(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に、ホモシステインデスルフラーゼを作用させて２−ケト酸を生成せしめ、次いで酸化型または還元型ニコチンアミド補酵素及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の共存下に、当該２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素を作用させて酵素反応を行い、該酵素反応の進行に伴って消費される前記ニコチンアミド補酵素またはチオニコチンアミド補酵素の量、若しくは該酵素反応の進行に伴って生成する対応ニコチンアミド補酵素または対応チオニコチンアミド補酵素の量を定量することにより被検体中のホモシステイン量を決定することを特徴とするホモシステインの定量方法。
【請求項２】
請求項１記載のホモシステインの定量方法において、２−ケト酸に２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素を作用させる際に、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素が作用する基質を共存させることを特徴とするホモシステインの定量方法。
【請求項３】
ニコチンアミド補酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイトであり、チオニコチンアミド補酵素がチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイトである請求項１または２記載のホモシステインの定量方法。
【請求項４】
ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェイト、還元型または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト、及び２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成しうる反応を触媒する脱水素酵素を含有して成ることを特徴とするホモシステイン定量用試薬。
【請求項５】
ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェイト、還元型または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト、２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成しうる反応を触媒する脱水素酵素、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素が作用する基質を含有して成ることを特徴とするホモシステイン定量用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は検体中のホモシステインを極めて高感度に定量する新規な方法に関するものである。特に、生体内の各臓器及び体液中のホモシステイン定量に対して有効であり、例えば臨床検査などの医療の分野において広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来のホモシステインの定量方法としては、検体中のホモシステインをＳＨ基と反応する蛍光標識試薬を使用して標識した後に高速液体クロマトグラフィーにより分離して定量するプレラベルＨＰＬＣ法、検体を高速液体クロマトグラフィーにより分離した後にＳＨ基と反応する蛍光標識試薬と反応させて検出定量するポストラベルＨＰＬＣ法、ホモシステインと特異的に作用する酵素を作用させて、その酵素反応生成物を抗体法によって検出定量する酵素免疫法、及びホモシステインに特異的に作用する酵素を作用させた後に、その生成物を酵素法で検出定量する酵素法等が提案されている。
【０００３】
かかる従来の定量技術はいずれも多検体を簡便かつ精度良くホモシステインを定量することは不可能な方法である。従来の技術の中で高速液体クロマトグラフィーを使う定量方法として、例えばMethods in Enzymology、143巻、67頁（1987年）に記載の方法は、検体中のチオール化合物を高感度である蛍光ラベル試薬でプレラベル化反応を行った後、高速液体クロマトグラフィーで標識化ホモシステインを分離定量する方法である。この定量方法は、高感度化は図られてはいるが、プレラベル化反応が煩雑であることや検体の処理能力が低い等の難点を有している。
【０００４】
高速液体クロマトグラフィー法の中のかかるプレラベル化の煩雑さを解決する方法として、例えば Analytical  Biochemistry、227巻、14頁（1995年）に記載の高速液体クロマトグラフィーによってホモシステインを分離した後、蛍光試薬を反応させる、所謂ポストラベル化法が提案されている。しかし、かかるポストラベル高速液体クロマトグラフィー法にしても、検体処理能力の低いという課題は依然解決されない上に、高価な蛍光試薬をポストラベル化に多量に使用するという欠点を有している。
【０００５】
上記の高速液体クロマトグラフィー法の課題を解決する方法として、酵素と抗体を使用する定量方法が提案されている。例えば、特表平8-50648号公報やClinical Chemistry、44巻、311頁（1998年）に記載のホモシステインの定量方法は、検体中のホモシステインをアデノシンとS-アデノシルホモシステイン合成酵素の存在下で反応せしめ、生成したS-アデノシルホモシステインを該化合物に対して特異的に作用する抗体を使用して酵素免疫法で定量する方法である。該酵素免疫法は、高速液体クロマトグラフィー法と比較すれば多検体の処理能力の点では有利になってはいるが、酵素反応と酵素免疫法を組み合わせた煩雑さや高価な抗体を使用する欠点を有している。
【０００６】
かかる酵素免疫法の課題を改良する技術として、酵素的ホモシステインの定量方法が提案されている。例えば、国際特許WO-9905311号公報に記載の方法は、検体中のホモシステインをホモシステイナーゼなる酵素と作用せしめ、生成した硫化水素を色素に導いた後に比色分析することによってホモシステインを定量する方法である。また、国際特許WO-9807872号公報に記載の方法は、検体中のホモシステインをホモシステインデスルフラーゼなる酵素と作用せしめ、生成した２−ケト酪酸を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記載する）の存在下で乳酸脱水素酵素あるいはピルビン酸脱水素酵素と作用せしめ、生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと記載する）を定量することによってホモシステインを定量する方法である。
しかし、これらの酵素的定量方法の中で、検体中のホモシステインをホモシステイナーゼなる酵素と作用せしめ、生成した硫化水素を比色分析することによってホモシステインを定量する方法は、色素法であるため感度が低い難点を有している。
【０００７】
また、検体中のホモシステインをホモシステインデスルフラーゼなる酵素と作用せしめ、生成した２−ケト酪酸をＮＡＤＨの存在下で乳酸脱水素酵素あるいはピルビン酸脱水素酵素と作用せしめ、生成するＮＡＤを定量することによってホモシステインを定量する方法は、高感度である有利さはある一方、定量工程の途中でＮＡＤＨを分解させる煩雑な工程を経た後に酵素サイクリングを行わしめる方法であり、自動分析機で定量することが困難であるという難点を有している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来の技術の課題を解決する簡便かつ高感度な検体中のホモシステインの定量方法を提供するものである。即ち、本発明は、血清や血漿等のホモシステイン含量の低い検体中のホモシステインを定量するに際して、定量工程として酵素反応のみである簡便さを有し、かつ高感度で自動分析機にも適用できるホモシステインの定量方法と定量用試薬組成物を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ホモシステインを含有する被検体に、ホモシステインデスルフラーゼを反応させた後／あるいは反応させながら、酵素反応の進行に伴って生成する２−ケト酪酸の量を、２−ケト酪酸を基質としてニコチンアミド補酵素存在下で２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素、ニコチンアミド補酵素、及びチオニコチンアミド補酵素の存在下で作用せしめ、反応の進行に伴って生成する対応ニコチンアミド補酵素又は対応チオニコチンアミド補酵素の量、或いは反応の進行に伴って減少する予め添加したニコチンアミド補酵素、及びチオニコチンアミド補酵素の量を定量することによって被検体中のホモシステイン量を簡便にかつ高感度に定量する方法である。
【００１０】
即ち、本発明は、被検体に、ホモシステインデスルフラーゼを作用させて２−ケト酸を生成せしめ、次いで酸化型または還元型ニコチンアミド補酵素及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の共存下に、当該２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素を作用させて酵素反応を行い、該酵素反応の進行に伴って消費される前記ニコチンアミド補酵素またはチオニコチンアミド補酵素の量、若しくは酵素反応の進行に伴って生成する対応ニコチンアミド補酵素または対応チオニコチンアミド補酵素の量を定量することにより被検体中のホモシステイン量を決定することを特徴とするホモシステインの定量方法である。
【００１１】
他の発明は、ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェイト、還元型または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト、及び２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成しうる反応を触媒する脱水素酵素を含有して成ることを特徴とするホモシステイン定量用試薬である。
【００１２】
更に他の発明は、ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェイト、還元型または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト、２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成しうる反応を触媒する脱水素酵素、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素が作用する基質を含有して成ることを特徴とするホモシステイン定量用試薬である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の酵素サイクリング法を実施する際に使用するニコチンアミド補酵素とチオニコチンアミド補酵素は、それぞれ還元型と酸化型の２種類があるため、ニコチンアミド補酵素として還元型を使用する場合は、チオニコチンアミド補酵素として酸化型を使用し、またニコチンアミド補酵素として酸化型を使用する場合は、チオニコチンアミド補酵素として還元型を組み合わせて用いる必要がある。
【００１４】
本発明において、酸化型または還元型ニコチンアミド補酵素及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の共存下に、２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素（以下、２−ケト酪酸脱水素酵素類という）を作用させて酵素反応を行うと、該酵素反応の進行に伴って２−ヒドロキシ酪酸が生成し、又、用いた補酵素は、該補酵素が酸化型で有れば還元型に、該補酵素が還元型で有れば酸化型に変換される。従って、本発明において、対応ニコチンアミド補酵素、対応チオニコチンアミド補酵素とは、２−ケト酢酸に２−ケト酪酸脱水素酵素類を作用させた結果、その酵素反応よって変換した補酵素を指し、反応前の補酵素が酸化型であれば、還元型を意味し、還元型で有れば酸化型を意味する。
【００１５】
反応の経過に伴って生成する対応ニコチンアミド補酵素または対応チオニコチンアミド補酵素の量を定量する場合、若しくは反応の経過に伴って消費されるニコチンアミド補酵素または対応チオニコチンアミド補酵素の量を定量する具体的方法としては、還元型ニコチンアミド補酵素と酸化型チオニコチンアミド補酵素を組み合わせて反応を進行させる場合は、反応の経過に伴って増加する還元型チオニコチンアミド補酵素の量を、また酸化型ニコチンアミド補酵素と還元型チオニコチンアミド補酵素を組み合わせて反応を進行させる場合は、反応の経過に伴って減少する還元型チオニコチンアミド補酵素の量を定量する方法が一般的である。
【００１６】
本発明の代表的測定原理を以下の式に例示する。
【化１】
0003869603.tif 000002
【００１７】
上式では、ニコチンアミド補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、チオニコチンアミド補酵素として酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、また２−ケト酪酸脱水素酵素類として２−ケト酪酸脱水素酵素を使用した例を示している。
【００１８】
本発明は、さらに精度の高い簡便かつ高感度なホモシステインの定量法を提供する。上記の酵素サイクリング法を実施する場合、最終的に酵素サイクリング反応の経過に伴って増減するニコチンアミド補酵素またはチオニコチンアミド補酵素を定量する際、条件によっては各々の補酵素がそれぞれ補酵素の定量を妨害することがある。この課題を解消するためには、ニコチンアミド補酵素濃度とチオニコチンアミド補酵素濃度の差を大きくすればこれらの妨害を少なくすることが可能となる。しかし一方で、片方の補酵素の濃度が低いことに起因する酵素サイクリング反応速度の低下や、片方の補酵素の濃度変化による一方の補酵素測定の誤差を招くことがある。これらの難点を解消する手段として、濃度を低くした補酵素の再生反応を酵素サイクリング反応に組み入れる手段が好適に使用出来る。
【００１９】
該補酵素の再生反応としては、２−ケト酪酸脱水素酵素類の酵素反応には影響を与えず、かつ対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素反応であれば如何なるものでも良く特に限定されない。
【００２０】
この補酵素の再生反応を含む代表的ホモシステイン測定原理を下式に例示する。
【００２１】
【化２】
0003869603.tif 000003
【００２２】
上式では、ニコチンアミド補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、チオニコチンアミド補酵素として酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、２−ケト酪酸脱水素酵素類類として２−ケト酪酸脱水素酵素、ニコチンアミド補酵素あるいはチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素（以下、酸化還元脱水素酵素類という）としてアルコール脱水素酵素、及びアルコール脱水素酵素の基質としてエタノールを使う例を示す。
かかる補酵素の再生反応を含む被検体中のホモシステインの高感度測定方法を詳細に説明すると以下の通りである。
【００２３】
ホモシステインを含む被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させ、酵素反応に伴って生成する２−ケト酪酸に、高濃度の酸化型チオニコチンアミド補酵素と低濃度の還元型ニコチンアミド補酵素の存在下で２−ケト酪酸脱水素酵素類を作用させると、可逆反応の進行に伴って還元型チオニコチンアミド補酵素が生成すると共に、還元型ニコチンアミド補酵素が消費されて行く。この還元型ニコチンアミド補酵素が消費されて行くと該可逆反応は速度が低下するか、あるいは反応が停止する。そこで該可逆反応を行わしめながら、チオニコチンアミド補酵素には作用せず、かつまた該可逆反応には影響を与えない還元型ニコチンアミド補酵素の再生反応のための酸化還元脱水素酵素類とその基質を加えると、消費された還元型ニコチンアミド補酵素が酸化型ニコチンアミド補酵素から再生され、該可逆反応が継続すると共にニコチンアミド補酵素の還元型と酸化型の濃度の割合が比較的一定になる。反応速度が減少することなく継続する該可逆反応に伴って生成して行く還元型チオニコチンアミド補酵素の濃度は、例えば吸光度測定によって還元型ニコチンアミド補酵素由来の吸光度に影響されることなく容易に測定され、最終的には被検体中のホモシステイン濃度を正確かつ高感度に定量することが可能となる。
【００２４】
本発明における被検体とは、医学や臨床検査分野等におけるホモシステインの測定対象となる検体を指し、例えば血清、血漿、細胞液、及び臓器抽出液等を言う。
【００２５】
本発明の定量法あるいは定量用試薬におけるホモシステインデスルフラーゼ（ＥＣ 4.4.1.2）は、測定対象となる被検体の種類や測定条件によって異なるが、ホモシステインを基質として２−ケト酪酸を生成する反応を触媒する酵素であれば如何なるものでも良く、かかる特性を有する公知の酵素が特に制限なく使用される。この特性を有する酵素を例示すれば、Methods in Enzymology、第２巻、318頁（1955年）及びJournal of Biological Chemistry、192巻、371頁（1951年）に記載のプロテウス・モルガニ由来のホモシステインデスルフラーゼ、Journal of Biochemistry、79巻、1263頁（1976年）、Biochemistry、16巻、100頁（1977年）、及びMethods in Enzymology、143巻、459頁（1987年）に記載のシュードモナス属由来のホモシステイナーゼ、Medical Science、第13巻、493頁（1985年）、及び国際特許WO 9807872号公報に記載の線虫トリコモナス属由来のホモシステインデスルフラーゼ等が挙げられる。
【００２６】
本発明の定量法において、被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させる方法は、被検体の種類や測定条件によって任意に選択することが出来る。即ち、測定の煩雑さを問わない場合は、被検体に含まれるホモシステインの殆ど全てがホモシステインデスルフラーゼの作用によって２−ケト酪酸に変換した後に２−ヒドロキシ酪酸との可逆反応あるいは該可逆反応と補酵素の再生反応を行わしめる方法を選ぶことが出来る。測定を簡便に実施しようとする場合は、被検体中のホモシステインをホモシステインデスルフラーゼの作用によって２−ケト酪酸に変換せしめつつ、２−ヒドロキシ酪酸との可逆反応あるいは該可逆反応と補酵素の再生反応を同時進行させる方法を選ぶことが可能である。
【００２７】
本発明における被検体に作用させるホモシステインデスルフラーゼの量は、被検体の種類や酵素の種類によって適宜決定されるが、一般的には0.1〜1000μmoles/min/mlの濃度範囲、特に0.2〜500μmoles/min/mlの濃度範囲が好適に使用される。ホモシステインデスルフラーゼを作用させる際のｐＨは、酵素の由来によって適宜選ばれるが、一般的にはｐＨ3.5〜10.5の範囲、特にｐＨ4.0〜10.0の範囲が好適に選ばれる。また、ホモシステインデスルフラーゼを作用させる際の反応温度は、一般的には20〜45゜Cの温度範囲、好ましくは25〜40゜Cの温度範囲が好適に選ばれる。
【００２８】
本発明の定量法あるいは定量用試薬におけるニコチンアミド補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ：還元型、ＮＡＤ：酸化型、以下同様）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェイト、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト等が具体的に挙げられる。また、チオニコチンアミド補酵素としては、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（チオＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト等が具体的に挙げられる。
【００２９】
本発明の定量法において使用されるニコチンアミド補酵素あるいはチオニコチンアミド補酵素の濃度は、1μM〜200mMの広い濃度範囲が一般的であるが、特に5μM〜100mMの濃度範囲が好適に使用される。
【００３０】
本発明の２−ケト酪酸脱水素酵素類とは、ＮＡＤＨに代表される還元型ニコチンアミド補酵素、あるいはチオＮＡＤＨに代表される還元型チオニコチンアミド補酵素の存在下で、２−ケト酪酸を可逆的に還元して２−ヒドロキシ酪酸を生成せしめる酵素であれば特に限定されることはなく、かかる特性を有する公知の酵素が制限なく使用される。この特性を有する酵素を例示すれば、動物由来、植物由来、及び微生物由来のＬ−乳酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.27）、あるいは多くの微生物由来のＤ−乳酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.28）が挙げられるが、特にブタ心臓あるいはブタ筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素、微生物Bacillus属由来のＬ−乳酸脱水素酵素、微生物Lactobacillus属由来のＬ−乳酸脱水素酵素、あるいは大腸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素等が入手の容易さで好適に使用出来る。
【００３１】
本発明の定量法における２−ケト酪酸脱水素酵素類の量は、使用する被検体の種類や測定条件あるいは酵素の由来によって適宜決定されるが、一般的には0.1〜1000μmoles/min/mlの濃度範囲、特に0.5〜500μmoles/min/mlの濃度範囲が好適に使用される。２−ケト酪酸脱水素酵素類の反応ｐＨは、使用する酵素によって適宜決定されるが、一般的にはｐＨ4.0〜10.5の範囲、好ましくはｐＨ4.5〜10.0の範囲が好適である。また、２−ケト酪酸脱水素酵素類の反応温度は、一般的には20〜45゜Cの温度範囲、好ましくは25〜40゜Cの温度範囲が好適に選ばれる。
【００３２】
本発明の定量法において、反応の経過に伴って消費または生成するニコチンアミド補酵素、チオニコチンアミド補酵素、対応ニコチンアミド補酵素、若しくは対応チオニコチンアミド補酵素を定量する方法としては、これら何れの補酵素の増減を定量しても良いが、一般的には、還元型ニコチンアミド補酵素あるいは還元型チオニコチンアミド補酵素が有する極大分子吸光係数を示す波長における吸光度分析が好適に採用される。還元ニコチンアミド補酵素の場合は、340nm付近における吸光度の増減で定量を行い、還元チオニコチンアミド補酵素の場合は、400nm付近における吸光度の増減で容易に定量が可能である。
【００３３】
本発明の定量法において、補酵素の再生反応を組み合わせることで更なる高感度化を実現することが出来る。最終的な測定対象補酵素が対応チオニコチンアミド補酵素である場合は対応ニコチンアミド補酵素の再生反応を、最終的な測定対象補酵素が対応ニコチンアミド補酵素である場合は、対応チオニコチンアミド補酵素の再生反応を適宜組み合わせることによって、ホモシステインの高感度定量法を更に精度の高いものとすることが可能となる。補酵素の再生反応を行わしめる酵素とその基質は、２−ケト酪酸と２−ヒドロキシ酪酸の可逆反応に影響を及ぼさないものであれば如何なるもので良く、かかる条件を満たす再生反応を進行させる酵素とその基質を例示すればアルコール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.1、またはＥＣ 1.1.1.2）とエタノールあるいはアセトアルデヒド；グリセロール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.6）とグリセロールあるいはジヒドロキシアセトン；アラビニトール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.12、あるいはＥＣ 1.1.1.14）とアラビニトール、キシルロースあるいはリブロース；グリセリン酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.29）とグリセリン酸あるいはヒドロキシピルビン酸；リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.37、あるいはＥＣ 1.1.1.82）とリンゴ酸あるいはオギザロ酢酸；アリールアルコール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.90）とベンジルアルコールあるいはベンズアルデヒド；酒石酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.93）と酒石酸あるいはオギザログリコール酸等が挙げられる。これらの補酵素の再生反応に使用される酸化還元脱水素酵素類の濃度は、使用される補酵素の種類や濃度によって異なるが、一般的には0.1〜1000μmoles/min/mlの濃度範囲、特に0.5〜500μmoles/min/mlの範囲が好適に使用される。
【００３４】
本発明によるホモシステインの測定方法は酵素サイクリング法を使用する高感度測定方法であるため、本方法を実施する際、以下に示す実施方法が測定の精度を上げるために好適である。
【００３５】
本発明の測定方法における温度範囲は、使用する各酵素成分の平均的至適温度範囲、すなわち20〜45゜Cの温度範囲、好ましくは25〜40゜Cの温度範囲が好適である。測定精度に最も影響する温度因子は各被検体あるいは検量線を作成するための標準ホモシステイン標準液を測定する際の測定温度である。測定精度を上げるためには酵素反応セルあるいはキュベットの温度調整誤差範囲が、±0.5゜C以下の範囲、好ましくは±0.2゜C以下の範囲が好適である。
【００３６】
また、セルあるいはキュベットに分注する被検体、ホモシステイン標準液、及び使用する酵素溶液の量は、極めて再現精度の高いピペットあるいは分注ポンプを使うことが必要となる。本発明の測定方法に使用するピペットあるいは分注ポンプの再現精度は、±0.3%以下の精度範囲、好ましくは±0.1%以下の精度範囲が好適である。
【００３７】
さらに、測定ごとの反応時間の精度も測定精度に大きく影響されため、被検体あるいはホモシステイン標準液における反応時間を一定にする必要がある。各測定における反応時間の精度は、±2秒以下の時間範囲、好ましくは±1秒以下の温度範囲が精度を上げるために好適である。
【００３８】
種々の被検体中のホモシステイン濃度を測定する際には、高感度測定法の常法である検量線作成のために予めホモシステイン標準液の測定を行う。この検量線作成は、測定精度を高くするためには種々の濃度の標準液の測定することが好ましいが、被検体中のホモシステイン濃度の上限に近い濃度の標準液とブランク（ホモシステイン濃度がゼロ）の２点検量線法に依っても高い精度が得られる。検量線作成のための測定頻度は、精度を上げるためには多くすることが好ましいが、通常50回の被検体測定あたり1回以上、好ましくは20回の測定あたり1回以上の検量線作成測定が好適である。
【００３９】
本発明の定量用試薬は、前述の高感度定量法に使用される各種酵素及び補酵素、更に必要に応じて酵素が作用する基質を主成分とし、通常緩衝液中に溶液状態で存在させるものが一般的であるが、使用直前に緩衝液で溶解させる凍結乾燥状態の試薬とすることも可能である。
【００４０】
具体的な本発明の定量用試薬の主構成は、ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、及び２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒する脱水素酵素から成る。
【００４１】
また、補酵素の再生反応を利用する場合の定量用試薬の主構成は、ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型または還元型ニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、２−ケト酪酸を基質として２−ヒドロキシ酪酸を可逆的に生成しうる反応を触媒する脱水素酵素、対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び対応ニコチンアミド補酵素あるいは対応チオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素が作用する基質からなる。
【００４２】
上記定量用試薬は構成する成分をすべて含んだ一液の試薬とした場合でも、定量の基礎となる各反応は逐次的に進行するので定量が可能となる。必要に応じて、各反応毎に必要な成分から成る複数の試薬としても構わない。
【００４３】
上記構成成分を緩衝液中に溶解させる場合の緩衝液としては、各酵素が有効に作用するｐＨを維持できるものであれば特に制限はなく、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などが使用できる。
【００４４】
当該試薬中の各成分の濃度や試薬のｐＨ等の諸条件は、測定時に該試薬と被検体とを混合した際に、前述の高感度定量法の項で述べた諸条件を満足するように調製すればよい。また、当該試薬中には、試薬を安定化させるためのシュークロースなどの糖類、アジ化ナトリウム、抗菌剤などの防腐剤等々必要に応じて公知の成分を含有させることができる。
【００４５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、酵素量は37゜C下で1.0μmole/minの反応を触媒する酵素量を1.0Uと示す。
【００４６】
実施例１  ホモシステイン水溶液の測定
以下に示す組成の測定用試液Ａ、測定試液Ｂ及びホモシステイン溶液を調製した。
［測定用試液Ａ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
10U/ml  ホモシステインデスルフラーゼ
(Proteus morganii IFO-3168由来)
［測定用試液Ｂ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
5mM  チオＮＡＤ（シグマ社製）
1mM  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
200U/ml  L-乳酸脱水素酵素
(オリエンタル酵母社製、ブタ筋肉由来)
［ホモシステイン溶液］
50μM  ホモシステイン標準水溶液
【００４７】
上記ホモシステイン標準水溶液を精製水にて希釈して、10μM,20μM,30μM, 40μM濃度の希釈系列のホモシステイン希釈溶液を調製した。20μlのホモシステイン標準水溶液、それぞれのホモシステイン希釈溶液、及び精製水を各々のキュベットに分注し、さらに0.5mlのあらかじめ37゜Cに加温した測定用試液Ａを各々のキュベットに分注し混和後、37゜C下で10分間反応させた。反応後、各々のキュベットにあらかじめ37゜Cに加温した測定試液Ｂを0.5mlずつ、各々のキュベットに分注混和後、3分間後と13分間後の400nmの吸光度を測定し、それぞれの吸光度の差をΔAbsとした。ホモシステイン濃度とΔAbsとの関係を図１に示す。この結果から水溶液中の微量のホモシステインを正確に定量できることが判る。
【００４８】
実施例２  ホモシステインデスルフラーゼの反応方式
以下に示す組成の測定用試液Ａ、測定試液Ｂ及びホモシステイン溶液を調製した。
［測定用試液Ａ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
10U/ml  ホモシステインデスルフラーゼ
(Proteus morganii IFO-3168由来)
［測定用試液Ｂ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
5mM  チオＮＡＤ（シグマ社製）
1mM  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
200U/ml  L-乳酸脱水素酵素
(オリエンタル酵母社製、ブタ筋肉由来)
［ホモシステイン溶液］
50μM  ホモシステイン標準水溶液
【００４９】
上記ホモシステイン標準水溶液を精製水にて希釈して、10μM,20μM,30μM, 40μM濃度の希釈系列のホモシステイン希釈溶液を調製した。50μlのホモシステイン標準水溶液、各ホモシステイン希釈溶液、及び精製水をそれぞれのキュベットに分注し、あらかじめ37゜Cに加温した0.5mlの測定用試液Ａと0.5mlの測定用試液Ｂを各々のキュベットに分注し混和し、3分間後と13分間後の400nmの吸光度を測定した。13分後と3分後のそれぞれの吸光度の差をΔAbsとし、ホモシステイン濃度とΔAbsとの関係を図２に示す。この結果からホモシステインデスルフラーゼ反応を完結することなく酵素サイクリング反応を同時進行させることによってもホモシステンの高感度測定が可能であることが判る。
【００５０】
実施例３  補酵素の再生反応の付加した測定
以下に示す組成の測定用試液Ａ、測定試液Ｂ及びホモシステイン溶液を調製した。
［測定用試液Ａ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
10U/ml  ホモシステインデスルフラーゼ
(Proteus morganii由来 IFO-3168より調製)
200mM  エタノール
［測定用試液Ｂ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
5mM  チオＮＡＤ（シグマ社製）
0.2mM  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
300U/ml  L-乳酸脱水素酵素
(オリエンタル酵母社製、ブタ筋肉由来)
50U/ml  アルコール脱水素酵素
（オリエンタル酵母社製、酵母由来）
［ホモシステイン溶液］
50μM  ホモシステイン標準水溶液
【００５１】
上記ホモシステイン標準水溶液を精製水にて希釈して、10μM,20μM,30μM, 40μM濃度の希釈系列のホモシステイン希釈溶液を調製した。20μlのホモシステイン標準水溶液、各ホモシステイン希釈溶液、及び精製水をそれぞれのキュベットに分注し、あらかじめ37゜Cに加温した0.5mlの測定用試液Ａと0.5mlの測定用試液Ｂを各々のキュベットに分注し混和し、3分間後と13分間後の400nmの吸光度を測定した。13分後と3分後のそれぞれの吸光度の差をΔAbsとし、ホモシステイン濃度とΔAbsとの関係を図３に示す。この結果から補酵素の再生反応を組み合わせることによってホモシステイン測定の更なる高感度化を達成出来ることが明らかになった。
【００５２】
実施例４  血清サンプルの測定
以下に示す組成の測定用試液Ａ、測定用試液Ｂを調製した。
［測定用試液Ａ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
10mM  ジチオスレイトール（DTT）
10U/ml  ホモシステインデスルフラーゼ
(Proteus morganii IFO-3168由来)
［測定用試液Ｂ］
50mM  トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
5mM  チオＮＡＤ（シグマ社製）
1mM  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
200U/ml  L-乳酸脱水素酵素
(オリエンタル酵母社製、ブタ筋肉由来)
［ホモシステイン溶液］
50μM  ホモシステイン標準水溶液
【００５３】
あらかじめ37゜Cに加温した0.5mlの測定用試液Ａをキュベットに分注し、
20μlの５種類の血清サンプルをそれぞれのキュベットに添加混和して、37゜C下で反応させた。10分後、あらかじめ37゜Cに加温しておいた測定試液Ｂを0.5mlずつ、各々のキュベットに分注混和後、3分間後と13分間後の400nmの吸光度を測定し、それぞれの吸光度の差をΔAbsとした。血清サンプルの代わりにホモシステイン標準水溶液を使用したものを標準として同様の操作を行いΔAbsを測定した。標準のΔAbsから５種類の血清サンプルのホモシステイン濃度を算出した結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
【発明の効果】
本発明のホモシステインの高感度定量法及び定量用試薬は、簡便な操作で被検体中の極微量のホモシステインを正確に定量することができる方法を提供するものであり、臨床検査などの医療の分野に大きく貢献することが期待される。例えば、血清中のホモシステイン定量分析のための自動分析装置への応用等を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図２】  実施例２の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図３】  実施例３の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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