(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２０００Ｌｆ／ｍｇＰＮ以上の比活性を有し、かつ２００Ｌｆ／ｍｌ以上のＬｆ含量を有する精製破傷風トキシンを０．０５〜０．２Ｍのリジンの存在下で０．２５〜０．５％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドとともに、６．５〜７．５のｐＨ、３７℃±２℃の温度で、約２８日間インキュベートし；および
（ｂ）生じたトキソイド化されたトキシンを、医薬的に受入れることができる担体または希釈剤とともに製剤化する、
ことからなる破傷風ワクチンの調製方法。
【請求項２】
破傷風トキシンが、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の培養物から精製された請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精製トキシンが、２０００〜３０００Ｌｆ／ｍｇＰＮの比活性を有し、かつ２５０〜５００Ｌｆ／ｍｌのＬｆ含量を有する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
精製トキシンが、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、そして／またはナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で定量したとき、８０％以上の純度を有する請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
精製トキシンが、リジンの存在しないときに、ホルムアルデヒドとともに３５〜４０℃において、２０〜４０分間プレインキュベートされる請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、破傷風ワクチンとして使用のための破傷風トキシンの調製のための工程に関する。
既存の破傷風ワクチンは、ホルムアルデヒドの添加によって不活性化された（“トキソイド化された”）Clostridium tetaniの７日間のフラスコ培養物から産生される。ホルムアルデヒドは、その水溶液であるホルマリンとして添加される。トキソイドは、ワクチンとして使用するために、塩析分画によって約１２００綿状凝集単位（Limes flocculationis；Ｌｆ）／ｍｇタンパク室の窒素（ＰＮ）の比活性まで精製され、これは、３０％〜４０％の純度に相当する。
免疫吸着剤（Hughesら、J．Appl．Bact３７，６０３−６２１，１９７４）を使用して、トキソイドを精製することにより、ワクチンの比活性を増加させる試みが行なわれた。しかし、これは、１６００Ｌｆ／ｍｇＰＮまでの限られた増加を示すという結果に止った。ＧＢ−Ａ−９６９７７２には、精製細菌のトキシン、特に精製ジフテリアトキシンから、水性媒体中該トキシンを、一級アミノ基、または２級アミノ基を含む分子量が２００以下の脂肪族ジアミンの不在下でホルムアルデヒドで処理することによってトキソイドを精製する一方法が開示されている。より好ましいジアミンは、リジンとエチレンジアミンである。
本発明者らは、破傷風トキソイドの調製のための新しい工程を考案した。トキシンをトキソイド化してから、そのトキソイドを精製する代りに、本発明者らはまずトキシンを精製してから、精製トキシンをトキソイド化した。しかし、驚くべきことには、これらの調製物の多くは不安定であることが見出され、ホルマリンの存在下で、３７℃で貯蔵されるとき、種々の程度に毒性を取戻すことが明らかになった。
次に、本発明者は、トキソイド化反応に対して異なる濃度においてアミノ酸を加えたり、また、ホルマリン濃度、ｐＨ、およびインキュベーション時間を変化させてみた。免疫原性が不良な調製物を生じた総結合力（ＴＣＲ）／Ｌｆ比の低下という犠牲を払わない限り、毒性への復帰をさけることは困難であった。特異的な条件下においてのみ安定で高度に免疫原性の調製物を得ることができる。
したがって、本発明は、その工程が、精製破傷風トキシンを０．２〜１％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドと共に、０．００５〜０．２５Ｍのリジンの存在下で２４〜３２日間、ｐＨ、６．０〜８．０、３０〜４５℃の温度でインキュベートすることからなる破傷風トキソイドの調製のための工程を提供する。
破傷風のトキシンは典型的にはclostridium tetaniの培養物から得られる。Cl.tataniのどんな適切な菌株も使用することができる。トキシンは最初にブロスを遠心分離し、次に培養の上清を、例えば、２段階の濾過によって透明にすることによって発酵ブロスから精製することができる。透明にした上清を濃縮することができ、次に、上清はダイアフィルトレーションを行って小さい荷電分子を除き、次にイオン交換クロマトグラフィーにかけることができる。
精製したトキシンは、Ｌｆ／ｍｌ含量が２５０Ｌｆ／ｍｌ以上、例えば２５０から５００Ｌｆ／ｍｌであることが望ましい。Ｌｆ含量が２５０Ｌｆ／ｍｌ未満であるならば、トキシンの収率をあげるために、さらなる濃縮工程によって再調製することができる。
該トキシンの比活性は、精製試料のタンパク質窒素含量（ＰＮ）を推定し、ＰＮに対するＬｆ比を計算することによって定量することができる。典型的には、精製トキシンは、例えば２０００から３０００Ｌｆ／ｍｇＰＮ、または２０００から２８００Ｌｆ／ｍｇＰＮの２０００Ｌｆ／ｍｇ以上のＰＮ対Ｌｆ比を有している。該トキシンの比活性が２０００Ｌｆ／ｍｇＰＮ未満あるならば、精製試料は、イオン交換カラムを通して再精製することができる。２０００Ｌｆ／ｍｇの比活性は約７０％の純度に相当し、１００％の純度のトキシンは、３０００から３２００Ｌｆ／ｍｇＰＮの比活性を有することが報告されている。
トキシンの純度は、代替的に、または付加的に、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析、そして／または、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価することができる。
より好ましくは、純度はＨＰＬＣによって決定される。その場合、溶出ピークが積分され、トキシン関連ピークが、総積分面積の百分率として表現されるトキシン関連ピークによって純度が評価される。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によってトキシン分子は、その構成要素である重鎖（１００ＫＤ）と軽鎖（５０ＫＤ）に分離される。２つの該バンドは、染色後に同定することができ、そして密度測定によって定量された両者の和の強度が総バンドの百分率として表現される。
ＨＰＬＣ分析、そして／または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、トキシンが７０％未満の純度であることが判明したならば、その試料は、純度を上げるためにイオン交換カラムを通して再精製することができる。したがって、ＨＰＬＣ、そして／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたように、トキシンは例えば７０％から１００％の純度であることがより好ましい。トキシンは、８０％以上、または９０％以上の純度であることがある。
精製した破傷風トキシンは、０．００５〜０．２５Ｍのリジンの存在下で、０．２〜１％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドによってトキソイド化される。精製トキシンの溶液のｐＨを、６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５に調整するために、ナトリウムボロコハク酸塩のようなバッファーを加えるのが典型的である。溶液中の精製トキシンの濃度は、典型的には１５０〜３００Ｌｆ／ｍｌ、より好ましくは約２００Ｌｆ／ｍｌに調整される。
典型的には、精製トキシンは、まずリジンの存在しないときに、ホルムアルデヒドとともにプレインキュベートされる。したがって、精製トキシンは、ホルムアルデヒドと、３０〜４５℃で１０分から２時間、あらかじめプレインキュベートされることがある。プレインキュベーションは、好ましくは、例えば約３０分のように２０〜４０分間行われる。プレインキュベーションの温度は、より好ましくは、例えば約３７℃のように、３５〜４０℃である。
次に、リジンを加える。リジンは、典型的には、Ｌ−リジンモノハイドロクロライドのようなＬ−リジンである。ナトリウムバイカーボネートバッファーのようなバッファーがｐＨを調製するために加えられることがある。精製トキシンのホルムアルデヒドとリジンとのインキュベーションは、約２８日間行われる。インキュベーションの温度は、より好ましくは、例えば約３７℃のような３５〜４０℃である。ホルムアルデヒドの濃度は、好ましくは、０．２５〜０．５％（Ｖ／Ｖ）である。リジンの濃度は、好ましくは、０．０５〜０．２Ｍである。適当な条件は：
−０．２５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドと０．０５〜０．１ＭＬ−リジンとの組合せ、および、
−０．５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドと０．１〜０．２ＭＬ−リジンとの組合せである。
次に、生じたトキソイドを精製することができる。残余のホルムアルデヒドリジンは除去する。該トキソイドを、限外濾過によって濃縮することができ、ダイアフィルターして残余のホルムアルデヒド、及びリジンを取除き、膜濾過によって除菌することができ、該トキソイドのＰＮに対するＬｆの比は、例えば２０００〜３０００Ｌｆ／ｍｇＰＮ、または２０００〜２８００Ｌｆ／ｍｇＰＮのように２０００Ｌｆ／ｍｇ以上であることが望ましい。また、該トキソイドは、ＨＰＬＣ、そして／または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたとき、例えば、７０％〜１００％のような７０％以上の純度であることが望ましい。したがって、ＨＰＬＣ、そして／または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたとき、該トキソイドは８０％以上、または９０％以上の純度であると考えられる。もしＰＮに対するＬｆの比が２０００Ｌｆ／ｍｇ未満であるかそして／またはＨＰＬＣ、そして／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されるとき、７０％未満の純度であるならば、該トキソイドはイオン交換カラムを通して再精製することができる。
したがって、本発明に記載の破傷風トキソイドは、３７℃で３か月以上、より好ましくは６か月までの間貯蔵したとき、トキシンに戻らず、例えば２４００〜２７００ＬＦ／ｍｇＰＮのような２０００〜２８００Ｌｆ／ｍｇＰＮの比活性を有し、例えば２００〜２５０ＩＵ／３．５Ｌｆのような１３０〜２７０国際（ＩＵ）／３．５Ｌｆの力価を有している。
その結果得られたトキソイドは、毒性へ復帰せず既存のワクチンよりも免疫原性が高い。したがって、トキソイドは、ワクチン組成物を形成するために、医学的に受入れることができる担体、または希釈剤で製剤することができる。該トキソイドは、生理的食塩水のような生理的に受入れることができる溶剤を混合することができる。代替法として、血液と等張性の生理的食塩水か、または別の適切な溶液中の適切な担体上に沈着させるか、それによって吸着させることができる。このうような製剤は、使用前には、２〜８℃に一般的に貯蔵することができる。Thiomersalが、該ワクチン製剤中に存在することができる。該トキソイドは、ジフテリア−破傷風ワクチン、またはジフテリア−破傷風−百日咳の組合せワクチンのような多成分ワクチンの一部となることができる。
したがって、ヒトは本破傷風トキソイドの効果的な量の投与によって破傷風に対して免疫感作することができる。典型的には、投与は、筋肉内、または皮下注射によって達成される。いずれの場合にも、投与を受けたトキソイドの開始用量は３Ｌｆ〜１０Ｌｆであると考えられる。この用量は、２か月の間隔で２回まで繰返される。５年か１０年後に３Ｌｆ〜１０Ｌｆの増強用量が与えられることがある。
以下の例は、本発明を分り易く説明する。
参照例、および比較例も提供されている。
参照例：精製破傷風トキシンの調製
Cl. tetani（Mueller とMiller J. Immonol５０；３７７−３８４，１９４５）のHarvard株の継代培養物であるCl. tetani（Cl. tetani株ＣＮ３９１１を改変Meullerの培地（Lathamら、Appl. Microbiol.１０，１４６，１９６２）中で培養した。さらに具体的には、１０％（Ｖ／Ｖ）Ｎの４８時間種培養物を用いてMuellerの改変培地を含む静置びん、または調節された発酵槽に接種した。静止培養の場合には、接種の前にアルミニウムの粉を培地に加えた。１５ｌの発酵槽は、５０ｒｐｍで拡拌し、培養の表面に沿って０．２ＵＭのフィルターを濾過した空気を５００ｍｌ／分の速度で送風した。静置びん、または発酵槽中での発酵は、３３±２℃において４〜７日間続行した。
発酵ブロスは×３０００ｇにおいて４０分間バッチ式遠心分離（６×１ｌのローター）によって分離された。上清は、さらに１．２／０．８μｍ組み合せフィルターに続いて０．２μＭの除菌用フィルターを通して２段階の濾過を行って透明化した。
次に、培養上清を３０Ｋカットオフ限外濾過膜を使用して１０倍に濃縮し、同じ膜を使用し、１０倍量のバッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２５ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２Ｍエチレンジアミンテトラアセティックアシッド（ＥＤＴＡ）ｐＨ７．５］を使用して徹底的にダイアフィルターした。この結果、ＨＰＬＣによって定量したところによると、純度において１８倍の増加を生じた。この工程からの平均回収率は８０％であることが判明した。
濾過した試料は、陰イオン交換カラムに適用した［ＤＥＡＥ  Sepharose Fast Flow］。該カラムをｐＨ７．５の２０ｍＭトリスバッファーで洗浄した。破傷風トキシンは、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、トリスバッファーｐＨ７．５で溶出した。溶出した資料は、０．２μｍの除菌用フィルターを通して除菌濾過した。このようにして精製した物質を以下の試験にかけた。
（ｉ）Ｌｆ含量の推定
本試験は、精製されたトキシン試料のトキシンの収量をモニターした。約５ｍｌの精製トキシンを試験のために採取した。試料は、試験の前に貯蔵しなかった。定量はRamon, G,（１９９２）Sur une technique de titrage in vitro due serum anti-diphtherique. C. P. Soc. Biol.(Paris)  ８６，７１１−７１２において記載された手順によって行なわれた。精製物質のＬｆ含量は２５０−５００Ｌｆ／ｍｌであった。
（ii）タンパク質窒素に対するＬＦの比の推定
本試験は、精製した試料の純度を定量した。精製した物質の１ｍｌ以上が試験のために使用された。直ちに試験が行われないならば、試料は、５℃±３℃に貯蔵された。タンパク質の窒素（ＰＮ）の含量は、トリクロロ酢酸で沈澱させた後、ケルダールの消化技術（Kgeldahl J.（１８８８）C. R. Carlsberg Labor. (Copenhagen) ２，１−１２）を使用して推定された。Ｌｆ：ＰＮ比は２０００−３０００Ｌｆ／ｍｇであった。
（iii）サイズ排除によるＨＰＬＣプロファイルの定量
本試験により、精製トキシンのＨＰＬＣプロファイルは、受入れ限界内であることが保証された。１ｍｌ以上の精製試料が試験のために採取された。試料は、試験を行うまで＋４℃で貯蔵された。精製されたトキシンの試料は、ＨＰＬＣゲル濾過カラム（ＳＴＫＧ３０００ＳＷ×１）に適用された。試料中の成分の分離は、２．８０ｎｍにおいてモニターされ、ピーク領域が積分された。ＨＰＬＣの結果は：
−ピーク１（保持時間１０．６−１０．７分）−トキシンモノマー；
−ピーク２（保持時間１２．４−１２．５分）−トキシンフラグメントＣ；および
−ピーク３（保持時間＞１４分）−汚染物質
ピーク１と２の結合積分面積は、ピーク１から３までの総積分面積の７０〜１００％であった。
（iv）ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルの定量
本試験によって、精製トキシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルが受け入れることができる限界内であることが保証された。精製試料の０．５ｍｌ以上を試験のために採取した。試料は、試験を行うまで＋４℃で貯蔵された。試料は、メルカプトエタノールを使用して還元した後に、Laemili （Nature,２２７，６８０−６８５，１９７０）によって記載された方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。ゲルは密度計と積分したピーク面積によって走査した。トキシンの重鎖（１００ＫＤ）と軽鎖（５０ＫＤ）バンドは、密度計測によって検出された積分面積から計算し、クーマシーブルーで染色した全バンドの７０〜１００％をなしていた。
例：精製破傷風トキシンのトキソイド生成
参照例からの精製破傷風トキシンを最終トキシンの濃度が２００Ｌｆ／ｍｌになるのに十分量のナトリウムボロコハク酸（ＳＢＳＡ）バッファーｐＨ７．５で希釈した。部分量が以下の如くトキソイド化された。
１．０．２５％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドを１つの部分量にフォルマリンの形で加え、混合物を３７℃で３０分間プレインキュベートした。次いでＬ−リジンモノハイドロクロライドを０．１Ｍナトリウムバイカーボネートの存在下で最終濃度０．０５−０．１Ｍになるまで加えた。反応混合物のｐＨは６．５から７．５であった。そして、トキソイド化反応を３７℃±２℃で２８日間進行させた。２．０．５％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドをホルマリンの形で別の部分量に加え、混合物を３７℃で３０分間プレインキュベートした。次に、Ｌ−リジンモノハイドロクロライドを、０．１Ｍのナトリウムバイカーボネートの存在下で最終濃度０．１〜０．２Ｍまで加えた。反応の混合物のｐＨは、６．５〜７．５であった。そして、トキソイド化を３７℃±２℃において２８日間進行させた。
インキュベートした試料のＬｆ含量を、参照例に記載の如くに試験した。インキュベートした試料を、３０Ｋカットオフ限界濾過膜を使用した限外濾過によって濃縮した。濃縮物を、残余のホルムアルデヒドとリジンを除くために、同じ３０Ｋ膜を使用して、ＳＢＳＡバッファーｐＨ７．５に対してダイアフィルターした。Thiomersal（ethyl mercurithiosalicylic acid，ナトリウム塩）を最終濃度０．１ｇ／ｌ（２．５×１０-4ｍｏｌ／ｌ）thiomersalになるまで加えた。得られた溶液を、膜濾過によって除菌（０．２μｍ膜）した。試料を採取し、以下の如く試験を行った。
（ｉ）タンパク質窒素含量の推定
本試験は、参照例中に記載されたように行われた。結果は、２０００−２８００Ｌｆ／ｍｇＰＮであった。
（ii）総結合力（ＴＣＰ）の推定
本試験は、破傷風トキソイドの抗原含量を定量した。ＴＣＰは、破傷風の分野においてよく使用される用語である。そして、ＷＨＯマニュアル（１１，Appendix  Ｔ．１０）に引用さてている。ＴＣＰは、トキソイドを希釈し、１国際単位（ＷＨＯ  ＢＬＧ／ＵＮＤＰ／７７．１  Ｒｅｖ．１）に等価になったときのトキソイドの容量の逆数として定義される。トキソイドの質は、Ｌｆ単位に対するＴＣＰ（結合単位）の比を求めることによって測定することができ、それは、１より大きいはずである。
５．０ｍｌ以上のトキソイドが、試験のめに採取された。その試料は、直ちに試験されないときは、５℃±３℃で貯蔵された。補正された幾何学的数列を形成する０．０１〜０．０３μｌの適当な範囲の容量の試験物質と参照破傷風トキソイド８７国際単位（ＩＵ）／ｍｌは、一連の試験管に分注された。参照破傷風アンチトキシン溶液の２ＩＵ／０．５ｍｌの一定量が各試験管に加えられ、室温で６０分間保たれた。
各チューブに、アンチトキシン用量の１倍半に等価である破傷風テストトキシンの用量を加え、３０分間放置した。各チューブの内容物を、それぞれ、体重が１８−２２ｇのマウスに皮下注射した。マウスは、４日間破傷風の典型的な麻痺のサインについて観察された。
もし、特異的な破傷風の麻痺が３日以内に起ったならば、試験試料は、加えたアンチトキシンの用量の１．５倍以上のアンチトキシンに等価な用量を含んでいた。もしマウスが３日以上の間破傷風に特異的な麻痺なしで生存したならば、該試験は、加えたアンチトキシンの用量の１倍半未満と等価な破傷風トキソイドを含んでいた。３日目における破傷風固有の麻痺の発現は、加えたアンチトキシンの１倍半の量に等価な破傷風のトキソイドの量が正確に採取されたことを示唆している。
結果は、平均値の２０％以上異ならない限り、２つの試験の平均値として容認された。結果は２００−３５０Ｕ／ｍｌであった。
（iii）Ｌｆ含量の推定
Ｌｆ含量は、参照例に記載の如く定量された。その結果は、１５０−２５０Ｌｆ／ｍｌであった。
（iv）ＨＰＬＣプロファイルの定量
ＨＰＬＣプロファイルは、参照例において記述された如く定量された。結果は、７０〜１００％の純度であった。
（ｖ）復帰についての試験
本試験は、貯蔵または使用中にトキソイドからトキシンへの復帰を全く起きないことを示し、ＷＨＯ  Technical Report Series ＮＯ．７２５，ｐ．６７の要求事項を満していることが証明された。１０ｍｌのジアファイルターしたトキソイド試料を採取し、上述のようにＬＦ含量が推定されるまで５±３℃において貯蔵した。該試料を１６Ｌｆ／ｍｌに希釈した。希釈した試料は、３７℃で保持された。６週間、２か月、および３か月の貯蔵後に、試料を無毒性について試験した。５ｍｌの試料を２匹の健康なモルモットの各々に対して皮下に接種した。モルモットを、死と固有の麻痺の徴候について１４日間観察した。トキシンへの復帰の証拠はなかった。
（iv）電気泳動移動度によるトキソイドの特徴づけ
本試験は、トキソイド化した試料の力価を予告した。０．５ｍｌのディアフィルターされたトキソイドの試料を、試験のために採取した。試料は、直ちに試験されない場合は、５±３℃において貯蔵された。ガラスのプレートを、ｐＨ８．６の６０ｍＭトリスバッファー中の１％（Ｖ／Ｖ）アガロースで覆った（０．１８ｍｌ／ｃｍ2）。試料（５μｌ）を、一次元で、２０ボルト／ｃｍで６０分間電気泳動を行った。ウマ−抗−破傷風血清を含む（０．０６％Ｖ／Ｖ）アガロース中に、２番目の次元の電気泳動を、６ボルト／ｃｍで１６時間行った。
ゲルを、クーマシーブルーで染色し、トキソイドピークの原点からの移動度を測定した。参照トキソイド（１４ｍｍ）の結果を含めて、結果は５−３０ｍｍであった。
（vii）力価に対する試験
本試験は、英国薬局方（１９８０）、II巻、ｐ８８０，Ｐｈ．Ｅｕｒ．，III巻に対する補遺（１９７７），ｐ１７５とＷＨＯ  Technical Report Series Ｎｏ.６３８，ｐ．９０，Section Ａ．３，５，６の要求事項を満足していた。力価は、トキソイド試料をアジュバンド上（アルミニウムヒドロキシド，Alhydrogel）に吸着させることによって調製したワクチンでの免疫感作に対する応答から決定された。
最終バルク吸着ワクチンのトランジットの容器からの試料が、試験のために使用された。試料は、即座に試験されなければ、５℃±３℃で貯蔵された。試料は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．ＶｏｌIII（１９７７）に対する補遺、ｐ．１７５に記載の方法によって試験された。力価は、ホルムアルデヒドでトキソイド化し、次にトキソイドを精製することによって調製された現行ワクチンの７０〜１１０Ｉｕ／７Ｌｆの力価よりも有意に高い１３０〜２７０Ｉｕ／３．５Ｌｆと定量された。
（viii）特異的毒性のための試験
本試験は、英国薬局方（１９８８）、ＶｏｌII、ｐ．１０６２；Ｐｈ．Ｅｕｒ．，１９８５，ｐ．４５２、およびＷＨＯ  Technical Report Series Ｎｏ.６３８，ｐ．９０，Section Ａ．３，５，５の要求事項に基づいている。試験は、破傷風トキソイドのためと考えられる検出できる毒性が存在しないことを確認した。１２．５ｍｌ以上のトキソイド試料が、試験のために採取された。直ちに試験をしない場合には、試料は５℃±３℃で貯蔵した。方法は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．，１９８５，ｐ．４５２に記述された方法に基づいていた。少くとも５００Ｌｆ単位の破傷風トキソイドを含む１ｍｌの希釈液を、それぞれ、体重が、２５０ｇ〜３５０ｇの５匹の健常なモルモットの各々に皮下注射した。動物を、特異的毒性、または麻痺の徴候について２１日間観察した。破傷風のトキソイドのためと考えられる毒性の証拠はなかった。
比較例１：リジンの不在下におけるトキソイド形成
参照例の精製破傷風トキシンを、ホルマリン単独添加によってトキソイド化した。０．２５〜１．０％のホルムアルデヒドをホルマリンの形で、２００Ｌｆ／ｍｌにおけるトキシンと共に、３７℃±２℃で１４日間インキュベートした。したがって、リジンを添加しなかった。
その結果得られたトキソイドを、例に記載の如く、復帰について試験した。トキソイドは、毒性に復帰した。復帰したトキシンは古典的な破傷風を誘発することは希であったが、異なる神経症候群を生じた。
比較例２：異なる条件下でのリジンの存在におけるトキソイド形成
参照例の破傷風トキシンを以下のようにトキソイド化した：
（ｉ）対照例の破傷風トキシンを最終トキシン濃度が、２００Ｌｆ／ｍｌになるように、十分量のｐＨ７．５のＳＢＳＡバッファーで希釈した。０．１〜１．０％のホルムアルデヒドを、ホルマリンの形で部分量に加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、Ｌ−リジンモノハイドロクロライドを、０．１Ｍナトリウムバイカーボネートの存在下で最終濃度が０．００５〜０．１Ｍになるまで加えた。反応混合物のｐＨは、６．５〜７．５であった。そして、トキソイド形成を、３７℃で１４日間進行させた。
（ii）トキソイド形成反応のｐＨを６．０から８．５に変更したことを除き（ｉ）のように行った。
（iii）リジンの代りに、アルギニン（０．０５〜０．１Ｍ）が使用されたことを除き、（ｉ）のように行った。
（iv）インキュベーション期間を１４日間から２１日間まで増加させたことを除き、（ｉ）のように行った。
（ｖ）プレインキュベーションの期間を設けなかったことを除き、（ｉ）のように行った。
得られたトキソイドは、すべて、例に記載の如く復帰について試験した。トキソイドはすべて毒性へ復帰した。