(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与し、かつイデオネラ エス・ピー No. １３(Ideonella sp. No. １３：ＦＥＲＭ Ｐ-１６２０６)菌株に由来するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列、すなわち；
Met-Arg-Phe-Leu-Arg-Pro-Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Leu-Thr-Ala-Ala-Leu-
Val-Leu-Ala-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Asp-Ala-Pro-Pro-Ala-Arg-
Gly-Thr-Ile-Met-Ser-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Gln-Leu-Asn-Pro-Asn-Gln-
Thr-Trp-Pro-Ile-Pro-Ala-Ala-Gln-Ile-Asp-Ala-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-
Gly-Val-Gln-Ala-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Thr-Cys-Asp-Val-His-Ile-Ala-
Tyr-Val-Leu-Tyr-Met-Thr-Arg-Asp-Pro-Lys-Gly-Glu-Ala-Ala-Thr-Ala-
Ser-Thr-Ala-Val-Phe-Val-Pro-Ser-Gly-Thr-Asn-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-
Ser-Arg-Pro-Val-Val-Leu-Tyr-Ala-His-Gly-Thr-Thr-Thr-Glu-Lys-Ala-
Phe-Asn-Met-Ala-Asp-Ile-Ala-Asn-Asn-Gln-Glu-Gly-Ser-Leu-Thr-Ala-
Ala-Met-Phe-Ala-Ala-Gln-Gly-Tyr-Ile-Val-Val-Ala-Pro-Asn-Tyr-Leu-
Gly-Tyr-Asp-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-His-Pro-Tyr-Leu-Asn-Ala-Glu-
Ala-Glu-Ala-Val-Asp-Met-Val-Asp-Gly-Leu-Arg-Ala-Ala-Lys-Ser-Tyr-
Leu-Thr-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Thr-Pro-Ser-Ala-Gln-Leu-Phe-Val-Thr-
Gly-Tyr-Ser-Glu-Gly-Gly-His-Val-Ala-Met-Ala-Thr-Gln-Lys-Val-Leu-
Glu-Arg-Asp-Tyr-Ala-Ser-Glu-Phe-Thr-Val-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Met-
Ser-Gly-Pro-Tyr-Asn-Leu-Thr-Lys-Phe-Val-Gly-Gln-Ile-Met-Ala-Ser-
Pro-Asp-Tyr-Cys-Ala-Ser-Val-Gly-Ser-Thr-Asp-Pro-Asn-Cys-Ala-Val-
Asn-Val-Gly-Ala-Thr-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Trp-Gln-
Lys-Ala-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Gly-Ser-Ala-Ser-Asp-Val-Tyr-Gln-Ala-Ala-
Tyr-Ala-Gly-Phe-Met-Glu-Thr-Leu-Leu-Pro-Ser-Asn-Ser-Ser-Val-Asp-
Asp-Leu-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Leu-Pro-Ala-Asp-Pro-Thr-Ala-Arg-Leu-
Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Met-Ile-Asn-Glu-Ser-Phe-Arg-Thr-Ala-Ala-
Leu-Ala-Asn-Ala-Ser-Ser-Gly-Leu-Met-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Asn-Thr-
Leu-Leu-Gly-Trp-Lys-Pro-Lys-Asn-His-Met-Ala-Met-Cys-Tyr-Ser-Ser-
Ala-Asp-Pro-Thr-Val-Tyr-Gly-Tyr-Asn-Thr-Thr-Asp-Ala-Gln-Ala-Asp-
Phe-Tyr-Ser-Ser-Gly-Val-Thr-Val-Pro-Ala-Leu-Asn-Leu-Arg-Gly-Asp-
Leu-Ala-Thr-Ile-Gln-Thr-Gln-Phe-Gly-Ala-Ala-Thr-Ala-Gln-Leu-Ala-
Gly-Ala-Phe-Gln-Gln-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ser-Val-Pro-Gln-Asn-Gln-Gly-
Asn-Glu-His-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Phe-Cys-Ala-Ala-Phe-Val-Arg-Gly-
Tyr-Phe-Ala-Asn-Phe-Ala-Gln
で示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
ショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、イデオネラ エス・ピー No. １３（Ideonella sp. No. １３：ＦＥＲＭ Ｐ-１６２０６）を培養し、および、その培養液上清を得る、工程を含むショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質の製造方法。
【請求項４】
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法によって製造され、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の塩基配列、すなわち；
5'-ATGCGTTTCC TGCGCCCATT GTCTTTGCTG CCGCTGACTG CGGCCCTTGT GTTGGCCGGT
TGTGGTGGTG GCAGCGAGGA TGCCCCGCCG GCTCGGGGAA CCATCATGTC TGCGCTGGCG
GATGCCCAGC TCAACCCCAA CCAGACATGG CCCATCCCTG CGGCCCAGAT CGACGCCGGA
ACCTCGGCGT CCGGCGTTCA GGCGCTGACC GGTGCTGCGA CCTGTGATGT GCACATCGCC
TACGTGCTGT ACATGACGCG TGACCCGAAG GGTGAGGCGG CCACCGCCTC CACCGCGGTG
TTCGTGCCTT CCGGCACCAA CGCGGCCTGC ACGGGCTCTC GGCCGGTGGT GCTGTATGCG
CACGGCACGA CGACCGAGAA GGCCTTCAAC ATGGCCGACA TCGCCAACAA CCAGGAAGGC
AGCCTGACCG CTGCCATGTT CGCCGCGCAA GGCTACATCG TCGTCGCGCC GAACTACCTG
GGTTACGACC TTTCCAGCCT GAGCTACCAC CCCTACCTCA ACGCCGAAGC CGAGGCGGTG
GACATGGTCG ATGGTCTGCG TGCCGCCAAG AGCTATCTGA CGGCGTCCGG TCTGGGCACG
CCCTCGGCCC AGCTGTTCGT GACCGGCTAT TCGGAAGGTG GCCATGTGGC CATGGCCACC
CAGAAGGTGC TCGAGCGCGA CTATGCGAGC GAGTTCACCG TGACGGCCGC CGCGCCCATG
TCTGGTCCTT ATAACCTGAC CAAGTTCGTT GGCCAGATCA TGGCCAGCCC AGACTATTGC
GCCAGTGTCG GCTCCACCGA CCCGAACTGC GCGGTCAATG TGGGCGCTAC GCTGTTTACT
CCGCTACTGC TCACCAGCTG GCAGAAAGCC TACGGTATCT ACGGCTCGGC CTCGGACGTG
TATCAGGCGG CCTACGCCGG GTTCATGGAG ACGCTGCTGC CTAGCAACAG CTCCGTGGAC
GACTTGGTCG CAGCAGGCAA GTTGCCGGCC GATCCGACAG CCCGCCTGCT GTTCGGCACC
GGTGGCATGA TCAATGAAAG CTTCCGCACT GCAGCCTTGG CCAATGCGTC CAGCGGCTTG
ATGGGGGCGG CTGCCACCAA TACCTTGCTG GGGTGGAAGC CCAAGAACCA CATGGCGATG
TGCTACTCGT CCGCAGACCC GACCGTGTAT GGCTATAACA CGACGGATGC GCAGGCCGAC
TTTTACAGCA GTGGCGTGAC CGTGCCTGCT CTGAACCTGC GGGGAGACTT AGCCACGATT
CAAACTCAGT TCGGCGCGGC GACGGCGCAA CTGGCAGGTG CTTTCCAACA GACCTATTCG
CTGAGCGTGC CGCAGAACCA GGGCAACGAG CATAGCAACG CCGCTCCCTT CTGCGCGGCC
TTCGTCCGCG GCTACTTCGC GAACTTCGCC CAGTGA-3'
で示される塩基配列からなり、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡによってコードされ、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項６または７に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
大腸菌である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の宿主細胞によって生産され、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【請求項１３】
ショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、請求項１０または１１に記載の宿主細胞を培養し、および、その培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ショ糖および脂肪酸に、請求項１、２、５、８または１２のいずれかに記載のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質を作用させる工程を含むショ糖脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１６】
ジエステル以上のポリエステルを含まない生成物、すなわち、ショ糖脂肪酸モノエステルの生成物が得られる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
２種類のショ糖脂肪酸モノエステル置換位置異性体が生成する請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
化学的方法によって合成された複数のショ糖脂肪酸モノエステル置換位置異性体混合物に、請求項１、２、５、８または１２のいずれかに記載のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質を作用させる工程を含む、置換位置が限定されたショ糖脂肪酸モノエステルを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ショ糖脂肪酸エステラーゼに関し、更に詳細には、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与する酵素タンパク質、これらをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
蔗糖脂肪酸エステルは、界面活性剤の一種であり、人体・生態系に対する高い安全性が確認されているため、今日まで、商業ベースで工業的に大量生産され、食用品の乳化・分散剤などの用途を含め、幅広く使用されている。
【０００３】
この蔗糖脂肪酸エステルの従来の製造法は、化学法が主流であるが、一方で、酵素法による合成方法を待望する声が根強いのも事実である。
【０００４】
この背景として、酵素法によると、化学法に比べて、以下のような利点が期待できることが挙げられる。すなわち；
▲１▼  酵素反応は常温、常圧、中性ｐＨの条件下で反応が進行するため、耐酸、耐アルカリ、耐圧設計の設備が不要となり、また、反応温度が化学法より低いため、温度調節に要する設備負担が軽減され、その管理も容易になる。
【０００５】
▲２▼  酵素はタンパク質であるため、無毒かつ生分解性であり、環境や生態系に対する影響が小さいSEの製造法の実現が図れる。
【０００６】
▲３▼  酵素反応は反応特異性が高く、常温、中性ｐＨにて反応が進行するため、副反応が起こりにくく、よって、純度の高い生成物が得られやすい。  さらに、反応中に原料の変質が起こりにくく、また、未反応原料が次回の反応に供することができるので、原料の有効利用も可能となる。
【０００７】
▲４▼  酵素反応によれば、位置特異的反応が可能であり、これを利用することで、蔗糖の特定位置の水酸基のみをエステル化して、目的とする改変体（生成物）が高い純度で得ることができる。
【０００８】
近年、エステル合成に適した固定化リパーゼ剤（リポザイム、ノボザイム等）の入手が容易になったこともあって、酵素法によるエステル合成への関心が高まり、とりわけ糖類はエステル化可能な水酸基を多数有することから、その位置的選択（部位特異的）エステル化は、多くの科学者が研究テーマとしている。
【０００９】
例えば、Klibanov等［Klibanov et al., "Protease-catalyzed Regioselective esterification of sugars and related compunds in anhydrous dimethylformamide", J. Am. Chem. Soc., 110, pp. 584-589 (1988)]は、原料に高反応性の脂肪酸トリクロロエチルエステルを用い、プロテアーゼを触媒とすることで、蔗糖の1'位を選択的にエステル化している［Patil et al., "Enzymatic synthesis of a sucrose-containing linear polyester in nearly anhydrous organic media", Biotechnol. Bioeng., 37, pp. 639-646 (1991);  Chan et al., "A regioselective, chemoenzymatic synthesis of sucrose-1'-methacrylate", Biocatalysis, 8, pp.163-169 (1993);及びSoedjak et al., "Enzymatic transesterification of sugars in anhydrous pyridine, Biocatalysis, 11, pp.241-248 (1994)の文献も参照されたい］。
【００１０】
また、Fregapane等［Fregapane et al., "Enzymatic solvent-free synthesis of sugar fatty acid ester", Enzyme Microb. Technol., 13, pp. 796-800 (1991)]は、アセトンを付加した糖（イソプロピリデン誘導体）を原料に用いることで、糖の脂肪酸メチルへの溶解性を向上させ、さらに、市販の固定化リパーゼ剤を触媒として用いることで、主に単糖類をエステル化している［Fregapane et al., "Facile chemo-enzymatic synthesis of monosaccharide fatty acid esters", Biocatalysis, 11, pp.9-18 (1994); 及びSarney et al., "Chemo-enzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters", J. Am. Oil Chem. Soc., 71, pp.711-714 (1994)の文献も参照されたい］。
【００１１】
また、Klibanov等［Klibanov et al., "Lipase-catalyzed acylation of sugars solubilized in hydrophobic solvents by complexation", Biotechnol. Bioeng., 42, pp. 788-791 (1993)]は、糖のフェニルホウ酸エステルを原料に用いることで、糖類の溶剤への溶解性を向上せしめ、さらに、リポプロテインリパーゼを触媒とすることで、蔗糖アクリレートを合成している［Schlotterbeck et al., "Lipase-catalyzed monoacylation of fructose", Biotechnol. Letters, 15, pp.61-64 (1993)及びOguntimein et al., "Lipase catalyzed synthesis of sugar ester in organic solvents", Biotechnol. Letters, 15, pp.175-180 (1993)等の文献も参照されたい］。
【００１２】
さらに、特殊な誘導体を用いずに、単糖類と脂肪酸を直接反応させた例として、市販の固定化酵素剤（リポザイム、ノボザイム等）を触媒として、果糖またはグルコースをエステル化した報告もされている。［Khaled et al., "Fructose oleate synthesis in a fixed catalyst bed reactor", Biotechnol. Letters, 13, pp.167-172 (1991); Coulon et al., "Comparison of direct esterification of fructose by Candida antartica lipase", Biotechnol. Letters, 17, pp.183-186 (1995);及びLjunger et al., "Lipase catalyzed acylation of glucose", Biotechnol. Letters, 11, pp.1167-1172 (1994)等の文献も参照されたい］。
【００１３】
このように、糖と脂肪酸を原料として単糖エステルを酵素法で合成することは可能であったのに対して、蔗糖エステルは、特殊な誘導体を原料とすることで初めて酵素法によって合成できていたのが実情であった。このような特殊な誘導体の利用は、蔗糖エステルを工業生産する上には不利であり、従って、このことが酵素法による工業生産が未だ達成されていない理由の一つでもあった。
【００１４】
また、合成用に使用されている酵素はいずれも市販のリパーゼ剤またはプロテアーゼ剤であり、これらの蔗糖脂肪酸エステルに対する活性は満足のゆくものではなかった。実際、市販のリパーゼ剤13種の内、蔗糖脂肪酸エステルに対して分解活性が認められたのは、リパーゼMY(名糖産業）とリパーゼOF(名糖産業）の２種類のみであり、これらの分解活性にしても実用レベルにはほど遠いものであった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質はこれまでに知られていない。本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであり、以下のショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有するベクター、ならびにかかるベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。さらに本発明のタンパク質により、入手容易な基質を用い、安全性の高い生物学的方法を利用して高純度のショ糖脂肪酸エステルを工業的レベルで製造するに好ましい方法が提供される。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかるショ糖脂肪酸エステルの合成における、前記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果成し遂げられたものであって、下記の（１）〜（13）を特徴とする。
【００１７】
（１）ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片。
【００１８】
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１９】
（３）ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、イデオネラ  エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質またはその活性断片の製造方法。
【００２０】
（４）前記（３）の製造方法によって製造された、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質またはその活性断片。
【００２１】
（５）前記（２）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２２】
（６）配列番号：１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、またはこの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２３】
（７）前記（６）のＤＮＡによってコードされる、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００２４】
（８）前記（６）のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【００２５】
（９）前記（８）の組換えベクターが宿主細胞に含まれた形質転換体。
【００２６】
（10）前記（９）の形質転換体によって生産され、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【００２７】
（11）ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、前記（９）の形質転換体を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質またはその活性断片の製造方法。
【００２８】
（12）ショ糖と脂肪酸に、前記（１）、（２）、（４）、（７）または（10）のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片を作用させる工程を含むショ糖脂肪酸エステルの製造方法。
【００２９】
（13）化学的方法によって合成された複数のショ糖脂肪酸モノエステル置換位置異性体混合物に前記（１）、（２）、（４）、（７）または（10）のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片を作用させて、置換位置が限定されたショ糖脂肪酸モノエステルを製造する方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片（以下、「ショ糖脂肪酸エステラーゼ」と称する）は、好ましくは、イデオネラ  エス・ピー No.13（受託番号：FERM P-16206、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年４月２４日受託）菌株由来であるが、この菌に限定されることはない。さらに当該ショ糖脂肪酸エステラーゼは、好ましくは、イデオネラ  エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む製造方法によって製造される。また、この製造方法において、必要に応じて陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程が含まれてもよい。
【００３１】
本発明はまた、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、イデオネラ  エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法を提供する。この製造方法において、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程を含むこともできる。
【００３２】
ここで、イデオネラ  エス・ピーは、L培地、L/10培地、その他肉汁培地、公知の種々の複合培地などにおいて培養されるとよい。炭素源として、ショ糖脂肪酸エステル、酢酸、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、D-フルクトース、D-グルコース、グリセロール、マルトースなどを追加することができる。特にショ糖脂肪酸エステラーゼの生産及び分泌量に鑑みれば、培地としてショ糖脂肪酸エステル及び／またはグルコースを添加したL培地またはL/10培地が好ましい。この培地を用いて、好ましくは好気的に菌体の培養を行う。培養時間、温度、pHなどは培地及び菌大量に応じて適宜に選択することができるが、前記の好ましい培地を用いて培養する場合、好ましくは30〜37℃、特に好ましくはおよそ37℃にて、中性pH近傍で培地のOD660が２〜４程度になるまで行うとよい。
【００３３】
培養終了後、遠心または濾過操作などによって、ショ糖脂肪酸エステラーゼを含む培養上清を得る。その後必要に応じて、例えば、硫安分画、限外濾過などにより酵素を粗抽出し、得られた粗酵素溶液は、適宜、カラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。精製は、好ましくは陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを組み合わせて行うとよいが、これら以外にも、例えば、陽イオン交換カラム、親和性カラム、逆相カラムなど、酵素タンパク質の失活や変性が生じない限りにおいて酵素活性を指標に適宜精製操作を行うことで、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することができる。
【００３４】
また、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼは、好ましくは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質である。さらには、配列番号：３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、またはこの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質も好ましい。
【００３５】
本発明はまた、配列番号：２で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。そして、配列番号：３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、またはこの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成／分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明により意図されるところである。
【００３６】
さらに本発明は、上記のＤＮＡのいずれかを含有する組換えベクターを提供する。この組換えベクターにおいてＤＮＡが挿入されるベクターとしては、一般に使用される種々のものが使用可能であり、例えば、pBR322、PUC19、pUB110、pETシリーズ、RSF1010などのプラスミド、λgtなどのファージ等が挙げられ、このベクターによって形質転換される細胞への感染性に応じて適宜選択される。
【００３７】
また本発明によって、上記の組換えベクターが宿主細胞に含まれた形質転換体も提供される。この宿主細胞は、前記ベクターによって形質転換され、目的のショ糖脂肪酸エステラーゼを生成、分泌することができれば大腸菌、酵母、枯草菌、その他動物細胞など種々可能であるが、好ましくは大腸菌が用いられる。
【００３８】
前記形質転換は、当業者によく知られている、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法などによって前記宿主細胞にベクターを導入することにより成し遂げられる。
【００３９】
このような形質転換体によって生産されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有する組換えタンパク質が、本発明によって提供される。ここで、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼは、その配列をコードする ＤＮＡを化学的に合成してベクター内の適当なプロモーターの下流に挿入し、前記宿主細胞に導入して、この形質転換体を培養することによって産生させることもできる。また、適当な菌のcＤＮＡライブラリーから 当該タンパク質をコードするＤＮＡを分離し、これに部位特異的変異導入法によって、所望の変異を導入して改変タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、これを発現させることも可能である。例えば、プロテアーゼの組換え体において実施されているような、酵素タンパク質自体の分解を抑制する改変による安定な酵素の作成法などを適用して、本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することで、さらにショ糖脂肪酸エステル合成に有利な酵素を作り出すことが可能になる。このような組換え体を適切な宿主細胞にて発現させることにより、酵素の大量生産が可能になると予測される。
【００４０】
そして、本発明によって、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、前記の形質転換体を培養してその培養液上清を得る工程を含む製造方法が提供される。次いで、必要に応じて、得られた培養液上清からショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を単離する。この単離のための方法は特に限定されることなく、上記したイデオネラ  エス・ピー培養上清からのタンパク質精製に準じて、硫安分画、限外濾過などで濃縮及び粗精製した後適宜カラムクロマトグラフィー操作にて精製すればよい。ここで、形質転換体を構成する宿主細胞として大腸菌を用いた場合、その培養上清には前記イデオネラ  エス・ピーの培養上清よりも目的のタンパク質が多量に含まれ、不純物の量も少ないので、一層容易に、そして大量に所望のタンパク質を得ることが可能となる。
【００４１】
また、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼを適当な他のタンパク質に接続し、安定な融合タンパク質の形で宿主細胞に産生させることも有効である。発現した融合タンパク質は、その接続したタンパク質部分の抗原性等の特性を利用して精製等が行える可能性があるなどの点で有利であり、また、例えば、かように精製した後に、得られた融合タンパク質を適当なタンパク質分解酵素やペプチドの配列に応じた化学的な切断法を用いて部位特異的に切断することにより、目的のタンパク質を分離することもできる。
【００４２】
さらに本発明は、これまでに記載したショ糖脂肪酸エステラーゼを、ショ糖と脂肪酸に作用させる工程を含むショ糖脂肪酸エステルの製造方法を提供する。
【００４３】
原料の脂肪酸は、炭素数、不飽和度等、特に限定されることなく、種々のものが利用可能である。下記の実施例に示すように本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼを用いて、ショ糖を炭素数８〜14の飽和飽和脂肪酸でエステル化すると、２種のエステル置換位置異性体であるショ糖脂肪酸モノエステルが産生されることが確認されている。
【００４４】
前記エステル化において炭素数が大きく水に難溶性の脂肪酸を用いる場合、反応液に脂肪酸の水溶性を高めるための物質を適宜添加することが好ましいであろう。そのような物質として、例えば、ジメチルスルホキシドが挙げられるが、酵素活性への影響に鑑み、添加量は上限を約25容量％とすべきである。反応液のpHは、好ましくは6〜9に調整され、特に好ましくは約7〜8に調整される。さらに反応液には、酵素の安定性を維持するためにショ糖脂肪酸エステラーゼの分解を阻止しうるプロテアーゼ阻害剤や、安定化剤等の添加物を、エステラーゼ活性に影響を与えない範囲で加えてもよい。酵素反応液は、例えば、50 mM程度のリン酸緩衝液（pH 6〜8）に脂肪酸、ショ糖、酵素液及びジメチルスルホキシドを適量含むものである。
【００４５】
反応液は、好ましくは３０〜８０℃、特に好ましくは約４０〜５５℃にて適当な時間インキュベートされる。次いで、反応液は、得られるショ糖脂肪酸エステルの親媒性に応じて選択した溶媒によって抽出される。例えば、炭素数8〜14の脂肪酸のエステルを得た場合、メタノール／クロロホルム等量混合溶媒、イソブタノール等を用いて溶媒抽出するとよい。
【００４６】
本発明の一実施態様において、前記製造方法によって得られる生成物がショ糖脂肪酸モノエステルであって、ジエステル以上のポリエステルが含まれないことを特徴とするショ糖脂肪酸エステルの製造方法が提供される。このように、従来の化学的合成方法では困難であったエステル置換数を限定したショ糖脂肪酸エステルの合成が、本発明によって可能になる。
【００４７】
さらに、前記方法においてショ糖のエステル化部位が限定され、特定の置換位置のみにエステルを含むショ糖脂肪酸モノエステルの製造が、本発明によって可能になる。
【００４８】
また、このショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解反応は部位特異性を有するので、これを利用して、化学的に合成したショ糖脂肪酸エステルに含まれる複数種のモノエステル異性体のうちの特定の置換位置異性体のみを選択的に分解し、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼに対して耐性を有するショ糖脂肪酸エステルのみを未分解のまま残して、特定のエステル化部位を有する高純度のモノエステル置換位置異性体を製造することができる。このような高純度ショ糖脂肪酸エステルは、従来知られているショ糖脂肪酸エステルの用途のみならず、さらに広範な用途において有用であることが期待される。
【００４９】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに説明するが、これら実施例によって本発明が限定的に解釈されるべきものではない。
【００５０】
【実施例】
１．イデオネラ  エス・ピー No.13（受託番号：FERM P-16206）菌株からのショ糖脂肪酸エステラーゼの精製
まず、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することを目的として、廃水処理場の活性汚泥、土壌などから分離した様々な菌株を分離した。培地には、L+SE培地（ペプトン10 g/l、酵母エキス5 g/l、NaCl 5 g/l及びショ糖脂肪酸エステル（DKエステルSS、第一工業製薬社製）10 g/lを含有、pH 7）またはL/10+SE培地（ペプトン1 g/l、酵母エキス0.5 g/l、NaCl 0.5 g/l、ショ糖脂肪酸エステル10 g/lを含有、pH 7）を使用し、固体培地には、上記いずれかの培地にさらに15 g/lの寒天を添加した。分離された８４の菌株のうち、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を高発現し、培養液中にこの酵素を多量に分泌している菌株を単離し、イデオネラ  エス・ピー （Ideonella sp.）No.13と命名した。このイデオネラ  エス・ピー No.13菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、平成９年４月２４日付にて受託番号：FERM P-16206として受託された。
【００５１】
ここでショ糖脂肪酸エステラーゼ活性の指標としては、ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法によるショ糖脂肪酸エステル分解能の判定結果を採用した。これらの方法は、具体的には以下のとおりである。
【００５２】
(a)ショ糖脂肪酸エステル寒天法
0.2重量／容量％のショ糖脂肪酸エステル及びpH 7の50 mMリン酸緩衝液を含む1.5重量／容量％の寒天溶液を厚さ5〜7 mmになるようにペトリディッシュに固化し、寒天に直径4 mmの孔を空けて、試料液20μlを注入した。37℃で一晩静置して酵素反応を許容し、孔の周囲に形成された白濁円（ハロー）の直径を測定した。
【００５３】
(b)滴定法
5重量／容量％ショ糖脂肪酸エステル水溶液5 ml、McIlvaine緩衝液（0.2 Mリン酸水素２ナトリウムと0.1 Mクエン酸を混合してpH 8に調整）4 ml及び酵素試料液1 mlを含む酵素反応液を、37℃または60℃にて30分間インキュベートした。反応終了後、アセトン／エタノール＝50/50（容量％）の混液10 ml及び10 mlの0.05 N NaOHを加えて反応を停止し、さらにアセトン／エタノール＝50/50（容量％）の混液を10 ml加えた。酵素反応によって生じた遊離脂肪酸を、フェノールフタレインを指示薬として0.05 N塩酸で逆滴定した。この条件下において、１分間当たり1μmolの脂肪酸を遊離する酵素量を1単位として規定した。
【００５４】
なお、上記のショ糖脂肪酸エステル寒天法(a)によって測定したハローの直径(mm)と、滴定法(b)で測定した酵素活性（単位、対数）との間に、直線的な相関関係があることが示された。
【００５５】
このような方法を用いて選択したイデオネラ  エス・ピー No.13菌株によるショ糖脂肪酸エステラーゼの生成及び分泌に好ましい培地を検討するために、種々の培地及び炭素源を用いてこの菌を培養した。すなわち、L培地（ペプトン10 g/l、酵母エキス5 g/l及びNaCl 5 g/lを含有、pH 7）、L/10培地（ペプトン1 g/l、酵母エキス0.5 g/l、NaCl 0.5 g/lを含有、pH 7）ならびに最少培地（(NH4)2SO4 5g/l、K2HPO4 0.5 g/l及びMgSO4・7H2O 0.25 g/lを含有、pH 7）の３種の培地を基本培地とし、炭素源としてはショ糖脂肪酸エステル及び／またはグルコース（0.5または1重量／容量％）を添加したものを用いた。これらの培地で37℃にて２日間振盪培養した後、上記ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法によって培養上清のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を測定し、また菌体の増殖を培養液のOD600より推定した。
【００５６】
この結果、イデオネラ  エス・ピー No.13菌株は、炭素源を添加したL/10培地、L培地及び炭素源を添加したL培地で良好に増殖し、且つショ糖脂肪酸エステラーゼを多量に生成分泌していることが明らかになった。ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を最も高発現していると考えられた、グルコース1重量／容量％を含有するL培地（以下、「L+Glu 1％培地」と称する）を用いてイデオネラ  エス・ピー No.13菌株を培養することにした。
【００５７】
ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質を多量に得るために、イデオネラ  エス・ピー No.13菌株を大容量にて培養した。先ず、グルコース1重量／容量％を含むL/10培地5 mlにおいて試験管内でイデオネラ  エス・ピー No.13菌株を37℃にて一晩、前々培養した。次いで、この培養液を加えた1 LのL+Glu 1％培地を、2 L容量の坂口フラスコを用いて37℃にて一晩振盪培養して、前培養液を調製した。この前培養液を50 LのL+Glu 1％培地に加え、100 L容量のジャーファーメンター（マルビシ・バイオ・エンジン社製、タイプMPF）内で、37℃にて通気量50 L/分（1 vvm）として４８時間培養した。
【００５８】
こうして得られた培養液は、シャープレス連続遠心機で菌体成分を取り除き、上清を4℃にて限外濾過濃縮機（旭化成社製、マイクローザUF SPL-1053）で1/10容量にまで濃縮した。次いで、濃縮液に60重量／容量％飽和となるように硫安を添加し、一夜静置した後、生じた沈殿を遠心分離によって採取した。この沈殿をpH 7.5の20 mMトリス塩酸緩衝液に溶解して、同緩衝液中にて透析することにより脱塩を行った。脱塩後の酵素溶液を凍結乾燥して、粉末状の粗酵素を得た。得られた粗酵素は、滴定法によってショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を測定すると、約3000単位/gであることがわかった。この粗酵素を用い、以下の工程に従ってショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質を精製した。精製工程において、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性は、上記ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法をによる測定結果をその指標とした。
【００５９】
▲１▼第一陰イオン交換カラム：カラムに充填したDEAEセルロース（DE52、ワットマン社製）φ5.7×14 cmを20 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8）で平衡化し、タンパク質試料液（2 gタンパク質）を付した。同様の緩衝液中、0〜0.5 MのNaCl濃度の直線濃度勾配にてタンパク質を溶出して、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を呈する画分を集めた。
【００６０】
▲２▼第二陰イオン交換カラム：▲１▼と同様の緩衝液の系にて、Hitrap Q（ファルマシア社製、1 ml）に▲１▼の活性画分を付し、さらにショ糖脂肪酸エステラーゼを精製した。カラムは、FPLCシステム（ファルマシア社製）に装備し、流速1 ml/分で５０分間にわたって直線濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出させた。酵素活性は、NaCl濃度約0.25 M付近に溶出した。
【００６１】
▲３▼第三陰イオン交換カラム：▲１▼と同様の緩衝液を用いて、高性能陰イオン交換カラムMono Q（ファルマシア社製、1 ml）において▲２▼で得られた活性画分をさらに精製した。カラムは、FPLCシステム（ファルマシア社製）に装備し、流速    1 ml/分で３０分間にわたって直線濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出させた。所望のエステラーゼ活性は、NaCl濃度約0.2 M付近に溶出した。この溶出のプロファイルを図１に示す。図中に矢印を付したのが、エステラーゼ活性のピークである。
【００６２】
▲４▼ゲル濾過カラム：150 mMのNaClを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.2）を用いて、▲３▼で得られた活性画分をゲル濾過カラムSupedex 200 HR10/30（ファルマシア社製、φ1×30 cm）に付し、流量0.2 ml/分で溶出させ、活性画分を集めた。このカラムからの溶出プロファイルを図２に示す。
【００６３】
これらの工程によって、SDS電気泳動上ほぼ単一バンドに近い状態にまで、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することができた。この電気泳動上の主バンドに相当するタンパク質の見かけ上の分子量は、約48,000ダルトンであった。SDS電気泳動後のゲルからこのタンパク質のバンドに相当する部分を切り出して、Ｎ末端アミノ酸配列の分析を試みたが、配列を決定することはできなかった。これはタンパク質のＮ末端がブロックされているためではないかと思われた。
【００６４】
２．ショ糖脂肪酸エステラーゼの同定
イデオネラ  エス・ピー No.13が有するショ糖脂肪酸エステラーゼを酵素学的に同定するため、以下の各特性を調べる実験を行った。
【００６５】
▲１▼温度依存性：１．に記載のショ糖脂肪酸エステラーゼ粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステル分解反応の温度依存性を調べた。酵素活性の測定は、前記滴定法により、2単位の粗酵素を用いて行った。結果を図３に示すが、６０℃で最も活性が高く、７０〜８０℃でも活性を有することが明らかである。
【００６６】
▲２▼pH依存性：１．に記載の粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステル分解反応のpH依存性を調べた。酵素活性の測定は、緩衝液をpH 4〜8では前記McIlvaine緩衝液を用い、pH 9〜10ではClark-Lubs緩衝液（(i)0.1 Mホウ酸＋0.1 M KCl、(ii)0.1 M NaOH、(i)＋(ii)で所定のpHに調整）を用いたことを除いては前記滴定法に従って、2単位の粗酵素を用いて行った。結果を図４に示すが、本酵素活性の至適pHは8であり、また6〜8の範囲のpHにおいて高い活性を有することが明らかである。
【００６７】
▲３▼基質特異性：一般にエステラーゼまたはリパーゼの基質となりうる代表的なエステル化合物の分解活性を、１．に記載の粗酵素を用いて調べた。反応条件は、本質的に１．に記載した滴定法と同様であり、pH 8のMcIlvaine緩衝液、4.75 mlの水、0.25 gの各基質及び粗酵素2単位（1 ml）の反応液を60℃、30分間反応させたものについて各分解産物を定量した。得られた結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0003878293.tif 000002
【００６９】
この結果、本酵素はショ糖脂肪酸モノエステル以外に糖類のエステル誘導体であるTween 80（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）を分解した。糖エステルであっても、水に溶解しないショ糖脂肪酸ポリエステルにはほとんど作用しなかった。また、エステラーゼの基質である酢酸エチルはこの反応条件下では水溶性であるが、本酵素はほとんど作用しなかった。尚、データは示していないが、エステラーゼ及びリパーゼの活性測定用基質として広く使用されているパラニトロフェニルアセテートにも、本酵素はほとんど活性を示さなかった。さらに、表１に示すように、水溶性のトリアセチンならびに非水溶性のトリブチン及びオリーブ油などのトリグリセリドに対してほとんど活性を示さなかったことから、本酵素はいわゆるリパーゼと称される酵素には属さないと考えられる。このように、得られた酵素は水溶性の糖類エステルに特異的に作用するものであることがわかった。
【００７０】
▲４▼ショ糖脂肪酸エステルの分解反応
１．に記載の粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステルの分解反応を確認した。ショ糖脂肪酸エステルとしては、主成分としてショ糖モノステアレートを含有するDKエステルSS（第一工業製薬社製）を用いた。5重量／容量％のDKエステルSS水溶液50μl、0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7）、粗酵素液10μl（0.6単位）、0〜100μlのジメチルスルホキシド（最終濃度0、5、10、25及び50容量％）及び適宜の量の水からなる総容量200μlの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、53℃にて一夜反応させた後、エタノール800μlを加えて反応を停止した。対照群として、粗酵素液を含有しない反応液で同様の操作を行った。10,000 rpmにて５分間遠心した後、得られた上清10μlを、薄層クロマトグラフィー分析に供した。薄層クロマトグラフィーには、シリカゲルプレート60（メルク社製）を使用し、展開溶剤としてクロロホルム／メタノール／酢酸／水＝80／10／8／2の混合溶剤を用い、発色は20容量％の硫酸を噴霧した後オーブンで加熱して行った。この結果を図５に示す。図５において反応基質であるショ糖モノステアレートは主として、おそらくエステル化部位が相違する３種の置換位置変異体を表す、３つのスポットとして示される。それぞれのRf値は、およそ0.21、0.18及び0.14であった。本酵素を添加して反応を行うと、ジメチルスルホキシド濃度25容量％以下では（図５、レーンｆ〜ｉ）、これら３つのスポットのうちRf値が低い２つのスポット（Rf値：0.18及び0.14）が選択的に消失しており、従って、本酵素によってエステル化部位特異的にショ糖モノステアレートが分解され、エステルの置換位置が限定されたショ糖脂肪酸モノエステルが得られることが明らかになった。
【００７１】
反応液中にジメチルスルホキシドが50容量％存在すると、分解反応は進行しなかった（同、レーンｊ）。酵素を添加しない場合は、いずれのジメチルスルホキシド濃度においても分解反応は認められていない（同、レーンａ〜ｅ）。
【００７２】
▲５▼ショ糖脂肪酸エステルの合成反応
１．に記載の粗酵素を用いて、様々なショ糖脂肪酸エステルの合成反応を行った。オクタン酸（C8）、ラウリン酸（C12）またはミリスチン酸（C14）のうちいずれかの脂肪酸10 mg、50重量／容量％ショ糖を含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7）100μl、粗酵素液20μl（3単位）及びジメチルスルホキシド20μl（13.3容量％）を含む反応液をエッペンドルフチューブに入れ、45℃にて２０時間反応させた。次いで、反応液に400μlのメタノール、400μlのクロロホルム及び100μlの水を加えて溶媒抽出し、下層のクロロホルム層40μlを▲４▼にて前記したと同様の薄層クロマトグラフィー分析に供した。ここで展開溶剤は、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝70／20／8／2の混合溶剤を用いた。対照群として、粗酵素液を含有しない反応液で同様の操作を行った。この結果を図６に示す（図中、微弱なスポットが存在していた箇所に、手書きにてマークしてその存在を示した）。図６において、酵素存在下に反応を行うと、各炭素数の脂肪酸について鎖長に応じたRf値（C8：0.19及び0.15、C12：0.22及び0.18ならびにC14：0.25及び0.20）を有する、矢印で示される各々２種の反応産物が生成されている（図６、レーンｂ、ｄ及びｆ）。ここで、脂肪酸の炭素数が大きくなるほど生成物のRf値は大きくなっており、また、上記▲４▼の分解反応において本酵素が２つのショ糖脂肪酸エステル異性体を分解したことに対応するように反応産物が２種であることに基づくと、これらのエステラーゼ反応によってショ糖脂肪酸モノエステルの置換位置異性体２種が生成されたと考えられる。
【００７３】
さらに同様の条件下での反応におけるエステルの生成を確認するために、ショ糖とラウリン酸を反応させて合成される産物について検討した。反応条件は、上記と同様であり、反応終了後の抽出物を、ショ糖モノラウレートを含む標準試料（DKエステルS-L18A、第一工業製薬社製）と比較すべく薄層クロマトグラフィー分析した。展開溶剤は、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝70／20／8／2の混合溶剤を用いた。この結果を図７に示す。図７に明示されるように、本酵素を用いたショ糖とラウリン酸との反応によって、標品のショ糖モノラウレートと同様のRf値（0.40及び0.33）を有する産物が得られた。次いで、この反応産物を高速液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）に供した。LC-MS装置として、高速液体クロマトグラフィー部分には、カラムCosmosil 5C18-AR（φ4.6 mm×150 mm、ナカライテスク社製）を装備したLC10AT（島津社製）を用いた。使用溶離液は、10 mMの酢酸アンモニウム水溶液（溶離液Ａ）と10 mM酢酸アンモニウムのメタノール溶液（溶離液Ｂ）を用い、流速0.7 ml/分にて溶離液Ａ100％から溶離液Ｂ100％までの直線濃度勾配とした。質量分析部分には、Finigan Mat LCQ装置（Finigan社製）を用いて、イオン化はESI法により、また検出は負イオンにて行った。得られた液体クロマトグラフィーの結果を図８に示す。主たるピークａ及びｂの保持時間は、市販のショ糖モノラウレートの標品の保持時間と一致していた。そして、双方のピークのマススペクトルにより、ショ糖モノラウレートの分子量524.6に対して、-H(523.6)、+CH3CO0(583.6)及び+CF3COO(637.6)の質量数にピークが確認された。また、市販の標品のマススペクトルにおいても同様の質量数のピークが確認された。従って、本発明の酵素存在下にショ糖とラウリン酸とを反応させると、ショ糖モノラウレートの２種類のエステル置換位置異性体が得られることが明らかになった。
【００７４】
３．ショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子のクローニング
イデオネラ  エス・ピー No.13菌株由来のショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子のクローニングをショットガン法を用いて以下の通りに行った。すなわち、sarkosyl法［Morikawaら、J.Ferment.Bioeng.、74巻、255〜261頁(1992)］で調製したイデオネラ  エス・ピー No.13菌株の染色体ＤＮＡを、制限酵素EcoRIで切断し、pBR322ベクターのEcoRI部位に連結した。Wizard Kit（プロメガ社製）を用い、製造業者のプロトコルに従ってゲノミックライブラリーを作成した。得られたゲノミックライブラリーでEpicurian coli ABLE K [lac(LacZw-),Kan-,McrA-,McrCB-,McrF-,Mrr-,HsdRk-Mk-[F'proAB,lacIqZΔM15,Tn10(Tetr)]]（ストラタジーン社製）を、LederbergとCohen（Lederberg,E.M.及びCohen,S.N.、J.Bacteriol.119巻、1072〜1074頁(1974)）の方法に従って形質転換した。この宿主細胞は、通常用いられる宿主細胞E. coli JM109などよりもベクターのコピー数を1/10に低減するものである。この形質転換体を、アンピシリン50μg/ml及びショ糖脂肪酸エステル（DKエステルSS）2g/L及び1.5重量／容量％の寒天を含むL培地に塗布した。37℃にて一夜培養した後、室温下に１週間放置した。約5000の形質転換体コロニーについて、その周辺に生じる、エステラーゼの作用によって形成される白いハローを指標として、目的のクローンを探索した。しかして、微弱であるがハローを形成する11の陽性クローンが得られた。
【００７５】
この陽性クローンから、約10 kbのEcoRI−EcoRI断片を取り出し、サブクローニングに供した。サブクローニングにおいて、E. coli JM109 [recA1,endA1,gryA96,thi,hsdR17,supE44,relA1,Δ(Lac-proAB),F'(traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15)]を宿主細胞として用い、ベクターとしてはpUC18を用いた。次いで前記の約10 kbのEcoRI−EcoRI断片を、BamHIで消化した。切断部位は、図９、ａに示す通りであり、得られる４つの断片の各々について上記寒天法にてエステラーゼ活性を確認したところ、EcoRI−EcoRI断片の5'上流域に位置する、3.3 kbのEcoRI−BamHI（図９、ｂ）断片に高い活性が認められた。この活性は、EcoRI−EcoRI断片よりも高いものであった。このようにして得られたEcoRI−BamHI断片の塩基配列を、Dideoxy法に従って、Auto Read Sequencing Kit（ファルマシア社製）を用い、ALFexpress装置で分析した。かくして得られた塩基配列は、配列番号：１に示される通りであった。
【００７６】
次いで、得られた塩基配列のうち、エステラーゼの構造遺伝子を特定するために、当該ＤＮＡの上流及び下流領域の削除を行い、削除に伴うエステラーゼ活性の変動に基づき、1613塩基対の断片（図９、ｃ）にまで活性断片を限定した。このように領域を限定していくに伴って、コロニー周囲のハローの直径は大きくなったので、得られた断片により発現されるエステラーゼ活性が強くなっていることが示唆された。
【００７７】
この1613塩基対の断片の塩基配列を調べると、1416塩基対の読み取り枠が存在していることが示された。また、この断片をプロモーターに対して逆向きになるようにpUC19ベクターに挿入すると、エステラーゼ活性は著しく低下したので、この遺伝子の向きが図９、ｃに示すとおりであることが示唆された。
【００７８】
図９、ｃに示すように、得られたエステラーゼＤＮＡをコードする1613塩基対の断片の読み取り枠において、▲印に示す４箇所の開始コドンの配列が認められた。正確な開始コドンを確認するために、この断片の5'上流側の配列を欠失させた。図９、ｄに示すように２番目のATG配列の下流まで削除したところエステラーゼ活性が認められなくなったので、開始コドンは１または２番目のATG配列であると考えられた。さらにシャイン・ダルガーノ配列を検索すると、１番目のATG配列（配列番号：１の第689〜691位）上流には見出されず、２番目のATG配列（配列番号：１の第710〜712位）の上流（同、第697〜703位）に当該配列の存在が確認された。従って、２番目のATG配列が開始コドンであると考えた。また、終止コドンの下流には、ターミネーター配列（配列番号：１の第2134〜2149位）が見出された。
【００７９】
上記の結果より、イデオネラ  エス・ピー No.13の有するショ糖脂肪酸エステラーゼの構造遺伝子は、1416塩基対からなり、酵素タンパク質を構成するアミノ酸残基数は471（配列番号：２参照）、そしてタンパク質の分子量は48,758ダルトンと推定された。これは１．において前記したイデオネラ  エス・ピー No.13由来のエステラーゼタンパク質のSDS電気泳動上の見かけの分子量約48,000ダルトンとほぼ一致していた。
【００８０】
このタンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端部分には、塩基性アミノ酸に富む配列の次に非極性アミノ酸に富む配列が続いており、およそ２０のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドが存在していると推定された。
【００８１】
また、アミノ酸配列のほぼ中央部（配列番号：１のアミノ酸残基第189〜193位）に、エステラーゼ類及びリパーゼ類のタンパク質の活性中心に共通のアミノ酸配列「-Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly-」（配列番号：４）が見出された。このなかのセリン残基をシステイン残基に置換すべく、配列番号：１の塩基配列第1340〜1342位のTCGを、TGCにする変異を導入し、このＤＮＡがコードするタンパク質を発現させたところ、そのエステラーゼ活性は著しく低いことが示された。従って、この５つのアミノ酸残基からなる配列が活性中心であることが確認された。
【００８２】
このようにして明らかになったイデオネラ  エス・ピー由来のエステラーゼの配列について、既知の配列との相同性をDNASIS（日立社製）のソフトを用いて解析した。一般に真核細胞性物のエステラーゼ類及びリパーゼ類の配列は高い相同性を呈することが見出されている［Cygler,M.ら、Protein Science、2巻、366〜382頁(1993)］が、細菌のリパーゼについてはあまり互いに相同性がないことが報告されている（Jeager,K.E.ら、Bacterial lipase, FEMS Microbiology Reviews、15巻、29〜63頁(1994)）。配列を検索した結果、本ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質と高い相同性を示すものは見出されなかった。
【００８３】
４．ショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子を含む形質転換体におけるタンパク質発現
前記３．の工程によって調製した、配列番号：１に示すＤＮＡの第658〜2276位の部分をpUC18ベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、これを用いて宿主細胞の大腸菌（E.coli JM109）を形質転換した。前記と同様に、LederbergとCohenの方法に従って形質転換を行った。
【００８４】
形質転換した大腸菌をアンピシリン50μg/ml及びショ糖脂肪酸エステル（DKエステルSS）2 g/Lを含むL寒天培地に塗布し、37℃で一夜培養した。ハローを形成している１つのコロニーを選択し、アンピシリン50μg/mlを含む5 mlのL培地に植菌し、37℃で振盪培養した。培養開始２時間後に、最終濃度が0.1 mMとなるようにIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を添加し、誘導発現を行った。さらに３時間振盪培養して培養を終了した。培養物は10,000 rpmにて２分遠心分離して集菌した。集菌した菌体を50 mMリン酸緩衝液pH 7.0に懸濁し、超音波破砕した。破砕液を上記の寒天法によって活性測定したところ、培養液1 ml当たり0.25単位の酵素活性が検出された。
【００８５】
【発明の効果】
本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによって、特殊な誘導体などの原料を用いる必要なく、また副産物の少ない温和な条件下でショ糖と脂肪酸から直接ショ糖脂肪酸エステルを合成することが可能になるという効果が奏される。特にかかる反応において生成するショ糖脂肪酸エステルがモノエステルであって、ジエステル以上のポリエステルが合成されないので、本発明によって、選択的にショ糖脂肪酸モノエステルを製造する上で非常に有用な製造方法が提供されるのである。また、かかるショ糖脂肪酸モノエステルが、特にショ糖が位置選択的にエステル化された結果得られるものであるので、置換位置を限定したショ糖脂肪酸モノエステルの製造において、本発明が貢献するとことろは大である。
【００８６】
また、本発明によりショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質の遺伝子の構造が解明されたので、この遺伝子の塩基配列を改変して、さらにショ糖脂肪酸エステル合成に有利な酵素を作り出すことが可能になる。例えば、プロテアーゼにおいて実施されているように、酵素タンパク質自体の分解を抑制するような改変を行なって、より安定な酵素を作り出すことができると予測される。このような酵素の組換え体を適切な宿主細胞において発現させることによって、大量の酵素生産が可能になると考えられる。
【００８７】
また、このショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解反応の部位特異性を利用して、化学的に合成したショ糖脂肪酸エステルに含まれる３種のモノエステル異性体のうちの２つを選択的に分解し、特定のエステル化部位を有する高純度のモノエステル異性体を得ることができる。このような高純度ショ糖脂肪酸エステルは、従来知られているショ糖脂肪酸エステルの用途のみならず、さらに広範な用途において有用であることが期待される。
【００８８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法の１工程である高性能陰イオン交換カラムからの、タンパク質溶出の態様を示す図である。
【図２】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法の１工程であるゲル濾過カラムからの、タンパク質溶出の態様を示す図である。
【図３】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの活性のpH依存性を示すグラフである。
【図４】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの温度依存性を示すグラフである。
【図５】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解の態様を表す図である。
【図６】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによる種々のショ糖脂肪酸エステルの合成の態様を表す図である。
【図７】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖ラウレートの合成の態様を表す図である。
【図８】図７において得られたショ糖ラウレートの高速液体クロマトグラフィーにおける分離を示す図である。
【図９】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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