(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（３）〜（６）のいずれかに規定するホスファターゼ遺伝子を導入又は発現強化した宿主細胞を培養し、その培養物からプレニルアルコールを採取するプレニルアルコールの製造方法。
（３）配列番号７、８、１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列を有する。
（４）配列番号７、８、１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し, かつ、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）に対し、（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が８０以上であると言う基質特異性を示すポリペプチドをコードする。
（５）配列番号１、２、４〜６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
（６）配列番号１、２、４〜６のいずれかに示すアミノ酸配列における５個以下のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し, かつ、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）に対し、（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が８０以上であると言う基質特異性を示すポリペプチドをコードする。
【請求項２】
下記の（３）〜（６）のいずれかに規定するホスファターゼ遺伝子とプレニル二燐酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とを導入又は発現強化した宿主細胞を培養し、その培養物からプレニルアルコールを採取するプレニルアルコールの製造方法。
（３）配列番号７、８、１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列を有する。
（４）配列番号７、８、１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し, かつ、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）に対し、（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が８０以上であると言う基質特異性を示すポリペプチドをコードする。
（５）配列番号１、２、４〜６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
（６）配列番号１、２、４〜６のいずれかに示すアミノ酸配列における５個以下のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し, かつ、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）に対し、（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が８０以上であると言う基質特異性を示すポリペプチドをコードする。
【請求項３】
前記ホスファターゼ遺伝子とプレニル二燐酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とが連結遺伝子として導入又は発現強化されている請求項２に記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項４】
前記プレニル二燐酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子が以下の（１）及び／又は（２）の遺伝子である請求項２に記載のプレニルアルコールの製造方法。
（１）ファルネシル二燐酸合成酵素遺伝子及びゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
（２）アセチルCoA合成酵素遺伝子、アセチルCoA−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルCoA合成酵素遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸合成酵素遺伝子、MEPシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、CDP-MEキナーゼ遺伝子及びMECDP合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
【請求項５】
前記プレニル二燐酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子が以下の（１）及び／又は（２）の遺伝子である請求項３に記載のプレニルアルコールの製造方法。
（１）ファルネシル二燐酸合成酵素遺伝子及びゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
（２）アセチルCoA合成酵素遺伝子、アセチルCoA−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルCoA合成酵素遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルCoA還元酵素遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸合成酵素遺伝子、MEPシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、CDP-MEキナーゼ遺伝子及びMECDP合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
【請求項６】
前記ホスファターゼ遺伝子が、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）に対し、（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が８０以上であると言う基質特異性を示す請求項１〜請求項５のいずれかに記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項７】
前記プレニルリン酸がファルネシルリン酸、ゲラニルゲラニルリン酸、ゲラニルファルネシルリン酸、ヘキサプレニルリン酸、ヘプタプレニルリン酸、オクタプレニルリン酸、ノナプレニルリン酸、デカプレニルリン酸、ウンデカプレニルリン酸又はドデカプレニルリン酸の１種又は２種以上である請求項６に記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、以下のいずれかの宿主細胞である請求項１〜請求項５のいずれかに記載のプレニルアルコールの製造方法。
（１１）真菌（Eumycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、単細胞真核生物のいずれか。
（１２）酵母。
（１３）サッカロミセス属（Saccharomycetes）の酵母。
（１４）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）YPH499 株、YPH500株、A451株、W303-1A株、W303-1B株又はこれらに由来する株。
【請求項９】
前記プレニルアルコールが炭素数１５以上のものである請求項１〜請求項５のいずれかに記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項１０】
前記プレニルアルコールがファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ゲラニルファルネソール、ヘキサプレニルアルコール、ヘプタプレニルアルコール、オクタプレニルアルコール、ノナプレニルアルコール、デカプレニルアルコール、ウンデカプレニルアルコール又はドデカプレニルアルコールの１種又は２種以上である請求項９に記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項１１】
前記プレニルアルコールが全トランス型である請求項１〜請求項５のいずれかに記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項１２】
前記プレニルアルコールが全トランス型である請求項９に記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換え核酸、組換え体及びプレニルアルコールの製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は、炭素数１５以上のプレニルアルコールを選択的に大量生産したい場合に有効であるホスファターゼ、かかるホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む組換え核酸、このようなポリヌクレオチドが導入された組換え体、及び、生細胞におけるプレニルアルコールの生合成に関わる酵素の発現をコントロールしてプレニルアルコール（特に生物学的に活性なトランス型の異性体構造を持ち、とりわけ炭素数１５以上の例えばＦＯＨ，ＧＧＯＨ）を効率的に大量生産する方法に関する。
背景技術
イソプレノイド生合成経路は多様な生物種に普遍的に備わると考えられる。イソプレノイド化合物の基本骨格単位であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の生合成経路として、主に真核生物に存在するメバロン酸経路と、主に原核生物に存在する非メバロン酸経路（ＤＸＰ経路）の二つの経路が知られている。
メバロン酸経路では、アセチルＣｏＡを出発物質として、アセトアセチルＣｏＡ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）、メバロン酸、メバロン酸５−リン酸（ＭＶＰ）、メバロン酸５−二リン酸（ＭＶＰＰ）を経て、活性イソプレン単位である炭素数５のＩＰＰが生合成される。非メバロン酸経路では、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸が縮合して生じる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を経由して、ＩＰＰが生合成される。非メバロン酸経路に関する知見は徐々に蓄積されつつあるが、関与する酵素やそれをコードする遺伝子等の幾つかは未だ不明である。
ＩＰＰは異性化反応によりジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換される。ＤＭＡＰＰはＩＰＰとトランス型（Ｅ型）に順次重縮合することにより、炭素数１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、炭素数１５のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、炭素数２０のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）・・・等の順に合成される。又、全トランス型のＦＰＰ，ＧＧＰＰに対して、シス型（Ｚ型）にＩＰＰが順次重縮合することにより、ウンデカプレニル二リン酸，デヒドロドリシル二リン酸等が生合成される。
上記ＩＰＰ，ＤＭＡＰＰ，ＧＰＰ，ＦＰＰ，ＧＧＰＰ，ウンデカプレニル二リン酸，デヒドロドリシル二リン酸等が、プレニル二リン酸と総称される。これらのプレニル二リン酸の内、有用性の高い（生物学的に活性な）全トランス型の純品は生合成により製造することに適しており、化学合成では制御が難しい。
又、これらのプレニル二リン酸は、ホスファターゼの作用により二リン酸が分離されて（あるいは、プレニル二リン酸から１個のリン酸が分離されたプレニル一リン酸を中継して、更に１個のリン酸が分離されて）、相当するプレニルアルコールを生成する。本明細書において、以下、プレニル二リン酸とプレニル一リン酸とを一括して指す時は「プレニルリン酸」と言う。
上記のプレニルリン酸やプレニルアルコールの内、特に炭素数１５以上のものは利用価値が高い。例えば炭素数１５以上のプレニル二リン酸であるＦＰＰ，ＧＧＰＰ等や、これらの脱リン酸化物である炭素数１５のファルネソール（ＦＯＨ），炭素数２０のゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）等は、フィトール，ビタミンＥ，ビタミンＫ，ユビキノン（ＣｏＱ）等の合成基質となる。炭素数３５のヘプタプレニルアルコール、炭素数５０のデカプレニルアルコール等も医薬品中間体として有用であり、合成開始物質として上記ＦＰＰ，ＧＧＰＰ，ＦＯＨ，ＧＧＯＨ等を利用できる。
又、プレニルリン酸とプレニルアルコールとを対比すると、一般的にプレニルリン酸は水溶性が比較的高い一方、部分的に非極性基を有するので抽出・精製が容易でないと言う難点があり、ヘキサンやペンタン等の非極性有機溶媒で容易に抽出・精製できるプレニルアルコールを生産する方が有利である。更に、ファルネシル基やゲラニルゲラニル基を有する化合物の化学合成にはプレニルアルコールが用いられる。
以上の点から、生合成経路を利用して、生物学的に活性なトランス型の異性体構造を持つ、特に炭素数１５以上のプレニルアルコール（例えば、いずれも全トランス型の、ゲラニルファルネソール，ヘキサプレニルアルコール，ヘプタプレニルアルコール，オクタプレニルアルコール，ノナプレニルアルコール，デカプレニルアルコール，ウンデカプレニルアルコール，ＦＯＨ，ＧＧＯＨ等）を効率的に大量生産する方法の提供が望まれる。
特公昭６３−１７４３７号公報には、シュードモナス株の培養によるポリプレニルアルコールの生産方法が開示されているが、全トランス型ウンデカプレニルアルコールが３ｍｇ／Ｌ生産されるだけであって、有用なＦＯＨやＧＧＯＨの生産は開示されていない。特開平９−２３８６９２号公報には、トウダイグサ科の植物細胞の培養によるＧＧＯＨ及びＧＧＰＰの生産方法が開示されているが、最大で３．２５ｍｇ／ＬのＧＧＯＨ生産が報告されるに止まる。天然の微生物や動植物細胞をそのまま培養しても、プレニルアルコールの効率的な大量生産は期待できない。
特開平１０−２４８５７５号公報には、アセチルＣｏＡのＭＶＰやＭＶＰＰへの変換過程に関与するＨＭＧ−ＣｏＡ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ）還元酵素遺伝子を酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）に導入してカロテノイドを生産する方法が開示されている。特開平５−１１５２９８号公報には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のコピー数を増加することによって、植物中のステロールの蓄積を増加する方法が開示されている。特開平５−１９２１８４号公報には、ステロール生合成酵素の発現に欠損を持つ変異体酵母において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現レベルを上昇させることによりスクアレンおよびステロールの蓄積を増大させる方法が開示されている。特開平１０−１５５４９７号公報には、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子（ｃｒｔＥ）を導入した微生物による発酵法を用いたカロテノイド生産方法が開示されている。しかし、上記した特開平１０−２４８５７５号公報，特開平５−１１５２９８号公報，特開平５−１９２１８４号公報ないし特開平１０−１５５４９７号公報に開示された方法は、プレニルアルコールの効率的な大量生産には結び付かない。特開昭５３−１２７８８９号公報には、ジャガイモの根から分離したホスファターゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプレニルアルコールの製造方法が開示されている。しかし、この方法は生合成を利用する方法ではないし、ホスファターゼ遺伝子の利用について何ら開示するところがない。
一方、プレニルリン酸脱リン酸化活性のあるホスファターゼに関しては、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）肝臓ミクロソーム中に存在するプレニルピロホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．７．１）の報告（Ｂａｎｓａｌ，Ｖ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１５（２），３９３−３９９）があるが、単離されていない。酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＰＰ１遺伝子がコードするジアシルグリセロール二リン酸ホスファターゼが、ＩＰＰ，ＧＰＰ，ＦＰＰ，ＧＧＰＰに作用する旨の報告（Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ａ．ｅｔ．ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２１），１４８３１−１４８３７）もあるが、このホスファターゼがプレニルリン酸とその前駆体のリン酸エステル化合物（ＭＶＰやＭＶＰＰ）との間でどのような選択的な基質特異性を示すかについて解明していない。更に、上記Ｆａｕｌｋｎｅｒらの報告のＦｉｇ．５によれば、上記ＩＰＰ，ＧＰＰ，ＦＰＰ，ＧＧＰＰの個々に対する相対的な基質特異性においては、相互に余り選択的とは言えないデータが提示されている。そして、上記のＢａｎｓａｌら、Ｆａｕｌｋｎｅｒらによる２報は、専ら酵素学的研究等を目的とし、ホスファターゼやその遺伝子の産業的利用を全く示唆しない。
なお、ＵＳＰ  ６，２４２，２２７号公報では、ＦＰＰ，ＧＧＰＰを脱リン酸する効果の高いホスファターゼをコードする遺伝子を過剰発現させればＦＯＨ，ＧＧＯＨの生産性を向上させることが出来るであろう、との記載がある。しかし、ホスファターゼ遺伝子の利用に関する実施例は開示されていないし、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼに関する記述はない。更に、実施例に示したように、上記のような基質特異性のない非特異的ホスファターゼはＦＰＰ，ＧＧＰＰを脱リン酸する効果はあるが、非特異的ホスファターゼをコードする遺伝子を過剰発現させてもＦＯＨ，ＧＧＯＨの生産性を向上させることは出来なかった。
微生物等の生細胞を利用した目的物質の生産において、代謝経路の特定ステップを酵素作用の強化等により増強して目的物質の生産性を向上させる方法は、一般論としては知られている。
しかし、生細胞におけるプレニルアルコールの生合成プロセスを人為的にコントロールしたプレニルアルコールの効率的な大量生産系の構築は、未だ報告されていない。又、プレニルアルコールを生細胞で特異的に合成するには上記生合成プロセスのどのステップをどのようにコントロールすれば良いか、未だ明らかとなっていない。更に、炭素数１５以上のプレニルアルコールを選択的に大量生産したい場合に有効であるホスファターゼも、明らかになっていない。
本発明の目的は、炭素数１５以上のプレニルアルコールを選択的に大量生産したい場合に有効であるホスファターゼ、かかるホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む組換え核酸、このようなポリヌクレオチドが導入された組換え体、生細胞におけるプレニルアルコールの生合成に関わる酵素の発現をコントロールしてプレニルアルコール（特に生物学的に活性なトランス型の異性体構造を持ち、とりわけ炭素数１５以上の例えばＦＯＨ，ＧＧＯＨ）を効率的に大量生産する方法を提供することである。
発明の開示
本願の第１発明は、配列番号１〜配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有し、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すポリペプチドである。
本願発明者は、第１発明のポリペプチドが炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼであることを発見した。従って、第１発明のポリペプチドにより、炭素数１５以上のプレニルアルコール、例えばＦＯＨ，ＧＧＯＨ，ヘプタプレニルアルコール，デカプレニルアルコール等を効率良く選択生産することができる。
本願の第２発明は、配列番号１〜配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列における５個以下のアミノ酸が置換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すポリペプチドである。
第２発明に係るポリペプチドにおいても、前記第１発明と同等の作用・効果を期待することができる。
本願の第３発明は、以下の（１）〜（３）式の内の少なくとも一つのホスファターゼモチーフを含み、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すポリペプチドである。
（１）ＫＸＸＸＧＸＸＲＰ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基から選ばれることを表す）
（２）１ＸＸＳＧＨ（式中、１はアミノ酸残基Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘは任意のアミノ酸残基から選ばれることを表す）
（３）ＳＲ２ＸＤＸＸＨＸＸＸＤＶＸＸＧＸＸＸ３（式中、２はアミノ酸残基Ｖ又はＴから選ばれ、３はアミノ酸残基Ｇ又はＡから選ばれ、Ｘは任意のアミノ酸残基から選ばれることを表す）。
本願発明者は、配列番号１〜配列番号６に示す炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるポリペプチドのアミノ酸配列を詳細に検討した結果、第３発明において（１）〜（３）として規定した、これらのポリペプチドに共通した保存配列を見出した。その詳細は第１図に基づいて後述するが、この保存配列は炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を発現するために必要な配列（ホスファターゼモチーフ）であると考えられる。従って、第３発明に係るポリペプチドは、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼであると考えられる。
本願の第４発明は、前記第３発明に係る（１）〜（３）式で示されるホスファターゼモチーフにおいて、種類が特定されている任意の１以上のアミノ酸残基が同類置換を受けているポリペプチドである。ここに、「種類が特定されているアミノ酸残基」とは、上記（１）〜（３）式において「Ｘ」以外の記号で表記されているアミノ酸残基を言う。又、「同類置換」とは、ポリペプチドの機能が全体的に実質的に不変のまま維持されるように、所定のアミノ酸残基を化学的または機能的に類似した別のアミノ酸残基で置換することを言う。化学的または機能的に類似したアミノ酸の例示として、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）同士、極性だが電荷のないアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）同士、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）同士、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）同士、等が挙げられる（Ｅ．Ｅ．Ｃｏｒｎｎら著、田宮信雄ら訳、「コーン・スタンプ生化学  第５版」東京化学同人刊、ｐ５６−５８、１９８８）。
第４発明に係るポリペプチドは、そのホスファターゼモチーフにおいて特定されている任意の１以上のアミノ酸残基が同類置換を受けているため、第３発明に係るポリペプチドと同様に、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼであると考えられる。
本願の第５発明は、配列番号７〜配列番号１２のいずれかに示す塩基配列を有し、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードするポリヌクレオチドである。
本願発明者は、第５発明に係るポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼであることを発見した。従って第５発明のポリヌクレオチドを生細胞又は生物体に導入又は発現強化することにより、該生細胞内又は生物体内で炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼを生産させ、炭素数１５以上のプレニルアルコールを有効に生産することができる。
本願の第６発明は、配列番号７〜配列番号１２のいずれかに示す塩基配列又はこれと相補的な塩基配列に対して所定のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードするポリヌクレオチドである。
第６発明に係るポリヌクレオチドにおいても、前記第５発明と同等の作用・効果を期待することができる。
本願の第７発明は、前記第１発明〜第４発明に係るいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
第７発明に係るポリヌクレオチドにおいても、前記第５発明と同等の作用・効果を期待することができる。
本願の第８発明は、前記第５発明〜第７発明に係るいずれかのポリヌクレオチドを含む組換え核酸である。
第８発明によって、前記第５発明〜第７発明に係るポリヌクレオチドを生細胞又は生物体に導入する有力な手段が提供される。
本願の第９発明は、前記第８発明に係るいずれかの組換え核酸が導入されている組換え体である。
第９発明に係る組換え体によって、炭素数１５以上のプレニルアルコールを一層有利に選択生産することができる。
本願の第１０発明は、前記第９発明に係る組換え体の宿主細胞が、真菌（Ｅｕｍｙｃｅｔｅｓ），子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ），単細胞真核生物のいずれかである組換え体である。
即ち、第９発明に係る組換え体の宿主としては、例えば真菌（Ｅｕｍｙｃｅｔｅｓ），子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ），単細胞真核生物のいずれかを好ましく用いることができる。
本願の第１１発明は、前記第９発明に係る組換え体の宿主細胞が酵母である組換え体である。
即ち、第９発明に係る組換え体の宿主としては、例えば酵母を好ましく用いることができる。
本願の第１２発明は、前記第１１発明に係る酵母がサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）の酵母である組換え体である。
即ち、第１１発明に係る酵母としては、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）の酵母を好ましく用いることができる。
本願の第１３発明は、前記第１１発明に係る酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株，ＹＰＨ５００株，Ａ４５１株，Ｗ３０３−１Ａ株，Ｗ３０３−１Ｂ株又はこれらに由来する株である組換え体である。
即ち、第１１発明に係る酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株，ＹＰＨ５００株，Ａ４５１株，Ｗ３０３−１Ａ株，Ｗ３０３−１Ｂ株又はこれらに由来する株を好ましく用いることができる。
本願の第１４発明は、ホスファターゼ遺伝子を導入又は発現強化した宿主細胞を培養し、その培養物からプレニルアルコールを採取するプレニルアルコールの製造方法である。
本願発明者は、アセチルＣｏＡを出発物質とする前記メバロン酸経路、又はピルビン酸を出発物質とする前記非メバロン酸経路より、各種のプレニル二リン酸を経由してプレニルアルコールに到るプレニルアルコールの生合成反応に対して詳細な実験的検討を加えた結果、生細胞におけるホスファターゼ遺伝子の導入又は発現強化と言う方法により、生物学的に活性な異性体構造（例えば、いずれも全トランス型の、ゲラニルファルネソール，ヘキサプレニルアルコール，ヘプタプレニルアルコール，オクタプレニルアルコール，ノナプレニルアルコール，デカプレニルアルコール，ウンデカプレニルアルコール，ＦＯＨ，ＧＧＯＨ等）を持つプレニルアルコールの効率的な大量生産が可能となることを見出した。一方、第１４発明の方法は、炭素数５以上のプレニルアルコール全般の生産量を増量させたい場合にも有用である。
本願発明者は、酵母を宿主とする実施例において、ホスファターゼ遺伝子の導入又は発現強化により、現在のところ、炭素数１５以上のプレニルアルコール（例えば、全トランス型のＦＯＨ，ＧＧＯＨ）の生産性を約４０倍に高めることに成功している。即ち、第１４発明により、プレニルアルコール、特にトランス型のプレニルアルコール、とりわけトランス型で炭素数１５以上のプレニルアルコールを効率的に大量生産する方法が提供される。
本願の第１５発明は、ホスファターゼ遺伝子とプレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とを導入又は発現強化した宿主細胞を培養し、その培養物からプレニルアルコールを採取するプレニルアルコールの製造方法である。
第１５発明のように、ホスファターゼ遺伝子とプレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とを宿主細胞に導入又は発現強化した場合、即ちホスファターゼ遺伝子を導入又は発現強化すると共にプレニル二リン酸生合成経路における他の任意のステップに関わる酵素の遺伝子を導入又は発現強化した場合、プレニルアルコールの生産性が更に高くなることがある。プレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子のみを導入又は発現強化しても、プレニルアルコール（特に炭素数１５以上のプレニルアルコール、例えばＦＯＨ，ＧＧＯＨ）の効率的な大量生産に対する寄与は限定的である。更にこの場合において、ホスファターゼ遺伝子とプレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とを連結して導入又は発現強化することが、とりわけ好ましい。
本願の第１６発明は、前記第１５発明に係るプレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子が、以下の（４）及び／又は（５）の遺伝子であるプレニルアルコールの製造方法である。
（４）ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
（５）アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、アセチルＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸合成酵素遺伝子、ＭＥＰ（２−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＤＰ−ＭＥ（４−（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）−２−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）キナーゼ遺伝子及びＭＥＣＤＰ（２−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ２，４−ｃｙｃｌｏｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子。
前記第１５発明においてホスファターゼ遺伝子と共に導入又は発現強化する遺伝子として、第１６発明の（４）に列挙する遺伝子が特に好ましい。第１６発明の（５）に列挙する遺伝子も好ましい。
本願の第１７発明は、前記第１４発明〜第１６発明に係るホスファターゼ遺伝子が、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子であるプレニルアルコールの製造方法である。
第１７発明のように、導入又は発現強化されるホスファターゼ遺伝子が炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子である場合、炭素数１５以上のプレニルアルコールの効率的な大量生産と言う目的からは、特に効果が著しい。これらのプレニルアルコールとして、前記「第１４発明の作用・効果」の欄で例示した各種の生物学的に活性な異性体構造を持つプレニルアルコールを特に好ましく例示することができる。
本願の第１８発明は、前記第１４発明〜第１６発明に係るホスファターゼ遺伝子が、前記第５発明〜第８発明に記載のいずれかのポリペプチドであるプレニルアルコールの製造方法である。
即ち、第１４発明〜第１６発明において導入又は発現強化されるホスファターゼ遺伝子として、第５発明〜第８発明に係るホスファターゼ遺伝子を好ましく利用できる。
本願の第１９発明は、前記第１４発明〜第１６発明に係るホスファターゼ遺伝子が、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ以外のホスファターゼをコードする遺伝子であるプレニルアルコールの製造方法である。
第１９発明のように、導入又は発現強化されるホスファターゼ遺伝子が炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ以外のホスファターゼをコードする遺伝子である場合にも、炭素数が５〜１５の範囲にわたる各種のプレニルアルコールを有効に得ることができる。
本願の第２０発明は、前記第１４発明〜第１９発明に係る宿主細胞が、第１０発明〜第１３発明に記載のいずれかの宿主細胞であるプレニルアルコールの製造方法である。
即ち、第１４発明〜第１９発明における宿主細胞として、前記第１０発明〜第１３発明に係るいずれかの宿主細胞を好ましく用いることができる。
本願の第２１発明は、前記第１４発明〜第２０発明に係るプレニルアルコールが炭素数１５以上のものであるプレニルアルコールの製造方法である。
上記第１４発明〜第２０発明に係るプレニルアルコールの製造方法において、炭素数５又は炭素数１０のプレニルアルコールも採取することができるが、炭素数１５以上のプレニルアルコールが相対的に生産量が多く、非極性有機溶媒による抽出・精製が容易であり、かつ前記のように有用性も高い。従って炭素数１５以上のプレニルアルコールを採取することが特に有効である。炭素数１５以上のプレニルアルコールの全てを採取することもできるし、その内の１種又は２種以上を選択的に採取することもできる。
本願の第２２発明は、前記第２１発明に係るプレニルアルコールが、ファルネソール，ゲラニルゲラニオール，ゲラニルファルネソール，ヘキサプレニルアルコール，ヘプタプレニルアルコール，オクタプレニルアルコール，ノナプレニルアルコール，デカプレニルアルコール，ウンデカプレニルアルコール又はドデカプレニルアルコールから選ばれる１種又は２種以上のプレニルアルコールであるプレニルアルコールの製造方法である。
即ち、前記第２１発明において採取する炭素数１５以上のプレニルアルコールとして、上記の各プレニルアルコールから選ばれる１種又は２種以上のプレニルアルコールが、特に好ましく例示される。
本願の第２３発明は、前記第１２発明〜第２２発明に係るプレニルアルコールが全トランス型であるプレニルアルコールの製造方法である。
即ち、第１２〜第２２発明に係るプレニルアルコールの製造方法においては、宿主細胞を用いた生合成であるため、有用性の高い全トランス型のプレニルアルコールを製造することができる。このような全トランス型のプレニルアルコールを採取することが、より好ましい。
発明を実施するための最良の形態
ポリペプチド
本願発明に係るポリペプチドは、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼである。かかるホスファターゼの好ましい基準の一例を、次のように規定できる。即ち、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）のみを基質とした酵素活性測定系において示された（Ａ）に対する比活性を１００とした場合、（Ａ）及びモル比でその２０倍量の炭素数１０以下のプレニルリン酸又はその前駆体（Ｂ）を共存させた場合における（Ａ）に対する比活性が、８０以上、より好ましくは８５以上、更に好ましくは９０以上を示すことである。
本願発明に係る、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるポリペプチドの代表例が、配列番号１〜配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらのポリペプチドはいずれも、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼであることが、本願発明者によって初めて見出された。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノムＤＮＡ中に存在するホスファチジン酸ホスファターゼホモログ遺伝子〔Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＣ００６２００（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１６７７８．．１７６８６））、この遺伝子をＡｔＰＡＰ１と命名した〕によりコードされるホスファターゼである。ＡｔＰＡＰ１の塩基配列を配列番号７に示す。配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａのゲノムＤＮＡ中に存在するホスファチジン酸ホスファターゼホモログ遺伝子〔Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＣ００７５９１（３６１０．．５００６）、この遺伝子を「ＡｔＰＡＰ２」と命名した）によりコードされるホスファターゼである。ＡｔＰＡＰ２の塩基配列を配列番号８に示す。
配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＤＰＰ１によりコードされるホスファターゼである（Ｔｏｋｅ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（６），３２７８−３２８４）。ＤＰＰ１のＧｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．はＮＣ  ００１１３６であり、その塩基配列を配列番号９に示す。
配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは酵母の遺伝子ＬＰＰ１によりコードされるホスファターゼである（Ｔｏｋｅ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２３），１４３３１−１４３３８）。ＬＰＰ１のＧｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、ＮＣ００１１３６であり、その塩基配列を配列番号１０に示す。
配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ラット（Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）の遺伝子ＰＡＰ２によりコードされるホスファターゼである（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ  ＤＮ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３８），２４２８１−２４２８４）。ＰＡＰ２のＧｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、Ｕ９０５５６であり、その塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの遺伝子Ｄｒｉ４２によりコードされるホスファターゼである（Ｂａｒｉｌａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４７），２９９２８−２９９３６）。Ｄｒｉ４２のＧｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、Ｙ０７７８３であり、その塩基配列を配列番号１２に示す。
更に、配列番号１〜配列番号６に示す、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるポリペプチドのアミノ酸配列を詳細に検討した結果、第１図に示すように共通して保存された配列を見出した。
第１図において、配列番号１〜配列番号６に係る各ポリペプチドは、それらをコードする前記各遺伝子の表記により区別（即ち、例えば「ＤＰＰ１」の表記は、配列番号３に係るポリペプチドを表す）し、これらの各ポリペプチドに見出した保存配列を示した。又、第１図の最下行には、これらの保存配列に共通するアミノ酸配列をマルチプルアライメント方式の配列表記により示した。このマルチプルアライメントの配列表記式において、１はアミノ酸残基ＳまたはＴから選ばれ、２はアミノ酸残基ＶまたはＴから選ばれ、３はアミノ酸残基ＧまたはＡから選ばれ、Ｘは任意のアミノ酸残基から選ばれることを表す。ｎ１は任意の個数（例えば、３４〜３９個）の任意のアミノ酸残基を表し、ｎ２も任意の個数（例えば、３８〜４６個）の任意のアミノ酸残基を表す。
従って、第１図のマルチプルアライメントの配列表記式で示される保存配列においては、第３発明において規定する（１）〜（３）の配列部分の内の少なくとも１以上の部分が、又はその全部が、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を発現するために必要な配列（ホスファターゼモチーフ）であると考えられる。
又、第１図のマルチプルアライメントの配列表記式で示される保存配列において、特定されたアミノ酸残基の１以上が前記した定義に係る「同類置換」を受けている変異体であるポリペプチドについても、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すと考えられる。
本願発明に係るポリペプチドの他の代表例が、配列番号１〜配列番号６に示すアミノ酸配列において、５個以下のアミノ酸が置換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すポリペプチドである。
上記において、置換，欠失又は付加される５個以下のアミノ酸は、その全部がアミノ酸配列において互いに隣接する位置にあるアミノ酸であり得る。又、上記の５個以下のアミノ酸は、その一部がアミノ酸配列において互いに隣接する位置にあるアミノ酸であり得る。更に、上記の５個以下のアミノ酸は、いずれもがアミノ酸配列において互いに隣接しない位置にあるアミノ酸であり得る。
以上に列挙したポリペプチドは、上記それぞれの起源生物の細胞から常套的な酵素単離手段によって直接に取得することができ、又はそれぞれのポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主に導入することにより、同様にして多量に取得することができる。
第１４発明に係るプレニルアルコールの製造方法において、導入又は発現強化されるホスファターゼ遺伝子によってコードされるホスファターゼは、少なくともプレニルリン酸に対して作用するものである限りにおいて限定されない。即ち、基質特異性の低い酸性ホスファターゼやアルカリホスファターゼ等から、プレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ、更には炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼに到る、多様なレベルの基質特異性のホスファターゼが限定なく含まれる。但し、より高い基質特異性のあるホスファターゼ、特に炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼを用いることが、更に好ましい。プレニルリン酸に対して高い基質特異性のあるホスファターゼとして、第１発明〜第４発明に係るポリペプチドを好ましく例示することができる。同等の機能を有する酵母，動物又は植物由来のポリペプチドも好ましく例示することができる。
ポリヌクレオチド
本願発明において、ポリヌクレオチドとは、１本鎖、２本鎖又は３本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを言う。又、本発明において、組換え核酸とは、組換えのために調製されたポリヌクレオチドを言う。
本願発明に係るポリヌクレオチドは、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードするポリヌクレオチドである。
本願発明に係るポリヌクレオチドの代表例が、配列番号７〜配列番号１２のいずれかに示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである。これらは、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ活性を示すポリペプチドをコードすることが、本願発明者によって初めて見出された。
配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、前記ＡｔＰＡＰ１である。配列番号８に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、前記ＡｔＰＡＰ２である。なおＡｔＰＡＰ１はシロイヌナズナ・ゲノムプロジェクトで発表された第ＩＩ染色体第２セクションに位置することが分っており（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，ｐ．７６７−７６８）、ＡｔＰＡＰ２は第１染色体ＢＡＣライブラリＦ９Ｌ１に位置することが分っている（Ｆ９Ｌ１．２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００７５９１））。
配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは前記ＤＰＰ１である。配列番号１０に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは前記ＬＰＰ１である。配列番号１１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは前記ＰＡＰ２である。配列番号１２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは前記Ｄｒｉ４２である。
本願発明に係るポリヌクレオチドの他の代表例が、図１のマルチプルアライメントの配列表記式で示される保存配列の一部（第３発明において規定する（１）〜（３）の配列部分の内の少なくとも１以上の部分）又は全部を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、又はそれらにおいて特定されたアミノ酸残基の１以上が同類置換を受けているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本願発明に係るポリヌクレオチドの更に他の代表例が、配列番号７〜配列番号１２のいずれかに示す塩基配列と所定のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードするポリヌクレオチドである。
上記において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、コロニーハイブリダイゼーション法，プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等の適宜なハイブリダイゼーション法において、以下の条件下で一方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）又は該ポリヌクレオチドの断片に対し他方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）がハイブリダイズできることを言う。即ち、フィルターに固定化された一方のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの断片に対し、０．７〜１ＭのＮａＣｌの存在下、所定温度（Ｘ°Ｃ）下で他方のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用いてＸ°Ｃの条件下でフィルターを洗浄した場合に、他方のポリヌクレオチドを同定できることを言う。そして「Ｘ°Ｃ」とは、少なくとも５０°Ｃ以上であり、より好ましくは６０°Ｃ以上であり、更に好ましくは６５°Ｃ以上である。
以上に列挙したポリヌクレオチドは、上記した各起源生物から常套的な単離手段によって取得することができるし、その他の原核生物等の各種単細胞生物や動植物細胞から取得できる可能性がある。当業者に良く知られた利用可能な方法としてハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  １９７５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓ）やＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８））が挙げられる。即ち、当業者にとって、既知の遺伝子の塩基配列又はその一部をプローブとして、あるいはかかる塩基配列の一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、これと高い相同性を持つポリヌクレオチドを単離し、該ポリヌクレオチドからホスファターゼ遺伝子をクローニングすることは容易である。又、上記した特徴的なホスファターゼ活性を指標にして該ホスファターゼを単離し、そのアミノ酸配列から該ホスファターゼ遺伝子をクローニングすることも容易である。
第１４発明に係るプレニルアルコールの製造方法において導入又は発現強化されるホスファターゼ遺伝子は、少なくともプレニルリン酸に対して作用するホスファターゼをコードする遺伝子である限りにおいて、限定されない。即ち、基質特異性の低い酸性ホスファターゼやアルカリホスファターゼ等から、プレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ、更には炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼに到る、多様なレベルの基質特異性のホスファターゼをコードする遺伝子が限定なく含まれる。但し、より高い基質特異性のあるホスファターゼ、特に炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子を導入又は発現強化することが、更に好ましい。プレニルリン酸に対して高い基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子として、第５発明〜第７発明に係るポリヌクレオチドを好ましく例示できる。同等の機能を有する酵母，植物又は動物由来のポリヌクレオチドも好ましく例示できる。
ホスファターゼ遺伝子の導入又は発現強化
上記した非特異的ホスファターゼをコードする遺伝子、より好ましくはプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子、更に好ましくは炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子が、宿主細胞に導入又は発現強化される。
本願発明において「ホスファターゼ遺伝子を導入又は発現強化」とは、以下の意味である。即ち、「ホスファターゼ遺伝子を導入」とは、該ホスファターゼ遺伝子を組換え核酸として宿主細胞に導入する全ての場合を含む。少なくとも、ベクターによってホスファターゼ遺伝子を導入する場合や、ＰＣＲフラグメント等を用いたポリヌクレオチドの相同組換えによってホスファターゼ遺伝子を導入する場合が含まれる。より好ましくは、該ホスファターゼ遺伝子が発現を強化する発現ベクターによって導入される。又、「ホスファターゼ遺伝子を発現強化」とは、結果的に該ホスファターゼ遺伝子の発現が強化される全ての場合を含む。例えば、該ホスファターゼ遺伝子をその発現を強化する手段を伴って組換え核酸として導入する場合、宿主細胞における該ホスファターゼ遺伝子のコピー数を増強させる場合、宿主細胞の培養条件を調整（遺伝子発現の誘導物質の添加等）することにより該ホスファターゼ遺伝子の発現を強化する場合、等が含まれる。
又、上記各種のホスファターゼをコードする遺伝子を導入又は発現強化すると同時に、プレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子のうち少なくとも１の遺伝子を宿主細胞に導入又は発現強化することができる。ホスファターゼをコードする遺伝子とプレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子とを同時に導入又は発現強化する形態は任意であり、例えば、これらの遺伝子を同時期にかつ別個に上記各種の同一又は別異の手段を利用して導入又は発現強化しても良いし、後述のように連結遺伝子として同時に導入又は発現強化しても良い
プレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子としては、例えばヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を好ましく例示できる。あるいは、アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、アセチルＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ合成酵素遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸合成酵素遺伝子、ＭＥＰシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ遺伝子及びＭＥＣＤＰ合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子も好ましく例示できる。
又、上記各種のホスファターゼをコードする遺伝子を、プレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子と連結して、上記と同様に宿主細胞に導入又は発現強化することができる。プレニル二リン酸生合成経路に関与する酵素の遺伝子としては、例えばファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を好ましく例示できる。あるいは、アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、アセチルＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素遺伝子、メバロン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸リン酸キナーゼ遺伝子、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子、デオキシキシルロースリン酸合成酵素遺伝子、ＭＥＰシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＤＰ−ＭＥキナーゼ遺伝子又はＭＥＣＤＰ合成酵素遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子も好ましく例示できる。このように連結された遺伝子を「ホスファターゼ連結遺伝子」とも呼ぶ。
なお、連結された遺伝子とは、２つ以上の遺伝子を１つの読み枠（ＯＲＦ）として発現できるように連結し、発現されるポリペプチドが融合タンパク質になるようにしたものである。また連結する遺伝子と遺伝子の結合領域に、それぞれの遺伝子翻訳産物が適切に機能する立体構造がとれるように人工的なヌクレオチド配列（リンカー配列）を自由に挿入することも可能である。例えばＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  ＳｅｒやＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒというペプチド配列をコードするリンカー配列などが挙げられる。これらの配列は、大腸菌で抗体を発現させるときのＨ鎖とＬ鎖をつなぐリンカー配列として利用された（Ｈｕｓｔｏｎ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）。
発現ベクター又は導入しようとする遺伝子の発現機能を持つポリヌクレオチド断片は、導入しようとするホスファターゼ遺伝子又はホスファターゼ連結遺伝子の発現を強化する種々のポリヌクレオチド断片と連結されたものである。好ましくは、発現ベクターは転写プロモーター，転写ターミネーター，組換え体選抜用マーカー遺伝子，エンハンサーを含み得る。植物発現ベクターにおいては、更に好ましくＴ−ＤＮＡ領域を含み得る。一般的な発現ベクターの構築方法として、例えば、ＰＣＲ法等で調製した遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法で発現ベクターに組み込むことができる。
ベクターとしては、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合に良く利用される「ＹＥｐ１３」，「ＹＥｐ２４」，「ＹＣｐ５０」，「ｐＹＥＳ２」，「ｐＲＳ４１４」，「ｐＲＳ４１５」，「ｐＲＳ４１６」，「ｐＲＳ４１３」，「ｐＲＳ４０４」，「ｐＲＳ４０５］，「ｐＲＳ４０６」，「ｐＲＳ４０３」，「ｐＡＵＲ１０１」等、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主とする場合に良く利用されるプラスミド「ｐＳＣ１０１」，「ｐＢＲ３２２」，「ｐＨＳＧ２９８」，「ｐＶＣ１８」，「ｐＶＣ１９」，「ｐＴｒｃ９９Ａ」，「ｐＭａ１−ｃ２］，「ｐＧＥＸ２Ｔ」，「ｐＴＶ１１８Ｎ」，「ｐＴＶ１１９Ｎ」等、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を宿主とする場合に良く利用されるプラスミド「ｐＵＢ１１０」，「ｐＣ１９４」等を好ましく使用でき、その他にも「ｐＢＩ１２２１」，「ｐＢＩ１１０１」その他各種のものを限定なく使用できる。
発現ベクターは、ホスファターゼを恒常的又は誘導的に発現させるための転写プロモーターを含有し得る。例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合に良く利用されるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１及びＡＤＨ２），トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３），ガラクトース異化に関連する遺伝子（ＧＡＬ１，ＧＡＬ７，ＧＡＬ１０），酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）又はメタロチオネイン遺伝子（ＣＵＰ１）の転写プロモーターが挙げられる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での発現用としてｔｒｐ，ｌａｃ，ｔｒｃ，ｔａｃ等の転写プロモーターを用いることができる。
他にも、恒常的に発現させるための転写プロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８５  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０），イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１１５５），トウモロコシのユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９３  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：５６７）その他各種のものを限定なく使用できる。誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、糸状菌，細菌，ウイルスの感染や侵入、低温，高温，乾燥，紫外線の照射，特定化合物の散布等の外因によって発現することが知られている転写プロモーター等が挙げられる。
ホスファターゼ遺伝子又はホスファターゼ連結遺伝子を導入又は発現強化するための組換え核酸は、必ずしもベクター機能を持っていなくても、例えばゲノムインテグレーションすることができれば良い。
発現ベクターその他の組換え核酸に連結するホスファターゼ遺伝子又はホスファターゼ連結遺伝子には、ホスファターゼに脂質膜近傍への局在化シグナルを付加する塩基配列領域を含ませることも可能である。
プレニルリン酸（特に炭素数１５以上のプレニルリン酸）は疎水性であり、宿主細胞の細胞膜近傍や、宿主細胞が真核細胞である場合のゴルジ体，小胞体等の各種細胞器管膜近傍に高濃度に局在する傾向がある。従ってホスファターゼに疎水性ペプチド等の局在化シグナルを付加することにより、ホスファターゼと基質たるプレニルリン酸との接触確率を向上させ、プレニルアルコールの生産性を高め得る。特にホスファターゼ遺伝子が元々基質非特異的ホスファターゼをコードする遺伝子である場合に、ホスファターゼに対する上記シグナルの付加が有効である。
局在化シグナルの代表的なものは、公知の各種疎水性シグナルペプチドである。周知のように、局在化シグナルの選択により宿主細胞内におけるホスファターゼの局在化部位を選択することも可能である。ホスファターゼ遺伝子又はホスファターゼ連結遺伝子に対して局在化シグナルを付加するための塩基配列領域を付加したもとで発現ベクターその他の組換え核酸を構築する一般的な方法として、例えば、公知の各種シグナルペプチドをコードする遺伝子ドメイン及びホスファターゼ遺伝子又はホスファターゼ連結遺伝子をＰＣＲ法等で調製し、これらの遺伝子を適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法で連結し、更に連結された遺伝子を適当な発現ベクターに組込むことができる。
組換え核酸の宿主への導入
本願発明に係るホスファターゼ遺伝子を生物体に導入又は発現強化させる場合、宿主細胞の種類は限定されない。例えば、原核生物，真菌（Ｅｕｍｙｃｅｔｅｓ），子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ），単細胞真核生物，又は動物あるいは植物の生細胞を任意に選択できる。植物組織培養細胞及び動物組織培養細胞を含む多細胞生物の生組織培養細胞も任意に選択できる。
上記の植物細胞又は植物組織培養細胞において、「植物」とは藻類，蘚苔類，シダ類，裸子植物及び被子植物を含む。上記の動物細胞又は動物組織培養細胞において、「動物」とは海綿動物，腔腸動物，線形動物，軟体動物，節足動物，刺皮動物及び各種の脊椎動物を含む。動物又は植物の生細胞又は生組織培養細胞としては、動植物の懸濁培養細胞、内臓，葉，根等の動植物器管の組織培養細胞，植物におけるカルス等を例示できる。
宿主としては、特に限定されないが、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）等のサッカロミセス属やピキア属その他に属する酵母、Ｅ． ｃｏｌｉ、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），バシルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）等のエシェリヒア属又はバシルス属に属する細菌、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ），アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇａｒ）等のアスペルギルス属に属する糸状菌、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）の培養細胞，ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいは植物細胞等が好ましく例示される。
宿主としては、特にサッカロミセス属の酵母を好ましく例示できる。より具体的には、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ７６６２５，ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−ｄｅｌｔａ６３，ｈｉｓ３−ｄｅｌｔａ２００，ｌｅｕ２−ｄｅｌｔａ１）、ＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ７６６２６，ＭＡＴａｌｐｈａ，ｕｒａ３−５２，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−ｄｅｌｔａ６３，ｈｉｓ３−ｄｅｌｔａ２００，ｌｅｕ２−ｄｅｌｔａ１）、Ａ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９，ＭＡＴａｌｐｈａ，ｃａｎ１，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３，ａｒｏ７）、Ｗ３０３−１Ａ（ＡＴＣＣ２０８３５３，ＭＡＴａｌｐｈａ，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｕｒａ３−１，ｔｒｐ１−１，ｃａｎ１−１００）又はＷ３０３−１Ｂ  ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｕｒａ３−１，ｔｒｐ１−１，ｃａｎ１−１００；ｈａｐｌｏｉｄ  ｏｆ  Ｗ３０３（ＡＴＣＣ２０１２３９））を、とりわけ好ましく例示できる。
本願発明に係るホスファターゼ遺伝子を宿主細胞に導入するに当たり、前記のような種々の態様で、宿主に適合した組換え核酸を利用することができる。より具体的には、大腸菌への外来遺伝子の導入法は、ハナハンの方法等の確立された幾つかの方法を利用できる。酵母への外来遺伝子の導入法は、リチウム法等の確立された幾つかの方法を利用できる。ホスファターゼ遺伝子の導入においては、宿主細胞の染色体内に組込むこともできるし、プラスミド等として細胞内に保持することもできる。
プレニルアルコールの製造方法
本願発明に係るプレニルアルコールの製造方法はプレニルアルコール全般の生産性の向上に有利であるが、中でも炭素数１０以上のプレニルアルコール、とりわけ炭素数１５以上のプレニルアルコールの生産性の向上が著しい。プレニルアルコールの製造方法における炭素数１５以上のプレニルアルコール特にＦＯＨ，ＧＧＯＨの生産性の向上を一般的に対比すると、第１５発明の方法が特に効果が高い。又、第１３発明の方法や第１９発明の方法も、プレニルアルコールの生産性を向上させる。
本願発明に係るプレニルアルコールの製造方法においては、産業上有用なトランス型のプレニルアルコールを製造できると言う利点がある。ここに「トランス型」とは、炭素数５のプレニルアルコールにおけるトランス型と、炭素数１０以上のプレニルアルコールにおける全トランス型とを意味する。
一般的に組換え体を利用する目的物の生産法において認められることであるが、本発明のプレニルアルコールの製造方法においても、導入遺伝子の選択、導入すべき宿主の選択、発現ベクター等の導入手段とそれに適したポリヌクレオチドの構築方法の選択、培地もしくはこれに対する添加物の種類や濃度の選択、組換え体の培養条件あるいは生育条件の選択等のファクターが、プレニルアルコールの生産量に影響する場合がある。
培養物からのプレニルアルコールの採取に当たり、プレニルアルコール全般を採取するか、例えば炭素数１５以上のプレニルアルコール又はその内の１種又は２種以上のみを採取する場合のように特定の１種又は２種以上のプレニルアルコールを選択的に採取するかは、プレニルアルコール製造方法の実施目的次第で、任意に決定できる。
生産されたプレニルアルコールは、通常行われる細胞破砕物からの抽出だけでなく、適当な有機溶媒を用いて培養液からも直接に抽出できる。宿主として酵母を用いる場合を含め、利用する宿主の種類によってはプレニルアルコールの少なくとも一部が宿主細胞内あるいは細胞表面に止まる場合があるが、細胞膜もしくは細胞壁の破壊や、ヘキサンやペンタン等の非極性有機溶媒による抽出等の公知の各種の操作を経て、容易に抽出することができる。
実施例
宿主、ベクター等
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＝Ｅ． ｃｏｌｉ間のシャトルベクターとして、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＡＵＲ１０１（Ｔａｋａｒａ）を使用した。ＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅベクター又はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへ導入してクローニングする際には、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｔａｋａｒａ）を宿主として用いた。ＤＮＡ断片をｐＲＳベクター又はｐＡＬＴＥＲベクターへ導入してクローニングする際には、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＳＵＲＥ２スーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞（Ｔａｋａｒａ）を宿主として用いた。
遺伝子導入用の宿主には、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹＰＨ４９９、Ａ４５１、Ｗ３０３−１Ｂの各株を用いた。
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｃＤＮＡから遺伝子をクローニングする際には、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＢＹ７４６由来のｃＤＮＡライブラリ“Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ”（Ｃｌｏｎｔｅｃ）を用いた。又、酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット“Ｇｅｎとるくん”（Ｔａｋａｒａ）添付のプロトコルに従って、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９からゲノムＤＮＡを調製した。
Ｅ． ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの調製には、Ｗｉｚａｒｄ  ＰｕｒｅＦｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
ＰＣＲ
ＰＣＲ法による遺伝子クローニングは、特別な記載がない限り、次の条件で行った。５μＬの１０ｘ  ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）、４μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬの５Ｕ／μＬ  ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）、１０ｐｍｏｌのプライマー１（ＦＷプライマー、以下同様）、１０ｐｍｏｌのプライマー２（ＲＶプライマー、以下同様）、及び０．５ｎｇのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む５０μＬ溶液を調製し、次のようにＰＣＲを行った。
９４°Ｃ−４５秒，５５°Ｃ−１分，７２°Ｃ−２分；３０サイクル。
ｐＲＳベクターへのＣＹＣ１転写ターミネーターの挿入
ＣＹＣ１転写ターミネーターであるＣＹＣ１ｔ断片は、ＰＣＲで調製した。配列番号１３に示す塩基配列を持つＰＣＲプライマー（ＸｈｏＩ−Ｔｃｙｃ１ＦＷ）、配列番号１４に示す塩基配列を持つＰＣＲプライマー（ＫｐｎＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶ）、配列番号１５に示す塩基配列を持つＰＣＲプライマー（ＡｐａＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶ）を、前記ＸｈｏＩ−Ｔｃｙｃ１ＦＷとＫｐｎＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶの組合せと、前記ＸｈｏＩ−Ｔｃｙｃ１ＦＷとＡｐａＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶの組合せによって用い、鋳型としてｐＹＥＳ２を用いた。反応溶液としては、０．１μｇ  ｐＹＥＳ２、５０ｐｍｏｌプライマーＤＮＡ、１Ｘ  ｐｆｕ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ＭｇＳＯ４（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、１．５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μＬ  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μＬ溶液を調製し、次のようにＰＣＲを行った。
９５°Ｃ−２分
９５°Ｃ−４５秒，６０°Ｃ−３０秒，７２°Ｃ−１分；３０サイクル
７２°Ｃ−５分，４°Ｃストック
増幅した２種のＤＮＡをそれぞれ、制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩ、又はＸｈｏＩとＡｐａＩを用いて切断し、アガロースゲル電気泳動によって２６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。これらのＤＮＡ断片をＣＹＣ１ｔ−ＸＫ及びＣＹＣ１ｔＸＡと呼ぶ。
ｐＲＳ４０５のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ切断部位にＣＹＣ１ｔ−ＸＫを、ｐＲＳ４０４及びｐＲＳ４０６のＸｈｏＩ−ＡｐａＩ切断部位にＣＹＣ１ｔＸＡを挿入した。これらをそれぞれ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０６Ｔｃｙｃと呼ぶ。
転写プロモーターの調製
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲによりＴＤＨ３転写プロモーター（ＴＤＨ３ｐ）及びＴＥＦ２転写プロモーター（ＴＥＦ２ｐ）を含むＤＮＡ断片を調製した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号１６に示す塩基配列を持つプライマー（ＳａｃＩ−Ｐｔｄｈ３ＦＷ）、配列番号１７に示す塩基配列を持つプライマー（ＳａｃＩＩ−Ｐｔｄｈ３ＲＶ）、配列番号１８に示す塩基配列を持つプライマー（ＳａｃＩ−Ｐｔｅｆ２ＦＷ）、及び配列番号１９に示す塩基配列を持つプライマー（ＳａｃＩＩ−Ｐｔｅｆ２ＲＶ）を用いた。ＴＤＨ３ｐの増幅用には、プライマーとしてＳａｃＩ−Ｐｔｄｈ３ＦＷとＳａｃＩＩ−Ｐｔｄｈ３ＲＶを用い、ＴＥＦ２ｐの増幅用には、プライマーとしてＳａｃＩ−Ｐｔｅｆ２ＦＷとＳａｃＩＩ−Ｐｔｅｆ２ＲＶを用いた。鋳型としてはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡを用いた。
反応溶液として、０．４６μｇのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡ、１００ｐｍｏｌ  ＤＮＡ、１Ｘ  ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ）、２０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、０．５Ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）、１μＬ  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒを含む１００μＬ溶液を調製し、次のようにＰＣＲを行った。
９５°Ｃ−２分
９５°Ｃ−４５秒，６０°Ｃ−１分，７２°Ｃ−２分；３０サイクル
７２°Ｃ−４分，４°Ｃストック
増幅したＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって６８０ｂｐ、４００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。これらをＴＤＨ３ｐ、ＴＥＦ２ｐと呼ぶ。
２μＤＮＡ複製開始領域の調製
ＹＥｐベクターであるｐＹＥＳ２を制限酵素ＳｓｐＩとＮｈｅＩで切断した後、２μＤＮＡ複製開始点（２μ  ｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化した。このＤＮＡ断片を２μＯｒｉＳＮと呼ぶ。
ＹＥｐ型発現ベクターの作製
ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０６ＴｃｙｃをＢＡＰ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｔａｋａｒａ）によって処理したＮａｅＩ切断部位に２μＯｒｉＳＮを挿入し、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＳＵＲＥ２に導入して形質転換した後、プラスミドＤＮＡを調製した。これらを、制限酵素ＤｒａＩＩＩとＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、または、ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動し、２μｏｒｉの挿入の有無とその向きとをチェックした。作製したｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０６ＴｃｙｃにおいてｐＹＥＳ２と同じ向きに２μｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれ、ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３６Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉと呼び、ｐＲＳ４０５ＴｃｙｃにおいてｐＹＥＳ２と反対向きに２μｏｒｉが挿入されたプラスミドをｐＲＳ４４５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉと呼ぶ。
ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３６Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４４５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉ、の４種のプラスミドのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ切断部位に、転写プロモーターを含む断片ＴＤＨ３ｐ、ＴＥＦ２ｐを挿入してＤＮＡをクローン化したところ、ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉからｐＲＳ４３４ＧＡＰ，ＰＲＳ４３４ＴＥＦが、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉからｐＲＳ４３５ＧＡＰが、ｐＲＳ４３６Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉからｐＲＳ４３６ＧＡＰが、ＲＳ４４５Ｔｃｙｃ  ２μＯｒｉからｐＲＳ４４５ＧＡＰが、それぞれ得られた。ここで作製した各ｐＲＳベクター由来のＹＥｐ型発現ベクターを総称してｐＲＳ発現ベクターと呼ぶ。
ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１のサブクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法で、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｃＤＮＡを鋳型にして、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ１遺伝子約３．２ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号２０に示す塩基配列を持つプライマーと配列番号２１に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。作製したプラスミドをｐＴ７ＨＭＧ１と呼ぶ。
ｐＴ７ＨＭＧ１を鋳型にして３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により塩基配列を決定したところ、ＨＭＧ１内に、ｃ２０３ｔ，ｔ４２６ｃ，ｔ１０２６ｃ，ａ１１６７ｇ，ｔ１２４８ｃ，ｇ１５５７ａ，ａ１６０５ｇ，ｔ１８２０ｃ，ａ２４５１ｇ，ａ２７２６ｇ，ｔ２７８７ｃ，ｇ２９４０ａの１２ヶ所のＰＣＲエラーが検出された。これらのＰＣＲエラーの表記法は、例えば「ｃ２０３ｔ」と表記した場合、ＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に登録されている塩基配列において、開始コドンａｔｇのａを第一塩基としたときの第２０３番目の塩基「ｃ」がエラーにより塩基「ｔ」となっていることを示す。他の場合も同様の表記法である。これらＰＣＲエラーのうち、ｃ２０３ｔ，ｔ１８２０ｃ，ａ２７２６ｇについては、コードしているアミノ酸残基にそれぞれＳ６８Ｆ，Ｌ６０７Ｓ，Ｈ９０９Ｒの置換変異が導入されていた。これらの置換変異の表記法は、例えば「Ｓ６８Ｆ」と表記した場合、上記ＳＧＤに登録されている塩基配列に基づくアミノ酸配列において、第６８番目のアミノ酸残基「Ｓ」がエラーにより「Ｆ」となっていることを示す。他の場合も同様の表記法である。その他のＰＣＲエラーは、コードしているアミノ酸残基に変化がないサイレントミューテーションであった。
上記ＰＣＲエラーによるアミノ酸置換変異を、部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により次のようにして修正した。部位特異的変異は、Ｐｒｏｍｅｇａ発行のＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｇｕｉｄｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６  Ｐｒｏｍｅｇａ，ＩＳＢＮ  １−８８２２７４−５７−１に記載の方法で行った。ｐＴ７ＨＭＧ１を制限酵素ＳｍａＩ，ＡｐａＬ１，ＳａｌＩで切断し、３．２ｋｂｐのＨＭＧ１断片をアガロースゲル電気泳動によって調製した。これらの断片をｐＡＬＴＥＲ−１のＳｍａＩ−ＳａｌＩ切断部位に挿入し、ｐＡＬＨＭＧ１を作製した。ｐＡＬＨＭＧ１をアルカリ変性させた後、ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｏｌｉｇｏとしてＨＭＧ１（１９０−２１６）、ＨＭＧ１（１８０７〜１８３３）、ＨＭＧ１（２７１３−２７３９）の３種、Ｒｅｐａｉｒ  ｏｌｉｇｏとしてＡｍｐ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  ｏｌｉｇｏとしてＴｅｔ  Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアニーリングさせ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入した。そして部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を１２５μｇ／ｍＬのａｍｐｉｃｉｌｉｎを含む培地で集積培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。上記ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｏｌｉｇｏ  ＨＭＧ１（１９０−２１６）の塩基配列を配列番号２２に、同ＨＭＧ１（１８０７−１８３３）の塩基配列を配列番号２３に、同ＨＭＧ１（２７１３−２７３９）の塩基配列を配列番号２４に、それぞれ示す。
こうして得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより決定したところ、ｃ２０３ｔ，ｔ１８２０ｃ，ａ２７２６ｇの３ヶ所のエラーはＳＧＤに登録されている配列に修正されていた。このＨＭＧ１内の配列が修正されたプラスミドを、ｐＡＬＨＭＧ１０６と呼ぶ。
ｐＡＬＨＭＧ１０６を制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によって３．２ｋｂｐのＨＭＧ１遺伝子断片を精製した。これをｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３４ＴＥのＳｍａＩ−ＳａｌＩ切断部位へ挿入した。サブクローン化したプラスミドは、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＮａｅＩ、ＳｐｈＩの各制限酵素マッピングと、挿入された３．２ｋｂｐのＨＭＧ１遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列の確認とにより、物理地図をチェックした。そして計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドはそれぞれ、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１と呼ぶ。
ｐＹＨＭＧ０４４発現ベクターの構築
ＨＭＧ１コード領域の一部を欠失させた遺伝子の発現ベクターを、以下の方法で作製した。ｐＴ７ＨＭＧ１からＨＭＧ１を含むＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を調製し、ｐＹＥＳ２のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入し、発現ベクターｐＹＥＳ−ＨＭＧ１を作製した。配列番号２５に示す塩基配列を持つＰＣＲプライマー（プライマーＨＭＧ１（１１９１−１１６５））と、配列番号２６に示す塩基配列を持つＰＣＲプライマー（プライマーＨＭＧ１（１２６７−１２９３））を用いて、ｐＹＥＳ−ＨＭＧ１を鋳型にしたＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ増幅産物をＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端にした後、セルフ−ライゲーションにより再び環化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９へ導入して形質転換した後、プラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡ内におけるＨＭＧ１の上流、下流のアミノ酸の読み枠がずれていないことと、その結合部位近辺にＰＣＲエラーによるアミノ酸置換が起きていないことを、３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで確認した。作製したプラスミドをｐＹＨＭＧ０４４と呼ぶ。
イソペンテニル二リン酸△−イソメラーゼ遺伝子ＩＤＩ１のクローニング及び発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃＤＮＡライブラリを鋳型にして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＤＩ１遺伝子約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号２７に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号２８に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。ＩＤＩ１は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ内のｌａｃＺと反対向きに挿入されていた。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＩＤＩ１と呼ぶ。
ｐＴ７ＩＤＩ１からＢａｍＨＩ−ＳａｌＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断部位に挿入した。ＩＤＩ１をサブクローン化したプラスミドであって、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ認識部位マッピングにより計画通りに作製できたプラスミドを、選抜した。選抜したプラスミドをｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＩＤＩ１と呼ぶ。
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子ＢＴＳ１のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃＤＮＡライブラリを鋳型にして、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＴＳ１遺伝子約１．０ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号２９に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＢＴＳ１と呼ぶ。
ｐＴ７ＢＴＳ１からＢａｍＨＩ−ＳａｌＩによって切りされる１．０ｋｂｐ断片を調製し、ｐＹＥＳ２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドをｐＹＥＳＧＧＰＳと呼ぶ。
次に、ｐＹＥＳＧＧＰＳを制限酵素ＢａｍＨＩとＭｌｕＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により１．０ｋｂｐ断片を精製した。これをｐＲＳ４３５ＧＡＰとｐＲＳ４４５ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ切断部位に挿入した。これらのプラスミドをｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１と呼ぶ。
遺伝子ＤＰＰ１のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＤＰＰ１約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号３１に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号３２に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後，ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＤＰＰ１と呼ぶ。
ｐＣＲ−ＤＰＰ１からＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩによって切出される０．９ｋｂｐの断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ，ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドはｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＤＰＰ１と呼ぶ。
遺伝子ＬＰＰ１のクローニングおよびｐＲＳ発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＬＰＰ１約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号３３に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号３４に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＬＰＰ１と呼ぶ。
ｐＣＲ−ＬＰＰ１からＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドをｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＬＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＬＰＰ１と呼ぶ。
遺伝子Ｄｒｉ４２のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、ラット（Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）の遺伝子Ｄｒｉ４２約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号３５に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号３６に示す塩基配列を持つプライマーである。鋳型ＤＮＡとしては、ラット肝臓由来のＰｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてラット肝臓ｃＤＮＡライブラリを調製して用いた。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＧｅｎＢａｎＫの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−Ｄｒｉ４２と呼ぶ。
ｐＣＲ−Ｄｒｉ４２からＢａｍＨＩ−ＳａｌＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ，ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドを、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２と呼ぶ。
遺伝子ＰＡＰ２のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法で、Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの遺伝子ＰＡＰ２約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号３７に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列を持つプライマーである。鋳型ＤＮＡとしては、前記のＰｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリを調製して用いた。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行いＧｅｎＢａｎＫの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＰＡＰ２と呼ぶ。
ｐＣＲ−ＰＡＰ２からＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ，ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドを、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＡＰ２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＰＡＰ２と呼ぶ。
遺伝子ＡｔＰＡＰ１のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａの遺伝子ＡｔＰＡＰ１約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号３９に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列を持つプライマーである。鋳型ＤＮＡとしては、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡ  Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）４０μＬを１００°Ｃで１０分間加熱処理した後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿処理して１０μＬのＴＥバッファーに溶解したものを用いた。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＡｔＰＡＰ１と呼ぶ。クローニングしたＡｔＰＡＰ１の塩基配列決定を行ったところ、配列番号１に示す通りであった。
ｐＣＲ−ＡｔＰＡＰ１からＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ，ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドをｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１と呼ぶ。
遺伝子ＡｔＰＡＰ２のクローニングおよび発現ベクターの作製
ＰＣＲ法により、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａの遺伝子ＡｔＰＡＰ２約０．９ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号４１に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号４２に示す塩基配列を持つプライマーである。鋳型ＤＮＡとしては、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡ  Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ４０μＬを１００°Ｃで１０分間加熱処理した後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿処理して１０μＬのＴＥバッファーに溶解したものを用いた。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＡｔＰＡＰ２と呼ぶ。クローニングしたＡｔＰＡＰ２の塩基配列決定を行ったところ、配列番号２に示す通りであった。
ｐＣＲ−ＡｔＰＡＰ２からＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩによって切出される０．９ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３６ＧＡＰのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドを、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２と呼ぶ。
組換え酵母の作製
Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いＳ． ｃｅｒｅｖｉａｅの形質転換を行った。形質転換には、１μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。形質転換を行った菌体をＳＤ選択平板培地〔１．７ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ），２０ｇ／ｌグルコース（Ｗａｋｏ），０．７７ｇ／ｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｉｏ  １０１）、２０ｇ／ｌ  Ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）から選択マーカー遺伝子に対応するアミノ酸及び／又はヌクレオチドを除いたもの〕に塗沫し、生育したコロニーをさらに別のＳＤ選択平板培地にストリークすることにより組換え体を純化し、以後の実験に用いた。
組換え酵母の培養
形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉａｅは、マーカー遺伝子に応じたＳＤ選択培地〔１．７ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ），２０ｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ，０．７７ｇ／ｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｉｏ  １０１）から選択マーカー遺伝子に対応するアミノ酸及び／又はヌクレオチドを除いたもの、ｐＨ７〕で２日間、３０℃で前培養した。次いで、２５μＬの前培養液を２．５ｍＬのＹＭ培地（０．３％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．３％  ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  ｐｅｐｔｏｎｅ、１．０％  ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７）あるいはＳＧ選択培地（ＳＤ選択培地のグルコース成分をガラクトースに置き換えたもの）に接種し、３０°Ｃで４日間１３０ｒ．ｐ．ｍ．の回転振盪培養で培養した。ただし、前培養液をＳＧ選択培地に加える前には、菌体を生理食塩水で洗浄し、グルコース成分の持ち込みがないようにした。また、ＹＰＨ４９９を宿主に用いたときには、４０μｇ／ｍＬになるようにａｄｅｎｉｎｅ  ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅを培地に加えた。
培養液からのプレニルアルコールの抽出
上記組換え酵母の培養液から５０μＬを抜き取り、３０倍希釈液にしてＯＤ６００を測定した。残りの培養液に２．５ｍＬのメタノールを加えて混合した。その後、さらに約５ｍＬのペンタンを加えてボルテックスミキサーで１５秒間激しく攪拌した後に静置した。そしてペンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化させて溶質成分を濃縮した後、内部標準物質として１．０ｍＬ／Ｌウンデカノールを１０μＬ加え、ＧＣ／ＭＳ用サンプルとした。
ＧＣ／ＭＳ解析
ペンタン抽出画分をＨＰ６８９０／５９７３  ＧＣ／ＭＳシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて分離、同定、定量した。使用カラムはＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ×３０ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）であり、分析条件は以下の通りである。
温度条件：注入口温度  ２５０°Ｃ，検出器温度  ２６０°Ｃ
ＭＳゾーン温度：ＭＳ  Ｑｕａｄ  １５０°Ｃ，ＭＳソース  ２３０°Ｃ，マススキャンレンジ  ３５−２００。
注入条件：自動注入モード，サンプル量  ２μＬ，スプリット比１／２０，キャリアガス；ヘリウム  １．０ｍＬ／分，ソルベントディレイ  ２分。
昇温設定：１１５°Ｃ  ９０秒−２５０°Ｃまで昇温（７０°Ｃ／分）−２５０°Ｃ  ２分−３００°Ｃまで昇温（７０°Ｃ／分）−３００°Ｃ  ７分。ポストタイム  ０。
標準物質：内部標準；０．０１μＬ  １−ウンデカノール。標準物質；（Ｅ）−ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ（Ｅｉｓａｉ），（ａｌｌ−Ｅ）−ｆａｒｎｅｓｏｌ（Ｓｉｇｍａ），（ａｌｌ−Ｅ）−ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｉｏｌ（Ｅｉｓａｉ），ｓｑｕａｌｅｎｅ（Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ  Ｋｏｇｙｏ）。
ホスファターゼ活性の発現
ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＤＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＬＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＰＡＰ２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１及びｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２ベクターをそれぞれＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ４５１へ導入して形質転換した。得られた組換え体を、それぞれ５ｍＬのＳＤ選択培地でＯＤ６００が約１になるまで培養し、遠心分離により菌体を集菌した。菌体を生理食塩水で２度洗い、３００μＬの抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／Ｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／Ｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／Ｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に懸濁した。そして、等量のガラスビーズ（φ＝０．４５−０．５ｍｍ）を加え、ボルテックスミキサーにて１５分間強く撹拌（４°Ｃ）して菌体を破砕した。更に３００μＬの抽出バッファーを加え、遠心分離（１，０００ｇ、５分）により未破砕の菌体を除去した。その上清を粗酵素画分として、酵素活性測定に供した。
ＧＧＰＰホスファターゼ活性（ＧＧＰＰａｓｅ活性）の測定は、５μＭのＧＧＰＰ（２．１ｋＢｑの［３Ｈ］ＧＧＰＰを含む）を含む反応バッファー（最終濃度０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に適当量の粗酵素画分を添加し、３０分間３７°Ｃで反応を行なった（合計１００μＬ）。反応後、アルコールＫＯＨ液（９０％エタノール：４０％ＫＯＨ（１：１））１００μＬを添加して反応を停止した。そして、ｎ−ヘキサン５００μＬを加えた後、１分間ボルテックスミキサーにて激しく撹拌して、生成した［３Ｈ］ＧＧＯＨをヘキサン層に抽出した。このヘキサン層３００μＬを分取して、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。０〜５００ｍＵ／ｍＬのアルカリホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ベーリンガー）を用いて検量線を作成し、前記で求めた放射活性を酵素活性値（Ｕｎｉｔ）に換算した。粗酵素画分中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＢＳＡを標準タンパク質として測定し、粗酵素液中のＧＧＰＰａｓｅ比活性（Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。野生株のＧＧＰＰａｓｅ比活性を１とした場合の相対活性を表１に示す。ホスファターゼ遺伝子導入株は野生株に比べて２．４〜３４．８倍ＧＧＰＰａｓｅ比活性が増大したことから、ホスファターゼ遺伝子を導入することによりＧＧＰＰａｓｅ活性が発現することが確かめられた。
【表１】
0004002833.tif 000002
ホスファターゼの基質特異性
「ホスファターゼ活性の発現」の項で得られた形質転換体を５００ｍＬのＳＤ選択培地でＯＤ６００が約１になるまで培養し、遠心分離により菌体を集菌した。得られた菌体ペレットから、Ｗｕ  Ｗ．Ｉ．らの方法（（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４），１８６８−１８７６）を参考にして、発現したホスファターゼの部分精製を行った。部分精製酵素を用いて、ホスファターゼの基質特異性を以下の方法で調べた。
５μＭ  ＧＧＰＰ（２．１ｋＢｑの［３Ｈ］ＧＧＰＰを含む）および部分精製酵素を含む反応バッファー〔最終濃度０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に対して、ＧＧＰＰ以外の追加基質として１００μＭ  ＡＴＰ、１００μＭグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）、１００μＭピロリン酸ナトリウム（ＮａＰＰ）、１００μＭ  β−グリセロリン酸（β−ＧＰ）、１００μＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、１００μＭ  ＭＶＰ、１００μＭ  ＭＶＰＰ、１００μＭ  ＩＰＰ、１００μＭ  ＤＭＡＰＰ、１００μＭ  ＧＰＰ、５μＭ  ＦＰＰ又は５μＭ  ＧＧＰＰのいずれかを添加し、３０分間３７°Ｃで反応を行なった。そして１００μＬアルコールＫＯＨ液を添加して反応を停止し、ヘキサン５００μＬを加えた後、１分間ボルテックスミキサーにて激しく撹拌し、生成した［３Ｈ］ＧＧＯＨを抽出した。このヘキサン層３００μＬを分取して液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定することにより、ＧＧＰＰａｓｅ比活性を求めた。［３Ｈ］ＧＧＰＰ以外の追加基質を加えなかったとき（＋ｎｏｎｅ）のＧＧＰＰａｓｅ比活性を１００％とした場合の相対活性を表２にまとめた。
【表２】
0004002833.tif 000003
表２の結果から、プレニル二リン酸生合成経路に関係しないリン酸化合物（ＡＴＰ、Ｇ６Ｐ、ＮａＰＰ、β−ＧＰ又はｐＮＰＰ）を、追加基質としてＧＧＰＰの２０倍量加えても、追加基質を加えなかった場合と比較してＧＧＰＰに対するホスファターゼ活性は９０％以上保持していた。即ち、実験に供したホスファターゼのプレニル二リン酸生合成経路に関係しないリン酸化合物に対するホスファターゼ活性は、ＧＧＰＰに対する酵素活性に比べて低いことが確かめられた。次に、プレニルリン酸前駆体（ＭＶＰ，ＭＶＰＰ）、炭素数５のＩＰＰ又はＤＭＡＰＰ、あるいは炭素数１０のＧＰＰを、追加基質として、ＧＧＰＰの２０倍量加えても追加基質を加えなかった場合と比較してＧＧＰＰに対するホスファターゼ活性は９０％以上保持していた。即ち、実験に供したホスファターゼのプレニルリン酸前駆体及び炭素数１０以下のプレニルリン酸化合物に対するホスファターゼ活性は、ＧＧＰＰに対するホスファターゼ活性に比べて低いことが確かめられた。一方、炭素数１５のｃｏｌｄ  ＦＰＰを、追加基質として、ＧＧＰＰと等モル（５μＭ）加えた場合には、基質競合により［３Ｈ］ＧＧＰＰに対する見かけ上のホスファターゼ活性が約４０〜６０％減少した。これはｃｏｌｄ  ＧＧＰＰを、追加基質として、ＧＧＰＰと等モル（５μＭ）加えた場合の見かけ上のホスファターゼ活性の減少度合いと同程度であった。即ち、実験に供したホスファターゼの炭素数１５のＦＰＰに対するホスファターゼ活性と炭素数２０のＧＧＰＰに対する酵素活性は同等であることが確かめられた。以上のことから、実験に供したホスファターゼは次のような活性を示すことが明らかとなった。即ち、炭素数１５以上のプレニルリン酸（Ａ）を基質とした酵素活性測定系において、過剰量（モル比で２０倍）のプレニル二リン酸生合成経路に関係しないリン酸化合物又は炭素数１０以下のプレニルリン酸又はプレニルリン酸前駆体（Ｂ）を共存させても、（Ａ）に対する酵素活性が（Ｂ）を共存させなかった場合と比べて９０％以上の活性を示す。
酵母によるプレニルアルコールの生産
本発明に係るホスファターゼ遺伝子を用いて生体内でプレニルアルコールを大量生産させるためには、この遺伝子を適当なベクターあるいはＤＮＡ断片に組んで宿主に導入し、生体内で発現させればよい。
更に、プレニル二リン酸生合成経路（メバロン酸経路、非メバロン酸経路を含む）に関わる幾つかの酵素の遺伝子を用いてプレニルリン酸の供給能力を向上む）に関わる幾つかの酵素の遺伝子を用いてプレニルリン酸の供給能力を向上させたもとで上記ホスファターゼ遺伝子を導入すれば、より高いプレニルアルコール生産性を期待できる。例えば、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素は、メバロン酸経路の中で律速酵素であることが知られている（Ｄｉｍｓｔｅｒ−Ｄｅｎｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．５，６５５−６６５．）。又、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ）遺伝子の発現を増強したＥ． ｃｏｌｉでカロテノイドの生産量が増加することが報告されている（三沢ら、特開平８−２４２８６１）。ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子（例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉａｅ  ＢＴＳ１）は、ＧＧＯＨの前駆体であるＧＧＰＰを合成する酵素である。かかるＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の発現の増強により、ＧＧＰＰ生産能力の強化を期待できる。よって、これらの遺伝子の導入又は発現強化と、本発明に係るホスファターゼ遺伝子の導入又は発現強化とを組合わせることにより、より高いプレニルアルコール生産性の実現を期待できる。
ホスファターゼ遺伝子を導入したＷ３０３−１Ｂによるプレニルアルコールの生産
ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１をＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ｂに導入し、得られた組換え体に対して更に、本発明に係るホスファターゼ遺伝子を組込んだ発現ベクターｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＤＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＬＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＰＡＰ２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１又はｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２を導入した。各組換え体及び宿主のＧＧＯＨ生産性を測定した結果を表３に示す。
【表３】
0004002833.tif 000004
Ｗ３０３−１ＢではＧＧＯＨの生産は検出されなかったが、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子を導入することによりＧＧＯＨが０．２ｍｇ／Ｌ生産されるようになった。これは、ＧＧＰＰ合成酵活性上昇によりＧＧＰＰが生産され、このＧＧＰＰが酵母菌体内在性の脱リン酸化活性によりＧＧＯＨに変換されたことを示唆している。更に、この株に本発明に係るホスファターゼ遺伝子を導入することにより、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子のみを導入した場合に比べて、５．７〜１７倍にＧＧＯＨの生産性が向上した。即ち、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の導入によりある程度のＧＧＯＨ生産性向上が認められるが、ＧＧＯＨを更に効率的に大量生産させるためには、本発明に係るホスファターゼ遺伝子の導入が重要であることが判った。
ホスファターゼ遺伝子を導入したＹＰＨ４９９によるプレニルアルコールの生産
ｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１、ｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１又はｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＩＤＩ１を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９に導入した。又、別途に、ｐＲＳ４３４ＴＥＦ−ＨＭＧ１及びｐＲＳ４４５ＧＡＰ−ＢＴＳ１の２種のプラスミドをＹＰＨ４９９に導入した。上記２種のプラスミドを導入した組換え体に対して、更に本発明のホスファターゼ遺伝子を組込んだ発現ベクターｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＤＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＬＰＰ１、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＰＡＰ２、ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１又はｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２の各プラスミドを導入した。各組換え体及び宿主のＦＯＨ、ＧＧＯＨ生産性を測定した結果を表４に示す。
【表４】
0004002833.tif 000005
ＹＰＨ４９９ではＧＧＯＨは検出されなかった。ＩＰＰ−△イソメラーゼ遺伝子のみの導入ではＧＧＯＨは検出されなかったが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のみの導入によってＧＧＯＨの生産量がある程度増大し（ＧＧＯＨ  ０．０５ｍｇ／Ｌ）、ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の導入によってもＧＧＯＨの生産量がある程度増大した（ＧＧＯＨ  ０．２ｍｇ／Ｌ）。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の２種の遺伝子を導入することによりプレニルアルコール生産性向上の相乗効果が認められた。但しその場合に比較して、上記の２種の遺伝子に加えて更に本発明のホスファターゼ遺伝子を導入することにより、１．３倍〜５．９倍にＧＧＯＨ生産性が向上した。
ホスファターゼ遺伝子を導入したＡ４５１によるプレニルアルコールの生産
Ａ４５１のＡＵＲ１遺伝子がＡＵＲ１−Ｃ遺伝子に置換変異した株をＡＵＲＧＧ１０１（ＡＵＲ１：：ＡＵＲ１−Ｃ）と呼ぶ。ＡＵＲＧＧ１０１にｐＹＨＭＧ０４４を導入し（１５−２と呼ぶ）、１５−２に更にｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１を導入し、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１／１５−２を得た。ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１／１５−２にｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＰ１，ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＬＰＰ１，ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−Ｄｒｉ４２，ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＡＰ２，ｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ１又はｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＡｔＰＡＰ２を導入した。各組換え体及び宿主のプレニルアルコール生産性を測定した結果を表５に示す。
【表５】
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Ａ４５１ではプレニルアルコールの生産は検出されなかった。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子とＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の２種の遺伝子を導入した場合、ＦＯＨ、ＧＧＯＨがある程度生産されるようになった（ＦＯＨ  １．４ｍｇ／Ｌ，ＧＧＯＨ  ０．４ｍｇ／Ｌ）。更にこの株に本発明に係るホスファターゼ遺伝子を導入すると、上記２種の遺伝子を導入した場合に比較してＦＯＨで２．６〜２０倍、ＧＧＯＨで８．８倍〜３１倍に生産性が向上した。
この結果は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子やＧＧＰＰ合成酵素遺伝子が導入されている場合、ＦＯＨやＧＧＯＨの生産の増量に対しては、ホスファターゼ遺伝子の導入が決定的であることを示している。
ＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１とプレニルリン酸特異的ホスファターゼ遺伝子ＤＰＰ１の連結
Ｎｉｋａｗａらの方法（Ｎｉｋａｗａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｗａｂａｔａ，Ｍ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６．８６０−８６１．）を参考にして、ＰＣＲ法により、プレニルリン酸特異的ホスファタゼ遺伝子ＤＰＰ１とＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１の連結遺伝子（以後、「ＤＰＧＧ」と呼ぶ）を作製した。
１ｓｔＰＣＲの条件を以下に示す。１ＸＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ），０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ），２０ｐｍｏｌプライマー１，２０ｐｍｏｌプイマー２，６０ｎｇ  ＹＰＨ４９９  ゲノムＤＮＡを含む４０μＬの反応液を調製し、次のように１ｓｔ  ＰＣＲを行った。
９８°Ｃ−１５秒，４４°Ｃ−２秒，７４°Ｃ−３０秒；２５サイクル
プライマー１として配列番号４３に示す塩基配列を持つＳ−ＤＰＰ１−１、プライマー２として配列番号４４に示す塩基配列を持つＤＰＰ−２を用いたときのＰＣＲ産物を＃１とした。また、プライマー１として配列番号４５に示す塩基配列を持つＢＴＳ−３、プライマー２として配列番号４６に示す塩基配列を持つＸ−ＢＴＳ−４を用いたときのＰＣＲ産物を＃２とした。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製した。次に、Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応を以下の条件で行った。１ＸＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ，０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２５Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．５μＬ  ＰＣＲ  産物＃１，０．５μＬ  ＰＣＲ  産物＃２を含む１０μＬの反応液を調製し、次のように行った。
９８°Ｃ−１５秒，５４°Ｃ−２秒，７４°Ｃ−３０秒；５サイクル
得られたＰＣＲ産物の一部についてアガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物＃１および＃２の連結遺伝子（約１．９ｋｂ）が合成されていることを確認した。
続いて２ｎｄ  ＰＣＲを以下の条件で行った。１ＸＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ），０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ），２０ｐｍｏｌ  Ｓ−ＤＰＰ−１，２０ｏｌ  Ｘ−ＢＴＳ−４，２μＬ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応液を含む１０μＬの反応液を調製し、次のように２ｎｄ  ＰＣＲ反応を行った。
９８°Ｃ−１５秒，５８°Ｃ−２秒，７４°Ｃ−３０秒；２５サイクル
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製した（これをＳＸ−ＤＰＧＧと呼ぶ）。ＳＸ−ＤＰＧＧを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで消化した後、ｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＧＧを得た。ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＧＧの構造遺伝子部分と、制限酵素サイト周辺とのＤＮＡシークエンシングを行い、設計通りの塩基配列を持っていることを確認した。以上の方法により、ＤＰＰ１とＢＴＳ１の結合領域にリンカー配列（５’  ｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔ  ３’）を導入したホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＧＧの発現ベクターを作製した。
ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０とプレニルリン酸特異的ホスファターゼ遺伝子ＤＰＰ１の連結
前記ＢＴＳ１とＤＰＰ１の連結の場合と同様にして、ＦＰＰ合成酵素遺伝子ＥＲＧ２０（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ００１１４２，１０５００６．．１０６０６４）とプレニルリン酸特異的ホスファターゼ遺伝子ＤＰＰ１を連結した遺伝子（ＤＰＦと呼ぶ）を作製した。
プライマー１として配列番号４７に示す塩基配列を持つＳ−ＤＰＰ１３Ａ、プライマー２としてＤＰＰ−２を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物＃３を得た。又、プライマー１として配列番号４８に示す塩基配列を持つＤＰＦ３、プライマー２として配列番号４９に示す塩基配列を持つＸ−ＦＰＳ４を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物＃４を得た。これらのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製した。
ＰＣＲ産物＃３および＃４を用いてＡｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応を行い、得られたＰＣＲ産物の一部についてアガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物＃３および＃４の連結遺伝子（約１．９ｋｂ）が合成されていることを確認した。Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応液、Ｓ−ＤＰＰ１３ＡおよびＸ−ＦＰＳ４を用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製した（これをＳＸ−ＤＰＦと呼ぶ）。ＳＸ−ＤＰＦを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで消化した後、ｐＲＳ４３４ＧＡＰおよびｐＲＳ４３５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入し、それぞれｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＦ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＤＰＦを得た。ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＦ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＤＰＦの構造遺伝子部分と制限酵素サイト周辺とのＤＮＡシークエンシングを行い、設計通りの塩基配列を持っていることを確認した。以上の方法により、ＤＰＰ１とＥＲＧ２０の結合領域にリンカー配列（５’  ｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔ  ３’）を導入したホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦの発現ベクターを作製した。
ホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦおよびＤＰＧＧを導入したＹＰＨ４９９のＧＧＰＰａｓｅ活性の発現
ＤＰＦを発現した場合はＤＰＰ１がコードするホスファターゼとＥＲＧ２０がコードするファルネシル二リン酸合成酵素との融合酵素が発現され、ＤＰＧＧを発現した場合はＤＰＰ１がコードするホスファターゼとＢＴＳ１がコードするゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素との融合酵素が発現されると考えられる。そこで、連結遺伝子ＤＰＦおよびＤＰＧＧを発現した場合でもＧＧＰＰａｓｅ活性が発現されるかどうかを調べた。
ＰＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＰ１、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＦ及びｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＧＧをそれぞれＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９へ導入して形質転換を行い、得られた組換え体のＧＧＰＰａｓｅ比活性を、前記「ホスファターゼ活性の発現」の項で記載した方法と同様にして測定した。その結果を表６に示す。
【表６】
0004002833.tif 000007
ＤＰＰ１を単独で発現させた株のＧＧＰＰａｓｅ比活性は野生株の約１０倍であった。一方、ＤＰＦ及びＤＰＧＧを発現させた株のＧＧＰＰａｓｅ比活性は野生株の約４倍であった。即ち、ＤＰＦ及びＤＰＧＧを発現させた株においては、ＤＰＰ１を単独で発現させた場合に比べるとＧＧＰＰａｓｅ活性の発現量は少ないものの、野生株に比べると有意にＧＧＰＰａｓｅ比活性が増大した。この結果から、連結遺伝子ＤＰＦおよびＤＰＧＧを発現した場合でもＧＧＰＰａｓｅ活性が発現されることが明らかとなった。
ホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦおよびＤＰＧＧを導入したＡ４５１によるプレニルアルコール生産
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１の発現ベクターであるｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をＡ４５１に導入し（これをＡＨ１と呼ぶ）、ＡＨ１に更にｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＤＰＦを導入した。こうして得られた組換え体、及びＡ４５１、ＡＨ１をＹＭ培地で培養し、ＦＯＨ生産性を測定した。その結果を表７に示す。
【表７】
0004002833.tif 000008
Ａ４５１ではＦＯＨの生産は検出されなかった。ＨＭＧ１を発現したＡＨ１ではＦＯＨがある程度生産されるようになった（ＦＯＨ  ０．３ｍｇ／Ｌ）。ＡＨ１にホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦを導入すると、ＡＨ１に比べてＦＯＨの生産性が１１．３倍に向上した（ＦＯＨ  ３．４ｍｇ／Ｌ）。この結果から、ホスファターゼ遺伝子とプレニル二リン酸生合成系路に関与する酵素の遺伝子（特にプレニル二リン酸合成酵素遺伝子）とを連結した連結遺伝子の導入が、プレニルアルコールの生産性向上に有効であることが分かった。
ホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦおよびＤＰＧＧを導入したＡＵＲＧＧ１０１によるプレニルアルコール生産
前記した１５−２に対して、それぞれｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＦおよびｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＧＧを導入した。又、別途に１５−２に対してｐＲＳ４３５ＧＡＰ−ＢＴＳ１とｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＰ１の２種のプラスミドを導入した。各組換え体および宿主をＳＧ選択培地で培養し、プレニルアルコール生産性を測定した結果を表８に示す。
【表８】
0004002833.tif 000009
Ａ４５１ではプレニルアルコールの生産は検出されず、ＡＵＲＧＧ１０１のプレニルアルコール生産量は微量であった。ＡＵＲＧＧ１０１にＨＭＧ０４４遺伝子を導入した１５−２では、ＦＯＨ，ＧＧＯＨがある程度生産されるようになった（ＦＯＨ  ８．５ｍｇ／Ｌ，ＧＧＯＨ  ２．２ｍｇ／Ｌ）。１５−２にホスファターゼ連結遺伝子ＤＰＦを導入すると、１５−２に比べてＦＯＨでは７．８倍、ＧＧＯＨでは２．６倍に生産性が向上した（ＦＯＨ  ６６．７ｍｇ／Ｌ，ＧＧＯＨ  ５．７ｍｇ／Ｌ）。次に、１５−２にＧＧＰＰ合成酵素遺伝子ＢＴＳ１とプレニルリン酸特異的ホスファターゼ遺伝子ＤＰＰ１の２種の遺伝子を別々のプラスミド上に組み込んで導入したところ、１５−２と比べてＦＯＨ，ＧＧＯＨの生産性が向上した（ＦＯＨ  ２８．８ｍｇ／Ｌ，ＧＧＯＨ  １３．７ｍｇ／Ｌ）。一方、１５−２に連結遺伝子ＤＰＧＧを導入すると、ＢＴＳ１とＤＰＰ１を別々のプラスミド上に組み込んで導入した場合と比べて、ＦＯＨでは２．４倍、ＧＧＯＨでは５．５倍に生産性が向上した（ＦＯＨ  ６８．７ｍｇ／Ｌ，ＧＧＯＨ  ７５．５ｍｇ／Ｌ）。
この結果から、ホスファターゼ遺伝子とプレニル二リン酸生合成系路に関与する酵素の遺伝子（特にプレニル二リン酸合成酵素遺伝子）とを連結した連結遺伝子の導入が、プレニルアルコールの生産性向上に非常に有効であることが分かった。
ジャー培養
１５−２に連結遺伝子ＤＰＧＧを導入した株（ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＤＰＧＧ／１５−２）を５Ｌ容ジャーファーメンタ（ＭＳＪ−Ｕ２Ｗ；丸菱バイオエンジ）で培養して、その生産性を測定し、連結遺伝子ＤＰＧＧを導入することによる生産性向上への効果を更に確認することとした。培地は、５０ｇ  ガラクトース（ナカライ）、１００ｇ  パクトペプトン（ＤＩＦＣＯ）、５０ｇ  酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）、５０ｍｌ  大豆油（ナカライ）、５ｍｌ  アデカノールＬＧ１０９、水道水５１を混合して作製し、ジャーファーメンタで滅菌（１２１℃、２０分）して培養に用いた。
ジャー培養条件は次の通りである。植菌量２％、温度３３℃、通気量１ＶＶＭ、かくはん速度３００ｒｐｍ、ガラクトース・フィード・レート＝３．４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０（４Ｎ  ＮａＯＨで制御）。経時的に培養液を採取してプレニルアルコール生産量を定量した結果を図２に示す。
培養１３４時間目にＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産量は極大に達し、それぞれ０．３８ｇ／Ｌ、０．２４ｇ／Ｌであった。
酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ３およびアルカリ性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ８のクローニングおよび発現ベクターの作製
リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において基質特異性のない（非特異的な）ホスファターゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現ベクターの作製を、以下の方法で行った。非特異的ホスファターゼとしてＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ００１１３４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４２７６５７．．４２９０６０））及びアルカリ性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ８（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ００１１３６，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４１８５３７．．１４２０２３７））を用いた。
ＰＣＲ法により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＨＯ３約１．４ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号５０に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号５１に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＰＨＯ３と呼ぶ。ｐＣＲ−ＰＨＯ３からＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩによって切出される１．４ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドをｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＨＯ３と呼ぶ。
ＰＣＲ法により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＨＯ８約１．７ｋｂｐ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、配列番号５２に示す塩基配列を持つプライマーと、配列番号５３に示す塩基配列を持つプライマーである。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。クローニングした断片の塩基配列決定を行い、ＳＧＤの配列と比較したところ、ＰＣＲエラーは無かった。作成したプラスミドＤＮＡをｐＣＲ−ＰＨＯ８と呼ぶ。ｐＣＲ−ＰＨＯ８からＳａｃＩＩ−ＳｍａＩによって切出される１．７ｋｂｐ断片を調製し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＳｍａＩ切断部位に挿入した。作製したプラスミドをｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＨＯ８と呼ぶ。
非特異的ホスファターゼ活性の測定
酸性ホスファターゼ活性はＦｅｒｍｉｎａｎらの方法（Ｅ．Ｆｅｒｍｉｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３，２６１５−２６２５）を参考にして以下のようにして測定した。ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＨＯ３を前記１５−２に導入し、得られた組換え体および宿主を５ｍＬのＳＤ選択培地で１日間培養し、遠心分離により菌体を集菌した。菌体を生理食塩水で２度洗い、３００μＬの抽出バッファー（１０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．３）、１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／Ｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／Ｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／Ｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に懸濁した。そして、等量のガラスビーズ（φ＝０．４５−０．５ｍｍ）を加え、ボルテックスミキサーにて１５分間強く攪拌（４°Ｃ）して菌体を破砕した。更に３００μＬの抽出バッファーを加え、遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分、４°Ｃ）した後、上清を分取して粗酵素画分とした。１０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．３）で適当に希釈した粗酵素画分１００μＬに、１００μＬのｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液（１０ｍＭ  ｐＮＰＰ、２００ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．３））を添加し、３０°Ｃで１５分間反応を行った。５０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を添加して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。０〜０．０３Ｕ／ｍＬの酸性ホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検量線を作成し、前記で求めた４０５ｎｍの吸光度を酵素活性値（Ｕｎｉｔ）に換算した。粗酵素画分中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙで、ＢＳＡを標準タンパク質として測定し、粗酵素画分中の酸性ホスファターゼ比活性（Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。また、ここで得られた粗酵素画分のＧＧＰＰａｓｅ比活性は、反応バッファーとして１２０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．３）を用いて、前記「ホスファターゼ活性の発現」の項で記載した酵素活性測定法と同様の方法で測定した。
アルカリ性ホスファターゼ活性はＤｈａｍｉｊａらの方法（Ｓ．Ｓ．Ｄｈａｍｉｊａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，４６７−４７３）を参考にして以下のようにして測定した。ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＰＨＯ８を前記１５−２に導入し、得られた組換え体および宿主を５ｍＬのＳＤ選択培地で１日間培養し、遠心分離により菌体を集菌した。菌体を生理食塩水で２度洗い、３００μＬの抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／Ｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／Ｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／Ｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に懸濁した。そして、等量のガラスビーズ（φ＝０．４５−０．５ｍｍ）を加え、ボルテックスミキサーにて１５分間強く攪拌（４°Ｃ）して菌体を破砕した。更に３００μＬの抽出バッファーを加え、遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分、４°Ｃ）により可溶性画分（上清）を分取して粗酵素画分とした。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適当に希釈した粗酵素画分１００μＬに、１００μＬのｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液（１０ｍＭ  ｐＮＰＰ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５））を添加し、３０°Ｃで１５分間反応を行った。５０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を添加して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。０〜０．３Ｕ／ｍＬのアルカリ性ホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて検量線を作成し、前記で求めた４０５ｎｍの吸光度を酵素活性値（Ｕｎｉｔ）に換算した。アルカリ性ホスファターゼ比活性（Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は酸性ホスファターゼの場合と同様にして求めた。又、ここで得られた粗酵素画分のＧＧＰＰａｓｅ比活性は、反応バッファーとして６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて、前記「ホスファターゼ活性の発現」の項で記載した酵素活性測定法と同様の方法で測定した。
以上の方法で測定した非特異的ホスファターゼ比活性（酸性ホスファターゼ比活性およびアルカリ性ホスファターゼ比活性）を以下ｐＮＰＰａｓｅ比活性と呼ぶ。
非特異的ホスファターゼ遺伝子を導入した１５−２のホスファターゼ活性の発現とプレニルアルコールの生産
酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ３及びアルカリ性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ８をそれぞれ組込んだ発現ベクターを導入した１５−２のｐＮＰＰａｓｅ比活性、ＧＧＰＰａｓｅ比活性及びプレニルアルコール生産性（ＳＧ選択培地で培養）を測定した。その結果を表９に示す。表９では、宿主を１とした相対値で表示している。表中のＧＧＰＰａｓｅ比活性の項で、＋ｐＮＰＰの列は、前記「ホスファターゼの基質特異性」の項で記載したのと同様に、ＧＧＰＰ以外の追加基質として１００μＭのｐＮＰＰを添加した場合のＧＧＰＰａｓｅ比活性値を示し、−ｐＮＰＰの列は、ｐＮＰＰを添加せずにＧＧＰＰａｓｅ比活性を測定した値を示す。
【表９】
0004002833.tif 000010
酸性ホスファターゼ遺伝子又はアルカリ性ホスファターゼ遺伝子の導入により、ｐＮＰＰａｓｅ比活性は宿主に比べて２８〜３５倍に増大した。ＧＧＰＰａｓｅ比活性は、追加基質としてｐＮＰＰを加えない場合は宿主に比べて３〜６倍に増大した。しかし、追加基質としてｐＮＰＰを加えると［３Ｈ］ＧＧＰＰに対する見かけ上のホスファターゼ活性はゼロとなった。このことから、酸性ホスファターゼ遺伝子およびアルカリ性ホスファターゼ遺伝子の導入により発現されたホスファターゼは、ＧＧＰＰとｐＮＰＰのいずれとも反応する基質特異性の低いホスファターゼであることが示された。この結果は、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ遺伝子を導入した場合と、対照的である（表２参照）。一方、プレニルアルコールの生産性は、酸性ホスファターゼ遺伝子又はアルカリ性ホスファターゼ遺伝子を導入しても向上しなかった。以上の結果から、非特異的ホスファターゼ遺伝子を宿主に導入して、ｐＮＰＰａｓｅ活性又はＧＧＰＰａｓｅ活性を上昇させても、プレニルアルコールの生産性の向上への効果は無いことが分かった。
実施例の評価
以上の実施例は、次のように評価される。
即ち、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする６種類の遺伝子を、それぞれＦＯＨおよびＧＧＯＨ産生酵母に導入することにより、６種類いずれの遺伝子を導入した場合においても、ＧＧＰＰａｓｅ比活性が上昇した。更に、６種類いずれの遺伝子を導入した場合においても、ＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産性が実際に数倍〜数十倍に向上することを示した。
本願発明者らは、ＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産性を向上させることのできるホスファターゼのアミノ酸配列には、第１図に示すホスファターゼモチーフが含まれていることを見出した。このホスファターゼモチーフは、炭素数１５以上のプレニルリン酸に対する基質特異性に関係があると推測している。
更に、炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼをコードする遺伝子とプレニル二リン酸生合成系路に関与する酵素をコードする遺伝子を連結してなる遺伝子を、ＦＯＨおよびＧＧＯＨ産生酵母に導入することにより、ＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産性が更に向上した。上記連結遺伝子を導入した場合、連結せずに別々のプラスミド上に組み込んで導入した場合と比べてＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産性が、数倍に向上することも示した。
一方、リン酸エステル化合物に対する加水分解活性において基質特異性のない（非特異的な）ホスファターゼをコードする遺伝子（ＰＨＯ３，ＰＨＯ８）を、ＦＯＨおよびＧＧＯＨ産生酵母に導入した場合、ＧＧＰＰａｓｅ比活性は上昇したが、ＦＯＨおよびＧＧＯＨの生産性は向上しなかった。非特異的ホスファターゼは、基質特異性がないために菌体中のあらゆるリン酸エステル化合物と反応すると考えられる。そのため、菌体中のプレニルリン酸以外のリン酸エステル化合物（例えば菌体中に多量に存在すると考えられるＡＴＰ等）とも反応してしまう。そして、実質的にプレニルリン酸と反応してプレニルアルコールを産生できる非特異的ホスファターゼの数は非常に限られてしまうため、プレニルアルコールの生産性が向上しなかったと推定される。
又、これらの非特異的なホスファターゼのアミノ酸配列を詳細に検討した結果、第１図に示したようなホスファターゼモチーフは含まれていないことが明らかとなった。このことは、上記ホスファターゼモチーフを含み炭素数１５以上のプレニルリン酸に基質特異性のあるホスファターゼ遺伝子の導入又は発現強化が、プレニルアルコールの生産性の向上に対して決定的であることを示している。
産業上の利用分野
以上のように、本発明は、プレニルアルコール、特に生物学的に活性な全トランス型で、しかも炭素数１５以上であるプレニルアルコールの効率的な大量生産を可能とする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に係る各ポリペプチドの保存配列を示す図である。
第２図はプレニルアルコール生産量の定量結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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