(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一反応チャンバーにおいて核酸増幅コントロール反応を行う方法であって、以下：
内部コントロールポリヌクレオチド、内部コントロールプライマー、該内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な伸長不能オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログ、標的ポリヌクレオチド、標的プライマー、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド５’三リン酸；レポーターおよびクエンチャー部分を含む自己クエンチする蛍光プローブを提供する工程であって、
該プローブは、ハイブリダイズしない場合は、少なくとも１つの一本鎖コンフォメーションで存在し、ここで該クエンチャー色素は、該レポーター色素の蛍光をクエンチし、そして該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合は、少なくとも１つのコンフォメーションで存在し、ここで該レポーター色素の蛍光は、クエンチされず、該レポーター色素の蛍光強度は、プローブがポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、クエンチャー色素の蛍光強度よりも大きい、工程；ならびに以下の工程
該標的ポリヌクレオチドに対して該標的プライマーをハイブリダイズさせる工程；
該内部コントロールポリヌクレオチドおよび／または該標的ポリヌクレオチドに対して該自己クエンチする蛍光プローブをハイブリダイズさせる工程；
該内部コントロールポリヌクレオチドに対して該内部コントロールプライマーをハイブリダイズさせる工程；
ＰＣＲにより該標的ポリヌクレオチドを増幅し、これにより標的ポリヌクレオチド増幅産物が生成される工程；
ＰＣＲにより該内部コントロールポリヌクレオチドを増幅し、これにより内部コントロールポリヌクレオチド増幅産物が生成される、工程；および
該内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な該伸長不能オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを該内部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、該内部コントロールポリヌクレオチドの増幅を阻害する工程
を包含し、ここで、該内部コントロールポリヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドに対して相補的でなく、ハイブリダイズもしない、方法。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、増幅の間に前記プローブを消化して、前記クエンチャー色素から前記レポーター色素を分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の自己クエンチする蛍光プローブが、前記内部コントロールポリヌクレオチドに相補的であり、そして第２の自己クエンチする蛍光プローブが、前記標的ポリヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の自己クエンチする蛍光プローブのレポーター色素が、前記第２の自己クエンチする蛍光プローブのレポーター色素からスペクトルで分離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記内部コントロールポリヌクレオチドの核酸増幅産物が前記標的ポリヌクレオチドの核酸増幅産物からスペクトルで分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記内部コントロールポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの核酸増幅産物がエンドポイント分析により測定および定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記内部コントロールポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの核酸増幅産物がリアルタイム分析により測定および定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内部コントロールポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの核酸増幅産物が蛍光検出により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーターがキサンテン色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記キサンテン色素がフルオレセイン色素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フルオレセイン色素が以下：
【化１】
0003942079.tif 000034
からなる群から選択され、ここでＬがリンカーである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記クエンチャーが以下：
【化２】
0003942079.tif 000035
からなる群から選択され、ここでＬがリンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター色素が少なくとも１２個のヌクレオチドにより前記クエンチャー色素から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター色素が自己クエンチする蛍光プローブの５’末端または３’末端に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記クエンチャー色素が自己クエンチする蛍光プローブの５’末端または３’末端に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な前記伸長不能オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログが、以下：
【化３】
0003942079.tif 000036
ここでＲはフルオロ、クロロ、アミノ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、
【化４】
0003942079.tif 000037
からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
核酸増幅のための試薬のキットであって、以下：
内部コントロールポリヌクレオチド、内部コントロールプライマー、該内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な伸長不能オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ、標的プライマー、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、レポーターおよびクエンチャー部分を含む自己クエンチする蛍光プローブ、ヌクレオチド５’三リン酸；および核酸増幅に必要な他の試薬を含み、ここで
該内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な該伸長不能オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを該内部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、該内部コントロールポリヌクレオチドの増幅を阻害し、そして、該内部コントロールポリヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドに対して相補的でなく、ハイブリダイズもしない、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、核酸増幅の分野に関し、そしてより詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応時の特定の標的配列の非存在または存在を確認する内部コントロールの方法に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
0003942079.tif 000002
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0003942079.tif 000009
(背景）
核酸増幅、および特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝子マッピング、薬物の発見などにおける適用により、重要な探索ツールとなった（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、１９９０；Ｂｅｖａｎら、１９９２；Ｇｒｅｅｎら、１９９１）。ＰＣＲの説明、およびそれを行うためのガイダンスは、対象物についての広範な文献に提供される（Ｉｎｎｉｓら、１９８９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５）。
【０００４】
核酸増幅を行うための自動化装置が、開発されてきた（最も一般的には、ＰＣＲなどを行うための自動化サーマルサイクラー）。ＰＣＲ装置の開発に対する基礎である重要な設計の目的は、以下を含んでいる：精密な温度制御、ハイスループットで高度に多重化したサンプルのサーマルサイクリングにおけるサンプル対サンプルの変異性の最小化、、ＰＣＲ前後の処理工程の自動化、高速サイクリング、サンプル容量の最小化、増幅産物のリアルタイム測定、相互混入またはサンプルの持ち越しの最小化など。特に、ＰＣＲをリアルタイムで行ってモニターすることを可能にする装置の設計が、高度に所望される。増幅および分析の間閉じたままである反応チャンバーが、相互混入を防ぐために所望される（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９２；Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３；Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９１）。
【０００５】
複数チャネルピペッティングまたはロボット化分配（ｒｏｂｏｔｉｃ  ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）を容易にする方法、試薬、および試薬のキットが所望される。限られた数の自動化されたピペッティング工程および分配工程は、誤差および不明瞭な結果を最小化する。明らかに、これらの設計の目的の首尾よい実現は、診断用サンプルの分析において特に所望され、診断用サンプルにおいては、高頻度の偽陽性および偽陰性は、ＰＣＲに基づいた手順の価値を重度に減少させる。
【０００６】
ＰＣＲの間に増幅産物のリアルタイム測定を提供する、蛍光に基づいたアプローチ（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９１）は、インターカレート色素（例えば、エチジウムブロマイド）を使用して、存在する二本鎖ＤＮＡの量を示す（Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９２；Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９３；Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９３）か、または増幅の間に切断されるレポーター−クエンチャ−対を含むプローブ（「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、エキソヌクレアーゼアッセイ）を使用して、二本鎖ＤＮＡの存在の量に比例する蛍光シグナルを放出する（Ｌｉｖａｋ  １９９６）かのいずれかである。プライマーの伸長を行い、そしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼもまた、プローブを切断するように作用する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を保有する。エキソヌクレアーゼアッセイにおいて、「レポーター」色素および「クエンチャー」色素は、標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプローブに付着される。これらの色素は、共鳴蛍光エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）プロセス（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ、１９９２）を通じて相互作用するように、選択され、そして配置される。このレポーターは、化学反応（化学発光を生成する）または光吸収（蛍光を生成する）のいずれかによって励起され得る発光化合物である（図１）。このクエンチャーは、このレポーターと相互作用して、その光の発光を変化させ得、通常、このレポーターの発光効率の減少を生じる。この現象は、クエンチングと呼ばれる。クエンチングの効率は、レポーター分子とクエンチャー分子との間の距離の強い関数である。従って、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ハイブリダイゼーション事象の検出は、エネルギー転移システムを設計することによって達成され、このシステムでは、レポーターとクエンチャーとの間の間隔は、ハイブリダイゼーションの結果として調節される。エキソヌクレアーゼアッセイおよび他の定量化を行うシステムの２つの例である蛍光に基づくアレイは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM７７００およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM７２００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）である。
【０００７】
レポーター−クエンチャープローブを使用する核酸増幅のエキソヌクレアーゼアッセイ（Ｌｅｅら、１９９３；Ｌｉｖａｋら、１９９５）は、下流のサンプル処理を伴わずに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の直接検出を与える。このクエンチャーは、切断の際にレポーターのその密接な近傍から放出され、その結果、このレポーターからのシグナルはもはやクエンチされる。ＰＣＲ産物のコピーの増加と、直接かつ比例的に相関する蛍光の増加が生じる。リアルタイムまたはエンドポイント分析を使用することによって、ＰＣＲ産物の検出および定量は、切断された、自己クエンチ蛍光プローブの蛍光の増加を測定することによって得られ得る。
【０００８】
蛍光の放出は、非侵襲性の閉鎖反応チャンバーにおいて光ファイバープローブを用いて、レーザーで誘導された蛍光によって検出され、そして測定され得る。このアッセイは、ＰＣＲサーマルサイクリングの過程の間（リアルタイム分析）またはＰＣＲの終了時（エンドポイント分析）に、ハイスループットデータサンプリングルーチンによって行われる。ＰＣＲを使用する自動化定量が高度に所望される。手動方法は、ＰＣＲのアリコートのエンドポイント電気泳動および光学定量または濃度定量に依存する。ＰＣＲのリアルタイムモニタリングは、手動エンドポイント方法よりも、複標的（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ）増幅における開始時の標的ＤＮＡ濃度のさらに正確な定量を可能にする。較正された内部コントロールを用いて、近接する濃度の相対値は、ＰＣＲの間の相対濃度値歴を因数に分解することによって決定され得る。内部コントロールを用いた標的のリアルタイムモニタリングが望ましい。
【０００９】
標的の増幅についての条件を確認する内部および／または平行試験は、コントロール試験として所望される。ハイスループット形式（例えば、９６ウェルのマイクロタイタープレート配置）において使用される場合、ＰＣＲは、しばしば、隣接するウェル、ピペッティングの誤差、またはエアロゾルの伝播に由来するテンプレートの混入に起因する偽陽性によって悩まされる。さらに、ＰＣＲは、酵素インヒビターが標的サンプルに存在する場合、または試薬が消失または分解される場合の偽陰性の結果に苦しむ。それゆえ、コントロール増幅試験が所望される。
【００１０】
陽性増幅コントロール試験は、標的から分離され、そして区別される成分に由来する検出可能な産物を与える。陽性コントロール産物の検出は、増幅が可視であり、そして反応チャンバー内で実施されることを示す。陽性増幅コントロール試験（これは、コントロール成分から検出可能な産物を生じない）は、増幅が可能ではない反応チャンバー内の条件を示す。増幅コントロールの別の所望の特徴は、アッセイの間に、他の反応チャンバーへの陰性または「ブロッキング」エレメントの添加を用いて陽性コントロールシグナルを「遮断する」ことであり、このことは、バックグラウンドの測定を可能にする。
【００１１】
内部増幅コントロールは、「受動的」内部参照分子と区別されるべきであり（Ｌｉｖａｋ，Ｓｅｒ．０８／６５７，６８９）、これは、シグナルおよび検出補正を提供する。受動的内部参照（例えば、非相補的なレポーター−クエンチャー分子）は、標的または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズせず、酵素についての基質として消費されないかまたは作用せず、そして任意の種類の化学または酵素反応を受けない。従って、受動的内部参照は、反応チャンバー内の、増幅のための条件の検証または指標を提供しない。
【００１２】
シグナルおよび検出に関連する上記の限定および問題に加えて、受動的内部参照は、以下のまさに一般的な論点に取り組まない：（ｉ）標的または他の試薬への外来ＤＮＡの混入、（ｉｉ）ＰＣＲの阻害、および（ｉｉｉ）反応チャンバー内の増幅効率の確認。内部蛍光生成コントロールを用いるレポーター−クエンチャープローブアッセイは、単に増幅産物の形成に起因する蛍光の変化の、正確な、厳密な、かつ感度のよい測定を提供するために必要である。
【００１３】
コントロール増幅反応は、以下を必要とする：（ｉ）定量結果の正規化、（ｉｉ）標的および他の試薬における増幅インヒビターの検出、および（ｉｉｉ）バックグラウンドシグナルレベルを確立すること。全般的な困難性は、コントロールポリヌクレオチドの増幅が標的の増幅または産物の検出を妨げることを、抑えることである。内部コントロールポリヌクレオチド（ＩＣＰ）は、既知または未知の標的ポリヌクレオチドと同じ反応チャンバー内で増幅を受け、サンプルの調製および結果の測定の際の簡便性を提供する。ＩＣＰは、内因性、すなわち、標的と同じ供給源、ゲノム、染色体、遺伝子、プラスミド、またはフラグメント由来であり得る。内因性ＩＣＰは、増幅インヒビターに供され、それゆえ、偽陰性のシグナルを与え得る。内因性ＩＣＰはまた、標的プライマーについてプライミング部位を有し得、それゆえ偽陽性のシグナルを与え得る。実際に、内因性ＩＣＰシステムは、１つ以上のプライマーを標的と共有し得る。共有したプライマーの消耗は、不正確なＰＣＲの定量および限定されるダイナミックレンジをもたらす。内因性ＩＣＰの別の陰性の特徴は、各標的についてのＩＣＰ、ＩＣＰプライマー、およびＩＣＰ自己クエンチプローブを選択、設計および精製して、適合性および実行可能な増幅を確実にする必要性である。それゆえ、ユニバーサル内因性ＩＣＰ（標的と同じ供給源などに由来しない）が、これらの欠点を回避するために所望される。
【００１４】
陽性コントロール増幅に加えて、エキソヌクレアーゼアッセイのような定量システムのためのバックグラウンドシグナルレベルを確立するための、別々の並行陰性コントロール試験を有することが所望される。コントロール増幅の「スイッチオフ」によって、内部コントロールポリヌクレオチドのインタクトな自己クエンチするプローブの蛍光は、モニターされ得、そして正常な増幅を受けるサンプルからベースライン値を減算され得る。陰性コントロールバックグラウンドの測定での以前の試みは、以下を内包した：（ｉ）増幅の本質的な成分（例えば、マグネシウム、ｄＮＴＰ、および酵素）の検出、または（ｉｉ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もしくはＥＤＴＡのような増幅インヒビターの添加。これらの試みの全ては、蛍光シグナルの生成もしくは検出を変化させるか、変形させるか、または不明にするという欠点に苦しむ。
【００１５】
総ＲＮＡの単離に使用されるほとんどの技術は、有意な量のゲノムＤＮＡの夾雑を伴うＲＮＡを生じる（Ａｍｂｉｏｎ）。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、限定量の組織から低量のｍＲＮＡを分析するためおよび遺伝子発現の定量分析ための一般的な方法である。ＰＣＲ工程は、指数関数的な増幅を含むので、増幅効率における管の間の小さな変動は、最終産物の収率における劇的な差異および最初の豊富さの評価における大誤差に翻訳され得る。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う研究者の間の関心の頻繁な原因は、ＲＮＡ調製の際のＤＮＡの夾雑によって生じる不正確なデータである。ＰＣＲは、逆転写によって合成されるｃＤＮＡ標的と、ゲノムＤＮＡ夾雑物とを区別し得ない。ＤＮＡの夾雑は、「ＲＴなし（ｎｏ−ＲＴ）」の陰性コントロールを行うことによって容易に検出されるが、本発明が提供する夾雑および阻害に対する満足かつ包括的な解決策は存在しない。ＲＴ−ＰＣＲ定量分析の従来の方法（Ｗａｎｇら、１９８９；Ｔｓａｉら、１９９６；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９６）は、全てゲルに基づくアッセイであり、これらは、不正確かつ主観的な可視化技術に依存する。
【００１６】
核酸増幅産物の定量および検出のための従来のコントロールの制限および欠乏を考慮すると、ゲルに基づかない内部コントロール法を開発することが目的であり、この方法は、陰性および陽性の両方の指標の増幅を提供する。本明細書中に記載される発明は、このような内部コントロール試薬、キット、および方法を提供する。
【００１７】
（要旨）
本発明は、既知および未知の標的ＤＮＡの核酸増幅の存在下でかつそれと同時に、コントロールＤＮＡの核酸増幅を定量するための新規な方法および試薬のキットに関する。
【００１８】
本発明の特定の実施態様の目的は、単一の反応チャンバーにおいて核酸増幅反応を行い、それにより内部コントロールプライマーが内部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして標的プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてポリヌクレオチドの増幅が、ポリメラーゼ鎖の伸長、熱溶解、およびハイブリダイゼーションによって生じる方法を提供することである。内部コントロールポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成され、そして標的ポリヌクレオチドに配列相同ではない。内部コントロールポリヌクレオチドは、標的プライマーによる増幅または標的プローブとのハイブリダイゼーションを可能にしない。内部コントロールプライマーを用いた内部コントロールポリヌクレオチドの増幅から生じる増幅産物は、代表的には、５０〜５００ｂｐの長さである。アンプリコンは、内部コントロールプローブのハイブリダイゼーションに相補的な内部部位を含む。ＲＮＡから構成される内部コントロールポリヌクレオチドは、逆転写酵素のための基質であり得、そしてｃＤＮＡコピーの生成を生じる。
【００１９】
本発明の特定の実施態様の別の目的は、ＰＣＲ混合物中の標的および他の成分中のＰＣＲインヒビターの存在を検出する内部コントロール試薬および方法を提供することである。内部コントロールは、分配が容易である特性（すなわち、最小のピペッティング操作）、および従来の９６ウェルマイクロタイタープレート形式におけるロボット化自動化につながる特性を有する。内部コントロール試薬は、標的ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅効率を減少するべきではない。陰性および陽性の両方の内部コントロールシグナルは、区別可能かつ効力のある結果を与えるべきである。陽性内部コントロールシグナルは、偽陰性から真の陰性標的シグナルを区別し得る。陰性内部コントロールシグナルの測定は、陽性内部コントロールシグナルから減算されるバックグラウンドを与える。内部コントロールプローブ上のレポーターの蛍光は、反応から反応へと変化するそのような増幅因子の反応を正規化するために測定される。従って、内部コントロールプローブからの蛍光シグナルを調べることによって、ＰＣＲ阻害のほとんどの供給源の効果が同定される。
【００２０】
本発明の内部コントロール試薬を含むレポーター−クエンチャープローブアッセイは、種々の核酸増幅システムと組み合わせて使用され得る。一般的には、このアッセイは、エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの使用または反応がモニターされている過程の間に増加する二本鎖ＤＮＡの集団の使用のいずれかを必要とする。本発明のシステムとともに使用され得る例示的な増幅スキームは、ＰＣＲ、リガーゼに基づく増幅スキーム（例えば、リガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ（Ｂａｒａｎｙ、１９９１））、Ｑ−βレプリカーゼに基づく増幅スキーム、鎖置換増幅（ＳＤＡ）スキーム（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２；Ｋｅｌｌｅｒ、１９９３）を含む。
【００２１】
外因性ＩＣＰは、配列データバンクの検査からの任意の既知の標的との配列相同性を有しないように選択され、そして設計される。この外因性ＩＣＰは、５０〜５００ｂｐの長さのＤＮＡまたはＲＮＡである。この外因性ＩＣＰは、ＩＣＰプライマーおよび自己クエンチプローブとともに、既知の量の蛍光シグナルを一貫して生じる既知の量で、増幅試薬キットに添加される。この外因性ＩＣＰは、反応チャンバー内の増幅条件を検証して、標的ＤＮＡの存在について真の陰性を確立し得る。
【００２２】
本発明の特定の実施態様のなお別の目的は、標的および内部コントロールポリヌクレオチドの内部部分へのハイブリダイズのための、異なりかつ非相同性の配列を有する自己クエンチ蛍光プローブを提供することである。内部コントロールポリヌクレオチド（ＩＣＰ）は、任意の公知の標的ポリヌクレオチドと最小の相同性を有するように設計されるかまたは選択されるので、内部コントロールプローブは、ＩＣＰにのみハイブリダイズし、そして標的ポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない。同様に、標的プローブは、標的ポリヌクレオチドのみハイブリダイズし、ＩＣＰにハイブリダイズしない。自己クエンチプローブは、ハイブリダイズしない場合に、少なくとも１つの一本鎖コンフォメーションで存在し、その結果、クエンチャー色素がレポーター色素の蛍光をクエンチする。ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、プローブは、少なくとも１つのコンフォメーションで存在し、ここでは、レポーター色素の蛍光はクエンチされず、そしてレポーター色素の蛍光強度は、プローブがポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合のクエンチャー色素の蛍光強度よりも大きい。核酸ポリメラーゼは、増幅の間にプローブを実質的に消化して、クエンチャー色素からレポーター色素を分離し得る。切断された色素からの蛍光は、核酸増幅の発生に対応する。蛍光はまた、相補的な標的またはＩＣＰへのプローブのハイブリダイゼーションに基づいて発生し得る。標的および内部コントロールプローブは、同じ反応チャンバーで使用される場合に、異なりかつスペクトルで分離可能なレポーター部分で標識される。反応チャンバーとのレポーター部分からの各々の発光スペクトルは、十分に非重複でなければならず、その結果、別々の発光の寄与が決定され得る。別々のピークが定量され得、これは、増幅産物（すなわち、標的および内部コントロールポリヌクレオチド）の相対量に相関する。
【００２３】
明らかに、このシステムは、複数の蛍光レポーターを含むように生成されて、例えば、一回の反応でいくつかの標的核酸の同時増幅をモニターし得、その結果、複数の蛍光強度比がモニターされる。このようなマルチレポーターシステムは、単一の反応チャンバーで生じる複数の増幅の分析を必要とする適用において有利である。このようなシステムにおいて、各々のレポーター分子は、任意の他のレポーターからの発光からスペクトルで分離可能な発光を生成する。各レポーターとともに使用される特定のクエンチャーは、同じであっても異なっていても良く、クエンチャーおよびレポーターのスペクトル特性に依存する。そのような実施態様における使用に適切ないくつかのスペクトルで分離可能な色素は、Ｆｕｎｇら；Ｍｅｎｃｈｅｎら；Ｂｅｒｇｏｔら；などの参考文献に開示される。
【００２４】
自己クエンチ蛍光プローブの好ましい実施態様において、レポーター色素は、クエンチャー色素から、少なくとも１２のヌクレオチドによって分離され、このレポーター色素は、自己クエンチ蛍光プローブの５’末端または３‘末端に付着され、そしてこのクエンチャー色素は、５’末端または３’末端に付着される。別の実施態様において、第１の自己クエンチ蛍光プローブは、内部コントロールポリヌクレオチドに相補的であり、そして第２の自己クエンチ蛍光プローブは、標的ポリヌクレオチドに相補的である。さらに、第１の自己クエンチ蛍光プローブのレポーター色素は、第２の自己クエンチ蛍光プローブのレポーター色素から、スペクトルで分離可能である。好ましくは、この実施態様において、励起ビームは、アルゴンイオンレーザーの４８８ｎｍの発光ラインから生成されて、レポーター色素において蛍光を誘導する。レポーターおよびクエンチャーからの蛍光発光は、５００〜６５０ｎｍで検出され得る。反応チャンバーにおける蛍光団は、発光最大が十分異なり、発光バンド幅が十分狭い場合に、区別され得る。
【００２５】
レポーター部分の好ましい実施態様は、以下の一般的な構造および番号付けシステムを有するフルオレセイン色素であり、ここでＬはリンカーである。
【００２６】
【化５】
0003942079.tif 000010
フルオレセインレポーター色素の好ましい実施態様は、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、および２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）（図２）からなる群より選択される。レポーター部分の他の実施態様は、シアニン色素、ダンシル誘導体などである。
【００２７】
クエンチャー部分の好ましい実施態様は：（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびテトタプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群より選択されるローダミン色素、ならびに（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、シアニン、アントロキノン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾールなどの化合物である（図３）。ローダミン色素は、以下の一般的な構造および番号付けシステムを含み得、ここでＬはリンカーである。
【００２８】
【化６】
0003942079.tif 000011
本発明のフルオレセイン誘導体およびローダミン誘導体は、上記の１つ以上の番号付けされた位置で置換され得る。
【００２９】
本発明の別の局面は、ＩＣＰと相補的でありそして核酸増幅の間に伸長不能である、本明細書以下で「ブロック」と呼ばれるオリゴヌクレオチドまたは核酸アナログを提供することである。このブロックは、内部コントロールプライマーと同程度かまたはより高いアフィニティーで、ＩＣＰの任意の部分にハイブリダイズし得、そしてＩＣＰの増幅を妨害し得る。ＰＣＲへのブロックの添加は、内部コントロールにネガティブな結果をもたらす。内部コントロールプローブからの蛍光の非存在または最小のバックグラウンドによって検出されるように、ＩＣＰからの増幅産物が得られない。内部コントロールプローブからの蛍光は、最大放射（例えば、内部コントロールレポーターの５００〜６５０ｎｍの間で生じる）において測定される。標的プローブ上のレポーターは、内部コントロールプローブのレポーターとのスペクトル的な重複をほとんど有さないか、または全く有さないように選択される。従って、標的プローブ上のレポーターは、単一の反応チャンバー中で内部コントロールプローブ上のレポーターから独立してかつ同時に測定され得る。
【００３０】
このブロックは、ＤＮＡプライマーのヌクレオチド間結合、糖部分、または核塩基部分に対する修飾から構成され、このプライマーをポリメラーゼによる伸長不能にし得る。適切な修飾の例は、３’リン酸基である。ＤＮＡのアナログ（例えば、２−アミノエチルグリシン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および他のアミド結合オリゴマー；２’−Ｏ−メチルおよび他の２’−Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチド；ホスホロチオエートおよび他のリン酸アナログなど）がこのブロックとして利用され得る。このブロックは、いくつかの特性について選択され、それらの特性には、（ｉ）高い特異性、（ｉｉ）高いアフィニティー、（ｉｉｉ）非伸長能、（ｉｖ）化学的安定性、（ｖ）増幅を妨害しないこと、が含まれる。好ましい実施態様において、このブロックはＰＮＡ（ペプチド核酸）オリゴマーである（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら）。可溶性およびより低い凝集効果を改善するために、このＰＮＡブロックは、親水性標識（例えば、ポリエチレンオキシ、ペプチド、核酸、核酸アナログなど）と結合体化され得る。
【００３１】
ＰＮＡは、ＰＣＲにおいて、単一塩基対変異分析のために、「クランピングエレメント」として使用されてきた（Ｏｒｕｍら）。この報告では、ＰＮＡは、相補的標的配列（代表的には、野生型）の増幅を抑制し、そして低コピー数または拮抗するＤＮＡプライマーを有する変異型標的配列の選択的増幅を可能にする。
【００３２】
本発明の特定の好ましい実施態様は、増幅産物形成の終了点測定およびリアルタイム測定のための方法を包含する。終了点方式において、増幅反応が完了した後（例えば、ＰＣＲ反応のすべての増幅サイクル、または実質的にすべての増幅サイクルが完了した後）に蛍光測定が行われる。リアルタイム方式において、蛍光測定は、増幅反応の間（例えば、ＰＣＲプロセスの各々の熱サイクル後）に複数回行われる。リアルタイム方式は、標的核酸の最初の量（例えば、血液サンプル中に存在する病原体核酸のコピー数）の定量的測定が必要である場合に好ましい。
【００３３】
蛍光測定は、標的ベッセル中におけるＰＣＲの操作性を確証するために使用され得る。本発明の内部コントロール試薬の使用は、高感度試験（例えば、低コピー数またはまれな遺伝子）のためのゼロに近い蛍光のバックグラウンドの割り当てを可能にする。本発明の内部コントロール試薬の使用は、レポータークエンチャープローブアッセイにおける複数のレポータークエンチャープローブの同時使用を可能にする。
【００３４】
本発明の目的は、増幅産物の量に比例した安定な蛍光シグナルを生成するための装置および蛍光試薬を提供することによる、核酸増幅反応の正確かつリアルタイムのモニタリングのための方法を提供することである。増幅反応の進行を示すデータの利用可能性は、標的核酸の相対開始濃度のより正確な見積もりをもたらし、増幅反応の効率の迅速な評価をもたらし、そして還元剤の使用およびフィードバック反応制御の可能性を明らかにする。
【００３５】
本発明の目的は、本発明の改善された増幅方法の実施のための核酸増幅反応に必要とされる試薬からなるキットを提供することである。キットは、特許請求の範囲に記載の方法の実施がより再現性よくかつ容易に実施されることをもたらす。キットは、本発明の方法の実施を単純化するためにあらかじめ測定された量の試薬を提供し得る。さらに、キットは、代表的には、本発明の方法を実行するための詳細な指示を含む。本発明の１つの実施態様において、このキットは、内部コントロールポリヌクレオチド、内部コントロールプライマー、内部コントロールポリペプチドに対して相補的な非伸長オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ、標的プライマー、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、レポーター部分およびクエンチャー部分を含む自己クエンチング蛍光プローブ、ヌクレオチド５’三リン酸を含む。本発明のキットはさらに、本発明の方法を実行するために必要なさらなる試薬を含み得、そのような試薬には、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、緩衝剤、分子量サイズスタンダード、ワックスビーズなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
１つの目的は、標的サンプルの抽出、単離、または精製の時点において、サンプル追跡およびシグナル較正に本発明の方法を利用することである。これらの目的のために、ＩＣＰ、内部コントロールプライマーおよびプローブからなる内部コントロール試薬が、粗サンプル調製物に添加され得る。
【００３７】
１つの目的は、ｍＲＮＡサンプル（とりわけ、低コピー数遺伝子）上での逆転写酵素／ＰＣＲに本発明の方法を利用することである。
【００３８】
１つの目的は、多型サンプルの対立遺伝子の識別に本発明の方法を利用することである。遺伝子のバリエーションは、エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｌｅｅら、１９９３）によって、遺伝された対立遺伝子の単一塩基対差異のレベルにおいて区別され得る。
【００３９】
１つの目的は、病原体検出のための標的特異的アッセイのある／なしで本発明の方法を利用することである。ここで、一対のまたは限定された複数の対のプライマーおよび単一レポータークエンチャー標的プローブは、増幅キットの構成要素である。このキットはまた、内部コントロール試薬および増幅に必要な他の構成要素を含む。キットからの測定されたアリコートは、空間的にアドレス可能な試験ホルダー中の位置に高処理能力様式または自動化様式で分配され得る。場所は、ウェル、部位、または表面アレイであり得る。このホルダーの好ましい実施態様は、マイクロタイターウェルトレイである。この配置の好ましい実施態様は、マイクロタイターウェルトレイ中のウェルである。代表的な配置密度は、公認の工業規格に適合するウェルの８×１２配列の９６ウェルである。ホルダーの配置のための材料は、ポリマー、金属、ガラス、またはセラミックであり得る。標的サンプルは、キット構成要素の送達前または送達後の位置に、高処理能力様式または自動化様式で分配され得る。
【００４０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明の好ましい実施態様に対してここで詳細に言及がなされ、その例は、添付の図面において例証される。本発明は、好ましい実施態様とともに記載されるが、それらは本発明をこれらの実施態様に限定することを意図しないことが理解される。逆に、本発明は、変更、改変、および等価物を網羅することが意図され、これらは添付の請求の範囲によって規定される本発明に含まれ得る。
【００４１】
（Ｉ．定義）
別に言及されない限り、本明細書中で使用される以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される：
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然のヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの直鎖状ポリマーをいい、これには二本鎖または一本鎖のデオキシリボヌクレオチド「ＤＮＡ」、リボヌクレオチド「ＲＮＡ」、それらのα−アノマー型などが含まれる。すなわち、「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）をそれぞれ含む構造単位であるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの鎖である。
【００４２】
「ヌクレオチド」は、生体ポリマー核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）におけるモノマー単位である。ヌクレオチドは３つの部分からなる：糖、リン酸、および核塩基である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．，１９９６）。二重鎖のヌクレオチド部分はまた、「塩基」または「塩基対」といわれる。最も一般的な天然に存在する核塩基である、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）は、配列特異的な様式で１つの核酸鎖を他の鎖に結合する水素結合官能基を有する。「ヌクレオシド」とは、リン酸部分（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｙｅ）を欠くヌクレオチドをいう。通常ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結によって連結されており、本明細書中で使用される場合、用語「ホスホジエステル連結」とは、ホスホジエステル結合またはそのリン酸アナログを含む結合をいい、これらには、付随するカウンターイオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、Ｎａ+など）が含まれる。ポリヌクレオチドは、代表的には、いくつかのモノマー単位（例えば、８〜４０）から数千のモノマー単位までのサイズの範囲にわたる。ポリヌクレオチドについての大部分の分子生物学的適用は、１５〜３０ヌクレオチド長の独特の配列を必要とする。ＤＮＡポリヌクレオチドが文字の配列によって表される場合（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）には常に、他に示されていない限り、そのヌクレオチドは、左から右に、５’→３’の順番であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００４３】
「ワトソン／クリック塩基対」および「ワトソン／クリック相補性」とは、水素結合を通して互いに結合するヌクレオチドおよびそのアナログの特定の対のパターン（例えば、ＡはＴおよびＵと対をなし、そしてＧはＣと対をなす）をいう。
【００４４】
「オリゴヌクレオチドアナログ」とは、化学合成によってモノマーヌクレオチドアナログ単位から作られるＤＮＡおよびＲＮＡのポリマー性アナログであり、核酸に関連する性質および特性のいくつかを有する。
【００４５】
「結合部位」とは、リンカーに結合されるオリゴヌクレオチド上の原子をいう。
【００４６】
「リンカー」とは、オリゴヌクレオチドおよび標識を接続する鎖を含む１つ以上の原子をいう。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「キメラ」とは、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含むオリゴヌクレオチドをいう。モノマー単位は、ホスホジエステル結合およびホスホジエステルアナログ結合を通して連結される。
【００４８】
「ホスホジエステルアナログ」とは、それらの組成および／またはヌクレオチドへの連結の位置において異なる、天然のホスホジエステル３’，５’−ヌクレオチド間連結のアナログをいい、２’，５’−連結、３’，３’−連結、５’，５’−連結、メチルホスホネート、アルキル化ホスホトリエステル、３’−Ｎ−ホスホルアミダイト、およびＰＮＡを含むがこれらに限定されない。
【００４９】
「低級アルキル」「低級アルキレン」および「低級置換アルキレン」とは、１〜１２炭素原子からなる直鎖基、分枝基、または環状基をいう。
【００５０】
「標識」とは、核塩基オリゴマーの一方または両方の末端に共有結合される基をいう。この標識は、例えば、蛍光、化学発光、および電気化学的発光（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．）のような手段によって分子の検出のためのシグナルを与えるような機能を行い得る。あるいは、この標識は、特異的または非特異的捕捉方法（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．，１９９５）によって分子の分離または固定化を可能にする。
【００５１】
「エネルギー移動」および「蛍光クエンチング」とは、１つのプロセスであり、それによってエネルギーが電子的に励起された発光「レポーター」分子から「クエンチャー」分子によって取り除かれ、それによって、レポーター分子からの光の放出なしでこのレポーター分子をその基底状態に戻す。このレポーター分子は、光吸収および化学反応を含む多数のプロセスのいずれかによってそのより高いエネルギーレベルの１つに励起され得る。
【００５２】
複数の色素に関連する「スペクトルの分解能」および「スペクトル的に分解可能」とは、色素の蛍光放射が十分に異なること（すなわち、十分に重複しないこと）、それぞれの色素が結合している試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、標準的な光検出系を使用するそれぞれの色素によって生成される蛍光シグナルに基づいて分解され得ることを意味する。
【００５３】
「検出」とは、共有結合した検出標識の特性に基づく核塩基オリゴマーの検出、観察、または測定をいう。検出標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセインおよびローダミン誘導体、シアニン色素、およびエネルギー移動色素（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．，１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ，１９８８）を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
「プライマー」とは、特定された標的核酸に選択的にアニーリングし得、そしてその後、プライマー伸長反応の開始点として作用する（ここでこのプライマーは５’→３’方向に伸長する）オリゴヌクレオチドをいう。
【００５５】
「プライマー伸長反応」とは、標的／プライマー二重鎖とヌクレオチドとの間の反応であって、このプライマーの３’末端にこのヌクレオチドの付加を生じ、その結果、付加されたヌクレオチドが標的核酸の対応するヌクレオチドに相補的である、反応をいう。
【００５６】
用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性」とは、ホスホジエステル結合で核酸を切断する酵素活性をいう。この活性は、エンド（内部ホスホジエステル結合で切断する）またはエキソ（その核酸鎖の５’または３’いずれかの末端に最も近いホスホジエステル結合で切断する）のいずれかであり得る。
【００５７】
用語「ブロック」とは、内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な、伸長不能オリゴヌクレオチドまたは伸長不能核酸アナログをいう。ブロックは、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド５’三リン酸を用いての、ＤＮＡプライマーの３’末端の伸長を介する正常な様式でのポリマー化または伸長を行わない。ブロックは、陰性コントロールエレメントとして機能し、本質的に、内部コントロールポリヌクレオチドの増幅を止め、それによりこの内部コントロールプローブに由来する蛍光の増加を妨げる。
【００５８】
用語「自己クエンチする」とは、分子間のエネルギー転移効果をいい、例えば、レポーターとクエンチャーが、蛍光団からクエンチャーへのエネルギー転移を可能にする配置でオリゴヌクレオチド上で結合することをいう。
【００５９】
用語「エンドポイント分析」とは、データの収集が、反応が完了した場合にのみ生じる試験をいう。エキソヌクレアーゼアッセイのエンドポイント分析は、ＰＣＲが完了した時のレポーターシグナルの測定を必要とする。結果は、（レポーターシグナルの蛍光の変化）−（内部コントロール増幅の蛍光の変化）に関して記録される。
【００６０】
用語「リアルタイム分析」とは、試験の間の定時的モニタリングをいう。エキソヌクレアーゼアッセイのリアルタイム分析は、（サイクルからサイクルへのレポーターシグナルの変化）−（内部コントロール増幅の蛍光の変化）を測定する。
【００６１】
（ＩＩ．内部コントロールポリヌクレオチドおよびブロックを用いるエキソヌクレアーゼアッセイ）
図１に示されるＴａｑＭａｎ（登録商標）エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９１；Ｌｅｅら、Ｌｉｖａｋ、１９９６）は、自己クエンチするプローブ１（レポーター標識Ｆ1とクエンチャー標識Ｑの両方を含む）ならびに標的プライマー３ａおよび３ｂが、標的ポリヌクレオチド２にハイブリダイズすることを示す。次いで、増幅のポリマー化段階の間に、プライマー３ａおよび３ｂは、ポリメラーゼ酵素を使用して伸長され、それにより（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用して）伸長されたプライマー４ａおよび４ｂを形成する。このプライマー伸長反応の間に、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性がプローブ１を切断するように作用して、プローブフラグメント（レポーター保有フラグメント５およびクエンチャー保有フラグメント６を含む）を形成する。従って、レポーター標識とクエンチャー標識は分離され、それによりこの２つの間のエネルギー転移が妨げられ、そしてこのレポーターの発光が、プローブの消化の際にクエンチされなくなる。蛍光の増加（Ｆ1として検出可能）が生じる。
【００６２】
本発明の内部コントロール試薬および方法が、エキソヌクレアーゼアッセイの間に行われる場合、上記に加えて、試薬（自己クエンチするプローブ７、および内部コントロールポリヌクレオチド９に相補的なプライマー８ａおよび８ｂを含む）が、反応チャンバーに添加される（図４）。次いで、増幅のポリマー化段階の間に、プライマー８ａおよび８ｂが、ポリメラーゼ酵素を使用して伸長され、それによりＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長されたプライマーを形成する。プライマー伸長反応の間に、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性がプローブ７を切断するように作用して、プローブフラグメント（レポーター保有フラグメント１０およびクエンチャー保有フラグメント１１を含む）を形成する。従って、レポーター標識とクエンチャー標識は分離され、それによりこの２つの間でのエネルギー転移が妨げられ、そしてレポーターの発光がプローブの消化の際にクエンチされなくなる。蛍光の増加（Ｆ2として検出可能）が生じる。レポーター色素Ｆ1およびＦ2は、スペクトルで分離可能であるように選択される。１および７のクエンチャー部分は、同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００６３】
陰性内部コントロールブロック１２が添加される場合、内部コントロールポリヌクレオチド９の増幅は生じない。伸長不能ブロック１２は、８ａプライマー結合部位、または９上の別の部位に選択的に結合し、そして増幅を妨げる。自己クエンチするプローブ７は、インタクトでかつクエンチされたままである。陰性コントロールのベースラインが測定され得、そして陽性コントロールの蛍光の変化に適用され得る。
【００６４】
（ＩＩＩ．試薬の設計および合成）
一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドの設計および合成は、従来の教示に従う。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９９２；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８３）を使用する、自動化固相ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ＤＮＡ合成機またはＭｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ合成機（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））で合成される。
【００６５】
（ａ．クエンチするプローブ）
自己クエンチするプローブを設計する際に、以下の一般的指針に従われ得る：（１）標的核酸配列がＰＣＲアンプリコン内に位置する場合、プローブ配列は、そのプローブがＰＣＲプライマー間の配列の位置でハイブリダイズするようであるべきである；（２）プローブは、約２０〜３０ヌクレオチドの長さであり、良好なハイブリダイゼーション速度論および結合の特異性を確実にすべきである；（３）プローブと標的核酸配列における２次構造を避ける；（４）プローブは、正方向プライマーおよび逆方向プライマーのいずれにもハイブリダイズするべきではない；そして（５）単一ヌクレオチドの長いストレッチ（すなわち、４より多い）を含むプローブを避ける；そして（６）プローブ配列とその相補体との間で選択する場合、ＧヌクレオチドよりもＣヌクレオチドを有する鎖を選ぶ。
【００６６】
自己クエンチするプローブは、レポーターをクエンチャーの近傍にもたらし、レポーターからクエンチャーへの効率的なエネルギー転移を可能にするように設計される。所定の実施態様についての適切な距離の選択に関する指針は、蛍光レポーター分子とクエンチ分子（時折、それぞれ「ドナー」分子と「アクセプター」分子ともまた呼ばれる）との間の共鳴エネルギー転移に関する多数の参考文献（例えば、Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８；Ｏｚａｋｉら；Ｌｉｖａｋら、１９９５など）に見出される。自己クエンチするプローブは、分子内ワトソン／クリック塩基対形成特性（すなわち、自己相補性）を有し得る。安定な、水素結合された高次構造の選定は、レポーターとクエンチャーとの間に、それらの強制的な近さに起因して、高い程度のエネルギー転移を生じ得る（Ｔｙａｇｉら、１９９６；Ｔｙａｇｉら、１９９７）。増幅の間に標的ポリヌクレオチドまたは内部コントロールポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの際の、自己相補性の、自己クエンチするプローブ（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ」）の蛍光の増大は、プローブのエキソヌクレアーゼ切断を必要としないほど十分に有意であり得る。
【００６７】
レポーターおよびクエンチャーは、好ましくは十分近接し、その結果、レポーターからの実質的に全て（例えば、９０％）の蛍光がクエンチされる。代表的には、エネルギー転移に基くクエンチングのために、第１の蛍光団と第２の蛍光団との間の距離は、１０〜１００オングストロームの範囲内であるべきである。好ましくは、蛍光物質とクエンチャーは、約４ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間で分離される。しかし、本発明は、蛍光団を分離するヌクレオチドの数が１０を超え得る実施態様を含む。好ましくは、レポーターおよびクエンチャーいずれかが、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端ヌクレオチドに付着する。レポーターおよびクエンチャーはまた、プローブの３’末端ヌクレオチドにも付着し得る。本発明の参照分子の他の実施態様において、蛍光物質およびクエンチャーは、ポリヌクレオチドの内部部位に付着する。本発明はまた、２つの蛍光団のうちの１つが内部部位に位置し、そして他の蛍光団がそのポリヌクレオチドの末端に付着している実施態様を含む。
【００６８】
クエンチャーとして使用される色素は、その蛍光の特徴が核酸（特に、二本鎖ＤＮＡ）の存在または核酸の結合によって実質的に影響されない蛍光色素を含む。特定のプローブについてのレポーター−クエンチャー対は、レポーターの発光スペクトルがクエンチャーの吸収と重複するように選択される（図５）。スペクトルの重複により、プローブがインタクトである場合の効率的なエネルギー転移（ＦＲＥＴ）が可能になる。このような色素は、この基準を満たし、またレポーター−クエンチャープローブに対して使用されるどの蛍光団からも、スペクトルで分離される事実上いかなる蛍光色素を含み得る。レポーターとして適切な色素はまた、クエンチャーとしても適切であり得る。同様に、クエンチャーとして適切な色素はまた、レポーターとしても適切であり得る。自己クエンチするプローブの１つの実施態様において、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）がレポーターとして使用され、そして６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）がクエンチャーとして使用され、その結果、ＴＡＭＲＡ色素は、６−ＦＡＭによるいかなる蛍光発光をも実質的にクエンチする。
【００６９】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドに加えて、種々の核酸アナログが自己クエンチするプローブとして使用され得、例えば、（ｉ）ヌクレオチド間結合中の酸素が、硫黄、炭素、または窒素により置換され得、そして（ｉｉ）このヌクレオチド間ホスホジエステル結合は、サルフェート、カルボキシレート、アミドなどであり得る。あるいは、プローブは、１つ以上のヌクレオシド中における糖修飾を有し得る（例えば、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドなど）。また、プローブは、１つ以上のヌクレオシドにおけるヌクレオベース（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）修飾を有し得る（例えば、Ｃ−５−アルキニルピリミジンなど）。蛍光団は、ブロックを構築する蛍光団および／またはポリマーの適切な機能化により、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに結合され得る。蛍光団を核酸およびアナログに結合する方法の詳細な説明は、文献中にたくさん見出され得る（Ａｎｄｒｕｓ、１９９２；Ａｎｄｒｕｓ、１９９５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６；Ｊｕら、１９９５）。
【００７０】
自己クエンチするプローブのレポーターおよびクエンチャーは、オリゴヌクレオチドの所定のヌクレオチドに、反応性基を含むヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーを使用して、共有結合で付加され得る。例えば、そのような反応性基は、ホスフェート上、またはホスフェートアナログ上（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．１９９０）、５’ヒドロキシル上（付着が５’末端ヌクレオチドに対してである場合）（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）、および塩基部分上（例えば、Ｒｕｔｈ；Ｕｒｄｅａらなど）にあり得る。さらに好ましい場合、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドは、ブロックされ、すなわち核酸ポリメラーゼによる伸長ができなくされる。このような３’ブロックは、リン酸基（Ｈｏｒｎ、１９８６；ＰｈｏｓｐｈａＬｉｎｋ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより市販される）の化学的付加により簡便に実行される。本発明の好ましい実施態様において、ＴＡＭＲＡが自己クエンチするプローブに対するクエンチャーとして使用され、そしてこのＴＡＭＲＡ色素は３’末端に付着される（Ｍｕｌｌａｈ、１９９７；Ｍｕｌｌａｈ、１９９８）。
【００７１】
（ｂ．ブロック）
好ましいブロックは、ペプチド−核酸オリゴマー（ＰＮＡ）であり、これは、天然のホスホジエステル−デオキシリボース骨格がＮ−（２−アミノエチル）−グリシンというペプチド様単位により置換されたＤＮＡアナログである（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９１）。天然の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）由来のヌクレオベースは、天然の骨格に対するアミド結合を通じて保持される。ＰＮＡの構造は、以下に示され：
【００７２】
【化７】
0003942079.tif 000012
ここでＢ1およびＢ2はヌクレオベースである。
【００７３】
ＰＮＡオリゴマーは、ワトソン／クリック塩基対形成により、相補的配列を認識し得る。その相補体に対するＰＮＡの結合は、ＰＮＡの平行な方向または逆平行な方向のいずれかで生じ得る。しかし、逆平行二重鎖が大いにより安定である（Ｅｇｈｏｌｍら）。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびＰＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの融解温度は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも大いに高く、それは、ＰＮＡ含有二重鎖中の静電反発力に欠如に起因する。ＰＮＡオリゴマーは、市販の、自動化合成機（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ３９４（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、市販の試薬を用いる従来の方法（Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ、１９９７）により合成され得る。
【００７４】
（ＩＶ．試薬のキット）
以下から構成されるキットのマスター混合物からのアリコートが、すべてのサンプルウェルに送達される：内部コントロールポリヌクレオチド、内部コントロールプライマー、この内部コントロールポリヌクレオチドに相補的な伸長不能オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ、標的プライマー、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、自己クエンチする蛍光プローブ、ヌクレオチド５’三リン酸、およびこのエキソヌクレアーゼアッセイに必要な他の試薬。
【００７５】
本発明の実施態様は、核酸増幅反応における使用のための試薬組成物を含む。本発明の組成物は、核酸増幅緩衝液を含む。用語「核酸増幅緩衝液」とは、本明細書中で使用される場合、核酸増幅反応に必要とされる酵素反応（または複数の反応）を支持する緩衝化水溶液をいう。緩衝組成物の選択は、目的の核酸増幅反応を触媒するために選択される特定の酵素に従って変化する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．、１９９５）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される増幅反応に適切な核酸増幅緩衝液の例は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン、０．０１％  ＮＰ４０、および０．０１％  ＴｗｅｅｎTMである。
【００７６】
本発明の試薬組成物は、濃縮形態か、または使用前に有意な希釈を必要としない形態で供給され得る。この試薬組成物は、目的のアッセイを実施するのに必要とされるさらなる化合物を添加することにより使用され得、このような化合物は、耐熱性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標的ポリヌクレオチド、レポーター−クエンチャープローブなどを含む。必要なさらなる化合物の添加後、次いで、反応混合物は、しかるべく、例えば、熱サイクリングにより処理されて、所望の増幅結果を生成し得る。
【００７７】
（Ｖ．ＰＣＲ産物の検出）
リアルタイム検出系は、閉鎖反応チャンバーに作動可能に結合された光学的構成成分を含み、この構成成分は、反応混合物に励起ビームを集束するためおよび生じた蛍光を収集するためのレンズ、ならびに光源からレンズまでの励起ビームとレンズから検出手段および分析手段までの蛍光シグナルとの両方を伝達するためのファイバーオプティクスを含む。増幅の間に蛍光を誘導するために、レーザー光が、光ファイバーの多重アレイを介して９６のサンプルウェルへと分配され得る。生じた蛍光発光は、このファイバーを介して戻り、そして電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを備える分光写真器に指向される。好ましくは、この反応混合物は、閉鎖反応チャンバーに含まれて、相互混入または「持ち越し」を防ぐ。従って、レンズは、励起ビームを集束し、そして閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通じて蛍光を収集する。好ましい反応チャンバーは、例えば、従来の微小遠心管の構造および容積を有する管である。この管は、反応混合物が添加された後、この管の開口末端に栓を付けることにより閉められ、その結果、漏出しない密封が形成される。ＰＣＲについてのサンプル接続器の好ましい実施態様において、レンズは励起ビームを指向し、そしてプローブにより生成された蛍光を管の栓を介して収集する。換言すると、一旦、反応混合物が管の中に配置され、そしてその栓が付けられると、閉鎖反応チャンバーが形成される。第１の蛍光シグナルおよび第２の蛍光シグナルの連続分析から生じ得る可能な変動性は、光検出器のアレイ上にシグナル光をスペクトルで分離することによって（例えば、ＣＣＤアレイ上にシグナルを分散することによって）シグナルを同時に分析することにより排除される。単一光源により生成された励起ビーム（例えば、レーザー）は、ファイバーオプティクスによって、複数の閉鎖反応チャンバーに簡便に分配される。同様に、同じファイバーオプティクスは、単一の検出および分析系による分析のために、複数の反応チャンバーからの蛍光シグナルを収集し得る。あるいは、この反応チャンバーは、ウェル（例えば、マイクロタイターウェル、または固体アレイ上の窪み）であり得る。このアレイは、空間的にアドレスで呼び出せる複数の位置から構成され得る。好ましくは、この系は、核酸のＰＣＲ増幅を伴って使用される。好ましい実施態様の例は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。別の実施態様は、エンドポイント分析のためのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ７２００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍである。好ましくは、本発明の系は、ＰＣＲをモニターするために使用されるが、この系はまた、他の増幅スキームを伴っても使用され得る。
【００７８】
（ＶＩ．データ分析）
エキソヌクレアーゼアッセイの結果は、２つのパラメーター（Ｒｎ値およびＣｔ値）を使用して分析され得る。Ｒｎ値は、ＰＣＲ実験の終了時の、レポーター色素の蛍光と受動参照物（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）の蛍光との比である。Ｒｎは、標的およびＩＣＰの各々について計算される：
Ｒｎ（標的）＝（標的プローブの発光強度）÷（受動参照物の発光強度）
Ｒｎ（ＩＣＰ）＝（ＩＣＰプローブの発光強度）÷（受動参照物の発光強度）
Ｃｔ値（すなわち、閾値サイクル数）は、蛍光の比がバックグラウンドから区別可能であるＰＣＲサイクルの数である。所定のレポーター色素および固定された濃度の標的について、Ｒｎ値およびＣｔ値の両方が、クエンチャーの効力を反映する。
【００７９】
（ＶＩＩ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明確にされる。これらの実施例は、純粋に本発明の例示を意図し、いかようにもその範囲を制限することは意図しない。
【００８０】
（実施例１：エキソヌクレアーゼアッセイのための二重標識された、自己クエンチングプローブの調製）
自己クエンチングプローブの自動合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用して、ユーザーマニュアルに記載の一般的手順に従って行い得る。５’ＦＡＭ、３’ＴＡＭＲＡプローブをＴＡＭＲＡ標識ＣＰＧ固体支持体（Ｍｕｌｌａｈら、１９９７；Ｍｕｌｌａｈら、１９９８）、ホスホルアミダイトヌクレオシドＡbz、Ｇdmf、Ｃbz、Ｔ、製造業者（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が推奨する他の試薬およびＦＡＭ色素標識ホスホルアミダイト（Ｔｈｅｉｓｅｎら）のセットを使用して０．２μｍｏｌスケールで合成し得る。ＦＡＭアミダイトのカップリング時間をさらに１２０秒間延長することにより、標準的な０．２μｍｏｌ合成サイクルをわずかに改変する。各プローブは、そのプローブの５’末端に付着したレポーター色素および３’末端に位置したクエンチャー色素を含む（図６）。
【００８１】
合成完了後、オリゴヌクレオチドを、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）の混合物（Ｗｏｏ、１９９３）でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のオペレーターマニュアルに記載の１時間の自動切断手順で処理することによって、ＤＮＡ合成機の支持体から自動切断する。塩基保護基を、この混合物を８５℃で１時間、または６５℃で３時間加熱することによって除去する。このオリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ、陰イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および他の従来技術（Ａｎｄｒｕｓ、１９９２）により、分析および精製し得る。
【００８２】
（実施例２：外因性ＩＰＣを使用するエキソヌクレアーゼアッセイによるＣ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの検出）
（逆転写）
ｃＤＮＡを、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＣＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、および５００μＭのｄＧＴＰ、１．２５Ｕ／μｌのＭｕＬ  Ｖ逆転写酵素、０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、およびＲＮａｓｅを含まないＨ2Ｏを含む１００μｌの溶液中の、５０ｎｇのヒトＲＮＡおよびＣ−ＭＹＣ逆方向プライマー：
【００８３】
【化８】
0003942079.tif 000013
を使用して、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ９６００サーマルサイクラーで４８℃、３０分間で調製する。
【００８４】
（試薬）
１）以下の試薬キットを混合し、そして４５μｌを９６ウェル（Ａ１〜Ｈ１２）全ての各ウェルに分配する（図７）
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１６％グリセロール、０．１％ゼラチン、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０TM、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、
４００μＭのｄＡＴＰ、４００μＭのｄＣＴＰ、４００μＭのデアザｄＧＴＰおよび８００μＭのｄＵＴＰ、
０．１Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、
０．０２Ｕ／μｌのＡｍｐｅｒａｓｅ  ＵＮＧ、
１２０ｎＭ受動参照、
正方向Ｃ−ＭＹＣ標的プライマー：
【００８５】
【化９】
0003942079.tif 000014
逆方向Ｃ−ＭＹＣ標的プライマー
１００ｎＭ  ＦＡＭ標識自己クエンチング標的プローブ：
【００８６】
【化１０】
0003942079.tif 000015
外因性内部ポジティブコントロール（ＩＰＣ）試薬：
８０ｂｐのアンプリコン内部コントロールポリヌクレオチド（ＩＰＣ）を有するプラスミドＤＮＡ
５０ｎＭ  正方向ＩＰＣプライマー：
【００８７】
【化１１】
0003942079.tif 000016
５０ｎＭ  逆方向ＩＰＣプライマー：
【００８８】
【化１２】
0003942079.tif 000017
２００ｎＭの自己クエンチングＩＰＣプローブ：
【００８９】
【化１３】
0003942079.tif 000018
２）１０μｌのｃＤＮＡを８４ウェルの各ウェル（Ｂ１〜Ｈ１２）に添加する（図７）
３）ＰＮＡブロックをウェルＡ１〜Ａ６に添加する（図７）：
３００ｎＭ  ＰＮＡブロック：
【００９０】
【化１４】
0003942079.tif 000019
（ＰＣＲ）
ヒトｃＤＮＡを、５０℃で２分で開始し、９５℃で１０分間維持、次いで以下を４０サイクルのサーマルサイクリング条件により増幅する：９５℃で１５秒間変性および６０℃で１分間のアニーリングおよび伸長。サーマルサイクリングおよびリアルタイム蛍光検出をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）で行う。
【００９１】
標的ｃＤＮＡおよびＩＰＣをこのＩＰＣの存在下で増幅し、ウェルＢ１〜Ｈ１２中のそれぞれのＦＡＭおよびＪＯＥシグナルの存在によって検出する。ＰＮＡブロックは、ウェルＡ１〜Ａ６中のＩＰＣの増幅を阻害し、ＪＯＥシグナルの非存在によって検出される。標的増幅は、ウェルＡ１〜Ａ１２中で、ＦＡＭシグナルがないために検出されない。ＩＰＣを、ＪＯＥシグナルによって検出されるように、ウェルＡ７〜Ａ１２中で増幅する（図７）。
【００９２】
（実施例３：ＤＮＡの検出：外因性ＩＰＣを用いるエキソヌクレアーゼアッセイによるトランスジェニック綿植物由来のＮＰＴＩＩ遺伝子）
約２００ｎｇのトランスジェニック綿ゲノムＤＮＡを９６ウェル試験のための標準的技術により調製する。
【００９３】
（試薬）
実施例２と同じ試薬のキット（同じＩＰＣ試薬を含む）を混合し、そして合計容量４５μｌを全９６ウェルの各ウェルＡ１〜Ｈ１２に分配する（ＮＰＴＩＩ標的特異的プライマーおよびプローブを含む）（図７）：
３００ｎＭの正方向標的プライマー
【００９４】
【化１５】
0003942079.tif 000020
３００ｎＭの逆方向標的プライマー：
【００９５】
【化１６】
0003942079.tif 000021
２００ｎＭの自己クエンチング標的プローブ：
【００９６】
【化１７】
0003942079.tif 000022
（ＰＣＲ）
増幅を、実施例２と同じ条件下およびシステムで行う。
【００９７】
綿サンプルＤＮＡおよびＩＰＣ両方を、連続して増幅する。ＩＰＣを含むＣｔとＩＰＣを含まないＣｔとの比較は、ＰＣＲ効率がサンプルＤＮＡの複雑性に影響を及ぼされないことを示唆する。
【００９８】
（実施例４：外因性ＩＰＣを用いるエキソヌクレアーゼアッセイによるＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７の検出）
クローニングした標的配列を含む精製したプラスミド由来の約１００ｎｇのＤＮＡを、９６ウェル試験についての標準的な技術により調製する。１ウェルあたり１０，０００〜１コピー未満の範囲を未知サンプルにおいて使用する。
【００９９】
（試薬）
実施例２と同じ試薬のキット（同じＩＰＣ試薬を含む）を混合し、そして合計容量４５μｌを全９６ウェルの各ウェルＡ１〜Ｈ１２に分配する（ＮＰＴＩＩ標的特異的プライマーおよびプローブを含む）（図７）：
３００ｎＭの正方向標的プライマー
【０１００】
【化１８】
0003942079.tif 000023
３００ｎＭの逆方向標的プライマー：
【０１０１】
【化１９】
0003942079.tif 000024
２００ｎＭの標的プローブ
【０１０２】
【化２０】
0003942079.tif 000025
（ＰＣＲ）
増幅を、実施例２と同じ条件下およびシステムで行う。
【０１０３】
結果を図８Ａ〜図８Ｂに示す。１〜１０，０００コピーの未知サンプルは、バックグラウンドを超えるＦＡＭシグナルの検出によりポジティブ検出を与えた。
【０１０４】
（実施例５：外因性ＩＰＣを用いるエキソヌクレアーゼアッセイによる培養細胞から抽出したＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ＤＮＡの検出）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅの複数の供給源由来の約１００ｎｇのＤＮＡを、９６ウェル試験についての標準的な技術により調製する。各供給源を１０連（ｔｅｎ−ｆｏｌｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）で試験する。
【０１０５】
（試薬）
実施例２と同じ試薬のキット（同じＩＰＣ試薬を含む）を混合し、そして合計容量４５μｌを全９６ウェルの各ウェルＡ１〜Ｈ１２に分配する（図７）。この試薬のキットは、以下を含む：
正方向プライマー：
【０１０６】
【化２１】
0003942079.tif 000026
逆方向プライマー
【０１０７】
【化２２】
0003942079.tif 000027
自己クエンチングプローブ：
【０１０８】
【化２３】
0003942079.tif 000028
（ＰＣＲ）
増幅を、実施例２と同じ条件下およびシステムで行う。標的アンプリコンの長さは、１４３ｂｐである。
【０１０９】
結果を図９Ａ〜図９Ｂに示す。増幅コントロールサンプルなし（Ａ１〜Ａ６）（ＩＰＣを含む）、ＰＮＡブロックおよび標的なしは、全て、予測された通り、有意なＦＡＭもＪＯＥシグナルも与えなかった。テンプレートコントロールサンプル（Ａ７〜Ａ１２）（ＩＰＣを含む）、ＰＮＡブロックなしおよび標的なしは、全 て、予測された通り、有意なＦＡＭを与えなかったが、有意なＪＯＥシグナルを与えた。未知サンプル（Ｂ１〜Ｂ１２）（ＩＰＣを含む）、ＰＮＡブロックなし、および標的は、全て、真のネガティブな結果を示すサンプルＨ８（標的Ｃｔ＝４０）以外は、真のポジティブな結果を与えた。
【０１１０】
全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が各々具体的におよび個々に参考として援用されると示される場合と同程度に本明細書中に参考として援用される。
【０１１１】
わずかな実施態様のみが上記で詳述されたが、分子生物学の当業者は、その教示から逸脱することなく、多くの改変が好適な実施態様において可能であることを明らかに理解する。全てのこのような改変は、上記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、自己クエンチングプローブを有するエキソヌクレアーゼアッセイ標的ポリヌクレオチドを示す。
【図２】  図２は、フルオレセインレポーター構造：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥを示す。
【図３】  図３は、クエンチャー構造：ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬを示す。
【図４】  図４は、内部コントロールポリヌクレオチド：ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの局面でのエキソヌクレアーゼアッセイを示す。
【図５】  図５は、レポーターおよびクエンチャースペクトル特性：最大放射および最大吸収のチャートを示す。
【図６】  図６は、自己クエンチングプローブ構造：５’ＦＡＭレポーターおよび３’ＴＡＭＲＡクエンチャーを示す。
【図７】  図７は、内部ネガティブコントロールウェル（Ａ１〜Ａ６）および内部ポジティブコントロールウェル（Ａ７〜Ａ１２）を用いる、９６ウェル様式におけるエキソヌクレアーゼアッセイの結果およびサンプル割り当てを示す。
【図８Ａ】  図８Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７の検出を示す。エキソヌクレアーゼアッセイは、実施例４からの結果である。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７の検出を示す。エキソヌクレアーゼアッセイは、実施例４からの結果である。
【図９Ａ】  図９Ａは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ＤＮＡの検出を示す。エキソヌクレアーゼアッセイは、実施例５からの結果である。
・ウェル：９６ウェル様式の配置（図７）
・型：ＮＡＣ−増幅コントロールなし、ＮＴＣ−鋳型コントロールなし、未知
・サンプル：希釈による標的コピー数、またはネガティブ
・ＰＣＲ：ポジティブ（＋）な結果またはネガティブ（−）な結果
・Ｒｎ：レポーターマイナスＮＴＣ（Ａ７〜Ａ１２）
・Ｃｔ：限界サイクル数；蛍光がバックグラウンドから区別可能なＰＣＲサイクル数。
【図９Ｂ】  図９Ｂは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ＤＮＡの検出を示す。エキソヌクレアーゼアッセイは、実施例５からの結果である。
・ウェル：９６ウェル様式の配置（図７）
・型：ＮＡＣ−増幅コントロールなし、ＮＴＣ−鋳型コントロールなし、未知
・サンプル：希釈による標的コピー数、またはネガティブ
・ＰＣＲ：ポジティブ（＋）な結果またはネガティブ（−）な結果
・Ｒｎ：レポーターマイナスＮＴＣ（Ａ７〜Ａ１２）
・Ｃｔ：限界サイクル数；蛍光がバックグラウンドから区別可能なＰＣＲサイクル数。
【配列表】
0003942079.tif 000029
0003942079.tif 000030
0003942079.tif 000031
0003942079.tif 000032
0003942079.tif 000033
【図１】
0003942079.tif 000038
【図２】
0003942079.tif 000039
【図３】
0003942079.tif 000040
【図４】
0003942079.tif 000041
【図５】
0003942079.tif 000042
【図６】
0003942079.tif 000043
【図７】
0003942079.tif 000044
【図８Ａ】
0003942079.tif 000045
【図８Ｂ】
0003942079.tif 000046
【図９Ａ】
0003942079.tif 000047
【図９Ｂ】
0003942079.tif 000048