(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質；
（１）分子量が90〜150kDaである；
（２）セルロースアセテート膜を用いた電気泳動でほぼ単一、PAS染色陽性、フェノール硫酸法による呈色反応陽性を示す多糖類である；
（３）アセチルコリンエステラーゼ誘導活性を有する；
ことを特徴とする巨核球成熟作用を示す物質。
【請求項２】
ミクロバクテリウム（Microbacterium）属A173株（FERM P-18238）を培養し、該培養物から採取される請求項１記載の巨核球成熟作用物質。
【請求項３】
ミクロバクテリウム（Microbacterium）属A173株（FERM P-18238）を培養し、該培養物から巨核球成熟作用物質を採取することを特徴とする巨核球成熟作用物質の製造方法。
【請求項４】
ミクロバクテリウム属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物A173株（FERM P-18238）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、巨核球成熟作用物質、該物質産生微生物及び該物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液細胞のひとつである血小板は生体の止血、血栓形成に重要な役割をもっているが、血小板自身は増殖することができない。そのため、血小板が止血のために利用された場合、或いは体内で一定の寿命を経て崩壊する際に、絶えず供給されていなければ血小板減少をきたす。血小板を含む様々な血液細胞は、血液幹細胞から特異的な分化因子の作用により、分化、増殖して産生されることが知られている。血小板は血液幹細胞から分化して、巨核球系前駆細胞、前巨核芽球、巨核芽球、前巨核球を経て成熟巨核球となり、やがて断烈して形成される。巨核芽球以後、 endmitosis(核分裂はするが細胞分裂しない)により大型で多核な成熟巨核球となり、更に、巨核球の胞体内に細胞膜がくびれこむことにより血小板分離膜が形成され、やがて胞体の一部が分離し血小板が産生される等の機構が考えられているが、まだ詳細には解明されていない。
【０００３】
巨核球造血系の場として、ストロマ細胞が重要な役割を果たしていることが報告されている。ストロマ細胞は、繊維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、マクロファージなどからなり、サイトカインを産生し血液細胞の産生を制御している。骨髄細胞を培養すると巨核球系前駆細胞により巨核球コロニーが形成されるが、この巨核球コロニー法を用いた巨核球系前駆細胞から巨核芽球までの分化には、巨核球コロニー刺激因子(Meg‐CSF)と呼ばれるIL-3とGM-CSFが必要である。また、その後の巨核球系細胞の成熟、すなわち、巨核球のサイズ、ploidy(核DNA量)、齧歯類では酵素活性(アセチルコリンエステラーゼ活性)などを増加させる巨核球増幅因子(Meg‐POT)と呼ばれるEP0、IL-3、IL-6、IL-11、LIFが必要であることが明らかにされた。
【０００４】
しかし、これらのサイトカインには血小板産生を刺激する以外に多彩な作用があること、また、血小板減少時に増加するという生理的な血小板産生調節因子としての性質に欠けていることから、かねてより概念として巨核球造血系に特異的な造血因子トロンボポエチン(TP0)の存在が考えられていた。近年、TP0がc-mplリガンドとしてクローニングされ、その実体が明らかになった。TP0は巨核球系前駆細胞増加作用と前駆細胞の巨核球への分化、成熟、さらに血小板形成に至るまでの広範な血小板産生に作用し、マウスへ投与すると血小板値が増加することが報告されている。TP0は、癌化学療法時の骨髄抑制によって起こる血小板減少や、重症の感染症によって起こる血小板減少に対する医薬品として期待されているが、ヒトへ投与した際に抗体の産生が起こることが報告されており、未だ臨床での応用には到っていない。
従って、巨核球分化に作用する新規な制御物質の探索、解明が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な巨核球成熟作用物質、該物質産生微生物及び該物質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、マウス骨髄細胞のアセチルコリンエステラ―ゼ誘導活性を指標として天然物中より巨核球造血系に作用する物質を検索し、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物が巨核球成熟作用物質を産生することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の性質；（１）分子量が約90?150kDaである；（２）セルロースアセテート膜を用いた電気泳動でほぼ単一、PAS染色陽性、フェノール硫酸法による呈色反応陽性を示す多糖類である；（３）アセチルコリンエステラーゼ誘導活性を有する；ことを特徴とする巨核球成熟作用を示す物質である。
また、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物を培養し、該培養物から採取される巨核球成熟作用物質である。
さらに、ミクロバクテリウム属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物を培養し、該培養物から巨核球成熟作用物質を採取することを特徴とする巨核球成熟作用物質の製造方法である。
また、ミクロバクテリウム属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物A173株（FERM P-18238）である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の巨核球成熟作用物質、該物質産生微生物及び該物質の製造方法についてさらに詳細に説明する。
本発明に使用される微生物は、ミクロバクテリウム属に属し、巨核球成熟作用物質を産生するものであればいずれでもよいが、その代表的な菌株として微生物A173株があげられる。微生物A173株は以下のようにして得た。すなわち、茨城県つくば市周辺において採取した土壌サンプルを無菌水に懸濁した後、上澄液をエマーソン培地に塗布し、30℃に静置し、２〜７日後に生育する菌を分離した。分離された菌株について、マウス骨髄細胞のアセチルコリンエステラーゼ誘導活性を指標として、巨核球成熟作用を有する培養物を生産する菌株を検索した結果、微生物A173株を得た。
【０００９】
微生物A173株は、形態観察、生理的性状試験、菌体成分の分析及び菌体内DNAのGC含量の測定による同定を行った結果、表１に示す菌学的性質を有していた。1) Sneath,P.H.A., Mair,N.S., Sharpe,M.E. and Holt,I.G.: "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"  Vol.2 (1986) Williams & Wilkins、 2) Holt,I.G., Krieg,   N.R., Sneath, P.H.A., Staley,J.T. and Williams,S.T.: "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" Ninth Edition (1994) Williams & Wilkins、  3) Yokota A., Takeuchi M. Sakane T. and Weiss N.: Int.J.Syst.Bacteriol., 43,    555‐564(1993)、4) Takeuchi M. and Hatano K.: Int.  J.Syst.Bacteriol., 48, 739-747(1998)、5) Takeuchi,M. and Hatano  K.: Int.J.Syst.Bacteriol., 48, 973-982(1998)、6) 薮内栄子他: "新しい分類学に伴走する細菌同定法" (1987)菜根出版、7) 駒形和男編: "微生物の化学分類実験法" (1982) 学会出版センターの文献に基づき検討した結果、本微生物A173株はミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する細菌であると同定されたが、前記文献の1)〜4)に記載されているいずれの菌種とも性状が一致せず、新種であると判断した。ミクロバクテリウム属菌は多形性を示す無芽胞のグラム陽性桿菌で、乳製品、汚水、昆虫などからの分離例が報告されている。なお、本微生物A173株は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに（FERM P-18238）として寄託されている。
【００１０】
【表１】
0004002963.tif 000002
【００１１】
本発明で利用できる、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物の培地栄養源および培養条件は以下のとおりである。微生物を培養する培地としては、本微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物があげられる。さらに、培地構成成分として、酵母エキス、ペプトン等の有機窒素源、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源、塩化ナトリウム、リン酸マグネシウム等の無機塩類、また、必要に応じてビタミン、抗生物質等を添加することができる。培養は液体培養が好ましく、通常、攪拌を伴う好気的条件において３日間培養する。培地のpHは無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いてpH7.4に調整するのが好ましく、培養温度は28〜30℃が好ましい。
【００１２】
本発明の微生物を培養することによって、培養物から巨核球成熟作用物質を採取することができる。「培養物」とは、培養液の他、培養菌体自体、または培養菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。採取方法は特に限定されないが、培養後、巨核球成熟作用物質が菌体内に生産される場合には菌体を破砕処理するなどして目的の物質を採取する。また、本発明の物質が菌体外に生産される場合には、培養液を使用する。さらに、必要に応じてゲル濾過、各種クロマトグラフィー等により単離精製することができる。例えば、本発明の巨核球成熟作用物質は、培養終了後、培養液に遠心分離等の分離手段を施して菌体を除去し、その後培養上清から、マウス骨髄細胞アセチルコリンエステラーゼ誘導活性を指標として、Amberite XAD-2、Diaion WA30を用いてバッチ法で分画した後、Ce11ulofine GC700カラムクロマトグラフィーにより分離することによって得られ、さらにQ‐Sepharoseカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００１３】
上記のようにして得られる本発明の巨核球成熟作用物質は、分子量90〜150kDa、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動でほぼ単一、PAS染色陽性であり、フェノール硫酸法による呈色反応陽性の性質を示す多糖類であり、アセチルコリンエステラーゼ誘導活性を有することを特徴とする巨核球成熟作用物質である。
【００１４】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例1](微生物A173株培養液の調製)
微生物A173株の大量培養はグルコース1.5%、肉エキス0.5%、酵母エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、塩化ナトリウム0.5%、の組成でpH7.4に調製した液体培地を用いて行った。斜面培地で保存したA173株を8mlの液体培地を含む試験管で、30℃、3日間振盪培養した。次に、菌体を含む培養液8mlを100mlの液体培地を含む500ml三角フラスコに移し、30℃で３日間、振盪培養した。さらに、この菌体を含む培養液100mlを1000mlの液体培地を含む5000ml三角フラスコに移し、30℃で３日間、ロータリーシェーカーで培養した。培養液はl2,000回転、l5分間の遠心分離を行うことによって菌体を除去し、A173株の培養液10Lを得た。
【００１５】
[実施例2](微生物A173株培養液からの巨核球成熟作用物質の精製)  微生物A173株の培養液10Lを、あらかじめ水で洗浄した吸着剤Amberlite XAD-2 3000mlに添加し、活性のある素通り画分を回収した。さらにこれにDiaion WA30を添加し、1.5M NaC1で溶出される活性画分について Ce11ulofine GC700によるゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行って３つに分画し、さらに再度Ce11ulofine GC700によるゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行った。その結果を図１に示す。図１の結果に基づき、溶出画分を(B-1)フラクション62-68、(B-2)フラクション69‐90、(B-3)フラクション91-105の３画分に分けた。その結果、(B-2)を主要な活性画分とした。さらに、分子量マ―カーによる検量線から活性物質の分子量は90〜150kDaであることが推察された。
【００１６】
活性画分(B-2)45mlをQ‐Sepharoseカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分画した。各フラクションの280nmの吸光度を測定し活性測定をした結果を図２に示す。その結果、溶出曲線と活性のピークがほぼ一致したため、フラクション103-109の付近に精製された活性物質が存在することが示唆された。
そこで、SDS-PAGE及び続くCBB染色によってタンパク質の検出を行ったが、タンパク質は検出されなかった。
一方、フェノール硫酸法により、溶出曲線とほぼ一致するグルコース換算の総糖量が検出された。また、フラクション106、107について、SDS-PAGE及び続くPAS染色を行ったところ、糖質由来とみられるスメアなバンドを確認した。さらに、酢酸セルロース膜電気泳動法によりフラクション106を分離し、トルイジンブルーにより染色したところ、ほぼ単一のバンドが認められた。その結果を図３に示す。
以上のことから本活性物質は多糖類であることが示唆された。
【００１７】
[実施例3](マウス骨髄細胞を用いたアセチルコリンエステラーゼ誘導活性の測定)5〜10週齢のオスICRマウス(日本クレア)大腿骨より採取した骨髄細胞を10%FCS含有RPMI培地(SIGMA)に懸濁し、室温で20分間、DFP (diisopropylfluorophosphate)（和光純薬)処理した。次に、0.1% BSA （SIGMA)含有RPMI 1640 (SIGMA)培地で3回洗浄し、2×106 cells/mlとなるよう0.1% BSA、1% Nutridoma NS （Boehringer Mannheim)含有RPMI培地に細胞を懸濁した。調整した細胞懸濁液を96we11平底プレート(Costar)に１we11当たり100μl播種した。さらに、濾過滅菌済みの被験液を50μl添加し、37℃、5% C02存在下で７日間培養した。
培養終了後、培養上清を除去し、0.2% TritonX-100、0.12M NaC1 50mMを含有するHEPES Buffer(pH7.6)180μl及び5.6mM Acetylthiocholine iodide (SIGMA)20μlを添加し、室温で３〜４時間静置した。得られた細胞溶解液を20μl取り、新たなプレートへ移し、0.6mM CPM (7-diethylamino-3-4-(maleimidylpheny1)‐4-methylcoumarin)(SIGMA)アセトニトリル溶液を20μl及び0.2% TritonX‐100、1mM EDTA含有50mM Acetate Buffer (pH5.0) l60μlを添加し、さらに、１時間室温に静置した後、マイクロプレートリーダーを用いて励起波長355nm、蛍光波長460nmで蛍光測定を行った。その結果、無処置では蛍光強度51.3±8.7であったのに対し、巨核球成熟作用物質を0.55μg/ml添加した場合は106.6±16.6と増幅し、1.12μg/ml添加した場合には114.3±9.2と増幅した。
また、巨核球成熟作用物質とマウス骨髄細胞へ添加し培養すると、アサチルコリンエステラーゼ誘導活性が増幅すると同時に、大型の成熟巨核球様細胞が多数認められた。その結果を図４に示した。
【００１８】
[実施例4](巨核球コロニー形成作用)
５〜10週齢のオスC57BL/6Nマウス(日本クレア)大腿骨より取り出した骨髄細胞を5×10-5mol/Lの2-メルカプトエタノールを含有するMccoy's 5A培地(GIBC0)に懸濁し、ピペッティングにより単細胞浮遊液にし、5×l05ce11s/mlとなるよう20% HS(GIBC0)、0.3% アガロース、 5×105mol/L 2-メルカプトエタノール、Meg-POT活性測定時のみ1ng/ml IL-3(Genzyme)、所定濃度の被験液を含有するMccoy's 5A培地に懸濁した。また、陽性対照として、Meg-CSF活性測定時 には5% PWM-SCMを、Meg-P0T活性測定時には10ng/ml IL-6 (Genzyme)をそれぞれ用いた。調整した細胞懸濁液を径35mmのシャーレ(Nunc)にlmlづつ分注し、37℃、5% C02存在下で6日間培養した。培養終了後、寒天の水分をろ紙を用いて除去した後、細胞を5% グルタルアルデヒドで固定し、アセチルコリンエステラ一ゼ染色液  (Acetylthiocholine iodide 0.5mg/m1、5mMクエン酸ナトリウム、3mM CuS04、0.5mMヘキソシアノ鉄(III)酸カリウム/リン酸バッファー(pH6.0)溶液)中で１時間染色し、PBSで洗浄した後、巨核球コロニーを検鏡下に算定した。その結果を図５に示す。
図５より、IL‐3非存在下においてはコロニーの形成はみられなかったが、IL-3存在下において巨核球威熟作用物質0.5μg/ml添加により、陽性対照として用いたIL-6添加群と同程度の巨核球コロニーが形成されていることが確認された。
【００１９】
[実施例5](巨核球細胞膜表面糖タンパク質の発現に対する作用)  ５〜10週齢のオスICRマウス(日本クレア)大腿骨より採取した骨髄細胞を CATCH液に懸濁し、ピペッティングにより単細胞浮遊液にし、50% パーコール/CATCH液6mlに重層し、1,500回転、15分間遠心して巨核球濃縮画分を回収し、10倍容量の0.1% BSA含有RPMI培地で洗浄した。次に2×l06cells/mlとなるよう0.1% BSA、l% Nutridoma NS (Boehringer Mannheim)含有RPMI培地に細胞を懸濁した。調製した細胞懸濁液を24we11sプレート(SUMILON)に1we11当たり１ml播種した。さらに、A173株培養液5%あるいは巨核球成熟作用物質0.5μg/mlを添加し、37℃、5% C02存在下で7日間培養した。培養終了後、0.2% BSA含有PBSで洗浄した細胞を100μ1の0.2% BSA含有PBSに懸濁した。細胞懸濁液50μlに0.5mg/ml FITC蛍光標識抗マウスGp b/a抗体(ニチレイ)を50μ1添加し、氷上に30分間静置した後、0.2% BSA含有PBSで２回洗浄し、500μ1の0.2% BSA含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターにより解析した。
その結果、無処置では8.58%の発現率であったのに対し、巨核球成熟作用物質添加により12.0%と発現率が上昇した。このことから、巨核球威熟作用物質は巨核球細胞の成熟を促進することが示唆された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によるミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属し、巨核球成熟作用物質産生能を有する微生物を培養し、該培養物から採取される巨核球成熟作用物質は、巨核球系細胞を成熟させる活性を有する。巨核球成熟作用物質は、巨核球−血小板分化のメカニズム解明における試料、及び血小板産生調節の医薬品素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物A173株から得られた活性画分をCe11ulofine GC700によるゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分画した、各フラクションの測定結果を示す図である。
【図２】微生物A173株の培養液から得られた活性画分をQ‐Sepharoseカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分画した、各フラクションの測定結果を示す図である。
【図３】酢酸セルロース膜電気泳動法による分離を示す図である。
【図４】巨核球成熟作用物質をマウス骨髄細胞へ添加し培養した場合の大型成熟巨核球様細胞を示す写真である。
【図５】微生物A173株の培養液から得られた活性物質の巨核球コロニー形成作用を示す図である。
【図１】
0004002963.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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