(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロラミンのプロテインボディーへの集積をもたらすシグナルアミノ酸配列をコードする塩基配列を上流に連結させ更にその上流にCaMV35Sプロモーターの塩基配列を連結させた、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を、ゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなることを特徴とするイネ科植物。
【請求項２】
イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ又はトウモロコシである、請求項１の植物。
【請求項３】
イネである、請求項１の植物。
【請求項４】
該ヒトインターフェロンがヒトインターフェロンα又はωである、請求項１ないし３の何れかの植物。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れかの植物のカルス。
【請求項６】
請求項１ないし４の何れかの植物の体細胞。
【請求項７】
プロラミンのプロテインボディーへの集積をもたらすシグナルアミノ酸配列をコードする塩基配列を上流に連結させ更にその上流にCaMV35Sプロモーターの塩基配列を連結させた、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を有する組換えプラスミドＤＮＡを構築し、該プラスミドＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換し、該形質転換されたアグロバクテリウムをイネ科植物のカルスに加えて感染させ、ヒトインターフェロンタンパク質を発現しているカルスを選択することを特徴とする、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列をゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなるイネ科植物の製造方法。
【請求項８】
該イネ科植物が、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ又はトウモロコシである、請求項７の製造方法。
【請求項９】
該イネ科植物がイネである、請求項７の製造方法。
【請求項１０】
該ヒトインターフェロンがヒトインターフェロンα又はωである、請求項７ないし９の何れかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンタンパク質を組込んだ植物に関し、取り分け、インターフェロンα又はωタンパク質をコードする塩基配列をゲノムＤＮＡに組込んだイネ科植物、及びチャに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物細胞への外来遺伝子の導入法の確立は、従来の交雑法では不可能であった、進化的に離れた他の植物や、更には微生物や動物の有用な形質も植物に付与できる可能性を生み出し、植物育種の革新的な技術として期待されている。実際にある単離遺伝子を植物細胞に導入する方法には、物理的手法によるものと生物を利用するものとがある。
【０００３】
物理的手法には、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、電子穿孔（エレクトロポレーション）法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法がある。これらの方法は、単子葉、双子葉の両植物体に適用できる点で有用性が高い。しかし、ポリエチレングリコール法とエレクトロポレーション法では、細胞壁が障害となるため、プロトプラストを用いなければならない上、導入された遺伝子の植物細胞の染色体ＤＮＡへの組込み頻度が低いことが問題である。また、プロトプラストを用いずに、カルスや組織を用いたマイクロインジェクション法では、針の太さや組織の固定等に関して困難が多い。組織を用いたパーティクルガン法でも、変異がキメラの形で出現してくる等の問題がある。また、これら物理的手法では、一般に、導入された外来遺伝子が核ゲノムに不完全な状態で多コピーの遺伝子として組込まれやすい。外来遺伝子が多コピー導入されると、その遺伝子が不活化されやすいことが知られている。
【０００４】
他方、生物を利用して単離遺伝子を導入する方法には、アグロバクテリウム法、ウイルスベクター法、及び近年開発されている、花粉をベクターとして用いる方法がある。これらの方法は、プロトプラストを用いず植物のカルス、組織又は植物体を用いて遺伝子導入を行うため、培養が長期間に及ぶことがなく、またソマクローナル変異等の障害を受けにくいという長所を有している。これらのうち花粉をベクターとして用いる方法は、まだ実験例も少なく、植物の形質転換法としては未知数の部分が多い。ウイルスベクター法は、ウイルスに感染した植物体全体に導入すべき遺伝子が広がるという利点はあるものの、各細胞内で増幅されて発現されるだけで、次世代に伝えられるという保証がないという点、及び長いＤＮＡ断片を導入できないという点に問題がある。アグロバクテリウム法は、20 kbp以上のＤＮＡを大きな再編成なしに染色体に導入できること、導入される遺伝子のコピー数が、数コピーと少ないこと、及び再現性が高いこと等、多くの利点がある反面、これまで単子葉植物には適用しにくいとされてきた。
【０００５】
イネ科植物等の単子葉植物にとってアグロバクテリウムは宿主範囲外であるため、イネ科植物への外来遺伝子導入は、従来は、先に述べたような物理的手法により行われてきた。しかしながら、近年、単子葉植物でもイネ等、培養系が確立されている植物においては、アグロバクテリウム法が適用されるようになっている。
【０００６】
アグロバクテリウム法による外来遺伝子の導入では、TiプラスミドVir領域に植物が合成するアセトシリンゴン等の低分子フェノール化合物が作用すると、TiプラスミドからＴ-ＤＮＡ領域が切り出され、幾つかの過程を経て植物細胞の核染色体ＤＮＡに組み込まれる。双子葉植物では、植物自身がそのようなフェノール化合物の合成機構を備えているため、リーフディスク法等により容易に外来遺伝子を導入することができ、再現性も高い。これに対し、単子葉植物では、そのようなフェノール化合物を植物自身が合成しないため、アグロバクテリウムによる形質転換植物の作出は困難であった。しかし、アグロバクテリウムの感染時にアセトシリンゴンを添加することで、単子葉植物への外来遺伝子導入も現在では可能となっている。
【０００７】
有用植物の作出に関しては、除草剤耐性植物や、ウイルス抵抗性植物、昆虫抵抗性植物等の病虫害抵抗性植物及び環境ストレス（公害、冷害、乾燥、強光）抵抗性植物が、これまで報告されている。他方、医薬品の製造という面での植物の利用の可能性についても、研究が始められている。
【０００８】
現在注目されていることの一つとして、種子のタンパク質貯蔵システムを利用した、生理活性ペプチドの生産がある。種子に貯蔵されたタンパク質は、その分離が比較的容易である。また、貯蔵タンパク質の本来の役割は窒素源として利用されることにあるため、その生理的役割を損なうことなくそのアミノ酸配列を変化させることが可能である。
【０００９】
例えば、イネの種子胚乳細胞内の貯蔵タンパク質であるプロラミンとグルテリンは、登熟期のほぼ同時期に胚乳細胞で合成され、それぞれ異なったタイプの、プロテインボディ（PB）と呼ばれる細胞内顆粒に集積される。胚乳細胞に最も多く含まれているグルテリンは、プロテインボディタイプII（PB-II）に集積され、もう一方の主要貯蔵タンパク質であるプロラミンは、プロテインボディタイプI（PB-I）に集積される。この選別は、それぞれのタンパク質に存在する特徴的なシグナル配列が、異なった小胞体領域で識別されることに基づくと考えられている。
【００１０】
外来遺伝子をイネに導入するのに、これらのシグナル配列を適切に利用できれば、発現された外来タンパク質をプロテインボディに集積させることができることとなり、外来タンパク質の安定な集積及び容易な単離、回収が容易となる可能性がある。コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ等、イネ以外のイネ科植物種子の胚乳にも同様な貯蔵タンパク質が含まれており、それらのシグナル配列も同様に有用である。
【００１１】
これらイネ、コムギ、トウモロコシ等のように、もともと食用に供される植物を用いてヒトのタンパク質を発現させる場合は、組換え植物から単離精製されたヒトタンパク質にヒトにとって有害な成分が混入する可能性が低いという利点がある上、植物体又はカルス等をそのまま経口的に摂取するという方法でのそのタンパク質の利用も可能となる。ヒトが摂取するという点では、飲料となるチャも同様であり、チャに外来の有用遺伝子を導入できれば、新たな用途が開ける。
【００１２】
一方、肝炎等の治療に用いられているヒトインターフェロン（INF）は、患者へ長期間にわたって投与される必要があるが、その供給量は限定されており、患者に投与される期間は、通常、比較的短期間に限られている。このため、インターフェロンの生産をより効率的にでき、肝炎等の治療におけるその利用を促進できる可能性のある植物の作出に対する需要がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の背景において、本発明は、ヒトインターフェロンタンパク質を産生することのできるイネ及びチャを作出することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ヒトインターフェロン遺伝子（INF）上流に、イネ科植物であるイネのプロラミンのシグナル配列をコードする塩基配列を融合した人工遺伝子を構築し、この人工遺伝子をアグロバクテリウム法を用いて矮生イネに導入した。その結果、カルスを含む種々の組織においてヒトインターフェロンタンパク質の発現が確認され、またそのタンパク質がヒトインターフェロンの生理活性を維持していることが確認された。更に、免疫電子顕微鏡観察の結果、シグナル配列の機能によりヒトインターフェロンタンパク質がPB-Iに集積していることが示唆された。一方、Camellia sinensisについても、カルスを用いて形質転換を行い、外来遺伝子であるＧＵＳの導入及び発現が確認された。ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列は、矮性イネについての実施例に示したのと同様、レポーター遺伝子であるＧＵＳの塩基配列の一部に置き換えた形で挿入することができ、それによりCamellia sinensis組織においてもヒトインターフェロン遺伝子を導入して発現させることが可能である。Camellia（ツバキ）は、分類学上Thea（チャ）と隣接していることから、チャについても、Camellia sinensisと同様の操作で、ヒトインターフェロン遺伝子を導入して発現させることが可能である。
【００１５】
すなわち本発明は、胚乳の貯蔵タンパク質のプロテインボディーへの集積をもたらすシグナルアミノ酸配列をコードする塩基配列を上流に連結させた、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を、ゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなることを特徴とするイネ科植物を提供する。該イネ科植物の好ましい例としては、イネ、コムギ、オオムギ及びカラスムギ又はトウモロコシが挙げられる。該イネ科植物は、個々の体細胞、カルス、植物体の何れの形でも提供できる。
【００１６】
更に本発明は、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を、ゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなることを特徴とするチャをも提供する。該チャとしては、個々の体細胞、カルス、植物体の何れの形でも提供できる。
【００１７】
更に本発明は、胚乳の貯蔵タンパク質のプロテインボディーへの集積をもたらすシグナルアミノ酸配列をコードする塩基配列を上流に連結させた、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を有する組換えプラスミドＤＮＡを構築し、該プラスミドＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換し、該形質転換されたアグロバクテリウムをイネ科植物のカルスに加えて感染させ、ヒトインターフェロンタンパク質を発現しているカルスを選択することを特徴とする、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列をゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなるイネ科植物の製造方法をも提供する。該イネ科植物の好ましい例としては、イネ、コムギ、オオムギ及びカラスムギ又はトウモロコシが挙げられる。
【００１８】
更に本発明は、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列を有する組換えプラスミドＤＮＡを構築し、該プラスミドＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換し、該形質転換されたアグロバクテリウムをチャのカルスに加えて感染させ、ヒトインターフェロンタンパク質を発現しているカルスを選択することを特徴とする、ヒトインターフェロンタンパク質をコードする塩基配列をゲノムＤＮＡに発現可能に組み込んでなるチャの製造方法をも提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明により製造されるヒトインターフェロンタンパク質を発現するイネ科植物又はチャは、例えばカルスよりヒトインターフェロンタンパク質を抽出して回収するのに用いることができるほか、カルス自体をそのまま又は乾燥等の処理を加えた形で、ヒトインターフェロンの経口的補給のために供することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、代表的な実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこの具体例に限定されることは意図しない。
【００２１】
１．ヒトインターフェロン遺伝子を含んだプラスミドベクターの構築
ヒトインターフェロン遺伝子を含んだプラスミドベクターを、以下のＡ〜Ｃの手順で構築した（図１〜５を参照）。インターフェロンとしては、インターフェロンα及びωを、例として用いた。
【００２２】
Ａ．pINT-RP10sGUSの調製
１）  イネスーパーオキシドジスムターゼ（イネＳＯＤ）を含むゲノムＤＮＡクローンを、BamHI（宝酒造）で消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキット（フナコシ）を用いて精製した。BamHIで消化したpBSK(+)（東洋紡績）にライゲーションキットver2（宝酒造）を用いてサブクローニングした。
【００２３】
２）  イネゲノムＤＮＡを鋳型としてフォーワード・プライマー（5-aatcagcaatggcagcatac-3）（配列表において配列番号５で示す）とリバース・プライマー（5-catggctaatgttggtgggaa-3）（配列表において配列番号６で示す）を用いてＰＣＲにより増幅し、イネ 10ｋＤａプロラミンシグナルを含むＤＮＡ断片を得た。更に、ブランティングキット（宝酒造）とポリヌクレオチドキナーゼで処理した後、SmaIで消化したpBI221（Clontech）に挿入した。
【００２４】
３）  上記１）のプラスミドをBamHIとNheI（宝酒造）で消化し、ＳＯＤ第１イントロンを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製し、BamHIとXbaI（宝酒造）で消化した上記２）のプラスミドにライゲーションキットver2（宝酒造）を用いてサブクローニングして、pINT-RP10sGUSを得た。
【００２５】
Ｂ．pIG121Hmの調製
１）  イネゲノムＤＮＡを鋳型として、フォーワード・プライマーINT-f（5-ggatccactagttctagagtcatcttc-3）（配列表において配列番号７で示す）とリバース・プライマーINF-r（5-cgtcctaggaagtgataacagata-3）（配列表において配列番号８で示す）を用いてＰＣＲによりイネＳＯＤ第１イントロンを含むＤＮＡを増幅し、XbaIとBamHIで消化した。XbaI、BamHI断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製し、XbaIとBamHIで消化したpBI121（Clontech）にライゲーションキットver2を用いてサブクローニングした。
【００２６】
２）  上記１）で得られたプラスミドをHindIII（宝酒造）とEcoRI（宝酒造）で消化し、HindIII、EcoRI断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製した。次いでこれを、HindIII、EcoRIで消化したpUC19（宝酒造）にライゲーションキットver2を用いてサブクローニングした。
【００２７】
３）  pGPTV-HPT（ATCC）をXbaIとSstI（Gibco）で消化し、XbaI、SstI断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製した。
【００２８】
４）  上記２）で得られたプラスミドを、XbaIとSstIで消化し、アガロースゲル電気泳動でプラスミドを精製し、GUS遺伝子を除去し、上記３）のHPT遺伝子（ハイグロマイシン耐性）を持つXbaI、SstI断片をライゲーションキットver2を用いて挿入した。
【００２９】
５）  上記４）で得られたプラスミドを、HindIIIとEcoRIで消化し、HindIII、EcoRI ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製した。次いでこれを、ブランティングキットを用いて平滑末端にした。
【００３０】
６）  上記１）で得られたプラスミドをEcoRIで消化し、ブランティングキットを用いて平滑末端にした。このプラスミドに上記５）のHindIII、EcoRI ＤＮＡ断片をライゲーションキットver2を用いて挿入し、pIG121Hmを得た。
【００３１】
Ｃ．pIG-A11、pIG-O89の調製
１）  ヒトゲノムを鋳型としてフォーワード・プライマー A-GUS-SF（5-ctcctggtgctcatacgtaagtcacgcggctctgtgggctg-3）（配列表において配列番号９で示す）とリバース・プライマー A-SacR（5-catttccatgttggagctcttttcattccttacttc-3）（配列表において配列番号１０で示す）を用いてヒトインターフェロンα２Ａ（INF-α2A）を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。また、フォーワード・プライマー O-Gus-SF（5-ccctagtgatgatacgtaatagccctcgtggatctctgggc-3）（配列表において配列番号１１で示す）とリバース・プライマー O-SacR（5-gcaaattaatcaatgagctccgtatcaagatgag-3）（配列表において配列番号１２で示す）を用いてヒトインターフェロンω（INF-ω）を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００３２】
２）  pINT-RP10sGUSと、上記１）のＰＣＲ産物をそれぞれ、SnaBI（宝酒造）とSacI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製し、ライゲーションキットver2を用いてライゲーションし、INF-α2Aと、INF-ωの遺伝子をクローニングした。
【００３３】
３）  上記２）で得られたプラスミドを、XbaIとSacIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製した。
【００３４】
４)  pIG121HmをXbaIとSacIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、GENE CLEANキットを用いて精製し、ＳＯＤイントロンとＧＵＳ遺伝子を除去した。
【００３５】
５）  上記４）のプラスミドに上記３）のXbaI、SacI断片をライゲーションキットver2を用いて挿入し、INF-α2A遺伝子の入ったpIG-A11と、INF-ω遺伝子の入ったpIG-O89を得た。
【００３６】
配列表の配列番号１に、本発明において使用した、インターフェロンαタンパク質をコードする塩基配列を含んだプラスミドＤＮＡの特徴部分を構成する塩基配列を示す。該配列において、塩基１〜６はXbaI部位であり、塩基10〜894はイネＳＯＤイントロンの塩基配列であり、塩基916〜987は24個のアミノ酸よりなるプロラミン10ｋシグナルをコードする塩基配列、塩基988〜1044は19個のアミノ酸よりなるプロラミンＮ末端領域をコードする塩基配列、塩基1045〜1437は126個のアミノ酸よりなるＧＵＳのＮ末端領域とこれに続く５個のアミノ酸よりなる連結部をコードする塩基配列、塩基1438〜1446は３個のアミノ酸よりなるトロンビン認識部位をコードする塩基配列、塩基1447〜1947は167個のアミノ酸よりなるインターフェロンαタンパク質（全長）をコードする塩基配列、塩基1948〜1950は終止コドン、塩基1954〜1959はSacI部位である。
【００３７】
配列番号２には、配列番号１のＤＮＡによってコードされてイネ中で発現されるタンパク質のアミノ酸配列を示す。該アミノ酸配列において、アミノ酸１〜24はプロラミンシグナルであり、膜通過に際して切断されて除去される部分である。アミノ酸25〜43はプロラミンＮ末端領域の19個のアミノ酸に対応する。アミノ酸44〜169はＧＵＳのＮ末端領域の126個のアミノ酸に対応し、アミノ酸170〜174は連結部を構成するアミノ酸である。アミノ酸175〜177はトロンビン認識部位を構成するアミノ酸（Arg-Gly-Ser）であり、トロンビンによってアルギニンとグリシンとの間で切断される。アミノ酸178〜344は、167個のアミノ酸よりなるインターフェロンαタンパク質の全長アミノ酸配列を構成する。トロンビンによってインターフェロンαタンパク質が切り出されるとき、トロンビン認識配列の一部（Gly-Ser）が、アミノ酸178〜344よりなるインターフェロンαタンパク質のＮ末端側に残存することになるが、20種以上見出されている天然のインターフェロンαタンパク質のうちには、この配列Gly-Serを含んでいるものが存在するため、この配列Gly-Serを含めた169個のアミノ酸よりなる配列もまたインターフェロンαタンパク質のものである。
【００３８】
配列表の配列番号３に、本発明において使用した、インターフェロンωタンパク質をコードする塩基配列を含んだプラスミドＤＮＡの特徴部分を構成する塩基配列を示す。該配列において、塩基１〜６はXbaI部位であり、塩基10〜894はイネＳＯＤイントロンの塩基配列であり、塩基916〜987は24個のアミノ酸よりなるプロラミン10ｋシグナルをコードする塩基配列、塩基988〜1044は19個のアミノ酸よりなるプロラミンＮ末端領域をコードする塩基配列、塩基1045〜1440は126個のアミノ酸よりなるＧＵＳのＮ末端領域とこれに続く６個のアミノ酸よりなる連結部をコードする塩基配列、塩基1441〜1449は３個のアミノ酸よりなるトロンビン認識部位をコードする塩基配列、塩基1450〜1971は174個のアミノ酸よりなるインターフェロンωタンパク質（全長）をコードする塩基配列、塩基1972〜1974は終止コドン、塩基1975〜1980はSacI部位である。
【００３９】
配列番号４には、配列番号３のＤＮＡによってコードされてイネ中で発現されるタンパク質のアミノ酸配列を示す。該アミノ酸配列において、アミノ酸１〜24はプロラミンシグナルであり、膜通過に際して切断されて除去される部分である。アミノ酸25〜43はプロラミンＮ末端領域の19個のアミノ酸に対応する。アミノ酸44〜169はＧＵＳのＮ末端領域の126個のアミノ酸に対応し、アミノ酸170〜175は連結部を構成するアミノ酸である。アミノ酸176〜178はトロンビン認識部位を構成するアミノ酸（Arg-Gly-Ser）であり、トロンビンによってアルギニンとグリシンとの間で切断される。アミノ酸179〜352は、174個のアミノ酸よりなるインターフェロンωタンパク質の全長アミノ酸配列を構成する。
【００４０】
以下、実験操作を、インターフェロンα遺伝子を用いた例に基づいて記述する。上記インターフェロンωその他のインターフェロン遺伝子を用いた操作も、インターフェロンαを用いた場合と同様にして行われる。
【００４１】
２．  アグロバクテリウムの形質転換
２．１  大腸菌へのプラスミドの導入
宿主細胞としてE. coliを用いた。室温で融解した宿主細胞に、上記で構築した組換えプラスミドベクターpIG-A11を１〜２μｌ加え、氷上で１分間静置した。次いで細胞をキュベット（0.2ＣＭ、Bio Rad Inc.）に移し、電気パルス（25μFD、200Ω、2.5 kV）を加えた（GENE PULSER, Bio Rad Inc.）。
。予め37℃に加温しておいたSOC培地（トリプトファン10ｇ／l、酵母エキス5.0ｇ／ｌ、塩化ナトリウム10ｍＭ、塩化マグネシウム2.5ｍＭ、硫酸マグネシウム10ｍＭ、グルコース20ｍＭ）1.0ｍｌをキュベットに加えてヒートショックを与え、滅菌済み試験管に移して37℃にて１時間、180〜220ｒｐｍでロータリーシェーカーを用いてインキュベートした。ＬＢプレート（ＬＢ培地１Ｌ中、塩化ナトリウム5.0ｇ、トリプトファン5.0ｇ、酵母エキス10ｇ、1.5％アガー、アミピシリン又はカナマイシン50μｇ／ｍｌ）にプレーティングし、37℃にて一晩静置培養した。
【００４２】
２．２  プラスミドの大量調製
組換えプラスミドＤＮＡpIG-A11を持ったE. coliを、抗生物質を含有するLB培地（LB培地50ｍｌ＋アンピシリン50μｇ／ｍｌ）中で一晩振盪培養した。培養液を遠心チューブに移し、7,000ｒｍｐ（卓上微量遠心機 BECKMAN MicrofugeTM R）で５分間、４℃にて遠心し、沈殿にアルカリ溶解液Ｉ（25ｍＭトリス塩酸、50ｍＭグルコース、10ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍｌを加え、よく懸濁し、室温で５分間放置した。次いでアルカリ溶解液II（0.2Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ）２ｍｌを加えて軽く混合し、氷上に５分間放置した。３Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ5.7）1.5ｍｌを加えて混合し、氷上に10分間放置した。12,000ｒｐｍ（高速冷却遠心機：BECKMAN AvantiTM HP-25I、ローター：JA-12）にて10分間遠心し、上清を新しい遠心チューブに移し、イソプロパノール3.5ｍｌを加えて（最終濃度60％）、混合し、氷上に10分〜１時間放置した。12,000ｒｐｍにて10分間遠心し、沈殿を採取し、乾燥させた後、蒸留水１ｍｌを加えて溶解させた。蒸留水に溶かしたＤＮＡをスピッツ管に移し、1.6ｍｌにフィルアップした後、ＣｓＣｌを1.75ｇとエチジウムブロマイド100μｌを加え混合した。これを超遠心用クイックシールチューブに入れてシールし、80,000ｒｐｍ（超遠心機：BECKMAN OptimaTM TLX, ローター：TLA 120.2）にて16〜20時間、20℃にて超遠心した。１ｍｌ用滅菌シリンジ（ツベルクリン用）で回収し、エッペンドルフ型チューブに移した。0.5ｍｌまで蒸留水でフィルアップし、ｎ−ブタノール0.5ｍｌを加えて、３〜４回振り混ぜ、エタノール（室温）１ｍｌを加えた。析出したＣｓＣｌが消えるまで蒸留水を１滴ずつ加えた。-80℃にて30分間静置してエタノール沈殿後、室温に戻して振り混ぜた。15,000ｒｐｍ（BECKMAN MicrofugeTM R）にて５分間、４℃にて遠心して上清を捨て、沈殿に蒸留水200μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム20μｌ及び100％エタノール550μｌを加た後、-80℃にて20分間放置した。15,000ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、上清を捨て、沈殿に80％エタノール200μｌを加えた。-80にて20分間放置し、15,000ｒｐｍにて３分間４℃にて遠心し、上清を捨て、沈殿を乾燥させた後、蒸留水50μｌに溶解させた。吸光度法によりＤＮＡ濃度の測定を行った（５μｌを１ｍｌにフィルアップしたものを測定し、ＯＤ260×10μｇ／ｍｌとして算出）。
【００４３】
２．３  アグロバクテリウムへのプラスミドの導入
２．３．１  コンピテントな細胞の調製
Agrobacterium tumefaciens野生株（EHA101株及びEHA105株）を、それぞれ抗生物質含有のＬＢプレート（LB培地＋カナマイシン50μｇ／ｍｌ）にシングルコロニーが出るように画線して、28℃にて２〜３日培養した。コロニーを、抗生物質含有のＬＢ培地（塩化ナトリウム5.0ｇ／ｌ、トリプトン5.0ｇ／ｌ、酵母エキス10ｇ／ｌ）３ｍｌに植菌し、28℃にて一晩培養した。0.1〜0.5ｍｌの培養液を抗生物質含有のＬＢ培地50ｍｌに植菌し28℃にてＯＤ600＝0.4程度まで培養した。Agrobacterium tumefaciens培養液の入ったフラスコを、氷水中で15分間冷却した後、50ｍｌコーニングチューブに移し、3,500ｒｐｍにて15分間４℃にて遠心し、培地を除去した。４℃の10％グリセロールを約10ｍｌ加えた後、菌体を懸濁させ、更に冷10％グリセロールを加えて合計40ｍｌとし、4,000ｒｐｍにて15分間遠心した。グリセロールを除去し、再び冷10％グリセロールを約10ｍｌ加えた後、菌体を懸濁させ、更に冷10％グリセロールを加えて合計40ｍｌとし、4,000 rpm にて15分間遠心した。グリセロールを十分に除去した後、400μｌの10％グリセロールを加えてAgrobacterium tumefaciens菌体を懸濁させた。40μｌずつ1.5ｍｌエッペンドルフチューブに分注し、液体窒素で急冷し、-80にて保存した。
【００４４】
２．３．２  Agrobacterium tumefaciensの形質転換
室温融解した宿主細胞に、組換えプラスミドＤＮＡpIG-A11 ＤＮＡを１〜２μｌ加え、氷上に１分間静置した。予め冷やしておいたキュベットに宿主細胞を移し、電気パルスを与えた（25μＦＤ、200Ω、2.5ｋＶ）。予め28℃に暖めておいたSOC培地1.0ｍｌをキュベットに加えてヒートショックを与え、滅菌済み試験管に移して、28℃にて３時間、ロータリーシェーカーを用いて180〜220ｒｐｍでインキュベートした。細胞をLBプレート（LB培地、カナマイシン50μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン50μｇ／ｍｌ、1.5％アガー）にプレーティングし、28℃にて２〜３日培養した。シングルコロニーを抗生物質含有のLB培地に植菌し、その後Flex prep（Pharmacia）でプラスミドを回収し、ＰＣＲで常法により目的遺伝子の導入を確認した。
【００４５】
３．  矮生イネの形質転換
３．１  アグロバクテリウムの調製
安全キャビネット内で、-80℃グリセロールストックしたAgrobacterium tumefaciens（EHA101/pIG-A11及びEHA105/pIG-A11）のバイアルに白金耳を差込み、AB培地（培地リスト参照）に塗布した。ビニールテープでシールし、28℃にて暗所で３日間培養した。
【００４６】
３．２  カルスの誘導
矮生イネ種子の籾を取り除いた後、スリ付き瓶に入れ、70％エタノールを加えて約１分間スターラーで攪拌した。エタノールを捨てた後、50％に希釈した次亜塩素酸ナトリウムを加えて約１時間スターラーで攪拌した。クリーンベンチ内で茶こしを用いて次亜塩素酸ナトリウムを完全に切り、種子をシャーレに移し、蒸留水で５〜６回洗浄した。種子をピンセットでＮ６ＣＰ培地（培地リスト参照）に移し、28℃にて明所で２週間培養した。生じたカルスをピンセットで取り分けて、新しいＮ６ＣＰ培地に移し、１〜２週間以内に使用した。
【００４７】
３．３  アグロバクテリウムの感染による遺伝子の導入
超音波処理の有無による２通りの方法で試みた。
【００４８】
３．３．１  超音波処理を行わない方法
ＡＡ懸濁培地（培地リスト参照）を50ｍｌコーニングチューブに約25ｍｌ分注した。アセトシリンゴン（DMSOに50ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、遮光して４℃にて保存）を10ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加えたＡＡ懸濁培地に、ＡＢ培地（培地リスト参照）上のアグロバクテリウム（EHA101株）の菌体をスパチュラで数センチ掻き取り懸濁させた。誘導開始から31日目のカルスを、アグロバクテリウムの菌体を懸濁させたＡＡ懸濁培地に移し、振り混ぜ、その後、時々振り混ぜつつ５分間感染させた。菌体懸濁液を少し捨て、懸濁液とカルスを一緒にシャーレに移した。Ｎ６共培養培地（培地リスト参照）にカルスを置床し、サージカルテープでシールし、28℃にて暗所で３日間共培養した。
【００４９】
３．３．２  超音波処理を行う方法
ＡＡ懸濁培地（培地リスト参照）を50ｍｌコーニングチューブに約25ｍｌ分注した。誘導17日目のカルスをコーニングチューブに入れ、超音波処理を30秒間行った。ＡＡ懸濁培地（培地リスト参照）に、ＡＢ培地上のアグロバクテリウムの菌体をスパチュラで数センチ掻き取り懸濁させた。振り混ぜてアグロバクテリウム（EHA105株）の菌体を懸濁させた後、時々振り混ぜつつ５分間感染させた。菌体懸濁液を少し捨て、懸濁液とカルスを一緒にシャーレに移した。Ｎ６共培養培地（培地リスト参照）にカルスを置床し、サージカルテープでシールし、28℃にて暗所で２日間共培養した。
【００５０】
３．４  アグロバクテリウムの除去と回復
50ｍｌコーニングチューブに蒸留水約25ｍｌ入れ、更に共培養後のカルス加えた。振り混ぜた後、静止させ、カルスが沈降したことを確認し、洗浄水を捨てた。蒸留水約25ｍｌの添加、混合、静置及び洗浄水の廃棄の操作を、蒸留水が濁らなくなるまで（２〜３回）繰り返した。蒸留水25ｍｌを加えた後、カルベニシリン（250ｍｇ／ｍｌになるように滅菌水に溶解しクリーンベンチ内で濾過滅菌した後４℃にて保存）50μｌを加え（最終濃度500ｍｇ／ｍｌ）、混合後静置し、カルスが沈降したことを確認し、洗浄水を捨てた。カルベニシリン含有蒸留水の添加混合、静置、洗浄水の廃棄の操作を、洗浄水が濁らなくなるまで（３〜４回）繰り返し、最後の洗浄後、洗浄水を少量捨てた後、洗浄水ごとカルスをシャーレに移した。カルスをピンセットでＮ６Ｃ＋カルベニシリン培地（培地リスト参照）に置床し、サージカルテープでシールし、28℃にて明所で、EHA101株に感染カルスついては10日間、EJHA105株感染カルスについては９日間、それぞれ培養した。
【００５１】
この回復操作は、アグロバクテリウムの感染により植物が受けるダメージからの回復を目的としており、この操作の省略は、形質転換体が得られる可能性を低下させるため、好ましくない。Ｎ６Ｃ＋カルベニシリン培地での培養期間は、１週間程度が最適であると。
【００５２】
３．５  選択
Ｎ６Ｃ＋カルベニシリン培地で１週間培養した全てのカルスを、Ｎ６選択培地（培地リスト参照）に置床した。これに際し、大きくなっているカルスは、過剰な力がかかるのを避けつつ、小さく分けて置床した。サージカルテープでシールした後、置床したカルスを28℃にて、明所で培養した。培地は約２週間毎に交換した。用いたＮ６Ｃ＋カルベニシリン培地のハイグロマイシン濃度は、EHA101株感染カルスについては、最初の15日間は25ｍｇ／ｌ、残りの期間（17日間）は40ｍｇ／ｌとし、EHA105株感染カルスについては、全期間（27日間）30ｍｇ／ｌとした。
【００５３】
３．６  再分化
Ｎ６選択培地で培養して増殖してきたカルスのみを、ハイグロマイシン濃度25ｍｇ／ｌのMS再分化培地（培地リスト参照）に置床した。１〜２週間でカルスはグリーニングした。再分化個体をＭＳホルモンフリー培地（培地リスト参照）に移した。ハイグロマイシン耐性の有無を確認し、植物体を成長させた。
【００５４】
３．７  順化
根が十分伸びかつシュートが成長してきたら、３日間かけて蓋を徐々に開放した。この際、カビの発生を防ぐため、培地の上に水を張り、水を１日１回交換した。順化させた植物体から培地を十分に除去した後、土に植え替え、ハイポネックスを与えて成長させた。
【００５５】
４．  培地リスト
上記の操作において用いた各培地の組成は次の通りである。
【００５６】
ＡＡ培地：  リン酸二水素ナトリウム150ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム２水塩150ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水塩250ｍｇ／ｌ、ヨウ化カリウム0.75ｍｇ／ｌ、塩化コバルト６水塩0.025ｍｇ／ｌ、ホウ酸3.0ｍｇ／ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩0.25ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン４水塩10.0ｍｇ／ｌ、硫酸銅５水塩0.025ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水塩2.0ｍｇ／ｌ、エデト酸第一鉄40.0ｍｇ／ｌ、イノシトール100ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン10.0ｍｇ／ｌ、ニコチン酸1.0ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン1.0ｍｇ／ｌ、グリシン7.5ｍｇ／ｌ、アルギニン177ｍｇ／ｌ、塩化カリウム３ｇ／ｌ、グルタミン900ｍｇ／ｌ、アスパラギン酸300ｍｇ／ｌ、ショ糖２ｇ／ｌ
【００５７】
ＡＡ懸濁培地：ＡＡ塩類及びアミノ酸類、B5ビタミン類、ショ糖20ｇ／ｌ、キネチン0.2ｍｇ／ｌ、2,4-Ｄ ２ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン10ｍｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００５８】
ＡＢ培地：  リン酸水素カリウム３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水塩0.3ｇ／ｌ、塩化カリウム0.15ｇ／ｌ、塩化カルシウム0.01ｇ／ｌ、硫酸第一鉄７水塩2.5ｍｇ／ｌ、グルコース５ｇ／ｌ、アガー15ｇ／ｌ、ｐＨ7.2
【００５９】
Ｎ６培地：  硫酸アンモニウム463ｍｇ／ｌ、硝酸カリウム2830ｍｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム400ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム２水塩166ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水塩185ｍｇ／ｌ、ヨウ化カリウム0.8ｍｇ／ｌ、塩化コバルト６水塩0.025ｍｇ／ｌ、ホウ酸1.6ｍｇ／ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩0.25ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン４水塩4.4ｍｇ／ｌ、硫酸銅５水塩0.025ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水塩1.5ｍｇ／ｌ、硫酸第一鉄７水塩27.85ｍｇ／ｌ、エデト酸二ナトリウム37.25ｍｇ／ｌ、イノシトール100ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン1.0ｍｇ／ｌ、ニコチン酸0.5ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン0.5ｍｇ／ｌ、グリシン2.0ｍｇ／ｌ、ショ糖30ｇ／ｌ
【００６０】
Ｎ６共培養培地（Ｎ６ｃｏ）：  N6塩類及びビタミン、ショ糖30ｇ／ｌ、グルコース10ｇ／ｌ、2,4-Ｄ ２ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン10ｍｇ／ｌ、アガー８ｇ／ｌ、ｐＨ5.2
【００６１】
Ｎ６カルス誘導培地（Ｎ６Ｃ）：  Ｎ６塩類及びビタミン類、ショ糖30ｇ／ｌ、2,4-Ｄ ２ｍｇ／ｌ、アガー８ｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００６２】
Ｎ６カルス誘導＋プロリン培地：  Ｎ６カルス誘導培地、プロリン2.8ｇ／ｌ
【００６３】
Ｎ６Ｃ＋カルベニシリン培地：  ＮＣ６カルス誘導培地、カルベニシリン500ｍｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００６４】
Ｎ６選択培地：  N6塩類及びビタミン類、ショ糖30ｇ／ｌ、2,4-Ｄ ２ｍｇ／ｌ、ゲルライト（gelrite）２ｇ／ｌ、カルベニシリン500ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン30〜50ｍｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００６５】
ＭＳ培地：  塩化カルシウム２水塩440ｍｇ／ｌ、硝酸アンモニウム1650ｍｇ／ｌ、硝酸カリウム1900ｍｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム170ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水塩370ｍｇ／ｌ、ヨウ化カリウム0.83ｍｇ／ｌ、塩化コバルト６水塩0.025ｍｇ／ｌ、ホウ酸6.2ｍｇ／ｌ、モリブデン酸ナトリウム４水塩0.25ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン４水塩22.3ｍｇ／ｌ、硫酸銅５水塩0.025ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水塩8.6ｍｇ／ｌ、硫酸第一鉄７水塩27.85ｍｇ／ｌ、エデト酸二ナトリウム37.25ｍｇ／ｌ、イノシトール100ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン1.0ｍｇ／ｌ、ニコチン酸0.5ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン0.5ｍｇ／ｌ、グリシン2.0ｍｇ／ｌ、ショ糖30ｇ／ｌ
【００６６】
ＭＳ再分化培地（ＭＳｒｅ）：  ＭＳ塩類及びビタミン類、ショ糖30ｇ／ｌ、ソルビトール30ｇ／ｌ、ＮＡＡ１ｍｇ／ｌ、ＢＡＰ２ｍｇ／ｌ、カルベニシリン 250ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン25ｍｇ／ｌ、ゲルライト（gelrite）２ｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００６７】
ＭＳホルモンフリー培地（ＭＳｈ）：  ＭＳ塩類及びビタミン類、ショ糖30ｇ／ｌ、カルベニシリン250ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシン25ｍｇ／ｌ、ゲルライト（gelrite）２ｇ／ｌ、ｐＨ5.8
【００６８】
５．  得られた形質転換矮性イネについての検討
５．１  矮性イネにおけるヒトインターフェロンαの導入効率
上記の方法により、ヒトインターフェロンα遺伝子の導入によって形質転換された矮性イネが得られた。用いた種子数、カルス数、得られた形質転換固体数、種子ベースの形質転換効率を示す。
【００６９】
【表１】
0003922869.tif 000002
【００７０】
５．２  形質転換矮性イネにおける目的遺伝子の確認
５．２．１  ＰＣＲによる確認
（１）ＰＣＲ
得られた形質転換個体の各々（α−１，α−２、α−３、α−４及びα−５系統）につき確認を行った。ゲノムＤＮＡを４ｎｇ／２μｌに調製し、鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに用いた。次の組成に従い、鋳型ＤＮＡ以外の混合物を0.5ｍｌエッペンチューブに分注し、これに鋳型ＤＮＡを加えた。陰性対照としては、野生型矮性イネのゲノムＤＮＡと蒸留水とを用いた。
鋳型ＤＮＡ・・・・・・・・２μｌ
10×緩衝液・・・・・・・・２μｌ
25ｍＭ ＭｇＣｌ2・・・・・２μｌ
10×ｄＮＴＰ・・・・・・・２μｌ
前方プライマー*1・・・・・１μｌ
後方プライマー*2・・・・・１μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ・・・ 0.1μｌ
蒸留水              全量  20μｌ
*1  GUS snaFを使用
*2  GUS sacRを使用
【００７１】
GeneAmp PCR system 2400に0.5ｍｌエッペンチューブをセットし、下記のプログラムを実行した。
〔標準プログラム〕
（ａ）  94℃    １分
（ｂ）  94℃    0.5分
（ｃ）  60℃    １分
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）を35サイクル反復する
（ｅ）  72℃    1.5分
（ｆ）  72℃    ５分
（ｇ）  ４℃    保存
【００７２】
（２）  アガロースゲル電気泳動
上記の反応操作の後、反応液20μｌを次の手順でアガロースゲル電気泳動し、バンドの確認を行った。すなわち、アガロース0.4ｇを三角フラスコに入れ、ＴＡＥ緩衝液（0.4Ｍトリス酢酸、0.62Ｍ ＥＤＴＡ）を40ｍｌ加えた。電子レンジで溶解後、蒸留水で補正し、型に流して固化させた（ゲル濃度0.8％）。固化後、ＴＡＥ緩衝液を満たした泳動装置にゲルを入れ、ＰＣＲ産物にＰＢＰを少量加えて、ウェルに適用した。両端には、λHind IIIマーカーを適用した。約30分間泳動させた後、エチジウムブロマイド染色液に10分間浸して染色した。染色後、ゲルをImageMaster（Pharmacia Biotech）にかけてバンドの位置を確認し、併せて写真撮影した。
【００７３】
（３）  結果
ＰＣＲの結果を図４に示す。全ての形質転換系統において、目的の位置（500ｂｐ付近）にＤＮＡ断片を確認することができた。また陰性対照においてはＤＮＡの増幅は見られなかった。この結果、形質転換体において目的遺伝子が導入されていることが確認された。
【００７４】
５．２．２  ゲノミックサザンブロットによる確認
（１）  イネゲノムの単離
得られた形質転換個体のうち、α−２、α−３及びα−４系統について確認を行った。約10ｇのイネ緑葉を鋏でできるだけ小さく切ってから乳鉢に入れ、これに液体窒素を加えて乳棒でパウダー状になるまですりつぶした。細かくなった組織をスパチュラで50ｍｌコーニングチューブに入れ、予め沸騰寸前まで加熱しておいた２％ＣＴＡＢ溶液〔100ｍＭトリス塩酸、20ｍＭ ＥＤＴＡ、1.4Ｍ ＮａＣｌ、２％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）、ｐＨ8.0〕20ｍｌを加えた。56℃にて20分間震盪した後、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温にて20分間転倒混和した。遠心して上層を分離しこれに、再び等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温にて20分間転倒混和した。遠心して上層を分離し、これに１〜1.5倍量の１％ＣＴＡＢ溶液（50ｍＭトリス塩酸、10ｍＭ ＥＤＴＡ、1.4Ｍ ＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ、ｐＨ8.0）を加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。3,000ｒｍｐにて20分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿に１Ｍ ＮａＣｌを５ｍｌ加え、更に10ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａを５μｌ加えて、56℃にて沈殿が溶けるまで震盪した。クリーンベンチ内で、冷却した100％エタノール10ｍｌを静かに重層し、先を熱で融かしたパスツールピペットに巻き付けるようにしてゲノムＤＮＡを回収した。このとき、目視し得る程のゲノムＤＮＡが得られた。80％エタノールに２回、100％エタノールに１回、この順にそれぞれ約５分浸漬した後、巻き付けたＤＮＡが透明になるまで風乾した。ＴＥ２ｍｌの入った15ｍｌのコーニングチューブにゲノムＤＮＡを入れ、必要な場合は56℃に加熱して、完全に溶解させた。吸光度（ＯＤ260）を測定してＤＮＡ濃度を求めた。
【００７５】
（２）ＤＮＡトランスファーメンブランの調製
ゲノムＤＮＡ10μgを、Hind III、Xba I、Sac I及びEco RI〔導入遺伝子（Ｔ−ＤＮＡ）中に１ヶ所しかない制限酵素部位に対する制限酵素である〕の各制限酵素で37℃にて一晩消化した。
ゲノムＤＮＡ・・・・・・・10μg
10×緩衝液・・・・・・・・10μｌ
制限酵素・・・・・・・・・ 8μｌ
蒸留水・・・・・・・全量  100μｌ
【００７６】
反応後、エタノール沈殿を行い、全体量の1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２〜2.5倍量の100％エタノールを加え、混合した後、-80℃にて15分以上放置した。
その後卓上遠心機で15,000ｒｐｍ、室温にて20分間遠心し、上清を捨て、80％エタノール200μｌを加え、15,000ｒｐｍで室温にて10分間遠心し、上清を捨て、沈殿を減圧乾燥させた。回収されたＤＮＡを蒸留水20μｌに溶解させ、0.8％濃度のゲル、50ｍＡの条件で電気泳動を行った。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色液に10分間以上浸漬した。ゲルをＢＰＢが黄変するまで0.25Ｎ塩酸中で震盪した後、0.4Ｎ水酸化ナトリウム中で20分間処理して、ＤＮＡを一本差に変性した。ゲルと同じ大きさのHybond-N+（Amersham）１枚と３ＭＭ濾紙２枚を切り、ブロット台を組み立て８時間〜一晩、ＤＮＡをHybond-N+（Amersham）にブロットした。Hybond-N+（Amersham）のゲルのコームに位置するところに印をつけてから、２×ＳＳＣ〔塩化ナトリウム17.53ｇ／ｌ、クエン酸ナトリウム8.82ｇ／ｌ〕で５分間洗浄した。Hybond-N+（Amersham）をペーパタオルに挟んで80℃にて２時間ベーキングした後、デシケーターに保存した。
【００７７】
（３）  プローブＤＮＡの調製
下記の系で制限酵素処理を２時間行った。
pIG-A11 ・・・・・・・・・８μg
10×緩衝液・・・・・・・・４μｌ
SnaB I  ・・・・・・・・・２μｌ
Sac I ・・・・・・・・・・２μｌ
10×BSA ・・・・・・・・・４μｌ
蒸留水              全量  40μｌ
【００７８】
制限酵素で消化したＤＮＡを100ｍＡで電気泳動した（手順は上記参照）。泳動後、ゲルの写真を撮り、ＵＶ照射下に必要なバンドをかみそりでカットした。溶出装置を水平に合わせ、１×電気溶出緩衝液（20ｍＭトリス塩酸、0.2ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ8.0）を注いだ。１ｍｌピペットマンで緩衝液を出し入れすることにより各チャンネルから空気を抜いた。３Ｍ 酢酸ナトリウム125μｌを、溢れないよう注意しつつ全てのチャンネルに加えた。切り出したゲルを台に載せ、100Ｖ・400Ａで１時間溶出させた後、ゲルをＵＶ照射してＤＮＡが全て回収されたことを確認した。緩衝液を抜き、キャピラリーチップをつけた１ｍｌピペットマンでチャンネル内の液を回収した。100％エタノール１ｍｌを加えて振り混ぜた後、-80℃に15分以上おいた。卓上遠心機で15,000ｒｐｍで20分間遠心した後、上清を捨てた。濯ぎのため、80％エタノール200μｌを加えて15,000ｒｐｍにて10分間遠心し、ピペットマンを用いて上清を注意深く捨てた。減圧乾燥機で沈殿を乾燥させ、蒸留水12μｌに溶解させた。
【００７９】
（４）  ＤＮＡの標識化
上記プローブを25〜100ｎｇ／３μｌの濃度に調整し、３μｌのＤＮＡ溶液とBcaBESTTMキット（宝酒造）〔ランダムプライマー（９マー）、10×緩衝液、ｄＮＴＰ混液（0.2ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、BcaBESTTM ＤＮＡポリメラーゼ〕付属のランダムプライマー２μｌを混ぜて、95℃にて３分間、水浴中で熱変性させた。次いで、これを氷上で５分間冷却することによりアニーリングさせた。これに10×緩衝液2.5μｌ、ｄＮＴＰ混液2.5μｌ、蒸留水9.0μｌを加えた。混合し、遠心した後、［α−32Ｐ（3,000Ｃｉ／ｍｍｏｌ）］ｄＣＴＰを５μｌ加え、更にBcaBESTTM ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた。55℃にて10分間反応させた。スピンカラムで3,400ｒｐｍで２分間遠心し、未反応のｄＮＴＰを除去し、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰの取り込み効率をチェックした後、エッペンチューブのまま４℃にて保存した。
【００８０】
（５）  プレハイブリダイゼーション
サケ精子ＤＮＡを、95℃にて３分間熱変性させた後、氷上に５分間置いた。シャーレにハイブリダイゼーション緩衝液〔６×SSPE、５×Denharts 試薬、0.5％ＳＤＳ、〕〔20×SSPE：3.6Ｍ ＮａＣｌ、200ｍＭ リン酸二水素カリウム、20ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ7.4）；  50×Denharts 試薬：1.0％フィコール、1.0％ポリビニルピロリドン、1.0％ＢＳＡ〕を10ｍｌ入れ、１／100量の熱変性サケ精子ＤＮＡを加えた。気泡が入らないようにメンブランをシャーレに入れ、ビニールテープでシールした後、65℃にて３時間以上インキュベートした。
【００８１】
（６）  ハイブリダイゼーション
32Ｐ標識プローブＤＮＡを95℃にて３分間熱変性させた後、氷上に５分間放置して冷却させた。プレハイブリダイゼーションを終えたメンブランに32Ｐ標識プローブＤＮＡを加え、55℃にて６時間以上インキュベートした。
【００８２】
（７）  洗浄
ハイブリダイゼーション緩衝液を捨て、洗浄緩衝液〔６×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ〕30ｍｌで、42℃、20分間の洗浄を２回行った。サーベイメーターでメンブラン上の数カ所をカウントし、目的のバンドがある位置以外でカウントされないことを確認した。メンブランが乾燥しないうちにHybribagに入れて周囲をシールし、Molecular imager（BioRAD）スクリーンに露光させた。露光後、Molecular imager（BioRAD）で目的のバンドにハイブリダイゼーションが起こっていることを確認し、Ｘ線フィルム（Fujifilm: XR-1）に露光させ、フィルムを現像した。
【００８３】
（８）  結果
結果を図５に示す。形質転換系統であるα−２、α−３及びα−４系統のみで目的遺伝子のバンドが検出され、陰性対照である野生型のゲノムＤＮＡではバンドは検出されなかった。形質転換系統につき、４種の制限酵素で消化したゲノムＤＮＡについて、１〜３個のバンドが検出され、全ての制限酵素で単一バンドしか与えないような形質転換系統はなかった。このことは、これらの形質転換系統において、目的遺伝子が複数コピー導入されていることを示唆している。
【００８４】
５．３  形質転換イネにおける組換えタンパク質の発現解析
５．３．１  ＥＬＩＳＡ法による解析
（１）  タンパク質の抽出
カルス、根、葉については、組織300ｍｇに対して細胞溶解緩衝液1.0ｍｌを加えてホモジナイズした後、遠心分離し、上清をサンプルとして用いた。また種子（登熟期種子及び完熟種子）については、組織50ｍｇに対して細胞溶解緩衝液500μｌを加えて上記と同様に処理し、上清をサンプルとして用いた。また、上記で得られたカルスについても、液体倍法を行った後ヒトインターフェロンαタンパク質の発現につき更に調べた。
【００８５】
（２）  ＥＬＩＺＡ
ELIZA用96ウェルプレートに、１μｌ／ｍｌの濃度の非標識抗体を100μｌ／ウェルづつ入れ、37℃にて１時間インキュベートした。抗体を除いた後、水分を拭い、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳを350μｌ／ウェル加え、37℃にて１時間インキュベートした。ブロック液を捨てた後、水分を拭い、ＴＴＢＳで１回洗浄した。ウェルにインターフェロンの標準品と１％牛血清アルブミン含有ＢＰＳで希釈したサンプルを100μｌ／ウェル添加し、37℃にて１時間インキュベートした。サンプルを捨て、ＴＴＢＳで３回洗浄した。１μg／ｍｌのＨＲＰ標識抗インターフェロンα抗体を100μｌ／ウェル添加し、37℃にて１時間インキュベートした。二次抗体を捨てた後、ＴＴＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰの基質（ＴＭブルー）を50μｌ／ウェル加え、約５分間室温で発色させる。その後、0.1Ｎ硫酸を50μｌ／ウェル加えて反応を停止させた。450ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにより測定し、標準品について予め作成しておいた検量線からサンプル中の濃度を算出した。
【００８６】
（２）  結果
各組織についての結果を図６及び表２にまとめる。
【００８７】
形質転換個体におけるヒトインターフェロンαタンパク質量（ＥＬＩＺＡ）
【表２】
0003922869.tif 000003
【００８８】
結果は、イネ組織50ｍｇ中におけるヒトインターフェロンαタンパク質量として示されている。図及び表が示すように、カルス及び登熟期の種子おいて高い発現量が得られた。完熟種子においては僅かな発現しか認められなかったが、操作に用いた細胞溶解緩衝液がプロテインボディを溶解させる物質を含有していないことから、ヒトインターフェロンαが完熟種子のプロテインボディ中に集積されている可能性がある。免疫電子顕微鏡観察の所見は、種子中において、ヒトインターフェロンαタンパク質がPB-Iに集積していることを示唆している（データは示さず）。
【００８９】
液体培養したカルスについての結果を次の表３に示す。上記表との対より、液体培養によっても個体培地で培養したカルスとほぼ同定のヒトインターフェロンαタンパク質が産生されていることが分かる。
【００９０】
【表３】
0003922869.tif 000004
【００９１】
５．３．２  抗ウイルス活性分析
発現されたヒトインターフェロンαタンパク質の抗ウイルス活性を評価した。
（１）  方法
用いたタンパク質サンプルは、上記ＥＬＩＺＡと同様の手順で作成した。但しカルスは使用しなかった。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヒト白血球インターフェロンα標準品、及びＦＬ５−１細胞（ヒト羊膜由来細胞）を用い、50％ＣＰＥ減少法（色素取り込み法）により、通常の手順に従って操作を行った。
【００９２】
（２）  結果
結果を図４及び表４にまとめる。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
図及び表は、形質転換イネより抽出されたタンパク質が抗ウイルス活性を有していることを明らかにしている。また、抗ウイルス活性が、ＥＬＩＺＡにおいて確認されたヒトインターフェロンαタンパク質の発現量と相関していることは、この抗ウイルス活性が形質転換イネ中に発現されたヒトインターフェロンαによるものであることを示している。
【００９５】
６．Camellia sinensisへのヒトインターフェロンα遺伝子の導入
６．１  Camellia sinensisのカルス培養及び不定胚形成
Camellia sinensisの未熟種子を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃度１％）溶液で10分間滅菌した後、滅菌水で３回洗浄した。滅菌した未熟種子から子葉を切除し２分割して1.0ｍｇ／ｌのＢＡを添加した１／２ＭＳ培地に置床し、4,000ｌｕｘの蛍光灯下で16時間日長、25℃の条件で培養した。培養６週間後からカルス形成が認められた。得られたカルスは、同組成の培地に継代培養することにより維持できた。ホルモンフリーの１／２ＭＳ培地に移植することにより、カルスから不定胚を経由して幼植物体が得られた。
【００９６】
６．２  形質転換カルスの作出
大腸菌へのpNPI132の導入を、前記「２．１  大腸菌へのプラスミドの導入」と同様にして行い、前記「２．２  プラスミドの大量調製」と同様の手順によりプラスミドの大量調製を行った。プラスミドを前記「２．３  アグロバクテリウムへのプラスミドの導入」と同様にしてアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）へ導入した。次いで、上記で作成したCamellia sinensisの子葉由来カルスを超音波処理（38ｋＨｚ、５秒間）した後、pNPI132（日本製紙株式会社）を有するAgrobacterium tumefaciensと、前記「３．３  アグロバクテリウムの感染による遺伝子の導入」に準じて３日間共存培養を行った。共存培養終了の１ヶ月後にＧＵＳ活性について検討した。その結果、約30％のカルスにおいてＧＵＳ活性が認められた。pNPI132の構造については図１０を参照のこと。図において、Ｒｓは、組換え酵素が認識し作用するＤＮＡ配列、Ｒは、組換え酵素をコードする遺伝子、iptは、サイトカイニンの合成に関与するイソペンテニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｔはターミネーターを表す。
【００９７】
イネの場合の実験手順において行ったのと同様にして、Sna BIとSac IとでpNPI132を消化し、pNPI132中のＧＵＳ遺伝子の一部を残して除去し、代わりにインターフェロンをコードするＤＮＡをライゲートすることにより、インターフェロン遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡが得られる。これをイネの場合に行ったのと同様にして、大腸菌中で増幅し、これを用いてアグロバクテリウムを形質転換し、形質転換されたアグロバクテリウムをCamellia sinensisのカルスに感染させることにより、インターフェロン遺伝子を導入したCamellia sinensisを得ることができる。
【００９８】
７．チャへのヒトインターフェロンα遺伝子の導入
チャ（Thea）は、Camelliaと分類学上隣接した位置にあるため、チャについても上記Camellia sinensisについて行ったのと同様の手順により、ＧＵＳ遺伝子又はヒトインターフェロンα遺伝子を導入することが可能となる。例えば、チャの未熟種子を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃度１％）溶液滅菌し、滅菌水で洗浄し、子葉を切除し２分割して1.0ｍｇ／ｌのＢＡを添加した１／２ＭＳ培地に置床し、4,000ｌｕｘの蛍光灯下で16時間日長、25℃の条件で培養する。得られるカルスを上記と同様に超音波処理し、pNPI132（日本製紙株式会社）を有するAgrobacterium tumefaciensと共存培養を行うことにより、ＧＵＳ遺伝子を組み込んだチャを得ることが可能であろう。従ってまた、pNPI132中のＧＵＳ遺伝子の一部を残して除去し、代わりにインターフェロンをコードするＤＮＡをライゲートすれば、インターフェロン遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡが得られる。これをイネの場合に行ったのと同様にして、大腸菌中で増幅し、これを用いてアグロバクテリウムを形質転換し、形質転換されたアグロバクテリウムをチャのカルスに感染させればインターフェロン遺伝子を導入したチャが得られることが、合理的に推定される。
【００９９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pINT-RP10sGUSの調製プロセスを示す図。
【図２】  pIG121Hmの調製プロセスを示す図。
【図３】  pUC19へのヒトインターフェロンα遺伝子配列の組み込みを表す図。
【図４】  ヒトインターフェロンα遺伝子配列を組み込んだpUC19断片のpIG121Hmへの組み込みを表す図。
【図５】  構築されたpIG-A11の、ヒトインターフェロンα遺伝子配列を含んだ領域を表す図。
【図６】  形質転換植物における目的遺伝子の導入を示すＰＣＲによる増幅像。
【図７】  形質転換植物における目的遺伝子の導入を示すゲノミックサザン分析。
【図８】  形質転換植物組織中のヒトインターフェロンαタンパク質量を示すグラフ。
【図９】  形質転換植物組織中のタンパク質の抗ウイルス活性を示すグラフ。
【図１０】  pNPI132の構造を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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