(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識したＤＮＡプローブを、検出しようとする標的ＤＮＡ分子と複合体形成させることにより、該プローブに含まれる配列に対して相補的な所望の配列を有する標的ＤＮＡ分子を検出する方法であって、
検出しようとする標的ＤＮＡ分子が有する所定の配列に対して相補的な配列を具備し、更に該相補的配列の両端に末端配列を具備し、該末端配列を介して分子内結合を形成することが可能であり、且つ標識を具備することを特徴とするＤＮＡ検出用ＤＮＡプローブ分子に、ＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブとＲｅｃＡタンパク質からなる第一複合体を形成させる第一ステップと、
標的ＤＮＡ分子を該第一複合体に接触させて、該プローブと該標的ＤＮＡ分子との間で第二複合体を形成させる第二ステップと、
該第二複合体からタンパク質を除去する第三ステップと、
複合体を形成しなかった未反応プローブを、該第二複合体から分離する第四ステップとを具備し、
該第二複合体に含まれるＤＮＡプローブ中の標識を検出することにより、該プローブと相補的な配列を有するＤＮＡを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸検出用プロ−ブ、及び該プロ−ブを利用した核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の核酸検出技術は、病気の診断、動植物の品種や親子の鑑定、ＤＮＡのクロ−ニング等に応用されている。従来の核酸検出方法としては、サザンハイブリダイゼーション等の、標識したプロ−ブを用いた検出方法がある。これらの方法に関して、これまでに種々の改良がなされてきた。
【０００３】
一般的に、改良にはおおまかに分けて二つの方向がある。一つは、コストの上昇や実験操作の煩雑化を伴うが、検出精度及び／または検出感度の上昇を目的として行うものである。もう一つは、検出精度及び／または検出感度の低下を招いても、コスト低下と実験の簡略化を実現することを目的とするものである。前者、すなわち検出感度及び／または検出精度の上昇を目的とした、核酸検出方法の改良例としては、被検体ＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、両者を架橋剤により架橋する方法（J. Mol. Biol., 197(2):349-362, 1987 ）、オリゴヌクレオチドをプロ−ブとして用い、標的二重鎖ＤＮＡとの組み換え中間体を、ＲｅｃＡタンパク質分子を使った酵素反応により形成させることを特徴とする、標的ＤＮＡ検出方法（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-15117, 1988 ）などがある。このような、検出感度及び／または検出精度を重視した方法に関しては、その目的にのっとれば、高コスト、及び操作の煩雑化は許容せざるを得ない。しかしながら、その経済的負担、及び労働的負担が大きいことは否めない。
【０００４】
本願に最も近い従来技術としては、特願平８−５４２７８がある。この従来技術では、パドロック型のプロ−ブ２０（図２）と標的ＤＮＡとの複合体を形成させた後、標的配列上で、向かい合ったプロ−ブの両末端のギャップ（２２、３１）を連結している（図３参照）。その結果、標的ＤＮＡとハイブリダイズしたプロ−ブはそれ自体で環状構造を形成する。これにより、形成されたハイブリッドの安定性が向上し、検出が可能になる。この従来技術においては、RecAとリガ−ゼを作用させることにより、反応を行っている。そのため従来よりも感度がよくなってはいるものの、コストがかかり、また実験操作が煩雑になっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、従来の検出感度、及び／または検出精度を重視した核酸検出方法では、経済的負担、労働的負担が大きかった。本発明の目的は、従来の核酸検出技術の検出感度及び検出精度に比較した時に、感度及び精度が同程度であるか、好ましくは検出感度がより向上した核酸検出方法であって、尚且つ実験操作が簡略化され、更にコストが低減されるといった、従来では一度に解決できなかった問題が一挙に解決された核酸検出方法、及び該方法において使用することが可能なプロ−ブ分子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決し、目的を達成するために、本発明の核酸検出用プロ−ブ分子、及び該プロ−ブ分子を利用した核酸検出方法は、以下のごとく構成されている。
【０００７】
（１）本発明の核酸検出方法は、標識したＤＮＡプローブを、検出しようとする標的ＤＮＡ分子と複合体形成させることにより、該プローブに含まれる配列に対して相補的な所望の配列を有する標的ＤＮＡ分子を検出する方法であって、
検出しようとする標的ＤＮＡ分子が有する所定の配列に対して相補的な配列を具備し、更に該相補的配列の両端に末端配列を具備し、該末端配列を介して分子内結合を形成することが可能であり、且つ標識を具備することを特徴とするＤＮＡ検出用ＤＮＡプローブ分子に、ＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブとＲｅｃＡタンパク質からなる第一複合体を形成させる第一ステップと、
標的ＤＮＡ分子を該第一複合体に接触させて、該プローブと該標的ＤＮＡ分子との間で第二複合体を形成させる第二ステップと、
該第二複合体からタンパク質を除去する第三ステップと、
複合体を形成しなかった未反応プローブを、該第二複合体から分離する第四ステップとを具備し、
該第二複合体に含まれるＤＮＡプローブ中の標識を検出することにより、該プローブと相補的な配列を有するＤＮＡを検出する方法である。この核酸検出方法における第三ステップの除タンパクの方法は、当該技術分野で知られるものであれば特に限定するものではない。第四ステップの核酸分離方法も同様であるが、一つの態様としては、アガロースゲル電気泳動がある。
【０００８】
なお、上記の末端配列の双方は、互いに相補的な配列を具備し、該相補的配列間でのアニールにより分子内結合を形成することを特徴とすることが好ましい。また上記標識は、当該技術分野で知られるものであれば特に限定する必要はなく、プローブへの標識の導入方法も、当該技術分野でよく知られるものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態にかかる核酸プロ−ブ、及び該プロ−ブを利用した核酸検出方法について、図を用いて説明するが、これらはあくまで本願発明を例示するにとどまり、本願発明を限定するものではないことは、当業者には自明である。
＜核酸検出用プロ−ブ分子＞
図１は、本願発明にかかる核酸検出用プロ−ブ分子の、一つの態様の構造を示す図である（配列番号１）。このプロ−ブ１０は、標的核酸配列と相補的な配列（１１、３３）を具備し、この部分を介して標的核酸との複合体を形成する。このプロ−ブは更に、前記の相補的配列の両端に、スペ−サ−配列１２を挟んで自己相補的配列１３を具備している。該プロ−ブ分子は、この自己相補的配列を介して分子内結合を形成して環状構造をとり、標的核酸との間で複合体を形成したときの安定性を向上させる。
【００１０】
別の態様において本願発明の核酸プロ−ブ分子は、末端配列中の上記の自己相補的配列を具備していなくてもよい。この場合には、該自己相補的配列を具備しない末端配列部を利用して例えば架橋剤または酵素によりプロ−ブの末端同士を連結して、分子内共有結合を生じさせることも、本発明の応用例として可能である。架橋剤や酵素を使用すると、複合体の安定性が増して検出感度も向上するが、実験操作は若干複雑になる。
【００１１】
＜本願の核酸プロ−ブを利用した核酸検出方法＞
図３は、従来技術と本願発明の核酸検出方法とを比較した図である。図２に示した従来のパドロック型の核酸プロ−ブ（配列番号２）を利用して核酸分子の検出を行うと（図３の左側）、プロ−ブ分子は、その両末端が向かい合った状態で、標的核酸分子と複合体を形成する。このままだと、プロ−ブ分子の両末端が互いに連結しておらず、ハイブリッドが不安定である。そのため従来は、リガ−ゼを利用してこの末端同士を連結し、プロ−ブ上で閉環した環状構造をとらせてハイブリッドの安定性を向上させていた。これにより検出感度の向上が可能とされていた。
【００１２】
一方、本願発明のフィグリング型プロ−ブを利用して核酸検出を行うと（図３右側）、ハイブリダイズしたプロ−ブ分子を、標的核酸に相補的な部分３３の両末端にある末端配列同士で分子内結合させることができる。これにより、従来とは構造の異なる、閉環した環状構造をとらすことが可能である。該末端配列３２を互いに相補的な配列にした場合には、上記の末端配列間での結合が、自己相補的配列間で行なわれるために、酵素や薬剤などを用いることなく環状化がおきる。このように、プロ−ブの環状化を酵素や架橋剤を用いることなく行えるので、コストの低減、及び実験操作の簡略化が実現する。これは本発明の特徴の一つである。この態様においては、プロ−ブの分子内結合が非共有結合的に行なわれるので、検出反応後の標的核酸をプロ−ブより切り離して再利用することが可能である。
【００１３】
以下に具体的な本願発明のフィグリング型プロ−ブを用いた核酸分子検出方法の具体的な実験条件を示す。プロ−ブには、図１に示した１２１量体のオリゴヌクレオチド（配列番号１）を用いた。このプロ−ブは、当該技術分野でよく知られる方法により、放射性同位元素３２Ｐ（ＩＣＮ社）で標識した。標的ＤＮＡには、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社）で切断して直鎖状にしたＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ（宝酒造社）を用いた。
【００１４】
まず０．５ｐｍｏｌの標識済みプロ−ブ、１．２μｇのＲｅｃＡタンパク質（ベ−リンガ−マンハイム社）、最終濃度が０．４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベ−リンガ−マンハイム社）を、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に調製した（カクテルＡ）。ＲｅｃＡ・プロ−ブ複合体を形成させた。ＲｅｃＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＤＮＡの相同組み換えに関与している酵素タンパク質であり、ＡＴＰの存在下で一本鎖ポリヌクレオチドと結合することによりその酵素活性が活性化される。ＲｅｃＡは更に、ＡＴＰア−ゼ活性を有し、二重鎖ＤＮＡを部分的に巻き戻して、これと部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡを結合させることにより、ＤＮＡの組み換えを行う酵素である。
【００１５】
次に、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度が０．４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に調製した（カクテルB ）。カクテルＡ及びＢを、それぞれ３７℃で１５分間インキュベーションした後に混合して、３７℃で４〜１６間インキュベーションした。このときの反応溶液量は２０μl であった。
【００１６】
次に、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌ  プロテイナ−ゼＫ（それぞれ最終濃度）を加えて３７℃で３０分間インキュベーションし、この半分量を、０．８％アガロ−スゲル電気泳動にかけた後、臭化エチジウムでの染色とゲルの写真撮影を行い、次いでゲルを乾燥させた後にオ−トラジオグラフィ−にかけて、シグナルを検出した（図４及び５のパネル(a) を参照されたし）。
【００１７】
【実施例】
実施例１：ＤＮＡプロ−ブと標的ＤＮＡとの中間体形成における配列特異性の確認
（実験方法）
実施の形態で示した方法により核酸の検出を行った。標的ＤＮＡには、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡと、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して直鎖状にしたｐＢＲ３２２ＤＮＡを使用した。プロ−ブには、それぞれの配列に対して相補的な配列を有するプロ−ブ（図１、及び図４のパネル(c) ）を使用した。
【００１８】
（実験結果）
図４は、複合体形成における、ＲｅｃＡ及び相補的配列への依存性を示す。パネル（ａ）は、オ−トラジオグラフィ−の結果で、パネル（ｂ）は、同じゲルの臭化エチジウム染色像である。レ−ンＭは分子量マ−カ（λ／HindIII ＤＮＡ）であり、レ−ン１は標的ＤＮＡがＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ、プロ−ブ分子が図１のもの（Ｍ１３用）で、反応時にＲｅｃＡを加えたもの、レ−ン２は、標的ＤＮＡがＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ、プロ−ブ分子が図１のもの（Ｍ１３用）、反応時にＲｅｃＡを加えなかったもの、レ−ン３は、標的ＤＮＡがｐＢＲ３２２、プロ−ブ分子が図４(c) のもの（ｐＢＲ３２２用、配列番号３）で、反応時にＲｅｃＡを加えたもの、レ−ン４は、標的ＤＮＡがｐＢＲ３２２、プロ−ブ分子が図４(c) のもの（ｐＢＲ３２２用、配列番号３）で、反応時にＲｅｃＡを加えなかったもの、レ−ン５は、標的ＤＮＡがｐＢＲ３２２、プロ−ブ分子が図１のもの（Ｍ１３用）で、反応時にＲｅｃＡを加えたもの、そしてレ−ン６は、標的ＤＮＡががＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ、プロ−ブ分子が図４(c) のもの（ｐＢＲ３２２用、配列番号３）で、反応時にＲｅｃＡを加えたものである。複合体形成は、プロ−ブに相補的な配列と、反応時のＲｅｃＡの共存とに依存する結果が得られた。
【００１９】
実施例２：従来のパドロック型プロ−ブを使用したときと、本願発明のフィグリング型プロ−ブを使用したときの、複合体形成効率の比較
（実験方法）
実施の形態の項で示した方法により核酸の検出を行った。プロ−ブには、従来からある南京錠のような形態を有するパドロック型プロ−ブ（図２、配列番号２）と、本発明のフィグリング型プロ−ブ（図１、配列番号１）とを用いた。本願発明のフィグリング型プロ−ブを用いた時の反応は、実施の形態に記載された方法により、また従来のパドロック型プロ−ブを用いたときの反応は、特願平８−５４２７８に記載の方法により、次のように行った。３０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ  ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に、０．５ｐｍｏｌの３２Ｐで標識した、パドロック型プロ−ブと、１．２μg のＲｅｃＡタンパク質と、最終濃度が０．４８mMとなるようにしたＡＴＰ−γＳとを加えて、溶液A とした。一方、２００ｎｇの標的ＤＮＡと、最終濃度が０．４８ｍＭとなるようにしたＡＴＰ−γＳとを、３０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ  ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液に加えて、溶液Ｂとした。溶液Ａ及びＢを３７℃で１５分間インキュベーションした後に混合して、３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、上記反応の終了した溶液に、ライゲ−ス反応用の緩衝液及びNAD 要求性の耐熱性ライゲ−スを加えて４５℃で１５分間インキュベーションした。反応後、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、ＳＤＳ（０．５％  ｗ／ｖ）、プロティナ−ゼＫ（０．７ｍｇ／ｍｌ）を加えて除タンパクを行った。これ以後の操作は、本願発明のフィグリング型プロ−ブを用いた場合と同じである。
【００２０】
（実験結果）
図５は、従来のパドロック型プロ−ブを用いて行った核酸検出の結果と、本願発明のプロ−ブを用いて行った核酸検出の結果とを比較した図である。パネル（ａ）のレ−ン１と２との比較より明らかなように、本願のプロ−ブを使用した時の方が検出感度が２〜３倍以上よかった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明にかかる核酸プロ−ブを使用して、本発明にかかる核酸検出を実施すると、以下のような効果が生じる：
・本願では、プロ−ブと標的核酸との間の複合体の安定化を、酵素を用いて行う必要が本質的にいらなくなり、この工程を省くことができるので、検出全体にかかる時間が短縮され、さらに操作が簡略化される；
・本願発明では複合体の形成率がよくなったため、従来の核酸検出法に比べて検出感度がよくなる；
・末端配列に自己相補的配列を具備させることにより分子内結合を生じさせることが可能であるために、標的核酸に障害を与えずに検出が行える；
・必要であれば架橋剤、酵素等を用いて、末端配列におけるプロ−ブ分子内結合を形成することができるので、複合体の安定性を更に上昇させることも可能である。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフィグリング型プロ−ブの一態様を示す図。
【図２】従来のパドロック型プロ−ブの一態様を示す図。
【図３】パドロック型プロ−ブを用いた従来の核酸検出方法と、本願のバルブ型プロ−ブを用いた、新規の核酸検出方法との比較を示す図。
【図４】ＤＮＡプロ−ブと標的ＤＮＡとのＲｅｃＡ酵素依存性、及び中間体形成における配列特異性を示す電気泳動写真、並びに使用したプローブ構造を表す図。
【図５】従来のパドロック型プロ−ブを使用したときと、本発明のバルブ型プロ−ブを使用したときの、複合体形成効率の比較を示す電気泳動写真。
【符号の説明】
１０・・・Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡの配列に対して相補的な配列を有するフィグリング型プロ−ブ
１１・・・標的核酸中の配列に対して相補的な配列
１２・・・スペ−サ−配列
１３・・・分子内結合用の自己相補的配列
２０・・・パドロック型プロ−ブ
２１・・・標的核酸中の配列に対して相補的な配列
２２・・・ライゲ−スで連結するギャップ部分
２３・・・二つに分断された相補鎖をつなぐスペ−サ−部
３１・・・ライゲ−スで連結されたギャップ部分
３２・・・自己相補的配列により生じた分子内結合
３３・・・標的核酸配列と相補的な配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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