(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列に対しプライマーをハイブリダイズさせ、このプライマーを複製起点として相補鎖合成反応によって遺伝子を増幅する方法において、５’末端において互いに連結された３分子以上のオリゴヌクレオチドであって少なくとも２つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
５’末端において互いに連結された３分子のオリゴヌクレオチドであって３つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする請求項１の核酸配列の増幅方法。
【請求項３】
標的核酸配列が、複数の遺伝子の配列から選択されるものである、請求項１から２いずれかに記載の核酸配列の増幅方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載された方法によってもたらされるマトリクス状の構造を有する増幅生成物を指標とする、標的遺伝子の検出方法。
【請求項５】
マトリクス状の構造を持つ増幅産物を光学的な手段によって追跡する請求項４の標的核酸配列の検出方法。
【請求項６】
複数の標的核酸配列に対応する３以上のオリゴヌクレオチドを、５’末端において互いに連結したマルチリンクプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡの増幅方法に関するものである。ＤＮＡの増幅反応は遺伝子の塩基配列を特異的に増幅させる反応である。ＤＮＡの増幅反応は、感染症の原因となる病原体の高感度な検出方法や遺伝子のクローニング等に応用されている。
【０００２】
【従来の技術】
標的核酸配列を増幅する方法の一つとしてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法[ 1]が知られている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として最も一般的な方法である。ＰＣＲ法は以下のような原理に基づいている。すなわち増幅の対象とする配列の両端に相補的なプライマーを用意し、その３’末端をＤＮＡポリメラーゼの起点として１本鎖の標的配列を鋳型として相補鎖合成を行わせる。反応後に生成する２本鎖を加熱によって１本鎖に変性させ、再びプライマーのアニールと相補鎖合成を行わせる。一連の反応を繰りかえすことによって、理論的には１つの１本鎖から２n本の増幅生成物を得る事ができる。
【０００３】
ＰＣＲ法は、遺伝子のクローニングや検出において広い範囲で応用されている優れた増幅方法であるが、遺伝子の検出に利用する場合にはいくつかの問題点を持っていた。第１に、ＰＣＲ法のような高度な増幅を行なう反応には、非特異的なノイズも同じように増幅されるという危険性が常にともなう。つまり標的配列が存在しないのにもかかわらずプライマーの非特異的なアニールによって１本でも増幅生成物が生じれば、そのノイズは以降の反応で鋳型として機能するため結果としてプラスと判定されてしまう事になる。一般には、できるだけ非特異的なアニールが生じないように特異的な配列をプライマーに設定し、しかもＴｍすなわち２本鎖ＤＮＡが１本鎖に融解する温度に近い高温条件下でアニールさせることでノイズを防ぐように努力されている。しかし常に望ましい特異性を維持できるとは限らないので、非特異反応の危険性を否定する事はできない。
【０００４】
ＰＣＲ法における非特異反応の対策として提案されたのが入れ子式のＰＣＲ法(nested PCR)[ 2]である。この方法では、ある領域の内側に位置する領域を増幅することができる２組目のプライマーセットを組み合わせてＰＣＲ法を行う。すなわち、まず外側に位置する１組のプライマーセット(outer primer)でＰＣＲ法を行って増幅産物を得、この増幅産物の一部分を増幅することができる２組目のプライマーセット(inner primer)によって再びＰＣＲ法を行う。この方法によれば、たとえ１組目のプライマーセットが誤った配列を増幅しても、その産物には２組目のプライマーがアニールできないので誤った結果にはつながらない。その上、増幅産物を鋳型として利用することから高い増幅効率を期待できるので感度向上につながるとされている。しかし増幅産物を直接的に確認できないという特徴（後述）は、基本となっているＰＣＲ法と同じである。
【０００５】
ＰＣＲ法の非特異的な反応としては、コンタミネーションによる偽陽性反応も指摘されている。増幅生成物が鋳型として機能するＰＣＲ法では、増幅生成物を含む反応液が他の反応系にわずかでも混入すると、それが鋳型となって陽性結果をもたらすことになる。コンタミネーションの影響は、増幅反応の基質としてｄＵＴＰを用い、ＰＣＲ法に先だってウラシルグルコシダーゼで反応液を処理することで防止できる。しかし検出対象であるＤＮＡにはｄＵＴＰが取りこまれていないのでウラシルグルコシダーゼで分解することができない。したがって、検出対象であるＤＮＡが多量に存在する時にはこの方法は無力である。また付加的な操作が必要になるので簡便な方法とは言いにくい。
【０００６】
特異性の改善を意図したものではないが、複数の領域を同時に増幅しその変異を分析する、いわゆる多重ＰＣＲ(Multiplex PCR)法によって遺伝子診断を行った報告がある。すなわち、ジストロフィン遺伝子の欠失変異を、９つの領域に対応する１８種類のプライマーによるＰＣＲ法で検出する試みである[ 3]。この試みは、複数の領域について増幅を行う点で本発明と共通するが、特異性の向上や増幅生成物の直接的な検出を目的とするものではない。
複数の領域を増幅する技術は、プライマーの混合物を使ったＰＣＲ法(Mixed oligonucleotide primed amplification;MOPAC)[ 4]においても応用されている。この方法は、ＰＣＲ法をｃＤＮＡのクローニングに応用したもので、増幅生成物の検出を目的とする本発明とは技術分野を異にしている。いずれにせよ、これらの複数の領域を増幅する技術では、通常のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いているので生じる増幅生成物はやはり単なるＤＮＡであり直接的な検出は困難である。
【０００７】
ＰＣＲ法の第２の問題点は、増幅生成物の検出方法である。ＰＣＲ法の増幅生成物は単なるＤＮＡなので、それを直接検出する事は難しい。通常は電気泳動によって予想される長さのＤＮＡが増幅されているかどうか、あるいはどの程度の量が増幅されたかを検出している。ＤＮＡの電気泳動像は、エチジウムブロマイド等で染色すれば比較的容易に確認することはできる。とはいえ、電気泳動操作は多量の検体を迅速に処理するには不向きな分析技術である。
このような問題点は、増幅反応に当たって予め標識したプライマーを利用する事で改善することができる。たとえば、ビオチン化したプライマー[ 5]や蛍光物質標識したプライマー[ 6]が公知である。この反応系によって生成する増幅産物は、ビオチンや蛍光物質を備えている。ビオチン部分は固相化アビジンで捕捉する事ができる。標識には蛍光物質のみならず、酵素、発光物質、あるいは放射性同位元素などが利用できる。またハプテン標識を利用し、これを標識した抗ハプテン抗体で検出する方法も公知である。
【０００８】
しかしこの種の標識を利用すると、未反応のプライマーを分離するステップを要求するので反応の進行をリアルタイムに監視することはできない。蛍光−消光物質の組み合わせのように標識の組み合わせによっては分離を不要とするいわゆる均一系（ホモジニアス）な検出反応を可能とする測定原理も知られてはいる。だが蛍光−消光物質の組み合わせを利用した反応は増幅生成物の大きさや塩基の配列などに制限を受けるので、広い範囲に応用しにくい。
【０００９】
ＰＣＲ法による増幅産物を凝集によって確認できることを示唆している報告[ 7]もある。すなわち、1組のプライマーが粒子表面に結合するとき相補鎖の合成にともなって粒子の凝集が期待できるというものである。この方法によって増幅産物の直接的な追跡は可能かもしれないが、使用しているプライマーは一組なのでいぜんとして非特異的な反応による誤った結果につながる可能性は否定できない。
粒子上に多くのプローブを結合させてハイブリダイゼーションアッセイを粒子凝集として捉えようとした試み[ 8][ 9]がある。しかしこの報告では単にプローブとしてのオリゴヌクレオチドを開示するにとどまり、これをプライマーとして利用することはできない。プライマーとして利用するには相補鎖の複製起点として利用できる３’末端を持たなくてはならないが、この報告では粒子上のオリゴヌクレオチドの方向性は考慮されていない。
【００１０】
粒子ではなく、ヌクレオチド鎖の中に分岐構造を取り入れることで、やはりハイブリダイゼーションアッセイの高感度化を意図した技術[10][11][12][13]も公知である。分岐構造は本発明におけるマルチリンクプライマーに共通するが、これらの先行技術はプライマーとしての利用を開示していない。そのため先に説明した粒子上に固定したものと同じようにオリゴヌクレオチドの方向性が考慮されていない。したがって、これらの先行技術に開示された分岐構造を持つオリゴヌクレオチドの接合体は、ポリメラーゼによる複製起点として機能する３’末端を持つことが要求されない。あるいはその合成方法では２種類のオリゴヌクレオチドを繰り返し連結した構造は実現できるが、３種類以上のオリゴヌクレオチドを構成比や構造を制御しつつ連結することは困難である。言い換えればいずれもプローブとしての利用しか考慮していないので、ヌクレオチド鎖の構成比や構造はプライマーとして利用する条件とは違っているのである。
【００１１】
ＰＣＲ法の進行は、ＤＮＡポリメラーゼの作用による相補鎖合成にともなって生成するピロリン酸を指標として追跡することも可能である。ピロリン酸の検出方法には酵素的な方法[14][15]等が知られている。これらの方法ではピロリン酸を検出するための試薬成分を用意し、ＰＣＲ法とは別の反応を行わせる必要があるので、簡便な方法とは言いがたい。
【００１２】
酵素反応ではなく染色剤を利用してＰＣＲの進行をモニターしようとする試み[16]も知られている。エチジウムブロマイドをはじめとする２本鎖ＤＮＡの染色剤の存在下でＰＣＲを行い、特定の波長における蛍光強度の変化をトレースする。２本鎖ＤＮＡに吸着して蛍光特性が変化する色素を染色剤に用いれば、反応をリアルタイムに追跡することができる。しかしもともとＤＮＡを分離後に染色するための色素であるエチジウムブロマイドでは、２本鎖ＤＮＡに結合しなかったものの蛍光シグナルとの識別が困難であった。エチジウムブロマイドに代えてピリリニウム塩化合物のような２本鎖ＤＮＡのシグナルを識別し易い染色剤の利用も報告されている[17]。しかしＰＣＲ法に基づいているこれらのモニタリング技術では、ＰＣＲ法自身が持っている特異性に関する問題点は改善できない。
【００１３】
ＰＣＲ法が加熱による２本鎖の変性操作を伴うのに対して、鎖置換増幅反応（Strand Displacement Amplification、ＳＤＡ法）[18]では、２本鎖部分を解離させながら相補鎖合成を行う特殊なＤＮＡポリメラーゼを用いることによって増幅反応サイクルを実現している。また隣接する２つの領域にハイブリダイズするプローブをライゲーションし、その産物を検出するＬＣＲ法(Ligase Cycling Reaction)[19]も公知である。これらの増幅反応においても、非特異的な反応を生じる可能性や増幅生成物を直接検出することができない点はＰＣＲ法と共通である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＣＲ法における特異性と増幅生成物の検出操作の改善を課題としている。具体的には、たとえプライマーが非特異的にアニールしたとしてもノイズにつながりにくい増幅原理を提案する。また検出操作については、反応の進行をリアルタイムに監視することができる新しい技術の提供を課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、複数のオリゴヌクレオチドが相互に連結した新規な構造を持つプライマーの利用によって前記課題を解決するものである。すなわち本発明は、核酸配列の増幅すべき領域（以下標的核酸配列と省略）に対しプライマーをハイブリダイズさせ、このプライマーを複製起点として相補鎖合成反応によって遺伝子を増幅する方法において、相補鎖合成を妨げない部位において互いに連結された３分子以上のオリゴヌクレオチドであって少なくとも２つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする方法である。本発明は、この増幅方法によってもたらされるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物（図７）を指標とする核酸配列の検出方法、並びに反応に必要な複数のプライマーを相互に連結した新規なプライマーを提供する。なお本発明が提供する相互に連結されたプライマーを、本明細書ではマルチリンクプライマー（multi link primer、以下ＭＬＰと省略する）と呼ぶ。
【００１６】
本発明による核酸配列の増幅方法で増幅の対象となる複数の領域とは、単一の遺伝子上の複数の領域であっても良いし、あるいは複数の遺伝子に分かれて存在するものであっても構わない。増幅対象が、たとえばウイルスのように１本のＤＮＡあるいはＲＮＡから構成されているときには、この１本の核酸の配列上で複数の領域を選択する。複数の領域は、互いに重複しない独立した領域を選択するのが望ましい。複数の領域が相互に重複していても本発明を実施することは可能である。しかし領域が重複すると、重複部分のみの増幅生成物が同時に生成するために結果として増幅効率の低下につながる可能性がある。
一方複数の遺伝子上から複数の領域を選択するケースとしては、たとえば異なる染色体上の遺伝子配列を増幅対象とする時、細菌のプラスミド等を増幅対象とする時、また複数種のｒＲＮＡの配列を増幅対象とする時等が挙げられる。あるいは１本の核酸で構成されるウイルスの遺伝子配列を増幅対象とする場合であっても、複数種のウイルスに対して同時増幅を試みる場合には異なる核酸上に増幅対象を求めることになる。
たとえば、最近報告されたヒトＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）は、遺伝学的には異なる肝炎ウイルスであるヒトＣ型肝炎（ＨＣＶ）との重複感染の可能性が高いことが指摘されている[20]。本発明の複数の増幅対象領域をこれらのウイルスの遺伝子配列上に求め、同時に増幅を行うことによって重複感染の検出に利用することが可能である。
ＨＧＶとＨＣＶのように近縁のウイルス間で同時検出を試みる時には、次のような標的配列を選択することもできる。まず３つの標的配列のうち、２つは２種のウイルスにそれぞれ特徴的な配列を設定する。残る１つとして、両者の間で保存性の高い領域を選んで標的配列とするのである。種を越えて保存されている遺伝子は多く知られているので、特殊なウイルス間に限らず同様の手法で様々な検出対象の同時検出が可能である。
【００１７】
本発明においては、直接的な検出対象のみならず増幅反応を監視するための対照を増幅のための領域に選ぶこともできる。すなわち、たとえば３つの増幅対象領域を組み合わせる場合に、３つのうちの２つは検出対象である遺伝子から増幅対象領域を設定する。一方残る１つの増幅対象領域として、増幅反応を正常に実施したかどうかを確認することができる配列（内部標準）を選択する。このような目的で利用される配列に、ヒトのβアクチン遺伝子などが知られている。βアクチン遺伝子は全てのヒト細胞に見られる遺伝子なので、そのためのプライマーを加えているのにもかかわらずもしも遺伝子の増幅が観察されない場合には、操作ミスや反応条件が不適切であった可能性が疑われる。
【００１８】
本発明の増幅対象とする複数の領域とは、２以上、好ましくは３つ以上の領域である。中でも３つの領域に対して本発明を適用する時には、ＭＬＰを構成するプライマーとして各領域に対するプライマーを１つづつとすることができ、均等な増幅効率を得やすい。また３つの領域が揃って増幅された時にのみマトリクス状の増幅生成物を与えることから、特異性の面でも有利である。なぜなら例えば非特異的な増幅生成物が生じたとしても、それが２つの領域までであればマトリクス状の増幅生成物を構成できず陽性結果にはつながらないためである。
【００１９】
一方３より多くの領域に対して本発明を適用することも可能である。たとえば６つの領域を選ぶのであれば、６つの領域に対するプライマーを設定し相互に連結してＭＬＰとする。このＭＬＰによって核酸配列の増幅を行えば、６つの領域のうち少なくとも３つの領域が増幅できればマトリクス状の増幅生成物を与える。
このような組み合わせが有利なケースとして、単一の試料で複数の病原体の分析を行う場合を挙げることができる。尿試料に含まれるナイセリアとクラミジアを同時分析する場合を例に取ると、ナイセリア用のプライマーを３組、クラミジア用のプライマーを３組、合計６つの領域に対するプライマーを利用して本発明によるＭＬＰを用意する。このＭＬＰによってＰＣＲ法を行うと、ナイセリアとクラミジアのいずれかが存在する時に陽性結果をもたらすことになるので、一度の操作で２種の病原体に対するスクリーニングを実施できる。近縁の微生物を同時にスクリーニングする時にはプライマーのうちの一部を共用することもできるであろう。
逆に種としては１種でありながら、いくつかのサブタイプが存在していることがわかっており、いずれかのサブタイプが存在することを確認したい時には、各サブタイプに対して特異的な標的配列を選び対応するプライマーを連結して本発明のＭＬＰとすることもできる。このような使い方をする時には、サブタイプ間で保存されている領域と特異的な領域とを適宜組み合わせて、どのサブタイプが存在してもマトリクス状の増幅生成物を与えるように設計する。
逆に３以下、すなわち２つの領域に対して本発明を適用するには、ＭＬＰを構成するプライマーとして領域Ａに対するものと領域Ｂに対するものの、少なくとも一方を複数としなければならない。プライマーを一つづつ連結したのでは本発明の必須要件であるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物を与えず、単なる線状の増幅生成物をもたらすためである。この種の構造は、３以上の違う配列を持つオリゴヌクレオチドを連結するよりも合成操作は単純であることが多い。
【００２０】
前記複数の領域に対して相補鎖合成反応の複製起点として機能するプライマーとは、たとえばＰＣＲ法でプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドを指す。ＰＣＲ法のためのプライマーは、増幅対象領域の５’末端に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドと、３’末端と同じ配列（つまり相補鎖にアニールすることができる配列）を持つオリゴヌクレオチドの組み合わせを１セットとするプライマーセットである。ここで５’側のプライマーはセンス側、３’側のプライマーはアンチセンス側と呼ぶこともある。
相補鎖合成反応をＤＮＡポリメラーゼで行う時、オリゴヌクレオチドが複製起点となるためには、その３’末端は必ず増幅対象となるＤＮＡにハイブリダイズして２本鎖のＤＮＡを構成できるものでなければならない。また３’末端はＤＮＡポリメラーゼによる次のヌクレオチドの付加が可能なように活性な−ＯＨ基を備えている必要がある。
他方、各オリゴヌクレオチドの３’末端以外の部分は、増幅対象となる塩基配列に対して全体としてハイブリダイズすることができる程度のホモロジーを備えていれば良い。つまり、必ずしも目的とする増幅対象配列に完全に相補的である必要はない。通常の相補鎖合成反応の条件下では、７０−１００%のホモロジーを備えていれば特異的なハイブリダイズを維持できる。ＰＣＲ法においては、一般にホモロジーが１%下がるとＴｍが１℃低下するとされている。したがって７０%以下のホモロジーしか備えていない場合にはＴｍが３０℃以上も低下することになり、通常の温度条件ではアニールすることができなくなってしまう。逆に多少の不整合を伴いながらもハイブリダイズが可能な範囲にアニール温度を調節することによって、一定の配列を持つオリゴヌクレオチドで幅広い変異を持つ配列に対しても増幅を行うことができるようになる。
【００２１】
本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基数で少なくとも６以上、好ましくは１０〜５０、特に好ましくは１５〜３０程度とする。６未満では通常の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでなく、確率的にも非特異的な反応につながる可能性が増す。これに対して必要以上に長いプライマーを用いると、プライマー間あるいはプライマー内の水素結合による２本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応につながる可能性が大きくなる。また塩基数が大きくなるのにしたがって化学的に合成する時に収率が低下していく。
各オリゴヌクレオチドは、相補鎖に対する親和性が同じ程度となるように配列の長さを調整するのが望ましい。相補鎖のハイブリダイズの強さは、構成塩基のＧ／Ｃ含量によって左右されるので、構成塩基の数と共にその構成によって相補鎖とのハイブリダイズ効率には差が生じる。一方本発明では、ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ効率をできるだけ等しくすることがバランスの良いマトリクス構造につながる。したがって、例えば他のオリゴヌクレオチドに対してＧ／Ｃ含量の極端に低い配列を使う時には、構成塩基数を増やしてやるといった調整を行う。通常は、アニール温度を変えることで配列間のハイブリダイズ効率を調整するが、本発明ではＭＬＰとして全てのオリゴヌクレオチドを同じ環境で遺伝子増幅に利用するので配列そのものによる調整が求められる。
【００２２】
こうして選択したプライマーセットは、相補鎖合成を妨げない部位において相互に連結される。相補鎖合成を妨げない部位とは、オリゴヌクレオチドの５’末端やオリゴヌクレオチドの側鎖のような、複製起点となる３’末端以外の部分である。また本発明においては、この連結されたプライマーセットを起点とする分岐した増幅生成物が相互にハイブリダイズしたマトリクス状の構造を持つことが特徴である。したがって、プライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせも増幅生成物がマトリクス状の構造を取るように連結する必要がある。以下に３つの重複しない領域に対するプライマーセットを連結し、本発明に基づいてＰＣＲ法による核酸配列の増幅を試みる場合に可能な組み合わせを示す。なお各プライマーセットは、３つの領域Ａ、Ｂ、およびＣに対してそれぞれの５’側、３’側をＡＦ／ＡＲ、ＢＦ／ＢＲ、並びにＣＦ／ＣＲで示した。連結後のプライマーをＭＬＰ１、ＭＬＰ２、ＭＬＰ３、およびＭＬＰ４とし、各ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせを表１にまとめた。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
表１の組み合わせから明らかなようにＭＬＰを構成するプライマーは３’側用と５’側用のものを任意に組み合わせることができる。３つのオリゴヌクレオチドが互いに異なるようにすれば、どのように組み合わせても本発明のＭＬＰとして機能する。またマトリクス状の生成物を生成させるには、１分子のＭＬＰ内に同一の領域に対する３’側と５’側のプライマーがともに存在しないように設定することも本発明のＭＬＰの条件である。１分子内に同一の標的配列に対するプライマーがともに存在すると、ＭＬＰ１分子内部だけで相補的な２本鎖を形成してしまうため、他のＭＬＰ分子との連結を阻害しマトリクス状の生成物の形成を妨害する結果につながる。
表１の組み合わせのうち、３つのオリゴヌクレオチドを連結したもののみでＭＬＰを構成する場合（すなわちcaseＡ−Ｄ）は、本発明におけるもっとも望ましい態様である。これらの組み合わせでは、各プライマーの間でハイブリダイズする機会、増幅反応の効率といった条件が等しくなり、結果としてバランスの良いマトリクス状の増幅生成物につながりやすいためである。
【００２５】
表１の組み合わせの他にもマトリクス状の増幅生成物をもたらすプライマーの組み合わせは考えられる。たとえば、同じ領域に対するプライマー（たとえばＡＦとＡＲのセット）とが１つの分子となるように連結した場合がそうである。プライマーセットのうち少なくともいずれか一方を複数連結しておけば、これをプライマーとして得られた増幅生成物はマトリクス状の構造を与える。しかしこのような組み合わせでは、１つの増幅対象領域に由来する増幅生成物で陽性の結果につながることから公知のＰＣＲと同じ程度の特異性が期待できるに過ぎないことになる。したがって本発明における望ましいＭＬＰは、少なくともある増幅対象領域のプライマーセットの一方のみで構成され、複数のＭＬＰを用いて初めてマトリクス状の増幅生成物を生じるように組み合わされたものと言うことができる。このようなＭＬＰを用いることで、従来のＰＣＲでは達成できない特異性を実現できるのである。
【００２６】
ここまではＭＬＰをＰＣＲ法に利用するケースを想定して説明した。しかし本発明によって提供される核酸配列の増幅方法は、ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅反応へも応用することができる。たとえばリガーゼを利用したＬＣＲ法[19]、あるいはその改良法[21]、そしてＴＭＡ法(Transcription-Mediated Amplification)[22]へもＭＬＰを利用することが可能である。ＬＣＲ法では、１つの増幅対象領域に対して４つのプライマーが必要となる。ＬＣＲ法を本発明によるＭＬＰを使って実現するためには、３つの領域Ａ、Ｂ、およびＣのそれぞれに４つのプライマー（センス鎖とアンチセンス鎖に対してそれぞれ３’側と５’側のプライマー）が必要なことから、合計４種類のＭＬＰを用意することになる。一方ＬＣＲ法と同じく遺伝子の増幅反応として知られているＳＤＡ法[18]では、増幅生成物にニックを生じて切り出す反応が基本になっていることから、本発明に応用することはできない。増幅生成物がマトリクス状の構造をもたらさないためである。
【００２７】
一方、ＴＭＡ法ではＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を付加した第１プライマー、そして標的配列のアンチセンス側の合成起点となる第２プライマーを用い、ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素を組み合わせて標的配列に相補的なＲＮＡとＤＮＡを増幅する。ＲＮＡを標的配列とするとき、第一段階ではＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを合成起点として逆転写酵素により相補的な配列を持つＤＮＡが合成される。次いで標的配列であるＲＮＡがＲＮａｓｅＨによって消化分解され、残ったＤＮＡ（１本鎖）に対して第２プライマーがハイブリダイズしてこれを合成起点とする相補鎖合成が行われる。続く第二段階は、第一段階で生成したＤＮＡ（２本鎖）を鋳型として進行するＲＮＡポリメラーゼによる転写反応である。第一段階で生成したＤＮＡ（２本鎖）は、第１プライマーに由来するプロモーター部分が２本鎖となっているので、ＲＮＡポリメラーゼがこれを認識して標的配列に対応するＲＮＡが転写される。こうして生じたＲＮＡはＤＮＡ増幅のための鋳型として機能できるとともに、ＲＮａｓｅＨにより酵素的に分解できることから、ＰＣＲのような加熱変性工程が不要となり結果的に等温条件のもとで増幅が実現する。したがって、第１プライマーと第２プライマーのそれぞれを、ＭＬＰとしておけば本発明に基づくマトリクス構造を持つ増幅生成物を与える。
ＴＭＡの増幅対象とする標的配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良い。特にｒＲＮＡを標的配列として選んだ場合には、もともと１本鎖の状態で存在しているので変性工程が不要であり、更に１細胞中に数百コピー存在していることから感度的にも有利である。ＴＭＡ法と同様にＲＮＡポリメラーゼを利用した遺伝子増幅方法としてＮＡＳＢＡ法(Nucleic Acid Basedsequence Amplification)が知られているが、この方法に本発明によるＭＬＰを組み合わせることも可能である。
【００２８】
本発明に必要なＭＬＰは、β−シアノエチルアミダイト法[23]のような通常の方法によって合成した各オリゴヌクレオチドを適当な方法で連結することによって得ることができる。たとえば、トリスアミンと呼ばれる一群の３官能性試薬によってオリゴヌクレオチドの５’末端を連結すれば３つのオリゴヌクレオチドを連結することができる。トリスアミンを用いた合成方法の詳細については後に述べる。
【００２９】
４つのオリゴヌクレオチドを連結するには、まず２つのオリゴヌクレオチドを５’側で連結し、得られた連結オリゴヌクレオチドを更に結合する方法を利用する。５’側で２つのオリゴヌクレオチドが連結した構造はＩＬＯ (inverse linkage oligonucleotides) として公知である[24]。ＩＬＯは、通常の固相ホスホルアミダイト法により得ることができる固相−３’−５’というオリゴヌクレオチド[25]をもとに、更に逆ホスホルアミダイト法[26]に基づいて５’→３’方向へオリゴヌクレオチドを付加していくことで製造することができる。こうして得られるＩＬＯにアミノ基やチオール基を導入し、ヘテロ２官能性試薬によって架橋すれば４種類のオリゴヌクレオチドを１分子づつ連結し、しかもそれぞれのオリゴヌクレオチドがプライマーとして相補鎖合成の起点となりうるＭＬＰとすることができる。
【００３０】
ＭＬＰは修飾されていないオリゴヌクレオチドを連結したものであっても良いが、検出のために標識しておくこともできる。好ましい標識成分としては、蛍光物質や発光物質、あるいはこれらの標識物質の間接的な結合を可能とする結合性リガンドを示すことができる。
【００３１】
本発明による核酸配列の増幅方法は、プライマーとしてＭＬＰを利用する他は、公知のＰＣＲ法と同じ条件の基で実施することができる。すなわち、相補鎖合成を触媒するＤＮＡポリメラーゼに必要な補助的な成分、活性の発現に好適なｐＨを維持する緩衝液や保護剤、ＤＮＡ合成に必要なヌクレオチド類を加えて温度サイクルを行えば良い。ＭＬＰは増幅対象となる遺伝子の予想される量に対して大過剰となるように加える。プライマーを過剰とすることで、鋳型との間でハイブリダイズが促進され、結果として増幅効率の向上につながる。
【００３２】
本発明による核酸配列の増幅方法は、遺伝子の検出に応用することができる。本発明によって生成するマトリクス状の構造を持つ増幅産物は、単なる２本鎖のＤＮＡとは異なり光学的な手法などによって直接的に検出することが可能である。マトリクス状の構造を持つ増幅生成物は、アグリゲートとして光学的に追跡することができる。したがって、相補鎖合成を行いながらリアルタイムで反応の進行を監視することができる。
【００３３】
本発明に基づいて遺伝子の検出を行う時、検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌクレオチドである。本発明の検出対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものに由来するポリヌクレオチドにおよぶ。またポリヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸はもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから逆転写酵素によって誘導されたｃＤＮＡを検出対象とすることも可能である。
【００３４】
本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な各種成分は、予め組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
【００３５】
本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な成分；
１．ＭＬＰ
２．ＤＮＡポリメラーゼ
３．ｄＮＴＰ
【００３６】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸配列の増幅方法を、ある遺伝子の検出に応用する場合を例に具体的な実施の形態を説明する。まず増幅対象領域には、検出対象である遺伝子の３つの重複しない領域に設定する。ここで選択した３つの領域をそれぞれ標的配列Ａ、Ｂ、そしてＣと呼ぶ。標的配列の３’末端、５’末端に対応してＰＣＲ法において複製起点となるプライマーセットを設計する。各プライマーは、必要な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって容易に得ることができる。合成したオリゴヌクレオチドは、それぞれＡＦ／ＡＲ、ＢＦ／ＢＲ、そしてＣＦ／ＣＲと名付けられる。
【００３７】
合成された各オリゴヌクレオチドをもとに、［ＡＦ＋ＢＦ＋ＣＦ］、そして［ＡＲ＋ＢＲ＋ＣＲ］という構成を持つ２つのＭＬＰを製造する。本発明のＭＬＰを図１に示した。３官能性試薬にはトリスアミンと呼ばれる試薬を利用すると良い。合成操作を図２にまとめた。トリスアミンとしてはトリス（２−アミノエチル）アミン(Tris(2-aminoethyl)amine)等が好適である。連結には次のような操作を行なえば簡便である。つまり、１本目のオリゴヌクレオチドをトリスアミンと結合した後に、残りの２種類を同時に結合させるのである。１本目のオリゴヌクレオチドは選択的に結合させることができるから、残りの２本についてランダムに結合させてしまうことになる。この結果得られる生成物は、３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが１本づつ連結されたものと、１本目のオリゴヌクレオチドに対して２本の同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを連結してしまったものとの混合物である。
いずれの生成物も分子量がほとんど変わらないことから、これらの混合物の精製は通常の技術では困難である。本発明者らは、オリゴヌクレオチドの相補鎖をハイブリダイズさせ、非変性条件下で電気泳動による分離を行なえば、各生成物を確実に分離できることを見出した。この分離技術の原理を以下に説明する。
３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、およびＣを連結するとき、まずＡを３官能性試薬に結合する。このときの結合は条件設定によって特異的に行なうことができるので、たとえばＡだけが複数本結合してしまうことはない。次いでＢとＣを同時に結合させる。このときの結合はランダムに生じることから、反応生成物はＡＢＣ、ＡＢＢ、そしてＡＣＣの３種類の混合物である。この混合物に、たとえばＢの相補配列を持つオリゴヌクレオチドＢ−ＡＳを加えると、各反応生成物に対して以下のような割合でＢ−ＡＳがハイブリダイズする。
ＡＢＣ←Ｂ−ＡＳ×１
ＡＢＢ←Ｂ−ＡＳ×２
ＡＣＣ←Ｂ−ＡＳ×０
したがってハイブリダイズの後に非変性条件下で分子量に基づく分離を行なえば、３つの生成物は確実に分離することができる。分離後に加熱やアルカリ変性すれば相補鎖は外れ、目的とするＭＬＰの精製を行なうことが可能である。出発原料に対する収率の面では必ずしも効率的な方法とは言えないが、合成ステップが簡単なため実施例ではこの方法を採用している。
【００３８】
またシステイン骨格を利用してＭＬＰを合成することも可能である。システインのチオール基（ＳＨ基）部分、アミノ基部分、そしてカルボキシル基部分に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、およびＣを連結した構造を合成することができる。具体的には、次のような操作に基づいて合成する。
すなわち５’末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチド（Ａ）とシステインのＳＨ基をスルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate、ＰＩＥＲＣＥ製、以下Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣと省略する）のような２官能性試薬を介して結合させる。このシステインのアミノ基に更にＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを導入する一方、シスタミン化したオリゴヌクレオチド（Ｂ）と混合して両者を結合させる。
得られた生成物のシステインが持つカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)でスクシンイミド化し、次いで５’をアミノ化したオリゴヌクレオチド（Ｃ）を加えれば、Ａ、ＢそしてＣが連結した構造となる。
【００３９】
３官能性試薬を利用して各オリゴヌクレオチドの５’末端を連結するには、以下のような方法を採用することもできる。合成操作は図３−図４に示した。すなわち、ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオチドを１本づつ連結していくのである。具体的には以下のような方法を用いる。
トリスアミンが持つ３つのアミノ基のうちのひとつに保護基を導入しておき、第１のオリゴヌクレオチドをイミダゾール存在下で結合する。第２のオリゴヌクレオチドはアミノ基に２官能性試薬であるマレイミドによって結合させる。マレイミドは残る２つのアミノ基のうちの一方にしか導入できないので、第２のオリゴヌクレオチドを１分子だけ連結することが可能である。２つのオリゴヌクレオチドが連結した状態のトリスアミンを最後に脱保護し、再びマレイミドを介して第３のオリゴヌクレオチドを結合させれば、３つのオリゴヌクレオチドが１本づつその５’末端で連結されたＭＬＰが完成する。合成したＭＬＰは、ゲルろ過等の方法によって精製しポリメラーゼによる相補鎖合成に用いる。
【００４０】
いずれの方法を用いるにしても、これらの方法で得ることができるＭＬＰは、３つのオリゴヌクレオチドの全てがＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成に必要な３’−ＯＨを備えている。またその連結構造は高温でも安定なので、加熱操作を要求されるＰＣＲ法にも応用することができる。
【００４１】
本発明による核酸配列の増幅方法は、プライマーとしてＭＬＰを用いる他は一般的なＰＣＲ法と同じ操作に基づいて実施される。本発明に基く遺伝子の増幅反応を図５、図６、そして図７に示した。すなわち、増幅対象となるＤＮＡを含む試料に対して、ＭＬＰ、Ｔａｑポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ、そして相補鎖合成に必要なｄＮＴＰを加え、温度サイクルを行えば良い。反応液には、酵素活性の発現に必要なＭｇ等の金属イオン、反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイル、反応効率を向上させるためのポリエチレングリコールやゼラチン等の補助的な成分を加えておく。以下に一般的なＰＣＲ法のための反応液組成を例示する。ＭＬＰの使用量は予想される増幅対象ＤＮＡの量に対して過剰になるように設定する。具体的には、ＭＬＰを０．１−１μM程度の濃度で用いれば多くの場合十分である。
【００４２】
５０mMのＫＣｌ
１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５mMのＭｇＣｌ2
５０００unit/mLのＴａｑポリメラーゼ
２５μM       ｄＮＴＰ
５０μg/mL    牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）
１０mM        ジチオスレイトール
【００４３】
温度サイクルは、プライマーとして用いる配列の長さ、添加するＭｇイオンの濃度、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類などによって変動する。ＤＮＡポリメラーゼにＴａｑポリメラーゼを使った場合、一般的には次のような温度サイクルが利用されている。なお反応開始前に９３℃で数分間の変性ステップの後にＤＮＡポリメラーゼを添加するとよい結果を得られる。伸長に必要な時間は、増幅対象配列１０００塩基あたり１分程度を目安として設定されている。
なお変性とアニールの条件は、ＤＮＡポリメラーゼの種類にかかわらず、主として先に例示した反応液中の塩濃度と、用いるプライマーの相補鎖に対する親和性や特異性に大きく左右される。
変性(denature)：９０−９５℃で２０秒−１分
アニール(anneale)：４０−６０℃で２０秒−１分
伸長(extention)：７０−７５℃で３０秒−１分
【００４４】
この反応によって生成する増幅産物は、ＭＬＰを構成する３つのオリゴヌクレオチドの全てが伸長したものと、１ないし２つが伸長し未反応のオリゴヌクレオチドが残っているものが生じる。３つ全てが伸長したものは他のＭＬＰ伸長生成物と相互に２本鎖を構成し、マトリクス状の構造をもたらす。このマトリクス状の構造を、ろ過によって回収したり、あるいは散乱光分析方法によって追跡すればＰＣＲの増幅生成物の測定が可能となる。
【００４５】
本発明によるＭＬＰを使った核酸配列の増幅方法を、分岐プローブの製造に応用することもできる。先に先行技術として紹介したように、分岐構造を持つプローブを利用した核酸配列の高感度検出方法が公知である。本発明による分岐構造を持つ増幅生成物は、そのままこれらの高感度ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブとする事が可能である。ＰＣＲ反応を行なう時に蛍光物質、ハプテン、あるいはビオチン等で標識したヌクレオチドを利用すれば簡単に標識プローブとすることができる。また、化学合成では製造が困難な長い塩基配列であっても、簡単に合成することができる。
ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブとするときには、ＭＬＰやその増幅生成物の塩基配列の少なくとも一部が検出対象となる塩基配列とハイブリダイズできるように設定する。本発明に基づいて製造した分岐構造のプローブを利用するには、たとえば固相サンドイッチ法のような反応系を応用する。すなわち、ある検出対象配列に対して、その一部とハイブリダイズする捕捉プローブを用意する。これに検出対象配列を含む核酸を接触させて捕捉し、次いで捕捉プローブとは異なる部分で検出対象配列に対してハイブリダイズする本発明による分岐構造を持ったプローブと接触させる。この状態で固相を洗浄すれば、検出対象配列を介して分岐構造を持ったプローブが固相上に捕捉された状態（サンドイッチ）となる。分岐構造を持つプローブはマトリクス状態となっていることから多くの標識を持っており、結果として１分子の検出対象配列に対して多分子の標識を結合させられるため高い感度を実現することができる。
【００４６】
【作用】
本発明における重要なポイントは、ＭＬＰである。これまでにも分岐した構造を持つオリゴヌクレオチドの存在は知られていた。しかし公知の分岐構造は、もっぱらハイブリダイゼーションアッセイにおいて、より多くのシグナルを結合することを意図して設計されたものである。これに対して本発明におけるＭＬＰは、遺伝子の増幅産物にマトリクス状の特殊な構造を与えることを目的としている。このような特殊な構造が複数の領域に対するプライマーを連結したＭＬＰによって実現できることはまったく新規な知見である。
【００４７】
更に本発明におけるＭＬＰが複数の領域に対応していることは、遺伝子の増幅精度の向上に貢献するものである。たとえば１つの領域のみの増幅反応では、予想に反してプライマーに類似した配列が存在する時に誤って増幅生成物が生じる可能性がある。これに対して複数の領域を同時に増幅対象として選択する本発明では、対象となる全ての領域が同時に存在していない限りマトリクス状の増幅生成物を生じない。たとえ１つの領域が非特異的に増幅されてしまっても、マトリクス状の増幅生成物は生じないので誤った結果にはつながりにくいと言うことができる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によって、単一の領域をＰＣＲ法で増幅するケースでは期待できなかった高い特異性を容易に実現することができる。すなわち複数の領域で増幅反応がもたらされるため、確率論的にいって非特異的な反応が疑陽性につながる危険性が小さくなるのである。
【００４９】
また本発明では、公知のＰＣＲ法では困難であった増幅生成物の直接的な検出、あるいはリアルタイムに反応を監視することが可能となる。より具体的には、たとえば本発明に基く増幅反応によってもたらされるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物は、これまでの遺伝子増幅反応では得ることができなかった新規な構造を持つものである。このような新規な特徴により、本発明に固有の検出方法を採用することができるのである。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００５０】
［１］オリゴヌクレオチドの合成
ＭＬＰを構成する各オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルアミダイト法[23]に従って合成した。ＤＮＡ合成機としてＣｙｃｌｏｎｅ（登録商標）ＰｌｕｓＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（日本ミリポアリミテッド）を用いた。合成したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、常法に従いＨＰＬＣで精製して使用した。合成した配列は配列１−９に示す９種類である。これらの配列のうち実際にＰＣＲによる増幅反応に用いるのは、以下の６種類で、Ｍ１３ファージｍｐ１８の遺伝子配列において３つの重複しない異なる領域Ａ、Ｂ、およびＣを規定するプライマーである。
ＡＦ（配列１）
ＢＦ（配列２）
ＣＦ（配列３）
ＡＲ（配列４）
ＢＲ（配列５）
ＣＲ２（配列６）
以下に示す残りの３種は、合成後のＭＬＰの分離のために用意したＢＦ、ＣＦ、およびＣＲ２の相補鎖である。
ＢＦ−ＡＳ（配列７）
ＣＦ−ＡＳ（配列８）
ＣＲ２−ＡＳ（配列９）
【００５１】
［２］同じ配列を持つオリゴヌクレオチド接合体の合成
［２］−１  ５’チオール化オリゴヌクレオチド
まず本発明のモデルとして、同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチド３本をその５’で連結した接合体を合成した。基本的には、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール基を導入し、これを３官能性試薬とマレイミド基を介して結合することにより上記接合体とした。具体的な操作は次のとおりである。
オリゴヌクレオチドとしてはＣＦ（配列３）とＣＲ２（配列６）を用いた。４０nmolの５’リン酸化したＣＦまたはＣＲ２を０．１Mの１−メチルイミダゾール（1-methylimidazole、ｐＨ７．５）と０．１Mのシスタミン２塩酸塩（cystamine）を含む溶液に溶解した。これに５mgの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、ＥＤＣと省略する、ナカライテスク）を加えて室温で一晩反応させた。反応液は精製水で平衡化したSephadexG-25 fine ５mL カラム（商品名、ファルマシア製）にて脱塩後、真空乾燥した。得られた生成物は２００μLの精製水で再溶解し、ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと省略する）２mgを添加して３７℃で１時間還元した。脱気した精製水で平衡化したSephadexG-25 fine ５mLカラムにて脱塩後、真空乾燥して５’をチオール化したオリゴヌクレオチドを得た。
【００５２】
［２］−２  ＴＡＥＡのマレイミド化
３５０nmolのトリス（２−アミノエチル）アミン（N(CH2CH2NH2)3、東京化成製、以下ＴＡＥＡと省略する）を含む０．１Mのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μLに５μmolのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを添加し、室温で1時間反応後に、マイクロ遠心機で遠心分離した（１５０００rpm、４℃、３０分間）。回収した沈殿を５００μLの精製水で２回遠心洗浄して最終的にマレイミド化したＴＡＥＡを得た。得られたマレイミド化ＴＡＥＡは精製水３５０μLで再懸濁後、２０μLづつ分注して凍結乾燥し−８０℃に保存した。
【００５３】
［２］−３  同じ配列を持つオリゴヌクレオチド接合体
［２］−１の還元したチオール化オリゴヌクレオチドＣＦ、およびＣＲ２はそれぞれ０．１Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で０．２５nmol/μLに再溶解し、マレイミド化ＴＡＥＡ（［２］−２）の１nmol/μLジメチルフォルムアミド（以下ＤＭＦと省略する）溶液とモル比で３：１となるように混合し、室温で一晩反応させた。反応後に逆相ＨＰＬＣカラムＷａｋｏｐａｋ ＷＳ−ＤＮＡ（和光純薬工業製、商品名）へアプライし、リニアグラジエントにて溶出した。溶出条件は、次のとおりである。
溶出条件：
溶出液Ａ：０．１Mのtriethylamine-acetate（ｐＨ７．１）
溶出液Ｂ：０．１Mのtriethylamine-acetate（ｐＨ７．１）＋７０%のacetonitrile
gradient0-40% B in 27min.
ＤＮＡによる紫外部の吸収を追跡して各ピークフラクションを分取し、各フラクションを７M尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オリゴヌクレオチド３本分が結合した分子量を持つ接合体を含むピークを確認し、そのフラクションを最終合成物とした。このフラクションは脱塩後、真空乾燥後に精製水で溶解した。
【００５４】
［３］本発明によるＭＬＰの合成
３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが５‘末端で結合した構造を持つ、本発明によるＭＬＰを合成した。結合させる組み合わせは、ＡＦ−ＢＦ−ＣＦ、ならびにＡＲ−ＢＲ−ＣＲ２とした。基本的には、まず３つの異なる塩基配列を持つオリゴヌクレオチドのうちの１本を３官能性試薬に結合し、次いで他の２本を同時に結合させる。この操作によって３本の異なる塩基配列で構成されるＭＬＰの他に、２本の同じ塩基配列を結合してしまったものも生じる。これらの混合物を相補配列とのハイブリダイズ特性の違いを利用して分離し、最終的に３本の異なるオリゴヌクレオチドを連結したＭＬＰを精製する。
ＡＦ
ＢＦ
ＣＦ
ＡＲ
ＢＲ
ＣＲ２
以下にＡＦ−ＢＦ−ＣＦの合成について述べるが、ＡＲ−ＢＲ−ＣＲ２についても原料となるオリゴヌクレオチドが違う他はまったく同じ操作によって本発明によるＭＬＰを得た。
［３］−１  ５’ＴＡＥＡ結合オリゴヌクレオチド
６０nmolの５’−リン酸化したＡＦを、それぞれ０．１μmolのＴＡＥＡを含む０．１Mの１−メチルイミダゾール（ｐＨ７．５）に加え５００μLとした。これに１５mgのＥＤＣを添加して室温で一晩反応させて５’ＴＡＥＡ結合ＡＦとした。
［３］−２  ＴＡＥＡ−ＡＦとＢＦのマレイミド化
５’ＴＡＥＡ結合ＡＦとＢＦを１００μLの精製水で再溶解し、３０μLの１Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、更に精製水で２２０μLとした。精製水で溶解した０．１MのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを８０μL添加し、室温で２時間反応させた。精製水で平衡化したSephadexG-25 fine６mLカラムにて脱塩後、真空乾燥してマレイミド化したＴＡＥＡ−ＡＦとＢＦを得た。
【００５５】
［３］−３  ５’をチオール化したＢＦとＣＦ
５’−リン酸化ＢＦ（またはＣＦ）のそれぞれ６０nmolを、０．１Mの１−メチルイミダゾール（ｐＨ７．５）および０．１Mの塩酸シスタミン２塩酸塩を含む反応液に添加し精製水で５００μLとした。これに、１５mgのＥＤＣを添加し、室温で一晩反応させた。反応後に精製水で平衡化したSephadexG-25 fine ６mLカラムにて脱塩後、真空乾燥した。得られた生成物はそれぞれ２００μLの精製水で再溶解し、４mgのＤＴＴを添加して３７℃で１時間還元した。脱気した精製水で平衡化したSephadexG-25 fine ６mLカラムにて脱塩後、真空乾燥して５’をチオール化したＢＦ（またはＣＦ）を得た。
【００５６】
［３］−４  ＭＬＰの合成と分離
５’チオール化ＢＦ（またはＣＦ）（［３］−３）を、それぞれ脱気した０．１Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で０．５nmol/μLとなるように再溶解した。一方、マレイミド化ＴＡＥＡ−ＡＦも同じ緩衝液で０．５nmol/μLとなるように再溶解した。３者をモル比で１：１：１となるように混合し、室温で一晩反応させた。この反応により３者が１本ずつ結合したＡＦ−ＢＦ−ＣＦという構成のＭＬＰが生じるが、同時にＡＦ−ＢＦ−ＢＦ（あるいはＡＦ−ＣＦ−ＣＦ）という３つのうちの２つは同じ配列を持つもので構成されたＭＬＰも生じる。したがって、このあとの相補鎖を組み合わせた精製方法により目的とするＭＬＰ、すなわちＡＦ−ＢＦ−ＣＦという構造のＭＬＰを分離する。
【００５７】
［３］−５  ＭＬＰの確認と分離
１μLの合成反応液（［３］−４）にＢＦに対する相補鎖ＢＦ−ＡＳ２００pmol/μLを添加し、６５℃で５分加温後室温まで徐冷してハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後の反応液を１２%のポリアクリルアミドゲルにて泳動した。この操作によってＢＦ部分が２本鎖となるため、ＡＦ−ＢＦ−ＣＦ（目的とするＭＬＰ）と、ＡＦ−ＢＦ−ＢＦやＡＦ−ＣＦ−ＣＦといった２つの同じオリゴヌクレオチドを含む目的外のＭＬＰとの間で構成塩基数に違いができてくる。結果として、それぞれ異なった移動度を示すはずである。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、相補鎖を添加しないときは得られたＭＬＰの混合物は十分に分離できないのに対して、相補鎖を添加することにより３本のバンドに分離可能であった。したがって、この原理を応用して以下の精製操作を行なうこととした。
【００５８】
［３］−６  ＭＬＰの精製
［３］−５の条件にしたがってＭＬＰの混合物を含む反応液（［３］−４）に２００pmol/μLとなるようにＣＦの相補鎖ＣＦ−ＡＳを添加し、相補鎖をＭＬＰにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後の反応液は、いったん非変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により目的とするＭＬＰをＣＦ−ＡＳとハイブリダイズした状態で分離後、そのまま変性条件下のポリアクリルアミドゲルで泳動することでＣＦ−ＡＳとの分離を行なった。すなわち、下段に７M尿素を含む１２%ポリアクリルアミドゲルを、上段に７M尿素を含まない１２%ポリアクリルアミドゲルを積層した２段ゲルを調製し、上記相補鎖結合反応液をアプライして上段でＭＬＰを分離後、下段で相補鎖との分離を行なった。泳動後のゲルより、目的とするＭＬＰに相当するバンドを切り出し精製して最終的に本発明によるＭＬＰを回収した。
【００５９】
［４］同じ配列のオリゴヌクレオチド３本の接合体による増幅実験
本発明のモデルとして、［２］で合成した同じ配列のオリゴヌクレオチド３本の接合体による増幅実験を試みた。下記組成の反応液２０μLを９５℃で５分の前処理後、９５℃／３０秒→５５℃／２分→７２℃ ／２分を１サイクルとして３５サイクル反応させてＰＣＲ法を行なった。また対照として、ＣＦとＣＲ２のモノマーを用いて同条件で反応を行った。
【００６０】
反応液の組成：
１０mM  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
５０mM  ＫＣｌ
１．５mM  ＭｇＣｌ2
２００μM ｄＮＴＰｓ
２．５U  Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
１fmol  Ｍ１３ファージｍｐ１８
２．５pmol  ＣＦトリマー
２．５pmol  ＣＲ２トリマー
反応液は、０．７%のアガロースゲル（０．５×ＴＢＥ）、および同ゲル（５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴＡ）で泳動しエチジウムブロマイド（以下ＥｔＢｒと省略）にて染色して確認した。０．５×ＴＢＥ（前者）ではλファージのEcoRI/HindIII二重消化断片を、またＮａＯＨ＋ＥＤＴＡ（後者）ではＸＩＶ（１００ｂｐラダー、ベーリンガーマンハイム社製、商品名）を分子量マーカーとした。前者では２本鎖が変性しないので、ハイブリダイズした状態のまま泳動される。
【００６１】
電気泳動の結果を図８として模式的に示す。この結果から以下のようなことが確認できた。
−０．５×ＴＢＥ−
モノマーのみでＰＣＲを行なった対照では、プライマーによって規定される約４００bpの位置に１本の単一バンドが得られた。一方、トリマーを用いた場合には約１０kbp程度の位置までに明瞭に識別できない幅広いバンド（スメアなバンド）が得られた。
−５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴＡ−
このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約４００baseに単一バンドが得られる。しかしトリマーを用いた場合は、４００b、８００b、そして１２００bの３本のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成するオリゴヌクレオチドの１つ、２つ、そして３つ全てから伸長した産物に対応する。これらの結果から、本合成プライマー（トリマー）の使用により高分子のマトリクスが形成されることが判明した。
【００６２】
［５］異なる３つのオリゴヌクレオチドで構成される本発明のＭＬＰによる増幅実験
プライマーとして異なる３つのオリゴヌクレオチドで構成される本発明のＭＬＰ（ＡＦ−ＢＦ−ＣＦとＡＲ−ＢＲ−ＣＲ２）を各２pmolとする他は［４］と同じ条件でＰＣＲ法を行なった。また対照として、ＡＦとＡＲ、ＢＦとＢＲ、およびＣＦとＣＲ２の単独の組み合わせを用いて同じ条件で反応を行った。反応後の反応液は、［４］と同じ条件で電気泳動した。
【００６３】
電気泳動分析の結果を図９として模式的に示す。この結果から以下のようなことが確認できた。
−０．５×ＴＢＥ−
モノマーのみでＰＣＲを行なった対照では、プライマーによって規定される約４００bpの位置にそれぞれ１本の単一バンドが得られた。一方、ＭＬＰトリマーを用いた場合には約２０kbp程度の位置までの明瞭に識別できない幅広いバンド（スメアなバンド）が得られた。３つの異なる配列を連結したＭＬＰを用いたことにより、同じ配列を持つオリゴヌクレオチド３本による接合体をプライマーとした［４］よりも大きなマトリクス構造ができていることが推測された。
−５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴＡ−
このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約４００baseに単一バンドが得られる。しかしＭＬＰトリマーを用いた場合は、４００b、８００b、そして１２００bの３本のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成するオリゴヌクレオチドの１つ、２つ、そして３つ全てから伸長した産物に対応する。これらの結果から、本合成プライマー（トリマー）の使用により高分子のマトリクスが形成されることが判明した。
【００６４】
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[26] Tetrahedron Letters,No.33,2861-2863,1974
【００６５】
【配列表】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＭＬＰの構造
【図２】本発明によるＭＬＰの合成フロー
【図３】本発明によるＭＬＰの別の合成フロー（図４へ続く）
【図４】本発明によるＭＬＰの別の合成フロー（図３の続き）
【図５】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図（図６へ続く）
【図６】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図（図７へ続く）
【図７】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図（図７の続き）
【図８】同じ配列を持つオリゴヌクレオチドの接合体をプライマーとしたＰＣＲによる増幅生成物の電気泳動像を模式的に示す図
【図９】本発明のＭＬＰをプライマーとしたＰＣＲによる増幅生成物の電気泳動像を模式的に示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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