(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１、２、若しくは３に示すアミノ酸配列、若しくはそれらのアミノ酸配列に於いて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求項１記載のポリペプチド。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、７４，０００乃至１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（２）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、４０乃至５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、４５乃至５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、６５℃に至適温度を有する。
（３）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ６．０乃至８．４のｐＨ範囲内に至適ｐＨを有する。
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下において、４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件下において、５５℃以下に温度安定域を有する。または
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、６０℃以下に温度安定域を有する。
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下において、ｐＨ５．０乃至１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表に於ける配列番号４、５、若しくは６に示す塩基配列か、若しくはそれらの塩基配列に於いて、コードするポリペプチドの、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を変えることなく１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、又は、それらに相補的な塩基配列からなる請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列表における配列番号４、５、若しくは６に示す塩基配列における塩基の１若しくは複数個の塩基を、遺伝子の縮重に基づき、コードする配列表における配列番号１、２、又は３に示すアミノ酸配列を変えることなく、他の塩基で置換した塩基配列からなる請求項３又は４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
バチルス属の微生物に由来する請求項３、４又は５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
アルスロバクター属の微生物に由来する請求項３、４又は５記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項３乃至７のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載の複製可能な組換えＤＮＡを導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
宿主が大腸菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、その培養物から請求項１又は２記載のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
培養物中の請求項１又は２記載のポリペプチドを、遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種又は２種以上の方法により採取することを特徴とする請求項１１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１又は２記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成させる方法。
【請求項１４】
請求項１又は２記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによる、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質の製造方法。
【請求項１５】
請求項１又は２記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成させ、次いで、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する酵素を作用させて、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させ、これを採取することを特徴とする環状四糖の製造方法。
【請求項１６】
環状四糖を結晶化させる工程を含むことを特徴とする請求項１５記載の環状四糖の製造方法。
【請求項１７】
環状四糖がシラップ又は結晶であることを特徴とする請求項１５又は１６記載の環状四糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド（以下、特に断りがない限り、「本発明のポリペプチド」と言う。）及び遺伝子組換え技術による当該ポリペプチドの製造方法とその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端のいずれか一方が非還元末端で他方が還元末端であり、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・イクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ＝ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、低分子、低粘度、甘味で、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変して悪臭を発生し、得られる製品の品質を劣化し易いとの欠点があることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランス  アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ  ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシル結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かして、各種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報及び特開平７−２１３２８３号公報などに開示したように、マルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα、α−結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、このトレハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かしての用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらの特性を生かして各種用途に利用されているものの、斯かる非還元性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。
【０００３】
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合とが交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（本明細書では特に断らない限り、本糖質を「環状四糖」と略称する。）が生成し、これをメタノール共存下で晶出させることが示されている。
【０００４】
斯かる環状構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用やアミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく、各種用途に利用、加工できるものと期待されている。
【０００５】
しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。
【０００６】
斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際特許出願公開第ＷＯ  ０１／９０３３８  Ａ１号で開示したように、非還元末端の結合様式として、α−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質（本明細書においては、本糖質を「α−イソマルトシルグルコ糖質」と略称することもある。）を原料とし、これに、本糖質のα−イソマルトシル部分とそれ以外のグルコ糖質部分とを特異的に切断し、このα−イソマルトシル部分を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を作用させて、環状四糖を生成させることに成功した。このα−イソマルトシル転移酵素は、α−イソマルトグルコ糖質からα−イソマルトシル転移することによって環状四糖を生成する酵素であって、詳細には、下記の理化学的性質を有するα−イソマルトシル転移酵素である。
【０００７】
（１）  作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至約１３６，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．７乃至約８．３の範囲に等電点を有する。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の反応条件下、約４５乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
（５）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の反応条件下、ｐＨ約５．５乃至約６．５のｐＨ範囲内に至適ｐＨを有する。
（６）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、約４５℃以下に温度安定域を有する。
（７）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で下、ｐＨ約３．６乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【０００８】
しかしながら、環状四糖の原料糖質についてみると、豊富で安価に供給される澱粉からの生産が望まれるものの、実際には、α−イソマルトシル転移酵素が澱粉に直接作用しないことから、予め、澱粉を前述の特定構造を有するα−イソマルトシルグルコ糖質、例えば、パノースやイソマルトシルマルトースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖に変換させ、次いで、これにα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させる手法が採用されている。一方、原料からの環状四糖の収率についてみると、パノースを用いる場合、原料パノース重量当たりの収率は約４４％である。同様に、イソマルトシルマルトースを用いる場合の収率は、約３１％であるのに対して、澱粉を用いる場合には、予め、α−アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、β−アミラーゼ及びα−グルコシダーゼなどを作用させてパノースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖を生成させる必要があるだけでなく、環状四糖の収率も約１５％と極めて低いことが判明している。澱粉からの環状四糖の生産は、このように低い生成率でも可能であるものの、コスト高が懸念され、澱粉を原料として、環状四糖の収率を向上させた新規製造方法の確立が望まれていた。
【０００９】
斯かる状況下、本発明者等は、澱粉を原料とし、澱粉から環状四糖の収率を著しく向上させることのできるα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する新規な酵素に期待を込めて、微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、国際特許出願公開第ＷＯ  ０１／９０３３８  Ａ１号で開示した土壌からの分離菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するα−イソマルトシル転移酵素産生微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株およびＡ１９株が、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をも併せて産生することを見出し、澱粉部分分解物をはじめとする比較的高分子のグルコ糖質に、この新規α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、目指していた環状四糖の収率を著しく向上させることのできることを見出し、このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、当該酵素によるα−グルコシル転移反応方法、α−イソマルトシルグルコ糖質の製造方法、及び当該酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用した環状四糖又はこれを含む糖質及びその製造方法、併せて、これら方法により得られる環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、これら微生物は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能が充分でなく、α−イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖を大規模に製造する場合、斯かる当該酵素の供給源としての微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【００１０】
この点、今日では分子生物学が進展し、酵素の本質がポリペプチドであり、それを構成するアミノ酸配列がその酵素活性の発現を左右するものであり、そのアミノ酸配列は、遺伝子ＤＮＡに暗号化されていることが知られている。したがって、ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを適宜微生物や動植物細胞に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、比較的容易に所望量のポリペプチドが取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記酵素の本質であるポリペプチドをコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【００１１】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の目的は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを創製することである。
【００１２】
本発明の第二の目的は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１３】
本発明の第三の目的は、前記ＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【００１４】
本発明の第四の目的は、前記組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
【００１５】
本発明の第五の目的は、前記形質転換体を用いる、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の第六の目的は、前記ポリペプチドの用途を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記第一の目的を下記の理化学的性質を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドにより解決するものである。
【００１８】
（１）作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）
分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至約１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下、約４０乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（４）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ約６．０乃至約８．４のｐＨ範囲内に至適ｐＨを有する。
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間反応の条件下、５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【００１９】
本発明は、前記第二の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００２０】
本発明は、前記第三の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能なＤＮＡにより解決するものである。
【００２１】
本発明は、前記第四の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００２２】
本発明は、前記第五の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物からポリペプチドを採取してなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００２３】
本発明は、前記第六の目的を、前記ポリペプチドの種々の用途を確立することにより解決するものである。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドとは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有するポリペプチド全般を意味する。本発明のポリペプチドは、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表に於ける配列番号１に示すアミノ酸配列、若しくはそのアミノ酸配列に於いて、１若しくは複数個のアミノ酸、即ち、１乃至５０個、或いは、１乃至３０個、若しくは、１乃至１０個のアミノ酸が欠失したり、他のアミノ酸で置換されたり、更には付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを例示することができる。尚、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地成分、組成や培養温度、ｐＨなどの条件によっては、宿主内外酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の理化学的性質は保持しているものの、配列表に於ける配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１若しくは複数個、即ち、１乃至５０個、１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個欠失したり、他のアミノ酸と置換されたり、更には、Ｎ末端に１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個のアミノ酸が新たに付加した変異体が生成することがある。斯かる変異体であっても、それが所期の理化学的性質を具備している限り、当然、本発明のポリペプチドに包含されることは言うまでもない。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体の培養液から採取することもできる。本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列表における配列番号４、５、又は６に示す５´末端からの塩基配列か、若しくは、それらの塩基配列において、コードするポリペプチドの酵素活性を実質的に変えることなく１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、または、それらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡを例示できる。また、上記塩基配列として、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１若しくは複数個、即ち、１乃至１５０個、１乃至９０個、或いは１乃至６０個、若しくは１乃至３０個を他の塩基で置き換えたものを例示できる。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列である限り、天然由来のものであろうと、人為的に合成されたものであろうとその由来は問わない。天然の給源としては、例えば、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３として寄託されているバチルス  グロビスポルスＣ９株、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４として寄託されているバチルス  グロビスポルスＣ１１株、及び平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９１として寄託されているバチルス  グロビスポルスＮ７５株を含むバチラス属、または、平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０として寄託されているアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株を含むアルスロバクター属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至約３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。この際、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を用いたり、ＳＤＳなどの界面活性剤の存在下で凍結融解することもできる。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理など斯界に於ける通常一般の方法を適用することにより目的のＤＮＡを得ることができる。一方、本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表に於ける配列番号４、５、又は６に示す塩基配列に基づいて化学合成すればよい。又、当該ＤＮＡを含む遺伝子を鋳型として、適当なプライマーとなり得る化学合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００２７】
これらＤＮＡを用いて本発明のポリペプチドを工業的に大量に、安価にかつ容易に製造することができる。即ち、当該ＤＮＡを、通常、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養し、その培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得、これを、通常、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。前記組換えＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが入手できさえすれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。又、前記ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
【００２８】
本発明に係るＤＮＡを前記ベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等の適宜宿主に導入して形質転換体とし、これら形質転換体から所望の形質転換体をクローニングし、これを培養することにより容易かつ大量に複製可能である。前記クローニングに際しては、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質を含む栄養培地で培養し、該糖質より、非還元末端の結合様式としてα−１，６結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する形質転換体を選択すればよい。
【００２９】
これらクローニングにより得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該ポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２０乃至４０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至約６日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は本発明のポリペプチドを含む粗ポリペプチドとしてそのまま使用可能であるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出したり、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより本発明のポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には斯界に於いてポリペプチドを精製するために用いられる通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などから選ばれる１種又は２種以上の方法を適宜組合わせて適用すればよい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、詳細には、下記の理化学的性質を有する。
【００３１】
（１）  作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至約１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下、約４０乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（４）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ約６．０乃至８．４のｐＨ範囲内に至適ｐＨを有する。
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間反応の条件下、５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件において、1ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【００３２】
本発明のポリペプチドが作用する基質としては、澱粉、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲンなどのα−１，４グルコシル結合を含む多糖や、それらをアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が用いられる。これらα−１，４結合を含むグルコ糖質を、更にブランチングエンザイムなどの枝付け酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）で処理した糖質を用いることも随意である。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｍｙｌａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ』、パーガモン・プレス社（東京）（１９８８年）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２）、マルトトリオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）などのアミラーゼで分解した部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。基質としての澱粉は、とうもろこし、小麦、米などの穀類に由来する地上澱粉であっても、また馬鈴薯、さつまいも、タピオカなどの地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び／又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状四糖の生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下が好適である。基質濃度は特に限定されない。例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｗ）（以下、本明細書では、特に断らない限り、「％（ｗ／ｗ）」を単に「％」と略称する）の低濃度溶液として用いた場合でも、本発明の酵素反応は進行するが、工業的には、１％以上が好適である。又、基質溶液中に、完全に溶けきらない不溶性基質を含有するものであってもよい。望ましくは、濃度４０％以下、更に望ましくは２０％以下が好適である。反応温度は反応が進行する温度、即ち、６５℃付近までの温度、好ましくは３０乃至５５℃付近の温度で実施すればよい。反応ｐＨは、通常、４．５乃至８の範囲に調整すればよい。好ましくはｐＨ約５．５乃至７の範囲に調整する。反応時間は酵素反応の進行により適宜選択する。
【００３３】
本発明のポリペプチドをその基質に作用させて生成したα−イソマルトシルグルコ糖質にα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、斯界に於いて有用な環状四糖を大量かつ容易に製造することができる。α−イソマルトシル転移酵素を作用させる時期は、本発明のポリペプチドを作用させ、当該ポリペプチドを失活させた後に作用させてもよい。しかしながら、好適には、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させるのがよい。具体的には、澱粉又はその部分分解物やグリコーゲンの水溶液に本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用することにより、澱粉又はその部分分解物からは環状四糖が固形物当たり約３０％以上の収率で、また、グリコーゲンの場合は固形物当たり約８０％以上もの収率で環状四糖を得ることができる。本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素との併用する場合の環状四糖の生成メカニズムは、両者の反応特性から以下のように推察される。
【００３４】
（１）  本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質、例えば、澱粉、グリコーゲン、又はこれらの部分分解物などの糖質の非還元末端のα−１，４グルコシル基に作用し、グルコース基を他の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有する糖質が生成する。
（２）  α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有する糖質に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端に位置するイソマルトシル基を有する糖質の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質を生成する。
（３）  α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を糖質から切り離し、これを環状化して環状四糖を生成する。
（４）（３）に於いて、イソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を切り離された後の糖質は、再度、（１）から（３）の反応を経由することによって、環状四糖を生成し、更にこれらの反応が繰返されて著量の環状四糖が生成し蓄積される。
【００３５】
以上、説明したように、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素の併用により、上記したように、両者がそれぞれの基質に繰り返し作用し、環状四糖の収率が著しく向上するものと推察される。
【００３６】
又、この環状四糖の生成反応に於いて、他の転移酵素を更に併用して、環状四糖の収率を向上させることも有利に実施できる。即ち、例えば、濃度約１５％の澱粉部分分解物に、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させることにより、基質固形物当たり約５５％の収率で環状四糖が得られるところ、同じ条件で本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素並びにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの三者を併用して作用させることにより、基質固形物当たりの環状四糖の収率を更に約５乃至約１０％高めて約６０乃至約６５％にまで高めることができる。
【００３７】
上記の反応によって得られた溶液は、環状四糖又はこれを含有する糖質を含む溶液としてこのまま用いることも可能である。しかしながら、一般的には、これら糖質は適宜手法により精製して用いられる。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、精製、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）などやα−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）などの酵素を用いて残存する他の糖質を分解する方法、酵母による発酵処理、アルカリ処理などによる残存する還元性糖質の分解除去などの各種精製方法を１種又は２種以上組み合せて精製することができる。とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーが好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去することにより、高純度の環状四糖又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００３８】
このようにして得られた環状四糖又はこれを含む糖質は、更に濃縮し、シラップ状製品とするか、乾燥して非晶質の環状四糖又はこれを含む粉末状糖質製品にすることも随意である。
【００３９】
又、環状四糖結晶を製造するには、例えば、有機溶媒存在下又は非存在下、固形物純度約５０％以上、固形物濃度約３０％乃至約９０％の環状四糖高含有液を助晶缶にとり、固形物当たり、０．１乃至２０％の環状四糖種結晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で、攪拌条件下、高温から低温に徐冷し、環状四糖結晶を含有するマスキットを製造する。マスキットから環状四糖結晶又はこれを含有する糖質を製造する方法としては、例えば、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの公知の方法、又は含蜜結晶を製造する方法としては、分蜜方法などを適宜採用すればよい。
【００４０】
斯くして得られる環状四糖は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末又はシラップで、安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸含有物質と混合し、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも、又、混合した他の素材の物性を損なうことも殆どない。又、環状四糖は包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止し、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要ならば、シクロ（環状）デキストリン類、分岐シクロデキストリン類、シクロデキストラン類、シクロフラクタン類などの他の環状糖質を併用することにより、包接能による各種成分の安定化を更に高めることも有利に実施できる。前記環状四糖以外にシクロデキストリン類などの環状糖質は、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種のシクロデキストリンを含有した澱粉部分分解物であっても用いることができる。
【００４１】
更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、又、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができ、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料として、更には、粉末状物の付着、固結防止剤としても利用することができる。更に、斯かる環状四糖自体は、無毒、無害の天然甘味料であり、安全で安定な甘味料である。環状四糖結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤、糖衣錠に利用することも有利に実施できる。又、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難醗酵性などの有用な性質をも具備している。
【００４２】
従って、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４３】
又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、乳糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース（α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、β，β−トレハロース）、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの他の甘味料と併用することも、又、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ及びスクラロースなどの１種又は２種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして好適に利用することができる。
【００４４】
更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そのままで、又は必要に応じて、他の増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して用いることも随意である。
【００４５】
又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。又、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピ−ナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。又、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止��子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類又はローヤルゼリーなどの各種生理活性物質、更には、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペーストなどの有効成分や活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００４６】
以上述べたような各種組成物に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。含有させる環状四糖の量は、通常０．１％以上、望ましくは、１％以上とするのが好適である。
【００４７】
以下、バチルス  グロビスポルスＣ１１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）、バチルス  グロビスポルスＮ７５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９１）、及びアルスロバクター・グルビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）が産生するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質の解明、及び、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの解明、更に、そのＤＮＡを利用した組換え型α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製方法を実験例に基づいて説明する。
【００４８】
【実験例１】
〈バチルス  グロビスポルスＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製〉
【実験例１−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５１単位／ｍｌ（総活性約９，１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌ（総活性約３０，４００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
【００４９】
尚、前記に種類の酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、ＨＰＬＣは、『Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＳ−８０１』カラム（昭和電工（株）製）を用い、カラム温度６０℃、溶離液として水の流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー（株）製）を用いて行なった。
【００５０】
又、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応停止液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することにより行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。
【００５１】
【実験例１−２】
〈部分精製酵素標品の調製〉
実験例１−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位含んでいた。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、何れも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着せずに、両酵素活性は非吸着画分に検出された。この非吸着画分を回収し、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ   Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエント、これに続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭに濃度上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素活性成分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安リニアグラジエント濃度が約０．３Ｍ付近の画分に検出され、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエント濃度が約３０ｍＭ付近の画分に検出された。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
【００５２】
【実験例１−３】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製〉
実験例１−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。再度、この回収画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ   Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0003942543.tif 000002
【００５４】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
【００５５】
【実験例１−４】
〈α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製〉
実験例１−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００５６】
【表２】
0003942543.tif 000003
【００５７】
精製したα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
【００５８】
【実験例２】
〈バチルス  グロビスポルスＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製〉
【実験例２−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｎ７５株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．３４単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．３３単位／ｍｌ（総活性約５，９４０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，８００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
【００５９】
【実験例２−２】
〈部分精製酵素標品の調製〉
実験例２−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約４，７１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位含んでいた。この粗酵素液を『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）  ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着し、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着せずに非吸着画分に検出された。続いて、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２５Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
【００６０】
【実験例２−３】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製〉
実験例２−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲ   Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエント、これに続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭに濃度上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエント濃度が約３０ｍＭ付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ   Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表３に示す。
【００６１】
【表３】
0003942543.tif 000004
【００６２】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
【００６３】
【実験例２−４】
〈α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製〉
実験例２−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲ   Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲル（東ソー（株）製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表４に示す。
【００６４】
【表４】
0003942543.tif 000005
【００６５】
精製したα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
【００６６】
【実験例３】
〈アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製〉
【実験例３−１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Lのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０L入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．０６単位／ｍｌ（総活性約１９，１００単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．６単位／ｍｌ（総活性約２８，８００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
【００６７】
尚、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、基質のための緩衝液として１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた以外、実験例１に記載の方法と同様に行った。
【００６８】
【実験例３−２】
〈部分精製酵素標品の調製〉
実験例３−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約８，２１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位含んでいた。この粗酵素液を『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲル（東ソー（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。両酵素活性は、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルゲルには吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
【００６９】
【実験例３−３】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製〉
実験例３−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジエント濃度が約０．２Ｍ付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【００７０】
【表５】
0003942543.tif 000006
【００７１】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
【００７２】
【実験例３−４】
〈α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの部分精製〉
実験例３−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、部分精製酵素標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
【００７３】
【表６】
0003942543.tif 000007
【００７４】
部分精製したα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、メインの蛋白バンド以外に、３種のマイナーな蛋白バンドが認められた。
【００７５】
【実験例４−１】
〈各種糖質への作用〉
各種糖質を用いて、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチドの基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
【００７６】
これらの溶液に、実験例１−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、又は実験例２−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、実験例３−３の方法で得たアルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２％（ｗ／ｖ）になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行なった。展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとして『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ、メルク社製）を用い２回展開した後、硫酸−メタノール法で糖質を発色し検出し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表７に示す。
【００７７】
【表７】
0003942543.tif 000008
【００７８】
表７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【００７９】
【実験例４−２】
〈マルトオリゴ糖からの生成物〉
最終固形物濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース又はマルトペンタオース水溶液に、実験例１−３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、固形物グラム当たり２単位（マルトース及びマルトトリオース水溶液の場合）、０．２単位（マルトテトラオース水溶液の場合）、  ０．１単位（マルトペンタオース水溶液の場合）加えて、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（（株）ワイエムシー製）を用い、カラム温度４０℃、溶離液としての水の流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー（株）製）を用いて行なった。その結果を表８に示す。
【００８０】
【表８】
0003942543.tif 000009
【００８１】
表８の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させた結果、基質としてのマルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース）とが生成し、基質としてのマルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、その他、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース）、及び生成物Ｘが生成することが判明した。基質としてのマルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、その他、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルマルト−ス（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、及び生成物Ｙが生成することが判明した。基質としてのマルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、その他、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、及び生成物Ｚが生成することが判明した。
【００８２】
次いで、基質としてのマルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘと、基質としてのマルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの精製と単離を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５Ｓ−１５ １２Ａ』（（株）ワイエムシイ製）を用いて生成物Ｘ、Ｙを精製し単離することにより、上記マルトテトラオースからの反応物から、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、また上記マルトペンタオースからの反応物から、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【００８３】
これら生成物Ｘ及び生成物Ｙについて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析とを行なった。メチル化分析結果は表９にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、生成物Ｘと生成物Ｙの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを第１図および第２図にそれぞれ示した。又、生成物Ｘと生成物Ｙの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを第３図及び第４図にそれぞれ示し、それらの帰属を表１０にまとめた。
【００８４】
【表９】
0003942543.tif 000010
【００８５】
これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドによるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα−結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【００８６】
構造式１
α−D−Glcｐ―（１→６）―α−D−Glcｐ−（１→４）−α−D−Glcｐ−（１→４）−α−D−Glcｐ−（１→４）−D−Glcｐ
【００８７】
又、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
構造式２
α−D−Glcｐ−（１→６）−α−D−Glcｐ−（１→４）−α−D−Glcｐ−（１→４）−α−D−Glcｐ−（１→４）−α−D−Glcｐ−（１→４）−D−Glcｐ
【００８８】
【表１０】
0003942543.tif 000011
【００８９】
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドのマルトオリゴ糖に対する作用を以下のように判断された。
【００９０】
１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、基質として、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用し、その非還元末端のグルコシル残基を他の分子の非還元末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
２）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【００９１】
【実験例４−３】
〈還元力生成試験〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドが、還元力生成能を有するか否かを調べることを目的として以下の試験を行った。即ち、最終濃度１％のマルトテトラオース水溶液に、実験例１−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、又は実験例２−３の方法で得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、実験例３−３の方法で得たアルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
【００９２】
計算式：
【数１】
0003942543.tif 000012
【００９３】
結果を表１１に示す。
【００９４】
【表１１】
0003942543.tif 000013
【００９５】
表１１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力は増加しないことがわかり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは加水分解作用を示さない若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
【００９６】
【実験例４−４】
〈分子量〉
実験例１−３の方法で精製して得たバチルス  グロビスポルスＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たバチルス  グロビスポルスＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たアルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５％（ｗ／ｖ）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）と比較して当該酵素ポリペプチドの分子量を測定した。Ｃ１１株由来の当該ポリペプチドの分子量は約１３７，０００±２０，０００ダルトンで、Ｎ７５株由来の当該ポリペプチドの分子量は約１３６，０００±２０，０００ダルトンで、Ａ１９株由来の当該ポリペプチドの分子量は約９４，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００９７】
【実験例４−５】
〈等電点〉
実験例１−３の方法で精製して得たＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、２％（ｗ／ｖ）アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して当該酵素ポリペプチドの等電点を求めた。その結果、Ｃ１１株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐＩ約５．２±０．５で、Ｎ７５株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐＩ約７．３±０．５で、Ａ１９株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐＩ約４．３±０．５であった。
【００９８】
【実験例４−６】
〈作用温度及びｐＨ〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度とｐＨの影響について、各種温度、ｐＨ条件下、実験例１−１に示すα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第５図［温度の影響（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第６図［温度の影響（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第７図［温度の影響（Ａ１９株由来のポリペプチド）］、第８図［ｐＨの影響（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第９図［ｐＨの影響（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１０図［ｐＨの影響（Ａ１９株由来のポリペプチド）］に示した。その結果、Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４５℃（Ｃａ２＋非存在）又は約５０℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０で、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃（Ｃａ２＋非存在）又は約５５℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０で、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの至適温度は、ｐＨ８．４、６０分間反応で、約６０℃（Ｃａ２＋非存在）又は約６５℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約８．４であった。
【００９９】
【実験例４−７】
〈安定性〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は、当該ポリペプチド含有溶液［２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ａ１９株由来のポリペプチドの場合、２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）］をＣａ２＋非存在下または１ｍＭＣａ２＋存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０（Ａ１９株由来のポリペプチドの場合、ｐＨ８．０）に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を第１１図［温度安定性（Ｃ１１株由来のポリペプチド）］、第１２図［温度安定性（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１３図［温度安定性（Ａ１９株由来のポリペプチド）］、第１４図［ｐＨ安定性（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第１５図［ｐＨ安定性（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１６図［ｐＨ安定性（Ａ１９株由来のポリペプチド）］に示した。Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約４５℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０で、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約５０℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至９．０で、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約６０℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
【０１００】
【実験例５】
〈部分アミノ酸配列〉
【実験例５−１】
〈Ｎ末端アミノ酸配列〉
実験例１−３の方法で精製して得たＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドについて、そのＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号７に示すアミノ酸配列を有し、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列を有し、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号２６に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
【０１０１】
【実験例５−２】
〈Ｃ１１株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列〉
実験例１−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダパックＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した１０ペプチド［Ｐ８（保持時間約８分）、Ｐ２０（保持時間約２０分）、Ｐ５６（保持時間約５６分）、Ｐ６０（保持時間約６０分）、Ｐ６２（保持時間約６２分）、Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ７５（保持時間約７５分）、Ｐ８２（保持時間約８２分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号８乃至１７に示すアミノ酸配列が得られた。
【０１０２】
【実験例５−３】
〈Ｎ７５株由来ポリペプチドの内部アミノ酸配列〉
実験例２−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した５ペプチド［ＰＮ４７（保持時間約４７分）、ＰＮ５９（保持時間約５９分）、ＰＮ６７（保持時間約６７分）、ＰＮ８７（保持時間約８７分）、ＰＮ８９（保持時間約８９分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号２０乃至２４に示すアミノ酸配列が得られた。
【０１０３】
【実験例５−４】
〈Ａ１９株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列〉
実験例３−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−１６％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した５ペプチド［ＰＡ３９（保持時間約３９分）、ＰＡ８１（保持時間約８１分）、ＰＡ８６（保持時間約８６分）、ＰＡ９２（保持時間約９２分）、ＰＮ１０４（保持時間約１０４分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号２７乃至３１に示すアミノ酸配列が得られた。
【０１０４】
【実験例６】
〈バチルス  グロビスポルスＣ１１株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製〉
【実験例６−１】
〈染色体ＤＮＡの調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【０１０５】
【実験例６−２】
〈形質転換体ＢＧＣ２の調製〉
実験例６−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ  ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を常法により制限酵素Ｂａｍ  ＨＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約５，０００個をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験例５−２の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号１６に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＧＮＴＴＹＡＴＧＡＡＹＴＴＹＡＧＲＴＧＧＧＡ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して２種類の形質転換体を選択した。常法により、これら２種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号１７に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＹＧＣＮＴＧＧＡＴＧＴＴＹＧＧＮＧＡＹＴＧＧ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＢＧＣ２』と命名した。
【０１０６】
【実験例６−３】
〈ＤＮＡ配列の解明〉
実施例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス  グロビスポルスＣ１１株に由来する、鎖長５２９４塩基対の、配列表に於ける配列番号１８に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１７図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｘｂａ  Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１８に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−２の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号７及び配列番号８乃至１７に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号７に示すアミノ酸配列は、配列番号１８に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至４４番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号１８に併記したアミノ酸配列に於ける第８２３乃至８３２番目、第５７６乃至５８９番目、第８７４乃至９０４番目、第１１１７乃至１１４１番目、第６５７乃至６７０番目、第３６７乃至３９９番目、第９７０乃至９９３番目、第９３８乃至９５３番目、第２７９乃至２９５番目及び第６３２乃至６５１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号１８に於ける第４７８３乃至４７８５番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５´−ＴＡＡ−３´）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のグルタミン酸（配列表に於ける配列番号１８に於ける第１２８４番目のアミノ酸）であることが判明した。
【０１０７】
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルス  グロビスポルスＣ１１株に於いては、配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号１８に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号１８に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＣ２』と命名した。
【０１０８】
【実験例７】
〈バチルス  グロビスポルスＮ７５株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製〉
【実験例７−１】
〈染色体ＤＮＡの調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｎ７５株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【０１０９】
【実験例７−２】
〈形質転換体ＢＧＮ２の調製〉
実験例７−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｋｐｎ  Ｉを約２００単位加え、３７℃で１６時間反応させて染色体ＤＮＡを分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム社製）を常法により制限酵素Ｋｐｎ  Ｉを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム社製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約２，５００個をナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』（アマシャム製）上に固定した。別途、実験例５−３の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号２４に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＹＧＣＮＴＧＧＡＴＧＴＴＹＧＧＮＧＡＹＴＧＧ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して３種類の形質転換体を選択した。常法により、これら３種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号２３に示すアミノ酸配列における第１４番目より第２１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＴＮＡＡＹＣＡＲＡＡＹＣＡＹＴＧＧＴＴＹＴＡ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＢＧＮ２』と命名した。
【０１１０】
【実験例７−３】
〈ＤＮＡ配列の解明〉
実施例７−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を常法に従い、  アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス  グロビスポルスＮ７５株に由来する、鎖長４９９１塩基対の、配列表に於ける配列番号２５に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１８図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号２５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−３の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号１９及び配列番号２０乃至２４に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列は、配列番号２５に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至４３番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号２０、２１、２２、２３、及び２４に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号２５に併記したアミノ酸配列に於ける第９０７乃至９２５番目、第３６７乃至３８６番目、第１０３４乃至１０５８番目、第９９６乃至１０２０番目、及び第６３２乃至６４２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号２５に於ける第４２９４乃至４２９６番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５´−ＴＡＡ−３´）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のグルタミン（配列表に於ける配列番号２５に於ける第１２８６番目のアミノ酸）であることが判明した。
【０１１１】
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルス  グロビスポルスＮ７５株に於いては、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号２５に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号２５に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号２５に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＮ２』と命名した。
【０１１２】
【実験例８】
〈アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製〉
【実験例８−１】
〈染色体ＤＮＡの調製〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【０１１３】
【実験例８−２】
〈形質転換体ＡＧＡ１の調製〉
実験例８−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｋｐｎ  Ｉを約１０単位加え、３７℃で３０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約４，０００乃至８，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を常法により制限酵素Ｋｐｎ  Ｉを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約６，０００個をナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』（アマシャム（株）製）上に固定した。別途、実験例５−４の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号２７に示すアミノ酸配列における第１番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＣＡＲＧＡＲＴＧＧＡＡＹＹＴＮＡＣＮＧＧＮＧＡＹＣＣＮＴＧＧＡＣ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して２種類の形質転換体を選択した。常法により、これら３種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号２９に示すアミノ酸配列における第６番目より第１６番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＴＧＧＡＣＮＣＡＲＣＣＮＧＡＲＧＣＮＧＧＮＧＣＮＧＴＮＴＴＧＣＡ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＡＧＡ１』と命名した。
【０１１４】
【実験例８−３】
〈ＤＮＡ配列の解明〉
実施例８−２の方法で得た形質転換体『ＡＧＡ１』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株に由来する、鎖長５８１１塩基対の、配列表に於ける配列番号３２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１９図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号３２に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−４の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号２６及び配列番号２７乃至３１に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号２６に示すアミノ酸配列は、配列番号３２に併記したアミノ酸配列に於ける第３７乃至４９番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号２７、２８、２９、３０、及び３１に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号３２に併記したアミノ酸配列に於ける第２２７乃至２３９番目、第３４５乃至３７４番目、第４０１乃至４３０番目、第８９乃至１１５番目、及び第６４１乃至６６７番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号３２に於ける第４５５０乃至４５５２番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５´−ＴＧＡ−３´）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のフェニルアラニン（配列表に於ける配列番号３２に於ける第９６５番目のアミノ酸）であることが判明した。
【０１１５】
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５９０）に於いては、配列表における配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号３２に併記したアミノ酸配列における第１乃至３６番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号３２に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号３２に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＡＧＡ１』と命名した。
【０１１６】
【実験例９】
〈本発明の形質転換体によるポリペプチドの産生〉
【実験例９−１】
〈形質転換体ＢＧＣ２〉
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、常法にしたがい、この培養物を遠心分離して培養上清と菌体とに分離して個別に回収した。菌体については、超音波破砕法による細胞からの全抽出物と、浸透圧ショック法による細胞ペリプラズムからの抽出物とを別々に調製した。前記超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモゲナイザー（『モデルＵＨ−６００』）（（株）エスエムテー製）で細胞を破砕し、その破砕物を細胞全抽出物とする方法を採用した。前記浸透圧ショック法は、菌体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した後、洗浄菌体を２００ｇ／ｌスクロース及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む３３ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁し２７℃で２０分間振盪し、続いて、遠心分離して菌体を回収し、その菌体を、予め約４℃に冷却しておいた０．５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液に懸濁し、氷水中で２０分間振盪して細胞ペリプラズムから抽出する方法を採用した。その後、遠心分離して、上清を回収し、その上清を細胞ペリプラズム抽出物とした。
【０１１７】
このようにして得た培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１２に示す。
【０１１８】
【表１２】
0003942543.tif 000014
【０１１９】
表１２の結果から明らかなように、形質転換体『ＢＧＣ２』は本発明のポリペプチドを細胞内に産生し、その大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス  グロビスポルスＣ１１株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．３７単位、約０．０２単位であり、形質転換体『ＢＧＣ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
【０１２０】
上記で得た細胞ペリプラズム抽出物を、更に実験例１の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）  ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲル、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例１に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約５．２±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約４５℃（Ｃａ２＋イオン非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋イオン存在）、至適ｐＨ約６．０、温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋イオン非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋イオン存在）、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例１の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
【０１２１】
【実験例９−２】
〈形質転換体ＢＧＮ２〉
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例７−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、実験例９−１の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリプラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１３に示す。
【０１２２】
【表１３】
0003942543.tif 000015
【０１２３】
表１３の結果から明らかなように、形質転換体『ＢＧＮ２』は本発明のポリペプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス  グロビスポルスＮ７５株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．２１単位、約０．０１単位であり、形質転換体『ＢＧＮ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
【０１２４】
上記で得た培養上清と細胞ペリプラズム抽出物との混合物を、更に実験例２の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）  ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲル、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例２に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約１３６，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約７．３±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約５０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約５５℃（Ｃａ２＋存在下）、至適ｐＨ約６．０、温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約５０℃（Ｃａ２＋存在下）、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
【０１２５】
【実験例９−３】
〈形質転換体ＡＧＡ１〉
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例８−２の方法で得た形質転換体『ＡＧＡ１』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、実験例９−１の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリプラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１４に示す。
【０１２６】
【表１４】
0003942543.tif 000016
【０１２７】
表１４の結果から明らかなように、形質転換体『ＡＧＡ１』は本発明のポリペプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、アルスロバクター  グロビホルミスＡ１９株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．３３単位、約０．０１単位であり、形質転換体『ＡＧＡ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
【０１２８】
上記で得た培養上清と細胞ペリプラズム抽出物との混合物を、更に実験例３の方法に準じて、塩析、透析し、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約９４，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約４．３±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約６０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約６５℃（Ｃａ２＋存在下）、至適ｐＨ約８．４、温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約６０℃（Ｃａ２＋存在下）、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
【０１２９】
これらの結果から、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造できると共に、ポリペプチドの生産性も著しく向上することが判明した。
【０１３０】
以下、実施例により、本発明のポリペプチドの製造方法と、本発明のポリペプチドを用いた環状四糖又はそれを含む糖質の製造方法について具体的に説明する。
【０１３１】
【実施例１】
〈本発明のポリペプチドの製造〉
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例５−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２７℃で４８時間通気培養した。培養物を遠心分離して菌体を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去して上清を得た。この上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当り、約１，１００単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例１の方法により精製したところ、比活性約１３．５単位／ｍｇ蛋白質の本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約６１単位含む水溶液が約７０ｍｌ得られた。
【０１３２】
【実施例２】
〈本発明のポリペプチドの製造〉
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を接種し、３７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約１８ｌとり、同様に滅菌し、２７℃まで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２７℃で４８時間通気培養した。培養物を遠心分離して培養上清を得た。この培養上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１Ｌ当り、約７５０単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例２の方法により精製したところ、比活性約１２．６単位／ｍｇ蛋白質の本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約７２単位含む水溶液が約７５ｍｌ得られた。
【０１３３】
【実施例３】
〈環状四糖を含むシラップ状物の製造〉
タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業（株）製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た本発明のポリペプチドと、実験例１−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれぞれ２．２単位と６．６単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
【０１３４】
本シラップは、固形物当り、グルコース３８．４％、環状四糖５８．１％、その他の糖質を３．５％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１３５】
【実施例４】
〈環状四糖結晶性粉末の製造〉
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得たポリペプチドと実験例１−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ２．５単位と７．０単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース３４．２％、環状四糖６２．７％、その他の糖質を３．１％含有する濃度６０％の環状四糖含有シラップを得た。
【０１３６】
この環状四糖含有シラップを、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバ−ライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』、オルガノ（株）製）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５％（ｖ／ｖ）加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有する環状四糖高含有液を得た。
【０１３７】
本溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、原料澱粉固形物当たり収率約２０％で環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
【０１３８】
本品は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１３９】
【実施例５】
〈環状四糖結晶性粉末の製造〉
とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約５１℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例２の方法で得たポリペプチドと実験例２−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ２．４単位と８．０単位の割合加え、更にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り３単位になるように加え、ｐＨ５．５、温度５１℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ  Ｌ「アマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース４６．８％、環状四糖４４．０％、その他の糖質を９．８％含有する濃度６０％の環状四糖含有シラップを得た。得られた環状四糖含有シラップを原糖液とし、環状四糖の含量を高めるため、実施例５の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、濃縮し、噴霧乾燥して、環状四糖含有粉末を原料澱粉固形物当たり収率約４５％で得た。
【０１４０】
【発明の効果】
本品は、固形物当たり、グルコース３．７％、環状四糖８０．５％、及びその他の糖質を１５．８％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４１】
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明と言える。
【０１４２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsukagaku Kenkyujo
<120> Polypeptide having α-isomaltosylglucosaccharide-forming
enzymatic activity
<130> WO879
<160> 32
<210> 1
<211> 1249
<212> PRT
<213> Microorganism
<220>
<400> 1
Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val Thr Gly Asp
1                5                  10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser Asp Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg
35                  40                  45
Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn
50                  55                  60
Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr Ala Asn Pro
65                  70                  75                  80
Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr Lys Asn Pro
85                  90                  95
Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu Phe Trp Glu
100                105                  110
Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Ala
115                120                  125
Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser
130                135                  140
Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala His Ala Gly
145                150                  155                160
Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr
165                170                  175
Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Ser Thr
180                185                  190
Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg
195                200                  205
Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro
210                215                  220
Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met
225                230                  235                240
Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn
245                250                  255
Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile
260                265                  270
Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu
275                280                  285
Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ala
290                295                  300
Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met
305                310                  315                320
Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala Ser Ala Asn
325                330                  335
Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro
340                345                  350
Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr Val Arg Ser
355                360                  365
Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp Asn His Ser
370                375                  380
Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr
385                390                  395                400
Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr
405                410                  415
Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg Ala Tyr Thr
420                425                  430
Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly
435                440                  445
Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln
450                455                  460
Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln
465                470                  475                480
Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly
485                490                  495
Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro
500                505                  510
Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro
515                520                  525
Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr
530                535                  540
Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile Gln Leu Arg
545                550                  555                560
Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu
565                570                  575
Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr Pro Thr Asp
580                585                  590
Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu
595                600                  605
Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys Asp Ile Tyr
610                615                  620
Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn Ala Ile Thr
625                630                  635                640
Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp
645                650                  655
Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr Gln Lys Val
660                665                  670
Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp Val Asp Val
675                680                  685
Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly
690                695                  700
Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln Asn Met Thr
705                710                  715                720
Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys
725                730                  735
Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His
740                745                  750
Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala Met Thr Ser
755                760                  765
Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu Gly Trp Ala
770                775                  780
Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Val Thr Ala
785                790                  795                800
Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Val
805                810                  815
Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Ser Gly
820                825                  830
Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr
835                840                  845
Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val
850                855                  860
Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu
865                870                  875                880
Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val
885                890                  895
Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp
900                905                  910
Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Val
915                920                  925
Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn
930                935                  940
Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile Gly Lys
945                950                  955                960
Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr
965                970                  975
Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Ser Ala
980                985                  990
Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser Ala Gly Ser
995                1000                1005
Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr
1010                1015                1020
Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr Ser Phe Thr
1025                1030                1035                1040
Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val Gln Thr Val
1045                1050                1055
Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Ala
1060                1065                1070
Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala
1075                1080                1085
Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe
1090                1095                1100
Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp His Pro Gly
1105                1110                1115                1120
Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr Thr Asn Pro
1125                1130                1135
Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Phe Ala Ala
1140                1145                1150
Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val Pro Val Asn
1155                1160                1165
Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys Asn Thr Thr
1170                1175                1180
Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser Ala Ile
1185                1190                1195                1200
Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser Val Ser
1205                1210                1215
Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe Tyr Val Asp
1220                1225                1230
Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val Thr Lys
1235                1240                1245
Gln
<210> 2
<211> 1251
<212> PRT
<213> Microorganism
<220>
<400> 2
His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp
1                5                  10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Ile Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp Ile
20                  25                  30
Leu Val Leu Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg
35                  40                  45
Pro Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn
50                  55                  60
Lys Thr Trp Pro Ser Ile Gly Ala Val Ile Asn Thr Ala Ser Asn Pro
65                  70                  75                  80
Met Thr Ile Thr Thr Pro Ala Met Lys Ile Glu Ile Ala Lys Asn Pro
85                  90                  95
Val Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu
100                105                  110
Pro Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly
115                120                  125
Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser
130                135                  140
Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gly
145                150                  155                160
Asp Gln Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr
165                170                  175
Gly Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala
180                185                  190
Thr Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg
195                200                  205
Arg Tyr Thr Lys Gln Asp Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro
210                215                  220
Lys Glu Ile Met Ser Gly Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met
225                230                  235                240
Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn
245                250                  255
Glu Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile
260                265                  270
Pro Ile Asp Gly Tyr Ala Ile Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu
275                280                  285
Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala
290                295                  300
Ala Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gln Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met
305                310                  315                320
Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn
325                330                  335
Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro
340                345                  350
Gly His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Ile Pro Val Phe Val Arg Ser
355                360                  365
Ile Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser
370                375                  380
Lys Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr
385                390                  395                400
Asp Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr
405                410                  415
Thr Gly His Met Ser Gln Ala Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Ala Tyr Thr
420                425                  430
Ser Asn Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly
435                440                  445
Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln
450                455                  460
Tyr Thr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln
465                470                  475                480
Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Ile Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly
485                490                  495
Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro
500                505                  510
Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro
515                520                  525
Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr
530                535                  540
Tyr Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gln Leu Arg
545                550                  555                560
Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu
565                570                  575
Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Glu Tyr Pro Ala Asp
580                585                  590
Ala Asn Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu
595                600                  605
Leu Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gln Gln Thr Ser Lys Glu Ile Tyr
610                615                  620
Leu Pro Ala Gly Thr Trp Ile Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr
625                630                  635                640
Gly Gly Gln Lys Ile Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp
645                650                  655
Ile Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Ser Gln Lys Val
660                665                  670
Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Pro Val Gln Thr Val Asp Val Asp Val
675                680                  685
Phe Pro Asn Thr Ala Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly
690                695                  700
Ser Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gln Leu Met Thr
705                710                  715                720
Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys
725                730                  735
Thr Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His
740                745                  750
Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser
755                760                  765
Tyr Ala Ser Leu Gln Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala
770                775                  780
Lys Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala
785                790                  795                800
Gly Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ile Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val
805                810                  815
Ser Val Ala Asp Val Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly
820                825                  830
Asn Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr
835                840                  845
Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val
850                855                  860
Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu
865                870                  875                880
Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val
885                890                  895
Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp
900                905                  910
Asp Thr Trp Gly Thr Gln Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr
915                920                  925
Asn Val Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser
930                935                  940
Val Asn Leu Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala Ile Gly Lys
945                950                  955                960
Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln
965                970                  975
Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala
980                985                  990
Pro Gly Ala Gln Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser
995                1000                1005
Tyr Gln Ile Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr
1010                1015                1020
Leu Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Ala Phe Ala
1025                1030                1035                1040
Ser Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Ser Val Gln Thr Val
1045                1050                1055
Ala Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly
1060                1065                1070
Asp Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala
1075                1080                1085
Ala Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Gly
1090                1095                1100
Gly Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gln Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His
1105                1110                1115                1120
Pro Ala Ser Gln Ala Ile Ala Tyr Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Met
1125                1130                1135
Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr
1140                1145                1150
Ala Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Val Ser Val Pro
1155                1160                1165
Val Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn
1170                1175                1180
Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser
1185                1190                1195                1200
Pro Ile Phe Thr Asn Ile Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser
1205                1210                1215
Val Ser Asp Ile Gln Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Ile Gly Phe Tyr
1220                1225                1230
Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val
1235                1240                1245
Thr Lys Gln
1250
<210> 3
<211> 929
<212> PRT
<213> Microorganism
<220>
<400> 3
Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly Ser Ser Tyr
1                5                  10                  15
Leu Val Val Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala
20                  25                  30
Gly Gly Gly Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro
35                  40                  45
Gln Val Ala Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr
50                  55                  60
Gly Ser Val Leu Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Asp Leu Cys Val Thr Ala Thr Asp Ile Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val
85                  90                  95
Leu His Glu Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gln Ala Trp Lys Gly Leu
100                105                  110
Asn Ile Thr Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gln Gln
115                120                  125
Phe Phe Thr Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg
130                135                  140
Thr Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Asn Ala Met Val Phe Asp Pro Glu Asn
145                150                  155                160
Gly Pro Val Gly Asn Thr Gln Ile Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Asp
165                170                  175
Asp Asn Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Val Asp Gln Leu Tyr Lys Gln Glu
180                185                  190
Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg Met Trp Gly Asp Gln
195                200                  205
Val Arg Trp Tyr Leu Met Ser Gly Asp Asp Leu Pro Asp Leu Arg His
210                215                  220
Asp Tyr Met Glu Leu Thr Gly Thr Pro Pro Val Pro Pro Lys Lys Ala
225                230                  235                240
Phe Gly Leu Trp Val Ser Glu Phe Gly Tyr Asp Asn Trp Ser Glu Val
245                250                  255
Asp Asn Thr Ile Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Pro Val Asp Gly
260                265                  270
Ala Met Leu Asp Val Gln Trp Phe Gly Gly Val Thr Ala Asp Ser Asp
275                280                  285
Asp Thr Arg Met Gly Thr Leu Asp Trp Asp Thr Ser Arg Phe Pro Asp
290                295                  300
Pro Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile
305                310                  315                320
Pro Ile Glu Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg
325                330                  335
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro
340                345                  350
Pro Val Tyr Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met Ile
355                360                  365
Asp Trp Thr Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gln Arg
370                375                  380
Gln His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly
385                390                  395                400
Glu Pro Glu Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val Ile Pro
405                410                  415
Gly Lys His Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp
420                425                  430
Ala Gln Ser Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gln Lys Arg
435                440                  445
Pro Phe Met Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg His Gly
450                455                  460
Ala Gly Met Trp Ser Ala Asp Ile Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly
465                470                  475                480
Ser Gln Gln Asn Ala Gln Met His Met Ser Met Ser Gly Ile Asp Tyr
485                490                  495
Tyr Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp
500                505                  510
Val Asn Glu Leu Tyr Thr Gln Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp
515                520                  525
Thr Pro Leu Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr
530                535                  540
Ser Pro Asp Ser Ile Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Val
545                550                  555                560
Arg Arg Tyr Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala
565                570                  575
His Gln Phe Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Val Tyr Tyr Tyr Gln
580                585                  590
Asn Asp Asp His Val Arg Glu Met Gly His Gln Lys Met Leu Gly Arg
595                600                  605
Asp Leu Leu Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp
610                615                  620
Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asp Ile His Thr Asn Glu Arg
625                630                  635                640
Ile Gln Ser Thr Gly Gln Trp Ile Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp
645                650                  655
Gly Val Phe Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala Ile Ile Pro
660                665                  670
Lys Ala Phe Val Asp Ala Ser Thr Lys Asp Ile Thr Gly Lys Arg Glu
675                680                  685
Asp Ala Ala Val Arg Asn Glu Leu Ile Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp
690                695                  700
Val Ala Ser Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala
705                710                  715                720
Tyr Ala Asp Gly Ala Val Arg Thr Thr Gln Ile Ser Gln Ser Leu Thr
725                730                  735
Asn Gly Val Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser
740                745                  750
Gly Ala Pro Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly
755                760                  765
Thr Gln Ala Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Val Pro Leu Thr Glu His
770                775                  780
Ala Asn Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala
785                790                  795                800
Gly Gly Gly Leu Val Val Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr
805                810                  815
Ala Lys Thr Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr
820                825                  830
Phe Ser Cys Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gln Ser Val Tyr Val
835                840                  845
Val Gly Asn Val Pro Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val
850                855                  860
Lys Leu Glu Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Val Arg Asn
865                870                  875                880
Leu Pro Pro Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys Ile Lys Arg Gln Glu
885                890                  895
Ala Gly Leu Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn
900                905                  910
Ile Leu Ser Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly Ile Thr Thr Gly Ala
915                920                  925
Phe
<210> 4
<211> 3747
<212> DNA
<213> Microorganism
<400> 4
tatgtcagca gcctaggaaa tctcatttct tcgagtgtca ccggagatac cttgacgcta  60
actgttgata acggtgcgga gccgagtgat gacctcttga ttgttcaagc ggtgcaaaac  120
ggtattttga aggtggatta tcgtccaaat agcataacgc cgagcgcgaa gacgccgatg  180
ctggatccga acaaaacttg gtcagctgta ggagctacga ttaatacgac agccaatcca  240
atgaccatca cgacttccaa tatgaagatt gagattacca agaatccagt acgaatgacg  300
gtcaagaagg cggacggcac tacgctattc tgggaaccat caggcggagg ggtattctca  360
gacggtgtgc gcttccttca tgccacaggg gataatatgt atggcatccg gagcttcaat  420
gcttttgata gcgggggtga cctgctgcgg aattcgtcca atcatgccgc ccatgcgggt  480
gaacagggag attccggtgg tccgcttatt tggagtacgg caggatatgg actattagtc  540
gatagcgatg gcggctaccc ctatacagat agcacaaccg gtcaaatgga gttttattat  600
ggtgggaccc ctcctgaggg acgtcgttat gcgaaacaaa acgtggaata ttatattatg  660
ctcggaaccc ccaaggaaat tatgaccgac gtaggggaaa tcacagggaa accgcctatg  720
ctgcctaagt ggtcgcttgg attcatgaac tttgagtggg atacgaatca aacggagttt  780
acgaataatg tggatacgta tcgtgccaaa aatatcccca tagatgctta cgccttcgac  840
tatgactgga aaaagtacgg ggaaaccaac tatggtgaat tcgcgtggaa tacgactaat  900
ttcccttctg cgtcaacgac ttctttaaag tcaacaatgg atgctaaagg catcaaaatg  960
atcggaatta caaaaccccg catcgttacg aaggatgctt cagcgaatgt gacgacccaa  1020
gggacggacg cgacaaatgg cggttatttt tatccaggcc ataacgagta tcaggattat  1080
ttcattcccg taactgtgcg tagtatcgat ccttacaatg ctaacgaacg tgcttggttc  1140
tggaatcatt ccacagatgc gcttaataaa gggatcgtag gttggtggaa tgacgagacg  1200
gataaagtat cttcgggtgg agcgttatat tggtttggca atttcacaac aggccacatg  1260
tctcagacga tgtacgaagg ggggcgggct tacacgagtg gagcgcagcg tgtttggcaa  1320
acggctagaa ccttctaccc aggtgcccag cggtatgcga ctacgctttg gtctggcgat  1380
attggcattc aatacaataa aggcgaacgg atcaattggg ctgccgggat gcaggagcaa  1440
agggcagtta tgctatcctc cgtgaacaat ggccaggtga aatggggcat ggataccggc  1500
ggattcaatc agcaggatgg cacgacgaac aatccgaatc ccgatttata cgctcggtgg  1560
atgcagttca gtgccctaac gcctgttttc cgagtgcatg ggaacaacca tcagcagcgc  1620
cagccatggt acttcggatc gactgcggag gaggcctcca aagaggcaat tcagctgcgg  1680
tactccctga tcccttatat gtatgcctat gagagaagtg cttacgagaa tgggaatggg  1740
ctcgttcggc cattgatgca agcctatcca acagatgcgg ccgtcaaaaa ttacacggat  1800
gcttggatgt ttggtgactg gctgctggct gcacctgtgg tagataaaca gcagacgagt  1860
aaggatatct atttaccgtc tgggtcatgg attgactatg cgcgaggcaa tgcaataact  1920
ggcggtcaaa ccatccgata ttcggttaat ccggacacgt tgacagacat gcctctcttt  1980
attaaaaaag gtgccattat tccaacacag aaagtgcagg attacgtagg gcaggcttcc  2040
gtcacttccg ttgatgtgga tgtgtttccg gatacgacgc agtcgagttt cacgtactac  2100
gatgatgatg gcgccagtta taactatgag agcggcactt attttaagca aaatatgact  2160
gctcaggata atgggtcagg ctcgttaagt tttactttag gagcaaagag tggcagttac  2220
acgccggctc tccaatccta tatcgttaag ctgcacggtt ctgctggaac ttctgttacg  2280
aataacagcg cagctatgac atcttatgca agcttggaag cattaaaagc tgctgctggg  2340
gaaggctggg cgactgggaa ggacatttat ggggatgtca cctatgtgaa agtgacggca  2400
ggtacagctt cttctaaatc tattgctgtt acaggtgttg ctgccgtgag cgcaactact  2460
tcgcaatacg aagctgagga tgcatcgctt tctggcaatt cggttgctgc aaaggcgtcc  2520
ataaacacga atcataccgg atatacggga actggatttg tagatggttt ggggaatgat  2580
ggcgctggtg tcaccttcta tccaaaggtg aaaactggcg gtgactacaa tgtctccttg  2640
cgttatgcga atgcttcagg cacggctaag tcagtcagta tttttgttaa tggaaaaaga  2700
gtgaagtcca cctcgctcgc taatctcgca aattgggaca cttggtctac acaatctgag  2760
acactgccgt tgacggcagg tgtgaatgtt gtgacctata aatattactc cgatgcggga  2820
gatacaggca atgttaacat cgacaacatc acggtacctt ttgcgccaat tatcggtaag  2880
tatgaagcag agagtgctga gctttctggt ggcagctcat tgaacacgaa ccattggtac  2940
tacagtggta cggcttttgt agacggtttg agtgctgtag gcgcgcaggt gaaatacaac  3000
gtgaatgtcc ctagcgcagg aagttatcag gtagcgctgc gatatgcgaa tggcagtgca  3060
gcgacgaaaa cgttgagtac ttatatcaat ggagccaagc tggggcaaac cagttttacg  3120
agtcctggta cgaattggaa tgtttggcag gataatgtgc aaacggtgac gttaaatgca  3180
ggggcaaaca cgattgcgtt taaatacgac gccgctgaca gcgggaacat caacgtagat  3240
cgtctgcttc tttcaacttc ggcagcggga acgccggttt ctgagcagaa cctgctagac  3300
aatcccggtt tcgagcgtga cacgagtcaa accaataact ggattgagtg gcatccaggc  3360
acgcaagctg ttgcttttgg cgttgatagc ggctcaacca ccaatccgcc ggaatccccg  3420
tggtcgggtg ataagcgtgc ctacttcttt gcagcaggtg cctatcaaca aagcatccat  3480
caaaccatta gtgttcctgt taataatgta aaatacaaat ttgaagcctg ggtccgcatg  3540
aagaatacga cgccgacgac ggcaagagcc gaaattcaaa actatggcgg atcagccatt  3600
tatgcgaaca taagtaacag cggtgtttgg aaatatatca gcgtaagtga tattatggtg  3660
accaatggtc agatagatgt tggattttac gtggattcac ctggtggaac tacgcttcac  3720
attgatgatg tgcgcgtaac caaacaa                                      3747
<210> 5
<211> 3753
<212> DNA
<213> Microorganism
<400> 5
catgtgagcg cgctgggcaa cctgctttcc tcggcggtga ccggggatac gctcacgctg  60
acgatcgata acggcgcgga accgaatgac gatattctag ttctgcaagc agtccagaac  120
ggtattctga aggtggacta ccggccgaac ggtgtagctc caagcgcgga tacgccgatg  180
ctggatccca ataaaacctg gccgtccata ggcgccgtta tcaatacagc ctctaatccg  240
atgacgatca caacgccggc gatgaagatt gagattgcca aaaatccggt gcgcctgacc  300
gtgaaaaaac cggacggcac cgctctgtta tgggaacccc cgaccggcgg cgtcttctcg  360
gacggcgtcc gtttcttgca cgggacgggc gacaatatgt acggcatccg cagcttcaat  420
gcttttgaca gcggcgggga tctgctgcgc aacagctcca cccaagccgc ccgtgcaggc  480
gaccagggca actccggcgg cccgctgatc tggagcacag ccgggtacgg ggtgctcgtt  540
gacagcgacg gtgggtatcc gttcacggac gaggctaccg gcaagctgga gttctattac  600
ggcggcacgc ctccggaagg ccggcgctat acgaagcagg atgtggagta ctacatcatg  660
ctcggcacgc cgaaagagat catgtccggc gtcggggaaa ttacgggcaa accgccgatg  720
ctgcccaagt ggtccctggg ctttatgaac ttcgagtggg atctgaatga agctgagctc  780
aagaaccatg tggatacgta ccgggccaaa aatattccga tcgacggcta tgcgatcgat  840
ttcgattgga agaagtacgg cgagaataat tacggcgaat tcgcttggaa tacggccaat  900
ttcccttccg ccgccacgac ggcgctgaag tcgcagatgg acgccaaggg cattaaaatg  960
atcggcataa ccaagcctcg catcgcgacg aaggattttt cgaacaatcc taccgtgcag  1020
ggaacggacg cggcgagcgg cggttatttt tatccgggac atagcgaata caaggactac  1080
ttcatcccgg tctttgtgcg cagcatcgac ccttataacc ctgctgcacg ctcctggttc  1140
tggaaccact ccaaggatgc gttcgataaa ggcatcgtag gctggtggaa cgacgagacg  1200
gatgcggtat cgtcgggagg ggcctcctac tggttcggca attttacgac cggccatatg  1260
tcccaggcgc tttacgaggg acagcgggca tatacgtcga acgcccagcg cgtctggcag  1320
acagcgcgca cgttctatcc cggggcgcag cgttatgcga cgacgctctg gtcgggagac  1380
atcgggattc agtataccaa gggggaaaga atcaactggg ctgccggcat gcaggagcag  1440
cgggcggtga tgctttcttc gatcaacaac ggccaggtca aatggggaat ggacacaggc  1500
ggcttcaacc agcaggacgg cacgacgaac aatccgaatc cggacctgta cgccagatgg  1560
atgcagttca gcgcgctgac tccggtgttc cgcgtgcatg gcaacaatca ccagcagcgc  1620
cagccttggt attatggctc gacagccgag gaggcatcca aggaagcgct ccagctccgt  1680
tactccctga ttccttatat gtatgcttac gaaagaagcg cctacgagaa cggtaacgga  1740
cttgtccggc cgctgatgca ggaataccct gccgatgcca acgccaaaaa ctatctcgat  1800
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ggcggccaga agatcagcta cgccgtcaat cccgacacgc tgacggatat tccgctcttc  1980
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gtccaaacgg tggatgtgga tgtattcccg aatacggcac aatcgagctt tacctattat  2100
gacgatgacg gcagcagcta caattatgaa agcggagctt acttcaagca attgatgacg  2160
gctcaggaca acggatccgg tgcgctgagc tttacgctgg gcgccaaaac cggcacgtac  2220
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gtgcagtacg aagccgaaga agcttcgctg tccggcaata cgacagcaac caaggcgacc  2520
gtgaatacga accacgcagg ctacacgggc agcggcttcg tggatggact gagtaatccg  2580
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gtcaaatcca cgtcgctggc gaacctgccg aactgggata cgtgggggac gcaggctgag  2760
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gctgcgaaga cgctcagcac gtatgtgaac gggacgaagc tggggcaaac ggccttcgcc  3120
agccctggcg gcaactggaa cgtgtggcag gacagcgtgc agaccgtcgc gctcgccgcc  3180
ggtacgaaca cgatcgcgtt caagtacgat gccggcgaca gcggcagcgg cagcgtcaat  3240
ctggaccgtc tgttgctctc tgccgcagcg ccaggcgtgc ccgtgtccga gcagaacctg  3300
ctcgataacg ggggctttga acgcgatccg tcgcagagca gcaactggac cgagtggcat  3360
ccggcttcgc aggcgattgc ttacggcatc gacagcggct ccgggatgaa tccgcctgaa  3420
tcgccatggg caggcgataa gcgcgcctat ttctatgcgg caggcccgta tcagcaaagc  3480
atccatcaaa cagtcagcgt gcctgtcaat aatgccaagt acaagttcga agcctgggta  3540
ttgctgaaga atacaacacc gacaacggcc cgggtggaga ttcaaaatta cggcggttcg  3600
ccgatcttca cgaacatcag taaagacggc gtctggaaat acatcagcgt cagcgatatt  3660
caggtcacga acggccaaat cgatattggc ttctatgtgg attcgcccgg aggcaccacg  3720
ctccacatcg acgatgtgcg ggtcaccaag caa                               3753
<210> 6
<211> 2787
<212> DNA
<213> Microorganism
<400> 6
gctcccctgg gcgtgcaacg cgcgcagttc cagtcggggt cgagctacct cgtcgtcgag  60
gtgctcgatg acgacctcgt ccacttcgag ctggccgggg gcggcaccgc ccccggcacg  120
ggctccccgc tgttcacgac gcctcaggtc gcgaagcacg actacgcggg acccgacgtg  180
ttcacccaga ccgggtctgt tctgcagacc gcggcgatgc gcatcgaggt cgatcccgcg  240
gatctgtgcg tgacggccac cgacatcacc cgcaccccga accttgtact gcacgaggcg  300
tgtcccgccg acctcggcca ggcgtggaag gggctgaaca tcacgaggtc ggcgatggag  360
aacgcctacg gtctcgggca gcagttcttc acgggcggca gcgcggacgg cgactgggtg  420
ggccgcaccc gcaccccggg tggcacctac ggcaacgcga tggtgttcga ccccgagaac  480
gggccggtcg gcaacacgca gatcccggtg ctcttcgcgg tcggcgatga caacgcgaac  540
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acggtgcgca tgtggggcga ccaggtgcgc tggtacctca tgagcggcga cgacctgccc  660
gaccttcgcc acgactacat ggagctgacg ggcaccccgc ccgtgccgcc gaagaaggcg  720
ttcgggctct gggtgtcgga gttcggctac gacaactgga gcgaggtcga caatacgatc  780
gcgggcctgc gctcggccga ctttccggtc gatggcgcga tgctcgacgt acagtggttc  840
gggggcgtca ccgccgactc ggacgacacc cgcatgggca ccctcgattg ggacacgtcg  900
aggtttcccg accctgcggg aaagatcgcc gacctcgccg aggacggcgt cggcatcatc  960
ccgatcgagg agtcgtacgt cggtcgcaac ctgccggagc acgcccggat ggcggcggac  1020
ggttacctcg tgcgctccgg ctgcgctacg tgcccgccgg tgtacctgac ggggaacccc  1080
tggtggggca agggcgggat gatcgactgg acgcagccgg aagccggcgc cgtctggcac  1140
gacgagcagc gccagcatct cgtcgacgag ggcgtactgg gccactggct cgatctcggc  1200
gaaccggaga tgtacgaccc gaacgactgg accgccggcg tcatccccgg caagcacgcg  1260
cacgccgact atcacaacgc gtacaacctg ctgtgggcgc agagcatcgc cgacgggtac  1320
gccgacaacg gcgtgcagaa gcgtcccttc atgctgacgc gcgccgcggc cgccggcatc  1380
cagcgtcatg gcgcgggcat gtggtcagcc gacatcgggt cgaccatgaa ggcgctcggg  1440
agccagcaga acgcgcagat gcacatgtcg atgtcgggga tcgactatta cggctccgac  1500
atcggcgggt tccggcggga gatggccgac ggcgacgtga acgagctcta cacccagtgg  1560
ttcgccgaca gcgcgtggtt cgacactccg ctccggccgc acaccgacaa tctctgcaac  1620
tgcctcgaga cgagccccga ctcgatcggc gacgtcgcga gcaaccgcga gaacctggtg  1680
cgccgctacg agctggctcc gtactactac tcgctcgcgc accgcgctca ccagttcggc  1740
gagccgctcg ctcccccgct cgtgtactac taccagaacg acgaccacgt tcgcgagatg  1800
gggcatcaga agatgctcgg gcgcgacctg ctgatcgcga tcgtcgccgg agagggcgag  1860
cgggaacgcg acgtgtacct tccggcgggc gagtggatcg acatccacac gaacgagcgc  1920
atccagagca cgggtcagtg gatcgacaac gtgccgctgt ggcgtgacgg cgtcttcacc  1980
ctgccggcgt acgcccgggc gggggcgatc atcccgaagg ccttcgtcga cgcctccacg  2040
aaggacatca ccggcaagcg cgaggatgcc gcggtgcgca acgagctgat cgcaaccgtt  2100
tacgccgacg acgtcgcgag cgacttcacc ctgtacgagg atgacggcgc gacgaccgca  2160
tacgccgacg gggctgtcag gaccacgcag atcagccaat cgctcacgaa cggcgtggcc  2220
acggtgacgg tgggagcggc atctggaacc tactccggtg cgccctccac ccgtcccacg  2280
gtcgtcgagc ttgtcactga cggcacgcag gcctcgaccg tctccctcgg cagcgttccg  2340
ctgacggagc acgcgaacaa ggcggcgttc gacgcggcga gcagcggctg gtacaacgcc  2400
ggcggggggc tcgttgtggc caaggcggcg agcagttcgg tgaacaccgc caagaccttc  2460
tcgttcacgc tcggtgagga gtcggtctgg gcgacgttct cctgcgagaa cgccacgacg  2520
accttcggtc agtcagtgta cgtcgtcgga aatgttccgc agctcggcaa ctggtcgccg  2580
gcggatgccg tgaagctcga gccgagcgcc taccccacct ggaccggggt ggtgcggaac  2640
ctgccgccgt cgagcacggt cgaatggaag tgcatcaaac gtcaggaggc cggcctgccg  2700
aacacggcgg atgcgtggga gcccggcggg aacaacatcc tctcgacgcc accttccggc  2760
tcggcgggga taaccaccgg cgccttc                                      2787
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 7
Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile
1                5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 8
Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys
1                5                  10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 9
Gln Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys
1                5                  10
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 10
Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val
1                5                  10                  15
Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys
20                  25                  30
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 11
Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn
1                5                  10                  15
Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe Glu Arg
20                  25
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 12
Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg
1                5                  10
<210> 13
<211> 33
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 13
Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly
1                5                  10                  15
Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 14
Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile
1                5                  10                  15
Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile
20
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 15
Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln
1                5                  10                  15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 16
Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn Gln Thr Glu
1                5                  10                  15
Phe
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 17
Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro
1                5                  10                  15
Val Val Asp Lys
20
<210> 18
<211> 5294
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (937)...(4785)
<400> 18
atctaccggt ttttgtgaag tttggcagta ttcttccgat gaatttgaac gcgcaatatc  60
aagtgggcgg gaccattggc aacagcttga cgagctacac gaatctcgcg ttccgcattt  120
atccgcttgg gacaacaacg tacgactgga atgatgatat tggcggttcg gtgaaaacca  180
taacttctac agagcaatat gggttgaata aagaaaccgt gactgttcca gcgattaatt  240
ctaccaagac attgcaagtg tttacgacta agccttcctc tgtaacggtg ggtggttctg  360
tgatgacaga gtacagtact ttaactgccc taacgggagc gtcgacaggc tggtactatg  420
atactgtaca gaaattcact tacgtcaagc ttggttcaag tgcatctgct caatccgttg  480
tgctaaatgg cgttaataag gtggaatatg aagcagaatt cggcgtgcaa agcggcgttt  540
caacgaacac gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc  600
ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg  660
ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag  720
tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta  780
gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac  840
ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc  900
cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg                            936
atg cgt cca cca aac aaa gaa att cca cgt att ctt gct ttt ttt aca    978
Met Arg Pro Pro Asn Lys Glu Ile Pro Arg Ile Leu Ala Phe Phe Thr
1                5                  10                  15
gcg ttt acg ttg ttt ggt tca acc ctt gcc ttg ctt cct gct ccg cct    1026
Ala Phe Thr Leu Phe Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro
20                  25                  30
gcg cat gcc tat gtc agc agc cta gga aat ctc att tct tcg agt gtc    1074
Ala His Ala Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val
35                  40                  45
acc gga gat acc ttg acg cta act gtt gat aac ggt gcg gag ccg agt    1122
Thr Gly Asp Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser
50                  55                  60
gat gac ctc ttg att gtt caa gcg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg    1170
Asp Asp Leu Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val
65                  70                  75                  80
gat tat cgt cca aat agc ata acg ccg agc gcg aag acg ccg atg ctg    1218
Asp Tyr Arg Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu
85                  90                  95
gat ccg aac aaa act tgg tca gct gta gga gct acg att aat acg aca    1266
Asp Pro Asn Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr
100                105                  110
gcc aat cca atg acc atc acg act tcc aat atg aag att gag att acc    1314
Ala Asn Pro Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr
115                120                  125
aag aat cca gta cga atg acg gtc aag aag gcg gac ggc act acg cta    1362
Lys Asn Pro Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu
130                135                  140
ttc tgg gaa cca tca ggc gga ggg gta ttc tca gac ggt gtg cgc ttc    1410
Phe Trp Glu Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe
145                150                  155                160
ctt cat gcc aca ggg gat aat atg tat ggc atc cgg agc ttc aat gct    1458
Leu His Ala Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala
165                170                  175
ttt gat agc ggg ggt gac ctg ctg cgg aat tcg tcc aat cat gcc gcc    1506
Phe Asp Ser Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala
180                185                  190
cat gcg ggt gaa cag gga gat tcc ggt ggt ccg ctt att tgg agt acg    1554
His Ala Gly Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr
195                200                  205
gca gga tat gga cta tta gtc gat agc gat ggc ggc tac ccc tat aca    1602
Ala Gly Tyr Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr
210                215                  220
gat agc aca acc ggt caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct    1650
Asp Ser Thr Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro
225                230                  235                240
gag gga cgt cgt tat gcg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg ctc    1698
Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu
245                250                  255
gga acc ccc aag gaa att atg acc gac gta ggg gaa atc aca ggg aaa    1746
Gly Thr Pro Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys
260                265                  270
ccg cct atg ctg cct aag tgg tcg ctt gga ttc atg aac ttt gag tgg    1794
Pro Pro Met Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp
275                280                  285
gat acg aat caa acg gag ttt acg aat aat gtg gat acg tat cgt gcc    1842
Asp Thr Asn Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala
290                295                  300
aaa aat atc ccc ata gat gct tac gcc ttc gac tat gac tgg aaa aag    1890
Lys Asn Ile Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys
305                310                  315                320
tac ggg gaa acc aac tat ggt gaa ttc gcg tgg aat acg act aat ttc    1938
Tyr Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe
325                330                  335
cct tct gcg tca acg act tct tta aag tca aca atg gat gct aaa ggc    1986
Pro Ser Ala Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly
340                345                  350
atc aaa atg atc gga att aca aaa ccc cgc atc gtt acg aag gat gct    2034
Ile Lys Met Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala
355                360                  365
tca gcg aat gtg acg acc caa ggg acg gac gcg aca aat ggc ggt tat    2082
Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr
370                375                  380
ttt tat cca ggc cat aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act    2130
Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr
385                390                  395                400
gtg cgt agt atc gat cct tac aat gct aac gaa cgt gct tgg ttc tgg    2178
Val Arg Ser Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp
405                410                  415
aat cat tcc aca gat gcg ctt aat aaa ggg atc gta ggt tgg tgg aat    2226
Asn His Ser Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn
420                425                  430
gac gag acg gat aaa gta tct tcg ggt gga gcg tta tat tgg ttt ggc    2274
Asp Glu Thr Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly
435                440                  445
aat ttc aca aca ggc cac atg tct cag acg atg tac gaa ggg ggg cgg    2322
Asn Phe Thr Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg
450                455                  460
gct tac acg agt gga gcg cag cgt gtt tgg caa acg gct aga acc ttc    2370
Ala Tyr Thr Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe
465                470                  475                480
tac cca ggt gcc cag cgg tat gcg act acg ctt tgg tct ggc gat att    2418
Tyr Pro Gly Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile
485                490                  495
ggc att caa tac aat aaa ggc gaa cgg atc aat tgg gct gcc ggg atg    2466
Gly Ile Gln Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met
500                505                  510
cag gag caa agg gca gtt atg cta tcc tcc gtg aac aat ggc cag gtg    2514
Gln Glu Gln Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val
515                520                  525
aaa tgg ggc atg gat acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc acg acg    2562
Lys Trp Gly Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr
530                535                  540
aac aat ccg aat ccc gat tta tac gct cgg tgg atg cag ttc agt gcc    2610
Asn Asn Pro Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala
545                550                  555                560
cta acg cct gtt ttc cga gtg cat ggg aac aac cat cag cag cgc cag    2658
Leu Thr Pro Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln
565                570                  575
cca tgg tac ttc gga tcg act gcg gag gag gcc tcc aaa gag gca att    2706
Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile
580                585                  590
cag ctg cgg tac tcc ctg atc cct tat atg tat gcc tat gag aga agt    2754
Gln Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser
595                600                  605
gct tac gag aat ggg aat ggg ctc gtt cgg cca ttg atg caa gcc tat    2802
Ala Tyr Glu Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr
610                615                  620
cca aca gat gcg gcc gtc aaa aat tac acg gat gct tgg atg ttt ggt    2850
Pro Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly
625                630                  635                640
gac tgg ctg ctg gct gca cct gtg gta gat aaa cag cag acg agt aag    2898
Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys
645                650                  655
gat atc tat tta ccg tct ggg tca tgg att gac tat gcg cga ggc aat    2946
Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn
660                665                  670
gca ata act ggc ggt caa acc atc cga tat tcg gtt aat ccg gac acg    2994
Ala Ile Thr Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr
675                680                  685
ttg aca gac atg cct ctc ttt att aaa aaa ggt gcc att att cca aca    3042
Leu Thr Asp Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr
690                695                  700
cag aaa gtg cag gat tac gta ggg cag gct tcc gtc act tcc gtt gat    3090
Gln Lys Val Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp
705                710                  715                720
gtg gat gtg ttt ccg gat acg acg cag tcg agt ttc acg tac tac gat    3138
Val Asp Val Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp
725                730                  735
gat gat ggc gcc agt tat aac tat gag agc ggc act tat ttt aag caa    3186
Asp Asp Gly Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln
740                745                  750
aat atg act gct cag gat aat ggg tca ggc tcg tta agt ttt act tta    3234
Asn Met Thr Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu
755                760                  765
gga gca aag agt ggc agt tac acg ccg gct ctc caa tcc tat atc gtt    3282
Gly Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val
770                775                  780
aag ctg cac ggt tct gct gga act tct gtt acg aat aac agc gca gct    3330
Lys Leu His Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala
785                790                  795                800
atg aca tct tat gca agc ttg gaa gca tta aaa gct gct gct ggg gaa    3378
Met Thr Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu
805                810                  815
ggc tgg gcg act ggg aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa    3428
Gly Trp Ala Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys
820                825                  830
gtg acg gca ggt aca gct tct tct aaa tct att gct gtt aca ggt gtt    3474
Val Thr Ala Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val
835                840                  845
gct gcc gtg agc gca act act tcg caa tac gaa gct gag gat gca tcg    3522
Ala Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser
850                855                  860
ctt tct ggc aat tcg gtt gct gca aag gcg tcc ata aac acg aat cat    3570
Leu Ser Gly Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His
865                870                  875                880
acc gga tat acg gga act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc    3618
Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly
885                890                  895
gct ggt gtc acc ttc tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat    3666
Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn
900                905                  910
gtc tcc ttg cgt tat gcg aat gct tca ggc acg gct aag tca gtc agt    3714
Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser
915                920                  925
att ttt gtt aat gga aaa aga gtg aag tcc acc tcg ctc gct aat ctc    3762
Ile Phe Val Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu
930                935                  940
gca aat tgg gac act tgg tct aca caa tct gag aca ctg ccg ttg acg    3810
Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr
945                950                  955                960
gca ggt gtg aat gtt gtg acc tat aaa tat tac tcc gat gcg gga gat    3858
Ala Gly Val Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp
965                970                  975
aca ggc aat gtt aac atc gac aac atc acg gta cct ttt gcg cca att    3906
Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile
980                985                  990
atc ggt aag tat gaa gca gag agt gct gag ctt tct ggt ggc agc tca    3954
Ile Gly Lys Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser
995                1000                1005
ttg aac acg aac cat tgg tac tac agt ggt acg gct ttt gta gac ggt    4002
Leu Asn Thr Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly
1010                1015                1020
ttg agt gct gta ggc gcg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct agc    4050
Leu Ser Ala Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser
1025                1030                1035                1040
gca gga agt tat cag gta gcg ctg cga tat gcg aat ggc agt gca gcg    4098
Ala Gly Ser Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala
1045                1050                1055
acg aaa acg ttg agt act tat atc aat gga gcc aag ctg ggg caa acc    4146
Thr Lys Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr
1060                1065                1070
agt ttt acg agt cct ggt acg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg    4194
Ser Phe Thr Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val
1075                1080                1085
caa acg gtg acg tta aat gca ggg gca aac acg att gcg ttt aaa tac    4242
Gln Thr Val Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr
1090                1095                1100
gac gcc gct gac agc ggg aac atc aac gta gat cgt ctg ctt ctt tca    4290
Asp Ala Ala Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser
1105                1110                1115                1120
act tcg gca gcg gga acg ccg gtt tct gag cag aac ctg cta gac aat    4338
Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn
1125                1130                1135
ccc ggt ttc gag cgt gac acg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg    4386
Pro Gly Phe Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp
1140                1145                1150
cat cca ggc acg caa gct gtt gct ttt ggc gtt gat agc ggc tca acc    4434
His Pro Gly Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr
1155                1160                1165
acc aat ccg ccg gaa tcc ccg tgg tcg ggt gat aag cgt gcc tac ttc    4482
Thr Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe
1170                1175                1180
ttt gca gca ggt gcc tat caa caa agc atc cat caa acc att agt gtt    4530
Phe Ala Ala Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val
1185                1190                1195                1200
cct gtt aat aat gta aaa tac aaa ttt gaa gcc tgg gtc cgc atg aag    4578
Pro Val Asn Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys
1205                1210                1215
aat acg acg ccg acg acg gca aga gcc gaa att caa aac tat ggc gga    4626
Asn Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly
1220                1225                1230
tca gcc att tat gcg aac ata agt aac agc ggt gtt tgg aaa tat atc    4674
Ser Ala Ile Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile
1235                1240                1245
agc gta agt gat att atg gtg acc aat ggt cag ata gat gtt gga ttt    4722
Ser Val Ser Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe
1250                1255                1260
tac gtg gat tca cct ggt gga act acg ctt cac att gat gat gtg cgc    4770
Tyr Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg
1265                1270                1275                1280
gta acc aaa caa taa                                                4785
Val Thr Lys Gln
1284
acaaacaacc agctctcccg ttaatgggag ggctggttgt ttgttatgat aatccatcta  4845
tttagagtgg attaaacgtt ttgaagtgct tgctgaactt cttgcacaat ggataacgcc  4905
gcggtgcggg cacttgagaa agcacgttct gcaagctctc ccttacctgt acagccgtct  4965
ccgcagaagt agaaaggaac gttttccacg cgtatcggca gcagattatt ggaagcaatg  5025
tttttcacgc tggaaaccat cgctttcttg gaaacccgtt tcacggctgt gacatcgcgc  5085
cagcctggat aatgtttatc aaataaggct tccatttgga ggttcttctc ttccaggtac  5145
gctttgcgct gctcctcgtt atcaaagcgg tcgcttaagt atgcgatacc ttgcagcagc  5265
tgcccgcctt ctggtactag tgtgtgatc                                    5294
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 19
His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu
1                5
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 20
Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly
1                5                  10                  15
Ala Ala Lys
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 21
Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly
1                5                  10                  15
Gly Tyr Phe Tyr
20
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 22
Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr Gln Ile Ala Leu Arg
1                5                  10                  15
Try Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys
20                  25
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 23
Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln
1                5                  10                  15
Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala
20                  25
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 24
Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp
1                5                  10
<210> 25
<211> 4991
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (466)...(4326)
<400> 25
ggtaccggct ttgtcgacgg cttcgatgcg gcaggcgatg cagtgacctt cgacgtatcc  60
gtcaaagcgg ccggcacgta tgcgctcaag gtccggtacg cttccgctgg tggcaacgct  120
tcacgcgcta tctatgtcaa caacgccaag gtgaccgatc tggcgcttcc ggcaacggcc  180
aactgggaca cctgggggac ggcaaccgtc aacgtagcct taaacgccgg ctacaactcg  240
atcaaggtca gctacgacaa caccaatacg ctcggcatta atctcgataa cattgcgatc  300
gtggagcatt gacagcagga atcttcgcga ggaatgagtt agcgaagagt tcatgcaggc  360
agaggggtta cccataattg taaagcccgg cgcagccagg caccaagtat gcccgggagg  420
gccgccggcc ctccctttat ttcaatgatg aaaggcggca tcgat atg ggt cta tgg  477
Met Gly Leu Trp
1
aac aaa cga gtc act cgc atc ctc tcc gta ctc gca gca agc gcg ctg    525
Asn Lys Arg Val Thr Arg Ile Leu Ser Val Leu Ala Ala Ser Ala Leu
5                    10                  15                  20
atc ggc tct acc gta cct tct cta gcg cca cct ccc gct caa gcc cat    573
Ile Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Ala Pro Pro Pro Ala Gln Ala His
25                  30                  35
gtg agc gcg ctg ggc aac ctg ctt tcc tcg gcg gtg acc ggg gat acg    621
Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp Thr
40                  45                  50
ctc acg ctg acg atc gat aac ggc gcg gaa ccg aat gac gat att cta    669
Leu Thr Leu Thr Ile Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp Ile Leu
55                  60                  65
gtt ctg caa gca gtc cag aac ggt att ctg aag gtg gac tac cgg ccg    717
Val Leu Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg Pro
70                  75                  80
aac ggt gta gct cca agc gcg gat acg ccg atg ctg gat ccc aat aaa    765
Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn Lys
85                  90                  95                  100
acc tgg ccg tcc ata ggc gcc gtt atc aat aca gcc tct aat ccg atg    813
Thr Trp Pro Ser Ile Gly Ala Val Ile Asn Thr Ala Ser Asn Pro Met
105                110                  115
acg atc aca acg ccg gcg atg aag att gag att gcc aaa aat ccg gtg    861
Thr Ile Thr Thr Pro Ala Met Lys Ile Glu Ile Ala Lys Asn Pro Val
120                125                  130
cgc ctg acc gtg aaa aaa ccg gac ggc acc gct ctg tta tgg gaa ccc    909
Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu Pro
135                140                  145
ccg acc ggc ggc gtc ttc tcg gac ggc gtc cgt ttc ttg cac ggg acg    957
Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly Thr
150                155                  160
ggc gac aat atg tac ggc atc cgc agc ttc aat gct ttt gac agc ggc    1005
Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser Gly
165                170                  175                180
ggg gat ctg ctg cgc aac agc tcc acc caa gcc gcc cgt gca ggc gac    1053
Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gly Asp
185                190                  195
cag ggc aac tcc ggc ggc ccg ctg atc tgg agc aca gcc ggg tac ggg    1101
Gln Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr Gly
200                205                  210
gtg ctc gtt gac agc gac ggt ggg tat ccg ttc acg gac gag gct acc    1149
Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala Thr
215                220                  225
ggc aag ctg gag ttc tat tac ggc ggc acg cct ccg gaa ggc cgg cgc    1197
Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg Arg
230                235                  240
tat acg aag cag gat gtg gag tac tac atc atg ctc ggc acg ccg aaa    1245
Tyr Thr Lys Gln Asp Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro Lys
245                250                  255                260
gag atc atg tcc ggc gtc ggg gaa att acg ggc aaa ccg ccg atg ctg    1293
Glu Ile Met Ser Gly Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met Leu
265                270                  275
ccc aag tgg tcc ctg ggc ttt atg aac ttc gag tgg gat ctg aat gaa    1341
Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn Glu
280                285                  290
gct gag ctc aag aac cat gtg gat acg tac cgg gcc aaa aat att ccg    1389
Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile Pro
295                300                  305
atc gac ggc tat gcg atc gat ttc gat tgg aag aag tac ggc gag aat    1437
Ile Asp Gly Tyr Ala Ile Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu Asn
310                315                  320
aat tac ggc gaa ttc gct tgg aat acg gcc aat ttc cct tcc gcc gcc    1485
Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala Ala
325                330                  335                340
acg acg gcg ctg aag tcg cag atg gac gcc aag ggc att aaa atg atc    1533
Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gln Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met Ile
345                350                  355
ggc ata acc aag cct cgc atc gcg acg aag gat ttt tcg aac aat cct    1581
Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn Pro
360                365                  370
acc gtg cag gga acg gac gcg gcg agc ggc ggt tat ttt tat ccg gga    1629
Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly
375                380                  385
cat agc gaa tac aag gac tac ttc atc ccg gtc ttt gtg cgc agc atc    1677
His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Ile Pro Val Phe Val Arg Ser Ile
390                395                  400
gac cct tat aac cct gct gca cgc tcc tgg ttc tgg aac cac tcc aag    1725
Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser Lys
405                410                  415                420
gat gcg ttc gat aaa ggc atc gta ggc tgg tgg aac gac gag acg gat    1773
Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr Asp
425                430                  435
gcg gta tcg tcg gga ggg gcc tcc tac tgg ttc ggc aat ttt acg acc    1821
Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr Thr
440                445                  450
ggc cat atg tcc cag gcg ctt tac gag gga cag cgg gca tat acg tcg    1869
Gly His Met Ser Gln Ala Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Ala Tyr Thr Ser
455                460                  465
aac gcc cag cgc gtc tgg cag aca gcg cgc acg ttc tat ccc ggg gcg    1917
Asn Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly Ala
470                475                  480
cag cgt tat gcg acg acg ctc tgg tcg gga gac atc ggg att cag tat    1965
Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln Tyr
485                490                  495                500
acc aag ggg gaa aga atc aac tgg gct gcc ggc atg cag gag cag cgg    2013
Thr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln Arg
505                510                  515
gcg gtg atg ctt tct tcg atc aac aac ggc cag gtc aaa tgg gga atg    2061
Ala Val Met Leu Ser Ser Ile Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly Met
520                525                  530
gac aca ggc ggc ttc aac cag cag gac ggc acg acg aac aat ccg aat    2109
Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro Asn
535                540                  545
ccg gac ctg tac gcc aga tgg atg cag ttc agc gcg ctg act ccg gtg    2157
Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro Val
550                555                  560
ttc cgc gtg cat ggc aac aat cac cag cag cgc cag cct tgg tat tat    2205
Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr Tyr
565                570                  575                580
ggc tcg aca gcc gag gag gca tcc aag gaa gcg ctc cag ctc cgt tac    2253
Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gln Leu Arg Tyr
585                590                  595
tcc ctg att cct tat atg tat gct tac gaa aga agc gcc tac gag aac    2301
Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu Asn
600                605                  610
ggt aac gga ctt gtc cgg ccg ctg atg cag gaa tac cct gcc gat gcc    2349
Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Glu Tyr Pro Ala Asp Ala
615                620                  625
aac gcc aaa aac tat ctc gat gcc tgg atg ttc ggc gat tgg ctg ctg    2397
Asn Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu
630                635                  640
gcg gcg cct gtg gtc gag aag cag cag acc tcc aag gaa atc tat ctc    2445
Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gln Gln Thr Ser Lys Glu Ile Tyr Leu
645                650                  655                660
cct gca ggc act tgg att gac tac aac cgg ggc acg gtg ctc acc ggc    2493
Pro Ala Gly Thr Trp Ile Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr Gly
665                670                  675
ggc cag aag atc agc tac gcc gtc aat ccc gac acg ctg acg gat att    2541
Gly Gln Lys Ile Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp Ile
680                685                  690
ccg ctc ttc att aag aag ggc gcg att atc cct tcg cag aag gtg cag    2589
Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Ser Gln Lys Val Gln
695                700                  705
gac tac gtg ggc cag gct ccc gtc caa acg gtg gat gtg gat gta ttc    2637
Asp Tyr Val Gly Gln Ala Pro Val Gln Thr Val Asp Val Asp Val Phe
710                715                  720
ccg aat acg gca caa tcg agc ttt acc tat tat gac gat gac ggc agc    2685
Pro Asn Thr Ala Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly Ser
725                730                  735                740
agc tac aat tat gaa agc gga gct tac ttc aag caa ttg atg acg gct    2733
Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gln Leu Met Thr Ala
745                750                  755
cag gac aac gga tcc ggt gcg ctg agc ttt acg ctg ggc gcc aaa acc    2781
Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys Thr
760                765                  770
ggc acg tac agc ccc gca ctg caa tcc tat atc gtc aag ctt cac ggg    2829
Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His Gly
775                780                  785
gcc gca ggc gcg tcg gtg aca agc aat ggg gcg gcg ctg gcc tcc tat    2877
Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Tyr
790                795                  800
gcc agc ctg caa gcg ctg aaa gcc tca gcc agt gaa ggc tgg gcc aag    2925
Ala Ser Leu Gln Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala Lys
805                810                  815                820
ggc aag gac atc tac ggc gat gtc acg tat gtc aag cta tcc gcg ggg    2973
Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala Gly
825                830                  835
gca gcg gcg gcc aag gcg att gcc gtc acc ggc aac agc ccg gtc agc    3021
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ile Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val Ser
840                845                  850
gtg gcg gat gtg cag tac gaa gcc gaa gaa gct tcg ctg tcc ggc aat    3069
Val Ala Asp Val Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly Asn
855                860                  865
acg aca gca acc aag gcg acc gtg aat acg aac cac gca ggc tac acg    3117
Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr
870                875                  880
ggc agc ggc ttc gtg gat gga ctg agt aat ccg gga gcg gcg gtt acg    3165
Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val Thr
885                890                  895                900
ttc tat ccg aag gtg aaa acg ggc gga gac tac aat gtc tcg ctg cgc    3213
Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg
905                910                  915
tac gct aat tcg acg gga gcg gca aag agc gtc agc atc ttc gtt aac    3261
Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val Asn
920                925                  930
ggc aag cgc gtc aaa tcc acg tcg ctg gcg aac ctg ccg aac tgg gat    3309
Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp Asp
935                940                  945
acg tgg ggg acg cag gct gag aca ctg ccg ctg acg gcg ggg acg aac    3357
Thr Trp Gly Thr Gln Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr Asn
950                955                  960
gtt gtc acc tac aag ttc tac tcg gat gcc gga gat acg ggc tcg gtt    3405
Val Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser Val
965                970                  975                980
aac ctg gac aac atc acg gtg ccc ttc gct ccg gcc atc ggc aaa tac    3453
Asn Leu Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala Ile Gly Lys Tyr
985                990                  995
gag gcg gag agc gcc gag ctg agc ggc ggc agc acg gtc aac cag aat    3501
Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln Asn
1000                1005                1010
cat tgg ttc tac agc ggc acg gca ttt gta gat ggc tta acc gca ccg    3549
His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala Pro
1015                1020                1025
ggc gcc caa gtc aaa tat acc gtg aac gcc ccg gcc gca ggc agc tac    3597
Gly Ala Gln Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr
1030                1035                1040
cag atc gcg ctt cgc tat gcg aac ggc acg ggt gct gcg aag acg ctc    3645
Gln Ile Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr Leu
1045                1050                1055                1060
agc acg tat gtg aac ggg acg aag ctg ggg caa acg gcc ttc gcc agc    3693
Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Ala Phe Ala Ser
1065                1070                1075
cct ggc ggc aac tgg aac gtg tgg cag gac agc gtg cag acc gtc gcg    3741
Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Ser Val Gln Thr Val Ala
1080                1085                1090
ctc gcc gcc ggt acg aac acg atc gcg ttc aag tac gat gcc ggc gac    3789
Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly Asp
1095                1100                1105
agc ggc agc ggc agc gtc aat ctg gac cgt ctg ttg ctc tct gcc gca    3837
Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala
1110                1115                1120
gcg cca ggc gtg ccc gtg tcc gag cag aac ctg ctc gat aac ggg ggc    3885
Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Gly Gly
1125                1130                1135                1140
ttt gaa cgc gat ccg tcg cag agc agc aac tgg acc gag tgg cat ccg    3933
Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gln Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His Pro
1145                1150                1155
gct tcg cag gcg att gct tac ggc atc gac agc ggc tcc ggg atg aat    3981
Ala Ser Gln Ala Ile Ala Tyr Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Met Asn
1160                1165                1170
ccg cct gaa tcg cca tgg gca ggc gat aag cgc gcc tat ttc tat gcg    4029
Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr Ala
1175                1180                1185
gca ggc ccg tat cag caa agc atc cat caa aca gtc agc gtg cct gtc    4077
Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Val Ser Val Pro Val
1190                1195                1200
aat aat gcc aag tac aag ttc gaa gcc tgg gta ttg ctg aag aat aca    4125
Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn Thr
1205                1210                1215                1220
aca ccg aca acg gcc cgg gtg gag att caa aat tac ggc ggt tcg ccg    4173
Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser Pro
1225                1230                1235
atc ttc acg aac atc agt aaa gac ggc gtc tgg aaa tac atc agc gtc    4221
Ile Phe Thr Asn Ile Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser Val
1240                1245                1250
agc gat att cag gtc acg aac ggc caa atc gat att ggc ttc tat gtg    4269
Ser Asp Ile Gln Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Ile Gly Phe Tyr Val
1255                1260                1265
gat tcg ccc gga ggc acc acg ctc cac atc gac gat gtg cgg gtc acc    4317
Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val Thr
1270                1275                1280
aag caa taa                                                        4326
Lys Gln
1285
tccggtaaca ctagccctcc cccgccttgc ggcaggaggg ctttttgctt ctgtaggttg  4386
tgaaggcgat accgagcgat gagaattcga ttctgaacag ctcgccctgt gtcctgctaa  4446
attcctctcc tccctggcag ggaagccgct tccacatgtc gaattgggga ggtactatga  4506
gaagttagta ctaccgtctg caacggcttt cgctacaatg gaaccaataa gacatcgcga  4566
aggtttggga ggattcggca tgcagagacg cgaggttaaa gtaataggca cgggcaaata  4626
tttgcccgcc catcgagtga ctgcgcagga gatggaccgg cggctaggag tgcccgacgg  4686
atgggtgctg aagaagtcgg atgtggccgt tcgttatttc gccggtacgg agaaggcctc  4746
ggagatgggg gcgagagcgg ctgaggcggc gctggcttcc gcaggcctgg ccttcacgga  4806
tatcgactgc ctgatgtgcg ccagcgggac gatggaacag ccgattccat gcacggcggc  4866
gctcattcag aaggcgatag gccaaggaca ctccggagtg ccggcactgg atttgaatac  4926
aacctgtctg agctttgtgg cggctctgga catggtttct tatatggtga cggcgggaag  4986
gtacc                                                              4991
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 26
Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly
1                5                  10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 27
Gln Glu Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg
1                5                  10
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 28
Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile Pro Ile Glu Glu
1                5                  10                  15
Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met Ala
20                  25                  30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 29
Gly Gly Met Ile Asp Trp Thr Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His
1                5                  10                  15
Asp Glu Gln Arg Gln His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly
20                  25                  30
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 30
His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr Gly Ser Val Leu
1                5                  10                  15
Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro
20                  25
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> Microorganism
<400> 31
Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu
1                5                  10                  15
Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu
20                  25
<210> 32
<211> 5811
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (1655)...(4552)
<400> 32
ggtacctcgt cgaggagctc ggtgtcgacg gcttcaagac cgacgggagc gaggcgctct  60
tcgggcgtga cctgatcgtc agcgacgggc gccgcggtga cgagatgcac aacgcctacc  120
cgaacgagta cacctccgcc tacaacgact tcgtgcagga gacgacgggc gccgacggca  180
cgatcttcag ccgggcgggc acctccggcg gccagagcga atccatcttc tgggccgggg  240
accaggcgtc gacgttcggc gctttccagg aggccgtccg ggccgggcag agcgcgggcc  300
agtcgggagt gccgttctgg gcctgggacc tcggcggctt caccgggtcg ttcccaagcg  360
cggagctgta tctgcgctcg accgctcagg cggtgttctc gccgatcatg cagtaccact  420
cggagaaggc cgaccccagt ccgtccgagg cgcgcacgcc ctggaacgtg caggcgcgca  480
ccgggaacac cactgtcgtc cccaccttcg cccgttacgc gaacgtacgg atgaacctcg  540
tgccctatct gtacacggag gcggacgaca gcgcgacgac gggtgtgccg atgatgcgcg  600
cgatgagcct cgcgttcccc gacgacccgg atgccgcgca gtacgaccag cagtacatgt  660
tcgggtctca gctgctggtc gcaccgatta cgaaccaggg ccagaccgtg aaagacgtct  720
acctgcccgc gggcgagtgg tacgacttct ggaacggcgg acgcgcgagc ggcgagggcg  780
tgaagatgta cgacgccgga cccgacggca tccccgtata cgctcgcgcc ggagcggtca  840
tcccgctcaa cctcaacgac gcgtatgagg tgggcggcac gatcggcaac gacgtggaga  900
gctacgacaa ccttgtgttc cgcgtttacc cctccggtga gagcagctac gagtacttcg  960
aagaccaagc gaacgcgcac cgccggatcg atgtctcggc cgaccgcgca gcgcgcacgg  1020
tcgaggtgtc tgctcccgcg ctcacgaccg cgagcacctt ccaggtgtcg ggcaccaagc  1080
ccgacaccgt gaccgtcgcg ggctcggcac tgcctgaggt caacagcgtg agcgcgctgg  1140
ccgcatccac cgaggcctgg tactgggatg cgaagcagca gctgacgtac gtgaaggtcg  1200
gtgcgagcac cggcgagcgc acgatcctcc tgctgggcgt cgacaaggcc gggtacgagg  1260
ccgagttcgc gggtcatacg gccgtctcga cgaacgccga ccacccgggc tacaccgggc  1320
tcggcttcgt cgacggcttc gcgaacgcag gagacgcggt ggagttcgac gtgtgggccg  1380
aggagaacgg cgcgcaccag ctccgcttcc gctacggaaa cggagcggcg acccccgcca  1440
cccgcacgat ccgggtcgac ggagcgcctc tgggaacgct gtcgcttccg cccaccgggt  1500
cgtggagttc gtggggcacg gcctcgatcg acgtgaccct cccacccgga cgccacgccg  1560
tacggatcga gtacgccgga ggcgattccg gcggcgtcaa cctcgacaac ctcgtcctcg  1620
cgcgctgagc gcacacggga aagggagaag aacc atg cct gct ctt ccg tgg cgc  1675
Met Pro Ala Leu Pro Trp Arg
1                5
cgc acg acg gcg ctc gcg ctc acc acg gcg gtg acg gcc gcg acc ctg    1723
Arg Thr Thr Ala Leu Ala Leu Thr Thr Ala Val Thr Ala Ala Thr Leu
10                  15                  20
gtc gcc gtc ggg gtg aac gac gcc ggt cag gcg gcg gct gct ccc ctg    1771
Val Ala Val Gly Val Asn Asp Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Pro Leu
25                  30                  35
ggc gtg caa cgc gcg cag ttc cag tcg ggg tcg agc tac ctc gtc gtc    1819
Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly Ser Ser Tyr Leu Val Val
40                  45                  50                  55
gag gtg ctc gat gac gac ctc gtc cac ttc gag ctg gcc ggg ggc ggc    1867
Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala Gly Gly Gly
60                  65                  70
acc gcc ccc ggc acg ggc tcc ccg ctg ttc acg acg cct cag gtc gcg    1915
Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro Gln Val Ala
75                  80                  85
aag cac gac tac gcg gga ccc gac gtg ttc acc cag acc ggg tct gtt    1963
Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr Gly Ser Val
90                  95                  100
ctg cag acc gcg gcg atg cgc atc gag gtc gat ccc gcg gat ctg tgc    2011
Leu Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro Ala Asp Leu Cys
105                110                  115
gtg acg gcc acc gac atc acc cgc acc ccg aac ctt gta ctg cac gag    2059
Val Thr Ala Thr Asp Ile Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val Leu His Glu
120                125                  130                135
gcg tgt ccc gcc gac ctc ggc cag gcg tgg aag ggg ctg aac atc acg    2107
Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gln Ala Trp Lys Gly Leu Asn Ile Thr
140                145                  150
agg tcg gcg atg gag aac gcc tac ggt ctc ggg cag cag ttc ttc acg    2155
Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gln Gln Phe Phe Thr
155                160                  165
ggc ggc agc gcg gac ggc gac tgg gtg ggc cgc acc cgc acc ccg ggt    2203
Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg Thr Pro Gly
170                175                  180
ggc acc tac ggc aac gcg atg gtg ttc gac ccc gag aac ggg ccg gtc    2251
Gly Thr Tyr Gly Asn Ala Met Val Phe Asp Pro Glu Asn Gly Pro Val
185                190                  195
ggc aac acg cag atc ccg gtg ctc ttc gcg gtc ggc gat gac aac gcg    2299
Gly Asn Thr Gln Ile Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Asp Asp Asn Ala
200                205                  210                215
aac tac ggg ctg ttc gtc gat cag ctg tac aag cag gaa tgg aac ctc    2347
Asn Tyr Gly Leu Phe Val Asp Gln Leu Tyr Lys Gln Glu Trp Asn Leu
220                225                  230
acc ggc gac ccg tgg acg gtg cgc atg tgg ggc gac cag gtg cgc tgg    2395
Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg Met Trp Gly Asp Gln Val Arg Trp
235                240                  245
tac ctc atg agc ggc gac gac ctg ccc gac ctt cgc cac gac tac atg    2443
Tyr Leu Met Ser Gly Asp Asp Leu Pro Asp Leu Arg His Asp Tyr Met
250                255                  260
gag ctg acg ggc acc ccg ccc gtg ccg ccg aag aag gcg ttc ggg ctc    2491
Glu Leu Thr Gly Thr Pro Pro Val Pro Pro Lys Lys Ala Phe Gly Leu
265                270                  275
tgg gtg tcg gag ttc ggc tac gac aac tgg agc gag gtc gac aat acg    2539
Trp Val Ser Glu Phe Gly Tyr Asp Asn Trp Ser Glu Val Asp Asn Thr
280                285                  290                295
atc gcg ggc ctg cgc tcg gcc gac ttt ccg gtc gat ggc gcg atg ctc    2587
Ile Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Pro Val Asp Gly Ala Met Leu
300                305                  310
gac gta cag tgg ttc ggg ggc gtc acc gcc gac tcg gac gac acc cgc    2635
Asp Val Gln Trp Phe Gly Gly Val Thr Ala Asp Ser Asp Asp Thr Arg
315                320                  325
atg ggc acc ctc gat tgg gac acg tcg agg ttt ccc gac cct gcg gga    2683
Met Gly Thr Leu Asp Trp Asp Thr Ser Arg Phe Pro Asp Pro Ala Gly
330                335                  340
aag atc gcc gac ctc gcc gag gac ggc gtc ggc atc atc ccg atc gag    2731
Lys Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile Pro Ile Glu
345                350                  355
gag tcg tac gtc ggt cgc aac ctg ccg gag cac gcc cgg atg gcg gcg    2779
Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met Ala Ala
360                365                  370                375
gac ggt tac ctc gtg cgc tcc ggc tgc gct acg tgc ccg ccg gtg tac    2827
Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro Pro Val Tyr
380                385                  390
ctg acg ggg aac ccc tgg tgg ggc aag ggc ggg atg atc gac tgg acg    2875
Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met Ile Asp Trp Thr
395                400                  405
cag ccg gaa gcc ggc gcc gtc tgg cac gac gag cag cgc cag cat ctc    2923
Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gln Arg Gln His Leu
410                415                  420
gtc gac gag ggc gta ctg ggc cac tgg ctc gat ctc ggc gaa ccg gag    2971
Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly Glu Pro Glu
425                430                  435
atg tac gac ccg aac gac tgg acc gcc ggc gtc atc ccc ggc aag cac    3019
Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val Ile Pro Gly Lys His
440                445                  450                455
gcg cac gcc gac tat cac aac gcg tac aac ctg ctg tgg gcg cag agc    3067
Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp Ala Gln Ser
460                465                  470
atc gcc gac ggg tac gcc gac aac ggc gtg cag aag cgt ccc ttc atg    3115
Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gln Lys Arg Pro Phe Met
475                480                  485
ctg acg cgc gcc gcg gcc gcc ggc atc cag cgt cat ggc gcg ggc atg    3163
Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg His Gly Ala Gly Met
490                495                  500
tgg tca gcc gac atc ggg tcg acc atg aag gcg ctc ggg agc cag cag    3211
Trp Ser Ala Asp Ile Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly Ser Gln Gln
505                510                  515
aac gcg cag atg cac atg tcg atg tcg ggg atc gac tat tac ggc tcc    3259
Asn Ala Gln Met His Met Ser Met Ser Gly Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser
520                525                  530                535
gac atc ggc ggg ttc cgg cgg gag atg gcc gac ggc gac gtg aac gag    3307
Asp Ile Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp Val Asn Glu
540                545                  550
ctc tac acc cag tgg ttc gcc gac agc gcg tgg ttc gac act ccg ctc    3355
Leu Tyr Thr Gln Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp Thr Pro Leu
555                560                  565
cgg ccg cac acc gac aat ctc tgc aac tgc ctc gag acg agc ccc gac    3403
Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr Ser Pro Asp
570                575                  580
tcg atc ggc gac gtc gcg agc aac cgc gag aac ctg gtg cgc cgc tac    3451
Ser Ile Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Val Arg Arg Tyr
585                590                  595
gag ctg gct ccg tac tac tac tcg ctc gcg cac cgc gct cac cag ttc    3499
Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala His Gln Phe
600                605                  610                615
ggc gag ccg ctc gct ccc ccg ctc gtg tac tac tac cag aac gac gac    3547
Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Val Tyr Tyr Tyr Gln Asn Asp Asp
620                625                  630
cac gtt cgc gag atg ggg cat cag aag atg ctc ggg cgc gac ctg ctg    3595
His Val Arg Glu Met Gly His Gln Lys Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu
635                640                  645
atc gcg atc gtc gcc gga gag ggc gag cgg gaa cgc gac gtg tac ctt    3643
Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu
650                655                  660
ccg gcg ggc gag tgg atc gac atc cac acg aac gag cgc atc cag agc    3691
Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asp Ile His Thr Asn Glu Arg Ile Gln Ser
665                670                  675
acg ggt cag tgg atc gac aac gtg ccg ctg tgg cgt gac ggc gtc ttc    3739
Thr Gly Gln Trp Ile Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp Gly Val Phe
680                685                  690                695
acc ctg ccg gcg tac gcc cgg gcg ggg gcg atc atc ccg aag gcc ttc    3787
Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala Ile Ile Pro Lys Ala Phe
700                705                  710
gtc gac gcc tcc acg aag gac atc acc ggc aag cgc gag gat gcc gcg    3835
Val Asp Ala Ser Thr Lys Asp Ile Thr Gly Lys Arg Glu Asp Ala Ala
715                720                  725
gtg cgc aac gag ctg atc gca acc gtt tac gcc gac gac gtc gcg agc    3883
Val Arg Asn Glu Leu Ile Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp Val Ala Ser
730                735                  740
gac ttc acc ctg tac gag gat gac ggc gcg acg acc gca tac gcc gac    3931
Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala Tyr Ala Asp
745                750                  755
ggg gct gtc agg acc acg cag atc agc caa tcg ctc acg aac ggc gtg    3979
Gly Ala Val Arg Thr Thr Gln Ile Ser Gln Ser Leu Thr Asn Gly Val
760                765                  770                775
gcc acg gtg acg gtg gga gcg gca tct gga acc tac tcc ggt gcg ccc    4027
Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ala Pro
780                785                  790
tcc acc cgt ccc acg gtc gtc gag ctt gtc act gac ggc acg cag gcc    4075
Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly Thr Gln Ala
795                800                  805
tcg acc gtc tcc ctc ggc agc gtt ccg ctg acg gag cac gcg aac aag    4123
Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Val Pro Leu Thr Glu His Ala Asn Lys
810                815                  820
gcg gcg ttc gac gcg gcg agc agc ggc tgg tac aac gcc ggc ggg ggg    4171
Ala Ala Phe Asp Ala Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala Gly Gly Gly
825                830                  835
ctc gtt gtg gcc aag gcg gcg agc agt tcg gtg aac acc gcc aag acc    4219
Leu Val Val Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr Ala Lys Thr
840                845                  850                855
ttc tcg ttc acg ctc ggt gag gag tcg gtc tgg gcg acg ttc tcc tgc    4267
Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr Phe Ser Cys
860                865                  870
gag aac gcc acg acg acc ttc ggt cag tca gtg tac gtc gtc gga aat    4315
Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gln Ser Val Tyr Val Val Gly Asn
875                880                  885
gtt ccg cag ctc ggc aac tgg tcg ccg gcg gat gcc gtg aag ctc gag    4363
Val Pro Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val Lys Leu Glu
890                895                  900
ccg agc gcc tac ccc acc tgg acc ggg gtg gtg cgg aac ctg ccg ccg    4411
Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Val Arg Asn Leu Pro Pro
905                910                  915
tcg agc acg gtc gaa tgg aag tgc atc aaa cgt cag gag gcc ggc ctg    4459
Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys Ile Lys Arg Gln Glu Ala Gly Leu
920                925                  930                935
ccg aac acg gcg gat gcg tgg gag ccc ggc ggg aac aac atc ctc tcg    4507
Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn Ile Leu Ser
940                945                  950
acg cca cct tcc ggc tcg gcg ggg ata acc acc ggc gcc ttc tga        4552
Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly Ile Thr Thr Gly Ala Phe
955                960                  965
cccagggggg ctcgatcccg gtcgccagcg caagcgcggc gcccggggtc gacgcgtgtt  4612
aggccagtac gcgaaggaac cagccctcta cgacaccggc ctcgaccccg ccgaaggact  4672
ctggcaccgg tcaggctgga tcggacaaca ctgacacgcc ccgacgccat ccactctttt  4732
tggcctacaa cccgttgtcg cacgtgcgcc tcttggcccg ggcacgacga aacccccgcg  4792
atccagggat cggcgggggt ttcggatggc ggtgacggtg ggatttgaac ccacggtagg  4852
gggttaccct acacaacttt tcgagagttg caccttcggc cgctcggaca cgtcaccggg  4912
gtcgagttta cgcgacgttc tcctggcgcg ccaatcggcg gcgccccgcc cgcgagaatc  4972
caggcccgcg ccgagaatcc gcgggcgcct ggattctcag cacggggatg gattctcgcc  5032
gctcatccga gccccgcggc gagcgggctc agtgctcgtc ctccatgagc atgccgaccg  5092
aggtggcgca ggcgtcgccg cgccaggcct cgatgccctc gcgcacggcg aaggcggcga  5152
tgatgaggcc ggtgatcgcg tcggcccacc accagcccag gaggctgttg agcacgaggc  5212
ccgcgagcac ggccgccgac aggtaggtgc agatgagggt ctgcttcgag tcggccacgg  5272
cggtggccga tccgagctcg cggccggcgc ggcgctcggc gaacgacagg aacggcatga  5332
tcgccacgct gagcgccgtg atgacgatgc cgagcgtcga gtgctccacg tccgcgccgc  5392
cgacgagggc caggaccgac gtgacggtga cgtacgcggc gagcgcgaag aaggccacgg  5452
cgatgacgcg cagcgtgccg cgctcccagc gctccgggtc gcgccgcgtg aactgccacg  5512
cgacggcggc ggccgagagc acctcgatgg tcgagtccag gccgaacgcg acgagcgcgg  5572
ccgacgaggc cgcagctccc gcggcgatcg cgacgaccgc ctcgacgacg ttataggcga  5632
tggtcgcggc gacgatccag cggatgcgcc gctgcaggac ggatcgccga tcggcagacg  5692
cggtggcggt catgcgcagg tgcagctctc tccggcgcag cagccgggct cgacgtacag  5752
gacgacgcgc agcagctcgt cgagcgcggg cgcgaggtgg gcgtcggcca gccggtacc   5811
【図面の簡単な説明】
【図１】  マルトテトラオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｘの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】  マルトペンタオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｙの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】  マルトテトラオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｘの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】  マルトペンタオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｙの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】  バチルス  グロビスポルスＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】  バチルス  グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図７】  アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図８】  バチルス  グロビスポルスＣ９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図９】  バチルス  グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１０】  アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】  本発明のバチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１２】  バチルス  グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１３】  アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１４】  バチルス  グロビスポルスＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】  バチルス  グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１６】アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１７】  本発明による組換えＤＮＡ『ｐＢＧＣ２』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス  グロビスポルスＣ１１由来の本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【図１８】  本発明による組換えＤＮＡの『ｐＢＧＮ２』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス  グロビスポルスＮ７５由来の本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【図１９】  本発明による組換えＤＮＡの『ｐＡＧＡ１』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アルスロバクター グロビホルミスＡ１９株由来の本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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