(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第３生物実体を検出、確認および定性化又は定量化するテスト媒体において、塩イオンを含む栄養剤媒体と、第１および第２クロモゲンサブストレートと、非クロモゲンサブストレートとを備え、前記第１および第２クロモゲンサブストレートはそれぞれ第１および第２生物実体の存在で沈殿物を形成し、前記非クロモゲンサブストレートは前記第３生物実体および前記塩イオンの存在で沈殿物を形成し、前記テスト媒体内に存在する前記第１生物実体の凝集は第１色であり、前記テスト媒体内に存在する前記第２生物実体の凝集は第２色であり、前記テスト媒体内に存在する前記第３生物実体の凝集は実質的に黒色であり、前記第１生物実体はエーロモナス属およびサルモネラ菌の何れかであり、前記第２生物実体は通常大腸菌であり、前記第３生物実体はＥ.Ｃ（大腸菌）であることを特徴とするテスト媒体。
【請求項２】
前記第１クロモゲンサブストレートは、前記第３生物実体の酵素の存在で前記第１色の沈殿物を形成するが、前記第１色は前記非クロモゲンサブストレートの沈殿物と干渉せず、前記第３生物実体の凝集は実質的に黒色であることを特徴とする請求項１に記載のテスト媒体。
【請求項３】
前記第２クロモゲンサブストレートは、前記第３生物実体の酵素の存在で第４色の沈殿物を形成するが、前記第４色は前記非クロモゲンサブストレートの沈殿物と干渉せず、前記第３生物実体の凝集は実質的に黒色であることを特徴とする請求項２に記載のテスト媒体。
【請求項４】
前記第１クロモゲンサブストレートは、前記第２生物実体に応じて前記第１色の沈殿物を形成し、前記第２色は前記第１クロモゲンサブストレートから形成された前記第１色および前記第２生物実態の酵素に応じて前記第２クロモゲンサブストレートから形成される第４色の合成色であることを特徴とする請求項１に記載のテスト媒体。
【請求項５】
周囲光の下で一般大腸菌、Ｅ.Ｃ（大腸菌）およびテストサンプル中のエーロモナス属およびサルモネラ菌の少なくとも１つを検出、定量化、定性化および分化する方法において、一般大腸菌、Ｅ.Ｃ、エーロモナス属およびサルモネラ菌の少なくとも１つの存在でそれぞれ成分を形成する第１、第２および第３サブストレートを含む栄養剤ベーステスト媒体を設けるステップと、前記第１サブストレートが非クロモゲンサブストレートおよび前記第２および前記第３サブストレートがクロモゲンサブストレートであり、前記テスト媒体中のＥ.Ｃの群体は前記第１サブストレートの存在下で第１色を生じ、前記テスト媒体中の一般大腸菌の群体は前記第２および前記第３サブストレートによる色を合成する第２色を生じ、前記テスト媒体中の少なくともエーロモナス属およびサルモネラ菌の少なくとも１つの群体は前記第２又は前記第３サブストレートの存在下で第３色を生じ、前記各色はそれぞれ識別可能に前記サブストレートを選択するステップと、前記テスト媒体を前記テストサンプルに植え付けるステップと、前記植え付けられた媒体を培養するステップと、該培養された媒体に前記第１色を有する第１群体、前記第２色を有する第２群体および前記第３色を有する第３群体の存在を検査するステップを備え、前記第１群体はＥ.Ｃであり、前記第２群体は一般大腸菌であり、前記第３群体はエーロモナス属およびサルモネラ菌の少なくとも１つであることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記テスト媒体に塩を加え前記第１サブストレートと反応させ前記第１群体の存在で実質的に黒色の水不溶性成分を生成する工程を更に備えることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テスト媒体に第４色を有する第４群体の存在を検査する工程を更に備え、前記サブストレートはエーロモナス属の群体が第３色であり、サルモネラ菌の群体が第４色であり、該第４色は前記第１、第２および第３色から識別可能であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第４色が実質的に青緑色になるように前記サブストレートを選択することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１色が実質的に黒色であるように前記サブストレートを選択することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２色が実質的に青紫色になるように前記サブストレートを選択することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第３色が略赤桃色であるように前記サブストレートを選択することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エーロモナス属の群体が前記第３色となるように前記サブストレートを選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
一般大腸菌、Ｅ.Ｃおよびエーロモナス属およびサルモネラ菌の少なくとも１つを検出、定量化および分化するテスト媒体において、塩イオンを含む栄養剤ベース媒体と、Ｅ.Ｃの存在で第１色の第１水不溶性成分を形成する第１非クロモゲンサブストレートと、一般大腸菌の存在で第２色の第２成分を形成する第２クロモゲンサブストレートと、エーロモナス属、サルモネラ菌およびシゲラの１つの存在で第３色の第３成分を形成する第３クロモゲンサブストレートとを備え、前記第３色は前記第１および第２色から識別可能であり、前記全ての色は識別可能であり、前記第１色は実質的に黒色であることを特徴とするテスト媒体。
【請求項１４】
前記第１サブストレートは、８-オキシキノリン-β-Ｄ-グルクロニド、エスクレチングルクロニドおよびシクロヘキサノエスクレチン-β-Ｄ-グルクロニドよりなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項１５】
前記第１サブストレートは、実質的にβ-グルクロニドよりなることを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項１６】
前記第２サブストレートはα-ガラクトシドおよび前記第３サブストレートはβ-ガラクトシドよりなることを特徴とする請求項１５に記載のテスト媒体。
【請求項１７】
前記第１サブストレートは実質的にβ-Ｄ-グルクロニドよりなり、前記塩イオンと結合して実質的に非拡散性成分を形成することを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項１８】
前記第３サブストレートは一般大腸菌の存在で前記第３色の前記第３成分を形成し、前記第２および第３色は一般大腸菌の存在で合成されて第４色を形成することを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項１９】
前記第３色はエーロモナス属の存在で形成され、前記第２サブストレートはサルモネラ菌の存在で前記第２色の前記第２成分を形成し、Ｅ.Ｃは前記テスト媒体中において前記第１色で指示され、サルモネラ菌は前記第２色で指示され、エーロモナス属は前記第３色で指示され、一般大腸菌は前記第４色で指示されることを特徴とする請求項１８に記載のテスト媒体。
【請求項２０】
前記塩は金属塩よりなり、前記第１成分は水不溶性であり且つ前記イオンおよびＥ.Ｃの酵素と反応して形成され、前記第１色は実質的に黒色であることを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項２１】
前記第１サブストレートはβ-グルクロニドよりなり、前記第２サブストレートはα-ガラクトシドよりなり、前記第３サブストレートはβ-ガラクトシドよりなることを特徴とする請求項１３に記載のテスト媒体。
【請求項２２】
前記第１サブストレートは実質的に８-オキシキノリン-β-Ｄ-グルクロニドよりなり、前記第２サブストレートは実質的に５-ブロモ-４-クロロ-インドリル-α-Ｄ-ガラクトシドよりなり、前記第３サブストレートは実質的に６-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトシドよりなることを特徴とする請求項２１に記載のテスト媒体。
【請求項２３】
エーロモナス属の群体を他の生物実体から検出、定量化、確認および／又は分化するテスト媒体において、第１酵素の存在で第１色の第１成分形成するβ-Ｄ-ガラクトシドサブストレートおよび第２酵素の存在で前記第１色と識別可能な第２色の第２成分を形成可能なα-Ｄ-ガラクトシドサブストレートを含むベース媒体よりなり、エーロモナス属の群体の凝集は前記第１色で指示され、サルモネラ菌の群体の凝集は前記第２色で指示され、Ｅ.Ｃおよび一般大腸菌の群体は前記第１および第２色と識別可能な第３色で指示されることを特徴とするテスト媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はテスト媒体に関し、特に複数の異なる生物資料（biological materials）を含み得るサンプル内の生物資料を検出、定量化、特定および／又は識別するテスト媒体および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バクテリアは、人間、高等動物および植物の各種病気の原因であり、水、飲み物、食物およびその他の有機体等のキャリヤにより伝染されるのが普通である。これら潜在的な獏照り矢のキャリヤをテストするのは極めて重要であり、一般的に「試薬（indicator organisms）」に依存している（Borrego等によるMicrobiol.
Sem.13:413-426,(1998)参照）。例えば、大腸菌（Escherichia coli、以下、E.Cという）は、温血動物の通常の腸内細菌叢の一種である腸内細菌（エンテロバクテリア：Enterobacteriaceae)族のグラムネガティブ類である。そして、その存在は、糞便の汚染（例えば、下水汚物）を示す。E.Cの大部分の種族は、病気の実際の原因ではないが、それらの存在は、コレラ、赤痢、肝炎その他の腸内病気に関連する病原体の存在を示す有力な目安である。従って、E.Cは、糞便汚染の主要な指示生物（indicator organism）であるので、E.Cを他のバクテリアから識別特定する方法は大変有用である。
【０００３】
また、「通常大腸菌（general coliforms）」、特にゼネラシトロバクタ（genera Citrobakuter）と一般に称されている腸内細菌類の他の種族に腸内細菌（Enterobacter）およびクレブシーラ(Klebsiella)は、水、飲み物および食物の品質を示す有力な指示生物であると考えられている。従って、通常大腸菌をE.Cから確認および分化するテストも、極めて有効である。また、エーロモナス属(genus Aeromonas)の各種の種類は、潜在的な病原体であるのみならず、他の指示生物と相関関係があることが判明している（Pettibone等によるJ.Appl.Microbil、85:723-730(1998）参照）。エーロモナス属を類似の腸内細菌科から特定し、分離し且つ計数する最新のテスト方法は、不足し、酵素サブストレートを使用する最新の方法の多くは、生物学的プロファイルが殆ど同一であるので、エーロモナス属を腸内細菌科から分離できない。β-ガラクトシド（β-galactoside）サブストレートによる一般大腸菌を特定する方法は、エーロモナス属を一般大腸菌から分化できないか又は特定の反応抑制剤（Cefsulodin等の抗生物質）を使用するサンプルからエーロモナス属を排除するかの何れかである（Brenner等によるAppl. Envir. Microbio.59:3534-44(1993)参照）。それらは、E.Cおよび一般大腸菌と共にエーロモナス属を分化、確認および計数できない（Landre等によるLetters Appl. Microbiol.26:352-354 (1998)参照）。斯かるバクテリアのタイプを効果的に確認、分化および計数する改良されたテスト方法が必要であり、迅速、正確、使用が容易且つ一層多様性のあるこの分野におけるテスト方法および装置の研究が進められている。
【０００４】
多くのテスト方法が使用され、１以上の指示生物を決定、確認および計数している。これらのテスト方法の幾つかは、微生物の有無を示すのみであり、他のものはサンプル中の１以上の特定生物の定量化を試みている。例えば、有無（又はP／Ａ）テストと称される定性テストは、テストサンプル中の大腸菌およびE.Cの有無の決定に使用される。β‐ガラクトシドサブストレートO−ニトロフェニル-＊-D-ガラクトフィラノシド（ONPG）およびβ‐グルクロニダーゼ（β‐glucuronidase）サブストレート４-メチル-アンブレリフェリル-β-グルクロニド（MUG）をサンプルに接種される。一般大腸菌をE.Cから識別するために、一般的に全ての大腸菌はβ-ガラクトシダーゼを生成し、これに対しE.Cのみがβ‐ガラクトシダーゼに加えて＊-グルクロニダーゼをも生成するという事実に、このテストは依存している。もし何らかの大腸菌（E.Cを含め）が存在すると、ブロス媒体（煮汁）はONPG体に対するがラクトシダーゼ酵素の作用で、拡散性の黄色顔料が解放されることにより黄色に変色する。もしE.Cが存在すると、煮汁は、紫外線を照射することにより、MUG試薬が破壊されグルクロニダーゼ酵素の生成により生じる蛍光性（fluorogenic）色素を解放し、青色蛍光を発する。これらの反応は極めて特殊であり、一般的に大腸菌およびE.Cの存在を単一のサンプルで特定可能にする。このテストの欠点の１つは、両試薬が拡散性の顔料を生成するので、何れかのバクテリアタイプを直接定量化できないことである。他の欠点は、テストサンプル中にエーロモナス属が存在すると、偽の大腸菌反応を行うことである。これの発生を防止することを意図する反応抑制剤が存在しても、これが生じることを示している（Landre等によるLetters Appl. Microbiol. 26:352-354(1998)参照）。また、このテストは、紫外線を発生させるための特殊機器を必要とする。更に、このテストは、大腸菌およびE.Cの検出のみに使用可能である。グルクロニダーゼネガティブである種族のE.C０１５７の如き他の重要な微生物は、検出できないのみならず、他の非ガラクトシダーゼ-グルクロニダーゼ生成微生物も同様である。
【０００５】
Violet Red Bile Agar (VRBA)方法が使用され、テストサンプル内で大腸菌およびE.C両方の定量化を決定する。この方法で使用されたテスト媒体は、胆汁塩（非大腸菌を抑制する）、ラクトースおよびpＨ指示中性赤を含んでいる。大腸菌（E.Cを含む）が媒体内で増殖すると、ラクトースは発酵して酸を生成し、バクテリア群体（コロニー）中で中性赤は、レンガ赤色になる。このテスト結果の解釈は容易ではなく、E.Cの存在を決定するには、明るい緑色のラクトース煮汁発酵、４４．５℃のEC煮汁中での増殖およびEosin Methylene Blue Agar(EMBA)のストリーキング等の確認のための追試を実行しなければならない。
【０００６】
被膜フィルタ（MF）法は、サンプルを通過させるとバクテリアが表面に残るようなミクロ細孔フィルタを使用する。この方法はバクテリアの数が極めて少数であり、十分な個数を得るのに大きなサンプルが必要である場合に頻繁に採用される。次に、フィルタを選択された媒体の表面に載置し、被膜フィルタ上で増殖するバクテリア群体を計数し評価する。この方法は広く採用され且つ適当な試薬および媒体とともに使用すると良好な結果が得られる。この方法の欠点は、高価であり且つ時間を要することである。また、この方法は、固体サンプルおよび高粒子数の場合にはうまく機能しない。このMF法は、本発明で説明する方法と共に使用可能である。
【０００７】
m-Endo法も、E.Cおよび一般大腸菌の量を決定するために使用され、水質テスト方法としてUSEPAで公式承認された方法である。媒体は、一般に被膜フィルタと共に使用され、ユニット（CFU）を形成するE.Cおよび一般大腸菌は、金緑金属光で暗い群体として増殖する。エラー発生率が高いことが判明しているので、典型的な群体は、追加テストで確認する必要がある（Standard Methods for the Examination of water and Wastewater,20th Edition,9-10 & 9-60(1998)参照）。
【０００８】
Most Probable Number (MPN)等の他のテストは、ブロス（煮汁）を含むラクトース（LST,BGLB,EC）を使用し、一般大腸菌およびE.Cの個数を推定するが、エラー発生率が高く、複雑でありしかも結果を得るまでに時間を要する（Evans等によるAppl. Envir. Microbiol.41:130-138 (1981)参照)。
【０００９】
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド (X-gal)試薬は、大腸菌を分化する周知のテスト化合物である。大腸菌により生成されたβ-ガラクトシダーゼ酵素と作用すると、X-galはインジゴ青色の不溶性沈殿物を生じる。X-galは、寒天板等の栄養剤ベース（培養基）媒体と一体化させ、もしサンプルが大腸菌を含むと、大腸菌はインジゴ青色の群体を成長させる。X-galは、上述の如く、拡散性ではなく水不溶性の沈殿物を形成し、テストサンプルを固体媒体内又は上に組み込むとき又は大腸菌を液状媒体で飽和させたパッド上に載せた被膜フィルタ固体媒体上に載せた被膜フィルタ上で大腸菌を増殖させるとき大腸菌の定量決定を可能にするので、ONPG化合物に対して上述した利点を有する。更に、それは紫外線を使用する必要がない。
【００１０】
同様の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド (X-gluc)は、E.Cを確認する周知のテスト化合物である。大部分のE.Cにより生成されたβ-グルクロニダーゼ酵素と作用すると、X-glucは、不溶性のインジゴ青沈殿物を形成する。X-glucは、上述の如く、MUG化合物より利点を有する。即ち、拡散性化合物ではなく水不溶性の沈殿物を形成し、テストサンプルを固体媒体内又は上に組み込むとき、E.Cの定量決定が可能になる。X-glucおよびそのE.C特定作用は、Watkins等によるAppl. Envir. Microbiol.54:1874-1875(1988)に説明されている。類似の化合物であり、E.Cのシャープな青群体を生じるインドキシル-β-D-グルクロニドは、Ley等によるCan. J. Microbiol. 34:690-693(1987)に説明されている。
【００１１】
X-galおよびX-glucは、大腸菌（X−gal）又はE.C（X−gluc）の定量決定にそれぞれ個別に有用であるが、これら指示化合物は、同じ色原体を含んでいるという欠点を有する。従って、これら両者は、同じインジゴ青群体を生じるので、単一サンプルを使用する１回のテストでE.Cおよび一般大腸菌の両方を確認・分化するために一緒に使用することはできない。両方の試薬を使用する者は、X-galのみを使用するのと同様に、大腸菌の合計数量を定量確認することができるが、どの群体がE.Cであり、どの群体がE.C以外の他の大腸菌であるか指示できない。
【００１２】
１つのテストサンプルで一般大腸菌およびE.Cを定量確認および分化する最近開発され且つ商業的に大変成功しているテスト媒体は、本発明の発明者と共通する米国特許第５２１００２２号および同５３９３６６２号に開示されている。そこで、これらを本発明の参考文献とする。この方法およびテスト媒体は、単一サンプル中の一般大腸菌およびE.Cを定量確認および分化可能であるという点で従来技術を改善する。更に、確認テストが不要である。テストサンプルを６-クロ路インドリル-*-D-ガラクトシド等の β-ガラクトシダーゼサブストレートおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-*-D-グルクロニド(X-gluc)等のβ-グルクロニダーゼサブストレートを含んでいる媒体に加えられる。β-ガラクトシダーゼサブストレートは、β-ガラクトシダーゼと反応して第１色の水不溶性の沈殿物を形成可能であり、一方β-グルクロニダーゼサブストレートは、β-グルクロニダーゼと反応する場合の第１色と対比される第２色の水不溶性の沈殿物を形成可能である。その結果、第１色の群体（β-ガラクトシダーゼ作用を有する）の個数を数えることにより一般大腸菌の定量化が可能である。一方、Ｅ.Cは、第２色の群体（β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼの両機能を有する）を数えることにより定量化可能である。この技術は、広くコピーされている。
【００１３】
最近開発された別のテスト方法および装置は、一般大腸菌、E.CおよびE.C０１５７種族および非大腸菌を確認・分化するのに優れた成果を得ている。この方法およびテスト媒体は、本発明の発明者と共通する米国特許第５７２６０３１号に開示されており、ここに参考資料として組み込む。
【００１４】
ここで「非クロモゲン（nonchromogenic）」という一種のサブストレートが、各種微生物の検出に使用されている。Dalet等によるJ.Clin.Microbiol.33(5):1395-8(1995)には、ヒドロキシ-キノリン-β-D-グルクロニドを使用するE.Cを検出するデップスライド（dipslide）が開示されている。同様に、8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドを使用する寒天ベース媒体中のE.Cの検出技術は、James等によるZentralbl Bakterio Mikrobiol Hyg{A}、267(3):316-21(1988)に開示されている。
Perry等の国際特許公報WO98/55644（D1）およびJournal of Clinical Microbiology１９９９年３月号pp７６６-７６８のPerry他著の「ABC Medium,  A New Chromogenic Agar for Selective Isolation of Salmonella spp」記事には、サルモネラ菌の確認媒体および方法が開示されている。この媒体は、２つのサブストレートを組み込んでいる。第１は、３，４-シクロヘキサノエスクレチン-β-D-ガラクトシド（CHE-GAL）であり、第２は５-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシド(X-GAL)である。この媒体において、サルモネラ種族は、緑色に見え、検出される腸内細菌科の他の全ては黒又は透明群体である。この媒体は、特にサルモネラ菌のみが検出でき且つ他のバクテリアから識別可能であるという欠点を有する。水およびその他のソース中の各種バクテリアを確認する必要に基づき、サルモネラ菌以外のバクテリアを確認・分化できる媒体を有するのが有効である。
Applied and Environmental Microbiology, １９９６年１０月号pp3868-3870のA. Jamesその他による「Evaluation of Cyclohexenonesculetin-β-D-Galactoside(CHE-GAL) and 8-Hydroxyquinoline-β-D-Galactoside  (8HXO-GAL), as Substrates for the Detection of β-Galactoside」の記事には、CHE-GALおよび８HXQ-GALの合成および評価が説明され且つX-GALと比較されている。一度に１個のサブストレートがこの評価でテストされているが、CHE-GALは潜在的に蛍光性化合物と組み合わせ、X-GALで知られている単一の被膜フィルタ上でE.Cおよび合計大腸菌を同時に計数できることを暗示している。A. James等は、CHE-GALと蛍光体の組み合わせが成功するか否か評価していなかった。また、特にエーロモナス属が確認できると共に少なくとも３つの生物実体を分化し確認できるテスト媒体を有することができれば好ましい。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
テスト媒体に生じる識別可能な色を一層改善するのが好ましい。即ち、２つの生物実体検出・分化する従来のテスト媒体では、媒体内に現れる２色間に混乱を生じ得る。
【００１６】
更に、エーロモナス属、ビブリオ属およびサルモネラ菌およびシゲラ菌のファミリーメンバー等の密接に関連する生物を確認・分化可能にするのが好ましい。例えば、エーロモナス属は、大腸菌に関連し且つ殆んど同じ生化学テストパターンを生じる。更に、ビブリオ属もまた、重要なバクテリアタイプであり、大腸菌と同じ一般的条件下で増殖する。一定サンプル内の全ての群体にシトクロムオキシダーゼの存在をテストすることによりエーロモナス属の群体を一般大腸菌から識別することは知られている。しかし、これには別の一連のテストが必要である。更に、エーロモナス属は水や食物に共通であり、一般大腸菌としてテストサンプル中には普通に指示され、最近の多くのテスト方法ではエラーとなることが多い。媒体にある種の抑制剤を加えることにより大腸菌の結果が干渉されるのを防止可能である。しかし、加える抑制剤の量は、慎重に制御しなければならない。更に、従来使用されてきた抑制剤は、媒体内での寿命が短く、凍結状態でなければその威力を急速に失う。抑制されるとできなかったエーロモナス属（Aeromonas spp.）を培養、確認および計数可能にすることが好ましい。
【００１７】
更に、エーロモナス属を抑制したい場合に、抑制剤の付加により媒体のシェルフ寿命をあまり短縮することなく、よりよい方法で行うのが好ましい。更にまた、サルモネラおよびシゲラ菌の種類をE.C、一般大腸菌およびエーロモナス属から識別可能にするのが好ましい。
【００１８】
【発明の目的】
本発明は、従来技術の上述した課題又は欠点に鑑みなされたものであり、複数の異なる生物実体を含み得るテストサンプル内の生物実体を定量的および定性的に特定・識別するテスト方法および媒体を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、「非クロモゲン」サブストレートを使用し、本発明のテスト媒体内に存在する特定の生物実体（biological entities）により生じる複数の色の識別を強化する。期待に反して、本発明によるテスト媒体内に存在する他の「クロモゲン（chromogenic）」サブストレートは、非クロモゲンサブストレートにより得た実質的に黒色と干渉しないことが判明した。換言すると、特定の生物実体が非クロモゲンサブストレートに応答する限り、テスト媒体内にそれが凝集すると、その生物実体が媒体内に存在する１、２又は更に多くのクロモゲンサブストレートに応答するか否かに関係なく、実質的に黒色である。本発明は、従来知られていなかった、非クロモゲンサブストレートの特性を利用するものである。
【００２０】
その１つの形態では、本発明は、第１および第２生物実体を検出、特定および定性化又は定量化するテスト媒体を提供する。このテスト媒体は、塩イオンを含む培養基媒体、クロモゲンサブストレート（基体）および非クロモゲンサブストレートを含んでいる。第１生物実体は非クロモゲンサブストレートに応答し、他方第２生物実体はクロモゲンサブスレートに応答する。このテスト媒体で、テスト媒体内に存在する第１生物実体の凝集は、実質的に黒色であり、テスト媒体内に存在する第２生物実体の凝集は、実質的に黒色から識別可能な第２色である。
【００２１】
好適形態において、本発明のテスト媒体は、第１生物実体がクロモゲンサブストレートおよび非クロモゲンサブストレートに応答する。この場合には、テスト媒体内に存在する第１生物実体の凝集は、実質的に黒色である。この好適形態では、第１生物実体の凝集は第１および第２サブストレートの両方に応答するが、これらの凝集はテスト媒体内では実質的に黒色である。即ち、クロモゲンサブストレートは、実質的に黒色と干渉しない。非クロモゲンサブストレートのこの特性は、複数の異なる生物実体が単一媒体で確認・分化でき、各生物実体の凝集は、視覚的に識別可能な色を有するという効果を呈する。上述した本発明の媒体の他の好適形態では、媒体は、抑制剤としてナリジキシン酸を更に含み、エーロモナス属の増殖を抑制する。セフスロヂン（cefsulodin）と比較してナリジキシン酸は、それを取り込むテスト媒体のシェルフ寿命を大幅に短縮することはないという効果を呈することが判明した。
【００２２】
これに関し、本発明の他の形態は、少なくとも１つの第１タイプの生物実体を検出し且つ第２タイプの生物実体の増殖を抑制するテスト媒体の製造方法を提供する。この方法は、所望のサブストレートを栄養剤ベース（培養基）媒体と組み合わせ、媒体に抑制剤を加え、その後少なくとも１００℃に加熱し滅菌する工程を含んでいる。抑制剤を最初の工程で加えているので、その後抑制剤の無菌付加は不要である。
【００２３】
その他の形態では、本発明は、第１、第２および第３生物実体を検出、確認および定性化又は定量化するテスト媒体を提供する。このテスト媒体は、塩イオンを含む培養基ベースを含んでいる。第１および第２クロモゲンサブストレートおよび非クロモゲンサブストレートがテスト媒体内に設けられる。第１および第２生物実体は、それぞれ第１および第２クロモゲンサブストレートに応答し、第３生物実体は非クロモゲンサブストレートに応答する。テスト媒体内における第１生物実体の凝集の存在は第１色で、テスト媒体内に存在する第２生物実体の凝集の存在は第２色で、テスト媒体内に存在する第３生物実体の凝集は実質的に黒色である。
【００２４】
好適形態において、本発明のテスト媒体は、第３生物実体が非クロモゲンサブストレートに加えて第１および／又は第２クロモゲンサブストレートに応答する。この場合には、第３生物実体の凝集は、実質的に黒色である。
【００２５】
１以上のクロモゲンサブストレートを１以上の非クロモゲンサブストレートと共に使用することにより、単一媒体内で検出・分化できる生物実体の数が共同作用で増加でき且つ検出される生物実体の一定セットに対して可能な色数を共同作用で増加する。換言すると、サブストレートの１つとして非クロモゲン成分を含むことにより、テスト媒体の他のサブストレートの選択自由度および対応する色を行動作用で増加する。これは、非クロモゲンサブストレートに応答する生物実体の凝縮は、実質的に黒であるからである。非クロモゲンサブストレートについては合成色効果がない。例えば、３個のクロモゲンサブストレートおよび１個の非クロモゲンサブストレートを含むテスト媒体では、４個のクロモゲン成分を使用するものと比較して、１個の非クロモゲン成分を使用することにより少なくとも３つの色合成効果が回避できる。
【００２６】
本発明の他の形態では、周囲光の下で一般大腸菌および／又はE.Cを検出、定量化および分化するテスト媒体を提供する。このテスト媒体は、塩を含む培養基媒体よりなる。E.Cおよび塩イオンが存在すると第１色の第１水不溶性成分を形成する第１サブストレートが媒体内に設けられる。第１色は実質的に黒である。一般大腸菌が存在すると第２色の第２水不溶性成分を形成する第２サブストレートが設けられる。第２色は第１色と視覚的に識別可能である。よって、テスト媒体内に存在するE.Cの群体は、第１の実質的に黒色で指示され、一般大腸菌の存在は、第２色で指示される。
【００２７】
上述した発明の好適形態では、テスト媒体は、サルモネラ又はシゲラ菌の存在で第３水不溶性成分を形成する第３サブストレートを更に含んでいる。この第３色は第１および第２色と識別可能であり、このテスト媒体は、E.C、一般大腸菌およびサルモネラ又はシゲラ菌を定量化および／又は分化可能である。更に、これらサブストレートは、テスト媒体内の一般大腸菌が第３サブストレートと作用し、第３色の水不溶性成分を形成する。その結果、一般大腸菌の群体は、テスト媒体中で第２および第３色の合成色である第４色で指示される。この第４色は、第１および第３色から視覚的に識別可能である。更に、エーロモナス属は第２サブストレートと作用して第２色の不溶性成分を形成するが、第１および第３サブストレートとは反応しないようにサブストレートを選択する。よって、本発明のテスト媒体では、E.C群体は一般的に黒色であり、一般大腸菌は第４色であり、エーロモナス属の群体は第２色であり、シゲラ又はサルモネラ菌は第３色になる。
【００２８】
また、他の形態では、本発明は、周囲光の下で、テストサンプル中の一般大腸菌、E.Cおよびエーロモナス属、サルモネラ又はシゲラ菌の少なくとも１つを検出、定量化および分化する方法を提供する。この方法は、第１、第２および第３サブストレートを含む栄養剤ベース媒体を提供する工程よりなる。各サブストレートは、一般大腸菌、E.C、エーロモナス属、サルモネラ又はシゲラの少なくとも１つ存在で水不溶性成分を形成可能である。テスト媒体中でのE.C群体の存在は第１色、テスト媒体中の一般大腸菌群体の存在は第２色、およびテスト媒体中のエーロモナス属およびサルモネラ菌又はシゲラ菌の群体の存在は第３色を生じるようにサブストレートを選択する。これら各色は、視覚的に識別可能である。テスト媒体はテストサンプルに植え付けられ、次に培養される。次に、テスト媒体に第１色の第１群体、第２色の第２群体および第３色の第３群体が存在するか検査される。第１群体はE.Cであり、第２群体は一般大腸菌であり、第３群体はエーロモナス属、サルモネラ菌又はシゲラ菌の１つである。
【００２９】
好適形態では、本発明の方法は、テスト媒体に１以上のサブストレートと反応する塩イオンを加える工程を更に備える。これにより、そのサブストレートに特定の酵素が存在すると実質的に黒色の沈殿物を生じる。塩イオンの存在で実質的に黒色を形成する好適化合物は、β-D-グルクロニドである。この化合物は、加水分解するとアグリコンを解放し、イオンの存在下で実質的に黒色錯体を形成する。
【００３０】
本発明の方法の他の好適形態では、第４色を有する第４群体が存在するかテスト媒体を検査する工程を更に有する。ここで、サブストレートは、エーロモナス属の群体が第３色で、サルモネラ又はシゲラ菌の群体が第１、第２および第３色から視覚的に識別可能な第４色になるように選択される。更に好適には、第１色が黒色、第２色が実質的に青紫色、第３色が実質的に赤桃色および第４色が実質的に青緑色となるようにサブストレートを選択する。
【００３１】
本発明の他の好適形態では、エーロモナス属の群体およびプレシモナス属（Plesiomonas）およびビブリオ菌が第３色で指示されるようにサブストレートを選択する。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法および媒体は、テストサンプル中に混在する種々の選択された生物実体を同時に検出、定量化および分化可能にするものである。このテスト方法および媒体は、E.Cおよび一般大腸菌の検出、定量化、確認および分化、更にエーロモナス属、サルモネラ、シゲラ、プレシモナス属およびビブリオ属のバクテリア種類を含む他の選択された生物自体の定量確認および分化に有効である。
【００３３】
本発明を取り込む方法およびテスト媒体は、生物実体特にバクテリアの酵素活動は、関心のあるバクテリアの種族および／又はファミリーにより変化するという事実を活用している。本発明を取り込む方法およびテスト媒体は、サブストレート錯体を確認する各種酵素は、明らかな色を形成する特定の酵素を確認するためし湯可能であるという事実を利用する。特に、本発明を取り込む方法およびテスト媒体は、テスト媒体内に存在するクロモゲンサブストレートは、非クロモゲンサブストレートにより生成された実質的に黒色と干渉しないという事実を活用する。
【００３４】
非クロモゲンサブストレート自体は、従来周知であるが、クロモゲンサブストレートに対する明確な特性は、知られていなかった。しかし、クロモゲンサブストレートとの組み合わせを含む媒体内での非クロモゲンサブストレートの行動はユニークである。即ち、２つのクロモゲンサブストレートに応答する生物実体の凝集は、テスト媒体内で典型的に２つのサブストレートの分裂で生じる２色の合成として現れる。もし３つのクロモゲンサブストレートが含まれていると、合成色効果は、予想および説明が困難である。更に、生物実態の特定種族により生成される酵素量の本質的な変化は、クロモゲンサブストレートが分裂すると、色の色調又は色相が異なることとなる。その結果、テスト媒体を検査する未熟練者には、色の識別が困難である。従って、クロモゲンサブストレートは、一定のテスト媒体内に含まれるように計画している他のクロモゲンサブストレートを考慮して選択されなければならない。
【００３５】
このことは非クロモゲンサブストレートについては当たらない。非クロモゲンサブストレートと共にクロモゲンサブストレートに応答する生物実体の凝集は、テスト媒体中で色の付いた又は蛍光「ハロ」として現れ、斯かる凝集は実質的に黒であり、識別が容易である。クロモゲンサブストレートと異なり、合成色項か効果を計算に入れる必要がないので、非クロモゲンサブストレートでは大きな「自由度」が実現できる。
【００３６】
非クロモゲンサブストレートを使用すると、単一のテスト媒体で異なる４つのバクテリア種族を４つの視覚的に識別可能な色で分化することが可能である。黒は誤解されにくいので、優れている。更に、実質的に黒い顔料は拡散しないので、群体の位置は正確に知られ、群体を正確に計数可能である。非クロモゲンサブストレートは、不溶性のキレート化合物を生成し、これはクロモゲンサブストレートにより生成された二量体と異なる。
【００３７】
本発明のテスト媒体および方法は、一般大腸菌およびE.Cの検出、定量又は定性確認および分化可能であるのみならず、サルモネラ、シゲラおよびエーロモナス属、更にはプレシモナス属およびビブリオ属の種族が決定できるが、極めて密接に関連するエーロモナス属の種族とは分化できない。
【００３８】
（定義）
一般大腸菌、E.C等の生物実体は、本明細書中では、ある種のクロモゲンおよび非クロモゲンサブストレートに「応答」するものとする。特に、生物実体は、それが以下に説明する如きテスト媒体内に存在するとき特定の酵素を予想可能に生成する。これらの酵素は、クロモゲンおよび非クロモゲンサブストレートに選択的に分裂する。分裂すると、これらサブストレートは、テスト媒体内に色を生成する。この色を生成するメカニズムは、後述する如く、クロモゲンサブストレートと非クロモゲンサブストレートとで異なる。
【００３９】
β-ガラクトシダーゼ活動する微生物は、通常「大腸菌」と称されるものを含んでいる。「大腸菌」には種々の定義があるが、一般的な定義は、腸内細菌科ファミリーのメンバーであり、ガスと酸を放出してシュガーラクトスを発酵する機能を有する。大部分の大腸菌は、α-およびβ-ガラクトシダーゼの両方にポジティブである。即ち、α-およびβ-ガラクトシダーゼの両方を生成する。
【００４０】
ガラクトシダーゼ機能に加えてβ-グルクロニダーゼ機能を有する微生物は、主に大部分のE.C種族を含んでいる。即ち、E.Cは、β-グルクロニダーゼと共にα-およびβ-ガラクトシダーゼの両方にポジティブである。
【００４１】
本明細書中で使用する「一般大腸菌」の用語は、E.Cの各種族以外の大腸菌を意味する。これら「一般大腸菌」は、一般にα-およびβ-ガラクトシダーゼ機能（即ち、ラクトス発酵）を有するが、β-グルクロニダーゼ機能を有さず、またシュガーソルビトールを発行する機能を有するグラムネガティブ（gram-negative）、非胞子形成微生物である。
【００４２】
本明細書の目的で、「クロモゲンサブストレート」とは、加水分解すると、色生成にテスト媒体内に付加化学物質が不要であるサブストレートである。即ち、そのサブストレートに対応する特定の酵素によりクロモゲンサブストレートが分裂すると、このサブストレートの分裂エリアに濃縮された色の二量体を形成する。多くのクロモゲンサブストレートが従来知られている。本明細書中で、「クロモゲン」とは、蛍光性サブストレートを含んでいる。蛍光性サブストレートのプロダクトは、検出に紫外線が必要であり、好適クロモゲンサブストレートより溶解性を有し、一般に以下に開示されるテスト媒体と共に使用するには好ましくない。
【００４３】
ここでは「非クロモゲン」と称される一種のサブストレートは、塩イオンの存在および発酵活動により暗い、実質的に黒色の沈殿物を生成する。例えば、フェリアンモニウムシトレート(ferric ammonium citrate)の如きイオンを生成する塩と共に媒体内に含まれるとき、8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドは、E.C又はその他の生物実体により生成されるβ-グルクロニダーゼの存在中で実質的に黒い沈殿物を生成する。特に、特定酵素により非クロモゲンサブストレートの分裂により、媒体内に実質的に黒色の水不溶性の錯体を生成する。実質的に黒い沈殿物は、鉄イオンよりなり、サブストレートがグルクロニダーゼによりE.Cから加水分解されると、アグリコンが解放される。この沈殿物はキレート化された化合物であり、拡散しない。また、実質的に黒色は、テスト媒体内に存在するクロモゲン化合物から干渉され難い。
【００４４】
本明細書の目的で、「非クロモゲンサブストレート」は、クロモゲン成分（コンポーネント）と共に使用されるものに加えて、サブストレートが対応する酵素により分裂されるとき、化学物質がテスト媒体内に存在しなければならいことを意味する。これにより形成される実質的に黒色の沈殿物は、サブストレートおよび塩錯体の組み合せであり、「クロモゲン化合物」により形成される二量体ではない。
【００４５】
本明細書の目的で、「周囲光の下で」とは、可視スペクトラム、即ち裸眼で見え且つ識別可能である色を意味する。例えば、見るために紫外線を必要とするテスト媒体中の群体は、この「周囲光の下で」の定義に入らない。しかし、この「周囲光の下で」との用語は、必要に応じて拡大装置の使用を含む。多数の群体を計数するには、拡大が特に有効である。「視覚的に識別可能」との用語は、周囲光の下で識別可能な２以上の色を意味する。
【００４６】
本明細書において、「実質的に黒」とは、暗い褐色から黒を含み、赤紫、緑、蛍光等の各種の色のハロを含む。
【００４７】
本明細書の目的で、ここで言及する色の名称は、目安であって、これら色の名称は広く解釈すべきであることに留意されたい。即ち、ここで言及する色にはオーバーラップがあり得る。その理由は、上述の如く、生物実体は異なる量の酵素を生成し、これは結果的に得られる色の色調又は色相に影響するからである。
【００４８】
ここで使用される「β-がラクトシダーゼサブストレート」は、サブストレート上でβ-ガラクトシダーゼの作用により遊離されるとき、水不溶性の着色化合物を形成する置換基にβ‐結合により結合されたガラクトースよりなるβ-ガラクトシドを意味する。同様に、ここで使用される「α-ガラクトシダーゼサブストレート」という用語は、サブストレート上の＊-ガラクトシダーゼの作用により遊離されるとき、水不溶性の着色化合物を形成する置換基にα‐結合にて結合されたガラクトースよりなるα-ガラクトシドを意味する。ここで使用する「β-グルクロニダーゼサブストレート」は、サブストレート上にβ-グルクロニダーゼの作用により遊離されるとき、水不溶性の着色沈殿物を形成する置換基に＊−結合により結合されたグルクロン酸よりなるβ-グルクロニドを意味する。
【００４９】
β-グルクロニダーゼサブストレートおよび化合物および他のサブストレートと共にここで説明されるα-およびβ-ガラクトシだーゼサブストレートおよび化合物およびその他のサブストレートは、適当なガラクトシド又はグルクロンカルボキシルグループと適当なベース（塩基）と反応して形成されるカルボキシル塩より構成される。適当なベースは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属水酸化物又は例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび対応する炭酸塩およびアンモニア等の窒化塩、およびトリメチルアミン、トリエチルアミンおよびシクロヘキシルアミン等のアルキルアミンを含んでいる。
【００５０】
（特定生物実体用テスト媒体のデザイン）
腸内細菌科ファミリーの一種のメンバーは、β-ガラクトシダーゼ活動の欠如におけるα-ガラクトシダーゼ活動の存在又はその逆により、識別可能である。例えば、大部分のサルモネラおよびシゲラ菌は、α-ガラクトシダーゼに対してポジティブであり、β-ガラクトシダーゼに対してネガティブである。同様に、エーロモナス属は、α-ガラクトシダーゼ活動の欠如下でβ-ガラクトシダーゼ活動の存在により腸内細菌科ファミリーの他のメンバーから識別可能である。本発明を取り込む方法および媒体は、これら識別可能な特性を活用するようデザイン（設計）されている。例えば、一般大腸菌に対し、サルモネラおよびエーロモナス属の特定酵素活動は、以下の如く説明可能である。
【００５１】
ここに説明する方法は、上述した一般大腸菌、E.C、エーロモナス属およびサルモネラ菌およびシゲラ菌である微生物の異なるクラスの検出、定量又は定性確認および分化に特に好適である。本発明の方法は、これら特定の微生物に特に好適であるが、これに限定するものではない。その代わり、ここに説明する技術は、広範な生物実体の確認および分化に応用できる。
【００５２】
即ち、特定の生物実体は、各種のサブストレートに「応答」する。特に、生物実体は、既知の酵素を予測可能に生成又は含んでいる。クロモゲン又は  非クロモゲンサブストレートは選択でき、特定酵素の存在の下で、予測可能且つ識別可能な色の不溶性成分を形成する。多くのサブストレートは、単一テスト媒体で複数の明確な生物実体の凝縮は、個別の識別可能な色で確認可能である。更に、ここで開示する好適実施形態は、ここで定義した周囲光の下でテスト媒体内に存在する各種の凝縮の全てを識別されるが、これは必要ない。例えば、ここに開示される幾つかのサブストレートは、媒体内に存在する凝集を見るために紫外線の使用が必要である。
【００５３】
表１は、表２に一覧されたサブストレートの何れかを使用して存在が検出可能な各種酵素を一覧している。
【表１】
0003971611.tif 000002
【表２】
0003971611.tif 000003
【００５４】
本発明のテスト媒体に使用可能な特定サブストレート化合物は、次の通りである。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal) は、市販されているβ-ガラクトシダーゼサブストレートであり、β-ガラクトシダーゼにより反応するとき略青緑を有する不溶性の沈殿物を生成し且つ米国イリノイ州のBiosynth  Internationalから入手可能である。
【００５５】
6-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドは、マジェンタ色の不溶性沈殿物を生成し、その生成は、上述した米国特許第５２１００２２号に開示され米国オハイオ州のResearch  Organicsから入手できる。
【００５６】
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド(X-gluc)は、市販されているβ-グルクロニドであり、β-グルクロニダーゼにより反応するとき、略青緑色を有する不溶性の沈殿物を生成する。同様に、インドキシル-β-グルクロニドは、同様の化合物であり、その製法は、上述したLey等によるCan.J.Microbiol.に説明されており、これをここに参考資料として組み込む。他の適当なβ-ガラクトシドは、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド化合物であり、桃色／マジェンタ色を有する不溶性の沈殿物を生成し、その製法は、上述した米国特許第５２１００２２号に開示されている。他の適当な化合物は、本発明を実施するサブストレートとして応用され、米国特許第５２１００２２号に規定され、その全てをここに参考しようとして組み込む。
【００５７】
8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドサブストレートは、市販されているβ-グルクロニドであり、鉄の如き金属イオンの存在下で、β-グルクロニダーゼと反応し、他のα-およびβ-ガラクトシドサブストレートの存在中に略黒い有する不溶性の沈殿物を生成する。8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドは、米国イリノイ州NapervilleのBiosynth  Internationalから入手可能である。
【００５８】
更に、本発明と共に使用するのに好適なイオンを提供する塩は、米国ミズーリ州セントルイスのSigma  Chemicalから入手可能なフェリアンモニウムシトレートである。シクロへキセノエスクレチン（Cyclohexenoesculetin）サブストレートは、James等によるAppl.& Envir.Micro.62:3868-3870(1996）に説明され、鉄イオンの存在下で不溶性の実質的に黒い沈殿物を生成する。N-メチルヒドロキシ-β-D-ガラクトピラノシドの如きN-メチル-インドリルサブストレートは、米国イリノイ州NapervilleのBiosynth  Internationalから入手可能である。2-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド等のニトロフェニルサブストレートは、米国イリノイ州NapervilleのBiosynth  Internationalから市販されている。同様に、ニトロフェニリン化合物は、上述のSigma Chemicalから入手可能である。
【００５９】
実質的に黒い他のサブストレートは、シクロヘキサノエスクレチン-β-D-ガラクトシドの如きエスクレチンサブストレートを含み、James等によるAppl. & Envir. Microbol. 62:3868-3870(1996)に説明されている。8-オキシキノリン-β-D-ガラクトシドおよび8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドの如きキノリンサブストレートは、上述したBiosynth  Internationalから入手可能である。5-インド-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドの如きインド-インドリルサブストレートも、上述したBiosynth  Internationalから入手可能である。
【００６０】
いくつかの蛍光サブストレートは、本発明と共に使用するのに好適である。4-メチルアンブレリフェリルサブストレートおよび5-トリフロロメチルアンブリフェリル（trifluoromethylumbelliferyl）サブストレートの如きクマリンサブストレートは、上述したBiosynth Internationalから市販されている。また、fluorescein、rhodamineおよびresorufinサブストレートも好適である。これら３つのサブストレートの市販先は不知であるが、コンポーネントは上述したSigma  Chemicalから入手可能である。
【００６１】
本発明と共に使用するのに好適なサブストレートの特定例を上述したが、これらは本発明を限定するものではない。当業者は、後述する表４および５を使用して、サブストレートの数は、実質的に無制限であることが理解できよう。
【００６２】
（テスト媒体の製造）
テスト媒体は、所望のサブストレートを栄養剤ベース媒体と組み合わせることにより形成される。この栄養剤ベース媒体は、従来周知の培養基でもよく、生存する細胞を維持および再生する。一般的に、斯かる媒体は、栄養剤、バッファ、水および時にはゲル剤を含んでいる。可能なゲル剤は、寒天、ペクチン、カラゲーニン、アルギナート、ローカストビーンおよびキサンチン等を含んでいる。
【００６３】
以下に、本発明と共に使用に適するテスト媒体の製造例を説明する。この例は、以下の例Iと一致する。8-オキシキノリン-β-D-グルクロニド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドおよび 6-クロロ-3-インドリル-β -D-ガラクトピラノシドサブストレートを、それぞれ２５０mg／Lおよび１７５mg／Lの媒体に加える。これらサブストレートは、滅菌前にブレンダーに（以下の式により）熱い（７５〜８５℃）の媒体に直接加えられる。
【００６４】
標準の寒天媒体は、次の栄養式で１５ｇｍの細菌学量を加えて製造される。
カゼインのパンクリアチックダイジェスト  5.0gm
イーストエキス                          3.0gm
デポタジウムリン酸塩                    0.3gm
脱イオン水                              990ml
フェリアンモニウムシトレート       800mg/10ml脱イオン水
（他のコンポーネントとは別に滅菌する）
次に、１２１℃で１５分間滅菌する。媒体は、pＨが７．０となるように調整する。滅菌された寒天は、水バス中で４５℃に低下させ、上述の如く製造されたサブストレートを含む滅菌液を加える。媒体を満遍なく混合し、２０ml／プレートの量で滅菌ペトリプレートに注ぐ。
【００６５】
ペクチンベースのテスト媒体を上述した工程と同じ工程で製造する。しかし、２５ｍｇの低メトキシルペクチンを硬化剤として使用し、媒体をカルシウムイオンを含む薄いゲル層を含むペトリプレート内に室温で注ぎ、これでペクチンと合成して固体ゲルを形成する。適当なペクチン培養媒体は、米国特許第４２４１１８６号および第４２８２３１７号に説明されている。これらを、ここに参考資料として組み込む。ペクチンベース媒体は、ユーザに簡便であり且つ温度依存性がないので標準寒天媒体よりも好適である。ペクチン媒体の使用は、十分に説明されており且つAOAC共同研究および他の出版および社内研究として承認されている。
【００６６】
適当なペクチン媒体は、Micrology  Laboratories、LLCからEasygel（登録商標）として市販されている。ゲル剤を使用しない水ベースの媒体は、被膜フィルタと共に使用するため米国インジアナ州GoshenのMicrology  Labs.から入手可能である。
【００６７】
（テスト媒体のサンプルへの植え付け）
尾のテスト媒体は、微生物を含むサンプルに媒体を植え付ける如何なる従来技術により微生物を含む被試験サンプルに植え付けられる。例えば、被試験サンプルは、栄養剤ベース媒体を加える前にペトリプレートに加え（選択平面技法）又は冷却且つ固化した後にプレート表面に散布（スワブ又はしま平面技法）される。また、液状サンプルは、ミクロ細孔（寸法.４５μｍ）被膜フィルタにかけ、次に固体媒体の表面又は媒体で飽和させたパッド上に載置する。
【００６８】
（テスト媒体のインキュベーション）
植え付けられたテスト媒体は、サンプル中に存在する各微生物が検出可能な群体に増殖する温度で、十分な時間培養する。媒体内で微生物が増殖する適当な培養温度は、業界では周知である。通常、テスト媒体は、約３０〜４０℃の温度で約２４〜４８時間培養される。
【００６９】
一般微生物の占有率抑制剤を使用しない限り、一般大腸菌、E.C、エーロモナス属およびサルモネラ菌およびシゲラ菌は、培養テスタ媒体中で増殖する。テスト媒体中で形成される沈殿物は不溶性であるので、それらは各種酵素を形成する微生物の付近に留まる。微生物が再生されると群体を形成するので、これら群体は特定のサブストレートにより生成された色を有するユニット形成群体として示される。例えば、E.Cは、β-ガラクトシダーゼおよびβ-ガラクトシターゼを生成するが、一般大腸菌およびエーロモナス属もまたβ-グルクロニダーゼを生成する。従って、各β-ガラクトシダーゼサブストレート、α-ガラクトシダーゼサブストレートおよびβ-グルクロニドサブストレートの不溶性沈殿物は、対応する酵素の作用により形成され、E.Cの群体は、実質的に黒色、時にはその周囲に青紫色のハロを有するようにする。
【００７０】
一般大腸菌は、β-ガラクトシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼを生成するので、その結果、α-ガラクトシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼサブストレートの両方を分裂する。本発明の例において、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシドサブストレートは、青緑色を生成し、6-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシドサブストレートは、桃色又は赤桃色を生成する。従って、一般大腸菌の群体は、それぞれα-およびβ-ガラクトシドで生成される色の合成色である青紫となる。
【００７１】
しかし、大調菌に密接に関連し且つほとんど同じ生化学テストパターンであるするエーロモナス属は、β-ガラクトシダーゼポジティブおよびα-ガラクトシダーゼネガティブである。即ち、エーロモナス属は、α-ガラクトシドサブストレートを加水分解しない。従って、テスト媒体中のエーロモナス属群体は、８-ガラクトシドサブストレートにより生成されたピンク赤色を有する群体を示す。
【００７２】
更に、サルモネラおよびシゲラ菌の大部分のメンバーは、α-ガラクトシダーゼにポジティブであるが、β-ガラクトシダーゼにネガティブであることが判明した。即ち、サルモネラおよびシゲラ菌は、β-ガラクトシダーゼサブストレートを加水分解しない。従って、テスト媒体内に存在するサルモネラおよびシゲラ菌の群体は、α-ガラクトシドサブストレートにより生成された青緑色に見える。時々、シゲラ菌は、ある種のシゲラ菌はβ-グルクロニダーゼにポジティブであるので、青緑ハロを有する黒に見える。また、珍種のシゲラ菌は、α-およびβ-ガラクトシダーゼの両方にポジティブであるので、青紫色に見える。
【００７３】
（テスト媒体の検査および微生物の計数）
上欝の例で選択したサブストレートは、３つの明確な色を生成し、一般大腸菌はこれら３色のうちの２色の合成色である第４色で指示される。即ち、E.C群体は実質的に黒であり、一般大腸菌の群体は青紫色であり、エーロモナス群体は赤桃色であり、サルモネラ菌およびシゲラ菌の群体は青緑色である。これら各色の色調は、生物実体が生成する酵素の差等の要因により変化するが、これら４色は十分に識別可能であり、これらの間での混乱は生じないことが判明した。
【００７４】
各タイプの微生物の群体は、群体を計数し又はテストプレート上の微生物を計数する既知の方法により計数可能である。各タイプの群体の個数は、培養前のサンプル中に最初に在した各タイプの微生物の個数を示す。
【００７５】
（オプション材料）
（抑制剤）
本発明の方法は抑制剤を必要としない。しかし、一般微生物占有率を抑制し、大腸菌には殆ど影響を与えることのない各種成分を必要に応じて加えることにより一般大腸菌およびE.Cを一層選択的にするよう媒体を製造可能である。使用可能な成分は、a)約０．３g／リットルの胆汁塩、ｂ）約０．２ｇ／リットルの硫化ドデシルナトリウム（sodium lauryl sulfate）、ｃ）約０．２g／リットルのsodium desoxycholateおよびｄ）約０．１ml／リットルのTergitolである。これらの成分の１以上を使用することにより、背景（非大腸菌）微生物を低減し、プレートの散乱を低減し、サンプル中の非大腸菌の抑制又は干渉を排除する。ある種の抑制剤を使用することと同様の結果が達成可能である。
【００７６】
セフスロヂンは、エーロモナス属を抑制するために現在利用されるテスト媒体に一般的に使用される。しかし、セフスロヂンの抑制剤としての使用は、プロセス中に余分な工程、即ちフィルタで滅菌された抗生物質の付加による滅菌工程が必要になる。この工程は、制御が困難である。更に、セフスロヂンの存在は、媒体のシェルフ寿命を大幅に短縮する。ナリジキシン酸をセフスロヂンの代わりに使用し、エーロモナス属を同様程度に抑制可能であることが判明している。ナリジキシン酸は、テスト媒体のオートクレーブ時に達する約１２０℃の温度に耐えられるので好ましい。従って、セフスロヂンと異なり、ナリジキシン酸は、滅菌前に初期媒体形成の一部としてテスト媒体に加えてもよい（上述したテスト媒体の製法参照）。また、ナリジキシン酸の好ましくない環境条件への抵抗力は、セフスロヂンに比較して、それを含む媒体のシェルフ寿命を長くする。
【００７７】
（誘導者）
一般大腸菌の酵素生成は、酵素誘導者（inducer）と称される極少量の物質を加えることにより強化することが可能である。β-ガラクトシダーゼ用の１つの特定誘導者が利用でき、イソプロピル-β-ガラクトシダーゼと化学的に称される。媒体１リットル当たり約１００ｍｇを加えると、特定の大腸菌種族の酵素生成速度を加速する効果がある。他の酵素誘導者が利用でき、媒体に加え、酵素生成の強化に有効である。
【００７８】
（具体例）
本発明の実施で製造される上述した栄養剤式又は他の栄養剤式と組み合わせて使用されるテスト媒体酵素サブストレート組み合わせの種々の例を以下に一覧する。表IIIは、本発明を取り込む好適実施形態の柔軟性を示す。表３は、本発明により検出可能なE.C、一般大腸菌およびエーロモナス属、サルモネラ菌又はシゲラ菌の少なくとも１つの好適生物実体に利用可能な４色組み合わせのマトリクスである。他の色組み合わせも可能である。多くの場合、複数の異なるサブストレートは、好ましい結果を達成するが、差は特定の酵素検出色である。E.C検出用の好適な色選択は、表３中に＊印で示し、他の微生物の検出に選択された色に依存する。上述の如く、他のクロモゲンサブストレートはそれと干渉せず、しかも実質的に黒色は他の色と容易に識別可能であるので、実質的に黒色が好ましい。
【００７９】
上述の如く、表３は、単一の媒体中に複数のクロモゲンサブストレートを含むことにより生成される上述した合成色効果を考慮する必要がある。例えば、表IIIの第１実体を参照すると、一般大腸菌は（１）赤桃色（マジェンタ）および（２）青緑の合成色に見え、その結果は青紫となる。その理由は、一般大腸菌は２つのクロモゲンサブストレートに応答するからである。同様に、一般大腸菌は、表IIIの第２実体によるテスト媒体内で（１）赤桃色（マジェンタ）および（２）黄色の合成色である。
【表３】
0003971611.tif 000004
【００８０】
表４は、本発明により検出される好適生物実体の酵素パターンの部分一覧である。当業者には既知である他の酵素を生成され、単に理論上知られている酵素も満足的に機能するであることが理解できよう。
【表４】
0003971611.tif 000005
【００８１】
表５は、本発明によりテスト媒体で使用される各種サブストレートおよびそれらに関連する色のマトリクスである。表５の左側には、リストされたクロモゲン成分がそのサブストレート用の特定酵素により分裂されることにより得られる色を示す。非クロモゲンサブストレートの場合には、色は実質的に黒色であり、反応メカニズムは、上述の如く、サブストレートの分裂により塩イオンの存在を必要とする。
【００８２】
ある種の生物実体により精製されるテスト酵素（表４参照）は、表５の右に示す。「サブストレート成分」は、特定テスト酵素の左に示す。表５の右に一覧された 各サブストレート成分は、表５の左に一覧されたクロモゲン又は非クロモゲン成分の何れかと組み合わせられ、テスト媒体で使用される特定サブストレートを確定する。従って、表５は、多くのサブストレートが本発明に使用可能であることが理解できよう。表５の上述した使用により確定される多くのサブストレートは、市販されており、他のサブストレートは文献に説明されている。表５を使用して特定できる更に他のサブストレートは、単に理論上の可能性を示す。
【００８３】
非クロモゲン成分は、表５の左下に含まれている。そして、分裂して特定の色を生成しないので、クロモゲン成分と異なる。その代わり、サブストレートが特定の酵素により分裂されるとき、媒体内に存在しなければならないキノリン又はエスクレチン成分は、塩イオン（例えば、鉄イオン）と化合する。非クロモゲン成分により形成される実質的に黒色の沈殿物は、クロモゲン成分により形成される二量体ではなくキノリン又はエスクレチンイオンの結合である。
【００８４】
非クロモゲン成分と異なり、クロモゲン成分は媒体に選択された全ての他のクロモゲン成分および検出される実体の酵素パターンにより選択すべきである。クロモゲン成分の選択は、形成される色の区別が最大になるように行う。
【００８５】
表５には各種のクロモゲン成分およびサブストレート成分／酵素の可能性を示すが、本発明の範囲を逸脱することなく他の可能性も当業者には理解できよう。例えば、表５中に示す如く、当業者はN-アセチルグループを表５中に一覧した多くのサブストレート成分のシュガーと組み合わせられる。例えば、N-アセチルグループは、β-D-マノピラノシド（mannopyranoside）と結合してN-アセチル-β-D-マノサミニド（mannosaminide）を生成し、対応する酵素はN-アセチル-β-D-マノサミニダーゼである。表５の左に一覧されたどのクロモゲン又は非クロモゲン成分もサブストレート成分と結合してサブストレートを確定できる。サブストレートが市販されているか又は製法が既知であれば、そのサブストレートはテスト媒体に使用できる。テスト媒体内の対応する酵素によるサブストレートの分裂により、一覧された色が現れる。
【００８６】
一般的に、本発明は、次の如く、各種の微生物又はセルタイプの検出用テスト媒体の製造に使用できる。最初に、検出および分化したい微生物を選定する。検出に好適な生物は、E.C、一般大腸菌およびエーロモナス属、サルモネラ菌又はシゲラ菌の少なくとも１つである。これら選択された生物により生成される酵素は、表４により確認できる。各微生物により生成される特定の酵素の知識を持つことにより、表５の右から対応するサブストレート成分を誰でも確認できる。希望する色により、テスト媒体に含めるサブストレートを確定するサブストレート成分と結合されるクロモゲン又は非クロモゲン成分を表５から選択できる。これにより、確定されたサブストレートが市販されているかその合成方法が既知であれば、そのサブストレートはテスト媒体で使用可能である。
【表５】
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【００８７】
表６は、特定例の詳細な要約である。
【表６】
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【００８８】
（例１）
特定、定量化および分化したい微生物は、E.C、一般大腸菌、エーロモナス属、サルモネラ菌又はシゲラ菌である。
【００８９】
表４を参照すると、E.Cは酵素Bglucを生成し且つBglucは検出したい他の微生物の何れによっても生成されない。表Vの右を参照すると、テスト酵素Bglucは、β-D-グルクロニド対応するサブストレート成分を有する。よって、Bglucの分裂により明確な色を生成するクロモゲン又は非クロモゲン成分は、表５の左から選択すべきである。8-オキシキノリンが、好適な実質的に黒色から選択される。従って、第１のサブストレートは、８‐オキシキノリン‐β-D-グルクロニドであり、その入手先については上述した。フェリックアンモニウムシトレートの如き金属塩も必要であり且つテスト媒体に加え、Bglucによりサブストレートが分裂すると、実質的に黒い水不溶性の錯体が媒体内に形成される。サブストレートがE.Cからグルクロニダーゼにより加水分解されるとき解放される、この実質的に黒色の沈殿物は、鉄イオンおよびアグリコンを含む。
【００９０】
更に、表４を参照すると、Bgal、BfucおよびBgluは、エーロモナス属および一般大腸菌に共通である。しかし、表IVに示す如く、Bgal、BfucおよびBgluは、一般的にサルモネラおよびシゲラ菌により生成されない。従って、Bgal、BfucおよびBgluの１つに対応するサブストレート成分は、表５の右から選択される。Bgalおよび関連するサブストレート成分であるβ-D-ガラクトピラノシドが選択される。６−クロロ-3-インドリル-クロモゲン成分は、Bgalの存在下でサブストレートから分裂すると赤桃色を生成し且つクロモゲン成分として選択される。従って、第２サブストレートは、6-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドである。
【００９１】
再度、表４を参照して、Bman、AaraおよびAgalは、サルモネラ菌、シゲラ菌および一般大腸菌に共通である。しかし、表４に示す如く、Bman、AaraおよびAgalは、エーロモナス属では生成されない。よって、表５を参照して確定されるBman、AaraおよびAgalの１つおよびそれに関連するサブストレート成分が選択できる。テスト酵素Agalおよび対応するサブストレート成分であるα-D-ガラクトピラノシドが選択される。次に、表５からクロモゲン成分を選択しなければならない。表５の左に示す如く、クロモゲン成分である ５-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルは、関連するサブストレートから分裂されると青緑色を生成するので、選択される。従って、第３サブストレートは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドである。
【００９２】
一般大腸菌は、広い酵素パターンを有し、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドサブストレートおよび5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドサブストレートの両方に応答する。従って、一般大腸菌は、それぞれ上述した２つのサブストレートにより生成された色の合成である第４の明確な色である。この場合には、第４色は青紫であり、これは赤桃色と青緑色の合成色である。
【００９３】
最後に、表４に示す如く、E.Cもまた広い酵素パターンを示し、この例で選択された３つのサブストレートである8-オキシキノリン-β-D-ガラクトピラノシド、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドの全てに応答する。それにもかかわらず、テスト媒体内に存在するE.C群体は、上述の如く、クロモゲンサブストレートが実質的に黒色と干渉しないので、実質的に黒色を示す。この実質的に黒色は、E.Cを識別する優れた手段を提供し、また４つの別の微生物を単一のテスト媒体内で検出、定量化、分化および特定可能である（表６参照）。
【００９４】
（例II）
検出、定量化、分化および確認される選択された微生物は、第１色のE.C、第２色の一般大腸菌、サルモネラおよびシゲラ菌および第３色のエーロモナス属である。
【００９５】
表４を参照して、E.CはBgluc酵素を生成し、Bglucは検出される他のどの微生物でも生成されない。表５の右を参照すると、テスト酵素Bglucは、β-D-グルクロニドの対応サブストレート成分を有する。よって、Bglucの分裂で明確な色を生じるクロモゲン又は非クロモゲン成分は、表５の左から選択されるべきである。8-オキシキノリンは、その好適な実質的に黒色であるので選択された。従って、第１サブストレートは、8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドであり、その入手先は上述した。また、フェリアンモニウムシトレートの如き金属塩も必要であり、テスト媒体に加え、Bglucでサブストレートを分裂すると、実質的に黒色の水不溶性錯体が媒体内に生成される。この実質的に黒色の沈殿物は、サブストレートがグルクロニダーゼによりE.Cから加水分解されるとき解放されるアグリコンおよび鉄イオンからなる。
【００９６】
更に、表４を参照すると、Bgal、BfucおよびBgluは、エーロモナス属および一般大腸菌に共通である。しかし、表４に示す如く、Bgal、ＢfucおよびBgluは、サルモネラ菌又はシゲラ菌により生成されない。上述の如く表Vを使用して、第２サブストレートとして6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドが選択され、表５のクロモゲン成分リストにより示す如く分裂すると、赤桃色を生じる。
【００９７】
表４に示す如く、Bman酵素は、サルモネラ／シゲラ菌に共通であるが、エーロモナス属は異なる。表VからBmanに関連するサブストレート成分は、β-D-マノピラノシドである。この例において、サルモネラ／シゲラ菌では明確な第２色（赤桃色）を生じ、究極的にテスト媒体内に存在するサルモネラ／シゲラ菌の群体がテスト媒体内に存在する一般大腸菌と同じ色に見える。よって、クロモゲン成分は6-クロロ-3-インドリル-および第３サブストレートは6-クロロ-3-インドリル-β-D-マノピラノシドである。
【００９８】
この例において、表５を再度使用して、第４サブストレートは、サルモネラ／シゲラ菌に共通なBman、Aara、Agal酵素の１つで分裂されると明確な第３色を生じて確認できる。上述のように表５を使用して、選択された第４サブストレートは、5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドであり、サルモネラ／シゲラ菌の共通なAgalの存在により青緑色を生じる。
【００９９】
このテスト媒体内に存在する群体の色は、次のように予測できる。E.Cは、この例で選択された４つのサブストレートの全てにポジティブである広い酵素パターンを示し、これらサブストレートは8-ヒドロキシ-グルクロニドを含み、鉄イオンの存在下で実質的に黒色を生じる。E.C群体は、実質的に黒色である。エーロモナス属は、子お礼で選択された6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドサブストレートのみと反応する酵素パターンを有する。そして、エーロモナス属の群体は赤桃色である。サルモネラ／シゲラ菌はこの例で選択された第３および第４サブストレートの両方を分裂する酵素パターンを有し、従って、サルモネラ／シゲラ菌の群体は、青紫色（青緑色と赤桃色の合成色）である。最後に、一般大腸菌は、選択された第２、第３および第４サブストレートの各々にポジティブであり、サルモネラ／シゲラ菌の群体から識別可能な青紫色を示す。上述の如く、各菌の全ての種類の異なる種族は、各種酵素を同量生成するものではないので、例えば青紫色の色調が僅かに変化するかも知れない。
【０１００】
（例IIIA）
この例で定量化および分化される選択された微生物は、第１色のE.C、第２色の一般大腸菌およびエーロモナス属および第３色のサルモネラ／シゲラ菌である。
【０１０１】
表４を参照すると、E.Cは、Bgluc酵素を生成し且つ検出したい他のどの微生物もBglucは生成しない。表５の右を参照すると、テスト酵素Bglucは、β-D-グルクロニドの対応サブストレート成分を有する。即ち、Bglucの分裂により明確な色を生じるクロモゲン又は非クロモゲン成分は、表Vの左から選択されなければならない。8-オキシキノリンが好適な実質的に黒色用に選択される。従って、第１サブストレートは、8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドであり、その入手先は上述した。また、フェリアンモニウムシトレートの如き金属塩も必要であり、テスト媒体に加えてサブストレートをBglucにより分裂すると、実質的に黒い水不溶性の錯体が媒体中に形成される。この実質的に黒色の沈殿物は、サブストレートがグルクロニダーゼによりE.Cから加水分解されるとき解放されるアグリコンおよび鉄イオンよりなる。
【０１０２】
例Iおよび例IIを参照して上述したのと同様に表４および５を使用すると、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドが第２サブストレートとして選択され、大腸菌およびエーロモナス属に共通のBgal、BfucおよびBglu酵素の１つと結合するが、サルモネラ／シゲラ菌にはネガティブであり、この場合には実質的に赤桃色である明確な第２色を生じる。
【０１０３】
同様に、6-クロロ-3-インドリル-α-ガラクトピラノシドが第３サブストレートとして選択され、Agalと結合する。これは、大腸菌およびサルモネラ／シゲラ菌に共通であるが、エーロモナス属にはネガティブである。この酵素と反応すると、このサブストレートもまた明確な同じ第２色である赤桃色を生じる。
【０１０４】
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドが第４サブストレートと結合するよう選択される。これは、大腸菌およびエーロモナス属に共通であるが、サルモネラ／シゲラ菌にはネガティブである。この第４サブストレートは、Bgalと反応して青緑色を生じる。
【０１０５】
テスト媒体に存在する群体の色は、次の如く予想できる。E.Cは、広い酵素パターンを生じ、この例に選択された４つのサブストレートの全てにポジティブである。従って、E.C群体は、実質的に黒色である。一般大腸菌の群体は、第２、第３および第４サブストレートにポジティブである酵素パターンを有し、一般大腸菌は青紫色に見える。エーロモナス属は、選択された第２および第４サブストレートにポジティブであり、またエーロモナス属の群体も、青紫色に見える。最後に、サルモネラ／シゲラ菌に共通の酵素は、４つのサブストレートの第３のみにポジティブであり、サルモネラ／シゲラ菌の群体は赤桃色に見える。
【０１０６】
（例IIIB）
バリエーションとして、例IIIAのテスト媒体は、サルモネラ／シゲラ菌の群体が赤桃色ではなく青緑色に見え、他の群体の全ての色は、例IIIAと同じになるように製造される。表６を参照すると、例IIIAの6-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドを5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドに置換することにより、それを達成する。
【０１０７】
（例IIIC）
例IIIAと同じ４成分で同じ３色を生じさせる第２の独立した方法は、ナリジキシン酸又は他の抗生物質又は例１に一覧された成分にエーロモナス属の抑制剤を加えて達成する。それにより、セフロヂン又はナリジキシン酸又は他の物質は、エーロモナス属の抑制剤として作用し、エーロモナス属の群体を増殖させない。もしエーロモナス属を除くと、青紫色の群体は、全て真性の大腸菌であり、もし除去されないと、エーロモナス属は、大腸菌の一部としてカウントされる。エーロモナス属は、重要なインジケータ生物であるので、これを好む人もいる。
【０１０８】
（例IV）
この例では、検出、定量化および分化される選択された微生物は、明確な第１色のE.C、大腸菌およびサルモネラ／シゲラ菌および明確な第２色のエーロモナス属である。この結果を得るテスト媒体の１つは、例IIで説明したテスト媒体と同じであるが、第１サブストレートおよび金属塩が省かれている。よって、E.Cの酵素パターンは、一般大腸菌用の酵素パターンと同じサブストレートに反応するので、E.Cおよび大腸菌は、このテスト媒体内で同じ色になる。特に、E.C、大腸菌およびサルモネラ／シゲラ菌の群体は青紫色になり、一方、エーロモナス属の群体は実質的に赤桃色になる。
【０１０９】
（例V）
検出、定量化および分化される微生物は、第１色のE.C、一般大腸菌およびエーロモナス属、および明確な第２色のサルモネラ／シゲラ菌である。この結果を得る例３のテスト媒体であり、第１サブストレートおよび金属塩を省いている。このテスト媒体では、E.C、一般大腸菌およびエーロモナス属は略青緑に見え、サルモネラおよびシゲラ菌は略青緑色又は赤桃色である。オプションとして、6-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトシドを5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシドに置換し、サルモネラ菌を桃色はなく青緑色で示す。
【０１１０】
同じ結果を得る第３の手法は、好ましくはナリジキシン酸の抗生物質を加え、エーロモナス属の群体の増殖を抑制する。もしエーロモナス属を除くと、青紫色の群体は全て真性の大腸菌である。もし除かなければ、エーロモナス属は大腸菌の一部としてカウントされ、これはエーロモナス属が重要なインジケータ生物であるので、これを好む人もいる。
【０１１１】
（例VI）
検出、定量化および分化される選択された微生物は、明確な第１色のE.Cおよび大腸菌、明確な第２色のエーロモナス属および明確な第３色のサルモネラ／シゲラ菌である。この結果を得るテスト媒体は、例Iのテスト媒体であるが、第１サブストレートおよび金属塩を省いている。斯かるテスト媒体では、E.Cおよび一般大腸菌の群体は青紫色で示され、エーロモナス属の群体は略赤桃色で示され、サルモネラ又はシゲラ菌の群体は略青緑色で示される。
【０１１２】
（例VII）
検出、定量化および分化される選択された微生物は、実質的に黒色である明確な第１色のE.C、略青紫色である第２色の一般大腸菌、実質的に赤桃色である第３色のエーロモナス属／ビブリオ属／プレシオモナス属および実質的に青緑色のサルモネラ／シゲラ菌である。
【０１１３】
表４を参照して、E.CはBgluc酵素を生成し且つBglucは検出したい他の微生物の何れでも生成されない。従って、Bglucの分裂により明確な色を生じるサブストレートは、表５から選択されなければならない。8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドは、Bglucの存在下で実質的に黒色を生じ、後述の如く、これが好適な選択である。フェリアンモニウムシトレートの如く金属塩も加え、グルクロニダーゼによりE.Cからサブストレートが加水分解されてアグリコンおよび鉄イオンよりなる実質的に黒色の水不溶性錯体を形成する。
【０１１４】
更に表４を参照すると、NgalおよびNaglu酵素は、エーロモナス属、プレシオモナス属およびビブリオ属の微生物に共通であることが分かる。従って、これらの微生物の全てを明確な単一の色でテストする適当なサブストレートは、6-クロロ-3-インドリル-N-アセチル-β-D-ガラクトサミニド（galactosaminido）であり、これらの酵素が存在すると、これは実質的に赤桃色を生じる。
【０１１５】
表４を再度参照すると、Bman、AaraおよびAgalは、サルモネラ／シゲラ菌および一般大腸菌に共通である。しかし、表IVに示す如く、Bman、AaraおよびAgalは、エーロモナス属では生成されない。従って、サブストレートは表５から選択され、Bman、AaraおよびAgalの１つと反応し、明確な第３色を生じる。表Vに示すように、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトシドは、Agalの存在により青緑色を生じ且つサブストレートとして選択される。
【０１１６】
このテスト媒体において、E.C群体は、実質的に黒色、一般大腸菌の群体は実質的に青紫色、エーロモナス属、ビブリオ属およびプレシモナス属の群体は実質的に赤桃色、およびサルモネラおよびシゲラ菌の群体は実質的に青緑色を生じる。
【０１１７】
（例VIII）
検出、定量化および分化される選択された微生物は、明確な第１色のE.C、第２色の大腸菌、サルモネラ菌又はシゲラ菌、および第３色のエーロモナス属、ビブリオ属およびプレシモナス属である。この結果を得る１つのテスト媒体は、選択される第４サブストレートが6-クロロ-3-インドリル-N-アセチル-α-D-ガラクトサミニドである点を除き、例２のテスト媒体である。これに、プレシモナス、ビブリオおよびエーロモナス属の各微生物が応答し、これらの各群体は略赤桃色を生じる。
【０１１８】
（例IX）
この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、青紫色である第１色のE.Cおよび一般大腸菌、赤桃色である第２色のエーロモナス属、プレシモナス属およびビブリオ属、および青緑色である第３色のサルモネラ又はシゲラ菌である。この結果を得るテスト媒体は、例６と同じであるが、プレシモナス、ビブリオおよびエーロモナス属の各微生物が応答する6-クロロ-3-インドリル-N-アセチル-β-D-ガラクトサミニドを加えている。
【０１１９】
（例X）この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、第１色のE.Cおよび一般大腸菌、第２色のエーロモナス、ビブリオおよびプレシモナス属、および第３色のサルモネラ又はシゲラ菌である。この結果を得る適当なテスト媒体は、E.C群体の検出用サブストレートが省かれている点を除き例７に開示されるテスト媒体と同様である。この例で、E.Cおよび一般大腸菌は略青紫色を示し、エーロモナス、ビブリオおよびプレシモナス属は略赤桃色、サルモネラ又はシゲラ菌は略青緑色を示す。E.Cの群体に青紫色を生じるためには、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを加える。
【０１２０】
（例XI）
この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、実質的に黒色のE.Cおよび赤桃色の一般大腸菌である。表４を参照すると、E.CはBglu酵素を生成し、Bglucは検出される他の微生物では生成されない。従って、Bglucの分裂により明確な色を生じるサブストレートは、表Vから選択するべきである。ここで、Bglucの存在下で暗い色を生じる8-hydroxyquinoline-β-D-グルクロニドは、サブストレートの好適選択である。フェリアンモニウムシトレート等の金属塩も加え、サブストレートがグルクロニドによりE.Cから加水分解されるとき解放されるアグリコンおよび鉄イオンよりなる黒色の水不溶性錯体を形成する。
【０１２１】
更に表４を参照すると、Bgal、BfucおよびBgluは、エーロモナス属および一般大腸菌に共通である。しかし、表IVに示す如く、Bgal、BfucおよびBgluは、一般にサルモネラ又はシゲラ菌により生成されない。従って、サブストレートは、表VからBgal、BfucおよびBgluの１つと反応して明確な第２色を生じるように選択する。6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドがBgalの存在下で桃色を生じるので、第２サブストレートとして選択される。
【０１２２】
オプションとして、6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドと置換してエーロモナス属および一般大腸菌が桃色でなく青緑色を示すようにする。
【０１２３】
上述の如く、選択された第２サブストレートは、略赤桃色を示すエーロモナス属の群体を生じる。エーロモナス属の群体の増殖を避けるため、好ましくはナリジキシン酸である抑制剤を加える。よって、E.Cの群体は、実質的に黒色であり、一方、一般大腸菌の群体は赤桃色を示す。
【０１２４】
（例XII）
この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、実質的に黒色である第１色のE.C、一般大腸菌およびエーロモナス属および第２色のサルモネラ又はシゲラ菌である。選択された第１サブストレートは、8-オキシキノリン-β-D-ガラクトシドであり、E.Cおよびエーロモナス属の群体は実質的に黒色となる。第２サブストレートは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシド又は6-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドの何れかを選択する。これら２つのサブストレートのうち前者を選択すると、サルモネラ又はシゲラ菌の群体が青緑色を示し、一方、上述したサブストレートのうち後者を選択すると、サルモネラ又はシゲラ菌の群体が赤桃色を示す。
【０１２５】
オプションとして、この例において、上述の如く、好ましくはナリジキシン酸である抑制剤を加えて、エーロモナス属を省いてもよい。
【０１２６】
（例XIII）
この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、例１と同じであるが、偽のポジティブを訂正する。即ち、一種の非通常の腸内細菌科およびKlebsiellaは、例１で示したテスト媒体中で、E.Cと共に黒色の群体を示す。よって、E.Cの数が不正確に高くなり得る。
【０１２７】
この例では、例１で説明したテスト媒体に4-メチル-アンブレリフェリル-β-D-キシロピラノシドを加える。これにより、黒色を示す上述した腸内細菌およびKlebsiellaは蛍光を発する。従って、E.Cの偽のポジティブカウントを減少させることが可能である。この例は、本発明を取り込む実施形態の柔軟性を示す。蛍光成分は、実質的に黒色と干渉しないので、黒色群体は裸眼で容易に識別可能である。しかも、紫外線下で、偽のポジティブが検出され、蛍光を発する黒色群体を検査することにより実質的に低減可能である。
【０１２８】
（例XIV）
検出、定量化および分化される選択された微生物は、自室的に黒色のE.Cおよび赤桃色のサルモネラ菌である。一般大腸菌は、この例では無色である。
【０１２９】
例Iを参照すると、E.Cは8-ヒドロキシ-キノリン-β-D-グルクロニドに応答する。サルモネラ、シゲラおよびエーロモナス属は、8-ヒドロキシ-キノリン-β-D-グルクロニド応答しない。よって、第１サブストレートとして選択されたのは、8-ヒドリキシ-キノリン-β-D-グルクロニドである。
【０１３０】
表４を参照すると、エステラーゼ酵素は、サルモネラ菌にポジティブであるが、検出したい他の好適微生物のいずれにも反応しない。表Vを参照すると、6-クロロ-3-インドリル-カプリレートサブストレートは、分裂すると赤桃色を生じて検出できるので、第２サブストレートとして選択される。このテスト媒体では、E.Cの群体は、実質的に黒色を示し、サルモネラ又はシゲラ菌は赤桃色を示す。
【０１３１】
（例XV）
検出、定量化および分化される選択された微生物は、実質的に黒色であるE.C、暗い青紫色であるサルモネラ菌および赤桃色である一般大腸菌である。
【０１３２】
例Iを参照すると、E.Cは8-ヒドリキシ-キノリン-β-D-グルクロニドに応答する。一般大腸菌、サルモネラ菌、シゲラ菌およびエーロモナス属は、8-ヒドリキシ-キノリン-β-D-グルクロニドには応答しない。よって、第１サブストレートは、8-ヒドリキシ-キノリン-β-D-グルクロニドが選択される。
【０１３３】
表４および５を参照すると、５‐ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-カプリレートは、第２サブストレートとして特定され、これにサルモネラ又はシゲラ菌が応答する。更に、表５を参照すると、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-カプリレートは、分裂すると青緑色を生じる。
【０１３４】
分裂すると赤桃色を生じる6-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドが第３サブストレートとして選択され、E.C、一般大腸菌およびサルモネラ菌又はシゲラ菌に応答する。この例では、E.Cの群体は、実質的に黒色であり、一般大腸菌の群体は赤桃色であり、サルモネラ／シゲラ菌は、青紫色（赤桃色＋青緑色）となる。
【０１３５】
（例XVI）
この例で検出、定量化および分化される選択された微生物は、実質的に黒色のE.Cおよび明確な第２色の一般大腸菌である。
【０１３６】
表４を参照すると、E.CはBgluc酵素を生成し、Bglucは検出される他の微生物により生成されない。従って、Bglucの分裂により明確な色を生じるサブストレートは、表Vから選択すべきである。8-オキシキノリン-β-D-グルクロニドはBglucの存在下で暗い色を生じるので、好適なサブストレート選択である。フェリックアンモニウムシトレート等の金属塩を加え、サブストレートがグルクロニダーゼによりE.Cから加水分解されるとき、解放されるアグリコンおよび鉄イオンよりなる黒色の水不溶性錯体を形成する。
【０１３７】
更に表４を参照すると、Bgal、BfucおよびBgluは、エーロモナス属および一般大腸菌に共通である。しかし、表Vに示す如く、Bgla、BfucおよびBgluは、サルモネラ／シゲラ菌により生成されない。従って、サブストレートは表Vから選択され、Bgal、BfucおよびBgluの何れか１つと反応し、明確な第２色を生じるようにする。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドが、第２サブストレートとして選択され、この場合にE.Cは実質的に黒色に見え、一般大腸菌は青緑色に見える。オプションとして、第２サブストレートとして選択された5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-ガラクトピラノシドは、E.Cの群体が実質的に黒色に見え且つ一般大腸菌の群体がマジェンタに見える。エーロモナス属の群体の増殖を避けるために、好ましくはナリジキシン酸の抑制剤を加える。よって、E.Cの群体は実質的に黒色に見え、一方、一般大腸菌の群体はマジェンタ色に見える。
【０１３８】
本発明を取り込む幾つかの例を上述したが、本発明はこれらの例に限定されるべきではないと理解されるべきである。事実、上述の開示および例示は、本発明の要旨を逸脱することなく、実質的に無制限の数のテスト媒体が当業者には得られる。
【０１３９】
更に、本発明は好適デザインを有するものとして上述したが、種々の変形変更が可能である。従って、本発明は、その原理を使用するこれらの変形、応用および適用を包含するものである。更に、本発明の属する技術分野において周知技術を置換するものも、本発明に包含されると理解されるべきである。
【０１４０】
【発明の効果】
以上の説明から理解される如く、本発明によると、次の如き実用上の種々の顕著な効果が得られる。第１に、１以上のクロモゲンサブストレートと共に非クロモゲンサブストレートを使用することにより、共同作用で本発明のテスト媒体の色選択に自由度が増加する。その理由は、クロモゲンサブストレートは、非クロモゲンサブストレートにより形成される実質的に黒い沈殿物と干渉しないからである。
【０１４１】
第２に、周囲光の下で、単一のテストサンプルを使用して単一テスト媒体にて同時に４つのバクテリア種族を同時に定量化、識別および分化可能である。これにより、後続テストに付随する余分な時間およびコストが回避可能である。勿論、本発明のテスト媒体によると、単なる有無(P／A)テストである定性目的にも使用可能である。
【０１４２】
第３に、本発明のサブストレートは、必要に応じて拡大手段を使用する以外に、紫外線（UV）等を必要とすることなく容易に視覚的に相互に色が識別可能に選択可能である。例えば、好適実施形態では、E.Cの群体は実質的に黒色を有する沈殿物により明確に示され、一般大腸菌の群体は青紫色で指示され、エーロモナス属の群体は赤桃色で指示され、しかもサルモネラ又はシゲラ菌は青緑色で指示される。これらの色は視覚的に明瞭であるので、従来の媒体と比較して色間の混乱を大幅に減少可能である。
【０１４３】
第４に、本発明のテスト媒体は、使用が柔軟性に富み且つ容易である。生物の増殖および分化は最適レンジで行われるので、培養温度はクリティカルでない。従って、蘇生工程が回避でき且つ温度に敏感な種族の抑制は起らない。また、安価な機器が使用できる。
【０１４４】
第５に、本発明は、E.Cを一般大腸菌から確認分化するテスト媒体中での色識別が強調できる。好適テスト媒体において、E.Cの群体は実質的に黒色であり、一方、一般大腸菌は赤桃色であり、この識別は、従来のテスト媒体よりも遥かに明確である。両色間の混乱は、大幅に減少できる。
【０１４５】
第６に、エーロモナス属を一般大腸菌から確認分化可能である。従来のテスト媒体では、内部にエーロモナス属が増殖するのを防止するセフスロヂン抑制剤の使用が必要であった。しかし、抑制剤としてセフスロヂンを使用すると、フィルタ滅菌された抗生物質を付加する滅菌という付加工程が必要であり、制御が困難である。更に、セフスロヂンの存在は、媒体のシェルフ寿命を大幅に短縮する。更に、抑制剤を使用すると、エーロモナス属の検出および定量化を阻止する。これに対し、本発明によると、エーロモナス属が単一テスト媒体で一般大腸菌から検出、定量化および分化可能である。
【０１４６】
第７に、テスト媒体中でエーロモナス属の群体が増殖するのを抑制したい場合には、本発明はそれを行う優れた手段を提供する。特に、本発明お好適実施形態では、抑制剤として取り込む媒体のシェルフ寿命への悪影響が遥かに少ないナリジキシン酸を使用する。更に、ナリジキシン酸は、滅菌前に媒体の所期形成の一部として加えることが可能であり、これによりセフスロヂンで必要であった高価且つ困難なプロセスを回避可能である。最後に、ナリジキシン酸は、セフスロヂンより遥かに安価である。
【０１４７】
第８に、本発明は、定性又は定量テスト用のテスト媒体を提供する。即ち、本発明によるテスト媒体は、単なるバクテリアの有無テスト装置又は本発明のテスト媒体上で異なる色で指示される各種生物実体の定量化に使用可能である。