(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記群Ａ：
群Ａ：ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸
から選択されるグリコサミノグリカンと
下記群Ｂ：
群Ｂ：リン脂質、グリセロ脂質、脂肪酸、脂肪族アミン、コレステロール、スフィンゴシン、セラミド
から選択される脂質とが、直接又はスペーサーとしてアルキレンジアミン若しくはアミノ酸を介して共有結合した脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする神経疾患治療剤。
【請求項２】
共有結合が、グリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基もしくは１級アミノ基、又はグリコサミノグリカンに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基もしくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合、エステル結合又はアミノアルキル結合であることを特徴とする、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンと脂質との結合様式が、
（ａ）グリコサミノグリカンがラクトン化グリコサミノグリカンであり、脂質がアミノ基を有するリン脂質の場合には、
【化９】
0003942205.tif 000011
であり、
（ｂ）グリコサミノグリカンがラクトン化グリコサミノグリカンであり、脂質がアミノ基を導入した脂質の場合には、
【化１０】
0003942205.tif 000012
（なお、
【化１８】
0003942205.tif 000013
は、スペーサーとの反応により脂質に導入されたアミノ酸残基を示す。）であり、
（ｃ）グリコサミノグリカンがアルデヒド化グリコサミノグリカンであり、脂質がアミノ基を有するリン脂質の場合には、
【化１１】
0003942205.tif 000014
であり、
（ｄ）グリコサミノグリカンがアルデヒド化グリコサミノグリカンであり、脂質がアミノ基を導入した脂質の場合には、
【化１２】
0003942205.tif 000015
（なお、
【化１９】
0003942205.tif 000016
は、スペーサーとの反応により脂質に導入されたアミノ酸残基を示す。）であり、
（ｅ）グリコサミノグリカンがウロン酸部分であり、脂質がアミノ基を有するリン脂質の場合には、
【化１３】
0003942205.tif 000017
であり、
（ｆ）グリコサミノグリカンがウロン酸部分であり、脂質がアミノ基を導入した脂質の場合には、
【化１４】
0003942205.tif 000018
（なお、
【化２０】
0003942205.tif 000019
は、スペーサーとの反応により脂質に導入されたアミノ酸残基を示す。）であり、
（ｇ）グリコサミノグリカンがアミノ基導入グリコサミノグリカンであり、脂質がカルボキシル基を導入した脂質の場合には、
【化１５】
0003942205.tif 000020
（なお、
【化２１】
0003942205.tif 000021
は、スペーサーとの反応により脂質に導入されたカルボキシル基残基を示し、
【化２２】
0003942205.tif 000022
は、スペーサーとの反応によりＧＡＧに導入されたアミノ酸残基を示す。）であり、
（ｈ）グリコサミノグリカンがアミノ基導入グリコサミノグリカンであり、脂質がアルデヒド化脂質の場合には、
【化１６】
0003942205.tif 000023
（なお、
【化２３】
0003942205.tif 000024
は、スペーサーとの反応によりＧＡＧに導入されたアミノ酸残基を示す。）であり、
（ｉ）グリコサミノグリカンが水酸基を有するグリコサミノグリカンであり、脂質がカルボキシル基を導入した脂質の場合には、
【化１７】
0003942205.tif 000025
（なお、
【化２４】
0003942205.tif 000026
は、スペーサーとの反応により脂質に導入されたカルボキシル基残基を示す。）である、
請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である、請求項１〜３いずれか１項記載の治療剤。
【請求項５】
脂質がホスファチジルエタノールアミンである、請求項１〜４のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項６】
コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸のラクトンを含むカルボキシル基と、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とがアミド結合により結合した脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする神経疾患治療剤。
【請求項７】
神経疾患治療剤が神経突起伸展促進剤である、請求項１〜６のいずれか１項記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする神経疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種プロテオグリカンは細胞膜表面や細胞間のマトリックスに存在しており、サイトカイン類との結合や細胞間あるいは細胞−基質間の相互作用を介して、細胞接着、伸展、シグナル伝達などの細胞の応答性を変化させ、発生・増殖・分化・成長・老化・癌化及び免疫反応、炎症反応に対する応答性などに関係していると考えられている。
【０００３】
近年多くの種類のプロテオグリカンが神経組織に存在していることが判ってきた。そしてこれらプロテオグリカンが脳などの神経組織の形態形成や機能発現に密接に関与していると考えられるようになってきた（R.K. Margolis and R.U. Margolis, Experientia., 49, 429-446 (1993), A. Oohira et al., Neurosci. Res., 20, 195-207 (1994))。
【０００４】
神経組織は、神経細胞の分化、移動、神経突起の伸展、標的細胞の認識、標的細胞とのシナプス形成・維持と再編成などの現象によってその形態が形成されると考えられている。
【０００５】
プロテオグリカンはコア蛋白質と呼ばれる蛋白質部分とグリコサミノグリカンと呼ばれる特異な構造を持つ糖鎖部分から成り立っている。脳中のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを神経細胞の培養系に添加すると神経突起の伸長を促進したり（N. Iijima et al., J. Neurochem., 56, 706-708 (1991))、時には抑制したりする（A. Oohira et al., J. Neurosci., 11, 822-827 (1991)）。但し、多くの場合その活性はコア蛋白質部分にあり、グリコサミノグリカンの単独投与では効果がみられないとの報告が多い。一方、神経突起は高濃度のコンドロイチン硫酸やケラタン硫酸が存在する領域には侵入できない（D. M. Snow et al., J. Neurobiol. 23, 322-336 (1992))ことから、グリコサミノグリカンが神経突起伸展の方向付けをするガイド分子として機能している可能性も示唆されている。
【０００６】
このようにプロテオグリカンは神経系に作用して、末梢神経損傷や中枢神経障害の回復に有効である可能性が考えられるが、臨床的な検討はまだほとんど行われていない。これはプロテオグリカンが巨大分子であり、そのままでは神経系には適用し難いことや、特にコア蛋白質部分に動物種間の違いがあり、抗体産生などの問題が生じるためと思われる。
【０００７】
一方、本発明者らは、先に脂質とグリコサミノグリカンとが共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンを合成し、それらが細胞接着阻害作用等の生物活性を有することを見い出している（J. Biol. Chem., 268, 15779-15787 (1993) 、特開平４−８０２０１、特開平４−８０２０２、特開平４−８２８３６、特開平５−２３６９５１、特開平６−７２８９３）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、神経疾患の緒症状を改善する新しい薬剤を提供することを目的とする。特に、毒性等の副作用のない神経疾患治療剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１）脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする神経疾患治療剤、特に神経突起伸展促進剤
２）グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である上記薬剤を提供するものである。
【００１０】
本発明の神経疾患治療剤は、末梢及び中枢の神経細胞の神経突起伸展、及び神経損傷や神経欠損等によって障害を受けた神経機能の回復を促進することを特徴とする。
【００１１】
本発明の神経疾患治療剤の有効成分である脂質結合グリコサミノグリカンは公知物質である。例えば、特開平４−８０２０１号公報又は特開平４−８０２０２号、及び文献J. Biol. Chem., 268, 15779-15787 (1993）に記載された化合物が例示される。しかし、本発明はこれに限定されず、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）と脂質とが共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンであれば本発明薬剤の有効成分として使用できる。
【００１２】
特に脂質結合グリコサミノグリカンは、ＧＡＧのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基もしくは１級アミノ基、又はＧＡＧに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基もしくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合又はアミノアルキル結合（−ＣＨ2 −ＮＨ−）によって共有結合したものが好ましい。とりわけ、以下の結合を有するものが好ましい。
【００１３】
ＧＡＧの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＧＡＧのカルボキシル基（ラクトンを含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、
ＧＡＧのウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、又は
ＧＡＧの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＧＡＧのホルミル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ2 −ＮＨ−）。
【００１４】
なお、上記共有結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含む）、水酸基はＧＡＧ又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めＧＡＧ又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。
【００１５】
脂質結合グリコサミノグリカンとその原料化合物との関係を模式的に示すと次の通りである。
【００１６】
【化１】
0003942205.tif 000002
【００１７】
【化２】
0003942205.tif 000003
【００１８】
【化３】
0003942205.tif 000004
【００１９】
本発明で用いる脂質結合グリコサミノグリカンは、その塩であることができ、好ましくはナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属塩、トリアルキルアミンのようなアミン塩、又はピリジンのような有機塩基との塩であることができる。
【００２０】
原料のＧＡＧは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどのいずれも使用することができる。具体的にはヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＫ）、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等が例示される。これらのＧＡＧは通常使用される塩（例えばナトリウム塩）であってよい。但し、より効果的な神経疾患治療作用や神経突起伸展促進作用を得るためには、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びそれらの塩が好ましい。
【００２１】
原料の脂質は、動物、植物、微生物等の天然物由来、又は化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することができる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。とりわけ、１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。また、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴシン、セラミドであってもよい。なお、脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好ましい。例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノイル）が例示される。また、これらの脂質は通常使用される塩であってもよい。
【００２２】
脂質結合グリコサミノグリカンの製造法は、特に限定されず公知の製造法（例えば、特開平４−８０２０１号、特開平４−８０２０２号参照）を採用することができる。代表的な製造法については以下に説明する。
【００２３】
還元末端限定酸化法
この方法は、ＧＡＧの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、該ＧＡＧの還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ2 −ＮＨ−）を形成させて、ＧＡＧと脂質とを共有結合させる方法である。
ＧＡＧの還元末端の糖残基の還元は、ＧＡＧに対して５〜５０当量程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩など）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
上記還元後、限定酸化を行ってＧＡＧの還元末端に特異的にホルミル基を有するアルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後のＧＡＧに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩など）を用い、通常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができる。
得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質など）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応させることができる。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩など）を作用させてシッフ塩基を還元することができる。
なお、本反応方法で脂質結合グリコサミノグリカンを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジアミン、又はリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ2 −ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。
【００２４】
還元末端ラクトン化法
この方法は、ＧＡＧの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させて該ＧＡＧの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応に付すことによって該ＧＡＧの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることによって、ＧＡＧと脂質とを共有結合させる方法である。
ＧＡＧの還元末端の糖残基の酸化は、ＧＡＧに対して２〜２０当量程度、好ましくは５〜１５当量程度の酸化剤（ヨウ素、臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃で行うことができる。
上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス５０（商品名；ダウケミカル社製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ社製）及び／又は酸（塩酸、硫酸等の無機酸、又は酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理することによって、ＧＡＧの還元末端が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造することができる。
得られたラクトン化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
なお、還元末端限定酸化法の場合と同様に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクトン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。
【００２５】
その他の方法
上記以外の方法としては、例えばＧＡＧのウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基とを反応させて、酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させる方法が挙げられる。
上記反応に際し、縮合剤（例えば、１−エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させるか、あるいはウロン酸部分のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることができる。
なお、上記反応においてＧＡＧのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）とし、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００２６】
代表的化合物
本発明薬剤の有効成分である脂質結合グリコサミノグリカンの好適な化合物を以下に例示する。
（１）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸
原料
ＧＡＧ：ヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量１万）
脂質  ：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−１）参照）
【００２７】
【化４】
0003942205.tif 000005
【００２８】
（２）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量３万）
脂質  ：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−２）参照）
【００２９】
【化５】
0003942205.tif 000006
【００３０】
（３）ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量３万）
脂質  ：ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン
合成法
還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（３）参照）
【００３１】
【化６】
0003942205.tif 000007
【００３２】
（４）モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステル結合コンドロイチン硫酸
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量３万）
脂質  ：モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステル
合成法
還元末端アミン法（特開平４−８０２０１号公報、実施例２−（３）参照）
【００３３】
【化７】
0003942205.tif 000008
【００３４】
（５）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸
原料
ＧＡＧ：ヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量１万）
脂質  ：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端限定酸化法（特開平４−８０２０２号公報、実施例１−（２）−１）参照）
【００３５】
【化８】
0003942205.tif 000009
【００３６】
本発明の神経疾患治療剤は、その有効成分である脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩（以下、脂質結合ＧＡＧと略すことがある）の有効量を、末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因する神経疾患に羅患したヒトを含む哺乳動物に投与することによって該動物を治療することができる薬剤である。代表的な疾患として、例えば、外傷性の神経損傷や神経欠損に起因する神経障害（特に体性神経障害、さらに特に感覚神経障害）、代謝障害性多発性神経障害、機械的神経障害、毒性神経障害などの種々の末梢神経疾患；ならびに、例えば、脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳外傷、記憶障害、老年痴呆、アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの神経繊維が再生されることによって治療効果が期待される種々の中枢神経疾患が挙げられる。
【００３７】
本発明の神経疾患治療剤は、脂質結合ＧＡＧを経口的あるいは非経口的に投与（静脈内、筋肉内、皮下など組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与等）するための医薬品として、液体製剤、固体製剤、半固体製剤など任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。
【００３８】
該製剤は、脂質結合ＧＡＧに通常薬学的に許容される製剤補助剤を加えることにより常法に従って製造される。さらに公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
【００３９】
本発明の薬剤を中枢神経の障害に起因する神経疾患の治療に使用する場合、筋肉注射、静脈注射、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。
【００４０】
脂質結合ＧＡＧは、多くは水溶性であり、容易に液体製剤を製造することができる。注射剤等の液体製剤を製造するには、脂質結合ＧＡＧを必要に応じてpH調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウム、ブドウ糖など）とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下に凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、脂質結合ＧＡＧに、乳化剤（レシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）を加えて水中で乳化させ、注射用乳剤とすることもできる。
【００４１】
また、脂質結合ＧＡＧと賦形剤（乳糖、デンプン、結晶セルロースなど）、結合剤（白糖、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）などの製剤補助剤を用いて、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の経口投与用の固形製剤、あるいは脂質結合ＧＡＧに甘味剤（白糖、ソルビトールなど）、水、精油、エタノールなどを加えてシロップ剤などの経口投与用の液状製剤とすることもできる。
【００４２】
直腸投与剤は、脂質結合ＧＡＧに、カカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の座剤用基剤を加えた後、加温して溶融し、これを型に流し込んで冷却するか、あるいは脂質結合ＧＡＧをポリエチレングリコール、大豆油等に溶解した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。
【００４３】
さらに脂質結合ＧＡＧを、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等に加えて軟膏剤とするか、必要に応じ加温し、混練して皮膚用外用剤とすることができる。テープ剤は、脂質結合ＧＡＧに、ロジン、アクリル酸エステル重合体等の粘着剤を混練し、これを不繊布等に展延して得ることができる。
【００４４】
吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、脂質結合ＧＡＧを溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００４５】
また、注射剤としては目標臓器すなわち、例えば脳のような中枢神経系や、末梢神経束への移行速度の改善が可能なリポソーム製剤及び脂質エマルジョン製剤が挙げられる。脂質結合ＧＡＧは、それ自体水溶液中で脂質部分を介して、２０〜３０分子が集合した会合体を形成しており（J. Biol. Chem., 268, 15779-15787 (1993))、更にリポソームを形成する両親媒性物質を使用することにより、より有効なリポソーム製剤が製造され得る。特に、ナノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子）は網内系組織に取り込まれることなく血中濃度を高め、薬効発現に必要な最小有効投与量を低下させることができるだけでなく、脳血液関門を通過しやすいので、脳の神経疾患の治療に使用する場合、好適である。リポソーム製剤は公知のリポソーム製造法（Liposomes: Physusial Struvture to Therapeutic Applications, pp.51-82, Elsevier, Amsterdam (1981); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198 (1978)）に従って製造することができる。
【００４６】
リポソームの製造は、例えば以下の方法で行うことができる。上記両親媒性物質及び添加剤と脂質結合ＧＡＧとを有機溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン、エタノール、メタノール、ヘキサンなどの単独又は混合溶媒）に溶解あるいは混合し、フラスコなどの容器中において不活性ガス（窒素ガス、アルゴンガスなど）存在下で有機溶媒を除去し、器壁に薄膜として付着させる。次いで、この薄膜に適当な水性媒体（生理食塩水、緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水など）を加え、攪拌機で攪拌する。小粒径のリポソームを得るためには、超音波乳化機、加圧型乳化機、フレンチプレス細胞破砕機などを用いてさらに分散させる。さらにこれをメンブレンフィルター処理することによって、粒径分布が制御されたナノスフェアーリポソーム（脂質超微粒子；粒子径２５〜５０nm程度）を得ることができる。また、リポソームを限外濾過、遠心分離、ゲル濾過などの分画処理に付し、リポソームから分離した脂質結合ＧＡＧを除去してもよい。
【００４７】
リポソームを形成する両親媒性物質としては、天然リン脂質（卵黄レシチン、大豆レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、カルジオリピンなど）又は合成リン脂質（ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンなど）等のリン脂質を使用する。また、膜の安定性、流動性、有効成分の膜透過性を改善するために、コレステロール類（コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロールなど）、リポソームに負電荷を付与することが知られている物質（ホスファチジン酸、ジセチルホスフェートなど）、正電荷を付与することが知られている物質（ステアリルアミン、ステアリルアミンアセテートなど）、酸化防止剤（トコフェロールなど）、油性物質（大豆油、綿実油、ゴマ油、肝油など）等、公知の種々の添加剤を使用しても良い。
【００４８】
上記製剤中の脂質結合ＧＡＧの含量は、剤形、投与方法、投与回数等によって変動するが、通常、注射剤の場合は０．１〜１０重量％程度、経口投与用製剤の場合は１〜８０重量％程度、外用剤の場合は０．１〜１０重量％程度である。
【００４９】
脂質結合ＧＡＧの投与量は、患者の年齢、症状、体重、投与方法によって異なり、一概には特定できないが、組織内投与（注射）の場合は１日量１〜１，０００mgを１回もしくは数回に分けて投与することが好ましい。
【００５０】
脂質結合ＧＡＧは低毒性の化合物であり、医薬としての安全性は極めて高い。脂質結合ＧＡＧの急性毒性を以下の方法で調べた。
【００５１】
４週齢のＳｉｃ−ｄｄｙ系雌雄マウスを１週間予備飼育後、雄２３〜３０ｇ、雌２０〜２５ｇの体重になった時点で、上述したジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸又はジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸を、各々５％の濃度になるように局方生理食塩水に溶解し、腹腔内に投与した。雌雄それぞれ１群１０匹を用いて、ＬＤ50値を算出した。その結果、いずれの化合物もＬＤ50値は２，０００mg/kg 以上であり、医薬としての安全性は問題ない。
【００５２】
【実施例】
試験例１  ＰＣ１２細胞の神経突起伸展への影響
末梢神経様細胞への分化能を持つ、ラット副腎髄質由来のＰＣ１２細胞株（大阪大学蛋白研  畠中教授より供与）を、ラミニン（１、５、１０μg/ml）（マウスＥＨＳ由来；新田ゼラチン社製）でコートした２４穴培養皿（ＭＳ−８０２４Ｒ；住友ベークライト社製）に１×１０4 個/cm2の密度で撒き、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５時間培養した。その後、上記培養液を除去し、ホスファチジルエタノールアミン結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＥ）含有、又は非含有のＤＭＥＭ−ハムＦ１２培地（Ham's Ｆ１２）（１：１）混合培地を添加した。３７℃で２４時間培養後、細胞を２％グルタールアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で固定後、ＰＣ１２細胞から伸びた神経突起の状態を位相差顕微鏡で観察した。結果を図１に示す。なお、ＦＣＳはFlow Labotatories 社から、ＤＭＥＭ及びハムＦ１２培地は日水製薬社から購入した。またＣＳ−ＰＥは、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸（原料として、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量３万）、脂質はジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン、合成法として還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−２））を使用した。
ＰＣ１２細胞の神経突起はラミニンコート濃度が高いほど数も多く、長い突起伸長であったが、ＣＳ−ＰＥを含む培地に交換したものは、さらに長い神経突起伸展がみられた。
【００５３】
試験例２  ラット胎仔脳由来初代培養神経細胞の突起伸展促進効果
胎生１８日齢のラットの脳（海馬）を採取し、パパイン（９units/ml、Worthington 社製）処理して、神経細胞を分離・調製した（Neurosci. Res., 8, 69-82 (1990))。２０μg/mlのポリリジン（シグマ社製）を加え３７℃で一晩、前処理して、水で３回洗浄した１２穴培養皿（ファルコン社製）に、各種グリコサミノグリカン〔コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）〕５０μg/ml及び各種脂質結合グリコサミノグリカン〔ホスファチジルエタノールアミン結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン結合ヒアルロン酸（ＨＡ−ＰＥ）〕０．５μg/mlを加え、３７℃で２４時間処理した。この培養皿に、該神経細胞を１０×１０4 個/cm2の密度で接種し、５％新生ウシ血清（三菱化学社製）と５％加熱処理ウマ血清（ギブコ社製）及び９０％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−ハムＦ１２培地（Ham's Ｆ１２）（１：１）混合培地（１．５mM  ＨＥＰＥＳ含有）からなる培地で、３７℃で２４時間培養した。培養液の半量を４％パラホルムアルデヒドに交換して、神経細胞を固定し、位相差顕微鏡でそれぞれの神経細胞から伸展した神経突起を観察した。結果を図２に示す。ＣＳは鮫軟骨由来、分子量３万、ＨＡは鶏冠由来、分子量１万、ＣＳ−ＰＥは試験例１で使用したものと同じものを、ＨＡ−ＰＥは、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸（原料としてＧＡＧはヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量１万）、脂質はジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン、合成法として還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−１））を使用した。
グリコサミノグリカンのみの処理では５０μg/mlでも神経突起形成にほとんど影響を示さなかった。しかし、脂質結合グリコサミノグリカンでは、ＣＳ−ＰＥ及びＨＡ−ＰＥそれぞれ０．５μg/mlの処理で明らかな神経突起伸展促進の効果がみられた。
【００５４】
試験例３  ラット胎仔脳由来初代培養神経細胞の突起伸展促進効果
試験例２と同様にして、胎生１８日齢のラット脳（海馬）から神経細胞を調製した。試験例２と同様にポリリジンで前処理して、水で３回洗浄した９６穴培養皿（コースター社製）に濃度の異なる各種脂質結合グリコサミノグリカン〔ホスファチジルエタノールアミン結合ヒアルロン酸（ＨＡ−ＰＥ）０．１及び０．５μg/ml、ホスファチジルエタノールアミン結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＥ）（０．００４、０．０２、０．１、０．５及び１．０μg/ml）〕を加え、３７℃で２４時間処理し、脂質結合グリコサミノグリカンでコートされた培養皿を調製した。この培養皿に、該神経細胞を１０×１０4 個/cm2の密度で接種し、５％新生ウシ血清（三菱化学社製）、５％加熱処理ウマ血清（ギブコ社製）及び９０％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−ハムＦ１２培地（Ham's Ｆ１２）（１：１）混合培地（１．５mM  ＨＥＰＥＳ含有）からなる培地で、３７℃で２４時間培養した。
神経細胞を固定後、神経突起を、抗ニューロフィラメント抗体（ＲＴ９７）を使ってP. Dohertyらの方法（J. Neurochem., 42, 1116-1122 (1984))で、酵素抗体法によって免疫染色した。すなわち、培養液の半量を４％パラホルムアルデヒドに交換し、１５分間保存して神経細胞を固定した。−２０℃に冷却したメタノールで３０分間処理し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（カルシウム・マグネシウム非含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した。該培養皿に抗ニューロフィラメント抗体（ＲＴ９７）（ベーリンガー・マンハイム社製）の５％ヤギ血清含有ＣＭＦ−ＰＢＳ溶液（１０μg/ml）を加え、４℃で一晩処理した。ＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄後、１：１，０００倍希釈のパーオキシダーゼ結合抗マウスイムノグロブリンを加え、室温で６０分間インキュベートした。ＣＭＦ−ＰＢＳで３回、蒸留水で１回洗浄後、５０μl の１００μg/mlテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）（同人化学社製）及び０．００１％Ｈ2 Ｏ2 の０．１M 酢酸ナトリウム（pH６．０）溶液を加え、インキュベートした。５０μl の１N 硫酸を加え反応を止め、５１０nmの吸光度を測定した。細胞数あたりの吸光度を算出することで、伸展した神経突起量を定量化した。結果を図３に示す。ＨＡ−ＰＥ及びＣＳ−ＰＥは試験例２で使用したものと同じものを使用した。
ＨＡ−ＰＥは０．１〜０．５μg/mlの濃度の処理で、ＣＳ−ＰＥは０．０２〜１．０μg/mlの濃度の処理で、それぞれ神経突起伸展の促進作用がみられた。特にＨＡ−ＰＥは０．５μg/mlのコートで約１６０％、ＣＳ−ＰＥでは１．０μg/mlのコートで約１５０％コントロールよりも高いニューロフィラメント産生の増加、すなわち神経突起伸展の増加がみられた。
【００５５】
試験例４  ラット神経損傷モデルに対する効果
ネンブタール麻酔下に１１週齢のＳＤ系雄性ラット左大腿部外側を切開し、座骨神経を露出し、１２cmのペアン鉗子で１０秒間圧迫挫滅した。右足は無処置群であり、対照足とした。挫滅後すぐに、被験液（ＣＳ−ＰＥ  １０mg/ml ＰＢＳ溶液）又は対照液（ＰＢＳ）０．０５mlを損傷部位周辺に滴下した。その後足趾の開閉及び足の裏への荷重に対する障害を運動機能障害として、足底部の損傷、足趾の損傷及び爪ののびの悪さと脱落を感覚神経のマヒあるいは障害による外傷としてその程度を表１のスコア表により判定して測定した。また疼痛反応はノギスでピンチングして測定した。この試験はPain. 47 (1991) p31-39に記載の方法に準じた。ＣＳ−ＰＥは試験例１で使用したものと同じものを使用した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
神経損傷後１週間毎に運動機能障害及び外傷に関して観察し、両者の程度を総障害度スコアーとして測定した。図４に結果を示す。
【００５８】
ＰＢＳのみを滴下した対照群では神経損傷後２週目以降に足趾の自傷（噛みちぎり）例が経時的に増え、５週目では５／５例すべてにみられた。ＣＳ−ＰＥ投与群ではラットの足の外傷はほとんど見られず、対照群と大きく異なる効果がみられた。
【００５９】
足の外傷は、末梢神経の損傷により下肢の感覚神経機能が損なわれたために、足趾を噛み切るなどの自傷等が生じたものと考えられる。ＣＳ−ＰＥの投与により外傷がほとんど見られなかったことから、ＣＳ−ＰＥは末梢神経機能の回復を促進し、感覚神経を含めた末梢神経の障害に起因する神経疾患に有効であることが示された。
【００６０】
製剤例
無菌的に調製したステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＳ）及びジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸（ＨＡ−ＰＥ）のそれぞれ５０mgを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に室温で溶解して５０mlとした。これを無菌ろ過（孔径Ｏ．２２μm のメンブレンフィルター使用）し、２．５mlずつ分注後封入し、１アンプルあたり２．５mgの上記有効成分をそれぞれ含有する注射用薬剤を製造した。なお、ＣＳ−ＰＳは、ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸（原料としてＧＡＧはコンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量３万）、脂質はステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン、合成法は還元末端ラクトン化法（特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（３））、ＨＡ−ＰＥはジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸（原料としてはＧＡＧはヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量１万）、脂質はジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン、合成法は還元末端限定酸化法（特開平４−８０２０２号公報、実施例１−（２）−１））を使用した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の脂質結合ＧＡＧを有効成分とする神経疾患治療剤は、末梢及び中枢の神経細胞の神経突起伸展促進効果、及び神経損傷や神経欠損によって障害をうけた神経機能の回復促進効果を有し、また神経細胞の変性脱落防止効果や神経繊維再生効果が期待されることから、末梢神経系及び中枢神経系の種々の疾患の治療に有効である。例えば、外傷性の神経損傷や神経欠損に起因する神経障害（特に体性神経障害、さらに特に感覚神経障害）、代謝障害性多発性神経障害、機械的神経障害、毒性神経障害などの種々の末梢神経系疾患；ならびに、例えば、脳卒中、脳梗塞、脳出血、脳外傷、記憶障害、老年痴呆、アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの神経繊維が再生されることによって治療効果が期待される種々の中枢神経疾患に有効である。
【００６２】
また、本発明薬剤の有効成分である脂質結合ＧＡＧは、毒性の極めて低い化合物であるので、本発明薬剤はほとんど副作用がないものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣ１２細胞に対するＣＳ−ＰＥの神経突起伸展促進効果を示す、生物の形態の位相差顕微鏡写真である。
Ａ：ラミニン１０μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  無し
Ｂ：ラミニン１０μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  １００μg/ml
Ｃ：ラミニン  ５μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  無し
Ｄ：ラミニン  ５μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  １００μg/ml
Ｅ：ラミニン  １μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  無し
Ｆ：ラミニン  １μg/ml  ＣＳ−ＰＥ  １００μg/ml
【図２】ラット胎仔脳由来初代培養神経細胞の神経突起伸展に対する、ＧＡＧ及び脂質結合ＧＡＧの影響を示す、生物の形態の位相差顕微鏡写真である。
Ａ：コントロール
Ｂ：ＣＳ（コンドロイチン硫酸）５０μg/ml
Ｃ：ＣＳ−ＰＥ                  ０．５μg/ml
Ｄ：ＨＡ（ヒアルロン酸）      ５０μg/ml
Ｅ：ＨＡ−ＰＥ                  ０．５μg/ml
【図３】ラット胎仔脳由来初代培養神経細胞における、ＨＡ−ＰＥとＣＳ−ＰＥの神経突起伸展促進効果を示すグラフである。
【図４】ラット座骨神経損傷モデルにおける、運動機能障害度と外傷度をスコアー判定法により総障害度スコアーとして、経時的に示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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