(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(3)：
【化１】
0003935992.tif 000010
又は下記式(4)：
【化２】
0003935992.tif 000011
で表される光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステル。
【請求項２】
シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、並びにリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解することを特徴とする、下記式(1):
【化３】
0003935992.tif 000012
又は下記式(2):
【化４】
0003935992.tif 000013
で表される光学活性３−クロロラクトニトリルの製造方法。
【請求項３】
シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物の菌体又はエステル加水分解酵素を含有する該微生物の処理物の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解することを特徴とする、下記式(1):
【化５】
0003935992.tif 000014
又は下記式(2):
【化６】
0003935992.tif 000015
で表される光学活性３−クロロラクトニトリルの製造方法。
【請求項４】
シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、並びにリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法。
【請求項５】
シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物の菌体又はエステル加水分解酵素を含有する該微生物の処理物の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法。
【請求項６】
前記酵素が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081により生産されるエステル加水分解酵素、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)により生産されるエステル加水分解酵素、エシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡ６（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、名糖リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業製）、リパーゼLP-051-S（商品名、旭化成工業製）、リパーゼアマノＰ（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＰＳ（商品名、天野製薬製）、キャンディダリパーゼ（商品名、シグマ製）、リパーゼＭ１０（商品名、天野製薬製）、トヨチームＬＩＰ（商品名、東洋紡製）、及びリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項２又は４記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081により生産されるエステル加水分解酵素、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)により生産されるエステル加水分解酵素、エシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡ６（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、名糖リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業製）、及びリパーゼLP-051-S（商品名、旭化成工業製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項２又は４記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)、及びエシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、請求項３又は５記載の方法。
【請求項９】
不斉加水分解反応を水、又は水と有機溶媒との混合液中で行う、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒中、シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、並びにリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリルをアセチル化剤で不斉エステル化することを特徴とする、下記式(1):
【化７】
0003935992.tif 000016
又は下記式(2):
【化８】
0003935992.tif 000017
で表される光学活性３−クロロラクトニトリルの製造方法。
【請求項１１】
有機溶媒中、シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物の菌体又はエステル加水分解酵素を含有する該微生物の処理物の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリルをアセチル化剤で不斉エステル化することを特徴とする、下記式(1):
【化９】
0003935992.tif 000018
又は下記式(2):
【化１０】
0003935992.tif 000019
で表される光学活性３−クロロラクトニトリルの製造方法。
【請求項１２】
有機溶媒中、シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、並びにリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリルをアセチル化剤で不斉エステル化することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法。
【請求項１３】
有機溶媒中、シュウドモナス(Pseudomonas)属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ムコール(Mucor)属及びキャンディダ(Candida)属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物の菌体又はエステル加水分解酵素を含有する該微生物の処理物の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリルをアセチル化剤で不斉エステル化することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法。
【請求項１４】
前記酵素が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081により生産されるエステル加水分解酵素、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)により生産されるエステル加水分解酵素、エシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡ６（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、名糖リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業製）、リパーゼLP-051-S（商品名、旭化成工業製）、リパーゼアマノＰ（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＰＳ（商品名、天野製薬製）、キャンディダリパーゼ（商品名、シグマ製）、リパーゼＭ１０（商品名、天野製薬製）、トヨチームＬＩＰ（商品名、東洋紡製）、及びリパーゼアマノＡＰ（商品名、天野製薬製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項１０又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)により生産されるエステル加水分解酵素、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081により生産されるエステル加水分解酵素、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)により生産されるエステル加水分解酵素、エシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)により生産されるエステル加水分解酵素、リパーゼアマノＡ６（商品名、天野製薬製）、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、及び名糖リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業製）からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である、請求項１０又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2068株(FERM-BP-3846)、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.)MR-2301株(FERM-BP-4870)、シュウドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)IFO3081、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)、及びエシェリキア コリ(Escherichia coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物である、請求項１１又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アセチル化剤が酢酸ビニル、酢酸イソプロペニル、又は無水酢酸である、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光学活性３−クロロラクトニトリル及び光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステル、並びにこれらの光学活性体を生物化学的な不斉加水分解又は不斉合成反応により製造する方法に関する。
本発明で得られる光学活性３−クロロラクトニトリル及び光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは医薬、農薬、液晶等の原料、中間体等として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
ラセミ体３−クロロラクトニトリルおよびその酢酸エステルは、クロロアセトアルデヒド、青酸及び酢酸を原料として合成されることが報告されているが(Journal of Organic Chemistry, 28, 1182(1963))、Journal of Organic Chemistry, 29, 1800(1964)等) 、それらの光学活性体及びその製造法に関しては知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、光学活性３−クロロラクトニトリル及びその酢酸エステル、並びにそれらの効率的な製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵素反応によりラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解するか、或いはラセミ体３−クロロラクトニトリルを酢酸ビニルなどのアシル化剤で不斉エステル化することにより、光学活性３−クロロラクトニトリル及びその酢酸エステルが容易に、しかも、高い光学純度で合成されることを見い出して本発明を完成した。
本発明は、下記式(1) ：
【０００５】
【化５】
0003935992.tif 000002
【０００６】
又は下記式(2) ：
【０００７】
【化６】
0003935992.tif 000003
【０００８】
で表される光学活性３−クロロラクトニトリルである。
また、本発明は、下記式(3) ：
【０００９】
【化７】
0003935992.tif 000004
【００１０】
又は下記式(4) ：
【００１１】
【化８】
0003935992.tif 000005
【００１２】
で表される光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルである。
更に、本発明は、エステル加水分解酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを不斉加水分解することを特徴とする、上記光学活性３−クロロラクトニトリル又は光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法である。
【００１３】
更に、本発明は、有機溶媒中、エステル加水分解酵素の存在下、ラセミ体３−クロロラクトニトリルをアシル化剤で不斉エステル化することを特徴とする、上記光学活性３−クロロラクトニトリル又は光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の光学活性体の製造方法に使用する原料は、ラセミ体３−クロロラクトニトリル又はラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルである。これらの化合物は公知の方法により合成することができる。
すなわち、ラセミ体３−クロロラクトニトリルは、例えば、２−クロロアセトアルデヒドの重亜硫酸塩水溶液に、アンモニウム塩存在下、冷却しながらシアン化カリウム水溶液を滴下して反応させることによって合成することができる。得られた反応混合物から、常法、例えば、エーテルにて抽出後減圧蒸留することによりラセミ体３−クロロラクトニトリルを分離することができる。
【００１５】
また、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは、例えば、前記ラセミ体３−クロロラクトニトリルをピリジン溶媒中でアセチルクロライドでエステル化することにより容易に合成することができる。
本発明に用いられる酵素は、ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを加水分解して光学活性３−クロロラクトニトリル及びその対掌体エステルを製造する能力を有するエステル加水分解酵素であれば酵素の種類、その製造源を問わない。また、このような酵素は、溶媒、温度等の反応条件を適宜選択することにより、不斉加水分解反応又は不斉エステル化反応のいずれの反応にも使用することができる。
【００１６】
本発明においては、例えば、シュウドモナス(Pseudomonas) 属、アスペルギルス(Aspergirus)属、アシネトバクター(Acinetobacter) 属、エシェリキア(Escherichia) 属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ムコール(Mucor) 属及びキャンディダ(Candida) 属からなる群から選ばれる微生物であって、上記エステル加水分解酵素生産能を有する微生物が生産するエステル加水分解酵素を使用することができる。シュウドモナス属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、シュウドモナス sp.(Pseudomonas sp.) MR-2068 株(FERM-BP-3846)、シュウドモナス sp. MR-2301株(FERM-BP-4870)、シュウドモナス  フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) IFO3018 等が挙げられる。アスペルギルス属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、アスペルギルス  ニガー(Aspergilus niger)、アスペルギルス  オリザエ(Aspergilus oryzae) 等が挙げられる。アシネトバクター属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、アシネトバクター sp.(Acinetobacter sp.)MR-2302株(FERM-BP-4871)等が挙げられる。クロモバクテリウム属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、クロモバクテリウム  ビスコサム(Chromobacterium viscosum)等が挙げられる。ムコール属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、ムコール  ミエヒー(Mucor Miehei)、ムコール  ジャバニカス(Mucor javanicus) 等が挙げられる。キャンディダ属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、例えば、キャンディダ  アンターチカ(Candida antartica) 、キャンディダ  リポリティカ(Candida lipolytica)、キャンディダ  ルゴーサ(Candida rugosa)等が挙げられる。エシェリキア属に属し、エステル加水分解酵素生産能を有する微生物としては、シュウドモナス sp. MR-2068(FERM-BP-3846)のエステル加水分解酵素をコードする遺伝子により形質転換された、エシェリキア・コリ(E. coli)MR-2103株(FERM-BP-3835)等が挙げられる。これらの中で好ましいのは、シュウドモナス属に属する微生物、キャンディダ属に属する微生物、及びエシェリキア  コリ MR-2013株である。
【００１７】
エステル加水分解酵素としては、具体的にはリパーゼが例示され、市販されているリパーゼとしては、リパーゼアマノＰ（商品名、天野製薬製、シュウドモナス属由来酵素) 、リパーゼアマノＰＳ（商品名、天野製薬製、シュウドモナス属由来酵素) 、リパーゼアマノＡ６（商品名、天野製薬製、アスペルギルス属由来酵素）、リパーゼアマノＡＰ４（商品名、天野製薬製）、リパーゼＭ１０（商品名、天野製薬製、ムコール属由来酵素）、名糖リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業製、キャンディダ属由来酵素）、東洋紡トヨチームＬＩＰ（商品名、東洋紡製、シュウドモナス属由来酵素) 、リパーゼLP-051-S（商品名、旭化成工業製、クロモバクテリウム属由来酵素) 、キャンディダリパーゼ（商品名、シグマ製、キャンディダ属由来酵素）等が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法において、上記エステル加水分解酵素を反応に供するに際しては、該酵素が活性を示す限りその使用の態様は特に限定されず、精製されたエステル加水分解酵素はもちろんのこと、上記エステル加水分解酵素生産能を有する微生物の菌体を含む培養液をそのまま、又は該培養液から遠心分離などの手段によって分離して得られる菌体もしくはその処理物をも用いることができる。菌体処理物としては、微生物菌体を凍結乾燥したもの、微生物菌体をアセトン乾燥したもの、微生物菌体組織を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液等が挙げられる。また、当該酵素を固定化したものや、上記微生物を固定化したものも用いることができる。精製酵素や微生物の菌体等は、そのままで、或いは適当な溶媒に懸濁させた懸濁液の状態で反応に供することができる。
【００１９】
不斉加水分解反応は、通常、リン酸緩衝液等の水性媒体中で行うが、この水性媒体と有機溶媒との混合液中で行うこともできる。有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、ブタノール、tert−ブチルアルコール、tert−アミルアルコール等のアルコール類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類等が挙げられる。水性媒体に有機溶媒を添加すると、基質であるラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの濃度を調製しながら反応を行うことができるので、反応速度の調節や高濃度の基質による酵素の失活を防ぐことができる。
【００２０】
また、基質の溶媒中の濃度は、 0.1〜30重量％で行うことができるが、生産性等を考慮すると５〜20重量％が好ましい。
基質である３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは、単独で、あるいはそれが溶解する有機溶媒、例えば、tert−ブチルアルコール、イソプロピルエーテル等に溶解した状態で反応に供することができる。
【００２１】
不斉加水分解反応は、通常、10〜60℃、好ましくは20〜40℃の温度で行われる。また、この反応は、通常、pH４〜８、好ましくは、pH６〜7.5 で行われる。反応液中の酵素量は当該反応に対する接触能力に応じて適宜調製すればよく、具体的には、0.01〜10重量％の濃度である。
この不斉加水分解反応においては、反応の進行に伴い、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリを添加してpHを一定に保持するのが好ましい。これにより、反応の進行が促進される場合が多い。
【００２２】
このような不斉加水分解反応により、光学活性３−クロロラクトニトリルが生成する。また、残存基質は、光学活性３−クロロラクトニトリルの対掌体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルとなる。
不斉エステル化反応は、有機溶媒中で、上記エステル加水分解酵素の存在下、基質である３−クロロラクトニトリルと、酢酸ビニル、酢酸イソプロペニル、無水酢酸等のアシル化剤とを反応させることにより行われる。
【００２３】
不斉エステル化反応に用いる溶媒としては、例えば、tert−ブチルアルコール、tert−アミルアルコール、イソプロピルエーテル等が挙げられ、これらの有機溶媒は予め脱水しておくのが好ましい。
不斉エステル化反応は、通常、10〜60℃、好ましくは20〜40℃の温度で行われる。
【００２４】
このような不斉エステル化反応により、光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルが生成する。また、残存基質は、光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの対掌体３−クロロラクトニトリルとなる。
不斉加水分解反応又は不斉エステル化反応は、いずれも、溶液状又は懸濁状で振盪等により攪拌しながら行われる。尚、基質濃度、反応温度、酵素濃度等の反応条件は、条件の相違による反応収率、光学収率、立体選択性の厳密さなどを考慮して、目的とする光学活性体が最も多く採取できる条件を選択する。通常、反応が１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間で終了する反応条件を選択することが好ましい。また、必要に応じてpHを調整しながら反応を行うことも可能である。
【００２５】
また、上述のように、不斉加水分解反応及び不斉エステル化反応のいずれによっても、反応終了後の反応混合物中には光学活性３−クロロラクトニトリル及びその対掌体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルが生成する。生成した光学活性３−クロロラクトニトリル及びその対掌体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの反応混合物からの分離は一般的な分離法で行うことができる。例えば、反応混合物を蒸留することにより溶媒を除去した後、例えば、エチルエーテル等の有機溶媒により光学活性３−クロロラクトニトリルとその対掌体３−クロロラクトニトリルエステルを抽出分離することができる。光学活性３−クロロラクトニトリルとその対掌体３−クロロラクトニトリルエステルの分離は種々の方法で行うことができるが、簡便に行う方法としては、例えば、これらをシリカゲルクロマトグラフィーを用いて通常の方法で溶出分離する方法が挙げられる。
【００２６】
得られた光学活性３−クロロラクトニトリルは、通常の方法で有機酸によりエステル化することにより光学活性を保持したまま３−クロロラクトニトリル有機酸エステルにすることができる。また、得られた光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは通常の方法で加水分解することにより光学活性を維持したまま３−クロロラクトニトリルとすることができる。
この光学活性３−クロロラクトニトリル及び光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは種々の医薬品や生理活性物質の重要な中間体として利用することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
〔調製例１〕
ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの製造方法
２−クロロアセトアルデヒドの40〜45重量％水溶液30.2ｇ、亜硫酸水素ナトリウム27ｇ及び水30mlを混合して85℃で２時間反応させた。得られた反応混合物を冷却した後、該混合物を、それと等量の酢酸エチルで洗浄した。洗浄後、水相に、水70mlに塩化アンモニウム13.9ｇ及び青酸カリウム16.9ｇを溶解した水溶液を、氷冷下で徐々に添加して５〜10℃で２時間放置した。得られた溶液について、100ml の酢酸エチルによる抽出を３回行った。得られた抽出液を無水酢酸ナトリウムで脱水し、溶媒を留去した。このようにして、ラセミ体３−クロロラクトニトリル14.4ｇが得られた。
【００２８】
次いで、塩化メチレン40mlに上記で得られたラセミ体３−クロロラクトニトリル2.36ｇ及びピリジン2.77ｇを加えた。次いで、これに、アセチルクロライド2.25ｇを氷冷下にて滴下した後、室温にて１時間放置した。その後、得られた反応混合物を50mlの水で２回洗浄した。洗浄後、有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を留去した。このようにしてラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステル 2.4ｇが得られた。
【００２９】
〔実施例１〕
下記の組成からなる液体培地を調製した。
培地組成
ペプトン（Difco 社製）10ｇ、酵母エキス（Difco社製）５ｇ、食塩５ｇ、蒸留水１Ｌ
上記液体培地を、 300mlエルレンマイヤーフラスコに50mlずつ分注し、 120℃で15分間蒸気滅菌した。
【００３０】
このフラスコ５本にシュウドモナス sp. MR-2068株(FERM-BP-3846)を１白金耳植菌し、30℃で１日間振盪培養した。次に、各フラスコ内の培養液から遠心分離により菌体を集めて水洗した後、各菌体を50mMリン酸緩衝液（pH 7.2)10ml に懸濁した。
この菌体懸濁液を下記に示す反応液 100mlに加え、30℃にて攪拌しながら24時間反応を行った。
【００３１】
反応液組成
５重量％ラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの50mMリン酸バッファー（pH7.2)／tert−ブチルアルコール（１：９ vol/vol) 溶液
反応終了後、反応混合物から遠心分離により菌体を除去し、得られた上清について、ガスクロマトグラフィー（カラム：Chirasil-DEX CB 0.25mm×25M （クロムパック社製））により残存基質及び生成物濃度並びにそれらの光学純度を分析した。
【００３２】
生成物である３−クロロラクトニトリルは光学活性体（Ｒ体）であり、その光学純度は92.8e.e.％であった。残存基質である３−クロロラクトニトリル酢酸エステルも光学活性体（Ｓ体）であり、その光学純度は99.0e.e.％であった。
また、得られた上清の溶媒を50℃にて除去した後、残油分をクロロホルム20mlに溶解し、 100mlのシリカゲルカラム（充填剤：ワコーゲルｃ-300 (和光純薬工業（株）製））を用いてクロロホルムを溶離液として常法にしたがってＲ−３−クロロラクトニトリルとＳ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステルを溶出分離した。
【００３３】
溶出分離したシアノヒドリン画分とエステル画分をそれぞれまとめた後、溶媒を除去した。このようにして、Ｒ−３−クロロラクトニトリル1.78ｇ及びＳ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステル1.16ｇが得られた。
得られたＲ−３−クロロラクトニトリル及びＳ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステルのＮＭＲ分析結果を下記に示す。
【００３４】
（Ｒ−３−クロロラクトニトリル）
1Ｈ−ＮＭＲδ（ppm in CDCl3、270MHz）：4.731(t, J=5.37Hz, 1H),3.775(w, J=4.88Hz, 2H), 3.369(s, 1H)
（Ｓ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステル）
1Ｈ−ＮＭＲδ（ppm in CDCl3、270MHz）：5.494(t, J=5.86Hz, 1H), 3.755(d, J=5.37Hz, 2H), 2.113(s, 3H)
【００３５】
更に、得られたＲ−３−クロロラクトニトリル及びＳ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの旋光度 [α] D25を測定したところ、それぞれ−6.26（5.16重量％CHCl3 溶液）、＋76.3（2.25重量％CHCl3 溶液）であった。
また、得られたＲ−３−クロロラクトニトリル 0.5ｇを前記調製例１に記載の方法に従ってエステル化することにより、Ｒ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステル 0.4ｇが得られた。更に、上記で得られたＳ−３−クロロラクトニトリル酢酸エステル(0.5ｇ）を名糖リパーゼOF（名糖産業製）を用いて同様に加水分解することにより、Ｓ−３−クロロラクトニトリル 0.2ｇが得られた。
【００３６】
〔実施例２〕
表１に示す微生物を、実施例１と同様にして培養、集菌して菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液 0.2mlを２重量％濃度のラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの50mMリン酸バッファー（pH7.2) 0.8mlに添加し、30℃にて振盪攪拌しながら24時間反応を行った。
【００３７】
反応終了後、反応混合物から遠心分離により菌体を除去した。得られた上清について、ガスクロマトグラフィー（カラム：Chirasil-DEX CB 0.25mm×25M （クロムパック社製））により残存基質である３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの濃度（重量％）及びその光学純度（e.e.％）を分析した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0003935992.tif 000006
【００３９】
〔実施例３〕
表２に示す酵素を、それぞれ、２重量％濃度のラセミ体３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの50mMリン酸バッファー（pH7.２）溶液に 0.1〜0.2wt/vol ％の濃度で添加し、30℃にて24時間反応を行った。
反応終了後、反応混合物中の残存基質である３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの濃度（重量％）及びその光学純度（e.e.％）を、実施例２と同様にして分析した。その結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
0003935992.tif 000007
【００４１】
〔実施例４〕
表３に示す溶媒10mlに、ラセミ体３−クロロラクトニトリルを１重量％及び酢酸ビニルを５重量％の濃度で溶解し、次いでそれぞれにリパーゼＡ６（天野製薬製） 1.0ｇを添加して30℃にて３日間振盪攪拌して反応を行った。
反応終了後、反応混合物中の３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの濃度（重量％）及びその光学純度（e.e.％）を実施例２と同様にしてガスクロマトグラフィーにて分析した。その結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
0003935992.tif 000008
【００４３】
〔実施例５〕
ラセミ体３−クロロラクトニトリル及び酢酸ビニルを、それぞれ２重量％濃度で溶解したtert−ブチルアルコール溶液５mlに、表４に示す酵素を 0.5ｇ添加し、30℃にて３日間振盪攪拌して反応を行った。
反応終了後、反応混合物中の３−クロロラクトニトリル酢酸エステルの濃度（重量％）及びその光学純度（e.e.％）を実施例２と同様にしてガスクロマトグラフィーにて分析した。その結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
0003935992.tif 000009
【００４５】
【発明の効果】
本発明の光学活性３−クロロラクトニトリル及び光学活性３−クロロラクトニトリル酢酸エステルは医薬、農薬、液晶等の原料、中間体等として有用な化合物である。また、本発明により、それらの光学活性体を効率的に製造することができる。