(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩を、一つ以上の不活性で、非毒性かつ薬学的に許容しうる添加剤と組み合わせて含有する、関節症の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項２】
塩化ストロンチウムを、一つ以上の不活性で、非毒性かつ薬学的に許容しうる添加剤と組み合わせて含有する、関節症の予防及び治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、関節症の予防及び治療を目的とする医薬組成物としてのストロンチウム塩の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ストロンチウム塩の治療目的での使用はすでに、多くの刊行物及び特許の主題となっている。例えば、米国特許第４，１５２，４３１号明細書には、炎症の治療に使用することのできるアルカリ金属塩が記載されている。ＷＯ−Ａ−９４／０９７９８は、皮膚疾患の治療に有効である各種金属の硫酸錯体を示している。Olle Svensson ら（Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand., Sect. A, 93, (1985), 115-120)による研究では、ストロンチウムが、くる病のある種の症例において役割を果たしていることが示されている。
【０００３】
【発明の実施の態様】
本出願人は、今や、無機又は有機塩の形のストロンチウムが、顕著な薬理学的特性を有することを発見し、関節症の予防及び治療において非常に有用な用途を有することを見いだした。
【０００４】
ストロンチウム塩が、ヒト軟骨細胞によるプロテオグリカン及びII型コラーゲンの合成を刺激することが、実際に発見された。
【０００５】
これらの分子は、細胞外軟骨マトリックスの主要な２成分である。組織に機械的特性をもたらすのは、繊維状コラーゲンネットワーク内における高濃度のプロテオグリカンの組み合わせである。
【０００６】
プロテオグリカンの合成と分泌は、加齢と共に低下するため、ストロンチウム塩は、関節症の予防及び治療の分野において、非常に興味深い。このため、ストロンチウム塩は、この疾患の初期相に現れる修復のプロセスにおいて、特に有効である。
【０００７】
本発明は、特に、関節症の予防及び治療を目的とする医薬組成物としての有機又は無機酸の二価のストロンチウム塩の用途に関する。
【０００８】
ストロンチウムを塩として本発明の塩を得るために使用する無機酸としては、詳細には、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸及びリン酸が、挙げられる。
【０００９】
ストロンチウムを塩として本発明の塩を得るために使用する有機酸としては、詳細には、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ショウノウ酸、及びクエン酸、並びに２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸が、挙げられる。
【００１０】
本発明は、例として以下に記載するストロンチウム塩の本発明による用途に関するが、これらに限定されるものではない。
１）２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩；
２）クエン酸ストロンチウム；
３）ショウノウ酸ストロンチウム；
４）エタンスルホン酸ストロンチウム；
５）メタンスルホン酸ストロンチウム；
６）コハク酸ストロンチウム；
７）乳酸ストロンチウム；
８）シュウ酸ストロンチウム；
９）グルコン酸ストロンチウム；
１０）フマル酸ストロンチウム；
１１）マロン酸ストロンチウム；
１２）マレイン酸ストロンチウム；
１３）リンゴ酸ストロンチウム；
１４）酒石酸ストロンチウム；
１５）リン酸ストロンチウム；
１６）炭酸ストロンチウム；
１７）硝酸ストロンチウム；
１８）硫酸ストロンチウム；
１９）塩化ストロンチウム。
【００１１】
本発明の好ましいストロンチウム塩は、２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩であり、ＥＰ−Ｂ−０４１５８５０号には、その抗骨粗鬆症特性と、皮膚及び血管の老化、肝疾患、並びに歯科疾患の治療におけるその用途が記載されている。
【００１２】
関節症は、解剖学的には、関節軟骨の初期及び一次性破壊を特徴とする。
【００１３】
正常条件下では、軟骨の更新、代謝は、軟骨細胞による吸収相と、これを直接的に代償する、同じ軟骨細胞による形成相からなる、非常に緩徐なプロセスである。
【００１４】
病理学的条件下では、軟骨の更新、代謝は亢進され、早期の軟骨修復反応が起き、細胞の代償不全と軟骨の分解が、それに続く。修復反応は、軟骨細胞のクローン性増殖と、軟骨のマトリックス成分の合成増大によるものである（D. Hamerman ら、N. Eng. J. Med., (1989), 320 (20), 1322-1330）。
【００１５】
この恒常性反応は、適当ではなく、その分泌が加齢と共に低下する全身ホルモンと成長因子に依存している。軟骨吸収は、隣接する組織によって産生される酵素と遊離ラジカルによって調節されるが、また特に軟骨細胞自体によっても調節される。
【００１６】
したがって、軟骨細胞の代謝、つまり軟骨形成と軟骨吸収の両方に作用することを可能とする医薬組成物を得ることが特に好都合である。
【００１７】
これらの医薬組成物は、経口、非経口、経皮、鼻腔内、直腸内、又は経舌径路による投与に適した剤型、そして特に注射用液剤、錠剤、舌下錠、グロセット剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、口内錠剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、皮膚用ゲル剤などの剤型で提供することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、ストロンチウム塩に加えて、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、吸収剤、着色料、甘味料などから選択される一つ以上の添加剤を含有することができる。
【００１９】
添加剤としては、例えば以下の成分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
希釈剤用：乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリセリン；
滑沢剤用：シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール；
結合剤用：ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びポリビニルピロリドン；
崩壊剤用：寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、飽和剤。
【００２０】
有用な用量は、患者の性別、年齢及び体重、投与径路、状態の特性、及び関連する治療法に応じて変化させることができ、２４時間当たりストロンチウムとして２５mg〜３ｇ、例えば２４時間当たりストロンチウムとして１００mg〜２ｇの間とすることができる。
【００２１】
【実施例】
以下に記載する実施例は、本発明を説明するものであるが、いかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
薬理学的研究
実施例Ａ：軟骨細胞の代謝に対する本発明のストロンチウム塩の効果に関する研究
Ａ）方法
ａ）ヒト軟骨細胞の培養
軟骨細胞の表現型を保存するために、軟骨細胞を短期間培養した。この方法では、死亡直後のヒトの死体の膝から、軟骨を除去した。石灰化層を避けながら、表層及び中央層の切除を行った。軟骨を切断して小片とし、酵素による消化に付した。次に、軟骨断片を、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ、そしてコラゲナーゼにより連続的に処理した。まず、軟骨片を、あらかじめダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ICN Biomedical）に溶解しておいたヒアルロニダーゼ（０．５mg/ml ；酵素溶液１０ml当たり軟骨３ｇ）と共に３７℃で３０分間、規則的に撹拌しながら（１分間当たり２００回転）インキュベーションした。
次に、軟骨断片を、プロナーゼ溶液（ＤＭＥＭ中１mg/ml ；酵素溶液１０ml当たり軟骨３ｇ）に入れ、３７℃で１時間酵素と共にインキュベーションした。
次に軟骨断片を、１％Ultrosser G （Gibco, Gand, Belgium）を含有するＤＭＥＭに溶解したコラゲナーゼ（１mg/ml ；酵素溶液１０ml当たり３ｇ）と共に、３７℃で２０時間、規則的に撹拌しながら（１分間当たり２００回転）インキュベーションした。細胞を、ナイロンチュール（孔の直径：２５μm)で濾過し、３回洗浄し、計数（研究の範囲に応じて、１×１０6 〜５×１０6 個/ml の範囲の数）し、次に適当な培養培地に再懸濁した。このように細胞を、旋回ミキサー中、規則的に撹拌しながら（１分間当たり１００回転）、空気９５％と二酸化炭素５％からなる雰囲気下で、懸濁液中に保持した。細胞と上清を遠心分離（１０００回転／分を５分間）により分離した。細胞凝集物と上清を−２０℃で保存した。
【００２２】
ｂ）軟骨細胞培養物の処理
軟骨細胞（約１．５×１０6 個/ml)を、試験を行うストロンチウム塩の非存在下、又は存在下（１０-4M 、５×１０-4M 及び１０-3M の濃度）で、２４、４８及び７２時間培養した。試験化合物の各濃度と対応する対照について、３個の培養フラスコからなる１バッチを用いた。それぞれのフラスコには、軟骨細胞約１〜１．５×１０6 個を含有させた。実験は、２人の異なるドナーについて、２回行った。上清及び細胞相において、プロテオグリカンとII型コラーゲンを測定した。
【００２３】
ｃ）検討したパラメーター
１．軟骨形成パラメーター
ＩＴＳ＋１％とアスコルビン酸塩５０μg/mlを補給したＤＭＥＭ中で培養を行った。ＩＴＳ＋には、インスリン６．２５μg/ml、トランスフェリン６２５μg/ml、セレン６．２５μg/ml、ウシ血清アルブミン１．２５mg/ml 、及びリノール酸５３５μg を含有させた。あらかじめプロテアーゼ阻害剤を補給した上清中で、プロテオグリカンとII型コラーゲンを直接測定した。測定前に、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で、超音波解離（１０秒間の３パルス）によって、細胞凝集物をホモジナイズした。本研究で使用したプロテアーゼ阻害剤は、６−アミノヘキサン酸（０．１M)、塩酸ベンズアミジン（０．０５M)、トリプシン阻害剤（５×１０-8M)、ＥＤＴＡ（０．０１M)と窒化ナトリウム（６．７×１０-3M)であった。
【００２４】
プロテオグリカンの放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）
培養培地（ＣＭ）中に放出されるプロテオグリカンと、軟骨細胞凝集物（ＣＡ）中に存在するプロテオグリカンを、P. Gysen及びP. Franchimont (J. Immunoassay, (1984), 5, 221-243) 記載の方法で測定した。ＲＩＡの分析による感受性は、０．６ng/ 試験管であった。
偏差のアッセイ内及びアッセイ間係数は、曲線の直線部に沿って、それぞれ１０％未満及び２０％未満であった。抗体は、コアタンパク質の抗原決定基のみに対するものであった。ＣＭ及びＣＡ中のプロテオグリカンの合計は、この分子の総産生量に対応していた。
【００２５】
硫酸化グリコサミノグリカンの合成
本法は、35ＳＯ4 の取り込みによる硫酸化プロテオグリカンの産生を評価するものである。ストロンチウム塩で処理した軟骨細胞を、Ｎａ235 ＳＯ4 の存在下で２４時間培養した。細胞を遠心分離により分離し、すすいだ。培養培地と細胞中に存在するグリコサミノグリカンを、プロテアーゼ阻害剤の存在下で抽出した。培養２４時間における硫酸化グリコサミノグリカンの総産生量を、放射活性を測定することによって評価した。抽出物の物理化学的構造を検討するために、セファロースＣＬ２Ｂによるクロマトグラフィーに、抽出物を付した。
【００２６】
II型コラーゲンの放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）
培養培地中に放出されたII型コラーゲン及び細胞相に存在するII型コラーゲンを、Y. Henrotin ら(J. Immunoassay, (1990), 11, 555-578) 記載のＲＩＡ法により測定した。本アッセイの検出限界は、３ng／試験管であった。偏差のアッセイ内及びアッセイ間係数は、それぞれ８％及び１５％であった。抗体は、天然分子のらせん部分に対するものであった。
【００２７】
２．軟骨吸収のパラメーター
培養は、１％ＴＳ＋とアスコルビン酸塩５０μg/mlを補給したＤＭＥＭ中で行った。ＴＳ＋には、トランスフェリン６２５μg/ml、セレン６．２５μg/ml、ウシ血清アルブミン１．２５mg/ml 、そしてリノール酸５３５μg を含有させた。プロテオグリカンとII型コラーゲンは、あらかじめプロテアーゼ阻害剤を補給しておいた上清中で直接測定した。測定前に、細胞凝集物を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で、超音波解離（１０秒間の３パルス）によってホモジナイズした。
【００２８】
ストロメライシン活性の測定
牛乳より得た標識レソルフィン（resorufin)−カゼイン（Boehringer Mannheim)を用いて、カゼイン分解活性を測定した。本研究では、潜伏（latent）ストロメライシンの活性化は、ＡＰＭＡ（酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（II）、Sigma Chemie, Deinsenhofen, Germany)を加える（最終濃度２mM）ことによって行った。軟骨細胞を含む調整培地を３７℃で４時間インキュベーションした。活性化された培養培地を、０．０２M 塩化カルシウムを含有する滴定緩衝溶液（０．２M トリス−ＨＣｌ；pH７．８）中、標識レソルフィン−カゼイン２０μg と共に、３７℃で１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、トリクロロ酢酸を加える（最終濃度１．６％）ことによって、酵素反応を停止させた。試料を７０００g で１５分間遠心分離した。この条件下で、分解されなかったカゼインを、完全に沈殿させたが、一方、分解されたカゼインの９５％以上は、上清中に残留していた。蛍光により測定を行った。励起波長は、５７４nm、発光波長は、５８４nmであった。
精製ストロメライシンを増量しながらインキュベーションを行うことによって、標準曲線を作成した。平行して、インキュベーション前に１０mMのＥＤＴＡを加えた試料を、同様の方法で処理することによって対照値を得、これを活性培地で得られた値から差し引いた。対照値は、活性培地で測定した蛍光の５％を越えることはなかった。測定は、いずれも二重に行った。
【００２９】
Ｂ）結果
結果は、プロテオグリカンとII型コラーゲン（培養培地中に放出されたものと、細胞相に存在するもの）のＤＮＡ１μg 当たりの割合として表示した。平均値±標準偏差を算出した。群間の比較は、対のないステューデントｔ検定を用いて行った。差は、ｐ＜０．０５である場合に、統計学的に有意であると判断した。
【００３０】
１．軟骨形成パラメーター
プロテオグリカンの放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）
以下の結果は、培養２４、４８及び７２時間後のプロテオグリカンの総産生量（培養培地＋細胞相）に対する２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩の各種濃度における効果を示すものである。
【００３１】
【表１】
0003935557.tif 000002
【００３２】
硫酸化グリコサミノグリカンの産生
二番目の方法によるこれらの結果によって、プロテオグリカンの合成に対する２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩（化合物Ａ）の効果が確認され、そして塩化ストロンチウムが、同様の効果を呈することが示され、これによって、ヒト軟骨細胞による軟骨形成の刺激は、ストロンチウムに起因することが示された。
培養２４時間後に得られた結果を、以下の表に示す：
【００３３】
【表２】
0003935557.tif 000003
【００３４】
２種類のストロンチウム塩、特に化合物Ａについて得られたクロマトグラフィーの結果では、高分子量グリコサミノグリカン合成の増大が示された。以下に示す表には、合成されたプロテオグリカンの分子量に応じた分布（％）を示す。
【００３５】
【表３】
0003935557.tif 000004
【００３６】
II型コラーゲンの放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）
以下の結果は、培養２４、４８及び７２時間後に培養培地に放出されたII型コラーゲン産生に対する酸の二ストロンチウム塩（化合物Ａ）の各濃度における効果を示すものである。
【００３７】
【表４】
0003935557.tif 000005
【００３８】
２．軟骨吸収パラメーター
ストロメライシン活性の測定
以下の結果は、培養２４、４８及び７２時間後のストロメライシン産生に対する２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩の各濃度における効果を示すものである。
【００３９】
【表５】
0003935557.tif 000006
【００４０】
実施例Ｂ：医薬組成物：錠剤
２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩５００mg、つまりストロンチウム１７０mgを含有する錠剤を調製した。
１，０００錠の処方：
２−〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ〕−３−シアノ−４−カルボキシメチルチオフェン−５−カルボン酸の二ストロンチウム塩
（ストロンチウム１７０mgに相当）                            ５００mg
小麦デンプン                                            １，０００ｇ
乳糖                                                        ８００ｇ
ステアリン酸マグネシウム                                      ５０ｇ
シリカ                                                        ２０ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                                  ５０ｇ