(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質変性剤を利用することなく、該非変性タンパク質の単離・精製が実施されている、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａに見かけ上の分子量を示す、モラクセラ属菌株由来の単離・精製された、非変性トランスフェリン受容体タンパク質を調製する方法であって、
該調製方法は、
（ａ）該トランスフェリン受容体タンパク質を発現するため、鉄欠乏条件下において生育させた該モラクセラ属菌株の細胞塊を調製する工程、
（ｂ）該細胞塊を第一の緩衝水溶液と接触するとともに、該細胞塊を破砕するため、該細胞塊を超音波処理して、前記細胞塊より水溶性蛋白質を選択的に抽出し、そして、遠心して、第一の上清と第一のペレットとを調製する工程、
（ｃ）前記第一のペレットより前記第一の上清を分離する工程、
（ｄ）少なくとも一回は、該第一のペレットを洗浄剤と可溶化剤とを含んでなる第二の緩衝水溶液と接触するとともに、該第一のペレットを破砕するため、該第一のペレットを超音波処理して、少なくとも約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａの分子量を有するトランスフェリン受容体タンパク質を前記第一のペレットより選択的に可溶化させて、そして、遠心して、第二の上清と第二のペレットとを調製する工程、
（ｅ）前記第二のペレットより前記第二の上清を分離する工程、
（ｆ）下記の
ｉ）当該カラム上、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、選択的に通過し、そして、夾雑タンパク質は、結合する、第一のクロマトグラフ・カラムにおける第一のクロマトグラフィー操作；
ｉｉ）当該カラム上、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、選択的に通過し、そして、夾雑タンパク質は、結合する、カチオン交換マトリックスを含んでなる第二のクロマトグラフ・カラムにおける第二のクロマトグラフィー操作；
ｉｉｉ）当該カラム上、該モラクセラ  カタラリス株のＯＭＰ  Ｂ２タンパク質に対して優先して、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、結合する、第三のクロマトグラフ・カラムにおける第三のクロマトグラフィー操作；
ｉｖ）前記第三のクロマトグラフ・カラムより、前記トランスフェリン受容体タンパク質を溶出させること
を含む多段クロマトグラフィー操作によって、前記選択的な可溶化工程において、前記第一のペレットより可溶化された、モラクセラ属菌株の他のタンパク質を含まないように、前記第二の上清中の、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａに見かけ上の分子量を示すトランスフェリン受容体タンパク質を精製する工程
とを有しており、
該過程  ｉ）の第一のクロマトグラフ・カラムにおける第一のクロマトグラフィー操作は、ＤＥＡＥ−セファセル・カラム上において、ｐＨ  ７〜８．５で、１０ｍＭ〜１Ｍのトリス−ＨＣｌを用いて行われ、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、流過（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分に回収され；
該過程  ｉｉ）のカチオン交換マトリックスを含んでなる第二のクロマトグラフ・カラムにおける第二のクロマトグラフィー操作は、ＳＥ−セルロース・カラム上において、ｐＨ  ７〜８．５で、１０ｍＭ〜１Ｍのトリス−ＨＣｌを用いて行われ、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、流過（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分に回収され；
該過程  ｉｉｉ）の第三のクロマトグラフ・カラムにおける第三のクロマトグラフィー操作は、ｐＨ  ８、１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液で平衡させたヒドロキシアパタイト・カラムを用いて行われ、前記トランスフェリン受容体タンパク質は、該ヒドロキシアパタイト・カラム上に結合され、流過（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分に存在するＯＭＰ  Ｂ２タンパク質の分離がなされ；そして、
該過程  ｉｖ）の第三のクロマトグラフ・カラムより、前記トランスフェリン受容体タンパク質を溶出する工程は、ｐＨ  ８、５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液を用いて、該ヒドロキシアパタイト・カラムを洗浄した後、ｐＨ  ８、２００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液を用いて、該ヒドロキシアパタイト・カラムから前記トランスフェリン受容体タンパク質を溶出させる
ことを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
前記第一の緩衝水溶液は、ｐＨ  約７〜約８．５で、約５０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣｌを含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第一の緩衝水溶液は、ｐＨ  約７〜約８．５を示し、約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣｌ、約０．２〜約２重量％の洗浄剤、ならびに約２〜約２０ｍＭのＥＤＴＡを含むことを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記洗浄剤は、トリトンＸ−１００である
ことを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（ｄ）における、接触と超音波処理、ならびに遠心分離の工程を、少なくとも２回繰り返し、そして、各回で得られる上清をプールして、前記第二の上清を調製する
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、免疫学分野、特に、モラクセラ属菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質と、その生産方法およびその使用法に関する。
発明の背景
中耳炎は、小児早期に最も普通に見られる疾病であり、全小児の約８０％は３才以下に罹患する（レファレンス１：本申請書では、発明に関係する技術の現状を詳しく説明するために多数のレファレンスを丸括弧で囲んで示してある。丸括弧で示したレファレンスの詳細は、本申請書のクレームの項の直前に列記している。これらの文献の中で開示されている発明については、本申請書の中でもその文献を示して参照できるようにしている。）。小児における慢性中耳炎は、聴覚傷害、言語傷害、知覚傷害に進行することがある。その原因は細菌感染であるが、その原因菌の約５０％が肺炎連鎖球菌、約３０％が型別不能のインフルエンザ菌、約２０％がモノクセラ属カタル球菌である。中耳炎の治療費は、米国だけで年間１０〜２０億ドルに達しており、抗生物質、扁桃切除手術、アデノイド切除手術、鼓膜切開チューブ挿入などの外科治療のための費用である。小児における中耳炎は小児の言語機能が急速に発達している時期に発症するので、特に、学習と関連した発達上の不能となって現われる。
カタル球菌は主に気道で集落形成し、これは圧倒的に粘膜病原菌である。鼓室穿刺により得られた中耳液を用いた研究では、カタル菌は中耳炎の原因菌の約２０％を占めている（レファレンス２）。
カタル菌は、長い間日和見病原菌であろうと考えられてきたが、現在では、局所的感染またはまれではあるが全身的感染の結果としておこる、ヒトを衰弱させる多様な疾病の原因であると認識されている。カタル球菌は、成人における下部気道感染症、特に慢性気管支炎と気腫（レファレンス３、４、５、６、７、８、９）の主要原因である。カタル菌は、小児と成人における副鼻腔炎の原因菌でもあり（レファレンス１０、１１、１２、１３、１４）、時に侵襲性疾患の原因となることもある（レファレンス１５、１６、１７、１８、１９、２０）。さらに、カタル球菌は、院内感染の発生原因菌でないかと考えられている（レファレンス２１）。
カタル球菌による中耳炎の発症例は増加している。肺炎球菌と型別不能のインフルエンザ菌が原因の中耳炎を予防する方法が開発されるにつれて、中耳炎の原因であるカタル球菌の重要性が相対的に高まるものと予想される。臨床現場では、分離カタル球菌の抗生物質耐性が一般に見られるようになっている（レファレンス２２）。このように、１９７０年以前にすでにβ−ラクタマーゼを産生するカタル菌の存在が報告されていたが、その後１９７０年代の中頃には、β−ラクタマーゼを発現するカタル菌が頻繁に分離されている。
鉄制限は、細菌病原菌に対する一般的な宿主防御機構であるが、必ずしも、全部の病原菌の成長速度を制限するものではない（レファレンス２３）。髄膜炎菌（レファレンス２４）、淋菌（レファレンス２５）、インフルエンザ菌（レファレンス２６）を含む若干の細胞は、２種類の膜タンパク質を産生し、これらは特にヒト・トランスフェリンと結合する（レファレンス２７、２８）。これらのタンパク質の産生は、それらの菌の成長環境に存在する鉄の量により制御を受ける。その他の細菌の受容体とは違って、カタル球菌受容体には鉄結合トランスフェリン（例えば、フェリトランスリン）に対する好ましい親和性がある（レファレンス２９）。この２つのカタル球菌トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の見かけ分子量は、１つは１１５ｋＤａ（ＴｆＲ１）であり、もう一方は８０から９０ｋＤａ（ＴｆＲ２）である（レファレンス２７）。
外側膜タンパク質ＯＭＰ・Ｂ２（レファレンス３０、３１）の分子量は、このＴｆＲ２に近く、さらに、このＯＭＰ・Ｂ２の発現は、鉄の存在量により制御されていると報告されている（レファレンス３２）。
YuとSchryversにより、カタル球菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質（ＴｆＲ１とＴｆＲ２）の精製法、つまり、変性剤であるグアニジンＨＣＬを使用したトランスフェリン・セファロース親和性カラムで選択的に溶出させる方法が報告されている（レファレンス２９）。
受容体タンパク質を分離する方法では、鉄欠乏粗カタル球菌膜に２０ｍＭ・ＥＤＴＡと０．７５％サーコシル（Sarkosyl）を添加して溶解させ、その混合物から砕片を取り除くために、２０、０００ｇにて１５分間遠心分離する。その上清に、２０ｍｌのＦｅ2hＴｆ−セファロース（例えば、鉄飽和ヒトトランスフェリン）を添加し、混合しながら室温で４５分間インキュベートした。その混合物をカラムに入れ、結合溶液を取り除いた後、樹脂を２５０ｍｌの５０ｍＭトリスＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、２０ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．７５％サーコシル（Sarkosyl）、２５０ｍＭ・グアニジンＨＣＬを含む緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した。１．５Ｍ・グアニジン−ＨＣＬを含む緩衝液（サーコシルを含まない）使用してＴｆＲ２タンパク質を溶出させ、その後、ＴｆＲ１タンパク質を、４Ｍグアニジンを含む緩衝液を使用して溶出させた。その分画を２４時間、５０ｍＭトリスＨＣＬ（ｐＨ８）に対して透析した。
この手順を改良した方法では、ＴｆＲ１と結合させるためにアポ・ｈＴｆ−セファロースを溶解膜調整液と混合させ、その後、処理済みの溶解膜調整液を、後に残っているＴｆＲ２と結合させるためにＦｅ2ｈＴｆ−セファロースと反応させた。その後、親和性樹脂を洗浄し受容体タンパク質を上記の方法で溶出させた。
カタル球菌感染は重大な疾病に発展する可能性がある。従って、ワクチン、その他の抗原の担体のような免疫剤、免疫原性物質、診断試薬の生産での、抗原として使用できるようなカタル球菌由来の未変性のトランスフェリン受容体タンパク質を提供することには益がある。
発明の概要
本発明の目的は、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）およびその他のモラクセラ属菌から分離して精製した、見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質を提供することである。
本発明の態勢の１つによれば、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離分析した、見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａのモラクセラ属菌由来の分離精製未変性トランスフェリン受容体タンパク質またはフラグメントまたは類似体（ＴｆＲ２）を提供する。本発明のトランスフェリン受容体タンパク質は、本来的に固有立体配座で存在するものであり（その立体配座により、モラクセラ菌中のトランスフェリン受容体タンパク質の特徴的な免疫原性を保持する）、例えば、モラクセラ属カタル球菌４２２３、５１９１、１３５のようなカタル球菌株から分離できる。見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａである分離・精製トランスフェリン受容体タンパク質は、分子量が８０〜９０ｋＤａではない別のモラクセラ属菌タンパク質とは別物であり、特にモラクセラ属菌の分子量約１０５ｋＤａであるＯＭＰ・Ｂ２タンパク質や、モラクセラ属菌のホスホリピドやリポ多糖とは別物である。この分子量が約８０〜９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質は少なくともその純度が７０ｗｔ％、好ましくは、９０ｗｔ％であり、水溶液の状態でもかまわない。
さらに本発明は、免疫として有効な効果の期待できる程度の量の活性成分から成る免疫原性成分、つまりトランスフェリン受容体タンパク質、またはそのフラグメント、またはその類似体であり、薬学的に受け入れられる担体と一緒に提供する。この免疫原性成分は、モラクセラ菌、特にモラクセラ属カタル球菌が原因となる疾病の予防のために、宿主にインビボ投与するワクチンとして製剤可能である。この免疫原性成分は微粒子カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム製剤としての調剤も可能である。この免疫原性成分は免疫システムの特定細胞または粘膜表面への薬剤デリバリーのためのターゲット分子と組み合わせて使用することも可能である。このターゲット分子には、ＷＯ９２／１７１６７（Biotech Australia Pty. Ltd.）に開示されているような菌株Ｂ１２と細菌毒性のフラグメントや、米国特許番号５、１９４、２５４（Barberら）で開示されているようなモノクローナル抗体がある。本発明の免疫原性成分はさらに少なくとも１個の別の免疫原性物質または免疫刺激物質を含んで成り、その免疫刺激物質には少なくとも１個のアジュバントが含まれる。本発明で使用できる適当なアジュバントとして（ここで提示したものに限定されない）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１やＱｕｉ１  Ａとその誘導体、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、グリコリピド類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、リポタンパク質がある。アジュバントの有益な組み合わせについては、同時係属米国特許出願番号０８／２６１，１９４（１９９４年６月１６日）および、本申請書のレファレンスとして組み入れられている文献中に開示されている。本発明には、さらに本発明により提供される免疫原性成分を宿主に免疫することで産生されるトランスフェリン受容体タンパク質に特異的な抗体も含まれる。
本発明で提供される免疫原性成分は、パラミクソウイルス、クラミジア、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎菌、ジフテリア・トキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌、ヘモフィルス菌、百日咳菌、肺炎球菌、ミコバクテリア、Ａ型肝炎菌かまたはこれらの菌由来の少なくとも１個の免疫原を追加して使用できるように調剤が可能である。また、本発明の別の態様は、宿主中で免疫応答を発生させる方法であって、本発明の免疫原性成分の有効量を宿主へ投与する工程を含む方法を提供する。免疫応答は体液性免疫応答または細胞性免疫応答であってもよい。疾病予防のための実験宿主としてはヒトを含む霊長動物でもよい。
本発明の別の態様によれば、本発明で提供される免疫原性物質を、トランスフェリン受容体タンパク質の投与量とその回数を決定するために、試験対象宿主に投与する手段から成るワクチンの生産方法と、モラクセラ菌が原因である疾病の予防のために、トランスフェリン受容体タンパク質を上記で決定された投与量と投与回数で、対象宿主に適した投与形態に調整する方法を提供する。投与対象はヒトでもよい。
本発明のさらに別の態様によれば、
（ａ）トランスフェリン受容体タンパク質と、これと特異的に反応する試料中に存在する抗体との複合体を産生させるために、本発明により提供されるトランスフェリン受容体タンパク質と試料を接触させることと、
（ｂ）複合体の生産量を定量することから成る、モラクセラ菌由来の分子量が約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質と特異的に反応する試料中の抗体の存在を定量する方法を本発明は提供する。
さらに、本発明の別の態様によれば、
（ａ）トランスフェリン受容体タンパク質に特異的である抗体を生産させるために、対象を本発明で提供される免疫原性成分で免疫化すること、
（ｂ）試料内の外側膜タンパク質とこの外側タンパク質特異的抗体から成る複合体を産生させるために抗体と試料を接触させること、
（ｃ）複合体の産生を定量することのステップから成る、試料中のモラクセラ菌由来の分子量が約８０〜９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質の存在を測定する方法を本発明は提供する。
トランスフェリン受容体タンパク質は、モラクセラ属カタル球菌の一部であってもかまわない。
さらに、本発明の別の態様によれば、
（ａ）本発明によるトランスフェリン受容体タンパク質と、
（ｂ）トランスフェリン受容体タンパク質と試料中の上記抗体から成る複合体を産生させるために、トランスフェリン受容体タンパク質と試料を接触させる手段と、
（ｃ）複合体の生産を測定する手段から成る、試料中に、モラクセラ属菌由来の分子量が約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質と特異的に反応する抗体が存在することを決定する診断キットを提供する。
さらに、本発明の別の態様によれば、
（ａ）本発明で提供される分子量が約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質と特異的に反応する抗体と、
（ｂ）トランスフェリン受容体タンパク質とトランスフェリン受容体タンパク質特異的抗体から成る複合体を産生させるために抗体と試料を接触させる手段と、
（ｃ）複合体の産生を測定する手段から成る、試料内の分子量が約８０〜９０ｋＤａであるモラクセラ属菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質の存在を探知する診断キットを提供する。
さらに別の態様によれば、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離分析した見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質、または試験宿主内においてトランスフェリン・タンパク質と特異的に反応する抗体を誘発する機能のあるタンパク質を産生するモラクセラ属菌が原因で発症する疾病予防のために必要な投与量と投与回数を決定するために、本発明による免疫原性成分を試験宿主に投与する工程と、決定された量と回数でヒトを含む対象宿主へ投与するのに適した免疫原性成分を調剤する工程を含んで成るワクチンの生産方法を提供する。
さらに本発明の追加の態様によれば、
（ａ）本発明によるトランスフェリン受容体タンパク質を、免疫化マウスを作るために、少なくとも１匹のマウスに投与すること、
（ｂ）少なくとも１匹の免疫化マウスからβ−リンパ球を除去すること、
（ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからのβ−リンパ球を骨髄腫細胞と溶融させ、ハイブリドーマを産生させること、
（ｄ）ハイブリドーマをクローンニングすること、
（ｅ）抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体を産生するクローンを選択すること、
（ｆ）抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体産生クローンを培養すること、
（ｇ）その培養物から抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体を分離することから成る、モラクセラ属菌由来の見かけ分子量約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生させる方法を提供する。
さらに本発明の別の態様によれば、
（ａ）モラクセラ菌株の細胞塊を供給する工程、
（ｂ）第１の上清と第１のペレットを提供するために細胞塊から選択的に水溶性タンパク質を選択的に抽出する工程、
（ｃ）第１のペレットから第１の上清を分離する工程、
（ｄ）第２のペレットと第２の上清を提供するために、第１のペレットから分子量約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質を選択的に溶解させる工程、
（ｅ）第２のペレットから第２の上清を分離する工程、
（ｆ）第２の上清中の分子量が約８０〜９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質を、選択的溶解段階において第１のペレットから溶解した別の種類のモラクセラ菌タンパク質が実質的に含有されないように、精製する工程を含んで成る、非変性のモラクセラ属カタル球菌のようなモラクセラ属菌由来の分子量約８０〜９０ｋＤａである、分離・精製トランスフェリン受容体タンパク質の生産方法を提供する。
水溶性タンパク質は、以下の方法により選択的にその細胞塊から抽出できる。約５０ｍＭ〜約１Ｍのトリス-ＨＣＬ含有緩衝液（ｐＨ：７〜８．５）と細胞塊とを接触させ、細胞塊を破壊するための音波処理を行い、さらに第１のペレットと第１の上清を形成するために遠心分離を行う。
選択的な溶解ステップは次にようにして行われる。第１のペレットを少なくとも１回、緩衝溶液と接触させる。緩衝溶液として、約２０ｍＭ〜１Ｍのトリス・ＨＣＬを用いることができ、この緩衝溶液は洗剤および可溶化剤を含み、洗剤として約０．２−２ｗｔ％のトリトンＸ−１００（TRITON X-100）（これは商標であり、非イオン性洗剤であってオクタデシルフェノール（エチレングリコール）１０のことである）、可溶化剤として約２〜２０ｍＭのＥＤＴＡを用いることができる。次に、第１のペレットを音波処理して破壊し、その後、第２のペレットと第２の上清を形成するために遠心分離を行う。このような緩衝溶液との接触、遠心分離、音波処理は少なくとも２回行う。各ステップで発生した上清は、第２の上清を作製するために保管する。
精製ステップとして実行される多段クロマトグラフィカラム操作には、下記の内容が含まれる：
（ａ）第１のクロマトグラフィカラムによる第１のクロマトグラフィ操作では、ＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）カラムを使用しており、この中をトランスフェリン受容体が選択的に流れ、そのカラム内で、約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７−８．５）の使用などにより不純物蛋白質が結合する。
（ｂ）第２のクロマトグラフィカラムは、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９のような陽イオン交換マトリックスから成っており、第２のクロマトグラフィ操作により、このカラムの中をトランスフェリン受容体が選択的に流れ、その内部で約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７−８．５）の使用などにより不純物蛋白質が結合する。
（ｃ）第３のクロマトグラフィ操作では、第３のクロマトグラフィカラムはヒドロキシアパタイトなどが充填されており、ｐＨ約７から約８．５でカラム充填すること等により、トランスフェリン受容体タンパク質がＯＭＰ・Ｂ２タンパク質に優先して選択的に結合する。
（ｄ）約１００ｍＭから２５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4を含むｐＨ約７から約８．５の緩衝溶液を使用することにより第３クロマトグラフィカラムからトランスフェリン受容体タンパク質を溶離させる。
ここで挙げた調製手順により、精製された非変性のトランスフェリン受容体タンパク質の分離が可能となる。
本申請書の中で、「分子量が約８０〜９０ｋＤａであるモラクセラ属菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質（Ｔｆｒ２）」とは、分子量が約８０〜９０ｋＤａであるモラクセラ属カタル球菌由来の一連のトランスフェリン受容体タンパク質であって、モラクセラ属の種々の菌株において自然に発生している多様なアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものを定義するために使用している。この申請書において、もし第１のタンパク質が第２のタンパク質と免疫学的に関係している、及び／又は第２のタンパク質と同じ機能を有しているのであれば、第１のタンパク質は、第２のタンパク質の「機能的類似体」と定義している。例えば、そのような機能的な類似体は、タンパク質のフラグメント、または置換突然変異体、付加突然変異体、欠失突然変異体であってもよい。
本発明の利益は以下の形態を含む。
−トランスフェリン受容体タンパク質を産生する、モラクセラ属カタル球菌を含むモラクセラ属菌株から見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａである精製トランスフェリン受容体タンパク質を分離する方法。
−モラクセラ菌株から分離精製をした見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａである非変性トランスフェリン受容体タンパク質。
−モラクセラ属菌を特異的に特定でき、この菌による宿主の感染を特定できる診断キットと免疫試薬。
【図面の簡単な説明】
本発明は、図面を参照しながら、下記の記述を読むことにより、さらに詳しく理解できる。
図１は、本発明の１つの実施例による、モラクセラ属カタル球菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法を示したフロー図である。
図２は、見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａである分離・精製したトランスフェリン受容体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示したものである。
図３は、精製したトランスフェリン受容体のヒト・トランスフェリンに結合する能力を示したものである。
図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）は、精製トランスフェリン受容体タンパク質のイムノブロットを示し、図５（ａ）と図５（ｂ）は、中耳炎の原因となるモラクセラ属カタル球菌とその他の細菌病原体を特異的に区別するための分離・精製トランスフェリン受容体タンパク質を使用した免疫により産生されたモルモットの抗−Ｔｆｒ抗血清の能力を示すイムノブロットである。
発明の一般的説明
本発明は、モラクセラ属カタル球菌由来の精製トランスフェリン受容体タンパク質Ｔｆｒ１を調製するために用いられる新規技術を提供するものである。Ｔｆｒ２を産生するモラクセラ属カタル球菌株は、本発明で提供するような分離・精製Ｔｆｒ２を得るために利用できる。そのような菌株は、臨床源（clinical sources）や細菌培養コレクション（bacterial culture collection）から一般的に入手できる。
本発明で使用できるようなモラクセラ属カタル球菌にはモラクセラ属カタル球菌５１９１、１３５、４２２３がある。
第１図は、発明の１つの態様による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）により分離分析した、見かけ分子量が約８０〜９０ｋＤａのモラクセラ属カタル球菌由来のトランスフェリン・タンパク質を精製する方法の流れ図である。下記で述べる種々の操作を、一般的には約４℃から３０℃までの周囲環境温度で実行可能である。全細胞を約１０ｍＭ〜１Ｍのトリス−ＨＣＬ含有緩衝液（ｐＨが約７〜８．５）に接触させ、音波処理により細胞を破壊し、次いで遠心分離を行って、第１の上清（Ｓ１）と第１のペレット（ＰＰＴ１）を得る。上清（Ｓ１）には、第１の細胞ペレットから出るかなりの量の溶解タンパク質が含まれるがこれは廃棄する。残留溶解タンパク質を取り除き、ペレットから出てくるＴｆＲ２タンパク質を含む膜タンパク質を溶解させるために、残りのペレット（ＰＰＴ１）を洗剤を使って抽出する。この選択的抽出は簡単に実行できる。ペレットの洗剤抽出にも多様な方法がある。特に、第１の洗剤抽出をトリトンＸ−１００とＥＤＴＡを使用して実施した後、第２のペレット（ＰＰＴ２）と第２の上清（Ｓ２）を作製するために遠心分離を行い、この第２の上清はそのまま保管する。第２の上清（Ｓ２）の分離の後、残っているペレットＰＰＴ２を再度トリトンＸ−１００とＥＤＴＡを使用して洗剤抽出し、その後、遠心分離を行う。残留している第３ペレット（ＰＰＴ３）（この第３のペレットは廃棄する）から分離された第３の上清（Ｓ３）を、第１の抽出液からの第２の上清（Ｓ２）と組み合わせ、上清（ＴｆＲ２−１）を得てプールする。このトリトンＸ−１００による抽出は、トリトンＸ−１００（濃度０．２〜２ｗｔ％）とＥＤＴＡ（濃度２〜２０ｍＭ）を使用して、緩衝条件下（ｐＨ約７〜８．５、約１０ｍＭ〜１Ｍのトリス）で行うことができる。
このプールさた上清（ＴｆＲ２−１）には、ＴｆＲ２タンパク質も含んでいるが、このＴｆＲ２タンパク質と同じ分子量（図２の３、５レーン）であるＯＭＰ・Ｂ２タンパク質などの別のモラクセラ属カタル球菌タンパク質も含まれている。このプールされた上清（ＴｆＲ２ー１）を処理して、一連のカラムクロマトグラフィ操作において汚染物質を取り除く。
最初のカラムクロマトグラフィ操作として、ＴｆＲ２タンパク質がカラムを通過し、その間に汚染物がカラムに結合するように、プールされた上清（ＴｆＲ２−１）を、ＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）カラムまたはその他の適当なカラムに１０ｍＭ〜１Ｍのトリス・ＨＣＬ（ｐＨ約７〜８．５）の緩衝液を加えながら注入する。流す前にＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）カラムを洗浄してもよい。
ＴｆＲ２タンパク質がカラムを通過し、その間に汚染物がカラムに結合するように、ＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）カラムからの流出・洗浄液（ＴｆＲ２−２−２）を、例えば、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９またはＳ−セファロースなどの陽イオン交換カラムに１０ｍＭ〜１Ｍのトリス-ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ約７〜８．５）を加えながら注入する。流す前に陽イオン交換カラムを洗浄してもよい（図２の４レーン）。
少量の残留汚染タンパク質やＯＭＰ・Ｂ２タンパク質を依然として含んでいる陽イオン交換カラムからの流出・洗浄液（ＴｆＲ２−３）を、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質やその他の汚染タンパク質に優先して、ＴｆＲ２タンパク質がカラムに結合できるように、緩衝液存在下で、ヒドロキシアパタイト・カラムに流す。ここで使用される緩衝液は、ｐＨ６〜ｐＨ８．５、濃度５〜５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液である。カラムからの流出液は汚染タンパク質（図２の５レーン）を含む。
カラムに残った汚染物を取り除くために緩衝液で繰り返し洗った後、ＴｆＲ２タンパク質を適当な緩衝液（ｐＨ約７〜約８．５の１５０〜２５０ｍＭリン酸緩衝溶液）を使用してヒドロキシアパタイトカラムから溶出させる。溶出した画分を集め、この集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離分析し、ＴｆＲ２含有画分をプールする。ＴｆＲ２タンパク質含有溶液を得るために、プールした画分を濃縮してもかまわない（図２、レーン６）。この手順を行うことにより、分離・精製された非変性のＴｆＲ２タンパク質の水溶液を提供する。所望の用途に合わせて、適当な濃度（一般的には、約１００〜２００μｇ／ｍｌ）のＴｆＲ２水溶液としてもよい。
図２には、ＳＤＡ−ＰＡＧＥ分析によるトランスフェリン受容体タンパク質の純度の分析結果が示されており、図１に示された上記方法で精製したものの結果である。図２のレーン１は、モラクセラ属細胞の溶解産物を示している。レーン２は、プールした上清（ＴｆＲ２−１）を示している。レーン３は、ＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）カラムクロマトグラフィを通過した分画（ＴｆＲ２−２）を示し、レーン４は、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９コラム・クロマトグラフィを通過した分画（ＴｆＲ２−３）を示している。レーン５は、ＨＴＰの通過分画を示し、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質を含んでいる。レーン６は、ＴｆＲ２を含むＨＴＰ結合分画を示す。レーン７は、レファレンス２９に記載したようなアフィニティクロマトグラフィにより分離したトランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２を示す。本発明により提供されているＴｆＲ２タンパク質の精製方法により少なくとも７０％純粋ＴｆＲ２タンパク質製剤を生産できる。図２・レーン６での図示製剤の純度は少なくとも９５％であり、デンシト（ＴｆＲ２−２）メータ・スキャンニングにより決定されたものである。
図３は、本発明で提供されたようなモラクセラ属カタル球菌の精製ＴｆＲ２の、特にヒト・トランスフェリンとの結合能力を図示したものである。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離し、レフェレンス２７に記載したような方法でインビトロでトランスフェリン結合を評価する。レーン１は、レファレンス２９で記載されたようなアフィニティ・クロマトグラフィにより分離したモラクセラ属カタル球菌のＴｆＲ２を含む。レーン２は、この申請書で示したような方法で精製したモラクセラ属カタル球菌由来のＴｆＲ２を含む。レーン３は、モラクセラ属カタル球菌ＯＭＰＢ２タンパク質を含む。図３から分かるように、トランスフェリン結合タンパク質製剤はトランスフェリンと特異的に結合する。これらの結果より、この申請書で提供する方法により、モラクセラ属カタル球菌由来のＴｆＲ２が分離されていることを確認できる。
本申請書に記載された方法で精製されたトランスフェリン受容体タンパク質は、複数のモラクセラ属カタル球菌を認識し中性化する抗体を産生する能力があり、免疫原性組成物の成分（ワクチンを含む）、あるいは診断用の抗原として有用である。
図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）は、ＴｆＲ２のイムノブロット分析結果と、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質からのＴｆＲ２タンパク質の特異的な分離結果を示している。各図において、試料１はＯＭＰＢ２タンパク質を含み、試料２はＴｆＲ２タンパク質を含む。モラクセラ属カタル球菌株は、（ａ）が５１９１株、（ｂ）が１３５株、（ｃ）が４２２３株である。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたものである。試料３は、精製されたＴｆＲ２である。図４（ａ）は、クーマシーブルー染色ゲルである。図４（ｂ）は、抗−ＴｆＲ２・抗血清を使用したイムノブロットを示している。図４（ｃ）は、抗−ＯＭＰ・Ｂ２・抗血清を使用したイムノブロットを示している。図４の結果から、特にＯＭＢ・Ｐ２タンパク質を含まないモラクセラ属カタル球菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の、本発明の方法による特異的な精製が確認できる。
図５（ｂ）は、精製したＴｆＲタンパク質でモルモットを免疫化することにより得られたモルモット・抗−ＴｆＲ・抗血清が、種々の入手源から分離したモラクセラ属カタル球菌由来のＴｆＲタンパク質を認識する能力を示すイミュノブロット結果である。試験した試料は下記の通りである。
0004005634.tif 000002
本発明の１つの態様によれば、ここで提供する分離・精製ＴｆＲ２タンパク質は、モラクセラ属カタル球菌と他の中耳炎の原因菌である細菌病原体を特異的に区別するために使える抗体を産生させるのに有用である。図５（ａ）は、モルモットをＴｆＲ２タンパク質で免疫化させることにより産生されたモルモット抗−ＴｆＲ２抗血清の特異的反応を示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、図５（ｂ）はそのイムノブロットである。分析した試料は以下の通りである。
0004005634.tif 000003
図５（ｂ）で示された結果は、本発明のＴｆＲ２特異的抗血清が同じような臨床徴候のある疾病を産生する細菌病原体を区別する場合に有用であることを示している。
表１に示された結果は、モルモットを本発明のＴｆＲ２タンパク質で免疫することで得られたモルモット抗−ＴｆＲ２抗血清におけるモラクセラ属カタル球菌を死滅させるための能力を示している。この結果から分かることは、菌株４２２３から分離したＴｆＲ２タンパク質で免疫化することで得られた抗血清は、菌株４２２３由来の相同の非凝集モラクセラ属カタル球菌ＲＨ４０８に対する殺菌性を示す。分離・精製ＴｆＲ２タンパク質が殺菌力のある抗体を賛成する能力があるということは、モラクセラ属カタル球菌が原因で発症する疾病予防のためのワクチンとしてインビボで使えることの証拠である。
このように、本発明の別の態様によれば、ＴｆＲ２タンパク質を産生するか、またはＴｆＲ２を特異的に認識する抗体を誘発する能力のあるタンパク質を産生するモラクセラ属菌やその他の細菌性病原体に対するワクチンであって、免疫的に効果のある量の本発明のＴｆＲ２タンパク質と、生理活性的に受け入れられる担体から成るワクチンを提供する。ＴｆＲ２と関係のない抗原決定基に対する複合ワクチンを作製する際にも、ここで提供されるＴｆＲ２タンパク質をハプテン、ポリ多糖、またはペプチド用の担体タンパク質として使える。
本発明で提供されるＴｆＲ２タンパク質は、診断薬として、抗ＴｆＲ２抗体産生のための抗原として、モラクセラ属菌が原因である疾病に対する予防接種のための抗原として有用である。
本発明の追加の態様として、本発明のＴｆＲ２タンパク質は、キメラ分子、及び病原細菌（被包性細菌を含む）に対する複合ワクチン（複合糖質を含む）を調製する担体分子として使用してもよい。例えば、本発明の複合糖質は、糖鎖抗原（リポオリゴ糖（ＬＯＳ）とＰＲＰを含む）を有する細菌が原因となる疾病と感染の予防のために使用できる。そのような細菌病原菌としては、インフレンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutants）、プリプトコックス・ネオファルマンス（Cryptococcus neoformans）、クレブシェラ属菌（Klebsiella）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）がある。ＴｆＲ２タンパク質と結合する特定の抗原と、そのような結合をさせる方法について、ＰＣＴ・ＷＯ９４／１２６４１（譲受人に譲渡済み、レファレンスは本申請書のレファレンスに開示されている）に記載されている。
別の実施例では、例えば、腫瘍細胞の異常多糖に対する免疫を誘導するためや化学療法剤または生理活性剤と結合できる抗腫瘍抗体を産生するために、ＴｆＲ２タンパク質の担体機能が使える。
本発明によるＴｆＲタンパク質を製剤原料として、特にモラクセラ属菌による感染が原因となる疾病に対するワクチンの有効成分として使うこともできる。
さらに別の態様によれば、本発明のＴｆＲ２タンパク質をモラクセラ属菌による感染が原因となる疾病に対する免疫剤製剤用に使用できる。
本発明は、ワクチン生産分野、診断薬分野、モラクセラ属菌感染治療、免疫剤生産の分野で種々の実施例が可能であることは当業者には明かである。そのような使用例に関しての非限定的な論議を下記に示す。
１．ワクチン製剤とその使用
ワクチンとしての使用に適している免疫原性成分を、ここで記載されている免疫原性トランスフェリン受容体タンパク質、またはその類似体から調製できる。抗原材料を、好ましくない小さな分子量の分子を除去するために広範囲に透析すること、および／または、より製剤しやすい形に調製することが望ましい。免疫原性成分は、免疫応答を誘発し、抗体（抗トランスフェリン受容体抗体を含む）と、オプソニン作用および殺菌力のある抗体を産生する。ワクチンを投与した対象にモラクセラ属菌やトランスフェリン受容体を産生するような他の細菌が侵入した場合、その抗体がトランスフェリン受容体と結合して、生存に必要な鉄源に細菌が接近するのを阻止する。さらに、オプソニン作用があるかまたは殺菌力のある抗ＴｆＲ抗体も別の代替メカニズムにより細菌の予防が可能である。
ワクチンを含む免疫成分は、注射できるように液体にしたりエマルジョンの形にして使用することができる。トランスフェリン受容体タンパク質は、これと適合性のある、薬学的に受け入れられる医薬品添加物と混合できる。そのような添加物として、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらを組み合わせものがある。この免疫原性成分とワクチンには浸潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントなどの補助剤を、効果の強化のために一緒に使用することが可能である。免疫原性成分及びワクチンは、非経口、皮下、筋肉内投与することもできる。また、本発明にかかる免疫原性成分を粘膜表面での免疫応答を誘発するために調製・注入することができる。免疫原性成分を粘膜表面に、例えば、経鼻または経口（胃内）で投与できる。その他の投与法として座剤の使用と経口調剤が望ましい。座剤用の結合剤と担体にはポリアルカリングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。このような座剤は、有効成分を０．５〜１０％、望ましくは１〜２％含む混合物質から調製する。経口用の調剤としては、通常、糖類で製剤的に使えるもの、セルロース、炭酸マグネシウムのような補助剤を含む。これらの組成物成分は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤、粉末の形態をとることができ、１〜９５％、好ましくは、２０〜７５％のトランスフェリン受容体タンパク質を含む。
免疫原性調製物およびワクチンは、投与製剤に適合するような方法で、かつ治療的に有効、防御性かつ免疫原性であるような量を投与する。投与すべき量は、処理する被験者に依存し、例えば、抗体を合成する個体の免疫系の能力、希望する防御の程度および、必要ならば細胞媒介性免疫反応の生成を含む。投与すべき有効成分の正確な量は、実施者の判断による。しかし、好適な投与範囲は、この分野の専門家には容易に決定でき、接種当たりにマイクログラム程度のトランスフェリン受容体タンパク質でよい。初回投与およびブースター投与の適当な割合も変化してもよいが、初回投与に続く投与を行うとよい。この投与は、投与経路にも関係し、宿主の大きさによっても変化する。
本発明による免疫原性組成物中のトランスフェリン受容体タンパク質の濃度は、一般に約１〜９５％である。ただ一種類の病原の抗原物質を含むワクチンは、単価ワクチンである。数種類の病原の抗原物質を含むワクチンは、混合ワクチンであり、これも本発明に属する。このような混合ワクチンは、例えば、種々の病原から、または同じ病原の種々の菌株から、または種々の病原の混合からの物質を含む。
免疫原性は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５〜０．１％溶液として通常用いられるアジュバントと同時に抗原が投与された場合に、著しく強化できる。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は必ずしも免疫原性ではない。アジュバントは、投与位置の近くの局部に抗原を保持して、免疫系の細胞への遅く、継続した抗原の放出を容易にするデポー効果を発生するように作用する。アジュバントは、また、免疫系の細胞を抗原デポーに誘引し、かかる細胞に免疫反応を誘発するように刺激することもできる。
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンへの宿主免疫反応を強化するために、多年にわたって使用されている。内因性アジュバント、例えばリポ多糖類は、通常、ワクチンとして使用される死んだ菌または弱毒菌の成分である。外因性アジュバントは、代表的には抗原に共有結合以外で結合しており、かつ宿主の免疫反応を強化するように配合される免疫調整剤である。このように、アジュバントは、非径口投与された抗原に対する免疫反応を強化すると認められられる。しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、かつ望ましくない副作用を起こし、ヒトや多くの動物への使用が不適当である。実際には、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（両者を一緒にしてミョウバンと呼ぶ）のみがヒトおよび獣医学的ワクチン中のアジュバントとして日常的に用いられている。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体反応を強化するミョウバンの効力は、明らかに確立されており、ＨＢｓＡｇワクチンにはミョウバンが添加されている。ミョウバンの有用性は、一部の用途には十分に確立されているが、これには限界がある。例えば、ミョウバンは、インフルエンザワクチンに対しては効力がなく、細胞媒介性免疫反応の誘発は不規則である。ミョウバンをアジュバントとした抗原により誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ１アイソタイプであり、これは一部のワクチン剤による防御のためには最適ではない。
広範囲の外因性アジュバントが、抗原に対して強い免疫反応を引き出すことができる。これらには、膜タンパク質抗原に複合したサポニン（免疫刺激性複合体）、鉱油と混合したプルロニック（Pluronic）ポリマー、鉱油中の死んだミコバクテリア、フロイント完全アジュバント、菌生成物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびに脂質Ａおよびリポソームを含む。
効率的に体液性免疫反応（ＨＩＲ）および細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）を誘発するために、免疫原はしばしばアジュバント中で乳化される。多くのアジュバントは、毒性で、肉芽腫、急性および慢性炎症（フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）を誘発する。ＦＣＡは優れたアジュバントであり。研究に広く使用されているが、その毒性のためにヒトおよび獣医学的ワクチンへの使用に関しては認可されていない。
理想的なアジュバントの望ましい特性は下記の通りである。
（１）無毒性；
（２）長期持続性免疫反応を刺激する能力；
（３）製造が簡単で長期の貯蔵でも安定；
（４）必要ならば、各種の経路で投与された抗原に対し、ＣＭＩおよびＨＩＲの両者を誘発する能力；
（５）他のアジュバントとの相乗効果；
（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の集団との選択的交互作用の能力；
（７）適当なＴH１またはＴH２細胞特異性免疫反応を特異的に誘発する能力；および
（８）抗原に対して、適当な抗体アイソタイプレベル（例えばＩｇＡ）を選択的に増加する能力。
本発明に引用して含まれる、１９８９年８月８日にロックホッフら（Lockhoff et al.）に許可された米国特許第４８５５２８３号は、いずれも糖残基においてアミノ酸により置換されているＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアーゼおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類縁体を、免疫媒介体またはアジュバントとして教示している。このように、ロックホッフら（米国特許第４８５５２８３号および引用文献３３）は、天然に存在する糖脂質、例えばグリコスフィンゴリピドおよびグリセロ糖脂質に対して構造的な類似性を示すＮ−糖脂質類縁体が、単純性ヘルペスウイルスワクチンと仮性狂犬病ウイルスワクチンの両者の中で強い免疫反応を誘発できることを報告している。天然に存在する脂質残基の機能を模倣するために、一部の糖脂質が、長鎖アルキルアミンと脂肪酸から合成されており、これはアノマー炭素原子を介して糖と直接リンクしている。
モロニー（Moloney）に許可され、その譲渡人に譲渡され、本発明に引用して含まれる米国特許第４２５８０２９号は、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドおよびホルマリンで不活性化されたタイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩポリオウイルスワクチンと複合された場合に、アジュバントとして機能することを教示している。また、ニクソン−ジョージら（Nixon-George et al.）（引用文献３４）は、組換え型Ｂ形肝炎表面抗原と複合化された芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ形肝炎ウイルスに対する宿主の免疫反応を強化することを報告している。
２．免疫検定
本発明のトランスフェリン受容体タンパク質は、抗トランスフェリン受容体タンパク質抗体の生成のための免疫原として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ、並びに抗菌性、抗モラクセラ、および抗ＴｆＲ抗体の検出のための従来から公知のその他の非−酵素リンク抗体結合検定または手順を含む免疫検定法における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定において、トランスフェリン受容体タンパク質は、選定された表面、例えばタンパク質を結合できる表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレート上で固定化される。不完全に吸着されたトランスフェリン受容体タンパク質を除くために洗浄した後に、供試試料に関して抗原的に中性であることが知られている非特異性タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を選定された表面上に結合させてもよい。これは固定面上の非特異性吸着サイトのブロッキングを許し、従って、表面への抗血清の非特異性結合により起きるバックグラウンドを減少させる。
次いで、免疫複合体（抗原／抗体）形成に導くように、固定化面を試験すべき試料、例えば臨床または生物学的物質と接触させる。これには、希釈媒体、例えばＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液を用いる試料の希釈を含んでいてもよい。次いで、この試料を２〜４時間、温度約２５〜３７℃の程度でインキュベーションする。インキュベーションに続いて、非免疫複合物質を除くために、試料接触面を洗浄する。洗浄手順には、溶液、例えばＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸塩緩衝液を用いる洗浄を含んでいてもよい。供試試料と結合トランスフェリン受容体タンパク質との間に特異性免疫複合体が形成され、引き続き洗浄した後に、免疫複合体形成の発生およびその量も、第一抗体に特異性を有する第二抗体に対して免疫複合体を作用させて測定してもよい。供試試料がヒト由来の場合には、第二抗体は、ヒト免疫グロブリン、一般にはＩｇＧに対して特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、第二抗体は、同伴活性、例えば適当な発色物質を用いてインキュベーションして発色する酵素活性を有していてもよい。次いで、定量は、例えば分光光度計を用いて発色の程度を測定して得られる。
実施例
以上の開示は、本発明を一般的に記載したものである。さらに完全な理解は、下記の特定の実施例を参照して得ることができる。これらの実施例は、説明のみを目的として記載されており、本発明の範囲の限定を意図するものではない。相当する物との変形また置換は、環境から要求されるかまたは便宜的なものである。この中に特定の用語が使用されているが、その用語は、内容を説明するためであり、限定を目的としたものではない。
使用されているが、本開示および実施例中に明らかには記載されていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学的方法は、科学文献中に広く記載されており、十分にこの分野の専門家の能力の範囲内にある。
実施例１
本実施例は、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）の増殖を説明する。
使用したＭ．カタラリス菌株は、１３５，４２２３（引用文献３５）、５１９１（引用文献３５）（いずれも中耳抽出物）、ＡＴＣＣ２５２４０、Ｑ８（喀出物からの分離物）およびＲＨ４０８であった。
ＴｆＲ２の単離のための細胞を提供するために、Ｍ．カタラリス（M. catarrhal）菌株をチョコレートアガープレート（ＢＢＬ）上に常法により維持した。
Ｍ．カタラリス菌株４２２３を脳−心臓滲出物インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス２０ｍＬ中に接種した。カルチャーを一晩、通気しながら３７℃でインキュベーションした。鉄制限条件下での増殖のために、一晩培養カルチャーの１ｍＬを、２５μＭ  ＥＤＤＡを含むＢＨＩブロス２０ｍＬ中に接種し、カルチャーを３７℃において約３〜４時間増殖させた。対数増殖中間期まで増殖した細胞（Ａ578＞０．５）を２０分間、１０，０００ｘｇの遠心分離により採取した。下記の実施例３に記載のようにして、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ２）タンパク質の抽出のためにこのペレットを用いた。
実施例２
本実施例は、Ｍ．カタラリスの非凝集菌株（ＲＨ４０８）の生成を説明する。
Ｍ．カタラリス菌株４２２３をＢＨＩブロス２０ｍＬを入れた数個のフラスコ中に接種し、カルチャーを一晩、３７℃で振とう（１７０ｒｐｍ）しながらインキュベーションした。それぞれの一晩培養カルチャー５ｍＬを個別に１ｍＬ試験管に移し、室温で３〜８時間静置し、菌を沈降させた。各カルチャー媒体の透明な上相１００μＬをＢＨＩブロス２５ｍＬの接種に用い、カルチャーを上記のように３７℃において一晩インキュベーションした。この処理手順を６回反復し、それぞれの一晩培養カルチャーに対して、ＢＨＩ２５ｍＬに接種するために透明な培地２５μＬを用いた。処理した菌株と、最初のＭ．カタラリス菌株４２２３カルチャーとの沈降速度を比較するために、非凝集菌カルチャーは、３時間間隔でＡ578を測定して決定した。Ｍ．カタラリスＲＨ４０８を含む非凝集変異菌株は、３時間の期間中、凝集しなかった。ＲＨＩアガープレート上で、ＲＨ４０８菌株は、すべての非凝集菌株に一般的なコロニー形態を有していた。ＲＨ４０８菌株は、１９９４年１２月１３日、ブタペスト条約の規定に従って、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド、２０８５２、米国にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に供託した。ＡＴＣＣ Accession No.55637を受けた。
実施例３
本実施例は、アフィニティ精製によるトランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の抽出を説明する。
アフィニティ精製ＴｆＲ２は、引用文献２９に記載されてるトータル膜から、セファロース４Ｂ（Pharmacia）結合ヒトトランスフェリン（Sigma）を用いて調製した。アフィニティマトリックスに結合している細菌受容体タンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ラウリルサルコシン酸ナトリウム、２Ｍグアニジンの緩衝液を用いて選択的に溶出した。溶出したタンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に対して透析した。
実施例４
本実施例は、トランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の抽出と精製を説明する。
トランスフェリン受容体タンパク質は、図１に一般的に説明されている手順によりＭ．カタラリスから単離したものである。
Ｍ．カタラリスの鉄欠乏一晩培養カルチャーからの細胞ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に再懸濁し、音波破砕により破壊した。音波破砕物を３０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含む得られた上清（Ｓ１）を廃棄した。ペレット（ＰＰＴ１）を、０．５％トリトンＸ−１００および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に懸濁した。この抽出工程はＴｆＲ２を可溶化した。懸濁液を２０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中で平衡化したＤＥＡＥ  セファセル（Pharmacia）カラムに負荷した。ＴｆＲ２を流出画分中で回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中で平衡化したＳＥ−セルロースＤ５２９カラムを用いてさらに精製した。ＴｒＦ２を含む流出画分を次いで１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０中で平衡化したヒドロキシアパタイト（ＨＰＴ）カラム上に負荷した。この工程は、ＨＴＰと結合して残っているＴｆＲ２からＯＭＰ  Ｂ２（ＨＴＰ流出画分中に存在する）を、分離した。５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０を用いてＨＴＰカラムを十分に洗浄した後に、２００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０を用いてマトリックスからＴｆＲ２を溶出させた。ＴｆＲ２の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。
実施例５
本実施例は、Ｍ．カタラリス外膜タンパク質Ｂ２  ＯＭＰ  Ｂ２の精製を記載する。
ＨＴＰカラムの流出フラクションを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。電気泳動の後に、ＯＭＰ  Ｂ２タンパク質バンドに相当するゲルスライスをゲルから切り取った。溶出緩衝液（１５ｍＭ  ＮＨ4ＣＯ3／０．１％ＳＤＳ）中、１００ボルトで１２時間、電気溶出によりゲルスライスからタンパク質を回収した。
実施例６
本実施例は、モルモットの免疫を説明する。
モルモット（チャールズリバー、ケベック）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したＴｆＲ２またはＯＭＰ  Ｂ２のいずれかのタンパク質の５μｇを用いて１日目に筋肉内免疫（ｉ．ｍ．）した。１４日目および２８日目に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した同じ投与量を用いて動物をブーストした。血液試料は、４２日目に採取した。得られた結果は表１に記載してある。
実施例７
本実施例は、精製したＴｆＲ２およびＯＭＰ  Ｂ２タンパク質の分析を記載する。
分離ゲル中の１１．５％または１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド（ＢＲＬ）を用いて、ルンテンベルグら（Luntenberg et al.）（引用文献３６）に記載のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。クーマッシー・ブリリアントブルー（BioRad）を用いてゲルを着色して、タンパク質を目に見えるようにした。タンパク質標準分子量マーカーは、ＢｉｏＲａｄおよびＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質は、ポリ二フッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ、Millipore）上にタウビンら（Towbin et al.）の方法（引用文献３７）により電気ブロットした。免疫ブロットに対して、希釈度１：１０００で抗血清を用いた。組換え型タンパク質Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Zymed）を希釈度１：４０００でレポーターとして用いた。比色反応（４ＣＮ／ＤＡＢ；Pierce）または化学蛍光反応（LumiGlo; Kirkegaard and Perry）のいずれかを用いて、ブロットを現像した。メーカーの推奨する手順を両方の検出法に用いた。予備着色分子量マーカーは、ＢｉｏＲａｄから購入した。
精製タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェリン−結合活性は、シュリベルスとリー（Schryvers and Lee）（引用文献２７）が記載した方法をいくらか変更して用いて評価した。簡単に記載すると、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いでＰＣＤＦ膜に塩基泳動により移行させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヒトトランスフェリン（１：５０希釈、Jackson ImmunoResearch）を用いて、一晩、４℃で膜をインキュベーションした。上記のようにＬｕｍｉＧｌｏ化学蛍光反応を用いてブロットを現像した。
実施例８
本実施例は、Ｂ．カタラリスに対する殺菌性検定を説明する。
抗血清試料（２５μＬ）を５６℃に３０分間加熱して、補体活性を除き、０．１％ＢＳＡを含むベロナール緩衝液（ＮａＣｌ  ８．０ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3  ０．２５ｇ／Ｌ、バルビツール酸ナトリウム０．３０ｇ／Ｌ、バルビツール酸０．４５ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ／Ｌ）（ＶＢＳ）中で１：８に希釈し、次いで９６ウエルＮｕｎｃマイクロタイタープレートの最初のウエルへ加えた。ＶＢＳ中の抗血清の２倍段階希釈物を、残ったウエルに加えた。ＯＤ578＞０．５まで増殖した菌細胞をＶＢＳ中で１：２００，０００に希釈し、菌懸濁液の２５μＬ部分をそれぞれのウエルに加えた。モルモット補体（Biowhittaker, Wakersville, MD）をＶＢＳ中で１：１０に希釈し、溶液２５μＬをそれぞれのウエルに加えて反応を開始させた。３７℃で６０分間プレートをインキュベーションし、次いで、それぞれの反応混合物５０μＬを、２．２％ミュラー−ヒントン−ブロスおよび１．５％アガーを含むミュラー−ヒントンアガープレート上に置いた。３７℃で４５分間インキュベーションした後、コロニーを計数して、殺菌力価を決定した（５０％以上の菌を殺菌できる抗血清の最高希釈度の逆数を免疫前血清を含む対照と比較した）。結果は表１に記載してある。
開示の要約
開示を要約すると、本発明は、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ見かけ上分子量を有し、Ｍ．カタラリスから単離したトランスフェリン受容体タンパク質、これを製造する方法、免疫原性組成物としてのこの利用および診断体系を提供する。本発明の範囲内で、変更はできる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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