(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を植物細胞に導入することを特徴とする、アルミニウム耐性トランスジェニック植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野に関する。特に遺伝子工学を用いた有用な形質転換植物の作出に関する。
【０００２】
【従来の技術】
世界中の耕地の広い範囲で貧栄養土壌による植物の生育阻害が見られ、作物生産に大きな影響を及ぼしている。このような植物の生育阻害の大きな原因としては、特に、土壌の酸性化に伴うアルミニウム害、即ち、土壌中のアルミニウムが植物の栄養素であるリン酸に結合して植物のリン酸吸収を阻害することによる植物のリン酸欠乏障害が挙げられている。
【０００３】
ところで植物には貧栄養土壌に高い耐性を示す品種が存在する。そして、このような貧栄養土壌耐性の高い品種では、クエン酸やリンゴ酸などの有機酸の分泌が観察されることが報告されている（Miyasaka C.S.et al.Plant Physiol. (1991) 96,737-743)、Delhaize E.et al.Plant Physiol. (1993) 103,695-702、Kochian L.V.Annu Rev.Plant Pysiol.Plant Mol.Biol. (1995) 46,237-260）。また、実際にリンゴ酸の分泌量が高い品種では、アルミニウム耐性が強くなっていることも観察されている（Ryan P.R.et al.Aust.J.Plant Physiol. (1995) 22,531-536）。このことから現象面から見た限りにおいて、植物による有機酸の分泌と貧栄養土壌耐性には何らかの関係があるのではないかと考えられている。例えば、植物により分泌された有機酸が土中のアルミニウムと結合して、リン酸を植物が吸収可能な形態に変化させ、これにより植物がアルミニウム耐性を獲得するのではないかと想像されている。また、有機酸にアルミニウムとキレートを形成させることによってアルミニウムイオンが植物体内に吸収されることを防止し、アルミニウムイオンによる植物体への害を防ぐという機構も構想されている。しかし、これまでに有機酸の分泌が直接的に貧栄養土壌耐性と関係していることを実証した報告例はなく、植物の有機酸の分泌能を高めることにより植物にアルミニウム耐性を付与することに成功した例はない。なお、リンゴ酸などがアルミニウムとキレートを形成することは実験室レベルで確かめられている（Delhaize E.et al.Plant Physiol. (1993) 103,695-702）。
【０００４】
一方、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）はクエン酸やリンゴ酸の合成が行われるTCAサイクルの補充反応に関与している酵素であり、この遺伝子を過剰発現させるとタバコ植物体内のリンゴ酸濃度の上昇が観察されることが報告されている(R. L. Hudspeth et al, Plant Physiol. (1992) 98, 458-464)。しかしながら、該文献記載の研究は、有機酸の分泌によるアルミニウム耐性植物の作出を目的にしたものではなく、C3型光合成をするタバコをC4型光合成の植物に変換することを目的にしており、有機酸の細胞外への分泌については何ら示されていない。即ち、外来性のPEPC遺伝子を植物細胞内で発現させることによって、有機酸を植物細胞外へ分泌させることに成功したという報告例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、有機酸分泌能が高められ貧栄養土壌耐性を有する植物、及び該植物の作出方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子を植物細胞へ導入して該遺伝子を植物細胞内で高発現させることにより、植物による有機酸の分泌能を高め、これにより植物にアルミニウム耐性を付与することができることを見出した。即ち、本発明者らは、有機酸合成を促進する遺伝子の植物細胞への導入により有機酸を人工的に植物細胞外へ分泌させることに初めて成功し、さらに有機酸の分泌が植物のアルミニウム耐性に直接的に関与していることを初めて実証し、これにより本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、高い有機酸の分泌能を有し、アルミニウム耐性のトランスジェニック植物、及び該植物の作出方法に関し、より具体的には、
アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子が導入されたアルミニウム耐性植物細胞、好ましくは、アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子である該植物細胞に関する。また、本発明は該植物細胞を含む植物体に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子を植物細胞に導入することを特徴とする、アルミニウム耐性トランスジェニック植物の作出方法、好ましくは、アルミニウムとキレートを形成する有機酸の合成を促進する遺伝子がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子である該作出方法に関する。
【０００９】
なお、本発明において、「アルミニウム耐性」とは、アルミニウムの存在下においても生長することができる植物（または植物細胞）の能力を指す。また、本発明の「アルミニウム」には、イオン化した形態のもの、塩を形成している形態のものも含まれる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、高い有機酸の分泌能を有し、アルミニウム耐性を有するトランスジェニック植物に関する。本発明のトランスジェニック植物は、有機酸の合成を促進する遺伝子を植物細胞に導入し該植物細胞を再分化させることにより、あるいは直接植物体に遺伝子導入することにより作出することが可能である。
【００１１】
本発明におけるアルミニウムとキレートを形成する有機酸としては、例えば、クエン酸、リンゴ酸などが挙げられる。これら有機酸の合成を促進する遺伝子としては、有機酸の代謝に関わる酵素の遺伝子であれば特に制限はないが、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子などが好ましい。
【００１２】
本発明の有機酸の合成を促進する遺伝子は、適当な発現ベクターに組み込んで、植物細胞または植物体に導入することが好ましい。
【００１３】
発現ベクターとしては、導入遺伝子を植物細胞内で高発現させることが可能であれば特に制限はないが、例えば、pBI121（CLONTECH）、pBI221（CLONTECH）などが挙げられる。
【００１４】
有機酸の合成を促進する遺伝子の導入される植物としては、特に制限はないが、例えば、シロイヌナズナやタバコ等の草本性双子葉植物、イネやトウモロコシ等の単子葉植物、ユーカリやポプラ等の木本性植物などが挙げられる。
【００１５】
植物細胞または植物体への遺伝子導入は、例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法（電気的穿孔法）、アグロバクテリウム感染法等を用いて行うことが可能である。
【００１６】
遺伝子導入された植物細胞は、例えば、文献（Pillon et al.Plant J. (1996) 9,573-577）記載の方法で再分化させることが可能であり、これにより本発明のトランスジェニック植物を作出することが可能である。
【００１７】
なお、形質転換植物体、または形質転換植物細胞は、形質転換に用いる組換えＤＮＡ中にカナマイシンやハイグロマイシン等に対する薬剤耐性遺伝子を組み込んでおけば、これら薬剤を含む寒天個体培地、あるいは液体培地中で栽培あるいは培養することにより、安定的に維持することが可能である。
【００１８】
これにより得られた本発明のトランスジェニック植物は、野生型の植物と比較して高い有機酸分泌能を示す。酸性土壌では土壌中のアルミニウムがリン酸に結合して植物によるリン酸の利用を阻害するが、本発明のトランスジェニック植物はアルミニウムをキレートし得る有機酸を放出することにより、リン酸を吸収可能な形態に変化させることができる。従って、本発明のトランスジェニック植物は、土壌中にアルミニウムが存在する貧栄養土壌においてもリン酸を吸収して生長することが可能である。
【００１９】
なお、本発明のトランスジェニック植物は、周囲のリン酸の有無に関わらず、アルミニウムの植物体内への侵入を防止することが可能であり、アルミニウムイオンが存在する条件下一般に、耐性を有することはいうまでもない。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。なお、実施例におけるDNAの切断、連結、大腸菌の形質転換等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)」参照）の記載に基本的に従って行った。
【００２１】
[実施例１]  形質転換用コンストラクトと過剰発現形質転換植物の作製
過剰発現用のコンストラクト（p35S-PEPC）はpBI121（CLONTECH）のGUS geneをBamHIとSacIで切断し除去した部分をブラント化し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(PEPC#16:T. Sugimoto et al, Plant Molecular Biology (1992),20,743-747)の全長cDNAクローンのEcoRI断片（ダイズPEPC#16全長を含む）をライゲーションした。
【００２２】
[実施例２]  タバコ培養細胞へのPEPC遺伝子導入
PEPC遺伝子を過剰発現されるために構築したプラスミド（p35S-PEPC）を、パーティクルガン法によりタバコ培養細胞（BY-2）に導入した。次いで、50μg/mlのカナマイシンを含むMS寒天培地で培養細胞を選抜しプラスミドが安定に導入されたカルスを選抜した。この選抜された遺伝子導入株を以下のクエン酸分泌測定実験に用いた。なお、本実験のコントロールとして、pBI121を導入したタバコBY-2細胞を用いた。
【００２３】
形質転換したタバコ培養細胞のクエン酸分泌量を測定するためにカナマイシン耐性の形質転換培養細胞を50μg/mlのカナマイシンを含むR2液体培地（pH5.7：Ohira K et al.Plant Cell Phsiol.(1973),14,1113-1121）で約2週間振とう培養し、さらに50μg/mlのカナマイシンを含む0.5mMリン酸二水素ナトリウムのR2液体培地に移植して約1週間振とう培養した。以上により懸濁培養（suspension culture）化した。
【００２４】
[実施例３]  PEPC過剰発現タバコ培養細胞におけるクエン酸・リンゴ酸分泌量の解析
実施例２で懸濁培養化した細胞を、R2基本培地に4mM塩化アルミニウムと30mM MES（以上、終濃度）を添加してpH5.6に調整した培地に移植した。この際、1〜2g/8〜9mlの細胞密度で120rpmで回転培養した。3時間、24時間経過時に培養液をサンプリングし、遠心により培養細胞を沈降させ、その上澄のクエン酸濃度及びリンゴ酸濃度を測定した。濃度の測定にはサイクリング反応を用いた。具体的には1N NaOHでpH12に調整し60℃で15分間処理した。次に、1N HClを培地に添加しpH2に調整して室温で3分間放置し、培地中のNAD及びNADHを分解した。この培地をイオン交換カラム（Dowex50w-x8）に通してアルミニウムイオンを除去し、1N NaOHで中和しpH6〜8に調整した。以上のサンプルを反応液（クエン酸のときはイミダゾール塩酸(pH7.0)、NADH、ZnCl2、MDH、Citrate Lyase：リンゴ酸のときは2-アミノ-2-メチルプロパノール(pH9.9)、NAD、グルタミン酸、MDH、Glutamate-OAA-Transaminase）に添加して撹拌後、25℃で30分間反応させた。次いで、塩酸（クエン酸測定時）または水酸化ナトリウム（リンゴ酸測定時）を加え、さらに100℃で5分間煮沸して反応を停止させた。以上の反応で、クエン酸の場合には該当量をNADに、リンゴ酸の場合には該当量をNADHにそれぞれ変換し、さらにこの液をアルコールデヒドロゲナーゼを含むサイクリング反応液に添加し、NADまたはNADHを定量してクエン酸量及びリンゴ酸量をそれぞれ測定した。この結果、pBI121導入細胞と比較してp35S-PEPC導入細胞のクエン酸分泌量は約2倍に、リンゴ酸分泌量は約3倍に上昇していた。
【００２５】
[実施例４]  PEPC過剰発現タバコ培養細胞のアルミニウム耐性の解析
アルミニウム耐性の測定に用いる培養細胞は、定常期（ステーショナリーフェーズ）の細胞を用いた。培養細胞は自然沈降により集め、約0.2g/mlになるようリン酸アルミニウム液体培地（リン酸アルミニウム、MES）に懸濁した状態で10mlの細胞懸濁液を15mlのプラスチックチューブ中で、25℃、170rpmで培養した。3日経過後に培養液をサンプリングし、濾過によって培養細胞を集め、その湿重量を測定した。この結果、PEPC過剰発現細胞の湿重量はコントロール細胞と比較して重く、このことからPEPC過剰発現タバコ培養細胞にはアルミニウム耐性が付与されていることが証明された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、高い有機酸分泌能を示し、アルミニウム存在下でもリン酸を吸収できるトランスジェニック植物が提供された。従って、本発明のトランスジェニック植物を有用な農作物に応用すれば、貧栄養土壌下におけるこれら農作物の生産性を向上させることが可能である。