(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別を要する製品（３０）に付着され、かつエリアエレメント（１０）で形成される所定のマーク（３２）を識別する方法であって、以下のステップ：
ａ）第１の核酸を前記エリアエレメント（１０）の第１の部分に結合させて、第１の所定の部分パターンを形成するステップ、
ｂ）前記マーク（３２）を、前記第１の核酸に対する親和性を有する第３の核酸に、該第３の核酸が実質的に第１の核酸にのみ結合する所定の厳格な結合条件の下で接触させて、前記第１および前記第３の核酸を互いに結合させるステップ、および
ｃ）前記第１および第３の核酸間の結合を１段階の検出方法で検出することにより、前記結合された第１および第３の核酸によって形成された前記第１の部分パターンを識別するステップを包含し、
ここで、前記１段階の検出方法は、直接前記製品（３０）上で、洗浄ステップなしに、以下の効果：
供与体／受容体の対の形成または分離
を用いて行なわれ、
前記マーク（３２）を前記製品（３０）から分離させず、該製品（３０）上において直接識別する、方法。
【請求項２】
第２の核酸を前記エリアエレメント（１０）の第２の部分に結合させて、第２の部分パターンを形成するステップを、ステップｂの前に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸は、合成のかつ／もしくは一本鎖の核酸（１４、１６）、またはその類似体を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂにおいて、前記第２の核酸に対する親和性を有する第４の核酸を、前記マーク（３２）に、該第４の核酸が実質的に第２の核酸にのみ結合する所定の厳格な結合条件の下でさらに接触させ、
ステップｃにおいて、前記第２および第４の核酸間の結合を検出して、前記結合された第２および第４の核酸によって形成された部分パターンを識別する、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第３の核酸と、適宜前記第４の核酸とは、溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの他の核酸または前記第２の核酸が前記エリアエレメント（１０）に結合されて、不特定の結合部位を飽和させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２の核酸は、それぞれ、親水性リンカーを介して、前記エリアエレメントのある部分または他の部分に結合される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記親水性リンカーは、以下のグループ、すなわち、ペプチド、ポリエチレングリコール、糖の重合体、ポリアクリルアミド、ポリイミン、またはデンドリマー分子から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記親水性リンカーは、第１または第３の核酸に対して、それぞれ前記第２または第４の核酸と相補関係にない部分において結合される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸の少なくとも１つは、粒子、特にアガロース粒子によって前記エリアエレメント（１０）に結合される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸の少なくとも１つは、印刷技術、特にインクジェット技術によって、エリアエレメント（１０）に付着される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および／または第２の核酸は、その構成の所定の部位において、前記エリアエレメント（１０）に結合される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記部分パターンは、バーコード形式をとる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記部分パターンは、配列形式で設計される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
エリアエレメント（１０）は、丸く設計されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
エリアエレメント（１０）は、１００μｍ未満の直径を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合核酸が有する、変化した光学的特性によって、前記結合は検出される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの前記核酸は、結合時における蛍光特性を変化させる蛍光体（２２）を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記第３および／または第４の核酸を、滴状付着、吸着、吹き付け、または噴霧によって均質的に分散させて前記マーク（３２）に接触させる、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記マークは、１０μｇを超えない量の前記第１の核酸を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法に用いるキットであって、識別を要する製品（３０）に付着させるための担体を含み、
前記担体は、エリアエレメント（１０）で形成される所定のマーク（３２）が、前記担体の一方側に付着され、
第１の核酸は、エリアエレメント（１０）の第１の部分に結合されて、第１の部分パターンを形成し、
前記担体の他方側は粘着剤で塗膜されたシートとして設計されており、
さらに前記キットは前記第１の核酸に対する親和性を有する第３の核酸を含み、
ここで、少なくとも１つの前記核酸は、結合時における蛍光特性を変化させる蛍光体（２２）であって、供与体／受容体の対の形成または分離を用いる蛍光体を有する、キット。
【請求項２２】
前記蛍光体は、分子ビーコンである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記担体の一方側が着脱可能な保護シートで覆われている、請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記粘着層は、他の着脱可能な保護シートで覆われている、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
第２の核酸が、前記エリアエレメント（１０）の第２の部分に結合されて、第２の部分パターンを形成する、請求項２１〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
前記第２の核酸に対する親和性を有する第４の核酸が存在する、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固体に付着され、かつエリアエレメントで形成されるマークを識別する方法、担体、およびキットに関する。本発明は、特に、セキュリティ、コーディング、および識別技術の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ドイツ１９７３８８１６Ａ１は、マーキングのために固体に付着された核酸を固体から抽出または除去することを開示している。核酸を溶解させ、ＰＣＲのような特定の反応によって増殖させる。その後、増殖された核酸の配列は、分析される。この方法は、時間がかかる。マーキングのために付着された核酸を固体ごとに抽出することは、不可能であり、望ましくない。
【０００３】
固体に与えられたマークを識別するための方法が、ドイツ１９８１１７３０Ａ１に開示されている。この場合のマークは、ヌクレオチド配列を有する。ヌクレオチド配列を、検出手段の固体フェーズに結合された、対応ヌクレオチド配列に接触させる。満足の行くハイブリダイゼーションを得るためには、検出手段の固体フェーズをマークに押し付けなくてはならない。これでは、識別は困難なものとなる。
【０００４】
ＵＳ５１３９８１２は、物品に対して偽造防止マーキングを行うために所定の核酸を含むインクを用いることを開示している。複数の物品を区別してマーキングするためには、それぞれ異なる印をインクで与える。このようにして与えられたマークの識別は、所定の核酸に他の核酸を結合させることによって行われる。結合された核酸は、色反応や放射性標識に基づいて視覚化することができる。配列に非特異的な核酸の結合により、マーキングに用いられた配列について知ることなく、マークを明らかにすることができる。この方法は、確実ではない。
【０００５】
ＥＰ０７４５６９０Ａ２は、ハイブリダイゼーションのためのいわゆる分子ビーコンと、その使用とについて説明している。マーク検出のための使用は、この書類には開示されていない。
【０００６】
ＵＳ５８６６３３６は、蛍光体で標識されたプライマーについて説明している。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応によってハイブリダイズされる。ハイブリダイズした状態では、プライマーの再折りたたみは、分離される。それにより、プライマーに与えられる蛍光体の蛍光特性は、変化させられる。既知のこの方法は、多大のコストおよび時間がかかるポリメラーゼ連鎖反応を必要とするので、マークを速やかに識別するには不適切である。
【０００７】
ＤＥ１９９０１７６１は、レドックス電位の変化によってＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出する方法を開示している。このようなレドックス電位の変化は、簡単明瞭には計測できない。既知のこの方法によっては、マークを迅速かつ簡易に識別することはできない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、先行技術の欠点をなくすことにある。特に、固体に付着されたマークの確実な識別を、迅速かつ簡易に行うことができる、他の方法を示すことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
本目的は、クレーム１および２４の特徴により達成される。本発明の好適な展開は、クレーム２〜２３および２５〜２９に明らかである。
【００１０】
本発明は、固体物に付着され、かつエリアエレメントで形成される所定のマークを識別する方法を提供するものであって、以下のステップ、すなわち
ａ）第１の生体高分子をエリアエレメントの第１の部分に結合させて、第１の所定の部分パターンを形成し、
ｂ）マークを、第１の生体高分子に対する親和性を有する第３の生体高分子に接触させて、第１および第３の生体高分子を互いに結合させ、
ｃ）第１および第３の生体高分子間の結合を１段階の検出方法で検出することにより、結合された第１および第３の生体高分子によって形成された第１の部分パターンを識別する。生体高分子は、エリアエレメントに対して、共有結合されてもよいし、または非共有結合で、結合されてもよい。また、エリアエレメント上に直接合成されてもよい。生体高分子は、特異的に結合可能な他の生体高分子に対する親和性を有する。本発明の方法によって、固体物に付着させたマークを確実に識別することができる。特に、マークを製品から分離させる必要なく、製品上において直接識別することができる。
【００１１】
有効な展開として、以下のステップがステップｂの前に行われる。第２の生体高分子をエリアエレメント（１０）の第２の部分に結合させて、第２の部分パターンを形成する。第２の生体高分子が結合されたエリアエレメントを用いることにより、第１の生体高分子が結合されたエリアエレメントが非特異的に識別されることを防止する。適切な条件の下、非特異的な第３の生体高分子を、第１の生体高分子が結合されたエリアエレメントに結合させることが可能である。しかしながら、これらは、他のエリアエレメントにも結合するので、マークの識別はできない。識別は、該当する特異的な第３の生体高分子が既知である場合にしかできない。これにより、本方法は、非常に安全性の高いものとなる。さらに、本方法は、迅速かつ簡易に行える。
【００１２】
生体高分子は、特に合成のかつ／もしくは一本鎖の核酸（１４、１６）、その類似体、抗原、タンパク質、特に抗体、抗体断片、抗体もしくは抗体断片の派生物、または核酸結合タンパク質を含む。タンパク質−タンパク質、核酸−核酸、または核酸−タンパク質の相互作用が、結合の際に生体高分子間に生じてもよい。さらに、各場合において、核酸を核酸類似体に置き換えることも可能である。タンパク質−タンパク質相互作用は、抗体と抗原との間において生じてもよい。抗原は、抗体、抗体断片、又は抗体もしくは抗体断片の派生物によって特異的に結合される、あらゆる分子を含む。抗原は、純粋に合成によって生成されてもよい。生体分子の派生物である必要はない。
【００１３】
有効な展開として、ステップｂにおいて、第２の生体高分子に対する親和性を有する第４の生体高分子をマークにさらに接触させる。ステップｃにおいて、第２および第４の生体高分子の結合を検出して、結合された第２および第４の生体高分子によって形成された部分パターンを識別する。第２の生体高分子の検出は、該当する特異的な第４の生体高分子がわかっている場合にのみ可能である。このような方法は、第１の生体高分子のみを特異的に識別する方法よりも、安全性が高い。結合した第１と第３の生体高分子で形成された部分パターンと、結合した第２と第４の生体高分子で形成された部分パターンとで、明確な差異が生じさせることができる。この目的のために、第３および第４の生体高分子に対して、明確に区別可能なマーキング物質を与えることが可能である。部分パターン間の区別は、結合した第１および第３の生体高分子によって形成された部分パターンのみを検出する場合よりも、はるかに鮮明に行える。これは、部分パターンが非常に小さかったり、狭かったりする場合に、特に有効である。第３の生体高分子と、適宜第４の生体高分子とは、溶液中に存在してもよい。これにより、本方法の実施が確実に簡素化される。
【００１４】
さらに有効な展開として、接触は、所定の厳格な結合条件の下に行われ、好ましくは室温で行われる。厳格な結合条件とは、第３の生体高分子及び適宜第４の生体高分子が、実質的に、親和性を有する生体高分子にだけ結合する条件である。他の生体高分子との非特異的な結合は、実質的には生じない。厳格な結合条件は、適切な温度またはイオン強度によって達成することができる。生体高分子として核酸を用いる場合には、厳格な結合条件は、適切なヌクレオチド配列の選択により、決定することができる。したがって、厳格な結合条件を、特定用途のマーキングに採用することが可能となる。核酸は、そのヌクレオチド配列が大きく異なればより有効である。こうすれば、非特異的なハイブリダイゼーションは、ほとんど生じない。
【００１５】
少なくとも１つの他の生体高分子または第２の生体高分子がエリアエレメント（１０）に結合されて、非特異的な結合部位を飽和させる事は有効である。これにより、第３および／または第４の生体高分子が、エリアエレメントの領域内の下地に非特異的に結合することを防止する。マークを識別する直前に、エリアエレメントの非特異的な結合部位をブロックする必要はなくなる。これにより、本方法をとりわけ非常に迅速に行えるようになる。
【００１６】
ある展開において、第１および第２の生体高分子は、それぞれ、親水性リンカーを介して、エリアエレメントのある部分または他の部分に結合される。親水性リンカーは、以下のグループ、すなわち、ペプチド、ポリエチレングリコール、糖の重合体、ポリアクリルアミド、ポリイミン、またはデンドリマー分子から選ばれる。このようなリンカーを与えることによって、生体高分子が第３の生体高分子および適宜第４の生体高分子に対してより接触しやすくなる。さらに、親水性リンカーは、第１または第３の生体高分子に対して、それぞれ第２または第４の生体高分子と相補関係にない部分において結合されれば好適である。これにより、互いに相補関係にある生体高分子のハイブリダイゼーションが保証される。リンカーは、第１または第３の生体高分子の末端に結合されても有効である。本方法の感度は向上する。さらに、生体高分子の少なくとも１つは、粒子、特にアガロース粒子によって、エリアエレメントに結合されうる。これは、固体表面に生体高分子またはリンカーを直接結合できない場合には、特に有効である。
【００１７】
生体高分子の少なくとも１つが、印刷技術、特にインクジェット技術によって、エリアエレメントに付着されれば、特に有利である。このような方法により、製造工程における、たとえばパッケージのような大量の固体物に自動的に異なるマークを付着させることが可能となる。
【００１８】
さらなる展開において、第１および／または第２の生体高分子は、その構成の所定の部位において、エリアエレメントに結合される。この手法により、第１および／または第２の生体高分子が、第３および第４の生体高分子に結合する結合部位において、エリアエレメントに結合してしまうことを防止することができる。たとえば、抗体の場合、抗原に結合する部位ではなく、ＦC部分でエリアエレメントに結合することが重要である。所定の結合は、プロテインＡまたはプロテインＧでエリアエレメントを被膜することによって、達成することができる。これらのタンパク質は、接触した抗体のＦC部分に特異的に結合する。
【００１９】
部分パターンは、バーコード形式をとってもよい。部分パターンを配列形式で設計したら有効である。エリアエレメントを丸く設計して、好ましくは、１００μｍ未満の直径を有するようにしてもよい。
【００２０】
さらなる発展において、結合生体高分子が有する、変化した光学的および／または電気的特性によって、結合は検出される。光学的特性は、たとえば、特定の波長の光を吸収する能力である。結合によって吸収能力が変化すると、色の変化が生じることがある。電気的特性は、たとえば、伝導性である。変化した特性による検出は、化学的または生化学的検出反応を必要としない。結合された生体高分子を固体物から抽出または除去することは必要でない。識別は、簡易かつ迅速に行われる。
【００２１】
少なくとも１つの生体高分子は、結合時における蛍光特性を変化させる蛍光体を有してもよい。このような生体高分子は、たとえば、ＥＰ０７４５６９０Ａ２に開示されたいわゆる分子ビーコンの形態に設計されてもよい。そのような分子が適切な相補核酸に結合することにより、その蛍光が著しく向上する。蛍光は、結合直後に検出することができる。結合した生体高分子は、マーキング物質を適切に選べば、裸眼でも認識することができる。
【００２２】
さらに、少なくとも１つの生体高分子は、結合時におけるレドックス電位を変化させるマーキング物質を有することも可能である。そのような生体高分子の結合は、適切な電位によって、検出できる。
【００２３】
好ましい展開において、第３および／または第４の生体高分子を、滴状付着、吸着、吹き付け、または噴霧によって均質的に分散させてマークに接触させる。このような方法は、実施するのが非常に簡単であるという利点を有する。第３および／または第４の生体高分子は、溶液の状態で、たとえばスプレー缶から、マークに吹き付けることができる。その後、短時間で、特異的に結合した生体高分子を検出することができる。
【００２４】
１段階の検出方法は、好適には、洗浄ステップなしで行われる方法である。さらに、１段階の検出方法は、以下の効果、すなわち、供与体／受容体の対の形成または分離、表面プラズモン共鳴、重量差、および介在物の包含または放出、のうちの１つを用いて行なわれてもよい。供与体／受容体の対の形成または分離を用いれば、特に効果的である。このような効果は、例えば、分子ビーコンを用いれば生じる。
【００２５】
マークは、１０μｇを超えない量の第１の生体高分子を含めば効果的である。この方法は、生体高分子の量が非常に少なくてすむ。
【００２６】
本発明の目的は、固体物に付着させるための担体を提供することによってさらに達成される。ここでは、エリアエレメントから形成される所定のマークが、担体の一方側に付着され、第１の生体高分子が、エリアエレメントの第１の部分に結合されて、第１の部分パターンを形成し、担体は、他方側が粘着剤で塗膜されたシートとして設計されている。このような担体は、マーキング対象の固体物に容易に付着することができる。
【００２７】
さらなる発展において、第２の生体高分子がエリアエレメントの第２の部分に結合されて、第２の部分パターンを形成する。これにより、第１の部分パターンを特に確実に識別できるようになる。
【００２８】
一方側、すなわち生体高分子で塗膜された側が、着脱可能な保護シートで覆われていてもよい。同様に、粘着層は、他の着脱可能な保護シートで覆われていてもよい。
【００２９】
本発明は、本発明の担体を含み、かつ第１の生体高分子に対する親和性を有する第３の生体高分子を含むキットをさらに提供する。この生体高分子は、溶液中に存在してもよい。キットは、第２の生体高分子に対する親和性を有する第４の生体高分子をさらに含んでもよい。
【００３０】
担体の生成には、あらゆる適切な物質が考えられる。プラスチック製または金属製のシートが、特に好ましい。
【００３１】
以上に述べた特徴および以下に説明する特徴は、明示された特定の組み合わせにより用いることができるだけでなく、他の組み合わせまたは単独でも用いることができる。さらなる利点は、以下の実施例の説明および図面との関連から明らかである。
【００３２】
【発明の実施の形態】
図１は、第１の核酸１４を結合させたエリアエレメント１０を示す。図１ｂは、第２の核酸１６を結合させたエリアエレメント１０を示す。図１ｃは、第１および第２の核酸１４、１６を結合させたエリアエレメント１０を示す。
【００３３】
図２は、分子ビーコン２０の模式図である。これは、ヘアピン構造のＤＮＡ分子の形態をとる。このＤＮＡ分子のＤＮＡ鎖は、その末端において互いに相補する領域を有する。これらの領域は、塩基対の形態をとる。ＤＮＡ鎖の一端には、フルオレセインのような蛍光体２２があり、他端には、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−塩化スルフォニルのような消光剤２４がある。分子ビーコン２０を、蛍光体２２の励起波長光で照射すると、光の放射は生じない。その代わりに、消光剤２４への無放射エネルギ転移が生じる。分子ビーコン２０のループ２６には、第１の核酸１４のヌクレオチド配列と相補関係にあるヌクレオチド配列（ここでは図示せず）がある。
【００３４】
図２ｂの左側は、第１の核酸１４を結合させたエリアエレメント１０の模式図を示す。右側は、分子ビーコン２０の結合後の、このエリアエレメント１０を示す。分子ビーコン２０は、ループ２６内のヌクレオチド配列によって、第１の核酸１４の相補ヌクレオチド配列に結合する。これにより、分子ビーコン２０のＤＮＡ鎖の末端領域における基の対の分離が促される。この結合により、蛍光体２２は、消光剤２４と空間的に離間される。蛍光体２２から消光剤２４への無放射エネルギ転移は、もはや不可能となる。蛍光体２２が励起波長光により励起されると、測定可能な、または裸眼でも見える光の照射が生じる。
【００３５】
図３は、マーク３２が付いた、たとえば銀行券のような固体物３０を示す。マーク３２は、エリアエレメント１０の配列からなる。第１の核酸１４は、ここでは図示していないが、エリアエレメント１０のある部分に結合されている。これらは、それぞれ、ヌクレオチド配列を有し、ヌクレオチド配列は、分子ビーコン２０のループ２６のヌクレオチド配列と相補関係にある。第２の核酸配列１６は、同様にここでは図示しておらず、また相補関係にはないものであって、エリアエレメントの他の部分に結合されている。加えて、他の核酸がエリアエレメント１０に結合されて、非特異的な結合部位を飽和させる。分子ビーコン２０は、溶液中に存在する。この溶液に、マーク３２を接触させる。厳格な結合条件を保証するためには、当該溶液は、所定のイオン強度を有し、高温において接触が起こるようにする。このような条件下において、分子ビーコン２０は、第１の核酸１４を介して、エリアエレメント１０の一部分とだけ結合する。これらは、エリアエレメント１０と非特異的に結合するわけではない。なぜならば、非特異的な結合部位は既に飽和しているからである。また、これらは、飽和のために用いられた他の核酸にも結合せず、また、エリアエレメント１０の他の部分上にある第２の核酸１６にも結合しない。
【００３６】
結合条件の厳格性を低くした場合、非特異的な分子ビーコンが第１の核酸１４および第２の核酸１６に結合することは可能であろう。この場合、部分パターンの識別はできない。
【００３７】
結合した分子ビーコン２０を有するエリアエレメント１０は、黒で塗りつぶした円領域で示し、その他は、塗りつぶしていない円領域で示す。マーク３２を適切な波長の光で照射すると、結合された分子ビーコン２０は発光する。検出器３４が、蛍光を測定および特定する。それにより、生じた部分パターンが出力装置３６において示される。本方法の確実性を向上させるには、ここでは図示しない特定の他の分子ビーコンを用いて、エリアエレメントの他の部分に結合された第２の核酸１６をさらに検出すればよい。他の分子ビーコンは、分子ビーコン２０とは異なる蛍光体を有し、明確に異なる蛍光を有する。これにより、特異的に結合された分子ビーコン２０と、特異的に結合された他の分子ビーコンとの両方を検出することが可能となる。エリアエレメントのある部分と他の部分との差異は、分子ビーコン２０のみを用いた場合の差異と比較すると、明らかに増大する。差異が大きくなれば、蛍光を読み取る際の確実性も向上する。これにより、小さいまたは狭い部分パターンを識別することが可能となる。
【００３８】
図４〜６に示すマークは、以下のようにして生成された。まず、ガラス製のスライドを、連続してそれぞれ３０分間ずつ、水、６％のアンモニア、５％Ｈ2Ｏ2、水、アセトン、２％３−アミノプロピルトリエトキシレンのアセトン溶液、その後アセトンで、それぞれインキュベートする。その後、このように前処理したスライドを３７℃で１時間乾燥させる。
【００３９】
マークは、平均直径８０μｍの架橋４％アルデヒド活性化粒子を用いて生成される。粒子は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）内で懸濁および遠心分離によって洗浄され、１：１の容積比で懸濁される。２０μＭのアミノ活性化オリゴヌクレオチド水溶液５μｌを、粒子懸濁液５０μｌに加える。粒子懸濁液は、オリゴヌクレオチドと共に室温で、１時間静かに振とうされる。オリゴヌクレオチドとして、たとえば、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
５’−アミノ−ＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＣＴＴＴＧＣＧＣＴＴＧＧ−３’
【００４０】
その後、アミノ活性化済みのスライド上に、「Ａ」字形の切り抜きを有するプラスチック製テンプレートを置く。オリゴヌクレオチドを加えて用意しておいた粒子懸濁液を、１Ｍのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム（ミュンヘン、シグマ社が供給元）を加えて、５０ｍＭのシアノ水酸化ホウ素ナトリウムに調整し、１０ｍＭのＮａＯＨに溶解した。その後、この粒子懸濁液を、テンプレートに付着させる。粒子懸濁液は、テンプレート内の切り抜きを介して、スライドのアミノ活性化済み表面に接触する。粒子懸濁液は、スライドの表面に接した状態で、室温の調湿チャンバにて約２０時間インキュベートした。
【００４１】
その後、アルデヒド活性済みの粒子は、ＰＢＳ内で懸濁および遠心分離によって洗浄され、１：１の容積比で懸濁される。２０μＭの他のアミノ活性化オリゴヌクレオチド水溶液２０μｌを、粒子懸濁液２μｌに加える。この粒子懸濁液および他のオリゴヌクレオチドは、共に室温で、１時間静かに振とうされる。他のオリゴヌクレオチドとして、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
５’−アミノ−ＴＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＣ−３’
【００４２】
他のオリゴヌクレオチドで塗膜された粒子を、テンプレート除去後のスライドに付着させた。余分な粒子は、顕微鏡下におけるガラスの毛管吸引によって除去した。スライド上に、プラスチック製のフレームを置いた。他のオリゴヌクレオチドを含んだ粒子懸濁液を、１Ｍのシアノ水酸化ホウ素ナトリウムを加えて５０ｍＭのシアノ水酸化ホウ素ナトリウムにし、１０ｍＭのＮａＯＨに溶解させる。他のオリゴヌクレオチドを含んだ粒子懸濁液を、フレーム内に付着させておき、室温の調湿チャンバにて一晩インキュベートした。結合しなかった粒子を取り除くために、スライドをＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で数回洗浄し、調湿チャンバにおいて０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＴＥ中に保存した。
【００４３】
オリゴヌクレオチド１によって生成されたマークを識別するために、以下の配列の分子ビーコンを、濃度５０ｎＭでＴＥに溶解して、スライドに付着させた。
３’−Ｘ−ＧＧＴＴＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＡＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＡＣＣ−６ＦＡＭ−５’；Ｘ  ＝  ｄｔ（Ｃ２−ＤＡＢＣＹＬ）
【００４４】
分子ビーコンの配列は、オリゴヌクレオチドの配列と相補関係にある。溶液は、噴霧器によって、３７℃の温度でスライドに付着させた。スライドには、溶液の付加の前後に、４９６ｎｍの波長光を照射させた。溶液を付加して５分後に、波長５１６ｎｍの照射を計測した。
【００４５】
図４は、アミノ塗膜されたスライド表面において、オリゴヌクレオチドが共有結合された粒子を示す。粒子は、「Ａ」字形に付着されている。これらの粒子は、第１の部分パターンを形成する。
【００４６】
図５は、第２の部分パターンを組み合わせた図４の第１のパターンを示す。第２のパターンは、共有結合された他のオリゴヌクレオチドで塗膜された粒子から形成される。第１および第２の部分パターンは、透過光では判別できない。
【００４７】
図６は、オリゴヌクレオチドと相補関係にある分子ビーコンで処理後の、図５の部分パターンを示す。分子ビーコンとオリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションしているので、ＵＶ光による励起により、わずか数分後に、蛍光を確認することができる。第１の部分パターンを識別することができる。「Ａ」字形で、はっきりと見分けがつく。
【００４８】
図７に示す第２の実施例では、厚さ０．２５ｍｍのポリカーボネート製のシートを担体として用いた。これは、第１のステップにおいて、イソプロパノールで洗浄後、５ＮのＮａＯＨによって３０分間活性化し、その後Ｈ2Ｏで洗浄した。
【００４９】
その後、第２のステップにおいて、生体高分子を担体に直接結合させた。生体高分子として、配列Ｎ（例えば前述の配列であってもよい）のアミノ変性ＤＮＡオリゴマーを用いた。
【００５０】
この目的のため、ＤＮＡオリゴマー（１００μＭ）５μｌと、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）１μｌと、０．１Ｍの炭酸緩衝液４μｌとからなるｐＨ９．５の溶液を作った。それぞれについて、この溶液１μｌを、予め活性化させた担体に点状に付着させ、特徴的なパターンが生じるようにした。飽和水蒸気中にて一晩インキュベートすることによって、結合は完了し、余分なＤＮＡオリゴマーはＨ２Ｏと０．１％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０とによって洗浄することによって、除去された。
【００５１】
結合は、配列Ｎと部分的に相補関係にある配列Ｎ’を有する分子ビーコンの形態の他のＤＮＡオリゴマーによって検出された。これらは、濃度１．０ｐｍｏｌ／μｌでマークに付着され、約３０秒後、蛍光顕微鏡で計測された。
【００５２】
図７は、担体に直接結合されたＤＮＡマークからの部分パターンを示す。このマークから、ある個所を取り出して、別途図８に示す。
【００５３】
第３の実施例において、厚さ０．２５ｍｍのポリカーボネート製のシートを、エタノール１００対グリシジルシラン１の割合の混合物を用いて、室温で３０分間インキュベートした。この間に、シランが表面に沈着する。余分なシランは、水によって担体から洗い流され、担体は、窒素流内で送風乾燥された。その後、担体上のシランを、８０℃で６０分、架橋反応させた。
【００５４】
配列Ｎ（たとえば、上述の配列であってもよい）を有する、アミノ修飾オリゴヌクレオチドを、でｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸緩衝剤で希釈して、濃度０．５ｐｍｏｌ／μｌ、１．０ｐｍｏｌ／μｌおよび２．０ｐｍｏｌ／μｌにし、活性化させた担体に対して１μｌ滴下し、３０分間インキュベートする（図９〜１１）。図１２に示すサンプルでは、６時間インキュベートを続けた。
【００５５】
ＤＮＡで塗膜した担体を、配列Ｎと部分的に相補関係にある配列Ｎ’の分子ビーコンを用いて、μｌ当たり濃度１ｐｍｏｌで約３０秒間処理し、その後、蛍光顕微鏡で計測する。
【００５６】
その結果は、図９から１２に明らかである。滴内のオリゴヌクレオチド濃度が高いほど、占有密度が高くなり、それにより、生成されたマークは、より明るく見えるようになる。したがって、オリゴヌクレオチドの濃度を変えることにより、強度の異なるマークをも、生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  核酸が結合されたエリアエレメントの模式図。
【図２】  分子ビーコンによって核酸が結合されたエリアエレメントの模式図。
【図３】  固体物に付着させたマークの模式図。
【図４】  透過光における第１の実施例の、粒子からなる第１の部分パターン。
【図５】  透過光における、図４の部分パターンおよび、他の粒子からなる第２の部分パターン。
【図６】  ＵＶ励起を施した図５の部分パターン。
【図７】  第２の実施例。
【図８】  図７の拡大図。
【図９】  濃度０．５ｐｍｏｌ／μｌで生成した第３の実施例。
【図１０】  濃度１．０ｐｍｏｌ／μｌで生成した図９の実施例。
【図１１】  濃度２．０ｐｍｏｌ／μｌで生成した図９の実施例。
【図１２】  （濃度２．０ｐｍｏｌ／μｌ）で６時間の処理時間で生成した図９の実施例。
【符号の説明】
１０  エリアエレメント
１４  第１の核酸
１６  第２の核酸
２０  分子ビーコン
２２  蛍光体
２４  消光剤
２６  ループ
３０  固体物
３２  マーク
３４  検出器
３６  出力装置
【配列表】
0004002764.tif 000002
【図１】
0004002764.tif 000003
【図２】
0004002764.tif 000004
【図３】
0004002764.tif 000005
【図４】
0004002764.tif 000006
【図５】
0004002764.tif 000007
【図６】
0004002764.tif 000008
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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