(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖度管理用の標準試料に用いる糖化アミノ化合物の製造方法であって、
血由来のアミノ化合物を含む生体試料を準備する工程、
グルコースと前記生体試料とを混合して混合物を調製する工程、
この混合物を減圧乾燥することにより前記グルコースと前記アミノ化合物とを反応させる工程、および、
前記減圧乾燥後に未反応グルコースの除去を行う工程を含み、
前記血由来のアミノ化合物からなる生体試料が、血清、ヘモグロビン及びアルブミンからなる群から選択される少なくも一つであることを特徴とする糖度管理用の標準試料に用いる糖化アミノ化合物の製造方法。
【請求項２】
前記未反応グルコースの除去が、透析法、限外ろ過法、及び、ゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ法）からなる群から選択される少なくとも一つの方法により行われる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記減圧乾燥の圧力が、０．０５〜５ｍｍＨｇである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記減圧乾燥の時間が、６〜１８時間である請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記減圧乾燥の温度が、−１０℃〜−５０℃である請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記グルコースが、前記グルコースのリン酸エステルである請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化タンパク質をはじめとする糖化アミノ化合物の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖化アミノ化合物は、糖質とアミノ化合物とが共有結合により結合したものである。このなかでも糖化タンパク質は、産業的には、食品や医療の分野において製造されるものであり、特に最近では、臨床検査の分野において、指標物質として注目されている。これは、糖化タンパク質の生体内での濃度が、過去のある一定期間（当該タンパク質の平均寿命に依存する）にタンパク質とともに共存した糖質の平均濃度に依存するからである。
【０００３】
例えば、血中グルコースと血中ヘモグロビンとの反応より生成される糖化ヘモグロビンの平均濃度は、１〜２ケ月前の血中グルコースの平均濃度に依存している。また、血中グルコースと血清アルブミンとの反応より生成される糖化アルブミンの平均濃度は、１〜２週間前の血中グルコースの平均濃度に依存している。このため、糖尿病患者の過去の血糖値を知るために、患者の血中の糖化ヘモグロビンおよび糖化アルブミンが測定されている。
【０００４】
糖化タンパク質の測定検査を精度よく行なう場合、精度管理用の標準試料となる糖化タンパク質が必要である。このため、前記糖尿病患者に対する測定検査においては、任意の濃度の糖化ヘモグロビンおよび糖化アルブミンが人工的に生成されて、標準試料として使用されている。
【０００５】
このような精度管理用の糖化タンパク質を製造する方法は、糖質とタンパク質とを混合し、その混合物を約７日間、約３７度でインキュベーションして反応させる方法が一般的である（例えば、Ｍａｒｋ  Ｒｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉ．Ｍｅｄ．１０５  ６３−６９  （１９８５）  Ｅ．Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｏ．Ｈ．Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９  ８１−８７  （１９８１）等に記載の方法）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の糖化タンパク質の製造方法は、約７日間という長期間のインキュベーションの工程を必要とするという問題がある。また、製造に時間がかかると、タンパク質を含有した生体試料は、腐敗する恐れがあり、これを防止するために、通常、生体試料を無菌処理する工程を設けるが、この無菌処理は操作が煩雑である。また、インキュベーションを長時間行なうので、タンパク質の変性が起こりやすくなるという問題もある。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、短時間で、簡便に行なうことができ、特にタンパク質の変性が起こりにくい、糖度管理用の標準試料に用いる糖化アミノ化合物の製造方法の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の糖度管理用の標準試料に用いる糖化アミノ化合物の製造方法は、血由来のアミノ化合物を含む生体試料を準備する工程、グルコースと前記生体試料とを混合して混合物を調製する工程、この混合物を減圧乾燥することにより前記グルコースと前記アミノ化合物とを反応させる工程、および、前記減圧乾燥後に未反応グルコースの除去を行う工程を含み、前記血由来のアミノ化合物からなる生体試料が、血清、ヘモグロビン及びアルブミンからなる群から選択される少なくも一つであるという構成をとる。
【０００９】
本発明者らは、前記問題を解決するために、一連の研究を重ねた。その過程で糖質とタンパク質とを混合し、この混合物を減圧乾燥するだけで、前記両者の反応が速やかに進行することを突き止めた。そして、このことは、タンパク質に限らず、アミノ酸やペプチド等にも適用できることも突き止めた。さらに、この工程は、約１日以内の短時間で完了することから、腐敗およびタンパク質等の変性の問題もなくなることを見い出し、本発明に到達した。
【００１０】
本発明において、アミノ化合物とは、アミノ基を有する化合物をいい、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸を含む広い概念である。本発明において、単糖類は、「単純糖質」だけでなく、糖以外の物質が結合してなる「複合糖質」をも含む。
【００１１】
また、本発明において、「タンパク質」とは、アミノ酸がペプチド結合により連結した高分子含窒素化合物をいう。なお、後述するように、糖質とタンパク質との結合はアミノ基とカルボニル基またはケトン基との脱水縮合反応によると推察されることから、タンパク質に限らずアミノ基を有するアミノ酸またはペプチド等のアミノ化合物についても本発明の製造方法を適用できる。
【００１２】
そして、本発明において、減圧乾燥とは、大気圧以下の減圧条件下で試料を乾燥させることをいう。この条件は、通常、圧力０．０５〜５ｍｍＨｇであり、時間６〜１８時間である。
【００１３】
前記減圧乾燥は、より短時間でできるという理由から、凍結乾燥であることが好ましい。凍結乾燥は、試料を凍結させ、その凍結物の水蒸気圧以下の減圧条件下で乾燥させることをいう。この場合の温度は、通常−１０〜−５０℃であり、圧力等の条件は、前述と同様である。
【００１４】
さらに、本発明の糖化アミノ化合物の製造方法は、必要に応じ、減圧乾燥後、未反応糖質の除去を行なう。糖化タンパク質を製造する場合、未反応糖質が存在すると、これと溶液中の未反応タンパク質との反応が徐々に進み、糖化タンパク質の濃度の安定性がなくなり、標準試料として使用する際に、測定に支障を及ぼすからである。
【００１５】
また、本発明において、前記タンパク質は、ヘモグロビン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブリンおよびリポタンパクからなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明において、前記糖質が、糖質のリン酸エステルであってもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明を具体的に説明する。
まず、糖質とタンパク質との一般的な反応機構を説明する。
【００１８】
糖質とタンパク質とが共存すると、タンパク質中のアミノ基と、糖質のアルデヒド基またはケトン基との間で、脱水縮合が起こる。さらに、前記アルデヒド基またはケトン基に隣接する水酸基が、異性化を起こし、安定性のあるケトース型アミンに変換された糖化タンパク質が生成される。これらの反応は、全て非酵素的に進行する。なお、この反応機構は、一般的なものであり、この反応機構が本発明の製造においても起こるものと推察される。また、同様の反応が、アミノ酸やペプチド等の他のアミノ化合物についても生じるものと推察される。
【００１９】
つぎに、本発明の糖化アミノ化合物の製造方法を、糖化タンパク質の製造方法を例にとり説明する。糖化タンパク質の製造方法は、例えば、以下のようにして行なわれる。
【００２０】
すなわち、まず、糖質とタンパク質とを混合する。通常、この混合は、液体であるタンパク質試料に糖質を添加することにより行なわれる。
本発明において、糖質およびタンパク質として好ましいのは、先に述べた通りであるが、血糖値検査のための精度管理用の糖化タンパク質を製造する場合は、糖質としてグルコースを用い、タンパク質として血清タンパク質を用いるのが一般的である。血清タンパク質は、一般に、血清からの精製によって得られる標品を用いてもよいし、血清をそのまま使用してもよい。
【００２１】
前記タンパク質の濃度は、特に制限はないが、生体成分検査のための精度管理用の糖化タンパク質を製造する場合は、生体中の濃度と同じにするのが望ましい。例えば、血中のヘモグロビン濃度は１２０〜１６０ｍｇ／ｍｌ、また血清中のアルブミンの濃度は３５〜４５ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
前記タンパク質と共存させる前記グルコースとの重量割合は、特に制限はない。生成する糖化タンパク質は、グルコース濃度に依存するので、目的とする糖化タンパク質の濃度となるようにグルコース量を決定すればよい。
【００２３】
そして、前記混合物（通常液体）を減圧乾燥、好ましくは凍結乾燥する。この条件（温度、圧力、および時間等）は、特に制限はなく、従来公知の条件を適用するが、通常の圧力条件は前述のとおりである。この減圧乾燥の工程で、混合液が濃縮されて糖質およびタンパク質の濃度が上昇して反応速度が増大し、この結果、前記縮合反応が速やかに起こると推測される。この減圧乾燥処理は、通常６〜１８時間で終了する。
【００２４】
そして、必要に応じ、未反応グルコースの除去を行なう。その方法は、糖質とタンパク質との分子サイズの差を利用した透析法、限外ろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ法）等の方法を採用することが好ましいが、これらの方法に制約されるものではない。
【００２５】
そして、糖化タンパク質を粉末として提供する必要がある場合は、未反応グルコースの除去後、もう一度凍結乾燥を行なってもよい。
なお、前記タンパク質に代えてアミノ酸またはペプチドを用いてもよく、この場合も前述の方法で、糖化アミノ酸または糖化ペプチドが得られる。
【００２６】
このようにして得られた糖化タンパク質は、糖化工程が短時間であるため、腐敗の恐れがなく、また変性の恐れもない、高品質のものである。
【００２７】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
健常人から採血した血清にグルコース（特級、ナカライ社製）を、下記の表１に示すように、１００〜１０００ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、混合液を調製した。このグルコース添加血清を１ｍｌずつバイアル瓶に分注し、冷却温度（−２０℃）、圧力（２ｍｍＨｇ）、時間（１２時間）の条件下にて、凍結乾燥を行なった。凍結乾燥後のグルコース添加血清を１ｍｌ蒸留水で溶解し、その０．５ｍｌを市販の透析チューブに分注した。この透析チュ−ブを３リットルの生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）に、浸漬および攪拌（１２時間）し、透析により未反応グルコースを除去した。その後、血清中のグルコース濃度をグルコースオ−ト＆スタットＧＡ−１１２０（京都第一科学社製）で測定したところ、いずれも０ｍｇ／ｍｌであった。
【００２８】
これら透析後の血清について、糖化アルブミン量を、全自動グルコアルブミン測定装置ＧＡＡ−２０００（京都第一科学社製）を用いて測定した。一方、比較例として、凍結乾燥を除く上記実施例と同じ操作を施した血清についても、糖化アルブミン量を測定した。これらの結果を、下記の表１に示す。
【００２９】
【表１】
0003896430.tif 000002
【００３０】
上記表１の実施例の結果から、１２時間の短時間の凍結乾燥により、グルコースとアルブミンが反応し、糖化アルブミンが生成することがわかる。また、グルコース添加濃度が増すにしたがい、凍結乾燥後に生成した糖化アルブミンの濃度が高くなることがわかる。これに対し、凍結乾燥しなかった比較例では、グルコース添加濃度が増加しても血清中の糖化アルブミン量はほとんど変化せず、１２時間の短時間では、グルコースとアルブミンの反応による糖化アルブミンは生成しにくいことがわかる。
【００３１】
【発明の効果】
以上のように、本発明の糖化アミノ化合物の製造方法は、糖質とアミノ化合物とを混合し、この混合物を減圧乾燥することにより、短期間で糖化アミノ化合物を製造する。
【００３２】
このように、アミノ化合物と糖質との反応を短期間で行なうことができるので、例えば、糖化タンパク質の製造において、腐敗防止のために行なっていたタンパク質試料等の無菌処理操作等が省略可能となって、製造が簡略化される。また、タンパク質の変性も防止されるため、得られる糖化タンパク質が高品質となる。さらに、工程が短期間になることから、製造コストが低減され、この結果、得られる糖化タンパク質のコストの低減も期待できる。