(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式：
Ａ−Ｌ−Ｂ
〔式中、Ａは、保護ペプチドであり；
Ｂは、目的ペプチドであり；そして
Ｌは、リンカーペプチドであって、そのＣ−末端部分に配列：X1−X2−(Pro，Lys又はArg)−Arg（式中、X1は Asp 及び Glu 以外の任意のアミノ酸であり、そしてX2は Pro 以外の任意のアミノ酸である）を有し、そしてＮ−末端に〔(His)4−Pro−Gly〕n（式中、ｎは１〜６である）の配列を有する、
により表わされるキメラタンパク質。
【請求項２】
前記Ｎ−末端部分のアミノ酸配列と前記Ｃ−末端部分のアミノ酸配列との間に１〜５個の任意のアミノ酸が存在する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
X1がArg、Lys又はHisであり、そしてX2がHis又はPheである請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
Ａがアミノ酸配列；Pro−Arg、Arg−Arg及びLys−Argを含有しないポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
Ａがアミノ酸配列；Pro−Arg、Arg−Arg又はLys−Argを含有するポリペプチドである場合、Ａ中に該アミノ酸配列を含有しないように該アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
Ａが220アミノ酸残基以下のポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
Ａが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼのＮ−末端側の１位のアミノ酸から97位、117位又は139位のアミノ酸までのペプチドである、請求項６記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
Ａ中のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されている、請求項１〜７のいずれか１項記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記他のアミノ酸がセリン残基である、請求項８記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
Ｂがヒト副甲状腺ホルモン又はその誘導体であって、前記誘導体が、ヒト甲状腺ホルモンのＮ−末端の１位又は３位のアミノ酸残基から、31位、34位、37位、38位もしくは84位のアミノ酸残基までの配列を有する断片、又はこれらのＣ−末端にGlyを付加した断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
ＢがGLP-1又はその誘導体であって、前記誘導体が、GLP-1のＮ−末端の７位のアミノ酸残基から37位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーペプチドＬがKex2プロテアーゼ又はその誘導体により切断され、前記誘導体がKex２プロテアーゼのＣ−末端を除去し、Ｎ−末端から660位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、請求項１〜11のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜12のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の製造方法において、該キメラタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から前記キメラタンパク質を採取することを特徴とする方法。
【請求項１４】
目的ペプチド（Ｂ）の製造方法において、請求項１〜13のいずれか１項に記載のキメラタンパク質に、Kex2プロテアーゼ又はその誘導体を作用させてリンカーペプチド（Ｌ）のＣ−末端と目的ペプチド（Ｂ）のＮ−末端との間のペプチド結合を切断する工程を含み、前記誘導体がKex２プロテアーゼのＣ−末端を除去し、Ｎ−末端から660位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、目的ペプチド（Ｂ）を得ることを特徴とする方法。
【請求項１５】
目的ペプチド（Ｂ）を得る際に等電点沈澱処理を用いることを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ペプチドまたはその前駆体を生産する際に基質となるキメラタンパク質及びその生産方法に関する。本発明はさらには、該キメラタンパク質から該生理活性ペプチドを遊離させ、精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キメラタンパク質発現法による多くのペプチド生産方法が試みられている。目的ペプチドの遊離方法として、化学的あるいは酵素による切断が用いられている。酵素としては、リジン残基のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼ−Ｉ）、グルタミン酸残基のＣ末端側を特異的に切断するスタフィロコッカルプロテアーゼＶ８などがある。化学的方法としては、亜硝酸によるアスパラギン残基の開裂、ＣＮＢｒによるメチオニン残基の開裂などがある。
【０００３】
化学的方法は、目的ペプチドの修飾が避けられず、切断後の目的ペプチドの精製において種々の類似体からの精製が必要になる。一方、酵素切断方法は、特異性の高く、切断も比較的穏やかな条件で行われるため、目的ペプチドの精製が容易であるが、これらの酵素が利用可能か否かは目的ペプチドのアミノ酸配列に依存するため、既存のプロテアーゼが選択できない場合があり、汎用性の高い切断酵素が求められている。
【０００４】
ペプチドホルモン及びその前駆体が生体内で生成される際、該ペプチドのプレカーサーポリペプチドが酵素（プロセッシング酵素）により特異的に切断される。該酵素には、前駆体変換酵素１／３（ＰＣ１／３）、前駆体変換酵素２（ＰＣ２）、フリン（ｆｕｒｉｎ）等が知られており、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のα−因子（α−ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）の生成時に機能するＫｅｘ２プロテアーゼもその一種である。これらのプロセッシング酵素をキメラタンパク質からの目的ペプチドの切り出しに直接使用すれば、ペプチドホルモンを損なわなず、かつ、多種多様のペプチドに適用できると期待できるため、このような生産方法が望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチドを保護ペプチドとし、適切なリンカーペプチドを選び、目的ペプチドとのキメラタンパク質を大腸菌体内で、効率的に不溶性の封入体として生産する方法を報告した（特開平５−３２８９９２）。該キメラタンパク質は、尿素等の変性剤で可溶化され、プロセッシング酵素の基質とされる。
【０００６】
【関連技術】
一方、本発明者等は膜結合型酵素のサッカロマイセス・セレビジアエ由来のＫｅｘ２プロテアーゼを、その遺伝子を改変することにより、可溶性酵素（分泌型Ｋｅｘ２誘導体）として生産する方法を報告した（「分泌型Ｋｅｘ２誘導体の製造方法」と題する平成８年３月４日出願の明細書）。しかし、本酵素をプロセッシング酵素として使用するにあたり、その基質となるキメラタンパク質の設計についての言及はなされていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、大量培養下、大腸菌体内で効率良く封入体として生産され、プロセッシング酵素が有効に作用する条件下で容易に可溶化されるキメラタンパク質を設計し、生産する方法、さらにはプロセッシング酵素により目的ペプチドがキメラタンパク質から効率よく切断される様に切断部位近傍のアミノ酸配列を設計し、生産する方法の開発が望まれていた。また、このようにして生産された生理活性ペプチドを９９％以上の純度にまで高回収率で精製する、汎用性の高い精製方法の開発も同時に望まれていた。
従って、本発明は分泌Ｋｅｘ２誘導体のごときプロセッシング酵素を使用して生理活性ペプチドを生産する際に基質となるキメラタンパク質の設計、生産方法及び該ペプチドの精製方法を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記の課題の解決方法を検討した結果、１）キメラタンパク質に、Ｈｉｓに富む配列、例えば｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）を含むリンカーペプチドを挿入することが生産量の増加と分泌型Ｋｅｘ２誘導体のごときプロセッシング酵素反応条件下での溶解性の上昇につながるという事実、２）リンカー内のプロセッシング酵素作用部位のアミノ酸配列をＸ１−Ｘ２−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ／Ｐｒｏ）−Ａｒｇとし、望ましくは、Ｘ１としてＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓを選択し、Ｘ２としてＨｉｓ又はＰｈｅを選択することが、反応性の高い基質の条件であるという事実、さらに、
【０００９】
３）反応後、反応液のｐＨを弱酸性にシフトし、さらに希釈して変性剤の濃度を低下させて目的ペプチド以外の成分のほとんどを沈殿させ、遠心分離あるいは圧搾濾過により目的ペプチドを９５％以上上清に回収でき、そして例えば陽イオン交換クロマトグラフィー、低圧逆相クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等を単独で又は好ましくは組合わせて使用することにより高純度かつ高回収率で目的ペプチドを精製できる、という事実を初めて明らかにし、本発明を完成した。
【００１０】
従って本発明は、次の式：
Ａ−Ｌ−Ｂ
〔式中、Ａは、保護ペプチドであり；
Ｂは、目的ペプチドであり；そして
Ｌは、リンカーペプチドであって、そのＣ−末端部分に配列：Ｘ1 −Ｘ2 −（Ｐｒｏ，Ｌｙｓ又はＡｒｇ）−Ａｒｇ（式中、Ｘ1 及びＸ2 は任意のアミノ酸である）を有し、そしてＮ−末端にＨｉｓに富む部分を有する〕
【００１１】
により表わされるキメラタンパク質を提供する。前記Ｎ−末端のＨｉｓに富む部分としては配列：〔（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ〕n （式中、ｎは１〜６である）が好ましく、またＸ１はＡｒｇ，Ｌｙｓ又はＨｉｓであり、そしてＸ２はＨｉｓ又はＰｈｅであることが好ましい。さらに、前記Ｎ−末端部分のアミノ酸配列と前記Ｃ−末端部分のアミノ酸配列との間に１〜５個の任意のアミノ酸が存在していてもよい。
本発明はまた、上記のキメラタンパク質の製造方法において、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から前記キメラタンパク質を採取することを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、前記の目的ペプチド（Ｂ）の製造方法において、前記のキメラタンパク質にプロセッシング酵素を作用させてリンカーペプチド（Ｌ）のＣ−末端と目的ペプチド（Ｂ）のＮ−末端との間のペプチド結合を切断し、目的ペプチド（Ｂ）を得ることを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
上記の方法は、好ましい態様においては、キメラタンパク質をコードする遺伝子を発現できるベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該形質転換体を破砕して封入体の不溶性画分を得、不溶性画分を可溶化剤で処理することで封入体中のキメラタンパク質を可溶化し、該可溶化されたキメラタンパク質の前記リンカーアミノ酸残基のＣ末端と前記目的ペプチドのＮ末端の間のペプチド結合を分泌型Ｋｅｘ２誘導体のごときプロセッシング酵素により切断して該目的ペプチドを切り離し、沈殿処理、陽イオン交換クロマトグラフィー、低圧逆相クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣにより該目的ペプチドを精製する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法により、上記保護ペプチド、リンカー及び生理活性ペプチド（目的ペプチド）からなるキメラタンパク質をプロセッシング酵素により切断して、生理活性ペプチドを製造することができる。このようなペプチドとして、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ（１−８４））及びその誘導体（ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３７）、ｈＰＴＨ（１−３８））、ヒト副甲状腺ホルモンの他の誘導体（ｈＰＴＨ（１−３１）Ｇｌｙ、ｈＰＴＨ（１−３４）Ｇｌｙ、ｈＰＴＨ（１−３７）Ｇｌｙ、ｈＰＴＨ（１−３８）Ｇｌｙ、ｈＰＴＨ（３−８４）、ｈＰＴＨ（３−３４）、ｈＰＴＨ（３−３７）、ｈＰＴＨ（３−３８））、細胞増殖因子、カルシトニンおよびその前駆体、グルカゴン様タンパク質１（Glucagon-like peptide   １：ＧＬＰ−１）及びその誘導体（ＧＬＰ−１（１−３７）ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 等) 等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
また、プロセッシング酵素としては、Ｋｅｘ２プロテアーゼ、フリン（Ｆｕｒｉｎ）、前駆体変換酵素１（ＰＣ１）もしくは前駆体変換酵素２（ＰＣ２）又はこれらの誘導体等を使用することができるが、これらに限定されない。本発明においては特にＫｅｘ２酵素のＣ−末端を除去することにより得られる分泌型Ｋｅｘ２誘導体が好ましい。
【００１６】
本発明における保護ペプチドは、その大きさが２２０アミノ酸以下のペプチドであることが好ましい。例えば、大腸菌βガラクトシダーゼのＮ末端の１位から９０〜２１０個のアミノ酸からなるものが好ましい。さらに好ましくは、大腸菌βガラクトシダーゼのＮ末端の１位から９７位、１１７位又は１３９位からなるペプチドである。またさらに好ましくは、これらのペプチドのシステイン残基がセリン残基に置換されたものであり、最も好ましいのは、さらに１４位のアルギニン残基がリジン残基に置換されたものである。また、保護ペプチド中にはプロセッシング酵素により認識される配列、例えばＰｒｏ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ等、を含まないものが好ましく、保護ペプチド中に該認識配列がある場合には、そのような認識配列の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸で置換し、プロセッシング酵素により認識されない配列にすることにより、プロセッシング酵素による切断を防止することができる。
【００１７】
キメラタンパク質の溶解性を改善するためのリンカーアミノ酸としては、親水性のものが好ましい。目的ペプチドの種類によってキメラタンパク質の電荷が変化し、封入体生産性の低下をもたらす場合があるため、親水性アミノ酸として、封入体生産の場である菌体内の生理的ｐＨ（中性）近傍で緩衝能を持つヒスチジン残基を用いることが望ましい。さらに変性・可溶化後、リンカー部分の二次構造を緩やかなものにする目的でＰｒｏ−Ｇｌｙ配列を挿入することが望ましい。多種の生理活性ペプチドに対応できるように、（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙをコードする合成ＤＮＡフラグメントを用意し、保護ペプチドをコードするＤＮＡフラグメント中に適宜重複挿入させて、｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）となるようにリンカーを設計することが最も好ましい。なお、以下このリンカーのＮ末端部分の配列をＬＮと記す。
【００１８】
さらに、本発明者等は、大量生産可能となったサッカロマイセス・セレビジアエ由来のＫｅｘ２プロテアーゼ誘導体（分泌型Ｋｅｘ２誘導体）が、キメラタンパク質を基質とした場合、Ｋｅｘ２プロテアーゼ認識部位（Ｌｙｓ／Ａｒｇ／Ｐｒｏ）−Ａｒｇ近傍のアミノ酸もその活性に大きく影響することを初めて明らかにした。すなわち、リンカーのＣ末端に位置するアミノ酸配列を、Ｘ１−Ｘ２−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ／Ｐｒｏ）−Ａｒｇ（式中Ｘ１、Ｘ２は任意のアミノ酸）とし、Ｘ１にはＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを、Ｘ２にはＨｉｓ又はＰｈｅを用いた場合に分泌型Ｋｅｘ２誘導体活性が最大となることを明らかにした。なお、以下このリンカーのＣ末端部分の配列をＬＣと記す。
【００１９】
キメラタンパク質法で生産され切り出された目的ペプチドは、種々の手法で精製されるが、該キメラタンパク質を用いた場合、未反応キメラタンパク質、保護ペプチド類、大腸菌由来不純物を簡便な沈殿操作により、効率的に除去できることを明らかにした。すなわち、分泌型Ｋｅｘ２誘導体反応後、ｐＨを弱酸性側にシフトし、さらに反応液を希釈して変性剤濃度を低下させることで、大腸菌由来不純物のほとんどと、未反応キメラタンパク質、保護ペプチド類を９５％以上沈殿に移行させ、目的ペプチドを９５％以上上清に保持でき、遠心分離あるいは圧搾濾過により目的ペプチドを含む清澄液を簡便に得られることを明らかにした。
【００２０】
本上清をｐＨ調製等の後に直接陽イオン交換クロマトに通して目的ペプチドを吸着させ、塩濃度の変化あるいはｐＨの変化を利用して溶出させ、さらに溶出画分を低圧の逆相クロマトに通して目的ペプチドを吸着させ、有機溶媒濃度の変化を利用して溶出かつ濃縮させた。有機溶媒濃度を低下させた後、逆相ＨＰＬＣに供し、有機溶媒濃度の変化を利用して分離分画し、高純度の目的ペプチドを得た。
次に、本発明を目的ペプチドがヒト副甲状腺ホルモン誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）である場合を例にとって説明する。
【００２１】
βＧａｌ−２１０ＳＰＰＨ８４発現用プラスミドｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨは、まずｈＰＴＨ（１−８４）遺伝子を合成ＤＮＡオリゴマーの連結により作製し、次に作製した遺伝子をプラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］のｈＣＴ［Ｇ］遺伝子をコードする領域と置換して作製した（図３）。ｈＰＴＨ（１−８４）遺伝子のＮ末端から３５番目のアミノ酸（Ｖａｌ）をコードするコドンを翻訳停止コドンに、βＧａｌ−２１０Ｓ（大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端１位から２１０位までのペプチドにおいて、システイン残基がセリン残基に置換されているペプチド）をコードする遺伝子をβＧａｌ−１１７Ｓ（大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端１位から１１７位までのペプチドにおいて、システイン残基がセリン残基に置換されているペプチド）をコードする遺伝子に変えたｐＧ１１７ＳＨＰＰＨ３４を作製した（図６〜７）。
【００２２】
同様に、βＧａｌ−２１０Ｓをコードする遺伝子に変えて、βＧａｌ−１３９Ｓをコードする遺伝子あるいはβＧａｌ−９７Ｓをコードする遺伝子を挿入することにより、ｐＧ１３９ＳＨＰＰＨ３４あるいはｐＧ９７ＳＨＰＰＨ３４を作製することができる。
これらのプラスミドは、それぞれβＧａｌ−９７Ｓ、βＧａｌ−１１７Ｓ及びβＧａｌ−１３９Ｓをコードする構造遺伝子と誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）の構造遺伝子とがリンカーペプチドＰｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを介して連結されており、このキメラタンパク質をコードする構造遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下にある。またこのプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子マーカーを含有する。
【００２３】
βＧａｌ−９７ＳＰＰＨ３４は分泌型Ｋｅｘ２誘導体反応条件下での溶解度が高かったが生産量が少なく、βＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４とβＧａｌ−１３９ＳＰＰＨ３４は、生産量は多かったが該条件下での溶解性が低下し、キメラタンパク質から誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）を切り出すためには、より多くの分泌型Ｋｅｘ２誘導体が必要であった。そこで、生産量が多く尿素溶液の溶解度が高いキメラタンパク質を得るため、前記保護ペプチドとリンカーＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの間に、親水性かつ中性付近で緩衝能を持ち、キメラタンパク質の二次構造形成を阻害するアミノ酸からなるリンカーＬＮを挿入した。
【００２４】
ＬＮとしては、｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）からなるペプチドを用いた。｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）の導入は、（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙまたは｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝2 をコードするＤＮＡフラグメントを合成し、保護ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントの３’末端部分に適当なモル比で挿入反応させることで行い、前記アミノ酸配列を一つまたは複数個含有したリンカーペプチドを含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製することができる。
【００２５】
なお、ＤＮＡフラグメントが反転して挿入されたものもは、ＤＮＡ塩基配列分析で確認し、除外した。これらのキメラタンパク質をコードするプラスミドで大腸菌Ｍ２５株を形質転換し、キメラタンパク質の生産性を見た（図８）。その結果、保護ペプチドβＧａｌ−９７ＳおよびβＧａｌ−１３９Ｓの場合はｎ＝３で、βＧａｌ−１１７Ｓの場合はｎ＝１〜６で、キメラタンパク質の生産量が高いことがわかった。また、これらキメラタンパク質の封入体を菌体破砕、遠心分離により洗浄単離し、尿素で可溶化・希釈して、Ｋｅｘ２−６６０反応に供した（図９）。
【００２６】
その結果、｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）の導入により、すべてのキメラタンパク質がＫｅｘ２−６６０に対して感受性が高くなっていることがわかった。そこで、キメラタンパク質生産量、Ｋｅｘ２−６６０に対する反応性、および保護ペプチドの大きさを考慮し、ｈＰＴＨ（１−３４）生産用のキメラタンパク質には、保護ペプチドとしてβＧａｌ−１１７Ｓ、リンカーペプチドＬＮとして（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−ＧｌｙからなるβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を採用した。
【００２７】
以上の結果より、分泌型Ｋｅｘ２誘導体により生理活性ペプチドを切り出すためのキメラタンパク質の設計として、大腸菌体内での生産性のみならず分泌型Ｋｅｘ２誘導体反応条件下での溶解性を改善するために、｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）なるペプチドを挿入することが適していることを明らかにした。
本過程では、分泌型Ｋｅｘ２誘導体がモル比でキメラタンパク質の１／１０００程度必要であり、製造原材料費の大半を占めていた。そこで、さらに、分泌型Ｋｅｘ２誘導体により切断されやすいキメラタンパク質を設計する必要があった。βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の分泌型Ｋｅｘ２誘導体認識部位は、ヒト副甲状腺ホルモン前駆体のプロ配列Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを使用した。
【００２８】
しかし、この配列が分泌型Ｋｅｘ２誘導体による切断に最適か否かは不明であり、多くの他のプロテアーゼに見られるように最適化によりさらに切断効率が増加する可能性が考えられる。認識部位のＣ末端側にはｈＰＴＨ（１−３４）が続いているのでアミノ酸の置換はできないが、Ｎ末端側の配列は新たに認識部位を創生しなければ任意に選択できる。そこで基質であるキメラタンパク質のＰ３部位（Ｘ２）を任意のアミノ酸に変換することを試みた。図１０に示す１８種類のアミノ酸配列について検討した結果、Ｘ２にＨｉｓまたはＰｈｅを導入すると、キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率が良くなることが判明した。
【００２９】
次に、副反応が少なかったＨｉｓをＸ２に固定して、Ｐ４部位（Ｘ１）を図１１に示す２０種類のアミノ酸配列について検討した結果、Ｘ１にＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓを導入すると、キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率が良くなることが判明した。このうち最も切り出し効率が良かった、Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇをＬＣに選んだ。
さらに本研究の過程で、βＧａｌ−１１７Ｓの１３、１４位に存在するＡｒｇ−Ａｒｇ配列のＣ末端側のペプチド結合が分泌型Ｋｅｘ２誘導体により切断され、この結果生じるβＧａｌ（１−１４）が、後の酸性沈殿による精製工程において、ｈＰＴＨ（１−３４）と同じ上清画分に回収されることが判明したので、１４位のＡｒｇをＬｙｓに置換して切断を抑制し、βＧａｌ（１−１４）の生成を抑えた。
【００３０】
以上の結果より、ｈＰＴＨ（１−３４）生産用キメラタンパク質には、保護ペプチドとして１４位のＡｒｇをＬｙｓに置換したβＧａｌ−１１７Ｓ（βＧａｌ−１１７ＫＳ）を、リンカーペプチドとしてＰｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇなるアミノ酸配列を有するペプチドを採用した。
【００３１】
次に本発明者等は、このようにして設計したキメラタンパク質βＧａｌ−１１７ＫＳ４ＨＲＨＰＨ３４を大腸菌で発現させ、封入体として洗浄回収後可溶化し、分泌型Ｋｅｘ２誘導体反応に供したのち精製方法を検討した。大腸菌由来不純物、未反応キメラタンパク質や保護ペプチドを含むペプチドは、中性から弱酸性で溶解性が極端に低下することを利用して、ｐＨを分泌型Ｋｅｘ２誘導体反応至適ｐＨの７．８〜８．２から６．２〜６．５へシフトすることで沈殿させることができた。
【００３２】
さらに、変性剤（尿素）濃度を希釈により低下させることでほとんどの不純物を沈殿させ得た。遠心分離または圧搾濾過により沈殿を除去し、ｈＰＴＨ（１−３４）を効率よく上清に回収した。上清をｐＨ５．０に調整後陽イオン交換クロマト（例えば、PorosHS 、SPトヨパール）にｈＰＴＨ（１−３４）を吸着させ、０．３Ｍ〜０．４ＭのＮａＣｌで溶出させた。溶出液に酢酸を添加し、低圧逆相クロマト（例えば、PorosR2 、SokenODS - W）にｈＰＴＨ（１−３４）を吸着させ、３０％程度のアセトニトリルで溶出させ、濃縮及び逆相ＨＰＬＣに悪影響を与える不純物の除去を行った。
【００３３】
溶出液中のアセトニトリルを減圧蒸留で除き、０．２２μｍのフィルターで濾過し、逆相ＨＰＬＣ（例えば、InertsilPrepODS 、TSK-ODS-120T）にｈＰＴＨ（１−３４）を吸着させ、アセトニトリルのグラジエント溶出にて分画し、高純度の画分を集め、純度９９．５％のｈＰＴＨ（１−３４）を回収率４０％〜７０％で分取した。以上の結果から、この回収率は今まで報告されている中で最も高く、本発明の有用性が実証された。
【００３４】
【実施例】
実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下本発明のための材料として用いたプラスミド、大腸菌、各実施例に共通な基本的な実験操作ついて述べる。
【００３５】
プラスミド
プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］は、β−ガラクトシダーゼのＮ末端１位から２１０位までのアミノ酸からなるペプチドのうち、７６位、１２２位及び１５４位のシステイン残基がセリン残基に置換されているもの（βＧａｌ−２１０Ｓ）にグルタミン酸残基を介して、ｈＣＴ［Ｇ］（ヒトカルシトニンの３２位のアミノ酸のＣ末端にグリシン残基が付加したペプチド）が結合したキメラタンパク質を大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃプロモーター）により発現できるプラスミドである。
【００３６】
ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで消化して得られるβＧａｌ−２１０Ｓの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで消化して得られるベクター部分を含むＤＮＡフラグメントと連結して作製した（図１３）。なお、ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- の作製方法については特公平６−８７７８８に開示され、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］を含有する大腸菌Ｗ３１１０株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＢＭ３２３と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０３）として１９９１年８月８日に寄託されている。
【００３７】
プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］に目的とするペプチドをコードするＤＮＡ領域を読み枠を合わせてEco RI−Sal I ＤＮＡフラグメントとして導入すれば、βＧａｌ−２１０Ｓとのキメラタンパク質を発現することができる。合成ヒト副甲状腺ホルモン前駆体（ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４））遺伝子のクローニングおよびプラスミドｐＧＰ＃１９の作製の材料として用いた（図３）。
【００３８】
大腸菌
大腸菌ＪＭ１０９株はコンピテントセルの状態で東洋紡（株）から購入し、プラスミドの調製に利用した。大腸菌Ｍ２５株（Ｗ３１１０／ompT：Sugimura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 153 、753-759 、1988）は、キメラタンパク質の発現に利用した。
【００３９】
培地
大腸菌の培養には以下の培地を用いた。
ＳＢ培地：０．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．４％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．２％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．１Ｍリン酸水素カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
ＮＵ１合成培地：０．４％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．４％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．４％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 、０．２７％（ｗ／ｖ）Ｎａ2 ＨＰＯ4 、１．２％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮＨ4 Ｃｌ、０．３％（ｗ／ｖ）Ｌ−メチオニン、０．２％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＡｌＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ2 Ｍｏ4 ・２Ｈ2 Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．５ｍｇ／Ｌ  Ｈ3 ＢＯ3 および１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ。
【００４０】
基本的な実験操作
具体的に実施例に示さない場合は、実験操作は以下の方法に従った。
ＤＮＡプライマーは、フォスホアミダイド法による全自動合成機（アプライドバイオシステムズモデル320A）で合成した。ＤＮＡ塩基配列はジデオキシ法で決定した。
ＤＮＡ切断は購入先の指定する３〜１０倍量の制限酵素を用いて１時間反応させた。プラスミド構造の解析は０．５〜１μｇのＤＮＡを用いて２０μｌ反応液中で行い、ＤＮＡの調製には３〜１０μｇのＤＮＡを用いて５０〜１００μｌ反応液中で行った。反応温度、反応バッファー等の条件は購入先の指定に従った。
【００４１】
アガロースゲル電気泳動サンプルは、反応液に１／５容量の色素液（０．２５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルーを含む１５％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ水溶液）を加え調製した。アガロースゲル電気泳動用バッファーにはＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ／酢酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた。プラスミドの構造解析にはＭｕｐｉｄ−２（コスモバイオ（株））を用いて１００ボルト１時間の泳動を行ない、ＤＮＡの調製のためには水平ゲル（20 cm x 15 cm x 0.7 cm）を用いて１５０ボルト４時間または３５ボルト１３時間の泳動を行なった。ゲルはエチジウムブロミド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）で２０分染色した後、紫外線照射してＤＮＡバンドを検出した。アガロースゲル濃度は、分画するＤＮＡフラグメントの大きさに合わせて、１．０、２．０％（ｗ／ｖ）を用いた。
【００４２】
アガロースゲル中のＤＮＡは、０．１×ＴＡＥバッファーを満たした透析チューブ内にゲルを入れ電圧をかけて溶出させ、ゲルから抽出した。ＤＮＡ溶液をフェノール処理、クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。
ライゲーション反応は、０．０５〜１μｇのＤＮＡフラグメントを含む反応液（６７ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）３０μｌに１０単位のＴ４ＤＮＡライゲースを加え、１６℃で１２〜１８時間反応を行うか、TAKARA ligation Kit （宝酒造（株））を用いて行なった。
【００４３】
大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換法は購入先の指示に従い、大腸菌Ｍ２５株の形質転換法は塩化カルシウム法に準じて行い、形質転換株は薬剤耐性（テトラサイクリン）で選択した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルは、同量のＳＤＳサンプルバッファー（６３ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０μｇ／ｍｌブロムフェノールブルー）を加え、３分間煮沸し調製した。電気泳動は、１６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳＰＡＧＥｍｉｎｉ（TEFCO ）ゲルを用いて１枚あたり２０ｍＡで７０分間行い、ゲルはクマジーブリリアントブルーＧで染色した。
【００４４】
ｈＰＴＨ（１−３４）の定量は、まず、ｈＰＴＨ（１−３４）を含む溶液をサンプルバッファー（１Ｍ酢酸／２Ｍ尿素）で１０倍から２０倍に希釈後、遠心上清を得、次に、これをＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３０２（d4.6mmX150mm）カラム（（株）山村化学研究所）を接続したＨＰＬＣ島津製作所（株）LC10A ）に供し、Ａ液（０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）、Ｂ液（０．０９４％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）、Ｂ４０％→８０％／２０ｍｉｎ勾配の系にて展開し、２１４ｎｍの吸光度測定にて検出されたｈＰＴＨ（１−３４）のピーク面積を既知濃度の標準ｈＰＴＨ（１−３４）のピーク面積と比較し行った。
その他、別途表示する以外は基本的な遺伝子操作はMolecular Cloning （Maniatisら編、Cold Spring Harbor laboratory 、New York（1982））に記載の方法に従って行なった。
【００４５】
実施例１．ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子の作製
ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、図１に示すようにＵ１〜Ｕ７（配列番号１〜７）およびＬ１〜Ｌ７（配列番号８〜１４）の１４本のフラグメントに分け、合成した。
ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、各フラグメントを以下のように連結し、作製した（図２）。
【００４６】
まず、ＤＮＡフラグメントＵ１（配列番号１）とＬ７（配列番号１４）（各々約１μｇ）を１６単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネースと０．５ｎＭ（１ＭＢｑ以上）の［γ−32Ｐ］ｄＡＴＰを含むリン酸化反応液１５μｌ中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ  ＤＴＴ）で３７℃、１５分間反応させた。これに５ｍＭ  ＡＴＰを含むリン酸化反応液５μｌを加え、さらに３７℃で４５分間反応させた。Ｕ２（配列番号２）とＬ６（配列番号１３）、Ｕ３（配列番号３）とＬ５（配列番号１２）、Ｕ４（配列番号４）とＬ４（配列番号１１）、Ｕ５（配列番号５）とＬ３（配列番号１０）、Ｕ６（配列番号６）とＬ２（配列番号９）、およびＵ７（配列番号７）とＬ１（配列番号８）についても同様に行った。
【００４７】
上述の７個の反応液をひとつにまとめ、エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。これを８０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、３００ｍＭ  ＮａＣｌに溶解した。このうち４０μｌを９５℃に５分間放置した後、３０分かけて４３℃まで温度を下げた。氷冷後４０μｌのライゲーションＢ液（宝酒造（株））を加え、２６℃に１５分放置した。
このサンプルを５％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、オートラジオグラフィーで、連結したＤＮＡフラグメントを検出した。約２８０ｂｐに対応するＤＮＡフラグメントをゲルから抽出後、定法に従い精製した。
【００４８】
実施例２．βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４発現プラスミドｐＧＰ＃１９の作製
合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子を含む約２８０ｂｐのＤＮＡフラグメントには、５’末端には制限酵素Eco RI  部位が３’末端には制限酵素Sal I 部位が存在する。ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子のクローニングはこのEco RI／Sal I   ＤＮＡフラグメントをｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］のEco RI／Sal I 部位に挿入し、行った。
【００４９】
ｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素Eco RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約３．５ｋｂＤＮＡフラグメントを調製した。これと実施例１で得られた約２８０ｂｐからなるｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子のＤＮＡフラグメントを連結し、プラスミドｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨを得た（図３）。ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＪＭ１０９［ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨ］を得た。
さらに、ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨの制限酵素XhoI  ／EcoRI 部位にリンカーＫＭ０９１（配列番号１５）及びＫＭ０９２（配列番号１６）を導入し、プラスミドｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）を作製した（図３）。なお、このリンカーは、両端に制限酵素XhoIとEcoRI 部位を、その間にSac I 部位を持つ。
【００５０】
ｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）は、制限酵素Sac I およびXho I で消化後、Kilo-Sequence 用 Deletion Kit （宝酒造（株））を用いて、βＧａｌ−２１０ＳをコードするＤＮＡ領域を経時的かつ特異的に欠失させた。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで末端修復をおこなったのち、セルフライゲーションを行ない、βＧａｌ−１３９ＳとｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）がＰｈｅ−Ｍｅｔを介して連結されたキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４をコードするプラスミドｐＧＰ＃１９を得た（図４）。ｐＧＰ＃１９を導入した大腸菌ＪＭ１０９株をＪＭ１０９［ｐＧＰ＃１９］と呼ぶ。
【００５１】
実施例３．βＧａｌ−１１７ＳｍＨＰＰＨ３４発現プラスミドｐＧ１１７ＳｍＨＰＰＨ３４の作製
本実施例においては、βＧａｌ−１１７ＳｍＨＰＰＨ３４発現プラスミドｐＧ１１７ＳｍＨＰＰＨ３４の作製を例に挙げるが、βＧａｌ−１１７Ｓに変えてβＧａｌ−９７ＳあるいはβＧａｌ−１３９Ｓを用いることにより、βＧａｌ−９７ＳｍＨＰＰＨ３４発現プラスミドｐＧ９７ＳｍＨＰＰＨ３４あるいはβＧａｌ−１３９ＳｍＨＰＰＨ３４発現プラスミドｐＧ１３９ＳｍＨＰＰＨ３４を作製することができる。
【００５２】
１）ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の作製
ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４は、ｐＧＰ＃１９を鋳型にＳ０１（配列番号１７）およびＳ０２（配列番号１８）をプライマーとして、ＰＣＲ法により、ｈＰＴＨ（１−８４）の３５位のバリン残基のコドンＧＴＴを翻訳停止コドンＴＡＡに変換したＤＮＡフラグメントを増幅後、常法により制限酵素 Aat II −Sal I ＤＮＡフラグメントを単離精製し、ｐＧＰ＃１９の対応する部分と交換して作製した（図５）。
【００５３】
２）ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４の作製
ｐＧ２１０（Ｓ／Ｘ）を鋳型にＳ０３（配列番号１９）とＳ０５（配列番号２０）をプライマーとしてＰＣＲ法により増幅後、制限酵素 Pvu IとSma I で消化したＤＮＡフラグメント、ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４を鋳型にＳ０７（配列番号２１）およびＳ０２をプライマーとしてＰＣＲ法により増幅後、制限酵素Sal I とSma I で消化したＤＮＡフラグメント、並びにｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の複製開始起点を含む制限酵素 Pvu I-Sal I  ＤＮＡフラグメントをＴ４ライゲースで連結し、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４を作製した（図６〜７）。
【００５４】
３）ｐＧ１１７ＳｍＨＰＰＨ３４（ｍ＝４又は８）の作製
ｐＧ１１７ＳｍＨＰＰＨ３４（ｍ＝４又は８）は、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４の制限酵素Sma I 部位に（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−ＧｌｙをコードするリンカーＳ０８（配列番号２２）とＳ０９（配列番号２３）、および｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝2 をコードするリンカーＳ１０（配列番号２４）とＳ１１（配列番号２５）を挿入し作製した。なお、リンカーの長さを変えることにより、ｍ＝１２、１６又は２４であるプラスミドを作ることができる（図６〜７）。
【００５５】
さらに、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４の制限酵素Sma I 部位に（Ｌｙｓ）4 −Ｐｒｏ−ＧｌｙをコードするのリンカーＳ１２（配列番号２６）とＳ１３（配列番号２７）を挿入し、ｐＧ１１７Ｓ４ＫＰＰＨ３４を作製した。同様にして、ｐＧ９７Ｓ４ＫＰＰＨ３４、ｐＧ１３９Ｓ４ＫＰＰＨ３４を作製することができる。
また、挿入されたリンカーの数および方向は、プラスミドを調製後、ＤＮＡ塩基配列を決定し、確認し、本実施例において作製したキメラタンパク質を表１に示した。
【００５６】
【表１】
0003925982.tif 000002
【００５７】
実施例４．ｈＰＴＨ（１−３４）キメラタンパク質の生産
表１に示したキメラタンパク質の生産性をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて調べた。表１に示したキメラタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド１６個をそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、２ｍｌのＳＢ培地で３７℃１６時間試験管で振盪培養後、生理食塩水にて希釈し、培養液濁度（ＯＤ６６０）を１０とした。この懸濁液１００μｌに同量のＳＤＳサンプルバッファーを加え、３分間煮沸し、その上清１０μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、各菌体あたりのキメラタンパク質生産量を比較した。
【００５８】
結果を図８に示す。その結果、β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒスチジン残基の数の組み合わせにより発現量が変化し、βＧａｌ−９７Ｓでは、｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n においてｎ＝２、３、βＧａｌ−１１７Ｓでは、ｎ＝１、２、３、４、６、βＧａｌ−１３９Ｓでは、ｎ＝２、３で高生産性を獲得したことがわかった。特にβＧａｌ−１１７Ｓの誘導体においては｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）の導入により発現量が顕著に増加し、これらの生産量はリジン残基によって単に電荷を変えたものより多かった。
【００５９】
実施例５．キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−３４）切り出し
高生産量のキメラタンパク質（βＧａｌ−９７ＳｍＨＰＰＨ３４（ｍ＝１２）、βＧａｌ−１１７ＳｍＨＰＰＨ３４（ｍ＝０、４、８、１２、１６、２４）、βＧａｌ−１３９ＳｍＨＰＰＨ３４（ｍ＝０、１２）；ｍ＝０はコントロール）について、Ｋｅｘ２−６６０の基質としての適性を調べるため、キメラタンパク質封入体を回収し、８Ｍ尿素で溶解後反応液組成（２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．０Ｍ尿素、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ2 、８ｍｇ／ｍｌキメラタンパク質）になるように希釈し、Ｋｅｘ２−６６０を終濃度２０ｋＵ／ｍｌとなるように添加して、ｈＰＴＨ（１−３４）の切り出しを行った。本条件下、１時間でコントロールのβＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４は９０％以上切断された。
【００６０】
各誘導体のＫｅｘ２−６６０反応性は、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４のｋｃａｔとの比をもって図９に示した。ｈＰＴＨ（１−３４）の定量は［基本的な実験操作］に示した方法で行った。この結果、実施したすべての例で｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）の導入によりＫｅｘ２−６６０反応性も改善されることがわかった。
特に、βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４は、１個の（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙリンカーの挿入で、キメラタンパク質の生産量とＫｅｘ２−６６０反応性が改善され、さらにＫｅｘ２反応条件下での溶解度も１５ｇ／Ｌ以上でβＧａｌ−１３９ＳＰＰＨ３４の８ｇ／Ｌに比べて改善されていることがわかった。
【００６１】
実施例６．ｈＰＴＨ（１−３４）の大量生産
高発現かつＫｅｘ２−６６０の基質としても適していたキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を大量に得るため、本キメラタンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４で大腸菌Ｍ２５株（Ｗ３１１０／ompT）を形質転換し、Ｍ２５［ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４］株を得た。Ｍ２５［ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４］株は、２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、１．２％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 、０．５％（ｗ／ｖ）グリセロールからなる培地を用い、２０Ｌ培養槽にて３７℃で培養した。
【００６２】
菌体濃度がＯＤ６６０＝１．０のときにＩＰＴＧ（イソプロピルベータチオガラクトシド）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、菌体濃度がＯＤ６６０＝１２まで培養を継続した。集菌後、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に懸濁し、高圧ホモジナイザー（Manton-Gaullin）による菌体破砕、遠心分離、ＴＥおよび脱イオン水での懸濁洗浄を行って、封入体約１００ｇを得た。封入体懸濁液（１６０ｇ／Ｌ）２５０ｍｌに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）１００ｍｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ５０ｍｌ、脱イオン水５００ｍｌ、尿素９００ｇを加えて３０℃の恒温槽中３０分撹拌溶解し、暖めた脱イオン水で希釈し、３０℃で５Ｌとした。
【００６３】
これに２５０ｍＭ  ＣａＣｌ2 溶液５０ｍｌを撹拌しながら穏やかに添加し、さらにＫｅｘ２−６６０を２０ｋＵ／ｍｌとなるように加えた。２時間後、（切断率は９０％以上）酢酸にてｐＨを６．４に合わせ、さらに脱イオン水で２倍に希釈し、未反応キメラタンパク質および保護ペプチドを凝集沈殿させた。遠心分離によりｈＰＴＨ（１−３４）を含む上清を得、酢酸にてｐＨを５．０とし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換樹脂（SPトヨパール）カラムを通してｈＰＴＨ（１−３４）を吸着させ、０．４Ｍ  ＮａＣｌで、ｈＰＴＨ（１−３４）を溶出させた。
【００６４】
これに酢酸を最終３％（ｖ／ｖ）となるように添加し、３％（ｖ／ｖ）酢酸で平衡化した低圧逆相カラム（SokenODS-W）を通してｈＰＴＨ（１−３４）を吸着させ、３％（ｖ／ｖ）酢酸を含む３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液でｈＰＴＨ（１−３４）を溶出させた。減圧下でアセトニトリルを除き、０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過して、逆相ＨＰＬＣ分取カラム（TSKgelODS120T Φ55X600）にて精製した。溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配（Ａ：５％（ｖ／ｖ）酢酸／１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；Ｂ：５％（ｖ／ｖ）酢酸／４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；％Ｂ＝２０％→８０％／６０分、流速４０ｍｌ／分）で溶出した。各工程でのｈＰＴＨ（１−３４）回収率を表２に示した。
【００６５】
【表２】
0003925982.tif 000003
【００６６】
実施例７．キメラタンパク質のＫｅｘ２−６６０認識部位Ｐ３のアミノ酸置換
Ｐ３部位のアミノ酸（Ｌｙｓ）を他のアミノ酸に変換するため、Ｐ３部位に対応するコドンを変換したオリゴヌクレオチドＳ１４〜Ｓ１８（配列番号２８〜３２）を合成し、これらとＳ０２（配列番号１８）をプライマーに、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡフラグメントを合成した。該ＤＮＡフラグメントを、エタノール沈殿法にて精製し、Stu I およびSal I で切断後、２．０％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動を行い、目的とする０．４ｋｂｐのStu I-Sal I フラグメントを精製した。
【００６７】
次に該ＤＮＡフラグメントと、Stu I およびSal I で消化し同様に精製したｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４のβガラクトシダーゼ部分をコードするＤＮＡフラグメントとをライゲーション反応に供した。反応後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得した。各組み合わせ毎に形質転換体を１０個選択し、培養後、プラスミドを調製し、変異導入部分のＤＮＡ塩基配列を決定、Ｐ３部位アミノ酸が以下のアミノ酸に置換した遺伝子を含むプラスミドを持つクローンを選択した。
【００６８】
すなわち、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４のコードするキメラタンパク質のＫｅｘ２−６６０認識部位Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇがＳｅｒ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（Ｘ＝Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）に置換されたアミノ酸配列を持つキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＶＸＰＨ３４の発現ベクターｐＧ１１７Ｓ４ＨＶＸＰＨ３４を得た。
【００６９】
各キメラタンパク質とＫｅｘ２−６６０反応性を調べるため、各クローンを５０ｍｌのＳＢ培地で培養し、菌体濃度がＯＤ６６０＝１．０の時にＩＰＴＧにて発現を誘導後、さらに４時間培養を続け、集菌、ＴＥ緩衝液洗浄、懸濁、破砕、遠心分離を行い、封入体を得た。さらに各封入体を１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよびＴＥで洗浄し、精製した封入体を得た。
該封入体に含まれるペプチド成分の９０％以上が目的とするキメラタンパク質であった。各キメラタンパク質の封入体懸濁液に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）２０μｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ２０μｌ、１０Ｍ尿素３００μｌを加えて溶解し、脱イオン水６５０μｌで希釈後、３０℃の恒温槽中で１０分保温し、これに２５０ｍＭ  ＣａＣｌ2 溶液１０μｌを添加し、さらにＫｅｘ２−６６０を２０ｋＵ／ｍｌとなるように加えた。
【００７０】
本条件下、１時間でコントロールのβＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４は９０％以上切断された。ｈＰＴＨ（１−３４）の生成は、前述のＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣで定量した。各誘導体のＫｅｘ２−６６０反応性は、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４のｋｃａｔとの比をもって示した（図１０）。Ｘ＝Ｐｈｅ、Ｈｉｓのときには、Ｋｅｘ２−６６０によるｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率が良くなり、Ｘ＝ＰｒｏではＫｅｘ２−６６０によりｈＰＴＨ（１−３４）がほとんど切り出されないことが明らかになった。
【００７１】
実施例８．キメラタンパク質のＫｅｘ２−６６０認識部位Ｐ４のアミノ酸置換
実施例７の結果および、切断時の副生成物の少ないことから、Ｐ３部位にヒスチジン残基を持つキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＶＨＰＨ３４をｈＰＴＨ（１−３４）生産のためのキメラタンパク質として選び、Ｐ４部位のアミノ酸置換によるＫｅｘ２−６６０反応性のさらなる向上を試みた。オリゴヌクレオチドＳ１９〜Ｓ２４（配列番号３３〜３８）を合成し、これらとＳ０２をプライマーとし、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＶＨＰＰＨ３４を鋳型として、ＰＣＲ法にて変異が導入されたＤＮＡフラグメントを合成した。
【００７２】
実施例７に示した方法で、キメラタンパク質のＫｅｘ２−６６０認識部位Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇがＳｅｒ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（Ｘ＝Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）に置換された構造を持つキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＸＨＰＨ３４の発現ベクターｐＧ１１７Ｓ４ＨＸＨＰＨ３４が得られた。
【００７３】
該キメラタンパク質を基質として実施例６と同じ条件でＫｅｘ２−６６０に対する感受性を判断した。Ｘ＝Ｌｙｓ、Ａｒｇのときには、Ｋｅｘ２−６６０によるｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率が良くなり、X が酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の時にはＫｅｘ２−６６０によりｈＰＴＨ（１−３４）がほとんど切り出されないことが明らかになった（図１１）。これにより、Ｋｅｘ２−６６０プロテアーゼは、Ｐ１部位にアルギニン残基、Ｐ２部位に強塩基性アミノ酸又はプロリン残基を要求するだけでなく、Ｐ３部位にヒスチジン残基又はフェニルアラニン残基、Ｐ４部位に強塩基性アミノ酸を好むことおよび、Ｐ３部位にプロリン残基が、またはＰ４部位に酸性アミノ酸があると該キメラタンパク質切断活性が極端に低下することが初めて明らかになった。
【００７４】
実施例９．保護ペプチドのＫｅｘ２−６６０切断部位の除去
実施例７及び８におけるＫｅｘ２−６６０切断反応を経時的にＨＰＬＣにて追跡した結果、保護ペプチドβＧａｌ−１１７Ｓの１３、１４位のＡｒｇ−Ａｒｇ配列のＣ末端側のペプチド結合が切断されることが判明した。これにより、生じるβＧａｌ（１−１４）は、ｈＰＴＨ（１−３４）を酸性沈殿により精製する時に混入することが予想された。そこで、１４位のＡｒｇをＬｙｓに置換し、Ｋｅｘ２−６６０による切断を抑制し、βＧａｌ（１−１４）の生成を抑えることを試みた。
【００７５】
１４位のＡｒｇをＬｙｓに置換したキメラタンパク質（βＧａｌ−１１７ＫＳ４ＨＲＨＰＨ３４）をコードするプラスミドｐＧＫＳＰＨ３４（図１２）を以下のように作製した。まず、オリゴヌクレオチドＳ２５（配列番号３９）とＳ２６（配列番号４０）をプライマーとし、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＲＨＰＨ３４を鋳型として、ＰＣＲ法にて変異が導入されたＤＮＡフラグメント、Ase I-RKを合成した。同様にオリゴヌクレオチドＳ２７（配列番号４１）とＳ２８（配列番号４２）をプライマーとし、ＤＮＡフラグメント、RK-Bgl II を合成した。
【００７６】
各ＤＮＡフラグメントを精製し、各々約１ｎｇずつを混合し、プライマー非存在下でＰＣＲを４回行い、変異が導入された、Ase I-Bgl IIフラグメントを合成した。これに再度オリゴヌクレオチドＳ２５とＳ２８を添加してＰＣＲを継続し、同フラグメントを増幅した。本フラグメントをエタノール沈殿法にて精製し、Ase I およびBgl IIで切断後、２．０％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動を行い、目的とする０．３５ｋｂｐのフラグメントを調製した。ｐＧ１１７Ｓ４ＨＲＨＰＨ３４のAse I / Sph I （１．８ｋｂｐ）フラグメントおよびSph I / Bgl II（１．４ｋｂｐ）フラグメントを、１．０％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動を行い、精製した。
【００７７】
上記３フラグメントをライゲーション反応後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得し、プラスミドをアルカリ法にて調製後、変異導入部分のＤＮＡ塩基配列を解析し、保護ペプチド１４位のＡｒｇをコードするＤＮＡ配列ＣＧＧをＡＡＧに置換した遺伝子を含むプラスミドｐＧＫＳＰＨ３４を持つ目的クローンを選択した。実施例５に示した方法で、キメラタンパク質の封入体を取得し、Ｋｅｘ２−６６０反応に供した結果、この置換によりほぼ完全に保護ペプチドの切断が抑制され、精製工程の負担を軽減できることが判明した。
【００７８】
実施例１０．キメラタンパク質βＧａｌ−１１７ＫＳ４ＨＲＨＰＨ３４の大量調製とｈＰＴＨ（１−３４）の生産
試験管レベルでＫｅｘ２−６６０の基質として最適と考えられたキメラタンパク質βＧａｌ−１１７ＫＳ４ＨＲＨＰＨ３４の大量培養条件下における生産性とＫｅｘ２−６６０プロテアーゼによる切り出し、およびｈＰＴＨ（１−３４）の精製を行った。
ｐＧＫＳＰＨ３４にて、大腸菌Ｍ２５株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得し、生産株Ｍ２５［ｐＧＫＳＰＨ３４］を作製した。Ｍ２５[ ｐＧＫＳＰＨ３４］株を２％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＮＵ１合成培地にて大量培養を行った。
【００７９】
グルコース消費後は、炭素源としてグリセロールをフィードし、ｐＨを７．０にコントロールしながら、２４時間培養を行った。最終到達菌体濃度は、１５０−２００ＯＤであった。該キメラタンパク質は、大量培養条件下でも安定した生産性を示し、大量発現にも関わらず、顕著な宿主大腸菌の生育阻害は見られなかった。封入体生産量は約５ｇ／Ｌ培地であった。菌体破砕後の不溶性画分をＴＥおよび脱イオン水で洗浄して精製封入体を得た。
【００８０】
尿素で可溶化した後希釈して、反応液組成を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、２．７Ｍ尿素、８．０ｍｇ／ｍｌキメラタンパク質とし、反応温度３０℃でＫｅｘ２−６６０を５ｋＵ／ｍｌになるように添加し、キメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−３４）の切り出しを行い、ｈＰＴＨ（１−３４）の生成を定量した。３０分で切断率９０％以上となり、βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＨ３４と比較して、Ｋｅｘ２−６６０量が１／４に減少した。反応終了後、実施例５と同様にｈＰＴＨ（１−３４）精製した。精製工程の回収率は実施例５の場合とほぼ同様であった。
実施例１１．βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＧＰ生産プラスミド、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰの作製
グルカゴン様ペプチドＩ（ｈＧＬＰ−１（７−３７））を含むキメラタンパク質（βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＧＰ）を生産するプラスミド、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰは以下の手順で作製した。まず、図１４（ａ）に示す４つのＤＮＡ（ＧＬＰ−１（配列番号：４３），ＧＬＰ−２（配列番号：４４），ＧＬＰ−３（配列番号：４５），ＧＬＰ−４（配列番号：４６）を合成し、それらの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてリン酸化後、これらを混合し、アニーリングさせて、ｈＧＬＰ−１（７−３７）遺伝子（ＤＮＡ（Ｉ））を調製した。一方、図１４（ｂ）に示す２つの合成ＤＮＡ（１１７Ｓ４Ｈ  Sph Ｉプライマー（配列番号：４７）、１１７Ｓ４Ｈ  Bgl IIプライマー（配列番号：４８）はＰＣＲプライマーとして使用し、ｐＧＫＳＰＨ３４を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、Bgl IIおよびSph Ｉで消化し、Bgl IIおよびSph Ｉの粘着末端を持つＤＮＡ断片（ＤＮＡ（II））を調製した。
【００８１】
次に、ｐＧＫＳＰＨ３４をBgl IIおよびSal Ｉで消化後、１％アガロース電気泳動を行い、大きい方のＤＮＡ断片（ＤＮＡ（III)）をゲルより回収した。このようにして得られたＤＮＡ（Ｉ），ＤＮＡ（II) およびＤＮＡ（III)をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰを作製した（図１５）。
【００８２】
実施例１２．キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＧＰの生産
作製したｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰを有する大腸菌Ｗ３１１０Ｍ２５株を、１．５％グルコース、４ｇ／Ｌ  Ｋ2 ＨＰＯ4 、４ｇ／Ｌ  ＫＨ2 ＰＯ4 、２．７ｇ／Ｌ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．２ｇ／Ｌ  ＮＨ4 Ｃｌ、１．２ｇ／Ｌ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、４ｇ／Ｌ  酵母エキス、２ｇ／Ｌ  Ｌ−メチオニン、２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＡｌＣｌ3 ・Ｈ2 Ｏ、４ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．５ｍｇ／Ｌ  Ｈ3 ＢＯ4 、１０ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリンを含む培地で、３２℃，ｐＨ７．０で培養し、グルコースの枯渇後は、グリセリンを炭素源として、３７℃でさらに８時間培養し、菌体内にβＧａ１−１１７Ｓ４ＨＧＰの封入体を生産させた。
【００８３】
培養終了後、培養液をマントンゴリーンホモジナイザー（マントンゴーリン社製、モデル１５Ｍ−８ＴＡ）により６００KG／cm2 の条件でホモジナイズ処理し、遠心分離（ＣＥＰＡ遠心分離機）により沈殿画分を回収した。得られた沈殿を培養液と等量の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、再度、遠心分離で沈殿を回収し、培養液と等量の脱イオン水に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い沈殿を回収した後、沈殿と等容量の脱イオン水に懸濁し、後の操作に使用した。
【００８４】
実施例１３．キメラタンパク質からのｈＧＬＰ−１（７−３７）の切り出し
実施例１２で得られたキメラタンパク質封入体を回収し、８Ｍ尿素で溶解後反応液組成（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，３．０Ｍ尿素、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ2 ，８ｍｇ／ｍｌ  キメラタンパク質）になるように希釈し、Ｋｅｘ２−６６０を１０，０００Ｕ／ｍｌとなるように添加して、ｈＧＬＰ−１（７−３７）の切り出しを行った。本条件下、一時間でコントロールのβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＧＰは９０％以上切断された。
【００８５】
実施例１４．ｈＧＬＰ−１（７−３７）の分取（図１６、表３）
高発現かつＫｅｘ２−６６０の基質としても適していたキメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＧＰを大量に得るため、本キメラタンパク質をコードするプラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰにて大腸菌Ｍ２５（Ｗ３１１０／ｏｍｐＴ）を形質転換し、２０Ｌ培養槽にて培養した。培地は酵母エキス２０ｇ／Ｌ、バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 １２ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌからなり、菌体濃度がＯＤ６６０＝１．０で、ＩＰＴＧ（イソプロピルベータチオガラクトシド）を最終濃度１ｍＭとなるように添加した。消泡剤（ディスフォームＣＣ−２２２、（株）日本油脂）を用いた。
【００８６】
３７℃で菌体濃度がＯＤ６６０＝１２まで培養を継続した。集菌後、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に懸濁し、高圧ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｌｉｎｅ）による菌体破砕、遠心分離、ＴＥ及び脱イオン水での懸濁洗浄を行って、封入体約１００ｇを得た。封入体懸濁液（１６０ｇ／Ｌ）２５０ｍｌに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）１００ｍｌ，５モル  ＮａＣｌ溶液５０ｍｌ、脱イオン水５００ｍｌ、尿素９００ｇを加えて３０℃の恒温槽中３０分攪拌溶解し、暖めた脱イオン水で希釈し、３０℃で５Ｌとした。これに２５０ｍＭ  ＣａＣｌ2 溶液５０ｍｌを攪拌しながら穏やかに添加し、更にＫｅｘ２−６６０を２０，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ（約４，０ｍｇ／Ｌ）となるように加えた。
【００８７】
２時間後、（切断率は９０％以上）酢酸にてｐＨを６．４に合わせ、更に脱イオン水で２倍に希釈し、未反応キメラタンパク質及び、保護ペプチドを凝集沈殿させた。遠心分離によりｈＧＬＰ−１（７−３７）を含む上清を得、酢酸にてｐＨを５．０とし、２Ｍ尿素・１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換樹脂（ＳＰトヨパール）カラムを通してｈＧＬＰ−１（７−３７）を吸着させ、２Ｍ尿素・１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）で洗浄後、０Ｍから３００ｍＭまでの塩化ナトリウム濃度勾配にて、ｈＧＬＰ−１（７−３７）を溶出させた。あらかじめフラクションチューブには、最終３％となるように酢酸を入れておき、ｈＧＬＰ−１（７−３７）の凝集を抑制した。
【００８８】
ｈＧＬＰ−１（７−３７）を含む画分を集め、５％酢酸で平衡化した低圧逆相カラム（ＳｏｋｅｎＯＤＳ−Ｗ）を通してｈＧＬＰ−１（７−３７）を吸着させ、５％酢酸を含む５０％アセトニトリル溶液で、ｈＧＬＰ−１（７−３７）を溶出させた。減圧下でアセトニトリルを除き、０．２２μｍのメンブレンフィルター濾過後、凍結乾燥した。
【００８９】
ｈＧＬＰ−１（７−３７）の定量を以下詳述する。ｈＧＬＰ−１（７−３７）を含む溶液をサンプルバッファー（１Ｍ酢酸／２Ｍ尿素）で１０倍から２０倍に希釈し、遠心上清を得る。ＨＰＬＣ（島津ＬＣ１０Ａ）にＹＭＣ−Ｃ８−Ａ３０２（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）カラムを接続し、Ａ液（０．１％  ＴＦＡ／１０％アセトニトリル）、Ｂ液（０．０９４％  ＴＦＡ／６０％アセトニトリル）、Ｂ４０％→８０％／２０ｍｉｎ勾配の系にて該上清の１０μｌないしは２０μを展開し、２２０ｎｍの吸光度測定にて検出されたｈＧＬＰ−１（７−３７）と既知濃度の標準ｈＧＬＰ−１（７−３７）のピーク面積比から定量する。回収率表を表３に示す。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
【配列表】
0003925982.tif 000005
【００９２】
0003925982.tif 000006
【００９３】
0003925982.tif 000007
【００９４】
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【００９５】
0003925982.tif 000009
【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
0003925982.tif 000012
【００９９】
0003925982.tif 000013
【０１００】
0003925982.tif 000014
【０１０１】
0003925982.tif 000015
【０１０２】
0003925982.tif 000016
【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子作製に用いた合成オリゴマーの配列を示す。
【図２】図２は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子の作製方法を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）の作製方法を示す図である。Ｐｌａｃは大腸菌のラクトースオペロンのプロモーターを、Ｔｔｒｐは大腸菌のＴｒｐＥのアテニュエーターターミネーターを示す。
【図４】図４は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９の作製方法を示す。
【図５】図５は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の作製方法を示す図である。
【図６】図６は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４およびβＧａｌ−１１７ＳｎＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４とｐＧ１１７ＳｎＨＰＰＨ３４の作製方法の前半部分を示す図である（ｎ＝１〜６）。ｐＧ９７ＳＰＰＨ３４とｐＧ９７ＳｎＨＰＰＨ３４はプライマーＳ０５をＳ０４に変え、ｐＧ１３９ＳＰＰＨ３４とｐＧ１３９ＳｎＨＰＰＨ３４はプライマーＳ０５をＳ０６に変え、作製した。
【図７】図７は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４およびβＧａｌ−１１７ＳｎＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４とｐＧ１１７ＳｎＨＰＰＨ３４の作製方法の後半部分を示す図である（ｎ＝１〜６）。ｐＧ９７ＳＰＰＨ３４とｐＧ９７ＳｎＨＰＰＨ３４はプライマーＳ０５をＳ０４に変え、ｐＧ１３９ＳＰＰＨ３４とｐＧ１３９ＳｎＨＰＰＨ３４はプライマーＳ０５をＳ０６に変え、作製した。
【図８】図８は、ポリヒスチジンリンカー｛（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝n （ｎ＝１〜６）がキメラタンパク質の生産量に与える影響を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。図中４Ｈはヒスチジン残基が４個すなわち、ｎ＝１であることを示す。
【図９】図９は、Ｋｅｘ２−６６０によるｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率に与えるポリヒスチジンリンカー｛（Ｈｉｓ）４−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ｝ｎ（ｎ＝１〜６）の影響を示した図である。横軸はβＧａｌ−１１７ＳＰＰＨ３４のｋｃａｔ値を１としたときの相対値を示した。
【図１０】図１０は、Ｋｅｘ２−６６０によるｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率に与えるＫｅｘ２プロテアーゼの認識部位Ｐ３のアミノ酸の影響を示した図である。Ｐ４のアミノ酸はバリン残基に固定し、Ｐ３部位のアミノ酸を置換した。横軸はβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＶＫＰＨ３４のｋｃａｔ値を１としたときの相対値を示した。
【図１１】図１１は、Ｋｅｘ２−６６０によるｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し効率に与えるＫｅｘ２プロテアーゼの認識部位Ｐ４のアミノ酸の影響を示した図である。Ｐ３のアミノ酸はヒスチジン残基に固定し、Ｐ４部位のアミノ酸を置換した。横軸はβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＶＫＰＨ３４のｋｃａｔ値を１としたときの相対値を示した。
【図１２】図１２は、βＧａｌ−１１７ＫＳ４ＨＲＨＰＨ３４遺伝子の発現ベクターｐＧＫＳＰＨ３４の構造を模式的に示した図である。なお、βＧａｌ−１１７ＫＳはβＧａｌ−１１７Ｓの１４位のアルギニン残基がリジン残基に置換されているペプチドである。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ（Ｇ）の作製方法を示す図である。
【図１４】図１４は、ｈＧＬＰ−１（７−３７）遺伝子（ＤＮＡ（１））作製用合成オリゴヌクレオチドの塩基配列、及びｐＧＫＳＰＨ３４を鋳型とするＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す図である。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨＧＰの作製過程を示す図である。
【図１６】図１６は、ｈＧＬＰ−１の精製のプロフィルを示す図であり、ＡはＫｅｘ２反応後、Ｂは酸性沈殿上清、Ｃは陽イオン交換カラム後、Ｄは低圧逆相カラム後の結果を示す。ピーク１はｈＧＬＰ−１（７−３７）、ピーク２はｈＧＬＰ−１、ピーク３は保護ペプチド、ピーク４はキメラタンパク質を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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