(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MALQRQFLR（SEQ ID NO:35）の癌ペプチド。
【請求項２】
MSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の癌ペプチド、および医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物がさらに、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫刺激分子を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載の癌ペプチドを単独で、または少なくとも１つの免疫刺激分子とともに含む、抗原。
【請求項６】
免疫刺激分子が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の抗原。
【請求項７】
MALQRQFLR（SEQ ID NO:35）の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項８】
MSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項９】
核酸配列がATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAGG（SEQ ID NO:10）を含む、請求項８に記載の単離された核酸配列。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞または非ヒト宿主生物。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸配列に対して相補的な核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸配列が組み込まれたウイルスゲノムを含む、組換えウィルス。
【請求項１４】
免疫刺激分子をコードする少なくとも一つの遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の組換えウイルス。
【請求項１５】
免疫刺激分子が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組換えウイルス。
【請求項１６】
ウイルスがレトロウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えウイルス。
【請求項１７】
MALQRQFLR（SEQ ID NO:35）の癌ペプチドに結合する、単離された抗体または、前記抗体の抗原結合部位を含むフラグメント。
【請求項１８】
MSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチドに結合する、単離された抗体または、前記抗体の抗原結合部位を含むフラグメント。
【請求項１９】
組換え癌ペプチドの製造方法であって：
a.  単離されたヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、ここでヌクレオチド配列がMALQRQFLR（SEQ ID NO:35）またはMSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチドをコードし；
b.  発現ベクターを宿主細胞に導入し；
c.  癌ペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
d.  組換え癌ペプチドを回収する；
ことを含む前記方法。
【請求項２０】
哺乳動物における癌または前癌の存在の検出方法であって：
a.  MALQRQFLR（SEQ ID NO:35）またはMSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチドをコードする単離された核酸配列を、哺乳動物から採取したmRNAの試験生物学的試料と、該配列と該mRNAとの間に複合体を形成させる条件下で接触させ；
b.  複合体を検出し；
c.  試験試料中のmRNAの量を、既知の正常の生物学的試料中からのmRNAの量と比較し、試験試料からのmRNAの増加した量が癌または前癌の指標である、
ことを含む前記方法。
【請求項２１】
癌または前癌がメラノーマである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的試料におけるTRP-1遺伝子からのORF3ゲノム核酸配列の検出方法であって：
a.  ゲノム核酸配列を、MALQRQFLR（SEQ ID NO:35）またはMSLQRQFLR（SEQ ID NO:9）の癌ペプチドをコードする核酸配列と、該ゲノム核酸配列と該癌ペプチドをコードする核酸配列との間に複合体を形成させる条件下で接触させ；そして
b.  複合体を検出する；
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
生物学的試料における癌ペプチドの検出方法であって；
a.  試料を、請求項１７または１８の抗体と、免疫複合体を形成させる条件下で接触させ；そして
b.  その存在が生物学的試料中の前記癌ペプチドの指標となる免疫複合体の存在を検出する；
ことを含む、前記方法。
【請求項２４】
哺乳動物における癌を防止または阻害するための医薬組成物であって、有効な量の請求項１または請求項２の癌ペプチドを、単独または免疫刺激分子と一緒に含む、前記医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳動物におけるメラノーマを阻害し得る細胞を生産する方法であって、前記細胞は、in vitroで、請求項１または請求項２の癌ペプチドに、単独または免疫刺激分子と一緒に、癌ペプチド特異的Tリンパ球を誘導するのに十分な時間曝露されたTリンパ球である、前記方法。
【請求項２６】
哺乳動物における癌を防止または阻害するための医薬組成物であって、有効な量の請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組換えウイルスを、単独または外因性免疫刺激分子と一緒に含む、前記医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組換えウイルスを単独または外因性免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗菌薬、抗ウイルス薬またはそれらの組み合わせと一緒に含み、そして薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
免疫刺激分子が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４、２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
免疫刺激分子が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
抗原特異的Tリンパ球と反応性を有する癌抗原の抗原性癌エピトープの同定方法であって：
a.  SEQ ID NO:5として図２に記載したORF3またはSEQ ID NO:46の欠失変異体のセットを生成し；
b.  前記セットの各欠失変異体を発現ベクター中に置き；
c.  宿主細胞をベクターでトランスフェクションまたは形質導入し；
d.  前記セットの欠失変異体を発現する宿主の存在下で、癌抗原特異的Tリンパ球応答を測定する、
ことを含む前記方法。
【請求項３１】
癌抗原がメラノーマである抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
TRP-1またはTRP-2癌抗原の抗原性癌エピトープの同定方法であって：
a.  多数の合成ペプチドを生成し；
b.  癌抗原提示細胞を合成ペプチドでパルスし；
c.  ペプチドでパルスした細胞をTRP-1またはTRP-2癌抗原特異的Tリンパ球に添加し；そして
d.  癌抗原特異的Tリンパ球応答を測定する、
ことを含む前記方法。
【請求項３３】
請求項１または請求項２の癌ペプチドをコードする外因性遺伝子を保持する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３４】
請求項１または請求項２の癌ペプチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３５】
哺乳動物の癌を防止または阻害するための医薬を製造するための、請求項１または２に記載の癌ペプチドの使用であって、製造において単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせて使用される、前記使用。
【請求項３６】
哺乳動物のメラノーマを阻害し得る細胞を製造するための、請求項１または２に記載の癌ペプチドの、単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせた使用であって、Tリンパ球をin vitroで、前記癌ペプチドを単独でまたは免疫刺激分子と組み合わせて、癌ペプチド特異的Tリンパ球を誘導するために十分な時間曝露する工程を含む、前記使用。
【請求項３７】
哺乳動物の癌を防止または阻害する方法において使用するための医薬の製造の際における、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組換えウィルスの、単独でまたは外因性免疫刺激分子と組み合わせた使用。
【請求項３８】
免疫刺激分子が、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、インターロイキン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５−３７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、癌ワクチンを含む癌の診断薬および治療薬の領域に関する。より具体的には、本発明は、新規な癌ペプチド並びにその癌ペプチドをコードする代替（alternative）オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の単離と精製に関する。本発明はさらに、癌を治療および防止する際の道具として作用し得る新規な腫瘍抗原並びにその癌抗原をコードするＤＮＡの単離と精製に関する。本発明はさらに、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）遺伝子内に由来する代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる新規な癌ペプチドに関する。本発明はまた、ＴＲＰ２遺伝子内に由来する新規な癌ペプチドに関する。本発明はさらに、個人における癌と前癌を検出および診断および治療するための方法に関する。
発明の背景
腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）の養子免疫伝達は、転移性メラノーマを伴う患者で腫瘍の退行を仲介することができ、Ｔ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原がこれらの腫瘍細胞上に存在することが示唆される。そのようなＴ細胞が入手可能なことにより、ヒトメラノーマ抗原をコードする遺伝子をクローン化し配列決定することが可能になっている。ヒトメラノーマからこれまでに同定された抗原は、その発現パターンに基づいて２つのクラスに分類することができる。第１のクラスの抗原は、腫瘍および精巣でのみ発現し、他の正常ヒト組織で発現しない遺伝子によってコードされる。ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＡＧＥおよびＢＡＧＥはこのクラスの例である。第２のクラスの抗原は、メラノサイト、メラノーマおよび正常網膜でのみ発現する遺伝子によってコードされる分化抗原を表す。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００およびチロシンはこのクラスの例である。これらの抗原は全て未変異自己タンパク質である。しかしながら、ＣＤＫ４、Ｂ−カテニンおよびＭｕｍ−１を含む幾つかの変異抗原もまた、Ｔ細胞によって認識されることが同定された。対応する遺伝子産物に由来するＴ細胞によって認識される抗原性エピトープの同定は、自己抗原に対する免疫応答の機構を理解するためのみならず、癌を伴う患者の治療のためのこれらの抗原または合成ペプチドによる新規で有効な免疫治療戦略を開発するためにも、重要である。
以前の研究により、メラノーマを伴う自己由来患者内にＴＩＬ５８６＋ＩＬ−２を注入すると転移の客観的な退行が生じることが示された。より最近に、ＨＬＡ−Ａ３１と関連してＴＩＬ５８６によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１またはｇｐ７５）がクローン化された。興味深いことに、遺伝子産物ｇｐ７５は、転移性メラノーマを伴う患者からの血清中のＩｇＧ抗体によって認識される抗原として最初に同定された。その遺伝子は、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜でのみ発現し、試験した他の正常組織では発現しないことが判明した。従って、この遺伝子は、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００およびチロシナーゼを含む第２のクラスの抗原の一員である。
本分野では、癌の発達から個人を保護するための免疫原またはワクチンとして有用である癌細胞上のエピトープを同定することは困難であった。本発明は、Ｔ細胞によって特異的に認識されるＴＲＰ−１遺伝子内の代替オープンリーディングフレーム配列からコードされるペプチド内の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープの同定である。本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子によってコードされる癌ペプチドを包含する。本発明の癌ペプチドは哺乳類で癌を阻害または防止するための免疫原およびワクチンとして有用である。
発明の要旨
本発明の一つの目的は、Ｔリンパ球によって癌抗原として認識される新規なペプチドおよびその一部を提供することである。
本発明の癌ペプチドおよびその癌ペプチドの抗原性癌エピトープ部分は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる。この範囲内に入る遺伝子はＴＲＰ−１遺伝子である。
本発明の別の側面は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる腫瘍抗原である。この範囲内に入る遺伝子はＴＲＰ−１遺伝子である。
本発明の別の目的は、癌ペプチドとして作用する、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびその変異体のペプチドフラグメントである。
本発明の腫瘍抗原およびその腫瘍抗原の抗原性癌ペプチドは、ＴＲＰ−２遺伝子（配列番号４６）の全部または一部によってコードされる。ＴＲＰ−２は、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員である。ＴＲＰ−２はＴ細胞に免疫応答を引き出させることができる新規で潜在的な腫瘍抗原として現在同定されている。
本発明の一つの側面は、癌の発達から被験者を保護できる癌ワクチンとして有用である、ＴＲＰ−１遺伝子、ＴＲＰ−２遺伝子またはその変異体によってコードされる癌ペプチドである。本発明はまた、癌を防止するのに有効な量の癌ワクチンを投与する方法に関する。
本発明の別の側面は、癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープを単独または１以上の免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の側面は、ＴＲＰ−１癌抗原を単独、ＴＲＰ−２腫瘍抗原を単独、または１以上の同時免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の目的は、Ｔ細胞を刺激して腫瘍および癌に対して免疫原性応答を引き出す、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２ペプチドまたはその組み合わせを含む、医薬組成物である。癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープは、癌の防止または治療のための免疫原としてまたはワクチンとして提供することができる。医薬組成物は、哺乳類において癌を治療または防止する方法で有用である。治療方法では、医薬組成物は、哺乳類における癌を防止または阻害するのに有効な量で哺乳類に投与される。
本発明の別の目的は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の翻訳によって癌ペプチドおよびそのペプチド内の抗原性癌エピトープを生成する方法である。
本発明のさらに別の目的は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配から翻訳される遺伝子産物以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列から翻訳される癌ペプチド遺伝子産物またはその一部を検出および同定する方法である。
本発明のさらに別の側面は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡまたはＲＮＡ配列、並びに癌ペプチドまたはその一部を産生する方法におけるそのＤＮＡまたはＲＮＡ配列の使用である。本発明はさらに、プローブまたはプライマーとして使用するための代替オープンリーディングフレームＤＮＡまたはＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のさらに別の目的は、細胞で発現させた場合に腫瘍抗原を産生する、ＴＲＰ−２またはそのフラグメントをコードする核酸配列である。
本発明はさらに、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を単独または少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターを提供する。代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。
本発明はまた、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を単独または少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、腫瘍抗原をコードするＴＲＰ−２遺伝子またはその一部を単独または少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターを提供する。ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、腫瘍抗原または癌ペプチドの発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。
本発明はまた、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその変異体をコードするＤＮＡを単独または少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。
ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、ＴＲＰ−２腫瘍抗原の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における抗原特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。
ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、癌ペプチドまたはその一部の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における癌ペプチド特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。
本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。
本発明は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替リーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を検出することによって哺乳類における癌または前癌を診断する方法であって、その癌ペプチドまたはその一部がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。代替リーディングフレーム核酸配列は、ＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。
本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。本発明によれば、その方法は、ヒトから細胞、組織またはその抽出物を単離し、癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはその一部を検出するか、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列によって発現される癌ペプチドまたはその一部を検出することを含み、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列または発現産物の検出またはその増加は、前新生物または新生物の指標である。
本発明は、ＴＲＰ−２腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその変異体がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。
本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子またはそのフラグメントによってコードされる腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。
本発明のさらに別の目的は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。代替リーディングフレーム核酸配列はＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の取り込みにより、多重型または変異型の癌ペプチドの過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。
本発明のさらに別の目的は、本発明の腫瘍抗原の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。ＴＲＰ−２ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの取り込みにより腫瘍抗原の過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。
本発明はまた、代替オープンリーディングフレーム核酸配列またはＴＲＰ−２腫瘍抗原核酸配列に特異的にターゲッティングして結合し、同一の遺伝子に由来する正常タンパク質の発現に悪影響を及ぼすことなく癌ペプチドまたは腫瘍抗原の発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明のさらに別の側面は、診断および検出アッセイで使用するためのＴＲＰ−１癌ペプチドおよびＴＲＰ−２腫瘍抗原を含む癌ペプチドおよびその抗原性癌エピトープと反応性を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗体である。モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、単独または診断および検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒のキットの形態で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、および随伴する利点の多くは、添付する図面を一緒に考慮して、以下の詳細な説明を読むことでより良く理解されるであろう。図面中、
図１Ａおよび１Ｂは、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドをコードするｇｐ７５ヌクレオチド配列の位置を示す。
図１Ａは、ｇｐ７５の１５８４ｂｐのオープンリーディングフレームを含む全長ｃＤＮＡを示す。ヌクレオチドは、リーダー配列と成熟ｇｐ７５から成るタンパク質へと翻訳される開始コドンから番号付けされている。ｐｃＤＮＡ７７６は最初の２４６ヌクレオチドコード領域を欠くｇｐ７５の部分ｃＤＮＡであり、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子と一緒にＣＯＳ−７をコトランスフェクションした際に、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を刺激する能力に基づくアッセイを使用してｃＤＮＡライブラリーから単離された。一連の欠失構築物およびＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントを作製した。ｐＤ７７６ＡはＡｐａＩ制限酵素での消化後のｐｃＤＮＡ７７６の誘導体である。
図１Ｂは、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦの放出を示す。ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌は、図１Ａに示すＤＮＡフラグメントとＨＬＡ−Ａ３１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７で同時培養した後に測定した。対照刺激物質細胞は、５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ／Ａ３１＋、ＣＯＳ−７単独、およびＨＬＡ−Ａ３１またはｐｃＤＮＡ７７６ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７を含む。
図２は、ｇｐ７５遺伝子のヌクレオチド、アミノ酸配列およびオープンリーディングフレームを示す。最初の１５７アミノ酸の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）の翻訳の開始コドンから示した。ＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を付与したＤＮＡフラグメントを下線で示す。２個の推定開始コドン、ＡＴＧ（２５４−２５６）およびＡＴＧ（２９４−２９６）を太字で示し、各々ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の翻訳を生じさせることができる。ＯＲＦ３からＴＩＬ５８６によって認識されるペプチド配列は太字と下線で示す。
図３Ａと３Ｂは、抗原性ペプチドと代替オープンリーディングフレームの翻訳を示す。
図３Ａは、ＰＣＲによって増幅されたＰＣＲフラグメントの位置と長さを示す。ＤＮＡフラグメントはＰＣＲ増幅によって得られ、ｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化された。位置２９４−２９６のＡＴＧのＡＴＣによる置換は、材料および方法に記載される通りに行った。
図３Ｂは、ＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激するＤＮＡフラグメントおよび変異構築物の試験を示す。ＧＭ−ＣＳＦ放出アッセイは図１の場合と同様に行った。
図４Ａ−４Ｃは、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドの特徴を示す。
図４Ａは、種々の刺激物質とともに同時インキュベートした場合の、ＨＬＡ−Ａ３１制限ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦの放出を示す。トランスフェクションおよびサイトカインアッセイは図１ＡおよびＢと同様に行った。５８６ｍｅｌおよび３９７ｍｅｌをＴＩＬ５８６の反応性に関して陽性および陰性対照として含めた。ＯＲＦ３Ｐペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で９０分間５８６ＥＢＶ（Ａ３１＋）およびＴ２（非−Ａ３１）細胞とともにインキュベートした。ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌の刺激は、ペプチドＯＲＦ３Ｐでパルスした自己由来５８６ＥＢＶおよび異質遺伝子型の１５１０ＥＢＶ（Ａ３１＋）細胞で同時インキュベートした場合は有意に増加したが、５８６ＥＢＶ単独またはＯＲＦ３Ｐペプチドで充填したＴ２（非−Ａ３１）細胞で同時インキュベートした場合は増加しなかった。
図４Ｂは、ＴＩＬ５８６による標的細胞の細胞毒性溶解を示す。５８６ｍｅｌ（−■−）および３９７ｍｅｌ（−□−）を各々陽性および陰性対照として使用した。５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞を、マークした通り、ＯＲＦ３Ｐ（ｐｅｐ）と（−▲−）、無関係なペプチドと（ｉｐｅｐ）（−●−）、ペプチドなしに（−△−）インキュベートし、そしてＴ２細胞をＯＲＦ３Ｐでパルスした（−○−）。インキュベーション後、ＴＩＬ５８６を添加し標的細胞と混合した。ＴＩＬ５８６の細胞溶解活性を４時間のクロム放出アッセイで測定した。
図４Ｃは、ＴＩＬ５８６による溶解のために標的細胞を感作するためのペプチド濃度の滴定を示す。５８６ＥＢＶ細胞を、ＯＲＦ３Ｐ（ｐｅｐ）（−▲−）または無関係なペプチド（ｉｐｅｐ）（−●−）の連続希釈で、そしてＴ２細胞をＯＲＦ３Ｐペプチドで（−○−）９０分間別々にインキュベートした。ＴＩＬ５８６の細胞溶解活性は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率４０：１で４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。
図５Ａおよび図５Ｂは、ＯＲＦ３Ｐペプチドでロードした未標識５８６ＥＢＶ細胞による５１Ｃｒ標識した標的細胞の溶解の阻害を示す。
図５Ａは、５８６ｍｅｌ細胞をクロムで９０分間「ホット」標的として標識したことを示す。ＯＲＦ３Ｐ（−▲−）、無関係なペプチド（−△−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞並びにＯＲＦ３ＰペプチドでロードしたＴ２細胞（−□−）を「コールド」標的細胞として使用した。洗浄後、「ホット」および「コールド」標的細胞を再度計数し、１：１、５：１、１０：１および２０：１の「コールド」／「ホット」比で混合した。ＴＩＬ５８６をエフェクター：「ホット」標的（Ｅ：Ｔ）比率２０：１で添加した。クロムの放出を４時間のインキュベーション後に測定した。
図５Ｂは、ｇｐ１００を認識したＴＩＬ１２００による５１Ｃｒ標識した６２４ｍｅｌ（「ホット」標識）の溶解が、無関係なペプチド（−△−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞と比較して、ＯＲＦ３Ｐ（−▲−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞によって阻害されなかったことを示す。「コールド」および「ホット」標的細胞を示した比率で混合した。ＴＩＬ１２００をエフェクター：ホット標的（Ｅ：Ｔ）比率３０：１で添加した。ＴＩＬ１２００の細胞溶解活性を４時間の５１Ｃｒ放出活性で評価した。
図６Ａ−６Ｄは、ＴＩＬ５８６細胞株からの抗原性ペプチドＴ細胞クローンの認識を示す。Ｔ細胞クローンをＴＩＬ５８６細胞株から生成した。５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞をＯＲＦ３Ｐペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした。Ｔ細胞クローンまたはＴＩＬ５８６細胞を添加して同時インキュベートした。５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ／Ａ３１＋腫瘍およびメラノサイトＮＨＥＭ６８０細胞について、１×１０５細胞／ウエルを、各々Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５８６−Ｃ１（図６Ａ）、ＴＩＬ５８６−Ｃ４（図６Ｂ）およびＴＩＬ５８６−Ｃ６（図６Ｃ）またはＴＩＬ５８６（図６Ｄ）に１８〜２４時間１×１０５細胞でインキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦアッセイを図１Ｂに記載した通り行った。
図７．ＴＩＬ５８６に由来するＣＴＬクローンによる種々の標的細胞および抗原性ペプチドの認識。Ｔ細胞クローンをＴＩＬ５８６細胞株由来の限界希釈（１細胞／ウエル）によって生成し、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ培地中でさらに膨張させた。ＣＴＬクローン５８６ＴＩＬ−Ｃ１およびクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を、正常メラノサイト細胞株（ＨＬＡ−Ａ３１＋）、ＯＲＦ３Ｐペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞、３９７ｍｅｌまたは５８６ｍｅｌ細胞と同時培養した後に測定した。
図８．ＣＴＬクローン４により認識された新規な腫瘍抗原としてのＴＲＰ−２の同定。ＣＴＬクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ放出を、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ１５およびＴＲＰ−２をコードする遺伝子と一緒にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡでコトランスフェクションしたＣＯＳ−７と同時培養後に測定した。対照刺激物質細胞には、５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ、ＣＯＳ−７単独、およびＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−７が含まれた。
図９．ＴＲＰ−２遺伝子の欠失およびサブクローンの構築およびＴ細胞認識。１５５７ｂｐオープンリーディングフレームを含むＴＲＰ−２の全長ｃＤＮＡを示す。ヌクレオチドをＴＲＰ−２ｃＤＮＡの５’未翻訳領域からｆ〜ｒｓｔヌクレオチドから番号を付けた。一連の欠失構築体およびＤＮＡフラグメントのスブクローニングを作製した。各構築物のＴ細胞認識を、上記したＤＮＡフラグメントおよびＨＬＡ−Ａ３１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７でＣＴＬクローン４を同時培養した後に測定した。
図１０．ＴＲＰ−２の抗原性ペプチドおよび部分コード配列．ＴＲＰ−２遺伝子の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ｐＴＤ４、ｐＴＡ、ｐＴＤ３およびｐＴＫ中のＤＮＡフラグメントの長さおよび３’末端を矢印で示し、ＡｐａＩ、ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの制限部位に印を付ける。ＣＴＬクローン４で認識される抗原性ペプチド配列を太字および下線で示す。
図１１Ａから図１１Ｃ．  ＣＴＬクローン４で認識される抗原性ペプチドの特徴。
図１１（Ａ）．異なるペプチド濃度でのＴ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ放出。５８６ＥＢＶ（Ａ３１＋）を、ＴＲＰ197-205ペプチド（−−▲−−）でパルスし、Ｔ２（非−Ａ３１）細胞をＴＲＰ197-205ペプチド（−−●−−）で異なるペプチド濃度で９０分間パルスした。対照ペプチドとしてのＯＲＦ３Ｐを、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞（−−△−−）上にパルスした。ＣＴＬクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ放出を、ＴＲＰ197-205およびＯＲＦ３Ｐでパルスした５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞、そしてＴＲＰ197-205でパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした後に測定した。
図１１（Ｂ）．異なるペプチド濃度でのＣＴＬクローン４による溶解のための標的細胞の感作。５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞を、ＴＲＰ197-205（−−▲−−）、無関係なペプチドＯＲＦ３Ｐ（−−△−−）とインキュベートし、そしてＴ２細胞を種々のペプチド濃度でＴＲＰ197-205でパルスした（−−●−−）。ペプチドインキュベーション後に、標的細胞を３０分間標識した。洗浄後、Ｅ：Ｔ比率４０：１でのＣＴＬクローン４の細胞溶解活性をＴ細胞と標的細胞との４時間のインキュベーション後に測定した。図１１（Ｃ）．異なるＥ：Ｔ比率でのＣＴＬクローン４による標的細胞の溶解。標的５８６ＥＢＶ細胞を、ＴＲＰ197-205（−−▲−−）または無関係なペプチドＯＲＦ３Ｐ（−−△−−）と別々にインキュベートし、標的Ｔ２細胞をＴＲＰ197-205ペプチド（−−●−−）と９０分間インキュベートした。５８６ｍｅｌ（−−□−−）および３９７ｍｅｌ（−−■−−）を各々陽性および陰性対照として使用した。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫系のＴリンパ球によって免疫学的に認識される、癌ペプチド、腫瘍抗原並びにそれらの一部、誘導体または変異体を包含する。本発明はさらに、癌ペプチドまたは腫瘍抗原中に含まれる抗原性癌エピトープを包含する。抗原性癌エピトープは免疫系のＴ細胞との相互作用により細胞仲介免疫応答を特異的に生じさせる。抗原性癌エピトープとＴ細胞との相互作用により、Ｔ細胞はヒトを含む哺乳類中の癌に対して反応し、それを防止、排除または減少させる。
一つの態様において、本発明の癌ペプチドの中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、癌ペプチドが遺伝子内の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレーム以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームによってコードされるという点で、正常のタンパク質またはペプチドと区別される。癌ペプチドおよびその一部は、特徴的なことに、正常な細胞では不在であるか非常に低いレベルで存在し、前癌および癌細胞では高いレベルで存在する。高いレベルでの癌ペプチドの発現は、正常細胞から前癌または癌細胞への形質転換と相関している。
本発明の癌ペプチドは、原発性または転移性のメラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホドキンの（non-Hodgkin's）リンパ腫、ホドキンのリンパ腫、白血病、子宮癌、頸部癌、膀胱癌、腎臓癌、およびアデノカルチノーマ、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等を含むがこれらに限定されない癌の一部を形成するか、それらから誘導される。
メラノーマという用語には、メラノーマ類、転移性メラノーマ、メラノサイトまたはメラノサイト関連母斑細胞の何れか由来のメラノーマ、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、in situメラノーマ、表在拡散性メラノーマ、結節性メラノーマ、ほくろ悪性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、侵食性メラノーマまたは家族性非定型性母斑及びメラノーマ（ＦＡＭ−Ｍ）症候群が含まれるが、これらに限定されない。
特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者中の自己由来ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。さらに興味深いのは、ＭＨＣ制限ＣＴＬ、特にＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。
本発明の「腫瘍抗原」は、哺乳類での抗腫瘍応答を引き出すことができる癌または腫瘍タンパク質およびその癌または腫瘍タンパク質の任意の部分を包含する。一つの態様では、腫瘍抗原には、全長ＴＲＰ−２タンパク質が含まれる。
「癌ペプチド」という用語は本明細書で使用する場合、腫瘍抗原として作用する、癌または腫瘍タンパク質の任意のエピトープまたはフラグメントを包含する。
「フラグメント」という用語は本明細書で使用する場合、タンパク質フラグメントの場合で少なくとも５または６アミノ酸そして遺伝子の場合で少なくとも１５から１８ヌクレオチドを有するタンパク質または遺伝子の任意のセグメントを意味する。
一つの態様では、本発明の癌ペプチドは、正常遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の発現から生じる。正常の遺伝子産物が発現されるよりむしろ、ＭＨＣ制限様式でＴリンパ球によって免疫学的に認識されることができる癌ペプチドが発現する。ＭＨＣ制限Ｔリンパ球は癌または前癌に関連する代替オープンリーディングフレーム遺伝子産物を同定するのに有用である。
特に興味深いのは、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）；マウス腫瘍サプレッサーＩＮＫ４ａ遺伝子の代替リーディングフレームから生じるタンパク質ｐ１９ARF（Quelle, D.E.他、Cell Vol.83, pp993-1000, 1995）；抗原性オクタペプチドＳＶＶＥＦＳＳＬ、即ち、ＪＡＬ８、ｂｍ１抗Ｂ６同種異系反応性ｂｍ１ＢＺ１９．４Ｔ細胞によって認識される異質遺伝子型ペプチド（Malarkannan, S他、J.Exp.Med. Vol.182, pp.1739-1750, 1995）など：に関連する癌ペプチドである。
一つの態様では、本発明の癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体は、哺乳類の癌腫瘍由来の腫瘍浸透性リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫学的に認識される抗原性癌エピトープを含む。特に興味深いのは、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される抗原性癌エピトープである（ＣＤ８＋）。
本発明の一つの態様では、癌ペプチドは約２４アミノ酸を含み、図２に記載したチロシナーゼ関連タンパク質１をコードする同一の遺伝子由来またはそれらのホモログまたは変異体由来の代替オープンリーディングフレーム３ＤＮＡ配列によって発現される。
一つの態様では、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列：
ＭＸａａＬＱＲＱＦＬＲＴＱＬＷＤＶＰＳＷＬＥＲＳＣＬ（配列番号７）およびそのフラグメントまたは誘導体を含む（式中、ＸａａはＳｅｒまたはＡｌａである）。配列番号６と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、配列番号６と少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Ｔリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。
本発明の一つの態様では、癌ペプチドは式：
ＭｅｔＸａａＬｅｕＧｌｎＡｒｇＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇ（配列番号８）およびそのフラグメントおよび誘導体によって表すことができる（式Ｘａａ＝ＳｅｒまたはＡｌａ）。
本発明の癌ペプチドの別の態様では、アミノ酸配列：
ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号９）およぴそのフラグメントおよび誘導体を含む。
別の態様では、本発明の腫瘍抗原の中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜で主として発現するＴＲＰ−２タンパク質に由来する。本発明の腫瘍抗原は、前癌および癌細胞で見られる上昇したレベルよりも大部分の正常細胞では有意に低いレベルで存在する。腫瘍抗原の上昇した発現は正常細胞の前癌または癌細胞への形質転換と相関する。ＴＲＰ−２はヒト染色体１３に位置し、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員であることが示され、チロシナーゼおよびｇｐ７５／ＴＲＰ−１に対して４０−４５％のアミノ酸配列同一性を共有する（Yokoyama他（1994）；Bouchard他（1994））。ＴＲＰ−２は５１９アミノ酸を有するタンパク質をコードし、メラニン合成に関与するＤＯＰＡクロム互変異性化酵素（tautomerase）活性を有することが実証されている（Bouchard他（1994））。
特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者における自己由来ＣＴＬによって認識されるＴＲＰ−２の癌ペプチドまたはその変異体である。さらに興味深いのは、ＭＨＣ制限ＣＴＬ、特にＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。癌ペプチドによって認識される好ましいＨＬＡサブタイプはＨＬＡ−Ａ３１サブタイプである。本発明は、ＨＬＡ−Ａ３１制限Ｔ細胞によって認識される潜在的な腫瘍抗原としての、ＴＲＰ−２、チロシナーゼタンパク質ファミリーのメラノーマ／メラノサイト分化抗原の同定に関する。ＴＲＰ−２遺伝子産物はＴＩＬ５８６から単離されたＣＴＬクローンによって認識される第２の腫瘍抗原である。
本発明の別の態様では、腫瘍抗原は約９アミノ酸を含む癌ペプチドであり、チロシナーゼ関連タンパク質−２（配列番号４６）をコードする遺伝子または図１０に示すそのホモログまたは変異体から発現される。
さらに別の態様では、ＴＲＰ−２タンパク質のフラグメントまたはその機能的に均等な変異体は癌ペプチドとして使用される。好ましくは、本発明の腫瘍抗原はアミノ酸１９７−２０５の少なくとも一部分を含むＴＲＰ−２タンパク質のフラグメントを含む。最も好ましくは、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列：ＬＬＧＰＧＲＰＹＲおよびそのフラグメントまたは誘導体を含む。アミノ酸１９７−２０５を含むＴＲＰ−２の領域と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲと少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Ｔリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。
本発明の別の態様は、癌ペプチドとして有効に作用するのに十分な相同性をＬＬＧＰＧＲＰＹＲに対して有する癌ペプチドを包含する。そのようなペプチドは１以上の位置で保存的アミノ酸変化を有していてもよい。保存的アミノ酸変化とは、特定の位置での本来存在するのと同一の型のアミノ酸変化を意味し、即ち、疎水性アミノ酸が疎水性アミノ酸に変化し、塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に変化すること等である。そのようなアミノ酸変化はペプチドの全体の荷電および配置を有意には変更せず、従ってそのような変異体は癌ペプチドの抗癌活性を維持する。そのような保存的変化の例は当業者に周知であり、本発明の範囲内である。
本発明のさらに別の態様は、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲペプチドに由来するが、１以上の位置で非保存的アミノ酸変化を含む数種の癌ペプチドに関する。そのようなペプチドが本発明で同定され、ＬＳＧＰＧＲＰＹＲ、ＫＬＧＰＧＲＰＹＲ、ＬＬＧＰＧＦＰＹＲおよびそのフラグメントおよび誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明はＴＲＰ−１またはＴＲＰ−２癌ペプチドの機能的に均等な変異体に関する。「機能的に均等な変異体」には、部分的配列相同性を有するペプチド、１以上の特定の保存的および／または非保存的アミノ酸変化を有するペプチド、ペプチド結合体、キメラタンパク質、融合タンパク質およびペプチド核酸が含まれる。
癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、一次臨床単離物、細胞株などからなどのように天然源から精製および単離することができる。癌ペプチドおよびその一部は少なくとも９０％の純度、好ましくは少なくとも９５％の純度、そして１００％の純度である。癌ペプチドおよびそれらの抗原性エピトープはまた、化学合成によってまたは当分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって得ることもできる。化学合成の技術はJ.M. StewardおよびJ.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; M. Bodansky他"Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 第２編、１９７６、およびJ.Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptidea", Vol.2, p.46, Academic Press, New York, 1983およびE.SchroderおよびK.Kubke "The Peptides" Vol.1, Academic Press, New York, 1965に記載されている。
癌ペプチドおよびそれらの抗原性癌エピトープは、当分野で公知の方法によって薬学的に許容可能な担体とともに医薬組成物に調剤化することができる。本組成物は癌を防止または治療するためのワクチンとして有用である。本組成物はさらに少なくとも１つの免疫刺激分子を含む。抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するために癌ペプチドまたはその一部分と組み合わせて使用するための免疫刺激分子には、１以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、例えばクラスＩおよびクラスＩＩ分子、好ましくはクラスＩ分子が含まれるが、これらに限定されない。本組成物はさらに、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２等を含む他の刺激剤分子、並びに、ＩＬ−１からＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βを含むがこれらに限定されないサイトカイン類、またはそれらの組み合わせ等を、免疫強化のために含んでもよい。
刺激分子は物理的に別個の形態として提供してもよいし、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹枝状細胞などの抗原提示細胞の膜中に、リポソームの膜中に提供してもよいし、形質導入またはトランスフェクションした細胞の表面上に発現してもよい。ＭＨＣ免疫刺激分子のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ等から入手可能である。
癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、癌を防止または治療するための方法で有用であり、ヒトを含む哺乳類中の癌または前癌を検出するための診断アッセイで有用である。癌ペプチドまたはその一部は、放射標識、ビオチン、フルオレセインなどの他の構成成分がそれに付着している、誘導体の形態でもよい。特定の器官、腫瘍または細胞型への特異的ターゲッティングを可能にするターゲッティング物質もまた腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその一部に付着させてもよい。そのようなターゲッティング物質は、ホルモン、サイトカイン、細胞受容体などでもよい。癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの一部は、単独または他の試薬と組み合わせてキットの形態で用意することができる。
本発明の別の側面は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫性を誘導するのに有用なワクチンである。
癌の免疫療法に対するアプローチは能動または受動のカテゴリーに分類することができる。能動免疫療法には、腫瘍に対する免疫応答を増進するための試みにおいて癌抗原を有する癌患者を直接免疫感作することが含まれる。受動免疫治療は、抗腫瘍応答を直接的に仲介することを目標にして、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞または抗体などの免疫試薬を投与することを言う。
能動免疫療法の最初の試みは、無傷な癌細胞または癌細胞抽出物のいずれかを、これらの物質が免疫応答を刺激できる量および形態で腫瘍抗原を含んでいるという期待をもって、利用した。しかしながら、癌抗原の分子の同定により、ヒト癌の治療のための免疫療法を開発する新たな可能性が開けた。これらの試みの幾つかの要約を表１に示す。
表１  癌抗原の分子同定に基づく癌治療
１．  以下のものによる能動免疫治療：
ａ．免疫優性ペプチド
１）単独
２）アジュバンドとの組み合わせ
３）ヘルパーペプチド、脂質またはリポソームに結合
４）抗原提示細胞上にパルス
ｂ．ＭＨＣ分子への結合を増大させるアミノ酸置換による免疫優性ペプチド
ｃ．単独またはアジュバンドと組み合わせたタンパク質
ｄ．癌抗原をコードする「裸の」ＤＮＡ
１）皮膚内注入のための「遺伝子銃」
２）筋肉内注入
３）脂質に結合
ｅ．次をコードするワクシニア、鶏痘又はアデノウイルス等の組み換えウイルス
１）癌抗原単独
２）癌抗原＋サイトカインをコードする遺伝子、同時刺激分子、または免疫疫応答を増強する他の遺伝子
ｆ．単独または免疫刺激分子と組み合わせて癌抗原をコードするＢＣＧ、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌
２．  免疫刺激サイトカインの投与を伴う（上記の）能動免疫治療
１．  ＩＬ−２
２．  ＩＬ−６
３．  ＩＬ−１０
４．  ＩＬ−１２
５．  ＩＬ−１５など
３．TIL又はPBLの次へのインビトロ感作で生じた抗腫瘍リンパ球による受動免疫治療
１．抗原提示細胞上にパルスした免疫優性ペプチド（ＣＤ８細胞を生じる）
２．抗原提示細胞と同時インキュベートした抗原性タンパク質（ＣＤ４細胞を生じる外生抗原提示経路）
Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母またはバキュロウイルスなどの高効率発現系への癌抗原をコードする遺伝子の挿入は、免疫化で使用するための大量の精製された腫瘍抗原を得る機会を提供する。あるいは、これらの腫瘍抗原からの免疫優性ペプチドはインビトロで容易に合成でき、単独にあるいはアジュバンド、脂質／リポソームまたはヘルパーペプチドへの結合との組み合わせなどのそれらの免疫原性を改善することを意図した形態で免疫化のために大量に精製することができ、または抗原提示細胞上へパルスすることができる。ＭＨＣ抗原への結合効率を改善するための免疫優性ペプチドの個々のアミノ酸の修飾により、天然のペプチドと比較して免疫原性を潜在的に増加させることができる。
筋肉中または皮膚中に直接注入した「裸の」ＤＮＡを使用する最近の技術は、コードされた抗原に対する細胞性とホルモン性の両方の免疫応答を高めることを示した（Cooney, E.L., A.C. Collier, P.D. Greenberg, R.W. Coombs, J.Zarling, D.E. Arditti, M.C. Hoffman, S.L. HuおよびL. Correy, 1991, Lancet 337:567; Wolff, J.A., R.W. Malone, P.Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani,およびP.L.Felgner, 1990, Science 247:1465; Davis, H.L., R.G. Whalen,およびB.A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther.4:151; Yang, N.S., J.Burkholder, B. Roberts, B Martinelli,およびD. McCabe, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:9568; Williams, R,S., S.A. Johnston, M.Riedy, M.J. Devit, S.G. McElligott,およびJ.C. Sanford, 1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:2726; Fynan, E,R., Webster, D.H. Fuller, J.R. Haynes, J.C. Santoro,およびH.L.Robinson, 1995, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:11478; Eisembraum, M.D., D.H.Fuller,およびJ.R. Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12:791; Fuller, D.H.およびJ.R. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11):1433; Acsadi, G., G. Dickson, D.R.Love, A. Jani, F.S. Walsh, A. Gurusinghe, J.A. Wolff, およびK.E. Davies, 1991, Nature 352:815）。生活力のないＤＮＡベクターを使用する技術は準備の容易性と投与の安全性の利点を有している。本発明の代替核酸配列は癌に対する免疫原としてまたはＤＮＡワクチンとして有用である。ＴＲＰ−１の本発明の代替オープンリーディングフレーム核酸配列あるいは本発明のＴＲＰ−２タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列は、癌細胞に対する細胞応答を引き出す量で遺伝子銃を使用して投与することができる。ナノグラムの量がそのような目的にとって有用である。
免疫化の有効な形態は、ＢＣＧ、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌中にあるいはワクシニア、鶏痘またはアデノウイルス等の組み換えウイルス等中に免疫原性分子をコードする遺伝子を取り込むことを含む。癌抗原をコードする遺伝子は、単独で、あるいは免疫刺激分子をコードする遺伝子または感染後に免疫応答を増大させることができる他の遺伝子と一緒に発現させることができる。マウスモデル中のモデル腫瘍抗原による研究は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはＢ７．１の遺伝子の取り込みによりモデル腫瘍抗原の免疫原性を増大することができ、これらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえでき、そしてこれらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえできることを示した。ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５等の免疫刺激サイトカインの外来投与を伴う能動免疫治療を使用して免疫応答を改善することもできる。
ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝的に改変した免疫細胞（通常は養子免疫治療と称される）による受動免疫は転移性メラノーマを有する選択患者における癌の退行を仲介するのに有効である。ヒトリンパ球が抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原免疫優性ペプチドにインビトロで感作されるインビトロ技術が開発されている。反復したインビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原をコードする遺伝子をクローン化するために使用したＴＩＬよりもはるかに大きなヒト腫瘍抗原を認識する能力を有する細胞を誘導することができる。即ち、癌ペプチドによる反復したインビトロ感作によって、ＴＩＬの５０〜１００倍以上の効力を有するリンパ球を誘導することができた。これらの細胞の養子移入は、通常通り生育したＴＩＬよりもインビトロでの腫瘍退行を仲介するのにより有効であるかもしれない。
癌を防止または阻害する方法において、癌ペプチドまたはその一部を、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、くも膜内、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内などを含むがこれらに限定されない複数の経路の一つを通じて投与することができる。
投与は、粘膜通過または皮膚通過手段で行うことができる。粘膜通過または皮膚通過投与のためには、透過すべき障壁に適した浸透剤を調剤中に使用する。そのような浸透剤は当分野で一般的に既知であり、例えば、粘膜通過投与のためには胆汁塩およびフシジン酸（fusidic acid）誘導体が含まれる。さらに、洗浄剤を使用して浸透を容易化することができる。粘膜通過投与は、例えば、鼻腔スプレー、または座薬によるものでもよい。経口投与のためには、癌ペプチド、腫瘍抗原、その一部または変異体は、カプセル剤、錠剤および毒物（toxics）などの通常の経口投与形態に調剤化される。
一般に、被験者の体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１ｐｇ、好ましくは体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１ｎｇ、より好ましくは体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１μｇ以上の投与量の癌ペプチドまたはその一部を被験者に供給することが望ましい。体重１Ｋｇ当たり約１ｎｇから体重１Ｋｇ当たり約１００ｍｇの範囲が好ましいが、より低い投与量またはより高い投与量を投与することもできる。投与により、癌抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくは細胞毒性Ｔリンパ球のクローン性膨張を開始、刺激および／または生じさせるのに有効であり、これらは次いで被験者中で癌を防止または阻害することができる。
投薬量は少なくとも１回投与され、巨丸薬（bolus）としてまたは連続投与として供給してもよい。数週間から数カ月間にわたる投薬量の多数回投与が好ましいかもしれない。次の投与は指示された通りに投与することができる。
治療方法においては、癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンを有効量で哺乳類に投与し、哺乳類における癌を防止する。特に興味深いのは、メラノーマの防止のためのＴＲＰ−１遺伝子のＯＲＦ３によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンである。また特に興味深いのはメラノーマの防止のためのＴＲＰ−２遺伝子のフラグメントによってコードされる１以上のペプチドを含むワクチンである。
腫瘍を有する動物における腫瘍の負荷を減少する方法においては、当該方法は腫瘍の負荷の部位に有効量の抗原性癌エピトープを投与することを含み、その量はその部位の腫瘍の大きさを減少するのに有効である。
治療の別の方法では、自己由来の細胞毒性リンパ球または腫瘍浸透リンパ球を癌を有する患者から得ることができる。リンパ球を培養液中で生育させ、特異的癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの単独での、またはサイトカインを有する少なくとも１つの免疫刺激分子と一緒での存在下において培養することによって癌抗原特異的リンパ球を膨張させる。抗原特異的リンパ球を次いで、患者の腫瘍を減少または排除するのに有効な量で患者中に注入して戻す。
免疫化の後に、ワクチンの効率を、特異的溶解活性、特異的サイトカイン産生、腫瘍退行またはこれらの組み合わせによって評価される通り、癌抗原を認識する免疫細胞の産生によって評価することができる。免疫化すべき哺乳類が癌または転移性癌に既に罹患している場合には、ワクチンを、免疫調節剤、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、インターフェロン、腫瘍壊死因子などの他の治療処置、シスプラチナムなどの化学治療剤、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤、アムホテリシンＢ、抗生物質などと組み合わせて投与することができる。
本発明の別の側面は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列であって、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列が免疫系のＴ細胞によって免疫学的に認識される癌ペプチドおよびその一部をコードする、上記ＤＮＡ配列である。
代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＴＲＰ−１遺伝子、ＴＲＰ−２遺伝子、ＩＮＫ４ａ遺伝子などからのＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。
興味深いのは、メラノーマ形成遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列である。メラノーマ形成遺伝子は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ｇｐ７５（ＴＲＰ−１）、ＴＲＰ−２（Helahan, R他、1993 J. Invest. Dermatol. 100(Suppl.): 176S-185S）などをコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
本発明の一つの態様は、チロシナーゼ関連タンパク質をコードする遺伝子配列内からの癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列またはその一部である。ＴＲＰ−１の遺伝子配列は、Vijayasaradhi, S. 他（1990, J.Exp.Med.171:1375-80）に記載されている通り、アクセッション番号Ｘ５１４５５により、そしてCohen, T. 他1990 Nucleic Acids Research, VOL.18:2807に記載されている通り、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ５１４２０により、ＥＭＢＬデータバンクに開示されている。
一つの態様において、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Ｔリンパ球によって認識される癌ペプチドまたはその一部をコードする、配列番号５を有する図２に記載のＯＲＦ３、その一部および機能的に均等なその配列変異体を含む。図２に記載したＯＲＦ３に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。
別の態様において、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、
0003998713.tif 000002
を含む。
本発明の一つの態様は１以上の癌ペプチドをコードするＴＲＰ−２の一部である。ＴＲＰ−２の遺伝子配列は、Yokoyama他（1994）に記載されている通りアクセッション番号Ｄ１７５４７そしてBouchard他（1994）に記載されている通りジーンバンクアクッション番号Ｓ６９２３１によりジーンバンクに開示されている。
一つの態様において、ＴＲＰ−２遺伝子フラグメントは、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲおよび、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Ｔリンパ球によって認識される癌ペプチドについての機能的に均等なその配列変異体をコードする。ＬＬＧＰＧＲＰＹＲをコードする配列およびその均等な配列変異体に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。
別の態様において、ＴＲＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列は全てまたはその一部以上を発現する。ＴＲＰ−２遺伝子の好ましいフラグメントは、ヌクレオチド位置９４７のＰｓｔＩ部位とヌクレオチド位置１０８０のＫｐｎＩ部位の間の領域を含む。
ＴＲＰ−２遺伝子の別の好ましいフラグメントは、
0003998713.tif 000003
を含む。
遺伝コードの縮重のため、ＤＮＡ配列の変形が均等な癌ペプチドの翻訳を生じるであろう。その結果、置換が癌抗原ＭＨＣ制限Ｔ細胞によって認識される癌ペプチドの発現を生じる限り、そのような置換も本発明の範囲内に含まれる。本発明に包含される一つの置換は、ＳｅｒをコードするＴＣＡのＡｌａをコードするＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧの代わりの置換である。他の哺乳類種からのホモログが本発明の範囲内に含まれる。
ＴＲＰ−１遺伝子などからのような代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の全部または一部をプローブとして使用して他の哺乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。同様に、ＴＲＰ−２遺伝子の全部または一部をプローブとして使用して他の哺乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。一つの態様においては、マウスｃＤＮＡ配列を使用してヒトホモログ核酸配列の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。陽性クローンを選択して配列決定する。ｃＤＮＡライブラリーを合成できる組織種類の例としては、真皮、表皮、固体腫瘍、メラノーマ、メラノサイトなどが含まれるがこれらに限定されない。当業者ならばホモログを検出するために使用する好適なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸ハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術の慣用的方法はSambrook他（eds）（1989）「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, Plainview, New YorkおよびAusubel他（eds）「Current Protocols in Molecular Biology」（1987）、John WileyおよびSons, New York, New Yorkに記載されている。
本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２癌ペプチドなどのような癌ペプチドを転写するＲＮＡの検出および定量のための核酸プローブである。対照ＲＮＡ試料に対するＲＮＡのレベルの変化は哺乳類の疾患の診断および予後において有用である。
一つの態様において、ｍＲＮＡを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のｍＲＮＡと比較する。対照と比較して、患者中の癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームｍＲＮＡの定量的および／または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。ｍＲＮＡはｍＲＮＡにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。一つの態様において、プローブはＴＲＰ−１のＯＲＦ３の転写産物とハイブリダイズできる。
本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のＴＲＰ−２腫瘍抗原を転写するＲＮＡの検出および定量のための核酸プローブである。対照ＲＮＡ試料に対するＲＮＡのレベルの変化は哺乳類の疾患の診断および予後において有用である。
一つの態様において、ＴＲＰ−２ｍＲＮＡを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のＴＲＰ−２ｍＲＮＡと比較する。対照と比較して、患者中のＴＲＰ−２ｍＲＮＡの定量的および／または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。ｍＲＮＡはオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。
癌ペプチドまたはその一部をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせをＰＣＲプライマーとして使用して、選択されたＲＮＡ配列を増幅するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して生物試料中のｍＲＮＡを検出することができる。本発明はまた癌ペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡおよびＲＮＡの検出のためのｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕＲＴ−ＰＣＲをも包含する。その技術は、標的核酸のコピー数が非常に低い場合、または異なる型の核酸を区別しなければならない場合に好ましい。その方法は正常細胞由来の前癌および癌を検出および識別する際に特に有用である。
本発明は、遺伝子由来の核酸欠失フラグメントの生成を含む抗原特異的Ｔ細胞と反応性を有する抗原性癌エピトープを同定する方法を含む。欠失フラグメントを好適なベクター中に置き、これを次いで核酸産物の発現のために宿主細胞中にトランスフェクトまたは形質導入する。場合により、宿主細胞は免疫刺激分子をも発現する場合もある。癌抗原特異的Ｔ細胞応答は欠失産物を発現する宿主細胞の存在下で測定される。
宿主細胞が欠失産物のみを発現する場合、免疫刺激分子を、Ｂ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞などの抗原提示細胞によってあるいは刺激分子でトランスフェクションした細胞によって供給することができる。一つの態様において、免疫刺激分子はＭＨＣクラスＩ分子である。
このアプローチを使用するマッピングによって、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を決定する。
癌抗原および抗原性癌エピトープを同定する代替法は、合成ペプチドを作製し、その合成ペプチドで抗原提示細胞をパルスし、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞を抗原特異的Ｔ細胞と一緒に添加し、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞の存在下でＴ細胞の抗原特異的応答を測定することによる。抗原特異的Ｔ細胞応答を生じる合成ペプチドは本発明の抗原性癌エピトープを含む。
本発明はまた、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも１つの免疫刺激分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。一つの態様において、ベクターはＴＲＰ−１遺伝子のＯＲＦ−３を含む。
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原をコードするＴＲＰ−２遺伝子およびそのフラグメントを含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。
真核発現ベクターには、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルスベクター、馬脳炎ベクター、インフルエンザウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、同一の遺伝子からの正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。別の態様において、本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子またはそのフラグメントまたは変異体の核酸配列によってコードされるＴＲＰ−２腫瘍抗原を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。組み換えウイルスは少なくとも１つの免疫刺激分子を発現してもよい。組み換えウイルスは、哺乳類、特にヒトの癌を防止または治療する目的のために、哺乳類において細胞仲介免疫応答を引き出すかアップ調節することができる。
組み換えウイルスは、単独または免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子と一緒に、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープをコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。一つの態様において、組み換えウイルスは、ＴＲＰ−１癌ペプチドまたはその一部をコードする核酸配列をそのゲノム中に取り込んでいる。別の態様において、組み換えウイルスは、単独または同時免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子と一緒に、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその変異体をコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。組み換えウイルスで感染した宿主細胞は、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープを単独または少なくとも１つの免疫刺激分子と一緒に発現する。
組み換えワクシニアウイルスベクターからの外来遺伝子産物を構築および発現させる方法は、Perkus他Science 229:981-984, 1985、Kaufman他Int.J.Cancer 48:900-907, 1991、Moss Science 252:1662, 1991、SmithおよびMoss BioTechniques Nov/Dec, p.306-312,1984、および米国特許４，７３８，８４６号に開示されている。SutterおよびMoss（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10847-10851, 1992）およびSutter他（Virology 1994）は、本発明でウイルスベクターとして使用できる非複製性組み換えアンカラウイルス（ＭＶＡ、改変したワクシニアアンカラ）のベクターとしての構築および使用を開示している。BaxbyおよびPaoletti（Vaccine 10:8-9, 1992）は、本発明でウイルスベクターとして使用するための、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよび他の鳥類種を含む非複製性プロキシウイルス（proxvirus）のベクターとしての構築および使用を開示する。
本発明のベクターは、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの発現のために好適な宿主細胞中に置くことができる。真核宿主細胞株には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、昆虫細胞、樹枝状細胞などの抗原提示細胞などが含まれるがこれらに限定されない。場合により、宿主細胞は刺激分子を発現することもできる。宿主細胞が癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープを少なくとも１つのＭＨＣ分子と一緒に両方発現する場合、真核発現系を使用して適当なグリコシル化を行うことが好ましい。宿主細胞による癌抗原および免疫刺激分子の両方の発現により、特異的Ｔ細胞に対して必要なＭＨＣ制限ペプチドとＴ細胞に対する好適なシグナルが供給され、抗原認識と増殖が助けられ、または抗原特異的Ｔ細胞のクローン性膨張が助けられる。全体的な結果は免疫系のアップ調節である。免疫応答のアップ調節は、癌または前癌の増殖を殺傷または阻害することができる癌抗原特異的細胞毒性リンパ球の増加によって明白である。
ＤＮＡは、当分野で既知の方法によってトランスフェクション、形質導入、リポソームなどによって宿主細胞中に挿入される（Sambrook他、1989、「Molecular Cloning A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor press, Plainview, New York）。リポソームのためには、例えば、ポリカチオン性脂質である、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）と複合化したジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）などのカチオン性脂質が好ましく、Nabel, E.G 他, 1992, Hum.Gene.Ther. 3:367-275; Nabel, G.J.他，1992, Hum.Gene Ther.3:649-656; Stewart,M.J. 他, 1992, Hum.Gene Ther.3:399-410; Nabel, G.J. 他 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:l1307-l1311;およびHarrison, G.S.他 1995 BioTechniques 19:816-823に開示されている通りである。
宿主細胞によって発現された組み換え癌タンパク質、腫瘍抗原または抗原性癌エピトープは、当分野で既知の標準的タンパク質精製法によって細胞ライセートまたは細胞上清から精製することができる。これらには、モレキュラーシーブクロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣなどが含まれるがこれらに限定されない（Ausubel他、1987, Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons, New York, NY）。免疫アフィニティークロマトグラフィーを、免疫アフィニティー試薬として、本明細書に記載した抗癌タンパク質抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して精製のために使用することもできる。
組み換えウイルスは治療剤またはワクチンとしても使用できる。そのような使用では、被験者に約１０5から約１０10プラーク形成単位／哺乳類ｍｇの範囲内の組み換えウイルスの投与量を供給することが望ましいが、より低いまたはより高い投与量を投与することもできる。
組み換えウイルスベクターは、メラノーマなどの癌の証拠の前に、またはメラノーマなどの癌に罹患した哺乳類の疾患の退行を仲介するために、哺乳類に導入することができる。ウイルスベクターを哺乳類に投与するための方法の例としては、ｅｘ  ｖｉｖｏで組み換えウイルスに細胞を露出すること、あるいは罹患した組織中の組み換えウイルスの注入または静脈内、皮下、皮膚内、筋肉内などのウイルス投与が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、組み換えウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターの組み合わせを好適な薬学的に許容可能な担体中で癌性損傷への直接注入または局所投与によって局所的に投与することができる。問題の核酸配列を有する組み換えウイルスベクターの量はウイルス粒子の力価に基づく。免疫化の好ましい範囲は、哺乳類１頭、好ましくはヒト１人当たり約１０5から１０10ウイルス粒子である。
腫瘍拒絶に関与する本発明の癌抗原エピトープは本明細書に具体的に開示されたものに限定されない。本発明で開示した方法を使用して、代替オープンリーディングフレーム産物に含まれる他の癌抗原エピトープを他の腫瘍関連抗原から同定することができ（Van der Bruggen, P. 他1991 Science 254:1643-47; Gaugler, B 他1994 J.Exp.Med. 179:921-30; Boel, P. 他1995 Immunity. 2:167-75; Brichard, V他1993, J.Exp.Med. 178:489-95; Robbins, P.F. 他、1994、Cancer Research 54; 3124-26; Kawakami, Y.他1994, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:3515-19; Coulie, P.G.他1994 J.Exp.Med. 180:35-42; Bakker, A.他1994, J. Exp.Med.179:1005-09）、例えばＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（Kawakami, 他J. Exp.Med.180:347-352, 1994）、ＭＡＧＥ−３（Gaugler他、J. Exp.Med.179:921-930, 1994）、ｇｐ１００（Kawakami, 他Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:6458-6462, 1994）、チロシナーゼ（Brichard他J. Exp.Med.178:489, 1993）、ＴＲＰ−２、ＣＥＡ、ＣＡ−１９−Ａ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ｅｒｂ−２（Boon他、Ann.Rev.Immunol.12:337, 1994）などから同定することができる。
腫瘍保有患者由来の腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬｓ）は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によって提示される腫瘍関連抗原を認識する。インターロイキン−２（ＩＬ−２）と一緒にＴＩＬ５８６を転移性メラノーマを有する自己由来患者に注入すると、主要の客観的退行が生じた。ＴＩＬ５８６によって認識された腫瘍抗原をコードする遺伝子は最近単離され、ｇｐ７５をコードすることが示された。本発明は、正常のｇｐ７５タンパク質に由来しない、ＴＩＬ５８６によって認識された、抗原ペプチド、ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号９）の同定と単離である。代わりに、この９量体ペプチドが同一遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じた。即ち、ｇｐ７５遺伝子は２種の完全に異なるポリペプチド、即ち、癌を有する患者からの血清中のＩｇＧ抗体によって認識される抗原としてのｇｐ７５と、Ｔ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原としての２４アミノ酸産物とをコードする。これは、ヒト腫瘍拒絶抗原が正常のタンパク質をコードするために使用されるもの以外のオープンリーディングフレームを使用して正常の細胞遺伝子から生成できることの最初の実証を意味する。これらの知見は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫を誘導するためのワクチンとして有用である、腫瘍抗原を生成するための新規な機構を明らかにした。
ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１欠失分析の方法は癌エピトープをｇｐ７５遺伝子の小さいＤＮＡフラグメントに位置付けた。癌エピトープは正常のｇｐ７５タンパク質に不在であった。ＴＩＬ５８６によって認識された本発明の癌ペプチドは、正常のｇｐ７５タンパク質をコードする同一の遺伝子の代替オープンリーディングフレームから翻訳された遺伝子産物から誘導された。ヌクレオチド２９４−２９６のＡＴＧをＡＴＣで置換するとＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力の完全な損失が生じた。コールド標的阻害実験は、同定された癌エピトープが腫瘍細胞上に存在する天然でプロセスされたペプチドによってＴ細胞認識を競合できることを示した。ＴＩＬ５８６細胞株から作製した６個のＴ細胞クローンは、５８６ｍｅｌ腫瘍細胞、このペプチドでパルスした５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞、および正常メラノサイトをＨＬＡ−Ａ３１制限様式で認識することができ、また代替オープンリーディングフレームによってコードされた遺伝子産物が腫瘍細胞並びに正常メラノサイト中に存在するかもしれないことも示唆される。
本発明はまた、ＴＩＬ５８６によって認識される腫瘍抗原をコードしＴＲＰ−２をコードすることを示した遺伝子に関する。本発明はまた、ＴＲＰ−２に由来し、癌ワクチンとして活性である抗原性ペプチドＬＬＧＰＧＲＰＹＲの同定および単離に関する。
本発明は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその一部をコードするＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物の一般的な作製方法は、Krimpenfort他、米国特許5,175,384、Leder他、米国特許5,175,383、Wagner他、米国特許5,175,385、Evans他、米国特許4,870,009およびBerns米国特許5,174,986に記載されている。遺伝子の取り込みは、癌ペプチドの多重形態または変異体の過剰発現、変化した発現または発現を生じる。得られたトランスジェニック動物は本発明の癌または腫瘍抗原の発達の研究で有用である。動物モデルは癌治療のためのワクチンおよび化学療法剤のスクリーニングで有用である。トランスジェニック動物はまた癌の発達の研究でも有用である。
本発明はさらに、本発明の癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの免疫化によって引き出された抗体またはその抗原結合部分を含む。癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープが数個のアミノ酸のみから成る場合、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープは、抗体反応を引き出すために担体タンパク質と結合させることができる。ＫＬＨまたは破傷風毒素などの担体タンパク質および結合の方法は当分野で公知である。抗体は本発明の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープに対する特異性を有し、それと反応または結合する。
例示的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子または抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子のこれらの一部分であり、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、ヒト化キメラ抗体、およびＦ（ｖ）として当分野で公知の免疫グロブリン分子の一部が含まれる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は当分野で既知の方法によって作製できる（KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256, 495-497; Campbell「Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」in Burdon他(eds.)(1985)、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」第１３巻、Elsevier Science Publishers, アムステルダム）。抗体または抗原結合フラグメントは遺伝子工学によって作製することもできる。重鎖および軽鎖の両方の発現のための技術はＰＣＴ特許出願、公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４２４、Huse他（1989）Science 246:1275-1281、及び米国特許４，９４６，７７８の主題である。
一つの態様において、本発明の抗体を免疫分析で使用して、生物試料中のＴＲＰ−１ペプチドおよびＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその一部を含む癌ペプチドを検出する。抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して癌に罹患した哺乳類からの組織バイオプシー試料中の癌ペプチドを検出できる。疾患組織中の癌抗原の評価を使用して哺乳類における疾患の進行を予測したり、治療の効果を診断できる場合がある。免疫分析は放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析、酵素免疫分析、ケミルミネッセント分析、免疫組織化学分析などが可能であり、インビトロ、インビボまたはｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。ＥＬＩＳＡに関する当分野で公知の標準技術は、「Methods in Immunodiagnosis」第２版、RoseおよびBigazzi eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell他「Methods and Immunology」、W.A. Benjamin,社、1964; およびOellerich, M.1984, J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 22:895-904に記載されている。免疫組織化学のための慣用法はHarlowおよびLane（eds）（1988）、「Antibodies A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausbel他(eds)1987「Current Protocols in Molecular Biology」、John WileyおよびSons（New York, NY）に記載されている。そのような検出分析のために適当な生物試料は、細胞、組織バイオプシー、全血、血漿、血清、たん、脳髄液、胸膜液、尿などが含まれるがこれらに限定されない。
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは免疫治療でも使用できる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の症状の度合い、範囲または持続期間を防止、減少または減衰させるのに十分な量で哺乳類に提供される。
引用された全ての文献および特許は引用により本明細書中に取り込まれる。
本発明を一定の特定の態様に関して上記で説明してきたが、多くの変形が可能であること、並びに代替の物質および試薬を本発明から離れることなく使用できることが理解される。ある場合には、そのような変形および置き換えは若干の実験を必要とするかもしれないが、通常の試験を含むだけである。
特定の態様の上記の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにし、他者は、現在の知識を適用することによって、一般的概念から離れることなくそのような特定の態様を各種の応用のために容易に改良および／または採択でき、従ってそのような採択および改良は開示した態様の意味および均等の範囲の中に含まれることが意図される。
実施例１
材料と方法
化学薬品と試薬
下記化学薬品と試薬は表示供給源から購入した：ＲＰＭＩ  １６４０，ＡＩＭ−Ｖ培地，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｒｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）；真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；抗−ＨＬＡ−Ａ３１モノクローナル抗体（Ｏｎｅ  ｌａｍｄａ，Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）；フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリン  Ｍ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と細胞系統
ＴＩＬ５８６を、転移性メラノーマを有する患者の腫瘍標本から単離し、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）（Ｃｈｉｒｏｎ）を含有する培地中で３２〜６０日間、既述されたように増殖させた（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．，Ｄ．Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｆ．Ｐ．Ａｖｉｓ，Ａ．Ｅ．Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｌ．Ｆｒｅｅｋｓｅｎ，Ｗ．Ｍ．Ｌｉｎｅｈａｎ，Ｍ．Ｔ．ｌｏｔｚｅ，Ｃ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｅｉｐｐ，Ｐ．Ｓｉｍｏｎ，Ｃ．Ｇ．Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９〜５３）。ＴＩＬ５８６は主としてＣＤ８+Ｔ細胞であった。ＴＩＬ１２００はＴＩＬ５８６に関して述べた条件と同じ条件下で増殖させた。Ｔ細胞クローンはＴＩＬ５８６細胞系統から限界希釈法によって得て、次に、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で膨張させた（expanded）。
メラノーマ細胞系統３９７ｍｅｌ，３９７ｍｅｌ／Ａ３１，５８６ｍｅｌ，６２４ｍｅｌ及びＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶをこの実験室で確立して、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。幼児包皮（infant foreskin）に由来する正常培養メラノサイト（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＡから購入したＮＨＥＭ６８０）はメラノサイト増殖培地（ＭＧＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＡ）中で培養した。ＣＯＳ７細胞系統はＷ．Ｌｅｏｎａｒｄ博士（ＮＩＨ）から提供された。
ＧＭ−ＣＳＦ分泌アッセイ
ＤＮＡトランスフェクションとＧＭ−ＣＳＦ分析は既述されたようにおこなった（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．，Ｐ．Ｆ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｙ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｘ．Ｑ．Ｋａｎｇ及びＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。簡単には、異なるフラグメントを含有するＤＮＡ  ２００μｇとＨＬＡ−Ａ３１  ＤＮＡ  ５０ｎｇとを１００μｌのＤＭＥＭ中の２００μｌのリポフェクタミンと１５〜４５分間混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を次にＣＯＳ−７（５ｘ１０4）細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＤＭＥＭ培地によって２回洗浄した。ＴＩＬ５８６を１２０  ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中に１ｘ１０5細胞／穴の濃度で加えた。１８〜２４時間のインキュベーション後に、１００μｌの上澄み液を回収し、ＧＭ−ＣＳＦを標準ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で測定した。ペプチドに関しては、５８６ＥＢＶ、１５１０ＥＢＶ及びＴ２細胞を３７℃においてペプチドと共に９０分間インキュベートしてから、１２０  ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地によって３回洗浄した。ＴＩＬ５８６を加え、さらに１８〜２４時間インキュベートし、１００μｌの上澄み液をＧＭ−ＣＳＦアッセイのために回収した。
ＥｘｏＩＩＩ／ＳＩ欠失構築とＰＣＲフラグメント
一連の欠失を作製するために、ｐｏＤＮＡ７７６プラスミドＤＮＡをＸｂａＩによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化をブロックした。ｐｃＤＮＡ７７６プラスミドは２．４ｋｂ  ＤＮＡフラグメントと、転写を導くためのＣＭＶプロモーターとを含有するｐｃＤＮＡ３ベクターの誘導体である。直鎖状（linearized）ＤＮＡを第２の制限酵素ＸｈｏＩ消化にさらして、ＥｘｏＩＩＩに感受性の１末端を形成した。ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼ欠失は製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に従っておこなった。詳細なプロトコールは次の通りである：
１．１０μｇのＤＮＡをＸｂａＩによって消化させて、αホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドによって充填した。
２．ＤＮＡを第２酵素ＸｈｏＩによって消化させた後に、フェノール抽出及びエタノール沈降をおこなった。
３．ＤＮＡペレットを乾燥させ、１２５μｌの２Ｘ  Ｅｘｏ緩衝剤、２５μｌの１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１００μｌの水中に懸濁させた。
４．全てのアリコートが取り出されて、ドライアイス上に置かれた時点で、チューブを６８℃で１５分間加熱してから、氷上に置いた。
５．１５ＵのＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼを各時点のチューブに（１Ｘ  Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ希釈緩衝剤によって予め希釈して）加えて、３０℃において３０分間インキュベートした。
６．下記を加えた：
４μｌの２０％ＳＤＳ
１０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５
２０μｌの８Ｍ  ＬｉＣｌ
２５０μｌの緩衝剤平衡化フェノール：クロロホルム
７．サンプルをボルテックスし、マイクロフュージ中で１分間回転させ、上部水層を取り出して、クロロホルムで抽出して、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎタンパク質をＤＮＡから抽出した。
８．２５μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ７．０）を水相に加えた。１０ｎｇ／μｌの最終濃度までのｔＲＮＡを沈降のためのキャリヤーとして用いた。
９．６５０μｌの冷エタノールを加えた。サンプルをドライアイス上で１０分間急冷して、マイクロフュージ中で２０分間回転させた。
１０．上澄み液を排出して、ペレットを８０％エタノールによって洗浄した。
１１．ペレットを乾燥させた。
１２．ＤＮＡペレットを１５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再溶解した。
Ｂ．ライゲーション
１３．ＤＮＡ欠失を下記条件を用いてライゲートした。
１．０μｌのＥｘｏ／Ｍｕｎｇ処理ＤＮＡ
２．０μｌの１０Ｘライゲーション緩衝剤
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５
７０ｍＭ  ＭｇＣｌ2
１０ｍＭ  ＤＴＴ
２．０μｌの５ｍＭ  ＡＴＰ，ｐＨ７．０〜７．５
２．０μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ＃６０００１１；キットとして提供）
１３．０μｌのＨ2Ｏ
２０．０μｌの総反応容量
室温においてインキュベート
インサートをベクターにライゲートするためのＤＮＡライゲーションキット（Ｃａｔ＃２０３００３）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅが提供。
１４．残留する１４．０μｌのＥｘｏ／Ｍｕｎｇ処理ＤＮＡのうちの７μｌをゲル電気泳動分析に用いた。
１５．１μｌのライゲーション反応を用いて、１００μｌのＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ−ＪＭ１０９又はＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させ、ＬＢ／ＡＭＰプレート上にプレートした。
Ｃ．低融点アガロース方法
欠失体のスクリーニングを最少にするために、欠失の一部を低融点アガロース中で泳動し、問題のバンドを切り取り、ライゲーションを続けた。ライゲーション反応において、アガロース濃度は０．５％未満に維持した。
ＰＣＲ反応を９４℃において２分間おこなった後に、９４℃で１分間、５５℃で４５秒間そして７２℃で１分間の２５サイクルを続けた。プライマーｇｐＮ（５’ＡＧＡＡＴＧＡＧＴＧＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧ）（配列番号：４２）とｇｐ１１Ｂ（５’ＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡ）（配列番号：４３）とを用いて、ＤＮＡフラグメント（１〜６６７）を生成し、次にｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化して、ｐＰＣＲ１１０を作製した。プラスミドｐＰＣＲ２１０とｐＰＣＲ２２０とは、それぞれ、プライマーｇｐ−１（５’ＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣ  ＡＣＡＡＣＴＣ）（配列番号：４４）とｇｐ１１Ｂ，ｇｐ−１及びｇｐ２２（５’ＴＡＡＡＴＧＧＡＡ  ＡＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴ  ＧＧＣＧＴＧ）（配列番号：４５）とを用いて増幅させたＤＮＡ挿入フラグメントを含有するｐＣＲ３ベクターであった。
細胞傷害性溶菌アッセイ
溶菌アッセイを既述されたようにおこなった（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ等，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８〜６２）。簡単には、ターゲット細胞をクロムによって９０分間標識した。３回洗浄した後に、細胞を１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドと共に９０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、カウントし、次にＴＩＬ５８６とエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）の指定比率で混合した。４時間のインキュベーション後に、クロム放出を測定した。ペプチドはペプチドシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ  ＡＭＳ４２２，Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏ．社，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いて固相法によって合成した。一部のペプチドはＨＰＬＣによって精製され、９８％を越える純度を有した。ＴＩＬ５８６によって認識されるＯＲＦ３Ｐペプチドの滴定のために、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞を種々な濃度の精製ＯＲＦ３Ｐペプチドと共にインキュベートした。特異的溶菌（specific lysis）の％を式：（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）ｘ１００［式中、Ａはペプチドの存在下でのＴＩＬ５８６による５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞の溶菌であり、Ｂは同じペプチドの存在下、但し、エフェクター細胞の不存在下での５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞からの自然放出（spontaneous release）であり、Ｃは最大クロム放出である］から算出した。細胞溶解のコールドターゲット阻害は“ホット”ターゲットとして51Ｃｒ標識５８６ｍｅｌ又は６２４ｍｅｌを、“コールド”ターゲットとして、ペプチドをパルスされた（pulsed）５８６ＥＢＶ  Ｂ及びＴ２細胞を用いておこなった。
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異を構築するために、変異したプライマーＧＰＭＵＴＩ、（５’ＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣ）（配列番号：１１）とＧＰＡ１とを用いて、ヌクレオチド２９６に変異（ＧからＣへ）を含有するＰＣＲフラグメントを生成した。野生型ＤＮＡフラグメントをプライマーＧＰＦ１（５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧ  ＴＣＴＧ）（配列番号：１２）、ＧＰＥ１（５’ＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧ）（配列番号：１３）、ＧＰＥ２（５’ＧＡ  ＡＴＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣ）（配列番号：１４）及びＧＰＡ１（５’ＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣ  ＣＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣ）（配列番号：１５）を図３Ａにおける矢印頭によって指示されるように用いることによって増幅させた。精製ＰＣＲ生成物を次にｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化した。ＰＣＲフラグメントを含有する全てのプラスミドを配列決定して、方向とヌクレオチド配列とを確認した。
実施例２
ＴＩＬ５８６によって認識される抗原ペプチドの局在化
ｇｐ７５から抗原性エピトープを同定するために、ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１ヌクレアーゼを用いて３’末端からｇｐ７５遺伝子の一連のネストされた欠失（nested deletions）を生成し、さらに、ＰＣＲ増幅によってｇｐ７５から付加的なＤＮＡフラグメントを生成した（図１Ａ）。欠失研究のための出発物質としてｐｃＤＮＡ７７６を選択した理由は、このクローンが最初にライブラリースクリーニングによって同定され、ＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力を与えたからである。プラスミドｐｃＤＮＡ７７６はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にＢｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙに従って１９９６年１月１９日に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ９７４２３を与えられた。この研究の目的はＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープを同定することであるので、比較的小さいＤＮＡフラグメント中のエピトープを迅速に局在化することができるように、できるかぎり短いフラグメント（全長ｃＤＮＡの代わりの、切頭型のｇｐ７５）が用いられた。次に、これらの欠失構築体をＨＬＡ−Ａ３１遺伝子を含有するｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドと共にＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトした（transfected）（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。２４時間後に、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を検査して、どの構築体がＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激することができるのかを判定した。正常ｇｐ７５開始コドンを欠いた、ヌクレオチド２４７から７７１までの範囲の小さい切頭ＤＮＡフラグメントはＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を有し、このことはＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープが２４７から７７１までのヌクレオチドを含有するＤＮＡフラグメント中に位置付けされることを示唆する。ヌクレオチド４４５〜４４７に位置付けされたＫｏｚａｋ配列（ＧＡＴＡＴＧＧ）（配列番号：１６）に比較的良好に関係して、ｇｐ７５オープンリーディングフレームと同じフレーム内にＡＴＧ開始コドンが存在するので、ＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープがヌクレオチド４４５から７７１までの範囲内に位置付けされると推理された。それ故、ｐＰＣＲ２１０とｐＰＣＲ２２０とを構築したが、これらはｐＣＲ３発現ベクターの誘導体であり、切頭正常ｇｐ７５タンパク質の翻訳のための開始コドンとして４４５ｂｐに位置付けされたｇｐ７５（ＧＡＴＡＴＧＧ）（配列番号：１６）を有するフレーム中に内部ＡＴＧコドンを含有した。しかし、ｐＰＣＲ２１０又はｐＰＣＲ２２０のいずれも、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子とのＣＯＳ−７の同時トランスフェクション後に（図１Ｂ）ＴＩＬ５８６からのサイトカイン分泌を刺激する能力を与えず、このことはこのエピトープがこれらのフラグメントの上流に局在することを示唆した。それ故、さらに別のプラスミドｐＤ７７６Ａを構築したが、これは２４７から４４２までのヌクレオチド配列を含有し、ｇｐ７５と同じフレーム中にＡＴＧコドンを有さなかったが、ｇｐ７５とは異なるオープンリーディングフレーム中に２個のＡＴＧコドンを含有した。このプラスミドは、Ａ３１ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞中に同時トランスフェクトしたときにＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を強度に刺激した。ｇｐ７５の真正の開始コドンを含有するプラスミドｐＰＣＲ１１０は、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子と共に同時トランスフェクトしたときに（図１Ｂ）、ｐＤｅｌ５又はｐＤ７７６Ａよりも数倍低いサイトカイン放出を刺激した。これらの結果は、ＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープ（単数又は複数）がヌクレオチド２４７〜４４２の領域に位置付けされることを示唆した。
この領域（ヌクレオチド２４７〜４４２）は正常ｇｐ７５オープンリーディングフレーム中にＡＴＧ開始コドンを有さなかったが、例えばＡＣＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧのような非ＡＴＧコドンからの翻訳開始が幾つかの場合に報告されている（Ｈａｎｎ，Ｓ．Ｒ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７６：８８０〜８６；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ，Ｓ．等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４，６８：１７０〜７６）。この領域のエピトープを同定するために、ＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフ（binding motif）（位置２における疎水性残基とＣ末端における正に荷電した残基）に基づいて合成ペプチドを作製した（図２）（Ｆａｌｋ，Ｋ等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９４，４０：２３８〜４１）。この研究のために選択されたペプチドの大部分はノナマー（nonamer）であったが、一部は１０マー及び１１マーであった。これらのペプチドを５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスさせて、ＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激するこれらの細胞の能力を調べた（表１）。１つのペプチド、ＡＡＣＤＱＲＶＬＩＶＲＲ（配列番号：２５）はＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を非常に弱く誘導した。しかし、このペプチドはＴＩＬ５８６による溶菌に関してペプチド負荷５８６ＥＢＶ  Ｂを感作させることができなかった（表１）。
0003998713.tif 000004
５８６ＥＢＶ細胞は１μｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ放出はＴＩＬ５８６とのペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞の同時インキュベーション後に測定した。刺激物質なしのＴＩＬ５８６のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶはＨＬＡ−Ａ−３１を発現するＥＢＶ形質転換済みＢ細胞系統であった。ＴＩＬ５８６による、ペプチドパルスされた５８６ＥＢＶの細胞傷害性溶菌を４時間クロム放出アッセイにおいておこなった。
このペプチドは、高濃度（＞１μｇ／ｍｌ）で５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞をインキュベートしたときにのみＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を弱く刺激し、１０μｇ／ｍｌのペプチド濃度においてもターゲット細胞をＴＩＬ５８６による溶菌に関して感作しなかった（データ示さず）ので、このペプチドはＴＩＬ５８６によって認識される主要なＴ細胞エピトープに相当する可能性はなかった。
この主要なＴ細胞エピトープを含有する領域をさらに定義するために、それぞれ、プライマーＧＰＦ１と、ＧＰＥ１及びＧＰＥ２とによって増幅されたＰＣＲフラグメントを含有する、さらに２種類のプラスミドを構築した（図３Ａ）。図３Ｂに示すように、小さいＰＣＲフラグメントの始点にＡＴＧ開始コドンを含有する両プラスミドは、ＨＬＡ−Ａ３１に関連したＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激する能力を与え、このことはＴ細胞によって認識されるエピトープがｇｐ７５ｃＤＮＡの塩基２４７から３２９までの８２ヌクレオチド配列内でコードされることを示唆した。ＯＲＦ１中の２８のオーバーラップペプチド（overlapping peptides）（９マー又は１０マー）をこの領域中のｇｐ７５のアミノ酸配列に基づいて合成したが、いずれもＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激しないか、又は５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞をＴＩＬ５８６による溶菌に関して感作しないことが判明した（データ示さず）。
実施例３
ｇｐ７５遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチド
この小領域においてＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープを同定できないことは、代替オープンリーディングフレームが翻訳されうることを示唆した。比較的良好に関連した２種類のＡＴＧコドンが、ｇｐ７５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）とは異なるオープンリーディングフレーム中のこの領域（ヌクレオチド２４７〜４４２）に存在した（図２）。最初のＡＴＧ（２５１ＧＡＧＡＴＧＡ２５７）（配列番号：２９）からの翻訳は４５アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を生じたが、ヌクレオチド２９４〜２９６間に位置付けられたＡＴＧ（ＧＡＣＡＴＧＴ）（配列番号：３０）から出発した翻訳は２４アミノ酸遺伝子産物（ＯＲＦ３）を生成した（図２）。ＯＲＦ２に由来する３ペプチドとＯＲＦ３に由来する２ペプチドを選択して、ＨＬＡ−Ａ３１結合モチーフに基づいて合成した（表２と図２）。意外にも、ＯＲＦ３に由来する１つのペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）（ＯＲＦ３Ｐと表示）は、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスされたときに、ＴＩＬ５８６によって強度に認識された（表２）。ＴＩＬ５８６によるＯＲＦ３ペプチド（ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ）（配列番号：９）の認識は、このペプチドが自己由来５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞及び１５１０ＥＢＶ  Ｂ（Ａ３１＋）細胞上にパルスされたときにのみ観察されたが、ペプチドがＴ２（非ＨＬＡ−Ａ３１）細胞上に負荷したときには観察されず、このことはＴＩＬ５８６によるこのペプチドの認識がＨＬＡ−Ａ３１制限されることを示唆した。ＯＲＦ３Ｐのペプチド質量（peptide mass）は質量分光測定分析によって確認された。図４Ｂに示すように、ＴＩＬ５８６はＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞を溶菌したが、ＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフの基準を満たすがＴＩＬ５８６によって認識されない関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞、又はＯＲＦ３ＰペプチドをパルスされたＴ２細胞を溶菌することができなかった。ペプチドによる溶菌に関する感作は１００ｎＭにおいて最大効果を示したが、１ｎＭのペプチド濃度においても溶菌活性は検出された（図４Ｃ）。ＴＩＬ５８６はペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲＴ（配列番号：３３）若しくはＳＬＱＲＱＦＬＲＴ（配列番号：３４）のいずれも認識せず、ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に由来する修飾ペプチド（位置２、６及び９におけるアンカー残基の置換）ＭＬＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：３６）、ＭＲＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：３７）、ＭＳＬＱＲＬＦＬＲ（配列番号：３８）、ＭＳＬＱＲＱＦＬＥ（配列番号：３９）、ＭＳＬＱＲＱＦＬＫ（配列番号：４０）も認識しなかった（表２）。ＴＩＬ５８６は、ペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に比べて位置２におけるＡｌａによるＳｅｒ置換を有するペプチドＭＡＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：３５）のみを認識した（表２）。
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５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞によるペプチドインキュベーションとＧＭ−ＣＳＦ放出アッセイとの条件は、表１に述べた条件と同じであった。刺激物質なしのＴＩＬ５８６のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。修飾ペプチドはＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に対する位置２、６及び９におけるアミノ酸置換によって作製した。ＴＩＬ５８６による、ペプチドパルスされた５８６ＥＢＶの細胞傷害性溶菌を４時間クロム放出アッセイにおいておこなった。
実施例３
自然プロセス抗原性ペプチド生成のために翻訳が必要である
ＯＲＦ３のＡＴＧ開始コドン（２９４〜２９６）の上流の６ヌクレオチド中に位置付けられた停止コドンＴＡＧ（２８８〜２９６）が存在した（図２）ので、ＯＲＦ３Ｐペプチドがフレームシフト（frameshift）から生じたとは思われなかった。ＤＮＡ配列分析も、この上流領域に欠失又は挿入が存在しないことを確認した。ヌクレオチド２９４〜２９６に位置付けられたＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳に重要な役割りを果たすかどうかを調べるために、ＡＴＧＴ（２９４〜２９７）からＡＴＣＴへ変異させて（２９４〜２９７）、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）におけるＣｙｓ（ＵＧＵ）からＳｅｒ（ＵＣＵ）への変化を生じると考えられる、ＯＲＦ３の翻訳を排除した（図３Ａ）。変異した遺伝子を含有するプラスミド（ｐＧＦＭＵＴ１）を、ＣＯＳ−７中にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと共に同時トランスフェクトしたときにＴＩＬ５８６による認識を生じるその能力に関して試験した。図３Ｂは、変異した遺伝子が、野生型遺伝子を含有する構築体に比べて、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を完全に失ったことを実証した。この観察は、ヌクレオチド位置２９４〜２９６におけるＯＲＦ３中のＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳のために必要であるので、ＴＩＬ５８６によって認識されるＴ細胞エピトープの生成のために重要であることを意味した。
Ｍｅｔ（ＡＴＧ）はペプチドエピトープの位置１に存在し、ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧからＡＴＣへの変異はペプチドの位置１におけるＭｅｔからＩｌｅへの変化を生じたので、ＴＩＬ５８６が変異した遺伝子を認識しないことは変異したペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を失ったことによると考えられる可能性を研究した。変異した遺伝子によってコードされる配列と同じアミノ酸配列を有する合成ペプチド（ＩＳＬＱＲＱＦＬＲ）（配列番号：４１）を作製して、ＴＩＬ５８６による認識に関して検査した。合成変異ペプチドが野生型ペプチドに匹敵する濃度においてＴＩＬ５８６によってまだ認識されることが判明した。さらに、同じ変異を全長ｃＤＮＡ中に導入した場合には、ＴＩＬ５８６に対する反応性が観察されなかったが、野生型ｃＤＮＡはｐＰＣＲ１１０と同様なレベルにおいてＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激することができた。このことは欠失データと一致し、ＴＩＬ５８６が遺伝子の他の領域におけるペプチド（単数又は複数）を認識しなかったことを意味した。これらの結果は、Ｔ細胞が変異遺伝子（ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧからＡＴＣへ）を認識しないことはＯＲＦ３の翻訳開始の不活化によるものであると示唆した。
実施例４
腫瘍細胞並びにメラノサイト上の抗原性ペプチドの認識
腫瘍細胞上のＯＲＦ３Ｐペプチドと同様な又は同じである自然プロセス（naturally processed）ペプチドをＴＩＬ５８６が認識するかどうかという問題に対処するために、ＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞がコールドターゲット阻害アッセイにおいて51Ｃｒ標識５８６ｍｅｌの溶菌を阻害する能力を検査した。51Ｃｒ標識５８６ｍｅｌの溶菌の顕著な阻害が、ＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞によって観察されたが、関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞又はＯＲＦ３ＰペプチドをパルスされたＴ２細胞によっては観察されず（図５Ａ）、このことは、このペプチドエピトープがＴ細胞認識に関して腫瘍細胞上の自然プロセスペプチドと競合しうることを意味した。予想されたように、ＯＲＦ３Ｐ負荷５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞はＴＩＬ１２００によるターゲット６２４ｍｅｌの溶菌を阻害せず、ＴＩＬ１２００は、５８６ＥＢＶ  Ｂ単独に比べて、ＨＬＡ−Ａ２に関連してｇｐ１００抗原を認識する（図５Ｂ）。Ｔ細胞クローンがＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞と腫瘍細胞系統の両方を認識することができるかどうかをさらに試験するために、Ｔ細胞クローンを限界希釈（９６穴丸底マイクロプレートにおいて１細胞／穴）によってＴＩＬ５８６細胞系統から生成し、培養においてさらに膨張させた。Ｔ細胞クローンは限界希釈（１細胞／穴）によってＴＩＬ５８６細胞系統から生成した。Ｔ細胞クローンを６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地においてさらに膨張させた。培養においてさらに膨張させた。５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞をＯＲＦ３Ｐペプチド又は関連のないペプチドによって３７℃において９０分間パルスした。３回洗浄した後に、Ｔ細胞クローン又はＴＩＬ５８６細胞を加えて、さらに１８〜２４時間同時インキュベートした。５８６ｍｅｌと、３９７ｍｅｌ／Ａ３１+腫瘍と、メラノサイトＮＨＥＭ６８０細胞とに関しては、１ｘ１０5細胞／穴を、それぞれ、Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５８６−Ｃ１（図６Ａ）、ＴＩＬ５８６−Ｃ４（図６Ｂ）及びＴＩＬ５８６−Ｃ６（図６Ｃ）又はＴＩＬ５８６（図６Ｄ）に対して１ｘ１０5細胞で１８〜２４時間インキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦアッセイを図１Ｂに示すようにおこなった。６種類のＴ細胞クローンは５８６ｍｅｌ腫瘍細胞と、ＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞と、ＨＬＡ−Ａ３１陽性（positive）メラノサイトとを認識することができたが、３９７ｍｅｌ／Ａ３１又は５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞単独を認識することができなかった。典型的なデータを図６Ａ〜６Ｄに示す。これらの結果は、Ｔ細胞クローンが恐らく腫瘍細胞及び正常メラノサイト上のＯＲＦ３Ｐペプチドと同様な又は同じの自然プロセスペプチドを認識することを示唆した。
チロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２に対するｇｐ７５の４０〜４５％アミノ酸配列同一性が存在するので、Ｔ細胞クローンによって認識されるペプチドがｇｐ７５に由来するのではなく、これらの他のタンパク質のいずれかに由来する可能性を試験した。ＣＯＳ−７細胞をＨＬＡ−Ａ３１に加えたチロシナーゼ、ｇｐ１００又はＴＲＰ−２ｃＤＮＡｓによって、それぞれトランスフェクトして、いずれも６種類のＴクローンによって認識されることができないが、ＨＬＡ−Ａ３１とｇｐ７５ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７は、これらのクローンからのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激することを発見した（データ示さず）。コンピューターのデータベースサーチも、データベース中のチロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２を含めた既知タンパク質がＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフを有するアミノ酸配列と、ＴＩＬ５８６によって認識されるペプチドエピトープとの顕著な類似性とを含有しないことを示した。
実施例５
Ｉｎ  ｖｉｖｏ保護アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ保護試験のために、ＭＨＬ−Ａ３１+トランスジェニックマウスを、１０4Ｔｒｐ−１+Ｂ１６マウスメラノーマ細胞による皮下チャレンジ又は５ｘ１０5Ｔｒｐ−２+Ｂ１６マウスメラノーマ細胞による静脈内チャレンジの前に、０日目と１４日目に０、１ｐｇ、１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は１００ｍｇの癌ペプチド（配列番号：９）によって静脈内で免疫感作させる。腫瘍細胞を皮下に受容したマウスを腫瘍発生に関して週２回観察して、サイズを測定する。腫瘍細胞を静脈内に受容したマウスを１２日目に安楽死させ、肺転移の数をＨｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１〜４０によって述べられているように測定する。
実施例６
Ｉｎ  ｖｉｖｏ処置アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ処置に関しては、肺転移を確立するために、ＭＨＬ−Ａ３１+トランスジェニックマウスを、１ｘ１０5又は５ｘ１０5Ｔｒｐ−１+Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに１０5ＰＦＵ／ｍｇ体重で癌ペプチド（配列番号：９）を発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを１２日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。
実施例７
癌抗原特異的Ｔリンパ球
免疫療法
メラノーマ抗原に対して予感作されたＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Ｔリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３〜２１９１）。
Ｔリンパ球を癌ペプチド（配列番号：９）に１μｇ／ｍｌの濃度において単独で又はＩＬ−２の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたＴリンパ球を哺乳動物に約１０9〜１０12リンパ球／動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマの手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。
実施例８
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原性癌エピトープによって免疫感作させる。
このトライアルに適した患者は、標準的な有効療法を失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性メラノーマの徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞ＲＮＡのＰＣＲ又はノーザンブロット分析によって実証されるような、ＴＰＩ−１抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。
患者は１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は５００ｍｇ／ｋｇ体重の癌ペプチド（配列番号：６）を０日目、７日目及び１４日目に単独で又はＩＬ−２及び／又は免疫刺激性分子と組合せて受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。
処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：６）を含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。
完全な反応は、少なくとも４週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の完全な消失として定義される。部分的反応（partial response）は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積（product）の全体として、少なくとも４週間にわたる５０％以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がない又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として２５〜４９％の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の２５％を越える増加は再発と見なされる。
実施例９
ＴＲＰ−２のための材料と方法
化学薬品と試薬
下記化学薬品と試薬は指定供給源から購入した：ＲＰＭＩ  １６４０，ＡＩＭ−Ｖ培地，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）；真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；抗−ＨＬＡ−Ａ３１モノクローナル抗体（Ｏｎｅ  ｌａｍｄａ，Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）；フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリン  Ｍ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。
Ｔ細胞クローンと系統
Ｔ細胞クローンは、ＴＩＬ５８６細胞系統から限界希釈法（１細胞／穴）によって、１０％ヒトＡＢ血清と５００ＩＵ  ＩＬ−２とを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で支持細胞として同種ＰＢＬ（１ｘ１０3細胞／穴）を用いて生成させた。１２日間後に、Ｔ細胞クローンを６０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で膨張させた。最適な膨張（expansion）を得るために、Ｓ．Ｒｉｄｄｅｌｌ（Ｗａｌｔｅｒ等，１９９５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１０３８〜１０４４）が述べているＯＫＴ３膨張方法を用いた。簡単には、０日目に５ｘ１０4〜５ｘ１０5Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ３１  ＰＢＬ（５００：１、ＰＢＬ：Ｔ細胞比率）及び５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞（１００：１、ＥＢＶ：Ｔ細胞比率）と共に、１１％ヒト血清と３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体と抗生物質とを含有するＲＰＭＩ  １６４０（２５ｍｌ）中で同時培養した。１日目に、ＩＬ−２を１８０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で加えた。５日目に、この培地を、１１％ヒト血清と、ＩＬ−２  １８０ＩＵ／ｍｌとを含有する新しい培地と交換した。次に、培地を３日間毎に交換した。１２〜１４日目に、Ｔ細胞を回収して、計数し、冷凍保存した。ＴＩＬ５８６を転移性メラノーマを有する患者の標本から単離し、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）（Ｃｈｉｒｏｎ）を含有する培地中で既述されたように３２〜６０日間増殖させた（Ｔｏｐａｌｉａｎ等，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９〜８５３）。ＴＩＬ５８６は主としてＣＤ８+Ｔ細胞であった。
メラノーマ細胞系統３９７ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ／Ａ３１、５８６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ／Ａ３１、及びＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統、５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶを我々の実験室で確立して、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。幼児包皮に由来する正常培養メラノサイト（ＮＨＥＭ６８０、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡから購入）をメラノサイト増殖培地（ＭＯＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）中で培養した。ＣＯＳ−７細胞系統はＤｒ．Ｗ．Ｌｅｏｎａｒｄ（ＮＩＨ）によって提供された。
ＧＭ−ＣＳＦ分泌アッセイ
ＤＮＡトランスフェクションとＧＭ−ＣＳＦアッセイとは既述されたようにおこなった（Ｗａｎｇ等，１９９５，Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。簡単には、抗原をコードするＤＮＡ  ２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ３１  ＤＮＡ  ５０ｎｇとを、１００ｍｌのＤＭＥＭ中の２μｌのリポフェクタミンと１５〜４５分間混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を次にＣＯＳ−７（５ｘ１０4）細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＤＭＥＭ培地によって２回洗浄した。ＴＩＬ５８６を１２０  ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で１ｘ１０5細胞／穴の濃度で加えた。Ｔ細胞クローンに関しては、１〜２ｘ１０4細胞／穴のみを加えた。１８〜２４時間インキュベートした後に、１００μｌの上澄み液を回収し、ＧＭ−ＣＳＦを標準ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で測定した。ペプチド認識を試験するために、５８６ＥＢＶ又はＴ２細胞を３７℃においてペプチドと共に９０分間インキュベートしてから、１２０  ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地によって３回洗浄した。Ｔ細胞を加え、さらに１８〜２４時間インキュベートし、１００μｌの上澄み液をＧＭ−ＣＳＦアッセイのために回収した。
ＥｘｏＩＩＩ／ＳＩ欠失構築とサブクローニング
ＴＲＰ−２ｃＤＮＡはＤｒ．Ｓｈｉｂａｈａｒａの贈り物（Ｙｏｋｏｙａｍａ等，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１７：３１７〜３２１）であり、これを発現のためのＣＭＶプロモーターと共にｐＣＲ３ベクター中にサブクローニングした。一連の欠失を作製するために、ＴＲＰ−２ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＲ３をＸｂａＩによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化をブロックした。直鎖状ＤＮＡを第２の制限酵素消化にさらして、ＥｘｏＩＩＩに感受性の１端部を生成した。ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼ欠失は製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に従っておこなった。全ての欠失構築体を配列決定して、取り出されるＤＮＡ配列の位置を決定した。ｐＴＡプラスミドは、ＴＲＰ−２遺伝子の３’末端からＡｐａ  Ｉ  ＤＮＡフラグメントが欠失した、ｐＣＲ３−ＴＲＰ−２の誘導体であった。ＴＲＰ−２遺伝子の３’末端からＫｐｎＩ  ＤＮＡフラグメントを除去した後に、ｐＴＫが作製された。ｐＴＰは内部ＰｓｔＩフラグメントの欠失と再ライゲーションとによって生成された。
ノーザンブロット分析
グアニジンイソチオシアネート／塩化セシウム遠心分離法によって、総ＲＮＡを単離した。ヒト正常組織からの総ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡから購入した。２０μｇの総ＲＮＡに１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル中での電気泳動をおこなって、これをナイロン膜上に移した。ＴＲＰ−２遺伝子の２．０ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをランダムプライミング法によって32Ｐ−α−ＣＴＰで標識した。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションとをＱｕｉｃｋＨｙｂプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従っておこなった。膜を室温での１５分間の２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって２回、６０℃での３０分間の０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって２回洗浄した。オートラジオグラフィーを−７０℃においておこなった。
細胞傷害性アッセイ
溶菌をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いておこなった。簡単には、Ｔ２細胞又は５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞をＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳ中でペプチドで９０分間パルスした。腫瘍細胞と、ペプチドパルスされたＥＢＶ  Ｂ細胞とをＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（１ｘ１０6細胞毎に１５μｌの１ｍｇ／ｍｌ  Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ）によって３７℃において３０分間標識した。インキュベーション後に、細胞をＡＩＭ  Ｖ／１２０ＩＵ  ＩＬ−２によって３回洗浄した。１ｘ１０3ターゲット細胞にＴ細胞を種々なＥ：Ｔ比率で混合した。３７℃における４時間のインキュベーション後に、５μｌの臭化エチジウム含有ウシヘモグロビンクエンチ溶液（bovine hemoglobin quench solution）を加えた。プレートをＬａｍｂｄａスキャンによって読み取った。溶菌の％は下記式：［１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）］ｘ１００［式中、ＡはＴ細胞の存在下での非溶菌細胞の読取り値であり、Ｂはバックグラウンドシグナル値であり、Ｃはターゲット細胞からの最大シグナル値である］から算出した。
ペプチドはペプチドシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ  ＡＭＳ  ４２２，Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏ．社，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いて固相法によって合成した。数種類のペプチドをＨＰＬＣによって精製し、これらは９８％を越える純度を有した。数種類のペプチドのペプチド質量を質量分光測定分析によって確認した。
実施例１０
ＣＴＬクローンによる腫瘍細胞上の新しい抗原の認識
以前の研究において、我々は限界希釈法によってＴＩＬ５８６細胞系統から多くのＴ細胞クローンを単離している（Ｗａｎｇ等，１９９６ｂ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１３１〜１１４０）。ごれらの中で、６種類のクローンが、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５遺伝子の代替オープンリーディングから翻訳された遺伝子産物に由来するＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞と、自己由来５８６ｍｅｌ腫瘍細胞とを認識したが、関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞を認識しなかった。図７に示すような、これらのＴ細胞クローンの１つの代表としてＴＩＬ５８６−Ｃ１を選択した。しかし、同じＴＩＬ５８６細胞系統から単離された幾つかのＴ細胞クローンは、ＴＲＰ−１ペプチドＯＲＦ３Ｐをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞も、ＴＲＰ−１とＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞も認識しなかったが、５８６ｍｅｌ並びにＨＬＡ−Ａ３１＋メラノサイトを認識することができた（図７）。これらの結果は、これらのＴ細胞クローンが５８６ｍｅｌ腫瘍細胞上の付加的な腫瘍抗原を認識することを示唆した。次に、これらのＴ細胞クローンを膨張させて、材料と方法の項（実施例９）に述べた方法による認識に関して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために又は他のｃＤＮＡを試験するために充分な細胞を得た。１種類のクローン、ＣＴＬクローン４を以下に述べるような他の研究のために上首尾に膨張させて、用いた。
実施例１１
Ｔ細胞クローンによって認識される腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡの同定
ＣＴＬクローン４に抗原を提示する役割を担うＨＬＡ分子を決定するために、例えば３９７ｍｅｌ及び６２４ｍｅｌのようなＡ３１陰性腫瘍系統中にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡをトランスフェクトして、ＣＴＬクローンによる認識に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ３１を発現する３９７ｍｅｌ及び６２４ｍｅｌのトランスフェクション体（transfectant）はＣＴＬクローン４によって顕著に認識された（表３）。さらに、これらのＴ細胞はＨＬＡ−Ａ３１陽性同種腫瘍系統１３５３ｍｅｌをも認識することができ、このことは、ＣＴＬクローン４による腫瘍抗原の認識がＨＬＡ−Ａ３１制限される（HLA-A31 restricted）ことを意味した。
0003998713.tif 000006
２ｘ１０4ＣＴＬクローン４細胞をメラノーマ細胞系統又は、ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７と共に２４時間インキュベーションした後に、上澄み液中のＧＭ−ＣＳＦを測定した。
限られた数のＴ細胞のみが利用可能であったので、これらのＴ細胞が予め同定された腫瘍抗原又はメラノサイト系統分化タンパク質（melanocyte-lineage differentiation protein）を認識するか否かを最初に試験した。ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉ等，１９９４ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５〜３５１９）、ｇｐ７５（Ｗａｎｇ等，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）、ｇｐ１００（Ｋａｗａｋａｍｉ等，１９９４ｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６４５８〜６４６２）、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ等，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９〜４９５）、ｐ１Ｓ（Ｒｏｂｂｉｎｓ等，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９４４〜５９５０）及びＴＲＰ−２（Ｙｏｋｏｙａｍａ等，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１７：３１７〜３２１；Ｂｏｕｃｈａｒｄ等，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１２７〜１３４）を包含する、既知腫瘍抗原又は推定される抗原をコードする遺伝子とによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の、ＣＴＬクローン４による認識を試験した。ＨＬＡ−Ａ３１のみ又はＴＲＰ−２のみによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞はＴ細胞クローンによる認識を生じなかった。しかし、ＨＬＡ−Ａ３１とＴＲＰ−２ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞はＴ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激したが、ＨＬＡ−Ａ３１と他の遺伝子とによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は刺激せず、このことは、Ｔ細胞クローン４がＨＬＡ−Ａ３１制限様式でＴＲＰ−２を腫瘍抗原として認識したことを示す。
ＨＬＡ−Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ３３及びＡ６８とそれらのペプチド結合モチーフとにおける構造類似性の分析は、Ａ３様スーパーモチーフ（A3-1ike supermotif）の存在を示唆している（Ｓｉｄｎｅｙ等，１９９６，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３）。単一エピトープペプチドは、総集団（general population）の約４０〜５０％に累積的に発現されるＨＬＡ−Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ３３及びＡ６８分子と交差反応することができた。Ｂ型肝炎ウイルス  ヌクレオキャプシドタンパク質に由来する同じペプチドエピトープがＨＬＡ−Ａ３１と−Ａ６８分子によって提示され、対応するＨＬＡ−Ａ３１又は−Ａ６８制限ＣＴＲによって認識されることが報告されている（Ｍｉｓｓａｌｅ等，１９９３，Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．１７７：７５１〜７６２）。ＨＬＡ−Ａ３１制限Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ３陽性ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスされた場合のＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２エピトープを認識するかどうかを試験した。興味深いことには、Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ放出に基づいて弱い認識が検出された。しかし、ＨＬＡ−Ａ３陽性腫瘍細胞の認識は検出されなかった。
実施例１２
ＴＲＰ−２遺伝子の発現
種々な組織におけるＴＲＰ−２の発現パターンを評価するためのプローブとしてＴＲＰ−２ｃＤＮＡを用いて、ノーザンブロット分析をおこなった。正常な網膜組織は試験した正常なヒト組織のうちでＴＲＰ−２発現において唯一の陽性であることが判明した。メラノーマ細胞系統と他の細胞系統とにおけるＴＲＰ−２の発現パターンを以下の表４に列挙する。３０のメラノーマ細胞系統のうちの２５の細胞系統がＴＲＰ−２を発現することが判明した。ＢｕｒｋｉｔｔのＢ細胞系統Ｄａｕｄｉと胸部癌細胞系統ＭＤＡ２３  １とは、以前の結果と一致して、陰性であった（Ｂｏｕｃｈａｒｄ等，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１２７〜１３４）。したがって、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００及びＭＡＲＴ−１と同様に、この遺伝子の発現パターンはメラノーマ、正常メラノサイト細胞系統及び網膜に限定されるように思われる。
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ＴＲＰ−２の発現をノーザンブロット分析によって１０−２０〜ｇの総ＲＮＡを用いて試験して、ＴＲＰ−２ｃＤＮＡフラグメントによってプローブした。ＤａｕｄｉはＢｅｒｋｉｔｔのＢ細胞系統であり、ＭＤＡ２３１は乳癌細胞系統である。
実施例１３
Ｔ細胞によって認識されるペプチドエピトープ
ＴＲＰ−２からの抗原性エピトープを判定するために、ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１ヌクレアーゼと、ＴＲＰ−２の切頭形をコードするＤＮＡフラグメントとを用いて３’末端からＴＲＰ−２遺伝子の一連の組重ね欠失体を生成した。これらの欠失体とサブクローン化構築体とを、ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡを含有するｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドと共に、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の認識をＣＴＬクローンによって、ＣＴＬクローンからのＧＭ−ＣＳＦサイトカイン放出を測定することによって試験した。図９は、ｐＴＤ１、２及び３構築体がＣＴＬクローン４からのサイトカイン放出を刺激する能力を保有するが、ｐＴＤ４とｐＴＤ５はＣＴＬクローン４に対する刺激活性を失ったことを示し、このことはＣＴＬクローン４によって認識されるエピトープ（単数又は複数）がヌクレオチド８３６〜１０４５の領域に位置付けられたことを意味した。このことはサブクローニング実験によって得られた結果と一致した。ｐＴＡとｐＴＰとはＣＴＬクローン４からのサイトカイン放出を刺激する能力を失ったが、ｐＴＫはサイトカイン放出アッセイにおいてまだ陽性のままである。それ故、これらのエピトープは、図１０に示すように、第１のＰｓｔＩとＫｐｎＩ部位によって隣接されたＤＮＡフラグメント中に存在した。
この小さいＤＮＡフラグメントのコーディング領域からエピトープを同定するために、５種類の合成ペプチドはＨＬＡ−Ａ３１の合成ペプチド結合モチーフ（位置２における疎水性残基と位置９における正に荷電した残基）に基づくものであった（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ等，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８〜２２８）。これらのペプチドを５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスし、ＣＴＬクローン４によるサイトカイン放出を刺激するそれらの能力に関して試験した。表５に示すように、ペプチドＴＲＰ197〜205は、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスされたときに、ＣＴＬクローン４によって強度に認識された。ＣＴＬクローン４によるこのペプチドの認識は、このペプチドを、例えば５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶのような、ＨＬＡ−Ａ３１＋ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスしたときにのみ観察され、ＨＬＡ−Ａ３１陰性Ｔ２細胞上にパルスしたときには観察されなかった。ＣＴＬクローン４はＴＲＰ−１遺伝子の代替オープンリーディングフレームに由来するＯＲＦ３Ｐペプチドを認識しなかった。これらの結果は、ＴＩＬ５８６−ＣｌがＴＲＰ−１由来ＯＲＦ３Ｐペプチドを特異的に認識し、ＣＴＬクローン４がＴＲＰ２由来ペプチドを特異的に認識することを実証した。ＯＲＦ３ＰとＴＲＰ２−ｐ１９７の両方がＨＬＡ−Ａ３１分子によってＴ細胞に提示されたときに、交差反応性は観察されなかった。
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５８６ＥＢＶ細胞を１〜ｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞を、ＴＲＰ−１又はＴＲＰ−２のいずれかを認識するＴ細胞クローンと共に同時インキュベーションした後にＧＭ−ＣＳＦ放出を測定した。刺激因子なしのＴ細胞のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶはＨＬＡ−Ａ３１を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統であった。
実施例１４
ＴＲＰ197-205ペプチドの特徴付け
滴定実験は、１ｎＭのペプチドがＴ細胞クローン４からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激するために充分であり、この刺激が５００ｎＭにおいてプラトーに達したことをことを実証した（図１０Ａ）。ＴＲＰ197-205をパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞のＣＴＬクローン４による溶菌も種々なペプチド濃度において測定し（図１０Ｂ）、サイトカイン放出アッセイと同様に、ＣＴＬクローン４によるターゲット細胞の溶菌は１ｎＭペプチド濃度において検出された。最大溶菌は１００ｎＭのペプチド濃度において見られた。ＣＴＬクローン４はＴＲＰ２−ｐ１９７をパルスされた５８６ＥＢＶと５８６ｍｅｌ腫瘍細胞とを低いＥ：Ｔ比率においても溶菌することができたが、単独若しくは対照ペプチドＯＲＦ３Ｐをパルスされた５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞も、ＨＬＡ−Ａ３１陰性３９７ｍｅｌ系統も溶菌することができなかった（図１０）。
現在までに同定されたヒトメラノーマ抗原の大部分は非変異自己抗原であり、対応するＭＨＣ分子に対するこれらの自己ペプチドのＴ細胞認識及び結合アフィニティは、幾つかの場合に、アンカー残基におけるアミノ酸の置換によって改良されている。８マー又は１０マーを包含する多くの合成ペプチドと、表６に表示する修飾ペプチドとを作製し、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスされた場合のＣＴＬクローン４による認識に関して試験した。ＴＲＰ197-205のＮ末端において１アミノ酸が伸長された、１０マーＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲは、５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスされた場合に、ＣＴＬクローン４によってまだ認識されたが、反応性は重複９マーＬＬＧＰＧＲＰＹＲの約６０％であった。ＨＬＡ−Ａ３１の結合モチーフに基づいて、アンカー残基位置２と９並びに他の位置におけるアミノ酸置換によって若干の修飾ペプチドを生成した。Ｃ末端の位置９におけるＡｒｇ残基は、Ｌｙｓ残基によって置換されることができ、この修飾ペプチドは親ペプチドの活性の少なくとも６０％を保有した。位置２におけるＬｅｕ残基の、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ又はＶａｌ残基による置換は、同じ活性を維持したか、又は親ペプチドの６０％に活性を低下させたが、この位置におけるＡｌａ又はＰｈｅによる置換はＴ細胞からのサイトカイン放出を刺激する能力を低下させた（表６）。他の修飾はＴ細胞認識における可変な癌ペプチド活性を生じた。
0003998713.tif 000009
５８６ＥＢＶ細胞を０．５〜ｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞を、ＣＴＬクローン４細胞と共に同時インキュベーションした後にＧＭ−ＣＳＦ放出を測定した。刺激因子なしのＴ細胞のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶはＨＬＡ−Ａ３１を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統であった。
ＴＲＰ−２タンパク質は２つの推定の銅結合部位と、システイン富化領域と、膜通過ドメインとを含有する。ヒトＴＲＰ−２は染色体１３にマッピングされており、マウスの対応物は染色体１４のコートカラー変異（coat color mutation）、スレーティ（slaty）の領域にマッピングされている。ＴＲＰ−２とチロシナーゼ又はＴＲＰ−１／ｇｐ７５との間には約４０％のアミノ酸配列同一性が存在するが、チロシナーゼタンパク質ファミリー間の共通ペプチドエピトープを認識するＣＴＬ系統又はクローンは現在までに見つかっていない。
ＣＴＬクローン４によって認識された９マーＴＲＰ197-205ペプチドはＴＲＰ−２のコーディング領域における銅結合部位の１つに位置付けられる。このペプチドは、この研究で試験した修飾ペプチドを含めた他のペプチドに比べて、Ｔ細胞からのサイトカイン放出を最も効果的に刺激した。このことは、位置２におけるＬｅｕと位置９におけるＡｒｇとが好ましい残基であることを示す、予測されたＨＬＡ−Ａ３１結合モチーフと一致した。位置２におけるＬｅｕと位置９におけるＡｒｇとはそれぞれ位置２におけるＩｌｅとＳｅｒ及び位置９におけるＬｙｓと、Ｔ細胞認識に対する反応性の損失が殆ど無く若しくは微々たる損失で、置換されることができるが、位置１、３又は６におけるアミノ酸置換は反応性の若干の損失を生じた。
実施例１５
Ｉｎ  ｖｉｖｏ処置アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ処置に関しては、肺転移を確立するために、ＭＨＬ−Ａ３１+トランスジェニックマウスを、１ｘ１０5又は５ｘ１０5Ｔｒｐ−１+Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに１０5ＰＦＵ／ｍｇ体重で癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを１２日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。
実施例１６
癌抗原特異的Ｔリンパ球
免疫療法
メラノーマ抗原に対して予感作されたＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Ｔリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養する（Ｋａｗａｋａｍｉ，等，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３〜２１９１）。
Ｔリンパ球を癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲに１μｇ／ｍｌの濃度において単独で又はＩＬ−２の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたＴリンパ球を哺乳動物に約１０9〜１０12リンパ球／哺乳動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマ損傷の手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。
実施例１７
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原癌エピトープによって免疫感作させる。
このトライアルに適した患者は、標準の有効療法に失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性黒色腫の徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞ＲＮＡのＰＣＲ又はノーザンブロット分析によって実証されるようなＴＰＩ−２抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。
患者は１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は５００ｍｇ／ｋｇ体重の癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを０日目、７日目及び１４日目に単独で又はＩＬ−２及び／又は同時免疫刺激性分子（co-immunostimulatory molecule）と組合せて静脈内で受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。
処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。
完全な反応は、少なくとも４週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の消失として定義される。部分的反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として、少なくとも４週間にわたる５０％以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として２５〜４９％の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の２５％を越える増加は再発と見なされる。
考察
例えばチロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ及びｇｐ１００のような対応する非変異性共有（non-mutated shared）メラノーマ抗原の正常オープンリーディングフレームに由来する幾つかの抗原性Ｔ細胞エピトープが同定されている。この研究では、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドがｇｐ７５遺伝子の第２遺伝子産物に由来することを実証した。我々の知るかぎりでは、これは、Ｔ細胞が同じ遺伝子の重複オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチドを認識する最初の例であり、かつ２種類の完全に異なるタンパク質及び／又はペプチドが単一細胞遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されることができるという真核細胞における唯一つの例である。ｇｐ７５遺伝子のＯＲＦ３は２４アミノ酸の短いタンパク質をコードする。ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドは、代替オープンリーディングフレームのＡＴＧ（２９４〜２９６）開始コドンの直後に位置付けられた配列によってコードされる。ｇｐ７５はチロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２に対して４０〜４５％の配列相同性を有するが、ＣＯＳ−７細胞中へのＨＬＡ−Ａ３１とチロシナーゼ、ｇｐ１００又はＴＲＰ−２ｃＤＮＡ、それぞれとの同時トランスフェクションはＴＩＬ５８６由来Ｔ細胞クローンからのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激することができなかった。データベースサーチは、ＨＬＡ−Ａ３１ペプチド結合モチーフと、ＴＩＬ５８６とそれに由来するＴ細胞クローンによって認識されるペプチドエピトープに対して顕著な配列相同性とを有するタンパク質を明らかにしなかった。さらに、以前の研究は、メラノーマトランスフェクション体（ｇｐ７５+／Ａ３１+）がＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を与えたが、ｇｐ７５メラノーマトランスフェクション体（ｇｐ７５-／Ａ３１+）は与えなかったことを示した（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．等，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。他のメラノーマ細胞系統（ｇｐ７５-／Ａ３１+）によっても同様な結果が得られた。ＯＲＦ３Ｐペプチドはｇｐ７５遺伝子から同定された唯一のエピトープであり、ＴＩＬ５８６由来の６種類のＴ細胞クローンによって認識されたので、このペプチドは腫瘍細胞又はメラノサイト上の自然プロセスペプチドと同じ又は類似すると考えられる。このことは、このペプチドは腫瘍細胞上の自然ペプチドとＴ細胞認識に関して競合することができたので、コールドターゲット阻害実験によってさらに支持された。
結腸癌における変異した腺腫症結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子のフレームシフトに由来するＴ細胞エピトープペプチドが予防接種したＢＡＬＢ／ｃマウスから得られたＣＴＬによって認識されることが報告された（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．等，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７１：６６２）。図３の結果は、ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳のために必要であり、２４アミノ酸産物は次にＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドにプロセシングされることを示した。ＴＩＬ５８６は５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスされた変異合成ペプチドをも認識したが、ＣＯＳ−７細胞中にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと共に同時トランスフェクトされた場合は、変異遺伝子を認識せず、このことは、ＴＩＬ５８６による変異（ＡＴＧからＡＴＣへ）遺伝子の認識喪失がＯＲＦ３産物の翻訳の無いことに起因することを示した。ＤＮＡ配列分析に加えてこれらの結果は、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドがｇｐ７５のフレームシフト産物に由来するという可能性を除外した。それ故、多重のペプチド又はタンパク質がしばしば単一真核遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されるが、これらの代替産物を検出するための手段が利用可能でなかったことが考えられる。自然プロセスペプチドを検出するためのＴ細胞の鋭敏な感受性は、この現象の多くの他の例を明らかにすることができる。
重複オープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）がｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳される機構は、現在不明である。１つより多いＡＵＧコドンにおいて開始し、幾つかの稀な場合にはＡＵＧコドンと、例えばＣＵＧのような非ＡＵＧコドンの両方において開始してＮ−末端伸長した同じ配列を形成する細胞ｍＲＮＡの幾つかの例が報告されているが、単一真核細胞ｍＲＮＡからの重複オープンリーディングフレーム（即ち、２種類の全く異なるペプチドを翻訳する）の利用は、我々の知る限りまだ述べられていない。単一ｍＲＮＡからの重複リーディングフレームの翻訳の幾つかの例は述べられているが、ウイルス遺伝子に排他的に限定されている。ウイルス遺伝子における重複オープンリーディングフレームの産物の検出は、ウイルス感染宿主の血清中の反応性抗体の存在のために可能であった。本発明では、Ｔ細胞アッセイを用いて、Ｔ細胞によって認識されるエピトープペプチドを同定した。このアプローチは慣用的なウェスタンブロット又は免疫沈降分析とは全く異なり、これらの分析よりも高感度である。真正開始コドンと、ＯＲＦ３の開始コドンとの間には５個のＡＴＧコドンが存在するが、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）のＮ末端部分と、完全なＯＲＦ２及びＯＲＦ３をカバーする構築体ｐＰＣＲ１１０（ヌクレオチド１〜６６７）はＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力をまだ保有する。しかし、刺激のレベルはｇｐ７５の５’切頭形（最初の２４６ヌクレオチドが欠失）による刺激レベルよりも数倍低く（図１Ａと１Ｂ）、このことは上流のＡＴＧコドンがＯＲＦ３発現を部分的に阻害したと考えられることを示唆した。幾つかのファクターがこの系におけるＯＲＦ３産物の発現を検出することを可能にしている。第一に、ＯＲＦ３のＡＴＧ開始コドンに先行する上流のＡＴＧコドンは最適に関係しないように思われ、このことがリーキースキャンニングモデル（leaky scanning model）による開始コドンとしての下流ＡＴＧの使用を可能にすると考えられる。第二に、ＣＯＳ−７細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の比較的高い発現と、極度に敏感な手段としてのＴ細胞アッセイの有効性とが非常に低レベルの翻訳産物の検出を可能にすると考えられる。
興味深いことには、ＯＲＦ３産物は腫瘍細胞中並びに正常メラノサイト中でＴ細胞によって検出され（図６Ａ〜６Ｄ）、このことはＯＲＦ３タンパク質が腫瘍細胞における遺伝的変化（genetic alteration）に起因する遺伝子産物でないことを強く示唆した。以前の研究では、ＴＩＬ５８６が試験された多重の腫瘍細胞系統（ｇｐ７５+／Ａ３１+）を認識したことが示され、これは、ＴＩＬ５８６が非変異共有腫瘍抗原を認識することを示唆した（Ｗａｎｇ  Ｒ．Ｆ．等上記文献）。ｇｐ７５遺伝子はノーザンブロットとＰＣＲ分析とに基づくとメラノーマ中に高度に発現され（Ｗａｎｇ  Ｒ．Ｆ．等上記文献）、その遺伝子産物ｇｐ７５タンパク質はメラノーマ細胞とメラノサイトに発現された最も豊富な細胞内糖タンパク質であるので（Ｔａｉ，Ｔ．，Ｅｉｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｏｇａｔａ，Ｓ．及びＬｌｏｙｄ，Ｋ．Ｏ．，１９８３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：２７７３〜２７７９；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，Ｍａｔｔｅｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．及びＬｌｏｙｅｄ，Ｋ．Ｏ．１９８５，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．８５：１６９〜１７４；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｒｅａｌ，Ｆ．Ｘ．，Ｍｕｔａｋａｍｉ，Ｓ．，Ｃｏｒｄｏｎ−ｃａｒｄｏ，Ｃ．，Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．及びＨｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．１９８８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．９０，４５９〜４６６），Ｔ細胞クローンが５８６ＥＢＶ  Ｂ細胞（Ａ３１+），メラノーマ（ｇｐ７５+／Ａ３１+）並びにＡ３１+メラノサイト上にパルスされた場合のＯＲＦ３Ｐペプチドを認識したが、ｇｐ７５+／Ａ３１+メラノーマ細胞上にパルスされた場合、又は非Ａ３１  Ｔ２細胞にパルスされたＯＲＦ３Ｐを認識しなかったことは意外ではない。腫瘍細胞とメラノサイトとにおけるペプチド発現を説明する他の可能性は、ＯＲＦ３がｇｐ７５ｍＲＮＡ又は異なるプロモーターの選択的スプライシング（alternative splicing）によって生成された別のｍＲＮＡ転写体（transcript）（単数又は複数）から翻訳されうることである。我々の知る限りでは、選択的スプライシングによって生成されたｍＲＮＡ転写体は、同じオープンリーディングフレームを用いてアイソフォームタンパク質に翻訳される。しかし、本発明の場合には、別の転写体が生成されて、翻訳の鋳型として用いられたとしても、ｇｐ７５とは全く異なるオープンリーディングフレームがＯＲＦ３産物の翻訳に用いられた。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＲＦ３タンパク質の翻訳の機構を解明するには、さらなる実験が必要である。それにも拘わらず、上述したこれらの可能性は相互に排他的ではない。
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：ヘルス・アンド・ヒューマンサービス省長官により代表されるアメリカ合衆国政府
（ii）発明の名称：チロシナーゼ関連タンパク質１及び２の新規ヒト癌抗原並びにこれをコードする遺伝子
（iii）配列の数：６０
（iv）通信先：
（Ａ）宛て名：モルガン＆フィンネガン、L.L.P.
（Ｂ）通り：３４５パークアベニュー
（Ｃ）都市：ニューヨーク
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ZIP：１０１５４
（Ｖ）コンピューター読み取り形式：
（Ａ）媒体型：３．５インチ、１．４４ＭＢ記憶装置
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト５．１
（vi）現出願のデータ：
（Ａ）出願日：１９９７年２月６日
（vii）先の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／５９９，６０２
（Ａ）出願日：１９９６年２月９日
（vii）先の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／７２５，７３６
（Ｂ）出願日：１９９６年１０月４日
（viii）弁護士／代理人情報：
（Ａ）氏名：キャサリンＭ、ブラウン
（Ｂ）登録番号：３４，５５６
（Ｃ）参照／ドケット番号：２０２６−４２０９ＰＣ
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：（２１２）７５８−４８００
（Ｂ）テレファックス：（２１２）７５１−６８４９
（Ｃ）テレックス：４２１７９２
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（X）公開情報：
（Ａ）著者：COHEN,T.；MULLER, R.M.；TOMITA, Y.：SHIBAHARA, S.
（Ｂ）名称：ヒトチロシナーゼ関連タンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（Ｃ）雑誌：NUCLEIC ACIDS RESEARCH
（Ｄ）巻：１８
（Ｅ）号：９
（Ｆ）頁：２８０７−２８０８
（Ｇ）日付：１９９０年５月１１日
（Ｈ）配列番号１中の関連残基：１から４７１
（xi）配列の記載：配列番号１
0003998713.tif 000010
（２）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２
0003998713.tif 000011
（２）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号３
0003998713.tif 000012
（２）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号４
0003998713.tif 000013
（２）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号５
0003998713.tif 000014
（２）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号６
0003998713.tif 000015
（２）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
(ix)特徴：
（Ａ）名称／キー：ＸＡＡ
（Ｂ）位置：１から２
（Ｃ）同定方法：実験による
（Ｄ）他の情報：ＸＡＡ＝ＳＥＲまたはＡＬＡ
（xi）配列の記載：配列番号７
0003998713.tif 000016
（２）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
(ix)特徴：
（Ａ）名称／キー：ＸＡＡ
（Ｂ）位置：１から２
（Ｃ）同定方法：実験による
（Ｄ）他の情報：ＸＡＡ＝ＳＥＲまたはＡＬＡ
（xi）配列の記載：配列番号８
0003998713.tif 000017
（２）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号９
0003998713.tif 000018
（２）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１０
0003998713.tif 000019
（２）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載、配列番号１１
0003998713.tif 000020
（２）配列番号１２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１２
0003998713.tif 000021
（２）配列番号１３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１３
0003998713.tif 000022
（２）配列番号１４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１４
0003998713.tif 000023
（２）配列番号１５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１５
0003998713.tif 000024
（２）配列番号１６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号１６
0003998713.tif 000025
（２）配列番号１７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１７
0003998713.tif 000026
（２）配列番号１８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１８
0003998713.tif 000027
（２）配列番号１９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１９
0003998713.tif 000028
（２）配列番号２０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２０
0003998713.tif 000029
（２）配列番号２１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２１
0003998713.tif 000030
（２）配列番号２２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２２
0003998713.tif 000031
（２）配列番号２３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２３
0003998713.tif 000032
（２）配列番号２４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２４
0003998713.tif 000033
（２）配列番号２５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２５
0003998713.tif 000034
（２）配列番号２６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２６
0003998713.tif 000035
（２）配列番号２７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２７
0003998713.tif 000036
（２）配列番号２８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号２８
0003998713.tif 000037
（２）配列番号２９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi） 配列の記載：配列番号２９
0003998713.tif 000038
（２）配列番号３０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号３０
0003998713.tif 000039
（２）配列番号３１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３１
0003998713.tif 000040
（２）配列番号３２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３２
0003998713.tif 000041
（２）配列番号３３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ．：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３３
0003998713.tif 000042
（２）配列番号３４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３４
0003998713.tif 000043
（２）配列番号３５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３５
0003998713.tif 000044
（２）配列番号３６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３６
0003998713.tif 000045
（２）配列番号３７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３７
0003998713.tif 000046
（２）配列番号３８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３８
0003998713.tif 000047
（２）配列番号３９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号３９
0003998713.tif 000048
（２）配列番号４０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４０
0003998713.tif 000049
（２）配列番号４１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４１
0003998713.tif 000050
（２）配列番号４２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号４２
0003998713.tif 000051
（２）配列番号４３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号４３
0003998713.tif 000052
（２）配列番号４４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号４４
0003998713.tif 000053
（２）配列番号４５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号４５
0003998713.tif 000054
（２）配列番号４６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２９１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ｃＤＮＡ
（x）公開情報：
（Ａ）著者：YOKOYAMA他
（Ｂ）名称：ヒトドーパクロム互変異性化酵素／チロシナーゼ関連タンパク質−２をコードするｃＤＮＡの分子クローニングと機能分析
（Ｃ）雑誌：  BIOCHIM．BIOPHSY．ACTA．
（Ｄ）巻：１２１７
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：３１７−３２１
（Ｇ）日付：１９９４年
（xi）配列の記載：配列番号４６
0003998713.tif 000055
（２）配列番号４７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５１９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：タンパク質
（x）公開情報：
（Ａ）著者：YOKOYAMA他
（Ｂ）名称：ヒトドーパクロム互変異性化酵素／チロシナーゼ関連タンパク質−２をコードするｃＤＮＡの分子クローニングと機能分析
（Ｃ）雑誌：  BIOCHIM．BIOPHSY．ACTA．
（Ｄ）巻：１２１７
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：３１７−３２１
（Ｇ）日付：１９９４年
（xi）配列の記載：配列番号４７
0003998713.tif 000056
0003998713.tif 000057
（２）配列番号４８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＴＲＰ−２ペプチド
（Ｂ）位置：１から１１
（Ｃ）同定方法：実験による
（Ｄ）他の情報：Ｘａａは同一または異なり、１以上のアミノ酸である。
（xi）配列の記載：配列番号４８
0003998713.tif 000058
（２）配列番号４９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号４９
0003998713.tif 000059
（２）配列番号５０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５０
0003998713.tif 000060
（２）配列番号５１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５１
0003998713.tif 000061
（２）配列番号５２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５２
0003998713.tif 000062
（２）配列番号５３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド：
（xi）配列の記載：配列番号５３
0003998713.tif 000063
（２）配列番号５４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５４
0003998713.tif 000064
（２）配列番号５５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５５
0003998713.tif 000065
（２）配列番号５６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５６
0003998713.tif 000066
（２）配列番号５７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５７
0003998713.tif 000067
（２）配列番号５８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５８
0003998713.tif 000068
（２）配列番号５９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号５９
0003998713.tif 000069
（２）配列番号６０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２７
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）分子の型：
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（xi）配列の記載：配列番号６０
0003998713.tif 000070
【図１Ａ】
0003998713.tif 000071
【図１Ｂ】
0003998713.tif 000072
【図２】
0003998713.tif 000073
【図３Ａ】
0003998713.tif 000074
【図３Ｂ】
0003998713.tif 000075
【図４Ａ】
0003998713.tif 000076
【図８】
0003998713.tif 000077
【図４Ｂ】
0003998713.tif 000078
【図４Ｃ】
0003998713.tif 000079
【図５Ａ】
0003998713.tif 000080
【図５Ｂ】
0003998713.tif 000081
【図６Ａ】
0003998713.tif 000082
【図６Ｂ】
0003998713.tif 000083
【図６Ｃ】
0003998713.tif 000084
【図６Ｄ】
0003998713.tif 000085
【図７Ａ】
0003998713.tif 000086
【図７Ｂ】
0003998713.tif 000087
【図９】
0003998713.tif 000088
【図１０】
0003998713.tif 000089
【図１１Ａ】
0003998713.tif 000090
【図１１Ｂ】
0003998713.tif 000091
【図１１Ｃ】
0003998713.tif 000092