(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−デオキシ−Ｄ−トレオ−ペンツロース（ＤＴＰ）および４−ヒドロキシ−Ｌ−トレオニン（ＨＴ）からのビタミンＢ6の製造方法であって、
ａ）ＤＴＰおよびＨＴを、ＤＴＰおよびＨＴからビタミンＢ6の生産能を有する微生物の細胞から調製した酵素反応系に添加するステップと、
ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、前記酵素反応系に添加するステップと、
ｃ）ビタミンＢ6を製造するステップと、
を備える、製造方法。
【請求項２】
ビタミンＢ6の製造に用いる酵素反応系を調製するための、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−デオキシ−Ｄ−トレオ−ペンツロース（以下ＤＴＰという）および４−ヒドロキシ−Ｌ−トレオニン（ＨＴ）からビタミンＢ6の酵素的製造方法に関する。本発明において用いられる「ビタミンＢ6」という表現は、ピリドキソール、ピリドキサールおよびピリドキサミンを含む。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
ビタミンＢ6は、動物、植物、および微生物の栄養にとって必須のビタミンの一つであり、ヒトにとっても医薬または食品添加物として非常に重要である。本発明の目的は、ＤＴＰおよびＨＴからの高度に効率的なビタミンＢ6の酵素的製造方法を提供することである。
【０００３】
ビタミンＢ6の発酵生産については多くの研究がある。以下の属：サッカロミセス（Saccharomyces〔G.H.Scherr and M.E.Rafelson, J.Appl.Bacteriol. 25, 187-194(1962)〕）、ピキア（Pichia〔N.Nishino, K.Fujii and T.Kamikubo, Agric.Biol.Chem. 37, 553-559(1973)〕）、クレブシエラ（Klebsiella〔R.Suzue and Y.Haruna, J.Vitaminol. 16, 154-159(1970)〕）、アクロモバクター（Achromobacter〔M.Ishida and K.Shimura, Agric.Biol.Chem. 34, 327-334(1970)〕）、バシルス（Bacillus〔W.Pflug and F.Lingens, Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem. 359, 559-570(1978)〕）およびフラボバクテリウム（Flavobacterium〔Y.Tani, T.Nakamatsu, T.Izumi and K.Ogata, Agric.Biol.Chem. 36, 189-197(1972)〕）に属する種々の微生物は、ビタミンＢ6を生産することが知られている。しかし、ビタミンＢ6の製造で商業的に魅力のある発酵方法はこれまで知られていない。ごく最近になって、欧州特許公開０７６５９３８Ａ２において、このビタミンを好気的条件下、培養培地中に生産可能なリゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物を培養することによるビタミンＢ6の発酵製造方法が記載された。この培養培地は、資化可能な炭素源および消化可能な窒素源、無機塩および他の栄養素は別として、ビタミンＢ6の力価を改善する更なる物質、例えば、ＤＴＰおよびＨＴを含んでもよい。ごく最近になって知られたこの方法はビタミンＢ6を高い収量で生産できるが、その効率には改善の余地がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明により、ＤＴＰおよびＨＴからビタミンＢ6をこれまでより高い効率で生産できる。例えば、以下の属：リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）、ラクトバシルス（Lactobacillus）、アリスロバクター（Arthrobacter）、バシルス（Bacillus）、クレブシエラ（Klebsiella）、エシェリヒア（Escherichia）、シュウドモナス（Pseudomonas）、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、エグジギオバクテリウム（Exiguobacterium）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ヤマダザイマ（Yamadazyma）、ピキア（Pichia）またはカンジダ（Candida）のような微生物の細胞から調製した無細胞抽出物は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で、ＤＴＰおよびＨＴからビタミンＢ6を生産できる。
【０００５】
したがって、本発明は、ＤＴＰおよびＨＴからのビタミンＢ6の酵素的製造方法に関するものであり、それは、ＤＴＰおよびＨＴを、ＤＴＰおよびＨＴからビタミンＢ6を生産可能な微生物の細胞から調製した酵素反応系と接触させることを含み、該接触は、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰの存在下で生じるものである。本発明はさらに、ビタミンＢ6の酵素的製造方法に関し、それはＤＴＰおよびＨＴを、ビタミンＢ6を生産可能な微生物、例えば、以下の属：リゾビウム、シノリゾビウム、フラボバクテリウム、クリセオバクテリウム、ラクトバシルス、アリスロバクター、バシルス、クレブシエラ、エシェリヒア、シュウドモナス、ステノトロホモナス、エンテロバクター、セラチア、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、エグジギオバクテリウム、サッカロミセス、ヤマダザイマ、ピキアまたはカンジダに属するものに由来する無細胞抽出物を含む酵素反応系と、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰの存在下で接触させることを含む。
【０００６】
反応混合物中のビタミンＢ6の含有量は、D.R.OsborneおよびP.Voogtの方法〔The Analysis of Nutrients in Foods, Academic Press, London, 224-227(1978)〕に従ってSaccharomyces carlsbergensis ATCC 9080を用いたバイオアッセイにより測定することができる。
【０００７】
本発明の方法を実施するためには、微生物の細胞、例えば以下の属：リゾビウム、シノリゾビウム、フラボバクテリウム、クリセオバクテリウム、ラクトバシルス、アリスロバクター、バシルス、クレブシエラ、エシェリヒア、シュウドモナス、ステノトロホモナス、エンテロバクター、セラチア、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、エグジギオバクテリウム、サッカロミセス、ヤマダザイマ、ピキアまたはカンジダに属するものの細胞は、該微生物を資化可能な炭素源、消化可能な窒素源、無機塩および微生物の増殖に必要な他の栄養素を含む培地中で培養することにより生産させることができる。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、デンプン、デキストリンおよびグリセロールが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、およびそれらの混合物が使用される。さらに、無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルトおよび鉄の硫酸塩、塩酸塩またはリン酸塩を用いてもよい。そして、必要ならば、一般的な栄養因子または消泡剤、例えば、動物油、植物油、または鉱油もまた培養培地に含有されてよい。培養培地のｐＨは、約５〜約９、好ましくは約６〜約８である。培養のための温度範囲は、約１０℃〜約４５℃が適当で、好ましくは約２５℃〜約４０℃である。培養時間は通常約１日〜約５日間、好ましくは約１日〜約３日間である。培養中の通気および撹拌は、通常、好ましい結果をもたらす。
【０００８】
本発明の方法において用いることができる微生物は、以下の属：リゾビウム、シノリゾビウム、フラボバクテリウム、クリセオバクテリウム、ラクトバシルス、アリスロバクター、バシルス、クレブシエラ、エシェリヒア、シュウドモナス、ステノトロホモナス、エンテロバクター、セラチア、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、エグジギオバクテリウム、サッカロミセス、ヤマダザイマ、ピキアおよびカンジダに属する全ての菌株を含む。そのような微生物は、公的な寄託機関（カルチャーコレクション）、例えば、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）（大阪府、日本）から請求によって誰でも入手可能である。そのような寄託された菌株の例は：リゾビウム メリロティ（Rhizobium meliloti）（シノリゾビウム メリロティ（Sinorhizobium meliloti）としても知られている）ＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ Ｎｏ，１０２２６）、フラボバクテリウム インドロゲネス（Flavobacterium indologenes）（クリセオバクテリウム インドロゲネス（Chryseobacterium indologenes）としても知られている）ＩＦＯ １４９４４、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis）ＩＦＯ １３１１０、アリスロバクター ニコチアエー（Arthrobacter nicotianae）ＩＦＯ１４２３４、バシルス サチルス（Bacillus subtilis）ＩＦＯ ３００７、クレブシエラ プランテコーラ（Klebsiella planticola）ＩＦＯ ３３１７、エシェリヒア コリー（Escherichia coli）ＩＦＯ １３１６８、シュウドモナス プチダ（Pseudomonas putida）ＩＦＯ ３７３８、ステノトロホモナス マルトヒラ（Stenotrophomonas maltophilia）（シュウドモナス マルトヒラ（Pseudomonas maltophilia）またはキサントモナス マルトヒラ（Xanthomonas maltophilia）としても知られている）ＩＦＯ １２６９２、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ３３２０、セラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）ＩＦＯ １２６４８、コリネバクテリウム アンモニアゲヌス（Corynebacterium ammoniagenes）（ブレビバクテリウム アンモニアゲヌス（Brevibacterium ammoniagenes）としても知られている）ＩＦＯ １２６１２、コリネバクテリウム グルタミクス（Corynebacterium glutamicum）（ブレビバクテリウム グルタミクス（Brevibacterium glutamicum）としても知られている）ＩＦＯ １２１６８、エグジギオバクテリウム アセチリクム（Exiguobacterium acetylicum）（ブレビバクテリウム アセチリクム（Brevibacterium acetylicum）としても知られている）ＩＦＯ １２１４６、ピキア ギリエルモンデー（Pichia guilliermondii）（ヤマダザイマギリエルモンデー（Yamadazyma guilliermondii）としても知られている）ＩＦＯ １０１０６、サッカロミセス セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）ＩＦＯ ０３０４およびＩＦＯ ０３０６ならびにカンジダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＩＦＯ ０１９９およびＩＦＯ ０５８７である。本発明の方法において、酵素反応系は好ましくは上記の属に属する１つまたはそれ以上の微生物に由来する無細胞抽出物を含むことができる。これらの微生物のうち、本発明では次のもの：リゾビウム メリロティＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ Ｎｏ，１０２２６）、フラボバクテリウム インドロゲネスＩＦＯ １４９４４、バシルス サチルスＩＦＯ ３００７、エシェリヒア コリーＩＦＯ １３１６８、セラチア マルセッセンスＩＦＯ １２６４８、コリネバクテリウム アンモニアゲヌスＩＦＯ１２６１２、コリネバクテリウム グルタミクスＩＦＯ １２１６８、ピキア ギリエルモンデーＩＦＯ １０１０６およびサッカロミセス セレビシエーＩＦＯ ０３０６の方がより好ましく用いられる。本発明の方法において、酵素反応系は好ましくは上記の属に属する１つまたはそれ以上の微生物に由来する無細胞抽出物を含むことができる。
【０００９】
培養によって得られた細胞からの無細胞抽出物の調製には、音波処理およびガラスビーズ存在下、またはフレンチプレスホモジナイザーによる細胞破砕のような一般的方法を適用することができる。所望ならば、上記の方法で破砕する前にリゾチームまたはチモラーゼ（zymolase）のような溶菌酵素を用いて１５℃〜４５℃で、好ましくは２０℃〜４０℃で、１〜３時間の処理を適用することもできる。例えば、培養ブロスの遠心分離後に、得られた細胞を生理食塩水で洗浄し、一般的な酵素の安定化物質としてスクロース、ジチオトレイトール（DTT）、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むTris-HCl（pH７．５）緩衝液のような緩衝液で懸濁する。細胞破砕の後、得られた溶液を遠心分離して細胞砕片を分離し、その上清を無細胞抽出物として用いることができる。
【００１０】
酵素反応系は、上記のように調製された無細胞抽出物、または酵素の精製のための一般的な方法、例えば、硫安沈殿あるいはゲル濾過クロマトグラフィーにより部分的に精製されたものを含む。あるいは、微生物の休止細胞または増殖細胞を用いることもできる。無細胞抽出物に加え、基質としてＤＴＰおよびＨＴ、補欠因子としてＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰもその反応系に加えられる。その系に加えられるＤＴＰ、ＨＴ、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰの量は、用いられる反応系に応じて変わり得る。しかし一般的には、この酵素反応系におけるＤＴＰ、ＨＴ、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰの濃度は、ＤＴＰおよびＨＴについては０．１mM以上、好ましくは１mM〜１０mM、ＮＡＤＰ+およびＮＡＤ+については好ましくは０．０５mM〜５mM、より好ましくは０．２mM〜０．４mM、そしてＡＴＰについては好ましくは１mM〜２０mM、より好ましくは３mM〜７mMである。この酵素反応系へのマンガンイオンまたはマグネシウムイオンの添加は反応を促進し、そのような両イオンの添加は、より一層好ましい結果を与える。そのようなイオンを生じさせる塩としては、例えば、マンガンおよびマグネシウムの塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩を用いることができる。加えられるマンガンイオンおよびマグネシウムイオンの量もまた、用いられる反応系に応じて変わり得る。しかし一般的には、マンガンイオンおよびマグネシウムイオンの濃度は、マンガンイオンの場合は０．１mM〜１００mM、好ましくは５mM〜１０mM、およびマグネシウムイオンの場合は３mM〜３００mM、好ましくは２０mM〜５０mMである。
【００１１】
酵素反応を始めるためには、ＤＴＰおよびＨＴからのビタミンＢ6の生産に影響を及ぼさない緩衝溶液を用いる。この目的のためにはTris-HCl緩衝液が好んで用いられる。酵素反応は、６．０〜８．５の範囲のｐＨで、より好ましくは７．０〜８．０の範囲である。反応温度は、１５℃〜４５℃が適当で、好ましくは２０℃〜４０℃である。インキュベーション時間は、反応条件に応じて変わるが、一般的には、３０分〜５時間、より好ましくは２時間〜４時間である。
【００１２】
上記のような条件下でＤＴＰおよびＨＴから生産されるビタミンＢ6は、以下のようにして容易に回収することができる。例えば、反応後、反応混合物中のタンパク質を熱、酸、アルカリまたは有機溶媒での変性により沈殿させ、遠心分離により取り除く。この目的のため、上記の上清からある生成物を抽出するために一般的に用いられる方法であって、ビタミンＢ6の種々の性質を利用して用いてもよい。したがって、例えば、上清中のビタミンＢ6はイオン交換樹脂で精製される。所望の生成物は、アルコールと水との混合物から更に再結晶化される。
本発明は以下の実施例によってより詳細な説明を行うが、本発明は以下の実施例に何ら限定されない。
【００１３】
【実施例】
実施例１
無細胞抽出物の調製
リゾビウム メリロティ（Rhizobium meliloti）ＩＦＯ １４７８２（ＤＳＭ Ｎｏ．１０２２６）を、１％グルコース、０．５％ポリペプトン（日本製薬株式会社、日本）、０．２％酵母エキス（Difco）、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏおよび０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む種菌培地中で２８℃で１７時間培養した。この種培養物を、４％グルコース、２％ポリペプトン、０．２％酵母エキス、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５％ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび１滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂株式会社、日本）を含む２００mlの発酵培地の入った５００ml容フラスコに移し、次いでこのフラスコをフラスコ振とう機で２８℃で振とうした。７２時間培養した後、細胞を４００mlの培養ブロスから１０，４００×ｇ、１０分間の遠心分離により採取し、０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、そして１５％スクロース、０．１mM ＰＭＳＦ、および１mM ＤＴＴを含む１０mM Tris-HCl（pH７．５）緩衝液で１回洗浄し、無細胞抽出物の調製に使用するまで−３０℃で保存した。
【００１４】
以下の操作は、全て氷水中または４℃で行った。−３０℃で保存していた細胞を解凍し、１５％スクロース、０．１mM ＰＭＳＦ、および１mM ＤＴＴを含む１０mM Tris-HCl（pH７．５）緩衝液５mlで懸濁した。細胞懸濁液をフレンチプレスホモジナイザー（（株）大岳製作所）にて２００kg/cm2で通過させた。得られたホモジネートを３４，８００×ｇで３０分間遠心分離し、細胞砕片を取り除いた。１０mlの上清を、１５％スクロース、０．１mM ＰＭＳＦ、および１mM ＤＴＴを含む８０％硫酸アンモニウム溶液１Ｌに対して一晩透析し、沈殿物を３４，８００×ｇで３０分間の遠心分離により回収した。沈殿物を１５％スクロースおよび０．１mM ＰＭＳＦを含む１０mM Tris-HCl（pH７．５）緩衝液１０mlに溶解し、同じ緩衝液に対して一晩透析し、透析された溶液を酵素反応に用いるまで−３０℃で保存した。無細胞抽出物中のタンパク質含有量は、Lowry法〔Lowry et al., J.Biol.Chem. 193, 265(1951)〕により測定したところ、１１．４mg/mlであった。
【００１５】
実施例２
ＤＴＰおよびＨＴからのビタミンＢ6の酵素による生産
酵素反応は、表１に列挙した反応混合物５００μlの入った試験管を２８℃でインキュベーションすることにより行った。完全反応系は、２．５mM ＤＴＰ、２．５mM ＨＴ、０．３８mM ＮＡＤＰ+、０．３８mM ＮＡＤ+および５mM ＡＴＰ、１９３．２５μlの無細胞抽出物、および８０mM Tris-HCl（pH７．５０）緩衝液を含んでいた。２時間インキュベーションした後、沸騰水浴中で３分間加熱することにより反応を停止させ、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで、１５μlの上清、１０μlの１mg/ml酸性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）および１０μlの１００mM酢酸緩衝液（pH５．０）の入った試験管を３７℃で３０分間インキュベーションすることによりその上清にホスファターゼ処理を行った。インキュベーション後、１，８００μlの水を試験管に加え、サッカロミセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）ＡＴＣＣ ９０８０を用いる下記のような微生物学的方法により測定した。ピリドキソールの標準溶液（０〜２μg/ml）を蒸留水で１．２１×１０-2に希釈した。希釈した標準溶液または試料１００μlおよびサッカロミセス カールスベルゲンシスＡＴＣＣ ９０８０を含むビタミンＢ6用のアッセイ培地（ニッスイ株式会社、日本）３mlをこの順番で試験管に加え、３０度の角度で２８℃でインキュベーションした。１７時間インキュベーションした後、５mlの０．１N塩酸を加えることにより細胞増殖を停止させ、次いで試料の吸光度を６６０nmで測定した。試料中のビタミンＢ6の量は、試料の濁度をサッカロミセス カールスベルゲンシスＡＴＣＣ ９０８０の標準増殖曲線と比較することにより決定した。その結果、完全反応系では９７ngのビタミンＢ6/ml/mgタンパク質/時間が生産された。一方、完全系から１つの因子を除いた反応系では、ビタミンＢ6は生産されなかった。さらに、完全系に８．４mM ＭｎＣｌ2、３２ｍＭ ＭｇＣｌ2または両方を補足した系では、それぞれ１１９、１２３または５８７ngビタミンＢ6/ml/mgタンパク質/時間が生産された（表１）。これらの結果は、無細胞抽出物、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤ+およびＡＴＰがＤＴＰおよびＨＴからのビタミンＢ6の生産に必須であり、そしてＭｎＣｌ2およびＭｇＣｌ2はその生産を促進することを示す。
【００１６】
【表１】
0003976941.tif 000002
【００１７】
実施例３
実施例１および２に記載したのと同様に、種々の微生物の無細胞抽出物によるビタミンＢ6の生産を試験した。表２に列挙した各菌株の寒天プレート上で増殖した白金耳１掻きの細胞を、各種菌培地で２８℃で１７時間培養した。２mlの種培養物を１００mlのバルク培地および１滴の消泡剤の入った５００ml容フラスコに移し、次いでこのフラスコをフラスコ振とう機で２８℃で振とうした。表２に列挙した各菌株の培養用の種菌培地およびバルク培地の組成を表３にまとめた。
【００１８】
【表２】
0003976941.tif 000003
【００１９】
【表３】
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【００２０】
２４時間培養後、各菌株の細胞を４００mlの培養ブロスから遠心分離によって採取し、０．８５％のＮａＣｌ溶液で２回、および１５％スクロース、０．１mMＰＭＳＦ、および１mM ＤＴＴを含む１０mM Tris-HCl（pH７．５）緩衝液で１回洗浄した。得られた細胞を同じ緩衝液５mlで懸濁した。以下の微生物：フラボバクテリウム インドロゲネスＩＦＯ １４９４４、ラクトバシルス ブレビスＩＦＯ １３１１０、アリスロバクター ニコチアエーＩＦＯ１４２３４、バシルスサチルスＩＦＯ ３００７、クレブシエラ プランテコーラＩＦＯ ３３１７、エシェリヒア コリーＩＦＯ １３１６８、シュウドモナス プチダＩＦＯ ３７３８、ステノトロホモナス マルトヒラＩＦＯ １２６９２、エンテロバクター クロアカエＩＦＯ ３３２０、またはセラチア マルセッセンスＩＦＯ １２６４８の細胞をフレンチプレスホモジナイザーを通過させることによるかまたは超音波破砕機（コスモバイオ株式会社、日本）により破砕し、他のものは、表４に示したような破砕の前にリゾチーム（Sigma）２mgまたはチモラーゼ（sigma）２００単位/細胞懸濁液１mlで３０℃で１時間処理した。得られたホモジネートを遠心分離して細胞砕片を除き、上清を１５％スクロースおよび０．１mM ＰＭＳＦを含む１０mM Tris-HCl（pH７．５）緩衝液に対して透析して無細胞抽出物として用いた。
【００２１】
酵素反応を、２．５mM ＤＴＰ、２．５mM ＨＴ、０．３８mM ＮＡＤＰ+、０．３８mM ＮＡＤ+、５mM ＡＴＰ、１９３．２５μlの無細胞抽出物、および８０mM Tris-HCl（pH７．５０）緩衝液を含む反応混合物Ａ ５００μl、または８．４mM ＭｎＣｌ2および３２mM ＭｇＣｌ2を補足した混合物Ｂ ５００μlの試験管を２８℃でインキュベーションすることにより行った。２時間のインキュベーションの後、沸騰水浴中で３分間加熱することにより反応を停止させ、混合物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清を酸性ホスファターゼで３７℃で処理した。３０分間のインキュベーションの後、反応混合物中で生産されたビタミンＢ6を、サッカロミセス カールスベルゲンシスＡＴＣＣ ９０８０を用いるバイオアッセイ法により測定した。その結果、反応混合物ＡおよびＢでは、それぞれ７〜２３ngおよび３３〜１３９ngビタミンＢ6/ml/mgタンパク質/時間が表４にまとめたように生産された。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
【表５】
0003976941.tif 000006
【００２４】
Ｆ：フレンチプレス、Ｕ：超音波破砕
*：破砕前にリゾチーム（Sigma）２mg/細胞懸濁液１mlで３０℃で１時間処理
**：破砕前にチモラーゼ（sigma）２００単位/細胞懸濁液１mlで３０℃で１時間処理
反応混合物Ａ：２．５mM ＤＴＰ、２．５mM ＨＴ、０．３８mM ＮＡＤＰ+、０．３８mM ＮＡＤ+、５mM ＡＴＰ、無細胞抽出物、および８０mM Tris-HCl（pH７．５０）緩衝液を含む総容量５００μl
反応混合物Ｂ：２．５mM ＤＴＰ、２．５mM ＨＴ、０．３８mM ＮＡＤＰ+、０．３８mM ＮＡＤ+、５mM ＡＴＰ、８．４mM ＭｎＣｌ2、３２ｍＭ ＭｇＣｌ2、無細胞抽出物、および８０mM Tris-HCl（pH７．５０）緩衝液を含む総容量５００μl