(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
II型コラーゲン、プロテオグリカン及びＩ型コラーゲン含有軟骨膜を含む脊椎動物由来の肉及び骨のないコラーゲン組織からＩ型コラーゲン及び他の不純物のないII型コラーゲンを含む産物を得るための方法であって、
（ａ）上記膜を切断または緩めるのに十分な時間、酸性プロテアーゼを含む酸性溶液と上記組織を攪拌と共に接触させ、Ｉ型コラーゲンのない上記組織を回収する工程；及びその後
（ｂ）プロテアーゼ：組織の重量比が0.05％-5％の範囲内での中性プロテアーゼを含む中性のpHの溶液と上記組織を、プロテアーゼが上記組織に含まれるプロテオグリカンを分離するのに十分な時間、攪拌と共に接触させ、Ｉ型コラーゲンとプロテオグリカンの両者がない上記組織を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
Ｉ型コラーゲンのない上記組織が、上記中性のｐＨの溶液と接触させる前に微粉化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記軟骨のソースがチキン胸骨である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記酸性プロテアーゼがペプシンである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記ペプシンの濃度が上記酸性溶液のリットル当たり100mgから500mgである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記酸性溶液の酸性化する試薬が0.5M酢酸である請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記工程（ａ）の時間が12時間から72時間継続する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記工程（ａ）の時間が24時間から48時間継続する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記工程（ａ）の接触が4℃から37℃の温度で実施される請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記工程（ａ）の接触が20℃の温度で実施される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記工程（ｂ）のプロテアーゼがキモトリプシン、パンクレアチン、パパイン、フィシン、キモパパイン、膵ペプチダーゼ、及びトリプシンよりなる群から選択される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記工程（ｂ）のプロテアーゼがトリプシンである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記トリプシンが0.8％の濃度で存在する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記工程（ｂ）の時間が8時間から36時間継続する請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記工程（ｂ）の時間が15時間から20時間継続する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記工程（ｂ）の接触が4℃から35℃の温度で実施される請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記工程（ｂ）の接触が4℃の温度で実施される請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は生のII型コラーゲン含有組織を隣接したＩ型コラーゲン含有組織(軟骨膜)から分離するための、さらに結果として生じたII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを除去するための、生のII型コラーゲン含有組織の加工法に関する。両方法は精製されたII型コラーゲンを生産するための工程での前処理として用いられる。さらに特に、本発明はII型コラーゲン含有組織をＩ型コラーゲン含有組織の除去を容易にするためのペプシンのような一つのプロテアーゼを用いて処理し、それからII型コラーゲン抽出の前にプロテオグリカンを除去するためのトリプシンのようなもう一つのプロテアーゼで処理する方法に関する。
発明の背景
コラーゲンは哺乳動物、鳥類、及び魚類の軟骨及び他の結合組織の主要な組成物である。それはグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの高含有量を持つことによって特徴付けられる。構造的には、全てのコラーゲン分子がGly-X-Yという繰り返しアミノ酸配列を含むトリプルストランドのヘリックスドメインを含み、そこではプロリンがX位に頻繁に見出され、4-ヒドロキシプロリンがY位に頻繁に見出される。ヘリックスはα鎖と呼ばれる3のポリペプチドから成り、それぞれはＩ-III、Ｖ、及びＸＩ型繊維形成コラーゲンでは長さにおいて約1000アミノ酸である。これらの鎖はおよそ300nmの長さで1.5nmの直径のスーパーヘリックス構造を形成するために互いに巻き付いている(Petruska,JA及びHodge,AJ,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,51:871,1964)。
今日では19の異なるコラーゲンが同定されており、それぞれは異なる遺伝子にコードされている(Prockop,DJ及びKivirikko,KI,Ann.Rev.Biochem.,64:403-434,1995)。これらのコラーゲンは、その形態または他の構造的特徴に依存して異なるクラスに分類できる。これらの中で最もよく特性指摘されているのがＩ型、II型、III型及びIV型コラーゲンである。Ｉ、II、及びIII型は結合組織において見出される主要なコラーゲンタイプである(Miller,EJ,Collagen Types:Structure,Distribution,and Functions,In:Collagen,Volume I-Biochemistry, ME Nimni編,CRC Press,Boca Raton,FL,1988,第五章、pp.139-156)。これら3のうちでＩ型コラーゲンは最も有名である。IV型コラーゲンは基底層でシート状メッシュワーク内に集合してもっぱら見出され、それは該シート状メッシュワークの主要な部分を構成している。II型コラーゲンの多数は軟骨構造に見出される。それはまた目の硝子体にも見出される。
脊椎動物組織(例えば軟骨)からのII型コラーゲンの抽出は、コラーゲンに結合しているプロテオグリカンの除去によって容易である。プロテオグリカンは全ての結合組織の「基質」を形成し、そこに結合組織繊維が埋め込まれている物質である。コラーゲンの抽出の前に軟骨からプロテオグリカンを除去するための様々な方法が本分野で用いられており、その多くは無機及び有機塩類の水溶液を用いている。コラーゲン抽出物からのII型コラーゲンの精製には、一般的にＩ、IX、ＸＩ型コラーゲンからII型コラーゲンを分離するために特異的な塩沈降が含まれる。ＩおよびII型コラーゲンは酸性塩沈降において共沈降し、IX及びＸＩ型コラーゲンと分離し得る。しかしながら中性塩沈降ではII型及びＩ型コラーゲンの効果的な分離が必要とされる。II型コラーゲンの精製は、もしＩ型コラーゲン含有膜が抽出及び精製の前に胸骨(または他の軟骨)ソースから除去されれば、より容易になされる。該分離は軟骨ソースから膜(軟骨膜)を手で剥ぎ取ることによって以前の技術では成し遂げられている(Butler,WT及びReese,CA,Preparation of TypeII-Collagen,In:Immunochemistry of The Extracellular Matrix,Volume Ｉ.Methods,H.Furthmayr編,CRC Press,Boca Raton,FL,1982 pp.55-60)。これは実験室レベル工程であり、II型コラーゲンのラージスケール調製には実践的ではない。さらにＩ型コラーゲンがたくさんのII型コラーゲンを含有した調製物から除去されることを確立するためのさらなる加工工程が必要があり、結果として精製II型コラーゲンの収量が減少するため、該除去では不十分である。該加工工程には中性pH溶液からＩ型コラーゲンを選択的に沈降するための約2.5Mの濃度での塩化ナトリウムの使用、及び中性溶液からII型コラーゲンを選択的に沈降するための約4.0Mの塩化ナトリウムの使用が含まれる。大量の固体の塩化ナトリウムがさらなる加工工程においてこれらの沈降のため必要とされる。II型コラーゲン産物におけるＩ型コラーゲンの残余レベルは、0.5%から5.0%の範囲であろう。本発明は軟骨膜の高く効率のよい除去のための方法を提供し、典型的には1%より少ないＩ型コラーゲンのみが最終沈降物に含まれるようになる。
本発明は軟骨膜の大半を部分的に切断し除去するために、そして緩やかに剥離されたものをこのＩ型コラーゲン膜の実質的に完全な、または完全な除去を引き起こすであろうように残りの部分を緩めるために、ペプシンのような酸性プロテイナーゼを用いる方法を開示する。軟骨膜除去はII型コラーゲンを精製するために必要とされる数多くの加工工程を減少し、それによってII型コラーゲンの調製を単純化し加工コストを減少する。酸性プロテイナーゼは組織からコラーゲンを抽出するために決まって用いられているが、一つのコラーゲンタイプから第二のコラーゲンタイプを別々に分離するためには用いられていない。II型コラーゲンはプロテオグリカンによって「保護」されており、それによってこの前処理の間該酵素によって有意に切断または抽出されないので、該別々の除去は特に胸骨組織のような軟骨組織からII型コラーゲンを抽出する工程に適用される。
一度軟骨膜が除去されると、軟骨組織はプロテオグリカンを除去するために機械的に粉砕され処理される。プロテオグリカンはさらなるII型コラーゲン抽出の前に除去されねばならない。以前の技術では、プロテオグリカンは一般的に無機または有機塩類を用いて抽出されていた。1から5モル(M)の濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化セシウムといったアルカリメタルハロゲン化物を含む溶液は、組織中に初めに存在する全ヘキスロン酸のわずか15-20%を抽出できるだけである(プロテオグリカンの構成要素である残余のヘキスロン酸はプロテオグリカン抽出効率の基準として用いられる)(Mason,RM及びMayes,RW,Biochem.Journal,131:535-540,1973)。臭化リチウム(4M)及び塩化リチウム(6M)は、より効率的なプロテオグリカン抽出試薬であり、軟骨からヘキスロン酸の70-80%の抽出に作用できる。しかしながらリチウム塩類は比較的高価であり、その使用は経済的に魅力がない(特にラージスケール操作においては)。さらに大量のリチウム塩類が抽出の必要があり、リチウム含有溶液は環境への悪い影響を避けるために徹底的に処分されねばならない。
塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化バリウムのようなII属金属ハロゲン化物の水溶液もまた、コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを抽出するための有用性が見出されている。塩化マグネシウム(3M)または塩化カルシウム(2M)のいずれかを用いた軟骨の抽出は、ウシ関節軟骨から全ヘキスロン酸の60-70%の除去を引き起こす(Mason,RM及びMayes,RW,Biochemical Journal,131:535-540,1973)。グアニジン塩酸(3-5M)及び塩化S-メチルイソチオウラニウムのような有機ハロゲン化物は、塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムのそれぞれよりプロテオグリカンの抽出においてより効率的(80-85%)である(Mason,RM及びMayes,RW,Biochemical Journal,131:535-540,1973)。II型コラーゲン含有組織からのプロテオグリカンの抽出効率は、抽出溶液(すなわちハロゲン化物塩)と同時に処理される組織のソースと年齢に依存する。胎児及び新生児組織からのプロテオグリカンの抽出は、大人の組織(典型的にはわずか約60%)と比較して高く効率的である(90%以上)(McNichol,D及びRoughley,PJ,Biochemical Journal,185:705-713,1980)。鼻、腫瘍、喉頭、及び気管の各軟骨からのプロテオグリカンの抽出(85%除去と同程度)は、関節及び膝半月板の各軟骨からのもの(典型的には56-62%)より効率的である(Stanescu,V.,等,Biochem.Biophys.Acta,629:371-381,1980)。抽出効率はまた、用いられる方法、すなわち低塩濃度で数多くの塩抽出か、または高塩濃度で少ない抽出かに影響される。以前の技術で引用されている組織からのプロテオグリカンのいくつかのさらなる抽出方法には以下のものがある：
Cremer等(J.of Immunol.124:2912(1980))は、ヒヨコ胸骨組織からのII型コラーゲンの調製の工程としてプロテオグリカンの除去を開示し、そこでは胸骨はある程度プロテオグリカンを除去するためにリン酸カリウムバッファーのような低イオン強度バッファーを用いて処理され、引き続きコラーゲンを抽出するために酵素:組織の割合が5%でペプシンを用いて処理され、その後II型コラーゲンを精製するためにクロマトグラフィー工程がなされる。
Steven及びThomas(Biochem.J.,135:245(1973))はヒト軟骨の超薄切片を過酸化水素溶液で18時間処理することによって軟骨から不溶性コラーゲンを調整する方法を記述する。それから過酸化水素処理軟骨を水で徹底的に洗浄し、1%塩化ナトリウム溶液で洗浄し、そして組織に対する酵素の割合が1%のトリプシンで切断を受けさせる。過酸化水素工程はトリプシンによるコアタンパク質の分解の前にプロテオグリカンのグリコサミノグリカン側鎖を脱重合化するために実行された。
Kempson等(Biochim.Biophys.Acta,297:456-472,1973)は、ヒト大腿部関節丘をコンドロイチナーゼとトリプシンを用いた処理に引き続いて、インキュベーション溶液内にウロン酸を放出する方法を記述する。トリプシンは37℃で48時間のインキュベーション後、軟骨ウロン酸の94%まで放出するのに効果的である。
他のもの(Heinegard及びHascall,Arch.Biochem.Biophys.,165:427-442,1974、そしてRoughley及びBarrett,Biochemical Journal,167:629-637,1977)は、トリプシンが軟骨組織から抽出されたプロテオグリカンを分解するのに効果的であることを示している。
Trentham等(J.of Exp.Med.,146:857(1977))は、2M塩化マグネシウムを用いたプロテオグリカン抽出の後、組織に対する酵素の割合が2%でペプシン切断、切断物の遠心分離、そしてDEAEセルロースカラムに上清を乗せ、Tris/NaClバッファーを用いたII型コラーゲンの溶出を含む、チキン剣状軟骨からのII型コラーゲンの調製法を開示する。
Bayliss等(Biochem.J.,169:123(1978))は、通常ヒト関節軟骨からのプロテオグリカンの抽出を開示し、そこでは軟骨をグアニジン塩酸(4M)で処理し、続いてCsCl密度遠心分離でコラーゲンから軟骨プロテオグリカンを分離する。
上記のプロテオグリカン抽出法は、低イオン強度溶液でのホモゲナイゼーションによる軟骨の機械的破壊、または塩化マグネシウム、塩化カルシウムあるいは塩酸グアニジンのような塩類の濃縮溶液による化学的抽出に主に依存している。これらの方法は軟骨からプロテオグリカンを抽出するが、それらは比較的不十分である。さらにこれらの方法は、残余の塩類を除去するためプロテオグリカン枯渇軟骨ペレットの徹底的な洗浄に引き続き多量の塩類の使用を必要とし、それは多量の塩類の調達と処理に関する価格、及びこれらのさらなる工程に必要とされる高価な工程のため、該方法のコストを増大させる。以前の技術の方法のもう一つの欠点は、ハロゲン化物塩類を用いて処理された軟骨から生産されたII型コラーゲン調製物の純度に不一致が存在することである。
II型コラーゲン含有軟骨からＩ型コラーゲン含有軟骨膜を除去する本方法、及びII型コラーゲンからプロテオグリカンを分離する本方法は、以前の技術の方法よりも驚くべきそして期待していなかった利点を持つことが見出され、それは1）II型コラーゲンの矛盾のない一回毎の収率と純度、2）引き続くII型コラーゲン含有組織からのプロテオグリカンの抽出のより大きい効率;そして3）与えられた量のスタート物質(例えばチキン胸骨)からのII型コラーゲンの増大した収率を制限することなく含む。
ここで用いられている以下の単語は以下のものに帰する意味を持つ：
0003935938.tif 000002
発明の目的
チキン胸骨からＩ型コラーゲン含有軟骨膜の除去に対する効果的な方法を提供することが本発明の目的である。Ｉ型コラーゲンから実質的にフリーのII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを効率よく除去する方法を提供することも本発明の目的である。特にII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを除去する方法を提供することが本発明の目的であり、それは少なくとも以下の一つを伴う:
(a）容易に処分可能な抽出試薬の少量で低価格な量を必要とする;
(b）II型コラーゲンからプロテオグリカンの容易な分離を提供する;そして(c）精製産物の高く矛盾のない収率を引き起こす。
動物組織からプロテオグリカンとＩ型コラーゲン物質の両者が実質的にフリーであるII型コラーゲンを得るための改良された工程を提供することが本発明のもう一つの目的である。
発明の概要
本発明の第一の面は、ペプシンのような酸性プロテイナーゼの存在下で酸性溶液で非加工II型コラーゲン含有組織を処理し、II型コラーゲン含有組織からＩ型コラーゲン含有組織の分解と分離を引き起こすのに十分な時間で緩やかな攪拌に該混合物を受けさせることを含む、II型コラーゲン含有動物組織を含んだＩ型コラーゲン含有組織を除去する改良された方法に向けられている。酸性コンディションで活性を持つ他のタンパク質溶解性酵素の非制限的な例としては、レニン(3.4.3)及び酸性カテプシン(B及びD)が含まれる。
加えて改良された方法は、中性プロテイナーゼで結合組織を処理することによってＩ型コラーゲンから実質的にフリーなII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを抽出及び除去し、不溶性II型コラーゲンから可溶性プロテオグリカンを分離するための遠心分離が引き続くことに対して見出されている。一つ以上の様々なプロテアーゼがII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを除去するために用いられ得、それにはトリプシン(3.4.4.4)(好ましい)、キモトリプシンA(3.4.4.5)、キモトリプシンB(3.4.4.6)、膵ペプチダーゼB(3.4.4.7)、カテプシンC(3.4.4.9)、パパイン(3.4.4.10)、キモパパイン(3.4.4.11)、及びフィシン(3.4.4.12)が含まれる(カッコ内の数はEnzyme Commissionリファレンスナンバーである)。
好ましい実施態様として、本発明はII型コラーゲン含有組織及び近接したＩ型コラーゲン含有組織を含む動物組織からII型コラーゲンを精製するための方法を提供し、該方法は第一に上述したようにＩ型コラーゲン含有組織を除去し、引き続き最初に記載した方法にしたがってプロテオグリカンを除去することを含む。
発明の詳細な説明
本発明の方法が好ましくは適用される組織は、脊椎動物由来の胸骨、椎間板、脊索、鼻、腫瘍、喉頭、及び気管の各軟骨のような構造的繊維、特にII型コラーゲンを含む組織である。それらが多く入手可能であるので、チキン軟骨組織が用いられており、特にチキン加工工場から入手可能なチキン胸骨の形態が好ましい。該組織は本発明の方法によって加工される前は4℃以下で保存されるのが好ましい。該生の組織はいかなる残存している肉または骨を除去するために切り取られる。II型コラーゲン含有組織としてチキン胸骨が用いられた場合、該組織のいかなるさらなる工程の前に、Ｉ型コラーゲンを多く含有している軟骨膜を除去することが好ましい(そして本発明の重要な面を構成する)。ほとんどの軟骨組織は繊維状軟骨膜によって取り巻かれている。例外は関節軟骨に存在するようであり(RA Stockwell,Biology of Cartilage Cells,Cambridge University Press,Cambridge,England,1979)、そして関節軟骨がII型コラーゲンのソースとして用いられた場合には、Ｉ型コラーゲンを除去する工程が省略される。もちろん以前の技術に教示されているようなピンセットやメスを用いて軟骨膜を除去することも可能である。しかしながら好ましくは、非加工の肉及び骨がフリーな胸骨がペプシンのような酸性コンディションの下で活性なタンパク質分解酵素の存在下で、希釈酸性溶液(例えば酢酸、クエン酸、塩酸等)に置かれ、約12から72時間緩やかに攪拌される。胸骨は数日間酸性溶液で貯蔵され得るが、ペプシンが酸性溶液中の胸骨の浸漬の時にすぐに加えられた場合、軟骨膜の除去は実質的により容易になる。コラーゲン組織は塩酸よりも高程度で酢酸中で溶け、これは酸性プロテアーゼの働きを容易にするので、酢酸が好ましい。
一般的に約0.05Mから約1.0Mの濃度で用いられる希釈有機酸溶液が好ましく、ペプシンは100mg/リットルから500mg/リットルで加えられる。酸性溶液は好ましくは約0.25から0.75M、好ましくは約0.5Mの濃度の酢酸である。酸性溶液中の典型的なペプシンの濃度は、約200から500mg/リットル、好ましくは約300から400mg/リットルの範囲である。ペプシンは、芳香族またはジカルボキシルアミノ酸残基に隣接するペプチド結合を持つアミノ酸を含むペプチドを加水分解する酸性プロティナーゼである。付着したＩ型コラーゲンを除去するための軟骨ソース(チキン胸骨のような)の処理に対して、軟骨組織からII型コラーゲンの有意な量の切断と抽出を引き起こさないで、Ｉ型コラーゲン膜を部分的に分解、軟化、そして緩めるために、十分な活性のペプシンが加えられるべきである。Ｉ型膜を除去するためのペプシン活性の十分な量は、軟骨組織の視覚による観察によって測定される。Ｉ型膜の分解、軟化及び緩めることは、約12から約72時間で成し遂げられるべきである。
ペプシンを用いた添加物の代わりにまたはそこにおいて用いられ得る酸性コンディションで活性を持つ他のタンパク質分解酵素には、レニン(3.4.4.3)、及び酸性カテプシン(B,D)が含まれる。ペプシンと同様のタンパク質分解特異性を持つ酵素であるレニンがＩ型コラーゲン含有膜を除去するために用いられる場合、それは約300から700mg/リットル、好ましくは約400から600mg/リットルの濃度で用いられるべきである。カテプシンDはウシ及びウサギ脾臓から精製されているカルボキシエンドプロテイナーゼであり、ペプシンと同様の特異性を示す、カテプシンBはチオエンドプロテイナーゼである。軟骨膜を除去するために必要とされるカテプシンB及びDの濃度は、ペプシン及びレニンのものより高く、約400から約1000mgのカテプシン(B及びDのそれぞれ)/リットルの範囲である。Ｉ型コラーゲン除去酵素のために必要とされる濃度の範囲はその活性に依存し、該酵素のそれぞれのソースに対して測定される必要がある。酵素活性の測定は当業者に対して容易である。
II型コラーゲン含有組織のペプシン処理の間、該溶液は約4℃から約28℃で維持され得るが、好ましくは約20℃で維持される。該組織はペプシン処理の間攪拌されるべきで、該攪拌は好ましくは酸性液体中に懸濁されたII型コラーゲン含有組織を保つ速度での攪拌を含む。該攪拌速度は混合容器の容量とユニット容量当たり加えられた胸骨の量に依存する。緩められた膜は攪拌ロッドに巻き付き、該ロッドから容易に引き離される。典型的なパイロットスケール工程では、ほとんどの肉と骨が除去された300のチキン胸骨(およそ25ポンド)が、溶液のリットル当たり400mgのペプシンを含む60リットルの希釈有機酸に混ぜられる。該胸骨はLightnin Mixerのような混合器を用いて約250-350rpmで、または溶液中の胸骨の懸濁を許容し、容器の底に胸骨が動かず止まっている状態にないような速度で溶液中で分散される。
軟骨膜は典型的には緩められて壊され、胸骨から分離され、そして攪拌物に巻き付き、それから容易に除去され得ることができよう。軟骨膜を除去する処理の後、該胸骨は残余の膜を除去するために水で洗浄されリンスされ、膜粒子が緩められる。該膜小片は容易に同定され、洗浄は全ての該小片が完全なII型コラーゲン含有組織から洗い流されるまで継続されるべきである。時折、水での洗浄とリンスでは除去されないいかなる緩められてはいるが未だ付着している軟骨膜を除去するために、例えば機械的な手段を用いて緩められた膜を拭き取ることや、またはII型コラーゲン含有組織を緩やかな研磨用の動きをする第二の混合系に置くことが必要であろう。
それからほとんど全ての軟骨膜が除去されているII型コラーゲン含有組織を微粉化を容易にするために凍結させる。該凍結組織をMicron Powder Systems Mikro-Bantam Pulverizer内に装填する。-20℃以下に温度を保つグラインディングチェンバー内に液体窒素を継続的に流す。胸骨を0.062インチスクリーンを通して均一なパウダーに微粉化する。該パウダーを約-15℃で貯蔵し得る。該パウダー化組織を7-9の範囲のpH、好ましくはpH8を提供するバッファーと混ぜる。該バッファーは好ましくはTrisバッファーである。スラリー中の該パウダー化組織の量は、約1から約100グラム/リットルの範囲であり、好ましくは約20から40グラム/リットル、そして最も好ましくは約25グラム/リットルである。該スラリーに対してプロテアーゼ、好ましくはトリプシンを加える。代わりに(またはその添加物中に)他の中性プロテアーゼで以下に含まれるのもを用い得る:キモトリプシンA、キモトリプシンB、膵ペプチダーゼB、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、そしてフィシン。トリプシンをバッファー内に溶解し、それから約0.005から0.05%、好ましくは約0.01から0.025%、そして最も好ましくは0.02%の最終濃度で加える。トリプシンの効果的な濃度は酵素調製物の特異的な活性に依存する。一般的にパウダー化組織に対する該プロテアーゼの重量比は、約0.05から約5%の間であるべきであり、好ましくは約0.8%であるべきである。組織に対する同様な酵素の重量比が、パパイン、キモトリプシン、膵ペプチダーゼ、キモパパイン、そしてフィシンを用いた場合にも用いられる。正確な量は与えられたロットの特異的な酵素活性及び酵素のソースに依存し、酵素のユニット重量当たりの特異的な活性を測定し、それから上述したトリプシン活性と大体等しい酵素活性の量を用いることによって当業者に容易に突き止められよう。
プロテアーゼの添加後、該スラリーを約4℃から約35℃で、好ましくは約4℃で、8から36時間、好ましくは約15から20時間、そして最も好ましくは約17時間攪拌する。トリプシンは高い純度の形態で容易に入手可能であり、比較的安価であるため、トリプシンが好ましい酵素である。
攪拌後、該スラリーを可溶層から非分解粒子を分離するため遠心分離にかける。該上清を捨て該ペレットを再懸濁してバッファーで洗浄し、引き続き第二の遠心分離にかける。該上清を再び捨て、他の酵素を用いてさらに切断され典型的には>99%II型コラーゲンを含むパウダーに精製されるペレットを得る。Ｉ型コラーゲン不純物の分析は周知の方法にしたがって逆相HPLCによってなされ、典型的には1%以下である。プロテオグリカン不純物のレベルも典型的には1%以下である。
プロテオグリカン抽出に引き続き、II型コラーゲン含有組織を、アニオン交換クロマログラフィーと高塩工程を削除することを除いて、Trentham,1977に記述されているもののような方法を用いてさらに抽出し精製する。残余の酵素を洗浄及び/または透析またはジアフィルトレーションによって除去し得る。前述のII型コラーゲン含有産物は、研究目的の細胞培養において、または例えばU.S.P.第5,399,347号に教示されているように慢性関節リウマチの治療において有用な経口製薬学的処方の調製において有用であろう。
全ての引用されている文書は参考として全体として取り込まれる。矛盾ある場合には本開示が定義を含めて優先するであろう。
以下の実施例は説明のための方法としてのみ与えられ、制限するために構成されているものではない。
実施例1:凍結冷製粉チキン胸骨からのII型コラーゲンの抽出
チキン胸骨を地元のUSDA検査チキン胸脱骨工場から得た。胸骨をさらなる加工まで冷蔵または冷凍しておいた。胸骨をいかなる肉及び骨をも除去するために刻み、それから0.5M酢酸溶液に置き、それに対してペプシンを400mg/リットルの溶液で加えた。該胸骨をペプシン含有酸性溶液に懸濁し、緩んだ残余の肉と軟骨膜を除去するためLightninミキサーセットを用いて280-350rpmで2日間より長く攪拌した。該胸骨を洗浄し、水気を取り、試験し、そしていかなる残余の軟骨膜をも緩やかに拭き取って除去した。クリーンな胸骨を引き続き凍結した。該凍結胸骨をMicron Powder Systems Mikro BantamTM Pulverizer内で微粉化し、-20℃以下に温度を維持するために液体窒素を継続的に流した。パウダーサイズは<0.062インチであった。このパウダーを加工の前に-15℃で凍結して貯蔵しておくとよい。該パウダー胸骨をTrisバッファー,pH8.0と混ぜ、それに対してトリプシンを0.02%の濃度で加えておいた。このスラリーを4℃で17時間攪拌した。トリプシンによって分解されるプロテオグリカンを該スラリーを遠心分離することによって除去し、引き続き0.25容量のバッファー、すなわちTrisバッファー,pH8.0または脱イオン水を用いて残余の沈降物を洗浄し、引き続き第二の遠心分離を行った。結果として生じた沈降物は、不溶化した非溶解形態のII型コラーゲンを含んだ。この沈降物は99%より高い純度に容易に精製され得る可溶性II型コラーゲンを生産するために酵素学的に容易に切断可能であり、その純度では製薬学的使用に適している。
実施例2:凍結冷製粉チキン胸骨からのII型コラーゲンの抽出
チキン胸骨を地元のUSDA検査チキン胸脱骨工場から得る。胸骨をさらなる加工まで冷蔵または冷凍しておく。胸骨をいかなる肉及び骨をも除去するために刻み、それから0.04M塩酸溶液に置き、それに対してレニンを500mg/リットルの溶液で加える。該胸骨をレニン含有酸性溶液に懸濁し、緩んだ残余の肉と軟骨膜を除去するためLightninミキサーセットを用いて280-350rpmで2日間より長く攪拌する。該胸骨を洗浄し、水気を取り、試験し、そしていかなる残余の軟骨膜をも緩やかに拭き取って除去する。クリーンな胸骨を引き続き凍結する。該凍結胸骨をMicron Powder Systems Mikro BantamTM Pulverizer内で微粉化し、-20℃以下に温度を維持するために液体窒素を継続的に流す。パウダーサイズは<0.062インチである。このパウダーを加工の前に-15℃で凍結して貯蔵しておくとよい。該パウダー胸骨をTrisバッファー,pH8.0と混ぜ、それに対してパパインを0.04%の濃度で加えておく。このスラリーを4℃で17時間攪拌する。トリプシンによって分解されるプロテオグリカンを該スラリーを遠心分離することによって除去し、引き続き0.25容量のバッファー、すなわちTrisバッファー,pH8.0または脱イオン水を用いて残余の沈降物を洗浄し、引き続き第二の遠心分離を行う。結果として生じた沈降物は、不溶化した非溶解形態のII型コラーゲンを含む。この沈降物は99%より高い純度に容易に精製され得る可溶性II型コラーゲンを生産するために酵素学的に容易に切断可能であり、その純度では製薬学的使用に適している。