(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジン親和性物質の測定方法。
【請求項２】
抗体が不溶性担体粒子に担持されていることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
抗体が遊離抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１、２又は３記載の測定方法。
【請求項５】
抗体がポリクローナル抗体である請求項１、２又は３記載の測定方法。
【請求項６】
不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項１〜５のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項７】
不溶性担体粒子が平均粒径１．６μｍ以下の粒子である請求項１〜６のいずれか１項記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を検出又は定量することができる測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質をはじめとする生体成分の中には、プラスミノーゲンやＬｐ（ａ）等のように、必須アミノ酸の一つであるリジンに対して親和性を有する物質が存在し、これらの多くは各種疾患により生体内濃度が変動することが知られている。従って、これらリジン親和性物質を測定することは、各種疾患を診断する指標を得ることとなり重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
リジン親和性物質等の生体内物質を検出又は定量する方法としては、抗原と抗原に対する抗体の特異的な結合を利用するイムノアッセイ法（ラジオアイソトープ標識を利用したＲＩＡ法、酵素標識を利用したＥＩＡ法、免疫凝集法、凝集阻害法等）が考えられ、この方法は臨床検査や生化学の分野で幅広く利用されており、生体中の蛋白質をはじめとした多くの物質が、この方法を利用して測定されている。
特に、測定対象抗原に対する抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応に基づく免疫凝集法の中で免疫比濁法と呼ばれる方法は、高感度化が可能な方法であり、また、自動分析装置への適用をはじめとした測定の自動化が可能なことから検査領域において注目されている。
【０００４】
免疫比濁法は、測定対象抗原を動物に免疫することにより得られた抗体を用い、液相中において測定対象抗原とこれに対する抗体を反応させ、生じる免疫凝集体を光学的に測定する方法であり、試薬としてラテックスのような担体を用いない方法（以下「ＴＩＡ法」という）と抗体が結合した担体を用いる方法（以下「ＬＴＩＡ法」という）が一般に知られている。
しかしながら、ＴＩＡ法やＬＴＩＡ法のような免疫比濁法に用いる抗体として、ポリクローナル抗体を使用する場合には、ポリクローナル抗体が測定対象物質たるリジン親和性物質以外の物質を認識することがあり、試料中の極わずかな夾雑成分や測定対象物質と構造が類似する他の成分と反応してしまうという問題があった。
【０００５】
このような問題点を解決するため、抗体として１種類又は２種類以上のモノクローナル抗体を用いる免疫比濁法もあるが、１種類のモノクローナル抗体を用いる方法は、Ｌｐ（ａ）のように同一構造が分子中に複数存在する特殊な抗原にしか利用できず、しかも用いる抗体は、分子中に複数存在する同一構造を認識しなければならないという問題があり、用途が極めて限定される。一方、２種類以上のモノクローナル抗体を用いる方法は、認識部位の数を抗体の数に相当する数にまで増やすことで免疫凝集体を形成させるものであるが、同じ抗原に対するモノクローナル抗体ならばどの抗体の組み合わせでも使用できるわけではなく、目的に応じて反応性が高くしかも認識部位の異なる特殊な抗体の組み合わせを選択しなければならないという問題がある。
【０００６】
この他の免疫比濁法として、抗原性物質を不溶性担体粒子にあらかじめ吸着もしくは結合させ、これに該抗原性物質に特異的に反応する１種の抗体もしくは抗体複合体を反応させて、凝集した不溶性担体を測定する方法（特開平７−３５７５２号）が知られているが、この方法は不溶性担体粒子への吸着の容易性の点から、ヘモグロビンのように試料中に高濃度含まれる物質に特異な方法であり、また使用する抗体も、液相中では該抗原性物質とは反応せずに、不溶性担体粒子と結合した該抗原性物質とのみ反応する抗体を選択しなければならないという問題がある。
【０００７】
従って、本発明の目的は、リジン親和性物質を上記の如き問題点がなく、簡便、迅速かつ感度良く検出又は定量することができる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、リジン親和性物質を含む検体に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体の両方を反応させ、生成する免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定すれば、感度が高く、しかも簡便かつ迅速にリジン親和性物質を検出又は定量できることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、リジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子と該リジン親和性物質に対する抗体を反応させ、生成する免疫凝集体を直接光学的に測定することを特徴とするリジン親和性物質の測定方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、検体中の測定対象抗原たるリジン親和性物質に、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子（以下「固定化リジン」又は「固定化ポリリジン」という）とリジン親和性物質に対する抗体（抗体は１種でも２種以上でもよい）を反応させ、生じる免疫凝集体の吸光度等を直接光学的に測定することにより、該リジン親和性物質の検出又は定量を行うものである。
【００１１】
本発明において用いられる不溶性担体粒子としては、平均粒径が１．６μｍ以下のものが好ましく、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に０．０５〜０．５μｍのものが免疫凝集体を直接光学的に測定する上で好ましい。
【００１２】
不溶性担体粒子の材質は特に制限されず、従来、ホモジニアス系で不溶性担体を用いて抗原又は抗体を測定する場合に使用される公知の物質であればいずれも使用することができる。このような物質としては、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が挙げられる。このうち、有機高分子物質としては、ラテックス粒子が好ましく、特に、アクリル酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ばれた１種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子が挙げられる。
【００１３】
不溶性担体粒子にリジンもしくはポリリジンを担持させる方法は特に限定されず、公知の物理吸着や化学結合法による方法等を用いることができる。但し、不溶性担体粒子にポリリジンを担持させる場合、ポリリジンの分子量が大きすぎると不溶性担体粒子同士がポリリジンを介したと考えられる凝集を生じる場合がある。それ故ポリリジンは、平均分子量１００００以下のものが好ましく、特に、平均分子量が５０００以下のものが好ましい。また、リジンもしくはポリリジンをキャリア蛋白質（アルブミン、カゼイン、フィブロネクチンなど）に縮合剤あるいは二架橋試薬等を用い化学的に結合させたものを、不溶性担体粒子に物理吸着や化学結合法により結合させる方法も挙げられる。
【００１４】
本発明で使用する抗体は、抗原たるリジン親和性物質に高い特異性を有していれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また抗体は、遊離抗体であっても、不溶性担体粒子に担持させた抗体（以下「固定化抗体」という）であってもよいが、固定化抗体が測定感度の点で好ましい。不溶性担体粒子に抗体を固定する場合、その方法は特に限定されず、物理吸着、化学結合、免疫的結合を利用する方法のほか、あらかじめ抗体に対して結合性を有する物質を単体に担持させ、この物質を介して抗体を結合させる方法等を用いることができる。また、本発明では、１種類の抗体があればよいが、より高感度な測定を行うために２種以上の抗体を用いてもよい。
【００１５】
固定化リジン等又は固定化抗体を懸濁する液は、特に限定されないが一般的にはリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液が使用される。反応におけるpHは５〜１０、特に６〜９が好ましい。
【００１６】
本発明における測定対象物質としてはリジンと親和性のある物質であれば特に限定されず、プラスミノーゲン、プラスミン−プラスミンインヒビター複合体、プラスミノーゲン活性化因子、Ｌｐ（ａ）等の血液凝固関連物質の他、リジンを担持させたゲルを用いて精製されるＤＮＡ、ＲＮＡ等の物質が挙げられる。
【００１７】
本発明では、小粒径の不溶性担体粒子が使用されているので、本発明方法により得られる免疫凝集体は懸濁状態が保たれており、従ってこれを光学的に測定することができる。光学的な吸光度の測定は、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置（日立製作所社製  日立７１５０、７０７０、７１７０等、東芝社製  東芝  ＴＢＡ−８ＯＲ等）、近赤外を測定波長とした装置（三菱化成社製  ＬＰＩＡ等）、積分球濁度を測定原理とした装置（協和発酵社製  ＥＬシステム等）、散乱光強度を測定する装置（ベーリンガー社製
ＢＮＡシステム等）等の光学的測定機器を用いて行うことができる。
【００１８】
【実施例】
以下、製造例、実施例並びに比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
製造例１．固定化リジン液の調製
ポリスチレンラテックス（ＣＯＯＨタイプ、平均粒径０．２μｍ、セキスイ化学社製）３００μｌに１．５mlの５０mMホウ酸緩衝液（pH７．５）を添加したのち遠心洗浄を行い、同じ１．５mlの５０mMホウ酸緩衝液（pH７．５）に懸濁させた。この液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同人化学研究所製）を１０mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３７５μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次いで、Ｎ′−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（東京化成工業製）を２mg／mlの濃度で上記ホウ酸緩衝液に溶解した溶液３７５μｌを加え、２５℃で３時間反応させた。この溶液に氷冷下トリフルオロ酢酸（キシダ化学製）７５０μｌを加え、更に氷冷下で３０分静置したのち、５００mMグリシン緩衝液（pH８．４）２２mlを加え、遠心洗浄を行った。この後、２％グリシンを含有した５０mMホウ酸緩衝液（pH７．５）１０mlに再懸濁させ、２５℃で一夜穏やかに攪拌した後、再度遠心し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１０．５mlで再懸濁させ、固定化リジン液を得た。
【００２０】
製造例２．固定化ポリリジン液の調製
ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μｍ、セキスイ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）に懸濁した液１mlにポリ−Ｌ−リジン（平均分子量３９７０、シグマ社製）を１．５mg／mlの濃度で上記グリシン緩衝液に溶解した溶液１mlを添加し、４℃で一夜反応させた。次いでＢＳＡを０．５％含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加え、４℃で３時間反応させた。その後、遠心洗浄を行い、０．００５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で一夜穏やかに攪拌した。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１４mlで再懸濁させ固定化ポリリジン液を得た。
【００２１】
製造例３．抗プラスミノーゲン固定化抗体液の調製
ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μｍ、セキスイ化学社製）を２％の濃度で２５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）に懸濁した液１mlに、抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体（７ＰＧ、テクノクローン社製）を１mg／mlの濃度になるように調製した溶液１mlを添加し、４℃で５時間反応させた。次いで、ＢＳＡを０．５％含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加え、４℃で一夜反応させた。その後、遠心洗浄を行い、０．００５％ Tween８０を含んだ５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）２mlを加えて懸濁させ、４℃で６時間穏やかに攪拌した。再度遠心洗浄し、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１４mlで再懸濁させ、抗プラスミノーゲン固定化抗体液を得た。
【００２２】
製造例４．遊離抗プラスミノーゲン抗体液の調製
抗プラスミノーゲンモノクローナル抗体（７ＰＧ、テクノクローン社製）を１mg／mlの濃度になるように精製水で溶解した。次いで抗体濃度が０．５mg／mlとなるように、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセリンを含む５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）で希釈し、遊離抗プラスミノーゲン抗体液を得た。
【００２３】
実施例１．固定化リジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラスミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬として製造例１で得た固定化リジン液１容に対して１容の製造例３で得た抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図１に示した。
【００２４】
比較例１．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１容に対して、１容の製造例３で得た抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例１と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
【００２５】
比較例２．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１容に対して、１容の製造例１の固定化リジン液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例１と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図１に示した。
【００２６】
図１に示したように、比較例１及び２は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例１ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
従って、固定化リジンと抗プラスミノーゲン抗体の双方が本発明の効果を奏するために必要であることが判る。
【００２７】
実施例２．固定化ポリリジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラスミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬として製造例２で得た固定化ポリリジン液１容に対して１容の製造例３の抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図２に示した。
【００２８】
比較例３．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１容に対して、１容の製造例３の抗プラスミノーゲン固定化抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例２と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００２９】
比較例４．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）１容に対して、１容の製造例２の固定化ポリリジン液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例２と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図２に示した。
【００３０】
図２に示したように、比較例３及び４は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例２ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
【００３１】
実施例３．固定化リジンと遊離抗プラスミノーゲン抗体を用いたプラスミノーゲンの測定
第１試薬として１０％グリセリンを含有した２０mMトリス緩衝液（pH９．０）を用い、その２００μｌにプラスミノーゲンを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬として製造例１の固定化リジン液７容に対して３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲン抗体液を混和した溶液１００μｌを加え攪拌した。その後１〜５分の波長６００nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とプラスミノーゲン濃度の関係を図３に示した。
【００３２】
比較例５．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）７容に対して、３容の製造例４の遊離抗プラスミノーゲン抗体液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例３と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示した。
【００３３】
比較例６．
０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロールを含有した５０mMグリシン緩衝液（pH８．４）３容に対して、７容の製造例１の固定化リジン液を混和した溶液を第２試薬とする以外は、実施例３と同様に操作してプラスミノーゲンの測定を実施した。得られた吸光度変化量を図３に示した。
【００３４】
図３に示したように、比較例５及び６は共に吸光度の変化はほとんど認められなかったのに対して、実施例３ではプラスミノーゲン濃度に依存した吸光度変化を示した。
以上の実施例及び比較例の結果から、リジン又はポリリジンを担持させた不溶性担体粒子とリジン親和性物質に対する抗体の両方が本発明の効果を奏する上で必要であることが判る。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、ホモジニアスな系で簡便かつ迅速に検体中のリジン親和性物質を感度良く検出又は定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固定化リジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図２】固定化ポリリジンと抗プラスミノーゲン固定化抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図３】固定化リジンと遊離抗プラスミノーゲン抗体を組み合わせて、又はいずれか一方を用いた場合の、プラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図１】
0003938627.tif 000002
【図２】
0003938627.tif 000003
【図３】
0003938627.tif 000004