(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解が、オートクレーブ処理、ブロメライン処理およびコラゲナーゼ処理のうちの少なくとも１つで行われている、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物を有効成分として含み、アレルギー疾患治療用のヒアルロニダーゼ阻害活性剤。
【請求項２】
ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物のうち合成ペプチドにより測定される分子量が５０００以下のものを必須成分として含む、請求項１に記載のヒアルロニダーゼ阻害活性剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害活性剤に関し、詳しくはアレルギー性疾患などに有効なヒアルロニダーゼ阻害活性剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品の分野では、抗炎症活性を有する物質としてステロイド剤や抗ヒスタミン剤などさまざまなものが開発されている。しかし、このような医薬品は副作用があり、安易な使用は重大な障害を生じる恐れがある。そこで、最近では予防医学的な見地からも自然由来の素材からより緩和な作用を持った抗炎症性活性を有する物質の探求が行われている。その結果、お茶、アロエ、シソ、ヨモギ等の植物のエキスに抗炎症活性が存在することが突き止められている( 食衛誌Vol.31 No.3 233-237 ，FRAGRANCE JOURNAL 1994-8 81-86，特開平６−９３９１号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これら植物由来のエキスは作用が緩やかな物質であるので医薬品および薬物に対してあまり知識のないものでも容易に使用することができるという利点を有するが、植物の持っている独特の臭いのために食品として供する場合には難がある。
【０００４】
したがって、本発明の課題は、副作用が少なく、臭いの少ないヒアルロニダーゼ阻害活性剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は、分解が、オートクレーブ処理、ブロメライン処理およびコラゲナーゼ処理のうちの少なくとも１つで行われている、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物を有効成分として含み、アレルギー疾患治療用のヒアルロニダーゼ阻害活性剤を提供する。
また、前記において、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物のうち合成ペプチドにより測定される分子量が５０００以下のものを必須成分として含むものを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるヒアルロニダーゼ阻害活性剤は、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物を有効成分として含む。ゼラチンやコラーゲンの分解物がヒアルロニダーゼ阻害活性剤として機能する理由は定かではないが、コラーゲンは皮膚組織の主要な構成蛋白質であるため、皮膚組織中で炎症が発生した場合、炎症性酵素によりコラーゲンあるいはゼラチンが分解され、その分解物が炎症反応に対して何らかの抑制的作用を保持しているものと考えられる。
【０００７】
コラーゲンとは、生体内に最も大量に存在する蛋白質で皮膚や腱などの結合組織および骨中に分布している。コラーゲンの特徴としてGly-X-Y のアミノ酸配列を持ち、３本鎖のヘリックス構造を有している。ゼラチンとは、コラーゲンが変成したものをいう。よって、コラーゲンと一次構造（アミノ酸配列）は同一であるが、変成しているためにヘリックス構造の崩壊した状態である。
【０００８】
ゼラチン、コラーゲンの分解の方法としては、熱、酸およびアルカリのうちの少なくとも一つを用いて物理化学的に行ってもよいし、酵素および／または微生物を用いて生物学的に行ってもよい。
ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物のうち、合成ペプチドにより測定される分子量が５０００以下のものを必須成分として含むことが好ましい。より好ましくは２５００以下、さらに好ましくは１０００以下である。合成ペプチドにより測定される分子量が５０００以下のものを含まない場合には、ヒアルロニダーゼ阻害活性の高いものが得られにくい。
【０００９】
合成ペプチドにより分子量を測定するには、Leu-Gly-Gly 、Gly-His-Leu 、Gly-Gly-Gly 、(Pro-Pro-Gly)5、(Pro-Hyp-Gly)5、(Pro-Pro-Gly)10 、(Pro-Hyp- Gly)10の６つの合成ペプチドを標準とし、
カラム：Ultrahydrogel 120(7.8 ×300mm)＋Ultrahydrogel 250(7.8 ×300mm)
移動相：0.35M NaCl＋50mM  リン酸緩衝液 (in 20%  アセトニトリル、pH7.4)
流速  ：0.6 ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１０μｌ
カラム温度：６０℃
検出  ：ＵＶ２３０ｎｍ
の条件により測定すればよい。
【００１０】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性剤は、特にアレルギー性疾患に有効であり、中でもＩ型アレルギーに有効である。Ｉ型アレルギーとしては、気管支喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーなどが挙げられる。
具体的な用途としては、健康食品、化粧品、医薬品等を挙げることができ、本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性剤を添加したものはアレルギー予防食品、アレルギー性皮膚炎などに対応したローションやクリームなどの化粧品または医薬品として用いることができる。
【００１１】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性剤は、単独で使用してもよいし、適当な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤等の通常用いられる担体を用いて調製してもよい。
本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性剤を人体に投与する場合の投与量としては一日１５〜２０ｇ程度であり、経口、非経口いずれの手段によってもよい。経口投与する場合には、散剤、錠剤、カプセル剤などとして用いることができる。化粧品などに配合する場合には、最終濃度５〜５０％程度となるように添加すればよい。
【００１２】
【実施例】
実施例における「％」とは、特に断りがない限り「重量％」を表すものとする。
(1) ゼラチンの分解
▲１▼オートクレーブ処理サンプル
約３５％となるようにゼラチン（新田ゼラチン製）を水に溶解し、濃度１０％、ｐＨ３．０、１２１℃で１０時間オートクレーブ処理を行った。
【００１３】
▲２▼ブロメライン処理サンプル
約３５％になるようにゼラチン（新田ゼラチン製）を水に溶解し、ブロメラインＦ（天野製薬製）を添加し、ｐＨ４．５、５０℃にて分解した。ブロメラインの添加量および処理時間は表１に示すとおりである。
▲３▼コラーゲナーゼ処理サンプル
約３５％となるようにゼラチン（新田ゼラチン製）を水に溶解し、濃度５％、ｐＨ７、５０℃で２４時間コラーゲナーゼ処理を行った。
(2) 各サンプルの分子量分布の測定方法
▲１▼試験溶液の調製
各サンプルを溶出液で０．３％濃度になるように希釈し、孔径０．２μｍのメンブランフィルターにて濾過した液を試験溶液とした。
【００１４】
▲２▼分析条件
カラム：Ultrahydrogel 120(7.8 ×300mm)＋Ultrahydrogel 250(7.8 ×300mm)
移動相：0.35M NaCl＋50mM  リン酸緩衝液 (in 20%  アセトニトリル、pH7.4)
流速  ：0.6 ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１０μｌ
カラム温度：６０℃
検出  ：ＵＶ２３０ｎｍ
なお、Leu-Gly-Gly 、Gly-His-Leu 、Gly-Gly-Gly 、(Pro-Pro-Gly)5、(Pro-Hyp-Gly)5、(Pro-Pro-Gly)10 、(Pro-Hyp-Gly)10 の６つの合成ペプチドを標準として用いた。分子量の測定結果を表１に示す。また、分子量の測定結果の溶出曲線の面積から見かけの分子量含有率を算出したものもあわせて表１に示す。
(3) ヒアルロニダーゼの阻害活性の測定方法
各サンプルを酵素（ヒアルロニダーゼ）に接触させた後、酵素刺激剤（compound48/80 ）で酵素を刺激し、0.2mg/mlになるようにヒアルロン酸を添加し、分解されて出てきたアミノ糖の量を測定した。
【００１５】
各々の結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
0003947263.tif 000002
【００１７】
分子量5000以下のものを68.2％含み、分子量2500以下のものを22.7％含み、分子量1000以下のものを9.1 ％含むペプチド（ブロメライン0.05％、pH4.5 、30分処理）を30％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が110 ％まで抑制された。
分子量5000以下のものを91.2％含み、分子量2500以下のものを59.6％含み、分子量1000以下のものを29.8％含むペプチド（ブロメライン0.2 ％、pH4.5 、２時間処理）を30％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が50％まで抑制された。
【００１８】
分子量5000以下のものを97.7％含み、分子量2500以下のものを72.1％含み、分子量1000以下のものを40.7％含むペプチド（ブロメライン0.2 ％、pH4.5 、７時間処理）を30％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が20％まで抑制された。
分子量5000以下のものが100 ％であり、分子量2500以下のものを78.8％含み、分子量1000以下のものを51.8％含むペプチド（ブロメライン0.2 ％、pH4.5 、24時間処理）を30％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が０％まで抑制され、20％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が55％まで抑制された。
【００１９】
上記の酵素以外の酵素であるコラーゲナーゼで処理したペプチドである、分子量5000以下のものを97.4％含み、分子量2500以下のものを93.5％含み、分子量1000以下のものを75.6％含むペプチド（コラーゲナーゼ５％、pH7.0 、24時間処理）を20％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が０％まで抑制され、10％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が70％まで抑制された。
【００２０】
また、酵素以外の処理方法であるオートクレーブ処理によるペプチドである、分子量5000以下のものを87.9％含み、分子量2500以下のものを63.2％含み、分子量1000以下のものを32.3％含むペプチドを30％濃度で作用させることで、ヒアルロニダーゼ活性が50％まで抑制された。
以上から、オートクレーブ処理、ブロメライン処理、コラーゲナーゼ処理のいずれのサンプルでも、サンプル濃度を高くするにつれて、ヒアルロニダーゼ活性が低下していっており、サンプルがヒアルロニダーゼ阻害活性を有していることがわかる。また、ブロメライン処理サンプルでは、処理条件を厳しくし、分子量の小さな成分が多くなるにしたがって、ヒアルロニダーゼ阻害活性が高くなっていることがわかる。
【００２１】
なお、表中でヒアルロニダーゼ活性が１００％を越えているデータがあるのは、サンプル自身がヒアルロン酸と類似した成分を含んでおり、これが検出されるためである。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性剤は、自然由来であるためステロイド剤等の医薬品で問題となるような副作用がなく、植物由来のエキスと比べて臭いが少ない。