(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜の構造・機能を障害する薬剤ナイスタチンに耐性を有し、菌体内にL-グルタミン酸を５３０ｍｇ／ｌ以上蓄積する能力を有するヤロウィア・リポリティカ酵母を用いることを特徴とする酵母エキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞膜の構造・機能を障害する薬剤に耐性を有し、菌体内にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力が向上した酵母、及び該酵母を用いる酵母エキスの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然系調味料は天然・自然・健康・本格・高級・グルメといったキーワードで表せうる時流の中でその需要が拡大し続けており、酵母エキスも天然系調味料の発展とともにその市場規模が拡大している。酵母エキスの製造には一般にビール酵母やパン酵母、トルラ属酵母等が利用されており、ビール醸造で副生するビール酵母を用いる場合では、ビール品質の設計範囲内で酵母の選定・改良が行われており、エキス製造だけを目的とした酵母でないがために、エキスを製造した場合に不快な臭いがしたり、うま味が足りないの等品質の点から必ずしも満足のいくものではないことが指摘されている。
【０００３】
これらを解決する方法として酵母を育種改良して好ましい味や風味を持つ酵母を造成し、これを用いて酵母エキスを製造する方法がある。風味という点ではノルバリン耐性を付与した酵母を用いることにより、エステル類やアルコール類等の香気成分を増加させた例が知られおり（ジャーナル・オブ・ジィ・インスティテュート・オブ・ブリューイング、第７６巻、８４３頁〜８４７頁、１９８１年）これを用いたアルコール飲料の製造が報告されている。しかしながら、うま味等の呈味を変えた例は知られいない。
【０００４】
うま味等の呈味を増強するものとしてＬ−グルタミン酸ナトリウム、５’−イノシン酸ナトリウム、５’−グアニル酸ナトリウムが知られており、調味料として用途に応じて食品に添加されている。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はうま味を増強する物質であるＬ−グルタミン酸を菌体内に蓄積する能力の高い酵母を効率良く育種する方法を開発し、育種された酵母を用いてよりＬ−グルタミン酸含量の高い酵母エキス製造する方法を見いだすことにある。上記課題はこれまでになかったものであり、すなわち、課題自体が新規なのである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロシン等のグルタミン代謝拮抗物質に対する耐性を付与した酵母変異株がＬ−グルタミン酸を菌体内に高い濃度で蓄積すること、本変異株を用いて酵母エキスを調製したところ、エキス中のＬ−グルタミン酸濃度が高く、官能評価の結果では、うま味が増し、風味、あつ味、こく等呈味に優れる酵母エキスであることを見いだした。
【０００７】
しかしながら、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与した酵母変異株の中には菌体内Ｌ−グルタミン酸濃度が親株と変わらず、むしろ菌体外Ｌ−グルタミン酸蓄積量が向上したものもあった。また、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与した酵母変異株であって菌体内Ｌ−グルタミン酸濃度が高まった変異株であっても、菌体外に多量のＬ−グルタミン酸を蓄積していた。
【０００８】
本発明者らは、Ｌ−グルタミン酸を著量生産する酵母変異株が生合成するＬ−グルタミン酸を特異的に菌体内にとどめさせることができれば、菌体内Ｌ−グルタミン酸濃度が高い酵母を育成でき、その結果Ｌ−グルタミン酸含量の高い、より呈味に優れた酵母エキスを調製することが可能になると考えた。
【０００９】
そこで本発明者らは、この様な新たな課題を解決すべくさらに検討した結果、酵母にその細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に対する耐性を付与することにより、菌体内にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力の高い酵母を効率良く作出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
（１）細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に耐性を有し、菌体内にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力が向上した酵母。
（２）細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤がナイスタチンである前記（１）記載の酵母。
（３）酵母がヤロウィア・リポリティカである前記（１）または（２）記載の酵母。
（４）前記（１）ないし（３）記載の酵母を用いることを特徴とする酵母エキスの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
【００１２】
本発明に用いられる酵母としてはサッカロマイセス属に属する酵母（サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ウバルム、サッカロマイセス・シュバリエ、サッカロマイセス・ロゼイ等）トルラスポラ属に属する酵母（例えばトルラスポラ・デルブルツキ）、クライベロマイセス属に属する酵母（例えばクライバロマイセス・サーモトレランス）、ピヒア属に属する酵母（例えばピヒア・メンブラネファシエンス）、ヤロウィア属に属する酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ）等が挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられる細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤としては、例えばアンホテリシンＢやナイスタチン等のポリエン系抗生物質やエコナゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール等のエルゴステロール合成を阻害する抗生物質が挙げられる。これらの抗生物質は市販のものを用いることが出来る。特に好ましい薬剤としてはナイスタチンが挙げられる。
【００１４】
本発明の酵母は細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に耐性を有し、かつ菌体内のＬ−グルタミン酸濃度が向上した酵母であり、かかる性質を有していれば菌体内Ｌ−グルタミン酸濃度の向上に効果の見られる他の薬剤、例えば６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシンや本発明で用いたブロモピルビン酸等に対する抵抗性を有していても良い。
【００１５】
細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に対する耐性を親株に付与するには、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルフォン酸等）で処理した後、親株が生育できないような濃度の細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤を含む寒天培地で生育可能な菌株を採取すればよい。
【００１６】
細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に耐性な変異株とは、親株と比較したときに同薬剤に対してより強い耐性を有する株のことである。
【００１７】
本発明の酵母は細胞膜の構造・機能に障害を与える薬剤に耐性を有し、かつ菌体内Ｌ−グルタミン酸濃度が向上した酵母である。例えば以下のものがある。
ヤロウィア・リポリティカ  ＡＪ１４７１８
【００１８】
本発明における酵母を培養し、菌体を得るために用いられる培地は、炭素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地である。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源、窒素源は、培養される酵母の利用可能なものならばよい。
【００１９】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、マニトール、エタノール、ｎ−パラフィン等が用いられる。また乳酸やクエン酸等の有機酸も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
【００２０】
窒素源としては尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等が用いられる。
【００２１】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が用いられ、生育にアミノ酸や、ビタミン等を要求する野生株や栄養要求性変異株を培養する場合には要求される栄養素を補添することが必要である。
【００２２】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、カルシウム塩等が用いられる。
【００２３】
培養方法は、培養温度２０ないし３７℃で、ｐＨを３ないし８に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニア水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより酵母菌体が得られる。
【００２４】
得られた菌体から酵母エキスを調製するには、遠心分離により培養ブロスから菌体を回収し、公知の方法に従って行えばよい。例えばトルエンや酢酸エチルを菌体当り１〜２％添加し、温度４５〜５０℃で自己消化を行い、エキス分を減圧濃縮し、噴霧乾燥により粉末酵母エキスが得られる。
【００２５】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【００２６】
【実施例１】
ヤロウィア・リポリティカＡＪ５００４からブロモピルビン酸耐性株の分離
自然界から分離されたヤロウィア・リポリティカＡＪ５００４（アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー、第３３巻、１５８頁〜１６７頁、１９６９年）を胞子形成培地（１％酢酸カリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％グルコース）にて１ないし２日間３０℃で培養後、０．８５％生理食塩水にて洗浄し、最終１ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ５０００を含む０．８５％生理食塩水に懸濁し、３０℃で１２０分間処理した。さらにポアサイズ６０μｍナイロンメンブレンで濾過し、胞子を回収した。エチルメタンスルホン酸を最終濃度３０μｌ／ｍｌとなるように添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（最終濃度２．５％のグルコースを含む）に懸濁し、３０℃で６０分間の変異処理を行った。遠心分離の後、胞子を０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄し、ブロモピルビン酸０．５ｇ／ｌを含む最少培地（ディフコ  イーストナイトロジェンベース  ウィズアウト  アミノ  アシド  ０．６７％、グルコース  ２％、寒天  ２％）に塗布し、３０℃で３〜７日間培養した。
【００２７】
ピルビン酸の代謝拮抗物質として知られるブロモピルビン酸はヤロウィア・リポリティカＡＪ５００４の生育を阻害し、０．５ｇ／Ｌのブロモピルビン酸を含む最少培地上ではヤロウィア・リポリティカＡＪ５００４の生育は認められなかった。
【００２８】
ブロモピルビン酸を含む最少培地上に出現したコロニーを釣り上げ、同一組成の最少培地上で単コロニー分離を行った後、菌体調製用培地（ｎ−パラフィン  ８０ｇ／ｌ、硝酸アンモニウム  ２０ｇ／ｌ、リン酸２水素カリウム  ２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  １ｇ／ｌ、硫酸第一鉄７水和物  １０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水和物  ４０ｍｇ／ｌ、チアミン  ６μｇ／ｌ、炭酸カルシウム  ２０ｇ／ｌ、ｐＨ５．０）を２０ｍｌ注入した５００ｍｌ容坂口フラスコに植菌し、２日間３０℃でシード培養した後、同一組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容坂口フラスコに植菌し、３０℃で５日間培養した後、培養ブロスを遠心し、上清中のＬ−グルタミン酸濃度をバイオテックアナライザーＡＳ２００（旭化成社製）で測定した結果、培養ブロス中に２３０ｍｇ／ｌのＬ−グルタミン酸を蓄積するＮ４６株（ＡＪ１４７１７）を見いだした。
【００２９】
【実施例２】
ブロモピルビン酸耐性株Ｎ４６（ＡＪ１４７１７）からナイスタチン耐性株の分離
【００３０】
実施例１で用いた方法によりブロモピルビン酸耐性株Ｎ４６（ＡＪ１４７１７）の胞子を調製し、最終１０ｍＭになるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加した１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、３０℃で２０分間の変異処理を行った。遠心分離後、変異処理した胞子を１Ｍソルビトール溶液で洗浄し、ナイスタチン１ｇ／ｌを含む最少培地に塗布した。ブロモピルビン酸耐性株Ｎ４６株（ＡＪ１４７１７）はナイスタチン１ｇ／ｌを含む最少培地上では全く生育できなかった。
【００３１】
３０℃で３〜７日間培養後、１ｇ／ｌナイスタチンを含有する最少培地に出現したコロニーを釣り上げ、同一組成の培地で単コロニー分離した後、実施例１で用いた菌体調製用培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に植菌し、３０℃で５日間培養した。培養終了後培養ブロス１ｍｌをエッペンドルフチューブに採り、密閉し、沸騰しているウオーターバス中に３０分間浸漬し、菌体内の遊離Ｌ−グルタミン酸を抽出した。遠心分離により抽出残査を除いたのち、上清のＬ−グルタミン酸濃度をバイオテックアナライザーＡＳ２００で測定し、測定値を菌体内外を併せたＬ−グルタミン酸濃度とした。一方、菌体外グルタミン酸濃度は培養ブロスを遠心分離し、得られた上清中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、測定値を菌体外Ｌ−グルタミン酸濃度とした。菌体内のＬ−グルタミン酸濃度は菌体内外を併せたＬ−グルタミン酸濃度から菌体外Ｌ−グルタミン酸濃度を引いた値で表せうる。
【００３２】
分離し、培養評価した１３株のナイスタチン耐性株の内、菌体内外を併せたＬ−グルタミン酸濃度が親株であるＮ４６株（ＡＪ１４７１７）よりも高い株が９株存在した（図１）。１３株の内、菌体外のＬ−グルタミン酸濃度が親株に比し顕著に向上した株は１株だけであった。菌体内外を併せたＬ−グルタミン酸濃度が向上した９株では、菌体外Ｌ−グルタミン酸濃度が親株より顕著に増加したものはなく、親株と同等、もしくは低下しており、ナイスタチン耐性付与により菌体内のＬ−グルタミン酸濃度が顕著に向上したことが明らかになった。
【００３３】
菌体内外のＬ−グルタミン酸濃度が最も高かったナイスタチン耐性株ＡＪ１４７１８では菌体内に７００ｍｇ／ｌ（菌体乾燥重量当り３．５％）、菌体外に２０ｍｇ／ｌのＬ−グルタミン酸を蓄積した。
【００３４】
実施例１の菌体調製培地の炭素源のみをｎ−パラフィンからグルコース（８％）に変更して培養評価を行った。培養評価菌株をＹＰＤ寒天培地（ディフコ  バクト  イーストエキストラクト１％、ディフコ  バクトペプトン２％、グルコース２％、寒天２％）にて３０℃で２間培養し、寒天プレート全面に生育した内の１／１６プレート分を菌体調製用培地（炭素源グルコース）５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に植菌し、３０℃にて５日間培養し、菌体内外、及び菌体内のＬ−グルタミン酸濃度を測定したところＡＪ１４７１８はＬ−グルタミン酸を菌体内に５３０ｍｇ／ｌ、菌体外に４２ｍｇ／ｌ蓄積し、一方親株であるブロモピルビン酸耐性株Ｎ４６（ＡＪ１４７１７）では菌体内に１９８ｍｇ／ｌ、菌体外に４９ｍｇ／ｌ蓄積していた。炭素源をグルコースに変更しても炭素源をｎ−パラフィンとした場合と同様にナイスタチン耐性株では菌体内のＬ−グルタミン酸濃度が顕著に向上していることが明かとなった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の方法により酵母菌体内のＬ−グルタミン酸濃度を高めることができ、本発明の方法により育種された酵母を用いることによりＬ−グルタミン酸含量の高い酵母エキスを製造することが可能となる。
【００３６】
ヤロウィア・リポリティカＡＪ１４７１７は、平成８年５月２９日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６５３が付与されている。
ヤロウィア・リポリティカＡＪ１４７１８は、平成８年５月２９日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６５４が付与されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】ナイスタチン耐性株の菌体内外を併せたＬ−グルタミン酸濃度を評価した結果である。縦軸にはＬ−グルタミン酸濃度を、横軸にはナイスタチン耐性株の菌株番号を示した。Ｎ４６は親株である。
【図１】
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