(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼの作用により、基質としてフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを含有する水性媒体中で該基質からＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項２】
ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼおよびアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物由来のマレイン酸イソメラーゼの作用により、基質としてマレイン酸または無水マレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを含有する水性媒体中で該基質からＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項３】
基質水性媒体中にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれるいずれか１種の金属イオンを存在させる請求項１または２記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項４】
金属イオンが、マグネシウム、マンガンおよび鉄から選ばれるいずれか１種の金属イオンである請求項３記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項５】
基質水性媒体中に不純物として含まれるＲ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の含有量が、生成するＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の理論値の２．５モル％以下である請求項１または２記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項６】
請求項３または４の反応終了液に水酸化アルカリを添加して、存在させた金属イオンを不溶性の沈殿として分離回収すると共にＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸をアルカリ金属塩とする、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸アルカリ金属塩の製造法。
【請求項７】
分離回収した不溶性の沈殿を金属イオン源として再使用する請求項３または４記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項８】
反応終了液にフマル酸、マレイン酸または無水マレイン酸から選ばれる少なくとも１以上の有機酸を添加し、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸またはその塩を不溶物として回収し、母液を反応に再使用する、請求項１〜５いずれか１項記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項９】
反応終了液から鉱酸を使用して酸性下でＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を結晶性粉末として析出、回収する工程を含む請求項１〜５のいずれか１項記載Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項１０】
エチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼが、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来であり、前記形質転換された微生物が、ブレブンディモナス属に属するＴＮ−３株のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１６１）またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４８）である請求項１記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項１１】
エチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼが、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来であり、前記形質転換された微生物が、ブレブンディモナス属に属するＴＮ−３株のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１６１）またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４８）であり、並びにマレイン酸イソメラーゼが、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物由来のマレイン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来である請求項２記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
本発明は微生物の有するリアーゼの作用によりＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関する。
Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は生分解性キレート剤として写真、洗剤、および製紙等の分野での使用が期待される化合物である。
背景技術
２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（以下ＨＰＤＤＳと略記する）の製造法としては、マレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミン（別名；１，３−ジアミノ−２−プロパノール）から立体異性体混合物（ｍｅｓｏ体とラセミ体の混合物）を得る製法〔米国特許３１５８６３５号公報参照〕、および光学活性体であるＳ−アスパラギン酸と１，３−ジクロロ−２−プロパノールから光学活性なＳ，Ｓ−体の製法〔Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｏｂｓｈｕｃｈｅｉ  Ｋｈｉｍｉｉ  Ｖｏｌ．４９，Ｐ６６３，１９７９年  参照〕が開示されており、Ｓ，Ｓ−、Ｒ，Ｒ−、ｍｅｓｏ−の３つの異性体の中で、Ｓ，Ｓ−体のみが容易に生分解することが知られている〔特表平８−５０７８０５号公報参照〕。
発明の開示
一方、本発明者らは、先に、フマル酸とエチレンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸に変換する微生物の新規なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作用を利用し、経済的かつ効率的な光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案した〔特開平９−１４０３９０号公報参照〕。さらに、これら光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法に関する様々な技術を開発してきた〔例えば、特開平９−２８９８９５号、特開平１０−５２２９２号、特開平１０−２１８８４６号、特開平１０−２７１９９９号、各公報参照〕。しかしながら、酵素は厳密な基質特異性を持つ場合がほとんどで、ＥＤＤＳアーゼの作用によりＨＰＤＤＳが合成できるかどうかは全く不明であった。
本発明は、高価な光学活性体を使用することのない、経済的に有利なＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＥＤＤＳアーゼの作用により、１分子のフマル酸と１分子の２−ヒドロキシプロピレンジアミンからＳ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸が合成され、これにさらに１分子のフマル酸が反応してＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを立体特異的に合成できること、また、このＥＤＤＳアーゼの作用にマレイン酸イソメラーゼの作用を組み合わせることによりマレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンから同様にＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを合成できることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼの作用により、基質としてフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを含有する水性媒体中で該基質からＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（２）微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼおよびマレイン酸イソメラーゼの作用により、基質としてマレイン酸または無水マレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを含有する水性媒体中で該基質からＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（３）基質水性媒体中にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属イオンを存在させ上記（１）または（２）記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
（４）金属イオンが、マグネシウム、マンガンおよび鉄から選ばれる少なくとも１種の金属イオンである上記（３）記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（５）  基質水性媒体中に不純物として含まれるＲ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の含有量が、生成するＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の理論値の２．５モル％以下である上記（１）または（２）記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（６）上記（３）または（４）の反応終了液に水酸化アルカリを添加して、存在させた金属イオンを不溶性の沈殿として分離回収すると共にＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸をアルカリ金属塩とする、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸アルカリ金属塩の製造法、
（７）分離回収した不溶性の沈殿を金属イオン源として再使用する上記（３）または（４）記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（８）反応終了液にフマル酸、マレイン酸または無水マレイン酸から選ばれる少なくとも１以上の有機酸を添加し、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸またはその塩を不溶物として回収し、母液を反応に再使用する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（９）反応終了液から鉱酸を使用して酸性下でＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を結晶性粉末として析出、回収する工程を含む上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（１０）下記構造式［１］および［２］で示される環化物の合計が、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸に対して１モル％以下である、Ｓ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の結晶性粉末、
0004006183.tif 000002
（１１）エチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼが、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（ＡｃｉｄｏＶｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物、あるいはこれらの微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来である上記（１）記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
（１２）エチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼが、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物、あるいはこれらの微生物由来のエチレンジアミンジコハク酸エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来であり、並びにマレイン酸イソメラーゼが、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、あるいはこれらの微生物由来のマレイン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡにより形質転換された微生物由来である請求項２記載のＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法、
である。
発明を実施するための最良の形態
微生物の培養
本発明で使用される微生物は後記の通りである。
本発明で使用される微生物の培地には何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれを用いることもできる。また、活性の高い菌体を得たい場合には、例えば、ＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物の場合には、培地へＨＰＤＤＳ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸やフマル酸等を添加し、またマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の場合にはマレイン酸等を添加する。培養条件は菌体や培地により異なり、培地のｐＨは、好ましくは、４〜１０、より好ましくは６〜９の範囲、培養温度は、２０〜４０℃が好ましいが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属など好熱性菌の場合には、５０〜７０℃程度を採用する場合もある。必要に応じて曝気、撹拌を行い、活性が最大となるまで培養すればよい。
微生物のフマラーゼ活性除去
微生物に存在するフマラーゼ活性の除去は、菌体または該菌体処理物（本明細書では菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安定化処理等）した菌体または酵素を示す）に対して、処理ｐＨは好ましくは８〜１０．５、より好ましくは８．５〜１０の範囲、処理温度は好ましくは氷結温度〜５５℃の範囲で時間に制限無く行うことができる（特願平９−３１１０４６号明細書参照）。
Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生産反応
Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの生産反応は、基質であるフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミン、および必要に応じて、反応に関与する金属イオン源としての金属化合物や、酵素の安定化のために添加する緩衝能を持つ塩類等を含む水性媒体中で、菌体または該菌体処理物を接触させることにより行われるのが好ましいが、菌体培養液にフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンおよび該金属化合物を直接添加しても行うことができる。
反応は、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは２０〜４５℃の範囲で行う。ｐＨは、好ましくは４〜１１、より好ましくはｐＨ７〜１０の範囲で行う。反応で用いるフマル酸の濃度は反応温度やｐＨにより異なるが、好ましくは０．０１〜３Ｍ（ｍｏｌ／ｌ）であり、反応液中に飽和溶解度以上の沈殿物として存在させても反応の進行と共に溶解するため差し支えない。２−ヒドロキシプロピレンジアミンの濃度は、好ましくは０．０１〜２Ｍである。
なお、フマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンのモル比を変えることにより本反応の中間体であるＳ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸とＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの生成比率を必要に応じて変えることができる。この場合、２−ヒドロキシプロピレンジアミン／フマル酸比を大とするとＳ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の生成比率は大きくなる。
微生物などの使用量は基質に対する乾燥菌体換算で、好ましくは０．０１〜５重量％である。
また、原料がいずれかに関わらず、２−ヒドロキシプロピレンジアミン、フマル酸を他化合物から合成し得る反応系を本反応系と共存させたとしても、本発明の要旨とする効果が得られる限り差し支えない。
また、マレイン酸イソメラーゼを共存させると、前記フマル酸の代わりにマレイン酸あるいはその塩を基質とすることができる。また、無水マレイン酸も水溶液中でマレイン酸に容易に変換されるため同様に使用できる。その条件は共存させるＥＤＤＳアーゼにより異なることがあるけれども、上記フマル酸原料の場合に準ずる。
金属イオン存在下における反応
本反応は平衡反応であり、反応が途中で見かけ上停止するため、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに配位され得る多価金属イオンを存在させることにより平衡を生産物側に傾け、収率を向上させることができる。
本発明における金属イオンとしては、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳにキレートされ、錯体を形成し得る金属イオンであれば特に制限はなく、重金属、アルカリ土類金属単体のイオン、あるいは配位化合物等のイオンが挙げられる。具体的には、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｔｉ（ＩＶ）等の重金属のイオン、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）等のアルカリ土類金属のイオンを挙げることができ、実際には、これら金属イオンの水酸化物、酸化物やその塩、硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、炭酸との化合物を添加するのが好ましい。したがって、これらの化合物が、反応液中で金属および非金属元素からなるイオンとして存在するか、もしくは添加後にそのようなイオンが生じたとしても、それがＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳと配位し、本発明の効果が得られるものであれば使用できる。さらに、これらのイオンまたは化合物を２種以上混合して用いることも可能である。
金属化合物、あるいは金属化合物とフマル酸またはマレイン酸からなる塩には、溶解度の低いものがあるが、飽和量以上に、すなわち懸濁状態として存在させても、反応と共に生成するＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳがキレートすることにより、本発明の主旨とするところの効果は得られるため差し支えない。また、これら金属化合物は、反応開始時に一括して添加しても、反応途上で添加しても構わない。
金属イオン源としての金属化合物は、反応液中への金属化合物添加量は生成するＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに対して、好ましくは０．０１〜２倍モルである。
ｐＨ調節を行う場合、金属イオンを添加しない時およびアルカリ土類金属を添加したときにはｐＨが低下するので、アルカリ金属の水酸化物、２−ヒドロキシプロピレンジアミン、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳのアルカリ金属やアンモニウム塩等のアルカリによって行い、アルカリ土類金属以外の金属イオンを添加する場合は、ｐＨが上昇するので硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ等の酸によって行うことができる。
Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの金属錯体を必要とする場合には、所定の金属のイオンの存在下で反応を行った後、ｐＨ調整、濃縮、その他の操作により目的化合物を直接得ることができる。一方、反応終了液からＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを採取するには、後記の通り酸析を行うことにより採取できる。しかしながら、鉄等の重金属イオンの存在下に反応を行った場合のように酸析のｐＨで安定な錯体を形成している系においては、酸析以前に該金属のイオンを除去する必要がある。したがって、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを必要とする場合には、酸析に際し上記のような除去操作を省略できるマグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のイオンの存在下に反応を行うことが効率的である。
金属イオン添加の効果は、前記の通り、金属イオンにより化学平衡点を基質側から生成物側に移動させることに基づくと考えられる。通常、化学平衡点は触媒の種類に左右されないため、本発明における化学平衡点は、副反応やその他の反応が関わらない限り、すべての触媒について一定の値を示す。したがって、金属イオン添加の効果は、触媒であるＥＤＤＳアーゼがいずれの微生物由来であるかは特に関係しない。
反応中のｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳ生成の抑制
反応終了液そのものあるいは後記のアルカリ金属塩水溶液を必要とする場合等には、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳの混入は目的のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの化学純度を下げるばかりでなく、前述の様にＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに比べ生分解性に乏しく、通常の場合、好ましくない。
ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳ混入の原因としては、まず、フマル酸またはマレイン酸、および２−ヒドロキシプロピレンジアミンから、ラセミ体の２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸が微生物触媒を介さずに生成し、ＳとＲの２つの光学異性体うち、Ｒ−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸とフマル酸からＥＤＤＳアーゼの触媒作用によりｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳが生ずる（Ｓ体はＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳとなる）との実験的裏付けを得ている。
このラセミ−２−プロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の生成は、温度が高いほど、ｐＨが高いほど、基質濃度が高いほど、あるいはこれらの条件に曝露される時間が長いほど顕著になり、特に、基質濃度が高い時、すなわち反応中よりも主に基質水溶液調合中に生成する。すなわち、基質水溶液調合時のラセミ−２−プロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の生成を抑えれば、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳの混入を大幅に抑えることができ、望ましくは、基質水溶液中のＲ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の含有量を、生成するＳ，Ｓ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の理論値の２．５モル％以下にするのがよい。
金属イオン添加反応における金属の回収とそのリサイクル使用、およびＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳアルカリ金属塩製造
反応終了後、菌体または菌体処理物をろ過あるいは遠心分離等で除去し、これに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリを金属イオンが不溶化するまで添加し、不溶化した沈澱をろ過あるいは遠心分離などの通常の固液分離することにより、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳアルカリ金属塩を母液として得ることができる。回収した沈殿は、金属イオン源として前記反応に再使用できる。
水酸化アルカリの使用量は、反応に使用した金属イオンの種類によっても異なるが、反応液中に含まれるＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに対し、反応液中の最終濃度（基質溶液調合時や反応中に添加した量も含む）として、好ましくは２〜６倍モル、より好ましくは３〜４．５倍モル相当量である。水酸化アルカリは混合使用、あるいは他のアルカリと併用することも可能である。
水酸化アルカリを添加する際、短時間で一度に加えると、析出する不溶化物は微細粒子となり難分離性であるが、十分に時間をかけて添加すると沈降性の良い粒子が得られるので望ましい。また、反応終了液に水酸化アルカリを添加しても、あるいはその逆に水酸化アルカリに反応終了液を添加しても、添加した液滴が他方の液に接触した瞬間に固化するため、槽内の均一性を保つのは難しく、粒径も不均一で微細になりがちである。その様な場合には、反応終了液と水酸化アルカリを適当な晶析槽内に共供給を行い、好ましくは、共供給および槽内のスラリー抜き出しを連続的に行えば、分離性の改善された比較的粗大な粒子を得ることができる。
フマル酸、マレイン酸によるＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの酸析と回収、および母液のリサイクル使用
反応の基質であるフマル酸、マレイン酸（無水マレイン酸またはその処理物を含む）を使用して、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの酸析を行うことができる。その条件は、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ回収と同時に、母液の該反応へのリサイクル使用を目的とするため、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳが析出、かつこれら基質が溶解する範囲を選択する。フマル酸、マレイン酸の添加量は、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度、温度などにより異なるが、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに対して、好ましくは０．２〜３倍モル、より好ましくは、０．８〜２．４倍モルである。温度は好ましくは約０〜約８０℃、より好ましくは１０〜６０℃の範囲に調整し、必要によりＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを一部析出させた後またはＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの種結晶を添加した後、徐々に冷却することにより行うことができる。また、連続法で行う場合、上記の様な条件で、フマル酸またはマレイン酸と前述の反応終了液を滞留時間が好ましくは約０．５〜約１０時間、より好ましくは１〜５時間になるように供給し、得られたＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶スラリーを連続的にまたは間欠的に抜き出すことにより行うことができる。
析出した結晶の取得は濾過、遠心分離等の通常の方法が採用できる。次いで、粗結晶中の酸析の際に生成した塩類や後述する環化物等を水や有機溶剤を用いて洗浄する。この洗浄に関しても特に制限はなく、リンス、スラリー洗浄等の通常の方法で行うことができる。
また、洗浄後の湿結晶の乾燥は品温が８０℃以下となる温度で行うのが望ましい。
Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ回収後の母液は、所定量の２−ヒドロキシプロピレンジアミンとｐＨ調整用の酸、アルカリ等と混合することで、前記反応に再使用できる。
鉱酸によるＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの酸析と回収
晶析は、前述の反応終了液やＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳアルカリ金属塩水溶液またはそれらの濃縮物等を、回分法で行う場合、硫酸、塩酸などの鉱酸を用いてｐＨを好ましくは約１．８〜約４．５、より好ましくは２．０〜４．０の範囲、温度を好ましくは約４０〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃の範囲に調整し、必要によりＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを一部析出させた後またはＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの種結晶を添加した後、徐々に冷却することにより行うことができる。冷却温度は好ましくは約４０℃以下、より好ましくは３０〜０℃である。また、連続法で行う場合、ｐＨを好ましくは約１．８〜約４．５、より好ましくは２．０〜４．０の範囲、温度を好ましくは０〜４０℃の範囲に調整した後、ｐＨや温度条件により異なるが、鉱酸と前述の反応終了液やＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳアルカリ金属塩水溶液またはそれらの濃縮物等を滞留時間が好ましくは約０．５〜１０時間、より好ましくは１〜５時間になるように供給し、得られたＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶スラリーを連続的にまたは間欠的に抜き出すことにより行うことができる。
なお、結晶の析出に伴いｐＨが上昇するが、必要に応じて、例えば硫酸、塩酸などの鉱酸を用いて所定のｐＨとなるように調整する。また、晶析ｐＨを約４以上とすると反応液に含まれる陽イオンの塩として沈殿しやすい。例えば、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳそのものよりも、１ソーダ塩の方が水になじみやすいなどの利点を持つので、必要に応じてｐＨを変えることで、所望の塩を得ることも可能である。
一方、下記構造式［１］および［２］で示されるＨＰＤＤＳ由来の環化物は、ｐＨが低いほど、温度が高いほど、また、これらの条件に暴露する時間が長いほど生成し易い。環化物生成はＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶の回収率の低下をもたらすだけでなく、母液中に残存した環化物は結晶に付着し品質低下の原因となるが、上記の好ましいとする条件は該環化物の生成をより少ない状態に抑制し得る。本酸析法によれば最終的にＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの結晶を収率９０％以上で得ることができる。
析出した結晶の取得、乾燥等は、前記フマル酸、マレイン酸による酸析に記載した方法と同様に行うことができる。
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ＥＤＤＳアーゼを有する微生物
ＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物としては、例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体などを挙げることができる。
具体的には、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＫＫ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１２）、同ＫＫ−９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１３）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．ＴＮ−５１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＫ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１５）、同ＴＮＯ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４７）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１７）および同ＴＮ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６）、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９  株〔Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ５３３２３株〕またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５  株を用いた形質転換体等を例示することができる。
上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９株、ＴＮ−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６、日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、これらの菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９０号公報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載されている。
また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性質は以下に示す通りである。
菌学的性質
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上記菌学的性質を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．９（１９９０）により分類するとＴＮＯ−５株はパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌と同定された。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（ｄｉｍｉｎｕｔａ）種であることが確認されている。
大腸菌  ＪＭ１０９株（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ５３３２３株）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。これらの菌株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドｐＥＤＳ０２０およびｐＳＥ００１を導入した形質転換体が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１６１）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４８）として、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
なお、これら形質転換体の作成方法は、本出願人の出願に係る特願平９−６００７７号明細書に記載されている。
マレイン酸イソメラーゼを有する微生物
マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物としては、マレイン酸を異性化してフマル酸に変換する微生物であれば特に制限はなく、例えば、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を挙げることができる。さらに、これらの微生物に由来するマレイン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体などを挙げることができる。
具体的な菌株としては、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ  １２６６９株、同ＩＦＯ  １３１１１株、同ＩＡＭ１４７３株、アルカリゲネス  ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａｓ）ＩＡＭ１２３０５株、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ２３７２８株、キサントモナス  マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＡＴＣＣ１３２７０株、バチルス  ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＭＩ１０５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６４）、バチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｒｕｓ）ＭＩ１０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６０）、同ＭＩ１０２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６１）、バチルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）  ＭＩ１０３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６２）、同ＭＩ１０４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６３）等を例示することができる。
これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）（日本）、東京大学分枝細胞生物学研究所細胞・機能高分子総合センターＩＡＭカルチャーコレクション（日本）、およびアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国）、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本）より容易に入手可能である。
また、ＥＤＤＳアーゼ保有微生物の中で、マレイン酸をフマル酸に変換する能力を有し、すなわち、マレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを、直接Ｓ、Ｓ−ＨＰＤＤＳに変換する微生物を用いることもでき、前記のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＫＫ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１２）、同ＫＫ−９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＫ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１５）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１７）はその代表的な例である。このように自然界にも存在するが、マレイン酸イソメラーゼ遺伝子およびＥＤＤＳアーゼ遺伝子を同時に導入した形質転換体を用いることも可能である。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
（１）菌体懸濁液の調製
Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３株を斜面培地から１白金耳取り、下記の培地に接種し、３０℃、３日間好気的に振とう培養した。
培地組成（ｐＨ７．５，１００ｍｌ）：
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸      ０．２ｇ
グルコース                                  ０．２ｇ
酵母エキス                                  ０．１ｇ
ポリペプトン                                ０．０５ｇ
硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ                  ０．１ｇ
硫酸ナトリウム                              ０．２８ｇ
燐酸緩衝液                                  ２５ｍＭ
金属塩混合物溶液＊                          ０．５ｍｌ
＊金属塩混合物溶液（１００ｍｌ）；  塩化マグネシウム・６Ｈ２Ｏ  ８ｇ，塩化カルシウム  ０．８ｇ，硫酸マンガン・４Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ，塩化第二鉄・６Ｈ２Ｏ  ０．１２ｇ，硫酸亜鉛  ０．０６ｇ
菌体培養液２０ｍｌを遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間遠心分離し菌体を集めた後、５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ８．０で２回洗浄した菌体懸濁液を調製した。
（２）反応液の調製と反応
反応液は、２００ｍＭフマル酸と２００ｍＭ２−ヒドロキシプロピレンジアミン、上記菌体懸濁液を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨ８．０に調整したものを用い、３０℃、２４時間、振とうしながら反応を行った。その結果、２０ｍＭのＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳが生成し、ｍｅｓｏ体、ＲＲ体は検出されなかった。
なお、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度の測定法は、次の通りである。
液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーにてＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを定量した。定量用カラムとしては  ＷＡＫＯＳＩＬ  ５Ｃ８（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ  水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また、光学分割カラムとして  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＲＳ  １０Ｗ（三菱化学社製）〔溶出液；１０ｍＭ  ＣｕＳＯ４〕を使用した。
また、生成物の分離精製は、Ｔ，  Ｎｉｓｈｉｋｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３７，  ４２６（１９８４）に記載のイオン交換樹脂を用いる手法で行い、結晶を取得した後にＮＭＲとマススペクトルによる分析で化学構造の確認を行った。
実施例２
（１）菌体懸濁液の調製
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＫＫ−５株、同ＫＫ−９株、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．ＴＮ−５１株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＫ−６株、同ＴＮＯ−５株、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３０株および同ＴＮ−３株を実施例１と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。
（２）反応液の調製と反応
上記菌体懸濁液を用いて、実施例１と同様の反応液、および同様の組成に１００ｍＭ硫酸マグネシウムまたは１００ｍＭ塩化マグネシウムを添加した反応液で、３０℃、１５時間、振とうしながら反応を行いＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成量を比較した。
（３）結果
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実施例３
（１）菌体懸濁液の調製
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０を斜面培地から１白金耳とり、５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン、１ｍＭ  イソプロピル−β−チオガラクトシドを含有）に、２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう培養した。培養液１，０００ｍｌから、菌体を遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２０分）により集菌し、１００ｍＭ１，４−ジアミノブタンを含む５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ７．７５）５００ｍｌで１回洗浄した。５００ｍｌの同様の緩衝液に菌体を再懸濁した後、氷中において２５％グルタルアルデヒドを２５ｍＭとなるように徐々に添加した。ｐＨが低下するので６ＮＮａＯＨにてｐＨ７．７５に調整した後、撹拌しながら２時間放置した。エチレンジアミンを５０ｍＭとなるように添加し、６ＮＮａＯＨでｐＨ９．０とした後、２時間放置した。次に水素化ほう素ナトリウムを２５ｍＭとなるように添加してかくはんしながら２時間放置した。さらに、６ＮＮａＯＨにてｐＨ９．２に調整した後、水浴中で４５℃、４時間、加熱処理を行い、フマラーゼ活性を除去した菌体懸濁液を調製した。
（２）反応液の調製と反応
反応開始時の濃度が、フマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、菌体１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）となるように反応液を調製した。水、フマル酸、２−ヒドロキシプロピレンジアミンの順に激しくかくはんしながら混合し、７．５ＮＮａＯＨでｐＨ８．５に調整した透明な反応液を得た。これに対して上記菌体懸濁液を加え１，０００ｍＬとし、４０℃下、かくはんしながら反応を行った。
その結果、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は４３０ｍＭであった。
実施例４
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
反応開始時の濃度が、フマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、水酸化マグネシウム５７０ｍＭ、菌体１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）となるように反応液を調製した。水に対してフマル酸、水酸化マグネシウム、２−ヒドロキシプロピレンジアミンの順に激しくかくはんしながら添加し、７．５ＮＮａＯＨにてｐＨ８．５に調整した１，０００ｍｌの透明な反応液を得た。この際、液温が２０℃を超えないように冷却し、完全に溶解するまでは約３０分を要した。２−ヒドロキシプロピレンジアミンを加えてから１時間後、上記菌体懸濁液を加え１，０００ｍｌとし、４０℃下、かくはんしながら反応を行った。反応中ｐＨが低下するので、７．５ＮＮａＯＨを添加しながらｐＨを８．５に保った。反応開始時にはフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンが反応し２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸が生成しており、Ｒ体として２ｍＭであった。
２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は４９４ｍＭ、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳは１ｍＭ、ＨＰＤＤＳ環化物は検出されなかった。
実施例５
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
反応液調製温度を６０℃とし、２−ヒドロキシプロピレンジアミンを添加してから反応開始までの時間を２４時間（この間、２０〜３０℃）とした以外は実施例４と同様に反応液の調製と反応を行った。６０℃では、５分以内で迅速に溶解することができた。この時のＲ−２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸の濃度は４２ｍＭであった。
２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は４５２ｍＭ、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳは３８ｍＭ、ＨＰＤＤＳ環化物は検出されなかった。
実施例６
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例４と同様
（３）マグネシウムイオンの不溶化および回収
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分）により菌体を除去した透明な反応終了液に７．５ＮＮａＯＨをＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度に対して最終濃度（反応液調製時、反応中に添加したＮａＯＨを含む）が、３倍モルおよび４倍モルとなるように添加し、かくはんしながら１時間室温に放置した。生成したマグネシウムイオン由来の沈殿を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）により除去したところ、マグネシウムイオンの除去率は各々５２％および９４％であった。
（４）回収マグネシウムの再利用
回収したマグネシウムの沈殿を用いて実施例４に従って反応液を調製した。反応開始時の各成分の濃度はフマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、回収マグネシウム５７０ｍＭ（マグネシウムとしての濃度）、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ４３ｍＭであり、菌体は１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）とした。ｐＨを７．５ＮＮａＯＨにて８．５に調整し、実施例４と同様に反応を行った。
その結果、反応速度に有意差は見られず、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度は５２３ｍＭであった。
実施例７
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
水酸化マグネシウムの代わりに５７０ｍＭの水酸化鉄（ＩＩＩ）を用いて実施例４と同様に反応液を調製した。ただし、ｐＨは７．５ＮＮａＯＨを用いて７．５とした。この際、水酸化鉄（ＩＩＩ）は反応液に部分的に溶解するのみであった。
反応時は水酸化マグネシウムの場合と異なり反応の進行に伴いｐＨが上昇したので５Ｎ硫酸を用いてｐＨ調整を行った。その結果、２４時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は４７２ｍＭであった。
（３）鉄（ＩＩＩ）イオンの不溶化および回収
遠心分離により菌体を除去した透明な遠心上清に対し、実施例６と同様に７．５Ｎ  ＮａＯＨをＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度に対して最終濃度（反応液調製時に添加したＮａＯＨを含む）が、４倍モルとなるように添加して鉄（ＩＩＩ）イオンを不溶化させ回収した。鉄（ＩＩＩ）イオンの除去率は９７％であった。
（４）回収鉄（ＩＩＩ）の再利用
回収した沈殿を用いて（２）に従って反応液を調製した。反応開始時の各成分の濃度はフマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、回収鉄（ＩＩＩ）５７０ｍＭ（鉄としての濃度）、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ６４ｍＭ、菌体は乾燥重量換算で１０ｇ／ｌとして、（２）と同様に反応を行った。
その結果、反応速度に有意差は見られず、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度は５１１ｍＭであった。
実施例８
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
水酸化鉄（ＩＩＩ）の代わりに同モル濃度の水酸化マンガン（ＩＩ）を用いた他は実施例７と同様に反応液を調製し、反応を行った。その結果、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は４８０ｍＭであった。
（３）マンガン（ＩＩ）の不溶化および回収
実施例７と同様にマンガン（ＩＩ）を不溶化させ回収した。マンガン（ＩＩ）イオンの除去率は９６％であった。
（４）回収マンガン（ＩＩ）の再利用
回収した沈殿を用いて（２）に従って反応液を調製した。反応開始時の各成分の濃度はフマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、回収マンガン（ＩＩ）５７０ｍＭ（マンガンとしての濃度）、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ５６ｍＭ、菌体は１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）として、（２）と同様に反応を行った。反応液調製の際、水に回収マンガンとフマル酸を加えた褐色（マンガンが酸化されたことによる着色と思われる）の懸濁液に、ピンク色になるまで亜硫酸ナトリウム粉末（マンガンに対して約５モル％）を添加し、２−ヒドロキシプロピレンジアミンと７．５ＮＮａＯＨを加え、ｐＨ７．５に調整し、（２）と同様に反応を行った。
その結果、反応速度に有意差は見られず、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度は５０５ｍＭであった。
実施例９
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０の菌体懸濁液を調製した。
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＩＦＯ  １２６６９を斜面培地から１白金耳取り、マレイン酸培地（１ｌあたり；マレイン酸ナトリウム５ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、実施例１記載の金属塩混合物溶液５ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７）１ｌに接種し、３０℃、３日間好気的に振とう培養した。
菌体は、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）により集菌し、５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ８．０で２回洗浄した菌体懸濁液を調製した。
（２）反応液の調製と反応
反応液は、マレイン酸３００ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン１００ｍＭ、上記２つの菌体懸濁液の両者を含み（各々、乾燥重量換算で５ｇ／ｌ）、７．５ＮＮａＯＨによってｐＨ８．５に調整したものを用い、同様の組成に１００ｍＭとなるように塩化マグネシウムを添加したものを、３０℃、２４時間、かくはんしながら反応させ比較した。
反応の進行に伴いｐＨが低下するのでｐＨコントローラーで７．５ＮＮａＯＨ溶液を添加しながらｐＨを８．５に保持した。２４時間後の反応後、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの濃度は、塩化マグネシウムを含まない反応では４１ｍＭ、塩化マグネシウムを含む反応液では８１ｍＭであった。
参考例１
参考として実施例４における反応中の電導度変化と反応液組成を表２に記す。
なお、電気伝導率の測定は、交流２電極式電気伝導率指示調節計（東亜電波工業；ＣＤＩＣ−７型）および電気伝導率セル（同；ＣＧＳ−３５１１型）をＫＣｌ水溶液を標準として校正し使用した。
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実施例１０
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例４と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．４ｍＳ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度は３７７ｍＭ、フマル酸は３０６ｍＭであった。
実施例１１
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例４と同様の組成、条件で、１，０００ｍｌで反応を開始し、電気伝導率が３６．４ｍＳ／ｃｍとなった時でチューブポンプで同じ組成の反応液を供給、同時に反応液の一部を回収することにより、電気伝導率を３３．４〜３３．８ｍＳ／ｃｍの幅に保ち、液量を９８０ｍｌ〜１，０２０ｍｌの幅に保った。この回収の際、ギアポンプと中空糸膜［クラレ；ＳＦ−８１０２（孔径０．１μｍ、内径×長さ＝１．２×３５０ｍｍ）］を用いることで、菌体は反応槽に戻し、ろ液のみを回収できる様にした。
１００時間操作を行い、この間のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ濃度は４８７〜４９４ｍＭ、フマル酸濃度は１０６〜１１５ｍＭ、原料供給速度は平均１８．６ｍｌ／時であった。
実施例１２
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例４と同様。
（３）Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの回収
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）により菌体を除去した透明な反応終了液１００ｍｌを６０℃とした後、４７％硫酸を添加し、ｐＨ２．６に調整した。その後、３０分間６０℃に保温した後、２０℃に達するまで２時間かけて徐々に冷却した。この間ｐＨが上昇したので、４７％硫酸によりｐＨ２．４〜２．８の幅に保持した。析出した結晶をブフナーろうとでろ過し、約１／１０重量の脱塩水で洗浄した。８０℃で１５時間乾燥したＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶は反応終了液からの回収率９０％、ＨＰＤＤＳ環化物は対Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳで０．１モル％以下、母液中のＨＰＤＤＳ環化物は最初のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに対して３モル％であった。
実施例１３
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例４と同様。
（３）Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの回収
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）により菌体を除去した透明な反応終了液１００ｍｌを２０℃とした後、４７％硫酸を添加しｐＨ３．０に調製した溶液中に該反応液を３０ｍｌ／時で供給した。この際、同時にスラリーを抜き出すことで液量を１００ｍｌに保つ（滞留時間３．３時間）と同時に、４７％硫酸によりｐＨ２．４〜２．８の幅に保持した。２４時間後、析出した結晶の一部をブフナーろうとでろ過し、約１／１０重量の脱塩水で洗浄した。８０℃で１５時間乾燥したＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶は反応終了液からの回収率９２％、ＨＰＤＤＳ環化物は含まれておらず、母液中のＨＰＤＤＳ環化物は最初のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳに対して０．１モル％であった。
実施例１４
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
実施例３と同様。
（３）Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳの回収
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）により菌体を除去した透明な反応終了液１，０００ｍｌに、９５０ｍｍｏｌのフマル酸を加え、３０分間かくはんした後、１５℃まで冷却し、１時間かくはんした。析出した結晶をブフナーろうとでろ過し、約１／１０重量の脱塩水で洗浄した。８０℃で１５時間乾燥したＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ結晶は反応終了液からの回収率は５２％であった。
（４）Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ回収母液の再利用
回収母液を用いて（２）に従って反応液を調製した。反応開始時の各成分の濃度はフマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロパンジアミン５７０ｍＭ、Ｓ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ１９６ｍＭ、菌体１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）であり、（２）と同様に反応を行った。
その結果、２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は６１９ｍＭであった。
実施例１５
（１）菌体懸濁液の調製
実施例３と同様。
（２）反応液の調製と反応
反応開始時の濃度が、フマル酸１，１３９ｍＭ、２−ヒドロキシプロピレンジアミン５７０ｍＭ、水酸化マグネシウム８５５ｍＭ、菌体１０ｇ／ｌ（乾燥重量換算）となるように反応液を調製した。水に対してフマル酸、水酸化マグネシウム、２−ヒドロキシプロピレンジアミンの順に激しくかくはんしながら添加し、１，０００ｍｌの透明な反応液（ｐＨ約９）を得た。この際、液温が２０℃を超えないように冷却し、完全に溶解するまでは約３０分を要した。２−ヒドロキシプロピレンジアミンを加えてから１時間後、上記菌体懸濁液を加え１，０００ｍｌとし、４０℃下、かくはんしながら反応を行った。反応中ｐＨが低下するので、７．５ＮＮａＯＨを添加しながらｐＨを８．５に保った。反応開始時にはフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンから２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸が生成しており、Ｒ体として２ｍＭであった。
２８時間後のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は５１０ｍＭ、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳは１ｍＭ、ＨＰＤＤＳ環化物は検出されなかった。
反応開始時の半量に相当するフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンを反応終了液に追加し、その際、７．５ＮＮａＯＨを使用してｐＨが８〜９の幅になるように保ち、最終的にｐＨ８．５に調整した。この際、液温が４０℃を超えない様に冷却し、完全に溶解するまでは約１５分を要した。この時の２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸濃度は、Ｒ体として１ｍＭであった。
１５時間後（原料追加による調合時間も含む）のＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳ生成濃度は６６７ｍＭ、ｍｅｓｏ−ＨＰＤＤＳは２ｍＭ、ＨＰＤＤＳ環化物は検出されなかった。
産業上の利用可能性
ＥＤＤＳアーゼの作用によりフマル酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンから、また、このＥＤＤＳアーゼの作用にマレイン酸イソメラーゼの作用を組み合わせることによりマレイン酸と２−ヒドロキシプロピレンジアミンから、高価な光学活性体を使用することなく常温、常圧下という温和な条件で工業的に有利にＳ，Ｓ−ＨＰＤＤＳを立体特異的に合成できる。