(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも近赤外線蛍光色素と、脂溶性成分を含有する物質とを有する複合体からなる近赤外線蛍光トレーサー。
【請求項２】
前記近赤外線蛍光色素がインドシアニングリーン系色素であり、前記脂溶性成分を含有する物質が高密度リポ蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の近赤外線蛍光トレーサー。
【請求項３】
請求項１または２に記載の近赤外線蛍光トレーサーを生体（ヒトを除く。）内に導入し、前記生体を励起光照射し、前記トレーサーからの近赤外線蛍光を検出することによる体外蛍光イメージング方法。
【請求項４】
少なくとも近赤外線蛍光色素と、脂溶性成分を含有する物質と、被検出物認識部からなる近赤外線蛍光トレーサー。
【請求項５】
前記近赤外線蛍光色素がインドシアニングリーン系色素であり、前記脂溶性成分を含有する物質が高密度リポ蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の近赤外線蛍光トレーサー。
【請求項６】
前記被検出物認識部が抗体であることを特徴とする請求項４または５に記載の近赤外線蛍光トレーサー。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の近赤外線蛍光トレーサーを生体（ヒトを除く。）内に導入し、前記生体を励起光照射し、前記トレーサーからの近赤外線蛍光を検出することによる体外蛍光イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、近赤外線蛍光トレーサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
厚みのある生体試料（人体等）の内部の様子を光を使って体外計測する手法は、医学研究や疾病の診断・治療にとって重要である。特に腫瘍の位置・大きさを画像診断によって予め知る事は、腫瘍の摘出にとって重要な技術であり、すでにいくつかの方法が知られている。
【０００３】
例えば、放射性同位元素（ＲＩ）による腫瘍組織や神経軸策流の画像診断は、被爆・汚染の懸念があり管理が煩雑であるという問題がある。また、管理区域外では利用できないため、手術時への応用は難しいという問題がある。例えば、神経筋接合部近傍に物質を投与すると、神経細胞がその物質を取り込み、神経終端から細胞体に向かって能動的に運搬する現象（神経軸策流）が知られており、神経軸策流のスピードが正常に比べ低下している場合は、その神経細胞に何らかの障害があると診断できることが知られている。実際、この診断にＲＩを用いる試みがなされているが、腫瘍の診断と同様の問題点を有している。
【０００４】
またＸ線ＣＴ技術は、被爆の問題は放射性同位元素の場合と同様であり、また、装置が大型であり、被験者を断層撮影装置の奥まった内部に置かなければならないので、手術時への応用は難しいという問題もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以上の問題点に鑑みなされたものである。すなわち、厚みのある生体試料（人体等）の内部の様子を近赤外蛍光により体外計測するための毒性の低い生体に使用可能な新規トレーサーを提供するものであり、また該トレーサーを用いた体外計測イメージング法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
近赤外光は生体への透過性が高いため、近赤外蛍光を放つ色素を体内に分布させてその体外計測を行い、種々の診断等に応用することが可能と考えられる。さらに、この方法においてはハロゲンランプ、ＣＣＤカメラ、光学フィルターとレンズなど、小型で安価な装置のみの構成で実現できる。
【０００７】
一方、色素については、トレーサーとして生体に用いた場合はその毒性が問題になり、使用できる色素に制限がある。この毒性の問題から、トレーサー色素として使用可能なももの１つとしてインドシアニングリーンが実際に臨床応用されている。この色素は有機溶媒中で近赤外蛍光（８３５ｎｍ）を放ち、またこれを使って眼底血管を蛍光観察した例がある。
【０００８】
しかし、この色素は無極性溶媒（有機溶媒等）中では蛍光性であるが、極性溶媒（水溶液等）中では無蛍光であり、上記の色素としてはこのままでは使用できないものである。
【０００９】
本発明者は以上の点に鑑み鋭意研究し、毒性のない近赤外線蛍光色素を有し、しかも水溶性である新規な近赤外線蛍光トレーサーを見出すことに成功した。すなわち、インドシアニングリーンのような毒性の低い、しかし水溶液では実質的に蛍光性でない色素を適当な高密度リポ蛋白質等と複合体を形成することにより、蛍光性となることを見出し、この知見に基づき上記複合体を近赤外線蛍光トレーサーとすることに成功した。また被検出物を特異的に認識可能とする認識部をさらに有する近赤外線蛍光色素トレーサーを見出し、この知見に基づき上記複合体を、被検出物を特異的に認識する近赤外線蛍光トレーサーとすることに成功した。
【００１０】
より詳しくは、本発明は、少なくとも近赤外線蛍光色素と、脂溶性成分を含有すＲ物質とを有する複合体からなる近赤外線蛍光トレーサーを提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、少なくとも近赤外線蛍光色素と、脂溶性成分を含有する物質と、被検出物認識部からなる近赤外線蛍光トレーサーを提供するものである。
【００１２】
さらには、本発明は、赤外線蛍光色素がインドシアニングリーン系色素であり、前記脂溶性成分を含有する物質が高密度リポ蛋白質であることを特徴とする近赤外線蛍光トレーサーを提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、被検出物認識部が抗体であることを特徴とする近赤外線蛍光トレーサーを提供するものである。
【００１４】
さらには、本発明は、近赤外線蛍光トレーサーを生体（ヒトを除く。）内に導入し、生体を励起光照射し、トレーサーからの近赤外線蛍光を検出することにより体外蛍光イメージングする方法を提供するものである。
【００１５】
以下実施の形態に即して本発明をさらに詳しく説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（近赤外線トレーサー）
本発明に係る近赤外線トレーサーは、近赤外領域に蛍光波長を有する色素を含むものであり、該蛍光を検出することにより追跡可能とするものである。ここで好ましい近赤外領域は、７００ｎｍ、より好ましくは８００ｎｍ以上の範囲であり、また上限は特に限定されないが、実際の有機系色素においては１２００ｎｍ〜１６００ｎｍ程度の範囲である。該色素自体は、少なくとも被検出物が存在する媒体中で蛍光性を有するものである必要があるが、以下に説明するように必ずしも水溶液中では蛍光性である必要はない。
【００１７】
また、本発明に係るトレーサーを生物体内で使用する際には特に必要な特性として水溶性であること（生体内液体媒体に溶けること）と、該生体に対して毒性がないことが望ましい。上記の２つの特性を兼備する色素であれば本発明においては特に限定されることはないが、本発明においては、例えばインドシアニングリーン系の色素が好ましく使用可能である。実際インドシアニングリーン系の色素は水溶性であり、肝循環機能検査用薬として使用されるものであり毒性の点では問題はない。
【００１８】
さらに、本発明に係る近赤外線トレーサーは、好ましくは該色素が他の生体成分に結合した複合体である。該色素が結合し得る他の生体成分としては、特に限定はないが、本発明に係るトレーサーの使用目的により種々の生体成分を選択可能である。例えば、(1)上記色素が生体内液体媒体（例えば血液、脊髄液等）に不溶性である場合に、可溶化するために種々の生体成分と複合体を形成させることも可能であるし、(2)逆に、上記色素が生体内液体媒体（例えば血液、脊髄液等）には可溶性であるにもかかわらず、水溶性の生体内液体媒体中では、十分蛍光性でなく、むしろ非水溶媒中で蛍光性となる場合に、種々の生体成分と複合体を形成させることで蛍光性とすることも可能であるし、(3)さらに、以下で説明するように本発明に係るトレーサーに被検出物を特異的に認識する部を導入するために適当な生体成分と複合体を形成することも可能である。
【００１９】
実際、上記のインドシアニン系色素は、毒性の点ではまったく問題ではないが、水溶性溶媒中では実質的に非蛍光性である。従って、本発明の実施例で示されるように、インドシアニン色素を脂溶性成分を有する生体成分である高密度リポ蛋白質と複合体を形成させることにより、インドシアニン色素を含みかつインドシアニン色素を蛍光性とすることができる。
【００２０】
さらに、好ましくは本発明に係る近赤外線トレーサーは、上記色素に他の生体成分を複合体化したものにさらに被検出物を特異的に認識する部を有するものである。上記認識部は、被検出物を特異的に認識すればよく、特に限定されることはない。例えばよく知られている、蛋白質−蛋白質の相互作用に基づくもの、例えば抗原抗体結合、レセプターリガンド結合等に基づくものが可能である。さらには、被検出物としては、特に限定されないが、種々の生体内の細胞（例えばガン細胞）が可能である。上記の認識部を設ける方法は、特に限定されないが、例えば通常の蛋白質の化学修飾反応で用いられる結合形成反応が好ましく使用可能である。上記説明した場合、蛍光色素を含み、かつ被検出物を特異的に認識する認識部を有するトレーサーが構成されることとなる。
【００２１】
（近赤外線トレーサーを用いたイメージング）
本発明に係る近赤外線トレーサーは、生体内で生体内液体媒体中で可溶性であり、かつ近赤外線領域で蛍光性を有するものである。従って、該トレーサーを生体内に導入し、該トレーサーが、拡散または体液の流動等により生体内を移動し、その位置及び濃度変化を生体外から該トレーサーに基づく蛍光を観察することでリアルタイムにイメージングすることが可能となる。
【００２２】
例えば、インドシアニングリーン−高密度リポ蛋白質（ＩＣＧ−ＨＤＬ）複合体に、抗腫瘍抗体を化学的に結合させることで、生体内での外腫瘍の位置及び大きさをリアルタイムで体外計測可能となる。この際イメージング装置が小型でリアルタイム計測できるので、該腫瘍の切除手術中にも用いることが出来るものである。この際腫瘍組織と正常組織の弁別がその場で出来るので、正常組織を無駄に切除したり腫瘍組織を切除し残す事がなくなることとなる。
【００２３】
また他の表面抗原（組織表面に出たリセプター蛋白やウイルスの外皮蛋白）に対する抗体を標識することにより、腫瘍に限らず任意の抗原が生体内のどの部分に存在するのか、また、ウイルスに感染した組織はどれかを簡便かつ特異的に認識することが可能であり、種々の疾患への診断試薬及び診断方法へ使用可能となる。
【００２４】
例えば、神経軸策流の画像診断として、上記ＩＣＧ−ＨＤＬ単体を神経筋接合部近傍に投与すれば、神経細胞に取り込まれ、軸策流に乗り、得られる蛍光を体外計測することで軸策流の測定が観察可能である。
【００２５】
本発明に係る上記トレーサーを使用し、該トレーサーからの蛍光を体外計測するための装置についても特に限定はないが、通常の励起光源と、必要ならば励起光源用フィルターにより最適な励起光を試料の生体の外部へ照射し、該励起光により生じる該色素からの蛍光を蛍光検出器で検出する。この際必要ならば、該色素からの蛍光のみを選択するためにフィルターを使用することも可能である。さらに、得られた蛍光情報をデーター処理することによりイメージングするものが好ましい。この際上記データー処理装置につても特に限定されることはないが、例えば「ＡＲＧＵＳ２０（浜松ホトニクス株式会社製）」が使用可能である。
【００２６】
さらには、上記説明したイメージングにより、本発明に係るトレーサー、例えばＩＣＧ−ＨＤＬに抗腫瘍抗体を化学的に結合させることで、腫瘍の位置・大きさを体外計測できることとなる。この手法を例えば手術中に行うと、腫瘍組織と正常組織の正確な区別により、正常組織を無駄に切除したり腫瘍組織を切除し残すのを防ぐための装置の開発に利用され得ることとなる。この際、ＩＣＧ−ＨＤＬへ抗体を結合させるには、すでに説明したように例えば、ＨＤＬ部分と抗体を結合（蛋白質間の架橋反応、通常アミノ基間をグルタルアルデヒドで架橋する等）させる方法、または、ＩＣＧ部分を抗体のアミノ基に架橋する方法等が可能である。
【００２７】
（実施例）
以下のように、近赤外領域蛍光色素インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とヒト高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）との複合体（ＩＣＧ−ＨＤＬ）を調整したものを使用した。ここで使用したＨＤＬは脂質と蛋白質が結合した血中蛋白成分である。ＩＣＧは上で説明したように該ＨＤＬの脂質部分に溶解して、その結果蛍光性となるものである。得られる複合体は水に可溶であり、従ってＩＣＧ−ＨＤＬは生体内の種々の部分にも投与可能であり、かつその近赤外蛍光を体外から観測するものである。
【００２８】
ＩＣＧは実際に臨床検査で人体に投与されているものであり、またＨＤＬも元来生体成分であるので、この複合体を外部から人体に投与しても毒性は少ない。
【００２９】
(1)  ＩＣＧ（ジアグノグリーン、第一製薬）２０．５ｍｇを蒸留水４ｍｌに溶解し、約５．１ｍｇ／ｍｌ（＝５．５４ｍＭ）水溶液を調整した。
【００３０】
ヒト高密度リポ蛋白溶液（ＨＤＬ，Ｋａｐｐｅｌ社製、２０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌに、ＩＣＧ水溶液２．５μｌを加え攪拌し、色素ー蛋白複合体（ＩＣＧ−ＨＤＬ）を調整した。この複合体溶液中のＩＣＧ濃度は約５５．４μＭである。
【００３１】
(2)  ＩＣＧ−ＨＤＬの光学的特性。
【００３２】
上記のＩＣＧ−ＨＤＬをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて５０倍に希釈し、この蛍光スペクトル（未補正）を測定した。また、比較のために同じ濃度の有機溶媒（ＤＭＳＯ）溶液のスペクトルも測定した。結果を図１に示す（なお、未補正のスペクトルであり、蛍光極大値は文献値(A. Schneider, A. Kaboth, L. Neuhauser : Detection of subretinal neovascular membranes with indocyanine green and an infrared scanning laser ophthalmoscope, American J. of Ophthalmol., 113-1, 45/51 (1992)とは一致しない)。
【００３３】
この結果から、ＩＣＧ−ＨＤＬ複合体はＤＭＳＯ溶液と同様の蛍光スペクトルを示すことが明らかである。すなわち、ＤＭＳＯ溶液に対して、ＩＣＧ−ＨＤＬは５８．３％の蛍光強度（波長８３５ｎｍ）を示す。
【００３４】
(3)  ＩＣＧ−ＨＤＬを用いた近赤外線蛍光イメージング。
【００３５】
上記得られた、ＩＣＧ−ＨＤＬを実際に生きた実験動物に投与し、ＩＣＧの近赤外蛍光を画像化して、ＩＣＧ−ＨＤＬが体内に分布していく様子を体外計測した。図２には本実施例で使用した測定系の概略を示す。すなわち、実験動物３にＩＣＧ−ＨＤＬトレーサー４を導入した後、１５０Ｗのハロゲンランプにバントバスフィルター（中心波長７２０ｎｍ）を装着して励起光源１とし、この光を光ファイバー２を介して実験動物３に照射する。発生するＩＣＧ−ＨＤＬの近赤外蛍光の検出にはＴＶレンズ（ＦＵＪＩＮＯＮ  ＣＦ８Ａ１：１．８／８）を装着したＣＣＤカメラ（Ｃ２４００−７５ｉ  浜松ホトニクス（株）製）６を用いた。ただし、ＣＣＤカメラの赤外カットフィルターは除去し、ＴＶレンズにシャープカットフィルター（透過波長８４０ｎｍ以上）５をセットする。ＣＣＤカメラ６の信号は画像処理装置７（ＡＲＧＵＳ２０（浜松ホトニクス（株）製））にて取り込む。
【００３６】
すなわち、生後３日のウイスター系ラット（オス）の右脳にＩＣＧ−ＨＤＬ溶液２５μｌを注射器にて注入した。図３にその反射光像（シャープカットフィルターなし）と近赤外蛍光像（シャープカットフィルター装着）を示す。
【００３７】
図３は投与直後の頭部の映像である（蛍光像におけるＣＣＤカメラの露光時間は１秒間）。投与部位を中心に前頭部にＩＣＧ−ＨＤＬが分布しているのが分かる。図４は投与後１時間の頭部の映像である（露光１秒間）。蛍光像よりＩＣＧ−ＨＤＬの分布が後頭部に移ってきているのが分かる。また図５は投与後８時間の体全体の映像である（右が頭部、左が尾部。露光８秒間）。脊髄の終端にＩＣＧ−ＨＤＬが移動してきたのが分かる。さらに、図６には、以上の時間変化の結果を、得られた蛍光強度と時間との関係を明らかにするために模式的に示したものである。
【００３８】
この結果は、ＩＣＧ−ＨＤＬが脳から脊髄の中へと、体表より深い部分を移動していく様子が生きた実験動物で経時的に観察できることを明確に示している。これはまた、厚みを持った生体試料の観察にＩＣＧ−ＨＤＬをトレーサーとして使用可能であることを示している。
【００３９】
【発明の効果】
本発明に係るトレーサーの構成、すなわち、近赤外領域蛍光色素と、適当な生体物質との複合体は、生体内体液中で可溶であり、さらに、水溶液では蛍光色素としては使用不可能である毒性の低い色素を水溶液でも蛍光性とするものである。従って、本発明に係るトレーサーを、蛍光検出装置（励起光源、ＣＣＤカメラ等の検出系、および画像処理装置）とともに用いることにより生体外で計測してイメージングすることが可能となる。
【００４０】
すなわち、Ｘ線源・レ−ザ−光源・断層撮影用検知器・高速コンピューター等は必要なく、同等のイメージングが可能となる。さらに、簡便・安価なために、リアルタイムイメージング（例えば手術中）の応用も可能とする。
【００４１】
また、ＩＣＧ単体を用いた血管造影では適応部位が限られたが、ＩＣＧ−ＨＤＬを用いればそうした制限はない。
【図面の簡単な説明】
【図１】インドシアニングリーン色素のＤＭＳＯ中での蛍光スペクトルと、本発明に係るインドシアニン−高密度リポ蛋白質複合体の水溶液中での蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】本発明に係るインドシアニン−高密度リポ蛋白質複合体をトレーサーとして用いた、イメージングのための測定系の概略を示す図である。
【図３】ＩＣＧ−ＨＤＬを投与したラットの投与直後の反射光像（上）と近赤外蛍光像（下）を示す顕微鏡写真である。
【図４】ＩＣＧ−ＨＤＬを投与したラットの投与後１時間の反射光像（上）と近赤外蛍光像（下）を示す顕微鏡写真である。
【図５】ＩＣＧ−ＨＤＬを投与したラットの投与後８時間の反射光像（上）と近赤外蛍光像（下）を示す顕微鏡写真である。
【図６】ＩＣＧ−ＨＤＬを投与したラットの投与後の時間変化の結果を、得られた蛍光強度と時間との関係を模式的に示した図である。
【符号の説明】
１…励起光源、２… 光ファイバー、３…試料（ラット新生児）、４…ＩＣＧ−ＨＤＬトレーサー、５…シャープカットフィルター（８４０ｎｍ）、６… 検出機（カメラ）、７…画像処理装置、８…蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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