(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための多機能分子複合体であって、（Ａ）該核酸組成物；および（Ｂ）該核酸組成物に対して結合した１種類またはそれ以上のカチオンポリアミン成分を含む運搬部分を組み合わせて含み、該成分はそれぞれ独立して、式（１）
ＮＲ（Ｒ3）-［-（ＣＲ1Ｒ2）m-Ｎ（Ｒ3）-］n-（ＣＲ1Ｒ2）m-ＮＲ（Ｒ3）      （１）
［式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；
それぞれの場合のｍは、独立して、２〜５までの整数から選択され；
ｎは、１〜２までの整数から選択され；
Ｒ3は、独立して、水素；Ｃ1-6アルキル；および１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であって、
（ａ）-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3
（式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；ｊは、６〜２４までの整数であり；そしてＢは、場合により不存在であるか、または式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
を有する架橋基であり、ここにおいて、
ｋは、独立して、１〜６までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；そしてＺは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；
（ｂ）-Ｂ-（Ｒ4）Ｒ
（式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；Ｂは不存在ではありえないし且つ上記（ｉ）〜（iv）までの基と、更に、式
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
を有する基とから独立して選択される架橋基であり、ここにおいて、
ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は、独立して、
（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；
（ii）式（２）を有するコール酸誘導体、
0003925815.tif 000055
ここにおいて、
0003925815.tif 000056
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6は、-Ｈ、-ＯＨ、-ＣＯ2Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＮＨ2または-Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈであり、ここにおいて、ｎ’は１〜６までの整数であり；
Ｒ7は、-Ｃ1-6アルキル-または-Ｃ1-6アルキルカルボニル-を含む、該コール酸誘導体の結合点を形成する基であり；そして
Ｒ8はＣ1-6アルキルである；および
（iii）式（３）を有するコレステリル誘導体、
0003925815.tif 000057
ここにおいて、
0003925815.tif 000058
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6aは、-Ｃ1-6アルキル-、-ＯＣ（＝Ｏ）-または-ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）-を含む、該コレステリル誘導体の結合点を形成する基であり；
Ｒ7aは、Ｃ1-6アルキルであり；そして
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキルである
から成る群より選択される）；
但し、Ｒ3は、少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の少なくとも１個の窒素原子に対して結合した１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であるという条件付きであり；そして
場合により、Ｒ3は、該１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分が結合している少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の別の窒素原子に対してかまたは、そこにいずれのエンドソーム膜破壊促進成分も結合していない少なくとも一つの別のポリアミン成分の窒素原子に対して結合した、以下に定義の１個またはそれ以上の基であってよい；
（ｃ）-Ｂ-（Ｒ5）Ｒ
（式中、Ｂは不存在ではありえないし且つ（ｉ）〜（ｖ）までの基から独立して選択される架橋基であり；Ｒは独立して、上記のように定義され；そして
Ｒ5は、
（ｉ）Ｄ-ビオチン；
（ii）β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
（iii）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（iv）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（ｖ）５-メチルテトラヒドロ葉酸；
（vi）葉酸；
（vii）フォリン酸；
（viii）α-３’-プロピオニルチオマンノシド；および
（ix）α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸
から成る群より独立して選択される受容体特異的結合成分である）
から成る群より独立して選択される上記エンドソーム膜破壊促進成分から成る群より選択される］
を有するカチオンポリアミンを含む、上記複合体。
【請求項２】
それらの基Ｒ3の少なくとも一つが、式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3を有し、ここにおいて、Ｂは不存在であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は定義の通りであり；そしてｊは定義の通りである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
Ｒ、Ｒ1およびＲ2が、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｍは３または４であり；ｎは１又は２であり；そして請求項２の式に対して、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；そしてｊは８〜１８までの整数である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
ｊが８〜１２までの整数である請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
基Ｒ3の二つが、式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3を有する請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
それらの基Ｒ3の少なくとも一つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ4）Ｒを有し、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は定義の通りであり；ｊ’は定義の通りであり；ＸはＮであり；そしてＲ4は、（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；および（ii）コール酸並びに３α，７α，１２α-トリヒドロキシ-５β-コラン-２４-オイックエステルおよびアミドから成る群より選択される誘導体から成る群より独立して選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
Ｒ、Ｒ1およびＲ2が、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｍは３または４であり；ｎは１又は２であり；そして請求項６の式に対して、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｊ’は２〜４までの整数であり；そしてＲ4は、３α，７α，１２α-トリヒドロキシ-５β-コラン-２４-オイックエステルおよびアミドである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
基Ｒ3の二つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ4）Ｒを有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
基Ｒ3の少なくとも一つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ4）Ｒを有し、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は定義の通りであり；ｊ’は定義の通りであり；ＸはＯまたはＳであり；そしてＲ4は、（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；および（ii）コレステリル並びにコレスト-５-エン-３’-β-カーボネート、-β-カルバメートおよび-β-メチレンカルボキサミドから成る群より選択される誘導体から成る群より独立して選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｒ、Ｒ1およびＲ2が、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｍは３または４であり；ｎは１又は２であり；そして請求項９の式に対して、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｊ’は２〜４までの整数であり；そしてＲ4は、コレスト-５-エン-３’-β-カーボネート、-β-カルバメートまたは-β-メチレンカルボキサミドである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
基Ｒ3の二つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ4）Ｒを有する、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
定義のエンドソーム膜破壊促進成分であることに加えて、基Ｒ3の少なくとも一つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ5）Ｒを有し、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、定義の通りであり；ｊ’は定義の通りであり、そしてＲ5は、
（ｉ）Ｄ-ビオチン；
（ii）β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
（iii）Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン；
（iv）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（ｖ）５-メチルテトラヒドロ葉酸；
（vi）葉酸；
（vii）フォリン酸；
（viii）α-３’-プロピオニルチオマンノシド；および
（ix）α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸
から成る群より独立して選択される受容体特異的結合成分である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｒ、Ｒ1およびＲ2が、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｍは３または４であり；ｎは１又は２であり；そして請求項１２の式に対して、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それらが存在する場合はいつでもそれぞれ水素であり；ｊ’は２〜４までの整数であり；そしてＲ5は、
（ｉ）Ｄ-ビオチン；
（ii）β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
（iii）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（iv）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（ｖ）５-メチルテトラヒドロ葉酸；
（vi）葉酸；
（vii）フォリン酸；
（viii）α-３’-プロピオニルチオマンノシド；および
（ix）α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸
から成る群より独立して選択される受容体特異的結合成分である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
基Ｒ3の二つが、式-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ（Ｒ5）Ｒを有する、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための自己集合性デリバリーシステムであって、簡単に混合することによって互いに且つ化学的に結合して分子複合体にすることができる下記の別々の成分、（Ａ）運搬される該核酸組成物；および（Ｂ）運搬部分であって、請求項１に記載の式（１）を有するカチオンポリアミンを含む、該核酸組成物に対して結合されうるカチオンポリアミンを含む、該核酸組成物に対して結合しうるカチオンポリアミン成分を含む上記運搬部分を含む、上記自己集合性デリバリーシステム。
【請求項１６】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のためのデリバリーシステムを形成するように、簡単に混合することによって該核酸組成物と一緒にすることができるし且つ該核酸組成物に化学的に結合して分子複合体を形成することができる運搬部分であって、請求項１に記載の式（１）を有するカチオンポリアミンを含む、該核酸組成物に対して結合されうるカチオンポリアミンを含む、該核酸組成物に対して結合しうるカチオンポリアミン成分を含む、上記運搬部分。
【請求項１７】
標的細胞に対する核酸組成物の生体外（in vitro）運搬方法であって、該標的細胞と請求項１に記載の多機能分子複合体とを接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項１８】
前記標的細胞に対して運搬される核酸組成物が、ペプチド若しくはタンパク質をコードするまたは核酸分子の鋳型として役立つヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチド、タンパク質または核酸分子が、治療薬；ワクチン；食品および栄養補充品；農学的に重要な化合物；除草剤および植物成長調節剤；殺虫剤；殺ダニ剤；殺鼠剤；および殺真菌剤；動物の健康に有用な化合物；殺寄生生物薬；抗線虫薬から成る群より選択される、工業的、商業的および科学的価値がある製品である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞が、細菌の微生物細胞、酵母、植物または哺乳動物細胞を含む宿主細胞の培養物であり；該細胞培養物が、生産されるペプチド、タンパク質または機能性核酸分子の生産を最大限にする発酵技術にしたがって維持されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸組成物が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み且つ調節配列に対して機能的に結合している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
核酸組成物が、免疫応答が望まれる抗原のエピトープと同一であるかまたは実質的に同様である少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が調節配列に対して機能的に結合している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子が病原性ウイルス由来のペプチド又はタンパク質をコードし、そして該ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ；インフルエンザウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、ＨＡＶ；Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ；Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ；ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＰＶ；単純ヘルペス１型ウイルス、ＨＳＶ１；単純ヘルペス２型ウイルス、ＨＳＶ２；サイトメガロウイルス、ＣＭＶ；エプスタイン・バールウイルス、ＥＢＶ；ライノウイルス；およびコロナウイルスから成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸分子が、腫瘍遺伝子ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、ｒａｓ、ｓａｒｃ、ｎｅｕおよびｔｒｋのタンパク質産物；トランスロケーション遺伝子ｂｃｌ／ａｂｌのタンパク質産物；Ｐ５３；ＥＧＲＦ；Ｂ細胞リンパ腫によって作られた抗体の可変部；およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変部、から成る群より選択される標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が、Ｂ細胞に媒介された自己免疫疾患に関与する抗体の可変部；およびＴ細胞に媒介された自己免疫疾患に関与するＴ細胞受容体の可変部から成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸分子が、酵素、構造タンパク質、サイトカイン、リンホカインおよび成長因子から成る群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
核酸組成物を含有する請求項１に記載の多機能分子複合体の薬学的に許容しうる塩およびエステル形を含めた該分子複合体を、薬学的に許容しうる担体と一緒に含む、薬剤組成物。
【請求項２９】
前記核酸分子が、病原体抗原のエピトープと同一であるまたは実質的に同様である少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質；高増殖性細胞に関係したタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同様であるエピトープを含むタンパク質；自己免疫疾患を生じるまたは特徴付ける細胞に関係したタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同様であるエピトープを含むタンパク質；個体中の失われた、非機能性または部分的に機能性のタンパク質を、存在することで補償するであろうタンパク質；および個体に対して治療効果を生じるタンパク質から成る群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
リン酸緩衝溶液であるかまたは、等張性のための添加剤が、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースから成る群より選択されるメンバーである等張配合物を含む、実質的に無菌であり且つ発熱物質不含であり、そして筋肉内注射用に適している、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
ゼラチンおよびアルブミンである安定化剤；並びに血管収縮薬を更に含有する、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２、繊維芽細胞成長因子、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン並びにヒアルウロン酸などの成長因子、サイトカインおよびリンホカインから成る群より選択される１種類またはそれ以上のメンバーを更に含有する、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
エマルジョンとしてコラーゲンと混合されてＤＮＡの徐放のための手段を与える、実質的に無菌であり且つ発熱物質不含であり、そして非経口注射用に適している、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
ＤＮＡ約１００μｇがコラーゲン１ｍｌと混合されている、請求項３３に記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容しうる担体が、溶媒、溶媒系、可溶化剤および分散助剤、界面活性剤、乳化剤、粘度調整剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、抗菌薬並びに緩衝剤を含む認可された医薬品等級の賦形剤から成る群より選択される１種類またはそれ以上のメンバーである、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
核酸組成物を含む容器、および請求項１６に記載の運搬部分を含む容器を含む薬剤キット。
【請求項３７】
賦形剤、担体、保存剤およびビヒクルを更に含有する、請求項３６に記載の薬剤キット。
【請求項３８】
前記核酸組成物が、病原体抗原のエピトープと同一であるまたは実質的に同様である少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質；高増殖性細胞に関係したタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同様であるエピトープを含むタンパク質；自己免疫疾患を生じるまたは特徴付ける細胞に関係したタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同様であるエピトープを含むタンパク質；個体中の失われた、非機能性または部分的に機能性のタンパク質を、存在することで補償するであろうタンパク質；および個体に対して治療効果を生じるタンパク質から成る群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項３６に記載の薬剤キット。
【請求項３９】
Ｒ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3を有し、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは、６〜２４までの整数であり；そしてＢは、式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
（式中、ｋは、独立して、１〜６までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；そしてＺは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）
を有する架橋基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４０】
Ｒ3が式-Ｂ-（Ｒ4）Ｒを有し、ここにおいて、Ｒは、独立して、定義の通りであり；そしてＢは、
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
（式中、ｋは、独立して、１〜６までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；そしてＺは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；および
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
（式中、ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は定義の通りである）
から成る群より独立して選択されるメンバーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項４１】
Ｒ3が式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒを有し、ここにおいて、Ｒは、独立して、定義の通りであり；そしてＢは、
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
（式中、ｋは、独立して、１〜６までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；そしてＺは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；および
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
（式中、ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ5は定義の通りである）
から成る群より独立して選択されるメンバーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項４２】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための多機能分子複合体であって、（Ａ）該核酸組成物を、（Ｂ）運搬部分に非共有結合させることを含み、ここで該運搬部分は該核酸組成物に対して結合した１種類またはそれ以上のカチオンポリアミン成分を含み、それぞれ独立して、式
ＮＨ2-（ＣＨ2）3-Ｎ（Ｒ3）-（ＣＨ2）4-ＮＨ2
［式中、Ｒ3は、
（ａ）−Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3
（式中、Ｒは、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され、またはＣ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族であるか若しくは不存在であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；ｊは、０〜２４までの整数であり；そしてＢは、場合により不存在であるか、または式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
を有する架橋基であり、ここにおいて、
ｋは、独立して、１〜１１までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；そしてＺは、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；そして
（ｂ）-Ｂ-（Ｒ4）Ｒ
（式中、Ｒは、独立して、上記のように定義されるかまたは不存在であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；Ｂは不存在ではありえないし且つ上記（ｉ）〜（iv）までの基と、更に、式
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
を有する基とから独立して選択される架橋基であり、ここにおいて、
ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は、独立して、
（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；
（ii）式（２）を有するコール酸誘導体、
0003925815.tif 000059
ここにおいて、
0003925815.tif 000060
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6は、-Ｈ、-ＯＨ、-ＣＯ2Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＮＨ2または-Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈであり、ここにおいて、ｎ’は１〜６までの整数であり；
Ｒ7は、-Ｃ1-6アルキル-または-Ｃ1-6アルキルカルボニル-を含む、該コール酸誘導体の結合点を形成する基であり；そして
Ｒ8はＣ1-6アルキルである；および
（iii）式（３）を有するコレステリル誘導体、
0003925815.tif 000061
ここにおいて、
0003925815.tif 000062
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6aは、-Ｃ1-6アルキル-、-ＯＣ（＝Ｏ）-または-ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）-を含む、該コレステリル誘導体の結合点を形成する基であり；
Ｒ7aは、Ｃ1-6アルキルであり；そして
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキルである
から成る群より選択される）；
但し、Ｒ3は、少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の少なくとも１個の窒素原子に対して結合した１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であるという条件付きであり；そして
場合により、Ｒ3は、該１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分が結合している少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の別の窒素原子に対してかまたは、そこにいずれのエンドソーム膜破壊促進成分も結合していない少なくとも一つの別のポリアミン成分の窒素原子に対して結合した、以下に定義の１個またはそれ以上の基であってよい；そして
（ｃ）-Ｂ-（Ｒ5）Ｒ
（式中、Ｂは不存在ではありえないし且つ（ｉ）〜（ｖ）までの基から独立して選択される架橋基であり；Ｒは独立して、上記のように定義され；そして
Ｒ5は、
（ｉ）Ｄ-ビオチン；
（ii）β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
（iii）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（iv）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（ｖ）５-メチルテトラヒドロ葉酸；
（vi）葉酸；
（vii）フォリン酸；
（viii）α-３’-プロピオニルチオマンノシド；
（ix）α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸；および
（x）細胞膜タンパク質に特異的に結合する抗体
から成る群より独立して選択される受容体特異的結合成分である）
から成る群より独立して選択される式のエンドソーム膜破壊促進成分である］
のカチオンポリアミンを含む、上記複合体。
【請求項４３】
Ｒ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｃ（Ｒ）3のＣ6Ｈ5芳香族であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは１であり；そして、Ｂは式：−（ＣＲ1Ｒ2）k−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−であり、ここにおいてｋは５であり；およびＺはＯである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４４】
Ｒ3が式-Ｂ-（Ｒ4）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり；Ｒは不存在であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｋは５であり、Ｚは不存在であり；そして、Ｒ4は融合誘導ペプチドである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４５】
Ｒ3が式-Ｂ-（Ｒ4）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-を有する架橋基であり；Ｒは不存在であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊ’は５であり、ＸはＮ（Ｒ）であり；そして、Ｒ4はコール酸であり、ここにおいてＲ6はＯＨであり、Ｒ7はＣ3アルキルカルボニルであり、そしてＲ8はＣ1アルキルである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４６】
Ｒ3が式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｒは存在し、そしてＢは式：−（ＣＲ1Ｒ2）k−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−を有する架橋基であり；ここにおいてＲ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｋは５であり、Ｚは不存在であり；そして、Ｒ5はα−３’−プロピオニルチオマンノシドである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４７】
Ｒ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3-のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｃ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは１であり、そして、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり；ｋは５であり、Ｎ（Ｒ）はＮＨであり、およびＺはＯである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４８】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための多機能分子複合体であって、（Ａ）該核酸組成物を、（Ｂ）運搬部分に非共有結合させることを含み、ここで前記運搬部分は前記核酸組成物に対して結合した１種類またはそれ以上のカチオンポリアミン成分を含み、それぞれ独立して、式
ＮＨ（Ｒ30）−（ＣＨ2）3−Ｎ（Ｒ3）−（ＣＨ2）4−Ｎ（Ｒ3）−ＮＨ（Ｒ30）
［式中、Ｒ30は水素であり、またはＮＨ（Ｒ30）はグアニジノであり；
少なくとも１つのＲ3は、
（ａ）式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3
（式中、Ｒは、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され、またはＣ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族であるか若しくは不存在であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；ｊは、０〜２４までの整数であり；そしてＢは、場合により不存在であるか、または式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
を有する架橋基であり、ここにおいて、
ｋは、独立して、１〜１１までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；そしてＺは、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；そして
（ｂ）-Ｂ-（Ｒ4）Ｒ
（式中、Ｒは、独立して、上記のように定義されるかまたは不存在であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；Ｂは不存在ではありえないし且つ上記（ｉ）〜（iv）までの基と、更に、式：
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
を有する基とから独立して選択される架橋基であり、ここにおいて、
ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は、独立して、
（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；
（ii）式（２）を有するコール酸誘導体、
0003925815.tif 000063
ここにおいて、
0003925815.tif 000064
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6は、-Ｈ、-ＯＨ、-ＣＯ2Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＮＨ2または-Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈであり、ここにおいて、ｎ’は１〜６までの整数であり；
Ｒ7は、-Ｃ1-6アルキル-または-Ｃ1-6アルキルカルボニル-を含む、該コール酸誘導体の結合点を形成する基であり；そして
Ｒ8はＣ1-6アルキルである；および
（iii）式（３）を有するコレステリル誘導体、
0003925815.tif 000065
ここにおいて、
0003925815.tif 000066
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6aは、-Ｃ1-6アルキル-、-ＯＣ（＝Ｏ）-または-ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）-を含む、該コレステリル誘導体の結合点を形成する基であり；
Ｒ7aは、Ｃ1-6アルキルであり；そして
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキルである
から成る群より選択される）；
但し、Ｒ3は、少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の少なくとも１個の窒素原子に対して結合した１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であるという条件付きであり；そして
場合により、Ｒ3は、該１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分が結合している少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の別の窒素原子に対してかまたは、そこにいずれのエンドソーム膜破壊促進成分も結合していない少なくとも一つの別のポリアミン成分の窒素原子に対して結合した、以下に定義の１個またはそれ以上の基であってよい；そして
（ｃ）-Ｂ-（Ｒ5）Ｒ
（式中、Ｂは不存在ではありえないし且つ（ｉ）〜（ｖ）までの基から独立して選択される架橋基であり；Ｒは独立して、上記のように定義されるか、または不存在であり；そして
Ｒ5は、
（ｉ）Ｄ-ビオチン；
（ii）β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
（iii）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（iv）Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
（ｖ）５-メチルテトラヒドロ葉酸；
（vi）葉酸；
（vii）フォリン酸；
（viii）α-３’-プロピオニルチオマンノシド；
（ix）α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸；および
（x）細胞膜タンパク質に特異的に結合する抗体
から成る群より独立して選択される受容体特異的結合成分である）
のエンドソーム膜破壊促進成分である］
のカチオンポリアミンを含む、上記複合体。
【請求項４９】
Ｒ30が水素である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
ＮＨ（Ｒ30）がグアニジノである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５１】
１つのＲ3が水素である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５２】
Ｒ30が水素であり；そして
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｃ（Ｒ）3がＣ6Ｈ5芳香族であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは１であり；そして、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ここにおいて、ｋは５であり；Ｎ（Ｒ）はＮＨであり；およびＺはＯである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５３】
Ｒ30が水素であり；そして
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊成分であり、ここにおいて、Ｂは不存在であり、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；およびｊは７である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５４】
ＮＨ（Ｒ30）がグアニジノであり；そして
それぞれのＲ3は、式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは不存在であり、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；およびｊは７である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５５】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3が水素であり；そして
１つのＲ3が式-Ｂ-（Ｒ4）-Ｒ
［式中、Ｒは不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊ’は５であり；および、ＸはＮ（Ｒ）であり、そして、ここにおいて、Ｒ4は式（３）：
0003925815.tif 000067
を有するタイプ（ｉｉｉ）コレステリル誘導体であり、
Ｒ6aはＯ-Ｃ（＝Ｏ）-、およびコレステリル誘導体の結合点であり；
Ｒ7aはＣ5アルキルであり；そして
Ｒ8aはＣ1アルキルである］
のエンドソーム膜破壊促進成分である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５６】
Ｒ30が水素であり；そして
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚを有する架橋基であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；そして、ｊは０であり、ｋは１１であり；ＺはＮ（Ｒ）であり、ここにおいて、ＲはＣ1アルキルであり、およびＣ（Ｒ）3はＣＨ3である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５７】
Ｒ30が水素であり；そして
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚを有する架橋基であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは１であり、ｋは１１であり；ＺはＯであり；および、Ｃ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５８】
Ｒ30が水素であり；そして
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは0であり、ｋは１１であり；ＺはＯＨであり；および、Ｃ（Ｒ）3は不存在である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５９】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3は水素であり；そして
１つのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは１であり、ｋは１１であり；ＺはＯであり；および、Ｃ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６０】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3が水素であり；そして
１つのＲ3が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｂは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-の架橋基であり；Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは０であり、ｋは１１であり；ＺはＯＨであり；および、Ｃ（Ｒ）3は不存在である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６１】
Ｒ30が水素であり；
それぞれのＲ3が式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分であり、ここにおいて、Ｒは不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり、ｋは５であり；Ｚは不存在であり；そして
Ｒ5はα-３’-プロピオニルチオマンノシドである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６２】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3は水素であり；そして
１つのＲ3は式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分でり、ここにおいて、Ｒは不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-（Ｃ＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｋは５であり；ｌは５であり；ｐは１であり；Ｚは不存在であり、そして
Ｒ5はα-３’-プロピオニルチオマンノシドである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６３】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3は水素であり；そして
１つのＲ3は式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分でり、ここにおいて、Ｒは不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-（Ｃ＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｋは５であり；ｌは５であり；ｐは１であり；Ｚは不存在であり、そして
Ｒ5はα-３’-プロピオニルチオマンノシドである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６４】
Ｒ30が水素であり；
１つのＲ3は水素であり；そして
１つのＲ3は式-Ｂ-（Ｒ5）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分でり、ここにおいて、Ｒは不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-（Ｃ＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｋは５であり；ｌは５であり；ｐは１であり；Ｚは不存在であり、そして
Ｒ5はＮ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシンである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項６５】
前記運搬部分がｌより多くのカチオンポリアミン成分を含む、請求項１に記載の多機能分子複合体。
【請求項６６】
第一のカチオンポリアミン成分がエンドソーム膜破壊促進成分を含み、および第二のカチオンポリアミン成分が受容体特異的成分を含む、請求項１に記載の多機能分子複合体。
【請求項６７】
第一のカチオンポリアミン成分が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分を有し、ここにおいて、Ｃ（Ｒ）3は不存在であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは０であり、およびＢは、請求項１において定義された（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から成る群より選択される架橋基である、請求項６６に記載の多機能分子複合体。
【請求項６８】
第一のカチオンポリアミン成分が式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3のエンドソーム膜破壊促進成分を有し、ここにおいて、Ｃ（Ｒ）3は不存在であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊは０であり、およびＢは式-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-を有する架橋基であり、ｋは１１であり、およびＺはＯＨである、請求項６７に記載の多機能分子複合体。
【請求項６９】
第一のカチオンポリアミン成分が式-Ｂ-（Ｒ4）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分を有し、ここにおいて、Ｒ4がコレステリル誘導体である、請求項６６に記載の多機能分子複合体。
【請求項７０】
第一のカチオンポリアミン成分が式-Ｂ-（Ｒ4）Ｒのエンドソーム膜破壊促進成分を有し、ここにおいて、Ｒが不存在であり、およびＢは式：-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-を有する架橋基であり、ここにおいて、Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり；ｊ’は５であり；およびＸはＮ（Ｒ）であり、そしてＲ4は式（３）：
0003925815.tif 000068
のタイプ（ｉｉｉ）コレステリル誘導体であり；
Ｒ6aはＯ-Ｃ（＝Ｏ）-であり、およびコレステリル誘導体の結合点であり；
Ｒ7aはＣ5アルキル；そして、Ｒ8aがＣ1アルキルである、請求項６６に記載の多機能分子複合体。
【請求項７１】
前記第二のカチオンポリアミン成分の受容体特異的結合成分が
β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド；
Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
Ｎ2，Ｎ6-ビス（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシル-Ｎ6-（β-３’-プロピオニルガラクトシル-β1-4-チオグルコシド）リシン；
α-３’-プロピオニルチオマンノシド；そして
α-３’-プロピオニルチオマンノシド-６-リン酸
から成る群より選択される、請求項６６に記載の多機能分子複合体。
【請求項７２】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための多機能分子複合体であって、（Ａ）該核酸組成物を、（Ｂ）運搬部分に非共有結合させることを含み、ここで前記運搬部分は前記核酸組成物に対して結合した１種類またはそれ以上のカチオンポリアミン成分を含み、それぞれ独立して、式（１）
ＮＨ（Ｒ3）-［-（ＣＲ1Ｒ2）m-Ｎ（Ｒ3）-］n-（ＣＲ1Ｒ2）m-ＮＨ（Ｒ3）      （１）
［式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；
それぞれの場合のｍは、独立して、２〜５までの整数から選択され；
ｎは、１〜２までの整数から選択され；
Ｒ3は、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；または、ＮＲ（Ｒ3）はグアニジノであり；そして
少なくとも１つのエンドソーム膜破壊促進成分は、独立して、
（ａ）式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3
（式中、Ｒは、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され、またはＣ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族であるか若しくは不存在であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；ｊは、０〜２４までの整数であり；そしてＢは、場合により不存在であるか、または式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
を有する架橋基であり、ここにおいて、
ｋは、独立して、１〜１１までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒは、独立して、上記のように定義されるか、若しくは不存在であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；そしてＺは、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；
（ｂ）-Ｂ-（Ｒ4）Ｒ
（式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、上記のように定義され；Ｂは不存在ではありえないし且つ上記（ｉ）〜（iv）までの基と、更に、式
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
を有する基とから独立して選択される架橋基であり、ここにおいて、
ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は、独立して、
（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；
（ii）式（２）を有するコール酸誘導体、
0003925815.tif 000069
ここにおいて、
0003925815.tif 000070
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6は、-Ｈ、-ＯＨ、-ＣＯ2Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＮＨ2または-Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈであり、ここにおいて、ｎ’は１〜６までの整数であり；
Ｒ7は、-Ｃ1-6アルキル-または-Ｃ1-6アルキルカルボニル-を含む、該コール酸誘導体の結合点を形成する基であり；そして
Ｒ8はＣ1-6アルキルである；および
（iii）式（３）を有するコレステリル誘導体、
0003925815.tif 000071
ここにおいて、
0003925815.tif 000072
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6aは、-Ｃ1-6アルキル-、-ＯＣ（＝Ｏ）-または-ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）-を含む、該コレステリル誘導体の結合点を形成する基であり；
Ｒ7aは、Ｃ1-6アルキルであり；そして
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキルである
から成る群より選択される）；
但し、Ｒ3は、少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の少なくとも１個の窒素原子に対して結合した１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であるという条件付きであり；そして
場合により、Ｒ3は、該１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分が結合している少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の別の窒素原子に対してかまたは、そこにいずれのエンドソーム膜破壊促進成分も結合していない少なくとも一つの別のポリアミン成分の窒素原子に対して結合した、以下に定義の１個またはそれ以上の基であってよい；そして
（ｃ）-Ｂ-（Ｒ5）Ｒ
（式中、Ｂは架橋基であり、そしてＲ5は受容体特異的結合成分である）
から成る群より独立して選択される］
のカチオンポリアミンを含む上記複合体。
【請求項７３】
Ｒ5が細胞膜タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項７２に記載の多機能分子複合体。
【請求項７４】
標的細胞に対する核酸組成物の運搬のための多機能分子複合体であって、（Ａ）核酸組成物を、（Ｂ）少なくとも１つのエンドソーム膜破壊促進成分および少なくとも１つの受容体特異的成分を含む運搬部分に非共有結合させることを含み、ここで前記運搬部分は前記核酸組成物に対して結合した１種類またはそれ以上のカチオンポリアミン成分を含み、それぞれ独立して、式（１）ＮＨ（Ｒ3）-［-（ＣＲ1Ｒ2）m-Ｎ（Ｒ3）-］n-（ＣＲ1Ｒ2）m-ＮＨ（Ｒ3）      （１）
［式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；
それぞれの場合のｍは、独立して、２〜５までの整数から選択され；
ｎは、１〜２までの整数から選択され；
Ｒ3は、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；または、ＮＲ（Ｒ3）はグアニジノであり；そして
少なくとも１つのエンドソーム膜破壊促進成分は、独立して、
（ａ）式-Ｂ-（ＣＲ1Ｒ2）j-Ｃ（Ｒ）3
（式中、Ｒは、独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され、またはＣ（Ｒ）3はＣ6Ｈ5芳香族であるか若しくは不存在であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；ｊは、０〜２４までの整数であり；そしてＢは、場合により不存在であるか、または式
（ｉ）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（ii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；
（iii）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｎ（Ｒ）-｛-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ2-Ｏ-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-（ＣＨ2）k-Ｎ（Ｒ）｝p-Ｃ（＝Ｏ）-Ｚ-；または
（iv）-（ＣＲ1Ｒ2）k-Ｃ（＝Ｏ）-｛-Ｎ（Ｒ）-［-（ＣＨ2）2-Ｏ-］l-ＣＨ2-Ｃ（＝Ｏ）｝p-Ｚ-
を有する架橋基であり、ここにおいて、
ｋは、独立して、１〜１１までの整数であり、ｌは０〜３０までの整数であり、そしてｐは１〜３までの整数であり；Ｒは、独立して、上記のように定義されるか、若しくは不存在であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素およびＣ1-6アルキルから成る群より選択され；そしてＺは、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在である）；
（ｂ）-Ｂ-（Ｒ4）Ｒ
（式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、上記のように定義され；Ｂは不存在ではありえないし且つ上記（ｉ）〜（iv）までの基と、更に、式
（ｖ）-（ＣＲ1Ｒ2）j'-Ｘ-
を有する基とから独立して選択される架橋基であり、ここにおいて、
ｊ’は１〜８までの整数であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、上記のように定義され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは不存在であり；そして
Ｒ4は、独立して、
（ｉ）エンベロープ付き動物ウイルスのスパイク糖タンパク質を含む融合誘導ペプチド；
（ii）式（２）を有するコール酸誘導体、
0003925815.tif 000073
ここにおいて、
0003925815.tif 000074
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6は、-Ｈ、-ＯＨ、-ＣＯ2Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＮＨ2または-Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈであり、ここにおいて、ｎ’は１〜６までの整数であり；
Ｒ7は、-Ｃ1-6アルキル-または-Ｃ1-6アルキルカルボニル-を含む、該コール酸誘導体の結合点を形成する基であり；そして
Ｒ8はＣ1-6アルキルである；および
（iii）式（３）を有するコレステリル誘導体、
0003925815.tif 000075
ここにおいて、
0003925815.tif 000076
は、規定されていない立体化学を有する結合を表わし；
---は、一重または二重結合を表わし、環系の飽和または不飽和部分を形成し、但し、それらは両方とも同時に不飽和ではありえないという条件付きであり、それによってその環系はΔ４かまたはΔ５でなければならないし；
Ｒ6aは、-Ｃ1-6アルキル-、-ＯＣ（＝Ｏ）-または-ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）-を含む、該コレステリル誘導体の結合点を形成する基であり；
Ｒ7aは、Ｃ1-6アルキルであり；そして
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキルである
から成る群より選択される）；
但し、Ｒ3は、少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の少なくとも１個の窒素原子に対して結合した１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分であるという条件付きであり；そして
場合により、Ｒ3は、該１種類またはそれ以上のエンドソーム膜破壊促進成分が結合している少なくとも一つの該カチオンポリアミン成分の別の窒素原子に対してかまたは、そこにいずれのエンドソーム膜破壊促進成分も結合していない少なくとも一つの別のポリアミン成分の窒素原子に対して結合した、以下に定義の１個またはそれ以上の基であってよい；そして
（ｃ）-Ｂ-（Ｒ5）Ｒ
（式中、Ｂは架橋基であり、そしてＲ5は受容体特異的結合成分である）
から成る群より独立して選択される］
のカチオンポリアミンを含む上記複合体。
【請求項７５】
核酸組成物を含有する請求項４２に記載の多機能分子複合体の薬学的に許容しうる塩およびエステル形を含めた該分子複合体を、薬学的に許容しうる担体と一緒に含む組成物。
【請求項７６】
核酸組成物を含有する請求項４８に記載の多機能分子複合体の薬学的に許容しうる塩およびエステル形を含めた該分子複合体を、薬学的に許容しうる担体と一緒に含む組成物。
【請求項７７】
核酸組成物を含有する請求項７２に記載の多機能分子複合体の薬学的に許容しうる塩およびエステル形を含めた該分子複合体を、薬学的に許容しうる担体と一緒に含む組成物。
【請求項７８】
核酸組成物を含有する請求項７４に記載の多機能分子複合体の薬学的に許容しうる塩およびエステル形を含めた該分子複合体を、薬学的に許容しうる担体と一緒に含む組成物。
【請求項７９】
個体の細胞に対する核酸組成物の運搬のための医薬組成物を製造するための、請求項１に記載の核酸組成物を含む多機能分子複合体の使用であって、該運搬が該個体の細胞と該核酸組成物とを接触させ、それによって該細胞に対して該核酸組成物を投与する工程を含む、前記複合体の使用。
【請求項８０】
該核酸組成物が、ペプチド若しくはタンパク質をコードするまたは核酸分子の鋳型として役立つヌクレオチド配列を含む核酸分子である、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
該核酸分子が、前記個体の細胞に対してｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ基準で投与する、請求項７９に記載の使用。
【請求項８２】
投与がｅｘ  ｖｉｖｏであり、そして該個体の前記細胞との接触が、処置されることが望まれる細胞を前記個体の体から取り出した後、前記細胞と前記核酸分子とを接触させ、続いて順次に、前記細胞を前記個体の体内に戻すことによって前記個体の体外で起こる請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
病原体に対して個体を免疫感作するための医薬組成物を製造するための、請求項１に記載の核酸組成物を含む多機能分子複合体の使用であって、ここで免疫感作が該個体の細胞と該多機能分子複合体とを接触させ、それによって、該病原体上に抗原として提示されるエピトープと同一のまたは実質的に同様の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を該細胞に対して投与する工程を含み；そしてここにおいて、該ヌクレオチド配列は調節配列に対して機能的に結合していて、および該核酸分子は該個体の細胞中で発現させることができる、前記複合体の使用。
【請求項８４】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記タンパク質が病原体抗原またはそのフラグメントである、請求項８３に記載の使用。
【請求項８６】
前記核酸分子を筋肉内投与する、請求項８３に記載の使用。
【請求項８７】
前記病原体が、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ；インフルエンザウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、ＨＡＶ；Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ；Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ；ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＰＶ；単純ヘルペス１型ウイルス、ＨＳＶ１；単純ヘルペス２型ウイルス、ＨＳＶ２；サイトメガロウイルス、ＣＭＶ；エプスタイン・バールウイルス、ＥＢＶ；ライノウイルス；およびコロナウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項８３に記載の使用。
【請求項８８】
少なくとも２種類またはそれ以上の異なった核酸分子を前記個体の種々の細胞に対して投与する、請求項８３に記載の使用。
【請求項８９】
前記異なった核酸分子がそれぞれ、同一病原体の１種類またはそれ以上の病原体抗原コードしているヌクレオチド配列を含む、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
疾患に対して個体を免疫感作するための医薬組成物を製造するための、請求項１に記載の核酸組成物を含む多機能分子複合体の使用であって、ここで免疫感作は、該個体の細胞と該多機能分子複合体とを接触させ、それによって、該疾患を含むまたは該疾患に関係している細胞によって生産されたタンパク質上に提示されるエピトープと同一のまたは実質的に同様の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を該個体の該細胞に対して投与する工程を含み；そして該核酸分子は調節配列に対して機能的に結合していて且つ該細胞中で発現させることができる、前記複合体の使用。
【請求項９１】
前記疾患が高増殖性細胞を特徴とする、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項９０に記載の使用。
【請求項９３】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項９０に記載の使用。
【請求項９４】
前記核酸分子を筋肉内投与する、請求項９０に記載の使用。
【請求項９５】
前記核酸分子が、腫瘍遺伝子ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、ｒａｓ、ｓａｒｃ、ｎｅｕおよびｔｒｋのタンパク質産物；トランスロケーション遺伝子ｂｃｌ／ａｂｌのタンパク質産物；Ｐ５３；ＥＧＲＦ；Ｂ細胞リンパ腫によって作られた抗体の可変部；およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変部、から成る群より選択される標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９０に記載の使用。
【請求項９６】
前記タンパク質が、Ｂ細胞に媒介された自己免疫疾患に関与する抗体の可変部；およびＴ細胞に媒介された自己免疫疾患に関与するＴ細胞受容体の可変部から成る群より選択される、請求項９０に記載の使用。
【請求項９７】
自己免疫疾患に苦しむ個体を治療するための医薬組成物を製造するための、請求項１に記載の核酸組成物を含む多機能分子複合体の使用であって、該治療は、該個体の細胞と該多機能分子複合体とを接触させ、それによって、不存在の、欠陥があるまたは阻害された遺伝子の活性を回復させる、或いは、失われた、非機能性若しくは部分的に機能性のタンパク質を、存在することで補償するであろうまたは個体に対して治療効果を生じるであろうタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、該個体の細胞に対して投与する工程を含む；そして該核酸分子は調節配列に対して機能的に結合していて且つ該細胞中で発現させることができる、前記複合体の使用。
【請求項９８】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項９７に記載の使用。
【請求項９９】
前記核酸分子を筋肉内投与する、請求項９７に記載の使用。
【請求項１００】
前記核酸分子が、酵素、構造タンパク質、サイトカイン、リンホカインおよび成長因子から成る群より選択されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、例えば、遺伝子情報、例えば外来ＤＮＡを標的細胞、特に真核生物細胞内に運搬するための方法の分野内にある。特に、本発明は、中でも、特別な立体配置のリポポリアミン、エンドゾームの崩壊を促進する成分およびレセプター特異的結合成分を含む多機能分子接合体からなる非ウイルス性遺伝子キャリヤーに関する。本出願は、「細胞に遺伝子を運搬するための多機能分子複合体」と称する米国特許０８／３１４，０６０（１９９４年９月２８日提出）に関連し、ここに参照として取り入れる。
これまで、様々な型のウイルスベクターが、標的細胞への選択された外来遺伝子情報の挿入、および真核細胞の場合には細胞のゲノム内への遺伝情報の取り込みのため、成功裡に用いられてきた。これらのウイルスベクターシステムは、侵入を試みる、即ち細胞に感染しようとする、ウイルスに対する重要な問題を打破するために時間をかけて進化させた、ウイルスの分子機構に依存してきた。そのようなウイルスベクターの有効性にもかかわらず、ウイルスを用いることの安全性に関して、特に望ましくない副作用の観点から、依然として懸念が残る。それ故、ウイルスベクターと同様に有効であるが、安全性の高い非ウイルス性遺伝子配達システムを発達させる努力が続けられている。
非ウイルスベクターまたはキャリヤーは、本発明に関する型では、それ故、ウイルスベクターと同様の障害を克服しなくてはならない。そのようなキャリヤーの問題点としては、標的細胞に到達するまでの充分な時間、生物体の生体層内（biophase）に存在し続けること；標的細胞の認識および細胞の細胞膜を通っての細胞質内への遺伝物質の輸送を仲介する手段；細網内皮系による細胞内での分解を回避すること；ならびに、核膜へ輸送され、それを通して、遺伝物質の転写を行うことのできる細胞の核内へ輸送されること；が含まれる。
本発明が提案するのは、上記の問題点を克服することであるが、問題点は様々でかつ異なっているので、本発明は、多機能複合体、即ち具体的な障害を打破するであろう様々なリガンドの分子接合体、を含む。
遺伝子運搬技術の有用性は、結局、数多くの領域に莫大な利益が潜在していることにある。遺伝物質の細胞内への運搬は、現在のところ、分子生物学、遺伝子治療および遺伝子免疫化の領域で広く受け入れられている数多くの方法に基づいている。同定された個々のたんぱく質を発現する細胞へ、ＤＮＡにコードされた遺伝子情報を運搬することは、そのようなたんぱく質の細胞レベルでの機能および根源的な細胞生理機能の研究を可能にする。また、遺伝物質は、不活性タンパク質を発現するかまたはタンパク質の発現を阻害する細胞の本質的な遺伝子欠陥によって存在しないタンパク質を導入するために、細胞内に運搬される。細胞内への遺伝物質の運搬は、よく知られている相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖のアンチセンス効果を通してそのような細胞内でのタンパク質発現を阻害するために用いることもできる。
外因性、即ち外来の遺伝物質は、実質上経済的に妥当な条件では他の手段によって手に入れることのできない有意量のタンパク質を、細胞が合成することを可能にする。これらの注目されるタンパク質は、酵母、細菌または哺乳動物細胞のような様々な宿主細胞内で生産される。また、遺伝物質は、免疫原性タンパク質、即ち所望の免疫応答を刺激することのできるタンパク質、をコードするＤＮＡを注入することによって、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）に予防的免疫応答を提供するために、用いることもできる。また、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での細胞内への外因性遺伝物質の導入は、上に列挙した同様の機構で、代謝性、腫瘍性または感染性の疾病の緩和、治療または予防への応用に有用である可能性がある。
従来技術
ベクターまたはキャリヤーを用いずに、標的細胞に遺伝物質を運搬することが可能である。例えば、遺伝物質は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で適用するために、静脈内または腹腔内注射を通して全身に導入することができるし、または、作用領域に直接注射することによって、作用部位に導入することができる。例えば、様々な組織内に注射されたＤＮＡは、独力で、細胞に入り、免疫応答を誘発するタンパク質を生成するであろうことが、以前から認識されていた。例えば、Ｐ．Ａｔａｎａｓｉｕら、Ａｃａｄｅｍｉｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｒｉｓ），２５４，４２８８−３０（１９６２）；Ｍ．Ａ．Ｉｓｒａｅｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２９，９９０−９６（１９７９）；Ｈ．Ｗｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２９９，７４０−４２（１９８２）；Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、国際特許出願ＷＯ８６／００９３０、１９８６年２月１３日公告；Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ、Ｇ．Ｈ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｒ．Ｗ．ＭａｌｏｎｅおよびＤ．Ａ．Ｃａｒｓｏｎ、国際特許出願ＷＯ９０／１１０９２、１９９０年１０月４日公告；およびＲ．Ｊ．ＤｅｂｓおよびＮ．Ｚｈｕ、国際特許出願ＷＯ９３／２４６４０、１９９３年１２月９日公告；を参照のこと。しかしながら、ＤＮＡそれ自身は、親水性であり、疎水性の細胞膜は、膜を横切るＤＮＡ運搬の有意の障壁となる。従って、この技術分野では、直接注射で細胞内へのＤＮＡ運搬を強化する促進剤を用いることが望ましい。
標的細胞に遺伝物質を配達するためのこの技術分野でのその他の方法は、細胞に存在する天然のレセプター仲介エンドサイトーシス経路を利用する方法である。今までに、いくつかの細胞レセプターが、薬剤の特異的な標的になれることによる望ましい作因として、また、特に本発明が関与する型の遺伝物質のキャリヤーとして供される巨大分子および分子接合体として、同定された。これらの細胞レセプターは、特定の組織に位置させる力によって、または特定の組織に対する結合力あるいは特定の組織内での活性を増強することによって、特異的な標的であると考えられる。Ｊ．Ｌ．ＢｏｄｍｅｒおよびＲ．Ｔ．Ｄｅａｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｕｍｏｌ．，１１２，２９８−３０６（１９８５）を参照のこと。これにより、より低い投薬量での治療が可能になり、望ましくない副作用が明らかに少なくなる。
よりよく知られた細胞および組織の選択的レセプターの一例として、肝細胞に存在するアシアログリコプロテイン−レセプターが上げられる。アシアログリコプロテインレセプターは、ガラクトース、特に三つの角を持つ（ｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴ糖、即ち末端にガラクトース残基を持つ三つ程の伸びた鎖またはスペーサーアームを持つオリゴ糖、に高い親和性を持つ細胞外レセプターである；Ｈ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ，ＴＩＢＳ，１６，３７４−７７（１９９１）を参照のこと。この高親和性レセプターは、肝細胞に位置しているが、クッパー細胞内には存在せず；高い選択性で肝臓への配達を可能にする。
また、レセプターの仲介する遺伝子運搬の分野では、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で効果的な方法として、組立ＤＮＡ複合体は、結果としてエンドサイトーシス経路を通しての取り込みに適当なサイズにＤＮＡを縮合させなければならない。Ｊ．Ｃ．Ｐｅｒａ１ｅｓ，Ｔ．Ｆｅｒｋｏｌ，Ｈ．Ｂｅｅｇｅｎ，Ｏ．Ｄ．ＲａｔｎｏｆｆおよびＲ．Ｗ．Ｈａｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４０８６−４０９０（１９９４）を参照のこと。
細胞選択的結合を提供する他の方法は、目標とする細胞型に結合する能力を有する本体を付着させることである；この目的のために一般的に用いられるのは、標的細胞の細胞膜または外側領域に存在する特異的タンパク質に結合することのできる抗体である。その他のレセプターもまた、ビオチンおよび葉酸塩レセプター［Ｐ．Ｓ．Ｌｏｗ，Ｍ．Ａ．ＨｏｒｎおよびＰ．Ｆ．Ｈｅｉｎｓｔｅｉｎ，国際特許出願ＷＯ９０／１２０９５、１９９０年１０月１８日公告；Ｐ．Ｓ．Ｌｏｗ，Ｍ．Ａ．ＨｏｒｎおよびＰ．Ｆ．Ｈｅｉｎｓｔｅｉｎ，国際特許出願ＷＯ９０／１２０９６、１９９０年１０月１８日公告；Ｐ．Ｓ．Ｌｏｗ，Ｍ．Ａ．ＨｏｒｎおよびＰ．Ｆ．Ｈｅｉｎｓｔｅｉｎ，米国特許第５，１０８，９２１号、１９９２年４月２８日；Ｃ．Ｐ．ＬｅａｍｏｎおよびＰ．Ｓ．Ｌｏｗ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５５７２−５５７６（１９９１）を参照のこと］、トランスフェリンレセプター；インスリンレセプター；およびマンノースレセプター（さらに以下を参照のこと）のような、巨大分子の輸送を容易にするに有用であることが認められた。列挙したレセプターは、ほんの代表にしか過ぎず、その他の例は、技術者の心のうちにあるであろう。
同じ分子上に異なる機能を結合することもまた、この技術分野で用いられてきた。例えば、Ｇ．Ｙ．ＷｕおよびＣ．Ｍ．Ｍｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１４６２１−１４６２４（１９８８）は、細胞レセプターの仲介する肝細胞へのＤＮＡの配達方法について記載している。この方法は、さらに、Ｇ．Ｙ．ＷｕおよびＣ．Ｈ．Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，８８７−８９２（１９８８）；Ｇ．Ｙ．ＷｕおよびＣ．Ｈ．Ｗｕ、米国特許第５，１６６，３２０号、１９９２年１１月２４日；ならびにＧ．Ｙ．ＷｕおよびＣ．Ｈ．Ｗｕ、国際特許出願ＷＯ９２／０６１８０、１９９２年４月１６日公告に記載されている。方法は、糖タンパク質、アシアロオロソムコイドをポリリシンに付着させ、肝細胞選択性ＤＮＡキャリヤーを提供することからなる。ポリ−リシンの機能は、正に荷電した（カチオンの）リシンのεアミノ基と負に荷電した（アニオンの）ＤＮＡのリン酸基との間のイオンの相互関係を通してＤＮＡに結合することである。オロソムコイドは、ヒト血清に通常存在する糖タンパク質である。枝分かれしたオリゴ糖から末端のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を除くと、オリゴ糖の末端がガラクトースになり、このようなオリゴ糖に対して、肝細胞レセプターは、既に記載したように、高い親和性を持つ。
肝細胞上にアシアログリコプロテインレセプターを結合させた後、タンパク質は、リソソーム前駆体エンドソーム内へのエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。ポリリシン−アシアロオロソムコイド−キャリヤーにイオン的に結合したＤＮＡもまた、エンドソーム内に取り込まれる。この配達システムを用いて、例えば、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｃａｂｒｅｒａ，Ｃ．Ｈ．ＷｕおよびＧ．Ｙ．Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１１４８３−１１４８９（１９９２）によってなされたさらなる仕事により、部分的肝切除が肝細胞内に配達されたＤＮＡ発現の持続性を改善することが見出された。また、この機構による細胞内へのＤＮＡ運搬は、カチオン脂質を追加することによって有意に強化される；例えば、Ｋ．Ｄ．Ｍａｃｋ，Ｒ．ＷａｌｚｅｍおよびＪ．Ｂ．Ｚｅｌｄｉｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，３０７，１３８−１４３（１９９４）を参照のこと。
アシアログリコプロテインレセプターと結合させるために、これに特異的なアシアログリコプロテインを用いる必要はない；この結合は、また、同様の立体配置を持つ合成小分子を用いることによる高親和性によっても可能である。炭水化物部分は、適当な糖タンパク質から切り離され、他の巨大分子に結合させることもできる；例えば、Ｓ．Ｊ．ＷｏｏｄおよびＲ．Ｗｅｔｚｅｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，３，３９１−３９６（１９９２）を参照のこと。この方法によって、糖タンパク質の細胞レセプター結合部分を除去し、選択的細胞結合に必要とされる特定の部分を他の分子に転移させることもできる。
巨大分子に付着することができ、関連するガラクトース特異的レセプターと結合する能力をその巨大分子に授与する、合成グリコシドの調製について、数多くの文献がある。枝分かれしたグリコシドの重要性は、早くから認識されていた；Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．，６７，５０９−５１４（１９７８）を参照のこと。糖密度［Ｋ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｋｕｈｌｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．ＲｏｓｅｍａｎおよびＹ．Ｃ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，２２３０−２２３４（１９８１）］および空間関係［Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｒ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．Ｒ．Ｈａｒｄｙ，Ｊ．Ｌｏｎｎｇｒｅｎ，Ｊ．Ａｒｎａｒｐ，Ｍ．ＨａｒａｌｄｓｓｏｎおよびＨ．Ｌｏｎｎ、Ｊ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２５８，１９９−２０２（１９８３）］が、結合力価の重要な決定因子であることは、さらに詳細に記載されている。枝分かれしたトリリシンをアミノ末端に持つペプチドの還元アミノ化は、ポリリシンまたはその他の巨大分子と容易に結合することのできる４つのガラクトシル残基を末端に持つリガンドを与え；Ｃ．Ｐｌａｎｋ，Ｋ．Ｚａｔｌｏｕｈａｌ，Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｋ．ＭｅｃｈｔｌｅｒおよびＥ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，３，５３３−５３９（１９９２）を参照のこと；また、ＤＮＡ構築物の調製に用いられた。
ガラクトースのチオプロピオン酸およびチオヘキサン酸グリコシド誘導体を調製し、Ｌ−リシル−Ｌ−リシンと結合させると、合成トリアンテナガラクトース誘導体が形成された。この合成トリアンテナガラクトースを含むビスアクリジンスペルミジン誘導体は、肝細胞への標的ＤＮＡとして用いられている；Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，ＪｒおよびＪ．Ｈａｅｎｓｌｅｒ、国際特許出願ＷＯ９３／１９７６８、１９９３年１０月１４日公告；およびＪ．ＨａｅｎｓｌｅｒおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４，８５−９３（１９９３）。
キャリヤーとしてポリ−リシンを用いることによって細胞内への遺伝子運搬を容易にすることを基本とする細胞レセプターを提供するその他の手段も、この分野に記載されている。細胞表面のトロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）に特異的な抗体は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で、ＤＮＡの配達システムとしてポリ−リシンと共に用いられた；Ｖ．Ｓ．Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ，Ｖ．Ｐ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｓ．Ｊ．ＫｅｎｎｅｌおよびＬ．Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｏｎｇ．Ｃｈｅｍ．，３，３２３−３２７（１９９２）を参照のこと。また、トランスフェリンレセプターは、赤芽球、Ｋ５６２マクロファージおよびＭＬ−６０白血病細胞への標的ＤＮＡとしても用いられた；Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｍ．Ｚｅｎｋｅ，Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｈ．ＢｅｕｇおよびＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｍ．Ｚｅｎｋｅ，Ｐ．Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ，Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｈ．ＢｅｕｇおよびＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、３６５５−３６５９（１９９０）；ならびにＧ．Ｃｉｔｒｏ，Ｄ．Ｐｅｒｒｏｔｔｉ．Ｃ．Ｃｕｃｃｏ，Ｉ．Ｄ’Ａｇｎａｎｏ，Ａ．Ｓａｃｃｈｉ，Ｇ．ＺｕｐｉおよびＢ．Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９，７０３１−７０３５（１９９０）を参照のこと。これらの研究には、小さなオリゴデオキシヌクレオチドならびに大きなプラスミドの両方をもちいた。
細胞内へのＤＮＡの侵入を容易にするポリリシンの能力は、ポリリシンが疎水性付加物で化学的に修飾される場合；Ｘ．ＺｈｏｕおよびＬ．Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１８９，１９５−２０３（１９９４）を参照のこと：カチオン脂質と複合する場合；Ｋ．Ｄ．Ｍａｃｋ，Ｒ．ＷａｌｚｅｍおよびＪ．Ｂ．Ｚｅｌｄｉｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，３０７，１３８−１４３（１９９４）；またはウイルスと関連させた場合に、明らかに強化される。多くのウイルスは、レセプター仲介結合および細胞内へのウイルスＤＮＡ／ＲＮＡ挿入によって、特定の細胞に感染し；それ故、ウイルスのこの作用は、上記のようなＤＮＡの侵入を容易にする作用と同様である。
複製不全−アデノウイルスを用いて、トランスフェリン−ポリリシン複合ＤＮＡの細胞内への侵入を強化した；Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓ．Ａｇａｒｗａｌ、Ｅ．ＷａｇｎｅｒおよびＭ．Ｃｏｔｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ、：Ｋ．Ｚａｔｌｏｕｋａｌ、Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ、Ｈ．Ｋｉｒｌａｐｐｏｓ、Ｋ．Ｍｅｃｈｔｌｅｒ、Ｄ．Ｔ．ＣｕｒｉｅｌおよびＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６０９９−６１０３（１９９２）；Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ、Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｋ．Ｚａｔｌｏｕｋａｌ、Ｓ．Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｄ．Ｔ．ＣｕｒｉｅｌおよびＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６０９４−６０９８（１９９２）；ならびにＬ．Ｇａｏ、Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ、Ｓ．Ａｇａｒｗａｌ、Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｍ．Ｒｏｍｅｒ、Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｐ．−Ｃ．ＨｕおよびＤ．Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，１７−２４（１９９３）を参照のこと。アデノウイルスは、ポリリシンに共有結合した場合および抗体結合部位を通して結合した場合に、ポリリシン−トランスフェリン−ＤＮＡ複合体の侵入を強化する。ポリリシン−トランスフェリン−ＤＮＡ複合体にアデノウイルスが直接付着する必要はなく、単一の混合物として存在する場合に、複合体の侵入を容易にできる。ポリリシン−トランスフェリン−ＤＮＡ複合体は、細胞へのレセプター特異的結合を提供し、ＤＮＡと共にエンドソーム内に侵入する。一度エンドソームの内側に侵入したならば、アデノウイルスは、エンドソームの区画を崩壊することによって細胞内へのＤＮＡ／トランスフェリン−ポリリシン複合体の侵入を容易にし、次いで、細胞質内へＤＮＡを放出する。また、複製不全アデノウイルスを用いると、ポリリシン−トランスフェリン複合体によって与えられた細胞レセプター選択性の恩恵を受けなくても、複合していないＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入が強められた；Ｋ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、Ｍ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｐ．ＳｅｔｈおよびＲ，Ｇ，Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３００−２３０３（１９９３）を参照のこと。
インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質のＮ末端領域のような合成ペプチドは、膜を不安定化することが知られており、またフソ遺伝子ペプチド（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）として知られている。４つのガラクトシル残基を末端に持つ枝分かれしたトリリシルアミノ末端を持つペプチドリガンドと共に、ポリリシンと結合させたインフルエンザのフソ遺伝子ペプチドを含む接合体を、肝細胞内へのＤＮＡ侵入促進剤として調製した；Ｃ．Ｐｌａｎｋ、Ｋ．Ｚａｔｌｏｕｈａｌ、Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｋ．ＭｅｃｈｔｌｅｒおよびＥ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，３，５３３−５３９（１９９２）を参照のこと。これらの接合体は、テトラガラクトースペプチドによって授与されるアシアログリコプロテインレセプター仲介結合能、インフルエンザフソ遺伝子ペプチドのエンドソーム崩壊能、およびポリリシンのＤＮＡ結合能を合わせ持つ。これらの接合体は、エンドソーム内へのレセプター仲介取り込みとインターナリゼーションの組み合わせによって、細胞内へＤＮＡを配達する。このインターナリゼーションに次いで、インフルエンザフソ遺伝子ペプチドによってエンドソームが崩壊し、細胞質内にＤＮＡが放出される。同様の様式で、インフルエンザフソ遺伝子ペプチドをポリリシンに付着させ、トランスフェリン−ポリリシン複合体と混合すると、トランスフェリンレセプターを持つ同様の細胞選択性ＤＮＡキャリヤーを提供することができる；Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｐｌａｎｋ、Ｋ．Ｚａｔｌｏｕｋａｌ、Ｍ．ＣｏｔｔｅｎおよびＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，７９３４−７９３８（１９９２）を参照のこと。また、設計した合成ペプチドを用いることもできる；例えば、”ＧＡＬＡ”ペプチド［Ｎ．Ｋ．Ｓｕｂｂａｒａｏ、Ｒ．Ａ．Ｐａｒｅｎｔｅ、Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ、Ｌ．ＮａｄａｓｄｉおよびＫ．Ｐａｎｇｒａｃｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６，２９６４−２９７２（１９８７）］をＤＮＡキャリヤーと結合し、細胞への侵入が強化促進されていることを見いだした［Ｊ．ＨａｅｎｓｌｅｒおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４，３７２−３７９（１９９３）］。カチオン両親媒性ペプチドであるグラミシジンＳは、細胞へのＤＮＡの侵入を促進することができる［Ｊ．−Ｙ．ＬｅｇｅｎｄｒｅおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８９３−８９７（１９９３）］が、ＤＮＡを明らかに運搬するためにはリン脂質が必要である。
ポリリシンは、ＤＮＡが細胞内へ侵入するためのポリカチオン骨格を提供する唯一のものではない。ＤＥＡＥ−デキストランもまた、細胞内へのＲＮＡおよびＤＮＡの侵入を促進するに効果的であることが示された；Ｒ．ＪｕｌｉａｎｏおよびＥ．Ｍａｙｈｅｗ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，７３，３−１２（１９７２）；ならびにＥ．ＭａｙｈｅｗおよびＲ．Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，７７，４０９−４１４（１９７３）を参照のこと。より最近では、エチレンジアミンとメチルアクリレートとの樹枝状結晶カスケード共重合体が、細胞内への侵入を容易にするＤＮＡキャリヤーを提供するに有効であることが示された。Ｊ．ＨａｅｎｓｌｅｒおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４，３７２−３７９（１９９３）を参照のこと。アルキル化ポリビニルピロリドン重合体もまた、細胞内へのＤＮＡの侵入を容易にするために用いられた；Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ、Ｉ．Ｖ．Ａｓｔａｆｉｅｖａ、Ｉ．Ｖ．Ｍａｋｓｉｍｏｖａ、Ｅ．Ｍ．Ｌｕｋａｎｉｄｉｎ、Ｇ．Ｐ．ＧｅｏｒｇｉｅｖおよびＶ．Ａ．Ｋａｂａｎｏｖ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４，４４８−４５４（１９９３）を参照のこと。
正に荷電したリポソームもまた、細胞への侵入を容易にするＤＮＡのキャリヤーとして広く用いられてきた；例えば、Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．およびＪ．Ｈａｅｎｓｌｅｒ、国際特許出願ＷＯ３／１９７６８、１９９３年１０月１４日公告；Ｒ．Ｊ．ＤｅｂｓおよびＮ．Ｚｈｕ、国際特許ＷＯ３／２４６４０、１９９３年１２月９日公告；Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｒ．Ｋｕｍａｒ、Ｃ．Ｂａｓａｖａ、Ｒ．Ｃ．ＢｏｒｄｅｒおよびＪ．−Ｙ．Ｈｗａｎｇ−Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許出願ＷＯ１／１６０２４、１９９１年０月３１日公告；Ｐ．Ｌ．ＦｅｌｇｎｅｒおよびＧ．Ｍ．Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ，３３７，３８７−３８８（１９８９）；Ｊ．Ｋ．Ｒｏｓｅ、Ｌ．ＢｕｏｎｏｃｏｒｅおよびＭ．Ａ．Ｗｈｉｔｔ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０，５２０−５２５（１９９１）；Ｃ．Ｆ．Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｍ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ、Ｈ．Ｃｈａｎ、Ｊ．Ｅ．Ｅ．ＳｃｈｏｅｍａｋｅｒおよびＣ．Ｋ．Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，４１，１０２３−１０３３（１９９２）；Ｊ．Ｈ，Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｒ．Ｋｕｍａｒ、Ｃ．Ｎ．Ｓａｒｉｄｈａｒ、Ｃ．Ｊ．Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ｙ．Ｊ．Ｔｓａｉ、Ｒ．Ｂｏｒｄｅｒ、Ｐ．Ｒａｍｓｅｙ、Ｍ．ＭａｒｔｉｎおよびＰ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５５０−２５６１（１９９４）；Ｊ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ｌ．ＷａｌｚｅｍおよびＪ．Ｂ．Ｇｅｒｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５４，３２７−３４０（１９９３）を参照のこと。これらのキャリヤー組成物もまた、ｐＨ感受性リポソームを含んでいる；Ｃ．−Ｊ．Ｃｈｕ、Ｊ．Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｍ．−Ｚ．Ｌａｉ、Ｋ．ＨｏｎｇおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，７，８２４−８５４（１９９０）；Ｊ．−Ｙ．ＬｅｇｅｎｄｒｅおよびＦ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９，１２５３−１２４２（１９９２）を参照のこと。
ポリ−カチオン性脂質は、ジオクタデシルアミドグリシンおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを５−カルボキシスペルミンとカップリングすることによって合成される；Ｊ．−Ｐ．Ｂｅｈｒ、Ｂ．Ｄｅｍｅｎｉｅｘ、Ｊ．−Ｐ．ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＪ．Ｐｅｒｚ−Ｍｕｔｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６，６９８２−６９８６（１９８９）；Ｆ．Ｂａｒｔｈｅｌ、Ｊ．−Ｓ．Ｒｅｍｙ、Ｊ．−Ｐ．ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＪ．Ｐ．Ｂｅｈｒ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２，５５３−５６０（１９９３）；Ｊ．−Ｐ．ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＪ．−Ｐ．Ｂｅｈｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，５９９−６１８（１９９３）；Ｊ．−Ｐ．ＢｅｈｒおよびＪ．−Ｐ．Ｌｏｅｆｆｌｅｒ、米国特許第５，１７１，６７８号、１９９２年１２月１５日、を参照のこと。これらの親油性スペラミンは、細胞膜を通してのＤＮＡの運搬において非常に活性である。
脂質の組み合わせは、細胞内への核酸の運搬を容易にするために用いられる。例えば、米国特許第５，２８３，１８５号では、適当な溶媒中に補脂質（ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ）と共にカチオン性脂質を混合した脂質の分散を利用する方法について開示している。脂質は、コレステロールより誘導した親油性基を含む構造、リンカー結合、リンカーアルキルスペーサーアーム、およびカチオン性アミノ基を持ち；また、補脂質は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである。
マクロファージは、マンノースおよびマンノース−６−リン酸塩の両者が結合できるレセプターを持ち、これらの糖を提示する分子を取り込む。分子は、エンドサイトーシスによってリソソーム前駆体であるエンドソーム内に取り込まれる。この取り込みを用いると、マンノース−６−リン酸塩で修飾しさらに修飾された３’末端へのジスルフィド架橋によってオリゴデオキシヌクレオチドと結合させたウシ血清アルブミンを用いて、オリゴヌクレオチドのマクロファージ内への侵入が強められた；Ｅ．Ｂｏｎｆｉｌｓ、Ｃ．Ｄｅｐｉｅｒｒｅｕｘ、Ｐ．Ｍｉｄｏｕｘ、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ、Ｍ．ＭｏｎｓｉｇｎｙおよびＡ．Ｃ．Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４６２１−４６２９（１９９２）を参照のこと。同様に、ビオチンで３’末端を修飾したオリゴヌクレオチドは、マンノース−修飾ストレプタビジンと結合し、また、マクロファージへの侵入を容易にすることもわかった；Ｅ．Ｂｏｎｆｉｌｓ、Ｃ．Ｍｅｎｄｅｓ、Ａ．Ｃ．Ｒｏｃｈｅ、Ｍ．ＭｏｎｓｉｇｎｙおよびＰ．Ｍｉｄｏｕｘ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，３，２７７−２８４（１９９２）を参照のこと。
様々なペプチドおよびタンパク質は、それらの多くが自然発生のものであるが、細胞表面にレセプターを持ち、ひとたびレセプターに付着するとエンドサイトーシスによって取り込まれることが分かった。これらのレセプターに結合した物質は、細胞の内側のエンドソーム区画に配達される。例として、インスリン、バソプレッシン、低密度リポタンパク質、表皮増殖因子およびその他のものが含まれる。この取り込みはまた、細胞内へのＤＮＡの侵入を容易にするためにも用いられた；例えば、インスリンはポリリシンと結合すると、インスリンレセプターを持つ細胞内へのＤＮＡの侵入を容易にした；Ｂ．Ｈｕｃｋｅｔｔ、Ｍ．ＡｒｉａｔｔｉおよびＡ．Ｏ．Ｈａｗｔｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，２５３−２６３（１９９０）。
発明の要約
本発明は、任意の機能の組み合わせ：１）核酸組成物；２）それぞれが３から１２の窒素原子を含む、核酸組成物と結合する、一つまたはそれより多くのカチオンポリアミン成分；３）ａ）少なくとも一つの親油性の長鎖アルキル基、ｂ）外皮を持つ動物のウイルスのスパイク糖タンパク質を含むフソ遺伝子ペプチド、またはｃ）コール酸またはコレステロールまたはその誘導体、を含み、アルキル、カルボキサミド、カルバメート、チオカルバメート、カルバモイル架橋基を通して少なくとも一つのポリアミン成分の少なくとも一つの窒素原子と結合した、一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分；および所望であれば、４）アルキル、カルボキサミド、カルバメート、チオカルバメート、またはカルバモイル架橋基を通して、ａ）一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分を結合する少なくとも一つのポリアミン成分のさらなる窒素原子、またはｂ）いかなるエンドソーム膜崩壊促進成分もそれと結合しない少なくとも一つのさらなるポリアミン成分の窒素原子、のいずれかに結合する、標的細胞の天然のレセプターのためのリガンドである一つまたはそれより多くのレセプター特異的結合成分：を含む、標的細胞に核酸組成物を運搬するための多機能分子複合体に関する。
さらに、本発明は、単に混合することによって分子複合体にまとめられて化学的に結合する能力を持つ次の分離成分：Ａ）運搬される核酸成分；およびＢ）ａ）核酸組成物と、結合するであろう即ち結合する能力を持つ、一つまたはそれより多くのカチオンポリアミン成分（そのそれぞれは３から１２の窒素原子からなる）；ｂ）ｉ）少なくとも一つの親油性の長鎖のアルキル基、ii）外皮を持つ動物のウイルスのスパイク糖タンパク質を含むフソ遺伝子ペプチド、またはiii）コール酸またはコレステロールまたはその誘導体、を含み、アルキル、カルボキサミド、カルバメート、チオカルバメート、カルバモイル架橋基を通して、少なくとも一つのポリアミン成分の少なくとも一つの窒素原子と結合する、一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分；および所望であれば、ｃ）アルキル、カルボキサミド、カルバメート、チオカルバメート、またはカルバモイル架橋基を通して、ｉ）一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分を結合する少なくとも一つのポリアミン成分のさらなる窒素原子、またはii）いかなるエンドソーム膜崩壊促進成分をもそれに結合しない少なくとも一つのさらなるポリアミン成分の窒素原子、のいずれかに結合する、標的細胞の天然のレセプターのためのリガンドである一つまたはそれより多くのレセプター特異的結合成分；を含む、配送ベヒクル、これより「運搬部分」と呼ぶ：を含む、標的細胞に核酸組成物を運搬するための自己組立配送システムに関する。
また、本発明は、直前に詳細に記載した運搬部分を、物質の分離組成物として、含む。
また、本発明は、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を基準として、核酸組成物を標的細胞に運搬する方法に関する。方法は、上にさらに詳細に記載したような核酸組成物を含む多機能分子複合体と、標的細胞を接触させる段階、それによって、所望のペプチドまたはタンパク質をコードするか又は機能的核酸分子の鋳型として提供されるかいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子を、細胞に運搬する段階、からなる。望ましいタンパク質または機能的核酸分子は、工業的、商業的または科学的興味による任意の生産物：例えば、ワクチンを含む治療薬；栄養素および栄養補助食品；除草剤および植物成長調節剤、殺虫剤、だに殺し剤、殺鼠剤、ならびに殺菌剤のような農業的に重要な化合物；殺線虫剤を含む殺寄生虫薬のような動物の健康に役立つ化合物：およびそれ以外のもの、を含むであろう。標的細胞は、典型的には細菌および酵母のような微生物細胞を含む宿主細胞の培地であるが、植物細胞および哺乳動物細胞を含んでもよい。細胞培養液は、所望のタンパク質または機能的核酸分子の生産を最大にするこの分野では熟知された発酵技術に従って維持され、発行生成物は、集められ、既知の方法で精製される。
さらに、本発明は、個体細胞への核酸組成物の運搬方法に関する。方法は、上に詳細に記載したように、核酸組成物を含む多機能分子複合体と個体の細胞を接触させる段階、それによって、所望のペプチドまたはタンパク質をコードするか又は機能的核酸分子の鋳型として供されるかのいずれかの核酸配列を含む核酸分子を細胞に投与する段階、からなる。核酸分子は、レトロウイルス粒子を用いること無しに投与される。所望のタンパク質は、個体内で機能するかまたは免疫応答を開始するために供されるかのいずれかのタンパク質であってよい。核酸分子は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）のいずれかに基づいて個体の細胞に投与することができる、即ち、個体の細胞との接触が最も典型的に用いられる方法に従って個体の体内で行われてよく、または、個体の細胞との接触が、処理が望まれる細胞を、様々な適当な手段によって個体の体内から取り出し、次いで細胞を核酸分子と接触させ、さらに個体の体に細胞を順番に戻すことによって、個体の体の外側で行われてもよい。
また、本発明は、病原体に対して個体を免疫化する方法に関係する。方法は、上に詳細に記載したように、核酸組成物を含む多機能分子複合体と個体の細胞を接触させ、それによって抗原として病原体上に表示されたエピトープと全く同じまたは実質上似した少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、制御配列と機能しうるように連結しているヌクレオチド列、を含む核酸分子を細胞に投与する段階、を含む。核酸分子は、個体細胞内で発現する能力を持つ。
本発明は、高増殖性疾病または自己免疫病に対して個体を免疫化する方法に関する。方法は、上に詳細に記載したように、核酸組成物を含む多機能分子複合体と個体の細胞を接触させ、それによって、高増殖性疾病関連タンパク質または自己免疫病関連タンパク質上にそれぞれ表示されるエピトープと同一または実質的に類似した少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、また制御配列に機能し得るように連結した、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を、個体の細胞に投与する段階を含む。核酸分子は、細胞内で発現する能力を持つ。
また、本発明は、上に詳細に記載したように、核酸組成物を含む多機能分子複合体と個体の細胞を接触させ、それによって、欠失遺伝子、欠損遺伝子または阻害された遺伝子の活性を復活させる、または個体内に治療効果を作り出すタンパク質をコードし、制御配列と機能し得るように連結しているヌクレオチド配列を含み、細胞内で発現する能力を持つ、核酸分子を個体細胞に投与する段階を含む、自己免疫病にかかった個体を治療する方法に関する。
さらにまた、本発明は、医薬として受け入れ可能な分子複合体の塩およびエステル型を医薬として適当な担体とともに含む、上に詳細に記載したような核酸組成物を含む多機能分子複合体からなる医薬組成物に関する。また、このことに関して、本発明は、核酸組成物を含む容器および運搬部分を含む容器からなる医薬キットに関する。所望であれば、そのようなキットの中には、補助剤、キャリヤー、防腐剤および溶媒のようなベヒクルが含まれる。
本発明の詳細な説明
本発明の一つの実施態様に従って、標的即ち宿主細胞内での核酸分子の高レベルのトランスフェクションおよび発現を提供する核酸組成物を、標的細胞に運搬するための多機能分子複合体が提供される。この多機能分子複合体は、主に二つのキーエレメントの組み合わせ：（Ｉ）標的細胞への運搬を所望する核酸組成物：および（II）核酸分子と複合し、且つｉ）標的細胞の膜表面上の特異的レセプターに応答するレセプター特異的結合成分によって個体の体内で所望の標的細胞に配置され；ii）核酸分子の親水性および細胞膜の親油性による相反性を解決して、その結果、前者が後者を通り抜けられるようにし；またiii）多機能分子複合体が標的細胞に入りエンドソームに取り込まれる標的細胞のエンドサイトーシスまたはピノサイトーシスのプロセスの結果形成されるエンドソームから多機能分子複合体が抜け出すのを許すエンドソーム膜分解成分によって成し遂げられる、エンドソーム形成期のリソソーム前駆体の分解よって、標的細胞のリソソーム内での核酸分子の分解を防ぐ；機能を持つ様々な成分を含む、運搬部分：を含む。
運搬部分の成分は、次の成分：Ａ）３から１２の窒素原子を含む、核酸組成物に結合したカチオンポリアミン成分；Ｂ）ポリアミンの窒素原子に結合した少なくとも一つの親油性の長鎖のアルキル基、または、フソ遺伝子ペプチドを結合する、末端にカルボキシル、アミノ、ヒドロキシルまたはスルフヒドリル基を持つより短いアルキル架橋基、または、コール酸またはコレステロールまたはその誘導体、を含むエンドソーム膜崩壊促進成分；および所望であれば、Ｃ）その末端基を通してポリアミンのさらなる窒素原子と結合する短いアルキル架橋基に結合する、標的細胞の天然のレセプターのリガンドである、一つまたはそれより多くのレセプター特異的結合成分：である。
運搬部分は、一つまたはそれより多くの独立的に選択された式（１）のカチオンポリアミン成分：
0003925815.tif 000002
式中：
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立的に、水素およびＣ1-6アルキルからなる基より選択され；
ｍは、それぞれの場合、２から５までの整数から独立的に選択され；３または４が望ましく；
ｎは、１から１０までの整数から選択され；１から６が望ましく；
Ｒ3は、水素；Ｃ1-6アルキル；および以下のａ）、ｂ）、ｃ）よりなる基より独立的に選択された一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分；からなる基より独立的に選択される：
として表すことができる。
ａ）−Ｂ−（ＣＲ1Ｒ2）j−Ｃ（Ｒ）3：
式中；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立的に上に定義した通りであり；
ｊは、６から２４までの整数、望ましくは８から１８、より望ましくは８から１２までであり；また
Ｂは、所望により欠けているか、または以下の式ｉ）からiv）の架橋基である；
0003925815.tif 000003
式中、ｋは、独立的に、整数１から６まで、望ましくは３から５、であり、ｌは、整数０から３０まで、望ましくは４から９、であり、また、ｐは、整数１から３まで、望ましくは１、であり；Ｒ、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立的に上に定義した通りであり；ＺはＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるかまたは欠けている、即ち単結合である。
ｂ）−Ｂ−（Ｒ4）Ｒ：
式中、
Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立的に上に定義した通りであり；
Ｂは、欠けていてはならないが、上のｉ）からiv）の基から、さらにｖ）−（ＣＲ1Ｒ2）j'−Ｘ−［式中、ｊ’は、整数１から８まで、望ましくは２から６まで、より望ましくは５であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立的に上に定義した通りであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）であるか又は欠けているかである］の基から、独立的に選択される架橋基であり：さらに
Ｒ4は、以下のｉ）からiii）よりなる基より独立的に選択され：
ｉ）外皮を持つ動物ウイルスのスパイク糖タンパク質からなるフソ遺伝子ペプチド；
ii）式（２）のコール酸誘導体：
0003925815.tif 000004
式中：
0003925815.tif 000005
は、明確でない立体化学結合を示し、；
---は、単結合または二重結合、即ち、環システムが両方とも同時に不飽和であることはできない、即ち、環システムがΔ４またはΔ５のいずれかであらねばならない、と言う条件下で、環システムの飽和または不飽和部分、を表す：
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨ2、または−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈ（式中、ｎ’は、整数１から６までである）であり；
Ｒ7は、−Ｃ1-6アルキルまたは−Ｃ1-6アルキルカルボニル−を含む、コール酸誘導体と結合する点を形成するラジカルであり；また
Ｒ8は、Ｃ1-6アルキル、特にＣＨ3であり；望ましいコール酸誘導体３α，７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−オイックエステルまたはアミドを含む；および
iii）式（３）のコレステロール誘導体：
0003925815.tif 000006
式中：
0003925815.tif 000007
は、明確でない立体化学結合を表し、
---は、単結合または二重結合、即ち、環システムが両方とも同時に不飽和であることはできない、即ち、環システムがΔ４またはΔ５のいずれかであらねばならない、と言う条件下で、環システムの飽和または不飽和部分、を表し：
Ｒ6aは、−Ｃ1-6アルキル−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、または−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−からなるコレステロール誘導体の結合点を形成するラジカルであり；
Ｒ7aは、−Ｃ1-6アルキル、特に（ＣＨ2）3ＣＨ（ＣＨ3）2であり；また
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキル、特にＣＨ3であり；望ましいコール酸誘導体、コレスト−５−エン−３’−β−カルボネート、−β−カルバメート、または−β−メチレンカルボキサミドを含み；
さらに、Ｒ3は少なくとも一つのカチオンポリアミン成分の少なくとも一つの窒素原子に結合する一つまたはそれより多いエンドソーム膜崩壊促進成分であると言う条件であり；また、
所望により、Ｒ3は、一つまたはそれより多くのエンドソーム膜崩壊促進成分を結合する少なくとも一つのカチオンポリアミン成分のもう一つの窒素原子、またはそれといかなるエンドソーム膜崩壊促進成分をも結合しない少なくとも一つのさらなるポリアミン成分の窒素原子のいずれかと結合する、以下に定義した一つまたはそれより多くの基であることができる。
ｃ）−Ｂ−（Ｒ5）Ｒ：
式中、
Ｂは、欠けていてはならず、ｉ）からｖ）までの基より独立的に選択された架橋基であり；
Ｒは、独立的に上に定義した通りであり；また
Ｒ5は、
ｉ）Ｄ−ビオチン；
ii）β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド；
iii）Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チアノグルコシド）リシン；
iv）Ｎ2，Ｎ6−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン；
ｖ）5-メチルテトラヒドロホレート；
vi）葉酸；
vii)フォリン酸；
viii）α−３’−プロピオニルチオマンノシド；および
ix）α−３’−プロピオニルチオマンノシド−６−ホスフェート。
からなる基より独立的に選択されるレセプター特異的結合成分である。
核酸組成物
本発明の多機能分子複合体の二つの基本成分は、核酸組成物および運搬部分である。「核酸組成物」とは、一つまたはそれより多くの分子のリン酸が炭水化物分子、即ちペントースまたはヘキソース、と結合し、この分子が、例えばアデニンのようなプリンから、例えばチミンの様なピリミジンから、誘導された塩基と代わる代わる結合する一つまたはそれより多くの任意の化合物群を意味する。特に、自然発生の核酸分子は、ゲノムのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびゲノムのリボ核酸（ＲＮＡ）ならびに様々な異なる型のＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、を含む。また、異なるＲＮＡに相補的な異なるＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をも含む。合成されたＤＮＡまたは自然発生のＤＮＡと合成ＤＮＡのハイブリッドが、計画されている。
本発明で用いられる核酸組成物は、一本鎖または二本鎖のいずれかであって良く、線状であっても環状、例えばプラスミド、であっても良く、またオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれかである。それらは、１５ほどの小ささの塩基または塩基対を含むことができ、または、２０，０００ほどの大きさの塩基または塩基対（２０ｋｂ）を含むこともできる。運搬部分は、核酸組成物に加える場合、案分で用いられるので、物理的輸送を実用面から考察すると、用いることのできる核酸組成物の大きさの上限は大きく制限されるであろう。
また、これらの自然発生物質に加えて、本発明に用いられる核酸組成物は、合成組成物、即ち、核酸類似体を含むことができる。これらは、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡと比較的短いオリゴヌクレオチドを相補的にハイブリダイゼーションし、そうすることによって、これらの細胞内核酸の正常で重要な機能を崩壊させる、アンチセンス方法論において特に有用であることが分かった。例えば、Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ（１９８９）を参照のこと。
標的細胞に運搬される核酸組成物のサイズ、形態および具体的配列は、予定される個々の適用について最適化することができ、そのような最適化は、当業者によく知られている。しかしながら、核酸組成物の運搬が所望される個体内の標的細胞の形態は、本発明の多機能分子複合体の個々の選択に深く関わる。例えば、免疫応答を誘発するために核酸分子を筋肉内に注射することによって標的細胞に核酸分子を運搬することを所望する場合、この運搬は、結合するためのカチオンポリアミン、エンドソーム膜崩壊促進成分として上に定義した親油性の長鎖のアルキル基、を含む上に定義したような本発明の多機能分子複合体を用いることによって、果たしうることが分かるであろう。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、望ましい核酸組成物の運搬は、カチオンポリアミンに体細胞の識別を可能にするレセプター特異的結合成分、例えばＮ２，Ｎ６−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシンまたはＮ２，Ｎ６−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ６−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン、を結合させる本発明の多機能分子複合体を用いることによって容易に果たされる。
本発明に従って標的細胞に運搬される核酸組成物は、適当なオープンリーディングフレームおよびタンパク質を発現するためのプロモーターならびに発現に適当であろうその他の任意の調節配列を含んでいなければならない。本発明の方法によって配達される核酸組成物は、所望される個々の適用に適当なように設計構築することができ、その全ては当業者に良く知られている。
本発明の多機能分子複合体および方法を用いて細胞へ配達される核酸分子は：１）予防的および／または治療的免疫化剤として機能するタンパク質の遺伝子鋳型；２）欠損、欠失または非機能遺伝子を置き換えるためのコピー；３）治療用タンパク質の遺伝子鋳型；４）アンチセンス分子のための、およびそれ自体がアンチセンス分子としての、遺伝子鋳型、または、５）リボゾームのための遺伝子鋳型：として供されてよい。
タンパク質をコードする核酸分子の場合、核酸分子は、それらが配達される個々の動物の標的細胞内での転写および翻訳に必要な調節配列を含むことが望ましい。
アンチセンス分子およびリボザイムの鋳型として供される核酸分子の場合、そのような核酸分子は、それぞれ、それによってコードされるアンチセンスおよびリボザイム分子のコピーを十分に生産するために必要な調節エレメントに連結していることが望ましい。核酸分子は、レトロウイルス粒子を含まず、また、プラスミドの形のＤＮＡとして提供されることが望ましい。
運搬部分
運搬部分のコアまたは骨格は、３から１２のアミンを含むカチオンポリアミンである。一つより多くのこれらのカチオンポリアミン成分を含んで良く、それ自体では核酸分子が細胞膜を通過することはできないであろうが、このカチオンポリアミンは核酸分子の親水性および細胞膜の親油性によって起こる相反性を解決する機能を持つ。ポリアミンのカチオン基は、イオン結合で核酸のアニオン基に結合し、こうすることによって、それらの電荷は中和され、また複合体に結合するポイントとしても提供される。１μｇのＤＮＡは、ヌクレオチドのナトリウム塩の平均分子量が３２５と仮定すれば、３．１ナノモルのリン酸塩のアニオン電荷を含む。本発明の運搬部分は、核酸のアニオン電荷が運搬部分のポリアミン成分のカチオン電荷によって実質的に中和されない限り、核酸組成物の運搬を成し遂げるに有効とはならないであろう。
本発明の実施態様では、標的細胞およびその他の細胞内に競合する結合部位が存在し、その存在は技術者に熟知されており、また所望したような核酸へのポリアミンの結合を競合阻害するかまたは他の方法で妨害するので、実際問題として、化学量より明らかに過剰な量のカチオンポリアミンを用いることが必要であると理解されるであろうが、概念的には、より多いまたはより少ない化学量論的様式でアニオンに電荷した核酸と釣り合う単一のカチオンポリアミンを用いることができることが分かるであろう。また、それぞれのポリアミン鎖または断片が、結合するようになるであろう関連する核酸より小さいような場合には、一つより多いそのようなカチオンポリアミンを用いることができると期待される。しかしながら、核酸のアニオン電荷の中和が起こるためには、これらの個々のカチオンポリアミン成分の全体のサイズまたは長さは、実質上、核酸成分と同じサイズまたは長さであらねばならない。また一方、実施上の理由により、存在する核酸成分の量を超えて、明らかに過剰のカチオンポリアミン成分が必要であることも、理解されるであろう。一つより多くのカチオンポリアミンを用いると、それと結合する基の型を柔軟に変えることができる。例えば、一つのカチオンポリアミン成分は、特別なエンドソーム膜崩壊促進成分を持つことができる、と同時に、もう一つのカチオンポリアミン成分はレセプター特異的結合成分または多分異なるエンドソーム膜崩壊促進成分を持つことができる。そのようなカチオンポリアミン成分の総数は、可変であり、核酸のサイズまたは長さだけではなく、その上それに結合する基の数および型にも依存するであろう。
運搬効率、即ちトランスフェクションは、多機能分子複合体、運搬部分と核酸の組み合わせが、強い正電荷を持つ限り、最適化されることはない。それ故、運搬部分の量は、これに注意して選択されねばならず、選ばれた正確な量は、この技術分野で熟知された方法によって計算することのできるその電荷密度に依存する。
運搬部分のトリアミン、テトラアミン、ペンタアミンおよびより高いポリアミン成分は、上に説明したように、機能するためにカチオンでなくてはならない。このことは、酸付加塩、例えば塩化アンモニウムユニットを形成する塩酸塩、を作る単純な手段によって成し遂げることができる。また、ポリアミンのカチオン型が生理的ｐＨの条件下で形成される場合もあり、その場合には、カチオンを直接的に形成させる必要はない。それ故、「カチオンポリアミン」と言う言葉は、これらの可能性の両方を含むつもりである。
ポリアミンに存在することが望まれるアミン基の数は、用いられる多機能分子複合体の投与様式にある程度依存するであろうことが予想される。例えば、筋肉内投与では、ポリアミンに３から５のアミン基を持つことが望ましいが；これに対して全身的注射、例えば静脈内注射では、ポリアミンに５から８のアミン基を持つことが望ましい。一般的に体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での適用では、ポリアミンに５から８のアミン基を持つことが望ましい。
運搬部分の次の成分は、存在することが要求されるエンドソーム膜崩壊促進成分である。これは、ポリアミンの一つまたはそれより多くの窒素原子を通して結合した一つあるいはそれより多くの親油性の長鎖のアルキル基を含む、かまたは、これを通してフソ遺伝子またはコール酸またはコレステロールまたはその誘導化合物に結合する、架橋基”Ｂ”、例えば、所望であれば末端にアミノ、ヒドロキシルまたはスルフヒドリル基を持つより短いアルキル結合部分を含む、かのいずれかであることができる。
親油性の長鎖アルキル基は、式−Ｂ−（ＣＲ1Ｒ2）j−Ｃ（Ｒ）3：式中、Ｂは定義した架橋基であり；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は水素およびＣ1-6アルキルよりなる基よりそれぞれ独立的に選択され；またｊは６から２４までの整数であり、望ましくは８から１８、より望ましくは８から１２までである：で定義される。
基”−Ｂ−”は、Ｒ3が前述のａ）に定義したような親油性長鎖アルキル基を含むエンドソーム膜崩壊促進成分である場合、無い、即ち単結合であってよい。また、基”−Ｂ”は、
0003925815.tif 000008
（式中の様々な置換基は上に定義した通りである）：
よりなる基から独立的に選択された一員である架橋エレメントであって良い。
エンドソーム膜崩壊促進成分が、親油性の長鎖アルキル基と言うよりはむしろ、フソ遺伝子ペプチドまたはコール酸またはコレステロールまたはその誘導体化合物である場合には、架橋基”Ｂ”は、存在する必要があり、それは上記のｉ）からｖ）の基から独立的に選択される一員であろう。この選択は、存在することが要求されるまたは望まれる化学結合の型に依存するであろう。例えば、ｉ）およびiv）は、カルボキサミド結合であるが、ii）およびiii）は、”Ｚ”が、Ｏ、Ｓまたは無い場合に依存して、それぞれカルバメート、チオカルバメート、またはカルバモイル結合である。ｖ）の場合、結合は、”Ｘ”が、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、または無い場合に依存して、それぞれ、オキシ、チオ、アミノまたはアルキレンであろう。他方、エンドソーム膜崩壊促進成分は、カルボニル、アミノまたはその他の末端基を持つことができ、これによって用いられる架橋構成員の選択を決定することができる。だが、そのような選択は全て、当業者に熟知されている。
最も単純には、架橋基は、立体化学的問題から、主にアルキレン結合部を用いることができる。しかしながら、他の架橋基もまた、様々な物理的および化学的ならびに立体配置的性質を本発明の多機能分子複合体に伝えるのに望ましいであろう。ポリエチレングリコール基は、特にこの点に関して有効でありうる。
”Ｃ1-6アルキル”と言う言葉は、上記のように、また本発明の説明全体を通して、これらに限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルを含む、直鎖および枝分かれ鎖のアルキル基を指す。
上記の親油性長鎖アルキル基の式においては、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は全て水素であることが望ましく、ｊは整数８から１８までを指す。少なくとの一つのこれらの親油性長鎖アルキル基が存在しなければならないが、３より大きくないそのような基が存在することが望ましい。たった一つのそのような基を持つことが望ましい。それ故、本発明の望ましい運搬部分の例としては、エンドソーム膜崩壊促進成分が上記のような親油性長鎖アルキル基である場合には、Ｎ4−オクチルスペラミジン、Ｎ4−ドデシルスペラミジン、Ｎ4−オクタデシルスペラミジン、Ｎ4−オクチルスペルミン、Ｎ4−ドデシルスペルミン、およびＮ4−オクタデシルスペルミンがあげられる。
また、エンドソーム膜崩壊促進成分は、所望であれば、末端にアミノ、ヒドロキシルまたはスルフヒドリル基を持ち、それを通してフソ遺伝子ペプチドまたはコレステロールまたはその誘導体化合物に連結する、より短いアルキル架橋基を含むこともできる。そのような成分は、式−Ｂ−（Ｒ4）Ｒ：式中、Ｂ基は、（ＣＲ1Ｒ2）j'−Ｘ−［式中、Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、水素またはＣ1-6アルキルからなる基よりそれぞれ独立的に選択され；ｊは、１から６までの整数であり、望ましくは２から４までであり；Ｘは，Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）または無い］である：で示すことができる。
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ水素であり、ｊ’は示したとおり２から４であるが、ＸはＮと定義されることが望ましい。それ故、より短いアルキル架橋基は、望ましくはエチル、ｎ−プロピルまたはｎ−ブチルであり、またエンドソーム膜崩壊促進成分を含む、フソ遺伝子ペプチドまたはコール酸またはコレステリルまたはその誘導体化合物に連結する、末端アミノ基を持つであろう。
代わりに、”Ｂ”架橋基の他の構成基を選ぶこともできる。例えば、構成基ｉ）は、カルボキサミド連結基を持つアルキル架橋部分を提供し、その最も単純な典型は、基−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であろう。構成基ii）は、カルバメート型の結合基を持つアルキレン架橋部分を提供し；またこの構成基の最も単純な典型は、カルバモイル型の連結基である−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基であろう。カルバメート連結基は、−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基で表されるであろうが、この基の単純な変異体は、チオカルバメート結合基：−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−：を提供するであろう。構成基iii）およびiv）は、”ｌおよび”ｐ”の定義に依存して、変化しうるサイズ、即ち、エチレンオキシドモノマーユニットの繰り返し回数、のポリエチレングリコール架橋部分をアルキル架橋部分に加えるが、同じ末端連結基変異体を提供する。
エンドソーム膜崩壊促進成分として機能するフソ遺伝子ペプチドは、この技術分野で既知の外皮を持つ動物のウイルスのスパイク糖タンパク質を含む。膜融合は、平面または環状のいずれかで、最初の接近、融合、および分離の段階からなる。融合反応は、急速で、高い特異性をもち、また漏出性でない。外皮を持つ動物ウイルスの膜タンパク質は、二重層のウイルス膜にわたる糖タンパク質を含み、ウイルスの主要部の大部分を外部に、また、二重層の内側表面に、これに関連する二重層にわたらない非グリコシル化タンパク質を持つ。糖タンパク質は、ウイルス膜の表面に基の突起物を形成し、また、これらのスパイク糖タンパク質は、ウイルスが宿主細胞内へ侵入する際のキーの役割を演じる。スパイク糖タンパク質は、最も良く特徴づけられたウイルス膜タンパク質の一つである。細胞への侵入において、スパイク糖タンパク質は、細胞表面へのウイルス分子の付着、およびサイトゾル内へのヌクレオキャプシドの貫通の原因となり、サイトゾル内では、ウイルス分子のエンドサイトーシスの後、スパイク糖タンパク質がエンドソームの限定膜と融合する役割を演じ、それによってまた、ヌクレオキャプシドがサイトゾルに再侵入する。外皮を持つある動物ウイルスでは、スパイク糖タンパク質は、具体的に特徴づけられており、例えば、オルトミクソウイルス内では、その一つはノイラミニダーゼであり、もう一つは赤血球凝集素である。これらのフソ遺伝子ペプチドの全ては、それらのアミノ酸配列、全体の形態、融合のプロセス全体での役割、および活性の必要条件に関して、長期間にわたる研究の課題であり、また詳細には技術文献に開示されている。例えば、Ｊ．Ｗｈｉｔｅ、Ｍ．ＫｉｅｌｉａｎおよびＡ．Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１６，１５１−１９５（１９８３）（ここにその全体を参照として取り入れる）を参照のこと。
そのようなフソ遺伝子ペプチドおよび外皮を持つウイルスのスパイク糖タンパク質から誘導した相同体の例としては、Ｎ末端からＣ末端まで読む以下のペプチド配列が含まれる。
0003925815.tif 000009
0003925815.tif 000010
当業者は、一つまたはそれより多くのアミノ酸の付加、欠損、または置換を持つ上記のペプチド、特にアミノ酸置換を保持するペプチド、と同等に機能するぺプチド、を含む、その他のそのようなフゾ遺伝子ペプチドを、本発明に用いうることを、容易に認識するであろう。
エンドソーム膜崩壊促進成分として機能するコール酸およびその誘導体は、式（２）の化合物：
0003925815.tif 000011
式中：
0003925815.tif 000012
は、明確でない立体化学結合を示し、；
---は、単結合または二重結合、即ち、環システムが両方とも同時に不飽和であることはできない、即ち、環システムがΔ４またはΔ５のいずれかであらねばならない、と言う条件下で、環システムの飽和または不飽和部分、を表す：
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨ2、または−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n'Ｈ（式中、ｎ’は、整数１から６までである）であり；
Ｒ7は、−Ｃ1-6アルキルまたは−Ｃ1-6アルキルカルボニル−を含む、コール酸誘導体と結合する点を形成するラジカルであり；また
Ｒ8は、Ｃ1-6アルキル、特にＣＨ3である：
からなる。コール酸およびその誘導体化合物は、３α，７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−オイックエステルまたはアミドからなる基より選択された一つまたはそれより多くの構成員を含むことが望ましい。
エンドソーム膜崩壊促進成分として機能するコレステリルおよびその誘導体は、式（３）の化合物：
0003925815.tif 000013
式中：
0003925815.tif 000014
は、明確でない立体化学結合を表し、
---は、単結合または二重結合、即ち、環システムが両方とも同時に不飽和であることはできない、即ち、環システムがΔ４またはΔ５のいずれかであらねばならない、と言う条件下で、環システムの飽和または不飽和部分、を表す：
Ｒ6aは、−Ｃ1-6アルキル−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、または−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−からなるコール酸誘導体の結合点を形成するラジカルであり；
Ｒ7aは、−Ｃ1-6アルキル、特に（ＣＨ2）3ＣＨ（ＣＨ3）2であり；また
Ｒ8aは、Ｃ1-6アルキル、特にＣＨ3である：
からなる。コレステリルおよびその誘導体は、コレスト−５−エンー３’−β−カルボネート、−β−カルバメート、または−β−メチレンカルボキサミドからなる基より選択された一つまたはそれより多くの構成員を含むことが望ましい。
本発明の実施態様は、所望であれば、細胞に存在する天然のレセプター仲介エンドサイトーシス経路を利用することによって、標的細胞、特に真核細胞への核酸組成物の効果的運搬を助ける、レセプター特異的結合成分を提供することである。レセプター特異的結合成分は、このように天然レセプターのリガンドであり、このように標的細胞への多機能分子複合体の結合を助けることができる。その後、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスが起こり、それによって複合体全体がエンドソーム内に包み込まれた状態で標的細胞内に運搬される。
レセプター特異的結合成分は、具体的な細胞集団、例えばヘパトサイト、を標的とする本発明の多機能分子複合体に課せられた重要な機能を提供する。結合成分は、複合体が投与される動物の体内において、標的細胞に複合体が実質的に連結することで、所望の標的細胞への配置を容易にする。
レセプター特異的結合成分が用いられる場合、多機能分子複合体上には、上に定義したエンドソーム膜崩壊促進成分もまた存在するであろう。従って、いったん結合成分が個体の所望される標的細胞に配置され、レセプターに結合することによってその細胞に複合体を連結させると、複合体は、エンドサイトーシスによってその細胞内に運搬され、その結果複合体はエンドソーム内に包含されるであろう。この点では、エンドサイトーシス膜崩壊促進成分は、その膜を崩壊することによってその重要な役割を果たし、その細胞の細胞質内への複合体の漏出を可能にする。
標的細胞内で出来事が正常に進行している限りは、エンドソームの形成は、加水分解酵素によって外来タンパク質の分解を起こすであろうリソソームが任意の外来タンパク質を標的とする前兆である。従って、リソソーム区画内への蓄積は、核酸配達システム効率の大きな障害となる。もしエンドソーム膜崩壊促進成分が存在しなかったならば、本発明の多機能分子複合体は、同じ運命を背負うであろう。この成分は、複合体がエンドソームから漏出することを可能にし、その上、この成分が標的細胞の核内へ移動して核酸組成物を放出することを可能にし、その後、その遺伝子情報は核内で転写されうる。これらの段階および経路を成し遂げる正確なメカニズムは良く理解されていないが、以下の実施例に示すように、多機能分子複合体に含まれる核酸分子の発現が起こる。
レセプター特異的結合成分は、式−Ｂ−（Ｒ5）Ｒ：
式中、
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立的に水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｂは、なかんずく、−（ＣＲ1Ｒ2）j'−Ｘ−［式中、Ｒ1およびＲ2は上に定義の通りであり、ＸはＮ（Ｒ）であり；
ｊ’は１から６まで、望ましくは２から４までの整数である］であり；また
Ｒ5は：
ｉ）Ｄ−ビオチン；
ii）β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド；
iii）Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン；
iv）Ｎ2，Ｎ6−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン；
ｖ）5-メチルテトラヒドロホレート；
vi）葉酸；
vii）フォリン酸；
viii）α−３’−プロピオニルチオマンノシド；および
ix）α−３’−プロピオニルチオマンノシド−６−ホスフェート：
からなる基から独立的に選択されるレセプター特異的結合成分である：
によって、表すことができる。Ｒ、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素であり、指摘したように、ｊ’は２から６であることが望ましい。このように、より短いアルキル架橋基は、望ましくは、エチル、ｎ−プロピルまたはｎ−ブチルであり、また、レセプター特異的結合成分を末端のアミノ基に連結する。
また、エンドソーム膜崩壊促進成分も存在しなければならないので、レセプター特異的結合成分が上記のようなガラクトシル基である場合、本発明の望ましい運搬成分の例は、
Ｎ2−オクチル−Ｎ4−［５−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１”−４’−チオグルコシド）アミノ］ペンチルスペルミジン；
Ｎ2−ドデシル−Ｎ4−［５−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１”−４’−チオグルコシド）アミノ］ペンチルスペルミジン；
Ｎ6−オクタデシル−Ｎ4−［５−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１”−４’−チオグルコシド）アミノ］ペンチル−スペルミジン；
Ｎ6−オクチル−Ｎ4−｛５−［Ｎ2'，Ｎ6'−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6'−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノ｝ぺンチル−スペルミン；
Ｎ2−ドデシル−Ｎ4−｛５−［Ｎ2'，Ｎ6'−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6'−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノ｝ペンチルスペルミン；および
Ｎ2−オクタデシル−Ｎ4−｛５−［Ｎ2'−Ｎ6'−ビス（β１−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6'−（β−３’−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノ｝ペンチル−スペルミン：である。
従って、標的細胞への核酸組成物の運搬に関する本発明の多機能分子複合体を、上に詳細に記載した。この複合体は、本発明の分割された別個の実施態様としての運搬部分を含む。さらに、本発明の態様は、多機能分子複合体を用いる方法に関する。
このように、本発明に従って、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を基本として、標的細胞に核酸組成物を運搬する方法が提供される。この方法では、標的細胞を、核酸組成物を含む多機能分子複合体と接触させる。一つの実施態様では、標的分子は、個体から単離され、それ故細胞は全て同じ型であり、そのために複合体がレセプター特異的結合分子を含む必要はない。特に望ましい実施態様は、微生物培地を発酵条件下に維持すること、本発明の多機能分子複合体を用いて核酸組成物をそれに運搬した結果として、タンパク質生成が微生物によって発現することである。タンパク質生産物は単離され精製される。ここで再び言うと、単一の型の標的細胞が含まれ、それ故レセプター特異的結合成分が存在する必要はない。
この方法は、所望のペプチドまたはタンパク質をコードするか、または鋳型として機能性核酸分子のために供されるかのいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子の標的細胞への運搬を提供する。望ましいタンパク質または機能性核酸分子は、工業的、商業的または化学的に興味ある任意の生産物：例えば、ワクチンを含む治療剤；栄養素および栄養補剤；除草剤および植物成長抑制剤、殺虫剤、だに殺し剤、殺鼠剤、および殺菌剤のような農業上重要な化合物；殺線虫剤を含む殺寄生虫薬のような動物の健康に有用な化合物；およびそれ以外生産物：であって良い。標的細胞は、細菌および酵母のような微生物細胞を含む宿主細胞の典型的な培地であるが、植物細胞および哺乳動物細胞を含むこともできる。細胞の培養は、所望のタンパク質または機能的核酸分子の生産を最大にする、この技術分野でよく知られた発酵技術に従って維持され、発酵生成物を集め、既知の方法によって精製される。
さらに、本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での様式で、個体の細胞に核酸組成物を運搬する方法に関する。方法は、核酸組成物を含む、本発明の多機能分子複合体と個体の細胞を接触させる段階を含む。ここで再び言うが、核酸分子は、所望のペプチドあるいはタンパク質をコードするか又は機能性核酸分子に関する鋳型として供されるかのいずれかの、ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド分子は、レトロウイルス粒子を用いずに投与される。所望のタンパク質は、個体内で機能するタンパク質であるか、または免疫反応を開始するために供されるかのいずれかであって良い。
核酸分子は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）のいずれかを基本として、個体細胞に投与することができる、即ち、個体細胞との接触が、最も典型的な方法に従って、個体体内で行われても良く、または、個体細胞との接触が、様々な適当な手段で個体の体内から治療が望まれる細胞を引き出し、次に核酸分子とその細胞を接触させ、さらに、その細胞を該個体の体内に順番に戻すことによって、個体の体の外側で行われても良い。
本発明によって提供される個体細胞への核酸組成物の運搬方法は、特に、病原体に対して個体を免疫化する方法を含む。この方法では、細胞に投与される核酸組成物は、抗原として病原体上に示されるエピトープと同一または実質的に同様の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドコードするヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチド配列は、調節配列に機能できるように連結されている。核酸分子は、もちろん、個体の細胞内で発現する能力を持たねばならない。
本発明によって提供される個体の細胞へ核酸組成物を運搬する方法は、さらに、高増殖性疾患または自己免疫病に対して個体を免疫化する方法を含む。そのような方法では、個体細胞に投与される核酸組成物は、それぞれ高増殖性疾患関連タンパク質上または自己免疫病関連タンパク質上に示されるエピトープと同一または実質上同様の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、制御配列に機能可能なように連結された、ヌクレオチド配列を含む。ここに再び記載するが、核酸分子は、個体細胞内で発現する能力を持たねばならない。
また、本発明に従って、個体細胞を核酸組成物を含む多機能分子複合体と接触させ、それによって、欠失、欠損または抑制された遺伝子の活性を回復させる、または個体に治療効果をもたらすタンパク質をコードし、且つ調節配列に機能するように連結させた、ヌクレオチド配列を含む、細胞内で発現する能力を持つ核酸分子を投与することで、自己免疫病に苦しむ個体を治療する方法を提供する。
上記の方法を行うために、本発明は、核酸組成物を含む多機能分子複合体、ならびにその分子複合体の医薬として許容しうる塩およびエステル型を、医薬として受容可能なキャリヤーと共に含む、医薬組成物を提供する。また、ここに記載するように、核酸組成物を含む容器および運搬部分を含む容器からなるキットも含まれる。所望であれば、そのようなキット内には、補助剤、キャリヤー、防腐剤および溶媒のようなベヒクルが含まれる。
本発明に従って、病原体または疾病に関連する異常細胞に対して個体を予防的および／または治療的に免疫化する組成物および方法が提供される。遺伝物質は、病原体または標的となる細胞上に認められる免疫原性タンパク質と少なくとも一つのエピトープを共有するペプチドまたはタンパク質をコードする。遺伝物質は、個体の細胞によって発現され、免疫応答を誘い出す免疫原性標的として提供される。得られた免疫応答は、幅広いもので、体液性免疫応答に加えて、細胞性免疫応答の両腕を誘発する。本発明の方法は、予防的および治療的免疫の授与に有用である。このように、免疫化の方法は、病原体の挑戦または特別な細胞の発生あるいは増殖から個体を保護する方法、ならびに病原体の感染、高増殖性疾病または自己免疫病の苦しむ個体を治療する方法の両方を含む。このように、本発明は、標的タンパク質、即ち病原体または個体自身の「異常」細胞と特異的に関連するタンパク質、に対して幅広い免疫応答を誘発するために有用である。
また、本発明は、高増殖性細胞と特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を誘発することによって、高増殖性疾患および癌のような病気と戦うのに有用である。さらに、本発明は、自己免疫状態に関わる細胞と特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を誘発することによって自己免疫病および疾患と戦うのに有用である。
本発明の他の態様は、遺伝子治療に関する。これは、不完全な、欠失した、機能しないまたは部分的に機能するいずれかの個体の遺伝子に関連する、または治療タンパク質；即ち個体内に存在すると個体内での欠失を排除するおよび／または存在すると個体に治療効果を提供するであろうタンパク質；をコードする、遺伝子の外因性コピーである核酸分子を個体細胞内に誘導する組成物および方法を含む。このように、個体へのタンパク質の直接投与に適当かつ望ましい代替物でもある、そのようなタンパク質を配達する方法を提供する。
ここに用いられるように、「所望のタンパク質」と言う言葉は、免疫応答の標的タンパク質、または遺伝子治療養生法においての治療用あるいは補強用タンパク質のいずれかとして作用する、本発明に用いられる遺伝子構築物によってコードされるペプチドおよびタンパク質をさすつもりである。
本発明の方法および組成物を用いて、所望のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、それを発現する個体細胞内に導入され、それに従って、所望のタンパク質が生産される。核酸組成物、例えば、望ましいタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、個体細胞内での発現に必要な制御エレメントに連結される。ＤＮＡ発現のための制御エレメントは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。さらに、コザック（Ｋｏｚａｋ）領域のような他のエレメントもまた、核酸組成物内に含まれるであろう。
ここに用いるように、「核酸組成物」と言う言葉は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、また構築物が投与される個体細胞内での発現を直接指示する能力を持つプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに機能可能なように連結した開始シグナルおよび終止シグナルを含む、ＤＮＡあるいはＲＮＡまたはその他の核酸分子をさす。
ここに用いるように、「発現できる型」と言う言葉は、標的タンパク質をコードするコード配列に機能できるように連結した必要な制御エレメントを含む遺伝子構築物であって、その結果個体細胞内に存在する場合コード配列を発現するであろう、遺伝子構築物をさす。
ここに用いるように、「遺伝子ワクチン」と言う言葉は、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を含む医薬調製物をさし、治療的免疫応答を呼び起こすに有用な医薬調製物を含む。
ここに用いるように、「遺伝子治療用」と言う言葉は、治療用または補正用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を含む医薬調製物をさす。代わりに、遺伝子治療用は、望ましくない遺伝子配列を阻害するアンチセンス配列をコードしても良い。さらに、遺伝子治療用は、リボザイムをコードしても良い。
ここに用いるように、「標的タンパク質」と言う言葉は、これに対して免疫応答を誘発することのできるタンパク質をさす。標的タンパク質は、それに対して免疫化が必要とされる、病原体、または癌細胞あるいは自己免疫病に関わる細胞のような望ましくない細胞型からのタンパク質の持つ少なくとも一つのエピトープを共有する免疫原性タンパク質である。標的タンパク質に対して向けられる免疫応答は、標的タンパク質が関連する特異的感染または疾病に対して個体を守り且つ個体を治療するであろう。
ここに用いられるように、「エピトープを共有する」と言う言葉は、別のタンパク質のエピトープと同一または実質的に同様の少なくとの一つのエピトープを含むタンパク質をさす。また、「実質的に同様のエピトープ」と言う言葉は、タンパク質のエピトープと同一ではない構造を持つにもかかわらず、そのタンパク質と交差反応する細胞性または体液性免疫応答を呼び起こすエピトープをさすつもりである。
ここに用いられるように、「治療用タンパク質」と言う言葉は、それが存在すると個体に治療効果を与えるタンパク質をさすつもりである。。
ここに用いられるように、「タンパク質を補正する」と言う言葉は、その存在が、欠失した、欠損した、機能しないまたは部分的に機能する内因性遺伝子による、完全に機能する内因性タンパク質生成の欠如を補正するタンパク質をさすつもりである。
標的細胞に取り込まれた場合、制御エレメントに機能できるように連結した所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明に用いられた核酸組成物は、機能する染色体外分子として細胞内に存在し続けることができるか、または細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれることができる。ＤＮＡは、分離された両遺伝物質としてプラスミドの形で細胞内に導入することもできる。代わりに、染色体内に組み込むことのできる線状ＤＮＡを標的細胞内に導入することもできる。ＤＮＡを細胞内に導入する場合、染色体内へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を加えることができる。組み込みを促進するに有効なＤＮＡ配列もまた、ＤＮＡ分子内に含むこともできる。代わりに、ＲＮＡを細胞に投与することもできる。また、セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む線状のミニクロモソームとして、核酸組成物を提供することも計画中である。ここに用いられているように、「ＤＮＡ構築物」、「核酸組成物」および「ヌクレオチド配列」と言う言葉は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方をさすつもりである。
ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な制御エレメントには：プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナル：が含まれる。さらに、エンハンサーもまた、時には遺伝子発現に必要である。このようなエレメントを所望のタンパク質コードする配列に機能するように連結すること、また、制御エレメントが投与される個体内で機能することが、必要である。
開始コドンおよび終止コドンは、一般的には、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分であると考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、遺伝子構築物が投与される個体内で機能することが必要とされる。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列とフレームが合わなくてはならない。用いられるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルもまた、個体細胞内で機能しなければならない。
本発明に用いられる核酸組成物に有用なプロモーターの例としては、特にヒトの遺伝子ワクチンの生産においては、これらに限定されるわけではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＴＶ）のプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端繰り返し（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）プロモーターのようなＨＩＶからのプロモーター、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスからのプロモーター、ＡＬＶからのプロモーター、シトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）即時型初期プロモーターのようなシトメガロウイルスからのプロモーター、エプスタインバールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）からのプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からプロモーターが含まれる。
本発明に用いられる核酸組成物で有用なポリアデニル化シグナルの例として、特にヒトの遺伝子ワクチン生産においては、これらに限定されるわけではないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして注目される、ｐＣＥＰ４０プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）内に組み込まれたＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いることができる。
核酸分子の発現に必要な制御エレメントに加え、他のエレメントもまた、ＤＮＡ分子内に含まれて良い。そのようなさらなるエレメントには、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、これらに限定されるわけではないが、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサー：を含む。
核酸組成物は、構築物を染色体外に維持し、また細胞内に多数の構築物のコピーを生産するために、哺乳動物の複製開始点と共に提供されうる。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、エプスタインバールウイルスの複製開始点、および組み込まれること無く高コピー数のエピソームを複製する核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。遺伝子治療に関係する本発明の態様では、活性化に必要な抗原を含む複製開始点を持つ構築物が望ましい。
免疫化への適用に関連する本発明のその他の実施態様では、核酸組成物は、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、さらにまたそのような標的タンパク質に対する免疫応答を強化するタンパク質のための遺伝子をも包含する。そのような遺伝子の例としては、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のようなサイトカインならびにリンホカインをコードするそれらがあげられる。いくつかの実施態様では、免疫化組成物に用いられる核酸組成物中に、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含むことが望ましいであろう。
いかなる理由にせよ、核酸組成物を受け入れた細胞を排除することを所望するならば、細胞崩壊の標的として供される核酸組成物に、さらなるエレメントを加えることができる。発現可能な形のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、核酸組成物中に含むことができる。次に、薬品ガングシクロビア（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ）を個体に投与することができ、その薬品は、ｔｋを生成する任意の細胞を選択的に殺傷する原因となり、それ故、核酸組成物を含む細胞を選択的に崩壊させるための手段を提供するであろう。
タンパク質の生産を最大にするために、構築物が運搬された細胞内での遺伝子発現に非常に適した制御配列を選択することができる。さらに、標的細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、標的細胞内で機能するＤＮＡ構築物を容易に製造することができる。
核酸組成物は、処理される細胞と同じ型の組織培養細胞を用いて、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で発現レベルを試験することができる。例えば、もし遺伝子ワクチンをヒト筋肉細胞に投与するならば、横紋筋肉腫の固い筋肉腫瘍細胞のように、培地中で増殖した筋肉細胞を生体外モデルとして用いて、発現レベルを測定することができる。
本発明に用いられる核酸組成物は、レトロウイルス粒子内には組み込まれていない。核酸組成物は、レトロウイルスＲＮＡを持つレトロウイルス粒子が細胞に感染する場合に起こるような、レトロウイルス粒子仲介挿入無しに、細胞によって取り込まれる。ここに用いられるように、「レトロウイルス粒子を含まない」と言う言葉は、レトロウイルス粒子内に組み込まれていない核酸組成物をさすつもりである。ここに用いられるように、「感染性試薬から引き離された」と言う言葉は、活性、不活性、生存または死滅のいずれにせよ、細胞に感染する能力を持つウイルス、細菌または真核生物のベクターの一部分ではない、遺伝子物質をさすつもりである。
いくつかの実施態様では、核酸組成物は、細胞内への導入時に、核酸組成物が感染性ウイルス粒子の生産を指示するには不十分な遺伝情報を持つように、完全でなく複製可能でないウイルスゲノムを構築する。ここに用いられているように、「不完全なウイルスゲノム」と言う言葉は、そのような核酸組成物の細胞内への取り込みが感染性ウイルスの生産に十分な遺伝情報の導入を構築しないような、完全でないゲノムを含む核酸組成物をさすつもりである。
いくつかの実施態様では、ウイルス粒子の生産を許すに十分な遺伝物質を含む核酸組成物として、薄めたウイルスワクチンを配達することができる。核酸組成物として薄めたワクチンを配達することは、安全、純粋かつ活性な多量の免疫化生成物の生産を許す。
本発明は、ウイルス、原核生物ならびに単細胞の病原性生物および多細胞性寄生物のような病原性真核生物のような全ての病原体に対して個体を免疫化するために用いることができる。本発明は、ウイルス、および淋病、リステリアおよび赤痢菌のような原核生物のように、細胞に感染し夾膜を持たないそのような病原体に対して個体を免疫化するために、特に有用である。さらに、本発明は、細胞内病原体であるそれらのライフサイクルの任意の段階を含む、原生動物病原体に対して個体を免疫化するためにもまた有用である。ここに用いられるように、「細胞内病原体」と言う言葉は、その再生またはライフサイクルの少なくとも一部分の間、宿主細胞内に存在し、そこで病原性タンパク質を生産するまたは生産する原因となるウイルスまたは病原性生物体をさすつもりである。表１は、本発明に従ってワクチンを作ることのできるいくつかのウイルスの科および属のリストを提供する。前記の表１に列挙したそのような抗原のような、病原体抗原上に出現するエピトープと同一または実質的に同様の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、ワクチンに有用である。
さらに、本発明は、表２に列挙したそれらのような原核生物および真核原生動物病原体ならびに多細胞の寄生虫を含むその他の病原体に対して個体を免疫化するのにも有効である。
病原体感染を防御するための遺伝子ワクチンを製造するためには、防御免疫応答を付与することのできる免疫原性タンパク質をコードする遺伝物質を、核酸組成物中に含まなくてはならない。病原体が細胞内に感染するか、このことに関して本発明は特に有用であるが、あるいは細胞外に感染するかいずれの場合においても、全ての病原体抗原が防御応答を誘発するとは限らない。ＤＮＡおよびＲＮＡは両者とも比較的小さく比較的容易に製造できるため、本発明は、複数の病原体抗原を持つ予防接種を可能にすると言うさらなる利益を提供する。遺伝子ワクチン中に用いられる核酸組成物には、多くの病原体抗原をコードする遺伝物質を含むことができる。例えば、いくつかのウイルス遺伝子を、単一の構築物中に含むことができ、それ故、複数の標的を提供することができる。さらに、個体内の異なる細胞に配達することのできる複数の接種物は、ある場合には、完全な、またはより好ましくは不完全な、例えば完全に近い遺伝子のセットがワクチン内にまとめて含まれるように、調製することができる。例えば、ウイルス遺伝子の完全なセットは、それぞれが異なる部位に投与される異なるゲノムの半分を含む二つの構築物を用いて投与することができる。こうすることによって、感染性ウイルスが組み立てられる危険性を伴わずに、それぞれの抗原に対して、免疫応答を引き出すことができる。これによって一つより多くの単一の抗原標的を導入することができ、防御抗原を同定する必要性をなくすことができる。
さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの扱い易さおよび安価さは、防御抗原をスクリーニングするより効率的な手段を与える。遺伝子は分類され、タンパク質よりもっと簡単に分類学的に試験することができる。一端、防御ワクチンを必要とするであろう病原性作因および生物体が選択されたならば、次に免疫原性タンパク質を同定する。表１および２は、それらによる感染から個体を防御する遺伝子ワクチンを調製することのできるいくつかの病原性作因および生物体のリストを含む。病原体に対して個体を免疫化する方法は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶまたはＨＢＶに対して個々に指示することができる。
また、本発明に従って、高増殖性疾病を特徴付ける高増殖性細胞に対する幅広い防御免疫応答を与える方法ならびに高増殖性疾病に罹患した個体を治療する方法が提供される。ここに用いられているように、「高増殖性疾病」と言う言葉は、細胞の高増殖性によって特徴付けられるそれらの疾病および病気をさすつもりである。高増殖性疾病の例としては、癌および乾せんの全ての型が含まれる。
個体細胞内に免疫原性「高増殖性細胞」に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を導入すると、結果として予防接種された個体の細胞内にそのようなタンパク質を生産することが分かった。ここに用いられているように、「高増殖性関連タンパク質」と言う言葉は、高増殖性疾病に関連するタンパク質をさすつもりである。高増殖性疾病に対して免疫化するために、高増殖性疾病に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を個体に投与する。
高増殖性関連タンパク質が効果的な免疫原性標的であるためには、それは、正常細胞と比較して高増殖性細胞内に独占的にまたはより高いレベルで生産されるタンパク質でなくてならない。標的抗原は、そのようなタンパク質上に見いだされる少なくとも一つのエピトープを含む、タンパク質、そのフラグメントおよびペプチドを含む。いくつかの場合には、高増殖性関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子変異体の生産物である。変異した遺伝子は、結果として正常タンパク質上には見いだされない異なるエピトープを生ずるアミノ酸配列のわずかな違いを除いては正常タンパク質と同一に近いタンパク質をコードする。そのような標的タンパク質には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのようなオンコジーンならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、およびＥＧＲＦによってコードされるタンパク質であるそれらが含まれる。標的抗原としてのオンコジーン生成物に加えて、抗癌治療および予防的養生法のための標的タンパク質は、いくつかの実施態様では、自己免疫病のための標的抗原としても用いられる、Ｂ細胞リンパ腫によって作り出される抗体の様々な領域、およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの様々な領域を含む。その他の腫瘍関連タンパク質は、腫瘍細胞内により高レベルで見いだされるタンパク質のような、モノクローナル抗体１７−１Ａによって認識されるタンパク質および葉酸結合タンパク質を含む、標的タンパク質として用いることもできる。
本発明は、一つまたはそれより多くの様々な形の癌に対して個体を免疫化するために用いることができるが、本発明は、特定の癌の進行を前もって処置する、または癌を持っておりそれ故ぶり返しやすい、個体を予防的に免疫化するために特に有用である。遺伝学およびバイオテクノロジーならびに疫学の発達は、個体内での癌の進行に関しての可能性および危険性の評価の決定を可能にする。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康歴を用いると、様々な型の癌の内の任意の一つの進行について特定の個体が持つ可能性を予測することが可能である。
同様に、既に癌が進行している個体、および癌の除去治療を受けたまたは別の方法で沈静化している個体は、特にぶり返しおよび再発を起こしやすい。一つの治療養生法の一部分として、そのような再発と戦うために、持っていると診断された癌に対して、そのような個体を免疫化することができる。それ故、一度、個体が癌の一つの型を持っている、またはぶり返す危険性があることが分かったなら、いかなる癌のさらなる出現とも戦う免疫システムを準備するために、そのような個体を免疫化することができる。
また、本発明は、高増殖性疾病に苦しむ個体を治療する方法を提供する。そのような方法では、核酸組成物の導入は、標的タンパク質を生成する高増殖性細胞と戦う個体の免疫システムを指示および促進する、免疫治療として供される。
本発明は、細胞レセプターおよび「自己」直示抗体を生産する細胞を含む、自己免疫に関連する標的に対して幅広い防御免疫応答を授与することによって、自己免疫病および疾病に苦しむ個体を治療する方法を提供する。
Ｔ細胞仲介自己免疫病には、慢性関節リュウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（ＲＡ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾せん、脈管炎、ヴェーベナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸結腸炎が含まれる。これらの疾病のそれぞれは、外因性抗原と結合し、自己免疫病に関連する炎症性カスケードを開始する、Ｔ細胞レセプターによって特徴付けられる。Ｔ細胞の様々な領域に対する予防接種は、ＣＴＬｓを含む免疫応答を誘発して、そのようなＴ細胞を排除するであろう。
ＲＡでは、病気に関わるＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）のいくつかの特異的な可変領域を特徴とする。これらのＴＣＲｓは、Ｖβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７およびＶ−１７αを含む。それ故、少なくとも一つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物を含む予防接種は、ＲＡに関わるであろうＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を誘発するであろう。Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａｌｉａｒｄ，Ｘ．ら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３２５−３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．ら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：３２６−３３３；を参照のこと、またそのそれぞれはここに参照として取り入れられる。
ＭＳでは、病気に関わるＴＣＲの様々な特異的可変領域を特徴とする。これらのＴＣＲはＶβ−７およびＶα−１０を含む。それ故、少なくとも一つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物の予防接種は、ＭＳに関わるＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を誘発するであろう。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ，Ｅ．Ｗ．ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１６−１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３４４−３４６；を参照のこと；またこれらのそれぞれをここに参照として取り入れる。
強皮症では、病気に関わるＴＣＲの様々な特異的可変領域を特徴とする。これらのＴＣＲには、Ｖβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα-７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２が含まれる。それ故、少なくとも一つのこれらのタンパク質をコードする核酸組成物の予防接種は、強皮症に関わるＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を誘発するであろう。
Ｔ細胞仲介自己免疫病に苦しむ患者を治療するためには、そのような病気に含まれるＴＣＲの可変領域は、特に未だに特徴付けられていないため、滑液の生検を行うことができる。存在するＴ細胞のサンプルを取り、標準技術を用いて、それらのＴＣＲの可変領域を同定することができる。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
Ｂ細胞仲介自己免疫病には、狼そう（ＳＬＥ）、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症および悪性貧血が含まれる。これらの病気のそれぞれは、内因性抗原と結合する抗体を特徴とし、自己免疫病に関わる炎症性カスケードを促進する。そのような抗体の可変領域に対する予防接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を誘発して、抗体を生産するそれらのＢ細胞を排除する。
Ｂ細胞仲介自己免疫病に苦しむ患者を治療するために、自己免疫活性に関わる抗体の可変領域を同定しなければならない。生検を行い、炎症部位に存在する個体のサンプルを取ることができる。それらの抗体の可変領域は、標準的な技術を用いて同定することができる。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
ＳＬＥの場合では、一つの抗原はＤＮＡであると信じられている。それ故、ＳＬＥに対して免疫化される患者において、彼らの血清を抗ＤＮＡ抗体についてスクリーニングし、血清中に見いだされるそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードする核酸組成物を含むワクチンを調製することができる。
ＴＣＲと抗体の両者の可変領域の間の共通の構造的特色は良く知られている。特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列は、一般的に、Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（ここに参照として取り入れられる）に記載の方法のような良く知られた方法に従って見つけだすことができる。さらに、抗体から機能性可変領域をクローニングする一般的方法は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｗ．Ｋ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１０６６に見いだされ、この文献はここに参照として取りられる。
遺伝子治療に関する本発明の態様では、核酸組成物は、補正遺伝子または治療タンパク質をコードする遺伝子のいずれかを含む。補正遺伝子の例としては、ジストロフィーまたは機能性フラグメントをコードする遺伝子、嚢胞性線維症に苦しむ患者の欠損遺伝子を補正する遺伝子、ＡＤＡに苦しむ患者の欠損遺伝子を補正する遺伝子、ＶIII因子をコードする遺伝子が含まれる。治療用タンパク質をコードする遺伝子の例としては、エリトロポイエチン、インターフェロン、ＬＤＬレセプター、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＴＮＦをコードする遺伝子が含まれる。さらに、毒性物質に特異的に結合する単鎖の抗体成分をコードする核酸組成物を投与することもできる。いくつかの望ましい実施態様では、ジストロフィー遺伝子は、小遺伝子の部分として提供され、筋ジストロフィーに苦しむ個体を治療するために用いられる。いくつかの望ましい実施態様では、部分的なジストロフィンタンパク質のコード配列を含む小遺伝子が提供される。ジストロフィンの異常は、軽症のベッカー筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ’ｓ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＢＭＤ）および重症のデュシェーヌ筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）の両方の原因である。ＢＭＤでは、ジストロフィンが作られるが、サイズおよび／または量のいずれかが異常である。患者の病状は軽く、徐々弱る。ＤＭＤでは、タンパク質が作られず、患者は年齢が１３歳になるまでには車椅子が必要になり、通常、年齢２０歳までには死に至る。幾人かの患者、特にＢＭＤに苦しむ患者では、本発明に従って配達された小遺伝子の発現によって生産される部分的ジストロフィンタンパク質が提供され、筋肉機能を回復させることができる。
いくつかの望ましい実施態様では、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンまたはＴＮＦをコードする遺伝子は、存在するかあるいは取り除かれたかのいずれかの腫瘍細胞に配達され、次に、個体に再導入される。いくつかの実施態様では、γ−インターフェロンをコードする遺伝子が、多発性硬化症に苦しむ個体に投与される。
アンチセンス分子およびリボザイムもまた、そのような活性化剤をコピーするための鋳型として働く核酸組成物を導入することによって、個体細胞に配達することができる。これらの薬剤は、存在することが望ましくないタンパク質をコードする遺伝子の発現を不活性化するか、さもなくば妨害する。アンチセンス分子をコードする配列を含む核酸組成物は、細胞内でのタンパク質の生産を阻害または妨害するために用いることができる。それ故、オンコジーン生成物のようなタンパク質の生成を、排除するまたは減少させることができる。同様に、リボザイムは、タンパク質に翻訳される前に、メッセンジャーＲＮＡを選択的に崩壊させることによって遺伝子の発現を崩壊することができる。いくつかの実施態様では、本発明に従って、他の治療および方法の投与に関わる治療養生法の一部分として、アンチセンスまたはリボザイムをコードする核酸組成物を用いて、細胞を処理する。アンチセンス分子およびリボザイムをコードする核酸組成物は、コード配列がタンパク質内でＲＮＡの翻訳を開始するための開始コドンを含まないことを除いて、タンパク質生産が望まれる場合に用いられるそれらとして類似したベクターを用いる。
リボザイムは、自己を切断する、または他のＲＮＡ分子を切断する能力を持つ触媒ＲＮＡである。ハンマーヘッド、ヘアピン、テトラヒメラＩ型イントロン、アヘッド、およびＲＮアーゼＰのような、様々な異なる型のリボザイムが、この技術分野で知られている；Ｓ．Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０、２５６−２６２を参照のこと。ハンマーヘッドリボザイムは、４０より少ないヌクレオチドのコアにマッピングされた触媒部位を持つ。植物ウイロイドおよびサテライトＲＮＡ内の様々なリボザイムは、共通の二次構造および一定の保存されたヌクレオチドを共有する。これらのリボザイムは、本来はそれ自身の基質として供されるが、酵素ドメインは、保存された切断部位に隣接した配列との塩基対を通して、別のＲＮＡ基質を標的とすることができる。リボザイムを注文設計するこの能力故に、配列に特異的にＲＮＡを切断するために、リボザイムを用いることができる；Ｇ．Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯ（１９９２）、１９１３−１９１９を参照のこと。それ故、ハンマーヘッド触媒配列のような、様々な型のリボザイムからの異なる触媒配列を用いること、およびそれらをここに開示したように設計することは、当業者に周知であろう。リボザイムは、病原体のヌクレオチド配列およびオンコジーン配列を含む様々な標的に対して設計することができる。望ましい実施態様は、切断反応の効率性を維持しつつ、具体的な標的であるａｂｌ−ｂｃｒ融合転写物に対する十分な相補性を含む。
本発明では、所望の核酸組成物を含む多機能分子複合体は、針のない注入装置を用いて個体に投与することができる。他の実施態様では、所望の核酸組成物を含む多機能分子複合体を、針のない注入装置を用いて、個体の皮内、皮下および筋肉内に同時投与することができる。針のない注入装置は、良く知られており、広く入手できる。当業者は、本明細書の教えに従って、針のない注入装置を用いて、所望の核酸組成物を含む多機能分子複合体を所望の核酸組成物を個体細胞に配達することができる。針のない注入装置は、これらの複合体をこれらの組織の全てに配達するのに非常に適している。そのような装置は、本発明の複合体を皮膚や筋肉細胞に配達するのに特に有用である。
いくつかの実施態様では、針のない注入装置を用いて、ＤＮＡ分子を含む本発明の液状複合体を、個体の皮膚の表面に向かって発射することができる。液体は、皮膚との衝突時に、液体が皮膚表面を貫通し、皮膚およびその真下の筋肉組織に浸透するほど十分な速度で発射される。それ故、核酸組成物は、皮内、皮下および筋肉内に同時投与される。いくつかの実施態様では、核酸分子を他の器官の細胞に導入するために、針のない注入装置を用いて、その器官の組織に核酸組成物を配達することができる。
本発明に従って、核酸組成物を含む多機能分子複合体を、直接個体に投与して免疫化する、または個体から除去した細胞内に生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で投与して投与後再移植することができる。いずれの経路によっても、遺伝物質は個体体内に存在する細胞内に導入される。投与の経路としては、これらに限定されるわけではないが、筋肉内、腹膜内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに経皮または吸入あるいは座薬が含まれる。望ましい投与経路には、筋肉内、腹膜内、皮内および、皮下注入が含まれる。標的タンパク質をコードする核酸組成物の配達は、物質が粘膜免疫と関連する組織に存在するような投与方法によって免疫化された個体に粘膜免疫を授与することができる。それ故、いくつかの実施態様では、核酸組成物は、個体口内の口腔に投与することによって配達される。
本発明による核酸組成物を含む多機能分子複合体は、一般的には、約１ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの望まし実施態様では、複合体は、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。より望まし実施態様では、複合体は約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。さらにより望ましい実施態様では、複合体は約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。さらにより望まし実施態様では、複合体は、約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。最も望ましい実施態様では、複合体は約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。
本発明による核酸組成物を含む多機能分子複合体は、用いられる投与方法に従って、調合される。当業者は、核酸組成物を含む医薬組成物を容易に調合することができる。筋肉内注入が選ばれた投与方法である場合には、等張の調合物を用いることが望ましい。一般的に、等張にするための付加物として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことができる。いくつかの場合、リン酸緩衝液のような等張溶液が望ましい。安定剤として、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施態様では、血管収縮剤を調合物に加える。本発明の医薬調製物は、無菌で、かつ発熱物質を含まないように調製される。
移入剤および／または複製剤として機能する他の試薬に加えて、本発明の複合体と共に、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２、ならびに繊維芽細胞増殖因子のような増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（ＩＳＣＯＭＳ）のような表面活性剤、フロイントの不完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ）（ＭＰＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体ならびにスクアレンおよびヒアルロン酸のようなベヒクルを用いて、本発明の複合体と共に、投与することができる。
本発明の複合体は、コラーゲンとを併用して、エマルジョンとして、非経口で配達することができる。コラーゲンエマルジョンは、ＤＮＡの持続的放出の手段を提供する；５０μｌから２ｍｌのコラーゲンを用いることができる。この調合物に用いられる望ましい実施様態において、約１００μｇのＤＮＡは１ｍｌのコラーゲンと併用される。そのようなその他の放出持続性調合物は、この分野の標準参考書である「レミントンの製薬科学」（”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”）、Ａ．Ｏｓｏｌに記載されており、ここに参照として取り入れる。そのような調合物には、水性懸濁液、油脂溶液および懸濁液、エマルジョンおよびインプラントならびにレザバー、デポットおよび経皮装置が含まれる。いくつかの実施態様では、複合体の時間放出調合物が望ましい；そこでは、複合体は、６−１４４時間、望ましくは１２−９６時間、より望ましくは１８−７２時間の間、時間放出されることが望ましい。
本発明のいくつかの実施態様では、十分な幅広い免疫応答を生成するために、個体に一回予防接種を行う。本発明の他の実施態様では、十分な幅広い免疫応答を生成するために、個体に連続して予防接種を行う。また、本発明の他の実施態様では、少なくとも２回、望ましくは４から５回の注射が期間を越えて行われる。注射の間隔は、２４時間から２週間またはそれより長く、望ましくは１週間離れていて良い。代わりの方法として、少なくとも２、最大で４までに注射を分けて、異なる部位に同時に注射を行う。
本発明のいくつかの実施態様では、完全なワクチン接種は、一つまたはそれより多くの標的とされるエピトープをコードする配列を含む核酸組成物を含む単一の接種物の注射を含む。
本発明の他の実施態様では、完全なワクチン接種は、２またはそれより多くの異なる接種物を異なる部位へ注射することを含む。例えば、ＨＩＶワクチンは、それぞれが異なるウイルスタンパク質をコードする核酸組成物を含む２つの異なる接種物を含むことができる。このようなワクチン接種の方法は、感染性ウイルス粒子が組み立てられる危険性なしに、個体にウイルス遺伝子のほぼ完全なセットを導入することを可能にする。それ故、ウイルスのほとんどまたは全体に対する免疫応答を、ワクチン接種した個体に誘発することができる。それぞれの接種物の注射は、異なる部位に、望ましくは、いかなる細胞も核酸組成物の全組み合わせを受けることがないと保証できる距離を隔てて行われる。さらなる安全性への予防措置として、いくつかの遺伝子を欠失または変化させて、さらに、感染性ウイルスを組み立てる能力を妨害することができる。
本発明に従って、多機能分子複合体を標的細胞へ配達することを促進する医薬組成物が提供され、その複合体は、次には、複合体内に含まれる核酸組成物の運搬を促進するために機能する。医薬組成物は、不活性希釈剤および医薬として適当な塩またはエステル型の分子複合体以外のものを含まない。しかしながら、当業者に良く知られている他の医薬として受け入れ可能なキャリヤーもまた、所望の性質を提供するために適当に用いることができる。このように、一つまたはそれより多くの薬剤を、次の認知された医薬補助剤の種類；溶媒、溶媒システム、および可溶化剤、ならびに界面活性剤および乳化剤のような分散剤；粘度修飾剤；ならびに抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、抗細菌剤、および緩衝化剤を含む、安定化剤および保存剤：から選択することができる。
また、本発明は、核酸組成物を含む容器および運搬部分を含む容器からなる、医薬キットを提供する。所望であれば、そのようなキットの中には、医薬組成物に関して上に記載した型の補助剤、キャリヤー、保存剤およびベヒクルが含まれる。また、「医薬キット」と言う言葉は、本発明の方法で用いられる複数の接種物を含むつもりである。そのようなキットは、異なる接種物および運搬部分を別々に含む分離容器を含む。また、本発明による医薬キットは、上記の通り、免疫化法および／または治療法に用いられる接種物のセットを含むように計画されている。
本発明の組成物および方法は、ヒトと家畜の両方の医薬分野で有用である。従って、本発明は、哺乳動物、トリおよび魚の遺伝的免疫化および医療的治療に関する。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコ科を含む哺乳動物の遺伝的免疫化および医療的治療に、特に有効である。
望ましい実施態様の記述
以下に記載する実施例は、本発明の様々な態様の代表的な説明を含む。実施例は、発明の範囲を制限するものではなく、むしろ単にそれの実例を供するつもりにすぎない。さらに、当業者は、以下の詳細な記述を基にして、本発明のさらなる態様および実施態様を容易に正しく認識することができるであろう。特に指示しない限り、以下の実施例中に列挙した全ての温度は、摂氏温度である。
実施例１
Ｎ4−５’−アミノペンチルスペラミジン塩酸塩（８）の調製
Ｎ4−（４−シアノブチル）−Ｎ1，Ｎ6−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−スペラミジン（６）
アセトニトリル（１２５ｍｌ）中にＮ1，Ｎ6−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）スペラミジン（２．９２ｇ、８．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）（Ｓ．ＮａｇａｒａｊａｎおよびＢ．Ｇａｎｅｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５０，５７３５−３７，１９８５）を溶解した液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．５３４ｍｌ、２０．０ｍｍｏｌ、２．４当量）、ヨウ化カリウム（２．８１ｇ、１６．９０ｍｍｏｌ、２．０当量）および５−クロロバレロニトリル（１．９０２ｍｌ、１６．９０ｍｍｏｌ、２．０当量）で処理した。得られた等質溶液を、２時間加熱し還流した。混合物をさらに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７６７ｍｌ、１．２当量）、ヨウ化カリウム（１．４１ｇ、１．０当量）および５−クロロバレロニトリル（０．９５１ｍｌ、１．０当量）で処理し、さらに１８時間還流した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、出発物質が残っていないことを示した。アセトニトリルを真空下で除去し、残留物をクロロホルム（２５０ｍｌ）に溶解した。この溶液を、水（２００ｍｌ）、乾燥Ｎａ2ＳＯ4で洗浄し、溶媒を取り除くと、油脂状の粗生成物ができた。物質は、シリカ上、２−プロパノール／クロロホルム＋１％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの勾配を用いて精製し、油脂（３．４０ｇ）を得た。
0003925815.tif 000015
Ｎ4−（５−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ6−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）−スペラミジン（７）
無水酢酸（１００ｍｌ）中の６（０．７７ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の溶液を、炭素（０．０８ｇ、１０％ｗ／ｗ）上、５％パラジウムで処理し、パールの水素化器（Ｐａｒｒ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｒ）上に、５０ｐｓｉの水素ガス圧で、２．７５時間置いた。混合物は、（無水酢酸で前もってリンスした）セライト（商標）ケイソウ土のろ紙を通してろ過し、セライトをクロロホルムでリンスした。ろ過液およびクロロホルム洗浄液を合わせ、溶媒を除去すると油脂が得られた。粗物質は、メタノール／クロロホルム＋０．４％ジイソプロピルエチルアミンの勾配を用いて、シリカクロマトグラフィーにかけた。物質は、無色の油脂（０．３２ｇ）になった。
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Ｎ4−（５−アミノペンチル）スペラミジン塩酸塩（８）
化合物７（０．２００ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）と共に、室温で２時間攪拌した。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、次いで３回クロロホルムを加え、次いで真空下で蒸発乾燥させた。得られた粗油脂を、２回、０．１Ｎ−ＨＣｌ（３０ｍｌ）中に溶解し、凍結乾燥させると、吸湿性の固体８（０．１９ｇ）が得られた。
実施例２
Ｎ4−（５−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１″−４′−チオグルコシド）アミノペンチル）スペルミジン  ９の製造
Ｓ−（スクシンイミジル−β−３′−プロピオニル）ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１′−４−チオグルコシド（１０）
Ｓ−β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド［Ｍ．エロフソン（Elofsson）、Ｓ．ロイ（Roy）、Ｂ．ワルス（Walse）およびＪ．キールバーグ（Kihlberg）、Carb.Res.，246,89-103(1993)］（４．６０ｇ，６．３５ミリモル）のイソプロパノール／クロロホルム１：１（１００ｍＬ）中溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７３ｇ，６．３５ミリモル）およびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３１ｇ，６．３５ミリモル）によって処理した。室温で１９時間撹拌後、混合物を４℃まで１時間冷却し且つ濾過した。溶媒を真空下で濾液から除去して白色固体を生じ、それを２−プロパノールから再結晶させた（３．４３ｇ）。単離生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって純度９２％であった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3）：δ２．０−２．１６（７ｓ，２１．０Ｈ），２．８５（ｓ，３．８Ｈ），２．８５−３．１（ｍ，４．２Ｈ），３．６５（ｍ，０．７Ｈ），３．７８（ｔ，１．０Ｈ），３．８８（ｔ，１．０Ｈ），４．１１（ｍ，４．０Ｈ），４．５４（ｍ，２．８Ｈ），４．９７（ｍ，１．８Ｈ），５．１１（ｍ，１．０Ｈ），５．２３（ｔ，１．０Ｈ），５．３６（ｄ，０．７Ｈ）。
Ｎ4（５（Ｓ−β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１″−４′−チオグルコシド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（１１）
１０（０．３００ｇ，０．７０ミリモル）の塩化メチレン（３０ｍＬ）中溶液を、７（０．５７ｇ，０．７０ミリモル）の塩化メチレン（３０ｍＬ）中溶液によって処理した。混合物を室温で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した。クロロホルム中の２−プロパノールの勾配を用いるシリカクロマトグラフィーは、精製された生成物を無色ガラス（０．４９ｇ）として与えた；ＨＰＬＣによって決定したところ純度１００％。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3）：δ１．３３（ｍ，３．０Ｈ；２．０Ｈであるべき），１．４４（ｓ，２０．０Ｈ；１８．０Ｈであるべき），１．５４（ｍ，１０．７Ｈ；６．０Ｈであるべき），１．６８（ｍ，２．０Ｈ），１．９７−２．１６（７ｓ，２７．３Ｈ；２１．０Ｈであるべき），２．２５（ｍ，６．０Ｈ；４Ｈであるべき），２．５２（ｍ，９．０Ｈ；８．０Ｈであるべき），２．８４（ｍ，１．０Ｈ），３．０１（ｍ，１．０Ｈ），３．１−３．２７（ｍ，６．７Ｈ），３．６４（ｍ，１．０Ｈ），３．８０（ｔ，１．０Ｈ），３．９０（ｔ，１．０Ｈ），４．１１（ｍ，４．０Ｈ），４．５５（ｄ，２．０Ｈ），４．７０（ｄ，１．０Ｈ），４．９１−５．０（ｍ，３．０Ｈ；２．０Ｈであるべき），５．１１（ｍ，１．３Ｈ），５．２１（ｔ，１．０Ｈ），５．３６（ｄ，１．０Ｈ），５．４４（ｍ，０．７Ｈ），６．２８（ｍ，０．７Ｈ）。
ＦＡＢ質量スペクトルＭＨ+＝１１３８。
トリフルオロ酢酸Ｎ4−（５−（Ｓ−β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１″−４′−チオグルコシド）アミノペンチル）スペルミジン（１２）
化合物１１（０．２００ｇ，０．１８ミリモル）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）によって処理し且つ室温で２時間撹拌した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を真空下で大部分除去し、そして残留物にクロロホルムを３回加えた後、溶媒を真空下で除去した。生成物を、明らかに微量のＴＦＡを含む油状物（０．２２ｇ）として回収した；ＨＰＬＣによって決定したところ純度１００％。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3）：δ１．２５−１．５３（ｍ，５．５Ｈ），１．６−２．０（ｍ，５．５；４Ｈであるべき），２．００−２．１５（７ｓ，２３．０Ｈ；２１．０Ｈであるべき），２．５６（ｍ，１．０Ｈ），２．６８（ｍ，１．３Ｈ），２．８０（ｍ，１．０Ｈ），３．０−３．４（ｍ，１１．０Ｈ；１０．０Ｈであるべき），３．６４（ｍ，１．０Ｈ），３．７９（ｍ，１．０Ｈ），３．９４（ｍ，１．０Ｈ），４．１１（ｍ，２．５Ｈ），４．５５（ｍ，１．５Ｈ），４．７０（ｍ，１．３Ｈ），４．９０−５．２０（幅広ｍ，１６．０Ｈ；水によって膨脹した；２．０または４．０Ｈであるべき），５．３６（ｍ，１．０Ｈ），７．１２（ｍ，０．５Ｈ），７．８６（ｍ，２．３Ｈ），８．０７（ｍ，２．３Ｈ），９．８（ｍ，０．５Ｈ）。
Ｎ4−（５−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１″−４′−チオグルコシド）アミノペンチル）スペルミジン（９）
１２（０．２０ｇ，０．１８ミリモル）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液を、炭酸ナトリウム（０．３８ｇ；３．０８ミリモル；１８当量）および水（３５ｍＬ）によって処理して均一溶液とした。室温で６時間後、溶媒を蒸発させ、そしてセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５メジウムゲル濾過樹脂および溶離剤として１％氷酢酸を用いて残留物を脱塩した。生成物含有画分を混合し且つ凍結乾燥させて、トリ酢酸塩（０．１０ｇ）として純粋な生成物とした；ＨＰＬＣによって決定したところ純度１００％。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6  Ｄ2Ｏ）：δ１．１５（ｍまたは幅広ｔ，１．５Ｈ），１．３−１．５（ｍ，８．０Ｈ），１．６５（ｍ，２．０Ｈ），１．６６（ｓ，１４．０Ｈ；９．０Ｈであるべき），２．３４（ｍ，６．５Ｈ），２．６０（ｍ，３．０Ｈ；２．０Ｈであるべき），２．７４（ｍ，６．０Ｈ），３．００（ｍ，３．０Ｈ），３．２７（ｍ，３．５Ｈ），３．４０（ｍ，１．５Ｈ），３．４７（ｍ，２．０Ｈ），３．５０（ｍ，１．０Ｈ），３．６０（ｍ，１．０Ｈ），３．７１（ｄ，１．０Ｈ），４．１４（幅広ｓ，水ピークによって遮蔽された），４．２７（ｍ，４．０Ｈ）。
実施例３
、Ｎ4−（５−［Ｎ2Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノ）ペンチルスペルミジン酢酸塩  １８の製造
比較の目的のために、上記の化合物１８のＣＡＳ形式名は以下、すなわち、４−［（Ｎ2−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（３−［４−Ｏ（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルチオ］プロピオニル）リシル］Ｎ6−（３−［４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルチオ］プロピオニル）リシンアミド）ペンチル］−１，８−ジアミノー４−アザオクタン酢酸塩である。
Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン（１４）
リシル−リシン（０．２５ｇ，０．６４ミリモル）の水／アセトニトリル１：１（１００ｍＬ）中溶液に対して、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３３６ｍｌ，１．９５ミリモル，３．０当量）および化合物１０（１．８５９，２．２５ミリモル）を加え且つ室温で均一になるまで数分間撹拌した。ｐＨを一定の間隔をおいて厳密に監視し、そして必要に応じてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えてｐＨ７〜８を維持した。全部で７当量の塩基を１時間にわたって加えた後、ｐＨを７〜７．５で安定させた。逆相ＨＰＬＣを用いて反応の進行を追跡した。室温で２４時間後、反応は約５０％の生成物生成によって停止したように見えた。アセトニトリルを真空下で蒸発させ、そして水性混合物を希ＨＣｌ（ｐＨ５）によって処理した。溶液をクロロホルム（２ｘ２００ｍｌ）中に抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、そして溶媒を真空下で除去して、粗生成物をガラス（２．１７ｇ）として与えた。その物質に、溶離剤としてクロロホルムおよび１％氷酢酸中のイソプロパノールの勾配を用いるシリカフラッシュクロマトグラフィーを施した（１．０９ｇ）。純度は、ＨＰＬＣによって約９６％であると確認された。
ＦＡＢ質量スペクトル：ＭＨ+＝２３９４。
スクシンイミジルＮ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン（１５）
Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン（１．００ｇ，０．４２ミリモル）のイソプロパノール／クロロホルム１：１（２０ｍＬ）中溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４８．１ｍｇ，０．４２ミリモル）およびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８６．２ｍｇ，０．４２ミリモル）によって処理した。室温で１９時間撹拌後、混合物を４℃まで１時間冷却し且つ濾過した。溶媒を真空下で濾液から除去し、そして粗生成物を２−プロパノールから再結晶させた。生成物を濾過によって集め且つ真空下で乾燥させて、白色粉末固体（０．７６ｇ）を生成した。この物質は、ＨＰＬＣにより、出発遊離酸およびスクシンイミジルエステルのそれぞれ約１：２の比率の混合物から成ることが分かった。混合物は更に精製されなかったが、次の工程でそのまま用いられた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．９６−２．２０（多重ｓ，８６．４Ｈ；６３．０Ｈであるべき），２．２８（ｍ，３．６Ｈ），２．５３（ｍ，６．６Ｈ），２．８８（ｍ，６．６Ｈ），３．０２（ｍ，３．６Ｈ），３．１８−３．４０（ｍ，４．２Ｈ），３．６２（ｍ，３．６Ｈ），３．８５（ｍ，３．６Ｈ），３．９５（ｍ，３．６Ｈ），４．１０（ｍ，１２．０Ｈ），４．５７（ｍ，６．０Ｈ），４．７０（ｍ，４．２Ｈ），５．０２（ｍ，７．２Ｈ），５．１０（ｍ，３．６Ｈ），５．２０（ｔ，３．６Ｈ），５．３６（ｄ，３．０Ｈ），６．３１（ｔ，０．６Ｈ），６．５８（ｔ，０．６Ｈ），６．９０（ｄ，０．６Ｈ），７．４７（ｄ，０．６Ｈ）。
Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノペンチル−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スペルミジン（１６）
７（８７ｍｇ，０．２０ミリモル）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、１５（６６％混合物０．７６ｇ，エステル０．５０ｇに対応する；０．２０ミリモル）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液によって処理した。混合物を室温で１８時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物を、クロロホルム中のイソプロパノールの勾配を用いるシリカクロマトグラフィーによって精製した。得られた不純生成物は、出発エステル中に混入物として存在する遊離酸に対する生成物の６５：３５混合物から成った。０．５％氷酢酸を加えた同様の勾配を用いる第二のシリカカラムは、純粋な生成物（０．３８ｇ）を効果的に単離した；ＨＰＬＣによって決定したところ純度１００％。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．３０−１．３９（ｍ，４．０Ｈ），１．４４（ｓ，１３．５Ｈ；１８．０Ｈであるべき），１．５３（ｍ，８．６Ｈ），１．６０−１．９０（ｍ，６．１Ｈ），１．９７−２．１６（多重ｓ，７３．８Ｈ；６３．０Ｈであるべき），２．２７（ｍ，３．７Ｈ），２．４９−２．７０（ｍ，８．０Ｈ），２．８５（ｍ，２．５Ｈ），３．００（ｍ，２．５Ｈ），３．２３（ｍ，６．２Ｈ），３．６５（ｍ，２．５Ｈ），３．８０−３．９３（ｍ，５．５Ｈ），４．１２（ｍ，８．０Ｈ），４．２０−４．４０（ｍ，１．８Ｈ），４．５７−４．６９（ｍ，８．０Ｈ），４．９１−５．００（ｍ，５．５Ｈ），５．０９（ｍ，３．１Ｈ），５．２１（ｔ，３．１Ｈ），５．３６（ｄ，２．５Ｈ），６．５７（ｍ，０．９Ｈ），６．９５（ｍ，０．６Ｈ），７．２０（ｍ，０．６Ｈ）。
Ｎ4（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノペンチル）スペルミジン（１７）
化合物１６（０．１７０ｇ，０．０５９ミリモル）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）によって処理し且つ室温で２．５時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を真空下で大部分除去した（０．１９ｇ）。純度は、ＨＰＬＣによって約１００％であると確認された。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．２０−１．８０（ｍ，４．８Ｈ），１．９６−２．１５（多重ｓ，８４．０Ｈ；６３．０Ｈであるべき），２．５４（ｍ，１２．０Ｈ；おそらく水ピークによって膨脹した），３．６５（ｍ，３．０Ｈ），３．８１（ｍ，３．０Ｈ），３．９３（ｍ，４．０Ｈ），４．１２（ｍ，１２．０Ｈ），４．２９（ｍ，２．０Ｈ），４．５５（ｍ，６．０Ｈ），４．６９（ｍ，４．０Ｈ），４．８９（ｍ，３．０Ｈ），５．０９（ｍ，６．０Ｈ），５．１９（ｍ，４．０Ｈ），５．３８（ｄ，３．０Ｈ），６．９９（ｍ，１．０Ｈ），７．６０（ｍ，０．５Ｈ），７．９１（ｍ，１．０Ｈ），８．０９（ｍ，１．０Ｈ）。
Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノペンチル）スペルミジン酢酸塩（１８）
１７（０．１７ｇ，０．０５９ミリモル）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に対して、炭酸ナトリウム（０．３７ｇ，２．９５ミリモル）、続いて水（４０ｍＬ）を均一になるまで加えた。室温で４時間撹拌後、溶媒を除去し、そして粗生成物を、溶離剤として１％氷酢酸を用いてセファデックスＧ−２５メジウムカラムから溶離した。生成物含有画分を混合し且つ凍結乾燥させて、純粋な生成物を極めて吸湿性の固体（０．０７ｇ）として与えた。
実施例４
Ｎ4−（５−［Ｎ2−Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノペンチル）スペルミジン酢酸塩  ２３の製造
スクシンイミジルＮ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン（２０）
Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシン（１．００ｇ，０．４２ミリモル）のイソプロパノール／クロロホルム１：１（２０ｍＬ）中溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４８．１ｍｇ，０．４２ミリモル）およびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８６．２ｍｇ，０．４２ミリモル）によって処理する。室温で１９時間撹拌後、混合物を４℃まで１時間冷却し且つ濾過する。溶媒を真空下で濾液から除去し、そして粗生成物を２−プロパノールから再結晶させる。生成物を濾過によって集め且つ真空下で乾燥させて、白色粉末固体（０．７６ｇ）を生成する。この物質は、ＨＰＬＣにより、出発遊離酸およびスクシンイミジルエステルのそれぞれ約１：２の比率の混合物から成ることが分かる。混合物は更に精製されないが、次の工程でそのまま用いられる。
Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スペルミジン（２１）
７（８７ｍｇ，０．２０ミリモル）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を、２０（６６％混合物０．７６９，エステル０．５０ｇに対応する；０．２０ミリモル）の塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液によって処理する。混合物を室温で１８時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去する。粗生成物を、クロロホルム中のイソプロパノールの勾配を用いるシリカクロマトグラフィーによって精製する。得られた不純生成物は、出発エステル中に混入物として存在する遊離酸に対する生成物の６５：３５混合物から成る。０．５％氷酢酸を加えた同様の勾配を用いる第二のシリカカラムは、純粋な生成物（０．３８ｇ）を効果的に単離する；ＨＰＬＣによって決定したところ純度１００％。
Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル）スペルミジン（２２）
化合物２１（０．１７０ｇ，０．０５９ミリモル）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）によって処理し且つ室温で２．５時間撹拌する。トリフルオロ酢酸を真空下で大部分除去する（０．１９ｇ）。純度は、ＨＰＬＣによって約１００％であると確認される。
Ｎ4−（５−［Ｎ2−Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル）スペルミジン酢酸塩（２３）
２２（０．１７ｇ，０．０５９ミリモル）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に対して、炭酸ナトリウム（０．３７ｇ，２．９５ミリモル）、続いて水（４０ｍＬ）を均一になるまで加える。室温で４時間撹拌後、溶媒を除去し、そして粗生成物を、溶離剤として１％氷酢酸を用いてセファデックスＧ−２５メジウムカラムから溶離する。生成物含有画分を混合し且つ凍結乾燥させて、純粋な生成物を極めて吸湿性の固体（０．０７ｇ）として与える。
実施例５
Ｎ4−５−（Ｄ−ビオチニル）アミノペンチルスペルミジン塩酸塩  ２４の製造
７（０．２０ｇ，０．４７ミリモル）のアセトニトリル２０ｍＬおよび水１０ｍＬ中溶液に対して、スクシンイミジルＤ−ビオチン１６０ｍｇを加えた。溶液を１８時間撹拌した。溶液の容量を真空下で１５ｍＬまで減少させ、そして残留する溶液を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル勾配を用いてオクタデシルシリル結合シリカ上で精製した。生成物含有画分を混合し、そして溶媒を真空下で除去して、ろう質白色固体を生じた（ＨＰＬＣによる純度９４％）。その白色固体に対して、２−プロパノール１０ｍＬおよびジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬを加えた。溶媒を真空下で除去した。得られた白色固体を水中に再溶解させ、そして真空下で乾燥させて、吸湿性泡状物（０．１１ｇ）を生じた。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１−３１（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｍ，６Ｈ），１．６４（ｍ，８Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），２．６３（ｄ，２Ｈ），２．９１（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｍ，８Ｈ），４．１８（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ）。
実施例６
Ｎ4−（５−コレステン−３′β−オキシカルボニル）アミノペンチルスペルミジン塩酸塩  ２５の製造
７（０．２０ｇ，０．４７ミリモル）の塩化メチレン２０ｍＬ中溶液に対して、クロロギ酸コレステリル２１０ｍｇおよびジイソプロピルエチルアミン２００μＬを加えた。溶液を２４時間撹拌した。塩化メチレンを真空下で除去し、そして残留する油状物をクロロホルム中に再溶解させ、そして０．１％ジイソプロピルエチルアミンを含有するメタノール／クロロホルム勾配を用いてシリカ上で精製した。生成物含有画分を混合し、そして溶媒を真空下で除去して、ろう質白色固体（０．２９ｇ）を生じた。その白色固体に対して、２−プロパノール１０ｍＬおよびジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬを加えた。溶媒を真空下で除去した。得られた白色固体を水中に再溶解させ、そして真空下で乾燥させて、ろう質白色固体（０．１５ｇ）を生じた。
実施例７
Ｎ4−オクチル−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン  ２６の製造
Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（１．０ｇ，２．８９ミリモル）のアセトン（１００ｍｌ）中溶液に対して、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６０５ｍｌ，３．４７ミリモル，１．２当量）、ヨウ化カリウム（０．４８９，２．８９ミリモル）および１−ブロモオクタン（０．５００ｍｌ，２．８９ミリモル）を加えた。混合物を還流するまで１時間加熱した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６０５ｍｌ，３．４７ミリモル）およびヨウ化カリウム（０．４８ｇ，２．８９ミリモル）を加えた。更に３時間還流後、１−ブロモオクタン（０．５００ｍｌ，２．８９ミリモル）を加え、そして還流を更に１時間続けた。アセトンを真空下で蒸発させた。残留物をクロロホルム（１２５ｍｌ）中に取り、そして水（２ｘ７５ｍｌ）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、そして溶媒を真空下で除去して液体を生じた。その液体を、１％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えたクロロホルム中のイソプロパノールの勾配を用いるシリカクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を淡橙色油状物（０．５９ｇ）として回収した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（ｔ，３．５Ｈ），１．２７（ｍ，１４．２Ｈ；１６．０Ｈであるべき），１．４４（ｓ，１８．７Ｈ），１．５８（ｍ，１．６Ｈ），１．８２（ｍ，１．６Ｈ），２．３７（ｍ，２．４Ｈ），２．４４（ｍ，２．２Ｈ），３．１９（ｍ，４．０Ｈ），４．８４（ｍ，０．３Ｈ），５．６２（ｍ，０．３Ｈ）。
Ｎ4−オクチル−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．１５ｇ）を、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  ６ｍＬ中に溶解させ且つ室温で１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、そして黄色油状物をクロロホルム中に懸濁させ、そして溶媒を真空下で除去した。得られた油状物を無水エタノール１０ｍＬ中に溶解させ、そしてジエチルエーテル３０ｍＬの添加によって沈殿させた。液体を傾潟除去し且つ真空下で乾燥させることによって固体を単離した（０．１０ｇ）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０８６（ｍ，３Ｈ），１．２８（ｍ，１０Ｈ），１．５８−１．８０（ｍ，６Ｈ），２．００（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），８．０１および８．１３（２ｍ，５Ｈ，６Ｈであるべき）。
分析：Ｃ15Ｈ38Ｃｌ3Ｎ3の計算値  Ｃ  ４９．１１，Ｈ  １０．４４，Ｎ  １１．４５。実測値  Ｃ  ４８．５７，Ｈ  １０．７５，Ｎ  １１．２９。
実施例８
Ｎ4−ドデシルスペルミジン三塩酸塩  ２７の製造
Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．５０ｇ，１．４５ミリモル）のアセトン（５０ｍＬ）中溶液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６０４ｍＬ，３．４８ミリモル）、ヨウ化カリウム（０．４８ｇ，２．９０ミリモル）および１−ブロモドデカン（０．３４８ｍＬ，２．９０ミリモル）によって処理した。混合物を１８時間還流させ、そして更に１−ブロモドデカン（０．３４８ｍＬ，２．９０ミリモル）によって処理した。還流を４時間続けた。アセトンを減圧下で除去し、そして残留物をクロロホルム（２５０ｍＬ）中に取った。その溶液を水（２ｘ１００ｍＬ）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、そして溶媒を除去して粗生成物とした。その物質を、０．４％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えたクロロホルム中のイソプロパノールの勾配によって溶離するシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を質量０．５２ｇの油状物として回収した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（ｔ，３．０Ｈ），１．２６（幅広ｓ，２１．０Ｈ；２０．０Ｈであるべき），１．４４（ｓ，２０．５；１８．０Ｈであるべき），１．６４（ｍ，５．８Ｈ），２．３７（ｍ，３．８Ｈ），２．４６（ｔ，２．５Ｈ），３．１５（ｍ，４．０Ｈ），４．８４（ｍ，０．５Ｈ），５．６２（ｍ，０．８Ｈ）。
Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎ4−ドデシルスペルミジン（０．５２ｇ，１．０１ミリモル）を２−プロパノール（５ｍＬ）中に溶解させ且つジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）によって処理した。均一溶液を室温で２０時間撹拌し、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製油状物をエタノール（２０ｍＬ）中に取り、そしてエーテル（１０−１５ｍＬ）によって撹拌しながら処理した。固体が溶液から沈殿し、濾過によって集められた（８５ｍｇ）。二回目の生成量を回収して更に７９ｍｇとした。全収量は１６４ｍｇであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ０．８６（ｔ，２．３Ｈ），１．２５（ｍ，１８．０Ｈ），１．６３（ｍ，３．７Ｈ），１．７６（ｍ，２．３Ｈ），１．９９（ｍ，１．３Ｈ），２．７９（ｍ，２．０Ｈ），２．９０（ｍ，２．０Ｈ），３．０２（ｍ，３．７Ｈ），３．１６（ｍ，２．３Ｈ），８．０３（ｍ，１．７Ｈ），８．１４（ｍ，２．７Ｈ）。
実施例９
Ｎ4−ヘキサデシルスペルミジン三塩酸塩  ２８の製造
Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．５０ｇ，１．４５ミリモル）のアセトン（５０ｍＬ）中溶液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３０２ｍＬ，１．７４ミリモル，１．２当量）、ヨウ化カリウム（０．２４ｇ，１．４５モル）および１−ブロモヘキサデカン（０．４４２ｍＬ，１．４５ミリモル）によって処理した。混合物を２０時間還流させ、そして真空下で除去した。残留物をクロロホルム（２５０ｍＬ）中に取り、そして水（１５０ｍＬ）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、そして溶媒を減圧下で蒸発させて、粗生成物を黄褐色油状物として与えた。その物質を、０．４％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えたクロロホルム中のイソプロパノールの勾配を用いるシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を淡黄色油状物、質量０．４２ｇとして回収した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（ｔ，２．９Ｈ），１．２６（幅広ｓ，３０．３Ｈ；２８．０Ｈであるべき），１．４４（ｓ，２２．９Ｈ；１８．０Ｈであるべき），１．６０（ｍ，４．０Ｈ），１．７２（ｍ，１．７Ｈ），２．３７（ｍ，３．７Ｈ），２．４６（ｍ，２．９Ｈ；２．０Ｈであるべき），３．１７（ｍ，４．０Ｈ），４．８３（ｍ，０．６Ｈ），５．６２（ｍ，０．６Ｈ）。
Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎ4−ヘキサデシルスペルミジン（０．４２ｇ，０．７４ミリモル）を２−プロパノール（５ｍＬ）中に溶解させ、そしてジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）によって処理した。均一溶液を室温で１．５時間撹拌した後、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物をエタノール（１２ｍＬ）中に取り、そしてエーテル（１０ｍＬ）によって撹拌しながら処理した。沈殿が溶液から生じ、濾過によって集められた；質量１２５ｍｇ。質量７５ｍｇの二回目の生成量を回収して、全収量０．２００ｇとした。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6＋Ｄ2Ｏ）：δ０．８３（ｔ，２．１Ｈ；３．０Ｈであるべき），１．２２（ｍ，２６．６Ｈ），１．５４−１．７０（ｍ，６．０Ｈ），１．９６（ｍ，１．７Ｈ），２．８１（ｍ，１．７Ｈ），２．８９（ｍ，２．１Ｈ），３．０４−３．１２（ｍ，６．０Ｈ）。
実施例１０
受容体含有細胞を用いる培養物中の付着細胞のトランスフェクション
ヒト肝細胞癌ＨｕＨ７細胞を増殖させ、そして１０％血清を含む最少必須培地α、修飾１００μＬ中に細胞１〜２ｘ１０4個を用いて９６ウェルプレート中に播種した。プレートを３７℃のＣＯ2インキュベーター中において細胞が６０〜８０％密集するまで（約２４時間）インキュベートした。培地を除去し、そして細胞をオプティメン（Optimem)▲Ｒ▼(血清不含培地)によって１回洗浄した。ｐＣＭＶβプラスミド（クローンテク（Clonetech）製、番号６１７７−１）０．５μｇ、Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル）−スペルミジン０．５μｇおよびＮ4−（５−コレステン−３′β−オキシカルボニル）−アミノペンチル）スペルミジン２．５μｇを含有するオプティメン▲Ｒ▼（１００μＬ）を細胞に対して加えた。細胞をその混合物と一緒に３７℃のＣＯ2インキュベーター中で４時間インキュベートし；その後、２０％血清含有培地１００μＬを加え、そしてインキュベーションを更に２０時間続けた。１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中０．５％ＮＰ−４０によって溶解された細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性についてｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて検定し、そして３０分後にＡ405＝１．３５を与えた。６ウェルプレート（２５ｍｍ直径）中で増殖し且つ同様に処理された細胞を２％パラホルムアルデヒドによって固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて検定した（Ｊ．サムブルック（Sambrook）ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor），1989年）。目視検査は、光学顕微鏡によって証明されたように、５〜１０％の細胞がトランスフェクトされたことを示した。多機能分子複合体の受容体特異的結合成分は細胞培養物から除かれたが、多機能分子複合体のエンドソーム膜破壊促進成分は保持されている場合、同様の結果が得られた。
同様の結果は、Ｎ4−（５−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）アミノペンチル）スペルミジン；およびＮ4−（５−（メチルテトラヒドロフォリル）アミノペンチル）スペルミジンによって得られ；エンドソーム膜破壊促進成分はその中に包含されていた。同様の結果はまた、受容体特異的結合成分がその中に包含されている、Ｎ4−オクチルスペルミジン；Ｎ4−ドデシルスペルミジン；Ｎ末端上にＮ4−（５−カルボキシペンチル）スペルミジンによってアシル化された融合誘導ペプチド；Ｎ4−（５−（３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−オイック）アミノペンチル）スペルミジンアミドによって得ることができた。
実施例１１
筋肉細胞in vivoトランスフェクション
溶液は、リン酸緩衝溶液１００μＬ中にそれぞれ、ｐＣＭＶβプラスミド１００μｇおよびＮ4−オクチルスペルミジンか、Ｎ4−ドデシルスペルミジンかまたはＮ4−（５−コレステン−３′β−オキシカルボニル）アミノペンチル）スペルミジン１００μｇを含んで調製された。プラスミド溶液（１００μＬ）を、６〜１２週令のＢＡＬＢ−Ｃマウスの大腿四頭筋背面に注射した。マウスを約９６時間後に屠殺し、そして大腿四頭筋組織全体を取出した。その筋肉をホルマリンによって２時間固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（トリス／ＥＤＴＡ  ｐＨ８．５中１ｍｇ／ｍＬ）を用いて検定した。クエン酸緩衝液ｐＨ６．０中０．２５％ブピビカイン塩酸塩１００μＬ中で注射されるｐＣＭＶβプラスミド１００μｇの注射の対照よりも青色が強かったので、３回の注射は全て陽性と評点された。同様の結果は、Ｎ末端上にＮ4−（５−カルボキシペンチル）スペルミジンによってアシル化された融合誘導ペプチド；およびＮ4−（５−（３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−オイック）アミノペンチル）スペルミジンアミドによっても得ることができる。
実施例１２
肝細胞in vivoトランスフェクション
溶液は、リン酸緩衝溶液１００μＬ中に、ｐＨＢＶＳＡプラスミド１０μｇ、Ｎ4−（５−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル）スペルミジン５μｇおよびＮ4−（５−コレステン−３′β−オキシカルボニル）アミノペンチル）スペルミジン１００μｇを含んで調製される。プラスミド溶液（１００μＬ）を、６〜１２週令のＢＡＬＢ−Ｃマウスの尾静脈に注射する。マウスを約４８〜１２０時間後に屠殺し、そしてその血清のＢ型肝炎表面抗原について市販の酵素結合免疫検定を用いて検査する。表面抗原の生成は、注射後４８時間にキットによって与えられる陽性対照よりも大である。
同様の結果は、受容体特異的結合成分がその中に包含されている、Ｎ4−（５−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）アミノペンチル）スペルミジン；Ｎ2，Ｎ6−（５−［ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］アミノペンチル）スペルミジン；Ｎ4−（５−（メチルテトラヒドロフォリル）アミノペンチル）スペルミジン；Ｎ4−（５−（フォリニル）アミノペンチル）スペルミジン；Ｎ4−（５−（α−３′−プロピオニルチオマンノシド）アミノペンチル）スペルミジンおよびＮ4−（５−（α−３′−プロピオニルチオマンノシド−６−リン酸）アミノペンチル）スペルミジンによって得られる。
同様の結果はまた、エンドソーム膜破壊促進成分がその中に包含されている、Ｎ4−オクチルスペルミジン；Ｎ4−ドデシルスペルミジン、Ｎ末端上にＮ4−（５−カルボキシペンチル）スペルミジンによってアシル化された融合誘導ペプチド；Ｎ4−（５−コレスト−５−エン−３′−β−カルバモイル）アミノペンチル）スペルミジン；およびＮ4−（５−（３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−オイック）アミノペンチル）−スペルミジンアミドによって得ることができる。
実施例１３
研究および製造用途のためのキット
研究および製造設定において本発明の多機能分子複合体を用いるためのキットは、個々の使用者が個々にＤＮＡを供給する場合、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の滅菌緩衝液中に０．１〜１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは１ｍｇ／ｍＬで溶解された本発明の運搬部分が入っているバイアルを包含する。許容しうる緩衝液としては、クエン酸塩、ヘペス（HEPES）およびリン酸塩があると考えられる。キットの使用は、運搬部分のアリコートを取出し、そしてそのアリコートをＤＮＡの溶液（０．０５〜２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍＬ）に対して加えて、運搬部分ｍｇ対ＤＮＡ  ｍｇの最終比率が０．５〜５．０ｍｇ／ｍｇであるようにすることを必要とする。最適比率は容易に決定することができる。ＤＮＡ−運搬部分混合物を簡単に混合し且つ３７℃で１５〜６０分間保持する。ＤＮＡ−運搬部分混合物はここで本発明の多機能分子複合体を形成しており、次に、これを最少必須培地（血清不含）によって５〜１００μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、そして培養物中の細胞に対して加える。最適濃度は容易に決定することができる。
実施例１４
臨床および獣医学用途のためのキット
臨床または獣医学設定において本発明の運搬部分を用いるためのキットは、個々の使用者が個々にＤＮＡを供給する場合、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の滅菌緩衝液中に０．１〜１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは１ｍｇ／ｍＬで溶解された運搬部分が入っているバイアルを包含する。許容しうる緩衝液としては、クエン酸塩、ヘペスおよびリン酸塩がある。キットの使用は、運搬部分のアリコートを取出し、そしてそのアリコートをＤＮＡの溶液（０．０５〜２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍＬ）に対して加えて、運搬部分ｍｇ対ＤＮＡ  ｍｇの最終比率が０．５〜５．０ｍｇ／ｍｇである、好ましくは、１ｍｇ／ｍｇであるようにすることを必要とする。最適比率は容易に決定することができる。ＤＮＡ−配合物混合物を簡単に混合し且つ周囲温度で３０〜６０分間保持する。ＤＮＡ−運搬部分混合物（ＤＮＡ  １０〜５００μｇ）はここで本発明の多機能分子複合体を形成しており、次に、これを患者または対象、ヒトまたは動物に、望ましい用途に矛盾しないように、例えば、免疫感作に対して筋肉内注射、肝局在化に対して静脈内注射等によって注射する。
実施例１５
臨床および獣医学用途のためのＤＮＡ含有キット
臨床または獣医学設定において本発明の多機能分子複合体を用いるためのキットは、ＤＮＡがキットの一部分として供給される場合、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の滅菌緩衝液中に０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｍＬで溶解された配合物が入っているバイアルを包含する。許容しうる緩衝液としては、クエン酸塩、ヘペスおよびリン酸塩がある。キットは、更に、目的の用途に適したＤＮＡを含み（０．０５〜２ｍｇ／μＬ、好ましくは、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍＬ）、キットの運搬部分成分ｍｇ対キットのＤＮＡ成分ｍｇの最終比率が０．５〜５．０ｍｇ／ｍｇである、好ましくは、１ｍｇ／ｍｇであるようにする。最適比率は容易に決定することができる。ＤＮＡ−運搬部分混合物を周囲温度で３０〜６０分間保持する。次に、ＤＮＡ−運搬部分混合物（ＤＮＡ  １０〜５００μｇ）を患者または対象、ヒトまたは動物に、望ましい用途に矛盾しないように、例えば、免疫感作に対して筋肉内注射、肝局在化に対して静脈内注射等によって注射する。
実施例１６
凍結乾燥成分含有キット
上記実施例１３〜１５まで記載されたキットは、更に、凍結乾燥粉末として供給されたそれらの成分を有することができ、その場合、運搬部分、緩衝液成分および賦形剤は滅菌水の添加によって使用部位において還元される。これらの凍結乾燥キットはまた、ＤＮＡを凍結乾燥成分として包含することができる。
実施例１７
Ｎ4−（ベンジル  ６′−ヘキサノニル）−スペルミジン三塩酸塩の製造
６−ブロモヘキサン酸ベンジルは、ベンジルアルコール６６．２２ｍＬのピリジン６０ｍＬ中溶液に対する塩化６−ブロモヘキサノニル（２０．０ｍＬ）の塩化メチレン１００ｍＬ中溶液の滴加によって製造された。その混合物を、氷水浴を用いて９０分間冷却した後、室温で１８時間撹拌した。その溶液を１Ｎ  ＨＣｌ  ２００ｍＬによって、続いて飽和ＮａＨＣＯ3  ２ｘ１５０ｍＬによって抽出した。抽出物を捨て、そして溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶液を濾過し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。この油状物を、シリカゲル上においてヘキサン中のクロロホルムの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．５２，ＣＨＣｌ3／ヘキサン６：４）を混合し、そして溶媒を除去して２４．４ｇを生じた。
Ｎ4−（ベンジル  ６′−ヘキサノニル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンは、Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（３．０ｇ）を、６−ブロモヘキサン酸ベンジル（それぞれ２．４５ｇ）およびＫ2ＣＯ3（それぞれ１．１９ｇ）の３アリコートによって還流アセトニトリル中において１時間間隔で処理することによって製造された。溶媒を真空中で除去し、そして残留物を水２００ｍＬとＣＨＣｌ3  ２ｘ１５０ｍＬとに分配した。ＣＨＣｌ3層を混合し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。この油状物をシリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．５０，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（ベンジル  ６′−ヘキサノニル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン３．８２ｇを油状物として生じた。
Ｎ4−（ベンジル  ６′−ヘキサノニル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．２０ｇ）をトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で１時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム（５０ｍＬ）中に２回溶解させ、そして溶媒を真空中で除去した。油状残留物を０．１Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬから凍結乾燥させて、Ｎ4−（ベンジル  ６′−ヘキサノニル）−スペルミジン三塩酸塩１２６ｍｇを油状物として生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．３７（２Ｈ），１．７７（９．４Ｈ），２．０５（２Ｈ），２．４２（１．８Ｈ），２．９（１．７Ｈ），３．００（４．４Ｈ），３．２０（１．７Ｈ），５．１２（１．７Ｈ），７．３７（５Ｈ），８．１９（５Ｈ），１０．７７（１Ｈ）。
実施例１８
Ｎ4−（６′−ヘキサノニル）−スペルミジン−ＨＡ−２−ペプチドの製造
Ｎ4−（６′−ヘキサン酸）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（１．４６ｇ）を、テトラヒドロフラン１００ｍＬ中においてＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．３７ｇおよびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．６６ｇによって２０時間処理した。沈殿を濾過によって除去し、そして溶媒を真空中で除去して、Ｎ4−（スクシンイミジル  ６′−ヘキサノニル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン１．９９ｇを生じた。ペプチドＳＧＳＧＧＬＦＥＡＩＡＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧは、ＡＢＩ４３１Ａ型ペプチドシンセサイザー、予め充填されたＦＭＯＣ−アミノ酸カートリッジおよび予め充填されたＦＭＯＣ−Ｇｌｙ−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂を用いて製造された。ＦＭＯＣ保護基をＮ末端セリンから除去し、そして樹脂を乾燥させた。ペプチド−樹脂を、ジメチルホルムアミド５０ｍＬ中においてＮ4−（スクシンイミジル  ６′−ヘキサノニル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン１．９９ｇおよびジイソプロピルエチルアミン１．２４ｍＬによって２４時間処理した。樹脂を濾過によって単離し且つジクロロメタンによって洗浄した。Ｎ4−（６′−ヘキサノニル）−スペルミジン−ＳＧＳＧＧＬＦＥＡＩＡＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧ−ＯＨを、水（０．２５ｍＬ）、エタンジチオール（０．２５ｍＬ）、チオアニソール（０．５０ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（９．５ｍＬ）の混合物を用いて樹脂から開裂させた。消費された樹脂を濾過によって除去し、そして粗製Ｎ4−（６′−ヘキサノニル）−スペルミジン−ＳＧＳＧＧＬＦＥＡＩＡＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧ−ＯＨをジエチルエーテルの添加によって沈殿させ且つ濾過によって単離した。粗製Ｎ4−（６′−ヘキサノニル）−スペルミジン−ＳＧＳＧＧＬＦＥＡＩＡＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧ−ＯＨの試料（１００ｍｇ）を、２５ｘ２５０ｍｍＣ−１８カラム上のＨＰＬＣにより、０．０５Ｍ重炭酸アンモニウムおよび８０％アセトニトリル中の０．０５Ｍ重炭酸アンモニウムの勾配によって溶離して精製した。
ＦＡＢ質量スペクトルＭＨ+＝２７７５。
実施例１９
Ｎ4−（５′−Ｎ−（３″α，７″α，１２″α−トリヒドロキシ−５″β−コランアミド）ペンチル）−スペルミジン三塩酸塩の製造
コール酸（９５ｍｇ）をテトラヒドロフラン１０ｍＬ中に溶解させ、そしてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２７ｍｇ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（４８ｍｇ）を加えた。その混合物を撹拌して溶解させ、そしてＮ4−（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−スペルミジン（１００ｍｇ）を加えた。その混合物を室温で４８時間撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗製ろうを、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３９，ＣＨＣｌ3／メタノール８５：１５）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（５′−（３″α，７″α，１２″α−トリヒドロキシ−５″β−コランアミド）ペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン０．１５ｇを白色固体として生じた。この固体を２−プロパノール１０ｍＬ中に溶解させ、そしてこの溶液に対して、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬを加えた。その混合物を室温で１８時間撹拌し、この間に、Ｎ4−（５′−（３″α，７″α，１２″α−トリヒドロキシ−５″β−コランアミド）ペンチル）−スペルミジン三塩酸塩を微細白色粉末として沈殿した。これを濾過によって単離して６７ｍｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ０．５８（ｓ，３Ｈ），０８１（ｓ，３Ｈ），０．９２（ｍ，５．５Ｈ），１．２８（ｍ，２０．８Ｈ），１．６２（ｍ，１６．２Ｈ），２．０５（ｍ，８．８Ｈ），２．８（ｑ，２．８Ｈ），２．９（ｑ，２．８Ｈ），３．０２（ｑ，８．３Ｈ），３．１８（ｍ，４．４Ｈ），７．８７（ｍ，１．１Ｈ），８．１３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），８．２３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），１０．７８（ｂｒ  ｓ，１．１Ｈ）。
実施例２０
Ｎ4−（５−Ｎ−（α−３′−プロピオンアミドチオマンノシド）ペンチル）−スペルミジン三塩酸塩の製造
Ｓ−α−３′−プロピオニルーテトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド（Ｓ−β−３′−プロピオニル  ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド、Ｍ．エロフソン、Ｓ．ロイ、Ｂ．ワルスおよびＪ．キールバーグ、Carb.Res.,246,89-103(1993)と同様に製造された）（０．９０ｇ）をＣＨＣｌ3５０ｍＬ中で製造した。その溶液に対して、２−プロパノール５ｍＬ、ジシクロヘキシルカルボジイミド０．４３ｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．２４ｇを加えた。溶液を室温で１時間撹拌した後、４℃で一晩貯蔵した。沈殿を濾去した、そして溶媒を真空中において濾液から除去して油状物を生じた。その油状物をテトラヒドロフラン３０ｍＬ中に溶解させた。この溶液に対して、Ｎ4−（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−スペルミジン（０．８６ｇ）の溶液（テトラヒドロフラン５０ｍＬおよび水３０ｍＬ中）およびジイソプロピルエチルアミン０．５５ｍＬを加えた。その溶液を室温で２時間撹拌し、得られた固体を濾去し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。その油状物を飽和ＮａＨＣＯ3  １００ｍＬ中に懸濁させ、そしてＣＨＣｌ3  ２ｘ７５ｍＬによって抽出した。溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を除去して油状物を生じた。その油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３０，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（５′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミド−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）ペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン０．１０ｇをガラスとして生じた。このガラスをトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ、そして混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物を再溶解させ、そしてクロロホルム（３ｘ２０ｍＬ）を用いて溶媒を除去した。固体を５５％エタノール中１５％ＮＨ4ＯＨによって２時間処理した。次に、生成物を０．０５Ｎ  ＨＣＬから凍結乾燥させて（３ｘ）、Ｎ4−（５−（α−３′−プロピオニルチオマンノシド）アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩を白色固体として生じた（６４ｍｇ）。
実施例２１
Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩の製造
Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンを、Ｎ4−（ベンジル  ６″−ヘキサノイル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．５ｇ）をＮ−ＣＢＺ−５−アミノ−１−ブロモペンタン（それぞれ１．７４ｇ）の４アリコートおよびＫ2ＣＯ3（それぞれ１．００ｇ）の５アリコートによって処理することにより製造した。得られた油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製して（ＴＬＣ  Ｒf  ０．４７，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１＋０．４％ジイソプロピルエチルアミン）、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン０．７２ｇを油状物として生じた。
Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ１、Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジン（０．２４ｇ）をトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ且つ窒素下の氷水浴中において２時間撹拌した。冷エーテルを加えて生成物を油状物として沈殿させた。溶媒を傾潟によって除去し、油状物を０．１Ｎ  ＨＣＬ  ２５ｍＬ中に溶解させ且つ凍結乾燥させて、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）スペルミジン三塩酸塩０．１６ｇをガラスとして生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２８（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｍ，８Ｈ），２．０１（ｍ，２Ｈ），２．８２，２．９０（ｍ，４Ｈ），３．０２（ｍ，８Ｈ），３．１５（ｍ，２．７Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），７．３５（ｓ＋ｍ，６．７Ｈ），８．００，８．１１（オーバーラップｂｒ  ｍ，７．３Ｈ）。
実施例２２
Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミン三塩酸塩の製造
Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、同様の反応順序を用いて製造した。Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、還流アセトニトリル（１００ｍＬ）中のＮ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン３．４２ｇに対するＮ−ＣＢＺ−５−アミノ−１−ブロモペンタン（５．１０ｇ）およびＫ2ＣＯ3（４．７０ｇ）の１回の添加を用いて製造した。前と同様の処理は生成物を油状物として生じ、それを、シリカゲル上においてジイソプロピルエチルアミン（０．２％）を含有するクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．４３，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１＋０．４％ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン６．０ｇを油状物として生じた。この物質のアリコート（０．２５ｇ）を脱保護し、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミン三塩酸塩０．１３ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２８（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｍ，４Ｈ），１．７６（ｍ，８．８Ｈ），２．０１（ｍ，４Ｈ），２．９０，３．００（オーバーラップｍ，１８．４Ｈ），３．１７（ｍ，４．４Ｈ），５．０３（ｓ，４Ｈ），７．３５（ｓ，１２Ｈ），８．１１（ｂｒ  ｍ，５．６Ｈ）。
実施例２３
Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−スペルミン四塩酸塩の製造
Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、アセトン（３０ｍＬ）中のＮ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．５０ｇに対する１−ブロモオクタン（０．５３ｇ）、ヨウ化カリウム（０．４５ｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５４ｍＬ）の１回の添加を用い且つ一晩還流して製造した。アセトンを真空中で除去し、そして混合物をクロロホルム２００ｍＬ中に取り且つ水１００ｍＬによって洗浄した。クロロホルム溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して生成物を油状物として生じた。この油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．５４，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．２６ｇをろうとして生じた。この物質（０．２６ｇ）を、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬによって室温で２時間処理した。溶媒を真空中で除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−スペルミン四塩酸塩０．２１ｇをろうとして生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ０．９４（ｔ，６Ｈ），１．３５（ｍ，２２Ｈ），１．７４，１．８３（オーバーラップｍ，８．２Ｈ），２．１０（ｍ，４Ｈ），２．９７，３．１２，３．２６（オーバーラップｍ，１８Ｈ），８．２７（ｂｒ  ｍ，５．６Ｈ）。
実施例２４
１，１２−ビスーＮ−グアニジノ−Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−４，９−ジアザドデカン四塩酸塩の製造
テトラヒドロフラン５０ｍＬおよび水１ｍＬ中のテトラトリフルオロ酢酸Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−スペルミン０．６８ｇに対して、Ｎ，Ｎ′−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素０．７７ｇおよびジイソプロピルエチルアミン０．８５ｍＬを加えた。その溶液を１時間還流させた後、室温で１８時間撹拌した。溶媒を窒素流下において６０℃で除去した。得られた固体を飽和ＮａＨＣＯ3  １００ｍＬ中に懸濁させ、そしてクロロホルム２ｘ１００ｍＬによって抽出した。クロロホルム溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。この油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３９，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、１，１２−ビス−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ″−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニルグアニジノ））−Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−４，９−ジアザドデカン０．１８ｇをろうとして生じた。このろうをトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させ、そして溶媒を除去して（２ｘ２０ｍＬ）油状物を生じた。この油状物を０．１Ｎ  ＨＣｌ  ３０ｍＬ中に溶解させ、そして凍結乾燥して、１，１２−ビス−Ｎ−グアニジノ−Ｎ4，Ｎ9−ビス（オクチル）−４，９−ジアザドデカン四塩酸塩（８６ｍｇ）を油状物として生じた。
ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）δ０．８２（ｍ，３Ｈ），１．２３，１．３０（オーバーラップｍ，１０Ｈ），１．６４，１．７１（オーバーラップｍ，４Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｍ，６Ｈ）。
実施例２５
Ｎ4−（５−Ｎ−（コレステン−３′β−カルバモイル）ペンチル）スペルミン四塩酸塩の製造
Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンは、Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンの製造中に少量成分として単離された。Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを含有する画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．２６，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１＋０．４％ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、そして溶媒を除去して、油状物０．８４ｇを生じた。この油状物に対して、アセトニトリル５０ｍＬ、ジイソプロピルエチルアミン０．４７ｍＬおよびジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル０．３５ｇを加えた。その混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム１００ｍＬ中に取り且つ水１００ｍＬによって洗浄した。クロロホルム溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．８３ｇを油状物、薄層クロマトグラフィーによる単一スポット（Ｒf  ０．５６，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１＋０．４％ジイソプロピルエチルアミン）として生じた。メタノール２０ｍＬ中のＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．２２ｇ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ  ０．０４ｇおよび５０  ＰＳＩＧ  Ｈ2によって室温で２時間処理した。珪藻土を介する濾過によってＰｄ／Ｃを除去し、そして溶媒を真空中で除去して、Ｎ4−（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを油状物（０．１４ｇ）として生じた。この油状物を塩化メチレン中に溶解させ、そしてその溶液に対してジイソプロピルエチルアミン（０．１４６ｍＬ）およびクロロギ酸コレステリル（０．０９４ｇ）を加えた。溶液を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして得られた油状物を、シリカゲル上においてジイソプロピルエチルアミンを含有するクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．２９，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１＋０．４％ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（５−Ｎ−（コレステン−３′β−カルバモイル）ペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．１９ｇを油状物として生じた。この油状物をトリフルオロ酢酸５ｍＬ中に溶解させ且つ窒素下の氷水浴中で２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させ、そして溶媒を除去して（２ｘ２０ｍＬ）油状物を生じた。この油状物を０．１Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬ中に溶解させ、そして凍結乾燥して、淡褐色油状物（０．０７７ｇ）を生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ０．５８（ｓ，３Ｈ），０．７８（２ｓ，６Ｈ），０．９０（オーバーラップｍ，１８Ｈ），１．４３（オーバーラップｍ，１５Ｈ），１．６４（オーバーラップｍ，８Ｈ），１．９６（ｍ，６Ｈ），２．８５（オーバーラップｍ，１６Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），５．２５（ｍ，１Ｈ），７．０（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），８．０６（ｂｒ  ｍ，８Ｈ），９．１９（ｂｒ  ｍ，２Ｈ）。
実施例２６
Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル−１２′−ドデカンアミド）−スペルミン四塩酸塩の製造
１２−ブロモドデカン酸７．８ｇの水１００ｍＬ中懸濁液に対して、テトラヒドロフラン中２Ｍジメチルアミン１４ｍＬを加えて透明な溶液を生じた。１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを７に調整し、そして１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド５．３６ｇを加えた。溶液を室温で１８時間撹拌した。得られたＮ，Ｎ−ジメチル−１２−ブロモドデカンアミドは、この間に白色固体として溶液から沈殿した。この固体を濾去し且つ水によって洗浄した後、真空中で乾燥させた。Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル−１２′−ドデカンアミド）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、還流アセトニトリル（５０ｍＬ）中のＮ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．５０ｇに対するＮ，Ｎ−ジメチル−１２−ブロモドデカンアミド（２．３４ｇ）およびＫ2ＣＯ3（１．７０ｇ）の１回の添加を用いて製造した。前と同様の処理は生成物を油状物として生じ、それを、シリカゲル上においてジイソプロピルエチルアミン（０．２％）を含有するクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．５３，ＣＨＣｌ3／メタノール８：２＋０．２％ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル−１２′−ブロモドデカンアミド）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．４９ｇを油状物として生じた。この物質のアリコート（０．２０ｇ）を脱保護し、そしてＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル−１２′−ドデカンアミド）−スペルミン四塩酸塩０．１９ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２６（ｍ，２５．６Ｈ），１．４６（ｍ，３Ｈ），１．７０，１．８０（オーバーラップｍ，６Ｈ），２．０４（ｍ，３Ｈ），２．７９（ｓ，６Ｈ），２．９４（ｓ，６Ｈ），３．０−３．２（オーバーラップｍ，１８Ｈ），８．１５（ｂｒ  ｍ，５Ｈ）。
実施例２７
Ｎ4，Ｎ9−ビス（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−スペルミン四塩酸塩の製造
１２−ブロモドデカン酸（１．０ｇ）およびベンジルアルコール（０．７４ｍＬ）のトルエン２００ｍＬ中溶液に対して、ｐ−トルエンスルホン酸（０．１０ｇ）を加えた。トルエンの大部分（約１８０ｍＬ）を大気圧での簡単な蒸留によって除去し、そして残留する溶媒を真空中で除去した。残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）中に取り且つ飽和ＮａＨＣＯ3によって洗浄した。酢酸エチル溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して、粗製１２−ブロモドデカン酸ベンジル（１．７５ｇ）を粗製液体として生じた。薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／ヘキサン８５：１５）は、唯一の生成物（Ｒf０．７８）およびベンジルアルコール（Ｒf  ０．０８）を示した。Ｎ4，Ｎ9−ビス（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、還流アセトニトリル（１００ｍＬ）中のＮ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン１．０ｇに対する粗製１２−ブロモドデカン酸ベンジル（４．６ｇ）およびＫ2ＣＯ3（１．７０ｇ）の１回の添加を用いて製造した。前と同様の処理は生成物を油状物として生じ、それを、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３５，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1、Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．３６ｇを油状物として生じた。この物質のアリコート（０．２７ｇ）を脱保護し、そしてＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−スペルミン四塩酸塩０．１７ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２４（ｍ，３１．４Ｈ），１．５５（ｍ，４．２Ｈ），１．７０，１．８０（オーバーラップｍ，８．６Ｈ），２．０２（ｍ，４．２Ｈ），２．９−３．２（オーバーラップｍ，２１．４Ｈ），５．０８（ｓ，４．２Ｈ），７．３６（ｓ，１０Ｈ），８．１３（ｂｒ  ｍ，５．８Ｈ）。
実施例２８
Ｎ4，Ｎ9−ビス（１２′−ドデカン酸）−スペルミン四塩酸塩の製造
Ｎ4，Ｎ9−ビス（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．５１ｇ）をメタノール５０ｍＬ中に溶解させ、そして１０％Ｐｄ／Ｃ  ０．０５ｇおよび５０  ＰＳＩＧ  Ｈ2によって室温で３時間処理した。珪藻土を介する濾過によってＰｄ／Ｃを除去した。溶媒を真空中で濾液から除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（１２′−ドデカン酸）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを油状物として生じた。この物質のアリコート（０．２２ｇ）を脱保護し、そしてＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（１２′−ドデカン酸）−スペルミン四塩酸塩０．１７ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２５（ｍ，２８Ｈ），１．４７（ｍ，５Ｈ），１．６６，１．７６（オーバーラップｍ，８Ｈ），２．０２（ｍ，３．６Ｈ），２．９１−３．１７（オーバーラップｍ，１９Ｈ），８．１１（ｂｒ  ｍ，５Ｈ）。
実施例２９
Ｎ4−（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−スペルミン四塩酸塩の製造
Ｎ4−（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを、Ｎ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ8−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミジンと同様に、還流アセトニトリル（１００ｍＬ）中のＮ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン１．４３ｇに対する１２−ブロモドデカン酸ベンジル（６．５８ｇ）の１回の添加を用いて製造した。前と同様の処理は、生成物を油状物として生じ、それをシリカゲル上において、ジイソプロピルエチルアミン（０．２％）を含有するクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．０８，ＣＨＣｌ3／メタノール８：２＋０．２％ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．３６ｇを油状物として生じた。この物質のアリコート（０．２９ｇ）を脱保護し、そしてＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4−（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−スペルミン四塩酸塩０．１９ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２４（ｍ，１２Ｈ），１．５３（ｍ，１．５Ｈ），１．６９，１．８０（オーバーラップｍ，４Ｈ），２．０１（ｍ，４Ｈ），２．９−３．２（オーバーラップｍ，１４Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），７．３６（ｓ，５Ｈ），７．４７（ｍ，１Ｈ），８．０９（ｂｒ  ｍ，５．５Ｈ），９．２０（ｂｒ  ｍ，２Ｈ）。
実施例３０
Ｎ4−（１２′−ドデカン酸）−スペルミン四塩酸塩の製造
Ｎ4−（ベンジル−１２′−ドデカノイル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．２９ｇ）をメタノール３０ｍＬ中に溶解させ、そして１０％Ｐｄ／Ｃ  ０．０３ｇおよび５０  ＰＳＩＧ  Ｈ2によって室温で１．５時間処理した。珪藻土を介する濾過によってＰｄ／Ｃを除去した。溶媒を真空中で濾液から除去して、Ｎ4−（１２′−ドデカン酸）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを油状物（０．１９ｇ）として生じた。この物質（０．１９ｇ）を脱保護し、そしてＮ4−（Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノペンチル）−スペルミジン三塩酸塩について上記に記載されたように塩酸塩に変換して、Ｎ4−（１２′−ドデカン酸）−スペルミン四塩酸塩０．１８ｇを生じた。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２６（ｍ，１６．７Ｈ），１．４８（ｍ，２．７Ｈ），１．７０，１．７８（オーバーラップｍ，６Ｈ），２．０１（ｍ，４Ｈ），２．９１−３．１７（オーバーラップｍ，１２Ｈ），８．１７（ｂｒ  ｍ，５．３Ｈ），９．３０（ｂｒ  ｍ，２Ｈ）。
実施例３１
四酢酸Ｎ4，Ｎ9−ビス（５−（α−３′−プロピオニルチオマンノシド）アミノペンチル）スペルミンの製造
Ｎ4，Ｎ9−ビス（Ｎ−ＣＢＺ−５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（２．０４ｇ）をメタノール５０ｍＬ中に溶解させ、そして１０％Ｐｄ／Ｃ  ０．８４ｇおよび５０  ＰＳＩＧ  Ｈ2によって室温で２．５時間処理した。珪藻土を介する濾過によってＰｄ／Ｃを除去し、そして溶媒を真空中で濾液から除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．７９ｇ）を油状物として生じた。Ｓ−α−３′−プロピオニル−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド（２．９４ｇ）の溶液をテトラヒドロフラン１００ｍＬ中で製造した。そのチオマンノシド溶液に対して、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．３９ｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．７８ｇを加えた。溶液を室温で２０時間撹拌した後、４℃で０．５時間貯蔵した。沈殿を濾去し、そして溶媒を真空中で濾液から除去して、スクシンイミジルＳ−α−３′−プロピオニル−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド（３．８０ｇ）を白色固体として生じた。Ｎ4，Ｎ9−ビス（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．７９ｇ）をテトラヒドロフラン（７５ｍＬ）中に溶解させ、そしてその溶液に対して、ジイソプロピルエチルアミン０．６４ｍＬおよびスクシンイミジルＳ−α−３′−プロピオニル−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド１．３２ｇを加え、そしてその溶液を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去してガラスを生じた。このガラスを、シリカゲル上において、ジイソプロピルエチルアミン（０．２％）を含有するクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３０，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4，Ｎ9−ビス（５−（α−３′−プロピオニル−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ12−ビス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．６９ｇをガラスとして生じた。このガラスをトリフルオロ酢酸２０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させ、そして溶媒を除去して（２ｘ２０ｍＬ）、Ｎ4，Ｎ9−ビス（５−Ｎ−（α−３′−プロピオンアミド−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）ペンチル）−スペルミン０．７８ｇを油状物として生じた。この油状物をメタノール２５ｍＬ中に溶解させ、そしてその溶液に対して、水２５ｍＬおよびＮａ2ＣＯ3  １．５６ｇを加え、そして溶液を室温で５時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物を１％酢酸６ｍＬ中に取り、そして三つの２ｍＬアリコートで三つのセファデックスTMＧ−２５メジウムカラム（それぞれ１２ｍＬ）上において１％酢酸によって溶離して精製した。生成物含有画分を混合し、そして凍結乾燥させて、四酢酸Ｎ4，Ｎ9−ビス（５−Ｎ−（α−３′−プロピオンアミドチオマンノシド）ペンチル）スペルミン０．３１ｇを白色固体として生じた。
ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．４２（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），１．７９（ｍ，９．５Ｈ），１．９５（ｓ，３８．５Ｈ），２．１４（ｍ，５Ｈ），２．６２（ｔ，４Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），３．１０（ｍ，４．５Ｈ），３．２４（ｍ，１８Ｈ），３．７２（ｍ，６Ｈ），４．０５（ｍ，６．５Ｈ），５．３４（ｓ，２Ｈ）。
実施例３２
四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（α−３″−プロピオンアミドチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミンの製造
ペンタエチレングリコール（５．０ｇ）のテトラヒドロフラン５０ｍＬ中溶液を、ＮａＨ（６０％の０．４２ｇ）のテトラヒドロフラン４０ｍＬ中急速撹拌懸濁液に対して加えた。反応混合物を窒素下で保持し且つ氷水浴中で懸濁させ、そして０．５時間撹拌した。Ｎ−ＣＢＺ−５−アミノ−１−ブロモペンタン（３．７８ｇ）のテトラヒドロフラン３０ｍＬ中溶液を加え、そして混合物を氷水浴中で１時間、続いて室温で１８時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をシリカゲル上において、クロロホルム中の２−プロパノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３０，ＣＨＣｌ3／２−プロパノール９５：５）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ−ＣＢＺ−２０−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタ−オキサ−１−エイコサノール３．２５ｇを油状物として生じた。Ｎ−ＣＢＺ−２０−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタ−オキサ−１−エイコサノール（３．２５ｇ）のテトラヒドロフラン５０ｍＬ中溶液を、ＮａＨ（６０％の０．２８ｇ）のテトラヒドロフラン２５ｍＬ中急速撹拌懸濁液に対して加えた。反応混合物を窒素下で保持し且つ氷水浴中で懸濁させ、そして０．５時間撹拌した。その溶液に対して、１−ブロモ酢酸ｔ−ブチル（１．１５ｍＬ）を加え、その混合物を氷水浴中で１時間、続いて室温で４日間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム１００ｍＬ中に懸濁させ且つ水（５０ｍＬ）によって洗浄した。そのクロロホルム溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。この油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中の２−プロパノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．４５，ＣＨＣｌ3／２−プロパノール９５：５）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ−ＣＢＺ−２３−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサ−オキサ−１−トリコサン酸ｔ−ブチル３．２４ｇを無色油状物として生じた。Ｎ−ＣＢＺ−２３−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサ−オキサ−１−トリコサン酸ｔ−ブチルのアリコート（０．４９ｇ）を、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ  １０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去した。得られた粗製Ｎ−ＣＢＺ−２３−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサ−オキサ−１−トリコサン酸を、ジメチルホルムアミド１５ｍＬ中に溶解させた。この溶液に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１０ｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（０．１６ｇ）およびＮ4−（５′−アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．５０ｇ）を加えた。その溶液を室温で２．５日間撹拌した。ジメチルホルムアミドをを真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム（１００ｍＬ）中に取った。そのクロロホルム溶液を、０．１Ｎ  ＨＣＬ（７５ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ3によって逐次的に洗浄した。クロロホルム溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去して油状物を生じた。この油状物を、シリカゲル上においてクロロホルム中の２−プロパノールの勾配に��って溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０３３，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（５−Ｎ−（Ｎ−ＣＢＺ−２３′−アミノ−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．１９ｇを無色油状物として生じた。この油状物を酢酸エチル５０ｍＬ中に溶解させ、そして１０％Ｐｄ／Ｃ  ０．１９ｇおよび５０  ＰＳＩＧ  Ｈ2によって室温で２．５時間処理した。珪藻土を介する濾過によってＰｄ／Ｃを除去し、そして溶媒を真空中で濾液から除去して、Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−アミノ−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミンを無色油状物（０．１３ｇ）として生じた。Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−アミノ−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．１３ｇ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解させ、そしてその溶液に対して、ジイソプロピルエチルアミン０．０４８ｍＬおよびスクシンイミジルＳ−α−３′−プロピオニル−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド０．０７３ｇを加え、そしてその溶液を室温で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去してガラスを生じた。このガラスを、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．３６，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミド−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．１０ｇを油状物として生じた。ＦＡＢ質量スペクトル、ＭＨ+＝３３２８。Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミド−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．５５ｇ）をトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させ、そして溶媒を除去して（２ｘ２０ｍＬ）、Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミド−テトラ−Ｏ−アセチルチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミン０．７６ｇを油状物として生じた。この油状物をメタノール２０ｍＬ中に溶解させ、そしてその溶液に対して、水２０ｍＬおよびＮａ2ＣＯ3  ０．８５ｇを加え、そして溶液を室温で６．５時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物を１％酢酸６ｍＬ中に取り、そして四つの１．５ｍＬアリコートで三つのセファ���ックスTMＧ−２５メジウムカラム（それぞれ１２ｍＬ）上において１％酢酸によって溶離して精製した。生成物含有画分を混合し、そして凍結乾燥させて、四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミドチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミン０．２２ｇを油状物として生じた。
ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．３５（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｍ，６Ｈ），１．７５（ｍ，６．４Ｈ），１．９１（ｓ，１４Ｈ），２．０９（ｍ，４．２Ｈ），２．５８（ｔ，１．７Ｈ），２．９０（ｍ，１．７Ｈ），３．０９，３．１９（オーバーラップｍ，１８．１Ｈ），３．５３（ｔ，２．５Ｈ），３．６９（ｍ，２２Ｈ），３．８８（ｍ，３．８Ｈ），４．０６（ｓ，１．７Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ）。
実施例３３
四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（Ｏ−（５−Ｎ−（α−３″−プロピオンアミドチオマンノシド）ペンチル）−Ｏ−（２−アセトアミド）ノナデカエチレングリコール）ペンチル）−スペルミンの製造
四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（Ｏ−（５−Ｎ−（α−３″−プロピオンアミドチオマンノシド）ペンチル）−Ｏ−（２−アセトアミド）ノナデカエチレングリコール）ペンチル）−スペルミンは、四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミドチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミンと同様に、実施例３２で記載の手順においてペンタエチレングリコールの代わりに平均分子量９００のポリ（エチレングリコール）１８．９ｇを置換えることによって製造することができた。
実施例３４
四酢酸Ｎ4−（（（２３−［Ｎ2，Ｎ6−ビス−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノ）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミンの製造
四酢酸Ｎ4−（（（２３−［Ｎ2，Ｎ6−ビスー（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル］−アミノ）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミンを、四酢酸Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｓ−α−３′−プロピオンアミドチオマンノシド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミンおよび実施例３２で記載の手順と同様に製造した。Ｎ4−（５−Ｎ−（２３′−アミノ−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．１４ｇ）を、テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中に溶解させ、そしてその溶液に対して、ジイソプロピルエチルアミン０．０５２ｍＬおよびスクシンイミジルＮ2，Ｎ6−ビス−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシネート０．３７ｇを加え、そしてその溶液を室温で７２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去してガラスを生じた。このガラスを、シリカゲル上においてクロロホルム中のメタノールの勾配によって溶離して精製した。生成物含有画分（ＴＬＣ  Ｒf  ０．４６，ＣＨＣｌ3／メタノール９：１）を混合し、そして溶媒を除去して、Ｎ4−（（（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシンアミド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン０．１５ｇを白色固体として生じた。ＦＡＢ質量スペクトル、ＭＨ+＝３３２８。Ｎ4−（（（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシンアミド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−Ｎ1，Ｎ9，Ｎ12−トリス（ｔ−ブチルオキシカルボニル）スペルミン（０．２８ｇ）をトリフルオロ酢酸１０ｍＬ中に溶解させ且つ室温で１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させ、そして溶媒を除去して（２ｘ２０ｍＬ）、Ｎ4−（（（５−Ｎ−（２３′−Ｎ−（Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニル−ヘプタ−Ｏ−アセチルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシンアミド）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリ��サンアミド）アミノペンチル）−スペルミン０．３６ｇを油状物として生じた。この油状物をメタノール１０ｍＬ中に溶解させ、そしてその溶液に対して、水１０ｍＬおよびＮａ2ＣＯ3  ０．４４ｇを加え、そして溶液を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物を１％酢酸５ｍＬおよびエタノール１ｍＬ中に取り、そして四つの１．５ｍＬアリコートで二つのセファデックスTMＧ−２５メジウムカラム（１５ｍＬおよび２０ｍＬ）上において１％酢酸中１０％エタノールによって溶離して精製した。生成物含有画分を混合し、そして凍結乾燥させて、四酢酸Ｎ4−（（（２３−［Ｎ2，Ｎ6−ビス（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル−Ｎ6−（β−３′−プロピオニルガラクトシル−β１−４−チオグルコシド）リシル）アミノ）−３′，６′，９′，１２′−１５′−１８′−ヘキサ−オキサ−トリコサンアミド）アミノペンチル）−スペルミン０．０９５ｇを生じた。
0003925815.tif 000017
0003925815.tif 000018
0003925815.tif 000019
0003925815.tif 000020
0003925815.tif 000021
0003925815.tif 000022
配列表
（2）配列情報 SEQ ID NO:1:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 25 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:1:
0003925815.tif 000023
（2）配列情報 SEQ ID NO:2:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 32 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:2:
0003925815.tif 000024
（2）配列情報 SEQ ID NO:3:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 35 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:3:
0003925815.tif 000025
（2）配列情報 SEQ ID NO:4:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 23 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:4:
0003925815.tif 000026
（2）配列情報 SEQ ID NO:5:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 17 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:5:
0003925815.tif 000027
（2）配列情報 SEQ ID NO:6:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 22 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:6:
0003925815.tif 000028
（2）配列情報 SEQ ID NO:7:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 25 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:7:
0003925815.tif 000029
（2）配列情報 SEQ ID NO:8:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 23 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:8:
0003925815.tif 000030
（2）配列情報 SEQ ID NO:9:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 27 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:9:
0003925815.tif 000031
（2）配列情報 SEQ ID NO:10:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 19 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:10:
0003925815.tif 000032
（2）配列情報 SEQ ID NO:11:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 23 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:11:
0003925815.tif 000033
（2）配列情報 SEQ ID NO:12:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 22 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:12:
0003925815.tif 000034
（2）配列情報 SEQ ID NO:13:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 22 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:13:
0003925815.tif 000035
（2）配列情報 SEQ ID NO:14:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 22 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:14:
0003925815.tif 000036
（2）配列情報 SEQ ID NO:15:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 28 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:15:
0003925815.tif 000037
（2）配列情報 SEQ ID NO:16:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 28 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:16:
0003925815.tif 000038
（2）配列情報 SEQ ID NO:17:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 28 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:17:
0003925815.tif 000039
（2）配列情報 SEQ ID NO:18:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 30 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:18:
0003925815.tif 000040
（2）配列情報 SEQ ID NO:19:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 53 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:19:
0003925815.tif 000041
（2）配列情報 SEQ ID NO:20:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 53 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:20:
0003925815.tif 000042
（2）配列情報 SEQ ID NO:21:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 53 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:21:
0003925815.tif 000043
（2）配列情報 SEQ ID NO:22:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 27 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:22:
0003925815.tif 000044
（2）配列情報 SEQ ID NO:23:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 27 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:23:
0003925815.tif 000045
（2）配列情報 SEQ ID NO:24:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 19 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:24:
0003925815.tif 000046
（2）配列情報 SEQ ID NO:25:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 19 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:25:
0003925815.tif 000047
（2）配列情報 SEQ ID NO:26:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 23 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:26:
0003925815.tif 000048
（2）配列情報 SEQ ID NO:27:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:27:
0003925815.tif 000049
（2）配列情報 SEQ ID NO:28:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:28:
0003925815.tif 000050
（2）配列情報 SEQ ID NO:29:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:29:
0003925815.tif 000051
（2）配列情報 SEQ ID NO:30:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:30:
0003925815.tif 000052
（2）配列情報 SEQ ID NO:31:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:31:
0003925815.tif 000053
（2）配列情報 SEQ ID NO:32:
（i）配列の特性:
（A）長さ: 20 アミノ酸
（B）型: アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー: 直線状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:32:
0003925815.tif 000054