(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓性疾患の経過において、事前に形成された血小板に富んだ血栓であってプラスミンによって脱凝集されない血栓を脱凝集するための薬剤であって、活性成分として、
以下に示すアミノ酸配列を有し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において約８０，０００の分子量を有する、
ヒルＨａｅｍｅｎｔｅｒｉａ  ｇｈｉｌｉａｎｉｉの唾液腺由来のポリペプチドであって、
トロンビンの作用によるフィブリノーゲンの凝固を妨げる活性を有する、
事前に形成された血小板に富んだ血栓を脱凝集する能力を有する該ポリペプチドを、該血栓を脱凝集するのに有効な量で含有する上記薬剤：
0003878668.tif 000015
【請求項２】
ヘメンティン以外の抗凝固剤を更に含有する請求項１の薬剤。
【請求項３】
血栓性疾患の経過において、事前に形成された血小板に富んだ血栓であってプラスミンによって脱凝集されない血栓を脱凝集するための薬剤であって、活性成分として、
以下に示すアミノ酸配列を有し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において約８０，０００の分子量を有する、
ヒルＨａｅｍｅｎｔｅｒｉａ  ｇｈｉｌｉａｎｉｉの唾液腺由来のポリペプチドであって、
トロンビンの作用によるフィブリノーゲンの凝固を妨げる活性を有する、
事前に形成された血小板に富んだ血栓を脱凝集する能力を有する該ポリペプチドを、該血栓を脱凝集するのに有効な量で含有する上記薬剤：
0003878668.tif 000016
【請求項４】
該ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を有する請求項１の薬剤：
0003878668.tif 000017
【請求項５】
該ポリペプチドは、
（ａ）ヒルＨａｅｍｅｎｔｅｒｉａ  ｇｈｉｌｉａｎｉｉの唾液腺からの組織を、１５〜２５ｍＭの塩濃度を有するｐＨ７〜８のバッファーでホモジナイズし、次いで
（ｂ）得られるホモジネートを、８０〜１５０ｍＭの塩濃度を有する溶離液でイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、更に任意にゲル濾過する、
工程によって得られる請求項１の薬剤。
【請求項６】
該ホモジナイズ工程はＨｅｐｅｓバッファー中で行い；
該イオン交換クロマトグラフィーは塩化ナトリウムを溶離液として実施し；
該ポリペプチドは、ウシ血清アルブミンによって、凍結または凍結乾燥による不活性化から保護する請求項５の薬剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、心臓病や脳卒中のような血栓性疾患に罹っている患者に起る生命を脅かす血液凝塊（血栓）の予防と治療のための方法と材料薬物に関する。
血栓症は、心臓や脳のような重要な器官に血液を供給する血管を遮断（閉塞）する凝血塊（血栓または塞栓）の形成に集約される疾病過程である。これら血栓が治療されなければ、心臓発作（心筋梗塞）、肺塞栓症または脳卒中による死を招く結果となり得る。これら生命を脅かす血栓症の形の外に、主として、血管網中の凝血塊が不都合に形成されることによる小血栓による多数の疾患がある。例として、深部静脈血栓症、そして、さらに深刻なものとしては、敗血症性ショックに至る細菌によって起る血栓症があげられる。血栓症が起る機構は極めて複雑で、十分理解されていないが、ある場合には、血管壁の罹病部分（アテローム病巣）が、傷害を受けた部位における血小板やフィブリンの沈積物のような血液成分の集積からなる血液凝固（止血）の正常治療過程を受けることによって開始されると考えられる。
ある時点では、治療が行われなければ、このような血栓は、十分大きく生長して、形成部位における血管を閉塞するか、ちぎれて、血流中を運ばれ、ついにはもっと径の小さい血管を遮断する（この現象は、塞栓と呼ばれている）。
現在では、血栓性疾患の治療は、大ざっぱに、以下の如く、２つのよく知られた治療形式に限定されている。
1.  抗血液凝固剤での凝血塊形成の予防、そして、
2.  プラスミノーゲンからプラスミンの産生を活性化させるために、組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）を投与することによってフィブリン凝固物を開裂させること。
しかし、今までのところ、上述のような仕方で血管を閉塞することが多い、血小板凝集物を、治療有効量で特異的に溶解するか、または脱凝集させることができる物質は同定されていない。（治療有効量とは、患者が受入れることができる量で、一般蛋白質分解のようなリスクが受入れることができる程度に低い用量である）。
血小板凝集物中に存在する血小板間の結合には、フィブリノーゲンが関与しているが、フィブリノーゲンを分解する性質をもった物質が、血小板凝集物の脱凝集を行う能力を必然的にもっているというような直接的相関は存在しない。血小板凝集物の脱凝集を行う能力をもたない血栓溶解剤が同定され、多数のフィブリン溶解酵素は、血小板凝集物を脱凝集できないことが知られている。例えば、ストレプトキナーゼやウロキナーゼのようなプラスミノーゲンやアクティベーターは、血小板凝集物を脱凝集しないし、トロンビンのようなＮ末端フィブリノーゲナーゼやヘビ毒から単離されたフィブリゲナーゼにもこの活性はない。
それぞれ、フィブリン凝集塊と血小板凝集物を粉砕する上でのヘメンティンとプラスミノーゲンアクティベーターの異なる役割、したがって、作用様式は、図１に図解されている。プラスミノーゲンアクティベーターは、プラスミノーゲンのフィブリン凝集塊に作用するプラスミンへの転換を促進する。それと対照的に、ヘメンティンは、血小板のフィブリノーゲン開裂に優先的に作用し、その開裂によって、引続いて凝集物の脱凝集を起すことが分った。
血小板凝集物の脱凝集は、治療的に有効な方法で凝集物を特異的酵素（フィブリノゲナーゼのような）で処理することによっては、不可能であると考えられた。
ＴＰＡは、過度に高い濃度（すなわち、治療有効量よりかなり過剰な量において）で、プロスミンによるフィブリノーゲン架橋結合血小板の蛋白質分解によって、血小板凝集物の脱凝集を促進することが知られている。しかし、ＴＰＡは、血小板凝集物を選択的に脱凝集しない。その上、循環系中の他の凝固因子（Ｘ因子など）に対し、有害な作用をもっており、血管網中の修復領域中に生ずる血止め栓の溶解を起す。プラスミノーゲンアクティベーターのこの非特異的作用は、このような血栓溶解剤に関して起ることが多い出血の原因となることがあると示唆されている。ＴＰＡの作用は、非特異的プロテアーゼの作用と類似しており、血小板凝集物のフィブリノーゲン結合に対して特異性がない。
in vivoで血小板凝集物を脱凝集するためにＴＰＡを使用することを妨げるもう１つの要因は、投与したＴＰＡが望ましい治療効果を発揮するためには、受入れ難い高用量を必要とすると考えられることである。その上、ＴＰＡは血漿によって阻害を受ける。そして、そのために、ＴＰＡを、それが血小板凝集物に対して、脱凝集活性を保持するためには、連続的灌流としてＴＰＡを投与することが必要となると考えられる。
哺乳動物の心血管系において、活性を有する種々の物質が、ヒルの分泌物中に存在することが知られている。これらの中には、Haementeria ghilianiiのようなRhynchohdellidia目のヒルに由来するフィブリン溶解酵素であるヘメンティンがある。ヘメンティンとその単離は、Ｕ．Ｓ．特許４３９０６３０中に記載されている。
ヘメンティンのフィブリノーゲン溶解活性は、Malinconico S.M. ；Katz J.B.とBudzynski A.Z.によって、“ヘメンティンによるフィブリノーゲン分解−ヒル、Haementeria ghilianilの唾腺からのフィブリノーゲン溶解性凝固剤”、J. Lab. Clin. Med.１９８４；１０４（５）pp８４２−８５４において記述されている。この論文、または上述の米国特許４３９０６３０には、ヘメンティンが他のフィブリノーゲン溶解酵素と比較して、血小板凝集物を脱凝集する特異的能力があるというなんらのヒントも示唆もない。
本発明者らは、今回、ヘメンティンを含む組成物について、予期しない性質を発見した。すなわち、治療有効量において、他の凝固因子や血液凝固に作用せずに、フィブリノーゲン開裂を経て、血小板凝集物を特異的に溶解するin vivoにおける能力である。
したがって、本発明の最初の部分によれば、動物の患者（ヒトのような）に対して、血小板凝集物を、容積で比較して優先的に含む部位において、該凝集物を脱凝集させる量と方法で、ヘメンティンを含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、血栓疾患の治療の方法が提供されている。
ヘメンティンが、血小板凝集物を脱凝集する、したがって、血小板に富んだ凝血塊を溶解する詳細な機構は、独特であるように思われる。他のフィブリノーゲン溶解性酵素は、優先的に、
1.  例えば、プラスミンと若干のヘビ毒（この露出したＡの鎖もトリプシンのような一般的プロテアーゼによって、酵素的攻撃を受け易い）のように、フィブリノーゲンの露出したＡの鎖のCOOH−末端において開裂を起すか、または、
2.  トロンビンや若干のヘビ毒のように、フィブリノーゲン分子のアミノ末端において開裂を起す。これは、主としてフィブリノペプチドＡそして／またはフィブリノペプチドＢ、（または同様な短鎖ペプチド断片）の除去に関るもので、この除去により、通常は、依然として重合することができ、したがって、主としてフィブリンを含む凝血を形成することができる成分を、結果として生成する。
ヘメンティンは、ＤとＥのドメインの間の結合部領域における３つの鎖（α，β，γ）を通じて最初に開裂を起すことが知られている唯一の酵素である。（Kirschbaum, N.E.とBudzynski, A.Z.１９９０）“天然分子のAa COOH−末端ドメインを含んでいて（J. Biol. Chem２６５：１３６６９−１３６７６）：後に血小板凝集物（治療的に有効な量で）を脱凝集させることができるヒトフィブリノーゲンの独特な蛋白質分解性断片。この部位における開裂は、血小板に結合したフィブリノーゲンの２価の結合の性質をこわすために、最も利用し易く、効果的であると仮定されている（Sawyer, R.T.,Powell-Jones, C.とMunro, R.１９９１，アマゾンのヒルHaementeria ghiliammiの吻におけるヘメンティンの生物学的機能；Blood coagulation and Fibrinolysis vol.２，pp１５３−１５９）。上述の特許または論文中においては、ヘメンティンの一次構造について、なんらヒントも示唆も存在していない。
本発明の第二の部分によれば、血栓性疾患の治療法が提供されており、その方法は、動物の患者（ヒトの患者のような）に、血小板凝集物を優先的に（容積で）含む凝血塊が存在する部位において、該血小板凝集物のフィブリノーゲン結合のＤとＥのドメインの間を優先的に開裂させることができる物質の治療的有効量を該凝集物を脱凝集させるような量と方法で、投与することを内容としている血栓性疾患を治療する方法が提供されている。
本発明による方法によって治療された血小板凝集物は、治療を行わなければ、血管を開塞し、心臓発作、肺塞栓症または卒中、そして／または、その他の大小の血液供給障害の症状発現によって病気を起すかもしれない凝血塊であってよい。
肺塞栓症に罹患している患者は、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の加速を経験するのが典型的である。このような患者にヘメンティンを含む組成物を、本発明の方法にしたがって投与すると加速されたＥＳＲを減速することが、今や明らかにされた。その上、ＥＳＲを減速させるヘメンティン含有組成物の作用から、また加速されたＥＳＲは、なんらかの方法で、赤血球とフィブリノーゲンの相互作用に関係づけられることを示された。したがって、ヘメンティンは、個々の患者における赤血球とフィブリノーゲンとの相互作用の程度に対する診断指標として役立つ。さらに、血漿フィブリノーゲンの増加が、血液の粘度に影響する場合は、ヘメンティン組成物は、粘度を減少させるための治療法として使用することができる。
ヘメンティンのさらなる有利な性質は、その血小板凝集を脱凝集させるin vitro活性が、そのin vivo活性に較べて、有意に増強されるということである。これは、ＴＰＡのin vivoとin vitroでの一般相対活性と、完全に反対の関係にある。ＴＰＡは、in vivoでの血漿による阻害のために、in vitroに較べin vivoでの活性がはるかに低い。
このような血栓性疾患を治療する上で使用される組成物は、ヒルの組織、またはRhunchobdellida目のヒルの分泌液（例えば、Haementeria ghilianiiの唾腺から）から直接由来するか、または、任意にさらに精製してもよい（例えば、単一の主要蛋白質ピークをもち、比活性が１０００Ｕ／mg蛋白質より大きいことを特徴とする事実上純粋なヘメンティンまで）。
ないしは、それはこのような組織または分泌物から、遺伝子操作、および複製技術によって間接的に由来することができる。（そして、本発明中に今後説明されるように、現在はじめて本発明者らがヘメンティンのアミノ酸配列を解明したので、このような遺伝子操作と複製技術が可能になった。典型的には、クローニングした物質は、ヒルの組織またはRhnchobdellida目のヒルの分泌液から間接的に由来し、その中でヘメンティンが複製される宿主バクテリアによって発現される。
これまでは、ヘメンティンの短いアミノ酸配列しか知られておらず、独特なオリゴヌクレオチドプローブの構築と複製を可能にするには不十分であった。前方唾腺からのヘメンティンのＮ末端における最初の１０このアミノ酸についての配列は、以下の如く報告されている。（Swadesh, J.K., Huang, T.Y.とBudzynski, A.Z.1990.“Haementeria ghilianiiからのフィブリン溶解性プロテアーゼ、ヘメンティンの精製と特徴づけ：J. Chromatography５０２；３５９−３６９）：
0003878668.tif 000002
本発明者らは、現在さらにそれによってヘメンティンの複製が可能になるヘメンティンのアミノ酸配列を解明した。
本発明者らは、前方唾腺または後方唾腺から単離されたヘメンティンのＮ−末端配列をそれぞれ次の通り決定した。
0003878668.tif 000003
本発明者らは、前方唾腺ヘメンティンの内部アミノ酸配列についても、次の通りであることを解明した。
0003878668.tif 000004
この配列の２−６位置と８−９の位置（星印で示されている）のこの配列の部分は、Swadeshら（１１９０，Ｊ．Chromatography５０２：pp.３５９−３６９）によって報告され、ヘメンティン精製における混在ペプチドと称された配列に相当する。その配列は、glu-val-try-thr-asn-tyr-ala-ser-phe-leu-である。本発明者らの配列は、混在ペプチドに相当しないであろう。この配列は、ヘメンティン分子内のasn-glyの酸加水分解から生じる可能性がある。
上記アミノ酸配列のいずれをコードするＤＮＡ配列も、標準的技術によって外挿されるか決定されることができる。したがって、本発明は、上記の新しいアミノ酸配列についてのいずれをコードするＤＮＡ塩基配列も含む。
ヘメンティンを含む組成物は、切除した唾腺（典型的にはHaementeria ghilianiiまたはHaementeria officinalis、もしくは、他の関連種のようなRhynchobdellida目のヒルから）を、適切な水溶性溶媒中でホモジナイズし、そして、一連のクロマトグラフィー操作を駆使して、活性成分を精製することによって得ることができる。
したがって、本発明によってあらかじめ生成された血小板凝集物を溶解することができる物質を単離する方法が提供されている。その方法には以下が含まれる。すなわち、
(a）  出発物質が、ヒルの組織である場合では、Rhynchobdellida目のヒルの唾腺を含む組織をホモジナイズし、
(b）  段階(a）のホモジネート、またはHepes緩衝液中のRhynchobdellida、またはバクテリア源から発現されたクローニングしたヘメンティンのイオン交換クロマトグラフィーによる精製、そして、
(c）  段階(b）の溶出液に安定剤を添加すること。
したがって、示したように、ヘメンティンが発現された微生物からクローニングした化学的に同一なヘメンティンを単離するためには、ヒルの組織や分泌物からのヘメンティンの単離に用いられる方法と同様な方法が用いられるであろう。
好ましくは、段階(b）における溶出液として、食塩緩衝液が使用される。段階(c）における安定剤は、精製ヘメンティンが、凍結乾燥、凍結、または解凍の際に活性を失うことを防ぐためのものである。このような安定剤の例は、ウシ血清アルブミンである。
典型的には、本発明の方法は、阻害因子Ｘａが目的物に混入するのを除くために、ヘパリンセファロースカラムの使用を、そして目的物の純度を向上させるために、ゲル濾過クロマトグラフィーの使用を含む。
したがって、本発明によって、本発明の詳細な説明においてこれまでに記述した単離法によって得られる産物が提供される。該産物は、動物の患者（ヒトの患者のような）に治療的有効量で投与した場合、選択的に血小板凝集物を溶解、すなわち、脱凝集することができる。好ましくは、産物はヘメンティンを含み、これは、典型的には事実上純粋なヘメンティンである。
小規模なヘメンティンの単離と精製の操作手順は、これまでに記述されている。（Swadesh, J.K., Huang,I.Y.とBudzynski, A.Z.１９９０。ヒル、Haementeria ghilianiiからのフィブリノーゲン溶解プロテアーゼの精製と特徴ずけ：J. Chromatography５０２：３５９−３６９）。しかし、この方法は、強アニオン交換過程と重炭酸アンモニウムを使用しており、以下の理由から、大規模用、または医薬用ヘメンティンに適用することはできない。すなわち、
(1）  塩化カルシウムの存在下の重炭酸アンモニウム緩衝液は、凍結乾燥時に不溶沈澱物を生じ、これは、恐らく炭酸カルシウムであろう。
(2）  精製したヘメンティンは、凍結、解凍および凍結乾燥時に、その活性の大部分を失う。
(3）  本操作の結果、ヒル、Haementeria ghilianiiの唾腺中に存在することが知られている（Blankenshipら、１９９０；Biochem. Biophys.Res. Comm.１６６：１３８４−１３８９）凝固因子Ｘａの検知しうる量が混入した産物を生じ得る。
本発明による方法で使用されるヘメンティンを含む組成物は、さらに、抗凝固作用とフィブリン溶解活性を有し、（血小板凝集物に対する活性と相俟って）血液凝固の１つ以上の過程について、相加的または相乗的に作用する。ヘメンティンを含む組成物は、単独または他の抗凝固剤、すなわち、血栓溶解剤、または抗血小板凝集剤と併用しても、血栓症の予防、または治療的処置に、本発明にしたがって用いることができる。
血小板凝集のための必須条件は、フィブリノーゲンが活性化された血小板上のＧｐIIｂ−IIIａ受容体に対して結合することである。コラーゲン、トロンビンおよびＡＤＰのような生理学的作用剤による活性化の結果、血小板上のフィブリノーゲンに対する結合部位の露出を起し、活性化血小板上のＤｐIIｂ−IIIａの受容体に結合したフィブリノーゲンのＡａ鎖を通じて、血小板の架橋結合を生ずる。
本発明者らは、ヘメンティンを含む組成物は、この過程に対して効果を有し、血小板凝集を防ぐばかりか血小板の脱凝集を起すことを見出した。
本発明者らは、ヘメンティンを含む組成物を使用して、ＡＤＰで誘発した血小板凝集物の広範な脱凝集を起させることができた。ＡＤＰを使用して、広範な脱凝集が起ったが、コラーゲンなどの他の誘発剤の高濃度を試みたとき、効果はやや劣った。これは、これらの他の誘発剤が使用されるとき、フィブリノーゲンを利用する結合以外の型の血小板結合が生ずるからであると考えられる。
ヘメンティンを含む組成物が、血小板を選択的に脱凝集させる能力は、ＴＰＡやストレプトキナーゼのようなプラスミノーゲンアクティベーターにはない特性である。これによりヘメンティンを含む組成物に、このようなプラスミノーゲンアクティベーターに対して応答しない血小板に富んだ血栓に対する選択性を有する点で、利点が与えられる可能性がある。したがって、血栓は、経過時間や組成が種々異なる複雑な多元成分構造なので、抗血小板治療は、重要な治療戦略となるものと思われる。ヘメンティンの血小板志向作用様式の確認は、血栓性疾患の治療に対する手立てを提供する重要な進歩である。
それゆえ、さらに本発明の一部分によれば、血小板凝集の治療的脱凝集、および任意的に、また血小板凝集の阻害または防御のための薬剤の製造において使用するためのヘメンティンを含む組成物が提供されている。
また、血小板凝集物の治療は、脱凝集、および任意的に、また血小板凝集の阻害、または防御のための薬剤の製造において使用するための該血小板凝集物中に存在するフィブリノーゲン結合のＤとＥドメイン間の選択的開裂を行うことができる物質を含む組成物も提供されている。
本発明は、ＴＰＡのような凝血塊溶解のためのプラスミノーゲンアクティベーターとして併用して、患者に投与するためのヘメンティンを含む組成物の使用をさらに含んでいる。このような投与は、血小板凝集物の阻害剤をさらに要しないと思われる。
本発明は、さらに、ヘメンティンを含む組成物を、ヒルディンや他のヒル由来抗凝固剤（我々の前回のＰＣＴ特許明細書ＷＯ９０／０５１４３において開示されたもののような）と併用することを含む。
したがって、本発明は、さらにヘメンティンを含む血小板凝集物の治療のための医薬製剤を含む。本製剤には、ヘメンティン、不活性担体またはそのための賦形剤、および、任意に、１つ以上のヒル由来抗凝固剤のような活性物質が含まれる。このような抗凝固剤は、アンチトロンビンであることが望ましく、典型的には、ヒルジン、ヒルジン類似体、もしくはＸａ因子である。
担体および賦形剤は、製剤が静脈投与できるようなものであることが望ましい。適切な担体の１例は、滅菌食塩水である。典型的には、患者に投与されるとき、ヘメンティン濃度が２０−１００Ｕ／ml血液になるだけのヘメンティンを含む。
本発明者らは、ヘメンティンを含む組成物は、単独で、または同様な標的に向けられる他の薬物との併用で効果を示す４つの抗凝固と抗血栓特性をもっていることを確立した。これらの特性は、以下の如く要約できる。すなわち、
1.  抗凝固剤−血液が凝固することを阻害する能力（精製されたヘメンティンの場合には、凝固に利用できるフィブリノーゲンを涸渇されるフィブリノーゲン溶解活性の結果であると考えられる）。
2.  フィブリン溶解性の−フィブリン凝固物を溶解する能力
3.  血小板凝集物の阻害剤−多数の作用薬によって、フィブリノーゲンに対する作用を経て開始される凝集を防ぐ能力
4.  血小板脱凝集−すでに形成された血小板凝集物を、選択的に脱凝集する独特な驚くべき能力である。
本発明を、これから以下の例をあげてさらに詳細に記述する。これらの例において引用される粗ヘメンティンとは、約１００（典型的には２５−１００）Ｕ／mg蛋白質の活性をもつ粗成物のことであり、精製ヘメンティンとは、１０００Ｕ／mg蛋白質を超える活性をもつ組成物のことである。
ヘメンティンの単位活性は、３７℃において、毎分トロンビンによって凝固できないようにされるmlあたりのフィブリノーゲンのμg数として定義されている。
本発明はまた、このヘメンティン活性を検知し、測定するための、新しい、より感度の高い検定法を提供する。本発明者らは、ヘメンティンは、塩依存性が極めて強く、その結果、活性は反応緩衝液中での塩化ナトリウムの生理的に近い濃度で測定しなければならないことを発見した。本発明者らの反応条件は、５０mM  Hepes，１０mM  CaCl2，０．１５mM NaCl，０．１％Brij３５，pH７．５であった。対照的に、Swadeshらによる上述の論文では、検定、緩衝液は、１５０mM Hepes，pH７．９および１０mM CaCl2であった。その上、本発明者らは、ＨＤＬＣによって検出されるフィブリノーゲン分解産物の分析に基く感度の高い検定法も提供している。
さらに、例をあげて、ヘメンティンについての単離精製技術、続いてその物理化学的性質の特徴づけが示される。
例１
前方唾腺からのヘメンティンの精製
１１７頭の飢餓状態のサードフェッドHaementeria ghilianiiの前方唾腺を手で切除し、ドライアイス上で解凍した。唾腺は、ドライアイス中で細い粉末に砕き、２０mM  Hepes，１０mM  CaCl2，pH７．５中でホモジナイズし、凍結した。ホモジネートを遠心分離し（1000×ｇ）、不溶細胞片を除き、次に、さらに遠心分離（１００００×ｇ）して濾過した（０．４５μフィルター）。この物質は、精製のための出発点とし、ステージＩ物質と称した。
ヘメンティンは、次に、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ステージＩ物質を、上記Hepes緩衝液中１０mlとし、１−２mlを１度にＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（１×５cm；Waters-Millipore）に加えた。線形食塩グレーディエントを使用し、活性は８０−１５０mM  NaClの間で溶出した。
集めた活性分画の凍結乾燥または凍結を行う前に、１mg／mlのウシ血清アルブミンを加えた（‘Cohn Fraction５’，Sigma）。典型的な精製結果は、以下の如くである。
0003878668.tif 000005
例２
前方唾腺物質のゲル濾過による精製
陰イオン交換後の物質（ステージII）を例１に記述したように集めた。集めた分画を、分子ふるいカラム(Superdex ２００；Pharmacia)に２０mM Hepes，１０mM CaCl2，pH７．５を含む緩衝液を使用してかけた。活性を含む分画を集めた。凍結または凍結乾燥する前に、この集めた分画に、１mg／mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた。次に、凍結乾燥し、ステージIII物質と称した。典型的な精製の結果は、以下の通りである。
0003878668.tif 000006
例３
後方唾腺からのヘメンティンの精製
１１８頭のハングリーフェッドHaementeria ghilianiiの後方唾腺を手で切除し、ドライアイス上で凍結した。ステージＩ物質とステージII物質（イオン交換クロマトグラフィー後）は、例１における如く調製した。イオン交換カラムからのステージII物質の溶出中に、活性を含む分画の部分量を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分析した（図２挿入図）活性分画を含し、凍結または凍結乾燥を行う前に、１mg／mlのＢＳＡを加えた。
典型的な精製の結果は、以下の如くであった。
0003878668.tif 000007
例４
前方唾腺ヘメンティンのＨＰＬＣによる精製
５５頭のスターヴド  サードフェッドHaementeria ghilianiiの前方唾腺を手で切除し、ドライアイス上で凍結した。唾腺は酸で洗った砂を用いて、１０mlの２０mM  Hepes，１０mM  CaCl2，pH７．５中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し（１０，０００×ｇ）、上清を０．４３μのフィルターを通して濾過した。これを陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−５ｐ，Waters）上にのせ、食塩グレーディエントを用いて溶出した。分画を集め、活性と蛋白質（２８０mM）について検定した。活性は、分画２１−２５と分画２９／３０中に見出された。分画２１と２３−２５を合し、逆相疏水的相互作用クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、さらに精製するのに用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、活性を含む分画について行った。陰イオン交換クロマトグラフィーからの、集めた活性分画を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中ＲＦ−ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８，Waters）に適用し、７０％水溶性アセトニトリルと０．１％ＴＦＡのグレーディエントで溶出した（図３）。分画を集め分画５３−５５に活性が含まれていることが見出され、それらを凍結乾燥した。蛋白質含量は約４０μgであった。還元条件下での産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ヘメンティンの分子量に相当する約８０，０００の分子量が与えられた。フィブリノーゲンに対する活性は、ヘメンティンを含む分画と、インキュベーションした後、フィブリノーゲンの断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて検出した。
例５
ヘメンティンの等電点電気泳動
蛋白質の精密な等電点（pI）についての知識は、精製のための条件を最大限にする上で役に立つ。ヘメンティンについてのこの特性を決定するために、以下の実験を行った。図２に示したように、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた後の活性分画を、さらに、０．２Ｍ  NaCl，１０mM  CaCl2および０．１％Tween ８０を含む２０mM  Hepes緩衝液pH７．５中で、あらかじめ平衡させたSuperose１２ゲル濾過カラム上のＦＰＬＣによって、さらに精製した。試料２００μlをカラムにのせ、上記の緩衝液で０．４ml／分の流速で溶出した。溶出液を、分画として集め、その吸光度を２８０nmでモニターした。２つの主要なピークが、それぞれ約３０分と４０分において溶出した。フィブリノーゲン分解検定（下記例１２に記述したように）に基いて、ヘメンティンのピークは、約３０分後に溶出するものと決定された。
このピークは、濃縮され、Sephadex  Ｇ−２５上で脱塩された。さらに濃縮した後、試料の一部をPharmacia Phast Systemを用いて、Phast Gel３−９上で、その等電点（pI）につき分析した。試料は、ゲルの中央に適用した。Coomassie Blueで染色した後、およそのpI６．２５±０．１の１つの主要バンドがヘメンティンに相当すると考えられた。微量の複数の不純物も、ゲル上pI値４．６より低値に可視化されてみられた。染色の強度に基いて、これらの不純物は、５％未満に相当するものと推定された。したがって、ヘメンティンのpIは、約６．２５±０．１である。
例６
フィブリノーゲン溶液検定
極めて限られた量の物質が関与している活性のピークを知るためには、フィブリノーゲン分解についての、以下の新しく、迅速で簡便な高感度の検定法を開発することが必要であった。検定は、酵素または精製カラム分画を、フィブリノーゲンと共にインキュベートして後、ＨＰＬＣ（ＲＰ３００−Ｃ８）上で、フィブリノーゲン分解産物を急速に分析することによる。ステージIIの酵素（５０μｌ）、またはカラム分画を、５０μｌの５０nM Hepes緩衝液、pH７．５、２mM CaCl2、５０μｌの０．１５mM NaClと５０μｌのフィブリノーゲン（５mg／ml）とともにReacti−Vial中でインキュベートした。この混合物のうち、２０μｌを３０μｌの２０mM Hepes緩衝液で希釈し、全容量を直ちにＲＰ３０−ＣＢカラムを備えたＡＢＩ  １３０Ａ分析クロマトグラフに注入し、０時間のクロマトグラムを作製した。反応混合物を、０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）と０．１％ＴＦＡの８０％アセトニトリル水溶液（溶媒Ｂ）との間のグレーディエントで溶出した。カラムは、３５％Ｂで平衡させ、その後５分間で４５％Ｂまで上昇させ、そして、２０分間かけて５０−５５％Ｂのグレーディエントを行った。バイアルの残りは、３０分間のような望ましい期間、３７℃でインキュベートした。この期間は、フィブリノーゲン分解産物の存在によるＨＰＬＣ溶出プロファイルの変化の形から、活性を検出するのに十分であった（図４）。フィブリノーゲン単独では、５２％溶媒Ｂにおいて、単一ピークとしてＨＰＬＣカラムから溶出した。３７℃でヘメンティンと３０分間インキュベートした後、フィブリノーゲンピークは、より早い溶出ピーク（５０％Ｂ）と、もとのフィブリノーゲンより遅く（５３％Ｂ）現れるピークに変換されていた（９０％）。
不活性物質は、２４時間も経っても溶出パターンを変化させなかった。
例７
ＨＰＬＣによる前グランド（gland)ヘメンチンの精製
例１で述べたようなステージII物質をＲＰ３００（ＣＳ）カラム上でＨＰＬＣにより精製した。溶媒Ａは、水中０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂは、０．１％ＴＦＡ、８０％水性アセトニトリルであった。グラジェントは３０分で２５から６０％溶媒Ｂであった。溶出により、物質は、溶出プロフィール（図５Ａ）に示すように７つのフラクションに分離した。このアッセイ条件下、実施例６で述べたセンシティブアッセイにより決定されるように、フラクション６及び７は活性を示したが、他の全てのフラクションは不活性であった。フラクション６が大きな活性を含んでいた。
例８
前グランドヘメンチンのアミノ酸組成
２４時間ベーパー相HCl加水分解及びフェニルイソソルシオシアナート（ＰＩＴＣ）の後、アミノ酸分析を実施した。
例７で述べたように製造したプールしたピーク６（図５Ｂではピーク１により示される）をWaters８４０アミノ酸分析システム(Picotag）にかけた。アルチプルリグレッション分析により、Black及びHognessのコンピュータープログラムで計算して、全てのアミノ酸値としてベストフィットファクターとして最小分子量８３，０００を得た。前グランドヘメンチンのアミノ酸組成は次のとおり決定された：
0003878668.tif 000008
例９
前グランドへメンチンのＮ−末端アミノ酸配列
アミノ酸配列分析用プレパレーションで、例７で製造した、ピーク６ヘメンチンをジクロロジメチルシラン処理ガラスチューブに、マニュアル的に収集した。グラジェントを１００マイクロリッター／分で行ない、ピーク６を１チューブ当り２００マイクロリッター以下で収集した。プールしたピーク６ヘメンチンを直ちに１００マイクロリッター以下に濃縮し、２０マイクロリッター部分で、Applied Biosystems４７７Ａパルス液相蛋白シーケンサーのポリブレーン処理膜に移した。配列分析のため、フラクションをHepesバッファーなしに収集した。Ｎ−末端配列を以下のとおり決定した：
0003878668.tif 000009
例１０
前グランドヘメンチンのインターナルアミノ酸配列
例７により製造した、プールしたピーク６ヘメンチンにより、トリフルオロ酢酸加水分解により以下の配列を有するペプチドフラグメントを得た：
0003878668.tif 000010
ポジション２−６及び８−９（星印で示す）それぞれでの配列部分は、Swadesh等により報告された配列（１９９０，J. Chromatograply５０２：pp.３５９−３６９）により報告された配列に対応し、ヘメンチン精製でのコンタミペプチドを示す。彼らの配列は：
glu-val-tyr-thr-asn-tyr-ala-ser-phe-leu-
我々の配列は、コンタミ  ペプチドに対応せず、ヘメンチン分子内のasn-gly結合の酸ヒドロリシスから得られた結果に対応する。
例１１
後グランドヘメンチンのアミノ酸配列
例３で述べた、後グランドから製造したステージIIヘメンチンを、実施例７で述べたようにＨＰＬＣにより精製した。この蛋白プロフィールは、前グラントステージIIヘメンチンのものと、３つの大きなピークをもっている点（図６）違っていた。活性はピーク３で見られた。活性ピーク（ピーク３）に対応するプールフラクションをパルス液相蛋白シーケンサーApplied Biosystems４７７Ａにかけた。Ｎ−末端配列を次のとおり決定した：
0003878668.tif 000011
例１２
抗−コアグラント効果
クルードヘメンチンによる３０U／ml（単位／ml）でのプラズマ抗−コアグラント率をマンチェスター試薬(Thrombosis Research Foundation,ストックポール、英国)を用いたプロトロンビン時間（ＰＴ）；カオリン／ベル及びアルトン  プレートレッドサブスチチュート（Diagnostic Reagents, Jhame, 英国）による活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）；ウシトロンビン(Baxter Healthcare, Newbury, Berks）によるトロンビン  クロッチング時間（ＴＣＴ）及びアトロキシン  クロッチング時間−ボスロプス(Bothrops)アトロックス(atrox）毒(Sigma）の０．５mg／ml濃度で使用される精製抽出物を測定することによりフォローした。ＰＴ，ＴＣＴ及びＡＰＴＴをクエン酸塩化プラズマ中で測定した。
クルードヘメンチンでのこの研究の結果は次のとおりであった：
0003878668.tif 000012
プラズマの凝固性に対するクルードヘメンチンの迅速な効果を示している。
精製ヘメンチンのクエン酸塩化プラズマの凝固に対する７０U／mlでの結果は次のとおりであった。
0003878668.tif 000013
フィブリノーゲンに対する精製ヘメンチンの効果を図７に示す。この図は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し、フィブリノーゲンフラグメントのジェネレーション時間と分子サイズを与えている。フィブリノーゲン（０．５mg／ml）を３７℃で精製ヘメンチン（１６０U／ml）でインキュベートし、アリコートを時間インターバルで採取し、非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。フィブリノーゲンの大フラグメント（１−４）；Marinconicoにより述べられたフラグメント４（ＭＷ２２５Ｋダルトン）；６（ＭＷ１５７Ｋダルトン）；７（ＭＷ＝１３３Ｋダルトン）；及び８（ＭＷ＝１００Ｋダルトン）；に対応が検出された。
例１３
血小板凝集の測定
クルードヘメンチンをHaementeria ghilianiiの前グラントから抽出した。凍結乾燥クルードヘメンチンを血小板研究に使用する前に生理食塩水又は、５０mM Hepes、１０mM CaCl2、０．１％Brij３５、pH７．５のインビトロアッセイ用に再構成した。新鮮な血液サンプルを少くとも２週間治療も受けず、アルコールも飲まない５人の健常人ボランティアの肘前静脈から静脈注射により採取した。各ボランティアからの対のサンプルを２つの別の抗凝固剤−１：９v/v ０．１０５Ｍクエン酸ナトリウム又はヘパリン（急速な血小板クランピングを来たさない濃度−２０IU/ml血液で）を含むシリコーン容器中に入れた。サンプルを２００ｇ１０分間遠心し、血小板リッチプラズマ（ＰＲＰ）９を採取して２５０−３５０×１０／リットルの血小板を含むものを作った。必要であれば、ＰＲＰをオートロガスな血小板プアプラズマ（ＰＰＰ）により稀釈する。全てのテストを静脈切開前の第２の時間中に行なった。血小板凝集及び脱凝集(deaggregation）研究を４チャンネル  アグレゴメーター中で３７℃で行なった。酸可溶タイプＩコラーゲン(Chronolog Corp., Havertown, PA）, ADP（Sigma chemical Co., Poole, Dorset)及びクエン酸塩化サンプルの場合には−ウシトロンビン（Baxter Healthcare Ltd., Newbury, Berks)を血小板凝集を誘導するのに使用した。インデューサー添加前のヘメンチンによる事前インキュベート（５分）ＰＲＰ（稀釈１：９）の効果を決定した。精製ヘメンチンによる血小板脱凝集を凝集の閾値レベルに到達する時にＰＲＰ／インデューサー混合物へのその添加に基づいて決定した。精製ヘメンチンの代りに生理ホスフェートバッファー食塩水を用いた適当なコントロールを各インデューサーで行なった。
ヘメンチンにより事前インキュベートされたＰＲＰでの血小板凝集
精製ヘメンチンにより事前インキュベートされたＰＲＰ中のトロンビンによるフィブリノーゲンコアグラビリチィーの低下は、クエン酸塩化、ヒルジン化(hirudinised)及びヘパリン化(heparinised）血液の両方で血小板凝集反応の重大な低下に関連している。典型的な反応、これは５人のボランティア全員で似ていたが、を図８に示す。
例１４
ヘメンチンによる血小板脱凝集
アグレゲートした血小板を含むプラズマへのヘメンチンの添加から得られる血小板脱凝集を図９に示す。正常ヒトＰＲＰの血小板を活性化し、誘導してＡＤＰ、コラーゲン又はトロンビンアゴニストの作用により凝集させた。ヘメンチンをこれらのアグレゲートに添加し、時間コースと効果の程度を血小板アグレゴメーター中でフォローした（図９）。クエン酸塩化又はヒルジン化プラズマにおいて、１から５UM投与量のＡＤＰは特徴的な（クエン酸塩化プラズマの場合に２相）血小板凝集カーブを誘導し、そしてこれは少くとも１０分間維持された。クエン酸塩化（図９ａ）又はヒルジン化（図９ｂ）ＡＤＰ−誘導血小板アグレゲートへのヒメンチン（１０から１００U/ml濃度）の添加は、血小板の急速で非可逆的脱凝集を生じた（図９ａ，ｂ）。ヘパリン化プラズマでは、類似の脱凝集の観察がみられた（データ示さず）。ヘメンチンにより脱凝集された血小板プレパレーションは、凝集しなかったコントロールと比較してサイズ分布に変化は無かった。
ヒルジン化ＰＲＰで、ひとたびヘメンチンによる脱凝集がなされたら、ＡＤＰ（１０μＭ）又はコラーゲン（５μｇ／ml）のいずれかを更に添加しても再凝集は、有意には誘導されなかった（図９ｂ）。これは、おそらくプラズマ内でのフィブリノーゲンの枯渇(depletion）及び／又は血小板機能を十分に回復させるのに必要な時間によるためであろう。
クエン酸塩化；ヒルジン化又はヘパリン化ＰＲＰ、において、コラーゲン（２μｇ／ml）は、特徴的な凝集反応を誘導した。しかしながら、ヘメンチン（１０−１００U／ml）；ＡＤＰ誘導化血小板凝集（１から５UM）に有効な投与範囲で、脱凝集（図９ｃ）をインビトロで起こさなかった。より高いヘメンチンの投与量は、インビボでコラーゲン関連血小板凝集を脱凝集した。
クエン酸塩化プラズマにおいて、０．２ug／mlの投与量のトロンビンは、ＰＲＰ中のトランジェント凝集反応を誘導した。より高いアゴニスト濃度１ug／mlで、ひき続いてクロッチングを伴なう完全な凝集反応を得た。ヘメンチンは、．０．２ug／mlの次最適トロンビン投与量をフォローする血小板アグレゲートの瞬時の脱凝集を有意に加速したが、コントロールでのクロット形成を完全に防止したにも拘らず、２ug／ml以上のトロンビン投与により凝集した血小板を脱凝集しなかった（データ示さず）。クエン酸塩化プラズマ中の脱凝集に対するヘメンチンの部分的効果はクエン酸塩によるヘメンチンのいくつかの阻害によるものかもしれない。
例１５
血小板凝集に対するＴＰＡの効果
ヘメンチンの血小板脱凝集に対する効果をもう一つのトロンボリチック剤の効果と比較して、我々は、同一のＰＲＰでの対比で、１０４IU／ml（プラズマクロットを２分内に溶解するのに十分）までの投与量で、ＴＰＡはクエン酸塩化ＰＲＰで血小板を脱凝集させなかったことを見出した。ヒト血小板を誘導し、ＡＤＰ（１から５uM）をアゴニストとして用いて凝集させ、そしてＴＰＡ（１０４IU/ml）又はヘメンチン（２０から７０u／ml）を添加し、脱凝集の経路を血小板アグレゴメーター中でフォローした。これにより、ヘメンチンはＴＰＡとは異なる作用機構を有しており、ヘメンチンは、トロンビ含有血小板及び他の血小板アグレゲートの溶解を助ける、別の抗血小板活性を有していることが明らかになった。
例１６
全血中のヘメンチン活性の強化
ヘメンチンは、血液の天然由来阻害剤であるコアグレーションプロテアーゼによって阻害されないことが知られている（米国特許４３９０６３０）。我々は、精製ヘメンチンの活性が全血において非常に強化されるという更に重大な発見をした。この知見は、驚くべきものであり、ＰＡ−１（プラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター１）により阻害されると良く知られているＴＰＡの作用に際立って対象的である。ＰＡ−１は心筋梗塞の生存者のプラズマの低いフィブリン溶解能（fibrinolytic capacity）の原因として見られてきた(Madison, E. E.等、１９８９，Nature  ３３９：７２１〜７２４）。
説明のために、以下の実験を行ない、全血、プラズマ（同一の個体から）及びバッファー中のフィブリノーゲン中の精製ヘメンチンの相対活性を決定した。ヒト全血を静脈注射により採取し、１：９v/v０．１２０５Ｍクエン酸ナトリウムで抗凝固化した。血液のアリコートを３０００rpmで１０分間室温で遠心してＰＲＰを得るために使用した。精製ウシフィブリノーゲンに使用する反応バッファーは：２０mM Hepes、１０mM CaCl2、０．２M NaCl、０．１％Brij３５、pH７．５であった。血液及びプラズマサンプルをフィブリノーゲン濃度（通常２．５から４mg／mlの範囲）をアッセイし、フィブリノーゲンの濃度をフィブリノーゲン／バッファー実験と比較するよう調節した。
クエン酸塩化ヒト血液、プラズマ及びフィブリノーゲン（比較血液／プラズマレベルに調節）を３７℃で、精製ヘメンチン（最終濃度１０単位／ml）とインキュベートした。
ヘメンチンプレパレーションを、不純プレパレーションにコンタミするとされているファクターXaの阻害剤が実質的に存在しないように注意した。アリコートを時間インターバルで除去し、２．５NIH単位ウシトロンビンと混合し、そしてクロッチング時間を記録した。
平行して行なった実験で、ヘビフィブリノーゲン溶解酵素アトロキシンを同じ時間インターバルでアリコートに添加して、フィブリノーゲンの完全性(integrity）を試験した（即ち、もしフィブリノーゲンが以前にヘメンチンにより作用されるなら、アトロキシンはクロットをもたらさないであろう）。結果は、次のとおりである（ＴＴ＝トロンビンクロッチング時間、Ａ＝アトロキシンクロッチング時間）：
0003878668.tif 000014
血小板リッチプラズマに関して同様の結果が得られた（全血の遠心は、約２００×ｇ  １０分間）。
例１７
ヘメンチンによる脱凝集とフィブリノーゲン溶解率
凍結乾燥ヘメンチンを、血小板研究用には使用前に生理食塩水で、又はインビトロアッセイ用には２０mM  Hepes、１０mM CaCl2、０．２M NaCl、０．１％ Briji３５、pH７．５で再構成した。血小板凝集の測定のため、ＰＲＰを、少くとも２週間医療を受けずアルコールも飲まないボランティアのクエン酸塩化静脈血から調製した（３００±５０×１０9血小板／リットル）。血小板凝集研究を３７℃で４チャンネルアグレゴメーター(Aggregocorder PA3210, Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd.日本）中で行なった。
血小板リッチプラズマを３７℃で精製ヘメンチン（１０単位／ml）でプレインキュベートし、そしてＡＤＰ（２．５um）を血小板凝集性を決定するために、５、１０及び２０分に添加した（結果を図１１ａに示す）。(a）と同じＰＲＰをＡＤＰ（２．５um）で凝集させ、そしてヘメンチン（１０単位／ml）をピーク凝集が得られた後添加した（結果を図１１ｂに示す）。十分なＡＤＰが添加されて誘導し、そして全期間にわたって十分な凝集を維持することを確認するためにコントロールを実施した。
ＰＲＰを３７℃でヘメンチン（１０単位／ml）とインキュベートした時、トロンビンとの凝集性が１０分後に失なわれた。同じＰＲＰプレパレーションのＡＤＰ−凝集をヘメンチン（１０単位／ml）の添加後の各時点でテストした時、凝集能は１０分後失なわれた。これに対して、あらかじめ形成された血小板アグレゲート（２．５uM  ＡＤＰで誘導）上の精製ヒメンチン（１０単位／ml）により誘導された脱凝集の時間コースはヒメンチンの添加後３分で実質的に完全となる脱凝集を有して非常に急速であった。結果を図１１に示す。この血小板に対するヒメンチンの作用は凝集パラメーター上のどのような有意の効果が測定される前に完全であった。ヒメンチンの無いコントロールインキュベーションは完全に凝集したままであった。
これらの結果は、ヒメンチンが、プラズマを凝集させうるよりもすばやく血小板−フィブリノーゲン−血小板クロスリンクを切断することができることを示唆している。これは、フィブリノーゲンのカルボキシル末端に優勢であり、GpIIb-IIIaレセプターに結合するのに関係するかもしれないプラスミン開裂サイトよりは、ヒメンチンへのより大きな分子接近性(accessibility）を許すかもしれないフィブリノーゲンのＤ及びＥドメインの間の独自の開裂サイトによるかもしれない。結極、ヘメンチンは、フリーのフィブリノーゲンに対してよりも血小板に結合したフィブリノーゲンへより選択的であろう。血小板凝集は、血小板リッチトロンビ、これはプラスミノーゲンアクチベーターに基づく現在のトロンボリチック剤には手に負えない、のバルクを構成するので、したがって、ヘメンチンは、トロンボリシスを起こす血小板リッチクロットの内で、血小板の脱凝集剤として医療的潜在性を有している。
例１８
他のフィブリノーゲン−媒介血液学的パラメーターに対するヘメンチンの効果
その特異的なフィブリノーゲン溶解作用のために、精製ヘメンチンは、トロンビンクロッチング時間、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）のような血液学的パラメーターに対するフィブリノーゲンの貢献を決定するのに使用できる。同様な方法で、ヘメンチンはミエローマ、リューマチ性関節炎のようなある種の血液学的疾病に対する診断マーカーであるエリストロサイトセディメンテーション率（ＥＳＲ）へのフィブリノーゲン貢献を決定するのに使用しうる。
図１２に要約したように、実験を次のとおり行なった。ボランティア（円）からのクエン酸塩化全血を１時間２５℃（白円）で、そして精製ヘメンチン（１０単位／ml）なしで（黒円）でインキュベートし、ＥＳＲを決定した。クロッチングパラメーターをＰＴ＝９５秒、ＡＰＴＴ＝３４０秒、ＴＣＴ＝９９秒；アトロキシン＝１４６秒で決定した。結果は、正常血液でのクロッチングパラメーターでの著しい延長にも拘らず、ＥＳＲに対してほとんど効果を示さなかった。
肺エンボリズム（四角）の患者からのクエン酸塩化全血を１ｈ２５℃で３５単位／mlのヘメンチン（白四角）と精製ヘメンチンなし（黒四角）でインキュベートして、ＥＳＲを決定した。結果は、正常値に対して、この患者のＥＳＲは非常に加速されたことを示す。ヘメンチンとのインキュベーションは、この効果をよりゆっくりしたＥＳＲに導いて部分的に逆行することができた。
上記の例において、ヘメンチンは、肺エンボリズムの患者に見られた加速されたＥＳＲがヘメンチンの作用が減少したＥＳＲに導くようなエリスロサイトのフィブリノーゲンとの干渉に幾分よるものであることを示唆して、ＥＳＲに対する著しい定量化しうる効果を示した。したがって、ヘメンチンは個々の患者におけるエリスロサイト／フィブリノーゲンの比率の診断的なインデックスとして使用できる。更に、ヘメンチンは異常ＥＳＲの原因ファクターをアドレスする治療剤として適切であることを示して、ＥＳＲを正常レベルに戻した。
最後に、増加したフィブリノーゲンが血液粘度に影響を与える場合に、ヘメンチンは粘度を低げるのに治療的に使用しうる。プラズマでの増大したフィブリノーゲンレベルは、感染、第３トリメスターフレグナンシー、凝固異常、肝疾患、術後及び加齢を含むある種の疾病状態において急性的に又は慢性的に上昇しうる。上昇したフィブリノーゲンレベルを低下させることは、クロッチングのリスクを低下させるのにつながる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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