(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のアミノ酸からなるペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子の塩基配列における第１の領域を覆うとともに、３’末端で互いにアニールし、繰り返されるアミノ酸配列を異なる縮重コドンでコードするように設計された塩基配列を含むように一対のプライマーを設計し、これら一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、これら一対のプライマーが３’末端で互いにアニールし、これら一対のプライマーのうち一方が他方を鋳型として伸長反応が進行し、当該第１の領域を合成する工程と、
当該第１の領域と一部重なる、上記遺伝子の塩基配列における第２の領域を覆うとともに、３’末端で互いにアニールし、繰り返されるアミノ酸配列を異なる縮重コドンでコードするように設計された塩基配列を含むように一対のプライマーを設計し、これら一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、これら一対のプライマーが３’末端で互いにアニールし、これら一対のプライマーのうち一方が他方を鋳型として伸長反応が進行し、当該第２の領域を合成する工程と、
これら各工程で合成された第１の領域及び第２の領域をアニールさせたものを鋳型として、ＰＣＲを行うことによって第１の領域及び第２の領域を含む塩基配列を合成する工程とを有することを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
上記ペプチドの繰り返し配列は、糖鎖のアクセプターであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項３】
上記糖鎖のアクセプターは、ムチン型糖鎖のアクセプターであること特徴とする請求項２記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項４】
複数のアミノ酸からなるペプチドはXaa-Thr-Pro-Xaa-Pro（配列番号５０、Xaaは任意のアミノ酸）からなるペプチドであることを特徴とする請求項１乃至３いずれか１項記載のＤＮＡ増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、複数のアミノ酸からなるペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子等、通常のＰＣＲで増幅するのが困難である塩基配列を、ＰＣＲを利用して増幅するＤＮＡ増幅方法、当該方法により増幅された遺伝子及び当該遺伝子を発現させて得られるタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法は、いまや分子生物学の分野で欠くことのできない重要な技術である。ＰＣＲ法によれば、微量の遺伝子試料からでも、目的とする遺伝子を簡単に増幅する事が可能となり、さらには、人為的な遺伝子配列を創製することも可能となる。しかしながら、その原理から明らかなように、ＰＣＲ法では、相同配列を多く含む配列を増幅することが困難であり、ましてや繰り返しを含むペプチド配列をコードする人為的遺伝子の合成はほとんど報告がなかった。この原因としては、主として、使用するプライマーが鋳型ＤＮＡに対してミスアニーリングを起こすことが考えられる。
【０００３】
唯一、報告された例としては、プライマーをビーズに固定化し、固相上でＰＣＲを行う手法（Kenneth E.Dombrowski, and Stephen E.Wright, Nucleic Acid Research, 1992, Vol.20, No.24 6743-6744 ）が挙げられる。しかしながら、この手法は、操作が煩雑であることに加え、通常のＰＣＲ法のプロトコールと異なる操作を行う必要があることから、殆ど利用されていない。また、この手法を用いた場合でも、高頻度、高密度な繰り返しについては現在までに報告例がない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、通常のＰＣＲ法で汎用される機器及び手法で増幅することが困難であったＤＮＡ断片を増幅する方法を提供することを目的とし、特に、ペプチドの繰り返し配列をコードするＤＮＡ断片を増幅する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、増幅対象の塩基配列における第１の領域を挟み込むとともに３’末端で互いにアニールするように一対のプライマーを設計し、これら一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、当該第１の領域を合成する工程（以下、第１の工程）と、当該塩基配列の第１の領域と一部重なる第２の領域を挟み込むとともに３’末端で互いにアニールするように一対のプライマーを設計し、これら一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、第２の領域を合成する工程（以下、第２の工程）と、これら各工程で合成された第１の領域及び第２の領域をアニールしたものを鋳型として、ＰＣＲ反応を行うことによって第１の領域及び第２の領域を含む塩基配列を合成する工程（以下、第３の工程）とを有することを特徴とするものである。
【０００６】
第１の工程では、ＰＣＲ反応において、各プライマーにおける３’末端側を互いにアニーリングさせて増幅反応を行う。すなわち、第１工程では、一方のプライマーが他方のプライマーを鋳型とするとともに、他方のプライマーが一方のプライマーを鋳型として増幅反応を行う。これにより、第１工程では、一対のプライマーにより挟み込まれる第１の領域を増幅することができる。同様に、第２の工程では、一方のプライマーが他方のプライマーを鋳型とするとともに、他方のプライマーが一方のプライマーを鋳型として増幅反応を行うことによって、第２の領域を増幅することができる。
【０００７】
そして、第３の工程では、第１の工程で増幅された第１の領域及び第２の工程で増幅された第２の領域を鋳型としてＰＣＲ反応を行う。ここで、第１の領域と第２の領域とは、重なる領域を有するため、ＰＣＲ反応においてこの領域でアニーリングすることになる。そして、第３工程では、任意に設定されたプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、第１の領域及び第２の領域を含む所望の塩基配列を増幅することができる。
【０００８】
また、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、上記増幅対象の塩基配列が複数のアミノ酸からなるペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子であってもよい。
さらに、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、上記ペプチドの繰り返し配列が糖鎖のアクセプターであってもよい。
【０００９】
さらにまた、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、上記糖鎖のアクセプターがムチン型糖鎖のアクセプターであってもよい。繰り返しペプチドの配列としての糖鎖のアクセプターを、生物学的に意味のあるムチン型糖鎖のアクセプターとすることにより、クラスター状ムチン型糖鎖の付加配列を導入する基盤技術が確立できる。
さらにまた、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、上記一対のプライマーが、繰り返されるペプチドのアミノ酸配列を異なる縮重コドンでコードするように設計された塩基配列を含むものであることが好ましい。
【００１０】
一方、本発明に係る遺伝子は、上記いずれかのＤＮＡ増幅方法により増幅され、糖鎖のアクセプターとなる機能を有するタンパク質をコードするものである。
また、本発明に係る遺伝子は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、他のタンパク質をコードする遺伝子の３’末端及び／又は５’末端、あるいはタンパク質コーディング領域の任意の場所に導入してなり、糖鎖のアクセプターとなる機能を有する領域を含むタンパク質をコードするものであることが好ましい。ここで、上記糖鎖のアクセプターとなる機能を有するタンパク質がAla-Thr-Pro-Ala-Pro（配列番号２）を代表とするXaa-Thr-Pro-Xaa-Pro（配列番号５０、Xaaは任意のアミノ酸）で一般化されるペプチドの繰り返し配列を含むことが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記他のタンパク質がヘパリン結合性を有する増殖因子であってもよい。
さらにまた、本発明に係る組み換え発現用ベクターは、上記いずれかの遺伝子を有するものである。
さらにまた、本発明に係る形質転換体は、組み換え発現用ベクターを用いて形質転換してなるものである。
【００１２】
さらにまた、本発明に係る糖タンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養又は栽培し、得られる培養物又は栽培物から糖タンパク質を採取するものである。
さらにまた、本発明の糖タンパク質は、上記遺伝子を発現させることによって得られるものである。
さらにまた、本発明に係る医薬組成物は、上記糖タンパク質を有効成分として含むものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
以下の説明では、ペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子の一例である「ムチン型糖鎖のアクセプターとなるペプチドの繰り返し配列」をコードする遺伝子を増幅するとともに、増幅した遺伝子を他のタンパク質をコードする遺伝子に導入する例について説明する。しかしながら、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、当該塩基配列を増幅する方法に限定されず、一般的なＰＣＲ法で増幅することが困難なＤＮＡ塩基配列を増幅する際に適用されるものである。一般的なＰＣＲ法で増幅することが困難なＤＮＡ塩基配列としては、塩基配列中に繰り返し配列を有しており、使用するプライマーがミスアニーリングしやすいようなものを挙げることができる。
【００１４】
１．ペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子の増幅
１）塩基配列の設計
ペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子の一例として、「ムチン型糖鎖のアクセプターとなるペプチド配列」を繰り返してなるアミノ酸配列（例えば、１０回繰り返し）をコードする遺伝子を設計する。
【００１５】
先ず、例えば、配列番号１に記載する塩基配列を設計する。すなわち、この塩基配列は、図１に示すように、ムチン型糖鎖のアクセプターとなるペプチドのアミノ酸配列を繰り返しコードする領域（以下、ムチン領域という）と、ムチン領域の５’末端側に付加されたシグナルペプチド配列の一部と、ムチン領域の３’末端側に繊維芽細胞増殖因子（以下、ＦＧＦ(fibroblast growth factor)という）のＮ末端側をコードする領域とを含んでいる。また、この塩基配列には、５’末端側及び３’末端側に制限酵素、例えば、Eco RIにより切断される配列を有している。
【００１６】
また、ムチン型糖鎖のアクセプターとなるペプチドのアミノ酸配列は、Ala-Thr-Pro-Ala-Pro（配列番号２）のようにXaa-Thr-Pro-Xaa-Pro （配列番号５０、Xaa は任意のアミノ酸）と一般化される配列であり、Ｎ−アセチルガラクトサミルトランスフェラーゼ−Ｉの作用部位となるＯ−結合型糖鎖修飾配列である。そして、配列番号１で示す塩基配列では、Ala-Thr-Pro-Ala-Pro（配列番号２）を１０回繰り返すペプチドのアミノ酸配列をコードするように設計する。
【００１７】
ここで、Ala、Thr及びProは、いずれもコドンの第一塩基及び第二塩基で規定される。したがって、Ala、Thr及びProのコドンにおいては、第三塩基を任意に決定することができる。例えば、Ala-Thr-Pro-Ala-Proをコードする塩基配列を、Ａカセットとしてgcaacaccagcacca（配列番号３）、Ｃカセットとしてgccacccccgccccc（配列番号４）、Ｇカセットとしてgcgacgccggcgccg（配列番号５）及びＴカセットとしてgctactcctgctcct（配列番号６）で設計する。そして、これらＡカセット、Ｃカセット、Ｇカセット及びＴカセットを用いて、配列番号１で示される塩基配列におけるムチン領域を、図１に示すように設計する。なお、図１中のムチン領域において、［Ａ］、［Ｃ］、［Ｇ］及び［Ｔ］は、それぞれ、Ａカセット、Ｃカセット、Ｇカセット及びＴカセットを示している。
【００１８】
２）プライマーの設計
配列番号１で示される塩基配列をＰＣＲ法で増幅するために、図１中矢印で示されるプライマーを設計する。例えば、上記塩基配列における前半部分（第１の領域と称する）を挟み込むとともに３’末端側で１０ｍｅｒ程度重なり合う一対のプライマーと、上記塩基配列における後半部分（第２の領域と称する）を挟み込むとともに、３’末端側で１０ｍｅｒ程度重なり合う一対のプライマーとを設計する。なお、第１の領域と第２の領域とは、２０ｍｅｒ程度重なり合うように規定する。
【００１９】
具体的には、第１の領域を挟み込む一対のプライマーとして、プライマー＃２２５（配列番号７）及びプライマー＃２３５（配列番号８）を設計し、第２の領域を挟み込む一対のプライマーとして、プライマー＃２２６（配列番号９）及びプライマー＃２３６（配列番号１０）を設計する。
【００２０】
なお、プライマー＃２３５は、配列番号１における第１塩基から第６１塩基と同じ配列であり、プライマー＃２２５は、配列番号１における第５２塩基から第１０６塩基までの配列に相補的な配列である。したがって、プライマー＃２２５及びプライマー＃２３５は、３’末端側で互いに相補的な塩基配列を有する。また、プライマー＃２２６は、配列番号１における第８５塩基から第１３９塩基と同じ配列であり、プライマー＃２３６は、配列番号１における第１３０塩基から第２０７塩基までの配列に相補的な配列である。したがって、プライマー＃２２６及びプライマー＃２３６は、３’末端側で互いに相補的な塩基配列を有する。
【００２１】
３）ＰＣＲ
本方法では、配列番号１で示される遺伝子を増幅するために、２段階のＰＣＲを行う。第１段階のＰＣＲでは、プライマー＃２２５及びプライマー＃２３５を用いて第１の領域のみを増幅するとともに、プライマー＃２２６及びプライマー＃２３６を用いて第２の領域のみを増幅する。言い換えると、第１段階のＰＣＲにおいては、第１の領域のみを増幅する第１の工程と、第２の領域のみを増幅する第２の工程とを互いに独立して行う。また、第２段階のＰＣＲでは、第１段階のＰＣＲで増幅された第１の領域及び第２の領域を鋳型として、配列番号１で示される遺伝子全体を増幅する。
【００２２】
第１段階における第１の工程では、鋳型ＤＮＡを存在させない以外は通常のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行う。すなわち、第１の工程におけるＰＣＲ反応の１サイクル目では、プライマー＃２２５及びプライマー＃２３５を３’末端側で互いにアニーリングさせ、その後、プライマー＃２２５を鋳型としてプライマー＃２３５からの伸長反応を行うと共にプライマー＃２３５を鋳型としてプライマー＃２２５からの伸長反応を行う。
【００２３】
また、第１の工程におけるＰＣＲ反応の２サイクル目以降では、１サイクル目と同様に伸長反応を行うか、或いは、すでに合成された断片を鋳型として伸長反応が行われる。このときも、プライマー＃２２５及びプライマー＃２３５を用いているため、ミスアニーリングが防止されており、第１の領域のみを増幅させることができる。
【００２４】
また、第２の工程では、第１の工程と同様に、鋳型ＤＮＡを存在させない以外は通常のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行う。すなわち、第２の工程におけるＰＣＲ反応の１サイクル目では、プライマー＃２２６及びプライマー＃２３６を３’末端側で互いにアニーリングさせ、その後、プライマー＃２２６を鋳型としてプライマー＃２３６からの伸長反応を行うと共にプライマー＃２３６を鋳型としてプライマー＃２２６からの伸長反応を行う。
【００２５】
また、第２の工程におけるＰＣＲ反応の２サイクル目以降では、１サイクル目と同様に伸長反応を行うか、或いは、すでに合成された断片を鋳型として伸長反応が行われる。このときも、プライマー＃２２６及びプライマー＃２３６を用いているため、ミスアニーリングが防止されており、第２の領域のみを増幅させることができる。
【００２６】
第２段階のＰＣＲでは、第１の領域及び第２の領域を鋳型ＤＮＡとし、図１中矢印で示すプライマー＃２３７（配列番号１１）及びプライマー＃２３８（配列番号１２）を用いて、通常のプロトコールに従って各反応を行う。ここで、第１の領域と第２の領域とは、２０ｍｅｒ程度重なり合うように規定しているため、この重なり合う部分でアニーリングする。そして、プライマー＃２３７及びプライマー＃２３８を用いることによって配列番号１で示される塩基配列全体を増幅することができる。以下、増幅した塩基配列を「増幅断片」と称する。
【００２７】
また、これら第１段階及び第２段階のＰＣＲにおいては、ＤＮＡポリメラーゼとして、プルーフリーディング活性の高いものを使用することが好ましい。これによって、不測のミスアニールが生じた場合であっても、該ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によって修正することができる。
【００２８】
一方、第１段階及び第２段階のＰＣＲにおいては、ＤＮＡ変性反応、アニーリング反応及び伸長反応の各反応における温度条件、時間条件及び反応サイクル数を適宜設定し、至適化を行うことが好ましい。
このように、本方法によれば、上記２）で設計したプライマーを用いて２段階のＰＣＲを行うことによって、ペプチドの繰り返し配列をコードする遺伝子を増幅できる。特に、そのアミノ酸配列として、生物学的に意味のあるムチン型糖鎖付加配列を繰り返し含むペプチドをコードする遺伝子を、上述した方法により増幅することができる。これにより、クラスター状ムチン型糖鎖の付加配列を導入する基盤技術が確立できる。
【００２９】
２．上記１．で調製した増幅断片の他の遺伝子への導入
他の遺伝子へ増幅断片を導入する手法としては、例えば、T.Maniatisら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p239 (1982) に記載の方法などが挙げられる。この方法に準じて増幅断片を他の遺伝子に導入することによって、増幅断片を他の遺伝子に連結してなる連結遺伝子を調製することができる。
【００３０】
他の遺伝子としては、通常の分泌経路にのって分泌されるタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。このタンパク質としては、FGFファミリーに属する因子、これと近縁の因子又はヘパリン結合性を有するが前者と構造的な類似性はない他のタンパク質を挙げることができる。ここで述べる他のタンパク質としては、具体的には、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子様因子（HB-EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。FGFファミリーに属する因子または近縁の因子の具体例としては、FGF-1〜23などが知られている。
【００３１】
増幅断片を他の遺伝子に導入することによって、ペプチドの繰り返し配列を他のタンパク質に導入することができる。このとき、増幅断片を導入する位置を適宜設定することによって、他のタンパク質における所定の位置にペプチドの繰り返し配列を導入することができる。
【００３２】
配列番号１で示した増幅断片を導入する場合、３’末端側にＦＧＦのＮ末端側をコードする領域を付加しているため、以下の手順に従って、増幅断片を、ＦＧＦをコードする遺伝子（以下、ＦＧＦ遺伝子と称する）の５’末端に導入することができる。
【００３３】
すなわち、増幅断片（配列番号１）とＦＧＦ遺伝子（配列番号３１）とを鋳型とし、例えば、＃237（配列番号１１）及び＃630（配列番号１６）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ反応では、増幅断片の３’末端側にＦＧＦのＮ末端をコードする領域が存在するため、この領域とＦＧＦのＮ末端をコードする領域とがアニールする。そして、これらプライマーからの伸長反応により、全長のＤＮＡを合成することによって、増幅断片とＦＧＦ遺伝子とを連結させることができる。
【００３４】
また、配列番号１で示した増幅断片は、５’末端側に分泌シグナル配列の一部をコードする領域を付加しているため、以下の手順に従って、増幅断片を、分泌シグナル配列をコードする遺伝子（以下、分泌シグナル遺伝子と称する）の３’末端に導入することができる。
【００３５】
すなわち、増幅断片（配列番号１）と分泌シグナル遺伝子（配列番号３０）とを鋳型とし、例えば、＃105（配列番号１７）及び＃238（配列番号１２）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ反応では、増幅断片の５’末端側に分泌シグナル配列のＣ末端をコードする領域が存在するため、この領域と分泌シグナル配列のＣ末端をコードする領域とがアニールする。そして、これらプライマーからの伸長反応により、全長のＤＮＡを合成することによって、増幅断片と分泌シグナル遺伝子とを連結させることができる。
【００３６】
さらに、ここで得られた、増幅断片とＦＧＦ遺伝子との連結遺伝子及び増幅断片と分泌シグナル遺伝子との連結遺伝子は、増幅断片を共通の領域として有するため、これら２つの連結遺伝子を鋳型として、例えば、＃105（配列番号１７）及び＃630（配列番号１６）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことによって、分泌シグナル遺伝子、増幅断片、ＦＧＦ遺伝子が連結した遺伝子を作成することが可能となる。
【００３７】
なお、増幅断片の５’末端にＦＧＦ遺伝子の３’末端の一部を付加することによって、上述した手法に準じてＦＧＦ遺伝子の３’末端に増幅断片を連結することができる（図３参照）。
そして、得られた連結した遺伝子を、通常用いられるプラスミド等のベクターに導入することによって、宿主内で複製保持することができる。ベクターとしては、宿主内で複製保持可能なものであればいずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来のpBR322、pUC18及びこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げることができる。
【００３８】
３．増幅した遺伝子の発現
１）発現ベクターの構築
上記２．で得られた連結した遺伝子を、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、発現ベクターを構築することができる。発現ベクターを構築する際には、ムチン領域及び他のタンパク質をコードする塩基配列を含む領域（以下、「ムチン型糖鎖付加型タンパク質をコードする塩基配列を含む領域」と記す。) を切り出し、これを発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結することにより、発現型ベクターを得ることができる。
【００３９】
ムチン型糖鎖付加型タンパク質をコードする塩基配列を含む領域は、その５’末端に翻訳開始コドンとしてのATG を有し、また３’末端には翻訳終始コドンとしてのTAA 、TGA またはTAG を有してもよい。さらに該領域にコードされているタンパク質を発現させるには、その上流にプロモーターを接続する。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換する宿主が枯草菌である場合には、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGK プロモーター、GAP プロモーター、ADH プロモーターなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターが挙げられる。
【００４０】
このようにして構築されたムチン型糖鎖付加型タンパク質をコードする塩基配列を有する組み換えＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、宿主細胞内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来のpBR322、pUC18 などを基に構築されたベクターなどを挙げることができる。プラスミドに組み込む方法としては、例えばT.Maniatisら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
【００４１】
２）形質転換体の調製
上記１）で構築した発現ベクターを、適当な宿主細胞に導入して形質転換体を得ることができる。宿主細胞としては、糖鎖付加経路を有するものであれば、いかなるものであってもよく、枯草菌 (例えば、Bacillus subtilis DB105)、酵母 (例えば、Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) 、動物細胞（例えば、COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell) 、昆虫細胞（例えば、Sf-9 cell 、Tn cell ）などを例示することができる。
【００４２】
形質転換は、それぞれの宿主細胞について一般的に行われている方法、或いは適用可能な方法ならばいかなる方法で行ってもよい。例えば、宿主細胞が酵母であれ、該酵母をリチウム法その他の方法によりコンピータント細胞とし、構築した発現ベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入することができる。宿主細胞が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に、構築した発現ベクターをリン酸カルシウム法、リポフェクション法あるいはエレクトロポレーション法により導入することができる。
【００４３】
４．繰り返しアミノ酸配列付加型タンパク質の創製
１）繰り返しアミノ酸配列付加型タンパク質の産生
上述したように得られた形質転換体を培地にて培養することにより、例えば、ムチン型糖鎖付加型タンパク質を産生させる。形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主について一般的に用いられているものを用いる。または一般的でなくとも適用可能な培地ならば良い。例としては、宿主が酵母であればＹＰＤ培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Dulbecco's MEMに動物血清を加えたものなどを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また一般的でなくとも適用可能な条件ならばよい。例としては、宿主が酵母であれば約25〜37℃で、約12時間〜2週間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約32〜37℃で、5% CO2、100%湿度の条件で約24時間〜2週間行い、必要により気相の条件を変えたり撹拌を加えることができる。
【００４４】
上記のような形質転換体の培養物からムチン型糖鎖付加型タンパク質を得るには、培養液中に放出されたものを、遠心分離後の上澄み液から直接回収できる。また、培養菌体あるいは細胞から抽出する場合には、培養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目的のタンパク質を溶出させ、可溶性の画分から該タンパク質を得ることができる。また目的のタンパク質が不溶性画分に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離により不溶性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性にして回収する方法も用いうる。このほか塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のタンパク質を溶出させる方法もある。
【００４５】
上澄み液からムチン型糖鎖付加型タンパク質を精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などを使用することができる。さらに、ムチン型糖鎖付加型タンパク質がヘパリン結合性を有する場合には、ヘパリンセファロースを担体としたアフィニティークロマトグラフィー法を適用することができる。
【００４６】
このようにして得られたムチン型糖鎖付加型タンパク質の活性が損なわれない限りにおいて透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清アルブミンなどを添加して保存することは、ムチン型糖鎖付加型タンパク質の容器への吸着を防ぐのに有効である。また、精製過程、あるいは保存過程における微量の還元剤の共存は、ムチン型糖鎖付加型タンパク質の酸化を防ぐのに好適である。還元剤としては、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチンなどが挙げられる。
【００４７】
２）糖鎖の付加
ムチン型糖鎖付加型タンパク質は、化学的な方法で糖鎖を結合させることもできる。その具体的な方法としては以下のa)，b)いずれか、あるいはこれらの組み合わせによる方法が考えられる。
【００４８】
ａ）．まず、これらの糖鎖を、生物学的方法又は化学的合成法或いはこれらの適宜組み合わせた方法により完成させる。その際、糖鎖末端に適当なタンパク質結合用の残基を導入しておくこともできる。例えば、完成された糖鎖の還元末端を還元および部分酸化することによりアルデヒド基を形成し、これをタンパク質中のアミノ基とアミド結合させることにより、糖鎖とタンパク質の結合が完成する。
【００４９】
ｂ）．まず、単糖の還元末端、あるいは単糖に結合した適当なタンパク質結合用の残基を還元および部分酸化することによりアルデヒド基を形成し、これをタンパク質中のアミノ基とアミド結合させることにより、単糖とタンパク質の結合が完成する。この単糖の水酸基などの官能基にさらなる単糖や糖鎖などを結合させることにより、糖鎖を完成させる。この結合には生物学的方法または化学的合成法またはこれの適宜組み合わせた方法などが考えられる。
【００５０】
３）生産したムチン型糖鎖付加型タンパク質の利用
上記２）で得られた新規なムチン型糖鎖付加型タンパク質は、タンパク質自身が本来的に有する生理活性を保持したままで、糖鎖の付加による新たな機能を付与されたものである。具体的には、糖鎖付加に起因する高分子量化による生体内動態の改変、生体内での糖鎖認識タンパク質による生体内臓器選択的分配、また、生理活性糖鎖エピトープの提示による組織特異的ターゲッティング等に応用が可能である。
【００５１】
さらに、得られたムチン型糖鎖付加型タンパク質は、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、タンパク質分解酵素抵抗性などの安定性に優れており、親水性の増大によって、非特異的吸着の低減をもたらすことが予想される。したがって、ムチン型糖鎖付加型タンパク質を医薬品に利用することにより、生体への投与前にあっては、耐酸性、耐アルカリ性といった物理的安定性の向上、容器への吸着の低減によるロスの予防などが見込まれ、また、生体への投与後にあっては、生物学的安定性の向上をもたらすとともに、臓器、組織特異的ターゲッティングや体内動態の改変に応用することが可能となる。
【００５２】
さらにまた、ムチン型糖鎖付加型タンパク質のなかでヘパリン結合性を有するもの（以下、「ムチン型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質」と称する）は、糖鎖を共有結合させることにより高機能化するため、医薬として利用可能である。ここで、高機能化とは、対象のタンパク質の活性が向上することを意味する。高機能化の例としては、糖鎖をタンパク質に共有結合させることによって、熱、酸及びアルカリによる処理の後に残存する活性が、糖鎖を共有結合させていないタンパク質に比べて高くなることが挙げられる。
【００５３】
例えば、ＦＧＦに付加されたクラスター状のムチン型糖鎖は、ＦＧＦの生理的機能を調節する作用を有する。ＦＧＦの生理的機能とは、具体的には、繊維芽細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、グリア細胞の増殖を促進または抑制することをいう。従って、ムチン型糖鎖付加型ＦＧＦは、細胞増殖や肝臓など組織再生の促進、創傷治癒や神経機能調節、および繊維芽細胞等の増殖調節に有効であり、各種疾病、具体的には、繊維芽細胞腫、血管腫、骨芽腫、神経細胞死、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経芽腫、健忘症、痴呆病、心筋梗塞の予防や治療に有用であり、発毛剤、育毛剤などとしても利用可能である。
【００５４】
上記のようにして得られたムチン型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、ローション剤、エアゾール剤、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤などの医薬組成物としてもよい。医薬組成物中、有効成分であるムチン型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質の含有量は、0.0000000001〜1.0重量％程度とすればよい。該医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与することができる。本医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、ムチン糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質を、0.0001〜100mgを患部に１日に数回適用することが例示される。
【００５５】
なお、上述した例では、ヘパリン結合性タンパク質を例にとり説明したが、ムチン糖鎖を共有結合させることにより、これ以外の天然のタンパク質も高機能化させることができる。上述した説明において、ＰＣＲ反応に使用するプライマーを適当な配列に変更することによって、様々の繰り返し度数のクラスター状ムチン型糖鎖付加配列をコードする cDNA を作製することができる。また、上述した説明のうち、「１．繰り返しアミノ酸配列をコードする遺伝子の増幅」で述べたクローニングの際、標的サイズのクローンのみならず、マイナーな副産物を選択、クローニングすることにより、様々の繰り返し度数のクラスター状ムチン型糖鎖付加配列をコードする cDNA を作製することができる。このようなｃＤＮＡ配列を含む蛋白質をコードする遺伝子の例を配列番号４８及び配列番号４９に示す。
【００５６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００５７】
〔実施例１〕
分泌型 FGF の N-末端に導入するムチン型糖鎖のアクセプターとなるペプチドのアミノ酸配列（以下、「ムチンボックス」という）をコードするcDNAの合成（図１参照）
１）ムチンボックスをコードするcDNAの前半部の合成
鋳型の非存在下、プライマーとして＃２２５（配列番号７）及び＃２３５（配列番号８）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中で PCR (Polymerase Chain Reaction:ポリメレース連鎖反応) を行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、６８℃（30 秒）、７２℃（30 秒）のサイクルを３０回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し（図２レーン１）、特異的に増幅された １０６塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られた DNA 断片は、配列番号１に示される塩基配列を含む。
【００５８】
２）ムチンボックスをコードするcDNAの後半部の合成
鋳型の非存在下、プライマーとして ＃２２６（配列番号９）及び＃２３６（配列番号１０）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中で PCRを行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、６８℃（30 秒）、７２℃（30秒）のサイクルを３０回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し（図２レーン２）、特異的に増幅された １２３塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られた DNA 断片は配列番号１に示される塩基配列を含む。
【００５９】
３）ムチンボックスをコードするcDNA全長の合成
上記１）、２）で得られたDNA断片（１０６塩基対の断片及び１２３塩基対の断片）を混合して鋳型として用い、プライマーとして＃２３７（配列番号１１）及び ＃２３８（配列番号１２）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中で PCRを行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、６０℃（30 秒）、７２℃（30 秒）のサイクルを３０回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し（図２レーン３）、特異的に増幅された２０７塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られた DNA 断片は配列番号１に示される塩基配列である。
【００６０】
この２０７塩基対の断片は、ムチンボックスをコードするコーディング鎖の３’末端に、分泌型 FGF の FGF-1部分の N-末端に導入するための配列として、該ＦＧＦのN-末端側をコードする塩基配列が挿入されている。また、この２０７塩基対の断片は、ムチンボックスをコードするコーディング鎖の５’末端に、分泌型 FGF のFGF-1部分のN-末端に導入するための配列として、該ＦＧＦの分泌シグナル配列のC-末端側をコードする塩基配列が挿入されている。また、この２０７塩基対の断片は、両端側に、ベクターに組み込むための制限酵素サイトとしてEco RIサイトが挿入されている。
【００６１】
４）ムチンボックスをコードする cDNAのクローニング
上記３）で得られた DNA 断片を Eco RIで完全に消化して、PCR 産物の末端処理を行った。この反応産物を、DNA 断片精製キット（ロシュ・ダイアグノスティクス（株）ハイピュアPCRプロダクトピュアリフィケーションキット）を用いて精製した。得られた精製 DNA 断片を、Eco RI 及び CIAP で前処理したベクター、pBluescript II (KS+) と混合し、DNA 連結反応に供した。この反応産物を用い、大腸菌株 DH5α の形質転換を行った。得られた形質転換体をアンピシリン、X-Gal、IPTG の存在下でアガロース培地上に播種し、生育した白色コロニーを選択することで一次スクリーニングを行った。
【００６２】
選択したコロニーを用い、ベクタープライマー#115（配列番号１９）及び#116（配列番号２０）を用いたダイレクトPCRを行うことによって、予想される295塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、二次スクリーニングとした。
二次スクリーニングで得られたコロニーをアンピシリン含有 LB培地中で液体培養し、増殖した菌体からアルカリ法によってプラスミドを粗精製した。このプラスミドを Eco RIで消化し、切り出された DNA断片をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的サイズである195塩基対のバンドを与えるクローンを選択し、三次スクリーニングとした。選択された数種のクローンについて、再びプラスミドを精製し、サイクルシークエンス法によってプラスミドの挿入配列を解読した。
【００６３】
予想される配列と一致した配列を持つクローンを一種選択し、mucx10@N-ter./pBS/cl.9/000524と名付け、平成１２年５月２９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17881にて寄託されている。このクローンの持つDNA配列を配列番号２１に示す。また、このクローンのプラスミドをEco RI で消化し、切り出された DNA 断片をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を「図２レーン４」に示す。
【００６４】
〔実施例２〕
分泌型 FGF の C-末端に導入するムチンボックスをコードするcDNAの合成（図３参照）
１）ムチンボックスをコードするcDNAの前半部の合成
鋳型の非存在下、プライマーとして＃224（配列番号２２）及び＃225（配列番号２３）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中でPCR を行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、５５℃（30 秒）、７２℃（30 秒）のサイクルを２５回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離して特異的に増幅された110塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られたDNA断片は配列番号２４に示す塩基配列を含む。
【００６５】
２）ムチンボックスをコードするcDNAの後半部の合成
鋳型の非存在下、プライマーとして＃226（配列番号９）及び＃227（配列番号２３）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中で PCRを行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、５５℃（30 秒）、７２℃（30 秒）のサイクルを２５回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離して特異的に増幅された107塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られたDNA断片は配列番号２４に示す塩基配列を含む。
【００６６】
３）ムチンボックスをコードするcDNA全長の合成
上記１）、２）で得られたDNA断片（それぞれ110塩基対のDNA断片及び107塩基対のDNA断片）を混合して鋳型として用い、プライマーとして＃230（配列番号２５）及び＃231（配列番号２６）を用い、これらがそれぞれ８pmol/μlの濃度で存在する反応系中で PCRを行った。反応条件は、９４℃（30 秒）、５０℃（30 秒）、７２℃（30 秒）のサイクルを２５回繰り返した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離して特異的に増幅された195塩基対のバンドを抽出し、エタノール沈殿によって精製した。得られたDNA断片は配列番号２４に示す塩基配列である。
【００６７】
この195塩基対の断片は、ムチンボックスをコードするコーディング鎖の５’末端に、分泌型 FGF のC-末端に導入するための配列として、該ＦＧＦのC-末端側をコードする塩基配列が挿入されている。また、この195塩基対の断片は、ムチンボックスをコードするコーディング鎖の３’末端に、蛋白質翻訳の終了を指示するための塩基配列が挿入されている。また、この195塩基対の断片は、両端側に、ベクターに組み込むための制限酵素サイトとしてEco RIサイトが挿入されている。
【００６８】
４）ムチンボックスをコードする cDNAのクローニング
上記３）で得られた DNA 断片を Eco RIで完全に消化して、PCR 産物の末端処理を行った。この反応産物を、DNA 断片精製キット（ロシュ・ダイアグノスティクス（株）ハイピュアPCRプロダクトピュアリフィケーションキット）を用いて精製した。得られた精製 DNA 断片を、Eco RI 及び CIAP で前処理したベクター、pBluescript II (KS+) と混合し、DNA 連結反応に供した。この反応産物を用い、大腸菌株 DH5α の形質転換を行った。得られた形質転換体をアンピシリン、X-Gal、IPTG の存在下でアガロース培地上に播種し、生育した白色コロニーを選択することで一次スクリーニングを行った。
【００６９】
選択したコロニーを用い、ベクタープライマー＃115（配列番号１９）及び＃116（配列番号２０）を用いたダイレクトＰＣＲを行うことによって、予想された283塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、二次スクリーニングとした。
【００７０】
二次スクリーニングで得られたコロニーをアンピシリン含有 LB培地中で液体培養し、増殖した菌体からアルカリ法によってプラスミドを粗精製した。このプラスミドを Eco RIで消化し、切り出された DNA断片をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的サイズである183塩基対のバンドを与えるクローンを選択し、三次スクリーニングとした。選択された数種のクローンについて、再びプラスミドを精製し、サイクルシークエンス法によってプラスミドの挿入配列を解読した。
【００７１】
予想される配列と一致した配列を持つクローンを一種選択し、mucx10@C-ter./pBS/cl.I2-3/000524と名付け、平成１２年５月２９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17882にて寄託されている。このクローンの持つDNA配列を配列番号２７に示す。
【００７２】
〔実施例３〕分泌型 FGFをコードする cDNA の合成
ここでは、分泌型 FGFとして、マウス由来ＦＧＦ−６のＮ末端の４０アミノ酸残基（分泌シグナル配列）と、ヒト由来ＦＧＦ−１（分泌シグナル配列を有さない）とのキメラタンパク質（配列番号３４）を合成した。
【００７３】
１）マウス FGF-6 cDNA 断片の作成
マウスの脳より調製したFGF-6のcDNA（配列番号２８）を鋳型とし、# 1048 (5'-GCG TCG ACC CAC CAT GTC CCG GGG AGC AGG ACG TGT TCA GGG CAC GCT GCA GGC TCT CGT CTT C-3')（配列番号１３）および # 968 (5'-GCG ATA TCC AGT AGC GTG CCG TTG GCG CG-3') （配列番号１４）をプライマーとして PCR 反応を行った。特異的に増幅された１３８塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、EcoR Vおよび Sal Iで二重切断した。得られた、１３０塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。この１３０塩基対の断片には、マウスFGF-6における分泌シグナルを示すアミノ酸配列をコードする領域を含んでいる。
【００７４】
２）ヒト FGF-1 遺伝子断片の作成
ヒトの肝臓細胞より調製したFGF-1 cDNA（配列番号２９）を鋳型とし、# 967 (5'-GCG TCG ACA GCG CTA ATT ACA AGA AGC CCA AAC TC-3')（配列番号１５）および # 630 (5'-CCG AAT TCG AAT TCT TTA ATC AGA AGA GAC TGG-3')（配列番号１６）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された４３４塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、EcoR IおよびSal Iで二重切断した。得られた４１８塩基対のバンドを分離抽出し、これを、EcoR I, Sal I で二重切断した pBluescript II (KS+) クローニングベクター (２９３４塩基対) に挿入して、FGF-1α/pBluescript II (KS+) を得た（３３５２塩基対）。得られたFGF-1α/pBluescript II (KS+) を Aor51H I および Sal Iで順次消化し、得られた３３４４塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。この３３４４塩基対の断片には、ヒトFGF-1をコードする領域を含んでいる。
【００７５】
３）キメラ遺伝子の作成
上記１）で得られた１３０塩基対の断片及び上記２）で得られた３３４４塩基対の断片をDNA連結反応に供し、N-FGF-6/1α-IV/pBluescript II (KS+)ベクターを得た（３４７４塩基対、配列番号３２）。なお、１３０塩基対の断片には、Ｎ型糖鎖が付加するアスパラギン残基をコードするコドンが存在している。
【００７６】
４）N-FGF-6/1α<NQ>キメラ遺伝子の作成
ここでは、上記３）で得られたN-FGF-6/1α-IV/pBluescript II (KS+)ベクターに部位特異的変異導入を行い、Ｎ型糖鎖が付加するアスパラギン残基をグルタミン酸に変異させた。すなわち、先ず、N-FGF-6/1α-IV/pBluescript II (KS+) ベクターを鋳型とし、# 105 (5'-GCG TCG ACC CAC CAT GTC-3') （配列番号１７）および # 124 (5'-GCG ATA TCC AGT AGC GTG CCT TGG GCG CG-3') （配列番号１８）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された１３８塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、EcoR VおよびSal Iで二重切断した。得られた、130 塩基対のバンドを、上記２）で得られた３３４４塩基対の断片と共にDNA連結反応に供し、N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターを得た（３４７４塩基対、配列番号３３）。なお、N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターにおいては、１３０塩基対の断片におけるＮ型糖鎖が付加するアスパラギン残基をコードするコドンがグルタミンをコードするコドンに変異している。
【００７７】
ここで得られたN-FGF-6/1α-IV/pBluescript II (KS+)ベクターのSal I/EcoR I 消化産物を、発現ベクター pMEXneo にクローニングしたクローンを一種選択し、FGF-6/1α-IV/pMEXneo/cl.15-1/DH5α/970903と名付け、平成１２年９月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16408にて寄託されている。このクローンの持つ DNA 配列を配列番号３２に示す。
【００７８】
また、N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターのSal I/EcoR I 消化産物を、発現ベクター pMEXneo にクローニングしたクローンを一種選択し、FGF-6/1α-IV'(NQ)/pMEXneo/cl.153-1/DH5α/970903と名付け、平成１２年９月１１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16418にて寄託されている。このクローンの持つ DNA 配列を配列番号３３に示す。
【００７９】
〔実施例４〕
分泌型FGFのN-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードするcDNAの合成（図４のＢに示す）
ここでは、実施例１で得られたムチンボックスをコードするcDNAを用いて、分泌型FGF（図４のＡに示す）のN-末端にムチンボックスを導入したタンパク質を創製するためのcDNAを作製した。
【００８０】
１）分泌型FGFのシグナル配列をコードする cDNA の合成
ここでは、分泌型FGFのシグナル配列をコードするcDNAを合成した。N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターを鋳型とし、＃115（配列番号１９）及び＃241（配列番号３５）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された160塩基対のバンドを抽出した。
【００８１】
２）ムチンボックス領域をコードする cDNA の合成
ここでは、ムチンボックス領域をコードするcDNAを合成した。実施例１で作成したmucx10@N-ter./pBS/cl.9/000524プラスミドを鋳型とし、＃239（配列番号３６）及び＃240（配列番号３７）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された196塩基対のバンドを抽出した。
【００８２】
３）分泌型FGFのFGF-1領域をコードする cDNA の合成
ここでは、分泌型FGFにおけるヘパリン結合性を有する領域をコードするcDNAを合成した。N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターを鋳型とし、＃242（配列番号３８）及び＃116（配列番号２０）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された447塩基対のバンドを抽出した。
【００８３】
４）分泌型 FGF の N-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードする cDNAの全長の合成
上記１）、２）、３）で得られた DNA 断片（それぞれ160塩基対、196塩基対、447塩基対）を混合して鋳型とし、＃213（配列番号３９）及び＃116（配列番号２０）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。このＰＣＲにおける反応条件は、94℃（30秒）、55℃（30秒）、72℃（60秒）のサイクルを25回繰り返すものとした。
【００８４】
そして、このＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された746塩基対のバンドを抽出した。この746塩基対の断片には、シグナル配列をコードする領域と、その下流に挿入されたムチンボックスをコードする領域と、その下流に挿入されたヘパリン結合性を有する領域（ヒトFGF-1をコードする領域）が含まれている。すなわち、ここで、分泌型FGFのN-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードするcDNAの全長を合成した。
【００８５】
５）分泌型FGFのN-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードするcDNAのクローニング
上記４）で得られたDNA断片をEco RIで完全に消化して、PCR産物の末端処理を行った（701塩基対）。その後、この反応産物を、DNA 断片精製キット（ロシュ・ダイアグノスティクス（株）ハイピュアPCRプロダクトピュアリフィケーションキット）を用いて精製した。得られた精製DNA断片を、Eco RI及びCIAPで前処理したpCADベクターと混合し、DNA連結反応に供した。この組み換えベクターを用い、大腸菌株DH5αの形質転換を行った。得られた形質転換体をアンピシリンの存在下でアガロース培地上に播種し、生育したコロニーを選択することで一次スクリーニングを行った。
【００８６】
選択したコロニーを用い、プライマー＃174（配列番号４０）及び＃212（配列番号４１）を用いたダイレクトＰＣＲを行うことによって、予想される807塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、二次スクリーニングとした。さらに、プライマー＃174（配列番号４０）及び＃102（配列番号４２）を用いたダイレクトＰＣＲを行うことによって、予想される704塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、挿入配列の方向の正しいものを選択した。
【００８７】
選択したコロニーをアンピシリン含有 LB 培地中で液体培養し、増殖した菌体からアルカリ法によってプラスミドを粗精製した。このプラスミドを Eco RIで消化し、切り出されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的サイズである701塩基対のバンドを与えるクローンを選択し、三次スクリーニングとした。三次スクリーニングで選択された数種のクローンについて、再びプラスミドを精製し、サイクルシークエンス法によってプラスミドの挿入配列を解読した。
【００８８】
予想される配列と一致した配列を持つクローンを一種選択し、NM10:mucx10@Nter.secFGF/pCAD/cl.N-6/000524と名付け、平成１２年５月２９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17879にて寄託されている。このクローンの持つ DNA 配列を配列番号４３に示す。
【００８９】
〔実施例５〕
分泌型FGFのC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードする cDNAの合成（図４のＣに示す）
ここでは、実施例２で得られたムチンボックスをコードするcDNAを用いて、分泌型FGF（図４のＡに示す）のC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質を創製するためのcDNAを作製した。
【００９０】
１）分泌型FGF のほぼ全長をコードする cDNA の合成
N-FGF-6/1α<NQ>/pBluescript II (KS+) ベクターを鋳型とし、＃213（配列番号３９）及び＃234（配列番号４４）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された551塩基対のバンドを抽出した。
【００９１】
２）ムチンボックスをコードする cDNA の合成
ここでは、ムチンボックス領域をコードするcDNAを合成した。実施例２で作製したmucx10@C-ter./pBS/cl.I2-3/000524プラスミドを鋳型とし、＃232（配列番号４５）及び＃233（配列番号４６）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された195塩基対のバンドを抽出した。
【００９２】
３）分泌型FGFのC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質のcDNAの全長の合成
上記１）、２）、で得られた DNA 断片を混合して鋳型とし、プライマーとして＃213（配列番号３９）及び＃233（配列番号４６）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにおける反応条件は、94℃（30秒）、55℃（30秒）、72℃（30秒）のサイクルを25回繰り返すものとした。
【００９３】
そして、このＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、特異的に増幅された721塩基対のバンドを抽出した。この721塩基対の断片には、シグナル配列をコードする領域と、その下流に挿入されたヘパリン結合性を有する領域（ヒトFGF-1をコードする領域）と、その下流に挿入されたムチンボックスとが含まれている。すなわち、ここで、分泌型FGFのC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質をコードするcDNAの全長を合成した。
【００９４】
４）分泌型FGFのC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質のcDNAのクローニング
上記３）で得られたDNA断片をEco RIで完全に消化して、PCR産物の末端処理を行った。その後、この反応産物を、DNA 断片精製キット（ロシュ・ダイアグノスティクス（株）ハイピュアPCRプロダクトピュアリフィケーションキット）を用いて精製した。得られた精製DNA断片を、Eco RI及びCIAPで前処理したpCADベクターと混合し、DNA連結反応に供した。この組み換えベクターを用い、大腸菌株DH5αの形質転換を行った。得られた形質転換体をアンピシリンの存在下でアガロース培地上に播種し、生育したコロニーを選択することで一次スクリーニングを行った。
【００９５】
選択したコロニーを用い、プライマー＃174（配列番号４０）及び＃212（配列番号４１）を用いたダイレクトＰＣＲを行うことによって、予想される807塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、二次スクリーニングとした。さらに、プライマー＃174（配列番号４０）及び＃102（配列番号４２）を用いたダイレクトＰＣＲを行うことによって、予想される554塩基対のバンドを与えるクローンを選択することで、挿入配列の方向の正しいものを選択した。
【００９６】
選択したコロニーをアンピシリン含有 LB 培地中で液体培養し、増殖した菌体からアルカリ法によってプラスミドを粗精製した。このプラスミドを Eco RIで消化し、切り出されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的サイズである701塩基対のバンドを与えるクローンを選択し、三次スクリーニングとした。三次スクリーニングで選択された数種のクローンについて、再びプラスミドを精製し、サイクルシークエンス法によってプラスミドの挿入配列を解読した。
【００９７】
予想される配列と一致した配列を持つクローンを一種選択し、CM10:mucx10@Cter.secFGF/pCAD/cl.D-5/000524と名付け、平成１２年５月２９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17880にて寄託されている。このクローンの持つ DNA 配列を配列番号４７に示す。
【００９８】
〔実施例６〕
分泌型FGFのN-末端又はC-末端にムチンボックスを導入したタンパク質の発現
１）動物細胞への遺伝子導入
実施例４で得られたNM10:mucx10@Nter.secFGF/pCAD/cl.N-6/000524プラスミド或いは実施例５で得られたCM10:mucx10@Cter.secFGF/pCAD/cl.D-5/000524プラスミドをリポフェクション法によってCHO-K1細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞 K1 亜株）に遺伝子導入し、チミジン及びヒポキサンチン非存在下で培養することによって遺伝子導入細胞を選択した。
【００９９】
２）遺伝子増幅
得られた遺伝子導入細胞の培養液にメトトレキサート(MTX)を加え、導入遺伝子の増幅を図った。順次MTX濃度を増加させ、最終的に1000nM MTX 存在下で生存するクローンを選択した。これらの選択されたクローンのうち、ムチンボックスをN-末端に導入したクローンをNM10/CHO と名付け、また、ムチンボックスをC-末端に導入したクローンを CM10/CHO と名付けた。
【０１００】
３）選択されたクローンによる目的タンパク質の大量生産
NM10/CHO 及びCM10/CHO を培養皿ほぼいっぱいになるまでそれぞれ増やし、培地を無血清培地に交換することによってタンパク質生産量を増大させた。１日毎に培地を交換し、得られた馴化培地は低速遠心分離した後、その上清を４℃で保存した。
【０１０１】
〔実施例７〕
シアリルルイスＸ抗原の発現
実施例６で調製したクローンに、更にコア２N-アセチルグルコサミン転移酵素及びフコース転移酵素７の遺伝子導入を図り、シアリルルイスＸ抗原を発現させた。
【０１０２】
１）コア２N-アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子導入
ヒトのコア２N-アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を、定法により PCR によってクローニングし、pZeoSV2(+) ベクターに組み込んだ。これを 実施例６で調製したNM10/CHO細胞あるいはCM10/CHO細胞に上述の手法によって遺伝子導入し、ゼオシン耐性によって導入遺伝子発現細胞を選択した。これらクローンをそれぞれNM10/C2GN-T/CHO、CM10/C2GN-T/CHOと名付けた。
【０１０３】
２）フコース転移酵素７の遺伝子導入
ヒトのフコース転移酵素７遺伝子を、定法によりPCRによってクローニングし、pMEXneo ベクターに組み込んだ。これをNM10/C2GN-T/CHOあるいはCM10/C2GN-T/CHOに上述の手法によって遺伝子導入し、ジェネティシン耐性によって導入遺伝子発現細胞を選択した。これらのクローンをそれぞれNM10/C2GN-T/FT7/CHO、CM10/C2GN-T/FT7/CHOと名付けた。
【０１０４】
＜試験例＞
上述した実施例６又は実施例７で得られた細胞株を用いて、以下に示すような各種試験を行い、ムチンボックスを導入したタンパク質の特性を評価した。
〔試験例１〕
分泌された蛋白質の解析
１）ヘパリン親和性を利用した分泌蛋白質の粗精製
実施例６で得られた馴化培地を用いて、ヘパリン親和性カラムクロマトグラフィーを行い、FGF含有画分を粗精製した。ヘパリン親和性カラムクロマトグラフィーは、先ず、実施例６で得られた馴化培地にヘパリンセファロースビーズを添加し、一昼夜４℃で撹拌した。次に、静置により沈降したビーズをカラムに詰め、生理的塩濃度の緩衝液で十分に洗浄した。その後、２．５Ｍの塩を含む緩衝液でビーズに結合したタンパク質を溶出させた。タンパク質を溶出させた緩衝液を２８０ｎｍの吸光度でモニターするとともに、各画分のFGF含量を抗FGF-1抗体を用いたELISA法によって測定した。
【０１０５】
その結果、NM10/CHO 及びCM10/CHO のいずれについても、５〜８ μg/ml のFGF-1抗原性を有する分子（それぞれ、NM10、CM10と呼ぶ）が分泌されていることを確認した。遺伝子を導入していないCHO細胞の馴化培地中には、FGF-1抗原性を有する分子は検出されなかった（検出感度；100 ng/ml）。
【０１０６】
２）SDS 変性電気泳動
上記により得られたFGF含有画分を、SDS変性電気泳動に供した。試料を電気泳動用緩衝液（SDS及び2-メルカプトエタノールを含有）と共に煮沸することによってタンパク質を変性し、12.5 %アクリルアミドゲルを用いて、SDS存在下で電気泳動を行った。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に電気的に転写後、抗 FGF-1単クローナル抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体、あるいは、ビオチン標識抗 FGF-1単クローナル抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとを用いて染色し、化学発光法で検出した。
【０１０７】
結果を図５のAに示す。分泌型FGF-1 の分子量18.5 kDa （レーン５）に対し、NM10、CM10は、ともに、35 kDa 近くの分子量を持つことが判明した（それぞれ、レーン１及び２）。これらは、分泌型FGF-1にムチン型糖鎖付加配列を一回だけ導入した分子（NM1、CM1）の分子量21 kDa よりも大きなものであった（それぞれ、レーン３及び４）。
分泌型FGF-1 の分子量とNM10、CM10の分子量の差は、蛋白質骨格の分子量増加だけで説明できるものではないため、NM10、CM10では糖鎖修飾が生じているものと予想された。
【０１０８】
３）各種糖質分解酵素による消化
上述のとおり、ヘパリン親和性カラムクロマトグラフィーによって粗精製されたタンパク質を用い、酢酸緩衝液（pH 5.0）、アースロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼを加え、37℃で一晩保温した後、100 ℃で３分間加熱して酵素反応を止めた。これを２）と同様にしてSDS変性電気泳動によって解析した。あるいは、リン酸緩衝液（pH 7.8）、フラボバクテリウム由来のペプチド-N-グリコシダーゼ F (PNGase)を加え、37℃で一晩保温した後、100℃で３分間加熱して酵素反応を止めた。これを同様にしてSDS変性電気泳動によって解析した。
【０１０９】
また、シアリダーゼ処理後の試料を用い、リン酸緩衝液（pH 6.4）、ストレプトコッカス・ニューモニア由来のO-グリコシダーゼを加え、37℃で一晩保温した後、100℃で３分間加熱して酵素反応を止めた。これを上述のとおりSDS変性電気泳動によって解析した。
結果を図5のＢ〜Ｅに示す。
【０１１０】
図５のＢでは、シアリダーゼ処理の結果を示す。酵素処理前のNM10、CM10（それぞれレーン１及び３）に比べ、酵素処理後のNM10、CM10（それぞれレーン２及び４）のSDS-PAGE上の分子量が変化した。このことから、NM10、CM10がシアル酸を含有する分子であると結論できた。
【０１１１】
図５のＣでは、PNGase処理の結果を示す。酵素処理前のNM10、CM10（それぞれレーン１及び３）と、酵素処理後のNM10、CM10（それぞれレーン２及び４）のSDS-PAGE上の分子量に変化は認められなかった。ただし、CM10のマイナーなバンド（36 kDa,レーン3）がPNGase処理によって消失する（レーン４）ことが判明した。この結果、NM10がN-結合型糖鎖を含有しない分子であること、また、CM10 もメジャーな画分はN-結合型糖鎖を含有しないが、一部のマイナー画分はN-結合型糖鎖を含有する分子であることが結論できた。
【０１１２】
また、図５のＤ及び図５のＥでは、NM10（図５のＤ）、CM10（図５のＥ）それぞれについてのO-グリコシダーゼで処理の結果を示す。無処理の試料（レーン１）に比べ、シアリダーゼ処理によって移動度は低下するが（レーン２）、O-グリコシダーゼ処理のみでは移動度に変化は見られない（レーン３）。一方、シアリダーゼ処理後の試料をO-グリコシダーゼで処理すると、分子量は大きく減少した（レーン４）。これは、O-グリコシダーゼは修飾されていないGal β 1-3 GalNAc 構造のみを切断するという高い基質特異性に基づくものであり、この結果から、NM10、CM10はシアリル化された Gal β 1-3 GalNAc 構造を持つ糖鎖で修飾されていることが明らかとなった。
さらに、得られた分子量は、O-型糖鎖生合成変異株である  ldlD 細胞を宿主とした際に得られる分子の分子量と一致したことからも（レーン５）、NM10及びCM10が O-型糖鎖で修飾された分子であることが確認できた。
【０１１３】
〔試験例２〕
アミノ酸・アミノ糖の組成分析
試験例１と同様にヘパリン親和性カラムクロマトグラフィーによって粗精製した試料を、希釈して塩濃度を低下させた後、再び、HPLCを用いたヘパリン親和性カラムクロマトグラフィーに供した（後述する試験例４を参照）。塩濃度を０．５〜２．５Ｍまで直線的に増加させ、２１４ｎｍの吸光度でモニターするとともに、各画分のFGF含量を抗FGF-1抗体を用いたELISA法によって測定した。得られたFGF含有画分をSDS変性電気泳動で分離し、銀染色によって解析した。結果を図７のＢ（レーン１）に示す。図７のＢに示すように、ムチンボックスを導入したFGFは、ほぼ単一バンドとして検出された。これによりムチンボックスを導入したFGFが高純度に精製されたことが判った。
【０１１４】
上記により高純度に精製された試料の一部を、６Ｎ塩酸中で110℃、２２時間加熱することで、ペプチド結合の加水分解を行った。これをアミノ酸分析計で解析することにより、タンパク質含量（濃度）を正確に定量した。また、他の一部を、４Ｎ塩酸中で100℃、６時間加熱することで、グリコシド結合の加水分解を行った。これをHPLCで定量分析することで、アミノ糖含量（濃度）を正確に定量した。
【０１１５】
これら、アミノ酸定量分析の結果とアミノ糖定量分析の結果をあわせ、糖蛋白質１分子中の糖鎖の数を算出した。
その結果、ＣＭ10蛋白質１モル中に、GalNAc残基が10.0残基存在することが判明し、上記、試験例１の結果と併せて、CM10はシアリル化された Gal β 1-3 GalNAc 構造を持つ糖鎖１０本で修飾されていることが結論できた。
【０１１６】
〔試験例３〕
ＤＮＡ合成促進活性
HUVEC（ヒト臍帯由来血管内皮細胞）は１５％血清存在下でもＦＧＦなどの増殖因子が欠乏すると細胞周期が停止する。このような状態においたHUVECに、試験例１で調製したムチンボックスを導入したＦＧＦあるいはCHO細胞で生産した分泌型FGF (secFGF)を添加し、１８時間後、放射標識されたチミジンを６時間取り込ませた。そして、この間にＤＮＡ中に取り込まれた放射活性を測定することによって、新たに合成されたＤＮＡ量を算出し、ＤＮＡ合成促進活性として評価した。
【０１１７】
結果を図６に示す。図６のＡはNM10、図６のＢはCM10、図６のＣは分泌型FGF-1のHUVECに対するＤＮＡ合成促進活性であり、白四角は無処理の試料の、黒四角はシアリダーゼ及びO-グリコシダーゼ処理によってO-型糖鎖を除去した試料の結果を示す。
【０１１８】
この結果、ムチンボックスを導入したＦＧＦ（図６のＡ、図６のＢ）は、secFGF（図６のＣ）に比べ、若干の比活性の低下は認められるものの、十分なＤＮＡ合成促進活性を保持していることが明らかとなった。また、これらは、そのO-型糖鎖を除去することによって、secFGFと同等の活性に回復する（黒四角）ことから、比活性低下の一因はO-型糖鎖にあるものと考えられた。
【０１１９】
〔試験例４〕
ヘパリン親和性アフィニテイークロマトグラフィー
試験例１で得られたムチンボックスを導入したＦＧＦ（CM10）或いは大腸菌で生産させたＦＧＦ−１について、ヘパリン親和性を調べた。ムチンボックスを導入したＦＧＦの分泌細胞の馴化培地にヘパリンセファロースビーズを加え、４℃で２時間以上攪拌した。低速遠心によって沈降するビーズを回収し、ＰＢＳで十分に洗浄後、２．５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳによってヘパリン固定化ビーズに結合したタンパク質を溶出した。さらに、この溶出液にリン酸緩衝液を加え塩濃度を低下させた後、再び、ヘパリン親和性アフィニテイービーズを充填した高速液体クロマトグラフィーに供し、ＮａＣｌの濃度勾配によって結合したタンパク質を溶出した。
【０１２０】
結果を図７のAに示す。図７のAは２１４ｎｍの吸光度でモニターしたCM10の溶出パターンを示す。ピーク１がCM10の溶出ピークであり、溶出塩濃度は1.3 M に相当する。一方、大腸菌由来ＦＧＦ-１はピーク２の位置すなわち塩濃度は1.7 Mで溶出される。この結果から、ムチンボックスを導入したＦＧＦ（CM10）は単純蛋白質FGF-1に比べ、固定化ヘパリンへの親和性が低下していることが判明した。
【０１２１】
図７のＢは図７のAの溶出パターンのうち、ピーク１（レーン１）及びピーク２に相当する位置（レーン２）の画分について、銀染色を行った結果である。この結果、ピーク１はほぼ純粋なCM10 として溶出されていること、また、ピーク２として溶出された蛋白質は、その分子量から、自然分解によってO-型糖鎖結合領域が分解し、ほぼFGF-1部分のみなった蛋白質に相当するものと考えられた。
【０１２２】
〔試験例５〕
ムチンボックスを導入したＦＧＦの耐熱安定性
ムチンボックスを導入したＦＧＦ及び大腸菌で生産させたＦＧＦ−１について、その分泌細胞の馴化培地をＰＢＳに対して十分に透析し、その一部を５６℃または７０℃に保温したＰＢＳ中に３０分間保持、あるいは、室温で１２時間保持した後、再び４℃のＰＢＳに対して透析し、試料とした。各試料の耐熱安定性は、各種処理の後、HUVECのＤＮＡ合成促進活性試験に供し、４℃のＰＢＳで１２時間透析した試料との比較によって、安定性の指標とした。
【０１２３】
室温で１２時間保持した場合、大腸菌由来ＦＧＦ−１でもヘパリンによってその活性は保護されるが、ムチンボックスを導入したＦＧＦではヘパリンの有無に拘わらず活性が保持された。また、熱処理した場合には、大腸菌由来ＦＧＦ−１はほとんど失活するにも拘わらず、ムチンボックスを導入したＦＧＦは、５６℃の場合には約５０％の活性が残存し、７０℃の場合には約３０％の活性が残存しており、耐熱安定性が向上しているものと考えられた。
【０１２４】
〔試験例６〕
ムチンボックスを導入したＦＧＦの耐酸安定性及び耐アルカリ安定性
ムチンボックスを導入したＦＧＦ及び大腸菌で生産させたＦＧＦ−１について、その分泌細胞の馴化培地をＰＢＳに対して十分に透析し、その一部をpH４．０のクエン酸緩衝液または pH１０．０の炭酸ナトリウム緩衝液中で１２時間透析し、再び ４℃のＰＢＳに対して透析した後、試料とした。各試料の安定性は、各種処理の後、HUVECのＤＮＡ合成促進活性試験に供し、４℃のＰＢＳで１２時間透析した試料との比較によって、安定性の指標とした。
【０１２５】
これらの酸、またはアルカリ処理によって、大腸菌由来ＦＧＦ-１はほとんど活性を消失する。一方、ムチンボックスを導入したＦＧＦはヘパリンの存在の有無に拘わらず、pH４．０の酸処理によってもほとんど活性の低下がみられず、耐酸安定性の向上が認められた。また、ムチンボックスを導入したＦＧＦはpH １０．０ のアルカリ処理の後でも約５０％の活性を保持しており、耐アルカリ安定性についても向上が認められた。
【０１２６】
〔試験例７〕
ムチンボックスを導入したＦＧＦの抗タンパク質分解酵素安定性
ムチンボックスを導入したＦＧＦの分泌細胞の馴化培地をＰＢＳに対して十分に透析し、その一部に蛋白質分解酵素トロンビン(0.01%)またはファクターXa (0.01%) を加え、３７℃で１時間保温した。これを前述のＳＤＳ変性電気泳動に供し、残存するバンドの強度を処理前の試料と比較することで安定性の指標とした。結果を図８に示す。
【０１２７】
CHO細胞で生産した単純蛋白質である分泌型FGF（secFGF）の場合、上記のような酵素処理で、当初のバンドの強度が減少し、これにつれて分解物に由来すると考えられる新たなバンドが出現する。しかし、ムチンボックスを導入したＦＧＦ（図８では「NM10」、「CM10」）の場合は、ほとんど分解物に相当するバンドは検出されなかった。これより、ムチンボックスを導入したＦＧＦは蛋白質分解酵素（トロンビン、ファクターXa）に対する抵抗性が増大しているものと考えられた。
【０１２８】
〔試験例８〕
ピーナツ凝集素を例とする糖鎖認識蛋白質への親和性の解析
上述したように、ムチンボックスを導入したＦＧＦ（NM10、CM10）はO-型糖鎖による修飾を受けていることが判明した。そこで、これらのＦＧＦに導入された糖鎖が機能をもっているか否かを検討する目的で、レクチン親和性カラムクロマトグラフィーを行った。小麦胚芽凝集素(WGA) は、糖鎖末端のシアル酸を認識することが知られており、その親和性はシアル酸が集塊状に存在したときに増大するとされている。ピーナツ凝集素（ＰＮＡ）は、ムチン型糖鎖への親和性が知られているタンパク質であり、その親和性はシアル酸のないムチン型糖鎖が集塊状に存在したときに増大するとされている。ヒマ凝集素 (RCA120)は、糖鎖末端のガラクトース残基を認識することが知られており、その親和性はガラクトースが集塊状に存在したときに増大するとされている。そこで、これら凝集素をセファロース担体に固定化したゲルを用い、ムチンボックスを導入したＦＧＦ（CM10）及び分泌型FGF-1(secFGF)、また、試験例１で用いたCM1について、これらレクチン固定化カラムへの結合性を比較した。
【０１２９】
各種のFGFを固定化レクチンカラムに負荷し、十分に洗浄後、それぞれのレクチンのハプテン糖（0.5 M N-アセチルグルコサミン (WGA)、0.3 M ガラクトース (PNA)、0.5 M ラクトース (RCA120)）を含有する緩衝液を用いて、結合したタンパク質を溶出した。洗浄液、溶出液をそれぞれ分画し、各画分中に存在するＦＧＦ含量を抗ＦＧＦ-１抗体を用いたELISAで定量解析した。
結果を表１に示す。なお、表１において、「WGA」は小麦胚芽凝集素を示し、「PNA」はピーナッツ凝集素を示し、「RCA120」はヒマ凝集素を示している。
【０１３０】
【表１】
0004006511.tif 000002
【０１３１】
この表１より、O-型糖鎖の導入によって、糖鎖の構造に応じたレクチン反応性が認められ、このことから、FGF-1 分子に O-型糖鎖の機能を付与できたものと考えられた。
【０１３２】
〔試験例９〕
生物学的安定性の解析
試験例１で調製したムチンボックスを導入したＦＧＦ（ＣＭ１０）をＩＣＲマウス尾静脈血管内に投与し、一定時間ごとに尾を切断して、浸潤する血液を一定量採取した。これに血液凝固阻止因子を添加した後、ＳＤＳ変性電気泳動に供し、抗ＦＧＦ-１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を、デジタル化処理することで、血流中に存在するＦＧＦの量を定量解析した。
【０１３３】
結果を図９に示す。図９のAは、各時間毎に採取した試料を、免疫染色で解析した結果を示す。(a) は無処理のCM10、(b) はシアリダーゼ処理したCM10、(c) はシアリダーゼ処理後O-グリコシダーゼ処理したCM10の結果を示す。また、図９のBは、免疫染色の結果を定量的に解析した結果を、CM1 の結果を含めて示す。
【０１３４】
その結果、糖鎖を持たないCM10 分子を基準にすると、シアリル化されたO-型糖鎖を持つCM10 は血中滞在時間が延長し、シアリダーゼ処理によってシアル酸を除去したCM10は、逆に血中滞在時間が短縮することが判明した、これにより、糖鎖の構造を修飾することで、薬剤の体内安定性を制御できる可能性を示した。
【０１３５】
〔試験例１０〕
物理的安定性（非特異的吸着性）の解析
一般に、ＦＧＦ類縁タンパク質は疎水結合により、非特異的吸着が激しいことが知られている。試験例１で調製したムチンボックスを導入したＦＧＦ（CM10）は、糖鎖の導入により親水性の向上が図られているため、非特異的吸着の低減が予想された。
【０１３６】
そこで、ムチンボックスを導入したＦＧＦあるいは大腸菌で生産させたＦＧＦ−１（rec FGF）について、一定濃度(400 ng/μl) にそろえてガラス試験管に分注し、これを４℃、あるいは３７℃に保持し、経時的に一定量(100 μl)を採取した。採取した試料は−８０℃に急速冷凍し保存した。これらの試料について、抗ＦＧＦ−１抗体を用いたELISAによってＦＧＦ含量を定量解析した。
【０１３７】
結果を図１０に示す。図１０のAは４℃で保温した場合、図１０のBは37℃で保温した場合の結果である。いずれの温度においても糖鎖を導入したCM10 分子のガラス壁面への非特異的吸着は、単純蛋白質FGF-1 よりも低減していることが判明した。
【０１３８】
〔試験例１１〕
シアリルルイスＸ抗原の発現
実施例７で調製されたクローンにおいては、ムチンボックスを導入したＦＧＦがシアリルルイスＸ抗原を発現しているものと予想された。そこで、シアリルルイスＸ抗原の機能を解析する目的で、これをリガンドとするタンパク質であるＥ−セレクチンへの親和性を検討した。
【０１３９】
遺伝子組み換えによって生産した分泌型Ｅ−セレクチンをプレートに固定化し、実施例７の馴化培地を添加した。洗浄後、抗ＦＧＦ−１抗体を用いたELISA様の分析により、Ｅ−セレクチンに結合したムチンボックスを導入したＦＧＦを定量分析した。その結果、当該細胞が生産するＦＧＦは、Ｅ−セレクチンに対して親和性を有していることが確認された。
【０１４０】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明に係るＤＮＡ増幅方法は、通常のＰＣＲによって増幅が困難な塩基配列を確実に増幅することができる。特に、本方法によれば、通常のＰＣＲによって増幅が困難な塩基配列として、複数のアミノ酸からなるペプチドの繰り返し配列をコードする塩基配列を確実に増幅することができる。また、本方法では、特別な装置、器具及び試薬等を必要とせず、汎用されている装置、器具及び試薬のみを用いて所望の塩基配列を増幅することができる。本発明によれば、タンパク質の機能カセットを重複して作成することが可能となり、これによってタンパク質機能の大幅な改質に寄与することが可能となる。
【０１４１】
【配列表】
0004006511.tif 000003
0004006511.tif 000004
0004006511.tif 000005
0004006511.tif 000006
0004006511.tif 000007
0004006511.tif 000008
0004006511.tif 000009
0004006511.tif 000010
0004006511.tif 000011
0004006511.tif 000012
0004006511.tif 000013
0004006511.tif 000014
0004006511.tif 000015
0004006511.tif 000016
0004006511.tif 000017
0004006511.tif 000018
0004006511.tif 000019
0004006511.tif 000020
0004006511.tif 000021
0004006511.tif 000022
0004006511.tif 000023
0004006511.tif 000024
0004006511.tif 000025
0004006511.tif 000026
0004006511.tif 000027
【０１４２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は合成されたDNA断片である。
配列番号２はO-糖鎖付加配列のモチーフである。
配列番号３はムチンボックスをコードするAカセットである。
配列番号４はムチンボックスをコードするCカセットである。
配列番号５はムチンボックスをコードするGカセットである。
配列番号６はムチンボックスをコードするTカセットである。
配列番号７〜２０はプライマーである。
配列番号２１は合成されたDNA断片である。
配列番号２２、２３はプライマーである。
配列番号２４は合成されたDNA断片である。
配列番号２５、２６はプライマーである。
配列番号２７、３２、３３は合成されたDNA断片である。
配列番号３４はキメラタンパク質である。
配列番号３５〜４２はプライマーである。
配列番号４３は合成されたDNA断片である。
配列番号４４〜４６はプライマーである。
配列番号４７〜４９は合成されたDNA断片である。
配列番号５０はO-糖鎖付加配列のモチーフであり、第１番目及び第４番目の「Xaa」は任意のアミノ酸を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】分泌型 FGF の N-末端に導入するためのクラスター状ムチン型糖鎖付加配列をコードする cDNA の合成戦略の模式図である。
【図２】分泌型 FGF の N-末端に導入するためのクラスター状ムチン型糖鎖付加をコードする cDNA の合成過程におけるアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図３】分泌型 FGF の C-末端に導入するためのクラスター状ムチン型糖鎖付加をコードする cDNA の合成戦略の模式図である。
【図４】分泌型 FGF の N-末端、C-末端にクラスター状ムチン型糖鎖付加を導入した分泌型FGF-1（CM10、NM10）の模式図である。
【図５】  CM10、NM10のSDS-PAGE 電気泳動の写真、および、各種酵素処理したCM10、NM10のSDS-PAGE 電気泳動の写真である。
【図６】  CM10、NM10のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞に対するDNA合成促進活性を示す特性図である。
【図７】  CM10及びこれを各種グリコシダーゼ処理した試料のヘパリンセファロースカラムからの溶出パターンを示すSDS-PAGE 電気泳動の写真である。
【図８】  CM10の各種蛋白質分解酵素に対する抵抗性試験の結果を示すSDS-PAGE 電気泳動の写真である。
【図９】CM10のマウス血中での安定性試験の結果を示す特性図である。
【図１０】  CM10の非特異的吸着性に関する評価試験の結果を示す特性図である。
【図１】
0004006511.tif 000028
【図２】
0004006511.tif 000029
【図３】
0004006511.tif 000030
【図４】
0004006511.tif 000031
【図５】
0004006511.tif 000032
【図６】
0004006511.tif 000033
【図７】
0004006511.tif 000034
【図８】
0004006511.tif 000035
【図９】
0004006511.tif 000036
【図１０】
0004006511.tif 000037