(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロラクチンレセプターを発現する乳癌細胞の増殖を防止するための医薬組成物であって、プロラクチンレセプターに結合し、１２０位のアミノ酸のグリシンがアルギニンで置換された（Ｇ１２０Ｒ）ヒト成長ホルモン変異体であるアンタゴニストである成長ホルモン類似体の有効量を含む医薬組成物。
【請求項２】
成長ホルモン類似体がプロラクチンレセプターポリペプチドリガンドのアミノ酸配列変異型である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
類似体がレセプターと１：１の複合体を形成する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
類似体が、成長ホルモンとレセプターの１：２複合体を解離する請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明はポリペプチドリガンド及びレセプター相互作用の領域に関するものであり、特に乳ガンの治療のためのアンタゴニストの使用に関するものである。
背景技術の説明
リガンド誘導レセプターオリゴマー化は、細胞外リガンド結合領域を含むチロシンキナーゼレセプターという大きな群へのシグナル導入の機構として提案されてきた（総説についてはYarden et al., Ann. Rev. Biochem. 57:443（1988）及びUllrich et al., Cell 61:203（1990）を参照）。これらのモデルにおいて、レセプター（Ｒ）あたりのホルモン１分子（または１サブユニット）（Ｈ）の結合はＨ2Ｒ2複合体の生成を誘発すると考えられてきた。例えば架橋および非解離的電気泳動の研究は、表皮成長因子（ＥＧＦ）はＥＧＦレセプターの二量化とそれに続く細胞内チロシンキナーゼの自動燐酸化と活性化を促進することを示唆している（Shector et al., Nature 278:835（1979）；Schreiber et al., J. Bio. Chem.258:846（1983）；Yarden et al., Biochemistry 26:1434（1987）；Yarden et al., Biochemistry 26:1443（1987））。インシュリンレセプター（Kahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 75:4209（1978）；Kubar et al., Biochemistry 28:1086（1989）；Heffetz et al., J. Biol. Chem. 261:889（1986）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター（Heldin et al., J. Biol. Chem. 264:8905（1989）；Hammacher et al., EMBO J. 8:2489（1989）；Seifert et al., J. Biol. Chem. 264:8771（1989））及びインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）レセプター（Ikari et al., Mol. Endocrinol. 2:831）を含む他のチロシンキナーゼレセプターの研究は、レセプターのオリゴマー化は生物学的効果と固く結ばれていることを示している。他のグループは最近、細胞外結合領域との複合体としてポリペプチドホルモンを結晶化した（Lambert et al., J. Biol. Chem. 264:12730（1989）；Gunther et al., J. Biol, Chem. 265:22082（1990））。しかし、これらの及びその他のレセプターにおけるリガンド誘導による変化の構造的摂動と必要性の詳細な分析は、これらの膜関連系の複雑さと高度に精製した天然または組換えレセプターの適当な量の不足のために妨げられている。
精製されたレセプターが入手できれば、ホルモン−レセプター複合体の性質が認識されるようなアッセイ方法が構築される。アメリカ特許第５０５７４１７号においてはｈＧＨ結合アッセイが、組換えｈＧＨレセプター（ｈＧＨｂｐ）またはｈＧＨ結合蛋白の細胞外領域と結合するため低温のｈＧＨとの125Ｉ−ｈＧＨを用いて行われ、生じた複合体をポリエチレングリコールを添加してｈＧＨｂｐに対する抗体で処理し得られた複合体を沈澱させている。これらの免疫沈澱アッセイはｈＧＨがｈＧＨｂｐと１：１の複合体を形成していることを示唆する。この免疫沈澱アッセイは、結合した125Ｉ−ｈＧＨの量を正確に検出するが、１：１のモル比の指示は不正確である。
ｈＧＨレセプターおよび結合蛋白のために種々の固相アッセイが用いられている。そのようなアヅセイは、結合ｈＧＨ量を検出するが、ｈＧＨのレセプターに対するモル比率は検出しない。ｈＧＨレセプターを含む膜分画または固相の結合アッセイは、活性レセプターの総量及び／または内因性ｈＧＨ結合量の検出ができないのでｈＧＨとレセプターのモル比の決定には適当でない。ＥＧＦにおけるような過去の研究に基づき、ｈＧＨ−レセプター複合体はＨ2Ｒ2テトラマーであろうと考えられている。
ヒトの肝臓からクローニングしたｈＧＨレセプター（Leung et al., Nature 330:537（1987））は、単一の細胞外領域（約２８ｋＤ）、貫膜セグメント及び公知のチロシンキナーゼや他の蛋白と相同でない細胞内領域（約３０ｋＤ）を持っている。しかしながら、ｈＧＨレセプターの細胞外領域部分はプロラクチンレセプターの細胞外領域と構造的に関連し（Boutin et al., Cell 53:69（1988））そして少なくとも８コの他のサイトカイン及び関連するレセプターと広義に関連している。Escherichia coli内で発現するｈＧＨｂｐは１リットルあたり数十ミリグラム程度分泌される（Fuh et al., J. Biol. Chem. 265:3111（1990））。高度に精製したｈＧＨｂｐは、血清中に見いだされる天然のｈＧＨｂｐに比べｈＧＨに対して同等の特異性と高度の親和性（ＫDは約０．４ｎＭ）を保持している。
ｈＨＧは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン及びその他の成長ホルモンの遺伝子的および種的変異型を含む相同なホルモン類の一員である（Nicoll et al., Endocrine Reviews 7:169（1986））。その類の中でｈＧＨは広い種特異性を持ち、そしてクローン化した体因性の（Leung et al., Nature 330:537（1987））またはプロラクチンレセプター（Boutin et al., Cell 53:69（1988））の何れかと結合する点において特異的である。ｈＧＨにクローン化した遺伝子はEscherichia coli中の分泌形態として発現され（Chang et al., Gene 55:189（1987））そのＤＮＡ及びアミノ酸配列が報告されている（Goeddel et al., Nature 281:544（1979）；Gray et al., Gene 39:247（1985））。ｈＧＨの三次元構造はまだわかっていない。しかしブタの成長ホルモン（ｐＧＨ）の三次元折りたたみパターンは適度の解決と精製で報告されている（Abdel-Meguid et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U. S. A. 84:6434（1987））。：ｈＨＧレセプターと抗体結合部位は、同族体スキャニング突然変異誘発で同定されている（Cunningham et al., Science 243:1330（1989））。Ｎ−端末アミノ酸で欠失または変異させた成長ホルモンは公知である。次を参照せよ。Gertler et al., Endocrinology 118:720（1986）；Ashkenazi et al., Endocrinology 121:414（1987）；Binder, Mol. Endo. 7:1060（1990）；WO 90/05185。ｈＧＨのアンタゴニスト変異型はChen et al., Mol. Endo. 5:148（1991）とそこに引用の文献ならびにWO 91/05853に記載がある。ｈＧＨ変異型はCuningham et al., Science 244:1081（1989）；Science 243:1330（1989）に開示されている。
多くのポリペプチドリガンドとレセプターとの相互作用の様式は明確でないので、そのようなリガンドのアミノ酸配列変異型を作り出して所望の性質を得ることは困難である。本質的に、本技術においては変異型を無作意に、つまり幾つかの場合には類似の作用をもつリガンドや動物同族体の相同性分析から、またはフラグメント例えばトリプシン消化フラグメントの分析からの案内によって導いている。ついで本技術は、所望の活性たとえばアゴニストまたはアンタゴニスト活性の候補となるべきものをスクリーニングする。このスクリーニング方法は、例えば形質転換動物を使ったりして（WO 91/05853）長期間と高い経費がかかる。候補品の選択の効率化の改良の方法が必要である。特にアンタゴニストやアゴニストとしての候補品に焦点をあてる方法が必要とされている。アンタゴニストとは天然のリガンドの生物学的活性を阻害しまたは拮抗する物質であり、一方アゴニストとは天然のリガンドよりもそれ自体大きな活性をもち但しそれ自体は生物学的活性をもたないものである。
プロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモンが乳ガンの発達と進行に役割をもっていることは実験動物で良く確立されている（Tornell et al., Int. J. Cancer 49:114（1991））。例えば高い血清レベルの成長ホルモンは乳ガンの形成を誘発し（Tornell, id.）、いっぽう成長ホルモンの循環レベルの減少は乳ガンの抑制と関連している（Phares et al., Anticancer Res. 6:845（1986））。高い血清レベルの乳腺刺激ホルモンは若干の研究では乳ガン患者で見いだされているが（Maddox et al., Brit. J. Cancer 65:456（1992））、ほかの研究ではそうではない（Love et al., Cancer 68:1401（1991））。乳ガンの生体組織検査の４０−７０％はプロラクチンレセプターの存在が陽性である（Bonneterre et al., Cancer Res. 47:4724（1987）；Murphy et al., Cancer Res. 44:1963（1984））。
培地におけるヒトの乳ガン細胞のほとんどはプロラクチンレセプターを含んでいる。実際、乳ガン細胞系の大多数は２−１０倍のプロラクチンレセプターを過剰発現している（Shiu, ”Prolactin, Pituitary Hormones, and Breast Cancer,”in Hormones and Breast Cancer, Pike et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1981））。乳腺刺激ホルモンは培地においてヒト乳ガン細胞系ＭＣＦ−７の成長を誘導することが見いだされている（Biswas et al., Cancer Res. 47:3509（1987））。Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞系は共に、ヌードマウスでの固形腫瘍として成長するとプロラクチンおよび成長ホルモンに感応する（Welsch et al., Cancer Lett. 14:309（1981））。Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７は何れも高いレベルのプロラクチンレセプターを含んでおり、しばしば乳腺刺激ホルモンや乳ガンの関連性のためのモデルとして用いられる（Shiu, id.）。
従って本発明の目的は、アゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドリガンドの効率的な選択のための改良された方法を提供することである。
他の目的はリガンドレセプターと１：２の逐次複合体を形成するリガンドを検出する方法の提供である。
別の目的は、そのようなリガンド−レセプターの１：２複合体の形成を阻害しまたは促進する能力のある候補物質をアッセイすることである。
追加的な目的は、アゴニストやアンタゴニストとして作用する能力のあるポリペプチドリガンドのアミノ酸配列変異型の提供である。
他の目的は、ガン細胞による例えばプロラクチンレセプターのような成長ホルモンレセプターまたは成長ホルモン類似体レセプターの発現を特徴とする、乳ガンまたはその他のガンの治療の提供である。
本発明のその他の目的、内容や特徴は次の説明や請求の範囲を検討することから更に明瞭となるであろう。
発明の概要
予期しなかったことに我々は次のことを見いだした。すなわち成長ホルモン及びそれに属する一群の配座リガンドは、最初のリガンド部位（部位１）が一つのレセプターと結合し次いで第２の部位（部位２）が他のレセプター分子と結合して１：２複合体を生じる、という具合にレセプターと１：２複合体を形成する能力があることを見いだした。本発明の適用されるリガンドは、非ヘリックス（らせん）アミノ酸配列で両端が分離され終わっている４つの両親媒性の逆平行アルファヘリックス領域を含む単量体リガンドである。以下に詳細に説明するように、部位１及び／または部位２へアミノ酸配列変異型を導入することにより、該リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストアミノ酸配列変異型を効果的にデザインすることが、成長ホルモン、プロラクチン及び胎盤ラクトゲンについての我々の研究との類推で可能となった。
２つの部位の複合体形成アッセイは、リガンドアゴニストまたはアンタゴニストである物質のスクリーニングに用いられる。そのような物質は本質的に限定がなく、かつリガンドや結合蛋白またはレセプター変種のアミノ酸配列変種と同様に有機の非蛋白化合物を含むものである。
そのようなアルファヘリックスリガンドの新規なアミノ酸配列変種もまた記載される。特に、リガンドの部位２でのレセプターとの親和性を減少させまたは消滅させる部位２におけるアミノ酸配列変異から成るところのポリペプチドリガンドのアンタゴニストが提供される。理想的にはリガンドアンタゴニスト類似体は、部位２のレセプター親和性が低いかまたは無く、そして部位１のレセプター親和性が高い。
更には、一方または両方の部位でのリガンド親和性を上昇する部位１または／及び部位２で変異をもつアゴニストリガンドアミノ酸配列変種が提供される。好ましい実施態様においては両方の部位の速度定数は、２量体複合体のリガンドの平均滞留時間が所望の反応をおこす複合体に必要な時間より大きいか同等であるように選択される。リガンドのポリペプチドアゴニスト変種は以下から成る方法で同定される。すなわち（ａ）変異をリガンドに導入してアゴニスト候補を作成する；（ｂ）候補がその第一のリガンド部位を介してレセプターに結合する親和性を決定する；（ｃ）候補がその第二のリガンド部位を介してレセプターに結合する親和性を決定する；そして（ｄ）もしアゴニストが天然のリガンドより大きい親和性で第一および第二の部位の一方または両方で結合したときは、そのアゴニストを候補として選択する。
本発明によれば、通常、まず第一のリガンド部位を介してレセプターポリペプチドに結合し次いで第一部位とは別の第二のリガンド部位を介してレセプターポリペプチドの第二のコピーに結合するポリペプチドリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法を提供する。その方法はリガンドの第二のレセプター結合部位における、レセプターへのポリペプチドリガンドの親和性に対する候補品の効果を決定することから成る。部位１の相互作用は、上述のＭａｂ５のような部位２をブロックする抗体を用いる免疫沈澱で決定される。もしくは実質的にレセプターと１：１の複合体のみを形成する野生型のリガンドの量を決定し、次いでその比率でレセプターと天然のリガンドと拮抗する候補品の能力を決定する。部位２の相互作用は三元複合体を形成する候補品の能力を調べることによりアッセイされる。
候補品がリガンドのポリペプチド類似体であるときは、部位２での類似体の結合の欠如をアンタゴニスト活性と積極的に関連づけることができる。レセプター部位２に対して天然のリガンドより大きい親和性で結合する能力は、アゴニスト活性と関連している。アンタゴニスト及びアゴニスト活性は共に、天然のリガンドよりも大きい親和性で部位１に結合する候補の能力と積極的に関連している。小さい分子や他の非類似の候補は、部位１及び／または部位２への天然のリガンドの結合を促進または抑圧する能力についてアッセイされる。アンタゴニストは、部位１及び／または部位２、但し好ましくは部位２での天然のリガンド−レセプター結合を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、たとえは部位２不能のリガンド変異型をポジティブコントロールとして用いることにより、部位１でリガンドレセプター結合を抑圧せず部位２で阻害するアンタゴニストの同定を許容する。
候補品の効果は、天然のポリペプチドリガンドの存在下、または天然のポリペプチドリガンドの活性と比較して測定することが出来る。最初のやりかたにおいては、野生型リガンドによるレセプター相互作用における候補品の効果が測定される。次の場合においては野生型リガンドの活性が正の対照として使用され、候補品（通常はリガンドのアミノ酸配列変異型）のレセプター結合特性を野生型リガンドの不存在下に測定する。しかし一般的にはアゴニストやアンタゴニスト候補のアッセイは、野生型リガンドの存在下での競合アッセイで最も良く行われる。
我々はまたＧＨレセプターを結合する能力のある選択された抗体はＧＨのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することを決定した。従って成長ホルモンの欠乏または過剰の治療におけるＧＨのアンタゴニズムやアゴニズムの方法が提供される。
本発明の他の観点は、細胞を成長ホルモン類似体の効果的量と接触させ、プロラクチンレセプターを発現する細胞の成長を阻害する方法を提供する（ここで、該類似体はプロラクチンレセプターと結合するアンタゴニストである）。
本発明の他の観点では、患者に成長ホルモン類似体の効果的量を投与し、患者の乳ガンの治療方法を提供する（ここで、類似体はプロラクチンレセプターと結合するアンタゴニストである）。
【図面の簡単な説明】
図１ａ及び１ｂ。図１ａ：ｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の複合体の結晶。このｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ複合体は、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ７５−１００サイズの排除カラム上で複合体を精製することによって得られる。複合体を含む高分子量のピークは、遊離のｈＧＨから分離し、プールし、濃縮する。成分は、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で線形アセトニトリル勾配でアイソクラチックに溶離する（図１ｂ）。勾配は破線で示した矢印のところで開始する；２１４ｎｍでの吸収を実線で示す。
図２。４：３、３：１、２：１、１：１及び０．５：１に対応する種々の比率のｈＧＨｂｐとｈＧＨのゲル濾過クロマトグラフィーである。各々の混合物におけるｈＧＨ濃度（ｈＧＨが各々２０μＭ及び４０μＭである場合の１：１及び０．５：１の比率のときを除き１０μＭに固定）とｈＧＨｂｐ濃度は、２８０ｎｍでの吸収に基づく。セファローズ１２ＦＰＬＣカラム（Pharmacia）に１００マイクロリットルの蛋白サンプルを加え、そして溶離した。ピークは２８０ｎｍにおける吸収で監視した。
図３。複合体が種々の抗モノクローナル抗体で沈澱されるｈＧＨｂｐへのｈＧＨの結合のスキャッチャード分析である。
図４。ｈＧＨｂｐと結合するため作り出されたｈＧＨｂｐとヒトプロラクチン（パネルＡ）もしくはヒト胎盤ラクトゲン（パネルＢ）の変種との２：１比率またはｈＧＨ（パネルＣ）のゲル濾過クロマトグラフィー。
図５。ｈＧＨとｈＧＨｂｐとの滴定熱量測定。ｈＧＨｂｐ（１０ｍＭトリス（ｐＨ：８．０）中１５μＭ）を１．３７ｍｌの滴定セル（ＭＣ２滴定熱量計、Microcal Incorporated, Northampton, MA）に入れ、２５℃で平衡化する。この溶液にｈＧＨ（１０ｍＭトリス（ｐＨ：８．０）中４３７μＭ）を４μＬ増加分加える。各々の注入はそれらの間に５分間の間隔をとって８秒間おこなう。
図６。ｈＧＨとｈＨＧｂｐを１：１の比率で混合する前（−）及び後（．．）のそれらの個々のスペクトルの和の遠紫外部（パネルＡ）または近紫外部（パネルＢ）における円二色性スペクトル。遠紫外および近紫外スペクトルは、各々０．０１ｃｍと１．０ｃｍのセル中で０．２ｎｍおよび０．５ｎｍの間隔で集めた。
図７。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：１の比率で混合する前（−）及び後（．．）のそれらの個々のスペクトルの和の蛍光発光スペクトル。
図８。ｈＧＨの順次の添加による１０ｎＭＳ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチング。培養後、島津ＲＦ５０００Ｕ分光蛍光光度計を用い４９０ｎｍの励起１と５１２ｎｍの発光１（バンド幅は各々３ｎｍ及び１０ｎｍ）で蛍光測定を行った。
図９。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのｈＧＨ誘導二量化のＩＣ50測定。結合緩衝液（20mM Tris.HCl pH7.5, 0.1% BSA, 0.02% NaN3）中のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（図８に記載のようにして製造）の系列的希釈（３倍）を２０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲で行い、１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管に分配した。同様にｈＧＨを系列的に但し１ｍＭから０．００４ｍＭの範囲で希釈した。ｈＧＨ希釈のアリコート１０ｍｌ（ｈＧＨとＳ２３７Ｃ−ＡＦモル比は１：２）と緩衝液のみをアッセイ管を含むＳ２３７Ｃ−ＡＦに加え、混合し、そして暗所で２５℃に５時間かけて平衡化した。平衡化のあと、励起バンド幅を１０ｎＭとした以外は前述と同様（図８）にして蛍光を測定した。ＩＣ50値を、４パラメーターの曲線適合から得た半極大値Ｄ  Ｆ／Ｆｏを与えるｈＧＨ濃度として計算した。６つの独立した実験の平均から０．５４（±０．１４）というＩＣ50値を計算した。
図１０。過剰のｈＧＨまたはｈＧＨ変異体によるｈＧＨ誘発Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ二量化の反転。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦとｈＧＨを各々１０ｎＭ及び５ｎＭの濃度まで結合緩衝液で希釈し、１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管に入れる。次いでｈＧＨ、変異体または緩衝液の系列的希釈のみを加え、混合物を暗所で２５℃に５時間培養して平衡化させ、図１で述べたようにして蛍光を測定する。データの点は３回の測定の平均値で、１はｈＧＨ、ｓはＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ、ｎはｈＰＬリクルートを表す。誤差のバーはＳＥＭを与える。
図１１。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2の結晶構造。太い線の中央の上部はｈＧＨ分子を表す。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子（一つは左側、そしてもう一つは右側）に結合する。これらｈＧＨｂｐ分子の各々は、単一鎖で結合した２つの領域をもつ；上方の領域はｈＧＨ分子と同じ高さであり、他の領域は垂直で図の下方へと突出している。ｈＧＨｂｐのこれらの最後の２つの領域は最下部で互いに接触している。
図１２。成長ホルモンレセプターに特異的な抗体に対応する体重増加。モノクローナル抗体であるＭａｂ２６３を８匹のラットに投与（１．０５ｋｇ／ｋｇ）し、対照群には希釈剤のみを投与する。毎日の体重を測定する。
図１３。ｈＧＨ−ｍＧ−ＣＳＦハイブリッドレセプター含有の、ｈＧＨ−誘発ＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖（Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:4498（1991））。細胞を、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、１０μＭのｂ−メルカプトエタノール及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中において３７℃、５％ＣＯ2で成長させる。細胞をＩＬ−３無しに同じ培地で洗浄しそして、高い濃度のｈＧＨで１８時間処理する前に、４ｘ１０5／ｍｌ（１）、２ｘ１０5／ｍｌ（１）及び１ｘ１０5／ｍｌ（ｎ）密度の１００μｌのアリコート中の９６−ウエルのプレートに植える。ＤＮＡ合成を測定するため、細胞を２０μｌの培地内で１μＣｉ／ウエルの添加によって［3Ｈ］−チミジンでパルスを行う。４時間後、細胞を収集しガラスフィルター上で洗浄する。シンチレーションカクテルの２ミリリットルを添加し、ベックマンＬＳ１７０１シンチレーションカウンターで計数を行う。各々のデータ点は３回の測定の平均であり、誤差のバーは標準偏差である。
図１４。ｈＧＨ変異型によるｈＨＧ−誘発細胞増殖のアンタゴニズム。細胞を図１３のようにして作成し、高い濃度の部位１変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）（１）、部位２変異体（Ｇ１２０Ｒ）（ｎ）、部位１変異体／部位２変異体の結合増強物（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ／Ｇ１２０Ｒ）（ｎ）及び野生型ｈＧＨ（１）を加えた１ｎＭのｈＧＨで培養する。
図１５ａ、１５ｂ及び１５ｃ。ＩＬ−６アンタゴニストまたはアゴニストを作成における変異に適したヘリックス部位を仮定した車輪状のプロット。これらの図の残基の番号づけはＮ−末端を前残基として開始していることに注意。
図１６。ｈＧＨ、ＰＲＬまたはＧ１２０Ｒに対するＴ４７Ｄ細胞の応答。Ｔ４７Ｄ細胞を、示されたホルモン濃度で培養する。細胞濃度は１０5／ｍｌであり、最終容量は１００μｌであった。誤差のバーは３回の測定からの標準偏差である。白ヌキのバーは亜鉛の追加のないアッセイを表し、灰色のバーは２５μＭの硫酸亜鉛でのアッセイを表す。対照はアッセイ培地のみである。
Ｔ４７Ｄ細胞増殖のアゴニスト（Ａ）またはアンタゴニスト（Ｂ）としてのｈＧＨまたはＧ１２０Ｒの用量依存的アッセイ。（Ａ）ではｈＧＨまたはＧ１２０Ｒを２５μｌの硫酸亜鉛と共にまたは無しでＴ４７Ｄ細胞で培養し、増殖を3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定する。（Ｂ）においてはＴ４７Ｄ細胞を硫酸亜鉛と共にまたは無しで１ｎＭのｈＧＨと共に高い濃度のＧ１２０Ｒで培養する。
図１８。ＭＣＦ−７細胞の、種々のｈＨＧ類似体に対する応答。ＭＣＦ−７細胞を、５０μＭの硫酸亜鉛と共に（灰色のバー）または無しに（白ヌキのバー）３日間ｈＧＨ、ＰＲＬまたはＧ１２０Ｒと共に培養する。
好ましい実施態様の説明
本発明の方法はアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドリガンドの同定を容易にする。一般的に、本発明は次のように実施される。
まず、レセプターと１：２の３成分複合体となるリガンドを同定するために、リガンドとそのレセプターの会合の化学量論を決める。会合の化学量論は、下記の方法の一つを用いる生理学的条件下でリガンドとレセプターに対する比率を測定して決定される。すなわちＸ線結晶学、セファローズゲルを用いたサイズ排除クロマトグラフィ、抗体結合研究、走査熱量測定、ＢＩＡ−コア分析およびＣＤまたは蛍光スペクトル分析。リガンド−レセプター複合体のＸ線結晶構造は有用であるが、決して記載の化学量論を決定するに必要なものでない事を了解すべきである。好ましくは、蛍光ホモクエンチング方法は以下に述べるようにして用いられる。この方法においてはレセプターは次のように位置したフルオレセインでラベルされる。すなわちレセプター２分子が滴定で定められたようにリガンドで結合されたとき、フルオレセイン分子は互いにクエンチし溶液のフルオレセインは減少する。ここに記載の技術はそれ自体が公知であり、当業者の技術範囲内にある。
好ましくはレセプターの細胞外領域が化学量論分析で用いられる。すなわち分析は、膜挿入または疎水性会合の能力のない削除されたまたはその他の処理をされたトランスメンブラン領域を持つレセプター変異型と共に試験管内で溶液中で行われる。必要に応じ、細胞質領域もまた削除される。そのようなレセプターは公知であり、組換え細胞培養内で発現しそしてそこから回収できる。
もしレセプターが１コより多いポリペプチド鎖を含有しておれば、好ましくはレセプター製造はレセプターポリペプチド鎖の全てを含有する。また、もしも３成分複合体が２つの異なったレセプター鎖から成っておれば（例えばα及びβ鎖を含むＩＬ−２またはＩＬ−３レセプター複合体の場合；Teshigawa et al.,J. Exp, Med. 165:223（1978）など）、分析は両方の鎖で行われる。この場合、各々のレセプター鎖への結合は連続して一元的にのみ進行する。会合の順序は、異なるレセプター分子が含まれているときは容易に決定される。
幾つかのレセプターは１：２複合体をつくるが、レセプターは各々が１つより多い鎖を含むことがある。もしリガンドが鎖の１コと結合するのみで他のものは結合鎖の適当なコンホメーションの保持に必要でないときは多鎖レセプターの使用は不要であろう；リガンド結合に必要な鎖のみ存在が必要である。
１：２複合体を形成するリガンドは、２つの別の結合部位を介してそれらのレセプターと結合する。レセプター類がまず一つの部位（部位１）にそして次に他の部位（部位２）に、連続的な順序で２つの部位に結合することが見いだされたことが本発明の顕著な特徴である。この逆の順序の発生は見いだされていない。この理解はアンタゴニストリガンドの生成のために特に重要である。第一の部位へのリガンドの親和性が保存される（もし高められるのでなければ）ことは重要である。さもなくばリガンド類似体は全くレセプターと結合しない。その一方、第２の部位の結合の効果的な破壊または阻害はアンタゴニスト活性のための属性である。
本発明によってリガンド結合部位とその添加順序が定められる。部位１と２は、以下に詳しく説明するように候補リガンドのコンホメーションを成長ホルモンのそれと比較することによって同定される。それらはアラニン走査または他の系統的な変異誘発方法、たとえばカセット突然変異、ＰＣＲ突然変異またはアラニン走査などで更に十分に解決される。コンホメーションの分析は変異型を作成しスクリーニングする前にかなり狭められるべき潜在的部位１と２残基の分野を許容する。
いずれの場合においても、機能的部位１と不能部位２変異を持つリガンド類似体は、それが三元のリガンド：レセプター複合体を形成できないことで同定される。ただしそのような変異型はレセプターと１：１の複合体を形成可能であろう。一方、機能的部位２と不能部位１変異を持つ類似体は、レセプターとは全く結合できないであろう。この決定のために用いるアッセイはポリペプチドの会合の検出に用いるいかなるアッセイであってもよい。ゲル濾過などと同じように以下に示すホモクエンチングアッセイが用い得る。
コンホメーション分析は、両親媒性のαヘリックス性モノマーリガンド類からのリガンド候補の選択性を高める。そのようなリガンドは成長ホルモン、胎盤ラクトゲン及びプロラクチンとコンホメーション的に関連しているので、成長ホルモン構造からの類推によりこれらのリガンドの部位１と２と決定することは簡単である。反語的には、例えばＥＰＯ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ並びにインターロイキン−２、３、４、６、及び７のようなリガンドの一次アミノ酸配列は、成長ホルモン、胎盤ラクトゲンまたはプロラクチンとあまり類似していない。しかしこれらのリガンド（普通はサイトカインまたはホルモン）が一般のコンホメーション構造原理で分析されるとき（Bazan et al., Immunol. Today 11:350（1991）；Chou et al., Biochemistry 13:222（1974））は、それらはある共通の構造特性を持つものである。最も顕著なことはそれらは、各々が実質的に非ヘリックス構造（蛋白端末のＮ−及びＣ−端末配列とヘリックスのあいだのループ）によって先行され及び後行されている４つの優位の両親媒性のαヘリックスで特徴づけられている。優位のαヘリックスは典型的には約１５−３０の残基長さをもっている。それらはＮ−端末からの順序によりＡ−Ｄと命名される。短いヘリックスセグメントは、優位のヘリックスと結合したループとして存在し得る。
このようなリガンド類のαヘリックスは両親媒性である。換言すれば普通それらは、ヘリックスの片側に疎水性残基を、そして反対側に親水性残基を持っている。ヘリックスの各３．６の逐次残基を、ヘリックスはしごの意味においてターン（turn）と命名する。ヘリックスの末端での若干の小さな論争が考えられる。すなわち各々のαヘリックス末端は、用いたアルゴリズムと技術者の判断に応じて約１−３残基の変動があり得る。この種のリガンド類の間の相同性の全体的な欠如にも関わらず、若干の保守的な残基がヘリックスにおいて見いだされ、それらは成長ホルモンと共にリガンドの構造配列を援助するのに用いることが出来る。
成長ホルモンおよび相同のリガンドプロラクチンと胎盤ラクトゲンについての我々の分析は、このグループの４級αヘリックスサイトカイン及びホルモンの部位２は本質的に（ａ）Ｎ−端末からおおむね最初の３〜４ターンまで延びる配列と（ｂ）ヘリックスＣのおおむね中央の４〜５ターンから成ることを示した。すなわち部位２は非連続であり、両セグメントは蛋白中で密接しており、その態様でレセプターと相互作用している。部位２領域の片方または両方は変異されている。ヘリックス形の疎水性残基は一般に変異誘発の候補選択の目的のためには無視されるが、時折はそれらは候補の機能的完全性に影響する。加えて、部位２中のすべての残基がレセプター結合に機能的または構造的関与をもつものではないであろう。しかしこの原則の適用は、アンタゴニストまたはアゴニスト活性をスクリーニングの必要のある候補の数を大いに減少するものである。
アンタゴニスト変異型は、以下に詳しく説明するように候補位置にある固有の残基の電荷、疎水性または大きさの実質的変化によって特徴づけられる。これは一般に、問題の残基を置換するか削除することにより達成される。若干の例においては所望の効果は、機能的または構造的に活性な部位２残基の隣接位置へ残基を挿入することで達成可能である。アンタゴニストの生成の目的は、部位２におけるレセプター結合の除去または固有のリガンドに対して少なくとも約２倍減少することである。これは、レセプターとの構造的相互作用（水素結合、塩架橋、疎水性相互作用など）に重要である固有残基の一つまたはそれ以上の特性の劇的な変化によって最も効果的に達成される。そのような残基は接触残基と呼ばれる。または残基は、レセプターと直接接触せずに接触相互作用に関与する残基の適切な位置ぎめに重要な位置で選択される。そのような残基は機能的残基と呼ばれる。
典型的には、約２０以下の位置（残基）が部位２変異型の生成に潜在的興味がある（但し疎水性両親媒性残基を除く）。これらのうち各アミノ酸グループの代表的なものだけが候補の創製に用いられる。すなわち、通常、部位２中の各々の残基について、１９の天然残基を残した１９の変異体のスクリーニングが必要な訳ではない。そのかわりに残基グループの代表的なものが選択される。一般的にこれらのグループは、（ａ）正に荷電した残基（Ｋ，Ｒ及びＨ）、（ｂ）負に荷電した残基（Ｄ及びＥ）、（ｃ）アミド（Ｎ及びＱ）、（ｄ）芳香族（Ｆ、Ｙ及びＷ）、（ｅ）疎水性基（Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭ）並びに（ｆ）無電荷の親水性残基（Ｓ及びＴ）である。更に、アンタゴニスト候補を作成するときは、５クラスの代表残基のスクリーニングよりもむしろ、適切な残基におけるいかなる実質的変異型も部位２を無力にするので、典型的には１−３クラスを選択するだけで十分である。下記の表Ｉａを参照のこと。最末端の置換は向かい側との結合の選択で生産される。例えばもしも元来の残基がアラニン（少し疎水性）であれば、向かい側の置換基は親水性、嵩高、そして荷電されているグルタミン酸であろう。更に残基が、進化多様性を示すものから選ばれる。すなわち、もし動物種リガンドがｈｕレセプター部位２に結合しなかったときは、変異型残基は候補として選択される。そのようにしてアンタゴニストを含むような変異体の適切なプールは典型的には約２０から約６０の部位２変異型を含むであろう。部位２のアゴニストの候補の選択のためには、すこし別の戦略が用いられる。部位１に関する下記の討論を参照のこと。そのようなプールの生産とスクリーニングは不適切な実験を含まず、そして当業者の技術範囲の中にある。
置換アミノ酸の選択はまた、残基がαヘリックス中にあるか非ヘリックス構造の中にあるかを考慮せねばならぬ。もしも残基がヘリックスターンの一部分であれば、置換は好ましくはプロリンやグリシンのような、ヘリックスブレーカーではない。その一方、もしもプロリンやグリシンが野生型ヘリックス中に見られたならば、それらの置換はヘリックスコンホメーションを不安定化しないので自由に置換してよい。
部位１はまた不連続部位でもある。それは（ａ）ヘリックスＡの中央部４０％（多分ヘリックスＡの部位２のＣ−端末と重複して）、（ｂ）ヘリックスＡとＢを結合するループのＣ−末端２／３ｒｄ（好ましくはＣ−末端１／２）及び（ｃ）ヘリックスＤのＣ−末端１／２（好ましくは１／３）に位置する３つのセグメントから成る。この比率はアミノ酸残基の線形配列を表す。部位２アンタゴニスト変異で用いた戦略と対照的に、部位１領域にある残基は修飾されておらず（アンタゴニストの場合、部位２のみが変異により不能化される）または修飾される場合、部位１への変化は結合を分裂させぬように選択される。その理由は、部位１を不能化することは大抵の実施態様では好ましくないからである。そのかわり、目的は部位１の親和性を約１０％から２倍を越えるまで増加させることである。すなわちこれらの領域中の残基は一般的に（削除または隣接挿入よりもむしろ）置換され、そして最初のスクリーニングは阻害決定因子（特に荷電したときに嵩高い側鎖がリガンド−レセプター結合相互作用を阻害または妨害する残基）を同定するためにアラニン走査と共に行われる。いったん阻害残基が同定されると、アゴニストまたはアンタゴニストの部位１置換は、表Ｉａの「アゴニスト」置換から選択される。種多様性分析はまたアゴニストの同定においても役に立つであろう。再び、部位１変異のために約２０以下の位置が選択される必要があろう。一般に各々の位置における変異は、もとの残基グループの残余のものや、よりかさの低い側鎖を有する、次に最も密接に関連したグループ（表Ｉａ）の残基による置換及び／又は不変である。
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例示グループは指定の野生型残基を除く；グループのメンバーは上記の本文中に記載してある。
各々の部位は幾つかの不連続的領域を含んでいるので、変異が領域のどれか一つに導入される。すなわち与えられた部位の各々の領域を変えることは必要でない。部位２のヘリックス領域（ヘリックスＡまたはＣ）好ましくはヘリックスＣは、部位２のための好ましい変異誘発位置である。部位１のヘリックス領域（へリックスＡまたはＤ）好ましくはヘリックスＤは、部位１のための好ましい変異位置である。典型的には、１つの残基のみが各部位に対して変異される。但し各々の部位の各々の領域中の少なくとも１つの残基（部位２には２コ；部位２には３コ）を変異するのが本発明の範囲に入る。他の実施態様では２つまたはそれより多い残基、通常は約５コまでの残基が各領域で変異される。
変異誘発または変異のためのヘリックス残基の選択は、図１５ａ、ｂ及びｃに示すようなヘリックス車輪ダイアグラムの構築によって促進される。これらは通常のやりかたで作製され、部位１及び２のヘリックス部分中の変異の標的位置の同定に有用である。興味ある特定の残基は、ヘリックスコンホメーションを不安定化する残基、非嵩高残基および親水性残基である。
置換、挿入、削除または結合はスクリーニングの候補の作製には有用であるが、残基変更の効果は残基それ自体以外に延び得る。例えばレセプター結合を防ぐ部位２を修飾する方法は、部位２にＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位を導入することである。この部位は酵母や高級真核細胞中に発現するときにグリコシル化され、そして立体障害により部位２結合と拮抗するであろう。このやりかたの一つの利点は、近隣の嵩高いグループの挿入が結合阻害に要するすべてであるために、部位２構造残基の正確な位置を決定するのに必要なことである。他の利点は循環半減期を調節（たとえば増加）し、また変異型の免疫原性を減少する能力である。従って例えば本発明は、ここにおけるリガンド（例えばＩＬ−２）のヘリックスＡ及び／またはＣ（好ましくはＣ）中のグリコシル化部位の挿入を包含する。
次に候補アゴニスト及びアンタゴニストの安定性を、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能的に働くことの候補の能力についてスクリーニングする。そのようなアッセイは通常のもので広く知られている。例えば典型的には、野生型のリガンドの能力と活性を調べるのに用いる通常のアッセイがある。その変わりにまたはそれに加えて、レセプター化学量論を決定するのに用いるアッセイが用いられる（特に、部位２でなく部位１に結合するアンタゴニストを同定するために）。これらのアッセイそれ自体はルーチンなもので、特別の実験を必要としない。
ヒトの成長ホルモンに関して部位２構造残基は、Ｔ３、Ｉ４、Ｌ６、Ｌ９、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｑ２２、Ｙ１０３、Ｎ１０９、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｇ１２０及びＴ１２３を含む。部位２機能的残基はＦ１、Ｉ４、Ｌ６、Ｒ８、Ｄ１１６及びＥ１１９を含む。いかなる残基もこれらの位置のどれか一つまたはそれより多いところで置換され、元来の残基は削除されるか他の残基がその近辺に挿入される。上記したように、または通常はアンタゴニストまたはアゴニスト効果が求められているかどうかに依って同じかまたは別のクラスのメンバーが置換される。これらの位置の一つもしくはそれ以上のところまたはその近傍に導入された変異は、部位２結合に影響するであろう。一般に変異に好ましい残基は、少なくとも１つの変異をＮ−末端領域／ヘリックスＡ中の指定領域に、そして他の１つをＣヘリックス特にＦ１、Ｉ４、Ｌ６、Ｄ１１９及びＧ１２０中に含む。ｈＧＨアンタゴニストの例は次のものを含む。すなわちＩ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０ＡｈＧＨ、Ｉ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０Ａ／Ｔ１２３ＡｈＧＨ、Ｆ１Ａ／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０１／Ｔ１２３ＡｈＧＨ、ＦｌＡ／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０ＦｈＧＨ及びＦ１Ｔ／Ｉ４Ｆ／Ｌ６Ｒ／Ｇ１２０Ｒ／Ｔ１２３ＤｈＧＨ、更には部位１とそのレセプターの親和性を増大するようなＥ１７４、Ｈ２１、Ｒ６４、Ｋ１７２及び／またはＦ１７６のような残基での付加的な変異をもつ既述のいかなるものも含む。例えばＥ１７４は好ましくはＳに変異され、しかしまた他の実施態様ではG, V, L, I, A, T, D, N, Q, H, K, R, M, F, Y, WまたはPから選択される残基に変異される。Ｆ１７６は好ましくはＹに変異され、そして最適にはＥ１７４Ｓ、Ｒ１６８Ｎ、Ｄ１７１Ｓ／Ａ及び／またはＩ１７９Ｔ（ヘリックスせんＤからの）と、並びにヘリックスＡ、Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ及びＨ２１Ｎからと共に用いられる。２つの部位１ｈＧＨ変異型は、野生型ホルモン（F10A/M14W/H18D/H21N/R167N/D171SまたはA/E174S/F176Y/I179T）であるＧＨｂｐと約３０倍強固な結合をもつファージミッドスクリーニング（Phageimid Screening）で同定されている。これらの部位での変異は、アゴニストまたはアンタゴニストを生成するために部位２で上述の変異と結合される。アンタゴニストの例は次のようである。すなわちF1A/I4A/F10A/M14W/H18D/H21/G120R, F, Y, W, D, EまたはI/R167N/D171SまたはA/E174SまたはA/F176Y/I179T hGH；F1A/I4A/H21A/R4K/E174A hGH, I4A/G120R/E174A hGHまたはI4A/G120I/E174A hGH。
他のアンタゴニストの実施態様ではＩ４Ａ、Ｌ６Ａ、Ｆ１及び／またはＧ１２０が削除されこれらの残基の一つまたはそれ以上が削除され、その一方では残る残基は置換され、そして／または一つまたはそれ以上の残基がこれら残基の近傍に挿入される。置換、削除および挿入の結合は有用である。それらの選択は単に成長ホルモンの活性の最適化の問題である。そのような結合は次のものを含む。すなわちF1(D)/I4A/G120I/E174A及びI4(D)/G120(K)/E174A。
部位１と２の位置での変異の効果は一般に結合と親和性を抑圧するであろう。但しこれらの部位での選択的修飾はまたルーチンなスクリーニングで決定される親和性の増大をもたらし得る。例えばＥ１７４（Ｓ、Ｇ、ＡまたはＴ）並びに２１、１８及び６４位置での変異はＧＨｂｐに対する部位１の親和性を増大することがわかっている。
ｈＧＨ部位１構造的残基は次のようである。すなわちH18, H21, Q22, F25, K41, Y42, L45, Q46, P61, S62, N63, R64, E66, R167, K168, D171, K172, T175, R178, C189。部位１の機能に影響する側鎖をもつ残基は次のようである。すなわちP5, R6, F10, M14, F54, E56, I58, S62, N63, R64, E66, Q68, Y164, D171, K172, E174, T175, F176, R178, I179, C182, V185。レセプターに対する部位１の親和性を増大する好ましい残基はＨ２１、Ｒ６４及びＥ１７４である。一般的に部位１残基は単に置換されるのみで削除はされずまたその近傍に挿入もされない。更に部位１置換は一般に、表Ｉａからわかるように、元来の残基と同じかまたは密接に関連する基から取り出される。通常はアゴニストとアンタゴニスト活性は部位１がレセプターに結合することを必要とするので、部位１を重度に動揺させることは好ましくない。にもかかわらず、例えばＥ１７４Ａのような例外があるので、最適のものを決定するには置換のパネルをスクリーニングするのが望ましい。
他の成長ホルモン中の類似の残基は同様にして容易に同定され修飾される。例えばｈＧＨ中のＩ４は、ｂＧＨ中のＭ４に対応する。残基の数の幾つかの変化は、成長ホルモンをｈＧＨの他のアレレや他の種から比較すると存在し得ることに注意せよ。もしも動物ＧＨが相同の位置にヒトＧＨと同じ残基を含まないならば、置換した残基は動物残基からのものとは異なっており、そして好ましくはその位置でヒトの残基とは異なっている。さもなければ変異誘発のための残基の選択は既述のものと同じやりかたで行われる。
構造分析または分子モデル化は、他のリガンド、すなわち４つの逆平行の両親媒性のαヘリックスを含むモノマーポリペプチドリガンドでの変異のための類似の配列を同定するために用いられる。候補リガンドの構造はChow Fassman分析を用いて決定され、次に各々のリガンドに対する部位１と２中に位置する類似の残基が同定される。幾つかの例においては構造研究は既に発表されており、種々の領域中の残基を成長ホルモンと比較して部位１と２を同定するのが必要なことの全てである。単量体リガンドは、正常の生理学的条件下での循環におけるモノマーとして見いだされたものである。
そのようなリガンドの現在知られている実例は次のものを含む。すなわちＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン２、３、４、６及び７、胎盤ラクトゲン及びプロラクチン、α−インターフェロン、β−インターフェロン。これ以外のものは将来同定され得るし、本発明の教示はそれにもまた同等に適用できる。
これらのリガンドのアンタゴニスト候補の生成のために、実質的な変異を次の２つの領域の一つまたは両方に導入する。（ａ）Ｎ−端末からＡヘリックスのＮ−端末１／３へ；（ｂ）Ｃヘリックスの概ね中央１／２（好ましくは１／３）。これらの領域はｈＧＨの部位２領域に対応する。アゴニストは、あまり嵩高でなく及び／またはあまり荷電してない置換を部位１及び／または２に導入して行われる。最適のアンタゴニストはレセプター結合を防ぐか実質的に削除するために部位２お変異するか、またはそのレセプターに対する親和性を増大するために部位１を変異することによって生成される。ここに見られるように、部位１はアゴニスト及びアンタゴニスト実施態様の両方においてレセプターに対する親和性を増大するために修飾される。
成長ホルモン以外のリガンドのアンタゴニストやアゴニスト変異型が製造されるようなやりかたの説明として、後記の表Ｉｂが参照される。該表はｈＰＲＬ、ＩＬ−２、ＬＫ−４、ＩＬ−４、ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰＯのために必要な部位１と２の主要なそして大切な決定因子を開示する。各部位のヘリックス決定因子は各リガンドのヘリックス領域を同定しそしてｈＧＨの類似領域と比較することによって選択される。同様な分析は、ｈＧＨ以外のリガンドの構造または機能に貢献する非ヘリックス領域の同定に用いられる。表Ｉｂは、アンタゴニスト変異型はＮ−端末の部位２領域よりもむしろ部位２のヘリックス残基を標的として好ましくは行われるという本発明者の考えを反映している。しかし部位１と２のための非ヘリックスの類似残基もまた変異し得る。部位１と２のための表Ｉｂの残基は、表示するリガンドのためのレセプターと構造的または機能的に相互作用する少なくとも１つの残基を含むものと信じられる。これは、Ｏ−またはＮ−結合グリコシル化部位を創製するように３つの領域の一つまたはそれ以上で残基を置換するか、その領域または部分を削除することによりその３つのヘリックス領域または部分の１−３コのブロックアラニンスキャニングまたはホモローグスキャンニングで容易に確認できる。いったん領域の活性が確認されると、鍵となる機能的または構造的残基を同定するために残基から残基へのアラニンスキャンニングを用いることは容易である。
表Ｉｂのためのヘリックス構造情報は次から得た。すなわちDeVos et al.,Science 225:306（1992）（hGH）；Bazan et al., Immunol. Today 11:350（1991）（hPRL, IL-6, IL-2 and EPO)；Lokker et al., EMBO J. 10:2125（1991）；Bazan et al., op.cit．（IL-2）；Diederichs et al., Science 254:1779（19**）（GM-CSF）。上述のように他のリガンドに関するこのような情報はモデル化、ＮＭＲまたは好ましくはＸ線結晶学的分析で得られる。
表Ｉｂにおける部位の指示は、ヘリックスＡの０．０７から０．５の長さ及びヘリックスＣの０．５から０．８の長さの部位２に基づくコンタクトパッチの計算で得られた。これらの部位は概略と考えられ、適当な精製を必要とするであろう。各々の部位は配列から±１〜５残基に位置しているであろう。
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アンタゴニストの作成において標的のヘリックス残基中へ導入される残基または構造はふつうは同じもの（上記参照）でなく、好ましくは置換される残基よりも一段と嵩高いものである。ほかの実施態様では部位残基は削除され、または他の残基（例えばＧやＰのような、ヘリックスブレーカー）が部位残基の近傍に挿入される。次に候補の一群が作成され、最適の候補を同定するためにここに述べる方法でスクリーニングされる。しかし、たとえ変異型リガンドが元来のリガンドに比べてアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できなくてもその変異型はリガンドのために普通に用いられるものとして（ここで変異型は元来のリガンドと概ね同じ活性を保持している）またはレセプターと結合できない免疫試薬（例えば診断試薬）として有用であることは強調されねばならない。
ＩＬ−２アンタゴニスト候補の作成の代表的な概要表Ｉｃに示す。この概要で表Ｉｂで同定した推定上の部位２残基は、減少したレセプター結合のために好ましくはアミノ酸で置換される。付加的な他の置換もまた表に示してある。
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ＩＬ−６ヘリックスＡ、Ｃ及びＤの代表的なヘリックスホイールプロットは各々図１５ａ、ｂ及びｃに示す。ヘリックスＡで潜在的に興味あるのはＤ５４、Ｒ５８、Ｅ５１、Ｋ５５、Ｔ４８、Ｒ５２、Ｑ５６及びＳ４９であり、ヘリックスＣにおけるそれはＫ１５７、Ａ１５８、Ｑ１５５、Ｑ１５２、Ｋ１５６及びＶ１４９である。
ｈＰＲＬに対する類似のプロットは、修飾部位２のための位置は次の残基であることを示唆する。すなわちH58, D69, H55, D48, N59, V52, D45, Y56, R49（ヘリックスＡ）；K143, Q150, G157, E146, Q164, R153, L160, S142, E149, S163, V145, K152, E148, H166, E156, E159（ヘリックスＣ）。
興味のあるｈＰＲＬ部位１（ヘリックスＤ）残基は次のようである。すなわちC202,R220, S191, K209, N198, L216, R205, S194, N212, H201, C219, E190, H208, Y197, K215, R204, D211, L193, L200, K218。ｈＰＲＬ残基は前配列＝１のＮ−端末Ｍから番号づけを始める。
無論ここのアゴニストやアンタゴニストはまた、部位１及び／または２に見られるものより付加的な残基中へ変異が導入されるリガンドを含む。例えば候補は免疫親和性精製を促進するために他のポリペプチドと融合され、領域または残基を削除され、例えばリガンドの活性フラグメントをつくるため所望の活性に関与せず正当なコンホメーションの保持に不要なものを置換または挿入し、または通常のやりかたで変異される。
リガンドがレセプターに結合するＫａ、すなわち親和性定数は、問題の部位でレセプターからリガンドが解離する速度（「オフ」の速度）でリガンドがレセプターに結合する速度（「オン」の速度）を割った比率である。高度親和性相互作用はオン速度が優先的である。アンタゴニストは普通は部位１で高度親和性変異をもつであろう。たいていどちらかの部位での高度親和性変異は、レセプターの性質に応じて所望される。もしリガンドがレセプターに結合し、三元レセプター複合体が連続シグナルよりもむしろ単一を出すならば、レセプターに極めて高度親和性をもつリガンド類似体は、アンタゴニストとして作用し始めるほど長くレセプターを占拠し得る。例えばもし細胞の特性変化のシグナルを出すのに二量体レセプターにとっては２０−３０分必要であれば（例えば蛋白を解放したり有糸分裂を促進したり）、アゴニストリガンドが速度定数をもつことは不要でありレセプターを何時間も占拠することになる。すなわちアゴニスト親和性はもっともよく最適化されるべきで、それによって変異は、レセプターシグナル事項を完結するに要するのと概ね同じ時間後にレセプターから解離される。高い部位１のＫａは不活性部位２を持つアンタゴニストにとって完全に望ましく、何故ならばこれはアンタゴニストによるレセプター部位１の占拠を高めそれにより元来のリガンドに有り得るレセプターを結合するからである。すなわちアゴニスト変異は最も好ましくは二量体レセプターのシグナル特性と速度定数一致性をもち、一方アンタゴニストは部位１では高い親和性をもち部位２では親和性が低いかまたは無い。Ｋａは、与えられたリガンド変異型について例えばファルマシア社から商業的に入手可能なＢＩＡ−コア装置を用いて容易に測定できる。
三元複合体を形成するリガンドとそのレセプターの能力はまた、複合体の形成に影響を与えるが但しリガンドアミノ酸配列変異型でない物質の終末点の便利なアッセイとして役立つ。例えばもしアゴニストまたはアンタゴニスト効果のために一群の非ペプチドまたは短いペプチド分子候補をスクリーニングしたいときは、候補の存在または非存在下で三元複合体の形成を調べるだけでよい。複合体の形成を抑圧する候補はアンタゴニストとして作用し、複合体形成に必要なリガンドとレセプターの量を減少するものはアゴニスト候補である。レセプターまたはリガンドに対する非特異的効果、たとえば蛋白変性はＣＤ研究のような通常の分析から排除される。
同様にこのアッセイ方法は変異型レセプターとそれらの活性の検出に有用である。例えば変異体レセプターは、リガンド結合部位について元来のレセプターと競合する能力を測定することで、その結合能力を正確にアッセイできる。ホモクエンチングを用いるそのようなアッセイにおいてフルオレセインでラベルしたレセプターは、限られた量の元来のリガンドに加えられ、そしてラベルしたレセプターと競合する候補レセプターの能力を標準レセプターと比べての蛍光の増大によって測定する。蛍光のクエンチングもしくは増大はまた、レセプター数の半分を１つの発蛍光団でラベルし残り半分を増大もしくはクエンチした分子でラベルして検出することができる。そのようなやりかたは広く知られており、一般に三元アッセイに適用可能である。このアッセイはまた、単に複合体の分子サイズをみるだけで部位１と２の結合の分析ができるように変更できる。もしリガンドとレセプターが適当な比率にも関わらずまったく複合体を形成しないときは、部位１は欠陥があるかまたは（レセプターが候補のときは）リガンド部位１に対するレセプター結合部位が不完全である。もし１：１複合体のみが形成されれば（たとえ適切な量のリガンドまたはレセプターが存在していても）、リガンド部位２（または使用候補に応じてそのレセプター部位）がレセプターとの結合能力において不完全である。同様の分析は、野生型の蛋白よりも大きい親和性のある部位１または２で結合できるリガンドまたはレセプターを同定するのに用いられる。
複合体形成のアッセイ
三元複合体の検出のためのアッセイ方法は次のものを含む。すなわち複合体の分子量の測定、レセプター上のラベル間の蛍光発光または蛍光消光またはその他のエネルギー移転測定、バイアコア（Biacore）分析、ゲル排除クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動、等電点電気泳動、沈降法および透析法。この他の適当な方法は次のようである。すなわちレセプター−リガンド部位に結合する抗体の使用、偏光の旋光、クロマトグラフィー及び核磁気共鳴。クロマトグラフィーにはゲル濾過、イオン交換および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の種類がある。非複合のリガンド及び／またはレセプターの背景において三元複合体形成の測定ができるような如何なる分析方法も用い得る。
リガンドとそのレセプター
構造的に分析されそしてもし適当ならば変異されているリガンドは例えば次のようである。すなわち成長ホルモン、インシュリン様の成長因子、副甲状腺ホルモン、インシュリン、レラキシン、糖蛋白ホルモン例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）、造血成長因子、肝臓増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子（α及びβ）、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン、神経成長因子たとえばＮＧＦ−ｂ、血小板誘導成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）（例えばＴＦＦ−α及びＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ、ＥＰＯ、骨誘導因子（Osteoinductive Factors）、インターフェロン（例えばインターフェロン−α、β及びγ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ、インターロイキン類（ＩＬｓ）例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８並びにその他のポリペプチド因子類。好ましいリガンドは例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＥＰＯ、成長ホルモン、胎盤ラクトゲン及びプロラクチンのようなヘリックス形のモノマーサイトカイン類／ホルモン類である。これらのリガンドのレセプターは、上に選択され記載されたｈＧＨ、アンタゴニストまたはアゴニストと同様なやりかたで用いられる。
以上の議論はアミノ酸変異に焦点があてられた。しかし同様の目的はまた、インビトロ方法によって標的残基を共有的に修飾して達成される。これは、レセプターに結合する標的位置の残基の側鎖の能力を阻止しまたは修飾する化学的修飾の如何なるタイプによってでも行われる。得られる効果は、もしも共有修飾が標的残基に対して十分に特異的であれば、例えば置換的変異と同じである。特異性は、所望の側鎖と好ましく反応する物質の選択によって得られる。追加的な特異性は、保護されるべき領域と結合する抗体で他の側鎖をブロックして達成される。修飾は結合に直接関与する一つまたはそれ以上のアミノ酸であり得る（構造残基）。またはコンホメーションの保持を行うレセプター結合の領域中もしくは近傍のアミノ酸がインビトロで共有的に置換される。共有的修飾は例えば酸化、還元、アミド化、脱アミド化、縮合などの反応や、例えばポリサッカライドやポリエチレングリコールのような嵩高い基の置換を包含する。蛋白にそのような基（例えばポリエチレングリコール）を共有的に加えるための方法は公知である（例えばDavid, et al., U. S. Pat. No. 4,179,337参照）。
システイン残基は、クロロ酢酸やクロロアセタミドのようなハロアセテート（及び対応するアミン）と最もふつうに反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイン残基はまたブロモトリフルオロアセトン、ａ−ブロモ−ｂ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル１−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応して誘導体化される。
ヒスチジル残基はｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボネートと反応して誘導体化される。何故ならばこのものは比較的ヒスチジル側鎖に特異的だからである。パラブロモフェナシルブロミドもまた有用である。この反応はｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ソーダ中で好ましく行われる。
リジニル及びアミノ端末残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの化合物での誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする効果がある。アミノ含有残基の誘導体化のこれ以外の適当な試薬は次のものを含む。すなわちイミドエステル例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼネスルフォン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；並びにグルオキシレート及びポリエチレングリコールやその他の嵩高い置換基のエステルとのトランスアミナーゼで触媒された反応。
アルギニル残基は若干の通常の試薬たとえばフェニルグリオキサール、２，３−ブタジノン、１，２−シクロヘキサンジオン及びフェニルグリオキサールの一つまたはそれ以上との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン機能基の高いｐＫａのためにアルカリ性条件で行う必要がある。更にこれらの試薬はアルギニンε−アミノ基と同様、リジン基と反応できる。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物やテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトルラベルの導入に特に興味をもって行われる。最も普通にはＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を得るためにはＮ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを各々用いる。チロシル残基は、ラジオイッムノアッセイに使用するラベルした蛋白を作るために125Ｉまたは131Ｉでヨード化する。既述のクロラミンＴ方法が適当である。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応で選択的に修飾される。ここにＲとＲ’は異なるアルキルであって、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。更にアスパルチル及びグルタミル残基はアンモニウムイオンと反応してアスパラギル及びグルタミニル残基に変換される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて各々対応するグルタミル及びアスパラチル残基となる。またはこれらの残基は穏和な酸性条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形も、本発明の範囲に入る。
その他の修飾は次のものを含む。すなわちプロリンとリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のホスホリル化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86（1983））、Ｎ−末端アミンのアセチル化ならびにいろんなＣ−末端カルボキシル基のアミド化。
ｈＧＨｂｐの２つの結合部位の証拠は抗体結合から生じる。ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの親和性は、ｈＧＨｂｐから［125Ｉ］ｈＧＨを置換し、グリコシル化したウサギＧＨレセプターから得た抗レセプターモノクローナル抗体（Ｍａｂ５）との複合体を沈澱することによって測定される（Barnard et al., Encocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985））。このアッセイを用いてのスキャッチャード分析は、ｈＧＨとｈＧＨｂｐが１：１の複合体を形成することを示す（Leung et al., Nature 330:537（1987）；Fuh et al., J. Biol. Chem. 265:3111（1990）；Barnard et al., Endocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985）；Spencer et al., J. Biol Chem. 263:7862（1988））。別のＭＡｂｓセット（ＭＡｂ３８７または３Ｄ７）を使っての置換曲線のスキャッチャード分析は、１つのｈＧＨｂｐに対して０．５のｈＧＨの化学等量を与える。これらの結果は、もしＭａｂ５がｈＧＨの第２の部位への結合のためのｈＧＨｂｐの決定因子をブロックするものであるとすれば説明可能である。
各々のｈＧＨポリペプチド上の２つの結合部位の証拠は、ｈＧＨ（Cunningham et al., Science 244:1081（1989））とｈＧＨｂｐ（実施例２）の間の結合決定因子のスキャニング−変異分析でモノクローナル抗体を用いることによって開発された。これらの研究で同定された決定因子は１：１複合体の形成の調整に重要である。このデータに基づいて、本発明者はこれらの決定因子をｈＧＨの非結合同族体へあてはめ、そしてｈＧＨｂｐへ固く結合した類似体を製造した（Cunningham et al., Science 247:1461（1990））。８つの置換基をｈＰＲＬへ、または５つをｈＰＬへ導入して本発明者はｈＧＨｂｐと結合し１：１複合体を形成する変異型を製造した。
これらのｈＰＲＬまたはＲＬ変異型（図４Ａ及びＢ）がｈＧＨｂｐの１または２分子と結合するかどうかの決定のためにゲル濾過を行った。ｈＧＨｂｐとホルモンの比が２：１のとき、ｈＰＲＬの両方の結合変異型はｈＧＨｂｐとの１：１複合体に対応する２つの対象的なピークを示した。
さらに化学量論と反応熱を評価するために、走査熱量計を用いた。何故ならば結合は、複合体を分離するために抗体またはクロマトグラフィーを用いる必要なしに溶液中で容易に研究可能だからである（図５）。この実験は反応熱と、ｈＧＨｂｐに結合したｈＧＨの当量の測定を可能とした。
野生型ｈＧＨ並びにｈＧＨ及びｈＰＲＬの変異型の滴定終末点を表ＩＩに示す。全てのｈＧＨｂｐと結合するに必要なｈＧＨの比率は約０．５〜１である。これらのデータ全体は、ｈＰＲＬとｈＰＬはｈＧＨｂｐの二量化のための重要な決定因子を欠いていることを示す。これらの決定因子はｈＧＨの単一アラニン変異体中に大量に保存されているが、ｈＰＲＬやｈＰＬ変異型中にはそうではない。このことは、ｈＧＨ上にはｈＧＨｂｐに対する２つの結合部位があることを示唆する。これら部位の１つは、各々Ｍａｂ５またはＭａｂ２６３免疫沈澱アッセイを用いてｈＧＨ（Cunningham et al., Science 244:1081（1989））またはｈＧＨｂｐのアラニン走査変異により詳しく機能的に特徴づけられている。ｈＧＨ及びｈＧＨｂｐ上の２つめの部位は未解決のままである。
ｈＧＨのｈＧＨｂｐとの結合は、成分において僅かのスペクトル変化をもたらす。本発明者は複合物形成における円二色性（ＣＤ）及び蛍光スペクトルの変化を調べた。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混ぜると、遠紫外線ＣＤスペクトルがｈＧＨとｈＧＨｂｐのスペクトルの和と事実上おなじになる（図６Ａ）。この結果は、複合体の形成における規則的な第二の構造の大きな変化の欠如を示す。近紫外線ＣＤスペクトル（図６Ｂ）は、芳香族アミノ酸側鎖の非対象的環境を反映している（Bewley, Recent Progress in Hormone Research 35:1555（1979）；Bewley et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219（1984））。ｈＧＨとｈＧＨｂｐのＵＶ吸収スペクトル間には大きな差があり、これは主にｈＧＨに比べてのｈＧＨｂｐの大きなトリプトファン含量の結果である（１対９）。しかしスペクトルの強度の増大を除き、個々のスペクトルの和は混合後に得られるものと本質的に同一である。
蛍光スペクトルにおいては、ｈＧＨのｈＧＨｂｐとの結合により３４０ｎｍから３３４ｎｍへの青色のシフトと、蛍光強度の僅かの減少がある（図７）。ヨードの消光とスターン−ヴォルマー分析は、ホルモンレセプター複合体においてトリプトファンの露出の減少がある。これはｈＧＨの結合でｈＧＨｂｐの中に１つまたはそれ以上のＴｒｐ残基が埋め込まれた結果であろう。何故ならば蛍光クエンチング研究は、ｈＧＨの中のトリプトファンは溶媒に露出されないことを示しているからである（Bewley, Recent Progress in Hormone Researh 35:1555（1979）；Bewley et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219（1984））。それと対照的に、ｈＧＨｂｐの変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨとの結合において特に重要であることを示している。
上述のように、ｈＧＨの結果は、例えばホルモン−レセプターやサイトカイン−レセプター系のようなポリペプチドリガンドに合致している。成長ホルモンとプロラクチンレセプターは、インターロイキン２、３、４、５、６、７、エリスロマイシン、マクロファージコロニー刺激因子及びその他のものに対するサイトカインレセプターの大きな一群に関連している。これらのレセプターの細胞内領域が、もし配列が類似ならば僅かしか共有せず、そしてどれも公知のチロシンキナーゼと相同でないのは驚くべきことである。にもかかわらず、ＧＨ（Carter-Su et al., J. Biol. Chem. 264:18654（1989））、ＩＬ−２（Asao et al., J. Exp. Med. k171:637（1990））及びＩＬ−３（Itoh et al., Science247:324（1990））レセプターがホルモンとの結合のすぐあとでホスホリル化される。ＩＬ−２（Sharon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:4869（1990））及びＩＬ−６（Taga et al., Cell 58:573（1989））レセプターの場合は、補助的な蛋白及び／またはレセプターはシグナルの形質導入に関与していないことを示す証拠がある。ｈＧＨとその結合蛋白についてのこの結果は、ｈＧＨ結合が細胞質の（または膜に結合した）成分と相互作用し得る活性領域をつくるべく細胞内領域と共にくるレセプターの細胞外部分の二量化を誘発するようなｈＧＨレセプターの活性化のモデルを支持する。これは複雑な成分のコンホメーションの実質的変化なしに生起しまたはしない。
他の２つのグループが最近に細胞外結合領域で結合したポリペプチドホルモンを結晶化させた（Lambet et al., J. Biol. Chem. 264:12730（1989）；Gunther et al., J. Bio. Chem. 265:22082（1990））。しかし何れもレセプターの二量化の結論的な証拠を報告していない。ヒトＩＬ−２は、ＩＬ−２レセプターのヒトｐ５５成分の可溶性組換え体との１：１複合体で優先的に結晶化される。ただし少量のジスルフィド結合ｐ５５二量体が観察される。橋かけ研究は、機能的なＩＬ−２レセプター複合体はＩＬ−２、ｐ５５及び別のレセプター成分（ｐ５０と呼ばれる）の間に形成されるヘテロダイマーであることを示唆する（Saragori et al., J. Immunol. 139:1918（1987）；Ogura et al., Mol. Biol. Med. 5:123（1988））。ＥＧＦレセプター（ＥＧＦｂｐ）の細胞外領域は、１分子のＥＧＦと共になって結晶化された（Gunther et al., J. Biol. Chem. 265:22082（1990））。結合の研究と沈降の分析は、溶液中での１：１のＥＧＦ・ＥＧＦｂｐ複合体の形成を示す。これらのデータは、細胞外領域はホルモン誘発二量化を行うには不十分であることを示唆する。しかし結合研究が、複合体の沈澱のために抗ＥＧＦレセプターポリクローナル抗体を用いたことは注意すべきことである。更に結晶化及び沈降実験はレセプターに比し大過剰のホルモンを用いている。本発明の場合、Ｍａｂｓは天然のＧＨレセプターブロック二量化（図３）に対して多く、そして大過剰のｈＧＨがモノマー複合体（図２）の中へｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2複合体を解離する。
この後者の効果は重要な薬理学的意味をもつであろう。ｈＧＨは天然には血清中５ｎＭを越える濃度で脈拍中で生産され、その濃度は１ｎＭの極めて下方まで急速に下がる（Tayler et al., J. Clin. Invest. 48:2349（1969）；Thompson et al., J. Clin. Invest. 51:3193（1972）；Ho et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64:51（1987））。しかしｈＧＨｂｐは天然に血清中に約０．５〜１ｎＭという一定の濃度で存在する（Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62:134（1986）；Herington et al., J. Clin. Invest. 77:1817（1986））。すなわちｈＧＨがｈＧＨｂｐに比べて過剰に送られるので、細胞レセプターと相互作用できる遊離のｈＧＨと同様にｈＧＨｂｐと１：１の複合体を生成することが予期される（ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ・ｈＧＨ膜−レセプターの形のヘテロダイマー的複合体さえも生成しよう）。
本発明者はｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用を行ってｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2の形の複合体を作ることを確認し、そして得られた細胞外レセプター領域の二量化はこのホルモンに体因性のシグナルトランスダクションを開始することを提案した。回収したｈＰＬとｈＰＲＬ同族体（実施例４）はｈＧＨｂｐの二量化を促進しないので、ｈＰＬとｈＰＲＬ骨格は、レセプター認識と結合に必要なものから明白な必須の二量化決定因子を欠いていると結論することができる。関係する領域を局所化するため、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ類似体置換した一連のｈＧＨ変異体および２つの削除類似体を、ホルモン誘発レセプター二量化の減少のためにスクリーニングした。次に重要な側鎖を、更に詳細なアラニン走査戦略で同定した。
ｈＧＨｂｐ変異型（Ｓ２３７Ｃ）を構築し蛍光でラベルした。蛍光クエンチングを、図８に示すようにホルモン誘発二量化をモニターして測定した。このクエンチングはｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２モル比を示した（図４）。ｈＬＰとｈＰＲＬセグメント置換のある一連の同族体走査ｈＧＨ変異型を、蛍光アッセイで試験した（表ＩＩＩ）。これらのうち４つは、ホルモン誘発ｈＧＨｂｐ二量化の著しい減少を示した（実施例４）。他の２つのｈＧＨ削除類似体においては、ｈＧＨｂｐの二量化の損失は、第二部位のｈＧＨｂｐ結合の分裂に起因するもののようである（表ＩＩＩ）。
ｈＧＨｂｐ変異体（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を蛍光的にラベルする。この蛍光シグナルは、図８に示すようにホルモン誘発二量化のモニターに用いる。ｈＧＨは１０ｎＭの定濃度のＳ２３７−ＡＦで系列的に希釈し、そして平衡で蛍光クエンチングを測定する。フルオレセインラベルのホモクエンチングはｈＧＨの添加と共に増大し、０．５モル当量のｈＧＨにおいて最大となる。しかし極めて顕著なことにはこのクエンチングは高い濃度のｈＧＨでは逆転し、これは過剰のｈＧＨの存在下ではｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2はｈＧＨ・ｈＧＨｂｐのモノマー複合体に解離することを示している。
ｈＰＬとｈＰＲＬセグメント置換の一連の同族体走査ｈＧＨ変異体を、Ｓ２３７Ｃ−ＡＦに基づくアッセイで試験した（表ＩＩ）。これらのうち３つ、すなわちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）及びｈＰＲＬ（１１１−１０９）は著しい減少を示した（１８倍、６倍及び１００倍以上）。これらの変異体に結合する一次部位（部位１）の損失は、観察されたｈＧＨｂｐの二量化の減少に大いに関係するようである。更に、結合親和性を減少させる一次部位決定因子（例えばＲ６４Ａ及びＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）の変異体もまたｈＧＨｂｐ親和性を高めることが示され、そして一次部位のｈＧＨｂｐ親和性を高めることが示されたｈＧＨ変異体（Ｅ１７４Ａ）もまた本発明者のアッセイの測定では二量化を高める。同族体走査変異体に加えて、ｈＧＨ削除類似体（１−８削除）は、ｈＧＨｂｐ二量化誘発能力において、劇的な減少（１００倍を越える）を示した（実施例４）。ｈＧＨｂｐの二量化におけるこの損失はまた、二次部位ｈＧＨｂｐ結合における分裂に基づくもののようである。
第２の部位ｈＧＨｂｐ結合に関係する特定アミノ酸の特定側鎖は、アラニン走査でプローブされる（実施例６）。２６のアラニン変異体の分析（表ＩＶ）は、ｈＧＨｂｐ二量化で１０倍より大きい分裂をおこす２つの変異体（Ｆ１ＡとＩ４Ａ）及び２倍より大きい分裂をもつもう４つ（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６ＡとＥ１１９Ａ）を見いだしたのみであった。これらの決定因子は、１次部位結合に決定的なものとは異なるものである。逐次的なｈＧＨ添加を行った実験で一定濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ）とし、そして蛍光ホモクエンチングはｈＧＨ誘発二量化には迅速な平衡時間（３分より短い）を、過剰のｈＧＨによる次の二量化の反転には遅い平衡時間（３０分より長い）を示した。これは、二量化の反転は速度以外の限定があることを示唆する（メカニズムについては実施例６）。
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2結晶の生成は、Blundell and Johnson, Academic Press, London, 1976に記載の方法によるＸ線結晶写真技術を用いるｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2の３次元構造の決定を可能とする。この構造は図１１に示され、そして以下の実施例７で説明する。図１１の構造は、各々のｈＧＨは２つのｈＧＨレセプターまたはｈＧＨｂｐに結合していることを示す。各々のｈＧＨｂｐはｈＧＨの異なる位置に接触している；最初のｈＧＨｂｐは表ＩＶのアミノ酸と接触し、そして２つめのｈＧＨｂｐと接触するｈＧＨアミノ酸は表ＶＩに示してある。２つのｈＧＨｂｐの間の接触アミノ酸は図６に示される。
ｈＧＨの変異体はこれらのアミノ酸接触点で作られ、本発明のアッセイ方法で検出される。同様にｈＧＨｂｐ変異体は、ｈＧＨと結合するところで、または２つのｈＧＨｂｐそれ自体の間で作られる。そのようなｈＧＨｂｐ変異体は、野生型ｈＧＨ及びｈＧＨＢｐを用いて本発明のアッセイ方法で検出できる。
治療組成物と投与
ここにいう「成長ホルモン類似体」とは、成長ホルモン並びにその他のラクトゲンホルモン類、例えば胎盤ラクトゲン、プロラクチン及び他の成長ホルモンの遺伝子的や種の変異体、それにアミン酸置換、挿入または削除で作成したこれらの蛋白の変異体を包含するものである。成長ホルモン類似体は、レセプターに対する類似体の結合をも含めて成長ホルモン類似体の活性のアンタゴニストまたはアゴニストをも含むことができる。
リガンド類似体またはＧＨｂｐ抗体の治療処方は、所望の生成度のリガンド類似体蛋白を任意的な生理的に許容される担体、希釈剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, supra）を混合し凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態で貯蔵用に製造される。許容し得る担体、希釈剤または安定剤は使用用量や濃度で被投与者に毒性がないものであって例えば次のようである。すなわち緩衝剤たとえば燐酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；抗酸化剤たとえばアスコルビン酸；低い分子量（約１０残基より少ない）のポリペプチド（メトキシドの形成を避けるため）；蛋白たとえばアルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマーたとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物たとえばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤たとえばＥＤＴＡ；糖アルコールたとえばマンニトールやソルビトール；塩形成性の対イオン例えばナトリウム；及び／または非イオン性の界面活性剤たとえばツーン、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
インビボ投与に用いるリガンド類似体やＧＨｂｐ抗体は無菌でなければならぬ。これは凍結乾燥や再構築の前または後に無菌濾過膜で濾過することで容易に達成できる。リガンド類似体またはリガンド類似体に対する抗体は通常は凍結乾燥形態または溶液で貯蔵される。
治療用のリガンド類似体またはリガンド類似体特異性抗体は一般に、無菌アクセスポート例えば皮下注射針貫通可能な栓をもつ静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
リガンド類似体またはＧＨｂｐ抗体の投与ルートは、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内または傷害部内への注射や注入、さらには後記のような持続投与系のような公知の方法による。リガンド類似体は注入や丸薬注射により連続投与される。ＧＨｂｐ抗体も同様なやりかたで、または血流やリンパ液の中へ投与される。
持続放出型製剤の適当な例は、フィルムやマイクロカプセルのような有形物品の形態のマトリックスの蛋白を含有する固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスを含む。持続放出マトリックスの例は次のようである。すなわちポリエステル、ヒドロゲル（例えばLanger et al., J. Biomec. Mater. Res. 15:167（1981）；Langer, Chem. Tech. 1298（1982）に記載のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（U. S. Pat No. 3,773,919；EP 58,481）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメート（Sidman et al., Biopolymers 22:547（1983））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（Langer et al., supra）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー例えばLupron Depot（乳酸−グリコール酸コポリマーとリュープロライドアセテートから成る注射可能のマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）。エチレン−ビニルアセテートや乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日にわたって分子を放出できる一方、ある種のヒドロゲルは短期間のあいだ蛋白を放出する。カプセル化した蛋白が長時間体内に残るときは、３７℃で水分に露出される結果として変性または凝縮し、生物学的活性損失や免疫遺伝的変化をおこす。合理的な戦略は、関係するメカニズムによる蛋白の安定化によって工夫される。例えばもし凝縮メカニズムがチオジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であるときは、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分を調節し、適切な添加物を用いそして特定のポリマーマトリックス組成物を発達させることで得られる。
持続放出リガンド類似体または抗体組成物はまた、リポソーム的に包まれたリガンド類似体や抗体を含む。リガンド類似体や抗体を含むリポソームは、それ自体公知の方法で作成される。例えばDE 3,218,121；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82:3688（1985）；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:4030（1980）；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；Japanese Patent Application 83-118008；U. S. Pat. No. 4,485,045；U. S. Pat. No. 4,544,545；EP 102,324。通常はリポソームは、脂質含量が約３０モル％より大きいコレステロール（選択された比率は最適のリガンド類似体治療によて調節される）である小型（約２００−８００オングストローム）の単ラメラ型のものである。高められた循環時間のリポソームは、アメリカ特許第５０１３５５６号に開示されている。
変異型の用途
本発明のアッセイで選択されるアンタゴニストリガンド変異体は治療処方に用いられるか、天然存在のリガンドの作用をブロックするアンタゴニストとして作用する形質転換動物を発現する。例えばアンタゴニストは、成長ホルモン類似体のレセプターの発現で特徴づけられるガンや他の病気の治療に有用である。形質転換動物は新規なものとして、または実験モデルとして有用である。他の選択されたリガンド変異型は、アゴニストとして作用すべく治療的処方で用いられ、天然存在サイトカインによるものと類似の応答を増大または促進すべく投与される。例えばｈＧＨ変異体は医薬的に効果のある用量処方で用いられる（例えばアメリカ特許第５０９６８８５号；１９８８年４月１５日出願）。リガンド変異体は、天然のサイトカインと類似の活性をもち、但し好ましくない副作用は少ないかまたは無いという利点があり、その一例は糖尿病を誘発する活性の無いｈＧＨ変異型である。アゴニストとしてもアンタゴニストとしても生物学的活性のないリガンド変異型は、少なくとも１つのリガンド免疫エピトープを保持しているために野生型リガンドまたはその抗体のインムノアッセイに有用である。
ここで治療目的に使用される成長ホルモン類似体、変異型およびアンタゴニストは、個々の患者の臨床的状態、組成物の到達部位、投与の方法、投与のスケジュール及びそのほか実務者に公知の因子を考慮に入れ、善良な医学的実務に則ったやりかたで処方され投与される。ここで、目的のための化合物の「効果的な量」はそのようなことを考慮して決定され、それは細胞成長を阻害または防御する最低量である。そのような量は好ましくは哺乳動物に毒性を示す量より低いものである。
モノクローナル抗体とレセプターの刺激
幾つかの抗体はｈＧＨレセプターを刺激する能力があることがわかった。すなわちそれらはレセプターを、３元複合体を形成しレセプターを活性化する能力を模倣するようなやりかたでレセプターを架橋結合する能力がある。そのようなアゴニスト抗体の例は本発明の時点で既に公知であったが、それらがｈＧＨのアゴニストとして作用する能力は認められていなかった。適当な抗体はＭＡｂ２６３である（Barnard et al., Endocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985））。他の例はＭＡｂｓ１３Ｅ１及び３Ｄ９であり、下記の方法で製造される。必要に応じこれらの抗体は、意図した宿主内の親の抗体より免疫性の低いＣＤＲグラフト型またはキメラを生成するのに用いる。抗体は好ましくはヒトのレセプターに指向される。ｈＧＨのアゴニストは少なくとも２価でなければならぬ。しかしＦＡｂフラグメントのような１コのレセプター分子としか結合しない１価の抗体はアンタゴニストとして有用である。
２価の抗体は若干の実施態様では２特異的である。すなわち抗体の１つのアームはひとつのレセプターエピトームに向けられ、もう１つのアームはレセプター上の他のエピトームに向けられている。アンタゴニスト抗体の実施態様は、ひとつのアームがレセプターに向かい（好ましくはそのレセプター−レセプター接触領域）他のアームがＧＨレセプター以外の抗原に向かうことを含む。抗体は通常のハイブリドーマ方法または組換え方法で作られ、ここで組換え細胞は各々のアームをコード化する重いそして軽い鎖で転換される。２特異的抗体は組換え方法で作られ、細胞培養からアフィニティー精製で回収されるか、または抗体は別個に作られそして通常の方法でインビトロで組換えされる。
これらの結果は獣医学の分野で特に興味がある。何故ならば、活性免疫によりＧＨアゴニストを生成するように成長ホルモンレセプターまたはそのフラグメントに対してヒトを免疫することによりインビボでそのような抗体を培養することが今や可能だからである。すなわち抗体は（外因性抗体の投与により）受動的か、またはレセプターでの免疫により活発的に投与される。
アゴニスト抗体は、成長ホルモンに対する親和性に基づく用量で投与される。哺乳動物についてのこれ以上の用量は、上述のラットの成長研究から容易に外挿法できめられる。アンタゴニスト抗体は、もしも小動物が対象のときは正常量またはそれより低い範囲に効果的活性を減少させるように十分な成長ホルモンで計算した用量で投与する。
抗体は、上述のリガンド類似体と実質的に同様なやりかたで処方され投与される。アゴニスト抗体は、成長ホルモンが用いれた上記と同じ目的のために用いられる。
次の実施例は本発明を行うために現在最良のやりかたを説明するためのものであり、本発明はこれらの実施例に限定されると理解してはならない。
実施例１。ｈＧＨ−レセプター複合体の構造
本発明のアッセイ方法は、ｈＧＨ−レセプター複合体構造（すなわち１つのｈＧＨと２つのｈＧＨレセプターまたは結合蛋白が、検出されるべき安定な複合体を形成しているもの）に基づくものである。これらのアッセイ方法はｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2複合体のアッセイ方法で例示される。
ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2複合体の結晶化
ｈＧＨ（２ｋＤ）とｈＧＨｂｐ（２８ｋＤ）（図１ａ）の間の複合体の結晶は、蒸気相拡散で成長する（A. McPherson, in Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley & Sons, New York（1982））。結晶は少なくとも２．７Åで回折され、そしてａ＝１４５．８Å、ｂ＝６８．６Å、ｃ＝７６．０Åの単位細胞パラメータの空間群（Ｐ２1２1２）に属する。これらの結晶の非対称単位の量は、複合体がｈＧＨ・ｈＧＨｂｐまたは（ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ）2の何れかの形を持たないようなものである。特に溶媒含量は１：１複合体にはあまりにも高く（６８％）また単位細胞の２：２複合体にはあまりにも低い（３２％）。結晶の典型的な溶媒量は約５０％（Matthews, J. Mol. Biol. 33:491（1968））なので、これらの結晶は成分の非対称的混合物を含有するようである。
結晶の精密な組成を調べるために、それを０．１％のトリフルオロ酢酸に溶かし、変性条件下でクロマト処理する（図１ｂ）。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの量を、２１４ｎｍでモニターしつつ対応するピークの積分で定量する。それはペプチド結合の不存在に対応する。４つの独立した測定から、ｈＧＨｂｐピークに対するｈＧＨピークのＡ214の比率は０．４２±０．０２であった。ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2の形を持つ複合体について、積分ピーク面積の予測比率は、各々の成分中の残基数（ｈＧＨでは１９１残基；ｈＧＨｂｐでは２３８残基）に基づいて０．４０である。対照実験においてｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２混合物は本質的に図１Ｂと同一のクロマトグラムを示し、なお生成した２：１と１：１の混合物は予期された異なるクロマトグラムを示した。従って図１の結晶はｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２のモル比を含有している。溶液中で安定な複合体を形成するｈＧＨとｈＧＨｂｐの能力は、複合体形成は信頼できるアッセイパラメータであることを確認する。
溶液中でのｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2複合体の形成
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2複合体の存在は、サイズ排除クロマトグラフィーによって溶液中で確認された。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：４、１：３、１：２、１：１及び１：０．５の比で混合し、成分をSuperose 12 FPLCカラム（図２）上でゲル濾過によって分離する。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：４の比のところで（図２）、各々ｈＧＨ・（ｈＢＨｂｐ）2複合体と遊離のｈＧＨｂｐに対応する分子量が約７０ｋＤ及び３０ｋＤの２つのピークが存在する。ピークの面積は、その
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がｈＧＨ１２より２．９倍高いのでｈＧＨｂｐの不存在で支配される。純粋なサンプルの吸収と組成分析に基づくｈＧＨの
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は０．８２ｃｍ-1であり、ｈＧＨｂｐは２．３５ｃｍ-1である。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：３及び１：２の比率において（図２Ｂ及び２Ｃ）、複合体ピークの形や位置には変化がない。しかし遊離のｈＧＨｂｐに対応するピークは顕著に減少してゼロとなる。すなわち１：２比においては、実質上すべてのｈＧＨとｈＧＨｂｐは複合体に結合する。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比を１：１に調節し最終的に１：０．５とすると（図２Ｄ、２Ｅ）、複合体ピークの位置は小さいサイズへと変化し（約５５ｋＤ）、非対称的となり、そして遊離のｈＧＨが蓄積するので、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2、ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ及びモノマーのｈＧＨに対応する種の混合物が示唆される。これらのピークを越えて採取された蛋白サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、与えられた組成を確認する。追加的の対照実験は、遊離の成分はモノマー蛋白として挙動することを示し、これは二量化はこれらの条件下でｈＧＨとｈＧＨｂｐの両方の存在を必要とすることを示している。従って複合体の形成は複数のアッセイ方法で検出可能であり、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2複合体形成は細胞レセプターへのｈＧＨの結合を示すものとして役立つ。同様にして、ｈＧＨ−ｈＧＨレセプター複合体に類似のサイトカイン−サイトカインレセプター複合体を形成するサイトカインレセプターを通じて作用するいかなるサイトカインも、そのようなアッセイ方法で評価することができる。
実施例２  ｈＧＨレセプターの結合部位
ｈＧＨ結合蛋白またはｈＧＨレセプターへのｈＧＨ結合部位の性質は、結合蛋白またはレセプターへのｈＧＨ結合部位をブロックした抗体を用いて特性化された。ｈＧＨｂｐ上の２つの結合部位の証拠は次のようである。
ｈＧＨｂｐへのｈＧＨの親和性は、ｈＧＨｂｐからの［125Ｉ］ｈＧＨの置換およびグルコシル化したウサギＧＨレセプターから生産した抗レセプターモノクローナル抗体（Ｍａｂ５）との複合体の沈澱によって典型的に測定される（Barnard et al., Endocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985））。このアッセイを用いたスキャッチャード分析は、ｈＧＨとｈＧＨｂｐは１：１の複合体が形成可能であることを示した（Leung et al., Nature 330:537（1987）；Fuh et al., J. Biol. Chem. 265:3111（1990）；Barnard, R. et al., Endocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985）；Spencer et al., J. Biol. Chem. 263:7862（1988）；Spencer et al., J. Biol. Chem. 263:7862（1988））。
最近、追加的なＭａｂがE. coliから精製した非グリコシル化ｈＧＨｂｐで免疫して製造された（Fuh et al., J. Biol. Chem. 265:3111（1990））。複合体を沈澱させるためこれらの抗ｈＧＨｂｐＭａｂ（３Ｂ７及び３Ｄ９）の２つを用いての置換曲線のスキャッチャード分析は、より高い結合親和性（Ｍａｂ５の０．４ｎＭに対してＫD０．１ｎＭ）と化学量論（１ｈＧＨｂｐに対し０．５ｈＧＨ）を与える。これらの結果はもしＭａｂ５が、ｈＧＨの第２の部位に結合するｈＧＨｂｐの決定因子をブロックするとすれば説明可能である。Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ９を用いてのアッセイにおける協力性の欠如は、１：１複合体におけるｈＧＨの親和性（Ｍａｂ５を用いての測定）が１：２複合体のもの（Ｍａｂ３Ｂ７及び３Ｄ９を用いての測定）よりも僅かに約４倍弱いのみであるという事実を反映しているようである。さらに大きい示差親和性が、スキャッチャードプロットで上部への反映による積極的な協力性を得るために必要であろう。さらにＭａｂ３Ｂ７と３Ｄ９は、いかなる協力性をも弱めるであろう１：１及び１：２の複合体の両方を沈澱させる。従ってｈＧＨの第２の結合部位のブロッキングは１：１ｈＧＨ−ｈＧＨｂｐモル比をもたらす；一方では第２の結合部位をブロックしない抗体は１：２モル比をもたらす。
ｈＧＨの２つの結合部位の証拠は次のようである。Ｍａｂ５を、ｈＧＨとｈＧＨｂｐ間の結合決定因子の走査−変異分析に用いた。従ってこれらの研究で同定した決定因子は、１：１複合体の形成を調節するにはこれらが重要であることを示す。このデータに基づいて本発明者はこれら決定因子を、非結合性のｈＧＨ同族体およびｈＧＨｂｐと強固に結合する作成された類似体の中へ取り込んだ（Cunningham et al., Science 247:1461（1990））。例えば野生型のヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）またはヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）は、ｈＧＨよりもｈＧＨｂｐに対して各々１０5倍または１０3倍以上弱く結合する。８つの置換分をｈＰＲＬに入れたり（E62S/D63N/Q66E/H171D/E174A/N175T/Y176F/K178R；Cunningham et al., Science 247:1461（1990））または５つをｈＰＬに入れたり（V4I/D56E/M64K/E174A/M179I）して、本発明者はｈＧＨよりも僅かに６．２倍または１．４倍弱くｈＧＨｂｐと結合する変異型を製造した。
本発明者は、これら変異型がｈＧＨｂｐの１または２分子と結合できるか否かを決定すべくゲル濾過を行った（図４）。ｈＧＨｂｐ：ホルモンが２：１の比のとき、ｈＰＲＬ（図４Ａ）及びｈＰＬ（図４Ｂ）の両方の結合変異体は、ｈＧＨｂｐとの１：１複合体に対応する２つのピーク（分子量は約５５ｋＤ）並びに化学量論的過剰のｈＧＨｂｐを表す低い分子量のピーク（３０ｋＤ）を示した。同じ条件下で野生型ｈＧＨは、ｈＧＨ・（ｈＨｂｐ）2複合体に対応する単一のピーク（分子量は約７７ｋＤ）を生じた（図４Ｃ）。図４Ｃにおける小さい衛星的ピークは、小過剰のｈＧＨｂｐからのものである。ピーク組成はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。
更に化学量論と反応熱を評価するために走査熱量計を用いた。何故ならば結合は、複合体を分離するために抗体またはクロマトグラフィーを用いる必要なしに溶液中で自由に研究できるからである。一定のｈＧＨｂｐ濃度（１５μＭ）を含む溶液へｈＧＨを加え、それ以上のエンタルピー変化がなくなるまで反応熱を測定した（図５）。この実験で、反応熱とｈＧＨｂｐに結合するｈＧＨの当量を測定することができた。
野生型ｈＧＨとｈＧＨ及びｈＰＲＬ変異体の滴定終末点と反応熱を表ＩＩに要約する。すべてのｈＧＨｂｐを結合するに必要なｈＧＨ比率は約０．５から１である。更に、結合を減少させる（２０倍まで）かまたは結合を高める（４．５倍まで）一連の単一アラニン変異体は、反応のエンタルピーの変化にもかかわらず野生型ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの結合と同じ化学量論を与える。これと対象的に、ｈＰＲＬ変異型のｈＧＨｂｐに対する結合の化学量論は０．８５から１である。
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ａ：Ｍａｂ５免疫沈澱アッセイを用いての１：１ｈＧＨｈＧＨｂｐ複合体の形成についての値（Cunningham et al., Science 244:1081（1989））。ナノメータ範囲での２量体複合体の結合定数測定のためには熱量測定は適当でない。何故ならば熱量計は、濃度が結合定数より低く設定される必要のある成分の反応熱の変化を正確に測定するに十分には正確でないからである。
ｂ：２回の平均値（±ＳＥ）；その他は１回の測定である。
これらのデータ全体はｈＰＲＬとｈＰＬ変異型は、ｈＧＨｂｐの２量化のための隠れた重要な決定因子であることを強く示す。これらの決定因子はｈＧＨの単一アラニン変異体内に多く保存されているが、ｈＰＲＬまたはｈＰＬ変異型内にはない。このことは、ｈＧＨｂｐに対しｈＧＨ上には２つの結合部位のあることを示唆する。これらの部位の１つは各々Ｍａｂ５免疫沈澱アッセイを用いるｈＧＨｂｐまたはｈＧＨ（Cuningham et al., Science 244:1081（1989））のアラニン走査変異で詳しく機能的に特徴づけられる。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの上の２番めの部位は未解決であり下記される。
実施例３  ｈＧＨ−レセプター複合体とスペクトルの変化
ｈＧＨとそのレセプターの結合は成分に少しのスペクトル変化をおこす。ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの結合が成分の２次的または３次的構造に変化をおこすか否かを決めるために、複合体形成における円２色性（ＣＤ）及び蛍光スペクトルの変化を調べた。０．０１ＭトリスｐＨ８．０と２００ｍＭのＮａＣｌ中の約１．０ｍｇ／ｍｌの蛋白を透析して、分光分析のための蛋白を作成した。透析のあと、溶液を濾過（０．２２μ、ミリポア）しそして吸収スペクトルを得た。スペクトルを光の散乱に対して補正し（Shauenstein et al, J. Polymer Sci. 16:45（1955））そして蛋白濃度ｗ２８０ｎｍの吸収で測定した。精製サンプルの吸収および組成分析に基づくｈＧＨの
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は０．／８２ｃｍ-1であり、ｈＧＨｂｐのそれは２．３５ｃｍ-1である。ｈＧＨは、その４つの束ねられた構造（Abdel-Meguid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84:6434（1987））に特徴的な強いａ−ヘリックスＣＤスペクトル（Bewley et al., Arch. Biochem. Biophys. 138:338（1970））を持つ。対照的にｈＧＨｂｐのＣＤスペクトルは、ジスルフィド結合で接続するターンやループ（Cleary et al., Biochemistry 31:45（1989）；Hilder et al., Biophysical Chemistry 31:45（1988））から主に成る蛋白に特徴的である。ｈＧＨｂｐは３つの隣接的に結合したジスルフィド結合を含む（Fuh et al., J. Biol. Chem. 265:3111（1990））。冷凍細胞ペーストを低等張の緩衝液（10mM Tris pH8.0, 1mM PMSF（Sigma），2mM EDTA）で解凍する。懸濁液をホモジナイズし、４℃で１時間攪拌し、ついで１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離する。上澄み液に２６０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを加え、溶解するまで攪拌する。蛋白の沈澱を１０，０００ｘｇで３０分間遠心して採取する。ペレットを１０ｍＭトリス（ｐＨ：８．０）と１ｍＭのＰＭＳＦに再懸濁し、同じ緩衝液に透析する。透析液を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中のＱセファローズカラム（Pharmacia）にかけ、０．０から０．５Ｍの線形勾配のＮａＣｌで溶離する。ｈＧＨｂｐ含有のピーク分画をｈＧＨ親和性カラムの上に直接おく。洗浄後、カラムを４ＭのＭｇＣｌ2と１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）で溶離する。ピーク分画を合併し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で透析し、モノＱカラムにかけ、洗浄し、そして１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と０．０〜０．２Ｍの線形勾配のＮａＣｌで溶離する。
ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混ぜると、遠紫外ＣＤスペクトルはｈＧＨとｈＧＨｂｐのスペクトルの和と実質的に同じとなる（図６Ａ）。この結果は、複合に際して通常の２次的構造に大きな変化がないことを示す。近紫外ＣＤスペクトル（図６Ｂ）は、芳香族アミノ酸側鎖の非対象的環境を反映している（Bewley, Recent Progress in Hormone Research 35:1555（1979）；Bewley et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219（1984））。ｈＧＨに比べてｈＧＨｂｐのもつ大きなトリプトファンの量（１対９）が大きく影響し、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの紫外吸収スペクトルの間には大きな相違がある。しかしスペクトルの強度の増大を除き、個々のスペクトルの和は混合後に得たものと本質的に同一である。
蛍光スペクトルにおいて、３４０ｎｍから３３４ｎｍへの青色のシフトがあり、ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの結合に際し蛍光強度の僅かな減少がある（図７）。ヨード消光とシュテルン−ボルマー分析は、ホルモンとレセプターの複合体ではトリプトファンの露出の減少のあることを示す。これは、ｈＧＨとの結合においてｈＧＨｂｐ中の１つまたそれ以上のＴｒｐ残基が埋め込まれた結果のようである。何故ならば蛍光消光研究は、ｈＧＨの中のトリプトファンは溶媒によく露出しないことを示しているからである（Bewley, Recent Progres in Hormone Research 35:1555（1979）；Bewley et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219（1984））。対照的に、ｈＧＨｂｐの変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨとの結合に特に重要であることを示す。これらのスペクトル研究はｈＧＨとｈＧＨｂｐの結合に僅かのコンホメーション変化しか示さないけれども、これらの方法は芳香族の基の位置変化（近紫外ＣＤ及び蛍光消光）と通常の２次構造の構造的変化（遠紫外ＣＤ）に偏っている。従って複合および遊離の成分の高分解能構造はなおコンホメーションの変化をあらわす。
実施例４  アッセイ方法と修飾ｈＧＨ
修飾ポリペプチドホルモンをアッセイ方法で評価した。１セットのｈＧＨ残基（F10, F54, E56, I58, R64, Q68, D171, K172, E174, F176, R178,V185を含む）はｈＧＨｂｐとの高度親和性の化学量論結合に重要なことが知られている（WO 90/04788）。これらの決定因子はｈＧＨｂｐを強固に結合するｈＰＬ及びｈＰＲＬ類似体を同定するため（Ｋｄは各々１ｎＭ及び６ｎＭ）ｈＧＨｂｐ結合不能のｈＧＨ同族体、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）及びヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）に取り入れられた。既述のように、ｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用しｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2の形の複合体をつくる。補充したｈＰＬ及びｈＰＲＬ類似体はｈＧＨｂｐの２量化を促進しないのでｈＰＬ及びｈＰＲＬ材料は、最初のレセプター認識および結合に必要なものとは別の必要な２量化決定因子を欠如していると結論する。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2の形成に関係する領域を局在化するために、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ同族体置換した一連のｈＧＨ変異体並びに２つの削除類似体を、ホルモン誘発レセプター２量化の減少のためにスクリーニングした。次に重要な側鎖は、さらに詳細なアラニン走査戦略で同定した。
ホルモン誘発ｈＧＨｂｐの２量化の定量のために、蛍光でラベルしたｈＧＨｂｐのホモクエンチングを測定する感度アッセイを用いた。変異体のｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ）を構築し、精製し、そして５−ヨードアセタミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）と反応して蛍光的にラベルしたｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を得た。得られたＳ２３７Ｃ−ＡＦ試薬はｐＧＨｂｐあたり１コのラベルをもち、競合的結合アッセイでは十分な結合活性を保持する。フルオレセインは、重なりあう励起および発光スペクトルをもっているのでこの蛍光プローブは分子が互いに接近するときにホモクエンチングを受ける。このシグナルは、図８に示すようにＳ２３７Ｃ−ＡＦのホルモン誘発２量化をモニターするのに用いる。
図８には、ｈＧＨの順次添加による１０ｎＭのＳ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチングを示す。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦを結合緩衝液（20mM Tris.HCl, pH7.5；0.1% BSA；0.02% NaN3）の中で１０ｎＭ濃度に希釈し、そして１．０ｍｌのアリコートを１２ｘ７５ｍｍのポリプロピレンアッセイ管に入れる。１２０ｍＭから０．００２ｍＭの範囲でｈＧＨの別々の希釈を行う。次に緩衝液またはｈＧＨ希釈液のアリコート（１０ｍｌ）のみをＳ２３７Ｃ−ＡＦ管に加え、混合物を暗所で２５℃に５時間培養して平衡化させる。培養後、島津のＲＦ５０００Ｕ分光蛍光計で４９０ｎｍの励起１と５１２ｎｍの発光１（バンド幅は各々３ｎｍと１０ｎｍ）を用いて蛍光を測定する。Ｆ／Ｆｏ比を３回の測定から計算し、ｈＧＨ濃度に対してプロットする。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの製造は次のようである。変異体Ｓ２３７Ｃ−ｈＧＨｂｐを構築し前述のようにして精製する。１ｍｇ／ｍｌのＳ２３７Ｃ溶液を２５ｍＭシステイン塩酸塩と２５ｍＭのＮａＨＣＯ3に加え、４℃で２時間培養して２３７の位置でシステインを脱ブロックする。５０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０（Pharmacia）ミニカラムで脱塩し、直ちに暗所で５００ｍＭの５−ＩＡＦ（Molcular Probes）と４℃で１６時間反応させる。５−ＩＡＦ添加前の脱ブロックＳ２３７ＣのＤＴＮＢ分析は、Ｓ２３７Ｃ分子あたり平均１つの遊離チオール基を示す（２２ｍＭの遊離ＳＨに対して１７ｍＭのＳ２３７Ｃ）。５−ＩＡＦの反応したＳ２３７Ｃは、２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）で平衡化した別のＰＤ１０ミニカラムを用い遊離のフルオルフォア（Fluorfore）から精製する。精製したＳ２３７Ｃ−ＡＦのアリコートを−８０℃で貯蔵し、使用直前に解凍する。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの吸収スペクトル分析は、７１３００（４９４ｎｍで）と６４８００（２８０ｎｍで）のモル吸光係数を用い２８０ｎＭでの５−ＩＡＦ吸収干渉を補正することで、１．０ｍＭのＳ２３７Ｃあたり０．８４ｍＭのフルオレセイン結合を示す。
ここに、ｈＧＨは一定の１０ｎＭ濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦに対し系列的に希釈され、そして蛍光クエンチングを平衡点で測定する。ホモクエンチングはｈＧＨの添加と共に増加し、ｈＧＨの０．５モル当量（５ｎＭ）で最大（ＤＦ／Ｆｏ＝１１％）となる。しかし極めて顕著なことには、このホモクエンチングはｈＧＨの高濃度では逆転し、これはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2は過剰のｈＧＨの存在下で（すなわちｈＧＨ／ｈＧＨｂｐが０．５よりも大きいとき）ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐモノマー複合体に解離することを示す。測定された蛍光ホモクエンチングは、供与体（Ｓ２３７Ｃ−ＡＥＤＡＮＳ）蛍光クエンチングと受容体（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）蛍光励起の両方を測定するため非同一の供与体／受容体のペアを用いた実験から示されるような正当のフォルスターエネルギー転移を反映している。大過剰のｈＧＨ（７０ｎＭより大きい）の存在下でおこるところのＦ／Ｆｏが１より大きい値の測定蛍光値の上昇は、結合したｈＧＨ・Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ複合体に対する遊離のＳ２３７Ｃ−ＡＦの高い非特異性結合によるもののようである。この現象はアッセイで得た（図９）ＩＣ50値を僅かに歪めるようであるが、我々の分析の基礎である相対的ＩＣ50値は影響を受けないで保持されるべきである。
図９において、Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのｈＧＨ誘発２量化のＩＣ50測定が行われた。結合緩衝液（20mM Tris.HCl, pH7.5；0.1% BSA；0.02% NaN3）中のＳ２３７Ｃ−ＡＦの系列的希釈（３倍）（図８に示すようにして作成）は６０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲にわたって作られ、そして１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管に入れる。同様に、ｈＧＨを系列的に希釈したが、ただしその範囲は３ｍＭから０．００４ｍＭとする。ｈＧＨ希釈（ｈＧＨ：Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのモル比は１：２）のアリコート（１０ｍｌ）と緩衝液のみを、Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ含有のアッセイ管に添加し（３回）、混合し、そして暗所で平衡に達するまで２５℃で５時間培養する。平衡のあと、既述のようにして（図８）蛍光を測定する。但し励起バンド幅は１０ｎＭとする。ＩＣ50値を、最大の半分のＤＦ／Ｆｏ値を与えるｈＧＨ濃度として計算する。
表ＩＩＩには、ｈＧＨの削除変異体および同族体置換で誘導されたＳ２３７Ｃ−ＡＦの２量化のＩＣ50値が示されている。ｈＧＨ変異体の同等性を次のように示す。削除はＤ；ヒト胎盤ラクトゲン置換はｈＰＬ；そしてヒトプロラクチン置換はｈＰＲＬ。削除または置換した領域はカッコで示す。ＩＣ50値は図２で説明したようにして測定する。標準偏差はふつうは文献値の＋／−５０％よりも少ない。
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まずｈＰＬ及びｈＰＲＬセグメント置の一連の同族体走査ｈＧＨ変異体をＳ２３７Ｃ−ＡＦに基づくアッセイで試験した（表ＩＩＩ）。そのうち３つ、すなわちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（７５−７４）及びｈＰＲＬ（１１１−１２９）は、ホルモン誘発ｈＧＨｂｐ２量化において著しい減少（各々１８、６及び１００倍より大きい）を示した。しかしｈＰＲＬ１２−１９及びｈＰＲＬ５４−７４は、１次部位結合に決定的な残基を分裂させ、この部位のｈＧＨｂｐ親和性を実質的に減少させた。これらの変異体に対する１次部位結合の損失は、ｈＧＨｂｐの２量化について観察された減少に大いに関係しているようである。実際、野生型のｈＧＨによるＳ２３７Ｃ−ＡＦホモクエンチングで観察された５００ｐＭＩＣ50は、１次部位ｈＧＨｂｐ親和性に関して報告されたもの（Ｋｄ＝４００ｐＭ）と殆ど同等である。更には、結合親和性を減少する１次部位決定因子の変異体（たとえばＲ６４Ａ及びＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）もまた２量化を減少し、そして１次部位のｈＧＨｂｐ親和性を高めるｈＧＨ変異体（Ｅ１７４Ａ）も我々のアッセイでは２量化を高める。他の同族変異体すなわちｈＰＲＬ（１１１−１２９）は、１次部位結合には影響しないけれども、サイズ排除クロマトグラフィーで分析したとき不均一性の証拠を示し、９０％はｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体のみを形成するが残りの１０％はｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2を形成する。比較的完全な２次部位結合のこの変異体の副分画の存在は、この変異体の効果は蛋白の保持不全または翻訳後修飾に帰せれれることを示唆する。
同族体走査変異体に加えて２つのｈＧＨ削除類似体、すなわち１つはＮ−末端から８つの残基を除いたもの［Ｄ（１−９）］もう１つは３２−４６残基を削除した天然の変異型（２０ＫｈＧＨ、アメリカ特許第４４４６２３５号）を試験した（表ＩＩＩ）。Δ（１−８）変異体はｈＧＨｂｐ２量化誘発能力において劇的な減少を示した（１００倍より大きい）。この変異体は１次部位結合に僅かの効果しかないので（Ｋｄmut／Ｋｄwt＝４）、ｈＧＨｂｐ２量化での損失は２次部位ｈＧＨｂｐ結合の分裂によるものであろう。
実施例５  ｈＧＨ変異体のアラニン走査
２次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定の側鎖を解明するために、アラニン走査によってＤ（１−８）、ｈＰＲＬ（１１−１９）及びｈＰＲＬ（１１１−１２９）変異体で同定された領域を調査した。同族性置換で同定した２つの領域はブタ成長ホルモンのＸ線結晶構造によればヘリックス形で高度に両親媒性なので、我々は変異体について残基が溶媒に露出されているこれらのヘリックスの親水性面に位置するもののスクリーニングに焦点をあてた。これらの領域に加えて、我々は更にＣ−末端に近い３つの変異体（Ｅ１８６Ａ、Ｓ１８８Ａ及びＦ１９１Ａ）をスクリーニングした。何故ならば我々はこの領域における適当な同族的置換類似体を欠いているからである。
２６のアラニン変異体のセット（表ＩＶ）から我々は、ｈＧＨｂｐ２量化で大きい分裂（３３及び５６倍）を惹き起す２つの変異体すなわちＦ１Ａ及びＩ４Ａ並びに２倍以上の減少を惹き起すもう４つのもの（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ及びＥ１１９Ａ）を発見した。アラニン走査は、Ｎ末端におけるＦ１Ａ及びＩ４Ａの近傍の残基はヘリックスＡとＣのＣ末端領域の残基と同様に、２次部位ｈＧＨｂｐ結合に顕著に貢献しないことを示す。Ｎ末端領域からＦ１とＰ２を削除したｈＧＨ類似体［Ｄ（１，２）］からの付加的データはＤ（１，２）を示しＦ１Ａ単独が起こすようなものより大きく２量化を分裂しない。このことはＮ末端アミンまたはカルボニル基ではなくてフェニルアラニン側鎖が重要であることを示す。アラニン走査分析は２次部位ｈＧＨｂｐ結合とレセプター２量化に最も関係するｈＧＨ決定因子はＦ１とＩ４の疎水性の側鎖であることを示す。これらの決定因子は、支配的な親水特性の多くの残基から成る（Matthews, J. Mol. Biol. 33:491（1968））１次部位結合に必須なものとは全く異なっている（Boutin et al., Cell 53:69（1988））。
アラニン置換ｈＧＨ変異体で誘発されたＳ２３７Ｃ−ＡＦ２量化のＩＣ50値を表ＩＶに示す。変異体は、野生型残基とアミノ酸配列内の位置、そして変異体残基（この場合はアラニン）から命名される。アミノ酸は１次コードで次のように表す。A, Ala；C, Cys；D, Asp；E, Glu；F, Phe；G, Gly；H, His；I, Ile；K, Lys；L, Leu；M, Met；N, Asn；P, Pro；Q, Gln；R, Arg；S, Ser；T, Thr；V, Val；W, Trp；Y, Tyr。発現されなかった変異体はＮＥと表示する。ＩＣ50値は図２に示すようにして計算する。標準偏差はふつう文献値または既述の値の＋／−５０％より少ない。
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実施例６  蛍光のホモクエンチング
一定濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ）にｈＧＨを逐次的に加え蛍光ホモクエンチングをリアルタイムでモニター（実施例４）したところ、ｈＧＨ誘発２量化では迅速な平衡時間（３分より短い）を、そして過剰のｈＧＨの２量化（ｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ比は０．５より大）では緩徐な平衡時間（３０分より長い）を示した。これは２量化の反転が、次のメカニズムによるオフ速度限定（off-rate limited）であることを示唆する。
ＨＲ1Ｒ2  ｆｉ  ＨＲx＋Ｒ  ｆｉ+excessHfi  ２ＨＲ
ここに化学量論結合は過剰のｈＧＨ（Ｈ＝ｈＧＨ、Ｒ＝遊離ｈＧＨｂｐ、Ｒ1＝１次部位ｈＧＨｂｐ、Ｒ2＝２次部位ｈＧＨｂｐ）条件下で２量化と競合する。１次部位化学量論的結合がおこり、従ってｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2複合体生成と競合することはわかっている。化学量論的２次部位結合が起こるかどうかの決定のために、２量化に競合する能力について１次部位を除去した類似体を試験した。ｈＧＨｂｐ親和性を５００倍減少する１次部位の中央にある変異による二重変異体であるＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａは、２次部位を保持している。図１０は、ｈＧＨｂｐはたとえ１６０倍過剰（８００ｎＭ）で存在していても過剰のＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａによって反転されないことを示す。対照してみると、作りだした１次部位をもつが２次部位決定因子を欠如する公知のｈＰＬ変異型は、２量化を２０ｎＭ（４倍過剰）のＩＣ50で効果的にブロックする。このデータは、化学量論的２次部位結合はおこらないこと、そして２量化は連続的な結合メカニズム、すなわち
Ｈ＋Ｒ  ｆｉ  ＨＲ1  ｆｉ＋R  ｆｉ  ＨＲ1Ｒ2
によって進行することを示す。
２次部位ｈＧＨｂｐ結合は化学量論的な１次部位複合体形成を必要とするので、この結合はｈＧＨ単独ではなくて、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）の中に存在する決定因子に依存せねばならぬ。そのようにこれらの決定因子は、最初のｈＧＨｂｐ結合によって引き出されるコンホメーション的変化及び／または１次部位ｈＧＨｂｐから誘導されねばならぬ。
実施例７  Ｘ線結晶学に基づくｈＧＨ−ｈＧＨｂｐアミノ酸相互作用
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2結晶の生成は、Blundell and Johnson, Academic Press, London, 1976に記載の方法に従うＸ線結晶学技術を用いてｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2複合体の３次元構造の決定を可能とする。複合体の結晶は、結晶種添加の反復と共に存在する液滴の蒸気拡散を組み合わせて成長させる。結晶の貯蔵液は、ｈＧＨｂｐにｍｅｔ-ｈＧＨを僅かに２：１モル過剰で添加し４℃で２４時間培養して製造される。次に複合体を濃縮し、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び１ｍＭのＰＭＳＦで平衡化したサイズ排除カラム（G75-120 Sephade（Sigma））上におく。複合体を含む分画をプールし、濃縮し、そして５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と１ｍＭのＰＭＳＦで脱塩する。得られたストック液中の複合体濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。Ｅ280（０．１％）＝１．６７ｃｍ-1。複合体のストック溶液は、飽和硫酸アンモニウム（超精製したもの；Schwarz-Mann）を添加して１０％飽和溶液とした０．１Ｍビストリス液（ｐＨ６．５）を用いて１．７ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＭＰＤ（Aldrich）を、最終濃度が１％になるように添加した。次に混合物５０μｌをパイレックスガラスの滴板にピペットで加え、結晶種添加の前に１５０ｍｍｘ２５ｍｍのプラスチックの培養皿の中で室温で２日間４０％硫酸アンモニウムで平衡化する。２週間のうちに、４５ｋＶ、１１０ｍＡで作動する回転陽極ゼネレータ上で２．７オングストロームで回折する１ｘ０．５ｘ０．１ｍｍの大きさの結晶を得る。
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）2結晶構造の３次元ポリペプチド構造を図１１に示す。中央上の領域の太線はｈＧＨ分子を表し、αヘリックスは明瞭に見える。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子と結合し、その１つは左側、もう１つは右側である。これらのｈＧＨｂｐ分子の各々は一本鎖で結合する２つの領域をもち、上の領域はｈＧＨ分子と同じ高さで、他の領域は垂直に位置し図の下のほうへ出ている。ｈＧＨｂｐのこれら最後の２つの領域は、図１１の下端で互いに接触している。この底部での接触は、２つのｈＧＨｂｐ分子間の唯一の接触領域であり、その接触点は以下に記載する。この構造に基づいて、３つのポリペプチドの相互作用アミノ酸の分析が行われた。それらは次の３つのカテゴリーに分けられる：１）表Ｖに示すｈＧＨとｈＧＨｂｐ１（結合すべき最初のｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；２）表ＶＩに示すｈＧＨとｈＧＨｂｐ２（結合すべき２番目のｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；３）表ＶＩＩに示す複合体の２つのｈＧＨｂｐの間の相互作用。表ＶとＶＩは、そこに示す特異なｈＧＨｂｐアミノ酸へ結合する特異な個々のｈＧＨアミノ酸を開示する。特定の基の結合と化学的相互作用の性質もまた記載してある。命名は標準的なアミノ酸１文字命名法に従い、天然のｈＧＨまたはｈＧＨｂｐのアミノ末端から数えるときのアミノ酸の数に従う。表Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩにおけるその他の記号の意味は次のようである。ＭＣ＝主鎖、ＳＣ＝側鎖、ＳＳ：ジスルフィド、ＨＢ＝水素結合、ＳＢ＝塩橋、ＶＷ＝ファンデルワールス。これらの表は全ての部位１−及び２−影響残基を包含するものではない。
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実施例８  モノクローナル抗体のｈＧＨレセプター刺激のための使用
本発明のアッセイは、成長ホルモンレセプターに向けられたモノクローナル抗体のスクリーニングに用いられる。得られたモノクローナル抗体は、成長促進の相対的能力をインビボで評価できる。モノクローナル抗体ＭＡｂ２６３（Agen Biochemical Ltd., Queensland, Australia）を、グリコシル化ラットとウサギレセプターを免疫源として作成する。ＭＡｂ２６３を、ラットで１５５ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ用量とモル比で当量の用量で下垂体切除ラットの皮下注射で毎日投与すると、図１２に示すように著しい体重増加が認められる。
１群８匹のラットから成る２群に対して、ＭＡｂ２６３（１．０５ｍｇ／ｋｇ）と共にまたは無しで希釈緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、０．１％ウシ血清アルブミン）を投与する。ラットには食餌と水を要求に応じて与える。毎日の体重を図１２に示す。第６日目の終わりにラットの体重を測定し、結果を下の表ＶＩＩＩに示す。
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従って成長ホルモンレセプターに対するモノクローナル抗体は、体重増加をおこさせるために投与することができる。
実施例９  アゴニストまたはアンタゴニスト活性のための細胞アッセイ
新規な細胞に基づいた生物活性アッセイ系をここに提供する。それは、ホルモンまたはサイトカインレセプターへＣ末端で自由にしたＧＨレセプターの細胞外ＧＨ結合領域、例えばＥＰＯ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｃ−ＣＳＦ、プロラクチン、胎盤ラクトゲンまたはインターロイキン２、３、４、６もしくは７のそれ、ホルモンまたはサイトカインに通常応答する細胞系およびホルモンまたはサイトカインのレセプターを通常含有する細胞系から成るところのハイブリッドレセプター（アメリカ特許第４８５９６０９号）形質転換細胞系に基づくものである。通常は、Ｎ末端とＧＨレセプターフラグメントが融合したホルモンまたはサイトカインレセプターの貫膜および内質部分のみが用いられる。細胞の応答性は、測定可能な特性たとえば膜特性の変化、増殖、有糸分裂性、被検体の放出（たとえば脱顆粒）などである。
ｈＧＨレセプターは、インターロイキン３（ＩＬ−３）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）レセプターを含む造血起源のレセプターの一大グループに属する（Bazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6934（1990）；Cosman et al., Trends Biochem. Sci. 15:265（1990）；Patthy, Cell 61:13（1990））。ナガタとその共同研究者（Fukunaga et al., EMBO J. 10:2855（1991））は、全長のネズミＧ−ＣＳＦレセプターでトランスフェクトしたＩＬ−３依存性骨髄白血病細胞系（ＦＤＣ−Ｐ１）ばＩＬ−３無しのＧ−ＣＳＦの添加によって増殖することを示した。ハイブリッドレセプター（アメリカ特許第４８５９８０９及び５０３０５７６号）が大阪生科学研究所のイシザカ−イケダエツコ及びナガタシゲカズ博士によって構築された。このものはＧ−ＣＳＦ結合領域を欠如し但し３つの細胞外フィブロネクチン反復、貫膜および細胞内領域を含むｍＧ−ＣＳＦレセプターの形に結合したｈＧＨｂｐを含有している。フィブロネクチン領域はＧ−ＣＳＦの結合に関与せず、ｍＧ−ＣＳＦレセプターの良好な発現に必要である（Fukunaga et al., EMBO J. 10:2855（1991））。
ハイブリッドレセプターは、ｍＧ−ＣＳＦレセプター（３つのフィブロネクチン領域ならびに全貫膜および細胞内領域をコードしているもの）のエキソン７から１５までに結合しているｈＧＨレセプター（分泌シグナルと細胞そとｈＧＨ結合領域をコードしているもの）のエキソン１から５までを含有するｃＤＮＡから構築された。ｈＧＨレセプターから誘導される配列（Leung et al., Nature 330:537（1987））は、ＦＤＣ−Ｐ１細胞のハイブリッドレセプターの発現を許すベクター、すなわちｐＢＯＳ−Ｉ６１（Fukunaga et al., EMBO J. 10:2855（1991））の中へＰＣＲでクローンされた。単一のシステインは、２つのレセプターフラグメントの接続部で生産された。安定なＦＤＣ−Ｐ１細胞のトランスフェクションと培養は（上に）述べたとおりであった。
全細胞でのハイブリッドレセプターからの［125Ｉ］ｈＧＨの競合的置換は、細胞あたりのレセプターの概数と親和性を調べるために用いた。ＩＬ−３で成長させた細胞は、アッセイの前に燐酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）と１０％ＦＢＳで洗浄する。細胞を４℃で１８時間、１０ｐＭの［125Ｉ］ｈＧＨ（Ｙ１０３）の存在下にｈＧＨの系列的希釈で培養（１．２ｘ１０6／ｍｌ）する。次に細胞をＰＳＣで２回洗浄して過剰のラベルを除去する。Ｙ１０３Ａは、第２のｈＧＨｂｐの結合を部分的にブロックするであろうＹ１０３のヨード化を防ぐのに用いる（Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:4498（1991））。
幾つかの独立した結合実験において、ｈＧＨのＫd値は０．１±０．０３ｎＭであり、細胞あたり１０００±３００のレセプターがあった。この親和性は、可溶性のｈＧＨｂｐへのｈＧＨ結合より約３倍強力で、細胞のレセプターへのｈＧＨの結合の結合活性効果を反映している。非トランスフェクト細胞は、ｈＧＨの特異的結合部位を欠いている（Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:4498（1991）。図１３は、細胞増殖を誘発するｈＧＨの能力におけるｈＧＨ濃度の増大効果を示す。低濃度ではｈＧＨはこのアッセイでは、細胞全体におけるＫd（約１００ｐＭ）より若干低い約２０ｐＭのＥＣ50で潜在的アゴニストとして作用する。これは、１００％のレセプター占拠率より低いところで最大の細胞い増殖がおこっているであろうことを反映する。
突然変異分析（Cunningham et al., Science 254:821（1992）；Cunnngham et al., Science 244:1081（1989））及び構造研究（De Vos et al., Science 255:306（1992））は、各々のｈＧＨ分子は２価でｈＧＨｂｐを結合するのに２つの別々の部位を含有していることを示す。対照的に、ｈＧＨｂｐは効果的に１価である。何故ならばその各々は、ｈＧＨの部位１または２と結合するのに実質的に同じ決定因子を用いるからである。過剰のｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）2複合体を分解してｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体とし、ここでｈＧＨはｈＧＨｂｐの部位１にのみ結合する。すなわち本発明者は過剰のｈＧＨはシグナル化をアンタゴナイズすると考える（図１）。事実、きわめて高いｈＧＨ濃度では増殖活性は失われる（ＩＣ50＠２μＭ）。ＩＬ−３誘発の細胞増殖は、高い濃度のｈＧＨ（８μＭ）の存在下では変化せず、ｈＧＨは細胞増殖に毒性的でないことを示す。アゴニストもアンタゴニストもその変曲点は細胞密度に依存せず（図１３）、これはこの効果が細胞間の橋かけ結合レセプターまたは他の細胞−細胞相互作用を含まないことを示す。更に、全長ｍＧ−ＣＳＦを含有するＦＤＣ−Ｐ１細胞はｈＧＨに応答せず、ハイブリッドレセプターを含有する細胞はＧ−ＣＳＦに応答しない。
実施例１０
ハイブリッドレセプター細胞増殖アッセイをシグナルするｈＧＨｂｐの２量化に必要なものを更に調べるため本発明者は、ｈＧＨｂｐに対して指向されるそれら（ＦＡＣｓ）から誘導される１価のフラグメントと２価のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を用いた。低濃度の４つの異なる抗レセプターＭＡｂｓのうちの３つを高濃度で添加したところ、細胞増殖を誘発するためにはｈＧＨと同程度に活性であった（表ＩＸ）。Ｎｏｎｅは効果のないことを表し、ＮＤは測定してないことを表す。
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ＭＡｂ５と２６３はArgen, Inc.（New Jersey）から入手し、Waters及び共同研究者（Barnhard et al., Endocrinology 115:1805（1984）；Barnard et al., Biochem. J. 231:459（1985）に記載されている。ＭＡｂｓ１３Ｅ１と３Ｄ９はジェネンチックハイブリドーマグループから入手し、その性質はいろんなところに記載がある（Cunningaham et al., Science 254:821（1992））。簡単にいえば、ＭＡｂｓはマウスの腹水症液をプロテインＡセファローズと結合させ、０．１Ｍの酢酸塩（ｐＨ３．０）で溶離して精製する。ＦＡｂフラグメントは、１０ｍＭシステインを添加したＰＢＳの中で、ジチオスレイトールで活性化したパパインでＭＡｂｓを１時間処理（ＭＡｂとパパインは５０：１の重量比）して製造する。０．１Ｍのヨードアセタミドを添加して消化を停止させる。Ｆｃと残りのＭＡｂは、プロテインＡセファローズに２回吸着させＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（Pharmacia）上でゲル濾過して除去する。
各々のＭＡｂ（０．３〜１ｎＭ）のＥＣ50値は通常は、ＥＬＩＳＡで測定したＫdよりも若干低い（表ＩＸ）。ｈＧＨについてはこれは、細胞全体への結合活性効果を反映しているか及び／またはその最大シグナル化は１００％より少ないレセプター占拠率で得られる。さらに高い濃度（２０ｎＭ〜１０μＭ以上）では、これらのＭＡｂｓのうち２つは活性を失う。これは多分過剰のＭＡｂが、ｈＧＨｂｐとの１価結合によってレセプターの橋かけ結合をブロックするからである。対応する１価のＦＡｂフラグメントは実質的に不活性であり（図ＩＸ）これは更に２価がシグナル活性に必要であることを示す。
これらのＭＡｂｓの用量依存性曲線における相違は、それらのｈＧＨｂｐへの結合において異なったやりかたがあることで説明できる。ＭＡｂ５は、たぶん両方のレセプターが互いに接触している領域への結合により（図１１）、ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐへの第２のｈＧＨｂｐの結合を防ぐ（Cunnningham et al., Science 254:821（1992））。ＭＡｂ５が最も効果が低いという事実は、レセプターは最大シグナル化のために互いに近接する必要があることを示す。ＭＡｂ１３Ｅ１はｈＧＨ結合をブロックし（Cunningham et al., Science 247:1461（1990））ｈＧＨの効果を模倣する。このＭＡｂは広いプラトーを示し、アンタゴニストの相を示さない。これは多分我々がそれを観察するほど十分に高い濃度に達していないからであろう。我々はこの中和ＭＡｂはｈＧＨのように結合し極めて安定なレセプター２量体を形成することを示唆する。対照的にＭＡｂｓ２６３と３Ｄ９は、ホルモンとレセプターの界面から離れたところを結合して類似のアゴニスト及びアンタゴニスト相を示す。これら２つの相は、ｈＧＨほど広くは隔たっていない。これは多分２量体は最良のレセプター−レセプター接触をもっていないからであろう。ＭＡｂｓ３２６３と３Ｄ９がアゴニストであるという事実は、活性２量体を形成する構造上の必要はかなり緩やかであることを示唆する。
ＭＡｂ１３Ｅ１またはＭＡｂ５から誘導されたＦＡｂフラグメントはｈＧＨ−誘発の細胞増殖に拮抗し、いっぽうＭＡｂ２６３及び３Ｄ９から誘導されたものはそうではない（表Ｘ）。これらの実験において細胞は、１ｎＭのｈＧＨに高濃度のＦＡｂまたはｈＧＨ類似体を加えたもので培養する。半分最大阻止濃度は、ｈＧＨの細胞増殖活性の５０％をブロックするに必要な濃度である。Ｎｏｎｅは、１０μＭまでにＦＡｂまたはｈＧＨ類似体では阻止が認められなかったことを表す。これらの研究は、ＭＡｂ１３Ｅ１及びＭＡｂ５のエピトープはホルモン−レセプターまたはレセプター−レセプター界面をブロックするという事実と一致する。
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実施例１１
２量化のためのｈＧＨの構造必要性を更に決定するために（図１１）、我々は部位１または２へのレセプターの結合を減少させるように設計したｈＧＨの変異体を調べた。部位２決定因子は保存するが部位１の重要な側鎖を変化させる二重変異体（Elberg et al., J. Biol. Chem. 265:14770（1990））は細胞増殖を促進する。しかしＥＣ50は野生型のｈＧＨよりも約１０3倍も高い濃度にシフトされる（表ＩＸ）。これは、インビボで測定した部位１のＫdにおける５６０倍の減少と一致する（Elberg et al., J. Biol. Chem. 265:14770（1990））。我々はＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａの滴定において不活性な相を観察するのに十分高い濃度に到達できなかった。単一のｈＧＨ変異体（Ｇ１２０Ｒ）は機能的な部位１を保持しているが、部位２を立体的にブロックしている。この変異体はいかなる濃度においても実質的に不活性である。すなわち部位１または２への結合は必要であるが、細胞増殖の促進には十分ではない。
変異体が部位２に結合をブロックする（但し部位１の結合はブロックしない）という逐次的シグナル化のメカニズムはｈＧＨ−誘発細胞増殖と拮抗すべきことが予想される。これを調べるために、９０％最大細胞増殖を支持するに十分な濃度（１ｎＭ）のｈＧＨに高い濃度の野生型ｈＧＨまたは部位１の変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）もしくは部位２の変異体（Ｇ１２０Ｒ）を加えたもので細胞を培養した。予期したように部位２変異体はｈＧＨを拮抗し、いっぽう部位１変異体はまったく効果がなかった。実際、部位２変異体は野生型ｈＧＨよりもアンタゴニストとして殆ど１００倍も強力であった（ＩＣ50はＧ１２０Ｒでは１０ｎＭ、ｈＧＨでは２０μＭ；表Ｘ）。これは我々が予測してなかったものである。何故ならば、いったんＧ１２０Ｒが結合するとそれは２量化されずレセプターを拮抗できないからである。すなわちＧ１２０ＲとｈＧＨの間の競合は、部位１による遊離ホルモン分子結合になお一層限定される。これと対照的にアンタゴニスト的となるべきｈＧＨについては遊離ホルモンは、結合ｈＧＨ中間体が反応する前に占有されてないレセプターと反応する必要がある。これは高濃度のｈＧＨを要する。
Ｇ１２０ＲはｈＧＨよりも極めて良好なアンタゴニストであるが、５０％の拮抗性に必要な変異体の濃度は、このアッセイでのｈＧＨのそれよりも約２０倍高い（表Ｘ）。これは、単量体であるＧ１２０Ｒ・レセプター複合体におけるＧ１２０Ｒよりも２量体であるｈＧＨ・（レセプター）2においてｈＧＨはより強力に結合するという事実を反映している。または、最大シグナル化は１００％のレセプター占有を必要としないであろう。いずれの場合でもＧ１２０Ｒ変異体における部位１の親和性の改善は、それをさらに強力なアンタゴニストとするであろう。
ｈＧＨ変異体は、部位１によってｈＧＨｂｐに更に強固に結合する突然変異誘発により生産される（Cunningham et al., Science 24:1081（1989）；Itoh et al., Science 247:324（1990））。これらの変異型の結合（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ）は、ｈＧＨｂｐへ３０倍も強固に結合する（表Ｘ）。この変異型はｈＧＨと比較し得るＥＣ50をもっているが、自己拮抗作用のＩＣ50はｈＧＨの約３０倍低い。これは自己拮抗作用は、結合したホルモン−レセプター中間体の部位２と可溶性ホルモンの遊離部位１の間の競合から生じるという考えと一致する。部位１の結合の改善はアゴニストとしてのこのホルモンを改善しないという事実は、レセプターの２量化は速度限定的であり従って部位１と２の両方へアゴニスト変異体を導入するのが望ましいことを反映する。我々は更にこの変異型を、Ｇ１２０Ｒを含有するように変異した。テトラ変異体の変異型は、ｈＧＨアンタゴニストとしてＧ１２０Ｒよりも１０倍強力であった（図１４、表Ｘ）。これは拮抗作用に対する部位１の結合親和性の重要性の更なる証拠である。
我々の研究は、ｈＧＨ、ＭＡｂｓ及びそれらの誘導体によっておこされる拮抗作用または自己拮抗作用はレセプター２量化のブロッキングでありレセプターの下方調節でないことを示す。まず、ｈＧＨでなくＩＬ−３で増殖された細胞は、より大きなｈＧＨ応答またはｈＧＨレセプター数を示さない。レセプターの下方調節はふつうレセプター活性化と密接に関連している。この場合、ｈＧＨの用量依存性曲線の拮抗作用的部分は、ｈＧＨの生理学的に適切な濃度（１μＭではなく）から開始されると期待される。更にＭＡｂｓとｈＧＨの各々のＥＣ50対ＩＣ50の比は広範に変化し、これはレセプター活性化は単に結合性質を変えることで阻害とは容易に無関係にすることができることを示す。最後に、Ｇ１２０Ｒ変異体は不活性であるが、それでもｈＧＨよりも更に強力なアンタゴニストであり、そしてＧ１２０Ｒによる細胞の前処理はその拮抗作用の効果を高めない。すなわちＧ１２０Ｒの拮抗作用の効果は単純なレセプターの下方調節と一致しない。高い濃度で自己拮抗作用をもつ他のリガンドがレセプターの２量化のブロッキングに関与することは可能であり、そしてこれは本発明の実施に有用なリガンドの同定の追加的な基礎として役立つ。
実施例１２
この研究においては、乳ガン細胞系に影響する泌乳刺激ホルモンの能力を調べた。細胞系ＭＣＦ−７とＴ４７ＤはＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手した。ＭＣＤ−７は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）を添加したＦ−１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）培地中に保持した。Ｔ４７Ｄは１０％ＦＢＳ添加のＲＰＭＩで保持した。
トリプシン化した細胞を９６ウエルの培養皿に３回入れ、最終細胞密度を１０4／ウエル／０．１ｍｌ培地とした。アッセイ用培地は、１％のダイフィルトレートしたウシ胎児血清と抗生物質を添加したＦ１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）である。３〜４日後、細胞を５〜６時間１μＣｉ／ウエルのＨ3−チミジンでパルス標識した。細胞を５ｍＭのＥＤＴＡで処理して採取を容易にした。
ｈＧＨおよびプロラクチンは共に、図１６に示すようにＴ４７Ｄ細胞の増殖を誘発し得た。しかしｈＧＨ類似体のＧ１２０Ｒは単に不活性な成長刺激体であるのみならず、成長刺激濃度のｈＧＨと共培養したときのアンタゴニストでもある（図１６）。亜鉛の添加は何らの明白な相違を示さなかった。Ｇ１２０Ｒそれ自体が対照よりも少ないチミジン補集をするという事実は、アッセイ培地に存在するラクトゲンに対する拮抗作用効果からくるものであろう。
Ｔ４７Ｄ細胞成長におけるｈＧＨまたはＧ１２０Ｒの用量依存的効果を図１７に示す。ベルの形をした曲線は、上記のプロラクチンレセプター及びｈＧＨレセプターと結合するｈＧＨの逐次的２量化モデルに対応する。手短にいって、ｈＧＨ濃度の低いときは、ｈＧＨの第一レセプターへの結合に次いで、１対２の複合体を生成する第二のレセプターへの結合がおこり、それはシグナルのトランスダクションと生物学的機能を活性化する。ｈＧＨ濃度が増大するときｈＧＨモノマーは、部位１のレセプター結合と競合し、そして生物学的応答を不活性にする１対２複合体を生成する。
プロラクチンレセプターへのｈＧＨの結合には亜鉛が必要である（Cunningham et al., Science 250:1709（1990））。すなわち亜鉛の添加がｈＧＨの成長刺激活性を増大させるという観察は、プロラクチンレセプターは観察された成長刺激効果に主として関係することを示す。
上記のアンタゴニストＧ１２０Ｒは成長刺激剤としては不活性であった。１ｎＭのｈＧＨと拮抗するＧ１２０Ｒの用量依存的効果を図１７Ｂに示す。
ＭＣＦ−７細胞については図１８に示すように、アッセイ培地での５０μＭの亜鉛の添加は、単にｈＧＨ活性のみならずバックグラウンド成長においてもまた顕著な差異をもたらす。プロラクチンでなくてｈＧＨは、対照のアッセイ培地と比較してＭＣＦ−７細胞の成長を増大した。亜鉛の現実の役割は将来の研究を必要とする。Calvalloほかは、乳ガン患者は著しく高い血清亜鉛レベルをもつと報告している（Cancer 67:738（1991））。アッセイに必要な亜鉛の量を滴定したとき、ＭＣＦ−７細胞は、試験したすべての他の胸部肉腫細胞系よりも約２〜３倍も高いレベルの亜鉛を必要とした（データは示さず）。しかし亜鉛が存在すると、ｈＧＨ及びｈＧＨ類似体のＧ１２０ＲはＭＣＦ−７細胞中ではＴ４７Ｄ細胞中でと同じようには機能しなかった。
すなわちこれらの実験結果は成長ホルモン類似体のＧ１２０Ｒは、２つの乳ガン細胞系の増殖における成長ホルモンの成長刺激活性と拮抗するのに効果的であった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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