(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞毒性作用を有するウイルス構造蛋白質を発現するウイルスベクター産生用細胞を作製するためのDNA構築物であって、該DNA構築物を細胞に導入し増殖させた後、リコンビナーゼを作用させることにより該ウイルス構造蛋白質を発現する、プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物。
【請求項２】
細胞毒性作用を有する外来遺伝子を発現するウイルスベクター産生用細胞を作製するためのDNA構築物であって、該DNA構築物を細胞に導入し増殖させた後、リコンビナーゼを作用させることにより該外来遺伝子を発現する、レトロウイルスのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、外来遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物。
【請求項３】
プロモーターがCAGである請求項１に記載のDNA構築物。
【請求項４】
リコンビナーゼとその認識配列がCreリコンビナーゼとloxP配列である請求項１又は２に記載のDNA構築物。
【請求項５】
薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子である請求項１又は２に記載のDNA構築物。
【請求項６】
薬剤耐性遺伝子が、低効率薬剤耐性遺伝子又は、薬剤耐性遺伝子のmRNAを短寿命化した塩基配列を有する転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子である、請求項１又は２に記載のDNA構築物。
【請求項７】
低効率薬剤耐性遺伝子又は転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子由来である、請求項６に記載のDNA構築物。
【請求項８】
polyA付加シグナルがSV40由来又はβ-グロビン由来である請求項１又は２に記載にDNA構築物。
【請求項９】
ウイルスの構造蛋白質遺伝子が水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus、VSV）のG蛋白質（VSV-G）をコードするDNAである、請求項１に記載のDNA構築物。
【請求項１０】
レトロウイルスのLTR、パッケージングシグナル遺伝子がモロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus、MoMLV）由来である請求項２に記載のDNA構築物。
【請求項１１】
レトロウイルスのLTR、パッケージングシグナル遺伝子がレンチウイルス由来である請求項２に記載のDNA構築物。
【請求項１２】
外来遺伝子が遺伝子治療のために細胞導入を目的とする遺伝子である請求項２に記載のDNA構築物。
【請求項１３】
CAGプロモーター、loxP配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、loxP配列、VSV-G遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向した、請求項１に記載のDNA構築物。
【請求項１４】
レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、loxP配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、loxP配列、外来遺伝子、LTRの順に配向した請求項２に記載のDNA構築物。
【請求項１５】
レトロウイルスのgag-pol産生細胞に請求項１に記載のDNA構築物を導入した、レトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項１６】
レトロウイルスのgag-pol-env産生細胞に請求項２に記載のDNA構築物を導入した、レトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項１７】
レトロウイルスのenvがエコトロピックまたはアンフォトロピックマウス白血病ウイルス由来である、請求項１６に記載のレトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項１８】
レトロウイルスのgag-pol産生細胞に請求項１及び２に記載のDNA構築物を導入した、レトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項１９】
レトロウイルスがマウス白血病ウイルス（murine leukeimia virus、MLV）である、請求項１５、１６、１７又は１８に記載のレトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項２０】
レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１５、１６、１７又は１８に記載のレトロウイルスベクター産生用細胞。
【請求項２１】
請求項１５から２０のいずれかに記載のウイルスベクター産生用細胞に、リコンビナーゼ発現DNAを導入することを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法。
【請求項２２】
レトロウイルスのgag-pol産生細胞に、プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、細胞毒性作用を有するウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物を導入し増殖させた後、リコンビナーゼ発現DNAを導入して該ウイルス構造蛋白質を発現させることを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法。
【請求項２３】
レトロウイルスのgag-pol-env産生細胞に、レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、細胞毒性作用を有する外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物を導入し増殖させた後、リコンビナーゼ発現DNAを導入して該外来遺伝子を発現させることを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法。
【請求項２４】
レトロウイルスのgag-pol産生細胞に、プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、細胞毒性作用を有するウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物、及びレトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、細胞毒性作用を有する外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物を導入し増殖させた後、リコンビナーゼ発現DNAを導入して該ウイルス構造蛋白質及び該外来遺伝子を発現させることを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の属する技術分野：
本発明は遺伝子治療に利用する高力価のレトロウイルスベクターの作製法に関するものである。
従来の技術：
近年のめざましい遺伝子工学の進歩によって、多くの遺伝病の原因遺伝子が同定され、病態の分子機構が明らかになってきた。それに伴い病態を改善させることができると考えられる遺伝子を細胞に導入する遺伝子治療の研究が行われ、実際に実施されるに至っている。また、癌、AIDS等の疾患においても遺伝子治療が応用されつつある。遺伝子治療において外来遺伝子を導入する方法はいくつかあるが、現在もっとも広く用いられている方法はレトロウイルスベクターを用いるものである（Miller, A. D., Blood, 76, 271-278, 1990）。このベクターの利点として、導入された遺伝子が確実に染色体に組み込まれるため長期間安定した発現が期待できる点、細胞障害性が少なく安全性も高いという点が挙げられる。一方、欠点としては、ウイルスのエンベロープ蛋白質のレセプターが導入細胞に存在しないことにより遺伝子導入できない細胞が少なくないこと、サイズの大きなDNAを挿入することができないこと、分裂している細胞にしか導入できないこと、などが挙げられる。これらの欠点によりレトロウイルスを用いた遺伝子治療はもっとも繁用されていながら十分な治療効果を上げるに至っていない（Marshall, E., Science, 269, 1050-1055, 1995）。
いずれの方法を用いるにしろ遺伝子治療を行うためには、1)標的細胞に目的の遺伝子を効率よく導入できること、2)導入された遺伝子が形質発現し、かつ持続すること、3)患者を含め公共に対して安全であることの３条件を最低限クリアしなければならない。
これまでのレトロウイルスベクターの作製法は、レトロウイルスのgag、pol、envを安定に発現しているパッケージング細胞と呼ばれる細胞へ、目的の外来遺伝子を含むレトロウイルスゲノムを導入することで外来遺伝子をそのゲノムに含むレトロウイルスを作製する方法を用いていた。しかしながら、臨床の使用に耐える高品質ベクターの作製は難しく、これまでに自己複製可能なレトロウイルス（Replication Competent Retrovirus：RCR）の出現を防ぐ方法、力価の高いレトロウイルスを産生させる方法、ベクターゲノムの構造を改良したり、濃縮方法や遺伝子導入の条件などを検討することによってレトロウイルスベクターの力価を高める方法など多くの研究がなされているが（Vile, R. G., Gene Therapy, Churchill Livingstone, 12-30, 1995）、未だ感染範囲が広く力価の高いベクターを大量に安定に調製することができる技術は確立されていない。このことが遺伝子治療の大きな障害の一つとなっている。
一方、レトロウイルスと他のウイルスの研究の接点として、古くから水疱性口内炎ウイルス（VSV）を用いたシュードタイプウイルスの研究が精力的になされてきた（Zavada, J., Arch. Virol., 50, 1, 1976）。シュードタイプとは一つのウイルスゲノムが別種のウイルスの外皮蛋白質に囲まれて発芽してくる現象をいう。VSVはラブドウイルス科に属するネガティブ１本鎖RNAゲノムをもつウイルスであり、その外皮蛋白質（G蛋白質）の細胞側のレセプターはホスファチジルセリンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられ極めて広い宿主域を有することが知られている。したがって、このVSV-G遺伝子産物を外皮に持つシュードタイプレトロウイルスを作製することにより、本来の外皮蛋白質を持つレトロウイルスでは感染効率が低かったり、感染させることができなかった細胞に効率よく遺伝子を導入することが可能になると考えられる。実際にEmiら（Emi. N, et al., J. Virol., 65, 1202-1207, 1991）及びYeeら（Yee, J. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9564-9568, 1994）はVSV-G遺伝子産物を外皮にもつレトロウイルスベクターの作製法を報告するとともに、そのシュードタイプウイルスが、本来の外皮蛋白質を持つレトロウイルスでは感染効率が低かった細胞に効率よく遺伝子を導入できることを示した。
VSV-Gシュードタイプウイルスベクターを臨床応用するためには、高力価のウイルスを再現性よく得る方法を確立する必要がある。しかし、VSV-G遺伝子産物自体が細胞障害性を有しているため、パッケージング細胞において再現性よくVSV-G遺伝子産物を高レベルに産生させることが困難である。このことが広い応用が期待されるシュードタイプベクターを開発する上で大きな問題となっている。最近、テトラサイクリンを用いてVSV-G遺伝子産物の発現を制御することによりVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの産生細胞を作製できることが報告されているが（Yang,Y., et al. Hum. Gene. Ther. 6, 1203-1213, 1995、Chen, S. T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10057-10062, 1996、Ory, D. S. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11400-11406, 1996）、テトラサイクリンによるVSV-G遺伝子産物の発現制御が完全ではなく常に産生細胞に再感染可能な102から104i.u./ml程度のVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを産生していること、VSV-G発現DNAと薬剤耐性遺伝子発現DNAとのコ・トランスフェクションを用いていることからパッケージング細胞としての長期安定性に疑問が残る、などの問題を残している。
またレトロウイルスによる標的細胞への外来遺伝子導入の際に、外来遺伝子が細胞に対して影響の強いものである場合に、ウイルス産生細胞（ウイルスゲノムを含むパッケージング細胞）自体の中で外来遺伝子産物が影響を与えることによりその外来遺伝子をウイルスゲノムにもつウイルスを安定に回収できないことが知られている（Pear, W. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8392-8396, 1993）。
なお、本明細書においてはVSV-G遺伝子産物を外皮に持つレトロウイルスベクターを「シュードタイプウイルスベクター」と表記する。また、本来の外皮蛋白質を持つレトロウイルスベクターと、「シュードタイプウイルスベクター」を合わせて「レトロウイルスベクター」とする。
またレトロウイルスのgag、polを発現し、通常は発現しないもののリコンビナーゼによりenvが発現できる細胞を「プレパッケージング細胞」と標記する。またそこにウイルスゲノムを導入した細胞を「ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞」と表記する。さらに、リコンビナーゼの導入によりウイルスを産生する細胞を「ウイルスゲノムを含むパッケージング細胞」とする。
さらに低効率薬剤耐性遺伝子又は、薬剤耐性遺伝子のmRNAを短寿命化した塩基配列を有する転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子および従来型の薬剤耐性遺伝子を総称して「薬剤耐性遺伝子」とする。
発明の開示
上記現状を鑑み、本発明の目的は細胞毒性作用をもつウイルス構成蛋白質を従来のものより厳密に制御することで、細胞に影響を与えるものを含む外来遺伝子を、幅広い標的細胞に特異的に導入・発現させるためのレトロウイルスベクターを安定して高力価で作製しえる方法を確立すること、及びシュードタイプレトロウイルスベクターが産生細胞に再感染することを抑制することによるレトロウイルスベクターの回収量増大方法を確立すること、及びリコンビナーゼにより二つの遺伝子を同一プロモーターで転写させる際に低効率あるいは転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子を用いることで効率よく高発現細胞クローンの選択を行うことにある。
そこで、本発明者らは上記問題を解決するために鋭意検討した。
強力なプロモーターの下流にloxP配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、loxP配列、VSV-G遺伝子およびpolyA付加シグナルをこの順に配向させたDNAを、レトロウイルスのgag、pol遺伝子が導入されている細胞に導入し、薬剤で選択することによりプレパッケージング細胞を作製する。このようにして作製したプレパッケージング細胞に、目的とする遺伝子を挿入したレトロウイルスベクターを感染させて遺伝子を導入するとともに、リコンビナーゼを作用させることにより、薬剤耐性マーカーの発現に用いたものと同一の強力なプロモーターで、VSV-G遺伝子産物を短時間に高発現させることが可能となる。この結果、VSV-G遺伝子産物の細胞障害性が現れる前に高力価のシュードタイプウイルスベクターを大量に作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
さらにシュードタイプレトロウイルスベクターが産生細胞に再感染することを見いだし、培養液に陰性荷電高分子物質を添加することにより再感染を抑制し、回収量を増大することができることを発見した。
また、上記のプレパッケージング細胞を作製する際に用いる薬剤耐性マーカー遺伝子として、そのコーティング領域内の塩基配列に置換、挿入、欠失を加えることにより機能を低下させたものや、非翻訳領域の塩基配列に置換、挿入、欠失等を導入することにより翻訳効率を低下させたり（低効率薬剤耐性遺伝子）、その遺伝子から産生されるmRNAの安定性を低下させたものを用いることにより（転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子）、より高い耐性マーカーの発現を必要とする細胞を効率よく選択することができることを利用した。本発明ではこれらの工夫を加えた転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子を使用した。また、この細胞に目的とする遺伝子を挿入したレトロウイルスベクターあるいはそのDNAを導入するとともに、リコンビナーゼを作用させることで、さらに高いVSV-G遺伝子産物の発現を得ることが可能となり、高力価のシュードタイプベクターを大量に作製することに成功した。
発明の詳細な説明：
本発明は、リコンビナーゼとその認識配列を用いてウイルスの構造蛋白質の発現を制御するDNA構築物（以下、DNA構築物(A)と記す）、及びリコンビナーゼとその認識配列を用いて、ウイルスゲノムにコードされる外来遺伝子の発現を制御するDNA構築物（以下、DNA構築物(B)と記す）をレトロウイルスのgag-pol産生細胞に導入した後、リコンビナーゼ発現DNAを導入することを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法に関するものであって、1）プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物(A)、及びレトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物(B)をレトロウイルスのgag-pol産生細胞に導入した後、リコンビナーゼ発現DNAを導入することを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法、2）レトロウイルスのgag-pol-env産生細胞に、レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物(B)を導入した後、リコンビナーゼ発現DNAを導入することを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法、3）プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物(A)および外来遺伝子をコードするレトロウイルスゲノムをレトロウイルスのgag-pol産生細胞に導入した後、リコンビナーゼ発現DNAを導入することを含む、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの作製法、4）プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物(A)、5）レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物(B)、6）プロモーターがCAGであるDNA構築物(A)、7）リコンビナーゼとその認識配列がCreリコンビナーゼとloxP配列であるDNA構築物(A)又はDNA構築物(B)、8）薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子法又はハイグロマイシン耐性遺伝子であるDNA構築物(A)又はDNA構築物(B)、9）薬剤耐性遺伝子が、低効率薬剤耐性遺伝子又は、薬剤耐性遺伝子のmRNAを短寿命化した塩基配列を有する転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子であるDNA構築物(A)又はDNA構築物(B)、10）低効率薬剤耐性遺伝子又は転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシ耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子由来であるDNA構築物(A)又はDNA構築物(B)、11）ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子のmRNAを短寿命化した塩基配列を有することを特徴とする転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子、12）mRNAの短寿命化がc-fos由来のmRNA不安定化シグナルによるものである転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子、13）polyA付加シグナルがSV40由来又はβ−グロビン由来であるDNA構築物(A)又はDNA構築物(B)、14）ウイルスの構造蛋白質遺伝子が水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus、VSV）のG蛋白質（VSV-G）をコードするDNAであるDNA構築物(A)、15）レトロウイルスゲノムがモロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus、MoMLV）由来である請求項2に記載のDNA構築物(B)、16）レトロウイルスゲノムがレンチウイルス由来であるDNA構築物(B)、17）外来遺伝子が遺伝遺伝子治療のために細胞導入を目的とする遺伝子であるDNA構築物(B)、18）外来遺伝子が、細胞毒性を有する蛋白質の遺伝子であるDNA構築物(B)、19）CAGプロモーター、loxP配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、loxP配列、VSV-G遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したDNA構築物(A)、20）レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、loxP配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、loxP配列、外来遺伝子、LTRの順に配向したDNA構築物(B)、21）レトロウイルスのgag-po1産生細胞にDNA構築物(A)を導入した、レトロウイルスベクター産生用プレパッケージング細胞、22）レトロウイルスのgag-pol-env産生細胞にDNA構築物(B)を導入した、レトロウイルスベクター産生用の、ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞、23）レトロウイルスのgag-pol産生細胞にDNA構築物(A)及びDNA構築物(B)を導入した、レトロウイルスベクター産生用の、ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞、24）レトロウイルスのgag-pol産生細胞にDNA構築物(A)および外来遺伝子をコードするウイルスゲノムを導入した、レトロウイルスベクター産生用の、ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞、25）レトロウイルスがマウス白血病ウイルス（murine leukeimia virus, MLV）であるレトロウイルスベクター産生用プレパッケージング細胞、26）シュードタイプレトロウイルスを作製する方法において、培養液中に陰性荷電高分子物質を共存させる方法、27）陰性荷電高分子物質がヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸から選ばれるシュードタイプレトロウイルスの作製方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
図１はプレパッケージング細胞によるシュードタイプレトロウイルス産生系の概略図を示す。
図２はpCALNLG及びpCALNdLGの構築図を示す。
図３はpBabe,pBabeloxpuroの構築図を示す。
図４はウエスタンブロットによるVSV-Gの検出を示す。
図５はPtG-L1のプレパッケージング細胞としての安定性を示す。
図６はPtG-L1のウイルス産生量の経時変化を示す。
図７はPtG-S2からのシュードタイプレトロウイルス産生量の経時変化を示す。
図８はPtG-L1からのシュードタイプレトロウイルス産生量の経時変化を示す。
図９はウェスタンブロット法によるCreリコンビナーゼ導入前後におけるタンパク合成変化の解析を示す。
は図１０はサザンブロット法によるCreリコンビナーゼ導入前後のおける染色体の変化の解析を示す。
図１１はウイルス感染に及ぼすヘパリンの効果を示す。
本発明の方法により作製された遺伝子治療用レトロウイルスベクターに関する発明の概要を図１に示した。
リコンビナーゼはDNA部位特異的組換え酵素であって、特定の塩基配列を認識して切断・結合という部位特異的組換えに必要な一連の反応を単独で行う酵素である。具体的には酵母の２μプラスミド由来のFLP遺伝子がコードするリコンビナーゼ、シゾサッカロマイセス・ルーイイのpSR1プラスミド由来のもの、大腸菌のP1ファージにコードされているCreリコンビナーゼ（Cre recombinase）などとそれらに対応する認識配列の組み合わせのいずれも使用できるが、好ましくはCreリコンビナーゼが挙げられる。Creリコンビナーゼは34塩基対のloxP配列を特異的に認識する酵素であるが（Fukushige, S., et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-6236, 1992）、このloxP配列を同じ向きに2コピーもつ組換えベクターを作製し、Creリコンビナーゼを作用させることにより２つのloxP間の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出される。これをCre/loxPシステムという。
リコンビナーゼとその認識配列を用いてウイルスの構造蛋白質遺伝子の発現を制御するDNA構築物(A)は、プロモーター、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、ウイルスの構造蛋白質遺伝子、polyA付加シグナルの順に配向したものであり、リコンビナーゼとその認識配列を用いて外来遺伝子の発現を制御するDNA構築物(B)は、レトロウイルスゲノムのLTR、パッケージングシグナルに続き、リコンビナーゼ認識配列、薬剤耐性遺伝子、polyA付加シグナル、リコンビナーゼ認識配列、外来遺伝子、LTRの順に配向したものである。この場合、プロモーター（又は、DNA構築物(B)におけるLTR）は薬剤耐性遺伝子のみを発現させていることから、これら構築物を細胞に導入した際に、薬剤による細胞の選択をすることができる。選択された細胞にCreリコンビナーゼを作用させると、これら構築物の２つのloxP間の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出されることにより、初めてウイルス構造蛋白質遺伝子（又は外来遺伝子）が発現されることになる。本発明はこのCre/loxPシステムを用いることによって、一つのプロモーターで薬剤耐性マーカー遺伝子の発現およびCreリコンビナーゼ作用後のウイルス構造蛋白質（例えば、VSV-G）の発現の２つの機能を持たせたことに大きな特徴を有している。目的とする外来遺伝子又はウイルス構造蛋白質が細胞障害性を持つ等の理由により、再現性良く高力価のレトロウイルスベクターを作製することが困難である場合にも、Cre/loxPシステムを応用することで臨床応用できる高力価ベクターを作製することを可能としたものである。
DNA構築物(A)および(B)中で、リコンビナーゼ認識配列は順方向に挿入してあるが、逆方向に挿入したものも本発明に含まれる。DNA構築物(B)の場合、パッケージングシグナルに続きプロモーターを挿入しても、あるいは薬剤耐性遺伝子に続くpolyA配列を削除しても差し支えない。これら両者の有無に関わらずDNA構築物(B)の順に配向したものを含むDNA構築物は本発明に含まれる。ここでpolyAシグナルを含まないものはCreリコンビナーゼを作用させなくともウイルスゲノムとなることができ、目的細胞に感染してからCreリコンビナーゼを導入することで外来遺伝子の発現を開始させることができるものである。また特異的プロモーターを使用することで感染後の外来遺伝子の発現を特異的に制御することが可能となる。これらDNA構築物(A)及び(B)の構成は、上記の遺伝子（DNA構築物）の間に別のDNAを挿入することは差し支えないが、本発明の趣旨と同一目的のDNA構築物、上記の順に配向したものを含むDNA構築物は本発明に含まれる。
薬剤耐性遺伝子としては通常使用されているネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを使用することができるが、好ましくは、薬剤耐性遺伝子のコーディング領域内の塩基配列に置換、挿入、欠失を加えることにより機能を低下させたもの、非翻訳領域の塩基配列に置換、挿入、欠失等を導入することにより翻訳効率を低下させた薬剤耐性遺伝子（低効率薬剤耐性遺伝子）、mRNAの安定性を低下させた薬剤耐性遺伝子（転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子）が挙げられる。さらに好ましくは、c-fos遺伝子の3'非翻訳領域にみられるmRNA不安定化配列（ARE：AU-rich elememt）（Chen, C. A., Shyu, A., Mol. Cell. Biol., 14, 8471-8482, 1994）を公知の耐性遺伝子の3'非翻訳領域に導入することによる転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子であるmRNA短寿命ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
本発明のもう一つの大きな特徴は、これら工夫した薬剤耐性遺伝子を用いることにより、染色体に正常に挿入され導入したプロモーターからの発現が特に高い細胞を効率よくに選択することを可能にし、高力価ベクター作製のためのプレパッケージング細胞の選択効率をさらに高くしたことにある。本発明ではG418（シェーリング社製）で選択できるネオマイシン耐性遺伝子を用いた。
シュードタイプレトロウイルス回収量増大のための再感染抑制物質としての陰性家電高分子物質は特に限定はされず、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などが挙げられ、好ましくはヘパリンが挙げられる。
ウイルス構造蛋白質としては、いずれのウイルスであれ特に限定されないが、シュードタイプウイルスを産生するためのエンベロープとしては全長翻訳領域を含むVSV-G（indiana）種の配列（Gallione, C. J., 46, 162-169, 1983）であるVSV-G遺伝子が好ましい。
外来遺伝子としては、遺伝子治療のための細胞導入を目的とする遺伝子であれば特に限定はされないが、本発明のCre/loxPシステムを用いる方法においては、細胞毒性を有する蛋白質の場合に特に有効である。リコンビナーゼを作用させる前では該蛋白質の発現は起こらず、リコンビナーゼを作用させることにより初めて同一プロモーターにより短時間に該蛋白質の発現がもたらされ、細胞毒性を発揮する前にレトロウイルスベクターの作製を可能することができるためである。
本発明のウイルスゲノムはレトロウイルス由来のゲノムであれば特に制限されず使用することができるが、好ましい例として、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukeimia virus、MoMLV）、ヒト後天性免疫不全症候群ウイルス（Human immunodeficiency virus、HIV）などのレンチウイルス由来のものが挙げられる。
DNA構築物(A)のプロモーターとしては通常使用されているプロモーターであれば使用可能であるが、短時間にウイルス蛋白質を発現しえる高力価プロモーターが好ましく、例えばNiwaらが報告しているCAGプロモーターが挙げられる（Niwa, H., Yamamura, k., Miyazaki, J., Gene, 108, 193-200, 1991）。
polyA付加配列は特に限定されないが、ウサギβグロビン遺伝子またはSV40ウイルス由来のものが望ましい。
DNA構築物(A)及び(B)を導入する細胞は、構造タンパク質をコードするgagおよびpol遺伝子が発現するものであればよい。好ましい細胞としてFLY細胞（Cosset, et al., J. Viol., 69, 7430-7436, 1995）が挙げられる。
上記の、レトロウイルスのgag、pol産生細胞にDNA構築物(A)、特にVSV-G遺伝子を含むDNA構築物(A)はウイルスベクター、特にシュードタイプウイルスベクター産生用プレパッケージング細胞作製用に有用であり、本発明に含まれる。レトロウイルスのgag、pol産生細胞にDNA構築物(A)及びDNA構築物(B)又は従来型の外来遺伝子をコードするレトロウイルスゲノムを導入した細胞は、レトロウイルスベクター（特にシュードタイプ）産生の、ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞として有用であり、本発明に含まれる。齧歯類細胞のみに感染可能なエコトロピック又はヒトを含めて多くの種の細胞に感染可能にアンフォトロピックenvをもつレトロウイルス産生用プレパッケージング細胞、すなわちレトロウイルスのgag-pol-env産生細胞にDNA構築物(B)を導入した細胞は、導入目的外来遺伝子を含む通常のレトロウイルスベクター産生用の、ウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞として有用であり、特に導入目的外来遺伝子蛋白質が細胞毒性を有する場合に有用である。これら細胞も本発明に含まれる。
Creリコンビナーゼを細胞内で作用させるためのCreリコンビナーゼ発現系を細胞に導入するためには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が利用可能であるが、好ましい例としてアデノウイルスベクター（ＪＰ−Ａ−8-84589）が挙げられる。
本発明はこのCre/loxPシステムを用いることによって、一つのプロモーターで薬剤耐性マーカー遺伝子の発現およびCreリコンビナーゼ作用後のVSV-G遺伝子（又は外来遺伝子）の発現の2つの機能を持たせたこと、転写産物短寿命化薬剤耐性遺伝子を用いることにより、高力価ベクター作製のためのプレパッケージング細胞の選択効率をさらに高くしたことに大きな特徴を有するものである。目的とする外来遺伝子が細胞障害性を持つ等の理由により、再現性良く高力価のレトロウイルスベクターを作製することが困難である場合に特に有効であると期待される。
発明の実施の形態：
各DNA構築物の作製方法、ウイルス・細胞の取り扱い操作などは、通常行われる公知の方法により実施することができ、例えば、新生化学実験講座18細胞培養技術（1990）・東京化学同人、遺伝子治療の基礎技術・羊土社（1996）、遺伝子治療の基礎技術（1996）・羊土社、およびMolecular Cloning. A Laboratory Manual., T. Manitisら編（1989）・Cold Spring Harbor Laboratoryに記載の方法に準じて行うことができる。
CreリコンビナーゼによりVSV-G遺伝子産物の発現を誘導させるのための薬剤耐性遺伝子をもったDNA構築物（pCALNLG）、およびその中の薬剤耐性遺伝子の転写産物を短寿命化させるための配列（以下転写産物短寿命化配列と略する）を導入したDNA構築物（pCALNdLG）の作製法を以下に説明する。
pCALNLGを作製するために、VSV（Indiana:血清型）：（Rose, J. K. Cell, 30, 753-762, 1982）のGタンパク質のコード配列を、pCALNLw［（Kanegae, Y., et al., Nucl. Acids, Res., 23, 3816-3821, 1995）に報告されているpCALNZからlacZ遺伝子を除きSwaI切断部位を導入したもの、loxP配列はネオマイシン耐性遺伝子の両側に順方向に並んでいる］のSwaI切断部位に挿入した（図２）。
またmRNA短寿命化配列をpCALNLG中の薬剤耐性遺伝子の3'-非翻訳領域へ導入するために、ネオマイシン耐性遺伝子の3'-非翻訳領域部分をNspV、ClaI（ClaIサイトはklenow fill inによるblunt化によりNruIサイトを創出後NruIで切断することで平滑末端化）で切断した部分へchicken c-fosのmRNA短寿命配列（AU Rich Element：ARE）である414bpsの配列をClaI、BglII（BglIIサイトはklenow fill inによるblunt化）で切断したものを、両者のNspVとClaIが付着することを利用して挿入し、pCALNdLGを構築した（図2）。
外来遺伝子を導入するためのモロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus、MoMLV）由来のレトロウイルスゲノムとしてはpBabe（Morgens tenm, J., P. and Hartmut, L., Nucleic Acids Res., 18, 3587-3596, 1990）等を用いた。レトロウイルスゲノムとして使用・作製したものを図3に示す。
Creリコンビナーゼを作用させて薬剤耐性遺伝子を環状分子として切り出されることにより外来遺伝子の発現を開始させるレトロウイルスゲノムpBabe loxpuroは以下のように構築した。外来遺伝子挿入のためのマルチクローニングサイトとして次に示すオリゴDNAを設計・発注しグライナージャパンより購入した。下線部に制限酵素の認識サイトを示す。
0003959117.tif 000002
ピューロマイシン耐性遺伝子とSV40 polyAシグナルを含むDNAはpPUR（GIBCO）よりHindIII、BamHIで切り出し、loxP配列を組み込むためのプラスミドであるpBS246（GIBCO）のHindIII、BamHIサイトに挿入した。そこからloxP-ピューロマイシン耐性遺伝子-SV40 polyA-loxP配列をEcoRI、ScaIで切り出し、klenow fragmentにより平滑末端としたものをloxpuroインサートとした。別にpBabeよりSalI、ClaIを用いてSV40プロモーターと薬剤耐性遺伝子を除き前述のマルチクローニングサイト導入用オリゴDNAを挿入した後、SnaBIで切断した部分にloxpuroインサートを挿入してpBAbe loxpuroを作製した。またSV40 polyAシグナルを含まないためにCreリコンビナーゼを作用させなくともウイルスゲノムとなることができ、目的細胞に感染してからCreリコンビナーゼを導入することで外来遺伝子の発現を開始させるもの（pBabe loxpuroDpA）も同時に作製した。
pCALNZ（Kanegae, Y., et al., Nucl. Acids, Res., 23, 3816-3821, 1995）より切り出したnlslacZをpBabe又はpBabe loxpuroに挿入し、ウイルス力価測定のための核移行シグナルの付いたβ-galactosidase（nlslacZ）をもつレトロウイルスゲノム作製に用いた。
ウイルス力価の測定は以下のように行った。感染一日前に1.5×103/96wellとなるようにラットの線維芽細胞3Y1を96穴プレートに用意した。解凍したサンプルは種々の段階に培養液で希釈し、0.5mg/96wellのポリブレンとともにラットの線維芽細胞3Y1に感染させた。３日後、感染細胞を1.25%グルタルアルデヒドにて固定し、前記に記載の方法に従ってX-galを用いてlacZ感染細胞の染色を行った。青く染まったコロニー数を数え希釈に応じたコロニー数の変化があることを確認して力価を算出した。力価は１mlあたりに含まれる感染粒子（Infectious units、以下i.u.と略する）を単位（i.u./ml）として表記した。
VSV-G遺伝子産物およびMLV gagp12の免疫染色はVECTASTAIN（VECTOR）を用いて以下のように行った。細胞を３％パラフォルムアルデヒド＋0.1% Triton X-100を含むPBSで室温15分間固定した。PBSで2回洗浄した後、1/1000から1/3000に希釈した各々の一次抗体液をヤギ血清を含むHank's平衡塩溶液（HBSS）で調製して、室温2時間結合させた。PBSで2回洗浄した後、一次抗体の産生動物であるマウスに対する二次抗体にbiotinを標識したものをヤギ血清を含むHBSSで1/1000希釈して室温30分間結合させた。以後はVECTASTAINの取り扱い説明書に従って染色を行った。
実施例
次に実施例をもって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１  pCALNLGのFLY細胞への導入とVSV-G遺伝子産物を発現誘導するプレパッケージング細胞株の一次選択
CreリコンビナーゼによりVSV-G遺伝子産物の発現を誘導させるためのネオマイシン薬剤耐性遺伝子をもったDNA構築物pCALNLG（図２）を、MoMLVのgagおよびpol遺伝子産物を安定に発現するFLY細胞（Cosset, et al., J. Virol., 69, 7430-7436, 1995）へ以下のようにトランスフェクションを行った。
前日に５×105cells/10cm dishとなるように継代したFLY細胞に10-30μgのpCALNLGをリン酸カルシウム法（Chen, C. and Okayama, H., Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2752, 1987）によってトランスフェクトした。翌日リン酸カルシウムを除き、その１あるいは２日後に培養細胞を分割した。さらにその翌日、安定株を選択するために１mg/mlのネオマイシン誘導体であるG418（GIBCO）を加え１４日間程度選択を行った。G418に抵抗性のあるコロニーがつり上げ可能な大きさになった時点で、クローニングシリンダーを用いて各コロニーを別々に96穴プレートへ移して培養を続けた。
各コロニーは２つに分割し、一方にはCreリコンビナーゼ発現のためのアデノウイルス（AxCANCre）（Kanegae, et al., Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821, 1995）を感染多重度（以下m.o.i.）30の割合で感染させ、Creリコンビナーゼを導入するとともに培養液からG418を除去した。他方は無処置のまま細胞を液体窒素に保存するために培養を続けた。AxCANCreを感染したものは感染３日後に、VSV-G抗体（P5D4、Sigma V5504）を用い上述した免疫染色法によりVSV-G遺伝子産物の発現を検出した。ここで得られた11クローンのうち２クローン（PtG-L1、PtG-L2）が、AxCANCreを作用させてVSV-G遺伝子産物の発現がみられた。両者を比較するとPtG-L1はPtG-L2よりもかなり強い染色がみられた。一方AxCANCreを感染させなかったものは、全てのクローンでVSV-G遺伝子産物の発現はみられなかった。
実施例２  PtG-L1細胞の産生するVSV-G遺伝子産物のウェスタンブロト法による検出
実施例1で強い染色がみられたプレパッケージング細胞であるPtG-L1の産生するVSV-G遺伝子産物をそのC末端部分を認識する抗VSV-G抗体（P5D4）により以下のように検出した。
PtG-L1細胞を5×105cells/10cm dishとなるように継代したものを２つ用意し、翌日に一方はAxCANCreをm. o. i, ＝30で感染し、他方は感染を行わなかった。その４日後にサンプルバッファー（61.2mM Tris/HCl pH＝6.8、1.6％ SDS、2.5％ β-mercaptoethanol、9.8％ glycerol）500μ1で細胞成分を可溶化後100℃５分間の処理を行い-20℃に保存した。その後得られたサンプルのタンパク量をprotein assay溶液（BIORAD）を用いて定量し、１レーンあたり20μgとなるようにしてSDS-PAGEを行った。泳動ゲルをエレクトロトランスファーによりImmobilon（Millipore）にトランスファーし、一次抗体として1/3000希釈したVSV-G抗体（P5D4、Sigma V5504）を、二次抗体として1/1000希釈したbiotinをラベルした一次抗体免疫動物であるマウスIgGに対する抗体を結合させ、ECLキット（Amersham）により検出を行った。AxCANCreを作用させたものは70kDa付近にVSV-G遺伝子産物と思われるバンドがみられるのに対して、感染を行わないものにはバンドがみられなかった。この結果は免疫染色の結果と一致し、AxCANCreを作用させないものでは全くVSV-G遺伝子産物の発現がみられないのに対して、AxCANCreによりCreリコンビナーゼを導入することでVSV-G遺伝子産物の発現が開始されることを示している。結果を図４に示す。
実施例３  PtG-L1へのウイルスゲノム導入とCreリコンビナーゼによるウイルス産生の測定
実施例１で記述した無処置のまま培養を続けていた11クローンを液体窒素中に保存すると共に、その一部に対してβ-galactosidase（lacZ）をコードするレトロウイルスゲノムをウイルス感染により導入した。X-galによる染色でほとんどの細胞にlacZをコードするレトロウイルスゲノムが導入されたことを確認した後２つに分割し、一方はそのまま感染を行わず、他方はAxCANCreを感染させVSV-G遺伝子産物の発現を誘導した。以後、3日間程度の間隔で、ウイルス回収前日に培養液を交換しその翌日培養上清を回収した。3000rpmで30分間遠心した上清をウイルスストックとして-80℃に保存した。前述した方法でラット線維芽細胞3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標として各クローンの力価を測定したところ、AxCANCreを感染したものから前述のPtG-L1、PtG-L2を含む４クローンでウイルスを検出した。一方、AxCANCreを作用させないものはいずれも全くウイルスの産生がみられなかった。VSV-G遺伝子産物の発現が確認できなかった２クローンは力価が低く、またそのウイルス産生がAxCANCre依存的であることから、それらはVSV-Gを遺伝子産物を発現するものの少量であり免疫染色の感度ではとらえられなかったものと考えられる。このうちCreリコンビナーゼを導入したPtG-L1は最大で４×103i.u./mlのウイルスを産生した。PtG-L1以外の３クローンのウイルス産生量は100i.u./ml以下であったため以後PtG-L1に絞りその性質を解析した。
実施例４  PtG-L1より産生されたウイルスベクターの外皮蛋白質の性質
PtG-L1が産生するウイルスのエンペロープは、ウイルスがAxCANCre依存的な産生であることからpCALNLGに由来するVSV-G（Indiana型）であることが期待されるが、それを確かめるために抗VSV-G抗体（Indiana型ATCC VR-1238AF）をATCCより購入し、感染抑制の実験を以下のように行った。
PtG-L1にAxCANCreを作用させて産生させたウイルスサンプルと、その1/10量（v/v）の抗体を混合し４℃で１時間反応させた。その後、前述した方法で3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標として感染に対する影響を調べた（表1）。陰性対象としてはIndiana型VSV-Gとは結合しない抗VSV-G抗体（New Jersey型ATCC VR-1238AF）を用いた。抗VSV-G抗体（Indiana型）を用いたものは1/10では感染が完全に抑制され、その効果は1/1000でも観察された。一方陰性対象である抗VSV-G抗体（New Jersey型）では希釈度に関わらず感染に影響はみられなかった。これらのことからPtG-L1が産生するウイルスのエンペロープは期待通りVSV-G（Indiana型）であることが示された。
0003959117.tif 000003
実施例５  Creリコンビナーゼ導入後のネオマイシン耐性遺伝子の染色体からの脱落
PtG-L1をAxCANCre感染によるCreリコンビナーゼの導入直後、培養液からG418を加えたものと除いたものを用いて両者の生存細胞数を比較した。G418を加えたものの細胞数は９日後に、除いたものの５％以下に減少した。ネオマイシン耐性遺伝子は染色体に存在していれば発現を続けるが、環状DNAとなって染色体から除かれると発現はなくなると考えられる。したがって、AxCANCreを感染させたPtG-L1でネオマイシン耐性がなくなったことは、Creリコンビナーゼによってネオマイシン耐性遺伝子が染色体から除かれたためと思われた。
実施例６  pCALNLG遺伝子のPtG-L1における安定性
PtG-L1でのpCALNLG遺伝子が安定に保持されているかをみるために、PtG-L1に実施例3で使用したlacZゲノムを導入したPtG-L1lacZを液体窒素に保存したものを用いて以下の実験を行った。新たに液体窒素より解凍したPtG-L1lacZ-1とCreリコンビナーゼを導入せずに2カ月間継続して培養したPtG-L1lacZ-2とに対してm.o.i＝30でAxCAHCreによりCreリコンビナーゼを導入した。PtG-L1lacZ-2は２カ月の間継続培養により当初の8.7×1013倍となったものである。以下実施例１と同様に培養液をウイルスストックとし、前述した方法で3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標としてウイルス産生量を調べた。AxCANCre感染後3日目から37℃の培養を継続したものの結果を図5aに、32℃に移したものからの結果を図5bに示す。AxCANCre感染３日目の産生量はやや低いものの、その後の産生量はほぼ同等でありPtG-L1中でpCALNLGおよびgag、pol遺伝子は安定に保持されていると考えられた。
実施例７  PtG-L1からのウイルス産生条件の検討
実施例２から４までの結果よりPtG-L1は当初期待した性質をもつものと思われた。そこで、ウイルス産生の至適条件を見いだすために以下の実験を行った。
PtG-L1lacZからのウイルス産生条件を以下の点（a〜c）から検討し、その際に産生されるウイルスの力価の経時的変化を測定した。
(a)AxCANCreの感染m.o.i（m.o.i＝0、3、10、30、100、300、1000、3000）3、10、1000、3000は一部のみ、
(b)感染時の細胞数（1.5×104、4.5×103、1.5×103）48wellあたり、
(c)AxCANCre感染３日後からの培養温度（32℃、37℃）。
前述した方法で3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標として、各条件におけるウイルスの力価に対する影響を調べたところ以下のような結果が得られた。
(a)AxCANCreの感染m.o.i.は300以上は毒性が強く、生存細胞が再び増えてくるまでウイルス力価は低かった。m.o.i＝30から100程度が最も産生量が多かった。AxCANCre感染させないもの（m.o.i＝０）では、すべての条件でウイルスの産生はみられなかった。
(b)感染時の細胞数は細胞一個あたりのウイルス産生量に大きな影響を与えない。初期細胞が少ないと初期にはウイルス産生量は少ないが、培養を続けて細胞が増えることで初期細胞が多かったものと同等のウイルス産生がみられた。
(c)細胞増殖にとって好ましい37℃とウイルス粒子がより安定であるとされる32℃（Kotani, H., et. al., Hum. Gene. Ther., 5, 19-28, 1994）とでは、最高力価を指標とすると大きな差はみられなかった。32℃のほうが比較的安定したウイルス産生がみられた。
最高ウイルス産生は２×104i.u./mlであった（初期細胞4.5x103cells/48well、m.o.i＝3000、感染後22日目、37℃）。この条件のウイルス産生量の経時的変化を図6aに、同条件で温度を32℃としたもののそれを図6bに示す。最高産生をしたものは当初AxCANCreを高m.o.i.で感染させたためアデノウイルスによる細胞障害性の影響を受けて細胞数が減少していたが、22日目には細胞はコンフルエントになっていた。
実施例８  PtG-L1のgenotypeの詳細な解析
これまで示したようにpCALNLGをFLY細胞にトランスフェクトして、安定な細胞株PtG-L1を樹立することができた。そのウイルス産生は完全にCreリコンビナーゼの導入に依存的であり、産生されるウイルスのエンベロープはVSV-G（indiana型）であった。しかし、質的には当初予想した性質を示すとはいえ、量的にはそのウイルス産生量は最大で2×104i.u./mlと十分なものではなかった。
前述したようにPtG-L1からのウイルス産生量が十分でなかった。そこでこの原因がどこにあるかを調べる目的で以下の実験（a〜c）を行った。
(a)Creリコンビナーゼ導入によるVSV-G遺伝子産物の発現がない細胞がPtG-L1の一部にあるのか、または、アデノウイルスによるCreリコンビナーゼの導入効率に問題があるのか、
(b)X-gal染色によるlacZの安定保持の確認、
(c)免疫染色によるMLVgagの安定保持の確認。
PtG-L1lacZとそのもととなっているFLY細胞および陰性対象として3Y1細胞を48穴プレートに1.5×104（PtG-L1、FLY）、5×103（3Y1）ずつ用意したものを３枚準備した。翌日AxCANCreをm.o.i＝０あるいは30で感染し、５日後固定し、以下の結果を得た。
(a)前述した方法でVSV-Gの免疫染色を行った。AxCANCreの感染の有無にかかわらずFLY、3Y1は全く染色されなかったのに対して、PtG-L1lacZではAxCANCreを感染させたもののみほぼ全ての細胞でVSV-Gの染色がみられた。このことは、PtG-L1は均一な細胞クローンであり、VSV-G遺伝子産物を発現しないものの混入がウイルス産生に影響しているのではないと考えられた。また、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入はほとんど全ての細胞にCreリコンビナーゼを導入することが可能であり、その導入に引き続いてCreリコンビナーゼによる組換えが起きたことが示された。
(b)lacZをコードするウイルスゲノムが安定に保持されていることを調べるために、PtG-L1lacZを前述した方法でlacZによる染色を行った。全ての細胞でlacZによる染色がみられlacZをコードするウイルスゲノムはPtG-L1lacZ中で安定に保持されておりウイルス産生に影響しているのではないと考えられた。
(c)MLVgagp12に対する抗体を産生するハイブリドーマ（CRL-1890）をATCCより購入し、マウス腹水よりモノクローナル抗体を調製したものを用いて前述した方法によりMLVgagp12の検出を行った。3Y1は全く染色されなかったのに対してFLY、PtG-L1lacZは全ての細胞でMLVgagp12の染色がみられた。このことよりMLVgagはPtG-L1lacZ中で安定に保持されておりウイルス産生に影響しているのではないと考えられた。またgag、polは同一の転写開始点をもつことからpolも安定に保持されていると考えられた。
以上の結果よりウイルスを構成するgag、pol、env（VSV-G）およびlacZをコードするウイルスゲノムは安定にPtG-L1に保持されていると考えられ、これらのことがウイルス産生に影響しているのではないと考えられた。
一方、実施例1で記述したPtG-L1以外のウイルス産生が少ない細胞株とPtG-L1とをCreリコンビナーゼ導入後のVSV-G免疫染色で比較するとPtG-L1の方がかなり強く染色されVSV-G遺伝子産物の発現量とウイルス力価との間に相関がみられた。
これらのことより実施例6で記述されたPtG-L1のウイルス産生量が少ない原因は、VSV-G遺伝子産物の発現量がまだ高力価ウイルス産生には十分ではないことによるものと考えられた。
そのためより効率よくVSV-G遺伝子産物の高発現安定細胞株を選択することを目的として、以下のDNA構築物を考案、作製した。
薬剤耐性遺伝子の3'-非翻訳領域にc-fos由来のmRNA短寿命配列を導入し、耐性遺伝子の産生量を減少させることで、相対的に導入したCAGプロモーターからの発現の高い細胞株を効率よく選択できることを目的とした。Creリコンビナーゼ導入後VSV-G遺伝子は耐性遺伝子と同一のプロモーターで転写されるため、このDNA構築物によって選択された細胞株はVSV-G遺伝子産物産生量が高いことが期待される。前述したように薬剤耐性遺伝子の3'-非翻訳領域にc-fos由来のmRNA短寿命配列を導入したDNA構築物（pCALNdLG）を作製し、これと前述しているpCALNLGとを比較しながら以下のような実験を行った。
実施例９  mRNA短寿命配列を含むpCALNdLGの効果とVSV-G遺伝子産物を発現するプレパッケージング細胞株の一次選択
実施例１に記述した方法でpCALNLGあるいはpCALNdLG 10-30μgをFLY細胞へトランスフェクトし、G418を用いて安定発現株を96穴プレートへ移した。
各コロニーは２つに分割し、一方にはAxCANCreをm.o.i.＝10の割合で感染させ、Creリコンビナーゼを導入するとともに培養液からG418を除去した。他方は無処置のまま細胞ストックをとるために培養を続けた。アデノウイルスを感染したものは感染３日後に、上述した方法に従ってVSV-G抗体（P5D4、Sigma V5504）を使用した免疫染色により産生したVSV-G遺伝子産物を検出した。３回の独立したトランスフェクション実験から、pCALMGをトランスフェクトしたもののG418による選択クローン数と比較してpCALNdLGをトランスフェクトしたもののそれは1/3程度であり、薬剤耐性遺伝子のmRNAを短寿命したことで、より厳しい選択が行われていることが示唆された。別の独立した２回のトランスフェクション実験から、PtG-L1と同等以上のVSV-Gの発現がみられたクローンはpCALNLGをトランスフェクトしたものが25クローン中１クローンであったのに対して、mRNA短寿命ネオマイシン耐性遺伝子をもつpCALNdLGをトランスフェクトしたものでは11クローン中３クローンであった。また、全てのクローンでCreリコンビナーゼ発現のためのアデノウイルスを感染させなかったものは、VSV-G遺伝子産物は検出されなかった。これらのことから、薬剤耐性遺伝子のmRNAを短寿命化したことで、より厳しい選択を行うことが可能となり、リコンビナーゼにより誘導されるVSV-G遺伝子産物の発現量の高いクローンを効率よく選択できることが示された。そのためpCALNdLGに絞って同様のトランスフェクションとVSV-G遺伝子産物の検出を行い、合計225クローンから25クローンのCreリコンビナーゼ依存的VSV-G遺伝子産物高発現クローンを得た。今回pCALNLGをトランスフェクトしたものでは、PtG-L1を越えるVSV-G遺伝子産物の発現がみられたものがなかったため、以後pCALNLGの安定細胞株の代表としてPtG-L1を用いることとした。
実施例１０  プレパッケージング細胞株へのレトロウイルスゲノムの導入とCreリコンビナーゼによる各クローンのシュードタイプウイルス産生の測定
Creリコンビナーゼ依存的にVSV-G遺伝子産物を高発現するクローンとしてこれまでに得られたpCALNLGをトランスフェクトしたもの1クローン（PtG-L1）とpCALNdLGをトランスフェクトしたもの25クローンを液体窒素中に保存ると共に、その一部に対してウイルス産生活性を調べるためにβ-galactosidase（lacZ）遺伝子をゲノムにもつウイルスの感染により、それぞれ26クローンをウイルスゲノムを含むプレパッケージング細胞とした。ベクターの各クローンへの導入効率は、上述した方法に従って染色するとほぼ100％であった。その後、各クローンを２つに分け、AxCANCreをm.o.i.＝10の割合で各クローンに感染させた。以後この日を第０日として定義し両者ともに第２日まで37℃で培養を続けリコンビナーゼを作用させた。第３日以降一方は37℃で培養を続け、他方はウイルス粒子がより安定であると言われる32℃で培養した。ウイルスの力価は採取一日前に培養液を交換してほぼ３日間隔で測定した。採取したウイルスサンプルは遠心分離（3000rpm、30分）し、上清を分析の直前まで−80℃で保存した。これらウイルスサンプルの力価は上述した方法に従って3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標として測定した。
測定した26クローンの最高タイターで分類すると、106i.u./ml以上のものが1クローン、106i.u./ml未満から105i.u./ml以上のものが８クローン、105i.u./ml未満から104i.u./ml以上のものが14クローン、104i.u./ml未満から103i.u./ml以上のものが３クローンであった。Creリコンビナーゼを導入しないものは、いずれも全くウイルスを産生しなかった。そのなかでタイターの高かったpCALNdLG １クローン（PtG-S2）とpCALNLG １クローン（PtG-L1）のウイルス産生量の時間的変遷を図７及び図８に示す。
実施例１１  PtG-L1、PtG-S2、PtG-S1より産生されたウイルスベクターの外皮蛋白質の性質
生成したウイルスベクターの外皮蛋白を確認するために、実施例９で選択された３クローンが産生するウイルスサンプルの感染が抗VSV-G抗体（Indiana型）で中和されるかどうか調べた。実施例２で記述した方法で抗体と反応させた後、前述した方法に従って3Y1を用いlacZ遺伝子の発現を指標として感染に対する影響を調べた。その結果を（表２）に示した。
いずれのクローンから産生されたウイルスに対しても抗VSV-G（Indiana型）抗体は完全にウイルスの感染を抑制したが、抗VSV-G（New Jersey型）では変化はなかった。したがって、Creリコンビナーゼの導入によって誘導されたウイルスはpCALNLG、pCALNdLGに由来するVSV-G（Indiana型）を外皮蛋白質として有するシュードタイプウイルスであることが示された。
0003959117.tif 000004
実施例１２  プレパッケージング細胞の産生するネオマイシン耐性遺伝子産物とVSV-G遺伝子産物のウェスタンブロット法による解析、及びその際にmRNA短寿命配列が両者の量に及ぼす影響
プレパッケージング細胞へのCreリコンビナーゼ導入前後で、合成されるネオマイシン耐性遺伝子産物とVSV-G遺伝子産物の量的変化を調べるために以下の実験を行った。
lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-L1、PtG-S2細胞を用い、実施例２と同様にCreリコンビナーゼ導入したもの（導入後）としないもの（導入前に相当）からタンパクサンプルを調製しウェスタンブロッティングを行った（図９）。ネオマイシン耐性遺伝子産物を検出するためには抗ネオマイシン耐性遺伝子産物（5Prime to 3Prime社/フナコシ）を1/1000に希釈し、二次抗体としてbiotinをラベルした一次抗体免疫動物であるウサギIgGに対する抗体を1/1000希釈して用いた。
ネオマイシン耐性遺伝子産物を検出したもの（図９a）では、PtG-L1、PtG-S2共にCreリコンビナーゼ導入しないものでバンドが見られた（1レーンあたり20μg）。PtG-S2でのバンドはPtG-L1でのそれより少なく、PtG-L1のサンプルを1/2ずつ希釈したもの（PtG-L1 Cre(-)と記載のもの、右から１レーンあたり10、5、2.5、1.25μgとなる）と比較するとPtG-S2でのネオマイシン耐性遺伝子産物量はPtG-L1の1/3程度であると考えられた。
VSV-G遺伝子産物を検出したもの（図９b）では、PtG-L1、PtG-S2共にCreリコンビナーゼを導入したもののみでバンドが見られた（１レーンあたり20μg）。Creリコンビナーゼを導入しないものでバンドが全く見られないことは、実施例１０でCreリコンビナーゼを導入しないものからは全くウイルスが検出されなかったことと符号する。PtG-S2のサンプルを1/2ずつ希釈したもの（PtG-S2 Cre(+)と記載のもの、右から１レーンあたり10、5、2.5、1.25μgとなる）と比較するとPtG-S2でのVSV-G耐性遺伝子産物量はPtG-L1の20倍程度であると考えられた。
以上の結果よりPtG-L1、PtG-S2共に期待されたとおりCreリコンビナーゼ導入により、ネオマイシン耐性遺伝子産物からVSV-G遺伝子産物に発現が切り替わることが示された。PtG-L1、PtG-S2はそれぞれ図２に示されるpCALNLG、pCALNdLGを持ち、両者の差はmRNA短寿命配列の有無のみである。ネオマイシン耐性遺伝子産物およびVSV-G遺伝子産物は同一のプロモーターより転写される（図１矢印）ことを考えると、PtG-S2がPtG-L1より約30倍効率よくネオマイシン耐性遺伝子産物よりVSV-G遺伝子産物を産生することは、PtG-S2では転写されたネオマイシン耐性遺伝子mRNAがmRNA短寿命配列により速やかに分解されることによるものと考えられた。このことは実施例９でG418を用いてVSV-G高発現クローンの効率の良い選択を行うことができたことを説明するものである。
実施例１３  サザンブロット法によるCreリコンビナーゼ導入前後のVSV-G発現ユニットの変化の解析
プレパッケージング細胞へのCreリコンビナーゼ導入前後で、トランスフェクションにより導入されたVSV-G発現ユニット（pCALNLG、pCALNdLG）の変化を調べるために、発明の実施の形態の項に記載の方法でサザンブロティングを行った。
lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-L1、PtG-S2細胞を用い、実施例２と同様にCreリコンビナーゼ導入したもの（導入後）としないもの（導入前に相当）を用意した。Creリコンビナーゼ導入４日後にDNA抽出溶液により細胞を可溶化し、プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出を行ってゲノムDNAを調製した。ゲノムDNAをNcoI消化した後にアガロース電気泳動し、キャピラリートランスファーにより陽荷電ナイロンメンブレン（HybondN+ Amesham）にトランスファーした。検出は図１０に示すようにVSV-G翻訳領域中の0.7kbのMluI-NcoI断片を32Pでラベルしたものをプローブとして行った。その結果、期待されたようにCreリコンビナーゼ導入によりVSV-G発現ユニットはPtG-L1では1.2kbから2.0kb、PtG-S2では1.5kbから2.0kbへと変化した。PtG-L1とPtG-S2はCreリコンビナーゼ導入前はmRNA短寿命配列の有無により0.3kbの差があり、導入後は同じ構造をもつこととなる。このことは図１０での想定と一致し、プレパッケージング細胞ではCreリコンビナーゼにより効率よくloxP配列間に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子及びpolyA付加シグナルが切り出され、実施例１２に示したような転写産物の切り替えが行われていることが示された。バンドの濃度よりPtG-S2が含むVSV-G発現ユニットはPtG-L1のそれより多く、PtG-S2が多量のVSV-G遺伝子産物を産生することの一因となっていると考えられる。
実施例１４  プレパッケージング細胞から産生されるシュードタイプレトロウイルス中に自己増殖可能なレトロウイルス（replication competent retrovirus：RCR）が含まれないことの証明
常法（遺伝子治療の基礎技術  羊土社、1996）に従い、lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2細胞から調製された5×106i.u./mlのシュードタイプレトロウイルスをm.o.i＝5でM.dunni細胞に感染させ、４日毎に1/10の継代を３回繰り返した後の培養液を採取し、DEAE-dextran存在下でPG-4 S+L-細胞に加えた。同時に行ったRCRを含むMink4070A細胞からの培養液をPG-4 S+L-細胞に加えたものでは4日後からファーカスが観察されたのに対して、PtG-S2細胞から調製されたシュードタイプレトロウイルス中に含まれている可能性のあるRCRをM.dunniで増幅したものでは８日後でも非感染のものと同様にフォーカスがみられなかった。このことはPtG-S2細胞から調製された5×106i.u./mlのシュードタイプレトロウイルス中にはRCRが含まれていないことを示している。
実施例１５  プレパッケージング細胞から産生されるシュードタイプレトロウイルス中にアデノウイルスが含まれないことの証明
本特許で記述しているプレパッケージング細胞へのCreリコンビナーゼ導入のための方法としては、前述したようにアデノウイルスに限定されるものではないが、高い導入効率で再現性の良い導入法としてはアデノウイルスを用いる方法は極めて有効である。反面、プレパッケージング細胞から産生されるシュードタイプレトロウイルス中にアデノウイルスが含まれることは、臨床応用上避けなければならないことであり以下の方法によりシュードタイプレトロウイルス中にアデノウイルスが含まれているか否かを検討した。
lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2へ、実施例２に記述した方法でアデノウイルス（AxCANCre）によりCreリコンビナーゼを導入した。培養液は毎日交換すると共に、交換時に培養液で入念に３回ずつ細胞を洗い残存している可能性のあるアデノウイルスを除いた。導入４日後（洗浄回数９回）のサンプルから調製された５×104i.u./mlのシュードタイプレトロウイルス中に含まれる可能性のあるアデノウイルスを常法（バイオマニュアルシリーズ４遺伝子導入と発現・解析法、羊上社、1994）により293細胞を用いて検出した。AxCANCreを感染させたものでは、感染12日後までに一つのアデノウイルスが存在する条件でも293細胞の50％以上の変性が見られたのに対して、５×104i.u./mlのシュードタイプレトロウイルス中を感染させたものでは293細胞の変性は見られず、この中にアデノウイルスは存在しないことが示された。
洗浄を行わない条件でアデノウイルスによるCreリコンビナーゼ導入２日後のサンプルを含むものから293細胞を用いて同様にアデノウイルスを検出したところ、293細胞の変性が見られたが、同時に抗アデノウイルス抗体をProtein G Sepharose（Pharmacia）に結合させたものでサンプル中のアデノウイルスを除去することで変性は減弱した。完全な除去にはさらなる至適化が必要であるものの、抗体処理によりアデノウイルスは除去することが可能と考えられた。
実施例１６  VSV-GシュードタイプレトロウイルスはVSV-G遺伝子産物を表面に発現しているパッケージング細胞に対して干渉作用が成立せず、自己感染しうること(1)
VSV-Gシュードタイプウイルスベクターが遺伝子導入時に用いるレセプターは、一般のレトロウイルスとは異なりタンパク質ではなく、細胞表面に豊富に存在するフォスファチジルセリンをはじめとする陰イオン脂質であると考えられている。そのため一般のレトロウイルスとは異なり、パッケージング細胞表面のレセプターはVSV-G遺伝子産物で飽和されておらず、産生されたVSV-Gシュードタイプウイルスベクターが、再度パッケージング細胞に感染する可能性があると考えて以下の実験を行った。
lacZをコードするMLVベクターを含まないPtG-S2細胞を、24穴プレートに３×104cells/wellとなるようにしたものを５枚用意し、翌日１枚のプレートの半分にAxCANCreをm.o.i＝10で感染させた。感染しないもの及び感染後４日まで毎日10及び100i.u./wellのlacZをコードするVSV-GシュードタイプレトロウイルスをCreリコンビナーゼ導入したものしないもの双方に感染させた。その後、上述の方法に従って固定、X-gal染色を行った。いずれのプレートでもCreリコンビナーゼを導入しVSV-Gを発現しているPtG-S2は、Creリコンビナーゼを導入せずVSV-Gを発現していない細胞と同等以上のlacZ遺伝子導入によるX-gal染色が見られた。このことはVSV-G遺伝子産物のパッケージング細胞上の有無によらず、lacZをコードするVSV-Gシュードタイプレトロウイルスはパッケージング細胞に感染することが示唆された。そこで大量のVSV-Gシュードタイプレトロウイルスが存在している条件下でのものとして実施例１７に示す実験を行った。
実施例１７  VSV-GシュードタイプレトロウイルスはVSV-G遺伝子産物を表面に発現しているパッケージング細胞に対して干渉作用が成立せず、自己感染しうること(2)
lacZをコードするMLVベクターを含まないPtG-S2細胞へ、実施例２と同様にCreリコンビナーゼ導入したもの（導入後）としないもの（導入前に相当）を２枚ずつ用意した。Creリコンビナーゼ導入３日後に細胞を継代し、その翌日に別に調製したlacZをコードするMLVベクターを含むVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを、m.o.i＝3で感染させた。継代はコンフルエントになることを避けるために行ったが、このことによりVSV-G発現細胞に大きく影響することが確かめられている。lacZをコードするMLVベクターの感染2日後に各１枚は上述の方法に従って固定、X-gal染色を行い、各１枚は前記に記載の方法でVSV-G遺伝子産物に対する免疫染色を行った。その結果、Creリコンビナーゼの導入の有無によらず、VSV-GシュードタイプウイルスベクターによりlacZ遺伝子が、lacZをコードするMLVベクターを含まなかったPtG-S2へ導入され、X-galによる染色がみられた。このとき免疫染色の結果より、Creリコンビナーゼを導入した細胞のみからVSV-G遺伝子産物が産生されていることが示されている。以上の結果はVSV-Gシュードタイプウイルスベクターは一般のレトロウイルスとは異なり、干渉作用が成立することなく産生細胞自体に感染しうることを示している。
前述したように、これまでにテトラサイクリンを用いてVSV-G遺伝子産物の発現を制御することによりVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの産生細胞を作製できることが報告されているが、それらでは、テトラサイクリンによるVSV-G遺伝子産物の発現制御が完全ではなく、常に産生細胞に再感染可能な102から104i.u./ml程度のVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを産生していることが報告されている。前述した結果は、このようにパッケージング細胞維持時に産生される少量のVSV-Gシュードタイプウイルスベクターが、パッケージング細胞自体に再感染しうる可能性を示唆するものであり、その結果、パッケージング細胞中の染色体は、常にVSV-Gシュードタイプウイルスベクターによる遺伝子導入によって不安定な状態にある可能性が考えられる。一方、プレパッケージング細胞であるPtG-S2は、実施例１０で示したように、Creリコンビナーゼ作用前には全くVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを産生せず、安定したVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを調製することが可能である。
実施例１８  ヘパリンによるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの感染抑制
前述したようにVSV-Gシュードタイプウイルスベクターはパッケージング細胞に再感染することが示されたため、この再感染を抑制することによりVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの回収量を増大することができないかと考えた。再感染を抑制するためには、培養液を環流することでVSV-Gシュードタイプウイルスベクターとパッケージング細胞を分離すること、再感染抑制物質を見いだして回収時に添加することが考えられる。そこで陰荷電高分子であるヘパリンに再感染抑制効果を見いだし、以下の実験でその効果を確かめた。
前記に記載した方法でβ-galactosidase（lacZ）をコードするVSV-Gシュードタイプウイルスベクター及びアンフォロトロピックMLVエンベロープをもつレトロウイルスベクターについてポリブレン（8μg/ml）を加えず、ヘパリン（ノボ・ノルディスク）０、１、３U/mlの条件下での力価測定を行った。結果を図１１に示す。VSV-GシュードタイプウイルスベクターはアンフォロトロピックMLVエンベロープをもつレトロウイルスベクターに比べヘパリンにより著しく力価が減少した。このことはヘパリンにVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの感染抑制効果があるためと考えられた。
実施例１９  ヘパリンによるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの回収量増大
前述したようにヘパリンによるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの感染抑制効果が示されたため、パッケージング細胞からVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを回収する際にヘパリンを添加することにより、再感染を抑制し回収量が増大できるか検討した。
lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2細胞へ実施例2と同様にCreリコンビナーゼ導入し、ヘパリンをCreリコンビナーゼ導入後２あるいは４日後に１U/mlあるいは３U/m1培養液に加えた。産生されてくるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの力価を測定したところ、ヘパリンを加えないものに比べ２から４倍の回収量の増大が見られた。
ヘパリンは抗凝血剤として臨床に用いられている薬剤であり安全性については問題がないと考えられる。また、ヘパリンを希釈するとVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの感染性は回復することより、両者の作用は可逆的であり、超操作時にヘパリンを除くことが可能である。
実施例２０  プレパッケージング細胞PtG-S2の安定性
PtG-S2についてプレパッケージング細胞としての安定性を調べた。
３ヶ月間継続培養したもの及び新たに液体窒素より解凍したlacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2細胞へ実施例１６と同様にCreリコンビナーゼ導入したものとしないものを用意した。産生されてくるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの力価を前記に記載の方法でしたところ両者ともにCreリコンビナーゼ導入しないものでは全くVSV-Gシュードタイプウイルスベクターが検出されなかったのに対して、Creリコンビナーゼを導入したものでは同等のVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの産生が見られた。以上のことはPtG-S2のプレパッケージング細胞としての安定性は高いことを示している。
実施例２１
超遠心によるVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの濃縮
超遠心装置（Beckman L-60E）を使ってVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの濃縮を行った。
2.2×108 i.u.／480mlのVSV-Gシュードタイプウイルスベクターを滅菌した超遠心チューブ（Beckman No.344058）１２本に４０ｍｌずつ分注し、２回に分けて６本ずつをSW28ローターで19500rpm１時間４０分間、濃縮を行った。濃縮後のチューブから上清を除いた後にFCSを含まないDMEMを０．２ｍｌ加え、氷上１時間静置したのちに時々軽く揺らしながら懸濁してさらに氷上1時間放置した。この濃縮により４×107i.u／mlのVSV-Gシュードタイプウイルスベクターが1.5ｍｌ得られた（回収率６９％）。さらにこの濃縮VSV-Gシュードタイプウイルスベクターを超遠心チューブ（Beckman 358650）に入れSW41ローターを用い19500rpm１時間４０分間、濃縮を行った。上清を注射筒で除きFCSを含まないDMEM O.05ｍｌを加え、氷上で懸濁した。この遠心により１×109／ｍｌまで濃縮されたVSV-Gシュードタイプウイルスベクターが0.08ｍｌ得られた。２回目の超遠心の回収率は５３％であり、当初のVSV-Gシュードタイプウイルスベクターの３７％が１×109／ｍｌまでに濃縮された。
実施例２２
VSV-Gシュードタイプウイルスベクターによる導入遺伝子発現の持続
FLY（ヒト線維芽細胞）、3Y1（ラット線維芽細胞）に対して、いずれも核移行シグナルをもつlacZ（beta-galactosidase）をベクターRNAにもつ以下のレトロウイルスベクターをm.o.i.＝１で感染させ、lacZの発現の持続をしらべた。
１．  濃縮したVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクター
２．  濃縮していないVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクター
３．  アンフォトロピックエンベロープをもつレトロウイルスベクター
感染後３日毎に細胞をまきなおし、その一部についてX-galを用いて核に局在しているlacZによる染色をしらべた。感染後１３日までに３者のレトロウイルスベクターによるlacZの発現の持続に差は見られず、VSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクターはアンフォトロピックエンベロープをもつレトロウイルスベクターと同様に安定した導入遺伝子の発現を行うと考えられた。
実施例２３
mRNA短寿命配列を耐性遺伝子中に含むpBabe loxpuro-dの作成
前記の方法で作製したpBabe loxpuro中のピューロマイシン耐性遺伝子とポリＡ付加シグナルの間に存在するNcoIサイトを同制限酵素で切断し、klenow fragmentによる平滑末端化を行った。ここへ前記で述べたchicken c-fosのmRNA短寿命配列（AU Rich Element:ARE）である414bpsの配列をklenow fragmentによる平滑末端化したものを挿入しpBabe loxpuro-dを作成した。
実施例２４
Creリコンビナーゼにより完全長のベクターRNAの遺伝子発現を開始させるVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクターの作成
pBabe loxpuroのマルチクローニングサイトにlacZを挿入したpBabe loxpurolacZをリポフェクションによりPtG-S2へ導入した。導入細胞をピューロマイシンに対する耐性を利用して選択し、選択された細胞をクローニングせずに増やした。その細胞に対してAxCANCreによりCreリコンビナーゼを導入し、産生されてくるVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクターの力価をlacZを指標に測定した。Creリコンビナーゼを導入したものはVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクターの産生を始め、導入5から8日後には２×104ｉ．ｕ．／ｍｌの産生が見られた。X-galを用いてlacZの染色を行ったところ、導入８日後の細胞では染色がみられた細胞が存在したのに対して、導入しない細胞ではlacZの発現が全く見られなかった。このことはベクターRNAにコードされる遺伝子もCreリコンビナーゼにより発現を厳密に制御することでVSV-Gシュードタイプレトロウイルスベクターを産生させることができることを示しており、細胞に対して毒性を示すものなど影響の大きい遺伝子をコードするベクターRNAをもつレトロウイルスベクターの安定した大量調製法を可能とするものである。
実施例２５
プレパッケージング細胞から産生されるシュードタイプレトロウイルス中に自己増殖可能なレトロウイルス（replication competent retrovirus: RCR）が含まれないことの証明（２）
実施例１４で記述した内容を改善し以下の結果を得た。常法（遺伝子治療の基礎技術、羊土社  1996）に従い、lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2細胞から調製された１×107ｉ．ｕ．／ｍｌのシュードタイプレトロウイルスをm.o.i＝５でM.dunni細胞に感染させ、４日毎に１／１０の継代を３回繰り返した後の培養液を採取し、DEAE-dextran存在下でPG-4 S+L-細胞に加えた。同時に行ったRCRを含むMink4070A細胞からの培養液をPG-4 S+L-細胞に加えたものでは４日後からフォーカスが観察されたのに対して、PtG-S2細胞から調製されたシュードタイプレトロウイルス中に含まれている可能性のあるRCRをM.dunniで増幅したものでは８日後でも非感染のものと同様にフォーカスがみられなかった。このことはPtG-S2細胞から調製された１×107ｉ．ｕ．／ｍｌのシュードタイプレトロウイルス中にはRCRが含まれていないことを示している。
実施例２６
プレパッケージング細胞から産生されるシュードタイプレトロウイルス中にアデノウイルスが含まれないことの証明（２）
実施例１５で記述した内容をさらに改善し以下の結果を得た。lacZをコードするMLVベクターを含むPtG-S2へ実施例２で記述した方法でアデノウイルス（AxCANCre）によりCreリコンビナーゼを導入した。培養液は毎日交換すると共に、交換時に培養液で入念に３回ずつ細胞を洗い、洗った際の培養液はピヘットで完全に吸い取ることで残存している可能性のあるアデノウイルスできる限り除いた。導入３から５日後（洗浄回数６回以上）のサンプルから調製された２×106ｉ．ｕ．／ｍｌのシュードタイプレトロウイルス中に含まれる可能性のあるアデノウイルスを常法（バイオマニュアルシリーズ4遺伝子導入と発現・解析法、羊出社、1994）により293細胞を用いて検出した。AxCANCreを感染させたものでは、一つのアデノウイルス感染粒子が存在する条件でも感染１２日後までには293細胞の５０％以上の変性が見られたのに対して、２×106ｉ．ｕ．／ｍｌのシュードタイプレトロウイルス中を感染させたものでは293細胞の変性は一切見られず、この中にアデノウイルスは存在しないことが示された。
またこのアデノウイルスベクターを１×106ｉ．ｕ．／ｍｌ含む培養液をウサギポリクローナル抗アデノウイルス抗体（東京大学医科学研究所ウイルス研究部白木先生より譲渡）とProtein G Sepharose（Pharmacia）とを結合させたもので４度１時間処理後に遠心しその上清を回収して上記と同様に293細胞による検出を試みた。感染１２日後までに一切293細胞の変性は見られず、この抗体により培養液中に含まれるアデノウイルスベクターは完全に除去されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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