(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
振幅が変調された超音波として、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波を照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法。
【請求項２】
超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法。
【請求項３】
振幅が変調された超音波として、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波を照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法。
【請求項４】
超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法。
【請求項５】
振幅が変調された超音波として、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波を照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴とする核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法。
【請求項６】
超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴とする核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法。
【請求項７】
振幅が変調された超音波として、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波を照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法。
【請求項８】
超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、（ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡおよび（ｂ）該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超音波を利用した核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置に関し、特に迅速、または高精度な核酸または核酸結合タンパク質の分析方法及びそれらの装置に関する。臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い産業分野での利用が可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い産業分野において、糖、タンパク質、核酸などの各種生体成分の分析および定量が日常的に行われている。特に、臨床検査の分野では、血液、尿などの体液中の、特定の生体成分の分析および定量を行うことにより病気の診断や治療効果の判定を行うことができる。一般的な生体成分の分析および定量方法としては、対象とする生体成分の種類によって多種、多様なものがあるが、これらの反応には酵素と基質、抗体と抗原、核酸と酵素または核酸との親和性を利用した反応を用いる場合と、対象物の物理的化学的性質を利用した電気泳動法、濾紙や樹脂を用いたクロマトグラフィー法を用いる方法がある。しかしながら、これらの方法では対象とする生体成分によっては、反応や操作に長時間を要しているものや、精度が不足していたり、原理的な限界があって、正確な分析ができていないものもある。
【０００３】
酵素反応では通常、１時間の反応時間を要し、この時間は生化学反応系における酵素特有の反応速度により決定される。すなわち、基質に対する至適酵素量が存在し、その条件下で反応時間が決定される。過剰量の酵素を用いると反応速度は短くなるが、多くの場合、非常に不経済であるし、また、しばしば、過剰量の酵素は特異的反応条件を低下させ、異常産物の蓄積が認められる。さらに抗原抗体反応でも化学反応論が適用され、至適反応時間が決定されて、通常、約１時間程度が必要である。電気泳動では用いる媒体（例えばアガロースやポリアクリルアミド）の性質や生体試料の電気的性質によって、分析可能範囲が存在する。クロマトグラフィーでも同様である。
核酸ハイブリダイゼーション反応では、酵素反応や抗原抗体反応とは異なり、対になる分子種が鎖状であるため、１回の衝突によって反応は完了せず、複数回の分子衝突が誤対合分子を補正しつつ、連続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられる。また、対合の安定性は塩基の水素結合にのみ依存するので、塩濃度、温度によって規定される条件下での分子衝突頻度は理論的に決定され、反応時間はそれに従う。通常、１２時間から２日間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、一般的に用いられている核酸ハイブリダイゼーション反応において、その反応時間を短縮することおよびその分析の感度を高めること、または再現性を高めることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは物理的な手段の１つである超音波に着目し、鋭意検討したところ、核酸ハイブリダイゼーション反応に、外部より振幅が変調された超音波を照射することにより、著しく反応時間を短縮できることがわかった。
【０００６】
すなわち、本発明は振幅が変調された超音波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法である。
【０００７】
また、本発明は振幅が変調された超音波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させる、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法である。
【０００８】
さらに、本発明は水槽および超音波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器固定装置および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器である。
【０００９】
本発明は振幅が変調された超音波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴とする核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法である。
【００１０】
また、本発明は振幅が変調された超音波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法である。
【００１１】
さらに、本発明は水槽および超音波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定装置および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器である。
【００１２】
本発明では、振幅が変調された超音波を使用することが特徴である。振幅が変調された超音波とは、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波である。脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあり、半波方式と全波方式がある。
核酸のハイブリダイゼーション反応は互いに分子衝突頻度で律速されると考えられるが、連続波による一定周波数の超音波でも、それら分子の運動が促進されるために、それらの分子衝突頻度が高まり、核酸ハイブリダイゼーション反応が相対的に速くなると推測される。しかしながら、核酸は分子に対して１回の衝突によって対合反応は完了せず、複数回の分子衝突によって徐々に誤対合部分を補正しつつ、連続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられるので、連続波ではなく、振幅が時間とともに変化する変調波で構成された超音波がより効果的であると考えられる。この場合、至適出力は１〜６Ｗ（平均）であり、瞬間最大出力は半波を用いる振幅変調方式によっても、１２Ｗ程度であって、キャビテーションによる核酸分子の破壊は起こらない。
【００１３】
また、分子の媒体中の自然拡散も超音波照射によって促進されると考えられ、自然拡散能を高めた新しい分離法は分子量のみに依存する再現性の高い分離法として期待される。超音波を利用した細胞破砕、洗浄、加工、溶接、脱泡、乳化作用、音響発光などは、超音波照射のときに生じる空洞現象（キャビテーション）を使用し、局所的な高温の発生とそれに伴う作用をむしろ利用するが、本発明においては、振幅が時間とともに変化すること、低出力であることおよび短時間で処理することから、キャビテーションによる熱上昇による作用効果ではない。また、核酸ハイブリダイゼーションには融解温度（Ｔｍ）による至適温度が存在するため、超音波によって熱発生が起こった場合、むしろ成績が悪くなることが考えられる。
【００１４】
なお、特異的に結合する対の構成員の間の複合体の形成の速度は、特異的に結合する対の構成員に含有する媒質の超音波処理によって増大されることが公知である（特公平６−５４３１５号公報）。しかしながら、この方法では、超音波周波数は約５〜１０３ＫＨｚ、電力は約１０〜１００Ｗ、温度は約１５〜４０℃、時間は約３０秒〜２時間と記載されるが、これらの条件では反応の態様としては、１回の分子衝突が反応完了に十分であることを前提としているので一定振幅で構成される超音波を連続的に照射するものである。核酸は鎖状の二重らせん構造をもち、これらの対合は水素結合によるので、変性した核酸が二本鎖を形成する場合には、より複雑な複数回の分子衝突と塩基配列に依存した順次、進行する補正過程を包含する。したがって、単純な一定振幅で構成される超音波ではこの過程を十分に促進することが困難であるが、本発明においては、脈動超音波によって初めて効率のよい核酸ハイブリダイゼーションが可能となった。さらに先行技術で好ましいとされる２０ｋＨｚ前後の超音波は人間の可聴範囲にあるため、きわめて騒音が著しく操作上、困難を伴っていたが、本発明では、さらに周波数の高い音域を用い、電力も１〜１０Ｗであるので、騒音発生は大きく軽減される。
【００１５】
【発明の実施態様】
本発明の一実施態様は、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法である。
【００１６】
本発明においてＲＮＡとしては、前核生物、真核生物およびウイルス由来のｍＲＮＡなどがある。ＤＮＡとしては、前核生物、真核生物由来の染色体ＤＮＡの他、オルガネラ由来のミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡなど、およびウイルス染色体、プラスミドＤＮＡなどが挙げられる。
標識物質としては、放射性同位元素（32Ｐ, 32Ｐ, 35Ｓなど）、検出可能な物質と結合し得る物質、例えばビオチンなど、またはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素などが挙げられる。
【００１７】
超音波照射方法は、まず、ＲＮＡまたはＤＮＡをナイロン膜などの上にブロティングしたものに対し、通常の条件でハイブリダイゼーション用溶液に、該ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を入れたものを、プラスティックバッグに入れてシールするか、またはプラスティック皿に入れる。プラスティックバッグまたは皿を水槽型振動子の場合、恒温装置に接続し、水面上で脈動超音波（例えば３８ｋＨｚの超音波を半波方式で振幅を変調、電力３Ｗ）を５〜１０分間照射する。ホーン型振動子の場合は、プラスティックバッグまたは皿を直接に載せ、同様に超音波を照射する。この照射条件はハイブリダイゼーションのみならず、プレハイブリダイゼーションおよび洗浄にも適用できる。
【００１８】
また、核酸ハイブリダイゼーション反応を利用した分析方法でも、ＤＮＡまたはＲＮＡを電気泳動ゲルからナイロン膜などの膜に固定する（ブロッテイング）という操作を行う場合はある。このブロッテイング操作においても、同様にして脈動超音波を照射する。具体的には反応プラットホームにアルカリで変性したゲルをおき、ナイロン膜などの膜を重ね、次に濾紙３〜４枚、ペーパータオル３ｃｍ程度を重ねる。脈動超音波を適当量で適当時間照射することで、ＤＮＡまたはＲＮＡが効率よくナイロン膜などの膜に転写できる。
【００１９】
脈動超音波照射条件は、反応器に対し、超音波を２０〜４０ＫＨｚ、好ましくは３８ＫＨｚで、電力１〜１０Ｗ、好ましくは６Ｗ程度、照射時間２〜１０分間、好ましくは４分間照射する。例えば３８ｋＨｚの超音波を半波方式で振幅を変調して照射する。一定振幅の超音波によって照射を行うと、核酸ハイブリダイゼーションの効果が低下する。
【００２０】
本発明の別な実施態様は、細胞内核酸と標識核酸を脈動超音波を照射しながら反応させることを特徴とするin situ 核酸ハイブリダイゼーション反応方法である。
細胞内核酸としては、前核生物または真核生物の染色体、ウイルスＤＮＡ、真核生物オルガネラ由来ＤＮＡ、各種ＲＮＡなどがある。標識核酸は前記細胞内核酸に相補的な配列を有するものである。標識物質としては、前記した放射性同位元素(3Ｈなど）、検出可能な物質を結合しうる物質、例えばビオチンなど、またはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
脈動超音波照射条件は、上記した(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させる核酸ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様である。
【００２１】
また、本発明の一実施態様は、試料中のＲＮＡまたはＤＮＡをＤＮＡまたはＲＮＡと脈動超音波を照射しながら反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法である。
これはＤＮＡまたはＲＮＡが相補的な配列をもつＤＮＡまたはＲＮＡ（ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ）とハイブリダイズするという性質を利用したものである。このハイブリダイズさせる工程においても、脈動する超音波を照射する。超音波照射条件は、上記した(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させる核酸ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様である。
【００２２】
また、本発明のハイブリダイゼーション反応を利用する方法では、そのプローブ作成時に、酵素反応を利用して核酸の末端のリン酸基を外し、アイソトープでラベルされたリン酸基を結合させる操作を行うことがある。この酵素反応においても、外部より超音波を照射してもよい。超音波照射条件は、上記条件と同じである。具体的には水槽型の場合、反応器 (例えば試験管、プラスティックチューブなど) を水面に浮かし、ホーン型振動子の場合、反応器の底が振動子に接するように垂直に静置して照射する。望ましくは水槽型で恒温装置に接続し、各酵素の至適温度を維持しながら行う。
【００２３】
本発明の別な実施態様は、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質に超音波を照射しながら反応させることを特徴とする核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法である。
【００２４】
ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質としては、１）ＤＮＡ構造に変化を与えて遺伝子発現を調節する二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えばラムダファージｃｒｏタンパク質、ｃＩリプレッサーやラクトースオペロンリプレッサーなどの遺伝子発現調節タンパク質など）、２）複製、組換え、修復の過程に必須な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば大腸菌から高等生物に至る生物種に見いだされているＳＳＢ）、３）染色体に強く結合し、染色体の高次構造の保持に関与するタンパク質（例えばヒストンや非ヒストンタンパク質など）、４）ヘリカーゼなどのＤＮＡ依存生ＡＴＰアーゼ（例えばｒｅｐヘリカーゼ、ｎ’やｄｎａＢなどの複製タンパク質、ｒｅｃＡやｒｅｃＢなどの組換えタンパク質など）や５）ＤＮＡコンホメーションに変化を与えるトポイソメラーゼ（例えばトポイソメラーゼＩ、II、ラムダファージｉｎｔタンパク質やφＸ１７４遺伝子Ａタンパク質など）などがある。超音波照射条件は、上記した核酸のハイブリダイゼーション反応におけるものと同様である。
【００２５】
本発明の別な実施態様は、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法である。超音波照射条件は、上記した核酸のハイブリダイゼーション反応におけるものと同様である。
【００２６】
照射時間および温度は、材料により簡単に至適化される。通常、温度は常法に従い、照射時間は５分間程度、もしくは５分間以下である。なお、反応容器と発振器の間には気相を介さないように、水もしくは軽油を充填する。
【００２７】
本発明の別な実施態様は、水槽および超音波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定装置および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器である。
図１にて本発明の核酸ハイブリダイゼーション反応のための機器を説明する。１は超音波発振子、２は反応用プラットホーム、３はハイブリダイゼーション用フィルター（ナイロン膜など）、４は反応溶液、５は蓋、６は水、７は水槽、８はモーター、９は攪拌子、１０は温度制御付きヒーター、１１は超音波発振子および振幅変調回路、１２は制御装置、１３は電源を示す。
【００２８】
試料(3) は反応プラットホーム(2) に入れ、これらは反応溶液(4) で満たされ、上部は蓋(5) で閉じられる。超音波は超音波発振子(1) で発生し、反応用プラットホームまで満たされ、水槽(7) 内の水(6) を通り、試料に作用し、ここで反応が起こる。水温は温度制御装置の付いたヒーター(10)で一定に保持されるが、モーター(8) に接続された攪拌子(9) で水槽内全体の恒温作用を効率化している。超音波振動子は水槽の底に設置されるが、超音波発振子(11)によって駆動され、このための制御装置(12)および電源(13)が付加されている。
【００２９】
反応を水槽内で行い、水槽内は設置温度が維持できるようになっているほか、反応用プラットホームに蓋を設け、エアロゾル対策を取っている。
【００３０】
本発明の別な実施態様は、水槽および超音波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器固定装置および超音波発振器を有する核酸タンパク質ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器である。上記ハイブリダイゼーション用フィルター（ナイロン膜など）も同様である。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置では、外部より超音波を断続的に照射することにより、その反応時間を短縮することが可能となり、生体成分の分析の精度を高めることが可能となる。
また、公知の技術で、特に効果があるとされる２０ｋＨｚ前後の超音波照射と異なり、人間の可聴域を越える４０ｋＨｚ前後の脈動超音波は極端に発生音が軽減されるため、より実用的である。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
実施例１  脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションへの利用
核酸ハイブリダイゼーションへの脈動超音波の効果の検討は、ＤＮＡを転写したナイロン膜を用いて行った。ナイロン膜は直径６ｍｍのパンチを用いて打ち抜き円形のディスクとし、これを２６枚用意した。これを１１３μｇ／ｍＬのラムダＤＮＡ、０．２Ｎ  ＮａＯＨの溶液に３０分間浸漬し、次いで２ｍＬの６×ＳＳＣで洗浄したものを通常の方法にて、熱変性したサケ精子ＤＮＡとプレハイブリダイゼーションを３０分間行った。
次に２枚は０分間のコントロールとして、また、他のディスクはそれぞれ３０秒、１分、２分、４分間の超音波非照射、２８ｋＨｚ超音波照射および３８ｋＨｚ振幅変調超音波（半波式）照射試料として、図１に示した核酸検出用機器内でハイブリダイゼーションを経時的に行った。なお、振幅変調超音波（半波式）では、超音波発振子の印加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波を使用した。
【００３３】
各点において２枚のディスクを用いた。ハイブリダイゼーションのプローブにはラムダＤＮＡの０〜１０００ｂｐの断片をＰＣＲで、ビオチン化ｄＵＴＰを用いて標識したものを用いた。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、常法に従い、ＳＳＣ濃度を段階的に希釈したものを用いた。ハイブリッドの検出には東洋紡製 Imaging high-Chemilumi-/-Color-を用い、化学発光させ、Ｘ線フィルムに感光させた。この濃淡をゲルスキャナーで定量化したものを図２に示す。図２中、直線は脈動超音波照射、破線は一定振幅の超音波照射、点線は非照射を示す。各点は２点の平均値である。超音波照射サンプル（直線、破線）は非照射（点線）よりハイブリダイゼーション効率が良いが、特に脈動超音波照射したサンプル（直線）では著しい効率の改善が見られ、感度が高くなるとが判明した。
【００３４】
実施例２  脈動超音波のサザーンブロティングへの応用
サザーンブロティングへの脈動超音波の効果の検討は、アガロースゲルからＤＮＡを転写したナイロン膜を用いて行った。常法に従い、アガロースゲル（０．７％）上で電気泳動したHindIII 消化ラムダＤＮＡ断片（０．５μｇ／レーン）をナイロン膜に転写し、サケ精子ＤＮＡでプレハイブリダイゼーションを行った。次にこのナイロン膜を各レーンに添って切り、３枚の短冊を用意した。各々、非照射コントロール、一定振幅の超音波（２８ｋＨｚ、〜８Ｗ）照射、および脈動超音波（３８ｋＨｚ、６Ｗ）照射サンプルとして図１に示した核酸検出用機器内でハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーションのプローブには実施例１と同様なものを用い、同条件で４分間反応を行い、同条件で洗浄、発光反応を行った。なお、脈動超音波は、超音波発振子の印加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波である。
その結果を図３に示す。図３において、レーン１は非照射コントロール、レーン２は連続波超音波照射サンプルおよびレーン３は脈動超音波照射サンプルを示す。レーン２および３では矢印で示した２４ｋｂと４．４ｋｂの断片が明確にバンドとして検出され、非照射コントロールと比べ、感度が向上していることがかわった。
【００３５】
実施例３  脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションのための至適出力
脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあり、半波方式と全波方式がある。それぞれの方式で至適出力を求めた。核酸ハイブリダイゼーションは実施例２と同様に行ったが、得られたＸ線フィルム上のバンドをゲルスキャナーで定量した。結果を図４に示す。縦軸はコンピューター画像の濃淡の相対値であり、したがってハイブリダイゼーション強度を表す。横軸はワット数を示す。半波および全波方式ともに６Ｗ近傍でコンピューター画像の濃淡の相対値（ドット数）が最大値を示し、いずれの方式でもほぼ同等の結果が得られた。
ハイブリダイゼーションは用いるプローブによって反応温度が定まり（Ｔｍ−２５℃、通常、６５℃が汎用される）、超音波を照射しない場合であって、熱を加えると寧ろ、反応条件は悪くなる。但し、上述の超音波出力、時間ではキャビテーションによる熱発生はほぼ無視できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸ハイブリダイゼーション反応のための機器である。
【図２】ナイロン膜をラムダＤＮＡ溶液に浸漬し、反応させ、プレハイブリを行った後、超音波によりハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図３】脈動超音波を用いてサザーンブロティングを行った結果を示す電気泳動図に代わる写真である。
【図４】脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションのための至適出力を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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