(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID No.１に記載のヌクレオチド配列を有するエキスポートキャリヤー遺伝子lysEを過剰発現させることを特徴とする、リジンを産生するコリネバクテリウムグルタミクムの培養培地中に増加したリジンを蓄積させる方法。
【請求項２】
エキスポートキャリヤーlysEの遺伝子発現を、遺伝子コピー数の増加によって高める、請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子コピー数を、エキスポート遺伝子LysEを遺伝子構築物中に組み込むことにより増加させる、請求の範囲２記載の方法。
【請求項４】
リジンを産生するコリネバクテリウムグルタミクムを、lysEエキスポート遺伝子含有遺伝子構築物で形質転換する、請求の範囲２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
形質転換に、対応するアミノ酸合成に関与する酵素を制御しないコリネバクテリウムグルタミクムを使用する、請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
形質転換に、主要物質代謝の代謝物の高められた割合を含有するコリネバクテリウムグルタミクムを使用する、請求の範囲４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
lysEエキスポート遺伝子をコリネバクテリウムグルタミクムから単離する、請求の範囲２ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
SEQ ID No.２に示されるアミノ酸配列を有するLysEリジンエキスポートキャリヤーをコードするエキスポート遺伝子lysE。
【請求項９】
SEQ ID No.１に記載のヌクレオチド1016ないし1726のヌクレオチド配列を有する、請求の範囲８記載のエキスポート遺伝子。
【請求項１０】
請求の範囲８または９のいずれかに記載のエキスポート遺伝子を含有する遺伝子構築物。
【請求項１１】
請求の範囲８または９のいずれかに記載のエキスポート遺伝子又は請求の範囲10記載の遺伝子構築物を有するベクター。
【請求項１２】
複製可能な形で、請求の範囲８または９のいずれかに記載のエキスポート遺伝子又は請求の範囲10記載の遺伝子構築物を有する形質転換された細胞。
【請求項１３】
請求の範囲11記載のベクターを有する、請求の範囲12記載の形質転換された細胞。
【請求項１４】
コリネバクテリウム属に属する、請求の範囲12又は13記載の形質転換された細胞。
【請求項１５】
形質転換された細胞へ移行したlysEエキスポート遺伝子によりコードされるエキスポートキャリヤーによって細胞から排出されるリジンの合成に関与する酵素が制御されない、請求の範囲12ないし14のいずれかに記載の形質転換された細胞。
【請求項１６】
主要な物質代謝の代謝物の高められた割合を含有する、請求の範囲12ないし15記載の形質転換された細胞。
【請求項１７】
６つの膜貫通ヘリックスを有し、lysEエキスポート遺伝子によってコードされ、そしてSEQ ID No.２に示されるアミノ酸配列を有するリジンエキスポートキャリヤーLysE。
【請求項１８】
コリネバクテリウムグルタミクムのリジン産生の増加に、SEQ ID No.１に記載のヌクレオチド配列を有するlysEエキスポート遺伝子を使用する方法。
【請求項１９】
遺伝子コピー数の増加により遺伝子発現が増加しているlysEエキスポート遺伝子を使用する、請求の範囲18記載の方法。
【請求項２０】
リジンを産生するコリネバクテリウムグルタミクムを、lysEエキスポート遺伝子を含有する遺伝子構築物で形質転換する、請求の範囲18又は19記載の使用方法。
【請求項２１】
コリネバクテリウムのlysEエキスポート遺伝子を使用する、請求の範囲18ないし20のいずれかに記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、請求の範囲１ないし２０記載のアミノ酸の微生物による産生方法、請求の範囲２１ないし２６記載のエキスポート（export）遺伝子、請求の範囲２７及び２８記載の調節遺伝子、請求の範囲２９及び３０記載の遺伝子構造（遺伝子構築物）、請求の範囲３１ないし３３記載のベクター、請求の範囲３４ないし４０記載の形質転換細胞、請求の範囲４１及び４２記載の膜たん白質並びに請求の範囲４３ないし４８記載の使用方法に関する。
アミノ酸は、極めて産業上重要であり、アミノ酸の使用は多様である：すなわちたとえばＬ-リジン、たとえばＬ-スレオニン、及びＬ-トリプトファンは飼料添加物として、Ｌ-グルタミン酸塩は調味料として、Ｌ-ロイシン及びＬ-チロシンは医薬業界で、Ｌ-アルギニン及びＬ-イソロイシンは薬剤として、あるいはＬ-グルタミン酸塩及びＬ-フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化合物として必要とされる。
この種々のアミノ酸製造の好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な粗物質を使用することができるからである。微生物としてたとえばコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacteriumglutamicum）及びその同属菌ｓｓｐ．フラブム（flavum）及びｓｓｐ．ラクトフェルメンタム（lactofermentum）（Liebl等、Int J System Bacteriol（1991）41:255-260）及び大腸菌及びその同属菌を使用する。
しかしこの菌は、一般にアミノ酸を増殖に必要な量でしか産生しないので、過剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸のバイオ合成が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコントロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である。この方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、バイオ合成の有効な調節を遮断するために使用する。Ｌ-チロシン-及びＬ-フエニルアラニン相似体に耐性であるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている（特開昭５１−１９０３７号及び第５３−３９５１７号公報）。同様にＬ-リジン-又はＬ-スレオニン相似体に対して耐性の細菌をコントロールメカニズムを阻害するために使用することが記載されている（ヨーロッパ特許第０２０５８４９号明細書、英国特許公開第２１５２５０９号公報）。
更に、組換えＤＮＡ-法によって産生された微生物も公知である。この際、同様にバイオ合成の調節は、もはやフィードバック阻害しない鍵酵素をコードする遺伝子をクローン化し、発現することによって抑えられる。したがって、たとえばプラスミド-コードされたフィードバック-耐性アスパルタートキナーゼを有する組換えられた、Ｌ-リジン産生細菌は公知である（ヨーロッパ特許第０３８１５２７号明細書）。同様にフィードバック−耐性プレフエナートデヒドロゲナーゼを有する組換えられた、Ｌ-フエニルアラニン産生細菌も記載されている（特開昭６１−１２４３７５、ヨーロッパ特許第０４８８４２４号明細書）。更にアミノ酸合成のフィードバックセンスティブ酵素をコードしない遺伝子の過発現によっても増加されたアミノ酸収量が得られる。したがってリジン産生は、ジヒドロジピコリナートシンターゼの高められた合成によって改良される（ヨーロッパ特許第０１９７３３５号明細書）。スレオニンデヒドラターゼの高められた合成も改良されたスレオニン産生が得られる（ヨーロッパ特許公開第０４３６８８６号公報）。
アミノ酸産生を増加するための他の試みは、主要物質代謝の細胞の第一代謝物質の改良された供給に向けられる。したがって組換え法によって得られる、トランスケトラーゼの過発現が、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン、又はＬ-フエニルアラニンの改良された生成物産生を可能にすることは公知である（ヨーロッパ特許公開第０６００４６３号公報）。更に、コリネバクテリウム中でのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の還元は、芳香族アミノ酸の改良された産生を生じる（ヨーロッパ特許第０３３３１１４５号公報）。
生産性を増加するための多様な試みは、アミノ酸のサイトゾル合成の制限を抑えることに全部が向けられている。しかし他の制限としては、原則的に細胞内で産生されるアミノ酸の培地へのエキスポートも挙げられる。したがって個々の出発物、これらのエキスポート及びそれによってアミノ酸産生の経済上の効果を改良することがある。コリネー細菌での細胞透過性をビオチン欠乏、洗剤-又はペニシリン処理によって増加する。しかしこの排出を助けることは専らグルタミン酸塩産生の場合に必要であり、一方他のアミノ酸の合成はこの方法で改良されない。化学的又は物理的変異によって分泌系の活性が高められる菌株も増殖する。これによってたとえば改良された分泌活性によって特にＬ-リジン産生に適するコリネバクテリウムグルタミクム-菌株が得られる（ドイツ特許第４，２０３，３２０号明細書）。
全体として、細胞内で産生されたアミノ酸の分泌を増加するための、従来すべて行われた試みからは、アミノ酸の増加された流出が選ばれた適応しない又は非特異的な方法に基づいてたまたましか達成されないことが分かる。ドイツ特許出願第１９５２３２７９．８−４１号明細書中に唯一、細胞内で産生されたアミノ酸の分泌が極めて適切に増加され、その際アミノ酸のインポート（import）をコードする遺伝子の発現が増加することが記載されている。細胞インポートたん白質はアミノ酸のエキスポートに対して使用するという知見に基づくこの処理法と、微生物は本来過剰でないアミノ酸を産生し、分解するという事実から、アミノ酸トランスポート（輸送）に特異的なエキスポート遺伝子又は-たん白質が全く存在しないのではなく、細胞からアミノ酸が他のエキスポートシステムによって分泌されることが示唆される。
従来公知のエキスポートシステムは、有毒な金属イオン、毒性抗生物質及び高分子毒物をエキスポートする。このエキスポートシステムは比較的に複雑に構成される：一般に膜たん白質は細胞質膜に関与するがこの膜はエキスポートの部分反応にしか作用しないので、恐らく輸送に対して、更に細胞質外サポートたん白質が必要である（Dinh, T. 等、A family of extracytoplasmic proteins that allow transport of large molecules across the outer membranes of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 1994, 176: 3825-3831）．更に、細胞外たん白質に対するsec-依存エキスポートシステムに於て、少なくとも６つの異なるたん白質成分がエキスポートに必要であることは知られている。従来の技術から、アミノ酸のエキスポートに特有の、しかし従来知られていないシステムも同様に種々のたん白質成分から成るか又は種々の遺伝子がアミノ酸のエキスポートに適することが示唆される。このことに関しては、Vrljic等によって記載された（J Bacteriol（1995）177: 4021-4027）、リジンエキスポートに欠点のある種々の変異が指摘される。
今や、驚くべきことには、本発明者はアミノ酸のエキスポートに夫々たった１つの特異的遺伝子が原因となっていることを見い出した。したがって本発明によれば、対応するアミノ酸を産生する微生物のエキスポート遺伝子-発現及び（又は）エキスポートキャリヤー-活性が適切に増加するアミノ酸の微生物による産生方法が初めて実施される。この処理方法から生じる増加されたエキスポートキャリヤーの発現又は活性は、高められた分泌割合を生じるので、対応するアミノ酸のエキスポートは増加する。この様に変化された微生物は培地中に対応するアミノ酸の増加された割合を蓄積する。
エキスポートキャリヤー活性の増加のために、特にアミノ酸を産生する微生物の内因性遺伝子活性を高める。酵素活性の増加は、たとえば触媒中心の変化によって基質の変換が増加するか又は酵素阻害剤の作用を中止するかで達成される。高められた酵素活性を、酵素合成の増加によって、たとえば遺伝子増幅によって又は酵素-バイオ合成を抑制するファクターの流出によってを引き起こすことができる。内因性遺伝子エキスポートキャリヤー活性を、内因性遺伝子エキスポート遺伝子の変異によって増加するのが好ましい。この様な変異は、古典的な方法に従って、たとえばＵＶ-照射もしくは突然変異を引き起こす化学物質によって生じさせられるか又は遺伝子工学法、たとえば欠失、挿入及び（又は）ヌクレオチド交換によって任意に得られる。
エキスポート遺伝子-発現は遺伝子複写数（遺伝子コピー数）の増加によって及び（又は）エキスポート遺伝子-発現に積極的に影響を与える調節フアクターによって増加される。したがって調節要素の強化は、特に転写シグナルが増加するように転写レベルで行われる。これはたとえば構造遺伝子に連結するプロモーター配列の変化によってプロモーターをその有効性の点で増加するか又はプロモーターを有効なプロモーターによって完全に交換することによって行うことができる。転写の強化はエキスポート遺伝子に組み込まれた調節遺伝子の対応する影響によって、たとえば下記に示すように行うこともできる。しかしその他に翻訳の強化は、たとえばｍ-ＲＮＡの安定性を改良することでも起り得る。
遺伝子複写数の増加のために、遺伝子構造又はベクター中にエキスポート遺伝子を、好ましくは低い複写数を有するベクター中に組み込む。遺伝子構造は、特にエキスポート遺伝子に属する調節遺伝子配列、好ましくは遺伝子発現を強化する配列を含有する。調節遺伝子配列は、特に表１に記載されたアミノ酸配列又はその対立変種をコードするヌクレオチド配列又は表２によるヌクレオチド９５４〜８２のヌクレオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する。対立変種又は同一に作用するＤＮＡ配列は、特に機能誘導体を含む。この誘導体はヌクレオチドの欠失、挿入及び（又は）置換によって対応する配列から得られる。しかしこの場合、調節たん白質活性又は-機能が保たれるか又はそのうえ増加する。したがって調節遺伝子配列の変異によって、調節たん白質の結合の効果は調節すべきエキスポート遺伝子のＤＮＡに影響を与え、それによって転写は強化され、遺伝子発現は増加する。更にエキスポート遺伝子に調節配列としていわゆる“エンハンサー”が組み込まれる。これはＲＮＡ-ポリメラーゼとＤＮＡとの改良された交換作用によって高められたエキスポート遺伝子発現も生じさせる。
遺伝子構造中にエキスポート遺伝子を組み込むために、エキスポート遺伝子をコリネバクテリウム属の微生物-株から単離し、エキスポート遺伝子を有する遺伝子構造で対応するアミノ酸を産生する微生物-株、特にコリネバクテリウムを形質転換する。対応する輸送遺伝子の単離及び形質転換は慣用方法に従って行われる：コリネバクテリウムからの輸送遺伝子の単離及びクローニングの場合、たとえばエキスポート欠損変異の相同相補性の方法が適する（J Bacteriol（1995）177: 4021-4027）。構造遺伝子の直接のクローニングが起り得ない場合、ベクター配列の輸送遺伝子への挿入が先ず行われ、次いで“プラスミド-レスキュー”によって不活性フラグメントの形で単離することができる。本発明による方法に特にＣ．グルタミクム（glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２又はＣ．グルタミクムssp．フラバム（flavum）ＡＴＣＣ１４０６７又はＣ．グルタミクムssp.ラクトフエルメンタム（lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９が適する。遺伝子の単離及び公知のベクターとのその試験管内組換え後、（Appl Env Microbiol（1989）55: 684-688; Gene102（1991）93-98）、形質転換がアミノ酸を産生する菌株中でエレクトロポレーションによって（Liebl等（1989）FEMS Microbiol Lett 65: 299-304）又は接合（Schaefer等（1990）J Bacteriol 172: 1663-1666）によって行われる。転写に、低い複写数を有するベクターを使用するのが好ましい。宿主細胞として、対応するアミノ酸の合成で調節されない及び（又は）主要物質代謝-代謝物質の高められた割合を含有するアミノ酸産生物を使用するのが好ましい。
単離後、ヌクレオチド配列を有するエキスポート遺伝子が得られ、これは表３に記載のされたアミノ酸配列、すなわち、以下のSEQ ID No.２：
0003942194.tif 000002
0003942194.tif 000003
に記載のアミノ酸配列、
又はその対立変種をコードするか又は表２によるヌクレオチド配列、すなわち、以下のSEQ ID No.１：
0003942194.tif 000004
0003942194.tif 000005
0003942194.tif 000006
0003942194.tif 000007
0003942194.tif 000008
に記載のヌクレオチド配列（なお、SEQ ID No.１のヌクレオチド配列は、表２のヌクレオチド配列の相補鎖の形態で示してある）のうちのヌクレオチド1016ないし1725のヌクレオチド配列又は実質的同一に作用するDNA配列を有する。この場合も対立変種又は同一に作用するＤＮＡ-配列は、特に調節配列で上述した意味中に含まれる。このエキスポート遺伝子を本発明による方法で使用するのが好ましい。
連結されるプロモーター含有又は不含あるいは組み込まれる調節遺伝子含有又は不含エキスポート遺伝子に１種又はそれ以上のＤＮＡ-配列を前もって及び（又は）後から連結し、その結果として遺伝子は遺伝子構造中に含有される。
エキスポート遺伝子を含有し、−−上述した様に−−アミノ酸-産生物の形質転換に適するプラスミド又はベクターがエキスポート遺伝子のクローニングによって得られる。形質転換によって得られる細胞−−これはコリネバクテリウムの形質転換された細胞であるのが好ましい−−は、遺伝子を複製可能な形で、すなわち染色体上での更なる複写形で得られる。この際遺伝子複写は相同組換えによってゲノムの任意の位置に及び（又は）プラスミドもしくはベクター上に組み込まれる。
未公知の機能の膜-たん白質をコードする多くの配列は、知られている。エキスポート遺伝子、たとえば表２によるヌクレオチド１０１６〜１７２５のヌクレオチド配列を有する。又は対応するエキスポートたん白質、たとえば表１によるアミノ酸配列を有するものを本発明により供給することによって、現在、膜たん白質−−その機能はアミノ酸の輸送である−−を配列比較して同定することができる。次いでこれによって同定されたエキスポート遺伝子を、アミノ酸産生の改良のために本発明の方法に従って使用することができる。
従来の技術から公知の膜たん白質は、一般に１２個、部分的に４個の経膜らせんを有する。今や驚くべきことにアミノ酸のエキスポートに特有の適する膜たん白質は６個の経膜らせん（膜貫通ヘリックス）を有することを見い出した（たとえば表３に記載されたエキスポートたん白質のアミノ酸配列参照、この際６個の経膜範囲は下線を引くことによって見分けられる。）。したがってこの場合膜たん白質の従来まだ開示されておらず、同時に新しいクラスが存在する。
実施例
ａ）エキスポート遺伝子のクローンニング化及びコリネバクテリウムグルタミクムからの調節剤のクローンニング
Ｃ．グルタミクムＲ１２７（FEMS Microbiol Lett（1989）65: 299-304）から染色体ＤＮＡを、Scharzer等（Bio/Technology（1990）9: 84-87）に記載されている様に単離する。これを制限酵素Sau 3Aで切断し、サッカロース-勾配-遠心分離、たとえばSambrook等（Molecular Cloning, A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbour Laboratory Press）に記載されている様に分離する。個々の分画をゲル電気泳動でその大きさについて分析し、約６〜１０ｋｂのフラグメントサイズの分画をベクターｐＪＣｌとの連結に使用する。これにベクターｐＪＣｌをＢａｍＨＩで線状化し、脱ホスホリル化する。
そのうちの５ngを染色体６−１０ｋｂフラグメントの２０ngと連結する。全連結物を用いて、エキスポート欠損変異ＮＡ８（J Bacteriol（1995）177: 4021-4027）をエレクトロポラレーション（FEMS Microbiol Lett（1989）65: 299-304）によって形質転換する。形質転換体をＬＢＨＩＳ（FEMS Microbiol Lett（1989）65:299-304）上で１ｍｌあたりカナマイシン１５μｇを用いて選択する。この形質転換体に広範なプラスミド分析を行う。この際全体で４５００の得られたクローンのうちの２００を個々に培養し、そしてそのプラスミド割合及び-サイズを測定する。検査されたカナマイシン-耐性クローンのほぼ半分は、平均して８ｋｂの平均サイズの挿入断片を有する組み換えプラスミドである。したがって遺伝子バンク中でのＣ．グルタミクムに由来する各Ｘ-任意の遺伝子の存在については０．９６の確率になる。４５００の得られた形質転換体を、リジン分泌が再び獲得されたことについてすべて個々に調べる。更にVrljicにより示されたシステムをコリネバクテリウムグルタミクム中でＬ-リジン分泌の誘発のために使用する（J Bacteriol（1995）177: 4021-4027）。いわゆる鉱物培地-指示プレートを調製する。このプレートは１ｌあたり、２０ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、５ｇ尿素、１ｇＫＨ2ＰＯ4、１ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．２５ｇ  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、４２ｇモルホリノプロパンスルホン酸、１ｍｌ  ＣａＣｌ2（１ｇ／１００ｍｌ）、７５０ｍｌ蒸留水、１ｍｌ  Ｃｇ微量-塩、１ｍｌビオチン（２０ｍｇ／１００ｍｌ）、ｐＨ７．４％グルコース１．８ｍｇプロトカテク酸、１ｍｇ  ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１ｍｇ  ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ  ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．０２ｍｇ  ＣｕＳＯ4、０．００２ｍｇ  ＮｉＣｌ2６Ｈ2Ｏ、２０ｇ寒天、及び１０7細胞／ｍｌリジン-栄養要求体Ｃ．グルタミクム変異体４９／３を含有する。本来の４５００の形質転換体を、すべて個々につまようじを用いて指示プレート上に置く。夫々本来の非分泌ＮＡ８（J Bacteriol（1995）177: 4012-4027）及び出発菌株Ｒ１２７のコントロールを併用する。リジン分泌を誘発するために更に５mＭ  Ｌ-メチオニンのみを含有する２つのプレート夫々に平行して植菌する。指示プレートを３０℃でインキュベートし、１５，２４及び４８時間後に調べる。全体で２９のクローンが得られ、これはメチオニンが添加された指示-プレート上に指示菌株４９／３による増殖域を示す。クローンを分離し、ついで新たに、上述のように増殖域が再び維持されることについて調べる。この方法で２つのクローンＮＡ８ｐＭＶ８−５−２４及びＮＡ８ｐＭＶ６−３が得られ、これはリジンを分泌する能力を再び獲得する。これらのクローンによって、プラスミド調製を、Sohwarzer等（Bio/Technology（1990）9: 84-87）に記載されているように実施する。ＮＡ８中での再形質転換によってＬ-リジン分泌のプラスミドに関係する作用を確認する。２つのプラスミドに制限分析を行う。プラスミドｐＭＶ８−５−２４は、８．３ｋｂの挿入、ｐＭＶ６−３は９．５ｋｂの挿入を有する。挿入の物理的地図を図１に示す。ｂ）リジンエキスポートを再構成するＤＮＡ-フラグメントのサブクローニングプラスミドｐＭＶ６−３の挿入によって、特定の制限切断部位の利用で個々のサブクローンを調製する。３．７ｋｂ  ＸｈｏＩ-Sall-フラグメント、���．３ｋｂＢａｍＨＩ-フラグメント及び７．２ｋｂ  ＢａｍＨＩ-フラグメントを対応する切断され、かつ処理されたベクターｐＪＣｌ（Mol Gen Genet（1990）220: 478-480）と連結する。連結生成物を用いて、直接Ｃ．グルタミクムＮＡ８を形質転換し、形質転換体を上述の様にリジン分泌が再び獲得されることについて調べ、サブクローンの存在をプラスミド調製及び制限分析によって確認する。この方法で最も小さいサブクローンとしてプラスミドｐＭＶ２−３を有する菌株が得られる（図１）。リジンエキスボートを促進するこのフラグメントは、ｐＭＶ６−３からの２．３ｋｂ  ＢａｍＨＩ-フラグメントを挿入として含有する。
ｃ）リジンエキスポート遺伝子lysE及びその調節lysGの配列
２．３ｋｂ  ＢａｍＨｉ-フラグメントのヌクレオチド配列化を、Sanger等のジデオキシ-チェインターミネーター法に従って行い（Proc Natl Acad Sci米国（1977）74: 5463-5467）、配列化反応を自動読取り配列化キット（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いて行う。電気泳動分析は自動レーザー蛍光ＤＮＡ配列化装置（A.L.F.）（Phamacia-LKB, Piscataway, NJ. 米国）を用いて行われる。得られたヌクレオチド配列を、ドイツ癌中央研究所（ハイデルベルグ）のプログラムパケットＨＵＳＡＲ（リリース３．０）を用いて分析する。ヌクレオチド配列及び分析の結果を表２に再度記載する。分析は配列されたＤＮＡ断片上に２つの完全にあいている解読わく（ＯＲＦ）を生じる。ＯＲＦ１は長さ２３６アミノ酸を有するたん白質をコードし、ＯＲＦ２は長さ２９０アミノ酸のたん白質をコードする。ＰＲＦ１に由来するたん白質は、疎水性アミノ酸の集積を示し、たとえばこれは耐膜性たん白質にとって特有である。プログラムＰＨＤ．ＨＴＭ（Protein Science（1995）4: 521-533）を用いる疎水性及び親水性アミノ酸の分布の詳細な分析を、表３に示す。これからたん白質が６つの疎水性らせん領域を有し、これは膜を通過することが分る。したがってこのたん白質はアミノ酸Ｌ-リジンの求められたエキスポーターである。それ故に対応する遺伝子を以下lysEと表示する。対応して表２中に印をつけた。ＯＲＦ２をＯＲＦ１に対向して転写する。配列分析は、ＯＲＦ２が１つのファミリーとして集められた調節遺伝子と高い同一性を有することを示す（Ann Rev Microbiol（1993）597-626）。このファミリーの遺伝子は、種々の異化又は同化処理に関与する遺伝子の発現を積極的に調節する。それ故に以下、ＯＲＦ２をlysG（Govern＝調節する）として表示する。この相関性の故に、及びlysEはlysGとともにしかクローン化（ａ）参照）、サブクローン化（ｂ）参照）されないので、lysGはlysEの調節剤であり、したがってリジンエキスポートにも同様に関与する。遺伝子lysG及びこれに由来するアミノ酸配列を表２又は表１にも示す。
ｄ）大腸菌に由来する未公知膜たん白質を配列比較によって同定
配列された範囲に由来するたん白質を機能に組み込むために、表３による確立された配列を用いてすでに存在する配列バンクで行う。対応してＣ．グルタミクムからのリジンエキスポートのアミノ酸配列をドイツ癌中央研究所（ハイデルベルグ）でプログラノパケットＨＵＳＡＲ（リリース３．０）の使用下で、すべてそこに保存されたＤＮＡ配列に由来するたん白質-配列と比較する。大腸菌からの従来未公知の機能の唯一配列に対して３９．３％同一アミノ酸の高い相同性及び６４．９％類似アミノ酸が生じる。比較を図２に示す。大腸菌に由来する従来から特有ではない、あいている解読わくは、この方法によってアミノ酸エキスポート遺伝子として同定される。
ｅ）細胞内蓄積Ｌ-リジンの増加されたエキスポート
菌株Ｃ．グルタミクムＮＡ８（J. Bacteriol（1995）177: 4021-4027）を、プラスミドｐＭＶ２−３で形質転換し、菌株のＬ-リジン分泌を比較する。これにＮＡ８及びＮＡ８ｐＭＶ２−３を、Vrljic等（J. Bacteriol（1995）177: 4021-4027）に記載されている様複合培地中で増殖し、醗酵培地ＣＧＸＩＩ（J  Bacteriol（1993） 175: 5595-5603）に夫々別々に植菌する。培地は更に５ｍＭ  Ｌ-メチオニンを含有し、細胞内Ｌ-リジンバイオ合成を誘発する。１４０Ｕｐｍで反応振とう器で、３０℃で２４時間培養した後、細胞内部及び外部Ｌ-リジン測定を行う。細胞内部測定のために、シリコーンオイル遠心分離を行う（Methods Enzymology LV（1979）547-567）；アミノ酸の測定は、高圧液体クロマトグラフィーによって行われる（J Chromat（1983）266: 471-482）。この測定は、図３に示すように、種々の時間で行われる。したがって使用された方法に対応して、ためられた細胞内部Ｌ-リジンはｐＭＶ２−３によってますます分泌され、蓄積される。対応して、予期に従って細胞内に存在するＬ-リジンは著しく減少する。したがって検知されかつ作図されたエキスポーターの利用はＬ-リジン産生を対応して改良するための方法である。
ｆ）lysE又はlysEGによるＬ-リジンの増加された蓄積
ｐＪＣｌ中に配列された２３７４ｂｐ  ＢａｍＨＩ-フラグメントを含有するサブクローンｐＭＶ２−３（図１参照）によって、配列情報に対応してlysEを有する１１７３ｂｐ  PvuII-HindIIフラグメントをｐＺｌ（Appl EnV Microbiol（1989）55: 684-688）中で連結し、プラスミドplysEが得られる。このプラスミド及びlysE lysGを有するプラスミドｐＭＶ２−３を、電気泳動によってＣ．グルタミクム菌株ｄ中に入れ、その際染色体域は欠失する。得られた菌株Ｃ．グルタミクムｄ  ｐＭＶ２−３、Ｃ．グルタミクムｄ  ｐｌｙｓＥ，C.グルタミクムｐＪＣｌをe）に示した様に先ず複合培地中で増殖し、次いで産生最小培地ＣＧＸII中で４％グルコースと５ｍＭＬ-メチオニンと共に培養し、プローブを蓄積されたＬ-リジンの測定のために取り出す。図４から明らかな様に、LysElysGによってコントロールに比してリジン蓄積の増加が得られる。plysEはこの方法によって、１３．２ｍＭ  Ｌ-リジンに対して極めて増加する蓄積4.8を生じる。
表及び図の説明
表１：ＤＮＡ-結合たん白質に典型的ならせん-ターン-らせんモチーフを有するコリネバクテリウム  グルタミクムからのリジンエキスポーター調節剤のアミノ酸配列。
表２（３頁）：Ｃ．グルタミクムからの、Ｌ-リジンエキスポーター及びリジンエキスポート-調節剤をコードする領域のヌクレオチド配列。
表３：同定された経膜らせんＴＭＨ１〜ＴＭＨ６を有する、コリネバクテリウムグルタミクムからのリジンエキスポーターのアミノ酸配列。
図１：ｐＭＶ６−３及びｐＭＶ８−５−２４中でクローニングによって得られたＤＮＡ-フラグメント−−これはリジン分泌を生じさせる−−、並びにｐＭＶ６−３から産生したサブクローンｐＭＶ２−３−−これはリジン分泌を生じさせ、配列化もする−−。B, BamHI; Sm, SmaI; Sc, SacI; Sl, SalI; H, HindII; X, XhoI.
図２：Ｃ．グルタクムからのLysEの導かれたアミノ酸配列（上段）と大腸菌からの従来知られていない機能の遺伝子生成物−−これはこれによってエキスポートキャリヤーとして同定される−−（下段）との比較。
図３：Ｃ．グルタミクムＮＡ８を有するｐＭＶ２−３による増加されたリジンエキスポート。上段；リジンの僅かなないし約１５０ｍＭの分泌及び細胞内蓄積を有するコントロール。下段；ｐＭＶ２−３によって生じる高い分泌と約３０ｍＭの細胞内のほんの僅かな蓄積。
図４：LysElysG（ｐＭＶ２−３）によるＣ．グルタミクム中でのリジン蓄積の増加（中央カーブ）、及びlysE（plysE）に起因する蓄積（上側カーブ）。
0003942194.tif 000009
0003942194.tif 000010
0003942194.tif 000011
0003942194.tif 000012
0003942194.tif 000013
【図１】
0003942194.tif 000014
【図２】
0003942194.tif 000015
【図３】
0003942194.tif 000016
【図４】
0003942194.tif 000017