(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを確認するための方法であって、
前記被試験水を透過する赤色光の透過率を測定する工程１と、
被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを含まず単に白濁しているときにおける赤色光の透過率と、被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴにより変色しているときにおける赤色光の透過率との差の範囲内において設定された所定の基準値を、前記工程１において測定した透過率が超えるか否かを判定する工程２と、
を含む５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否確認方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否確認方法、特に、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを確認するための存否確認方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
飲料水や食品の衛生管理においては、大腸菌群の存否の検査が必要不可欠となっている。ここで、「大腸菌群」とは、好気性または通性嫌気性のグラム陰性無芽胞の桿菌であり、乳糖を分解して酸とガスとを生じるか、β−ガラクトシダーゼをもつ細菌群をいい（例えば、社団法人日本水道協会発行、「上水試験方法２００１  解説」８４５頁参照）、「大腸菌」そのものとは異なる概念である。因みに、飲料水中に大腸菌群が含まれている場合、当該飲料水は、単に汚物で汚染されているということだけではなく、病原菌類も含んでいる可能性があることを示唆することになるため、水道法上の水質基準では飲用に不適なものと判定されることになる。
【０００３】
ところで、大腸菌群の指標となる性状は乳糖発酵性であり、それに関与する酵素はβ−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）である。したがって、飲料水等の被試験水を細菌の培養環境に設定し、そこからβ−ガラクトシダーゼを検出することができると、間接的に大腸菌群の存在を証明することができる。そこで、このような大腸菌群の性状を利用した、飲料水等の被試験水中における大腸菌群の存否を迅速に判定するための方法として、合成酵素基質培地法が知られている。合成酵素基質培地法は、発色物質または発光物質を結合させた酵素基質を培地に使用し、目的とする細菌がもつ特異酵素により当該酵素基質が加水分解されて発色または発光することを利用した検査方法（判定方法）であり、大腸菌群の検出用の合成酵素基質培地法として、被試験水の変色の有無により大腸菌群の存否を判定するＸＧａｌ−ＭＵＧ法が知られている。
【０００４】
ＸＧａｌ−ＭＵＧ法では、発色合成酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ―３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（通称Ｘ−Ｇａｌ）、大腸菌群の栄養素となるペプトン等およびピルビン酸ナトリウム等の炭素源、塩類、界面活性剤並びにｐＨ調整剤を所定の濃度で含む合成酵素基質培地を一定量の被試験水中に所定量添加し、３６±１℃で合成酵素基質培地の種類に応じて２４〜４８時間培養する。ここで、被試験水中に大腸菌群が含まれている場合は、大腸菌群が栄養素により培養され、β−ガラクトシダーゼが生成する。生成したβ−ガラクトシダーゼは、発色合成酵素基質であるＸＧａｌを加水分解し、青〜青緑色を呈する５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを生成させる。これにより、被試験水は青〜青緑色に変色するので、大腸菌群を含むものと判定することができる。一方、被試験水中に大腸菌群が含まれていない場合は、上述の合成酵素基質培地を添加しても大腸菌群が培養されることはないので、被試験水中にβ−ガラクトシダーゼは生成しない。したがって、被試験水中において５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴは生成しないので、被試験水は上述のような青〜青緑色に変色しない。この結果、被試験水には大腸菌群が存在しないものと判定することができる。
【０００５】
ところで、上述のようなＸＧａｌ−ＭＵＧ法は、経験を積んだ検定者の手作業により実施され、被試験水の変色は当該検定者が目視で判断しているため、作業が煩雑である。このため、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法を簡便に実施するためには、その自動化装置の開発が不可欠となる。このような自動化装置においては、β−ガラクトシダーゼによるＸＧａｌの加水分解により、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが生成したか否か、すなわち、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを人間の目視に頼らず機械的に正確に確認する必要がある。
【０００６】
本発明の目的は、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを人間の目視に頼らずに確認することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを確認するための方法であり、被試験水を透過する赤色光の透過率を測定する工程１と、被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを含まず単に白濁しているときにおける赤色光の透過率と、被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴにより変色しているときにおける赤色光の透過率との差の範囲内において設定された所定の基準値を、工程１において測定した透過率が超えるか否かを判定する工程２とを含んでいる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
合成酵素基質培地法であるＸＧａｌ−ＭＵＧ法により水中に大腸菌群が存在するか否かを判定する場合を例にして、本発明の実施の一形態に係る５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否確認方法を説明する。
【０００９】
ＸＧａｌ−ＭＵＧ法により水中に大腸菌群が存在するか否かを判定する場合は、石英ガラスなどの透光性を有する無色透明の材料を用いて形成された容器（例えば試験管）内に試験対象となる水（被試験水）を注入する。ここで、被試験水の注入量は、通常、５０ｍｌに設定する。
【００１０】
次に、容器内の被試験水中にＸＧａｌ−ＭＵＧ法を実施するための合成酵素基質培地、すなわちＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を所定量供給する。ここで用いられるＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は、例えば、社団法人日本水道協会発行、「上水試験方法２００１  解説」８４２〜８４３頁の表に挙げられたＸＧａｌ−ＭＵＧ培地やピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地である。因みに、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は、１リットル中において次のような酵素基質、大腸菌群培養のための栄養成分、塩類、界面活性剤およびｐＨ調製剤を含みかつｐＨが７．１±０．２に調整されたものである。
【００１１】
酵素基質
β−ガラクトシターゼと反応して発色する発色合成酵素基質であるＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ―３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．１０ｇ、大腸菌群酵素誘導剤であるＩＰＴＧ（１−イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を０．１０ｇおよび大腸菌検出のための酵素基質であるＭＵＧ（４−メチルアンベルリフェリル−β−グルクロニド）を０．１０ｇ。
大腸菌群培養のための栄養成分
ペプトンを５．０ｇおよびその他の炭素源としてピルビン酸ナトリウムを１．０ｇ。
塩類
塩化物として塩化ナトリウムを５．０ｇ、硝酸塩として硝酸カリウムを１．０ｇ。
界面活性剤
ラウリル硫酸ナトリウムを０．１０ｇ。
ｐＨ調整剤
リン酸二水素カリウムを１．０ｇ、リン酸水素二カリウムを４．０ｇ。
【００１２】
なお、上述のようなピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は市販されており、一例として日水製薬株式会社の商品名“ＥＣブルー”を挙げることができる。
【００１３】
次に、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地が添加された被試験水を十分に撹拌しながら３６±１℃に加温し、被試験水を大腸菌群の培養に適した環境に設定する。そして、当該温度で被試験水を２４時間維持した後、被試験水中に大腸菌群が存在するか否かを判定する。このような培養環境において、被試験水が大腸菌群を含む場合、この大腸菌群は、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地により培養され、β−ガラクトシダーゼを生成する。このβ−ガラクトシダーゼは、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地中に含まれるＸＧａｌを加水分解し、５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを被試験水中に生成させる。一方、被試験水が大腸菌群を含まない場合、被試験水中で大腸菌群が培養されることはないので、被試験水中において５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴは生成しない。
【００１４】
したがって、被試験水中に大腸菌群が存在するか否かは、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かの確認により判定することができる。そこで、次に、被試験水中における５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否確認方法を説明する。
【００１５】
５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴは、青〜青緑色を呈する物質であり、被試験水中に微量に存在するだけで人間の目視で判定可能な程度に被試験水を青〜青緑色に変色させる。このため、被試験水が青〜青緑色に変色しているか否かを判定すると、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを確認することができる。
【００１６】
被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴにより青〜青緑色に変色しているか否かを判断する場合は、容器を挟んで赤色光の発光素子（例えば、赤色ダイオード）とその受光素子とを配置する。そして、発光素子から照射される赤色光を受光素子で受光し、被試験水を透過する赤色光の透過率を測定する。ここで、被試験水が青〜青緑色を呈しない場合は赤色光の透過率が低下しにくいのに対し、被試験水が青〜青緑色を呈すると赤色光の透過率が大幅に低下することから、そのような赤色光の透過率の相違に基づいて被試験水の青〜青緑色への変色を判断することができる。なお、ここで用いる赤色光は、通常、６００〜８００ｎｍの範囲内の波長のものが好ましい。
【００１７】
但し、大腸菌群以外の細菌を含む被試験水に対してＸＧａｌ−ＭＵＧ法を実施すると、被試験水は白濁し、赤色光の透過率がやはり低下することになる。このため、被試験水が５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴを含まず単に白濁しているだけ（便宜上、「白濁」という）なのか、或いは５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴにより青〜青緑色に変色している（便宜上、「変色」という）のかの判別が必要になる。
【００１８】
そこで、白濁と変色とを判別するために、通常は、白濁時の赤色光の透過率と変色時の赤色光の透過率との差に基づいて、赤色光の透過率に判別のための基準値を設定する。そして、赤色光の透過率が当該基準値以上に低下している場合（すなわち、透過率が当該基準値を超える場合）は変色と判定し、基準値未満の場合は白濁と判定する。具体的には、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法を実施中の被試験水が大腸菌群を含まず、大腸菌群以外の細菌を含む場合、被試験水は、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の存在下、３６±１℃で２４時間培養されると、図１に点線で示すように赤色光の透過率が１２時間を経過したあたりから白濁のために低下するが、その低下の程度は一定レベルで維持される。これに対し、ＸＧａｌ−ＭＵＧ法を実施中の被試験水が大腸菌群を含む場合、すなわち、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが生成する場合、図１に実線で示すように赤色光の透過率は１５時間を経過したあたりから急激に低下し続ける。このため、培養開始から２４時間後（すなわち、培養終了後）では、白濁の場合と変色の場合とでは赤色光の透過率に大きな差（Ｄ）が生じる。したがって、この差Ｄの範囲内において、赤色光の透過率についての任意の基準値Ｘを設定すれば、赤色光の透過率が当該基準値Ｘよりも高い側にあるか低い側にあるかを判定することにより、変色か白濁か、すなわち、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを正確に確認することができる。
【００１９】
なお、上述の差Ｄは、発光装置および受光装置の種類や感度により異なるので、判別のための基準値Ｘは、これらの種類や感度等に応じて適宜設定するのが好ましい。
【００２０】
上述のように、この実施の形態では、被試験水を透過する赤色光の透過率に基づいて、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを確認しているので、被試験水の色や可視紫外光の吸収スペクトルを人間の目視で確認しなくても、被試験水中における５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否を機械的に正確に確認することができる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明に係る５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴの存否確認方法は、被試験水を透過する赤色光の透過率を測定し、その透過率が所定の基準値を超えるか否かに基づいて５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが被試験水中に存在するか否かを判定しているので、被試験水中に５，５−ジブロモ−４，４−ジクロロインジゴが存在するか否かを人間の目視に頼らずに確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＧａｌ−ＭＵＧ法を実施中の被試験水における、赤色光の一般的な経時的透過率変化を示す図。
【図１】
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