したマウス抗血清を、マウス陽性対照として用いた。Ｆ−ＭＯＣペプチド固相合成、ＴＦＡ／Ｈ2Ｏグラジエントを用いるＣ１８カラムのＨＰＬＣによるペプチドの精製、ＫＬＨへの結合およびFreund'sアジュバントを用いる多数回の皮下注射によるマウスへの投与により、この抗血清を製造した。主要な反応性は、ｇｐ１６０に対して観察される追加の反応性を伴い、ｇｐ１２０で起こる。ＨＩＶＩＧ対照により、ｇｐ４１バンドは検出されなかった。ｇｐ１６０およびｇｐ１２０は両方とも、抗−ヒトＩｇＧにより同等に染色される。ｇｐ４１は、本発明者らのほとんどのウエスタンブロット調製物で日常的に検出されるけれども、このブロット調製物では、ｇｐ４１は観察されない。ＩｇＧに対する同様の反応性は、検出用の抗−マウス抗−ＩｇＧ抗体を用いたｇｐ１６０に対して観察される。ＩｇＧおよびＩｇＡ応答に比べて量は減少するけれども、ｇｐ１６０に対するＩｇＭ抗体も観察された。遺伝的に免疫されたマウスによる明らかなｇｐ４１応答の欠如は、ＨＩＶＩＧを用いてｇｐ４１のバンディングが本発明者らの研究室で通常検出されるので、ウエスタンブロット調製物のアーチファクトのようである。両対照を用いるｇｐ１２０バンドの明確な存在により、ｇｐ１６０で検出される主要な反応性は、実質的にｇｐ４１であることが示唆される。あるいは、ｇｐ１６０バンド中で移動することが公知のｇｐ４１のテトラマーが検出されているかもしれない（１８１）。それにもかかわらず、粘膜遺伝的免疫に対する明確な抗ＨＩＶｅｎｖ全身応答が存在する。
ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖ−ＤＮＡの鼻エアロゾルで免疫した動物の肺の組織のＩｇＡ特異的アルカリフォスファターゼ装飾が、観察された。対照動物は、一貫して粘膜表面のＩｇＡ標識を示さなかった。ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖ−ＤＮＡの鼻エアロゾル送達により免疫したマウスの肺の細気管支上皮の抗−ＨＩＶｅｎｖ反応性が示された。対照動物は、ＨＩＶｅｎｖ抗原に対する細気管支反応性を示さなかった。鼻エアロゾルを介する免疫由来の結腸粘膜の蛍光抗体修飾が観察された。遺伝的粘膜免疫およびＨ９／IIIＢ感染細胞由来のＨＩＶエンベロープ蛋白質の結合後のＩｇＡ応答のこの可視化は、粘膜遺伝免疫感作に対する特異的分泌ＩｇＡ応答を表す。
Sunil Chada博士から最近入手したＢａｌｂ／ｃ標的細胞（１８２）を、ＣＴＬｓの検出のために増殖させる。ヒト中和および促進抗体の測定を伴う広範な実験があるけれども、５６℃で０．５時間で熱不活化されたＢａｌｂ／ｃマウス血清を用いる初期の努力により、ＨＩＶ阻害因子が明らかになった。熱不活化血清を用いるさらなる中和測定は、陽性対照としてのＨＩＶ−１IIIBで免疫したマウス由来の熱不活化Ｂａｌｂ／ｃ血清を用いて正確に標準化されるであろう。この試薬は、我々の知る限り商業的に利用されていないし、本発明者らは、現在不活化ＨＩＶ−１IIIBを用いてマウスを免疫している。
ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖ  ＤＮＡの鼻エアロゾルで免疫したマウスにおける組織化学的染色活性を行なった。冷凍ミクロトームを用いて、標準シリコン化（silinized）スライドグラスに付着させて、鼻エアロゾル免疫マウスの急速凍結（液体窒素）肺および結腸から、５ミクロンの凍結切片を調製した。ＨＩＶｅｎｖ決定基に特異的な粘膜抗体を示すために、各切片を、Ｈ９／IIIＢ溶解物の１：１００希釈物と３０分間インキュベートした。ＴＥ緩衝液で切片を十分洗浄し、１００μｌのＨＩＶＩＧの１：１００希釈物とともにインキュベートした。ＴＥ緩衝液で十分洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いて肺切片におけるマウス抗−ＨＩＶ粘膜抗体のＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出で現像し、および結腸における抗−ＨＩＶ粘膜抗体の検出のためにフルオレッセイン結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いてヒトＩｇの結合を検出した。アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＡを用いて、肺凍結切片における粘膜ＩｇＡ抗体を可視化した。
ＤＮＡに対するＤＯＧＳの結合は、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＲＩＳＣに基づくコンピューターでＢｉｏｇｒａｆソフトウエアパッケージ（Molecular Simulations, Inc.）のＤＲＥＩＤＩＮＧ  II  フォースフィールドを用いる分子モデリングにより研究された。分子ダイナミックス後、該分子はＤＮＡの主溝と結合するように見える。ＤＯＧＳの極性末端の４つの陽電荷の２つとペプチドアミド水素は、ＤＮＡ上の単一のリン酸と対称的に配位している。１つの疎水性アームが、リン酸から伸び、２つめは、いくつかのメチレン基に対する主溝に沿って反対方向に伸び、それから第１のアームに向かって折れ曲がっている。この構造は、リン酸塩当たり溶媒に曝された４〜５個のメチレン基配列を配置する。ＤＯＧＳの脂肪親和性鎖の１つが溶媒内に伸びている。５：１：：ＤＯＧＳ／ＤＮＡの分子荷電比で、すべてのリン酸基は、全ＤＮＡ分子を覆う疎水性外殻とイオン的に複合体を形成するであろう。このことにより、複合体の安定性およびその脂肪原形質膜に対する親和性が説明される。ＤＯＧＳ／ＤＮＡ荷電複合体が比較的水素イオンに対して近寄り難いならば、この型の構造は、胃という酸性環境を通過して残存することが可能である。
２．Ｂｏｌｉｓｔｉｃ免疫化の現状
我々の研究室では、Ａｇｒｉｃｅｔｕｓから「遺伝子銃」の最新版（すなわち、Accel▲Ｒ▼Pulse Gun）を最近入手した。これは、０．９５μｍの金粒子に結合したＤＮＡを、ヘリウム推進力を用いて原形質膜を物理的に通過推進させる「１２連発銃」である。ＤＮＡを金に結合させ、水平に分散させて１／８”ＯＤポリエチレンチューブで乾燥させ、標準の１／２”の長さに切断する。５週齢および６ヵ月齢のＢａｌｂ／ｃマウスの背部皮膚および頭頂部皮膚における基底層への皮膚浸透およびランゲルハンス細胞に対する最適ヘリウム圧を決定する初期の研究が遂行された。金の浸透性のレベルを組織学的に決定するためおよびケラチノサイトまたはランゲルハンス細胞の原形質膜上のＨＩＶｅｎｖ蛋白質の発現が検出できるかどうかを免疫組織化学により決定するために、切片を処理する。
３．ベクターの設計および合成
我々の試験的遺伝的免疫感作研究に用いるベクターであるｐＨｅｎｖは、ＳＶ４０プロモーターを含む９６００ｂｐのプラスミドである。しかし、ＨＩＶエンベロープ配列は、それぞれ十分に機能的なｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子とＲＮＡ受容体部位のＴＡＲおよびＲＲＥを有するＬＴＲｓ内に含まれている。恐らく、ｇｐ１６０の発現は、ＬＴＲプロモーター制御下にある。我々の提案の中心的な特徴は、この発現系がｅｎｖ蛋白質を発現させて機能的な免疫応答を誘導するために最も有利であるかどうかを調べることである。ｇｐ１６０ばかりでなくｇｐ１２０およびｇｐ４１も別々にまたは組み合わせて発現される。１つの起こり得る問題は、ｇｐ４１の初期促進ドメインにおける我々の初期の部位特異的突然変異の努力において我々を困難にさせたＲＲＥの広範な二次構造である。従って、我々は、ＲＲＥの二次構造を完全に破壊するように設計したサイレント突然変異を導入した（すなわち、ｇｐ４１のアミノ酸配列において何の変化もなし）。我々は、２つのかかる突然変異を作製した。ＲＲＥ−３Ｃを、Ｒｅｖに対する結合部位を崩壊するように設計し、一方、ＲＲＥ−４Ｃを、全ＲＲＥをより広範に崩壊する。図２は、ＲＲＥおよび突然変異部位を図示する。ｐＨｅｎｖを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後アガロースから４７００ｂｐのｇｐ１６０を単離した。この配列を、ｐＡｌｔｅｒ  ＭＣＳにクローニングし、ＲＲＥ、アンピシリン（修復）およびテトラサイクリン（感受性）部位での部位特異的突然変異を行い、アンピシリンで選別した。変異したＲＲＥは、抗生物質選別後、正確なサイズおよび制限部位を得た。ＲＲＥのサイレント突然変異が構築されたことを確認するために、配列分析が行なわれる。
我々の試験的遺伝的免疫感作研究は、対照ＤＮＡとして無関係なプラスミドを用いた。しかし、適切なより良い対照は、すべてのＨＩＶ配列を欠失したｐＨｅｎｖであろう。ＨＩＶ挿入物なしで、新規のＳｎａＢ制限部位を含む再環状化ｐＨｅｎｖを構築した。このプラスミドは、ｐＨｅｎｖを用いる将来のすべての遺伝的免疫感作のための対照となることが可能である。
４．ＨＩＶエンベロープ蛋白質の分子モデル
ＨＩＶのｅｎｖ蛋白質の一次配列は、超可変的であるけれども、ある種の構造上の特徴は、すべての単離物間で定常に残存している。図２は、Leonardら（１７４）により報告されたｇｐ１２０に対する構造的なデータを表し、図中、ジスルフィド対を古典的化学方法により同定し、一般的なグリコシル化パターン（シアル化対非シアル化）を、酵素的方法により示した。ｇｐ４１に存在する唯一のジスルフィドおよび構造が不明なＮ−結合グリコシル化部位が、図２に含まれる。これらの構造上の相関は、RobinsonとMitchell（１７８）により評論された中和および促進抗体結合ドメインと組み合わせられる。ｇｐ１２０では、９個のジスルフィド結合および１個の遊離スルフヒドリルが存在する。ｇｐ１２０のシステイン残基の位置は、追加の２個のシステインが４番目の超可変ドメインに存在するＺ３単離物を除いて、すべての単離物で高度に保存されている。このことにより、IIIBにおけるジスルフィド対をすべての単離物間で維持されることが強く示唆される。分子シュミレーションのためのＤｒｅｉｄｉｎｇ  II  一般的フォース  フィールドを用いて、GabrielとMitchell（１７２）は、ｇｐ１２０のグリコシル化、抗原構造およびｇｐ１２０／ＣＤ４結合相互作用に関するすべての公知のデータと一致する切断型ｇｐ１２０に対する分子シュミレーションを作成した。我々のモデルにさらなる信用を提供する公知のｇｐ１２０／ＣＤ４結合阻害剤とのドッキング阻害研究が、最近完成した（１７９）。Mooreら（１４９）の理論的予言と一致するｇｐ４１のＣｙｓ−Ｃｙｓループがｇｐ１２０のＣ末端凹部にドッキングしたｇｐ４１に関する同様なモデル研究が行なわれた。ｇｐ１２０における主要な抗原決定部位およびＮ−結合オリゴサッカリド間の相関に対するモデルがある。ｇｐ１２０をＣＤ４にドッキングさせる。Ｖ３ループは、一部が炭水化物により不明瞭であるけれども、一方の面で溶媒に接近できる。第２の保存ドメインは、一方の側からのみ接近できる。ＣＤ４−結合ドメインは、一方の面で炭水化物により全く不明瞭であるが、反対側の面で容易に接近可能である。我々の遺伝的免疫原における配列可変性の効果が予想できるモデル構造を提供する現可能性は、蛋白質の免疫原の構造変化に依存しているそれらの生物学的応答の設計および分析において助けとなる価値の高い道具である。
５．国立ＨＩＶワクチンプログラムに対する原理および重要性
容易な粘膜の遺伝的免疫感作により、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて特異的抗−ＨＩＶｅｎｖ応答を産生することが可能となった。通常の方法により得られるマウスポリクローナル対照ＨＩＶ中和血清を得るために、マウスを現在ＨＩＶ−１IIIBに対して免疫化している。本発明者らは、ヒトのＨＩＶに対する機能的体液性応答の定量化における広範な実験を有し、驚くべきことに、本発明者らが最初に得たマウス血清の天然の抗−ＨＩＶ活性に関して何の困難性も予期しない。遺伝的免疫化によりＣＴＬ応答が起こされることが示されたので、２週間前の間に、サンジエゴのViagene社のSunil Chada博士から、免疫機能としてのＢａｌｂ／ｃマウスにおける細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の応答（１８２）を評価することを可能にする２つのユニークな細胞株を入手した。Ｈｕ／Ｄd株は、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＤdＭＨＣ座を有して発現するＣＤ４発現ＨｅＬａ派生株である。この株は、Ｂａｌｂ／ｃ  ＣＴＬｓに対する標的として用いられる種々の確立されたおよび初代ＨＩＶ単離物で感染させることができる。２番目は、細胞表面上で発現するＨＩＶｅｎｖ（IIIＢ）で永久に形質転換したＢａｌｂ／ｃ繊維芽細胞である。この細胞は、ＨＩＶに対する免疫機能としてのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴＬ分析に対する別の好適な標的を提供する。第２の発見は、ユタ大学のDayneの研究室由来である。彼は、ワクチン調製物にナノグラム量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ３を包含させることにより、再現性よく通常の蛋白質免疫化から粘膜型応答に全身性免疫応答を変換することを可能にした（２）。本発明者らは、最近、Hoffman-LaRocheから大量のこの活性型ビタミンＤ３（５ｍｇ）を入手した。また、本発明者らは、最近、表皮遺伝的免疫に対するDayne博士の独創的な発見を広げ、評価することを可能にするAgricetus遺伝子銃に接近した。本発明者らが製造した各ベクター生成物を用いてＨＩＶに対する機能的粘膜応答を産生する両方法を直接比較することができる。
この適用の直接的な範疇を超えるけれども、この適用は、Ｃ’−ＡＤＥ応答を誘導する許容力を欠失したＤＮＡ免疫原の製造である。現在、この許容力のために構築したｇｐ１６０突然変異を評価している。本発明者らは、ＨＩＶワクチン候補としての考察のための最終産物に対する両研究手段（すなわち、計画中と現行の）融合を想像する。
最後に、遺伝的免疫は、ＨＩＶに対して観察された遺伝的可変性が、それらの重要な領域（すなわち、Ｖ３ループ）に対する単一の産物に多数類似してもよい産物の構築を可能にする。遺伝的免疫は、この病原体の超可変性が再現される唯一の実験方法である。
４．方法の設計およびプロトコール
Ａ．一般的な設計
本発明者らの最初の評価は、遺伝的免疫に対する粘膜および全身応答の直接比較において、通常のベクターとしてのｐＨｅｎｖを用いる。Ｉｇの血清力価、ウエスタンブロットおよび免疫体液性応答のラジオイムノアッセイ特性、耳下腺分泌におけるｓＩｇＡ力価、ＨＩＶに特異的な粘膜抗体による直接的な可視化、血清および耳下腺抗体の中和力価ならびに51Ｃｒ標識標的ＢＣｅｎｖおよびＨｕ／Ｄd／ＨＩＶに対する脾臓ＣＴＬ活性に関して、２つの年齢群（６週齢および６ヵ月）のＢａｌｂ／ｃマウスを評価する。通常の粘膜応答を誘導するＤＯＧＳ／ＤＮＡｅｎｖ複合体の能力を、鼻エアロゾル、結腸曝露、膣曝露および胃送達処方で評価する。それぞれの場合、最高の全ＤＮＡ１回投与量曝露として１０μｇのＤＮＡを用いて、投与量応答分析を行なう。同様に、応答の間、２週間および／または３ヵ月の間隔を可能にする１、２または３回の遺伝的免疫感作スケジュールを関数として応答を評価する。同様に、１，２５（ＯＨ）2Ｄ３の追加ありおよび追加なしで、マウス皮膚のボリスティック免疫を評価する計画である。各年齢のマウスに関して最適のヘリウム送達圧を確立し、１，２５（ＯＨ）2Ｄ３の部位注射に対する用量応答を確立した後、単純な処方が可能であるかを確立するためにボリスティックＤＮＡ／Ａｕ処方に該ビタミンを包含させることを評価する。実行可能ならば、種々の生理的状態下での処方の安定性をさらに評価する。
前記概略した遺伝的免疫感作の種々の経路および様式を評価中であるが、遺伝的粘膜免疫に対する免疫応答の質と量に主要な影響を与えるかもしれない種々のＤＮＡ構築物を開発する。免疫原の発現に関する種々の真核細胞のプロモーターの効果を調べる計画である。遺伝的免疫の対して現在まで調べた真核細胞のプロモーターで最も有効なプロモーターは、該分野は組織的に調べられていないけれども、ＨＢＶサブユニット発現に対するＣＭＶプロモーターである（１８）。本発明者らは、ｐＴＫｂ（GenBank accession # U02438）を用いる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター、ｐＳＶｂ（GenBank accession # U02435）を用いるＳＶ４０初期プロモーター、ｐＣＭＶ−Ｌｉｃ（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーＬＩＣクローニング部位、ＨＧＨポリアデニル化部位およびＳＶ４０初期プロモーター）またはｐＣＭＶｂ（GenBank accession # U02451）を用いるＣＭＶ即時型遺伝子プロモーター、およびアデノウイルス主要後期プロモーター（GenBank accession # U02442）を試験する。ＬＴＲｓを欠失したｇｐ１６０を用いて、ＨｅＬａおよびＳＧ１８１（ヒト繊維芽細胞）およびヒトＨ９ならびに初代マウス肺、腸および皮膚移植組織培養物等の種々の真核細胞株で、どのベクターが最大の発現を提供するかを評価する計画である。最良の一貫した発現を提供するそれらのプロモーターは、その後のベクター構築物に用いる。
標的真核細胞の表面発現に対する最良のプロモーターの同定後、最良のシグナルペプチド配列（すなわち、例えば、ＨＩＶシグナル配列対ＴＰＡシグナルペプチド）、ＲＲＥ二次構造対最初のアミノ酸配列に対する変化なしにＲＲＥ二次構造を除去したサイレント突然変異を有するベクターからの発現、ｇｐ１６０対ｇｐ１２０および／またはｇｐ１６０膜アンカードメインを含むｇｐ４１ならびにｇｐ１６０の切断部位を除去したｇｐ１６０を同定するように設計されたベクター構築物を調製する。遺伝的免疫に対する最良の構築物の同定後、このＨＩＶｇａｇ蛋白質において、Ｎ末端中和部位が同定されているので、ＨＩＶｅｎｖ配列とｐ１７を有するベクターも構築する計画である。基礎的な方針は、以下の遺伝的免疫を質および量の両方を最大にするために同定されることが可能な最良のプラスミドベクター構築物を探すことである。
遺伝的免疫は、ＨＩＶの原則中和ドメイン（すなわち、Ｖ３ループ）の種々の超可変型に対する多数の応答を起こす最良の機会を提供する。クレード（clade）Ｂウイルスの主要なマクロファージ指向性およびリンパ球指向性変異体ならびに感染ドナーの感染力を有する多くの変異体から感染変異体であることをＨｏ研究室（１７１）により認識されたそれらの限定されたＶ３ループ配列を反映するｐＮＬ４−３ＤＮＡエンベロープ配列上でＶ３ループ突然変異を作製する。各Ｖ３ループ変異体に対して、群特異的構造的エピトープ上の変化を予想するために、分子モデルによりｇｐ１２０／ｇｐ４１構造上の効果を調べる。最後に、多数のＶ３ループ種を含むＤＮＡｅｎｖカクテルに対する応答を調べる。
詳細なプロトコール
１）容易なＤＮＡｅｎｖ粘膜免疫感作
Ｐｒｏｍｅｇａ社から
0003938935.tif 000007
として入手したジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）を、１００％のエタノールに溶解し、５：１のモルカチオン荷電過剰で、Ｈ2Ｏ中でＤＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡの濃度に基づいて免疫感作投与量までＴｒｉｓ生理食塩水で希釈し、以下の処方で即時に投与する。６週齢または６ヵ月齢の麻酔（ケタミン／キシラジン）メスＢａｌｂ／ｃマウスに、１００μｌを、鼻エアロゾル、胃ボーラスまたは結腸浴または２５μｌ寄託した膣内投与する。すべての動物を、５つの群に無作為に分ける。最終免疫感作後３週間でケタミン／キシラジン麻酔下、全採血により各動物を安楽死させる。腹部大動脈のカテーテル法（Catherization）（#25小児科用切断セット）により全血を採取する。脾臓を採集し、白色パルプを掻き裂いてHypaque-FicolでＰＢＭＣｓを単離する。肺、結腸、小腸および膣を採集し、その後の凍結切片処理のために、液体窒素で急速凍結する。
２）ベクター構築物
ａ．ＬＩＣに基づくＰＣＲを用いるＨＩＶｅｎｖ  ＤＮＡクローニング：ライゲーション非依存性クローニングを、AslanidisとdeJong（１８３）およびHaunら（１８４）の方法に基づいて行なう。センス（５’−ＣＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＡ〔遺伝子特異的プライマー〕−３’）およびアンチセンス（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＧＡ〔遺伝子特異的プライマー〕−３’）プライマーを、標準オリゴヌクレオチド合成および精製手法により調製し、またはＩＤＴ  Ｃｏｒｐ．（Coraville, IA）から入手する。Ｖｅｎｔ▲Ｒ▼ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ増幅は、ハイブリダイゼーションおよび伸長時間ならびにIntelligenetics▲Ｒ▼ソフトウエアで理論的に計算した温度を使用する。各３’末端の最初のチミジンから消化を停止するｄＴＴＰの存在下でＴ４ポリメラーゼを用いる消化により、ｄｓＤＮＡ産物から５’突出を作製する。１０モル過剰の５’突出ＤＮＡを、室温で０．５時間、２５ｍｇのＬＩＣベクターＤＮＡとハイブリダイズさせる。標準形質転換プロトコールで、ハイブリダイズした産物をコンピテントＨＢ１０１またはＪＭ１０９大腸菌細胞に対して用い、アンピシリンプレートで選択する。この方法により、ＨＩＶ制御、アクセサリーおよびエンベロープ遺伝子の種々のＰＣＲ  ＬＩＣ挿入物を製造した。また、クローニングした遺伝子のいずれかの末端に新規の唯一の制限部位、ＬＩＣハイブリダイゼーション配列と遺伝子特異的ハイブリダイゼーション部位の間の配列の挿入による開始または停止コドンを導入することができた。これは、方向性クローニングおよび遺伝子特異的部位の外側の新規な制限部位の導入のための強力な方法である。
ｂ．部位特異的突然変異：特異的部位に突然変異を導入するために、ｐ−Ａｌｔｅｒ▲Ｒ▼方法を日常的に用いる。ＨＩＶNL4-3エンベロープ配列を含むｐＨｅｎｖのＳａｌＩ／ＥｃｈｏＲＩアガロース精製制限断片を、ｐ−Ａｌｔｅｒベクターにクローニングした。このベクターは、多数回の追加の突然変異の間、選択のための変異アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。ｐ−ＡｌｔｅｒHIVenvで形質転換したＪＭ１０９大腸菌を誘導して、ヘルパーファージＤＮＡを用いて一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを製造する。３つの変異プライマー（アンピシリン耐性修復プライマー、テトラサイクリン耐性不活化プライマーおよび分析対象遺伝子の変異プライマー）を、室温でｓｓＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼで埋め、変異修復大腸菌を形質転換に用いて、抗生物質選択プレート上で突然変異したプラスミドを回収する。手中にしたこの方法は、本発明者らが試験した種々の方法で変異を確かめた所望の配列の最高の収量を提供した。厳密な因子は、ファージＤＮＡの精製度とすべてのＤＮＡ修復系を欠失したＭｕｔＳ−Ｂｌｕｅ大腸菌の使用である。
３）ボリスティック（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ免疫
１．５ｍｌのマイクロフュージチューブ中で、５０μｇ（０．９５μｍ）の金粒子を、１００μｌの０．１Ｍスペルミジンと混合し、５秒間超音波処理し、０．１〜５．０μｇＤＮＡ／ｍｇ金となる濃度で、等容量またはそれ以下のプラスミドＤＮＡを添加して、ｖｏｒｔｅｘにより混合する。ｖｏｒｔｅｘの間、２００μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を添加し、混合物を室温で１０分間放置して沈殿させる。混合物を短時間遠心分離して、溶液中の残存した金を沈殿させる。上清を捨てる。４℃で５００μｌのエタノールでペレットを３回洗浄し、洗浄間で３０秒のマイクロフュージスピンを行なう。エタノールの容量を７ｍｇ金／ｍｌに調整し、ｖｏｒｔｅｘし、超音波処理（３秒間）して、Ａｇｒｉｃｔｅｕｓチューブターナーに水平に固定した回転１／８”ＯＤ  Ｔｅｆｚｅｌポリエチレンチューブに、５００μｌを移す。粒子を放置して沈殿させる（５分間）。過剰のエタノールを機械的にゆっくり除き、２０ｒｐｍで回転を開始する。３０秒後、０．４１ｐｍでＮ2を用いてチューブを乾燥させる。次いで、チューブを１／２”切片に切断する。量の制御のために、光学顕微鏡によりチューブの各末端の金粒子数を測定し、所望のｐｓｉで、３％のアガーに浸透させる。チューブを、乾燥剤中、４℃で貯蔵する。
Ｏｓｔｅｒ細剪断クリッパーを用いる最初の剪断により、ボリスティック（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換のためにマウス皮膚を調製し、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ乾式／湿式電気かみそりを用いて、最終調製する。金と複合体を形成した付着ＤＮＡを有する１／２インチのチューブを、Ａｃｃｅｌ▲Ｒ▼Ｐｕｌｓｅ  Ｇｕｎ内に負荷し、種、部位、動物の年齢および皮膚からの距離（標準）に基づき、予め決定しておいた最適の皮膚浸透ｐｓｉのＨｅによりＤＮＡ／金複合体を推進させる。浸透部位は、容易に観察され、必要なら次の処理のためにＩｎｄｉａインクで永久に印を付けることができる。
４）全身抗体分析
ａ．Ｉｇ力価。ＨＩＶ−１のｅｎｖ蛋白質に対する抗体の血清力価を、ドット−ブロット手法で定量する。ＨＩＶ−１IIIBで感染したＨ９細胞を、１０6細胞／１００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコーレート、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）で溶解し、遠心分離により細胞の破片を除去する。ＲＩＰＡ溶解液のＴｒｉｓ生理食塩水での１：１００希釈物の１００μｌを、ニトロセルロース膜に吸着させ、ウシ血清アルブミンで過剰の部位をブロックする。マウス血清の連続希釈液を、各ドットブロットとともにインキュベートし、ＴＥ緩衝液で３回洗浄した。過剰のアルカリフォスファターゼ結合抗−マウスＩｇ抗体免疫グロブリン型抗−マウス抗体を用いて、全Ｉｇまたは特異的ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの力価を決定し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、Pierce Chemical Company）で発現させ、４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いて、９６ウエル  プレートＦｌｏｗ比色計で定量する。次の６週間内に、本発明者らは、ドット−ブロットで直接ＯＤスキャンを行なうことを可能にする光学密度スキャナーを所有するべきである。対照を超える平均光学密度±１  Ｓ．Ｄ．を得る最高希釈として、力価のカットオフを報告する。
ｂ．ウエスタンブロット。ウエスタンブロットは、４日間の受動拡散転移により成されたニトロセルロースへの転移を伴うＨＩＶ−１IIIB感染Ｈ９細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調製される。アルブミンでブロックしたストリップをニトロセルロースシートから調製し、２００μｌのマウス血清の１：４０希釈物で１時間インキュベートした。アルカリフォスファターゼ結合抗−マウス抗体を用いて検出を行い、５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリフォスフェート  ｐ−トルイジン／ニトロ−ブルー  テトラゾリウムクロリド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Pierce Chemical Company）を用いて発現させた。ニューヨーク血液センターのFred Princeから入手したＨＩＶＩＧを、抗−ヒトアルカリホスファターゼ検出系を用いてヒト陽性対照として使用した。
ｃ．ラジオイムノプレシピテーション分析（ＲＩＰＡ）。Ｈ９／IIIＢ細胞を、１ｘ１０6細胞を含むシステインを含まない培地中、４時間、１ｍＣｉ／ｍｌの35Ｓ−システインで標識する。ＲＩＰＡ緩衝液（前記４ａを参照）で溶解した細胞を、ＰＢＳで３回洗浄する。２ｘ１０5ｃｐｍ／μｌで２０ｘ１０6ｃｐｍを達成するようにする。試験対象の血清を、４℃で１時間、１００μｌの希釈したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−セファロース（Pierce）とともにインキュベートする。０．５〜１ｘ１０6細胞と同等の溶解物を添加する。血清抗体および溶解物抗原を、４℃で一晩インキュベートし、ＲＩＰＡ洗浄緩衝液（すなわち、ＲＩＰＡ溶解緩衝液からデオキシコーレートとフェニルメチルスルフォニルフルオリドを除いたもの）で洗浄する。免疫複合体−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ粒子を、１０００ｇで遠心分離し、４ｍｌのＲＩＰＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００℃で２分間変性させ、１０％の分離ゲル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させる。電気泳動後、３０％メタノール、１０％酢酸、６０  ｄｄＨ2Ｏまたは同等物でゲルを固定し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを用いて放射活性のバンドを可視化する。
ｄ．中和測定。
（ｉ）標準マイクロタイター中和測定。中和抗体活性を、本研究室から最初に記載されたように、マイクロタイター感染測定で測定する（１８３）。要約すると、熱不活化（６０℃、３０分間）血清試料を、１２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０生育培地に３連で２倍連続希釈する。ウイルス（５〜１０ｘ１０5感染単位）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次に、１００μｌの生育培地中の２〜５ｘ１０5個のＭＴ−２細胞を、各ウエルに添加し、プレートを、５％ＣＯ2／９５％空気中、３７℃で２〜３日間インキュベートする。合胞体形成に関して、細胞を位相差顕微鏡でモニターし、ウイルス対照ウエル（マウス血清なし）が広範な細胞変性効果を示したときに測定する。これは、ＭＯＩ≧１を使用したとき、通常３．５日で起こる。細胞を、ポリ−Ｌ−リシン被覆プレートに移し、Finter'sニュートラルレッド染色剤と共に１時間インキュベートする。付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、酸アルコールを用いて生細胞染色を遊離する。プレートを、生細胞に対して５４０ｎｍで、Ｆｌｏｗ  Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  マイクロ比色計で測定する。細胞対照ウエル（ｎ＝４）と比較して、生存率を決定する。中和力価を、細胞対照と比べて、≧５０％細胞生存率を生じる最高希釈として定義する。
（ii）初代単離物中和。中和に対する金標準は、初代単離物パネルのヒトＰＢＭＣを感染させる能力を中和する能力である。ＰＢＭＣを、Hypaque-Ficolで新たに単離する。１０μｌの非希釈初代単離ＨＩＶ（すなわち、ＰＢＭＣｓで常に増殖させる）中の５ｘ１０6細胞を、３連で、マウス血清の連続５倍希釈液中、４℃で１時間インキュベートし、次いで、生物学的に派生したＩＬ２を含む１ｍｌのＲＰＭＩ／１２％ＦＣＳに添加する。７日めの上清を、対照培養液に対してＲＴおよび／またはｐ２４レベルを測定する。≧５０％阻害を生じる最高希釈を、中和力価として報告する。
５）粘膜抗体分析
ａ．耳下腺分泌ＩｇＡ／ＩｇＧ力価：短期免疫感作スケジュールに対しては毎週、長期スケジュールに対しては毎月、力価をモニターする。麻酔（ＩＭケタミン／キシラジン）Ｂａｌｂ／ｃマウスの耳下腺分泌を、ピロカルピン（２０μｇ／マウス）を用いて誘導し、パスツールピペットを用いて、特定の日に唾液を集める。前記４ａで記載のドットブロット手法により、２倍の連続希釈物の分析を決定する。種々のＶ３ループ発現免疫原に対する特異的応答の検出、すなわち耳下腺分泌は、Ｆ−ｍｏｃ法によりＭｉｌｉｇｅｎ９０５０ペプチド合成機で合成したＶ３ループペプチドを用いて滴定する。１００μｌの被覆緩衝液（０．１Ｍの重炭酸緩衝液〔ｐＨ９．６〕）中の１μｇの合成ペプチドを、Ｉｍｍｕｌｏｎ２マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートする。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回ウエルを洗浄し、次いで、連続希釈（２倍）唾液を、各３連のウエルに添加する。３７℃で２時間インキュベーション後、洗浄緩衝液で３回ウエルを洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスイムノグロブリンＡまたはＧ（重鎖および軽鎖特異的）を、１：１，０００希釈で添加し、３７℃でもう１時間インキュベートする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回ウエルを洗浄後、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）を基質として添加し、室温で３０分間インキュベートする。各ウエルの光学密度（ＯＤ）を、４１０ｎｍで酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）リーダーで読む。本発明の手法および分析のより詳細な記載に関しては、参考文献１４３〜１４５を参照されたい。
ｂ．免疫細胞化学：冷凍ミクロトームを用いて、標準シリコン化（silinized）スライドグラスに付着させて、遺伝的免疫マウスの急速凍結（液体窒素）肺、結腸、空腸および膣組織から、５ミクロンの凍結切片を調製する。ＨＩＶｅｎｖ決定基に特異的な粘膜抗体を示すために、各切片を、Ｈ９／IIIＢ細胞溶解物の１：１００希釈物（１：１００：：ＲＩＰＡ：Ｔｒｉｓ生理食塩水）と３０分間インキュベートする。ＴＥ緩衝液で切片を十分洗浄し、１００μｌのＨＩＶＩＧの１：１００希釈物と共にインキュベートする。ＴＥ緩衝液で十分洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いてヒトＩｇ（ＨＩＶＩＧ）の結合を検出し、肺および膣切片におけるマウス抗−ＨＩＶ粘膜抗体のＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出で、ならびに空腸および結腸における抗−ＨＩＶ粘膜抗体の検出のためにフルオレッセイン結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いて発現する。アルカリフォスファターゼまたはフルオレッセイン結合ヤギ抗−マウスＩｇＡを用いて、凍結切片における粘膜ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を可視化する。
６）ＨＩＶ発現標的に対する細胞傷害性リンパ球活性（ＣＴＬｅｎｖ）の分析
初代ＨＩＶ単離物で感染させたＨ／Ｄd細胞株または予備的なデータとして早期に記載したようにネズミＢＣｅｎｖ株（ＨＩＶ発現）を用いて、ＣＴＬｅｎｖを定量する。非感染Ｈｕ／ＤdおよびＢＣｇａｌ（ｂ  ガラクトシダーゼ発現）を、それぞれ対照として用いる。ＰＢＳ中の１５０μｌのＮａ251ＣｒＯ4（１ｍＣｉ／ｍｌ、Dupont/NEN製のグラム当たり４００〜１２００Ｃｉの比活性のＣｒ）を有するＲＰＭＩ１６４０中１．５ｘ１０6細胞を５％ＣＯ2下、４５分間インキュベートすることにより、標的細胞に51Ｃｒを細胞内に入れる。標識された細胞を、冷ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで３回洗浄し、細胞傷害性測定のために、氷上に保つ。Hypaque-Ficolにより単離したマウス脾臓単核細胞を、１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１のエフェクター：標的比で、標的細胞（１００μｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ中１０4細胞）に添加し、５％ＣＯ2下、３７℃で４時間インキュベートし、遠心分離し、ガンマカウンターで１００μｌを計数する。対照標的細胞を、５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて溶解し、最大放出値および％細胞傷害度＝＼｜ｆ（測定放出−自発放出、最大放出−自発放出）ｘ１００により計算された細胞傷害度を得る。
７）組織中の形質転換ＤＮＡｅｎｖの持続性の分析
最初の形質転換部位組織を、形質転換後の時間を関数として集め、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で一部を溶解し、１０００ｘｇで遠心分離して不溶性の細胞の破片を除去し、上清を取って、１００℃で５分間加熱する。ＤＮＡｅｎｖの分析は、６１６０〜７３５８ｂｐに相当する１２００ｂｐのＤＮＡ産物を生じるＥＤ５（５’−ＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＴＧ）およびＥＤ１２（５’−ＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧ）プライマーを用いるＶ３〜Ｖ５領域のＰＣＲ増幅を使用する。５０μｌ容量におけるこの遺伝子産物の標準条件は、９５℃およびワックスビーズ「ホットスタート」で５分間のインキュベーション後のサイクル開始を伴う、９４℃６０秒間、５５℃６０秒間および７２℃１２０秒間の工程間に１秒のランプタイムを有する３５サイクルである。ＰＣＲ反応は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ中で０．２μＭの各プライマーを用いた。鋳型として、２〜１０μｌの細胞溶解物を用いる。増幅ＤＮＡを、ＴＢＥ緩衝液（８８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、８９ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１２０ボルトで１時間、１．２％アガロースゲルまたは６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離かつ同定する。ＤＮＡのバンドを、臭化エチジウム染色およびＵＶ光検出により同定する。プライマーの特異性は、ｐＮＬ４−３プラスミド由来ＤＮＡおよびＡＣＨ−２細胞（陽性対照）から得た全ゲノムＤＮＡを用いることにより、確認する。
８）ＤＮＡｅｎｖ形質転換細胞型のin situ分析
高い特異性の好適なプローブを用いるＰＣＲ増幅ＤＮＡのin situハイブリダイゼーションは、別な方法では検出できないであろう正常細胞構造における形質転換ＤＮＡｅｎｖの検出を可能にする。形質転換組織由来の生検標本を、非架橋性水溶性固定液［Strekk Tissue Fixative（STF）］中、１時間固定し、パラフィン組織ブロック中に埋めて、切片をポリリシン被覆スライドグラスにマウントし、日常的なＨ＆Ｅ組織学用に作製する。ＰＣＲ増幅を行うために、スライド当たり３つの切片を含む４μｍの切片を、キシレンでの連続洗浄により脱パラフィンし、累進的にアルコール溶液で希釈する。脱パラフィンしたスライドを、原形質膜のプロテアーゼＫ浸透（１０μｇ／ｍｌ、ＲＴで２０分間）に付す。次いで、膜浸透スライドそれぞれを、Perkin-Elmer In Situ PCRスライドPrep装置の熱い載物台（５℃＞プライマーの融解温度）に置く。対照として２つの切片（すなわち、１つは陰性対照としてプライマーを欠失したもの、および２つめは膜透過に関する陽性対照としてＦ−アクチン等のハウスキーピング遺伝子増幅を用いたもの）を用意する。溶液ＰＣＲに関して最適の適当なイオンおよびｐＨ（すなわち、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中ＭｇＣｌ2、ＫＣｌ）ならびに７．５ユニットのＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）と前記溶液ＰＣＲのためのプライマーを含むが、５’−ビオチン（ＤＮＡ  Ｃｙｃｌｏｎｅで調製）とハウスキーピング対照のためのプライマーを含む３５μｌのＰＣＲ混合物。各切片を使い捨てのプラスチックチャンバーおよび加熱シンクとして役立つ外部の金属クランプで密封する。引き続いて、各調製スライドをスライドPrep装置の温度で保温し、１０枚のスライド収容量を有するIn Situ PCR Cyclerに移す。温度サイクル時間は、溶液ＰＣＲを用いて予め確立したものである。この手法は、手法の準備の間の非特異的プライマー結合およびポリメラーゼ伸長を最小にするホットスタートを提供する。特異的ＤＮＡ配列のin situ増幅後、５’−ビオチンを含む増幅ＤＮＡの特異的配列を検出するために、アルカリフォスファターゼ結合ストレプアビジン（strepavidin）により検出を提供する。水溶性基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４クロロ−３’−インドイルホスフェート  ｐ  トルイジン）は、酵素触媒基質加水分解部位で沈殿し、形質転換細胞の青色染色が生じる。これは、最適な作業のためにPerkin-Elmer In Situ PCR装置を必要とする新規な技術である。現在、本発明者らはこの装置を注文中であり、近い将来、契約配給する。本発明者らは、限定in situ ＰＣＲ実験と同様にヒトＰＢＭＣｓで溶液ＰＣＲ実験を行う。本発明者らは、この技術水準の方法論および装置に適用させることにおいてはほとんど困難さを予想しない。
９）インビボ形質転換ＤＮＡの毒性
筋肉組織の遺伝的免疫に必要な大量のＤＮＡと比べて、容易なＤＮＡおよびボリスティックＤＮＡ形質転換法は少量のＤＮＡを使用し、形質転換細胞は持続的に脱落しながら組織を再生中であるけれども、ＦＤＡは、疑う余地なく、ＤＮＡ候補免疫原のいかなるフェーズＩ臨床試験でも承認に先立ち、急性および慢性毒性に関するプラスミドベクターの毒性試験を要求するであろう。慢性毒性の最大の可能性は、ＤＮＡに対する抗体の発現である。本発明者らは、プラスミドベクターＤＮＡに対する抗体の発現に関して、ペプチド抗原において既報のように、ＩｍｍｕｎｏｌｏｎプレートにＤＮＡを付着させ、アルブミンでブロックしたウエルを形質転換動物由来の血清に曝すＥＬＩＳＡ型を用いてマウス、ラット、モルモットおよびラビットをモニターする予定である。ＤＮＡに対する抗体結合は、アルカリフォスファターゼ結合抗−マウス（またはラット、モルモットまたはラビット）Ｉｇにより検出する。定量は、基質過剰の条件下（すなわち、０次カイネティックスを生じる）での酵素量−対照動物酵素量に基づいている。
本出願を通して、種々の刊行物が挿入番号により引用される。これらの刊行物に関する全ての引用を以下に示す。これらの刊行物の全体の開示は、本発明に属する技術水準をより完全に記載するために、参照により本願発明に取り込まれる。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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