(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体を構成する複数の分子のうち、一の分子である蛋白質の側鎖に存在するメチル基の水素、メチレン基の水素、メチン基の水素及び芳香環上の非易動性水素から選択される１又は複数個の特定水素を除き当該蛋白質の水素を重水素に置換した後、ＮＭＲ法を使用して交差飽和現象により、これに隣接する他の分子に含まれる水素から１０Å以内に存在する特定水素の位置を決定することを特徴とする蛋白質複合体の界面残基を同定する方法。
【請求項２】
当該特定水素がメチル基の水素、メチレン基の水素、メチン基の水素又は芳香環上の非易動性水素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該蛋白質の特定水素の重水素化率が多くとも１０％である請求項１記載の方法。
【請求項４】
特定水素を除く当該蛋白質の全水素の少なくとも９０％が重水素で置換される請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
交差飽和現象がアディアバティックシェイプトパルス法によるものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
交差飽和現象が特定水素以外の水素に対して選択的にパルスを与える方法によるものである請求項１又は５記載の方法。
【請求項７】
当該複合体が蛋白質と、蛋白質、核酸、及び脂質の少なくとも１種とで構成される請求項１記載の方法。
【請求項８】
当該特定水素が炭素に結合する場合、当該炭素が１３Ｃで置換される請求項１記載の方法。
【請求項９】
当該一の分子である蛋白質が複数個の他の分子と隣接し、当該他の分子のうち、当該蛋白質と隣接する１個の分子以外の隣接分子が水素を有する場合、その水素が重水素で置換される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
当該複合体中に当該一の蛋白質と隣接しない分子が含まれ、その分子が水素を有する場合、その水素が重水素で置換される請求項１、７又は９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質複合体、即ち蛋白質を少なくとも１個含む複数の分子で構成される複合体において、他の分子と隣接する当該蛋白質の界面残基をNMR法で同定する方法に関し、当該複合体における当該蛋白質の相互作用界面を高感度かつ高効率に決定できる方法を提供する。
【０００２】
本発明においては、当該蛋白質を構成するアミノ酸側鎖の水素において交差飽和現象を利用し、分子が複数結合して構成した複合体の当該蛋白質の界面残基を同定することにより、この相互作用界面を従来法に比較して高感度かつ高効率に決定（解析）することができる。
【０００３】
【従来の技術】
生命現象には様々な分子の相互作用が関与しており、複雑なネットワークを形成している。これ等分子の相互作用ネットワークを解明し、生体分子間の相互作用部位を明らかにすることができれば、相互作用部位を標的とした新規薬物の設計にとって重要な情報を与えることが期待される(de Vos et al., 1992; Clackson et al., 1995; Song et al., 1998参照。)。
【０００４】
NMR法を用いた蛋白質−蛋白質及び蛋白質−核酸複合体の相互作用界面残基の特定には、アミノ酸主鎖のアミド水素において、複合体形成に伴う交差飽和法（Takahashi et al., 2000参照。）や転移交差飽和法（Nakanishi et al., 2002参照。）を利用することによって行われてきた。
【０００５】
プロテインAは黄色ブドウ球菌の細胞壁構成蛋白質で、免疫グロブリンG（IgG）に結合することが分かっている（Langone et al., 1982参照。）。プロテインAの細胞外領域はA〜Eの五つのドメインから構成されている。このうち、Bドメインについて、以下「FB」と称する。
【０００６】
FBのIgGとの結合に重要な残基は、既にNMR法を用いた転移交差飽和法実験を基に求められている（Nakanishi et al., 2002参照。）。しかし、この方法は、スピン拡散を抑え相互作用界面の検出精度を高める目的で高い重水率の溶媒を用いる必要があること、また、検出するアミド水素自体は相互作用界面そのものに存在することが少なく、原子間距離に依存する交差飽和の効率は高いものではないことから、検出感度は高いとは言えない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような情況下で、従来のNMR法では生体分子複合体等各種の複合体を含む複数分子複合体の相互作用界面を感度良くかつ効率良く捉えるには不十分であり、このような複合体の相互作用界面を感度良くかつ効率良く解析することができるその改良方法が求められている。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、NMR法を使用して蛋白質を含む複数分子複合体における蛋白質の界面残基を同定し、その相互作用界面を高感度かつ高効率に決定することのできる方法を提供することにある。従って、これを達成するのが本発明の目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、蛋白質とこれに接する水素を有する分子を含む複合体における蛋白質との相互作用界面を高感度かつ高効率に決定することができる方法を開発すべく、従来法について種々検討を行った。
【００１０】
これまで、NMR法を使用して転移交差飽和法により、例えば高分子量蛋白質複合体（分子量150,000以上）の相互作用界面を、複合体形成に伴うアミド水素の交差飽和を指標にして決定する方法が提案されている（Nakanishi et al., 2002参照。）。しかしながら、この方法は、感度が低いため測定に多大な時間を要するのに加え、交差飽和の効率も良いとは言えず、厳密な分析には限界があることが分った。そこで、本発明者等は上記方法を改良すべく鋭意検討を行った結果、複合体を構成する蛋白質のアミノ酸側鎖の特定水素における交差飽和現象に着目することによって、蛋白質複合体における相互作用界面を高感度かつ高効率に決定できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１１】
即ち、本発明は、複合体を構成する複数の分子のうち、一の分子である蛋白質の側鎖に存在する特定水素を除き当該蛋白質の水素を重水素に置換した後、NMR法を使用して交差飽和現象により、これに隣接する他の分子に含まれる水素から１０Å以内に存在する特定水素の位置を決定することに特徴を有する蛋白質複合体の界面残基を同定する方法に存する。
【００１２】
複合体中に複数の蛋白質分子を含む場合、解析の対象となる相互作用界面残基を有する蛋白質が上記一の分子である蛋白質に相当する。このような場合、１個のみの蛋白質界面残基について解析したい場合には、この蛋白質を上記一の分子である蛋白質として上記方法を実施すればよい。一方、複数個の蛋白質の界面残基について解析したい場合には、先ず１個目の蛋白質についてこれを上記一の分子である蛋白質として上記方法を実施し、その後順次２個目、３個目…等の蛋白質について同様に上記方法を実施すればよい。この場合、前記の如く当該蛋白質に隣接する他の分子のうち少なくとも一つは水素を有していることが必要となる。
【００１３】
上記一の分子である蛋白質に隣接する相互作用界面が複数個存在する場合、即ち当該蛋白質が複数個の他の分子と隣接する場合、目的とする相互作用界面１個について上記方法を実施することができる。複数個について解析したい場合、その複数個について順次上記方法を実施することもできる。この場合、前記の如く当該蛋白質に隣接する他の分子のうち少なくとも一つは水素を有していることが必要となる。
【００１４】
本発明において、「特定水素」とは当該蛋白質を構成するアミノ酸側鎖中任意に選択される特定の位置に存在する非易動性の水素であり、当該特定水素の選択に際しては特に制限は無い。当該蛋白質を構成するアミノ酸の側鎖に存在する水素の中から本発明においてその位置を決定したい水素として、その１個又は複数個を適宜（任意に）選択することができる。好ましくは、メチル基の水素、メチレン基の水素、メチン基の水素及び芳香環上の水素（１個又は複数個）から選択する（少なくとも１種を選択する）ことができる。従って、当該特定水素として、メチル基（ＣＨ3）の水素、メチレン基（ＣＨ2）の水素、メチン基（=ＣＨ-；ＨＣＣ-等。）の水素又は芳香環（フェニル基、ヒドロキシフェニル基、インドール基、イミダゾール基等の１個又は複数個）上の水素を選択することができるが、中でもメチル基の水素は運動性が高いことによりピークが先鋭化しており、また３個の水素が存在し鋭いピークが得られ易い（メチル基水素のシグナルが等価な三つ分の水素の強度を持つ）等の理由でメチル基の水素が好ましい。
【００１５】
特定水素を除く当該蛋白質の水素を重水素化する場合、対象となる水素を全て重水素化するのが最も好ましいが、全水素の少なくとも９０％程度が重水素で置換されることが好ましく、更に特定水素を除く当該蛋白質の全水素の少なくとも９５％程度が重水素で置換されることがより好ましい。
【００１６】
一方、特定水素については重水素化しないが、一部重水素化されていても支障は無く、例えば当該蛋白質の特定水素の重水素化率が多くとも１０％（１０％以下）の場合何等支障は無い。
【００１７】
交差飽和現象については、アディアバティックシェイプトパルス法によるものが好ましく、また特定水素以外の水素に対して選択的にパルスを与える方法により行うことが望ましい。
【００１８】
当該複合体を構成する成分については、先ず相互作用界面を解析する対象としての蛋白質が必須成分として存在し、これと複合体を構成する分子については、解析の対象となる相互作用界面を含む分子が水素を有しておればよく、それ以外では特に制限は無い。例えば、この蛋白質と、蛋白質（前記一の分子である蛋白質と異種でも同一種でも良い。）、核酸、脂質及び水素を有し又は有しない低分子物質の中から選択される少なくとも１種とで構成される複合体を採用することができる。更に、これ等蛋白質、核酸、脂質及び低分子物質はそれぞれ１種に限ること無く複数種を採用することもできる。尚、蛋白質複数個が存在する複合体においては、前記の如く目的とする蛋白質１個又は複数個について、その相互作用界面残基を解析することができる。
【００１９】
当該特定水素が炭素に結合する場合、当該炭素を13Ｃで置換して上記方法を実施するのが、解析上効率良く分析を行うことができる。
【００２０】
当該一の分子である蛋白質が複数個の他の分子と隣接する場合、当該他の分子のうち、相互作用界面を解析しようとする当該蛋白質に隣接する１個の分子についてはその水素を重水素に置換することなく、それ以外の隣接分子が水素を有する場合、その水素については重水素に置換して（９０％程度以上）上記方法を実施する方が、目的とする相互作用界面の解析上好ましい。更に、本発明において解析対象の相互作用界面と関係しない分子が複合体に含まれる場合、これ等の分子が水素を有する場合にも、その水素について重水素に置換して（９０％程度以上）上記方法を実施するのが好ましい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２２】
本発明に使用する複合体は、好ましくは複数の分子が相互に非共有結合を介して複数結合するもので、当該一の蛋白質或いはその他の分子に生体分子を採用することができる。生体分子とは、動植物及び微生物の生体内に存在する蛋白質、核酸、脂質等の高分子物質であり、この場合複合体として、生体分子が非共有結合によって二つ以上結合したものを例示することができる。本発明においては、複合体を構成する分子には生体分子に限定すること無く、水素を有し又は有しない非生体分子の中から選択することもできるが、本発明における解析対象の相互作用界面を含む分子に関しては水素を含む必要がある。従って、必須成分の蛋白質以外では低分子物質でもよい。複合体の分子量としては、例えば10,000以上を有することができるが、当該蛋白質以外の成分については、2,000以上の高分子物質或いはそれ以下の低分子物質を挙げることができる。核酸についてはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００２３】
蛋白質複合体の形態として、蛋白質−蛋白質複合体、蛋白質−核酸複合体、蛋白質−脂質複合体、蛋白質−低分子物質複合体、蛋白質−蛋白質−蛋白質複合体、蛋白質−低分子物質−蛋白質複合体、蛋白質−蛋白質−核酸複合体等を例示することができる。このように、構成分子が非共有結合によって二つ以上結合したものを例示することができる。
【００２４】
本発明において、一の分子である蛋白質の側鎖に存在する特定水素を除き当該蛋白質の水素を重水素に置換する必要があるが、その方法は従来技術を利用して容易に行うことができる。例えば、メチル基を特定水素とする場合は、Goto et al., 1999のような手法が存在する。
【００２５】
例えば、特定水素を除く水素を重水素化する方法として、当該分子（蛋白質）を発現する微生物を、重水化した成分を含有する培地で培養した後、適当な非標識物質を添加することによって得られる。また、蛋白質分子を軽水素化分子、及び重水素化分子から化学合成、或いは無細胞合成すること等によっても得ることができる。
【００２６】
交差飽和とはＮＭＲ現象の一つであり、一対の水素核磁化間のスピン−スピン相互作用によって生じる。例えば、二つの分子から成る複合体の場合には一方の分子由来の水素シグナルのみを選択的に飽和することができれば、他方の分子は、飽和された分子からの交差飽和を受けることになる。この交差飽和は、分子の相互作用界面を通して起こる現象であるため、適切な飽和時間で観測を行えば、相互作用界面に位置している水素原子を同定することが可能となる。交差飽和を生じさせるには、ＮＭＲパルスを用いればよい。このとき、ＮＭＲスペクトルの一部の領域にシグナルを与える水素原子に選択的に、ＮＭＲパルスを与えて交差飽和現象を引き起こすことができる。
【００２７】
更に、アディアバティックシェイプトパルス（adiabatic shaped-pulse）を用いることにより、弱いラジオ波パワーで効率良く飽和を達成できる。また、帯域選択的に作用させると、例えば約3〜9ppm領域の水素のみを飽和させることが可能となる。従って、例えば複合体の一方の芳香環上水素、α水素及びメチレン水素等の水素を重水素化させると、もう一方の分子のみを選択的に飽和させることができ、その結果生じた交差飽和から複合体の界面残基を決定することが可能となる。帯域選択的に飽和するためにはWURST-2タイプのadiabatic shaped-pulse(Kupce, et al., 1995参照。)を用いるとよいが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明においては、複合体を構成する複数の分子のうち、一の分子である蛋白質において特定水素以外の水素が重水素化されているため、これに隣接する分子の水素から１０Å以内に存在する特定水素が交差飽和を受ける。相互作用界面に存在するアミノ酸側鎖の特定水素は、その距離的条件から主鎖のアミド水素よりも交差飽和の効率も高いことから、当該蛋白質分子の界面残基、或いはその相互作用界面を高感度かつ高効率に決定（解析）することができる。
【００２９】
以下、蛋白質−蛋白質複合体を例として、本発明についてより具体的に説明する。
【００３０】
本発明方法の原理
相互作用界面を同定する対象である蛋白質Aにおいてアミノ酸側鎖の特定水素以外の水素を重水素で標識し、それと複合体を形成する蛋白質Bは非標識にする。このとき、蛋白質複合体は水素密度が極めて低い蛋白質Aと高い蛋白質Bから構成されることになる。
【００３１】
尚、重水素で標識（置換）する程度は標識対象の水素全てを重水素置換するのが最も好ましいが、好ましくは９０％程度以上、より好ましくは９５％程度以上標識すればよい。一方、標識対象でない水素については重水素標識しない方が好ましいが、一部（１０％程度）重水素標識されていても何等支障は無い。
【００３２】
蛋白質A-B複合体に対して広域ラジオ波照射を適用すると、スピン拡散現象により蛋白質B分子の水素全体が飽和されることになる（Kalk et al., 1976; Akasaka, 1981参照。）。このとき、蛋白質Aの相互作用界面付近に存在する特定水素は、その界面を介して蛋白質Bの飽和した水素との交差緩和の機構により飽和の移動が観測される。
【００３３】
磁化の飽和はNMRシグナルの強度減少として観測されるため、複合体の1H-13C HSQCスペクトル上に観測される特定水素のシグナル強度減少を指標として、蛋白質Aの相互作用界面に存在する特定水素を含むアミノ酸残基を決定することができる。
【００３４】
蛋白質−蛋白質複合体への適用とその結果
特定水素以外の水素を2Hによって、及び特定水素が結合する炭素を13Cによって標識した蛋白質Aと非標識の蛋白質Bにおいて、NMRを用いて解析を行った。
【００３５】
その結果、蛋白質Aの相互作用界面に近接するアミノ酸側鎖の特定水素において顕著な交差飽和現象が観察された。これ等の特定水素は、これまでに相互作用界面に存在することが明らかとなっている。
【００３６】
また、本法のNMR測定時間は、主鎖のアミド水素を利用した従来法と比べ、約５分の１の測定時間であった。更に、界面に存在する特定水素の場合、従来法と比べ８分の１の照射時間で、同程度の強度比の交差飽和現象が観測された。これは、従来の主鎖のアミド水素を利用した方法に比べて著しく効率が高いことが分かる。
【００３７】
考察
本発明は、複合体を構成する複数の分子のうち、一の分子である蛋白質における特定水素以外の水素を重水素に置換して交差飽和現象を起こさせることにより、複合体相互作用界面残基を高感度かつ高効率に決定できる。これは、本発明方法が複合体中において、主鎖のアミド水素と比べて相互作用界面に近接する側鎖の水素を観測していることから、交差飽和の効率が非常に高く、主鎖のアミド水素を指標にした従来の方法よりも明らかに優れていることが確認された。従って、本発明方法は、高分子物質、及び低分子物質を問わず、蛋白質を含むあらゆる分子の相互作用解析に対しても適用可能な方法であると期待される。
【００３８】
本発明は、交差飽和現象をアミノ酸側鎖における特定水素に対して利用したもので、従来法に比較して高感度かつ高効率に相互作用界面を決定することができる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。尚、この実施例により本発明は何等制限されることはない。
【００４０】
（実施例１）
FBの調製
アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンを均一に13C標識し、そのメチル基水素以外の水素を2Hで標識したFB（以下、「FB_Me」と記載する。）の調製は、以前に報告された方法（Goto et al., 1999参照。）に従った。即ち、15NH4Cl、[U-2H]glucose、及び99.5% 2H2Oを組み合わせて調製したM9最小培地において大腸菌を培養し、発現誘導1時間前に、[13C4,3,3-2H]α-ketobutyric acid、及び[U-13C5,3-2H]α-ketoisovaleric acidを添加することによって標識体を得るという方法を採用した。
【００４１】
また、FBの単離、及び精製法は、以前に報告された方法（Torigoe et al., 1990参照。）に従った。
【００４２】
IgGの調製
IgGはハイブリドーマ細胞から、以前に報告された方法（Torizawa et al., 1998参照。）に従って調製した。
【００４３】
NMR測定法
サンプルは450 μLの20 mM PBS(pH 6.0)の99.8% D2O中、FB_Me（7 kDa）0.8 mMと非標識IgG（157 kDa）0.16 mMを混合した複合体（164 kDa）溶液を用いた。
【００４４】
NMR測定は、Bruker Avance700スペクトロメーター（プロトン共鳴周波数700,13MHz）を用い、測定温度298 Kで行った。交差飽和実験は、コンスタントタイム1H-13C HSQCパルス（Vuister and Bax，1992参照。）の前にアディアバティックシェイプトパルス・デカップリングによる照射スキームを加えて行った。また、参照スペクトルとして照射を行っていない測定も行った。アディアバティックシェイプトパルス・デカップリングには，WURST-2デカップリングスキーム（Kupce and Wagner, 1995参照。）を用いた。WURST-2（adiabatic factor Q0=1）に対する最大ラジオ波強度は0.17kHzと設定し，飽和中心周波数は，6.0 ppmとした．パルスの繰り返しの待ち時間は2.0秒（うち照射時間は、0.25秒）、積算回数8回、スペクトル幅は9328 Hz（t1）/4225 Hz（t2）、データ取り込みは38ミリ秒（t1）/55ミリ秒（t2）で行い、全測定時間は、3時間であった。
【００４５】
FB-IgG複合体への適用とその結果
図１は、複合体中のIgGに対して、ラジオ波照射の有無による交差ピークのシグナル強度比をFBのメチル基側鎖を有するアミノ酸残基について表示したものである。この結果から、Leu18の二つのメチル基、及びIle32のδメチル基に顕著な交差飽和現象が観察された。これ等の残基は、全て相互作用界面に存在することが明らかとなった（Nakanishi et al., 2002参照。）。図２は、FB-IgG複合体においてLeu18の二つのメチル基及びIle32のδメチル基の存在位置を示したものである。
【００４６】
また、アミド水素を利用した従来法においては、16時間程度の測定時間を要するのに対して、本法の測定時間は約3時間であった。更に、界面に存在するLeu18のメチル基の場合、従来法では2.0秒間の照射時間で強度比が約0.4であったのに対し、本法では、転移交差飽和実験でありながら、0.25秒間の照射時間で強度比が約0.6の交差飽和現象が観測された。これは従来のアミド水素を利用した方法に比べて著しく効率が高い（Nakanishi et al., 2002参照。）ことを示している。
【００４７】
考察
複合体を構成する複数の分子のうち、一の分子である蛋白質におけるメチル基水素以外の水素を重水素に置換して交差飽和現象を起こさせることにより、複合体相互作用界面残基を短時間でかつ高感度に決定することができた。これは、本法が複合体中において、主鎖のアミド水素より相互作用界面に近接する側鎖のメチル基を観測していることから交差飽和の効率も高い上にスピン拡散の影響も抑制されており、またメチル基水素のシグナルも等価な三つ分の水素の強度を持つ上に先鋭化していることによるものであると考えられる。更に、アミノ酸前駆体がメチル基のみ13C標識されたものを利用した場合、コンスタントタイム実験の必要がなくなる。よって、高感度の測定が30分未満の短時間で行うことが可能となるとともに、より高分子量の複合体に対しても適用可能になることが期待される（Hajduk et al., 2000参照。）。
【００４８】
以下に、本願明細書中で引用、参照した参考文献のリストを示す。尚、当該文献の内容は必要により本明細書中に参考により組み込まれる。
【００４９】
Akasaka, K. (1981). Longitudinal relaxation of protons under cross saturation and spin diffusion. J. Magn. Res. 45, 337-343.
Clackson, T. and Wells, J. A. (1995). A Hot Spot of Binding Energy in a Hormone-Receptor Interface. Science 267, 383-386.
Goto, K. N., Gardner, H. K., Mueller, A. G., Willis, C. R. and Kay, E. L. (1999). A robust and cost-effective method for the production of Val, Leu, Ile (δ1) methyl-protonated 15N-, 13C-, 2H-labeled proteins. J. Biomol. NMR 13. 369-374.
Hajduk, J. P., Augeri, J. D., Mack, J., Mendoza, R., Yang, J., Betz, F. S. and Fesik, W. S. (2000). NMR-Based Screening of Proteins Containing 13C-labeled Methyl Groups. J. Am. Chem. Soc. 122, 7898-7904.
Kalk, A. and Berendsen, H.J.C. (1976). Proton magnetic relaxation and spin diffusion in proteins. J. Magn. Res., 24, 343-366.
Kupce, E. and Wagner, G. (1995). Wideband homonuclear decoupling in proteinspectra. J. Magn. Res. B. 109, 329-333.
Langone, J.J. (1982). Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumonococci. Adv. Immunol. 32, 157-252
Nakanishi, T., Miyazawa, M., Sakakura, M., Terasawa, H., Takahashi, H. and Shimada, I. (2002). Determination of the Interface of a Large Protein Complex by Transferred Cross-saturation Measurements. J. Mol. Biol. 318, 245-249.
Song, J. and Ni, F. (1998). NMR for the design of functional mimetics of protein-protein interactions: one key is in the building of bridges. Biochem. Cell Biol. 76, 177-188.
Takahashi, H., Nakanishi, T., Kami, K., Arata, Y. and Shimada, I. (2000). A novel NMR method for determining the interfaces of large protein-protein complexes. Nature Struct. Biol. 7, 220-223.
Torigoe H., Shimada, I., Saito, A., Sato, M. and Arata, Y. (1990). Sequential 1H NMR assignments and secondary structure of the B domain of staphylococcal protein A: structural changes between the free B domain in solution and the Fc-bound B domain in crystal. Biochemistry. 29, 8787-8793.
Torizawa, T., Kato, K., Kimura, Y., Asada, T., Kobayashi, H., Komatsu, Y., Morioka, H., Nikaido, O., Ohtsuka, E. and Shimada, I. (1998). 31P NMR study of the interactions between oligodeoxynucleotides containing (6-4) photoproduct and Fab fragments of monoclonal antibodies specific for (6-4) photoproduct. FEBS Letters,  429, 157-161.
de Vos, A.M., Ultsch, M., Kossiakoff, A.A. (1992). Human Growth Hormone and Extracellular Domain of Its Receptor: Crystal Structure of the Complex. Science 255, 306-312.
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【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、蛋白質を含む複合体において、他の分子と隣接する蛋白質の相互作用界面残基を、NMR法により同定することにより、従来法に比較して高感度かつ高効率に当該蛋白質を含む複合体の相互作用界面を決定（解析）することができる。
【００５１】
従って、本発明は構造解析の分野、機器分析の分野或いは医薬品の分野等で広く実施することができ、故に本発明は産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１において、複合体中のIgGに対して、ラジオ波照射の有無による交差ピークのシグナル強度比をFBのメチル基側鎖を有するアミノ酸残基について表示したものである。
縦軸：強度比；横軸：メチル基番号。
0003947775.tif 000002
【図２】図２は、実施例１中、FB-IgG複合体においてLeu18の二つのメチル基及びIle32のδメチル基の存在位置を示したものである。
【図１】
0003947775.tif 000003
【図２】
0003947775.tif 000004