(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列(I)は(Ia)：
0004002608.tif 000016
はそれぞれαアミノ酸を示す］の１つにより規定されるペプチドであり、
該ペプチドは
６又は７個の疎水性アミノ酸を含み、
X6はトリプトファンを示し、
X3、X7及びX14は疎水性アミノ酸を示し、
X1、X2、X4及びX9は非疎水性アミノ酸を示し、
X15及びX16はアルギニン又はリジンを示し、
ただし、以下のペプチド：
−配列が別紙の配列リストで配列ID NO:1で示されるペプチド、
−X3及びX5がそれぞれバリンを示すペプチド、
は除かれる
ことを特徴とする、生細胞に貫入可能なペプチド。
【請求項２】
６個の疎水性アミノ酸と10個の非疎水性アミノ酸からなることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
X14はトリプトファン又はイソロイシンを示すことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
細胞の機能に関し活性な分子を培養生細胞に導入するための請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項５】
細胞の機能に関し活性な分子を生細胞に導入するための細胞内アドレス用ベクターを製造するための請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項６】
細胞の機能に関し活性な分子がペプチドであることを特徴とする請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
細胞の機能に関し活性な分子がヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４又は５に記載の使用。
【請求項８】
X3、X7及びX14の位置のアミノ酸の少なくとも１つがプロリンである式Ｉのペプチドを用いることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
細胞の機能に関し活性なペプチド又はヌクレオチドを生細胞に導入するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドと細胞の機能に関し活性なペプチド又はヌクレオチドとの融合産物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、細胞膜を通過し、細胞の様々な画分に達することができるペプチドの群に関する。
生細胞への薬理学的性質を有する様々な物質の侵入及び様々な細胞内画分、特に細胞質画分ならびに核画分へのその接触は、研究ならびに治療上の両方の使用に非常に重要な問題である。
細胞内画分へポリペプチド及びオリゴヌクレオチドのような物質を導入する方法は、限られたものが現在知られている。様々な技術が現在提案されているなかで、以下のものがあげられる：
1．遺伝子のトランスフェクション、インビボ又はインビトロでトランスフェクション速度を促進させることができる派生技術(例えばリン酸カルシウムを用いる沈降)、カチオン性脂質の使用、エレクトロポレーション、トリチュレーション(負荷切屑(scrape 1oading))、ウイルスベクターの使用など、
2．細胞膜レセプターへの結合(これらのレセプターは、連続的に飲食作用を受け、細胞質画分に結合分子を放出する。この種類に、葉酸塩レセプター、ジフテリア毒素又はHIVレトロウイルスのTATタンパク質のような転写因子が挙げられ得る。これらのレセプターの関与する輸送機構はまだあまり知られていないが、全ての場合に飲食作用の段階を必要とする)、
3．ホメオドメインタイプのペプチド。転写因子アンテナペディア(AntpHD)のホメオドメインに関し本発明者らのチームで行われた以前の研究により、ホメオドメインペプチドがエネルギー独立の方法で原形質膜を通過し、このために飲食作用と区別されることが示された。ホメオドメインペプチドの第3ヘリックスは、同一の性質を有する[ジョリオットら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88,P.1864〜1868(1991);デソーリら、J.Biol.Chem.269,14,p.10444〜10450,(1994)]。
これらの性質は、遺伝子融合又は生化学的結合でホメオドメイン又は第3ヘリックスに結合する細胞、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチドで内在化に用いられる[ペレッツら、J.Cell.Science,102,p.712〜722,(1992)]。この侵入は定量的であり、ベクターとその負荷は100％の細胞で見られる。さらに、内在化は関係する細胞タイプとは独立している。
膜を通過し、他のペプチド又はオリゴヌクレオチドのベクターとして役立つことができるホメオドメインの最小のフラグメントは、第3ヘリックスに対応する16アミノ酸のペプチドである。ホメオドメインの43〜58のアミノ酸からなるこのペプチドを、以下のように名づけた。例として、ホメオドメインAntpの43〜58のペプチド配列は、
0004002608.tif 000002
である。この配列は、別紙の配列リストで配列ID No:1で示す。
このペプチドが生細胞に貫入する機構は、様々な研究の対象となっており、これまでそのα-ヘリックス構造が内在化に必須であると想定されていた。本発明者らのチームは、ペプチドの構造を改変したペプチド配列のある種の置換体又は欠損体は、該ペプチドの活性を阻害することを以前に示している。例えば、2つのTrp(48と56)を2つのPheで置換したペプチド又はホメオドメインの41〜55のアミノ酸からなるペプチドは、内在化されない[デソーリら、1994年、上記刊行物]。別のチーム[ブルギドウら、Biophys.Biochem.Res.Com.,214:2,pp685〜693,(1995)]は、43〜58のペプチドの構造類似体を構成するペプチドの内在化を観察し、43〜58のペプチド(45と47の位置の2つのイソロイシンをバリンで置換するホメオドメインAntpの43〜58のペプチドとは異なる)からレトロ-インバース(retro-inverse)タイプの変異体を構築した。天然のペプチドの三次元構造をまねることができるレトロ-インバースの変異体は、再産生されるペプチドと逆の配列にしたがって結合する(天然のペプチドのL系アミノ酸の代わりの)D系アミノ酸からなる。
本発明者らは、内在化にベクターとして役立ち、ポリペプチドならびにオリゴヌクレオチドのアドレスが可能なアミノ酸配列の最小限の特徴を定義づけるため研究し、この目的のために、ある種の残基を特異的に改変して幾つかのペプチドを合成した。
本発明の対象は、以下の配列(I)又は(Ia):
0004002608.tif 000003
はそれぞれαアミノ酸を示し、ペプチドは6〜10個の疎水性アミノ酸を含み、以下のペプチド：
-配列が別紙の配列リストで配列ID NO:1で示されるペプチド、
-X3及びX5がそれぞれバリン残基を示すペプチド、
を除いて、X6がトリプトファンを示すことを特徴とする]
の1つに対応するペプチドである。
疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンである。
本発明によるペプチド構造に入るアミノ酸残基は、非疎水性アミノ酸であり、極性アミノ酸(グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン)、酸性アミノ酸(アスパラギン酸もしくはグルタミン酸)又は塩基性アミノ酸(リジン、アルギニンもしくはヒスチジン)、又はこれら3種類のアミノ酸の組合わせであってもよい。
本発明によるペプチドの具体例によれば、ペプチドは6個の疎水性アミノ酸と10個の非疎水性アミノ酸からなることが好ましい。
極性又は負荷の非疎水性アミノ酸、及び疎水性アミノ酸の結合は、本発明者らにより行われる実験によれば、本発明のペプチドの性質に必須であるとみられる両親媒性の特徴を与える。さらに、これらの実験により、細胞内輸送に必須である他の特徴が明らかにされ、
-細胞内輸送は、特異的なレセプターを必要とせず、このために全ての細胞タイプに作用することができ、
-αヘリックス構造は、細胞内輸送で役割を果たさず(しかし、核のアドレスでは確実に役割を果たし)、
-他方、Trp残基の存在のみならずペプチドの両親媒性の性質は、輸送に重要であるらしい
ことが示された。
本発明のペプチドは、ペプチド鎖に沿って交互に分布した1〜6個の非疎水性アミノ酸及び1〜6個の疎水性アミノ酸を含む配列からなることが好ましい。
本発明のペプチドの他の具体例によれば、X1、X2、X4、X9、X15及びX16は非疎水性アミノ酸であり、X3、X7及びX14は疎水性アミノ酸である。この具体例の好ましい特徴によれば、X14はトリプトファン又はイソロイシンを示す。
本発明のペプチドの細胞内貫入の性質は、ホメオドメインペプチドの第3ヘリックスの性質に匹敵しており、内在化、及び細胞の機能に活性な分子、特に他のペプチド又はヌクレオチド配列の生細胞への導入用の細胞内アドレスベクターとしてのその使用を可能にする。
導入が望まれる活性分子の、より詳しくは細胞質のアドレスを得るためには、X3、X7及びX14の位置のアミノ酸の少なくとも1つがプロリンである本発明のペプチドの使用が好ましいだろう。
本発明の実施のために、輸送されるポリペプチド又はオリゴヌクレオチドは、本発明のペプチドに結合される。
本発明のペプチドと他のペプチド配列、又はオリゴヌクレオチド配列との融合産物は、それ自体公知である異なる方法により得ることができる。ポリペプチドの場合には、例えば従来の遺伝子工学又はペプチド合成技術を用いることができる。オリゴヌクレオチドの場合は、例えばルメイトルら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,648〜652,(1987)]又はマツエダら[Chemistry Letters,p.951〜952,(1978)及びInt.J.of Peptide and Protein Research, p.107〜112(1986)]に記載の技術を用いることができる。
本発明は、本発明による様々なペプチドの性質を示す実施例を言及する以下の付加的な記載でより明らかに理解されるであろう。
しかしながら、この実施例は、本発明の対象の例証にのみ挙げられるものであり、いかなる方法でもその限定を成すものでないと理解されるべきである。
実施例
その配列が、配列ID NO:1〜配列ID NO:10の別紙の配列リストで示される10個のペプチドを合成した。さらに、これらのペプチド全てのN末端にアミノペンタノイックのアームとビオチンを付与し、それらの内在化をモニターできるようにした。このようにして改変したペプチドを以下の表I及び表IIに示す。
0004002608.tif 000004
0004002608.tif 000005
表Iの説明
43〜58：ペプチド第3ヘリックス
41〜55：対照：非内在化ペプチド(デソーリら(1994年)を参照)
58〜43：逆配列
43〜58D：D系アミノ酸からなるペプチド第3ヘリックス43〜58
Pro50：50に(Glnの代わりに)プロリンを有するペプチド43〜58
3Pro：45、50及び55の位置のそれぞれIle、Gln及びLys残基の代わりに3個のプロリンを有するペプチド43〜58
表IIの説明
Met-Arg：52に(Argの代わりに)Met、54に(Metの代わりに)Argを有するペプチド43〜58
7Arg：46を除くリジンの全てがArgに置換されるペプチド43〜58
W/R：本質的にTrpとArgの連続からなる高度に改変したペプチド43〜58
L/R：Trpの代わりにLeuを有するペプチドW/R
培養中の細胞へのこれらの様々なペプチドの侵入は、デソーリらによる記載[1994年、上記刊行物]と同一の方法を用いて、同じ条件下で研究した。
培養中の神経細胞又は繊維芽細胞へのペプチドの侵入は、4℃と37℃で調べた。
表Iのペプチドの侵入は、共焦点顕微鏡、ゲル電気泳動及びELISAで試験した。
表IIのペプチドの侵入は、共焦点顕微鏡のみで試験した。実際に、これらのペプチドはリジンがないので、付着を非常に難しくし、このためにろ過又はELISA試験での転移(多重洗浄(multiple washes))に不適当な急速な観察を要する。
1)ペプチド43〜58、58〜43、D43〜58、Pro50ならびに3Proの37℃と4℃での内在化
E15の胚皮質細胞(1.1x106細胞/ml)を、量IXに対し44μMの濃度のペプチド43〜58、58〜43、D43〜58、Pro50ならびに3Proと、又はペプチドなし(ウェルC)で37℃又は4℃で2時間インキュベートした。
インキュベート培地及びトリプシンで洗浄後の細胞におけるペプチドの存在を、12〜22％のSDS-PAGEの電気泳動ゲル及びエレクトロトランスファーで分析した。
結果を図1A、1B(37℃)及び2(4℃)に示す。
図1の説明：
A:生物発光(ルミノール(登録商標)、アマーシャム)で標識後の細胞抽出物のオートラジオグラム
B:生物発光で標識後のインキュベート培地のオートラジオグラム
図2の説明：
ウェルSPは、1μlの物質Pのゲル上の負荷に対応する。
41〜55を除く表Iのすべてのペプチドを4℃と37℃で内在化させ、細胞で回収する。ペプチド43〜58は、4℃でなく37℃で分解(約50％)する。
2)ペプチド43〜58、51〜55、58〜43、D43〜58、Pro50ならびに3Proの37℃と4℃での細胞の局在化
E15の皮質及び線条細胞を2日間25,000細胞/cm2の密度でカバーグラス上で培養する。最終濃度20μMのペプチド全てを加える。37℃で2時間インキュベート後、細胞を洗浄、固定し、ビオチンの存在を蛍光ストレプトアビジン(streptavidin)で示す。共焦点顕微鏡で観察した切片を図3(37℃)及び図4(4℃)に示す。ペプチドを組み込んだ細胞は、黒地に蛍光を示すようである。
図3の説明：
1：ペプチド43〜58、           2：ペプチド58〜43、
3：ペプチドD43〜58、          4：ペプチドPro50、
5：ペプチド3Pro、             6：ペプチド41〜55．
図4の説明：
1：ペプチド43〜58、           2：ペプチド58〜43、
3：ペプチドD43〜58、          4：ペプチドPro50、
5：ペプチド3Pro、             6：ペプチド41〜55．
プロリンの存在(Pro50又は3Pro)は、内在化を妨げないが、核のアドレスを阻害するようである。試験したペプチドの侵入は、繊維芽細胞でも観察される(データ示さず)。
3)ペプチド43〜58、51〜55、58〜43、D43〜58、Pro50ならびに3Proの37℃と4℃で内在化の比色検定
E15(B)又はE16(A)の皮質及び線条細胞を、量IXに対し17μM(A)又は44μM(B)の濃度のペプチドと、又はペプチドなし(9)でインキュベートした(1.1x106細胞/ml)。細胞を0.5M NaCl(A)又はトリプシン(B)で洗浄した。それらをELISAプレートで培養、固定し、ビオチニル化ペプチドをストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼの着色基質(PNPP)を用いて示した。
結果を図5A及び5Bに示す。
図5A及び5Bの説明：
A：37℃で実験
B：4℃で実験
1：ペプチド43〜58  1X
2：ペプチド43〜58  4X
3：ペプチド58〜43  1X
4：ペプチドD43〜58
5：ペプチドPro50
6：ペプチド3Pro
7：ペプチド41〜55  1X
8：ペプチド41〜55  4X、Aには存在しないサンプル
9：ペプチドなし
4)ペプチドMet-Arg、W/RならびにL/Rの37℃での内在化
E15の皮質及び線条細胞を2日間25,000細胞/cm2の密度でカバーグラス上で培養する。ペプチド43〜58に対し最終濃度20μMのペプチド、他に対し2μMのペプチドを加え、細胞を37℃で2時間インキュベートする。細胞を洗浄、固定し、ペプチドのビオチンをストレプトアビジン-FITCで示す。結果を図6に示す。
図6の説明：
1：ペプチド 7Arg
2：ペプチド Met-Arg
3：ペプチド W/R
4：ペプチド L/R
Met-Arg、7Arg及びW/Rの内在化及び細胞質ならびに核のアドレスを観察する。しかしながら、ペプチドL/Rは、明らかに小胞タイプの画分、おそらく飲食作用の特徴である画分に見られる。
結果
表Iのペプチドを用いて得た結果から、以下を結果づけることができる：
-内在化は、ペプチド58〜43及び43〜58Dが内在化されるので、レセプターを必要としない。しかしながら、最初は、(たとえその一般的な両親媒性のヘリックス構造が保存されているとしても)初期ペプチドとは異なる配列を有しており、D系アミノ酸からなるペプチドは、L系アミノ酸からなる天然のレセプターと相互作用しない；
-αヘリックス構造は、3のプロリン及びフォルティオリ(fortiori)の導入がらせん性を破壊するため不要である。しかしながら、プロリンの付加は核のアドレスを阻害し得ることに注意すべきである。
表IIのペプチドに関し、得た結果から以下が結果づけられ得る：
-両親媒性は内在化に必要であるが、L/RがW/Rの性質を有しないため十分ではない；
-Trp残基の存在ならびに位置は重要である。
また、本発明者らは、(Ile残基で置換される)56にTrp残基を有さないが、48にそれを保存する波形の(Engrailed)ホメオタンパク質のホメオドメインの内在化も決定したので、それからTrp48のみが輸送に重要であることを結論づけることができる。
配列リスト
(1)一般情報：
(i)出願人：
(A)名称：サントル  ナショナル  ドゥ  ラ  ルシェルシェサイエンティフィック  -C.N.R.S.
(B)通り：リュ  ミシェル  アンジュ  3、
(C)都市：パリ
(E)国：フランス
(F)郵便番号(ZIP)：75794 セデックス  16
(A)名前：シャサン  ジェラール
(B)通り：プラス  スアン  11、
(C)都市：パリ
(E)国：フランス
(F)郵便番号(ZIP)：75013
(A)名前：プロシアンツ  アラン
(B)通り：リュ  マリエ-パップ  カルペンティエール  8、
(C)都市：パリ
(E)国：フランス
(F)郵便番号(ZIP)：75006
(ii)発明の名称：活性分子の細胞内アドレス用ベクターとして利用可能なペプチド
(iii)配列数：10
(iv)コンピュータ読み取り可能な形態：
(A)媒体の型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC コンパチブル
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエア：パテントインリリース#1.0、
バージョン#1.30(EPO)
(vi)先行出願データ：
(A)出願人のナンバー：FR 95 11714
(B)出願日：1995年10月5日
(2)配列ID NO:1:の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ：16アミノ酸、
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:1:
0004002608.tif 000006
(2)配列ID NO:2:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:2:
0004002608.tif 000007
(2)配列ID NO:3:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:3:
0004002608.tif 000008
(2)配列ID NO:4:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(ix)特徴：
(A)名称/キー：ペプチド
(B)位置：1..16
(D)他の情報：/産物＝“D系アミノ酸”
(xi)配列の記載：配列ID NO:4:
0004002608.tif 000009
(2)配列ID NO:5:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:5:
0004002608.tif 000010
(2)配列ID NO:6:の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:6:
0004002608.tif 000011
(2)配列ID NO:7:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:7:
0004002608.tif 000012
(2)配列ID NO:8:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:8:
0004002608.tif 000013
(2)配列ID NO:9:の情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:9:
0004002608.tif 000014
(2)配列ID NO:10:の情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：ペプチド
(xi)配列の記載：配列ID NO:10:
0004002608.tif 000015
【図１】
0004002608.tif 000017
【図２】
0004002608.tif 000018
【図３】
0004002608.tif 000019
【図４】
0004002608.tif 000020
【図５】
0004002608.tif 000021
【図６】
0004002608.tif 000022