(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｙ５にメタンフェタミン抗体を共有結合した蛍光プローブと、メタンフェタミンと競合し、かつ前記蛍光プローブと抗原抗体反応により蛍光共鳴エネルギー移動する結合をする、メタンフェタミン−プロテイン結合体とＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体を共有結合した蛍光プローブとを組み合わせた蛍光共鳴エネルギー移動を利用した競合ホモジニアス時間分解蛍光イムノアッセイ方法によるメタンフェタミンの測定方法。
【請求項２】
Ｃｙ５にメタンフェタミン抗体を共有結合した蛍光プローブと、メタンフェタミンと競合し、かつ前記蛍光プローブと抗原抗体反応により蛍光共鳴エネルギー移動する結合をする、ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋にメタンフェタミン−プロテイン結合体を共有結合した蛍光プローブとの組み合わせからなる請求項１に記載のメタンフェタミンの測定キット。
【請求項３】
Ｃｙ５とメタンフェタミン抗体とが共有結合した請求項１に記載のメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブ。
【請求項４】
ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体にメタンフェタミン−プロテイン結合体を共有結合した構造を含む請求項１に記載のメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブ。
【請求項５】
プロテインがウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ），サイログロブリン，または合成ポリアミン類であることを特徴とする請求項４に記載の蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、時間分解蛍光イムノアッセイ方法により高感度でメタンフェタミン（以下、ＭＡと表現する場合もある。）を検出する方法、特に、新規な蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer、ＦＲＥＴ）現象を示す蛍光プローブの組み合わせ、具体的には、メタンフェタミンをプロテイン（例えばＢＳＡ）−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体で標識した蛍光プローブとＣｙ５にメタンフェタミン抗体を共有結合した蛍光プローブとを組み合わせて用いた競合ホモジニアス時間分解蛍光イムノアッセイ方法による簡易で高感度のメタンフェタミンの測定方法、ならびに該測定方法に用いる新規なキットおよび蛍光プローブ類に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある希土類錯体は強い蛍光を発すること、これらの希土類錯体は通常の有機蛍光色素とは異なり、紫外光で（〜３３０ｎｍ）で励起され、希土類の持つ特異な発光現象により蛍光を発生するため、蛍光寿命が数百マイクロ秒から２ミリ秒と極めて長いという特徴を持つことが良く知られている。特に希土類としてＥｕ３＋、Ｔｂ３＋を用い、これに適当な配位子を用いて錯体化した蛍光材料は、蛍光特性を持つ測定材料として、また適当なプロテインと化学結合、例えば共有結合させて抗体としての機能を用いた蛍光プローブとして利用されてきている。
【０００３】
このような蛍光を利用した測定技術の発展の中で、本発明者らも優れた発光特性を示す希土類錯体、具体的には配位子として４座配位β−ジケトン型配位子ＢＨＨＣＴ〔４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”２”−ヘプタフロロ−４”，６”−ヘキサンヂオン−６”−イル）クロロスルフォ−ｏ−テトラフェニル〕またはＢＰＴＡ〔Ｎ，Ｎ，Ｎ1，Ｎ2−（２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−フェニルピリジン）テトラキス（アセティックアシッド）〕を用いたＥｕ３＋錯体を見出している。そして、該錯体をメタンフェタミンの時間分解蛍光イムノアッセイのラベリング剤として利用することを発表している（Kimura,H.,Yuan,J.,Wang,G.,Matsumoto,K. and Mukaida, M.J Anal Toxicol, 23, 11-16, 1999、）。更に前記ラベリング剤を適当なプロテイン、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に結合させて蛍光プローブを作成し、該蛍光プローブを時間分解蛍光イムノアッセイの蛍光試薬とすることについても既に提案している（Yuan,J.,Matsumoto,K. and Kimura,H.，Anal Chem,70,596-601,1998.）。
【０００４】
時間分解蛍光イムノアッセイは、パルス励起光照射後、一定の時間をおいて非特異的な蛍光バックグラウンドが減衰した後、ラベル剤に由来する特定波長の長寿命蛍光のみを測定する方法であり、高感度分析が可能になることが知られている。しかしながら、現在用いられているＥｕ錯体のラベル剤は蛍光強度が十分でないという欠点があった。前記本発明者らの新しいラベル剤は比較的おだやかな条件でプロテインを直接標識でき，強い蛍光と安定性をもつのが特徴である。また、２０００年１０月５，６日コクヨホールにおいて開催された「単一分子・原子レベルの反応制御」第４回シンポジウムの講演要旨集（前記開催日に頒布）第３５頁〜３６頁において、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋錯体をドナーとしてＣｙ３をアクセプターとする共鳴エネルギー移動を利用する均一溶液でのＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイについてはすでに報告されていることを述べている。しかしながら、ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体とＣｙ５とを組み合わせて蛍光共鳴エネルギー移動を利用してメタンフェタミンを時間分解蛍光イムノアッセイによる定量分析することについては全く報告されていない。ただ、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋とＣｙ３をそれぞれドナーおよびアクセプターの組合せとして用いて分析を行ったことを、前記予稿集において報告している。因みに、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer、ＦＲＥＴ）とは、ある２つの蛍光化合物が距離的に近い位置（おおよそ１００Å以内）に存在するとき、その２つの蛍光物質のうちの片方（ドナーと呼ばれる）の発光スペクトルと他方（アクセプターと呼ばれる）の励起スペクトルが重なりを持つ場合、ドナー励起波長の光を当てると、本来観察されるはずのドナーの蛍光が減衰し、代わりにアクセプターの蛍光が強化（エネルギーの移動により）されて観察される現象であることが知られており、蛍光を用いた分析法において、ドナー側の蛍光が小さくなり、アクセプターの蛍光が増幅されるので、蛍光増幅分析方法に利用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メタンフェタミンをより高感度で、容易に測定する方法を提供することである。本発明者らは前記のように種々の蛍光プローブの組み合わせを用いて、被測定物を高感度で測定できる方法を開発してきた。その中で、メタンフェタミンを測定（定性的および定量的）できる蛍光プローブの組み合わせ、特に被測定物であるメタンフェタミンと競合し、蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光増幅特性をもち、かつ、感度が１ｎｇ／ｍＬでホモジニアス（均一溶液系）イムノアッセイが可能な時間分解蛍光プローブの組み合わせを見出すことができ、前記課題を解決することができた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、（１）Ｃｙ５にメタンフェタミン抗体を共有結合した蛍光プローブと、メタンフェタミンと競合し、かつ前記蛍光プローブと抗原抗体反応により蛍光共鳴エネルギー移動する結合をする、メタンフェタミン−プロテイン結合体とＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体を共有結合したた蛍光プローブとを組み合わせた蛍光共鳴エネルギー移動を利用した競合ホモジニアス時間分解蛍光イムノアッセイ方法によるメタンフェタミンの測定方法である。本発明の第２は、（２）Ｃｙ５にメタンフェタミン抗体を共有結合した蛍光プローブと、メタンフェタミンと競合し、かつ前記蛍光プローブと抗原抗体反応により蛍光共鳴エネルギー移動する結合をする、ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋にメタンフェタミン−プロテイン結合体を共有結合した蛍光プローブとの組み合わせからなる前記（１）に記載のメタンフェタミンの測定キットである。本発明の第３は、（３）Ｃｙ５とメタンフェタミン抗体とが共有結合した前記（１）に記載のメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブである。または第４の発明は、（４）ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体にメタンフェタミン−プロテイン結合体を共有結合した構造を含む前記（１）に記載のメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブであり、好ましくは、（５）プロテインがウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ），サイログロブリン，または合成ポリアミン類であることを特徴とする前記（４）に記載のメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブである。
【０００７】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．Ｃｙ５（Amersham Life Science社の登録商標）にメタンフェタミン（ＭＡ）抗体を共有結合したメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブについて。
該プローブは、ウサギなどに免疫して作製した抗体、例えば、抗ＭＡ抗体であるウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）に有機色素である蛍光シアニン（fluorescing cyanine、Ｃｙ５,Amersham Life Science社から市販されている。）を標識することにより得られる。Ｃｙ５の吸収極大波長は６４３ｎｍであである。この標識物質は新規である。
【０００８】
Ｂ．ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体とメタンフェタミン−プロテイン結合体とを共有結合した構造を含むメタンフェタミンの測定方法に用いる蛍光プローブは、例えば、Ｎ−アミノブチルＭＡと適当なプロテイン、例えばウシ血清アルブミンとの結合体（ＭＡ−ＢＳＡ）に前記公知のＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体でラベリングすることによって得られる。ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体の蛍光極大波長は６１５ｎｍであるが、該蛍光波長域はＣｙ５の吸収波長域と６０５ｎｍ〜６２５ｎｍの領域で重なる。
【０００９】
Ｃ．蛍光共鳴エネルギー移動については、前記したとおりである。ドナー蛍光体の発光領域とアクセプター蛍光体の吸収領域（励起波長域）が充分な重なりがあり、かつ前記発光部位−吸収部位とが充分に蛍光共鳴エネルギー移動が可能にドナー−アクセプターの結合構造（前記エネルギー移動が可能な近接領域にあるような）が設計されていることが、競合ホモジニアス系での分析を可能にする条件である。したがって、抗ＭＡ抗体としては、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、 マウスＩｇＧなどを好ましいものとして挙げることができる。また、ＭＡに結合する前記プロテインとしては、ＢＳＡ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ストレプトアビジン，合成ポリアミン類などを好ましいものとして挙げることができる。
【００１０】
Ｄ．また、測定法としては、蛍光測定用マイクロタイタープレートに標識抗原、例えば、ＭＡ−ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋を配置し、ＭＡ（被検出物）標準液（検量線作成）または検体液または希釈液、さらにＣｙ５標識抗体溶液を同時に加えて混合し，適当な温度、例えば３７℃で、適当な時間、例えば３０分反応させる。ドナー蛍光プローブの励起波長、例えば、ＭＡ−ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋の場合３４０ｎｍでＥｕ３＋を励起し、アクセプターの発光、例えば抗ＭＡ抗体−Ｃｙ５の場合、６８０ｎｍの蛍光強度を時間分解蛍光測定（遅延時間;５０マイクロ秒、 遅延時間後測定時間（window time）;４００マイクロ秒）で測定される。
【００１１】
【実施例】
使用機器；時間分解蛍光測定器としてはＡＲＶＯ ＳＸ（ワラックベルトールジャパン社（社名変更によりパーキンエルマージャパン社）製）を用いた。
【００１２】
実施例１
Ｎ−アミノブチルＭＡとＢＳＡの結合体（ＭＡ−ＢＳＡ）にＥｕ蛍光ラベル剤（ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋）を標識し、抗ＭＡ抗体に対して検体または標準物質のＭＡを競合させて反応させる。前記抗ＭＡ抗体は、ウサギに免疫して作製した抗体（抗ＭＡウサギＩｇＧ）に蛍光有機色素であるＣｙ５（図５）（Amersham Life Scienceの商品名）を標識することにより作成した。エネルギードナーである前記ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋の蛍光ピーク波長６１５ｎｍは、エネルギーアクセプターであるＣｙ５の吸収ピーク波長の６４３ｎｍに近く、前記蛍光波長領域と吸収波長領域に十分な重なりがあり、前記ドナーの励起光である紫外光で励起されることにより、ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体からのエネルギー移動が起こり，アクセプターであるＣｙ５は増感発光した。
【００１３】
蛍光測定用マイクロタイタープレートに標識抗原であるＭＡ−ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋を２５μＬ配置し、被検体であるＭＡの標準液または検体希釈液５０μＬ、さらにＣｙ５標識抗体溶液２５μＬを同時に加えて混合し、３７℃で３０分反応させた。前記標識抗原のＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋錯体の励起波長３４０ｎｍでＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋を励起し、ＭＡ−Ｃｙ５の蛍光極大値６８０ｎｍにおけるＣｙ５の蛍光強度を時間分解蛍光測定で求めた。
【００１４】
緩衝液（０．０５Ｍトリスハイドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）中の標準MAの最小検出濃度は、第１図のＣｙ５の発光とＭＡ濃度との相関を示す検量線から約０．１ｎｇ／ｍＬの感度で測定可能であった。また、濃度範囲１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの濃度範囲で測定可能であった。測定誤差は８濃度の平均ＣＶ（coefficient of variation、再現性を示す。）が１．９８％であった。
【００１５】
実施例２
次に検体である尿や血清が測定に及ぼす影響を調べるために、覚せい剤を含まないことが明らかなヒトの尿および血清を１００倍（■）、２０倍（▲）、１０倍（×）、５倍（＊）希釈および未希釈（●）したものに、ＭＡを１０２〜１０−２ｎｇ／ｍＬの濃度になるように加えた。これらの尿および血清について前記Ｃｙ５およびＥｕ３＋のそれぞれの蛍光強度を測定し、緩衝液で希釈したＭＡ溶液の測定値との比較を行った（図２ａ、２ｂ）。Ｃｙ５の蛍光強度で表したＭＡの標準曲線は図２に示すように尿や血清の濃度が高くなる（希釈率が下がる）ほどＣｙ５の蛍光強度が下がり、また、検量線の傾きも小さくなった。この原因のひとつは図３ａ、ｂに示すようにエネルギードナーであるＥｕの蛍光強度が尿や血清の濃度に依存して下がっていることによる。
【００１６】
ＭＡの競合剤であるＭＡ−ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋は一定の濃度で加えているので、Ｅｕの蛍光強度は理論的に一定であるはずであるが、被検物のバッファーによる希釈度により異なることが前記測定により理解される。しかし図３ａ、ｂからも明らかなように、被検体（被測定成分）であるフリーＭＡの濃度には依存しない、換言すればＭＡの測定に影響しないことを示す。また、図２および３から、Ｅｕの蛍光強度は尿や血清を１００倍に希釈した時はほとんど影響を受けないが、未希釈検体の場合は緩衝液の時の約８５−５０％程度にまで減少することが分かった。
【００１７】
これに対し、次にＥｕ３＋の発光による励起エネルギーを受け取るアクセプターのＣｙ５の蛍光の受ける影響を調べた。図４ａ、４ｂ〔バッファー（□）、ＭＡが、０．０１ｎｇ／ｍＬ（◇）、０．１（○）、１（△）、１０（■）、１００（◆）〕にはＣｙ５／Ｅｕの蛍光強度比が尿や血清の濃度によってどのような変化を示すかを表している。尿や血清を含まない緩衝液でのＣｙ５／Ｅｕの値を１００％とすると、未希釈の尿や血清では約９０％に下がっている。また、血清に血球を加えて溶血させ、溶血血清がどのような影響を与えるかについても検討した。溶血血清は溶血を含まない血清に較べると明らかにＥｕの消光を強くしたが、Ｃｙ５／Ｅｕの割合は溶血していない血清と変わらなかった。これらの結果から、検体条件によるＣｙ５の消光、あるいはエネルギー遷移の効率がほとんど影響を受けていないことが理解できる。ホモジニアスアッセイでは検体のもつ様々な夾雑物が影響することが予測されたが、同率希釈のＭＡを含まない尿や血清で検量線をひけば種々の検体条件においても、メタフェタミンを測定できることが理解された。
【００１８】
実施例３
前記知見に基づいて、覚せい剤使用者の尿検体２０について蛍光共鳴エネルギー移動を利用した競合ホモジニアス時間分解蛍光イムノアッセイ方法によるメタンフェタミンを測定し、その測定結果とガスクロマトグラフィーの測定値と比較したところ、相関係数ｒ＝０．９４と高い相関が得られた。本発明の方法は全く洗浄操作を必要とせず、３０分で測定結果が得られるので、簡便迅速なＭＡ測定方法として有効であることが分かった。 他の薬剤のスクリーニング手段としても本手法が適用できることが予測できる。
【００１９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明により、メタンフェタミンの簡単で、高感度の測定が可能になった、という優れた効果がもたらされる。更に、他の薬剤のスクリーニング手段としても十分に本手法が適用できることが予測できることから、今後の高感度で、簡易な種々の薬剤の測定手段の確立に貢献すること大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｃｙ５の発光とＭＡ濃度との相関を示す検量線
【図２】 検体である尿（ａ）や血清（ｂ）のＣｙ５の蛍光によるＭＡの測定におよぼす影響〔１００倍（■）、２０倍（▲）、１０倍（×）、５倍（＊）希釈および未希釈（●）〕
【図３】 検体である尿（ａ）や血清（ｂ）のＥｕ３＋の蛍光強度におよぼす影響〔１００倍（■）、２０倍（▲）、１０倍（×）、５倍（＊）希釈および未希釈（●）〕
【図４】 Ｃｙ５／Ｅｕの蛍光強度比と尿や血清の濃度の相関〔バッファー（□）、ＭＡが、０．０１ｎｇ／ｍＬ（◇、０．１（○）、１（△）、１０（■）、１００（◆）〕
【図５】 Ｃｙ５の化学構造
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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