(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の１００７ｎｔと１００８ｎｔの間を第１切断部位、１１８９ｎｔと１１９０ｎｔの間を第２切断部位、１２２８ｎｔと１２２９ｎｔの間を第３切断部位及び１３２６ｎｔと１３２７ｎｔの間を第４切断部位とした場合、これら４箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅し、制限酵素Alu Iで消化し、その切断パターンに基づき、第２及び第４切断部位で切断されるＡ１型、第２、第３及び第４切断部位で切断されるＡ２型、第１、第２及び第４切断部位で切断されるＡ３型並びに第１、第２、第３及び第４切断部位で切断されるＡ４型に分類することから成る、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法であって、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号１に示す塩基配列の第１番目のヌクレオチドを基準として表したものである、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法。
【請求項２】
ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の９５８ｎｔ〜１３７６ｎｔの領域を含み、その5'末端が５６８ｎｔよりも下流でその3'末端が１４４４ｎｔよりも上流にある核酸断片であって、その5'末端から１００７ｎｔまでの距離と１３２７ｎｔから3'末端までの距離が１０ｂｐ以上異なる核酸断片を増幅し、増幅断片を制限酵素Alu Iで消化し、電気泳動によりその切断パターンを調べることから成り、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号１に示す塩基配列の第１番目のヌクレオチドを基準として表したものである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・パイロリは胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の原因菌として知られ、さらに最近、ヘリコバクター・パイロリが胃癌の発生にも深く関わっていることがわかってきた。
【０００３】
ヘリコバクター・パイロリの遺伝子型は複数存在することが知られており、従来より、ＰＣＲによりヘリコバクター・パイロリの遺伝子断片を増幅し、その増幅断片を制限酵素で消化してその切断パターンを調べる方法(PCR-RFLP)により、ヘリコバクター・パイロリの型分類が行なわれている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のPCR-RFLPによる型分類方法は、疾患との関連性がなく、臨床上は意味のないものであった。
【０００５】
従って、本発明の目的は、胃癌や、萎縮性胃炎を引き起こすか否かを予測することに役立つ、ヘリコバクター・パイロリの新規な型分類方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子中の特定の領域を含む核酸断片を増幅し、Alu I で消化してその切断パターンにより型分類を行なうと、特定の型のものしか胃癌や萎縮性胃炎にならないことを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の１００７ｎｔと１００８ｎｔの間を第１切断部位、１１８９ｎｔと１１９０ｎｔの間を第２切断部位、１２２８ｎｔと１２２９ｎｔの間を第３切断部位及び１３２６ｎｔと１３２７ｎｔの間を第４切断部位とした場合、これら４箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅し、制限酵素Alu Iで消化し、その切断パターンに基づき、第２及び第４切断部位で切断されるＡ１型、第２、第３及び第４切断部位で切断されるＡ２型、第１、第２及び第４切断部位で切断されるＡ３型並びに第１、第２、第３及び第４切断部位で切断されるＡ４型に分類することから成る、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法であって、ここで、上記したヌクレオチドの位置は、配列番号１に示す塩基配列の第１番目のヌクレオチドを基準として表したものである、ヘリコバクター・パイロリの型分類方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、先ず、上記４箇所の切断部位を含む核酸断片を増幅する。なお、切断断片の検出を容易にするため、核酸断片中の第１切断部位の上流及び第４切断部位の下流がそれぞれ５０ｂｐ以上であることが好ましい。すなわち、ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の９５８ｎｔ〜１３７６ｎｔの領域を含む核酸断片を増幅することが好ましい。vacA遺伝子の塩基配列は公知であり、標準的なvacA遺伝子の塩基配列を図１（ただし、１ｎｔ〜２５００ｎｔ）及び配列表の配列番号１に示す。なお、９５８ｎｔとは、図１に示すvacA遺伝子の塩基配列の5'末端から第９５８番目のヌクレオチドという意味であり、同様に、１３７６ｎｔは、図１に示すvacA遺伝子の塩基配列の5'末端から第１３７６番目のヌクレオチドという意味である( 以下、同様に表記する) 。５６８ｎｔと５６９ｎｔの間にAlu I 切断部位が存在するので、核酸断片の5'末端は５６８ｎｔよりも下流にあることが好ましく、また、１４４３ｎｔと１４４４ｎｔの間にもAlu I 切断部位が存在するので、核酸断片の3'末端は１４４４ｎｔよりも上流にあることが好ましい。なお、核酸断片の5'末端が５６９ｎｔより上流であっても、5'末端から５６８ｎｔまでの断片が判定に影響のないサイズのものであるならば、核酸断片の5'末端が５６９ｎｔよりも上流であっても構わない。同様に、核酸断片の3'末端が１４４３ｎｔより下流であっても、１４４４ｎｔから3'末端までの断片が判定に影響のないサイズのものであるならば、核酸断片の3'末端が１４４３ｎｔよりも下流であっても構わない。なお、切断パターンを明瞭に区別するために、増幅する核酸断片は、その5'末端から１００７ｎｔまでの距離（5'末端が５６９ｎｔよりも上流にある場合には５６９ｎｔから１００７ｎｔまでの距離、すなわち４３９ｂｐ）と１３２７ｎｔから3'末端までの距離（3'末端が１４４３ｎｔよりも下流にある場合には１３２７ｎｔから１４４３ｎｔまでの距離、すなわち、１１７ｂｐ）が好ましくは１０ｂｐ以上、さらに好ましくは３０ｂｐ以上異なる。同様の理由により、他の各核酸断片のサイズもそれ自身以外の核酸断片と１０ｂｐ以上異なることが好ましいが、例えば下記実施例に示す場合のように、２つの核酸断片の大きさにほとんど差のない場合（下記実施例では９８ｂｐと１０１ｂｐの核酸断片が現れる）であっても、型分類に支障を生じない場合には問題はない。
【０００９】
核酸断片を増幅する方法はこの分野において周知であり、代表的な方法としてＰＣＲを挙げることができる。ＰＣＲを行なうための試薬及び装置は市販されているので、それらを用いて容易に核酸を増幅することができる。なお、プライマーは、上記の条件を満たす核酸断片を増幅するように設定される。上記のようにヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の塩基配列は公知であるので、核酸増幅に用いるプライマーは容易に設定することができる。
【００１０】
本発明の方法では、上記した４箇所の切断部位における切断の有無により、ヘリコバクター・パイロリを４つの型に分類する。すなわち、下記表１に示すように分類する。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法により型分類すると、各型と、それが検出される臨床症状とは下記表２に示す関係を有する。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
表２に示されるように、本発明の方法により分類された型と、臨床症状との間には関連があるので、本発明の方法によって型を決定することにより、上記疾病の診断を行なうことができ、また、将来的に胃癌及び前癌状態と言われる萎縮性胃炎のような重大な疾患に発展する可能性を予測することができる。
【００１５】
Alu I 消化により、上記の各切断部位で切断されるか否かは、増幅した核酸断片をAlu I で消化し、それによって生じる切断断片のサイズを例えば電気泳動等により測定することにより容易に決定することができる。なお、各切断部位における切断の有無を調べることができる方法であれば、どのような方法でも採用することができ、電気泳動に限定されないことは言うまでもない。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
消化器疾患を有する患者５５名の胃液からヘリコバクター・パイロリを分離し、常法により培養した。ヘリコバクター・パイロリ培養陽性の培地から市販の核酸抽出試薬であるSepaGene( 三光純薬) を用いてＤＮＡ抽出を行なった。抽出ＤＮＡを５０μｌの緩衝液に溶解し、１０μｌをＰＣＲ反応系に用いた。ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲキット及びサーマルサイクラー( 商品名) を用いて、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分間のサイクルを３５回繰り返した。なお、プライマーセットはフォワード側がVA1-F (5' atggaaatacaacaaacaca 3', 797-816 nt)、リバース側がVA1-RR (5' ctccagaacccacacgatt 3', 1427-1409 nt)(Cover TL et al., JBC 269(14), 10566-10573 (1994))であった。なお、これらのプライマーがハイブリダイズする領域が図１中に四角で囲まれている。また、増幅領域中のAlu I 部位が図１中に黒塗りの下向き三角形により示されている。増幅産物１０μｌを常法に従いアガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射下で６３１ｂｐのバンドを確認した。更に、増幅産物１０μｌに反応用緩衝液１０μｌ及び制限酵素Alu I １０単位を加え、３７℃、６０分インキュベートを行なった。消化産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下でバンドを検出、検出バンドをパターンにより分類した。
【００１８】
なお、本実施例では、増幅断片が７９７ｎｔから１４２７ｎｔまでの６３１ｂｐの領域であるので、各型における切断断片サイズは下記表３に示す通りであり、また、その電気泳動パターンは図２に示すようになる。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
上記方法により、消化器疾患を有する患者５５名からのヘリコバクター・パイロリを分類したところ、遺伝子型と疾患との関係は下記表４に示す通りであった。
【００２１】
【表４】
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【００２２】
表４に示されるように、胃癌及び前癌状態といわれる萎縮性胃炎の症例はＡ２及びＡ４のみに分類された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、臨床症状と関連したヘリコバクター・パイロリの型分類方法が初めて提供された。本発明の方法により型分類を行なうと、将来的に胃癌及び萎縮性胃炎のような重大な疾患に発展する可能性を予測することができる。
【００２４】
【配列表】
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【００２６】
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【００２７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヘリコバクター・パイロリのvacA遺伝子の標準的な塩基配列並びに本発明における第１〜第４切断部位の位置及び本発明の実施例で用いたＰＣＲ用プライマーの位置を示す図である。
【図２】本発明の実施例において得られたAlu I 切断電気泳動パターンの模式図である。
【図１】
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【図２】
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