(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミノ酸が置換し、その結果、基質結合ポケット領域において正の電荷の減少または負の電荷の上昇をもたらし、
アミノ酸の置換体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のカウントに従って、Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ及びＬ２１１Ｄからなる群から選択されるか、あるいは、（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｅ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）又は（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｄ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）のアミノ酸置換を伴うことを特徴とするスブチリシンプロテアーゼ突然変異体。
【請求項２】
Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ及びＬ２１１Ｄのアミノ酸置換体の少なくとも１つ、あるいは（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｅ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）又は（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｄ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のプロテアーゼから誘導された請求項１のプロテアーゼ突然変異体。
【請求項３】
Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ及びＬ２１１Ｄのアミノ酸置換体の少なくとも１つ、あるいは（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｅ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）又は（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｄ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）によってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のプロテアーゼから誘導された請求項１のプロテアーゼ突然変異体。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表わされるプロテアーゼである請求項３のプロテアーゼ突然変異体。
【請求項５】
Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ又はＲ９９Ｓのアミノ酸置換体の少なくとも１つによってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のプロテアーゼから誘導された請求項１のプロテアーゼ突然変異体。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表わされるプロテアーゼである請求項５のプロテアーゼ突然変異体。
【請求項７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表わされる請求項１〜６のいずれか１つに記載のプロテアーゼ突然変異体をコードする遺伝子。
【請求項８】
転写方向において、
プロモーター、
リボゾーム結合部位、
開始コドン、及び
請求項７のいずれか１つの遺伝子のプレ領域の一部ならびに全プロ及び成熟領域に、操作可能にリンクされたBaillus licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプレ領域の主要部分、
それに続くBaillus licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の転写ターミネーター配列を含む請求項７の遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子を有するBacillus属で複製されるプラスミド。
【請求項１０】
請求項９に記載のプラスミドを含むBacillus属の形質転換宿主。
【請求項１１】
宿主細胞が、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６である請求項１０に記載の形質転換宿主。
【請求項１２】
宿主細胞が、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）である請求項１０に記載の形質転換したバチルス宿主細胞。
【請求項１３】
少なくとも１種の界面活性剤と、請求項１〜６のいずれか１つに記載のプロテアーゼ突然変異体を含む洗浄剤組成物。
【請求項１４】
タンパク質加水分解活性量の突然変異プロテアーゼを含み、該プロテアーゼはケラチナーゼ／カゼイナーゼ活性比（ＫＣ比）が０．８０未満である請求項１３の洗浄剤組成物。
【請求項１５】
プロテアーゼのＫＣ比が０．７０未満である請求項１４に記載の洗浄剤組成物。
【請求項１６】
プロテアーゼのＫＣ比が０．２〜０．６５である請求項１５に記載の洗浄剤組成物。
【請求項１７】
タンパク質繊維からなる生地を洗浄するための請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項１８】
プロテアーゼが、１００ＰＵ／ｇ〜７５００ＰＵ／ｇのタンパク質加水分解活性を有する請求項１３〜１７のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項１９】
プロテアーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有する請求項１３〜１８のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項２０】
プロテアーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する請求項１９に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２１】
少なくとも１種の界面活性剤が、脂肪族アルキルポリグリコシド、脂肪族アルキルポリアルコキシレート、脂肪酸ポリヒドロキシアミド、エトキシ化脂肪族アルキルアミン、プロポキシ化脂肪族アルキルアミン、エトキシ化ビシナルジオール、プロポキシ化ビシナルジオール、エトキシ化脂肪族アルキルエステル、プロポキシ化脂肪酸アルキルエステル、エトキシ化脂肪族アミド、プロポキシ化脂肪酸アミド及びそれらの混合物からなる群より選ばれるノニオン界面活性剤を含む請求項１３〜２０のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項２２】
ノニオン界面活性剤を２〜２５重量％含む請求項１６に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２３】
脂肪族アルキル硫酸塩、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸（sulfofattyacid）エステル、スルホ脂肪酸二塩、及びそれらの混合物からなる群より選ばれるアニオン界面活性剤をさらに含む請求項２１又は２２に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２４】
少なくとも１種の界面活性剤が、硫酸脂肪族アルキル、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステル、スルホ脂肪酸二塩、及びそれらの混合物からなる群より選ばれるアニオン界面活性剤を含む請求項１３〜２０のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項２５】
アニオン界面活性剤を２〜２５重量％含む請求項２３又は２４に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２６】
アニオン界面活性剤が、アルキル基またはアルケニル基の炭素数が８〜２２の硫酸アルキル、硫酸アルケニル、硫酸アルキルエーテル、硫酸アルケニルエーテルからなる群より選択される請求項２５に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２７】
アルキル基またはアルケニル基の炭素数が１２〜１８である請求項２６に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２８】
さらに、アルカリ金属アルミニウムケイ酸塩（alumosilicate）、モジュラスが１より大きい結晶性アルカリ金属ケイ酸塩、単量体ポリカルボキシレート、重合体ポリカルボキシレート、及びそれらの混合物からなる群より選ばれる１種のビルダーを含む請求項１３〜２７のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項２９】
ビルダーを２．５〜６０重量％含む請求項２８に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３０】
２０〜５５重量％の無機ビルダーと、１５重量％以下の水溶性有機ビルダーと、２．５〜２０重量％のアニオン界面活性剤と、１〜２０重量％のノニオン界面活性剤と、２５重量％以下の漂白剤と、８重量％以下の漂白活性化剤と、２０重量％以下の無機塩と、０．４〜１．２重量％の酵素をさらに含む請求項１３〜２９のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項３１】
酵素が、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼまたはこれらの混合物である請求項３０に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３２】
無機塩がアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩またはアルカリ金属硫酸塩である請求項３０又は３１に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３３】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の第一及び第二のプロテアーゼの突然変異体を含む組成物であって、第一のプロテアーゼの突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９９位及び１５４位の少なくとも一方のアミノ酸残基がバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３と異なっており、第二のプロテアーゼの突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の２１１位のアミノ酸残基がバチルス・レントゥスＤＳＭ５４８３と異なっている組成物。
【請求項３４】
第一のプロテアーゼの突然変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有する請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
第二のプロテアーゼの突然変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３６】
プロテアーゼのそれぞれが、少なくとも１つのＲ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ及びＬ２１１Ｄのアミノ酸置換体の少なくとも１つ、あるいは（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｅ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）又は（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｄ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）のアミノ酸置換体によって特徴付けられる請求項３３〜３５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項３７】
第一プロテアーゼ突然変異体及び第一プロテアーゼ突然変異体とは異なる第二プロテアーゼ突然変異体を含み、双方は請求項１〜６のいずれか１つのプロテアーゼ突然変異体である請求項１３〜３２のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物。
【請求項３８】
第一プロテアーゼ突然変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９９位及び１５４位の少なくとも１つの位置におけるアミノ酸置換によって特徴付けられ、第二プロテアーゼ突然変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の２１１位におけるアミノ酸置換によって特徴付けられる請求項３７に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３９】
第一プロテアーゼ突然変異体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有する請求項３７又は３８に記載の洗浄剤組成物。
【請求項４０】
第二プロテアーゼ突然変異体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する請求項３７又は３８に記載の洗浄剤組成物。
【請求項４１】
プロテアーゼのそれぞれが、少なくとも１つのＲ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ及びＬ２１１Ｄのアミノ酸置換体の少なくとも１つ、あるいは（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｅ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）又は（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ１５４Ｄ＋Ａ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ＋Ｖ１９９Ｉ）のアミノ酸置換体によって特徴付けられる請求項３７〜４０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４２】
織物を、請求項１３〜３２又は３７〜４１のいずれか１つに記載の洗浄剤組成物と接触させることからなる生地の洗浄方法。
【請求項４３】
織物が、タンパク質繊維からなる請求項４２に記載の洗浄方法。
【請求項４４】
血液及び卵による染みの双方を有する生地から染みを除去する請求項４２又は４３に記載の洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．技術分野
本特許は、クリーニングおよび配合洗剤に含まれる野生型酵素に比較して改善された特性を有する新規な変異たんぱく質分解酵素、該改善プロテアーゼをコ−ドする核酸配列、およびこの新規なプロテアーゼをコードする核酸配列を保有する宿主生物に関する。本発明はまた、有効な洗浄力を有する量の上記酵素を含む新しい改良された洗剤および洗浄合成物をも網羅するものである。
２．関連技術の説明
スブチリシン（subtilisin）は、デンプン液化バチルス（Bacillus amyloliquefaciens）などの土壌バクテリアにより産生される分子量２万から４万５千ダルトンの細菌の細胞外プロテアーゼの系統のひとつである。プロテアーゼとは、たんぱく質やペプチド基質内のペプチド結合やある種の末端エステル（terminal ester）のエステル結合の加水分解を触媒する酵素である。スブチリシンは、ペプチド（エステル）結合への求核性攻撃（necleophilic attack）を、活性部位であるセリン残基で開始するセリンプロテアーゼのグループに属する。スブチリシンは、物理的および化学的によく解明された酵素である。数種類のスブチリシンの三次元構造は、Ｘ線解析解析研究により詳細に解明されている（Bezel,C.,G.P.,and Sanger,W.（1988）Eur.J.Biochem,178,155-171;Bott,R.,Ultsch,M.,Kossiakoff,A.,Graycar,T.,Katz,B.,and Power,S.（1988）J.Biol.Chem.263,7895-7906;Goddette,D.W.,Peach,C.,Yang,S.S.,Mielenz,J.R.,Bystroff,C.,Wilke,M.,and Fletterick,R.J.（1992）J.Mol.Biol.228,580-595;Heinzs,D.W.,Priestle,J.P.,Rahuel,J.,Wilson,K.S.and Grutter,M.G.（1991）J.Mol.Biol.217,353-371;Kraut,J.（1997）Annu.Rev.Biochem.46,331-358;Neidhart,D.J.,and Petsko,G.A.（1988）Protein Eng.2,271-276;Teplyakov,A.V.,Kuranova,I.P.,Harutyunyan,E.H.,Vainsthtein,B.K.,Frommel,C.,Hohne,W.E.,and Wilson,K.S.（1990）J.Mol.Biol.214 261-279）。このように、多くの情報があるにもかかわらず、これらの近しく関係するスブチリシン間の構造／機能の違いは未だ説明されていない。
スブチリシンは、市販の製品（例えば、洗濯および食器洗い用の洗剤、コンタクトレンズクリーナーなど）や研究目的（合成有機化学における触媒）において広く使用されている。ある系統のスブチリシン、配合洗剤に使用される強アルカリ性プロテアーゼは、特許出願WO 91/02792に既に記載されている。このBacillus lentusアルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）は、Bacillus licheniformisＡＴＣＣ53926アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターの制御下で、野生型ＢＬＡＰ遺伝子を有する表現プラスミドで形質転換させたBacillus LicheniformisＡＴＣＣ53926株を利用して商業規模の量を入手できる。ＢＬＡＰの結晶構造は既に解明されており（Goddette,D.W.,et al,（1992）J.Mol.Biol.228,580-595;WO 92/21760）、同等物はthe Brookhaven Protein Data Bankに寄託されている。別に特に記載がないかぎり、アミノ酸の位置の番号は、ＢＬＡＰ（２６９アミノ酸）の配列によっており、これはスブチリシンＢＰＮ’（２７５アミノ酸）と異なっている。配列の相同性が最大になるように並べると、以下のパターンが出現する。ＢＬＡＰにおけるポジション１から３５、３６から５４、５５から１６０、１６１から２６９が、それぞれスブチリシンＢＰＮ’におけるポジション１から３５、３７から５５、５７から１６２、１６７から２７５に相当する。
本発明によるプロテアーゼの変種を説明するために、以下の用語が用いられる；［元々のアミノ酸、成熟酵素のＮ末端からの位置；置換アミノ酸］。例えば、ＢＬＡＰのポジション４のバリンのイソロイシンによる置換は、Ｖ４Ｉとする。アミノ酸の略字のリストを表１に示す。
0003922391.tif 000002
ひとつのたんぱく質分子内において複数の変異がある場合は、例えばS3T＋V41;A188P＋V193M＋V1991などのように、個々の変異を足して示す。
熱および化学的な不活性化に対する予防措置および洗浄能力の改善が、技術面および商業面での応用に向けたプロテアーゼの研究開発の主たる目的である。スブチリシンを含む多数の酵素はランダムおよび位置特異的な突然変異誘発で作りだされ、これらは熱および化学的安定性の改善に向けての合理的アプローチに対する幾らかの指針となった（Estell,D.A.,Graycar,T.P.,and Walls,J.A.（1985）J.Biol.Chem,260 6518-6521;Matsumura,M.,Becktel,W.J.,Levitt,M.,and Matthews,B.W.（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6562-6566;Pantoliano,M.W.,Whitlow.M.,Wood,J.F.,Rollence,M.L,.Finzel,B.C.,Gilliand,G.L.,Poulos,T.L.,and Bryan,P.N.（1988）Biochemistry 27,8311-8317;Russell,A.J.,and Fersht,A.R.（1987）Nature 328,496-500;Siezen,R.J.,De Vos,W.M.,Leunissen,J.A.M.,and Dijkstra,B.W.（1991）Protein Eng.4,719-737;van Ee,J.H.（1991）Chemiseoggi（7/8）,31-36;Wells,J.A.and Estell,D.A.（1988）Trends Biochem.Sci.13,291-297）。酵素活性の調節、特に速度増大や基質サブセットに対する最適化は、かなり難解な問題である。EP0260105は、catalytic triadの１５Ａ内の特定のアミノ酸残基を変えることによってtransesterfication速度／加水分解速度比率とnucleophile specificityが変更されたスブチリシンＢＰＮ’変異株の作成を教授している。Russell,A.J.and Fersht,A.R.（1987）J.Mol.Biol.193:803-813は、活性部位の１４Åから１５Åに表面電荷が変っているスブチリシンＢＰＮ’変異株（D099S）を教授している。この置換は、スブチリシンの触媒反応におけるｐＨ依存性に影響を与えるものである。これらの発表のどちらも、プロテアーゼの洗浄能力の改善につながるアミノ酸の置換を予測する方法を教授していない。EP0130756、EP0247647、US4,7609,025は、スブチリシンＢＰＮ’において、アミノ酸残基（ＢＰＮ’numbering）Ａｓｐ３２、Ａｓｎ１５５、Ｔｙｒ２１７、Ｍｅｔ２２２、Ｇｌｙ１６５、Ｈｉｓ６４、Ｓｅｒ２２１、Ｇｌｙ１６９、Ｇｌｕ１５６、Ｓｅｒ３３、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、および／またはＡｌａ１５２の一つまたは複数の変異を引き起こすsaturation mutation methodを教授している。このアプローチを使用して、酸化安定性が改善され、異なる基質特異性、および／または異なるｐＨ活性を有する変異プロテアーゼを得ることができる。これらの発表はまた、プロテアーゼの活性部位領域内での変異は活性に影響を与える可能性が高いことを教授するものである。しかし、EP0130756、EP0247647、US4,7609,025はいずれも、プロテアーゼの洗浄能力の改善につながるアミノ酸の置換を予測する方法を教授していない。
スブチリシンの触媒活性についての情報の大半は、構成の判明している小さいペプチド基質の加水分解について調査することにより収集されたものである。これに対して大きなたんぱく質基質との相互作用については、ほとんどわかっていない。基質がテキスタイルの表面に付着し、ブリーチ、tensides,ビルダーなどの干渉成分の存在下で触媒反応が起きる場合などは特にわかっていない。
EP0328229は、洗浄テストの結果に基づく洗濯用洗剤としての特性が改善されているPB92スブチリシン変異体の単離および特性指摘を教授している。これは、洗浄における酵素の能力を予測する場合は、生物化学的特性は信頼できるパラメーターではないことを教授する。変異体の選別方法のは、アミノ酸を同じカテゴリー（極性、非極性、芳香族、帯電、脂肪族、中性）に属する他のアミノ酸で置換、極性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸を帯電アミノ酸で置換、そして活性部位以外の部位でのプロテアーゼのアニオン特性を増大させることが含まれる。変更すべきアミノ酸を決定する方法は教授されていない。特許出願WO91/00345（ノボノルディスク社）は、スブチリシンCarlsbergとスブチリシン３０９の等電点を、この酵素が使用されると想定される洗濯溶液のｐＨに合うように修飾することにより、スブチリシンの洗浄能力を改善する方法が教授されている。しかし、ヨーロッパ諸国における洗濯状況下では、強アルカリ性スブチリシンは洗剤のｐＨと非常に近いｐＩを有するため、この手法では明らかな利点はない。WO91/00345はまた、catalytic triadから１５Åを越えるアミノ酸を変えることにより酵素の反応速度特性を変化させられることを教授している。スブチリシン３０９に存在する２６９のアミノ酸のうち１１６の異なるアミノ酸が、酵素の総電荷を変化させるために置換、付加、削除できる可能性のある対象としてあげられている。
WO92/11357（ノボノルディスク社）は、スブチリシン分子のpH依存性電荷を減少させることによりスブチリシンのpH安定性が増大、洗浄力が改善されることを教授する。このことは、一定のpH範囲において実質的に電荷の一定を実現するための突然変異の導入を意味する。好ましくは、ｐＨ範囲７から１１において総電荷の変化をほぼ無くす。ヨーロッパ特許出願No.057049A1は、変異たんぱく質分解酵素を開示している。これらの酵素は、ＰＢ９２セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％のホモロジーを有し、ＰＢ９２ seringプロテアーゼ中の９９、１０２、１１６、１２６、１２７、１２８、１３０、１６０、２０３、２１１、および２１２に相当する少なくとも一つのアミノ酸が異なるとされている。意図される変異プロテアーゼを製造するために、ＤＮＡからなり変異プロテアーゼをコードする表現ベクターで形質転換された微生物宿主株を成育させて変異プロテアーゼが作成される。
洗剤および洗浄補助剤（washing aid）中で使用するために提案される本発明のプロテアーゼは、強いたんばく質分解活性を有するものが選択された。特異性が低いため、このプロテアーゼによる繊維の損傷や繊維の破壊は、特に例えばシルクやウールのシート形のテキスタイルなどたんぱく質原性繊維でできたファブリックを繰り返し洗う場合に起こりうる。一方、プロテアーゼ活性が少しでも低下すると、洗剤の使用者が気付くほどの洗浄力の低下を引き起こす。したがって本発明にかかる課題は、実質的には同じ洗浄力があり、たんぱく質原性繊維、より限定的にはウール、に対する活性が低いプロテアーゼ含有洗剤を開発することである。本発明にかかるもうひとつの課題は、布についた卵や血液などの特定の染みを除去する汚れに特異的なプロテアーゼおよび、このような汚れ特異的プロテアーゼを含有する配合洗剤の開発である。
発明の要旨
本発明によるプロテアーゼ変異体が由来するところの野生型プロテアーゼは、２６９のアミノ酸残基と２６，８２３ダルトンの分子量を有し、標準ｐＫ値に基づく計算による等電点が９．７のＤＳＭ５４８３から得られるBacillus lentusアルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）である。ＢＬＡＰの遺伝子は、B.lentus ＤＳＭ５４８３の染色体ＤＮＡより単離し、B.lentusのプロテアーゼをコードする領域のputative ＤＮＡ配列のＤＮＡプローブを作成し、単離した染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成し、プローブに対するハイブリダイゼーションで目的の遺伝子についてライブラリーをスクリーニングすることで得られる。
熱および表面安定性が改善されたB.lentus ＤＳＭ５４８３プロテアーゼ変異体は、１９９１年５月２９日に提出された特許出願Serial No,07/706,691中に記載されている。一般に、本発明に記載の突然変異は、野生型のＢＬＡＰに以下のアミノ酸置換を導入する；Ｓ３Ｔ、Ｖ４１、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、およびＶ１９９Ｉ（番号はＢＬＡＰ配列による）。
テキスタイル上の大きな分子のたんぱく質基質へのプロテアーゼの結合についての研究の結果、基質結合部位に近接する位置にあるアミノ酸の電荷が重要であることを示した。プロテアーゼの基質結合ポケット領域内において、プラスに帯電したアミノ酸残基を除去またはマイナスに帯電したアミノ酸残基を導入することで、野生型よりも高い洗浄力が得られることが示されたといえる。
本発明はまた、ウールなどのたんぱく質原性繊維からなるファブリックを、これらの繊維を損なう原因となることなく、洗うための洗剤合成物に関する。該洗剤は、少なくとも１種類の表面活性剤とたんぱく質分解活性を発揮する量でkeratinase/caseinase活性比が少なくとも約０．８０のプロテアーゼからなる。
本発明の他の局面は、血液や卵等のシミそして特にこれらのシミが組み合わされたものをファブリックから除去するのに特に有効な洗剤成分に関する。この洗剤は、Bacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体であるプロテアーゼの組み合わせと少なくとも１種類の表面活性剤から構成される。
【図面の簡単な説明】
図１は、酵素に結合した合成基質ＡＡＰＦとの野生型ＢＬＡＰの基質結合領域のモデルである。結合基質との関係におけるアルギニン９９、セリン１５４、およびロイシン２１７の位置が示されている。
図２は、Bacillus licheniformls ＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子とBacillus lentus ＤＳＭ５４８３ＢＬＡＰ遺伝子のハイブリッド遺伝子フュージョンを含む大腸菌プラスミドｐＣＢ１３Ｃの制限酵素切断マップを示す。ＡＴＣＣ５３９２６のプロモーター、リボソーム結合部位およびpresequence（５３９２６）は、proおよびmature ＢＬＡＰ遺伝子に融合された。ＡＴＣＣ５３９２６の転写ターミネータ（Ｔ−５３９２６）がＢＬＡＰのコード配列に付与されている。
図３は、実施例２で検討されるＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のＮ末端領域由来のＡｖａＩ／ＣｌａＩフラグメントのＤＮＡ配列を示す。このフラグメントには、putativeプロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、およびpre sequenceの大半が含まれる。この２９２塩基対のフラグメントの、それぞれ５’および３'末端はＡｖａＩおよびＣｌａＩ制限酵素切断部位となる。
図４は、ｐＭａｃ５−８に由来しＢＬＡＰ遺伝子を含有する大腸菌プラスミドｐＭｃ１３Ｃの制限酵素切断地図である。ｐＭｃ１３Ｃ中のアンピシリン耐性（ＡｐR）遺伝子には、これを不活性化するamber mutationを有している。このプラスミドは、さらにクロラムフェニコール耐性（ＣｍR）もコードしている。
図５は、BacillusプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１の制限酵素切断地図で、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１をコードする遺伝子を含有する。図２でｐＣＢ１３Ｃについて記載されているように、含まれるのはＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼとＢＬＡＰのハイブリッドフュージョンである。また、５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の転写停止配列も存在している。これは、カナマイシン耐性をコードするｐＵＢ１１０を基にするプラスミドである。
図６は、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＢ１１０に由来するＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドｐＨ７０の制限酵素切断地図を示す。プロテアーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントが、ｐＵＢ１１０のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断位置の間にクローニングされている。このプラスミドは、実施例３、突然変異プロテアーゼ遺伝子のクローニング、において検討されている。プラスミドｐＨ７０は、カナマイシン耐性をコードする。
図７は、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＣ１６に由来するBacillusプラスミドｐＣ５１の制限酵素切断地図を示す。プロテアーゼ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩが、プラスミドｐＢＣ１６上のＥｃｏＲＩ切断位置およびＢａｍＨＩ切断位置の間にクローニングされている。このプラスミドは、実施例３、突然変異プロテアーゼ遺伝子のクローニング、において検討される。プラスミドｐＣ５１は、テトラサイクリン耐性をコードする。
図８は、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１の遺伝子をコードするBacillusプラスミドｐＢＣ５６Ｍ１３１の制限酵素切断地図を示す。図２でｐＣＢ１３Ｃについて説明されているように、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子とＢＬＡＰ遺伝子間のハイブリッドフュージョンが含まれる。また、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の転写停止配列も含まれる。これは、テトラサイクリン耐性をコードするｐＢＣ１６を基としたプラスミドである。
図９は、ＢＬＡＰのトリプシン消化により得られるペプチドを示す。ＢＬＡＰ（l/mg/ml）は、１．６Ｍ尿素、０．１６Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3中でトリプシン（１ｍＭ ＨＣｌ中１％、ｗ／ｗ）で摂氏３７度で１０分間消化された。次いでサンプルを、１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）で最終的に１％ＴＣＡ濃度となるまで酸性化した。実施例８に記載されるように、１０μlのサンプルをＨＰＬＣカラムに注入してペプチドを分離した。トリプシン消化ペプチドは、以下のＢＬＡＰ配列に相当する。フラグメント＃１−Ａｌａ１からＡｒｇ１０；フラグメント＃２−Ｖａｌ１１からＡｒｇ１９；フラグメント＃３−Ｇｌｙ２０からＬｙｓ２７；フラグメント＃４−Ｖａ１２８からＡｒｇ４４；フラグメント＃５−Ｇｌｙ４５からＬｙｓ９２；フラグメント＃６−Ｖａ１９３からＡｒｇ９９；フラグメント＃７−Ｇｌｙ１００からＡｒｇ１４３；フラグメント＃８−Ｇｌｙ１４４からＡｒｇ１６４；フラグメント＃９−Ｔｙｒ１６５からＡｒｇ１８０；フラグメント＃１０−Ａｌａ１８１からＬｙｓ２２９；フラグメント＃１１−Ｇｌｎ２３０からｌｙｓ２３１；フラグメント＃１２−Ａｓｎ２３２からＡｒｇ２４１；フラグメント＃１３−Ａｓｎ２４２からＬｙｓ２４５；およびフラグメント＃１４−Ａｓｎ２４６からＡｒｇ２６９。
微生物の寄託
プラスミドｐＢＣ５６Ｍ１３１を持ったBacillus licheniformisは、ＡＴＣＣ６８６１４として寄託されている。プラスミドｐＭＣ１３Ｃを持ったEschericia coli ＷＫ６は、ＡＴＣＣ６８６１５として寄託されている。プラスミドｐＣＢ１３Ｃを持ったEschericia coli ＧＭ３３は、ＡＴＣＣ６８６１６として寄託されている。プラスミドｐＭａ５−８を持ったEschericia coli ＷＫ６は、ＡＴＣＣ６８６１７として寄託されている。プラスミドｐＭｃ５−８を持ったEschericia coli ＷＫ６は、ＡＴＣＣ６８６１８として寄託されている。
好ましい実施態様の説明
本発明の一つの局面は、アミノ酸置換を選択する方法とその結果として得られる洗浄能力の改善された突然変異プロテアーゼに関する。洗浄力の改善は、酵素の基質結合ポケットの領域内にマイナス荷電の増大となるようなアミノ酸置換をおこなうことによってえられる。本発明によれば、これはプロテアーゼの基質結合ポケットの領域において、ＡＡＰＦなどのような結合基質分子の７Ａ以内に、マイナスに帯電したアミノ酸残基数を増加させるかプラスに帯電したアミノ酸残基数を減少させることでおこなうことができる。特に、Bacillus lentusアルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）変異体Ｍ１３０およびＭ１３１の中のポジション９９、１５４、および２１１におけるアミノ酸置換は、酵素の洗浄力を向上させることが証明されている。
本発明の第二の局面は、実験テストにおいて野生型のプロテアーゼよりも高い洗浄力をもつたんぱく質分解酵素変異体に関する。本発明に記載されるこの変異は、以前に、１９９１年５月２９日に申請された特許出願Serial No.07/06,691に記載されているＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０およびＭ１３１に導入するものである。Ｍ１３０およびＭ１３１のどちらも、野生型のプロテアーゼよりも高い安定性を有することが証明されている。変異体Ｍ１３０は、４つのアミノ酸置換、すなわちＳ３Ｔ、Ａ１８８Ｐ／Ｖ１９３Ｍおよび１９９Ｉを有する。変異体Ｍ１３１は、５つのアミノ酸ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ、すなわち、Ｓ３Ｔ、Ｖ４１、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを有する。好ましいプロテアーゼを決めるために使用されたシステムでは、よく使用される１文字によるアミノ酸コードを使用し、まず番号付与したポジションにmature formのＢＬＡＰのアミノ酸残基を全てリストアップし、次いでアミノ酸の置換をおこなう。Ｍ１３０およびＭ１３１のアミノ酸配列は、それぞれ１９９１年５月２９日に提出された特許出願Serial No.07/706,691に添付されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される。参照のために、本発明の「配列一覧表」に、Ｍ１３０の配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に、Ｍ１３１の配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示す。Ｍ１３０およびＭ１３１のどちらも、より洗浄力の高いプロテアーゼを得るためにさらなるアミノ酸置換を行うための土台として使用された。本発明による変異プロテアーゼは、変異プロテアーゼＭ１３０またはＭ１３１のアミノ酸残基の少なくともひとつを置換することにより得られるものであり、ここにおいて、置換されるアミノ酸残基はポジション９９のアルギニン、ポジション１５４のセリン、およびポジション２１１のロイシンからなるグループから選択される。表２は、本発明において特許請求されるＢＬＡＰ変異プロテアーゼを示し、Ｆ１１、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５４およびＦ５５を含む。例えば表２に記載されるＦ１１は、Ｍ１３０に由来し、Ｍ１３０に存在する他の変異、すなわちポジション３のセリンがスレオニンで置換（Ｓ３Ｔ）、ポジション１８８のアラニンがプロリンで置換（Ａ１８８Ｐ）、ポジション１９３のバリンがメチオニンで置換（Ｖ１９３Ｍ）、ポジション１９９のバリンがイソロイシンで置換（Ｖ１９９Ｉ）、のほかにポジション９９のアルギニンがセリンで置換されている（Ｒ９９Ｓ）。その他の変異プロテアーゼについては、Ｆ４３からＦ４９は、Ｍ１３１に由来する。変異体Ｆ５４とＦ５５は、変異体Ｆ４９に由来する。好ましいたんぱく質分解酵素Ｆ１１、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５４およびＦ５５のアミノ酸配列は、それぞれ本出願のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記載される。
本発明の他の局面は、表２に一覧される変異プロテアーゼをコードする遺伝子に関する。本発明の全ての変異プロテアーゼの遺伝子構造は、実施例２において詳細に記載される。いずれの場合にも、アミノ酸置換を起こす突然変異は既知の手法を用いて行う。上記されたプロテアーゼＦ１１、Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９、Ｆ５４およびＦ５５の成熟型をコードするＤＮＡ配列。上記にあげた変異プロテアーゼのひとつをコードする各ハイブリッド遺伝子は、転写の方向に、プロモーター、リボゾーム結合部位および開始コドンとＢＬＡＰ遺伝子変異体のproおよびmature領域の全てとpre領域の一部とoperablyに結合したB.licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のpre regionの主要部分、これに続くＡＴＣＣ５３９２６のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子に対する転写停止配列から構成される。ハイブリット遺伝子は、宿主の染色体内に組み込むことも、選択したBacillus株中で複製されるプラスミドに挿入することもできる。特にBacillusサブチリスの菌株においてプロテアーゼを生産する場合はプラスミドｐＵＢ１１０またはｐＵＢ１１０由来のプラスミドが選択、およびB.licheniformisの菌株でプロテアーゼを生産する場合はプラスミドｐＢＣ１６またはこれに由来するプラスミドが選択される。ハイブリッド遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたBacillus株を適当な培地で成育させることにより変異プロテアーゼが生産される。
本発明のもうひとつの局面は、少なくとも１種類の表面活性化剤と、たんぱく質分解活性を有する量の、およそ０．８未満、好ましくはおよそ０．７未満、より好ましくはおよそ０．２からおよそ０．６５の範囲のケラチンナーゼ／カゼイナーゼ活性比（以下ＫＣ比とする）を有するプロテアーゼを含有する。
洗剤は、好ましくはおよそ１００PU/gからおよそ７５００PU/gの範囲のたんぱく質分解活性を有するものとする。
本発明は、またおよそ０．８未満、好ましくはおよそ０．７未満、より好ましくはおよそ０．２からおよそ０．６５の範囲のＫＣ比を有するプロテアーゼを、たんぱく質原性の繊維からなるテキスタイルまたは少なくとも一部がたんぱく質原性の繊維から成るテキスタイルの洗濯に使用することに関する。
ＫＣ比は、二種類の異なる基質、カゼインとケラチンに関するプロテアーゼの活性にも関する。
カゼインを基質とした場合、記載の測定条件下にて吸光値が0.500 ODとなるプロテアーゼ溶液のたんぱく質分解活性を、１mlあたり１０PU（プロテアーゼ単位）と定義する。プロテアーゼを含有する洗剤を使用する者が認める洗浄結果は、PUで表されるこの活性と相関する。たんぱく質原性繊維に対する認められた損傷は、一定の洗浄結果に対するＫＣ比と相関する。
上記の課題に鑑みて予想されるように、市販のプロテアーゼの場合、カゼインとケラチンに対する活性の差はほんの僅かしか認められず、ＫＣ比は比較的１に近い。たんぱく質原性繊維に対する損傷があまり認識されない程度にするために、ＫＣ比が０．８０未満のプロテアーゼを使用する必要があることが分かる。
驚くべきことだが、上記の特性を有するプロテアーゼは、特定の他の洗剤成分に相乗的に作用すること、および反対にプロテアーゼのたんぱく質分解活性が特定の他の洗剤成分によって相乗的に高められていることが見いだされた。これらの作用は、特に、本発明による合成物成分中の表面活性剤成分に非イオン系表面活性剤、soil-release copolyester（より詳細には、テレフタル酸ユニットを有するもの）、非水溶性有機ビルダー、水溶性無機および有機ビルダー（より詳細には酸化炭水化物）、硫酸塩およびスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性剤、を含む場合に起きるが、アルキルベンゼンスルホン酸塩の場合はそんなに強い作用ではない。本発明による洗剤は、好ましくはその特性が増強されたものまたはこれがプロテアーゼの特性を増強する成分を含む。
本発明にしたがって使用するに適当なプロテアーゼは、遺伝子工学で作成されたBacillus lentus ＤＳＭ５４８３の変異体を含む。これらの変異体は、１９９４年２月２４日に提出された米国特許出願serial number 08/201,120に述べられる方法に従って作成することができ、この出願の内容全ては、参考文献として、本出願および米国特許番号5,340,735に取り入れられている。Bacillus lentus ＤＳＭ５４８３（ＢＬＡＰ）の好ましい変異体は、実施例２の表２に一覧する。
表２に関して、変異体の同定に使用するシステムは、米国特許番号5,340,735で使用されたものと同じもので、そこにおいて説明されている。例えば、変異体Ｆ４９は、S3T＋V4I＋A188P＋V193M＋V199I＋L211Dと同定される。このようなプロテアーゼは、ポジション３のセリン残基がスレオニンで置換、ポジション４のバリンがイソロイシンで置換、ポジション１８８のアラニン残基がプロリンで置換、ポジション１９３のバリン残基がメチオニンで置換、ポジション１９９のバリン残基がアスパラギン酸で置換されたBacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体である。野生型のＢＬＡＰプロテアーゼのアミノ酸配列は、米国特許番号5,340,735のシークエンスＩＤ番号５２として記載されている。参照のために、本発明の「配列一覧表」に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２として示す。
Bacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体には、血液のシミに選択的な活性を示すものもあれば、卵のシミに選択的な活性を示すものもある。血液と卵のシミをファブリックから除去するに特に有効な変異体は、野生型のBacillus lentus ＤＳＭ５４８３たんぱく質に以下の置換を起こすことで作成された変異体である、すなわちＲ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２２１ＤおよびＬ２２１Ｅである。９９と１５４の位置のアミノ酸置換を有する変異体は、血液のシミの除去に特に有効である。２２１の位置にアミノ酸置換を有する変異体は、卵のシミの除去に特に有効である。ポジション９９と１５４に置換アミノ酸を有する変異酵素と、ポジション２２１に置換アミノ酸を有する変異酵素は、血液と卵のシミの組み合わせを除去するに特に有効である。
本発明の他の局面は、血液や卵のようなシミの組み合わせをファブリックから除去するにとくに有効な洗剤合成物に関する。この洗剤は、Bacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体であるプロテアーゼの組み合わせ、非イオン系表面活性剤、アニオン系表面活性剤、石鹸、またはこれらの表面活性剤の組み合わせからなる。プロテアーゼの組み合わせには、上記の表に一覧されるBacillus lentus ＤＳＭ５４８３変異体の二種類以上の全ての組み合わせが含まれる。血液と卵のシミからなるシミを除去するに特に好ましい組み合わせは、F46＋F49である。
一つの好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、脂肪族アルキルポリグルコシド類、脂肪族アルキルポリアルコキシレート類、更に詳細にはエトキシレートおよび／またはプロポキシレート類、脂肪族ポリヒドロキシアミド類、および／または脂肪族アルキルアミン類のエトキシル化および／またはプロポキシル化産物、vicinal diol類、脂肪族アルキルエステルおよび／または脂肪族アミド類およびこれらの混合物を、さらに詳細には、重量比で２％から重量比で２５％までの量で含む。
他の好ましい実施態様においては、本発明による洗剤は、硫酸塩および／またはスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性剤、さらに詳細には脂肪族アルキル硫酸塩、脂肪族アルキルエーテル硫酸塩、スルホ脂肪酸エステルおよび／またはスルホ脂肪酸二塩を、さらに詳細には重量比で２％から重量比で２５％までの量で含有する。アニオン系表面活性剤は、好ましくは、アルキルまたはアルケニル基が８から２２個の炭素原子を有し、さらに好ましくは１２から１８個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル硫酸塩類および／またはアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩類から選択される。
他の好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、水溶性および／または非水溶性ビルダー、さらに詳細には、アルカリ金属alumosilicate、モジュールが１未満の結晶アルカリ金属ケイ酸塩、単量体のポリカルボン酸塩、重合ポリカルボン酸塩およびこれらの混合物から選択されるビルダーを、さらに詳細には重量比で２．５％から重量比で６０％までの量で含有する。
ウールまたはシルクの生地の洗濯を目的とする、本発明の洗剤の別の、多少好ましさは劣るが、実施態様においては、過酸化物を基にした漂白剤、さらに詳細には過酸化水素、アルカリ金属perborate tetrahydrate、アルカリ金属perborate monohydrateおよび／またはアルカリ金属percabonateを、さらに詳細には重量比で５％から重量比で７０％までの量で、および任意洗濯で漂白剤活性化剤を、さらに詳細には重量比で２％から重量比で１０％までの量で含有する。
最後に、本発明による洗剤の別の実施態様においては、ジカルボン酸およびグリコールのコポリエステルに基づくsoil-release剤を、特に重量比で０．０１％から重量比５％までの量で含有する。これらのsoil-release剤は、ジカルボン酸ユニット、アルキレングリコール、ポリアルキレングルコールユニットを含有するコポリエステルで、その化学的類似性から特にポリエステル繊維に対して有効であるが、また他の材質のファブリックで要求される効力を開発可能である。このタイプのsoil-relaseコポリエステルおよび洗剤中におけるその使用は、しばらく以前から知られている。
本発明による洗剤合成物は、石鹸を含む少なくとも一種類の表面活性剤を含有する。この表面活性剤は、非イオン系またはアニオン系表面活性剤または非イオン系とアニオン系表面活性剤の組み合わせ、非イオン系およびアニオン系表面活性剤と一種類以上の石鹸との組み合わせである。
適当な非イオン系表面活性剤にはalkoxylate、さらに詳細には炭素原子数１０から２２、好ましくは炭素原子数１２から１８の飽和またはモノ−からポリ不飽和直鎖または分岐型アルコールのethoxylateおよび／またはpropoxylateが含まれる。アルコールのalkoxylationの程度は、一般に１から２０、好ましくは３から１０の間である。これらは、相当するアルコールを相当するalkylene oxideで反応させることにより既知の方法で得られる。脂肪族アルコールの誘導物は特に適当であるが、分岐鎖異性体、より詳細にはいわゆるoxoalocoholを使用して有用なalkoxylateを作ることができる。したがって、直鎖基、より詳細にはdodecyl、tetradecyl、hexadecylまたはoctadecyl基およびこれらの混合物、を有する第１アルコールのalkoxylate、詳細にはethoxylteが使用できる。さらに、アルキル基に関して上記したアルコールに相当するアルキルアミン、vicinaldiolおよびカルボン酸アミドの相当するalkoxylation産物も適当である。本発明による洗剤に入れるに適当なアルキルポリグルコシドは、一般式（Ｇ）n−ＯＲ1に相当する化合物であり、該式においてＲ1は炭素原子数８から２２のアルキルまたはアルケニルラジカル、Ｇはグルコースユニット、ｎは１から１０の数値である。グルコシド成分（Ｇ）nは、自然に存在するアルドースまたはケトースモノマーのオリゴマ−またはポリマーで、特にグルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、talose、gulose、altrose、allose、idose、リボース、アラビノース、キシロース、lyxoseを含む。このようなグルコシドの結合したモノマ−からなるオリゴマーは、その中にある糖のタイプで分類される以外に、その数、いわゆるオリゴメリゼーションの度合いで分類される。分析で測定される量として、オリゴメリゼーションの度合いｎは、一般的に１から１０のbroken numberで、好ましく使用されるグルコシドの場合は、１．５未満、さらに好ましくは１．２から１．４の間の値である。グルコースは、入手が容易であることから、好ましいモノマーユニットである。グルコシドのアルキルまたはアルケニル置換体Ｒ1もまた、好ましくは補充可能な原材料からなる容易に入手できる誘導体、さらに好ましくは脂肪族アルコールから生成するが、これらの分岐鎖isomer、さらに詳細にはいわゆるoxoalcoholも有用なグルコシドの製造に使用することができる。したがって直鎖オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、またはオクタデシル基およびこれらの混合物を有する第１アルコールおよびこれらの混合物は特に適当である。特に好ましいアルキルグルコシドには、ある種のcocofatty alkyl group、すなわち、基本的にＲ1がドデシルおよびＲ1がテトラデシルの混合物がある。
本発明による洗剤に含まれる非イオン系表面活性剤は、好ましくは重量比で１％から重量比で３０％まで、さらに好ましくは重量比で１％から重量比で２５％までの量である。
非イオン系表面活性剤に加え、またはこれに代わり、本発明による洗剤は、他の表面活性剤、好ましくは硫酸塩またスルホン酸塩型の合成アニオン系表面活性剤を、洗剤を１００として、好ましくは重量比で２０％未満さらに好ましくは重量比で０．１％から１８％までの量で含んでもよい。本発明の洗剤中での使用に特に適している合成アニオン系表面活性剤は、アルカリ金属、アンモニウムまたはアルキルまたはヒドロキシアルキル置換アンモニウムイオンを対イオンとして含有する炭素原子数８から２２のアルキルおよび／またはアルケニル硫酸塩である。炭素原子数１２から１８の脂肪族アルコールおよびこれの分岐鎖アナログ、いわゆるオキソアルコールは好ましい。アルキルおよびアルケニル硫酸塩は、相当するアルコール成分を典型的な硫酸塩化剤さらに詳細には三酸化イオウまたはクロロスルホン酸、と反応させ、次いでアルカリ金属、アンモニウムまたはアルキル−またはヒドロキシルアルキル置換アンモニウム塩基で中和することによる既知の方法で作成できる。これらのようなアルキルおよび／またはアルケニル硫酸塩は、好ましくは本発明による洗剤中に重量比で０．１％から重量比で２０％まで、さらに好ましくは重量比で０．５％から重量比で１８％までの間の量で含まれる。
硫酸塩型の適当な表面活性剤には、上記アルコールのアルコキシル化産物、いわゆるエーテル硫酸塩が含まれる。これらのエーテル硫酸塩は、好ましくは一分子あたり２から３０、さらに好ましくは４から１０のグリコール基を有する。スルホン酸塩型の適当なアニオン系表面活性剤には、脂肪酸エステルを三酸化イオウと反応させ次いで中和することによって得られるα−スルホエステル、さらに好ましくは、Ｃ8-22さらに好ましくははＣ12-18脂肪酸およびＣ1-6好ましくはｃ1-4直鎖アルコールに由来するスルホン化産物および、formalけん化中にこれらのスルホン化産物から生じるスルホ脂肪酸が含まれる。
この他の考えられる表面活性剤成分には石鹸が含まれるが、適切な石鹸はラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸の塩など飽和脂肪酸石鹸、および例えばココナツ油、パーム種油、または獣脂の脂肪酸などのような自然の脂肪酸混合物である。重量比でその５０％から重量比で１００％が飽和Ｃ12-18脂肪酸石鹸からなり、オレイン酸石鹸が重量比で５０％以下である石鹸混合物が特に好ましい。石鹸含有量は、好ましくは重量比で０．１％から重量比で５％までである。しかし、特定の液体石鹸においては、重量比で２０％以下の石鹸を含有してもよい。
本発明による洗剤は、好ましくは重量比で２０％から重量比で５５％までの水溶性および／または非水溶性、有機および／または無機ビルダーを含有する。水溶性有機ビルダーには、特に、ポリカルボン酸のクラス、さらに詳細にはクエン酸およびsugar acidのもの、および重合（ポリ）カルボン酸のクラス、さらに詳細にはポリサッカライドの酸化により得られるポリカルボン酸塩、重合アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、および共重合体でカルボン酸基を有さない重合可能な物質がまだ少量含まれるこれらの共重合体が含まれる。遊離の酸での計算で、不飽和カルボン酸のホモ重合体の相対分子量が一般的に5,000から200,000の範囲であるのに対して、共重合体の相対分子量は2,000から200,000の範囲、好ましくは50,000から120,000である。特に好ましいアクリル／マレイン酸共重合体の相対分子量は、50,000から100,000の範囲である。適当であるが好ましさが少し劣る、このクラスの化合物は、アクリル酸またはメタクリル酸とビニルメチルエーテルなどのビニルエーテルとの共重合体、ビニルエステル、エチレン、プロピレン、およびスチレンで、ここにおいて酸が重量比で少なくとも５０％を占めている。他の適当な水溶性有機ビルダーは、二つのカルボン酸および／またはこれらの塩をモノマーとして、ビニルアルコールおよび／またはビニルアルコール誘導体または炭水化物を三番目のモノマーとして含有するterpolymerである。一つ目の酸性モノマーまたはその塩は、エチレン基をひとつ有する不飽和Ｃ3-8カルボン酸から誘導される塩で、好ましくはＣ3-4モノカルボン酸誘導体、さらに好ましくは（メタ）アクリル酸誘導体である。二つ目の酸性モノマーまたはその塩は、Ｃ4-8ジカルボン酸誘導体、好ましくはＣ4-8ジカルボン酸で、マレイン酸が特に好ましい。この場合、三つ目のモノマーユニットは、ビニルアルコールおよび／または好ましくはエステル化されたビニルアルコールにより形成される。短鎖カルボン酸、好ましくはＣ1-4カルボン酸とビニルアルコールとのエステルの形のビニルアルコール誘導体が特に好ましい。好ましいterpolymerには、重量比で６０％から重量比で９５％、さらに好ましくは重量比７０％から重量比９０％の（メタ）アクリル酸または（メタ）アクリル酸塩、さらに好ましくはアクリル酸またはアクリル酸およびマレイン酸またはマレイン酸塩、および重量比５％から重量比４０％好ましくは重量比１０％から重量比３０％のビニルアルコールおよび／または酢酸ビニルを含む。（メタ）アクリル酸または（メタ）アクリル酸塩のマレイン酸またはマレイン酸塩に対する重量比が１：１から４：１の範囲内、好ましくは２：１から３：１、さらに好ましくは２：１から２．５：１のterpolymerが最も好ましい（量も重量比もいずれも酸として）。二番目の酸性モノマーまたはその塩も、２のポジションがアルキルラジカル、好ましくはＣ1-4アルキルラジカル、または芳香族ラジカル、好ましくはベンゼンまたはベンゼン誘導体に由来するもの、で置換されたアリルスルホン酸誘導体であってもよい。好ましいterpolymerは、重量比で４０％から重量比６０％、さらに好ましくは重量比で４５％から重量比５５％までの（メタ）アクリル酸または（メタ）アクリル酸塩、さらに好ましくはアクリル酸またはア��リル酸塩と、重量比１０％から重量比３０％およびさらに好ましくは重量比１５％から重量比２５％のメタアリルスルホン酸またはメタアリルスルホン酸塩と、三つ目のモノマーとして重量比１５％から４０％さらに好ましくは重量比２０％から重量比４０％の炭水化物を含有する。この炭水化物は、例えば、モノ−、ジ−、オリゴ−またはポリサッカライド、好ましくはモノ−、ジ−、またはオリゴサッカライド、特に好ましくはシュークロースである。三つ目のモノマーを使用することで、おそらくポリマーが容易に生分解するという弱点があるであろう。これらのterpolymerは一般に、1,000から200,000、好ましくは200から50,000、さらに好ましくは3,000から10,000の範囲の相対分子量を有する。これらは、水溶液の形態、好ましくは重量比３０％から５０％の水溶液として、特に液体洗剤の生産に使用してもよい。上記のポリカルボン酸は全て、一般にその水溶性塩の形態、さらに詳細にはアルカリ金属塩の形態で使用される。
問題のタイプの有機ビルダーの含有量は、好ましくは重量比４０％未満で、さらに好ましくは重量比２５％以下、最も好ましくは重量比１％から５％である。上記の上限付近の含有量は、本発明による洗剤のペースト状または液体状、さらに好ましくは水を含んだ洗剤での使用が好ましい。
結晶またはアモルファス状のアルカリ金属alumosilicateは特に、非水溶性、水拡散性無機ビルダーとしては重量比５０％未満の量、好ましくは重量比４０％未満の量で、および液体洗剤中では重量比１％から５％の量で使用される。これらのalumosilicateのなかでも、洗剤中の結晶alumosilicateナトリウム、特にゼオライトＡ、ＰおよびＸが好ましい。上記の上限付近の量は、好ましくは固形粒子状洗剤において使用される。適当なalumosilicateは、大きさ３０μｍより大きい粒子を含まず、少なくとも重量比８０％が大きさ１０μｍより小さい粒子でなる。これらのカルシウム結合能力は、一般に１００から２００ｍｇＣａＯ／ｇの範囲にある。
上記のalumosilicateに対する適当な置換体または部分的置換体は、単体としてまたはアモルファスケイ酸塩との混合物として存在する結晶アルカリ金属ケイ酸塩である。本発明による洗剤中のビルダーとして使用するに適当なアルカリ金属ケイ酸塩は、好ましくはアルカリ金属オキシドのＳｉＯ2に対するモル比が０．９５未満および、さらに好ましくは１：１．１から１：１．２の範囲であり、アモルファスまたは結晶形態で存在する。好ましいアルカリ金属ケイ酸塩は、ケイ酸ナトリウム、さらに好ましくはアモルファスのケイ酸ナトリウムで、Ｎａ2ＯのＳｉＯ2に対するモル比が１：２から１：２．８である。こういったアモルファスのケイ酸ナトリウムは市販されており、例えばＰＯＲＴＩＬ（登録商標）などがある。Ｎａ2ＯのＳｉＯ2に対するモル比が１：１．９から１：２．８のものは、固形中で好ましく使用されるが、本発明による洗剤の製造における溶液の形態では使用されない。単体としてまたはアモルファスケイ酸塩との混合物として存在する好ましい結晶アルカリ金属ケイ酸塩は、一般式Ｎａ2ＳｉxＯ2x+1・ｙＨ2Ｏ、式中Ｘ−いわゆるモジュールーは１．９から４、ｙは０から２０の値、好ましいｘ値は２、３または４である、を有する結晶層状構造のケイ酸塩である。好ましい結晶層状構造のケイ酸塩は、一般式中のｘが２または３のものである。βおよびσジケイ酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5・ｙＨ2Ｏ）はどちらも、特に好ましい。モジュールが１．９から３．２のσジケイ酸ナトリウムは好ましい。ｘの値が１．９から２．１の上記の一般式に相当する実質的に水を含まない結晶アルカリ金属ケイ酸塩もまた、本発明の洗剤に使用することができる。本発明による洗剤の別の好ましい実施態様は、モジュールが２から３の結晶層状ケイ酸ナトリウムである。モジュールが１．９から３．５の結晶ケイ酸ナトリウムは、本発明の洗剤の別の好ましい実施態様において使用される。本発明による洗剤のアルカリ金属ケイ酸塩の含有量は、無水活性物質として、好ましくは重量比１％から重量比５０％、さらに好ましくは重量比５％から重量比３５％である。この他のビルダーとしてアルカリ金属alumosilicate、さらに詳細にはゼオライト、が存在する場合は、アルカリ金属ケイ酸塩の含有量は、無水活性物質として、重量比１％から重量比１５％、さらに好ましくは重量比２％から重量比６％である。この場合、almosilicateのケイ酸塩に対する重量比率は、無水活性物質として、好ましくは４：１から１０：１である。アモルファスおよび結晶アルカリ金属ケイ酸塩の両方を含む洗剤においては、アモルファスアルカリ金属ケイ酸塩の結晶アルカリ金属ケイ酸塩に対する重量比率は、好ましくは１：２から２：１、さらに好ましくは１：１から２：１である。
上記の無機ビルダーの他に、本発明の洗剤において他の水溶性または非水溶性の無機物質を使用することもできる。アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、およびアルカリ金属硫酸塩、およびこれらの混合物が、この場合に適当である。この他の無機物質は、重量比で７０％までの量で含有する場合があるが、好ましくは含有しないほうがよい。
重量比１％の水溶液でのｐＨ値を酸性または弱アルカリ性、特に約８．０から９．５、に任意に調整するために、本発明の洗剤には固形の無機および／または有機酸または酸性塩類、例えば硫酸水素のアルカリ金属塩、コハク酸、アジピン酸またはグルタル酸およびこれらの混合物を含有してもよい。これらのような酸性物質は、本発明による洗剤中に、好ましくは重量比５％未満の量、更に好ましくは重量比０．１％から３％までの量で含有される。
本発明による洗剤は、この他に他の典型的な洗剤成分を含有してもよい。これらの任意成分、特に例えばアミノポリカルボン酸、アミノヒドロキシポリカルボン酸、ポリリン酸、および／またはアミノポリリン酸などの重金属の錯体化剤、例えばセルロースエーテルなどの再沈着防止剤、例えばポリビニルピロリドンなどのdye transfer inhibitor、例えばorganopolysiloxaneまたはパラフィン等のfoam inhibitor、溶剤および、例えばスチルベン、ジスルホン酸誘導体などのoptical brightenerを含有してもよい。本発明による洗剤は、好ましくは重量比１％未満、より好ましくは重量比０．０１％から重量比０．５％のoptical brighterner、さらに詳細には置換4,4'-bis-（2,4,6-triamino-s-triazinyl）-stilbene-2,2'-disulfonic acidのクラスの化合物、重量比５％未満より好ましくは重量比０．１％から重量比２％の重金属の錯体化剤、より詳細にはアミノアルキレンリン酸とその塩、重量比３％未満より好ましくは重量比０．５％から重量比２％の再沈着防止剤、および重量比２％未満より好ましくは重量比０．１％から重量比１％のfoam inhibitorを含有するが、上記の重量比は洗剤を１００とするものである。
水の他に、特に本発明による液体洗剤中で使用される溶剤は、好ましくは例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール異性体などの低級アルコール、グリセロール、例えばエチレンおよびプロピレングリコールのような低級グリコール、上記化合物のクラスから誘導されるエーテル等の水混合性溶剤である。
任意で含有される典型的な酵素安定剤、さらに詳細には本発明の液体洗剤中には、例えばモノ、ジ、トリエタノールアミンおよびプロパノールアミンおよびこれらの混合物のようなアミノアルコール、低級カルボン酸、ホウ酸またはアルカリ金属ホウ酸塩、およびホウ酸／カルボン酸の組み合わせ物がある。
適当なfoam inhibitorには、長鎖の石鹸、より詳細にはbehenic soap、脂肪酸アミド、パラフィン、ワックス、微小結晶ワックス、organopolysiloxaneおよびこれらの混合物でさらにmicrofine、optically silanizedまたはその他のhydrophobicized silicaが含まれる。特に本発明の洗剤における使用においては、これらのfoam inhibitorは好ましくは顆粒状の水溶性支持剤上に沈着させる。
さらに本発明による洗剤は、再沈着防止剤を含有することもできる。再沈着防止剤の機能は、繊維から剥がされた汚れを溶液中にけん濁状態に維持し、これにより繊維の変色を防止する。適当な再沈着防止剤は、水溶性で、一般に有機コロイドで、例えば重合カルボン酸の水溶性塩、糊、ゼラチン、エーテルカルボン酸またはエーテルスルホン酸の塩、またはスターチまたはセルロースまたはセルロースまたはスターチの酸性の硫酸エステル塩がある。酸性基を有する水溶性ポリアミドもまた、この目的に適当である。可溶性スターチ調製物および上記以外のスターチ製品、例えば部分的に加水分解されたスターチなども使用できる。ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースおよびこれらの混合物も好ましく使用される。
本発明の洗剤のこの他の成分として使用できる漂白剤は、一般的に洗剤中で使用される過酸化化合物で、tetrahydrateまたはmonohydrateとして含有される過ホウ酸塩、percarbonate、perpyrophosphateおよび一般にアルカリ金属塩、さらに詳細にはナトリウム塩として存在するpersilicateがある。このような漂白剤は、本発明による洗剤中において、洗剤を１００として、好ましくは重量比２５％未満、さらに好ましくは重量比１５％未満、最も好ましくは重量比５％から重量比１５％までの量で含有される。
任意の成分としての漂白剤活性化剤には、典型的に用いられるN-アシルまたはO-アシル化合物、例えばポリアシル化アルキレンジアミン、さらに詳細にはテトラアセチルエチレンジアミン、acylated glycolurils、さらに詳細にはtetraacetylglycoluril、N-アシル化ヒダントイン、ヒドラジド、トリアゾール、ウラゾール、ジケトピペラジン、sulfurylamindeおよびcyanurate、また無水カルボン酸さらに詳細には無水フタル酸、カルボン酸エステルさらに詳細にはsodium isononanoyl phenol sulfonateおよびアシル化糖誘導体さらに詳細にはペンタアセチルグルコースがある。保存中における過酸化化合物との相互作用を起こさないために、漂白剤活性化剤はshell-forming物質で被覆するか既知の方法で顆粒化されるが、カルボキシメチルセルロースで平均粒子径０．０１ｍｍから０．８ｍｍに顆粒化されたテトラアセチルエチレンジアミン、および／または顆粒化された1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazineが特に好ましい。漂白剤活性化剤は、好ましくは本発明の洗剤中に、洗剤を１００として重量比で８％未満、さらに好ましくは重量比２％から重量比６％までの量で含有される。
プロテアーゼの他に任意で含有される酵素には、特にリピダーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼのクラスのものおよびこの混合物が含まれる。真菌や細菌株から得られる酵素が好ましく使用される。
本発明の洗剤中での使用に適当なアミラーゼには、好ましくは約ｐＨ１０未満のアルカリ領域に最適ｐＨを有する細菌または真菌から得られる酵素が含まれる。有用な市販の製品は、例えばＴＥＲＭＡＮＹＬ（登録商標）、ＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）である。本発明による洗剤中においてアミラーゼは、最終的洗剤が０．０１KVU/gから２KNU/g（Novo Companyの標準方法によるグラムあたり"Kilo Novo Unit"、１KNUはMethod in Enzymology,Vol.1,1995,page149に記載される方法で測定した場合にｐＨ５．６／摂氏３７度で５．２６９のスターチを分解する酵素量）、好ましくは０．０１５KNU/gから１．８KNU/g、さらに好ましくは０．０３KNU/gから１．６KNU/gの範囲を有するような含有量で使用される。
本発明にしたがった使用に適当なセルラーゼもまた、好ましくはほぼ中性から弱アルカリ性領域、６から９．５の最適ｐＨを有する細菌または真菌から得られる酵素に属するものである。これらは、本発明による洗剤中で、最終洗剤が０．０５IU/gから１．５IU/g（ｐＨ９．０／摂氏４０度におけるNacarboxymethyl celluloseの酵素分解に基づく１グラムあたりの"International Units"、好ましくは０．０７IU/gから１．４IU/g、さらに好ましくは０．１IU/gから１．３IU/gのセルロース分解活性を有するような量で好ましく使用される。適当な市販製品は、例えばNovo Nordiskの製品CELLUZYMETMまたは花王の製品であるＫＡＣ（登録商標）である。
粒子状の洗剤に入れた場合に、取扱いをより容易にし使用前に不活性化することを防止するために、酵素は、既知の方法で支持体上に吸着、shell-forming物質中に封入、および／または支持物質と共に顆粒化される。プロテアーゼの他に任意で含まれる酵素は、本発明による洗剤中に、洗剤を１００として好ましくは重量比２％未満、さらに好ましくは重量比０．０１％から重量比１．５％の量で含有される。
一つの好ましい実施態様において、本発明による洗剤は、粒子状で重量比で２０％から重量比５０％の無機ビルダー、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比２％から重量比１２％の水溶性有機ビルダー、重量比２．５％から重量比２０％の合成アニオン系表面活性剤、重量比１％から重量比２０％の非イオン系表面活性剤、重量比２５％未満、より詳細には重量比１％から重量比１５％の漂白剤、重量比８％未満、さらに詳細には重量比０．５％から重量比６％の漂白剤活性化剤、および重量比２０％未満さらに詳細には重量比０．１％から重量比１５％の無機塩さらに詳細にはアルカリ金属カルボン酸塩および／または硫酸塩、および重量比２％未満より詳細には重量比０．４％から重量比１．２％のプロテアーゼ以外の粒子状酵素より詳細にはリパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、オキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含む。
他の好ましい実施態様において、特に軽い汚れ用の洗剤として使用する本発明による粉末洗剤は、重量比２０％から重量比５５％の無機ビルダー、重量比１５％未満さらに詳細には重量比２％から重量比１２％の水溶性有機ビルダー、重量比４％から重量比２４％の非イオン系表面活性剤、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比１％から重量比１０％の合成アニオン系表面活性剤、重量比６５％未満さらに詳細には重量比１％から重量比３０％の無機塩さらに詳細にはアルカリ金属カルボン酸塩および／または硫酸塩を含み、漂白剤も漂白剤活性化剤も含まない。
本発明による洗剤の他の好ましい実施態様は、液体洗剤で、重量比５％から３５％の水溶性有機ビルダー、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比０．１％から重量比５％の非水溶性無機ビルダー、重量比１５％未満さらに詳細には重量比０．５％から重量比１０％の合成アニオン系表面活性剤、重量比１％から重量比２５％の非イオン系表面活性剤、重量比１５％未満、さらに詳細には重量比４％から重量比１２％の石鹸、および重量比３０％未満、さらに詳細には重量比１％から重量比２５％の水および／または水混合性溶剤、および重量比１０％未満、さらに詳細には重量比０．０１％から重量比７．５％の酵素安定化システムを含有する。上記の各好ましい実施態様のプロテアーゼは、S3T＋V4I＋A188P＋V193M＋V199I＋L211Dのアミノ酸置換を有する変異体F49である。
本発明による粒子状洗剤は、個々の粒子を標準的なミキサー、より詳細にはドラムミキサー、ローラーミキサー、リボンミキサー、またはfree-fallミキサー、で混合し、他の任意の粉末成分および、必要な場合は、特に非イオン系表面活性剤、それに染料や香料を含む液体または液化成分をスプレーすることで任意に混合できる。高温に耐えられる成分は、好ましくは水溶性slurryのスプレー乾燥による既知の方法で粉末状態の製品にされ、得られた粉末は、プロテアーゼおよび任意で他の酵素性物質および特に漂白剤など他の熱に弱い成分と混合される。個々の成分の添加は、これらを含有する顆粒またはextrudateにミキシングしておこなうことも可能であり、特に好ましくは６５０g/lから９００g/lという見かけ密度の高い本発明による洗剤の製造に特に好ましい。本発明による流体または液体洗剤は、液体状または水または定められた溶媒中の溶液の形態で存在する材料または成分を単に混合する。
実施例１
突然変異のためのＢＬＡＰ中のサイトの確認
多数の天然サブチリシンや他のプロテアーゼの洗浄力をテストした。その結果、洗浄力は、基質結合領域中における帯電アミノ酸残基の数と分布に関係があることが示された。基質結合領域において、マイナスに帯電したアミノ酸残基数が増加しているか、またはプラスに帯電したアミノ酸残基数が減少していることで洗浄力が改善されていることが認められた。したがって、本出願で特許を請求するＢＬＡＰ変異体は、基質結合領域のプラスの実効電荷（net charge）が少なく、洗浄力が改善されている。
洗浄力の改善は、結果として荷電の変化に至る、基質結合ポケット内のアミノ酸を変化させることで得た。変化は、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０またはＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１のいずれかの基質結合ポケット内に存在するアミノ酸について行った。これらの酵素の基質結合ポケットは、結合基質分子ＡＡＰＦの７Å内の領域と定義される。図１は、合成基質ＡＡＰＦと結合した野生型ＢＬＡＰの基質結合ポケットの特徴的な構造を示す。酵素に結合したＡＡＰＦは、文献に記載されておりBrookhaven Protein Bankで入手可能なサブチリシン−インヒビタ複合体の結晶学データに基づいて作成された。Ｘ線結晶学に基づくと、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０およびＢＬＡＰ変異体Ｍ１３１の基質結合ポケット内の構造は、本質的に野生型ＢＬＡＰと同一である。１．４Åレゾルーション（resolution）に対する野生型ＢＬＡＰの構造は、１９９１年５月２９日に提出された特許出願Serial No.07/706,691中に記載されており、相当する原子配位（atomic coordinates）はBrookhaven Protein Bankに寄託されている。特に、ＢＬＡＰ変異体Ｍ１３０およびＭ１３１内のポジション９９、１５４、２１１のアミノ酸変化により、酵素の洗浄力が高まることが示された。これらの部位を占める元々のアミノ酸、アルギニン９９、セリン１５４およびロイシン２１１を図１に示す。３つ全てのアミノ酸は、ＡＡＰＦの半径７Ａで特定される範囲内に存在する。
実施例２
ＢＬＡＰ遺伝子の突然変異遺伝子の作成
Ａ．変異体Ｍ１３０とＭ１３１の作成
本発明による突然変異B.lentus ＤＳＭ５４８３プロテアーゼを発現する遺伝子は、野生型のB.lentus ＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の一つまたは複数のコドンを変えることによって作成される。プロテアーゼＭ１３０は、突然変異Ｓ３Ｔ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを引き起こすことによりＢＬＡＰから得られた。プロテアーゼＭ１３１は、突然変異Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３ＭおよびＶ１９９Ｉを引き起こすことによりＢＬＡＰから得られた。Ｍ１３０およびＭ１３１プロテアーゼをコードする遺伝子は、ｐＭａｃ法を使用して作成された（Stanssens,P.,Opsomer,C.,McKeown,Y.M.,Kramer,W.,Zabeau,M.,and Fritz,H.-J.（1989）Nucleic Acids Res,17,4441-4445）。プロテアーゼＭ１３０およびＭ１３１は、１９９１年５月２９日に提出された特許出願Serial No.07/706,691に既に記載されている。プロテアーゼＭ１３０およびＭ１３１は、野生型ＢＬＡＰに比べて熱および表面活性剤に対する安定性が高くなっており、より高い洗浄力を有するプロテアーゼの開発における基礎となった。Ｍ１３０およびＭ１３１プロテアーゼ作成のためのＢＬＡＰ遺伝子の修飾に使用された遺伝子技術もまた、特許出願WO 91/02792に記載されている。本出願において、技術水準を示す目的でWO91/02792中の記載を参考として引用した。
プロテアーゼＭ１３０およびＭ１３１は、B.lentus ＤＳＭ５４８３アルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）から野生型ＢＬＡＰを成熟した形態でコードするＤＮＡの部位特異的な突然変異誘発により作成された。野生型ＢＬＡＰを成熟した形態でコードするＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＣＢ１３Ｃ（図２）を用いて作成された。プラスミドｐＣＢ１３Ｃは、B.licheniformis ＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子とB.lentus ＤＳＭ５４８３ＢＬＡＰ遺伝子からなるハイブリッドフュージョン（hybrid fusion）を含有する。特に、このハイブリッドフュージョンは、ＢＬＡＰのpre sequenceの最後の５残基とＢＬＡＰの不活性型（pro）および成熟型（mature）残基すべてをコードするＤＮＡに融合されたＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、リボソーム結合部位、および予備配列（pre sequence）の２１残基をコードするＤＮＡを含有する。このフュージョンは、Ｃ／ａｌフュージョンと呼ばれるが、これはこの制限部位（restriction site）がＡＴＣＣ５３９２６とＤＳＭ５４８３ＤＮＡの間の継ぎ目に存在するためである。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子中の予備配列およびプロ配列（pro sequence）の継ぎ目の近くに新しいＣ／ａｌ制限部位を導入する必要がある。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のＮ末端部分からの情報を含むＤＮＡフラグメンドを増幅するためには、ポリメラーゼ鎖反応（polymerase chain reaciton、PCR）を使用して、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子中にＣ／ａｌ制限部位を導入した。増幅されたフラグメントは、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼプロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、および大半の予備配列が含まれる。このフラグメントのＤＮＡ配列を図３に示す。この２９２bpのＤＮＡフラグメントは、ＡｖａＩおよびＣ／ａｌ制限部位をそれぞれ５’および３’末端に有する。ＢＬＡＰ遺伝子はすでに自然発生性のＣ／ａｌ部位を対応する位置に有していた。ＡＴＣＣ５３９２６およびＢＬＡＰ遺伝子のフュージョンのＤＮＡ配列分析の結果、予想されたＤＮＡとアミノ酸配列が確認された。
突然変異誘発を行うために、ＢＬＡＰ遺伝子を突然変異誘発ベクターｐＭａ５〜８中にサブクローンニングする。これは、ＰＣＲを使用して、Ｃ／ａｌフュージョン遺伝子とＳａ／ＩカセットとしたＡＴＣＣ５３９２６転写ターミネーターを含むＤＮＡフラグメントを合成しておこなう。ＰＣＲは、メーカー（Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT）が記載する条件を使用して実施され、ＰＣＲでは、Ｓａ／Ｉ部位を有する二つの合成オリゴヌクレオチドがプライマーとして、大腸菌ベクターｐＣＢ１３ＣＤＮＡがテンプレートとして使用される。ＰＣＲ産物をＳａ／Ｉで切断した後、このフラグメントを事前にＳａ／Ｉで切断し細菌のアリカリ性ホスファターゼで脱リン酸化された突然変異誘発プラスミドｐＭｃ５〜８中にクローンニングする。プラスミドｐＭｃ５〜８およびｐＭａ５〜８は、H.-J.Fitzから入手したもので、Stanssens,P.らによるNucleic Acids Res,17,4441-4454（1989）に記載されている。ＰＣＲフラグメントがｐＭｃ５〜８中で、どちらの方向にもクローンされるようにＳａ／Ｉ部位が選択される。ライゲーションミックス（ligation mix）を、大腸菌ＷＫ６中に取り込ませる。挿入されたＤＮＡを有するものを選択するのに、クロラムフェニコール耐性（CmR）形質転換体をスクリーニングし、正しいプラスミド構築物ｐＭｃ１３Ｃが図４に示されるように同定される。いったん遺伝子がｐＭｃ５〜８ベクター中にクローニングされ意図する部位に突然変異が確認されれば、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して公表されている修飾方法（Stanssens,P.らによるNucleic Acids Res,17,4441-4454（1989））で突然変異が導入される。導入された突然変異を含有するオリゴヌクレオチドを一本鎖の（ｓｓ）ＤＮＡのセグメント上にＢＬＡＰ遺伝子を有するギャップド・デュプレックス（gapped duplex,gd）構造とアニーリングさせる。ｐＭｃ１３Ｃからの直鎖ｓｓＤＮＡを、変成させ制限酵素で切断されたｐＭａ５〜８ＤＮＡとアニーリングすることでギャップド・デュプレックス構造を形成することができる。プラスミドｐＭａ５〜８は、活性なアンピシリン耐性遺伝子を有するが、クロラムフェニコール耐性遺伝子中に不活性化点突然変異を有し、一方でプラスミドｐＭｃ１３Ｃは、無傷のＢＬＡＰ遺伝子のほかに活性なクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するが、アンピシリン耐性遺伝子中に不活性化点突然変異を有する。アニーリングされた物質は、クローンされたＢＬＡＰ遺伝子全体をスパニング（spanning）するｓｓＤＮＡギャップ（ｇａｐ）の二重鎖のヘテロ二本鎖である。突然変異オリゴヌクレオチドは、ギャップ内の同類のｓｓＤＮＡとアニーリングすることができ、残りのギャップにはＤＮＡポリメラーゼ（Klenowフラグメント）が充填され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs Inc.,Beverly,MA[NEB]）を使用してライゲート（ligate）される。このようなシステムの突然変異誘発効果は、エキソヌクレアーゼIII（Exo III,NEB）を使用することで向上させることができる。Ｅｘｏ ＩＩＩは、３’末端から二重鎖ＤＮＡを分解（digest）するエキソデオキシリボヌクレアーゼである。遊離した３’末端を必要とするために、この酵素は閉じた環状ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡには作用しない。次いでＥｘｏ ＩＩＩによるフィル・イン（fill-in）反応の産物を処理して��完全に埋まっていないギャップを有するスピーシズ（species）を除去する。この処理は突然変異誘発効果を大きく向上させ、好ましい突然変異誘発方法である。フィル・イン反応の産物は修復機能の欠如した大腸菌株（ＷＫ６ｍｕｔＳ）に取り込ませ、アンピシリン耐性形質転換体（ＡｐR）を選別する。形質転換したヘテロ二本鎖プラスミドの複製の結果、二種類の異なる後代が得られる。一方の後代は野生型のＢＬＡＰ遺伝子と無傷のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、不活性なアンピシリン耐性遺伝子を有する。もう一方の後代は、意図する突然変異を持つＢＬＡＰ遺伝子を有し、アンピシリン耐性であるが、クロラムフェニコール耐性は有さない。
野生型のＢＬＡＰ遺伝子を有するＡｐR、ＣｍRの後代のバックグラウンド・グロウス（background growth）を完全に排除するには、ＡｐR、ＣｍR突然形質転換体をアンピシリンで選別するだけでは不十分である。したがって、ＷＫ６ｍｕｔＳ株のＡｐR形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを使用して、第二の形質転換処理を大腸菌に対しておこなう必要がある。この第二の形質転換では、ＷＫ６などの大腸菌のサプレッサー欠失（suppressor deficient）株をレシピエント細胞（recipient cells）とし、プラスミド濃度を低くして大量のレシピエント細胞を使用する。この処理で、双方の後代に由来するプラスミドＤＮＡを得るレシピエント細胞の可能性が低下する。ＡｐR形質転換体を選別し、幾つかの形質転換体からのプラスミドＤＮＡを単離し、突然変異が起こっているかどうかについてスクリーニングする。一回目の突然変異誘発処理で得られるｐＭａ突然変異体を、この変異体のｓｓＤＮＡを取り出してｐＭｃ５〜８のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、変成させたＤＮＡとアニーリングさせて、二回目の突然変異誘発に使用することができる。プラスミドｐＭｃ５〜８は、活性なクロラムフェニコール耐性遺伝子と不活性なアンピシリン耐性遺伝子を有することを除いて、ｐＭａ５〜８と同一である。一般的な方法は上記に記載されるものと同様である。プロテアーゼＭ１３０とＭ１３１をコードする遺伝子の作成は、二回の突然変異誘発が必要である。一回目の突然変異誘発でオリゴヌクレオチドに、突然変異Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉが導入される。二回目の突然変異誘発では、Ｍ１３０の場合はＳ３Ｔの突然変異を、Ｍ１３１の場合はＳ３ＴとＶ４Ｉの突然変異をオリゴヌクレオチドに導入するように設計された。これらの突然変異の発生は、全てＤＮＡ配列分析により確認された。
Ｂ．洗浄力の改善された新しいプロテアーゼをコードする遺伝子の作成
突然変異Ｒ９９Ｇ、Ｒ９９Ａ、Ｒ９９Ｓ、Ｓ１５４Ｄ、Ｓ１５４Ｅ、Ｌ２１１Ｄが、オーバーラップ・イクステンション（overlap extension）によるＰＣＲ突然変異誘発を使用して、Ｍ１３１プロテアーゼをコードする遺伝子に導入された。突然変異Ｒ９９Ｓが、overlap extensionによるＰＣＲ突然変異誘発を使用して、Ｍ１３０プロテアーゼをコードする遺伝子に導入された。作成プラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１（図５）を使用して、突然変異体Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７およびＦ４９（表２）が作成された。作成プラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３０を使用して突然変異体Ｆ１１が、作成プラスミドｐＣＢ７６Ｆ４９（新たに作成された突然変異体）を使用して突然変異体Ｆ５４とＦ５５が作成された。
0003922391.tif 000003
この手順の実施に必要な材料としては次のものが含まれる：ＡＤＮＡサーマル・サイクラ（A DNA Thermal Cycler、Perkin Elmer Cetus）、ジーンアンプキット（GeneAmp kit、Perkin Elmer Cetus）、アンプリワックス（AmpliWax、Perkin Elmer Cetus）、０．５mlポリプロピレン製無菌試験管（Perkin Elmer Cetus）、ミクロコン-100濃縮器（Microcon-100 concentrators、Amicon,Beverly,MA）、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン［Tris］、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、２ＮのＨＣｌでｐＨ８に調整）、ミニゲル電気泳動装置（Minigel electrophoresis apparatus、Hoefer Scientific,San Francisco,CA）、ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍホウ酸、２mM ＥＤＴＡ）中１％（w/v）のシーケム・アガロースゲル（Seakem agarose gel、ＦＭＣ,Rockland,ME）、水中０．５μg／ml臭化エチジウム、制限酵素Ｎｈｅｌ（ＮＥＢ）、制限酵素Ｘｂａｌ（ＮＥＢ）、および制限酵素Ｓｓｔｌ（BRL,Gaithersburg,MD）。
製造業者が規定した通りにジーンアンプキットおよびアンプリワツクスを使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、１サイクルの変性（３分、９５℃）、アニーリング（２分、５０℃）およびイクステンション（２分、７２℃）と、３０サイクルの変性（１分、９４℃）、アニーリング（１分、５０℃）およびイクステンション（１分、７２℃）を行った。７２℃で１０秒間、各サイクルを延長した。
オーバーラップ・イクステンションによる部位指定突然変異誘発については、（Ho,S.N.,Hunt,H.D.,Horton,RM.,Pullen,J.K.,and Pease,L.R.,Gene 77,51-59,1989年）に記載されている。ＢＬＡＰ突然変異体Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９の場合、突然変異誘発の第１ラウンドの鋳型として１０ngのpCB76M131プラスミドＤＮＡを使用した。ＢＬＡＰ突然変異体Ｆ１１の場合、鋳型として１０ngのpCB76M130プラスミドＤＮＡを使用し、ＢＬＡＰ突然変異体Ｆ５４およびＦ５５の場合、鋳型として１０ngのpCB76F49ＤＮＡを使用した。これらのプラスミドのpUB110型は、各プラスミドのpBC16型よりB.subtilis DB104宿主におけるプロテアーゼの収量が多いため、pUB110型を選択した。各ラウンドのＰＣＲ後、ＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動で確認し、マイクロコン-100濃縮器（Amicon）を使用して洗浄した。第２ラウンドのＰＣＲ後に、（意図した突然変異の位置によって）Ｎｈｅｌ／ＸｂａｌまたはＮｈｅｌ／Ｓｓｔｌでこのフラグメントを分解し、前述のようにB.subtilis DB104感応細胞を使用して、突然変異体Ｆ４３、Ｆ４４、Ｆ４５、Ｆ４６、Ｆ４７、Ｆ４９の場合にはpCB76M131ＤＮＡに、突然変異体Ｆ１１の場合にはpCB76M130ＤＮＡに、突然変異体Ｆ５４およびＦ５５の場合には、pCB76F49に戻してクローニングした。イオン交換ミニカラム（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）を使用してプラスミドＤＮＡ単離を遂行し、前述のようにしてサンガー（Sanger）ds DNA配列決定によって突然変異を確認した。
実施例３
突然変異体プロテアーゼ遺伝子のクローニング
Ａ．ｐＭａｃ系により産生される突然変異体プロテアーゼのクローニング
プロテアーゼＭ１３０およびプロテアーゼＭ１３１は、特定の大腸菌pMC13C誘導体ベクター由来のＭ１３０またはＭ１３１のいずれかをコードするそれぞれの遺伝子を、Baccilusで複製できるプラスミドベクターに転移することによって産生することができる。これを遂行するためには、制限エンドヌクレアーゼＡｖａｌおよびＳｓｔｌで分解することによって当該pMc13Cプラスミドから所望の突然変異体遺伝子を分離し、引き続いてプラスミドｐＨ７０（第６図）またはプラスミドｐＣ５１（第７図）のいずれかに由来する、より大きいＡｖａｌ／Ｓｓｔｌフラグメントに結合する。これらのｐＨ７０およびｐＣ５１由来のＡｖａｌ／ＳｓｔｌフラグメントはBacillusにおける複製に必要なＤＮＡ配列を含み、それぞれカナマイシン耐性（ＫｍR）かテトラサイクリイン耐性（ＴｃR）のいずれかをコードする。プラスミドｐＨ７０は、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントに担持されているＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を、ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間のＫｍRプラスミドｐＵＢ１１０にクローニングすることによって構築する。プラスミドｐＣ５１は、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに担持されているＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子を、ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間のＴｃRプラスミドｐＢＣ１６にクローニングすることによって構築する。Ｍ１３０かＭ１３１のいずれかをコードするＤＮＡフラグメントのクローニングに使用されるｐＨ７０またはｐＣ５１由来の、より大きいＡｖａｌ／Ｓｓｔｌフラグメントがまず、陰イオン交換カラム（Gen-Pak FAX、直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ、Waters,Milford,MA）を用いた高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により、他のプラスミドＤＮＡフラグメントから精製される。ＤＮＡ溶出条件は、流速０．７５ml／分で、３０分で緩衝液Ａ（１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、２ＮＨＣｌでｐＨ８．０に調整した、２５ｍＭトリス）と緩衝液Ｂ（１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１Ｍ ＮａＣｌを含み、２Ｎ ＨＣｌでｐＨ８．０に調整した、２５ｍＭトリス）各々５０％から緩衝液Ａ３０％と緩衝液Ｂ７０％までの勾配である。
結合した２つのＤＮＡをB.subtilis DB104に転換する。この菌株に存在する主アルカリ性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼをコードする遺伝子は、不活性化されている（Kawamura,FおよびDoi,R.A,J.Bacteriol.160,442-444,1984年）。これらのプラスミドによって形質転換されたB.subtilis DB104の細胞は、カナマイシンかテトラサイクリンのいずれかの存在下、栄養ミルク寒天で培養する。突然変異体プロテアーゼを製造するＤＢ１０４の形質転換細胞は、スキムミルクにおける加水分解の透明帯域の形成によって同定する。プロテアーゼ産生形質転換細胞がプラスミド由来のＭ１３０遺伝子またはＭ１３１遺伝子と希望する突然変異を担持していることの確認は、各形質転換細胞の培養由来のプラスミドＤＮＡを精製することによって遂行される。プラスミドＤＮＡを細胞蛋白質から除去し、ＳＤＳ塩沈殿に後続するＱＩＡＧＥＮイオン交換カラム（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）によるクロマトグラフィで染色体ＤＮＡを除去する。異なる形質転換細胞由来の各Ａｖａｌ／Ｓｓｔｌ分解プラスミドＤＮＡを、無傷のＢＬＡＰ遺伝子を担持することがわかっているプラスミドｐＨ７０またはプラスミドｐＣ５１のＡｖａｌ／Ｓｓｔｌ分解誘導体と比較する。適当なサイズのＡｖａｌ／Ｓｓｔｌ  ＤＮＡフラグメントを有するプラスミドを同定するために、これらのプラスミドの制限分解物をアガロースゲル電気泳動で比較する。希望する突然変異が存在することを確認するため、選択された各プラスミドＤＮＡの、予測されるＭ１３０突然変異またはＭ１３１突然変異の領域全体の配列を測定する。プラスミドｐＣ５１の誘導体（ＴｃＲ）にクローニングされた遺伝子Ｍ１３０および遺伝子Ｍ１３１は、それぞれプラスミドｐＣＢ５６Ｍ１３０およびプラスミドｐＣＢ５６Ｍ１３１と呼ばれる（第８図）が、プラスミドｐＨ７０の誘導体にクローニングされた同一遺伝子はそれぞれプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３０およびプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１と呼ばれる（第５図）。各ＢＬＡＰ突然変異の１つ以上のクローンを１５％グリセロール中、−７０℃で凍結保存し、併せてキャラクタリゼーション用の突然変異体プロテアーゼを産生するために振とうフラスコで培養する。
Ｂ．ＰＣＲオーバーラップ法により産生される突然変異体プリテアーゼのクローニング
上記の通り、増幅されたＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３０、プラスミドｐＣＢ７６Ｍ１３１またはｐＣＢ７６Ｆ４９に戻してクローニングする。B.licheniformis産生菌株に発現させる場合は、前述の通り、変更した（modified）Ｍ１３０、Ｍ１３１またはＦ４９遺伝子を担持しているＡｖａｌ／ＳｓｔｌフラグメントをｐＣ５１型ベクターに戻してクローニングする。
実施例４
突然変異体プロテアーゼの産生
野生型ＢＬＡＰ蛋白質および突然変異体蛋白質を、振とうフラスコ内の形質転換Bacillus subtilis DB 104に産生させた。ホットループ（hot loop）を使用して、凍結低温生育培養から、２０μｇ／mlのカナマイシンまたは１５μｇ／mlのテトラサイクリンのいずれかを含むＬＢスキムミルク寒天へ各突然変異体菌株を線状に接種した。プレートを３７℃で２０〜２４時間保温（incubate）した。２０μｇ／mlのカナマイシンか１５μｇ／mlのテトラサイクリンのいずれかを含むルリアブイヨン（Luria Broth、ＬＢ）約５０mlが入った２５０mlエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに、スキムミルクの加水分解の完全な帯域を形成する分離コロニー１個を採集した。このブイヨンを、ニュー・ブランスウィック・シリーズ２５インキュベータ・シェーカ（New Brunswick Series 25 Incubator Shaker）で２８０rpmで振とうしながら３７℃で７〜８時間保温した。濁った予備培養液２．５mlを、５００ml緩衝化フラスコ４本の各々に入っている、２０μｇ／mlのカナマイシンか１５μｇ／mlのテトラサイクリンを含む５０mlのＭＬＢＳＰに移すか、予備培養液５mlを、５００ml緩衝化フラスコ２本の各々に入っている抗生物質を含むＭＬＢＳＰブイヨン１００mlの接種材料として使用した（５％、ｖ／ｖ、転移）。すべてのフラスコを２４０rpm、３７℃で６４時間保温した。６４時間保温した後、各培養液について１組のフラスコの内容物を合併して５０ml遠心分離管に移し、４℃、20,000×ｇavで１５分間遠心分離した。このブイヨンを、ミラクロス（Miracloth Calbiochem Corp.,#475855）を通過させて氷上の４００mlビーカー内にろ過した。この溶液に氷酢酸を加えて、ｐＨを５．８に調整した。３０分間撹拌した後、20,000×ｇavで１５分間遠心分離して細屑を除去した。上清の体積を記録した。未変性（native）ポリアクリルアミドゲル電気泳動および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PhastSystem,Pharmacia）による分析用、ＨＰＥ法による総蛋白質分解活性の測定用、および活性部位滴定用に、部分標本１mlを取って置いた。プロテアーゼが精製できるまで、ブイヨンを氷上で保存した。長期保存または輸送するために、ブイヨンを等量のプロパン−１，２−ジオールと混合した。振とうフラスコ培養でＢＬＡＰを産生するのに使用したＭＬＢＳＰ培地の組成を表に示す。
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実施例５
ＢＬＡＰおよびその突然変異体蛋白質の精製
そうでないという記述がなければ、次のすべてのステップは、氷上または４℃で実施した。実施例３で得られたブイヨンサンプルを、０．２μｍフィルターを通過させてろ過し、ろ液を限外ろ過で濃縮した。ミニタンカセットMinitan Cassette（Millipore）または限外ろ過セル（Amicon）に取り付けた保持膜の名目上の分子量カットオフは10,000であった。その後、搬送したり長期間貯蔵したりするために、ブイヨン溶液を等量のプロパン−１，２−ジオールと混合してプロテアーゼ安定化させた。さもなければ、ｐＨ７．０（「リン酸緩衝液」）の２０ｍＭリン酸ナトリウム、または１ｍＭのＣａＣｌ2を含み、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調整した２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（「ＨＥＰＥＳ緩衝液」）で１６時間、濃縮物を透析した。透析物を遠心分離（20,000×ｇav、１０分）で清澄にし、必要に応じて、溶液のｐＨを再調整した。陰性に帯電した蛋白質を捕捉するため、リン酸緩衝液に対して透析したサンプルを、同緩衝液で予め平衡化しておいた５％（ｗ／ｖ）ＤＥＡＥセルロースで１５分間平衡化した。遠心分離またはろ過でＤＥＡＥ−セルロースを除去後、その上清を、リン酸緩衝液で予め平衡化しておいた陽イオン交換カラム（S-Sepharose Fast Flow,Pharmacia、直径１６ｍｍ、長さ９０ｍｍ、床量１８ml、流速５０ml／時）に充填した。ＨＥＰＥＳ緩衝液で透析したサンプルは、ＨＥＰＥＳ緩衝液で予め平衡化しておいた陽イオン交換カラム（S-Sepharose Fast Flow,Phrmacia、直径１５ｍｍ、長さ７５ｍｍ、床量１３ml、流速５０ml／時）に直接加えた。すべての着色副産物が溶出したら、カラムの３〜５倍量の使用緩衝液でカラムを洗浄した。１．０ＭのＮａＣｌをリン酸緩衝液に含めるか、または０．２５ＭのＮａＣｌをＨＥＰＥＳ緩衝液に含めることにより、陽イオン交換体からプロテアーゼを溶出させた。活性酵素を含む分画をプールした。
リン酸緩衝液中で精製した酵素を、セントリコン管Centricon tube（分子量カットオフ10,000、Amicon）を使用した限外ろ過により濃縮し、脱塩した。蛋白質濃度は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法、Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）で測定した。プロテアーゼを安定化させるため、５０％（ｖ／ｖ）プロパン−１，２−ジオールを貯蔵溶液に加えた。
ＨＥＰＥＳ緩衝液中で精製した酵素を含むプール分画を、５〜８倍量過剰の、−２０℃のアセトンと混合した。蛋白質を４分間沈殿させ、その混合物を6,600×ｇav.で４分間遠心分離した。上清を捨て、アセトンの大部分を除去するためにペレットを暫時真空（水分アスピレータ）に曝し、蛋白質濃度が約３０mg／mlとなるように、１ｍＭＣａＣｌ2を含み、２ＮのＮａＯＨでｐＨ５．８に調整した２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）にペレットを溶解した。エッペンドルフ遠心分離器（Eppendorf centrifuge）で、全速（13,000×ｇmax.）で３分間遠心分離して溶液を清澄にし、使用するまで凍結保存した。蛋白質濃度は、ビウレット法（Gornall,A.G.,Bardawill,C.S.,David M.M.,J.Biol.Chem..177,751-766,1948年）で測定した。
実施例６
活性プロテアーゼの測定
活性酵素濃度は、フェニルメチルフッ化スルホニルをインヒビタとして用いた活性部位滴定により測定した。プロテアーゼ溶液は、１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５中で、蛋白質測定に基づいて約１００μＭの濃度で調製した。インヒビタ濃度は、推定モル比０．２５、０．５、０．７５、１．０および１．２５と等価であった。室温で１時間、混合物を反応させた。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ法（下記参照）により、分光測光で残余酵素活性を測定した。
実施例７
蛋白質分解活性の測定
２種類の異なるプロテアーゼ分析法を使用した。ＨＰＥ法で、基質として１種類の濃度のカゼインでプロテアーゼ活性を確立した。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ分析法で、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｐ−ニトロアニリド（ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、Bachem Bioscience,Philadelphia,PA）支持触媒（supported catalysis）の初速を使用して速度パラメータＫm、ＫcatおよびＫcat／Ｋmを測定した。
Ａ．ＨＰＥ法によるプロテアーゼ活性
カゼインを基質として使用する不連続分析で蛋白質分解活性を測定した。基質溶液の最終濃度は合成水道水中、１２mg／mlのカゼイン（Hammarsten、Merck,Damstadt,#2242に従って調製）および３０mMのトリスであった。合成水道水は０．０２９％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０１４％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、および０．０２１％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ3の溶液で、その硬度は１５°ｄＨ（deutsche Harte、ドイツの硬度）であった。基質溶液を７０℃に加熱し、０．１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨを５０℃で８．５に調製した。合成水道水中２％（ｗ／ｖ）無水トリポリリン酸五ナトリウムを含むプロテアーゼ溶液を調製し、塩酸でｐＨを８．５に調整した。カゼイン基質溶液言６００μlに、酵素溶液２００μlを加えた。混合物を５０℃で１５分間、保温した６００μlの０．４４Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、３％（ｖ／ｖ）氷酢酸中の０．２２Ｍ酢酸ナトリウムを加えて反応を停止させた。氷上で１５分間冷却した後、遠心分離でＴＣＡ不溶性蛋白質を除去し、９００μlのアリコートを２ＮのＮａＯＨ３００μlと混合し、ＴＣＡ可溶性ペプチドを含むこの混合物の２９０nmにおける吸光度を記録した。ＴＣＡ溶液６００μlをカゼイン溶液６００μlに加え、続いて酵素溶液２００μlを加えて、コントロール値を求めた。
この分析条件で、２９０ｎｍで０．５００ＯＤの吸光度変化をもたらしたプロテアーゼ溶液を、ml当たり１０ＨＰＥの活性を有すると表した。ＢＬＡＰ蛋白質およびＢＬＡＰ突然変異体蛋白質のデータを以下にまとめる（表４）。
Ｂ．色素原基質ＡＡＰＦ−ｐＮＡによるプロテアーゼ分析
プロテアーゼ・サンプルを１００ｍＭトリス中５０％（ｖ／ｖ）１，２−プロパンジオールで希釈し、２ＮのＨＣｌを用いて２５℃でｐＨ８．６に調整した（トリス−プロパンジオール緩衝液）。ここで、プロテアーゼ・サンプルは室温で少なくとも６時間安定していた。１６０ｍＭのＡＡＰＦ−ｐＮＡの原液は、使用する少なくとも２４時間前に、モレキュラーシーブビーズ（Aldrich,４Å、４〜８メッシュ）で乾燥させたジメチルスルホキシドで調製した。２ＮのＨＣｌを用いて２５℃でｐＨ８．６に調製した１００ｍＭトリス中１．６mMのＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて、２５℃、総量１．０２０mlで、固定点分析を実施した。分析開始の１分前に基質を分析緩衝液に加え、比活性に応じてml当たり蛋白質が２０ng〜１．３μｇ（０．７５〜４８．５nMの酵素）の最終濃度で酵素を添加することにより反応を開始させた。４１０ｎｍでｐ−ニトロアニリドの遊離をモニタリングし、モル吸光係数８，４８０／Ｍ・cmを使用して生成産物の量および濃度を算出した（DelMar,E.G.,Largman,C.,Brodrick,J.W.,及びGeokas,M.C.,Anal Biochem.99,316-320,1979年）。
０．１６〜３．２mMの範囲の異なる１２種類のＡＡＰＦ−ｐＮＡ濃度で各々１度測定した初速から作成した速度対基質濃度プロットから速度パラメータを算出した。データを双曲線にあてはめ、プログラムENZFITTER（Leatherbarrow,R.J.（1987年）ENZFITTER,Biosoft,Cambridge,UK）を使用して、比例して重みをつけた。蛋白質濃度とプロテアーゼ酵素のモル濃度の変換を必要とするすべての計算に、名目上の分子量２６．８ｋＤａを使用した（表４）。
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実施例８
蛋白質構造確認
ＢＬＡＰに導入した突然変異は、突然変異点のすぐ隣のＤＮＡ配列分析で確認した。しかし、部位特異的変異領域外の自然突然変異が起こることは判明しており、判定された突然変異体プロテアーゼの特性が、ヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列とともに実際に存在することを実証することが肝要であった。そこで、個々のピークのアミノ酸配列分析によって確認されたＢＬＡＰのトリプシン・マップを作成し（第９図）、すべてのＢＬＡＰ蛋白質と比較した。アミノ酸残基１７個またはそれ以下であるペプチドばかりでなく、アミノ酸残基が４８個、４４個および４９個であるペプチド５Ｔ、７Ｔおよび１０Ｔ（第９図）でも、１つの（保存的（conservative）であっても）置換で分離条件での保持時間がかなり変化した。特に間一髪の危機脱出は、等量の標準（ＢＬＡＰ）と突然変異体蛋白質の共分解（co-digestion）によって解決された。
貯蔵溶液のプロテアーゼの部分標本５mgまでを２．２mlエペンドルフ管内の氷上に置き、蛋白質最終濃度３．３３mg／ｍｌ、総量１．５ml中０．１ＮのＨＣｌとなるように、０．１５ＮのＨＣｌを１．０mlおよび水（両者とも冷却した）と混合した。混合物を３０分間保温した後、冷却した５０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１６５μｌを加えて蛋白質を沈殿させた。この沈殿を氷上に５分間放置し、13,000×ｇmax（エッペンドルフ遠心分離器）で４分間遠心分離してペレット化させた。このペレットを８０％（ｖ／ｖ）アセトン１mlで１度洗浄し、真空で短時間乾燥させた。
トリプシン分解に必要なすべての試薬溶液および水は、使用する前に０．４５μｍフィルター（Ultrafree-MC,Millipore Product）を通過させた。８Ｍの尿素を含む０．８Ｍ炭酸水素アンモニウム９０μlに変性蛋白質のペレット（５mg、１８５nmol）を溶解した。この溶液を水３６０μlでゆっくり希釈し、遠心分離により０．４５μｍフィルタを通過させた。シリコン処理した０．５ml微小試験管（Phenix Res.Products）内で、後続のステップを実施した。標本３００μlのアリコートを１mMのＨＣｌ中2.5mg／mlのトリプシン１３μlと混合した（ＢＬＡＰ：トリプシンの質量比＝１００：１）。コントロール用に、蛋白質溶液１００μlを４．５μlの１mMのＨＣｌと混合した。残りの蛋白質溶液部分標本５０μlを１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５μlと混合し、出発材料のコントロールとして使用した。他の２種類の溶液を３７℃で１０分間保温した。１０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ３０μlおよび１０μlを、それぞれ分解物およびコントロールに加えて反応を停止させた。ペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣで分離した。
ＨＰＬＣ装置はWatersのもので、自動サンプラー（モデル７１５Ultra Wisp）、二重ポンプシステム（モデル６００Ｅ）および二極管配列検出器（モデル９９０）で構成されていた。サンプル採取および勾配形成は、Walterのソフトウエアプログラム「９９０+Powerline」で管理した。トリプシンペプチド類は、Ｃ18カラム（Vydacモデル２１８ＴＰ５４、４．６×２５０mm、粒子サイズ５μ、孔サイズ３００Å）で分離させた。Ｃ18保護カラム（Vydacモデル２１８ＦＳＫ１０４、粒子サイズ１０μ）は、分離カラムと一直線をなしていた。分離カラムおよび保護カラムは、３０±１℃に設定したカラムヒーター内に収容した。使用した溶媒系は、溶媒Ａ＝水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝アセトニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）ＴＦＡであった。サンプルの充填後、Ｃ18カラムを溶媒Ａで３分間展開した後、勾配を７０分で溶媒Ａ中溶媒Ｂ０％から３５％（ｖ／ｖ）にした。７０分で、勾配を１５分で１００％溶媒Ｂに上昇させ、次に１５分で１００％溶媒Ａに戻した。次に注入する前に、カラムを溶媒Ａで少なくとも２０分間平衡化した。
２１５ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の変化を記録した。分析用および予備用に分離したペプチド混合物の量は、体積５〜５０μl中に１１μｇ（０．４nmol）〜５００μｇ（１８nmol）の範囲で、２．２〜１０mg／mlの濃度範囲であった。
ペプチド配列決定のため、取り付けた記録装置で観察された吸光度の変化にしたがって、溶出液を手動分別した。β−メルカプトエタノールを用いた以前の試験では、記録時刻からシステムより溶出する時刻までの遅延時間は２秒未満であった。Speed Vac Concentrator（Savant,Hickville,NY）内で分画を１００μl未満まで真空濃縮し、最終ＴＦＡ濃度１％を達成するため、ＴＦＡ水溶液で１００μlとした。濃縮中にサンプルが完全に乾燥しないように注意した。
実施例９
界面活性剤安定性によるプロテアーゼの特性化
典型的な陰イオン洗剤としてＳＤＳを用いて、界面活性剤に対するプロテアーゼ突然変異体の安定性を試験した。１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含み、５０℃でｐＨが１０．５の５０mM炭酸ナトリウムで安定性を試験した。最終蛋白質濃度０．２５mg／mlのプロテアーゼ蛋白質を保温した。保温した混合物から部分標本を定期的に取り出し、氷上で冷却したトリス−プロパンジオール緩衝液で希釈した。基質濃度１．１mMで、ＡＡＰＦ−ｐＮＡ分析により残余プロテアーゼの活性を測定した。安定性は、時間の関数としての残余活性の片対数プロットから求めた活性の半減期（ｔ1/2）として表した。
実施例１０
プロテアーゼ突然変異体の洗浄能力
卵と煤煙（ＥＲ）で汚損した木綿の布切れ、および血液、牛乳および煤煙（ＢＭＲ）で汚損した木綿の布切れを使用し、特別に開発した試験で洗浄能力を試験した。各々明確に規定された洗剤組成物と試験プロテアーゼが入ったステンレススチール試験容器を備え付けた、Atlas洗濯器（タイプＬＰ２）で洗浄試験を実施した。
予め洗濯した木綿を、明確に規定された量の汚れで汚損し、６日間風乾させた。洗濯器のビーカを、汚損した木綿の布切れ１枚と汚損していない木綿の布切れ３枚で満たす。機械的処理のため、金属ボール（直径１０mm）を加えた。洗濯時間は３０分で、加熱４分後に、最終温度の３０℃に達した。
これらの試験用の洗濯洗剤は、ヨーロッパで使用される典型的な組成のものであった（Jakobi,G.Lohr,A.Detergents and Textile Washing,VCH,Weinheim,Germany,1987年）。取り扱いが簡単な（easy-care）着色織物用のデリケートな織物用洗剤（５〜１５％（ｗ／ｗ）陰イオン界面活性剤、１〜５％（ｗ／ｗ）非イオン界面活性剤）、強力なコンパクト洗剤（８％（ｗ／ｗ）陰イオン界面活性剤、６％（ｗ／ｗ）非イオン界面活性剤、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）および過ホウ酸塩漂白剤を含む）、および超コンパクト洗剤濃縮物（１８％（ｗ／ｗ）陰イオン界面活性剤、２．５％（ｗ／ｗ）非イオン界面活性剤、ＴＡＥＤおよび過ホウ酸塩漂白剤を含む）の濃度は、１６°ｄＨ（deutsche Harte、ドイツの硬度）の水１００ml中、それぞれ０．５ｇ、０．５ｇ、および０．４ｇであった。超コンパクト洗剤は、幾つかの特許出願（ＷＯ９１／０２０４７、ＷＯ９１／１３６７８、ＷＯ９３／０２１７６、ＷＯ９３／１５１８０、ＷＯ９４／０１５２６）に記載されている、押し出し洗剤顆粒である。全例ともｐＨは１０．４であった。洗剤グラム当たり０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００および１０００ＨＰＥの比率のＨＰＥで測定した酵素活性に基づいて、プロテアーゼを洗濯液に加えた。
洗濯後、織物を流水ですすぎ、風乾させてアイロンをかけた。Dr.Lange色差測定装置（Micro Color）で測定した４４０nm（４００nm〜５００nm）における軽減（％Ｒｅｍ）の変化（△Ｒｅｍ）によって酵素の洗浄効果を測定した。△Ｒｅｍは、プロテアーゼを添加して洗濯した後の軽減とプロテアーゼを添加せずに洗濯した後の軽減との差である。洗浄能力試験の結果を表５および表６に示す。
洗浄能力の改善は、標準△Ｒｅｍの達成に必要な野生型酵素と同じ効果を達成するために必要な突然変異体酵素の量の比率によって測定した。したがって、改善が２であるということは、野生型酵素と同じ効果を得るのに、半量の突然変異体酵素が必要なことを示す。
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0003922391.tif 000007
実施例１１
特許請求項６で定義されているプロテアーゼ突然変異体の濃縮製剤を約３０重量％、セルロースを約５重量％、サッカロースを５重量％、小麦粉を２０重量％、デンプンを３０重量％、カルボキシメチルセルロースを５重量％、およびポリエチレングリコール（分子量20,000）を５重量％混合して、酵素洗剤組成物を調製する。結果として生じる混合物を押し出し造粒によって造粒する。乾燥後、この顆粒の活性は70,000〜250,000ＨＰＥ／ｇである。ＴｉＯ2を含むポリエチレングリコール（分子量６０００）で、この顆粒をコーティングする。過ホウ酸塩／ＴＡＥＤを含む強力コンパクト洗剤（Porsil supra）１００ｇとプロテアーゼ酵素顆粒を混合すると、標準プロテアーゼ活性１２００ＨＰＥ／ｇになる。
実施例１２
プロテアーゼを特許請求項７に定義されているプロテアーゼを使用したこと以外は、実施例１１と同様にして酵素洗剤組成を調製した。
実施例１３
約１３重量％のＣ１０〜Ｃ１３直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、約５重量％のアルキルポリグリコシド（Ｃ１２〜Ｃ１４）、約１０重量％のＥＯユニットを７個有するＣ１３アルコールポリエトキシレート、約６重量％のラウリン酸、約７重量％のオレイン酸、約５重量％のトリエタノラミン、約５重量％のプロパンジオール１，２、約２重量％の水酸化ナトリウム、約１重量％のクエン酸、約７重量％のエタノール、約１重量％のヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸および水を室温で一緒に混合して液体酵素洗剤組成物を調製する。
結果として得られた溶液のｐＨは８．１である（１０％水溶液として測定した）。約０．５重量％の液体プロテアーゼ濃度（１２５０ＨＰＥ／ｇ）を有する組成物を得るために、特許請求項６に定義された十分量のプロテアーゼを加える。
実施例１４
比較のため、プロテアーゼＦ４９のＫＣ比および３種類の市販のプロテアーゼのＫＣ比を上記の方法で測定し、次の結果を得た。
プロテアーゼ ＫＣ比
MAXACAL（商標）ａ             0.92
SAVINASE（商標）ｂ            0.80
BLAP（商標）                  0.83
F49                           0.63
ａ）製造業者：オランダ、Gist Brocades
ｂ）製造業者：デンマーク、Novo Nordisk
実施例１５
蛋白質分解活性が５．６ＰＵ／mlのＦ４９−含有炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）５０mlに紡毛糸１ｇを加え、全体を室温で１時間反応させた。遊離した各アミノ酸およびペプチドの量をＴＮＢＳで測定した（コントロール測定はプロテアーゼを含まない緩衝溶液中）。以上のプロテアーゼＢＬＡＰの条件で得られた毛糸の損傷値を１００％とした。以上の条件で、プロテアーゼＦ４９の値は３１％であった。
実施例１６
絹糸１９を使用して、実施例２に記述されている試験を繰り返した。次の絹糸損傷が得られた。
プロテアーゼ              絹糸損傷
BLAP（商標）              100％
ESPERASE（商標）ａ        165％
SAVINASE（商標）ａ        89％
F49                       28％
ａ）製造業者：デンマーク、Novo Nordisk
実施例１７
MIELE（商標）Electronic W793洗濯機で、バラスト洗いの（ballast washing）木綿の洗濯物の存在下、４０℃（水の硬度１６°ｄ、液比１：１５）で９回、羊毛衣類を洗濯した（総荷重１．２kg）。無酵素有色洗剤９８ｇ（コントロール試験）、およびそれにＢＬＡＰ１４０溶液４９ml（比較試験）またはＦ４９（発明）のＰＵで表した、同等に活性な量を加えておいたものを洗浄液剤で使用した。洗濯した毛織物を乾燥させ、特定の寸法の一部分を切り取り重量を測定した。洗濯前の値の％で表した重量の減少を下表に示す。
ａ）メリノウール８０％とポリアミド２０％の混合物。
実施例１８
純毛の灰色のソックスを使用して実施例４を繰り返し、同等の活性の量のプロテアーゼ（１０８０ＰＵ／ｇの洗剤）を再度使用した。実施例４と違って、５回の洗濯を６０℃で実施した。プロテアーゼＦ４９を使用した場合、重量の減少は僅か１０．７％であり、ＢＬＡＰ（商標）を使用した場合は４０．５％であった。
実施例１９
硬度が１５°ｄＨの水（０．０５８重量％のＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２８重量％のＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏおよび０．０４２重量％のＮａＨＣＯ3を含む）に１２ｇ/lの基質（カゼインまたはケラチン）および３０mMのトリポリリン酸ナトリウムを含む溶液を７０℃に加熱し、５０℃の０．１ＮのＮａＯＨを加えてｐＨを８．５に調製した。２重量％トリポリリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で試験が行われる酵素溶液２００μlを６００μlの基質溶液に加える。反応混合物を５０℃で１５分間保温する。ＴＣＡ溶液（３体積％酢酸中０．４４Ｍのトリクロロ酢酸および０．２２Ｍの酢酸ナトリウム）５００μlを加えて反応を停止させる。ＴＣＡに不溶性の蛋白質を遠心分離で除去し、上清相９００μlを３００μlの２ＮのＮａＯＨで希釈する。この溶液の２９０ｎｍにおける吸収を、吸光スペクトルで測定する。吸光ゼロ値は、上述のＴＣＡ溶液６００μlと上述の基質溶液６００μlとを混合し、次に酵素溶液を加えて調製した遠心分離液の測定によって決定しなければならない。
実施例２０
予め洗濯した木綿織物を等量の汚れで汚損し、３日間風乾した。洗濯器（launderometer）のビーカを汚損した木綿と汚損していない木綿の布切れ６枚および金属ボール１０個（直径１cm）で満たし、選択時間は３０分で、加熱４分後に最終温度の３０℃に到達した。Atlas LP-2タイプ洗濯器で洗濯した。微細特殊（fine specialty）洗剤を、取り扱いが簡単な（easy-care）着色織物用に使用した（０．７５ｇ/１００ml）。強力なコンパクト洗剤（０．５ｇ／１００ml）および超コンパクト洗剤濃縮物（０．４ｇ／１００ml）も使用した。洗剤の組成は、「洗剤と織物の洗濯（Detergents and Textile Washing）」、G.Jacobi & A.Lohr,VCH,Weinheim,ISBN 0-89573-687-X、1987年に記述されている。使用した水は１６°ｄＨ（ドイツの硬度）で、ｐＨは４であった。洗剤の酵素活性は、０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００および１０００HPE/g洗剤であった。洗濯後、試験布切れを水道水ですすぎ、風乾し、アイロンをかけた。Dr.Lange色差測定装置Micro Colorを使用して測定した４４０nmにおける軽減（％Ｒｅｍ）の変化（△Ｒｅｍ）によって酵素の洗浄効果を測定した。△Ｒｅｍは、プロテアーゼを添加して洗濯した後の軽減とプロテアーゼを添加せずに洗濯した後の軽減との差である。種々の酵素を含む洗剤および酵素の組合せを含む洗剤組成物の洗浄能力の結果を下記の表２および表３に示す。各記載事項は、標準△Ｒｅｍを達成する突然変異体酵素の量の同じ洗浄効果を達成するための野生型酵素の量に対する比率である。改善が２であるということは、同じ洗浄効果を達成するのに特定の突然変異体の２倍の野生型酵素が必要であることを示す。データ、突然変異体Ｆ４６と突然変異体Ｆ４９の組合せを含む洗剤組成物は、個々の酵素の平均より洗浄効果が大きいことも示す。
0003922391.tif 000008
0003922391.tif 000009
実施例２１
プロテアーゼを特許請求項７に定義されているプロテアーゼと置き換えたこと以外は実施例１３に記載の組成物と同様な組成物を調製する。
配列一覧表
（１）一般情報
（i）出願人：Wilson,Charles R
（ii）発明の名称：洗浄能力が改良されたプロテアーゼ
（iii）配列数：１８
（iv）通信宛先
（Ａ）受信人：Henkel Corporation
（Ｂ）街：140 Germantown Pike,Suite 150
（Ｃ）市：Plymouth Meeting
（Ｄ）州：Pennsylvania
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：１９４６２
（ｖ）コンピュータ判読書式：
（Ａ）媒体の種類：フロッピ・ディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：Patentln Release #1.0,Verssion #1.25
（vi）現在の出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：Drach,John,E.
（Ｂ）登録番号：３２８９１
（Ｃ）参照／事件整理番号：Ｈ０５８７
（ix）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：２１５−８３２−２２１５
（Ｂ）テレファックス：２１５−９４１−６０６７
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｒ９９Ｓ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003922391.tif 000010
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003922391.tif 000011
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｒ９９Ａ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003922391.tif 000012
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｒ９９Ｓ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003922391.tif 000013
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ１５４Ｅ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003922391.tif 000014
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：６に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ１５４Ｄ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003922391.tif 000015
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：７に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株:Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、Ｌ２１１Ｄ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003922391.tif 000016
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：８に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、Ｌ２１１Ｄ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0003922391.tif 000017
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：９に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：８０７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5483
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ１５４Ｅ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９９Ｉ、Ｌ２１１Ｄ
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003922391.tif 000018
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１０に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ１１
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ１１
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003922391.tif 000019
0003922391.tif 000020
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１１に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４３
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003922391.tif 000021
0003922391.tif 000022
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１２に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４４
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0003922391.tif 000023
0003922391.tif 000024
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１３に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４５
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0003922391.tif 000025
0003922391.tif 000026
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１４に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４６
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0003922391.tif 000027
0003922391.tif 000028
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１５に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４７
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0003922391.tif 000029
0003922391.tif 000030
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１６に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ４９
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：
0003922391.tif 000031
0003922391.tif 000032
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１７に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ５４
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0003922391.tif 000033
0003922391.tif 000034
（２）配列ＩＤ  ＮＯ：１８に関する情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）分子の種類：蛋白質
（iii）仮説：無
（iv）アンチセンス：無
（vi）原始起源：
（Ａ）微生物：セリンプロテアーゼ
（Ｂ）菌株：Bacillus lentus DSM 5843
（vii）直接起源
（Ｂ）クローン：Ｆ５５
（xi）配列記述：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0003922391.tif 000035
0003922391.tif 000036
0003922391.tif 000037
0003922391.tif 000038
0003922391.tif 000039
0003922391.tif 000040
0003922391.tif 000041
0003922391.tif 000042