(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０8Ｍ-1の親和定数でヒトＦａｓリガンドに結合し、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１−３が配列表の配列番号１１、１３および１５のアミノ酸配列にそれぞれ対応し、重鎖のＣＤＲ１−３が配列番号１９，２１および２３のアミノ酸配列にそれぞれ対応し、これら軽鎖および重鎖から構成される中和抗体である、抗Ｆａｓリガンド抗体。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５のハイブリドーマが産生する抗Ｆａｓリガンド抗体。
【請求項３】
前記ＣＤＲが、ヒトＦａｓリガンドと特異的に結合する非ヒト供与体（ドナー）免疫グロブリン（Ｉｇ）からのＣＤＲであり、さらにヒト受容体（アクセプター）フレームワーク領域（ＦＲ）を含有するヒト化免疫グロブリンである、請求項１に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
【請求項４】
前記ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列が、供与体免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列に対して６５％以上９５％以下の同一性がある、請求項３に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
【請求項５】
前記ヒト化免疫グロブリンが、受容体免疫グロブリン重鎖又は軽鎖フレームワーク中の対応するアミノ酸と置き換わる、供与体免疫グロブリンフレームワーク由来のアミノ酸を含み、かつ、該アミノ酸のそれぞれが、
（１）供与体免疫グロブリン配列中のＣＤＲに１次配列上近接している、又は（２）該供与体もしくはヒト化免疫グロブリン中のＣＤＲから５オングストローム以内の距離にある原子を含む、請求項３または４に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の抗Ｆａｓリガンド抗体を用いてＦａｓリガンドを測定するＦａｓリガンドの測定方法。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株。
【請求項８】
前記ハイブリドーマが、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５である請求項７に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗Ｆａｓリガンド抗体及び該抗体を用いた測定方法に関する。特に抗Ｆａｓリガンド抗体を用いたヒト体液中のＦａｓリガンドの測定方法及び該測定方法に使用する抗体に関する。また、本発明は、Ｆａｓリガンドによるアポトーシスを高度に抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体に関する。さらに、本発明は、上記の抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株に関する。
背景技術
ヒトＦａｓリガンドは、Ｆａｓ抗原を発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する生体内分子として、長田等により報告されたポリペプチドである（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻、１５６７−１５７４頁、１９９４年）。ヒトＦａｓリガンドは、ＴＮＦファミリーに属する分子量約４０ｋＤのＩＩ型膜蛋白質で、ＴＮＦと同様に、生体内で３量体を形成すると考えられている（Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ等、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１４巻、１１２９−１１３５頁、１９９５年）。また、ヒトＦａｓリガンドはラットＦａｓリガンド（Ｔａｋａｓｈｉ  Ｓｕｄａ等、Ｃｅｌｌ、７５巻、１１６９−１１７８頁、１９９３年）やマウスＦａｓリガンド（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｃｅｌｌ、７６巻、９６９−９７６頁、１９９４年）と細胞外領域において高いホモロジーを有しており、ヒトＦａｓリガンドはヒトＦａｓ抗原のみでなくマウスＦａｓ抗原をも認識し、アポトーシスを誘導することができる。逆に、ラットＦａｓリガンドおよびマウスＦａｓリガンドは、ヒトＦａｓ抗原を認識してアポトーシスを誘導することができる。
もともと細胞のアポトーシスという現象は、生体の恒常性の維持に深い関わりをもつものとして注目されていたが、上記のようにＦａｓリガンドが異なる種間でホモロジーを有することから、Ｆａｓリガンド−Ｆａｓ抗原を介したアポトーシスは生体の恒常性の維持に極めて重要な役割を担っているものと考えられる。
特に最近、Ｆａｓリガンド、Ｆａｓ抗原の異常と自己免疫疾患との関係について興味ある報告がなされた。すなわち、自己免疫疾患のモデルマウスの１系統であるＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒではＦａｓ抗原遺伝子に変異が生じており、このような変異の生じたＦａｓ抗原遺伝子を発現している細胞ではアポトーシスが起きない（Ｒｉｅ  Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ等、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、３１４−３１７頁、１９９３年およびＡｄａｃｈｉ  Ｍ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、１９９３年）。一方、自己免疫疾患のモデルマウスの他の系統であるＣ３Ｈ−ｇｌｄ／ｇｌｄでは、Ｆａｓリガバンド遺伝子に変異が生じており、ｇｌｄマウスのＦａｓリガンドはアポトーシス誘導活性を持たない。この変異とは、遺伝子のポイントミューテーションであり、その結果、Ｆａｓリガンドの細胞外領域のＣ末端より数えて７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に変化している。（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｃｅｌｌ、７６巻、９６９−９７６頁、１９９４年）。このようなｇｌｄマウスのＦａｓリガンドは、Ｆａｓ抗原に結合することができない（Ｆｒｅｄ  Ｒａｍｓｄｅｌｌ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４巻、９２８−９３３頁、１９９４年）。
これらの事実から、ヒトにおける自己免疫疾患のある種のものは、Ｆａｓ抗原もしくはＦａｓリガンドの異常によって、本来アポトーシスを起こして生体内から除去されるべき自己反応性のＴ細胞が残存するために生じるのであろうと考えられるようになった。
最近では、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖も、これらの細胞で正常にアポトーシスが生じないために起こるのではないかと考えられている。また、コバヤシＮ．（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｎ．）等は、エイズウイルス感染によりＴ細胞膜上にＦａｓ抗原の発現が誘導されるので（日経サイエンス、６巻、３４−４１頁、１９９３年）、エイズウイルス感染時におけるＴ細胞の減少もＦａｓリガンドを介したものであると予想している。
このようにＦａｓリガンド−Ｆａｓ抗原を介したアポトーシスと疾患との関わりが明らかになるにつれて、アポトーシスの異常を伴う疾患、すなわち、上記自己免疫疾患やリウマチ、エイズ等の治療に、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓ抗原を応用することが期待されてきている。
また、長田らは、Ｆａｓリガンドに対する抗体を取得し、該抗体がアポトーシスを抑制しうることを報告してきた（Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ等、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１４巻、１１２９−１１３５頁、１９９５年および国際特許出願公開公報ＷＯ９５／１３２９３）。
発明の開示
前述のように長田らは鋭意研究を重ね、Ｆａｓリガンドを単離し、また、それに対する抗体を作製し、報告してきた。
しかしながら、実際にヒト体液中に存在するＦａｓリガンドを測定した報告はなく、ヒト体液中に可溶性のＦａｓリガンドが存在することも確認されていなかった。通常Ｆａｓリガンドのような生理活性サイトカイン類は、局所において微量産生され、局所で作用すると考えられている。また、一般的に半減期が短く、作用した後は速やかに組織または血中から除去される。よって、必ずしも末梢血中等で容易に検出可能であるとはいえない。Ｆａｓリガンドは、元々膜貫通（結合）蛋白質として報告されており、ある特殊な条件下では細胞から遊離することがｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で示されている（Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４巻、１１２９−１１３５頁、１９９５年）が、生理的な状態でしかも生体内でそのような現象が起きていることは知られておらず、ヒト体液中にＦａｓリガンドの存在することも未知であった。また仮に存在していたとしても、上記理由から、その濃度は極めて低いものと予想され、これを測定することは相当に困難であると考えられていた。また、体液中には免疫学的測定における種々の妨害物質の存在の可能性があり、高感度かつ特異性の高いＦａｓリガンド測定系およびそれに適した抗体の開発が必要であった。また、Ｆａｓリガンドは種々の疾患との関連が示唆されており、それらの疾患を診断する一つの手段として体液中のＦａｓリガンド濃度を測定することが臨床上有用と考えられている。しかし、いかなる疾患で体液中のＦａｓリガンド濃度が変動しているかについては未だ報告がない。さらに将来的にＦａｓリガンドのようなアポトーシスを誘導する物質の投与が有用と予想されている疾患の患者にＦａｓリガンドを投与した場合、またはＦａｓリガンドの活性あるいは発現に影響を与えるような物質を投与した場合、血中濃度のモニタリングまたは治療効果の判定のために体液中のＦａｓリガンド濃度を測定することが必要であり、高感度かつ特異的なＦａｓリガンドの測定方法が待望されていた。また、中和抗体については、より中和活性の高い抗体およびその特性の解明が望まれており、特に治療等の生体内における適用を考慮した場合、より低容量でＦａｓリガンドによるアポトーシスを抑制しうる抗体が有効性および安全性の面から強く望まれていた。
不運にも、非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体の使用は、ヒトの治療において、特に以下に説明するような繰り返しの治療療養法においてある種の欠点を有する。マウスモノクローナル抗体は、例えば、比較的短い循環半減期を有し、そしてヒトに用いられた場合は、他の重要な免疫グロブリンの機能的特性を欠く。
恐らく更に重要には、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト患者体中に注入されたときに免疫原性となるアミノ酸配列の実質的な長さを含む。多くの研究により、外来の抗体の注入の後、患者によって引き起こされた抗体に対する免疫応答が、非常に強くなり得て、最初の処置後の抗体の治療的有用性を本質的に排除してしまうと示されている。更に、種々の疾患を治療するために、益々多数の種々のマウス又は他の（ヒトに）抗原性のモノクローナル抗体が開発されると予想されるので、いずれかの異なった非ヒト抗体を用いた最初の又は数回の処置の後、それに続く関連のない療法のための処置でさえ、交叉反応性のために、効果がなかったり、またそれ自身が危険であることがあり得る。
いわゆる「キメラ抗体」（例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス可変領域）の製造が幾分か成功であると証明されている一方、著しい免疫原性の問題が残っている。一般的に、典型的なヒトモノクローナル抗体生産技術を用いてＦａｓリガンドに反応性のヒト免疫グロブリンを生産することは、多くの抗原の場合と同様に、非常に困難であろう。同様に、いわゆる「ヒト化」または「再形成」抗体（例えば、ジョーンズら、ネーチャー３２１：５２２−５２５（１９８６）；シャールマンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４３６６−４３７３（１９９１）；ケッテルボロフ、プロテイン  エンジニアリング４：７７３−７８３（１９９１）；ゴールマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５（１９９１）；テンペストら、バイオテクノロジー９：２６６−２７１（１９９１）；リーチマンら、ネーチャー３３２：３２３（１９８８）及びヨーロッパ特許公開第０２３９４００号公報、これらの引例はそれぞれ本明細書の部と成す、参照。）を生産するために組換ＤＮＡ技術を利用することは、部分的には、得られる免疫グロブリンの予期し得ない結合親和性のために一定の結果を与えない。
さらに、体液中のＦａｓリガンドをより詳細に検討するため、またＦａｓリガンドの機能を解析するため、特定のＦａｓリガンド由来ペプチドと反応する抗体、すなわちＦａｓリガンド内の結合部位の明らかな抗体の取得が待望されていた。
本発明の目的は、抗Ｆａｓリガンド抗体及び該抗体を用いた測定方法を提供することにある。特に抗Ｆａｓリガンド抗体を用いたヒト体液中のＦａｓリガンドの測定方法、及び該測定方法に使用する抗体、測定試薬および測定キットを提供する。また、本発明は、Ｆａｓリガンドによるアポトーシスを高度に、例えば、５０％以上抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体、およびヒト化抗体である該抗Ｆａｓリガンド抗体を提供する。さらに、本発明は、上記の抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体の少なくとも一つを必須の構成成分または有効成分として含有する組成物または医薬を提供し、ならびに、Ｆａｓ抗原／Ｆａｓリガンド系の異常もしくはＦａｓ抗原を介するアポトーシスの異常を伴う、該異常により引き起こされるまたは該異常の関与する、全身性または局所性の病的状態または疾患を処置するための方法であって、ＦａｓリガンドによるＦａｓ抗原発現細胞のアポトーシスを抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体の治療有効量を患者に投与することを含む方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域上のエピトープ領域と推定された部分とそのアミノ酸配列を示す模式図である。
図２は、抗Ｍ５２ペプチドモノクローナル抗体を用いたＦａｓリガンドのウエスタンブロッティングによる結果を示す図面代用写真である。
図３は、アポトーシス誘導活性に及ぼす抗Ｍ５２ペプチドモノクローナル抗体の影響を示すグラフである。
図４は、抗Ｆａｓリガンド抗血清（ロット８−２）の抗体価を示すグラフである。
図５は、Ｆ９１９−９−１８モノクローナル抗体によるアポトーシス抑制活性を示すグラフである。
図６は、酵母由来のＦａｓリガンド細胞外領域のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図７は、ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系の標準曲線を示すグラフである。
図８は、サンドイッチＥＩＡ系における正常ヒト血清の影響を示すグラフである。
図９は、各種疾患患者血清中のＦａｓリガンドの測定値を示すグラフである。
図１０は、マウスＦ９１９抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
図１１は、マウスＦ９１９抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
図１２は、ヒト化Ｆ９１９抗体（ｖｅｒｓｉｏｎ２）の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
図１３は、ヒト化Ｆ９１９抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲに下線を引き、成熟鎖の１番目のアミノ酸には二重下線を引いた。
図１４は、マウス及びヒト化Ｆ９１９抗体（ｖｅｒｓｉｏｎ１）の競合的結合を示すグラフである。Ｆａｓリガンドを発現するトランスフェクタント１Ａ１２細胞とともに、放射標識されたトレーサーマウスＦ９１９抗体の存在下に、順次増加させた量のマウス又はヒト化競合物抗体を、インキュベートした。そして結合／遊離放射活性の比率を測定した。結果を２つの試料の平均値で示す。
図１５は、マウス及びヒト化Ｆ９１９抗体（ｖｅｒｓｉｏｎ２）の競合的結合を示すグラフである。Ｆａｓリガンドを発現するトランスフェクタント１Ａ１２細胞とともに、放射標識されたトレーサーマウスＦ９１９抗体の存在下に、順次増加させた量のマウス又はヒト化競合物抗体を、インキュベートした。そして結合／遊離放射活性の比率を測定した。結果を２つの試料の平均値で示す。
図１６は、マウスならびにヒト化Ｆ９１９抗体（ｖｅｒｓｉｏｎ１）ＩｇＧ１（Ｇ１ｖ１）およびＩｇＧ４（Ｇ４ｖ１）のアポトーシス抑制活性を示すグラフである。結果を３つの試料の平均値で示す。
図１７は、マウスならびにヒト化Ｆ９１９抗体（ｖｅｒｓｉｏｎ２）ＩｇＧ１（Ｇ１ｖ２）およびＩｇＧ４（Ｇ４ｖ２）のアポトーシス抑制活性を示すグラフである。結果を３つの試料の平均値で示す。
図１８は、２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系の標準曲線を示す。
図１９は、ＨＩＶ感染患者パネル血清のＦａｓリガンド濃度の推移を示すグラフである。
図２０は、Ａ型肝炎患者パネル血清のＦａｓリガンド濃度の推移を示すグラフである。
図２１は、Ｂ型肝炎患者パネル血清のＦａｓリガンド濃度の推移を示すグラフである。
図２２は、Ｃ型肝炎患者パネル血清のＦａｓリガンド濃度の推移を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は以下の抗体を提供する。すなわち、
（１）抗Ｆａｓリガンド中和抗体であって（以下、中和抗体と称することがある）、
▲１▼ＦａｓリガンドによるＦａｓ抗原発現細胞のアポトーシスを高度に抑制する活性を有する抗Ｆａｓリガンド抗体であって、３０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは３μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．３μｇ／ｍｌにおいて５０％以上のアポトーシス抑制率を示す抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲２▼生物活性を有するＦａｓリガンドの少なくともいずれか１つを認識する抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲３▼生物活性を有さないＦａｓリガンドの少なくともいずれか１つを認識しない曲抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲４▼▲２▼及び▲３▼の性質を合わせ持つ抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲５▼該生物活性を有するＦａｓリガンドが後に実施例で記載するＦａｓリガンド細胞外領域、遊離型Ｆａｓリガンド、Ｆａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ５、ｎｄ１２、ｎｄ２０、ｎｄ３２およびｎｄ４２、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の置換変異体であるＬ１７９Ｆの少なくとも何れか一つである▲２▼または▲４▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲６▼該生物活性を有さないＦａｓリガンドがＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ４９、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるｃｄ１７９または硫安塩析により凝集変性したＦａｓリガンドの少なくとも何れか一つである▲３▼▲４▼または▲５▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲７▼▲１▼および▲２▼の性質を合わせ持つ抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲８▼少なくとも１０7Ｍ-1以上、好ましくは１０8Ｍ-1以上、より好ましくは１０9Ｍ-1以上、さらに好ましくは１０10Ｍ-1以上の親和定数でＦａｓリガンドと結合する抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲９▼少なくとも１０7Ｍ-1以上、好ましくは１０8Ｍ-1以上、より好ましくは１０9Ｍ-1以上、さらに好ましくは１０10Ｍ-1以上の親和定数でＦａｓリガンドと結合する▲１▼ないし▲７▼のいずれかに記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１０▼図１０または１１に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一つ、好ましくはすべてを含有する抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１１▼図１０または１１に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一つ、好ましくはすべてを含有する、▲１▼ないし▲９▼のいずれかに記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１２▼ヒトＦａｓリガンドに特異的に結合する非ヒト供与体の免疫グロブリン（Ｉｇ）からの少なくとも一つ、好ましくはすべてのＣＤＲおよびヒト受容体免疫グロブリンからの少なくとも一つ好ましくはすべてのフレームワーク領域を含有するヒト化免疫グロブリンである抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１３▼▲１２▼に記載のヒト化免疫グロブリンである▲１▼ないし▲１１▼のいずれかに記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１４▼前記非ヒト供与体Ｉｇが▲１▼ないし▲１１▼のいずれかに記載の抗Ｆａｓリガンド抗体である▲１２▼または▲１３▼に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲１５▼前記非ヒト供与体Ｉｇが、マウスＦ９１９−９−１８抗体である▲１４▼に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体。
ここで中和抗体とは、ＦａｓリガンドによるＦａｓ抗原発現細胞のアポトーシスを抑制する活性を示す抗体をいい、後述する実施例の１−３に記載の方法または公知の方法で測定するアポトーシス（これは放射活性または特異的溶解率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ，％）等で表現される）が、対照群例えば無添加群と比較して低値であるものをいう。具体的には、以下の式で計算されるアポトーシス抑制率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは９０％以上である抗体である。
0003925663.tif 000002
また、Ｆａｓリガンドの生物活性とは、Ｆａｓ抗原発現細胞のアポトーシスを誘導または抑制する活性をいい、後述する実施例の１−３に記載の方法または公知の方法で測定される。
また、抗Ｆａｓリガンド抗体とは、Ｆａｓリガンドを認識する活性、またはＦａｓリガンドと反応する活性を有する抗体をいい、例えば本明細書に記載のいずれかの方法または公知の方法で抗原であるＦａｓリガンド（例えばＦａｓリガンド細胞外領域）との結合が確認される抗体が含まれる。
本発明はまた以下の抗体を提供する。すなわち、
（２）特定のＦａｓリガンド由来ペプチドに対する抗Ｆａｓリガンド抗体であって、
▲１▼該ペプチドと特異的に反応する抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲２▼該ペプチドが配列表の配列番号１〜８のいずれかである▲１▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲３▼該ペプチドが配列表の配列番号１または６である▲１▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲４▼該ペプチドが配列表の配列番号１である▲１▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
▲５▼該ペプチドが配列表の配列番号１中に記載されるアミノ酸の番号で１〜９または１０〜２０に対応する部分のペプチドである▲４▼の抗Ｆａｓリガンド抗体。
すなわち、本発明（１）の抗体はＦａｓリガンドの生物活性発現に重要なエピトープを認識する抗体であり、該エピトープは生物活性を有するＦａｓリガンド、例えば、Ｆａｓリガンド細胞外領域、遊離型Ｆａｓリガンド、Ｆａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ５、ｎｄ１２、ｎｄ２０、ｎｄ３２およびｎｄ４２、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の置換変異体であるＬ１７９Ｆ等には表現されているが、生物活性を有さないＦａｓリガンド、例えばＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ４９、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるｃｄ１７９および実施例４−１記載のＦａｓリガンド細胞外領域の硫安塩析による凝集物等には表現されていないエピトープと考えられる。また本発明は、標準的結合条件（例えば生理的食塩液または血清条件）下で後に実施例で述べるような検定法において、少なくとも１０7Ｍ-1以上、好ましくは１０8Ｍ-1以上、より好ましくは１０9Ｍ-1以上、さらに好ましくは１０10Ｍ-1以上のＦａｓリガンドに対する結合親和性を有する抗Ｆａｓリガンド抗体ならびに、図１０および１１に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一つ、好ましくは３つ、より好ましくはすべてを含有する抗Ｆａｓリガンド抗体を提供する。本発明（１）の抗体の好適な例としてはハイブリドーマＦ９１９−９−１８の産生するモノクローナル抗体またはこれと同一のエピトープを認識する抗体或いは該抗体とその抗原の結合を競合する抗体があげられる。本発明（１）の抗体は高度にアポトーシスを抑制することが可能である。また、Ｆａｓリガンド特に生物活性を有するＦａｓリガンドを認識するため、ヒト体液中のＦａｓリガンド、特に生物活性を有するＦａｓリガンドを高感度に検出する測定方法に使用可能である。
本発明（２）の抗体の好適な例としては、ハイブリドーマＦ９１８−７−３、Ｆ９１８−９−４およびＦ９１８−２０−２等が産生する抗体またはこれと同一のエピトープを認識する抗体或いは該抗体とその抗原との結合を競合する抗体があげられる。前記（２）▲５▼の抗体の内、配列番号１のペプチドのアミノ酸番号１から９のペプチドに特異的に反応する抗体としてはＦ９１８−７−３が、また、アミノ酸番号１０から２０のペプチドに反応する抗体としてはＦ９１８−９−４およびＦ９１８−２０−２があげられる。本発明（２）の抗体は特異的にＦａｓリガンドと反応し、また、その反応するペプチド部分が明らかであり、特定のＦａｓリガンドと反応する。そのため、ヒト体液中のＦａｓリガンドを高感度に検出する測定方法に使用可能である。また、１種類または複数の特定のＦａｓリガンドを選択的に検出する測定方法にも使用し得る。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体は、ＦａｓリガンドまたはＦａｓリガンド由来ペプチドと結合する限り、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体は特性がより明らかであるという点で好ましい。
抗体、すなわち、免疫グロブリンの構造はＨ鎖とＬ鎖とからなり、Ｈ鎖のクラスにより、５つのイソタイプ（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）に分けられる。このうち、ＩｇＧ、ＩｇＡのＨ鎖はサブクラスに分けられる。本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体は、これらの、および後述のいずれの分類の鎖を含有するものでもよく、またいずれのイソタイプに属するものであってもよい。
さらに、免疫グロブリンは例えばペプシンで分解すると、Ｆ（ａｂ’）２とＦｃ’に別れ、パパインで分解するとＦａｂとＦｃの２つのフラグメントに分かれる。本発明の抗体は、抗原と結合するものであれば、完全な抗体分子でもその一部のフラグメントでもよい。また、本発明の抗体はキメラ抗体またはヒト抗体であってもよい。さらに、公知方法により種々の標識物を結合させた標識抗体、他の物質、例えばポリペプチドとの融合抗体及びイムノトキシン等も本発明の抗体に含まれる。
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを構成すると知られている。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアから成り、各ペアは、１つの“軽”鎖（約２５ｋＤ）及び１つの“重”鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮＨ2末端は、主として抗原認識に寄与する約１００〜１１０或いはそれ以上のアミノ酸の可変領域から始まる。各鎖のＣＯＯＨ部分は、主としてエフェクター機能に寄与する定常領域を定めている。
軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それぞれ抗体のイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと決定づけている。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域が、約１２或いはそれ以上のアミノ酸の“Ｊ”領域によって連結されており、重鎖はまた約１０より多いアミノ酸の“Ｄ”領域を含む（一般に、ファンダメンタル  イムノロジー、ポールＷ．編、第７章、１３１−１６６頁、ラベンプレス、Ｎ．Ｙ．（１９８４）、本引例をもって明細書の一部と成す、参照）。
各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。鎖は全て、３つの超可変領域（この領域はまた相補性決定領域又はＣＤＲと呼ばれる［“免疫学的興味の蛋白質配列”、カバット  Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．デパートメント  オブ  ヘルス  アンド  ヒューマン  サービシース（１９８７）；及びチョチア  アンド  レスク、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照］）によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域の同じ普遍的構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって一列に並べられ、特異的なエピトープへの結合を可能とする。
本明細書において、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にエンコードされる１以上のポリペプチドからなる蛋白質を云う。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びにミリアド（ｍｙｒｉａｄ）免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、例えばＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２並び二価抗体（例えば、ランザベチアら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５（１９８７））を含む抗体の他の種々の形態で、及び一本鎖（例えば、ヒューストンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びバードら、サイエンス、２４２：４２３−４２６（１９８８）、本引例をもって本明細書の一部と成す）にて存在しうる（一般に、フードら、ＩｍｍｕｎｏＩｏｇｙ（ベンジャミン、Ｎ．Ｙ．、第２版、１９８４）、ハルロウ  アンド  レーン、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー、１９８８）及びハンカピラー  アンド  フード、ネーチャー、３２３：１５−１６（１９８６）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照）。
「成熟免疫グロブリン」の天然の形態は、配列中の１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加によって長さが多少変化することはよく知られている。このように、可変領域および定常領域は、実質的な天然の修飾を受けるが、なお実質的に同一であり、かつそれらの各活性を保持しうる。
ヒト定常領域および再編成した可変領域ＤＮＡは、公知の操作法に従って種々のヒト細胞、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離しうる。同様な方法により非ヒト材料から非ヒト免疫グロブリン配列を単離することができる。ＤＮＡ配列のための材料の細胞ならびに発現および分泌のための宿主細胞は、種々の材料、例えばアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（セルライン及びハイブリドーマのカタログ、第５版（１９８５）、ロックビル、ＭＤ、本引例をもって本明細書の一部と成す）から得ることができる。
これらの「天然に存在する形態」の免疫グロブリン鎖に加えて、他の「実質的に同一な」修飾された免疫グロブリン重鎖および軽鎖が当業者に周知の種々の組み換えＤＮＡ技術を利用して容易にデザインされそして製造されうる。例えば、鎖は、いくつかのアミノ酸の置換、末端及び中間での付加や欠失等によって、その１次構造レベルにて天然の配列から変化することができる。或いは、１又はそれ以上の免疫グロブリン活性（例えば、結合活性）を有するような、一次の抗体構造の部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができよう。特に、多くの遺伝子と同様に、免疫グロブリン遺伝子も分離した機能的領域を含有し、各領域は異なる生物活性を有することが注目される。一般に、所望のエピトープ結合成分をコードする遺伝子の修飾は、種々の良く知られた技術、例えば、特定部位の突然変異誘発（ギルマン  アンド  スミス、Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７（１９７９）及びロバーツら、ネーチャー３２８：７３１−７３４（１９８７）、本引例を持って本明細書の一部と成す、参照）によって、容易に達成されよう。
より好ましい本発明の態様において、エピトープ結合成分は、「キメラ」または「ヒト化」された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる（ＣｏおよびＱｕｅｅｎ  Ｎａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年）。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメント、例えば、γ1及びγ4と連結されうる。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からのＶ又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体からのＣ又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
本明細書において、「フレームワーク領域」という用語は、カバットら（前掲）による定義の如く、単一種中の種々の免疫グロブリンの内で、比較的保存されている（即ち、ＣＤＲ以外の）免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一（約８５％又はそれ以上）であるところのフレームワーク領域である。
本明細書において、「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのＣＤＲを含む免疫グロブリンを云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、即ち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。従って、恐らくＣＤＲを除く、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、１以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
より好ましい本発明の態様において、Ｆａｓリガンドに特異的に反応するヒト化免疫グロブリンである抗Ｆａｓリガンド抗体が提供される。これらの免疫グロブリンは、より特異的には、本発明は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体（アクセプター）免疫グロブリンからのフレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て（４つ）、より好ましくはすべて（各鎖について４つ）を含有し、そして、Ｆａｓリガンドに特異的に結合する非ヒト、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス供与体免疫グロブリンからの１以上、好ましくはすべて（各鎖について３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するヒト化免疫グロブリンである、本発明の抗体のいずれかに従う抗Ｆａｓリガンド抗体を提供する。該免疫グロブリンは、軽鎖／重鎖複合体の２つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、１以上、好ましくは全て（３つ）の供与体（マウス）免疫グロブリンの相補性決定領域を含む。例えば、供与体（マウス）相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体（マウス）アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入されて、約１０7Ｍ-1より強い親和性レベルにてＦａｓリガンドに結合できるヒト化免疫グロブリンを製造できる。これらのヒト化免疫グロブリンはまた、ＣＤＲを供与するマウスモノクローナル抗体のＦａｓリガンドへの結合をブロックできる。好ましい実施態様において、１以上のＣＤＲが本発明の抗体、より好ましくは本発明（１）の抗体のいずれかに従う非ヒト供与体抗体、特にマウスＦ９１９−９−１８抗体から由来し、そしてヒト化免疫グロブリンはＩｇＧ１又はＩｇＧ４イソタイプである。さらに明確な例としては、本発明のヒト化免疫グロブリンは、各々、配列表の配列番号１１、１３、１５、１９、２１または２３のいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるＣＤＲの少なくとも一つ、好ましくはすべて（各鎖３つ）を含有するものである。ヒト化免疫グロブリンにおける各ＣＤＲおよびフレームワークの位置は元の供与体免疫グロブリンにおける位置と対応していることが望ましい。
一般に、本発明のヒト化抗体は、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク及び供与体免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワーク間において、６５％以上９５％以下、好ましくは７０％以上９０％以下の相同性（即ち、配列同一のパーセント）が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖及び軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、２つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる２以上のヒト抗体から由来してもよい。
ヒトフレームワーク領域に関しては、ＣＤＲを得る非ヒト免疫グロブリンのフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト免疫グロブリン配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は６０％以上、より好ましくは６５％以上である。また、好ましくは、受容体免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の５つ、より好ましくは３つの中にある。ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下のように行うことができる。
１）アミノ酸が以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリーに該当する場合は、用いられ用るヒト免疫グロブリン（受容体免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸はＣＤＲを供与する非ヒト免疫グロブリン（供与体免疫グロブリン）由来のアミノ酸で置換される。
（ａ）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト免疫グロブリンのその位置に稀であり、そして供与体免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に典型的である；
（ｂ）該アミノ酸がＣＤＲの１つに一次配列上近接もしくは隣接している；または、
（ｃ）該アミノ酸が供与体もしくはヒト化免疫グロブリンの三次元モデルにおいてＣＤＲの約５、好ましくは４、より好ましくは３オングストローム以内に原子を有する（Ｃｏ等Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８、２８６９、１９９１）。
２）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体免疫グロブリンの対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。ヒト化免疫グロブリンの製造の詳細な説明については、クイーンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９（１９８９）、国際特許出願公開公報ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９２／１１０１８、Ｃｏ等Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ２８６９（１９９１）、ＣｏおよびＱｕｅｅｎ  Ｎａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年、ならびに、コーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）が参照される。
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては暖昧であることもあり、そして、代わりの様々な免疫グロブリンが製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。本発明のヒト化抗体は、通常、少なくとも１、３、５及び更に通常は７つの、対応する供与体（マウス）軽鎖フレームワーク残基または他のアミノ酸残基での置換を含む。そして、ヒトフレームワークがＥｕ抗体由来である場合、特にＣＤＲ供与体がマウスＦ９１９−９−１８である場合、それらの置換は表４および５に示される位置での置換を含む。ヒト化抗体はまた、通常、少なくとも１、３、５、７、９、１１、１３及び更に通常は１６の位置において、対応する供与体（マウス）重鎖フレームワーク残基での置換を含む。そして、ヒトフレームワークがＥｕ抗体由来である場合、特にＣＤＲ供与体がマウスＦ９１９−９−１８である場合、それらの置換は表４および５に示される位置での置換を含む。これらの位置は、通常、典型的なアミノ酸残基を有するヒト免疫グロブリンの等価位置からのアミノ酸またはその同類のアミノ酸で置換されてもよい。
また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の２６から３０の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており（チョチアおよびレスク、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７））、その意味ではＣＤＲと同様に移植することも可能である。
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、マウスに比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による、より効率的な標的細胞の破壊）。
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を異物として認識せず、従って、このような注入された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
３）注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている（ショー、Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７））。注入されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与量を与えることを可能とする。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体には、Ｆａｓ抗原とＦａｓリガンドの結合に影響する物およびしない物が含まれる。本発明（１）の抗Ｆａｓリガンド抗体のように、Ｆａｓリガンドに結合し、かつアポトーシスを誘導しない場合には、生体内のＦａｓリガンドに拮抗する物質として、アポトーシスを人為的に抑制するために使用することができる。また、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体は以下に示すＦａｓリガンドの測定方法のために、ならびに該測定方法のための試薬およびキットの構成成分として、使用される。
また、本発明は以下の測定方法、測定試薬及び測定キットを提供する。すなわち、
（３）抗Ｆａｓリガンド抗体を用いたヒト体液中のＦａｓリガンドの測定方法、測定試薬及び測定キットであって、
▲１▼（１）または（２）の何れかに記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いる、または含有することを特徴とするＦａｓリガンドの測定方法、測定試薬及び測定キット。
▲２▼競合法による▲１▼記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲３▼サンドイッチ法による▲１▼記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲４▼同一または異なる２種類以上の中和抗体を組み合わせて用いる、または含有する▲１▼−▲３▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲５▼同一または異なる２種類以上の（２）記載の抗体を組み合わせて用いる、または含有する▲１▼−▲３▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲６▼中和抗体および（２）記載の抗体を組み合わせて用いる、または含有する▲１▼−▲３▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲７▼前記中和抗体が受託番号ＢＰ−５５３５のハイブリドーマの産生するＦ９１９−９−１８である▲６▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲８▼前記（２）記載の抗体が配列表の配列番号１のペプチドに特異的に反応する抗体である▲６▼または▲７▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲９▼前記（２）の抗体が配列表の配列番号１のアミノ酸番号１１−２０のペプチドに特異的に反応する抗体である▲８▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
▲１０▼前記（２）の抗体が、Ｆ９１８−９−４またはＦ９１８−２０−２である▲８▼または▲９▼に記載の方法、測定試薬及び測定キット。
上記▲１▼から▲１０▼に記載の方法、測定試薬及び測定キットにおいて、１又は２種以上の他の抗Ｆａｓリガンド抗体を併用してもよい。
中和抗体、特に本発明の中和抗体は、Ｆａｓリガンドの生物活性に重要なＦａｓリガンド上の構造またはエピトープを認識していると考えられるので、中和抗体を用いた本発明の測定方法は、検体特にヒト体液中のＦａｓリガンド、特に生物活性を有するＦａｓリガンドを高感度に測定することができる。また、該方法は検体中のＦａｓリガンドの生物活性を試験する方法として生物試験法（バイオアッセイ）の代替法としても使用可能である。前述のようにＦａｓリガンドは生理的には３量体として存在または機能することが示唆されており、実施例で記載されるように同一の抗体同士の組み合わせにおいてもサンドイッチ法による測定が可能である。
また、本発明（２）の抗体は、Ｆａｓリガンドと特異的に反応し、また、その反応するペプチド部分が特定されているため、本発明（２）の抗体を用いた測定方法は、検体特にヒト体液中のＦａｓリガンドを高感度に測定することができる。また、１種類または複数の特定のＦａｓリガンドを選択的に測定することも可能である。
また、中和抗体、特に本発明の中和抗体と本発明（２）の抗体とを組み合わせることにより、生物活性を有する１種類または複数の特定のＦａｓリガンドを選択的に測定することも可能である。
さらに、複数の本発明の測定方法で同一の検体を同時に測定することによりＦａｓリガンドの全量および特定のＦａｓリガンドの量ならびにそれらの量比を測定することも可能であり、例えば、特定の疾患または病態におけるＦａｓリガンドの量的変化のみでなく、質的変化をも測定することが可能である。
本発明の測定方法の対象試料は必ずしも体液に限定されないが、本方法は体液、特にヒト体液中のＦａｓリガンドを測定するために特に適している。体液としては例えば、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、腹水、胸水より選ばれる試料である。
本発明の抗体が認識する抗原であるＦａｓリガンドおよび本発明の測定方法で検出されるＦａｓリガンドは、実施例に示すように、それが、Ｆａｓ抗原に結合するかしないかに関わらず、また、アポトーシスを誘導するかしないかに関わらず、Ｆａｓリガンド、特にヒトＦａｓリガンド由来のものであれば、生体内の内在性Ｆａｓリガンドならびに外因性のＦａｓリガンドの何れでもよく、それらは天然物から由来したもの、遺伝子工学的に作製したもの、または化学的に合成したもの等、何れもが該当する。糖鎖を有するもの、有さないものいずれもが含まれる。例えば、Ｆａｓリガンド発現細胞、Ｆａｓリガンド、Ｆａｓリガンド細胞外領域、遊離型ＦａｓリガンドまたはＦａｓリガンド由来ペプチド断片、あるいはＦａｓリガンドの１アミノ酸以上を欠失もしくは置換された欠失体及び置換体ならびに少なくともＦａｓリガンドの一部を有する融合蛋白質等が含まれる。
本発明の測定方法を用いて健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中のＦａｓリガンドを測定することができる。また、本発明により初めて体液中のＦａｓリガンド濃度が明らかとなった。例えば、肝炎、ＨＩＶ感染症または自己免疫疾患では健常人より高値を示し、これらの疾患の診断に応用できる。さらにＦａｓリガンドによるアポトーシスに影響を与えない抗Ｆａｓリガンド抗体は、体内診断にも応用可能である。
さらに本発明は以下の方法、測定試薬および測定キットを提供する。
（４）抗Ｆａｓリガンド抗体を用いる、または含有する体液中のＦａｓリガンドの測定方法、測定試薬および測定キットであって、
▲１▼Ｆａｓリガンドの増加、減少および／またはＦａｓ抗原／Ｆａｓリガンド系の異常の予知、検出、およびそれらを伴う疾患および該疾患に付随する病態の予知、検出または診断のために使用される体液中のＦａｓリガンドの測定方法、測定試薬および測定キット。
▲２▼Ｆａｓ抗原／Ｆａｓリガンド系の異常を伴う疾患においてＦａｓ抗原／Ｆａｓリガンド系の異常に起因した全身または局所における病態を検出するための方法、測定試薬および測定キット。
▲３▼（３）記載の測定方法による▲１▼または▲２▼に記載の方法、測定試薬および測定キット。
▲４▼該疾患が自己免疫疾患、肝炎またはＨＩＶ感染症である▲１▼−▲３▼に記載の方法、測定試薬および測定キット。
さらに本発明は以下のハイブリドーマまたは細胞株を提供する。
（５）抗Ｆａｓリガンド抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株。
▲１▼（１）および（２）に記載の抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株。
▲２▼受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３４またはＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３５であるハイブリドーマ（本明細書では、各々Ｆ９１８−７−３、Ｆ９１８−９−４、Ｆ９１９−９−１８と表示、いずれも平成７年６月２２日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に原寄託され、平成８年５月９日にブタペスト条約に基づき移管）。
本発明は、前記した本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体の少なくともいずれかひとつを活性成分または有効成分として含有する新規組成物または医薬を、ならびに、Ｆａｓ抗原／Ｆａｓリガンド系の異常もしくはＦａｓ抗原を介するアポトーシスの異常を伴う、該異常により引き起こされるまたは該異常の関与する、全身性または局所性の病的状態または疾患を処置するための方法を提供する。該方法は、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体、特にＦａｓ抗原発現細胞のＦａｓリガンドによるアポトーシスを抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体の少なくともいずれか一つの治療有効量を患者に投与する工程を含む。
以下に、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体の取得方法等についてさらに説明する。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体を作製するための抗原としては、実施例に示すように、それが、Ｆａｓ抗原に結合するかしないかに関わらず、また、アポトーシスを誘導するかしないかに関わらず、Ｆａｓリガンド、特にヒトＦａｓリガンド由来のペプチドを含むものであれば、天然物から由来したもの、遺伝子工学的に作製したもの、または化学的に合成したもの等、何れも本発明の抗体を作製するための抗原として使用することができる。糖鎖を有するもの、有さないものいずれもが含まれる。例えば、Ｆａｓリガンド発現細胞、Ｆａｓリガンド全長、Ｆａｓリガンド細胞外領域、遊離型ＦａｓリガンドまたはＦａｓリガンド由来部分ペプチド断片、あるいはＦａｓリガンドの１アミノ酸以上が欠失もしくは置換された欠失体及び置換体ならびに少なくともＦａｓリガンドの一部を有する融合蛋白質等が含まれる。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体は、それがポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該抗Ｆａｓリガンド抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原としてＦａｓリガンドまたはその部分ペプチドを必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いるＦａｓリガンドは、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。
免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。Ｆａｓリガンドで免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、Ｆａｓリガンドに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製するごとによって得る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を組み合わせて行う。
また、遺伝子工学的な方法により当該抗Ｆａｓリガンド抗体を得る。例えば、Ｆａｓリガンドまたはその部分ペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、Ｆａｓリガンドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製する。
本発明の、結合性フラグメント及びそれらの他の誘導体を含む免疫グロブリンは種々の組み換えＤＮＡ技術により製造されることができ、トランスフェクションされた細胞、好ましくは不死化された真核細胞、例えばミエローマ又はハイブリドーマ細胞中で最終的に発現されうる。ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一配列、及び所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二配列セットを含むポリヌクレオチドが、合成的に又は適当なｃＤＮＡとゲノムＤＮＡセグメントを組み合わせることによって製造されうる。
一の態様においては、本発明は、Ｆａｓリガンドの所望のエピトープに結合できる免疫グロブリン、好ましくは本発明（１）の抗体、例えばモノクローナル抗体マウスＦ９１９−９−１８からの重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲをエンコードする組み換えＤＮＡセグメントに向けられている。これらの領域をエンコードするＤＮＡセグメントは、典型的には、適当なヒトフレームワーク領域をエンコードするＤＮＡセグメントに連結される。好例としてのＤＮＡ配列（これらは、発現すると、モノクローナル抗体マウスＦ９１９−９−１８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含むポリペプチド鎖をコードする）は、図１２および１３に含まれる。コドン縮重及び重要でないアミノ酸置換のため、以下に詳述する如く、他のＤＮＡ配列が容易にそれらの配列の代わりに用いられうる。ヒト化免疫グロブリンのデザイン及び製造の詳細な記載のためには、国際特許出願公開公報ＷＯ／０７８６１が参照される。
ＤＮＡセグメントは、典型的には、更に、ヒト化免疫グロブリンコーディング配列に作動可能に連結された発現制御ＤＮＡ配列を含み、自然に随伴されている又は異種のプロモーター領域を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションできるベクター中の真核生物のプロモーター系であるが、原核生物宿主のための制御配列もまた用いられ得る。ベクターがいったん適当な宿主中に組み入れられると、宿主はヌクレオチド配列の高レベルでの発現に適した条件下で維持され、そして所望により、軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖ダイマー又は完全な抗体、結合フラグメント又は他の免疫グロブリン形態の収集及び精製が引き続き行われうる。
所望のヒト化抗体を最終的に発現できる本発明の核酸配列は、種々の異なったポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド等）及び構成成分（例えば、Ｖ、Ｊ、Ｄ及びＣ領域）から、並びに種々の異なった技術により形成されうる。適当なゲノム配列と合成配列を連結することは、現在、製造の最も普通の方法であるが、ｃＤＮＡ配列もまた利用されうる（ヨーロッパ特許第０２３９４００号公報及びリーチマン、Ｌ．ら、ネーチャー３３２：３２３−３２７（１９８８）、これらの引例は共に、本明細書の一部と成す、参照）。
ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、良く知られた方法に従って、種々のヒト細胞、好ましくは不死化されたＢ細胞から単離されうる（カバット、前掲、及びＷＯ８７／０２６７１参照）。本発明の免疫グロブリンを製造するためのＣＤＲは、同様に、Ｆａｓリガンドに結合できるモノクローナル抗体から由来し、そしていずれかの便利な哺乳動物源（マウス、ラット、ウサギ又は良く知られた方法によって抗体を生産できる他の脊椎動物を含む）中で生産される。ＤＮＡ配列のための適したソース細胞、及び免疫グロブリン発現及び分泌のための適した宿主細胞は、多くのソース、例えばアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（セルライン及びハイブリドーマのカタログ、第５版（１９８５）、ロックビル、ＭＤ、）から得ることができる。好ましい実施態様において、ＣＤＲは、それぞれ、マウスＦ９１９−９−１８のＣＤＲ配列に対応する配列を有し、そしてマウスＦ９１９−９−１８の対応するＣＤＲアミノ酸配列がコードされる同義性のヌクレオチド配列を含みうる。
本明細書に詳細に記したヒト化免疫グロブリンに加えて、他の「実質的に相同な」修飾された免疫グロブリンが、本技術分野の熟練者に良く知られた種々の組み換えＤＮＡ技術を利用して容易にデザインされそして製造されうる。例えば、種々の異なるヒトフレームワーク領域が、本発明のヒト化免疫グロブリンのための基礎として、単独でまたは組み合わせて使用することができる。さらに、フレームワーク領域は、いくつかのアミノ酸の置換、末端及び中間での付加や欠失等によって、その１次構造レベルにて天然の配列から変化させることができる。もちろん、フレームワーク中のアミノ酸の多くは、抗体の特異性又は親和性に対しては、殆ど或いは全く、直接には寄与しない。従って、フレームワークアミノ酸残基の多くの個々の同類置換は、得られたヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性を感知できるほど変えることなしに許容され得る。しかしながら、一般的にこのような置換は望ましくない。遺伝子の修飾は、種々の良く知られた技術、例えば、特定部位の突然変異誘発（ギルマン  アンド  スミス、Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７（１９７９）及びロバーツら、ネーチャー３２８：７３１−７３４（１９８７）参照）によって、容易に達成されうる。
或いは、一次の抗体構造の部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができ、該フラグメントは１又はそれ以上の免疫グロブリン活性（例えば、結合活性）を有する。これらのポリペプチドフラグメントは、本技術分野にて良く知られた方法によって完全な抗体を蛋白質分解することにより、又は、特定部位の突然変異誘発を用いて停止コドンをベクターｐＶｋ及びｐＶｇ１−ｄｈｆｒの所望の位置、例えばＦａｂフラグメントを製造するためにＣＨ１の後に、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを製造するためにヒンジ領域の後に挿入することにより製造されうる。一本鎖抗体は、ＤＮＡリンカーを用いてＶＬ及びＶＨを連結することにより製造されうる（ヒューストンら、前掲、及びバードら、前掲、参照）。一つの例として、Ｆｖ又はＦａｂフラグメントが、ブフナー  アンド  ルドルフ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１５７−１６２（１９９１））及びスケラら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７７（１９９１）の方法（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ中で製造されうる。Ｆｖ及びＦａｂはまた、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞中で、コードしているポリヌクレオチドを発現することにより製造されうる。また、多くの遺伝子と同様に、免疫グロブリン関連遺伝子は分離された機能的領域を含み、それぞれが１以上の別個の生物学的活性を有しているので、遺伝子は、新規な性質を有している融合蛋白質（例えば、イムノトキシン）を製造するために、他の遺伝子からの機能的領域（例えば、酵素、共通の譲渡人を有する米国特許シリアル番号第１３２，３８７号明細書（１９８７年１２月１５日出願）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照）に融合されうる。
バクテリア宿主中でのヒト化免疫グロブリン配列の発現は、ＣＤＲ領域を突然変異誘発し、かつＦａｓリガンドに対する高い親和性及び／又は高い特異的結合性を有するヒト化免疫グロブリンＣＤＲ変異型のためにスクリーニングされることができるバクテリオファージ表現（ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリーを製造することにより、より高い親和性のヒト化免疫グロブリン配列を選択するために有利に用いられ得る。このような鋭敏な親和性の潜在的な利点は、Ｆａｓリガンド以外の分子との結合親和性が改善された及び／又は交叉反応が減少されたヒト化免疫グロブリンＣＤＲ変異型の製造である。免疫グロブリン可変領域配列を有するファージディスプレイライブラリーを製造するための方法は、本技術分野において提供されており、例えば、セサリーニ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３０７：６６−７０（１９９２）；スイマーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３７５６−６０（１９９２）；グラムら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−８０（１９９２）；クラックソンら、ネーチャー  ３５２：６２４−８（１９９１）；スコット  アンド  スミス、サイエンス  ２４９：３８６−９０（１９９０）、ガラードら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ９：１３７３−１３７７（１９９１）（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）が参照される。得られた親和性が鋭敏化されたＣＤＲ変異型ヒト化免疫グロブリン配列は、次いで、効率的な発現に適した宿主中で発現される。
既に記したように、ＤＮＡ配列は、配列を発現制御配列に作動可能に連結（即ち、発現制御配列が機能することを保証するように配置）した後に、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして或いは宿主染色体ＤＮＡの肝要な部分として宿主中で複製可能である。通常、発現ベクターは、選択マーカー、例えばテトラサイクリン耐性（ｔｅｔR）、Ｇ４１８耐性（ｎｅｏR）、ミコフェノール酸耐性（ｇｐｔ）又はＨＳＶ−ｔｋを含み、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とする（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照）。
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な一つの原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主は、バチルス、例えば枯草菌、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチア、及び種々のシュードモナス種を含む。これらの原核生物宿主において、また発現ベクターを作ることもでき、該ベクターは、典型的には、宿主細胞と適合した発現制御配列（例えば、複製起点）を含む。更に、任意の数の種々の良く知られたプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はλファージからのプロモーター系が存在してもよい。プロモーターは、典型的には（場合によりオペレーター配列と共に）発現を調節し、そして、転写及び翻訳を開始し、完成させるためのリボソーム結合部位配列等を有する。
他の微生物、例えば酵母もまた発現のために用いられ得る。サッカロミセスは、発現制御配列、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素を含むプロモーター、及び複製起点、末端配列、及び所望の類似のものを有する適当なベクターを伴った好ましい宿主である。
植物又は植物細胞培養物が、本発明のヒト化免疫グロブリンの発現のために用いられ得る（ラリック  アンド  フライ、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２（４）：１７２−８９（１９９１）；ベンヴェヌトら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７（４）：８６５−７４（１９９１）；デューリンら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（２）：２８１−９３（１９９０）；ハイアットら、ネーチャー３４２：７６−８（１９８９）、これらの引例をもって本明細書の一部と成す）。好ましい植物宿主は、例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ  ルスチカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ）及びソラヌム  ツベロズム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）を含む。本発明のヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体がコードされるポリヌクレオチド配列を発現するための好ましい発現カセットは、その中で、ヒト化免疫グロブリン鎖をエンコードする挿入されたポリヌクレオチド配列が重複したエンハンサーとともにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに作動可能に連結されているところのプラスミドｐＭＯＧ１８である。ｐＭＯＧ１８は、シーモンズら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２１７−２２１（１９９０）（この引例をもって本明細書の一部と成す）の方法に従って用いられる。或いは、植物中でのヒト化免疫グロブリンの発現のための好ましい実施態様は、ハイアットらの方法（前掲）に従う。但し、本発明のヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体がコードされるポリヌクレオチド配列を、ハイアットら（前掲）によって用いられた免疫グロブリン配列に代えて用いる。アグロバクテリウム  ツミファシエンスのＴ−ＤＮＡに基づいたベクターもまた、ヒト化免疫グロブリン配列を発現するために用いられることができ、好ましくは、このようなベクターは、スペクチノマイシン耐性又は他の選択性マーカーがコードされるマーカー遺伝子を含む。
昆虫細胞培養物もまた、本発明のヒト化免疫グロブリンを製造するために用いられることができ、代表的には、バキュロウイルスに基づいた発現系が用いられる。ヒト化免疫グロブリンは、プトリッツら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６５１−６５４（１９９０）の方法（本引例をもって本明細書の一部と成す）に従って、ヒト化免疫グロブリンがコードされるポリヌクレオチド配列を発現することにより製造されうる。プトリッツらの方法に、本発明のヒト化抗Ｆａｓリガンド抗体をエンコードするポリヌクレオチド配列をプトリッツらのマウスモノクローナルＡｂ  ６Ａ４重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ配列の代わりに挿入するという変更を加えることができる。
微生物及び植物に加えて、哺乳動物細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現し、製造するために用いられ得る［ウイナッカー、遺伝子からクローンへ（ＶＣＨパブリッシャーズ、Ｎ．Ｙ．、１９８７）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照］。哺乳動物細胞は、実際に好ましい。なぜなら、完全な免疫グロブリンを分泌できる多くの適した宿主セルラインが本技術分野で開発されており、それらは、ＣＨＯセルライン、種々のＣＯＳセルライン、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマセルライン等、又は形質転換されたＢ細胞又はハイーブリドーマを含む。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（クイーンら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８（１９８６）、本引例をもって本明細書の一部と成す）、及び必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含む。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等から由来のプロモーターである。一般に、選択性マーカー、例えばｎｅｏＲ発現カセットは、発現ベクター中に含まれる。
本発明のヒト化免疫グロブリンがコードされるトランスジーンは、所望のヒト化免疫グロブリンを、典型的には、回収可能な体液、例えばミルク又は血清中に発現するトランスジェニック非ヒト動物を製造するために用いられ得る。このようなトランスジーンは、通常は連結されたエンハンサー、例えば齧歯類の免疫グロブリンエンハンサー又はカゼイン遺伝子プロモーター／エンハンサー（ブーラーら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１４０−１４３（１９９０）；メアデら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４４３−４４６（１９９０）、これらの引例をもって本明細書の一部と成す）と共に、プロモーターに作動可能に連結されたヒト化免疫グロブリンがコードされるポリヌクレオチド配列を含む。トランスジーンは、本技術分野で示されそして以下に記載された方法に従って、相同な組み換え構築物のために細胞及び胚中に移入されうる。好ましい非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ及びヤギを含み、ウシミルク中での発現が特に好ましい（ＷＯ９１／０８２１６（１９９１）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照）。ヒト化抗体の精製は、免疫グロブリン精製のための本技術分野で公知の精製方法により達成される。目的のＤＮＡセグメント（例えば、重鎖及び軽鎖がコードされる配列及び発現制御配列）を含むベクターは、宿主細胞のタイプに応じて変更を加えた良く知られた方法により宿主細胞中に移入されうる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、通常、原核生物細胞のために利用され、一方、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ウイルスに基づいたトランスダクション、又はエレクトロポレーションが他の細胞宿主のために用いられ得る。タングステン粒子バリスティックトランスジェネシスは、植物細胞及び組織のために好ましい［一般に、マニアティスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールド  スプリング  ハーバー  プレス、１９８２）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照］。
いったん発現されれば、本発明の、完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖、または免疫グロブリンの他の形態は、本技術分野の標準方法に従って精製されることができ、該方法は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む［一般に、スコープス、Ｒ．、蛋白質精製（スプリンガー−フェルラーク、Ｎ．Ｙ．、１９８２）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照］。薬学的用途のためには、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質上純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％或いはそれ以上の均質性が最も好ましい。いったん部分的に又は所望の均質性まで精製されると、その後、ポリペプチドは、治療用に（体外用途を含む）、又は検定方法、例えば免疫蛍光染色等の開発及び実行において用いられ得る。一般に、免疫学的方法、第Ｉ及びII巻（ルフコビッツ  アンド  ペルニス編、アカデミック  プレス、ＮＹ、１９７９及び１９８１）を参照することができる。
本発明の他の一つの態様において、モニター上に抗体の３次元イメージを示すコンピュータープログラムが提供される。例えば、ＵＮＩＸオペレーティングシステム下で動き、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を用いるシリコングラフィックスＩＲＩＳ  ４Ｄワークステーションが適している。コンピューターは、ヒト化抗体の変異体を作るのに有用である。一般に、本発明の抗体は既に、満足のいく結合親和性を提供している。しかしながら、なお強い結合親和性をもった抗体を、あるアミノ酸残基の更なる変更により同定できると見込まれる。３次元イメージはまた多くの重要でないアミノ酸を同定し、該アミノ酸は、抗体の結合親和性に検出されるほど影響しない同類置換の対象となりうる。全体的に、同類置換でさえ免疫グロブリンの特性に著しく影響するかもしれない。しかしながら、多くの個々の同類置換は、免疫グロブリンの特性を著しく損なうことはないようである。
本発明の他の一つの態様において、Ｆａｓリガンドに対するヒト抗体が提供される。これらの抗体は、下記する種々の技術により製造される。例えば、インビトロ免疫化法、トリオーマ方法論（オストベルグら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７（１９８３）；オストベルグ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；及びエングルマンら、米国特許第４，６３４，６６６）、およびヒト抗体遺伝子トランスジェニック非ヒト動物［ロンベルグら、ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；クッヒェルラパティー、ＷＯ９１／１０７４１（１９９１）］、などが応用でき、これらと慣用のケーラー−ミルステイン法を組み合わせて用いることによりヒトモノクローナル抗体が調製される。
また、ヒュースら、サイエンス、２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説されている通常のプロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。Ｆａｓリガンド又はそのフラグメントに結合する抗体が選択される。次いで、このような抗体（又は結合性フラグメント）がコードされる配列がクローン化され、増幅される。ヒュースによって記載されたプロトコルは、ファージ表現技術と組み合わせると更に効率的に変わる。例えば、ドワーら、ＷＯ９１／１７２７１及びマッカフェルティら、ＷＯ９２／０１０４７（これらの引例をもって、それぞれ本明細書の一部と成す）が参照される。これらの方法において、メンバーが、それらの外表面上に種々の抗体を発現するところのファージライブラリーが製造される。抗体は、通常、Ｆｖ又はＦａｂフラグメントとして表現される。所望の特異性を有する抗体を発現するファージは、Ｆａｓリガンドポリペプチド又はそのフラグメントに対する親和性の増大により選択される。
ファージ表現法の変法において、選択されたネズミ抗体の結合特異性を有するヒト抗体が製造されうる（ウインター、ＷＯ９２／２０７９１参照）。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体は、体液中や組織中に存在するＦａｓリガンドを検出するために使用することができる。また、Ｆａｓリガンドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＦａｓリガンドを検出するために使用することができる。
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体には細胞に対するＦａｓリガンドの作用を修飾、例えば促進または抑制するものが含まれる。
Ｆａｓリガンドが誘導するアポトーシスを抑制する効果を有する抗体を得るには、前記ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する過程で得られる血清や、ハイブリドーマの培養上清を、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現する細胞と、Ｆａｓ抗原を発現する細胞とを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系等にかけてスクリーニングする。スクリーニングの結果、選別された血清や培養上清から公知方法を組み合わせて目的の抗体を精製する。なお、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現する細胞とＦａｓ抗原を発現する細胞を利用したスクリーニング方法の好ましい例は、実施例で例示されるが、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３等にも詳述されている。また、特定のＦａｓリガンド、例えば実施例で示されているｎｄ３２、ｎｄ４２またはＬ１７９Ｆの少なくとも１つとの反応性、およびｎｄ４２またはｃｄ１７９の少なくとも１つとの非反応性を指標としてスクリーニングすることも可能である。
本発明の抗体又はそれらの混液を含む組成物は、予防的な及び／又は治療的な処置のために投与されうる。特に、Ｆａｓリガンドが誘導するアポトーシスを、高度に抑制することができる本発明の中和抗体は、生体におけるアポトーシスを調節するために使用することができる。たとえば、当該抗体はリウマチにおける関節組織の破壊、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における自己組織の破壊、あるいは糖尿病、インフルエンザ、エイズ、肝炎等の組織や細胞のアポトーシスが関与する疾患の治療薬として使用することができる。
一方、本発明の抗体の中でＦａｓリガンドの作用を促進する抗体は、エイズ感染初期の治療や、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖や自己免疫疾患における自己抗原反応性Ｔ細胞の増殖を抑制するため等、生体にとって不要な細胞を除去するために使用できる。
本発明の抗体及びそれらの薬学的組成物は、特に、非経口投与、即ち、皮下、筋肉内又は静脈内投与において有用である。本発明の抗体はまた、典型的には局所適用のために、胃瘻栄養法又は（胃）洗浄、腹腔内注入、眼軟膏剤、局所軟膏剤、頭蓋内注入（典型的には、脳室中に）、心膜内注入、又は内包（ｉｎｔｒａｂｕｒｓａｌ）注入によって投与されうる。非経口投与のための組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された免疫グロブリンの溶液又はそれの混液を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒトアルブミン溶液等が用いられ得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的には微粒子物質が存在しない。これらの組成物は、慣用の、良く知られた滅菌方法により滅菌されうる。組成物は、生理学的条件に近づけるために、要求に応じて、薬学的に許容できる補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝化剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含みうる。これらの製剤中の抗体の濃度は、広範囲に、即ち、約０．００５重量％未満（通常は、少なくとも約１重量％）から１５又は２０重量％と大きい量まで変化することができ、主として、選択された投与の特定の様式に従って、液容量、粘性等に基づいて選択される。
非経口投与組成物を調製するための現実の方法は、本技術分野の熟練者にとって公知又は明白であり、例えば、レミントンズ  ファーマシューティカル  サイエンス（第１５版、マック  パブリッシング  カンパニー、イーストン、ペンシルバニア、１９８０）（本引例をもって本明細書の一部と成す）に更に詳細に記載されている。洗浄（ｌａｖａｇｅ）又はその他のルートのために適した組成物は、意図される特定の使用に従って選択される。いくつかの薬学的組成物は、抗Ｆａｓリガンド抗体及びその疾患に於いて常用される他の治療剤を含みうる。いずれの場合も、ボラス投与および持続投与が適用されうる。また、予防的または治療的有効量は、対象疾患、病態および患者の状態等によって適宜決定される。
本発明の抗体は、貯蔵のため凍結又は凍結乾燥され、使用に先だって適当な担体中で再構成されうる。この技術は、慣例の免疫グロブリンにおいて有効であると知られており、公知の、凍結乾燥及び再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成が、様々な程度の抗体の活性損失をもたらしうる（例えば、慣例の免疫グロブリン、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも大きい活性損失を生じる傾向にある）ということ、及び使用レベルが、それを補うために調節されなけらばならないかもしれないということは、当業者にとって認識されることである。
本発明の好ましい薬学的組成物は、Ｆａｓリガンド発現細胞へ特定の薬剤等を送達するためのデリバリーシステムとしての、特に、Ｆａｓリガンド発現細胞を殺すための、イムノトキシン中での本発明の主体である免疫グロブリンの使用を含む。イムノトキシンは、２つの構成成分によって特徴づけられ、特に、インビトロ又はインビボで選択された細胞を殺すのに有用である。一つの構成成分は、細胞障害剤であり、それは、通常、付着された又は吸収されたときに細胞に対して致死的である。第二の構成成分は、「デリバリービヒクル」として知られており、特定の細胞タイプ、例えばＦａｓリガンドエピトープを発現している細胞に、毒性の薬剤をデリバリーする手段を提供する。２つの構成成分は、通常、種々の良く知られた化学的方法のいずれかにより、互いに化学的に結合されている。例えば、細胞障害剤が蛋白質でありかつ第二の構成成分が完全な免疫グロブリンである場合は、結合は、ヘテロ二価性の架橋物質、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等である。種々のイムノトキシンの製造は、本技術分野で良く知られており、例えば、「モノクローナル抗体−毒素コンジュゲート：不思議な弾丸を狙って」トルペら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，アカデミック  プレス、第１６８−１９０頁（１９８２）（本引例をもって本明細書の一部と成す）中に見ることができる。構成成分はまた、遺伝子的に連結されうる［チャウダリーら、ネーチャー３３９：３９４（１９８９）、本引例をもって本明細書の一部と成す、参照］。
種々の細胞障害剤が、イムノトキシンでの使用に適している。細胞障害剤は、放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１或いは他のヨウ素のアイソトープ、イットリウム−９０、レニウム−１８８及びビスマス−２１２或いは他のαエミッター、多くの化学療法剤、例えば、ビンデシン、メソトレキセート、アドリアマイシン及びシスプラチン、及び細胞障害蛋白質、例えば、リボソーム阻害蛋白質様ポークウィード抗ウイルス蛋白質、シュードモナスエキソトキシンＡ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖等、又は細胞表面で活性な薬剤、例えばホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーセＣ）を含みうる［一般に、共通の譲渡人を有する米国特許出願シリアル番号０７／２９０，９６８および０７／３１０，２５２号明細書、「キメラ毒素」オルスネス  アンド  フィル、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒｅ．、２５：３５５−３８１（１９８２）、及び癌の検出及び治療のためのモノクローナル抗体（バルドウィンとバイエルズ編、アカデミック  プレス、１９８５）、１５９−１７９頁、２２４−２２６頁、これら全ての引例をもって本明細書の一部と成す、参照］。
イムノトキシン中のデリバリー成分は、本発明の免疫グロブリンを含む。完全な免疫グロブリン又はそれらの結合性フラグメント、例えば、Ｆａｂ又はＦｖが好ましく用いられる。典型的には、イムノトキシン中の抗体は、ヒトＩｇＭ又はＩｇＧイソタイプであるが、他の哺乳動物定常領域が、所望により用いられ得る。
Ｆａｓリガンド自体を、治療や研究に使用するためには、当該蛋白質を高純度で、大量に生産することが必要になるが、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体はＦａｓリガンドの精製に有用である。特に本発明の中和抗体は生物活性を有するＦａｓリガンドと選択的に結合するため治療用の医薬として重要な、活性を保持したＦａｓリガンドを高純度にかつ効率よく精製することができる。
本発明の測定方法は、上記のようにして得た抗体を用いるステップを含むが、該ステップは、対象試料中の被検物質であるＦａｓリガンドと、上記のようにして得た抗体との抗原抗体反応による、対象試料中の被検物質をトラップする工程であることが好ましい。
本発明の測定方法における被検物質の検出原理は特に限定されないが、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等が例示される。この内、サンドイッチ法及び競合法が好ましく、特にサンドイッチ法が好ましい。
凝集法では、抗体を粒子、例えばラテックス粒子や赤血球（例えば羊赤血球）の表面に結合させて、Ｆａｓリガンドが存在すると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程度を指標としてＦａｓリガンドを測定する。
なお、この凝集法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイクロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。
また、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ケミルミネッセンスイムノアッセイ（化学発光免疫測定法）、フルオロイムノアッセイ（蛍光免疫測定法）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）等の原理で測定を行なうことができる。
以下に、本発明の測定方法の好適例の１つである、ＥＩＡの原理に基づく、サンドイッチ法、固相直接法、競合法を説明する。
ＥＩＡによるサンドイッチ法では、まず、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した、Ｆａｓリガンドを認識する抗体または２次抗体を準備する。特にポリペルオキシダーゼ標識した抗体は好ましい例である。また、使用する固相には、Ｆａｓリガンドを認識する抗体を吸着させておく。サンプル（試料）もしくはスタンダードを添加後、上述の酵素標識抗体を添加し、抗原抗体反応を行なわしめる。過剰の酵素標識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた発色基質、例えばオルトフェニレンジアミンとＨ2Ｏ2、ｐ−ニトロフェニルリン酸、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等を加えて酵素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサンプル中のＦａｓリガンドに依存するので、発色最終産物の量を測定することによりＦａｓリガンドを定量することができる。
固相直接法では、サンプル（試料）を直接固相に吸着させ、固相のＦａｓリガンド非吸着面を、その測定系には影響しないタンパク質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などでブロッキング処理し、次いでＦａｓリガンドを認識する酵素標識抗体を添加し、反応させる。以降は、サンドイッチ法と同様の操作を行ない、サンプル中のＦａｓリガンドの有無を判定するか定量を行う。
競合法では、使用する抗体が認識する一定量のＦａｓリガンドを直接固相に吸着させ、次いでブロッキング処理した後、ここに、Ｆａｓリガンドを認識する酵素標識抗体とサンプル（試料）とを添加する。一定時間反応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添加による、酵素標識抗体の固相Ｆａｓリガンドへの結合阻害度を測定することにより、サンプル中のＦａｓリガンドを定量する。
なお、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識したＦａｓリガンドをサンプルと同時に添加し、サンプル添加による標識物の固相化抗体への結合阻害度を測定することにより、サンプル中のＦａｓリガンドを定量してもよい。
上記以外の方法として、抗原抗体反応を液相中で行ない、後に、抗体を用いた凝集沈降法もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合したＦａｓリガンドと結合しなかったＦａｓリガンドを分離し定量する方法もある。また、Ｆａｓリガンドを認識する抗体を標識するのではなく、その抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体反応を行なわせて、Ｆａｓリガンドを測定することも可能である。
サンドイッチ法、固相直接法、競合法のいずれにおいても、標識酵素−発色基質の組合せを、標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素−蛍光基質等の組合せに変えることが可能である。この場合の、酵素−発光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ＡＭＰＰＤ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ルミノール、ルシフェラーゼ−ルシフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ウンベリフェリルフォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ｐ−ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。
さらに、上記３種の測定方法において、酵素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、サンプル中のＦａｓリガンドを測定することも可能である。
放射性物質としては、125Ｉや131Ｉ等が一般に使用されており、化学発光物質の代表的な物には、アクリジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光照射後にそのキレート剤に結合する希土類金属から発せられる蛍光の強度を時間分解的に測定することにより、試料中のＦａｓリガンドを測定する方法（時間分解蛍光免疫測定法）も有用である。なお、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあげられる。
本発明の測定方法は、以上説明したように、試料中のＦａｓリガンドを検出または測定することを目的としている。この場合、対象試料は動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片があげられるが、体液であることが好ましい。より好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、腹水、胸水より選ばれる試料である。
本発明の測定方法を用いて健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中のＦａｓリガンドを測定することができる。また、初めて体液中のＦａｓリガンド濃度が明らかとなり、特定の疾患においてＦａｓリガンド濃度が変動することも明らかとなった。
なお、本発明の測定試薬及びキットは、上記した測定方法の構成等に準拠することができる。
実施例
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
なお、以下に示す実施例中の諸操作は、主にサムブルック等編〔モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版〕コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９年；今本文男等編〔組換え遺伝子の細胞への導入と発現〕蛋白質核酸酵素臨時増刊２８（１４）１９８３年；岡田善雄監修〔細胞工学的技術総集編〕実験医学臨時増刊７（１３）１９８９年等を参考として実施した。
１．抗Ｆａｓリガンドペプチド抗体の作製
１−１抗原ペプチドの選択
図１に示すように、配列表の配列番号９のＦａｓリガンド細胞外領域中に想定しうるエピトープの解析を行った。Ｆａｓリガンド細胞外領域のアミノ酸配列と相同性が高いタンパク質を、生体高分子立体構造のデータベースであるＰＲＯＴＥＩＮ  ＤＡＴＡ  ＢＡＮＫ（ＰＤＢ）から、ＢＩＯＳＹＭ社製、Ｈｏｍｏｌｏｇｙモジュール中のＦＡＳＴＡプログラムによって検索した。その結果、ＴＮＦ−α（ＰＤＢ−１Ｄ  １ＴＮＦおよび２ＴＵＮ）が、全体構造的に相同性の高いことが判明した。そこで、これらのＴＮＦ−α立体構造を参照タンパク質として、Ｆａｓリガンド細胞外領域のモデリングを行った。モデル構造構築において基盤構造とする構造保存領域の抽出は、ＴＮＦ−α各単量体構造をα炭素によって重ね合わせ、構造上のずれが１オングストローム以内であり、かつＸ線結晶解析において温度因子が２０以下となるような領域に設定した。構造保存領域に結合させる可変領域は、挿入欠失のある場合に限り、ＰＤＢ中の適当な構造を検索した。構造の構築には、ＢＩＯＳＹＭ社製、Ｈｏｍｏｌｏｇｙモジュールを使用した。構築した初期構造の置換の入った側鎖に関して、その配座のグローバルミニマムサーチを行った後、ＢＩＯＳＹＭ社製の計算ソフトウエアＤｉｓｃｏｖｅｒを用いて構造最適化計算をかけＦａｓリガンド細胞外領域モデル構造を得た。得られたモデル構造を用いて分子表面に露出している構造領域、ＴＮＦ−α各単量体構造の重ね合わせにおいて構造のずれが大きい領域、ＴＮＦ−αの温度因子が大きい領域を抗体に認識されやすいエピトープを含む領域として選択した。次に、モデル構造の二次構造情報などから、それらの領域のペプチドを合成した際にそのペプチドが抗原構造を維持しやすいように考慮して配列表の配列番号１〜８のペプチド８種類のアミノ酸配列を選択した。図１に、選択した８種類のペプチドのアミノ酸配列を示した。合成ペプチドは、キャリアーと結合させるためペプチドのＣ末端にＳＨ基を持つシステインを導入した。配列表の配列番号１〜８の配列は、このシステインを持たない配列で表している。
１−２抗血清の作製
図１記載のペプチドのアミノ酸配列に基づき、配列表の配列番号１〜８のペプチドを株式会社不二家バイオサイエンス研究所に依頼して合成した。ここで、図１に示すように配列番号１〜８のアミノ酸配列に対応するペプチド番号をＭ５２〜Ｍ５９として、以下この記載を用いる。また、キャリアーとしてのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）へのマレイミド法による結合およびウサギへの免疫は株式会社免疫生物研究所に依頼した。
１−３抗血清の評価
投与したペプチドに対する抗体価の上昇は株式会社免疫生物研究所において、固相化したペプチドと抗血清との反応性を測定することにより確認した。その結果、投与した８種類のペプチドに対する各々の抗血清は約６０００倍〜２４０００倍の希釈倍率で固相化した対応するペプチドと反応した。
次に、ヒトＦａｓリガンドに対して結合するか否かを確認するため、ウエスタンプロッティングを行った。後述する４−１に記載のＦａｓリガンド細胞外領域を含む培養上清１０μｌをゲルローディングバッファー（ＳＥＰＲＡＳＯＬ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と等量混合し３７℃で１時間処理した。この溶液２μｌを４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（テフコ社）の各ウエルにアプライし、２５ｍＡにて室温で約１時間泳動した。泳動終了後、ＰＤＶＦメンブレン（ミリポア社）に４℃にて２００ｍＡ、９０分の条件で転写した。メンブレンを原液のブロッキング剤（ブロックエース、雪印乳業（株））で室温１時間振とうしブロッキングを行ったのち、各レーンを裁断した。各レーンを０．５％ＢＳＡを添加した０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０７６Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ６．４）（以下、Ｔ−ＰＢＳと略す）で各々５００倍に希釈した各抗血清１ｍｌに浸し、室温にて１時間振とうした。反応終了後、各レーンをＴ−ＰＢＳで２回洗浄し、次に１０％ヤギ血清を添加したＴ−ＰＢＳで５００倍に希釈したＨＲＰＯ標識抗ウサギＩｇｓ抗体（ダコ社）１ｍｌに浸し、室温にて１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＣＬシステム（アマーシャム社）で検出した。また、プレートに結合したＦａｓリガンド細胞外領域との反応性をプレートアッセイ（固相直接法）にて確認した。まず、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に０．０７６Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ６．４）（以下、ＰＢＳと記す）で０〜２５ｎｇ／ウエルに希釈した後述の４−１に記載の部分精製Ｆａｓリガンド細胞外領域を５０μｌ分注し、４５℃で３０分間処理しＦａｓリガンド細胞外領域を結合した。イオン交換水で５回洗浄後０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ／ウエル添加し、ブロッキングした。ブロッキング剤を除去後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した抗血清を添加し３７℃で１時間反応させた。次に０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、１０％ヤギ血清／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰＯ標識抗ウサギＩｇｓ抗体（ダコ社）を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃で１時間反応した。反応終了後、洗浄液で５回、イオン交換水で２回洗浄し、３ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミンと０．０２７％過酸化水素を含む０．１Ｍマッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）５０μｌを添加し５分間反応後、１Ｎ塩酸５０μｌで反応を停止し４９０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、Ｆａｓリガンドによるアポトーシス誘導活性に与える影響について51Cｒリリースアッセイ法を用いて検討した。１０6個のＷＣ８細胞を２０μＣｉの（51Cｒ）クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３７℃で２時間培養し、51Cｒで標識した。次に51Cｒで標識した細胞を１×１０4個含む反応液中に、抗血清を終濃度５００倍希釈となるように添加し、さらにＣＯＳ−１細胞由来のＦａｓリガンド細胞外領域の培養上清（Ｆａｓリガンド細胞外領域濃度約０．９μｇ／ｍｌ相当）を終濃度１０％で添加し、３７℃で４時間培養後、51Cｒの遊離を指標にアポトーシス誘導活性を測定した。表１は各抗血清のＦａｓリガンドに対する結合活性とアポトーシス誘導活性への効果を示している。ウエスタンプロッティングではＭ５２およびＭ５７ペプチドを投与し作製した抗血清はＦａｓリガンド細胞外領域と結合した（＋）が、他の抗血清は結合しなかった（−）。一方、プレートアッセイでは各抗ペプチド抗血清のうち、Ｍ５２またはＭ５７ペプチドを投与して得られた抗血清はＦａｓリガンドと強く（＋＋）反応し、Ｍ５３またはＭ５４ペプチドを投与して得られた抗血清にも反応性（＋）が認められた。また、アポトーシス抑制活性はどの抗血清にも認められなかったが、Ｍ５２ペプチドを投与した抗血清にはＦａｓリガンドのアポトーシス誘導活性を促進する効果が認められた。
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１−４抗血清の精製
Ｍ５２およびＭ５７ペプチドを投与して得られた抗血清５ｍｌを塩析法とイオン交換カラム法により精製した。まず、各血清５ｍｌに等量の０．１５Ｍ  ＮａＣｌを添加した後、攪拌しながら希釈前の血清と等量の飽和硫安を滴下した。室温で３０分間攪拌し、さらに３０分間静置した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた沈殿を０．０２Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ６．３）５ｍｌに溶解後、透析した。遠心して不純物を除去した後、同じバッファーで平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２、ＷＨＡＴＭＡＮ社）１０ｍｌを充填したカラムにアプライした。未吸着分画を回収し、さらに５０ｍｌのバッファーで洗浄し、未吸着分画と混合した。得られたＩｇＧを含有する溶液をダイアフローＰＭ１０メンブレン（アミコン社）を用いて濃縮し、Ｍ５２およびＭ５７のペプチドを投与して得られたそれぞれの抗血清から精製抗体を得た。タンパク濃度を２８０ｎｍの吸光度より算出した。
２．抗Ｍ５２ペプチドモノクローナル抗体の作製
２−１投与抗原の調製およびマウスの免疫
Ｍ５２ペプチド１．１ｍｇを０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）１１０μｌに溶解し、マレイミド化ＫＬＨ（ベーリンガーマンハイム社）１．５４ｍｇを蒸留水１５４μｌで溶解した。両者を混合し、室温にて２時間反応させた後、生理食塩水で平衡化したＮｉｃｋカラム（ファルマシア社）で精製し、投与抗原を得た。
調製した投与抗原７０μｇを生理食塩水で０．１ｍｌに希釈し等量のフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と混合し，ｄｄＹマウス（５週令、雌）の腹腔に投与した。２週間後、同量をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と混合し同様に投与した。
２−２抗血清の評価
投与１週間後、眼底より採血し、Ｆａｓリガンド細胞外領域との結合を確認した。まず、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に０．０７６Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ６．４）（以下、ＰＢＳと略す）で０〜１００ｎｇ／ウエルに希釈した後述の４−１に記載の部分精製Ｆａｓリガンド細胞外領域を５０μｌ分注し、４５℃で３０分間処理しＦａｓリガンド細胞外領域を結合した。イオン交換水で５回洗浄後０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ／ウエル添加しブロッキングした。ブロッキング剤を除去後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した抗血清を添加し３７℃で１時間反応させた。次に０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、１０％ウサギ血清／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ社）を５０μｌ／ウエル添加し３７℃で１時間反応した。反応終了後、洗浄液で５回、イオン交換水で２回洗浄し、３ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミンと０．０２７％過酸化水素を含む０．１Ｍ  マッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）５０μｌを添加し５分間反応後、ｌＮ  塩酸５０μｌで反応を停止し４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、Ｍ５２ペプチドを投与して得られたマウス抗血清はＦａｓリガンド細胞外領域と強い反応性を示した。
２−３モノクローナル抗体の作製
２−１で得られた投与抗原７０μｇを生理食塩水４００μｌに希釈し、抗体価の上昇したマウスの尾静脈に投与し、３日後、「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」記載の方法に従い細胞融合を行った。６日後、培養上清中の抗体を２−２記載の方法によりスクリーニングし、反応性の得られたウエルを「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」記載の限界希釈法によりクローニングした。クローニング後、再度スクリーニングを行い、Ｆａｓリガンドと反応する抗Ｍ５２ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２０クローン（Ｆ９１８シリーズ）を得た。後述のＦ９１８−４−５（ＩｇＧ１／λ）、Ｆ９１８−２−４（ＩｇＧ１／λ）、Ｆ９１８−７−３（ＩｇＧ１／κ）、Ｆ９１８−９−４（ＩｇＧ１／λ）、Ｆ９１８−１７−１（ＩｇＧ１／κ）、Ｆ９１８−２０−２（ＩｇＧ１／λ）およびＦ９１８−２３−１（ＩｇＧ１／κ）がＦ９１８シリーズに含まれる。得られたハイブリドーマのサブクラスはＩｇＭ／κ３クローン、ＩｇＧ１／κ６クローン、ＩｇＧ１／λ９クローン、ＩｇＧ２ｂ／λ１クローン、ＩｇＧ２ｂ／κ１クローンであった。ハイブリドーマを無血清培地（ＰＨＦＭ−II、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）で培養し、培養上清を６０％飽和硫安で塩析後、ＩｇＧはプロテイン−Ａカラム（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ社）で精製し、精製抗体を得た。蛋白濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。
２−４抗体の評価
得られた精製抗体（抗体濃度３μｇ／ｍｌ）２ロット（Ｆ９１８−７−３およびＦ９１８−９−４）とＦａｓリガンド細胞外領域との結合を１−３記載の方法に準じてウエスタンプロッティングにより確認した。ここでは、後述する４−１に記載の精製Ｆａｓリガンド細胞外領域（図２に示すピキア（Ｐｉｃｈｉａ）酵母由来Ｆａｓリガンド細胞外領域）、実施例の５−１に記載のＣＯＳ−１細胞由来遊離型Ｆａｓリガンドおよび実施例の３に記載のＣＯＳ−１細胞由来Ｆａｓリガンド細胞外領域を用いた。２次抗体としてＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ社）を用い、検出にはＴＭＢ試薬（ＳＣＹＴＥＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。図２に示すように、Ｆ９１８−９−４では分子量約３万付近に酵母由来のＦａｓリガンド細胞外領域、ＣＯＳ−１由来のＦａｓリガンド細胞外領域および遊離型Ｆａｓリガンドでバンドが検出されＦａｓリガンドと結合していることが確認された。一方、Ｆ９１８−７−３では酵母およびＣＯＳ−１由来のＦａｓリガンド細胞外領域にはバンドが検出されたが、遊離型Ｆａｓリガンドにはバンドが検出されなかった。次に、Ｆａｓリガンドのアポトーシス誘導活性に与える影響を１−３記載の方法に従って検討した。図３に示すようにＦ９１８−９−４はアポトーシス誘導活性を変化させなかったが、Ｆ９１８−７−３にはアポトーシス誘導促進活性が認められた。これよりＭ５２ペプチドを投与したモノクローナル抗体中に少なくとも２種類以上の特異性の異なる抗体が存在することが明らかになった。
３．抗Ｆａｓリガンド抗体の作製
３−１投与抗原の調製及びマウスの免疫
投与抗原はＣＯＳ−１細胞に発現させて後述する方法で調製したＦａｓリガンド細胞外領域を使用した。ＣＯＳ−１細胞由来のＦａｓリガンド細胞外領域は、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載のプラスミドｐＭ１０７０をＣＯＳ−１細胞へ導入した形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０を用いて作製した。すなわち、８．１μｇのｐＭ１０７０を４０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下、ＴＥバッファーと略す）溶液に溶解した。これに、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥーデキストランおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１ｍｌを含有するＤ−ＭＥＭ（日本製薬（株））１１．３ｍｌを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を作製した。
１５０ｃｍ2のルーフラスコ内でセミコンフルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を滴下し、５％ＣＯ2存在下で３７℃にて培養し、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０を得た。４時間後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を除去し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、アーバインサイエンテイフィック社）を含有するＤ−ＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。その後、培地をｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  Ｄ−ＭＥＭ（ＦＢＳ，ＢＳＡ無添加）に交換し、さらに９６時間培養した後、培養上清を回収した。
培養上清は１２００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿物を除去し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。次にダイアフローＰＭ１０メンブレン（アミコン社）を用いて１０倍に濃縮し、２．５ｍｌ（２２．５μｇ相当）をＰＤ１０カラム（ファルマシア社）を用いてゲルろ過し、ボイドに溶出される分画３．５ｍｌを回収した。回収した分画をセントリコン−１０（アミコン社）で４００μｌに濃縮し、初回投与抗原とした。また、１０倍濃縮した培養上清３００μｌを４−２０％調整用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−Ｄ、テフコ社）により泳動し、分子量マーカー（プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬｏｗ、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ社）を参考にして３万付近のゲルを切り出し粉砕し、生理食塩水中で一晩振とうしてＦａｓリガンド細胞外領域を抽出した。抽出液をセントリコン−１０（アミコン社）で２００μｌに濃縮したものを追加および最終投与抗原とした。
マウスの免疫は、まず初回投与用抗原２００μｌを等量のフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と混合し、ｄｄＹマウス（５週令、雌）の腹腔に投与した。２週間後、追加投与用抗原１００μｌを等量のフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と混合し同様に投与した。
３−２抗血清の評価
追加投与１週間後に眼底より採血し、抗血清とヒトＦａｓリガンドとの結合を２−２記載の方法に従って測定した。図４が示すように、ＣＯＳ−１由来の部分精製Ｆａｓリガンド細胞外領域を投与したマウス（８−２）の抗血清は抗血清の希釈倍率に依存した吸光度の上昇がみられ、酵母由来Ｆａｓリガンド細胞外領域と結合することが確認された。また、１−３記載の方法に従いアポトーシス誘導活性に対する効果を検討したところ、強い抑制活性が認められた。
３−３モノクローナル抗体の作製
酵母由来Ｆａｓリガンド細胞外領域との結合活性が確認されたマウス（８−２）に３−１記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥで調製したＦａｓリガンド細胞外領域２００μｌを腹腔内に投与し、３日後「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」記載の方法に従い細胞融合を行った。６日後、培養上清のスクリーニングを２種類の方法を用いて行った。すなわち、２−２記載の方法によりＦａｓリガンドとの結合を測定した。また、１−４記載の抗Ｍ５２ペプチド抗体とサンドイッチが可能な抗体を取得する目的でサンドイッチＥＩＡ系によるスクリーニングも平行して行った。まず、１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈したＤＥＡＥ精製ウサギ抗Ｍ５２ペプチド抗体を５０μｌ／ウエルづつイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に分注し、４５℃で３０分間処理し抗体を結合した。イオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ１００μｌを各ウエルに添加し室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング液を廃棄した後、後述の４−１に記載の部分精製Ｆａｓリガンド細胞外領域２００ｎｇ／ｍｌを２５μｌ加え、さらに培養上清２５μｌを添加した。３７℃で１時間反応後２回洗浄液で洗浄し、次に１０％ウサギ血清／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ社）を５０μｌ添加し３７℃で１時間反応した。洗浄液で５回洗浄後、さらにイオン交換水で２回洗浄し、０．０２７％過酸化水素を含む３ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン／０．１Ｍマッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）を５０μｌ添加し１０分間反応させ、１Ｎ塩酸５０μｌで反応を停止した。吸光度計により４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、両方法で４−１記載の可溶型Ｆａｓリガンドと反応する培養上清１ウエルを得た。反応性の得られたウェルを「単クローン抗体実験操作入門、安東民衛・千葉丈著、講談社サイエンティフィク」記載の限界希釈法によりクローニングした後、同様にスクリーニングを行いＦａｓリガンド細胞外領域と反応し、抗Ｍ５２ペプチド抗体とサンドイッチが可能な抗体Ｆ９１９−９−１８（ＩｇＧ２ｂ／κ）を産生するハイブリドーマ１クローンを得た。
３−４抗体の評価
Ｆ９１９−９−１８抗体のアポトーシス抑制活性を１−３記載の方法に従い測定した。図５から明らかなように、Ｆ９１９−９−１８は、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１５および１６に記載の抗Ｆａｓリガンド抗体Ｆ８８３−１−１よりも百倍以上強い抑制活性を示し、この抑制活性は国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１に記載のｈＦａｓ−Ｆｃよりも強いものであった。
４．サンドイッチＥＩＡ系の作製
４−１標準品の作製
標準品として用いるＦａｓリガンド細胞外領域は以下のように調製した。
（１）配列表の配列番号９のヒトＦａｓリガンド細胞外領域１７９アミノ酸をコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＭ１２８３の構築
まず、センスプライマー１（ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧ）およびアンチセンスプライマー１（ＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡ）を化学合成した。センスプライマー１は、ピキア酵母発現用プラスミドｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のα−ｆａｃｔｏｒシグナル配列の一部をコードする塩基配列、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端配列、およびＸｈｏＩサイト（ＣＴＣＧＡＧ）を含む。アンチセンスプライマー１は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＣ末端部分をコードする塩基配列、終始コドン（ＴＡＧ）およびＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を含む。
得られたプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載の、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域１７９アミノ酸をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭ１０７０を５０ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｎｍｏｌ、２．５ユニットのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと添付のＰｆｕバッファー１０μｌ（共にストラタジーン社）を含む１００μｌの溶液を調製した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、パーキンエルマー社）を使用して、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとするＰＣＲを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで二重消化し、ｐＰＩＣ９のＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１２８３と命名した。２０μｇのｐＭ１２８３をＢｇｌＩＩで消化することにより直鎖状にし、ピキア酵母の形質転換に用いた。
（２）ピキア酵母の形質転換
ピキア酵母ＧＳ１１５株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＹＰＤプレート（１％（ｗ／ｖ）バクト  イーストイクストラクト／２％（ｗ／ｖ）ペプトン／２％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース／２％  バクト  アガー）に植込み、３０℃で２日間培養した後、単一コロニーを１０ｍｌのＹＰＤ（１％（ｗ／ｖ）バクト  イーストイクストラクト／２％（ｗ／ｖ）ペプトン／２％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース）に植込んだ。３０℃、２００ｒｐｍで終夜振とう培養後、１０μｌを５００ｍｌのマイヤーに入れた２００ｍｌのＹＰＤに植込み、さらに３０℃、２００ｒｐｍで終夜振とう培養することによりＯＤ６００値が０．２〜０．３の酵母培養液を得た。
酵母培養液を１，５００ｘｇ、室温で５分間遠心分離後、酵母を２０ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁して洗浄し、１，５００ｘｇで５分間遠心分離した。同様の操作でさらに酵母を２０ｍｌのＳＥＤバッファー（０．９５Ｍ  ソルビトール／２３．７５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）／５０ｍＭ  ＤＴＴ）で１回、２０ｍｌの１Ｍ  ソルビトールで１回洗浄した後、２０ｍｌのＳＣＥバッファー（１Ｍ  ソルビトール／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ塩酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．８）に再懸濁した。７．５μｌの３ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０ｍｌの酵母懸濁液に添加し、３０℃で９分間インキュベートすることにより、５％ＳＤＳ中におけるＯＤ６００値の低下を指標として、７０％の酵母をスフェロプラスト化した。７５０ｘｇで１０分間遠心分離後、１０ｍｌの１Ｍ  ソルビトール溶液で１回、１０ｍｌのＣａＳ溶液（１Ｍ  ソルビトール／１０ｍＭ  トリス塩酸、ｐＨ７．５／１０ｍＭ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ2））で１回洗浄した後、０．６ｍｌのＣａＳ溶液に懸濁した。
０．１ｍｌのスフェロプラスト溶液に１０μｇの直鎖状ｐＭ１２８３を添加し、室温で１０分間インキュベートした。１ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＣａＴ（２０％（ｗ／ｖ）  ＰＥＧ３３５０／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2）溶液を添加し、室温で１０分間インキュベートした後、７５０ｘｇで１０分間遠心分離した。１５０μｌのＳＯＳ溶液（１Ｍ  ソルビトール／０．３Ｘ  ＹＰＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2）をペレットに添加し、室温で２０分間インキュベートした後、８５０μｌの１Ｍ  ソルビトールを添加した。
４５℃に保温した１０ｍｌのヒスチジンを含まないＲＤ溶液（０．１８６ｇ／ｍｌ  ソルビトール／２０ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−グルコース／１３．４ｍｇ／ｍｌイースト  ナイトロジエン  ベース／０．４μｇ／ｍｌ  ビオチン／５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン酸／５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−メチオニン／５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−リジン／５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ロイシン／５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−イソロイシン／１％  アガー）に上記の溶液を１００μｌ添加後、ＲＤＢプレート（２％アガー／ＲＤ溶液）に重層し、３０℃で４日間培養した。得られた形質転換体をＭＭプレート（１３．４ｍｇ／ｍｌ  イースト  ナイトロジエン  ベース／０．４μｇ／ｍｌ  ビオチン／０．５％  メタノール／１．５％  アガー）およびＭＤプレート（１３．４ｍｇ／ｍｌ  イースト  ナイトロジエン  ベース／０．４μｇ／ｍｌ  ビオチン／２％  Ｄ−グルコース／１．５％  アガー）に植込み、３０℃で２日間培養した。培養後ＭＤプレートでは増殖し、ＭＭプレートではほとんど増殖しない形質転換体を選択し発現に用いた。
（３）ヒトＦａｓリガンド細胞外領域の酵母を用いた生産
（２）で作製した形質転換体を５０ｍｌの試験管に入れた１０ｍｌのＢＭＧＹ（１％（ｗ／ｖ）  イーストイクストラクト／２％（ｗ／ｖ）  ペプトン／１３．４ｍｇ／ｍｌ  イースト  ナイトロジエン  ベース／０．４μｇ／ｍｌ  ビオチン／１％（ｖ／ｖ）  グリセロール／０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー，ｐＨ６．０）中で３０℃で２日間振とう培養を行い、さらに５００ｍｌマイヤーに入れた１００ｍｌのＢＭＧＹ中に培養液を２ｍｌずつ添加し振とう培養することにより、ＯＤ６００値が１０〜２０の培養液２Ｌを得た。４０００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離を行うことにより酵母を採取し、４００ｍｌのＢＭＭＹ（１％（ｗ／ｖ）  イースト  イクストラクト／２％（ｗ／ｖ）  ペプトン／１３．４ｍｇ／ｍｌ  イースト  ナイトロジエン  ベース／０．４μｇ／ｍｌ  ビオチン／０．５％（ｖ／ｖ）  メタノール／０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー，ｐＨ６．０）に懸濁した。５００ｍｌマイヤー８本にそれぞれ５０ｍｌずつ分注し、さらに３０℃で２日間振とう培養を行い、１３，０００ｘｇ、１０分間遠心分離を行うことによりヒトＦａｓリガンド細胞外領域を含む培養上清を得た。
次に０．２２μｍのフイルターでろ過した培養上清５０ｍｌを８０％飽和硫安により塩析し、４℃で１時間放置後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿を回収した。沈殿を０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０６７Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に溶解し、透析した。透析後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、さらに０．２２μｍのフイルターで不純物を除去した。２ｍｌをゲルろ過カラム（Ｈｉｐｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ、ファルマシア社）にアプライし０．５ｍｌの流速で溶出した。溶出液を２ｍｌづつフラクションにとり、２８０ｎｍの吸光度より蛋白質を検出し、１−３に記載の方法により各フラクション３０μｌを用いてアポトーシス誘導活性を測定した。また、２−１記載の方法に従い各フラクション５０μｌをイムノプレートに感作し抗Ｍ５２ペプチド抗体でＦａｓリガンドを検出した。図６はゲルろ過のチャートを示しており、抗Ｍ５２ペプチド抗体では２カ所のフラクションに抗体結合活性が認められたが、アポトーシス誘導活性は低分子量側のフラクションにのみ認められた。活性の認められたフラクションを４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（テフコ社）により検定したところ、Ｆａｓリガンド細胞外領域の分子量である３万付近のバンドはアポトーシス誘導活性を示した低分子量側のフラクションにのみ認められ、高分子量側のフクションには分子量１４万以上のバンドが検出され、この分画はＦａｓリガンドが凝集したものと推定された（以下、酵母Ｆａｓリガンド凝集物ということがある）。アポトーシス誘導活性のあるフラクションを集め、セントリコン−１０（アミコン社）で濃縮し、ＢＳＡを標準品としてプロテインアッセイ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ社）で濃度を算出した。これを部分精製品とした。
精製Ｆａｓリガンド細胞外領域は酵母由来の培養上清を８０％飽和硫安で塩析後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析し、ｈＦａｓ−Ｆｃを結合したプロテインＡ−セルロファイン（チッソ（株）社）アフィニティーカラム（５ｍｌ）にアプライし以下のようにして得た。なお、該アフィニティーカラムは、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１に記載のｈＦａｓ−ＦｃをプロテインＡ−セルロファイン（チッソ（株）社）の添付文書に記載の方法に従い作製した。洗浄後、２Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、２８０ｎｍのピークを回収し、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に透析した。次に、Ｍｏｎｏ  Ｓ（ＨＲ５／５、ファルマシア社）にアプライし、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）で溶出し、２８０ｎｍのピークを回収しセントリコン−１０（アミコン社）で濃縮した。ＰＢＳで透析し、ＢＳＡを標準品としてＬｏｗｒｙ法により蛋白濃度を算出した。精製Ｆａｓリガンド細胞外領域３８μｇ（蛋白濃度３００μｇ／ｍｌ）を得た。
４−２ポリクローナル抗体によるサンドイッチＥＩＡ系の作製
ＤＥＡＥ精製ウサギ抗Ｍ５２ペプチド抗体と抗Ｆａｓリガンド抗血清（ロット８−２）を用いてサンドイッチＥＩＡ系を作製した。まず、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したＤＥＡＥ精製ウサギＭ５２ペプチド抗体を５０μｌ／ウエルづつイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に分注し、４５℃で３０分間処理し結合した。イオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ／ウエル添加し室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング液を廃棄した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した精製Ｆａｓリガンド細胞外領域０〜２５０ｎｇ／ｍｌを２５μｌ加え、さらに０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで５００倍に希釈した抗Ｆａｓリガンド抗血清（ロット８−２）を２５μｌ添加した。３７℃で１時間反応後、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％  ＮａＣｌで年２回洗浄し、次に１０％ウサギ血清／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ社）を５０μｌ添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄液で５回洗浄後、さらにイオン交換水で２回洗浄し、０．０２７％過酸化水素を含む３ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン／０．１Ｍマッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）を５０μｌ添加し１０分間反応させ、１Ｎ塩酸５０μｌで反応を停止した。吸光度計により４９０ｎｍの吸光度を測定した。図７は作成した標準曲線を示している。本系は、Ｆａｓリガンドを高感度かつ定量的に測定可能と考えられた。
４−３モノクローナル抗体によるサンドイッチＥＩＡ系の作製
モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系は以下のように作製した。
まず、中根ら（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｗ．Ｋｎａｐｐ，Ｋ．Ｈｏｌｕｂａｒ  ａｎｄ、Ｇ．Ｗｉｃｋ  ｅｄｓ．１９７８）の方法に従い、モノクローナル抗体をペルオキシダーゼで標識した。すなわち、ペルオキシダーゼ（ＲＺ３．１１、東洋紡（株））を６ｍｇ秤量し、１．５ｍｌの蒸留水で溶解した。次に蒸留水で溶解した０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを０．３ｍｌ添加し室温で１５分間静置し、続いて蒸留水で溶解した１．５％エチレングリコール０．３ｍｌを添加し室温で２０分間静置した。この溶液を０．００１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ４．４）に対して４℃で一夜透析した。
得られた活性化ペルオキシダーゼ１２７μｌ（ペルオキシダーゼ４００μｇ相当）に１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）を７μｌ添加し、続けて０．０１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で透析した精製モノクローナル抗体（２〜３ｍｇ／ｍｌのもの）５００μｇ相当を添加し２５℃にて２時間反応させた。次に、０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で溶解した４ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムを１２μｌ添加し４℃で２時間静置した。次に０．０７６ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．４）に対して４℃で一夜透析し、得られたペルオキシダーゼ標識抗体に半量の１８％シュークロース、０．３％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し−２０℃にて保存した。
次に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したＦ９１８シリーズまたはＦ９１９−９−１８モノクローナル抗体を５０μｌ／ウエルずつイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に分注し、４５℃で３０分間処理し抗体を結合させた。イオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング液を廃棄した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した精製Ｆａｓリガンド細胞外領域０〜１００ｎｇ／ｍｌを２５μｌ加え、次に１０％ウサギ血清／ＰＢＳで０．５〜２μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰＯ標識抗体（Ｆ９１８シリーズあるいはＦ９１９−９−１８）を２５μｌ添加し３７℃で１時間反応させた。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％  ＮａＣｌ洗浄液で５回洗浄後さらにイオン交換水で２回洗浄し、０．０２７％過酸化水素を含む３ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン／０．１Ｍマッキルベインバッファー（ｐＨ５．０）を５０μｌ添加し１０分間反応させ、１Ｎ塩酸５０μｌで反応を停止した。吸光度計により４９０ｎｍの吸光度を測定した。表２はモノクローナル抗体の組み合わせおよびＥＩＡの結果を示したものであり、抗Ｍ５２ペプチドモノクローナル抗体（Ｆ９１８シリーズ）と抗Ｆａｓリガンド抗体（Ｆ９１９）による組み合わせが可能であることを示している。また、抗Ｍ５２ペプチドモノクロナール抗体同士のサンドイッチ系であるＦ９１８−９−４／Ｆ９１８−７−３や同じ抗体であるＦ９１９−９−１８／Ｆ９１９−９−１８でもサンドイッチ系が可能であった。なお、表２において◎は高反応性を、○は中反応性を、△は低反応性を、×は反応性が認められなかったことを示す。表２においてウサギ抗Ｍ５２およびウサギ抗Ｍ５７は、Ｍ５２およびＭ５７ペプチドで免疫したウサギの抗血清である。
0003925663.tif 000004
５．測定系の評価
５−１各種Ｆａｓリガンドの作製
ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ４２およびｃｄ１７９を国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例２１に記載の方法で発現させた。なお、国際特許出願公開公報中ではポリペプチドｎｄ４２およびｃｄ１７９はそれぞれＮＤ４２およびＣＤ１７９として表示されている。また、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリペプチドｎｄ５、ｎｄ１２、ｎｄ２０、ｎｄ３２およびｎｄ４９、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の置換変異体であるＬ１７９Ｆならびに遊離型Ｆａｓリガンドを以下の方法で発現させた。なお、ｎｄ５、ｎｄ１２、ｎｄ２０、ｎｄ３２、ｎｄ４２およびｎｄ４９は、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から、それぞれ５アミノ酸、１２アミノ酸、２０アミノ酸、３２アミノ酸、４２アミノ酸および４９アミノ酸が欠失したそれぞれ６、１３、２１、３３、４３および５０番目のアミノ酸から１７９番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、ポリペプチドｃｄ１７９は配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列のＣ末端から１アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、すなわちアミノ酸番号１から１７８までのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ポリペプチドＬ１７９Ｆは配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基であるロイシンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチドである。また、遊離型Ｆａｓリガンドは、遺伝子としてＦａｓリガンド全長を有するプラスミドを導入されたＣＯＳ−１細胞表面上に発現したＦａｓリガンドが培養上清中に遊離したものである。
（１）プラスミドｐＭ１０８１の作製
ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドとヒトＦａｓリガンド細胞外領域をコードするプラスミドｐＭ１０８１を以下の方法で作製した。このｐＭ１０８１は、サイレントミューテーションにより、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列中にＳｐｅＩ、ＰｓｈＡＩ認識配列が導入され、またヒトＦａｓリガンドをコードする塩基配列中にＰｓｔＩ認識配列が導入されている。
まず、センスプライマー２（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ）およびアンチセンスプライマー２（ＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧ）を化学合成した。このセンスプライマー２は、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドをコードする配列の５’末端領域とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでいる。また、アンチセンスプライマー２は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側とヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端側をコードする塩基配列およびＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）、ＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ）、ＰｓｈＡＩサイト（ＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣ）を含んでいる。得られたアンチセンスプライマー２と、センスプライマー２とを、それぞれ１００ｐｍｏｌ、ヒトＦａｓ抗原をコードするＤＮＡ（イトウ  Ｎ、（Ｉｔｏｈ  Ｎ）等、Ｃｅｌｌ、６６巻、２３３−２４３頁、１９９１年）を含むプラスミドｐＢＬＦ５８−１を５０ｎｇ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ、添付のＰｆｕバッファー（共に、ストラタジーン）を１０μｌ含む１００μｌの溶液を調製した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、パーキンエルマー）を使用して、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、１分を１サイクルとするＰＣＲを３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。約７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、キアエックスキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを精製した。国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載のプラスミドｐＭ１０６７のＥｃｏＲＩサイトおよびＰｓｔＩサイト間に、上述の約７０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入した。
得られたプラスミドの塩基配列を確認したところ、ＥｃｏＲＩサイトとＳｐｅＩサイトとの間に１６ｂｐの欠損があった。そこで、目的とするＥｃｏＲＩサイトからＳｐｅＩサイトまでの配列を構築するためのセンスオリゴヌクレオチド１（ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド１（ＣＴＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＴＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧ）を化学合成し、それぞれを１ｎｍｏｌずつ含む２０μｌのＴＥ溶液を調製した。このＴＥ溶液を９５℃で５分間加熱後、１６℃まで徐冷することにより、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡの両端にそれぞれＥｃｏＲＩ切断配列とＳｐｅＩ切断配列を持つＤＮＡ断片を得た。これを上述の１６ｂｐ欠損したプラスミドのＥｃｏＲＩサイトとＳｐｅＩサイト間に挿入し、ｐＭ１０８１を得た。
（２）プラスミドｐＭ１２９１の作製
まず、センスプライマー３（ＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡ）およびアンチセンスプライマー３（ＧＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＧ）を化学合成した。このセンスプライマー３は、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端側に位置するアミノ酸配列と、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側６番目から１０番目までのアミノ酸配列をコードする塩基配列とＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ）、ＰｓｈＡＩサイト（ＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣ）を含んでいる。また、アンチセンスプライマー３は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のｃＤＮＡの塩基配列の１６４番目から１８６番目までの相補配列で、ＢｓｔＸＩサイト（ＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＧ）を含んでいる。得られたセンスプライマー３およびアンチセンスプライマー３をそれぞれ１００ｐｍｏｌ、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１２に記載のｐＢＸ−ｈＦＬ１を５０ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｎｍｏｌ、２．５ユニットのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび添付のＰｆｕバッファー（共にストラタジーン）１０μｌを含む１００μｌの溶液を調製した。上記（１）と同様にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩで二重消化した。これを（１）で作製したプラスミドｐＭ１０８１のＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩサイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１２９１と命名した。
（３）プラスミドｐＭ１２９２の作製
まず、センスプライヤー４（ＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＣＴＡＣＣＡＧＣ）を化学合成した。このセンスプライマー４は、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端側に位置するアミノ酸配列と、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側１３番目から１７番目までのアミノ酸配列をコードする塩基配列とＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ）、ＰｓｈＡＩサイト（ＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣ）を含んでいる。
得られたセンスプライマー４および（２）のアンチセンスプライマー３を使用して（２）と同様にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩで二重消化した。これを（１）で作製したプラスミドｐＭ１０８１のＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩサイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１２９２と命名した。
（４）プラスミドｐＭ１２９３の作製
まず、センスプライマー５（ＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧ）を化学合成した。このセンスプライマー５は、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端側に位置するアミノ酸配列と、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側２１番目から２５番目までのアミノ酸配列をコードする塩基配列とＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ）、ＰｓｈＡＩサイト（ＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣ）を含んでいる。
得られたセンスプライマー５と（２）で作製したアンチセンスプライマー３を用い、（２）と同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩで二重消化し、ｐＭ１０８１のＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩサイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１２９３と命名した。
（５）プラスミドｐＭ１２９５の作製
まず、センスプライマー６（ＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＴＡＧＴＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＡＡ）を化学合成した。このセンスプライマー６は、ヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端側に位置するアミノ酸配列と、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側３３番目から３７番目までのアミノ酸配列をコードする塩基配列とＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ）、ＰｓｈＡＩサイト（ＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣ）を含んでいる。
得られたセンスプライマー６と、（２）で作製したアンチセンスプライマー３を用い、（２）と同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩで二重消化し、ｐＭ１０８１のＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩサイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１２９５と命名した。
（６）プラスミドｐＭ１２９６、ｐＭ１２９７、ｐＭ１２９８、ｐＭ１３００の作製
（２）から（５）で得られプラスミドｐＭ１２９１、ｐＭ１２９２、ｐＭ１２９３、ｐＭ１２９５をそれぞれＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。それぞれ約５８０、５７０、５４０、５００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、キアジエン（ＱＩＡＧＥＮ）のキアエックス（ＱＩＡＥＸ）キットを使用してＤＮＡを精製した。動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマおよびナガタ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ＆  Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８巻、５３２２頁、１９９０年）にｄｈｆｒ遺伝子を組換え修飾したプラスミドｐＭ１１０３のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイト間に、上述の約５８０、５７０、５４０、５００ｂｐのＤＮＡ断片を組み込み、得られたプラスミドをそれぞれｐＭ１２９６、ｐＭ１２９７、ｐＭ１２９８、ｐＭ１３００と命名した。
作製したプラスミドの塩基配列をＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）とＤＮＡシーケンサ（モデル３７３Ａ、パーキンエルマー）を使用して決定した。その結果、プラスミドｐＭ１２９６、ｐＭ１２９７、ｐＭ１２９８、ｐＭ１３００にはそれぞれ、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域のＮ末端より数えて６、１３、２１、３３番目以降のアミノ酸配列をコードする国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ９５／００８８３の配列表の配列番号１、２、３および４に記載のＤＮＡが含まれていることが確認された。本発明者らは、公知方法にてプラスミドｐＭ１２９７およびｐＭ１３００で、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ、得られた形質転換体大腸菌ＨＢ１０１（ｐＭ１２９７）、ＨＢ１０１（ｐＭ１３００）を、生命工学工業技術研究所へ、１９９５年４月２６日付で寄託している（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０８３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０８４）。
（７）ヒトＦａｓリガンド細胞外領域をコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＭ１０７０−ｐＵＣ１１８の作製
まず、センスプライマー２（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ）およびアンチセンスプライマー４（ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧ）を化学合成した。センスプライマー２はＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）とヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＮ末端５アミノ酸をコードする塩基配列を含み、アンチセンスプライマー４はＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）とヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端４アミノ酸をコードする塩基配列とヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドのＣ末端５アミノ酸をコードする塩基配列を含む。
得られたプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、ヒトＦａｓ抗原のアミノ酸をコードするＤＮＡ（イトウ  Ｎ、（Ｉｔｏｈ  Ｎ）等、Ｃｅｌｌ、６６巻、２３３−２４３頁、１９９１年）を含むプラスミドｐＢＬＦ５８−１を５０ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｎｍｏｌ、２．５ユニットのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと添付のＰｆｕバッファー１０μｌ（共にストラタジーン）を含む１００μｌの溶液を調製した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、パーキンエルマー）を使用して、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとするＰＣＲを３０サイクル行い、得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。約７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、キアエックスキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製した。国際出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載のプラスミドｐＭ１０６７をＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで二重消化し、上述の約７０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＭ１０７０−ｐＵＣ１１８を得た。
（８）ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＣ末端アミノ酸変異体Ｌ１７９ＦをコードするＤＮＡを有するプラスミドｐＭ１０９０の作製
まず、センスプライマー７（ＧＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＧＣ）およびアンチセンスプライマー５（ＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＣＣ）を化学合成したセンスプライマー７は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域の１２９番目から１３５番目付近のアミノ酸をコードする２０ｂｐのＤＮＡを含み、６ｂｐ下流にＡｐａＩサイト（ＧＧＧＣＣＣ）が位置している。アンチセンスプライマー５は、ヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＣ末端１７５番目から１７８番目までのアミノ酸をコードする塩基配列を含み、１７９番目のロイシンをコードする塩基配列（ＣＴＣ）をフェニルアラニンをコードする塩基配列（ＴＴＣ）に置換してある。さらに、終始コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ）およびＫｐｎＩサイト（ＧＧＴＡＣＣ）を含む。
得られたセンスプライマー７およびアンチセンスプライマー５を用いて、（２）と同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｐａＩ、ＫｐｎＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。約１３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、キアエックスキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製した。ヒトＦａｓリガンド細胞外領域をコードするＤＮＡを含むｐＭ１０７０  ｐＵＣ１１８をＡｐａＩ、ＫｐｎＩで二重消化し、上述の約１３０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで二重消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約６００ｂｐのＤＮＡ断片をキアエックスキットを用いて精製した。動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマおよびナガタ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ＆  Ｎａｇａｔａ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８巻、５３２２頁、１９９０年）にＤＨＦＲ遺伝子を組み換えたプラスミドｐＭ１１０３のクローニングサイトのＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイト間に上述の約６００ｂｐのＤＮＡ断片を組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１０９０と命名した。
作製したプラスミドの塩基配列をＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）とＤＮＡシーケンサ（モデル３７３Ａ、パーキンエルマー）を使用して決定した。その結果、プラスミドｐＭ１０９０には、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域のアミノ酸配列（配列表の配列番号９）のＣ末端アミノ酸残基であるロイシンがフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれていることが確認された。
（９）ＣＯＳ−１細胞への導入
ｐＭ１０９０、ｐＭ１２９６、ｐＭ１２９７、ｐＭ１２９８、ｐＭ１３００および国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１８に記載のｐＭ１０７０、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１２に記載のｐＥＸ−ｈＦＬ１を使用して、以下の方法で形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０９０、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９６、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９７、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９８、ＣＯＳ−１／ｐＭ１３００、ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０、ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１を作製した。すなわち、それぞれのプラスミドＤＮＡ８．１μｇを４０μｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ溶液に溶解した。そのうちの２．５μｌに、それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストランおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するＤ−ＭＥＭ（日水製薬）０．７ｍｌを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を作製した。６ウェルプレートでセミコンフルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を添加し、５％ＣＯ2存在下で、３７℃にて培養し、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０９０、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９６、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９７、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９８、ＣＯＳ−１／ｐＭ１３００、ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０、ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１を得た。
上記で得た形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０９０、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９６、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９７、ＣＯＳ−１／ｐＭ１２９８、ＣＯＳ−１／ｐＭ１３００、ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０、ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１を１％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ中で３７℃で７２時間培養した後、培養上清をそれぞれ回収した。各培養上清中のアポトーシス誘導活性は実施例１−３に記載の方法で測定された。
（１０）遊離型Ｆａｓリガンド
遊離型Ｆａｓリガンドは、国際特許出願公開ＷＯ９５／１３２９３の実施例１２に記載のプラスミドｐＥＸ−ｈＦＬ１を上記（９）記載の方法に従い、ＣＯＳ−１細胞に導入して得られた形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清より回収したものを使用した（ＣＯＳ遊離型と称することがある）。また、特異的マトリックスメタロプロテアーゼ様酵素が膜結合Ｆａｓリガンドを切断してその可溶（遊離）型を生成する事が報告されており（タナカ  Ｍ．等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４巻、１１２９−１１３５頁、１９９５年およびタナカ  Ｍ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻、３１７−３２２頁、１９９６年）、この遊離型ＦａｓリガンドのＮ末端アミノ酸は、Ｆａｓリガンド細胞外領域の２７アミノ酸を欠失した第２８番目のグルタミンであった。
５−２各種Ｆａｓリガンドとの反応性
各種Ｆａｓリガンドを用いて８種類のサンドイッチＥＩＡ系の抗原特異性を検討した。ＦａｓリガンドとしてＦａｓリガンド細胞外領域の各種欠失体および置換体、４−１記載の凝集したＦａｓリガンド細胞外領域（酵母ＦａｓＬ凝集物）および精製したＦａｓリガンド細胞外領域（酵母ＦａｓＬ）、３−１記載のＣＯＳ−１細胞由来のＦａｓリガンド細胞外領域（ＣＯＳ  ｓＦａｓＬ）、ならびに遊離型Ｆａｓリガンド（ＣＯＳ遊離型）を用いて、それぞれに対する反応性を測定した。
表３から明らかなように、Ｍ５２ペプチドを投与して得られたモノクローナル抗体にはＭ５２ペプチドのＮ末端領域を認識しているグループ（Ｆ９１８−７−３）とＣ末端領域を認識しているグループ（Ｆ９１８−９−４）が存在した。また、Ｆ９１９−９−１８はＭ５２ペプチド領域を持たないＦａｓリガンド細胞外領域とも反応することから、Ｍ５２ペプチドの位置よりもさらにＦａｓリガンドのＣ末端側にその結合領域が存在し、かつアポトーシス誘導活性を有するもののみと結合することが明らかとなった。なお、○は高反応性を、△は低反応性を、×は反応しないことを示す。
0003925663.tif 000005
５−３正常人血清の影響
４−２記載の測定法を用いてヒト血清中のＦａｓリガンドの測定を行うため、ヒト血清の影響を検討した。実施例４−１記載の部分精製Ｆａｓリガンド細胞外領域を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳまたは正常ヒト血清で希釈し標準曲線を作製した。図８に示すように、正常ヒト血清でＦａｓリガンド無添加のバックグランドが０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ希釈剤よりも若干低値を示した以外両者に差は認められず、血清の影響はないと考えられた。
６．各種疾患患者血清中Ｆａｓリガンドの測定
各種の疾患の患者血清を用いて４−２記載の測定法により血中Ｆａｓリガンドの測定を行った。標準品として４−１記載の精製Ｆａｓリガンド細胞外領域を正常ヒト血清で希釈したもの（０，１０，５０，１００，２００ｎｇ／ｍｌ）を使用し、正常人血清２６例、Ｂ型肝炎患者血清３６例、Ｃ型肝炎患者血清１３例、ＨＩＶ抗体陽性患者血清１４例、その他各種疾患患者の血清を測定した。図９は各血清での測定値を示したものであり、正常人は測定感度（約１ｎｇ／ｍｌ）以下であったが、Ｂ型肝炎患者（９／３６）、Ｃ型肝炎患者（４／１３）、ＨＩＶ抗体陽性患者（１／１４）、（（  ）内はカットオフ値を１ｎｇ／ｍｌとした場合の陽性例／測定数を示す）に高値例がみられた他、マラリア患者（２／１０）、関節リューマチ患者（３／１２）および抗ＤＮＡ抗体陽性自己免疫疾患患者（１／１）においても陽性例が認められ、これらの疾患でＦａｓリガンドが病因または病態と関連していることが示唆された。
７．マウスＦ９１９−９−１８抗体可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
マウスＦ９１９−９−１８抗体（以下Ｆ９１９と略す）の重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子のｃＤＮＡを、（コーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）及び共通に譲渡された米国特許出願シリアル番号第０７／６３４，２７８号明細書参照）に記載の如くのアンカーされたポリメラーゼ連鎖反応を用い、定常領域にアニールされる３’プライマー、及びｃＤＮＡに付加されたｄＧ尾部にアニールされる５’プライマーを用いてクローン化した。ＰＣＲ増幅された遺伝子フラグメントは、ｐＵＣ１８ベクター中に挿入化された。軽鎖および重鎖可変領域ｃＤＮＡの両方に対して、数個の独立クローンからヌクレオチド配列を決定した。重鎖に対しては、マウス重鎖可変領域に特徴的な単一の配列が同定された。軽鎖に対しては、ともにマウス軽鎖可変領域配列に相同２つの特長的配列が同定された。しかし、１つの配列は、Ｖ−Ｊ結合におけるフレームシフトを生じるヌクレオチドの欠失のため機能的ではなく、また非産生アリールとして同定された。もう一方の配列はマウスカッパー鎖可変領域に典型的であった。各配列の数個のクローンが配列決定され、それぞれ同一であることがわかった。重鎖および機能的軽鎖の可変ドメインｃＤＮＡ配列ならびにそれらから導かれるアミノ酸配列を図１１および図１０に示す。
８．ヒト化Ｆ９１９抗体可変領域のコンピューターモデリングによる設計
ヒト化抗体中で高い結合親和性を保持するために、クイーンらの一般的方法に従った（クイーンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９（１９８９）及びＷＯ９０／０７８６１、（本引例をもって明細書の一部と成す）参照）。フレームワーク残基の選択は高親和性を保持するために重要である。原則として、いかなるヒト抗体からのフレームワーク配列もＣＤＲ移植のための鋳型として使用することができる。しかしながら、そのようなフレームワークへの直接的なＣＤＲ置換は抗原への結合親和性の有意な損失を招くことが示されている（Ｇｌａｓｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：２６０６（１９９２）；Ｔｅｍｐｅｓｔ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：２６６（１９９２）；Ｓｈａｌａｂｙ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７：２１７（１９９２））。受容体ヒト抗体が元のネズミ供与体抗体と相同であればあるほど、ネズミＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることが親和性を減少しうる歪みをＣＤＲ中に導入することになるということがより少ないと見込まれる。抗体配列データベースに対する配列相同検索に基づいて、ヒト抗体Ｅｕが、マウスＦ９１９抗体に高いフレームワーク相同性を提供するものとして選ばれたが他の高度に相同なヒト抗体鎖、特にヒトサブグループＩからのカッパー軽鎖およびヒトサブグループＩからの重鎖も同様に適しているであろう（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９９１）。
コンピュータープログラムＥＮＣＡＤ（レビット、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５（１９８３）、本引例をもって明細書の一部と成す）を、Ｆ９１９可変領域の分子モデルを構築するために用いた。モデルは、ＣＤＲと潜在的に相互作用するのに十分にＣＤＲに近接したところの、マウスＦ９１９フレームワーク中のアミノ酸を決定するために用いた。ヒト化Ｆ９１９軽鎖及び重鎖可変領域をデザインするために、マウスＦ９１９抗体からのＣＤＲが、ヒトＥｕ抗体のＦＲ中に移植された。コンピューターモデルがＣＤＲとの有意な接触を示したフレームワークの位置において、元のヒトフレームワークアミノ酸に代わってマウス抗体からのアミノ酸へ置換された。ヒト化Ｆ９１９に対しては、この置換は、重鎖の残基２７、３０、４５、４６、６８、７０、７２および９７ならびに軽鎖の残基７、２２、７０、７１および８７においておこなわれた。ヒト化軽鎖の追加のバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ２）を２つのヒトフレームワーク残基を保持するように、すなわち、ｖｅｒｓｉｏｎ１の位置７および２２におけるＴ（スレオニン）およびＳ（セリン）をｖｅｒｓｉｏｎ２では各々ＳおよびＴに置換して、構築した。後に示す結果から、２つのバージョンの軽鎖の間には結合親和性に大きな差はないことが示された。よって、より多くのヒト残基を保持しているという観点からは、ｖｅｒｓｉｏｎ２は、ヒト化軽鎖としては好ましい選択である。さらに、ヒト抗体のデータベース中でその位置においてまれにしか現れないフレームワークアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサスアミノ酸によって置換した。ヒト化Ｆ９１９抗体に対しては、この置換は、重鎖の残基７４、９３、９５、９８、１０７、１０８、１０９および１１１ならびに軽鎖の残基４８および６３においておこなわれた。
ヒト化Ｆ９１９抗体重鎖および軽鎖（ｖｅｒｓｉｏｎ２）可変領域の配列を図１３および１２に示した。しかしながら、多くの潜在的にＣＤＲと接触し得る残基は、抗体の抗原に対する実質的な親和性をなお保持させるであろう他のアミノ酸への置換を受ける余地がある。下表（表４）は、代替のアミノ酸も適しているであろうフレームワーク中の多くの位置を一覧にする（ＬＣは軽鎖を、ＨＣは重鎖を示す）。
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同様に、ヒト化Ｆ９１９抗体重鎖および軽鎖中のＣＤＲと接触していないフレームワーク残基の多くは、ヒト化抗体の親和性またはフレームワーク残基の多くは、ヒト化抗体の親和性または非免疫原性を有意に損なうことなく、ヒトＥｕ抗体、他のヒト抗体、マウスＦ９１９抗体または他のマウス抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換を受けることができる。下表（表５）は、代替のアミノ酸も適しているであろうフレームワーク中の追加の位置を一覧にする。
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代替のアミノ酸の組合せの選択は、親和性、特異性、非免疫原性、製造の容易性および他の望ましい性質の様々な組合せを有するヒト化Ｆ９１９抗体のバージョンを作製するために使用されるであろう。このようにして、上表中の例は、限定のためではなく、実例として提供される。
９．ヒト化Ｆ９１９抗体の構築
上記のように、ヒト化抗体可変領域アミノ酸配列が設計されると、シグナルペプチド、スプライス供与シグナルおよび適正な制限サイトを含むそれらのアミノ酸配列をコードするように遺伝子が構築された（図１２および１３）。重鎖可変領域遺伝子は、６１から７９塩基長の範囲の８つのオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドを用いて構築、増幅した。オリゴを対にしてアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長させ、４つの２本鎖断片を得た。得られた断片を変性し、アニールし、そしてＫｌｅｎｏｗ断片で伸長して、２つの断片を得た。これらの断片を変性アニールし、そしてもう一度伸長させ全長の遺伝子を得た。得られた産物をＴａｑポリメラーゼを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、ゲル精製し、ＸｂａＩで消化し、再度ゲル精製し、そしてｐＶｇ１（Ｃｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９（１９９２））、またはｐＶｇ４発現ベクターのＸｂａＩサイトヘサプクローン化した。ｐＶｇ４ベクターは、γ４遺伝子のＣＨｌエクソンの前のＨｉｎｄIIIサイトから該遺伝子のＣＨ４エクソンの後のＮｓｉＩサイトの２７０塩基対後方に渡るヒトγ４定常領域遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻、１９８４頁、１９８２年）の約２０００塩基対の断片で、γ１定常領域遺伝子を含むｐＶｇ１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を置換することにより構築された。得られたプラスミドは、ヌクレオチド配列決定および制限酵素マッピングにより確認された。
軽鎖可変領域配列は以前構築されたｇｐIIｂ／IIIａに特異的なヒト化抗体ＨｕＣ４Ｇ１に高度に相同であることが判明した。ＨｕＣ４Ｇ１軽鎖およびヒト化Ｆ９１９軽鎖（ｖｅｒｓｉｏｎ１）は、全可変領域中で位置３０、５３、７０および９２におけるわずかに４つのアミノ酸残基で異なる。それ故、我々は、合成オリグヌクレオチドおよびＰＣＲを用いた部位特異的突然変異導入により、ｐＶｋプラスミド中に構築したＨｕＣ４Ｇ１軽鎖遺伝子中へそれら４つの位置における望ましいアミノ酸残基を取り込むことによりヒト化Ｆ９１９軽鎖可変領域遺伝子を構築した。２番目のバージョンの軽鎖は位置７および２２における２つの追加の変更を有し、そして同様に構築された。従って、得られたプラスミドはヒトＣκ遺伝子を含むｐＶｋベクター中に各々のヒト化Ｆ９１９可変領域遺伝子を含有する（前出のＣｏ等参照）。最終のプラスミドは、ヌクレオチド配列決定および制限酵素マッピングにより確認された。すべての操作は当業者に周知の標準的方法により実施された。
以上のように４つのヒト化Ｆ９１９抗体が、下に示すように重鎖および軽鎖の異なる組合せにより構築された。
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上述の各抗体を産生する細胞株を作製するため、各重鎖および軽鎖プラスミドをマウスミエローマ細胞株Ｓｐ２−０−ａｇｌ４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）中へトランスフェクトした。トランスフェクション前に重鎖および軽鎖含有プラスミドを各々ＢａｍＨＩおよびＦｓｐＩを用いて直線化した。約２０μｇの各プラスミドをＰＢＳ中で１×１０7細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクションはメーカーの指示に従って３６０Ｖおよび２５μＦＤのキャパシタンスでＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（バイオラッド）を用いてエレクトロポーレーションによりおこなった。各トランスフェクションからの細胞を４枚の９６ウエルティッシュカルチャープレートに植込み、２日後、選択培地（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１ＸＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ）、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｘａｎｔｈｉｎｅ、１μｇ／ｍｌ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を添加した。
約２週間後、現れたクローンをＥＬＩＳＡにより抗体産生についてスクリーニングした。各トランスフェクションからの高産生クローンからの抗体は、細胞を標準培地（１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ）中でコンフルエントになるまで生育させ、次いで培地を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）に置き換え、そして培地中で最大の抗体価が得られるまで培養することにより調製した。培養上清をプロテインＡ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通し、抗体を０．１Ｍグリシン、０．１ＭＮａＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出し、続いてＰＢＳ中へ交換した。抗体の純度をアクリルアミドゲル上で分析することにより評価し、そして抗体濃度を、抗体蛋白質１．０ｍｇは１．３のＯＤ２８０値を有すると仮定して、ＯＤ２８０の値より決定した。
１０．ヒト化Ｆ９１９抗体の性状
マウスおよびヒト化Ｆ９１９抗体が抗原であるＦａｓリガンドに結合することを示すため、２５ｎｇの各抗体（マウスＦ９１９、ＨｕＦ９１９Ｇ１．Ｖ１、ＨｕＦ９１９Ｇ１．Ｖ２、ＨｕＦ９１９Ｇ４．Ｖ１およびＨｕＦ９１９Ｇ４．Ｖ２）を、ヒトＦａｓリガンドを発現するようにマウスリンパ腫細胞株ＷＲ１９Ｌをトランスフェクトした細胞である。１Ａ１２細胞とともに各々氷上で３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトまたは抗マウス抗体（ダコ  イムノロジカルズ）とともにさらに３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって解析した。ＦＡＣＳヒストグラムから、マウスおよび４つのヒト化Ｆ９１９抗体は特異的に１Ａ１２細胞に結合し、トランスフェクトしていない細胞株ＷＲ１９Ｌには結合しないことが示された。ヒト化Ｆ９１９抗体が受容体結合（Ｆａｓリガンド結合）に対してマウスＦ９１９抗体と競合する能力を調べるために、順次増加させた量（０．０１−１５０μｇ／ｍｌ）のマウスＦ９１９抗体および各バージョンのヒト化Ｆ９１９抗体を各々、一定量（５ｎｇ）の125Ｉ標識したトレーサーマウス抗体および５×１０5個の１Ａ１２細胞とともに４℃で９０分間インキュベートした。マウスおよびヒト化Ｆ９１９抗体は実質的に等しい効率で競合した（図１４および１５）。それらのデータから計算された各抗体の結合親和性は、下表（表７）に示されるようにほぼ同様であった。したがって、ヒト化操作は元の抗体の結合親和性を有意には減少させなかった。
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１１．ヒト化Ｆ９１９抗体のアポトーシス抑制活性の評価
１Ａ１２細胞のＷＣ８細胞に対する細胞障害活性を抑制する活性を指標としてアポトーシス抑制活性を測定した。１Ａ１２細胞はヒトＦａｓリガンドを発現するようにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を形質転換させた細胞であり（タナカ  Ｍ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻、３１７−３２２頁、１９９６年）、また、ＷＣ８細胞はヒトＦａｓ抗原を発現させるようにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を形質転換させた細胞である。このＷＲ１９Ｌ細胞は、マウスＦａｓ抗原を殆ど発現せず、ＴＮＦの細胞障害作用に感受性の細胞である。細胞障害活性の測定は、ルービエ  Ｅ．（Ｒｏｕｖｉｅｒ  Ｅ．）等の方法に準じて行った（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７巻、１９５−２００頁、１９９３年）。先ず、１Ａ１２細胞を１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭ１１６４０で洗浄しエフェクター細胞として使用した。一方、１００μｌの１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で、２０μＣｉの［51Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社）と共に１×１０6個のＷＣ８を３７℃で２時間インキュベートし、その後１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、これらの細胞をターゲット細胞として使用した。
１×１０4個の１Ａ１２細胞とターゲット細胞１×１０4個とを、様々な濃度のマウスまたはヒト化Ｆ９１９抗体と共に全液量が計１００μｌになるようにし３７℃で４時間インキュベートした。γカウンターによって測定した各ウェル中の上清の放射活性から、以下に示す式を用いて特異的細胞溶解率を算出した。51Ｃｒの自然放出量は、培地のみでターゲット細胞をインキュベートすることにより決定し、一方、最大放出量は、ターゲット細胞に０．１％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えることにより決定した。
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各ヒト化抗Ｆ９１９抗体は、マウス抗Ｆ９１９抗体とほぼ同等またはやや強いアポトーシス抑制活性を示した（図１６および１７）。
１２．２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ系による血中Ｆａｓリガンド濃度の測定
ヒト血中Ｆａｓリガンド濃度を測定するため、２種類のモノクローナル抗体（Ｆ９１８−２０−２、Ｆ９１９−９−１８）を用いた２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
（１）ポリパーオキシダーゼ標識抗体の調製
まず、ＰＩＥＲＣＥ社Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ２６１０１Ｘに記載の方法に従い、２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ・ＨＣｌ（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いてモノクローナル抗体Ｆ９１９−９−１８にＳＨ基を導入した。すなわち、抗体１５ｍｇ（１５ｍｇ／ｍｌ）をゲルろ過カラムＮＡＰ−１０（ファルマシア社）を用いて０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリエタノールアミン・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（以下ＴＥＡと記す）の緩衝液に交換した。得られた抗体９ｍｇ（６ｍｇ／ｍｌ）を１．４ｍｇずつ容器に分注し、ＴＥＡで１００μｇ／ｍｌになるように溶解したＴｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔをそれぞれ抗体：Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔのモル比が１：５、１：１０または、１：５０となるように添加し、窒素置換した後室温で６０分間反応させた。反応終了後反応液組成をＮＡＰ−５（ファルマシア社）を用いて０．ｌＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に交換した。導入されたＳＨ基の数を測定するためＰＩＥＲＣＥ社Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ２６１０１Ｘに記載の方法に従い、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて導入されたＳＨ基の数を算出した。その結果、抗体１モル当たりのＳＨ基の数は抗体：Ｔｒａｎｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  モル比１：５で１．４個、１：１０で１．０個、１：５０で１．３個であった。導入率が最も良かった抗体：Ｔｒａｎｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  モル比１：５の抗体を用いてポリパーオキシダーゼ（ＰｏｌｙＰＯＤ）標識物を以下のようにして調製した。
ＰｏｌｙＰＯＤ（ＭＨ）（ベーリンガーマンハイム社）を精製水で５ｍｇ／ｍｌになるように溶解し上記抗体２００μｇ（１．６７ｍｇ／ｍｌ）にそれぞれ抗体：ＰｏｌｙＰＯＤモル比が４：１、２：１または、１：１となるようにＰｏｌｙＰＯＤ溶液を添加し３０℃で１時間反応させた。反応液に５ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドをそれぞれ１０μｌ添加して反応を止め、０．４５％ＮａＣｌを含む０．０７６Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下ＰＢＳと記す）に４℃で一夜透析した。標識抗体濃度は２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度を測定し、以下に示す式を用いて算出した。透析後の液量を測定し、半量の１８％シュークロース／０．３％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し−４０℃で保存した。
標識抗体濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝
１０×Ａ280−（Ａ403×１０／７．５８×１０4）×２．２９×１０4
（２）Ｆ（ａｂ’）2断片の調製
次に超高感度酵素免疫測定法、（石川榮治著学会出版センター，１９９３年）に記載の方法に従い、モノクローナル抗体Ｆ９１８−２０−２よりＦ（ａｂ’）2を調製した。すなわち、抗体１０ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）に４℃で一夜透析した。同じ緩衝液で溶解したブタ胃ペプシン（シグマ社）を４０μｌ（０．４ｍｇ）を添加し３７℃で２４時間反応した。反応液を氷冷しトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンでｐＨを７付近に戻し、ＰＢＳで平衡化したプロテインＡ結合ガラス樹脂カラムＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏ  Ｐｒｏｓｓｅｓｉｎｇ社）にアプライし切断されたＦｃ部分を除いた。結合しなかった通過液を回収し、ＰＢＳに４℃で一夜透析し、これに最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加し４℃で保存した。Ｆ（ａｂ’）2の濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。
（３）ヒト血清中のＦａｓリガンド値の測定
Ｆ９１９−９−１８抗体を用いて血中のFasリガンドを吸収した正常人血清を希釈剤として実施例４−１に記載の精製Fasリガンド細胞外領域を５ｎｇ／ｍｌから倍々希釈により希釈系列（５〜０．０８ｎｇ／ｍｌ）を作製した。また、ブランク（Fasリガンド０ｎｇ／ｍｌ）には希釈剤を使用した。臨床症状との関連性を明らかにするため、表８のパネル血清（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）中のFasリガンド濃度を以下のようにして測定した。
0003925663.tif 000011
まず、ＰＢＳで３０μｇ／ｍｌに希釈したＦ９１８−２０−２Ｆ（ａｂ’）2を７０μｌ／ウェルづつイムノプレート（ＭａｘｉｓｏｒＰ、Ｎｕｎｃ社）に分注し、４５℃で３０分間処理し抗体を固相化させた。イオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ  ２００μｌを添加し室温で３０分間ブロッキングした。
プレートのブロッキング液を廃棄した後、希釈したFasリガンドの希釈系列または検体２０μｌを各ウエルに分注し、第一反応用緩衝液として０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％ＮａＣｌを含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）を各ウエルに８０μｌ添加した。３７℃で２時間反応させた後、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで５回洗浄した。次に１０％ウサギ血清１％マウス血清を含む第一反応用緩衝液で０．５μｇ／ｍｌに希釈した最も反応性の良かったＰｏｌｙＰＯＤ標識抗体（４：１結合）を各ウエルに１００μｌ分注し３７℃で１時間反応させた。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで５回洗浄した後、イオン交換水で２回洗浄した。０．２ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジジンと０．０１％の過酸化水素を含む０．１６Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を各ウエルに１００μｌ添加し、遮光して室温で１５分間反応させた。１Ｎ硫酸を各ウエルに１００μｌ添加し、反応を停止し吸光度計により波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
図１８は測定したＦａｓリガンドの希釈系列により作製した標準曲線を示したものであり、これを用いて各検体中のＦａｓリガンド濃度を算出した。図１９から図２２は各パネル血清の他の項目の測定値（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社添付文書記載）とＦａｓリガンド濃度の推移を経時的に示したものである。なお、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎患者パネル血清のＡＬＴ値はトランスアミナーゼＧＰＴ測定用体外診断用医薬品オートセラＧＰＴ−２（第一化学薬品）を用いて日立オートマチックアナライザー７０７０（日立製作所）により測定した。
ＨＩＶの初期感染が疑われる患者のパネル血清では感染初期にＦａｓリガンド値の上昇が認められた（図１９）。また、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎患者のパネル血清は両者とも初期感染が疑われ、ＡＬＴ値の上昇に伴ってＦａｓリガンド濃度が上昇した（図２０および２２）。一方、Ｂ型肝炎患者も初期感染例と推定され与たがＡＬＴ値の変動は認めれず、またＦａｓリガンド濃度も上昇しなかった（図２１）。したがって、これらの疾患ではＦａｓリガンドがその臨床症状と何らかの関連性を持っていることが示唆された。このことはＦａｓ／Ｆａｓリガンド系が症状の悪化に関与していることを示すものであり、アポトーシスを抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体がこれらの疾患で有効である可能性を示している。
産業上の利用可能性
本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体を用いたヒト体液中のＦａｓリガンドの測定方法及び該測定方法に使用しうる抗体は、Ｆａｓリガンドの関与が示唆されている種々の疾患におけるＦａｓリガンドの増加減少または異常を検出するために使用できるため、特定の疾患及び病態の予知、検出および診断または治療方法の選択のために応用しうる。またＦａｓリガンド及びＦａｓリガンド関連物質ならびにＦａｓリガンドの発現に影響を与える薬剤による治療を受けている患者のモニタリング及び治療効果および予後の判定にも有用である。
Ｆａｓリガンドの作用を調節する抗体は、それを使用して、内因性または外因性のＦａｓリガンドにより生体内で生じるアポトーシスを調節し、疾患の治療や、診断に使用する事ができる。エイズウイルス感染後期の免疫能の低下や、劇症肝炎における肝機能低下は、免疫担当細胞あるいは肝細胞のアポトーシスにより組織の機能が著しく低下した結果と考えられる。このような状態においては、Ｆａｓリガンドの作用を抑制し、細胞のアポトーシスを防ぐことが必要になる。したがって、このような病態には、Ｆａｓリガンドの作用を抑制する抗Ｆａｓリガンド抗体を治療に使用することができる。また、心筋梗塞時の再灌流傷害、臓器移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、潰瘍性大腸炎およびクローン病等のＦａｓリガンド／Ｆａｓ抗原の関与が示唆されている疾患の予防または治療に有用と考えられる。特に、本発明の抗Ｆａｓリガンド中和抗体は、低濃度で強力にアポトーシスを抑制することから、生体内においても低用量で有効でかつ副作用を低率に押えうることが期待されるので、有効性および安全性ならびにコストの面からも有用性が高い。
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、マウスに比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による、より効率的な標的細胞の破壊）。
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を異物として認識せず、従って、このような注入された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
３）注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト内での循環における半減期を有すると報告されている（ショー、Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７））。注入されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より小さい又はより少ない頻度の投与量を与えること可能とする。
一方、Ｆａｓリガンドによるアポトーシスを促進する抗Ｆａｓリガンド抗体は、生体にとって不必要な細胞を除去するために使用することが可能である。たとえば、先述したように、エイズウイルス感染細胞ではＦａｓ抗原が発現されているので、エイズウイルス感染初期においては、該抗Ｆａｓリガンド抗体を使用してＦａｓリガンドによるアポトーシスを人工的に増強し、感染細胞を早期に除去する事により、エイズを治療する事が可能であろう。また、ある種の自己免疫疾患では、人為的にＦａｓ抗原を介したＦａｓリガンドによるアポトーシスを促進させる事により、自己抗原反応性のＴ細胞の除去が可能になるであろう。また、モリモト  Ｈ．（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｈ．）等は、癌細胞にＦａｓ抗原を介したアポトーシスを誘導する事によって、アドリアマイシンやシスプラチンによる制癌効果が相乗的に増強されることを報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３巻、２５９１−２５９６頁、１９９３年）ので、Ｆａｓリガンドによるアポトーシスを促進する抗Ｆａｓリガンド抗体は癌治療にも使用することができるであろう。
さらに、それ自体はＦａｓリガンドによるアポトーシスに影響しない抗Ｆａｓリガンド抗体も、イムノトキシンのように他の物質を結合させることによって治療等に応用することが可能である。
また、Ｆａｓリガンド自体を、治療や研究に使用するためには、当該蛋白質を高純度で、大量に生産することが必要になるが、本発明の抗Ｆａｓリガンド抗体はＦａｓリガンドの精製にも有用である。特に治療用の医薬として重要と考えられる活性を保持したＦａｓリガンドを特異的にかつ効率よく精製することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：２
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：３
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：４
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：５
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：６
配列の長さ：１８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：７
配列の長さ：１６
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：８
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：９
配列の長さ：１７９
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
起源  生物名：ヒト
配列：
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配列番号：１０
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１１
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１２
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１３
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１４
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１６
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１７
配列の長さ：１２７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１８
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：１９
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２０
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２１
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２２
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２３
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２４
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２５
配列の長さ：１３６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２６
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２７
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２８
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：２９
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３０
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３１
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３３
配列の長さ：１２７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３４
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３５
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３６
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３７
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
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配列：
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配列番号：３８
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：３９
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：４０
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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配列番号：４１
配列の長さ：１３６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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