(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物と少なくとも１つの非標識化合物との間の結合を測定する方法であって、前記方法は前記結合の結果前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物により発せられた蛍光に対する消光効果を検出する工程を含み、前記結合は特異的であると共に、核酸塩基対核酸塩基以外の結合であり、前記方法は、前記消光効果の検出前に前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物と前記少なくとも１つの非標識化合物の複合体を前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物から分離せず、かつ前記発せられた蛍光を消光するためのシグナル消光剤を加えずに行われ、前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物が核酸であり前記少なくとも１つの非標識化合物がタンパク質であるか、または前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物がタンパク質であり前記少なくとも１つの非標識化合物が核酸である、方法。
【請求項２】
前記消光効果を検出する工程が、
前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物と前記少なくとも１つの非標識化合物とを含む試験媒質を提供する工程と、
前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物が蛍光を発するのに有効な放射線で、試験媒質を照射する工程と、
前記蛍光の蛍光強度を、前記少なくとも１つ非標識化合物を実質的に欠いている以外には試験媒質と実質的に同一な参照媒質の参照蛍光強度と比較する工程とを含み、
前記消光効果および前記特異的結合は蛍光強度が参照蛍光強度よりも小さいときに検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体およびオリゴヌクレオチドから成る群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、精製調製物、合成調製物、半精製タンパク質抽出物、粗タンパク質抽出物、またはインビトロ翻訳調製物の形で与えられる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非標識化合物が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または複数タンパク質の複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物がタンパク質であり、前記少なくとも１つの非標識化合物が核酸である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物が核酸であり、前記少なくとも１つの非標識化合物がタンパク質である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
複数の異なる非標識化合物に対する前記少なくとも１つの標識化合物の結合親和性を測定する工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの標識化合物が核酸であり、前記複数の異なる非標識化合物がタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合親和性の測定に基づいて前記複数の異なる非標識タンパク質の中から薬剤候補を選択する工程をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合親和性の測定に基づいて前記複数の異なる非標識タンパク質の中から遺伝子抑制または活性化剤を選択する工程をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が同等に結合するかどうかを決定するために前記複数の異なる非標識タンパク質の結合親和性を比較する工程をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物は核酸であり、前記少なくとも１つの非標識化合物は、前記核酸と複数タンパク質の複合体を形成する、少なくとも２つのタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数タンパク質の複合体は前記核酸の少なくとも２つの隣接部位にそれぞれ結合される前記少なくとも２つのタンパク質であり、前記方法は、前記少なくとも２つのタンパク質が前記少なくとも２つの隣接部位に独立して、協同的に、または共同作用的に結合するかどうかを決定する工程をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数タンパク質の複合体は前記核酸の少なくとも２つの部位にそれぞれ結合される前記少なくとも２つのタンパク質であり、前記２つの部位は２つの結合したタンパク質が互いに相互作用した場合にループから外れる介在ＤＮＡ配列により分離される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質へのタンパク質結合化合物の結合を検出する工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質結合化合物が、前記タンパク質に対して特異的に向けられた抗体である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質と抗体の結合が、蛍光強度が前記抗体の前記タンパク質への前記結合と前記タンパク質の前記核酸への前記結合とにより消光されたときに検出される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質と抗体の結合は蛍光強度が消光しないときに検出され、前記消光がないのは、タンパク質と抗体の複合体が形成され、前記核酸の前記タンパク質への結合を妨げられていることを示す請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記フルオロフォアの付いていない核酸を前記試験媒質に添加することにより前記核酸と少なくとも１つのフルオロフォアの付いていない核酸との間の競合測定を行う工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの非標識化合物は変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの標識化合物は変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの非標識化合物は複数タンパク質の複合体の中の突然変異タンパク質であり、前記少なくとも１つの非標識化合物は別のタンパク質が前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物に結合するのを妨げる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの非標識化合物はリン酸化、グリコシル化または金属イオンとの相互作用により修飾される請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質抽出物調製の異なる代謝状態の間にＤＮＡと結合することができる機能タンパク質または複数タンパク質の複合体の存在をタンパク質抽出物内で同定する工程をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が修飾されている請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸がメチル化されている請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（明細書）
（発明の属する技術分野）
本発明は生物ポリマー結合測定法に関し、詳細には、核酸とペプチドまたはタンパク質との結合を蛍光強度データを用いて測定する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質−核酸複合体は種々の生物学的プロセスで重要な役割を果たしていることが知られている。例えば、ヒル（Ｈｉｌｌ）ら、タンパク質−核酸複合体の研究への蛍光アプローチ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）２７８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３９０（１９９７）を参照されたい。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質は遺伝子調節に重要な役割を果たすことがわかっている。遺伝子は一般に、ＤＮＡ結合タンパク質により転写レベルで調節され、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写因子と称される。転写因子は、特にプロモータＤＮＡの標的核酸配列に結合することにより、遺伝子発現を調節する。
【０００３】
タンパク質−核酸相互作用は生物学的に重要であるため、タンパク質−核酸の結合特性を研究するための種々の方法が提案されている。例えば、ヒル（Ｈｉｌｌ）らや本明細書に引用した参考文献を参照されたい。
【０００４】
ヴァーディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）に付与された米国特許第５，７８３，３８４号は、標的核酸配列に対するＤＮＡ結合タンパク質の親和性を測定するための方法を開示している。ヴァーディンは、ＤＮＡ結合タンパク質と標的核酸配列との間に可逆的結合を提供する工程と、その可逆的結合を管理された条件下で破ることにより可逆的結合の相対強度（従ってタンパク質核酸のタンパク質の親和性）を測定する工程とから成る方法を教示している。結合を破るのに必要な条件が厳しければきびしいほど、核酸に対するタンパク質の親和性は高い。ヴァーディンは、蛍光に基づく結合アッセイについては開示も示唆もしていない。
【０００５】
ロイヤー（Ｒｏｙｅｒ）に付与された米国特許第５，４４５，９３５は、タンパク質−オリゴヌクレオチド結合を研究するための蛍光に基づく方法を開示している。しかし、同特許の教示は専ら蛍光異方性技術に限定されている。基本的に、異方性は、自由ＤＮＡまたはタンパク質が結合したＤＮＡの回転拡散事象を測定すると共に、リンカーアームを介してＤＮＡに取り付けられたフルオロフォアの局所運動を測定する。自由ＤＮＡは速く回転し、光を容易に偏光解消し、低い異方性値を示す。対照的に、タンパク質が結合したＤＮＡはフルオロフォアの寿命に対してゆっくり回転し、光をほんのわずかに偏光解消し、従って、比較的高い異方性値を示す。
【０００６】
しかし、異方性に基づく検定法には重要な欠点がある。結合の関数としての異方性の変化の程度は、異方性に基づく方法の提案者が示すほどには予測可能なものではない。相反するデータを理論期待値と適合させる異方性データの解釈には、解析的方法（特に該方法が自動化される場合）で望まれる努力よりも多くの努力が必要となる可能性がある。
【０００７】
放射性標識は、比較的遅く、健康や環境に危険を及ぼし、比較的大きな労働力を要するにも拘わらず、タンパク質−核酸相互作用を分析するための最も普及している方法である。一般に、従来の放射性標識法では、特定の酵素によって３２Ｐで末端が放射性標識されたＤＮＡプローブが必要である。組み込まれなかった３２Ｐからの標識ＤＮＡの精製には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一晩の溶出、ゲル濾過および濃縮工程が含まれる。３２Ｐの半減期はたった１４日であるため、各プローブに対して約３週間ごとに放射性標識が必要である。さらに、タンパク質−３２Ｐ−ＤＮＡ複合体は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により非結合３２Ｐ−ＤＮＡから分離する必要がある。その後ゲルは、オートラジオグラフィーまたはまたはリンイメージングにより乾燥、分析される。
【０００８】
ＷＯ９８／２６０９３号は、蛍光ヌクレオチド類似体を含む核酸とタンパク質との結合を検出する方法を開示している。ハイブリッド形成またはタンパク質の結合による核酸の通常のコンホメーションの変化により、該蛍光ヌクレオチド類似体の消光が減少および／または排除され、蛍光の検出可能な増加が生じる。
米国特許第５，８４６，７２９号および第６，０６，２４２号には発明者らが以前に開発した特定の測定法が開示されている。
上述の開発にも拘わらず、ペプチド−核酸およびタンパク質−核酸相互作用の分析のための簡単で効果的で速い方法に対する要求が、当該技術分野には存在し続けている。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物と少なくとも１つの非標識化合物との間の結合を測定する方法を提供する。該方法は、結合の結果前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物により発せられた蛍光に対する消光効果を検出する工程を含む。この場合、前記結合は特異的であり、核酸塩基対核酸塩基以外の結合である。該方法は、消光効果の検出前に前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物と前記少なくとも１つの非標識化合物の複合体を前記少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物から分離せずに、かつ前記発せられた蛍光を消光するシグナル消光剤を加えずに、好ましくは行われる。
【００１０】
本発明を、同様な参照符号は同様な要素を示す以下の図面と共に説明する。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、少なくとも１つのタンパク質配列と少なくとも１つの核酸配列との間の特異的結合を測定する方法であって、前記少なくとも１つのタンパク質配列および／または前記少なくとも１つの核酸配列が少なくとも１つのフルオロフォアを含む方法を提供する。該方法は、該特異的結合により少なくとも１つのタンパク質−核酸複合体が形成した結果起こる、少なくとも１つのフルオロフォアに対する蛍光強度の消光効果を検出する工程を含む。好ましくは、フルオロフォアは、少なくとも１つのタンパク質配列への結合より先に、少なくとも１つの核酸配列に取り付けられる。
【００１１】
タンパク質がＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合した時に増加する蛍光異方性レベルとは異なり、蛍光発出強度は複合体が形成されると減小する。
消光を検出する（従って結合を測定する）好ましい方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸配列と少なくとも１つのタンパク質配列を含む試験媒質を提供する工程と；（ｂ）該少なくとも１つのフルオロフォア標識化合物が蛍光を発するのに有効な放射線で試験媒質を照射する工程と；（ｃ）該蛍光の蛍光強度を、少なくとも１つのタンパク質配列を欠いている以外には試験媒質と実質的に同一な参照媒質の参照蛍光強度と比較する工程とから成り、消光効果および特異的結合は蛍光強度が参照蛍光強度よりも小さいときに検出される。消光は、特異的結合を介したタンパク質−核酸複合体の形成の指標である。
【００１２】
本明細書に記載するように、少なくとも１つのタンパク質配列と少なくとも１つの核酸配列との間の特異的結合からは、ペプチド核酸および核酸との間の相補的（すなわち、ワトソン−クリックの）塩基対合は除外されるが、すべての他の種類のタンパク質間の特異的結合は含まれる（本発明のために、「タンパク質」という用語は、例えばペプチド（例えば、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド等）、ポリペプチド、タンパク質および複数タンパク質の複合体）および核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、核酸類似体およびオリゴヌクレオチド）を含むものとして最も広い意味に定義される。
【００１３】
本発明の方法を用いて、種々のタンパク質−核酸複合体を測定することが可能である。本発明は、核酸と例えばペプチド、タンパク質、または複数タンパク質の複合体との間の結合特性（結合の存在または不在ならびに結合親和性）を測定するために使用することが可能である。分析に適したタンパク質には、例えば、野生型タンパク質、変異タンパク質、単離タンパク質、インビトロ翻訳タンパク質、および／または合成タンパク質が含まれる。本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質のｄｓＤＮＡへの結合を分析するのに特に適している。試験試料は純度１００％である必要はなく、むしろ精製調製物、合成調製物、半精製タンパク質抽出物、粗タンパク質抽出物、またはインビトロ翻訳調製物であり得る。
【００１４】
本発明の実施形態は、核酸配列上の１または複数の結合部位に結合する、同じか異なる複数のタンパク質を有する複数タンパク質の複合体の結合特性を分析する。複数のタンパク質：ＤＮＡの複合体は、１つのタンパク質：ＤＮＡ複合体またはホモ二量体：ＤＮＡ複合体よりも、自然界では一般的であり、生物学的にも重要である。本発明を用いて、２つの（またはそれより多くの）相互作用をしているタンパク質がその各ＤＮＡ部位に独立して、協同的に、または共同作用的に結合するかどうかを検出することが可能である。例えば、本発明は、２つの結合したタンパク質が互いに相互作用した場合にループから外れる介在ＤＮＡ配列により分離された２つのＤＮＡ部位に対する、２つのタンパク質の結合を測定することができる。
【００１５】
結合複合体の構成要素は野生型のみであったり完全に対になっているものであったりする必要はない。例えば、本発明は変異タンパク質と変異ＤＮＡ結合配列との結合または結合親和性が変えられた変異タンパク質と野生型ＤＮＡ結合部位との結合を測定することができる。
【００１６】
本発明では、第１の非標識化合物と標識化合物との間の（蛍光強度の変化によって示されるような）結合特性の変化を検出することにより、第１の非標識化合物の第２の非標識化合物に対する結合を検出することが可能である。本発明のために、そのような検出は「２次結合」の検出またはより広い意味では「間接的結合」の検出と称される。さらなる各結合レベルが標識化合物と第１の非標識化合物との間の結合に有意な変化を生じると仮定すると、理論的には、本発明では、３次結合の検出、４次結合の検出等が可能である。
【００１７】
同様に、本発明では、複合化合物の少なくとも１つが蛍光強度測定用に標識された、複数の複合化合物から成る複合体の少なくとも１つのメンバーへの非標識化合物の結合を検出することが可能である。標識化合物と非標識化合物は検出が起こるよう直接相互作用する必要はない。重要な点は、本発明が、標的に対する標識プローブの結合特性に間接または直接的に影響を及ぼすことにより、ある条件を検出できることにある。
【００１８】
従って、本発明により、抗体（すなわち「第２の非標識化合物」）の、該抗体が指向する特異的タンパク質（すなわち「第１の非標識化合物」）に対する結合を検出することが可能となる。特異的タンパク質は標識ＤＮＡ配列に直接結合されるか、または複数タンパク質：ＤＮＡ複合体に存在して該複合体中の１または複数の他のタンパク質と相互作用するが必ずしも標識ＤＮＡと直接相互作用する必要はない。タンパク質：ＤＮＡ複合体（特に複数タンパク質：ＤＮＡ複合体）への特異的抗体の添加は、タンパク質：ＤＮＡ複合体中の未知タンパク質の存在を確認するための広く使用されている技術である。抗体の結合により、タンパク質：ＤＮＡ複合体の生成（その結果、自由ＤＮＡと比べた強度の変化はない）が防止されるか、タンパク質：ＤＮＡ複合体よりもずっと大きく蛍光強度を減小させる抗体：タンパク質：ＤＮＡ複合体を生じるであろう。
【００１９】
本発明によれば、標識核酸が、他の配列特異的結合分子（例えばペプチド、ペプチド模倣分子、複合炭水化物または他のオリゴマー）に直接および間接的に結合することが可能である。
【００２０】
本発明は、部位特異的な方法で所望のＤＮＡまたは他の種類の配列に結合したり他の分子の結合を変化させたりする分子を設計および／または選択する等の多数の目的に有効である。本発明は、特異的結合活性を有するか他の結合対／複合体の結合特性を予測可能に変化させる新規物質または薬剤を同定および評価する方法を提供する。例えば、プロモータＤＮＡに結合し転写ブロッカーとして作用するＤＮＡ結合特異性を有する物質を同定することが可能である。この新たに同定された転写ブロック物質は、インビトロ転写プロセスでもインビボ転写プロセスでも使用することが可能である。
【００２１】
本発明の方法は、蛍光強度の検出前に少なくとも１つのタンパク質配列および少なくとも１つの核酸配列から成る少なくとも１つのタンパク質−核酸複合体を分離せず、かつ少なくとも１つのタンパク質または少なくとも１つの核酸配列に対するシグナル消光剤を与えずに、行うことができる。
【００２２】
該方法では、危険で、退屈で、使用に時間がかかり、絶えず再生する必要がある放射性プローブを使用する必要がない。本発明のプローブは、好ましくは安全に使用され、数年にわたって安定である。従って、プローブを大量に製造または注文することができると共に、貯蔵できる。
【００２３】
本発明の方法では、ゲル分離工程が不要であるため、ちょうど半日で試験および分析すべき試料の量を２倍にすることができる。定量分析は簡単・正確である。
【００２４】
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明がそのような実施例に制限されるものとはみなさないことは当然である。
（実施例）
実施例では、本発明のレーザに基づく測定がすべてのクラスのＤＮＡ結合タンパク質に適用可能であるという証拠として、３つの異なるクラスのＤＮＡ結合タンパク質の、その各ＤＮＡ認識部位に対する結合を証明する。この実施例のために選択した３つの各タンパク質は、ｃ−ＪＵＮ（実施例１−３および５）、ＳｐＩ（実施例４）およびＯｃｔ−１（６−７）である。
【００２５】
（実施例１）
ｃ−ＪＵＮは、多くの細胞およびウイルス遺伝子のプロモータまたはエンハンサー配列に天然に存在するＡＰ−１  ＤＮＡ結合部位に結合して該結合部位を調節する、ＡＰ−１ファミリー転写因子のメンバーである。例えば、ボーマン（Ｂｏｈｍａｎｎ）ら、“Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ−ｊｕｎ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＡＰ−１”２３８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３８６−１３９２（１９８７）を参照されたい。さらに、ヒトｃ−ＪＵＮタンパク質は、調節が解除され活性化されると、原腫瘍タンパク質と呼ばれる、腫瘍形成とがんを引き起こすタンパク質（ｃ−ＦＯＳおよびｃ−ＭＹＣを含む）のクラスに属する。ｃ−ＪＵＮ、ｅ−ＦＯＳおよびｃ−ＭＹＣは、ＤＮＡ結合ドメインが塩基性アミノ酸に富んだ領域（「塩基性領域」または「塩基性ドメイン」と一般に呼ぶ）から成り、「ロイシンジッパー」と称される構造ドメインにすぐ隣接して存在する、ＤＮＡ結合タンパク質の特異的グループを構成する。ロイシンジッパーは、２分子のコイルとコイルの構造を形成する、７個のアミノ酸の規則的間隔に離間された４〜５個のロイシン残基（ｃ−ＪＵＮは５個有する）から成る。そのパリンドロームＤＮＡ配列との特異的接触は、主として塩基性領域を介して起こる。ロイシンジッパーは、ｃ−ＪＵＮ：ｃ−ＪＵＮホモ二量体を形成するｃ−ＪＵＮのそれ自体に対する二量体形成またはｃ−ＪＵＮｃ−ＦＯＳヘテロ二量体を形成するｃ−ＪＵＮのｃ−ＦＯＳへの二量体形成を許容する。ｃ−ＪＵＮのホモ二量体は、ＤＮＡらせんの小溝に対してＤＮＡを７９゜に曲げるが、ｃ−ＪＵＮ：ｃ−ＦＯＳヘテロ二量体は小溝に対してＤＮＡを反対方向に９４゜曲げる。ＤＮＡ結合ドメインが完全に機能するには、塩基性領域とロイシンジッパーの両方が必要である。ヒトの純ｃ−ＪＵＮタンパク質を以下の測定に使用するため、実施例は、ｃ−ＪＵＮ：ｃ−ＪＵＮホモ二量体の１つのＡＰ−１部位（ＪＤ１Ｆ／２Ｆ）への結合を示す。
【００２６】
７塩基対の共通ＡＰ−１  ＤＮＡ結合部位を有する、フルオレセイン標識した野生型のｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドであるＪＤ１Ｆ／２Ｆは、ヒトコラゲナーゼ遺伝子のプロモータ配列から得た。共通ＡＰ−１部位の両端に隣接して５個のヌクレオチドを有する、相補的な５’−フルオレセイン標識したｓｓＤＮＡ１７量体ＪＤ１ＦおよびＪＤ２Ｆを、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅｓ核酸合成装置で合成し、ＨＰＬＣにより生成した。当モル量のＪＤ１ＦおよびＪＤ２Ｆオリゴを、９５℃で５分間変性することにより１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でアニーリングし、その後４２℃、３５℃および２１℃で４０分間ずつインキュベートした。アニーリングしたオリゴを２時間−２０℃でエタノ−ル沈殿させ、１４Ｋｒｐｍ、２０分間、０℃で遠心分離でペレットとし、１００％エタノールで洗浄し、１４Ｋｒｐｍ、２０分間、０℃で再びペレットとし、乾燥させ、最終濃度が１００ｎｇ／μｌとなるようにｄｄＨ2Ｏに溶解させた。生成したｄｓＤＮＡオリゴはいずれの５’末端にも１つのフルオレセイン分子を有していた。
【００２７】
野生型ＪＤ１Ｆ（配列番号１）に対する配列：
５’−Ｆｌｕ−ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＴＴ−３’
野生型ＪＤ２Ｆ（配列番号２）に対する配列：
５’−Ｆｌｕ−ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣ−３’
変異ｄｓＤＮＡ１７量体ＪＤ３Ｅ／４Ｆは、野生型ＡＰ−１共通ＤＮＡ結合部位でのＧＣからＴＡへの１つの塩基対の変化（下線）以外は、野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆと同じ配列であった。
【００２８】
変異ＪＤ３Ｆ（配列番号３）に対する配列：
５’−Ｆｌｕ−ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＴＴ−３’
変異ＪＤ４Ｆ（配列番号４）に対する配列：
５’−Ｆｌｕ−ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＡＣ−３’
ＤＮＡ結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含有していた：９．２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０３ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ、３．７５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１５μｇ／μｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０〜２．０μｇ  純ｃ−ＪＵＮタンパク質（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）または０〜４００ｎｇ純ｃ−ＪＵＮペプチド、および０．０７５ｐｍｏｌｅ  ５’−フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド。完全長ｃ−ＪＵＮを使用した場合、３ｎｇ／μｌポリ（ｄＩ）−ポリ（ｄＣ）が反応混合物に含まれ、タンパク質とフルオレセイン標識ＤＮＡの添加前に加えられる。図１Ｂおよび１Ｄの例は、５０ｍＭ  ＮａＣｌの代わりに５０ｍＭ  ＫＣｌを含有した。野生型および変異ｃ−ＪＵＮ  ＤＮＡ結合ドメインペプチドはダークボーマン（Ｄｉｒｋ  Ｂｏｈｍａｎｎ）博士、（ヨーロッパ分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ドイツ国ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）所属）より供与された。反応混合物は、２１℃で３０分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍ波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
【００２９】
野生型ｃ−ＪＵＮ  ＤＮＡ結合ドメインペプチドは、ｃ−ＪＵＮのＣ末端の１３２個のアミノ酸残基から構成された（Ｇｌｎ２０９からＰｈｅ３４０まで）。ｃ−ＪＵＮ変異１４ＤＮＡ結合ドメインペプチドは、２７７位置でリジンがイソロイシンに変わり、２７８位置でシステインがアスパラギン酸に変わる中心塩基性ドメイン内の２つのアミノ酸の置換（下線）以外は、野生型ペプチドと配列が同一であった。
【００３０】
野生型ｃ−ＪＵＮペプチド（配列番号５）に対する配列：
【００３１】
【表１】
0003959438.tif 000002
変異１４ｃ−ＪＵＮペプチド（配列番号６）に対する配列：
【００３２】
【表２】
0003959438.tif 000003
０．０７５ｐｍｏｌｅ野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆまたは０．０７５ｐｍｏｌｅ変異ＪＤ３Ｆ／４Ｆに対する２μｇ、１μｇまたは０．０５μｇの完全長ｃＪＵＮの結合について得られた蛍光スペクトルを図１Ａ〜１Ｄに示す。ＤＮＡ濃度は各試験試料に関して２．５ｆｍｏｌｅ／μｌに一定に保った。試料はすべて、ＤＮＡのみであろうと、ｃ−ＪＵＮの存在下であっても、同じ反応条件下で試験した。使用したフルオロフォアがフルオレセインであったため、最大蛍光強度は５２５ｎｍで起こった。１μｇまたは０．０５μｇのｃ−ＪＵＮをＪＤ１Ｆ／２Ｆに結合させた時に観察されたそれぞれの最大強度は、ＪＤ１Ｆ／２Ｆのみ（図１Ａ）について観察した最大強度よりも５４％および４９％低かった。２μｇのｃ−ＪＵＮをＪＤ１Ｆ／２Ｆに結合させると、５５％の強度の減少が生じた（データ示さず）。１μｇおよび２μｇ  ｃ−ＪＵＮの両方に関して得られた同様な強度の減小は、結合の飽和レベルが１μｇのタンパク質の添加により達成されることを示唆している。
【００３３】
種々の塩条件下でのｃ−ＪＵＮのＤＮＡとの結合の選択性を試験するため、上述の実験を、５０ｍＫ  ＮａＣｌの代わりに５０ｍＭ  ＫＣｌを含有する反応緩衝液で同時に行った（図１Ｂ）。２μｇのｃ−ＪＵＮをＫＣｌ反応緩衝液中で野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆと結合させると、ＤＮＡのみに関して達成されたレベルと比べて、５７％の強度の減少が観察された。５０ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液中で１μｇおよび０．５μｇのｃ−ＪＵＮを野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆと結合させると、それぞれ４０％および３４％の減小が起こり、結合の飽和レベルより低いことが示唆された。従って、ｃ−ＪＵＮは、５０ｍＭ  ＫＣｌ反応混合物よりも５０ｍＭ  ＮａＣｌ反応混合物中で、高い結合親和性でそのＡＰ−１部位に結合する。このように、本発明のレーザ結合測定法は、ｃ−ＪＵＮ：ＤＮＡ結合を高い信頼性で検出できただけでなく、選択的結合条件も同定できた。
【００３４】
同じ実験の間、まったく同量のｃ−ＪＵＮを５０ｍＭ  ＮａＣｌ反応混合物（図１Ｃ）または５０ｍＭ  ＫＣｌ反応混合物（図１Ｄ）中で０．０７５ｐｍｏｌｅ変異ＪＤ３Ｆ／４Ｆと反応させると、どの試料でも蛍光強度の減少は観察されず、これは変異ＤＮＡ配列にタンパク質が結合していないことを示した。以上の変異ＤＮＡ結合研究は、ｃ−ＪＵＮ：野生型ＤＮＡ結合条件とレーザ検出法との両方の特異性を確認している。
【００３５】
発出された蛍光強度を３つの異なる統合時間に測定したところ同じ結果が得られ（データ示さず）、これは統合時間に拘わらず結果が一致することを示した。
【００３６】
（実施例２）
完全長ｃ−ＪＵＮタンパク質はサイズが４０ＫＤａであるか３４０アミノ酸である。ｃ−ＪＵＮのＤＮＡ結合ドメインはｃ−ＪＵＮのＣ末端の１３２個のアミノ酸残基（２０９残基のグルタミン酸から３４０残基のフェニルアラニンまで）に局在しており、完全長タンパク質と同様な結合親和性でＤＮＡと結合することができる。
【００３７】
図２Ａ−２Ｂは、レーザ測定法がこの１３２個のアミノ酸ＤＮＡ結合ドメインのみから成る純タンパク質ペプチドによる特異的結合も検出できることを証明している。２０ｎｇ，１００ｎｇ，および２００ｎｇの野生型ｃ−ＪＵＮ  ＤＮＡ結合ドメインペプチドを、０．０７５ｐｍｏｌｅ野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆと５０ｍＭ  ＮａＣｌ反応混合物中で結合させると、ＪＤ１Ｆ／２Ｆのみで発生した強度と比較して、それぞれ１３％，２８％および４３％の蛍光強度の減少が起こった（図２Ａ）。ちょうど２０ｎｇのｃ−ＪＵＮペプチドの０．０７５ｐｍｏｌｅ  ＤＮＡへの結合が高い信頼性で検出できるという事実は、レーザ測定法の感受性が高いことを証明している。さらに、ｃ−ＪＵＮペプチドの量が増大すると野生型ＤＮＡへの結合は漸増的に結合するため、ペプチド：ＤＮＡ結合測定法は定量的である。
【００３８】
対照的に、２０ｎｇ，１００ｎｇおよび２００ｎｇの野生型ｃ−ＪＵＮペプチドは変異ＪＤ３Ｆ／４Ｆには結合せず、変異ＤＮＡのみに関して観察される蛍光強度より大きいわずかな蛍光強度の増加が生じた（図２Ｂ）。これは、レーザ結合測定法の特異性を確認している。
【００３９】
ＪＤ１Ｆ／２Ｆに対する２００ｎｇのｃ−ＪＵＮペプチドの結合に対して観察された４３％の蛍光強度の減少は、予測通り、１μｇおよび０．５μｇ完全長ｃ−ＪＵＮタンパク質に対してそれぞれ観察された５４％および４９％よりも小さい。少ない質量のタンパク質はペプチドに発出した蛍光を吸収するため、完全長のタンパク質よりもペプチドでは得られる静的消光が少ないことが予測されるだろう。
【００４０】
（実施例３）
変異ｃ−ＪＵＮ  ＤＮＡ結合ドメインペプチドを野生型または変異ＤＮＡと反応させることにより、レーザ結合測定法の特異性をさらに試験した。ｃ−ＪＵＮの塩基性ドメインの特異的変異が二量化に影響を及ぼさずにＤＮＡへの結合を破壊する一方で、ロイシンジッパーの特異的変異は、二量化およびＤＮＡへの結合の両方を妨げる。ｃ−ＪＵＮの塩基性ドメイン内に２つのアミノ酸置換を有する２００ｎｇおよび４００ｎｇの純ｃ−ＪＵＮ変異１４ペプチドを０．０７５ｐｍｏｌｅ野生型ＪＤ１Ｆ／２Ｆまたは変異ＪＤ３Ｆ／４Ｆと反応させた場合に得られる蛍光スペクトルをそれぞれ図３Ａおよび図３Ｂに示す。過剰のｃ−ＪＵＮ変異１４ペプチドが存在する場合であってもＪＤ１Ｆ／２ＦまたはＪＤ３Ｆ／４Ｆに対して蛍光強度の減少は全く観察されなかった。このことは、ＤＮＡへの結合が完全に破壊されていることを示すと共に、レーザ結合測定法の特異性をさらに証明している。
【００４１】
（実施例４）
Ｓｐｌは亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質と称されるＤＮＡ結合タンパク質の重要なクラスに属する。例えば、カドナガ（Ｋａｄｏｎａｇａ）ら”、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｐｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ．”、５１  Ｃｅｌｌ  １０７９−１０９０（１９８７）を参照されたい。Ｓｐｌは、ＨＩＶ−Ｉ長末端反復（ＬＴＲ）を含む、多数のウイルスおよび細胞プロモータまたはエンハンサーの転写を制御する。Ｓｐｌ結合部位の数、距離、方向および配列は、プロモータ間で大きく変わるので、結合部位の親和性は高いか、中程度か、または低くなる。Ｓｐｌは比較的大きなタンパク質（グリコシル化およびリン酸化型で９５ＫＤａおよび１０５ＫＤａ）ではあるが、ＤＮＡ結合活性は該タンパク質のＣ末端付近（５３９残基のシステインから６１９残基のヒスチジンまで）に局在している。この領域は、ＤＮＡと相互作用する金属タンパク質構造である３つの連続するＺｎ（ＩＩ）フィンガーモチーフを含む。ＤＮＡ結合の配列特異性は、その３つのＺｎ（ＩＩ）フィンガーにより専ら与えられる。フィンガー３は（結合親和性に関して言うと）最も重要なフィンガーであり、次にフィンガー２、最後にフィンガー１が来る。２つのシステインと２つのヒスチジン残基は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンに結合して、各フィンガーを形成する。亜鉛を除去すると、３つの亜鉛フィンガーの２次構造が折り畳まれる。このクラスのＤＮＡ結合タンパク質のフィンガーは、Ｃｙｓ−Ｘ2,4−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｘ5−Ｌｅｕ−Ｘ2−Ｈｉｓ−Ｘ3−Ｈｉｓの共通配列を有し、Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2フィンガーと称される。Ｃｙｓ2／Ｃｙｓ2フィンガーと称されＣｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ13−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓの形をした第２のタイプのＺｎ（ＩＩ）フィンガーモチーフは、多くのホルモンレセプター等の他のＤＮＡ結合タンパク質に見出される。
【００４２】
１つの共通１０塩基対ＳｐｌＤＮＡ結合部位を有する野生型フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドであるＪＤ１１Ｆ／１２Ｆは、ヒトメタロチオネイン−ＩＩA遺伝子のプロモーター配列から得た。相補的５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡ２０量体のＪＤ１１ＦおよびＪＤ１２Ｆは上述のように合成、精製、アニーリングした。
【００４３】
野生型ＪＤ１１Ｆに対する配列（配列番号７）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＴ−３’
野生型ＪＤ１２Ｆに対する配列（配列番号８）：
５’−Ｆｌｕ−ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧ−３’
【００４４】
変異ｄｓＤＮＡ２０量体ＪＤ１３Ｆ／１４Ｆは、共通Ｓｐｌの結合部位ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＣをＴＡＡ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃに変えた６塩基対の変化（下線）以外は、野生型ＪＤ１１Ｆ／１２Ｆと同じ配列であった。
【００４５】
野生型ＪＤ１３Ｆに対する配列（配列番号９）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＴＡＡ ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＴ−３’
野生型ＪＤ１４Ｆに対する配列（配列番号１０）：
５’−Ｆｌｕ−ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＣＣＴ ＡＴＴ ＴＡＧ  ＧＣＣ  ＧＧ−３’
【００４６】
Ｓｐｌ：ＤＮＡ結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含有していた：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１００μＭ  ＫＣｌ、１００μＭ  ＺｎＳＯ4、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５μｇ／μｌ  ＢＳＡ、０〜２００ｎｇ  純Ｓｐｌタンパク質（プロメガ社）および０．１ｐｍｏｌｅ  ５−フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド。反応混合物を、０℃で１５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍ波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
【００４７】
図４は、野生型ＪＤ１１Ｆ／１２Ｆまたは変異ＪＤ１３Ｆ／１４Ｆへの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質Ｓｐｌの結合を示す。２００ｎｇのＳｐｌを０．１ｐｍｏｌｅ  ＪＤ１１Ｆ／１２Ｆと結合させると、ＪＤ１１Ｆ／１２Ｆのみで達成された強度レベルと比較して、４４％の蛍光強度の減小が観察された（図４Ａ）。その上、２５ｎｇの完全長Ｓｐｌタンパク質の結合を高い信頼性で検出することができた（データ示さず）。これは、レーザ測定法の感受性が高いことを証明している。Ｓｐｌは比較的大きなタンパク質（９５ＫＤａ）であるが、ｃ−ＪＵＮのサイズは４０ＫＤａにすぎず、大きなタンパク質では発せられた蛍光の吸収と保持が大きいため、４４％の蛍光強度の減小を達成するのに必要なタンパク質の量は、Ｓｐｌ結合ＤＮＡではｃ−ＪＵＮ結合ＤＮＡに対するよりも少なかった。
【００４８】
２００ｎｇ  Ｓｐｌを０．１ｐｍｏｌｅ  変異ＪＤ１３Ｆ／１４Ｆと反応させたところ、蛍光強度の減少は全く観察されなかった（図４Ｂ）。このことは、変異ＤＮＡ配列に対してタンパク質が結合していないことを示す。この研究により、ＤＮＡ結合タンパク質の完全に異なるクラスに対するレーザ検出測定法の特異性が確認された。
【００４９】
（実施例５）
本実施例は、標識したＤＮＡ配列と直接結合する特定のタンパク質用の抗体の結合を研究するための本発明の能力を示す。タンパク質：ＤＮＡ複合体（特に複数のタンパク質：ＤＮＡ複合体）に対する特異的な抗体の添加が、タンパク質：ＤＮＡ複合体中の未知タンパク質の存在を同定するために使用される。抗体の結合により、タンパク質：ＤＮＡ複合体の生成（その結果、自由ＤＮＡと比較して蛍光強度は最小限に減小するか全く変化しない）が阻害または完全に防止されるか、タンパク質：ＤＮＡ複合体よりもずっと大きく蛍光強度を減小させる抗体：タンパク質：ＤＮＡ複合体を生じるであろう。
【００５０】
上述したように、１μｇ、５００ｎｇおよび２５０ｎｇ  ｃ−ＪＵＮを５０ｍＭ  ＮａＣｌまたは５０ｍＭ  ＫＣｌ反応混合物中で０．０７５ｐｍｏｌｅ変異ＪＤ３Ｆ／４Ｆと反応させた。２１℃での１５分のインキュベーション後、ヒトｃ−ＪＵＮの５６〜６９のアミノ酸に対応するペプチドに対して作製したモノクローナルＩｇＧ1抗体であるｃ−ＪＵＮ（ＫＭ−１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルス所在）の可変量をｃ−ＪＵＮ：ＤＮＡ混合物の一部に加えた。反応混合物を２１℃でさらに４０分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍ波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
【００５１】
図５Ａおよび５Ｂは、５０ｍＭ  ＮａＣｌ反応混合物中でのＪＤ１Ｆ／２Ｆへの１μｇまたは２５０ｎｇ  ｃ−ＪＵＮの結合をそれぞれ示す。１μｇまたは２５０ｎｇ  ｃ−ＪＵＮをＪＤ１Ｆ／２Ｆと結合させると、ＤＮＡのみで達成された強度レベルと比較して、２５％および１１％の強度の減少が観察された（図４Ａ）。５μｇまたは１μｇのｃ−ＪＵＮ抗体の１μｇ  ｃ−ＪＵＮへの添加によりそれぞれ４２％および３７％減小し（すなわち１７％および１２％のさらなる減小）、これはＩｇＧ：ｃＪＵＮ：ＤＮＡ複合体が形成されていることを示した（図５Ａ）。ｃ−ＪＵＮ抗体を５０ｍＭ  ＫＣｌ反応混合物中でＪＤ１Ｆ／２Ｆに結合した１μｇ  ｃ−ＪＵＮに結合させると、同じ強度の減小が観察された（データ示さず）。同様に、ＪＤ１Ｆ／２Ｆに結合した２５０ｎｇ  ｃ−ＪＵＮへ７５０ｎｇのｃ−ＪＵＮ抗体を添加すると、２７％の強度の減小が生じるが、タンパク質：ＤＮＡ複合体のみにより達成されるレベルからのさらに１６％の減少である（図５Ｂ）。ＩｇＧ：ｃ−ＪＵＮ複合体は変異ＤＮＡ  ＪＤ３Ｆ／４Ｆには結合しなかった（データ示さず）が、これによりレーザ検出測定法の特異性が確認された。
【００５２】
この実施例は、レーザ検出法が抗体：タンパク質：ＤＮＡ複合体とタンパク質：ＤＮＡ複合体とを区別できることを証明している。さらにこの実施例は、ＤＮＡと結合するタンパク質のたんなる単量体やホモ二量体ではなく、ＤＮＡと結合する異種から成る複数タンパク質の複合体を高い信頼性で検出する本発明の能力を確認した。複数のタンパク質：ＤＮＡ複合体のタンパク質のうちの１つだけがＤＮＡと結合する必要がある。２つ以上のタンパク質がＤＮＡと相互作用する場合の複数タンパク質：ＤＮＡ複合体も、本発明により測定することが可能である。
【００５３】
（実施例６）
遍在する細胞８量体結合タンパク質（Ｏｃｔ−１）は、ｃ−ＪＵＮまたはＳｐｌのＤＮＡ結合ドメインとは完全に異なるその特徴的なＤＮＡ結合ドメインにより直接ＤＮＡに結合する。Ｏｃｔ−１は細胞特異的転写と発生を調節するＰＯＵドメインＤＮＡ結合タンパク質のメンバーである。例えば、スターム（Ｓｔｕｒｍ）ら、“Ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏｃｔ−１  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｏｍｅｏ  ｂｏｘ  ｓｕｂｄｏｍａｉｎ．”２  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５  ８２−１５９９（１９８８）を参照されたい。単一のＤＮＡ結合ユニットとして機能的に協同する２つの構造的に独立したドメインを有するが故に、ＰＯＵドメインの構造はＤＮＡ結合ドメインの中でも特有である。Ｏｃｔ−１は、７５個のアミノ酸ＰＯＵ特異的（ＰＯＵs）ドメインと、短い２４個のアミノ酸のリンカー領域と、６０個のアミノ酸のＰＯＵ型ｈｏｍｅｏ（ＰＯＵH）ドメインとから構成されたＰＯＵドメインを介して、ＤＮＡに結合する。ＰＯＵsドメインとＰＯＵHドメインはへリックス−ターン−へリックス（ＨＴＨ）構造を有する。
【００５４】
精製タンパク質を使用した実施例１〜５とは異なり、本実施例ではＨｅＬａ細胞核抽出物（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）をＯｃｔ−１の供給源として使用している。多数の様々なＤＮＡ結合タンパク質と転写因子を含むＨｅＬａ細胞核抽出物の使用により、本発明のレーザ測定により配列特異的タンパク質：ＤＮＡ結合を検出するために粗タンパク質抽出物を用いることの可能性が示される。野生型フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドであるＪＤ４９Ｆ／５０Ｆは、１つの８塩基対の共通Ｏｃｔ−１  ＤＮＡ結合部位を有し、ヒト免疫グロブリン重鎖のプロモータから得た。相補的５−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡ１８量体のＪＤ４９ＦおよびＪＤ５０Ｆは上述のように合成、精製、アニーリングした。
【００５５】
野生型ＪＤ４９Ｆに対する配列（配列番号１１）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＧ−３’
野生型ＪＤ５０Ｆに対する配列（配列番号１２）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ−３’
変異ｄｓＤＮＡ１８量体ＪＤ５１Ｆ／５２Ｆは、ＰＯＵs結合部位を不活性化する塩基対の２点の突然変異（Ａ1Ｔ2→ＣＧ）（下線）と、ＰＯＵH結合部位を不活性化する第２の２点突然変異（Ａ6Ｔ7→ＣＣ）（下線）とを有し、それゆえ共通Ｏｃｔ−１結合部位ＡＴＧＣＡＡＡＴをＣＧＣＡＣＣＴへと変換させる以外は、野生型４９Ｆ／５０Ｆと配列が同一であった。
【００５６】
変異ＪＤ５１Ｆに対する配列（配列番号１３）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＧＴＧ−３’
変異ＪＤ５２Ｆに対する配列（配列番号１４）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＣＴＣ−３’
Ｏｃｔ−１  ＤＮＡ結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含有していた：９．２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０３ｍＭ  ＥＤＴＡ、６３ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、３．７５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０１ｍＭ  ＰＭＳＦ、６７μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＩ）−ポリ（ｄＣ）、６７μｇ／ｍｌポリ（ｄＧ−ｄＣ）−ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、０〜１５μｇ  ＨｅＬａ細胞核抽出物（プロメガ社）および０．０５ｐｍｏｌｅ  ５’−フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド。粗各タンパク質抽出物を用いた場合、配列特異的なタンパク質のＤＮＡ結合を確実にするには、比較的高濃度のポリ（ｄＩ）−ポリ（ｄＣ）とポリ（ｄＧ−ｄＣ）−ポリ（ｄＧ−ｄＣ）が必要である。反応混合物を、２１℃で３０分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍ波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
【００５７】
１０ｐｇのＨｅＬａ細胞核抽出物を０．０５ｐｍｏｌｅの野生型ＪＤ４９Ｆ／５０Ｆまたは０．０５ｐｍｏｌｅの変異ＪＤ５１Ｆ／５２Ｆと反応させたときに得られた蛍光スペクトルを図６Ａおよび６Ｂにそれぞれ示す。ＨｅＬａ細胞核抽出物に存在するＯｃｔ−１タンパク質は、野生型の高い親和性のＯｃｔ−１結合部位と特異的に結合し、ＪＤ４９Ｆ／５０Ｆのみ（図６Ａ）で観察されたレベルと比較して２２％の蛍光強度の減小が生じた。対照的に、Ｏｃｔ−１は、変異ＤＮＡのみ（図６Ｂ）について観察したのを超える蛍光強度の増大によって示されるように、変異ＪＤ５１Ｆ／５２Ｆとは結合せず、これによりレーザ結合測定法の配列特異性が確認された。以上の実験は、他の完全に異なるクラスのＤＮＡ結合タンパク質に対するレーザ検出測定法の特異性を証明した。
【００５８】
さらに、本実施例により、数百の他のＤＮＡ結合タンパク質を含む粗ＨｅＬａ細胞核抽出物を用いたときでさえも、特異的タンパク質：ＤＮＡ結合が本発明により高い信頼性で測定可能であることが確認された。特異性は、研究すべき特定のＤＮＡ結合タンパク質を認識する適切に標識されたＤＮＡ配列の選択により与えられる。
【００５９】
（実施例７）
本実施例は、本発明の方法が複数タンパク質の複合体（２またはそれより多くの異なるタンパク質から成る）の１つの（または複数の）ＤＮＡ配列上の結合部位への結合を測定できることをはっきり証明する。ヒト細胞タンパク質８量体結合タンパク質（Ｏｃｔ−１）および宿主細胞因子（ＨＣＦ――例えば、ヴィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、“Ｔｈｅ  ＶＰ１６  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＣＦ  ｉｓ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｏｃｅｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  ７４  Ｃｅｌｌ  １１５−１２５（１９９３）を参照。）の、単純疱疹ウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）タンパク質ＶＰ１６（またはＶｍｗ６５）によるＤＮＡ配列ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（Ｒはプリンである）への結合についての研究を行った。この複数タンパク質：ＤＮＡ複合体は、即時型複合体（ＩＥＣ）またはＶＰ１６誘導複合体と呼ばれている。ＶＰ１６はこれまでに同定された遺伝子のうち最も強力なトランスアクチベータではあるが、それ自体ＤＮＡと効率的に結合することができない。代わりに、ＶＰ１６は特にＯｃｔ−１およびＨＣＦと相互作用して、遺伝子を誘導する。ＶＰ１６はＯｃｔ−１およびＨＣＦと、アミノ末端の４１１個のアミノ酸を介して結合する。ＶＰ１６のＣ末端の強酸性ドメインは、アミノ酸４１１〜４９０によって形成され、転写活性化領域として機能する。例えば、ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）ら、“ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｅｎｅ  ｗｈｏｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．”１３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７８６５−７８７９（１９８５）を参照されたい。
【００６０】
Ｏｃｔ−１は、その２つの部分から成るＰＯＵドメインを介してＤＮＡに結合し、ＰＯＵドメインは、例外ＤＮＡ配列認識融通性を示すことができる。Ｏｃｔ−１  ＰＯＵドメインは、８量体の配列ＡＴＧＣＡＡＡＴに単量体として結合し、ＤＮＡの両側で、ＰＯＵsドメインはこの部位の５’半分（ＡＴＧＣ）と接触し、ＰＯＵHドメインはこの部位の３’半分（ＡＡＡＴ）と接触している。Ｏｃｔ−１が高親和性のＡＴＧＣＡＡＡＴ結合部位と結合すると、Ｏｃｔ−１はＶＰ１６と相互作用することができない。
【００６１】
Ｏｃｔ−１は８量体共通配列とほとんど類似しないＤＮＡ部位にも結合する。例えば、Ｏｃｔ−１は単独でまたはＨＣＦおよびＶＰ１６と会合して、８塩基対のうち４つしか８量体の共通部位に適合しないＤＮＡ配列ＴＡＡＴＧＡＲＡＴに結合することができる。ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位の２つの形式が、プロモータ配列単純疱疹ウイルス即時型（ＨＳＶ  ＩＥ）遺伝子に見出されている。その第１は、（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴモチーフと称され、Ｏｃｔ−１と高い親和性で結合する重複する８量体／ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ配列を有する。第２は、（ＯＣＴＡ-）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴと称され、重複する８量体配列がなく、Ｏｃｔ−１と比較的低い親和性で結合する。Ｏｃｔ−１のＰＯＵHドメインは、５’ＴＡＡＴ配列と結合し、ＰＯＵsドメインは（ＯＣＴＡ-）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位上のＧＡＲＡＴ配列に結合する。（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ結合部位上で、ＰＯＵHドメインはＴＡＡＴ配列と固定されたまま残り、ＰＯＵSドメインは５’ＴＡＡＴ配列か３’ＧＡＲＡＴエレメントに結合し得る。Ｏｃｔ−１  ＰＯＵHドメインは、ＶＰ１６と相互作用するのに十分である。
【００６２】
ＨＣＦは、ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位でのＯｃｔ−１のＶＰ１６との会合を安定化させるのに必要である。安定化は、Ｏｃｔ−１またはＴＡＡＴＧＡＲＡＴエレメントと独立してＶＰ１６との安定な複合体を形成することにより行われる。ＨＣＦがＯｃｔ−１とのＶＰ１６の会合を安定化する正確なメカニズムはまだ知られていない。ＨＣＦはＶＰ１６内でコンホメーションの変化を誘導し、ＶＰ１６をＯｃｔ−１およびＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位のＧＡＲＡＴエレメントと相互作用させる。代わりに、ＩＥＣ複合体内で、ＨＣＦはＯｃｔ−１またはＤＮＡと接触し、従って複合体の大きな安定性を与える。
【００６３】
（ＯＣＴＡ-）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位を有する野生型フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのＪＤ４１Ｆ／４２Ｆは、ＨＳＶ−１  ＩＥ遺伝子４／５プロモータ由来の２０塩基対の領域（−３４３〜−３２４）から得た。５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡ２０量体のＪＤ４１ＦおよびＪＤ４２Ｆは上述のように合成、精製、アニーリングした。
【００６４】
野生型ＪＤ４１Ｆに対する配列（配列番号１５）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＧＣ−３’
野生型ＪＤ４２Ｆに対する配列（配列番号１６）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＣＣＧ  ＣＣ−３’
変異ｄｓＤＮＡ２０量体ＪＤ４３Ｆ／４４Ｆは、ＰＯＵH結合部位を不活性化する２点の突然変異（Ａ2Ａ3→ＣＣ）（下線）と、ＰＯＵs結合部位を不活性化する第２の２点突然変異（Ａ8Ｔ9→ＣＧ）（下線）とを有し、それゆえＯｃｔ−１結合部位ＴＡＡＴＧＡＧＡＴをＴＣＣＴＧＡＧＣＧへと変換させる以外は、野生型４１Ｆ／４２Ｆと配列が同一であった。
【００６５】
変異ＪＤ４３Ｆに対する配列（配列番号１７）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’
変異ＪＤ４４Ｆに対する配列（配列番号１８）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＣＣ−３’
【００６６】
（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位を有する野生型フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドであるＪＤ４５Ｆ／４６Ｆは、ＨＳＶ−１遺伝子１プロモータの２３塩基対領域（−１７０から−１４８まで）から得た。相補的５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡ２３量体のＪＤ４５ＦおよびＪＤ４６Ｆは上述のように合成、精製、アニーリングした。
【００６７】
野生型ＪＤ４５Ｆに対する配列（配列番号１９）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’
野生型ＪＤ４６Ｆに対する配列（配列番号２０）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＣ−３’
【００６８】
変異ｄｓＤＮＡ２３量体ＪＤ４７Ｆ／４８Ｆは、ＰＯＵH結合部位を不活性化する２点の突然変異（Ａ6Ｔ7→ＣＣ）（下線）とＰＯＵs結合部位を不活性化するさらなる２つの２点の突然変異（Ａ1Ｔ2→ＣＧ）および（Ａ12Ｔ13→ＣＧ）（下線）とを有し、それゆえＯｃｔ−１結合部位ＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＡＴをＣＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧへと変換させる以外は、野生型ＪＤ４５Ｆ／４６Ｆと配列が同一であった。
【００６９】
変異ＪＤ４７Ｆに対する配列（配列番号２１）：
５’−Ｆｌｕ−ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’
変異ＪＤ４８に対する配列（配列番号２２）：
５’−Ｆｌｕ−ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＣ ＧＧＣ  ＡＣ−３’
【００７０】
Ｏｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６：ＤＮＡ結合反応混合物（３０μｌ）は以下を含有していた：９．２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０３ｍＭ  ＥＤＴＡ、６３ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、３．７５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１３３μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＩ）−ポリ（ｄＣ）、６７μｇ／ｍｌポリ（ｄＧ−ｄＣ）−ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、０〜２５μｇ  ＨｅＬａ細胞核抽出物（プロメガ社）、０〜０．１μｇ  ＨＳＶ−１ビリオン抽出物および０．０２５ｐｍｏｌｅ  ５’−フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド。８０％純ＶＰ１６を含有するＨＳＶ−１ビリオン抽出物はクリス  プレストン（Ｃｈｒｉｓ  Ｐｒｅｓｔｏｎ）博士（ＭＲＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）より供与された。ＨｅＬａ細胞核抽出物はＯｃｔ−およびＨＣＦの供給源として機能した。ＤＮＡおよびビリオン抽出物を除くすべての成分を、２１℃で１０分間インキュベートした。次にＤＮＡを加えてから、ＨＳＶ−１ビリオン抽出物（適切な場合）を加えた。反応混合物を、さらに２１℃で３０分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍ波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
【００７１】
１０μｇおよび２０μｇのＨｅＬａ細胞核抽出物に存在するＯｃｔ−１タンパク質は、０．０２５ｐｍｏｌｅ野生型ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆと特異的に結合し、その結果、ＨＤ４１Ｆ／４２Ｆのみ（図７Ａ）で達成されたレベルと比較してそれぞれ１０％および４３％の蛍光強度の減小が生じた。０．０２５ｐｍｏｌｅという低いＤＮＡ量は、ＨｅＬａ細胞核抽出物中に存在するＯｃｔ−１の量に対して過剰のモル量であった。Ｏｃｔ−１が０．０５ｐｍｏｌｅのその高い親和性ＪＤ４９Ｆ／５０Ｆ結合部位（実施例６）と結合すると、１０ｐｇのＢｅＬａ細胞核抽出物で蛍光強度が２２％減少するが、他方、Ｏｃｔ−１が０．０２５ｐｍｏｌｅのその低い親和性ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆ結合部位（存在するＯｃｔ−１の量より過剰のモル量である）と結合しても同量のＨｅＬａ細胞核抽出物では蛍光強度が１０％しか減少しないという観察により、同じタンパク質に対する高親和性ＤＮＡ結合部位と低親和性ＤＮＡ結合部位とを区別するレーザ結合測定法の能力が確認された。
【００７２】
０．１μｇのＶＰ１６がＯｃｔ−１：ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆ反応混合物に加えられると、２０％の蛍光強度の減少が観察された。これは、Ｏｃｔ−１：ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆ複合体のみ（図７Ａ）で達成されたレベルからさらに１０％減小したことを示している。このさらなる減小は、単一のタンパク質Ｏｃｔ−１：ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆ複合体よりも発せられた蛍光をより多く吸収および保持する複数タンパク質Ｏｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６：ＪＤ４１Ｆ／４２Ｆ複合体の形成に起因する。
【００７３】
ＶＰ１６の存在下または不在下で１０ｐｇまたは２０のＨｅＬａ細胞核抽出物を０．０２５ｐｍｏｌｅ変異ＪＤ４３Ｆ／４４Ｆと反応させた場合には、蛍光強度の減少が観察されなかった。このことは、Ｏｃｔ−１またはＯｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６複合体が変異ＤＮＡ配列（図７Ｂ）に結合しないことを示している。以上の変異ＤＮＡ結合の研究により、粗核抽出物を用いて特異的複数タンパク質：ＤＮＡ複合体形成を測定するための、レーザ結合測定法の特異性が確認された。
【００７４】
１０μｇのＨｅＬａ細胞核抽出物を０．０２５ｐｍｏｌｅの野生型４５Ｆ／４６Ｆと反応させた場合、ＪＤ４５Ｆ／４６Ｆのみ（図８Ａ）で観察された蛍光強度と比較して３２％の蛍光強度の減少が生じた。この比較的大きな強度の減少は、高い親和性で（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位と結合するＯｃｔ−１の能力のはたらきである。
【００７５】
０．１μｇのＶＰ１６を１０μｇＨｅＬａ細胞核抽出物と０．０２５ｐｍｏｌｅ野生型ＪＤ４５Ｆ／４６Ｆに加えることにより、蛍光強度は６９％減少したが、これはＯｃｔ−１：ＪＤ４５Ｆ／４６Ｆ複合体のみで得られる強度レベルからさらに３７％減小したことを示している（図８Ａ）。Ｏｃｔ−１、ＨＣＦおよびＶＰ１６のサイズはそれぞれ１１０ＫＤａ、約３００ＫＤａおよび６５ＫＤａなので、６９％という大きな減小は、ＪＤ４５Ｆ／４６Ｆに存在する（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位に高い効率で複数タンパク質Ｏｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６が結合した直接的結果である。
【００７６】
対照的に、０．１μｇのＶＰ１６の存在下または不在下で１０μｇのＨｅＬａ細胞核抽出物を０．０２５ｐｍｏｌｅの変異ＪＤ４７Ｆ／４８Ｆと反応させた場合には、蛍光強度の減小は観察されず（図８Ｂ）、変異ＤＮＡ配列への結合が妨げられることが明らかに示されると共に、レーザ結合測定法の特異性がさらに証明された。
【００７７】
この実施例は、本発明の方法が、粗核細胞を用いて、抽出物複数タンパク質の複合体（２またはそれより多くの種々のタンパク質から成る）の、ＤＮＡ配列上の１つ（または複数）の結合部位への特異的結合を、再現可能に測定できることを明らかに示している。その上、レ−ザ結合測定法は、特定のタンパク質または複数タンパク質の複合体の任意のＤＮＡ配列への親和性を評価することができる。
【００７８】
実施例により証明されたように、本発明はすべてのクラスのＤＮＡ結合タンパク質に適用可能である。例えば、腫瘍タンパク質ｃ−ＪＵＮがその特異的ＤＮＡ認識部位に結合する場合、非結合ＤＮＡにより達成されるレベルと比較して５５％の測定可能なユニットの減小が観察される（図１Ａおよび１Ｂ）。ｃ−ＪＵＮを変異ＤＮＡ配列と反応させる場合、減小は観察されず（図１Ｃおよび１Ｄ）、結合が起こっていないことが示され、検出方法の特異性が確認される。
【００７９】
さらに、タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをちょうど含むペプチドの特異的結合を、定量的な方法で検出することができる。例えば、野生型ＤＮＡと結合した２０ｎｇ，１００ｎｇおよび２００ｎｇのｃ−ＪＵＮペプチドは、自由ＤＮＡについて観察されたレベルと比較して、それぞれ１３％，２８％および４３％減小した（図２Ａ）。結合ちょうど２０ｎｇのｃ−ＪＵＮペプチドの結合を高い信頼性で測定さできるという事実は検出測定法の感度が高いことを証明している。対照的に、２０ｎｇ、１００ｎｇおよび２００ｎｇのｃ−ＪＵＮペプチドは変異ＤＮＡには結合せず、変異ＤＮＡのみに関して観察されたレベルを上回る小さな増加が生じた（図２Ｂ）。全長タンパク質の代わりにペプチドを結合させることは、医薬の設計および／またはスクリーニングに特に重要である。
【００８０】
検出測定法の特異性を、変異ｃ−ＪＵＮＤＮＡ−結合ドメインペプチドを野生型（図３Ａ）または変異ＤＮＡ（図３Ｂ）と反応させることによりさらに試験した。大量のｃ−ＪＵＮ変異１４ペプチドが存在した場合であっても減小は観察されず、ＤＮＡ結合が妨げられることが明らかに示され、検出法の特異性がさらに証明された。
【００８１】
図４Ａおよび４Ｂは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質Ｓｐ１の野生型または変異ＤＮＡ結合部位への結合をそれぞれ示す。２００ｎｇのＳｐｌを野生型ＤＮＡと結合させる場合、ＤＮＡのみについて測定されたレベルと比較して４４％の減小が観察される。変異ＤＮＡ配列に対しては、２００ｎｇＳｐｌの結合は全く観察されなかった。
【００８２】
レーザ検出測定法は、抗体：タンパク質：ＤＮＡ複合体とタンパク質：ＤＮＡ複合体を区別することができる。例えば、５μｇまたは１μｇのｃ−ＪＵＮ抗体を、野生型ＤＮＡと複合した１μｇ  ｃ−ＪＵＮに結合させると、ｃ−ＪＵＮ：ＤＮＡ複合体（図５Ａ）について得られた２５％の減小と比較して、４２％および３７％の蛍光強度の減小がそれぞれ観察された。ＩｇＧ：ｃ−ＪＵＮ複合体は変異ＤＮＡ配列に結合しなかった。
【００８３】
図６，７および８は、２つの部分から成るＰＯＵドメインＤＮＡ結合タンパク質Ｏｃｔ−１の、３つの異なるＤＮＡ配列認識部位への種々の結合親和性による結合を示している。さらに、実施例６−７は、ＤＮＡ結合タンパク質の供給源として粗核タンパク質抽出物を使用しつつ、非常に特異的なタンパク質−ＤＮＡ結合を維持することの実現可能性を証明している。各ＤＮＡ部位への結合親和性に依存して、非結合ＤＮＡに対して達成されるレベルと比較して１０％、２２％または３２％の減小で、１０μｇのＨｅＬａ細胞核抽出物は野生型Ｏｃｔ−１ＤＮＡ結合部位に結合した。
【００８４】
重要なことに、本発明の方法は、使用するのが純タンパク質であろうと粗核抽出物であろうと、複数タンパク質複合体（２またはそれより多くの異なるタンパク質から成る）の１つ（または複数）のＤＮＡ結合部位への結合を高い信頼性で測定することができる。例えば、Ｏｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６：ＤＮＡ複合体は、高親和性（ＯＣＴＡ+）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位または低親和性（ＯＣＴＡ-）ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ部位と結合すると、それぞれ６９％および２０％の蛍光強度の減小を生じた（図８および７）。Ｏｃｔ−１タンパク質またはＯｃｔ−１：ＨＣＦ：ＶＰ１６タンパク質複合体の非結合が、すべての変異ＤＮＡ配列に対して観察される。
【００８５】
複数タンパク質：ＤＮＡ複合体は、単一タンパク質：ＤＮＡ複合体よりも自然界では一般的であり、生物学的にも重要である。粗核タンパク質抽出物を用いて非常に特異的な様式で単一または複数タンパク質のＤＮＡへの結合を測定する本発明の方法の能力は、臨床への重要関連事項である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】蛍光スペクトル。
【図１Ｂ】蛍光スペクトル。
【図１Ｃ】蛍光スペクトル。
【図１Ｄ】蛍光スペクトル。
【図２Ａ】蛍光スペクトル。
【図２Ｂ】蛍光スペクトル。
【図３Ａ】蛍光スペクトル。
【図３Ｂ】蛍光スペクトル。
【図４Ａ】蛍光スペクトル。
【図４Ｂ】蛍光スペクトル。
【図５Ａ】蛍光スペクトル。
【図５Ｂ】蛍光スペクトル。
【図６Ａ】蛍光スペクトル。
【図６Ｂ】蛍光スペクトル。
【図７Ａ】蛍光スペクトル。
【図７Ｂ】蛍光スペクトル。
【図８Ａ】蛍光スペクトル。
【図８Ｂ】蛍光スペクトル。
【図１Ａ】
0003959438.tif 000004
【図１Ｂ】
0003959438.tif 000005
【図１Ｃ】
0003959438.tif 000006
【図１Ｄ】
0003959438.tif 000007
【図２Ａ】
0003959438.tif 000008
【図２Ｂ】
0003959438.tif 000009
【図３Ａ】
0003959438.tif 000010
【図３Ｂ】
0003959438.tif 000011
【図４Ａ】
0003959438.tif 000012
【図４Ｂ】
0003959438.tif 000013
【図５Ａ】
0003959438.tif 000014
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
0003959438.tif 000016
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
0003959438.tif 000018
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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