(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の5’-CGCTGAGTCAGCAT-3’配列を含む領域と同一であって前記配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドと、前記配列の少なくともTGAGTCA配列と相補的な配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドとからなる２本鎖オリゴヌクレオチを含有することを特徴とする転写因子AP-1の拮抗的阻害剤。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、14塩基長である請求項１の転写因子AP-1の拮抗的阻害剤。
【請求項３】
コラゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の5’-CGCTGAGTCAGCAT-3’配列を含む領域と同一であって前記配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドと、前記配列の少なくともTGAGTCA配列と相補的な配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドとからなる２本鎖オリゴヌクレオチを含有することを特徴とする特徴とする間葉系細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、14塩基長である請求項３の間葉系細胞増殖阻害剤。
【請求項５】
コラゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の5’-CGCTGAGTCAGCAT-3’配列を含む領域と同一であって前記配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドと、前記配列の少なくともTGAGTCA配列と相補的な配列を含む14〜24塩基長のオリゴヌクレオチドとからなる２本鎖オリゴヌクレオチを含有することを特徴とする膠原病治療・予防剤。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、14塩基長である請求項５の膠原病治療・予防剤。
【請求項７】
膠原病が慢性関節リウマチである請求項５または６の膠原病治療・予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、特定の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有し、転写因子AP-1の拮抗的結合阻害、間葉系細胞の増殖阻害、および慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の治療・予防に有効な薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
結合組織の炎症を主病変とする疾患群を総称する膠原病は、世界的にその病因の解明と治療が困難な難治性慢性疾患として知られている。この膠原病には、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、多発性筋炎、強皮症および全身性エリテマトーデス等が含まれている。これらの疾患は、世界的に多くの研究が進められているが、いまだに有効な治療法が発見されていない。たとえば、慢性関節リウマチは、比較的高い罹患率を示す疾患であるにも関わらず、その治療は、経験的な域を脱していない。また、未だ寛解を導くような治療法も開発されていない。このような現状は、最先端の病因研究の成果が正しく理解されていないことに起因している。
【０００３】
慢性関節リウマチは、各種の炎症性物質により関節の滑膜細胞の増殖が異常に亢進して関節が破壊されることにより発症する。今日までの治療薬の開発研究は、これらの炎症性物質の活性ならびに産生を抑制することに焦点が当てられているが、これらは対症療法であり、本質的な治療法ではない。たとえば、生体膜を構成するアラキドン酸の代謝物の中には、プロスタグランジン(PG)やロイコトリエン等の炎症性物質が多く含まれており、これらの産生を担う酵素（シクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ等）の阻害剤あるいは細胞膜上でのこれらの受容体拮抗剤が数多く開発されている。しかしながら、たとえば、シクロオキシゲナーゼを阻害し、PG産生を抑制することが知られている非ステロイド性抗炎症薬は、既に慢性関節リウマチの治療に用いられているが、関節破壊に奏功しないことが知られている。
【０００４】
また、炎症性物質として各種のサイトカインが最近注目されており、実際にインターロイキン−１(IL-1)やインターロイキン−６ (IL-6)、腫瘍壊死因子(TNF)等の産生阻害薬や抗サイトカイン抗体およびサイトカイン受容体に対する抗体等が世界中で研究されている。しかしながら、慢性関節リウマチの関節破壊は、多くの炎症性物質の複雑なネットワークの結果として生じると考えられることから、一つの炎症性物質の作用を打ち消したのみでは、病変の進行は抑えきれない。これは、炎症性物質の生理的な作用が相互に補完されており、一種の物質の作用を阻害しても代替的に他の炎症性物質が作用し、結果として炎症反応が進行することによると考えられる。
【０００５】
一方、慢性関節リウマチの病因に関する最近の研究から、関節病変の破壊的な進行には滑膜間葉系細胞が直接関与しており［アナルズ・オブ・リウマティック・ディジーズィーズ(Ann. Rheum. Dis.)、第51巻、第869-873頁(1992年)］、c-fos遺伝子の過剰発現はこの滑膜間葉系細胞の増殖を引き起こし、結果的にパンヌス形成や関節破壊、骨の粗鬆化を引き起こす因子として重要であることが明らかにされている［ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.)、第148巻、第3100-3104頁(1992年)；ジャーナル・オブ・リウマトロジー(J. Rheumatol.)、第20巻、第422-428頁(1993年)］。すなわち、c-fos遺伝子の産物であるc-Fosタンパク質は、核内タンパク質であるc-Junと二量化し、転写因子c-Fos/AP-1複合体を構成する。c-Fos/AP-1は、遺伝子プロモータ上にある特定のAP-1結合部位に結合し、下流の遺伝子の発現を促進する。AP-1結合部位は、関節炎発症において重要な役割を持つIL-1、IL-6およびTNF等のサイトカイン遺伝子のプロモータ領域並びに関節破壊を引き起こすコラゲナーゼおよびストロメライシン等のメタロプロテアーゼ遺伝子のプロモータ領域等に位置しており、特定の塩基配列 TGAGTCAを有している。したがって、滑膜間葉系細胞で過剰に発現しているAP-1の転写活性（AP-1のプロモータへの結合）を拮抗的に阻害することが可能になれば、関節破壊に関与する多種の炎症性物質の発現を防ぐことができ、より病因に近づいた治療法となると考えられる。このような間葉系細胞の活性化への着目は、慢性関節リウマチのみでなく、その他の膠原病や間葉系細胞の増殖が関与する難治性疾患への治療法提供という観点からも注目される。
【０００６】
このようなc-fos遺伝子の発現によるc-Fosタンパクの過剰産生と間葉系細胞の活性化の知見に基づく治療薬としては、遺伝子発現プロモータ領域に存在するAP-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAからなるヌクレオチド（以下、AP-1ヌクレオチドと記載する）を含有する間葉系細胞の増殖阻害剤が知られている（特開平7-126168号公報。以下、先願発明と記載する）。この先願発明には、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAからなる２本鎖AP-1ヌクレオチドがマウスII型コラーゲン関節炎モデルにおける慢性関節炎を有意に抑制することが記載されている。
【０００７】
なお、コラゲナーゼは、コラーゲンを特異的に分解するプロテアーゼであり、コラーゲンの存在するほとんどの組織に存在する。たとえば、マウスのタイプIVコラゲナーゼをコードする遺伝子のプロモータ領域の配列は以下のとおりである。
0003953552.tif 000002
上記の遺伝子のプロモータ領域はAP-1結合部位を有しており、その遺伝子の発現はc-Fos/AP-1によって調節されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、第268巻、第23460-23468頁(1993年)］。    一方、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊にコラゲナーゼが関与することも知られている（アリスリティス・アンド・リウマチズム［Arthritis. Rheum.、第34巻、第1085-1093頁、1991年］）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
先願発明において、AP-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAの塩基配列を含むヌクレオチドが間葉系細胞の増殖阻害作用を有することが示されているが、より強いAP-1結合阻害効果を有し、間葉系細胞の増殖阻害および膠原病の予防・治療に有効な薬剤が求められていた。
【０００９】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、コラゲナーゼ遺伝子の発現をコントロールする転写因子AP-1の結合部位に高い親和性を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有する新規な薬剤を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする転写因子AP-1の拮抗的阻害剤を提供する。
【００１１】
また、この発明は、コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする間葉系細胞増殖阻害剤を提供する。
さらにこの発明は、コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする膠原病治療・予防剤をも提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
前記従来の技術として説明したとおり、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊にはコラゲナーゼが関与することは明らかであり、コラゲナーゼ遺伝子の発現を抑制することで関節破壊を抑えることができると考えられる。
この発明は、コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域と同一または相同の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを生体内に投与し、この２本鎖オリゴヌクレオチドに転写因子AP-1を優先的に結合させることによって、転写因子AP-1がその本来の結合部位であるプロモータ領域に結合することを拮抗的に阻害し、これによってコラゲナーゼの発現を抑制することを特徴としている。その際に、２本鎖オリゴヌクレオチドはAP-1結合部位とその前後の配列を含むことが重要である。具体的には、任意の動物種のコラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、その一部としてAP-1結合部位（TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCA）を含むことを必須としている。コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域としては、たとえば、ヒト・コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域またはマウス・コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域などの一部が挙げられる。具体的には、マウス・コラーゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部であれば、以下の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００１３】
0003953552.tif 000003
この発明の薬剤に含有される２本鎖オリゴヌクレオチドは、動物のゲノムＤＮＡから単離したものでもよく、また公知の方法によって化学合成したものでもよい。２本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともAP-1結合部位であるTGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAと共に、その前後にコラゲナーゼ遺伝子の配列を含む８塩基長以上であることが必要であるが、好ましくは12〜30塩基長、さらに好ましくは14〜24塩基長の長さとすることができる。具体的には、上記に示したような24塩基長からなる２本鎖オリゴヌクレオチドである。また、２本鎖オリゴヌクレオチドの両端は、上記配列のように3'-あるいは5'-末端が突出していても(sticky end)よく、または平坦であっても(blunt end)よい。
【００１４】
この発明の薬剤は、医薬上許容される賦形剤、担体および希釈剤などの製剤助剤を適宜用いて、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、坐剤または注射剤などの製剤とし、経口または非経口で、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与することができる。注射剤は、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤および関節内注射剤等の剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法、すなわち２本鎖オリゴヌクレオチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解または懸濁乳化することによって調製される。また、２本鎖オリゴヌクレオチドをリポソームに包埋したり、あるいはカチオン性の脂質と混合して投与することもでき、この場合、より一層の効果が期待できる。また、投与方法、投与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に応じて適宜選択できるが、経口投与の場合、通常成人に対して１日10μg〜10mgを１回から数回に分割して投与すればよい。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例に使用した２本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列およびその構造は、以下のとおりである。全ての２本鎖オリゴムクレオチドは下線で示したAP-1結合部位を含んでいる。
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実施例１
マウスのコラーゲン関節炎モデルに対するヌクレオチドの効果を試験した。
【００１６】
DBA/1J雄性マウスの皮下にフロインドの完全アジュバント(FCA)と共に 200μgのII型コラーゲンを３週間間隔で２回投与し、関節炎を誘発した。初回投与の２週間後から週２回、１回5μgの対照オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド１を腹腔内に投与し、関節炎の抑制効果を調べた。なお、コントロール群（陰性対照）には、生理食塩水を同様に投与した。初回免疫後、６週に後肢関節の病理組織検査を実施した。
【００１７】
各検査の結果は、以下の指標に従って数値化した。
・関節炎の程度
０：正常
１：滑膜肥厚と細胞浸潤
２：パンヌスによる破壊
３：軟骨・骨の明確な破壊
４：関節構造の消失または骨性癒合
・細胞浸潤の程度
０：浸潤なし
１：全視野で50個未満
２：全視野で50〜200個未満
３：全視野で200〜500個未満
４：全視野で500個以上
・関節破壊の程度
０：正常
１：関節の２/３以上が正常
２：関節の１/３以上２/３未満が正常
３：関節の１/３未満が正常
４：全関節の破壊
検査結果は、各スコアの平均値として表１に示したとおりである。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドのAP-1結合部位以外の配列が、関節炎抑制効果に関与することを示している。すなわち、マウスのコラーゲナーゼのプロモータ領域の塩基配列の一部に一致するオリゴヌクレオチド１は、既知の対照オリゴヌクレオチドに比べ、関節炎および関節破壊の所見で強い治癒効果を有することが確認された。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
実施例２
実施例１と同様にして、オリゴヌクレオチドのマウスのコラーゲン関節炎に対する効果を観察した。関節炎の評価は BjorkとKleinauの方法［エージェンツ・アンド・アクションズ(Agents Actions)、第27巻、第319-321頁(1989年)］に準じ、四肢の腫脹の程度を初回免疫後、43日目に肉眼的に観察し、以下の炎症スコアに従って数値化した。
【００２０】
１：１ヶ所または２ヶ所の関節炎
２：２ヶ所の関節炎および足蹠の軽度の発赤と腫脹
３：３ヶ所以上の関節炎と足蹠の重度の発赤と腫脹
結果は表２に炎症スコアの平均値を示したとおりである。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドの両端は、平坦であっても（blunt end：オリゴヌクレオチド２）、3'-あるいは5'-末端が突出していても（sticky end：オリゴヌクレオチド１および３）同様の関節炎抑制作用を有することを示す。さらに、２本鎖オリゴヌクレオチドの長さを14塩基としても（オリゴヌクレオチド４）抑制効果が確認された。
【００２１】
【表２】
0003953552.tif 000006
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の発症に関与するコラゲナーゼ遺伝子の発現を制御する転写因子AP-1の結合を拮抗的に阻害し、間葉系細胞の増殖阻害および膠原病の予防・治療に有効な薬剤が提供される。