(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝血を測定するインビトロ診断方法において、
へパリンおよびアプロチニンを添加した血液サンプルを試験容器に入れる過程と、
この血液サンプルに、これを接触活性する試薬を添加する過程であって、該試薬が同時にへパリン化血液中のアプロチニンに対する上記方法の感受性および変動性を抑制するものであり、該試薬がベントナイト、イライト、ケツ岩、モンモリロナイト、レクトライトおよびディッカイトからなる群からなる粘土鉱物から選択した接触活性化剤を含有してなり、
該血液サンプルの凝血を測定する過程と、
からなることを特徴とするインビトロ診断方法。
【請求項２】
凝血を測定するインビトロ診断方法において、
へパリンおよびアプロチニンを添加した血液サンプルを試験容器に入れる過程と、
この血液サンプルに、これを接触活性する一種以上の添加試薬を添加する過程と、
該血液サンプルに別な試薬を添加し、該血液サンプルの凝血を測定する過程と、
からなり、
該別な試薬がへパリン化血液中のアプロチニンに対する上記方法の感受性および変動性を抑制するのに役立つものであることを特徴とするインビトロ診断方法。
【請求項３】
上記一種以上の添加試薬をセライト、ガラスビーズおよび粘土鉱物からなる群から選択する請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記粘土鉱物がイライト、ベントナイト、カオリン、ケツ岩、モンモリロナイト、レクトナイトおよびディッカイトである請求項３記載の方法。
【請求項５】
上記一種以上の添加試薬をセライト、ガラスビーズ、イライト、ベントナイト、カオリン、ケツ岩、モンモリロナイト、レクトナイトおよびディッカイトからなる群から選択する請求項２記載の方法。
【請求項６】
上記の別な試薬をイライト、ベントナイト、カオリン、ケツ岩、モンモリロナイト、レクトナイトおよびディッカイトからなる群から選択する請求項２記載の方法。
【請求項７】
活性化クロッティング時間インビトロ診断試験におけるアプロチニンの望ましくない作用を特性化する方法において、
（ａ）ヘパリン含有血液のサンプルに活性化クロッティング時間試験を行なう工程、
（ｂ）ヘパリン、アプロチニンの両者を含有する血液のサンプルに活性化クロッティング時間試験を行なう工程、および
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で行なった試験の結果から活性化クロッティング時間のアプロチニンに対する定量化感受性を計算する工程からなることを特徴とする特性化方法。
【請求項８】
工程（ａ）の試験結果を（ｂ）の試験結果から差し引き、得られた差を工程（ａ）の試験の結果で割り、得られた商に１００を掛けることによって上記定量化感受性を計算する請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の活性化クロッティング時間試験に用いた血液サンプルが活性化クロッティング時間を３００秒以上引き伸ばすのに十分な量のヘパリンを含有する請求項７記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）および（ｂ）の活性化クロッティング時間試験に用いた血液サンプルが等量のヘパリンを含有する請求項７記載の方法。
【請求項１１】
複数のドナーからの血液サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）の活性化クロッティング時間試験を反復実施することによって、母集団サンプルについて活性化クロッティング時間のアプロチニンに対する感受性に関する統計データを発生する請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特にヘパリンおよびアプロチニンの投与を受けている患者における血液または血漿の活性化クロッティング時間（ＡＣＴ）を測定することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは、心肺バイパス（ＣＰＢ）などの体外回路が必要な手術時に使用される抗凝血剤である。このヘパリンは、血液が体外回路を循環している間、血餅が発生するのを防止する。十分な抗凝血作用を確保するためには、血液へのヘパリンの抗凝血作用を測定できなければならない。ヘパリンの抗凝血作用については、インビトロ診断試験によって測定される活性化クロッティング時間（ＡＣＴ）を使用して管理することが多い。ＡＣＴは、ヘパリン投与後の方が長い。例えば、ヘパリンを投与しない場合、ＡＣＴは一般的におよそ１２０秒であるが、ヘパリン投与後は、例えば４８０秒以上になる。４８０秒を超えるＡＣＴの場合、ＣＰＢ手術に必要なヘパリン抗凝血作用の最小量と考えられている。ＡＣＴテストの目的は、血餅の恐れのない状態で手術を続けるために、十分なヘパリンが患者に投与されているかどうかを判定することである。
【０００３】
ヘパリンは、手術中に代謝されるため、十分なレベルの抗凝血作用を維持するためには、ＣＰＢ手術前と手術中の両者でヘパリンを投与する必要がある。また、ヘパリンの抗凝血作用には、個人差があるため、患者それぞれに応じて、ＣＰＢ手術前および手術中の両者において異なる量のヘパリンを投与する必要がある。
【０００４】
現在、ＣＰＢ手術時のヘパリン投与を管理するためにいくつかの異なるテストが用いられている。ヘパリン管理について最も広く利用されている試験は、ＡＣＴ、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＰＴ）、およびヘパリンのプロタミン滴定である。これら試験のうちで、ＣＰＢ手術時に、最もよく利用され、コストも最も低く、そして最も便利なのはＡＣＴである。ヘパリン管理プロトコルは、各医療機関で異なるが、ＡＣＴが例えば４００〜４８０秒の閾値時間以下になった時点で、ヘパリンを追加投与している。ＡＣＴ試験では、血餅の引き金となる接触活性化剤を使用する。ＣＰＢ手術には現在一般的に２種類の活性化剤、すなわち珪藻土（Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ社の商標登録名セライト）および粘土の一種であるカオリンが使用されている。また、ガラスビーズ（二酸化珪素）もＡＣＴ試験の接触活性化剤として使用されているが、ガラスビーズは比較量のセライトまたはカオリンと比べた場合、接触活性化作用が小さいため、ＣＰＢ手術に利用されていない。
【０００５】
既に、ＡＣＴを測定するために幾つかの器具が存在している。代表例は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＨｅｍｏｃｈｒｏｎ(登録商標) ８０１、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ  Ｊｒ．、Ｍｅｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｍｏ  Ｔｅｃ  Ｉｎｃ．のＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅｒ ＩＩ、Ｈｅｐｃｏｎ(登録商標)  ＨｅｍｏｓｔａｓｉｓＭａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｅｍｏ  Ｔｅｃ，Ｉｎｃ．のＨｅｍｏｔｅｃ  ＡＣＴ、Ａｒｒａｙ  ＭｅｄｉｃａｌのＡｃｔａｌｙｋｅ(登録商標)、およびＳｉｅｎｃｏ、Ｉｎｃ．のＳｏｎｏｃｌｏｔ(登録商標)  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ＆Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどである。これらはいずれも、血餅形成に必要な時間を計る器具である。例えば、全血サンプルと活性化剤との混合時に測定を開始し、血餅形成をもって測定を終了する。
【０００６】
Ｔｒａｓｙｌｏｌ(登録商標)の名でＢａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造しているアプロチニンは、心肺バイパス（ＣＰＢ）手術後の失血を抑える薬剤である。どのようなプロセスによりアプロチニンが失血を抑えるかについては、まだ完全な理解が得られてはいない。アプロチニンは、主にプラスミンおよびカリクレインを中和するプロテアーゼ抑制剤であり、血小板の糖タンパク損失を抑えることによって血小板のＣＰＢ後の凝集能力を維持するものである。アプロチニン投与の主目的は、手術後の輸血の必要性および出血を抑える再診査手術の必要性を軽減することである。また、アプロチニンは、他の作用規機序による血流遮断作用ももつ。
【０００７】
アプロチニンの望ましくない、潜在的に危険な副作用は、ヘパリンの存在した場合に、セライト活性化ＡＣＴ結果が得られる時間が長くなることである。例えば、ヘパリン投与患者のセライトＡＣＴは４８０秒であるが、同じ量のヘパリンに加えてアプロチニンを同じ患者に投与した場合、ＡＣＴは実質的に７００秒を超えることがある。セライトＡＣＴ結果は、アプロチニンの存在によりＡＣＴ結果が出るまでの時間が長くなるため、アプロチニンが存在する場合には、ヘパリン抗凝血作用の有効な指標ではない。ヘパリンとセライトを併用するＡＣＴ試験は、アプロチニンが存在する場合ＡＣＴが実質的に遅れ、ヘパリン投与の効果が過小になり、また手術時に血餅形成の恐れがあるため、有効ではない。また、７００秒というＡＣＴ待機時間は無駄であり、手術室の管理コストが嵩む要因であり、できるなら避けるべきである。
【０００８】
ヘパリンおよびアプロチニンを併用投与する患者に使用するセライト活性化ＡＣＴの好ましい代替品としてカオリン活性化ＡＣＴが現在検討されている。多くの文献によれば、カオリンＡＣＴの結果が出るまでの時間はアプロチニンによって延びることはない。これら文献には、Ｊ．Ｓ．Ｗａｎｇなどの“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｋａｏｌｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ”、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，７７：１０８０−１０８４，Ｄｅｃ．１９９２およびＷ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈなどの“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｉ−ｄｏｓｅ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ｏｎ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｃｅｌｉｔｅ  ａｎｄ  Ｋａｏｌｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  Ｏｐｅｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ”、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，８８：６７９−６８９，Ｏｃｔ．１９９５がある。これら文献におけるカオリン活性化ＡＣＴの検討結果は、カオリン試薬はいずれもＡＣＴに使用した場合同様に働くという仮定に基づいているように考えられる。また、各文献は、ただ一種のカオリンを使用した、市販品カオリンＡＴＣまたは特化されたカオリンＡＣＴの検討が記載されているが、ヘパリン存在下でカオリン源やカオリン純度がカオリンＡＣＴ結果の安定度にどのように寄与しているかの議論はない。
【０００９】
本発明者等の本来の目的は、ＣＰＢ手術時にアプロチニンを使用するさいに、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒに適用できるカオリンＡＣＴを開発することであった。既知の情報に基づき、この開発努力は成果を生むだろうと最初に仮定した。最初にカオリンとして使用したものは、ＵＳＰ級のカオリン、すなわちケンタッキー州のＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ．のパートＮｏ．５６４５カオリンで、他の市販カオリンＡＣＴ試験において所望のヘパリン投与反応を生じる濃度で使用した。このカオリンをアプロチニン安定性について試験したところ、予期しない結果が認められた。すなわち、このカオリンＡＣＴは、カオリンＡＣＴについて知られていた挙動ではなく、むしろセライトＡＣＴと同様な挙動を示した。ヘパリンが存在した場合、アプロチニンによってＡＣＴ結果が出るまでの時間がかなり長くなった。また、それ以降の研究により、カオリン活性化ＡＣＴ試験は、カオリン源およびカオリン純度に大きく依存することが判明した。
【００１０】
この研究から別の予期しないことも判明した。すなわち、カオリンＡＣＴ結果のアプロチニンによる変動は、個人差が大きいことである。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｄｙｎｅ製のＡＣＴ試験用カオリンを使用すると、ヘパリン化血液のＡＣＴ試験結果は、大半のサンプルについてアプロチニンの影響を受けなかった。ところが、通常の母集団から採取した血液サンプルのうちほぼ１０％において、ヘパリン化血液のＡＣＴ試験結果が出るまでの時間がアプロチニンによって長くなった。これは、非常に重要である。というのは、アプロチニンが存在する場合に、ＡＣＴ結果が出るまでの時間が長い、ヘパリン化血液サンプル患者のヘパリン摂取量が大幅に低くなるからである。これら患者は、過小ヘパリン化とその後に生じるＣＰＢ回路の詰まりの恐れが高い。カオリンＡＣＴに関する既知の特性データは、サンプル平均と標準偏差のみである。換言すれば、この統計分析は、サンプル母集団のごく一部で発生する患者個人間の変動性を無視している。以下、アプロチニン存在下のカオリンＡＣＴ特性についてさらに詳しく説明する。
【００１１】
アプロチニンの製造メーカーは、アプロチニンがＡＣＴ系ヘパリン管理にとって危険であることを認識している。アプロチニン製薬の折込には、ＣＰＢに使用する場合、セライトＡＣＴまたはカオリンＡＣＴそれぞれは７５０秒または４８０秒の最短時間で使用する旨の注意書きがある。また、この折込には、ＡＣＴ試験とは別に、次の２つの方法のうちいずれかを使用して、ヘパリンをモニターすべき旨の注意書きもある。第１の方法は、患者の体重およびＣＰＢ時間に基づいて一定の投与量でカオリンを投与する方法であるが、これは古く、ヘパリン管理にとっては精度の低い方法である。第２の方法は、プロタミン滴定を使用してヘパリンレベルを測定する方法である。いずれの方法も、容易さ、信頼性および便利さについてＡＣＴ測定には及ばない。加えて、プロタミン滴定方法は、操作コストが＄１５０ほど高くなる。
【００１２】
さらに、患者の抗凝血状態の評価精度については、血液に存在するヘパリンのレベルを測定することは、ＡＣＴを測定することに及ばない。ヘパリンは、間接的な抗凝血剤であり、血液そのものに存在する抗凝血剤で、アンチトロンビンＩＩＩとも呼ばれているアンチトロンビンと結合して始めて効果をもつ抗凝血剤である。ヘパリンがアンチトロンビンに結合すると、アンチトロンビン単独よりもはるかに強力な抗凝血剤になる。ある種の患者、すなわちアンチトロンビンレベルの低い患者は、ヘパリンに対して感受性がないか、耐性をもつ。従って、単にヘパリンのレベルを測定するだけでは、患者の効力のある抗凝血状態を判断するには十分ではない。一方、ＡＣＴ試験は血液の全抗凝血作用を判定できるため、ヘパリン抗凝血作用療法の管理するのに有効である。
【００１３】
Ａｒｒａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ社は、カオリン、セライトおよびガラスビーズを含む標準物質の混合物を使用するＭＡＸ−ＡＣＴと呼ばれるＡＣＴ試験剤を製造している。この剤の目的は、因子ＸＩＩ活性を最大化することである。この剤は、検討したところ、特性が市販のカオリンＡＣＴ剤と実質的に等価であることが判明した。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
理想的なＡＣＴ試験剤は、ヘパリンのみが影響する投与量反応関係をもつ。高いＡＣＴ結果は、循環ヘパリンの濃度が高いことを示す。現在使用されているＡＣＴ剤は、アプロチニンを併用する場合、理想的なＡＣＴ特性には程遠い。ヘパリンおよびアプロチニンを併用する患者から見た場合、ヘパリンはＡＣＴ結果が出るまでの時間を長くするもので、アプロチニンは試験結果が出るまでの時間をさらに長くするものである。従って、アプロチニンが存在する場合、現在使用されているＡＣＴ試験結果は、ヘパリン抗凝血作用のレベルを示すものではなく、患者を不十分かつ安全ではないヘパリン投与の危険にさらす恐れがある。アプロチニンとヘパリンを併用すると、セライト試験は結果が出るまでの時間が、ヘパリン単独の場合よりもかなり長くなる。また、カオリンＡＣＴ試験の特性は、アプロチニンが存在すると、一貫性を欠く。ある種のカオリン剤は、セライトＡＣＴ試験剤と同様な特性を示すが、アプロチニンおよびヘパリンが存在すると、ヘパリン単独の場合よりも結果が出るまでの時間がかなり長くなる。さらに、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが使用しているカオリンを含む他のカオリン活性化ＡＣＴ試験も、ヘパリンおよびアプロチニンの両者が存在すると、結果にバラツキが発生する。大半の血液サンプルにおいて、アプロチニンはＡＣＴにほとんど影響を示さないが、これら以外のサンプルにおいては、アプロチニンが存在すると、ＡＣＴ時間がかなり長くなる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが使用しているカオリンＡＣＴ剤を使用した場合、この試験租剤を使用するアプロチニンに対してたまたま感受性のない血液サンプルでもＡＣＴ試験結果が出るまでの時間が長くなるが、これはもっぱらヘパリンを理由とするもので、一方アプロチニンに感受性のある他の血液サンプルの場合、ＡＣＴ試験結果が出るまでの時間が長くなる理由は、ヘパリンとアプロチニンとの相乗作用である。従って、現在製造されているカオリンＡＣＴ試験結果は、カオリンＡＣＴを使用した場合にヘパリンの存在下でアプロチニンに対して強い感受性を示す各患者にとってヘパリン抗凝血作用の測定精度が非常に低い。このように、大半の患者からみてアプロチニンの影響をほとんど受けないＡＣＴ剤があれば、これはＣＰＢ手術における抗凝血作用の安全性を改善することになる。
【００１５】
すなわち、アプロチニン剤の有無にかかわらず抗凝血作用ヘパリンに対してバラツキのない反応を与える改良活性化クロッティング時間剤および異なる活性化剤のアプロチニン感受性を定量化して、アプロチニン感受性特性を評価できる方法を提供できるならば、これはきわめて有利である。
【００１６】
本発明の第１の目的は、アプロチニン剤によって変わることのない、ヘパリンの抗凝血作用を特性化するために有効なインビトロ診断試験方法を提供することである。
【００１７】
本発明の第２の目的は、ヘパリンの抗凝血作用を特性化するために、現在広く使用されている試験と同様な試験結果を与えるインビトロ診断試験方法を提供することである。
【００１８】
本発明の第３の目的は、あるサンプル母集団について平均値を与えるのではなく、ある広い範囲の個人について、アプロチニンの有無に関係なく、ヘパリンの存在下でバラツキのない等価な結果を与えるインビトロ診断試験方法を提供することである。
【００１９】
本発明の第４の目的は、アプロチニンの有無に関係なくヘパリンの抗凝血作用を特性化し、あるサンプル母集団の平均的特性および異なる活性化剤に対する患者個々の変動性の両者を表し、多くの割合の患者個々について正確なヘパリン抗凝血作用管理を実現できるインビトロ診断試験を対象とする、異なる活性化剤の特性を評価する方法を提供することである。
【００２０】
本発明は、ヘパリン化血液サンプル中のアプロチニンの存在に対する感受性の低い、インビトロ診断試験剤に関する。試験には、血液サンプル容器、接触活性化物質、攪拌棒などの任意の混合装置および生成した血餅を検出する手段が必要である。本発明の開発時には、コロラド州モリソンのＳｉｅｎｃｏ、Ｉｎｃ．により製造され、ＵＳＰ５，０１６，４６９、同５，１３８，８７２および同５，８９５，８４２に記載されている従来装置であるＳｏｎｏｃｌｏｔ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ＆Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、血餅形成プロセスをモニターするとともに、ＡＣＴ結果の測定を自動化した。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用すると、ＡＣＴ結果が得られるとともに、図２に示すように、血餅形成プロセス全体を通して生じる粘土変化をモニターするグラフが得られる。この装置は、研究に有用である。というのは、血餅形成プロセス全体に関する情報が得られるだけでなく、試験一回につき必要な血液が少量で済むからである。ニュージャージー州フランクリンレーキのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製の集合管(パートＮｏ．３６６４１５)を使用して多数の正常な被験者から集めたクエン酸処理全血サンプルを使用して、血餅形成試験を行なった。各ＡＣＴ試験につき０．３３０μＬのクエン酸処理全血、０．０１７μＬの０．２５ＭＣａＣｌ２、ヘパリンおよび活性化剤を使用した。血液サンプルを試験直前に３７℃に加熱した。３００〜６００秒間にある対照ＡＣＴを実現できるようにヘパリンの量を調節した。
【００２１】
図１に、ＳｏｎｏｃｌｏｔｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した血餅形成試験により得られたＡＣＴ曲線(曲線)を示す。この試験により、以下Ｓｏｎｏｃｌｏｔによる曲線と呼ぶ代表的なグラフ１０が得られる。このＳｏｎｏｃｌｏｔ曲線グラフのｙ軸は、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒによる測定粘度で、ｘ軸は時間である。測定粘度の単位はＣｌｏｔ  Ｓｉｇｎａｌで、血液サンプルについて得られた代表値に対して正規化した単調な粘度スケールである。測定時間の単位は分である。これら代表的なＳｏｎｏｃｌｏｔ曲線は、異なる血流遮断相に対応する別な相をもつ。液相１１は、最初に見られるＳｏｎｏｃｌｏｔ曲線の比較的平坦な部分である。血餅が形成し始めると、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線は点１２で立ち上がり始める。血餅形成開始時点が、例えば単位が秒のＡＣＴである。領域（１３）は、血液サンプル中のフィブリノゲンがフィブリンゲルに転化するときの相に対応する。さらに進むと、領域１４および１５で示すように、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線が、例えばフィブリンゲルを成熟血餅に変える血小板の作用により生じる粘度変化の相になる。血小板の作用に関係する相により、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線が領域１４に示すように立ち上がり、あるいは領域１５に示すように立ち下がる。
【００２２】
図２に、２つのＳｏｎｏｃｌｏｔ曲線２０、２２を示す。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線２０は、ヘパリン誘導抗凝血作用のないサンプルのものである。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線２０は、血餅が点２１で形成し始める時間で、１２５秒である。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線２２は、ＣＰＢ手術の安全な実施に十分なヘパリンを含有するサンプルのものである。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線２２のＡＣＴは、点２３で血餅が形成し始める時間で、５００秒である。ヘパリンのため液相時間が長く、ＡＣＴ結果が得られるまでの時間も長い。
【００２３】
図３に、アプロチニンがセライト活性化ＡＣＴ結果にどのように影響するかを示す。ヘパリンを含有する血液サンプルを使用して、Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線を発生する。点３１で４８０秒のＡＣＴ結果が得られる。ほぼ３００ＫＩＵ/ｍＬのレベルになるようにアプロチニンを添加した同じヘパリン化血液サンプルを使用して、Ｓｏｎｏｌｏｔ曲線３２を得た。Ｓｏｎｏｃｌｏｔ曲線３２上の点３３で８４０秒のＡＣＴ結果が得られた。アプロチニン添加により、ＡＣＴ結果は４８０秒から驚くべきことに８４０秒になった。本発明の一つの目的は、ＡＣＴ結果へのアプロチニンの影響を軽減することである。
【００２４】
試行錯誤法を使用して、本発明の好ましいサンプル剤を開発した。ヘパリン化血液サンプルに関するＡＣＴ結果と、制御された量のアプロチニンを添加した等価な血液サンプルに関するＡＣＴ結果とを比較することによって、異なる活性化剤を評価した。異なる活性化剤を比較する定量化のために、以下の関係を利用した。
【００２５】
アプロチニン感受性＝１００（ＡＣＴ（ヘパリン＋アプロチニン）−ＡＣＴ（ヘパリン）/ＡＣＴ(ヘパリン)）
【００２６】
アプロチニンの使用量は、３６μＬアプロチニンストック（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製Ｔｒａｓｙｌｏｌ(登録商標)、パートＮｏ．００２６−８１９７−６３）/全血１ｍＬであった。このアプロチニン量は、例えば高投与アプロチニン管理プロトコルにおいてみられる量より僅かに多い。異なる被験者間のアプロチニン感受性にかなりのバラツキが認められたので、アプロチニン感受性インデックスの評価には、多数の血液サンプルについて統計分析が必要である。
【００２７】
ここで、あるＡＣＴ剤の品質は、アプロチニン感受性結果の２つの統計特性に依存する。第１に、アプロチニン感受性の平均値はほぼ０％でなければならない。すなわち、ＡＣＴ剤がアプロチニンの存在下でほとんどバイアスをもたないことを意味する。第２に、アプロチニン感受性の範囲が狭くなければならない。すなわち、ＡＣＴ剤がすべてのサンプルについてバラツキのない結果をあたえなければならないことを意味する。この分析には、平方偏差または標準偏差も使用することができるが、推奨できない。というのは、患者母集団のアプロチニン感受性に関する分布関数は、双峰であり、正規な分布に従わないからである。
【００２８】
アプロチニン感受性特性の基準として、本発明者らは、セライト、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ．製のＵＳＰ級カオリン、パートＮｏ．５６４５（カオリン＃１）、およびカオリンＡＣＴ試験においてそのカオリンと同様な挙動を示し、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のカオリン（カオリン＃２）の特性を測定した。これら結果を表１にまとめる。
【００２９】
表１
アプロチニン感受性        平均            範囲
セライト                １１９％    ８１％〜３３３％
カオリン＃１            １１３％    ５６％〜１８２％
カオリン＃２            ３４％      −７％〜２１０％
【００３０】
表１の結果から、現在使用されているＡＣＴ剤はアプロチニンの影響が大きいことがわかる。セライトおよびカオリン♯１の場合、平均アプロチニン感受性は１００％を僅かに超え、ＡＣＴ結果が得られるまで時間がアプロチニンによってかなり長くなることがわかる。カオリン♯２の場合、平均アプロチニン感受性が３４％で、ＡＣＴ結果への平均的なアプロチニンの影響が小さいことがわかる。ところがカオリン♯２では、アプロチニン感受性の範囲が非常に広い。一部のサンプルでは、アプロチニンの存在は有意味な影響をもたない（アプロチニン感受性＝−７％）が、一部のサンプルでは、アプロチニンの存在によってＡＣＴ結果が得られるまでの時間が３００％以上の長くなる（アプロチニン感受性＞２００％）。いずれの剤も、アプロチニン感受性結果は、アプロチニンを含有するヘパリン化血液サンプルの安全かつ有効なＡＣＴに関する現在の設計構成を満足しない。このため、本発明では、０％に近い平均アプロチニン感受性を実現するとともに、アプロチニン感受性結果の狭い範囲をもつ活性化剤について検討を行なった。
【００３１】
本発明では、好適な活性化剤について、検討をカオリンから始めた。というのは、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製のＵＳＰカオリンとＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが使用しているカオリン活性化剤との間には、アプロチニン感受性結果において有意味な相違が認められたからである。一部の特性変動がカオリン源に基づくのではないかと考えて、異なる２０のカオリンサンプルを採取した。これら２０種類のカオリンのうち、２種類のカオリンのみが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＴｅｃｈｎｉｄｙｎｅのカオリンＡＣＴ試験と同様な低いアプロチニン感受性を示した。
【００３２】
カオリンサンプルの広い範囲の活性化特性に関して考えられる原因を調べるために、カオリンサンプルの不純物について検討を行なった。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ製のカオリンを含む２０種類のカオリンサンプルすべてについて、屈折により結晶構造を調べることにより粘度の組成を決定するエックス線回折法を使用して分析した。エックス線回折分析は、コロラド州ボウルダーのＵ．Ｓ．Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ＳｕｒｖｅｙでＳｉｅｍｅｎｓ  Ｄｉｆｆｒａｃ  ５０００を使用して実施した。結果は、図４Ａ−Ｃのグラフに示すように、屈折パターンとして記録した。これらグラフにおいて、異なる粘度好物は異なる特性曲線をもつ。図４Ａのグラフ４０は、ヘパリンの存在下でＡＣＴ結果が得られるまでの時間がかなり長くなったＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔカオリンのグラフである。このグラフの特性ピーク４１は、純粋なカオリンのものである。図４Ｂのグラフ４２は、ＡＣＴ結果へのアプロチニンの影響が小さく、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のカオリンＡＣＴに使用されているカオリンと同様な挙動を示すカオリンサンプルの屈折パターンである。グラフ４２は、純粋なカオリンの特性ピーク４１を示す上に、このカオリン中のイライト不純物の特性である低いピーク４３を示す。なお、イライトは、鉱物組成がカオリンと異なる粘度の一種である。
【００３３】
図４Ｃのグラフ４４は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ製のカオリンＡＣＴに使用されているカオリンの屈折パターンを示す。このグラフに示したパターンは、カオリンピーク４２に加えてイライト不純物ピーク４３を示す。ＮＪ州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｏ．製のカオリンについてもその屈折パターンを得た。なお、イライト不純物を含有する他のカオリン粘度の屈折パターンとほぼ同じであるため、Ｂａｋｅｒカオリンの屈折パターンについてはこれを図示していない。イライト不純物を含有するこれら２つのカオリンサンプルは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅによって使用されているカオリンとほぼ等価な特性を示した。平均的なカオリン特性がアプロチニンによって実質的に影響を受けないことを示した前記Ｗａｎｇの研究でも、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｏ．製のカオリンを使用していた。
【００３４】
イライト不純物を含有するカオリンを使用して得た本発明者らのＡＣＴ結果では、平均特性は、ヘパリン化サンプル中のアプロチニンによって実質的に影響を受けなかった。なお、被験者からの一部の血液サンプルでは、ヘパリンの存在下アプロチニンの有意味な影響が認められた。イライト不純物を含有するカオリンを使用したＡＣＴ試験結果は、双峰を示す統計分布関数をもつものと考えられ、大半のサンプルはアプロチニンの影響がなく、その他のサンプルがアプロチニンの強力な影響を受ける傾向がある。正規分布関数に適用できる従来の統計手法は、双峰をもつ分布関数には当てはまらない。
【００３５】
図５は、アプロチニンが存在すると安定性を欠く天然由来のイライト不純物を含有するカオリンを用いて試験した１種の血液サンプルの場合である。曲線５１は、イライトを含んだカオリンを使用したヘパリン化血液サンプルの曲線であり、曲線５２は、同じヘパリン化血液サンプルの曲線であり、アプロチニン以外の活性化剤を添加した。この特別な血液サンプルは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｏ．製カオリンおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｌｅｄｙｎｅ製カオリンＡＣＴ中のカオリンを含む、被試験カオリンすべてについて高いアプロチニン感受性を示した。この結果は、一部の血液サンプルの場合、天然由来のイライト不純物を含有するカオリンに対して高いアプロチニン感受性をもつことを示すものである。
【００３６】
異なる２０種類のカオリンに関する本発明者らの検討結果を次にまとめる。イライト不純物を含有しない純粋なカオリンを使用したＡＣＴ試験結果は、試験結果の得られるまでの時間が、ヘパリンが存在すると、アプロチニンの影響でかなり長くなるが、イライト不純物を含有するカオリンの場合、ほとんどの被験者について、ヘパリンが存在してもアプロチニンの影響を受けない。なお、一部の血液サンプルの場合、天然由来のイライト不純物を含有するカオリンを使用したＡＣＴ試験結果は、ヘパリンが存在すると、アプロチニンの影響が大きい。
【００３７】
活性化剤開発過程でのこの時点で、本発明者らは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ製カオリンＡＣＴと実質的に等価な特性を示すＡＣＴ試験法を開発するのに十分な知見をもつことになった。これが、本発明による開発の本来の目的であったが、ほかに、アプロチニンの影響を受けることが最も少ないカオリンを使用したカオリンＡＣＴの特性でも、ある一部の患者については、アプロチニンの存在下におけるヘパリン抗凝血作用の指標として正確な結果が得られない場合があることも突き止めた。ＡＣＴが長くなると、安全性に関してヘパリン化が不十分になる恐れがあるため、現在使用されているカオリンＡＣＴよりアプロチニンの影響が少ないＡＣＴ活性化剤を開発することになった。
【００３８】
このため、次の段階として、活性化剤としてのイライトの効用について検討を行なった。異なるイライト源からの異なる数種類のイライトを試験した。ＡＣＴ試験用活性化剤としてのイライトの特性は、そのイライト源に依存することがわかったが、いずれのイライトサンプルも許容できないＡＣＴ結果になった。すなわち、活性化剤としてイライトのみを使用した場合、生成した血餅は脆弱で、現在使用されているＡＣＴ試験とは全く異なる結果になった。このように、イライト単独は、活性化剤としては不合格であることがわかった。
【００３９】
次に、純粋なカオリンにイライトを添加したもの、およびカオリン＋天然由来のイライトにイライトを加えたものについて試験した。これら活性化剤は、アプロチニン感受性が若干低かったが、カオリン＋イライト試験では、ヘパリン単独と比較した場合、ある一部の患者には、ヘパリンおよびアプロチニンの両方が存在すると、遅れが認められた。セライト、カオリン、その他の粘度鉱物をイライトと異なる組み合わせで併用した試験も行なった。いずれのイライト活性化剤も、アプロチニンの存在下におけるヘパリン化サンプルのＡＣＴ特性を改善するものではなかった。
【００４０】
イライトの研究から、異なる粘土構造は、異なる特性を示し、またヘパリンが存在すると、アプロチニンに対して異なる感受性を示すことが認められた。従って、本発明者らは、類似の物理特性および化学組成をもつが、構造や化学作用が微妙に異なる幾つかの異なる粘土鉱物に検討を広げた。すなわち、ケツ岩、ディッカライト、レクトライト、イライト、カオリン、ベントナイト、モンモリロナイトすべてについて検討を行なった。これら各粘土物質は、イオン交換能および吸水性が異なっている。これら鉱物のうちイオン交換能が最大なのは、ベントナイトである。また、ヘパリン化血液のベントナイトＡＣＴ試験結果は、アプロチニンの影響をほとんど受けないことがわかった。
【００４１】
次に、本発明者らは、ベントナイトの量を変え、ＳｉｅｎｃｏのセライトＡＣＴ（パートＮｏ．８００−０４３２）と同等なＡＣＴ結果が得られるかについて検討した。代表的な結果を図６に示す。曲線６０は、ＳｉｅｎｃｏのセライトＡＣＴ試験を使用したヘパリン化血液サンプルの場合である。曲線６１は、１．２ｍｇのベントナイトを使用した、最短のベントナイト活性化ＡＣＴ結果を示す。曲線６４は、これより少ない量、０．０４ｍｇのベントナイトを使用した、非常に長いＡＣＴ結果を示す。曲線６２は、１．６ｍｇのベントナイトを使用した、曲線６１より時間が長い結果を示す。曲線６３は、２．０ｍｇのベントナイトを使用した、曲線６１または６２により時間が長い結果を示す。これら結果から、セライトの活性化特性に一致するＡＣＴ試験結果を実現できるようにベントナイトの量を調節することは不可能で、活性化時間は、活性化剤の量に対して必ずしも線形関係にはないことがわかった。
【００４２】
多数の活性化剤を試験し、数百の試験を行なった結果から、異なる粘土鉱物を併用すると、ヘパリンの量に感受性を示すと同時に、アプロチニンの存在に対しては感受性のないＡＣＴ試験結果が得られることがわかった。また、選択した活性化剤の濃度を変えることによって、ＡＣＴ活性化剤のアプロチニン感受性を実質的に取り除くことができる知見も得た。例えば、図７に、ケツ岩をセライトＡＣＴに添加した場合に得られるアプロチニン感受性の低下を示す。図７の曲線を得るために、各試験で２ｍｇのセライトを使用し、各試験間でケツ岩の添加量を変えた。曲線７０は、ヘパリン化血液サンプルを使用して行なった、ケツ岩を添加しないセライト対照例である。曲線７１、７２、７３および７４は、曲線７０と同じ量のセライトを使用し、アプロチニンを含有した結果である。曲線７１、７２、７３および７４の場合には、それぞれ異なる量の、すなわち０．０８ｍｇ、０．１６ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．３２ｍｇのケツ岩を使用した。これら曲線から理解できるように、ケツ岩のアプロチニンに対する中和作用は投与量に依存する。図７の最も高いケツ岩レベルでは、曲線７４は曲線７０におけるセライト反応に近くなっている。
【００４３】
検討過程のこの時点で、粘土鉱物を注意深く選択すると、所定のヘパリン投与反応と低アプロチニン感受性を同時に実現できる活性化剤を見出すことができることが確認できた。現在使用されている活性化剤との代替可能性について、所望の目標ＡＣＴヘパリン投与反応が現在使用されているＳｉｅｎｃｏのセライトＡＣＴ（パートＮｏ．８００−０４３２）の投与反応と対応していなければならないことを確認した。従って、接触活性化剤に好適な鉱物をセライトとし、また同様にベントナイトについても接触活性化剤に好適な鉱物としたが、他の鉱物も潜在的な可能性をもつものである。
【００４４】
さらに続けた試験の結果から、好ましい活性化剤として、ニューヨーク州ニューヨークのＣｈａｒｌｅｓ  Ｂ．Ｃｈｒｙｓｔａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．製のベントナイト３．７５ｍｇ、およびカリフォルニア州サンタバーバラのＷｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｉｎｃ．製の３．０ｍｇのセライト３１５を選択した。なお、この量は全血サンプル１ｍＬに対しての量である。また、この好ましい活性化剤は、本試験の設計対象ではないＳｏｎｏｃｌｏｔ曲線の血餅収縮相を示すことが認められた。好ましい活性化剤を使用する個々のＡＣＴ試験については、乾燥充填法で行なった。分析用秤を使用して、各活性化剤を個別に秤量し、各試験キュベットに入れた。攪拌棒をキュベットに挿入し、プラスチックのふたをキュベットにかぶせた。試験の直前に、硬い表面の上で数回タッピングし、血液サンプルに活性化剤粉末を再懸濁し、キュベットの底部に粉末が確実に位置するようにした。以下の表２に、前記のセライト活性化剤およびカオリン活性化剤と比較した、好適な活性化剤の特性をまとめる。
【００４５】
表２
アプロチニン感受性      平均          範囲
セライト              １１９％    ８１％〜３３３％
カオリン♯１          １１３％    ５６％〜１８２％
カオリン♯２            ３４％    −７％〜２１０％
好適な活性化剤          −２％    −１０％〜８％
【００４６】
好適な活性化剤の平均アプロチニン感受性は２％で、これは０％の完全平均に統計学的に匹敵する値である。アプロチニン感受性結果の範囲は、１０％〜８％であった。この範囲は、二重ＡＣＴ試験の正規統計変動に匹敵するものである。この特性は、アプロチニンに感受性のないＡＣＴの理想的な特性目的に対して統計学的に等価である。活性化剤では、アプロチニン感受性の活性化または低下に使用する粘土鉱物の種類および量は変えることができる。
【００４７】
図８に、ヘパリン化血液サンプルに対する好適な活性化剤の特性を示す。曲線８０および８１はＳｉｅｎｃｏのセライト活性化ＡＣＴを使用した対照である。曲線８１の場合、アプロチニンを含有し、アプロチニン存在下のヘパリン化血液に対するセライトＡＣＴ試験に伴う時間の長い代表的なＡＣＴ結果を示す。曲線８２および８３は、好適な活性化剤の場合を示す。曲線８２は、アプロチニンのない場合を示す。曲線８３は、アプロチニンが存在する場合を示す。ＡＣＴ試験からみて、曲線８０、８２および８３は実質的に等価である。この例は、この血液サンプルについては、活性化およびアプロチニン感受性に関する設計目的の両方が実現できたことを示す。また、天然由来のイライト不純物を含有したカオリンＡＣＴに対して高いアプロチニン感受性をもつ個人から採取した血液サンプルの場合には、アプロチニン感受性が低下したことも示す。患者母集団に関して実際のアプロチニン感受性特性をより完全に評価するためには、より大きな患者母集団について統計学的研究をより詳しく行なう必要がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】全血に対して行なったセライト活性化試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図２】全血およびヘパリン化全血に対して行なったセライト活性化試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図３】アプロチニンを含有した、あるいは含有しないヘパリン化全血に対して行なったセライト活性化試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図４Ａ】純粋なカオリンに関するエックス線回折グラフである。
【図４Ｂ】天然由来のイライト不純物を含有するカオリンに関するエックス線回折グラフである。
【図４Ｃ】従来のＡＣＴ試験で使用されているカオリンに関するエックス線回折グラフである。
【図５】アプロチニンの存在または不在下のヘパリン化全血に対して行なった、天然由来のヘパリン化活性化カオリン試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図６】ヘパリン化全血に対して行なった、ベントナイト活性化試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図７】アプロチニン存在下のヘパリン化全血に対して行なった、セライトおよび血岩活性化試験より得られたＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図８】アプロチニンの存在または不在下のヘパリン化全血に対して行なった、セライト活性化試験またはセライト＋ベントナイト活性化試験により得たＡＣＴ曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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