(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中の銅イオンに、
（１）５〜１００ｕ／ｌのフェニルエチルアミンオキシダーゼ、ならびに、フェニルエチルアミンまたはその塩酸塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンおよびベンジルアミンからなる群より選ばれる基質、
もしくは、
（２）５〜１００ｕ／ｌのヒスタミンオキシダーゼ、および、ヒスタミン
を作用させ、
生成する過酸化水素にペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を作用させ、吸光度変化を測定することにより、液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン測定方法。
【請求項２】
液体中の銅イオンに、
（１）５〜１００ｕ／ｌのフェニルエチルアミンオキシダーゼ、ならびに、フェニルエチルアミンまたはその塩酸塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンおよびベンジルアミンからなる群より選ばれる基質、
もしくは、
（２）５〜１００ｕ／ｌのヒスタミンオキシダーゼ、および、ヒスタミン
を作用させ、
生成するアンモニアにα−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、ＮＡＤ（Ｐ）変化量を測定することにより、液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン測定方法。
【請求項３】
（１）５〜１００ｕ／ｌのフェニルエチルアミンオキシダーゼ、ならびに、フェニルエチルアミンまたはその塩酸塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンおよびベンジルアミンからなる群より選ばれる基質の組合せ、
もしくは、
（２）５〜１００ｕ／ｌのヒスタミンオキシダーゼ、および、ヒスタミンの組合せ
に、さらに、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤からなる測定試薬を含有することを特徴とする銅イオン測定用試薬組成物。
【請求項４】
（１）５〜１００ｕ／ｌのフェニルエチルアミンオキシダーゼ、ならびに、フェニルエチルアミンまたはその塩酸塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンおよびベンジルアミンからなる群より選ばれる基質の組合せ、
もしくは、
（２）５〜１００ｕ／ｌのヒスタミンオキシダーゼ、および、ヒスタミンの組合せ
に、さらに、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱水素酵素からなる測定試薬を含有することを特徴とする銅イオン測定用試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体中の銅イオンの測定方法およびそのための試薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
銅イオンは、ヒト生体中において金属酵素の重要な構成成分として存在しており、銅イオンの増減は、これら金属酵素の活性の増減に密接に関わっている。したがって、ヒト体液中の銅イオンの測定は、金属酵素の増減に関わる疾病の診断において臨床意義が高い。血清中の銅イオンの測定方法としては、Landers-Zak 法（光電比色法）あるいは原子吸光分析法があるが、前者は試料の前処理が煩雑なこと、あるいは発色させるバソクプロインが銅以外の金属イオンにも作用することなど、操作性、特異性に問題がある。後者は銅イオンの特異性は高いものの特別な機器を必要とし、また大量な試料を処理するには不適であることに問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように液体中の銅イオンの測定方法において、特別の装置を必要とせず、短時間で正確に銅イオンを測定することが、従来の測定方法では困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解消するために、汎用の吸光度分析機器にて短時間で正確に体液中の銅イオンを測定する方法を検討した結果、銅イオンを補欠因子とするフェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼを使用することによって、体液中の銅イオンを測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は液体中の銅イオンに、銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素および該酵素の基質（銅イオンを除く）を作用させ、液体中の銅イオンによる該酵素活性の変化を測定することにより、液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン測定方法である。
【０００６】
また、本発明は銅イオンを補欠因子および／または活性化因子とする酵素、該酵素の基質（銅イオンを除く）、該酵素の反応生成物を測定する試薬を含有することを特徴とする銅イオン測定用試薬組成物である。
【０００７】
【発明の実施態様】
本発明において液体とは体液、例えば血液、尿、髄液、血漿などに限られず、他の液体、例えば天然水、海水、廃液、研究用試料など、各種金属の銅塩など含む液体を包含する。
本発明において使用する銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素としては、フェニルエチルオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼなどが例示され、これらの酵素はコファクターとして、３−（２，４，５−トリヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン（ｔｏｐａ）を有する酵素群である。好ましくはフェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼである。
本発明において補欠因子とは、酵素の発現に必要不可欠な物質のことである。
本発明において活性化因子とは、酵素の活性を増大する効果を有する物質のことである。
【０００８】
本発明に用いるフェニルエチルアミンオキシダーゼは、その起源は特に限定されるものではないが、好適には、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）由来のものが用いられる。
また、本発明に用いるヒスタミンオキシダーゼは、その起源は特に限定されるものではないが、好適には、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）由来のものが用いられる。
本発明において、銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素の基質とは銅イオンを含まない。
フェニルエチルアミンオキシダーゼの基質としては、フェニルエチルアミンおよびその塩、例えば塩酸塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンまたはベンジルアミンなどが例示される。
ヒスタミンオキシダーゼの基質としては、ヒスタミンなどが例示される。
【０００９】
本発明において使用する上記酵素の反応により生じる過酸化水素またはアンモニアを測定試薬としては、従来公知のものが使用できる。
過酸化水素測定試薬としては、４−アミノアンチピリンなどのカップラーとフェノールまたはアニリンおよびそれらの誘導体などの色原体およびペルオキシダーゼを含有する試薬、メタノールとカタラーゼおよび生成するホルムアルデヒドを測定する試薬などが例示される。
該試薬に使用するカップラーとしては４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾン等が使用される。また色原体としてはフェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン類が用いられる。
【００１０】
本発明の銅イオン測定用試薬組成物は、銅イオンを補欠因子および／または活性化因子とする酵素、該酵素の基質（銅イオンを除く）および必要により該酵素の反応生成物を測定する試薬を含有する。
試薬組成物中の銅イオンを補欠因子および／または活性化因子とする酵素、例えばフェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼなどの添加量は、特に限定されるものではないが、好適には５〜１００ｕ／ｌである。該酵素の基質濃度は銅イオンの測定に支障をきたさない限り、限定されるものではない。
【００１１】
本発明の試薬組成物のｐＨは、酵素反応を阻害しない範囲であれば、特に限定されるものではないが、好適には緩衝液によりｐＨ５〜１０に保たれているのが好ましい。また緩衝液の種類は、銅イオンを含有しないものであれば、いかなるものでもよい。たとえば、GOOD'S緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。
【００１２】
本発明の試薬組成物には必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤などを使用してもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤（例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤など、特に限定されるものではなく、約0.01〜0.5%で用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、抗生物質が用いられる。安定化剤としては、安定化効果を示すものであれば、特に限定されないが、グルコース、マンニトール、トレハロース、グリセロール等の糖類またはアミノ酸類、アルブミンなどが用いられる。
【００１３】
本発明の一実施態様はフェニルエチルアミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミン塩酸塩、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を含有する銅イオン測定用試薬組成物である。
また、別な実施態様はヒスタミンオキシダーゼ、ヒスタミン、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を含有する銅イオン測定用試薬組成物である。
さらに別な実施態様は、フェニルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼおよびこれらの基質、例えばフェニルエチルアミンおよびその塩、チラミン、トリプタミン、プトレッシンまたはベンジルアミンなど、またはヒスタミンなど、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱水素酵素を含有する銅イオン測定用試薬組成物である。
【００１４】
本発明の銅イオン測定方法では、液体中の銅イオンに、銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素および該酵素の基質（銅イオンを除く）を作用させ、液体中の銅イオンによる該酵素活性の変化を測定することにより、液体中の銅イオン濃度を測定する。
本発明の上記酵素活性を測定する方法としては、該酵素の作用により生成する過酸化水素あるいは消費される酸素または生成するアンモニアをそれぞれ公知の方法で測定する。
生成する過酸化水素を測定する場合は、一般的に４−アミノアンチピリンなどのカップラーとフェノールまたはアニリンおよびそれらの誘導体などの色原体をペルオキシダーゼ存在下反応させ、生成する色素の増加を吸光度を測定する方法あるいはメタノールとカタラーゼを作用させ生成するホルムアルデヒドを化学的または酵素を用いて比色定量する方法などが用いられる。
消費する酸素を測定する場合は、酸素電極を利用する。
【００１５】
また、アンモニアを測定する場合は、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱水素酵素を使用し消費されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定する方法が用いられる。
【００１６】
本発明の測定方法の一例は、試料中の銅イオンに銅イオンによって活性が変化する酵素を用いて、該酵素の反応がもたらす吸光度変化量を求め、予め標準液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定する方法である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、これらによって、本発明は限定されるものではない。なお、実施例中の略号は以下のものを示す。
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
【００１８】
実施例１  銅イオン濃度の測定
下記試薬１および２を調製した。
0003894236.tif 000002
【００１９】
上記サンプル６μＬに試薬１を２４０μＬ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬２を１２０μＬ添加し、第２試薬添加１分後と５分後に精製水を対照に５４６ｎｍの吸光度を測定し、１分間あたりの吸光度変化量を求めた。得られた吸光度変化量をもとに、予め標準液を用いて作成した検量線から銅イオン濃度を求めた。吸光度変化量より銅イオン濃度を求める計算式は、以下の通りである。
【００２０】
△ＡＢＳ／ｍｉｎ＝（Ａ５−Ａ１）／４
Ａ５：第２試薬添加５分後の吸光度
Ａ１：第２試薬添加１分後の吸光度
銅イオン濃度＝（Ｓ−ＢＬ）／（ＳＴＤ−ＢＬ）×１００
Ｓ：試料の△ＡＢＳ／ｍｉｎ
ＢＬ：精製水の△ＡＢＳ／ｍｉｎ
ＳＴＤ：標準液の△ＡＢＳ／ｍｉｎ
１００：標準液の銅イオン濃度（μＭ）
その結果を表１に示す。表中の数字の単位はμＭである。
【００２１】
【表１】
0003894236.tif 000003
【００２２】
表１から試料中の銅イオン濃度に比例して測定値の増加が認められた。
【００２３】
実施例２  血清中の銅イオン濃度の測定
サンプルの前処理操作
血清試料０．４ｍＬに２．５Ｍ塩酸グアニジン水溶液を０．２ｍｌ添加後、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、０．９Ｍ  ＴＣＡ（トリクロロ酢酸？）溶液を０．２ｍｌ添加し、攪拌後、遠心分離を行った。
上清を測定用試料とし、実施例１と同様に測定を行った（ｎ＝５）。
その結果を表２に示す。表中の数値の単位はμＭである。
【００２４】
【表２】
0003894236.tif 000004
表２から明らかなように、本発明の試薬により血清中の銅イオンを測定することができた。
【００２５】
実施例３  他イオンの影響の検討
下記金属塩の水溶液および精製水を試料として使用した（各水溶液濃度は５０μＭ）。
ＣｕＳＯ4 、ＭｇＣｌ2 、ＡｌＣｌ3 、ＭｎＣｌ2 、ＣｏＣｌ2 、ＺｎＣｌ2 、ＢａＣｌ2 、精製水
試料中の銅イオンの測定は、実施例１と同様にして行った。その結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
0003894236.tif 000005
【００２７】
表３から明らかなように、本発明の酵素では他のイオンの影響はほとんどなく、銅イオンに対して特異性が高いことが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、銅イオンを補欠因子または活性化因子とする酵素を用いることによって、特別な装置を必要とせず、正確性に優れた銅イオンの測定が可能となる。