(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸シンシチアルウイルスに対する中和抗体であって、ヒト定常部、重鎖可変部および軽鎖可変部を含み、前記重鎖可変部は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変部は配列番号３４のアミノ酸配列を含む中和抗体。
【請求項２】
薬剤組成物であって、
（ａ）請求の範囲第１項記載の中和抗体、および、
（ｂ）薬剤許容希釈剤
を含む薬剤組成物。
【請求項３】
ヒトの呼吸シンシチアルウイルス感染を治療または予防するための組成物であって、請求の範囲第１項記載の中和抗体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
背景
この出願は１９９１年１２月２３日受理された米国出願番号０７／８１３，３７２号の一部継続出願である。
呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）は病院に収容される若い児童の急性呼吸器系疾患の主要な原因であり、社会的慣行では多くの入院児童を５回は治療するであろう。従ってこれは小児下部気道感染のもっともよくある原因である。多くの市中獲得型ＲＳＶ感染は１週間乃至１０日でそれ自身消散するが、多くの病院収容児童、とりわけ６ケ月以下の幼児は補助装置での通気を必要とする。
効果的なワクチンを製造する試みは不成功であった（８）。ワクチン開発に対する主な障害は安全性である。当初のホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンはＲＳＶ下部気道疾病の発生率を増加させ、免疫を与えた児童をウイルスにさらした際に死亡をもたらした（５）。
最近薬品リバビリンがＲＳＶ肺炎および細気管支炎の治療用として許可された（２，３）が、その価値は議論の的となっている（４）。リバビリンは効能を示したが、この薬品は１８時間にわたりエアロゾル吸入で投与されねばならない。加えて治療を中止した後二次感染の水準は未治療の患者よりも著しく高い。
高力価のＲＳＶ免疫グロブリンが動物モデルのＲＳＶ感染の予防治療双方に有効であることを研究が示した（６，７）。ＲＳＶ免疫グロブリンで治療された感染動物は肺免疫複合体疾患の徴候を示さなかった。
たとえＲＳＶ高度免疫グロブリンが高リスク児童のＲＳＶ下部気道感染の発生率および発病度の減少を示したにせよ、いくつかの不利な点がその使用を制限する。第１の欠点は事前集中治療のため静脈よりのアクセスを制限されるこれら児童への静脈内注入の必要性があることである。第２の欠点は、とりわけこれらの児童は免疫反応が十分に発揮し得ない心肺機能を持つため大量のＲＳＶＩＧが保護のために必要とされることである。第３の欠点は、静脈内注入はＲＳＶシーズン中は毎月通院を必要とし、それがこれら児童を院内感染の危険にさらすということである（１）。最後の問題はこの製品の要求に合致するＲＳＶ高免疫グロブリンを生産する十分な供与体を選択するということが非常に困難であることがわかっていることである。現在の所僅かに約８％の供与体が高度免疫グロブリンの生産に適格な十分に高いＲＳＶ中和抗体力価を持つに過ぎない。
もう一つのアプローチは、高免疫グロブリンに代替するものとして高い特異的中和活性を持つモノクローナル抗体の開発である。必要ではないとしても、抗体の治療効能を損い、あるいは免疫複合体病理を誘発するヒト抗げっ歯類抗体反応の発生を最小にするために、マウスあるいはラット抗体よりもヒトモノクローナル抗体を使用することが望ましい。しかし望ましい特異性を持つヒトモノクローナル抗体の生成は難しく、ヒト細胞系からの生産水準はしばしば低く、それがこの開発の妨げとなっている。
代替的な一つのアプローチはヒト−マウスキメラ抗体の生産を含み、ここではマウス重鎖および軽鎖可変領域をコード化する遺伝子情報はヒト重鎖軽鎖定常領域をコード化する遺伝子に固定される。生成するマウス−ヒト雑種はマウス配列から誘導される完全免疫グロブリン約３０％を有している。従って数多くの研究所がマウス可変領域およびヒト定常領域でキメラ抗体を構築してきた（１０−１８）けれども、マウス可変領域は未だに異質であると見られている（１９）。
発明の概要
従ってこの発明の目的は、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体を提供することであり、これはＲＳＶ抗原を予防する少なくとも１個のモノクローナル抗体の各可変重鎖および可変軽鎖からの少なくとも１個のＣＤＲを含んでいる。モノクローナル抗体はいずれかの非ヒト動物から誘導され、望ましくはしかしそれはげっ歯類から誘導され、またもっとも望ましくはそれはマウスモノクローナル抗体である。望ましくはマウスモノクローナル抗体は中和抗体である。前記マウス抗体はＲＳＶ  Ｆ抗原を予防する抗体である。
ここで使用される「動物」という用語はもっとも広い感覚で用いられ、ヒトを含む哺乳類を含む。
図面の詳細な説明
ここで描かれ説明される図面はこの発明を詳細に説明することを意図しており、どのような方法であってもこの発明を限定することを意図するものではない。
図１はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質ＶHのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＨＶ３  ＶH（配列番号１６）、ＣＤＲ移植ＶH（配列番号１７）、およびＣＤＲ配列がそれから移植されたマウスＭＡｂ１３０８Ｆ  ＶHのＡＡ配列（配列番号１８）を表す。太字下線部はヒトＨＶ３  ＶHに移植されたＣＤＲを確認し、３個の領域のそれぞれはＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として個々に識別される。
図２はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＶLのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２ＶL（配列番号１９）、ＣＤＲ移植ＶL（配列番号２０）およびＣＤＲ配列がそれから移植されたマウスＭＡｂ１３０８Ｆ  ＶL（配列番号２１）のＡＡ配列を示す。太字下線部はヒトＫ１０２  ＶLに移植されたＣＤＲ配列を確認し、３個の領域のそれぞれはＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として個々に識別される。
図３はＨｕ１３０８ＶHを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを示し、下線のある配列は特異的プライマー配列である（配列番号２２−２５）。
図４はＨｕ１３０８ＶLを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを描き、下線のある配列は特異的なプライマー配列である（配列番号２６−２９）。
図５はヒト化１３０８のための発現ベクターのプラスミド構築を示す。
図６は中和パーセント対Ｃｏｓ  Ｈｕ１３０８ＦおよびＭｕ１３０８Ｆでの中和に対する反応当りＭＡｂ  ｎｇで表したＲＳＶの中和のグラフを示す。
図７はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質ＶHのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＣＤＲ  ＶH（配列番号３０）、ＣＤＲ移植ＶH（配列番号３１）、およびＣＤＲ配列がそれから移植されたマウスＭＡｂ１１２９  ＶHのＡＡ配列（配列番号３２）を示す。太字下線部はヒトＣＤＲ  ＶHに移植されたＣＤＲ配列を確認し、３個の領域のそれぞれはＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として個々に識別される。
図８はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＶLのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２ＶL（配列番号３３）、ＣＤＲ移植ＶL（配列番号３４）、およびＣＤＲ配列がそれから移植されたマウスＭＡｂ１１２９  ＶLＡＡ配列（配列番号３５）を示す。太字下線部はヒトＫ１０２  ＶLに移植されたＣＤＲ配列を確認し、３個の領域のそれぞれはＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として識別される。
図９はヒト化１１２９ＶＨを構築するために使用されたオリゴヌクレオチドを示す（配列番号３６−４２）。
図１０はＥＬＩＳＡ検定においてヒト化１１２９のための結合データを示す。
発明の詳細な説明
ＲＳＶ抗原を予防するマウスモノクローナル抗体から誘導される可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれからの少なくとも１個のＣＤＲの遺伝子情報のみのヒト抗体への移植が、動物中のＲＳＶの予防および治療に有効であることを出願人は発見した。望ましくはマウス抗体はＲＳＶを防ぐ中和抗体である。この発明のも一つの見地はマウス抗体がＲＳＶ  Ｆ抗原を防ぐ抗体であることを提供する。望ましくはマウス抗体はＲＳＶ  Ｆ抗原を防ぐ中和抗体である。ヒト可変フレームワークセグメントへのマウスＣＤＲの置換はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の可能性を最小にし、一方抗原であるＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合親和力および特異性を保持する。ＣＤＲが特徴的なマウスあるいはヒトモチーフ（主要素）を含まないので、マウス抗体ＣＤＲを含むヒト抗体は完全にヒト抗体から基本的に区別できないし、これによりヒト抗体応答を最小にし、またＲＳＶ  Ｆ抗原に対する結合親和力および特異性を保持する。
ＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するヒト化抗体の開発はＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体で開始した。このタイプのマウス抗体の例は以下のものである：ＭＡｂ１４３６Ｃ，ＭＡｂ１１３，ＭＡｂ１１２，ＭＡｂ１５１，ＭＡｂ１２００，ＭＡｂ１２１４，ＭＡｂ１２３７，ＭＡｂ１１２９，ＭＡｂ１１２１，ＭＡｂ１１０７，ＭＡｂ１３１−１，ＭＡｂ４３−１，ＭＡｂ１１１２，ＭＡｂ１２６９，ＭＡｂ１２４３，ＭＡｂ１３３１Ｈ，ＭＡｂ１３０８Ｆ、およびＭＡｂ１３０２Ａ（引用例２１参照）。
この発明の一つの見地は、ヒト抗体のＣＤＲがマウス抗体のそれぞれ可変重鎖および可変軽鎖からの３個の相補性決定領域よりなることを提供する。
ＲＳＶ  Ｆを予防するマウス抗原は、１６個の異なったエピトープを含む３個の幅の広い抗原部位（Ａ，Ｂ，Ｃ）に対する競争的結合および反応性プロフィルにより地図化された（２０）。抗原部位ＡおよびＣにあるエピトープは天然隔離集団内で最小の変異性を示した。
従ってこの発明のも一つの見地は、抗原部位ＡあるいはＣに特異的であるＲＳＶ  Ｆ抗原を予防する少なくとも１個のマウス抗体の各可変重鎖および可変軽鎖からの少なくとも１個のＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。一つの見地において、この発明はマウス抗体がＭＡｂ１３０８Ｆである抗原部位Ｃに特異的なＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体を提供する。
この発明のこのような一つの実施例において、ヒト抗体はＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体ＭＡｂ１３０８Ｆの可変重鎖のＣＤＲ含む。ＭＡｂ１３０８ＦのＣＤＲ可変重鎖は以下のアミノ酸配列：Ｎｏ．３１から３５、Ｎｏ．４７から６０およびＮｏ．９９から１０６を持つ３個のＣＤＲよりなる。加えてこの実施例は、ＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＣＤＲ可変軽鎖は下記のアミノ酸配列：Ｎｏ．２４から３４、Ｎｏ．５０から５６およびＮｏ．８９から９７を持つ３個のＣＤＲよりなる。
この発明のもう一つの見地は、抗原部位Ｃに特異的であるＲＳＶ  Ｆ抗原を予防する少なくとも１個のマウス抗体の各可変重鎖および可変軽鎖からの少なくとも１個のＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。望ましくは、この発明は抗原部位Ｃに特異的なＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体を提供し、ここでマウス抗体はＭＡｂ１１２９である。
この発明の実施例において、ヒト抗体はＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体ＭＡｂ１１２９の可変重鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１１２９のＣＤＲ可変重鎖は配列番号３１のアミノ酸番号３１から３７、アミノ酸番号５２から６７およびアミノ酸番号１００から１０９を持つ３個のＣＤＲよりなる。加えてこの実施例は、ＲＳＶ  Ｆ抗原を予防するマウス抗体ＭＡｂ１１２９の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＣＤＲ可変軽鎖は配列番号３４のアミノ酸番号２４から３３、アミノ酸番号４９から５５およびアミノ酸番号８８から９６を持つ３個のＣＤＲよりなる。
出願人の発明の付加された見地はＲＳＶ感染を予防し治療する一つの方法であり、この方法はＲＳＶ  Ｆ抗原を予防する少なくとも１個のマウス抗体の各可変重鎖および可変軽鎖からの少なくとも１個のＣＤＲを含むヒト抗体の有効量を動物に投与することよりなる。
出願人の発明のもう一つの見地は一つの組成物であり、この組成物は前記ヒト抗体の有効量を薬理的許容可能担体と併用して投与することよりなる。薬理的許容可能担体は必ずしもそれに限定されないが、無毒緩衝液、充填剤、等張液などを含む。
出願人の発明による組成物は局所あるいは全身で投与される。局所投与の例はヒト抗体組成物を含むエアロゾルの鼻腔内投与および吸入である。全身投与はヒト抗体組成物の静脈内あるいは筋肉内注射により達成される。
出願人の発明の望ましい一つの見地は、ヒト抗体がＲＳＶ  Ｆ抗原を防ぐ複数の抗体の一部として投与されるということである。これらの抗体はＲＳＶ  Ｆ抗原の同一もしくは異なったエピトープを予防することができる。
更に付加的に、この発明のヒト抗体は、患者にある呼吸シンシチアルウイルスを臨床的に診断するために使用することができる。ＲＳＶ  Ｆ抗原に対する親和性のために、これらのヒト抗体はサンプル例えば体液にあるＲＳＶ  Ｆ抗原の存在および濃度を検出する既知の診断検定手順に使用することができる。この発明のヒト抗体は例えばラテックスビーズ、カラムなどのような固形支持物に付着あるいは結合でき、それは次いでＲＳＶ  Ｆ抗原を含むものと考えられるサンプルと接触される。
出願人のＲＳＶを予防するヒト抗体の開発は、試験管内でＲＳＶを中和しＲＳＶによる下部気道感染からコットンラットを保護することが示されたマウスモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）細胞で開始した。
抗原部位Ｃに特異的であるこのような一つの抗体がマウス−ヒトキメラ抗体を生産するために選択された。この抗体はそれが（ｉ）テストされる多数の菌株（分離された１４個の内少なくとも１３個）で反応し、（ｉｉ）他の抗Ｆ抗体で選択されたウイルス逃避突然変異体に対し中和活性を保持し、また（ｉｉｉ）ウイルス攻撃の前に鼻腔内ルートによりコットンラットに低い用量で投与された時にＲＳＶ複製を遮断した、ということに基づいて選択された。この抗体はそれぞれの領域において抗体の間の肺疾患ウイルスを著しく減少させた。ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＣ領域に特異的なマウス抗体１３０８Ｆがヒト化の最初の標的として選択された。
要約すると、ヒト抗体は下記の通り構築された：ＲＮＡがマウス抗体生産細胞系から抽出され、抗体をＲＳＶに結合させることに責任のあるマウス可変領域がクローン化ならびに配列決定され、マウス抗体ＣＤＲの識別をもたらした。次いで可変重鎖および軽鎖マウス抗体と最高の相同性を持つヒト可変重鎖および軽鎖フレームワーク配列が選択された。前記のようなヒトフレームワーク配列はマウス誘導ＣＤＲを最良に受け入れるものである。
マウス可変重鎖は各種のヒト生殖系列遺伝子と比較され、最高の相同性はヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３との比較であった。２個の配列は全体で６２％相同であり、フレームワーク領域では６５％相同であった。重要なことにＦＲ２の５′末端を除き、ＣＤＲ分節および構造物の結合部で十分な相同性が存在する。マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは次いで可変重鎖ヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３に置換された。マウスおよびヒト配列ならびにこの２個の潜在的ＣＤＲ移植組合せが図１で示される。
ＶL領域に関する類似の分析はヒト生殖系列Ｖ−Ｋａｐｐａ遺伝子Ｋ１０２に対する高い相同性を明らかにした。これらの配列の平面線形は図２で示される。この場合相同性は全体で６２％であり、フレームワーク領域では７３％であった。マウス誘導可変軽鎖ＣＤＲは次いでヒト生殖系列遺伝子Ｋ１０２のヒト可変軽鎖に置換された。それぞれの場合においてマウス配列と同一であるヒトＪ領域が選択できる。
もう一つの実施例において、マウス１１２９可変重鎖が各種のヒト可変領域アミノ酸配列と比較され、最高の相同性はヒト転位ＣＤＲ配列と比較したものであった。２個のアミノ酸配列は全体で７５％相同であり、フレームワーク領域では８０％であった。重要なことに、ＣＤＲ分節およびフレームワークの結合部で十分な相同性が存在する。マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは次いで可変重鎖ヒトＣＤＲ  ＶH配列に置換された。マウスおよびヒト配列ならびにこの２個の潜在的ＣＤＲ移植組合せが図１で示される。
ＶL領域に関する類似の分析はヒト生殖系列Ｋ１０２に対する高い相同性を明らかにした。これらの配列のアラインメントが図８で示される。この場合相同性は全体で７３％であり、フレームワーク領域では８２％であった。マウス誘導可変軽鎖ＣＤＲは次いでヒト生殖系列Ｋ１０２のヒト可変軽鎖に置換された。この場合マウス配列と類似するヒトＪ領域、ヒトＪＫ４が選択された。
従ってヒト抗体は発現され、遺伝子操作が抗体の結合特性を徹底的に変更しなかったことを確実とするために親マウス抗体と関連して特徴付けられる。
出願人はここで実施例を提示し、それは請求されるべきこの発明を詳細に説明するものであるが、この発明を限定するものではない。
実施例  １．
抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体１３０８ＦのｃＤＮＡクローニングおよび配列化
標的抗体のＶHおよびＶLのｃＤＮＡコピーは下記の通り生成された。第１鎖ｃＤＮＡ反応は、ＡＭＶ逆転写酵素と、特定重鎖あるいは軽鎖イソタイプの定常領域をコード化するｍＲＮＡのセグメントに相補的なリン酸化オリゴヌクレオチドプライマーとを用いて行われた。１３０８Ｆにとってはイソタイプはｇａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａであり、特異的オリゴヌクレオチドはマウスｇａｍｍａｌ遺伝子のＣＨ１領域のコドン１２９−１３７に相補的である5’AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC（配列番号１）であり、またマウスＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子のコドン１１６−１２２に相補的である5’TGGATGGTGGGAAGATG（配列番号２）であった。このプライマーは可変領域に隣接するｍＲＮＡのセグメントにアニール化する。第２鎖ｃＤＮＡ合成はガブラーおよびホフマンにより記述されたように（遺伝子、２５巻、２６３ページ、１９８３年）、リボヌクレアーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行われ、次いで平滑末端が生産されることを確かにするためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより行われた。
0003896160.tif 000002
ｄｓ−ｃＤＮＡはｐＵＣ１８に連結され、後者は制限エンドヌクレアーゼで消化されアルカリ性ホスファターゼで処理された。連結は大腸菌ＤＨ５ａをハナハンの方法により形質転換するために使用された（分子生物学ジャーナル、１６６巻、５５７ページ、１９８３年）。第１鎖ｃＤＮＡプライマーおよびＶ領域の間に置かれているＣ領域配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、望ましいｃＤＮＡセグメントを運ぶ形質転換細胞を確認するためのコロニーハイブリッド形成で使用された。特異的プローブ配列はそれぞれマウスＣＨ１領域のコドン１２１−１２５に相補的であるGGCCAGTGGATAGAC（配列番号３）およびＣ−Ｋａｐｐａのコドン１１０−１１５に相補的であるTACAGTTGGTGCAGCA（配列番号４）であった。ハイブリッド形成にポジティブであるコロニーから分離された候補プラスミドは、ｃＤＮＡ挿入断片を放出する制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化により分析された。４００−５００塩基対の挿入断片をもつこれらのものがＤＮＡ配列化を受けた。
ｃＤＮＡ挿入断片は両方の鎖についてのＤＮＡ配列の決定のためにＭ１３  ｍｐ１８およびｍｐ１９に挿入された。生成組換えバクテリオファージからの一本鎖ＤＮＡは分離され、ジデオキシ鎖終結法により配列化された（全米科学アカデミー紀要、７４巻、５４６３ページ、１９７７年）。
１３０８抗体に存在したものを代表する１３０８Ｆハイブリドーマから分離された、転位され体細胞突然変異されたＶ遺伝子ｃＤＮＡの対を確認するために、一本鎖Ｆｖ遺伝子が生成され、哺乳類細胞で発現され、それから分泌され、次いでＲＳウイルスへの結合を検定された。競合結合実験が次いで結合部位の確認を示すために使用された。
実施例  ２
ヒト１３０８Ｆ  ＶHおよびＶLのデザインおよびアセンブリ
ＶHおよびＶLのＣＤＲ領域は、カバット（３８）に記述された通りアミノ酸配列を既知の配列と比較することで確認された。抗原結合部位の構造を保持するコンフォメーションでマウス誘導ＣＤＲ配列を最良に受け入れられるヒトフレームワーク配列を選択するために、下記の戦略が採用された。まず、マウスＶHおよびＶL領域が、配列操作プログラムのウイスコンシンパッケージ中のワードサーチプログラムを用いてジェンバンクおよびＮＢＲＦタンパク質データバンク双方からの既知のヒト配列と比較される（核酸研究、１２巻、３８７ページ）。いくつかの最良のヒトＶ領域が次いでフレームワーク領域、とりわけフレームワークおよびＣＤＲ領域の接合部で類似性を基礎にして更に分析された（図１および２参照）。
それぞれのヒトＶ領域のリーダー配列と共にＣＤＲ移植ＶH領域が長さ１００−１３７ヌクレオチドにわたる４個のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いて新たに合成された（図３参照）。オリゴヌクレオチドはまず対状組合せでアニール化を許され、ＤＮＡポリメラーゼを用いて拡張され、オーバーラッピング領域を持つ約２００塩基対ｄｓ  ＤＮＡ断片を生成した。断片は次いで混合され、一つの断片の３′末端および他の断片の５′末端でプライマーを使用するＰＣＲを受けた。これらの条件下で形成され得る唯一の生成物は全長ＶHセグメントである。特異的プライマー配列は図３で下線を付されている。エンドヌクレアーゼＳａｃＩは、それをヒト定常領域遺伝子分節に結合させるために、ＶH配列の３′末端に含まれていた。
ＣＤＲ移植ＶL領域は類似の方法で合成された（図４参照）。この場合、もとの２００塩基対断片は別個に増幅され別個のプラスミドに挿入された。アミノ末端をコード化する断片はＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＵＣ１８誘導体にクローンされ、一方カルボキシル末端をコード化する断片はＳｍａＩとしてＨｉｎｄＩＩＩ断片にクローンされた。断片は次いでＳｍａＩ部位を経て接合部で組合された。オリゴヌクレオチドは図４で示される。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、それをヒトＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子と連結するために遺伝子分節の３′末端近くに含まれた。
実施例  ３
１３０８Ｆ発現のためのベクター構築
ヒト化ＶHを表すＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片がヒトｃ−Ｇａｍｍａｌ  ｃＤＮＡを表すＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片に結合されｐＳ１８に挿入された（ｐＳ１８はＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間のポリリンカー領域に合体したものである）。ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片上のヒト化１３０８Ｆ−ｇａｍｍａｌ遺伝子は、次いでポリＡ追加部位を運ぶｐＳＪ３７から得たＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片およびＳＶ４０複製起点を含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶから得たＰｖｕＩ−ＳａｃＩ断片、ｄｈｆｒ遺伝子およびＣＭＶ即時型初期プロモーターと組合される。生成するプラスミドはｐＳＪ６０と名付けられた。
ヒト化ＶLを表すＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐＳ１８のヒト化ｃ−Ｋａｐｐａ  ｃＤＮＡを表すＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片と結合された。ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片のヒト化１３０８Ｆ−Ｋａｐｐａ遺伝子は次いでポリＡ追加部位を運ぶｐＳＪ３７から得たＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片およびＳＶ４０複製起点を含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶから得たＰｖｕＩ−ＳａｌＩ断片、ｄｈｆｒ遺伝子およびＣＭＶ即時型初期プロモーターと組合された。生成するプラスミドはｐＳＪ６１と名付けられた。
最後にｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１は軽鎖および重鎖ならびに発現シグナルを含む単一プラスミドに組合された。これは軽鎖を運ぶｐＳＪ６１から得たＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ断片を長鎖を運ぶｐＳＪ６０から得たＰｖｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を用いて分離し、ｐＳＪ６６を生成することで達成された（図５参照）。
実施例  ４
ｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１を用いるＣＯＳ  ｌ細胞の形質移入
形質移入は下記の修飾を伴うマッカッチャンおよびパガーノの方法に従って行われた（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）。ＣＯＳ  １細胞（ＡＴＣＣ．ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ＢＲＬ＃３２０−５０３０）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）内で組織培養フラスコ７５ｃｍ2のＣＯ2、５％加湿培養器で維持され、細胞が密集に到達した時の１：２０の分割比で通過させられた。形質移入の４８時間前に５個の１００ｍｍ組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０6細胞で接種された。形質導入当日、プラスミドｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１各１２０ｕｇが組合され、エタノール沈殿され、トリス緩衝食塩水２．５ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＬＥＭ、１０ｍｌに滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ  １細胞から除去され、細胞は一度ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）で洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）で補充されたＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、そして培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞は１回Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。細胞は３分間１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌを加えたＤ−ＰＢＳで室温で衝撃を与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられた。プレートは培養器に戻された。
形質移入の３日後、培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞は収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ／ニューセラム１０％、４０ｍｌおよび２個がＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ、４０ｍｌの４個の１５０ｃｍ2組織培養フラスコ内で接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして全体で１２５ｕｇのヒト化１３０８抗体がＦＢＳを補充した培地３１０ｍｌで蓄積されニューセラムで補充された培地２４０ｍｌで８５ｕｇが蓄積された。
実施例  ５
ｐＳＪ６６を用いるＣＯＳ  １細胞の形質移入
形質移入４８時間前、５個の組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０6細胞で接種された。形質導入当日、ｐＳＪ６６プラスミド１２５ｕｇでエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ  １細胞から除去され、細胞はダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で１度洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）を補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状に加えられ、プレートはＤＮＡを混合するため渦動され、それから培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで１度洗浄された。細胞は３分間Ｄ−ＰＢＳにジメチルスルホキシド１０％（ＤＭＳＯ）を加え室温で衝撃を与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられプレートは培養器に戻された。
形質導入３日後培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞が収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ、ニューセラム１０％の４０ｍｌ、２個がＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭの４０ｍｌの４個の５０ｃｍ2織培養フラスコに接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして合体で１９０ｕｇのヒト化１３０８Ｆ抗体がＦＢＳで補充された培地３１０ｍｌで蓄積されまたニューセラムで補充されまた培地２４０ｍｌに１２０ｕｇが蓄積された。
ＣＯＳ  １細胞から培地に分泌されたヒト化１３０８Ｆ抗体の濃度は捕捉エリザを用いて決定された。９６ウエルプレート上に被覆されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃがヒト化抗体を捕捉するために使用された。クロモーゲン基質で開発されたペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒト全ＩｇＧが次いで結合抗体を検出するために使用された。精製ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ調製物が検定を目盛り化するために使用された。
実施例  ６
ヒト化１３０８Ｆを用いるＲＳＶの中和
方法：
ＲＳＶはＣＯＳ細胞上澄みからのヒト化１３０８Ｆあるいは精製マウスモノクローナル抗体のいずれかで中和された。これはＲＳＶの５０プラーク形成単位を抗体の連続２倍希釈液で１時間３７℃で培養することにより行われた。２４ウエルパネルのＨｅｐ２細胞の密集単層が抗体処理ウイルス、未処理対照ウイルス、およびモック感染対照の１００μｌで感染された。１．５時間３７℃で加湿され、ＣＯ2５％で培養され、またＥＭＥＭ１．５ｍｌ、ＦＢＳ１％、およびメチルセルロース１％で上塗りされた。細胞は固められ４日目にグルタルアルデヒドおよびクリスタルバイオレットで染色された。プラークは三重ウエルで計数され中和パーセントとしてプロットされた。図６で示されるこの結果はウエル当り５乃至１０ｎｇでの精製マウス１３０８Ｆモノクローナル抗体およびヒト化１３０８Ｆモノクローナル抗体のいずれかがＲＳＶプラークを同じく５０％減少させた結果を示している。
実施例  ７
ＣＤＲ移植Ａ部位抗体１１２９の生成
ポリＡ＋ＲＮＡがオリゴ−ｄｔセルロースを用いて２×１０７マウス１１２９ハイブリドーマ細胞の溶菌液から精製された。第１鎖ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマープライマーを用いるｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇ、およびＡＭＶ逆転写酵素ｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇ、ｐＨ８．５のトリス塩酸５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2．８ｍＭ、ＫＣｌ、３０ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ｄＮＴＰ１ｍＭ、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤２５単位、ランダムヘキサマー３３ｕＭおよびＡＭＶ逆転写酵素１０単位から１時間４２℃で作られた。１１２９ＶＬ領域からのｃＤＮＡはオリゴヌクレオチドＳＪ４１およびＳＳ１１を用いるＰＣＲで増幅された。表１を参照されたい。１１２９ＶＨ領域からのｃＤＮＡは同様にオリゴヌクレオチドＳＪ４２およびＳＪ１０を用いて増幅された。表１を参照された。
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ＰＣＲ条件
第１鎖ｃＤＮＡ０．５ｕＬ、ｐＨ８．３トリス塩酸１０ｍＭ、ＫＣｌ、５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2、１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ゼラチン０．００１％、各プライマー１ｕＭ、ＤＮＡ鋳型１ｎｇおよびアンプリターク（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕ（パーキン・エルマー−シータス）。９４°１分、５５°２分、７２°２分パーキン・エルマー４８０サーモサイクラーで２５サイクル。生成するＤＮＡ断片は次いでフェノール／クロロホルム（１／１）で１回抽出され、ＥＴＯＨ２．５量で沈殿され、適切な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液で再懸濁され制限エンドヌクレアーゼで消化されてクローニングのために付着末端を生産した。生成断片は次いでアガロースゲル１％の電気泳動で分離された。臭化エチジウムでゲルを染色した後、断片は除去されフェノールの存在下で凍結および抽出によりアガロースから精製された。
断片は次いで制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化されプラスミドｐＵＣ１８にクローンされた。挿入断片は次いで修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ、ユーエス・バイオケミカル）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖末端法により配列化された。
翻訳された配列はヒト抗体タンパク質配列と比較された。ＶＬはＫ１０２軽鎖ともっとも相同性があり、またＶＨはＣｏｒ  ＶＨ領域ともっとも相同性があることが発見された。１１２９Ｆｖ領域は１１２９ＶＬおよびＶＨ配列から結晶構造ＭＣＰＣ６０３抗体での対応する残基の座標への残基の置換によりモデル化された。残基は視覚的なモデルの検査で折りたたみ構造あるいは溶媒接触に不可欠であるとして確認された。
マウスおよびヒト配列で不可欠でありなおかつ異なっているいくつかの残基は、Ｆｖの完全性を維持し、従って結合部位を維持するために、マウス残基として残された。この残基はＶＨ領域では３１、８３、１１３および１１６であり、ＶＬ領域では４７であった。生成配列は図７および８で示される。
設計されたヒト１１２９ＶＨはＰＣＲを用いて結合される合成オリゴヌクレオチドＳＪ１４７−ＳＪ１５３（図９）を用いて構築された。このＰＣＲの生成物は次いでＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化され、ｐＵＣ１８誘導体であるプラスミドベクターｐＳＪ４０にクローンされ、ここでは一つのフレームがＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として挿入される場合フレーム外１ａｃＺ１セグメントがフレーム内Ｖ領域セグメントに一つの融合としてフレーム内に戻される。５個の突然変異が単一５０塩基対領域に群がる挿入断片を含むプラスミドが次いでＰＣＲおよびプライマーＳＪ１６８およびＳＪ１６９を用いてこれらの変化の修復を受けた。表１参照。
ＶＬはヒト１３０８Ｆ軽鎖遺伝子の部位指向突然変異誘発により生成された。オリゴヌクレオチド、表１参照（ＣＤＲ１）およびＳＪ１５７（ＣＤＲ３）はＨ１３０８Ｌ遺伝子を別個に突然変異を起こさせるために使用された。突然変異誘発は大腸菌株ＢＷ３１３（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）で生成される。一本鎖ＤＮＡ鋳型を含むウラシル上のＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用し、続いて大腸菌株ＤＨ５（ｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋）に形質転換されることで行われた。２個の突然変異体は結合され、ＣＤＲ２はオリゴヌクレオチドＳＪ１７０、ＳＪ１５４、表１参照、（５′末端）およびＳＪ１７１、ＳＪ５３、表１参照、（３′末端）を用いる組換えＰＣＲにより導入された。ＣＤＲ移植ＶＨおよびＶＬはプラスミドｐＳＪ８１およびｐＳＪ１０５で生成するＨ１３０８ＦＶ領域セグメントにとって代るＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として、それぞれｐＳＪ６０（実施例３参照）およびｐＳＪ６１（実施例３参照）に置かれた。加えてマウスＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡ分節は、発現ベクターｐＳＪ７５およびｐＳＪ８４を生成するためにそれぞれ同様にヒトＣ−ＧａｍｍａｌおよびＣ−Ｋａｐｐａに接続された。
実施例  ８
ＨＵ１１２９一過性発現
ＣＯＳ  １細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清１０％（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ジブコ＃３２０−５０３０）で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）で７５ｃｍ2組織培養フラスコの加湿ＣＯ2５％培養器で維持され、密集到達直前に１：２０の分割比で通過された。
形質移入は以下の修正を加えたマッカッチャンおよびパガーノの方法（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）に従って行われた。形質移入の２４時間前に、１００ｍｍ組織培養皿（コーニング＃２５０２０）はＤＭＥＭ１４ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭで皿当り２×１０6ＣＯＳ  １細胞で播種された。形質導入当日、実施例７からのＨｕ１１２９重鎖プラスミド（ｐＳＪ８１）１０ｕｇが実施例７からのＨｕ１１２９Ｋａｐｐａ軽鎖プラスミドｐＳＪ１０５の１０ｕｇと組合され、ＤＮＡはエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地はＣＯＳ１細胞皿から除去され、細胞単層は１回ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）１０ｍｌで洗浄され、またニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）およびＬ−グルタミン２ｍＭを補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状で加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、培養器に戻された。ＤＮＡ吸着期間８時間後にプレートが培養器から除去され、上澄みがプレートから吸引された。細胞はプレート当りＤ−ＰＢＳ内でＤＭＳＯ、１０％の５ｍｌの追加で３分室温で衝撃を加えられ、その後ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞は１度Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ１５ｍｌ、ニューセラム１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（生産培地）が各プレートに加えられ、プレート培養器に戻された。
形質移入７２時間後馴化培地がプレートから収穫され−２０℃で貯蔵され、生産培地１５ｍｌがプレートに加えられプレートは培養器に戻された。９６時間後配置がプレートから収集され−２０℃で貯蔵された。
実施例  ９
Ｈｕ１１２９の定量化
ＣＯＳ  １細胞により培地に分泌されたＨｕ１１２９の定量化はサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を用いて行われた。要約すると、ナンク・マクシソープ・イムノプレート（ナンク＃４３９４５４）が室温で３時間ｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム０．１Ｍ内でヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（カッペル＃５５０７１）０．５ｕｇ／ｍｌの５０ｕｌ／ウエルで被覆された。ウエルは３回ｐＨ７．４リン酸ナトリウム０．０１Ｍ、ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、トウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）０．１％で洗浄された。プレートへの非特異的タンパク質結合は室温で３０分ＰＢＳ内の脱脂粉乳３％（Ｗ／Ｖ）の２００ｕｌ／ウエルの処理で遮断された。精製ヒトＩｇＧ１  Ｋａｐｐａ標準（シグマ＃１−３８８９）はＰＢＳ−Ｔ内１００ｎｇ／ｍｌで作られ１：２から１．５６ｎｇ／ｍｌまで連続的に希釈され、各５０ｕｌが検定プレートの二重ウエルに加えられた。ＣＯＳ  １細胞上澄みはＰＢＳ−Ｔで希釈され、二重の５０ｕｌサンプルがプレートに加えられた。室温培養で１時間後、ウエルは空にされ３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄された。結合Ｈｕ１１２９抗体の存在を検出するために、ホースラディッシュ共役親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（全分子、カッペル＃３６０１−００８１）がＰＢＳ−Ｔ内で１：１０００で希釈され、５０ｕｌがこの検定プレートの各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。プレートは３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄され、クロモーゲン基質ＴＭブルー（ＴＳＩ＃ＴＭ１０２）１００ｕｌが各ウエルに加えられた。プレートは室温で１０分暗くして培養されＨ2ＳＯ4、４．５Ｍのウエル当り５０ｕｌの追加で反応が停止された。プレートはモレキュラー・デバイシズ・ヴイマックス・マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読みとられ、データ分析はソフトマックス・ソフトウエア（モレキュラー・デバイス）を用いてＩＢＭ  Ｐ／Ｓモデル８０コンピューターを実行させて達成された。
生産の最初の７２時間の間に、ＣＯＳ  １細胞はＨｕ１１２９、０．０６ｎｇ／ｍｌ、全体で０．９ｕｇを生産した。次の９６時間の生産でＣＯＳ  １細胞はＨｕ１１２９、０．９９ｕｇ／ｍｌ、全体で１４．８５ｕｇを生産した。
実施例  １０
Ｈｕ１１２９結合検定
Ｈｕ１１２９の結合検定は捕捉ＥＬＩＳＡで、基本的には以下の変更を加えた定量化ＥＬＩＳＡに関して達成された。プレートは０．５ｕｇ／ウエルでＭｕ１３３１抗体を使って被覆され、ウエルはＰＢＳ−Ｔ内で脱脂乳３％で遮断され、ＲＳＶ感染ＨＥＰ２細胞溶菌液が各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。検定の残りは希釈サンプルをウエルに追加することで開始する定量化検定に関して行われた。結果はＯＤ対抗体濃度の二重の交互プロットとして分析され、これから０．７ｎＭのＨ１１２９分子に対する目掛け上のＫｄがＭ１１２９ＨｕＧａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａ抗体の１０ｎＭと比較して決定された。
Ｈ１１２９およびｃｈ１１２９抗体についてのＲＳＶ中和検定が下記の手順に従って実施された：
１．覆いのある９６ウエル・コスター細胞培養プレートの包装を解く。
２．成長培地（ＧＭ）を３７℃にあたためる。
３．ＭＡ１０４細胞を３７℃で解凍する。ＧＭを用いてｍＬ当り〜１５０，０００細胞まで希釈する。細胞を混合しウエル当り２００μｌに調合する。
４．細胞を３７℃、ＣＯ2５％で培養し、感染前一晩加湿する。
５．ＲＳＶ株を維持液（ＭＭ）でｍＬ当り１０，０００ｐｆｕまで希釈する。
６．ＭＭで希釈した抗体の等量を希釈ＲＳＶの等量と混合する。３７℃、ＣＯ2５％で培養し、感染前１時間加湿する。
７．ＭＡ１０４細胞のレプリケートウエルを抗体およびウイルス混合物２００μｌで感染させる。レプリケートウエルをウイルスおよびモック感染対照で感染させる。
８．プレートをセロハンで包み３７℃、湿度９５％、およびＣＯ2、５％で５日培養する。
９．ＲＳＶのためのＥＬＩＳＡ：各ウエルを吸引し、アセトン／ＰＢＳ８０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）１００μｌを加え室温で３０分培養する。
１０．各ウエルを吸引し薄層フローフッドのグリルで３０分空気乾燥する。
１１．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１２．各ウエルでＲＳＶ  Ｆタンパク質にモノクローナル抗体１００μｌを加える。３７℃で１時間培養する。
１３．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１４．抗マウス抗体ヤギ血清ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体１００μｌを各ウエルに加える。３７℃で１時間培養する。
１５．ＢＰＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１６．新鮮に調製されたＡＢＴＳおよび過酸化物１：１混合物１００μｌを各ウエルに加える。ウイルス対照の不透明度（４０５ｎｍ）がモック感染対照のそれの５乃至１０倍になるまで室温で培養する。
付録：
成長培地（ＧＭ）：最小必須培地（イーグル）およびアールＢＳＳ、
グルタミン２ｍＭ
イーグル可欠アミノ酸、最終０．１ｍＭ、
胎仔ウシ血清１０％（ｖ／ｖ）、
ペニシリン５０単位／ｍｌ、
ストレプトマイシン５０ｍｃｇ／ｍｌ、
維持液（ＭＭ）：血清を１乃至２％に減少させた前記のもの。
ＭＡ１０４細胞株は成長培地を用いてＴ１５０フラスコ内で成長する。株はＤＭＳＯ、１０％および成長培地内で１．８ｍＬガラス瓶当り３×１０6細胞で凍結される。ＬＮ２冷蔵庫で貯蔵される。
ＲＳＶ株：はＴ１５０フラスコのＭＡ１０４（サル腎臓）あるいはＨｅｐ２細胞内で成長する。密集Ｔ１５０当り〜０．２ｍｌ（〜１００，０００ｐｆｕ）ウイルス株を加える。室温で１時間吸着。次いで胎仔ウシ血清１％を加えた維持液２０ｍＬを加える。３７℃で４−５日培養する。１００％ｃｐｅの直前に削り落しで細胞を収集する。細胞を回転で落し、上澄み１０ｍＬのほかはみな除去する。細胞ペレットを凍結（ドライアイス−エタノール浴）解凍し、渦動させ、再凍結しウイルス株をＬＮ２冷蔵庫で貯蔵する。
ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液：ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ヤギ血清２．０％（Ｖ／Ｖ）およびゼラチン０．５％（Ｗ／Ｖ）
ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００まで希釈されたケミコンＭａｂ８５８−１抗ＲＳＶ融合タンパク質。
抗マウス血清：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖特異性）に共役されたフィッシャーホースラディッシュペルオキシダーゼ。
結果は図１０で示され、２５ｎｇ／ｍｌがこの検定で中和５０％を達成し、一方ｃｈ１１２９抗体４５ｕｇ／ｍｌがこの実験で中和５０％のために必要とさたことを示している。一連の６個の異なる検定にわたって、Ｈ１１２９の５０％中和の平均値は１７ｎｇ／ｍｌであった。対照として、また効能を比較するために、われわれはまたＲＳＶに対する高い中和力価を持つ個別のプラスマから作られたポリクローナルヒトＩｇＧ調製品を検定した。このＲＳＶｉｇと名付けられた調製品は３個の実験にわたり２．３ｕｇ／ｍｌの５０％中和平均値を提供した。かくしてＨ１１２９はこの実験で強化ポリクローナル調製品に比べて１００倍大きい効能を持っている。
実施例  １１
ＢｌＡｃｏｒｅＴＭによるヒト化ＲＳＶ  Ｍａｂｓのカイネティクス分析
ヒト化ＲＳＶ  ＭａｂおよびＲＳＶ  Ｆタンパク質の間の相互作用のカイネティクスがファルマシアＢｌＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサーを用いる表面プラスモン共鳴により研究された。Ｃ末端切形Ｆタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスはカイネティクス研究のための豊富な抗原の源を提供した。分泌Ｆタンパク質を含む上澄みはコンカナバリンＡおよびＱセファロースカラム上での連続クロマトグラフィーにより約２０倍増強された。プールされた画分はクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１０ｍＭに対して透析され、約０．１ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。Ｆタンパク質（１００ｍｌ）のアリコートがＢｌＡコアセンサーチップに対してアミン結合された。固定された量はＨ１１２９あるいはＨ１３０８Ｆのいずれかで飽和された時にシグナルの約２０００応答単位（Ｒｍａｘ）を与えた。これは、結合手順に続きＦタンパク質調製物に等数の「Ａ」および「Ｃ」抗原部位が存在することを示していた。２個の無関係の関連性のないＭａｂｓ（ＲＶＦＶ  ４Ｄ４およびＣＭＶ  Ｈ７５８）は固定されたＦタンパク質とは何らの相互作用を示さなかった。典型的なカイネティクス研究は、トウィーン２０、０．０５％を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ／トウィーン）内での異なった濃度（２５−３００ｎＭ）でＭａｂ３５ｍｌを注射することを含んでいた。フローレートは５ｍｌ／分を維持し７分結合相を提供した。Ｍａｂの注射に続き、フローは解離比率を決定するために３０分でＰＢＳ／トウィーン緩衝液を交換された。センサーチップは塩酸１０ｍＭの２分パルスを持つサイクルの間で再生された。再生段階は固定Ｆタンパク質の結合能力に最少損失（サイクル当り４％の損失）を生じた。この小さな減少は結合および解離のための比率定数の計算値を変更しなかった。
Ｆタンパク質に結合するための各種Ｍａｂｓの親和性は解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のための第１オーダー率定数の結合のための第２オーダー率定数に対する割合（Ｋｄ＝Ｋｄｉｓｓ／Ｋａｓｓｏｃ）から計算された。Ｋａｓｓｏｃ後は下記の率方程式に基づいて計算された。
（１）dR/dt=Kassoc[Mab]Rmax-(Kassoc[Mab]+Kdiss)R
ここでＲおよびＲｍａｘはそれぞれ時間ｔおよび無限大での応答単位である。Ｒの関数としてのｄｒ／ｄｔのプロットは（Ｋａｓｓｏｃ［Ｍａｂ］＋Ｋｄｉｓｓ）−のスロープを提供する。これらのスロープは［Ｍａｂ］と線形で関連しているため、Ｋａｓｓｏｃ値はスロープ対［Ｍａｂ］と線形で関連しているため、Ｋａｓｓｏｃ値はスロープ対［Ｍａｂ］の再プロットから誘導することができる。新しい線のスロープはＫａｓｓｏｃと等しい。Ｋｄｉｓｓ値はＹインターセプトから外挿することができるが、より正確な値はＫｄｉｓｓの直接測定で決定された。Ｍａｂの注入相に続き、ＰＢＳ／トウィーン緩衝液はセンサーチップを横切って流れる。この点から［Ｍａｂ］＝０となる。方程式（１）はかくして
（２）dr/dt=KdissあるいはdR/R=Kdissdt
に還元される。方程式（２）の積分は
（３）１ｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）＝Ｋｄｉｓｓｔ
となり、ここで（Ｒｏ／Ｒｔ）はそれぞれ時間ゼロ（解離相の開始）および時間ｔでの応答単位である。最後にｔの関数としてのＩｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）はＫｄｉｓｓのスロープを提供する。
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実施例  １２
ヒト化Ｍａｂを用いるコットンラットの生体内保護
Ｈ１１２９およびＨ１３０８Ｆは筋肉内投与された際にコットンラットの肺組織内で感染を減少する能力をそれぞれ検査された。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス、グループ当り４動物、平均重量１００グラム）がメトキシフルレンで麻酔され、筋肉内注射により抗体溶液１．０ｍｌを与えられた（その結果それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１．６７ｍｇ／ｋｇおよび０．５６ｍｇ／ｋｇの用量を生じた）。対照動物はウシ血清アルブミンを注射された。１日後動物は再び麻酔され、ＲＳＶのロング菌株、１０5.0プラーク形成単位（ＰＦＵ）の鼻腔内点滴により攻撃（免疫性をテスト）された。ウイルス攻撃の４日後、すべての動物は二酸化炭素窒息により犠牲となった。肺が収穫されハンクス平衡食塩水１０部（ｗｔ／ｖｏｌ）で均質化された。生成懸濁液がウイルス量をプラーク検定により定量化された。
以下に示されるこれら実験の結果は、Ｈ１１２９およびＨ１３０８ＦがＲＳＶ攻撃１日前に注射されると、コットンラットの肺でのウイルス力価を減少するのに有効であることを示している。
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引用文献
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１６．モリソン、エス．エル．、サイエンス、２２９巻：１２０２ページ、１９８５年。
１７．サヘーガン、ビー．ジー．、ドライ、エイチ．、ザルツガーバー−ミュラー、ジェイ．、他、免疫学ジャーナル、１３７巻：１０６６ページ、１９８６年。
１８．タケダ、エス．、ナイトウ、ティー．、ハマ、ケイ．、ノマ、ティー．、ホンジョウ、ティー．、ネイチャー、３１４巻：４５２ページ、１９８５年。
１９．カーソン、ディー．エイ．、フライマーク、ビー．ディー．、先端免疫学、３８巻：２７５ページ、１９８６年。
２０．ビーラー、ジェイ．エイ．、他、ウイルス学ジャーナル、６３巻：２９４１−２９５０ページ、１９８９年。
２１．ケーリン、他、ウイルス学、１４３巻：５６９−５８２ページ、１９８５年。
配列表
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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