(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌中に含まれる化学物質を分解する能力を有し、緩衝液、生理食塩水、水道水、工業用水、海水及び河川水から選ばれる少なくとも１種の溶液中の攪拌処理、当該溶液中の通気攪拌処理及び洗浄処理からなる群から選ばれるいずれか１以上の処理が施され、呼吸による酸素消費速度が低減した好気性微生物を含む土壌汚染処理剤。
【請求項２】
上記好気性微生物は、上記処理により呼吸に要する有機物成分の含有量が低減されたものであることを特徴とする請求項１記載の土壌汚染処理剤。
【請求項３】
上記処理前の上記好気性微生物の化学物質分解活性値に上記処理前の当該好気性微生物の呼吸による酸素消費速度の逆数を乗じて算出される上記好気性微生物の分解効率を１としたときに、上記処理後における上記好気性微生物の分解効率が１を超えることを特徴とする請求項１記載の土壌汚染処理剤。
【請求項４】
土壌中に含まれる化学物質を分解する能力を有する好気性微生物に対して、緩衝液、生理食塩水、水道水、工業用水、海水及び河川水から選ばれる少なくとも１種の溶液中の攪拌処理、当該溶液中の通気攪拌処理及び洗浄処理からなる群から選ばれるいずれか１以上の処理を施す工程を含む土壌汚染処理剤の製造方法。
【請求項５】
上記処理は、上記好気性微生物の呼吸に要する有機物成分の含有量を低減させる処理であることを特徴とする請求項４記載の土壌汚染処理剤の製造方法。
【請求項６】
上記処理前の上記好気性微生物の化学物質分解活性値に上記処理前の当該好気性微生物の呼吸による酸素消費速度の逆数を乗じて算出される上記好気性微生物の分解効率を１としたときに、上記処理後における上記好気性微生物の分解効率を、１を超える値にすることを特徴とする請求項４記載の土壌汚染処理剤の製造方法。
【請求項７】
化学物質を含む浄化対象の土壌に対して、土壌中に含まれる化学物質を分解する能力を有し、緩衝液、生理食塩水、水道水、工業用水、海水及び河川水から選ばれる少なくとも１種の溶液中の攪拌処理、当該溶液中の通気攪拌処理及び洗浄処理からなる群から選ばれるいずれか１以上の処理が施され、呼吸による酸素消費速度が低減した好気性微生物を含む土壌汚染処理剤を投入する工程を含む土壌汚染処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、化学物質を含む浄化対象の土壌に投入され、当該化学物質を分解して土壌を浄化できる土壌汚染処理剤及びその製造方法、並びに土壌汚染処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機化合物等の有害な化学物質を含む土壌は、いわゆる、バイオオーギュメンテーション及びバイオスティミュレーションを含むバイオレメディエーション技術を用いて浄化されている。バイオレメディエーション技術のなかでもバイオオーギュメンテーションは、所定の菌体を浄化対象の土壌に投入し、投入した菌体よる化学物質の分解活性によって土壌を浄化する方式である。
【０００３】
バイオオーギュメンテーションにおける浄化効率は、汚染土壌に投入する菌体が有する化学物質分解活性に大きく依存する。菌体が有する化学物質分解活性を向上させる技術としては、例えば、通気のためエアーの流れを増加させることや栄養素を注入することにより分解微生物を増殖させ分解を促進すること等を例示することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した方法には、土壌構造によりチャネリング等が起こることによりエアーや栄養素が均一に与えられない等の問題がある。また、汚染土壌に含まれる化学物質を分解して汚染土壌を浄化する際、投入した菌体による化学物質の分解効率が急激に低下し、汚染土壌を十分に浄化できないといった問題があった。
そこで、本発明は、上述した問題に鑑み、投入した菌体による化学物質の分解効率を高く維持し、汚染土壌を効果的に浄化できる土壌汚染処理剤及びその製造方法、並びに土壌汚染処理方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、土壌中に含まれる溶存酸素が土壌に投入した菌体の呼吸により消費されるため、化学物質の分解に必要な溶存酸素が不足する結果、投入した菌体による化学物質の分解効率が急激に低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）土壌中に含まれる有機物質を分解する能力を有し、呼吸による酸素消費速度を低減する処理が施された好気性微生物を含む土壌汚染処理剤。
（２）上記処理が、溶液中の攪拌処理、溶液中の通気攪拌処理及び洗浄処理からなる群から選ばれるいずれか１以上の処理であることを特徴とする（１）記載の土壌汚染処理剤。
（３）上記好気性微生物は、上記処理により呼吸に要する有機物成分の含有量が低減されたものであることを特徴とする（１）記載の土壌汚染処理剤。
【０００７】
（４）上記処理前の上記好気性微生物の化学物質分解活性値に上記処理前の当該好気性微生物の呼吸による酸素消費速度の逆数を乗じて算出される上記好気性微生物の分解効率を１としたときに、上記処理後における上記好気性微生物の分解効率が１を超えることを特徴とする（１）記載の土壌汚染処理剤。
（５）土壌中に含まれる有機物質を分解する能力を有する好気性微生物に対して、呼吸による酸素消費速度を低減させる処理を施す工程を含む土壌汚染処理剤の製造方法。
（６）上記処理が、溶液中の攪拌処理、溶液中の通気攪拌処理及び洗浄処理からなる群から選ばれるいずれか１以上の処理であることを特徴とする（５）記載の土壌汚染処理剤の製造方法。
【０００８】
（７）上記処理は、上記好気性微生物の呼吸に要する有機物成分の含有量を低減させる処理であることを特徴とする（５）記載の土壌汚染処理剤の製造方法。
（８）上記処理前の上記好気性微生物の化学物質分解活性値に上記処理前の当該好気性微生物の呼吸による酸素消費速度の逆数を乗じて算出される上記好気性微生物の分解効率を１としたときに、上記処理後における上記好気性微生物の分解効率を、１を超える値にすることを特徴とする（５）記載の土壌汚染処理剤の製造方法。
（９）浄化対象の化学物質を含む土壌に対して、土壌中に含まれる有機物質を分解する能力を有し、呼吸による酸素消費速度を低減する処理が施された好気性微生物を含む土壌汚染処理剤を投入する工程を含む土壌汚染処理方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る汚染土壌処理剤は、所定の化学物質を分解できる好気性微生物を含んでいる。好気性微生物としては、特に限定されないが、ジャニバクター属に属する菌（Janibacter sp.）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）Ｎ１６−１株（特開平１０−０５２２５９号公報）、メチロシナス・トリコスポリウム(Methyrosinus tricosporium) ＯＢ３（特表平４−５０１６６７号公報、特開平５−２１２３７１号公報）や、メチロシナス・トリコスポリウム(Methyrosinus tricosporium) ＴＵＫＵＢＡ（特開平２−９２２７４号公報、特開平３−２９２９７０号公報）、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida) Ｆ１（特開昭６４−３４４９９号公報）、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)ＢＨ（藤田ら；ケミカルエンジニアリング、３９，（６），ｐ４９４−４９８，１９９４）、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida) ＵＣ−Ｒ５，ＵＣ−Ｐ２（特開昭６２−８４７８０号公報）、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida) ＫＷＩ−９（特開平６−７０７５３号公報）、シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonus mendocina) ＫＲ−１（特開平２−５０３８６６号公報、特開平５−５０２５９３号公報）、シュードモナス・セパシア(Pseudomonus cepacia) Ｇ４（特開平４−５０２２７７号公報）、シュードモナス・セパシア(Pseudomonus cepacia) ＫＫ０１（特開平６−２９６７１１号公報）、アルカリジーナス・ユートロフス（Alcaligenes eutropus） ＪＭＰ１３４（A. R. Harker Appl. Environ. Microbiol., 56, (4), 1179-1181, 1990） 、アルカリジーナス・ユートロフス（Alcaligenes eutropus） ＫＳ０１（特開平７−１２３９７６号公報）、ニトロソモナス・ユーロパエア（Nitrosomonus europaea）(D. Arciero et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, (2), 640-643, 1989) 等を挙げることができる。
特に、好気性微生物としては、ジャニバクター属に属する菌、ＭＯ７株を用いることが好ましい。この、ＭＯ７株については国際公開ＷＯ９８／０７８３１に詳細に記載されている。
【００１０】
汚染土壌処理剤に含まれる好気性微生物は、呼吸による酸素消費速度を低減する処理が施されたものである。すなわち、上述した好気性微生物に対して後述する処理を施すことによって、呼吸による酸素消費速度を低減した好気性微生物を汚染土壌処理剤に使用している。
【００１１】
呼吸による酸素消費速度を低減する処理としては、特に限定されないが、例えば、対象の好気性微生物の有機物含有量を低減する処理を挙げることができる。すなわち、呼吸による酸素消費速度を低減する処理としては、対象の好気性微生物を緩衝液等の溶液中で攪拌する処理（以下、「攪拌処理」と呼ぶ）、対象の好気性微生物を緩衝液等の溶液中で通気攪拌する処理（以下、「通気攪拌処理」と呼ぶ）、対象の好気性微生物を洗浄する処理（以下、「洗浄処理」と呼ぶ）を挙げることができる。
【００１２】
攪拌処理或いは通気攪拌処理によれば、好気性微生物に緩衝液等の溶液中で呼吸を行わせることができ、当該好気性微生物が有する有機物を呼吸により消費させることができる。その結果、攪拌処理或いは通気攪拌処理が施された好気性微生物は、呼吸による酸素消費速度が低下したものとなる。また、洗浄処理によれば、好気性微生物の表面等に存在する有機物を除去することができる。その結果、洗浄処理が施された好気性微生物は、呼吸による酸素消費速度が低下したのもとなる。
【００１３】
また、このような呼吸による酸素消費速度を低減する処理によれば、当該処理前における好気性微生物による化学物質の分解効率を１としたときに、当該処理後の分解効率を、１を超える値、より好ましくは５を超える値にすることができる。ここで、分解効率は、呼吸による酸素消費速度の逆数が分解活性持続時間の係数となるため、好気性微生物による化学物質分解活性値に当該好気性微生物の呼吸による酸素消費速度の逆数を乗じて算出される。
【００１４】
上述した土壌汚染処理剤を製造する際には、先ず、所望の菌体量になるまで好気性微生物を培養する。培養の際の培地は、好気性微生物の種類毎に適切な培地を選択すれば良く、特に限定されない。培養条件については、好気性微生物及び培地の種類に応じて適宜設定すれば良く、特に限定されない。なお、所定の条件下で保存されている好気性微生物を用いる場合には、培養する必要はなく、保存状態から使用可能状態にする処理をおこなう。具体的に、冷凍保存されている場合には、所定の条件下で昇温して解凍すればよい。
【００１５】
次に、培養した好気性微生物を集菌して、好気性微生物に対して呼吸による酸素消費速度を低減する処理を施す。呼吸による酸素消費速度を低減する処理として通気攪拌処理を施す場合には、例えば、集菌した好気性微生物をリン酸緩衡液（pH7.2）等の溶液に懸濁する。溶液としては、特に限定されないが、微生物活性に阻害的に働かないものを用いることが好ましく、その意味において、水道水や工業用水、海水、河川水等を用いることも可能である。
【００１６】
通気攪拌処理では、例えば、ジャーファメンター、通気ポンプ等を備え付けた攪拌装置等を用いることができる。通気攪拌処理の条件としては、例えば、ジャーファメンターを用いる場合、通気しながら100〜500rpmの速度で1〜5時間攪拌する条件が挙げられる。また、通気条件としては濁度50の菌体溶液1リットルに対して空気を3リットル／分で通気する条件が挙げられる。なお菌体の多くは通気攪拌をすることにより発泡することがあるため、それを抑制するためにアデカノール等の消泡剤を使用することができる。消泡剤としては、例えば、アデカノール（LG-126）を用いる場合、添加濃度としては、0.01％量添加する条件が挙げられる。
【００１７】
一方、呼吸による酸素消費速度を低減する処理として洗浄処理を施す場合には、集菌した好気性微生物を洗浄液に懸濁する。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衡液（pH7.2）などの緩衡液や生理食塩水の他、微生物活性に阻害的に働かない場合には、水道水や工業用水、海水、河川水等を使用することができる。
【００１８】
洗浄処理では、例えば、ウエストファリア-集菌装置や攪拌槽等を用いることができる。洗浄処理の条件としては、例えば、洗浄液としてリン酸緩衡液（pH7.2）用いた場合、集菌後の菌体を元菌体液の等量のパッファーに単回或いは複数回、懸濁する条件が挙げられる。
【００１９】
上述したように製造された土壌汚染処理剤は、浄化対象の土壌に投入され、当該土壌に含まれる化学物質を分解し、当該土壌を浄化することができる。土壌への投入量は、特に限定されないが、当該土壌に含まれる化学物質の濃度及び当該汚染土壌処理剤に含まれる好気性微生物の化学物質分解活性に応じて適宜選択される。
【００２０】
土壌汚染処理剤が投入される土壌としては、特に限定されず、好気性微生物が分解できる化学物質を含む土壌であれば、いかなる土壌であっても良い。特に、土壌汚染処理剤は、粘土質の土壌や含水率の高い土壌等、溶存酸素量が比較的に低い土壌に投入されることが好ましい。
【００２１】
溶存酸素量が低い土壌であっても、土壌汚染処理剤に含まれる好気性微生物の呼吸による酸素消費速度が低下されているため当該好気性微生物の呼吸による酸素消費量を低く抑えることができる。このため、容存酸素量が低い土壌であっても、土壌汚染処理剤に含まれる好気性微生物による化学物質の分解に必要な酸素量が存在することとなる。したがって、土壌汚染処理剤によれば、溶存酸素量が低い土壌であっても効率よく化学物質を分解することができ、溶存酸素量が低い土壌を確実に浄化することができる。
【００２２】
具体的に、溶存酸素量が低い土壌としては、粘性土壌を挙げることができる。通常、粘性土壌に対して、従来の好気性微生物が投入された場合、従来の好気性微生物は溶存酸素の大部分を呼吸で消費してしまい、化学物質を分解する反応に溶存酸素を十分に利用することができない。このため、従来の好気性微生物では、粘性土壌を浄化できない。
【００２３】
これに対して、土壌汚染処理剤によれば、粘性土壌であっても、好気性微生物の呼吸による酸素消費を低く抑えているため、好気性微生物が粘性土壌中の溶存酸素を用いて化学物質を分解することができる。このため土壌汚染処理剤によれば、粘性土壌を確実に浄化できる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
通気攪拌処理による土壌汚染処理剤の調製
本例では、トリクロロエチレン分解微生物ＭＯ７株（Janibacter sp.）をモデル株として用いた例である。先ず、ＭＯ７株を以下のように培養した。
前培養は、50ml容積の試験管にいれた、0.05％の酵母エキスと500ppmのフェノールを含む5mlのNMS培地に、500ppmのフェノールを含むNYG培地に1.5%の寒天を加えた平板培地で植継ぎ保存した本微生物のコロニーを白金耳にて釣菌して播種するか、500ppmのフェノールを含むNYG培地で30℃にて当該微生物を1晩振盪培養した前培養液200(lを播種し、30℃にて120rpmで3日間振盪培養した。
本培養は、1000ml容積の三角フラスコにいれた、100mlのLB培地に、上記前培養液1mlを播種し、30℃にて120rpmで振盪培養した。培養途中で500ppm量のフェノールを添加し、引続き振盪培養を行った。
【００２５】
次にMO7株を培養した培養液を、6000xgで10分間遠沈分離して菌体沈殿物を得た。菌体沈殿物を10mMリン酸バッファー（pH7.2）に懸濁し、OD600=50となるように濁度を調節して微生物液を調製した。
次に、得られた微生物液をメディウム瓶に移し替え、25℃で、150rpmの速度で通気攪拌した。なお、通気量は3リットル/分とした。また、通気攪拌時の発泡を防止するために、消泡剤としてアデカノール（LG-126）を0.01%添加した。通気攪拌開始から0、60、90、120及び180分後に微生物液を分取し、呼吸速度とトリクロロエチレン分解活性とを計測した。
【００２６】
呼吸速度は以下のように計測した。まず、10mMのリン酸バッファー（pH7.2）によりOD600=1となるように濁度を調節した微生物液を1リットル容ジャーファメンタに満たし100rpmで1時間攪拌した。1時間攪拌の後、溶存酸素センサー（エイブル社製、商品名DO電極10AN）で微生物液における溶存酸素減少量を計測し、呼吸速度（ppmDO/OD・hr）を算出した。
【００２７】
トリクロロエチレン分解活性は以下のように計測した。まず、10mMのリン酸バッファー（pH7.2）によりOD600=0.05となるように濁度を調節した微生物液を20ml容のバイアル瓶に入れ、同時にトリクロロエチレンを添加した。トリクロロエチレンは、液相に全て溶解したときに30ppmとなる添加量とした。そして、20ml容のバイアル瓶をテフロンコートブチルゴム栓で蓋をするとともにアルミキャップで封止した。次に、当該バイアル瓶を30℃にて24時間振とうした後、ガスクロマトグラフィーを用いてヘッドスペース法により微生物液に含まれるトリクロロエチレン量を測定した。そして、測定したトリクロロエチレン量からトリクロロエチレン分解活性（%）を算出した。
【００２８】
通気攪拌開始から0、60、90、120及び180分後に分取した微生物液において、呼吸速度とトリクロロエチレン分解活性とを測定した結果を図１に示す。なお、図１において、呼吸速度は黒塗りの菱形を結んだグラフで示し、トリクロロエチレン分解活性（図１においては「分解活性」と表記）は白抜きの四角を結んだグラフで示した。
【００２９】
図１に示したように、例えば、通気攪拌180分後においては、通気攪拌0分後及び180分後の呼吸速度がそれぞれ0.3279及び0.0450であった。この結果から、通気攪拌180分後においては、呼吸速度に関して当初（通気攪拌0分後）の13.7%まで低下した。これに対して、通気攪拌0分後及び180分後のトリクロロエチレン分解活性がそれぞれ35.1%及び25.5%であり、通気攪拌180分後におけるトリクロロエチレン分解活性の低下は、72.6%であった。この結果から、トリクロロエチレン分解活性の低下は、呼吸速度の低下効果と比較して僅かであることが明らかとなった。
【００３０】
また、呼吸速度の逆数が、微生物による分解活性の持続時間の係数であるため、トリクロロエチレン分解活性に呼吸速度の逆数を乗じた値で、トリクロロエチレン分解効率を評価した。その結果、（通気攪拌0分後のトリクロロエチレン分解量）：（通気攪拌180分後のトリクロロエチレン分解量）＝35.1%/0.3279：25.5%/0.0450となり、通気攪拌180分後においては、トリクロロエチレン分解効率が5.67倍に向上していることが判った。
【００３１】
同様にして、通気攪拌開始から60、90、120及び180分後に分取した微生物液におけるトリクロロエチレン分解効率を、通気攪拌開始0分後を1として算出した結果を図２に示す。図２から判るように、微生物液に対して通気攪拌処理を施すことによって、未処理の微生物液と比較してトリクロロエチレン分解効率を確実に向上させることができた。
以上の結果から、微生物液に通気攪拌処理を施すことによって、トリクロロエチレン分解効率に優れた土壌汚染処理剤を調製できることを実証することができた。
【００３２】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明よれば、浄化対象の土壌に含まれる化学物質を長期間に亘って分解できる土壌汚染処理剤及びその製造方法並びに土壌汚染処理方法を提供することができる。従って、本発明に係る土壌汚染処理剤及びその製造方法並びに土壌汚染処理方法によれば、化学物質を含む土壌を確実に浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で調製した微生物液について、呼吸速度とトリクロロエチレン分解活性とを測定した結果を示す特性図である。
【図２】図１に示した呼吸速度とトリクロロエチレン分解活性とを測定した結果に基づいて算出したトリクロロエチレン分解効率を示す特性図である。
【図１】
0003901007.tif 000002
【図２】
0003901007.tif 000003