(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体を含有し、かつ、下記式(１)および式(２)を満足することを特徴とする甘味料。
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(Ｘ)〕≧０．４        (１)
〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．０            (２)
〔式中、ＧＲＡは甘味料中に含まれるβ−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合を表し、ＲＡは甘味料中に含まれるレバウディオサイドＡの重量割合を表し、Ｘは甘味料中に含まれるステビオール配糖体の重量割合を表す。〕
【請求項２】
下記式(３)および(４)を満足する請求項１記載の甘味料。
０．９５≧〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(Ｘ)〕≧０．５        (３)
１０．０≧〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．１            (４)
（式中、ＧＲＡ、ＲＡおよびＸは前記と同じである。）
【請求項３】
下記式(５)を満足する請求項１または２記載の甘味料。
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(ＧＳＴ＋ＳＴ)〕≧１．０        (５)
〔式中、ＧＲＡおよびＲＡは前記と同じである。また、ＧＳＴは甘味料中に含まれるβ−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜２個有するβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドの重量割合を表し、ＳＴは甘味料中に含まれるステビオサイドの重量割合を表す。〕
【請求項４】
下記式(３)、(６)および(７)を満足する請求項１記載の甘味料。
０．９５≧〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(Ｘ)〕≧０．５        (３)
５．０≧〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．１              (６)
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(ＧＳＴ＋ＳＴ)〕≧１．５        (７)
（式中、ＧＲＡ、ＲＡ、Ｘ、ＧＳＴおよびＳＴは前記と同じである。）
【請求項５】
レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の５〜２０倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させることを特徴とする甘味料の製造方法。
【請求項６】
前記水溶液中のレバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物固形分濃度が１〜５重量％であり、且つ、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を前記ステビア抽出物固形分１ｇに対して１〜１０００ユニット用いる請求項５記載の甘味料の製造方法。
【請求項７】
前記レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物が、ステビオサイドに対して１．５重量倍以上のレバウディオサイドＡを含むステビア抽出物である請求項５または６記載の甘味料の製造方法。
【請求項８】
前記β−１，４−ガラクトシル糖化合物が、乳糖である請求項７記載の甘味料の製造方法。
【請求項９】
前記β−１，４−ガラクトシル転移酵素が、バシルス属微生物由来の酵素である請求項７記載の甘味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い甘味度と優良な甘味質とを有し、種々の飲食物の甘味剤として有用な、レバウディオサイドＡとβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡとを主成分として含有する甘味料およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
砂糖（ショ糖）は、従来から飲食物の甘味料として広く利用されている。特に、缶入りコーヒーをはじめとするコーヒー飲料等や炭酸飲料等の清涼飲料水には多量の砂糖が用いられている。しかし、近年、健康志向や低カロリー志向の影響を受けて、肥満、糖尿病、ムシ歯の原因となる砂糖を減量したり、砂糖の替わりに高甘味度甘味料が利用される傾向にある。
【０００３】
このような高甘味度甘味料としては、南米パラグアイを原産地とするキク科の多年生植物、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＢＥＲＴＯＮＩ）の抽出物由来のステビア甘味料が挙げられる。
【０００４】
ステビア植物の抽出物（以下、ステビア抽出物と称する）から得られるステビア甘味料は、砂糖の数百倍の優れた甘味度を有するが、砂糖に比較して、甘味の発現が遅いという特徴、いわゆる甘味の立ち上がりが遅いという特徴と、後味として比較的長く甘味が残るという特徴、いわゆる、甘味の切れが悪いという特徴とがある。また、該ステビア甘味料に多量に含まれるステビオサイドには、甘味とは別に、後味に独特の渋味や苦味を伴う欠点があり、コーヒー飲料や清涼飲料水に用いると、明らかに違和感を感じる。
【０００５】
このため、ステビア甘味料の甘味質改善の為に種々の研究がなされてきた。例えば、特開昭５８−０９４３６７号公報には、ステビオサイドを主成分としたステビア抽出物とβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを有する水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させて、ステビオサイドにガラクトシル基をβ−１，４−結合させたβ−１，４−グルコシルステビオサイドを主成分とする甘味料の製造方法が開示されている。
【０００６】
この製造方法によれば、まろやかな甘味に改善され、さらに甘味の切れも比較的良くなり、苦味や渋味も低減されたものの、甘味質の改善効果は充分ではなく、特にコーヒー飲料や清涼飲料水に使用するには、未だ不十分であった。
【０００７】
また、特開平９−１０７９１３号公報等には、レバウディオサイドＡを主成分としたステビア抽出物にグルコースをα−付加反応させる方法が開示されている。しかし、酵素反応が進むとレバウディオサイドＡに付加したグルコースから長鎖のグルコース鎖が形成され、得られるα−グルコシルレバウディオサイドＡの甘味度はレバウディオサイドＡと比較して４５％程度も低下してしまう、という問題があった。
【０００８】
このように、従来の糖付加ステビア甘味料は、糖付加により、ある程度甘味質は改善されるものの、甘味度は低下し、また、ステビア甘味料特有の欠点である甘味の立ち上がりの遅さや、後味に苦味や渋味を伴う点の改善は未だ十分ではなく、コーヒー飲料や清涼飲料水等への使用に際して違和感が残っていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ステビア甘味料の高い甘味度を残しながら、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れが良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味を低減させた甘味料およびその製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、次の知見を見出した。
（Ａ）甘味料中に含まれるβ−１，４−ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合（ＧＲＡ）と、甘味料中に含まれるレバウディオサイドＡの重量割合（ＲＡ）と、甘味料中に含まれるステビオール配糖体の重量割合（Ｘ）が特定の関係にある甘味料は、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味が低減された甘味料である。
（Ｂ）β−１，４−ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡは、レバウディオサイドＡに付加したガラクトシル基にさらにガラクトシル基が付加重合することがないために甘味度の低下がレバウディオサイドＡの３０％程度に抑えられる。
（Ｃ）前記甘味料は、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の５〜２０倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させることにより容易に製造できる。
本発明は、上記知見に基づき完成された。
【００１１】
すなわち、本発明は、ステビオール配糖体を含有し、かつ、下記式(１)および式(２)を満足することを特徴とする甘味料を提供するものである。
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(Ｘ)〕≧０．４        (１)
〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．０            (２)
〔式中、ＧＲＡは甘味料中に含まれるβ−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合を表し、ＲＡは甘味料中に含まれるレバウディオサイドＡの重量割合を表し、Ｘは甘味料中に含まれるステビオール配糖体の重量割合を表す。〕
【００１２】
また、本発明は、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の５〜２０倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させることを特徴とする甘味料の製造方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の甘味料は、ステビオール配糖体を含有し、かつ、前記式(１)および式(２)を満足するものであればよいが、なかでも、よりまろやかな甘味となることから、下記式(３)および(４)を満足するものであることが好ましく、さらに下記式(５)を満足するものであることがより好ましい。
０．９５≧〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(Ｘ)〕≧０．５        (３)
１０．０≧〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．１            (４)
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(ＧＳＴ＋ＳＴ)〕≧１．０        (５)
〔式中、ＧＲＡおよびＲＡは前記と同じである。また、ＧＳＴは、甘味料中に含まれる、β−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜２個有するβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドの重量割合を表し、ＳＴは甘味料中に含まれるステビオサイドの重量割合を表す。〕
【００１４】
また、特にまろやかな甘味となることから、前記式(３)と共に下記式(６)および式(７)を満足するものであることが最も好ましい。
５．０≧〔(ＧＲＡ)／(ＲＡ)〕≧１．１              (６)
〔(ＧＲＡ＋ＲＡ)／(ＧＳＴ＋ＳＴ)〕≧１．５        (７)
（式中、ＧＲＡ、ＲＡ、ＧＳＴおよびＳＴは、前記と同じである。）
【００１５】
本発明の甘味料を得る方法としては、特に限定はないが、なかでも、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の５〜２０倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させるという、前記本発明の製造方法が、前記式(１)および式(２)を満足する甘味料であって、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味が低減された甘味料を、容易に得ることができることから好ましい。
【００１６】
ステビア抽出物としてレバウディオサイドＡを４０重量％未満の範囲で含有するステビア抽出物を用いた製造方法では、β−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ（以下、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡと称する。）の重量割合とレバウディオサイドＡの重量割合との合計(ＧＲＡ＋ＲＡ)が低くなり、同時に、β−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜２個有するβ−１，４−ガラクトシルステビオサイド（以下、β−１，４−ガラクトシルステビオサイドと称する。）の重量割合とステビオサイドの重量割合との合計（ＧＳＴ＋ＳＴ）が高くなることから、前記式(１)および式(２)を満足する甘味料とすることが困難となり、まろやかな甘味質が低下し、甘味の立ち上がりが遅く、甘味の切れも悪くなり、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味を伴うようになることから、好ましくない。
【００１７】
ステビア抽出物には、通常、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、ズルコサイドＡ等のステビオール配糖体からなる甘味成分が含有されており、ステビオサイドは以下の構造を有するものである。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
また、レバウディオサイドＡは、前記ステビオサイドの構造中の１３−Ｇ１で示されるグルコース残基に、さらにグルコースが結合した、以下の構造を有するものである。
【００２０】
【化２】
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【００２１】
前記本発明の製造方法で用いるβ−１，４−ガラクトシル糖化合物の代表例としては、ガラクトースとグルコースとが結合した二糖類、例えば、乳糖（ラクトース）、α−Ｄ−ガラクトース等が挙げられる。これらは、以下の構造を有するものである。
【００２２】
【化３】
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【００２３】
【化４】
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【００２４】
本発明の甘味料に含有されるβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡとしては、例えば、レバウディオサイドＡのステビオール骨格の１３位に結合したグルコース残基（１３−Ｇ１と称する。）、該ステビオール骨格の１３位に結合したグルコース残基に結合した２つのグルコース残基（１３−Ｇ２、１３−Ｇ３と称する。）、および、ステビオール骨格の１９位に結合したグルコース残基（１９−Ｇ１と称する。）の４個のグルコース残基のうちの１〜３個のグルコース残基のおのおのに、１個のガラクトシル基がβ−１，４−結合で結合しているもの等が挙げられる。
【００２５】
レバウディオサイドＡのグルコース残基の中でも、β−１，４−ガラクトシル転移酵素の作用によりガラクトシル基がβ−１，４−転移しやすいのは、１３−Ｇ２、１３−Ｇ３および１９−Ｇ１の３つのグルコース残基であると推定される。実際、後記する実施例に示したように、高速液体クロマトグラフィーによる分析では、レバウディオサイドＡに３つまでのガラクトシル基が結合したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡのピークが確認されている。
【００２６】
それらのガラクトシル基は、立体障害から前記の１３−Ｇ２、１３−Ｇ３および１９−Ｇ１の３つのグルコース残基に各々１つずつβ−１，４−結合しており、酵素反応の進行に伴い、レバウディオサイドＡに１つβ−１，４−ガラクトシル基が結合したもの（β−１，４−モノガラクトシルレバウディオサイドＡ）から、次に２つβ−１，４−ガラクトシル基が結合したもの（β−１，４−ジガラクトシルレバウディオサイドＡ）、さらに３つのβ−１，４−ガラクトシル基が結合したもの（β−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡ）が、順次生成するものと推定され、本発明で提供する甘味料中のβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡは、それらの複数のβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの混合物から成る。
【００２７】
ただし、本発明で提供する甘味料には、β−１，４−ガラクトシル転移酵素の作用によりβ−１，４−ガラクトシル糖化合物からガラクトシル基をレバウディオサイドＡに転移させて得られるガラクトシルレバウディオサイドＡであれば、前記した主たるβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの他に、例えば、前記の１３−Ｇ１にガラクトシル基がβ−１，４−付加したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡや、他の少量のガラクトシルレバウディオサイドＡが含まれていても差し支えない。
【００２８】
また、前記した本発明の甘味料の製造方法で用いるステビア抽出物としては、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物であることが必須であるが、なかでも、まろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味が低減された甘味料をさらに容易に得ることができることから、レバウディオサイドＡを５０重量％以上含むステビア抽出物であることが好ましく、レバウディオサイドＡを７０〜９５重量％含むステビア抽出物であることがより好ましい。さらに、本発明の製造方法で用いるステビア抽出物としては、ステビオサイドに対して１．５重量倍以上のレバウディオサイドＡを含むステビア抽出物であることが特に好ましい。これは、β−１，４−ガラクトシル転移酵素によりレバウディオサイドＡにガラクトシル基が転移したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの甘味度は、元のレバウディオサイドＡよりも低下するが、その甘味度低下率は、ステビオサイドにガラクトシル基が結合したβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドの甘味度の低下率よりもかなり小さいことに起因するものと思われる。なお、ステビア抽出物中のレバウディオサイドＡの含量比率が４０重量％未満であると、得られる甘味料の甘味度と甘味質が低下し、甘味質が優良でなくなるため、好ましくない。
【００２９】
前記の条件を満足するステビア抽出物を得る方法としては、以下に示す２つの方法が一般的であるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００３０】
第１の方法は、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含み、ステビオサイドに対して１．５重量倍以上のレバウディオサイドＡを含むステビア  レバウディアナ  ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＢＥＲＴＯＮＩ）の植物体または乾燥葉を水または含水メタノール、含水エタノール等の含水有機溶媒で抽出し、得られた抽出液から非甘味成分を除去する方法である。
【００３１】
第２の方法は、ステビオサイドに対して任意の比率でレバウディオサイドＡを含むステビア  レバウディアナ  ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＢＥＲＴＯＮＩ）の植物体または乾燥葉を水または含水メタノール、含水エタノール等の含水有機溶媒で抽出し、得られた抽出液から非甘味成分を除去した後に、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含み、レバウディオサイドＡがステビオサイドに対して１．５重量倍以上になる様に、再結晶やカラム精製などの一般的な方法で分離・精製取得する方法である。これら第１と第２の方法は組み合わせて実施することもできる。
【００３２】
これら第１および第２の方法において、非甘味成分を除去する方法としては、例えば、ステビア抽出液を陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂でイオン性不純物を除去した後、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で溶離し、溶離液を減圧濃縮する方法、逆に、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で溶離後、溶離液を減圧濃縮して該有機溶媒を除去し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂でイオン性不純物を除去する方法等の一般的な精製方法等が挙げられる。
【００３３】
前記の陽イオン交換樹脂としては、例えば、アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ株式会社製品）等が挙げられ、陰イオン交換樹脂としてはオルガノ株式会社製のアンバーライトＩＲＡ−９３等が挙げられる。吸着樹脂としては、例えば、オルガノ株式会社製のアンバーライトＸＡＤ−２等が挙げられる。
【００３４】
また、前記第２の方法において、抽出液から非甘味成分を除去した後に、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含み、レバウディオサイドＡがステビオサイドに対して１．５重量倍以上になる様に分離・精製する工業的な方法としては、例えば、非甘味成分を除去したステビア抽出物を、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒に飽和濃度になるまで溶解し、濃縮、冷却等の手段によりレバウディオサイドＡを選択的に析出させた後、濾過などの方法により、結晶を分離する再結晶方法等が挙げられる。
【００３５】
本発明で用いるβ−１，４−ガラクトシル糖化合物は、β−１，４−ガラクトシル転移酵素の基質になり、該β−１，４−ガラクトシル糖化合物からβ−１，４−ガラクトシル基をレバウディオサイドＡに転移できるものであればよく、特に限定されないが、入手の容易さなどから乳糖（ラクトース）が最も好ましい。
【００３６】
本発明で用いるβ−１，４−ガラクトシル転移酵素としては、β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素であればよく、例えば、β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物由来の酵素が挙げられ、なかでも、該微生物を培養した培養菌体から抽出した酵素が、取り扱いが容易であることから好ましいが、このようなβ−１，４−ガラクトシル転移酵素の代わりに、β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物を培養した菌体懸濁液をそのまま用いても良いし、該微生物を固定した固定化菌体を用いても良い。前記培養菌体から抽出した酵素としては、乳糖を加水分解するラクターゼ、例えば、大和化成株式会社製のビオラクタなどが挙げられる。
【００３７】
前記β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物としては、ロドトルラ属微生物が好ましく用いられ、特にロドトルラ  ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ−１５４０、ロドトルラ  マリナ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）ＩＦＯ−１４２１、ロドトルラ  ラクトサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｌａｃｔｏｓａ）ＩＦＯ−１４２４が好ましい。
【００３８】
また、バシルス属微生物も好ましく用いることができ、特に、バシルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）が好ましく用いられる。さらに、前記β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物としては、病原性などの飲食物として好ましくない性質を有しない限り、β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物であれば上記以外の属や種に属する微生物であってもよい。
【００３９】
これらの微生物は、通常の微生物の生育に適した培地、例えば、炭素源としてはグルコース、シュクロース、ラクトース、グリセリン等を、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、酢酸アンモニウム等を、含窒素天然物としては、酵母エキス、コーンスティーブリカー等を、無機塩類としてはリン酸カリウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を含有し、更にビタミン類、微量金属塩等を含有した培地で成育することにより得られる。
【００４０】
β−１，４−ガラクトシル糖化合物からのレバウディオサイドＡへのガラクトシル基の転移とβ−１，４−付加反応は、レバウディオサイドＡを含むステビア抽出物とβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含有する水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を添加することにより進行する。
【００４１】
本発明の製造方法で用いる、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物とβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液は、該ステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の５〜２０倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含めば良いが、なかでも、６〜１６倍量のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物を有するのが好ましい。
【００４２】
前記した水溶液中のステビア抽出物固形分濃度は、通常０．１〜１５重量％で良いが、経済性を考慮すると１〜５重量％が好ましい。また、該水溶液中でのβ−１，４−ガラクトシル糖化合物の濃度は、通常０．１〜３０重量％で良いが、経済性と生産性を考慮すると５〜２０重量％が好ましい。
【００４３】
β−１，４−ガラクトシル転移酵素の使用量は、β−１，４−ガラクトシル転移酵素が作用してβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを生成させる量であれば制限はないが、反応効率が良好なことと経済的なことから、ステビア抽出物固形分１ｇあたり１〜１０００ユニット（Ｕ）用いるのが好ましく、５〜５００Ｕ用いるのがより好ましい。ここで、１ユニット（Ｕ）とは、１μｍｏｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＯＮＰＧという。）とβ−１，４−ガラクトシル転移酵素とを反応させた時、該ＯＮＰＧ中のβ−ガラクトシド結合を加水分解し、１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールを１分間に生成するのに要する該ガラクトシル転移酵素の量を言う。
【００４４】
β−１，４−ガラクトシル転移酵素のユニットの測定は、濃度５ｍｍｏｌ／ｌ（リットル）のＯＮＰＧ水溶液２．５ｍｌと濃度１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム・ナトリウム緩衝液（ｐH７．２５）４．９ｍｌとを混合した溶液に、酵素液０．１ｍｌを加えて４０℃で１０分間反応させた後、濃度１．０ｍｏｌ／ｌの炭酸ナトリウム（Na2CO3）水溶液２．５ｍｌを加えて反応を停止させ、必要があれば適量の純水で希釈し、生成したｏ−ニトロフェノールの波長４２０ｎｍに於ける吸収を測定し、得られた吸光度から該ニトロフェノールの生成量を定量したのち、その生成量を１０で割り、１分間に生成した該ニトロフェノールの量を求めることにより行った。
【００４５】
該水溶液にβ−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させる際の系のｐＨは、β−１，４−ガラクトシル転移酵素が作用してβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを生成させうる条件であれば特に制限されるものではないが、通常ｐＨ３〜１０であり、なかでも酵素反応効率に優れることから、ｐＨ４〜７が好ましい。この際の温度も、β−１，４−ガラクトシル転移酵素が作用してβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを生成させうる条件であれば特に制限されるものではないが、通常２０〜７０℃であり、なかでも酵素反応効率に優れることから、４０〜６０℃が好ましい。該水溶液にβ−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させる時間は、通常３〜４８時間であるが、経済性と生産性を考慮すると９〜２４時間が好ましい。
【００４６】
β−１，４−ガラクトシル転移酵素の作用によるβ−１，４−ガラクトシル糖化合物からのガラクトシル基のレバウディオサイドＡへのβ−１，４−転移は、β−１，４−ガラクトシル糖化合物からのガラクトシル基の切断と、β−１，４−転移とが同時に生じるものであり、一度レバウディオサイドＡのグルコース残基に転移したガラクトシル基の４位の水酸基へは新たなガラクトシル基はβ−１，４−転移できず、α−１，４−グルコシダーゼやグルコシルトラスフェラーゼのように、先に転移したグルコース残基の４位の水酸基に、さらに新たなグルコシル基が次々にα−１，４−付加重合して長鎖のグルコース鎖を形成し、得られる甘味料の甘味度を低下させることがないという利点を有する。
【００４７】
ステビア抽出物とβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液にβ−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させた後の水溶液は、そのまま甘味料として使用することもできるが、通常は、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を加熱失活させた後（ただし、β−１，４−ガラクトシル転移酵素の代わりに、β−１，４−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物を培養した菌体懸濁液等を用いた場合は、該微生物の加熱殺菌も行った後）、スチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、例えばダイヤイオンＨＰ−２１（三菱化学株式会社製品）、アンバーライトＸＡＤ−２（オルガノ株式会社製品）や、陽イオン交換樹脂や、陰イオン交換樹脂を用いて不純物を除去した後、濃縮してシロップ状の甘味料としたり、乾燥して粉末状の甘味料として使用する。この際、濃縮、乾燥、粉末化の手段は公知慣用の方法、例えば減圧濃縮、膜濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥等の各種の方法が採用できる。
【００４８】
本発明の甘味料や本発明の製造方法で得られる甘味料は、単独で用いることもできるが、ソルビトール、マルチトール、還元水飴、キシリトール、トレハロース、エリスリトール等の砂糖より甘味度の低い低カロリー甘味料と併用することができ、これらの甘味料の特性を損なうことなくさらに強い甘味を付与することが可能であり、良質の低カロリー甘味料製剤とすることができる。
【００４９】
また、本発明の甘味料や本発明の製造方法で得られる甘味料の乾燥物は、淡黄色〜白色を呈する無臭の粉末である。この為、該甘味料は、例えば、乾燥物単独、若しくは、希釈剤として砂糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、異性化糖、水飴、デキストリン、澱粉等の糖質系甘味料と併用した状態で好適に使用することもできる。またさらに、甘草抽出物、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース等の非糖質系高甘味度甘味料と組み合わせて好適に使用することもできる。
【００５０】
なお、本発明において、前記式（１）および（３）で用いるＸ〔甘味料中に含まれるステビオール配糖体の重量割合〕は、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格（第二版、平成５年１０月１日発行）第１１９〜１２１頁「酵素処理ステビア」に記載された定量法〔（１）ステビオール定量法、（２）配糖体中の糖定量法、および、（４）含量の計算〕に準拠して測定した重量割合(％)である。
【００５１】
なお、「酵素処理ステビア」に記載された定量法はα−グルコシルステビオサイド等のグルコース付加反応物を対象とした定量法であり、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ等のガラクトース付加反応物を対象とした定量法ではないが、本発明では、この方法に準拠してＸを測定した。
【００５２】
また、前記式（１）〜（７）で用いるＲＡ〔甘味料に含まれるレバウディオサイドＡの重量割合〕、および、前記式（５）と（７）におけるＳＴ〔甘味料中に含まれるステビオサイドの重量割合〕は、いずれも、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格（第二版、平成５年１０月１日発行）第１２２〜１２３頁「ステビア抽出物」に記載された定量法および前記「酵素処理ステビア」に記載された定量法〔（３）未反応ステビオール配糖体定量法〕に準拠して測定した重量割合(％)である。
【００５３】
さらに、前記式（１）〜（７）で用いるＧＲＡ〔甘味料中に含まれるβ−１，４−結合ガラクトシル基を１分子中に１〜３個有するβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合〕およびＧＳＴ〔甘味料中に含まれるβ−１，４結合ガラクトシル基を１分子中に１〜２個有するβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドの重量割合〕は、測定方法が日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格に記載されていないが、前記ＲＡとＳＴを測定する際に同時に測定した。
【００５４】
本発明においては、Ｘ、ＲＡ、ＳＴ、ＧＲＡ、ＧＳＴの各重量割合は、前記した「酵素処理ステビア」および「ステビア抽出物」に記載された定量法に準拠しているが、下記の点で変更してある。変更点と、その理由を以下に示す。
【００５５】
「酵素処理ステビア」の「（１）ステビオール定量法」における変更点。
（１）−▲１▼試料の乾燥処理工程
「（１）ステビオール定量法」では、試料の乾燥についての記載はないが、厳密な分析を行うために、標準品と同様に、１０５℃で２時間の乾燥を行った。
【００５６】
（１）−▲２▼ステビオールの重量割合の計算式
「（１）ステビオール定量法」では、ステビオールの含有率の計算は、標準品のステビオサイドの純度は考慮していないが、厳密にステビオールの含有率を計算するために、用いた標準品のステビオサイドの純度を考慮し、以下の式を用いてステビオールの重量割合を求めた。
0003925356.tif 000006
ここで、
Ａ  ：試料のステビオールの重量割合(％)、
Ａｓ：検液のイソステビオールメチルエステルのスタワランに対する面積比、
Ａｓｔ：標準液のイソステビオールメチルエステルのスタワランに対する面積比、
Ｓ  ：ステビオサイド採取量（ｍｇ）、
Ｘ  ：試料採取量（ｍｇ）、
Ｋ  ：ステビオールへの換算係数  318．46／804．88＝0．3957
である。
【００５７】
「酵素処理ステビア」の「（２）配糖体中の糖定量法」における変更点。
（２）−▲１▼試料液の調製
「（２）配糖体中の糖定量法」におけて、試料の調製方法は以下の通りである。即ち、試料約１．０ｇを精密に量り、水５０ｍｌに溶解する。この溶液を酵素処理ステビア用吸着樹脂５０ｍｌを用いて作った直径約２．５ｃｍの樹脂柱に注ぎ、１分間に３ｍｌ以下の速さで流出させ、次いで水２５０ｍｌで洗浄する。次に、５０ｖ／ｖ％エタノール（エタノールと水の混合溶液１００ｍＬ中のエタノールの含有量が５０ｍｌである混合溶液）又は９０ｖ／ｖ％メタノール（メタノールと水の混合溶液１００ｍＬ中のエタノールの含有量が９０ｍｌである混合溶液）２５０ｍｌを１分間に３ｍｌ以下の速さで通液し、吸着されている成分を溶出する。この液をロータリーエバボレーターで濃縮乾固し、残留物を得るという処理操作を行った後、該残留物に水を加えて溶解し全量を正確に５００ｍｌとし、これを試料液とする。
【００５８】
しかしながら、前記した試料の調製方法は、酵素処理ステビアに糖類が添加されているものについて、該糖類を除去した試料を調製するための方法である。本発明においては、酵素処理したステビアに糖類を添加しないことから、前記した試料の調製方法において、前記した処理操作を行わず、試料約１．０ｇを精密に量り、水を加えて溶解し全量を正確に５００ｍｌとし、これを試料液とした。尚、厳密な測定を行うために、試料は、１０５℃、２時間の条件で乾燥処理した。
【００５９】
「ステビア抽出物」における変更点。
▲１▼試料の乾燥処理工程
「ステビア抽出物」に記載された定量法では、試料の乾燥についての記載はないが、本発明においては、厳密な分析を行うために標準品と同じ１０５℃、２時間の乾燥を行った。
【００６０】
▲２▼液体クロマトグラフィーの移動相
「ステビア抽出物」に記載された定量法では、液体クロマトグラフィーの移動相としてアセトニトリル・水混液（８０：２０）（体積比）を使用している。この溶媒組成は、ステビオサイド及びレバウディオサイドＡの定量を目的に規定されており、ステビオサイドのピークの保持時間は１０分前後、レバウディオサイドＡのピークの保持時間は２０分前後と、３０分以内でこれらの成分が溶出される。
【００６１】
しかしながら、この移動相組成でβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ組成物を分析すると、β−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡのピークの保持時間は１７０分前後となり、全糖付加成分の溶出に３時間以上を要する為、分析方法として現実的ではない。
【００６２】
この為、本発明においては、液体クロマトグラフィーの効率化の為、移動相としてアセトニトリル・水混液（７８：２２）（体積比）を用いた。この移動相を用いると、ステビオサイドのピークの保持時間は５分前後、レバウディオサイドＡのピークの保持時間は８分前後、最も遅いβ−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡのピークの保持時間は４５分前後となり、全糖付加成分の溶出は１時間以内で完了する。
【００６３】
▲３▼重量割合の計算
「ステビア抽出物」に記載された定量法では、用いる標準品（ステビオサイド、レバウディオサイド）の純度は考慮されていないが、厳密な定量を行うために、用いた標準品の純度を考慮し、標準品の採取量に純度を乗じた。これは、後述するβ−１，４−ガラクトシルステビオサイド、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡについても同様である。
【００６４】
▲４▼β−１，４−ガラクトシルステビオサイド、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合の算出。
β−１，４−ガラクトシルステビオサイド、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合は、「ステビア抽出物」に記載された定量法と、分子量換算法を組み合わせて測定した。β−１，４−ガラクトシルステビオサイドの重量割合は、ステビオサイドを標準物質とし、ステビオサイドの重量割合を求める計算式において、検液のステビオサイドのピーク面積に代えてβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドである、β−１，４モノガラクトシルステビオサイド、β−１，４−ジガラクトシルステビオサイドのそれぞれのピーク面積を用い、更に、ステビオサイドの重量割合を求める計算式に、下記第１表に示したステビオサイドとβ−１，４−ガラクトシルステビオサイド各成分との分子量比を乗じて算出した。
【００６５】
【表１】
0003925356.tif 000007
【００６６】
β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合は、レバウディオサイドＡを標準物質とし、レバウディオサイドＡの重量割合を求める計算式において、検液のレバウディオサイドＡのピーク面積に代えてβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡである、β−１，４−モノガラクトシルレバウディオサイドＡ、β−１，４−ジガラクトシルレバウディオサイドＡ、β−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡのそれぞれのピーク面積を用い、更に、レバウディオサイドＡの重量割合を求める計算式に、下記第２表に示したレバウディオサイドＡとβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ各成分との分子量比を乗じて算出した。
【００６７】
【表２】
0003925356.tif 000008
【００６８】
前記「ステビア抽出物」に記載された定量方法において、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、β−１，４−モノガラクトシルステビオサイド、β−１，４−ジガラクトシルステビオサイド、β−１，４−モノガラクトシルレバウディオサイドＡ、β−１，４−ジガラクトシルレバウディオサイドＡ、β−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合を測定するには、液体クロマトグラフィーにて得られる、前記したステビオサイド、β−１，４モノガラクトシルステビオサイド等の各成分のピークを特定する必要があるため、本発明においては、以下の条件による液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、ピーク保持時間を得た後、下記第３表に示した実施例１の測定結果の様に、ピーク保持時間毎に順次各成分を特定した。
【００６９】
測定条件
カラム：粒径５μｍのＮＨ２基結合シリカ（Unisil  Ｑ  ＮＨ２  ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム管：内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
カラム槽温度：４０℃
移  動  相：アセトニトリル・水混液（７８：２２）
流      速：２．０ｍｌ／分
注  入  量：５μｌ
測定波長：２１０ｎｍ
【００７０】
【表３】
0003925356.tif 000009
【００７１】
なお、これらの測定の具体例は、本明細書に実施例１として例示してある。
【００７２】
【実施例】
以下に参考例、実施例、比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。例中「％」とあるのは、断りのない限り重量基準である。なお、使用したステビア抽出物Ａ１、ステビア抽出物Ａ１、ステビア抽出物Ｂ中のそれぞれのステビオサイド重量割合、レバウディオサイドＡ重量割合は、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格（第二版、平成５年１０月１日発行）第１２２〜１２３頁「ステビア抽出物」に記載された定量法に準拠して測定した重量割合(％)である。
【００７３】
参考例１  （β−１，４−ガラクトシル転移酵素を産生する微生物を培養した菌体懸濁液の調製）
リン酸二水素カリウム０．４％、硫酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０６％、硫酸亜鉛０．００１％、硫酸第一鉄０．００５％、酵母エキス０．１％、グルコース１．０％、およびラクトース０．５％の培地組成からなる液体培地（ｐＨ５．２）３リットルを容量１０リットルのジャーファーメンターに仕込み、加圧蒸気滅菌した。放冷後、ロドトルラ  マリナ菌を接種し、３０℃で２４時間通気攪拌培養し、菌体を生産した。得られた培養液を遠心分離して菌体を捕集し、濃度０．０５ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液にて菌体を２回洗浄した後、同緩衝液６００ｍｌに懸濁して、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液のβ−１，４−ガラクトシル転移酵素の総活性は３４２０Ｕであった。
【００７４】
参考例２  （β−１，４−ガラクトシル転移酵素の粗酵素液の調製）
参考例１と同じ液体培地３リットルを容量１０リットルのジャーファーメンターに仕込み、加圧蒸気滅菌した。放冷後、バシルス  サーキュランス菌を接種し、３０℃で２４時間通気攪拌培養して菌体を生産した。得られた培養液を遠心分離しして菌体を捕集し、濃度０．０５ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液にて菌体を２回洗浄した後、同緩衝液１００ｍｌに懸濁して、菌体懸濁液を調製した。これを超音波破砕により菌体を破砕した後に遠心分離して、菌体破砕物を除去し、上清液を硫酸アンモニウム７０％飽和で塩析し生成した沈殿物を遠心分離によって回収した。回収した沈殿物を濃度０．０５ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液１００ｍｌに懸濁して粗酵素液を調製した。この粗酵素液のβ−１，４−ガラクトシル転移酵素の総活性は２９８８Ｕであった。
【００７５】
実施例１
ステビア抽出物Ａ１（ステビオサイドの重量割合２６．８％、レバウディオサイドＡの重量割合５８．５％）１０．０ｇとガラクトシル糖化合物として乳糖１００ｇとを純水５００ｍｌで加温溶解した後、室温まで放冷し、濃度１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．０に調整した。これに参考例１で得たβ−１，４−ガラクトシル転移酵素活性を有する菌体懸濁液１００ｍｌを加え、５０℃で２４時間反応させた。反応後、この反応液を９５℃に３０分間保持して酵素を加熱失活させた。
【００７６】
この液を濾過して浮遊固形物を除去した後、濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２１）５００ｍｌを充填したカラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度８０％の含水メタノール１０００ｍｌを通液し、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを含む甘味成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥し、淡黄色粉末状の甘味料（以下、甘味料１という）１１．２ｇを得た。
【００７７】
次に、前記した、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格（第二版、平成５年１０月１日発行）１２２〜１２３頁「ステビア抽出物」に準拠して、甘味料１中のレバウディオサイドＡの重量割合（ＲＡ）、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合（ＧＲＡ）、ステビオサイドの重量割合（ＳＴ）及びβ−１，４−ガラクトシルステビオサイドの重量割合（ＧＳＴ）を測定した。具体的な方法を以下に示す。
【００７８】
甘味料１を１０５℃で２時間乾燥し、その１．５２２０５ｇを純水に溶かして正確に１００ｍｌとし、検液を調製した。ステビオサイド標準品として和光純薬工業株式会社製の純度９９．４％のステビオサイドを用い、該ステビオサイドを１０５℃で２時間乾燥し、その５２．２６ｍｇを移動相に溶かして正確に１００ｍｌとし、ステビオサイド標準液を調製した。
【００７９】
同様にレバウディオサイドＡ標準品として和光純薬工業株式会社製の純度９９．６％のレバウディオサイドＡを用い、該レバウディオサイドＡを１０５℃で２時間乾燥し、その５０．７８ｍｇを移動相に溶かして正確に１００ｍｌとし、レバウディオサイドＡ標準液を調製した。
【００８０】
次に、検液及び標準液につき、次の操作条件で液体クロマトグラフィー法による分析を行った。
検  出  器：紫外部吸収検出器（測定波長２１０ｎｍ）
カラム：粒径５μｍのＮＨ２基結合シリカ（Unisil  Ｑ  ＮＨ２  ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム管：内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
カラム槽温度：４０℃
移  動  相：アセトニトリル・水混液（７８：２２）
流      速：２．０ｍｌ／分
注  入  量：５μｌ
【００８１】
液体クロマトグラフィー法による分析を行って得られた検液の高速液体クロマトグラムを図１に、該液体クロマトグラム中の各ピークの保持時間と成分名との関係を第４表に示す。また、検液中の各成分のピーク面積と、標準液のステビオサイド、標準品のレバウディオサイドＡのピーク面積を測定した結果を第５表に示す。
【００８２】
【表４】
0003925356.tif 000010
【００８３】
【表５】
0003925356.tif 000011
【００８４】
次に、第５表の各成分の面積と次式を用いて、甘味料１中の各成分の重量割合（ＳＴ、ＳＴ−Ｇ１、ＳＴ−Ｇ２、ＲＡ、ＲＡ−Ｇ１、ＲＡ−Ｇ２、ＲＡ−Ｇ３）を算出した。具体的な計算例を以下に示す。尚、ＳＴ−Ｇ１は、β−１，４−モノガラクトシルステビオサイドの重量割合を、ＳＴ−Ｇ２は、β−１，４−ジガラクトシルステビオサイドの重量割合を、ＲＡ−Ｇ１は、β−１，４−モノガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合を、ＲＡ−Ｇ２は、β−１，４−ジガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合を、ＲＡ−Ｇ３は、β−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合をそれぞれ表す。
【００８５】
ＳＴ＝（ステビオサイド標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のステビオサイドのピーク面積×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のステビオサイドのピーク面積）＝（０．０５２２６×０．９９４×１４２９０１２×１００）÷（１．５２２０５×３６１６０５）＝１３．５(％)
【００８６】
ＳＴ−Ｇ１＝（ステビオサイド標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のβ−１，４−モノガラクトシルステビオサイドのピーク面積×分子量換算係数×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のステビオサイドのピーク面積）＝（０．０５２２６×０．９９４×６７０７０４×１．２０×１００）÷（１．５２２０５×３６１６０５）＝７．６(％)
【００８７】
ＳＴ−Ｇ２＝（ステビオサイド標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のβ−１，４−ジガラクトシルステビオサイドのピーク面積×分子量換算係数×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のステビオサイドのピーク面積）＝（０．０５２２６×０．９９４×７６８７４×１．４０×１００）÷（１．５２２０５×３６１６０５）＝１．０(％)
【００８８】
ＲＡ＝（レバウディオサイドＡ標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のレバウディオサイドＡのピーク面積×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のレバウディオサイドＡのピーク面積）＝（０．０５０７８×０．９９６×１９２３０８１×１００）÷（１．５２２０５×３２４８１４）＝１９．７(％)
【００８９】
ＲＡ−Ｇ１＝（レバウディオサイドＡ標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のβ−１，４−モノガラクトシルレバウディオサイドＡのピーク面積×分子量換算係数×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のレバウディオサイドＡのピーク面積）＝（０．０５０７８×０．９９６×１３４６４９８×１．１７×１００）÷（１．５２２０５×３２４８１４）＝１６．１(％)
【００９０】
ＲＡ−Ｇ２＝（レバウディオサイドＡ標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のβ−１，４−ジガラクトシルレバウディオサイドＡのピーク面積×分子量換算係数×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のレバウディオサイドＡのピーク面積）＝（０．０５０７８×０．９９６×８０２２６８×１．３４×１００）÷（１．５２２０５×３２４８１４）＝１１．０(％)
【００９１】
ＲＡ−Ｇ３＝（レバウディオサイドＡ標準品の採取量（ｇ）×標準品の純度×検液のβ−１，４−トリガラクトシルレバウディオサイドＡのピーク面積×分子量換算係数×１００）÷（試料の採取量（ｇ）×標準液のレバウディオサイドＡのピーク面積）＝（０．０５０７８×０．９９６×１６２４６６×１．５０×１００）÷（１．５２２０５×３２４８１４）＝２．５(％)
【００９２】
次に、前記した、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格（第二版、平成５年１０月１日発行）１１９〜１２１頁「酵素処理ステビア」に準拠して、甘味料１中のステビオール配糖体の重量割合Ｘを測定した。
【００９３】
（１）甘味料１中のステビオールの重量割合の定量
甘味料１を１０５℃で２時間乾燥し、１１０．１ｍｇを、フラスコに量り、２０ｖ／ｖ％硫酸（硫酸と水の混合溶液１００ｍＬ中の硫酸の含有量が２０ｇである混合溶液）１０ｍｌを加え、還流冷却器をつけて水浴上で２時間加熱した流水中で冷却後内容物を分液漏斗に移し、フラスコは水１０ｍｌで洗って分液漏斗に加えた。フラスコはさらにエーテル３０ｍｌずつで３回洗い、洗液を分汲漏斗に合わせ、よく振り混ぜた後、静置した。水層を除きエーテル層を水２０ｍｌずつで２回洗浄した後水層を除いた。ついでエーテル層を別のフラスコに移し、分液漏斗はエーテル１０ｍｌずつで２回洗い、洗液はフラスコに合わせ、硫酸ナトリウム（無水）１５ｇを加え、よく振り混ぜた後、傾斜してエーテル層を更に別のフラスコに移した。残った硫酸ナトリウムは、エーテル１０ｍｌずつで２回洗い、洗液をフラスコに合わせた。エーテルを留去した後、残留物に酢酸エチル１０ｍｌを加えて溶かし、２ｗ／ｖ％ジアゾメタン・エーテル溶液（ジアゾメタンとエーテルの混合溶液１００ｍＬ中のジアゾメタンの含有量が２ｇである混合溶液）３ｍｌを加え、密栓して時々振り混ぜ、２０分間放置した。
【００９４】
この液に酢酸０．５ｍｌを加えてよく振り混ぜた後、スタワラン・n−ブタノール試液（スタワラン２．５ｇをn−ブタノールに溶解し、最終的にn−ブタノールで２００ｍｌにしたもの）２ｍｌを正確に加え、検液とした。
【００９５】
別に、和光純薬工業株式会社製の純度９９．４％のステビオサイドを１０５℃で２時間乾燥し、４２．１ｍｇをフラスコに量り、甘味料１の場合と同様の操作を行い、標準液を調製した。
【００９６】
検液及び標準液につき、次の操作条件でガスクロマトグラフイー法による分析を行った。
検出器：水素炎イオン化検出器
カラム充填剤：液相が、担体に対して２％の５０％フェニルメチルシリコーンポリマーで、担体が、１７７〜２５０μｍのガスクロマトグラフィー用ケイソウ土〔Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ＯＶ−１７  ２％Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ−ＤＭＣＳ  ６０／８０（ジーエルサイエンス株式会社製）〕
カラム管：３．２ｍｍφ×２．１ｍのガラス管
カラム槽温度：２４５℃
注入口温度：２６０℃
キャリアーガス：窒素ガス
流速：５０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２μｌ
【００９７】
検液のスクワラン、イソステビオールメチルエステルのピーク面積、及び標準液のスクワラン、イソステビオールメチルエステルのピーク面積を測定した結果を第６表に示す。
【００９８】
【表６】
0003925356.tif 000012
【００９９】
得られたピーク面積と、次式により甘味料１中のステビオールの重量割合を求めた。
Ａ＝（Ａｓ×Ｓ×標準品ステビオサイドの純度×１００×Ｋ）／（Ａｓｔ×Ｘ）    ・・・・・式（８）
ここで、
Ａ  ：試料のステビオールの重量割合(％)、
Ａｓ ：検液のイソステビオールメチルエステルのスタワランに対する面積比、
Ａｓｔ：標準液のイソステビオールメチルエステルのスタワランに対する面積比、
Ｓ  ：ステビオサイド採取量（ｍｇ）、
Ｘ  ：試料採取量（ｍｇ）、
Ｋ  ：ステビオールへの換算係数  318．46／804．88＝0．3957
である。
【０１００】
本実施例において、Ａｓ＝5168502／3887140＝１．３３０、Ａｓｔ＝3082803／3926785＝０．７８５である。従って、ステビオールの重量割合は、（１．３３０×４２．１×０．９９４×１００×０．３９５７）／（０．７８５×１１０．１）＝２５．５％である。
【０１０１】
（２）  ステビオール配糖体中の糖の重量割合の定量
甘味料１を１０５℃で２時間乾燥し、１．００７４gを量り、水５００ｍｌに溶解し、試料液を調製した。
【０１０２】
アントロン２００ｍｇを量り、硫酸１００ｍｌに溶かし、これを氷令しながら水２０ｍｌ中に徐々に加えて混合し、アントロン試液を調製した。試料液を水で５０倍に希釈し、検液とした。検液２ｍｌを正確に共栓付試験管にとり、これを氷水中で冷却しつつ、アントロン試液６ｍｌを正確に加え、二液が完全に混合するまでよく振り混ぜた。ついで沸騰水浴中で正確に１６分間加熱した。氷冷後、水を対照として、波長６２０ｎｍの吸光度を測定したところ０．３１３となった。
【０１０３】
次に、予め作成したグルコース検量線から、検液のグルコース濃度（μｇ／ｍｌ）を求めた。グルコース検量線は，グルコース１０．９６μｇ／ｍｌ、３２．８８μｇ／ｍｌ、５４．８０μｇ／ｍｌの溶液につき検液と同様に操作し、得られたそれぞれの吸光度と濃度から作成した。本実施例で用いたグルコース検量線のグルコース濃度と吸光度を第７表に示す。
【０１０４】
【表７】
0003925356.tif 000013
【０１０５】
検量線は、糖濃度（μｇ／ｍｌ）＝９６．３１×吸光度−２．１５という式で表された。検液の波長６２０ｎｍにおける吸光度（０．３１３）と検量線から、検液中の糖濃度を求めた。
検液の糖濃度（μｇ／ｍｌ）＝９６．３１×０．３１３−２．１５＝２８．０。
【０１０６】
更に、次式によりステビオール配糖体中の糖の重量割合を求めた。
配糖体中の糖の重量割合（％）＝〔検量線より求めた糖濃度（μｇ／ｍｌ）×０．９×５０×５００×１００〕÷〔試料採取量（ｇ）×１０００×１０００〕＝（２８．０×０．９×５０×５００×１００）÷（１．００７４×１０００×１０００）＝６２．５％。
【０１０７】
（３）  ステビオール配糖体の重量割合の計算
ステビオールの重量割合と配糖体中の糖の重量割合の値の和をもって、ステビオール配糖体の重量割合とする。甘味料１中のステビオール配糖体の重量割合は、２５．５＋６２．５＝８８．０(％)であった。
【０１０８】
甘味料１中の各成分の重量割合（ＳＴ、ＲＡ、ＳＴ−Ｇ１、ＳＴ−Ｇ２、ＲＡ−Ｇ１、ＲＡ−Ｇ２、ＲＡ−Ｇ３およびＸ）、〔（ＧＲＡ＋ＲＡ）／（Ｘ）〕の値および〔（ＧＲＡ）／（ＲＡ）〕の値を第８表に示す。
【０１０９】
実施例２
ステビア抽出物Ａ１（ステビオサイドの重量割合２６．８％、レバウディオサイドＡの重量割合５８．５％）１０．０ｇとガラクトシル糖化合物として乳糖１００ｇとを純水５００ｍｌに加温溶解した後、室温まで放冷し、濃度１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．０に調整した。これに参考例２で調製したβ−１，４−ガラクトシル転移酵素活性を有する粗酵素液全量を加え、５０℃で２４時間反応させた。反応後、この反応液を９５℃に３０分間保持して酵素を加熱失活させた。
【０１１０】
反応液を濾過して浮遊固形物を除去した後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２１）５００ｍｌを充填したカラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度８０％の含水メタノール１０００ｍｌを通液し、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを含む甘味成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥し、淡黄色粉末である甘味料（以下、甘味料２という。）１１．１ｇを得た。
【０１１１】
実施例１と同様にして、甘味料２中の各成分の定量を行った。その結果を、第８表に示す。
【０１１２】
実施例３
高度に精製し、レバウディオサイドＡを９０重量％以上含むステビア抽出物Ａ２（ステビオサイドの重量割合１．１重量％、レバウディオサイドＡの重量割合９１．３重量％）１０．０ｇとガラクトシル糖化合物として乳糖１００ｇとを純水５００ｍｌに加熱溶解した後、室温まで放冷し、濃度１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．０に調節した。これにβ−１，４−ガラクトシル転移酵素活性を有する酵素製剤〔ビオラクタＮ５、大和化成（株）製〕を１．０ｇ（２４７７Ｕ）加え、５０℃で２４時間反応させた。反応後、この反応液を９５℃に３０分間保持して酵素を加熱失活させた。
【０１１３】
反応液を濾過して浮遊固形物を除去した後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２１）５００ｍｌを充填したカラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度８０％の含水メタノール１０００ｍｌを通液し、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを含む甘味成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥させ、淡黄色粉末である甘味料（以下、甘味料３という）１０．４ｇを得た。
【０１１４】
実施例１と同様にして、甘味料３中の各成分の定量を行った。その結果を、第８表に示す。
【０１１５】
比較例１
ステビア抽出物Ｂ（ステビオサイドの重量割合７９．７％、レバウディオサイドＡの重量割合１１．１％）１０．０ｇとガラクトシル糖化合物として乳糖１００ｇとを純水５００ｍｌに加温溶解した後、室温まで放冷し、濃度１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．０に調節した。これに参考例１で得たβ−１，４ガラクトシル転移酵素活性を有する菌体懸濁液１００ｍｌを加え、５０℃で２４時間反応させた。反応後、この反応液を９５℃に３０分間保持して酵素を加熱失活させた。
【０１１６】
反応液を濾過して浮遊固形物を除去した後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２１）５００ｍｌを充填したカラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度８０％の含水メタノール１０００ｍｌを通液し、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡを含む甘味成分を溶出させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥させ、淡黄色粉末である甘味料（以下、甘味料１′という。）１１．０ｇを得た。
【０１１７】
実施例１と同様にして、甘味料１′中の各成分の定量を行った。その結果を、第８表に示す。
【０１１８】
【表８】
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【０１１９】
試験例１〜３及び、比較試験例１〜４（甘味度の評価）
甘味料１、甘味料２、甘味料３、甘味料１′、原料として用いたステビア抽出物Ａ１、ステビア抽出物Ａ２およびステビア抽出物Ｂを用いて、甘味度の評価を行った。
【０１２０】
甘味度の評価
砂糖の８％濃度水溶液を作製してこれを砂糖標準水溶液とした。甘味料１、甘味料２、甘味料３、甘味料１′、原料として用いたステビア抽出物ＡＡ１、ステビア抽出物Ａ２およびステビア抽出物Ｂの０．０２５〜０．０８０％濃度の水溶液を０．００５％段階濃度で８種類の試料水溶液を作製し、それぞれの水溶液と標準水溶液とを比較して甘味度を測定した。試験は試料水溶液と砂糖標準水溶液との二点比較法で、２０人のパネラーにより室温２５℃で行った。結果を第９表及び第１０表に示す。
【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
第９表および第１０表に示した結果から、砂糖濃度８％に相当する濃度は、甘味料１は０．０６０％（甘味度１３３倍）、甘味料２は０．０５７５％（甘味度１３９倍）、甘味料３は０．０５２５％（甘味度１５２倍）、甘味料１′は０．０６５０％（甘味度１２３倍）であった。また、ステビア抽出物Ａ１は０．０４２５％（甘味度１８８倍）、ステビア抽出物Ａ２は０．０３５０％（甘味度２２９倍）、ステビア抽出物Ｂは０．０４７５％（甘味度１６８倍）であった。
【０１２４】
これらの結果から、ガラクトシル基をβ−１，４結合させた甘味料の甘味度は、原料であるステビア抽出物Ａ１、ステビア抽出物Ａ２、ステビア抽出物Ｂのそれぞれの甘味度の７０％程度を保持しており、高い甘味度を有することが明らかとなった。
【０１２５】
試験例４〜６及び比較試験例５（甘味質の評価）
甘味料１、甘味料２、甘味料３および甘味料１´を用いて、甘味質の評価を行った。
【０１２６】
前記した、砂糖濃度８％水溶液に相当する濃度の各甘味料の水溶液を調製し、甘味質として主に前味として感じられるまろやかさ、および後味として感じられる苦味や渋味等の嫌味、さらに、甘味の立ち上がり、切れ、およびシャープさについて同等の甘味度を有する砂糖と比較して評価した。結果を第１１表に示す。
【０１２７】
【表１１】
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【０１２８】
第１１表に示した結果から、甘味料１′では甘味質のシャープさはほぼ同等の評価であったが、苦味、甘味の切れ、甘味の立ち上がりの項目では低い評価であり、味質の改善効果が少ないことが明らかとなった。これに対して甘味料１、甘味料２および甘味料３は、甘味料１´に比べ主に前味のまろやかさが改善され、後味の苦味や渋味等の嫌味をさらに抑えることができ、全体として砂糖に類似した良質な甘味質に改善された。
【０１２９】
応用例１
グラニュー糖３０ｇ、異性化糖１７０ｇ、クエン酸３．０ｇ、クエン酸ナトリウム０．２０ｇ、サイダーエッセンス０．２０ｇ、甘味料１の０．２２ｇ、および炭酸水を混合し、２リットルのサイダーを調製した。２０名のパネラーによる呈味試験の結果、甘味料１を用いたサイダーはあっさりした甘味で残味の切れが良好なサイダーであった
【０１３０】
比較応用例１
甘味料１を０．２２ｇ用いる換わりに甘味料１′を０．３０ｇ用いた以外は、応用例１と同様にして、サイダーを作製した。応用例１と同様に呈味試験を行ったところ、甘味の立ち上がりや切れの悪さが感じられるサイダーであった。
【０１３１】
応用例２
グラニュー糖１１ｇ、異性化糖１４１ｇ、粉末コーヒー２０ｇ、脱脂粉乳７６ｇ、甘味料１の０．２６ｇおよび温水を混合し２リットルのコーヒーを調製した。２０名のパネラーによる呈味試験の結果、コーヒーの苦味とマッチした良好な甘味を有するコーヒーであった。
【０１３２】
比較応用例２
甘味料１を０．２６ｇ用いる換わりに甘味料１′を０．３０ｇ用いた以外は、応用例２と同様にして、コーヒーを作製した。応用例２と同様に呈味試験を行ったところ、コーヒーの苦味と甘味との感じられるタイミングが一致せず不自然さが感じられるコーヒーであった。
【０１３３】
参考例３（β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの存在の確認）
実施例１の液体クロマトグラフィー法による分析と同じ条件で、甘味料３を液体クロマトグラフィー法にて分画し、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの推定ピーク留分を単離した。これらを粉末化し、純水に溶解し２％水溶液を作成した。この溶液１ｍｌを試験管にとり、これにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（和光純薬工業株式会社製品）を１０ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加後、３０℃で２４時間反応させた。
【０１３４】
得られたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ処理物をシリカゲルプレート６０Ｆ２５４ＴＬＣプレート（メルク社製品）にスポットし、対照としてステビオサイド、レバウディオサイドＡ、分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ、およびＤ−ガラクトースを併せてスポットした。このプレートをクロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４（体積比）の展開溶媒に展開した。十分に風乾後、０．２％アニスアルデヒドを含有させた濃硫酸を噴霧し、１００℃で１０分間加熱して発色させた。この薄層クロマトグラムを図２に示す。
【０１３５】
図２中の（ａ）はステビオサイドをスポットしたもの、（ｂ）はレバウディオサイドＡをスポットしたもの、（ｃ）は分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの推定成分をスポットしたもの、（ｄ）は分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ処理物をスポットしたもの、（ｅ）はＤ−ガラクトースをスポットしたものをそれぞれ展開したものを示す。
【０１３６】
図２に示すように、ＨＰＬＣ分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの推定ピーク留分をスポットした（ｃ）は、Ｒｆ値０．３５付近から０．５３付近までの連続した発色スポットが観察されたのに対して、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ処理して得られた試料をスポットした（ｄ）は、Ｒｆ値０．３５付近から０．５３付近までの連続した発色スポットが殆ど消失し、わずかにＲｆ値０．４８の残存スポットと、新たにレバウディオサイドＡの発色スポット（ｂ）と一致するＲｆ値０．５５のスポットと、Ｄ−ガラクトースの発色スポット（ｅ）と一致するＲｆ値０．２５のスポットとが出現した。
【０１３７】
以上の結果から、Ｒｆ値０．３５付近から０．５３付近までの連続した発色スポットが、レバウディオサイドＡとＤ−ガラクトースとが結合している物質、即ちβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡ誘導体であると確認できた。
【０１３８】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したようなものであるから、以下に記載されるような効果を奏する。
本発明の甘味料は、甘味料中に含まれるβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの重量割合（ＧＲＡ）と、甘味料中に含まれるレバウディオサイドＡの重量割合（ＲＡ）の合計（ＧＲＡ＋ＲＡ）のステビオール配糖体の含有割合（Ｘ）に対する比が０．４以上で、かつ、ＧＲＡのＲＡに対する比が１．０以上という関係を有していることにより、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味も低減している。
【０１３９】
そして、β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡは、レバウディオサイドＡに付加したガラクトシル基にさらにガラクトシル基が付加重合することがないために甘味度の低下がレバウディオサイドＡの３０％程度に抑えられる。
【０１４０】
さらに、本発明の甘味料の製造方法は、レバウディオサイドＡを４０重量％以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物の重量の５〜２０倍のβ−１，４−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−１，４−ガラクトシル転移酵素を作用させるという容易な製造方法であり、本発明の砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味も低減した甘味料を好適に製造することができる。
【０１４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の甘味料１の高速液体クロマトグラムである。
【図２】  β−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの薄層クロマトグラムである。
【符号の説明】
（ａ）  ステビオサイドをスポットしたもの
（ｂ）  レバウディオサイドＡをスポットしたもの
（ｃ）  分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡの推定成分をスポットしたもの
（ｄ）  分取したβ−１，４−ガラクトシルレバウディオサイドＡのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ処理物をスポットしたもの
（ｅ）  Ｄ−ガラクトースをスポットしたもの
【図１】
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【図２】
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