(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酒類、食品を製造する方法において、ＮＡＤ特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法。
【請求項２】
ＮＡＤ特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼのＩＤＨ１又はＩＤＨ２遺伝子より選択される一つ以上を破壊したものであることを特徴とする請求項１に記載の酒類、食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の酵素活性が低減又は消失した酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に実用酵母を用いて製造される酒類、食品（清酒、ワイン、紹興酒、ビール、醤油、味噌又はパン等）に含有される有機酸の組成は、使用する微生物（酵母、麹菌、乳酸菌等）及び原材料の影響が大きくこれらに依存している。その微生物の中で酵母が有機酸生成に関し、重要な役割をしている。
清酒の場合、清酒中の有機酸含量は乳酸、リンゴ酸及びコハク酸が大部分を占め、酵母は主にリンゴ酸及びコハク酸を代謝産物として生成することが知られている。
【０００３】
酵母を用いて清酒中の有機酸組成を変化させた例として以下の方法が報告されている。
エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、紫外線処理等の変異処理により薬剤耐性株又は感受性株を取得し清酒中の有機酸組成を変化させる方法（特開平６−１２１６７０号公報、特開平３−１７５９７５号公報、及び日本醸造協会誌、第８８巻、第６４５〜６４７頁、１９９３年）がある。該方法にはリンゴ酸を多量に含む清酒を製造する方法が記載されている。
【０００４】
遺伝子レベルで酵母を改良し清酒中の有機酸組成変化を行っている例としては以下の報告がなされている。
クエン酸回路中のフマラーゼ遺伝子を破壊した結果、親株と比較して生成するコハク酸が減少し、フマル酸が増加したという報告〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering) 、第８０巻、第３５５〜３６１頁、１９９５年〕がある。
また、フマラーゼ遺伝子及び／又はコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊し、有機酸組成への影響を報告している例（平成９年度農芸化学会大会講演要旨集、ｐ３４６、４Ｙａ７）もある。
クエン酸回路以外の酵素でＵｒａ３（ウラシル合成酵素遺伝子）を破壊した結果、親株と比較してコハク酸及びリンゴ酸が増加したという報告（特公平７−１１４６８９号公報）がある。
以上の報告はすべてコハク酸、フマル酸又はリンゴ酸の増減に関するものであり、これらのほかには遺伝子レベルで遺伝子を破壊又は増幅することにより有機酸組成を変化させる方法はなかった。
【０００５】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子レベルでの酵母の改良を行っている例としては以下の報告がなされている。
紫外線変異処理法を用い、酢酸培地にて選択することによりイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＮＡＤ特異的）が消失した酵母を取得した報告〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology)、第１７２巻、第４２８０〜４２８７頁、１９９０年〕がある。
また、イソクエン酸デヒドロゲナーゼのＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＰ１遺伝子の塩基配列はそれぞれ公知の配列であり、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＰ１の遺伝子破壊の酵母は取得されている。各々、下記文献に記載されている。ＩＤＨ１〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)、第２６７巻、第１６４１７〜１６４２３頁、１９９２年〕、ＩＤＨ２（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第２２１９９〜２２２０５頁、１９９１年）、ＩＤＰ１（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第２３３９〜２３４５頁、１９９１年）。
しかしながら、上記遺伝子破壊酵母は生化学実験に主に供されている酵母を用いており、すべて酵素又は遺伝子の細胞内での生理的役割を解明する目的のための手段として作製されたものである。酒類、食品の有機酸組成を変化させるために、酒類、食品の製造に適するよう改良し、嗜好に適した有機酸含量が増加し及び嗜好に不適な有機酸含量が減少した酵母の取得並びにその酵母を用いた酒類、食品の製造は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、前記のような方法で有機酸組成を変化させようとしているが、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失した酵母を用いて、従来にない有機酸組成を持つ酒類、食品の製造方法を開発していくことが課題として残されている。
本発明の目的は、特定の酵素活性が低減又は消失した酵母を用いて製造される従来にない有機酸組成の酒類、食品の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明はＮＡＤ特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法に関する。
【０００８】
本発明者らは、酵母を遺伝子レベルで操作することにより、酒類、食品（清酒、ワイン、紹興酒、ビール、醤油、味噌又はパン等）の有機酸組成を変化させようとした。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素の種類により２種類〔ＮＡＤ特異的：ＩＤＨ１、ＩＤＨ２（ＩＤＨ１、ＩＤＨ２はサブユニット構造を形成する）、ＮＡＤＰ特異的：ＩＤＰ１（ＩＤＰ１はダイマー構造を形成する）〕が存在する。
本発明者らは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失した酵母を取得し、この株を用いて清酒小仕込み試験を行った結果、有機酸組成が変化することを見出した。すなわち、酵母では元来調節不可能であったクエン酸が増加すると同時に、コハク酸が減少することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
使用する酵母は特に限定はなく酒類、食品に用いられる実用酵母であればよく例えば清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、醤油酵母又はパン酵母等が挙げられサッカロミセス（Saccharomyces)属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces)属等がありサッカロミセス属が香味の点から好ましい。
【００１０】
本発明においては一倍体、二倍体の実用酵母を使用することができ、例えば二倍体実用酵母から一倍体実用酵母を作製してもよい。
二倍体株からの一倍体株の取得方法は、特に限定はなく常法に従って行えばよい。例えば特開平５−３１７０３５号公報に記載されている製造方法にて取得した株、すなわち、日本醸造協会７０１号（以下、Ｋ−７０１と略記する）を麹汁培地にて胞子形成させた後、アルコール処理にて胞子を分離し、色素培地にて一倍体を選別するという方法を用いて取得したα型の一倍体株α４１（以下、α４１と略記する）又はａ型の一倍体株ａ１０（以下、ａ１０と略記する）を用いてもよい。
【００１１】
本発明におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失した酵母を取得する方法としては、特に限定はなく遺伝子破壊法、変異処理法でもよい。変異処理としては酵母に公知の変異誘導法、例えば、変異誘発の物理的手段としては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的手段としては、エチルメタンスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン等の変異剤を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が特異的に破壊された株を得るには遺伝子工学的手法の遺伝子破壊法を用いるのが好ましい。目的とする有機酸の生成酵母の選択方法は、通常用いられる方法でよく、特に限定はない。
酵母での遺伝子破壊の方法は、３通りの方法、すなわち化学と生物、第３１巻、Ｎｏ．８、第５２４〜５３０頁、１９９３年記載のＡ：破壊しようとする遺伝子の翻訳領域のＮ末端とＣ末端を欠失させた遺伝子と選択マーカー遺伝子からなるプラスミドを使用する方法、Ｂ：翻訳領域の真中に選択マーカー遺伝子を導入することにより目的遺伝子を破壊する方法、Ｃ：Ｎ末端とＣ末端の方向を逆にもつ破壊用プラスミドにより破壊する方法が存在するが、いずれの方法においても目的とする遺伝子破壊株は得られる。なお、酵母育種用の選択マーカーとしては酵母由来の選択マーカーが好適であり、該選択マーカーとしては本発明で使用したオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挙げられる。この選択マーカーはオーレオバシジンＡ耐性酵母形質転換システム〔宝酒造（株）製〕として市販されており、該システムを使用することにより簡便に目的酵母の形質転換を行うことができる。
【００１２】
通常、清酒、ワイン、紹興酒、ビール等の実用酵母においては二倍体あるいは、それ以上の高次倍数体である。
【００１３】
二倍体の遺伝子破壊株の取得方法としては、以下の３つの方法がある。
（１）マーカー遺伝子（本発明で用いたオーレオバシジンＡ耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドを用いて、一回の形質転換で染色体の二本両方共破壊された株を取得する方法。この方法は形質転換後、選択培地にて大きなコロニーを選択することで染色体の二本両方共破壊された株が取得可能である。
（２）異なったマーカー遺伝子を含む二種類の破壊用プラスミドを用いて、一本ずつ染色体を破壊する方法。まず最初に、あるマーカー遺伝子（例えばオーレオバシジンＡ耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドで一本の染色体を破壊後、次に別のマーカー遺伝子（例えばセルレニン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドを用いて残りの染色体を破壊する方法である。
（３）一倍体（ａ型及びα型）の遺伝子破壊株を各々取得後、交雑を用い二倍体株にする方法。この方法は異なったマーカー遺伝子を含む二種類の破壊用プラスミドを用いてａ型及びα型を各々破壊後、その破壊株を交雑し、二種類の選択培地にて順次二倍体株を取得する方法である。この場合、マーカー遺伝子を含む一種類の破壊用プラスミドを用いて各一倍体株（ａ型及びα型）を破壊後、交雑を行い、一種類の選択培地で二倍体株を取得することも可能である。
【００１４】
本発明で破壊したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＤＨ１、ＩＤＨ２）破壊株の効果は、この酵素だけに限定されず、同じイソクエン酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムであるＩＤＰ１遺伝子を破壊しても同様の効果が得られる。
【００１５】
以下にその取得方法の１例を示す。
（遺伝子破壊によるＩＤＨ１遺伝子破壊株の取得）
遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ１）（図１）はオーレオバシジンＡ耐性酵母形質転換システム〔Aureobasidin  Ａ (Code No.9000) 、ｐＡＵＲ１０１  ＤＮＡ (Code No.3600) ：宝酒造（株）製〕を使用し、以下のように作製した。なお、図１は遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ１）の構造を示す図である。
Ｋ−７０１の染色体ＤＮＡを精製後、これを鋳型として配列表の配列番号１、配列番号２でそれぞれ表される３０残基のプライマー（５′末端リン酸化）を用いてＰＣＲにてＩＤＨ１遺伝子部分配列〔−４７番目から７９５番目（既述のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６７巻、第１６４１７〜１６４２３頁、１９９２年の記載による）〕８４２残基を増幅した。ＰＣＲ増幅ＩＤＨ１遺伝子部分配列８４２残基をＰｖｕＩ処理後、末端平滑化処理、電気泳動にて精製し６２５残基のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とＳｍａＩ消化、脱リン酸化したプラスミドｐＡＵＲ１０１〔宝酒造（株）製〕とをリガーゼにて連結した。
得られた遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ１）の挿入遺伝子の塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサーにて行った。
ｐＩＤＨ１をＡｆｌIIで切断直線化後、Ｋ−７０１由来の一倍体株（α４１）を酢酸リチウム法にて形質転換し、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡ〔宝酒造（株）製〕含有ＹＰＤ培地にて選択し、ＩＤＨ１遺伝子破壊株１α−１（以下、１α−１と略記する）を取得した。遺伝子破壊の確認は、サザン解析及び酵素活性を測定することにより行った。
【００１６】
（遺伝子破壊によるＩＤＨ２遺伝子破壊株の取得）
遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ２）（図２）は以下のように作製した。なお、図２は遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ２）の構造を示す図である。
ｐＩＤＨ１作製時と同様にＫ−７０１の染色体ＤＮＡを精製後、これを鋳型として配列表の配列番号３、配列番号４でそれぞれ表される３０残基のプライマー（５′末端リン酸化）を用いてＰＣＲにてＩＤＨ２遺伝子部分配列〔３０４番目から８５０番目（既述のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第２２１９９〜２２２０５頁、１９９１年の記載による）〕５４７残基を増幅した。ＰＣＲ増幅ＩＤＨ２遺伝子部分配列５４７残基をＢｇｌII処理後、末端平滑処理、電気泳動にて精製し５１６残基のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とＳｍａＩ消化、脱リン酸化したｐＡＵＲ１０１〔宝酒造（株）製〕とをリガーゼにて連結した。
得られた遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ２）の挿入遺伝子の塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサーにて行った。
ｐＩＤＨ２をＦｂａＩで切断直線化後、Ｋ−７０１由来の一倍体株（α４１）を酢酸リチウム法にて形質転換し、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡ含有ＹＰＤ培地にて選択しＩＤＨ２遺伝子破壊株２α−１０（以下、２α−１０と略記する）を取得した。遺伝子破壊の確認は、サザン解析及び酵素活性を測定することにより行った。
【００１７】
（サザン解析）
遺伝子破壊株の染色体ＤＮＡを精製後、ＨｐａＩ（ＨｐａＩは、ｐＩＤＨ１、ｐＩＤＨ２に切断部位を持たない）消化し電気泳動にて分離、ナイロンメンブレンにブロッティングした。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを鋳型としてＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ〔宝酒造（株）製〕を用いて32Ｐ標識したプローブを作製後、ハイブリダイゼーション、洗浄、フィルムへの感光、現像を行った。１α−１のＩＤＨ１遺伝子破壊及び２α−１０のＩＤＨ２遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを各々図３と図４に写真で示した。横はｌａｎｅ（レーン）、縦は分子量の大きさを意味する。
図３に示すようにｌａｎｅ１のＫ７０１、ｌａｎｅ２のα４１では約１０ｋｂｐのＩＤＨ１遺伝子のバンドが検出された。ｌａｎｅ３の１α−１では約１０ｋｂｐのＩＤＨ１遺伝子のバンドが検出されず、ＩＤＨ１遺伝子内にオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挿入されたことを示す約１７ｋｂｐのバンドが検出された。
また、図４に示すようにｌａｎｅ１のＫ７０１、ｌａｎｅ２のα４１では約８ｋｂｐのＩＤＨ２遺伝子のバンドが検出された。ｌａｎｅ３の２α−１０では約８ｋｂｐのＩＤＨ２遺伝子のバンドが検出されず、ＩＤＨ２遺伝子内にオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挿入されたことを示す約１５ｋｂｐのバンドが検出された。
【００１８】
（酵素活性）
ダニエル（Daniel) ら（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー、第１７２巻、第４２８０〜４２８７頁、１９９０年）の方法に従い行った。
酵母をＹＰＤ溶液５０ｍｌで３０℃にて１９時間振とう培養した。遠心分離で集菌した後、蒸留水、緩衝液Ａ（組成は後述する）で洗浄した。洗浄菌体を緩衝液Ａ  １ｍｌ、０．５ｇのガラスを加えホモジナイザーで粉砕（５分）した。粉砕溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、上清を酵素抽出液として活性測定に供した。
酵素活性は、酵素活性測定用緩衝液〔１０倍（組成は後述する）〕０．３ｍｌ、蒸留水２．４ｍｌに酵素抽出液０．３ｍｌを加え、２５℃でのＮＡＤＨの増加をＯＤ３４０ｎｍで追跡することにより測定した。コントロールとして酵素活性測定用緩衝液（１０倍）から基質のイソクエン酸がない緩衝液を作製しＮＡＤＨ増加分を上記測定値から差し引いた。蛋白定量は、プロテイン  アッセイ  キット（バイオラッド社製）を用いて行った。
【００１９】
酵素活性を測定した結果、ＩＤＨ１遺伝子破壊株（１α−１）及びＩＤＨ２遺伝子破壊株（２α−１０）のＮＡＤ特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＩＤＨ１、ＩＤＨ２はサブユニット構造を形成する）は消失していた。
【００２０】
緩衝液Ａ：５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び２ｍＭ  ＰＭＳＦ  酵素活性測定用緩衝液（１０倍）：４００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、４０ｍＭＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ  ＤＬ−イソクエン酸三ナトリウム及び２．５ｍＭ  ＮＡＤ+ 
【００２１】
上記のように、本発明に用いられる菌株（１α−１、２α−１０）は、Ｋ−７０１由来の一倍体（α４１）遺伝子破壊株であるが、それらの菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：球形
ｂ）大きさ：長さ４．０〜５．６μｍ
２．胞子形成：無し
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％及び寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養した後、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して、当該２菌株を接種し、３０℃で７日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース  （＋）              ガラクトース（＋）
スクロース  （＋）              マルトース  （＋）
ラクトース  （−）              メリビオース（−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法にて、３０℃、１４日間後の生育を観察した。
グルコース  （＋）              ガラクトース（＋）
スクロース  （＋）              マルトース  （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いてオキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
５．高泡の形成
清酒の小仕込を行ったところ、いずれの遺伝子破壊株も高泡の形成は観察されなかった。
６．交雑
Ｋ−７０１由来の一倍体株（ａ型）と当該２菌株は交雑した。
７．オーレオバシジンＡに対する耐性
オーレオバシジンＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ培地を用いて、３０℃で２日間培養した結果、α４１は生育しなかったが、当該２菌株は生育した。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明に用いられる酵母２菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、かつ清酒の小仕込試験において高泡の形成も認められず、更に一倍体株（ａ型）と交雑することから、当該２菌株はＫ−７０１株由来の一倍体株（α型）であることを示すものである。
【００２２】
かくして、これらのα４１株のＩＤＨ１又はＩＤＨ２を遺伝子破壊した株が得られ、これらの株を用いることにより親株と比較し従来にない有機酸組成の酒類、食品例えば清酒が得られることが判明した。
【００２３】
Ｋ７０１由来の一倍体株であるα４１、α４１のＩＤＨ１遺伝子を破壊した株１α−１及びα−４１のＩＤＨ２遺伝子を破壊した株２α−１０は、それぞれSaccharomyces cerevisiaeα４１、Saccharomyces cerevisiae１α−１、 Saccharomyces cerevisiae ２α−１０と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、各々ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２９０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２９１、及びＦＥＲＭ  Ｐ−１６２９２として寄託されている。
【００２４】
以下に二倍体株の取得方法の１例を示す。
〔遺伝子破壊によるａ型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株の取得〕
１α−１取得時と同様の方法で、ＩＤＨ１遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ１）を用いて、Ｋ−７０１由来の一倍体ａ１０を形質転換し、ＩＤＨ１遺伝子破壊株１ａ−１（以下、１ａ−１と略記する）を取得した。
【００２５】
〔遺伝子破壊によるａ型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株の取得〕
２α−１０取得時と同様の方法で、ＩＤＨ２遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ２）を用いてＫ−７０１由来の一倍体ａ１０を形質転換し、ＩＤＨ２遺伝子破壊株２ａ−１（以下、２ａ−１と略記する）を取得した。
【００２６】
〔交雑組合せ〕
前記の方法で取得した一倍体の各遺伝子破壊株で交雑を行った。
二倍体のＩＤＨ１遺伝子破壊株を取得するために、ａ型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１α−１の組合せで交雑を行った。
二倍体のＩＤＨ２遺伝子破壊株を取得するために、ａ型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２α−１０の組合せで交雑を行った。
【００２７】
（交雑方法）
一倍体株をＹＰＤ液体培地にて一夜、３０℃にて振とう培養後、各１５μ１をＹＰＤ平板培地上、十字に植菌し２日間、３０℃にて静置培養した。交雑個所を採取し水に懸濁後、ＹＰＤ平板培地あるいはオーレオバシジンＡ含有ＹＰＤ平板培地に植菌し２日間、３０℃にて静置培養を行い、大きいコロニーを形成する株を選択した。選択した株の二倍体の確認は顕微鏡観察にて行い、遺伝子破壊の確認はサザン解析にて行った。
【００２８】
（サザン解析）
ａ型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１α−１の交雑株Ｎｏ．７（以下、Ｎｏ．７と略記する）、及びａ型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２α−１０の交雑株Ｎｏ．４９（以下、Ｎｏ．４９と略記する）の染色体ＤＮＡを精製後、ＨｐａＩ（ＨｐａＩは、ｐＩＤＨ１，ｐＩＤＨ２に切断部位を持たない）消化し電気泳動にて分離、ナイロンメンブレンにブロッティングした。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを鋳型としてＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ〔宝酒造（株）製〕を用いて32Ｐ標識したプローブを作製後、ハイブリダイゼーション、洗浄、フィルムへの感光、現像を行った。Ｎｏ．７のＩＤＨ１遺伝子破壊、及びＮｏ．４９のＩＤＨ２遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを各々図５と図６に写真で示した。横はｌａｎｅ（レーン）、縦は分子量の大きさを意味する。
図５に示すようにｌａｎｅ１のＫ７０１は約１０ｋｂｐのＩＤＨ１遺伝子のバンドが検出された。ｌａｎｅ２のＮｏ．７は約１０ｋｂｐのＩＤＨ１遺伝子のバンドが検出されず、ＩＤＨ１遺伝子内にオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挿入されたことを示す約１７ｋｂｐのバンドが検出された。
また、図６に示すようにｌａｎｅ１のＫ７０１では約８ｋｂｐのＩＤＨ２遺伝子のバンドが検出された。ｌａｎｅ２のＮｏ．４９では約８ｋｂｐのＩＤＨ２遺伝子のバンドが検出されず、ＩＤＨ２遺伝子内にオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挿入されたことを示す約１５ｋｂｐのバンドが検出された。
【００２９】
かくして本発明者らは、ａ型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ１遺伝子破壊株１α−１の交雑株Ｎｏ．７、及びａ型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２ａ−１とα型（一倍体）のＩＤＨ２遺伝子破壊株２α−１０の交雑株Ｎｏ．４９を取得した。
【００３０】
本発明に用いられる菌株（Ｎｏ．７、Ｎｏ．４９）はＫ−７０１由来の一倍体（ａ１０、α４１）遺伝子破壊株の交雑株であるが、それらの菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．８〜７．５μｍ    幅４．０〜５．７μｍ
２．胞子形成：有り
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％及び寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養した後、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して当該２菌株を接種し、３０℃で７日間培養してその炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース  （＋）            ガラクトース（＋）
スクロース  （＋）            マルトース  （＋）
ラクトース  （−）            メリビオース（−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法にて、３０℃、１４日間後の生育を観察した。
グルコース  （＋）            ガラクトース（＋）
スクロース  （＋）            マルトース  （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いてオキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
５．高泡の形成
清酒の小仕込を行ったところ、いずれの遺伝子破壊株も高泡の形成は観察されなかった。
６．オーレオバシジンＡに対する耐性
オーレオバシジンＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ培地を用いて、３０℃で２日間培養した結果、Ｋ７０１、ａ１０、α４１は生育しなかったが、当該２菌株は生育した。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明に用いられる酵母２菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、かつ清酒の小仕込試験において高泡の形成も認められないことから当該２菌株は、Ｋ−７０１株の交雑株であることを示すものである。
【００３１】
かくして、本発明によりＩＤＨ１又はＩＤＨ２を遺伝子破壊した二倍体株が得られ、この株を用いることにより親株と比較し従来にない有機酸組成の酒類、食品例えば清酒が得られることが判明した。
【００３２】
Ｋ７０１由来の交雑株であるＩＤＨ１遺伝子を破壊した株Ｎｏ．７及びＩＤＨ２遺伝子を破壊した株Ｎｏ．４９は、それぞれSaccharomyces cerevisiaeＮｏ．７、Saccharomyces cerevisiaeＮｏ．４９と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、各々ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５６７、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５６８として寄託されている。
【００３３】
本発明でいうイソクエン酸デヒドロゲナーゼの低減又は消失とは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼが、ＩＤＨ１、又はＩＤＨ２遺伝子起源の酵素よりなるが、消失とは、一つ以上の酵素活性が完全に失活していることをいう。低減とは、一つ以上の酵素活性が弱くなることをいう。
【００３４】
本発明の酒類とは、清酒、ワイン、紹興酒又はビール等があり、食品とは醤油、味噌又はパン等がある。
清酒、ワイン、紹興酒の製造は原料処理、仕込、糖化及び発酵、熟成、上槽及び精製工程からなる。蒸留酒の製造は原料処理、仕込、糖化及び発酵（糖化、発酵）、蒸留及び熟成工程からなる。醤油の製造は原料処理、仕込、発酵、上槽、精製工程からなる。味噌の製造は原料処理、仕込、発酵工程からなる。ここでいう原料処理は製麹工程も含む。
【００３５】
本発明の酒類、食品の製造方法は、これらのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失した酵母を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではない。
【００３６】
【実施例】
次に、本発明の酒類、食品製造の実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３７】
実施例１
ＩＤＨ１遺伝子を破壊した株１株（１α−１）及びＩＤＨ２遺伝子を破壊した株１株（２α−１０）を用いて麹汁発酵試験を行った。
麹汁培地は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の麹米に蒸留水を加え５５℃、一夜自己消化し、ブリックス度１０．０に調製したものを使用した。酵母は、３ｍｌ中に６×１０8 個含むものを添加した。発酵は、１５℃一定で行い、留後１５日目で上槽した。対照株として親株のα４１及びｐＡＵＲ１０１をＢｓｔＰＩで切断後α４１を形質転換した株ｐα−１（以下、ｐα−１と略記する）を用いた。有機酸組成分析は、イオン排除クロマトグラフィーを利用した島津高速液体クロマトグラフの有機酸分析システムにて行った。上槽液の分析結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
この結果、ＩＤＨ１遺伝子破壊株（１α−１）及びＩＤＨ２遺伝子破壊株（２α−１０）は親株と比較し、嗜好に適したクエン酸、リンゴ酸含量が増加し、及び嗜好に適さぬコハク酸含量が減少し、爽やかな味となり官能的にも良好な結果となった。
【００４０】
実施例２
ＩＤＨ１遺伝子を破壊した株１株（１α−１）及びＩＤＨ２遺伝子を破壊した株１株（２α−１０）を用いて、表２に示す仕込配合で清酒の製造を行った。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
掛米は精米歩合７７ｗ／ｗ％のα化米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０9 個含むものを添加した。発酵は、１５℃一定で行い、留後１５日目で上槽した。対照株としてα４１及びｐα−１を用いた。上槽液の分析結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
【００４５】
この結果、ＩＤＨ１遺伝子を破壊した株（１α−１）及びＩＤＨ２遺伝子を破壊した株（２α−１０）は、α４１株と違う有機酸組成を示した。すなわち、嗜好に適したクエン酸、リンゴ酸含量が増加し、及び嗜好に適さぬコハク酸含量が減少した。本発明において、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを破壊した酵母を用いた上槽清酒は、親株と比較し、爽やかな酸味を示し、バランスも優れており官能的にも良好な結果を示した。
【００４６】
実施例３
通常のパンを調製するに当り当該遺伝子破壊株１α−１又は２α−１０をそれぞれシクロデキストリンに充分含有させ、各々をパンのドウ当り１．０％〜２．０％添加した。また親株のα４１も同時に調製した。常法に従い発酵させ焙焼した。得られたパンについて官能検査を行った結果、当該遺伝子破壊株で作製したパンは、親株のα４１で作製したパンに比べ、爽やかな酸味を示し従来にない優れた味覚に改良されたことが認められた。
【００４７】
実施例４
１ａ−１と１α−１との交雑株であるＮｏ．７及び２ａ−１と２α−１０との交雑株であるＮｏ．４９を用いて実施例２に従い清酒の製造を行った。
対象株として二倍体株は、Ｋ７０１及びａ１０とα４１の交雑株である１０−４１−２及びｐα−１とｐａ−１（ｐα−１と同様の方法でａ１０を用いて取得）の交雑株である１０ｐ−４１ｐ−１５を用いた。一倍体の対照株としてａ１０、α４１を用いた。上槽液の分析結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
【００５０】
この結果、ＩＤＨ１遺伝子を破壊した二倍体株（Ｎｏ．７）及びＩＤＨ２遺伝子を破壊した二倍体株（Ｎｏ．４９）は、対照株として用いた二倍体株と違う有機酸組成を示した。すなわち、嗜好に適したクエン酸が増加し、嗜好に適さぬコハク酸が減少した。イソクエン酸デヒドロゲナーゼを破壊した清酒酵母（二倍体）を用いた上槽清酒は、対照株として用いた５株中で最も官能的に優れたＫ７０１と比較し、爽やかな酸味を呈し、爽快で、バランスも優れており官能的にも良好な結果を示した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減又は消失した酵母を用いることにより、従来にない有機酸組成をもつ酒類、食品の製造が可能になった。すなわち、該酵素活性を低減又は消失させることにより、嗜好に適したクエン酸含量が増加し、及び嗜好に不適なコハク酸含量が減少した新規な酒類、食品の製造方法を提供することができる。
【００５２】
【配列表】
【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ１）の構造を示す図である。
【図２】遺伝子破壊用プラスミド（ｐＩＤＨ２）の構造を示す図である。
【図３】１α−１のＩＤＨ１遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを示す写真である。
【図４】２α−１０のＩＤＨ２遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを示す写真である。
【図５】Ｎｏ．７のＩＤＨ１遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを示す写真である。
【図６】Ｎｏ．４９のＩＤＨ２遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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