(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、その薬理学的に許容される塩類、またはそれらの混合物を有効成分として含有する抗神経内分泌腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、抗神経内分泌腫瘍剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
従来より、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（6-diazo-5-oxo-L-
norleucine：以下「ＤＯＮ」と略記することがある）は強力なグルタミン合成阻害物質として知られており、癌細胞が高いグルタミン要求性を有することから、制癌剤、抗癌剤への利用が古くから提案されてきた。例えば、英国特許第 1,141,735号（1969年) にはラパコールとその他の成分からなる抗腫瘍剤組成物が開示されており、その他の制癌物質の一つとしてＤＯＮが例示されている。
【０００３】
しかしながら、これまでに報告されている多くの臨床試験の結果は、このＤＯＮの制癌剤、抗癌剤としての有効性を支持するものではなかった（例えば、Invest. New Drug, 8:113-119, 1990; Cancer Chemother Phamacol., 21:78-84,1988; Invest. New Drug, 3:369-374, 1985; Am. J. Clin. Oncol., 6:325-326,1983; Am. J. Clin. Oncol., 5:541-543, 1982; Cancer Treat. Rep., 66:1665-1666, 1982;  Cancer Treat. Rep., 66:1215-1217, 1982; Cancer Treat. Rep.,65:1031-1036, 1981）。すなわち、これらの臨床試験では、肺癌、大直腸癌(colorectal cancer) 、肉腫、白血病等を対象としてＤＯＮ効果を試験したが、深刻な副作用が生じる投与量でも僅かな効果が報告されているに過ぎない。
【０００４】
これに対して、この発明の発明者等は、神経内分泌腫瘍にはグルタミンの前駆体であるグルタミン酸が多量に存在すること（Eur. J. Cancer, 29:1982-1984, 1993）に着目し、種々の腫瘍細胞を用いた検討の結果、神経内分泌腫瘍に対するＤＯＮの効果が、これまでに検査された他の腫瘍細胞に対する効果とは明らかに異なることを見いだした。
【０００５】
この発明は、このようなＤＯＮ効果に関する新規な知見に基づいて成されたものであって、ＤＯＮを有効成分とする新しい抗神経内分泌腫瘍剤を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、その誘導体、その薬理学的に許容される塩類、またはそれらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗神経内分泌腫瘍剤を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この発明の抗神経内分泌腫瘍剤の有効成分であるＤＯＮは、市販品を利用することができ、あるいは公知の方法（特開昭４９−５０１９３号公報）によってストレプトミセス属に属する細菌から単離したものを使用することもできる。
また、その誘導体は、アミノ基、カルボキシル基の各種保護基をもつ類縁体あるいは縮合物等であり、公知の方法によって適宜に調製したものを用いることができる。
【０００８】
さらにＤＯＮは、薬理学的に許容される塩類としてもよく、その場合には、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機鎖塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、サルチル酸等の有機酸等を用いて生成することができる。
【０００９】
この発明の抗神経内分泌腫瘍剤は、上記の有効成分の他に、例えば薬理学的に許容される溶媒等を混合し、投与経路に応じた適宜な剤形とすることができる。投与量は、症状によって異なるが、成人１日当たり１〜１００ｇ程度とすることができる。
以下、神経内分泌腫瘍細胞に対するＤＯＮの効果を測定した試験例を示し、この発明の作用効果を詳しく説明する。
（１）材料の調製
ａ）被検細胞
ヒト神経内分泌腫瘍の細胞株としてして知られているＢＯＮ−Ｉ株（Texas 大学、Dr. M.C. Townsend より入手）と、神経芽細胞種の細胞株ＬＡＮを使用した。
【００１０】
ＢＯＮ−Ｉ株は、ＨａｍＦ−１２Ｋ培地（Ｌ−グルタミン酸 29.4mg/l 含有) とＤＭＥＭ培地（Ｌ−グルタミン酸を含まず）を１：１で混合した培地で培養した。ＬＡＮ株は、ＭＥＭ−イーグル培地（Ｌ−グルタミン酸 14.7mg/l 含有) で培養した。なお、いずれの細胞株の培地にも、10% 牛胎児血清、Ｌ−グルタミン（2mM)、ペニシリン(100 IU/ml) およびストレプトマイシン(100μg/ml) を添加した。
【００１１】
さらに、比較対照として、ヒト膵管腫瘍の細胞株（ＰＡＮＣ）、神経膠腫の細胞株（Ｕ３４３）、膀胱癌の細胞株（ＲＴ４およびＪ８２）も同様に培養し、以下の試験に供した。
ｂ）細胞凝集体の培養
上記の細胞株をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で培地から剥がし、予めアガロースで被覆した２４穴培養プレートの各ウェルに、ＢＯＮ−Ｉ株は１×１０4 個ずつ、ＬＡＮ株は５×１０4 個ずつ播種した。播種後４日目から２日に一度の割合で培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で培養を継続した。
ｃ）ＤＯＮ処置
ＤＯＮ（シグマ社製）は、上記細胞株の培地に、５、１０、５０、１００μＭの濃度で使用直前に添加した。
【００１２】
下記の各測定は、このＤＯＮ培地に細胞凝集体を移した１時間後から開始した。ＤＯＮ処置の期間は測定の種類によって異なるが、その期間内では、２日毎に新鮮なＤＯＮ培地に交換しながら培養を継続した。また、次の測定に移る際には、細胞凝集体を洗浄（ＤＯＮを含まない培地で、少なくとも３０分間の培養を３回）することによってＤＯＮ処置の影響を除去した。
【００１３】
なお、ＤＯＮの他、別種のグルタミン−グルタミン酸拮抗物質であるα−アミノアジピン酸（α-amino-adipic acid: ＡＡＡ）を用いて同様の実験を行った。
（２）測定方法
腫瘍細胞に対するＤＯＮの効果を判定する指標として、次の３つの測定を行った。
１．細胞凝集体サイズの測定
上記ｂ）の手続きで培養した細胞凝集体のサイズを、顕微鏡下で目視スケールによって計測し、次式によりその容量（Ｖ）を数値化した。
【００１４】
Ｖ＝４＊π／√（ａ＊ｂ）3 
（ａおよびｂは、直角における最小および最大半径を示す）
２．14Ｃ−メチオニン取込量の測定
サイズを計測した細胞凝集体を新しい培養プレートに移し、0.5 μCi/ml のＬ−（メチル−14Ｃ）−メチオニン（アマシャム社製）を含む培地 (0.5ml)において３７℃で４０分間培養した。培養後、細胞凝集体を洗浄し、Biolute-S (Zinsser Analytic 社製) に１夜溶解し、液体シンチレーションカウンターを用いて計測した。３ウェルの培地（10μL)を同様に測定して対照とした。
【００１５】
14Ｃ−メチオニンの取込量は、２つの方法によって決定した。
Ａ：全取込量  ＝（凝集体のｃｐｍ）／（対照１μｌのｃｐｍ）
Ｂ：相対取込量＝（凝集体のｃｐｍ）／（対照１μｌのｃｐｍ）／凝集体量
３．クロモグラニンＡ分泌量の測定
４つの培養ウェルから培地 (各ウェル0.5ml)を採取し、競合的な放射免疫測定によりクロモグラニンＡとその代謝産物（すなわち、クロモグラニンＡの全分泌量）を測定した。非特異的な影響を排するため、測定対象の培地は、測定の前に少なくとも４回（通常は１０回）、測定緩衝液に希釈した。
（３）結果
１．細胞株の種類に違いにおけるＤＯＮ効果
14Ｃ−メチオニンの全取込量におけるＤＯＮ処置の効果はＢＯＮ株の凝集体で最大であり、１０μＭ濃度のＤＯＮにより14Ｃ−メチオニン取込量が約６０％減少した（図１）。これに対して、他の細胞株では、約２０−３０％の減少が観察されただけであった。
【００１６】
一方、相対的な取込量（凝集体のサイズで補正した値）を指標とした場合には、ＢＯＮ株が３５％の減少であったのに対し、他の細胞株では０−１５％程度の減少にとどまった（図２）。なお、最大の抑制効果は、１０μＭ濃度の処置において観察され、これは他の細胞株においても同様であった。
アミノアジピン酸（ＡＡＡ）の効果はＤＯＮとは全く異なり、14Ｃ−メチオニン取込量に対する最大の抑制効果（約３０％）はＰＡＮＣ株で観察され、次いでＪ８２およびＲＴ４株の２０％、神経膠種の１０％であり、ＢＯＮおよびＬＡＮ株では５％以下の効果しか得られなかった（図３）。また、いずれの細胞株においても最大効果は１０μＭ濃度で得られ、投与量を増大しても効果の増加は観察されなかった（図４）。
２．ＤＯＮ処置期間の効果
ＤＯＮ（１０μＭおよび５０μＭ）の処置期間を様々に変えて、14Ｃ−メチオニンの全取込量に対する効果を検討した。
【００１７】
結果は図５に示したとおりである。ＢＯＮ凝集体における14Ｃ−メチオニン取込量は、ＤＯＮ処置中、いずれの濃度においても直線的に減少した。一方、ＬＡＮ凝集体においては、５０μＭ濃度のＤＯＮ処置の効果はＢＯＮの場合と同様であるが、１０μＭ濃度では７日目でのみ効果が観察された。
凝集体のサイズについても同様の効果が観察された。すなわち、ＢＯＮ株においては、凝集体の縮小効果は持続的なＤＯＮ処置によって直線的に減少し、ＬＡＮ株ではその効果は数日間以上無効果であった。
３．処置停止の効果
ＤＯＮ処置を５日間連続し、処置を停止した後の効果の残存を測定した。結果は図６に示したとおりである。
【００１８】
処置を受けなかったＢＯＮ細胞凝集体は、その後の２週間に渡って14Ｃ−メチオニン取込量を著しく増加させた。そして、２週間後には、ほとんどの凝集体は脆くなっており、培地を静かに交換するだけで破壊された。また、１０μＭ濃度のＤＯＮ処置を受けたＢＯＮ凝集体は、５日間の処置後の14Ｃ−メチオニン取込量が対照に比して有意に減少した。処置停止後の１０日間は取込量が僅かに増加し、２１日後移行に有意な増加が観察された。
【００１９】
一方、ＬＡＮ細胞凝集体では、ＤＯＮ処置を受けていない場合の14Ｃ−メチオニン取込量はＢＯＮ株の場合より低く、１０μＭ濃度のＤＯＮ処置による効果も僅かであった。５０μＭ濃度の場合には対照に比して効果が観察されたが、それも経時的に消失した。
凝集体サイズを指標とした場合にも、14Ｃ−メチオニン取込量と同様の処置停止後効果が観察された（図７）。無処置のＢＯＮ凝集体は経時的に急激に成長したが、ＤＯＮ処置を受けたＢＯＮ凝集体は２−３週間、その成長を停止した。また、再成長の開始時期には容量依存効果が観られた。
【００２０】
一方、ＬＡＮ細胞凝集体の場合には、そのサイズ変化に対するＤＯＮ処置後の効果はほとんど観察されなかった（図８）。
さらに、図９に示したように無処置凝集体の成長パタンを対数表示すると、ＢＯＮ細胞凝集体は直線的な増加を示すことから、ＢＯＮ細胞の倍化時間が５．２日間であることが確認された。そして、このグラフから、５、１０および５０μＭ濃度のＤＯＮ処置による成長休止期間が、それぞれ１４、１５および２４日間であることが推定された。これに対して、ＬＡＮ細胞の凝集体の場合にはこのような明瞭な効果は観察されなかった（図１０）。
４．クロモグラニンＡに対するＤＯＮ効果
ＢＯＮ細胞凝集体は、比較的多量のクロモグラニンＡを培地中に分泌するという特徴を有している。ＤＯＮによって処置されたＢＯＮ凝集体はクロモグラニンＡの分泌量を有意に減少させ、図１１に示したように、１０および５０μＭ濃度とも、処置後２日目には対照に比してクロモグラニンの分泌量を５０％にまで減少させた。処置後７日目には、５０μＭ濃度では９０％、１０μＭ濃度では８０％まで減少させた。
【００２１】
また、処置停止後のクロモグラニンのレベルは、凝集体サイズおよびメチオニン取込量を指標とした場合と同様のパタンを示した（図１２）。
一方、ＬＡＮ細胞の凝集体ではクロモグラニンＡの分泌は観察されなかった。
（４）考察
以上の試験結果から、ＤＯＮは神経内分泌腫瘍の細胞株であるＢＯＮ株の細胞凝集体に対して、その成長を停止させ（サイズの減少）、代謝機能を低減させ（メチオニン取込量の低下）、そして細胞機能発現の抑制（クロモグラニンＡの分泌量の減少）を生じさせた。しかもこのような効果は、ＤＯＮ処置停止後も持続することが確認された。
【００２２】
一方、以上のような効果は、ＬＡＮ株をはじめとする他の腫瘍細胞では観察されなかった。
これらのことから、ＤＯＮは、神経内分泌腫瘍に対して特異的な効果を有することが確認された。しかも、その効果は処置停止後も持続することから、薬剤として生体に投与することの有効性も確認された。この有効濃度は、既に行われた臨床フェーズＩでヒトにおいて副作用がない濃度である。
【００２３】
【発明の効果】
以上、詳しく説明したとおり、この発明によって神経内分泌腫瘍に対する有効な処方薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各被検細胞凝集体における14Ｃ−メチオニンの全取込量に対するＤＯＮ処置の効果を示したグラフである。
【図２】各被検細胞凝集体における14Ｃ−メチオニンの相対的取込量に対するＤＯＮ処置の効果を示したグラフである。
【図３】各被検細胞凝集体における14Ｃ−メチオニンの全取込量に対するアミノアジピン酸（ＡＡＡ）処置の効果を示したグラフである。
【図４】各被検細胞凝集体における14Ｃ−メチオニンの相対的取込量に対するＡＡＡ処置の効果を示したグラフである。
【図５】  14Ｃ−メチオニンの全取込量に対するＤＯＮ処置期間の効果を示したグラフである。
【図６】  14Ｃ−メチオニンの全取込量に対するＤＯＮ処置停止後の効果の持続を示したグラフである。
【図７】ＢＯＮ細胞凝集体のサイズ変化に対するＤＯＮ処置停止後の効果の持続を示したグラフである。
【図８】ＬＡＮ細胞凝集体のサイズ変化に対するＤＯＮ処置停止後の効果の持続を示したグラフである。
【図９】ＢＯＮ細胞凝集体の成長パタンと、これに対するＤＯＮ効果を示したグラフである。
【図１０】ＬＡＮ細胞凝集体の成長パタンと、これに対するＤＯＮ効果を示したグラフである。
【図１１】ＢＯＮ細胞凝集体におけるクロモグラニンＡ分泌量に対するＤＯＮ効果を示したグラフである。
【図１２】ＢＯＮ細胞凝集体におけるクロモグラニンＡ分泌量に対するＤＯＮ処置停止後の効果の持続を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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