(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ヒドロキシ−４−シトステン−３−オンを有効成分として含む肥満の予防及び／又は治療に用いる医薬。
【請求項２】
６−ヒドロキシ−４−シトステン−３−オンを有効成分として含む脂質代謝の異常を伴う疾患の予防及び／又は治療に用いる医薬。
【請求項３】
脂質代謝の異常を伴う疾患が高脂血症である請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
５−シトステン−３−オンを有効成分として含む脂質代謝の異常を伴う疾患の予防及び／又は治療に用いる医薬。
【請求項５】
脂質代謝の異常を伴う疾患が高脂血症である請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
６−ヒドロキシ−４−シトステン−３−オン又は５−シトステン−３−オンを含む健康食品又は健康飲料。
【請求項７】
６−ヒドロキシ−４−シトステン−３−オン又は５−シトステン−３−オンを含む家畜用飼料又は魚類用飼料。
【請求項８】
６−ヒドロキシ−４−シトステン−３−オン又は５−シトステン−３−オンを含むペットフード。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は肥満の予防及び／又は治療、並びに脂質代謝の改善に有用な医薬に関するものである。
【０００２】
肥満は、運動不足や習慣的な過食、あるいは遺伝的原因や内分泌疾患による代謝傷害などによって引き起こされる。肥満は、心筋梗塞や動脈硬化など種々の成人病を誘発するリスクファクターとなり、それらの疾患を悪化させる要因ともなることから、早期の治療や予防が非常に重要である。従来、軽度の肥満の治療には食事療法や運動療法などが処方されており、重度の肥満に対してはそれらの療法と組み合わせて薬物療法が用いられる場合もある。
【０００３】
肥満及び脂質代謝異常の薬物療法には、従来、ホルモン剤や代謝促進剤などが用いられている。例えば、デヒドロエピアンドロステロン、3-ケト−△9-19-ノルステロイドなどの男性ホルモンが抗肥満作用を有することが知られている（特開平2-275895号公報）。これらの男性ホルモンは筋肉内同化作用を亢進させ、貯蔵脂肪を消費させる作用を有していると考えられている。また、4-コレステン-3-オン（特開平5-170651号公報）、5-コレステン-3-オンなどの3-ケトステロイド類（特開平7-165587号公報）などが血清脂質低下作用及び抗肥満作用を有することが知られている。もっとも、コレステロールより誘導されたエノン構造をもつ上記のコレステノン類は体内に吸収及び蓄積される可能性があり、安全性の観点からはいまだ満足すべき医薬とはいえない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は抗肥満剤及び脂質代謝改善剤を提供することにある。より具体的には、体内への吸収及び蓄積がなく、安全性の高い抗肥満剤及び脂質代謝改善剤を提供することが本発明の課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、植物ステロール類（24-アルキルコレステロール）から誘導された24-アルキルコレステノン及びその類縁体が極めて優れた血清脂質低下作用及び体脂肪減少作用を有し、抗肥満剤及び脂質代謝改善剤の有効成分として有用であることを見出した。また、これらの物質が体内にはほとんど吸収されずに所望の生理活性を発揮できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００６】
すなわち本発明は、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物を有効成分として含む医薬を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、化合物が24-アルキルコレスタン-3-オン、24-アルキルコレストモノエン-3-オン、24-アルキルコレストジエン-3-オン、24-アルキルコレストトリエン-3-オン、及び24-アルキルコレストテトラエン-3-オンからなる群から選ばれる上記医薬；化合物が下記の一般式(I):
【化２】
0003873097.tif 000002
（式中、R1は低級アルキル基を示し；R2は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又はオキソ基を示し；１、４、５、６、７、８、8(14) 、9(11) 、11、14、15、16、22、23、24、25及び／又は25(27)位に１ないし４個の二重結合を有していてもよい）で表される化合物である上記医薬；並びに、化合物が5-シトステン-3-オンである上記医薬が提供される。これらの医薬は、ヒトを含む哺乳類動物の肥満の予防及び／又は治療、あるいは脂質代謝の異常を伴う疾患、例えば高脂血症などの予防及び／又は治療に用いることができる。また、この医薬は、脂質吸収阻害剤又は血清脂質低下剤として用いることもできる。
【０００７】
別の観点からは、肥満の予防及び／又は治療方法、並びに脂質代謝異常を伴う疾患の予防及び／又は治療方法であって、上記化合物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；並びに、上記抗肥満剤の製造のための上記化合物の使用が提供される。さらに別の観点からは、上記化合物を含む健康食品又は健康飲料；上記化合物を含む家畜用飼料又は魚類用飼料；肉質改善のために用いる上記の家畜用飼料又は魚類用飼料；上記化合物を含むペットフード；並びに、これらの食品、飼料、又はペットフードの製造のための上記化合物の使用が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬の有効成分は、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる。24-アルキルコレステン-3-オンに存在する二重結合の数は特に限定されないが、好ましくは１ないし４個であり、好ましい化合物は24-アルキルコレストモノエン-3-オン、24-アルキルコレストジエン-3-オン、24-アルキルコレストトリエン-3-オン、及び24-アルキルコレストテトラエン-3-オンからなる群から選ばれる。さらに好ましい化合物は、１ないし３個、より好ましくは１又は２個の二重結合を任意の位置に含んでいてもよい。環内に存在する二重結合の数は好ましくは１ないし３個、好ましくは１又は２個であり、２個以上の二重結合が存在する場合にはそれらは共役していてもよい。
【０００９】
より具体的には、24-アルキルコレスト-4-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-5-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-6-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-7-エン-3-オン24-アルキルコレスト-8-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-8(14)-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-9(11)-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-14-エン-3-オン、24-アルキルコレスト-4,6-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,7-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,8-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,9(11)-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-8,14-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-1,4,6-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-4,22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-7,22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-8,22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-8(14),22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-9(11),22-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-14,22-ジエン-3- オン、24-アルキルコレスト-4,6,22-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,7,22-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,8,22-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,9(11),22-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-8,14,22-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-1,4,6,22-テトラエン-3-オン、24-アルキルコレスト-5,25(27)-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-7,16,25-トリエン-3-オン、24-アルキルコレスト-8,24-ジエン-3-オン、24-アルキルコレスト-9(11),24-ジエン-3-オン、又は５β-24-アルキルコレスタン-3-オンなどを用いることができる。
【００１０】
さらに好ましい化合物としては、上記式(I)の化合物を用いることができる。式(I)において、R1は低級アルキル基を示す。低級アルキル基としては、例えば、炭素数１ないし４個、好ましくは炭素数１ないし３個の直鎖又は分枝鎖のアルキル基を用いることができる。例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基などを用いることができる。これらのうち、エチル基が好ましい。R2は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又はオキソ基(=O)を示す。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれを用いてもよいが、臭素原子を用いることが好ましい。
【００１１】
上記式(I) において、１、４、５、６、７、８、8(14) 、9(11) 、11、14、15、16、22、23、24、25及び／又は25(27)位に１ないし４個の二重結合を有していてもよい。もっとも、隣接した部位に二重結合が存在することはなく、5-6 位の炭素原子間に二重結合が存在する場合には4-5 位、及び6-7 位の炭素原子間に二重結合が存在し得ないことは当業者に自明である。これらのうち、5-6 位の結合が二重結合であることが好ましく、5-6 位の結合が二重結合であり、他の結合が単結合であることが好ましく、5-6 位の結合が二重結合であり、R2が水素原子であり、かつ他の結合が単結合である場合がより好ましい。最も好ましいのは、R1がエチル基であり、R2が水素原子であり、5-6 位の結合が二重結合であり、かつ他の結合が単結合である場合である。
【００１２】
24-アルキルコレスタン-3-オン又は24-アルキルコレステン-3-オンには不斉炭素が存在しているが、そ（れら）の不斉炭素の立体配置は特に限定されず、S-又はR-配置（α位又はβ位と呼ぶ場合もある）のいずれであってもよい。上記の式(I) において特に立体が明記されている炭素原子についてはその立体配置であることが好ましい。本発明の医薬の最も好適な有効成分として下記の式で表される5-シトステン-3-オン（24-ethylcholest-5-en-3-one) を挙げることができるが、本発明の医薬の有効成分はこの化合物に限定されることはない。
【００１３】
【化３】
0003873097.tif 000003
【００１４】
24-アルキルコレスタン-3-オン又は24-アルキルコレステン-3-オンは、例えばコレスタン-3-オン又はコレステン-3-オンなどの公知の製造方法に準じて、当業者に容易に製造することができる。例えば、式(I)で表される化合物の代表的化合物である5-シトステン-3- オンの製造方法は Parish らの文献（Parish, E.J., et al., Synthetic Communications, 22(19), pp.2839-2847, 1992) に具体的に説明されており、あるいはβ−シトステロールを出発原料として Chengらの方法(Cheng, Y.S., et al., Synthesis 1980, 223)に従って容易に製造することもできる。従って、これらの刊行物に記載された方法により、あるいはこれらの方法を参照しつつ必要に応じて反応条件や反応試薬などに適宜の改変又は修飾を加えることにより、24-アルキルコレスタン-3-オン又は24-アルキルコレステン-3-オンを製造できることは当業者に容易に理解されよう。なお、24-アルキルコレスタン-3-オン又は24-アルキルコレステン-3-オン、好ましくは式(I)で表される化合物の製造方法は化学的な合成方法に限定されることはなく、微生物等を培養することによって生物学的に製造してもよいし、あるいは微生物由来の酵素を用いて製造してもよい。
【００１５】
本発明の医薬は24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物の１種又は２種以上を含むことを特徴としており、肥満の予防及び／又は治療、脂質代謝の異常を伴う疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬の作用機序は、小腸粘膜細胞内で形成される脂質輸送リポタンパク質のカイロミクロンの形成を抑える一種の脂質吸収阻害であると考えられる。不足した脂質は体脂肪から動員されて消費され、結果的に増体重の減少を引き起こすと考えられる。体内に輸送されず小腸粘膜細胞内に残された食餌由来の脂質は、細胞の速い更新に伴って細胞と一緒に徐々に腸管腔に排泄されるものと推定される。もっとも、本発明の範囲は、上記の作用機序によってなんら限定されることはない。
【００１６】
本発明の医薬の適用対象となる肥満の原因は特に限定されず、例えば、運動不足や過食によるもの、遺伝性のもの、摂食調節機構障害によるもの、内分泌疾患による代謝障害によるもの、精神障害によるものなどはいずれも本発明の医薬の適用対象である。脂質代謝の異常を伴う疾患としては、脂質代謝の異常に起因する高脂血症や脂肪肝などの疾患のほか、動脈硬化、高血圧症、糖尿病、通風などを挙げることができる。また、本発明の医薬は、脂質吸収阻害剤又は血清脂質低下剤として用いることもできる。なお、本発明の医薬はヒトを含む哺乳類動物に適用可能である。
【００１７】
本発明の医薬としては、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物自体を用いてもよいが、通常は製剤学的に許容される製剤用添加物を用いて医薬組成物の形態で用いることが好ましい。本発明の医薬は経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の医薬の形態はこれらに限定されることはない。本発明の医薬の投与量は患者の年齢、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたり 1 mg から 5,000 mg 程度の範囲である。
【００１８】
本発明の医薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、pH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。本発明の医薬の有効成分である24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物は親油性であり、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などの天然食用油や、パナセートなどの中鎖脂肪酸トリグリセリドなどの油性媒体中に溶解して経口投与することが可能である。このような場合、有効成分を含む油性溶液をカプセル内に封入して経口投与することが好ましいが、この技術は当業者に周知であり、かつ慣用の技術である。
【００１９】
24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物を含む健康食品又は健康飲料は健康飲料は、例えば、体脂肪の蓄積を抑制して適正な体重を維持するなど、健康管理の目的で用いることができる。健康食品又は健康飲料の形態は特に限定されず、例えば、加工食品、調味料、いわゆるドリンク剤、又は清涼飲料などの形態であってもよい。これらの食品又は飲料には、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物の１種又は２種以上を配合することができる。製造工程も特に限定されないが、一般的には、加工食品の原料として用いられる油脂に予め式(I)の化合物を添加するか、加工中に適宜の手段で式(I)の化合物を添加して加工食品を製造することが可能である。24- アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物は、食品又は飲料 100 gあたり 1 mg から 5,000 mg 程度の範囲で配合することができる。
【００２０】
24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物を含む家畜用飼料又は魚類用飼料は、例えば、ウシやブタなどの家畜、又はハマチやタイなどの養殖魚の体脂肪の過剰蓄積を抑制し、肉質を改善する目的で使用することができる。また、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物を含むペットフードは、イヌやネコなどの愛玩動物（伴侶動物とも呼ばれる）の肥満の抑制及び健康管理の目的で用いることができる。上記の飼料やペットフードの形態及びその製造方法は特に限定されず、当業者に適宜選択可能である。一般的には、製造原料として用いられる油脂に予め上記の化合物を添加したり、加工中に適宜の手段で上記化合物を添加することにより目的の飼料又はペットフードを容易に製造することができる。なお、これらの飼料又はペットフードには、24-アルキルコレスタン-3-オン及び24-アルキルコレステン-3-オンからなる群から選ばれる化合物の１種又は２種以上を配合することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
(A) 材料と方法
5-シトステン-3-オンは、β-シトステロール（東京化成工業株式会社）を出発原料としてParishらの方法(Parish, E.J., et al., Synthetic Communication, 22, pp.2839-2847, 1992) に従って合成したものを用いた。なお、合成物の24-エチルと24-メチルの比率は6.5：3.5であった。実験動物として、５週齡のCDF1雄マウス（日本チャールス・リバー株式会社）を各実験群に６匹ずつ用いた。動物はマウス用アルミケ−ジで飼育し、飼料と水は自由摂取させた。温度24±１℃、相対湿度55±５%、明暗12時間交替、ケ−ジ及び床敷（ホワイトフレーク）の週２回交換の飼育条件で２週間飼育した。
【００２２】
実験飼料として、改変AIN （オリエンタル酵母工業株式会社）を基礎飼料とし、5-シトステン-3-オンを 0.5% に混合して実験飼料とした。また、4-コレステン-3-オン（特開平5-170651号公報）を基礎飼料に 0.5% 添加した飼料を調製して陽性対照として用い、無処置対照は基礎飼料のみとした。基礎飼料の組成は粗蛋白質 22.8%，炭水化物 54.1%，脂肪6.0%, 繊維4.9%，灰分2.9%，水分8.7%であり、熱量は 1,523kJであった。飼料は調製後４℃に保存し、毎日新しい飼料を給餌した。
【００２３】
動物を経時的に体重を測定し、各群の平均値と標準誤差を求めた。また、経時的に摂食量を測定し、１匹１日当たりの平均値を求めた。動物の観察は毎日行い、飼育終了後動物は炭酸ガス吸入により麻酔殺し、腹部下大静脈より採血して血清を採取した。屠体は剖検し、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、副腎、及び腹腔内脂肪について肉眼的観察と重量測定を行った。血清中の脂質については、中性脂肪は酵素法による臨床検査キット（トリグリセライド−E テスト、和光純薬工業株式会社）を用い、総コレステロールとコレスタノールは Kasama らの方法 (T.Kasama, et al., J. Chromatogr., 400, 241, 1987) を改変した方法、すなわちベンゾイルクロライドを10倍量とし、反応時間を２倍にして高速液体クロマトグラフィー装置を用いて測定を行った。体重及び血清脂質の値については無処置対照マウスの値に対してt-検定により有意差を求めた。
【００２４】
(B) 実験結果
(1) 体重の推移
実験動物の体重の推移を図１に示す。5-シトステン-3-オン(0.5%)添加飼料で飼育したマウスは、無処置対照マウスに比べて体重増加が非常に抑制されており、その作用は陽性対照の4-コレステン-3-オンに比べて顕著に強かった。図中、アステリスク *, **, 及び*** はt-検定によりそれぞれ 5% 以下、1%以下、及び0.1%以下の危険率(p) で無処置対照マウスに対して有意に低いことを示す。
【００２５】
(2) 体脂肪量の変化
5-シトステン-3-オン(0.5%)添加飼料で２週間飼育したマウスの体脂肪（皮下脂肪及び腹腔内脂肪）は著しく減少していた。その減少の程度は陽性対照の4-コレステン-3-オンよりも強く、腹腔内脂肪量は無処置対照マウスの1/2 であった（図２）。図中、アステリスク* 及び*** はt-検定によりそれぞれ 5% 以下及び 0.1% 以下の危険率(p) で無処置対照マウスに対して有意に減少していることを示す。
【００２６】
(3) 外見及び剖検所見
5-シトステン-3-オンを投与したマウスの外見所見は、対照マウスに比べて体躯が細いことを除いて、毛艶もよく、動作も活発であり、眼、粘膜、糞便、及び行動などに異常は認められなかった。また摂食についても軽度の抑制がみられた他は異常はなかった（表１）。飼育終了後の剖検所見は、5-シトステン-3-オン投与群の腎臓に軽度の重量低下がみられたが，毒性学的変化とは認められなかった。そのほかの臓器及び組織にも異常は観察されなかった。一方，陽性対照の4-コレステン-3-オン投与群では脾臓の腫大が認められた。
【００２７】
【表１】
0003873097.tif 000004
【００２８】
5-シトステン-3-オン投与群の血清脂質は、中性脂肪及び総コレステロールとも無処置対照マウスに比べてそれぞれ15% 及び51% にまで著しく低下した（表２）。この血清脂質低下作用は、4-コレステン-3-オン及びその他のコレステノン誘導体と比べて最も強いものであった（表２及び３）。
【００２９】
陽性対照の4-コレステン-3-オン投与群マウスは血清中に投与物質の代謝物であるコレスタノールが検出された。同様に、コレステノン誘導体のコレスタ-4,6-ジエン-3-オン、6β-ブロモ-4-コレステン-3-オン、及び 5β-コレスタン-3-オン投与群では、血清中にそれらの代謝物であるコレスタノール又はコプロスタノールが検出された（表３）。これらの物質は難代謝性物質であるため，前駆物質を連続して与えるとそれらの代謝物が臓器中に蓄積して障害を起こす可能性がある。一方、5-シトステン-3-オン投与群ではコレスタノール及びその他の代謝物は全く検出されなかった（表２）。
【００３０】
また、コレステノン誘導体の5-コレステン-3-オン及び 6β-ブロモ-4-コレステン-3-オンには強い食欲抑制作用が認められたが、5-シトステン-3-オンの食欲抑制作用は軽度であった（表１及び３）。以上の結果から、本発明の医薬は毒性の極めて少ない安全な医薬であり、高脂血症や肥満の治療及び／又は予防に有用であることが確認された。
【００３１】
【表２】
0003873097.tif 000005
【００３２】
【表３】
0003873097.tif 000006
【００３３】
例２
(A) 材料と方法
24-アルキルコレステン-3-オンとしてβ-シトステロール（東京化成工業株式会社）から以下の化合物：(1) 4-シトステン-3-オン、(2) 6α-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン、(3) 6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン (α:β=2.6:1) を合成した。なお、合成物の24-エチルと24-メチルの比率は6.5：3.5であった。実験動物は５週齡のCDF1雄マウス（チャールスリバー株式会社）を１群６匹として使用した。飼料は精製飼料（改変AIN, オリエンタル酵母工業株式会社製）を基礎飼料とし、試験化合物を0.5%に添加して動物に14日間自由摂取させた。週２回体重の測定と一般状態の観察を行い、飼育終了後剖検して血液を採取した。分離した血漿中の脂質濃度については酵素法による臨床検査キット（和光純薬工業株式会社）を用いて分析した。得られた数値については分散分析により有意性を検討した。その他の実験条件は例１と同様である。
【００３４】
(B) 実験結果
4-シトステン-3-オンには有意な体重抑制は認められなかったが、６位に水酸基を導入した6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オンはα体及びα,β (2.6:1)体の混合体とも強い体重抑制作用がみられ、特にα体では5-シトステン-3-オンと同程度かさらに強い作用を示した（図３）。6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン投与群はα体及びα,β混合体とも弱い摂食量の減少と強い飼料効率の低下が観察されたが、4-シトステン-3-オン投与群のそれらの変化はわずかであった（表４）。
【００３５】
【表４】
0003873097.tif 000007
【００３６】
表５に示すように、腹腔内脂肪量は6α-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン及び6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン投与群で60%及び50%それぞれ減少したが、4-シトステン-3-オン投与群の減少は有意ではなかった。血漿中のトリグリセライド及び遊離脂肪酸濃度に対する低下作用は３者の化合物とも強く、１＞３≧２の順で低下がみられた。血漿総コレステロール及びリン脂質濃度も6α-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン及び6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オンによって有意な低下がみられたが、その程度は軽く、またHDL-コレステロールの変動もみられなかった。表中のアステリスク*は分散分析により5%以下の危険率(p)で無処置対照マウスに対し有意に低いことを示す。動物の外見及び剖検所見からは毒性学的な異常はみられなかった。
【００３７】
【表５】
0003873097.tif 000008
【００３８】
例３
(A) 材料と方法
5-シトステン-3-オンは東京化成工業株式会社のβ-シトステロールからParishらの方法 (Parish, E.J., et al., Synthetic Communication, 22, p.2839-2847, 1992) により合成し、シリカゲルカラム及び再結晶により精製した。なお、合成物の24-エチルと24-メチルの比率は6.5：3.5であった。動物はチャールスリバー株式会社より入手したCDF1雄マウス、４週齡、30匹を用い、６匹ずつ５群に分けた。試験化合物の投与は飼料添加とし、(1)0.1%添加、(2)0.3%添加、(3)0.5%添加、(4)薬物無添加無脂肪食、及び(5)薬物無添加対照群を設けた。精製飼料の改変AIN-無脂肪（オリエンタル酵母工業株式会社製）を基礎飼料とし、大豆油（和光純薬工業株式会社製）を10%に加え、試験化合物をそれぞれの添加又は無添加し固形飼料を作成した。無脂肪食はそのまま固形化した。動物は無添加対照群の飼料で１週間の馴化期間の後，それぞれの試験飼料を自由摂取させた。
【００３９】
飼育は22×33×11(h)cmのアルミニウム製ケ−ジに６匹/ケ−ジの群飼とし、温度 24±1℃、相対湿度 50±5%、及び明暗12時間交替の環境で行った。体重、摂食量の測定及び一般状態の観察は週３回行い、試験飼料を３週間投与後、動物を剖検し血液を採取した。血中脂質分析はトリグリセライド、リン脂質、遊離脂肪酸、総コレステロール及びHDL-コレステロールについて臨床生化学検査キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて行った。得られたデーターは薬物投与群については分散分析により，無脂肪食群についてはt-検定により有意性を検定した。
【００４０】
(B) 実験結果
(1) 体重の推移
図４に示されるように5-シトステン-3-オンを投与したマウスの体重はいずれも有意に低下し，0.1%、0.3%及び0.5%の添加量に応じた用量効果が観察された。0.3%及び0.5%添加群は投与開始直後の摂食量の減少による急激な体重低下がみられた。それらの摂食量はその後回復したが、体重の増加は緩やかで対照群との差は次第に拡大した。とくに0.5%添加群の体重ののびは低く、ほぼ横ばい状態で推移した。無脂肪食群においても有意な体重抑制がみられ，0.1%添加群と類似の曲線を示した。
【００４１】
(2) 摂食量及び飼料効率
5-シトステン-3-オンの0.1%添加群の摂食量は変わらず，0.3%添加群はわずかに減少がみられたが，0.5%添加群は３週間の合計で約13%減少した。無脂肪食群は反対に摂食量の増加がみられた（表６）。飼料効率は薬物添加群はいずれも添加量に応じて低下し、とくに0.5%添加群で著しく対照群の約80%の低下がみられた。無脂肪食は0.1%添加群と同程度の約20%の低下であった。このことから、5-シトステン-3-オンによる体重抑制は、摂食量の低下よりも飼料効率の低下が強く関係していることが明らかである。
【００４２】
【表６】
0003873097.tif 000009
【００４３】
(3) 一般状態及び臓器重量
各実験群の一般状態は体重の軽重を除いて外見、糞便性状、呼吸及び行動に異常は認められなかった。臓器重量は肝臓、膵臓及び腎臓に体重に変化と関連した変化がみられた。肝臓は0.5%添加群で絶対重量が15%、相対重量が40%とともに有意に増加し、0.3%添加群においても相対重量で17%の増加がみられたが0.1%添加群では有意でな差は認められなかった。膵臓は薬物添加量に従って絶対重量が減少したが、相対重量の変化は有意ではなかった。腎臓においても薬物添加量に相関して減少し0.3%添加群で絶対重量が17%及び相対重量が10%、0.5%添加群で絶対重量が32%及び相対重量が17%減少した。0.5%添加群にみられた肺及び脾臓の絶対重量の減少は相対重量では対照群と変わらなかった。
【００４４】
以上の薬物添加群にみられた肝臓、膵臓、腎臓、肺の変化はその程度は異なるが無脂肪食群にも共通してみられた。すなわち無脂肪食群の肝臓は絶対重量が４%，相対重量が６%増加し、腎臓は絶対重量が12%、相対重量が11%減少した。このことは5-シトステン-3-オンを与えた動物の臓器には無脂肪食と同じ影響が強く現れていることを示唆している。またFischer F344ラットに0.5%飼料添加で４週間飼育してもこの変化はみられなかったことからCDF1マウス特有の変化と思われる。なお、この変化は病理組織学的変化を伴うものではなかったことから、体重低下及び脂質代謝の変化に伴う生理的なもの、又は毒性学的な影響としても軽微なものと判断された。
【００４５】
(4) 腹腔内脂肪量及び血中脂質濃度
表７に示すように、腹腔内脂肪量は対照群に対し0.1%添加群で83%、0.3%添加群で63%及び0.5%添加群では42%の量であった。血漿中のトリグリセライド、総コレステロール、リン脂質及び遊離脂肪酸の脂質関連項目の値はいずれも5-シトステン-3-オンの投与量に応じて低下し、とくにトリグリセライドが著しく0.5%添加群で対照群の26%まで低下した。しかしながらHDL-コレステロールは有意な変動はみられなかった。無脂肪食群では腹腔内脂肪量は対照群の80%まで減少し、血中総コレステロール、リン脂質も有意な低下がみられたが、トリグリセライド、HDL-コレステロール及び遊離脂肪酸は逆に増加していた。表中のアステリスク*は薬物投与群については分散分析により、また無脂肪食群についてはt-検定により0.5%以下の危険率で有意差があることを示す。
【００４６】
【表７】
0003873097.tif 000010
【００４７】
(5) 用量反応関係
図５に5-シトステン-3-オンの体重，体脂肪及び血中脂質に対する用量反応関係を示す。5-シトステン-3-オンの投与量に応じてCDF1マウスの腹腔内脂肪量の減少は直線的な関係が得られた。5-シトステン-3-オンと血漿トリグリセライド及び総コレステロールの減少は対数的な関係にあり，薬物投与量に応じて減少率の高さが減衰する曲線が得られた。一方，体重の減少率は薬物の0.3%添加まで直線的な関係にあったが，0.5%添加では逆に対数曲線的に舞い上がる傾向がみられた。このことから0.5%以上に薬物を添加しても血中脂質の低下にはあまり効果が期待できないことが推定される。一方、体重の抑制は薬物添加量が多くなると主効果以外の作用が表れる可能性が示唆される。
【００４８】
（６）ヒトの投与量への外挿
5-シトステン-3-オンのCDF1マウスの増体重、体脂肪及び血中脂質の抑制に十分な効果を示す投与量として0.3%飼料添加量を採用し，これをもとにヒトの投与量を算出した。マウス１匹あたりの３週間の総摂食量は58.79 g（表６より）、及び試験飼料のカロリーは374 kcal/100gであるので、以上の数値よりマウス１匹１日あたりの摂取カロリーは10.47 kcal/匹/日となる。薬物の飼料添加量0.3%からマウス１匹１日あたりの薬物摂取量は8.4 mgであるので、1,000 kcalあたりの薬物摂取量は802 mg/1,000 kcalとなる。以上の数値と日本人の１日平均摂取カロリー(2,500 kcal)からヒトに対する投与量は2.0 g/人/日と計算された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 5-シトステン-3-オンを 0.5%に添加した飼料で飼育したマウスの体重抑制効果を陽性対照の4-コレステン-3- オンと比較して示した図である。図中、アステリスク *, **, 及び*** はt-検定によりそれぞれ 5%以下、1%以下、及び0.1%以下の危険率(p)で無処置対照マウスに対して有意に低いことを示す。
【図２】 5-シトステン-3-オンを 0.5%に添加した飼料で２週間飼育したマウスの体脂肪（腹腔内脂肪）の減少量を示す図である。図中、アステリスク* 及び*** はt-検定によりそれぞれ 5% 以下及び0.1%以下の危険率(p)で無処置対照マウスに対して有意に減少していることを示す。
【図３】 4-シトステン-3-オン，6α-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン及び6-ヒドロキシ-4-シトステン-3-オン(α:β=2.6:1)を0.5%に添加した飼料で飼育したマウスの体重抑制効果を無処置対照群と比較した結果を示す図である。図中の値は平均値±標準誤差を表す。
【図４】 5-シトステン-3-オンの飼料添加によるCDF1マウスの体重抑制における用量効果を無処置対照及び無脂肪食マウスと比較した結果を示した図である。体重の各測定点は１群６匹の動物の平均値±標準誤差を表す。アステリスク*，**及び***は分散分析によりそれぞれ5%以下、1%以下及び0.1%以下の危険率(p)で無処置対照マウスに対して有意に低いことを示す。
【図５】 5-シトステン-3-オンの飼料添加量と体重、腹腔内脂肪量、血中トリグリセライド及び血中総コレステロール濃度の減少率との相関関係を示した図である。
【図１】
0003873097.tif 000011
【図２】
0003873097.tif 000012
【図３】
0003873097.tif 000013
【図４】
0003873097.tif 000014
【図５】
0003873097.tif 000015