(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘａａが、４−トランス−ヒドロキシプロリンを表わすアミノ酸配列：
0003953110.tif 000012
を含む単離されたκ−コノトキシンペプチド。
【請求項２】
Ｘａａがヒドロキシプロリンを表わすアミノ酸配列：
0003953110.tif 000013
を含む単離されたκ−コノトキシンペプチド。
【請求項３】
Ｘａａがプロリンを表わすアミノ酸配列：
0003953110.tif 000014
を含む単離されたκ−コノトキシンペプチド。
【発明の詳細な説明】
本発明は、メリーランド州ベセスダのナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（National Institute of Health）のナショナル・インスティチュート・オブ・ジェネラル・メディカル・サイエンス（National Institute of General Medical Sciences）によって投資された助成金番号ＰＯ１  ＧＭ２８６７７の下で政府援助によりなされた。米国政府は本発明のある種の権利を有する。
発明の背景
本発明は、２７のアミノ酸残基のペプチドに関する。このペプチドは、天然には、コーンカタツムリ（コヌス・パパラセンス（Ｃｏｎｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ））の毒液中から微少量得られ、合成することもできる。このペプチドは３つの環を構成するジスルフィド結合を含む。
発明の背景、特に、当該実施を配慮したさらなる詳細を提供する実例を明らかにするために本明細書中で使用された刊行物および他の資料は、出典明示して本明細書に含まれ、便宜上、以下の本文中では筆者名により参照され、添付した参考文献リストに筆者名によりアルファベット順に列挙されている。
捕食動物にとって、獲物を捕獲するための毒液の使用は、毒液産生のシステムおよび毒液を搬送する器官を含む、多くの適応を要求する。いくつかの毒性動物は、顕著な効率および速度で獲物を不動化する。獲物を捕獲するために種々の動物によって作られた毒液の解析は、それらの成分が広範囲の生理的標的を有することを明らかにした。毒液中の毒素の多様な分子機構を合理的に説明する統一的見解を進展させることが必要である。
機構上の精巧さの点で、フィッシュ・ハンティング・ジオグラフィー・コーンカタツムリ（コヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ））は注目すべきであろう［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３］。その毒液は、獲物の骨格筋において、シナプス前神経末端からの伝達物質放出だけではなく、神経伝達物質の受容および活動電位の発生をも阻害する。原因となる毒液成分は、ω−コノトキシン（シナプス前電位依存性カルシウムチャネルのブロッカー）、α−コノトキシン（骨格筋ニコチン性アセチルコリン受容体のインヒビター）およびμ−コノトキシン（筋繊維形質膜中の電位依存性ナトリウムチャネルのブロッカー）であり；全て小さな、ジスルフィド豊富なペプチド（１３−２７アミノ酸）である。これら３つの群の神経毒は、相乗効果的に作用して、神経筋伝達をブロックする［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ.，１９８５］。しかしながら、これらの毒素によって与えられた「三重の脅威」をもってしても、獲物が不動化するまでに依然何秒もかかる。
本明細書に記載の実験は、別のコーンカタツムリ（コヌス・パパラセンス、紫コーン）による魚類獲物の非常に急速な不動化に関する機構原理を詳しく調べたものである。注目すべきことに、２つの全く異なる生理的プログラムが該毒液によって誘発されることが判明した：このカタツムリは神経筋伝達を複数の神経毒を用いてブロックするだけではなく、データは、該カタツムリが、相乗効果的に作用して獲物に「ショック」を与えて、不動化、硬直状態にするエクサイトトキシンをも用いることを証明した。新規Ｋ+チャネル標的コノトキシンは後者のプログラムに関与する。コヌス・パパラセンスの毒液によって誘発される該２つの類似する生理的プログラムは、他の毒性動物による獲物捕獲に広く用いられる一般的戦術を代表し、毒液の特徴である困惑させる毒素の多様性のほとんどは、それらの生理的機構を考慮することによって理解され得ることが示唆されている。
コヌス・パパラセンスの生理学：ネット（ｎｅｔ）対フック・アンド・ライン（ｈｏｏｋ−ａｎｄ−ｌｉｎｅ）戦術。
コヌス・ジオグラフス（詳細に解析された最初のコーンカタツムリ
［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ.，１９８５］）は、獲物を捕獲するために「ネット」戦術を用いる。それがサカナを検知すると、その口（口吻）を非常に広く開け、極近傍にきた不用心なサカナを広げた口で飲み込み、次いで、刺す。それとは対照的に、ムラサキコーン（コヌス・パパラセンス）は、基本的にフック・アンド・ライン戦略を用いるフィッシュ・ハンティング種である。該カタツムリは約５μｌの毒液を、単に使い捨て皮下注射針としてだけではなく獲物を繋ぎとめる働きをする銛状の歯を通して獲物のサカナに注入する。該サカナは、好一撃によって、ほぼ即座に動けなくなる。多くの水槽観察は、不動化のこの初期段階は、常に、主要なヒレの剛直なテタニー性伸張を特徴とすることを明らかにした。この初期症状は獲物の突発性テタヌス（Ｓｕｄｄｅｎ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｏｆ  Ｐｒｅｙ、またはＳＴＯＰ）症候群と呼ばれる。時折、サカナは、このテタニー状態から回復し、再び動けるようになるが、後で麻痺して弛緩状態になる。一般に、該サカナは、テタニー性麻痺の初期段階の間に、該カタツムリの口に飲み込まれてしまう。
前記したごとく、コヌス・パパラセンスの毒液は、その主成分のうちのひとつとして、ニコチン性アセチルコリン受容体を標的するペプチドを含有する。この毒液成分（αＡ−コノトキシンＰＩＶＡ［Ｈｏｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］）は、シナプス伝達をブロックし、サカナの麻痺および死を引き起こす。さらに近年、弛緩性麻痺および死を引き起こす、少なくとも２つの別の毒液ペプチドがコヌス・パパラセンス毒液から確認された：これらのうちの１つであるμ−コノトキシンＰＩＩＩＡは、電位依存性ナトリウムチャネルをブロックすることによって、骨格筋における活動電位伝達を阻害する［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９６］。これらの毒素のいずれをサカナに注入しても全身性弛緩性麻痺（ＳＴＯＰ症候群とは全く異なる結果）を誘発する。かくして、コヌス・ジオグラフスのごとく、コヌス・パパラセンスは、相乗効果的に作用して、神経筋伝達をブロックする複数の毒を産出すると思われる。しかしながら、ＳＴＯＰ症候群の要因となるコヌス・パパラセンスの他の毒液成分があるはずである。
発明の概要
本発明は２７個のアミノ酸、それぞれ、１番目と４番目、２番目と５番目および３番目と６番目のシステイン間の３つのジスルフィド結合を形成する６つのシステインを有するコノトキシンペプチドに向けられる。本発明は、Ｘａａが４−トランス−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリンまたはプロリンを表わす式：Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ（配列番号：１）を有するκ−コノトキシンＰＶＩＩＡに向けられる。このペプチドは電位依存性カリウムチャネルを標的する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ．    コヌス・パパラセンス試料を以前に記載されたごとく、搾取する［Ｈｏｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］。搾取した毒液を貯め、高速液体クロマトグラフィーによって分画する：溶出曲線を図１Ａに示す［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］。棒線で示したピークは、ロック・ジョー（ｌｏｃｋ−ｊａｗ）ペプチド（δ−コノトキシンＰＶＩＡ）を含有し；このペプチドの精製および生化学的キャラクタリゼーションは、最近、記載された［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９６］。矢印で示したピークは、本明細書に記載したフィン・ポッピング（ｆｉｎ−ｐｏｐｐｉｎｇ）ペプチド（κ−コノトキシンＰＶＩＩＡ）である。図１ＢおよびＣ．    図１Ａで得られたピークをＨＰＬＣによって２回、標準ＴＦＡ／アセトニトリルバッファー系を用いて、再びクロマトグラフィーに付す。グラジエントは、１２−３０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡである。該フィン・ポッピングペプチドは、２２％アセトニトリルにおいて溶出する。
図１Ｄ．    同量の天然および合成ペプチドを混合し、単一の均一ピークとして、２２％アセトニトリルにおいて共溶出する。このことは、該配列帰属が合成によって確認できたことを示している。
図２Ａ．    κ−コノトキシンＰＶＩＩＡは、Ｓｈａｋｅｒ  Ｋ+チャネルをブロックする。Ｓｈａｋｅｒ  Ｈ４  Ｋ+チャネルを発現する卵母細胞［Ｋａｍｂ  ｅｔ  ａｌ.，１９８８］由来の全細胞電流を、１０ｍＶごとに−８０ないし＋６０ｍＶの試験電位によって誘起する。
図２Ｂ．    浴溶液中に２００ｎＭのκ−コノトキシンＰＶＩＩＡが存在すると、該ピーク電流値が対照値の約２０％に減少する。
図２Ｃ．    図２Ｂで見られる減少は、ここで見られるごとく、添加したκ−コノトキシンＰＶＩＩＡを除去する洗浄工程により可逆である。
図２Ｄ．    ＋４０ｍＶの試験電位におけるκ−コノトキシンＰＶＩＩＡによるブロックに関する用量反応曲線。
図２Ｅ．    種々の試験電位におけるκ−コノトキシンＰＶＩＩＡによるブロックのＩＣ50（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ.，ｎ＝５）。
図２Ｆ．    １００ｎＭのκ−コノトキシンＰＶＩＩＡによるブロックのキネティクスの実例。ブロックの定常状態を５秒以内に達成し、洗浄を１５秒以内に完了する（ｎ＝８）。２０ｎＭ（ｎ＝５）および１０００ｎＭ（ｎ＝６）で、同一のキネティクス結果を得、このことは該毒素の非常に急速なブロックを意味する。
図３Ａ．    δ−コノトキシンＰＶＩＡは、Ｎａ+電流の急速な不活性化を遅延する。Ｎａ+電流は、培地中海馬細胞由来の核形成パッチから記録する。電流を−８０ｍＶの保持電位に対して、１０ｍＶごとに−６０ないし＋６０ｍＶの試験電位によって誘起する。この図は、対照実験のデータを示す。
図３Ｂ．    ２μＭのＰＶＩＡの存在下である以外は、図３Ａに示した実験からのデータ。
図３Ｃ．    ＰＶＩＡ除去のための洗浄後の図３Ｂと同一の実験から示されたデータ。
図３Ｄ．    ラット脳Ｎａ+チャネルＩＩを発現するアフリカツメガエル卵母細胞から切り取られたアウトサイド・アウトマクロパッチ由来のＮａ+電流。パッチを、−１００ｍＶの保持電位から、１０ｍＶごとに−８０ないし＋６０ｍＶの範囲の試験電位に対して脱分極をする。対照実験の結果を示してある。
図３Ｅ．    ２μＭのＰＶＩＡの存在下である以外は、図３Ｄに示したものと同一の実験のデータ。
図３Ｆ．    海馬ニューロン由来の核形成パッチ（四角、ｎ＝１１）およびラット脳Ｎａ+チャネルＩＩを発現する卵母細胞から切り取られたアウトサイド・アウトマクロパッチ（丸、ｎ＝１０）に関する試験電位の関数としてプロットしたＮａ+電流不活性化の時定数。白抜き記号は対照条件下での値を示し、黒塗り記号は２μＭのＰＶＩＡ添加後の値を示す。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で与えられる。値は、１つの不活性化ゲートを仮定したＨｏｄｇｋｉｎ  ａｎｄ  Ｈｕｘｌｅｙ（１９５２）によるナトリウム電流キネティクスの記載に従って非線形最小自乗法フィッティングから求めたものである。
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は２７個のアミノ酸、それぞれ１番目と４番目、２番目と５番目ならびに３番目と６番目の間に３つのジスルフィド結合を形成する６つのシステインを有するコノトキシンペプチドおよびこれらのペプチドの前駆体に向けられる。本発明は、Ｘａａが４−トランス−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリンまたはプロリンを表わす式：Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ（配列番号：１）を有するκ−コノトキシンＰＶＩＩＡに向けられる。このペプチドは、カリウムチャネルを標的し、例えば、アルツハイマー病のごとき多くの病的な状況において、神経伝達物質放出を増大するために使用され得る。κ−コノトキシンＰＶＩＩＡのごとき、カリウムチャネルインヒビターは、ランバート−イートン症候群または重症筋無力症のごとき自己免疫疾患において、シナプスでの神経伝達物質の放出を増大し、これらの病状を軽減する有用性を有する。
コノトキシンの化学合成
これらのペプチドは、化学的に合成するのに充分に小さい。前記のコノトキシンペプチドを調製する一般的な化学合成を、以下に、いくつかのコノトキシンペプチドの特定の化学合成およびこれらの合成物の生理活性の指標と共に記載する。これらのコノトキシンペプチドの多くのものを特定のコヌス種から、米国特許第４，４４７，３５６号［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ.，１９８４］（該開示は出典明示して本明細書に含まれる。）記載の方法を用いて単離精製することによって得ることもできる。
本発明のコノトキシンペプチドは、コーンカタツムリから精製によって得ることができるが、個々のカタツムリから得られるコノトキシンペプチドの量は非常に少ないので、所望の実質的に純粋なコノトキシンペプチドは、最も実用的には、化学合成によって商業的に価値のある量で得ることができる。例えば、１匹のコーンカタツムリからの収量は、約１０マイクログラム以下のコノトキシンペプチドである。「実質的に純粋」とは、他の同一の型の生体分子の実質的な不存在下で、該ペプチドが存在することをいい、好ましくは、少なくとも約８５重量％の量で存在し、好ましくは、存在する同一の型の該生体分子の少なくとも約９５％存在する（すなわち、水、バッファーおよび無害な低分子が存在することができる）。生理活性コノトキシンペプチドの化学合成は、もちろん、該アミノ酸配列の正確な決定に依存する。
該コノトキシンペプチドを、周知の組換えＤＮＡ法によって産生することもできる。当該技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９７９）によって記載されている。このように産生された該ペプチドを単離して、必要ならば還元して、酸化して、正確なジスルフィド結合を形成する。
本発明のコノトキシンペプチド中にジスルフィド結合を形成する１つの方法は、長期間の低室温下おける直鎖状ペプチドの空気酸化である。この方法は、生理活性ジスルフィド結合ペプチドの充分な量の生産をもたらす。該酸化ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて分画して、異なる結合配置を有するペプチドを分離する。その後に、これらの画分を天然物質の溶出と比較するか、あるいは簡単な検定を用いるかのいずれかによって、最大生物学的能力について正確な結合を有する特定の画分を簡単に定量する。ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる架橋および／または再配列は、生物学的に効力のあるコノトキシン分子を産生することが明らかにされているので、該直鎖ペプチド、あるいは、１つ以上のフラクションを有する酸化生成物は、時には、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用し得ることも明らかとなった。しかしながら、生物学的効力の低い他のフラクションの存在により希釈されるために、幾分多めの用量を必要とするであろう。
本発明のコノトキシンペプチドにジスルフィド結合を形成する別の方法は、該コノトキシンペプチド合成の間、２番目および５番目のシステインの保護試薬としてのアセトアミドメチル（Ａｃｍ）の使用に関わる。これらの２つの残基に対するＡｃｍの使用は、他のコノトキシンペプチドにおけるジスルフィド架橋との類似による。Ａｃｍ保護システインを持つ該ペプチドを一晩、室温において空気酸化する。二環式ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離し、所望の異性体を単離する。最終ジスルフィド架橋をヨウ素化によって行う。所望しない異性体を直鎖ペプチドへの還元によって効率的に再利用する。該所望の異性体を部分還元解析［Ｇｒａｙ，１９９３］によって定量する。この解析において、二環式前駆体のサンプルをトリス−［２−カルボキシエチル］−ホスフィンで処理して、直鎖ペプチドおよび単一架橋中間体を得る。後者のペプチドをヨードアセトアミドと反応させ、アルキル化システイン残基の位置を配列解析によって確認する。この解析において、正確な結合は１番目と４番目、２番目と５番目および３番目と６番目のシステインの間であることが決定された。
該ペプチドを、完全固相法、部分固相法、フラグメント縮合または典型的な溶液カップリングのごとき、適切な方法によって合成する。最近開発された組換えＤＮＡ法を適用して、これらのペプチド、特に、後の翻訳プロセシング工程を必要としない、天然アミノ酸残基のみを含有する比較的長鎖のものを調製することができる。
慣用的な液相ペプチド合成において、構成アミノ酸を所望の順序で成長中のペプチド鎖に付加していく一連のカップリング反応によって、該ペプチド鎖を調製することができる。種々のＮ−保護基（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはカルボニルジイミダゾール）、種々の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのエステル）および種々の開裂試薬を使用して、溶液中で反応を行い、引き続いて、中間体を単離精製することは、周知の典型的なペプチド方法論である。典型的な溶液合成は、専門書［Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ（１９７４）］に詳しく記載されている。完全固相合成の技術は、教科書［Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，１９６９）］に記載されており、米国特許第４，１０５，６０３［Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９７８］の開示によって例示されている。フラグメント縮合法の合成は、米国特許第３，９７２，８５９号（１９７６）に例示されている。他の利用可能な合成は、米国特許第３，８４２，０６７（１９７４）および米国特許第３，８６２，９２５（１９７６）に例示されている。
当該化学合成に共通することは、適切な保護基を用いて、種々のアミノ酸部位の不安定な側鎖基を保護することであり、それらの保護基は、当該保護基を最終的に脱離するまでその部位において化学反応が起こることを防止する。アミノ酸またはフラグメントのα−アミノ基がカルボキシル基において反応する間それを保護し、引き続き、α−アミノ保護基を選択的に脱離して、その後の反応がその部位で起こる様にすることもｓ通常共通している。したがって、そのような合成における工程として、不安定な側鎖を有する残基の種々のものに結合した適切な側鎖保護基を持つ該ペプチド鎖においてその所望の順序で位置するアミノ酸残基の各々を含む中間化合物を生成することが共通する。
側鎖アミノ保護基の選択に関する限り、一般に、合成中、該α−アミノ酸の脱保護の間に脱離しないものが選ばれる。しかしながら、いくつかのアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ）に関しては、保護は一般的に必要ではない。該ペプチドの合成に使用される特定の側鎖保護基の選択において、以下の一般則が守られる：
（ａ）保護基は、好ましくは、カップリング条件下で、その保護特性を保持し、開裂しない、
（ｂ）保護基は、合成の各工程においてα−アミノ保護基を脱離するために選択された反応条件下で安定であるべきである、および
（ｃ）側鎖保護基は、望ましくなく該ペプチド鎖を改変することのない反応条件下、所望のアミノ酸配列を含有する合成の完了により、脱離可能であるべきである。
組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのペプチドの多くを、または全てでさえも、調製することが可能であろう。しかしながら、ペプチドがそのように調製されない場合、それらは、好ましくは、メリフィールド固相合成を用いて調製されるが、前記したごとく、当該分野で公知の他の同等な化学合成を使用することもできる。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂にカップリングすることによって、該ペプチドのＣ−末端から開始される。その様な出発物質は、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル化樹脂へのエステル結合によりあるいはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはパラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂へのアミド結合によりα−アミノ保護基を付加することによって調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９６６）によって記載されている。クロロメチル化樹脂は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）およびＬａｂ．Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手できる。その様な樹脂の調製は、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）によって記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂担体は、商業的に入手でき、合成されるべき所望のペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合、一般的に使用されている。かくして、固体樹脂担体は、式−Ｏ−ＣＨ2−樹脂担体、−ＮＨ  ＢＨＡ樹脂担体または−ＮＨ  ＭＢＨＡ樹脂担体を有するもののごとき、当該分野で公知のもののいずれであってもよい。非置換アミドが所望される場合、ＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂の使用が好ましい、何故ならば、開裂が直接、該アミドを提供するからである。Ｎ−メチルアミドが所望される場合、それは、Ｎ−メチルＢＨＡ樹脂から生成される。他の置換アミドが所望されるのであれば、米国特許第４，５６９，９６７号［Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ.．１９８６］の教示を使用でき、または、該遊離酸以外の基が依然としてＣ−末端に所望されるのであれば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ教科書（１９７４）に記載される典型的な方法を用いて、該ペプチドを合成することが好ましいかもしれない。
Ｃ−末端に遊離酸を有するペプチドを合成すべき場合、Ｂｏｃによっておよび側鎖保護基によって保護されたＣ−末端アミノ酸を、適当であれば、［Ｋ．Ｈｏｒｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，（１９７８）］に記載の方法に従い、ＤＭＦ中ＫＦを用いて、６０℃において２４時間、攪拌しながら、先ず、クロロメチル化樹脂にカップリングすることができる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂担体へのカップリングに引き続いて、該α−アミノ保護基を、塩化メチレン中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または単独でＴＦＡを用いて脱離する。脱保護を、約０℃ないし室温の間の温度で行う。ジオキサン中ＨＣｌのごとき、他の標準的な開裂試薬および特定のα−アミノ保護基脱離のための条件を［Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＆  Ｌｕｂｋｅ（１９６５）］に記載したごとく、用いることができる。
α−アミノ保護基の脱離後、残りのα−アミノおよび側鎖保護アミノ酸を、段階的に所望の順序でカップリングして、上で定義した中間体化合物を得る。あるいは、合成中、各々のアミノ酸を個別に添加する替わりに、固相反応器に添加するに先立ち、それらのうちのいくつかをお互いにカップリングすることができる。適当なカップリング試薬の選択は、先行技術の範囲である。カップリング試薬として、特に適切なのは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。
該ペプチドの固相反応に使用される活性化試薬はペプチドの分野で周知である。適切な活性化試薬の例は、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのごとき、カルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、［Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＆  Ｌｕｂｋｅ（１９６５）］および［Ｋａｐｏｏｒ（１９７０）］に記載されている。
各々の保護アミノ酸またはアミノ酸配列を、約２倍以上過剰にて固相反応器に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）の溶媒中あるいはＤＭＦまたはＣＨ2Ｃｌ2の単独溶媒中でカップリングを行うことができる。中間結合が起こる場合には、カップリング手順を、次のアミノ酸のカップリングに先立つα−アミノ保護基の脱離前に繰り返す。合成の各段階のカップリング反応の成功を、手動で行うのであれば、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）によって記載されたごとく、好ましくは、ニンヒドリン反応によって監視する。カップリング反応は、ベックマン９９０自動合成装置により、［Ｒｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）］に報告されているごときプログラムを用いて、自動的に行うことができる。
所望のアミノ酸配列を完了した後、液体フッ化水素のごとき、該ペプチドを樹脂担体から開裂するだけでなく残りのすべての側鎖保護基を開裂し、遊離酸の形態でペプチドを得るために前もってＮ−末端のα−アミノ保護基を脱離をしていないならば、それも開裂する試薬で処理することによって、中間体ペプチドを樹脂単体から脱離することができる。Ｍｅｔが配列中に存在するならば、Ｓ−アルキル化の可能性を除去するために、ＨＦを用いてペプチドを樹脂から開裂するに先立ち、Ｂｏｃ保護基を、好ましくは、初めにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを用いて脱離する。フッ化水素を開裂のために用いた場合、１つ以上の補足剤（アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメチルエチルスルフィドのごとき）を反応容器中に含ませる。
ペプチド樹脂の一部分であるうちの環化よりも、直鎖状ペプチドの環化を好んで行って、Ｃｙｓ残基間の結合を形成する。そのようなジスルフィド環化結合を達成するために、完全に保護したペプチドを、ヒドロキシメチル化樹脂またはクロロメチル化樹脂担体から、周知のごとく、アンモニウム加水分解によって開裂して、完全保護アミド中間体を得、それをその後、適切に環化し、脱保護する。別法として、脱保護、ならびに上記樹脂またはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）からの該ペプチドの開裂を、０℃において、フッ化水素酸（ＨＦ）を用いて行い、続いて、上記のごとく、酸化することができる。
実施例１
ＳＴＯＰに関連する毒液構成成分の同定
コヌス・パパラセンスの毒液を高速液体クロマトグラフィーによって、その主成分に分離する（図１Ａ参照）。金魚に注入することによって、該毒液の各主成分を個別にバイオアッセイする。何匹もが弛緩性麻痺または死を引き起こしたが、ＳＴＯＰ症候群に非常に似通った生理学的効果を誘発した個体はひとつもなかった。
毒液成分を組合せたペアーを試験して、該ペアーがＳＴＯＰ症候群を誘発するかを決定した。一緒に注入すると、２つのクロマトグラム上の画分（図１Ａ中で矢印および棒線で示した画分に対応する）はＳＴＯＰ症候群をもたらした。第１の成分（矢印のピーク）は、有効成分であり、本明細書中で「フィン・ポッピングペプチド」と呼称される；この成分の精製およびキャラクタリゼーションを以下に記載する。棒線で示された画分は、近年、精製され、化学合成された毒液成分であり、「ロック・ジョーペプチド」と呼ばれ、δ−コノトキシンＰＶＩＡとも呼称される［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］。
該２つのペプチドは一緒になって、ＳＴＯＰ症候群を誘発するが、フィン・ポッピングペプチドのみの注入はＳＴＯＰとは顕著に異なる症候を生じた。サカナは、顕著に活動亢進状態になり、連続的に、水槽のガラス壁に対して神経質に動いた。しばらくすると、該サカナは、特徴的に筋肉収縮し、次いで、突然、すべての主要なヒレが伸張する（「フィン・ポップ」を起こす）であろう。このフィン・ポッピング挙動は、多かれ少なかれ、連続的に繰り返され、幾分ギクシャクとした一連の動きを引き起こすであろう。大用量注入しても、精製フィン・ポッピングペプチドは、不動化も死も引き起こさなかった。対照的に、完全なるＳＴＯＰ症候群を示す、毒を注入されたサカナは、単一的な、回復せずに最終的に死に至る「フィン・ポップ」を行う。
ＳＴＯＰを誘発するために要求される第２の成分は、ロック・ジョーペプチド、（δ−コノトキシンＰＶＩＡ（δ−ＰＶＩＡ））である。獲物に注入すると、該精製ペプチドは、初期の無症状期間、続いて、しばしば、アゴの拡張（ロック・ジョー症状）を特徴とする過渡状態を引き起こし、それに引き続いて、今度は、サカナは、長時間、非常に急激な動きで泳ぐ；急激な動きは、しばしば、サカナが水槽の側面にぶつかるほど激しい。激しい泳ぎの期間後、サカナは、通常回復不可能な全身硬直麻痺を示すであろう。この点で、ロック・ジョーペプチドの作用は、ＳＴＯＰ症候群と共通するいくつかの要素を有している（但し、後者では、長い無症状期間および激しい泳ぎの短い過渡期が観察されない）。
典型的なＳＴＯＰ症状を誘発するためには、両ペプチドの組合せが必要である。該毒液のさらなる成分が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＳＴＯＰに寄与するようである；該カタツムリによる好一撃が与えられると、ヒレの硬直が１、２秒のうちに誘発される。該２つの精製成分を一緒に注入することは、ＳＴＯＰを誘発するが、開始までの時間は著しく長い。
実施例２
「フィン・ポッピングペプチド」の精製および生化学的キャラクタリゼーション
フィン・ポッピング活性の一因となる該毒液成分を調べるために、それをコヌス・パパラセンス毒液から均一になるまで精製した（図１Ａ−１Ｃに示す）。標準エドマン配列決定法によって決定した該アミノ酸配列は２７個のアミノ酸のペプチドであることが明らかとなった（表１）。生理学的に活性なペプチドの化学合成および分子クローニングが達成された。アミノ酸配列決定、化学合成、クローニングおよび質量分析の全てが、フィン・ポッピング活性は、３つのジスルフィド結合を持つ新規ペプチドに起因することを確認し、その配列は：
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このペプチドは、コノトキシンの他の系列（特に、電位依存性カルシウムチャネルをブロックするω−コノトキシンおよび電位依存性ナトリウムチャネルの不活性化を阻害するδ−コノトキシン［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］）において観察されるものと同一のＣｙｓ残基配列を有する。該ペプチドが、放射線標識ω−コノトキシンまたはδ−コノトキシンのいずれかと競合するかを直接試験した。特異的結合の置換は、該フィン・ポッピングペプチドがマイクロモーラーの濃度においてさえ、何も見られなかった（結果は示さず）。かくして、該フィン・ポッピングペプチドは、ω−およびδ−コノトキシンのＣａ2+およびＮａ+チャネルの標的サイトと異なる受容体サイトを標的しているらしい。
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実施例３
電気生理学的キャラクタリゼーション
上記の結合競合実験は、該フィン・ポッピングペプチドは、構造的に関係するが、ω−またはδ−コノトキシンのいずれでもないことを示唆した。該フィン・ポッピングペプチド活性の基本的な生理機構に関する実験的証拠を図２Ａ−２Ｆに示す。該純粋毒を、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からクローン化したＳｈａｋｅｒ  Ｋ+チャネルを発現する卵母細胞につき試験した。アフリカツメガエル卵母細胞に注入するための保護ランオフＳｈａｋｅｒ  ｃＲＮＡを、Ｔ７プロモータを持つテンプレートを用いて、標準プロトコール［Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，１９８７］によって合成した。卵母細胞注入を記載
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したごとく行った。Ｋｖ１．１［Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９８８］およびＫｖ１．４
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をＰＣＲによって再クローン化した。全細胞電流を二電極電圧クランプを用いて測定した
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電流の記録を、１ｋＨｚ（−３ｄＢ）でローパスフィルターし、４ｋＨｚでサンプリングした。浴溶液は、１１５  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ、１．８  ＣａＣｌ2、１０  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２（ＮａＯＨ）（ｍＭ単位）を含有する正常カエルリンガース液（ＮＦＲ）であった。κ−コノトキシンＰＶＩＩＡのＩＣ50を評価するために、浴中の該毒素濃度を連続的に増大しつつ、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈ４  Ｋ+チャネルを発現する卵母細胞の全細胞電流を測定した。ある特定の電圧におけるピーク電流を測定し、毒素濃度に対してプロットした。用量反応曲線を式  ｙ＝（１＋（Ｔ／ＩＣ50）n）-1（式中、「Ｔ］は毒素濃度、「ｎ」はヒル係数である。）にフィッティングした。ヒル係数は約１であった。すべての電気生理学実験を室温（１９−２２℃）において行った。図２Ｂに示すごとく、２００ｎＭの濃度において、該毒素は発現Ｓｈａｋｅｒ  チャネルのＫ+コンダクタンスをブロックし、そのことは該ペプチドが電位依存性カリウムチャネルを標的することを示している。用量反応を図２Ｄに示す。
Ｓｈａｋｅｒ  媒介電流に関する該ペプチドのＩＣ50を種々の試験電位で決定した（図２Ｅ）。使用した実験条件下で、ＩＣ50は６０±３ｎＭ（０ｍＶ）ないし７０±６ｎＭ（＋６０ｍＶ）の範囲であり、そのことは、該毒素のブロッキング効果がほんの僅かに電位依存性であることを示している（図２Ｅ）。驚くことではないが、ｉｎ  ｖｉｖｏで非常に急速な生理反応を与えると、ブロックのキネティクスは非常に速いようである。試験した濃度（２０ｎＭ、１００  ｎＭおよび１０００ｎＭ）に関して、定常状態ブロックは、図３Ｆに示したごとく、数秒で達成された。サカナおよびマウスの両方においてｉｎ  ｖｉｖｏで誘発される興奮性症状によって証拠付けられるごとく、該ペプチドは脊椎動物系に効果を有するが、該ペプチドによって強く阻害されるクローン化脊椎動物Ｋ+チャネルサブタイプは、未だ同定されていない；１μＭにおいて、該ペプチドは、ラット脳由来のＫ+チャネルＫｖ１．１またはＫｖ１．４に対して、何らの効果も有しない（示さず）。これらの結果は、該フィン・ポッピングペプチドは以前にキャラクタライズしたコノトキシン系列に属しないが、その代わり、Ｋ+チャネル標的ペプチドの推定コノトキシン系列の第一メンバーであることを立証した。この系列は、本明細書中でκ−コノトキシンと称され、コヌス・パパラセンンス由来の該フィン・ポッピングペプチドはκ−コノトキシンＰＶＩＩＡ（κ−ＰＶＩＩＡ）と称される。
実施例４
ロック・ジョーペプチド：ニューロン系における活性
ＳＴＯＰに要求されるもうひとつの毒液成分は、ロック・ジョーペプチド、δ−コノトキシンＰＶＩＡ（δ−ＰＶＩＡ）［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５］である。以前、この２９個のアミノ酸のペプチドは、カエル神経筋調製物において敏感性を増大することが示された。この活性およびカタツムリハンティングコヌス由来のδ−コノトキシンに対するその相同性に基づき、該ペプチドは電位依存性Ｎａ+チャネルによるＮａ+コンダクタンスを増大すると仮定された。図３Ａ−３Ｆの実験は、該ペプチドは、脊椎動物ＣＮＳニューロンにおけるＮａ+チャネル不活性化を遅延することを明らかに示している。
卵母細胞中で発現されたラット脳タイプＩＩナトリウムチャネルに対する、および海馬細胞から記録されたＮａ+電流に対するδ−ＰＶＩＡの効果を図３Ａ−３Ｆに示す。
方法
ラット海馬培地を［Ｓｅｉｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，１９８３］に記載のごとく、得た。培地中４−７日後、記録を取った。ニューロンの方法は、全細胞配置におけるクランプ実験の間、良好な電位制御を不可能にするため［Ｈａｍｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９８１］、核形成パッチ記録［Ｓａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２］を行った。ピペットは、２−３ＭΩの抵抗を有し、１００  ＣｓＣｌ、１０  ＮａＣｌ、２０  ホスホクレアチン、１ｍｌあたり５０単位クレアチンホスホキナーゼ、４  ＭｇＡＴＰ、１０  ＥＧＴＡおよび１０  ＨＥＰＥＳ−ＣｓＯＨ（ｐＨ７．２）（ｍＭ単位）を含有した。浴溶液は、１４０  ＮａＣｌ、２．８  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ2、２  ＭｇＣｌ2および１０  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）（ｍＭ単位）を含有した。電流をＰｕｌｓｅ＋ＰｕｌｓｅＦｉｔソフトウェアーパッケージによって駆動されるＥＰＣ−９パッチクランプアンプ（ＨＥＫＡ  エレクトロニク、ランブレヒト、ドイツ）を用いて測定した。電流記録を３ｋＨｚ（−３ｄＢ）においてローパスフィルターし、１０ｋＨｚの速度でサンプリングした。漏れおよび静電容量性電流をＰ／ｎ法により、オンラインで修正した。
アフリカツメガエル卵母細胞に注入するためのラット脳Ｎａ+チャネルＩＩｃＲＮＡ［Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ.，１９８６］を、ＳＰ６プロモータを持つテンプレートを用いて合成した。注入して２−５日後に、電流を記録した。０．８−１．４ＭΩの抵抗を持つ記録ピペットを、アウトサイド−アウトパッチに関して１００ｍＭ  ＫＣｌ、１６ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１０．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）またはインサイド−アウトパッチに関してＮＦＲのいずれかで満たした。電流記録を、５ｋＨｚ（−３ｄＢ）においてローパスフィルターし、２０ｋＨｚにおいてサンプリングした。浴溶液は、アウトサイド−アウト記録に関して、ＮＦＲを含有し、インサイド−アウト記録に関して、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１６ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）を含有した。ＰＶＩＡは非常に疎水的であるので、該毒素の濃厚原液を浴室（０．８−１．２ｍｌ）にギルソンピペッターを用いて添加した。示された毒素濃度は、浴室中の最終濃度に対応する。
電位依存ナトリウムコンダクタンスの正常な急速不活性が抑制され、巨視的Ｎａ+電流の持続時間は延長される（図３Ａ−３Ｅ）。該Ｎａ+電流に対するδ−ＰＶＩＡの効果は、可逆的である（図３Ａ−３Ｃ中、ニューロンに関して示す）。ラット脳タイプＩＩＮａ+チャネルを発現する卵母細胞から切り取られたインサイド−アウトパッチの細胞質側に、δ−ＰＶＩＡを添加した場合、δ−ＰＶＩＡは何ら効果を有せず、このことは、該毒素がチャネル複合体上の細胞外部のサイトを標的していることを示唆している。該ペプチドは試験したＫ+チャネルサブタイプ（Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．４およびＳｈａｋｅｒ  Ｈ４））のいずれに対しても何ら効果を有さなかった。
２つの生理的プログラム：エキサイトトキシンショックｖｓ．神経筋ブロック
上記の電気生理学的結果は、コヌス・パパラセンスがサカナを刺した場合、ＳＴＯＰ症候群は、相乗効果的に作用する２つのペプチドによって獲物において誘発されることを示唆している。両者とも事実上、エクサイトトキシンである：ひとつはＮａ+の流入を増大し、一方、もうひとつはＫ+の流出を減少する。
かくして、ムラサキコーンはサカナを不動化（最終的には殺戮）するために２つの全く異なるプログラムを使用するようである。アセチルコリン受容体および電位依存性Ｎａ+チャネルを阻害する該毒素は、神経筋伝達伝達をブロックし、弛緩性麻痺を引き起こすための一般的毒液戦略の一部である。該フィン・ポッピングペプチド（κ−ＰＶＩＩＡ）およびロック・ジョーペプチド（δ−ＰＶＩＡ）は、該毒液によって誘発される代替エクサイトトキシンショックプログラムに関して鍵となる成分であり、これは即座に、獲物の剛直（弛緩性と対照的）麻痺をもたらす。コヌス・パパラセンスは、明らかに、神経筋伝達を阻害する高効力神経毒を発展させてから以降、何故、該カタツムリはさらにエクサイトトキシンを有する必要があったのだろうか。この問題に取り組むために、神経筋伝達を阻害する戦略の潜在的に制限された特徴のいくつかに取り組む必要がある。
神経筋ブロックを引き起こす協調プログラムの成分であるコノトキシンは、いくつかの方法で適正化できるようである。それらの小さなサイズおよびコンパクトな形状は、獲物の体内中への急速な拡散を容易にする［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｔ.，１９９０］。コノプレシン［Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ.，１９８７］のごとき毒液成分の存在は、神経筋接合部への神経毒の運搬を加速するさらなる毒液ペプチドの存在の可能性を示唆する。それにもかかわらず、不動化のスピードが獲物の補足の成功を制限するならば、神経筋ブロックプログラムに関して、重大な理論的欠点が未だに残っている。
サカナを不動化するためには、該神経毒を注入サイトから主要なヒレ筋肉組織へと運ぶことが、明かに必要であろう。必然的にこれに伴う遅延に加えて、伝達に関わるある種の生体成分の「セーフティーマージン」がさらなる限定要因であろう。神経筋伝達のブロッキングが、特定成分の９０％以上が機能的に阻害されていることを要求するならば、該サイトにおけるブロッキング毒の濃度は、該毒素の解離定数の１０倍より高くあるべきである。かくして、筋肉麻痺によって獲物を不動化するためには、係る神経毒は、適当な神経筋接合部に運ばれるだけでなく、そこで標的された生体成分の機能的阻害が高効率でなければならない。
対照的に、エクサイトトキシン戦略は、標的された分子成分（例えば、電位依存性ナトリウムチャネルおよびカリウムチャネル）の大部分にさえも作用する必要がないであろう。ある特定の回路において、程良くナトリウムチャネルを活性化して、程良くカリウムチャネルを阻害して、該標的回路が興奮するようにバランスを傾け、はるかに少ない毒素分子を要するようにする必要があるであろう。加えて、エクサイトトキシンは、獲物の体内中の遠方の神経筋接合部の替わりに毒液注入サイト（またはその極く近傍）において作用するかもしれない。強力な局所的脱分極は、いくぶんコンピュータを破壊するパワーサージのごとく、全生体を極度に急速に機能停止するのに充分であろう。該系統は回路図を水準化し、サカナの急速ノックアウトを開始する正確な生体反応を調査することが残っている。
かくして、獲物の不動化速度が主なる考慮事項ならば、エクサイトトキシンショックプログラムは、少なくとも２つの利点を有しているであろう。毒液注入の観点から、エクサイトトキシン効果は、活動電位の速度で伝達され得；対照的に、神経筋ブロッキングペプチドは、より一層ゆっくりと拡散するであろう。さらに、エクサイトトキシンショックは、血液脳関門によって妨害されないであろう；逃避反応中心のごときＣＮＳ制御回路は、急速に混乱され得る；対照的に、神経伝達ブロッカーは、末梢神経における複数の神経筋接合部に「神経中枢隔離」されるべきである。
他の毒性捕食動物、進化論的考察
該ＳＴＯＰ症候群は、サカナに特異的な表現であり、本明細書中、エクサイトトキシンショックと呼称する、より一般的な生理的戦略である。多くの毒性捕食動物に関して、神経筋ブロックおよびエクサイトトキシンショックは、二者択一の一般的生理的プログラムである；コヌス・パパラセンスは、両方を誘発する１つの毒を有している点で異常である。
いくつかの毒性捕食動物は、明らかに神経筋ブロックを使用する方に偏っているようである。かくして、コブラは、それらの毒液中の主要成分として、ニコチン性アセチルコリン受容体をブロックするα−ニューロトキシンを有する［Ｃｈａｎｇ，１９７９］。クモは、シナプス前カルシウムチャネルおよびシナプス後グルタメート受容体の両ブロッカーを有する［Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ，１９９４］。コヌス・ジオグラフス毒液において、全ての主要な麻痺毒素は、神経筋ブロックに寄与する［Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ.，１９８５］。かくして、これらのケースすべてに関して、エクサイトトキシンショックは、存在しないかまたは非常に些細な役割しか演じていないかのいずれかのようである−−神経筋ブロックは最も有力な生理的戦略である。
対照的に、他の毒性捕食動物は、主要な生理的プログラムとして、エクサイトトキシンショックを使用するようである。例えば、サソリは、Ｎａ+コンダクタンスを非常に増大し［Ｓｔｒｉｃｈａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ.，１９８７］、Ｋ+コンダクタンスを減少する［Ｃａｒｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９８２；Ｐｏｓｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ.，１９８２］強力な神経毒を有する。コヌス・グロリアマリス（Ｃｏｎｕｓ  ｇｌｏｒｉａｍａｒｉｓ）［Ｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９４］のごとき、ある種のカタツムリ・ハンティングコーンカタツムリは、毒液の主要成分としてＮａ+コンダクタンスを増大するであろうδ−コノトキシンを有する。イソギンチャクは、ナトリウムコンダクタンスを増大するペプチドおよび電位依存性カリウムチャネルインヒビターの両方を有する
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これら３つのケースで、該毒液は、強く（およびおそらく、専ら）エクサイトトキシンショックに集中するようである。
おそらく、獲物を迅速に不動化する能力がますます決定的になるほど、初期の捕獲の時に、獲物が機械的に完全に捕獲されることがより少なくなる。神経筋ブロックを用いる毒性捕食動物は、それらのだんだん麻痺していく獲物を「追跡」できるか、または概して、獲物を完全に捕獲しているかのいずれかである。コヌス・ジオグラフス（その獲物を捕らえるため網戦略を採用する）は、刺す前に、本質的にサカナを完全に飲み込んでしまう；より一層小さなサカナを捕食するウミヘビは毒液を注入するときその毒牙で獲物をしっかりと捕まえてしまうであろう。弛緩した獲物を飲み込むことは、疑いなく、堅く剛直なものを飲み込むことより好ましい。
対照的に、初期の機械的な獲物の捕獲が、より一層不安定（コヌス・パパラセンスのごときフック・アンド・ライン・ハンティングコーンカタツムリまたはイソギンチャクのごとく）であるか、または、さらに実存しない（電気魚類のごとく）ならば、１箇所で誘導される大規模な脱分極が必要な戦略であろう、特に、捕食動物が獲物を有効に追跡できないならば（すなわち、比較的動けない捕食動物および／または様々な方向に動ける獲物）。より一層動ける獲物に対して弱い保持力しか有さないイソギンチャクのごとき動物は、毒液中に、Ｎａ+コンダクタンスを増大し、Ｋ+コンダクタンスをブロックする根本的な神経毒を発達させ、神経筋ブロックを全く必要としなくなったのであろう。
本発明の方法および組成物が種々の具体例の形態に包含され得、そのうちのほんの少ししか本明細書に記載されていないことが理解されるであろう。
他の具体例が存在し、本発明の精神を逸脱していないことは当業者に明白であろう。かくして、記載された具体例は、例示的であり、制限的なものと解釈されるべきではない。
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配  列  表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション
（ｉｉ）発明の名称：コノトキシンペプチドＰＶＩＩＡ
（ｉｉｉ）配列の数：１
（ｉｖ）通信住所：
（Ａ）受信人：Venable, Baetjer, Howard & Civiletti, LLP
（Ｂ）通り：1201 New York Avenue, N.W., Suite 1000
（Ｃ）都市：Washington
（Ｄ）州：DC
（Ｅ）国：U.S.A.
（Ｆ）郵便番号：20005
（ｖ）コンピュータ判読フォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：IBM PC compatible
（Ｃ）オペレーテイング・システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：Word for Windows 6.0
（ｖｉ）最新出願データ
（Ａ）出願番号：ＷＯ
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先の出願データ
（Ａ）出願番号：US 08/619,936
（Ｂ）出願日：１９９６年３月１８日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人／代理事務所情報：
（Ａ）氏名：Saxe, Stephan A.
（Ｂ）登録番号：38,609
（Ｃ）参照／ファイル番号：24260-121389
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話：２０２−９６２−４８４８
（Ｂ）テレファックス：２０２−９６２−８３００
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２７
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：コヌス・パパラセンス
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：修飾サイト
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他の情報：／生成物＝”４Ｈｙｐ”
／記載＝”アミノ酸４は、４−トランス−ヒドロキシプロリンであり得る。”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ジスルフィド結合
（Ｂ）存在位置：１.．１６
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ジスルフィド結合
（Ｂ）存在位置：８.．２０
（ｘｉ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号：ジスルフィド結合
（Ｂ）存在位置：１５.．２６
（ｘｉ）配列：配列番号：１
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【図１ａ】
0003953110.tif 000015
【図１ｂ】
0003953110.tif 000016
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
0003953110.tif 000020
【図２ｃ】
0003953110.tif 000021
【図２ｄ】
0003953110.tif 000022
【図２ｅ】
0003953110.tif 000023
【図２ｆ】
0003953110.tif 000024
【図３Ａ】
0003953110.tif 000025
【図３Ｂ】
0003953110.tif 000026
【図３Ｃ】
0003953110.tif 000027
【図３Ｄ】
0003953110.tif 000028
【図３Ｅ】
0003953110.tif 000029
【図３Ｆ】
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