(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ファルネシル二リン酸合成酵素とゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素との融合蛋白質遺伝子またはその変異型遺伝子を含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNAと、(ｂ)ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNAとを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からゲラニルゲラニオールを採取することを特徴とする、ゲラニルゲラニオールの製造方法。
【請求項２】
ファルネシル二リン酸合成酵素とゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素との融合蛋白質遺伝子またはその変異型遺伝子に、さらにHis Asp Glu Leuで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が付加されていることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ファルネシル二リン酸合成酵素が配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素が配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子が膜貫通ドメインを含むヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素をコードするものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子が配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードするものである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
宿主が酵母又は大腸菌である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
サッカロマイセス・セレビシエが、サッカロマイセス・セレビシエA451株、YPH499株、YPH500株、W303-1A株若しくはW303-1B株又はこれらに由来する株である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
以下の(i)-(vi)のいずれかの成分を含む培地を用いて宿主を培養することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
(i) 糖
(ii) アルコール
(iii) アンモニアガス、アンモニア水及び又はアンモニウム塩
(iv) 水酸化ナトリウムと硫酸との混合物
(v) KH2PO4、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカー、塩化カルシウム及び界面活性剤の混合物
(vi) 上記(i)-(v)のうち２種以上の混合物
【請求項１１】
以下の(i)、(ii)若しくは(iii)の成分又はこれらの２種以上の混合物を含む溶液をフィード液として培養することを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
(i) 糖
(ii) アルコール
(iii) アンモニアガス、アンモニア水及び又はアンモニウム塩
【請求項１２】
培養開始後12-24時間までのフィード液中の炭素源成分をグルコースのみとし、その後フィード液の炭素源成分を、エタノールを含む成分に切り替えて培養することを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
培養開始後12-24時間経過後におけるフィード液の炭素源成分中の全炭素源成分に対するエタノールの割合が50%以上である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１４】
培養開始後12-24時間経過後におけるフィード液の炭素源成分がエタノールのみである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１５】
培養物中に蓄積するゲラニルゲラニオールの濃度が少なくとも0.1g/l以上である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１６】
培養物中に蓄積するゲラニルゲラニオールの濃度が少なくとも1g/l以上である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１７】
宿主が原栄養体株である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１８】
宿主が二倍体細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１９】
宿主が原栄養体株かつ二倍体細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項２０】
培地をpH制御することを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項２１】
pH制御が、アンモニウムガス、アンモニウム塩溶液、水酸化ナトリウム溶液又は硫酸を用いて行うものである、請求項２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、プレニルアルコールの製造方法に関する。
背景技術
生体内でのテルペノイド（イソプレノイド）合成は、アリル性二リン酸基質にイソペンテニル二リン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰＰ，Ｃ５）を順次縮合することによって直鎖プレニル二リン酸であるゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＰＰ，Ｃ１０））、ファルネシル二リン酸（ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＰＰ，Ｃ１５））、ゲラニルゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＧＰＰ，Ｃ２０））が生合成されるところから始まる（図１）。図１において、枠で囲まれた文字が酵素を表す。ｈｍｇＲはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ：ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素、ＧＧＰＳはＧＧＰＰ合成酵素、ＦＰＳはＦＰＰ合成酵素を示す。
プレニル二リン酸のなかでも、ＦＰＰは最も重要な生合成中間体であり、膨大な種類のテルペノイド類、例えば、エルゴステロール（プロビタミンＤ２）を含むステロイド類、キノン（ビタミンＫ，ＶＫ）の側鎖、セスキテルペン類、スクアレン（ＳＱ）、ファルネシル化タンパク質のアンカー分子、天然ゴムなどの合成前駆体である。
ＧＧＰＰもまた、生体内では重要な生合成中間体であり、レチノール（ビタミンＡ，ＶＡ）、β−カロテン（プロビタミンＡ）、フィロキノン（ビタミンＫ１，ＶＫ１）、トコフェロール類（ビタミンＥ，ＶＥ）、ゲラニルゲラニル化タンパク質のアンカー分子、葉緑素の側鎖、ジベレリン、アーキアのエーテル型脂質などを始めとする化合物の生合成に必須である。
ＦＰＰ、ＧＧＰＰのアルコール誘導体であるファルネソール（ｆａｒｎｅｓｏｌ）（ＦＯＨ，Ｃ１５）、ゲラニルゲラニオール（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｉｏｌ）（ＧＧＯＨ，Ｃ２０）や、その異性体であるネロリドール（ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ）（ＮＯＨ，Ｃ１５）等は、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である（図１）。
従って、ｃｉｓ−，ｔｒａｎｓ（（Ｚ）−，（Ｅ）−）異性体混合物でないいわゆる活性型プレニルアルコールの純品を大量に生産できる系の確立が望まれている。
ＩＰＰの生体内での合成は、すべてメバロン酸経路（アセチル補酵素Ａ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）からメバロン酸を経てＩＰＰを合成する経路）によると考えられてきたが、１９８０年代末より、Ｍ．Ｒｏｈｍｅｒらがバクテリアを用いて新しいＩＰＰ合成経路を明らかにした。これは、非メバロン酸経路又はＤＸＰ（１−ｄｅｏｘｙｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）経路と呼ばれており、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸から１−ｄｅｏｘｙｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅを経てＩＰＰを合成する経路である。
ＧＧＯＨは、現在化学合成法により合成されている（例えば特開平８−１３３９９９号公報参照）。しかし、より炭素鎖の短いＦＯＨやＮＯＨと比べＧＧＯＨの化学合成はステップ数が多く、コストがかかる。また、化学合成法で合成されるＧＧＯＨは、一般的には炭素骨格が同じであるが、二重結合が（Ｅ）−型（ｔｒａｎｓ型）と（Ｚ）−型（ｃｉｓ型）の混合物として得られる。（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−ＧＧＯＨ（以下（ａｌｌ−Ｅ）−ＧＧＯＨと略す）は生物の代謝経路で合成される形であり、工業的利用価値を有する。（ａｌｌ−Ｅ）−ＧＧＯＨを純粋な形で得るためには、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などを利用した精製が必要である。しかし、熱的に不安定なアリルアルコール（ａｌｌｙｌａｌｃｏｈｏｌ）であるＧＧＯＨの精密蒸留は困難である。また、カラムクロマトグラフィーによる精製は、多量の溶媒充填剤を必要とし、順次溶出してくる各画分を分析しながら回収し、さらに溶媒を除去しなければならないなど、操作が煩雑でコストも高く、工業実施には適さない。そこで、（Ｅ）−、（Ｚ）−幾何異性体の生成制御や反応産物の繰り返し構造などの特徴から、（ａｌｌ−Ｅ）−ＧＧＯＨの生合成法が望まれているが確立されていない。ＧＧＯＨ合成基質は、例えば出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞内ではメバロン酸経路を経て供給されるが、そのキー酵素と考えられるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を利用しても、ＦＰＰ合成を経由するスクアレン合成能が上がることしか知られていない（特開平５−１９２１８４号公報；Ｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３，３３４１−３３４４）。また、ステロール取り込み能を獲得した特別な出芽酵母のスクアレン合成酵素遺伝子欠損株を培養しても、培養液１リットルあたり１．３ｍｇのＦＯＨの蓄積が知られているだけであり（Ｃｈａｍｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８，４１−４６）、ＮＯＨの生合成法は知られていない。ＧＧＯＨの生合成に関しては、特開平９−２３８６９２号公報において、植物細胞培養により１リットル培養液あたり０．６６〜３．２５ｍｇの生産が報告されているが、工業化には適さない高価な植物細胞培養用培地が必要であり、培養にも光が必要であり、従来の精油等の天然物からのＧＧＯＨ調製に比べても実用的でなく、より工業化に適した生合成法、例えば微生物培養による生合成法は全く知られていない。
発明の開示
本発明は、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む発現用組換えＤＮＡにより形質転換された組換え体を培養することによるプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、発酵工業に古来から広く用いられ、メバロン酸経路あるいはＤＸＰ経路を経てプレニル二リン酸合成を行い、遺伝子組換えに関する様々な手法が駆使できる宿主、例えば単細胞真核生物（特に酵母）または原核生物（例えばバクテリア、特に大腸菌）を実験材料にして、プレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子導入によるプレニルアルコール生産系の開発を行った。酵母でプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を代表とするメバロン酸経路関連酵素の遺伝子やＩＰＰΔイソメラーゼ遺伝子、各種プレニル二リン酸合成酵素遺伝子、またはそれらの変異型または融合型遺伝子）を宿主細胞内で人為的に発現させる系を構築するために、恒常発現型又は誘導発現型転写プロモーターを含み、各種栄養要求性マーカーを持った発現シャトルベクターの作製を行い、これに目的の遺伝子又はその変異型遺伝子を組み込み、これを宿主細胞へ導入した。そして、その培養物からプレニルアルコール（特にゲラニルゲラニオール）を得、上記目的を達成することに成功し、本発明を完成するに至った。バクテリア、特に大腸菌では、既存のベクターを用いプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（例えばＦＰＰ合成酵素変異型遺伝子やＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子）を宿主細胞に導入しその培養物を脱リン酸化した後ゲラニルゲラニオールを得、上記目的を達成することに成功し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコール（例えばゲラニルゲラニオール）の製造方法。
（２）プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡと、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡとを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
（３）プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡと、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡとを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からゲラニルゲラニオールを採取することを特徴とするゲラニルゲラニオールの製造方法。
（４）プレニル二リン酸合成酵素遺伝子としては、以下の（ａ）及び（ｂ）の遺伝子並びに（ｃ）及び（ｄ）の融合遺伝子からなる群から選択されるいずれかのものが挙げられる。
（ａ）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子
（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子
（ｃ）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子と、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子との融合遺伝子
（ｄ）上記（ａ）若しくは（ｂ）の遺伝子又は（ｃ）の融合遺伝子に、さらにＨｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が付加された融合遺伝子
また、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子としては、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列をコードするものが挙げられ、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。
（５）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からゲラニルゲラニオールを採取することを特徴とするゲラニルゲラニオールの製造方法。
（６）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡと、以下の（ｅ）〜（ｊ）からなる群から選択されるいずれかの遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡとを、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からゲラニルゲラニオールを採取することを特徴とするゲラニルゲラニオールの製造方法。
（ｅ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子
（ｆ）メバロン酸キナーゼ遺伝子
（ｇ）アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
（ｈ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子
（ｉ）メバロンリン酸キナーゼ遺伝子
（ｊ）メバロン二リン酸脱炭酸酵素遺伝子
（７）上記方法によれば、ゲラニルゲラニオールは、少なくとも０．０５ｍｇ／ｌの濃度で生産することができる。ここで、宿主としては酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）又は大腸菌が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエは、例えばサッカロマイセス・セレビシエＡ４５１株、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、Ｗ３０３−１Ａ株若しくはＷ３０３−１Ｂ株又はこれらに由来する株などを好ましく使用することができる。
（８）前記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子並びに（ｃ）及び（ｄ）の融合遺伝子からなる群から選択されるいずれかのもの、並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む発現用組換えＤＮＡ。
（９）転写プロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３（ＧＡＰ）プロモーター、ＴＥＦ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選ばれるいずれかのものが挙げられ、転写ターミネーターとしては、ＣＹＣ１ターミネーターが挙げられる。
（１０）前記組換えＤＮＡを宿主に導入してなる組換え体。
宿主は、前記と同様である。
（１１）以下の（ｉ）−（ｖｉ）のいずれかの成分を含む培地を用いてプレニルアルコールの生産力を有する微生物を培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
（ｉ）糖
（ｉｉ）アルコール
（ｉｉｉ）アンモニアガス、アンモニア水及び又はアンモニウム塩
（ｉｖ）水酸化ナトリウムと硫酸との混合物
（ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカー、塩化カルシウム及び界面活性剤の混合物
（ｖｉ）上記（ｉ）−（ｖ）のうち２種以上の混合物
上記（１１）の製造方法において、以下の（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の成分又はこれらの２種以上の混合物を含む溶液をフィード液として培養することができる。
（ｉ）糖
（ｉｉ）アルコール
（ｉｉｉ）アンモニアガス、アンモニア水及び又はアンモニウム塩
上記フィード液成分と添加について、例えば以下の方法を取ることができる。
培養開始後１２−２４時間までのフィード液中の炭素源成分をグルコースのみにしておき、培養開始後１２−２４時間経過後フィード液の炭素源成分をエタノールを含む成分に切り替えて培養する。このとき、培養開始後１２−２４時間以降のフィード液の炭素源成分中の全炭素源成分に対するエタノールの割合を５０％以上、又は、培養開始後１２−２４時間以降のフィード液の炭素源成分中の炭素源成分をエタノールのみにすることができる。
ここで、「フィード」とは、培養時間中、所定の溶液または成分を培養液中に任意の方法で流入あるいは添加させることを意味し、一つの培養槽に対しある成分を流入あるいは添加させる培養方法を「フェドバッチ培養」と言う。
また、培養物中に蓄積するプレニルアルコールの濃度は少なくとも０．１ｇ／ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。プレニルアルコールとしては、ゲラニルゲラニオールが挙げられ、微生物としてはサッカロマイセス・セレビシエなどの酵母が挙げられる。本発明において、サッカロマイセス・セレビシエは、サッカロマイセス・セレビシエＡ４５１株、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、Ｗ３０３−１Ａ株若しくはＷ３０３−１Ｂ株又はこれらに由来する株を使用することができる。
さらに、上記（１１）の製造方法において、微生物は組換え体であることが好ましい。このような組換え体としては、以下のａ）又はｂ）のものを例示することができる。
ａ）メバロン酸経路関連遺伝子若しくはその変異型遺伝子、又はプレニルニリン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡを、宿主に導入して作製されたもの
ｂ）プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡと、メバロン酸経路関連遺伝子若しくはその変異型遺伝子を含む、発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡとを、宿主に導入して作製されたもの
宿主は、サッカロマイセス・セレビシエ、例えばサッカロマイセス・セレビシエＡ４５１株、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、Ｗ３０３−１Ａ株若しくはＷ３０３−１Ｂ株又はこれらに由来する株を例示することができる。
メバロン酸経路関連遺伝子としてはヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（例えばＨＭＧ１遺伝子）が挙げられる。
プレニル二リン酸合成酵素遺伝子としては、以下の（ａ）及び（ｂ）の遺伝子並びに（ｃ）及び（ｄ）の融合遺伝子からなる群から選択されるいずれかのものが挙げられる。
（ａ）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子
（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子
（ｃ）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子と、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子との融合遺伝子
（ｄ）上記（ａ）若しくは（ｂ）の遺伝子又は（ｃ）の融合遺伝子に、さらにＨｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が付加された融合遺伝子
さらに、本発明において使用できる微生物は、原栄養体株、二倍体細胞、又は原栄養体株かつ二倍体細胞である。
さらに、本発明においては、培地をｐＨ制御することを特徴とする。ｐＨ制御は、例えばアンモニウムガス、アンモニウム塩溶液、水酸化ナトリウム溶液又は硫酸を用いて行われる。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０００−４０３０６７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明者は、代謝工学的な手法を用い、生体内で活性型プレニルアルコール、特に（ａｌｌ−Ｅ）−ゲラニルゲラニオール（以下「ＧＧＯＨ」という）を生産させる系の開発に臨んだ。
ＧＧＯＨは、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を前駆体としていると考えられており、一般には、単純にＧＧＰＰ合成酵素活性を増大させてもイソペンテニル二リン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（（３，３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＤＭＡＰＰ）からＧＧＰＰへの合成が速まるだけでＧＧＯＨが生産されることは予測できない（図１）。また、生体内でＧＧＰＰはカロテノイドやプレニル化タンパク質などの各種最終産物合成の前駆体としてしか知られておらず（図１）、仮にＧＧＰＰ合成速度を増大させてもそれら最終産物濃度が上昇すると予想され、工業的に価値のあるＧＧＰＰ合成系を確立できるかどうかはわからない。また、キー酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を増大させたりその他の上記（ｅ）〜（ｊ）に記載した酵素の酵素活性を増大させることによってメバロン酸経路のキー酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の発現量を増大させても、ＦＰＰ合成の方向に効果が出るのかＧＧＰＰ合成の方向に効果が出るのか予想できず、ＧＧＰＰ合成には効果が期待できなかった。さらに、現在までの情報からは、ＦＯＨ前駆体のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成を触媒するＦＰＰ合成酵素遺伝子の発現が、ＧＧＯＨの生産に効果があるという予想も成り立たない（図１）。
本発明においては、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び／又はＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入できるよう組換えＤＮＡを構築し、さらに組換え体を作製し、プレニルアルコール、特にＧＧＯＨの大量生産系を開発したものである。
１．発現用組換えＤＮＡ又はゲノムインテグレート用ＤＮＡ断片の作製
本発明において、宿主を形質転換するための発現用組換えＤＮＡは、その１つとしてプレニル二リン酸合成酵素遺伝子に、転写プロモーター及び転写ターミネーターＤＮＡを連結又は挿入することにより得ることができる。また、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子に、予め転写プロモーター及び転写ターミネーターが連結された遺伝子発現カセットを作製しておいて、これをベクターに組み込むこともできる。連結及び挿入の順序は任意であるが、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子の上流に転写プロモーターを連結し、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子の下流に転写ターミネーターを連結することが好ましい。本発明においては、適当なＤＮＡ、例えばベクターＤＮＡに順次プレニル二リン酸合成酵素遺伝子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを組み込んでもよく、転写方向が考慮されていれば順不同で組み込んでもよい。
プレニル二リン酸合成酵素遺伝子としては、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子（ＦＰＰ合成酵素遺伝子という）又はゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子（ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子という）が挙げられる。ＦＰＰ合成酵素遺伝子としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＧ２０（配列番号１）、エッシェリシア・コーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｉｓｐＡ（配列番号３）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子（特開平５−２１９９６１号公報、米国特許５，７８６，１９２号）が挙げられる。また、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエＢＴＳ１（配列番号５）、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ｃｒｔＥ（特開平７−３０８９１３号公報、米国特許５，７７３，２７３号）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｔｔｈ  ＧＧＰＳ遺伝子（特開平９−１０７９７４号公報、米国特許６，１０７，０７２号）が挙げられる。これらの遺伝子は、公知の遺伝子単離方法により、又は市販のキットを用いて得ることができる。また、本発明においては、ＦＰＰ合成酵素遺伝子の変異体（変異型遺伝子）、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の変異体を使用することも可能である。
また、本発明においては、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子又はその変異型とＦＰＰ合成酵素遺伝子又はその変異型との融合遺伝子を含むベクターを構築しておいて、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子及びＦＰＰ合成酵素遺伝子の発現により生産されるポリペプチドが融合タンパク質になるように、両遺伝子を結合させることもできる。本発明において、このような２種類以上の遺伝子を結合させ、発現産物が融合タンパク質になるように構築した遺伝子を「融合遺伝子」という。融合遺伝子を作製するには、一方のＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、これに、同じ制限酵素で切断しておいた他方のＤＮＡを、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の読み枠がずれないように連結する方法などが採用される。
さらに、本発明においては、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子又は前記融合遺伝子の発現により生産されるタンパク質のＣ末端に小胞体移行シグナル（Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列（配列番号２４）：以下「ＨＤＥＬ配列」という）が付加するように、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を上記プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又は融合遺伝子に付加させて改変した遺伝子を作製することもできる。
さらに、本発明においては、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏ−Ａ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ：ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素遺伝子（配列番号７）又はその変異型遺伝子を、単独で、あるいは上記プレニル二リン酸合成酵素遺伝子（融合遺伝子を含む）との融合遺伝子として宿主に導入し発現させて、プレニルアルコール（特にＧＧＯＨ）を生産することもできる。さらに、上記プレニル二リン酸合成酵素遺伝子又は融合遺伝子と、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子とを宿主に導入し、共発現させることもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビシエＨＭＧ１、ＨＭＧ２が挙げられる。
上記プレニル二リン酸合成酵素遺伝子の変異型やＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の変異型等は、その一部の領域（例えばＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子では最大で２２１７塩基）が欠損した欠失型や、野生型遺伝子又はこれら欠失型遺伝子の塩基配列のうち１個又は数個〜十数個の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子でもよい。従って、変異型遺伝子によりコードされるアミノ酸配列においても、天然型プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（ＦＰＰ合成酵素：配列番号２又は４；ＧＧＰＰ合成酵素：配列番号６）、又は天然型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列（配列番号８）のうち１個又は数個（例えば１個〜１０個、好ましくは１個〜３個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じてもよく、天然型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列（配列番号８）のうち最大で７３９個のアミノ酸が欠失した欠失型や、これら欠失型酵素から１個又は数個（例えば１個〜１０個、好ましくは１個〜３個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じてもよい。具体的には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の野性型若しくは図２Ｂに例示するような欠失型遺伝子、又はそれらにコードされる酵素のアミノ酸配列において、たとえば図２Ａに示される箇所の塩基又はアミノ酸の置換が、１〜１０箇所の範囲で部位特異的に生じていてもよい。さらに、天然型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子（例えば配列番号１、３、５）又は天然型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（配列番号７）をＰＣＲで増幅させる場合において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の忠実性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の低いＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で野性型ＤＮＡを増幅させたＤＮＡ断片に生じる塩基の置換変異を「ＰＣＲエラー」といい、例えば、野生型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（配列番号７）を鋳型に用いたときのＰＣＲエラーによる塩基の置換変異に起因するコードされるポリペプチドの置換変異を有するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（「ＨＭＧ１’」とする）も、本発明において使用することができる。野性型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（配列番号７）を鋳型にしたときの、ＰＣＲエラーによる塩基の置換の態様を図２Ａに示す。ＨＭＧ１’は配列番号９に示す塩基配列を有しており、これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。図２Ａにおいて、ヌクレオチドの変異は、置換前の塩基（１文字表記）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の開始コドンの第１塩基を１としたときの塩基番号、置換後の塩基（１文字表記）の順で表示してある。アミノ酸の変異は、ＰＣＲエラー型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列において、置換前のアミノ酸残基（１文字表記）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸番号、置換後のアミノ酸残基（１文字表記）の順で表示してある。さらに、上記ＰＣＲエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発法等により一部修正することもでき、このような修正型のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子も、本発明において使用することができる。ＰＣＲエラーによる塩基の置換の態様を図２Ａに示す。さらに、上記ＰＣＲエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発法等により一部修正することもでき、このような修正型のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（配列番号１２）をコードする遺伝子（配列番号１１）も、本発明において使用することができる。
また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の膜貫通ドメインと予想されている領域を欠損させた欠失体をコードするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＰＣＲエラー型を含む）として、例えば、ＰＣＲエラー型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１’の欠失型遺伝子ＨＭＧ１Δの例を示す（図２Ｂ）。最上段は欠失のない遺伝子ＨＭＧ１’である。細線（−）で表した部分は欠失した領域である。それぞれの欠失型遺伝子において、ＨＭＧ１’遺伝子（配列番号９）のうちどの領域を欠失させたのかを表１に示す。ＨＭＧ１’欠失型遺伝子は、欠失のパターンに従ってＨＭＧ１Δｘｘｙで表す。ｘｘは欠失のパターンを、ｙは作業番号（任意の数字）を表す。図２Ｂには、ＨＭＧ１Δ０２ｙの例として「Δ０２６」を表示した（他の欠失パターンのものも同様に表示した）。
0003894119.tif 000002
さらに、本発明においては、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＩＰＰΔ−イソメラーゼ）遺伝子を上記プレニル二リン酸合成酵素遺伝子またはその変異型遺伝子とともに導入することによって、プレニルアルコール、特にＧＧＯＨを生産することもできる。ＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子としては、大腸菌由来のｉｄｉ（配列番号３２）が、プレニル二リン酸合成酵素変異型遺伝子としては大腸菌由来のｉｓｐＡｍ各変異型遺伝子（Ｙ７９Ｍ：配列番号３７，Ｙ７９Ｅ：配列番号３５，Ｙ７９Ｄ：配列番号３３）やバシラス・ステアロサーモフィラス由来のｆｐｓｍ（Ｙ８１Ｍ；配列番号３９）がそれぞれ挙げられる。このｉｓｐＡ由来の変異型遺伝子は、野生型ＦＰＰ合成酵素（配列番号４）の第７９番目のアミノ酸残基ＴｙｒがＡｓｐ（配列番号３４）、Ｇｌｕ（配列番号３６）又はＭｅｔ（配列番号３８）に置換変異した変異型酵素をコードしている。
使用されるＤＮＡは、宿主細胞に遺伝的に保持される可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）等が挙げられる。また、ゲノムインテグレーションによる導入のための発現用組換えＤＮＡ断片としては、複製機能は必要ではなく、ＰＣＲ法又は化学合成により作製されたものを使用することが可能である。
プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２又はｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ２又はＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１又はｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６またはｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１５Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９等が挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などが挙げられる。ＹＡＣ用ベクターとしてはｐＹＡＣＣ２などが挙げられる。
宿主への組換えＤＮＡの導入には、選択マーカー遺伝子を用いる場合が多いが、アッセイ法がある場合は、必ずしもマーカー遺伝子は必要ではない。
転写プロモーターは、恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターを用いることができる。恒常発現型プロモーターとは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーターを意味し、どの生育条件でも転写活性を有するプロモーターである。誘導発現型プロモーターとは、特定の生育条件で転写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。
転写プロモーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＤＨ３（ＧＡＰ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＥＦ２プロモーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔａｃなどのプロモーターを用いることができる。
さらに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３などの栄養非要求性の表現型を指標とするマーカー遺伝子や、Ａｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、ＡＵＲ１−Ｃ等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
転写ターミネーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来するターミネーターを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、ＡＤＨ１ターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、ｒｒｎＢターミネーターが挙げられる。バクテリア細胞内での遺伝子発現のため、効率的翻訳のためのリボソーム結合部位として、開始コドン上流にＳＤ配列（５’−ＡＧＧＡＧＧ−３’で代表される）を組み込むこともできる。
本発明において遺伝子導入用組換えＤＮＡとして作製された発現ベクターは、プラスミド名の次に遺伝子名を表示することで命名及び識別することができる。プラスミドとしてｐＲＳ４３５ＧＡＰを使用したときの発現ベクター名とその構成との関係を表２に示す。ｐＲＳ４３４、ｐＲＳ４４４、ｐＲＳ４４５プラスミドの場合も、上記プロモーターとの組み合わせにより、ｐＲＳ４３５ＧＡＰと同じ要領で記載することができる。
0003894119.tif 000003
また、プラスミドｐＲＳ４３４ＧＡＰにＨＭＧ１遺伝子を連結した場合は「ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１」のように表示する。プラスミドとしてｐＲＳ４３４ＧＡＰを使用したときの発現ベクター名とその構成との関係を表３に示す。プラスミドがｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ等の場合も、ｐＲＳ４３４ＧＡＰと同じ要領で記載することができる。
0003894119.tif 000004
２．組換え体の作製
本発明の組換え体は、本発明の組換えＤＮＡを、各種プレニル二リン酸合成酵素遺伝子またはそれらの融合遺伝子、および／または、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（変異型を含む。特に記さないかぎり以下同じ）またはＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子が発現し得るように宿主内に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としてはプレニルアルコールを生産することができるものであれば特に限定されるものではないが、酵母またはバクテリアが好ましい。
本発明において、転写プロモーター及び転写ターミネーター並びにプレニル二リン酸合成酵素遺伝子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子または（ｅ）〜（ｊ）に記した遺伝子を含む組換えＤＮＡは、酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、原核生物、動物細胞、植物細胞などに導入して組換え体を得ることができる。
真菌としては、変形菌類（Ｍｙｘｏｍｙｃｏｔａ）、藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）が挙げられる。真菌としては、単細胞性のものが工業上利用上重要な酵母として良く知られており、子嚢菌類の子嚢菌酵母、担子菌類の担子菌酵母または不完全菌類の不完全菌酵母が挙げられる。酵母としては、子嚢菌酵母、特に、出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：パン酵母として知られる）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等、分裂酵母であるシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。酵母の株は、プレニルアルコールを生産することができる限り特に限定されるものではない。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、例えば下記のＡ４５１株、ＥＵＧ５株、ＥＵＧ８株、ＥＵＧ１２株、ＥＵＧ２７株、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、Ｗ３０３−１Ａ株、Ｗ３０３−１Ｂ株ＡＴＣＣ２８３８２、ＡＵＲＧＧ１０１株、ＡＵＲＧＧ１０２株、ＡＨ１株、ＹＨ１株などが挙げられる。酵母への組換えＤＮＡの導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を採用することができる。
Ａ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９，ＭＡＴα  ｃａｎ１  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３  ａｒｏ７）
ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ７６６２５，ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１−Δ６３  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
ＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ７６６２６，ＭＡＴα  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１−Δ６３  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
Ｗ３０３−１Ａ（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３  ｌｅｕ２−１１２  ｈｉｓ３−１１  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００）
Ｗ３０３−１Ｂ（ＭＡＴα  ｌｅｕ２−３  ｌｅｕ２−１１２  ｈｉｓ３−１１  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００）
ＡＵＲＧＧ１０１（Ａ４５１，ａｕｒ１：：ＡＵＲ１−Ｃ）：本発明によって樹立されたＡ４５１由来株でＡＵＲ１−Ｃ遺伝子をインテグレートしたもの。
ＡＵＲＧＧ１０２（Ａ４５１，ａｕｒ１：：ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１＆ＡＵＲ１−Ｃ）：本発明によって樹立されたＡ４５１由来株でＡＵＲ１遺伝子座にＡＵＲ１−Ｃ遺伝子と共に、ＧＡＬ１プロモーター、ＢＴＳ１およびＣＹＣ１ターミネーターを含む。
ＥＵＧ５、ＥＵＧ８（Ａ４５１，ＥＲＧ９ｐ：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１ｐ）：本発明において樹立されたＡ４５１由来株であり、スクアレン合成酵素遺伝子ＥＲＧ９、形質転換体選択マーカー遺伝子ＵＲＡ３及び転写プロモーターＧＡＬ１ｐを含む。
ＥＵＧ１２（ＹＰＨ４９９，ＥＲＧ９ｐ：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１ｐ）：本発明において樹立されたＹＰＨ４９９由来株であり、ＥＲＧ９、ＵＲＡ３及びＧＡＬ１ｐを含む。
ＥＵＧ２７（ＹＰＨ５００，ＥＲＧ９ｐ：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１ｐ）：本発明において樹立されたＹＰＨ５００由来株であり、ＥＲＧ９、ＵＲＡ３及びＧＡＬ１ｐを含む。
ＡＨ１株（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／Ａ４５１）：本発明において樹立されたＡ４５１由来株であり、Ａ４５１にｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１が導入されている。
ＹＨ１株（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９）：本発明において樹立されたＹＰＨ４９９由来株であり、ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１が導入されている。
原核生物としてはアーキア（ａｒｃｈａｅａ）とバクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ，細菌）が挙げられる。アーキアとしては、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などのメタン生産菌、ハロバクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの好塩菌、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）等の好熱好酸性菌が挙げられる。バクテリアとしては工業的または学術的に利用価値の高い各種グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリシア属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やバシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）やアグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）等のアグロバクテリウム属、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバシラス属、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）やストレプトマイセス属（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等の放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）が挙げられる。
大腸菌等のバクテリアを宿主とする場合は、本発明の組換えＤＮＡが細胞中で自律複製可能であると同時に、転写プロモーター、リボソームＲＮＡ結合領域としてのＳＤ配列、本発明の遺伝子により構成されていることが好ましい。転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、ＢＬ２１、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４、ＴＨ２、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｙ１０８８等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。転写プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、サザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、組換え体からＤＮＡを調製し、導入ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色するか、あるいはＵＶ検出器でＤＮＡを検出し、増幅産物を１本のバンド又はピークとして検出することにより、導入ＤＮＡを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
３．プレニルアルコールの生産
本発明において、プレニルアルコールは、導入されたプレニル二リン酸合成酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子（融合遺伝子を含む）、および／または、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子若しくはその変異型遺伝子、あるいは、前記（ｅ）〜（ｊ）記載のメバロン酸経路関連酵素遺伝子を含む上記組換え体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の組換え体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。プレニルアルコールとしては、例えばＧＧＯＨが挙げられる。上記プレニルアルコールは、それぞれ単独で又は混合物として上記培養物中に蓄積される。
微生物を宿主として得られた組換え体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、組換え体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられ、その他ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２６℃〜４２℃、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とした場合３０℃で２−７日、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主とした場合で３７℃で１２−１８時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えばＧＡＬ１プロモーターを用いた場合、炭素源としてガラクトースを使用することができる。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するときには、ＩＰＴＧを培地に添加することもできる。
上記培養条件で培養すると、宿主により高収率でプレニルアルコールを生産することができる。また、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることができる。特に、宿主がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９、導入したプラスミドＤＮＡがｐＲＳ４３５ＧＧＦおよびｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１の場合には、培地１リットルあたり１．５ｍｇ以上、培養条件によっては１２８ｍｇ以上生産することが可能である。
本発明においては、上記培地に、さらにテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加してプレニルアルコールの生産効率を高めることができる。これらの添加剤として以下のものを例示することができる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ２９５Ｓ（旭電化製）、アデカノールＬＧ２９７（旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ（旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１（旭電化製）
油脂濃度は０．０１％以上、好ましくは１〜３％であり、界面活性剤濃度は０．００５％〜１％、好ましくは０．０５〜０．５％であり、テルペノイド濃度は０．０１％以上、好ましくは１〜３％である。
さらに、本発明においては、以下の（ｉ）−（ｖｉ）のいずれかの成分を含む培地を用いてプレニルアルコールの生産力を有する微生物を培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することもできる。さらに、以下の（ｉ）−（ｖ）のいずれかの成分を含むフィード液を用いたフェドバッチ培養を行うことも出来る。
（ｉ）糖
（ｉｉ）アルコール
（ｉｉｉ）アンモニアガス、アンモニア水及び又はアンモニウム塩
（ｉｖ）水酸化ナトリウムと硫酸との混合物
（ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカー、塩化カルシウム及び界面活性剤の混合物
（ｖｉ）上記（ｉ）−（ｖ）のうち２種以上の混合物
上記糖としては、グルコース、スクロース、ガラクトース、ラクトースなどが挙げられる。また、アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。
フィード液中の炭素源成分としては、グルコースとエタノールとの組合せが好ましく、ｐＨ制御用化合物としてアンモニアガス又はアンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム）を加えることがさらに好ましい。フィード液の添加方法としては、培養開始後１２−２４時間まではグルコースを唯一の炭素源とするフィード液を用い、培養開始１２−２４時間以降にエタノールを含む成分を炭素源とするフィード液に切りかえることが好ましいが、そのままグルコースを唯一の炭素源としていても良い。フィード液の全炭素源に対するエタノールの割合は任意の割合でかまわないが、５０％以上、または１００％にすることもできる。
ところで、培地に特定の栄養が補給されなくても増殖できる株を原栄養体株という。一般に、原栄養体株は、栄養要求性の表現型において野生型株と同一の表現型を持つ株のことである。一方、組換え体の宿主株としては、しばしば栄養要求性変異株が用いられている。この栄養要求性変異株を原栄養体株と同一の栄養要求性の表現型にするには、栄養要求性変異の原因となる変異遺伝子に対する野生型遺伝子を導入し、変異を相補すればよい。栄養要求性の原因となる変異遺伝子に対する野生型遺伝子が変異遺伝子に対して優性遺伝子である場合は、その野生型遺伝子をもつ別の株と接合させることによって変異を相補することもできる。本発明においては、例えばＧＧＯＨの生産株（ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子とＦＰＰ合成酵素遺伝子との融合遺伝子を含むＹＨ１株）ゲノム中の栄養要求性の原因となる変異遺伝子のいくつかを野生型遺伝子で置換し、さらに残った変異型遺伝子にたいする優性野生型遺伝子を持つＹＰＨ５００由来株と接合させることにより原栄養体株を得ることができる。本発明では二倍体細胞であって原栄養体株を使用することが好ましい。
培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、本発明のプレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
本発明において、株とベクターとの好ましい組み合わせ及びプレニルアルコール生産の関係を例示すると表４の通りである。
0003894119.tif 000005
0003894119.tif 000006
0003894119.tif 000007
0003894119.tif 000008
0003894119.tif 000009
0003894119.tif 000010
（ｉ）ｐＲＳ４４５ＧＡＰに、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１を組み込んでプラスミドｐＲＳ４４５ＧＧを作製し、これを宿主であるＡ４５１株又はＹＰＨ４９９に導入すると、ＧＧＯＨ生産量が上昇する（平均約０．４ｍｇ／ｌ）。
（ｉｉ）ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１とＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０との融合遺伝子をｐＲＳ４３５ＧＡＰ又はｐＲＳ４４５ＧＡＰに組み込んだプラスミドｐＲＳ４３５ＦＧＧ、ｐＲＳ４４５ＦＧＧ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ又はｐＲＳ４４５ＧＧＦ、あるいは、これら融合遺伝子の末端にＨＤＥＬ配列をコードする塩基配列を連結したプラスミド（上記融合遺伝子が発現したときに生産されるポリペプチドのＣ末端にＨＤＥＬ配列が付加されるように改変した遺伝子を含むプラスミド）ｐＲＳ４３５ＦＧＧＨＤＥＬ、ｐＲＳ４４５ＦＧＧＨＤＥＬ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを作製し、これらを宿主Ａ４５１又はＹＰＨ４９９に導入すると、ＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合で平均０．２０ｍｇ／ｌ、ＢＴＳ１−ＥＲＧ２０融合で平均０．３９ｍｇ／ｌ、ＢＴＳ１−ＥＲＧ２０−ＨＤＥＬ融合で平均０．６２ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｉｉｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１がｐＲＳ４３４ＧＡＰに組み込まれたプラスミドｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１と、上記融合遺伝子を含むプラスミドｐＲＳ４３５ＧＧＦとを宿主ＹＰＨ４９９に導入して共発現すると、平均１．５５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。ＹＭＯ培地（ＹＭ培地に大豆油などを添加したもの）で３０℃で７日培養すると５．６１ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｉｖ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬとｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１とを宿主ＹＰＨ４９９に導入して共発現すると、平均１．５０ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。ＹＭＯ培地で３０℃で７日培養すると５．６４ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｖ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１とを宿主ＹＰＨ４９９に導入して、ジャーファーメンターで１０９時間培養すると１２８ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｖｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＦ融合遺伝子とを共発現させると、ほとんどの株で１００ｍｇ／ｌ以上のＧＧＯＨを生産し、最大で１８９ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｖｉｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＦ融合遺伝子との共発現株を原栄養体化及び二倍体化したｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ３株を用いフェドバッチ培養し、培養開始２０時間以降のフィード液として５００ｇ／ｌグルコース液を用いると０．４７ｇ／ｌのＧＧＯＨを、４００ｇ／ｌエタノール液を用いると１．１６ｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
（ｖｉｉｉ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ３株を用い、フェドバッチ培養を行い、培養開始後２１時間以降のフィード液の全炭素源に対するエタノールの割合を７１％にし、さらに酢酸アンモニウムを添加した場合は２．５ｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
本実施例は、以下の内容を包含する。
（１）Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＲＳ系各ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＹＥＳ、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９由来のゲノムＤＮＡをもとにして、発現ベクターｐＲＳ４３５ＧＡＰなどを作製する。
（２）メバロン酸経路関連酵素遺伝子のクローニング
アセチル補酵素Ａアセチル転移酵素遺伝子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその置換変異型遺伝子、及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子をクローニングし、発現ベクターを作製する。
（３）Ａ４５１、ＹＰＨ４９９などの宿主に、メバロン酸経路関連酵素遺伝子を含むプラスミドを導入する。また、Ａ４５１、ＹＰＨ４９９のゲノムＤＮＡ中のＥＲＧ９転写プロモーターをｐＹＥＳ２由来のＧＡＬ１転写プロモーターで置換した変異株（ＥＵＧ株）を作製し、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子導入用宿主とする。
（４）Ａ４５１にＡＵＲ１−Ｃ遺伝子をインテグレートしたＡ４５１宿主由来株ＡＵＲＧＧ１０１、及びＡＵＲ１遺伝子座にＡＵＲ１−Ｃ遺伝子と共に、ＧＡＬ１プロモーター、ＢＴＳ１およびＣＹＣ１ターミネーターを含むＡ４５１由来株ＡＵＲＧＧ１０２を作製し、遺伝子導入用宿主とする
（５）各宿主にプレニル二リン酸合成酵素発現ベクターを導入し、ＹＭ７培地（ＹＭ培地をＮａＯＨでｐＨ７に調整したもの）、ＹＭＯ培地、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ含有培地などの所定の培地で培養し、培養液を抽出してプレニルアルコール（特にＧＧＯＨ）を分離定量する。成績の良好な株については、ジャーファーメンターで長時間培養し、プレニルアルコールを大量生産する。さらに、組換え体を原栄養体化及び二倍体化したときのＧＧＯＨ生産に対する影響、あるいは培地に添加するエタノールやアンモニア等の化合物のＧＧＯＨ生産に対する影響も検討する。
〔実施例１〕  発現ベクターの構築
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクター
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社よりプラスミドｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４１４（図３）を購入した。宝酒造よりｐＡＵＲ１２３を購入し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からｐＹＥＳ２（図４）を購入した。
（２）ゲノムＤＮＡ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡは、宝酒造から酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」を購入し、添付のプロトコルに従ってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９からゲノムＤＮＡを調製した。
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造）から次の方法で調製した。ＪＭ１０９を１．５ｍｌ  ２ｘＹＴ培地で培養後、遠心により集菌し、５６７μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）、３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び３０μｌの１０％ＳＤＳを加え、３７℃で１時間保温後、１００μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加え混合した。これに、８０μｌのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％  ＣＴＡＢ，０．７Ｍ  ＮａＣｌ）を加え、６５℃で１０分加熱した。これを７００μｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、水層画分をさらに６００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。抽出後の水層画分に０．６容量のイソプロパノールを加えて遠心した。沈殿画分を７０％エタノールで洗い、乾燥後１００μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解し大腸菌ゲノムＤＮＡ溶液とした。ＤＮＡをＯＤ２６０で測定、定量後、ＤＮＡ濃度が１μｇ／μｌになるようにＴＥで調製した。
Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＷｉｚａｒｄ  ＰｕｒｅＦｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。
（３）ｐＲＳ４１４へＡＤＨ１ｐ−ＡＤＨ１ｔ断片の挿入
ｐＲＳ４１４（図３）をＮａｅＩとＰｖｕＩＩで切断し、ｆ１  ｏｒｉとＬａｃＺ部分を含まない４．１ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。また、ｐＡＵＲ１２３をＢａｍＨＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端にした後、アガロースゲル電気泳動でＡＤＨ１プロモーター（ＡＤＨ１ｐ）及びＡＤＨ１ターミネーター（ＡＤＨ１ｔ）を含む１．０ｋｂｐの断片（図５、配列番号２３）を精製した。ｐＲＳ４１４の４．１ｋｂｐ断片には、大腸菌と酵母の複製開始点、大腸菌用形質転換マーカーＡｍｐｒと酵母用栄養要求性マーカーＴＲＰ１が残っており、ｐＡＵＲ１２３  １．０ｋｂｐ断片はＡＤＨ１ｐ、ＡＤＨ１ｔおよびそれらに挟まれたクローニングサイトを含んでいる。この二つの断片を宝酒造ＤＮＡライゲーションキットにより連結したのちＥ．ｃｏｌｉ  ＳＵＲＥ２スーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）へ形質転換した。
得られた組換え体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｌＩとＳｃａＩによるマッピングでチェックしたところ、二通りの向きでｐＲＳ４１４へ挿入されたプラスミドｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈ（図６Ａ）及びｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈ（図６Ｂ）が得られた。
（４）ｐＲＳベクターへＣＹＣ１ｔ断片の挿入
ＣＹＣ１転写ターミネーターＣＹＣ１ｔ断片はＰＣＲで調製した。以下のＰＣＲ用オリゴＤＮＡ：ＸｈｏＩ−Ｔｃｙｃ１ＦＷとＡｐａＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶとの組合せをＰＣＲ用プライマーＤＮＡに用い、鋳型としてｐＹＥＳ２を用いた。
0003894119.tif 000011
反応は、０．１μｇ  ｐＹＥＳ２，５０ｐｍｏｌプライマーＤＮＡ，ＭｇＳＯ４含有１ｘ  Ｐｆｕバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），１０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ，１．５ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１μｌ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μｌの反応液を調製し、９５℃２分、（９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３０サイクル、７２℃５分、４℃ストックの反応条件で行った。増幅した２種のＤＮＡをそれぞれＸｈｏＩとＡｐａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で２６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製しＣＹＣ１ｔ−ＸＡとした。
ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５のＸｈｏＩ−ＡｐａＩ部位にＣＹＣ１ｔ−ＸＡを挿入し、それぞれ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃとした。
（５）転写プロモーターの調製
ｐＡＵＲ１２３または酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより転写プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製した。使用したＤＮＡプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000012
ＡＤＨ１転写プロモーターＡＤＨ１ｐ増幅用にはＳａｃＩ−Ｐａｄｈ１ＦＷ及びＳａｃＩＩ−Ｐａｄｈ１ＲＶをＰＣＲ用ＤＮＡプライマーに用い、鋳型にｐＡＵＲ１２３を用いた。ＴＤＨ３（ＧＡＰ）転写プロモーターＴＤＨ３ｐ（ＧＡＰｐ）増幅用にはＳａｃＩ−Ｐｔｄｈ３ＦＷ及びＳａｃＩＩ−Ｐｔｄｈ３ＲＶをＰＣＲ用ＤＮＡプライマーに用い、ＴＥＦ２転写プロモーターＴＥＦ２ｐ増幅用にはＳａｃＩ−Ｐｔｅｆ２ＦＷ及びＳａｃＩＩ−Ｐｔｅｆ２ＲＶをＰＣＲ用ＤＮＡプライマーに用い、鋳型にはそれぞれ酵母ゲノムＤＮＡを用いた。反応溶液は、０．１μｇ  ｐＡＵＲ１２３又は０．４６μｇ酵母ゲノムＤＮＡ，１００ｐｍｏｌプライマーＤＮＡ，１ｘ  ＥｘＴａｑバッファー（宝酒造），２０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ，０．５ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）及び１μｌ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサーを含む１００μｌ溶液を調製し、９５℃２分、（９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃４分、４℃ストックの反応条件で行った。増幅した４種のＤＮＡをＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でそれぞれ６２０ｂｐ、６８０ｂｐ、７１０ｂｐ、４００ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＴＤＨ３ｐ、ＴＥＦ２ｐとした。
（６）２μ  ＤＮＡ複製開始領域の調製
ＹＥｐベクターであるｐＹＥＳ２をＳｓｐＩとＮｈｅＩで切断後、２μ  ＤＮＡ複製開始点（２μ  ｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、このＤＮＡ断片を２μ  ＯｒｉＳＮとした。
（７）ＹＥｐ型発現ベクターの作製
ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ＴｃｙｃをＢＡＰ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，宝酒造）処理したＮａｅＩ部位に２μ  ＯｒｉＳＮを挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＵＲＥ２に形質転換した後プラスミドＤＮＡを調製した。これを、ＤｒａＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、または、ＰｓｔＩ及びＰｖｕＩＩにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、２μ  ｏｒｉの挿入とその向きをチェックした。作製したｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ＴｃｙｃにｐＹＥＳ２と同じ向きで２μ  ｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉとし、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ＴｃｙｃにｐＹＥＳ２と反対向きで２μ  ｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれｐＲＳ４４４Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉ、ｐＲＳ４４５Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉとした。
ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉ、ｐＲＳ４４４Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉ及びｐＲＳ４４５Ｔｃｙｃ２μ  Ｏｒｉの４種のプラスミドのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位に、転写プロモーターを含む断片ＡＤＨ１ｐ、ＴＤＨ３ｐ（ＧＡＰｐ）、ＰＧＫ１ｐ又はＴＥＦ２ｐを挿入しＤＮＡをクローン化した。その結果、（ｉ）ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μ  ＯｒｉからｐＲＳ４３４ＧＡＰ及びｐＲＳ４３４ＴＥＦが、（ｉｉ）ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μ  ＯｒｉからｐＲＳ４３５ＧＡＰが、（ｉｉｉ）ｐＲＳ４４４Ｔｃｙｃ２μ  ＯｒｉからｐＲＳ４４４ＧＡＰ及びｐＲＳ４４４ＴＥＦが、（ｉｖ）ｐＲＳ４４５Ｔｃｙｃ２μ  ＯｒｉからｐＲＳ４４５ＧＡＰが、それぞれ得られた（図７Ａ〜Ｆ）。
本発明で作製した発現ベクターを整理すると表５の様になる。
0003894119.tif 000013
（８）ＹＥｐ型発現ベクターの酵母への導入
作製したＹＥｐ型発現ベクターのＤＮＡ複製領域が機能するかを調べるため、各ＹＥｐ型発現ベクター約４０ｎｇをＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いた方法でＹＰＨ４９９へ導入し（手順はキット同封の説明書に従った）、ＳＤ−Ｗ寒天プレート（ＤＯＢ＋ＣＳＭ（−Ｔｒｐ），ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）上で３０℃で生育してくるコロニーを調べた。結果を表６に示す。
0003894119.tif 000014
表６の結果より、本発明で作製した各ＹＥｐ型ベクターは、プラスミドとして正常に保持されることがわかった。
〔実施例２〕  メバロン酸経路関連酵素遺伝子のクローニング
酵母ｃＤＮＡからの遺伝子クローニングの際には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）より購入したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＢＹ７４６由来のｃＤＮＡライブラリ“Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ”を用いた。
（１）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子のクローニング
（１−１）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０：
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０約０．９ｋｂｐ断片（配列番号１）を、ｃＤＮＡを鋳型にして増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000015
0003894119.tif 000016
上記反応溶液を用い、９４℃４５秒、５５℃１分、７２℃２分を３０サイクル行った。
なお、後述のＰＣＲは、特別な記載がない限り上記と同様の条件で行った。
ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。ＥＲＧ２０はｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ内のｌａｃＺと同じ向きに挿入されていた（図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）の配列と比較したところ、１−３００塩基と６１０−１０５９塩基の部分でのＰＣＲエラーは無かった。
作成したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ２０とした。
（１−２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ｉｓｐＡ：
大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型にし、以下の合成オリゴＤＮＡをプライマーに用いてＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ｉｓｐＡ（配列番号３）のクローニングを行った。
0003894119.tif 000017
１ｘ  ＥｘＴａｑバッファー、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１００ｐｍｏｌ  ＩＳＰＡ１、１００ｐｍｏｌ  ＩＳＰＡ２、０．２μｇ  Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ、５ｕ  ＥｘＴａｑを含んだ１００μｌの反応溶液で、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１．５分を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断後、アガロースゲル電気泳動で１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９へ導入し遺伝子クローニングを行った。ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ、Ｎｄｅｌ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを用いた制限酵素マッピングにより正しくｉｓｐＡ遺伝子が導入されたプラスミドｐＡＬｉｓｐＡ４、ｐＡＬｉｓｐＡ８、ｐＡＬｉｓｐＡ１５、ｐＡＬｉｓｐＡ１６及びｐＡＬｉｓｐＡ１８が得られた。
（１−３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｕｓ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子
特開平５−２１９９６１記載のｐＦＥ１５をＮｏｔＩとＳｍａＩで切断後、２．９ｋｂｐの転写単位を含んだＦＰＰ合成酵素遺伝子断片を精製した。これを、ｐＡＣＹＣ１７７（日本ジーン）のＳｃａＩ部位に挿入し、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ｆｐｓ（配列番号２５）を含む発現ベクターを作製した。
（２）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のクローニング
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１（配列番号５）のクローニングは、以下のように行った。
ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子（Ａ．Ｎ．Ｕ３１６３２）（Ｙ．Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３７），２１７９３−２１７９９（１９９５））の情報をもとに、該遺伝子によりコードされるタンパク質のＮ末端、Ｃ末端にマッチするプライマーを作製し、これを用いて酵母のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｏ．ＣＬ７２２０−１）を鋳型としたＰＣＲを行った。
0003894119.tif 000018
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９４℃４５秒の変性、５５℃１分のアニーリング及び７２℃２分の伸長を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
目的の断片（約１．０ｋｂｐ）が確認されたので、ＢＴＳ１断片をＴＡクローニング可能なｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクターにクローニングし、ＢＴＳ１の全領域の塩基配列を決定した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋの配列と完全に一致し（配列番号５）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子であることを確認した。
（３）アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ＥＲＧ１０（配列番号２６）の約１．２ｋｂｐゲノムＤＮＡ断片を鋳型にして増幅し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ部位へクローニングした。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000019
（下線部分は制限酵素認識部位）
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー共存下で９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル行った。作成したプラスミドはＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたかをチェックし、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ１０、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ１０とした。
（４）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
ＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素遺伝子ＨＭＧＳ約１．５ｋｂｐ断片（配列番号２７）を、ｃＤＮＡを鋳型にして増幅した。ただし、アニーリング温度は５０℃で行った。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000020
ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。ＨＭＧＳはｐＴ７ＢｌｕｅのｌａｃＺと反対向きに挿入されていた（図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤの配列と比較したところ、開始コドンＡＴＧのＡを第１塩基としたときの第３９番目のＡがＧにＰＣＲエラーを起こしていた（Ａ３９Ｇ；他のＰＣＲエラーについても以下同様に表示する。）。
その他、Ｔ１４４Ｃ、Ｔ２２３Ｃ、Ｔ１０３８Ｃ、Ｃ１１２２Ｔ、Ａ１３７０Ｇの５箇所にエラーが見つかった。これらＰＣＲエラーのうちＴ２２３ＣとＡ１３７０Ｇはコードしているアミノ酸のエラーも起こし、Ｔ２２３Ｃは第７５残基目のＳｅｒがＰｒｏにエラー（Ｓ７５Ｐ、以下同様に記載）を起こし、Ａ１３７０ＧはＫ４５７Ｒのアミノ酸配列エラーを起こしていた。
作成したプラスミドをｐＴ７ＨＭＧＳとした。
（５）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のクローニング
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１のクローニングは、以下のように行った。
ＧｅｎＢａｎｋにあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１（Ａ．Ｎ．Ｍ２２００２）（Ｍ．Ｅ．Ｂａｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，３７９７−３８０８（１９８８）：配列番号７）の情報をもとにＮ末端、Ｃ末端にマッチするプライマーを作製し、これを用いて酵母のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型としたＰＣＲを行った。
0003894119.tif 000021
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサーを使用し、９４℃４５秒の変性、５５℃１分のアニーリング及び７２℃２分の伸長を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
目的の断片（３．２ｋｂｐ）が確認されたので、ＨＭＧ１をＴＡクローニング可能なｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクターにクローニングし（これをｐＴ７−ＨＭＧ１とした）、ＨＭＧ１の塩基配列を決定した。その結果、配列番号９の塩基配列及び配列番号１０のアミノ酸配列を確認した。決定された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋの配列に示した塩基配列と一部異なっており、ＰＣＲエラーを起こしていた（図２Ａ）。このＰＣＲエラーを含んだ変異型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子をＨＭＧ１’とする。
（６）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のＰＣＲエラーの修正
ＰＣＲエラーは、ｐＴ７ＨＭＧ１からＨＭＧ１遺伝子断片をサブクローニングし、ＨＭＧ１部分のＰＣＲエラーによるアミノ酸置換変異部分を修正した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１のＰＣＲエラー型ＤＮＡであるＨＭＧ１’を有するｐＴ７ＨＭＧ１からＨＭＧ１’遺伝子断片をサブクローニングし、ＨＭＧ１部分のＰＣＲエラーによるアミノ酸置換変異部分を、部位特異的変異誘発法により修正し、ｐＡＬＨＭＧ１０６を作製した。作製方法の詳細は以下の通りである。
プラスミドｐＴ７ＨＭＧ１をクローン化ＨＭＧ１として用いた。また、部位特異的変異導入用ベクターとしてｐＡＬＴＥＲ−１を購入した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ発行の”Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６  Ｐｒｏｍｅｇａ，ＩＳＢＮ  １−８８２２７４−５７−１”に記載の方法で行った。変異導入用オリゴは、次の３種類を化学合成した。
0003894119.tif 000022
部位特異的変異導入は、ｐＴ７ＨＭＧ１をＳｍａＩ、ＡｐａＬＩ、ＳａｌＩで切断し、３．２ｋｂｐのＨＭＧ１断片をアガロースゲル電気泳動で調製した。これをｐＡＬＴＥＲ−１のＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＡＬＨＭＧ１を作製した。ｐＡＬＨＭＧ１をアルカリ変性後、上記変異導入オリゴ、リペアオリゴとしてＡｍｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ノックアウトオリゴとしてＴｅｔ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアニーリングさせ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入後、１２５μｇ／ｍｌアンピシリンで部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。以下の配列を有するプライマーを用いて塩基配列をチェックしたところ、ＨＭＧ１（１９０−２１６）、ＨＭＧ１（１８０７−１８３３）、ＨＭＧ１（２７１３−２７３９）に相当する配列は全てこれらオリゴヌクレオチドの配列に修正されていた（配列番号１１）。なお、修正された配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）は、ＨＭＧ１’によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）と一致していた（サイレント変異）。
0003894119.tif 000023
このＨＭＧ１内の配列が修正されたプラスミドをｐＡＬＨＭＧ１０６とした（図９）。
（７）メバロン酸キナーゼ遺伝子のクローニング
ＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメバロン酸キナーゼ遺伝子ＥＲＧ１２約１．３ｋｂｐ断片（配列番号２８）をｃＤＮＡを鋳型にして増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000024
（下線部分は制限酵素認識部位）
ＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＴ７ＢｌｕｅのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ部位にクローニングした。これで、ＥＲＧ１２はｐＴ７ＢｌｕｅのｌａｃＺと反対向きに挿入されることになる（図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。
作成したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ１２とした。
（８）メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子のクローニング
ＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ８遺伝子約１．３ｋｂｐ断片（配列番号２９）をｃＤＮＡを鋳型にして増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000025
ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。ＥＲＧ８はｐＴ７ＢｌｕｅのｌａｃＺと反対向きに挿入されていた  （図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤの配列と比較したところ、Ａ７０Ｃ、Ａ７２Ｇ、Ｇ１４６Ａ、Ｃ１７１Ｇ、Ｇ２２４Ｃ、Ａ３０６Ｇ、Ｔ３８７Ｃ、Ｇ５７４Ｔ、Ｃ６３７Ｇ、Ｇ６３８Ｃ、Ｇ７２９Ａ、Ｇ７３９Ａ、Ｔ７５９Ａ、Ａ８７９Ｇ、Ａ１２２２ＧのＰＣＲエラーを起こしていた。これらＰＣＲエラーのうちＡ７０ＣとＡ７２Ｇはアミノ酸のエラーのＴ２４Ｐを起こし、Ｇ１４６ＡはＧ４９Ｅ、Ｇ２２４ＣはＳ７５Ｔ、Ｇ５７４ＴはＡ１９２Ｓ、Ｃ６３７ＧとＧ６３８ＣはＲ２１３Ａ、Ｇ７３９ＡはＤ２４７Ｎ、Ａ１２２２ＧはＴ４０８Ａの各アミノ酸のエラーを起こしていた。
作成したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ８とした。
（９）メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
ＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子ＥＲＧ１９（ＭＶＤ１）約１．２ｋｂｐ断片（配列番号３０）をｃＤＮＡを鋳型に増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000026
（下線部分は制限酵素認識部位）
ＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＴ７ＢｌｕｅのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。これで、ＥＲＧ１９（ＭＶＤ１）はｐＴ７ＢｌｕｅのｌａｃＺと反対向きに挿入されることになる（図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。
作成したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ１９とした。
（１０）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子のクローニング  （１０−１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子ＩＤＩ１
ＰＣＲ法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＤＩ１遺伝子約０．９ｋｂｐ断片（配列番号３１）をｃＤＮＡを鋳型に増幅した。ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ１（ＳＣＩＰＰ−１）及びＰｒｉｍｅｒ２（ＳＣＩＰＰ−２）を用いた。
0003894119.tif 000027
ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。ＩＤＩ１はｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ内のｌａｃＺと反対向きに挿入されていた（図８）。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。
作成したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＩＤＩ１とした。
（１０−２）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ
Ｅ．ｃｏｌｉのＯＲＦ１８２（ＩＰＰΔ−イソメラーゼ相同なポリペプチドをコードすると予想されるオープンリーディングフレーム；遺伝子名ｉｄｉ）を含むゲノムＤＮＡがクローニングされているプラスミドｐ３−４７−１３（Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，１０８８−１０９６）を鋳型にして、ＰＣＲ法で約０．５５ｋｂｐのＯＲＦ１８２断片を増幅した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー共存下で９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル行った。ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000028
（下線部分は制限酵素認識部位）
ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｕＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により切断したところ図１０に示したようなＥｃｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｂ．ｍｅｄ．ｍｉａｍｉ．ｅｄｕ／ＥｃｏＧｅｎｅ／ＥｃｏＷｅｂ／）ｈｔｔｐ：／／ｂｍｂ．ｍｅｄ．ｍｉａｍｉ．ｅｄｕ／ＥｃｏＧｅｎｅ／ＥｃｏＷｅｂ／）のＯＲＦ１８２断片（ｉｄｉ）の塩基配列データ（配列番号３２）に即した物理地図が得られた。そこで、増幅した０．５５ｋｂｐのＰＣＲ断片をＳａｃＩＩとＸｂａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ部位へクローニングした。作成したプラスミドはそれぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＯＲＦ１８２、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＯＲＦ１８２とした。
大腸菌ＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子（配列番号３２）は、以前の命名ではＯＲＦ１８２（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーチによる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０００３７２）としていたが、Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，４４９９−４５０４によりｉｄｉと名付けられている。ｉｄｉをクローニングしたプラスミドとしては、Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２３，１０８８−１０９６記載のｐ３−４７−１１とｐ３−４７−１３を用いた。
〔実施例３〕  変異型遺伝子のクローニング
（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＦＰＰ合成酵素遺伝子のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子への変換（変異型ＦＰＰ合成酵素遺伝子のクローニング）
実施例２（１−２）で得られたｐＡＬｉｓｐＡ４、ｐＡＬｉｓｐＡ８、ｐＡＬｉｓｐＡ１５、ｐＡＬｉｓｐＡ１６、ｐＡＬｉｓｐＡ１８を用いて、Ｐｒｏｍｅｇａ発行の”Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｇｕｉｄｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６  Ｐｒｏｍｅｇａ，ＩＳＢＮ  １−８８２２７４−５７−１”に記載のプロトコルに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉｓｐＡにコードされるポリペプチドの７９番目のアミノ酸残基Ｔｙｒをコードしているコドンを置換変異により改変した。以下の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異オリゴともいう）は、化学合成法により調製した。
0003894119.tif 000029
上記変異オリゴＩＳＰＡ−Ｍは、第１６番目〜第１８番目の塩基（３塩基を下線で示した部分）が野性型ＦＰＰ合成酵素のアミノ酸配列の７９番目のＴｙｒをコードしているコドンであるため、Ｍｅｔをコードするように設計したものである。同様にして、変異オリゴＩＳＰＡ−Ｄ、変異オリゴＩＳＰＡ−Ｅは、それぞれＡｓｐ、Ｇｌｕをコードするように設計したものである。上記変異オリゴにおいて、第２６番目〜第３１番目の塩基（６塩基を下線で示した部分）は、置換変異導入より新たにＥｃｏＴ２２Ｉ（ＮｓｉＩ）部位ができるように設計し、変異遺伝子が制限酵素マッピングにより容易に区別できるように計画した配列である。変異オリゴは、あらかじめ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により５’末端をリン酸化し、Ｎｉｃｋ  Ｃｕｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてゲル濾過精製してある。変異導入の際にはリペアオリゴとしてＣｍ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ノックアウトオリゴとしてＴｅｔ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。アルカリ変性させたｐＡＬｉｓｐＡ１６にＣｍ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｌｉｇｏ、Ｔｅｔ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｌｉｇｏ、変異オリゴをアニールさせＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へ形質転換した。２０μｇ／ｍｌのＣｍ（クロラムフェニコール）共存下で生育してきた大腸菌からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９へ形質転換し、２０μｇ／ｍｌ  Ｃｍ寒天プレート上で生育してきたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。ｐＡＬｉｓｐＡ４を鋳型にし、ＩＳＰＡ−Ｄ、ＩＳＰＡ−Ｅ、ＩＳＰＡ−Ｍを変異オリゴに用いて作製した置換変異型ｉｓｐＡ（これをｉｓｐＡｍという）を含むプラスミドを、それぞれｐ４Ｄ、ｐ４Ｅ、ｐ４Ｍとした。同様に、ｐＡＬｉｓｐＡ８を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれｐ８Ｄ、ｐ８Ｅ、ｐ８Ｍとし、ｐＡＬｉｓｐＡ１５を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれｐ１５Ｄ、ｐ１５Ｅ、ｐ１５Ｍとし、ｐＡＬｉｓｐＡ１６を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれｐ１６Ｄ、ｐ１６Ｅ、ｐ１６Ｍとし、ｐＡＬｉｓｐＡ１８を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれｐ１８Ｄ、ｐ１８Ｅ、ｐ１８Ｍとした。
Ｙ７９Ｄ変異型アミノ酸配列（配列番号３４）をコードする遺伝子を配列番号３３に、Ｙ７９Ｅ変異型アミノ酸配列（配列番号３６）をコードする遺伝子を配列番号３５に、Ｙ７９Ｍ変異型アミノ酸配列（配列番号３８）をコードする遺伝子を配列番号３７に示す。このようにして得られたプラスミドは、適宜選択して使用した。
（２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＰＰ合成酵素遺伝子の変異型のクローニング
Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子（ｆｐｓ：配列番号３９）の置換変異体を含む発現ベクターは、Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０７４８−３０７５４記載のｐＦＰＳ（Ｙ８１Ｍ）から作製した。
ｐＦＰＳは、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造）のｌａｃプロモーター下流にｆｐｓが組み込まれており、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＦＰＰ合成酵素遺伝子をＩＰＴＧによりＥ．ｃｏｌｉ内で発現する発現プラスミドである。まず。このＦＰＰ合成酵素遺伝子に部位特異的変異導入によりＹ８１Ｍ変異、すなわち、ＦＰＰ合成酵素遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のうち第８１番目のＴｙｒがＭｅｔとなるように置換する変異を施した（ｐＦＰＳ（Ｙ８１Ｍ）とする）。ｐＦＰＳ（Ｙ８１Ｍ）は、Ｙ８１Ｍ置換変異導入によりコードしている酵素の反応産物特異性が変化し、比活性の低下なしにＦＰＰ合成酵素遺伝子がＧＧＰＰ合成酵素遺伝子に改変されたものである。次に、ｐＦＰＳ（Ｙ８１Ｍ）をＰｓｈＢＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端にした後、転写単位を含む２．７ｋｂｐ断片を精製し、ｐＡＣＹＣ１７７のＡｍｐｒ遺伝子内のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。Ａｍｐｒ遺伝子と同じ向きにｆｐｓ変異型遺伝子断片が挿入されたプラスミドをｐＦＰＳ２１ｍとし、その逆向きに挿入されたプラスミドをｐＦＰＳ３１ｍとした（図１１）。
（３）欠失型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のクローニング
恒常発現型プロモーターＡＤＨ１ｐを含むベクターｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈ、ｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈを制限酵素で処理してＨＭＧ１を挿入し、プラスミドｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈ−ＨＭＧ１及びｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈ−ＨＭＧ１を作製した。
実施例２（５）で作製したｐＴ７−ＨＭＧ１をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ処理してＰＣＲエラー配列を有するＨＭＧ１’遺伝子を取り出し、これをｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に導入した。得られた組換えベクターをｐＹＥＳ−ＨＭＧ１とした。ベクター内の塩基配列を確認したところ、配列番号３の塩基配列であることを確認した。なお、ｐＹＥＳ２は、複製起点として酵母２μｍＤＮＡのｏｒｉ、及びガラクトースで誘導可能なＧＡＬ１プロモーターをもつ酵母発現用シャトルベクターである（図４）。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の膜貫通ドメインに対応する領域を欠損させた欠失型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子発現ベクターを作製するため、前記の通り作製したｐＹＥＳ−ＨＭＧ１を鋳型として、ＰＣＲ法でベクター部分とともにＨＭＧ１コード領域の一部分を欠失させた断片を調製した。得られた断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端にした後、セルフライゲーションにより再び環化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９へ形質転換させ、プラスミドＤＮＡを調製した。プライマーとして使用した合成ＤＮＡ配列とその組合せを前記表１に示した。
得られたプラスミドＤＮＡ内のＨＭＧ１上流、下流のアミノ酸の読み枠がずれていないことと、その結合部位近辺にＰＣＲエラーによるアミノ酸置換が起きていないことを３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で確認した。その結果、結合部位近辺にＰＣＲエラーによるアミノ酸置換がなく、読み枠がずれずに遺伝子を欠失する事のできた以下のプラスミドを得た。欠失型ＨＭＧ１遺伝子は、欠失のパターンに従ってΔ０２ｙ（ｙは任意の作業番号を表す。）のように記載し、Δ０２ｙを含むｐＹＥＳ２ベクターを例えばｐＹＨＭＧ０２６と記すこととする（他の欠失体も同様）。
0003894119.tif 000030
0003894119.tif 000031
〔実施例４〕  遺伝子のベクターへのサブクローニング
今回使用した恒常発現型転写プロモーターをもつＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＲＳベクターは、実施例１において作製したものを使用した。
（１）ＦＰＰ合成酵素遺伝子のサブクローニング
（１−１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉａｅ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０：
実施例２（１−１）に記載のｐＴ７ＥＲＧ２０をＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により１．１ｋｂｐのＥＲＧ２０遺伝子断片を精製した。これを、ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ２０、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ２０とした。
（１−２）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子ｉｓｐＡ：
実施例２（１−２）に記載のｐＡＬｉｓｐＡ４をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により１．０ｋｂｐのｉｓｐＡ遺伝子断片を精製した。この断片にＳｐｈＩ−ＳａｃＩＩリンカーＤＮＡ（５’−ｐＴＴＴ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  Ｇ−３’（配列番号８６））とＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ５２ＩリンカーＤＮＡ（５’−ｐＡＡＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＴＣ−３’（配列番号８７））をライゲーションしたのちＳａｃＩＩとＥｃｏ５２Ｉで切断した。このＳａｃＩＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ  １．０ｋｂｐ断片を、ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ部位に挿入しサブクローン化した。サブクローン化したプラスミドは、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｌＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＮｄｅＩ、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉの各制限酵素の認識部位をマッピングし、計画通りに作製できたものを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ｉｓｐＡ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ｉｓｐＡとした。
（１−３）Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子
Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子は、ゲノムＰＣＲ断片から直接ベクターへクローニングした。
（２）ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子のサブクローニング  （２−１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉａｅ由来のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１：
実施例２（２）に記載のｐＴ７Ｂｌｕｅ  ＴベクターをＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ処理してＢＴＳ１断片を取り出し、これを、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに導入した。得られた組換えベクターをｐＹＥＳＧＧＰＳとした。
ｐＹＥＳＧＧＰＳをＢａｍＨＩとＭｌｕＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により１．３ｋｂｐ断片を精製した。これを、ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１とした。
（２−２）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子（置換変異型ＦＰＰ合成酵素遺伝子）ｉｓｐＡｍ：
実施例３（１）に記載のｐ１６ＭをＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により１．０ｋｂｐのｉｓｐＡｍ遺伝子断片を精製した。この断片に本実施例（１−２）に記載のＳｐｈＩ−ＳａｃＩＩリンカーＤＮＡとＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ５２ＩリンカーＤＮＡをライゲーションしたのちＳａｃＩＩとＥｃｏ５２Ｉで切断した。このＳａｃＩＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ  １．０ｋｂｐ断片を、ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ部位に挿入しサブクローン化した。サブクローン化したプラスミドは、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｌＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉの各制限酵素の認識部位をマッピングし計画通りに作製できたものを選抜した。このうちＮｓｌＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）認識部位は、ｉｓｐＡを置換変異した際に新たに導入した部位であり、これで切断できればｉｓｐＡ変異型遺伝子ｉｓｐＡｍであることが確認できる。選抜したプラスミドは、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ｉｓｐＡｍ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ｉｓｐＡｍとした。
（３）アセチル補酵素Ａアセチル転移酵素遺伝子のサブクローニング
アセチル補酵素Ａアセチル転移酵素遺伝子ＥＲＧ１０は、ゲノムＰＣＲ断片から直接ｐＲＳベクターへクローニングした。
（４）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のサブクローニング
実施例２（４）に記載のｐＴ７ＨＭＧＳからＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  １．５ｋｂｐのＨＭＧＳ遺伝子断片を調製し、これをｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。ＨＭＧＳをサブクローン化したプラスミドは、ＫｐｎＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたものを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＨＭＧＳ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＨＭＧＳとした。
（５）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子のサブクローニング
実施例２（５）に記載のｐＴ７Ｂｌｕｅ  ＴベクターをＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ処理してＰＣＲエラーによる変異型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＨＭＧ１’を取り出し、これをｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに導入した。得られた組換えベクターをｐＹＥＳ−ＨＭＧ１とした。
恒常発現型プロモーターＡＤＨ１ｐを含むベクターｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈ、ｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈを制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで処理し、これにＨＭＧ１遺伝子を挿入してプラスミドｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈ−ＨＭＧ１及びｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈ−ＨＭＧ１を作製した。
また、実施例２（６）に記載のｐＡＬＨＭＧ１０６（図９）をＳｍａＩとＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動で３．２ｋｂｐのＰＣＲエラー修正後のＨＭＧ１遺伝子断片を精製した。これをｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４４４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３４ＴＥＦ、ｐＲＳ４４４ＴＥＦ、ｐＲＳ４３４ＰＧＫ及びｐＲＳ４４４ＰＧＫのＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位へ挿入した。ＨＭＧ１をサブクローン化したプラスミドは、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＮａｅＩ及びＳｐｈＩの各制限酵素マッピングと、挿入された３．２ｋｂｐ  ＨＭＧ１遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列確認とにより物理地図をチェックし、計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドはそれぞれ、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４４４ＧＡＰ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４３４ＴＥ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４４４ＴＥＦ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４３４ＰＧＫ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４４４ＰＧＫ−ＨＭＧ１とした。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の欠失変異型遺伝子は、実施例３記載の対応するｐＹＥＳ２由来の欠失変異型ＨＭＧ１を組込んであるプラスミドから上記と同様にしてｐＲＳ４３４ＧＡＰへクローニングした。
（６）メバロン酸キナーゼ遺伝子のサブクローニング
実施例２（７）に記載のｐＴ７ＥＲＧ１２からＳｍａＩ−ＳａｌＩ  １．３ｋｂｐのＥＲＧ１２遺伝子断片を調製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。ＥＲＧ１２をサブクローン化したプラスミドは、ＫｐｎＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたものを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ１２、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ１２とした。
（７）メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子のサブクローニング
実施例２（８）に記載のｐＴ７ＥＲＧ８からＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  １．３ｋｂｐのＥＲＧ８遺伝子断片を調製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳｍａＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。ＥＲＧ８をサブクローン化したプラスミドは、ＸｈａＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたものを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ８、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ８とした。
（８）メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素遺伝子のサブクローニング
実施例２（９）に記載のｐＴ７ＥＲＧ１９をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  １．５ｋｂｐのＥＲＧ１９遺伝子断片を精製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。ＥＲＧ１９をサブクローン化したプラスミドはＸｂａＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ１９、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ１９とした。
（９）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子のサブクローニング
（９−１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子ＩＤＩ１：
実施例２（１０−１）に記載のｐＴ７ＩＤＩ１からＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ、ｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。サブクローン化したプラスミドは、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたものを選抜した。選抜したプラスミドはそれぞれ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＩＤＩ１、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＩＤＩ１とした。
（９−２）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子ＯＲＦ１８２（ｉｄｉ）：
実施例２（１０−２）に記載のようにして、ＯＲＦ１８２（ｉｄｉ）はゲノムＰＣＲ断片から直接ｐＲＳベクターへクローニングした。
〔実施例５〕  ＡＵＲＧＧ１０１、ＡＵＲＧＧ１０２及びＡＵＲＧＧ７０３の作製
実施例４（２−１）に記載のｐＹＥＳＧＧＰＳを鋳型にして、プライマーＰＹＥＳ２（１−２７）とＰＹＥＳ２（８６１−８３５）を用いてＰＣＲ法により、ＧＡＬ１プロモーター＝ＢＴＳ１＝ＣＹＣ１ターミネーターの一次構造（ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１−ＣＹＣ１ｔ）を持つ１．９ｋｂｐのＳａｌＩ断片を調製した。
0003894119.tif 000032
この断片をｐＡＵＲ１０１（Ｔａｋａｒａ）のＳａｌＩ部位へ挿入し、ｐＡＵＲＧＧ１１５を得た。ｐＡＵＲＧＧ１１５内のＢＴＳ１遺伝子にＰＣＲエラーがないことはＤＮＡシークエンシングにより確認した。
ｐＡＵＲＧＧ１１５をＥｃｏＯ６５Ｉで線状化し、酢酸リチウム法でＡ４５１株、ＹＰＨ４９９株へ導入し、１μｇ／ｍｌオーレオバシジンを含むＹＰＤ寒天プレート（１％酵母エキス，２％ペプトン，２％デキストロース，２％寒天）上で３０℃で生育してくるコロニーを形質転換体とした。
得られた形質転換体は、もう一度オーレオバシジン選択プレート上でシングルコロニー選抜した。
その結果、Ａ４５１を宿主とした組換え体としてＡＵＲＧＧ１０１及びＡＵＲＧＧ１０２の２クローンが得られた。また、ＹＰＨ４９９株を宿主とした組換え体としてＡＵＲＧＧ７０３が得られた。なお、ＡＵＲＧＧ１０１は、後述のサザンブロットハイブリダイゼーション（図１２）とＰＣＲマッピング（図１３）で明らかになったように、ＢＴＳ１遺伝子はインテグレートされておらず、ＡＵＲ１がマーカー遺伝子のＡＵＲ１−Ｃに置き換わったものであることが分かっている。また、ＡＵＲＧＧ１０２では上記ＧＡＬ１プロモーター＝ＢＴＳ１＝ＣＹＣ１ターミネーターがＡＵＲ１遺伝子座にインテグレートされていることが分かっている。
〔実施例６〕  各ＥＵＧ株の作製
ＳＧＤから、スクアレン合成酵素遺伝子ＥＲＧ９付近の遺伝子地図を引き出し、ＥＲＧ９転写プロモーター（ＥＲＧ９ｐ）置換用ＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲプライマーＤＮＡを設計した。形質転換体選択マーカー遺伝子ＵＲＡ３と転写プロモーターＧＡＬ１ｐを含む１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ｐＹＥＳ２をＮａｅＩとＮｈｅＩ切断後Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、セルフライゲーションにより２μ  ｏｒｉ部分を削除したｐＹＥＳ２Δを鋳型にしてＰＣＲ増幅することにより調製した。
ＰＣＲで使用したプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000033
上記プライマーには、ＹＨＲ１８９Ｗの下流部分を含む０．７ｋｂｐＤＮＡ断片とＥＲＧ９の上流部分を含む０．９ｋｂｐ  ＤＮＡ断片とでＴ／ＡライゲーションできるようにＥａｍ１１０５Ｉ認識部位（下線部分）を加えてある。ＹＨＲ１８９Ｗ断片は、ＰＣＲプライマーＹＨＲ１８９ＷｆとＹＨＲ１８９Ｗｒを用いてＹＰＨ４９９ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲにより調製し、ＥＲＧ９断片は、ＰＣＲプライマーＥＲＧ９ｆとＥＲＧ９ｒを用いてＹＰＨ４９９ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲにより調製した。ＹＰＨ４９９ゲノムＤＮＡは、「Ｇｅｎとるくん」を用いて調製した。
0003894119.tif 000034
１．８ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＥａｍ１１０５Ｉで消化後、０．７ｋｂｐＤＮＡ断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーＹＨＲ１８９ＷｆとＥ−ＭＣＳｆを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。増幅した２．５ｋｂｐ  ＤＮＡ断片をＥａｍ１１０５Ｉで消化後、０．９ｋｂｐ  ＤＮＡ断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーＹＨＲ１８９Ｗ−３ｆとＥＲＧ９−２ｒを用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。増幅した３．４ｋｂｐ  ＤＮＡ断片を形質転換用ＤＮＡ断片とした。
0003894119.tif 000035
0003894119.tif 000036
Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）より購入したＦｒｏｚｅｎ  ＥＺ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  ｋｉｔを用いて酵母にベクターの導入を行った。組換え体は、ＳＧＲ培地をベースにし、ＣＳＭ（−ＵＲＡ）（ＢＩＯ  １０１（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）より購入）と終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにアデニン硫酸塩を加えた寒天培地（ＳＧＲ（−ＵＲＡ）培地）上で３０℃で培養し、生育してきた菌体をもう一度同じ培地に広げ、培養しシングルコロニーアイソレーションを行った。
取得した組換え体は、ＥＵＧ（ＥＲＧ９ｐ：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１ｐ）株と名付け、Ａ４５１由来のクローンをＥＵＧ１〜１０、ＹＰＨ４９９由来のクローンをＥＵＧ１１〜２０、ＹＰＨ５００由来のクローンをＥＵＧ２１〜３０、Ｗ３０３−１Ａ由来のクローンをＥＵＧ３１〜５０、Ｗ３０３−１Ｂ由来のクローンをＥＵＧ５１〜７０とした。
ＳＤ培地でグルコースレプレッションによりＥＲＧ９の発現が抑制され生育抑制のかかったクローンを選抜し、Ａ４５１からＥＵＧ５及びＥＵＧ８が、ＹＰＨ４９９からＥＵＧ１２が、ＹＰＨ５００からＥＵＧ２７が得られた。
なお、ＥＵＧ５、ＥＵＧ８、ＥＵＧ１２、ＥＵＧ２７から「Ｇｅｎｅとるくん」を用いてゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型にしてＰＣＲを行った結果、ＵＲＡ３とＧＡＬ１ｐを含む１．８ｋｂｐのＰＣＲ断片がゲノム中のＥＲＧ９コード領域上流にインテグレートされていることを確認した。
〔実施例７〕  遺伝子解析、酵素活性解析
本実施例では、作製した各種組換え酵母（各組換え体の作製については、後述するプレニルアルコール生産についての実施例８〜１３を参照）の遺伝子発現を、プレニル二リン酸合成酵素の酵素活性、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲマッピング、プレニルアルコール生産量測定の各種手法を用いて解析した。
（１）サザンブロッティング
酵母ＤＮＡ精製キット「Ｇｅｎとるくん」を用いて酵母ＤＮＡの調製を行った。手順は、キット添付のプロトコルに従った。
酵母より調製したＤＮＡは、ＮｄｅＩおよびＳｔｕＩで切断後１レーンあたり３μｇを０．８％アガロースゲル電気泳動した。分子量マーカーは、Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の１ｋｂラダーとλ／ＨｉｎｄＩＩＩをそれぞれ０．５μｇ使用した。泳動後、定法に従ってアルカリ変性、中和し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に２０  ｘ  ＳＳＣによるキャピラリーブロットで転写した。転写後、メンブレンはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒでｏｐｔｉｍａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋの条件で紫外線照射し、ＤＮＡをメンブレン上に固定した。
（２）ノーザンブロッティング
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．１３．１２．２−１３．１２．３記載の方法を一部改変してＲＮＡを調製した。上記改変は、調製したＲＮＡサンプルをさらにＤＮａｓｅＩで処理した点である。
フォルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離後、定法に従って、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎナイロンメンブレンに２０  ｘ  ＳＳＣによるキャピラリーブロットで転写した。１レーンあたりｔｏｔａｌ  ＲＮＡは５μｇ泳動した。分子量マーカーはＤＩＧ−ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｉ  ２０ｎｇを使用した。転写後、メンブレンはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒでｏｐｔｉｍａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋの条件で紫外線照射し、ＲＮＡをメンブレン上に固定した。
（３）ＰＣＲマッピング
実施例５で作製したＹＩｐ型ベクターであるｐＡＵＲＧＧ１１５に由来する断片が、ゲノムにどのようにインテグレートされているかを調べるために、調製した酵母ＤＮＡ０．３−０．６μｇを鋳型にし、合成オリゴヌクレオチドＡＵＲ−ＦＷｃとＡＵＲ−ＲＶｃ、およびＡＵＲ−ＳＡＬ１とＡＵＲ−ＳＡＬ２との各組合せをプライマーに用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃３０秒，５５℃１分，７２℃３分を３０サイクル繰り返す条件で行った。
0003894119.tif 000037
（４）ＤＩＧラベルプローブＤＮＡの作製
ハイブリダイゼーションプローブはＰｒｏｂｅ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＶの４種を作製した（表７）。
0003894119.tif 000038
プローブＩ：
実施例２（１−１）で作製したｐＴ７ＥＲＧ２０を鋳型にしてＳＣＦＰＳ１とＳＣＦＰＳ２をプライマーに用い、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤＩＧラベルプローブＤＮＡを作製した。実験条件はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社添付のプロトコルに従った。ＰＣＲは９４℃３０秒，５８℃１分，７２℃３分のサイクルを３０サイクル繰り返す条件で行った。なお、ＤＩＧラベルプローブＤＮＡは、反応後アガロースゲル電気泳動により合成状態をチェックした。
プローブＩＩ：
合成オリゴヌクレオチドＢＴＳ１（１−２１）及びＢＴＳ１（１００８−９８８）をプライマーにし、ｐＹＥＳＧＧＰＳ（実施例４（２−１）参照）を鋳型にしてプローブＩと同様にしてＤＩＧラベルプローブＤＮＡを作製した。
0003894119.tif 000039
プローブＩＩＩ：
合成オリゴヌクレオチドＨＭＧ１（１２６７−１２９３）とＨＭＧ１（２７６６−２７４０）をプライマーにし、ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１（実施例３（３）参照）を鋳型にしてプローブＩと同様にしてＤＩＧラベルプローブＤＮＡを作製した。
0003894119.tif 000040
0003894119.tif 000041
プローブＶ：
合成オリゴヌクレオチドＡＵＲ−ＦＷとＡＵＲ−ＲＶをプライマーにし、ｐＡＵＲ１２３（宝酒造）を鋳型にしてＰｒｏｂｅ  Ｉと同様にしてＤＩＧラベルプローブＤＮＡを作製した。
0003894119.tif 000042
（５）ハイブリダイゼーションとプローブの検出
サザンブロットハイブリダイゼーションは、２０ｎｇ／ｍｌのプローブ濃度でＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４２℃２４時間行った。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、１００ｎｇ／ｍｌのプローブ濃度でＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて５０℃２４時間行った。それぞれ、あらかじめハイブリダイゼーションと同じ温度でＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液で２４時間プレハイブリダイゼーションを行ってある。ハイブリダイゼーション後、２ｘ  ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃，１０分で３回、０．２ｘ  ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃，１５−２０分で２回、それぞれ洗浄した。洗浄後メンブレンはＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）でＤＩＧラベルプローブを化学発光させ、Ｘ線フィルムに感光させ可視化した。
（６）酵素活性測定
作製した組換え体のうち、下記宿主株、組換え体を用いた。宿主への各ベクターの導入は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．１３．７．１−１３．７．２に記載の酢酸リチウム法、または、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いた方法で導入した（手順はキット同封の説明書に従った）。なお、１−２株はｐＹＥＳ−ＨＭＧ１をＡ４５１株に導入したものであり、３−２株はｐＹＨＭＧ０４４をＡ４５１に導入したものであり、１３−２株はｐＹＥＳ−ＨＭＧ１をＡＵＲＧＧ１０１に導入したものであり、１５−２はｐＹＨＭＧ０４４をＡＵＲＧＧ１０１に導入したものである。
Ｎｏ．１  宿主株：Ａ４５１
Ｎｏ．２  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：ＡＵＲＧＧ１０１（Ａ４５１，ａｕｒ１：：ＡＵＲ１−Ｃ）
Ｎｏ．３  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：ＡＵＲＧＧ１０２（Ａ４５１，ａｕｒ１：：ＢＴＳ１−ＡＵＲ１−Ｃ）
Ｎｏ．４  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１（ＹＥｐ）：１−２（ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／Ａ４５１）
Ｎｏ．５  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１Δ（ＹＥｐ）：３−２（ｐＹＨＭＧ０４４／Ａ４５１）
Ｎｏ．６  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１（ＹＥｐ）＆  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：１３−２（ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／ＡＵＲＧＧ１０１）
Ｎｏ．７  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１Δ（ＹＥｐ）＆  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：１５−２（ｐＹＨＭＧ０４４／ＡＵＲＧＧ１０１）
Ｎｏ．８  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１（ＹＥｐ）＆  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：２４−１（ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／ＡＵＲＧＧ１０２）
Ｎｏ．９  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１Δ（ＹＥｐ）＆  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：２７−２（ｐＹＨＭＧ０４５／ＡＵＲＧＧ１０２）
Ｎｏ．１０  ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１Δ（ＹＥｐ）＆  ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１（ＹＩｐ）：３１−２（ｐＹＨＭＧ０７６／ＡＵＲＧＧ１０２）
Ｎｏ．１−Ｎｏ．１０の株を２６℃で培養した１ｍｌの前培養液を生理食塩水で洗い、１００ｍｌの培養液へ加え、３００ｍｌの三角フラスコ内で２６℃、１分あたり１２０回の往復振盪で培養した。培地はＳＤおよびＳＧ（ＳＤ培地のグルコースをガラクトースに置き換えたもの）を用いた。ＵＲＡ３マーカーを保持している組換え体はＳＤ−Ｕ（ＳＤにＣＳＭ（−ＵＲＡ）を加えたもの）又はＳＧ−Ｕ（ＳＧにＣＳＭ（−ＵＲＡ）を加えたもの）培地にし、ＡＵＲＧＧ株はオーレオバシジンを１μｇ／ｍｌになるように加えた。
菌体増殖はＯＤ６００で測定し、ＯＤ６００が３−４程度になった時点（２３−５２時間）で培養を止め、氷中で冷却し、以下に記載のＤＮＡ調製、ＲＮＡ調製、粗酵素液調製を行った。
各培養液から遠心により菌体を集め、ＲＮＡ調製と同様にして４℃でガラスビーズで菌体を破砕後、滅菌水に懸濁した。微量冷却遠心機を用いて１２，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分遠心し、その上清を粗酵素画分とした。粗酵素画分中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でＢＳＡを標準タンパク質として測定した。粗酵素液１０μｇを用い下記の２００μｌ反応カクテル中で、３７℃で４０分間反応させた。
0003894119.tif 000043
反応後、水飽和ブタノールで伸長したプレニル二リン酸を抽出し、一部は液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。残りのサンプルは、Ｋｏｙａｍａらの方法（Ｋｏｙａｍａ  Ｔ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｇｕｒａ，Ｋ．１９８５．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１０：１５３−１５５）に従ってジャガイモ酸性フォスファターゼで脱リン酸化後、薄層クロマトグラフィー（プレートＬＫＣ１８（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）、展開液Ｈ２Ｏ／ａｃｅｔｏｎｅ＝１：１９）で展開し、Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でオートラジオグラムを可視化し、相対放射活性を測定した。
（７）結果と考察
（７−１）サザンブロットハイブリダイゼーションとＰＣＲマッピング
サザンブロットハイブリダイゼージョンの結果を図１２に示す。また、ＡＵＲ１近辺のＰＣＲによるマッピングの結果を図１３に示す。図１２及び図１３において、各レーン１〜１０は、（６）において使用した株の番号（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０）にそれぞれ対応する。
ＮはＮｄｅＩ消化、ＳはＳｔｕＩ消化ＤＮＡのレーンを示す。各レーンのＤＮＡは以下の株より調製した。
レーン１，Ａ４５１；レーン２，ＡＵＲＧＧ１０１；レーン３，ＡＵＲＧＧ１０２；レーン４，ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／Ａ４５１；レーン５，ｐＹＨＭＧ０４４／Ａ４５１；レーン６，ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／ＡＵＲＧＧ１０１；レーン７，ｐＹＨＭＧ０４４／ＡＵＲＧＧ１０１，レーン８，ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１／ＡＵＲＧＧ１０２；レーン９，ｐＹＨＭＧ０４５／ＡＵＲＧＧ１０２；レーン１０，ｐＹＨＭＧ０７６／ＡＵＲＧＧ１０２
ＥＲＧ２０（ＦＰＰ合成酵素遺伝子）は全ての株で同一であり、ＥＲＧ２０遺伝子の周辺のゲノムに変化がないことがわかった（図１２）。
ＢＴＳ１（ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子）とＡＵＲ１をプローブに用いたところ、ＡＵＲＧＧ１０２株では、ＡＵＲ１部分にＢＴＳ１がインテグレーションされていたが、ＡＵＲＧＧ１０１では宿主のＡ４５１と変わらなかった。ＡＵＲＧＧ１０１はＡＵＲ１遺伝子部分のみがｐＡＵＲ１０１由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子に置換変異しただけで、ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１断片はゲノムに組み込まれていないことがわかった。ＰＣＲによって、ゲノムインテグレーションの結果生じるＡＵＲ１遺伝子の重複を検出したところ、やはりＡＵＲＧＧ１０１由来の株ではバンドが検出されず、ＡＵＲＧＧ１０２株のみでバンドが検出された（図１３）。
図１２において、ＨＭＧ１をプローブにしたときには、ＮｄｅＩ切断の時プラスミド由来のバンドがみられた（Ｎｏ．４−７）。また、ＳｔｕＩ切断では１−２株（Ｎｏ．４）の様に８．２ｋｂｐのプラスミド由来のバンド（８．３ｋｂｐのゲノム由来のバンドと重なっている）が生じるはずなのに、１３−２株（Ｎｏ．６）、１５−２株（Ｎｏ．７）ではゲノム中のＨＭＧ１付近と導入したプラスミド間で組換えが起こりバンドシフトがみられた。
サザンブロットハイブリダイゼーションとＰＣＲマッピングの結果から、今回使用した株の遺伝子型は表８のようにまとめることができる。表中、ＡＵＲはオーレオバシジンを加えた培地で、培地１が前培養培地、培地２が本培養用の培地を示す。
0003894119.tif 000044
（７−２）ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図１４に示す。プローブは、表７のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖを使用した。
図１４において、各レーン１〜１０は図１２と同様である。また、−はＳＤ培地での転写産物を、＋はＳＧ培地での転写産物を示す。
ＥＲＧ２０の転写産物は、ＳＧ培地でＧＡＬ１ｐ転写誘導をかけたときに１３−２株（Ｎｏ．６）、１５−２株（Ｎｏ．７）で低下する傾向がみられた。
ＳＧ培地によりＧＡＬ１転写プロモーター制御下の遺伝子の転写誘導を行ったところ、ＢＴＳ１転写産物は、ＧＡＬ１ｐ−ＢＴＳ１断片がゲノムにインテグレートされている株、すなわちＡＵＲＧＧ１０２（Ｎｏ．３）でのみ誘導が増加していた。
しかしながら、ＨＭＧ１転写産物と比較すると、その転写誘導の度合いは低いことが分かる。ＨＭＧ１転写産物は、ＳＧ培地による転写誘導で、プラスミドによりＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１断片が導入された株（Ｎｏ．４−７）で顕著に増加した。
（７−３）プレニル二リン酸合成酵素活性
アリル性二リン酸基質としてゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）と１４ＣラベルしたＩＰＰとを用いて、粗酵素液中のプレニル二リン酸合成酵素活性を調べた。
ＧＰＰと［１４Ｃ］ＩＰＰを基質として合成された各プレニル二リン酸を脱リン酸化し、ＴＬＣ展開の後各スポットの放射活性を調べたところ、ＦＰＰ合成酵素活性が高く、次に、ＧＧＰＰ合成酵素活性に比べてはるかに高いＨｅｘＰＰ（ヘキサプレニル二リン酸）合成酵素活性が検出された。そこで、オートラジオグラムから反応産物の相対量を計算し、総タンパク質あたりの比活性を計算した。その結果を図１５に示す。図１５Ａは、上パネルがＦＰＰ合成酵素（ＦＰＳ）活性、下パネルがＧＧＰＰ合成酵素（ＧＧＰＳ）活性を示す。図１５Ｂは、上パネルがＨｅｘＰＰ合成酵素（ＨｅｘＰＳ）活性、下パネルがＰＴａｓｅ（総プレニル二リン酸合成酵素）活性を示す。また、灰色の棒はＳＤ培地での結果を、白色の棒はＳＧ培地での結果を示す。総プレニル二リン酸合成酵素活性のうちの多くがＦＰＰ合成酵素活性であり、ＳＧ培地による活性上昇がみられた。特に、１３−２株（Ｎｏ．６）と１５−２株（Ｎｏ．７）で顕著に増加していた。全体的には、ＧＰＰをアリル性基質にしたときのＧＧＰＰ合成酵素活性はＦＰＰ合成酵素活性の２００００分の一、ＨｅｘＰＰ合成酵素活性の３００分の一程度である。ＨｅｘＰＰ合成酵素活性はＳＧ培地で低下した。
〔実施例８〕  ＤＮＡの宿主への導入及び宿主の培養（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる発現）
本実施例では、メバロン酸経路関連酵素の遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞内で恒常的に発現させる系を構築するために、恒常発現転写プロモーターを含み、各種栄養要求性マーカーを持った発現シャトルベクターにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子を組み込み、メバロン酸関連酵素遺伝子の発現ベクターの作製を行い、これら遺伝子の高発現がプレニルアルコールの生産に与える効果を評価することにした。
（１）酵母の形質転換
各メバロン酸経路関連酵素遺伝子発現ベクターを宿主に導入した。新たに導入したベクターにはＴＤＨ３転写プロモーターＴＤＨ３ｐ（＝ＧＡＰｐ）の下流に各メバロン酸経路関連酵素遺伝子を挿入した。宿主として以下のものを使用した。
Ａ４５１
ＡＵＲＧＧ１０１
ＹＰＨ４９９
ＡＵＲＧＧ７０３
ＹＰＨ５００
Ｗ３０３−１Ａ
Ｗ３０３−１Ｂ
ＥＵＧ５（Ａ４５１由来）
ＥＵＧ８（Ａ４５１由来）
ＥＵＧ１２（ＹＰＨ４９９由来）
ＥＵＧ２４（ＹＰＨ５００由来）
ＥＵＧ２７（ＹＰＨ５００由来）
１５−２（ｐＹＨＭＧ０４４／ＡＵＲＧＧ１０１）（ＡＵＲＧＧ１０１由来）
（２）酵母の培養
メバロン酸経路関連酵素遺伝子を導入した酵母は、マーカー遺伝子に応じたＳＤ選択培地で前培養後、２５μｌ前培養液を２．５ｍｌのＹＭ又はＳＧ（ＳＤのグルコース成分をガラクトースに置き換えたもの）培地に加え、２６℃で４日間１３０ｒ．ｐ．ｍ．の往復振盪培養で培養した。ただし、ＳＧ培地に加える前には菌体を生理食塩水で洗浄し、グルコース成分の持ち込みがないようにした。また、ＹＰＨ４９９を宿主に用いたときには、４０μｇ／ｍｌになるようにアデニン硫酸塩を培地に加えた。
（３）ペンタン抽出
メバロン酸経路関連酵素遺伝子を導入した酵母を培養後、３０倍希釈液でＯＤ６００を測定した。その後、２．５ｍｌのメタノールを加え混合後、さらに約５ｍｌのペンタンを加え激しく攪拌し静置した。ペンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化させ溶質成分を濃縮後、内部標準物質として１．０ｍｌ／ｌウンデカノールを１０μｌ加え、ＧＣ／ＭＳ用サンプルとした。
（４）ＧＣ／ＭＳ解析
ペンタン抽出画分をＨＰ６８９０／５９７３  ＧＣ／ＭＳシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて分離、同定、定量した。使用カラムはＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ  ｘ  ３０ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）であり、分析条件は以下の通りである。本明細書中でのＧＣ／ＭＳ分析条件は、全て同様である。
インレット温度            ２５０℃
検出器温度                ２６０℃
［ＭＳ  ゾーン温度］
ＭＳ  Ｑｕａｄ            １５０℃
ＭＳ  Ｓｏｕｒｃｅ        ２３０℃
マススキャン範囲            ３５−２００
［インジェクションパラメーター］
自動インジェクションモード
サンプル容量              ２μｌ
３回のメタノール洗浄及び２回のヘキサン洗浄
スプリット比              １／２０
キャリヤーガス  ヘリウム  １．０ｍｌ／分
溶媒遅延                    ２分
［オーブン加熱条件］
0003894119.tif 000045
（５）結果
遺伝子、発現ベクター、宿主、培養条件（培地、温度、培養時間）及びＧＧＯＨの最大生産量を示す結果を表９に示す。
0003894119.tif 000046
0003894119.tif 000047
0003894119.tif 000048
0003894119.tif 000049
表中、宿主の欄のＥｃはＥ．ｃｏｌｉを、ＳｃはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを意味する。また、ＹＭ（２０）は、ＹＭ培地中の糖成分中の初期糖含量が２０％Ｇｌｃ−８０％Ｇａｌの培地に２日後にさらに終濃度５％Ｇｌｃを添加したものを意味する。他の培地や数値についても同様である。
（５−１）ＥＲＧ２０の発現によるＧＧＯＨの生産
ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ又はｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧをＡ４５１に導入すると高効率でＧＧＯＨが生産され、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧを用いたときには０．７３ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（表９）。
（５−２）ＢＴＳ１の発現によるＧＧＯＨの生産
ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１又はｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１をＡ４５１、ＹＰＨ４９９に導入するとＧＧＯＨの生産が増加し（表９）、Ａ４５１を宿主としたときに平均０．１０〜０．１１ｍｇ／ｌ、最大０．５８５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（表９）。さらに、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１又はｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１をＷ３０３−１Ａ又はＷ３０３−１Ｂに導入すると、最大０．１９−０．８５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨが生産された（表９）。
（５−３）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子又はその変異体の発現によるＧＧＯＨの生産
（ｉ）恒常発現型プロモーターを連結したＨＭＧ１遺伝子をＡ４５１に導入した場合（「恒常発現プロモーター；ＨＭＧ１；Ａ４５１」のように表記する。以下同様。）のＧＧＯＨ生産
ＧＧＯＨの生産量を測定した結果を図１６に示す。図１６において、４３４、４４４は、それぞれｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４４４ＧＡＰベクターを用いたときの結果を表す。一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主（Ａ４５１）を培養したときの結果を示す。
この結果より、Ａ４５１を宿主に用いると、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ／Ａ４５１ではＧＧＯＨの生産性が向上し、ＨＭＧ１遺伝子の転写を活性化させるだけでＧＧＯＨは平均０．１０５ｍｇ／ｌ、コロニーによっては、最高で０．３４８ｍｇ／ｌ生産され（表９）、ＧＧＯＨ生産に有効であることが分かった。
（ｉｉ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１；Ａ４５１  ＆  ＡＵＲＧＧ１０１
誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２にＨＭＧ１遺伝子（ＰＣＲエラー変異型ＨＭＧ１であるＨＭＧ１’）を挿入したプラスミドｐＹＥＳ２−ＨＭＧを、Ａ４５１とＡＵＲＧＧ１０１（Ａ４５１，ａｕｒ１：：ＡＵＲ１−Ｃ）へ導入した。
その結果、ＧＧＯＨを高生産するクローンが得られた。ＧＧＯＨ量はＡＵＲＧＧ１０１株で平均１．１ｍｇ／ｌに達し、最大２．２ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（図１７）。
（ｉｉｉ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１  ＆  ＢＴＳ１；ＡＵＲＧＧ１０２  ＆  ＡＵＲＧＧ７０３
誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２にＨＭＧ１’を挿入したプラスミドｐＹＥＳ２−ＨＭＧを、Ａ４５１由来株であるＡＵＲＧＧ１０２とＹＰＨ４９９由来株であるＡＵＲＧＧ７０３へ導入した（ゲノムへインテグレートされている）。
その結果、ＡＵＲＧＧ１０２及びＡＵＲＧＧ７０３のいずれを宿主に用いた場合でも、ＧＡＬ１ｐを使用したときは、ＧＧＯＨを高生産するクローンが得られ（図１８）、ＡＵＲＧＧ１０２において最大１．２８ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した。
（ｉｖ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１Δ；Ａ４５１
誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入した以下のプラスミドをそれぞれＡ４５１へ導入した。
ｐＹＨＭＧ０２６
ｐＹＨＭＧ０４４
ｐＹＨＭＧ０５６
ｐＹＨＭＧ０６２
ｐＹＨＭＧ０７６
ｐＹＨＭＧ０８１
ｐＹＨＭＧ１００
ｐＹＨＭＧ１１２
ｐＹＨＭＧ１２２
ＳＧ培地で培養後、ＧＧＯＨの生産量を測定した（図１９）。図１９において、ＨＭＧ１Δ０２６はｐＹＨＭＧ０２６をＡ４５１へ導入したときの結果を示す。他の遺伝子についても同様である（以下同じ）。
欠失型ＨＭＧ１遺伝子を誘導型プロモーターで発現させると、ＧＧＯＨ高生産株が得られた。ＧＧＯＨ生産にはＨＭＧ１Δ０５６とＨＭＧ１Δ０６２が効果があった（ＨＭＧ０６２／Ａ４５１で平均０．０６３ｍｇ／ｌ）。
（ｖ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１Δ；ＡＵＲＧＧ１０１
誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に、欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入した以下のプラスミドをそれぞれＡＵＲＧＧ１０１へ導入した。
ｐＹＨＭＧ０２６
ｐＹＨＭＧ０４４
ｐＹＨＭＧ０５６
ｐＹＨＭＧ０６２
ｐＹＨＭＧ０７６
ｐＹＨＭＧ０８１
ｐＹＨＭＧ１００
ｐＹＨＭＧ１１２
ｐＹＨＭＧ１２２
ｐＹＨＭＧ１３３
ＳＧ培地で培養後、ＧＧＯＨの生産量を測定した（図２０）。その結果、ＨＭＧ１Δ０４４において約３．１ｍｇのＧＧＯＨ生産が認められた。図２０において、一番右側のカラムは遺伝子導入前の宿主ＡＵＲＧＧ１０１の生産量を示す。
（ｖｉ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１Δ  ＆  ＢＴＳ１；ＡＵＲＧＧ１０２  誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入した以下のプラスミドをそれぞれＡＵＲＧＧ１０２へ導入した。
ｐＹＨＭＧ０２７
ｐＹＨＭＧ０４４
ｐＹＨＭＧ０４５
ｐＹＨＭＧ０５９
ｐＹＨＭＧ０６２
ｐＹＨＭＧ０６３
ｐＹＨＭＧ０７６
ｐＹＨＭＧ０８３
ｐＹＨＭＧ０９４
ｐＹＨＭＧ１０６
ｐＹＨＭＧ１１２
ｐＹＨＭＧ１２３
ｐＹＨＭＧ１３４
ＳＧ培地で培養後、ＧＧＯＨの生産量を測定した。
その結果、ｐＹＨＭＧ０４５を導入した場合、平均で０．３６ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産する株が得られた（図２１）。
（ｖｉｉ）誘導型プロモーター；ＨＭＧ１Δ  ＆  ＢＴＳ１；ＡＵＲＧＧ７０３
誘導型プロモーターＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入したプラスミドｐＹＨＭＧ０４４とｐＹＨＭＧ０６２をそれぞれＡＵＲＧＧ７０３へ導入した。ＳＧ培地で培養後、ＧＧＯＨの生産量を測定した。
その結果、ｐＹＨＭＧ０６２が導入された株において、平均で０．２１ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（図２２）。
（５−４）ＢＴＳ１とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子との発現によるＧＧＯＨの生産
ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＨＭＧ１又はｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＨＭＧ１とＢＴＳ１とをＹＰＨ４９９に導入し、ＧＧＯＨの生産量を測定した。その結果、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＨＭＧ１を導入すると最大０．５８ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産するクローンが得られた（表９）。
（５−５）ｉｓｐＡｍ、ＯＲＦ１８２（ｉｄｉ）、ＨＭＧＳ、ＥＲＧ８、ＥＲＧ１０又はＥＲＧ１９と欠失型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＨＭＧ１Δ）との発現によるＧＧＯＨの生産
ｉｓｐＡｍ、ＯＲＦ１８２（ｉｄｉ）、ＨＭＧＳ、ＥＲＧ８、ＥＲＧ１０又はＥＲＧ１９とＨＭＧ１ΔとをＡＵＲＧＧ１０１に導入し、ＧＧＯＨの生産量を測定した。その結果、最大０．６ｍｇ／ｌ〜２．７ｍｇ／ｌの範囲でＧＧＯＨを生産するクローンが得られた（表９）。
〔実施例９〕  ＤＮＡの宿主への導入及び宿主の培養（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦＰＰ合成酵素遺伝子ｉｓｐＡ発現ベクターとしてｐＡＬｉｓｐ４、ｐＡＬｉｓｐ１５、ｐＡＬｉｓｐ１６、ｐＡＬｉｓｐ１８を用い、ｉｓｐＡを置換変異させてＧＧＰＰ合成酵素遺伝子に改変したｉｓｐＡ（Ｙ７９Ｄ），ｉｓｐＡ（Ｙ７９Ｅ），ｉｓｐＡ（Ｙ７９Ｍ）の発現ベクターとしてｐ４Ｄ，ｐ４Ｅ，ｐ４Ｍ，ｐ８Ｍ，ｐ１５Ｄ，ｐ１５Ｅ，ｐ１６Ｄ，ｐ１６Ｅ，ｐ１６Ｍ，ｐ１８Ｅ，ｐ１８Ｍを用いて、また、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＰＰ合成酵素遺伝子ｆｐｓのＹ８１Ｍ変異型遺伝子としてｐＦＰＳｍ２１，ｐＦＰＳｍ３１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、５０ｍｌ／３００ｍｌ  ｆｌａｓｋの２ｘ  ＹＴ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に前培養液を０．５ｍｌ加え、必要に応じた抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール）と５ｍＭ（約０．１２％（Ｗ／Ｖ））のＩＰＰとＤＭＡＰＰを加え、３７℃で１６時間振盪培養した。
培養後、培養液上清と沈澱超音波破砕物にジャガイモ酸性フォスファターゼを加え、ペンタンを有機溶媒としてプレニルアルコールを抽出し、ＧＣ／ＭＳにより生産量を同定、定量した。また、ＩＰＰとＤＭＡＰＰを添加しなくてもプレニルアルコール生産が行えるかどうかを確かめるため、実施例３（１）で得られたプラスミドｐ１６Ｍ（ｐＡＬｉｓｐＡ１６ｍとする）と、実施例２（１０−２）で得られたＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉを保持するプラスミドｐ３−４７−１３をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入、５０ｍｌ／３００ｍｌ  ｆｌａｓｋの２ｘ  ＹＴ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に前培養液を０．５ｍｌ加え、必要に応じて抗生物質を加え（アンピシリン、クロラムフェニコール）、３７℃で１６時間振盪培養した。
その結果、培地に添加成分としてＩＰＰとＤＭＡＰＰを加えたときのＧＧＯＨの生産量は、変異型ｆｐｓを導入した場合（図２３中のｐＦＰＳｍ２１、ｐＦＰＳｍ３１で示す）でそれぞれ１６．１ｍｇ／ｌ、６．９ｍｇ／ｌであった。また、変異型ｉｓｐＡを導入した場合でも、ｐ４Ｍ、ｐ１６Ｍ、ｐ１８Ｍを保持するＪＭ１０９を培養した場合はそれぞれ１５．５ｍｇ／ｌ、２１．９ｍｇ／ｌ、６．０ｍｇ／ｌであり（図２３）、Ｙ７９Ｍ変異を導入したｐ４Ｍ、ｐ１６Ｍにおいて、沈殿画分に高いＧＧＯＨ活性が認められた。これは、ｐＡＬｉｓｐＡ４、ｐＡＬｉｓｐＡ１６はＥ．ｃｏｌｉ細胞内で活性のあるＦＰＰ合成酵素を発現し、その置換変異型プラスミドｐ４Ｍ、ｐ１６Ｍも十分な発現活性があると考えられる。
なお、培地に添加成分としてＩＰＰとＤＭＡＰＰを加えなかったときのＧＧＯＨの生産量は、ｐＡＬｉｓｐＡ１６ｍを保持するＪＭ１０９で０．０７ｍｇ／ｌであった。また、ｐＡＬｉｓｐＡ１６ｍと、ＩＰＰΔ−イソメラーゼを保持するプラスミドｐ３−４７−１３とを共発現させたときに、ＧＧＯＨ換算で生産性は０．１２ｍｇ／ｌであった。
〔実施例１０〕  融合遺伝子の発現によるプレニルアルコールの生産
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＴＳ１がコードしているＧＧＰＰ合成酵素は、プライマー基質としてＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ジメチルアリル二リン酸）よりもＦＰＰを好むと仮定する。そうすると、ＩＰＰからＧＧＯＨ前駆体であるＧＧＰＰへの合成能を強化するためには、ファルネシル二リン酸合成能を同時に補強する必要があると考えられた。
そこで、本実施例では、ＢＴＳ１とＥＲＧ２０の融合遺伝子を作製し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞内でその融合遺伝子を発現させ、ＧＧＯＨ生産能が向上するかを確かめることにした。また、あわせて小胞体移行シグナルをコードする塩基配列をＢＴＳ１、ＥＲＧ２０やその融合タンパク質遺伝子の下流に組み込み、プレニルアルコール生産に与える影響を調べることにした。
（１）プラスミドＤＮＡの作製
ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１をｐＹＥＳ２に組み込んだｐＹＥＳＧＧＰＳと、ＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０をｐＴ７に組み込んだｐＴ７ＥＲＧ２０とを鋳型に用い、ＰＣＲを行った。使用したＰＣＲプライマーは以下の通りである。
0003894119.tif 000050
0003894119.tif 000051
ＥＲＧ２０ＨＤＥＬ−ＸｂａＩの第３番目〜第８番目の塩基及びＢＴＳ１ＨＤＥＬ−ＸｈｏＩの第４番目〜第９番目の塩基（それぞれ、６塩基分を下線で施した部分）はベクター連結用のＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩまたはＸｂａＩ認識部位を示す。また、ＢＴＳＩ−１０９Ｉ、１０９Ｉ−ＢＴＳ１、ＥＲＧ２０−１０９Ｉ及び１０９Ｉ−ＥＲＧ２０の第４番目〜第１０番目の塩基（それぞれ、７塩基分を下線で施した部分）は融合遺伝子作製用のＥｃｏＯ１０９Ｉ認識部位を示す。
ＰＣＲは以下の反応液で行った。
0003894119.tif 000052
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓには１．６μｇ／μｌのＫＯＤ抗体が含まれている。反応条件は、９４℃で２分の反応後、９４℃１５秒、５５℃３０秒及び６８℃１分のサイクルを３０サイクル行い、その後６８℃２分保温した。
１ｓｔ  ＰＣＲは以下の鋳型、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ１，ｐｒｉｍｅｒ２）の組合せで行った。（表１０、図２４）。ＰＣＲ産物名も表１０及び図２４に示した。図２４において、最も左側の列に最終的なプラスミド名を記した。グレーの文字で示した配列はアミノ酸配列を意味し、このうちＧＳは融合遺伝子の結合配列に導入し、ＨＤＥＬは小胞体移行シグナルとして挿入した。くさび形矢印は、ＰＣＲで使用したプライマーの位置と向きを示している。
0003894119.tif 000053
ＰＣＲ産物＃９、＃１０、＃１１、＃１２、＃１３、＃１４を制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後、＃９と＃１１、＃１０と＃１２、＃９と＃１３、＃１０と＃１４とをそれぞれライゲーションした。このライゲーション溶液をＰＣＲの鋳型とし、それぞれ、ＳａｃＩＩ−ＢＴＳ１と−２１、Ｔ７とＢＴＳ１−ＸｈｏＩ、ＳａｃＩＩ−ＢＴＳ１とＥＲＧ２０ＨＤＥＬ−ＸｂａＩ、Ｔ７とＢＴＳ１ＨＤＥＬ−ＸｈｏＩをｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２に用いて、２ｎｄ  ＰＣＲを１ｓｔ  ＰＣＲと同じ条件で行い、２ｎｄ  ＰＣＲ産物＃９−＃１１、＃１０−＃１２、＃９−＃１３、＃１０−＃１４を得た。
＃９−＃１１をＳａｃＩＩとＢａｍＨＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４４５ＧＧＦとした。
＃１０−＃１２をＸｂａＩとＸｈｏＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＦＧＧとｐＲＳ４４５ＦＧＧとした。
＃９−＃１３をＳａｃＩＩとＸｂａＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬとした。
＃１０−＃１４をＸｂａＩとＸｈｏＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＦＧＧＨＤＥＬとｐＲＳ４４５ＦＧＧＨＤＥＬとした。
＃７をＳａｃＩＩとＸｂａＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＦＨＤＥＬとｐＲＳ４４５ＦＨＤＥＬとした。
＃６をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後ｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３５ＧＧＨＤＥＬとｐＲＳ４４５ＧＧＨＤＥＬとした。
作製したプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡシークエンシングにより設計通りの塩基配列を持っていることを確認してある。
融合遺伝子でないＢＴＳ１、ＥＲＧ２０の発現ベクターとして、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１（ｐＲＳ４３５ＧＧという）、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１（ｐＲＳ４４５ＧＧという）、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＥＲＧ２０（ｐＲＳ４３５Ｆという）、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＥＲＧ２０（ｐＲＳ４４５ＦＧという）を利用し、ＨＭＧ１発現用に使用したプラスミドとしてｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１とｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を利用した。
（２）組換え体の作製
組換え体の作製は、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）のＦｒｏｚｅｎ  ＥＺ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、上記の通り作製したプラスミドを宿主に導入することにより行った。宿主はＡ４５１、ＹＰＨ４９９、ＡＨ１（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／Ａ４５１）、ＹＨ１（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９）、ＥＵＧ５、ＥＵＧ１２を使用した。
（３）プレニルアルコール生産量測定
ＥＵＧ株以外の組換え体はＳＤ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）選択液体培地に接種し、ＥＵＧ株はＳＧＲ（ＳＤのグルコース成分をガラクトースとラフィノースに置き換えたもの）に接種し、３０℃で培養し前培養液とした。培養した前培養液１０または２５μｌを、１．０または２．５ｍｌのＹＭ７＋ａｄｅ（ＹＭ，ｐＨ７，４０μｇ／ｍｌアデニン硫酸塩）培地またはＹＭＯ（ＹＭ７＋ａｄｅ，１％大豆油，０．１％アデカノールＬＧ−１０９（Ａｓａｈｉ  Ｄｅｎｋａ  Ｋｏｇｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））培地に加え、３０℃で４日間または７日間１３０ｒ．ｐ．ｍ．で往復振盪培養した。
培養後、メタノールを等量加えて混合し、ペンタンを約２倍量加えて激しく攪拌した。静置後、ペンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化させ、溶質成分を濃縮後、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）でプレニルアルコールを同定・定量し、内部標準としてウンデカノールを用いて定量した。また、その際、菌体増殖の度合いを調べるため、培養液２０μｌを水で３０倍に希釈し、６００ｎｍの吸光度を測定した。
ＧＣ／ＭＳは、ＨＰ６８９０／５９７３  ＧＣ／ＭＳシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いた。
（４）結果と考察
融合遺伝子発現により得られるゲラニルゲラニオールの最大生産量の一覧を表１１に示す。
0003894119.tif 000054
0003894119.tif 000055
（４−２）Ａ４５１でのＥＲＧ２０、ＢＴＳ１発現
融合遺伝子をＡ４５１で発現させたときのプレニルアルコールの生産量の変化を図２５に示す。図２５において、４３５ＧＧＦはｐＲＳ４３５ＧＧＦを示し、４３５ＧＧＦＨＤＥＬはｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを示した（以下同様）。ＯＤ６００は６００ｎｍの吸光度を示す。図２５には、融合遺伝子でないＢＴＳ１遺伝子を組み込んだ発現ベクターをＡ４５１に導入した時の結果（４３５ＧＧ）も示した。
ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１（図中では「４４５ＧＧ／Ａ４５１」と表記）を導入したときにおいても、平均０．４４ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ生産量が認められた。
（４−３）ＹＰＨ４９９でのＥＲＧ２０、ＢＴＳ１発現
融合遺伝子をＹＰＨ４９９で発現させたときのＧＧＯＨの生産量の変化を図２６に示す。図２６において、４９９はＹＰＨ４９９を示し、４３５ＧＧＦはｐＲＳ４３５ＧＧＦを、４４５ＧＧＦＦＨＤＥＬはｐＲＳ４４５ＧＧＦＨＤＥＬを示す（以下同様）。図２６には、融合遺伝子でないＢＴＳ１遺伝子を組み込んだ発現ベクターをＹＰＨ４９９に導入した時の結果とあわせて示した。
ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１導入（図中では「４３５ＧＧ／４９９」と表記）で平均０．１１ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ生産量が認められ、ＥＲＧ２０とＢＴＳ１融合遺伝子を組み込んだｐＲＳ４３５ＦＧＧ（図中では「４３５ＦＧＧ／４９９」と表記）導入で平均０．２０ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ（図中では「４３５ＧＧＦ／４９９」と表記）導入で平均０．３９ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ、ｐＲＳ３５ＧＧＦＨＤＥＬ（図中では「４３５ＧＧＦＨＤＥＬ／４９９」と表記）導入で平均０．６２ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ生産が認められ、融合遺伝子やＨＤＥＬ配列によるＧＧＯＨ生産性向上の効果がみられた。
（４−４）ＹＰＨ４９９でのＨＭＧ１、ＥＲＧ２０、ＢＴＳ１発現
本発明者は、ＹＰＨ４９９において、ＨＭＧ１発現ベクターを導入した株ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９（ＹＨ１）とｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９を宿主にして、ＨＭＧ１との共発現によりＧＧＯＨをより多く生産する株が得られるかもしれないと考えた。
既に作製したｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１をＹＰＨ４９９へ導入した株を宿主にして、融合遺伝子でないＥＲＧ２０やＢＴＳ１遺伝子を組み込んだ発現ベクターをさらに導入した時のプレニルアルコール生産量を図２７に示す。図２７において、４３４ＴＥＦｐ−ＨＭＧ１はｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１を導入した株を表す。ＴＥＦｐはＴＥＦ２遺伝子の転写プロモーターである。４９９はＹＰＨ４９９を示し、４３５ＦはｐＲＳ４３５ＧＧＦを、４４５ＦはｐＲＳ４４５ＧＧＦを示した（以下同様）。ＢＴＳ１単独導入ではＧＧＯＨ生産量が０．１１ｍｇ／ｌであった。これに対し、ＴＥＦ２ｐ−ＨＭＧ１導入株を宿主としてＢＴＳ１発現ベクターを導入すると、ＧＧＯＨ生産量が平均０．４０ｍｇ／ｌになり（図中、４３５ＧＧ  ＆  ４３４ＴＥＦｐ−ＨＭＧ１／４９９）、ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１導入株を宿主としてＢＴＳ１発現ベクターを導入すると、ＧＧＯＨは０．４９ｍｇ／ｌ生産された（図中、４３５ＧＧ  ＆  ４３４ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１／４９９）。従って、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とプレニル二リン酸合成酵素遺伝子との共発現によるプレニルアルコール大量生産系の可能性が示された。
次に、ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１を導入したＹＨ１（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９）を宿主として、本発明において作製したＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子やＨＤＥＬシグナルを含んだ遺伝子をＴＤＨ３転写プロモーターＧＡＰｐ（ＴＤＨ３ｐ）により発現させたときのプレニルアルコール生産量を測定した。
結果を図２８に示す。図２８において、４３４ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１はｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を導入した株を表す。ＧＡＰｐはＴＤＨ３遺伝子の転写プロモーターである。ＨＤＥＬシグナルを導入したプレニル二リン酸合成酵素遺伝子とＨＭＧ１とを共発現させ、さらに、ＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子導入によりＧＧＯＨの生産性が向上した。特にｐＲＳ４３５ＧＧＦやｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ導入株で顕著であり、平均でそれぞれ１．５５ｍｇ／ｌ、１．５０ｍｇ／ｌのＧＧＯＨ生産を記録した（図中、４３５ＧＧＦ  ＆  ４３４ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１／４９９、４３５ＧＧＦＨＤＥＬ  ＆  ４３４ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１／４９９）。
（４−５）大豆油含有培地でのプレニルアルコール生産性
次に、本発明で作製したＧＧＯＨ生産株であるＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子導入株をＹＭ７（ＹＭ，ｐＨ７）培地とＹＭＯ（ＹＭ７，０．１％アデカノールＬＧ１０９，１％ｓｏｙｂｅａｎ  ｏｉｌ）培地で４日から７日培養し、プレニルアルコール生産量を測定した。Ａ４５１系統の株を宿主としたときの結果を図２９Ａ、２９Ｂに示し、ＹＰＨ４９９系統の株を宿主としたときの結果を図３０Ａ、３０Ｂに示した。図２９Ａ、２９Ｂにおいて、ＡＨ１はｐＲＳ４３４ＧＡＰｐ−ＨＭＧ１／Ａ４５１、ＧＧＦＨＤＥＬはｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを示す。「−１」は４日培養後の生産量、「−２」は７日培養後の生産量を示す。ＹＭＯ培地では大豆油懸濁のため菌体量を細胞数で示した。「１０∧３  ｃｅｌｌ／ｕｌ」は１マイクロリットルあたりの細胞数を１０００で割った値を示す。
ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／Ａ４５１は、ＹＭ７培地で７日培養したときの生産量（図２９Ａ、上パネルＧＧＦ／Ａ４５１−２）が平均０．２６ｍｇ／ｌ  ＧＧＯＨであったのに対し、ＹＭＯ培地中では平均０．９８ｍｇ／ｌ（図２９Ｂ、上パネルのＧＧＦ／Ａ４５１−２）と生産量が増加した。ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をＡ４５１に導入したＡＨ１株を宿主にしたときでも、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した場合は、平均２．５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産し（図２９Ｂ、中央パネル、ＧＧＦＨＤＥＬ／ＡＨ１−２）、最大で３．５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを記録した（表１１、遺伝子名４３５ＧＧＦＨＤＥＬの項）。Ａ４５１株のＥＲＧ９の転写プロモーターをＧＡＬ１転写プロモーターで置換したＥＵＧ５（実施例６参照）を宿主にした場合でも、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ導入により、ＹＭ７培地、７日間培養で平均６．６ｍｇ／ｌ  ＧＧＯＨであったものが（図２９Ａ、下パネルのＧＧＦ／ＥＵＧ５−２）、ＹＭＯ培地で培養すると平均９．６ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産するようになった（図２９Ｂ、下パネルのＧＧＦ／ＥＵＧ５−２）。
ＹＭＯ培地によるＧＧＯＨ生産性向上はＹＰＨ４９９系統の株を宿主にしたときにも観察され（図３０Ａ、３０Ｂ）、ｐＲＳ４３５ＧＧＦを導入したＹＰＨ４９９をＹＭ７で７日間培養したときに平均０．１９ｍｇ／ｌであったものが（図３０Ａ、上パネルのＧＧＦ／ＹＰＨ４９９−２）、ＹＭＯ培地では平均２．５ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（図３０Ｂ、上パネルのＧＧＦ／ＹＰＨ４９９−２）。さらにＨＭＧ１を共発現するＹＨ１株にｐＲＳ４３５ＧＧＦやｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したものをＹＭＯ培地で培養すると、７日培養後どちらも平均５．６ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した（図３０Ｂ、中央パネルのＧＧＦ／ＹＨ１−２，ＧＧＦＨＤＥＬ／ＹＨ１−２）。ＥＵＧ５と同様にしてＹＰＨ４９９から作製したＥＵＧ１２株（実施例６参照）を宿主にしたときには、ｐＲＳ４３５ＧＧＦやｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ導入株で３．７−４．０ｍｇ／ｌ程度のＧＧＯＨを生産した。従って、ＹＰＨ４９９株では、ＨＭＧ１とプレニル二リン酸合成酵素遺伝子との組合せでＧＧＯＨの生産性向上が見込める事が示された。
〔実施例１１〕  各グルコース−ガラクトース糖組成培地によるプレニルアルコール生産への影響
（１）ベクターの宿主への導入及び培養
本実施例では、各グルコース（Ｇｌｃ）−ガラクトース（Ｇａｌ）糖組成変化により出芽酵母のプレニルアルコール生産がどう変わるかを確認する。併せて、ＢＴＳ１−ＥＲＧ２０融合遺伝子発現によるプレニルアルコール生産への効果も調べる。
Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）より購入したＦｒｏｚｅｎ  ＥＺ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  ｋｉｔを用いて酵母にベクターの導入を行った。ＥＲＧ２０、ＢＴＳ１融合遺伝子発現ベクターとしてｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを用いた。また、宿主としてＡ４５１、ＹＰＨ４９９、ＡＨ１、ＹＨ１、ＥＵＧ５、ＥＵＧ１２を用いた。形質転換体は、ＳＧＲ培地をベースにして適宜栄養要求性を指標とした選択培地寒天プレート上で生育させた。クローン化のため、選択培地寒天プレート培養は２回行った。
作製した形質転換体をＳＧＲ選択培地で前培養し、０．０１−０．０５ｍｌの前培養液を１−５ｍｌのＹＭ７にそれぞれ加え、１８ｍｍ径の試験管で３０℃、１３０ｒ．ｐ．ｍ．の往復振盪培養条件で培養した。ＹＭ７培地の糖成分（ＧｌｃとＧａｌとの組成比）として、０％Ｇｌｃ−１００％Ｇａｌ、２０％Ｇｌｃ−８０％Ｇａｌ、５０％Ｇｌｃ−５０％Ｇａｌ、７５％Ｇｌｃ−２５％Ｇａｌ、１００％Ｇｌｃ−０％Ｇａｌの組成の各培地を作製し、これらの培地でまず３０℃、１３０ｒ．ｐ．ｍ．の往復振盪培養条件で培養した。２日培養後、終濃度５％になるようにＧｌｃをさらに加え、培養を７日目まで継続した。
（２）結果
（２−１）Ａ４５１のＧＧＯＨ生産
Ａ４５１にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのＧＧＯＨ生産の結果を図３１Ａ−Ｃに示す。この場合は、ＧＧＯＨはほとんど検出されなかった。特徴的なのは、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ／Ａ４５１を４日培養したところ、初期条件２０％ＧｌｃでＧＧＯＨ生産量が最大値（平均０．５６ｍｇ／ｌ）をとったことである。
（２−２）ＡＨ１のＧＧＯＨ生産
ＡＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのＧＧＯＨ生産の結果を図３２Ａ−Ｃに示す。ＢＴＳ１−ＥＲＧ２０融合遺伝子を導入したＡＨ１でも、ＧＧＯＨ生産量は、２−４日培養の場合は初期条件２０％ＧｌｃのときにＧＧＯＨの生産量が最大となり（３．３２ｍｇ／ｌ）、７日培養の場合は初期条件５０−８０％ＧｌｃのときにＧＧＯＨの生産量が最大となった（平均４．１３ｍｇ／ｌ）。
（２−３）ＥＵＧ５のＧＧＯＨ生産
ＥＵＧ５にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのＧＧＯＨ生産の結果を図３３Ａ−Ｃに示す。ｐＲＳ４３５ＧＧＦ導入株及びｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ導入株のいずれの場合も、２−４日の培養、初期条件２０−８０％Ｇｌｃが良好であった。
（２−４）ＹＰＨ４９９のＧＧＯＨ生産
ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのプレニルアルコール生産の結果を図３４Ａ−Ｃに示す。この場合は、Ａ４５１を用いたときと同様、ＧＧＯＨはほとんど検出されなかった。
（２−５）ＹＨ１のＧＧＯＨ生産
ＹＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのプレニルアルコール生産の結果を図３５Ａ−Ｃに示す。７日培養では、初期条件１００％ＧｌｃのときにＧＧＯＨの生産量が高かった。
（２−６）ＥＵＧ１２のＧＧＯＨ生産
ＥＵＧ１２にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入したときのプレニルアルコール生産の結果を図３６Ａ−Ｃに示す。初期条件２０％Ｇｌｃのときに、いずれの場合（宿主、発現ベクター）でも高いプレニルアルコールの生産性を示した。ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＥＵＧ１２の初期条件２０％Ｇｌｃ、４日培養の場合は、菌体がＯＤ６００＝１．１に相当する量であるのに対し、７．６ｍｇ／ｌ  ＦＯＨ、５．４ｍｇ／ｌ  ＧＧＯＨの生産性があった。これは、菌体あたりの生産性としては非常に効率が良いと考えられる。
〔実施例１２〕  ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１及び１５−２のジャーファーメンター培養
（１）ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１
ＧＧＯＨを大量に生産するため、ＧＧＯＨを優先的に５．６ｍｇ／ｌ生産したｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１株（実施例１０参照）を、以下の条件ででジャーファーメンターを用いて培養した。
＜ファーメンター培地＞
５％  グルコース（ＹＭ中に１％グルコースが含まれており、終濃度６％になる）
ＹＭ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）
３％  大豆油（ナカライテスク製）
０．１％アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）
＜運転条件＞
培養装置：ＭＳＪ−Ｕ  １０Ｌ培養装置（丸菱バイオエンジ）
培地量：５Ｌ
培養温度：３３℃
通気量：１ｖｖｍ
アジテーション：３００ｒｐｍ
ｐＨ：４Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び２Ｎ塩酸溶液を用い、以下のパラメーターでｐＨを比例制御
Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｂａｎｄ            １．００
Ｎｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｎｄ          ０．１５
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｅｒｉｏｄ                １６Ｓｅｃ
Ｆｕｌｌ  Ｓｔｒｏｋｅ                        １Ｓｅｃ
Ｍｉｎｉｍｕｎ  Ｓｔｒｏｋｅ                  ０Ｓｅｃ
この結果、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１株において、１１５時間培養後にＧＧＯＨを１２８ｍｇ／ｌ生産させることができた。このときスクアレン（ＳＱ）は１５ｍｇ／ｌ、ＦＯＨは５ｍｇ／ｌ、ネロリドール（ＮＯＨ）はほとんど０であり、ＧＧＯＨのみを大量に醗酵生産する系を作製することができた（図３７）。
（２）１５−２
実施例７に記載の１５−２株（ｐＹＨＭＧ０４４を保持するＡＵＲＧＧ１０１株）をＧＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１製）及びＤＯＢ（ＢＩＯ１０１製）培地（２００ｍｌ／５００ｍｌバッフル付き三角フラスコ）にスラントより植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで２日間培養した。次に、培養液に含まれているグルコースを完全に除くため、遠心（１５００ｒｐｍ、５分、４℃）及び滅菌した生理食塩水による洗浄を３回繰り返した。、その後、５０ｍｌの前培養液を用いて上記（１）ｐＲＳ３５ＧＧＦ／ＹＨ１と同様の条件でジャーファーメンターで培養した。ただし、用いた培地は以下の培地で温度は２６℃で培養した。
＜ファーメンター培地＞
５％  ガラクトース（ＹＭ中に１％グルコースが含まれており、終濃度６％になる）
ＹＭＢ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ製）
１％  大豆油（ナカライテスク製）
０．１％アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）
この結果１５−２株において、１５０時間培養後にＧＧＯＨを３ｍｇ／ｌ以上生産させることができた。（図３８）。
〔実施例１３〕  融合遺伝子の発現
ｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した細胞が融合遺伝子産物として計画どおりに発現しているかどうかを確かめるために、転写産物解析および翻訳産物解析をノーザンブロットハイブリダイゼーション法とウェスタンブロット法により行った。
（１）ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した組換え体、ＹＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した組換え体におけるノーザンブロットハイブリダイゼーション法による転写産物解析結果を図３９に示す。用いたプローブは、α−チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子コード領域中のＤＮＡ断片、実施例７表７記載のＥＲＧ２０プローブ、ＢＴＳ１プローブ、ＨＭＧ１プローブを用いた。ＴＵＢ１プローブは次のオリゴヌクレオチドＴＵＢ１ｆ−２とＴＵＢ１ｒ−２を用いて実施例７と同様に作製し、ＲＮＡ調製、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション条件も実施例７と同様にして行った。
0003894119.tif 000056
図３９中「−」はプレニル二リン酸合成酵素を保持するプラスミドを導入していない細胞由来のＲＮＡサンプル、「ＧＧＦ」はｐＲＳ４３５ＧＧＦを導入した組換え体由来のＲＮＡサンプル、「ＨＤＥＬ」はｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した組換え体由来のＲＮＡサンプル、「ＨＭＧ１」はＹＨ１株を宿主にした組換え体由来のＲＮＡサンプルを示す。プローブＴＵＢ１（チューブリンα遺伝子）の結果から調製した全てのサンプルについてほぼ同一量のメッセンジャーＲＮＡが得られていることがわかる。プローブＥＲＧ２０、プローブＢＴＳ１で過剰発現している共通の３．１ｋｂバンドが検出されており融合遺伝子の転写が効率良く行われていることを示している。プローブＥＲＧ２０で検出された１．８ｋｂのバンドはゲノム中の野生型ＥＲＧ２０遺伝子転写産物と考えられる。プローブＨＭＧ１の結果からは、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をあらかじめ導入してある株（ＹＨ１由来株、図３９中「ＨＭＧ１」で示したレーン）では全て４．１ｋｂの大量のプラスミド由来のＨＭＧ１転写産物であるＲＮＡが検出され、プレニル二リン酸合成酵素発現プラスミドを第２のプラスミドとしてさらに導入してもＨＭＧ１の転写が効率良く行われていることを示している。
（２）ウェスタンブロット
ＥＲＧ２０およびＢＴＳ１がコードするポリペプチドのＣ末端配列にしたがって下記のアミノ酸配列を持つポリペプチドを化学合成し、これを抗原として定法（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄ，”Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの一般的な実験書に記載）に従ってマウス抗体を作成した。下記ペプチドは２ｍｇを用い、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に架橋し抗原として用いた。
0003894119.tif 000057
ＹＰＨ４９９、ｐＲＳ４３５Ｆ／ＹＰＨ４９９、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＰＨ４９９、ｐＲＳ４３５ＦＧＧ／ＹＰＨ４９９、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ／ＹＰＨ４９９、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１の６株から次のようにして蛋白質を調製し、ウェスタンブロット解析を行った。各菌体は、選択培地（ＹＰＨ４９９にはＳＤ培地ＤＯＢ（ドロップアウトベース：グルコースを炭素源とする最少培地）にアミノ酸または核酸成分としてＣＳＭ（コンプリートサプリメントミックスチャー）を加えたもの）、ｐＲＳ４３５Ｆ／ＹＰＨ４９９にはＳＤ−Ｌ（ＳＤ培地からＬｅｕを除いたもの）培地、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＰＨ４９９にはＳＤ−Ｌ培地、ｐＲＳ４３５ＦＧＧ／ＹＰＨ４９９にはＳＤ−Ｌ培地、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ／ＹＰＨ４９９にはＳＤ−Ｌ培地、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１にはＳＤ−ＬＷ（ＳＤ培地からＬｅｕ、Ｔｒｐを除いたもの）培地を使用）に前培養溶液（６００ｎｍでの吸光度を測定し、菌量が等量となる様に生理食塩水で希釈したもの）を接種し、３０℃、１３０ｒ．ｐ．ｍ．で４日間振とう培養した。遠心機を用いて集菌後、菌体湿重量１ｇあたり２ｍｌのＹ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加し、室温で１時間激しく攪拌して全蛋白質溶液を調製した。得られた全蛋白質２０μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：手順はＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で分子量に従って分離し、ウェスタンブロット法（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で組換え体に導入した遺伝子の発現状況を確認した。なお今回実施のウェスタンブロット法では、以下の点を定法から改変した。
１）ＰＶＤＦ膜の一次抗体処理条件
定法でＰＶＤＦ膜は、一次抗体のＴＢＳＴ１０−１０００倍希釈溶液中で３０−６０分振盪。
改変後は上述の抗ペプチド抗体のＴＢＳＴ２０００倍希釈溶液中で６０分振盪。
２）ＰＶＤＦ膜の洗浄条件
定法では２００ｍｌのＴＢＳＴ溶液で１５分間ずつ４回洗浄。
改変後は８０ｍｌのＴＢＳＴ溶液で５分間ずつ５回洗浄。
３）ＰＶＤＦ膜の二次抗体処理
定法では抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリフォスファターゼコンジュゲートをブロッキング溶液で２００−２０００倍に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸し３０−６０分振盪。
改変後は、ＰＶＤＦ膜を抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリフォスファターゼのＴＢＳＴ４０００倍希釈溶液に浸し、３０分振盪。
４）抗原蛋白質のバンド検出法
定法ではＴＢＳＴ、ＴＢＳで洗浄したＰＶＤＦ膜をＢＣＩＰ（４−ｂｒｏｍｏ−４ｃｈｏｒｏ−３ｉｎｄｏｉｌ−ｐｈｏｓｐａｔｅ）、ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）混液に３０分間浸漬し、発色。
改変後は、ＴＢＳＴ、ＴＢＳで洗浄したＰＶＤＦ膜をＰｒｏｔｏＢｌｏｔ  ＩＩ  ＡＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ・Ｍｏｕｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に２０−４０秒浸漬し、発色。
ウェスタンブロット解析の結果を図４０に示す。図４０中「Ｍ」は分子量マーカー、「Ｆ」「ＧＧＦ」「ＦＧＧ」「ＧＧＦＨＤＥＬ」「ＧＧＦ／ＹＨ１」はそれぞれ「ｐＲＳ４３５Ｆ／ＹＰＨ４９９」「ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＰＨ４９９」「ｐＲＳ４３５ＦＧＧ／ＹＰＨ４９９」「ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ／ＹＰＨ４９９」「ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１」由来の蛋白質を電気泳動したレーンを示す。
ＢＴＳ１がコードするポリペプチドを検出する抗ＢＴＳ１−Ｃマウス抗体を用いた場合、約７９ｋＤａの融合蛋白質（ＧＧＦ、ＦＧＧおよびＧＧＦＨＤＥＬ）に相当するポリペプチドが検出された（図４０中白抜き三角で示した移動度のバンド）。この結果から、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入した組換え体においてＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子由来のＦＰＰ合成酵素−ＧＧＰＳ合成酵素融合蛋白質が実際に発現していることがわかった。またＹＰＨ４９９由来の蛋白質でも検出されたバンドが無いことから、非組換え細胞ではＢＴＳ１遺伝子にコードされたＧＧＰＰ合成酵素は発現量が微量だと言うことが予想された。
ｐＲＳ４３５Ｆ導入株（レーン「Ｆ」）ではＥＲＧ２０がコードするポリペプチドを検出する抗ＥＲＧ２０−Ｃマウス抗体でＥＲＧ２０がコードしているＦＰＰ合成酵素に相当する分子量（約４０ｋＤａ）を示す蛋白質の発現量が増加していることが示され（図中黒三角で示した移動度のバンド）、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ導入株（レーン「ＧＧＦ」）とｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬ（レーン「ＧＧＦＨＤＥＬ」）導入株では融合蛋白質（ＧＧＦおよびＧＧＦＨＤＥＬ）に相当するポリペプチドが検出された（図中白抜き三角で示した７９ｋＤａに相当する移動度約を示したバンド）。抗ＥＲＧ２０−Ｃ抗体では、ｐＲＳ４３５ＦＧＧ導入株で発現しているであろう融合遺伝子が検出されていないが、これはＦＰＰ合成酵素のＣ末端側にＧＧＰＰ合成酵素を融合させているため、ＦＰＰ合成酵素のＣ末端側を認識する抗ＥＲＧ２０−Ｃ抗体がうまく融合酵素を認識できなかったことが原因と考えられる。抗ＥＲＧ２０−Ｃ抗体で検出されたその他のバンドのうち、約４５ｋＤａのバンドは、非特異的に検出された蛋白質と予想され、４０ｋＤａ未満のバンドは、非特異的に検出された蛋白質またはＥＲＧ２０遺伝子がコードするアミノ酸配列を含んだ蛋白質の分解産物と予想される。
〔実施例１４〕  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＦ融合遺伝子とを共発現させたときのＧＧＯＨ生産
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子と、ＧＧＰＰ合成酵素−ＦＰＰ合成酵素融合蛋白質遺伝子であるＢＴＳ１−ＥＲＧ２０融合遺伝子の発現を強化すれば、ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ７６６２５，ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１Δ６３  ｈｉｓ３Δ２００  ｌｅｕ２Δ１）以外の株でも工業的に有用なＧＧＯＨ生産株が得られるかどうかを確認するために、以下の株を宿主に用いてｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１とｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを順次導入した。
ＩＮＶＳｃ１（ＭＡＴａ／ＭＡＴ  α  ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９  ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２／ｌｅｕ２）
ＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ７６６２６，ＭＡＴ  α  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１Δ６３  ｈｉｓ３Δ２００  ｌｅｕ２Δ１）
ＹＰＨ５０１（ＡＴＣＣ７６６２７，ＭＡＴａ／ＭＡＴ  α  ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１／ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１／ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１Δ６３／ｔｒｐ１−Δ６３  ｈｉｓ３Δ２００／ｈｉｓ３Δ２００  ｌｅｕ２Δ１／ｌｅｕ２Δ１）
Ｗ３０３−１Ａ（ＡＴＣＣ２０８３５２，ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３  ｌｅｕ２−１１２  ｈｉｓ３−１１  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００）
Ｗ３０３−１Ｂ（ＡＴＣＣ２０８３５３，ＭＡＴ  α  ｌｅｕ２−３  ｌｅｕ２−１１２  ｈｉｓ３−１１  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｔｒｐ１−１  ｃａｎ１−１００）
ＩＮＶＳｃ１、ＹＰＨ５００、ＹＰＨ５０１、Ｗ３０３−１Ａ、Ｗ３０３−１ＢにｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を導入した株をそれぞれ、ＩＨ１、ＹＨ２、ＹＨ３、ＷＨ１、ＷＨ２とした。これらＩＨ１、ＹＨ２、ＹＨ３、ＷＨ１、ＷＨ２を宿主としｐＲＳ４３５ＧＧＦを導入し、ＧＧＦ／ＩＨ１、ＧＧＦ／ＹＨ２、ＧＧＦ／ＹＨ３、ＧＧＦ／ＷＨ１、ＧＧＦ／ＷＨ２を得、ｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、ＨＤＥＬ／ＩＨ１、ＨＤＥＬ／ＹＨ２、ＨＤＥＬ／ＹＨ３、ＨＤＥＬ／ＷＨ１、ＨＤＥＬ／ＷＨ２を得た。得られた組換え体をＹＰＤＯ７ｒｉｃｈ培地で培養しプレニルアルコール生産性を測定した結果が図４１である。どの組換え体でもＧＧＯＨを優先的に生産し、ほとんどの株で１００ｍｇ／ｌ以上のＧＧＯＨを生産しており、特にＨＤＥＬ／ＹＨ２株では最大で１８９ｍｇ／ｌのＧＧＯＨを生産した。
〔実施例１５〕  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＦ融合遺伝子との共発現株をｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ及び二倍体化したときのＧＧＯＨ生産
ＧＧＯＨ生産株であるＧＧＦ／ＹＨ１をもとに、栄養要求性の原因となる変異型遺伝子を野生型遺伝子で置換し、さらにＹＰＨ５００由来株と接合させ原栄養体株（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ；培地に特定の栄養が補給されなくても増殖できる株）かつ二倍体化したＧＧＦ／ＹＨ３−ＡＨＫＵ株を下記のようにして作製した。
（１）ＧＧＦ／ＹＨ１へのＨＩＳ３、ＡＤＥ２導入と、ＹＰＨ５００へのＬＹＳ２、ＵＲＡ３導入
制限酵素ＰｖｕＩＩとＸｈｏＩで切断したｐＲＳ４０３ＧＡＰを鋳型にしＨＩＳ３−Ｌ（５’ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ３’（配列番号１２３））とＨＩＳ３−Ｒ（５’ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ３’（配列番号１２４））オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮＡに用いて次のような条件でＰＣＲを行いＨＩＳ３断片を調製した。
0003894119.tif 000058
同様にして、ＰｖｕＩＩとＸｈｏＩで消化したｐＲＳ４０６ＧＡＰを鋳型に用い、ＵＲＡ３−Ｌ（５’ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ３’（配列番号１２５））とＵＲＡ３−Ｒ（５’ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ３’（配列番号１２６））とをプライマーＤＮＡに用いてＵＲＡ３断片を調製した。
Ａ４５１ゲノムＤＮＡを鋳型にし、ＡＤＥ−１（５’ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ３’（配列番号１２７））とＡＤＥ−２（５’ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ３’（配列番号１２８））オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮＡに用い、または、ＬＹＳ−１（５’ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ３’（配列番号１２９））とＬＹＳ−２（５’ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ３’（配列番号１３０））オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮＡに用いて同様の反応条件でＡＤＥ２断片およびＬＹＳ２断片を調製した。調製したＨＩＳ３断片とＡＤＥ２断片をｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１に順次導入し、ヒスチジン非要求性かつ、アデニン非要求性を表現型として示したｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１−ＡＨを得、ＬＹＳ２断片とＵＲＡ３断片をＹＰＨ５００に順次導入し、リジン非要求性かつウラシル非要求性を表現型として示したＹＰＨ５００−ＫＵを得た。
（２）接合
ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１−ＡＨとＹＰＨ５００−ＫＵをＹＭ培地で３０℃で培養後ＤＯＢ（ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｂａｓｅ）寒天プレート培地に２株が交わるようにストリークし、３０℃で３日間インキュベートした。出現してきたコロニーをとり、前胞子形成プレート培地（１．６ｇ酵母エキス，０．６ｇポリペプトン，１００ｍＬ２０％グルコース，４ｇ寒天／１Ｌ）上で培養後、胞子形成プレート培地（２ｇ酢酸カリウム，０．２ｇ酵母エキス，５００μＬ２０％グルコース，４ｇ寒天／１Ｌ）上で培養後顕微鏡観察により胞子形成を確認した。最小培地であるＤＯＢプレート上で生育することにより原栄養株（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ）化を確認し、胞子形成培地上で胞子形成することにより二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）化を確認したクローンをＧＧＦ／ＹＨ３−ＡＨＫＵとした。
〔実施例１６〕  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養によるＧＧＯＨ生産（１）
ＧＧＦ／ＹＨ３−ＡＨＫＵを以下の条件でフェドバッチ（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）培養し、ＧＧＯＨ生産量を測定した。
（１）プレシード
培地組成は以下の通り。酵母エキス５ｇ／Ｌ，麦芽エキス５ｇ／Ｌ，バクトペプトン１０ｇ／Ｌ，グルコース５ｇ／Ｌ。
培地のｐＨは無調整とした。５００ｍｌ坂口フラスコに５０ｍｌの培地を張り込み１２０℃で２０ｍｉｎ殺菌した。スラントよりＧＧＦ／ＹＨ３−ＡＨＫＵを一白金耳掻き取り、３０℃、１２０ｒｐｍで往復振とう培養した。培養は２４時間とした。ＯＤ（２６倍希釈、５６２ｎｍ）は０．４に達した。
（２）シード
培地組成は以下の通り。グルコース２０ｇ／Ｌ，豆濃（味の素株式会社製）３１０ｍｇ／Ｌ（総窒素量として），ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４  ０．５ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム  ５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ，消泡剤  ０．１ｍｌ／Ｌ。豆濃中の総窒素濃度が６３ｇ／Ｌである場合、豆濃自体の添加液量は４．９ｍｌ／Ｌとなる。
培地成分を完全に溶解させた後、ＫＯＨ溶液にてｐＨを５．０に調整し、液量をあわせた後、１２０℃で２０ｍｉｎ殺菌した。
培養には、１リットル容ミニジャーを使用した。３００ｍｌ張り込みで、プレシード接種ボリュームは０．０６〜１ｍｌとした。プレシードを接種する前に、培地のｐＨを５．５に合わせた。通気は１／２ｖｖｍとし、温度は３０℃に設定した。ｐＨは５．５にアンモニアでコントロールした。攪拌は５００ｒｐｍでスタートし、溶存酸素（ＤＯ）＞２０％となるようにカスケード制御を行った。ＰＨが上昇した時点でシードを修了した。ＯＤ（５１倍希釈、５６２ｎｍ）は０．１８〜０．２に到達した。なお溶存酸素は、飽和時を１００％として算出した値である。
（３）メイン
培地組成は表１２の通り。全容に対し、Ａ区、Ｂ区、Ｃ区、Ｄ区はそれぞれ２０％、２０％、３０％、２０％の液量にフィルアップした。コーンスティープリカー（ＣＳＬ）は硫酸でｐＨを２．０にあわせた後、８０℃で一時間、予殺を行った。また添加濃度は総窒素量を基準とし、ＣＳＬ濃度の総窒素量は３１．４ｇ／Ｌだった。それぞれ１２０℃、２０ｍｉｎで殺菌した後混合し、液量を補正した後ベッセルに投入した。
0003894119.tif 000059
培養には１リットル容ミニジャーを使用した。１０％シードで、３００ｍｌ張り込みした。殺菌後培地のｐＨは２．６程度であったので、シード接種前にｐＨを上げた。通気は１／２ｖｖｍ、温度は３０℃とし、ｐＨは５．５にアンモニアで制御した。攪拌は５００ｒｐｍよりスタートし、ＤＯ＞２０％のカスケード制御を行った。グルコースフィードは培養２時間目より図４２に示したように、随時流速を上げていく形で行った。最大流速は３．５ｍｌ／ｈｒ、約５．８ｇ／ｌ／ｈｒグルコース相当とした。ＤＯ＞２０％を制御値とし、攪拌による溶存酸素確保が困難な場合、通気量を増加して対応した。培養約２０時間でフィード設定量が投入され、この時の到達ＯＤ（１０１倍希釈、５６２ｎｍ）は０．９〜１．０であった。
以降、培養条件に応じてフィードその他のパラメーターを変更した。
（４）培養条件検討
培養２０時間目までは同一条件下で菌体を形成させておき、以降グルコース、エタノールのＧＧＯＨ生成に与える影響について検討した。
４００ｇ／ｌのエタノール（区分１）と５００ｇ／ｌのグルコース液（区分２）とをフィードした。さらに区分１のエタノール溶液と区分２のグルコース液とを１：１に混合して区分３とした。フィード流速は３．５ｍｌ／ｈｒを最大とし、いずれの区分においても培養液中の基質濃度が１．０ｇ／ｌ以下になるよう、流速を調整した。生成したＧＧＯＨ蓄積量を表１３に示す。エタノールを炭素源としてフィードすることによって、ＧＧＯＨ蓄積量が増加することが判明した。
0003894119.tif 000060
〔実施例１７〕  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養によるＧＧＯＨ生産（２）
２００ｍｌのＤＯＢ（ｄｒｏｐｏｕｔ  ｂａｓｅ）グルコース最少培地（Ｑ・ＢＩＯｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にＧＧＦ／ＹＨ３−ＡＨＫＵ株を植菌し、３０℃、３日間回転培養した。次に、０．０９％グルコース、０．０７５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１４％硫酸マグネシウム、０．４５％硫酸アンモニウム、５．４％コーンスティープリカー、０．０３１％塩化カルシウム、０．１５％アデカノールＬＧ１０９（旭電化）を含む３．３５Ｌの培地（アンモニア水でｐＨ５．５に調整しておく）に全量を植菌し以下の条件で培養を行った。培養は、バッチ（Ｊａｒ１，Ｊａｒ２，Ｊａｒ３）で行った。
培養装置：ＭＳＪ−Ｕ２Ｗ（１０Ｌファーメンター）（丸菱バイオエンジ，東京都千代田区）
培養温度：３３℃
通気量：０．７４ｖｖｍ
攪拌速度：９００ｒｐｍ
ｐＨ５．５（４Ｎ水酸化ナトリウム溶液と２Ｎ硫酸溶液で調整）
４時間培養の後、４０％グルコース溶液のフィードを開始した。２１時間培養後Ｊａｒ２はフィード液を４０％グルコース、３．３％酢酸アンモニウム溶液に切り替え、Ｊａｒ３はフィード液を１．６５％酢酸アンモニウム、５０％エタノール、２０％グルコース溶液に切り替え、さらに培養を続けた。適宜培養液を無菌的に抜き取りプレニルアルコールを実施例８と同様に分析、定量した。培地中の糖濃度が０．１％以下になるようにフィードレートを調整した（最大１８．７ｇ／ｈ）。
この結果、ＦＯＨの生成を最小限にし、効率的に微生物によるＧＧＯＨ生産が可能であることが示された（表１４）。グルコースに加えて、エタノール、酢酸アンモニウムをフィードすることにより培養液中のＧＧＯＨ濃度は２．５ｇ／ｌに達した。
0003894119.tif 000061
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、プレニルアルコールの製造方法が提供される。本発明によれば、プレニルアルコール（特にゲラニルゲラニオール）を大量に入手できるため、生体内において重要な物質の生産に利用することができる点で、また、活性型プレニルアルコールの新たな生理活性を見出すための試薬として利用できる点で、本発明の方法は有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２５〜１２０：合成ＤＮＡ
配列番号１２１：合成ペプチド
配列番号１２２：合成ペプチド
配列番号１２３〜１３０：合成ＤＮＡ
【配列表】
0003894119.tif 000062
0003894119.tif 000063
0003894119.tif 000064
0003894119.tif 000065
0003894119.tif 000066
0003894119.tif 000067
0003894119.tif 000068
0003894119.tif 000069
0003894119.tif 000070
0003894119.tif 000071
0003894119.tif 000072
0003894119.tif 000073
0003894119.tif 000074
0003894119.tif 000075
0003894119.tif 000076
0003894119.tif 000077
0003894119.tif 000078
0003894119.tif 000079
0003894119.tif 000080
0003894119.tif 000081
0003894119.tif 000082
0003894119.tif 000083
0003894119.tif 000084
0003894119.tif 000085
0003894119.tif 000086
0003894119.tif 000087
0003894119.tif 000088
0003894119.tif 000089
0003894119.tif 000090
0003894119.tif 000091
0003894119.tif 000092
0003894119.tif 000093
0003894119.tif 000094
0003894119.tif 000095
0003894119.tif 000096
0003894119.tif 000097
0003894119.tif 000098
0003894119.tif 000099
0003894119.tif 000100
0003894119.tif 000101
0003894119.tif 000102
0003894119.tif 000103
0003894119.tif 000104
0003894119.tif 000105
0003894119.tif 000106
0003894119.tif 000107
0003894119.tif 000108
0003894119.tif 000109
0003894119.tif 000110
0003894119.tif 000111
0003894119.tif 000112
0003894119.tif 000113
0003894119.tif 000114
0003894119.tif 000115
0003894119.tif 000116
0003894119.tif 000117
0003894119.tif 000118
0003894119.tif 000119
0003894119.tif 000120
0003894119.tif 000121
0003894119.tif 000122
0003894119.tif 000123
0003894119.tif 000124
0003894119.tif 000125
0003894119.tif 000126
0003894119.tif 000127
0003894119.tif 000128
0003894119.tif 000129
0003894119.tif 000130
0003894119.tif 000131
0003894119.tif 000132
0003894119.tif 000133
0003894119.tif 000134
0003894119.tif 000135
0003894119.tif 000136
0003894119.tif 000137
0003894119.tif 000138
0003894119.tif 000139
0003894119.tif 000140
0003894119.tif 000141
0003894119.tif 000142
0003894119.tif 000143
0003894119.tif 000144
0003894119.tif 000145
0003894119.tif 000146
0003894119.tif 000147
0003894119.tif 000148
0003894119.tif 000149
0003894119.tif 000150
0003894119.tif 000151
0003894119.tif 000152
0003894119.tif 000153
0003894119.tif 000154
0003894119.tif 000155
0003894119.tif 000156
0003894119.tif 000157
0003894119.tif 000158
0003894119.tif 000159
0003894119.tif 000160
0003894119.tif 000161
0003894119.tif 000162
0003894119.tif 000163
0003894119.tif 000164
0003894119.tif 000165
0003894119.tif 000166
0003894119.tif 000167
0003894119.tif 000168
0003894119.tif 000169
0003894119.tif 000170
0003894119.tif 000171
0003894119.tif 000172
0003894119.tif 000173
0003894119.tif 000174
0003894119.tif 000175
0003894119.tif 000176
0003894119.tif 000177
0003894119.tif 000178
0003894119.tif 000179
0003894119.tif 000180
0003894119.tif 000181
0003894119.tif 000182
0003894119.tif 000183
0003894119.tif 000184
0003894119.tif 000185
0003894119.tif 000186
0003894119.tif 000187
0003894119.tif 000188
0003894119.tif 000189
0003894119.tif 000190
0003894119.tif 000191
0003894119.tif 000192
0003894119.tif 000193
0003894119.tif 000194
0003894119.tif 000195
0003894119.tif 000196
0003894119.tif 000197
0003894119.tif 000198
0003894119.tif 000199
0003894119.tif 000200
0003894119.tif 000201
0003894119.tif 000202
0003894119.tif 000203
0003894119.tif 000204
0003894119.tif 000205
0003894119.tif 000206
0003894119.tif 000207
0003894119.tif 000208
0003894119.tif 000209
0003894119.tif 000210
0003894119.tif 000211
0003894119.tif 000212
0003894119.tif 000213
0003894119.tif 000214
0003894119.tif 000215
0003894119.tif 000216
0003894119.tif 000217
0003894119.tif 000218
【図面の簡単な説明】
図１は、メバロン酸経路関連酵素の代謝経路を示す図である。
図２Ａは、置換変異のパターンを示す図である。
図２Ｂは、欠失型ＨＭＧ１遺伝子の構築図である
図３は、プラスミドｐＲＳ４１４を示す図である。
図４は、プラスミドｐＹＥＳ２を示す図である。
図５は、ＡＤＨ１プロモーター、ターミネーターの配列を示す図である。
図６Ａは、プラスミドｐＲＳ４１４ＰＴａｄｈを示す図である。
図６Ｂは、プラスミドｐＲＳ４１４ＴＰａｄｈを示す図である。
図７Ａは、プラスミドｐＲＳ４３４ＧＡＰを示す図である。
図７Ｂは、プラスミドｐＲＳ４３４ＴＥＦを示す図である。
図７Ｃは、プラスミドｐＲＳ４３５ＧＡＰを示す図である。
図７Ｄは、プラスミドｐＲＳ４４４ＧＡＰを示す図である。
図７Ｅは、プラスミドｐＲＳ４４４ＴＥＦを示す図である。
図７Ｆは、プラスミドｐＲＳ４４５ＧＡＰを示す図である。
図８は、ｐＴ７ベクターに挿入された各メバロン酸経路関連遺伝子の方向を示す図である。
図９は、プラスミドｐＡＬＨＭＧ１０６の物理地図を示す図である。
図１０は、ＯＲＦ１８２断片上の制限酵素認識部位を示す図である。
図１１は、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＰＰ合成酵素変異体（Ｙ８１Ｍ）の発現ベクターを示す図である。
図１２は、サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
図１３は、ＰＣＲマッピングの結果を示す写真である。
図１４は、ノーザンブロッティングの結果を示す写真である。
図１５Ａは、粗酵素液中の各プレニル二リン酸合成酵素の比活性を示す図である。
図１５Ｂは、粗酵素液中の各プレニル二リン酸合成酵素の比活性を示す図である。
図１６は、恒常発現型プロモーターを連結したＨＭＧ１遺伝子をＡ４５１に導入したときの各組換え体のＧＧＯＨ生産量を示す図である。
図１７は、ＧＡＬ１ｐ−ＨＭＧ１を含むＹＥｐ発現ベクターを保持するＡ４５１又はＡＵＲＧＧ１０１を宿主としたときの各組換え体のＧＧＯＨ生産量を示す図である。
図１８は、プラスミドｐＹＥＳ２−ＨＭＧを、ＡＵＲＧＧ１０２とＡＵＲＧＧ７０３へ導入したときの各組換え体のＧＧＯＨ生産量を示す図である。
図１９は、ＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入したときの各組換え体のＧＧＯＨ生産量を示す図である。
図２０は、ＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入したときの各組換え体のＧＧＯＨ生産量を示す図である。
図２１は、ＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入したときのＧＧＯＨ生産量を示す図である
図２２は、ＧＡＬ１ｐを含むベクターｐＹＥＳ２に欠失型ＨＭＧ１’遺伝子を挿入したときのＧＧＯＨ生産量を示す図である
図２３は、ｐ４Ｍ、ｐ１６Ｍ等を保持する組換えＥ．ｃｏｌｉを、ＩＰＰとＤＭＡＰＰを含む培地で培養したときのプレニルアルコール生成量を示す図である。
図２４は、ＢＴＳ１とＥＲＧ２０の融合遺伝子を作製するために使用するプライマー並びにその位置及び方向を示す図である。
図２５は、ＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子をＡ４５１系の株に導入してＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図２６は、ＥＲＧ２０−ＢＴＳ１融合遺伝子をＹＰＨ４９９系の株に導入してＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図２７は、ＴＥＦ２ｐ−ＨＭＧ１を導入したＹＰＨ４９９系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図２８は、ＴＤＨ３ｐ−ＨＭＧ１を導入したＹＰＨ４９９系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図２９Ａは、Ａ４５１系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図２９Ｂは、Ａ４５１系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図３０Ａは、ＹＰＨ４９９系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図３０Ｂは、ＹＰＨ４９９系株を宿主としたときのＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図３１Ａは、Ａ４５１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３１Ｂは、Ａ４５１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３１Ｃは、Ａ４５１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３２Ａは、ＡＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３２Ｂは、ＡＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３２Ｃは、ＡＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３３Ａは、ＥＵＧ５にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３３Ｂは、ＥＵＧ５にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３３Ｃは、ＥＵＧ５にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３４Ａは、ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３４Ｂは、ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３４Ｃは、ＹＰＨ４９９にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３５Ａは、ＹＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３５Ｂは、ＹＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３５Ｃは、ＹＨ１にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３６Ａは、ＥＵＧ１２にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で２日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３６Ｂは、ＥＵＧ１２にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で４日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３６Ｃは、ＥＵＧ１２にｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３５ＧＧＦＨＤＥＬを導入し、所定の糖組成で７日培養したときのＧＧＯＨの生産量を示す図である。
図３７は、ｐＲＳ４３５ＧＧＦ／ＹＨ１（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１／ＹＰＨ４９９）株を、大豆油含有培地でジャーファーメンター培養したときのプレニルアルコール生産量を測定した結果を示す図である。
図３８は、１５−２株を、大豆油含有培地でジャーファーメンター培養したときのプレニルアルコール生産量を測定した結果を示す図である。
図３９は、融合遺伝子の発現を確認するために行ったノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
図４０は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。
図４１Ａは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子と、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子−ＦＰＰ合成酵素遺伝子融合遺伝子とを共発現させた株におけるＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図４１Ｂは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子と、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子−ＦＰＰ合成酵素遺伝子融合遺伝子とを共発現させた株におけるＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図４１Ｃは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子と、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子−ＦＰＰ合成酵素遺伝子融合遺伝子とを共発現させた株におけるＧＧＯＨ生産量を測定した結果を示す図である。
図４２は、フィード液の流速条件を示す図である。
【図１】
0003894119.tif 000219
【図２Ａ】
0003894119.tif 000220
【図２Ｂ】
0003894119.tif 000221
【図３】
0003894119.tif 000222
【図４】
0003894119.tif 000223
【図５】
0003894119.tif 000224
【図６Ａ】
0003894119.tif 000225
【図６Ｂ】
0003894119.tif 000226
【図７Ａ】
0003894119.tif 000227
【図７Ｂ】
0003894119.tif 000228
【図７Ｃ】
0003894119.tif 000229
【図７Ｄ】
0003894119.tif 000230
【図７Ｅ】
0003894119.tif 000231
【図７Ｆ】
0003894119.tif 000232
【図８】
0003894119.tif 000233
【図９】
0003894119.tif 000234
【図１０】
0003894119.tif 000235
【図１１】
0003894119.tif 000236
【図１２】
0003894119.tif 000237
【図１３】
0003894119.tif 000238
【図１４】
0003894119.tif 000239
【図１５Ａ】
0003894119.tif 000240
【図１５Ｂ】
0003894119.tif 000241
【図１６】
0003894119.tif 000242
【図１７】
0003894119.tif 000243
【図１８】
0003894119.tif 000244
【図１９】
0003894119.tif 000245
【図２０】
0003894119.tif 000246
【図２１】
0003894119.tif 000247
【図２２】
0003894119.tif 000248
【図２３】
0003894119.tif 000249
【図２４】
0003894119.tif 000250
【図２５】
0003894119.tif 000251
【図２６】
0003894119.tif 000252
【図２７】
0003894119.tif 000253
【図２８】
0003894119.tif 000254
【図２９Ａ】
0003894119.tif 000255
【図２９Ｂ】
0003894119.tif 000256
【図３０Ａ】
0003894119.tif 000257
【図３０Ｂ】
0003894119.tif 000258
【図３１Ａ】
0003894119.tif 000259
【図３１Ｂ】
0003894119.tif 000260
【図３１Ｃ】
0003894119.tif 000261
【図３２Ａ】
0003894119.tif 000262
【図３２Ｂ】
0003894119.tif 000263
【図３２Ｃ】
0003894119.tif 000264
【図３３Ａ】
0003894119.tif 000265
【図３３Ｂ】
0003894119.tif 000266
【図３３Ｃ】
0003894119.tif 000267
【図３４Ａ】
0003894119.tif 000268
【図３４Ｂ】
0003894119.tif 000269
【図３４Ｃ】
0003894119.tif 000270
【図３５Ａ】
0003894119.tif 000271
【図３５Ｂ】
0003894119.tif 000272
【図３５Ｃ】
0003894119.tif 000273
【図３６Ａ】
0003894119.tif 000274
【図３６Ｂ】
0003894119.tif 000275
【図３６Ｃ】
0003894119.tif 000276
【図３７】
0003894119.tif 000277
【図３８】
0003894119.tif 000278
【図３９】
0003894119.tif 000279
【図４０】
0003894119.tif 000280
【図４１Ａ】
0003894119.tif 000281
【図４１Ｂ】
0003894119.tif 000282
【図４１Ｃ】
0003894119.tif 000283
【図４２】
0003894119.tif 000284