(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約７１ｋＤａで、Ｎ末端アミノ酸配列：Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala lys Thr Gln Phe Ile Asp を有する溶菌タンパク質。
【請求項２】
バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収し；
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収することにより得ることができる、請求項１に記載の溶菌タンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；この配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列；またはこの配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、溶菌タンパク質。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をからなる、請求項３に記載の溶菌タンパク質。
【請求項５】
バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収する工程；および
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収する工程；
を含む、請求項１から４の何れか１項に記載の溶菌タンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の溶菌タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列をからなる、請求項６又は７に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列をからなる、請求項６又は７に記載の遺伝子。
【請求項１０】
請求項６から９の何れか１項に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項１１】
ベクターが発現ベクターである請求項１０に記載の組み換えベクター。
【請求項１２】
宿主生物に請求項１０又は１１に記載の組み換えベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項１３】
宿主生物がナス科植物である、請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
宿主生物がタバコ植物である、請求項１２に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナス科青枯病（タバコ立枯病）の病原菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）を溶菌するバクテリオファージ由来のタンパク質（酵素）、これをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換体に関する。特に、本発明は、ナス科青枯病（タバコ立枯病）に対して抵抗性を付与することができるタンパク質（酵素）並びにこれをコードする遺伝子に関し、このような溶菌遺伝子を使用して農業上有用な形質転換植物を作成することができる。
【０００２】
【従来の技術】
細菌溶菌酵素として知られているリゾチームは、細菌細胞壁のムコペプチドに存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの間のβ１→４結合を加水分解する酵素である。リゾチームとしては、卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム、バクテリオファージ由来の各種リゾチーム等が知られており、幾つかでは塩基配列が解析されている。
【０００３】
例えば、卵白リゾチームは生化学的にも（Comp.Biochem.Physiol.92:523-527 (1989)、J.Phytopathology 141:159-164 (1994)）、分子生物学的にも（Appl.Microbiol.Biotechnol.39:537-540 (1993)）詳細な研究がなされている。また、バクテリオファージ由来のリゾチームとしては、大腸菌E.coliのＴ４ファージについて詳細な研究がなされている（J.Biol.Biochem. 243:391-397 (1968)、Biochimica et Biophysica, 662: 131-167 (1981)、 FEBS Letters 139:97-100 (1982)、Eur.J.Biochem. 133:717-722 (1983)、J.Virol. 54:460-466 (1985)、Mol.Gen.Genet. 202:363-367 (1986)、Biochem.Biophys.Research Communi.145:190-195 (1987)、The New Biologist 1:171-179 (1989)、J.Mol.Biol.222:67-87 (1991)）。
【０００４】
卵白リゾチーム（Plant Science 87:55-67 (1992)、Plant Science 106:55-62 (1995)）、ヒトリゾチーム（Agric.Biol.Chem. 50:713-723 (1986)、Plant Cell Report 16:674-679 (1997)）、Ｔ４リゾチーム（Plant J.3: 587-598 (1993)）の遺伝子で形質転換した植物も多数報告されている。また、ヒトラクトフェリンｃＤＮＡで形質転換した組み換えタバコはナス科青枯病（タバコ立枯病）に対して抵抗性を増強したという報告がある（Phytopathology 88:730-734 (1988)）。
【０００５】
現在までに多数のバクテリオファージ由来の細菌溶菌酵素が報告されている（J.Biol.Chem. 244:1968-1975 (1969)、J.Biochem. 89:275-284 (1981)、Current Microbiology 13:299-301 (1986)、Nucleic Acids Research 14: 10001-10008 (1986)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 955-958 (1987)、J.Bacteriology 178:1099-1104 (1996)）。しかしながら、タバコ立枯病菌に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌酵素については本発明者が知る限りこれまでには報告されていない。
【０００６】
また、ハエ由来の抗菌物質ザルコトキシンＩＡはレタス軟腐病菌、斑点細菌病、タバコ野火病菌、モモせん孔細菌病、ハクサイ軟腐病菌等に対して有効ではあるが、青枯病菌（タバコ立枯病菌）には無効である（植物防疫 50:19-22 (1996)、Plant Cell Physiol.39:57-63 (1998)）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質を精製することである。
本発明の別の目的は、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質の遺伝子をバクテリオファージのゲノムＤＮＡから単離することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、本発明による上記遺伝子を利用してナス科青枯病菌（タバコ立枯病菌）に対する抵抗性を向上させた形質転換体（特には、タバコ植物）を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、タバコ立枯病菌に寄生して溶菌しながら増殖するバクテリオファージに着眼し、そのバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質を精製し、そのゲノムＤＮＡから当該溶菌タンパク質をコードする遺伝子をクローニングして塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明の第１の側面によれば、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約７１ｋＤａで、Ｎ末端アミノ酸配列：Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp を有する溶菌タンパク質が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によれば、上記溶菌タンパク質は、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収し；
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収することにより得ることができる。
【００１２】
本発明の一態様によれば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列：この配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列；またはこの配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、溶菌タンパク質が提供される。
【００１３】
本発明の第２の側面によれば、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収する工程；および
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収する工程；
を含む、本発明の溶菌タンパク質の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明の第３の側面によれば、上記した本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
【００１５】
本発明の一態様によれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
【００１６】
本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有している。
【００１７】
本発明の第４の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターにおいて、好ましくはベクターは発現ベクターである。
【００１８】
本発明の第５の側面によれば、宿主生物に本発明の組み換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
本発明の形質転換体において、宿主生物は好ましくはナス科植物であり、特に好ましくはタバコ植物である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の形態または実施方法に関してさらに詳細に説明する。
本発明の第一の側面によれば、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質が提供される。
本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の溶菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組み換えＤＮＡから発現させた組み換えタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号２に記載の６８７個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。即ち、本発明のタンパク質は典型的には、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２１】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組み換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組み換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質は全て本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明のタンパク質は、例えば後述の実施例に従って、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収し；上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収することにより得ることができる。次いで、回収された各々のフラクションについて、溶菌活性の有無を測定することによって所望の溶菌タンパク質を含むフラクションを同定することができる。
【００２３】
本発明で使用するバクテリオファージはタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラムに寄生して溶菌酵素を産生するものであればその種類は限定されない。そのようなバクテリオファージの具体例としては、特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載されたもの（Ｐ４２８２と命名され、本明細書の以下の実施例においても使用した）が挙げられる。土壌からのバクテリオファージＰ４２８２の分離方法については、特公平４−４８７６２号公報に記載されている通りである（微生物学実験法：微生物研究法懇談会編、昭和５０年１２月講談社サイエンティフィック刊）。なお、これらの公報に記載の内容は全て本明細書中に引用される。
【００２４】
本発明で使用するタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の種類も特に限定されるものではないが、一例としては、特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００（１９８３年１２月１４日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託）を有する菌株が挙げられ、本明細書の以下の実施例でもこの菌株を使用した。なお、本菌株はその受託証においてはシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）と表示されているが、本明細書中ではタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）と表示されている。
【００２５】
あるいはまた、本発明による遺伝子を大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、本発明の溶菌タンパク質を大量に得ることもできる。
【００２６】
本明細書中に開示された本発明によるタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどの遺伝子工学的手法を用いて、他の起源などから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することは当業者の通常の知識の範囲内のことであり、そのようにして単離された遺伝子によりコードされるタンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本発明はまた、本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノミックＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
【００２８】
本発明の遺伝子は典型的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の溶菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００２９】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーションの条件は特に限定されず、目的の相同遺伝子とプローブとの相同性の度合いなどにより当業者ならば適宜選択することができるが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ［０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］、５×デンハルト（Denhardt's）溶液［１０００ｍＬ中に１ｇフィコール、１ｇポリビニルピロリドン、１ｇＢＳＡ］、０．５％ＳＤＳ、２５℃〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）；あるいは０〜５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、２５〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。ホルムアミド濃度、デンハルト溶液濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
【００３１】
上記のようなハイブリダイゼーションを使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、さ好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００３２】
本発明によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
組み換えべクターは、簡便には当業界において入手可能な組み換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。
用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322などが例示されるがこれらに限定されない。
【００３３】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、pQE-30、pQE-60、pMAL-C2、pMAL-p2、pSE420などが好ましく、酵母用発現べクターとしてpYES2（サッカロマイセス属）、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてpBacPAK8/9、pBK283、pVL1392、pBlueBac4.5などが好ましい。
【００３４】
プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Sambrook,J.ら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition)、Cold Spring Harbor Laboratory,1.53(1989)」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組み換えベクター（例えば、組み換えプラスミド）は、以下に記載するような方法で宿主細胞に導入することができる。
【００３５】
本発明の組み換えベクターを宿主細胞に導入（形質転換または形質移入）する方法としては、従来公知の方法を用いて行うことができ、例えば、「Sambrook,J.ら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition),Cold Spring Harbor Laboratory,1.74(1989)」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３６】
あるいはまた、例えば、宿主細胞が細菌（E.coil, Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168,111(1979)]やコンピテント法[J.Mol.Biol.,56,209(1971)]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1927(1978)]やリチウム法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法[Science,227,129(1985)]、エレクトロポレーション法[Nature,319,791(1986)]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology,52,456(1973)]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983)]によってそれぞれ形質転換することができる。
【００３７】
形質転換体を作成する際に使用する宿主細胞としては、本発明の組み換えべクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組み換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）などの原核細胞、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）などの単細胞性宿主を含む下等真核性細胞、カイコなどの高等真核性細胞などが挙げられる。
【００３８】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌(M15、JM109、BL21等）、酵母（INVSc1（サッカロマイセス属）、GS115、KM71（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（BmN4、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００３９】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００４０】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００４１】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAAなど）が例示される。
【００４２】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coilではブラスミドpQE30、pETまたはpCALもしくはそれらの人工的修飾物（pQE30、pETまたはpCALを適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント）が、酵母ではプラスミドpYES2もしくはpPIC9Kが、また昆虫細胞ではプラスミドpBacPAK8/9等があげられる。
【００４３】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４４】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質の耐性遺伝子などが例示される。例えば、タバコを形質転換するために使用するのに好適な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等をコードする抗生物質耐性遺伝子が挙げられ、これらの選択マーカーを利用することによって形質転換されたタバコ個体を容易に選抜することができる。
【００４５】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００４６】
本発明の遺伝子の最も重要な用途は、これを植物に導入することにより、その植物に溶菌活性を付与することである。例えば、タバコやトマト等のナス科植物に本発明の遺伝子を導入することにより、青枯病（タバコ立枯病）等に対する病害抵抗性能を付与することができる。即ち、本発明の好ましい態様によれば、バクテリオファージ由来の溶菌酵素をコードする遺伝子を植物内で転写および翻訳することができる組み換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換された形質転換植物、特に好ましくは形質転換タバコ植物が提供される。
【００４７】
本発明の形質転換された植物内で溶菌タンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが考えられるが、他のプロモーターを使用して本発明の遺伝子を発現させることもできることも明らかであり、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター以外の、構成発現または誘導発現可能な全てのプロモーターを使用することも本発明の範囲内に含まれる。特に、傷害応答性プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼプロモーターなど）は本発明の溶菌遺伝子の発現に有用である。
【００４８】
また、植物の形質転換用ベクターで使用するための各種の転写終結配列（ターミネーター）が知られている。例えば、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びＣａＭＶポリアデニル化ターミネーターは組み換えタバコ植物内での異種遺伝子の発現のために用いることができ、本発明の溶菌遺伝子の発現のために有用である。
【００４９】
外来ＤＮＡで安定的に植物を形質転換する方法としては多数の方法が報告されていて、既に公知である。その中の一つとして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いる系がある。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、Ｔ−ＤＮＡという配列を有するプラスミドを有し、かつ天然の双子葉植物（タバコを含む）の染色体に効率的な転移、組み込まれ、感染した植物に腫瘍を形成させるグラム陰性菌である。異種ＤＮＡを植物の染色体に組み込むベクター系は、植物遺伝子工学の分野では詳細に研究されており、有効なベクターが開発されている。このアグロバクテリウム法は当該技術分野では広く用いられており、本発明の実施においても使用することができる。しかしながら、本発明においては、アグロバクテリウム法以外の方法、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等によっても植物を形質転換することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００５０】
【実施例】
実施例１：バクテリオファージ由来の溶菌遺伝子の単離
（ａ）タバコ立枯病菌に寄生するバクテリオファージの溶菌酵素の精製
タバコ立枯病菌Ｍ４Ｓ株に寄生し、これを溶菌しながら増殖するバクテリオファージＰ４２８２（特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載されたもの）を供試して溶菌酵素の単離および精製を行った。ＣＰＧ液体培地（１％グルコース、１％ポリペプトン、０．１％カザミノ酸）にＭ４Ｓ菌（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００）を接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。遠心集菌後、少量のＣＰＧ液体培地に懸濁して、４０００ｍｌのＣＰＧ液体培地の入ったジャーファメンターに３×１０8細胞／ｍｌになるように接種した。さらに接種の１及び８分後に、Ｐ４２８２ファージ液をそれぞれ１５×１０8ｐｆｕ／ｍｌずつ添加し、２８℃、１００ｒｐｍで２．５時間培養した。
【００５１】
次に、Ｐ４２８２が寄生したＭ４Ｓ菌を遠心集菌後、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ硫酸マグネシウム）に懸濁し、終濃度５０μｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ、０．２％クロロホルムを添加して４℃で一晩静置した。遠心後、上清に硫酸アンモニウムを加え４０％飽和度として４℃で１時間以上攪拌した。４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心することにより４０％飽和度の硫酸アンモニウム画分を沈殿物として得た。上清は硫酸アンモニウムの濃度を４０％飽和度から８０％飽和度まで増大させた。同様に遠心して４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分を得、上清は破棄した。各沈殿は少量の緩衝液Ａに溶解し、セファデックスＧ−１００（ファルマシア）カラムに供して脱塩した。０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、および４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分について以下に記載する溶菌活性測定を行った結果、０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分に活性が認められた（図１を参照）。
【００５２】
次いで、この画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（YMC-Pack Diol-300、500×8.0 mm）に供した。溶媒は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用い、流速は０．７ｍｌ／分で行った。タンパク質の溶出に対応するピークを示す全部で６個のフラクションを分取した後（図２を参照）、各々のフラクションについて下記に記載する溶菌活性測定を行った結果、第４フラクションに活性が認められた（図１中の抽出タンパク質の結果を参照）。
【００５３】
溶菌活性はＭ４Ｓ菌体の濁度減少を光学的に測定した。具体的には改変Ｍ９培地（リン酸水素二ナトリウム０．６ｇ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ、塩化ナトリウム０．０５ｇ、塩化アンモニウム０．１ｇ、２５％グルコース１２ｍｌ、１Ｍ硫酸マグネシウム１ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩０．５ｍｌ、１００ｍＭ塩化カルシウム１ｍｌ、蒸留水９８５．５ｍｌ）で培養したＭ４Ｓ菌を集菌後、クロロホルムで飽和した緩衝液Ｂ（６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に懸濁し、クロロホルムを除去するために緩衝液Ｂで３回遠心洗浄した。菌体を緩衝液Ｂで懸濁して吸光度０．５〜０．６（波長６００ｎｍ）に調整した。菌液１ｍｌと上記酵素液５０μｌを混合して吸光度を測定後、３７℃に１０分間静置して、再度、吸光度を測定して濁度減少を算出した。
【００５４】
活性が認められたゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの第４フラクションを含む精製の各段階の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した（Nature 227: 680-685 (1970)）。泳動後、タンパク質バンドをＰＶＤＦ膜（アトー）上にエレクトロブロットし、次いで０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０、５０％メタノール、１０％酢酸で染色した。得られた結果を図３に示す。第４フラクションは約７１ｋＤａにバンドを示した。このバンドを切り取り、気相プロテインシークエンサーでＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp（配列番号３）の１３残基のアミノ酸が同定された。
【００５５】
（ｂ）サザンハイブリダイゼーションによる溶菌酵素をコードする遺伝子の単離決定した溶菌酵素のＮ末端アミノ酸配列の情報を利用してプローブを作製してファージＰ４２８２ＤＮＡから溶菌遺伝子を単離した。具体的には、溶菌酵素のアミノ酸配列と既知のコドン表とを比較してaaracncart tyathga（配列番号４、配列表フリーテキスト：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを示す）およびgaraaygcna aracnca（配列番号５、配列表フリーテキスト：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを示す）の２種類のプローブを合成した。プローブは５’末端を非放射性のビオチンで標識した。
公知の手法により抽出したファージＰ４２８２ゲノムＤＮＡ（約３９ｋｂｐ）をＳａｌＩ＋ＳｃａＩ、ＳａｌＩ＋ＳｃａＩ＋ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩの各制限酵素でそれぞれ消化して、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、ＤＮＡバンドをナイロン膜（Hybond-N+、アマーシャム）に転写後、上記した配列番号４および５の２種類のプローブを用いてそれぞれ３７℃でサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションには、PolarPlex サザン＆ノーザンキット（日本ミリポアリミテッド）を用い、メーカー指定のプロトコールに従った。即ち、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの組成のハイブリダイゼーション液を使用して３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションした後、プローブを２０ｎｇ／ｍｌになるように添加して３７℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ナイロン膜の洗浄は、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））、０．１％ＳＤＳで室温で１０分間３回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ３７℃で１５分間２回行った。Ｘ線フィルムへは約２０分間露光した。その結果を図４に示す。Ｐ４２８２ＤＮＡ全体の制限酵素地図と比較したところ、２種類のプローブとそれぞれハイブリダイズしたＤＮＡ断片は、ＳｃａＩ−ＢａｍＨＩの３．６ｋｂ断片であることが判明した。
【００５６】
（ｃ）溶菌遺伝子の塩基配列の決定
サザンハイブリダイゼーションで検出されたＳｃａＩ−ＢａｍＨＩの３．６ｋｂのバンドを数種の制限酵素で適当に消化後、得られたＤＮＡ断片を市販の大腸菌用プラスミドベクターpBluescript II SK-（東洋紡）にクローニングして、これをＤＮＡシークエンサーに供して塩基配列を決定した。その結果、配列番号１に示す全塩基配列が決定された。溶菌遺伝子のオープンリーディングフレームは全長２０６１ｂｐで６８７アミノ酸をコードしていることが判明し、その推定分子量は約７０．２ｋＤａであった。上記の（ａ）で解析されたＮ末端の１３アミノ酸配列と塩基配列から推定されるＮ末端アミノ酸配列とは完全に一致し、またＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果（約７１ｋＤａ）と推定分子量（７０．２ｋＤａ）は非常に近い値であったことから、単離された溶菌遺伝子は溶菌タンパク質をコードしていることが判明した。また、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡによるホモロジー検索の結果、全体的に相同性の高いタンパク質は見出されなかった。
【００５７】
実施例２：大腸菌（E.coli）による溶菌酵素の生成
（ａ）溶菌遺伝子のＰＣＲ法による増幅
全長の溶菌遺伝子を発現ベクターに挿入して、大腸菌（E.coli）を形質転換することにより溶菌酵素を生成させた。具体的には以下の通り行った。
先ず、配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、gaccaccatg gaattgctgc（配列番号６）およびtcaggatccc ccttatggtt（配列番号７）の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ＰＣＲ反応は、TaKaRa Ex TaqTM（宝酒造）を用いた。鋳型ＤＮＡとしてファージＰ４２８２ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌをＰＣＲ反応液（０．０５Ｕ／μｌのTaKaRa Ex TaqTM、１０×Ex TaqTMBuffer、終濃度各０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ混合物４８μｌ）に添加し、次いで配列番号６および７の一対の合成プライマー（終濃度０．１μＭ）を各０．５μｌずつ加え、ＰＣＲ反応を行った。
【００５８】
反応は，９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒、５５℃で１分間そして７２℃で１分間を３０サイクル；７２℃で１０分間を１サイクル行った。ＰＣＲ反応により増幅された遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動の結果、予想された長さ（２．０６ｋｂ）と一致していた。この遺伝子断片をGENECLEAN II キット（フナコシ）で精製した。
【００５９】
（ｂ）発現ベクターへの溶菌遺伝子の挿入と大腸菌（E.coli）の形質転換
ＰＣＲ反応により増幅した遺伝子断片をNcoI、BamHIで消化し、これを市販の発現ベクターpTrc99A（ファルマシア）のNcoI、BamHIサイトに挿入した。ライゲーションにはＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用い、１６℃で一晩行った。この反応液１０μｌを大腸菌ＮＭ５２２株（ファルマシア）コンピテントセル１００μｌに加えて形質転換した。具体的には、３０分間氷上に静置した後、４２℃で４５秒間熱処理を行い、再度氷上に２分間静置した。この菌液に０．９ｍｌのＳＯＣ培地（２％ Bacto-Tryptone、０．５％ Yeast Extract、０．０５％ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃で１時間激しく振盪培養した後、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ Bacto-Tryptone、１％ Yeast Extract、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）にプレーティングした。出現したコロニーを幾つか拾い、２ｍｌのＬＢ液体培地で培養してアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出して、目的の溶菌遺伝子を有するプラスミドを含むコロニーを選抜した。
【００６０】
（ｃ）形質転換した大腸菌により生成された溶菌酵素による立枯病菌溶菌活性
上記（ｂ）で選抜した溶菌遺伝子を有する形質転換大腸菌を、５０ｐｐｍアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、２５℃で５〜６時間培養した。これに終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、２５℃で３時間誘導培養した。菌体を遠心集菌し、１０ｍｌショ糖緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％ショ糖）に懸濁した。氷上に１０分間静置した後、遠心して得られた菌体を５ｍｌの５ｍＭ塩化マグネシウムに再懸濁した。さらに氷上で１０分間静置した後、再度遠心集菌した。得られた沈殿を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して、菌体を氷中で超音波破砕（３０秒、４回）した。これを遠心して可溶性タンパク質画分の上清を得た。立枯病菌に対する溶菌活性測定は実施例１（ａ）と同様に行った。その結果、表１に示すように立枯病菌溶菌活性が認められた。
【００６１】
表１：形質転換大腸菌が生産する溶菌酵素による立枯病菌溶菌活性
処理区                          濁度減少活性（Ｕ／分・ｍｇタンパク質）
プラスミドベクター(非誘導時)          ０．２１５±０．３７２
プラスミドベクター(誘導時)            ０．９１４±０．８８７
溶菌遺伝子挿入ベクター(非誘導時)      ６．３１２±２．０７２
溶菌遺伝子挿入ベクター(誘導時)      ２５．６６９±２．３０１ 
【００６２】
実施例３：タバコ立枯病菌のファージにおけるＰ４２８２溶菌遺伝子の相同性
ファージＰ４２８２の溶菌遺伝子が他の立枯病菌ファージに保存されているかどうかを検討するために、溶菌遺伝子をプローブとして全国のタバコ畑から分離したファージＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション法で解析した。
（ａ）プローブの作製
実施例２（ａ）に準じてＰＣＲ反応で増幅した溶菌遺伝子断片（２．０６ｋｂｐ）をPolarPlexビオチンラベルサブキット（日本ミリポアリミテッド）に従い、ビオチン標識した。即ち、溶菌遺伝子断片１μｇを熱変性し、ラベリングミックス（終濃度２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．６）、２．５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ビオチンランダムプライマー６０ ＯＤ／ｍｌ）、０．１ｍＭ ｄＮＴＰミックス、５Ｕ Klenowポリメラーゼを加え、３７℃で２０時間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止した後、エタノール沈殿を行い、ビオチン標識プローブを約９００ｎｇ得た。
【００６３】
（ｂ）サザンハイブリダイゼーション
全国のタバコ畑の土壌から公知の手法により立枯病菌ファージを単離した。単離および供試したファージは、ｓｐ７（京都府竹野郡丹波町）、ｓｐ１１（佐賀県唐津市）、ｓｐ２７（岡山県浅口郡）、ｓｐ６２（広島県神石郡）、ｓｐ６３（山口県阿武郡）、ｓｐ７２（高知県中村市）、ｓｐ７５（島根県安来市）、新潟（新潟県長岡市）、青森（青森県南郷村）、平良（沖縄県平良市）および大越（福島県田村郡大越）の１１株であった。なおＰ４２８２株は栃木県小山市で採取されたものである。
【００６４】
それぞれのファージから公知の方法でＤＮＡを抽出し、EcoRIで消化した。プローブにはファージＰ４２８２のビオチン標識溶菌遺伝子を用い、温度以外は実施例１（ｂ）と同じハイブリダイゼーション条件を使用してそれぞれのファージ中の相同遺伝子の同定を行った。即ち、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの組成のハイブリダイゼーション液を使用して６８℃で１時間プレハイブリダイゼーションした後、プローブを２０ｎｇ／ｍｌになるように添加して６８℃で一晩ハイブリダイゼーションした。得られた結果を図５に示す。図５から分かるように、新潟、青森、平良、福島県大越の各ファージＤＮＡとは非常に強いシグナルが、そしてｓｐ６３ＤＮＡとは弱いシグナルが検出された。他のファージＤＮＡとはハイブリダイゼーションのシグナルが検出されなかった。以上の結果から、Ｐ４２８２の溶菌遺伝子と相同性のある塩基配列を有する立枯病菌ファージが全国に分布して存在していることが判明した。
【００６５】
【発明の効果】
本発明により提供されるバクテリオファージ由来のタンパク質は、タバコ立枯病菌を溶菌させる活性を有するので、植物にタバコ立枯病に対する抵抗性を付与することができ農業上有用である。本発明により提供される上記タンパク質をコードする遺伝子は、当該タンパク質を発現させるために使用することができ、当該タンパク質の大量生産のために有用である。また、本発明の遺伝子を植物（特には、タバコ植物）内に形質転換することによって、タバコ立枯病に対する抵抗性が向上した形質転換植物、特に形質転換タバコ植物を作成することができる。
【００６６】
【配列表】
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【００６７】
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0003935279.tif 000004
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は溶菌酵素精製の各段階におけるＭ４Ｓ菌体に対する溶菌活性を示す。Ｍ４Ｓは立枯病菌Ｍ４Ｓ菌体から抽出した全タンパク質、Ｍ４ＳとＰ４２８２の混合培養液はＭ４Ｓ菌とファージＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質、硫安０〜４０％はＭ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、硫安４０〜８０％はその４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分、抽出タンパク質はゲル濾過高速液体クロマトグラフィーより分画したもの（第４フラクション）である。
【図２】図２は、Ｍ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供して得られた各フラクションのピークを示す図である。
【図３】図３は、溶菌酵素精製の各段階における銀染色１３．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。レーン１は分子量基準タンパク質（マーカー）、レーン２はＭ４Ｓ菌から抽出した全タンパク質、レーン３はＭ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、レーン４と５はゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの２つのメインピーク、レーン６は非変性ポリアクリルアミドゲルの活性バンドから抽出したものを示す。
【図４】図４は、溶菌酵素のＮ末端アミノ酸配列より合成した２つのオリゴヌクレオチドプローブによるサザンハイブリダイゼーションのＸ線フィルム像である。Ａは配列番号４の合成ＤＮＡ、Ｂは配列番号５の合成ＤＮＡをプローブとして使用して得られた結果であり、レーン１はＰ４２８２ＤＮＡのScaI＋SalI消化断片、レーン２はＰ４２８２ＤＮＡのScaI＋SalI＋BamHI消化断片、レーン３はＰ４２８２ＤＮＡのEcoRI消化断片、レーン４はＰ４２８２ＤＮＡのPstI消化断片、レーン５はＭ４Ｓ菌ＤＮＡのEcoRI消化断片、レーン６はＭ４Ｓ菌ＤＮＡのPstI消化断片を示す。
【図５】図５は、Ｐ４２８２株の溶菌遺伝子をプローブとした各種ファージＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションのＸ線フィルム像である。レーン１〜７は順にファージｓｐ７、ｓｐ１１、ｓｐ６２、ｓｐ２７、ｓｐ６３、ｓｐ７２およびｓｐ７５を泳動したものであり、レーン８〜１１は順に新潟、青森、福島県大越および平良から分離したファージＤＮＡを泳動したものであり、レーン１２はＰ４２８２株のＤＮＡを泳動したものであり、レーン１３はＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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