(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
双子葉植物または双子葉植物器官の炭水化物組成を変える方法であって、α−アミラーゼをコードする構築物が発現され上記双子葉植物または双子葉植物器官の炭水化物組成が変化する条件下で、微生物のα−アミラーゼ（分泌シグナル配列を欠く）をコードする組換えＤＮＡ発現構築物を含む、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物を生育させることを含む方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡ発現構築物が、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に結合しているプロモーターを含み、前記プロモーターがトランスジェニック双子葉植物または双子葉植物器官の選択された発生段階及び/又は特定の組織における、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
上記ＤＮＡ発現構築物が、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列と結合したリーダー配列を含み、前記リーダー配列がｍ-RNA安定化配列である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
上記トランスジェニック双子葉植物が、マルターゼ、α−デキストリナーゼ、α−１，６−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼからなる群より選択される第二の微生物の酵素（分泌シグナル配列を欠く）をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現カセットを含有する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
上記第二の微生物の酵素がグルコアミラーゼ（分泌シグナル配列を欠く）である、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
上記α−アミラーゼがバチルス・リチェニホルミス由来である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
微生物のα−アミラーゼをコードする第一のヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターと微生物のグルコアミラーゼをコードする第二のヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターを含み、前記α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼが分泌シグナル配列を欠き、前記プロモーターがトランスジェニック双子葉植物又は双子葉植物器官の選択された発生段階及び/又は特定の組織における上記酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を指令する、組換えＤＮＡ発現カセット。
【請求項８】
微生物のα−アミラーゼをコードする第一のヌクレオチド配列に機能的に結合した35S CaMVプロモーターと微生物のグルコアミラーゼをコードする第二のヌクレオチド配列に機能的に結合した35S  CaMVプロモーターを含み、前記α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼが分泌シグナル配列を欠く、組換えＤＮＡ発現カセット。
【請求項９】
請求の範囲第７項または第８項記載の発現カセットを含有するベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第７項または第８項記載の発現カセットを含む、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物。
【請求項１１】
請求の範囲第９項記載のベクターを含む、菌株。
【請求項１２】
変化した炭水化物組成を含み、請求の範囲第１項又は第４項記載の方法で製造された、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物または双子葉植物器官。
【請求項１３】
上記第二の微生物の酵素が、基質として第一の酵素の作用により得られた分解生成物を利用する、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項１４】
上記グルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー由来である、請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項１５】
上記トランスジェニック双子葉植物が、トマト、ジャガイモ、カッサバ、ニンジン、レタス、イチゴ及びタバコからなる群から選択される、請求の範囲第１項〜第６項、第１３項及び第１４項のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
（関連分野）
本発明は炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物の開発に関する。
（関連技術）
炭水化物の組成が変化した穀物を開発し、特定の用途により適した植物または植物器官を提供することは古くから農業の目標となっている。このような改良植物は、風味が良くなり、望ましい糖分の含量が高く、および、またはより望ましい構造の植物産物を提供する。これらの穀物は直接消費するか、または、さらに処理してから使用する。
トウモロコシ（シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）およびガーウッド（Ｇａｒｗｏｏｄ），１９８４）、エンドウ（バタカリヤ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ）等、１９９０）、ジャガイモ（ホーベンカンプーハーメリンク（Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ）等、１９８７）、アラビドプシス（キャスパー（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８５；リン（Ｌｉｎ）等、１９８８ａ；リン（Ｌｉｎ）等、１９８８ｂ）およびタバコ（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）等、１９８８）等のいくつかの植物種では、炭水化物組成が変化した変異体が発見されている。この現象は主に澱粉の合成の調節に関連する酵素における突然変異に起因する。これらの変異体のうちのいくつかは、直接消費しうるスイートコーン（シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）およびガーウッド（Ｇａｒｗｏｏｄ）、上述）など食品工業で既に使用されている。
澱粉代謝が変化した変異体は、ランダムスクリーニング操作や育種など古典的手法を用いて得ることが出来る。しかし、これらの方法は煩雑で長時間を必要とする。さらに、育種は、スクリーニングする表現型を与えることが可能であるが、他の望ましい特性の損失や、望ましくない特性（高アルカロイド含量のジャガイモ等）の誘導を起こす可能性がある。遺伝子工学による植物の特性の変化は、精密で予測可能な方法であり、ゲノムのスプライスされる遺伝子の性質は分かっていて望ましくない遺伝子が同時に組み込まれることはない。最後に、古典的手法を用いた特定の特性の変化、例えば変異体における特定の産物のレベルまたは性質の変化は困難である場合が多く、出来ないこともある。遺伝子的技術は新しい戦術を提供し、従来の方法で得ることが出来なかった産物を生じることが可能になった。
遺伝子工学に基づき、炭水化物組成を改良した植物を得る巧妙で予測可能な方法を開発することが望ましいことは明白である。
アメリカ特許４，８０１，５４０には、ポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクトウロニド）グリカンをガラクトウロニン酸に加水分解しうる酵素をコードするＤＮＡフラグメントが公開されている。この酵素をコードする構造遺伝子を修正した調節領域に結合し、この酵素の発現を調節した発現構築物が提供されている。この文献に報告されている発明の目的は、ポリガラクトウロニン酸の分解を防ぎ、果実の成熟を調節するためにポリガラクトウロナーゼの発現レベルを減少させることにある。
ＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／１２３８６では、植物中でスクラーゼやレバンスクラーゼ等の酵素の発現を介して炭水化物含量を変えた植物とその方法が公開されている。この発明の目的は、果実中の高分子量炭水化物ポリマー濃度を高め、固形物の可溶性および粘度を変化させることにある。
ヨーロッパ特許出願４３８，９０４は、ホスホフラクトキナーゼ活性レベルを増加し、スクロースの有意な減少および塊茎に蓄積する糖の減少を招く植物代謝（特に塊茎における）の修正を報告している。
ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／１２８７６は、遺伝子的に修正したジャガイモ植物のおける内在的α−アミラーゼ活性の調節について報告している。この公開は、還元糖がジャガイモを揚げているときにミラード反応を起こし、製品の風味や組織に有害な効果を引き起こすことから、ポテトチップの生産にはジャガイモα−アミラーゼ活性の低下、すなわち澱粉の還元糖への分解の低下が望ましいと報告している。一方、この公開は、もしもこの修正したジャガイモ塊茎を酒の生産を目的とした醗酵に用いるなら、より高いジャガイモα−アミラーゼ活性、すなわちより高い還元糖含量が望ましいことを報告している。
（発明の概要）
本発明は、ポリサッカライド組成を変化させたトランスジェニック植物または植物器官、並びに該植物の生産方法を提供する。このことは、植物に植物のポリサッカライドを分解する酵素をコードするＤＮＡ配列を導入することによって行う。
また、本発明は、植物のトランスホーメーションに用いるＤＮＡ発現構築物およびベクターを提供する。この発現構築物は、選択されたポリサッカライド修正酵素の発現を指令しうる調節配列のコントロール下にある。また、これらの調節配列には、植物または植物器官、および、または組織の望ましい分化段階で特異的に選択された酵素の発現を指令しうる配列が含まれる。
さらに、植物における目的産物に依存して、植物に一つ以上の別の発現構築物が導入される事もある。これらの付加的発現構築物には、最初の酵素反応で生ずる分解産物を望ましいオリゴまたはモノサッカライドに転換する第二の酵素をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
本発明により提供されるトランスジェニック植物は、味、固体含量および、または組織が改良された新しい産物としての用途がある。
（図式の簡単な説明）
第１図  バイナリーベクターｐＭＯＧ２３。
第２図  ベクターｐＰＲＯＭ５４中に存在するバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のゲノム配列。
第３図  種々の構築に使用する合成オリゴヌクレオチド二本鎖。
第４図  メチオニン翻訳開始コドンに続いてバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列を有するバイナリープラスミドｐＭＯＧ２３を含むバイナリーベクターｐＭＯＧ２２８。
第５図  メチオニン翻訳開始コドンに続き、ジャガイモ由来のクラス−Ｉパタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列を有するバイナリーベクターｐＭＯＧ２３を含むバイナリープラスミドｐＭＯＧ４５０。
第６図  いずれもメチオニン開始コドンに続き、かついずれもジャガイモ由来のクラス−Ｉパタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼおよびアスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の成熟グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列を有するバイナリーベクターを含むバイナリープラスミドｐＭＯＧ４３７。
（発明の詳細な説明）
本発明は、植物にポリサッカライドを分解しうる特定の酵素をコードするＤＮＡ配列を安定に導入することにより、従来の植物育種法の問題点を克服してポリサッカライド組成を改良した植物または植物器官を提供する。
予想に反して、バクテリアα−アミラーゼ遺伝子（分泌シグナル配列を欠く）によるタバコのトランスホーメーションは、α−アミラーゼ活性の指標であるマルトースやマルトトリオース等のマルトデキストリンを蓄積することが分かった。この知見は、ポリサッカライド分解酵素をコードする遺伝子の導入および翻訳により、植物中のポリサッカライド組成を修正しうることを示している。
α−アミラーゼの導入による澱粉の分解は、植物細胞における澱粉合成の全過程が澱粉が貯蔵されている特定のオルガネラ（クロロプラスト、アミロプラストなど）で起こり、一方発現するα−アミラーゼは、これをそのようなオルガネラに送る配列がないことから細胞質中に存在することが期待されるので非常に驚くべきことである。特定の澱粉分解酵素は、植物の葉細胞の細胞質中に存在する。しかし、細胞質中でのそれらの機能はまだ解明されておらず、それら二つが仕切りで分断されていることから澱粉の分解との関連は分かっていない（キャスパー（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８９；リン（Ｌｉｎ）等、１９８８ａ，ｂおよびｃ；オキタ（Ｏｋｉｔａ）等、１９７９）。
本発明における植物の味、および、または組織の変化の程度は、サッカライド修飾酵素の選択、目的の酵素の発現を目的とするＤＮＡ構築物の調節領域の選択および発現酵素の所定の細胞内部位への輸送を含む種々の手段で調節しうる。
目的酵素の選択が、目的の最終産物を得る上でもっとも重要であることは明白である。一つの植物中で一つ以上の酵素を発現したい場合は、各酵素の比を至適効果（例えば、甘味など）が得られるように選択すればよい。
また、発現レベルおよび発現の空間的（組織／器官特異的）および、または分化的調節に関する目的酵素の発現の調節も至適産物を得る手段である。たとえば、目的酵素の発現の時期および、または位置に関するプロモーターのタイプおよび強さは、そのトランスホーム植物の望ましい部位における目的酵素の至適レベルを提供する。
最後に、発現した酵素が送られる部位（例えば、細胞コンパートメントやオルガネラ）は、基質とより良く接近するなど至適効果が得られるように選択することが出来る。
トランスホームＤＮＡの組み込み部位やコピー数の違いにより発現レベルにしばしば違いが見られる。この自然のばらつきを用いて、甘味、組織等に関する望ましい特性を有するトランスジェニック植物から個々の植物を選択できる。これらの個々の植物は、別の特性を持つ植物種の増殖および、または育種に使用できる。
以上に示した特性を組み合わせて望ましい効果を得ることが出来る。また、以下に示す内容を用いて至適産物を得る方法が決定される。
本発明において、植物中で発現される目的の酵素には、植物のポリサッカライドを分解しうる酵素または酵素群の組み合わせが含まれる。特に、微生物由来のＤＮＡ配列によってコードされる酵素が好ましい。必要ならば、コード配列および、または調節配列を修正して、細胞質、またはオルガネラ発現組織特異性、または植物または植物器官の望ましい成熟段階における発現を誘導することが出来る。さらに、コドンを修正して選択した宿主植物における該遺伝子の発現を改良することが出来る。
本発明に使用しうる酵素には、
ａ）１）α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；２）アミログルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、α−グリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）および他のエクソ−アミラーゼ等のエクソ−１，４−α−Ｄグルカナーゼ、および３）イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）、パルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）等の澱粉枝切り酵素；
ｂ）エクソ−１，４−β−セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、エクソ−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．３９）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等のセルラーゼ；
ｃ）エンド−１，３−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）およびエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）等のエンドグルカナーゼ；ｄ）エンド−１，５−α−Ｌ−アラビノース（ＥＣ３．２．１．９９）、α−アラビノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）等のＬ−アラビナーゼ；
ｅ）エンド−１，４−β−Ｄ−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）、エンド−１，３−β−Ｄ−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．９０）、α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）等のガラクタナーゼ；
ｆ）エンド−１，４−β−Ｄ−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）、β−マンノシナーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）、α−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）等のマンナナーゼ；
ｇ）エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、β−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）、１，３−β−Ｄ−キシラナーゼ等のキシラナーゼ；
ｈ）α−Ｌ−フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５１）、α−Ｌ−ラムノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．４０）、ラベナーゼ（ＥＣ３．２．１．６５）、イヌラナーゼ（Ｅｃ３．２．１．７）
等の他の酵素が含まれる。
さらに、場合によっては、本発明は、さらにポリサッカライド分解産物（第一ポリサッカライド分解酵素の作用で得られたもの）を望ましいサッカライドサブユニットに変化させうる第二の酵素をコードする一つ以上のＤＮＡ構築物の標的植物（宿主）への導入に関する。この第二の酵素は、微生物由来であるＤＮＡ配列にコードされる酵素であることが特に好ましい。
例として、澱粉の第一分解で得られるマルトース、マルトトリオースおよびα−デキストリンをさらに分解しうる特に好ましい第二酵素には、マルターゼ、α−デキトリナーゼ、α−１，６−グルコシダーゼ等が含まれる。これらの酵素の作用でグルコースが生成する。
本発明の別の態様では、更にモノサッカライドを修飾しうる一つ以上の第二酵素を同植物中で発現させる。これらの酵素には、グルコースイソメラーゼ、インバーターゼ等が含まれる。
目的の酵素が発現もしくは指向する環境下で活性ならば、目的の酵素をコードするＤＮＡ配列の由来は問題にならない。第一（植物ポリサッカライド分解性）酵素および必要な場合は第二酵素の選択は、基質特異性および、または目的とするサッカライド最終産物に依存する。
目的の酵素は、トランスジェニック植物の分化のすべての段階で構成的に発現させることもできる。植物または植物器官の使用に依存して、この酵素は、例えば塊茎形成または果実分化の際など、分化段階特異的に発現させうる。さらに、その使用法に依存して、この酵素を例えば果実、塊茎、葉、または種子等の植物器官特異的に発現しうる。
本発明で定義される植物ポリサッカライドとは、本発明の酵素または酵素群の作用前に通常植物中に存在する結合する６個以上のモノサッカライドからなるポリヒドロキシアルデヒドまたはケトンを含むものである。これらのポリサッカライドは一般にＤ−アラビノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロースおよびマンノースのポリマーである。
本発明の望ましい最終産物であるサッカライドサブユニットとは、植物ポリサッカライドへの一つ以上の目的酵素の作用で得られるモノサッカライドを含む元のポリサッカライドよりも長さが短いサッカライドと定義される。
本発明で定義されるトランスジェニック植物には、組み換えＤＮＡ技術で遺伝子工学的に修正され目的の植物または植物器官中で少なくとも一つの目的酵素の生産を起こすかまたは増加した植物（該植物の一部および細胞も含む）およびそれらの子孫が含まれる。
本発明に使用しうる植物には、カリフラワー（ブラシカ  オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ））、朝鮮アザミ（シナラ  スコリマス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ））などの食用花生産作物、リンゴ（マルス（Ｍａｌｕｓ）、例えばドメスチカス（ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、バナナ（ムサ（Ｍｕｓａ）、例えばアクミナタ（ａｃｕｍｉｎａｔａ））、ベリー（スグリ等、ライベス（Ｒｉｂｅｓ）、例えばラブラム（ｒｕｂｒｕｍ））、チェリー（スイートチェリー等、プラナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、例えばアビウム（ａｖｉｕｍ））、キュウリ（ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、例えばサチバス（ｓａｔｉｖｕｓ））、ブドウ（バイチス（Ｖｉｔｉｓ）、例えばビニフェラ（ｖｉｎｉｆｅｒａ））、レモン（シトラス  リモン（ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ））、メロン（ククミス  メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ））、ナッツ（クルミ等、ジユグランス（Ｊｕｇｌａｎｓ）、例えばレジア（ｒｅｇｉａ）；ピーナッツ，アラキス  ヒポゲ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｅ））、オレンジ（シトラス（Ｃｙｔｒｕｓ）、例えばマキシマ（ｍａｘｉｍａ））、モモ（プラナス（Ｐｕｒｕｎｕｓ）、例えばパーシカ（ｐｅｒｓｉｃａ））、ナシ（パイラ（Ｐｙｒａ）、例えばコムニス（ｃｏｍｍｕｎｉｓ））、コショウ（ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）、例えばカプシカム（ｃａｐｓｉｃｕｍ））、プラム（プラナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、例えばドメスチカ（ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、ストロベリー（フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、例えばモスカタ（ｍｏｓｃｈａｔａ））、トマト（リコパーシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、例えばエスクレンタム（ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））などの果実、アルファルファ（メジカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））、キャベツ（ブラシカ  オリラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）等）、キクヂシャ（シコレウム（Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ）、例えばエンジビア（ｅｎｄｉｖｉａ））、ニラ（アリウム（Ａｌｌｉｕｍ）、例えばポラム（ｐｏｒｒｕｍ））、レタス（ラクツカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））、ホウレンソウ（スピナシア（Ｓｐｉｎａｃｉａ）、例えばオレラセ（ｏｌｅｒａｃｅａｅ））、タバコ（ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、例えばタバカム（ｔａｂａｃｕｍ））等の葉、アロールート（マランタ（Ｍａｒａｎｔａ）、例えばアランジナセ（ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））、砂糖大根（ベタ（Ｂｅｔａ）、例えばバルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ））、ニンジン（ドーカス（Ｄａｕｃｕｓ）、例えばカロタ（ｃａｒｏｔａ））、カッサバ（マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ）、例えばエスクレンタ（ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、カブラ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、例えばラパ（ｒａｐａ））、ラディッシユ（ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、例えばサチバス（ｓａｔｉｖｕｓ））、ヤム（ジオスコリア（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、例えばエスクレンタ（ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、スイートポテト（イポモエアバタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ））等の根、およびソラマメ（ファセオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、例えばブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ））、エンドウ（ピサム（Ｐｉｓｕｍ）、例えば���チバム（ｓａｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン（Ｇｌｙｃｉｎ）、例えばマックス（ｍａｘ））、小麦（トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、例えばアスチバム（ａｅｓｔｉｖｕｍ））、大麦（ホーデン（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、例えばバルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ））、コーン（ジー（Ｚｅａ）、例えばマイス（ｍａｙｓ））、米（オリザ（Ｏｒｙｚａ）、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））等の種子、カブキャベツ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、例えばオレラセア（ｏｌｅｒａｃｅａｅ））、ジャガイモ（ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）、例えばツベロサム（ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））などの塊茎などが含まれる。
植物種の選択は、その植物または植物の一部の用途およびその植物種のトランスホーメーションの難易度によって決定する。
植物における組み換え遺伝子の発現は、植物のポリメラーゼによる遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳などが詳細に関係する。この事は組み換えＤＮＡ技術の分野ではよく知られている。本発明の正しい理解に関係する事のみを詳細に説明する。
本発明では、植物における目的酵素をコードする遺伝子の発現を起こすことが知られている調節配列を使用する。使用する調節配列の選択は、標的となる作物および、または器官に依存する。このような調節配列は、植物または植物ウイルスから得ることが出来るし、また化学的に合成することもできる。これらの調節配列は、使用する植物またはその一部に依存して構成的、又は分化段階および、または組織特異的に植物中での転写を指令するプロモーターである。これらのプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）（ガリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、１９８２）の３５Ｓプロモーターなどの構成的発現を示すプロモーター、ルビローズ  ビスホスフェート  カルボキシラーゼのスモールサブユニット遺伝子のプロモーターなどの葉特異的発現を行うもの（コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）等、１９８４）、グルタミンシンテース遺伝子のプロモーターなどの根特異的発現を行うもの（チンギー（Ｔｉｎｇｅｙ）等、１９８７）、ブラシカ  ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のクルシフェリンＡプロモーターなどの種子特異的発現を行うもの（ライアン（Ｒｙａｎ）等、１９８９）、ジャガイモ由来のクラス−Ｉパタチンプロモーターなどの塊茎特異的発現を行うもの（ロシャ・ソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ）等、１９８９；ウェンズラー（Ｗｅｙｚｌｅｒ）等、１９８９）またはトマト由来のポリガラクトウロナーゼ（ＰＧ）プロモーターなどの果実特異的発現を行うもの（バード（Ｂｉｒｄ）等、１９８８）等が含まれる。
ターミネーター配列やポリアデニレーションシグナル等、その他の調節配列には植物において機能するものが含まれるが、その選択は当業者のレベルの範囲内にある。このような配列の例には、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）遺伝子の３’隣接領域がある（ビーバン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）。
また、調節配列には、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター中に見られるエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルス（Ａ１ＭＶ）ＲＮＡ４のリーダー配列などのｍＲＮＡ安定化配列（ブリデロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、１９８０）、または同様の機能を示す他の配列が含まれる。
本発明の態様において、植物細胞の細胞質における目的酵素の単純な発現が望ましい場合には、発現される酵素に分泌シグナルペプチドやその他のターゲッティング配列を含めるべきではない。
本発明の別の態様では、本発明の選択された酵素をコードするＤＮＡ構築物に所定の部位に発現された酵素を指向させ、その基質に酵素がより接近しやすくさせうるリーダー配列を提供している。目的の酵素に機能的に結合し、この機能を行わせるターゲッティング配列は文献に報告されている（スミーケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、１９９０；バン  デン  ブルーク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）等、１９８５；シュレーヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）等、１９８５）。例えば、クロロプラストおよびミトコンドリアで発現させるために発現酵素は、これらのオルガネラへの輸送を目的とした特異的な所謂トランジットペプチドを含んでいる（スミケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、１９９０）。もしもこの酵素の活性が液胞内で必要なら、分泌シグナル配列と酵素を液胞に送る特異的なターゲッティング配列が存在しなければならない（タグエ（Ｔａｇｕｅ）等、１９８８）。また、この事は酵素を種子に指向させることもできる。
もしも必要な場合は、本発明の関連ＤＮＡ構築物のすべての部分（プロモーター、調節−、安定化−、ターゲッティング−またはターミネーション配列）を従来法を用いて修正し、それらの調節特性を変化させることが出来る。
目的酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を標的植物に導入する方法は幾つかある。これらの方法には、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを用いたプロトプラストのトランスホーメーション、または（コート化）粒子衝突法が含まれる（ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ），１９９０）。
これらの所謂直接的ＤＮＡトランスホーメーション法に加えて、「ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）等、１９８６）およびバクテリアウイルス（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来、ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、１９９０）等のベクターを含むトランスホーメーションシステムが広く使用されている。トランスホームしたプロトプラスト、細胞、または植物の一部の選択、および、またはスクリーニング後、これらは従来法を用いて完全な植物に再生する（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９８５）。トランスホーメーションおよび、または再生の方法は本発明にとって本質的なものではない。
双子葉植物の場合の本発明の態様は、毒性遺伝子を有するプラスミドおよび転移する遺伝子構築物を有する適合プラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用するバイナリーベクターシステムの方法を取る（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３；シルパルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）等、１９８４）。このベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれにおいても複製可能で、細部にわたって本発明には関係しないように修正したバイナリーベクターＢｉｎ１９（ビーバン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）から誘導される。この実施例で使用するバイナリーベクターには、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界領域のあいだにカナマイシン耐性をコードするＮＰＴＩＩ−遺伝子と必要とされる遺伝子構築物をクローン化するための多重クローニング部位を含んでいる。
単子葉作物のトランスホーメーションおよび再生には標準的方法はない。しかし、最近の科学の進歩は、原則的に単子葉植物はトランスホームが容易であり、トランスホームした細胞から稔性トランスジェニック植物が再生しうることを示している。これらの作物に対する再生産可能な組織培養システムの発達は、植物細胞への遺伝子物質の導入に関する強力な方法とともに、トランスホーメーションを可能にしている。現在、単子葉植物のトランスホーメーションの方法には、植物片または細胞サスペンジョンへの微粒子衝突、およびプロトプラストの直接的ＤＮＡ取り込みまたはエレクトロポレーションがある。例えば、選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性をコードするバクテリアｈｐｈ遺伝子を用いて、トランスジェニック米植物がうまく得られている。この遺伝子はエレクトロポレーションで導入した（シマモト（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ）等、１９８９）。また、微粒子衝突により、トウモロコシ懸濁培養物の胚芽細胞にホスフィノスリシン  アセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスフィノスリシンを不活性化する酵素）をコードするストレプトミセス  ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のｂａｒ遺伝子を導入することにより、トランスジェニックトウモロコシ植物が得られている（ゴードン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）等、１９９０）。小麦や大麦などの他の単子葉作物の糊粉プロトプラストへの遺伝子物質の導入が報告されている（リー（Ｌｅｅ）等、１９８９）。最近、微粒子衝突による小麦細胞懸濁培養物の安定なトランスホーメーションが示された（バシル（Ｖａｓｉｌ）等、１９９１）。胚芽懸濁培養を行うために古く小さくて節のある胚芽カルス組織だけを選択し、その培養物から小麦植物を再生した（バシル（Ｖａｓｉｌ）等、１９９０）。これらの作物に対するトランスホーメーションシステムと再生技術を組み合わせることにより、本発明の単子葉植物への応用が可能となる。また、これらの方法は、双子葉植物のトランスホーメーションや再生にも応用しうる。
必要ならば、目的の一つ以上の酵素を発現するトランスジェニック植物を得るために多くの方法を使用する。これらには、
ａ．目的の異なる酵素を各々発現するトランスジェニック植物の交配。
ｂ．各自必要な調節配列を含む目的の酵素をコードする複数の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる植物のトランスホーメーション。
ｃ．必要な調節配列を有する目的の酵素をコードする遺伝子を各々が含んでいる異なるＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる同時の植物へのトランスホーメーション。
ｄ．必要な調節配列のコントロール下にある目的の異なる酵素をコードするＤＮＡフラグメントまたはプラスミドを用いた連続的な植物のトランスホーメーション。
ｅ．上述の方法の組み合わせ。
以上ａ−ｅの方法があるが、これらの方法に限定されるわけではない。
上記の方法の選択は本発明にとって本質的なものではない。
本発明の一態様において、タバコおよびトマト植物の細胞中でα−アミラーゼが構成的に発現され、同植物中の澱粉を低分子量の糖に分解している。バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼをコードする、すなわち、シグナルペプチド配列を含まないα−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡフラグメントが、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびエンハンサー配列のコントロール下に置かれた。Ａ１ＭＶ由来のＲＮＡ４のｍＲＮＡ安定化リーダー配列が、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）遺伝子のターミネーターおよびポリアデニレーションシグナル配列とともに含まれている。その後、この構築物をｐＭＯＧ２３（１９９０年１月２９日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号ＣＢＳ１０２．９０で登録されている）等のバイナリーベクターにサブクローニングする。このベクターをジスアームドＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞を標的植物由来の組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地中で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には、安定に組み込まれた遺伝子が含まれ、細胞中でα−アミラーゼが発現される。
このトランスジェニック植物のα−アミラーゼ酵素活性は、比色による直接的酵素検定法またはゲル検定法により検定できる。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。この蛋白質は、バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロットで検出しうる。
この植物を沃素で染色することにより澱粉含量を定量する。また、ＮＭＲおよびＨＰＬＣなどの方法を用いて澱粉分解産物の存在を定量的に検定する。これには別の方法も使用できる。この方法は本発明にとって本質的なものではない。
別の好ましい態様では、ジャガイモでα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方が発現されている。この酵素はその植物の塊茎のみで発現している。この結果、両酵素により塊茎中の澱粉が低分子の糖に分解される。バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡフラグメントおよびアスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の成熟グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントが、各々ジャガイモ由来のクラスーＩパタチン遺伝子の塊茎特異的プロモーターのコントロール下に置かれている。また、両構築物にはアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）遺伝子のターミネーターおよびポリアデニレーションシグナル配列が含まれる。その後、両構築物を一緒にバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にサブクローン化する。このベクターを、ジスアームドプラスミドＴｉを含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をジャガイモ植物由来の組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には安定に組み込まれた遺伝子が含まれている。α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方が、トランスホームしたジャガイモの塊茎でのみ発現している。両酵素は細胞内で発現している。
トランスジェニック塊茎におけるα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ酵素活性は、種々の検定法で検定しうる。例えば、グルコアミラーゼ活性は、グルコアミラーゼによるｐ−ニトロフェノール−α−Ｄ−グルコピラノシドから放出されるｐ−ニトロフェノールを測定することにより決定する。α−アミラーゼ活性は、先に示し、また以下の実施例で述べるように測定しうる。両酵素の存在は、例えば、イムノブロッティングにより示される。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。
トランスジェニックジャガイモ塊茎の炭水化物組成を、ＨＰＬＣおよびＮＭＲ等の糖の検出技術を用いて検定する。別の方法を使用することもできる。どの方法を用いるかは本発明にとって本質的ではない。
高含量のポリサッカライド分解産物を有し、結果的に風味が変わり、および、または組織が改良されたトランスジェニック植物または植物器官（花、果物、葉、根、塊茎など）は、そのまま、または植物の糖の変化による品質を維持する非醗酵的処理後に使用される。このような使用の例には、ベビーフード、ジュース、ソース、ペースト、濃縮物、甘味料、ジャム、ゼリー、シロップおよび動物飼料の生産が挙げられる。炭水化物組成が変わった穀物は、例えば、味の良いべーキング産物の生産に使用される。炭水化物組成の変わったタバコは、味や香りの変化を示す。
また、それらの植物または植物からポリサッカライド分解産物が抽出され、甘味料としてや種々の過程で使用される。
以下の実施例は、当業者を対象として本発明の生成法および使用法を完全に公開および説明することを意図するもので、本発明の範囲を制限するものではない。使用する数字（例えば、量、温度、ｐＨ等）は、正確を期するよう努力したが、いくらかの実験誤差やばらつきがあることを考慮しなければならない。特筆しないかぎり温度は℃で示し、圧力は大気圧付近である。
（実施例１）バイナリーベクターｐＭＯＧ２３の構築
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３（１９９０年１月２９日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号ＣＢＳ１０２．９０で登録されている；第１図）は、ベクターＢｉｎ１９（ビーバン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）の誘導体である。まず、ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ遺伝子II（ＮＰＴII）に関して左境界（ＬＢ）と右境界（ＲＢ）を交換した。次に、ＬＢの方向に転写してＮＰＴII遺伝子の方向を逆にした。最後に、Ｂｉｎ１９のポリリンカーを以下の制限酵素認識部位：ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｃＩ，ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIを有するポリリンカーで置換した。
（実施例２）バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング
本実施例のすべてのトランスホーメーションは、大腸菌ＤＨ５α株で行った。ａ．バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の調製
バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼ遺伝子（第２図）は、ヨーロッパ特許出願２２４，２９４（参考として引用する）に公開されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）ベクターｐＰＲＯＭ５４中に存在する。このプラスミドｐＰＲＯＭ５４は、１９８５年１１月５日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号ＣＢＳ６９６．８５で登録されている。
このプラスミドｐＰＲＯＭ５４をＸｂａＩおよびＢｃｌＩで消化した。このＸｂａＩ／ＢｃｌＩフラグメントを、予めＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８にクローン化しプラスミドｐＭＯＧ３１８を調製した。テンプレートとしてｐＭＯＧ３１８を使用し、ミスマッチプライマーを使用してＢａｍＨＩ部位を生成するＰＣＲを行ってＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを合成した（生成したＢａｍＨＩ部位の位置は第２図に示した）。このＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ  ＰＣＲフラグメントを、予めＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＩＣ−１９Ｒ（マーシュ（Ｍａｒｓｈ）等、１９８４）にクローニングし、プラスミドｐＭＯＧ３１９を調製した。α−アミラーゼ遺伝子の５’末端を含むｐＭＯＧ３１８のＳａｌＩフラグメント（第二のＳａｌＩは、ｐＵＣ１８中に存在する）を、ＳａｌＩで消化したｐＭＯＧ３１９にクローン化した。これで、全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＭＯＧ３２０が生成した。
ｂ．ベクターｐＭＯＧ１８の構築
ｐＲＯＫＩ（ボールコーム（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）等、１９８６）の発現カセットをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐＵＣ１８にクローン化した。このカセットには、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上に８００塩基長のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターフラグメントおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント上にアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）転写ターミネーターが含まれる。このプロモーターフラグメントには、ＣａＭＶプロモーターの−８００から＋１（両部位を含む）の配列が含まれる。部位＋１は転写開始部位である（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、１８９２）。部位−５１２のＮｃｏＩ部位の上流の配列が欠失しており、またこの部位はＥｃｏＲＩ部位に変わっている。この事は、ＮｃｏＩでｐＵＣ１８中にある発現カセットを切断し、クレノーポリメラーゼで一本鎖を平滑化してＥｃｏＲＩリンカーをライゲーションすることにより行った。
このプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、元のＮｃｏＩ部位の上流にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの配列を有するＥｃｏＲＩフラグメントを欠失させた。ｎｏｓターミネーターを含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントをフルファルファモザイクウイルス（Ａ１ＭＶ）のＲＮＡ４のリーダー配列（ブレデロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、１９８０）を含む合成ＤＮＡフラグメント（オリゴヌクレオチド二本鎖Ａ、第３図）で置換した。この事は、ＢａｍＨＩによる切断、ＨｉｎｄIIIによる切断および合成ＤＮＡフラグメントのライゲーションで行った。このＢａｍＨＩ部位および三個の上流ヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発で欠失させた。
そのプラスミドにｎｏｓターミネーターを含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを再導入した。β−グルクロニダーゼを含む遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２７５由来、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、１９８７）をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてライゲーションし、プラスミドｐＭＯＧ１４を調製した。
−３４３と−９０の間の配列の重複はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性を増加することが知られている（カイ（Ｋａｙ）等、１９８７）。二重の所謂エンハンサー配列を含むプロモーターフラグメントを得るために、プラスミドｐＭＯＧ１４由来のエンハンサーフラグメントをＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、クレノーポリメラーゼで末端平滑化した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断し末端平滑化したｐＭＯＧ１４に導入した。この結果、平滑化したＥｃｏＲＩとＡｃｃＩの境界で新しいＥｃｏＲＩが生成した。このプラスミドｐＭＯＧ１８２には、二重エンハンサー配列を有するＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ａ１ＭＶのＲＮＡ４リーダー配列およびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとして存在する発現カセット中のｎｏｓが含まれている。
ｃ．バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼ遺伝子のバイナリーベクターへのクローン化
プラスミドｐＭＯＧ３２０をＨｇａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。このＨｇａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを合成オリゴヌクレオチド二本鎖Ｂ（第３図）と共に、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＯＧ３２２にクローン化した。β−グルクロニダーゼ遺伝子をメチオニン翻訳開始コドンをコードするＡＴＧトリプレットに続くバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の成熟α−アミラーゼをコードする配列で置換した。プラスミドｐＭＯＧ１８は、カリホルニアモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターおよびエンハンサー、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）ターミネーターおよびアルファルファモザイクウイルス（Ａ１ＭＶ）のＲＮＡ４リーダー配列を含んでいる。この構築物にはシグナルペプチドをコードする情報は含まれていない。この全構築物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にライゲーションした。生成したプラスミドをｐＭＯＧ２２８と命名した。
このバイナリーベクターｐＭＯＧ２２８上のキメラα−アミラーゼ遺伝子を、プラスミドｐＲＫ２０１３を有する大腸菌ＨＢ１０１株を用いたトリペアレンタルメーティングにより（ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、１９８０）、植物へのＴ−ＤＮＡの移行に必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株に導入した（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、１９８３）。
（実施例３）タバコのトランスホーメーション
タバコ（ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ．ペチット  ハバナ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎｎａ）ＳＲ１）を、α−アミラーゼ遺伝子を有するバイナリーベクターｐＭＯＧ２２８を含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と植物葉ディスクとの共培養（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９８５）でトランスホーメーションした。このトランスジェニック植物をカナマイシン耐性で選択し、目的の酵素活性に関して検定した。α−アミラーゼ遺伝子を発現する植物は、さらに詳細に分析し以後の実験に使用した。
無菌的に生育させたタバコ（ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ．ペチット  ハバナ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎｎａ）ＳＲ１）の葉から約５×５ｍｍのディスクを切りだし、１％（ｖ／ｖ）となるようにアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ２２８）（１０9細胞／ｍｌ）を混合した３０ｇ／ｌのスクロースを含むＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）、１９６２）に、２０分間浮かした。このディスクを濾紙上で簡単に乾燥し、３０ｇ／ｌスクロース、７ｇ／ｌ寒天、１ｍｇ／ｌケラチンおよび０．０３ｍｇ／ｌナフチル酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ固体培地を含むプレートに移した。二日後、このディスクを、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む同培地のプレートに移した。一週間後、このディスクを約５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む同培地のプレートに移しトランスジェニックな新芽を選択した。このディスクを三週間ごとに新しいプレートに移した。成長してくる新芽を切りだし、根を成長させるために３０ｇ／ｌスクロース、１００ｍｇ／ｌカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌセフォタキシムを含むＭＳ固体培地を含むポットに移した。根が成長してきたら、これを土壌に移す。この植物を目的の遺伝子発現について検定した。
（実施例４）トランスジェニックタバコ植物におけるα−アミラーゼの発現
５６℃におけるα−アミラーゼ活性をサイトウ（Ｓａｉｔｏ）（１９７３）の方法で検定した。この場合のユニットは、１０分間で６９０ｎｍの吸収を１０％減少させる酵素量と定義する。バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの比活性は、８．７×１０5Ｕ／ｍｇ蛋白質である。先端の葉（約１００ｍｇ）を切りだし、１００μｌのα−アミラーゼ検定バッファ中でホモジナイズした（サイトウ（Ｓａｉｔｏ）、１９７３）。このホモジネートをエッペンドルフ遠心機で１０分間遠心した。上清を回収し、蛋白質およびα−アミラーゼ含量を検定した。コントロール植物の活性レベルは検出限界以下であった。
得られた６２個のトランスジェニック植物の発現レベルは、０から３．２９Ｕ／μｇ（蛋白質）の間でばらついていた。その酵素の比活性から、これらのレベルは全可溶性蛋白質の０−０．３８％に相当している。平均は、全可溶性蛋白質の０．１１％であった。バッファによる葉の減圧濾過および遠心による溶液の回収で単離した細胞外液にはα−アミラーゼ活性が検出されなかったことから、この蛋白質が細胞内に存在していることは明白である（シモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）等、１９９０）。これらの結果は、この蛋白質が目的のα−アミラーゼであることを示すウエスタンフブロットによるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの免疫学的検出からも確認される。さらに、この確証は、抽出物および細胞外液のポリアクリルアミドゲル電気泳動でも得られる。電気泳動後、ゲルを０．０４Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）のバッファを６回取り替えながら３時間インキュベーションして酵素を再生した。このゲルに１ｍＭＣａＣｌ2を含む０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中０．２５％ポテトリントナースターチおよび０．７５％寒天を含む溶液を重層し、３７℃で一番インキュベーションしたのち、１ｍＭ  Ｉ2／０．５Ｍ  ＫＩ水溶液で染色した。重層中の透明なゾーンとしてα−アミラーゼ活性が検出される（ラックス（Ｌａｃｋｓ）およびスプリングホーン（Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ）、１９８０）。トランスジェニック植物で、バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼと同じ分子量約５５，０００ｋＤａのα−アミラーゼが検出された。
α−アミラーゼを発現する植物は、薄い淡緑色（クロロチック）でコントロール植物と比較すると増殖がいくぶん遅い。
（実施例５）トランスジェニックタバコ植物の炭水化物分析
光周期の約半分のときに回収したトランスジェニックタバコ植物の葉の澱粉含量を、９６％エタノール中で葉を一晩振盪して脱染色し、０．２Ｎ  ＨＣｌ中５．７ｍＭＩ2および４３．３ｍＭ  ＫＩを含む溶液で染色することにより定性的に測定した。澱粉を含む葉は紺に染色され、澱粉を含まない葉は黄褐色に染色される（キャスパー（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８５）。
コントロールおよびトランスホームした（α−アミラーゼ発現良好）植物由来の葉約２．５ｇを、ウルトラタラックスを用い１０ｍｌの水中４℃でホモジナイズした。顕微鏡観察で生の細胞が残存していないことを確認した。遠心による細胞フラグメントの除去後、緑色上清のグルコースオリゴマー含量を測定した。濾過したサンプルは、溶出液として水を用いたアミネックスＨＰＸ−４２Ａカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ，８５℃）のＨＰＬＣで分析した。トランスホーム植物のサンプルにはマルトースおよびマルトトリオースの存在が確認されたが、コントロール（非トランスホーム）植物には確認されなかった。この結果を表１に示す。
0003938402.tif 000002
（実施例６）塊茎特異的発現構築物におけるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング
本実施例の大腸菌のトランスホーメーションは全てＤＨ５α株を用いた。
塊茎特異的発現用の発現カセットを構築するために、ジャガイモのクラス−Ｉパタチン遺伝子のプロモーター（ソラナム  ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ．ビンテ（Ｂｉｎｔｊｅ））を、テンプレートとして単離したゲノムＤＮＡを用いたポリメレースチェーンリアクションリアクションで合成した（メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）、１９８７）。ジャガイモ中でクラス−Ｉパタチン遺伝子は塊茎特異的発現を示した。いくつかのパタチンマルチジーン群のコードおよび隣接両配列が決定されている（ロカ−ソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ）等、１９８９；ビーバン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８６；ミグネリー（Ｍｉｇｎｅｒｙ）等、１９８８）。β−グルクロニダーゼに融合したクラス−Ｉパタチン遺伝子の５’隣接領域を含みβ−グルクロニダーゼの塊茎特異的発現を起こすキメラ遺伝子が報告されている（ウェンズラー（Ｗｅｎｚｌｅｒ）等、１９８９）。ｐＡＴ２１およびＢ３３の配列に対応する二つのオリゴヌクレオチド（ミグネリー（Ｍｉｇｎｅｒｙ）等、１９８９；ビーバン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８６）を合成し、ＨｉｎｄIII／ＮｃｏＩフラグメントとしてクラス−Ｉパタチン５’隣接領域を増幅した。
0003938402.tif 000003
このオリゴヌクレオチドは、その末端に適当な制限部位（ＨｉｎｄIIIおよびＮｃｏＩ）を含むよう設計し、その制限酵素でフラグメントを消化後発現カセットへの組込みを可能としている。機能的クラス−Ｉパタチンプロモーターフラグメントを含む約１．３ｋｂのフラグメントを合成した。ライゲーションによるＥｃｏＲＩ合成リンカーの付加後、このフラグメントをＥｃｏＲＩで線状化したｐＵＣ１８にクローン化しｐＭＯＧ５４６を調製した。三者ライゲーションではプラスミドｐＭＯＧ５４６のＨｉｎｄIII／ＮｃｏＩフラグメントを、プラスミドｐＭＯＧ３２２のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（実施例２参照、ＡＴＧ翻訳開始コドンにつづき、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｎｏｓターミネーターを従えるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の成熟αをコードする）と共に、ＨｉｎｄIIIで切断したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にライゲーションしてバイナリープラスミドｐＭＯＧ４５０を調製した（第５図参照）。
（実施例７）トマトのトランスホーメーション
トマト（リコペルシコン  イスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）ｃｖ．マネーメーカー（Ｍａｎｅｙｍａｋｅｒ））をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ２２８）でトランスホームした。基礎培養培地は、３０ｇ／ｌスクロース、Ｂ５ビタミン（ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）、１９７０）、２ｍｇ／ｌジーチンリボシドおよび０．１ｍｇ／ｌ酢酸インドール（ＩＡＡ）を補ったＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）、１９６２）を含んでいる。必要な場合はこの培地を０．７ｇ／ｌのダイチン寒天で固形化した。
日令６才の無菌的に生育させたシードリングの子葉の両端を切り、日令１０才のペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）細胞サスペンジョンのフィーダーを含む固体培地上で２４時間プレインキュベーションした。この子葉をＭＳ培地で洗浄したアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ２２８）株の対数期培養物と２４時間共培養した。この子葉を滅菌した濾紙で簡単に乾燥し、日令１０才のペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）細胞サスペンジョンのフィーダー層を含む固体培地上に置いた。４８時間後、この子葉をフィーダー層を含まず、２００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌバンコマイシンを含む同培地を含むプレートに移した。共培養５日後、この子葉を１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む同培地に移した。この子葉を三週間毎に新鮮なプレートに移し変えた。
新芽を切りだし、根づけ培地（１０ｇ／ｌスクロース、１００ｍｇ／ｌセファロタキシムおよび５０ｍｇ／ｌバンコマイシンを補ったＭＳ培地）上に置いた。根付き後、その植物を土壌に移し、α−アミラーゼの発現を検定した。
（実施例８）トマトにおけるバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼの発現およびトランスジェニックフルーツの炭水化物分析
構成的発現構築物ｐＭＯＧ２２８によるトランスホーメーションから得たトランスジェニックトマトの発現型は変わらなかった。土壌で３週間生育させたトランスジェニックトマトの葉のα−アミラーゼ活性を実施例４の方法で検定した。分析した植物中のα−アミラーゼ発現レベルは、０から１．２Ｕ／μｇ（可溶性蛋白質）の範囲にあった。この酵素の存在は、バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認された。
土壌に３週間生育させ、光周期の中点で回収した植物から得た葉中の澱粉含量を、実施例５で述べた方法で測定した。α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の葉に含まれる澱粉量は、コントロール植物のものより少なかった。
（実施例９）アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の成熟グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング
本実施例の大腸菌のトランスホーメーションで使用する株は全てＤＨ５α株である。
ａ．アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からのポリＡ+ＲＮＡの単離
アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＤＳ  ２９７５株（１９８８年８月１０日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号ＣＢＳ５１３．８８で登録されている）の約１×１０8個の胞子を、１リットル当たり１ｇ  ＫＨ2ＰＯ4；３０ｇマルトース；５ｇイーストイクストラクト；１０ｇカゼイン加水分解物；０．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび３ｇ  Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍｌの前培養培地中でインキュベーションした。このｐＨを、５．５に調整する。
ロータリーシェーカー中、３４℃で一晩増殖させたのち、培養物１ｍｌを、１リットル当たり２ｇ  ＫＨ2ＰＯ4；７０ｇマルトデキストリン（マルデックスＭＤＯ3，アミラム）；１２．５ｇイーストイクストラクト；２５ｇカゼイン加水分解物；２ｇ  Ｋ2ＳＯ4；０．５ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．０３ｇ  ＺｎＣｌ2；０．０２ｇ  ＣａＣｌ2；０．０５ｇ  ＭｎＳＯ4・４Ｈ2ＯおよびＦｅＳＯ4を含む１００ｍｌの本培養培地中でインキュベーションした。このｐＨを５．６に調整する。１４０時間で菌糸体が生育してくるので、これを回収する。乾燥した菌糸体０．５ｇを液体窒素で凍結し、粉末とする。つづいて、オーフレー（Ａｕｆｆｒａｙ）およびロージャン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）（１９８０）の方法に従い、菌糸体を、０℃で３Ｍ  ＬｉＣｌ，６Ｍ尿素溶液１０ｍｌ中、ウルトラ  ツラックスを用いてホモジナイズし、４℃に一晩維持する。１６，０００×ｇの遠心で全細胞ＲＮＡが得られるので、これを３ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ溶液に溶かし、フェノール：クロロホルム：イソアミルフルコール（５０：４８：２）で二回抽出する。ポリＡ+を選択するため、全ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱し、０．５Ｍ  ＮａＣｌとした後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかける。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳおよび０．１ｍＭＮａＣｌを含む溶液で数回洗浄後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および０．５％ＳＤＳを含む溶液でポリＡ+ＲＮＡを回収する。
ｂ．グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡの調製およびクローニング
ｃＤＮＡの第一鎖を合成するために、実施例１１ａで単離したポリＡ+ＲＮＡ５μｇを１６．５μｌの水に溶かす。つづいて、以下の成分を添加する：２．５μｌＲＮａｓｉｎ（３０Ｕ／μｌ）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2および４０ｍＭ  ＫＣｌを含むバッファ１０μｌ、１Ｍ  ＫＣｌ  ２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ５μｌ、オリゴ（ｄＴ）12-18（２．５ｍｇ／ｍｌ）０．５μｌ、８ｍＭ  ｄＮＴＰミックス５μｌ、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）５μ１およびモロニーＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）２．５μｌ。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後１０μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡおよび５０μｌのＨ2Ｏを添加して反応を停止する。１１０μｌのクロロホルムで抽出した後、５分間遠心し、その水層を回収して１１０μｌの５Ｍ  ＮＨ4Ａｃおよび４４０μｌのエタノール（温度−２０℃）を添加する。ドライアイス／エタノール溶液中３０分間沈澱化を行う。０℃、１０分間の遠心後、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡペレットを７０％氷冷エタノールで洗浄する。このペレットを乾燥し、２０μｌの水に溶かす。グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡの単離はポリメレースチェーンリアクションリアクションで行う。ボール（Ｂｏｅｌ）等、（１９８４）に報告されているグルコアミラーゼＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づき、二つのオリゴヌクレオチドを合成する。
0003938402.tif 000004
これら二つのオリゴヌクレオチドを用い、ＡＴＧ翻訳開始コドン（下線）につづき、適当なクローニング部位に隣接する成熟型、即ち、分泌シグナルペプチドおよびプロペプチドを含まない酵素をコードする領域を増幅する。得られたＤＮＡをＮｃｏＩおよびＳｓｔＩで消化する。ＣａＭＶ３５Ｓのターミネーター転写フラグメントを含むｐ３５ＳＧＵＳＩＮＴ（バンカネイト（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ）等、１９９０）のＳｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントと共に、ＮｃｏＩ／ＳｓｔＩフラグメントを三者ライゲーションにより予めＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＭＯＧ１８（実施例２参照）にクローン化して、ｐＭＯＧ５６７を調製する。
ｐＭＯＧ５６７のＰｓｔＩ／ＳｓｔＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＳｓｔＩで消化したｐＩＣ２０Ｈ（マーシュ（Ｍａｒｃｈ）等、１９８４）にクローン化する。このプラスミドではＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントが相当するアミログルコシダーゼｃＤＮＡフラグメントと置き変わっており、これをｐＭＯＧ５６８と命名する。ＨｉｎｄIII／ＳｓｔＩフラグメントの配列をボール（Ｂｏｅｌ）等、（１９８４）の配列と比較する。ｐＭＯＧ５６８のＰｓｔＩ／ＳｓｔＩフラグメントをアミログルコシダーゼｃＤＮＡのＰｓｔＩ／ＳｔｙＩフラグメントにライゲーションし、生成したフラグメントを合成アダプター：
0003938402.tif 000005
と共に、三者ライゲーションで予めＮｃｏＩおよびＳｓｔＩで消化したｐＭＯＧ５６７にクローニングし、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターのコントロール下にある成熟型アミログルコシダーゼをコードするプラスミドｐＭＯＧ５６９を調製する。
（実施例１０）バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼおよびアスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼ両方のクローニング
本実施例のトランスホーメーションは、全て大腸菌ＤＨ５α株で行う。
プラスミドｐＭＯＧ５４６由来のＨｉｎｄIII／ＮｃｏＩクラス−Ｉパタチンプロモーターフラグメント（実施例６参照）を、アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の成熟型アミログルコシダーゼおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターフラグメント（実施例１１参照）をコードするプラスミドｐＭＯＧ５６７のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントと共にＨｉｎｄIIIで線状化したｐＩＣ１９Ｒ（マーシュ（Ｍａｒｓｈ）等、１９８４）にクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４４０を調製する。
プラスミドｐＭＯＧ４５０（実施例６）をＨｉｎｄIIIで消化する。クラス−Ｉパタチンプロモーター、バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟型α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列およびアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のｎｏｓターミネーターを含むＨｉｎｄIIIフラグメントをＨｉｎｄIIIで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にクローン化する。これをバイナリーベクターｐＭＯＧ４３６とする。
プラスミドｐＭＯＧ４４０をＥｃｏＲＩで消化する。クラス−Ｉパタチンプロモーター、アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の成熟型グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含むＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩで線状化したバイナリープラスミドｐＭＯＧ４３６にクローン化する。制限酵素分析を用い、タンデムに二つの発現カセットを含むトランスホーマントをスクリーニングする。この配置の発現カセットを含むバイナリーベクターｐＭＯＧ４３７（第６図）を、トランスホーメーション実験に使用する。
バイナリープラスミドｐＭＯＧ４３７同様に、塊茎特異的クラス−Ｉパタチンプロモーターのコントロール下のバチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のキメラα−アミラーゼ遺伝子およびアスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のキメラグルコアミラーゼ遺伝子を、トリペアレンタルメーティングでプラスミドｐＲＫ２０１３を含む大腸菌ＨＢ１０１株（ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、１９８０）と共に、植物にＴ−ＤＮＡを移行させるのに必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株に取り込ませる（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３）。
（実施例１１）ジャガイモのトランスホーメーション
ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、（１９８９）の方法で、ジャガイモ（ソラナム  ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ．デジリー（Ｄｅｓｉｒｅｅ））をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４３７）株でトランスホームする。
基礎培養培地には、３０ｇ／ｌスクロースおよびＲ３−ビタミン（オームス（Ｏｏｍｓ）等、１９８７）、場合によっては５μＭ  ジーチンリボシド（ＺＲ）および０．３μＭ  酢酸インドール（ＩＡＡ）を補ったＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）、１９６２）であるＭＳ３０Ｒ培地を用いる。必要ならば、この培地を０．７ｇ／ｌダイチン寒天で固化する。
ソラナム  ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ．デジリー（Ｄｅｓｉｒｅｅ）の塊茎の皮を剥き、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．６％次亜塩素酸塩溶液中で２０分間表面を滅菌する。このジャガイモを少なくとも２時間かけて大量の滅菌水で完全に洗浄する。コルクボアで作成した円筒の塊茎組織を約２ｍｍの厚さのディスクにスライスする。このディスクを１０6−１０7個／ｍｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４３７）を含む、ＺＲ並びにＩＡＡ無しのＭＳ３０Ｒ３培地中で２０分間インキュベートした。つづいて、このディスクを滅菌した濾紙で乾燥し、ＺＲおよびＩＡＡを含む固体ＭＳ３０Ｒ３培地に移した。２日後、このディスクを１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／ｌバンコマイシンを含む新鮮な培地に移した。１週間後、このディスクを１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む同培地に移し、トランスジェニックな新芽を選択した。４−８週間後、このディスクから、ディスク１００個当たり５−１０個の頻度で新芽が出てきた。この新芽を切りだし、根付け培地（ＺＲおよびＩＡＡを含まず、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ３０Ｒ３培地）上に置いて、分裂組織切断により無菌的に増殖させてから土壌に移した。この植物に塊茎を作らせ、目的の遺伝子発現を検定した。
（実施例１２）ジャガイモにおけるα−アミラーゼ（バチルス  リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））およびグルコアミラーゼ（アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））の塊茎特異的な同時発現およびトランスジェニック塊茎の炭水化物分析
実施例７に述べたようにジャガイモ植物をバイナリーベクターｐＭＯＧ４３７でトランスホームする。この植物をα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性に関して検定する。α−アミラーゼ活性は実施例４に示したように測定する。グルコアミラーゼの存在はアスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで示す。植物物質（約５０ｍｇ）を１００μｌの検定バッファ中でホモジナイズする。このホモジネートをエッペンドルフ遠心機で１０分間遠心する。この上清をα−アミラーゼ活性、グルコアミラーゼの存在および蛋白質含量について検定する。これらの酵素の存在は、トランスジェニックジャガイモの塊茎にのみ検出される。
両酵素を発現するトランスジェニックジャガイモの塊茎をＨＰＬＣにより可溶性糖の存在について分析する。コントロール植物に比べて、トランスジェニック塊茎にはより高含量の可溶性糖が検出される。
（参考文献）
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バード（Ｂｉｒｄ），Ｃ．Ｒ．，スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｃ．Ｊ．Ｓ．，レイ（Ｒａｙ），Ｊ．Ａ．，モーリュー（Ｍｏｕｒｅａｕ），Ｐ．，ビーバン（Ｂｅｖａｎ），Ｍ．Ｗ．，バード（Ｂｉｒｄ），Ａ．Ｓ．，フーゲス（Ｈｕｇｈｅｓ），Ｓ．，モリス（Ｍｏｒｒｉｓ），Ｐ．Ｃ．，グリーソン（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ），Ｄ．およびシュッチ（Ｓｃｈｕｃｈ），Ｗ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，６５１．
ボール（Ｂｏｅｌ），Ｅ．，ホート（Ｈｊｏｒｔ），Ｉ．，スベンソン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ），Ｂ．，ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ），Ｆ．，ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ），Ｋ，Ｅ．およびフィル（Ｆｉｌｌ），Ｎ．Ｐ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，１０９７−１１０２．
ブレデロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ），Ｆ．Ｔ．，コパー−ズワーソフ（Ｋｏｐｅｒ−Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ），Ｅ．Ｃ．およびボル（Ｂｏｌ），Ｊ．Ｆ．（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，２２１３．
キャスパー（Ｃａｓｐａｒ），Ｔ．，フーバー（Ｈｕｂｅｒ）．Ｓ．Ｃ．およびソマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ），Ｃ．（１９８５）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７９，１１．
キャスパー（Ｃａｓｐａｒ），Ｔ．，リン（Ｌｉｎ），Ｔ．−Ｐ．，モンロー（Ｍｏｎｒｏｅ），Ｊ．，バーンハード（Ｂｅｒｎｈａｒｄ），Ｗ．，スピラトロ（Ｓｐｉｌａｔｒｏ），Ｓ．，プレイス（Ｐｒｅｉｓｓ），Ｊ．およびソマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ），Ｃ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５８３０．
コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ），Ｇ．，ブログリー（Ｂｒｏｇｌｉｅ），Ｒ．，エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ），Ｃ．，チュア（Ｃｈｕａ），Ｎ．−Ｈ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，１６７１−１６７９．
ジッタ（Ｄｉｔｔａ），Ｇ．，スタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ），Ｓ．，コービン（Ｃｏｒｂｉｎ），Ｄ．およびヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ），Ｄ．Ｒ．（１９８０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，７３４７．
フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ），Ｒ．Ｔ．，ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ），Ｓ．Ｇ．，ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ），Ｒ．Ｂ．（９８６）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４，１−４６．
ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ），Ｏ．Ｌ．（１９７０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５，３７２．
ゴードン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ），Ｗ．Ｊ．，スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ），Ｔ．Ｍ，マンガノ（Ｍａｎｇａｎｏ），Ｍ．Ｌ．，アダムス（Ａｄａｍｓ），Ｔ．Ｒ．，デインズ（Ｄａｉｎｅｓ），Ｒ．Ｊ．，スタート（Ｓｔａｒｔ），Ｗ．Ｇ．，オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ），Ｊ．Ｖ．，チャンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ），Ｓ．Ａ．，アダムス（Ａｄａｍｓ）Ｊｒ．，Ｗ．Ｒ．，ウィレッツ（Ｗｉｌｌｅｔｓ），Ｍ．Ｇ．，ライス（Ｒｉｃｅ），Ｔ．Ｂ．，マッキー（Ｍａｃｋｅｙ），Ｃ．Ｊ．，クルーガー（Ｋｒｕｅｇｅｒ），Ｒ．Ｗ．，コーシュ（Ｋａｕｓｃｈ），Ａ．Ｐ．およびレモークス（Ｌｅｍａｕｘ），Ｐ．Ｇ．（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，６０３．
ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ），Ｈ．，ダドリー（Ｄｕｄｌｅｙ），Ｒ．Ｋ．，ジョナード（Ｊｏｎａｒｄ），Ｊ．，バラス（Ｂａｌａｚｓ），Ｅ．およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ），Ｋ．Ｅ．（１９８２）  Ｃｅｌｌ  ３０，７６３．
ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ），Ｈ．Ｒ．およびマッコール（ＭｃＨａｌｅ），Ｎ．Ａ．（１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８，８３８．
ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．，ハーシュ（Ｈｉｒｓｃｈ），Ｐ．Ｒ．，ホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ），Ｐ．Ｊ．Ｊ．およびシルパルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ），Ｒ．Ａ．（１９８３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，１７９．
ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．，フイスマン（Ｈｕｉｓｍａｎ），Ｍ．Ｊ．，モレンジク（Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ），Ｌ．，バンデンエルゼン（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ），Ｐ．Ｊ．Ｍ．およびコーネリセン（Ｂｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ），Ｂ．Ｊ．Ｃ．（１９８９）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２７３．
ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ），Ｒ．Ｂ．，フライ（Ｆｒｙ），Ｊ．Ｅ．，ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ），Ｎ．Ｌ．，エイクホルツ（Ｅｅｃｈｈｏｌｔｚ），Ｄ．，ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ），Ｓ．Ｇ．およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ），Ｒ．Ｔ．（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，１２２９．
ホーベンカンプ−ハーメリンク（Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ），Ｊ．Ｈ．Ｍ．，ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ），Ｅ．，ポンスタイン（Ｐｏｎｓｔｅｉｎ），Ａ．Ｓ．，ビサー（Ｖｉｓｓｅｒ），Ｒ．Ｇ．Ｆ．，ボス−シェパーカーター（Ｖｏｓ−Ｓｃｈｅｐｅｒｋｅｕｔｅｒ），Ｇ．Ｈ．，ビモルト（Ｂｉｊｍｏｌｔ），Ｅ．Ｗ．，デブリス（Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ），Ｊ．Ｎ．，ウィソルト（Ｗｅｔｈｏｌｔ），Ｂ．およびフェンストラ（Ｆｅｅｎｓｔｒａ），Ｗ．Ｊ．（１９８７）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５，２１７．
ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，３８７．
カイ（Ｋａｙ），Ｒ．，チャン（Ｃｈａｎ），Ａ．，デイリー（Ｄａｙｌｙ），Ｍ．およびマックファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ），Ｊ．（１９８７）  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，１２９９．
ラックス（Ｌａｃｋｓ），Ｓ．Ａ．およびスプリングホーン（Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ），Ｓ．Ｓ．（１９８０）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５．７４６７．
リー（Ｌｅｅ），Ｂ．，マードック（Ｍｕｒｄｏｃｈ），Ｋ．，トッピング（Ｔｏｐｐｉｎｇ），Ｊ．，クレイス（Ｋｒｅｉｓ），Ｍ．およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｍ．Ｇ．Ｋ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２１．
リン（Ｌｉｎ），Ｔ−Ｐ．，スピラトロ（Ｓｐｉｌａｔｏｒｏ），Ｓ．Ｒ．およびプレイス（Ｐｒｅｉｓｓ），Ｊ．（１９８８ａ）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６，２５１．
リン（Ｌｉｎ），Ｔ−Ｐ．，キャスパー（Ｃａｓｐａｒ），Ｔ．，ソマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ），Ｃ．およびプレイス（Ｐｒｅｉｓｓ），Ｊ．（１９８８ｂ）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６，１１３１．
リン（Ｌｉｎ），Ｔ−Ｐ．，キャスパー（Ｃａｓｐａｒ），Ｔ．，ソマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ），Ｃ．およびプレイス（Ｐｒｅｉｓｓ），Ｊ．（１９８８ｃ）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８，１１７５．
マーシュ（Ｍａｒｓｈ），Ｊ．Ｌ．，アーフル（Ｅｒｆｌｅ），Ｍ．およびワイケス（Ｗｙｋｅｓ），Ｅ．Ｊ．（１９８４）  Ｇｅｎｅ  ３２，４８１．
メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ），Ｉ．Ｊ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｌ．Ｒｅｐ．５，３４６．
ミグネリー（Ｍｉｇｎｅｒｙ），Ｇ．Ａ．，ピカード（Ｐｉｋａａｒｄ），Ｃ．Ｓ．およびパーク（Ｐａｒｋ），Ｗ．Ｄ．（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６２，２７．
ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ），Ｔ．およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ），Ｆ．（１９６２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４，４７３．
オキタ（Ｏｋｉｔａ），Ｔ．Ｗ．，グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｅ．，カン（Ｋｕｈｎ），Ｄ．Ｎ．およびプレイス（Ｐｒｅｉｓｓ），Ｊ．（１９７９）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６４，１８７．
オームス（Ｏｏｍｓ），Ｇ．，ブレル（Ｂｕｒｒｅｌｌ），Ｍ．Ｍ．，カープ（Ｋａｒｐ），Ａ．，ビーバン（Ｂｅｖａｎ），Ｍ．およびヒル（Ｈｉｌｌｅ），Ｊ．（１９８７）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７３，７４４．
ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ），Ｉ．（１９９０）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．８，５３５．
ロカ−ソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ），Ｍ．，ソネワルド（Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ），Ｕ．，フロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ），Ｗ．Ｂ．，ストラトマン（Ｓｔｒａｔｍａｎ），Ｍ．，シェル（Ｓｃｈｅｌｌ），Ｊ．およびウィルミツァー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ），Ｌ．（１９８９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．８，２３．
ライアン（Ｒｙａｎ），Ａ．Ｊ．，ローヤル（Ｒｏｙａｌ），Ｃ．Ｌ．，ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ），Ｊ．およびショー（Ｓｈａｗ），Ｃ．Ｈ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，３５８４．
サイトウ（Ｓａｉｔｏ），Ｎ．（１９７３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５５，２９０．
シュレイヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ），Ｐ．Ｈ．，セフター（Ｓｅｆｔｏｒ），Ｅ．Ａ．，シェル（Ｓｃｈｅｌｌ），Ｊ．およびボナート（Ｂｏｈｎｅｒｔ），Ｈ．Ｊ．（１９８５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．４，２５−３２．
シルパルート（Ｓｃｈｌｐｅｒｏｏｒｔ），Ｒ．Ａ．，ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．およびホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ），Ｐ．Ｊ．Ｊ．（１９８４）ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．ＥＰ−Ａ  ０  １２０  ５１６．
シマモト（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ），Ｋ．，テラダ（Ｔｅｒａｄａ），Ｒ．，イザワ（Ｉｚａｗａ），Ｔ．およびフジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ），Ｈ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，２７４．
シモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ），Ｐ．Ｃ．，デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ），Ｂ．Ｍ．Ｍ．，シュラメイアー（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ），Ｂ．，バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ），Ｔ．Ｃ．，バンデンルゼン（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ），Ｐ．Ｊ．Ｍ．およびホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２１７．
シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ），Ｊ．Ｃ．およびガーウッド（Ｇａｒｗｏｏｄ），Ｄ．Ｌ．（１９８４）”澱粉  化学と技術”ｐ．２５（ウィスラー（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ），Ｒ．Ｌ．等、編），アカデミックプレス、オーランド．
スミーケンズ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ），Ｓ．，ワイスベーク（Ｗｅｉｓｂｅｅｋ），Ｐ．，ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ），Ｃ．（１９９０）  Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．１５，ｐ．７３．
タグ（Ｔａｇｕｅ），Ｂ．Ｗ．およびクリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｍ．Ｊ．（１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６，５０６．
チンギー（Ｔｉｎｇｅｙ），Ｓ．Ｖ．，ウォルカー（Ｗａｌｋｅｒ），Ｅ．Ｌ．およびコルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ），Ｇ．Ｍ．（１９８７）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，３５６５−３６６９．
バンカネイト（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ），Ｇ．，シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ），Ｒ．，オコーナー−サンチェス（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−Ｓａｎｃｈｅｚ），Ａ．，ウィルミツァー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ），Ｌ．およびロカ−ソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ），Ｍ．（１９９０）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２０，２４５．
バンデンブルーク（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ），Ｇ．，チムコ（Ｔｉｍｋｏ），Ｍ．Ｐ．，コーシュ（Ｋａｕｓｃｈ），Ａ．Ｐ．，キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ），Ａ．Ｒ．，バンモンターギュ（Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ），Ｍ．，ヘレラ−エストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ），Ｌ．（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，３５８−３６３．
バシル（Ｖａｓｉｌ），Ｖ．，レッドウェイ（Ｒｅｄｗａｙ），Ｆ．およびバシル（Ｖａｓｉｌ），Ｉ．Ｋ．（１９９０）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．８，４２９．
バシル（Ｖａｓｉｌ），Ｖ．，ブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｓ．Ｍ．リ（Ｒｅ），Ｄ．，フロム（Ｆｒｏｍｍ），Ｍ．Ｅ．およびバシル（Ｖａｓｉｌ），Ｉ．Ｋ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．９，７４３．
ウェンズラー（Ｗｅｎｚｌｅｒ），Ｈ．−Ｃ．，ミグリー（Ｍｅｇｕｅｒｙ），Ｇ．Ａ．，フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ），Ｌ．Ｈ．およびパーク（Ｐａｒｋ），Ｗ．Ｄ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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