(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とするヒト患者または非ヒト疾患動物の関節炎症の治療用医薬剤であって、抗炎症に有効な量のＣ５ブロッカーを含み、該Ｃ５ブロッカーがＣ５からＣ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害し、更に該Ｃ５ブロッカーがヒト補体成分Ｃ５に対する抗体であることを特徴とする医薬剤。
【請求項２】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の血液由来体液に存在する補体の細胞溶解能を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項３】
血液由来体液が血清である、請求項２に記載の医薬剤。
【請求項４】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の血液由来体液中の補体の活性化後に該体液中に存在する可溶性Ｃ５ｂ〜９レベルを実質的に低減させることを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項５】
血液由来体液が血清である、請求項４に記載の医薬剤。
【請求項６】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の血液由来体液中の補体の活性化後に該体液中に存在するＣ５ａレベルを実質的に低減させることを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項７】
血液由来体液が血清である、請求項６に記載の医薬剤。
【請求項８】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の炎症を起こしている関節の滑液中に存在する補体の細胞溶解能を少なくとも１０％低減させることを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項９】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の炎症を起こしている関節の滑液中に存在する可溶性Ｃ５ｂ〜９レベルを少なくとも１０％低減させることを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項１０】
Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の炎症を起こしている関節の滑液中に存在するＣ５ａレベルを少なくとも１０％低減させることを特徴とする、請求項１に記載の医薬剤。
【請求項１１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１の医薬剤。
【請求項１２】
請求項１の医薬剤であって、ヒト患者または非ヒト疾患動物が関節炎症を有することを特徴とする医薬剤。
【請求項１３】
請求項１の医薬剤であって、Ｃ５ブロッカーが、ヒト患者または非ヒト疾患動物の血清中の補体成分Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断に実質的に干渉しないことを特徴とする医薬剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、炎症性関節疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、確立した関節炎症を治療するための補体成分Ｃ５のブロッカー（「Ｃ５ブロッカー」）の医薬剤としての用途に関する。
発明の背景
１．補体系
補体系は、体の他の免疫系と共に作用して、細胞またはウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも２５種の補体タンパクがあり、これらは血漿タンパクおよび膜コファクターの複雑な集合物として見い出されている。血漿タンパク（それらはリンパ、骨髄、滑液および脳脊髄液のような大部分の他の体液中にも見い出される）は、脊椎動物の血清中のグロブリンの約１０％を構成する。補体成分は、複雑ではあるが正確な一連の酵素的切断および膜結合事象において相互作用することにより、その免疫防御機能を達成する。結果として生じる補体カスケードは、オプソニン機能、免疫調節機能および溶解機能を有する生成物の産生をもたらす。
補体カスケードは、古典的経路または第二経路を経て進行する。これらの経路は多くの成分を共有し、初期の段階では異なるものの、両者は合流して、標的細胞およびウイルスの破壊に関与する同じ最終補体成分（terminal complement components）を共有する。
古典的補体経路は、典型的には抗体の標的細胞上の抗原性部位の認識およびそれに対する結合により開始される。この表面結合抗体は、続いて補体の第１成分であるＣ１と反応する。こうして結合したＣ１は、一組の自己触媒的反応を行い、それが、中でも補体成分Ｃ２およびＣ４に作用するＣ１タンパク分解活性の誘発をもたらす。
この活性化されたＣ１は、Ｃ２およびＣ４をＣ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａおよびＣ４ｂに切断する。Ｃ２ｂの機能はあまり解明されていない。Ｃ２ａおよびＣ４ｂは、一緒になってＣ４ｂ，２ａ複合体を形成し、これは古典的Ｃ３コンベルターゼとして知られる活性プロテアーゼである。Ｃ４ｂ，２ａはＣ３をＣ３ａとＣ３ｂとに切断するよう作用する。Ｃ３ａおよびＣ４ａは、ともに比較的弱いアナフィラトキシンであり、マスト細胞の脱顆粒化を誘発して、ヒスタミンおよびその他の炎症媒介物質の放出をもたらしうる。
Ｃ３ｂは、複数の機能を有する。これは、オプソニンとして、細菌、ウイルス、および他の細胞および粒子に結合し、これらを循環から除去するための目印を付ける。また、Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂ，２ａと複合体を形成し、Ｃ４ｂ，２ａ，３ｂ、すなわち古典的Ｃ５コンベルターゼを生成する。これは、Ｃ５をＣ５ａ（別のアナフィラトキシンである）およびＣ５ｂに切断する。第二Ｃ５コンベルターゼは、Ｃ３ｂ，Ｂｂ，Ｃ３ｂであり、同じ機能を行う。Ｃ５ｂはＣ６と一緒になってＣ５ｂ，６を生成し、この複合体はＣ７と一緒になって三重複合体Ｃ５ｂ，６，７を形成する。このＣ５ｂ，６，７複合体は、細胞膜の表面でＣ８と結合する。Ｃ９が結合すると、完全な膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が形成され（Ｃ５ｂ〜９）、これが外来細胞、微生物およびウイルスの溶解を媒介する。
古典的補体経路の更なる考察、ならびに補体活性化の第二経路の詳細な記載は、多数の刊行物に見い出すことができ、例えば、Roitt, et al. 1988およびMuller-Eberhard, 1988が挙げられる。
２．関節炎症
種々の普遍的な医学的障害は、共通の要素として、患者の関節の炎症を有する。米国単独でも、数百万もの患者がそのような関節炎症を患っている。罹患した個体は障害者となる頻度が高く、このような障害を患う患者のための医療コストは重大である。関節炎症の治療のために多くの手段が利用可能であり、新しい治療が利用可能となり続けている一方で、それらのうちのどれ一つとして望み得るほど安全で効果的ではなく、したがって、関節炎症を制御する新規なアプローチおよびよりよい方法が長い間要望されていた。
臨床的には、関節炎症は、関節の硬直、疼痛、衰弱、および時には関節疲労に関連する。一律に、関節は、圧痛があって腫れ上がり、しばしば紅斑性である。関節疾患の炎症性の性質の診断は、大抵、この典型的な臨床的外観ならびにラジオグラフ検査および骨関節液の吸引検査に基づいている。炎症を起こしている関節の関節液の検査では、一般に、種々の炎症のマーカー、例えば、白血球（好中球を含む）、抗体、サイトカイン、細胞接着分子および補体活性化生成物の増加が証明される（De Clerck et al., 1989; Heinz et al., 1989; Moffat et al., 1989; Peake et al., 1989; Brodeur et al., 1991; Firestein et al., 1991; Matsubara et al., 1991; Olsen et al., 1991; Oleesky et al., 1991; Jose et al., 1990; Zvaifler, 1968; Zvaifler, 1969a; Zvaifler, 1969b; Zvaifler, 1974; Ward and Zvaifler, 1971; Ward, 1975; Moxley and Ruddy, 1985; Mollnes et al., 1986; Auda et al., 1990; Olmez et al., 1991; Kahle et al., 1992; Koch et al., 1994; Thorbecke et al., 1992; Saura et al., 1992; Feldman et al., 1990; Feldman et al., 1991; Fong et al., 1994; Harigi et al., 1993; Morgan et al., 1988; Shingu et al., 1994; Abbink et al., 1992;およびCorvetta et al., 1992）。罹患した関節のラジオグラフ検査では、一般に軟組織の膨張および／またはびらん性の変化が証明される。
関節炎症は、医学的に各種型関節炎（arthridities；関節炎のタイプ）と呼ばれる一群の疾患に関連する。「関節炎」という用語は、関節の疾患を一般的に記載するために医学的に用いられる。しかし、この用語は、複数の異なる病理学的状態の現れからなる（関節疾患を含むが、それに限らない）ある種の医学的状態を記載するためにも使用され、その中では関節リウマチ（ＲＡ）が代表例である。
したがって、関節炎の論評はＲＡのような疾患を含むことがあり、その場合は関節障害はその疾患に付随する種々の病態の一つの面にすぎない。本発明は、これらの疾患の関節障害の側面に特に向けられている。しかし、本発明の方法は、非関節関連病理学についても有益な効果を有する可能性がある。例えば、ＲＡ、乾癬、狼瘡およびその他の障害に付随する確立した関節炎症を治療するための本発明の方法の使用は、血管炎症および腎炎のようなこれらの疾患状態の現れのそれ以外の病的現れのいくつかに作用する治療的利益をも提供しうる（例えば、Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991；１９９４年３月２３日出願の米国特許出願第０８／２１７３９１号；１９９４年５月２日出願の米国特許出願第０８／２３６２０８号；およびSims et al.の米国特許第５１３５９１６号を参照されたい）。
本発明は、全てのタイプの関節障害に関するものではなく、炎症に関与するもののみに関するものであることは留意されるべきである。したがって、例えば、本発明は、炎症性関節疾患の１つである後期の変形性関節症（ＯＡ）の治療に適用可能であるが、一般に、典型的には有意な炎症成分を有さない初期のＯＡには適用されない。
各種型関節炎の詳細な考察は、多数の医学教本中に見い出すことができ、例えば、Arnett, 1992, Cecil Textbook of Medicine, Wyngaarden他編，W. B. Saunders Company, Philadelphia, Chapter 258, pp. 1508-1515; Lipsky, 1994, Harrison′s Principles of Internal Medicine, 13版，Isselbacher他編，McGraw-Hill, Inc., New York, Chapter 285, pp. 1648-1655；およびMcCarthy and Koopman, 1993, Arthritis and Allied Conditions, 12版，Lea and Febiger, Philadelphiaが挙げられる。これらのおよびその他の教本に詳細に考察されているように、そして以下に論評するように、関節炎症は多数の局所的および全身性疾患過程に関連している。
関節炎症に関連する因子
関節炎症は、他のものの中でも細胞性および体液性免疫応答の両方の活性化に関与する複雑な過程である。
細胞性免疫応答としては、優勢には好中球（多核細胞またはＰＭＮとも呼ばれる）である白血球の浸潤が挙げられる。単核白血球細胞の浸潤も、炎症を起こしている多くの関節において一般的である。Ｔリンパ球を含む浸潤性単核球（ならびに滑液細胞、線維芽細胞、および内皮細胞のような関節中に宿る細胞）は、活性化され、複数の炎症性サイトカインの産生に寄与する。これらには、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦおよびＦＧＦが含まれ、その最後の２つは、滑液細胞の増殖を刺激することができる。
これらの全てのサイトカインは、多数の他の炎症因子ならびに組織分解のその他の種々の媒介因子の産生を誘導することにおいて、ある役割を果たすと考えられている。これらの因子および分解媒介因子としては、アラキドン酸代謝の生成物（それらは種々の細胞内シグナル伝達経路において活性である）、反応性酸素中間体、およびコラゲナーゼ、ストロメリシン（stromelysin）およびその他の中性プロテアーゼ類のような分解性酵素が挙げられるが、これらの全ては、炎症性応答および組織破壊に更に寄与することができる。
滑膜への細胞の浸潤は、関節内の細胞上の細胞接着分子、例えば、セレクチン、ＬＦＡ−３、およびＩｇ様細胞接着分子のＩＣＡＭファミリーのメンバーのアップレギュレーションにより強化される。これらの接着分子は、白血球（リンパ球を含む）の接着、移動および活性化を刺激することにより、罹患した関節への活性化された白血球の浸潤を推進する。
体液性免疫もまた、関節炎症に寄与する。抗体は、ＲＡ、ＪＲＡおよびＯＡのような疾患（以下を参照されたい）においては炎症を起こしている関節内で産生され、補体系を活性化しうる局在した免疫複合体を生成する。上記に詳細に考察したように、活性化された補体成分は、細胞溶解性、細胞活性化、アナフィラトキシン性、および走化性の効果を有しうる。
これらの複数因子が関与する炎症性応答は、軟骨破壊および骨びらんをもたらし、それらは最終的には慢性関節炎症を有する患者に見られる関節変形に至る。
関節炎症の複雑な性質から見て、関与する種々の因子の相対的な重要性を説明するために当業界において多彩な説（その多くが矛盾する）が提案されてきた。広範な仕事にも拘わらず、関節炎症において補体がどのような役割を果たすのかを含め、関節炎症における細胞性および体液性免疫系の相対的な役割について、当業界においては基本的な論争が残されている。例えば、Andersson and Holmdahl, 1990; Brahn and Trentham, 1989; Chiocchia et al., 1990; Chiocchia et al., 1991; Durie et al., 1993; Goldschmidt et al., 1990; Goldschmidt and Holmdahl, 1991; Holmdahl et al., 1985; Holmdahl et al., 1989; Holmdahl et al., 1990; Hom et al., 1988; Hom et al., 1992; Hom et al., 1993; Mori et al., 1992; Myers et al., 1989A; Nakajima et al.,1993; Osman et al., 1993; Peterman et al., 1993; Seki et al., 1988; Seki et al., 1992; Terato et al., 1992; Watson et al., 1987;そして特に、補体系および／または関節炎におけるＴ細胞および補体成分の相対的な役割に関する以下の報告：Andersson et al., 1991; Andersson et al., 1992; Banerjee et al., 1988B; Banerjee et al., 1989; David, 1992; Fava et al., 1993; Haqqi et al., 1989; Kakimoto et al., 1988; Maeurer et al., 1992; Morgan et al., 1981; Moxley and Ruddy, 1985; Reife et al., 1991; Spinella et al., 1991; Spinella and Stuart, 1992; van Lent et al., 1992; Watson et al., 1987; Watson and Townes, 1985;およびWilliams et al., 1992Aを参照されたい。今日まで、これらの広範な研究は、補体系の調節に基づく、特にＣ５ブロッカーの使用に基づく確立した関節炎症の有効な治療をもたらしていない。
以下に実施例２において報告するＣ５ブロッカーの予防的効果の研究は、関節炎症を防止するためにＣ５が体液性免疫系を薬学的に調節するための適切で有効な標的であるかどうかを決定するように設計された。関節炎症の開始を防止することにおけるＣ５ブロッカーの驚くべき有効性は、Ｃ５ブロッカーを確立した炎症の治療に用いる、実施例１に報告する研究の設計および実行に導いた。これらの実験の開始の際に、このような治療は確立した関節炎症に対してはほとんど測定可能な効果を示さないであろうことが予期された。これは、Ｃ５が、Ｃ５ａの走化性活性が炎症細胞の浸潤のきっかけとなる時期である疾患過程の初期においてより重要であると考えられていたからである。更に、確立した疾患におけるＴ細胞の関与により、Ｃ５活性の不存在下においてさえ、有意な炎症刺激が提供され続けるであろうとも考えられていた。実施例１の結果により示されるように、この予測は、既に炎症を起こしている関節の炎症を止め、および／または軽減し、同時に、罹患していない関節への炎症の広がりを阻害することにおいて、Ｃ５ブロッカーが驚くほど効果的であることが見い出された点で、正しいものではなかった。
関節炎症に一般的に付随する疾患
関節リウマチ（ＲＡ）および若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）は、原因不明の慢性多系疾患である。ＲＡには、人口の約１％が罹り、女性では男性より３倍一般的に見られる。発病は、最も頻繁には、３０代および４０代である。ＲＡおよびＪＲＡは、全身性の疾患であり、関節炎症の側面に加えて、多数の病理学的徴候を有する。ＲＡにおいては、これらの徴候としては、ＲＡ血管炎（血管の炎症）が挙げられ、これはほとんどあらゆる器官系において起こり、多発性神経炎、皮膚潰瘍（cutaneous ulceration）、内蔵梗塞を含む多くの病理学的続発症を引き起こしうる。胸膜肺（pleuropulmonary）の徴候としては、胸膜炎、腸線維症、胸膜肺結節、肺臓炎および動脈炎が挙げられる。その他の徴候としては、伸筋表面のような種々の関節周囲構造上での、ならびに胸膜および髄膜上での炎症性リウマトイド結節の形成が挙げられる。骨格筋の萎縮および衰弱も一般的である。
ＲＡの関節炎症の側面は、持続性の炎症性滑膜炎として現れ、通常、対称に分布した末梢関節に関与する。一般に、ＲＡにおいて見られる複雑な関節内炎症性応答は、関節炎症の一般的考察において上記したタイプのものである。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する多くの患者は、狼瘡関節炎と呼ばれる関節炎症をも発症する。ＳＬＥは、原因不明の自己免疫性疾患であり、多数の異なる細胞、組織および器官が、病原性自己抗体および免疫複合体により損傷を受ける。ＳＬＥの臨床的徴候は多く、種々の斑紋丘疹性（maculopapular）発疹、腎炎、脳炎、血管炎、血球減少症および凝血異常を含む血液学的異常、心膜炎、心筋炎、胸膜炎、胃腸症状および前述した関節炎症が挙げられる。
変形性関節症（ＯＡ）は、人類の最も一般的な関節疾患であり、膝のＯＡは、先進国における慢性障害の最多原因である。これは、疼痛、硬直および関連関節の膨張として現れる。関節の最も重要な機械的機能を担う関節軟骨は、ＯＡの主要な標的組織である。ＯＡにおける関節軟骨の崩壊は、メタロプロテイナーゼ、プラスミンおよびカテプシンのような種々の酵素により媒介され、これらは炎症媒介因子としても作用しうる種々の因子により刺激される。これらの因子としては、インターロイキン−１のようなサイトカインが含まれ、これは病原性軟骨および滑膜プロテアーゼを活性化することが知られている。
全般的なＯＡにおける軟骨中の免疫グロブリンの正常を越えるレベルの同定およびある種のＯＡ患者におけるII型コラーゲン特異的抗体の証明は、この疾患状態における免疫活性化のための役割の証拠を提供する（例えば、Jasin, 1989を参照されたい）。ＯＡはほとんど単一関節に留まらないという観察は、この疾患が関節軟骨の全身性機能不全であることも示唆する。滑膜炎症は、疾患が進行するにしたがってより頻発する。実際、後期のＯＡにおいては、滑膜炎症の組織学的証拠は、ＲＡ付随性関節炎症の患者の滑膜におけるものと同様に顕著でありうる。
乾癬性関節炎は、乾癬を有する人々の５〜８％に罹患する慢性炎症性関節障害である。これらの個体のかなりの割合（４分の１）が、進行性破壊性疾患を発病する。関節炎症を有する乾癬患者の２５％が、ＲＡの関節炎症の徴候に似た対称の関節炎症を発症し、それらの半分以上が様々な度合いの関節破壊の発症に進む。
関節炎症に関連するその他の疾患
種々のその他の全身性の疾患が、臨床的徴候の目立った特徴として関節炎症を有する。
末梢関節炎症は、炎症性腸疾患の患者の５分の１もの人々に起こる。関節炎症は急性であり、腸疾患の勃発に付随しており、関節の腫れ、紅斑、ほてり、および疼痛により現れる。罹患者の滑液は大部分好中球の急性炎症性滲出液を有し、ラジオグラフにより軟組織の膨張および滲出が証明される。
Ｂ型肝炎に伴う滑膜炎は、血清病に似ており、発熱および関節炎症の突発を伴う。一般には、膝、肩、手首、足首、肘、および手の関節を含む関節の対称の炎症がある。Ｂ型肝炎抗原を含む免疫複合体が血清および滑液中に存在し、滑液炎は免疫学的に媒介されるという考え方の支持を与える。関節炎症を随伴するその他のウイルス性疾患としては、風疹、ヒト免疫不全症ウイルス感染、コクサッキーウイルス感染、およびアデノウイルス感染が挙げられる。
免疫複合体媒介性の関節炎症は、腸管バイパス手術にも付随し、関節炎症は、ウィップル病、または腸性脂肪異栄養症の目立った徴候であり、発熱、浮腫、漿膜炎、リンパ節症、ぶどう膜炎および脳の炎症が付随して観察される。更に、潜在的に免疫に関連する関節炎症は、感染性心内膜炎およびある種のスピロヘータ感染、最も顕著にはライム病の原因生物であるBorrelia burgdorferiによる感染に付随する続発症である。
第一期のシェーグレン症候群は、口腔乾燥症およびドライアイをもたらす外分泌腺のリンパ球浸潤を特徴とする進行の遅い慢性自己免疫性疾患である。患者の３分の１が、血管炎、腎炎、多発性単神経炎（mononeuritis multiplex）、および最も一般的には関節炎症を含む全身性の徴候を呈する。
強直性脊椎炎（ＡＳ）は、原因不明の炎症性障害であり、第一義的には中軸骨格を侵すが、末梢関節もまた侵される。その発病は、ＨＬＡ−Ｂ２７組織適合性ハプロタイプと相関し、免疫媒介性のメカニズムは、ＲＡの関節炎症の側面において見られるのと同様の特徴を有する炎症性の関節の組織学および上昇した血清ＩｇＡレベルにより更に暗示される。したがって、ＡＳにおける炎症性末梢関節からの滑液は、他の炎症性関節疾患のそれと大きく異ならない。
反応性関節炎（ＲｅＡ）は、体のどこかの感染に合併する急性非化膿性（nonpurulent）関節炎症である。反応性関節炎は、免疫学的に媒介されると信じられている。このカテゴリーに包含されるものとしては、しばしばライター症候群またはライター病と呼ばれる一群の臨床的所見がある。関節炎症に加えて、この症候群は、皮膚、眼、粘膜、およびそれらほど一般的ではないが心臓、肺および神経系を侵す。ライター症候群は、いくつかのShigella、Salmonella、Yersinia、およびCampylobacter種のいずれかによる腸管感染、Chlamydiatrachomatousによる生殖器感染の後に起こりうる。この症候群に罹患した関節の組織学は、他のタイプの関節炎症において見られるものと同様である。その関節炎症は、通常、非常に疼痛があり、緊張した関節滲出は、特に膝においては珍しくない。この関節炎症は、通常、非対称かつ加算的であり、数日〜数週間の期間にわたって新たな関節の関与が起こる。
３．現在の治療法
上記の種々の関節炎症のための現在の治療法としては、非ステロイド剤のような抗炎症剤、例えばアスピリン、ならびに金化合物、コルチコステロイド、ペニシルアミン、ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート、アザチオプリン、シクロホスファミドのようなアルキル化剤、およびスルファサラジンなどの非特異的免疫抑制剤の投与が挙げられる。これらの薬剤の各々の投与は、しばしば重大な副作用および毒性を伴う。これらのある種の治療を受ける患者は、全般的な免疫抑制に伴う日和見感染の危険および腫瘍形成のリスクの増加にもさらされる。上記で引用した医学教本に加えて、確立した関節炎症を治療するために用いられる薬剤の考察は、Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics 18版、Gilman他編、1990. Pergamon Press, Inc., New York, Chapter 26, pp.638-681; Physician′s Desk Reference 47版、1993, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ; The United States Pharmacopeia 22版、1989, Mack Printing Co., Easton, PA; Drug Evaluations Annual 1991, 1990, American Medical Association, Milwaukee, WI；およびCash and Klippel, 1994, N. Eng. J. Med. 330, pp. 1368-1375に見い出すことができる。
薬学的な治療に加えて、関節炎症の症状の軽減は、温浴または冷浴（warm or cold soaks）により達成される。腱解放法および／または関節置換法を用いる外科的介入は、しばしば慢性関節炎症の治療の最後の手段である。このような整形手術は、感染の増加に関連し、プロテーゼの寿命は限られている。
現在開発中の新規な治療アプローチとしては、炎症を起こしている関節に存在する炎症カスケードに寄与する細胞性免疫応答の種々の要素に取り組む試みが挙げられる。これらのアプローチとしては、抗Ｔ細胞および／または抗サイトカイン剤を含有する治療製剤の投与（例えば、Banerjee et al., 1988A; Cannon et al., 1990; Chiocchia et al., 1991; Elliot et al., 1993; Fava et al., 1993; Fujimori et al., 1993; Griswold et al., 1988; Hom et al., 1988; Hom et al., 1991; Hom et al., 1993; Inoue et al., 1993; Kakimoto et al., 1992; Kleinau et al., 1989; Myers et al., 1989b; Myers et al., 1993; Nagler-Anderson et al., 1986; Nishikaku and Koga, 1993; Peterman et al., 1993; Piguet et al., 1992; Smith et al., 1990; Spannaus-Martin et al., 1990; Thompson et al., 1988; Trentham et al., 1993; Williams et al., 1992b; Williams et al., 1994;およびWolos et al., 1993を参照されたい）が挙げられる。
発明の概要
前述の状況から、確立した関節炎症の治療のための新規なアプローチを提供することは、本発明の１つの目的である。
この目標を達成するために、本発明は、確立した関節炎症の治療処置を行うための医薬剤として補体成分Ｃ５のブロッカーの使用を含む方法を提供する。Ｃ５ブロッカーは、少なくとも１つの炎症を起こしている関節を有する動物（例えばヒト）に投与される。ブロッカーは、全身的に、または局所的に投与することができる。これらは、既に炎症を起こしている関節の炎症を軽減または安定化し、罹患していない関節への炎症の広がりを阻害する。
本明細書において用いる場合、「Ｃ５ブロッカー」は、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂの形成および／または生理学的機能を阻害するように、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂと直接相互作用する化合物、すなわち、これらの補体成分のいずれかに直接結合し、またはそれを直接改変する（すなわち直接的化学反応により）化合物である。好ましくは、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの両方の形成および／または生理学的機能が、Ｃ５ブロッカーにより阻害される。
Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂとの直接的相互作用は、補体カスケードの他の成分が損なわれずにいることができるという重要な利点を有する。特に、Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じるＣ３コンベルターゼによる補体成分Ｃ３の活性化に関連するオプソニン化機能は損なわれないで残り、Ｃ３ｂの作用により身体から外来粒子および物質を継続して排除することを可能にしうる。最も好ましいＣ５ブロッカーは、このタイプのもの、すなわちＣ３ｂ機能に干渉しないものである。
以下に提示する実施例によって明らかになるように、本発明にしたがえば、驚くべきことに、Ｃ５ブロッカーを用いる処置は、炎症を起こしている関節での疾患の進行を止め、多くの場合には少なくとも部分的に逆行させ、同時に、罹患していない関節への関節炎症の進行を防止することが見い出された。関節炎症における細胞性免疫系の役割に関する従来の当業界の理解（上記を参照されたい）のもとでは、Ｃ５ブロッカーが確立した関節炎症に対してこのような劇的に有益な効果を有するであろうことは予期されていなかった。
添付の図面は、本明細書に取り込まれてその一部を構成するものであり、本発明のある側面を説明する。そして、記載と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。もちろん、これらの図面および記載の両方は、説明のためだけのものであり、本発明を制限するものではないことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
図１ａ〜ｃは、確立した関節炎症の進行を止めるＣ５ブロッカーの用途を説明する、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した関節の顕微鏡写真である。図１ａは、正常マウスの足関節を示す。図１ｂは、対照処理マウスの当初の罹患足関節を示す。ここでは、関節は重度の炎症細胞浸潤および滑膜の肥厚を伴う広範な骨びらんを呈している。そして、図１ｃは、Ｃ５ブロッカー処理マウスの当初の罹患足関節を示し、こちらは、対照群の当初罹患関節（図１ｂ）と比較して、ある程度の滑膜の肥厚を伴うが、驚くほど多核細胞浸潤がない保存された関節構造を示している。
図２ａおよびｂは、炎症を起こしている関節の病理の進行を止めるＣ５ブロッカーの能力を明らかにするプロットである。図２ａは、平均関節炎症（ＪＩ）インデックス値の比較を示す。データは、平均ＪＩインデックス＋／−標準誤差（ＳＥ）を表す。黒丸は、Ｃ５ブロッカー処理マウスである（ｎ＝６）。白丸は、対照処理マウスである（ｎ＝４）。図２ｂは、当初罹患関節の足の厚さの比較を示す。関節炎症の発症の後、対照の足の厚さは、処理または正常（Ｎ）の足と比較して有意に増加した。データは、平均厚＋／−ＳＥを表す。黒丸は、Ｃ５ブロッカー処理マウス（ｎ＝８）である。白丸は、対照処理マウスである（ｎ＝４）。
図３ａ〜ｅは、Ｃ５ブロッカー処理マウスおよび対照処理マウスについての足の厚さ対時間のプロットである。図３ａ〜ｄは、対にした動物の当初罹患足の測定値を示す。図３ｅは、対にしていない２匹の動物の当初罹患足の測定値および図２ｂの平均対照測定値を示す。
図４ａ〜ｃは、関節炎症の発症を防止するＣ５ブロッカーの用途を説明する、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した関節の顕微鏡写真である。図４ａは、正常マウスの足関節を示す。図４ｂは、対照処理マウスの罹患した足関節を示す。ここでは、炎症細胞浸潤、滑膜の肥厚、および拡大する滑膜パンヌスによる骨びらんが見られる。そして、図４ｃは、Ｃ５ブロッカー処理マウスの典型的な足関節を示し、こちらは滑膜の亜臨床的な肥厚しか示していない。
図５は、Ｃ５ブロッカーを用いた処理が関節炎症を防止することを示す。図５ａは、Ｃ５ブロッカー処理マウス（ｎ＝９）と、２つの異なる対照処理を施したマウスの合計（ｎ＝１０）とのコラーゲン誘導関節炎症の発病の比較である。データは、処理の開始後２カ月以内に見られる関節炎症の発症の総計（合計）を表す。図５ｂは、処理開始後２週間のＣ５ブロッカー処理マウス（ｎ＝５）および対照マウス（ｎ＝３）の血清溶血活性の比較である。
図６は、コラーゲン特異的体液性応答および細胞性応答に対するＣ５ブロッカー処理の効果を示す。図６ａは、ＣII免疫後の示した時間にＣ５ブロッカー処理マウス（ｎ＝４）または対照処理マウス（ｎ＝４）から得た血清試料を分析して作成した。試料は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗Ｂ−ＣII  ＩｇＧについて分析した。抗Ｂ−ＣII抗体インデックスは、陽性血清および陰性血清から得た光学密度の比を表す。図６ｂは、リンパ節Ｔ細胞（５×１０5）をインビトロで２０μg／mlのＢ−ＣII、Ｃ−ＣII、Ｂ−ＣＩと共に、または培地のみで、５×１０5個のマイトマイシンＣ処理同系脾細胞の存在下で全部で４日間培養し、続いて収穫前に細胞を１８時間3Ｈ−チミジンでパルスすることにより作成した。
図７は、溶血アッセイの結果を示し、Ｃ５ブロッカーを用いた処理の後に体外サーキットを通じて循環させたヒト血液に付随する補体活性の阻害を明らかにする。アッセイは、実施例４に記載したように希釈していない血液（「非希釈」）および希釈した血液（「希釈」）を用いて、ブロッカーの添加前、またはＣＰＢサーキットの開始前（「Ｔｘ前」）に行った。ブロッカーを添加した希釈した血液（「Ｔｘ後」）の試料は、ＣＰＢサーキットの開始後、示した時点でアッセイした。
図８は、補体成分Ｃ３ａのレベルのアッセイの結果を示し、体外サーキットを通じて循環させたヒト全血中の補体成分Ｃ３ａの生成が、そのような全血へのＣ５ブロッカーの添加によって阻害されないことを明らかにする。アッセイは、実施例５に記載したように希釈していない血液（「非希釈」）および希釈した血液（「希釈」）を用いて、ブロッカーの添加前、またはＣＰＢサーキットの開始前（「Ｔｘ前」）に行った。ブロッカーを添加した希釈した血液（「Ｔｘ後」）の試料は、ＣＰＢサーキットの開始後、示した時点でアッセイした。
図９は、体外サーキットを通じて循環させたヒト血液中の可溶性Ｃ５ｂ〜９（ｓＣ５ｂ〜９）のレベルのアッセイの結果を示す。この図は、そのような全血へのＣ５ブロッカーの添加が、Ｃ５ｂ〜９最終補体会合体（assembly）の形成を阻害することを明らかにする。アッセイは、実施例６に記載したように希釈していない血液（「非希釈」）および希釈した血液（「希釈」）を用いて、ブロッカーの添加前、またはＣＰＢサーキットの開始前（「Ｔｘ前」）に行った。ブロッカーを添加した希釈した血液（「Ｔｘ後」）の試料は、ＣＰＢサーキットの開始後、示した時点でアッセイした。
図１０ａおよびｂは、種々のＣ５ブロッカーを用いた処理の後のマウス血液（図１０ａ）または体外循環ヒト血液（図１０ｂ）の細胞溶解能の減少の薬物動態解析を示す。Ｃ５ブロッカーＢは、モノクローナル抗体ＢＢ５．１であり、Ｃ５ブロッカーＦは、モノクローナル抗体ＢＢ５．１のＦａｂ’フラグメントであり、Ｃ５ブロッカーＮは、モノクローナル抗体Ｎ１９−８である。
好ましい態様の説明
上記で考察したように、本発明は、そのような治療を必要とする患者に１つのＣ５ブロッカーまたは複数のＣ５ブロッカーの組合わせを投与することにより確立した関節炎症を治療するための方法に関する。本明細書中で用いる場合、「確立した関節炎症」は、患者が治療の開始時点で少なくとも１つの炎症を起こしている関節を有することを意味する。
このようなＣ５ブロッカーは、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂの形成および／または生理学的機能を阻害するように、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂと直接相互作用するタンパク質（抗体を含む）、ペプチドおよびその他の分子を含む。このタイプの非タンパク分子の例としては、Ｋ−７６  ＣＯＯＨ（Hong et al., 1979を参照されたい）、および置換ジヒドロベンゾフラン、スピロベンゾフラン−２（３Ｈ）−シクロアルカン、およびその開鎖中間体、（Sindelar et al.の米国特許第５１７３４９９号を参照されたい）が挙げられるが、これらはＣ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂと直接相互作用すると報告されている。好ましくは、１つまたは複数のＣ５ブロッカーは、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの両方の形成および／または生理学的機能を阻害する。
体液中のＣ５ａおよびＣ５ｂの濃度および／または生理活性は、当業界で周知の方法により測定することができる。Ｃ５ａについては、このような方法としては、走化性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡが挙げられる（例えば、Ward and Zvaifler, 1971: Jose et al., 1990; Wurzner et al., 1991を参照されたい）。Ｃ５ｂについては、本明細書において論述する溶血アッセイまたは可溶性Ｃ５ｂ〜９のアッセイを用いることができる。当業界で公知のその他のアッセイも用いることができる。これらの、またはその他の好適なタイプのアッセイを用いて、１）本発明の実施に有用な化合物を同定するため、および２）そのような化合物の適切な用量レベルを決定するために、候補であるＣ５ブロッカー（現在知られているもの、または後に同定されるもの）をスクリーニングすることができる。実施例２、４、および６〜８は、モノクローナル抗体を含むＣ５ブロッカーを用いる溶血アッセイおよび可溶性Ｃ５ｂ〜９アッセイの使用を説明する。
Ｃ５ａに影響を与えるブロッカーは、好ましくは、患者の少なくとも１つの血液由来体液、例えば、血液、血漿または血清中の補体の活性化の後に、その体液中に存在するＣ５ａレベルの実質的な減少（すなわち、少なくとも約２５％の減少）を与える濃度で用いる。あるいは、これらは、炎症を起こしている関節の滑液中に存在するＣ５ａレベルの少なくとも約１０％の減少を与える濃度で用いる。
同様に、Ｃ５ｂに影響を与えるブロッカーは、好ましくは、患者の少なくとも１つの血液由来体液中の補体の活性化の後に、その体液中に存在するＣ５ｂレベルの実質的な減少（すなわち、少なくとも約２５％の減少）を与える濃度で用いる。あるいは、これらは、炎症を起こしている関節の滑液中に存在するＣ５ｂレベルの少なくとも約１０％の減少を与える濃度で用いる。Ｃ５ｂの場合には、このような濃度は、液中に存在する補体の細胞溶解能（例えば、溶血活性）または液中に存在する可溶性Ｃ５ｂ〜９のレベルを測定することにより、好都合に決定することができる（例えば、以下の実施例６を参照されたい）。したがって、Ｃ５ｂに影響を与えるＣ５ブロッカーの好ましい濃度は、患者の血液由来体液の少なくとも１つに存在する補体の細胞溶解能の実質的な減少（すなわち、少なくとも約２５％の減少）をもたらす濃度である。患者の体液中に存在する補体の細胞溶解能の減少は、当業界で周知の方法により測定することができ、例えば、Kabat and Mayer, 1961の１３５〜１３９頁に記載されている溶血アッセイのような従来の溶血アッセイ、または以下に記載するニワトリ赤血球溶血法のようなそのアッセイ法の従来の変法が挙げられる。
好ましいＣ５ブロッカーは、比較的特異的であり、初期の補体成分の機能をブロックしないものである。特に、このような好ましい物質は、体から外来粒子および物質を除去する手段を提供する、補体成分Ｃ３ｂに付随するオプソニン化機能を実質的に妨害しないものである。
Ｃ３ｂは、Ｃ３の切断によって生成されるが、これは、古典的および／または第二Ｃ３コンベルターゼにより行われてＣ３ａおよびＣ３ｂの生成がもたらされる。したがって、Ｃ３ｂに付随するオプソニン化機能を妨害しないためには、好ましいＣ５ブロッカーは、患者の体液（例えば、血清）中における補体成分Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断に実質的に干渉しない。Ｃ３の切断へのそのような干渉は、Ｃ３コンベルターゼの作用により等モル比で産生される体液中のＣ３ａおよび／またはＣ３ｂレベルを測定することにより、検出することができる。このような測定は、Ｃ５ブロッカーにより切断が干渉を受けた場合、Ｃ３ａおよびＣ３ｂレベルが（Ｃ５ブロッカーなしのマッチングした試料と比較して）減少するので、有益である。
実際には、このような切断の定量的測定は、一般的には体液中のＣ３ａレベルの測定によって行う方が、体液中のＣ３ｂレベルの測定よりも正確である。これは、Ｃ３ａは液相に残るのに対し、Ｃ３ｂは迅速に排除されるためである。体液中のＣ３ａレベルは、例えば、Quidel Corporation, San Diego, CAから市販されているＣ３ａ  ＥＩＡキットを製造者の説明書にしたがって使用すること等のような、当業界で周知の方法により測定することができる。特に好ましいＣ５ブロッカーは、このようなアッセイで試験した場合、補体活性化の後に体液中のＣ３ａレベルに実質的に全く減少を起こさない。
好ましいＣ５ブロッカー物質としては、抗体が挙げられる。抗体は、好ましくはモノクローナルであるが、従来の技術により作成してスクリーニングすることができるポリクローナル抗体も、望ましい場合には用いることができる。補体成分Ｃ５と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するハイブリドーマは、免疫原として補体成分Ｃ５、Ｃ５ａ、および／またはＣ５ｂを（好ましくは精製形態で）用いて、得ることができる。
最も好ましい抗体は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂを形成するＣ５の切断を防止し、したがってＣ５ａに付随するアナフィラトキシン活性の生成を防止し、かつ、Ｃ５ｂに付随する膜侵襲複合体の会合を防止する。上記で考察したように、特に好ましい態様においては、これらのＣ５ブロッカー抗体は、Ｃ３ｂの作用に付随するオプソニン化機能を妨害しない。
一般的な動物の免疫法（この場合、Ｃ５、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂを用いる）、抗体産生細胞の単離、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成するためのこのような細胞と不死化細胞（例えば、ミエローマ細胞）との融合、分泌されたモノクローナル抗体と所望の抗原（この場合、免疫原または免疫原を含有する分子）との反応性についてのハイブリドーマ上清のスクリーニング、ハイブリドーマ上清または腹水中でのこのような抗体の大量調製、およびこのようなモノクローナル抗体の精製および保存は、多数の文献に見い出すことができる。それらとしては、以下のものが挙げられる：Coligan他編、Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell and Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991; Montz, et al., Cellular Immunol. 127:337-351, 1990; Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991;およびMollnes, et al., Scand. J.Immunol. 28:307-312, 1988。
好ましい結合特性を有するマウス抗ヒトＣ５モノクローナル抗体の調製の説明を、以下の実施例８に記載する。Wurzner, et al., 1991には、Ｎ１９−８およびＮ２０−９と呼ばれる他の好適なマウス抗ヒトＣ５モノクローナル抗体の調製が記載されている。
本明細書において用いる場合、「抗体」（単数または複数）という用語は、インビボで産生された免疫グロブリン、ならびにハイブリドーマによりインビトロで産生されたもの、およびこのような免疫グロブリンの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ’調製物）、ならびに組換えにより発現された（工学的）抗原結合タンパクをいい、免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン、「ヒト化」免疫グロブリン、これらの免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、単鎖抗体、および免疫グロブリンに由来する抗原結合ドメインを含むその他の組換えタンパクを含む。本明細書において用いる場合、「モノクローナル」とは、ポリクローナル起源でないあらゆる抗体をいう。
工学的抗体の調製方法を記載する文献としては、直前に列挙したものに加えて、以下のものが挙げられる：Reichmann, et al., Nature, 332:323-327, 1988; Winter and Milstein, Nature, 349:293-299, 1991; Clackson, et al., Nature, 352:624-628, 1991; Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10:239-265, 1992; Haber, Immunol. Rev., 130:189-212, 1992;およびRodrigues, et al., J. Immunol., 151:6954-6961, 1993。ヒトの抗体およびヒト化抗体は、ヒト患者への投与に好ましい。
体液パラメーターの望ましい減少を達成するために、このような抗Ｃ５抗体を、種々の単位用量形態で投与することができる。用量は、特定の抗体によって変化する。例えば、異なる抗体は異なる質量および／またはアフィニティを有し、したがって異なる用量レベルを必要とする可能性がある。Ｆａｂ’フラグメントまたは単鎖抗体として調製された抗体も、同等のネイティブな免疫グロブリンとは異なる用量を必要とすることになる。これは、それらが、ネイティブな免疫グロブリンよりかなり質量が小さく、したがって患者の血液中で同じモル濃度レベルに達するには低い用量を必要とするためである。
ヒト個体のための抗体の用量レベルは、一般的には、１患者の１処置（治療）当たり約０．５mg／kgから約１００mg／kgの間であり、好ましくは、１患者の１処置当たり約１mg／kgから約５０mg／kgの間である。体液濃度については、抗体濃度は、好ましくは約５μg／mLから約５００μg／mLの範囲内である。
その他のＣ５ブロッカーも種々の単位用量形態で投与することができ、その用量も、投与される特定のＣ５ブロッカーのサイズ、強度、およびインビボ半減期によって変化する。
Ｃ５ブロッカーの用量は、投与の方式、治療すべき患者の特定の症状、患者の全体的な健康、状態、体格および年齢、ならびに処方する医師の判断によっても変化する。
医師の判断によるが、典型的な治療処置には、一連の用量が含まれ、これは通常、関与する関節の数、関節の赤み、関節の膨張、関節の運動性、疼痛のレベルなどの臨床的終点の監視にしたがって、望ましい臨床的な結果を達成するのに必要とされるとおりに用量レベルを調整しながら投与される。
投与の頻度も、種々のパラメーターにしたがって調整することができる。それらとしては、臨床的応答、Ｃ５ブロッカーの血漿中半減期、および血液、血漿、血清または滑液のような体液中のブロッカーのレベルが挙げられる。投与の頻度の調整の指針のため、治療の経過中、体液中のＣ５ブロッカーのレベルを監視してもよい。
あるいは、Ｃ５ｂに影響を与えるＣ５ブロッカーについては、患者の１または複数の体液中に存在する補体の細胞溶解能のレベルを監視して、追加的な用量または高いもしくは低い用量が必要かどうかを決定することができる。このような用量は、血液、血漿または血清中に存在する補体の細胞溶解活性の少なくとも約２５％の減少、好ましくは約５０％以上の減少、あるいは炎症を起こしている関節の滑液中に存在する補体の細胞溶解能の少なくとも約１０％の減少を維持するために、必要に応じて投与される。細胞溶解能は、本明細書中に記載するタイプの溶血アッセイにおける溶血パーセントとして測定することができる。本発明の実施において使用されるＣ５ブロッカー（１つまたは複数）による治療の後に体液中に存在する補体の細胞溶解能の１０％、２５％または５０％の減少は、治療後の溶血パーセントが、治療前の溶血パーセントのそれぞれ９０、７５または５０％であることを意味する。更に別の方法においては、用量パラメーターは、血液、血漿または血清中のＣ５ａレベルの実質的な減少、または炎症を起こしている関節の滑液中のＣ５ａレベルの少なくとも１０％の減少を達成するために、必要に応じて調整する。上記で考察したように、Ｃ５ａレベルは、Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991に記載された技術を用いて測定することができる。もちろん、その他の投与プロトコールも、望ましい場合には、医師の決定のとおりに用いることができる。
好ましい態様においては、Ｃ５ブロッカーの投与は、患者が、１つまたは複数の罹患している関節がより膨張し、紅斑化（赤変）した外観を呈するようになる関節炎症の「勃発」を起こした時に開始する。
Ｃ５ブロッカーの投与は、一般的には、非経口ルート、典型的には関節内もしくは血管内注射（例えば、静脈内点滴）または筋内注射のような注射により行う。他の投与ルート、例えば、経口（ｐ．ｏ．）ルートも、望ましい場合には用いてもよく、投与すべき特定のＣ５ブロッカーについては実用的である。
Ｃ５ブロッカーの全身的投与による（局所的投与、例えば、炎症を起こしている関節への関節内注射ではなく）確立した関節炎症の治療のためには、大量の初回用量の投与、すなわち、患者の血清中の溶血活性の実質的な減少を生じるのに十分な単一の初回用量、そして、より好ましくは少なくとも約５０％の減少を生じるのに十分な初回用量の投与が好ましい。このような大量の初回用量に続いて、好ましくは、血清溶血力価の実質的な減少を維持するために必要に応じて漸減させた用量の規則的な反復投与を行う。別の態様においては、初回の用量は局所的ルートおよび全身的ルートの両方で与え、続いて上述のような漸減させた用量の反復的全身的投与を行う。
注射、ｐ．ｏ．、およびその他の投与ルートに好適な処方は、当業界で周知であり、例えば、Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17版（1985）に見い出すことができる。非経口製剤は、無菌的で、非発熱性でなければならず、一般的には生理食塩水、緩衝（例えば、リン酸緩衝）生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース／食塩水、グルコース溶液などの医薬的に有効な担体を含む。これらの製剤は、必要に応じて医薬的に許容される補助物質、例えば、緊張度（tonicity）調節剤、湿潤剤、殺菌剤、保存剤、安定剤などを含有していてもよい。
本発明の製剤は、包装材と、１つまたは複数のＣ５ブロッカーおよび投与モードに適切なように医薬的に許容可能な担体を含有する医薬剤とを含む製造物として販売することができる。包装材は、その製剤が関節炎症の治療の用途のためのものであることを示すラベルを包含し、具体的に関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、狼瘡関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、反応性関節炎，ライター症候群（ライター病）、または関節炎症に関連するその他の疾患に言及してもよい。
本発明を、いかなる方式においても制限することを意図せずに、、以下の実施例において更に十分に説明する。種々の実施例に共通する方法および材料は以下のとおりである。
材料および方法
細胞溶解アッセイ
以下のように行った溶血アッセイを用いて、種々の体液中の補体の細胞溶解能を決定した。ニワトリ赤血球を、ＧＶＢＳ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO、カタログ番号Ｇ−６５１４）中で十分洗浄し、ＧＶＢＳ中に２×１０8／mLに再懸濁した。抗ニワトリ赤血球抗体（抗ニワトリＲＢＣ抗血清のＩｇＧ画分、Intercell Technologies, Hopewell, NJ）を最終濃度２５μg／mLで細胞に添加して、細胞を２３℃で１５分間インキュベートした。細胞をＧＶＢＳで２回洗浄し、５＊１０￥６個の細胞をＧＶＢＳ中に３０μLに再懸濁した。次に、体液試験溶液１００μLを添加し、最終反応混合物の容積を１３０μLとした。本明細書において用いる場合、これらのアッセイにおける血清パーセンテージおよび／または血清投入量への言及は、１００μLの体液試験溶液中の体液（血清、ならびに血液、血漿または滑液のような他の体液を含む）のパーセントを示す。
３７℃で３０分間インキュベーションした後、溶血パーセントを、完全に溶解した対照試料に比較して算出した。溶血は、細胞を遠心して落とし、４１５nmの光学密度として上清中の放出ヘモグロビンを測定することにより決定した。
本発明の実施において用いる１つまたは複数のＣ５ブロッカーによる治療の後の溶血の５０％の減少は、治療後の溶血パーセントが治療前の溶血パーセントの半分であったことを意味する。
実施例において以下に記載する種々の溶血アッセイは、このニワトリ赤血球アッセイを用いて以下の体液投入量で行った。マウス補体活性のアッセイについては、１００μLの体液試験溶液は、５０μLの希釈（ＧＶＢＳ中）マウス血清および５０μLのヒトＣ５欠損血清（Quidel Corporation, San Diego, CA）を含有していた。ヒト補体活性のアッセイについては、体液試験溶液は、種々の濃度のヒト血漿または血清を含有し、最終容積１００μLになるようにハイブリドーマ上清および／またはＧＶＢＳを添加した。実施例８において以下に記載するハイブリドーマ上清のスクリーニングに用いたアッセイについては、各１００μLの血清試験溶液は、５０μLのハイブリドーマ上清および５０μLのＧＶＢＳ中１０％のヒト血清溶液を含有しており、ヒト血清投入量は５％であった。
コラーゲン誘導関節炎症
実施例１、２および３は、１９７０年代以来ヒト関節炎症（特にＲＡ）の動物モデルとして利用されてきたコラーゲン誘導関節炎症系を用いた（例えば、Trentham, et al., 1977; Holmdahl et al., 1986; Boissier et al., 1987; Yoo et al., 1988を参照されたい）。このモデル系は、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した８〜１２週齢の雄のＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスを用いて実施した。
免疫
Elastin Products Company, Inc., Owensville, MOから入手したウシII型コラーゲン（Ｂ−ＣII）を、４℃で一晩撹拌して０．０１M酢酸に４mg／mLの濃度に溶解した。不完全フロイントアジュバント（Difco）に乾燥Mycobacterium tuberculosis Ｈ３７ＲＡ（Difco, Detroit, MI）を２mg／mLの濃度に添加して、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を調製した。Ｂ−ＣII溶液を等量のＣＦＡ中で乳化させ、この乳液の１００μLアリコート（２００μgのＢ−ＣIIおよび１００μgのMycobacteriumを含有する）を、マウスの尾の付け根に皮内注射した。２１日後、同じプロトコールを用いて全てのマウスを再度免疫した。この二次的なＣII再免疫は、主に、免疫したマウスにおける抗ＣII抗体の血清レベルをブーストするのに役立った。ＣII再免疫の後、関節炎症（ＪＩ）の発症および疾患の進行は劇的に上昇し、これは初回免疫から４〜６週間後付近で１以上の足の関節の重症の膨張および赤変を特徴とした。
臨床的評価
再免疫の日を最初に、ＪＩの出現について毎日マウスを検査した。ＪＩの存在は、前足および後足の各々を検査し、測定し、採点することにより決定した。コラーゲン誘導ＪＩ（ＣＩＪＩ）は、１以上の四肢の膨張および紅斑または視認しうる関節の湾曲を特徴とする。罹患した足の各々のＪＩの重症度は、０＝正常、１＝視認しうる赤みおよび膨張、２＝足もしくは関節全体に広がった重症の赤みおよび膨張、または３＝変形した足もしくは強直を有する関節、として採点した。各マウスの４つ全ての足の点数の合計を、総体的な疾患の重症度および進行を評価するためのインデックス（「ＪＩインデックス」）として用いた。
抗補体モノクローナル抗体
マウスＣ５に結合し、それをブロックするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＢＢ５．１（Frei, et al., 1987）から標準法により調製した。このハイブリドーマは、Brigitta Stockinger博士（the National Institute for Medical Research, Mill Hill, London, England）から入手した。マウスＣ８をブロックしないｍＡｂを生成する抗ヒトＣ８ハイブリドーマ、１３５．８は、Peter Sims博士（Blood Research Institute, Milwaukee, WI）から入手した。両抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、ＢＢ５．１または１３５．８の腹水は、それぞれ無胸腺ヌードマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスで得た。ＩｇＧは、プロテインＡアフィニティカラムを用いて、酢酸で溶出して腹水から精製し、続いてＰＢＳに対して透析した。精製抗体は、２８０nmでの吸光度の分光光度測定により定量し、０．２２μmフィルターで滅菌した。
抗体投与
予防的処置については、マウスをランダムにＣ５ブロッカー処理群と対照群とに分け、続いて、抗マウスＣ５  ｍＡｂであるＢＢ５．１、または対照として抗ヒトＣ８  ｍＡｂである１３５．８のいずれかを、１匹当たり７５０μgのｉｐ用量で週に２回与えた。確立したＪＩの治療的処置については、最初のＪＩの発症が観察された後、１０日間、１匹当たり２〜５mgのｉｐ用量で、抗マウスＣ５  ｍＡｂであるＢＢ５．１または抗ヒトＣ８  ｍＡｂである１３５．８を毎日マウスに与えた。抗Ｃ５  ｍＡｂの用量は、１注射当たり２mg〜５mgの範囲内に調整し、望ましいＣ５媒介性溶血活性の減少、すなわち少なくとも５０％の減少が得られることを確実にした。
遺伝的に関連のない個体の体液へのＣ５ブロッカーの投与が大体同等のレベルの補体阻害をもたらす、ヒトでの場合と異なり、マウスにおいては、ある量により溶血活性を減少させるのに必要な抗マウスＣ５  ｍＡｂの用量は、系統に依存する。ＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスにおいて溶血活性を減少させるのに必要な用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて同等の溶血活性の減少を達成するのに必要な用量よりもおよそ４倍高い。
Ｔ細胞刺激アッセイ
屠殺時に動物から採取したリンパ節を、II型コラーゲンに対する特異的Ｔ細胞応答について分析した。Ｔ細胞（５×１０5個）を、平底９６ウェルプレート中で正常ＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスからの５×１０5個のマイトマイシンＣ（５０μg／mL）処理同系脾細胞と共にインキュベートした。ウシII型コラーゲン（Ｂ−ＣII）、ウシＣＩ（Ｂ−ＣＩ）、ニワトリＣII（Ｃ−ＣII）およびオブアルブミンまたはＢＳＡを、２０μg／mLで培養に添加した。培地は、ＲＰＭＩ−１６４０に、５％熱非働化ＦＣＳ、５×１０-5M ２−ＭＥ、１０mMＨＥＰＥＳ緩衝剤、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、および１％ペンストレップ（penstrep）を添加したものであった。培養は、５％ＣＯ2中、３７℃で４日間インキュベートした。収穫する１８時間前、１μciの3Ｈ−チミジンを各ウェルに添加した。結果は、３つ一組のＴ細胞培養から得たcpmとして表した。
抗Ｂ−ＣII抗体の定量
Ｂ−ＣIIで免疫した後、種々の時点でマウスを採血した。血清抗Ｂ−ＣII抗体力価は、以下の実施例８に記載する抗Ｃ５抗体についてのＥＬＩＳＡと同様のＢ−ＣIIについての従来のＥＬＩＳＡを用いて、しかし、プレートのコーティングにはＢ−ＣIIを用いて測定した（同様のアッセイの記載については、Myers, et al., 1989およびSeki et al., 1992も参照されたい）。
組織学的検査
各群のマウスを屠殺して、各マウスの４本全ての脚を、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、３．１％ＨＣｌ、５％ギ酸および７％塩化アルミニウム溶液中で石灰質を除去した。組織試料をパラフィン中に包埋し、５μmの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫蛍光染色には、足を１０％ＥＤＴＡおよび７．５％ＰＶＰを含有する０．１Mトリス溶液中で３日間石灰質を除去し、ＯＣＴ中で−８０℃で凍結した。次に５μmの切片を作成し、１〜５０の希釈率の９ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ（Zymed Laboratories, South San Francisco, CA、カタログ番号６５−６４１１）で染色した。
実施例１
コラーゲン誘導関節炎症の臨床的発症後のＣ５ブロッカー治療の治療的効果
確立したＪＩに対するＣ５ブロッカーの投与の効果を評価するために、マウスを、上述したようにＣＩＪＩの誘導に続いて観察し、同日に容易に検出しうるＪＩ症状の初期の外観（膨張した足関節）を示したマウスを選択して対にした。このような対の各々の一方のマウスを抗Ｃ５ｍＡｂ、ＢＢ５．１で処理し、他方を関連のないｍＡｂ、１３５．８またはＰＢＳのいずれかの対照注射により処理した。Ｃ５ブロッカー処理に有利な結果に潜在的に傾かせるのを避けるために、マッチングした各対において、足炎症の最大の総体的レベルを有する動物をＣ５ブロッカー処理群に入れた。処理は、関節炎症が足炎症として観察された最初の日に開始して、１０日間毎日継続した（１つの場合においては、１対のマウスについて８日間のみ継続した）。これらのマッチングした対に加えて。２匹の対にしていないマウスにも、ＪＩ誘導後、Ｃ５ブロッカー処理した。
処理期間の終わりの対照処理マウスの当初に罹患した関節の組織学的検査により、重度の炎症細胞の浸潤を伴う広範な骨びらん、滑膜の肥厚およびパンヌス形成が明らかになった（図１ｂ）。これに対して、Ｃ５ブロッカー処理群の当初に罹患した関節は、ある程度の滑膜の肥厚および関節のいくつかへの単核細胞浸潤を伴う保存された関節構造を示した（図１ｃ）。対照処理された関節における重度の炎症細胞浸潤は、主に多核細胞（ＰＭＮ、好中球）で構成されていた。驚くべきことに、このようなＰＭＮ浸潤は、Ｃ５ブロッカー処理マウスにおいてはほぼ完全に欠如していた。
ＣＩＪＩの臨床的経過の間、疾患の進行の重要な指標は、更なる四肢の関与である。したがって、処理期間の終わりに臨床的に検出可能なＪＩを有する四肢の数を、治療法の開始前にＪＩ症状を呈していた四肢の数と比較した。各々の罹患した足におけるＪＩの重症度および進行を、「材料および方法」の表題の下に上述したように決定して採点し、各動物の４つ全ての足についての点数の合計を、「ＪＩインデックス」として使用した。各動物の４つ全ての足の厚さも、この実験の期間中測径器を用いて測定し、疾患の進行のこの側面の完全に客観的な評価を提供した。
表１（平均値）および表２（個々の値）に示すように、１０日間の処理の経過中の対照群における新たな四肢の関与には有意な増加が見られるが、一方、炎症を起こしている関節を有するＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスを疾患の発症時からＣ５ブロッカーで処理した場合には、炎症を起こしている関節の数は減少した。新たな四肢の参入に加えて、対照処理動物の当初に罹患した足は、より炎症が悪化したことにより炎症性関節疾患の重症度の進行を示した（図２ａ）。罹患した関節の急性炎症は、最初の数日間は重度の関節膨張および赤みとして観察され、続いて１０日間の期間の終わりには関節変形および強直として観察された。これに対して、Ｃ５ブロッカー治療の経過中には、新たな足は全く関与せず、罹患した関節の大部分において炎症の重症度は沈静化したか、変化しなかった（図２ａ）。
これらの実験の経過中のＣ５ブロッカー処理群および対照処理群の当初に罹患した四肢の足の厚さを、各群についての平均値として図２ｂに示す。図３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄは、対照処理およびＣ５ブロッカー処理動物の各々のマッチングした対の当初に炎症を起こした足のそれぞれについての値を示し、一方、図３ｅは、対にしていないＣ５ブロッカー処理動物の各々の当初に炎症を起こした足のそれぞれについて得られた値を示す（図２ｂの対照処理動物についての平均値と共に示す）。これらの図においては、かっこ内の数字は、特定の動物の命名を示しており、数字の後の文字（２以上の四肢が当初罹患した場合のみ）は、罹患した特定の四肢を示し、最初の文字が前（Ｆ）または後（Ｒ）足、２番目の文字が右（Ｒ）または左（Ｌ）足を表す。
図２および３、ならびに表１および２から分かるように、Ｃ５ブロッカー処理は、Ｃ５ブロッカー処理動物の１匹（マウス＃４）以外の全てにおいて、当初に罹患した関節の炎症を軽減させ（しかし、完全に撲滅しなかった）、更なる足の関与を成功裡に防止した。図２ｂに見られるように、対照処理群の当初に罹患した足の平均厚は、１０日間の期間中に有意に増大したが、Ｃ５ブロッカー処理群における当初に罹患した足の平均厚は、有意ではないものの、減少した。
実施例２
Ｃ５ブロッカーによる予防的処置はコラーゲン誘導関節炎症を防止する
これらの実験においては、Ｃ５ブロッカーの投与を、実験動物のＢ−ＣIIでの再免疫と同時に行った。再免疫の日、マウスは無症状であり、Ｃ５ブロッカー処理群または対照処理群にランダムに分けた。各マウスを、Ｃ５ブロッカー（抗マウスＣ５ｍＡｂ、ＢＢ５．１）または対照処理（抗ヒトＣ８ｍＡｂ、１３５．８）のいずれかで、１匹当たり７５０μg、ｉｐで、週２回処理した。動物は、４週間処理し、その時点で処理を停止した。この研究の結果を、図４および５に示す。
Ｃ５ブロッカーの投与は、ＣＩＪＩの発症を完全に防止した（８匹中、０匹）。Ｃ５ブロッカー処理群の全てのマウスは、処理期間中（そして、２匹の動物については処理停止後追跡した２カ月もの間も）、臨床的疾患の徴候を全く呈さなかった。これに対し、対照処理群の動物の９０％（１０匹中、９匹）が最初のＢ−ＣII免疫の後、４〜６週間までにＪＩを発症した。４〜６週間後に対照処理群およびＣ５ブロッカー処理群の動物に観察されたＪＩの発病率パーセントを、図５ａにプロットした（この図においてＣ５ブロッカー処理群についての値は実際には０％であるが、このセットの動物についてのデータが得られており、提示されていることを示すために、１％を示すグラフがプロットしてあることに留意されたい）。ピーク炎症レベルは、最初のコラーゲン免疫後５週間付近で観察された。図５ｂに示すように、Ｃ５ブロッカー処理群においては血清溶血活性の８０％〜９０％が削減され、一方、対照処理群においては血清溶血活性は正常のままであった。
図４に示すように、対照マウスからの罹患した関節の組織学的検査により、広範な単核細胞ならびに多核細胞浸潤、滑膜の肥厚および拡張する滑膜パンヌスによる骨びらんが明らかとなった（図４ｂ）。これに対し、Ｃ５ブロッカー処理マウスからの調べた関節の大部分においては、炎症過程の徴候は全く観察されなかった。これらのＣ５ブロッカー処理マウスの関節の２〜３は、滑膜のいくらかの亜臨床的な肥厚を示したが、この変化は、視認可能な骨びらんまたは炎症性細胞浸潤を全く伴っていなかった（図４ｃ）。興味深いことに、免疫蛍光染色により、対照処理およびＣ５ブロッカー処理動物の両方の関節において、軟骨表面に沿った抗体の沈着および滑膜でのＣ３活性化が示された。
実施例３
コラーゲンでの免疫に対する体液性および細胞性免疫応答へのＣ５ブロッカー処理の効果
ウシII型コラーゲンによるＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスの免疫後、体液性および細胞性免疫系の両方が活性化される。抗Ｂ−ＣII力価は増加し、Ｃ５ブロッカー処理マウスにおける血清ＩｇＧ抗Ｂ−ＣII力価は、最初のＢ−ＣII免疫後１４、２８および４２日に試験したところ、対照処理マウスのそれらと同等である（図６ａ）。対照処理および抗Ｃ５ｍＡｂ処理マウスの抗Ｂ−ＣII抗体力価は、共にＢ−ＣII再免疫後に有意に上昇し、長期間その結果達したプラトーを保った。
Ｔ細胞応答を研究するために、Ｃ５ブロッカー処理マウスおよび対照処理マウスからのリンパ節細胞（ＬＮＣ）を、Ｂ−ＣII、Ｂ−ＣＩ、Ｃ−ＣII、または培地のみと共に培養した。Ｃ５ブロッカー処理マウスまたは対照処理マウスからのＬＮＣは、Ｂ−ＣII再免疫と同時に動物が受けた処理にかかわらず、同等に、特異的にＢ−ＣIIに応答した。Ｂ−ＣIIと多くの相同な保存領域を共有するＣ−ＣIIもまた、Ｃ５ブロッカー処理マウスまたは対照処理マウスからのＬＮＣと共に培養すると、中程度のＴ細胞応答を誘起した。これに対し、免疫していない齢をマッチングさせたマウスからのＬＮＣは、試験したコラーゲンの全てに対してほとんど応答しなかった（図６ｂ）。
これらの実験から得られたデータ、および実施例１および２のデータは、Ｃ５ブロッカーのインビボ投与はＣＩＪＩの発症および進行を防止すること、およびこの処理はウシII型コラーゲンでマウスを免疫した後に見られる体液性および細胞性免疫応答に干渉しないことを明らかに証明する。コラーゲン特異的Ｔ細胞応答および抗ＣII抗体力価は、両方とも、Ｃ５ブロッカー処理マウスおよび対照処理Ｂ−ＣII再免疫マウスの両方において匹敵するものであった。
実施例４
補体活性のＣ５ブロッカーによる阻害
補体活性化に対するＣ５ブロッカーの効果を、ヒト血液の体外循環のための閉環（closed-loop）心肺バイパス（ＣＰＢ）モデルを用いて評価した。１９９４年３月２３日出願の係属中の米国特許出願第０８／２１７３９１号に十分に考察されているように、ヒト血液の体外循環は、血液中の補体の活性化を引き起こす。
このＣ５ブロッカーは、精製ヒトＣ５タンパクに対してマウスで生成させたモノクローナル抗体（Wurzner, et al., Complement Inflamm., 8:328-340, 1991; ｍＡｂ  Ｎ１９−８）であり、増殖させ、マウス腹水から回収し、ＩｇＧ画分として精製したものであった（Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992）。
これらの実験を行うために、健康なヒト供血者からヒト全血３００mLを採取し、更に１mLの試料を後の解析のための対照試料として採取した。この血液を、１０U／mLヘパリンを含有するリンゲル乳酸溶液の添加により６００mLに希釈した。希釈した血液に、Ｃ５ブロッカー（無菌的ＰＢＳ中、３０mg）を添加して、最終濃度を５０μg／mLとした。対照実験においては、同量の無菌的ＰＢＳを希釈血液に添加した。次に、この血液を用いてＣＯＢＥ  ＣＭＬ  ＥＸＥＬ  膜オキシゲネーターＣＰＢ機（Cobe BCT, Inc., Lakewood, CO）の体外サーキットのプライミングを行い、サーキットを開始した。サーキットは２８℃に冷却し、６０分間循環させた。次いで、サーキットを３７℃に暖め、更に３０分間循環させた。そして実験を終了した。いくつかの時点で試料を採取し、補体活性について評価した（図７）。
各時点で全血のアリコートを採取し、３つの試料に分け、Ａ）として、上述の米国特許出願第０８／２１７３９１号に考察されているように血小板および血液細胞活性化パラメーターを評価するために２％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで１：１に希釈し、Ｂ）として、遠心して全ての細胞を除去し、血漿をQuidel試料保存溶液（Quidel Corporation, San Diego, CA）で１：１に希釈して、−８０℃で保存し、その後、これらの凍結した希釈血漿試料を融解し、Ｃ３ａおよびＣ５ｂ〜９生成について評価するために用い（それぞれ実施例５および６）、そしてＣ）として、遠心して全ての細胞を除去し、希釈していない血漿を−８０℃で保存し、その後、これらの凍結した血漿試料を融解し、上述のように溶血アッセイを行った。
図７に見られるように、体外サーキットへのＣ５ブロッカーの添加は、血漿中の補体の細胞溶解能の９５％減少をもたらした。補体活性は、実験の間中（９０分間）を通じて阻害され続けた。
実施例５
Ｃ５ブロッカーの存在下でのＣ３ａの生成
ＣＰＢサーキットの後にQuidel試料保存溶液で希釈しておいた新鮮凍結血漿試料（実施例４）を、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃ３ａ  ＥＩＡキット（Quidel Corporation, San Diego, CA）を用いて補体切断生成物Ｃ３ａの存在についてアッセイした。これらの測定は、製造業者の説明書にしたがって行った。放出されたＣ３ａは、既知の量のヒトＣ３ａを含有する試料から作成した標準曲線に比較して決定したとおりに、ng／ウェルとして表す。
図８に見られるように、Ｃ５ブロッカーの添加は、ＣＰＢ実験の間中、Ｃ３ａの生成に何ら影響を与えなかった。Ｃ３ａ生成は、実験の最後の３０分間の間に劇的に増大し、試料の加温と相関した。
実施例６
Ｃ５ブロッカーによるＣ５ｂ〜９生成の防止
ＣＰＢ循環の後にQuidel試料保存溶液で希釈しておいた新鮮凍結血漿試料（実施例４）を、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃ５ｂ〜９キット（Quidel Corporation, San Diego, CA）を用いてヒト最終補体複合体Ｃ５ｂ〜９の存在についてアッセイした。各試料中の可溶性Ｃ５ｂ〜９（ｓＣ５ｂ〜９）の量は、製造業者の説明書にしたがって決定し、任意の吸光度単位（ＡＵ）で表す。
図９に見られるように、Ｃ５ブロッカーは、体外循環の間、Ｃ５ｂ〜９の生成を完全に阻害し、実験実行中の全期間にわたってｓＣ５ｂ〜９のレベルは対照（ｔ0）の時点と同等であった。この実験の結果ならびに実施例４および５の結果は、体外循環を受けているヒト血液に対するＣ５ブロッカーの添加が補体溶血活性（図７）およびＣ５ｂ〜９生成（図９）の両方を効果的に阻害するが、Ｃ３ａ生成（図８）を阻害しないことを示す。
実施例７
ｍＡｂ  Ｃ５ブロッカーの薬物動態学
ｍＡｂ  ＢＢ５．１およびｍＡｂ  ＢＢ５．１のＦａｂ’フラグメント（標準法により調製したもの）のインビボでの作用の持続時間を、Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEから入手した正常雌ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（各々平均約２０g）を用いて決定した。マウスに、ｍＡｂまたはｍＡｂのＦａｂ’フラグメント（または対照として等量のＰＢＳ）を単一の静脈内注射により与えた（３５mg／kg体重）。ＰＢＳ投与後、１、４、２４、９６および１４４時間；ｍＡｂ  ＢＢ５．１のＦａｂ’フラグメント投与後、４、１６および２４時間；そしてインタクトなｍＡｂ  ＢＢ５．１の投与後、４、２４、４８、７２、９６および１４４時間の時点に、後眼窩叢（retroorbital plexus）から血液試料を採取した。
図１０ａは、インタクトなｍＡｂ、そのＦａｂ’フラグメント、またはＰＢＳのインビボ投与後の、（上述のとおりに、血液から得て溶血アッセイにおいて２．５％に希釈した血清を試験することにより決定した）マウス血液中の補体の細胞溶解能の阻害のタイムコース（経時変化）を示す。この図に示すように、インタクトなｍＡｂは、６日間の試験期間の間中を通して、血液の溶血活性をほぼ完全に阻害した。しかし、そのＦａｂ’フラグメントは、およそ２４時間の半減期を有していた。
上記の実験に加えて、６日間の試験期間の終わりに、全てのマウスを屠殺した。腎臓、肺および肝臓を採取して、肉眼検査により検査し、また、染色切片の顕微鏡検査を行った。Ｃ５ブロッカー処理動物の全ての器官は、ＰＢＳ対照動物から採取したものと同じ外観であった。これらの試験マウスおよび対照マウスの総体的な外観は、剖検の前にも区別できないものであった。
抗ヒトＣ５  ｍＡｂは、上で実施例４に記載したように循環中のヒト血液中での薬物動態学的特性についても試験した。そこに記載したように、このＣ５ブロッカーの溶血阻害効果を、９０分間の循環の期間にわたってアッセイした。これらのアッセイの結果を、図１０ｂに図示し、Ｃ５ブロッカーが９０分間の循環の期間全体を通してヒト血液の細胞溶解能を実質的に完全に阻害したことを示す。
これらの実験の結果は、これらのＣ５ブロッカーはかなりの期間にわたって血流中で生き延び、したがって周期的な投与が実際的となることを明らかにする。
実施例８
Ｃ５ブロッカーの調製
本発明の実施における用途のために好適なＣ５ブロッカー  ｍＡｂは、以下のようにして調製した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＣ５タンパク（Quidel Corporation, San Diego, CA、カタログ番号Ａ４０３）を腹腔内注射することにより、３回免疫した。最初の注射物は、完全フロイントアジュバント乳剤中にＣ５タンパク１００μgを含有しており、２回目の免疫剤は、不完全フロイントアジュバント乳剤中にＣ５タンパク１００μgを含有しており、そして、３回目の免疫剤は、ＰＢＳ中の１００μgのタンパクであった。マウスには、大体２カ月の間隔で注射した。
ハイブリドーマを生成するための脾細胞とミエローマ細胞との融合は、基本的にCurrent Protocols in Immunology（John Wiley & Sons, New York, 1992 ２．５．１〜２．５．１７頁）に記載されているように行った。融合の１日前に、マウスを１００μgのＣ５タンパクで静脈内経路により追加免疫した。融合の日、免疫したマウスを殺して、脾臓を取り出した。融合の相手として、ＳＰ２／０−ＡＧ１４ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＃１５８１）を用いた。ＳＰ２／０−ＡＧ１４の培養は、活発な細胞分裂を誘発するために融合の前日に分割した。融合に際して、１：１０（ミエローマ細胞：脾細胞）の比を用いた。
細胞は、カルシウムを含まないＰＢＳ中のＰＥＧ１４５０（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、カタログ番号Ｐ−７１８１）を用いて融合し、１ウェル当たり１〜２．５×１０5個の細胞をプレーティングした。１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＧＰＳ）；およびＨＡＴ（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、カタログ番号Ｈ−０２６２）を添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３００培地（JRH Biosciences, Lexena, KS、カタログ番号１４３３７−７８Ｐ）中での選択を、翌日に開始した。次に、融合物に新鮮なＦＢＳ、ＧＰＳおよびＨＡＴ添加培地を１日おきに与えた。選択開始後、細胞死は２日目には早くも見られ、生存可能な細胞の塊は、５日目には早くも見られた。ＨＡＴ中で選択を続けて２週間後、その後の研究のために選んだ生存ハイブリドーマを、ＦＢＳ、ＧＰＳおよびＨＴ（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、カタログ番号Ｈ−０１３７）を添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３００培地に１週間移し、次に、ＦＢＳおよびＧＰＳを添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３００培地中で培養した。
融合から１０〜１４日後、Ｃ５との反応性および補体媒介性溶血の阻害についてハイブリドーマをスクリーニングし、ハイブリドーマは、少なくともスクリーニングの結果を解析するまでは保持した。溶血の阻害についてのスクリーニングは、上述のとおりのニワトリ赤血球溶解アッセイであった。Ｃ５反応性についてのスクリーニングはＥＬＩＳＡであり、これは以下のプロトコールを用いて行った。
炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．５中のＣ５（Quidel Corporation, San Diego, CA）の２μg／mL溶液の５０μLのアリコートを、９６ウェルプレート（Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, Roskilde, Denmark）の各試験ウェル中で４℃で一晩インキュベートした。次いで、各ウェルに洗浄工程を施した（各洗浄工程は、ＴＢＳＴでの３回の洗浄からなっていた）。次に、試験ウェルを、２００μLのブロッキング溶液、すなわちＴＢＳ中、１％ＢＳＡ（ＢＳＡ／ＴＢＳ）を用いて、３７℃で１時間ブロッキングした。更に洗浄工程を施した後、ハイブリドーマ上清の５０μLアリコートを各試験ウェル中で３７℃で１時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。二次（検出）抗体として、ＢＳＡ／ＴＢＳ中、１：２０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧの５０μLを、各試験ウェル中で３７℃で１時間インキュベートし、その後洗浄工程を行った。製造業者の手順に従って、１０mgのｏ−フェニレンジアミン（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、カタログ番号Ｐ−８２８７）を２５mLのリン酸−クエン酸緩衝液（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、カタログ番号Ｐ−４９２２）中に溶解し、この基質溶液５０μLを各ウェルに添加して、ペルオキシダーゼ活性の検出を可能にした。最後に、ペルオキシダーゼ検出反応を停止するために、各ウェルに３N塩酸の５０μLアリコートを添加した。ハイブリドーマ上清中のＣ５反応性抗体の存在は、４９０nmでの分光光度計によるＯＤ測定により読みとった。
５Ｇ１．１と名付けたハイブリドーマの上清は、ＥＬＩＳＡで陽性を示し、ニワトリ赤血球溶血アッセイにおいて正常ヒト血液中に存在する補体の細胞溶解能を実質的に減少させた。更に解析することにより、５Ｇ１．１抗体は、正常ヒト血液中に存在する補体の細胞溶解能を非常に効率的に減少させるので、溶血アッセイにおいてヒトＣ５のモル濃度のおよそ半分の濃度で存在する場合でさえ、血清溶血活性をほぼ完全に中和することができることが明らかになった。
ハイブリドーマ５Ｇ１．１は、１９９４年４月２７日にAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, United Statesに寄託され、識別番号ＨＢ−１１６２５を与えられている。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（１９７７）に基づいてなされたものである。
本明細書を通じて種々の刊行物および特許の開示が引用されている。これらの教示および開示は、その全体にわたって、本発明が属する分野の技術水準をより十分に説明するために、参照により本明細書に包含されるものとする。
本発明の好ましい態様およびその他の態様を、本明細書において説明したが、以下の請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲を逸脱することなく、当業者は更なる態様を企図することができる。
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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