(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境試料の土壌試料に減菌水を試料重量の１〜１００倍量添加し、微生物が資化し易い石油系炭化水素を濃度が５０〜５０００ｇ／Ｌになるように添加するとともに、微生物群集の形成を促進する物質として窒素源を濃度１〜２００ｍｇ−Ｎ／Ｌ、及びリン源を濃度０．２〜５０ｍｇ−Ｐ／Ｌになるように添加して、攪拌強度を３０〜３００ｒｐｍに保持して攪拌培養を行い、環境試料中に存在する石油系炭化水素の分解に応じた微生物群集を形成させ、該環境試料に形成された微生物群集内の石油分解微生物由来の遺伝子を検出することを特徴とする環境試料の石油分解能力予測法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、石油類に汚染された土壌、河川水、地下水などの微生物浄化（バイオレメディエーション）において、汚染環境試料の有する石油分解能力の予測法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油類による環境汚染は、船舶事故等による原油あるいは燃料油の流出による広域の海洋汚染が良く知られているが、陸上においてもパイプラインの破損や貯蔵タンクからの漏洩、汚染廃水の排出等により土壊、河川水、地下水などが汚染された例が数多く報告されている。諸外国では石油汚染が土壌・地下水汚染の大きな原因となっており、アメリカでは有機化合物による土壌・地下水汚染の約８０％が石油由来のものであることが報告されている（日本地盤環境浄化推進協議会監修：土壌・地下水汚染の実態とその対策、オーム社出版、ｐ．２８、２０００）。
【０００３】
近年、種々の有害物質による土壌、河川水、地下水などの環境汚染を浄化する技術が開発されてきた。微生物による浄化法では分解できる物質の種類や濃度が限定されるものの、常温・常圧の穏やかな条件下で、対象汚染物質を無害な化合物にまで分解できるため、他の物理化学的な浄化法と比較して低コストで環境に優しい浄化方法として注目されている。
【０００４】
微生物による浄化法としては浄化対象の環境中に存在している土着の微生物群を利用する方法（バイオスティミュレーション）が用いられるが、土着の微生物群のなかに汚染物質分解菌が存在しない場合は、分解菌を添加する方法（バイオオーグメンテーション）が用いられる。微生物による浄化法を適用する際には、対象とする汚染環境中から土壌や水などの試料を採取し、土着の微生物を利用するバイオスティミュレーションを前提とした分解実験（トリータビリティ試験）を行う。すなわち、採取した環境試料に適正量の栄養塩類や必要に応じて炭素源を添加し、実際の施工時に近い環境条件で培養し、土着微生物群による汚染物質の分解性を確認するものであるが、石油系の物質は、難分解性物質であるため、そのトリータビリティ試験に５から６週間以上あるいは数ヶ月を要していた。
【０００５】
さらに、石油類はその構成成分が多岐にわたり（Wang, Z., M. Fingas, and L. Ken: J. Chromatogr. Sci., 32, 367, 1994）、その組成は汚染サイトによって大きく異なることが特徴である。つまり、調査対象の試料に含まれる石油成分や濃度が一定でないため、石油分解細菌が利用可能な石油成分が十分含まれない場合があり、例え浄化対象の試料中に石油構成成分を資化できる石油分解微生物が存在する場合でも、試料の土着微生物の石油分解能が低いと誤認する場合があった。また、環境試料が石油系炭化水素以外の易微生物分解性有機物を多く含む場合もある。このような場合、試験対象の環境サンプルに微生物の増殖に必要な、窒素源、リン源を加えて培養を行っても、必ずしも石油汚染の浄化に有用な微生物を増殖させられないため、最適な施工法の選択が困難であった。さらに、試料中に有用な土着分解微生物が存在しない場合には、その分解能の判定に長期間を要することは言うまでもない。
【０００６】
近年、分子生物学的な解析手法の発達により、環境試料中の遺伝子を調べることにより、短時間で環境試料中の微生物群集構造を把握する方法が開発されてきた（Amann, R.I., Ludwig, W., and Schleifer, K.H.(1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ,Microbiol Rev. 59: 143-169）。しかしながら、前述のように石油構成成分が多岐に渡っているため、石油分解微生物群集においては個々の石油構成成分に対応する分解微生物の割合が小さいうえに多種類にわたる可能性が高く、その検出能の限界ゆえ、遺伝子解析によっても必ずしも検出できるとは限らないという問題があった(Kasai、Y., Kishira, H., Syutsubo, K., and Harayama, S., Molecular detection of marine bacterial populations on beaches contaminated by the Nakhodka tanker oil-spill accident.. Environ Microbiol vol.3 (4), 246〜255、2001)。また、様々な有機物を多く含む土壌などの環境試料の場合、土着の細菌数は１０8／ｇから１０10／ｇ程度と非常に多いため（Bitton, G. and Gerba, C.P.: Groundwater Pollution Microbiology, John Wiley & Sons, New York, p.23, 1984）、石油分解に関与しない土着の細菌数が少ない試料と比較して、石油分解微生物由来の遺伝子の検出は更に困難である。
【０００７】
石油汚染試料（土壌）に窒素、リンを加えた培養体を作成し、その試料中に存在する微生物群集の遺伝子を解析することで、石油分解に関与する微生物を同定しようとする試みも行なわれている（高畑陽、大場美保、鈴木朝香、帆秋利洋、ＤＧＧＥ法による石油汚染土壌中の菌相解析、日本水環境学会年会講演集、１９９９、ｐ４１２）。しかしながら、既存技術では、試料（土壌）に予め含まれる石油成分を石油分解微生物の炭素源として用いるために、試料によっては、含まれる石油の構成成分と濃度が異なり、必ずしも石油分解微生物の増殖を促進するために十分な質と量の石油系炭化水素を供給できるとは限らなかった。その結果、環境試料に含まれる易分解性の有機物を資化する細菌が優占的に増殖してしまい、石油分解微生物由来の遺伝子の存在量が、相対的に分子生物学的な手法による検出限界以下程度までしか維持できず、試料中の石油分解微生物の存在を確認することが難しかった。また、前述したように石油の構成成分は多岐に渡っており、成分によって分解できる微生物群が異なる。既存技術では、試料によって石油汚染の状況、換言すれば石油系炭化水素の組成や濃度が大きく異なるため、微生物群集構造解析の結果、同定された微生物が、どの石油構成成分を資化するのかを判定することが困難であった。
【０００８】
さらに、石油系炭化水素は、殆どが非水溶性の物質で構成されているため、石油分解微生物の増殖促進のためには、試料中に存在する石油分解微生物と石油の接触効率を高めることが必要である。既存技術では、土壌に少量の水分（５％（ｗ／ｗ））を加え、１日に１回程度の手動による攪拌を行うのみであり、試料（土壌）内に存在する石油と分解微生物との接触が不十分であり、石油分解微生物の増殖促進効果が著しく低かった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
石油によって汚染された土壌、河川水、地下水等の環境試料中に存在する石油分解微生物の増殖を高度に促進させ、得られた石油分解集積培養体に存在する石油分解微生物由来の遺伝子を解析、検出することで、石油汚染が起こった際の環境試料土着の微生物による石油汚染浄化能を短期間で予測することが出来る。
本発明の目的は、環境試料中に存在する微生物を起源とした高度石油分解集積培養体を迅速に作成し、石油分解微生物由来の遺伝子を解析、検出することで、環境試料の石油分解能力の予測の手段を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、環境試料中の石油分解微生物を迅速に培養促進可能な培養条件、および試料の石油分解能と集積培養体に存在する石油分解微生物由来の遺伝子との関連を明らかにし、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下記の手段によって上記課題を解決した。
（１）環境試料の土壌試料に減菌水を試料重量の１〜１００倍量添加し、微生物が資化し易い石油系炭化水素を濃度が５０〜５０００ｇ／Ｌになるように添加するとともに、微生物群集の形成を促進する物質として窒素源を濃度１〜２００ｍｇ−Ｎ／Ｌ、及びリン源を濃度０．２〜５０ｍｇ−Ｐ／Ｌになるように添加して、攪拌強度を３０〜３００ｒｐｍに保持して攪拌培養を行い、環境試料中に存在する石油系炭化水素の分解に応じた微生物群集を形成させ、該環境試料に形成された微生物群集内の石油分解微生物由来の遺伝子を検出することを特徴とする環境試料の石油分解能力予測法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の環境試料の石油分解能力予測法は、環境試料に窒素源、リン源あるいは石油系炭化水素を添加して石油分解集積培養体を作成し、その試料中石油分解微生物由来の遺伝子を検出することを特徴とするものである。以下に本発明の実施の形態について詳しく述べる。
【００１２】
環境試料中で石油系炭化水素汚染に応じて形成される微生物群集を得るためには、当該環境試料が、予め石油類で汚染された不飽和土壌の場合のように、単に水を添加して培養するだけでよい場合もあるが、一般的には微生物の増殖を促進させるために水のほかに窒素源、リン源、を添加して好気条件下で培養する。また、石油汚染されていない或いは石油汚染濃度の低い試料や、石油系炭化水素以外の有機物を多量に含む試料については、石油系の炭化水素の添加も行うことが望ましい。
【００１３】
石油分解微生物の増殖促進のために、調査対象試料が不飽和土壌などの含水率が低いサンプルである場合、適切量の水分を添加することが望ましい。水分は、少なくとも試料が飽和状態になるように添加し、添加量としては、試料の重量の０．５〜１０００倍量を添加するのが好ましく、試料重量の１〜１００倍量を添加するのが更に好ましい。当該環境試料が河川水、地下水等のように水分が十分にある場合は、あえて水を添加する必要はない。添加する水は、試料の遺伝子解析に影響を及ぼさない様に滅菌水を用いることが望ましい。
また、酸素供給不足の防止、土着微生物と石油系炭化水素の接触効率の向上、換言すれば石油分解微生物の増殖促進のために、振とう培養、旋回培養あるいはこれに准ずる方法で攪拌培養を行なうことが好ましい。攪拌の強度としては、３０〜３００ｒｐｍとするのが好ましく、１００〜２００ｒｐｍとするのが更に好ましい。
培養期間としては、３から３０日間、好ましくは７から１４日間とし、また、培養の温度としては、１０℃から４０℃が好ましく、１５℃から３５℃に設定するのが更に好ましい。
また、試料のｐＨが中性域でない場合、振とう培養を行う際にｐＨを中性域に調節することが望ましい。
【００１４】
添加する窒素源としては、無機性の窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸第一鉄アンモニウムなどを使用することが望ましいが、その他の無機アンモニウム化合物を利用しても良い。また、イソブチルアルデヒド縮合尿素、ホルムアルデヒド加工尿素などを含有する農業用の肥料を用いても良い。堆肥、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の有機性の窒素源を使用することも出来るが、それらに含まれる有機物を炭素源として利用する微生物が増殖することが考えられるため、実際の使用に当たっては無機性の窒素源を用いることが望ましい。窒素源の添加量は、汚染物質である石油系炭化水素の炭素源濃度に依存するが、その濃度が０．１〜１０００ｍｇ−Ｎ／Ｌになるように添加するのが好ましく、１〜２００ｍｇ−Ｎ／Ｌになるように添加するのが更に好ましい。
【００１５】
添加するリン源としては、無機性のリン化合物、例えばリン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸アンモニウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなど使用することが望ましいが、その他の無機リン酸化合物を利用しても良い。また、リン酸二石灰、リン酸苦土（リン酸マグネシア）などを含有する農業用の肥料を用いても良い。堆肥、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の有機性のリン源を使用することも出来るが、実際の使用に当たっては無機性のリン源を用いることが望ましい。リン源の添加量は、その濃度が０．１〜１０００ｍｇ−Ｐ／Ｌになるように添加するのが好ましく、０．２〜５０ｍｇ−Ｐ／Ｌになるように添加するのが更に好ましい。
【００１６】
添加する石油系炭化水素としては、石油の主成分であるアルカンや多環芳香族炭化水素を用いることが好ましい。アルカンや多環芳香族炭化水素を単独で添加しても良いし、複数の化合物を同時に添加しても良い。また、複数のアルカンや多環芳香族炭化水素を多く含む原油、重油、あるいは脂肪族炭化水素を中心とした軽質分を加熱除去した原油（weathered crude oil、以下ｗ．ｏｉｌと示す）、更に原油を薄層クロマトなどにより分画した飽和画分、芳香族画分なども用いることができる。また複数のアルカン類を多く含むガソリン、軽油、灯油を添加しても良い。
【００１７】
しかしながら、アルカン、多環芳香族炭化水素などの複合物である原油、ｗ．ｏｉｌなどを環境試料に添加した場合、易分解性のアルカンを分解する微生物の増殖が極めて速く、結果的に多環芳香族炭化水素分解菌の増殖が抑制される場合がある（珠坪一晃、瀧寛則、原山重明、流出油の微生物分解に及ぼす無機栄養塩濃度の影響、日本水環境学会年会講演集、２０００、ｐ．５３３）。この場合、多環芳香族炭化水素のみを炭素源として添加する培養系を別途作成することが望ましい。これらの石油系炭化水素の添加量は、その濃度が１０〜１０，０００ｍｇ／Ｌになるように添加するのが好ましく、５０〜５，０００ｍｇ／Ｌになるように添加するのが更に好ましい。
【００１８】
アルカンとしては直鎖の炭素数１０から３６までのノルマルアルカンを使用することが好ましいが、他の炭素数のアルカンや、側鎖を持ったブランチドアルカン類、環状のシクロアルカン類なども使用することが出来る。多環芳香族炭化水素としては、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、ジベンゾチオフェン、ピレン、ベンツピレン等の２環から５環までの石油に比較的多く含まれる化合物を用いることが好ましく、またこれらの化合物の異性体を使用しても良い。
【００１９】
上記の方法で培養を行った集積培養体より遺伝子を抽出し、遺伝子に基づいた微生物群集構造解析を行い、その中に含まれる石油分解微生物由来の遺伝子を同定、検出することにより、環境試料中に存在する士着の微生物による石油汚染浄化能を予測することが出来る。
環境試料および培養試料からの遺伝子の抽出法としては定法（Marmur, J. (1961) A Procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3:208〜218.）を用いることができるが、それ以外の方法を用いても良い。
【００２０】
環境試料中の微生物群集構造解析を行って石油分解細菌の存在を検出するためには、まず大凡の微生物の遺伝子を増幅可能なユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ反応（polymerase chain reaction、中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）を行い、試料より抽出した微生物の遺伝子（例えば１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子など）を増幅させる。増幅された様々な微生物由来の遺伝子の混合物を、変成剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Denaturing gradient gel electrophoresis: DGGE法、Muyzer G., S. Hottentrager, A. Teske, and C. Wawer Denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA-A new molecular approach to analyze the genetic diversity of mixed microbial communities Molecular Microbial Ecology Manual 3.4.4.:1〜23, 1996）あるいは、クローニング法（中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド４、秀潤社、１９９６）によって分離する。分離された遺伝子の配列をDNA sequencerにより決定し、GenBank (Benson DA. Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J. Rapp BA, Wheeler DL., GenBank, Nucleic Acids Res 2000 Jan 1, 28(1) 15〜8）などのデータベースに登録されている遺伝子情報と比較することにより、石油分解微生物の存在を同定、検出できる。
【００２１】
また、石油分解能を持つことが知られている微生物の特異的遺伝子配列を基に特異性の高いＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ産物が得られるか否かによって、石油分解微生物の存在を検出することも出来る。定量的なＰＣＲ法としては、競合的ＰＣＲ法（中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）、カイネティックスを利用する方法（中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）、リアルタイムＰＣＲ法（Taq Man PCR、ライトサイクラー等、磯野一宏、臨床病理、４５、ｐ２１８、１９９７）等を用いることが出来るが、これ以外の手法を用いても良い。特異性の高いＰＣＲプライマーを設計するために使うことができる遺伝子として、リボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）やジャイレースβサブユニットをコードするＤＮＡ（ｇｙｒＢ  ＤＮＡ）、アルカンや多環芳香族炭化水素あるいはそれらの分解中間代謝産物の分解酵素に関する機能遺伝子などをあげることが出来る。石油分解酵素に関する機能遺伝子としては、アルカンモノオキシゲナーゼ（ａｌｋＡ，ａｌｋＢ）、ナフタレンジオキシゲナーゼ（ｎａｈＡ）、カテコール２，３ジオキシゲナーゼ（ｎａｈＡ）などを例示することが出来るが、これ以外のアルカン、多環芳香族炭化水素、あるいはそれらの物質の分解代謝産物の分解に関与する遺伝子を検出対象としても良い。
【００２２】
更に石油分解微生物に関する遺伝子の検出は、ハイブリダイゼーション法によっても行うことが出来る。すなわち石油分解微生物由来の特異的遺伝子に特異性の高いＤＮＡプローブを設計し、このＤＮＡを放射性同位元素、蛍光色素等で標識した後、環境試料より抽出した遺伝子あるいは、環境試料中の微生物細胞に存在する遺伝子とのハイブリダイゼーション（雑種形成）を行うことにより、目的の遺伝子あるいは細胞を検出する方法である（Amann, R. I., Binder, B.J., Olson, R.J., Chisholm, S.W., Devereux, R., and Stahl, D.A., Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial population. Appl Environ Microbiol 56:1919〜1925, 1990, Amann, R.I., In situ identification of microorganisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes. In Molecular Microbial Ecology Manual, Kluwer academic publishers, 3.3.6: 1-15, 1995)。特異性の高いＤＮＡプローブを設計するために使うことができる遺伝子として、リボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）やジャイレースβサブユニットをコードするＤＮＡ（ｇｙｒＢ  ＤＮＡ）、アルカンや多環芳香族炭化水素あるいはそれらの分解中間代謝産物の分解酵素に関する機能遺伝子などを挙げることが出来る。
【００２３】
また、Ｔ−ＲＦＬＰ法（Terminal Restriction Fragment Patterns, Kitts CL., Terminal restriction fragment patterns : a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics. Curr Issues Intest Microbiol 2001 Mar; 2(1).17-25）によっても、石油分解微生物に関する遺伝子の検出が可能である。この方法では、まずフォワードあるいはリバースのどちらかのプライマーに蛍光色素を標識し、それらを用いたＰＣＲ反応（Polymerase chain reaction、中山広樹、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド３、秀潤社、１９９６）を行って、試料より抽出した微生物の遺伝子（例えば１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子など）を増幅させる。その後、ＰＣＲによって増幅された様々な微生物由来の遺伝子の混合物を、特異的な遺伝子配列を切断する制限酵素で処理する。この処理によって、片側に蛍光色素が付加された状態の様々な長さの遺伝子断片（terminal restriction fragment）が出来る。この制限酵素処理されたＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ  seqencer などで電気泳動し、蛍光色素が付加されたＰＣＲ産物の長さをパターン化することで、特異的な配列を持つ石油分解細菌由来の遺伝子を検出できる。
【００２４】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明の実施の形態は、これに限定されることはない。
【００２５】
〔実施例１〕  石油汚染土壌の石油分解能力の診断
環境試料を起源とする微生物群集による石油分解集積培養体を作成し、石油分解微生物由来の遺伝子の同定、検出により、環境試料の石油分解能力の予測が可能かを調査するために、２種の履歴の異なる石油汚染土壌（Ｉ、II）を用いた石油分解集積培養体を作成し、各土壌の石油分解能の調査と土壌中の微生物群集構造の解析を行った。
【００２６】
石油分解集積培養体の作成には、減菌処理した容量５０ｍＬのガラス製遠沈管を用い、遠沈管内には２ｇの各試験土壌を投入した。試験土壌の石油濃度は、約０．１〜１．５ｍｇ／ｇ、含水率は１５〜１９％であり、石油、水分共に石油微生物の増殖には不十分なレベルであった。そこで、土着の石油分解細菌の増殖を促すために、１０mＬの滅菌水とｎ−アルカンを豊富に含む原油（予め熱処理して揮発成分を除去した原油、以下「ｗ．ｏｉｌ」という）、あるいは多環芳香族炭化水素のＣ0−フェナントレン（以下、フェナントレンとする）を１０ｍｇ（５ｍｇ／ｇ）上記のガラス製遠沈管に加えた。更に、窒素源として塩化アンモニウム（３５ｍｇ−Ｎ／Ｌ）、リン源としてリン酸水素二ナトリウム（１０ｍｇ−Ｐ／Ｌ）を添加し、２８℃温度条件下で１週間振とう培養（１３０ｒｐｍ）を行った。
【００２７】
また、対照系として炭素源（Ｗ．ｏｉｌ、フェナントレン）の添加を行わない系列も設けた。試験対象の各土壌、また分解実験終了時の集積培養土壌サンプルより遺伝子を抽出し、細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子を標的にしたＰＣＲ法による遺伝子増幅、増幅した遺伝子混合物のＤＧＧＥ法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）による分離とパターン化、分離した微生物遺伝子（ＤＮＡバンド）の遺伝子配列の決定を行い、微生物群集内に存在する微生物群を同定した。また、石油分解集積培養実験における石油分解の様相を調査するために、培養実験終了時に培養液中から有機溶媒を用いた石油成分の抽出を行いＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析計）による分析を行った。
【００２８】
図１には、各培養条件下で得られた集積培養体の微生物群集の構造をＰＣＲ法およびＤＧＧＥ法により解析した結果を示した。レーン１から４はＩ土壌およびその集積培養体より得られたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物の泳動結果を、レーン５から８はII土壌およびその集積培養体のＰＣＲ増幅産物の泳動結果を示している。それぞれレーン１、５は供試土壌、レーン２，６は石油系炭化水素を添加しない対照系、レーン３，７はｗ．ｏｉｌ添加集積培養体、レーン４，８はフェナントレン添加集積培養体より得られたＰＣＲ増幅産物の泳動結果である。また、レーン９，１０は、土壌Ｉ、IIより単離した石油分解細菌より得られたＰＣＲ増幅産物（以下、単に試料の名前で表示する）の泳動結果である。ＤＧＧＥ法では、試料中の微生物群の存在をＤＮＡバンドとして示すことが出来る。これより、Ｉ、II土壌それぞれで得られた強いシグナルのバンド（存在率の多い微生物）に共通性は見られず、土壌によって異なる微生物が存在していることが分かった。一方、同一の土壌サンプルで、添加する炭素源などの培養条件が異なる場合においては、幾つかの強いシグナルのバンド（微生物群）の一致がみられた（バンドＡ、Ｂ、Ｄ）。これらのバンドの遺伝子配列を決定したところ、大部分が石油分解に直接関与しないと思われる細菌（バンドＡ、Ｅ）、あるいは石油汚染土壌中への存在が報告されており、石油系炭化水素分解能は不明であるが、その分解中間代謝物を資化すると推定される細菌群（バンドＢ、Ｃ、Ｄ）に近縁なものであった。
【００２９】
土壌自体（レーン１、５）あるいは土壌に水と窒素源、リン源を加えて培養を行った対照系（レーン２、６）で検出された主なバンド（微生物）の遺伝子配列を決定したが、石油分解微生物の存在は確認できなかった。これは、試験土壌の石油汚染濃度が低いため、石油を資化する微生物の増殖が促進されなかったためと考えられる。それに対して、土壌にｗ．ｏｉｌあるいはフェナントレンを添加した系列（レーン３，６）では、石油分解菌の遺伝子が検出できた（バンドＦ，Ｇ）。
また、図１には各培養条件下での培養液を、ヘキサデカン（Ｃ16−アルカン）あるいはフェナントレンを単一基質とした選択培地を用いて単離した石油分解細菌（単離菌Ｎｏ．１、Ｎｏ．２）の泳動パターンも示した（レーン９、１０）。これらの石油分解能を持つ細菌に対応するバンドが、Ｉ土壌にｗ．ｏｉｌを炭素源として添加した集積培養系（レーン３、バンドＦ）、II土壌にフェナントレンを添加した系（レーン８、バンドＧ）においても確認された。これらのバンドの遺伝子配列を決定したところ、単離株Ｎｏ．１はロドコッカス（Rhodococcus sp.）、単離株Ｎｏ．２はブルクホルデリア（Burkholderia sp.）に非常に近縁なものであり、それぞれがアルカン（alkanes：飽和画分）と多環芳香族炭化水素（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons、以下ＰＡＨｓとする）の分解に関与する菌であるということがわかった。
【００３０】
図２には、ｗ．ｏｉｌを炭素源に用いた集積培養系におけるアルカン（Ｃ10〜Ｃ36）およびＰＡＨｓの分解の結果を示した。Ｉ土壌ではII土壌に比べてアルカンの分解が良好であり、培養後１週間目には約９０％が分解された。一方、ＰＡＨｓの分解に関してはII土壌の方が優れており、ナフタレン、フェナントレン、フルオレンはほぼ完全に、ジベンゾチオフェンについても８０％程度が分解された。
以上の結果より、Ｉ土壌にｗ．ｏｉｌを加えて集積培養を行なった系（レーン３）からはアルカン分解能を持つ細菌由来の遺伝子（バンドＦ）が検出され、かつ土壌のアルカン分解能が高いこと、II土壌にフェナントレンを加えて集積培養を行なった系（レーン８）からはＰＡＨｓ分解菌由来の遺伝子が検出され、かつ土壌のＰＡＨｓ分解能が高いことが分かった。即ち、この様な高度石油分解集積培養体を作成し、培養体中の微生物群集の遺伝子の解析、石油分解細菌由来の遺伝子の検出を行うことにより環境試料の石油分解能を予測することが可能であることが示された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の方法を用いて、高度に石油分解微生物の増殖がなされた石油分解集積培養体を作成し、環境試料を起源とする石油分解微生物由来の遺伝子の存在を知ることで、短期間で環境試料の持つ石油分解能力を予測する手段を提供することができる。また、石油分解細菌由来の遺伝子情報（遺伝子配列データ）を得ることで、試料中で活躍する石油分解細菌の系統学的な分類や、その細菌の持つ石油分解酵素に関する知見を得ることができ、どのような成分の石油系炭化水素を、どのような物質まで分解できるかを知ることができる。
即ち、本発明により石油汚染環境試料土着の微生物による石油汚染成分毎の浄化能を予測することが出来、将来的には、バイオレメディエーション施工の際、浄化対象となる環境試料の汚染種や存在微生物種に応じた、最適な浄化法を提案していくことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による供試土壌及び石油分解集積培養体の解析結果を示す。
【図２】ｗ．ｏｉｌを炭素源に用いた集積培養系におけるアルカン及び多環芳香族炭化水素化合物の分解結果を示すグラフである。
【図１】
0003922944.tif 000002
【図２】
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