(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身循環を通じて投与される、疼痛の治療用製薬学的組成物の製造のための接合体の使用であって、該接合体が、
２００〜４０，０００ダルトンの公称平均分子量を有するポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーであるポリマーに共有結合したペプチドを含有する実質的に親水性のポリマー−ペプチド接合体であって、該ペプチドがビファリン又は［Ｄ-Ｐｅｎ2、Ｄ-Ｐｅｎ5］エンケファリン（ＤＰＤＰＥ）である実質的に親水性のポリマー−ペプチド接合体である接合体の使用。
【請求項２】
２００〜４０，０００ダルトンの公称平均分子量を有するポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーであるポリマーと、オピオイドペプチドとの間の実質的に親水性のポリマー−ペプチド接合体の使用であって、上記オピオイドペプチドが、ダイノルフィンとエンケファリンとエンドルフィンとエンドモルフィンとからなる一群から選択され、疼痛治療のために動物の脳にオピオイドペプチドを送達するための製薬学的組成物で動物の血流中に投与される製薬学的組成物を製造するためのポリマー−ペプチド接合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ペプチドとポリエチレングリコール又は実質的に置換可能なポリマーとの接合体と、それを使用する方法とに関する。
【０００２】
背景技術
疼痛並びにアルツハイマー病及びパーキンソン病などの脳疾患を治療する有能な神経医薬品（小分子、ペプチド、タンパク質及びアンチセンス）の発見及び開発はこの１０年間に大きく進歩した。しかし、新たに発見された多数の神経医薬品の全身送達は、送達するための効果的なシステムがないことにより阻害されている。静脈内注射は、脳と血液供給との間の障壁（バリア）（「血液−脳関門」又は「ＢＢＢ」）を超える輸送が不十分であるので、通常有効でない。血液−脳関門は、動物の全身循環から中枢神経系、すなわち、脳組織を分離する連続した物理的障壁である。障壁は、複雑な細胞内密着接合によって連なった微小血管の内皮細胞からなる。この障壁により、脳と血液の間の分子の選択的交換が可能になり、多数の親水性薬物及びペプチドが脳内に流入するのを防止している。強力な新規神経作用医薬品の多数は、分子量が５００ダルトンを超え、親水性であるので、ＢＢＢを超えない。親油性でなく、分子量が５００ダルトンを超える化合物は、一般に、ＢＢＢを超えない。
【０００３】
脳室内注入、神経作用化合物を分泌する遺伝子工作細胞の移植、及び医薬品を含有するポリマーマトリックスの植え込みを含む、分子量が大きく、親油性でない薬物を脳に送達するためのいくつかの方法が開発されている。Pardridge, W. M., J. Controlled Rel., (1996)39:281-286を参照。しかし、これらは全て種々の合併症を併発する可能性がある侵襲的外科的手法を含む。
【０００４】
ＢＢＢを越えるために、(i)トランスメンブラン拡散、(ii)受容体介在性輸送、(iii)吸収介在性エンドサイトーシス及び(iv)担体介在性輸送を含む、４つの非外科的輸送メカニズムが同定されている。Brownless et al., J. Neurochemistry, (1993)60(3):793-803を参照。血管透過性は、高浸透圧のサッカライド溶液及びブラジキニン類似物で密着接合を開放することによって増加することができる。この方法の本質的な問題は、全身循環中の望ましくない化合物が血液−脳関門の人工的に拡大した開口部から脳に流入することがあるということである。
【０００５】
血液−脳関門の毛細血管内皮細胞は高レベルの受容体を有し、該受容体はトランスフェリン、インスリン、インスリン様成長因子I及びII、低密度リポタンパク質及び心房ナトリウム利尿因子の受容体であるということが発見されている。Friden, P.M., J. Controlled Rel., (1996)46: 117-128を参照。Fridenに付与された米国特許第5,833,988号は、トランスフェリン受容体に対する抗体を使用して血液−脳関門を越えて神経医薬品又は診断薬品を送達する方法を記載している。神経成長因子又は神経向性（ニューロトロピック）因子はトランスフェリン受容体特異的抗体に接合される。得られる接合体を動物に投与すると、動物の血液−脳関門を越えて脳に達することができる。
【０００６】
Pardrigeらに付与された米国特許第４，９０２，５０５号は、血液−脳関門を越えて神経ペプチドを送達するキメラペプチドの用途を記載している。受容体特異的ペプチドは、ＢＢＢを越えて神経作用親水性ペプチドを搬送するために使用される。受容体介在性トランスサイトーシスによってＢＢＢを通過できる、開示されている担体タンパク質には、ヒストン、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子I(IGF-I)、インスリン様成長因子II(IGF-II)、塩基性アルブミン及びプロラクチンが挙げられる。Fukutaらに付与された米国特許第５，４４２，０４３号は、血液−脳関門を越えて神経ペプチドを輸送するために、キメラペプチド中に担体としてインスリン断片を使用することを開示している。
【０００７】
ＢＢＢを越えて神経医薬品を送達する非侵襲的方法は、典型的には、薬剤を脳内に実際に流入させる際には侵襲的方法ほど効果的ではない。キメラペプチドは分解されやすいので、望ましい治療効果を得るためには高用量が必要である。血液循環中のキメラペプチド濃度はタンパク質分解によって迅速に低下することがある。水送達系は疎水性薬物を送達するには一般に効果的ではない。
【０００８】
受容体介在性トランスサイトーシスによって親水性化合物を脳内に送達する別の方法は、PardridgeらによってPharm. Res. (1998)15(4):576-582に記載されている。ストレプトアビジンで修飾したトランスフェリン受容体のモノクローナル抗体(OX26-MAb)は、陽イオンタンパク質である、脳由来神経向性因子（ＢＤＮＦ）をＢＢＢを越えて輸送するのに使用される。ＢＤＮＦは、最初にPEG2000-ビオチンで修飾されてBDNF-PEG2000-ビオチンを形成し、次いでストレプトアビジン修飾抗体OX26 MAbに結合される。得られた接合体はＢＢＢを通過して脳内に達することができることが示されている。
【０００９】
動物における抗侵害効果の持続時間を延長すると、鎮痛薬の投与頻度を少なくすることができ、これにより患者のコンプライアンスを改善し、副作用の可能性を低下することができる。MaedaらはChem. Pharm. Bull. (1993)41(11):2053-2054、Biol.Pharm.Bull.(1994)17(6):823-825及びChem. Pharm. Bull. (1994)42(9):1859-1863において、ポリエチレングリコールアミン４０００をLeu-エンケファリンのＣ−末端ロイシン（抗侵害性(antinociception)に必要とされるチロシン残基から離れている）に接続することによって、それらは脳室内注射によって脳に直接投与されるときLeu-エンケファリンの効力を増し、持続時間を延長すると思われる。
【００１０】
従来技術に関連する欠点及び不利益をいくらか低下又は排除する、神経作用剤を全身循環から血液−脳関門を通って脳内に送達する必要性が当技術上存在する。
【００１１】
発明の開示
本発明は、ペプチドをヒト又はヒト以外の動物の脳内に血液−脳関門を越えて送達する方法を提供する。被送達ペプチドは水溶性非ペプチドポリマーに結合されて、接合体(conjugate)を形成する。次いで、接合体が血液−脳関門を通過して脳内に達するように、接合体を動物の血液循環に投与する。水溶性非ペプチドポリマーは、ペプチドに共有結合によって接合するために活性化されたポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーからなる一群から選択されてもよい。
【００１２】
本発明の一実施態様において、輸送可能な鎮痛ペプチド、すなわち、ポリエチレングリコールなどの水溶性の非ペプチドポリマーに共有結合された、血液−脳関門を通過できる鎮痛ペプチドを含有する実質的に親水性の接合体が提供される。本発明の接合体は動物の血液−脳関門を通過できる。
【００１３】
本発明のこの実施態様に使用するのに好適な輸送可能なペプチドには、ダイノルフィン、エンケファリン、エンドルフィン、エンドモルフィン及びビファリンを挙げることができる。典型的には、これらの小型神経ペプチドは生体内の血液循環及び脳内で分解されやすい。一方、ポリエチレングリコール、又は同様の特性を有する同様の非ペプチド非免疫原性水溶性ポリマーに接合すると、これらのペプチドは安定性がかなり高くなる。
【００１４】
本発明の別の実施態様において、上記の本発明の接合体と製薬学的に許容されうる担体を含有する組成物が提供される。組成物は、非経口注射、脳内静脈への注射並びに鼻腔内、肺、眼内及び口腔内投与のような任意の好適な手段によって動物の全身循環に直接投与することができる。
【００１５】
本発明のさらに別の実施態様によると、鎮痛ペプチドを血液−脳関門を越えて動物の脳内に送達する方法が提供される。本発明の方法は、上記の本発明の接合体を提供するステップと、接合体を宿主動物の血流に投与するステップとを含む。
【００１６】
ポリエチレングリコールなどの大型の親水性ポリマーは、血液−脳関門を通過できるペプチドに結合されると、血液−脳関門を通過するペプチドの輸送を妨害すると思われると以前は考えられていた。特に、大型の親水性ポリマーをペプチドに直接接合すると、親水性が増すだけでなく、大型のポリマー鎖による立体障害によってペプチドとＢＢＢの受容体又は他の構造物の相互作用を妨害すると考えられている。
【００１７】
本発明の接合体は実質的に親水性で、水溶性の非ペプチドポリマーを含有するが、接合体は動物の血液−脳関門を通過できるということが本明細書において発見された。未処理の状態と比較すると、水溶性の非ペプチドポリマーに接合されたペプチドは、免疫原性の低下、水溶性の増加及び安定性の増加を示すことができる。特に、本発明によるポリエチレングリコールに接合されたペプチドは，循環時間が長く、代謝分解及び除去を受けにくくなり、血液−脳関門を通過して脳内に一旦送達されると、脳内の半減期が延長される。このように、本発明によりヒト及びヒト以外の動物の脳内に鎮痛ペプチドを効果的に送達することが可能になり、送達されるペプチドの有効性を大きく改善することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される「血液−脳関門を通過する」又は「血液−脳関門を越える」は、動物の血液循環中に生理学的に許容されうる通常の用量が投与されると、脳に治療効果、抗侵害性効果又は予防効果を発揮するのに十分な、又は脳の生物機能に検出可能な程度影響を与えるのに十分な量の接合体又はペプチドが動物の脳内に送達される程度に接合体又はペプチドが動物の血液−脳関門を通過できることを意味する。「血液−脳関門を通過する」又は「血液−脳関門を超える」はまた、引用により本明細書の一部をなす、Williamsら、J. Neurochem., 66(3), pp1289-1299, 1996に開示されているインサイチュー(in situ)脳潅流のような当技術上周知の好適な方法によって検出可能な程度に接合体又はペプチドが動物の脳に取り込まれることができることを意味するために本明細書において使用されることができる。
【００１９】
本発明の接合体は、通常、実質的に親水性である。「実質的に親水性である」という用語は、本発明の接合体が脂肪酸又は糖脂質などの実質的に親油性部分を含有しないことを意味することが意図されている。脂肪酸及び糖脂質は、分子の細胞膜通過性を増すために分子の親油性を高めるために当技術において使用される。
【００２０】
本明細書中で使用される「鎮痛剤」という用語は、ヒトもしくはヒト以外の動物の疼痛を軽減、緩和もしくは防止する目的のために、又はヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的幸福を高める目的のためにヒト又はヒト以外の動物の脳内に送達することが望ましい任意の化学物質を意味する。鎮痛ペプチドは、動物の脳の生物機能に治療効果、抗侵害性効果又は予防効果を発揮するために動物の脳内に導入してもよく、疼痛を治療又は予防するために使用してもよい。
【００２１】
「鎮痛剤」と典型的には考えられない薬剤を本発明のペプチド/ポリマー接合体に接続することができる。例えば、診断薬又は造影剤を本発明の接合体に接続することができる。フルオレセイン、タンパク質又は特定の種類の細胞もしくはモノクローナル抗体などのタンパク質を特異的に標的とする他の種類の薬剤は全て、診断目的又は造影目的のために本発明の接合体に使用することができる。
【００２２】
以下に記載するように、薬剤が血液−脳関門を通過できない、すなわち、ＢＢＢを越えて輸送されない場合には、典型的には、血液−脳関門を通過できる、すなわち、ＢＢＢを越えて輸送されうるペプチドが担体として本発明の接合体に使用される。
【００２３】
本発明の一実施態様において、ペプチドは輸送可能な鎮痛ペプチドである。本明細書中で使用される「輸送可能な」という用語は、ペプチドが上記に規定した動物の血液−脳関門を超えることができることを意味する。このように、ポリエチレングリコールを含む、水溶性の非ペプチド非免疫原性ポリマーに接続された輸送可能なペプチドを含有する接合体が提供される。
【００２４】
「ペプチド」という用語は、動物の脳の状態及び生物機能に影響を与えることができ、各アミノ酸の間にペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を有するアミノ酸２〜約４０からなる任意の重合α−アミノ酸配列を意味する。鎮痛ペプチドは、通常、動物に天然に存在する内因性ペプチド又はその断片もしくは類似体である。しかし、動物の脳の状態及び生物機能に影響を与えることができる非内因性ペプチドも含まれる。
【００２５】
血液−脳関門を通過できると考えられている多数のペプチドが一般に当技術上知られている。本発明によるＰＥＧ化後に血液−脳関門を越えることができると考えられる輸送可能なペプチドの例は、限定されないが、ビファリン、及びダイノルフィン、エンケファリン、エンドルフィン、エンドモルフィン等のオピオイド(opioid)ペプチドが含まれる。これらの輸送可能なペプチドの多数の誘導体及び類似体も本発明を実施する際に使用することができる。
【００２６】
オピオイドペプチドは、本発明を実施するのに特に好適であると考えられている。オピオイドペプチドは、特に疼痛軽減（レリーフ）及び鎮痛を含む、種々の薬理作用を示す。
【００２７】
エンケファリンは、H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH(メチオニンエンケファリン）又はH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH（ロイシンエンケファリン）のアミノ酸配列を有するペンタペプチドである。異なる種類のオピエート受容体に特異的である多数のエンケファリン類似体が同定及び合成されている。例えば、Hruby及びGehrig, (1989) Medicinal Research Reviews, 9(3): 343-401を参照。例えば、米国特許第4,518,711号は、天然のペンタペプチドの第２及び第５アミノ酸残基をシステイン又はＤ−もしくはＬ−ペニシラミン（β,β−ジメチルシステイン）で置換し、ジスルフィド結合で２箇所を接続することによって作製される環状エンケファリン類似体である、ＤＰＤＰＥ、 [D-Pen2, D-Pen5]エンケファリンを含むいくつかのエンケファリン類似体を開示している。ＤＰＤＰＥは血液−脳関門を通過して脳内に達することができると報告されている。例えば、Williamsら、(1996) Journal of Neurochemistry, 66(3): 1289-1299を参照。米国特許第5,326,751号は、ＤＰＤＰＥの第３番目の位置のグリシン残基をアラニン残基で置換することによって作製されるＤＰＡＤＰＥを開示している。両方の特許は、共に引用により本明細書の一部をなす。
【００２８】
他のエンケファリン類似体には、式H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OHを有する２つの単位のＣ末端にヒドラジンをカップリングすることによって作製される二量体化テトラマーである、エンケファリンの合成類似体のビファリン(H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-)2が挙げられる。ダイマー型のエンケファリンはδ-オピオイド受容体に対する親和性及び特異性を増強する。ダイマーエンケファリン類似体は、その内容が引用により本明細書の一部をなすRodbardら米国特許第4,468,383号に開示されている。
【００２９】
ダイノルフィンは別のクラスのオピオイドペプチドである。自然界から単離されるダイノルフィンは１７のアミノ酸を有する。例えば、ダイノルフィン(1〜10)、ダイノルフィン(1〜13)、ダイノルフィン(1〜13)アミド、[D-Pro10]ダイノルフィン(1〜11)(DPDYN)、ダイノルフィンアミド類似体等を含む多数のダイノルフィン断片及び類似体が当技術に提案されている。例えば、引用により本明細書の一部をなす米国特許第4,684,624号、同第4,62,941号及び同第5,017,689号を参照。このような鎮痛ペプチドは、血液−脳関門を通過できるが、それらの多くは、生体内で生物分解を受けやすいので半減期が非常に短い。
【００３０】
ポリエチレングリコールは通常は、分子量が大きく、親水性であっても、親油性部分が存在しない場合に輸送可能なペプチドに接合してもペプチドの輸送性を妨害しない。接合されたペプチドも血液−脳関門を超えることができる。典型的には、動物の全身循環に投与すると、ポリエチレングリコール又は均等なポリマーに接続された輸送可能なペプチドを含有する、本発明の接合体は、未接合形態のペプチドと比較したとき、はるかに高い割合で脳に取り込まれる。本発明の接合体中のペプチドは、安定性が高く、生体内での半減期が長い。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、輸送可能なペプチドである第１のペプチドと、ポリエチレングリコール又は均等なポリマーによって互いに接続された第２の神経作用剤を含有する接合体が提供される。この第２の神経作用剤はそれ自体血液−脳関門を超えることができてもできなくてもよい。輸送可能でない神経作用剤を血液−脳関門を越えて動物の脳内に輸送するために、輸送可能なペプチドを担体として使用する。接続ポリマーは、リンカーとして働くだけでなく、接合体の溶解度及び安定性を増し、送達される神経ペプチド及び他の神経作用剤の免疫原性を低下する。
【００３２】
本発明によると、輸送可能なペプチド及び必要に応じて、上記の別の神経作用剤は水溶性の非ペプチドポリマーに共有結合されて、本発明の接合体を形成する。本発明の種々の態様に使用するのに好適な水溶性の非ペプチドポリマーには、ポリエチレングリコール、他のポリアルキレングリコール、及びポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーが挙げられる。
【００３３】
本明細書中で使用される「ポリプロピレングリコール（「ＰＥＧ」）という用語は包括的であり、一般式、
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
（式中、nは約１０〜２，０００である。）を有する一連のポリマーのいずれかを意味する。ＰＥＧはまた、構造単位、
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
（式中、ｎは約１０〜約２０００である）を言うこともある。このように、ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧを含む修飾ＰＥＧ、別の部分と反応する水酸基以外の少なくとも１つの末端部分を有するＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダント（吊り下げ）ＰＥＧ、フォーク（枝分かれ）ＰＥＧ等を意味する。
【００３４】
本発明を実施する際に有用なポリエチレングリコールは、通常、平均分子量が約２００〜１００，０００ダルトンである。分子量約２００〜１０，０００ が、幾分一般的に使用される。分子量約３００〜８，０００、特に約５００〜約５，０００ダルトンが幾分典型的である。
【００３５】
ＰＥＧは、とても望ましい物性を有し、生物的用途又は生物工学的用途に一般的に認められているので、生物的用途に有用である。ＰＥＧは、典型的には、クリア、無色、無臭、水溶性、耐熱性で、多数の化学物質に不活性で、加水分解又は劣化せず、一般に無毒である。ポリ(エチレングリコール）は生体適合性、すなわち、ＰＥＧは害を生ずることなく生きている組織又は生物と共存することができる。さらに詳細には、ＰＥＧは本質的に非免疫原性であると考えられる、すなわち、ＰＥＧは生体内で免疫応答を生じる傾向がない。ＰＥＧが種々のペプチドに接続することができる末端の望ましい活性基は、評価すべきことに、ＰＥＧの非免疫原性特徴を変えないので、免疫原性作用が回避される。望ましいＰＥＧ接合体は、実質的な免疫応答を生じたり、凝固又は他の望ましくない影響を生じる傾向がない。
【００３６】
ＰＥＧは、タンパク質又はペプチドを酵素消化、免疫系分子及び細胞から隠蔽することができる高度に水和されたランダムコイルポリマーであり、流体力学的容量を増加して細網内皮系（ＲＥＳ）クリアランスを緩徐にすることができる。ＰＥＧは水溶性及び多数の有機溶媒に対する溶解性という特性を有する有用なポリマーである。ＰＥＧの独自の溶解特性により、水溶性の低い化合物との接合（ＰＥＧ化）が可能になり、得られる接合体は水溶性である。しかし、ＰＥＧ分子を別の分子に接合するＰＥＧ化は難点がないわけではない。特定のＰＥＧ誘導体の影響は必ずしも予測できるわけではない。結果は、特定の化合物と機能的な非ペプチドＰＥＧポリマーとの特定の相互作用に依存する。
【００３７】
本発明に使用されるポリマーは、通常、直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。分岐ポリマー骨格は一般に当技術上周知である。典型的には、分岐ポリマーは、中心コア部分と、中心コアに接続した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの、種々のポリオールにエチレンオキサイドを付加することによって作製することができる分岐状で通常使用される。例えば、ペンタエリスリトールから作製される四アーム型分岐ＰＥＧを以下に示す。
C(CH2-OH)4 + nC2H4O→C[CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH]4
【００３８】
中心部分はいくつかのアミノ酸から誘導されてもよい。一例はリジンである。
【００３９】
分岐ポリエチレングリコールは、R(-PEG-OH)n（式中、Ｒはグリセロール又はペンタエリスリトールなどのコア部分を示し、ｎはアームの数を示す。）として一般的な形態で表すことができる。好適な分岐ＰＥＧは、その内容が全体として引用により本明細書の一部をなす米国特許第5,932,462号により作製することができる。これらの分岐ＰＥＧはここに記載の教示により使用することができる。
【００４０】
フォークＰＥＧ及び関連のポリマーは本発明を実施する際に有用であるはずである。「フォーク(forked)」という用語は、少なくとも一方の末端に隣接して分岐するようなＰＥＧを記載するために使用される。ポリマーは、ポリマー鎖の一方の末端部の分岐部分と、別の分子に共有結合するための、分岐部分の各末端部に１つずつの２つの遊離反応性基を有する。各反応性部分は、例えば、反応性基を分岐部分に接続しているアルキル鎖を含む、つなぎ留め基(tethering group)を有してもよい。このように、末端の分岐によりポリマーは２つの分子と反応することができ接合体を形成する。フォークＰＥＧ及び関連のあるフォークポリマーは、1999年3月11日に提出され、発明の名称が「近位反応性基を有するポリ（エチレングリコール）誘導体」である、同時係属出願中の同じ出願人所有の米国特許出願番号09/265,989号に記載されている。この同時係属出願中の特許出願は全体として引用により本明細書の一部をなす。フォークＰＥＧは、分岐末端に接続する骨格が直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。
【００４１】
ＰＥＧ以外の水溶性で、実質的に非免疫原性の非ペプチドポリマーも本発明を実施するのに好適であるはずであるが、必ずしも均等な結果が得られるわけではない。これらの他のポリマーは、直鎖型であっても、分岐鎖型であってもよく、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー等を含む他のポリ（アルキレンオキサイド）が含まれるが、それらに限定されない。例示的なポリマーは、その内容が全体として引用により本明細書の一部をなす米国特許第5,990,237号に掲載されている。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖の上記のポリマーのモノマーに基づいたホモポリマー又はランダムもしくはブロックコポリマー及びターポリマーであってもよい。
【００４２】
好適な追加のポリマーの具体的な例には、ポリ（アクリロイルモルホリン）（「ＰＡｃＭ」）及びポリ（ビニルピロリドン）（「ＰＶＰ」)及びポリ（オキサゾリン）が含まれるが、それらに限定されない。ＰＶＰ及びポリ（オキサゾリン）は当技術上周知であり、その作製は当業者に容易に明らかになるはずである。ＰＡｃＭ並びにその合成及び用途は、その内容が全体として引用により本明細書の一部をなす米国特許第5,629,384号及び同第5,631,322号に記載されている。
【００４３】
ＰＥＧにペプチド、例えば、輸送可能なペプチドを接続して本発明の接合体を形成するためには、ペプチドのある部分と反応するための反応性基を末端に有するＰＥＧ誘導体を作製するためにＰＥＧを「活性化する」必要があることが多い。活性化された多数のＰＥＧ誘導体が当技術上記載されており、全て本発明に使用することができるが、均等の結果が必ずしも得られるわけではない。このような活性化誘導体の一例はスクシンイミジルスクシネート「活性エステル」、
CH3O-PEG-O2C-CH2CH2-CO2-NS
（式中、ＮＳは、下記の構造を有する。）
【化１】
0004027663.tif 000002
【００４４】
スクシンイミジル活性エステルは、タンパク質及び他の分子のアミノ基と迅速に反応してアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成するので、有用な化合物である。例えば、Davisらに付与された米国特許第4,179,337号は、この誘導体をタンパク質（PRO-NH2と示す。）に接続することを記載している、
mPEG-O2CCH2CH2CO2NS + PRO-NH2 →mPEG-O2C-CH2CH2-CONH-PRO
【００４５】
当技術上周知の他の活性化ＰＥＧ分子には、反応性シアヌル酸塩化物部分を有するＰＥＧ、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、ＰＥＧのフェニルカルボネート、ＰＥＧのイミダゾリルホルメート誘導体、ＰＥＧ−カルボキシメチルアジド、ＰＥＧ−イミドエステル、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧの活性エチルスルホン誘導体、ＰＥＧのトレシレート、ＰＥＧ−フェニルグリオキサール、アルデヒド基で活性化したＰＥＧ、ＰＥＧ−マレイミド、末端アミノ部分を有するＰＥＧ等が挙げられる。これらのポリエチレングリコール誘導体及びこのような誘導体を薬剤に接合する方法は一般に当技術上周知であり、その全てが引用により本明細書の一部をなす、Use of Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biochemical Applications, J. M. Harris編、Plenum Press、ニューヨーク(1992)のZalipskyら、Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycol)s for Modification of Polypeptides、及びZalipsky, Advanced Drug Reviews(1995) 16: 157-182に記載されている。
【００４６】
典型的には、本発明により水溶性の非免疫原性ポリマーをペプチドに接合すると、ポリマーとペプチドの間に結合が形成される。「結合」という用語は、化学反応の結果として普通に形成される基又は結合に言及するために本明細書において使用される。
【００４７】
本発明を実施する際に形成される共有結合は加水分解を受けずにいられる。結合は、水溶液中で実質的に安定であり、生理的条件下の有用なｐＨにおいて長時間、好ましくは、無限に水と反応しない。又は、共有結合は、好ましくは動物の脳内に送達された後に、神経作用剤が動物の生体内でＰＥＧから放出されることができるように、生理的条件下において加水分解により分解可能となり得る。
【００４８】
送達される薬剤が生理的条件下においてより複雑な薬剤の分解によって放出される方法は、薬物送達の強力な要素である。R. B. Greenwald, Exp. Opin. Ther. Patents, 7(6): 601-609(1997)参照。例えば、本発明の接合体は、生理的条件下において分解可能な結合を使用して、ＰＥＧを輸送可能なペプチド及び/又は神経作用剤に接続することによって形成することができる。ＰＥＧ−神経作用剤接合体の半減期はインビボにおいて、ＰＥＧを神経作用剤に接続するＰＥＧ分子の反応性基の種類に依存する。典型的には、ＰＥＧカルボン酸又は活性化ＰＥＧカルボン酸を神経作用剤のアルコール基に反応させることによって形成されるエステル結合は、生理的条件下において加水分解して神経作用剤を放出する。例えば、Zalipsky, Advanced Drug Delivery Reviews, 16: 157-182(1995)を参照。例えば、国際公開公報第96/23794号では、エステル結合を使用してパクリタキセルをＰＥＧに接続し、接続したパクリタキセルを加水分解によって血清中で放出することができることが開示されている。加水分解可能なエステル結合を介してＰＥＧに結合されるジヒドロアルテミシニンの抗マラリア作用も証明されている。Bentleyら、Polymer Preprints, 38(1): 584(1997)を参照。加水分解を受ける好適な結合の他の例には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、ジスルフィド、アセタール、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４９】
典型的には、接合体の分解速度は、動物の脳内に接合体が流入するまでは実質的な分解が生じないようにコントロールされるべきである。未処理の状態の多数のペプチドは血液循環中並びに肝臓及び腎臓などの器官中で実質的な分解を受ける。加水分解で分解可能な結合は、接合体が血液−脳関門に到達するために血流中を循環するのに必要な時間より接合体の半減期が長くなるように形成することができる。ある種の神経作用剤とＰＥＧ誘導体の間に加水分解を受ける好適な結合を決定するにはある程度の実験が必要であり、これは、本願の開示内容を一旦知らされた当業者の能力の範囲内である。
【００５０】
ペプチドとポリマーの間の共有結合は、活性化ＰＥＧなどのポリマー誘導体をペプチドの活性部分と反応させることによって形成することができる。１つ以上のＰＥＧ分子を１つのペプチドに接続することができる。
【００５１】
逆に、輸送可能なペプチド及び／又は他の種類の神経作用剤を含む多数のペプチドを１つのＰＥＧ分子に接続することができる。典型的には、このようなＰＥＧ分子は、ペプチド及び神経作用剤と反応するための多数の反応部分を有する。この目的のために、二官能性ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ及び樹状ＰＥＧを全て使用することができる。いくつかの活性な官能基がポリマーの骨格に配置されている反応性ＰＥＧも合成されている。例えば、数多くの活性基がポリマーの骨格に配置されているリジン−ＰＥＧ接合体が当技術上作製されている。Zalipskyら、Bioconjugate Chemistry, (1993) 4: 54-62を参照。
【００５２】
本発明の一実施態様において、動物の血液−脳関門を通過することができる輸送可能なペプチド又は他の輸送可能な神経作用剤がポリエチレングリコール分子の一方の末端に共有結合され、動物の脳内に送達予定の別の神経作用剤がＰＥＧのもう一方の末端に接続されているダンベル構造を有する接合体が提供される。この他の神経作用剤は輸送可能なペプチドであっても、任意の他の神経作用剤であってもよい。典型的には、それは輸送可能ではなく、本質的に血液−脳関門を通過できない。従って、ＰＥＧ分子の一方の末端の輸送可能なペプチド又は他の薬剤は、輸送可能でない神経作用剤を脳内に送達する担体として作用する。この目的のために、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性ＰＥＧである二官能性ＰＥＧを使用することができる。本明細書中で使用される「二官能性ＰＥＧ」は、各々が別の分子の活性部分と反応することができる２つの活性部分を有するＰＥＧ誘導体を意味する。２つの活性部分はＰＥＧ鎖の２つの末端にあっても、ＰＥＧ鎖分子のフォーク(forked)末端において互いに近接してもよく、その場合には、立体障害を生じるかもしれない。本発明に使用するのに好適な輸送可能なペプチドは上記に記載されており、ダイノルフィン、エンケファリン、ビファリン、エンドルフィン、エンドモルフィン並びにそれらの誘導体及び類似体が含まれるが、それらに限定されない。
【００５３】
本発明の接合体は、疼痛を治療、緩和又は軽減する目的のために動物に投与することができる。動物宿主の例として、ヒト並びにネコ、イヌ、ウシ、ウマ、マウス及びラットを含む家畜などの哺乳類が含まれるが、それらに限定されない。
【００５４】
本発明の接合体は動物に任意の好適な方法で投与することができる。例えば、接合体は、静脈内注射、筋肉内注射又は皮下注射によって非経口的に投与することができる。又は、本発明の接合体は鼻腔内及び肺吸入によって、又は経口及び口腔内投与によって生体内に導入することもできる。好ましくは、注射用量の実質的に全ての接合体が、動物の血液−脳関門に循環する血流に送達されるように静脈内注射が利用される。
【００５５】
接合体は、任意の好適な種類の製剤の形態で注射することができる。例えば、注射用組成物は、水又は生理食塩液、リンガー液を含む溶液などの溶媒中に本発明の接合体を含有する、当技術上周知の任意の方法によって作製することができる。製剤中の他の成分と相溶性の１つ以上の製薬学的に許容されうる担体を製剤に添加してもよい。マンニトール、アルギン酸ナトリウム及びカルボキシメチルセルロースを含む賦形剤を含有してもよい。フェニルエチルアルコールなどの防腐剤、ポリエチレングリコールおよぶアルブミンなどの安定剤、グリセロール、ソルビトール及びグルコースなどの等張剤、溶解助剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムなどの安定性緩衝液、ベンジルアルコールなどの保存剤、デキストロースなどの増粘剤並びに通常使用される他の添加剤などを含む、他の製薬学的に許容されうる成分も製剤に含有することができる。注射用製剤は、凍結乾燥形態などの固形形態で調製することもできる。
【００５６】
本発明の輸送可能なＰＥＧ化ペプチドは、例えば、鼻腔内、口腔内及び経口投与を含む、種々の製剤で投与することができる。ヒト又はヒト以外の動物に投与する接合体の用量は、動物宿主、輸送可能なペプチドの種類及び／又は使用する神経作用剤、投与手段及び動物が罹患している症状に依存して異なる。しかし、特定の状況における好適な用量は、不要な実験を実施しなくても、当業者によって容易に決定され得るはずである。
【００５７】
本発明は、例示目的のためだけに意図され、本発明をどのようにも限定すると考えるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。
【００５８】
実施例１
ＰＥＧ−ダイノルフィンＡの修飾と精製
ダイノルフィンA(1〜11)(H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-NH2)(１．４７mg)を１．５ mlの微小遠心管中で０．２５mlの脱イオン水と０．２５mlの２５mM ＮａＰ, ｐＨ５．８緩衝液に溶解した。試薬、NHS-PEG2K-フルオレセイン(１．０mg)をペプチド溶液に約２倍過剰モル添加した。３０分の反応時間後、０．１ mlの２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４を添加し、反応を室温において３時間進行させた。
【００５９】
NHS-PEG2K-フルオレセインの接合はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）及び質量分析計（ＭＡＬＤＩ）でモニターした。ＰＥＧ−ダイノルフィンＡ接合体の精製は、５mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０から５０mMリン酸ナトリウム、１．５M ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５までの濃度勾配溶出を使用してAmersham/Pharmacia製のHiTrap SP陽イオン交換カラムで５３分実施した。分画を回収し、含有物をＭＡＬＤＩで分析した。これらの分画をプールし、インビボアッセイ時まで凍結保存した。
【００６０】
実施例２
ＰＥＧ−エンドモルフィンの修飾と精製
エンドモルフィンII(H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2, 2.3 mg)を１．１５mlの５mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０に溶解した。エンドモルフィンIIの修飾は、５過剰モルのmPEG2000-SPA(38mg)を添加することによって室温において１．５時間実施した。反応混合物は質量分析計（ＭＡＬＤＩ）で分析して、修飾の程度を求めた。ＭＡＬＤＩは、mPEG2000-SPAとエンドモルフィンIIの反応が完了したことを証明するために使用した。２０００ＭＷＣＯ膜を使用して試料を水で透析し、インビボアッセイ時まで凍結乾燥した。
【００６１】
実施例３
ＰＥＧ−ダイノルフィンA及びＰＥＧ−エンドモルフィンIIのインサイチュー潅流、毛細管枯渇(depletion)、脳抽出及びタンパク質結合研究
ラット脳潅流実験のプロトコールは、アリゾナ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。インサイチュー潅流、毛細管枯渇(depletion)及びタンパク質結合研究は以前に報告されているように実施した（Williams et al., J. Neurochem., 66(3), pp1289-1299, 1996)。ＰＥＧ−ダイノルフィンＡ（PdynA)は、インサイチュー取り込みRBr値が０．３４３±１．８４と非常に高かった。一方、I125ダイノルフィンによるインサイチュー潅流はRBrが約０．９６と非常に高かった。総放射能はその後のＨＰＬＣの溶媒先端で回収され、これは、標識ダイノルフィンＡ(1〜11)は迅速におそらくI125Tyrに分解することを示している。
【００６２】
PdynAの毛細管枯渇(depletion)研究を実施し、放射能の約88%は脳実質ではなく毛細管分画に関連していることを明らかにした。
【００６３】
ＰＥＧ−エンドモルフィンII(Pend)のインサイチュー取り込みは、ペプチドについて以前に報告されている値と同様に、RBr値が０．０５７±０．００８であった。その後の毛細管枯渇(depletion)は、脳内に流入する放射能のうち、３２％は毛細管分画に関連し、６７％は脳実質にあることを示した。
【００６４】
Pendのタンパク質結合は、centrifreeフィルターシステムを使用して研究した。２５，０００dpm Pendの３０％は１％BSA溶液に結合していることが見出された。
【００６５】
主な寄与は、ＰＥＧ化は脳及び血液の酵素安定性を劇的に改善したということである。エンドモルフィン及びダイノルフィンは脳内であっても、又は血中であっても非常に不安定で、その半減期は数分程度である。ＰＥＧ化後、それらの半減期はエンドモルフィンIIでは数時間に延長された。エンドモルフィンIIの場合には、血漿中の半減期は３．２分であり、脳組織は１３分であった。ＰＥＧ化後、それらの半減期は２時間越えるまで延長された。
【００６６】
実施例４
ＰＥＧ−ドキソルビシンのエンドモルフィンIへの接合
エンドモルフィンI(H-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2, 3.0mg, 4.9E-6モル）を、１５０mM ＮａＣｌと５０mM ＤＴＴを含有する１mLの５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ８．２緩衝液に溶解した。４倍過剰モルのTraut's試薬(2.7 mg)を添加し、室温において2時間処理した。チオール修飾エンドモルフィンを、Superdex 30サイズ排除カラム(Pharmacia)を使用してDTT及びTraut's試薬から精製した。修飾エンドモルフィン分画を回収し、凍結乾燥した。
【００６７】
塩酸ドキソルビシン(３．０mg, ５．２E-6モル）を、１５０ mM ＮａＣｌを含有する０．１mlの５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液に溶解した。溶液のｐＨは０．１N水酸化ナトリウムを滴下して８．０に調整した。１０過剰モルのヘテロ二官能性PEG(NHS-PEG2K-OPSS)をドキソルビシン溶液に添加した。反応を室温において２時間進行させた。OPSS- PEG2K -ドキソルビシンを、Superdex 30サイズ排除カラムを使用して未反応のＰＥＧ及び遊離のドキソルビシンから精製した。OPSS- PEG2K -ドキソルビシン分画を回収して、凍結乾燥した。
【００６８】
凍結乾燥した粉末の修飾エンドモルフィンI及びOPSS- PEG2K -ドキソルビシンを５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０に溶解した。等モル量の各溶液を混合し、両者を室温において６時間反応させた。ドキソルビシン- PEG2K -エンドモルフィン接合体はSuperdex 30サイズ排除カラムで精製した。
【００６９】
実施例５
ＰＥＧのＤＰＤＰＥへの接合
３．０mgのＤＰＤＰＥ(Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen)を５mlの無水アセトニトリルに溶解した。２０％過剰モルのＰＥＧ試薬（mPEG-SPA 5K[27.9mg]又はmPEG-SPA 2K[11.1mg])及びトリエチルアミン(０．８μl）をＤＰＤＰＥに添加した。アルゴン雰囲気下で、反応を室温において２日間進行させた。試料を脱イオン水で１５mlに希釈し、凍結乾燥した。ＰＥＧ−ＤＰＤＰＥ粉末を５mlの脱イオン水に溶解し、Superdex 30サイズ排除カラムで精製した。精製した分画をプールし、水で透析し、インサイチュー潅流実験時まで凍結した。
【００７０】
PEG2K-DPDPE及びPEG5K-DPDPEをヨウ素化し、実施例３のように、インサイチュー潅流、毛細管枯渇(depletion)、脳抽出及びタンパク質結合研究において試験した。PEG2K-DPDPE及びPEG5K-DPDPEの両者において脳の取り込みの有意な増加が観察された。これらの化合物の両者において、取り込みの増加は、毛細管内に捕獲されるのではなく、ペプチドが脳内に流入することによると判定された。
【００７１】
実施例６
ＰＥＧのビファリンへの接合
a.   (mPEG2K)2-ビファリン
ビファリン(２１．１mg, ０．０４６mmol)を１５ mlの無水アセトニトリルに溶解し、１６μlのトリエチルアミン（０．１１５mmol, ２．５倍過剰モル）で処理した。同時に、mPEG2K -SPA(１１０mg, ０．０５５mmol, 1.2倍過剰モル）を５mlのアセトニトリルに溶解した。溶解したmPEG2K -SPAを上記のビファリン溶液に徐々に添加し、反応混合物を窒素雰囲気下において室温において６６時間撹拌した。
【００７２】
ジ-ペギル化ビファリン[((mPEG2K)2-ビファリン]及びモノペギル化ビファリン[mPEG2K-ビファリン]を、溶液Ｂの３０％から６０％の濃度勾配を使用した流速１ml/分及び２１５ｎｍＵＶ検出器のVydac C18逆相カラムで未反応のＰＥＧ及び遊離のビファリンから分離した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液で、溶液Ｂは０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液である。
【００７３】
b.   (mPEG5K)2-ビファリン
１１８．７mgのメトキシ-PEG5K-SPA(２．３７４×１０-5モル、１．５倍過剰モル）を３．０ mLの無水アセトニトリルに溶解する。弱いアルゴン気流下において、１０．０mgのビファリン(１．５８３×１０-5 モルの-NH2基）を添加し、次に４．４μLのトリエチルアミン(３．１６６×１０-5モル、２．０倍過剰モル）を溶液に分注する。周囲温度において溶液を終夜撹拌する。
【００７４】
ほぼ乾燥するまで、４０℃において回転式エバポレーターで溶媒を留去し、次いで高真空で5分間さらに乾燥する（真空を適用するとき、液体窒素トラップを使用する）。残渣を１０mLの脱イオン水に溶解する。溶液のｐＨは４．５である。3500 MWCOで事前に水和したSlide-A-Lyzer透析カセット（PIERCE製）に溶液を注入し、３日間２×９００mLの脱イオン水で透析した。
【００７５】
溶液を２mLのDEAE Sepharose カラムにのせる。溶出液を回収する。カラムをさらに１２５mLの脱イオン水で溶出し、溶出液(ｐＨ７．６)を回収する。２つの分画を合わせて、液体窒素で溶液を凍結し、凍結乾燥器で凍結乾燥する。
【００７６】
c.   (mPEG12K)2-ビファリン
１４１．４mgのメトキシ-PEG12K-SPA(１．１８７×１０-5モル、１．５倍過剰モル）を２．０mLの無水アセトニトリルに溶解する。弱いアルゴン気流下において、５．０mgのビファリン−２ＴＦＡ(7.915×10-6モルの-NH2基）を添加し、次に２．２μLのトリエチルアミン(１．５８３×１０-5モル、２．０倍過剰モル）を溶液に分注する。周囲温度において溶液を終夜撹拌する。
【００７７】
乾燥するまで、室温において高真空で溶媒を留去する（真空を適用するとき、液体窒素トラップを使用する）。残渣を１０mLの脱イオン水に溶解する。10000 MWCOで事前に水和した透析カセット（PIERCE製）に溶液を注入し、３日間２×８００mLの脱イオン水で透析した。
【００７８】
溶液を脱イオン水で１８mLに希釈する。溶液を１０mLのDEAE Sepharose カラムにのせる。溶出液を回収する。カラムをさらに９０mLの脱イオン水で溶出する。分画を合わせて、液体窒素で溶液を凍結し、次いで凍結乾燥器で凍結乾燥する。
【００７９】
d.   (mPEG20K)2-ビファリン
２５５．２mgのメトキシ-PEG20K-SPA(１．１８７×１０-5モル、１．５倍過剰モル）を３．０ mLの無水アセトニトリルに溶解する。弱いアルゴン気流下において、５．０mgのビファリン−２ＴＦＡ(７．９１５×１０-6モルの-NH2基）を添加し、次に２．２μLのトリエチルアミン(１．５８３×１０-5モル、２．０倍過剰モル）を溶液に分注する。周囲温度において溶液を終夜撹拌する。
【００８０】
乾燥するまで、室温において高真空で溶媒を留去する（真空を適用するとき、液体窒素トラップを使用する）。残渣を１０mLの脱イオン水に溶解する。10000 MWCOで事前に水和した透析カセット（PIERCE製）に溶液を注入し、３日間２×８００mLの脱イオン水で透析した。
【００８１】
溶液を脱イオン水で２５mLに希釈する。溶液を１５mLのDEAE Sepharose カラムにのせる。溶出液を回収する。カラムをさらに１５０mLの脱イオン水で溶出する。分画を合わせて、液体窒素で溶液を凍結し、次いで凍結乾燥器で凍結乾燥する。
【００８２】
各試料の純度は逆相HPLC及び質量分析計(ＭＡＬＤＩ)で求めた。
【００８３】
実施例７
鎮痛性アッセイ
動物
雄のＩＣＲマウス(２０〜２５g)又は雄のSprague-Dawleyラット(２５０〜３００g)(Harlan Sprague-Dawley Inc., インディアナ州インディアナポリス）をこれらの実験に使用した。動物は、２２±０．５℃に維持し、１２時間の明-暗交互サイクルの動物飼育施設でケージあたり４匹ずつ飼育した。食餌と水は随時与えた。動物は一度だけ使用した。
【００８４】
プロトコール
薬物は全て滅菌生理食塩液に溶解し、５μl(i.c.v.)、１００μl(i.v.)、１００μl(s.c.)及び１００μl(i.m.)の基剤中で適切な用量が送達されるように調製した。ネズミは全て、薬物を注射する前にベースライン潜在値を記録した。試験化合物の鎮痛効果を比較するために、モルヒネ対照をi.c.v.及びi.v.注射手法に使用した。
【００８５】
Ｉ．Ｃ．Ｖ．注射
浅い睡眠状態に入るまで、エチルエーテルを浸したガーゼを入れたジャーにネズミを入れた。ネズミをジャーから速やかに取り出し、外科用メスで1/2"切開し、頭頂部を露出した。正中線の２mm側方、ブレグマの２mm尾側に右側側脳室を位置づけた。この時点において、ハミルトンシリンジ(22G, 1/2")を頭蓋から２mmの位置に配置し、５μlの化合物を注射して送達した。次いで、ネズミを明記した試験時間までケージに戻しておいた。側脳室への化合物の送達を確実に適切にするために、メチレンブルーを注射部位に塗布した。
【００８６】
Ｉ．Ｖ．注射
ネズミを拘束ホルダーに固定し、ネズミの尾を温水を入れたビーカーに入れ、尾静脈の拡張を最大にするためにエタノールで拭いた。静脈を選択し、動かないように固定した。化合物の送達に適切なサイズとして30Gの針を選択した。針を慎重に各マウスの静脈に挿入し、１００μlの量をゆっくり送達した。静脈が体幹方向に白みを帯びていくのは、送達が適切であることを示している。
【００８７】
Ｓ．Ｃ．注射
動かないようにラットを手で押さえた。化合物の送達に適切なサイズとして30Gの針を選択した。針を慎重に各ラットの頚部に挿入し、１００μlの量をゆっくり送達した。
【００８８】
Ｉ．Ｍ．注射
動かないようにラットを手で押さえた。化合物の送達に適切なサイズとして30Gの針を選択した。針を慎重に各ラットの右後脚筋肉に挿入し、１００μlの量をゆっくり送達した。
【００８９】
鎮痛性の試験
ネズミを拘束ホルダーに固定し、尾を放射熱ビームの真下に置いた。ビームのスイッチを入れ、動物がビームの下から尾をピクッと動かすまでの時間を各経過時点において記録した。動物が尾をピクッとさせないで動かした場合には、放射ビーム下での経過時間が5秒未満の場合のみ再試験した。
【００９０】
鎮痛性データの評価
生データ（記録された時間）を、１５秒として求めた可能な影響の最大値の割合（%M.P.E)に変換した。%M.P.E.は以下の等式で求めた、
%M.P.E = （記録された時間−ベースライン）/（15−ベースライン）×100。
【００９１】
次いで、これらの割合から、化合物を%M.P.E対時間で作図することができる。次いで、曲線を分析して曲線下面積（ＡＵＣ）を求めることができる。
【００９２】
ＰＥＧ−ＤＰＤＰＥのｉ．ｃ．ｖ．投与の結果は、ＰＥＧ化はＤＰＤＰＥが鎮痛作用を生ずる作用を妨害しないことを明らかに示している。（図１）さらに、この研究は、親化合物と比較したとき、PEG化化合物の鎮痛作用の延長傾向を示した。
【００９３】
ＰＥＧ−ＤＰＤＰＥの静脈内注射は、ＰＥＧ化化合物は、鎮痛作用を維持するのに十分な量が血液−脳関門を超えることができることを示した。（図２）この研究はまた、ＤＰＤＰＥのＰＥＧ化が鎮痛作用の持続時間を有意に延長することを確認する助けとなった。
【００９４】
ＰＥＧ化ビファリン及びビファリン試料は全てマウスにおいて強力な鎮痛応答を示し、８０〜９０％の最大応答は３０〜４５分に到達した。(mPEG2K)2-ビファリンは鎮痛作用を延長し続け、５０％M.P.E.は、未処理のビファリンの９０分時点と比較して、この研究の４００分時点で見られた。データはまた、PEGの分子量と%M.P.E.の逆の関係を示す。（図３）
【００９５】
マウスにおいてモノペギル化ビファリン(mPEG2K-ビファリン)の鎮痛作用を同じ濃度のジペギル化ビファリン[(mPEG2K)2-ビファリン]と比較すると、mPEG2K-ビファリンの鎮痛作用の持続時間は５０％M.P.E.において(mPEG2K)2-ビファリンのほぼ半分である。（図4）実際、(mPEG2K)2-ビファリンは半分の用量でmPEG2K-ビファリンとほぼ同等の鎮痛作用である。
【００９６】
試験した種々の用量では、ラットにおいて(mPEG2K)2-ビファリンを静脈内投与すると、未処理のビファリンより鎮痛作用がさらに長く持続する。（図５）。皮下又は筋肉内投与によって(mPEG2K)2-ビファリンを投与したラットは、同じ濃度の未処理のビファリンと比較して、鎮痛作用が大きく、持続する。（図６）
【００９７】
実施例８
ＰＥＧ−ＤＰＤＰＥ及びＰＥＧ−ビファリンのインサイチュー潅流研究
ラット脳潅流実験のプロトコールは、アリゾナ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。インサイチュー潅流研究は以前に報告されているように実施した（Williams et al., J. Neurochem., 66(3), pp1289-1299, 1996)。PEG2K-DPDPEは、インサイチュー取り込みRBr値が0.341±0.15と非常に高かった。I125DPDPEのインサイチュー潅流はモノペギル化DPDPEに匹敵し、RBr＝３．５４±０．３０である。I125標識ビファリンはインサイチュー潅流取り込みが７．２６±０．１１であるが、(mPEG2K)2-ビファリンのインサイチュー取り込みは劇的に低く、RBr値２．７０±０．２７であった。
【００９８】
本発明の多数の改良及び他の実施態様は、上記の明細書に示されている教示内容及び関連する図面の利点を有する本発明が関係する当業者に思い浮かばれる。従って、本発明は開示されている特定の実施態様に限定されるべきではないこと、並びに改良及び他の実施態様が添付の請求の範囲内に含まれることが意図されていることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において使用されているが、それらは一般的で説明的な意味においてだけ使用され、限定する目的のために使用されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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