(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療するための、動物中へ注入するためのヒドロゲル組成物であって、
ヒドロゲル組成物はアルギン酸塩、多価金属カチオンの高度溶解性塩、及び多価カチオンの弱溶解性塩を含み、
多価金属カチオンの高度溶解性塩が塩化カルシウムであり、多価カチオンの弱溶解性塩が硫酸カルシウムである、
ヒドロゲル組成物。
【請求項２】
ヒドロゲル組成物が、カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を更に含む、請求項１のヒドロゲル組成物。
【請求項３】
金属イオン封鎖剤がホスフェートアニオンを含む、請求項２のヒドロゲル組成物。
【請求項４】
ヒドロゲル組成物が生細胞をも含む、請求項１〜３のいずれかのヒドロゲル組成物。
【請求項５】
動物中へ注入するのに適当であり、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に硬化することになる、動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療するための、部分硬化ヒドロゲル溶液を調製するためのキットであって、
アルギン酸塩、
塩化カルシウム、及び、
硫酸カルシウムを含み、
それらの成分が、哺乳動物細胞の懸濁物と一緒にされた時に３０分以内に、注入に適し、１．５％の濃度のアルギン酸塩、１．５ｍｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム、そして１５ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸カルシウムを有する部分硬化ヒドロゲルを形成するように、与えられており、かつ部分硬化ヒドロゲルが少なくとも４時間粘度の変化を受けない、上記キット。
【請求項６】
請求項１のヒドロゲル組成物を調製するためのキットであって、（ａ）アルギン酸塩、（ｂ）塩化カルシウム、及び（ｃ）硫酸カルシウムを含む、上記キット。
【請求項７】
カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を更に含む、請求項６のキット。
【請求項８】
金属イオン封鎖剤がホスフェートアニオンを含む、請求項７のキット。
【請求項９】
ヒドロゲル組成物が生細胞をも含む、請求項６〜８のいずれかのキット。
【請求項１０】
請求項６〜９のヒドロゲル組成物を調製するためのキットであって、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が粉末状であり、任意に単一の容器中にある、上記キット。
【請求項１１】
動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療するための、動物中へ注入するためのヒドロゲル組成物を調製する方法であって、
（ａ）部分的に架橋されたアルギン酸塩を含むヒドロゲルを調製し、そして
（ｂ）ヒドロゲルをオリフィスに強制的に通すことにより、破壊して、ヒドロゲルの不規則形状の粒子を含むペーストを形成する
ことを含み、
ヒドロゲルが塩化カルシウム及び硫酸カルシウムの混合物によって架橋される、
上記の方法。
【請求項１２】
ヒドロゲル組成物が、カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を更に含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
金属イオン封鎖剤がホスフェートイオンを含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ヒドロゲル組成物が生細胞をも含む、請求項１２又は１３の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、米国第０８／７６２，７３３号；第６０／０５１，０８４号；及び第６０／０５９，５５８号の部分継続であり、それらの各々は、ここに明白に参考のため編入される。
発明の背景
発明の分野
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの新組識の創造のための細胞及び／またはヒドロゲル粒子の懸濁物を移植する方法に向けられている。
関連技術の検討
輪郭形状異常は、奇形でも、先天的でもあるいは審美的なものでも、最近は矯正のために侵入性手術技法を必要とする。さらには、添加物を必要とする形状異常は、感染及び噴出の問題がある異物形成補綴材をしばしば必要とする。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ペーストが用いられているように（膀胱尿道還流、声帯麻痺）、コラーゲンは、ある種の応用において組織バルクを創るのに使用されてきている（例えば、内因性括約筋欠失自制不能：Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅを矯正するのに使用される「Ｃｏｎｔｉｇｅｎ]）。しかし、コラーゲンは、生体中で急速に（６−１２月）分解することが示されており、バルクを保持するために多重の処理を必要とし、従って、例えば頭蓋及び顔面の形状異常の矯正のためには満足すべきものでない。同様にその他の処方におけるアルギン酸塩は、生体中で僅か数ヶ月で分解することが示されている。Ｔｅｆｌｏｎペースト粒子は、注入部位から、おそらく脳へ選択的に、移行することが示されている。
生相容性ポリマー骨組みを用いる組織処理技法は、頭蓋顎顔面手術に最近使用されている補綴材の代替物、ならびに疾病、欠損、または負傷組織を置きかえるための器官均等物の形成を創造する手段として、探求されてきている。組織処理は、単離細胞及び生相容性ポリマーから作られた構成物からの新組識の形態形成を包含する。細胞は、ポリマーのマトリックスに接合され、軟骨性の構造を形成するように移植されうる。これは、Ｖａｃａｎｔｉ氏らの米国特許第５，０４１，１３８号に記載されるように、移植に先立ってマトリックスを成形して、所望の解剖構造体とし、そしてその成形マトリックスを外科的に移植することによって、達成される。
特定部位及び制御された大きさで頭蓋顔面骨格に追加の自己発生軟骨または骨を加える簡単な方法は、手術外傷を小さくし、同種移植片または異物形成補綴材の必要をなくすであろう。もし、所望の部位へ注入または簡単な適用によって移植し、多数の単離細胞を接合させることができれば、自己発生細胞で、しかし過度の手術なしで、頭蓋顔面軟骨の骨組みを増加できよう。さらには、単離細胞の好結果の移植は、細胞の組織培養増加の可能性を作りだすであろう。
大規模な外科手術を行うことなく、多数の単離細胞を接合させ、頭蓋顔面骨軟骨の骨組みを自己発生組織で増加させることが可能な注射による移植が好ましいことは明らかである。しかしながら、解離細胞の、皮下注射または腹膜のような体のある領域内への注射はうまくいっていないことが示されている。細胞は、恐らく食細胞活動や細胞死によって比較的速く除去される。
形成外科手術のような分野への組織処理の適応性を発展させるために、組織処理技術を、細胞−ポリマー構成物を低い侵襲性で運搬し、運搬部位に留まらせるようなシステムに拡大することが調査されている。非細胞性材料を含む細胞組織と軟骨の構造を形成するために、解離細胞と、ヒドロゲルの形態の生相容性ポリマーの混合物が用いられており、このような混合物は、分解し、除去され、自然に生じる組織または軟骨と組織学的および化学的に同等な組織または軟骨から離脱すると予想される。ゆっくり重合する生相容性、生分解性のヒドロゲルは、患者に多数の単離細胞を運搬し、臓器に相当するもの、または組織（例えば軟骨）を創造する手段として有用であることが実証されている。このようなゲルは、生着を促進するとみられており、新細胞の成長のための３次元のテンプレートを提供し、さらに、生じた組織は、組成の点で、さらに組織学的に、天然に存在する組織に類似している可能性がある。
細胞−ポリマー構成物を創造するための固形ポリマー系の使用とは異なり、重合してゲル支持体マトリックスを形成する液体組成物は、注文に応じた再建または増加に応じてより容易に成形および鋳型加工することができる。加えて、液状ポリマー系は、開放性の移植よりかなり浸潤性が低いと予想される注射による運搬に使用することができる可能性を秘めている。接合と軟骨形成を促進するための多数の単離軟骨細胞を運搬する手段における成分として、アルギン酸カルシウムゲルが提唱されている。これらの初期の研究は、国際特許公報番号ＷＯ９４／２５０８０で、ゆっくり重合するアルギン酸カルシウムゲルの配合、および、これらのゲルを注射によって多数の軟骨細胞を運搬し新しい軟骨を生成させるための使用に拡大されている。
１９８１年には、患者の尿管より下の領域にポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））を注射する場合、膀胱尿管逆流の内視鏡的治療が最初に導入された。１０年以上たって、理想的な注射可能物質のための探索が続けられている。遠位の臓器への粒子の移動により、ポリテトラフルオロエチレンペーストの使用に関する懸念が生じた。移植材の容積が損失するために高確率で再治療が必要であり、そのためコラーゲンの有用性が制限されている。理想的な移植材の材料とは、非移動性、非抗原性であり、かつ内視鏡的に運搬されるものと予想され、さらに、その容積を維持するものと予想される。この目的に向かって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨細胞の作用を解明する長期的な研究により、軟骨細胞に埋め込まれたアルギン酸塩、生分解性ポリマーが、注射可能な運搬とｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨構造の維持のための合成基材として役立つ可能性があることが解明され、さらに、このシステムは、ブタのモデルで膀胱尿管逆流治療に関する試験が続けられている。しかしながら、システムの挙動は、成功には至らなかった。
適切な細胞をＭ１９９培地で懸濁し、この細胞懸濁物を同量の２％アルギン酸ナトリウム溶液と混合し、次に、固形の硫酸カルシウム粉末を添加して、アルギン酸塩の架橋を開始させ、ヒドロゲルを形成することによって、細胞を含む注射可能な組成物が製造されている。このような組成物は、典型的には、不溶性の硫酸カルシウムとのヒドロゲル中に、懸濁物１ｍｌあたり約２００ｍｇの量で１％アルギン酸ナトリウムを含むと予想される。少量の塩化カルシウムは、細胞懸濁物から組成物中に持ち越される可能性があるが、通常、最終的な懸濁物中に０．１ｍｇ／ｍｌ未満である。経験によれば、このような懸濁物はおよそ１時間の潜伏期間を有し、続いて迅速な粘度増加が起こり、粘度増加の３０分以内に比較的硬いが脆いゲルが生成することが示される。
しかしながら、上述のヒドロゲル−細胞懸濁物のコンシステンシィは、必要とする患者への注射に使用するために十分満足するものとはいえない。場合によっては、このようなヒドロゲル−細胞懸濁物は、患者に注射される前に硬化する。このようなゲルは、既知の形状の構造的な欠陥を修復するために、患者への移植用に予備成形された構造を製造するためには有用であるが、このような予備成形された構造を受け入れるのに十分な大きさの空隙を開けるための大規模な外科手術を必要とする。一方で、いくつかのヒドロゲル−細胞懸濁物は、体内の望ましい位置に注射されるまで低粘度を維持するが、このような懸濁物は、当然ながら、患者に現存する空隙または空間の形状であると思われる。このようなゲルは、規定された構造の欠陥がない場合には用いることができない。従って、移植に必要な外科手術の規模を最小化するために、患者に移植された場合、その形状を維持するのに十分なコンシステンシィを有するが、注射可能性を維持するヒドロゲル−細胞懸濁物が依然として必要である。特に、現存の注射可能な軟骨配合物の臨床試験における使用を不可能にしていると思われる短所としては、（ａ）組織平面を分離させるには不十分な粘度と、注射の際に溢出しないこと；（ｂ）注射を試みるのに十分高い粘度に達するまでの必要な時間が延びること；および、（ｃ）配合物の際の成分の不十分な分配による、ロット間で一定しない性能が挙げられる。
発明の要約
本発明の一目的は、手術部位へ注入することができるが、注入後に所望の形状を受け入れ、維持する組成物を提供することである。
殊に、本発明の一目的は、注入のときに、ＰＯＬＹＴＥＦ（登録商標）と類似のコンシステンシィを有して、そのコンシステンシィを適切な適用を許容するのに充分な時間保持する移植可能組成物を提供することである。
所望の部位から移行せず、重力に抗してその形状を維持し、そして注射カニューレを通しての圧送、を含む幾つかの手段によって特定領域に適用できる移植材を提供することは、本発明の別の目的である。これら及びその他の目的は、以下の具体例の一つまたはそれ以上に適台しうる。
一面において、本発明は、安定な部分硬化ヒドロゲルを形成する生相容性ポリマーからなる、動物中へ注入するための組成物を提供する。動物への注入に使用されるとき、組成物は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでブロックに成形されたときに重力に等しい力の下で流動に抗するペーストである。典型的には、注入可能ペーストは、３０ミクロンから５００ミクロンの範囲内のリニヤー寸法の不規則形状のヒドロゲル粒子から主に作られた懸濁物であり、その注入可能ペーストは、少なくとも０．１ｋｇｆ／ｃｍ2のゲル強度を有し、粒子中のヒドロゲルは少なくとも３ｋｇｆ／ｃｍ2のゲル強度を有する。そのような組成物は、脆いヒドロゲルを作り、そのヒドロゲルをオリフィスに通して、ヒドロゲルを破壊させて、不規則形状の粒子を形成させることにより調製でき；得られる組成物（粒子を含有する）は、動物中の組織平面を分離させるのに充分なコンシステンシィを保持するペーストのように見える。
好ましい態様において、本発明の組成物中の生相容性ポリマーは、アルギン酸塩であり、本組成物は、さらに多価金属カチオンの高度溶解性塩、多価カチオンの弱溶解性塩を含む。高度溶解性塩と弱溶解性塩の両者は、カルシウム塩であってよい。あるいは、高度溶解性塩がカルシウム塩で、弱溶解性塩が銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫、及びジ−、トリ−またはテトラ−官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分子量ジカボン酸イオン、サルフェート及びカーボネートからなる群より選択されるアニオンとからなりうる。殊に好ましい具体例において、弱溶解性塩は、塩化カルシウムであり、混合物は、塩化カルシウム／硫酸カルシウムを重量で０．００１から１００、さらに好ましくは０．００７５から１．０の比で含む。好ましくは、組成物は、重量ですくなくとも０．５％のアルギン酸塩を、そしてアルギン酸塩１グラム当たり少なくとも約０．００１ｇの塩化カルシウムを含む。別の好ましい態様においては、組成物は、さらに、カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を含み、その金属イオン封鎖剤はホスフェートアニオンを含んでいてよい。
随意には、ヒドロゲルを形成する生相容性ポリマーをふくむ本発明の注入可能組成物は、軟骨細胞及び軟骨組織を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨を形成するその他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞ならびに器官細胞のような生細胞をも含んでいてよい。典型的には細胞は、解離細胞及び／または細胞集合体であろう。
他面において、本発明は、方法で使用するためのキットを提供し、そのものは、ヒドロゲルを形成し得る生相容性ポリマー（または、そのポリマーは既製の弱く架橋したヒドロゲルの形で与えられてもよい。）を含み、またそのヒドロゲルが強制的に押し通されて、それにより弱架橋ヒドロゲルが破壊されるオリフィス（典型的にはそのオリフィスは、注射針またはカニューレであろう。）をふくむ。一具体例において、本発明は、動物中へ注入するのに適当であり、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で充分に硬化することになる、部分硬化ヒドロゲルを調製するためのキットであって、（１）多価カチオンで架橋結合する時に、ヒドロゲルを形成しうる生相容性ポリマー、（２）多価カチオンの高度溶解性塩、及び（３）多価カチオンの弱溶解性塩を含む。好ましい態様において、そのキットは、（１）２価カチオンにより架橋結合する時にヒドロゲルを形成する、好ましくはアルギン酸塩である、ポリマー、（２）２価金属カチオンを含む充分な可溶性の塩、好ましくは、塩化カルシウム、及び（３）銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫、及びジ−、トリ−またはテトラ−官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分子量ジカルボン酸、サルフェートイオン及びカーボネートイオンからなる群より選択されたアニオンとを有する弱可溶性塩、好ましくは、硫酸カルシウム、を含む。このキットは、それらの成分が、任意に哺乳動物細胞を含めて、一緒にされた時に、その一緒にされた成分が３０分以内に、注入に適し、１．５％の濃度でポリマー、１．５ｍｇ／Ｌの濃度で充分可溶性塩、そして１５ｍｇ／Ｌの濃度で弱可溶性塩を有する部分硬化ヒドロゲルゲルを形成するように与えられており、さらには、その部分硬化ヒドロゲルは少なくとも４時間粘度の変化を受けない。
キットの成分は、別々の容器に中にあってよく、あるいは２またはそれ以上の成分がキットにおいて一緒にされていてよい。随意に、生ポリマー及び少なくとも一方の塩は、粉末状であってよく、好ましい態様においては、生相容ポリマーふんまつ及び塩粉末は、一つの容器中で一緒にされる。更に好ましくは、弱溶解性塩及び生相容性ポリマー両者が粉末であり、一つの容器内で一緒にされる。別態様において、キットは、カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を含み、それは別の容器に入れても、あるいは、一つまたはそれ以上の他の成分と一緒にされていてもよい。
更に別の面において、本発明は、動物内の構造欠陥をその治療の必要に応じて治療する方法であって、本発明による組成物を欠陥の部位で動物中へ移植することからなる。一態様において、動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法は、（１）部分効果された生分解性、生相容性のヒドロゲルであって、任意に生細胞を含む部分硬化ヒドロゲルを調製し、（２）そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通過させて破壊して、ヒドロゲル粒子を含む懸濁物を作り、そして（３）その懸濁物を欠陥の部位で動物中に移植する、過程からなり、そのヒドロゲルが移植後に、組織を包囲すること及び移植物の脈管化により、繊維形成応答を誘発する、上記治療方法を提供する。あるいは、動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法は、（１）バイオポリマーまたは変性バイオポリマーからなり、任意に生細胞を含む生相容性ヒドロゲルを調製し、（２）そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通して、組織平面を分離させるのに充分なコンシステンシィを有する流動性組成物を作り、そして（３）その流動性組成物を欠陥の部位で動物中へ移植する、過程からなる。
別の態様において、本発明は、動物内の構造欠陥をその治療の必要に応じて治療する方法であって、部分硬化した生相容性ヒドロゲルの粒子懸濁物を調製し、そしてそのヒドロゲル懸濁物を欠陥の部位で動物中へ移植することからなり、そのヒドロゲルが、そのままであるが弱く架橋結合されたゲルとして（例えば、ゲル強度＝６．５９ｋｇｆ／ｃｍ2）で与えられ、それが２２−ゲージのかニューレを通して１０ｍｌ／分の割合で射出された時に、ゲル強度の減少をもたらす（例えば、ゲル強度＝０．２３１ｋｇｆ／ｃｍ2）上記方法を提供する。この方法で使用する組成物は、動物中に注入するのに適当である室温で部分硬化されるヒドロゲルを形成し、注入後には、ｉｎ ｖｉｖｏで完全に硬化する。
好ましい態様において、本発明は、一般的には塩化カルシウムの形であり、好ましくはほぼ１５分で、生相容性アニオンポリマー（例えば、アルギン酸塩）の架橋結合を開始し、部分架橋結合させるのみに充分な濃度である、容易に入手できる架橋結合用カチオン源を与える。更に好ましくは、アルギン酸塩は、処方中の全ての水を、緩く架橋結合したゲル中へ導入するのに充分な量で存在する（典型的には、約０．５％よりも多くのアルギン酸塩が、そのような注入可能細胞懸濁物中に存在する）。そのような処方物は、手術室での早急な使用のために迅速に固まるが、処置の完結を可能とするように長時間にわたって、良好な「注入可能」コンシステンシイを維持する。好ましくは、部分架橋結合ヒドロゲルは、２４時間を越えてこのコンシステンシイを維持する。なお更に好ましくは、コンシステンシイは、ヒドロゲルが部分架橋結合状態で調製され、市場販売されるのを可能とするように、充分な時間にわたり比較的安定である。一般的に、注入される際の懸濁物は注入された時に組織をより容易に分割し、注入部位からの溢出を受けることがより少ないような濃厚コンシステンシイを有する。
好ましい具体例において、本発明は、動物中の（解剖学的）構造欠陥を処理する方法であって、その欠陥部位で、典型的には、好ましくは多価イオンの可溶性塩及び多価イオンの弱可溶性塩の形である多価イオンによって架橋結合された時に、ヒドロゲルを形成する生分解性、生相容性ポリマーを含む懸濁物を、動物中に移植することにより処理する方法を提供し、それらの成分は、一緒にされて、その混合物が部分硬化、注入可能ヒドロゲルを形成し、そこで部分硬化ヒドロゲルがその場で所望の寸法及び形状の移植体を形作り、そして移植後にその寸法及び形状を維持し、動物の細胞がヒドロゲル移植体に侵入して、硬化されたヒドロゲルと実質的に同じ形状を有する繊維細胞マスを形成する。
【図面の簡単な説明】
図１は、、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ架橋結合されたアルギン酸塩について２５℃でのゲル形成の時間経過を示す。
図２は、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ架橋結合されたアルギン酸塩について３７℃でのゲル形成の時間経過を示す。
図３は、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ架橋結合されたアルギン酸塩について５℃でのゲル形成の時間経過を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、組織処理応用において、動物中へ移植されうる改善された組成物、ならびに注入によりそのような組成物を動物中に移植する方法を提供する。本発明の組成物は、ヒドロゲルの形の生相容性ポリマーを含む。本発明の組成物は、移植されるべき材料に生細胞を添加せずに使用でき、その場合には、移植体が時間の経過に伴い、周囲組織の細胞に予って侵入され最初の移植体の形を有する細胞マスを作り、あるいは生細胞が組成物中に含まれていて、それにより、組成物が注入により移植された領域に別のタイプの細胞を導入することができる。
本発明の個々の具体例は、長期間持続する組織様バルクを動物中に形成することに向けられており、その組織様物質はある種の軟組織の特性を模倣し得る。本発明について説明される組成物は、負傷、手術、または継承奇形に起因する組織ボイドの実用的矯正をなすために充分な期間にわたって持続する持続性バルキング物質を形成するために注入され得る。本組成物は切開または注入により適用し、次いで適用後に整形できる。注入された材料は、形をいじし引き続く繊維細胞増殖及び緩い結合組織侵入が、存在するボイドを矯正するために及びヒドロゲルをそれが注入で配置された所に保持するために器官化組織を作る。適用されたゲル物質は、所望の容積及び形を維持するために緩い結合組織によって侵入される。この導入された物質及び結果の繊維流入は、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間持続する。
本発明によるゲルは、繊維形成応答を刺激する性質を有している。ここに説明するように、皮下部分へのアルギン酸塩ゲルの注入は、注入ゲル節片内または周囲への緩い結合組織の浸入を促進する。この応答を介して、結合組織は最終的には、ゲル物質の注入で作り出されたバルクの可なりの割合を占めるようになる。本発明による適当な組成物は、典型的にはヒドロゲルの形の生相容性ポリマーからなる不規則形状の粒子を含む注入可能なペーストである。懸濁物は、注入された時に組織を分離し、そして注入部位からの流出を避けるために充分なコンシステンシイ（粘度）を保持する。繊維形成応答を刺激するゲル懸濁物の特性には、粒子寸法が含まれ、また粒子のヒドロゲル特性が繊維形成応答の刺激及び注入部位での移植体の固定の両方のために重要である。
好ましくは、本発明の組成物は、チキソトロピー性である様である。換言すれば、ヒドロゲルは部分硬化され（弱く架橋結合され）、結果としてヒドロゲルは、ある点まで変形に抗する；しかし力が増加するに連れて、組成物は流体挙動を示す。好ましい態様において、脆いヒドロゲルが作られ、例えばヒドロゲルを適当な寸法のオリフィスに強制的に通すことにより、破壊して、所望の寸法の不規則形状の粒子を形成する。得られるヒドロゲルの懸濁物は、重力に抗してその形状を保持するであろう。懸濁物は、積み重なって他の支持なしで同一形状を維持するマウンドをを形成することができる。得られるペーストのブロックまたはマウンドは平板状の歯磨きペーストの塊のように流動に抗するが、エッジの若干の丸みが起こりうる。
好ましくは、本発明のヒドロゲルは、注射針またはカニューれのようなオリフィス内を強制的に通すと破壊する脆い物質である。硬化されたヒドロゲルのコンシステンシイは、条件の変化により、変化し得る。例えば、大きなカルシウムイオンの濃度は、アルギン酸塩の架橋結合度を増加させ、高い温度はＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）ヒドロゲル、その他の架橋結合を増加させる。一旦それがゲル化すると、本発明による部分硬化ヒドロゲルは、安定であり、少なくとも２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、そしてしばしば数週間の単位の期間、重力の効果に等しいか、それよりも小さい力に抗してその形状をたもつ。破壊されたヒドロゲルは、オリフィスのサイズ及び圧力の関数である寸法をもつ、不規則形状の粒子の懸濁物である。典型的には、寸法は、３０μｍから５００μｍ、好ましくは４０μｍから３００μｍの範囲である。適当なオリフィス寸法及び注入圧力は当業者によって決定され得る、有効な粒子寸法は、実施例６に記載されるように繊維形成応答を監視することにより確認しうる。
ヒドロゲルは、注射器の筒内で硬化させ、次いで注射器プランジャーへの圧力作用は組成物を注射器から押し出す。典型的な配合において、組成物を注射器から押し出す。典型的な処方配合において、組成物は、部分硬化され、次いで２２ゲージのカニューレ内を１０ｍｌ／分の割合で、高粘度流体として押し通されも、その組成物中に含まれ得る細胞のひどい損傷がない。適当な処方において、カニューレを通過後に、組成物は、ＰＯＬＹＴＥＦ（登録商標）ペーストのコンシステンシイを有する。例えば、組成物は、２５℃において１５，０００ｃＰｓの測定粘度のペーストであり、そして組成物が細胞を含む時には、２２ゲージカニューレを介して１０ｍｌ／分の割合での組成物の押し出しは、細胞を実質的には破損しない（即ち、細胞の生存力２５％以上低減）。
注入及び繊維形成反応後の移植体の細胞持続性及び生存力は、走査電子顕微鏡、組織学、及びラジオアイソトープでの定量分析によって、測定できる。細胞の機能は、上記の技法及び機能測定の組み合わせによって測定できる。標識付きグルコースを用いての研究、ならびにタンパクアッセイを用いての研究は、ポリマーの骨組み上の細胞マスを定量するために実施できる。これらの細胞マスの研究は、適切な細胞マスがどれであるかをけっていするための細胞機能試験と関係付けることができる。軟骨細胞の場合に、機能は、周囲の結合した細胞のための適当な支持体を与え得る軟骨マトリックス成分（例えば、プロテオグリカン類、コラーゲン類）の合成として定義される。
本発明のバイオポリマー含有組成物は、またはヒドロゲル粒子の水性懸濁物の形で調製される。一般に、本発明のヒドロゲル組成物は、水性媒体を含み、そのものは、一種またはそれ以上の薬学的に許容される塩そして任意にその他の成分を含むのが普通である。例えば、バイオポリマーがアルギン酸塩であるとき、ヒドロゲルは、アルギン酸塩（例えば、可溶性アルギン酸ナトリウム）の溶液を、部分硬化ヒドロゲルを形成するためにアルギン酸塩の架橋結合を開始するのに充分な量で多価イオンを含む溶液と混合することにより、作られる。塩の量及びタイプは変わり得るが、普通は溶質及び溶質濃度は、組成物が動物組織中へ注入された時に動物への過度のストレスを避けるように選定される。ヒドロゲルが生細胞をも含んでいる時には、組成物の他の成分は、生細胞と相容性であり、好ましくは組成物は細胞の生育及び維持のために有利な因子を含む。
ポリマー
本発明による移植体で使用されるポリマー物質は、ヒドロゲルを形成しなければならない。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有、イオン性または水素結合を介して架橋結合して、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開口格子構造を作り出す時にできる物質と定義される。ヒドロゲルを形成するのに使用し得る材料の例としては、アルギン酸塩のような多糖類、カラジーナン、ポリホスファジン、及びイオン的に架橋結合される、ポリアクリレートあるいは、温度またはｐＨによって、それぞれ架橋結合されるＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）またはＴｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体のようなブロック共重合体が含まれる。
一般に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液または、水性アルコール溶液のような水性溶液中に少なくとも部分的に可溶でであり、またポリマーは電荷を有する側鎖、またはその一価イオン塩を含み得る。カチオンと反応しうる酸性側鎖をもつポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）及びスルホン化ポリスチレンの様なスルホン化ポリマーが含まれる。アクリルもしくはメタクリル酸及びビニルエーテルモノマーもしくはポリマーの反応で得られる酸性側鎖を有するコポリマーも使用できる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基及び酸性ＯＨ基である。
アニオンと反応し得る塩基性側鎖をもつポリマーの例は、ポリビニールアミン、ポリビニールピリジン、ポリビニールイミダゾリン及び若干のイミノ置換ポリホスファジンである。ポリマーのアンモニウムまたは四級塩も、主鎖窒素またはペンダントイミノ基から形成され得る。
ポリホスファゼンは、交互にあるシングル及びダブル結合によって分離された窒素及びリンから構成された主鎖を有するポリマーである。各リン原子は、二つの側鎖（”Ｒ”）に共有結合されている。ポリホスファゼン中の繰り返し単位は、一般式（Ｉ）を有する：
0004002299.tif 000002
ここに、ｎは整数である。
架橋結合のために適当なポリホスファゼンは、酸性であり、２または３価カチオンと塩橋を形成し得る多数の側鎖を有する。好ましい酸性側鎖の例は、カルボン酸基、およびスルホン酸基である。加水分解安定性ポリホスファゼンは、Ｃａ2+またはＡｌ3+のような２価または３価カチオンによって架橋されるカルボン酸基を有するモノマーから形成される。イミダゾール、アミノ酸エステルまたはグリコール側鎖基を有するモノマーを導入することによって、加水分解で分解するポリマーを合成できる。例えば、ポリアニオン性[ビス（カルボキシルアトフェノキシ）]ホスファゼン（ＰＣＰＰ）を合成することができ、この者は室温またはそれ以下において、水性媒質中の溶解多価カチオンで架橋結合されて、ヒドロゲルマトリックスを作る。
生分解性ポリホスファゼンは２種の異なるタイプの側鎖、すなわち、多価カチオンと塩橋を形成し得る酸性側鎖、及びｉｎ ｖｉｖｏ条件下加水分解する側基、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール及びグルコシルである。ここで使用される生分解性なる用語は、所望の応用（普通はｉｎ ｖｉｖｏ治療）において、一旦約２５℃−３８℃の温度を有するｐＨ６−８の生理溶液に曝されたときに、許容し得るある期間で溶解または分解するポリマーを意味し、約５年以下、最も好ましくは、約１年以下で、溶解または分解するポリマーを意味する。側鎖の加水分解は、ポリマーの崩壊をもたらす。加水分解性側鎖の例は、非置換または置換のイミジゾール及びアミノ酸エステルであって、基がアミノ結合を介してリン原子に結合しているもの（両Ｒ基がこのように結合しているポリホスファゼンポリマー）である。ポリイミダゾールホスファゼンについては、ポリホスファゼン主鎖上のＲ基のいくつかが、環窒素原子を介して主鎖中のリンに結合されたイミダゾール環である。その他のＲ基は、加水分解に参加しない有機残基、メチルフェノキシ基、またはＡｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１０：８２４−８３０（１９７７）の科学文献に記載されているその他の基のようなものである。
種々のタイプのポリホスファゼンの合成及び分析方法は、Ａｌｌｃｏｃｋ Ｈ．Ｒ．等のＩｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ．１１，２５４８（１９７２）；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ１６，７１５（１９８３）；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９，１５０８（１９８６）；ＡｌｌｃｏｃｋらのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９，５００（１９８８）；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１，１９８０（１９８８）；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＩｎｏｒｃｒ．Ｃｈｅｍ．２１（２），５１５５２１（１９８２）；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ２２，７５（１９８９）；Ａｌｌｃｏｃｋ等の米国特許４、４４０、９２１、４、４９５１７４および４、８８０、６２２；Ｍａｇｉｌｌ等の米国特許４、９４６、９３８；及びＧｒｏｌｌｅｍａｎ等のＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅ ｌｅａｓｅ ３，１４３（１９８６）に記載されており、これらの教示は、参考として特にここに導入される。
前記のその他のポリマーの合成方法は、当業者に公知である。例えば、Ｃｏｎ ｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＰｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ ｓ，Ｅ．Ｇｏｅｔｈａｌｓ編集（Ｐｅｒｇａｍｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ１９８０）参照。ポリ（アクリル酸）のような多くのポリマーが市販されている。
電荷のある側鎖を有する水溶性ポリマーは、そのポリマーを、反対電荷の多価イオンを含む水性溶液と反応させることにより架橋結合され、ポリマーが酸性側鎖を有するならば、多価カチオンあるいは、ポリマーが塩基性側鎖を有するならば、多価アニオンを用いる。ヒドロゲルを形成するのに酸性側鎖を有するポリマーの架橋結合のために好ましいカチオンは、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、及び錫のような２価及び３価カチオンであり、アルキルアンモニウム塩、例えば
0004002299.tif 000003
のようなジ−，トリ−またはテトラ−官能性カチオンも使用できる。これらのアニオンの水性溶液は、ポリマーに添加されて、柔らかい、高度に膨潤したヒドロゲル及び膜を形成する。カチオンの濃度が高いほど、あるいは結合価が大きいほど、ポリマーの架橋結合度が高くなる。０．００５Ｍのような低い濃度で、ポリマーを架橋結合させることが判明した。
ヒドロゲルを形成するのにポリマーを架橋結合させるのに好ましいアニオンは、低分子量ジカルボン酸、例えばテレフタル酸、サルフェートイオン、カーボネートイオンである。これらのアニオンの塩の水性溶液が、ポリマーに添加されて、カチオンの場合のように柔らかい、高度に膨潤したヒドロゲル及び膜を形成する。生相容性ポリマーおよび架橋結合剤は、任意の生理的に相容性の溶媒中に溶解し得る。例えばここでは共通培地Ｍ−１１９を代表溶媒として用いる。
種々のポリカチオンを、ポリマーヒドロゲルを錯化し、安定化して半透性表面膜とするために使用できる。３，０００−１００，０００の好ましい分子量を有するアミンやイミンのような塩基性反応性基を持つポリマーが、使用できる物質の例であり、例えば、ポリエチレンイミン及びポリリシンである。これらは市販されている。一つのポリカチオンは、ポリ（Ｌ−リシン）であり、合成ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニールアミン）及びポリ（アリルアミン）である。また多糖類，チトサンのような天然ポリカチオンもある。
ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基と反応して半透膜を形成するのに使用できるポリアニオンとしては、アクリル酸、メタクリル酸及びアクリル酸のその他の誘導体のポリマー及びコポリマー、スルホン化ポリスチレンのようなペンダントＳＯ3Ｈ基を有するポリマー、およびカルボン酸基を有するポリスチレンがある。
本発明における移植剤中で使用が意図されているポリマーには、ここに記載されているヒドロゲルと同様な粘弾性であるヒドロゲルを適当な条件下で形成するその他の天然、合成または変性バイオポリマーを包含する。適当なバイオポリマーとしては、例えば変性アルギン酸塩及びその他のバイオぽりまーがある（例えば、Ｐｕｔｎａｍ ＡＪ；Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ（１９９６）”Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｊｃｉｎｅ，２（７）；８２４−８２６，（１９９６）；Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９６），”Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍａｔｒｉｘｅｓ”，Ｂａｊｐａｉ，Ｐｒａｐｈｕｌｌａ Ｋ（Ｅｄ），Ｐｒｏｃ．Ｓｏｕｔｈ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．Ｃｏｎｆ．，１５ｔｈ，ＩＥＥＥ，ＮＹ，１９９６；及びＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．及びＤ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ａｔａｌａ等編集”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，１９９７，ＩＳＢＮ；０８１７６３９１９５を参照）。
アルギン酸バイオポリマー組成物
好ましい態様において、本発明方法は、酸性バイオポリマーの多価カチオンによる架橋結合によりヒドロゲルを形成することを含み、その際に多価カチオンの有効利用性が弱溶解度塩を溶解させて制御される、可溶性カチオンが架橋結合によって吸収されるにしたがって、可溶性カチオンを補充するためである。多価カチオンの一部は充分溶解度塩によって与えられ、自由に利用できる（速架橋結合イオン）、一方完全架橋結合のために必要な多価カチオンは、弱溶解度塩（遅架橋結合イオン）によって与えられる。この態様に好ましいポリマーは、アルギン酸塩である；しかしながら、本発明の方法は、バイオポリマーであるκ−カラゲナンのような様々な酸性ポリマーにも適用することもできる。以下の説明においてアルギン酸塩は、任意な適切なポリマーの代表である。
好ましいバイオポリマー（アルギン酸塩）と使用するために、好ましい多価イオンは、カルシウムである。ここで、本発明の、架橋カチオンを供給するための多価カチオン源を用いて（ここで、カチオン源は、溶解度が異なるものが選択される）ゲル化の性質と最終的なゲル特性を制御するための方法を、代表的な架橋剤としてカルシウムおよびカルシウム塩を用いて説明する。同様の性質を有するその他の多価イオンは、当然ながら、本発明の予想範囲内である。また、本発明によって提供される組成物は、好ましくは、多価カチオンに応じた可溶性の緩衝系も含み、上記カチオンが二価または三価の金属イオンである場合、通常はリン酸塩である。リン酸塩とアルギン酸塩とは、金属に関して競合するが、それによって、組成物の成分が混合される際に、限定された量の利用可能なカチオンに関してアルギン酸アニオンとリン酸アニオンとが競合し、組成物中でのアルギン酸塩の架橋が先取りされるようになる。
代表例において、生相容性酸性バイオポリマーのアルギン酸塩は、少量の充分可溶性塩化カルシウム及び多量の弱可溶性硫酸カルシウムによって架橋結合される。ヒドロゲルが形成される組成物は、リン酸イオンを比較的高濃度で含み、可溶性カルシウムイオン濃度を緩衝し、アルギン酸塩の完全架橋結合を妨げる。組成物が所望の部位で注入されると、リン酸イオンは周囲の生体液中へ拡散することにより希釈されてしまい、可溶性カルシウムイオンの濃度が局部的に増加する。可溶性カルシウムイオンの濃度が増加するにつれて、アルギン酸塩中で更なる架橋結合をカルシウムが与え、ヒドロゲルが硬化する。類似の金属イオンについても、リン酸アニオンまたはその他の類似の系（例えば、類似の方法で可溶性カチオン濃度を緩衝する生体適合性の金属イオン封鎖剤）で緩衝することによって同様の作用が得られる可能性がある。
アルギン酸塩は、海草から得られるポリマンヌロネート及びポリグルロネートのストレッチの共合体である。適当なアルギン酸塩が市販されている。個々のアルギン酸塩調剤はマンヌロネート：グルロネート（Ｍ／Ｇ）の関数である測定可能な結合用カルシウム容量を有する。Ｍ及びＧ残基の比の変化からもたらされる効果は米国特許４，３５２，８８３号に記載されている、これを参考のためここに導入する。適当な高精製アルギン酸塩は３５／６５のＭ／Ｇ比を有する。
アルギン酸塩は、室温で、水中において２価カチオンによりイオン的に架橋結合され、ヒドロゲルマトリックスを形成することができる。このような穏和な条件のために、アルギン酸塩は、例えばＬｉｍの米国特許４，３５２，８８３号に記載されるようにハイブリドーマ細胞カプセル化のために最も一般的に用いられているポリマーである。Ｌｉｍのプロセスでは、カプセル封入しようとする生物学的材料を含む水溶液を、水溶性ポリマー溶液に懸濁し、この懸濁物を液滴状にし、この液滴を多価カチオンと接触させることによって個々のマイクロカプセルに形成し、次に、このマイクロカプセルの表面をポリアミノ酸で架橋し、カプセル封入された材料の周囲に半透過性の膜を形成する。
ヒドロゲル態の細胞／ポリマー系は、組織処理（エンジニヤリング）のために用いられ、例えば、ヒドロゲル形成を開始させるためにカルシウム塩が添加されたアルギン酸塩溶液中の軟骨細胞のような細胞懸濁物がある。これらの系の典型は、軟骨細胞／アルギン酸カルシウム溶液であり、単離された細胞懸濁物をアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、０．１ＭのＫ2ＨＰＯ3中に、０．１３５ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）とかき混ぜ１．０％アルギン酸塩溶液中に２０Ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度（野生のウシ関節の軟骨の細胞密度の約５０パーセントの細胞密度）を生じさせる。軟骨細胞−アルギン酸ナトリウム懸濁物は使用するまで４℃で氷上に保存しそして注入前に冷軟骨細胞−アルギン酸塩溶液１ｍＬあたり０．２ｇの滅菌ＣａＳＯ4粉末を添加する。
架橋イオン源として硫酸カルシウムを用いた、配合のゲル形成の特性に関する研究によれば（例えば実施例１を参照）、このような配合物は、ヒトの体温では僅か１６分でゲル化が可能であるが、室温では容易にゲル化しないことが示されている。アルギン酸塩／細胞懸濁物の温度が、妥当な時間内（すなわち、手術室中で、時間ではなく分のレベルで）にゲル形成が開始されるような温度に上昇した場合、組成物のコンシステンシィが注射に適した状態にあるのは、ほんの数分である。このような配合物が室温でゲル化することを防ぐには、注射の前に配合物をインキュベートするための加熱器具の使用が必要である。加えて、混合および注射の問題は、ＣａＳＯ4粒子周囲に、溶液中のＣａ+2の移動を妨げるゲルが形成され、さらに、アルギン酸塩がカプセル封入されたＣａＳＯ4の塊が形成されて注射器のカニューレを介した注射が妨げられることによって発生する。それゆえに、懸濁物中のさらに迅速なゲル化領域によって形成された塊をふるい分けするために、注射器にフィルターを取り付ける必要がある。これらの特徴は、この配合の臨床での適用における複雑さを増大させ、あらゆるロット間の運搬におけるコンシステンシィとゲル化特性を達成することを難しくしている。
混合物を加熱する必要性及び注射器にフィルターを加える必要性を回避するため、本発明者は組織処理で使用される注入可能ヒドロゲルのための新処方を開発した。この処方は、迅速なゲル形成及びゲル懸濁物の長い注入可能性を与え、より一層一貫した性能を与える。
注射の際に組織平面を分離させるのに十分なコンシステンシィを迅速に形成し、注射器のカニューレが閉塞する問題を回避しつつ溢出を予防するために、本発明は、架橋多価カチオンの２種の源を含むヒドロゲル形成組成物を提供する：ここで、この２種の源とは、一つは、少量のカチオン源（十分に利用可能なカチオンを提供する）、および、もう一方は、多量のカチオン源（ゲルが形成されるにつれて架橋イオンの徐放性を提供する）である。第一のカチオン源は、高い水溶性を有する塩であり、すなわち、少なくとも１ｇ／１００ｍｌ、好ましくは少なくとも３０ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは少なくとも６０ｇ／１００ｍｌの溶解度を有する。特に好ましくは、カルシウム塩であり、例えば塩化カルシウムである。第二のカチオン源は、弱溶解性塩であり、すなわち、１ｇ／１００ｍｌ未満、好ましくは０．５ｇ／１００ｍｌ未満、より好ましくは０．３ｇ／１００ｍｌ未満の溶解度を有する。特に好ましくは、カルシウム塩であり、例えば硫酸カルシウムである。冷水及び熱水（１００℃）での硫酸カルシウム２水塩（ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ）の溶解度は、それぞれ２．４１及び２．２２ｍｇ／ｍＬである。また、塩化カルシウムおよび硫酸カルシウムに類似した水への溶解度を有する多価カチオンのあらゆる２種の塩も、本発明での使用にそれぞれ適している。どちらかの塩単独でも十分な架橋カチオンを提供して十分硬化したアルギン酸塩ヒドロゲルを生産することもあるが、２種の塩の使用により、架橋作用が長期にわたって延長され、それによって部分的に硬化されたヒドロゲル（弱く架橋されたヒドロゲル）が、カニューレを介した注射に適したコンシステンシィを有するようになる期間を拡大させる。
塩化カルシウムが好ましい「迅速な」Ｃａ+2源の一つであり、その高い溶解度のためにアルギン酸塩のゲル化をスピードアップさせることができる。同等の溶解度を有するその他のカルシウム塩が、同様の様式で作用する。ＣａＣｌ2単独で作用するかどうかを決定するために、実験を行った。１．０〜６．６ｍｇ／ｍＬの濃度範囲を試験したところ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏの濃度が３．３ｍｇ／ｍＬに等しいか、またはそれより高い場合、アルギン酸塩とＣａＣｌ2溶液との境界面でアルギン酸塩が即座にゲル化したが、２．７ｍｇ／ｍＬに等しいか、またはそれより低い場合、アルギン酸塩を１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度で用いた場合、全くゲル化しようとしなかったため、ＣａＣｌ2単独では、ヒドロゲルを架橋させるには不適切であることを発見した。アルギン酸塩濃度と望ましいゲル強度に応じて、ＣａＣｌ2は、０．５ｍｇ／ｍＬ〜３．０ｍｇ／ｍＬの範囲が考えられる。
典型的なアルギン酸ナトリウムと化学量論的に反応させるのに必要なＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏの量は、アルギン酸塩１ｍｇあたり０．３０９ｍｇである。典型的な既知の硫酸カルシウムで架橋された配合物は、アルギン酸ナトリウム１ｍｇあたり２０ｍｇのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ粉末、または、必要量の約６５倍を使用している。しかしながら、混合および注射の問題は、ＣａＳＯ4粒子周囲に、溶液中のＣａ+2の移動を妨げるゲルが形成され、さらに、アルギン酸塩がカプセル封入されたＣａＳＯ4の塊が形成されて注射器のカニューレを介した注射が妨げられることによって発生する。
必要な時間内で許容できるコンシステンシィの均一なゲルを生産する比率が好ましい。ＣａＳＯ4／ＣａＣｌ2の好ましい割合は、ポリマー（例えば、アルギン酸塩に関するＭ／Ｇ比）、ゲル化に必要な時間、必要な組織強度などに依存する。一例として、アルギン酸塩１ｇあたり０．３０９ｇのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏと結合できるアルギン酸ナトリウムにとって、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ／ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ／アルギン酸塩の割合は、１：１０：１０が可能であり、好ましくは、配合物中に存在する所定のリン酸塩の量と一致している。
適切な組成物としては、室温で約１４分間で、許容できるコンシステンシィのゲルが生じる比率を有するものが可能である。アルギン酸塩３０ｍｇあたり約３ｍｇの塩化カルシウムと３０ｍｇの硫酸カルシウムを示すＣａＳＯ4／ＣａＣｌ2の割合は、アルギン酸ナトリウム１ｇあたり０．３０９ｇのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏと結合するアルギン酸塩との使用に適している。当業者であれば、様々なカルシウム結合能を有するアルギン酸塩の化学量論は容易に決定することができ、さらに、弱溶解度で大量の可溶性の塩の類似のモル比を計算して、これらの代わりの塩の適切な量を決定することができる。アルギン酸塩のＭ／Ｇ比は、Ｃａ結合能を決定する。好ましくは、アルギン酸塩、十分な可溶性の塩および弱溶解度塩、ならびに、場合により可溶性金属イオン封鎖剤の相対的量は、混合物が２０分間以内にゲルを形成し、そのゲルが重力に抗してその形状を保持すると予想されるが、少なくとも４時間（この時間は、室温で混合物をインキュベートするための時間である）は注射器のカニューレを閉塞させることなく注射が可能になるような量と予想される。
上述したように、遅延性の可溶性カチオン源のみを用いた配合物は、アルギン酸塩がカプセル封入された塊に、溶解していない塩と、回収して注射することができるより液状の部分との成分の分配を起こす。このような生成物は、コンシステンシィの点で再現性が低く、十分な特徴付け、十分な制御ができないか、または、変更されて最終配合物に各種の特性を与える可能性がある。迅速な可溶性のカチオン源の使用も同様に、十分に架橋されたゲルが部分的に形成されるにつれてカチオンを混合物全体に分布させることができない場合、仕切りを形成する可能性があり、容易に注射できない。これらの問題は、弱溶解度と大量に利用可能な多価カチオン源とを両方添加することによって回避される場合もある。しかしながら、発明者等は、過剰なカチオン結合能を与えるカチオンを封鎖するアニオンの存在下で、アルギン酸塩を２種のカチオン源と混合することによって、現存するゲルを上回る改善：極めて均一な混合、および、全体にわたり制御された、かつ一様の特性を有する、完全に注射可能な一貫した懸濁物の製造を示す最終配合物が製造されることを発見した。
その結果として、本発明に係るヒドロゲル形成組成物は、場合により、バイオポリマーに利用可能な架橋カチオンの量を緩衝すると予想される成分を含む。緩衝成分は通常、アニオン性金属イオン封鎖剤であり、例えばリン酸アニオンである。アルギン酸塩の迅速で完全な架橋は、Ｃａ+2の結合においてアルギン酸塩と競合する配合のＰＯ4アニオンで妨害され、それにより、ゲル化速度は大きく減少する。リン酸アニオンは、典型的には、約０．１Ｍで存在するが、リン酸濃度は、ゲル化時間を制御できるように０．０３Ｍ〜０．３Ｍの範囲で様々であってよい。また、同様の方法でカルシウムに関してアルギン酸塩と競合すると予想され、そのためにアルギン酸塩がカプセル封入された塩の粒子の形成を予防するその他の生体適合性の金属イオン封鎖剤も本発明で考慮される。
過剰なカチオン結合能力、および、その利用可能なカチオンに関するアニオンとアルギン酸塩との競合は、懸濁物全体にわたり完全な利用可能なカチオンの分配を可能にする。その生成物は、全体にわたり均質であり、一貫して生産され、は、従来の試験プロトコールによって特徴付けが可能であり、生成物を損失させることなく適用に完全に利用可能であり、および、望ましい特性（例えば粘度、ゲル強度、ゲル化時間など）が付与されるように調節することができる。この混合において均一性は、様々な混合様式（例えば、試験管中、磁気式および機械式撹拌器での、混合注射器内での、ボルテックス混合またはハンドミキシングなど）で実証されている。
アルギン酸塩の分解速度は十分に文書で示されておらず、例えば、架橋方法、アルギン酸塩のタイプ、および、投与部位に依存する。所定のアルギン酸塩ゲル配合物は、人体中では、多糖類を認識する酵素が欠けているため極めてゆっくりしか崩壊する。その上、アルギン酸塩は、その分解速度を増加または減少させる様々な物質で修飾および／または架橋することができる。アルギン酸塩は、組織の空間または空隙に注射または適用することができ、さらに望ましい形状に順応するように成形または鋳型加工することができる弱いゲルが製造されるように、２種のカルシウム源を用いて架橋することができる。適切な組成物の製造（ただし、本発明の配合における細胞の添加が省略される場合を除く）が、米国出願番号０８／７６２，７３３で詳細に説明されており、これは、参照によりその全体を開示に含む。
本明細書で説明されている配合物に対するアルギン酸塩の分解と線維形成反応の特徴を合わせると、本発明は、注射された際の寸法を維持し、移動せずに、さらに、現在の組織充填剤より著しく長い期間持続させることが可能な、永続的な組織様の本体を製造する。特に有益な特徴は、この材料は、様々な寸法の針を介して注射可能であることであり、それにより、わずかな外科的処置を介入させるだけで膀胱鏡または内視鏡の適用が可能になる。
細胞源
本発明の組成物は、多数の細胞の効率的な移行のため、及び新組織または組織均等物の創出の目的で移植体接合の促進のために三次元の骨組み内で、遺伝子変更細胞を包含する多重細胞タイプを与えるのに使用できる。それは新組織または組織均等物が生長している間に宿主免疫系を排除することにより、細胞移植体の免疫保護のためにも使用できる。
ここに記載されているように移植できる細胞の例としては、軟骨細胞及び軟骨細胞を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨芽細胞を形成するその他の細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞ならびに器官細胞があり、また単離幹細胞の拡張物も含まれる。本明細書で用いられる場合、器官細胞とは、肝細胞、小島細胞、腸源細胞、腎臓から誘導された細胞、ならびに物質を合成し、分泌しまたは代謝する作用を主とするその他の細胞が包含される。
注入可能ヒドロゲルに含臓されるべき細胞は、ドナーから直接に、ドナーからの細胞の細胞培養から、または確立された細胞培養ラインから得られる。好ましくは態様において、細胞は、ドナーから直接得て、洗浄され、ポリマー物質と組合せて直接に移植される。細胞物質は、解離された単細胞でも、集塊組織（すなわち集合細胞の塊）または解離細胞から試験管内で生じた細胞集合体であってもよい。細胞は、組織培養の当業者に公知の方法で培養できる。
注入後の細胞持続性及び生存性は、走査電子顕微鏡、組織学、及びラジオアイソトープでの定量分析によって測定できる。移植細胞の機能は、上記の技法及び機能測定の組合せによって測定できる。例えば肝細胞の場合に、生体内肝機能研究は、患者の共通胆汁ダクト内にカニューレを配置することによって行うことができる。それにより胆汁は少量づつ捕集できる。胆汁色素は、基本テトラパイロールスを観察する高圧液体クロマトグラフィーにより、あるいは、Ｐ−グルクロニダーゼでの処理または処理なしで、ジアゾ化アゾジパイロールスエチルアンスラニレートとの反応によりアソジパイロールスへ転化した後に薄層クロマトグラフィーにより分析できる。ジコンジュゲート化、またはモノコンジュゲート化ビリルビンも、結合胆汁色素のアルカリンメタノリシスの後に薄層クロマトグラフィーにより測定できる。一般に、機能する移植肝細胞の数が増すにつれて、コンジュゲート化ビリルビンのレベルが増大する。また簡単な肝機能試験は、血液試料において、アルブミン産生のような項目が実施できる。
同様な器官機能試験は、移植後の細胞機能の程度を測定するために、当業者に公知の技法で実施できる。例えば、膵臓の小島細胞は、糖尿病を治すためにインスリンの適切な分泌によってグルコース調節を達成するのに、肝細胞を移植するのに特定的に使用するものと同様な方式で分配できる。その他の内分泌組織も移植できる。標識グルコースを用いての研究、ならびにタンパク分析を用いての研究はポリマー骨組み上の細胞マスを定量するのに使用できる。これらの細胞マスの研究は、どれが適切な細胞マスであるかを決定するために、細胞機能研究と相関させうる。軟骨細胞の場合に、機能は、周囲の結合した細胞のための適当な支持体を与え得る軟骨マトリックス成分（例えば、プロテオグリカン類、コラーゲン類）の合成として定義される。
また、軟骨細胞の前駆細胞、または、多分化能性幹細胞から誘導された軟骨細胞に分化する能力を有する細胞を、軟骨細胞の代わりに用いることもできる。例としては、分化して軟骨細胞を形成する線維芽細胞または間葉幹細胞が挙げられる。本明細書で記載される用語「軟骨細胞」は、このような軟骨細胞の前駆細胞を含む。
混合プロトコール
部分硬化コンシステンシイを有するヒドロゲルを形成するのに反応させる成分についての添加の順序は大きく変化されうる。典型的には、任意に金属イオン封鎖アニオンを含有するアルギン酸塩は、一またはそれ以上の段階でカチオン源と混合される。一般に、生分解性液体ポリマー、例えば次の多価イオン塩との混合時に制御された割合で固化させるように設計されたアルギン酸塩が使用される。個々の成分の濃度及び混合インキュベーションの条件の変化は、（ａ）注入時の材料のコンシステンシイを制御するため、（ｂ）注入可能コンシステンシイを達成するのに必要とされる時間を制御するため、そして（ｃ）適切なキメ及び寸法保持のために受容組織の特定の要件に適合するように生体内最終細胞の性質を制御するために改変しうる。
個々の成分の濃度は、単独または組合せで、適用の前及び後の両方で配合物の種々の性質を変更して、（ａ）注入及び適用のため、（ｂ）移植体の良好な接合ならびに最終ゲル及び交換組織の所要の性質及び機能の創出のため、あるいは（ｃ）配合物の製造、分配及び患者への適用のために、特定の要件に適合するようにできる。例えば、詰った組織（例えば筋肉、皮下）へのヒドロゲル配合物の注入は、材料の流出を防ぐために高粘度を必要とする。粘度の変更は、（１）原料の粘度の選択（例えば、低、中または高粘度アルギン酸塩）、（２）ゲルの濃度（例えば、広範囲のゲル粘度を達成するために０．３％〜３．０％のアルギン酸塩の範囲を使用できる。）、（３）部分架橋結合度を制御するための多価カチ才ン源の量、または（４）カチオン結合のためにアルギン酸塩と競合するために与えられるアニオン濃度、のような多くの機構を、単独または組合せることにより達成できる。種々の細胞タイプによる移植体への良好な侵入、あるいは創出されるべき所望の交換組織の性質は、配合物成分の変更を必要とする。例えば、硬い詰った組織（例えば肝臓、軟骨）の創出は、より大きなポリマー鎖長または濃度（例えば＞１．５％アルギン酸塩及び／または高グルロン含量アルギン酸塩）を必要とする。
注入可能時間及び注入前の配合物の性質の制御は、本発明による治療物の製造、分配及び適用の助けとなる。最終配合物の加工時間、または注入可能コンシステンシイまで配台物を固めるのに必要とされる時間は、多くの方法、例えば与えられる高溶解性カチオンの量及び／またはカチオン結合の競合のために与えられるアニオンの濃度により、さらには濃度調節により、制御できる。例えば、注入可能コンシステンシイの時間は、温度によって、数分間の加工時間（３４〜３８℃）または１月以上（４〜８℃）を許容するように制御できる。温度は、ゲル形成速度において、非常に重要な役割を果たす。温度を上昇させると、例えば３７℃の温度の組織中へ材料を注入するときに起こるように温度を上げると、材料は硬化を進行して、完全架橋結合ヒドロゲルになる。実施例１に示されたように０．１ｘのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏのレベルにおいて（すなわち配合バッチにおいて２０ｍｇ／ｍＬ）、部分硬化ゲルは体温で３２分間で固まり、少なくとも９０分間注入可能である。この３７℃でのＣａＳＯ4の最良の場合は、注入可能コンシステンシイに達するまでになお過大な時間を必要とし、所望されるものよりも繁雑でありまた所望されるものと矛盾する。
カチオン源は、ゲル化及びゲルの性質を制御するのに選択でき、また分解を制御するのに組み合わせができる。迅速及び遅延架橋結合源を含む本発明による組成物は、硫酸カルシウムのみの配合物と比較して、より迅速な粘度上昇、及び完全架橋されるまでにより長い時間を与える。殊に好ましい態様において、部分硬化ヒドロゲルを形成する混合物は、著量のリン酸アニオンも含むであろう。典型的には、リン酸濃度は約０．１モルであろう。
アルギン酸塩の濃度を増加すると、ゲルがより多くの水を保持する助けとなり、その結果として、より濃厚なペースト及びより強いゲルが得られ、またゲル形成を加速する。好ましいアルギン酸塩レベルは、ヒドロゲルを形成する最終細胞含有懸濁物中で、少なくとも０．７５％、さらに好ましくは１．５％〜２．５％、そして３．０％までである。
本発明の好ましい具体例において、酸性バイオポリマーは、アルギン酸ナトリウムであり、充分可溶性塩は塩化カルシウムであり、そして弱可溶性塩は硫酸カルシウムである。アルギン酸塩は溶液少なくとも０．７５重量％、好ましくは約１．５％の量で存在する。自由溶解性塩は１０〜１５ｍＭのカルシウムイオンを与え、一方弱溶解性塩は、アルギン酸塩溶液中に、もしも完全に溶解されたならば約８倍のカルシウムイオンを供給する量で、分散された粉末の状態で与えられる。換言すれば、二つの塩によって、２価金属架橋結合剤として供給され、すなわち重量で１部：１０部の重量比の塩化カルシウム及び硫酸カルシウムの二つの塩によって与えられる。ヒドロゲル懸濁物を製造する好ましい方法において、２％アルギン酸塩溶液の９部がＭ−１９９のような適当な細胞懸濁媒体の２部と混合され、次いで１．８％の無水塩化カルシウムを含む同じ細胞懸濁媒体に１８％の硫酸カルシウムを懸濁させたもの１部と混合される。最終混合物は良く混合され、組織中への注入のために使用される。粘度の迅速な増加は、全成分を一緒に混合して１５分以内に起こると予想される。この混合物のコンシステンシイは、混合物の形成が重力に抗して保持されるように充分であるべきであるが、少なくとも２４時間は室温において注入可能のままであろう。
注入可能応用のために好ましい粘度は意図された用途によって変るが、（ａ）配合物容器（例えば注射器寸法、ピストン直径、適切な可触のために必要とされる抵抗、または適用速度）、（ｂ）適用装置（カテーテルまたは針の長さ、直径、組成）、（ｃ）受容組織の分離抵抗及び（ｄ）必要とされる分配タイプ（例えば骨または器官表面への局所適用、流出しなでの組織内への注入等）の種々のパラメーターのバランスである。
本発明の意図の範囲には、本発明の組成物の調製及び注入に使用するキットがある。そのようなキットは、組成物の成分を一つまたはそれ以上の容器に収容してあり、処方容器（例えば混合容器または注射器）及び／またはゲル破壊オリフィス（例：カニューレまたは注射針）が含まれる。
治療用途
典型的には、ヒドロゲル溶液は、患者の部位に直接注射され、そこでヒドロゲルが移植材を形成し、周囲組織から線維形成反応を誘導する。線維形成反応によって形成されたゆるい結合組織は、ヒドロゲル粒子を所定位置に保持し、組織形成に血管新生が付随して起こり、血管新生を起こした軟部組織本体が生成し、その容積を占めるコンシステンシィは移植の際に確立される。このようなヒドロゲル移植は、移植材料をその場で鋳型加工することなどの多種多様な再建術に用いることができ、３次元的な組織の欠陥を再建することができる。
あるいは、細胞は、本発明のヒドロゲル組成物に含まれていてもよいし、患者の部位に直接注射してもよく、そこで、ヒドロゲルが、細胞を分散させるマトリックスに硬化する。その他の代替法において、細胞をバイオポリマー溶液に懸濁してもよく、ここで、この溶液を、望ましい解剖学的な形状を有する固定式または膨張式の鋳型に注ぐか、または注射し、続いて硬化させ、細胞を分散させるマトリックスが形成され、これを患者に移植することができる。移植の後に、本ヒドロゲルは、最終的には分解し、生じた組織だけが残留する。このようなヒドロゲル−細胞混合物は、３次元的な組織の欠陥を再建するため、注文に応じて細胞の移植材料を鋳型加工すること、予め挿入された膨張式鋳型または骨組みを充填すること、同様に、一般的には組織移植などの多種多様な再建術に用いることができる。本発明は、このような、本発明に係る組成物を用いた移植を想定している。
軟骨細胞、好ましくは自己由来の軟骨細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで液状の生分解性、生相容性のポリマー物質（例えば凝固可能なアルギン酸塩、またはその他のキャリアー）と混合し、細胞懸濁物を形成する、膀胱尿管逆流および失禁の治療が説明されている。本発明のヒドロゲル懸濁物を、尿路に必要な制御を提供する組織の本体の形成を誘導するのに有効な量で、逆流が起こっている領域、または、充填剤が必要な領域に注射してもよい。このような懸濁物は、カルシウム塩と接触した場合に制御された速度で凝固するように設計された生分解性の液状ポリマー（例えばアルギン酸塩）、グルロン酸とマンヌロン酸とのコポリマーを含む。このようなヒドロゲル組成物は、望ましい部位に注射され、そこで、欠陥を直すための組織様の本体が形成される。また、本発明に係るヒドロゲル組成物は、周囲組織からの細胞の浸潤を補うために、軟骨細胞のような細胞を含んでいてもよい。この細胞の懸濁物には、採取され、高密度になるまで成長させ、必要に応じて時間経過させ、続いてカルシウム塩と接触した場合に制御された速度で凝固するように設計された生分解性の液状ポリマー（例えば、アルギン酸塩、グルロン酸とマンヌロン酸のコポリマー）と混合された軟骨細胞が含まれる。このような細胞は、ヒドロゲル形成組成物と混合され、続いて、望ましい部位に注射され、そこで、それらは増殖し、欠陥を直す。好ましいは、自己由来の軟骨細胞であり、なぜなら、この治療方法は、自己由来の細胞を用いるとＦＤＡの承認を必要としないためである。
アルギン酸塩のような弱く架橋されたポリマー物質をベースとするヒドロゲルを、欠陥を直す膀胱粘膜、例えば尿路に必要な制御を提供する膀胱粘膜の隆起が生じるのに有効な量で、欠陥領域に注射することができる。同様に、生分解性ポリマーは、人体内で組織構造を維持するための注射可能な移植材のための合成基材として役立つ。このようなアルギン酸塩懸濁物は、膀胱鏡を用いて容易に注射することができ、さらに、形成された組織は、閉塞をまったく起こすことなく、膀胱尿管逆流を直すことができる。
逆流の内視鏡的治療に理想的な注射可能な物質は、非抗原性、非移動性であり、かつ容積が安定している天然の充填剤と予想される。この手法は、１５分間未満で、マスク麻酔をする短い時間で、外来患者単位で、入院の必要がまったくなく行うことができる。膀胱のドレーンも膀胱周囲のドレーンも必要ない。全ての手法が内視鏡的に行われ、膀胱は外科的処置を受けないため、術後の不快感がまったくない。患者は、ほとんどすぐに正常な活動レベルに戻ることができる。
本明細書で説明されているゲル材料は、滅菌成分から製造された場所で配合され、分離したユニット（これは、混合して最終的なゲル材料を形成することができる）、または、最終的な架橋生成物を含む予め充填された注射器ののいずれかとして医師に供給することができる。
この材料は、声帯麻痺や軟部組織の損傷の空隙のような用途で、現存の組織充填剤（例えばコラーゲンペースト；Ｔｅｆｌｏｎペースト）の代用として用いてもよい。
実施例
本発明のより完全な理解を促進するために、以下に幾つかの実施例を示す。しかし、これらの実施例に開示された具体的な実施態様に本発明の範囲は制限されず、これらの実施例は単に例証の目的のためだけである。
実施例１
硫酸カルシウム濃度のゲル化時間における影響
この実験は、塩化カルシウムの不存在下で硫酸カルシウム濃度を変化させることの影響を示す。０℃、３７℃および室温（２３℃）で、配合物のその他の内容を変化させないで維持しながら、硫酸カルシウム量を０．０２ｇ／ｍＬ（０．１ｘ）〜０．２ｇ／ｍＬ（１．０ｘ）に変動させた。アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ比が３５／６５のＵＰ ＭＶＧ等級、Ｐｒｏｎｏｖａ製）を、０．７９％の塩化ナトリウムを含有する０．１モルリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）の２％溶液として調製した。アルギン酸ナトリウム溶液をＭ１９９細胞培地で１対１に希釈し、硫酸カルシウム粉末を２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲の量で加えた。混合後、試料溶液を、氷浴温度（０℃）、室温（Ｒ．Ｔ．）、または体温（３７℃）のいずれかに保った。マイラーシート上に各試料のアリコットを注入することにより周期的にゲル形成について試験した。
表Ａに結果を示す。ゲル形成時間（Ｘとして示した）および注入阻止時間（記号Ｂ）も示す。表Ａから明らかなように、添加塩化カルシウムの不存在下氷浴上ではゲル形成が観察されなかった。室温では、７０〜１００分の間でゲル形成が起こり、ヒドロゲル注入はその時間の２０分以内で阻止された。３７℃では、硫酸カルシウムの濃度に依存して最初のゲル化が３２分から１６分までに起こり、注入の阻止が最初のゲル化の１５分以内で概ね起こった。
これらの実験は、０℃で、１２０分後までゲル化が起こらなかった（ｎｃ）ことを示す。室温では、０．２ｘについて９０分でゲル化が始まり、１．０ｘについて７０分でゲル化が始まった。体温では、１．０ｘ配合について１６分でゲル化が始まり、ゲル化時間は硫酸カルシウム濃度の減少に伴ってほとんど直線的に減少する。ヒト体温でこの硫酸カルシウム架橋ヒドロゲル配合物は１６分内にゲル化可能性があるが、注入に数分のみしか許されず、それにプラスされて、送達やゲル化特性におけるロット間のばらつきをなくするために加熱装置およびシリンジに装着されるフィルターを加える必要性がある。これらの要求事項の双方とも配合物の臨床用途に複雑性を増しうる。温度はゲル形成速度に非常に重要な役割を果たす。表Ａから、０．１ｘ、すなわち配合されたバッチ中に６０ｍｇのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏの量において、体温で３２分内でゲル化が起こり、少なくとも９０分間は注入できた。３７℃でＣａＳＯ4のこの最もよい場合のシナリオは、注入までに多くの時間がなお必要であり、目標よりもより複雑でありしかもよりばらつきがあることである。
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実施例２
塩化カルシウムと硫酸カルシウムの混合物
好適な配合物では、アルギン酸ナトリウムをｐＨ７．４のＫ2ＨＰＯ4緩衝液に溶解する。Ｍ１９９培地中に細胞を供給し、次いで、アルギン酸塩溶液中に懸濁させた。１．５ｍｌバイアル中に硫酸カルシウム粉末を貯える。Ｍ１９９培地に塩化カルシウムを１８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、別のバイアルに貯える。この応用では、ＣａＣｌ2溶液をＣａＳＯ4粉末と混合し、次いで、アルギン酸塩と混合し、シリンジ中に入れ、約１５分間待ち、この配合物は注入される準備が整う。
ボルテックス上での試験管混合に加えて、この配合物のシリンジ混合が同じゲル化特性を呈したことを示す実験も実施した。配合物中に軟骨細胞を加える実験も行い、それが室温で１４分に成功裡にゲル化したが、さらに２時間以上にわたって注入可能性を維持した。後の実験は、この配合物は２週間以上にわたってその注入可能性を維持できることを示す。表２は、この配合物の成分を列挙する。
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実施例３
ゲル化時間における温度の影響 塩化カルシウム／硫酸カルシウム塩混合物と混合したときのアルギン酸塩のゲル化に要する時間は温度により変動する。アルギン酸ナトリウム（ＵＰ ＭＶＧ等級、Ｐｒｏｎｏｖａ製）を、０．７９％の塩化ナトリウムを含有する０．１モルリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）の２％溶液として調製した。２．２５ｍｌアルギン酸塩溶液を０．５ｍｌのＭ１９９細胞培養培地と混合した。この混合物に、１８ｍｇの塩化カルシウム／ｍｌおよび４５ｍｇの懸濁した硫酸カルシウム粉末を含有する０．２５ｍｌの細胞培養培地を加えた。混合後、各試料を所定の温度に保持し、ゲル形成について周期的に試験した。二試料におけるゲル形成が検出された時間を添付の表に示す。室温で（２０〜３０℃）で、ゲルは１３〜３０分で形成した。３７℃で、７〜８分ゲル形成にかかった。
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実施例４
注入可能なアルギン酸塩ゲルの形成 混合物中の種々の成分の濃度をわずかに変動させてゲル化形成に要する時間の感度を以下に記載するように試験した。アルギン酸ナトリウム、塩化カルシウムおよび硫酸カルシウムの溶液を実施例１および２に記載したとおりにして調製した。但し、一または別の成分を基準値より１６％までプラスまたはマイナスに変動させた。混合後試料を室温に保ち、ゲル形成について周期的に試験をした。
表３にゲル形成時間と注入するのに適したコンシステンシーを維持した期間を示す。表中に、各成分の量について、基準値をＭ、基準値よりも１６％高い値をＨ、そして基準値よりも１６％低い値をＬで示す。これらのパラメーターの変動内で、ゲル化時間が１８分プラスまたはマイナス約１５％は、この範囲内のある特定の成分の変動にわずかしか影響がないことを示す。これらの溶液のすべては約２０分以内でゲル化したが、アルギン酸塩ゲルのコンシステンシーは２４時間後を超えてもなお注入するのに受け入れることができた。同様の方法で調製したこの配合物の試料は配合後１ヶ月を超えても適切な注入可能特性を示した。
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実施例５
ＣａＳＯ4粉末のＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4混合物に対する比較 この実験は２配合物のゲルおよびゲル化プロセスを定量的に特性化し、最終ゲルの強度を定性的に決定するために行う。上述の実験の間、ゲル化およびゲル化するのに要する時間を目視観察により決定した。粘度計を使用することにより、アルギン酸塩がゲル化を開始するときの粘度変化を直接測定でき、ゲルの相対強度も定性的に決定できる。
ＣａＳＯ4粉末によりゲル化したアルギン酸塩を実施例１について記述した通りにして調製し、そしてＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4の混合物によりゲル化したアルギン酸塩を実施例２について記述した通りにして調製した。ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料をシリンジ混合で調製し、ＣａＳＯ4粉末試料をボルテックス混合法を用いて調製した。シリンジ混合は、容易に行うことができしかも非常にばらつきのない生成物を得ることのできる非常に簡便な方法である。それは承認された生物医学器具の使用もでき、生成物が環境にさらされることから分離するクローズドシステムを作り上げる。５℃、２５℃および３７℃の温度におけるこれらの二種類の系のゲル化の過程に伴う粘度変化を測定し、結果を図１〜図３にプロットする。
室温では、ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料がゲル化して１３分で注入できるセットポイント（注入できるセットポイント：崩壊することなく積み重ねができるゲルのコンシステンシー）となった一方、ＣａＳＯ4単独試料は５６分までゲルに硬化しなかった。ゲル化前のＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料の粘度は約６６５ｃＰであり、ＣａＳＯ4単独試料は２０２ｃＰであり、前者は後者の約３．３倍程度の濃さである。アルギン酸塩がゲル化を開始するとき、その粘度は急激に増加し、２分以内で１１００ｃＰから３０，０００ｃＰまでとなる非常に高い値（図１）に達する。ゲル化後、ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料の粘度は、ＣａＳＯ4単独試料の約２倍である（約４０，０００ｃＰ対２０，０００ｃＰ）。
両配合物のゲル化は体温で促進される。ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料は４分でゲル化を開始し、ＣａＳＯ4単独試料は１３分でゲル化を開始する。ゲル化前の粘度は、３７℃でＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料およびＣａＳＯ4単独試料についてそれぞれ約５２０ｃＰおよび１３５ｃＰである。ゲル化後、ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料の粘度は１６，６００ｃｐに達することができ、ＣａＳＯ4単独配合物の粘度よりも約１０倍高く（図２）、ＣａＣｌ2およびＣａＳＯ4の混合はより強力なゲルを生成させ、移植用途により良好な組織分離を可能にすることができる。
ゲル化はより低い温度で非常に遅延する。同様に、ＣａＣｌ2／ＣａＳＯ4試料は、５℃のすべての時点においてＣａＳＯ4単独よりも一層粘度が高い（図３）。
ＣａＳＯ4単独の配合物に比較して、ＣａＣｌ2およびＣａＳＯ4の混合物を使用して、１）３〜４倍より高い最初の粘度；２）注入可能なコンシステンシーに到達するのにより短い時間；３）ゲル化後より高い粘度を与え、したがって、より良好な組織分離を与える。実施例６ 組織適応性および注入性特性を有するアルギン酸塩ゲルの組成物を示すために行われた実験 下の表４に列挙した成分を含有する組成物を調製した。この組成物の粘度は混合直後約１０００Ｃｐだった。混合後約１５分でゲル化が起こり、無傷であるが弱い架橋ゲルを生成した（モジュラス＝６．５９ｋｇｆ／ｃｍ2）。２２ゲージ針を通して注入するとき、ゲルは不規則形態片（「クランブル」）に破砕され、ゲル強度の減少をもたらす（モジュラス＝０．２３１ｋｇｆ／ｃｍ2）。
この物質を正常マウスの皮下部に注入し、６ヶ月間移植組織をモニターした。移植組織の組織学的評価をすると、５０ミクロン〜５００ミクロンの範囲の寸法のクランブルを観察した。移植組織の最初の体積は６ヶ月間持続した。経時の組織学的評価はクランブルを包む宿主から緩い結合組織を示し、皮下部に本明細書に記載した組成物のアルギン酸塩ゲルの注入は注入したゲルフラグメント中またはその周りの緩い結合組織の湿潤を促進させることを示す。このゲルは繊維形成応答の特性を示し、この応答により、結合組織は究極的にゲル物質の注入で形成された量のうち相当割合を占める。
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理解を明確にするために、本発明を、具体的な実施態様に関連させて例証および実施例により、ある程度詳細に記載したが、その他の態様、利点および修正は本発明に関連する技術分野の当業者に明かであろう。前述の記載および実施例は例証することを目的としており、本発明を制限するものではない。本発明を実施するための上述の態様の修正は、医学、形成外科、組織培養および／または関連分野の熟達者に明かであり、それもまた本発明の範囲内であるものとし、この範囲は請求の範囲にのみ制限される。
本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願は本発明に関連する業界の熟達者の水準を示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願を具体的におよび個別に参照として含めると本明細書中に記載した場合と同一の程度を限度として、参照として本明細書に含める。
［本発明の態様］
１．生相容性ポリマーからなる、動物中へ注入するための組成物であって、その生相容性ポリマーが安定な、部分硬化ヒドロゲルを形成することを特徴とする組成物。
２．組成物が、ブロックに成型されたといきに、重力に等しい力の下での流れに抵抗するペーストであり、そのペーストが動物中への注入に適当である、１の組成物。
３．注入可能ペーストが、不規則な形のヒドロゲル粒子の懸濁物から主としてなり、それらの粒子が３０ミクロンから５００ミクロンの直径を有する２の組成物。
４．注入可能ペーストが少なくとも０．１ｋｇｆ／ｃｍ2のゲル強度を有し、粒子中のヒドロゲルが少なくとも３ｋｇｆ／ｃｍ2のゲル強度を有する３の組成物。
５．脆いヒドロゲルを作り、そのヒドロゲルをオリフィスに通して、それによりヒドロゲルが破壊されて不規則な形の粒子を形成することにより、組成物が作られ、その組成物が動物中の組織平面を分離するのに充分なコンシステンシィを維持している粒子を含んでいる、１の組成物。
６．生相容性ポリマーがアルギン酸塩である１−５のいずれかの組成物。
７．多価金属カチオンの高度溶解性塩、多価カチオンの弱溶解性塩をさらに含む６の組成物。
８．高度溶解性塩及び弱溶解性塩が共にカルシウム塩である７の組成物。
９．高度溶解性塩が塩化カルシウムであり、弱溶解性塩が銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫及びジ−、トリ−またはテトラー官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分子量ジカルボン酸イオン、サルフェート及びカーボネートからなる群より選択されるアニオンと、を含む７の組成物。
１０．弱溶解性塩が硫酸カルシウムであり、混合物が塩化カルシウム／硫酸カルシウムを重量基準で０．００７５ないし１．０の比で含む９の組成物。
１１．混合物が重量で少なくとも０．５％のアルギン酸塩、及びアルギン酸塩グラム当たり少なくとも約０．００１ｇの塩化カルシウムを含む９の組成物。
１２．カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を更に含む９の組成物。
１３．金属イオン封鎖剤がホスフェートアニオンを含む１２の組成物。
１４．組成物が生細胞をも含む１−１３のいずれかの組成物。
１５．細胞が軟骨細胞及び軟骨組織を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨を形成するその他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞ならびに器官細胞からなる群より選択される１４の組成物。
１６．細胞が解離細胞及び細胞集合体からなる群より選択される１４−１５のいずれかの組成物。
１７．動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、１−１６のいずれかによる組成物を欠陥の部位で動物中へ移植することからなる該方法。
１８．動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、部分硬化された生分解性、生相容性のヒドロゲルであって、任意に生細胞を含む部分硬化ヒドロゲルを調製し、そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通過させて破壊して、ヒドロゲル粒子を含む懸濁物を作り、その懸濁物を欠陥の部位で動物中に移植する、ことからなり、そのヒドロゲルが移植後に、組織を包囲すること及び移植物の脈管化により、繊維形成応答を誘発する、上記治療方法。
１９．動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、バイオポリマーまたは変性バイオポリマーからなり、任意に生細胞を含む生相容性ヒドロゲルを調製し、そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通して、組織平面を分離させるのに充分なコンシステンシィを有する流動性組成物を作り、そして、その流動性組成物を欠陥の部位で動物中へ移植する、ことからなる上記方法。
２０．動物中へ注入するのに適当であり、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に硬化することになる、部分硬化ヒドロゲルを調製するためのキットであって、２価カチオンにより架橋結合する時にヒドロゲルを形成する、好ましくはアルギン酸塩である、ポリマー、２価の金属カチオンを含む充分な可溶性の塩、好ましくは塩化カルシウム、及び、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫、及びジ−、トリ−またはテトラ−官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分子量ジカルボン酸、サルフェートイオン及びカーボネートイオンからなる群より選択されたアニオンとを、有する弱可溶性塩、好ましくは硫酸カルシウム、からなり、それらの成分が、哺乳動物細胞の懸濁物と一緒にされた時に３０分以内に、注入に適し、１．５％の濃度でポリマー、１．５ｍｇ／Ｌの濃度で充分可溶性塩、そして１５ｍｇ／Ｌの濃度で弱可溶性塩を有する部分硬化ヒドロゲルを形成するように、与えられており、かつ部分硬化ヒドロゲル少なくとも４時間粘度の変化を受けない、上記キット。
２１．１−１６のいずれかによる動物注入用組成物を調製するためのキットであって、（ａ）多価カチオンで架橋結合された時にヒドロゲルを形成することができる生相容性ポリマー、（ｂ）多価金属カチオンの高度溶解性塩、及び（ｃ）多価カチオンの弱溶解性塩、からなる、上記キット。
２２．６−１１のいずれかによる動物注入用組成物を調製するためのキットであって、（ａ）多価カチオンで架橋結合された時にヒドロゲルを形成することができる生相容性ポリマー、（ｂ）多価金属カチオンの高度溶解性塩、及び（ｃ）多価カチオンの弱溶解性塩、からなり、その生相容性ポリマー及び弱溶解性塩が粉末状であり、任意に単一の容器中にある、上記キット。
２３．カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を更に含む２２のキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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