(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 原核宿主細胞を、FXプロテアーゼのチモーゲン前駆体をコードする組換え核酸で形質転換し、ここで、チモーゲン前駆体において天然非自己触媒的切断部位が該プロテアーゼの活性体により認識される自己触媒的切断部位で置換されており、よってチモーゲン前駆体が切断されてその活性体が生産されるものであり、
b) 宿主細胞を培養し、核酸を発現させ、
c) 細胞質に形成されるチモーゲン前駆体を含む封入体を単離し、
d) チモーゲン前駆体を再生し、そして
e) チモーゲン前駆体を自己触媒的に切断してFXプロテアーゼの活性体を産生させる、FXプロテアーゼの組換え生産方法。
【請求項２】
FXプロテアーゼの自己触媒的に切断可能なチモーゲン前駆体を含む封入体であって、チモーゲン前駆体において天然非自己触媒的切断部位が自己触媒的切断部位で置換されている、上記封入体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規プロテアーゼ切断部位が分子に導入された結果として自己触媒的に活性化され得るプロテアーゼのチモーゲン前駆体ならびにそれらの生産及び使用方法に関する。
【０００２】
特異的に切断するプロテアーゼは、例えば、インスリン(Janasson, P.ら, Eur. J. Biochem. 236(1996) 656-661; WO96/20724)、インスリン様増殖因子IGF-I及びIGF-II(Nilsson, B. ら, Methods Enzymol. 185(1991) 3-16; Forsberg, G.ら, J. Prot. Chem. 11 (1992) 201-211)、リラキシン、副甲状腺ホルモン(PTH)及び副甲状腺ホルモンペプチド断片(Forsberg, G.ら, J. Prot. Chem. 10(1991) 517-526; WO97/18314)、カルシトニン(EP-A 0 408 764)、グルカゴン（EP-A 0 189 998）、グルカゴン様ペプチド(GLP; WO 96/17942）、ナトリウム利尿ペプチド（WO 97/11186)、成長ホルモン放出因子(GRF; WO 96/17942)及びウロガストロン(Brewer, S.J. 及びSassenfeld, H.M., Trends in Biotechnology 3 (1985) 119-122; EP-A 0 089 626)のようなペプチドホルモン（ペプチドホルモンの概説については、Bristow, A.F.:In:Hider, R.C.; Barlow, D.,編, Polypeptides and Protein Drugs. Production, Characterization and Formulation, London, Ellis Horwood, pp.54-69(1991)を参照されたい）、ならびに例えばIL-1-β、IL-2、GM-CSF(Miller, C.G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987) 2718-2722)、G-CSF(EP-B 0 513 073)のような例えばN-末端開始メチオニンフリー増殖因子及びサイトカイン（増殖因子及びサイトカインの概説については、Wang, E.A., TIBTECH 11 (1993) 379-392; Meyer-Ingold, W., TIBTECH 11 (1993) 387-392を参照されたい）の組換え生産についてのバイオテクノロジーにおいて主な役割を果たしている。特異的切断プロテアーゼは、例えばヘモフィリアB（IX因子及びVII因子）を治療し、例えば心筋梗塞後の血餅を溶解させるための薬剤に用いられ（tPA、組織プラスミノーゲンアクチベーター及びストレプトキナーゼ）、トロンビン（米国特許第5,432,062号）は創傷治療における血液凝固を促進するために用いられる。
【０００３】
基質特異性に関して、例えば、リシンの後ろを切断するLysCエンドプロテアーゼのようなアミノ酸のN末端又はC末端側で選択的に切断するか、又は例えばリシン及びアルギニンの後ろを切断するトリプシンのような2個の特定のアミノ酸の後ろを選択的に切断するプロテアーゼ間が区別される。さらに、好ましくは≧2のアミノ酸の認識モチーフの後ろを切断するいわゆる制限プロテアーゼ（Carter, P.:In: Ladisch, M.R.; Willson, R.C.; Painton, C.C.; Builder, S.E.,編, タンパク質精製：分子機構から大量生産まで(Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes), ACS Symposium Series No.427, American Chemical Society, pp.181-193(1990)）が存在する。これらの制限プロテアーゼとしては、例えば、プロホルモン変換酵素フューリン、PC1/PC3、PC2、PC4、PC5及びPACE4(Perona, J.J.及びCraik, C.S., Protein Science 4 (1995) 337-360）、血液凝集プロテアーゼFVIIa、FIXa、FXa、トロンビン、プロテインC、カリクレイン、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター及びウロキナーゼ（Furie, B.及びFurie, B.C., Cell 53 (1988) 505-518; Davie, E.W.ら, Biochem. 30(1991) 10363-10370; WO 97/03027）及び例えばTEVプロテアーゼのようなウイルス起源のいくつかのプロテアーゼ（Parks, T.D.ら, Anal. Biochem. 216 (1994) 413-417）、及び／又は、例えば酵母由来のケキシン(Kex2p）プロテアーゼ（EP-A 0 467 839）及びNeisseria gonorrhoeae由来のIgAプロテアーゼ（Pohlner, J.ら, Nature 325 (1987) 458-462）のような微生物起源のプロテアーゼが挙げられる。
【０００４】
例えばトリプシン、カルボキシペプチダーゼB、トロンビン、Xa因子、コラゲナーゼ及びエンテロキナーゼのような特異的切断プロテアーゼは、ペプチドホルモン及び融合タンパク質由来のいくつかの治療タンパク質の組換え生産のための原料として必要とされるものである。融合タンパク質の酵素切断の方法論が当技術分野の現状であり、融合タンパク質を切断するための市販のプロテアーゼが記載されている（Flaschel, E.及びFriehs, K., Biotech. Adv. 11 (1993) 31-78; Sassenfeld, H.M., Trends Biotechnol. 8 (1990) 88-93）。通常、これらの参考文献に挙げられているプロテアーゼは、膵臓、肝臓及び血液のような動物原料から単離される。しかしながら、動物原料から単離される物質は、例えば、ヒトに対して病原性であるウイルス及びプリオンのような感染性作用因子が混入し得るので理想的ではない。動物及び／又はヒト原料（例えば血液）からのタンパク質／酵素の調製における適切な処置にもかかわらず、例えばAIDS、肝炎及び海綿状脳障害（クロイツフェルト−ヤコブ様病、キーワード：BSE)のような生命を脅かす病気の感染／発症の危険が残ったままである。特にトリプシン、トロンビン及びX因子などの多数のプロテアーゼは不活性（チモーゲン）前駆体の状態で合成されるので、たとえこれらのプロテアーゼが組換えにより生産されるとしても動物原料から誘導される第2の追加のプロテアーゼがその組換えプロテアーゼの酵素活性化に必要である。したがって、例えばエンテロキナーゼは、トリプシノーゲン（Hedstrom, L.ら, Science 255 (1992) 1249-1253）の活性化に用いられ、ヘビ毒素由来のプロテアーゼはX因子（Takeya, H.ら, J. Biol. Chem. 267 (1992) 14109-14117; WO 97/03027）及びトロンビン（DiBella, E.E.ら, J. Biol. Chem. 270 (1995) 163-169）の活性化に用いられる。
【０００５】
さらに、特異的切断プロテアーゼは、薬剤において重要な役割を果たしている。よって、例えばFIX、FVII、tPA（組織プラスミノーゲンアクチベーター）、プロテインC及びトロンビン及び／又はそれらから誘導されるプロテアーゼ変異体は凝固障害の治療に用いられているか、又は評価中である。さらに、トリプシンはいくつかの医薬調製物（軟膏、糖衣錠及び吸入されるエーロゾル剤）の成分である（"Rote Liste", 1997; The United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP23-NF18, 1995）。
【０００６】
Graf, E.ら(Biochem. 26 (1987) 2616-2623; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 4961-4965)は、E.coliにおけるラットトリプシノーゲン及びトリプシノーゲン突然変異体の発現／分泌を記載した。E.coliのペリプラズムにトリプシノーゲンを分泌させるために、天然トリプシノーゲンシグナル配列を細菌アルカリホスファターゼ(phoA)のシグナル配列で置換した。分泌された不活性トリプシノーゲンをペリプラズムから単離し、精製エンテロキナーゼを用いて酵素切断によって活性化した。
【０００７】
Vasquez, J.R.ら（J. Cell. Biochem. 39 (1989) 265-276）は、E.coliにおける陰イオン性ラットトリプシン及びトリプシン突然変異体の発現／分泌を記載した。天然トリプシノーゲンプレプロ−セグメント（シグナル配列及び活性化ペプチド）を細菌アルカリホスファターゼ(phoA)のシグナル配列で置換して、リン酸によって調節することができるphoAプロモーターを、E.coliのペリプラズムへの活性トリプシンの発現／分泌のために用いた。活性トリプシンをペリプラズムから単離した。しかしながら、その収量は非常に低かった（約1mg/l)。
【０００８】
Higaki, J.N.ら(Biochem. 28(1989) 9256-9263)は、tacプロモーター及びS.typhimurium hisJシグナル配列を用いたE.coliのペリプラズムへのトリプシン及びトリプシン突然変異体の発現／分泌を記載した。活性トリプシンの収量は約0.3mg/lであった。高細胞密度培養によって活性陰イオンラットトリプシンの容積収量を約50mg/lまで増大させることが可能であった（Yee, L.及びBlanch, H.W., Biotechnol. Bioeng. 41(1993) 781-790）。著者らは、E.coliにおける活性トリプシンの発現／分泌にいくつかの問題を指摘している。シグナル配列の切断及び６ジスルフィド架橋の生成による天然トリプシンタンパク質のフォールディング後に酵素活性トリプシンがE.coliのペリプラズムに形成される。活性トリプシンの生成は細胞に対して毒性である。活性トリプシンは細胞を溶解するペリプラズムE.coliタンパク質を加水分解する。さらに、トリプシンのタンパク質フォールディング、及び特に６ジスルフィド架橋の正確な天然生成が、E.coliのペリプラズムにおいてはさらに難しいということは明白である。この系は、大量のトリプシンの単離には適していなかった（＞10mg; Willett, W.S.ら, Biochem. 34 (1995) 2172-2180）。
【０００９】
X線結晶学的検査用の大量のトリプシン（50〜100mg）を生産するために、調節可能なADH/GAPDHプロモーターの制御下で酵母α−因子リーダー配列との融合によって不活性トリプシノーゲン前駆体を酵母に分泌させた。培地に分泌したトリプシノーゲンチモーゲンをエンテロキナーゼによってin vitroでトリプシンに変換した。収量は10〜15mg/lであった（Hedstrom, L.ら, Science 255 (1992) 1249-1253）。
【００１０】
上記のメチオニン残基を有する成熟トリプシン及びトリプシノーゲンをコードするDNA配列がEP-A 0 597 681に記載されている。
【００１１】
Aspergillusにおける組換え法によるトリプシン又は誘導体の生産方法がWO 97/00316に記載されている。シグナルペプチドにN-末端により融合されるトリプシノーゲン又はその誘導体をコードするベクターがトランスフェクションに用いられる。
【００１２】
本発明の課題は、プロテアーゼの簡単な組換え生産方法ならびに新規自己触媒的に活性化可能なプロテアーゼならびにそれらのチモーゲン（不活性、チモーゲン前駆体）を提供することである。
【００１３】
本発明は、
a) 宿主細胞を、天然では生じない自己触媒的切断部位を含むプロテアーゼのチモーゲン前駆体をコードする組換え核酸で形質転換し、ここで、前記プロテアーゼの活性体はかかる切断部位を認識し、前駆体を切断して活性プロテアーゼを形成するものであり、
b) プロテアーゼのチモーゲン前駆体が封入体の状態で宿主細胞に形成されるように宿主細胞を培養し、
c)封入体を単離し、チモーゲン前駆体のプロテアーゼ部分がその天然のコンホメーションで形成されるような条件下で再生し、そして
d) 再生チモーゲン前駆体を自己触媒的に切断して活性プロテアーゼを産生させることを特徴とする、
プロテアーゼの組換え生産方法に関する。
【００１４】
驚いたことに、本発明の方法によれば活性プロテアーゼを簡単な方法且つ高収量で生産することができることが分かった。
【００１５】
本発明の意味に含まれるプロテアーゼは、真核生物ならびに微生物プロテアーゼと理解される。これらの例は、発明の詳細な説明の導入部に述べられている。本発明の方法は、トリプシン、トロンビン及びXa因子の組換え生産に特に都合がよい。
【００１６】
本発明のさらなる主題は、プロテアーゼの自己触媒的に切断可能な（活性化可能な）チモーゲン前駆体であり、ここで、チモーゲン前駆体は、天然体の切断部位に取って代わる、天然では生じない（自己触媒的に活性化可能でない）自己触媒的切断部位を含んでいる。
【００１７】
本発明の意味に含まれる宿主細胞は、タンパク質が封入体として形成され得る任意の宿主細胞と理解される。これらは、通常、原核宿主細胞、好ましくはE.coli細胞である。そのようなプロセスは、例えば、F.A.O.Marston, Biochem. J. 240 (1986) 1-12, L.Stryer, Biochemistry, W.H.Freeman and Company, サンフランシスコ, 1975, 24-30, T.E.Creighton, Progress Biophys. Molec. Biol. 33(1978) 231-291, C.H.Schein, Bio/Technology 8 (1990) 308-317, EP-B 0 114 506, A.Mitraki及びJ.King, Bio/Technology 7 (1989) 690-697, EP-B 0 219 874, EP-B 0 393 725及びEP-B 0 241 022に記載されている。したがって、封入体は、本質的に、宿主細胞の細胞質に蓄積して、少なくとも部分的に顕微鏡で見える粒子の状態にある不溶性、変性且つ不活性タンパク質であると理解される。
【００１８】
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明のプロテアーゼの自己触媒的に切断可能なチモーゲン前駆体の調製法であって、調製されるタンパク質が原核細胞中に封入体の形で不活性且つ変性状態で存在することを特徴とする上記調製法である。本発明のさらなる主題は、封入体を溶解するのに適した濃度の変性剤、及び溶解した封入体を含んでなる水溶液である。
【００１９】
プロテアーゼのチモーゲン（不活性）前駆体（チモーゲン）は、タンパク質分解活性を持たないか、又は正確なタンパク質構造を有する活性プロテアーゼと比べてタンパク質分解活性が非常に低いタンパク質と理解される（活性体よりも活性が少なくとも5倍、好ましくは10倍低い）。切断が生じるか、プロテアーゼの活性体を得るために切断されるさらなるアミノ酸を含むチモーゲン体は、プロテアーゼの活性体とは本質的に異なる。これらのアミノ酸は、C末端、N末端及び／又はプロテアーゼ内に位置することができる。
【００２０】
IX因子、X因子、トロンビン又はプラスミノーゲンアクチベーターのようなプロテアーゼは、いくつかのドメインから構成される。これらのドメインの一つは、プロテアーゼドメイン、すなわちプロテアーゼ活性を仲介するドメインである。プロテアーゼの前駆体は、本発明の意味において、プロテアーゼドメインのN末端に自己触媒的に切断され得るさらなるアミノ酸が存在する場合、不活性である。
【００２１】
本発明の意味における再生は、変性した本質的に不活性なタンパク質を、タンパク質が自己触媒的切断後に所望の活性を示すコンホメーションに変換するプロセスと理解される。このコンホメーションは、通常、タンパク質の天然コンホメーションである。再生のために、溶解性の乏しい変性タンパク質を塩酸グアニジン又は尿素のような変性剤に溶解し、任意に還元し、変性剤の濃度を低下させることによって、及び／又は任意に当業者にはよく知られたプロセス（上記参照）によってアルギニンのような変性促進剤及び／又はGSH/GSSGなどの酸化還元系を加えることによってその活性コンホメーションに変換する。
【００２２】
本発明の意味における自己触媒的切断は、プロテアーゼのチモーゲン前駆体の、さらなる酵素を加えることなく生じる活性体への切断と理解される。チモーゲンプロテアーゼ前駆体は、通常、残留タンパク質分解活性が依然として低いので、これは、通常、自己触媒的タンパク質分解を開始させるのに適している。チモーゲン前駆体のタンパク質分解活性と活性プロテアーゼのタンパク質分解活性の比率は、好ましくは1:5以下である。
【００２３】
本発明は、さらに、天然体における切断部位が自己触媒的に切断され得る切断部位で置換されている、本発明によるプロテアーゼの自己触媒的に切断可能なチモーゲン前駆体に関する。
【００２４】
プロテアーゼの組換え生産を行うのは難しい。というのは、活性タンパク質である場合、これらのプロテアーゼは宿主生物のタンパク質を切断し、よって宿主生物に対して致命的であるからである。プロテアーゼが組換えにより不活性のチモーゲン体で生産される場合、組換え生産後にタンパク質を追加の工程で活性体に変換することが必要である。通常、動物原料などの天然起源から単離されるプロテアーゼを再び用いることによりチモーゲン体を切断する。よって、そのようなプロセスは時間がかかり、非常にコストがかかる。
【００２５】
それとは対照的に、本発明のプロセスは、さらなるプロテアーゼを加えることによってチモーゲン体を切断する追加の工程を完全に省略することができることを特徴とする。費用節約に加えて、この方法で調製される組換えプロテアーゼには、その他のプロテアーゼが混入せず（特に、動物起源のプロテアーゼが混入しない）、又は天然の起源から単離される場合に天然ではプロテアーゼ中の不純物として見出されるタンパク質（例えば哺乳動物細胞タンパク質）が混入しない。
【００２６】
プロテアーゼの不活性なチモーゲン体は、任意のその他のタンパク質のように、組換え生産において発現され、単離され、精製され得るものである。そのようなプロセスは、真核細胞ならびに原核細胞に対しては当業者には公知である。
【００２７】
本発明にしたがって生産され得るプロテアーゼは、全て、例えばセリンプロテアーゼのような特異的切断プロテアーゼ（例えば、IX因子、X因子、VII因子、プロテインC、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン又は組織プラスミノーゲンアクチベーターのような真核生物プロテアーゼ）である。
【００２８】
認識配列及びプロテアーゼに挿入される1個の自己触媒的切断部位又は複数の自己触媒的切断部位の位置決めは、プロテアーゼの型に依存し、また、チモーゲン体が活性化される様式にも依存する。X因子の活性体は、例えば、不活性チモーゲン体から断片を切断することによって形成される。このことは、本発明によれば、自己触媒的切断部位はこの断片のN末端又はC末端に存在するにちがいないということを意味するものである。トリプシンによる活性化中、活性化ペプチドがチモーゲン体のN末端で切り離される。したがって、この場合、天然活性化ペプチドは、それが自己触媒的に切断され得るように修飾されることが必要である。組織プラスミノーゲンアクチベーターのようなプラスミノーゲンアクチベーターの場合、活性化は分子内のペプチド結合の切断によってのみ生じる。したがって、本発明によれば、そのような場合において天然切断部位が自己触媒的切断部位に置換される。
【００２９】
エンドプロテイナーゼLys-Cの場合、活性化は、分泌中のプレプロ体からのN末端又はC末端断片の切断によって生じる。この場合、C末端プロセグメントが除去され、適当な自己触媒的切断部位がN末端プロセグメントと本発明によるプロテアーゼドメインとの間に挿入される。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態においては、プロテアーゼの組換えチモーゲン体は、天然のチモーゲン体とは異なる。例えば、細菌プロテアーゼのチモーゲン体（細胞前駆体）は不活性プロテアーゼの細胞からの輸送を可能にするシグナル配列及びプロ配列を含む。本発明の方法においては、組換えプロテアーゼは不溶性封入体の状態で形成される。したがって、プロテアーゼが都合よく高収量で再生され得る封入体を可能な限り完全に生成させるようにチモーゲン体のアミノ酸配列を最適化することが都合がよい。封入体はタンパク質の変性体のために酵素活性を持たないので、チモーゲン体がタンパク質分解活性を全く持たないということは必ずしも必要ではない。チモーゲン体は再生後に自己触媒的切断を促進するためにタンパク質分解活性が低いことが好ましくさえある。
【００３１】
1個又は複数の切断部位は、天然一次構造（プロテアーゼドメイン）が維持されるような様式で挿入されるのが好ましい。したがって、本発明によれば、例えば、原核生物において簡単な様式で、アミノ酸配列が修飾されていないその天然の配列を有する活性トリプシンを生産することが可能である。プロテアーゼは、もはやN末端開始コドン（メチオニン）を切り離す必要のないかかる方法で得られる。
【００３２】
さらに好ましい実施形態においては、本発明によって生産される活性プロテアーゼは固定される。そのような固定化は、例えば、ポリマー性の不溶性担体への結合又は自己架橋によって行うことができる（例えば、米国特許第4,634,671号及びEP-A 0 367 302を参照されたい）。
【００３３】
チモーゲン体は、本質的に（自己触媒的切断部位を除いて）プロテアーゼの天然チモーゲン体に一致し得る。X因子の場合、天然チモーゲン体は既に自己触媒的切断部位を含んでいる。この場合、チモーゲン体の第2の切断部位がさらなる自己触媒的切断部位によって置換される。好ましい実施形態においては、切断される1個又は複数の断片の配列はさらに修飾される。好ましい酵素についての適切な自己触媒的切断部位を下記の表に示す。
【００３４】
制限エンドプロテアーゼ／切断部位
−エンテロキナーゼ        (Asp)4 Lys↓
−Xa因子（ウシ）          IleGlyGluArg↓
−Xa因子（ヒト）          IleAspGlyArg↓
−トロンビン              ArgGlyProArg↓
−TEVプロテアーゼ         GluAsnLeuTyrPheGln↓Gly/Ser
−IgAプロテアーゼ         YyyPro↓XxxPro, Yyy = Pro, Ala, Gly,
Thr; Xxx = Thr, Ser, Ala
−Kex2pプロテアーゼ       2個の隣接塩基性アミノ酸（Lys又はArg)
−LysCエンドプロテアーゼ  Lys↓
−トリプシン              Lys↓又はArg↓
−クロストリパイン        Arg↓
−S.aureus V8             Glu↓
【００３５】
本発明の好ましい実施形態は、自己触媒的に活性化され得るX因子のチモーゲン前駆体である。X因子はいくつかのドメインから構成される複雑なグリコシル化プロテアーゼである。X因子は、機構的にセリンプロテアーゼのファミリーに属する。FXは肝臓において不活性プロ酵素（チモーゲン）として合成され、特異的タンパク質分解に必要な場合、血液中に分泌され活性化される。X因子におけるタンパク質ドメインの配列は、VII因子、IX因子及びプロテインCの配列と同様である。さらに、これらの４つのプロテアーゼのアミノ酸配列は、非常に相同的である（アミノ酸配列同一性：約40％）。それらは、プロテアーゼサブファミリー、IX因子ファミリーに含まれる。
【００３６】
本発明によれば、IX因子ファミリー（VII因子、IX因子、X因子及びプロテインC）のプロテアーゼも好ましい。Furie B.及びFurie, B.C.（Cell 53(1988) 505-518）によれば、これらのプロテアーゼは、
−1個のプロペプチド、
−1個のGLAドメイン、
−1個の芳香族アミノ酸積み重ねドメイン、
−2個のEGFドメイン（EGF1及びEGF2）、
−チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド、AP）及び
−触媒プロテアーゼドメイン（CD）
から構成される。
【００３７】
さらに、血漿プロテアーゼは分泌中に翻訳後修飾される：
−11〜12ジスルフィド架橋
−N-及び／又はO-グリコシル化（GLAドメイン及び活性化ペプチド）
−Bharadwaj, D.ら, J. Biol. Chem. 270(1995) 6537-6542
−Medved, L.V.ら, J. Biol. Chem. 270(1995) 13652-13659
−プロペプチドの切断
−Glu残基のγ-カルボキシル化（GLAドメイン）
−Asp残基のβ-ヒドロキシル化（EGFドメイン）。
【００３８】
1個又は2個のペプチド結合の特異的切断（活性化ペプチドの切断）によるチモーゲン（タンパク質のチモーゲン体）の活性化後、酵素活性プロテアーゼは、それらの分子量にしたがってH鎖及びL鎖と呼ばれる2本の鎖から構成される。IX因子プロテアーゼファミリーにおいては、2本の鎖は、EGF2ドメインとプロテアーゼドメインとの間の分子間ジスルフィド架橋によって保持される。チモーゲン−酵素変換（活性化）によりプロテアーゼドメイン内にコンホメーションの変化が生じる。このことにより、プロテアーゼドメインのN-末端アミノ酸のα-NH3+ 基と、FXaプロテアーゼドメイン内のAsp残基の間にプロテアーゼ活性に必要な必須の塩架橋を形成させることができる。N-末端領域は、セリンプロテアーゼのこのサブグループにとって非常に重要であり、修飾されるべきではない。その場合においてのみ、Ser、Asp及びHisから構成される触媒的三つ組を有するセリンプロテアーゼの典型的活性部位を形成させることが可能である（Blow, D.M.:Acc. Chem. Res. 9(1976) 145-152; Polgar, L.：In: Mechanisms of protease action. Boca Raton, フロリダ, CRC Press, 第3章(1989)）。
【００３９】
分泌の間に細胞内でFX活性化ペプチドのプロセシングが既に始まっている（EGF 2ドメインと活性化ペプチドの間の最初の切断）。次に、補因子FVIIIa又は組織因子との複合体の中の膜上での第二のFIXa又はFVIIa-触媒による切断によって、FXはFXaに活性化される(Mann, K. G. ら, Blood 76 (1990) 1-16)。
【００４０】
FXaの触媒ドメインは254個のアミノ酸からなり、これはグリコシル化されず、４つのジスルフィド架橋を形成している。これは構造的に２つのタル状のβ-折りたたみシート、いわゆるハーフサイドから構成される。
【００４１】
E.coliの対応する遺伝子の発現及びそれに続くin vitroにおける不活性なプロテアーゼタンパク質の再生及び活性化による、EGF2ドメイン、活性化ペプチド(AP)及び触媒ドメイン(CD)からなる因子IXファミリー（VII因子、IX因子、X因子及びタンパク質C）の、末端切断された翻訳後の未修飾の血漿プロテアーゼ変異体の製造については、WO 97/03027に詳細に記載されている。
【００４２】
本発明によれば、自己触媒的に切断することができるトリプシンプロテアーセのチモーゲン前駆体もまた好ましい。トリプシンプロテアーゼは、膵臓の外分泌腺房細胞において不活性なプロ酵素（チモーゲン）、いわゆるトリプシノーゲンとして形成される。４つの異なるトリプシノーゲン（トリプシノーゲンI、II、III及びIV)がヒト膵臓分泌液から単離され、酵素的に特徴づけられ、アミノ酸配列が決定された。二つの最も強く発現されるトリプシノーゲン遺伝子TRYI（トリプシノーゲンI）及びTRYII（トリプシノーゲンII）が知られている。これらは対応するcDNAをクローニングすることにより単離された(Emi, M. ら, Gene 41 (1986) 305-310)。ヒトトリプシノーゲン遺伝子TRYI及びTRYIIは、分泌されるタンパク質と一致する15アミノ酸残基の共通のシグナルペプチドをコードしている。ヒトトリプシノーゲンI及びIIの場合には、N-末端活性化ペプチドAlaProPhelAspAspAspAspLysからなる、トリプシノーゲン遺伝子の特徴的なプロセグメントがこれに続く(Guy, O. ら, Biochem. 17(1978) 1669-1675)。このプロセグメントは、小腸粘膜細胞から小腸に分泌されるグリコプロテアーゼエンテロキナーゼによって認識され、カルシウムの存在下で切断されて、その結果、不活性なトリプシノーゲンが活性型であるトリプシンに変換される。トリプシノーゲンの活性化は一部は自己触媒的に進行する。けれども、エンテロキナーゼによる切断は1000倍以上速い。
【００４３】
Xa因子と同様に、トリプシンはセリンプロテアーゼのファミリーに属する。N-末端活性化ペプチドの切断によるトリプシノーゲンの活性化はまた、この場合には、遊離のN-末端が関与したプロテアーゼドメイン内のコンホメーションの変化を招き（トリプシンのN-末端アミノ酸のα-NH3+基とプロテアーゼドメイン内のAsp194残基の間の本質的塩橋の形成）、これにより、Ser、Asp及びHisの触媒三つ組を有するセリンプロテアーゼの典型的な活性部位が形成される。
【００４４】
最も強く発現するヒトトリプシノーゲンI遺伝子(TRYI)は、15個のアミノ酸からなるシグナル配列及び８個のアミノ酸からなる活性化ペプチドを含む247個のアミノ酸をコードしている。このように、成熟したトリプシンIイソ酵素は、224個のアミノ酸残基からなる。これには５個のジスルフィド架橋を形成する10個のシステイン残基が含まれる(Emi, M. et al., Gene 41 (1986) 305-310)。FXaと同様に、トリプシンの触媒ドメインは、構造的に２つの樽状のβ折りたたみシートから構成される。
【００４５】
ヒトトリプシンイソ酵素Iは、ヒトトリプシンイソ酵素IIと89%の配列相同性を有し、ウシトリプシンと約75%の配列相同性を有し、ヒトXa因子の触媒ドメインと約43%の配列相同性を有する。
【００４６】
以下の実施例、文献、配列プロトコール及び図は、本発明、すなわち特許請求の範囲から導き出される保護の範囲をさらに詳しく説明するものである。記載された方法は、修正された後でさえも依然として本発明の主題を説明する例として理解されるべきである。
【００４７】
配列プロトコールにおいて：
配列番号１- 配列番号10は、プライマーN1-N10を示す。
配列番号11は、天然のFX活性化ペプチドを示す。
配列番号12は、クローン化されたTRYI変異体遺伝子のヌクレオチド配列を示す。図１は、短くなったプロセグメントを有するクローン化されたTRYI変異体遺伝子のヌクレオチド配列及び該配列から誘導されるアミノ酸配列を示す。自己触媒によって活性化されるトリプシン変異体rTRYI-GPK及びrTRYI-VGRの修飾された活性化ペプチドを示す。TRYI-GPK-SS変異体に付加的に導入された突然変異（P132C、P133A及びY233C；アミノ酸配列の番号はEmi, M. らによる文献（Gene 41 (1986) 311-314）に従ってつけた）に印を付けた。
【００４８】
【実施例】
方法
組換えDNA法
DNAを操作するために、Sambrook, J.ら、(1989)「分子クローニング・研究室マニュアル」(Molecular cloning. A laboratory manual.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載された通りの標準的な方法を用いた。分子生物学的試薬は、製造者の指示に従って用いた。
【００４９】
タンパク質の測定
プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算した分子吸光係数を用いて、280nmの光学濃度(OD)を測定することにより決定した。
【００５０】
発現ベクター
自己触媒的に活性化可能なプロテアーゼの発現のベクターは、コア-ストレプトアビジンの発現ベクターpSAM-COREに基づくものである。プラスミドpSAM-COREの製造法及び説明は、Kopetzki, E. ら、WO 93/09144に記載されている。コア-ストレプトアビジン遺伝子は、pSAM-COREベクターにおいて所望のプロテアーゼ遺伝子に置き換えられる。
【００５１】
実施例１
ヒトトリプシノーゲンI遺伝子のクローニング（プラスミド：pTRYI)
トリプシノーゲンIの19-247位のアミノ酸をコードする、トリプシノーゲンI cDNAの61-750位の塩基対（cDNA配列及びアミノ酸配列の番号は、Emi, M.らの文献（Gene 41 (1986) 305-310)に従ってつけた）を、Mullis, K. B. 及びFaloona, F. A. (Methods Enzymol. 155, (1987) 350-355)の方法に従って、PCRプライマーN1（配列番号１）及びN2（配列番号２）、
0003947653.tif 000002
及び鋳型DNAとしてStratagene Company(La Jolla, CA, U.S.A.)から市販されているヒト肝臓cDNA遺伝子バンク（ベクター：Lambda ZAP（登録商標） II)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。PCRプライマーは、コード領域の5'末端に１つのNcoI切断部位及びATG開始コドンを、またコード領域の3'末端に１つのHindIII切断部位を導入した（図１）。
【００５２】
約715bpの長さのPCR生成物を制限エンドヌクレアーゼNcoI及びHindIIIで消化し、約700bpの長さのNcoI/HindIII-トリプシノーゲンI断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した後、約2.55kbpの長さのNcoI/HindIII-pSAM-COREベクター断片中に結合した。所望のプラスミドpTRYIを制限マッピングにより同定し、PCRによって単離されたTRYI cDNA配列をDNA配列決定によってチェックした。
【００５３】
実施例２
トリプシン変異体遺伝子TRYI-GPKの構築（自己触媒的に活性化可能なトリプシン変異体；プラスミド：pTRYI-GPK）
N-末端天然型トリプシノーゲンIプロセグメント、AlaProPheAspAspAspAspLys(Guy, O. ら, Biochem. 17 (1978) 1669-1675)を活性化ペプチドGlyProLysに置き換えた。所望のTRYI-GPKトリプシン変異体遺伝子をPCR技術を用いて製造した。
このために、Lys-トリプシンIの23-247位のアミノ酸をコードするヒトトリプシノーゲンI cDNAの73-750位の塩基対（cDNA配列及びアミノ酸配列の番号はEmi, M.らの文献(Gene 41 (1986) 305-310)に従ってつけた）を、プライマーN3（配列番号３）及びN2（配列番号２、実施例１）、
0003947653.tif 000003
及び鋳型DNAとしてプラスミドpTRYI（実施例１）を用いて、PCRによって増幅した。ATG開始コドン及び一つのNcoI切断部位を有する活性化ペプチドGlyProLysをコードするDNA配列を、PCRプライマーN3の5'の突出末端を利用して5'末端に挿入した。さらに、付加的なMunI切断部位をトリプシンIの構造遺伝子のN-末端コード領域内に導入し、コドンの使用法（アミノ酸７、８及び10位）を、PCRプライマーN3を用いて、タンパク質配列を変えることなく好ましくはE. coliで用いられるコドンに部分的に適合させた（コドンの使用法が最適化されたATG環境、N3プライマーの小文字で書かれた塩基により表される）。
【００５４】
約700bpの長さのPCR産物を制限エンドヌクレアーゼNcoI及びHindIIIによって消化し、約685bpの長さのNcoI/HindIII-TRYI-GPK断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製した後、約2.55kbpの長さのNcoI/HindIII-pSAM-COREベクター断片中に結合した。所望のプラスミドpTRYI-GPKを制限マッピング（付加的なMunI切断部位）によって同定し、PCRによって増幅されたTRPI-GPK遺伝子をDNA配列決定によってチェックした。
【００５５】
実施例３
トリプシン変異体遺伝子TRYI-VGRの構築（自己触媒的に活性化可能なトリプシン変異体；プラスミド：pTRYI-VGR)
N-末端の天然型トリプシノーゲンIプロセグメント、AlaProPheAspAspAspAspLysを活性化ペプチドValGlyArgに置き換えた。TRYI-VGRトリプシン変異体遺伝子を、TRYI-GPKトリプシン変異体遺伝子と類似のPCR技術を用いて製造した。
【００５６】
このために、トリプシンIの24-247位のアミノ酸をコードするヒトトリプシノーゲンI cDNAの76-750位の塩基対（cDNA配列及びアミノ酸配列の番号は、Emi, M.らの文献（Gene 41 (1986) 305-310)に従ってつけた）を、プライマーN4（配列番号４）及びN2（配列番号２、実施例１）、
0003947653.tif 000004
及び鋳型DNAとしてプラスミドpTRYI（実施例１）を用いてPCRにより増幅した。ATG開始コドン及び一つのNcoI切断部位を有する活性化ペプチドValGlyArgをコードするDNA配列を、PCRプライマーN4の5'の突出末端を用いて5'末端に挿入した。さらに、付加的なMunI切断部位を、トリプシンI構造遺伝子のN-末端領域内に導入し、コドンの使用法（アミノ酸7、8及び10位）を、PCRプライマーN4を用いて、タンパク質配列を変えることなく、好ましくは大腸菌(E. coli)で用いられるコドンに部分的に適合させた（コドンの使用法が最適化されたATG環境、N4プライマー中に小文字で書かれた塩基で示される）。
【００５７】
約700bpの長さのPCR産物を、制限エンドヌクレアーゼNcoI及びHindIIIによって消化し、約685bpの長さのNcoI/HindIII-TRYI-VGR断片を、アガロースゲル電気泳動で精製した後、約2.55kbpの長さのNcoI/HindIII-pSAM-COREベクター断片中に結合した。プラスミドpSAM-COREの調製法及び説明はKopetzki, E.らにより、WO93/09144に記載されている。所望のプラスミドpTRYI-VGRを、制限マッピング（付加的なMunI切断部位）によって同定し、PCRによって増幅されたTRPI-VGR(TRYI-VGR?)遺伝子をDNA配列決定によってチェックした。
【００５８】
実施例４
トリプシン変異体遺伝子TRYI-GPK-SSの構築（自己触媒的に活性化可能な、付加的なジスルフィド架橋を有するトリプシン変異体；プラスミド：pTRYI-GPK-SS)
付加的なジスルフィド架橋を導入することにより、ヒトトリプシンIイソ酵素を修飾した。このために、132位のアミノ酸Pro及び233位のアミノ酸TyrをCysに突然変異させた（アミノ酸配列の番号は、Emi, M.らの文献（Gene 41 (1986) 305-310)に従ってつけた）。これらの二点の突然変異（P132C及びY233C）により、本発明に従って導入された132及び233位のシステイン残基の間に、付加的な６番目のジスルフィド架橋が形成される。さらに、133位のアミノ酸ProをAlaに突然変異させた（P133A）。
【００５９】
このために、トリプシノーゲンIの116-247位のアミノ酸をコードするトリプシノーゲンI cDNAの353-750位の塩基対（cDNA配列及びアミノ酸配列の番号は、Emi, M.らの文献(Gene 41 (1986) 305-310)に従ってつけた）を、プライマーN5（配列番号５）及びN6（配列番号６）、
0003947653.tif 000005
及び鋳型DNAとしてプラスミドpTRYI（実施例１）を用いてPCRにより増幅した。P132C及びP133A突然変異はPCRプライマーN5を用いて導入され、Y233C突然変異はプライマーN6を用いて導入された。変異は、PCRプライマー中の小文字で書かれた塩基によって示される。
【００６０】
約420bpの長さのPCR産物を制限エンドヌクレアーゼBsgI及びHindIIIによって消化し、約405bpの長さのBsgI/HindIII-TRYI断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した後、約2.85kbpの長さのBsgI/HindIII-pTRPI-GPKベクター断片中に結合した（実施例２）。所望のプラスミドpTRYI-GPK-SSを制限マッピング（DraIII切断部位が欠如している）によって同定し、PCRによって増幅されたTRYI DNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
【００６１】
実施例5
FXプロテアーゼ変異体遺伝子FX−EGF2−APau−CD（自己触媒的に活性化可能なFX−EGF2−AP−CD変異体；プラスミド：pFX−EGF2−APau−CD）の構築
FX遺伝子のクローニング及びプラスミドpFX−EGF2−AP−CDの構築はWO 97／03027号、実施例3に詳細に記載されている。プラスミドpFX−EGF2−AP−CDのFX−EGF2−AP−CD発現単位は、EGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒性プロテアーゼドメインを含んでなる、N末端切断FXプロテアーゼ変異体をコードする。
【００６２】
天然FX活性化ペプチド（AP）（配列番号11）
SerValAlaGlnAlaThrSerSerSerGlyGluAlaProAspSerIleThrTrpLys
ProTyrAspAlaAlaAspLeuAspProThrGluAsnProPheAspLeuLeuAspPhe
AsnGlnThrGlnProGluArgGlyAspAsnAsnLeuThrArg
をコードするDNAセグメントにおいて、C末端の3つのアミノ酸Asn、Leu、ThrをIle、Asp、Glyで置換し、その結果として修飾FX活性化ペプチドApauを形成した。
【００６３】
このNLTからIDGへの所望のアミノ酸配列の修飾は融合PCRによって導入した。
【００６４】
このために、EGF2ドメイン及び活性化ペプチドの111〜209位のアミノ酸をコードするFX DNAの330〜629位の塩基対（配列及びアミノ酸配列はWO 97／03027号の図３にしたがって番号付けした）を、第1 PCRにおいて、PCRプライマーN7（配列番号7）及びN8（配列番号8）
0003947653.tif 000006
並びに鋳型DNAとしてのプラスミドpFX−EGF2−AP−CD（製造及び説明はWO 97／03027号、実施例3を参照）を用いて増幅した。一つのVan91I開裂部位を3’末端にこのPCRプライマーN8を用いてアミノ酸配列を変化させることなく導入した。
【００６５】
第2のPCRにおいて、修飾FX活性化ペプチドのC末端領域及びFXプロテアーゼドメインの207〜454位のアミノ酸をコードするFX DNAの619〜1362位の塩基対（配列及びアミノ酸配列はWO 97/03027号の図３にしたがって番号付けした）を、PCRプライマーN9（配列番号9）及びN10（配列番号10）
0003947653.tif 000007
並びに鋳型DNAとしてのプラスミドpFX−EGF2−AP−CDを用いて増幅した。5’末端にある1つのVan91I開裂部位及び所望のNLTからIDGへのアミノ酸配列の修飾はこのPCRプライマーN9によって導入した。
【００６６】
第1 PCRの約300bp長のEGF2−AP DNA断片を制限エンドヌクレアーゼPstI及びVan91Iで消化し、第2 PCRの約750bp長のFX DNA断片を制限エンドヌクレアーゼVan91I及びHindIIIで消化した。アガロースゲル電気泳動で精製した後、約285bp長のPstI／Van91I−EGF2−AP DNA断片を740bp長のVan91I／HindIII−FX DNA断片及び約2.56kbpのPstI／HindIII pFX−EGF2−AP−CDベクター断片と3断片ライゲーションでライゲートした。所望のプラスミドpFX−EGF2−APau−CDを制限マッピング（追加のVan91I切断部位）によって同定し、そのFX−EGF2−APau−CD遺伝子をDNA配列決定によってチェックした。
【００６７】
実施例6
a）E.coliにおけるプロテアーゼ遺伝子の発現
トリプシン及びFX変異体遺伝子を発現させるため、E.coli K12株（例えば、UT5600；Grodberg, J.及びDunn, J.J, J. Bacteriol. 170 (l988) 1245-1253）を、各々の場合において、実施例2〜5に記述される発現プラスミドpTRYI−GPK、pTRYI−VGR、pTRYI−GPK−SS及びpFX−EGF2−APau−CD（アンピシリン耐性）の一つ並びにlacIq リプレッサープラスミドpUBS520（カナマイシン耐性、調製及び説明はBrinkmann, U.ら, Gene 85 (1989) 109-114を参照）で形質転換した。
【００６８】
発現プラスミドで形質転換したUT5600／pUBS520／細胞を、振盪培養で、50〜100mg／lアンピシリン及び50mg／lカナマイシンを含むDYT培地（1％（w／v）酵母抽出物、1％（w／v）バクト・トリプトン（Bacto Tryptone）、Difco及び0.5％ NaCl）中、37℃で、550nmでの光学密度（OD550）が0.6〜0.9になるまで培養した後、IPTG（最終濃度1−5ミリモル／l）で誘導した。37℃で4〜8時間（h）の誘導期の後、細胞を遠心（Sorvall RC−5B遠心機、GS3ローター、6000 rpm、15分）によって回収し、50ミリモル／lトリス−HCl緩衝液pH7.2で洗浄して、さらに処理するまで−20℃で保存した。1lの振盪培養から得た細胞収量は4〜5g（湿潤重量）であった。
【００６９】
b）発現分析
発現プラスミドpTRYI−GPK、pTRYI−VGR、pTRYI−GPK−SS及びpFX−EGF2−APau−CDで形質転換したUT5600／pUBS520／細胞の発現を分析した。このために、各々の場合において1mlの遠心分離した培養培地から得た細胞ペレットを0.25mlの10ミリモル／lトリス−HCl、pH7.2に再懸濁し、細胞をBranson Company（Heusenstamm、ドイツ）製のSonifier（登録商標）Cell Disruptor B15を用いる超音波処理（50％の強度で30秒のパルス2回）によって溶解した。不溶性細胞成分を沈殿させ（Eppendorf 5415遠心機、14000rpm、5分）、1／5容積（vol）の5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50ミリモル／lトリス−HCl、pH6.8、1％SDS、1％メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）をその上清に添加した。不溶性細胞残滓画分（ペレット）を6〜8M尿素を含む1×SDS試料緩衝液0.3mlに再懸濁し、それらの試料を95℃で5分間インキュベートして再度遠心した。その後、タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離し（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680−685）、クーマシー・ブリリアント・ブルーR染料で染色した。
【００７０】
E.coli内で合成されたプロテアーゼ変異体は均質であり、不溶性細胞残滓画分だけに見出された（封入体、IB）。発現収率は全E.coliタンパク質に対して10〜−50％であった。
【００７１】
実施例7
細胞の溶解、プロテアーゼ遺伝子の可溶化及び再生
a）細胞の溶解及び封入体（IB）の調製
3lの振盪培養物から得た細胞ペレット（約15gの湿潤重量）を75mlの50ミリモル／lトリス−HCl、pH7.2に再懸濁した。この懸濁液を0.25mg/mlリゾチームと混合し、それを0℃で30分間インキュベートした。2ミリモル／l MgCl2及び10mg／ml DNアーゼI（Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番号104159）を添加した後、細胞をSLM Amico Company（Urbana、IL、USA）製のFrench（登録商標） Pressにおける高圧分散によって細胞を機械的に破壊した。続いて、DNAを室温（RT）で30分間消化した。37.5mlの50ミリモル／lトリス−HCl pH7.2、60ミリモル／l EDTA、1.5モル／l NaCl、6％トリトンX−100をその調製品に添加し、それをRTでさらに30分間インキュベートしてSorvall RC−5B遠心機（GSA Rotor、12000rpm, 15分）で遠心した。上清を廃棄して100mlの50ミリモル／lトリス−HCl、pH7.2、20ミリモル／l EDTAをペレットに添加し、それを攪拌しながら4℃で30分間インキュベートして再度沈殿させた。この最終洗浄工程を繰り返した。精製したIB（湿潤重量1.5〜2.0g、25〜30％乾燥体、プロテアーゼ100〜150mg）をさらに処理するまで−20℃で保存した。
【００７２】
b）IBの可溶化及び誘導体化
精製したIBを、攪拌しながら室温で1ないし3時間以内、5〜10mg／mlタンパク質に相当する100mg IBペレット（湿潤重量）／mlの濃度で、6モル／lグアニジニウム−HCl、100ミリモル／lトリス−HCl、20ミリモル／l EDTA、150ミリモル／l GSSG及び15ミリモル／l GSH、pH8.0に溶解した。その後、pHをpH5.0に調整し、不溶性成分を遠心（Sorvall RC−5B遠心機、SS34ローター、16000rpm、10分）によって分離した。その上清を、4℃で24時間、100容積の4〜6モル／lグアニジニウム−HCl pH5.0に対して透析した。
【００７３】
c）再生
6モル／lグアニジニウム−HClに可溶化し、かつGSSG／GSHで誘導体化したプロテアーゼ変異体の再生を、4℃で、各々の場合において0.5mlのIB可溶化物／誘導体を50mlの50ミリモル／lトリス−HCl、0.5モル／lアルギニン、20ミリモル／l CaCl2、1ミリモル／l EDTA及び0.5ミリモル／l システイン、pH8.5に3−5時間の間隔で繰り返し（例えば、5回）添加することにより行い、次に4℃で10−16時間インキュベートした。この再生反応が完了した後、Seitz Company（Bad Kreuznach、ドイツ）製の深床フィルターK 250を備えるSatorius Company（Gottingen、ドイツ）製の濾過装置を用いる濾過により不溶性成分を分離した。
【００７４】
d）再生調製品の濃縮及び透析
プロテアーゼを含む透明上清を、Filtron Company（Karlstein、ドイツ）製のMinisette（膜タイプ：オメガ10K）でのクロス・フロー濾過によって10〜15倍に濃縮し、20〜25℃で12〜24時間、100容積の20ミリモル／lトリス−HCl及び50ミリモル／l NaCl、pH8.2に対して透析してグアニジニウム−HCl及びアルギニンを除去した。沈殿したタンパク質を遠心（Sorvall RC−5B遠心機、SS34ローター、16000rpm、20分）によって除去し、透明な上清をNalge Company（Rochester、NY、USA）製のNalgene（登録商標）使い捨て濾過ユニット（細孔径：0.2μm）で濾過した。
【００７５】
実施例8
再生活性トリプシン及びFXaプロテアーゼ変異体の精製
自己触媒によるトリプシン並びにrFXプロテアーゼ変異体rTRYI−GPK、rTRYI−VGR、rTRYI−GPK−SS及びrFX−EGF2−APau−CDの活性化は、再生並びに引き続く再生混合物の濃縮及び透析の間に既に生じていた。
【００７６】
再生混合物から得た活性トリプシン並びにrFXプロテアーゼ変異体rTRYI−GPK、rTRYI−VGR、rTRYI−GPK−SS及びrFX−EGF2−APau−CDは、必要であれば、当業者が精通するクロマトグラフィー法によってさらに精製することができる。
【００７７】
Q−セファロースffでのイオン交換クロマトグラフィーによるプロテアーゼ変異体の精製
20ミリモル／lトリス−HCl及び50ミリモル／l NaCl、pH8.2に対して透析した濃縮再生混合物を、Pharmacia Biotech Company（Freiburg、ドイツ）製の同じ緩衝液で平衡化したQ−セファロースffカラム（1.5×11cm、V＝20ml；充填容量：10mgタンパク質／mlゲル）にかけ（2カラム容積／時、2 CV／h)、平衡化緩衝液で、溶出物の280nmの吸光度がその緩衝液のブランク値に到達するまで洗浄した。結合した物質を20ミリモル／lトリス−HCl、pH8.2中の50〜500ミリモル／l NaClの勾配で溶出した（2 CV／h）。プロテアーゼは100〜200ミリモル／lのNaCl濃度で溶出した。プロテアーゼを含む画分を非還元及び還元SDS PAGEで同定し、溶出ピークをプールした。
【００７８】
実施例9
ベンズアミジン−セファロースCL−6Bでのアフィニティクロマトグラフィーによる活性プロテアーゼ変異体の精製
20ミリモル／lトリス−HCl及び50ミリモル／l NaCl、pH8.2に対して透析した濃縮再生調製品を、Pharmacia Biotech Company（Freiburg、ドイツ）製の同じ緩衝液で平衡化したベンズアミジンセファロースCL 6Bカラム（1.0×10cm、V＝8ml；充填容量：2〜3mgタンパク質／mlゲル）にかけ（2 CV／h)、平衡化緩衝液で、溶出物の280nmの吸光度がその緩衝液のブランク値に到達するまで洗浄した。結合した物質を20ミリモル／lトリス−HCl及び200ミリモル／l NaCl、pH8.2中の10ミリモル／lベンズアミジンで溶出した（2 CV／h）。プロテアーゼを含む画分を非還元及び還元SDS PAGE並びに活性の決定（実施例10を参照）によって同定した。
【００７９】
溶出に用いたセリンプロテアーゼ阻害剤ベンズアミジンを、1ミリモル／l HCl（トリプシン）又は50ミリモル／lリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.5（FXa）に対して透析することによって除去した。
【００８０】
実施例10
精製プロテアーゼ変異体の特性付け
a）SDS−PAGE
分子間ジスルフィド架橋形成によるオリゴマー及び凝集体の形成、ならびに再生され、自己触媒的に活性化され、且つ精製されたトリプシン及びrFXaプロテアーゼ変異体の均一性及び純度を、非還元（メルカプトエタノールを差し引く）及び還元（メルカプトエタノールを加える）SDS PAGE（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680−685）によって調べた。
【００８１】
b）活性の測定、速度定数Kcat及びKmの測定
N−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエステル（BAEE）を用いるトリプシン活性の測定
トリプシンの活性の測定を、Walsh、K.A.及びWilcox、P.E.のプロトコル（Methods Enzymol. XIX (1970) 31−41）に従い、25℃で、63ミリモル／lリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.6及び0.23ミリモル／l N−ベンゾイル−L−アルギニンエチルエステル塩酸塩（BAEE；Sigma-Aldrich Chemie GmbH、Deisenhofen、ドイツ、カタログ番号B−4500）中で1mlの容積にて行った。トリプシンを含む試料50ml（1ミリモル／l HClに溶解、300−600 U／ml）を添加することにより反応を開始させ、253nmでの吸光度の変化／分（ΔA／分）を測定した。トリプシンの1 BAEE単位は、述べられた試験条件下で0.0032の吸光度の変化（ΔA／分253）を生じる酵素の量と定義される。精製したヒトトリプシンの比活性はこれらの試験条件下で約12000 U／mgタンパク質である。活性及び速度定数を、ミハエリス・メンテン（Michaelis-Menten）式による直線初期勾配から決定した。
【００８２】
Chromozyme（登録商標） THを基質として用いるトリプシン活性の測定
トリプシンの活性を、25℃で、50ミリモル／lトリス−Hcl、150ミリモル／l NaCl、5ミリモル／l CaCl2、0.1％ PEG 8000、pH8.0及び0.1ミリモル／lのクロモジェニック基質Chromozyme（登録商標）TH（トシル−Gly−Pro−Arg−4−pNA、カタログ番号838268、Boehringer Mannheim GmbH、Mannheim、ドイツ）中で1mlの容積にて測定した。トリプシン（0.4〜4 U／ml、1ミリモル／l HClに溶解）を含む試料1〜10μlを添加することにより反応を開始させ、405nmでの吸光度の変化／分（ΔA／分）（ε405＝9.75［ミリモル-1×l×cm-1］）を測定した。1 Chromozyme（登録商標）TH トリプシン単位は、25℃で毎分1μl／l ｐ−ニトロアニリン(pNA)をこのchromozyme基質から放出させる酵素の量と定義される。
【００８３】
Xa因子の活性の測定
FXa活性を、クロモジェニック基質Chromozym（登録商標）X（0.1ミリモル／l、N−メトキシカルボニル−D−Nle−Gly−Arg−pNA、Boehringer Mannheim GmbH、Mannheim、カタログ番号789763）を用いて、25℃で、50ミリモル／lトリス−HCl、150ミリモル／l NaCl、5ミリモル／l CaCl2、0.1％ PEG 8000、pH8.0中で1mlの容積にて測定した。rFXa（0.4〜4 U／ml）を含む試料1〜10μlを添加することにより反応を開始させ、405nmでの吸光度の変化／分（ΔA／分）（ε405＝9.75［ミリモル-1×l×cm-1］）を測定した。1単位（U）Fxa活性は、25℃で毎分１μモルのpNAをこのchromozyme基質から放出させる酵素の量と定義される。活性及び速度定数を、ミハエリス・メンテン式による直線初期勾配から決定した。これらの結果を表1に示す。
【００８４】
【表１】
0003947653.tif 000008
1）ウシトリプシン（Boehringer Mannheim GmbH、Mannheim、ドイツ、カタログ番号109827）
2）ブタトリプシン（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、Deisenhofen、ドイツ、カタログ番号T−7418）
3）基質：Chromozyme（登録商標）TH
4）基質：Chromozyme（登録商標）X
【００８５】
c）トリプシンの温度安定性（Tm値）の測定
様々なトリプシンの温度安定性を示差走査熱量測定（DSC）によって測定した。このために、トリプシンの変性点（Tm）を規定溶媒（1ミリモル／l HCl）中、規定タンパク質濃度（40mg／ml）及び規定加熱速度（1℃／分）で測定した（表2を参照）。
【００８６】
【表２】
0003947653.tif 000009
1）ウシトリプシン（Boehringer Mannheim GmbH、Mannheim、ドイツ、カタログ番号109827）
2）ブタトリプシン（Sigma-Aldrich Chemie、Deisenhofen、ドイツ、カタログ番号T−7418）
【００８７】
d）温度ストレス後の残留トリプシン活性の測定
温度安定性を測定するため、トリプシンを45℃、50モル／lトリス−HCl、150ミリモル／l NaCl及び5ミリモル／l CaCl2、pH8.0中で3.5 U／mlの濃度にてインキュベートし、トリプシンの残留活性を3、6及び29時間後に、実施例10bに記載されるように、Chromozyme（登録商標）THを基質として用いて測定した。それらの結果を表3に示す。
【００８８】
【表３】
0003947653.tif 000010
1）ウシトリプシン（Boehringer Mannheim GmbH、Mannheim、ドイツ、カタログ番号109827）
2）ブタトリプシン（Sigma-Aldrich Chemie、Deisenhofen、ドイツ、カタログ番号T−7418）
【００８９】
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【００９０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：35
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N1""
配列
0003947653.tif 000011
配列番号：２
配列の長さ：39
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N2""
配列
0003947653.tif 000012
配列番号：３
配列の長さ：58
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N3""
配列
0003947653.tif 000013
配列番号：４
配列の長さ：58
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N4""
配列
0003947653.tif 000014
配列番号：５
配列の長さ：77
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N5""
配列
0003947653.tif 000015
配列番号：６
配列の長さ：80
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N6""
配列
0003947653.tif 000016
配列番号：７
配列の長さ：29
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N7""
配列
0003947653.tif 000017
配列番号：８
配列の長さ：38
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N8""
配列
0003947653.tif 000018
配列番号：９
配列の長さ：60
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N9""
配列
0003947653.tif 000019
配列番号：１０
配列の長さ：41
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
説明：/desc="Primer "N10""
配列
0003947653.tif 000020
配列番号：１１
配列の長さ：52
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003947653.tif 000021
配列番号：１２
配列の長さ：701
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
0003947653.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】
短くなったプロセグメントを有するクローン化されたTRYI変異体遺伝子のヌクレオチド配列及び該配列から誘導されるアミノ酸配列を示す。
【図１】
0003947653.tif 000023