(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物を含んでなる、ヒト又は動物において細胞増殖を処理するための医薬。
【請求項２】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質を含んでなる、ヒト又は動物において細胞増殖を処理するための医薬。
【請求項３】
２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナールを含んでなる、ヒト又は動物において細胞増殖を処理するための医薬。
【請求項４】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物を含んでなる、ヒト又は動物において腫瘍を治療するための医薬。
【請求項５】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質を含んでなる、ヒト又は動物において腫瘍を治療するための医薬。
【請求項６】
２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナールを含んでなる、ヒト又は動物において腫瘍を治療するための医薬。
【請求項７】
前記ヒト又は動物が常用の抗癌剤によっても治療される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物を含んでなる、ヒト又は動物において細胞分化を促進するための医薬。
【請求項９】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質を含んでなる、ヒト又は動物において細胞分化を促進するための医薬。
【請求項１０】
前記の酸化が有機溶媒中で行なわれる、請求項１、２、４、５、８及び９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
前記酸化が固体状態の前記化合物に対しておこなわれる、請求項１、２、４、５、８及び９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１２】
前記化合物が、β−カロチン、リコピン又はカンタキサンチンである、請求項１、２、４、５、８及び９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記化合物がβ−カロチンである、請求項１、２、４、５、８及び９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
前記化合物がリコピンである、請求項１、２、４、５、８及び９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１５】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物、及び細胞増殖を処理するために当該混合物をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項１６】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質、及び細胞増殖を処理するために当該重合体物質をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項１７】
２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナール、及び細胞増殖を処理するために当該２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナールをヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項１８】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物、及び腫瘍を治療するために当該混合物をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項１９】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質、及び腫瘍を治療するために当該重合体物質をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項２０】
２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナール、及び腫瘍を治療するために当該２−メチル−６−オキソ−2,4−ヘプタジエナールをヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項２１】
常用の抗癌剤投与する旨の指示を更に含む、請求項15〜20のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される混合物を、及び細胞分化を促進するために当該混合物をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項２３】
β−カロチン、リコピン、カンタキサンチン及びレチノイン酸からなる群から選択されるカロチノイド化合物の分子当り６〜８分子の酸素が反応するようにカロチノイド化合物を酸素により酸化することにより生成される重合体物質、及び細胞分化を促進するために当該重合体物質をヒト又は動物に投与する旨の指示書を含んでなるキット。
【請求項２４】
前記化合物が、β−カロチン、リコピン又はカンタキサンチンである、請求項15、16、18、19、22及び23のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記化合物がβ−カロチンである、請求項15、16、18、19、22及び23のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記化合物がリコピンである、請求項15、16、18、19、22及び23のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、化学療法剤及び化学予防剤として有用な細胞分化誘発特性、細胞増殖抑制特性及び抗ガン性を有する酸化されたカロチノイド、レチノイド及び関連する接合されたポリエン及びその誘導体、そしてより特定的にはカロチノイド，レチノイド及び関連する接合されたポリエンの大規模な酸化及びそれに続く処理により得られるような誘導体に関する。
発明の背景
カロチノイド及びレチノイドは、大規模に接合されたポリエン鎖を含む、天然に発生する物質である。カロチノイドは、その数多くのさまざまなあでやかな色を生み出す炭素−炭素の２重結合の最も大規模に接合された系をもつ。天然に発生する物質である数多くのカロチノイド及びレチノイドは、生物学的に活性である。例えば、カロチノイドグループのいくつかの炭化水素メンバー（最も顕著なのは、食物中で最も豊富なカロチノイドの１つであるβ−カロチン又はプロビタミンＡ）は、レチノール（ビタミンＡの１つの形態）の供給源である；カロチノイドは、おそらくは一重項酸素を非活性化することにより、光感作された酸化的損傷から植物を保護する；疫学的証拠から、カロチノイドの摂取がいくつかのタイプのガンの発生と逆相関関係をもつことが示されている（Peto et al. Nature, 1981, 290, 201〜208）。カロチノイド及びレチノイドは、いくつかの実験的に誘発された動物の腫瘍の発達を遅延させることが立証されている（N. I. Krinsky、生物学系におけるカロチノイドの作用、Annu. Rev. Nutr. 13, 561〜587, （1998）；Matthews-Roth, Curr. Top. Nutr. Dis. 〔New Prot. Roles Select. Nutr. J, 1989, 22, 17〜38；Pure Appl. Chem., 1985, 57, 717〜722）；ガンの死亡率を有効に減少させることができる非毒性の食事性抗発ガン物質としての補足的β−カロチンの効能を見極めようとして数多くの食事性介入研究が実施されつつあり、最近では、β−カロチンが冠心臓疾患の発生率の減少と関連性をもちうるという可能性が検討され始めてきた；関係する化合物（レチノイド−レチノイン酸、レチノール及びレチンアミド）の使用に関する最近の臨床データは、治療上及び予防上の両方の作用物質としての抗ガン療法における役割を立証している（頭及び首の皮ふガン、肺ガン及び膀胱ガン、急性前骨髄細胞白血病、白斑症及び脊髄形成異常症候群；D. L. Hill及びC. J. Grubs、レチノイドとガン予防、Annu, Rev. Nutr, 1992, 12, 161〜1811；そして最後に、β−カロチンは、組織内に見られる低酸素圧力で抗酸化特性をもつ（Burton及びIngold，β−カロチン；珍らしいタイプの脂質抗酸化剤、Science, 1984, 224, 569〜573）。
カロチノイド、レチノイド及び関連する接合されたポリエンは、分子酸素（Ｏ2）に向かって反応性をもち、従って、低い温度でさえ貯蔵中の食物の中で酸化的に分解されうる。カロチノイドは、２重結合系がより大きくより大規模に接合されていることから、レチノイドに比べ酸素に対する反応性が高い。それでもカロチノイド、レチノイド及び関連する接合されたポリエンのこのような酸化的分解の生成物及びその潜在的な生理学的活性については、β−カロチンの生物学的酸化の生成物として得られるビタミンＡを除いて、驚くほどわずかな注意しか払われてこなかった。
Tetrahedron Letters, 1991, 32（33）， 4203〜4206の中で公開されたMordi et alのβ−カロチンの自動酸化の調査研究は、β−カロチンの自己開始自動酸化の間に形成された生成物について検討していた。この論文は、β−カロチンの自動酸化の早期段階で同定された主要生成物がエポキシド、β−イオノン、β−アポ−13−カロテノン、レチナール及び関連するカルボニル化合物であり、最終的混合物の中で短鎖カルボニル化合物が優勢である、という結論を下している。
Tetrahedron第49巻、No. 4, p 911〜928,1993年１月22日の中で公表されたMordi et alのもう１つの論文「β−カロチン及びβ−アポ−８′−カロテナールの酸化的分解」は、分子酸素とのβ−カロチンの自己開始酸化が、エポキシド、ジヒドロフラン、カルボニル化合物、二酸化炭素、微量のアルコール及びその他のいくつかの化合物を生成することを示している。当該発明人の１人により共同制作されたこの論文は同様に、特にβ−カロチン酸化のその後の段階において溶液から往々にして沈積したいくつかの重合体／オリゴマー材料についても言及している。この重合体／オリゴマーの特性についてはこの論文中では開示されていない。
本特許出願は、カロチノイドの生物活性がカロチノイド自体から由来するものではなくインビボで生成されたその単数又は複数の酸化生成物に由来するものであるという我々の発想の展開の結果としてもたらされている。カロチノイドほど容易ではないが酸化能力をもつことからレチノイドも内含されている。酸化されたレチノイドの生物活性は、レチノイド自体の既知の活性とは全く異なるものである。
発明の要約
本発明に導く調査の第１段階において、基質の少なくとも一部が分子ベースで数倍多い量の酸素と反応する条件の下での酸素Ｏ2を用いたβ−カロチン、カンタキサンチン又はレチノイン酸の酸化（以下大規模酸化と呼ぶプロセス）により得られた混合物が、細胞培養においてガン由来の及びウイルス形質転換を受けた哺乳動物細胞を誘発して正常な細胞にとって非毒性な形でより緩慢に増殖するようにすることができる、ということが発見された。さらに、処理された細胞系統のうちのいくつかにおいて細胞分化が起こるすなわちガン様細胞が場合によって正常な細胞の特性の多くを獲得するということが決定された。同様に、大規模酸化されたβ−カロチンから得た材料の混合物が非毒性な形でマウス体内の腫瘍の成長を遅延又は停止させることができるということも発見された。
オリゴマー又は重合体成分を含む混合物を得るのに有効な条件下で酸素を用いてカロチノイド、レチノイド又は関連する接合されたポリエンを酸化させることが提案されている。
酸化は、固体状態で又は有機溶剤の中に溶解させた状態のカロチノイド及びレチノイド又は接合ポリエンと酸素を用いて行なうことができる。
以下で記述するような実験室試験に基づいて、β−カロチン、カンタキサンチン、リコピン、レチノール酸の酸化により得られた酸化混合物（及びオリゴマー／重合体成分）及びそれらの部分的に酸化された混合物は両方共、抗増殖剤及び抗腫瘍剤及び分化誘発物質として有効であると考えられている。
重合体成分の構造式は、この調査の第１段階において決定されなかった。β−カロチン、カンタキサンチン又はレチノイン酸の酸化の時点で形成された重合体がポリ過酸化物構造を有し、酸性基を含むということの証拠がある。
天然に存在する本発明の物質の問題にとり組むにあたり、分離されていないカロチノイド及びレチノイドがビタミンＥといった酸化防止剤により酸化から保護されていることから、自然では酸化中の重合体成分の形成が遅延される可能性がある、ということがわかるだろう。しかしながら、溶解したビタミンＥの存在下でβ−カロチンを酸化することによって得られた極性材料（分離時点で重合したもの）は、阻害されていない酸化において得られた重合体材料と同じ位、インビトロ細胞培養試験において活性であった。
本発明の混合物の大部分の重合体成分の分子量は、カロチノイド及びレチノイドの分子量に比べて比較的低いものである。このような理由から、この材料を重合体同様オリゴマーとも呼ぶことができる。本明細書では、この材料を定義づけするのに重合体又は重合体のという語を用いることにする。
本発明を導いた調査作業の第２段階においては、上述のような大規模な酸化によって得られた本発明の混合物が分子量に応じて分画化され得るということが見極められた。分画化は例えば、溶剤沈積又はゲル浸透クロマトグラフィによって実施することができる。かくして得られたいくつかの分画を、その極性に応じてさらに分画化（下位分画化）することが可能である。このようにして得られた分画及び下位分画の多く、そしてその中に含まれているいくつかの化合物が、調査作業の第１段階において規定された混合物のものにそれぞれ匹敵するか又はそれ以上の抗腫瘍、細胞増殖抑制及び／又は細胞分化活性を示すことが判明している。
１つの特定の化合物、すなわち２−メチル−６−オキソ−２，４−ヘプタジエナールが分離され、細胞増殖抑制及び抗腫瘍特性を示すことがわかった。この化合物は、本発明の大規模酸化された混合物（酸化β−カロチン）の分画化によってか又は従来の合成方法によって得ることができる。この化合物は、以前トランスレチノイン酸の酸化によって得られる生成物として報告されていた。Oyler et alの、Tetrahedron第45巻、No. 25, p 7679〜7694, 1989内で公表された「レチノイン酸の自動酸化生成物の特徴づけ」。
【図面の簡単な説明】
図面中
図１は、大規模酸化されたβ−カロチンの逆相高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）分離／分析を示す。
図２は、大規模酸化されたβ−カロチンのゲル浸透クロマトグラフィ（GPC）分析の結果を例示している。
図３は、大規模酸化されたβ−カロチンからの酸化混合物のフーリエ変換赤外線（FTIR）スペクトルを表わす。
図４は、大規模酸化されたβ−カロチンの酸化混合物の陽子核磁気共鳴（NMR）スペクトルを表わす。
図5aは、大規模酸化されたβ−カロチンの酸化混合物の重合体成分のUVスペクトル（分画１）を表わす。
図5bは、β−カロチンのUVスペクトルを表わす。
図6a−6bは、以下の通りの重合混合物の特定の分画のGPC分析の結果を例示する：
6a−分画１
6b−分画２
6c−分画３及び
6d−分画４。
図７は、重合体混合物の分画１のFTIRスペクトルを表わす。
図８は、固体β−カロチンの酸化により得られる材料のFTIRスペクトルを例示する。
図９は、固体β−カロチンの酸化により得られた重合体材料のGPC分析の結果を例示する。
図10a−10f（写真）は、以下の通りのES細胞の分化に対するレチノイン酸及び大規模酸化されたβ−カロチンの効果を例示する。
図10a−ES細胞、誘発物質無し
図10b−レチノイン酸
図10c−大規模酸化されたβ−カロチン３μＭ
図10d−大規模酸化されたβ−カロチン7.5μＭ
図10e−大規模酸化されたβ−カロチン15μＭ
図10f−大規模酸化されたβ−カロチン30μＭ
図11は、０，２，４，７，９，11，14，16及び18日目に注射した10mg／kgの用量の大規模酸化されたβ−カロチンの、腫瘍の成長に対する効果を例示する。
図12は、０，２，４，７，９，11，14，16及び18日目に注射した150mg／kg用量での大規模酸化されたβ−カロチンの、腫瘍の成長に対する効果を例示する。
図13aは、さまざまな用量の大規模酸化されたβ−カロチンでの処置を受けた屠殺された動物及び対照（未処置動物）における、腫瘍のサイズに対する大規模酸化されたβ−カロチンの効果を例示している。
図13bは、さまざまな用量の大規模酸化されたβ−カロチンで処置され腫瘍のまわりに出血を発生させた屠殺された動物、及び対照（未処理動物）における、腫瘍のサイズに対する大規模酸化されたβ−カロチンの効果を例示する。
図14は、比較を目的として、本発明の主要出発化合物の構造式を表わす。
図15は、本発明の主要分画の分子量分割を例示する。
図16は、混合物の３レベル溶剤媒介分画化を概略的に例示する。
図17は、分画LSG及びMSGへの分画SG１の予備的GPC分離のGPCクロマトグラムを例示する。
図18a及び18bは、それぞれ219及び265nmで監視された分画LSGのHPLCクロマトグラムを例示し、分画LSGがいかにして分画F1及びF2に分割されたかを示す。
図19a及び19bは、それぞれ219nm及び265nmで監視された分画F1のHPLCクロマトグラムを例示し、分画F1がいかにして分画F1.1及びFl.2及びFl.3へと分割されたかを示す。
図20a及び20bは、それぞれ219及び265nmで監視された分画F2のHPLCクロマトグラムを示す。
図21は、本発明の分画の同定された特定の化合物の構造式を例示する。
図22aは、結腸ガン細胞系統に対する本発明のいくつかの分画の細胞増殖抑制効果を示す。
図22bは、白血病細胞系統に対する本発明のいくつかの分画の細胞増殖抑制効果を示す。
図23aは、DA−３細胞系統内のグルタチオンレベルに対するβ−caroxのインビトロ効果を例示する。
図23bは、DA−３細胞系統内のメルファランのIC50に対するβ−caroxのインビトロ効果を例示する。
図24は、卵巣ガンにおけるβ−カロチン及び酸化されたβ−カロチンの抗腫瘍特性を示す。
図25a及び図25bは、マウスDA３モデルにおける腫瘍の成長に対する本発明のさまざまな分画の阻害効果を示す。
発明の詳細な説明
β−カロチン、レチノイン酸及び関連する化合物が、潜在的な抗ガン剤として同定され、さらには肺ガン及びいくつかの形態の白血病といったさまざまな形のガンの治療における予防的及び／又は治療用作用物質として使用されてきた。β−カロチンの化学的予防作用は同様に、それ自体β−カロチンの酸化生成物であるビタミンＡ（レチノイン酸）の作用様式と結びつけて幾分かの注目を集めてきた。ビタミンＡは、いくつかのタイプのガン細胞を少なくとも部分的にその増殖性胚芽様状態から正常な細胞に似た状態へと戻らせることができるものであると立証されてきた。
カロチノイドの作用メカニズムはまだわかっていない。細胞の成長及び分化に影響を及ぼすビタミンＡ自体及び関連するレチノイドの作用は、細胞核にあるレチノイド受容体を介して媒介されるものと思われる。
β−カロチン及び場合によってはその他のカロチノイドに関しては、その抗ガン効果が、ビタミンＡを形成するその能力からではなく幾分か無傷の分子の酸化防止特性に由来するものであるということが広く信じられてきているが、これはまだ立証されたわけではない。
分離されたβ−カロチン及びその他のカロチノイドは、空気中の酸素との反応により容易に自然発生的酸化を受ける。レチノイドも又自然発生的酸化を受けることができる。しかしながら、当初から、レチノイド内の接合されたオレフィン結合が少なければ少ないほどその自然発生的酸化の速度及び程度が低減することが認められている。
自然発生的酸化は、カロチノイド及びレチノイドをインビボで、生物活性ラジカル及び／又はラジカル由来の生成物の供給源として作用する細胞内プロ−酸化剤として挙動させる可能性がある。遊離基及び遊離基酸化生成物は、生きた細胞のシグナリング経路において有意な役割を果たす二次メッセンジャとして作用することが認められてきた。実際、遊離基の生成は好気環境内での生命の不可避的結果であるということが長い間認知されてきており又、これは一般に細胞にとって有害なものとしてみなされてきたが、さらに最近では、遊離基特にオキシラジカルが細胞の維持、制御及び発達において重要な役割を果たすということが増々認識されてきている。
我々は、大規模に酸化されたカロチノイド、レチノイド及び関連する接合されたポリエンの生成物及びその構造的類似体が、非ビタミンＡ生物活性を有することを発見した。我々はこのことを、インビトロでβ−カロチン、カンタキサンチン及びレチノイン酸を大規模に予備酸化し、生物活性について酸化生成物の混合物を試験することによって実証した。β−カロチンのインビボ酸化的変換の周知の生成物であるビタミンＡ及びその他のビタミンＡ生成カロチノイドからの、本発明の基礎である大規模な酸化の生成物の間の区別を認識することが重要である。
調査作業の第２段階においては、ここではβ−caroxと呼んでいる大規模酸化されたβ−カロチン混合物について、分画化スキーマが開発された。混合物は、溶剤沈降及びゲル浸透（サイズ排除）クロマトグラフィ（GPC）の組合せを用いて分子量（MW）分布に基づき３つの分画に分割された。生物学的検定は、低及び中MW分画に大部分の活性が存在していることを示している。従って、これら２つの分画、特に低MW分画に注意が集中して払われてきた。より複雑な中MW分画を探査するには、さらに時間が必要である。
低MW分画は、まずは溶剤沈降を用いて、ただしその後に逆相高性能クロマトグラフィ（RP−HPLC）を用いて、さらに分画化された。いくつかの分画がただ１つの又はわずかだけの主要化合物を含む点が達成された。これらの化合物のいくつかが同定された。不飽和ケトアルデヒドという１つの化合物が独立した経路（合成）により得られ、強い細胞増殖抑制及び抗腫瘍特性を有することがわかった。この化合物は以前はβ−カロチンから形成されるものとして同定されておらず、RAの自動酸化の生成物として報告されていた。不飽和接合ケトアルデヒドクラスの化合物の細胞増殖抑制特性及び抗腫瘍特性は、これまで認知されていないと思われる。
細胞増殖抑制及び分化誘発活性について、数多くのβ−carox分画が検定されてきた。分画のうちのいくつかは、β−caroxよりも強い細胞増殖抑制活性をもつ。いくつかのヒト細胞系統において、分化の誘発がテストされてきた。最強の効果は、IMR32神経芽細胞腫系統について、見られる。最も驚くべき結果は、異なる分画で処理された時点で単一の細胞系統内の前駆体細胞が２つの異なる表現型（神経細胞とグリア細胞）を発生させうるという観察事実であった（このような特性をもつ物質は、脳及び脊髄の損傷に対する神経再生療法において利用可能である）。
ヌードマウス内の異種移植片として成長させられたヒト卵巣ガン系統について、β−Carox抗腫瘍活性が実証された。ヒトの細胞系統から誘導されたヌードマウスの異種移植片は、動物の細胞系統から誘導された動物の腫瘍よりもヒトの腫瘍をより密に反映するものとみなされている。最初の特許に記述されたインビボモデルを用いたβ−carox分画の多くの試験は、いくつかの分画が強い活性を有することを示していた。又、動物における顕性毒性を全く示さない濃度で活性が達成されるということも特記に値する。
この時点すなわち調査作業の第２段階の後、我々は、複数の化合物（以上に規定されている通りの酸化混合物から誘導されたもの）が抗ガン剤として活性であること、そして、複数の化合物を含む分画が単一の化合物よりもさらに活性であることを確認した。
トマトの中に見られるカロチノイドであるリコピン（図14参照）も同様に、大規模な酸化の後細胞増殖抑制活性を有することがわかった。リコピンには、β−カロチンの中に存在する２つのシクロヘキシル環が欠けている。
本発明を確認する目的で、インビボ及びインビトロ生物学試験が行なわれ、以下では、β−カロチン、カンタキサンチン及びレチノイン酸の酸化混合物に関する合成方法及び分析データについて記述する。
実  験
調査の第１段階
化  学
以下の通りにβ−カロチン、カンタキサンチン及びレチノイン酸を酸化した。
例１：β−カロチンの酸化
酸素で飽和されたベンゼン中のβ−カロチン（Fluka）の20mM溶液を、大気圧、純粋酸素下、30℃、暗所で、振とう機浴の中でインキュベートした。72時間後、６〜８モル当量の酸素が消費された時点で、溶剤を蒸発させて樹脂様の黄色残渣を得た。
溶剤の効果：
四塩化炭素中でのβ−カロチンの酸化は、基本的にベンゼン中で得られたものと同じ結果を生み出した。
形成されたビタミンＡの量：
両方共β−カロチンのインビボでの酵素酸化の生成物であるレチノールもレチノイン酸も酸化混合物の中で検出されなかった。レチノイン酸に対し酸化されうるレチナールが生成物として同定されたが、酸化されたβ−カロチン混合物の生物活性を説明するには少なすぎる量でしか存在していない。その上、酸化された混合物の生物活性は、以下で記述するとおり、ビタミンＡのものとは実質的に異なっている。
重合体材料：
酸化中に、きわめて大量の重合体物質が形成される（以下参照）。その他のオレフィン化合物の酸化反応との類推により、より高い分子量の物質が、酸化されたβ−カロチンフラグメントから成る重合体に対応する可能性がある。溶液中のβ−カロチンの濃度に対する重合の依存性を見極めるため、さまざまな濃度のβ−カロチンをテストした。酸素で飽和させたベンゼン中の20mM，２mM及び0.2mMのβ−カロチン溶液を、暗所にて30℃で純粋酸素（760mmHg）下でインキュベートした。全てのケースにおいて重合体成分が主要な生成物であった。さらに、重合体成分は、β−カロチンの酸化の早い時期に形成する。
図１は、酸化混合物の逆相高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）による特徴づけを示す。
図２は、任意の単位での、成分の分子量に応じた酸化混合物の組成を示す、酸化混合物のGPC特徴づけを表わしている。分子量範囲は、約600ダルトンから約8000ダルトンまで広範に分布しており、最大は約900ダルトンにある（4.9分にある鋭いピークは、GPCカラムの性質による人為的産物であり、約1400より大きい分子量をもつ混合物の成分は全て同時に溶出する）。
図３は、酸化混合物のフーリエ変換赤外線（FTIR）スペクトルである。
図４は、酸化混合物の陽子核磁気共鳴（NMR）スペクトルである。
β−Caroxからの生成物の混合物の部分的分画化：
溶液の形で得られた、β−カロチンが全く残っていない大規模酸化された混合物を、連続的溶剤沈降によって分画化した。分画をゲル浸透クロマトグラフィ（GPC）及び元素分析により特徴づけした。元素分析及び酸及び過酸化物含有量の分析の結果は、表１に示されている：
0003983800.tif 000002
分画は以下の通りに得た：テトラヒドロフラン（THF）（５ml）の中に粗混合物（1.2ｇ）を溶解させ、溶液を渦流混合する間にヘキサン（15ml）をゆっくりと加えた。試料を遠心分離し（3000rpm，３分）、油性残留物を分離し、THF及びヘキサン（５：15）の混合物で一度洗浄し、真空下で乾燥して分画１を生成した。残りの溶液を洗浄からの液体と組合せ、残渣をTHF（３ml）中で溶解させた。ヘキサン（15ml）での沈降とそれに続く遠心分離及び洗浄（THF／ヘキサン、３：15）により分画２を得た。前の通り、洗液と組合せた残りの溶液を蒸発させベンゼン（３ml）の中で溶解させた。ヘキサン（15ml）での沈降とそれに続く洗浄（ベンゼン／ヘキサン、３：15）により分画３が得られた。分画４として上清材料を標識づけした。
個々の分画の重量及びGPCトレースから、重合体材料がβ−caroxの生成物の混合物の90重量％近くを占めていることが見積られた。最初に得られた３つの分画（すなわち生成物の大部分）の中の酸素の百分率は、β−カロチンにより取上げられた酸素の６〜８モル当量及び生成物の形成に付随する重量の30〜35％の正味増加を充分に反映している。当初11の接合された２重結合から成っていたβ−カロチンに対する６〜８個の酸素分子の付加は、新しい炭素−酸素結合の形成により２重結合のほとんどが分析されたことから、接合された２重結合系のほとんどの損失を暗に意味している。従って、重合体物質の紫外線−可視光線吸収スペクトルは、親β−カロチンと比較してはるかに短かい波長（280nmで肩部を伴い約240nm）で最大の吸収を示す（それぞれ図5b及び図5b）。
THF、メタノール、アセトン及びアセトニトリルの中で可溶な重合体材料は、室温以下で無制限に安定しているが、加熱下で部分的に分解し、ガスクロマトグラフィによって発見されるように、揮発性生成物を形成する。
図２と比較して、酸化混合物（それぞれ図ａ〜6d）の特定の分画１〜４のGPC分析は、分画１及び２が高い方のMWの化合物を比較的大量に含み、一方分画３及び４、特に分画４が低い方のMWの材料を大量に含んでいることを実証している。
酸化防止剤の存在下でのβ−カロチンの酸化
β−カロチン（20mM）の酸化は同様に、上述の条件下、ただし0.01〜0.10モル当量（β−カロチンとの関係において）のアルファートコフェロールか又は２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノールの存在下で行なわれた。反応は、著しく遅くなった（１モル当量の酸素が約６日で消費された）。酸素摂取プロットは線形であった。このラインの勾配は、阻害物質のタイプ及びその濃度とは無関係であった。β−カロチンの消費量は、６日間にわたり10％を超えなかった。
遊離基開始剤の存在下でのβ−カロチンの酸化
２，２′−アゾ−ビス（２−メチルプロピオニトリル）は反応生成物の形成を加速した。
β−カロチンの固体酸化：
固体状態で純粋な結晶質カロチンが酸化された場合、FTIR及びGPC分析により表わされるように、実質的に唯一の生成物として類似の重合体材料が得られた。反応は、日中も照明を排除しようとしないで開放した透明ガラス容器の中に最高８週間にわたり空気中に結晶質β−カロチンを維持することによって、実証した。反応は、溶液状態で行なわれた反応に比べ著しく緩慢であった（３日に対して４日）。固体β−カロチンの酸化によって得られた重合体のFTIRスペクトル（図８）及び溶液状態の酸化により得られた重合体の分画のFTIRスペクトル（図７）は、吸収ピークの場所及び相対的強さに関して明らかに類似していた。同様のことがGPC分析の結果についても言えた（図９対図6a）。さらに、固体状態でのβ−カロチンの酸化によって得られた物質及び溶液状態での部分的かつ大規模酸化から得られた物質は、培養中に成長させられたガン性及び形質転換された細胞の増殖を阻害する上で類似の生物活性を示した。
例２：カンタキサンチンの酸化
カンタキサンチンは、β−カロチンの酸化のために使用される条件と同じ条件下で酸化させた。従って、酸素で飽和させたベンゼン中のカンタキサンチン（Fluka）の20mM溶液を振とう機浴中で、大気圧、純粋酸素下、30℃で暗所にてインキュベートした。190時間後、約７モル当量の酸素が消費された時点で溶剤を蒸発させて樹脂様の黄色残渣を得た。かくして、反応はより緩慢であったが、ここでも又酸素との非常に大規模な反応があった。酸化混合物のGPC分析（データ示さず）は、大規模に酸化させたβ−カロチンとの強い類似性を表わしていた。すなわち、反応生成物は、重合体物質が優勢であった。
例３：レチノイン酸の酸化
β−カロチン及びカンタキサンチンのために用いられる条件下での酸素とレチノイン酸の反応は、非常に緩慢に進行した。反応は、それを高い圧力で行なうことによって加速された。
ガラス製試験管に入ったベンゼン（0.5ml，20mM）中に溶解させたレチノイン酸（Sigma）を、INCONEL 600で構成された高圧装置の中に置いた。装置を300psiの酸素になるまで加圧し、３日間42℃に設定した温度制御された浴の中に入れた。反応混合物のHPLC分析は、反応が不完全であることを示した。合計反応時間が５日となるように、温度を50℃に上昇させた点を除いて同じ条件下でさらに２日間、反応を続行させた。非常にわずかな未酸化レチノイン酸が残った（合計生成物の１％未満）。GPC分析（データ示さず）は、より高MW（分子量）生成物の存在を示したが、これは、β−カロチン及びカンタキサンチンについて見られたものよりもはるかに小さい合計反応生成物分画を表わしていた。又、カラムの分離限界よりも大きいMWをもつ検出可能な材料（約1400ダルトン）の不在も示されていた。
生物学
さまざまな培養細胞系統における細胞増殖抑制活性、分化の誘発及び腫瘍形成性ウイルスに対抗する活性についてテストすることにより、インビトロ生物検定を実施した。β−caroxについて大部分の結果が得られたが、これには又、大規模酸化されたカンタキサンチン及びレチノイン酸についてのいくつかの結果も含まれている。
以下のことについてβ−carox及び大規模酸化されたカンタキサンチンをテストすることによりインビボ試験を行なった：
−  マウス体内での毒性：
−  腫瘍の変化の組織病理学的検査を含むマウス体内の腫瘍の成長の阻害（移植された化学的に誘発されたラットの乳ガン細胞系統から誘導された腫瘍）。
インビトロ試験
本発明の混合物の生物学的特性を決定するため、β−caroxを、細胞増殖抑制効果及び分化の誘発についてインビトロでテストした。酸化されたβ−カロチンの効果と区別するため、試験対象の細胞系統のいくつかの中で対照としてレチノイン酸及び／又はβ−カロチンを使用した。細胞サイクルに対する酸化されたβ−カロチンの影響も同様に研究した。β−caroxの活性に関する全ての濃度は、β−カロチンのマイクロモル当量で表わされている。
細胞モデル：細胞系統及び特性
増殖及び／又は分化に対するβ−caroxの効果をテストするために、さまざまな細胞系統を使用した。これらの系統は、立証澄みの形質転換された細胞系統であるか又は、ガンを患う患者の腫瘍から分離されたもののいずれかである。さらに、適切なタンパク質標識で細胞分化プログラムが充分に規定されている２匹のマウス細胞系統を使用した。これら２つの細胞系統については、ヒト乳頭腫ウイルス16型（HPV16）（子宮頸ガンと結びつけられるウイルス）でのトランスフェクションを受けた整合するクローンが特徴づけされ、形質転換を示すことが立証されてきている。形質転換された表現型L6−HPV16（L16細胞から誘導されたもの）及びBALB／ｃ／MK−HPV16（BALB／ｃ／MK細胞から誘導されたもの）は、そのホルモン独立性及び軟寒天上でコロニーを形成するその能力によって特徴づけされてきた。
重症新生物を有する患者から得た生検におけるウイルスタンパク質の発現パターンは、逆転写酵素−複製連鎖反応（RT−PCR）を用いて我々の実験室にて立証された。生検された材料の中で、発現パターンは、形質転換されたL6クローンのものと類似しており、試験を目的としたL6モデルの有効性及び関連性を立証している。
BALB／ｃ／MK細胞は、高濃度のCa2+イオンに露呈した時点で分化することから、有利なものである。低カルシウムに露呈したとき、酸素は、72時間未満でその分化前状態に戻る。
β−caroxの分化誘発特性は、マウスの胚基幹細胞（すなわちほぼ正常な細胞系統）及びいくつかの動物及び人間の神経芽細胞腫細胞系統（すなわちガン性細胞）を用いた２つの付加的モデルにおいてさらに調査された。
胚基幹（ES）細胞は全能性である。すなわち、生体のあらゆる細胞系列を発生させることができる。インビトロで、或る種の条件下で、これらは自然発生的にさまざまな混合タイプへと分化する。分化を促進するものとして知られている物質での処置は、ES細胞を単一の表現型に向かって誘導する。例えば、レチノイン酸は、神経細胞へと分化するべく全米学術研究審議会において樹立された条件下で培養されたES細胞を刺激する（データ未公開）。
マウス細胞モデル
1a. L6ラット一次筋芽細胞（L6）。
1b．ヒト乳頭腫ウイルス16型でのトランスフェクションを受けたL6細胞（L6−HPV16）。
2a．マウスBALB／ｃ／MKケラチノサイト（BALB／ｃ／MK）。
2b．ヒト乳頭腫ウイルス16型でのトランスフェクションを受けたマウスBALB／ｃ／MK（BALB／ｃ／MM−HPV16）。
3a．Mat Ｂ−WT：ラット乳腺ガン
3b．MatB−MLNr  メルファラン耐性をもつラット乳腺ガン
3c．MatB−DOXr  アドリアマイシン耐性をもつラット乳腺ガン
４．B16マウス黒色腫
５．DA−３  DMBAにより誘発されたマウス乳ガン腫
６．FDCP−１、マウス骨髄性白血病
２つの細胞系統MatB MLNr及びMatB−DOXrは、多薬物耐性を示す；MatB−WTは野生型である。これらはエストロゲン又はプロゲステロン受容体を発現しない。
ヒト細胞モデル
7a．MCF7−WT  ヒト乳ガン
7b．MCF7−ADRr  アドリアマイシン耐性をもつヒト乳ガン
細胞は中程度に分化されており、エストロゲン及びプロゲステロン受容体について陽性である。
8a．Uro9ヒト尿道細胞層（urothelial）ガン；充分分化されたもの
8b．Uro10ヒト尿道細胞層ガン；分化レベルが低いもの
９．L14ヒト肺腺ガン；分化レベルが中程度のもの（患者の腫瘍から、モントリオール・ユダヤ人病院のレディ・ディビスインスティチュートで内部分離されたもの）。
10．NB４  ヒト急性前骨髄細胞性白血病。
細胞増殖抑制効果
表２は、PromegaからのMTT生存度／毒性検定（ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性に基づく代謝試験）で得た結果をまとめている。生存度は、増大する濃度の（2.5の倍数）β−caroxで評価された。未処理の対照と比較した、細胞集団の成長を半減させる用量がIC50値として報告されている。
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低密度（104〜103細胞／１〜５ml）で培養した対数増殖する細胞を、72時間以上にわたり単一用量の異なる濃度のβ−caroxに露呈した。細胞の成長をMTT試験により見極めた。生存曲線（β−caroxの濃度と細胞の成長の関係を表わすプロット）からグラフによりIC50値（β−カロチン当量で表わされたもの）を決定した。表２中の各々の値は、少なくとも２つの独立した実験の平均に対応する。大規模に酸化されたβ−カロチンの異なるバッチをテストし、一貫した結果が得られた。NB４白血病細胞系統の感受性及びL6対照細胞上の活性の欠如に留意されたい。いくつかの細胞系統のための対照として用いられたレチノイン酸及びβ−カロチン（各々３μＭ）は、レチノイン酸に応答したNB４細胞を除いて、細胞成長曲線に対し全く効果を及ぼさないことがわかった。
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連続的有機溶剤沈降の後β−caroxから得られた分画を、MCF7−WT細胞系統について検定した。表４で示されている通り、２つの分画１及び３が、粗製混合物よりもはるかに活性であることがわかった。
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細胞は、表２の脚注に記された通りに処理された。
正常な細胞は穏やかな阻害を受けていると思われるが、培養におけるより長い時間にわたりこの効果は漸進的に消滅し、β−caroxが正常な細胞に対し強烈な影響を及ぼさないことを示している。こうして副作用を制限しながら反復的にガン患者を治療できる可能性が得られるだろう。
細胞分化に対する効果
L6筋芽細胞モデルに対する形態学的観察：
培養されたラットの筋芽細胞L6は、インビトロで分化することができる。全米学術研究審議会では、体型測定、インサイチュ免疫螢光法及びフローサイトメトリーを用いてこれらの細胞の分化プログラム内で５つの段階を特徴づけした。
使用された筋細胞分化の既知の標識（特徴的タンパク質）は、フィブロネクチン、α−アクチン、Ｎ−CAM、ビメンチン及びアセチルコリン受容体の発現、であった。さらに、前融合段階に特異的なアセチルコリン受容体がL6−HPV16細胞内で発現されないことも実証された。５つの段階が識別され、分化の増大順のその表現型が以下に記されている：
１．細胞は、胚線維芽細胞様の外観をもつ。
２．細胞は、双極性形態を獲得する。
３．細胞は、配向された状態となる。
４．細胞は、前融合段階に入る。
５．細胞は、シンシチウム及び筋管の形成を示す。
HPV16のトランスフェクションを受けた細胞が、前融合段階で形質転換され遮断されることがわかった。すなわち、HPV16でのトランスフェクションを受けた細胞は、段階４で遮断される。しかしながらβ−caroxでの処理の時点で、細胞のより優れた配向が観察され、分化第５段階への部分的進入に対応するいくつかのシンシチウム形成が開始された。
カルシウム含有量が異なる培地中での培養は、培地のカルシウム含有量が低い（0.05mM）場合に、対照及びトランスブェクションを受けた細胞の両方に対してβ−caroxがより効力をもつことを示した。さらに、上で報告した分化標識の発現において、カルシウムとβ−caroxの間に拮抗が見られた。このことは、β−caroxで処理された細胞に対するカルシウムの効果についてのいくつかの探査的実験を刺激した。筋芽細胞及びケラチノサイトのモデルが使用された。
簡単に言うと、L6筋細胞において、細胞中の外因性カルシウムの内向きフラックスは非特異的カチオンチャンネルを介して起こる（我々が以前に実証した通り、そして既存の文献と合致して）。細胞の内側では、カルシウムレベルは、内部貯蔵からのカルシウム放出によって制御される。さらに、L6分化プログラムの前融合段階で発現されたアセチルコリン受容体が、筋形質カルシウムチャンネルを変調させる。
ケラチノサイト内では、貯蔵からのカルシウムの進入及び放出を調節するチャンネルの性質がいまだ解明されていない。
電気生理学及びFura−２を用いた撮像という２つの技術により実験が行なわれた。予備的結果は、β−caroxがカルシウムチャンネル遮断物質又はカルシウムキレート化剤として作用することを示している。このことは、前述の多薬物耐性細胞系統内での多薬物耐性を部分的に克服するその能力によって確認された。しかしながら、これは、ベラパミルといった従来のチャンネル遮断物質ほど有効でないと思われる。
BALB／ｃ／MKモデル内の分化標識のパターン
BALB／ｃ／MKケラチノサイトの中では、Dollカタログ中に規定されているようなサイトケラチン1.5及び10はまず最初にウェスタン免疫ブロット法によって同定された。サイトケラチン１及び10は、より高いレベルの分化に結びつけられるものとして知られているが、一方サイトケラチン５は、なおも増殖中の分化レベルが比較的低い細胞に結びつけられる。
フローサイトメトリー分析は、サイトケラチンが、未処理の整合する対照細胞においてよりも未処理のHPV16でのトランスフェクションを受けた細胞の中で発現レベルが一般に低いということを示した。
サイトケラチン５
３日以内で不可逆的な分化を誘発する1.8mMのカルシウムに対する露呈は、対照及び形質転換された細胞の中でのサイトケラチン５の発現の増大を結果としてもたらした。β−caroxに対する露呈は、類似の効果を結果としてもたらしたが、この場合、対照において発現を誘発するのに６日間の露呈で充分であったのに対して、形質転換された細胞の中では９日間が必要であった。
両方の誘発物質に対する同時露呈は、発現の増強を取消し、２つの化合物がアンタゴニストであることを示していた。
サイトケラチン１及び10
対照細胞の中では、増大したカルシウム（0.05mMから1.8mM）に対する露呈の時点でこれらのサイトケラチンの両方の発現における驚くべき増大が観察されたのに対し、一方形質転換された細胞はいかなる応答も示さなかった。
これとは対照的に、β−caroxは、両方の系統において両方の標識の発現を誘発した。L6細胞系統の場合と同様に、対照と比べてBALB−HPV16からの応答のためにはより長い露呈が必要とされた。
ここでも又、カルシウム処理との拮抗が観察された。これらの結果は、従来のカルシウム細胞分化誘発物質が効果がなかったのに対して少なくともケラチノサイトモデルにおいてβ−caroxがHPV16で形質転換された細胞の中での分化を増強するという証拠を提供していることから、実際上重要なものであると思われる。
β−caroxによる分化の誘発（形態学的基準によって見積られる）は同様にNB４前骨髄細胞性白血病細胞の中でも観察された。
ES及び神経芽細胞腫細胞
神経細胞内へのES細胞のレチノイン酸による分化の誘発のために全米学術研究審議会で開発されたものに類似した条件の下で、β−caroxは同様に、免疫組織化学的技術を用いて特異的標識により評価されるように、又図10に示されているように、神経細胞内へのES細胞の分化をも促進する。しかしながら、レチノイン酸及びβ−caroxのES細胞に対する効果の間には、２つの有意な差異が存在する。
１）レチノイン酸は、0.1〜１μＭの範囲内で用量依存的に双極性表現型の80％へのES細胞の分化を促進する（図10b）が、一方β−caroxは、最適な濃度（7.5μＭのβ−カロチン当量）で、プルキンＩ細胞に似た高度に分枝した表現型の約90％への最終分化を惹起する（図10d）；高度分枝のメカニズムは、まだ完全に解明されていない。
２）最終分化の誘発は、２つの誘発物質について反応速度面で異なっている；すなわちβ−caroxは、レチノイン酸よりもはるかに有効である（我々の実験条件下で、それぞれ15時間対３日）。
神経芽細胞腫の細胞系統Neuro 2A，IMR32，SK−Ｎ−SH及びSK−Ｎ−MCの中では、β−caroxは、同様に驚くべきほどの高度の分化を促進し、一方レチノイン酸は部分的な分化しか晩起しなかった。
ES及び神経芽細胞腫モデルからの結果は、β−caroxが、強力な分化プロモータであることを表わしており、その作用メカニズムはレチノイン酸のものと異なっていると思われる。
腫瘍形成性ウイルス遺伝子の発現に対する活性
β−caroxが腫瘍形成性ウイルス遺伝子の発現に対抗する活性を有しうるという観察事実は、次の独立した３つの実験に依存している。
細胞変性：トランスフェクションを受けた細胞L6−HPV16及びBALB／ｃ／MK−HPV16の核のまわりの集約的空胞形成として明らかに見えるウイルス感染の症状は、β−caroxに対する露呈の時点で著しく減少するか又は消滅した。
伝令RNAは、β−caroxに露呈された及び露呈されなかったトランスフェクションを受けた細胞から抽出された。RT−PCRにより、ウイルス遺伝子産物の発現パターンの速度が分析されてきた。当初の結果は、ウイルスタンパク質及びmycが遺伝子（増殖に関係するガン遺伝子）の発現パターンが、レチノイン酸又はβ−カロチンで処置されたものに比べてβ−caroxで処置された細胞について異なっている、ということを示していた。
HPV16のE6及びE7ガン遺伝子タンパク質にとって共通のフラグメントに対して発生したモノクローナル抗体を用いて、ポリアクリルアミドゲル、電気泳動、ウエスタンブロット分析及びフローサイトメトリーを使って両方のタンパク質の発現を見極めた。ウイルスのトランスフェクションを受けた細胞をβ−caroxに対し９〜12日間露呈した後、E6及びE7タンパク質の発現の減少が観察された。
不完全な酸化を受けたβ−カロチン、酸化防止剤の阻害を受けたβ−カロチン酸化混合物及び大規模酸化を受げたカンタキサンチン及びレチノイン酸の細胞増殖抑制効果：
表５は、重合体酸化生成物及び未反応のβ−カロチンの両方を含む不完全に酸化したβ−カロチン、α−トコフェロール（５モル％）により阻害されたβ−カロチンの酸化から得られた酸化生成物、完全に酸化されたカンタキサンチン及びレチノイン酸（上述の合成）がMC７−WT細胞系統に対して及ぼす相対的効果を示している。全ての試料は、高MW（分子量）の酸化材料の少なくともいくつかを含み、全て著しい細胞増殖抑制活性を示した。
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細胞は、表２の脚注に記した通りに処理された。
β−caroxの毒性及び抗腫瘍活性のインビボ研究
毒性の査定：β−carox及び大規模酸化されたカンタキサンチン雌のBALB／ｃマウスの体重を監視し、動物を全体的に検査することにより、毒性を査定した。１日目、３日目及び５日目に５mg／kg及び10mg／kgの用量を腹腔内注入した（表６）。対照グループは、溶剤のみ（20％の水性エタノール）を受けた。１日目、３日目、５日目、８日目及び11日目の100mg／kgの注入を用いて類似の研究を行なった。顕性毒性効果は全く観察されなかった（データ示さず）。
β−caroxは、６回の100mg／kg用量で適用された場合でも、健康なマウスに対し非毒性である。最高150mg／kgの反復的用量（９回）の場合でさえ（腫瘍をもつマウスで）、不利な効果は全く見られなかった。
同様に、大規模に酸化されたカンタキサンチンは、同じ用量／注入パターン状態で、毒性の顕性徴候を全く示さなかった（データ図示せず）。
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抗腫瘍活性：腫瘍モデル系
マウスのD1−DMBA−３（DA−３）乳腺ガンモデルを用いた。細胞系統は、7.12−ジメチルベンズアントラセン（DMBA）によって誘発された免疫原性の非転移性マウス乳腺ガンをもつBALB／ｃマウスから誘導された。
100万個のDA−３細胞を、各々の雌BALB／ｃマウスの体内に皮下注射した。腫瘍が触知可能になった時点で（直径0.5cm，１〜２週間）、動物をグループにランダム化し、５mg／kgから最高150mg／kgまでの範囲の用量でβ−caroxを腹腔内注入した。２〜３日毎に腫瘍の成長を測定した。Alaoui-Jamali et al．，によりJ. Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 264(3), 1299内で記述されているように、時間の関数として腫瘍の体積を測定することにより腫瘍の成長の阻害を見極めることによって、評価を行なった。ここでも又、対照グループは、溶剤だけを受けた（20％の水性エタノール）。
図11及び図12は、腫瘍の成長に対するβ−caroxの効果を例示している。図11は、０，２，４，７，９，11，14，16及び18日目に注入された10mg／kgの用量に対応する。図12は、同じ要領で注入された150mg／kgの用量に対応する。
組織学的検査のためには、いくつかの無作為に選ばれた動物を屠殺し、腫瘍を切開し、通常生理食塩溶液中の10％のホルマリンの中で固定した。ホルマリンで固定されたパラフィンで包埋された腫瘍の各々から組織学切片を調製し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。
結果は、β−caroxが、マウス体内に移植されたガン細胞由来の腫瘍に対する成長遅延効果を有することを示している。図11及び図12は、10mg／kgという低い用量で反復的に投与された大規模に（酸化された）β−caroxが、腫瘍の成長を有効に停止させそれを長期にわたり安定化させる能力をもつことを示している。
図13a及び13bは、異なる用量のβ−caroxで処置された屠殺された動物及び対照（未処置動物）における腫瘍の比較を示す。幾匹かの動物において、腫瘍のまわりで出血が発生した（図13b）。これらのケースにおいて、実際の腫瘍サイズは、はさみ尺で測定した場合より小さい（この食い違いは、見かけの腫瘍サイズを増大させる出血性腫脹のせいである）。
処置された動物から除去した腫瘍の組織病理学的検査は、次のことを明らかにした：
β−caroxは、DA−３腫瘍内の組織の死滅を反映する顕著な組織学的変性を誘発する。
−  腫瘍細胞は、細胞／組織分化の数多くの特長を示した。
−  処置された全ての腫瘍中に出血部域が存在し、これは広範な色素沈着及び壊死と結びつけられる。
−  色素は鉄ではなく（プルシアンブルーを用いた鉄染色は陰性であった）、おそらくは出血の結果と思われるヘモシデリンであり得る。色素がメラニンである可能性は低いと思われる。色素沈着の精確な性質については今後確認しなくてはならない。
正常な非腫瘍組織内の同様の組織病理学的変化の証拠は全くなかった。
β−caroxの多数の腹腔内注入は最高150mg／kgの濃度でさえ充分に寛容されていることから、β−caroxの治療指数は、きわめて高いと思われ、このことは潜在的に、従来の抗ガン薬に比べ主要な利点を提供する。
我々の調査の第１段階をまとめると、代表的カロチノイドとしてのβ−カロチン及びカンタキサンチン、そしてそれよりは低い程度で、代表的レチノイドであるレチノイン酸は、無制御の細胞増殖、腫瘍及び腫瘍形成性ウィルスに対して活性な非毒性作用物質として及び細胞分化プロモータとして有用なものとなるための特性を示す物質を、β−caroxをモデルとして生み出すべく、大規模酸化を受けることができる。β−caroxの化学的分析から、さまざまな形態のビタミンＡのいずれも全く存在しないか又はわずかな量でしか存在しないことは、明白である。さらに、ビタミンＡを形成できない酸化されたカンタキサンチン及びレチノイン酸の生物活性は、ビタミンＡとは異なる活性物質の存在を表わしている。β−caroxの細胞増殖抑制及び分化促進活性はビタミンＡ自体の活性に類似しているが、一般に、効果は、さまざまな状況の下でβ−caroxについてより強力なものである。同様に、β−caroxが非毒性であるという非常に重要な違いがある。
調査の第２段階
化  学
リコピンの酸化
ベンゼンの中に溶解したリコピン（図14参照）を、第１の作業段階におけるβ−カロチンと基本的に同じ要領で酸素雰囲気下で大規模に酸化させた。β−caroxと類似の要領で、細胞増殖抑制活性について、粗製生成物混合物をテストした。
β−caroxの分画化
分画化は３段階を通して推移した。深さ３〜４レベルの３つの分離スキーマについて、以下で記述する。
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β−caroxは、第１段階で記述されたものに非常に類似した手順を用いて合成された。簡単に言うと、ベンゼン（3.0ｌ：0.02Ｍ）中に溶解させたβ−カロチン（30ｇ）を、気体酸素の雰囲気内で室温にて４日間、撹拌した。GPCクロマトグラフィは、３つの主要成分すなわち低（＜300Da）、中（300〜1000Da）及び高（＞1000Da）MWの分画の存在を確認した（図15）。
レベル１の分離（段階１〜３）：溶液（3.0ｌ）を約200mlに濃縮し、次に約２ｌのヘキサンで希釈した。全混合物の約65％のIG１沈降物は、高MWの材料（＜1000Da）の大部分を含んでいた。可溶性分画すなわち低（＜300Da）及び中（300〜1000Da）MWの分画を含み、高MWの分画を事実上全く含まない上清（図16参照）を乾燥に至るまで蒸発させて残渣SG１を得た。
レベル２の分離（段階１）：分画SGｌ（1.2ｇ）を30分間、室温でヘキサン（120ml）の中で撹拌した。ろ過して取除いた不溶性分画IG２は、大部分の中MW材料といく分かの低MW材料を含んでいた（図15）。可溶性分画を含む上清を蒸発させて、大部分の低MW材料及びいく分かの中MW材料を含むSG２を生み出した（図16）。
レベル２の分離（段階２及び３）：テトラヒドロフラン（10ml）中で溶解させた分画SG１（10ｇ）を、分取規模のGPCクロマトグラフィカラム（19×300mm，Waters styragel、粒度15μｍ、孔径10nm）上への試料（250μｌ）の連続的注入及びテトラヒドロフランでの溶出（４ml／分）によって、それぞれLSG（40％）及びMSG（55％）という低及び中MWの分画へと分離させた。２つのMWの分画への明確な分離が、図17に例示する通りに得られた。
レベル３の分離（段階１）：分画SG２（688mg）をシリカゲルカラム上に投入し、酢酸ヘキサン／エチル（95：５）で溶出させた。溶出した分画を組合せ、溶剤を除去して分画SG３を得た。
レベル３の分離（段階２）：１分間氷冷ペンタン（１ml）と共に分画LSG（600mg）を撹拌し、次に大部分の上清を傾潟により除去した。この手順を４回反復した。不溶性分画ILSGをろ過し、可溶性成分を含む組合わされた上清分画から溶剤を蒸発させ、分画SLSGを得た。
レベル３の分離（段階３）：アセトニトリル（10ml）中に溶解させた分画LSG（4.4ｇ）を、直列に連結された３つのWaters Nova Pak HR C18（逆相、粒度６μｍ、孔径６nm）PrepPakカートリッジ（40×100nm）を備えた分取規模のHPLC計器上へ連続注入する（450μｌ：合計9.0ml）ことによって、２つの分画に分離させ、アセトニトリル（40ml／分）で溶出させた。それぞれ4.8〜6.4分及び6.4〜12分溶出剤を収集することによって、分画F1（80％）及びF2（20％）を得た。図18の分析的高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）クロマトグラムの中央の垂直な破線は、LSGがいかにして２つの分画F1及びF2に分割されたかを示している。（図18の化合物の溶出時間及び対応する分割時間は、それぞれ分析的条件及び分取条件下で最適な分離を得るのに必要な条件の差異のため、分取HPLCにおけるものと異なっている。）
レベル４の分離（段階３）：アセトニトリル（1.5ml）中に溶解させた分画F1（700mg）を、すでに記述したものと同じカラムの備わった分取規模のHPLC計器上に連続的に注入する（250μｌ；合計1.25ml）ことによって３つの分画、F1.1（11％），F1.2（13％）及びF1.3（５％）に分離し、40ml／分の流量で水、アセトニトリル及びメタノールの50：45：５の混合物を用いて溶出させた。それぞれ2.0〜6.6分、6.6〜12.0分及び12.0〜23分、溶出剤を収集することによって分画を得た。図19の垂直な破線は、３つの分画を得るためにいかにカットが行なわれたかを示している。
第３及び第４の分離レベルでの幾つかの分画の化学的組成の決定（番号付けされた化合物の構造は、図21に提供されている）
分画F1.1，F1.2及びF1.3は各々、図19が示す通り、わずかな化合物しか含んでいない。F1.2中の主要成分は、２−メチル−６−オキソ−２，４−ヘプタジエナール（本文の他の箇所でケトアルデヒドと呼ばれている化合物１）、である。ジヒドロアクチニジオリド（化合物２）がF1.3の主要成分である。化合物３〜14が、分画F2中で同定された。これらは、β−シクロシトラル（３）、β−イオノン（４）、β−イオノン５，６−エポキシド（５）、４−オキソ−β−イオノン（６）、β−イオニリデンアセトアルデヒド５，６−エポキシド（８）、４−オキソ−β−イオニリデンアセトアルデヒド（９）、β−アポ−13−カロテノン（10）、β−アポ−13−カロテノン５，６−エポキシド（11）、４−オキソ−β−アポ−13−カロテノン（12）、レチナール（13）及びレチナール５，６−エポキシド（14）である。
生物学
細胞増殖抑制活性、分化の誘発及び細胞サイクルに対する効果についてテストすることにより、インビトロ生物検定を実施した。マウス体内の腫瘍の成長の阻害についてテストすることにより、インビボ試験を実施した。
インビトロ試験
細胞増殖抑制特性及び分化誘発能力について、分画をテストした。結果を、分画化が増強した活性をもつ分画を導いているか否かを示す基準として役立つβ−caroxについて得られた結果と比較した。（β−caroxの効果と区分するべく、テストされた細胞系統のいくつかにおいて対照としてレチノイン酸及び／又はβ−カロチンを使用した）。多くの分画が不確定の性質をもつことから、全ての試料を同一の「重量」濃度でテストした。β−カロチンの分子量（537Da）で試料の重量を除することにより、擬モル濃度の尺度で比較を行なった。
使用した細胞系統：
HCT116              ヒト結腸ガン
IMR32               ヒト神経芽細胞腫
NB4                 ヒト急性前骨髄細胞性白血病
K562                ヒト慢性骨髄性白血病
BALB／ｃ／MK        マウスケラチノサイト
β−carox分画の細胞増殖抑制効果
各試料の６つの濃度で細胞を処理した（HCT116及びIMR32については2.5，7.5，15，22.5，30，45μＭ，NB４及びK562細胞系統については2.5，５，7.5，10，15，22.5μＭ）３日後、細胞を溶解させ、ヘキスト染料33258と共にインキュベートし、存在する細胞DNAの量の尺度を提供するよう溶液の螢光を測定した。テストした各々の物質についての螢光データを収集し、未処理細胞についての対応する値で除して（背景螢光について補正した後）、各試料の濃度についての細胞増殖抑制効果を決定した。図22a及び図22bは、それぞれHCT116ヒト結腸ガン及びK562ヒト白血病細胞系統について得られた結果を例示している。
相対的活性が、選ばれた細胞系統により非常に左右されうるということは明らかである。このことは、分画ILSGがHCT116細胞系統及びK562系統の両方においてきわめて活性である（β−carox以上に活性である）のに対してHCTl16細胞系統では活性であるもののK562系統では不活性である分画MSGによって、特によく例示されている。これらの観察事実は、細胞増殖抑制効果が複数の化合物の作用を通して得られるということを暗に意味している。
表７は、４つの細胞系統について得られた結果を要約している。分画は、各々の試料濃度での各々の成長抑制値を対応するβ−carox値で除し、６つの試料濃度を通しての傾向を検査により定性的に決定することによって、β−caroxとの関係において格付けされた。分画の活性は、それぞれβ−caroxの活性と比べて高い、同じ、及び低い活性を表わす「＋」，「Ｏ」及び「−」で表わされている。
最も印象的な結果は、分画F1.2の主要成分として同定されたケトアルデヒド（図21中の化合物１）について得られた細胞成長の強い阻害である。恐らく、驚くべきことは、例えば分画F1，F2，Fl.2及びF1.3といった、先行するレベル（１及び２）でのより複雑な親分画中の活性の増強に続く、より進んだ分画化レベル（３及び４）でのより単純な分画における活性の見かけの減少である。原則として、後続のより単純な分画になればなるほど、活性成分が富化され、より高い活性の期待に通じるはずである。より早期のより複雑な分画の中で観察されたより高い活性は、２つ以上の化合物の間の相乗関係及び／又は複数の活性化合物の存在に由来する可能性がある。
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大規模酸化されたリコピンの細胞増殖抑制効果
HCT-116細胞系統を用いて、大規模酸化されたリコピンの活性をβ−caroxの活性と比較した。表８の結果は、２つの物質がこの細胞系統に対し類似の活性を有することを示している。我々は、β−caroxカンタキサンチン、そしてここでリコピンが、強い細胞増殖抑制特性をもつ生成物を生み出すことを示してきた。リコピンにはその他の２つのカロチノイドの中に存在する２つのシクロヘキシル環が欠如していることから（図14参照）、この分子成分の存在は、酸化生成物における細胞増殖抑制活性にとって必要でないと思われる。
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細胞分化
分画の細胞分化誘発効果は、細胞系統内の形態学的変化を観察することによって定性的に、又モノクローナル抗体及びフローサイトメトリーを用いて特徴的タンパク質標識の発現を測定することにより定量的に、決定された。
表９では、活性分画は「＋」の記号で、非常に活性な分画は「++」によって示されている。
IMR32ヒト神経芽細胞腫細胞系統内の分画の間には広く行きわたった活性が存在する。予期しないことに、３対の分画（SG1，IG1；SG2，IG2及びLSG，MSG）が、同じ前駆体細胞系統からの２つの異なる表現型に向かっての分化を誘発する、前例のない（我々の知るかぎり）能力を示している。すなわち、分画の選択に応じて、グリア細胞又は神経細胞に向かってIMR32細胞系統を導くことが可能なのである。神経細胞の形成を誘発する能力は、後のより単純な分画（段階４；表９）において消滅する。これらの観察事実は、さらに、β−caroxが、異なるタイプの活性を有する多数の活性化合物を含んでいることの証拠である。
NB４ヒト白血病細胞系統内での分化誘発は、強い活性をもつ早期のそして化学的に複雑なIG2及びMSG分画に限られる。１つの分画、SG3のみが、ほぼ正常なL6ラットの筋芽細胞系統内での分化を強化する。
ほぼ正常なL6系統と比べての形質転換された細胞系統特にIMR32内のより大きい活性は、非毒性的にガン性細胞の成長を制御するために形質転換された細胞の選択的分化を用いる戦略に対する裏づけを提供している。
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マウスBalb／ｃ／MKケラチノサイト細胞系統に対するβ−caroxの分化誘発効果について調査の第１段階において定性的データが提供された。表10及び11はここで、裏づけする定量的データを提供している。
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サイトケラチン１及び10は、分化プログラムの進捗と共に増々発現される高分子量のタンパク質である。インビボでの細胞培養においては、分化は従来、高レベルのカルシウムを含む培地への露呈によって誘発される。低カルシウムの培地の中で培養された細胞は、増殖性であり続ける。表10に示されているように、レチノイン酸は、サイトケラチン１及び10の発現を増大する上でCa++の代用となりうる。β−caroxは同様に、Balb／ｃ／MKケラチノサイト分化を誘発する上でカルシウムの代用となりうる。レチノイン酸に比べてβ−caroxの効果が見かけ上小さいのは、潜在能が低いのではなく、作用の遅延によるものである。表11は、一団のその他のサイトケラチンを用いて類似の結果が得られたことを示す。
ａ）β−caroxの細胞標的の同定及びｂ）組合せ療法に向かっての全トランスレチノイン酸とのβ−carox又はその分画の組合せ効果
β−carox及びその分画のいくつかが細胞分化誘発特性を有することから、得られた効果をいくつかの哺乳動物細胞型の分化能力を調節できるものとして認識されているより良く知られた全−トランスレチノイン酸の効果と比較することのみならず、β−caroxとレチノイン酸が一緒に用いられた場合の細胞に対する効果を決定することも有益である。表12は、NB４及びIMR32の両方の細胞系統内でのβ−carox及びレチノイン酸のさまざまな組合せで得られた結果を表わす定性的データを示す。
等効力濃度のβ−caroxをレチノイン酸と組合せた場合、それらの分化誘発効果は相殺する。しかしながら、それらのうちのいずれか一方の濃度をもう一方のものに比べ増大させた場合、分化誘発は回復する。驚くべきことに、両方の作用物質を合わせた濃度が上昇すると、分化の著しい増強が見られる。
分化プログラムの間に、数多くの分化標識が過渡的に発現される。NB４細胞系統においては、タンパク質CD33が分化の早期段階と結びつけられ、それに続いて中間標識であるタンパク質CD116そして場合によっては進行した分化の標識であるタンパク質CD15がくる。従って、増強した分化は、CD33標識の発現及び強度の減少及びCD15標識の発現及び強度の増大により特徴づけられることになる。
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表13は、個々の分画又は全トランスレチノイン酸とのさまざまな二元性組合せのいずれかで補足されたNB４細胞中のこれらの特異的分化標識の発現レベルに対する、全トランスレチノイン酸、β−carox及びその分画のいくつかの効果に対する定量的データを示す。これらの結果は、β−caroxがレチノイン酸ほど有効でないことを表わしている（β−caroxはその効果を充分に発現するのにより多くの時間を必要とする）。レチノイン酸及びβ−carox又はその分画のいくつかとの組合せた処置は、β−caroxについて上述したように（表12）分化の阻害（アンタゴニスト効果）という結果をもたらすが、分画IG２の場合、IG２又はレチノイン酸のいずれか単独の場合よりも分化がさらに進む（相乗効果）。
β−carox及びその分画のいくつかがレチノイン酸の作用と干渉しもすればそれを増強もし得るというこの発見事実は、レチノイン酸が（レチノイド、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ3及びオーファン受容体を含む）核受容体の上位グループを通して作用しこれと相互作用することから、β−carox及びその分画のいくつかがこの受容体グループを特異的に標的とし、核DNA転写レベルで細胞に影響を及ぼしているということを暗に意味する。
上述の或る種の条件下で得られた分化の増強は、レチノイン酸及びβ−carox又は分画IG２の適切な組合せがレチノイン酸単独よりもさらに有効な療法であるだろうという見通しを提供している。レチノイン酸は、それが再発ガンの治療において有効でなくなる前にわずか５〜６カ月の緩解しか提供しないという事実にもかかわらず、まもなく一般に急性前骨髄細胞性白血病（APL）の治療に利用できるようになろうとしていることから、これにはきわめて今日的な意味がある。我々の結果は、２つの作用物質、特に上で挙げたものの組合せが白血病細胞をより完全に最終分化経路へと押し下げ、増殖性状態へのその復帰が遮断される確率を増大することになるという可能性を裏付けている。
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β−caroxが上述の受容体グループとの相互作用を通して核DNA転写のレベルで細胞に影響を及ぼしているという仮説は、もう１つの細胞系統IMR32とレチノイン酸及びβ−caroxの組合せた処理の結果によってさらに裏付けられる。NB４の場合と同様に、（両方の作用物質の濃度に応じて）アンタゴニスト効果又は相乗効果が観察できる（表7a参照）。例えば、神経フィラメントNF（神経細胞へと細胞が分化したことを表わす標識）の発現は、各々単独で使用した場合に、１μＭのRA及び５μＭのβ−caroxで最大となる。これらの濃度で一緒に使用した場合、これらは互いに相殺し、NFの発現は対照のものに類似している（拮抗）。しかしながら、RAの濃度が2.5μＭまで増大され、β−caroxの濃度が３μＭに減少した場合、NFの発現は、それらのいずれかが単独の場合よりも高い（相乗作用）。両方の作用物質により増強されるグリア原線維酸性タンパク質GFAP（グリア細胞に向かっての分化を表わす標識）の発現は、複雑な相互作用をも受ける。例えば、レチノイン酸自体は１μＭの低濃度で最も有効であるのに対して、β−caroxの存在はこの最適濃度を、β−caroxの濃度に応じて最高10μＭまで増大させる（表13ａ参照）。
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細胞サイクルに対するβ−caroxの効果
細胞サイクルの３つの段階（G1段階（休止細胞、Ｓ段階（DNA合成段階）及びG2段階（染色体倍増））の間でのβ−caroxで処理した細胞集団の分布は、Ｓ段階での細胞の蓄積を示している。G1遮断は全く無い。この効果は、細胞サイクルの持続時間の延長によるものである。β−caroxで処理された細胞が36時間で細胞サイクルを完了する一方、対照及びレチノイン酸処理された整合する試料における細胞サイクルの持続時間はそれぞれ22時間及び18時間であることがわかった。同期化された集団からの細胞の個々の細胞内DNA含有量のフローサイトメトリー分析を用いて、データを収集した。試料採取は、48時間にわたり５時間毎に行なった。懸濁状態で成長する細胞（NB４白血病細胞）及び粘着細胞として成長する細胞（L6筋芽細胞）という２つのタイプの細胞を使用した。
その他の生物学的特性
細胞のグルタチオンレベルを減少させる上での、及び従来の化学療法剤に向かってのガン細胞系統の感受性の増大に対する、β−caroxの効果
往々にして、従来の抗ガン薬は、ガン性細胞がその治療に対する耐性を獲得することから、有効でなくなっている。数多くの場合において、この現象は、薬物の有効成分と反応しかくして細胞からのその除去を助けることによってガン性細胞を保護するグルタチオン（GSH）のレベルの増大に関連づけられる。表14に記されているデータは、β−caroxが、抗腫瘍活性を査定するための動物モデルにおいて使用されるものと同じ細胞系統であるDA−３のマウス乳ガン細胞系統内のGSHのレベルを実質的に低下させることができるということを示している。表14の結果は、現在抗ガン剤としてテストを受けているGSH生合成のより有毒な阻害物質であるブチオニンスルホキシミン（BSO）の対応する効果にまさるとも劣らないものである。
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細胞GSH低下効果のもたらす恩恵は、従来の抗ガン剤であるメルファランとβ−caroxの両方で処理されたDA−３細胞の生存度に何が起こるか（MTT試験を用いて）によって例示される。表15中のデータは、低濃度のβ−caroxの存在下でメルファランのIC50が劇的に減少することを示している。（これらの結果は、図23a及び23bにグラフで例示されている。）
この効果は、メルファランといった従来の抗ガン剤とβ−caroxの同時投与が、抗ガン薬に対するガン性細胞の感受性を増大させる、ということを示唆している。このことは、次の２つの方法の１つにおいて有益である可能性がある：ａ）同じ用量でガン性細胞内の薬物のより高い濃度を達成することができる；ｂ）治療効果のためにより低い用量しか必要とされず、そのためメルファランの高い全身的毒性の結果もたらされる歓迎されない副作用が低減される。
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インビボでのβ−caroxの毒性及び抗腫瘍活性
その他の動物モデルにおけるβ−caroxの抗腫瘍効果。ヌードマウスの異種移植片
ヌードマウスへのA2780ヒト卵巣ガン細胞の移植により生じる腫瘍成長に対する効果の研究を含み入れるべく、β−caroxの抗腫瘍活性の評価を拡大した。図24は、β−caroxの腹腔内投与が、この著しくより攻撃的な腫瘍（DA−３モデルに比べて）の成長を有意に阻害することを示している。
β−carox分画及び関連する物質の抗腫瘍効果
マウスD1−DMBA−３（DA−３）乳腺ガンモデルを使用した。図25a及び25bの中に表わされた結果は、いくつかの分画が、β−caroxと少なくとも同じ位（分画SG，F1，F2）或いはそれ以上（分画F1.1，F1.2，F1.3；使用された濃度がより低いものであることに留意）の潜在能を有していたということを示している。ケトアルデヒド（化合物１、図８）の潜在能は顕著である。
表16は、実験28日目での対照（すなわち賦形剤のみを受けたグループ）との関係における発現された見積りの腫瘍体積を示す。β−caroxについて以前に観察されたものとは対照的に、少なくとも分画F1の場合に、用量−応答効果が存在することがわかる。
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F1及びF2という２つの分画について、同じモデルで、代替的な送り出しモードをテストした。表17のデータは、経口的に投与した（ｐ．ｏ．）場合に両方の分画が腹腔内投与（ｉ．ｐ．）の場合と少なくとも同程度に有効であることを示している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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