(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＤＶ免疫原サブユニット、またはＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる生きたウイルスベクターである異種ベクター、を含む、家禽のニューカッスル病（ＮＤ）に対する保護に使用するための組合わせタイプのワクチンであって、該ワクチンがさらに、低毒力の長潜伏期性ＮＤＶ株である生きたＮＤＶワクチン株を含むことを特徴とする前記組合わせタイプのワクチン。
【請求項２】
ＮＤＶ免疫原サブユニットが細菌または昆虫細胞発現系の発現産物であることを特徴とする請求項１に記載の組合わせタイプのワクチン。
【請求項３】
免疫原サブユニットが組換えバキュロウイルスの発現産物であることを特徴とする請求項２に記載の組合わせタイプのワクチン。
【請求項４】
生きたベクターウイルスがＨＶＴまたはＦＰＶであることを特徴とする請求項１に記載の組合わせタイプのワクチン。
【請求項５】
ＮＤＶ免疫原サブユニットまたはタンパク質が融合（Ｆ）タンパク質または赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合わせタイプのワクチン。
【請求項６】
低毒力の長潜伏期性ＮＤＶ株が、パスツール研究所（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）のＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１６１４で寄託されているＣ２株であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合わせタイプのワクチン。
【請求項７】
下記成分：
ａ．ＮＤＶ免疫原サブユニット、またはＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる生きたウイルスベクターである異種ベクター；
ｂ．低毒力の長潜伏期性ＮＤＶ株である生きたＮＤＶワクチン株；および
ｃ．所望により成分ａおよび／またはｂの担体または希釈剤
を含む、家禽をＮＤに対して免疫感作するための予防接種キット。
【請求項８】
担体または希釈剤がアジュバントであることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ＮＤＶ免疫原サブユニット、またはＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる生きたウイルスベクターである異種ベクター、を含むワクチンと、低毒力の長潜伏期性ＮＤＶ株である生きたＮＤＶワクチン株を含むワクチンとを組合わせて投与することを含む家禽のＮＤ予防法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＤＶ免疫原サブユニット、またはＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる異種ベクター、を含む、家禽のニューカッスル病（ＮＤ）に対する保護に使用するための組合わせタイプのワクチン（combination vaccine ）および該ワクチンの成分を含むキットに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ニューカッスル病は家禽のウイルス感染症で、地理的に広く分布し、家禽産業に多大な経済的損失を招く。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）がこの病気の原因物質であり、パラミクソウイルス属の原型ウイルスである。ニューカッスル病は、ウイルスの種々の単離体および株によってその病気の重さが大きく変化するという点で複雑である。一般に、若いニワトリほど病気は急性で重い。その感染症は、吸入または食物接種により発生すると考えられ、ウイルスの感染体は鳥から鳥へと蔓延する。
【０００３】
上述したように、いくつかの病理型のＮＤＶが確認されている。すなわち、ヴェロジェニック（短潜伏期性）、メソジェニック（亜病原性）およびレントジェニック（長潜伏期性）である。これらの用語は実験室でのテストから得られたものであるが、現在は一般に、ニワトリに対して毒力が高い、中位または低いウイルスを記載するために使用される。神経向性ヴェロジェニック型の病気は、ＮＤＶの病原性の高い株によって引き起こされ、呼吸器の重い症状が突然現れ、次いで神経に症状が現れる。ほとんどの場合、感染した動物は死に至る。内蔵向性ヴェロジェニック型ＮＤＶ菌株は病原性が高く、高い死亡率をもたらし、胃腸管に重い病変をもたらす。ＮＤＶのメソジェニック株は、通常、十分感染しやすい鳥類に重い呼吸器病を引き起し、成鳥の場合は、産卵の著しい低下を招く。ＮＤＶのレントジェニック株は、特に若い十分感染しやすい鳥類で、呼吸系の症状を特徴とする軽い病気を引き起こす。
【０００４】
商業家禽産業におけるＮＤによる経済的損失を少なくするために、ニワトリにＮＤに対する予防接種が行なわれている。レントジェニックおよびメソジェニック株由来の生ワクチンが定期的に接種され、メソジェニックワクチンは二次接種にのみ適している。しかし、レントジェニック群においても、毒力はかなり広範囲にわたっている。生ワクチンとして使用されるＮＤＶ株としては、Ｖ４、HitchnerＢ１、Ｆ、La Sota （レントジェニック）およびＨ株、Mukteswar 、Komarov および Roakin （メソジェニック）が挙げられる。生ＮＤワクチンの主な利点は、これらが、安価な集団接種法（噴霧剤および飲料水などによる接種法）によって投与できることである。しかし、生ワクチンは、特に噴霧式予防接種後の呼吸器において重症の予防接種反応を招く可能性がある。このため、毒力の極めて弱いウイルスを予防接種、特に初回接種、に使用することが重要であるが、その結果、多数回のワクチン接種が通常必要である。
【０００５】
より成熟した鳥類には一般に、不活化ワクチンが注入投与される。ほとんどの場合、これらのワクチンは、死滅させたウイルスをアジュバントの担体（水酸化アルミニウムまたは油中水型エマルジョンなど）と混合して含む。油−エマルジョンワクチンの調製に使用されるウイルスとしては、Ulster 2C 、Hitchner B1 、La Sota 、Roakinおよび種々の毒性ウイルスが挙げられる（D.J. Alexander, Diseases of Poultry,  第９版、1991、Calnekら編、Iowa State University Press, Ames, Iowa, 496-519）。
【０００６】
通常使用される生きたＮＤＶ株 Hitchner B1および La Sotaは、呼吸器に対して中位の予防接種反応を引き起こす。この結果、より弱い生きた株をベースとしたＮＤＶワクチンが開発されているが、一般に、ワクチン株の免疫原性は、特にＭＤＡ陽性の鳥類の場合、それらの毒性とともに低下することが認められている。そのような弱い株のいくつかは、公知文献に記載されている。米国特許第 5,250,298号（University of Delaware）は、Hitchner B1 親株の生きた低温感受性変異株（CaTsと命名）を開示している。米国特許第 5,149,530号（Duphar Int. Res. B.V. ）は、Ulster 2C 株由来のＮＤＷ株を開示している。さらに、米国特許第 5,188,502号（University of Gerorgia Research Foundation, Inc.）には、七面鳥の消化管から単離した、自然に弱毒化したＮＤＶ株が呼吸器病の兆候を示さないことを開示している。Ｃ２と命名されたさらに弱いＮＤＶ株が、係属中の米国特許出願第08/509,911号 (AKZO Nobel N.Y.)に記載されている。
【０００７】
遺伝子工学の最近の発達により、免疫原ウイルス成分の発現に基づいた新しい世代のワクチン、いわゆるサブユニット、の使用が可能になった。レントジェニックＮＤＶ株をべースとする従来の生ＮＤＶワクチンに対するこの種のワクチンの主な利点は、従来の予防接種後に通常起こる呼吸器の予防接種反応をそれらが引き起こさないということである。さらに、ＮＤＶ産生はもはや必要でなく、ワクチンウイルスの毒性を復帰する可能性は低減する。
【０００８】
免疫原サブユニットＮＤＶタンパク質、または免疫原ＮＤＶタンパク質を発現することができる異種ベクター、をベースとするワクチンは、従来文献に開示されている。特に、七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）および鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）などの生きたウイルスベクターによるか、あるいはバキュロウイルス発現系によるＮＤＶ融合（Ｆ）または赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質の発現に基づくワクチンが最近記載された（Morgan, R.W.ら、Avian Diseases 36, 858-870, 1992; Boursnell, M.E.G. ら、Virology 178, 297-300, 1990 および J. Gen. Virology 71, 621-628, 1990; Mori, H. ら、Avian Diseases 38, 772-777, 1994; Nagy, E.ら、Avian Diseases 35, 585-590, 1991）。
【０００９】
初期のＮＤＶ感染および続く発症の予防、ならびに吸入または汚染食物もしくは飲料水の採取により感染しやすいニワトリにウイルスが蔓延することの防御においては、呼吸器管を限局的に保護することが重要である。一般に、従来の生ＮＤＶワクチンは限局的な呼吸器保護を十分誘発する。ＦＰＶ−ＮＤＶワクチンのみを使用するほとんどの研究では、神経病の兆候に対する全身的免疫の研究が行なわれたが、呼吸に関する免疫の評価は行なわれなかった。さらに、眼からの投与によるＦＰＶ−ＮＤＶ／ＦまたはＦＰＶ−ＮＤＶ／ＮＨワクチンは、少しの全身的保護のみを誘発し、組換えＦＰＶ−ＮＤＶ／ＦおよびＦＰＶ−ＮＤＶ／ＨＮの両方による免疫感作からの追加効果は何も検出できなかった（Edbauer, C. ら、Virology 179, 901-904, 1990 ）。さらに、Morganら、Avian Diseases 36,前出; および Avian Diseases 37, 1032-1040, 1993 には、生きたウイルスベクターをベースとするＮＤＶワクチンを投与すると、比較的低レベルの限局的な呼吸器保護が、特にＮＤＶおよび後期抗原刺激に対する母親由来の抗体（ＭＤＡ）の存在下で得られることが示された。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、局所および全身レベルでの保護に関して、ＮＤに対する高められた保護を誘発する組合わせタイプのＮＤＶワクチンを提供する。
【００１１】
特に、本発明は、一方でＮＤＶ免疫原サブユニット、またはＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる異種ベクター、である第一の活性成分を含み、他方で生きたＮＤＶワクチン株である第二の活性成分を含む、家禽のＮＤに対する保護に使用するための組合わせタイプのワクチンに係る。第一の成分を単独成分として投与するとすると、その効果は主に、接種された鳥の（死亡率ならびに間代痙攣、筋肉の震え、斜頸、強直性発作および麻痺などの緊張した兆候に対する）全身保護の生起にあり、第二の成分はその場合、主に呼吸器管における（気管におけるＮＤＶ刺激ウイルスの増殖に対する）限局的な保護を誘発する。驚くべきことに、本発明で定義した組合わせタイプのワクチンが、全身的にも限局的にも、相乗作用による保護免疫反応を呼び起こすことが本発明において見いだされた。すなわち、本発明のワクチンは、たとえ母親由来の抗体が存在しても、メソジェニツクＮＤＶおよび神経向性ヴェロジェニックＮＤＶ株の両方によるＮＤＶ感染に対して高い保護を誘発する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
好ましくは、組合わせタイプのワクチンは、ＮＤＶ免疫原タンパク質を発現することができる異種ベクターを含む。そのようなベクターは、微生物、例えば細菌もしくはウイルスであるか、または免疫原ＮＤＶタンパク質をコードする遺伝子を含んでいるポリヌクレオチドである。該ベクターは、該タンパク質を発現するか、または接種された鳥で複製することにより該タンパク質を発現することができ、その結果、免疫感作された動物は、該タンパク質に対する免疫反応を引き出す。「異種」とは、事実上、該ベクターがＮＤＶ遺伝子を含んでいないことを示す。
【００１３】
生きたウイルスベクターが最も好ましい。鳥類の病原体のタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる多くの生きたウイルスベクター、特にＮＤＶタンパク質をコードするウイルスベクターはすでに従来文献で報告されている。本発明での使用に適するウイルスベクターは当業者には周知であり、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスおよび鳥類のレトロウイルスが挙げられる。
【００１４】
適するポックスウイルスの一例はワクシニアであるが、Avipoxウイルスがより好ましい。なぜならば、その宿主範囲がより限定されているからである。特に、ハトのポックスウイルス（ＰＰＶ）および鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）が適すると考えられる。
【００１５】
免疫原ＮＤＶ遺伝子を含んでいるそのような適するＰＰＶおよびＦＰＶベクターの例は、Letellier, C. ら、Archives of Virology 118, 43-56, 1991; Edbauer, C. E. ら、Virology 179, 901-904, 1990; Taylor, J. ら、J. Virology 64, 1441-1450, 1990; Ogawa, R.ら、Vaccine 8, 486-490, 1990; Bournsell, M.E.G. ら、Virology 178, 297-300, 1990 および J. Gen. Virology 71, 621-628, 1990;ならびに Boyle, D.B.ら、 Virus Research 10, 343-356, 1988 に開示されている。
【００１６】
ＮＤＶ  ＨＮ−遺伝子を含んでいる鳥類のレトロウイルスベクター（鳥類白血症ウイルス）の例は、Morrison, T ら、Microbial Pathogenesis 9, 387-396, 1990 に開示されている。
【００１７】
本発明で使用することができるより好ましいウイルスベクターはＨＶＴ（七面鳥のヘルペスウイルス；Sondermeyer, P.J.A. ら、Vaccine 11, 349-358, 1993 参照）である。ＨＶＴには、その立証された安全性およびマレク病（Marek's   disease ）に対する効力などいくつかの利点がある。さらに、ＨＶＴは１日齢の雛に日常的に投与することができる。ＨＮ−またはＦ−遺伝子を含んでいるＨＶＴ−ＮＤＶベクターの構成、およびワクチンにおける単独活性成分としてのその効力は、Morgan R.W. ら、Avian Diseases 36, 858-870, 1992および 37, 1032-1040, 1993に記載されている。
【００１８】
上記ウイルスベクターは、通常の組換えＤＮＡ技術によって調製することができ、その後、そのベクターウイルスを感染させた宿主細胞を培養して十分な量のベクターウイルスを産生することができる。次いで、細胞および／またはベクターウイルスを純粋な形態で含むウイルスを培地から採取した後、それを標準的方法に従ってワクチンに混入することができる。
【００１９】
ここで使用できる適する細菌ベクターとしては、大腸菌およびいくつかのサルモネラ種が含まれる。
【００２０】
あるいは、ベクターは、ＮＤＶ遺伝子をプロモーター、エンハンサー、または遺伝子を鳥類の細胞で発現させることができる他の配列、に作動可能に連結して含むポリヌクレオチドである。一般に、ポリヌクレオチドは鎖状ＤＮＡ分子である。通常、ＮＤＶ遺伝子は細菌プラスミド内に配置される。そのようなベクターは、ＤＮＡをベースとする免疫感作に使用することができ、その場合、この目的に対して公知の方法（Donnelly, J.J.ら、The Immunologist 2, 20-26, 1994 ）によるin vivo トランフェクションにより、ポリヌクレオチドが鳥類細胞に直接移入される。
【００２１】
上記の異種ベクターの代わりとして、ＮＤＶ免疫原サブユニットを、本発明に係るワクチンに混入することができる。サブユニットワクチンの場合、ＮＤＶ免疫原タンパク質は、免疫感作すべき動物にワクチンの活性成分として投与することができるよう十分な量で in vitro 産生する。ＮＤＶ免疫原サブユニットなる用語は、通常実際に関連するＮＤＶ（タンパク性の）物質を本質的に含まないＮＤＶ免疫原タンパク質を含む化合物または組成物を意味する。
【００２２】
原則的に、ＮＤＶ免疫原サブユニットは、標準的な生化学精製法によってＮＤＶビリオンから精製することができるが、組換えＤＮＡ発現系によるサブユニットの発現が好ましい。
【００２３】
後者の場合、ＮＤＶ免疫原サブユニットは、宿主細胞によって発現される。適する宿主細胞は、該サブユニットをコードするＤＮＡ断片によって形質転換でき、該サブユニットを発現することができる細胞である。
【００２４】
本明細書中で使用する「形質転換」は、使用する方法（例えば直接的取り込みまたは形質導入）に関係なく、宿主細胞に異種核酸配列を導入することを意味する。そのような異種核酸配列は、宿主のゲノム内に組み込むことも可能である。発現のために、異種ＤＮＡ断片には、指定の宿主と適合性があり、挿入した核酸配列の発現を調節することができる適切な発現調節配列が付加される。
【００２５】
宿主細胞は、原核生物起源、例えば、大腸菌、枯草菌またはシュードモナス種由来の細菌発現系であってもよい。
【００２６】
宿主細胞は、好ましくは酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）などの真核生物起源または昆虫、植物もしくは哺乳類細胞（HeLa細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）などの高等真核細胞である。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperda のSf9 細胞系（Luckowら、Biotechnology 6, 47-55, 1988）が挙げられる。真核生物クローン化系におけるＮＤＶ免疫原サブユニットのクローン化および発現に関する情報は、Esser, K. ら、（Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986 ）に見ることができる。
【００２７】
あるいは、適する宿主細胞は、ＮＤＶ免疫原サブユニットをコードするＤＮＡ断片を含んでいる組換えウイルスによって感染を受けやすい細胞である。そのウイルスでは、異種ＤＮＡ断片をウイルスの非必須領域、すなわち、ウイルスの本質的な機能（ウイルスの感染または複製に必要な機能など）を破壊することなく該ＤＮＡ断片の導入に使用することができる領域、に挿入する。
【００２８】
大量のＮＤＶ免疫原サブユニットを得るために好ましい発現系は、バキュロウイルス発現系（ＢＶＥＳ）である。この系では、Spodoptera frugiperda （Sf、IPLB-Sf21 ）細胞のような昆虫細胞が、Autographa californica  核多角体病ウイルス（AcNPV ）のようなバキュロウイルスの宿主として細胞培養に維持される。AcNPV の遺伝子のいくつかは高レベルで発現されるが、ウイルス感染サイクルには必須でない。これらの遺伝子は、pAcAS3などのバキュロ−転移プラスミドおよび野生型（wt）AcNPV ＤＮＡの間のトランスフェクションを受けた細胞での相同的組換えの標的である。pAcAS3（J. Vlak ら、Virology 179, 312-320, 1990 ）では、異種遺伝子が、必須でない p10遺伝子の代わりに p10プロモーターの下流に挿入され、組換え工程を標的とする wt AcNPV の配列によって取り囲まれる。組換え体のスクリーニングを容易にするために、pAcAS3は、LacZ遺伝子も含む。これは、培地に X-galを添加すると、組換え体プラークを青色に変えるものである。
【００２９】
ＮＤＶ  Ｆ−またはＨＮ遺伝子を含んでいる組換え体バキュロウイルスの構成および昆虫細胞でのその発現は、公知文献、例えば、Kamiya, N.ら、Virus Research 32, 373-379, 1994; Murakami, Y.ら、Virus Research 33, 123-137, 1994; Niikura, M. ら、Virus Research 20, 31-43, 1991; Mori, H.ら、Avian Diseases 38, 772-777, 1994; Nagy, E.ら、Virology 176, 426-438, 1990 および Avian Diseases 35, 585-590, 1991 で報告されている。
【００３０】
Cosset, F-L ら、Virology 185, 862-866, 1991 は、ＨＮタンパク質を構成的に発現する細胞系に基づくＮＤＶサブユニットワクチンの製造を記載している。
【００３１】
本発明では、上記で定義した宿主細胞を、ＮＤＶ免疫原サブユニットの発現に好ましい条件下で培養することができる。ワクチンは、粗培養物のサンプル、宿主細胞溶解物、宿主細胞抽出物または培養上清を使用して作ることができるが、別の態様では、より精製したサブユニットを、その目的用途に応じて作ることができる。得られたタンパク質を精製するために、サブユニットを発現する宿主細胞を十分な量で培養し、産生したタンパク質を該細胞から、またはタンパク質が排出される場合は培地から単離する。培地に排出されたタンパク質は、標準的方法、例えば塩分画、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲル濾過免疫沈降またはイムノアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、精製することができるが、細胞内のタンパク質は、最初に該細胞を集め、例えば音波処理または他の機械的破壊手段（フレンチプレスなど）によって細胞を破壊し、次いで、所望により、該タンパク質を他の細胞内成分と分離することにより単離することができる。細胞破壊は、化学的手段（例えば、ＥＤＴＡ処理）または酵素的手段（リゾチーム消化など）によって行なうこともできる。
【００３２】
本発明の第二の活性成分としては、周知の生きたＮＤＶレントジェニックワクチン株のいずれかを使用することができる。該株としては、Hitchner B1 および La Sotaワクチン株が挙げられる。
【００３３】
生きたＮＤＶワクチン株、ワクチンの産生およびワクチン投与に関する詳細な情報は、例えば、Allan ら、FAO Animal Production and Health Series No. 10, FAO, Rome, 1978 および D.J. Alexander, In: Diseases of Poultry, 第 9版、Calneck ら編、Iowa State University Press, Amer., Iowa, 496-519 によって開示されている。
【００３４】
生ＮＤワクチンの使用に関する問題点は、商業上のニワトリに母親由来のＮＤＶ抗体が存在することであり、これは、予防接種後の保護の確立を妨げるものである。この問題は、比較的毒力の大きいＮＤＶワクチン株を使用することにより克服することができる。しかし、そのようなより毒力の大きい生ＮＤＶワクチンの短所は、それらが呼吸病を引き起こし、またはその一因となり、その結果、ニワトリの能力の低下または若い雛の死亡すら招くということである。
【００３５】
その結果、本発明の特に好ましい実施態様は、生きたＮＤＶワクチン株が低毒力の（mild）レントジェニックＮＤＶ株である、組合わせタイプのワクチンである。そのようなワクチンは、呼吸器のワクチン反応を全く、あるいはほんの少ししか誘発しないし、それと同時に、高められた保護免疫反応を引き出す。低毒力のレントジェニックワクチン株は、ワクチン反応指数（ＶＲＩ１およびＶＲＩ２）が２より小さいワクチン株を意味する。ＶＲＩは、とりわけ予防接種による重量損失に基づき、 0〜10の範囲である（van Eck, J.H.H. ら、Avian Pathology 20, 497-507, 1991 ）。そのような低毒力ワクチン株の例としては、ＮＤＶ株Ｃ２（ＣＮＣＭ受託番号I-1614）、ＣａＴｓ（米国特許第 5,250,298号）、米国特許第 5,188,502号に開示されている自然に弱毒化した七面鳥株、およびＮＤＷ（米国特許第 5,149,530号）が挙げられ、Ｃ２菌株が最も好ましい。
【００３６】
本発明で使用することができるＮＤＶ免疫原サブユニットまたはタンパク質は、家禽において保護的免疫反応を誘発することができるＮＤウイルスのタンパク質成分であり、Ｆ−、ＨＮ−、マトリックス（Ｍ）および核タンパク質（ＮＰ）タンパクが挙げられる。
【００３７】
特に、好ましいＮＤＶ免疫原サブユニットまたはタンパク質は、Ｆ−またはＨＮ−タンパク質である。これらのウイルス成分および該成分をコードする遺伝子の例は、上記で挙げた文献のいくつかに開示されている。
【００３８】
本発明に係る非常に有益な組合わせタイプのワクチンは、生きたＮＤＶ  Ｃ２株とＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆベクターを含むものである。
【００３９】
本発明に係るワクチンは、ニワトリに効果的に使用することができるが、七面鳥、ホロホロチョウおよびヤマウズラなどの他の家禽もそのワクチンでうまく予防接種することができる。ニワトリには、ブロイラー、生殖用ストックおよび産卵用ストックを含む。
【００４０】
組合わせタイプのワクチンの活性成分の両方を混合した形態で投与するのが好ましいが、必ずしもそうする必要はない。各成分の投与法は、各成分の特定の性質に依存すると考えられる。例えば、生きたＮＤＶワクチン株は、好ましくは、ＮＤ予防接種に通常使用される安価な集団接種法（噴霧剤または飲料水などによる接種法）によって投与する。しかし、該ワクチンの注入による投与も意図する。例えばバキュロウイルスまたは上記で定義した異種ベクター（例えば、ＨＶＴまたはＦＰＶ由来）によって発現されるＮＤＶ免疫原サブユニットは、通常、非経口的に投与される。しかし、特定活性成分が投与後に保護免疫反応を引き出すことができる限り、in ovo などの他の方法による予防接種も意図する。本発明の利点はまた、組合わせタイプのワクチンの成分を、短時間間隔、例えば約 24 時間間隔、好ましくは８時間間隔で分けて鳥類に投与する場合に達成することができる。また、例えば、組合わせタイプのワクチンの有利な効果は、成分の一つ、例えば上述したＨＶＴベクターを孵化の直前にin ovo で投与し、生きたＮＤＶワクチン株を孵化直後、例えば孵化後１日目に投与すると得ることができる。
【００４１】
本発明に係るワクチンは、有効用量の活性成分、すなわち、毒力のあるＮＤウイルスによるチャレンジに対する免疫を予防接種した鳥に誘発する量の免疫化活性成分を含む。免疫は、本明細書中では、予防接種後の鳥の集団における、予防接種していない群と比較してかなり高いレベルの保護の誘発として定義する。
【００４２】
典型的には、生きたＮＤＶワクチン株を動物毎に103.0 〜108.0 胚感染用量50（ＥＩＤ50）の用量、好ましくは105.0 〜107.0 ＥＩＤ50の用量で投与することができる。ＨＶＴをベースとするベクターは、10〜10,000 pfu、好ましくは 100〜1500 pfuの量で投与することができるが、ＦＰＶベクターは通常、102.0 〜105.0 ＴＣＩＤ50の量で投与すると有効である。有効なバキュロウイルス発現サブユニットワクチンは、105.0 〜108.0 細胞から得られる。
【００４３】
本発明に係る組合わせタイプのワクチンは、孵化の後、すなわち孵化後１日目に鳥に直接投与することができる。ワクチンは、初回予防接種として使用することができ、所望ならば、次いで１回以上の二次予防接種を行なう。組合わせタイプのワクチンはまた、生きた形態かまたは不活化した形態の一価ＮＤＶワクチンの使用も含む予防接種プログラムにおける導入にも適する。
【００４４】
一例として、ブロイラーは、生後１日目に予防接種した後、10〜21日目に二次予防接種を行なうことができる。産卵用ストックまたは生殖用ストックは、 1〜10日目に予防接種した後、26〜38日目および16〜20週目に追加免疫の予防接種を行なうことができる。
【００４５】
本発明はまた、上記で定義した二つの活性成分の他に、家禽に感染する他の病原体由来の１種以上の免疫原を含むワクチンを含む多価ワクチンにも関する。
【００４６】
好ましくは、組合わせタイプのワクチンはさらに、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性包疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）またはレオウイルスの１種以上のワクチン株を含む。
【００４７】
本発明に係るワクチンは、懸濁物または凍結乾燥した形態で作り、市販することができる。さらに、活性成分に対して習慣的に使用される薬剤的に許容されうる担体または希釈剤を含む。担体としては、安定剤、保存剤および緩衝剤が挙げられる。適する安定剤は、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（ドライミルク、血清、アルブミンもしくはカゼインなど）またはその分解物である。適する緩衝液は、例えばアルキル金属リン酸塩である。適する保存剤はチメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンである。希釈剤としては、水、水性緩衝液（緩衝生理食塩水など）、アルコールおよびポリオール（グリセロールなど）が挙げられる。
【００４８】
所望により、本発明に係るワクチンはアジュバントを含むことができる。この目的に適する化合物または組成物としては、水酸化アルミニウム、リン酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、例えば鉱物油（Bayol F （登録商標）もしくはMarcol 52 （登録商標）など）または植物油（酢酸ビタミンＥなど）に基づく油中水型または水中油型エマルジョン、およびサポニンが挙げられる。
【００４９】
本発明は、上記で定義した各活性成分の容器を有する多容器パッケージを含むキット様式も意図する。そのキットは、一方または両方の活性成分用の担体または希釈剤を含む容器を有することもできる。
【００５０】
【実施例】
実施例１
ＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆベクターおよび生きたＮＤＶワクチン株の併用投与の効果
ＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆベクターを、Morgan, R.W.ら、Avian Disease 36, 858-870, 1992 および Sondermeyer, P.J.A.ら、Vaccine 11, 349-358, 1993 の記載に従って調製した。ＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆを、特定の病原体を含まない10日目の胚含有卵から調製したニワトリの原発性胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上で増殖させた。細胞を、５％のウシ胎児血清および抗生物質カクテルを補充したグラスゴーおよびイーグルの改良最小必須培地を組み合わせた中で保持した。
【００５１】
ＣＥＦを約 6×105 細胞／cm2 の密度でローラーボトルに接種し、0.01 pfu／細胞以下の moiでＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆを感染させ、37℃で48〜72時間インキュベートした。培養物の細胞変性作用が約 80 % に達すると、感染した細胞をトリプシンを使用して採取し、スピンさせて、凍結培地に再懸濁した。感染した細胞のアリコートを液体窒素の気相中に置いた密封ガラスアンプルに入れて保存した。
【００５２】
生ＮＤＶワクチンは、低毒力のＮＤＶワクチン株（パスツール研究所（25 Rue du Docteur Roux, Paris, France ）のＣＮＣＭに受託番号 I-1614 で寄託されている）から調製した。
【００５３】
ＮＤＶ  Ｃ２  Ｘ＋４を希釈して、0.1 mlにつき約 3〜4 log のウイルスを含むようにし、10〜12日齢のＳＰＦ胚 200個に接種した。胚を37℃に置いた。接種後４日目に胚を明かりに透かして調べ、生きた胚は全部、４℃で２時間置いた。次いで、尿膜液（allantoic fluid ）を採取した。全部で 1340 mlの尿膜液を660 mlの安定剤および 20 mlのゲントシン（Gentocin）と混合した。これを15分間混合した後、10ml容のガラスバイアルに１バイアルにつき2 mlずつ満たした。次いで、そのバイアルを凍結乾燥した。
【００５４】
30羽を一組とする１日齢の商業用ブロイラー２組に、眼鼻投与によりＮＤＶ−Ｃ２株を接種した。
【００５５】
30羽を一組とする１日齢の商業用ブロイラー２組に、筋肉内投与によりＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆ株を接種した。
【００５６】
30羽を一組とする１日齢の商業用ブロイラー４組に、筋肉内投与によりＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆ株を、眼鼻投与によりＮＤＶ−Ｃ２株を接種した。
【００５７】
２週目および５週目に、同じ年齢の２羽のＳＰＦコントロール用ニワトリを各チャレンジ群に加えた。
【００５８】
接種物につき、１組のニワトリを筋肉内投与によるＮＤＶ Herts 33/56株で抗原刺激した。これらのニワトリを、ニューカッスル病の臨床兆候および／または死亡の発生に関して 12 日間監視した。
【００５９】
他方の組は、眼鼻投与によるＮＤＶ Beaudette株で抗原刺激した。刺激後６日目に、これらのニワトリを屠殺し、気管を取り出してウイルスを再単離した。
【００６０】
血液サンプルを１日齢で採取し、ＨＩ−テストでＮＤＶに対する抗体を測定した（平均ＨＩ−力価は106.4 であった）。５週齢のＳＰＦニワトリの血清では、ＮＤＶに対する抗体は検出できなかった。
【００６１】
ニワトリにＮＤＶ−Ｃ２（１羽につき0.1 ml）（１回の投与につき 7.6 log10EID 50  ）およびＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆ（１羽につき0.2 ml）（１回の投与につき±1200 PFU）を予防接種した。
【００６２】
ニワトリをＮＤＶ Beaudette（１羽につき0.2 ml）（１回の投与につき 7.6  log 10ELD 50  ）およびＮＤＶ Herts 33/56（１羽につき0.2 ml）（１回の投与につき 7.6 log10ELD 50  ）で抗原刺激した。
【００６３】
全身保護の測定
ＮＤＶ Herts株による抗原刺激後 12 日間、全てのニワトリの死亡および／またはニューカッスル病の臨床兆候の発生に関して毎日観察した。そのデータを毎日記録した。採点は以下のように行なった。
【００６４】
０：ニューカッスル病の臨床兆候の発生が認められない；
0003947254.tif 000002
２：ＮＤＶ抗原刺激による死亡
局所保護の測定
ＮＤＶ Beaudette株で抗原刺激した全てのニワトリを刺激後６日目に屠殺し、気管を取り出した。全ての気管を、ウイルス再単離を行なうまで、−70℃のトリプトース 2.5％ブロス中で凍結保存した。
【００６５】
気管サンプルにつき、 8〜10個の卵を尿膜腔を通して接種した。卵は、左右に揺らしながら＋37℃の孵卵器で８日間インキュベートした。接種の24時間後に発生する胚の死亡は、ＮＤＶ複製によると考えられる。
【００６６】
予防接種の２および５週間後に得られた局所および全身保護結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
0003947254.tif 000003
【００６８】
生ＮＤＶ  Ｃ２ワクチンは、高レベルのＭＤＡの存在下で、局所および全身の両方において部分的保護のみを誘発した。また、一価のＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆワクチンは、これらの条件下では小さい局所（および全身）保護を誘発した。
【００６９】
予期しなかったことに、ＮＤＶ  Ｃ２およびＨＶＴ−ＮＤＶ／Ｆを併用投与した後は、単独投与と比較して、局所および全身ともに、保護が非常に改善された。この相乗効果により、その組み合わせは確実に、ＮＤＶに対する、特に１日齢の商業用ブロイラーの予防接種の良好なワクチンとなる。
【００７０】
実施例２
ＨＶＴ−ＮＤＶ／ＨＮまたはＦＰＶ−ＮＤＶ／Ｆおよび生きたＮＤＶワクチン株Ｃ２またはＶＧ／ＧＡの併用投与の効果
低毒力のレントジェニックＮＤＶ株Ｃ２またはＶＧ／ＧＡを含む両方のワクチンを、実施例１に記載したＮＤＶ  Ｃ２をベースとするワクチンと同様に調製した。ＮＤＶ株ＶＧ／ＧＡは、米国特許第5,118,502 号（ＡＴＣＣ No.VR 2239 ）に記載されている。ＨＶＴ−ＮＤＶ／ＨＮベクターワクチンは、Morganらおよび Sondermeyerら（実施例１）によって記載されているように調製した。
【００７１】
実施例１に記載したＮＤＶ  Ｆ遺伝子を、国際出願 WO 90/02191に開示されたＦＰＶ（鶏痘ウイルス）ゲノムの Bam-HI J 断片の必須でない領域に挿入した。ワクチンプロモーターおよび lacZ マーカー遺伝子の調節下でＦ−遺伝子を含む発現カセットを、ＦＰＶ感染したニワトリの細胞にＤＮＡをトランスフェクションすることにより in vivoで組み換えた。組換え体は、ブルーゲル（bluo-gal）染色によって確認し、連続して繰り返すプラーク精製により均一に精製した。Ｆ−遺伝子の発現は、蛍光染色およびＮＤＶに特異的な抗血清による免疫沈降により確認した。
【００７２】
140 羽の商業用ブロイラーを無作為に７組に分けて、各組を20羽とした。別に孵化した 20 羽の１日齢の雛の血を採り、血清中のＮＤＶに対する抗体の有無を調べた。１日目に、第１組のニワトリにＮＤＶ  ＶＧ／ＧＡ株を接種し、第２組のニワトリにＨＶＴ−ＮＤＶ／ＨＮ株を接種し、第３組のニワトリにＮＤＶ  ＶＧ／ＧＡ株およびＨＶＴ−ＮＤＶ／ＨＮ株の両方を接種し、第４組のニワトリにＮＤＶ−Ｃ２株を接種し、第５組のニワトリにＦＰＶ−ＮＤＶ／Ｆ株を接種し、第６組のニワトリにＮＤＶ−Ｃ２株およびＦＰＶ−ＮＤＶ／Ｆ株の両方を接種し、第７組のニワトリには何も接種しないで対照とした。14および13日目に血液サンプルを全部のニワトリから個々に集め、血清中のＮＤＶに対する抗体の有無を調べた。31日目に、全部のニワトリをＮＤＶ Herts株で抗原刺激した。刺激後10日間、ニワトリを毎日観察して死亡の発生を調べた。
【００７３】
処置
第１組および第３組の 20 日齢のニワトリに各々、 5.2 log10EID 50の感染性ＮＤＶ粒子を含むＮＤＶ  ＶＧ／ＧＡ−ＧＡ 0.1 ml を目からの投与により接種した。
【００７４】
第４組および第６組の20日齢のニワトリに各々、 7.2 log10EID 50の感染性ＮＤＶ粒子を含むＮＤＶ  Ｃ２ 0.1 ml を目からの投与により接種した。
【００７５】
第２組および第３組の20日齢のニワトリに各々、838 PFU の感染性ＨＶＴ粒子を含むＨＶＴ−ＮＤＶ−ＨＮ 0.2 ml を筋肉内投与により接種した。
【００７６】
第５組および第６組の20日齢のニワトリに各々、45000 PFU の感染性ＦＰＶ粒子を含むＦＰＶ−ＮＤＶ／Ｆ 0.2 ml を皮下投与により接種した。
【００７７】
31日齢で、ニワトリを、 7.4 log10EID 50の感染性ＮＤＶ粒子を含むＮＤＶ Herts株 0.2 ml で筋肉内投与により抗原刺激した。
【００７８】
病気の臨床兆候の確認
ＮＤＶ Herts株で抗原刺激した後、ニワトリの死亡発生を10日間毎日観察した。
【００７９】
血清学
14および35日齢で、全ニワトリの羽根の静脈から血液サンプルを個々に集めた。
【００８０】
血清サンプル中のＮＤＶに対する抗体を、標準的方法によるＮＤＶ  ＨＩ−テストで調べた。
【００８１】
一価ワクチンおよび組合わせタイプのワクチンの両方の効力を表２Ａおよび２Ｂに示す。
【００８２】
【表２】
0003947254.tif 000004
【００８３】
【表３】
0003947254.tif 000005
【００８４】
表２Ａは、低毒力のレントジェニックＮＤＶ  ＶＧ／ＧＡ株およびＨＶＴ−ＮＤＶ／ＨＮワクチン株はともに中位のＨＩ−抗体反応のみを誘発したが、組合わせタイプのワクチンは高い相乗免疫反応を誘発したことを示す。同様に、低毒力のレントジェニックＮＤＶ  Ｃ２株およびＦＰＶ−ＮＤＶ／Ｆベクターの両方を含む組合わせタイプのワクチンによって得られる保護は、一価ワクチンによって誘発される保護の和より高かった。