(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなることを特徴とするポリＡ+ＲＮＡの精製方法。
（ａ）核酸を含有する試料を  カオトロピック剤、及び、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキル硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である界面活性剤であるタンパク質変性剤を含む溶液により溶解する工程、
（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｄ）該複合体を洗浄する工程、
（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程、
（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、
（ｇ）該ＤＮａｓｅ処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｊ）該複合体を洗浄する工程、
（ｋ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程
【請求項２】
工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩衝液の添加を行う請求項１記載のポリＡ+ＲＮＡの精製方法。
【請求項３】
カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に用いられる緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む請求項２記載の方法。
【請求項５】
洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＤＮａｓｅにＲＮａｓｅ阻害剤を共存させる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）カオトロピック剤、及び、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキル硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である界面活性剤であるタンパク質変性剤を含有する溶解液、
（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体、
（ｃ）洗浄液、
（ｄ）溶出液、及び
（ｅ）ＤＮａｓｅ
を含むことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
【請求項８】
（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む請求項７記載のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
【請求項９】
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液をさらに含む請求項７記載のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
【請求項１０】
（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液
をさらに含む請求項７記載のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
【請求項１１】
（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む請求項７〜１０のいずれかに記載の試薬。
【請求項１２】
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む請求項９又は１０に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は高純度なポリＡ+ＲＮＡの精製方法及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、ポリＡ+ＲＮＡを含有する試料からオリゴｄＴ固定化担体及びＤＮａｓｅを用いて、簡便に高純度なポリＡ+ＲＮＡを精製する方法ならびにそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年種々の生物において、全ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列が解明されつつある。例えば、ヒトに関しては、２０００年末にはドラフトシーケンスが明らかになり、そこに存在する遺伝子数は１０万を越えるであろうといわれている。しかしながら、ゲノムＤＮＡ全てが生命現象を担っているわけではなく、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ核酸（ＲＮＡ）、すなわち、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の塩基配列情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領域が存在する。また、タンパク質のアミノ酸配列情報を含む領域も、必ずしも一つのタンパク質に対し一つの連続した領域からなるものではない。つまり、タンパク質の合成の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間に挟まれたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロン）も合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこの領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残ったメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成するのである。また、真核生物ではこのｍＲＮＡの３’末端がポリアデニル化されているのが特徴であり、ポリＡ+ＲＮＡと呼ばれる。
【０００３】
このポリＡ+ＲＮＡの解析により、生命現象を解明する上で非常に重要な情報が提供される。ポリＡ+ＲＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）等の混合物であるTotal ＲＮＡを用いて行われるが、このTotal ＲＮＡに占めるポリＡ+ＲＮＡは５％以下であり、特にコピー数の少ないポリＡ+ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生体材料からポリＡ+ＲＮＡを単離することは、これらの解析において非常に有意義である。これらの分野で頻繁に使用されるｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニング、ノザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）などの解析法において良好な結果を得るためには、可能な限り高純度のポリＡ+ＲＮＡを使用することが望ましい。
【０００４】
一般に、ポリＡ+ＲＮＡを精製するには、生体試料より、ＡＧＰＣ法 [Analytical Biochemistry 162, 156-159(1987)]、リチウム沈殿法（Molecular Cloning, 1.4, (1989)）、あるいはＢｏｏｍらにより考案されたシリカ粒子を用いた方法 [J. Clin. Microbiol. 28(3), 495-501] によりTotal ＲＮＡを抽出し、このTotal ＲＮＡのうちポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセファロース等のオリゴｄＴ固定化担体に特異的に吸着させ、ポリＡ+ＲＮＡを精製する方法が用いられてきた。しかしながら、これらの方法では操作工程が長く、煩雑となるため、一度に多サンプルを処理する場合には向かない。その上操作工程が長いため、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解の危険性も増大する。
【０００５】
一方、簡便なポリＡ+ＲＮＡの単離方法として、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース等のオリゴｄＴ固定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。しかしながら、この方法においては、オープンカラムの操作ではＲＮＡ分解酵素の混入の危険性が高く、またバッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多サンプルを処理する場合には煩雑となる。
【０００６】
オリゴｄＴ固定化担体を使用するポリＡ+ＲＮＡの単離方法としては、ビオチン化オリゴｄＴをストレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオリゴｄＴ−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリＡ+ＲＮＡを特異的に吸着する方法が考案され、磁石を用いて担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分離でき、遠心操作を必要としない。しかしながら、この方法においても担体への吸着が多段階であるため効率が悪い。
【０００７】
しかしながら、これらいずれの手法においてもｒＲＮＡやゲノムＤＮＡを一度の精製では完全に除くことが出来ないため、純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得るには精製操作を２回以上繰り返すことが必要である。また、ゲノムＤＮＡ上には遺伝子の他に類似の配列を持つが、遺伝子としての機能を失った領域（偽遺伝子）が存在し、しばしば研究の妨げとなっており、これを防ぐには混入ＤＮＡを完全に除くことが必要である。その方法として、ＤＮａｓｅによるゲノムＤＮＡの切断という手段が採られるが、その後ＤＮａｓｅを変性、除去するためにはフェノール−クロロホルム抽出のような有機溶媒を用いなければならず、危険な操作である。そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細胞等の核酸を含有する試料から、高純度のポリＡ+ＲＮＡを簡便でかつ安全に精製する方法ならびにそのために用いる試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポリＡ+ＲＮＡ中のｒＲＮＡの混入を極力抑えるために精製工程を複数回繰り返すこと、及びゲノムＤＮＡの混入を抑えるためにＤＮａｓｅで処理することに着目し、種々検討を重ねた結果、タンパク質変性剤を含む溶液にて細胞等の生体材料を溶解して、ポリＡ+ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅで処理後、処理液にそのままタンパク質変性剤を含む溶液を加え、再度ポリＡ+ＲＮＡを精製することにより危険な有機溶媒による操作を必要とせず、安全でしかも簡便なポリＡ+ＲＮＡの精製が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなることを特徴とするポリＡ+ＲＮＡの精製方法。
（ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶液により溶解する工程、
（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｄ）該複合体を洗浄する工程、
（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程、
（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、
（ｇ）該ＤＮａｓｅ処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｊ）該複合体を洗浄する工程、
（ｋ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程
（２）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩衝液の添加を行う（１）のポリＡ+ＲＮＡの精製方法。
（３）タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び／又は界面活性剤である（１）又は（２）の方法。
（４）カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（３）の方法。
（５）界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム、アルキル硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である（３）の方法。
（６）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に用いられる緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（２）の方法。
（７）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（１）〜（５）のいずれかの方法。
（８）ＤＮａｓｅにＲＮａｓｅ阻害剤を共存させる（１）〜（６）のいずれかの方法。
（９）（ａ）タンパク質変性剤を含有する溶解液、（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、（ｄ）溶出液、及び（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
（１０）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む（９）のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
（１１）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液をさらに含む（９）のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
（１２）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液をさらに含む（９）のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。
（１３）（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（９）〜（１２）のいずれかの試薬。
（１４）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（１１）又は（１２）の試薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においてポリＡ+ＲＮＡを含有する試料とは、特に限定されるものではないが、例えば、血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生体材料から分離した細胞及び培養細胞などの生体試料が挙げられる。
【００１２】
本発明においては、まず核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶液により溶解し、必要に応じて、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液を添加し、ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、あるいはポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる。タンパク質変性剤を含む溶液とは溶解液をいうものである。また、 本発明に使用するタンパク質変性剤とはカオトロピック剤及び／又は界面活性剤である。
【００１３】
カオトロピック剤とは、タンパク質及び核酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次または四次構造を変えることが可能である物質をいうものである。具体的には、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物、及び（イソ）チオシアン酸塩等が挙げられる。該カオトロピック剤の濃度は、それぞれの化合物によっても異なるが、通常は１〜２０Ｍである。
グアニジニウム塩としては、グアニジン無機塩またはグアニジン有機塩があり、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウム、リン酸グアニジニウム、（イソ）チオシアン酸グアニジニウム、硫酸グアニジニウム、炭酸グアニジニウムなどが例示されるが、一般にタンパク質の変性に使用されるグアニジンの塩であれば、特に限定されない。また、それらを組み合わせて用いても良く、グアニジニウム塩の濃度は２Ｍ以上の高濃度にて使用するのが望ましい。
一方、ヨウ化物としては、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムなどがあり、（イソ）チオシアン酸塩としては、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、（イソ）チオシアン酸カリウムまたは（イソ）チオシアン酸アンモニウムなどがある。
【００１４】
さらに、溶解液においては、細胞膜の破壊あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させる界面活性剤を単独で使用するか、あるいはカオトロピック剤と併用させても良い。カオトロピック剤と併用しない場合は、一般に細胞等から核酸抽出されるものであれば特に限定されないが、特表平１１−５０１５０４号公報に開示されているようなドデシル硫酸ナトリウムやアルキル硫酸アルカリ金属塩あるいはサルコシンが望ましい。しかしながら、カオトロピック剤と併用する場合、前者２つの界面活性剤は不溶化するために用いることができない。トリトン系界面活性剤、及びツイーン系界面活性剤などの非イオン性界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤であれば特に限定されない。本発明においては、特にＲＮＡ分解酵素活性が高い試料において、カオトロピック剤との併用で０．０１〜２．０％の陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
【００１５】
本発明において、特にカオトロピック剤を含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非常に高まり、担体あるいはオリゴｄＴへの特異的な結合を妨げてしまう。そのため、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特に０〜２００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩が含まれるこれらの緩衝液を２倍量程度加えて希釈し、粘性を下げることが好ましい。さらに、溶解された試料を２０〜２５Ｇの注射針を装着したシリンジに繰り返し通すことで、ゲノムＤＮＡを切断して粘性を下げてもよい。
【００１６】
本発明で使用するオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合で固定化された担体とは、ポリＡ+ＲＮＡの３’末端ポリアデニル化領域（ポリＡテール）に実質的に相補的な配列を固定化したものである。また、本発明において使用する担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴとは、ポリＡ+ＲＮＡのポリＡテールに実質的に相補的な約２０〜５０塩基からなる配列で担体に特異的に結合可能な官能基が付加されたものであり、担体との組み合わせにおいて具体的にはビオチン付加オリゴｄＴとストレプトアビジン付加担体、ジゴキシゲニン付加オリゴｄＴと抗ジゴキシゲニン抗体付加担体などが挙げられる。これら担体の形態としては、粒子、フィルター、及び反応器具等が具体的挙げられるが特に限定はされない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態のものが好ましい。さらには、磁性シリカ粒子を用いるのがより好ましい。
【００１７】
上記工程により得られた担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程では、例えば、遠心分離及び上清の除去、又は担体として磁性粒子を使用する場合は磁界を利用して液相から担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分離するのが好ましい。また、フィルター及び反応容器等の場合は、液を排出もしくは除去するのみでもよい。
【００１８】
上記工程により得られた担体−ポリＡ+ＲＮＡを洗浄する工程において、該複合体を適当な洗浄液により、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁し、再び液相より分離し、上清を除去するのが好ましい。該複合体の分離は、遠心分離、濾過およびカラム操作が好ましく、さらに磁性粒子を使用すれば、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が可能となるのでより好適である。
【００１９】
本発明においてしようする洗浄液は、ポリＡ+ＲＮＡとオリゴｄＴの特異的な結合を解離させない程度の低濃度の塩を含むｐＨが５〜１０の例えばＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液であり、オリゴｄＴの塩基数にも依存するが、２５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含むのがより好ましい。塩濃度が高いと担体に非特異的に吸着しているｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ等を十分に除けず、純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得ることができない。また、カオトロピック剤、界面活性剤等を含んでいてもよいが、後にＤＮａｓｅ等の酵素反応を行う場合には、さらに界面活性剤、カオトロピック剤を含まない低塩濃度の緩衝液にて洗浄することが必要である。
【００２０】
核酸の溶出工程においては、ポリＡ+ＲＮＡを担体に固定化されたオリゴｄＴより解離させる。この場合に用いられる溶出液としては、オリゴｄＴからの核酸の溶離を促進するものであれば特に限定されない。具体的には、ＲＮＡ分解酵素の混入がない水、トリス緩衝液 [１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０] が好ましい。
また、加熱により解離を促進させてもよい。加熱温度はオリゴｄＴの塩基数にもよるが、ポリＡ+ＲＮＡに悪影響を及ぼさない程度の条件であれば特に限定されないが、具体的には６０〜６５℃が好ましい。
【００２１】
本発明においては、上記工程にて得られたポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅにより処理する。本発明で用いるＤＮａｓｅとしては、ＤＮａｓｅＩ、エキソヌクレアーゼIII，ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、Mung Beanヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ等が挙げられるが、特に限定はされない。本発明においては、ＲＮａｓｅの混入のないＤＮａｓｅＩが好ましい。さらに、ＤＮａｓｅがＲＮＡに作用しないように過剰量の酵素を加えない、氷上などの低温で酵素反応を行うことの他、ＤＮａｓｅ中のＲＮａｓｅの混入が懸念されるため、ＲＮａｓｅ阻害剤を共存させることが望ましい。該ＲＮａｓｅ阻害剤としては、ヒトあるいはブタ胎盤由来のＲＮａｓｅ Inhibitor等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２２】
本発明においては、上記処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合し、必要に応じて緩衝液を添加し、ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる。続いて、担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離し、必要に応じて該複合体を洗浄し、ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる。
【００２３】
一般にＲＮＡ溶液をＤＮａｓｅで処理した場合、ＤＮａｓｅを変性失活・除去するために有害なフェノールとクロロホルムの混合液を用いて抽出操作を行うため危険である。本発明においては、処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合し、ＤＮａｓｅを変性させ、かつポリＡ+ＲＮＡを吸着分離することにより、ＤＮａｓｅが除去されるため、有害な有機溶媒を使う必要がない。また、このポリＡ+ＲＮＡの吸着分離の操作により同時に混入したｒＲＮＡも除去されるため、さらに純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得ることができる。
ＤＮａｓｅ処理後に使用するタンパク質変性剤を含む溶液、緩衝液、オリゴｄＴ固定化担体または担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴとその担体、洗浄液、溶出液等は、先の工程において用いたものと異なるものを使用してもよいが、作業効率等を考慮すれば特に異なるものを使用する必要はなく、同じものを使用することが好ましい。
【００２４】
本発明によるポリＡ+ＲＮＡの精製方法は、危険な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で極めて高純度なポリＡ+ＲＮＡを生体成分より分離することが可能であるため、ポリＡ+ＲＮＡの精製キットや、固相の分離操作や試薬の分注を自動化した核酸抽出装置への応用が可能であることが明らかである。また、本発明の方法により得られたポリＡ+ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニングの鋳型などとして使用可能であり、不純物の混入が少ないため、上述のような解析操作の負担を軽減することができる。
【００２５】
本発明におけるポリＡ+ＲＮＡの精製方法の一実施態様としては、次の工程を含むものである。
（ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶液により溶解する工程、
（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｄ）該複合体を洗浄する工程、
（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程、
（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、
（ｇ）該ＤＮａｓｅ処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工程、
（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｊ）該複合体を洗浄する工程、
（ｋ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程
工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩衝液の添加を行うことがより好ましい。
【００２６】
また、本発明におけるポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬の一実施態様として、（ａ）タンパク質変性剤を含有する溶解液、（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可能な部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、（ｄ）溶出液、及び（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴とする。さらに、（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び／又は（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液を含むことがより好ましい。
（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしくはリチウム塩を含むことが好ましい。また、（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含むことが好ましい。
【００２７】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２８】
実施例１  培養細胞からのポリＡ+ＲＮＡの精製
（１）ポリＡ+ＲＮＡの精製
培養されたＨｅＬａＳ３細胞５×１０6cellに４００μｌの溶解液 [４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．５％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオトレイトール] を加え、よく溶解した。次に８００μｌの緩衝液 [０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ] と混合し、２５Ｇ注射針を装着したシリンジに約１０回通し、粘性を低下させた。新しいマイクロチューブに１０ｍｇ／ｍｌのオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision社）を１２５μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；東洋紡績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。この磁性粒子に上記試料溶液を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置した。
【００２９】
次に、このマイクロチューブを磁性スタンドに静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去した。次に４条件の洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７５、５０、２５及び０ｍＭ塩化リチウム]を１ｍｌ加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除去した。９０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加え、粒子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性スタンドに静置し、上清を回収した。この際、 回収液より９μｌ抜き取り、１回精製サンプルとした。このポリＡ+ＲＮＡを含む回収液に１０×ＤＮａｓｅＩ  Buffer [１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ塩化マグネシウム] を１０μｌ、１Ｕ／μｌに調製したＤＮａｓｅＩ（宝酒造製）を１μｌ、１０Ｕ／μｌに調製したＲＮａｓｅ Inhibitor（東洋紡績製）を１μｌ加えて、氷上に１０分間放置してＤＮＡを処理した。この処理液にそのまま溶解液４００μｌを加えてよく混和した後、緩衝液で希釈した。
【００３０】
新しいマイクロチューブに１０ｍｇ／ｍｌのオリゴｄＴ固定化磁性粒子を１２５μｌ分取して、磁性スタンドに静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。この磁性粒子に上記希釈済み溶液を加えて、ボルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンドに静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去した。次に４条件の洗浄液を１ｍｌ加えて、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除去した。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加え、粒子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性スタンドに静置し、上清を回収した。
【００３１】
（２）アガロース電気泳動によるポリＡ+ＲＮＡの解析
本発明の方法により培養細胞から得られたポリＡ+ＲＮＡ溶液３μｌ及び途中で分取した１回精製サンプル９μｌをそれぞれ等量の色素液（０．２５％ブロモフェノールブルー、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ホルムアミド）と混合し、６５℃、１０分間加熱した後、１％アガロースゲルに全量をスロットした。電気泳動装置はGelMate（東洋紡績製）を用い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１００Ｖ、４０分間泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液で３０分間浸せきし、水道水にて軽く洗浄後、ＵＶ照射下で核酸の蛍光を撮影した。その結果を図１に示す。図１において、レーン１、５は洗浄液中塩化リチウム濃度が７５ｍＭ、レーン２、６は洗浄液中塩化リチウムが５０ｍＭ、レーン３、７は洗浄液中塩化リチウムが２５ｍＭ、レーン４、８は洗浄液中塩化リチウムが０ｍＭ、レーン１〜４は１回精製サンプル、レーン５〜８は本発明の方法により得られたポリＡ+ＲＮＡの泳動パターンを示す。いずれの洗浄条件においても１回の精製ではゲノムＤＮＡやｒＲＮＡの混入が見られる。しかし、本発明のＤＮａｓｅＩ処理と再精製を行うことで、特に洗浄液中の塩化リチウムを５０ｍＭとした場合に高純度のポリＡ+ＲＮＡが得られた。
【００３２】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、様々な生体材料から簡便でかつ高純度にポリＡ+ＲＮＡを精製することが可能となった。この方法により得られたポリＡ+ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニングなどの鋳型として利用でき、かつ不純物の混入が少ないため、上述したような解析操作の負担を大きく軽減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により、培養細胞より精製されたポリＡ+ＲＮＡの電気泳動による解析結果を示す。
【図１】
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