(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチド、
（２）ポリぺプチドの一端に剛直なリンカー配列を介して連結された第１の発色団、
（３）中間部分に柔軟性を有する剛直なリンカー配列を介してポリペプチドの他端に連結された、第１の発色団とは異なる蛍光波長を有する第２の発色団、および
（４）第２の発色団と剛直なリンカー配列を介して連結された膜局在化配列、
を有し、ポリペプチドが脂質セカンドメッセンジャーと結合すると、第１の発色団と第２の発色団の立体配座が変化して、発色団が発する蛍光波長が変化することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項２】
脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドは、脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質である請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項３】
脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質は、ＧＲＰ１のプレクストリン相同ドメインである請求項２の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項４】
第１の発色団が、ポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光タンパク質であり、第２の発色団が、ポリペプチドのＣ−末端に連結された黄色蛍光タンパク質である請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項５】
剛直なリンカー配列は、配列番号１の配列の繰り返しからなる剛直なα−ヘリックス状リンカーである請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項６】
中間部分に柔軟性を有する剛直なリンカー配列における柔軟性部分がジグリシンモチーフである請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項７】
膜局在化配列は、脂質化配列又は膜貫通配列である請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを生細胞内において脂質セカンドメッセンジャーと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項１０】
請求項８のポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを生細胞内に導入する請求項９の脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項１１】
請求項８のポリヌクレオチドを導入した非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現させる請求項９の脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項１２】
請求項８のポリヌクレオチドを導入した非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１３】
動物の生細胞内における脂質セカンドメッセンジャーに影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法であって、請求項１２の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、動物の細胞内における脂質セカンドメッセンジャーを定量することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、脂質セカンドメッセンジャーが生細胞内のどこで、いつ、産生されたかを定量的に検出するための脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブとそれを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出・定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
脂質セカンドメッセンジャーの一つであるホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸（PIP3）は、細胞膜に存在し、細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たしている。具体的には、Akt、PDK1、およびBtk等の結合タンパク質を活性化し、アポトーシス、糖尿病、癌等に関係する様々な細胞機能を調節することが知られている（非特許文献１〜３）。PIP3等の脂質セカンドメッセンジャーは、細胞膜において、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（PI3K）により触媒されて産生されることが明らかになっており（非特許文献４）、PI3Kが多くの刺激により活性化されることも知られている。しかし、細胞膜のどの部分で、いつ、どのようにしてPIP3が産生されるのかは明らかになっていない。その大きな原因の一つとして、生細胞におけるPIP3の空間的および時間的な動態を定量的に分析するための適当な方法がないことが挙げられる。
【０００３】
従来、PIP3の変化は、［32P］オルトリン酸を用いた細胞の標識により広く測定されてきた。しかし、このような方法では、充分な放射化学的シグナルを得るために数百万個の細胞を粉砕し、分析しなければならないという問題があった。また、最近になって、緑色蛍光タンパク質（GFP）と、Btk（非特許文献５）、GRP1（非特許文献６）、ARNO（非特許文献７）、またはAkt（非特許文献８）由来のPIP3結合ドメインとの融合タンパク質が、細胞膜におけるPIP3蓄積のための指示薬として作用することが報告され、このような指示薬では細胞質ゾルから細胞膜への該融合タンパク質の転位がPIP3の蓄積を反映するとされている。しかしながら、このような方法では、細胞の形状変化や細胞膜のラフリングなどの影響を受けやすく、PIP3に無関係な対象に応答しやすいという問題があった。さらに、このような蛍光融合タンパク質では、細胞内のどの膜に融合タンパク質が転位するのかを識別することが困難であるという問題もあった。
【０００４】
【非特許文献１】
Cantley, L. C. (2002) Science, 296, 1655-1657.
【非特許文献２】
Czech, M. P. (2000) Cell, 100, 603-606.
【非特許文献３】
Vanhaesebroeck, B. and Alessi, D. R. (2000) Biochem. J. , 346, 561-576.
【非特許文献４】
Wymann, M. P. and Pirola, L. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1436, 127-150.
【非特許文献５】
Varnai, P., Rother, K. I. and Balla, T. (1999) J. Biol. Chem., 274, 10983-10989.
【非特許文献６】
Venkateswarlu, K., Gunn-Moore, F., Tavare, J. M. and Cullen, P. J.
(1998) Biochem. J., 335, 139-146.
【非特許文献７】
Venkateswarlu, K., Oatey, P. B., Tavare, J. M. and Cullen, P. J. (1998) Curr. Biol., 8, 463-466.
【非特許文献８】
Watton, J and Downward, J. (1999) Curr. Biol., 433-436.
【非特許文献９】
Misra, S., Miller, G. J. and Hurley, J. H. (2001) Cell, 107, 559-562.
【非特許文献１０】
Zhang, C., Kazanietz, M. G., Blumberg, P. M. and Hurley, J. H. (1995) Cell, 81, 917-924.
【非特許文献１１】
Miyawaki, A. and Tsien, R. Y. (2000) Method. Enzymol., 327, 472-500.
【非特許文献１２】
Sato, M. , Hida, N., Ozawa, T., and Umezawa, Y. (2000) Annal. Chem., 72, 5918-5924.
【非特許文献１３】
Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T. and Umezawa, Y. (2002) Nature Biotechnol., 20, 287-294.
【非特許文献１４】
Resh, M. D. (1996) Cell. Signal., 8, 403-412.
【非特許文献１５】
Merutka, G., Shalongo, W. and Stellwagen, E. (1991) Biochemistry, 30, 4245-4248.
【非特許文献１６】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980
【非特許文献１７】
Current Biology 6(2); 178-182, 1996
【非特許文献１８】
Choy, E. et al. (1999) Cell, 98, 68-80.
【非特許文献１９】
Schlessinger, J. (2000) Cell, 103, 211-225.
【非特許文献２０】
Venkateswarlu, K., Cunn-Moore, F., Tavare, J. M. and Cullen, P. J. (1999) J. Cell Sci., 112, 1957-1965.
【非特許文献２１】
Vieria, A. V., Lamaze, C. and Schmid, S. L. (1996) Science, 274, 2086-2089.
【非特許文献２２】
Qualmann, B,. Kessels, M. M. and Kelly, R. B. (2000) J. Cell Biol., 150, F111-F116.
【非特許文献２３】
Frangioni, J. V., Beaham, P. H., Shifrin, V., Jost, C. A. and Neel, B. G. (1992) Cell, 68, 545-560.
【非特許文献２４】
Haj, F. G., Verveer, P. J., Squire, A., Neel, B. G. and Bastiaens, P. I. H. (2002) Science, 295, 1708-1711.
【非特許文献２５】
Ceresa, B. C. and Schmid, S. L. (2000) Curr. Opin. Cell Biol., 12,
204-210.
【非特許文献２６】
Lavoie, C. et al. (2002) J. Biol. Chem., 277, 35402-35410.
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、PIP3に代表される脂質セカンドメッセンジャーが生細胞内のどの部位で、いつ、産生されたかを定量的に検出するためのプローブを提供することを課題としている。また、この出願の発明は、このようなプローブを用いて細胞内脂質セカンドメッセンジャーによるシグナリングに影響を与える物質をスクリーニングする方法や疾病に関連したシグナルの測定による診断方法をも提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、第１には、脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に、剛直なリンカー配列を介して連結された異なる蛍光波長を有する二つの発色団と、一方の発色団と剛直なリンカー配列を介して連結された膜局在化配列を有することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提要する。
【０００７】
この出願の発明は、第２には、脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドが脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質である脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを、また、第３には、脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質がGRP1のプレクストリン相同ドメインである脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【０００８】
さらに、第４には、この出願の発明は、発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光タンパク質と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光タンパク質である前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【０００９】
この出願の発明は、第５には、リンカー配列が配列番号１の配列の繰り返しからなる剛直なα−ヘリックス状リンカーである前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャーを、第６には、少なくとも１つのリンカー配列がジグリシンモチーフを有する前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【００１０】
また、この出願の発明は、第７には、膜局在化配列が脂質化配列又は膜貫通配列である前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【００１１】
この出願の発明は、さらに、第８には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第９には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させる脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を、第１０には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブと脂質セカンドメッセンジャーを共存させる脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を提供する。
【００１３】
この出願の発明は、さらに、第１１には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法において、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブが細胞内で膜に固定化され、該膜において産生される脂質セカンドメッセンジャーを検出・定量する脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法をも提供する。
【００１４】
この出願の発明は、第１２には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
【００１５】
そして、この出願の発明は、第１３には、前記非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における脂質セカンドメッセンジャーを定量する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、各々異なる機能を有する３つの部位からなるものである。つまり、この脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、選択的に脂質セカンドメッセンジャーを認識する脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位と、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位の脂質セカンドメッセンジャー認識を光学的に信号発信する発色部位と、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを膜に固定化させるための膜固定化部位からなるものである。
【００１７】
図１にこの出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの概略模式図を示した。この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は、脂質セカンドメッセンジャー（6）と共存したとき、脂質セカンドメッセンジャーと特異的に結合する部位（以下、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位）（2）が脂質セカンドメッセンジャー（6）と結合し、その際に生じる発色部位（31、32）の立体配座の変化が、光学的変化（7a、7b）として現れるという原理によるものであり、この光学的変化（7a、7b）を測定することにより、脂質セカンドメッセンジャー産生の部位や時間を特定し、定量できるものである。
【００１８】
脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）は、例えば、種々の脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質等のポリぺプチドである。脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質としては、検出・定量される脂質セカンドメッセンジャー（6）がホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸（PIP3）の場合には、GRP1のプレクストリン相同ドメイン（以下PHドメイン）（非特許文献６）、ARNOのPHドメイン、BtkのPHドメイン等が、ホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸（PI(3,4)P2）の場合には、TAPPのPHドメイン等が、ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸（PI(4,5)P2）の場合には、PLCδのPHドメイン等が、ホスファチジルイノシトール-3-リン酸（PI(3)P）（非特許文献９）の場合には、p40phoxのPXドメインやEEA1-2xのFYVEドメインが、ジアシルグリセロール（非特許文献１０）の場合には、PKCのC1ドメイン等が好ましく例示される。
【００１９】
もちろん、脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）は、脂質セカンドメッセンジャー（6）と特異的に結合するポリぺプチドであれば、これらに限定されず、合成および天然のあらゆるぺプチド鎖を用いることができる。
【００２０】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）において、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位としては、種々の発色団（31、32）が考慮される。このとき、発色団（31、32）は、脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）の結合により生じる脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）の立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、立体構造の変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、FRET）（非特許文献１１〜１３）の生起により色調に変化を来たす発色団がある。
【００２１】
したがって、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）においては、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位として、異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団（31、32）を、各々脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）の両末端にそれぞれ連結する。このような蛍光発色団としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）のブルーシフト変異タンパク質であるシアン蛍光タンパク質（CFP）や、GFPのレッドシフト変異タンパク質である黄色蛍光タンパク質（YFP）が好ましく選択される。このとき、CFP（31）を脂質セカンドメッセンジャーと特異的に結合するポリぺプチドのN-末端に、YFP（32）をC-末端に連結することにより、それぞれドナーおよびアクセプターとして作用し、FRETを生起する。
【００２２】
また、脂質セカンドメッセンジャー（6）は、形質膜、内膜等の膜（8）で産生されることから、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は、末端に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を膜に固定化するための膜局在化配列（5）を有する。このような膜局在化配列（5）は、いずれか一方の発色団（32）に連結されており、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を膜（8）に固定化させるものである。具体的には、細胞膜に対しては、K-RasやN-Ras等の脂質化配列（非特許文献１４）や膜貫通配列が例示される。もちろん、検出する脂質セカンドメッセンジャー（6）あるいは固定化させたい膜（8）に応じて、膜局在化配列（5）を適宜選択すれば、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を形質膜や内膜に対してのみならず、核の内膜、あるいはミトコンドリアの外膜等の他の細胞小器官膜に対しても固定化できる。具体的には、小胞体膜やゴルジ体膜に対しては、N-RasのC181S変異体やN-RasのC181変異体-eNOS、ミトコンドリア膜に対しては、Tom20、カベオラに対しては、caveolin、ラフトに対しては、Cbpが例示される。さらに、その他の核膜やペルオキシソーム膜などのオルガネラ膜上の脂質セカンドメッセンジャー（6）も、それぞれのオルガネラ膜に局在するタンパク質内の局在化配列を導入すれば固定化できる。
【００２３】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）が細胞内に導入されると、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は、細胞膜（8）に固定化されるが、このとき脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は二つの発色団（31、32）が離れた立体配座をとる（A）。しかし、細胞膜（8）中で脂質セカンドメッセンジャー（6）が産生されると、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）がそれを認識し、結合が生じて脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）の立体配座が反転する。これにより二つの発色団（31、32）が近接してFRETを生起する（B）。
【００２４】
このような機構によりFRETが生起し、脂質セカンドメッセンジャー（6）の検出を光学的変化として発信するためには、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）における異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団（31、32）は、脂質セカンドメッセンジャー（6）非共存下では、立体的に離れた位置にあり、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）と脂質セカンドメッセンジャー（6）の結合により敏速に立体配座が反転する必要がある。そのため、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）と蛍光発色団（31、32）は、剛直なリンカー配列（41、42）、例えばEAAAR（配列番号１）の繰り返し配列からなる剛直なα−ヘリックス状リンカー（非特許文献１５）を介して連結していなければならない。
【００２５】
さらに、このような剛直なリンカー配列（41、42）において、少なくとも一つは、蝶番のような働きをする柔軟な部位（43）を有することが望ましい。これにより、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）が細胞膜（8）に固定化された際に、脂質セカンドメッセンジャー（6）非共存下では、二つの発色団（31、32）が離れた立体配座をとり、細胞膜（8）中で脂質セカンドメッセンジャー（6）が産生され、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）と脂質セカンドメッセンジャー（6）の結合が生じた際には、立体配座が反転して二つの発色団（31、32）が近接できるようになる。このように蝶番様の作用を示す柔軟な部位（43）は、側鎖の小さいアミノ酸数個からなるものであればよく、具体的にはジグリシンモチーフが例示される。
【００２６】
また、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）において、前記の膜局在化配列（5）と蛍光発色団（32）についても、同様の剛直なリンカー配列（44）を介して結合しているものとする。さらに、膜局在化配列（5）は、いずれの発色団（31、32）に連結されていてもよいが、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）が細胞膜（8）に固定化された際に、好ましい立体配座をとるためには、前記の蝶番様の柔軟な部位（43）を有するリンカー配列（42）によって脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）に連結された方の発色団（32）に連結することが望ましい。
【００２７】
以上のとおりのこの出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は、脂質セカンドメッセンジャー（6）と共存するとき、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（2）と脂質セカンドメッセンジャー（6）の結合が起こり、N-およびC-末端のそれぞれの蛍光発色団（31、32）によるFRETが生起して、蛍光波長の変化が生じるものである。したがって、この蛍光変化を通常行われる種々の化学的あるいは生化学的分析方法を用いて測定することにより、脂質セカンドメッセンジャー（6）を検出することが可能となるのである。また、蛍光強度と脂質セカンドメッセンジャー（6）の量の関係を予め検量することにより、試料における脂質セカンドメッセンジャーを定量することもできるのである。
【００２８】
この出願の発明では、以上のとおりの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）と脂質セカンドメッセンジャー（6）を共存させる方法としては、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊して、細胞内から脂質セカンドメッセンジャーを溶出させ、その溶液に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を添加して、脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を共存させる方法があげられる。このような方法で脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を共存させる場合には、予め脂質を供給してリポソーム膜を形成させ、そのリポソーム膜上に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を局在化させることにより、脂質セカンドメッセンジャー（6）をin vitroで検出・定量できる。
【００２９】
また、この出願の発明では、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する方法により、脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を共存させることができる。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を組み込んだ発現ベクターを細胞に導入する方法を用いることにより、脂質セカンドメッセンジャー（6）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）が細胞内で共存できる。したがって、細胞を破壊することなく、脂質セカンドメッセンジャー（6）の検出および定量をするin vivo法が可能となる。
【００３０】
さらに、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャーの検出および測定方法では、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）と脂質セカンドメッセンジャー（6）を共存させることもできる。このとき、細胞内で発現された脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）は、細胞内の任意の膜に固定化され、その膜において産生される脂質セカンドメッセンジャー（6）を検出・定量できるようになる。
【００３１】
この出願の発明では、以上のとおりの各種方法により、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）と脂質セカンドメッセンジャー（6）が共存しているトランスジェニック非ヒト動物が得られる。トランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えば、非特許文献１６）に従って作製することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを保有しているため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの検査物質を導入し、細胞および組織における脂質セカンドメッセンジャーの濃度を測定することによって、様々な物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３２】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３３】
【実施例】
〔準備〕
（１）試薬
以下の実施例において、各材料および試薬は次のものを使用した。
【００３４】
合成PIP3、L-α-ホスファチジル-D-myo-イノシトール-3,4,5-三リン酸（Dic16）は、和光純薬工業（日本、大阪市）から購入した。
【００３５】
ハムF-12培地、ウシ胎児血清、ハンクス液、およびリポフェクトアミン（LipofectAMINE）2000試薬は、ライフ・テクノロジーズ（メリーランド州、ロックビル）製のものを用いた。
【００３６】
ダルベッコ変法イーグル培養液およびPDGF-BBは、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
【００３７】
抗GFP抗体はクロンテック（カリフォルニア州、パロアルト）から購入した。
【００３８】
Cy5標識抗ウサギIgG抗体は、Jacson Immunoresearch Lab, Inc.（ペンシルバニア州、ウェストグローブ）から入手した。
【００３９】
BONIPY-セラミドC5およびブレフェルジンAは、Molecular Probes Inc.（オレゴン州、ユージーン）から購入した。
【００４０】
CFP突然変異は、F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N212K、YFP突然変異は、S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Yとした。
【００４１】
使用された他の化学物質は、すべて分析試薬等級とした。
（２）プラスミド構築
脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブのcDNAを構築するべく、CFP、リンカー配列（Ln1およびLn2）を有するPHD、リンカー配列（Ln3）と膜局在化配列（MLS1）を有するYFP、リンカー配列（Ln1およびLn2）を有するPHD-R284C（PHDの84番目のRがCに変換されたもの）、リンカー配列（Ln3）を有するYFP（以下YFP-Ln3）、およびリンカー配列（Ln3）と膜局在化配列（MLS2）を有するYFPのフラグメントcDNAは、標準的なPCRにより生成した。
【００４２】
各々はpBLuescript SK(+)へサブクローニングされた。クローニング酵素は、すべて宝酒造（日本、東京都）のものを、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【００４３】
PCRフラグメントは、ABI310ジェネティック・アナライザーにより配列決定した。
【００４４】
脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブをコードしている各cDNAは、哺乳類の発現ベクター、pCDNA3.1(+)（Invitrogen Co.、カリフォルニア州、カールズバート）のHind IIIおよびXhoI部位にサブクローニングされた。
＜実施例１＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの作成
図１に示されるように、ヒトGRP1（261-382）由来のPHDのN-末端にリンカーLn1（配列番号２）を介して発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）（例えば、非特許文献１７）の変異タンパク質である、シアン蛍光タンパク質（CFP）を、また、C-末端にリンカーLn2（配列番号３）を介して黄色蛍光タンパク質（YFP）をそれぞれ遺伝子工学的に連結し、さらに、YFPのC-末端にリンカーLn3（配列番号４）を介してN-Ras（非特許文献１８）のCAAXボックスモチーフを膜局在化配列MLS1（配列番号５）として連結して、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）（以下、Fllip-pmとする）を作成した。
【００４５】
また、この脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（1）において、PHDのアミノ酸配列を全長有するもの（図２ａ）の他に、同様の方法により、PHDの284番目のアルギニン残基をシステインに変換し、PIP3と結合しないようにしたもの（以下、Fllip-pmR284Cとする）（図２ｂ）、膜局在化配列MLS1を有さないもの（以下、Fllip-delとする）（図２ｃ）、および膜局在化配列をMLS1からMLS2（配列番号６）に変換したもの（以下、Fllip-emとする）（図２ｄ）を作製した。
＜実施例２＞  CHO-PDGFR細胞への脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（CGY）の導入
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO）を10 %ウシ胎児血清（FCS）を補充したHamのF-12培養液中、37℃、5 %CO2下で培養した。得られたCHO-PDGFR細胞をガラス底培養皿に塗布し、LipofectAMINE2000試薬（ライフテクノロジー社製）により37℃、5 %CO2下で24時間、Fllip-pm、Fllip-pmR284C、Fllip-del、およびFllip-em発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入した。
＜実施例３＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを導入されたCHO-PDGFRのイメージング
（１）Fllip-pm
無血清培養液で血清不足にした後、培養液をHankの平衡塩類溶液で置換した。
【００４６】
次に、発明者らによりすでに報告されている方法（例えば、非特許文献１２、１３）に基づき、室温下で、カール・ツァイス・アクシオバート135顕微鏡上で、MetaFluor（ユニバーサル・イメージング製）（ペンシルベニア州、ウェスト・チェスター）により制御された冷却CCDカメラMicroMAX（ローパー・サイエンティフィック製）（アリゾナ州、ツーソン）を用いて細胞を撮像した。
【００４７】
蛍光イメージは480±15 nmおよび535±12.5 nmのフィルターを通した40倍の油浸系対物レンズ（カール・ツァイス製）（ドイツ、イエナ）により検出した。YFPイメージは、共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM 510（カール・ツァイス製）により検出された。
【００４８】
図３に、CHO細胞におけるFllip-pmのの顕微鏡像を示した（ａおよびｃ：垂直方向、ｂ：水平方向）。これよりFllip-pmは、主としてCHO-PDGFR細胞の形質膜に局在化することが確認された。
（２）Fllip-em
次に図４に、CHO細胞におけるFllip-emの顕微鏡像を示した（ａ：抗GFP抗体によりCy5を染色、ｂ：ゴルジ体マーカーであるBODIPY-セラミドC5で染色、ｃ：小胞体マーカーであるブレフェルジンAで染色、ｄ：ａ〜ｃの重ね合わせ）。
【００４９】
MLS1における181番目のシステインがセリンで置換された変異体を膜局在化配列として用いたFllip-emでは、蛍光は内膜、すなわち小胞体（ER）およびゴルジ体に局在していた。
＜実施例４＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Fllip-pm発現CHO細胞における合成PIP3添加〕
実施例１で作成された各脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを、脂質セカンドメッセンジャーPIP3の合成品（1μM）でマイクロインジェクション法により刺激し、デュアルエミッション蛍光顕微鏡で蛍光を測定した。
【００５０】
図５に、CHO細胞におけるFllip-pmのFRET応答、すなわち、25℃、440±10 nmで励起させたCFP（480±15 nm）の発光強度とYFP（535±12.5 nm）の発光強度の比の経時変化を示した。
図５より、Fllip-pmのCFP/YFP発光比は、合成PIP3（1μl）の添加により急速に減少し、一定値に達することが確認された。これより、CFPからYFPへのFRETが、PIP3に比例して増大することが示された。したがって、Fllip-pmを用いて形質膜におけるPIP3の動態を可視化できることが示唆された。
＜実施例５＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Fllip-pm発現CHO-PDGFR細胞におけるPDGF刺激〕
次に、生理的刺激により産生されたPIP3に対するFllip-pmの応答性を調べた。
【００５１】
まず、Fllip-pmを、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）を安定に発現するCHO-PDGFR細胞に発現させた。血小板由来増殖因子（PDGF）は、形質膜におけるPDGFRの二量体化を促進し、それによりPDGFRを活性化させ、PDGFRに存在する多数のチロシン残基をリン酸化する。PI3Kは、Src相同2（SH2）ドメインを介してこれらのチロシルリン酸化部位に漸化され、それにより活性化される（非特許文献１９）。
【００５２】
PDGF（50 ng/mL）を形質膜にFllip-pmを発現している明るい細胞に添加した際の、CFP/YFP発光比の経時変化を図６および図７に示した。
【００５３】
図６ａより、PDGF（50 ng/mL）の添加により、直ちにCFP/YFP発光比が減少し、300秒以内に一定に達することが確認された。
【００５４】
一方、PI3Kの特異的阻害剤である、ウォルトマンニン100 nMを用いて同細胞を前処理し、同様にPDGFを添加したところ、PDGF刺激に対するFllip-pmのFRET応答が完全に消失することが確認された（図６ｂ）。
【００５５】
以上より、Fllip-pmは、形質膜において生理的に産生されたPIP3のレベルを検出できることが確認された。
＜比較例１＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Fllip-pmR284C発現CHO-PDGFR細胞におけるPDGF刺激〕
実施例４および５と同様の方法により、PHDがPIP3と結合しないように突然変異されたFllip-pmR284Cの応答性について検討した。
【００５６】
PDGF（50 ng/mL）を、形質膜にFllip-pmR284C（図２ｂ）を発現した細胞に添加した際の、CFP/YFP発光比の経時変化を図８ａに示した。
【００５７】
公知文献（非特許文献２０）に記載されるように、Fllip-pmR284Cは、PDGF刺激に対して応答を示さなかった。これより、Fllip-pmのFRET応答は、PHDが膜においてPIP3を認識したことによることが確認された。
〔Fllip-del発現CHO-PDGFR細胞におけるPDGF刺激〕
さらに、膜局在化配列（MLS）が欠失しているFllip-del（図２ｄ）を形質膜に発現した細胞に、PDGF（50 ng/mL）を添加した際のCFP/YFP発光比の経時変化を図８ｂに示した。
【００５８】
Fllip-delは、PDGF刺激に対し何ら応答を示さなかった。
【００５９】
これより、MLSが、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを細胞膜に固定化させるためだけでなく、膜における脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの反転型構造変化を生起する上でも重要な役割を果たしていることが示された。
＜実施例６＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Fllip-em発現CHO-PDGFR細胞におけるPDGF刺激〕
次に、実施例３（２）において、内膜内に局在化されることが確認されたFllip-emを用いて、内膜、すなわち小胞体およびゴルジ体におけるPIP3動態を可視化した。
【００６０】
まず、実施例２と同様の方法により、Fllip-emをCHO-PDGFR細胞に発現した。次に実施例５と同様の方法により細胞をPDGFで刺激し、CFP/YFP発光比の経時変化を測定した。結果を図９および図１０に示した。
【００６１】
Fllip-emの、CFP/YFP発光比はPDGF刺激により直ちには変化しなかった（図１０ａ）。一方、形質膜におけるFllip-pmは直ちに応答を示した（図１０ｂ）。しかし、100〜150秒後では、Fllip-emの内膜におけるCFP/YFP発光比は減少し、500秒以内に一定値に達することが確認された（図３ａ）。
【００６２】
これより、PDGF刺激により、形質膜のみならず、内膜においてもPIP3が増加することが示された。また、内膜におけるPIP3の増加が、形質膜におけるそれよりも2〜3倍大きいことが明らかになった。
【００６３】
なお、本発明者らは、他のペプチドリガンド、インスリン、および上皮増殖因子を用いた場合にも、同様に形質膜および内膜におけるPIP3の増加が誘導されることを確認している。
＜実施例７＞
そこで、刺激に際する内膜での実質的なPIP3の増加が形質膜でのそれと、どのような点で異なるのか、その機構を解明することを検討した。
【００６４】
内膜におけるPIP3増加の分子機構を調べるため、リジン４４がアラニンで置換されたdynaminのドミナントネガティブな変異体（DynK44A）（非特許文献２１）の、PIP3増加に対する影響を検討した。
【００６５】
Dynaminはグアノシントリホスファターゼ（GTPase）であり、PDGFRを含む受容体チロシンキナーゼのクラスリン介在性エンドサイトーシスを調節する（非特許文献２２）が、DynK44AはGTPase活性を欠いており、PDGFRのクラスリン介在性エンドサイトーシスを阻害する。
【００６６】
アデノウイルスを介在した遺伝子移入により、CHO-PDGFR細胞においてDynK44Aを発現した後、PDGF（50 ng/mL）により刺激した後、内膜におけるCFP/YFPの経時変化を測定し、図１１に示した。内膜において生起するFRETは、完全に失われていた。一方、形質膜では、DynK44Aの存在下でも、DynK44Aの非存在下と同様にPDGF刺激によりFllip-pmのFRET応答が直ちに観察された（図１２）。
【００６７】
以上より、内膜では、DynK44Aの過剰発現により、PDFG刺激によるPIP3増加が完全に阻害されたのに対し、形質膜においては、影響がなかったことが示された。
【００６８】
他のペプチドリガンド、インスリン、および上皮増殖因子による内膜内のPIP3の増加もまた、DynK44Aの過剰発現によりの過剰発現により阻害されたことから、クラスリン介在性エンドサイトーシスが、内膜における遅延性のPIP3増加を引き起こすことが明らかになった。
＜実施例８＞
そこで、どのようにしてエンドサイトーシスが内膜におけるPIP3増加を引き起こすのかについて検討した。
【００６９】
内膜におけるPIP3動態を詳細に調べるため、アデノウイルスを介在した遺伝子移入により、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（PTP1B）をCHO-PDGFR細胞において過剰発現させた。
【００７０】
PTP1Bは、主にERの細胞質側の表面上に局在化されることが知られている（非特許文献２３）。また、最近になって、PDGFRを含む受容体チロシンキナーゼがリガンドによる刺激を受けた場合、細胞表面で活性化された受容体がエンドサイトーシスにより内部移動した後、ERの細胞質側の表面においてPTP1Bにより脱リン酸化され、不活性化されることが報告されている（非特許文献２４）。
【００７１】
筆者らは、過剰発現されたPTP1Bが、エンドサイトーシスされたPDGFRを選択的に脱リン酸化すること、および形質膜におけるPDGFRには影響を及ぼすことなく、ERの細胞質側の表面でのPDGFRによるPI3Kの補充および活性化を阻害することを期待した。
【００７２】
PTP1BをCHO-PDGFR細胞に過剰発現させ、Fllip-emを用いてPDGF刺激後の内膜におけるCYP/YFP発光強度比の経時変化を測定し、図１３に示した。PDGF刺激によるPIP3の増加は、完全に失われていた。
【００７３】
一方、形質膜では、Fllip-pmを用いて検出されたPDGF刺激によるPIP3の増加は、PTP1Bの過剰発現により影響されなかった（図１４）。これは、形質膜にはPTP1Bが存在しないためと考えられる。
【００７４】
以上より、PIP3量の増加は、クラスリン被覆エンドサイトーシス小胞体により、活性化されたPDGFRが内膜に内部移動され、それによりPI3Kが活性化し、PIP3が内膜で産生されたことによると示唆された。したがって、形質膜において産生されたPIP3の、エンドサイトーシス小胞体による内膜への流入は無視できる程度であり、むしろ、内膜において観察されるPIP3は内膜においてin situで産生されていることが示された。
【００７５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、脂質セカンドメッセンジャーを検出・定量することを可能とする脂質セカンドメッセンジャープローブと、それを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出・定量方法が提供される。この発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、遺伝的にコードされた蛍光プローブであり、あらゆる脂質セカンドメッセンジャーに対して適応性を示す。
【００７６】
したがって、この発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを用いることにより、脂質セカンドメッセンジャーの単一生細胞における動態を可視化できるだけでなく、各種の外的刺激による脂質セカンドメッセンジャーの増加が、形質膜、内膜のいずれにおいて大きいのかや、脂質セカンドメッセンジャーの増加がどのような機構により生じるものなのかについても明らかにできる。
【００７７】
受容体エンドサイトーシスは、受容体の活性化を弱める作用だけでなく、下流でのシグナリングを調整する作用も有すると考えられてきた（非特許文献２１、２５、２６）が、これまでは、生細胞のどの部位において、いかにして、いつ、受容体エンドサイトーシスが起こり、シグナル経路が誘発されるのかについては明らかにされていなかった。この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、脂質セカンドメッセンジャー産生の機構、タイミング、および部位に関する広範な知見を得る上で非常に有用性が高いといえる。
【００７８】
また、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを用いることにより、今後さらに、例えば、細胞内の異なる膜において産生される同一の脂質セカンドメッセンジャー（例えばPIP3）が、その結合タンパク質の種類に応じて、異なる下流シグナルを調節し、遺伝子発現、細胞代謝、および細胞骨格の調節等の、個別の細胞機能を最終的に引き出していることなども明らかにされるものと期待される。
【００７９】
【配列表】
<110> Japan Science and Technology Agency
<120> Probe for visualizing lipid second messengers and method of detect
ion and determination of lipid second messengers using the same
<130> NP02527-YS
<160> 6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 1
Glu Ala Ala Ala Arg
1  5
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 2
Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu
1  5  10 15
Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 3
Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Gly
1  5  10 15
Gly Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 4
Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu
1  5  10 15
Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala ArgGlu Ala
20 25 30
Ala Ala Arg
35
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 5
Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
1  5  10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthesized Oligopeptide
<400> 6
Gln Gly Ser Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
1  5  10
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の脂質セカンドメッセンジャー可視化プローブの構成を例示した概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、作製された各種の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの構成を示した概略模式図である。（ａ：Fllip-pm、ｂ：Fllip-pmR284C、ｃ：Fllip-del、ｄ：Fllip-em）
【図３】この発明の実施例において、CHO細胞に局在化されたFllip-pmの蛍光顕微鏡像を示した図である。（ａおよびｃ：垂直方向、ｂ：水平方向）
【図４】この発明の実施例において、CHO細胞に局在化されたFllip-emの共焦点レーザー走査型顕微鏡像を示した図である。（ａ：抗GFP抗体によりCy5を染色、ｂ：ゴルジ体マーカーであるBODIPY-セラミドC5で染色、ｃ：小胞体マーカーであるブレフェルジンAで染色、ｄ：ａ〜ｃの重ね合わせ）
【図５】この発明の実施例において、CHO細胞におけるFllip-pmのFRET応答（25℃、440±10 nmで励起させたCFP（480±15 nm）度とYFP（535±12.5 nm）の発光強度の比）の経時変化を示した図である。（矢印：合成PIP3（1μl）添加）
【図６】この発明の実施例において、Fllip-pm発現CHO-PDGFR細胞にPDGF（50 ng/mL）を添加した際の、CFP/YFP発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：PDGF添加、ｂ：Wortmannin処理後PDGF添加）
【図７】この発明の実施例において、Fllip-pm発現CHO-PDGFR細胞にPDGF（50 ng/mL）を添加した際の、添加後の経過時間毎の蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ａ：0秒、ｂ：100秒、ｃ：300秒、ｄ：500秒）
【図８】この発明の実施例において、Fllip-pmR284C発現CHO-PDGFR細胞およびFllip-del発現CHO-PDGFR細胞にPDGF（50 ng/mL）を添加した際の、CFP/YFP発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：Fllip-pmR284C、ｂ：Fllip-del）
【図９】この発明の実施例において、Fllip-em発現CHO-PDGFR細胞にPDGF（50 ng/mL）を添加した際の、添加後の経過時間毎の蛍光顕微鏡写真（25℃）を示した図である。（ａ：0秒、ｂ：120秒、ｃ：300秒、ｄ：600秒）
【図１０】この発明の実施例において、Fllip-em発現CHO-PDGFR細胞およびFllip-pm発現CHO-PDGFR細胞にPDGF（50 ng/mL）を添加した際の、CFP/YFP発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：Fllip-em、ｂ：Fllip-pm）
【図１１】この発明の実施例において、DynK44A発現CHO-PDGFR細胞をPDGF（50 ng/mL）により刺激した際の、内膜におけるCFP/YFP発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：DynK44A発現なし（小胞体刺激）、ｂ：DynK44A発現（PDGF刺激）、ｃ：DynK44A発現なし（PDGF刺激））
【図１２】この発明の実施例において、DynK44A発現CHO-PDGFR細胞をPDGF（50 ng/mL）により刺激した際の、形質膜におけるCFP/YFP発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：DynK44A発現、ｂ：DynK44A発現なし）
【図１３】この発明の実施例において、Fllip-emを用いてPTP1Bを過剰発現させたCHO-PDGFR細胞にPDGFを添加した際の内膜におけるCYP/YFP発光強度比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：PTP1B過剰発現、ｂ：PTP1B過剰発現なし）
【図１４】この発明の実施例において、Fllip-emを用いてPTP1Bを過剰発現させたCHO-PDGFR細胞にPDGFを添加した際の形質膜におけるCYP/YFP発光強度比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：PDGF（50 ng/mL）添加、ａ：PTP1B過剰発現、ｂ：PTP1B過剰発現なし）
【符号の説明】
A  脂質セカンドメッセンジャー非共存下
B  脂質セカンドメッセンジャー共存下
1  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ
2  脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位
31  発色団（CFP）
32  発色団（YFP）
41  剛直なリンカー配列
42  剛直なリンカー配列
43  柔軟な部位
44  剛直なリンカー配列
5  膜局在化配列
6  脂質セカンドメッセンジャー
7a  脂質セカンドメッセンジャー非共存下の発光
7b  脂質セカンドメッセンジャー共存下の発光
8  膜
【図１】
0003878922.tif 000002
【図２】
0003878922.tif 000003
【図３】
0003878922.tif 000004
【図４】
0003878922.tif 000005
【図５】
0003878922.tif 000006
【図６】
0003878922.tif 000007
【図７】
0003878922.tif 000008
【図８】
0003878922.tif 000009
【図９】
0003878922.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
0003878922.tif 000012
【図１２】
0003878922.tif 000013
【図１３】
0003878922.tif 000014
【図１４】
0003878922.tif 000015