(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、目的酵素を含むトランスジェニック種子を使用する方法：
ａ）前記目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物により双子葉植物を形質転換し、前記酵素を前記トランスジェニック植物の種子中で発現する工程、ここで前記目的酵素は異種酵素であるフィターゼまたはα−アミラーゼである；
ｂ）前記種子を収穫する工程；及び
ｃ）前記種子を食物又は飼料へ添加することにより、または前記種子を大豆加工、湿式磨砕、澱粉液化、製紙工業におけるプロセス、食品及び飲料工業におけるプロセス及びベーキング工業におけるプロセスからなる群から選択される工業的プロセスにおいて添加することにより、前記酵素を触媒反応に用いる工程。
【請求項２】
食物又は飼料へ添加される該種子が、動物の栄養吸収を改良する酵素を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
食品及び飲料工業におけるプロセスが、発酵または醸造プロセスである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該種子を、食物若しくは飼料へまたは該工業的プロセスへ添加する前に粉砕する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該種子を、食物若しくは飼料へまたは該工業的プロセスへ添加した後に粉砕する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
消化反応を触媒し得るフィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物により形質転換され、前記目的酵素を種子中で発現するトランスジェニック双子葉植物の種子の医薬的有効量を動物（ヒトを除く）に投与することを特徴とする消化疾患を持つ動物の治療法。
【請求項７】
前記種子を動物（ヒトを除く）に投与する前に粉砕することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
反応混合物中の基質を触媒し得るフィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物により形質転換され、前記目的酵素を論種子中で発現するトランスジェニック双子葉植物の種子を、前記目的酵素が触媒すべき基質を含む、食物若しくは飼料へ、または大豆加工、湿式磨砕、澱粉液化、製紙工業におけるプロセス、食品及び飲料工業におけるプロセス及びベーキング工業におけるプロセスからなる群から選択される工業的プロセスにおける反応混合物へ添加することを特徴とするインビトロ反応の触媒方法。
【請求項９】
食物若しくは飼料に、または大豆加工、湿式磨砕、澱粉液化、製紙工業におけるプロセス、食品及び飲料工業におけるプロセス及びベーキング工業におけるプロセスからなる群から選択される工業的プロセスに使用するための組成物であって、フィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物により形質転換され、前記目的酵素を種子中で発現するトランスジェニック双子葉植物の種子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
組成物中に含まれる種子が粉砕されていることを特徴とする請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
請求項９記載の組成物を含む食物または飼料。
【請求項１２】
工業的プロセスにおいて直接使用するための、フィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物により形質転換され、前記目的酵素を種子中に発現するトランスジェニック種子生産双子葉植物。
【請求項１３】
下記の構成を有するプラスミドpMOG413。
0003938401.tif 000010
【請求項１４】
下記の構成を有するプラスミドpMOG429。
0003938401.tif 000011
【請求項１５】
下記の構成を有するプラスミドpMOG227。
0003938401.tif 000012
【請求項１６】
請求項１３に記載のプラスミドpMOG413でトランスホームされていることを特徴とする請求項１２記載のトランスジェニック種子生産植物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のプラスミドpMOG429でトランスホームされていることを特徴とする請求項１２記載のトランスジェニック種子生産植物。
【請求項１８】
請求項１５に記載のプラスミドpMOG227でトランスホームされていることを特徴とする請求項１２記載のトランスジェニック種子生産植物。
【請求項１９】
フィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物で形質転換されたトランスジェニック双子葉植物の種子であって、種子中で発現されかつ抽出または精製されていない前記目的酵素を含む前記種子を使用して、動物（ヒトを除く）における食物または飼料の消化を増進させる方法。
【請求項２０】
該種子を食物または飼料として使用する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
フィターゼまたはα−アミラーゼである目的酵素をコードするＤＮＡを含む発現構築物で形質転換されトランスジェニック双子葉植物の種子であって、種子中で発現されかつ抽出または精製されていない前記目的酵素を含む前記種子を動物（ヒトを除く）に投与することを特徴とする、膵臓不全を軽減するための治療方法。
【発明の詳細な説明】
（関連分野）
本発明はトランスジェニック植物の種子における目的酵素の生産および該酵素の抽出および単離を必要としない工業プロセスにおける該生産種子の使用に関する。
（関連技術）
多くの工業において酵素が使われている。それらには洗剤、織物、酪農、食品および飲料、飼料などの工業が含まれる。現在、工業規模での酵素の生産は発酵や動植物からの単離で得ている。微生物によって生産される酵素にはプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、フィターゼなどがある。発酵による酵素生産は非常に効率が良く、培地１リットル当り１０グラムの生産レベルが達成できる。
有用なたんぱく質生産システムとしてトランスジェニック植物の使用が提案された。今日までの例としてはタバコにおけるインターフェロン（グッドマン（Goodman）等、１９８７）、タバコ、ブラシカナパス（Brassica napus）およびアラビドシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）におけるエンケファリン（バンデケルクホブ（Vanderckhove）等、１９８９）、タバコにおける抗体（ハイアット（Hiatt）等、１９９０）およびタバコおよびポテトにおけるヒト血清アルブミン（シモンズ（Sijmons）等、１９９０）の生産があげられる。
実際に、植物、特に双子葉植物（たとえば、タバコ、ポテト、トマト、ペチュニア（Petunia）、ブラシカ（Brassica））のトランスホーメーションは当分野でルーチンに行なわれている（クリー（Klee）等、１９８７、ガサー（Gasser）およびフレーリー（Fraley），１９８９）。植物における外来遺伝子の発現の方法は確立されている（ガサー（Gasser）およびフレーリー（Fraley），１９８９）。植物遺伝子由来の調節配列で植物および植物細胞において機能的に発現し得るキメラ遺伝子の構築に使用できるものが同定されている。
植物に遺伝子構築物を導入するためにアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によるトランスホーメーションなどいくつかの方法が使用できる。この方法を用いて広範囲の植物組織が利用されてきており、その選択は植物種と組織培養の容易さに大きく依存している。うまくいった例にはプロトプラスト、マイクロスポアまたは花粉、および葉、茎、根、胚軽および子葉などの植物器官のトランスホーメーションがある。
さらにプロトプラストおよび植物細胞または組織に直接ＤＮＡを導入する、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝突および直接的ＤＮＡ取り込みなどの方法も使用される（ガサー（Gasser）およびフレーリー（Fraley），１９８９）。
種々の発現システムを用いて植物種子中でたんぱく質が生産される。たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターを用いると（ギリー（Guilley）等、１９８２）、とりわけトランスジェニック植物の種子に発現したたんぱく質が蓄積される。それとは別に、種子貯蔵たんぱく質をコードする遺伝子由来のプロモーターも利用できる。
種子貯蔵たんぱく質は非常に組織特異的に、かつ段階特異的に発現される（ヒギンズ（Higgins）、１９８４；ショートウェル（Shortwell）およびラーキンス（Larkins）１９８９）。すなわちその遺伝子は種子中種子分化の段階にのみ発現する。種子貯蔵たんぱく質（ヒギンズ（Higgins）、１９８４；ショットウェル（Shotwell）およびラーキンス（Larkins）、１９８９）は分化する種子中に有意に蓄積し（全種子たんぱく質の９０％まで）かつ発芽の際に加水分解して実生の早期の栄養源を提供するたんぱく質と定義される。このたんぱく質はたんぱく質体または貯蔵液胞と呼ばれる細胞内要素に含まれる。このたんぱく質体にはプロテアーゼインヒビターが含まれ、プロテアーゼフリーの環境が作られている。貯蔵たんぱく質を分解するプロテアーゼは発芽後３〜６日間活性となる。
多くの種子貯蔵たんぱく質遺伝子がその５′および３′側隣接領域とともに単離され、特徴づけられている（カセー（Casey）およびドモニー（Domoney）、１９８７）。グロブリンおよびアルブミンの例には大豆のグリシニンおよびコングリシニン遺伝子（フィッシャー（Fischer）およびゴールドバーグ（Goldberg）、１９８２；ハラダ（Harada）等、１９８９）、えんどう豆のレグミンおよびビシリン遺伝子（リセット（Lycett）等、１９８４；ヒギンズ（Higgins）等、１９８８）、１１Ｓフィールドビーン遺伝子（ボームレイン（Baumlein）等、１９８６）、ファセオラス（Fhaceolus）の７Ｓファセオリン遺伝子（ドイル（Doyle）等、１９８６）、ブラシカ（Brassica）のクルシフェリンおよびナピン遺伝子（ライアン（Ryan）等、１９８９；スコフィールド（Sco-field）およびクロー（Crough）、１９８７；ラドケ（Radke）等、１９８８）、ひまわりのヘリアンシン遺伝子（ボンダーハー（Vonder Haar）等、１９８８；ジョルダノ（Jordano）等、1989）およびアラビドシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）の２Ｓアルブミンおよびクルシフェリン遺伝子（バンデケルクホブ（Vande-kerckhove）等、１８９８；パン（Pang）等、１９８８）がある。
他の例はプロラミンおよびクルテリンをコードする遺伝子に見られる（カセー（Casey）およびドモニー（Domoney）、１９８７）。一般に貯蔵たんぱく質はマルチジーン群にコードされている。
種子貯蔵たんぱく質遺伝子はタバコ、ペチュニアおよびナタネの種子に移された（オカムラ（Okamuara）等、１９８６；ビーチー（Beachy）等、１９８４；セングターゴパラン（Sengupta-Gopalan）等、１９８５；ヒギンズ（Higgins）等、１９８８；エリス（Ellis）等、１９８８；バーカー（Barker）等、１９８８；バンデケルクホブ（Vandekerckhove）等、１９８９；アルテンバック（Alatenback）等、１９８９）。えんどう豆のベーターファをセリンの５′上流調節領域を用いて、ベーターグルクロニダーゼ（バストス（Bustos）等、１９８９）、フィトヘマグルチニン（ボルカー（Voelker）等、１９８９）、ルシフェラーゼ（リグス（Riggs）等、１９８９）およびゼイン（ホフマン（Hoffman）等、１９８７）をタバコで発現させた。アラビドシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）２Ｓアルブミン遺伝子のプロモーターを用いてタバコ、ブラシカナパス（Brassica napus）およびアラビドシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）において同種由来の２Ｓアルブミン修正物が発現された（バンデケルクホブ（Vandekerck-hove）等、１９８９）。先に述べた遺伝子は組織特異的かつ分化的に調節されて、すなわち種子中種子分化の際に発現された。これら全ての報告における発現レベルは様々であるが、全種子たんぱく質の１．７％程のレベルまで到達している（ボルカー（Voelker）等、１９８９）。異種発現において機能的かつ安定なｍＲＮＡを得るための基礎としてｃＤＮＡをイントロンを含むゲノムＤＮＡと置き換え得ることが分った（チー（chee）等、１９８６）。これらの結果は植物分子生物学の分野の人がトランスホーメーション法に適用し得る標的植物種中で所定の遺伝子を種子特異的に発現させる方策を設計できることを示している。
双子葉植物の種子分化の際、たんぱく質合成の大部分は貯蔵実質細胞の液胞またはたんぱく質体で行なわれる。このプロセスの調節のために一般にたんぱく質は前駆体として合成される。この前駆体たんぱく質は通常そのＮ末端に疎水的シグナルペプチドを備えており、これは特定の段階で切除される。多くの貯蔵たんぱく質シグナルペプチドについての報告がある（ドイル（Doyle）等、１９８６；パン（Pang）等、１９８８；ボンダーハー（Vonder Haar）等、１９８８；イツリアガ（Iturriaga）等、１９８９；ドレル（Dorel）等、１９８９；ボルカー（Voelker）等、１９８９；ハットリ（Hattori）等、１９８５；リセット（Lycett）等、1983；スミス（Smith）およびライケル（Raikhel）、１９８９）。
異種発現システムにおけるシグナルペプチドの一般的使用は、シグナルペプチドと異種“パッセンジャーたんぱく質”の融合がパッセンジャーたんぱく質の輸送やプロセシングに使用できるという考え方を支持しているように思われる（たとえば、シモンズ（Sijmons）等、１９９０；ビテール（Vitale）およびボリニ（Bollini）、１９８６；スライトン（Slighton）等；デラシオパ（Della-Cioppa）等、１９８７）。これらの参考文献は多くの潜在用的“パッセンジャーたんぱく質”がこのような発現システムの候補であることを示している。
しかし、バイオリアクターとして植物を使用することの魅力や期待にもかかわらず、これまでのシステムは困難を伴うものである。先に示した例では植物がバイオリアクターとして使用され、目的のたんぱく質はトランスジェニック植物体、すなわち目的のたんぱく質をもっとも多く含む組織から単離される。生産される種子から目的のたんぱく質を単離するのは本質的に繁雑でコストがかかる（クレバース（Krebbers）およびバンデケルクホブ（Vandekerckhove）１９９０）。
この問題に対する解答は植物体から発現したたんぱく質を抽出する必要性を回避することである。東ドイツ特許ＤＤ275，704はトランスホームした大麦の未発芽種子における熱安定性ベーターグルカナーゼ発現用の構築物および発酵プロセスにおける該種子の使用を公開している。しかし、小さな粒状穀物を取扱うことにおける難かしい問題としては穀物植物のプロトプラストのトランスホーメーションばかりではなく、トランスホームした植物の再生があげられ、これらは該公開で解決されていない。このようにこれまで公表されてきたプロセスを用いて酵素含有種子を得ることは出来ない。
（発明の概要）
本発明に従がい、目的の酵素を少なくとも１つ含む種子が提供され、これは該酵素を最初に抽出および、または単離することなく消化反応を目的とした触媒として種々の工業または食料、飼料に使用することができる。
種子において種々の目的酵素を発現し得る植物のトランスホーメーションを目的としたＤＮＡ構築物が提供される。この構築物は発現すべき酵素をコードするＤＮＡ配列に機能的に結合したシグナル配列を有している。これらの構築物は種子において所望される酵素を発現し得る調節配列のコントロール下にある。
また本発明は安定で管理可能な貯蔵型酵素としてトランスジェニック植物の種子を提供する。この酵素はプロテアーゼ活性が低く分解されにくい乾燥環境に維持する。
さらに貯蔵酵素としての種子は容易にパッケージされ、輸送され、実際に容易に取り扱い得る安定なベヒクルを提供する。
さらに、本発明は目的酵素を生産する種子から該酵素を抽出する高価で問題の多いプロセスに対する解答を提供する。この酵素は種子の内部に安定して残存しており、純料な酵素の代替物として使用し得る。種子生産植物は低コストで生育できることとともにこの利点がこれらの酵素の経済的に提供する。このように本発明は種々の酵素の生産貯蔵および使用に関するコストを低減することができる。
（図式の簡単な説明）
第１図：フィターゼｃＤＮＡのクローニング。
第２図：バイナリーベクターｐＭＯＧ２３。
第３図：ブラシカナパス（Brassica napus）の種子貯蔵たんぱく質クルシフェリン遺伝子のゲノム配列。
第４図：種々の構築に使用した合成オリゴヌクレオチド二本鎖。
第５図：プラスミドｐＭＯＧ４２９。クルシフェリンシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流の成熟フィターゼをコードするｃＤＮＡの一部を含むバイナリーベクターｐＭＯＧ２３。
第６図：フィチン塩酸からの無機リンの放出に関するフィターゼ含有種子粉砕物添加の効果。
第７図：ベクターｐＰＲＯＭ５４中に存在するバチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子のゲノム配列。
第８図：プラスミドｐＭＯＧ２９。植物において構成的に発現する発現カセットおよびタバコシグナルペプチドをコードする配列を含むプラスミドｐＵＣ１８。
第９図：プラスミドｐＭＯＧ２２７。構成的発現を目的とした発現カセットにおいてシグナルペプチドをコードするタバコ配列の下流に成熟酵素をコードするα−アミラーゼ遺伝子の一部を含むバイナリーベクター。
第１０図：インビトロ消化モデルにおけるアスペルギラス（Aspergillus）フィターゼの投与−応答関係。
第１１図：インビトロ消化モデルにおけるタバコ種子に含まれるフィターゼおよびアスペルギラス（Aspergillus）フィターゼの投与−応答関係。
第１２図：Ａ）バチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼをコードする遺伝子でトランスホームしたタバコ種子、Ｂ）バチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼおよびＣ）バチルスアミロリクェファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼを用いてポテトデンプンを加水分解して得られるオリゴ糖パターンの比較。
第１３図：Ａ）バチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ、Ｂ）バチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼおよびＣ）バチルスアミロリクェファシエンス（Bacillusa myloliquefaciens）α−アミラーゼを用いてコーンデンプンを加水分解して得られるオリゴ糖パターンの比較。
［発明の詳細な説明］
本発明で生産される目的の酵素には工業プロセスで使用し得る酵素が含まれる。
目的とする酵素にはこれを生産する植物とは異種（すなわち、この植物種には本来存在しない）である酵素が含まれる。また生産する植物と同種（この植物種に本来存在する）で、組換えDNA技術により過剰生産される酵素も含まれる。
このような酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、リンザイム、プルラナーゼおよびキチナーゼなどの加水分解酵素、ペクチンリアーゼなどのリアーゼおよびグルコースイソメラーゼなどのイソメラーゼから選択する。好ましい酵素としてはフィターゼ、α−アミラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドキシラナーゼ、エンドガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、セリンプロテアーゼ、キモシン、パパイン、胃リパーゼ、ペクチンリアーゼおよびグルコースイソメラーゼがある。
工業プロセスとはインビボにしろインビトロにしろ少なくとも１つの基質を含む反応混合物に抽出および、または単離した酵素が含まれるプロセスで、該酵素が基質の反応を触媒し所望される産物を生産する。
このようなプロセスの例には、大豆処理におけるフィターゼの使用、または湿式粉砕などの工業的プロセスまたはフィチン酸塩からのイノシトールまたはイノシトールリン酸の生産のようなインビトロプロセスなどがある。ヘミセルラーゼやセルラーゼも一般に細胞壁分解酵素として使用できる。同様の方法で、α−アミラーゼはベーキング産物の均一性を改善するためにベーキング工業で使用できる。
α−アミラーゼ、アミロクルコシダーゼ、キシラナーゼおよび、またはグルコースイソメラーゼはデンプン可溶化に使用でき、リグニナーゼおよび、またはキシラナーゼは製紙工業に使用でき、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、および、またはセルラーゼは食品および飲料工業、たとえば発酵または醸造プロセスに使用される。
インビトロプロセスにおける酵素の上述の作用とは異なり、種子中に貯蔵される酵素を用いてインビボでの消化反応を触媒する。この様に、酵素は摂取した動物が容易に利用できない食物から栄養分を放出させる。
このようなインビボプロセスに使用される酵素にはフィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼなどが含まれる。これらの酵素は食料の消化を改善させる。消化助剤としても嚢胞性繊維症や膵臓不全など病気をもつヒトに酵素を用いることができる。種子に含まれるリパーゼ、プロテアーゼおよびセルラーゼもこのような疾患を有する消化不良を緩和する治療剤として使用し得る。
本発明に従がいトランスジェニック植物の種子に所望する酵素を生産する。この種子は酵素を抽出および、または単離することなくそこに含まれる酵素を必要とする工業プロセスで使用する。工業的用途に使用する酵素を含む種子はこれらのプロセスに直接使用することもできるし、またこれらを所望される大きさに粉砕して使用することもできる。いずれの場合にも種子自体または粉砕した種子はその酵素を抽出または単離することなく、かつその酵素活性を損失することなく所定のプロセスに使用される。
本発明で定義されているトランスジェニック植物には、それらの種子に目的とする少なくとも１つの酵素の生産または増産が起こるよう遺伝的に修正した植物およびそれらの子孫が含まれる。目的酵素の生産は野生型植物よりも増加している。
本発明において“増加した酵素を含む種子”とは同数の無修正の種子中の平均酵素量と比較して統計的に増加した酵素を含む統計的に有意な数の種子を示している。
本発明を実施することによりその種子に目的の酵素を生産し得る植物にはニコチアナ（Nicotiana）（たとえば、タバカム（tabacum））、ブラシカ（Brassica）（たとえば、ナパス（napus）およびオレラセ（oleracea））、アラビドシス（Arabidopsis）、グリシン（Glycin）（たとえばマックス（max））、ゼア（Zea）（たとえばマイス（mays）、アマラントス（Amaranthus）、ホルデウム（Hordeum）（たとえばサティバム（Sativum））およびピサム（Pisum）（たとえば、サチバム（Sativum）））、ジュグランス（Juglans）（たとえばレジア（regia）、アラキス（Arachis）（たとえばハイポジェ（hypogeae）、メジカゴ（Medicago）（たとえばサチバ（sativa）、ファセオラス（Phaseolus）（たとえばバルガリス（Vulgaris）、ピサム（Pisum）（たとえばサチバム（Sativum）、トリチカム（Triticum）（たとえば、エスチバム（aestivum）、パニカム（Panicum）Ｌ．、ヘリアンサス（Helianthus）（たとえばアナス（annus）、アベナ（Avena）（たとえばサチバ（Sativa））およびオリザ（Oryza）（たとえばサチバ（Sativa））などが含まれる。
選んだ植物種は１年当り植物当り大量の種子を生産し、かつその種子の化学的かつ物理的性質がその酵素を使用する工業プロセスに適合することが望ましい。たとえば、これらの種子（親植物のトランスホーメーション後）を食料に含める場合、タンニンやその他の反栄養因子が低い種子を生産する植物が選ばれる。その他の場合で、その種子をたとえば小麦粉への添加剤として使用するとき所望する程度に粉砕したトランスジェニック種子の能力が選択基準となる。別の態様では、目的の酵素を含む種子を直接、場合によっては収穫後脱穀および、または乾燥して所望するプロセス（たとえば食品）に適用する。最も適した植物の選択は再生実験に基づく。トランスジェニック種子を使用しようとする工業プロセスに目的の酵素と野生の種子とを一緒に添加できる。
上述の種子生産植物の遺伝子修正とは、目的の酵素をコードする遺伝子を含む発現構築物を標的植物に導入することを意味する。この発現構築物にはその植物の種子に於ける目的酵素をコードする遺伝子の発現を調節し得るプロモーターおよびターミネーター領域のコントロール下にあるその植物とは異種の遺伝子が含まれる。また、目的酵素の過剰生産を起こし得る調節領域のコントローール下にある、その植物と同種の遺伝子も含まれる。過剰生産とは野生型のレベルよりも多い目的酵素の生産を意味する。目的酵素をコードするＤＮＡ配列を有する発現構築物を標的植物に導入する方法はいくつかある。これらの方法にはカルシウム／ポリエチレングリコール法を用いたプロトプラストのトランスホーメーション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたは（コード化）粒子衝突法（ポトリカス（Potrykus）、1990）などがある。
これらの直接的ＤＮＡトランスホーメーション法に加え、ウイルスベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス（CaMVなど）、およびバクテリアベクター（たとえば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属など）のようなベクターを含むトランスホーメーションシステムを使用できる（ポトリカス（Potrykus）、１９９０）。選択および、またはスクリーニングの後トランスホームしたプロトプラスト、細胞または植物の一部を既存の方法を用いて完全な植物体に再生できる（ホーシュ（Horsch）Ｒ．Ｂ．等、１９８５）。
本発明にとってトランスホーメーション及び再生法の選択は重要ではない。
双子葉植物の場合、本発明の好ましい態様では毒性遺伝子を含むvirプラスミドおよび転移すべき遺伝子構築物を含む適合プラスミドを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を用いたバイナリーベクターシステム（ホーケマ（Hoekema）等、１９８３；シルヘルート（Schilperoort）等、１９８４）を使用している。このベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）のいずれにおいても複製でき、また本発明には関係しない修正を受けたバイナリーベクターＢin１９（ビバン（Bevan），１９８４）から誘導する。本実施例で使用するバイナリーベクターにはＴ−ＤＮＡの左および右側ボーダー配列にカナマイシン耐性をコードするＮＰＴII遺伝子（ビバン（Bevan），１９８４）および必要とされる遺伝子構築物にクローニングするための多重クローニング部位を含む。
単子葉穀物のトランスホーメーションおよび再生は標準操作ではない。しかし、最近の科学の進歩は基本的に単子葉植物のトランスホーメーションは容易であり、かつ、そのトランスホームした細胞から繁殖性のトランスジェニック植物を再生し得ることを示している。これらの穀物の再現的組織培養システムの発展は、植物細胞への遺伝物質の強力な導入法と共にトランスホーメーションを容易にした。現在、単子葉植物のトランスホーメーション法には植物体または懸濁細胞の微粒子衝突法およびプロトプラストの直接的ＤＮＡ取り込みまたはエレクトロポレーション法が使用されている。たとえば選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性をコードするバクテリアのhgh遺伝子を用いてトランスジェニックコメ植物が得られている。この遺伝子はエレクトロポレーションで導入した（シマモト（Shimamoto）等、１９８９）。トランスジェニックトウモロコシ植物はトウモロコシの懸濁培養した胚細胞に微粒子衝突法でホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスフィノスリシンを失活させる酵素）をコードするストレプトミセスハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）bar遺伝子を導入することにより得られる（ゴートンカム（Gordon-Kamm）等、１９９０）。小麦や大麦など他の単子葉穀物のアリューロンプロトプラストへの遺伝物質の導入も報告されている（リー（Lee）等、１９８９）。小麦は胚懸濁培養を行うため古く緻密で、かつ結節性の胚カルス組織のみを選択することにより胚懸濁培養物から再生した（バシル（Vasil）等、１９９０）。これらの穀物に対してトランスホーメーションシステムを組合せると本発明を単子葉植物に応用できる。これらの方法は双子葉植物のトランスホーメーションおよび再生に応用できる。
植物における組換え遺伝子の発現は植物のポリメラーゼによる遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳などに関連し、このことは組換えＤＮＡ技術の分野ではよく知られている。本発明を適正に理解する上での関連事項を以下に議論する。
既知または種子において組換えＤＮＡの高い発現を起こす（以下に議論するように特定の応用を目的とした）調節配列を本発明に使用し得る。これらの調節配列は植物または植物ウイルスから得ることもできるし、また化学合成することもある。これらの調節配列は種子において転写を行うプロモーターである。これらにはブラシカナパス（Brassica napus）のcruＡプロモーターなど特定遺伝子特に貯蔵たんぱく質遺伝子のプロモーター（ライアン（Ryan）等、１９８９）またはＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）の３５Ｓプロモーターなど構成的発現遺伝子のプロモーター（ギリー（Guilley）等、１９８２）などが含まれる。他の調節配列には植物中で機能するターミネーター配列およびポリアデニレーションシグナルがある。その例にはアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンテース遺伝子の３′側隣接領域またはブラシカナパス（Brassica napus）のcruＡ遺伝子の３′側隣接領域がある。また、これらの調節配列にはＣａＭＶの３５Ｓプロモーター内に見られるエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルス（AlMV）ＲＮＡ４のリーダー配列などのｍＲＮＡ安定化配列やこれらの機能を果たすその他の配列が含まれる（ブレデロード（Brederode）等、１９８０）。
目的のたんぱく質は種子成熟の際、このたんぱく質が安定に存在する環境にあるべきでる。本発明では目的たんぱく質の生物物理学的パラメーターに依存して、このような安定な環境を作るのに細胞質ゾル、小胞体、液胞、たんぱく質体、または細胞周辺腔など細胞要素を用いることができる。これらのパラメーターには好ましい細胞要素の至適pH、プロテアーゼ感受性または濃度依存性などが含まれる。同種シグナル配列が好ましいが、異種シグナル配列も使用し得る。種子貯蔵たんぱく質由来のシグナル配列が特に好ましい。
種子貯蔵たんぱく質はその溶解性に基づき４つのクラスに分類できる。
1. アルブミン……水溶性で２つのクラス（１２Ｓおよび２Ｓ）に分けられる。１２Ｓクラスにはえんどう豆や種々の豆から単離されるレクチン類、たとえばブラシカナパス（Brassica  napus）、アラビドシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）、リシナスコムニス（Ricinus communis）（ヒマの種子）、バーソレチアエクセルサ（Bertholletia excelsa）（ブラジルナッツ）、えんどう豆、ラディッシュおよびひまわりの２Ｓアルブミンが含まれる。
2. グロブリン……食塩水可溶性でファセオラス由来のファセオリン、えんどう豆由来のビシリン、大豆由来のコングリシニン、オーツ麦由来のオートビシリンなど７〜８Ｓクラスおよび他の種の７Ｓグロブリン、またはえんどう豆由来のレグミン、大豆由来のグリシェン、ひまわり由来のヘリアンシン、ナタネ由来のクルシフェリンなどの１１〜１４Ｓクラスまたはアラビドシス（Arabidopsis）および豆などその他の種由来の１１〜１４Ｓたんぱく質が含まれる。
3. プロラミン……水性アルコール溶解性でコーン由来のゼイン、大麦由来のホルディン、小麦から単離されるクリアジンおよびさとうもろこしのカフィリンなどが含まれる。
4. グルテリン……酸性またはアルカリ性溶液可溶性で、小麦から単離されるもの。
例外はあるけれども、双子葉植物の種子における主要な貯蔵たんぱく質はグロブリンであり、また単子葉植物の場合はプロラミンおよびグルテリンである。
本発明のＤＮＡ構築物のすべて領域（プロモーター、調節、安定化、シグナルまたはターミネーション配列）は必要性に応じてその制御特性を従来法で修正される。種子中の必要とされる組換えたんぱく質量（“発現レベル”）は本発明の好ましい態様でマイナーな（体質、重量またはコスト的に）添加物としてトランスジェニック種子を用いられるように十分高くなければならない。
種子に１つ以上の目的酵素を含むトランスジェニック植物を得るにはいくつかの方法がある。それらには以下に示す方法が含まれる。
a. １つ以上の目的酵素を発現するトランスジェニック植物の交配。
b. 必要な調節配列を用いた目的酵素をコードする多重遺伝子を含むＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる植物のトランスホーメーション。
c. 必要な調節配列を用いた目的酵素をコードする遺伝子を各々含む異なるＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる同時の植物のトランスホーメーション。
d. 必要な調節配列のコントロール下にある異なる目的酵素をコードするＤＮＡフラグメントまたはプラスミドを各々用いた植物の連続的トランスホーメーション。
e. 上述の方法を組合せたもの。
目的酵素を１つ以上含む種子を得るために使用する実際の方法は、本発明の目的に関して限定されない。野生型の種子と比較して酵素量が増加した種子が得られるならば上述の組換え法以外の従来法でも酵素量が増加した種子を得ることができることが指摘される。たとえば、ソマクローナルバリエーション法でもそのような種子を得ることができる。さらに、これらの方法は単独もしくは細胞質雄不稔（sterility）−（Ｃms）または核雄不稔（Ｎms）の考え方を採用する育生法と組合せて使用できる（マニアチス（Maniatis）等、１９９０）。ＣmsまたはＮmsを用いるソマクローナルバリエーションやクロスブリーディングのような方法は種子内の酵素の相対量を増加するため上述の組換え技術と組合せて使用し得る。種子内の酵素量を増加するために使用する非組換え技術に関する参考文献には１９８３年４月７日刊行の米国特許No.4,378,655がある（これは参考として引用している）。Ｐ．リクラーク（LeClercq）（１９６８）によって発現された細胞質雄不稔および１９７０年Ｍ．Ｌ．キンマー（Kinmar）等によって発見された対応する優性稔性（fertility）回復遺伝子（Ｒf）関する育生枝術を示している多くの文献がある。最近、核メールステリリティーの使用についてマリアニ（Mariani）等（１９９０）の報告がある。植物育生に関するより一般的な説明がジェームス（James）Ｒ．ウェルシュ（Welsh）“植物遺伝学と育生の基礎”、１９８１およびＪ．Ｍ．ポールマン（Poehlman）、“畑穀物の育生”、１９５９に示されている。
本発明の態様では、アスペルギラスフィカム（Aspergillus ficcum）から単離したｍＲＮＡからフィターゼをコードする二本鎖ｃＤＮＡが調製されている（ファンゴルコム（van Gorcom）等、１９９１）。このＤＮＡ構築物はブラシカナパス（Brassica napus）の１２Ｓ貯蔵たんぱく質クルシフェリン由来の調節配列のコントロール下にある。さらにこの構築物をｐＭＯＧ２３のようなバイナリーベクター（大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５α株中、1990年１月２９日セントラルブリューボアシメルカルチャー、バーン、オランダ、に受理番号ＣＢＳ１０２．９０として登録）にサブクローニングする。このベクターをディスアームしたＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）へ導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコまたはブラシカ（Brassica）植物組織と共培養し、ついでトランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択し、分化した植物体へと再生した。この植物はそのＤＮＡ構築物を含みかつ発現する種子を含んでいる。
本発明の別の態様では、フィターゼコードＤＮＡ構築物をカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター由来の調節配列のコントロール下に置いた。それからこの構築物をバイナリーベクターに導入する。このベクターをディスアームしたＴｉプラスミドを含むアグロバクターツメファシエンス（Agrobacter tumefaciens）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコまたはブラシカ（Brassica）植物組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択して分化した植物体へと再生させた。この植物はそのＤＮＡ構築物を含み構成的にこれを発現する。
トランスジェニック種子のフィターゼ酵素活性はＥＬＩＳＡ検定法、ウェスタンブロッティングまたは比色法または非変性ゲルを用いた直接的酵素検定法など多くの方法で測定できるが、本発明には本質的ではない。
このように生産されたフィターゼを含む種子を非反芻動物の飼料添加物、大豆処理、フィチン酸塩からのイノシトールまたはイノシトールリン酸の生産などの工業プロセスに使用できる。必要ならフィターゼを抽出および、または単離することなく工業プロセスに応じて使用前に種子をまず所望される大きさに粉砕することもできる。そのような調製ステップが必要か否かは当業者によって決定され得る。
また、種子内で生産されるフィターゼは浸せきコーンまたはさとうもろこし殻粒の処理にも使用できる。種子は浸せきコーンに添加する前に粉にしておいてもよい。種子から放出されるフィターゼは多くのコーン調合物に存在するフィチンに作用する。浸せきコーン中のフィチンの分解はコーン浸せき液の商品価値をあげる。これは動物飼料や微生物発酵に使用される。さらにフィチンの分解はコーン浸せき液の濃縮、輸送および貯蔵の際のフィルター、パイプ、反応容器などへのゴミの蓄積に関する問題を回避し得る（バーラ（Vaara）等、１９８９）。またフィターゼの作用は浸せき過程やコーン湿式粉砕に関する分離工程を促進する。
本発明の別の態様ではバチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡフラグメントをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびエンハンサー配列のコントロール下に置いた。Ａ１ＭＶ由来のＲＮＡ４のｍＲＮＡ安定化リーダー配列およびアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンテース遺伝子のターミネーターおよびポリアデニレーションシグナル配列を含める。その後この構築物全体をバイナリーベクターにサブクローニングする。このベクターをジスアームしたＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコ植物組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択した後、同様の培地を用いて分化した植物体に再生させる。生成した植物はこのＤＮＡ構築物を含みかつ発現する種子を生産する。
このトランスジェニック種子のα−アミラーゼ活性は比色法または非変性ゲル検定法を用いた直接的酵素検定法など方法（本発明には本質的ではない）で測定する。
この種子はα−アミラーゼ源として用いることができ、デンプンシロップの調製などの工業プロセスに直接使用される。この種子はまず粉砕され、その混合物は、当業者によって判断されるプロセスに使用し得る。
以下の実施例は当業者を対象とし本発明の実施および使用の方法を公開および説明するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。使用されている数（たとえば、量、温度、pH等）は正確となるよう配慮されているが、実験誤差やばらつきがあると考えるべきである。特筆しないかぎり、温度は℃で表わし、また圧力は大気圧である。
（実施例１）
アスペルギラスフィカム（Aspergillus ficum）のポリＡ+ＲＮＡの単離
２２．７２ｇ／ｌトウモロコシ粉（１５分間pH７、８５℃でアミラーゼ処理したもの）、９．３６ｇ／ｌグルコース、２．９ｇ／ｌＫＮＯ3、０．１４２ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．１４２ｇ／ｌ MgSO4・７H2Oおよび５６．８ｍｇ／ｌFeSO4・７H2Oを含む培地中でＡ．フィカム（ficum）ＮＲＲＬ３１３５株を培養する。６日後その菌糸体を収獲する。
乾燥した菌糸体（０．５ｇ）を液体窒素で凍結し、粉砕する。つづいて、この物質を３ＭLiCl、６Ｍ尿素溶液中、０℃でウルトラソラックス（フルスピード、１分）を用いてホモジナイズし、その後４℃で一晩放置する。（オーフレー（Auffray）およびロージャン（Rougeon）（１９８０））。全細胞性ＲＮＡは16000ｘｇの遠心とそれにつづくフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４８：２）による２回の抽出により得られる。このＲＮＡをエタノール沈殿した後、１０ｍＭトリス−HCl（pH７．４）、０．５％ＳＤＳ溶液１ｍｌに溶解する。ポリＡ+選択のため、全ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱し、NaCl濃度を０．５Ｍとした後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかける。１０ｍＭトリスpH７．０、１ｍM ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ NaClを含む溶液で数回洗浄した後、１０ｍＭトリスpH７．０、１ｍM ＥＤＴＡ溶液による溶出でポリＡ+ＲＮＡを採取する。
（実施例２）
フィターゼをコードするｃＤＮＡの調製およびクローニングｃＤＮＡの第１鎖を合成するため、実施例に従って調製したポリＡ+ＲＮＡ５μｇを１６．５μｌの水に溶解し、ついで以下の成分：２．５μｌ  ＲＮasin（３０Ｕ／μｌ）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ pH７．６、６ｍＭ MgCl2および４０ｍＭ  ＫＣｌを含むバッファ１０μｌ、２μｌ１Ｍ  ＫＣｌ、５μｌ０．１ＭＤＴＴ、０．５μｌオリゴ（ｄＴ）12-18（２．５ｍｇ／ｍｌ）、５μｌ８ｍＭ ｄＮＴＰミックス、５μｌ  ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）および２．５μｌモロニーＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を加える。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、１０μｌ  ０．２Ｍ  ＥＤＴＡおよび５０μｌ  H2Oを添加して反応を停止した。１１０μｌクロロホルムによる抽出を行ない、５分間の遠心後水層に５Ｍ  ＮＨ4Ａｃおよび４４０μｌ無水アルコール（−２０℃）を添加する。ドライアイス／エタノール液中３０分間冷却して沈殿化する。遠心（０℃、１０分間）後、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡペレットを７０％氷冷エタノールで洗浄する。ペレットを乾燥後２０μｌの水に溶解する。
フィターゼをコードするｃＤＮＡの単離は２つのフラグメントのポリメレーセチェーンリアクション（ＰＣＲ）で行った。２つのフラグメントを遺伝子内のＢamＨＩ部位で合わせ全長のcDNAを作製する。フィターゼｃＤＮＡのクローニング法を第１図に示す。フィターゼ遺伝子のシーケンシング（ファンゴルコム（van Gorcom）等、１９９１）で開始コンから約８００塩基対の所にＢamＨＩ部位が存在することが分った。このＢamＨＩ部位付近のヌクレオチド配列並びに開始コドン前のヌクレオチド配列およびフィターゼ遺伝子の停止コドンの後の配列を用いてＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドを設計する。
ポリメレースチェーンリアクションは、第１鎖合成反応産物および各オリゴヌクレオチド０．５μｇを含む１．５μｌの溶液を用いＴaqポリメラーゼ（シータス）の使用説明書に従って行う。増巾はパーキンエルマー／シータスのＤＮＡ増巾器を用いて行う。
９４℃、２分間、５５℃、２分間および７２℃、３分間の２５回のサイクル後、反応液をフェノールおよびクロロホルムの抽出で脱たんぱく質を行う。ＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭトリス、pH７、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファに溶解した後、適当な制限酵素で消化する。
このたんぱく質のＮ末端をコーザするフラグメントを増巾するため以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用する：
0003938401.tif 000002
増巾したフラグメントをＥcoＲＩで消化し、ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア製）のＥcoＲＩ部位にクローニングする。制限地図作成およびヌクレオチドシーケンシングでフラグメントの正当性が示された。このプラスミドをｐＧＢ９２５と命名する。
第２のフラグメントの雑巾用に以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用する。
0003938401.tif 000003
増巾されたフラグメントをＢamＨＩおよびＰstＩで消化し、予めＢamＨＩおよびＰstＩで消化したｐＴＺ１８Ｒにクローン化する。
制限地図作成およびヌクレオチドシーケンシングで正しいフラグメントが単離されたことが示された。このプラスミドをｐＧＢ９２６と命名する。
全長のｃＤＮＡを単離するため、ｐＧＢ９２５をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化し、フィターゼコードＤＮＡを含むフラグメントを単離する。このフラグメントを予めＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化したプラスミドｐＧＢ９２６にクローン化し、プラスミドｐＧＢ９２７を作製する。プラスミドｐＧＢ９２７は約１．８kbpのフィターゼをコードする全長のｃＤＮＡを含んでいる。
（実施例３）
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３の構築
本実施例ではバイナリーベクターｐＭＯＧ２３（大腸菌Ｋ１２ＤＨ５α株中、１９９０年１月２９日、受理番号ＣＢＳ 102.90でセントラルブリューボアシメルカルチャーに登録）の構築について説明する。
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３（第２図）はベクターＢin１９の誘導体である（ビーバン（Bevan）、M．，１９８４）。ｐＭＯＧ２３を得るため、ベクターＢin１９に分子生物学でよく使用されている方法を用い本発明に本質的ではない変化を与えた。まず、左側ボーダー（ＬＢ）および右側ボーダー（ＲＢ）の位置をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子II（ＮＰＴII遺伝子に関して入れ替える。第２に、ＮＰＴII遺伝子の方向を逆にしてＬＢの方向への転写を可能とする。最後にＢin１９のポリリンカーを以下の制限酵素認識部位：ＥcoＲＩ、ＫpnＩ、ＳmaＩ、ＢamＨＩ、ＸbaＩ、ＳacＩ、ＸhoＩおよびＨindIIIを含むポリリンカーと置き換える。
（実施例４）
植物における構成的発現を目的とした発現構築物へのアスペルギラスフィカムのフィターゼｃＤＮＡのクローニング
アスペルギラスフィカム（Aspergillus ficum）のフィターゼ遺伝子を調製し、構成的発現を目的とした発現構築物中カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流にクローン化する。この発現構築物には植物由来のシグナルペプチド配列に関するコード情報も含まれている。
フィターゼｃＤＮＡをプラスミドｐＭＯＧ２９と同様に発現構築物にクローン化する（ａ）に説明されている）。つづいてこの全構築物をバイナリーベクターｐＭＯＧ２３に導入し、アグロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移す。
ａ）発現ベクターｐＭＯＧ２９の構築
ＲＯＫ１の発現構築物（ボールコーブ（Baulcombe）等、１９８６）をＥcoＲＩ／Ｈind IIIフラグメントとしてｐＵＣ18にクローン化する。この構築物にはＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメント上にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターおよびＢamＨＩ／Ｈind IIIフラグメント上にはノパリンシンテース（nos）転写ターミネーターが含まれる。プロモーターフラグメントにはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの−８００から＋１までの配列が含まれる。含まれている部位＋１は転写開始部位である（ギリー（Guilley）等、１９８２）。部位−５１２にあるＮcoＩ部位の上流の配列を欠失させ、かつこの部位をＥcoＲＩ部位に変化させる。これはｐＵＣ１８中に存在する発現構築物をＮcoＩで切断し、一本鎖末端をクレノーフラグメントで充填した後、ＥcoＲＩリンカーをライゲーションすることにより行う。生成したプラスミドをＥcoＲＩで切断し、元のＮcoＩ部位の上流の３５Ｓプロモーターの配列を有するＥcoＲＩフラグメントを欠失させる。
nosターミネーターを含むＢamＨＩ／Ｈind IIIフラグメントをアルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）のＲＮＡ４のリーダー配列を含む合成ＤＮＡフラグメント（オリゴヌクレオチド二本鎖Ａ、第４図）で置換する（ブレデロード（Brederode）等、１９８０）。このことはＢamＨＩによる切断、Ｈind IIIによる切断および合成ＤＮＡフラグメントのライゲーションによって行う。ＢamＨＩ部位および上流の３つのヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発で欠失させる。生成したプラスミドにはnosターミネーター配列を含むＢamＨＩ／Ｈind IIIフラグメントが再導入される。β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２７５由来；ジェファーソン（Jefferson）、１９８７）をＮcoＩ／ＢamＨＩフラグメントとしてライゲーションし、プラスミドｐＭＯＧ１４を生成する。文献から−343と−９０の間の配列の重複は３５Ｓプロモーターの活性を増加させることが知られている（ケイ（Kay）等、１９８７）。２つの、いわゆるエンハンサー配列を含むプロモーターフラグメントを得るため、当分野でよく知られている以下のステップを行う。プラスミドｐＭＯＧ１４からＡccＩ／ＥcoＲＩフラグメントとしてエンハンサーフラグメントを単離し、ついでクレノーフラグメントで平滑末端化する。このフラグメントをＥcoＲＩで切断し、平滑末端化したｐＭＯＧ１４に、導入した。この結果平滑末端化したＥcoＲＩおよびＡccＩ部位の間の境界は新しいＥcoＲＩ部位を生成する。このプラスミド（ｐＭＯＧ１８）には２つのエンハンサー配列を含む３５Ｓプロモーター、ＡｌＭＶのＲＮＡ４リーダー配列およびＥcoＲＩ／Ｈind IIIフラグメント上になお存在する発現構築物中のnosターミネーターが含まれる。最後に、β−グルクロニダーゼをコードするＮcoＩ／ＢamＨＩフラグメントをＰＲＯＢ１２ ｃＤＮＡから誘導される合成ＤＮＡフラグメントＢ（第４図）と置換する（コーネリセン（Cornelissen）等、１９８６）。このフラグメントＢはタバコサムサンＮＮ由来のＰＲ−たんぱく質、ＰＲ−Ｓシグナルペプチド配列をコードする。１つのヌクレオチドを変えることによりシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列にＳphＩ部位を作る。この変化により、コードされるＰＲ−Ｓシグナルペプチドのアミノ酸は修正されない。このプラスミドをｐＭＯＧ２９と呼ぶ（第８図）。
ｂ）バイナリーベクターにおけるアスペルギラスフィカムのフィターゼ遺伝子のクローニング
ＳphＩおよびＢamＨＩで消化したプラスミド ｐＭＯＧ２９にオリゴヌクレオチド二本鎖Ｃ（第４図）をクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４０７を作成する。このオリゴヌクレオチド二本鎖にはＰＲ−Ｓのシグナルペプチドの最後の２つのアミノ酸とそれにつづく成熟フィターゼの最初の６個のアミノ酸に関するコード情報が含まれる。
全フィターゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＢ９２７をＸhoＩ（部分）およびＰstＩで消化する。アミノ酸６から成熟フィターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＸhoＩ／ＰstＩフラグメントをＸhoＩおよびＰstＩで線状化したプラスミドｐＭＯＧ４０７にクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４１７を作成する。
キメラフィターゼ遺伝子を含む全構築物をＥcoＲＩおよびＨind IIIで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にＥcoＲＩ／Ｈind IIIフラグメントとして挿入する。生成するバイナリープラスミドｐＭＯＧ４１３は大腸菌Ｋ−１２ＲＫ２０１３株（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む）（ジッタ（Ditta）等、1980）とともに植物へのＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクターツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株に導入して三者交配させる。
（実施例５）
タバコプロトプラストにおけるキメラフィターゼ遺伝子の一時的発現
タバコプロトプラストを構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下のキメラフィターゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡでトランスホームする。７２時間後フィターゼ活性検定法を用い、導入したフィターゼ遺伝子の一時的発現に関し処理したプロトプラストを検定する。
プロトプラストは月令１〜２才の無菌的に生育させたタバコ植物（ニコチアナタバカム（Nicotiana tabacum）ＳＲ１）から調製する。全操作はロデンバーグ（Rodenburg）等、（１９８９）に説明されている。トランスホーメーションは５×１０5個のプロトプラストのプラスミドｐＭＯＧ４１７ＤＮＡ４０μｇによるエレクトロポレーションで行う。エレクトロポレーション後プロトプラストは３ｍｌのＫ３Ｇ培地に懸濁する。フィターゼ活性検定を行うためプロトプラストをペレット化し、その上清３ｍｌを過剰の水に対して一晩透析する。透析物を凍結乾燥した後３００μｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムpH５．５に懸濁する。２５０ｍＭグリシン−ＨＣｌバッファpH２．５の代りに２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファpH５．５を用いること以外実施例１０に詳細に述べた方法で検定を行う。
これらの実験におけるフィターゼ１ユニットはpH５．５、３７℃で１分間に１．５ｍＭフィチン酸ナトリウムから１μＭのリン酸を放出する活性と定義される。
未処理のプロトプラストについては活性は見られなかった。
プラスミドｐＭＯＧ４１７でエレクトロポレーションしたプロトプラストは上清中のたんぱく質１ｍｇ当り０．２６ＰＴＵ活性（フィターゼユニット、実施例１０参照）を示す。
（実施例６）
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロール下のタバコにおけるキメラフィターゼ遺伝子の発現
タバコ組織を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下のキメラフィターゼ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＭＯＧ４１３を有するアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株と共培養することによりトランスホームする。トランスホーメーションはホーシュ（Horsch）等（１９８５）の方法に従がいタバコ（ニコチアナタバカム（Nicotiana tabacum）ＳＲｌ）葉ディスクの共培養で行う。選択培地（１００ｍｇ／ｌカナマイシン）で生育させ、根付かせかつ土壌に移した若芽からトランスジェニック植物を再生する。若木のＮＰＴII活性（カナマイシン耐性）を検定し、成熟させた後自家受粉させて結実させる。
このトランスジェニック種子に存在するフィターゼ活性を測定するためその５０ｍｇを１ｍｌ２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（pH５．５）中氷冷した乳鉢と乳棒でホモジナイズする。遠心後、上清を一時的検定で述べた方法で検定する。３２個のトランスホームしたタバコで最高全可溶性種子たんぱく質の０．４％のフィターゼ発現が観測された。トランスホームしていない植物ではフィターゼ活性は検出されなかった。
種子における高いフィターゼレベル（約０．４％）に基づいて２つのトランスジェニック植物系列、４１３．２５および４１３．３２を選択した。
（実施例７）
種子特異的発現構築物におけるアスペルギラスフィカムのフィターゼｃＤＮＡのクローニング
ブラシカナパス（Brassica napus）１２Ｓ貯蔵たんぱく質遺伝子クルシフェリン（cruＡ；ライアン（Ryan）等、１９８９）の配列を用い種子特異的発現が起こるように発現構築物を構築する。これらの配列は本発明の目的を達成するため同様の種子特異的遺伝子由来の配列と置換え得る。
フィターゼｃＤＮＡをこの発現構築物にクローン化する。最後に構築物全体をアグロバクテリウムツメファシエンス（Agro-bacterium tumefaciens）に導入し、これをトランスホーメーションに用いる。他のたんぱく質の場合、この遺伝子またはcDNAのクローニングは基本的にフィターゼｃＤＮＡについて述べた方法で行う。本実施例における全大腸菌トランスホーメーションには大腸菌Ｋ−１２ＤＨ５α株を使用する。
a）発現構築物の構築
種子特異的発現を目的とする発現構築物の構築のため、テンプレートとして単離したゲノムＤＮＡ（メトラー（Mettler）、I．J．，１９８７）を用いたＰＣＲでブラシカナパス（Brassica napus）ＣＶ、Ｊet  ＮeufのクルシフェリンＡ（cruＡ）由来のプロモーターおよびターミネーター配列を合成する。この遺伝子は種子特異的に発現され、またそのコード配列および隣接配列が決定された（ライアン（Ryan）等、１９８９）。
２組のオリゴヌクレオチドを合成する。１組はcruＡ５′隣接領域およびシグナルペプチドコード配列の一部をＥcoＲＩ／ＮcoＩフラグメントとして増巾するものである：
５′GTTCGGAATTCGGGTTCCGG３′および５′AACTGTTGAGCTGTAGAGCC３′もう１組はＢglII／Ｈind IIIフラグメントとして３′隣接配列の増巾に用いるものである。
５′CTTAAGATCTTACCCAGTGA３′および５′CGGAGAAGCTTGCATCTCGT３′オリゴヌクレオチドはそれらの末端に適当な制限部位を含み制限酵素で出現するフラグメントを消化後に直接発現構築物を構築できるように設計する。
シグナルペプチドをコードする配列の５４個のヌクレオチドを含むcruＡ遺伝子の５′側フラグメントをベクターｐＭＯＧ４４５（オリゴヌクレオチド二本鎖Ｅ（第４図）がＳstＩおよびＥcoＲＩで線状化されたベクターｐＵＣ１８にクローン化されている）のＥcoＲＩおよびＮcoＩ消化物にクローン化しベクターｐＭＯＧ４２４を生成する。ブラシカパナス（Brassica napus）クルシフェリンのシグナルペプチド配列の最後の５個のコドンを含む合成オリゴヌクレオチド二本鎖Ｄ（第４図）、成熟フィターゼのアミノ酸１−６をコードする配列および多重クローニング部位をＮcoＩおよびＨindIIIで切断したベクターｐＭＯＧ４２４にクローン化する。このベクターをｐＭＯＧ４２５と呼ぶ。３′cru Ａ  ＰＣＲフラグメントをＢglII／ＨindIIIフラグメントとしてＢglIIおよびＨindIIIで消化したｐＭＯＧ４２５にクローン化し、ｐＭＯＧ４２６を生成する。
ｂ）バイナリーベクターにおけるアスペルギラスフィカム由来のフィターゼ遺伝子のクローニング
アスペルギラスフィヵム（Aspergillus ficuum）フィターゼの全コード配列を含むプラスミドpＧＢ９２７をＸhoＩ（部分）およびＰstＩで消化する。アミノ酸６からの成熟フィターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＸhoＩ／ＰstＩフラグメントをＸhoＩおよびＰstＩで切断したベクターｐＭＯＧ４２６にクローン化する。このベクターｐＭＯＧ４２８からのキメラフィターゼ遺伝子を含む全構築物をＥcoＲＩ／ＨindIIIフラグメントとしてＥcoＲＩおよびＨindIIIで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３に挿入する。このバイナリーベクターｐＭＯＧ４２９（第５図）は植物に対するＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４（ホーケマ（Hoekema）等、１９８３、上述）に大腸菌Ｋ−１２  ＲＫ２０１３（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む）と共に導入して三者交配させる。
実施例８
タバコ種子におけるクルシフェリンプロモーターのコントロール下のフィターゼの安定な種子特異的発現
クルシフェリンプロモーターのコントロール下のフィターゼｃＤＮＡを含むバイナリーベクターｐＭＯＧ４２９を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４株をトランスホーメーション実験に用いる。タバコ（ニコチアナタバカム（Nicotiana tubacum）ＳＲ１）のトランスホーメーションはホーシュ（Horsch）等（１９８５）の操作に従がい葉ディスクの共培養を用いて行う。トランスジェニック植物は選択培地（カナマイシン１００mg／ｌ）で生育する若木から再生する。この若木をＮＰＴII活性について検定し（カナマイシン耐性）、成熟後自家受粉させて結実させる。各トランスホーマント由来の種子を集め、この種子サンプルの一部についてフィターゼの有無を検定する。トランスホームしていないコントロールの種子と比べて最も高い発現レベルのクローンの種子をカナマイシン存在下（２００mg／ｌ）で発芽させ（フィターゼについてもトランスジェニックであるので）、選択後種子中に最もフィターゼを含む植物を大量に生産するのに使用する。これからこれらをたとえば消化実験などに使用する。
トランスジェニック種子中のフィターゼ活性を測定するため、約５０mgの種子を１mlの２５mＭ酢酸ナトリウムバッファ（pH５．５）中氷冷した乳棒と乳鉢を用いてホモジナイズする。遠心後その上清を一時的検定法に従って検定する。５５個のトランスホームしたタバコ植物において、全可溶性種子たんぱく質の０．１５％に及ぶ最高フィターゼ発現レベルが観測された。トランスジェニック植物の茎、根および葉にはフィターゼ活性は検出されなかった。トランスホームしていない植物にもフィターゼ活性は検出されなかった。
（実施例９）
ナタネ種子のトランスホーメーション
本実施例ではキメラフィターゼ遺伝子を有するバイナリーベクターを含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）と植物組織を共培養することによりナタネのトランスホーメーションを説明している。トランスジェニック植物は抗生物質耐性で選択できる。このトランスジェニック植物をフィターゼ活性について検定する。高発現体をより詳細に解析し、次の実験に使用する。
バイナリーベクターにおける同じキメラフィターゼ構築物
（ｐＭＯＧ４２９）を実施例７の方法に従ってアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ4404株に導入する。この株を用いてナタネ種子（ブラシカナパス（Brassicanapus）CV．ウェスター）をトランスホームする。この目的で開花の直前、５〜６週令の植物からの表面滅菌した茎断片を１mg／ｌＢＡＰを含むＭＳ培地（フライ（Fry）等、１９８７）で２４時間前処理し、ついで同培地を含む新鮮なプレート上アグロバクテリウム（Agrobacterium）と４８時間共培養する。選択培地（５００mg/ｌカルベニシリン、４０mg/ｌパロモマイシン）で生育する若芽からトランスジェニック植物を再生し、タバコについて実施例８で説明しているようにさらに詳しく分析する。
（実施例１０）
フィターゼ活性検定
統計約０．２５ＰＴＵを含むニコチアナタバカム（Nicotiana tabacum）４１３．２５系列由来の種子２５mgを粉砕する。（ＰＴＵ＝フィターゼユニット。フィターゼ１ユニットはpH２．５、３７℃、１μmol／minの速度で１．５mＭフィチン酸ナトリウムから無機リンを放出する酵素量であると定義する）。
０．８６ｇフィチン酸ナトリウム、１１H2Oを含む２５０ｍＭグリシン／HClバッファ（pH２．５）５０ml中粉砕した種子をインキュベートする。アスペルギラス（Aspergillus）フィターゼの発現の至適pHは２．５および５．５であるが、植物のフィターゼ活性の効果を排除するため低い方のpHを用いる。
この混合物を３７℃で１５分または６０分インキュベートする。反応はインキュベート物５mlを１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）５mlに混合することで停止する。その後、停止した酵素液に１０mlの指示薬（モリブデン酸アンモニウム溶液（２．５ｇ（NH4）6Mo7O24・４H2Oおよび８ml濃H2S04の溶液を脱イオン水で２５０mlに希釈したもの）５０ml中３．６６ｇFeSO4・７H2O溶液）を加える。青色の強度を７００nmの波長で分光学的に測定する。Ｔ＝０で存在する無機リン酸含量をブランクとした。
０〜１mMレンジのリン酸の校正曲線から放出したリン酸量が測定できる。
（実施例１１）
粉砕したニコチアナタバカム種子と飼料とのインキュベーション
典型的実験において、溶媒抽出した大豆ミール０．２５ｇをフィチン酸ナトリウム添加以外上述の方法と同様に約０．２５ＰＴＵを含む粉砕ニコチアナタバカム（Nicotiana tabacum）種子（植物系列４１３．２５）２５mgとインキュベートする。この場合、添加したインキュベーション試剤は４１０mlバッファおよび９０ml脱イオン水の混合物。溶媒抽出した大豆ミール中のフィチン酸塩からのリン酸塩の放出は第６図に示す。粉砕種子を添加しないと活性は見られなかった。
実質的に同一の実験で基質にトウモロコシグルテン飼料を用いても同様の結果が得られる。その結果を第６図に示す。粉砕した種子がない場合や、フィターゼ活性のない種子を用いた場合は活性は見られなかった。
（実施例１２）
家禽消化管をシミュレートした条件下でのフィターゼを含むトランスジェニック種子のインビトロテスト
トランスジェニックタバコ種子から生産されるフィターゼの効果を検定するため、アスペルギラス（Aspergillus）フィターゼ活性を家禽の消化管内の条件をシミュレートしたモデルで測定する。
標準的家禽飼料サンプルをまず３９℃、６０分間、１ｇ／１５mlの懸濁液としてインキュベートし、動物のエブクロ中の条件をシミュレートする。つづいて、ペプシン溶液（メルク、５．２８／ｌ、pH３．０HClで調整）５mlを添加し、pHをHClで３．０に調整してから同温度でさらに９０分間インキュベーションを継続して胃の条件をシミュレートする。
インキュベーションの際、サンプルを採取して飼料に存在するフィチン酸塩から放出されるリン酸塩量を測定する。
菌類フィターゼの作用は第１０図から明白である。フィターゼ投与量を飼料kg当り２５０から１０００ＰＴＵまで増やしていくと飼料からのリン酸塩からの放出も増加する。
菌類フィターゼの代りにトランスジェニック種子サンプル（系列４１３．２５または４１３．３２、乳鉢で粉砕後）を添加すると同様のリン酸塩放出の増加が見られる（第１１図）。フィターゼを含まないコントロールのタバコ種子もテストした。ブランクコントロールと比べてリン酸の放出は観測できなかった。
飼料kg当り５０ｇのトランスジェニックタバコ種子を用いた結果を飼料kg当り５００および７５０ＰＴＵを用いた結果の比較はこのインビトロ家禽消化モデルにおいて１ｇタバコ種子が約１２ＰＴＵに相当することを示している。
（実施例１３）
動物テスト
動物技術的結果に関する植物種子で発現されるフィターゼの効果と、タバコ種子のネガティブな効果のない事をブロイラーを用いたテストで示す。
フィターゼ発現タバコ種子およびコントロールの種子を収穫する。この種子１００ｇを冷却に注意しながら５００μｍのポアサイズのふるい（レッチミルＺＭ１）をもちいて粉砕する。
日令１才の雄のブロイラー（ハイブロ）を２つのケージ（0.45m2）に入れる。最初の２日は室温を３２℃にし、次の一週間は４℃に冷やす。次の週からは温度は２℃に冷やす。ブロイラーは１時間光をあて３時間暗くするという条件で育てる。
この鳥は１日目にクローン３０ワクチンでニューキャッスル病に対する免疫化を行う。実験の際、ブロイラーは実験飼料で飼育する。実験期間中生育および飼料／ゲイン比を測定する。３日間、見かけ上の全リン使用量を測定し、この期間乾燥物質としての飼料消費を測定し、かつ排泄物を定量的に回収する。
見かけ上のリン使用量とはリンの取り込みと排泄物中のリンの差と定義する。
フィターゼを添加しない以下のコントロール飼料を用いた。
0003938401.tif 000004
飼料１（基本飼料）には飼料用リン酸は添加しない。飼料２および３には無水リン酸二カルシウムおよびリン酸−アンモニウム（比５：１）の混合物由来のカルシウムおよびリンが補なわれている。全ての実験飼料は基本飼料への添加によって得られる（第１表）。実験飼料４にはヴァンゴルコム（Van Gorcom）等、（1991）の方法に従って調製した微生物フィターゼが飼料kg当り４００ＰＴＵの濃度で含まれている。
実験飼料５は飼料９０kg当り３kgの非トランスジェニックタバコ粉砕種子を添加すること以外は飼料４と同じである。実験飼料６は飼料kg当り４００ＰＴＵとなるよう飼料９０kg当り３kgのトランスジェニックタバコ（系列４１３．２５）種子粉砕物を添加すること以外は飼料４と同じである。
実験は日令２４才以前の１６ケージ内の１７６羽のブロイラー（ケージ当り１１羽）を用いて行う。
処理（飼育）は２度繰り返し各段のケージはランダムに指定する。
リンの使用量は日令２１〜２４のブロイラーで測定する。
飼料４．５および６を供給した動物の生育およびリン使用量の結果はフィターゼ添加のポジティブな効果を示している（第２表）。
また飼料４．５および６の比較は飼料へのタバコ種子の添加はブロイラーなどの家畜の消化管中の微生物フィターゼの作用に匹敵し、動物技術的結果に関してはネガティブな効果はないことを示している。
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（実施例１４）
構成的発現を目的とした発現カセットにおけるバチルスチェニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子のクローニング
本実施例では、バチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子を調製し、植物由来のシグナルペプチド配列のコード情報を含む発現カセットにクローニングする。最後のステップとして、その構築物をバイナリーベクターにクローニングし、目的の植物のトランスホームに用いるアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）2BA４４０４株にクローニングする。α−アミラーゼ遺伝子に対して説明した方法を用いてその他の遺伝子またはｃＤＮＡをクローニングする。
本実施例における全てのトランスホーメーションは大腸菌Ｋ−１２ＤＨ５−α株で行った。
ａ）バチルスリチェニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子の調製
バチルス（Bacillus）のベクターｐＰＲＯＭ５４（１９８５年１１月５日、受理番号ＣＢＳ６９６．８５でセントラルブリューボアシメルカルチャーに登録される）に存在するバチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子をＸbaＩおよびＢclＩで消化する。このＸbaＩ／ＢclＩフラグメントをＸbaＩおよびＢamＨＩで線状化したプラスミドｐＵＣ１８にクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ３１８を生成する。テンプレートとしてｐＭＯＧ３１８を用い、ミスマッチプライマーでＢamＨＩ部位が生成する（第７図参照）ＰＣＲでＳalＩ／ＢamＨＩフラグメントを合成する。ＳalＩおよびＢamＨＩで消化したプラスミドｐＩＣ−１９Ｒ（マーシュ（Marsh）等、１９８４）にＳalＩ／ＢamＨＩ  ＰＣＲフラグメントをクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ３１９を生成する。ｐＭＯＧ３１８由来のα−アミラーゼの５′末端を含むＳalＩフラグメントをＳalＩで線状化したｐＭＯＧ３１９にクローン化する。これによって全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＭＯＧ３２０が生成する。
ｂ）ベクターｐＭＯＧ２９の構築
ベクターｐＭＯＧ２９を実施例４（ａ）に述べた方法で構築した。
ｃ）バチルスリチェニホルミスのα−アミラーゼのバイナリーベクターにおけるクローニング
プラスミドｐＭＯＧ３２０をＨgaＩおよびＢamＨＩで消化する。アミノ酸９から成熟α−アミラーゼをコードするＨgaＩ／ＢamＨＩフラグメントをコードするＨgaＩ／ＢamＨＩフラグメントを合成オリゴヌクレオチド二本鎖Ｆ（第４図）とともにＳphＩおよびＢamＨＩで線状化したｐＭＯＧ２９にクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ３２１を生成する。このオリゴヌクレオチド二本鎖はＰＲ−Ｓのシグナルペプチドの最後の２個のアミノ酸および成熟α−アミラーゼの最初の９個のアミノ酸に関するコード情報を有している。キメラα−アミラーゼ遺伝子を含む全構築物をＥcoＲＩおよびＨindIIIで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にＢcoＲＩ／ＨindIIIとして挿入する。生成したバイナリープラスミドｐＭＯＧ２２Ｆ（第９図）は大腸菌Ｋ−１２ＲＫ２０１３株（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む）（ジッタ（Ditta）等、１９８０）と共に植物へのＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４株との三者交配に用いた。
（実施例１５）
タバコにおけるバチルスリチェニホルミスα−アミラーゼの安定な発現
本実施例ではキメラα−アミラーゼ遺伝子を含むバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）との共培養でタバコのトランスホーメーションを行う。抗生物質でトランスジェニック植物を選択する。このトランスジェニック植物の種子のα−アミラーゼ活性を検定する。高発現体をさらに分析し、次の実験に使用する。
トランスホーメーション実験にはアグロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４株（ｐＭＯＧ２２７）を使用する。タバコ（ニコチアナタバカムNicotiana tabacum SR1）のトランスホーメーションはホーシュ（Horsch）等（１９８５）の方法に従がい葉ディスクの共培養によって行う。トランスジェニック植物は選択培地（１００mg／ｌカナマイシン）で生育する若芽から再生する。若木のＮＰＴII活性を検定し、成熟後自家受粉させて結実させる。各トランスホーマントの種子を集め、その一部をα−アミラーゼの有無について検定する。トランスホームしていないコントロール種子との比較で最も高い発現レベルのクローンの種子をカナマイシン存在下（２００mg／ｌ）で発芽させ（α−アミラーゼに関してもトランスジェニックなので）、最も高い量のα−アミラーゼを含む種子を生産し得る植物を大量に得るために選択を行なう。最高のα−アミラーゼ発現レベルは全可溶性種子たんぱく質の０．４％であった。これらの種子は、消化実験などに使用する。
（実施例１６）
種子中のα−アミラーゼのデンプン可溶化への応用
タバコの種子内で発現されるバチルスリチェニホルミス
（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼを以下に示すようにデンプンの可溶化に応用した。α−アミラーゼ発現種子およびコントロールタバコ種子各１００グラムを収穫する。種子の冷却に配慮して２５０μｍのポアサイズのふるい（レッチミルＺＭ１）で粉砕する。それらのα−アミラーゼ含量を測定するため、粉砕種子をｌ０倍容の１０mＭ  CaCl2含有の０．５Ｍグリシンバッファ（pH９．０）で０℃、３０分間抽出する。その上清をファデバス法（ファルマシアダイアグノスティクス）によるα−アミラーゼ測定に使用する。ユニットはＴＡＵ（熱安定α−アミラーゼユニット）を示す。
可溶化テストは以下のように行った。デンプンスラリー（組成：３．３kgコーンまたはポテトデンプン；このスラリーのＤ．Ｓ．（乾燥物質）８８％（２．９０４kgデンプン）；５．４５１水；スラリーのＤ．Ｓ．は３３％となる。pHは１Ｎ硫酸または１Ｎ NaOHで６．５に調整する。４．４Ｔ．Ａ．Ｕ／ｇＤ．Ｓ．に相当する粉砕種子または微生物由来α−アミラーゼを加え、できる限り速く１００℃まで加熱し、１０分間この温度を維持する。それからこのスラリー温度を９５℃とし、２時間維持する。その後、このサンプルをH2SO4でpH３．５とし煮沸浴の中に１０分間放置して酵素活性を停止してから、ＨＰＬＣでＤＥ（デキシトロース当量）および加水分解パターンを測定した。ＨＰＬＣにはＢＩＯＲＡＤ  ＨＰＸ−４２Ａカラムを用い、溶出液には脱イオン水を用いた。
Ａ）トランスホームした植物種子、Ｂ）Maxamyl▲Ｒ▼（ギストブロケーズＮ．Ｖ．、デルフト、オランダから市販のバチルスリチェニホルミスα−アミラーゼ）、およびＣ）Ｄexlo▲Ｒ▼ＣＬ（ギストブロケーズ市販のバチルスアミロリクェファシエンスのα−アミラーゼ）を用いたポテトおよびコーンデンプンの加水分解から得られる多糖類パターンを比較した（第１２図および第１３図）。トランスホームした植物種子およびMaxamyl▲Ｒ▼から得た多糖類パターンは同じであったが、Dexlo▲Ｒ▼の結果は異なっており、このことで植物種子の中でバチルスリチェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼが生産されていることが確認された。植物種子から得られたＤＥ値（第３表）は市販品としての許容範囲内である
0003938401.tif 000007
（レイリー（Reilly），１９８５）。
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本発明はその特異的態様に関して述べられているが、本発明の真の精神や範囲を逸脱することなく種々の変化や等価な置換を行ないうることが理解できよう。
さらに本発明の目的、精神および範囲に対し特定の状況、物質、植物、種子、方法、操作を適用する修正を施し得る。これらすべての修正も以下の請求の範囲内にあると考えられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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