(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0003922431.tif 000018
[式中：
Ｒはイソプロピルであり；
ｎは０であり；
Ｒ１はナフチルメチルであり；
Ｒ２はｔ−ブチルであり；および
Ｒ３はメチルである]
で示される化合物。
【請求項２】
式（ＩＡ）：
【化２】
0003922431.tif 000019
で示される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｓ−ＣＤ２３の過剰生産が関与するアレルギー、炎症疾患および自己免疫疾患のような疾患の治療または予防用の医薬の製造における請求項１または請求項２記載の化合物の使用。
【請求項４】
ｓ−ＣＤ２３の過剰生産が関与するアレルギー、炎症疾患および自己免疫疾患のような疾患の治療または予防用の医薬組成物であって、請求項１または請求項２記載の化合物およびそのための任意の医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または請求項２記載の化合物の製造法であって：
（ａ）式（ＩＩ）：
【化３】
0003922431.tif 000020
[式中、Ｘはベンジルまたはトリメチルシリルのような保護基である]
で示される化合物を脱保護するか、または
（ｂ）式（ＩＩＩ）
【化４】
0003922431.tif 000021
[式中、ヒドロキシ基は保護されていてもよい]
で示される化合物とヒドロキシルアミンまたはその塩とを反応させることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５の記載と同意義である式（ＩＩ）で示される化合物。
【請求項７】
請求項５の記載と同意義である式（ＩＩＩ）で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、可溶性ヒトＣＤ２３形成の新規阻害剤、および自己免疫疾患、炎症およびアレルギーのような可溶性ＣＤ２３（ｓ−ＣＤ２３）の過剰生産に伴う症状の治療における該阻害剤の使用に関する。ＣＤ２３（低結合性ＩｇＥ受容体ＦｒｅＲＩＩ、ブラスト２）は、ＢおよびＴリンパ球、マクロファージ、天然キラー細胞、ランゲルハンス細胞、単球および血小板を含む、種々の成熟細胞の表面で発現する、４５ｋＤａの２型内在性蛋白質である（Delespesse et al, Adv Immunol, 49 [1991] 149-191）。また、好酸球上にはＣＤ２３様分子がある（Grangette et al, J Immunol, 143 [1989] 3580-3588）。ＣＤ２３は、免疫応答の調節に関係している（Delespesse et al, Immunol Rev, 125 [1992] 77-97）。ヒトＣＤ２３は、細胞内Ｎ末端アミノ酸だけが異なる２つの異なって調節されるイソ型、ａおよびｂとして存在する（Yokota et al, Cell, 55 [1988] 611-618）。ヒトにおいて、構造ａ異性体はＢリンパ球でのみ見出されるのに対して、ＩＬ４により誘導されるｂ型はＣＤ２３を発現できる全ての細胞で見出される。
完全な細胞定着ＣＤ２３（ｉ−ＣＤ２３）は、機構が未だあまり解明されていない、複雑な一連のタンパク質分解性事象の結果として産生される、多数の明確な可溶性フラグメント（ｓ−ＣＤ２３）の形成を誘導する、細胞表面からの切断を受けることが知られている（Bourget et al J Biol Chem, 269 [1994] 6927-6930）。未だ証明されていないが、蛋白質分解事象の主要な可溶性フラグメント（分子量３７、３３、２９および２５ｋＤａ）は、それらの全てがｉ−ＣＤ２３に共通のＣ末端レクチン領域を保持し、３７ｋＤａフラグメントの初期形成を介して連続的に生じると仮定されている（Letellier et al, J Exp Med, 172 [1990] 693-700）。代わりの分子内開裂経路は、Ｃ末端ドメインでｉ−ＣＤ２３とは異なる安定な１６ｋＤａフラグメントを導く（Grenier-Brosette et al, Eur J Immunol, 22 [1992] 1573-1577）。
【０００２】
いくつかの活性は、ヒトの膜定着ｉ−ＣＤ２３に起因しており、それらの全ては、ＩｇＥ調節で役割を果たすことが示されている。各々の活性は：ａ）抗原表示、ｂ）ＩｇＥ媒介好酸球細胞毒性、ｃ）リンパ節および脾臓の胚中心に存在するＢ細胞、およびｄ）ＩｇＥ合成のダウンレギュレーションを含む（Delespesse et al, Adv Immunol, 49, [1991] 149-191）。３つの高分子量可溶性ＣＤ２３フラグメント（分子量３７、３３および２９ｋＤａ）は、多機能性サイトカイン特性を有し、ＩｇＥ産生で主な役割を果たすとことは明らかである。したがって、ｓ−ＣＤ２３の過剰形成は、ＩｇＥの過剰生産、外因性喘息、鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーのようなアレルギー疾患の顕著な特徴に関連付けられる(Sutton and Gould, Nature, 366, [1993] 421-428)。ｓ−ＣＤ２３に帰する他の生物学的活性は、Ｂ細胞増殖の刺激、単球からのメディエーターの放出の誘発を含む。したがって、高レベルのｓ−ＣＤ２３は、Ｂ−慢性リンパ球白血病を患っている患者の血清中で（Sarfati et al, Blood, 71 [1988] 94-98）、およびリウマチ様関節炎を患っている患者の滑液中で観察される（Chomarat et al, Arthritis and Rheumatism, 36 [1993] 234-242）。ＣＤ２３が炎症において一の役割を有することは、多くの供給源で示唆されている。第１に、ｓＣＤ２３は、活性化された場合、炎症の細胞媒介事象に関連する細胞外受容体に結合することが報告されている。したがって、ｓＣＤ２３は、単球ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６放出を直接活性化することが報告されている（Armant et al, vol 180, J.Exp. Med., 1005-1011 (1994)）。ＣＤ２３は、単球／マクロファージ上でＢ２−インテグリン吸着分子、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃと相互作用し（S. Lecoanet-Henchoz et al, Immunity, vol 3; 119-125 (1995)）、ＮＯ２−、過酸化水素およびサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ）放出を引き起こすと報告されている。最後に、ＩＬ−４またはＩＦＮは、ＣＤ２３の発現およびヒト単球によるｓＣＤ２３のような放出を誘発する。膜定着ＣＤ２３受容体とＩｇＥ／抗−ＩｇＥ免疫錯体または抗ＣＤ２３ｍＡｂとのライゲーションは、ｃＡＭＰおよびＩＬ−６産生およびトロンボキサンＢ２形成を活性化し、それにより、炎症におけるＣＤ２３の受容体媒介役割が証明される。
ＣＤ２３のこれらの種々の特性のため、ｓ−ＣＤ２３の形成を阻害する化合物は、ａ）Ｂ細胞の表面でｉ−ＣＤ２３のレベルを維持することによりＩｇＥ合成の負のフィードバック阻害を増加する、およびｂ）ｓ−ＣＤ２３の高分子量可溶性フラグメント（分子量３７、３３および２９ｋＤａ）の免疫刺激性サイトカイン活性を阻害する、２面的の作用を有するはずである。加えて、ＣＤ２３切断の阻害は、ｓＣＤ２３誘導単球活性化およびメディエーター形成を緩和し、したがって炎症応答は軽減するにちがいない。
国際特許出願番号ＷＯ９６／０２２４０（Smithkline Beecham plc）は、マトリックス金属プロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ストロメリシンおよびゼラチナーゼ）の作用を阻害する化合物は、哺乳類の細胞培養系にトランスフェクトされるヒト可溶性ＣＤ２３の効果的な阻害剤であることを開示している。
【０００３】
国際特許出願番号ＷＯ９７／０２２３９（British Biotech Pharmaceuticals Limited）は、式（Ａ）：
【化５】
0003922431.tif 000002
（Ａ）
で示されるある種の化合物がマトリックス金属プロテアーゼ活性を有することを開示している。
【０００４】
国際特許出願番号ＷＯ９９／６７２０１（Smithkline Beecham plc）は、式（Ｉ）：
【化６】
0003922431.tif 000003
（Ｉ）
で示されるある種の化合物が哺乳類の細胞培養系にトランスフェクトされるヒト可溶性ＣＤ２３の放出の効果的な阻害剤であることを開示している。
【０００５】
この度、意外にも、式（Ｉ）で示される化合物が当初予想されていたよりもよい生物学的利用能を有することを見出した。
したがって、本発明は：
ｎが０であり；
Ｒがイソプロピルであり；
Ｒ１がナフチルメチルであり；
Ｒ２がｔ−ブチルであり；および
Ｒ３がメチルである
式（Ｉ）で示される化合物を提供する。
【０００６】
さらなる態様により、本発明は、ｓ−ＣＤ２３の過剰生産が関与するアレルギー、炎症疾患および自己免疫疾患のような疾患の治療または予防用の医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ｓ−ＣＤ２３の過剰生産が関与するアレルギー、炎症疾患および自己免疫疾患のような疾患の治療または予防方法であって、本発明の化合物を、その治療または予防を必要とするヒトまたは非ヒト哺乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。
また、本発明は、ｓ−ＣＤ２３の過剰生産が関与するアレルギー、炎症疾患および自己免疫疾患のような疾患の治療または予防用の医薬組成物であって、本発明の化合物およびそのための任意の医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
特別な炎症疾患は、アルツハイマー病、多発性硬化症および多梗塞性痴呆症などのＣＮＳ障害、ならびに発作および頭部外傷の炎症媒介続発症を含む。
本発明の化合物の医薬上許容される塩、溶媒和物および多の医薬上許容される誘導体もまた、本発明に含まれることが理解できる。
式（Ｉ）で示される化合物の塩は、例えば無機または有機酸から導かれる酸付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩および安息香酸塩を含む。
【０００７】
また、塩は塩基と形成されていてもよい。該塩は、無機または有機塩基から導かれる塩、例えば、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、モルホリン、ピペラジン、ジメチルアミンまたはジエチルアミン塩のような有機アミン塩を含む。
意外にも、本発明の化合物は、経口経路を経て、インビボで、有利な吸収特性を示し、ならびにＣＤ２３産生の強力および選択的な阻害剤であることが見出されている。
本発明の化合物は、いずれか適当な従来の方法、例えば、特許公報ＷＯ９７／０２２３９（British Biotech Pharmaceuticals Limited）に記載されている方法と類似の方法を使用することにより製造できる。
【０００８】
したがって、本発明のさらなる態様は、上記記載のような本発明の化合物の製造法であって：
（ａ）式（ＩＩ）：
【化７】
0003922431.tif 000004
（ＩＩ）
[式中、Ｘはベンジルまたはトリメチルシリルのような保護基である]
で示される化合物を脱保護するか、または
【０００９】
（ｂ）式（ＩＩＩ）
【化８】
0003922431.tif 000005
（ＩＩＩ）
[式中、ヒドロキシ基は保護されていてもよい]
で示される化合物とヒドロキシルアミンまたはその塩とを反応させることを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で示される化合物は新規のものであり、本発明のさらなる態様を形成する。
式（ＩＩ）で示される化合物は、式（ＩＩＩ）で示される化合物から、保護ヒドロキシアミンとの反応により製造できる。１つの保護ヒドロキシ基を有する式（ＩＩＩ）で示される化合物は、加水分解により式（ＩＩＩ）で示される非保護化合物に変換できる。
ヒドロキサム酸に関する適当な保護基は、当該分野に公知のものであり、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルおよびｔ−ブチルジメチルシリルである。
カルボン酸に関する適当な保護基は、当該分野に公知のものであり、ｔ−ブチル、ベンジルおよびメチルを含む。
【００１１】
式（ＩＩＩ）で示される化合物は、式（ＩＶ）または式（ＩＶａ）：
【化９】
0003922431.tif 000006
[式中、Ｙはカルボキシル基のための保護基である]
で示される化合物と式（Ｖ）：
【００１２】
【化１０】
0003922431.tif 000007
（Ｖ）
で示される化合物との反応により製造できる。式（ＩＶａ）を使用する場合、その後、ヒドロキシル基をアルキル化する必要がある。
【００１３】
式（ＩＶ）で示される化合物は、順に（ａ）式（ＶＩ）：
【化１１】
0003922431.tif 000008
（ＶＩ）
[式中、Ｒ１は上記と同意義であり、Ｚはカルボキシル基の保護基である]
で示される化合物と、アルキル化剤とを反応させ；
（ｂ）保護基を除去する；
ことにより製造される、Ｙが水素である対応する化合物を保護することにより製造できる。
【００１４】
Ｚが水素である式（ＶＩ）で示される化合物は、２−ヒドロキシコハク酸のジエステル（例えば、ジメチルまたはジエチルエステル）とＲ１がナフチルメチル、Ｘ’が臭素またはヨウ素のような脱離基である式Ｒ１Ｘ’で示される化合物とを、リチウムジイソプロピルアミドのような強塩基の存在下で反応させ、ついでエステル基を除去するために得られた化合物を加水分解することにより製造できる。
【００１５】
本発明の化合物の立体異性体を含む異性体は、このような異性体の混合物または個々の異性体として製造できる。個々の異性体は、適当な方法により製造でき、例えば、個々の立体異性体は、キラル物質から立体特異的化学合成により、または公知の方法を使用するジアステレオ異性体の混合物の分離により製造できる。好ましい態様において、本発明は、式（ＩＡ）：
【化１２】
0003922431.tif 000009
（ＩＡ）
で示される化合物を提供する。
【００１６】
該化合物は実質的に純粋な形態で単離されるのが好ましい。
本明細書に記載のように、可溶性ヒトＣＤ２３の形成の阻害剤は、有用な医学的特性を有する。好ましくは、活性化合物は、医薬上許容される組成物として投与される。
好ましくは、組成物は経口投与に適応させる。しかし、これらは、気道疾患の治療用の他の投与形態、例えば、噴霧、エアロゾルまたは吸入用の他の従来の方法；または心不全を患っている患者の非経口投与形態に適応できる。他の代わりの投与形態は、舌下または経皮投与を含む。
組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、坐剤、還元粉末または経口または滅菌非経口溶液または懸濁液のような液体製剤の形態であってもよい。
投与の一貫性を得るため、本発明の組成物は単位投与量の形態であることが好ましい。
経口投与用の単位投与量剤形は、錠剤およびカプセルの形態であってもよく、従来の賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；崩壊剤；例えば、スターチ、ポリビニルピロリドン、スターチグリコール酸ナトリウムまたは微結晶セルロース；または医薬上許容される湿剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含んでいてもよい。
固体経口組成物は、混合、充填または打錠の従来の方法により製造できる。繰り返しの混合操作を、活性成分を充填剤を大量に使用する組成物に完全に分布させるために使用できる。このような操作は当該分野では慣習的に行われている。錠剤は通常の医学的方法でよく知られた方法、特に、腸溶コーティングによりコートできる。
【００１７】
経口液体製剤は、例えば、乳濁液、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、水または他の適当なビヒクルで、使用前に還元する乾燥粉末であってもよい。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用油；乳濁化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含む）、例えば、アーモンド油、部分ココナッツ油、油性エステル、例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのエステル；防腐剤、例えば、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸；および所望により従来のフレーバーまたは着色剤を含んでいてもよい。
非経口投与に関して、流動性単位剤形は、化合物および滅菌ビヒクルを利用し製造され、使用される濃度に依存して、ビヒクル中に懸濁または溶解できる。溶液の製造において、化合物を注射用の水に溶かし、適当なビンまたはアンプルに充填する前に濾過滅菌し、封をする。有利には、局部増井剤、防腐剤および緩衝剤のような補助剤は、ビヒクルに溶解できる。安定性の増加のため、組成物はビンに充填後冷凍でき、減圧下で水を除去できる。非経口懸濁液は、化合物をビヒクルに溶解することの代わりに懸濁し、滅菌が濾過により成されないこと以外は、実質的に同様の方法で製造できる。化合物は、滅菌ビヒクルに懸濁する前にエチレンオキシドに曝すことにより滅菌できる。有利には、界面活性剤または滑剤は、化合物が均一に分布するように組成物に含まれる。
【００１８】
また、本発明の組成物は、適当には気道に投与するために、噴霧器用のスナッフ、エアロゾルまたは溶液、または吸入用の微小粉末のように単独またはラクトースのような不活性担体と組み合わせて製造できる。この場合、適当には活性化合物の粒子は５０ミクロンより小さい大きさであり、好ましくは、１０ミクロンより小さく、例えば１〜５０ミクロン、１〜１０ミクロンまたは１〜５ミクロンの範囲の大きさである。適切な場合には、少量の他の抗喘息剤および気管支拡張剤、例えば、交感神経興奮剤、例えば、イソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニルレフニンおよびエフェドリン；キサンチン誘導体、例えばテオフィリンおよびアミノフィリン、およびコルチコステロイド、例えばプレドニゾロンおよび副腎刺激剤、例えば、ＡＣＴＨを含んでいてもよい。
組成物は、０．１重量％〜９９重量％、好ましくは１０〜６０重量％の活性物質を、投与方法に依存して含んでいてもよい。吸入投与の好ましい範囲は、１０〜９９％、具体的には６０〜９９％、例えば９０、９５または９９％である。
【００１９】
微小粉末形成は、適当には、計量した投与量、または適当な呼吸活性化装置の方法で、エアロゾルで投与できる。
適当な計量した投与量エアロゾル形態は、従来の推進剤、エタノールのような共存溶質、オレイルアルコールのような界面活性剤、オレイルアルコールのような滑剤、硫酸カルシウムのような乾燥剤および塩化ナトリウムのような密度調整剤を含む。噴霧器用の適当な溶液は、例えば、ｐＨ４〜７に所望により緩衝化され、２０ｍｇ／ｍｌまでの化合物、より一般的には０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの化合物を含む、標準的な噴霧装置で使用される等張性滅菌溶液である。
有効量は、本発明の化合物の相対的な有効性、治療する疾患の重度および患者の体重に依存する。適当には、本発明の組成物の単位剤形は、本発明の化合物の０．１〜１０００ｍｇ（吸入経路では０．００１〜１０ｍｇ）、より好ましくは１〜５００ｍｇ、例えば、１〜２５または５〜５００ｍｇを含む。このような組成物は、1日に１〜６回、より好ましくは、1日に２〜４回投与でき、1日の投与量は、７０ｋｇの成人に対して１ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは５〜５００ｍｇという意味である。これは、約１．４×１０−２ｍｇ／ｋｇ／日〜１４ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、より好ましくは７×１０−２ｍｇ／ｋｇ／日〜７ｍｇ／ｋｇ／日である。
以下の実施例は本明細書を説明するものであって、何ら限定するものではない。
【００２０】
生物学的試験方法
方法１：可溶性ＣＤ２３の放出を阻害する試験化合物の能力を以下の方法を使用して調査した。
ＲＰＭＩ８８６６細胞膜ＣＤ２３切断活性分析:
高レベルのＣＤ２３を発現するＲＰＭＩ８８６６細胞、ヒトＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス形質転換Ｂ−細胞株（Sarfati et al.,  Immunology 60 [1987] 539-547）からの原形質膜を、水性抽出法を用いて精製する。均質化緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ pＨ７.４、１５０ｍＭ ＮaＣl、１.５ｍＭ ＭgＣl２、１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した細胞をＰａｒｒボンベでのＮ２キャビテーションにより破壊し、他の膜と混合している原形質膜フラクションを１０，０００Ｘｇで遠心分離に付すことにより回収する。軽質ペレットを１〜３ｇの湿った細胞当たり２ｍｌの０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．２）に再懸濁し、核ペレットを捨てる。その膜を、膜タンパク質１０〜１５ｍｇ当たり合計１６ｇの０．２５Ｍシュークロースでのデキストラン５００（６．４％ｗ／ｗ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０００（６．４％ｗ／ｗ）（ｒｅｆ）の間に分配することによりさらに分画する［Morre and Morre, BioTechniques 7, 946-957 (1989)］。相を、１０００Ｘｇで短時間遠心分離することにより分離し、ＰＥＧ相（上部）を収集し、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で３〜５倍に希釈し、１００，０００Ｘｇで遠心分離し、その相中の膜を回収する。ペレットを、リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁させ、３〜４倍豊富な原形質膜、同様に他の細胞膜（例えば、リソソーム、ゴルジ（Golgi））を含む。膜を分取し、−８０℃で貯蔵する。６．６％デキストラン／ＰＥＧで分画し、１０倍豊富な原形質膜を得る。
【００２１】
分画した膜を３７℃で４時間までインキュベートし、ＣＤ２３のフラグメントを得、その分析物をＰ３０９９４の調製例１の化合物（５μＭ）でクエンチした後、それを０．２ミクロンのDuraporeフィルタープレート（Millpore）での濾過により膜から分離する。膜から放出されたｓＣＤ２３を、The Binding Site（バーミンガム、ＵＫ）からのＥＩＡキットまたはＭＨＭ６抗−ＣＤ２３ ｍＡｂ［Rowe et al., Int. J. Cancer, 29, 373-382 (1982)］またはサンドウィッチＥＩＡの捕獲抗体としての他の抗−ＣＤ２３ ｍＡｂを利用する同様のキットを使用して測定する。総容量５０μｌのリン酸塩緩衝化生理食塩水中、０．５μｇ膜蛋白質で製造された可溶性ＣＤ２３の量を、ＥＩＡにより測定し、種々の濃度の阻害剤の存在下で得られた量と比較する。阻害剤を水またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液に製造し、最終のＤＭＳＯ濃度は２％を超えることはない。ＩＣ５０を、ｓＣＤ２３の産生の５０％阻害が、阻害剤なしでインキュベートされた対照との間でｓＣＤ２３の相違に関連して観察される濃度として曲線適合により測定する。
結果：Ｎ’−[４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル]−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミドは、上記分析において、６０ｎｍのＩＣ５０を与えた。
【００２２】
方法２：試験化合物のコラゲナーゼを阻害する能力を以下の方法を使用して試験した。
コラゲナーゼ阻害分析：
コラゲナーゼ阻害剤として作用する化合物の強度を、出典明示により本明細書に組み入れられるCawstonおよびBarrett（Anal. Biochem. 99, 340-345, 1979）の方法により測定し、試験する阻害剤の１ｍＭ溶液または希釈液を、コラーゲンおよびイー・コリからクローン化し、発現し、精製した滑液繊維芽細胞からのヒト組換えコラゲナーゼを３７℃で１８時間インキュベートした（１５ｍＭ塩化カルシウム、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、２００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％ナトリウムアジドを含む１５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６で緩衝化した）。コラーゲンはCawstonおよびMurphyの方法（Enzymology ８０，７１１，１９８１の方法）により製造される３Ｈ１型ウシコラーゲンでアセチル化した。試料を遠心分離し、未消化コラーゲンおよび加水分解の測定としてシンチレーションカウンターでの分析用に取り出される放射活性な上清の分取を沈殿させた。１ｍＭ阻害剤またはその希釈液の存在下のコラゲナーゼ活性を、阻害剤を欠く対照の活性と比較し、結果をコラゲナーゼの５０％に影響する濃度（ＩＣ５０）として報告した。
【００２３】
方法３：ＴＮＦ放出を阻害する試験化合物の能力を以下の方法を使用して試験した。
ＴＮＦαの、リポ多糖類（ＬＰＳ）エンドトキシンにより刺激されたヒト単球からの放出の阻害に関する分析。
１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養したヒト単球を１０００Ｘｇで５分間遠心分離し、ついで培地に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。その細胞懸濁液を２４ウェルプレ−トに１ｍｌ／ウェルに分取する。試験すべき化合物を、純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度の培養液に加える。化合物を反復して３つのウェルの細胞に加える。ＴＮＦα放出を、ＬＰＳを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に添加することにより刺激する。また、適当な対照培養液も反復して３つのウェルに設定する。プレ−トを３７℃、５％ＣＯ２で１８〜２０時間インキュベートし、ついで１０００Ｘｇで５分間遠心分離する。ヒトＴＮＦαに特異的なＥＬＩＳＡ（SmithKline Beecham）を、無細胞培養上澄中のＴＮＦレベルを測定するために使用する。
結果：Ｎ’−[４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル]−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミドは、１０μＭでＴＮＦ放出に対する効果を示さなかった。
【００２４】
方法４：以下の生物学的に同等な試験を使用して試験化合物の生物学的利用能を調査した。
雄のスプレーグ・ドーリー・ラット（Sprague dawley rat）における、静脈内薬物動力学パラメータおよび経口生物学的利用能の評価の研究。
本研究は、４回の別々の研究日に、クロスオーバーする設計方式を使用して行った。３匹のラットに、研究の開始の少なくとも３日前に、試験分子の注入用の大腿骨血管カテーテルを外科的に埋めこんだ。本研究の全ての投与は、結晶性試験化合物を使用して処方した。
研究の初日に、動物（肥育された）に、試験化合物を４．０μｍｏｌ／ｋｇ（４．０ｍＬ／ｋｇ）の標的投与量で、３０分の静脈内注射で投与した。投与溶液を、２０％の水性エンカプシン（Encapsin（登録商標））（ｐＨ＝８．０）中、１％のＤＭＳＯを含ませて製造した。エンカプシン（Cerestar USA Inc., Hammond, IN）は、別に非水性溶媒を使用して形成される必要がある化合物の溶解性を増加させるために使用されるヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、環状オリゴ糖類である。
研究の２日目に、動物（絶食した）に、８μｍｏｌ／ｋｇ（１６ｍＬ／ｋｇ）の試験投与量で、経口投与により、溶液として試験化合物を投与した。１％のＤＭＳＯ含有の５％の水性コハク酸処理したブタゼラチン（ｐＨ＝７．５）の投与用溶液を調製した。
血液試料を尾の側脈から収集した。各々の全体の血液試料の標本２５−μＬを、２５μＬの水に加え、約５分間氷上におき、完全な溶血を促進し；ついで試料を分析まで冷凍して保存した。試験化合物の血中濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＬＱ＝１０．０ｎｇ／ｍＬ）により定量した。非コンパートメントおよびコンパートメント薬物動力学分析の両方はWinNolinを使用するこれらのデータで行い、適当な静脈内薬物動力学パラメータを得た。種々のコンパートメント実験および秤量パラダイムを利用した。中央のコンパートメントからの１次エリミネーションを用いる２つのコンパートメント実験および１／Ｙ２の重量で秤量する反復最小自乗法に付し、標準モデル選択基準（すなわち、Akaike's Information Criterion Schwartz Criterion, and sum of squared residuals）に従って観察データに最も適合するデータを得た。薬物動力学パラメータを、最も適合したコンパートメント実験を使用して計算し；ＡＵＣ値（生物学的利用能を含む）の使用を必要とする全ての計算は、非コンパートメント分析から得たＡＵＣを使用して行った。
【００２５】
雄のビーグル・イヌ（Beagle Dog）における、静脈内薬物動力学パラメータおよび経口生物学的利用能を評価するための研究。
本研究は、７日を分けて、２回の別々の研究日に、クロスオーバーする設計方式を使用して行った。３匹の雄のビーグル・イヌを本研究に使用した。各々の研究日で、血液採取用のカテーテルを一時的に頭部の静脈に設置し；研究日の初日だけ、また、カテーテルを一時的に、静脈内注射のために、伏在静脈に設置した。
研究の初日に、各々の動物に、試験化合物を（２．０μｍｏｌ／ｋｇ標的投与）の試験投与量で、１時間の静脈内注射（４．０ｍＬ／ｋｇ）で投与した。投与溶液を、２０％の水性エンカプシン（Encapsin（登録商標））（ｐＨ＝８．０）中、１％のＤＭＳＯを含ませて製造した。エンカプシン（Cerestar USA Inc., Hammond, IN）は、別に非水性溶媒を使用して形成される必要がある投与溶液の調製において、溶解性を増加させるために使用されるヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、環状オリゴ糖類（７グルコース単位）である。
研究の２日目に、各々の動物に、試験化合物（６．０μｍｏｌ／ｋｇ標的投与）を、経口投与（８．０ｍＬ／ｋｇ）により投与した。投与溶液を、５％の水性コハク酸処理したブタゼラチン（ｐＨ＝７．５）中に、１％のＤＭＳＯを含ませて製造した。
試験化合物の血漿中濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＬＱ＝１０ｎｇ／ｍＬ）により定量した。非コンパートメント法を、血漿中濃度の種々の時間データの分析に使用した。
【００２６】
雄のカニクイザル（Cynomolgus Monkey）における、静脈内薬物動力学パラメータおよび経口生物学的利用能を評価するための研究。
本研究は、７日を分けて、２回の別々の研究日に、クロスオーバーする設計方式を使用して行った。３匹の雄のカニクイザルを本研究に使用した。各々の研究日で、血液採取用のカテーテルを頭部の静脈に設置し；研究日の初日に、また、カテーテルを一時的に、静脈内注射のために、伏在静脈に設置した。
研究の初日に、各々の動物（絶食）に、試験化合物を（２．０μｍｏｌ／ｋｇ標的投与）の試験投与量で、１時間の静脈内注射（４．０ｍＬ／ｋｇ）で投与した。投与溶液を、２０％の水性エンカプシン（Encapsin（登録商標））（ｐＨ＝８．０）中、１％のＤＭＳＯを含ませて製造した。エンカプシン（Cerestar USA Inc., Hammond, IN）は、別に非水性溶媒を使用して形成される必要がある投与溶液の調製において、溶解性を増加させるために使用されるヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、環状オリゴ糖類（７グルコース単位）である。
研究の２日目に、各々の動物（絶食）に、試験化合物（６．０μｍｏｌ／ｋｇ標的投与）を、経口投与（８．０ｍＬ／ｋｇ）により投与した。投与溶液を、５％の水性コハク酸処理したブタゼラチン（ｐＨ＝７．５）中に、１％のＤＭＳＯを含ませて製造した。
血液試料を大腿骨血管のカテーテルから得；血漿を遠心分離により単離した。試験化合物の血漿中濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＬＱ＝１０ｎｇ／ｍＬ）により定量した。非区画法を、血漿中濃度の種々の時間データの分析に使用した。
【００２７】
結果：Ｎ’−[４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル]−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミドの結果を、Ｎ’−[４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−プロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル]−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメトキシアミドの結果（ＷＯ９９／６７２０１（SmithKline Beecham）に開示されている）と比較する。
【００２８】
【表１】
0003922431.tif 000010
略語：Ｃｍａｘ−ｉ．ｖ．注射後に得られた最大濃度；Ｔ１／２−半減期、ＭＲＴ−試験分子の平均滞留時間；ＣＬ−全身血漿間隔；Ｖｄｓｓ−分配体積の定常状態；Ｆ−生物活性パーセント
ａ生物活性は、投与量規格化ＡＵＣ０−ｔ（ｔは（ラットでの実験の場合に）経口切片から視察可能な試験化合物の濃度での最終時点または（イヌおよびサルの実験の場合に）実験の機構または十二指腸内工程にて測定可能な薬物濃度での最終時点をいう）の分割により、ｉ．ｖ．セグメントからの投与量規格化ＡＵＣ０−ｔに１００で割り掛けることにより計算できる。
ｂ各々の値は大きな変化で表記した；動物は、常に同じ順で表記した。
【００２９】
製造法
ａ）３Ｓ−ｔ−ブトキシカルボニル−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）プロピオラクトース
【化１３】
0003922431.tif 000011
ＴＨＦ（１６０ｍｌ）中の（ｔ−ブチル−（３Ｒ）−じゃｒｙ日誦す−４−（２−ナフチル）ブチレート（１０ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）を−７０℃でアルゴン雰囲気化で撹拌し、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１ＭのＴＨＦ中溶液の６３．７ｍｌ、６３．７ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を−６０℃〜−７０℃で１時間撹拌し、ついで−８０℃に冷却し、ＴＨＦ（２０ｍｌ）中のＮ−ヨウドスクシニミド（７．１７ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）をカニューレを通して加えた。混合物を−３０℃まで１時間にわたってか音し、ついで飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチした。酢酸エチル（２×）を加え、２相混合物を室温で１．５時間急速に撹拌した。層を分割し、水層を５％のチオ硫酸ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、ついで乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し蒸発した。シリカゲルのクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％の酢酸エチルで溶出した）および回収したヘキサンを有する生成物をトリチュレーションし、白色固体（６３％）５．７０ｇを得た。
MS (AP +ve ) M+Na = 335
1H NMR (CDCl3): 1.31 (9H, s), 3.29  (1H, dd, J = 8.5, 14.6 Hz), 3.38 (1H, dd, J = 6.1, 14.6 Hz), 4.06(1H, m), 4.45 (1H, d, J = 4.4 Hz), 7.34 (1H, dd, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.48 (2H, m), 7.68 (1H, s), 7.82 (3H, m)
【００３０】
実施例
Ｎ'−［４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド
ａ）Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−ヒドロキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンベンジルエステル
【化１４】
0003922431.tif 000012
Ｔｅｒｔ−ロイシンベンジルエステルＴＦＡ塩（６．４９ｇ）を無水炭酸カリウム（２．８９ｇ）とＴＨＦ（１００ｍＬ）中で２０分間撹拌した。ＨＯＡＴ（２．２４ｇ）および３Ｓ−ｔ−ブトキシ−カルボニル−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）プロピオラクトン（４．６６ｇ、１４．９４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を７２時間撹拌した（付加的なＨＯＡＴ（１．０２ｇ）を４８時間後に加えた）。固体を濾過し、ＴＨＦでよく洗浄した。合した濾液を蒸発し泡沫体を得、ＥｔＯＡｃ中に溶解し、０．５ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、水および食塩水；で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発してゴムを得、ヘキサン／Ｅｔ２Ｏから結晶化させ、白色固体６．３５ｇ（８０％）として生成物を得た。
1H NMR (DMSO-d6): 0.88 (9H, s), 1.40 (9H, s), 2.88 (1H, dd, J = 13.5, 6 Hz), 3.00 (1H, dd, J = 13.5, 8.5 Hz), 3.19 (1H, m), 3.92 (1H, t, J ≒ 6.5 Hz), 4.18 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.77 (1H, d, J = 12.5 Hz), 4.84 (1H, d, J = 12.5 Hz), 5.53 (1H, d, J = 7.5), 7.24 (2H, m), 7.30-7.37 (4H, m), 7.45 (2H, m), 7.65 (1H, s), 7.77-7.87 (3H, m), 8.09 (1H, d, J ≒ 9Hz).
【００３１】
ｂ）Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンベンジルエステル
【化１５】
0003922431.tif 000013
１、２−ジエトキシエタン（７５ｍＬ）中のＮ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−ヒドロキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンベンジルエステル（３．０ｇ、５．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、２〜３分撹拌後、ＮａＨ（６０％のパラフィン中の懸濁液；０．２７ｇ）を加え、ペンタン中のｉＰｒＯＴｆ溶液（〜３０％ｗ／ｗ；６ｍＬ）を加えた。混合物を２５分間室温で撹拌し、さらにＮａＨ（０．０５４ｇ）およびｉＰｒＯＴｆ溶液（３ｍＬ）を加えた。さらに２５分間撹拌後、付加的なＮａＨ（０．０５４ｇ）およびｉＰｒＯＴｆ（３ｍＬ）を加えた。さらに２０分間撹拌後、０．５ＭＨＣｌを加え、混合物をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合した抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液水および食塩水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発してガムを得、これをシリカゲルのクロマトグラフィー（ヘキサン／Ｅｔ２Ｏ）により精製し、ほとんど無色のガム１．３３ｇ（４１％）として生成物を得た。
MS (ES +ve) M+H  =  576, M+Na = 598.
1H NMR (CDCl3): 0.87 (9H, s), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.21 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.49 (9H, s), 2.87-3.00 (2H, m), 3.10-3.22 (1H, m), 3.69 (1H, 7-tet, J = 6.0 Hz), 4.00 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.36 (1H, d, J = 9Hz), 4.57 (1H, d, 見た目にはJ = 12.5 Hz), 4.63 (1H, d, 見た目にはJ = 12.5 Hz) (Abqの１／２), 6.50 (1H, d, J = 9 Hz), 7.15-7.19 (2H, m), 7.27-7.40 (4H, m), 7.40-7.45 (2H, m), 7.60 (1H, s), 7.72-7.80 (3H, m).
【００３２】
ｃ）Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシン
【化１６】
0003922431.tif 000014
Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンベンジルエステル（１．３３ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（３８ｍＬ）中大気圧下で、Ｐｄ−ＢａＳＯ４触媒（０．６７ｇ）で１時間水素化した。触媒を濾過しＭｅＯＨでよく洗浄した。合した濾液を蒸発し泡沫体１．０９ｇ（９７％）として生成物を得た。
MS (ES +ve) M+H  =  486, M+Na = 508.
1H NMR (DMSO-d6): 0.92 (9H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.08 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1,42 (9H, s), 2.75 (1H, dd, J = 14, 4 Hz), 3.00 (1H, dd, J = 14, 9.5 Hz), 3.21 (1H, m), 3.57 (1H, 7-tet, J = 6.0 Hz), 3.93 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.10 (1H, d, J = 9 Hz), 7.29 (1H, m), 7.44 2H, m), 7.62 (1H, s), 7.74-7.84 (3H, m), 7.90 (1H, d, J ≒ 9Hz), 12.35 (1H, v. br.).
【００３３】
ｄ）Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド
【化１７】
0003922431.tif 000015
Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシン（１．０９ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２９ｍＬ）中に溶解し、ＨＯＡＴ（０．６１ｇ）およびＤＥＣ（０．８６ｇ）で処理した。混合物を室温で２０分間撹拌し、ついで、メチルアミン塩酸塩（０．６１ｇ）およびＮ−メチルモルホリン（０．７４ｍＬ）を加えた。混合物をさらに２時間撹拌し、ついで減圧下で濃縮した。残鎖をＥｔＯＡｃ中に溶解し、連続的に０．５ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、水および食塩水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発してガムを得、これをシリカゲルのクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製した。生成物をガム０．７７ｇ（６９％）として得た。
MS (ES +ve) M+H  =  499, M+Na = 521.
1H NMR (DMSO-d6): 0.84 (9H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.45 (9H, s), 2.16 (3H, d, J = 4.5 Hz), 2.74 (1H, dd, J = 13.5, 4.5 Hz), 2.93 (1H, dd, J = 13.5, 10 Hz), 3.17 (1H, m), 3.56 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 3.94 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.06 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.25 (1H, br. m), 7.28 (1H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz), 7.44 (2H, m), 7.59 (1H, m), 7.67 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.74-7.86 (3H, m).
【００３４】
ｅ）Ｎ'−［４−ヒドロキシ−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド
【化１８】
0003922431.tif 000016
Ｎ'−［４−（ｔ−ブトキシ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド（０．７７ｇ、１．５４４ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（１１ｍＬ）およびＤＣＭ（２２ｍＬ）中に溶解し、室温で２．５時間撹拌した。溶液を減圧下で蒸発し、トルエンで再蒸発した。残渣をエーテル／ヘキサンからトリチュレーションし、灰白色固体０．６７ｇ（９８％）として生成物を得た。
MS (ES +ve) M+H  =  443, M+Na = 465.
1H NMR (DMSO-d6): 0.85 (9H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz), 2.16 (3H, d, J = 4.5 Hz), 2.78 (1H, dd, J = 14, 5 Hz), 2.95 (1H, dd, J = 14, 10.5 Hz), 3.18 (1H, m), 3.58 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 4.00 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.05 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.20 (1H, q, J = 4.5 Hz), 7.29 (1H, dd, J  = 8.5, 1.5 Hz), 7.42-7.46 (2H, m), 7.59 (1H, d, J = 9 Hz), 7.60 (1H, s), 7.74-7.84 (3H, m), 12.87 (1H, br. s).
【００３５】
ｆ）Ｎ'−［４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド
【化１９】
0003922431.tif 000017
Ｎ'−［４−ヒドロキシ−３Ｓ−イソプロポキシ−２Ｒ−（２−ナフチルメチル）スクシニル］−Ｓ−ｔｅｒｔ−ロイシンメチルアミド（０．６７ｇ、１．５１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＨＯＡＴ（０．４１ｇ）およびＤＥＣ（０．５８ｇ）で処理した。溶液を室温で５分間撹拌し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３２ｇ）およびＮ−メチルモルホリン（０．５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、ついで減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、水（２×）および食塩水間で分離し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発して固体を得、これをエーテルでトリチュレーションし、白色固体０．５１ｇ（７４％）として生成物を得た。
MS (ES +ve) M+H  =  458, M+Na = 480.
1H NMR (DMSO-d6): 0.84 (9H, s), 1.00 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.04 (3H, d, J = 6.0 Hz), 2.02 (3H, d, J = 5 Hz), 2.65 (1H, dd, J = 14, 4 Hz), 2.83 (1H, dd, J = 14, 11.5 Hz), 3.18 (1H, m), 3.52 (1H, 7-tet, J = 6.0 Hz), 3.90 (1H, d,  J = 9 Hz), 4.01 (1H, d, J = 9 Hz), 6.93 (1H, q, J = 5 Hz), 7.25 (1H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz), 7.44 (2H, m), 7.53 (1H, d, J = 9 Hz), 7.57 (1H, s), 7.75-7.85 (3H, m), 9.08 (1H, s), 10.89 (1H, br. s).