(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスを有機溶媒中で抽出して得られるアポトーシス誘導物質を含有する、ヒト胃癌細胞に対するアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスから抽出されたアポトーシス誘導物質及びその製法に関し、梅の果肉、梅肉や梅肉エキスを原料として得られる癌予防剤及び治療剤として有用な物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、癌は死亡原因のトップの病気であり、その予防や治療に対する人々の関心は非常に高い。また、日常的に取り入れることができる癌予防及び治療のための方法が数多く提案されている。
【０００３】
近年、癌研究の分野ではアポトーシス、すなわち細胞自滅に関する研究が盛んに行なわれている。アポトーシスは生物個体発生における組織、臓器の形成、生体の恒常性の維持と防衛に重要な働きをするだけではなく、多くの病気の発生に深い関係があることが解明されつつある。
【０００４】
アポトーシスによる細胞の制御作用の異常は、癌形成の一つの原因であると考えられている。本来死滅すべき細胞がアポトーシス、つまり細胞自滅を起こすことなく生き残ると、その細胞が様々な刺激を受けて染色体に変異を重ね、最終的に癌細胞になるとされている。癌細胞は、アポトーシス機構への耐性を得て初めて増殖が可能となる。すなわち、癌はアポトーシス機構が衰退したために生じる病気である。このことから、種々の遺伝子変異を伴う細胞の癌化の過程はアポトーシスに対する耐性能獲得の過程に関係がある。
【０００５】
アポトーシスが正常に機能するためには、アポトーシス誘導を刺激する要因が必要である。この要因により、最終的に細胞死滅の実行過程を活性化し、アポトーシスが起きるとされている。
【０００６】
多くの抗癌剤が癌細胞のアポトーシス誘導刺激となる要因であることが知られている。ところが、抗癌剤は使用量や使用期間等を最適に設定することが困難であり、さらにその副作用は癌患者にとって大きな負担となるものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
アポトーシス誘導刺激となる要因の究明は癌の予防と治療に対して非常に重要である。
【０００８】
本発明の目的は、アポトーシス誘導刺激となる物質を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスを有機溶媒中で抽出して得られるアポトーシス誘導物質を提供する。
【００１０】
上記アポトーシス誘導物質は、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスに有機溶媒を加えて撹拌し、これらに含まれる成分を抽出した後、遠心分離して上清を回収し、上清を濃縮することによって得ることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、梅の果肉(生のもの)、梅肉(塩漬け処理等を施したもの)又は梅肉エキス(梅の果肉又は梅肉の熱水抽出物)を有機溶媒中で抽出してアポトーシス誘導物質を得るものであり、アポトーシス誘導物質の作用により、癌細胞の増殖を抑制するものである。
梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスを有機溶媒中で抽出した本発明のアポトーシス誘導物質は、分子量が１０００以下の低分子の脂質・ステロイド画分であると考えられる。
【００１２】
梅の果肉、梅肉又は梅肉エキス中の成分を取り出すために、有機溶媒を用いて抽出を行なう。有機溶媒はクロロホルム、アルコール等の脂溶性のものが好ましく、特にクロロホルム、メタノール、エタノールなどを単独、又はこれらを混合して用いることが望ましい。
【００１３】
本発明のアポトーシス誘導物質の製法について、図１の工程図に沿って説明する。
梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスに有機溶媒を加え(ステップ１)、梅の果肉又は梅肉を粉砕し(梅肉エキスは必要に応じて粉砕する)(ステップ２)、加熱しつつ一定時間撹拌する(ステップ３)。その結果、有機溶媒中に、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスの成分が抽出される。なお、粉砕、加熱及び撹拌は同時に行なってもよい。
続いて、抽出物を含む有機溶媒に遠心分離を施し(ステップ４)、上清を回収する(ステップ５)。次に、得られた上清をエバポレータを用いて減圧濃縮する(ステップステップ６)。なお、濃縮方法はこれに限定されるものではない。
濃縮を行なった後、必要に応じて、溶媒による稀釈(ステップ７)及び濾過滅菌(ステップ８)を行なうことができる。
上記ステップによって、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスの有機溶媒抽出物が得られる(ステップ９)。
【００１４】
得られた梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスの有機溶媒抽出物には、アポトーシス誘導物質が含まれており、この抽出物を摂取することによって、アポトーシスの機能を正常化、活発化させることができる。
アポトーシス誘導物質を含む抽出物は、飲料用に加工して、スポーツドリンクやお茶と同様の感覚で日常的に摂取したり、食品に添加して健康食品等として摂取することができる。また、ビタミン剤等のようにカプセルや錠剤、シロップ状等に加工して摂取することもできる。
【００１５】
【実施例】
梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスから得られたアポトーシス誘導物質の効果を確認するために、以下の実験を行なった。なお、実験には、梅肉又は梅肉エキスを原料として用いた。
【００１６】
(実施例１)
梅肉１０ｇに５０％クロロホルム・メタノール等量混合液を９０ｍｌ加えて室温で５分間ホモジナイズした。次に、５０〜６０℃に温度を保ちながら、５時間撹拌した。得られた溶液を４℃で１０分間、遠心加速度９０００×ｇの条件で遠心分離し、上清を回収した。回収された上清を５０℃で３時間、エバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮物をミリポアフィルター(０.２２μｍ)で濾過滅菌した。
【００１７】
なお、本実施例では有機溶媒として５０％クロロホルム・メタノールの等量混合液を用いているが、梅肉又は梅肉エキス中の成分の抽出には、クロロホルムとメタノールの混合比が２０：８０〜８０：２０のクロロホルム・メタノール混合液を用いることができる。
【００１８】
上記によって得られた梅肉のクロロホルム・メタノール抽出物を用い、これに含まれるアポトーシス誘導物質の作用による癌細胞の増殖抑制作用を調べるために以下の実験１及び実験２を行なった。実験には、ヒト胃癌患者由来の癌細胞であるヒト胃癌細胞(ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞)を用いた。
【００１９】
(実験１)
ヒト胃癌細胞(ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞)を１０％牛血清とペニシリンＧ(５０ＩＵ／ｍｌ)及びストレプトマイシン(５０μｇ／ｍｌ)が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
培養されたヒト胃癌細胞を１ｍｌ当たり４〜５×１０5ｃｅｌｌｓ含む浮遊液に、５０％クロロホルム・メタノール(対照サンプル▲１▼▲２▼)、梅肉の５０％クロロホルム・メタノール抽出物(実験サンプル▲１▼▲２▼)をそれぞれ添加した。なお、実験サンプル▲３▼▲４▼は、梅肉抽出物が夫々ヒト胃癌細胞浮遊液に対して２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
得られたサンプルを、３７℃、９５％空気−５％ＣＯ2中に放置し、３日間培養を行なった。
３日後、各サンプル▲１▼〜▲４▼中のヒト胃癌細胞の数を血球計算板で数え、細胞の増殖抑制率を算出した。結果を図２に示している。
【００２０】
図２を参照すると、梅肉の抽出物を添加した実験サンプル▲３▼▲４▼は何れも、梅肉抽出物を添加していない対照サンプル▲１▼▲２▼に比べて、ヒト胃癌細胞が大きく減少していることがわかる。特に、梅肉抽出物を多く添加した実験サンプル▲４▼は、ヒト胃癌細胞の約７０％を死滅できたことがわかる。一方、対照サンプル▲１▼▲２▼はヒト胃癌細胞の死滅は認められなかった。
以上より、梅肉のクロロホルム・メタノール抽出物中に、ヒト胃癌細胞の増殖を抑制する成分、すなわちアポトーシス誘導物質が含まれていることが確認できる。また、ヒト胃癌細胞へのアポトーシス誘導物質の添加量が多いほど、増殖抑制作用を向上できることがわかる。
【００２１】
(実験２)
ヒト胃癌細胞(ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞)を１ｍｌ当たり４〜５×１０5ｃｅｌｌｓ含む浮遊液に、以下に示す溶媒又は梅肉抽出物を添加し、上記と同じ条件で３日間培養し、サンプル▲１▼〜▲４▼を得た。なお、▲１▼▲２▼は対照サンプル、▲３▼▲４▼は実験サンプルである。
▲１▼５０％クロロホルム・メタノールをヒト胃癌細胞の浮遊液に添加し、１０μｌ／ｍｌとなるように調製。
▲２▼５０％クロロホルム・メタノールをヒト胃癌細胞の浮遊液に添加し、２０μｌ／ｍｌとなるように調製。
▲３▼梅肉クロロホルム・メタノール抽出物をヒト胃癌細胞の浮遊液に加えて、２ｍｇ／ｍｌとなるように調製。
▲４▼梅肉クロロホルム・メタノール抽出物をヒト胃癌細胞の浮遊液に加えて、４ｍｇ／ｍｌとなるように調製。
【００２２】
培養した各サンプルを、遠心分離(遠心加速度３０００×ｇ、５分間)し、上清を除去した後に残った細胞を採集した。この細胞はＰＢＳ(−)で一回洗浄した。得られた細胞ペレットに細胞融解用バッファーを２０μｌ加え、細胞を融解させた。
次に、ＲＮａｓｅ  Ａ溶液を加え、５０℃で２.５時間反応させてからプロテイナーゼＫ液を加え、５０℃で２.５時間反応させ、ＤＮＡ断片を抽出した。
得られたＤＮＡ抽出液１０μｌにゲルローディング液２〜３μｌを混合して、２％アガロースゲル板のウエルに添加し、１００Ｖで電気泳動を行なった。電気泳動後、ゲルを水に浸してから、ＵＶトランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を発するＤＮＡを検出した。検出されたＤＮＡの分布状態を写真撮影し、その写真を模式的に図３に示した。なお、図３で示すＭはＤＮＡ分子量マーカーである。
【００２３】
図３を参照すると、ＤＮＡ分子量マーカーＭと比較した場合、対照サンプル▲１▼▲２▼ではＤＮＡの断片化は認められないが、実験サンプル▲３▼▲４▼は、図中矢印で示すように、ＤＮＡの断片化が認められた。つまり、梅肉の有機溶媒抽出物にアポトーシスを誘導する作用があることが確認された。
【００２４】
(実施例２)
次に、梅肉エキスを原料として実施例２を行なった。原料を梅肉エキスに変えた以外は、実施例１と同様である。得られた梅肉エキスのクロロホルム・メタノール抽出物を用いてヒト胃癌細胞(ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞)の増殖抑制作用を調べるために、以下の実験３及び実験４を行なった。
【００２５】
(実験３)
実験１と同様の方法で行なった。実験に用いた対照サンプル▲１▼▲２▼は実験１と同じであり、実験サンプル▲３▼▲４▼は、４〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト胃癌細胞浮遊液に梅肉エキスの５０％クロロホルム・メタノール抽出物を添加したものである。なお、実験サンプル▲３▼▲４▼は、夫々、梅肉エキスのクロロホルム・メタノール抽出物がヒト胃癌細胞の浮遊液に対して１.７５ｍｇ／ｍｌ、３.５ｍｇ／ｍｌとなるように調製したものである。実験結果を図４に示す。
【００２６】
図４を参照すると、梅肉エキスの抽出物を添加した実験サンプル▲３▼▲４▼は何れも、梅肉エキスの抽出物を添加していない対照サンプル▲１▼▲２▼に比べて、ヒト胃癌細胞が減少していることがわかる。特に、梅肉エキスの抽出物を多く添加した実験サンプル▲４▼は、対照サンプルに比べて、ヒト胃癌細胞の約５０％を死滅できたことがわかる。一方、対照サンプル▲１▼▲２▼はヒト胃癌細胞の死滅は認められなかった。
以上より、梅肉エキスのクロロホルム・メタノール抽出物中に、ヒト胃癌細胞の増殖を抑制する成分、すなわちアポトーシス誘導物質が含まれていることが確認できる。また、ヒト胃癌細胞へのアポトーシス誘導物質の添加量が多いほど、増殖抑制作用を向上できることがわかる。
【００２７】
(実験４)
実験２と同様の方法で行なった。実験に用いた対照サンプル▲１▼▲２▼は実験２と同じであり、実験サンプル▲３▼は梅肉エキスのクロロホルム・メタノール抽出物をヒト胃癌細胞の浮遊液に添加して１.７５ｍｇ／ｍｌになるように調製したもの、実験サンプル▲４▼は梅肉エキスのクロロホルム・メタノール抽出物を添加して３.５ｍｇ／ｍｌになるように調製したものである。実験結果を図５に示す。
【００２８】
図５を参照すると、ＤＮＡ分子量マーカーＭと比較した場合、対照サンプル▲１▼▲２▼ではＤＮＡの断片化は認められないが、実験サンプル▲３▼▲４▼は、図中矢印で示すように、ＤＮＡの断片化が認められた。つまり、梅肉エキスの有機溶媒抽出物にアポトーシスを誘導する作用があることが確認された。
【００２９】
上記実施例１及び実施例２では梅肉と梅肉エキスを原料として用いたが、梅の果肉を原料としても同様の効果が得られる。また、梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスの２種又は３種を混合したものからアポトーシス誘導物質を抽出しても同様の効果を得ることができる。
【００３０】
梅肉エキスに含まれるムメフラールや、ムメフラールの構造異性体、又は、ヒドロキシメチルフルフラールもアポトーシス誘導作用を有するが、上記と同様の実験を行なったところ、その効果は本発明に比べて非常に弱いことが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導物質は、食品として安全性が確かな梅の果実から得られる梅の果肉、梅肉又は梅肉エキスを原料としているため、食品と同様の感覚で安心して手軽に摂取することができ、また副作用等のダメージを受けることもないため、日常的且つ継続的な癌の予防や治療に最適である。
また、本発明のアポトーシス誘導物質は、梅の果肉や、梅肉、梅肉エキスを原料とするため、比較的安価に入手でき、癌の予防や治療によって人類の健康にも貢献できる。
【００３２】
上記実施例の説明は、本発明を説明するためのものであって、特許請求の範囲に記載の発明を限定し、或は範囲を減縮する様に解すべきではない。又、本発明の各部構成は上記実施例に限らず、特許請求の範囲に記載の技術的範囲内で種々の変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例を示す概略工程図である。
【図２】実験１のヒト胃癌細胞の増殖抑制効果を比較するグラフである。
【図３】実験２のヒト胃癌細胞のＤＮＡ分布状態を比較する模式図である。
【図４】実験３のヒト胃癌細胞の増殖抑制効果を比較するグラフである。
【図５】実験４のヒト胃癌細胞のＤＮＡ分布状態を比較する模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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