(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性バチルス属に属する微生物が産生する酵素であって、以下の性質：
(1)  トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素活性を有する；
(2)  pH6-8において80％以上の相対活性を示す；
(3)  45-55℃の温度において80％以上の相対活性を示す；および
(4)  分子量が約26kD；
を有することを特徴とする耐熱性トレハラーゼ。
【請求項２】
好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）が産生する請求項１の耐熱性トレハラーゼ。
【請求項３】
好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P-18412）。
【請求項４】
好熱性バチルス属に属する微生物No. 8株（FERM P-18411）。
【請求項５】
好熱性バチルス属に属する微生物を培養し、培養物から請求項１の耐熱性トレハラーゼを分離・精製することを特徴とする耐熱性トレハラーゼの製造法。
【請求項６】
好熱性バチルス属に属する微生物が、請求項３または４の微生物である請求項５の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規な耐熱性トレハラーゼと、その製造法に関するものである。さらに詳しくは、トレハロース含有量の測定等に有用な新しい耐熱性酵素トレハラーゼと、このトレハラーゼを産生する微生物、およびこの微生物を用いたトレハラーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
トレハロースは、２分子のα−Ｄ−グルコースが結合した非還元性糖であり、酵母をはじめとする微生物、カビ、昆虫、茸類、藻類、地衣類、甲殻類等の自然界に広く分布しており、生体の耐寒性や耐乾燥性等に重要な役割を果たしている。このトレハロースは、従来は、酵母からの抽出法により製造されていたが、高価格のために広く利用されるに至らなかった。しかしながら、最近になって発見された酵素を用いてデンプン等から安価に大量生産できるようになったことから、トレハロースは甘味料等として数多くの食品や、保湿効果を利用してクリーム、ローション等の化粧品にも使用されるようになり、さらに医薬品、化成品への利用も期待されている。
【０００３】
このように、トレハロースの利用は今後ますます拡大すると予想されるが、トレハロースを含む製品の研究開発や品質管理等において、トレハロース含有量の測定は不可欠である。従来は、薄層クロマトグラフィや液体クロマトグラフィによってトレハロース含有量を測定していたが、操作性、迅速性の点で問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
トレハロース含有量の簡便かつ高精度の測定法として、「トレハラーゼ」を利用した方法が考えられる。トレハラーゼは、トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素である。そこで、このトレハラーゼを用いてトレハロースをグルコースに分解し、より簡便に測定可能なグルコース量を同定することによって、製品中のトレハロースを高精度に測定することが可能となる。
【０００５】
なお、トレハラーゼとしては、例えば、クロレラ由来のトレハラーゼ（特開平7-246094号公報：従来技術１）や、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ムコール属、ピキア属、ハンセニュラ属、カンジダ属、ロドスポリジウム属、サッカロミセス属、エシェリヒア属またはクレブジエラ属に属する微生物由来のトレハラーゼ（特開平7-51063号公報：従来技術２）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、これら従来技術のトレハラーゼは、グルコースからトレハロースを合成するために使用する酵素である。しかも、従来技術１のトレハラーゼは至適pHが5〜6であり、従来技術２のトレハラーゼの至適pHは4〜5である。トレハロース含有量の測定をより簡便かつ高精度に行うためには、装置システム（バイオセンサ）の開発が不可欠である。そして、バイオセンサに適用可能なトレハラーゼの条件は、40℃以上の温度でも安定な耐熱性酵素であることと、中性域において高い活性を有することである。すなわち、酸性域やアルカリ域で作用する酵素を使用した場合には、pH調整のために使用する物質によって装置部品が劣化（腐食、溶解）することが避けられないからである。このため、酸性域において酵素活性を有する従来技術のトレハラーゼは、バイオセンサにおける使用には適していない。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、トレハロース含有量のバイオセンサによる測定のために使用可能な、中性域で高い酵素活性を有する新しい耐熱性トレハラーゼを提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、好熱性バチルス属に属する微生物が産生する酵素であって、以下の性質：
(1)  トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素活性を有する；
(2)  pH6-8において80％以上の相対活性を示す；
(3)  至適温度が50℃；および
(4)  分子量が26kD；
を有することを特徴とする耐熱性トレハラーゼを提供する。
【０００９】
この発明の耐熱性トレハラーゼは、好ましくは、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）が産生する耐熱性トレハラーゼである。
【００１０】
この出願の発明はさらに、新規菌株として、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P-18412）およびNo. 8株（FERM P-18411）を提供する。
また、この出願の発明は、好熱性バチルス属に属する微生物を培養し、培養物から請求項１の耐熱性トレハラーゼを分離・精製することを特徴とする耐熱性トレハラーゼの製造法を提供する。この製造法においては、好熱性バチルス属に属する微生物が前記No. 6B株（FERM P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）であることを好ましい態様としてもいる。
【００１１】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この発明の耐熱性トレハラーゼは、基本的には、以下の性質を有する酵素である。
(1)  トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素活性を有する。
(2)  pH6〜8において80％以上の相対活性を示す。
(3)  45〜55℃の温度において80％以上の相対活性を示す。
(4)  分子量が約26kDである。
【００１３】
すなわち、この発明のトレハラーゼ（α,α-トレハラーゼ）は、α,α-トレハロースのグルコシド結合を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生成する。なお、pH6〜8および45〜55℃の温度において「80％以上」の相対活性を示すということは、酵素単位として50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1Uとし、グルコースの生成を3,5-Dinitrosalicylic acid（DNS）法によって測定した酵素活性の最大値に対して80％以上の活性を示すことを意味する。
【００１４】
このようなトレハラーゼは、バチルス属に属する微生物を培養し、その培養物から単離・精製することによって得ることができる。バチルス属に属する微生物としては、好ましくはこの出願の発明者らが土壌より新たに分離・同定したNo. 6B株およびNo. 8株を例示することができる。なお、これらのNo. 6B株およびNo. 8株は2001年7月10日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERM P-18412およびFERM P-18411として特許寄託されている。なお、これらNo. 6B株およびNo. 8株が生成するトレハラーゼの至適pHは7.25、至適温度は50℃である。
【００１５】
これらのバチルス属細菌の培養に使用する培地は、この菌株が良好に生育するものであれば、いかなる組成の培地であっても良く、また、菌体増殖用とトレハラーゼ生産用にそれぞれ異なる２種類の培地を用いても良い。培地は液体培地または固体培地を使用することができ、培地成分として、炭素源の他に、窒素源および無機イオン等を含有していても良い。
【００１６】
菌体増殖用の培地における炭素源は特に制限はなく、公知の炭素源を使用することができるが、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、プロピオン酸、バルミチン酸等の低級脂肪酸、デンプン、ショ糖等が好ましく使用できる。これらの炭素源は、単独または混合して培地に添加することができる。一方、トレハラーゼ生産用の培地には、その基質としてトレハロースを含有させることができる。
【００１７】
また、窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物、およびペプトン、酵母エキス等の有機窒素源が利用できる。
さらに、無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオン等が挙げられ、これら無機イオンを培地に無機塩等の形で含有させても良い。
【００１８】
この発明の微生物の培養方法としては、振とう培養法等の液体培地による培養法および寒天培地等の固体培地による培養法等が利用できる。培養温度は例えば40〜80℃、好ましくは50〜70℃であり、培地のpHは中性付近である。トレハラーゼ生産時の培養時間は、菌体量ならびにトレハラーゼの産生等に応じて決めることができるが、0.5日〜10日間、より好ましくは１日〜６日間程度が適当である。
【００１９】
このような培養の後、培養上清から公知の手段によってこの発明のトレハラーゼを単離・精製することができる。例えば、硫安だけによる塩析、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２０】
以下、この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のスクリーニング方法、菌学的性質、ならびにこれら微生物から単離・精製されたトレハラーゼの特性について詳しく説明する。なお、これらの菌株の培養には、表１〜３にそれぞれの組成を示したA〜C培地のいずれかを選択して用いた。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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【００２４】
1  スクリーニング
1.1  スクリーニング方法１
50種類の土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、上清液を表１のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養し、生育のみられた菌株をC固体培地（表３）に移し、65℃で３日間培養した。得られた菌株をB液体培地（表２）に植菌し、60℃で３日間、振盪培養した。培養液を遠心分離（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに分離した。上清液については、そのトレハラーゼ活性をDNS法により測定した結果、２菌株が高トレハラーゼ産生能を有することが確認された。また、35菌体はリン酸バッファーに懸濁し、超音波処理（１秒間に0.2秒発振、0.8秒停止、100W、10分間）し、その液を遠心分離し、得られた上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により測定した。その結果、１菌株にトレハラーゼ活性が確認された。
1.2  スクリーニング方法２
103種類の土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、上清液を表１のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養した。各培養液をB液体培地（表２）に植菌し、60℃で３日間、振盪培養した。培養液を遠心分離（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに分離し、上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により測定した結果、３菌株が高トレハラーゼ産生能を有することが確認された。
1.3  菌の選択
前記スクリーニング方法１、２でトレハラーゼ活性を認めた菌株を純粋分離し、得られた20菌株をA液体培地に植菌し、60℃で３日間振盪培養した。培養液を遠心分離（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに分離し、上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により測定した結果、活性の高い５株が得られたが、菌の形態からNo. 6B株およびNo. 8株を選択した。
2  菌学的性質
2.1  生理的試験
No. 6B株およびNo. 8株を表１に示したA培地組成からなる固体培地および液体培地で60℃、２日間培養し、それぞれの第１次性状（細胞形態、グラム染色、運動性、芽胞、酸素に対する態度、カタラーゼ、オキシダーゼ、OFテスト等）を調べた。また、第２次性状として、炭素源、窒素源の利用、硫化水素の生成、代謝産物、酵素活性、培養至適温度、pH等を調べた。
【００２５】
結果は表４に示したとおりである。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
また、両菌株の培養温度と増殖との関係は図１に示したとおりであり、いずれの菌株も約55℃において最も良好に増殖した。
2.2  16S rDNAの決定
No. 6B株およびNo. 8株を表１に組成を示したA培地で60℃、４日間培養し、培養液を遠心分離して集菌した。菌体からDNAを抽出し、PCR法によってDNAを増幅し、DNAシークエンサーによってそれぞれのDNA配列を決定した。その結果、No. 6B株のゲノムDNAの一部配列は配列番号１に示したとおりであり、No. 8株の配列は配列番号２に示したとおりである。これらの配列は、Bacillus subtilisと約94％の相同性を示した。
3.3  菌種の特定
前記の生理学的試験および16S rDNA配列決定の結果から、この発明のNo. 6B株およびNo. 8株はバチルス属に属する微生物であることが確認された。なお、DNA配列の相同性は、98％以上が一致する場合に同一種とすることが一般的であるため、このNo. 6B株およびNo. 8株は、Bacillus subtilisと同一ではないものの、それに極めて近縁の種であることが確認された。
3  トレハラーゼ特性
3.1  粗トレハラーゼ
No. 6B株およびNo. 8株を表1に組成を示したA培地にて60℃で４日間、振盪培養し、培養上清液に硫酸アンモニウムを加え、最終濃度を70％にしてトレハラーゼを沈殿させた。
【００２８】
この粗トレハラーゼ溶液を用いて、トレハラーゼ活性に及ぼす温度とpHの影響、耐熱性、ミハエリス定数（Km値）について検討した。なお、トレハラーゼ活性は、酵素単位として50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1Uとして、グルコースの生成をDNS法により測定し、最大値に対する相対活性として算出した。
3.2  温度の影響
様々な温度における粗トレハラーゼ溶液の酵素活性を、100mMリン酸バッファー（pH7.0）中、50℃で30分間の酵素反応を行った後、生成したグルコース量をDNS法により測定した。結果は図２に示したとおりである。No. 6B株およびNo. 8株由来のトレハラーゼは、共に45〜55℃において80%以上の相対活性を示した。そして、いずれのトレハラーゼも至適温度は50℃であった。
【００２９】
また、粗トレハラーゼ溶液を100mMリン酸バッファー（pH7.0）中で30分間、様々な温度でインキュベーションし、その後の残存活性を50℃で測定した。結果は図３に示したとおりであり、いずれのトレハラーゼも50℃までは高い安定性を有することが確認された。
3.3  pHの影響
様々なpHにおいて50℃で30分間の酵素反応を行った後、生成したグルコース量をDNS法により測定することによって、粗トレハラーゼ溶液の酵素活性におけるpHの影響を調べた。pH値の調整は、以下の50mMバッファーを用いて行った。CH3COOH-CH3COONa(pH4.0-5.5)、Na2HPO4-KH2PO4(pH6.0-7.0)、Na2CO3-H3BO3-KCl(pH8.0-10.0)。結果は図４に示したとおりである。No. 6B株およびNo. 8株由来のトレハラーゼは、共にpH6.0〜8.0において80%以上の相対活性を示した。そして、いずれのトレハラーゼも至適pHは7.25であった。
3.4  Km値
粗トレハラーゼのKm値を、Lineweaver-Burkプロットにより算出した。結果は図５に示したとおりであり、No. 6B株由来のトレハラーゼのKm値は7.7、Vmax値は0.17、N0. 8株由来のトレハラーゼのKm値は6.8、Vmax値は0.27であった。
4  精製トレハラーゼ
4.1  トレハラーゼの精製
粗トレハラーゼ溶液を1.5φ×40cm DEAE-セルロースカラムにのせ、50-500mM NaCl濃度勾配によりトレハラーゼを溶出した。得られた分画のトレハラーゼ活性をDNS法で測定し、活性の高かった画分No. 14, 15, 16溶液（図６）を、2.5φ×75cmセファロース-4Bカラムにのせ、リン酸バッファーを用いて溶出した。得られた画分のトレハラーゼ活性をDNS法により測定し、活性の高かった画分N0. 28（図７）を、前記と同様のDEAE-セルロースカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。
【００３０】
以上の精製工程による結果は表５に示したとおりである。粗トレハラーゼから最終公知のクロマトグラフィーによって126倍に濃縮され、114U/mgもの高い酵素活性を有するトレハラーゼが得られた。なお、この酵素活性は、50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1Uとした。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
4.2  精製トレハラーゼの分子量測定
粗トレハラーゼおよび各工程で得られた精製トレハラーゼの分子量をSDS-PAGEによって決定した。結果は図８に示したとおりであり、この発明のトレハラーゼの分子量は26kDaであることが確認された。
4.3  金属イオンの影響
精製トレハラーゼを10mM Tris-HClバッファー（pH7.0）に溶解し、表６に示した各金属イオン1mMを添加して50℃、30分間インキュベートし、その後の残存活性を、無添加（コントロール）を100％として算出した。結果は表６に示したとおりである。トレハラーゼ活性は、Mn++、Co++の添加によりそれぞれ205％、130％に酵素活性が増加し、Cu++、EDTAの添加によりそれぞれ0％、57％に酵素活性が低下した。
【００３３】
【表６】
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【００３４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、中性域で高い酵素活性を有する耐熱性のトレハラーゼが提供される。このトレハラーゼによって、トレハロースを含有する製品の研究開発や品質管理に不可欠なトレハロース含有量測定のためのバイオセンサが実用化可能となる。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株の、培養温度と増殖の程度の関係を示すグラフである。
【図２】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれに由来する粗トレハラーゼの温度と相対活性の関係を示すグラフである。
【図３】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれに由来する粗トレハラーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図４】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれに由来する粗トレハラーゼのpHと相対活性の関係を示すグラフである。
【図５】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれに由来する粗トレハラーゼのKm値の測定結果を示すグラフである。
【図６】  DEAE-セファロースカラムを用いたクロマトグラフィーの結果である。
【図７】セファロース-4Bカラムを用いたゲルフィルトレーションの結果である。
【図８】各精製段階のトレハラーゼのSDS-PAGEによる泳動像である。MKはマーカー、レーン１はDEAE-セファロースカラムを用いた２回目のクロマトグラフィーによる最終精製トレハラーゼ、レーン２は粗トレハラーゼ、レーン３はDEAE-セファロースカラムを用いた１回目のクロマトグラフィーによる精製トレハラーゼ、レーン４はセファロース-4Bカラムを用いたゲルフィルトレーションによる精製トレハラーゼである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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