(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor  Cytotoxic  Factor−II;ＴＣＦ−II)又は肝細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor;ＨＧＦ)を有効成分とする、癌増殖による体重減少の抑制剤。
【請求項２】
腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor Cytotoxic Factor−II;ＴＣＦ−II)又は肝細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor;ＨＧＦ)を有効成分とする、癌増殖による貧血進行の抑制剤。
【請求項３】
腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor Cytotoxic Factor−II;ＴＣＦ−II)又は肝細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor;ＨＧＦ)を有効成分とする、癌増殖によるＴＮＦ上昇の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍細胞障害因子（Tumor Cytotoxic Factor-II ；ＴＣＦ−II）を有効成分とする悪液質予防及び／又は治療剤に関する。本発明により、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、心臓疾患、感染症、ショック、熱傷、エンドトキシン血症、臓器炎、手術、糖尿病、膠原病、放射線治療、又は化学療法からなる群から選択される１以上の要因に基づき発症した悪液質に対する優れた予防及び／又は治療剤が提供され、医薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
一般に癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、心臓疾患を初めとした疾患においては食欲不振、体重減少、体力消耗、衰弱、皮膚萎縮や乾燥、貧血、浮腫、血液凝固線溶系異常などを伴い、これらの病態を悪液質（cachexia）という。この全身衰弱症状に陥ることにより、患者はついには死亡する（玉熊正越ほか：医学のあゆみ, 149, 371-373 (1989) ）さらに、手術による根治が望めなくなった進行あるいは末期癌に、放射線療法や化学療法を積極的に行うと、上述のような特有な栄養低下を背景に、免疫能などの生体防御能が極端に低下し、生命をかえって短縮する事態が発生してしまうため、治療上の大きな問題点となっている。悪液質の成因はこれまで、栄養摂取量低下と疾患生体の栄養消費の上昇による出納の不均衡や、癌組織や病変部位から動員される体液性因子の、全身の代謝に及ぼす影響などで説明されてきた。このことから悪液質の改善には、圧倒的な栄養あるいはエネルギー不足を補い免疫能を高めるために、高カロリー輸液などの積極的な栄養投与が行われている。しかし、悪液質の状態では、投与されたエネルギーは患者の生命維持の目的には使用され難く、特に担癌生体では癌細胞の栄養となり、その増殖を助ける結果となってしまうため、栄養補給のみでは満足な治療方法とは言えなかった。
【０００３】
近年、腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Factor；ＴＮＦ) など、マクロファージから動員されるモノカインやサイトカインが悪液質の成因として注目されている。ＴＮＦは癌細胞を障害する因子として発見され、免疫担当細胞の１つで貧食作用を持つマクロファージなどが分泌することが明らかになっている。当初、直接殺細胞効果があり、強い抗腫瘍活性を有することから、抗癌剤として期待されていたが、近年になって、癌の患者や重症感染症患者の体重減少などの衰弱、即ち悪液質の原因となること、あるいは炎症反応を惹起する元凶のサイトカインであることが解明され、それ以降ＴＮＦの多様な作用が研究されている。ＴＮＦの主な作用は、(1) 破骨作用、(2) 細胞への脂質の取り込み阻害による高脂血症、(3) インターロイキン１やコロニー刺激因子の生産誘導、(4) 血管内皮細胞の障害、(5) 重症感染症で起こる外毒素ショックの仲介反応などである。これらのことから、ＴＮＦの上昇を抑制することにより各種の疾患の治療、即ち癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、心臓疾患、感染症、ショック、熱傷、エンドトキシン血症、臓器炎などに伴う悪液質、またはこれら疾患の治療、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患をはじめとした各種炎症性疾患の治療を目的とした薬剤の開発が望まれているが、いまだ満足したものが得られていないのが実状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、悪液質に対する治療薬物を鋭意探索した結果、腫瘍細胞障害因子として知られているＴＣＦ−II、又はヒト血液、特に劇症肝炎患者の血液由来の蛋白性物質である肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor; ＨＧＦ）が、悪液質に対し優れた予防及び治療効果を有することを見出した。従って本発明は、ＴＣＦ−II又はＨＧＦを有効成分とする癌、ＡＩＤＳ、心臓疾患、感染症、ショック、熱傷、エンドトキシン血症、臓器炎、手術、放射線治療、化学療法などの要因に基づき発症した悪液質の予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＣＦ−II又はＨＧＦを有効成分とする悪液質予防及び／又は治療剤に関する。本発明により、癌、ＡＩＤＳ、心臓疾患、感染症、ショック、熱傷、エンドトキシン血症、臓器炎、手術、糖尿病、膠原病、放射線治療、又は化学療法からなる群から選択される１以上の要因に基づき発症した悪液質に対する優れた予防及び／又は治療剤が提供され、医薬として有用である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞由来の公知の蛋白質であり、下記の特性を有する。
0004006057.tif 000002
上記ＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞培養液を濃縮しイオン交換体に吸着させ、その溶出液をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する方法（ＷＯ９０／１０６５１号公報）、或いは遺伝子工学的手法（ＷＯ９２／０１０５３号公報）によって得られる。
【０００７】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、線維芽細胞由来のものを用いることが可能であり、又、ＷＯ９０／１０６５１号公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や他の細胞により遺伝子組換え操作により生産されたものでもよい。又、ＷＯ９２／０１０５３号公報に開示された遺伝子工学的手法により得られたものを用いてもよい。この時、宿主細胞又は微生物の違いによる糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合していないものであっても使用可能であるが、好ましくは糖鎖の結合しているものを用いる。これらの方法により得られたＴＣＦ−IIは、通常の単離精製法によってさらに濃縮、精製することができる。例えば、有機溶媒による沈殿法、塩析、ゲル濾過、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法等が挙げられる。モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトによる精製は、特開平５−９７号公報に開示されているモノクローナル抗体を用いて精製することができる。得られた精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥あるいは凍結保存することができる。その他、ＴＣＦ−IIと同様の活性を有するものであれば、本発明と同様の薬剤として利用可能である。例えば、ＴＣＦ−II蛋白質と５アミノ酸の違いを有する蛋白質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；特開昭６３−２２５２６号）、あるいは精製Scatter Factor（ＳＦ； Gherardi and Stocker, Nature, 346, 228 (1990)）などが挙げられる。
【０００８】
又、本発明の有効成分のＨＧＦは、肝細胞を増殖させる活性を有し、劇症肝炎患者の血液から単離された、下記の特性を有する公知の蛋白性物質である（特許第 2564486号公報）。
i)  分子量（非還元下SDS-PAGE) ；76,000〜92,000
ii)  前記活性は56℃、15分間の加熱では失活せず、80℃、10分間の加熱により失活する
iii)  トリプシンあるいはキモトリプシンに消化により前記活性が失活する
iv)  ヘパリンに強い親和性を有する
このＨＧＦは、血漿を56℃程度で約15分間加熱し、硫安濃度約1.1 〜1.2Mの沈殿画分を取得し、これをゲル濾過、ＤＥＡＥなど陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーで精製して得ることができる。また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【０００９】
本発明の悪液質予防及び／又は治療剤は、注射剤として静脈、筋肉内、あるいは皮下より投与することができる。これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ製造され、必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を添加することができる。本発明の製剤を患者に投与する場合、投与患者の症状の程度、健康状態、年齢、体重等の条件によって異なり、特に限定されないが、成人１日当たり精製ＴＣＦ−IIとして 0.6mg〜 600mg、好ましくは 6mg〜 60mg を含有する製剤を１日１回若しくはそれ以上投与すれば良い。又、ＨＧＦにおいても、この程度の量を同様に投与すれば良い。
【００１０】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１１】
【実施例１】
ＴＣＦ−IIの精製
ＷＯ９０／１０６５１号公報に開示された方法、及び東尾らの方法（Higashio,K. et al,B.B.R.C., vol.170, pp397-404 (1990))に準じて細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。即ち、ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８６）を５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地１００ｍｌをいれたローラーボトルに３×１０6 個移植し、０．５〜２回転／分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が１×１０7 個になったところでトリプシンにより細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミック１００ｇ（東芝セラミック社）を殺菌して投入し、２４時間静置して培養した。その後、上記培養液を５００ｍｌ加え、培養を継続した。７〜１０日ごとに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このようにして２ヵ月間生産を継続し、ローラーボトル一本当たり４Ｌの培養液を回収した。このようにして得た培養液当たりの生産量は３２μｇ／ｍｌであった。培養液７５０Ｌをメンブランフィルター（ＭＷ６０００カット；アミコン社）処理によりＵＦ濃縮し、ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア社）、ＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社）、ＭｏｎｏＳカラム（ファルマシア社）、ヘパリンセファロース（ファルマシア社）による４段階のクロマト精製を行い、精製ＴＣＦ−IIを得た。
【００１２】
【実施例２】
遺伝子組換えＴＣＦ−IIの生産
ＷＯ９２／０１０５３号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ−II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。形質転換ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞を培養し、培養液２０Ｌを得た。この培養液をＣＭ−セファデックスＣ−５０クロマト（ファルマシア社）、Ｃｏｎ−ＡセファロースＣＬ−６Ｂクロマト（ファルマシア社）、ＭｏｎｏＳカラム（ファルマシア社）を装着したＨＰＬＣの順に処理を行い、約１１ｍｇの精製ＴＣＦ−IIを得た。
【００１３】
【実施例３】
遺伝子組換えＨＧＦの生産
ＨＧＦｃＤＮＡの発現ベクターは、プラスミドpcDNA1のNheI部位にマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）転写単位、2.4 ｋｂ断片を挿入し、さらにMiyazawaらによりクローニングされたＨＧＦｃＤＮＡ (BBRC 163, 967-973, 1989)2.3 kbをサイトメガロウイルス（CMV ）プロモーターの下流に挿入して構築した。構築したＨＧＦｃＤＮＡ発現ベクター10μg とpSV2 neo 1μg をリポフェチンによるリポソーム介在トランスフェクション法によりナマルワ（Namalwa ）細胞にコトランスフェクションした。形質転換した細胞をG418耐性により選別した後、続いてメトレキセート（MTX ）により遺伝子増幅した。ＨＧＦ高生産株を2Lローラーボトルを用い、5 ％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地1Lで37℃、 7日間培養した。約20本のローラーボトル培養（回転数約2 回／分) を実施し、約21L の培養液を得た。このようにして得られた培養液は、4mg/L のＨＧＦを含んでいた。ＨＧＦを含む培養液20L について、東尾らの方法（Higashio et al., BBRC  vol. 170, 397-404, 1990) を若干改変し、CMセファデックスC-50（ファルマシア社) 、Mono Sカラム（ファルマシア社）、ヘパリン5-PW（東ソー社）のFPLCによる3 段階のクロマト精製を行い、SDS-電気泳動的に均一な精製ＨＧＦを約60％の収率で得た。
【００１４】
【実施例４】
ヒト肝細胞癌移植担癌マウスの悪液質に対するＴＣＦ−II投与の効果
移植するヒト肝細胞癌株は、in vitroの予備実験においてＴＣＦ−IIにより細胞増殖、あるいは細胞分散傾向が観察されたＫＹＮ−２株およびＫＹＮ−３株を用いた。何れの細胞株も、ダルベッコＭＥＮ培地（日水製薬社）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ社）、１２ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、２０％熱不活化仔牛血清（Whittaker Bioproducts 社）を加えた培養液で３７℃、５％ＣＯ2 、湿度１００％の条件下で静置培養を行った。この両細胞株にそれぞれトリプシン−ＥＤＴＡを加え細胞を分離し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄後、 2.0×107 個／ｍｌとなるよう細胞浮遊液を調製した。
４〜５週齢の雌ＳＣＩＤマウスの移植部分の皮膚を剃毛および７０％エタノールで消毒し、エーテル麻酔後に２３Ｇの注射針を用いて、先に調製した腫瘍細胞を移植した。ＫＹＮ−２株(1.0×107 個／匹) は背部皮下に、またＫＹＮ−３株（1.0 ×107 個／匹）は腹腔内に細胞を移植した。ＫＹＮ−２株皮下移植腫瘍については、直径が５ｍｍになった移植後３週目に、またＫＹＮ−３株腹腔内移植では移植後５週目に、これら移植マウスをそれぞれ４群に分けた。溶媒のみを投与した対照群をＩ群、０．３ｍｇ／ｋｇ／日  ＴＣＦ−II投与群をII群、３．０ｍｇ／ｋｇ／日  ＴＣＦ−II投与群を III群、３０ｍｇ／ｋｇ／日  ＴＣＦ−II投与群をIV群とした。ＴＣＦ−IIの投与はＫＹＮ−２株移植マウスでは腹腔内に、ＫＹＮ−３株移植マウスでは皮下に、１日２回２週間行った。
ＫＹＮ−２株皮下移植腫瘍マウスの実験においては、ＴＣＦ−II投与前の体重と投与終了時の体重を測定した。又、ＫＹＮ−３を用いた実験においては、ＴＣＦ−IIの投与前後に、エーテル麻酔下に眼底動脈からヘパリン処理したヘマトクリット毛細管（テルモ社）を用いて採血し、常法で遠心した後直ちにヘマトクリット値を測定した。さらに、ＴＣＦ−II投与終了時にエーテル麻酔下に解剖を行い腹水中ＴＮＦ値をFactor-Test-XTM Mouse TNF ELISA キット（ジェンザイム社）を用いて測定した。吸光度測定にはEasy Reader EAR 400 （ＳＬＴラボインストゥルメンツ社）を用いた。
【００１５】
溶媒およびＴＣＦ−II投与群の体重変化を図１に示す。溶媒投与群（Ｉ群）では、体重は２週間で約２０％と著しい低下を認めた。一方、ＴＣＦ−II投与群（II〜IV群）においては、投与量に依存して体重減少が抑制され、特にIV群においては投与前後で有意差は認められず、また投与後体重がＩ群の投与後体重に比較して明らかに高値を示した。次に、溶媒およびＴＣＦ−II投与群のヘマトクリットの変化を図２に示す。ＴＣＦ−II投与により、担癌マウスのヘマトクリット値は改善し、癌増殖に伴う貧血の進行が抑制される傾向が認められた。さらにＴＣＦ−IIの上昇抑制効果を図３に示す。担癌生体の悪液質の原因であるＴＮＦは、ＴＣＦ−IIの投与量に依存し、また最低用量である０．３ｍｇ／ｋｇ／日のII群から顕著な低下を示した。即ち、ＴＣＦ−IIの投与により、癌増殖による体重減少、貧血の進行、ＴＮＦの上昇などの悪液質の状態を著しく改善した。
【００１６】
【実施例５】
エンドトキシン誘発悪液質におけるＨＧＦによる改善効果
６週齢のWistar系雄ラットに浸透圧ポンプ（Model2001, Alzet社）を用いてエンドトキシン（LPS- E.coli ；10mg/kg/日, DIFCO LABORATORIES社）を持続注入し、カヘキシーを発症させた。発症後群分け（１群６匹）し、溶媒（クエン酸緩衝液：pH 6.03 ）またはＨＧＦ 1mg/kg を１日１回７日間静脈内投与した。最終投与終了翌日のラットの臨床検査値を表１に示す。表１の結果より、ＬＰＳ処理した溶媒群ではヘマトクリット値、総蛋白、アルブミン及びプラスミノーゲンが低下しカヘキシー状態を示したが、ＨＧＦ投与群では有意にこれらの値が改善した。この結果より、ＨＧＦがエンドトキシンにより誘発されるカへキシーに対し、優れた効果を有することが確認された。
【００１７】
【表１】
0004006057.tif 000003
【００１８】
【実施例６】
ＴＣＦ−II製剤の製造
実施例１及び２により得られたＴＣＦ−IIの注射剤の製造例を示す。
0004006057.tif 000004
上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００１９】
0004006057.tif 000005
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２０】
0004006057.tif 000006
上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２１】
0004006057.tif 000007
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２２】
0004006057.tif 000008
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２３】
0004006057.tif 000009
上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２４】
0004006057.tif 000010
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２５】
0004006057.tif 000011
上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２６】
【実施例７】
ＨＧＦ製剤の製造
実施例３により得られた遺伝子組換えＨＧＦの注射剤の製造例を示す。
【００２７】
0004006057.tif 000012
上記組成をｐＨ６．０３のクエン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２８】
0004006057.tif 000013
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２９】
0004006057.tif 000014
上記組成をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液に溶解し全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後バイアル瓶に２ｍｌづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、ＴＣＦ−IIまたはＨＧＦを有効成分とする悪液質予防及び／又は治療剤が提供される。本発明の悪液質予防及び／又は治療剤は、癌、ＡＩＤＳ、心臓疾患、感染症、ショック、熱傷、エンドトキシン血症、臓器炎、手術、糖尿病、膠原病、放射線治療、又は化学療法からなる群から選択される１以上の要因に基づき発症した悪液質に対する優れた予防及び／又は治療するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例４における、ＴＣＦ−IIのＫＹＮ−２細胞移植マウスの体重低下に対する改善効果を示す。
【符号の説明】
++ :  危険率1%以下(P<0.01)で有意差あり。
** :  危険率1%以下(P<0.01)でＩ群投与後に対して有意差あり。
【図２】  実施例４における、ＴＣＦ−IIのＫＹＮ−３細胞移植マウスのヘマトクリット低下に対する改善効果を示す。
【符号の説明】
++ :  危険率1%以下(P<0.01)で有意差あり。
【図３】  実施例４における、ＴＣＦ−IIのＫＹＮ−３細胞移植マウスの腹水中ＴＮＦ値上昇に対する抑制効果を示す。
【符号の説明】
*  :  危険率5%以下(P<0.05)でＩ群に対し有意差あり。
** :  危険率1%以下(P<0.01)でＩ群に対し有意差あり。
【図１】
0004006057.tif 000015
【図２】
0004006057.tif 000016
【図３】
0004006057.tif 000017