(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩、および界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒中で混合することにより作製される薬物を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と混合させることにより作製される薬物含有ナノ粒子。
【請求項２】
脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩、および界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒中で混合することにより作製される薬物を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と混合させることにより作製される二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を混合させることにより作製される薬物含有ナノ粒子。
【請求項３】
炭素数６〜２４の脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸から選択されるものである請求項１または２に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項４】
２価または３価の金属塩が、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩である請求項１または２に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項５】
１価ないし３価の塩基性塩が、炭酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および尿酸塩から選択されるものである請求項２に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項６】
水溶性薬物の脂溶性化が、水溶性薬物と２価または３価の金属イオンとの接触、水溶性薬物と酸性または塩基性多糖体との接触、水溶性薬物を溶解した溶液のｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段により行われる請求項１または２に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項７】
水溶性薬物と接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである請求項６に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項８】
界面活性剤が、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種または２種以上のものである請求項１または２に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項９】
脂溶性薬物または水溶性薬物が、分子量が１０００以下であって生理活性を有し、かつヒトに投与することができる化学物質である請求項１〜８のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１０】
脂溶性薬物が、水に対して溶けにくい〜ほとんど溶けないの範囲の溶解性であって、かつ有機溶媒に溶ける薬物である請求項９に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１１】
脂溶性薬物が、ステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、カルシウム拮抗薬、降圧薬、プロスタグランジン系薬および脂溶性ビタミンから選択されるものである請求項９または１０に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１２】
脂溶性薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール、酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、テガフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジピン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ユビデカレノン、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫから選択されるものである請求項９〜１１のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１３】
脂溶性薬物がビタミンＡ（レチノール）である請求項１〜５および８のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１４】
粒子の直径が１〜２００ｎｍである請求項１３に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１５】
水溶性薬物が、２価または３価の金属イオンと結合して脂溶性化される薬物である請求項９に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１６】
水溶性薬物が、水溶性のステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、降圧薬、プロスタグランジン系薬およびビタミンから選択されるものである請求項９または１５に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１７】
水溶性薬物が、リン酸ベタメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リン酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾン、バンコマイシン、ビンクリスチン、ビンプラスチン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、カルモナム、リン酸クリンダマイシンおよびアバカビルから選択されるものである請求項９、１５または１６のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１８】
脂溶性薬物が、エナント酸テストステロン、シクロスポリン、吉草酸ベタメタゾン、ユビデカレノンであり、水溶性薬物がリン酸ベタメタゾンである請求項９に記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項１９】
粒子の直径が１〜２００ｎｍである請求項１〜１８のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤。
【請求項２１】
請求項１３に記載の薬物含有ナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤。
【請求項２２】
外用剤が軟膏剤、ゲル剤、舌下錠、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤および貼付剤から選択される請求項２０または２１に記載の外用剤。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子を含有する注射用剤。
【請求項２４】
脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を水に分散させることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液と２または３価の金属塩を混合させることを特徴とする薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項２５】
脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を水に分散させることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液と２価または３価の金属塩を混合させることにより二次ナノ粒子を作製し、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を混合させることを特徴とする薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項２６】
有機溶媒が、アセトン、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選択される１種または２種以上である請求項２４または２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
脂溶性薬物がビタミンＡ（レチノール）である請求項２４〜２６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２８】
水溶性薬物の脂溶性化が、水溶性薬物を２価または３価の金属イオンと接触させることにより行われる請求項２４または２５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有するナノ粒子に関し、さらに詳細には、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物のナノ粒子およびその製造方法、ならびに当該ナノ粒子からなる皮膚および粘膜適用、ならびに注射用の非経口投与用製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  薬物を経皮・経粘膜投与する目的は、経口投与剤の欠陥である、例えば、（１）消化管からの薬物の吸収が悪く、吸収がばらつき、肝で不活性化される、（２）急激な薬物の吸収で副作用が発現し、特に胃腸管や肝における副作用が強く出る、（３）薬物の徐放効果が得られない、などを改善するためである。【０００３】  薬物の皮膚および粘膜適用に関しては、すでに多くの技術が実用化されている。それらの問題点として、局所作用を目的としたものでは皮膚・粘膜への吸収・分布が不十分であること、皮下・粘膜下組織への浸透が十分でないことなどが挙げられ、また全身への吸収を目的として用いられる場合には、全身への吸収が十分でない薬物が多いことである。【０００４】  さらに、薬物の全身投与を目的とした外用剤にあっては、表皮または粘膜で副作用が起きるもの、皮膚・粘膜の代謝酵素で不活性化されて副作用のある物質に変換されるものなどがあり、この場合には、薬物が表皮および粘膜で反応、代謝を受けないで、皮膚組織を通過される必要がある。たとえば、テストステロンの経皮投与剤は広く用いられているが、テストステロンは、皮膚に存在する２，５−ジハイドロキシナーゼにより脱毛、前立腺がんを起こす活性代謝物に多く代謝されることが知られている。【０００５】  近年、経口投与では不活性化してしまい、注射投与を余儀なくされている生理活性タンパク質、ペプチドについて、経皮・経粘膜投与が試みられているが、吸収率の改善を確保するまでは到っていないのが現状である。【０００６】  生理活性タンパク質の一つとして、比較的低分子で、しかも化学的に安定なインスリンを用いて皮膚、粘膜経由の投与法について種々の研究が行われているが、その吸収率は、確実なデータでは数パーセント程度にすぎず、皮膚経由の投与ではほとんど吸収されないとされている（非特許文献１）。【０００７】  また、生物活性物質をカルシウム含有水難溶性無機物粒子に封入した製剤（特許文献１）、生理活性タンパク質あるいはペプチドと亜鉛イオンとの沈殿物による水不溶性徐放性組成物（特許文献２）などが提案されている。しかしながら、これらの製剤は、薬物の吸収性、あるいは局所刺激等の点で十分なものとは言い難く、未だ実用化に至ったものはない。また、本発明が目的とする脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有するナノ粒子を用いて皮膚、粘膜経由により生体内吸収させようとする技術については、これまで知られていない。【０００８】［特許文献１］国際公開ＷＯ  ０２／０９６３９６号公報
［特許文献２］特開２００３−０８１８６５号公報
［非特許文献１］ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭ  今日のＤＤＳ  薬物送達システム（医薬ジャーナル）３２５〜３３１頁、１９９９年
［非特許文献２］臨床薬理（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）：２６（１），ｐ．１２７〜１２８（１９９５）
［非特許文献３］Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ：１２１（１２），ｐ．９２９〜９４８（２００１）
［非特許文献４］Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ：７９，ｐ．８１〜９１（２００２）【０００９】  上述したように、経口投与により吸収性が悪い、あるいは不活性化する、副作用が発現するなどの欠陥を有する薬物を、皮膚、粘膜投与に適用することができ、かつ薬物の吸収性に優れ、十分な活性を発揮し、副作用を最小限にする薬剤の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  したがって本発明は、経口投与によって薬効を発揮できないか、または吸収性、副作用等で欠点を有する薬物、および注射剤、皮膚外用剤として使用されているが、吸収性、副作用などの点で改善を要する薬物について、皮膚および粘膜経由の投与方法により局所も含め生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティーを発揮し得る技術を提供することを課題とする。【００１１】  かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、ナノテクノロジーを応用し、赤血球よりも遥かに小さい特殊なナノ粒子を利用し、それに薬物を含有させることに成功し、かくして得られたナノ粒子を、皮膚ならびに粘膜経由による投与を行った場合、ナノ粒子に含有された薬物の生体内への高い吸収性が得られ、バイオアベイラビリティーに優れるものであることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】  本発明者らは、先に、生理活性タンパク質またはペプチドのナノ粒子を発明し、特許出願を行っている（特願２００３−３１２０３１号）。本発明者らは、さらに脂溶性薬物およびタンパク質、ペプチド以外の水溶性薬物について、ナノ粒子の作製に成功し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、全身投与および局所投与を目的とした皮膚または粘膜投与により優れた吸収性、バイオアベイラビリティーを有する、脂溶性薬物または水溶性薬物を含有するナノ粒子を提供する。また、本発明のナノ粒子は、注射用剤としても有利に使用できる。
より具体的には、本発明は、
（１）脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩、および界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒中で混合することにより作製される薬物を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と混合させることにより作製される薬物含有ナノ粒子、
（２）脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩、および界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒中で混合することにより作製される薬物を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と混合させることにより作製される二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を混合させることにより作製される薬物含有ナノ粒子、
（３）炭素数６〜２４の脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸から選択されるものである上記（１）または（２）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（４）２価または３価の金属塩が、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩である上記（１）または（２）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（５）１価ないし３価の塩基性塩が、炭酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および尿酸塩から選択されるものである上記（２）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（６）水溶性薬物の脂溶性化が、水溶性薬物と２価または３価の金属イオンとの接触、水溶性薬物と酸性または塩基性多糖体との接触、水溶性薬物を溶解した溶液のｐＨの調整またはイオン強度の変化のいずれかの手段により行われる上記（１）または（２）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（７）水溶性薬物と接触させる２価または３価の金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである上記（６）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（８）界面活性剤が、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種または２種以上のものである上記（１）または（２）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（９）脂溶性薬物または水溶性薬物が、分子量が１０００以下であって生理活性を有し、かつヒトに投与することができる化学物質である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子、
（１０）脂溶性薬物が、水に対して溶けにくい〜ほとんど溶けないの範囲の溶解性であって、かつ有機溶媒に溶ける薬物である上記（９）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１１）脂溶性薬物が、ステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、カルシウム拮抗薬、降圧薬、プロスタグランジン系薬および脂溶性ビタミンから選択されるものである上記（９）または（１０）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１２）脂溶性薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール、酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、テガフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジピン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ユビデカレノン、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫから選択されるものである上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子、
（１３）脂溶性薬物がビタミンＡ（レチノール）である上記（１）〜（５）および（８）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子、
（１４）粒子の直径が１〜２００ｎｍである上記（１３）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１５）水溶性薬物が、２価または３価の金属イオンと結合して脂溶性化される薬物である上記（９）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１６）水溶性薬物が、水溶性のステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、降圧薬、プロスタグランジン系薬およびビタミンから選択されるものである上記（９）または（１５）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１７）水溶性薬物が、リン酸ベタメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リン酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾン、バンコマイシン、ビンクリスチン、ビンプラスチン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、カルモナム、リン酸クリンダマイシンおよびアバカビルから選択されるものである上記（９）、（１５）または（１６）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子、
（１８）脂溶性薬物が、エナント酸テストステロン、シクロスポリン、吉草酸ベタメタゾン、ユビデカレノンであり、水溶性薬物がリン酸ベタメタゾンである上記（９）に記載の薬物含有ナノ粒子、
（１９）粒子の直径が１〜２００ｎｍである上記（１）〜（１８）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子、
を提供するものである。
【００１４】
さらに本発明は、
（２０）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤、
（２１）上記（１３）に記載の薬物含有ナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤、
（２２）外用剤が軟膏剤、ゲル剤、舌下錠、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤および貼付剤から選択される上記（２０）または（２１）に記載の外用剤、
（２３）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の薬物含有ナノ粒子を含有する注射用剤、
（２４）脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を水に分散させることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液と２または３価の金属塩を混合させることを特徴とする薬物含有ナノ粒子の製造方法、
（２５）脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を水に分散させることにより一次ナノ粒子を作製し、当該一次ナノ粒子含有溶液と２価または３価の金属塩を混合させることにより二次ナノ粒子を作製し、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を混合させることを特徴とする薬物含有ナノ粒子の製造方法、
（２６）有機溶媒が、アセトン、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選択される１種または２種以上である上記（２４）または（２５）に記載の製造方法、
（２７）脂溶性薬物がビタミンＡ（レチノール）である上記（２４）または（２５）に記載の製造方法、
（２８）水溶性薬物の脂溶性化が、水溶性薬物を２価または３価の金属イオンと接触させることにより行われる上記（２４）または（２５）に記載の製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】  本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有される脂溶性薬物および水溶性薬物を、皮膚または粘膜経由により生体内吸収させるものであり、また、注射投与によっても優れた徐放性、ターゲッティングを示すものである。したがって、これまで十分に達成されていなかった脂溶性薬物、水溶性薬物の経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、高吸収性、徐放性の脂溶性・水溶性薬物を含有する外用剤、注射剤が提供される。また、本発明のナノ粒子を経皮投与すると、表皮から深部まで浸透し、真皮、皮下組織に高濃度に分布し、よって皮膚に近い関節、腱鞘、筋肉などの疾患に極めて有用である。粘膜下組織に対しても同様のことがみられ、さらに種々の疾患に応用することが可能である。また、物理化学的に不安定な薬物を本発明のナノ粒子とすることにより、極めて安定化することができる。したがって、本発明のナノ粒子は、医薬品、医薬部外品、化粧品として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本発明は、上記するように、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩を作用させることからなる薬物含有ナノ粒子（二次ナノ粒子）、および脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有する一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩と作用させることにより二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を作用させることからなる薬物含有ナノ粒子（三次ナノ粒子）、ならびにそれらのナノ粒子の製造方法、さらにそれらのナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤および注射用剤である。【００１７】  本発明のナノ粒子は、その直径は１〜２００ｎｍ程度であり、好ましくは５〜１５０ｎｍ程度である。かかる粒子径は、含有させる薬物と中長鎖有機化合物との配合比率、界面活性剤の添加量、１価ないし３価の塩基性塩の添加量、使用する溶媒量、攪拌の強度などによって調整することができ、直径５〜５００ｎｍ程度の粒子を作製することができる。また、界面活性剤の量が多くなるほど粒径は大きくなるが、少なすぎても粒子間の凝集や大きな粒子が形成される。粒子径の測定は、光散乱法あるいは電子顕微鏡下で測定することができる。【００１８】  本発明が提供するナノ粒子に含有される脂溶性薬物としては、水に対して溶けにくい〜ほとんど溶けないの範囲の溶解性であって、かつ有機溶媒に溶ける薬物であればいずれでも良く、例えばステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、カルシウム拮抗薬、降圧薬、プロスタグランジン系薬および脂溶性ビタミンから選択されるものである。さらに具体的にはエナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール、酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メサトレキセート、カルモフール、テガフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジピン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ユビデカレノン、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００１９】  上記薬物が塩、エステル、立体異性体、光学異性体、溶媒和物などを有する場合はそれらの全てを包含する。【００２０】  本発明が提供するナノ粒子に含有される水溶性薬物としては、２価または３価の金属イオンと結合して脂溶性化される薬物であればいずれでも良く、例えば水溶性のステロイドホルモン、免疫抑制・調節薬、抗癌薬、抗生物質、化学療法薬、抗ウイルス薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗精神病薬、降圧薬、プロスタグランジン系��およびビタミンから選択されるものであり、分子内にリン酸基、カルボキシル基または硫酸基を有する薬物が特に好ましい。さらに具体的にはリン酸ベタメサゾン、リン酸デキサメタゾン、リン酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾン、バンコマイシン、ビンクリスチン、ビンプラスチン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、カルモナム、リン酸クリンダマイシンおよびアバカビルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２１】  上記薬物が塩、エステル、立体異性体、光学異性体、溶媒和物などを有する場合はそれらの全てを包含する。【００２２】  本発明の一次ナノ粒子を製造する場合において、脂溶性薬物または水溶性薬物の場合は脂溶性化する必要がある。水溶性薬物を脂溶性化する手段として最も好ましいのは、水溶性薬物と沈殿物を形成する２価または３価の金属イオンを使用することである。そのような２価または３価の金属イオンとしては、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩による亜鉛イオン；炭酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩によるカルシウムイオン；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩による鉄イオン；塩化銅、硫酸銅などの銅塩による銅イオン等を挙げることができ、なかでも亜鉛イオンを好ましく使用することができる。【００２３】  この場合の水溶性薬物と２価または３価の金属イオンとの配合比は特に限定されず、両物質が結合することにより沈殿物を生じるに十分な比率であればよい。例えば、亜鉛イオンの場合、水溶性薬物と亜鉛塩とを重量比で１０：１〜１：１０程度とするのがよい。その他の脂溶性化方法として、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサンなどの酸性または塩基性多糖体と接触させること、あるいは水溶性薬物を溶解した溶液のｐＨ調節、イオン強度の変化などにより行うことも可能である。なお、脂溶性薬物はそのまま使用することができる。【００２４】  本発明の一次ナノ粒子を製造するためには、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基などの陰イオン残基を持つ有機化合物が必要であり、それらを有していればいずれでもよいが、なかでもカルボキシル基を有する中長鎖有機化合物が好ましい。そのような陰イオン残基を持つ中長鎖有機化合物としては炭素数６〜２４の不飽和または飽和脂肪酸あるいはその塩が好ましく、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸が挙げられ、オレイン酸、ミリスチン酸が特に好ましい。これらの中長鎖有機化合物は粉末である場合にはそのまま加えることが可能であるが、水、有機溶媒または含水有機溶媒に溶解して使用するのが好ましい。そのような有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが使用でき、なかでもアセトン、エタノールが好ましい。なお、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物と中長鎖有機化合物との配合重量比は、１：３０〜１：０．０３程度とするのが好ましい。【００２５】  この一次ナノ粒子を製造する段階で、微細な粒子を含有する良好な均一状態を得るために、攪拌機、超音波発振器を使用し、また、フレン���プレッシャー、マントゴーリーなどを使用し、圧力を強めることにより微細なナノ粒子としての一次ナノ粒子が作製される。【００２６】  本発明の一次ナノ粒子を製造するに際しては、生成したナノ粒子同士の凝集を避けるために、適量の界面活性剤を添加するのが好ましく、その配合量はナノ粒子同士が凝集しない程度で適宜選択することができ、中長鎖有機化合物に対してモル比で０．３〜０．０１程度使用するのがよい。そのような界面活性剤としては、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート（Ｔｗｅｅｎ８５）、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、脂肪酸−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体などの非イオン性界面活性剤を使用することができる。これらの界面活性剤は１種または２種以上を選択して使用することができる。なかでも、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体が好まく、この場合の脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸を挙げることができる。【００２７】  さらに植物油を添加することもできる。この場合に使用される植物油としては、大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、各種サラダ油等の植物油を好ましく使用することができる。【００２８】  本発明のナノ粒子は、上述により得られる一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩と作用させることにより得られる二次ナノ粒子、およびこの二次ナノ粒子を１価ないし３価の塩基性塩と作用させることにより得られる三次ナノ粒子からなる。【００２９】  使用される２価または３価の金属塩としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；または塩化銅、硫化銅などの銅塩であり、なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、有効成分となる薬物に対し重量比で５〜０．０１程度が好ましい。【００３０】  また、三次ナノ粒子を得るための１価ないし３価の塩基性塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの炭酸水素塩；リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなどのリン酸水素塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩、尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などであり、なかでも脂溶性薬物の場合は炭酸水素塩、炭酸塩が好ましく、脂溶性化された水溶性薬物の場合は炭酸塩とくに炭酸ナトリウムが好ましい。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、上記２価または３価の金属塩に対しモル比で１．０〜０．０５程度であるのが好ましい。【００３１】  以下に、本発明が提供するナノ粒子の製造方法について説明する。
先ず、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物と、陰イオン残基を持つ中長鎖有機化合物と界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に分散させ、この溶液を１〜３０分間程度攪拌することにより一次ナノ粒子が作製される。かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間攪拌して二次ナノ粒子を作製する。次いで、かくして得られた二次ナノ粒子の溶液に１価ないし３価の塩基性塩を加え、１分〜２４時間攪拌することにより三次ナノ粒子を得ることができる。なお、水溶性薬物を脂溶性化する方法は、水溶性薬物を酸性、塩基性または中性の水に溶解し、その溶液に２価または３価の金属イオンを加えることにより得られる。【００３２】  かくして製造された本発明の脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有する二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の溶液を、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等をすることにより溶媒を除去し、製剤用組成物として、適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の非経口投与用製剤である皮膚・粘膜適用型外用剤または注射用剤を調製することができる。【００３３】  本発明は、また、そのような皮膚・粘膜適用型外用剤または注射用剤を提供するものである。そのような外用剤としては、全身および局所投与・治療を目的として局所へ塗布、貼付、滴下、噴霧などの形態で投与しうるものであり、具体的には、軟膏剤、ゲル剤、舌下錠、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤、貼付剤等を挙げることができる。液剤としては点鼻剤、点眼剤として好ましい。また、皮膚または粘膜への塗布、下気道への噴霧などが有効な投与形態である。注射用剤としては、静脈注射、皮下注射、筋肉注射のいずれの投与形態も可能であり、それぞれの薬物の特性によって選択される。【００３４】  これらの外用剤、注射剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に外用剤、注射剤の調製に使用されている基剤、成分を挙げることができる。具体的には、ワセリン、プラスチベース、パラフィン、流動パラフィン、軽質流動パラフィン、サラシミツロウ、シリコン油などの油脂性基剤；水、注射用水、エタノール、メチルエチルケトン、綿実油、オリーブ油、落花生油、ゴマ油などの溶剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどの非イオン性界面活性剤；ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアガム、ゼラチン、アルブミンなどの増粘剤；ジブチルヒドロキシトルエンなどの安定化剤；グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、尿素、ショ糖、エリスリトール、ソルビトールなどの保湿剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｐ−クレゾールなどの防腐剤であり、剤型に応じて適宜選択して使用することができる。また、点鼻剤の場合、ヒドロキシプロピルセルロースなどの経鼻吸収促進剤を配合すると好ましい。さらに、ハイドロゲル剤とするには、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのゲル化剤を使用する。【００３５】  例えば、本発明のナノ粒子を有効成分として含有する軟膏剤の場合には、基剤等の成分としてワセリンを使用し、懸濁安定化するために０．０５〜０．５％のカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）を一緒に使用するのがよい。
【実施例】
【００３６】  本発明を、以下の実施例、試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３７】［実施例１］二次ナノ粒子の作製−界面活性剤の影響
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを水０．１ｍＬに添加し、バス型超音波発生器でミセルとして完全に溶解した。その後、所定量のＴｗｅｅｎ８０およびエタノールに溶解したエナント酸テストステロン１ｍｇまたはシクロスポリンＡ１ｍｇを混合し、１０分間超音波発生器を用いて均一にした。次いで、所定量の塩化カルシウム水溶液を加え３０分間攪拌することによりエナント酸テストステロンまたはシクロスポリンＡを含有する二次ナノ粒子を作製した。こうしてえられた薬物含有の溶液を１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、その上清中のエナント酸テストステロンおよびシクロスポリンＡの含有量をＨＰＬＣによって定量した。結果を表１および表２に示した。【００３８】カルシウムおよびＴｗｅｅｎ量（重量比）がエナント酸テストステロン（ＴＥ）含有粒子形成に及ぼす影響【００３９】
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【００４０】カルシウムおよびＴｗｅｅｎ量（重量比）がシクロスポリンＡ（ＣＹＡ）含有粒子形成に及ぼす影響【００４１】
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【００４２】  表１および表２に示した結果から、Ｔｗｅｅｎ８０を混合しない場合には、大きな粒子や凝集体が形成され、薬物が沈殿してしまったが、２ｍｇ以上のＴｗｅｅｎ８０を混合することで、薬物を含有した小さな粒子が形成されていることが判明した。また、カルシウム量の変化によっては薬物の含有量は影響されなかった。【００４３】［実施例２］二次ナノ粒子の作製
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを水０．１ｍＬに添加し、バス型超音波発生器でミセルとして完全に溶解した。その後、所定量のＴｗｅｅｎ８０およびエタノールに溶解した吉草酸ベタメサゾン１ｍｇを混合し、１０分間超音波照射した。次いで、１Ｍ塩化カルシウム水溶液３３μＬを添加し、３０分間攪拌することにより吉草酸ベタメサゾンを含有する二次ナノ粒子を作製した。こうして得られた薬物含有の溶液を１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、その上清中の吉草酸ベタメサゾンの含有量をＨＰＬＣによって定量した。結果を表３に示した。【００４４】吉草酸ベタメサゾン（ＢＶ）の粒子化【００４５】
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【００４６】［実施例３］界面活性剤と粒径の関係
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムに、所定量の脂質−ＰＥＧ（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（ＭＷ：２０００）、日本油脂製）またはＴｗｅｅｎ８０を混合し、超音波発生器を用いて均一にしてから、１Ｍ塩化カルシウム水溶液３３μＬを添加しその粒径を測定した。結果を表４に示した。【００４７】界面活性剤量が界面活性剤／オレイン酸粒子の粒径に及ぼす影響【００４８】
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【００４９】  表４に示した結果より、界面活性剤の量が多くなるほどその粒径が大きくなるが、少なすぎても凝集や大きな粒子が形成され、最小の粒径を形成する混合比が存在することが判明した。【００５０】［実施例４］三次ナノ粒子の作製−金属塩／塩基性塩の種類の影響
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを水０．１ｍＬに添加し、バス型超音波発生器でミセルとして完全に溶解した。その後、６ｍｇのＴｗｅｅｎ８０およびエタノールに溶解したシクロスポリンＡ１ｍｇを混合し、１０分間超音波発生器を用いて均一にした。次いで、１Ｍ塩化カルシウムあるいは１Ｍ塩化亜鉛をオレイン酸ナトリウムに対し等モル量となるように添加し、３０分間攪拌することによりシクロスポリンＡを含有する二次ナノ粒子を作製した。次いで、この二次ナノ粒子を含有する溶液に金属塩と等モル量の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムあるいはリン酸二水素ナトリウムを添加し、１時間攪拌することにより薬物を含有する三次ナノ粒子を作製した。その後、１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、その上清中のシクロスポリンＡの含有量をＨＰＬＣにより定量した。結果を表５に示した。【００５１】種々の金属塩および塩基性塩による三次ナノ粒子形成【００５２】
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オレイン酸Ｎａ：１０ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：６ｍｇ、シクロスポリンＡ（ＣＹＡ）：１ｍｇ【００５３】  表５に示した結果からも判明するように、塩化亜鉛を添加した場合に比較して塩化カルシウムを添加した時のほうが、小さくて安定なシクロスポリンＡ含有ナノ粒子が調製できることが判明した。また、塩化亜鉛を添加した場合には、塩基性塩としてリン酸塩のほうが炭酸塩に比較して小さくて安定なシクロスポリンＡ含有ナノ粒子が調製でき、逆に、塩化カルシウムを添加した場合には、塩基性塩として炭酸塩のほうがリン酸塩に比較して小さくて安定なシクロスポリンＡ含有ナノ粒子が調製できることが判明した。【００５４】［実施例５］三次ナノ粒子の作製一塩基性塩の影響
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを水０．１ｍＬに添加し、バス型超音波発生器でミセルとして完全に溶解した。その後、５ｍｇのＴｗｅｅｎ８０およびエタノールに溶解したエナント酸テストステロン１ｍｇまたはシクロスポリンＡ１ｍｇを混合し、１０分間超音波発生器を用いて均一にした。次いで、塩化カルシウムをオレイン酸ナトリウムに対し３倍モル比となるように添加し、３０分間攪拌することによりエナント酸テストステロンまたはシクロスポリンＡを含有する二次ナノ粒子を作製した。次いで、この二次ナノ粒子を含有する溶液に所定量の炭酸水素ナトリウムを添加し、１時間攪拌することにより薬物を含有する三次ナノ粒子を作製した。その後、１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、その上清中のエナント酸テストステロンおよびシクロスポリンＡの含有量をＨＰＬＣにより定量した。結果を表６および表７に示した。【００５５】炭酸水素ナトリウム量の粒子形成への影響（エナント酸テストステロン、ＴＥ）【００５６】
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【００５７】炭酸水素ナトリウム量の粒子形成への影響（シクロスポリンＡ、ＣＹＡ）【００５８】
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【００５９】  表６および表７に示した結果より、カルシウムに対する炭酸水素ナトリウムの量を増加させるほど上清中の薬物の量は減少した。これは、過剰に存在する炭酸とカルシウムが反応し、炭酸カルシウムが形成され、その沈殿物と作製されたナノ粒子が共沈したためと思われる。【００６０】［実施例６］三次ナノ粒子の作製
実施例５において薬物をエナント酸テストステロンとし、炭酸水素ナトリウムの代わりにリン酸水素二ナトリウム（塩化カルシウムに対し０．５倍モル量）を使用した以外は実施例５と同様の操作を行うことにより、リン酸カルシウムにより被覆されたエナント酸テストステロンを含有する三次ナノ粒子を作製した。【００６１】［実施例７］三次ナノ粒子の作製−界面活性剤の影響−安定性
１０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを水０．１ｍＬに添加し、バス型超音波発生器でミセルとして完全に溶解した。その後、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル（ＣＳ−２０、日本エマルジョン製）またはＰＥＧ−オレイン酸（日本油脂製）の所定量およびエタノールに溶解したシクロスポリンＡ１ｍｇを混合し、１０分間超音波発生器を用いて均一にした。次いで、１Ｍ塩化カルシウム水溶液３３μＬ、および１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１６．５μＬを順次撹拌しながら添加し、その後１時間攪拌することにより、シクロスポリンＡを含有する三次ナノ粒子を作製した。その後、１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、その上清中の粒子懸濁液を水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に１：９の体積比で添加し、５５０ｎｍでの吸収値を測定することにより、各液中における安定性を評価した。結果を表８に示した。【００６２】各溶液中でのナノ粒子の分散安定性（３時間後の５５０ｎｍでの濁度変化）【００６３】
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【００６４】  表８に示した結果より、ＣＳ−２０およびＰＥＧ−オレイン酸においてもＴｗｅｅｎ８０と同様にナノ粒子が調製できたが、Ｔｗｅｅｎ８０を使用して調製されたナノ粒子が各液中で最も安定であった。【００６５】  また、本実施例の各調製段階における粒子の粒径を測定した。その結果を下記表９に示した。それによると、二次ナノ粒子、三次ナノ粒子ともに数１００ｎｍの粒子が得られることが判明した。【００６６】ナノ粒子径の変化【００６７】
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【００６８】［実施例８］三次ナノ粒子の作製−マウス経皮吸収試験
１０ｍｇオレイン酸ナトリウム、シクロスポリンＡ１ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ４ｍｇ、１Ｍ塩化カルシウム水溶液３３μＬおよび１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１６．５μＬを用いて、実施例５と同様の操作を行ってシクロスポリンＡ含有の三次ナノ粒子を作製した。こうして得られたナノ粒子を含有する溶液を３，５００ｒｐｍで遠心することにより炭酸カルシウム沈殿を除去し、上清をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（ＹＭ−５０、アミコン製）で濃縮して、シクロスポリンＡ含有の三次ナノ粒子を得た。【００６９】  この粒子中のシクロスポリンＡ量をＨＰＬＣにより定量し、７週齢雌ｄｄｙマウスの脱毛した背中の皮膚にシクロスポリンＡ量として２ｍｇ／匹となるように粒子懸濁液（２５％グリセリン水溶液）を塗布した。また、同量の粒子の水懸濁液（グリセリンなし）を皮下注射投与した。対照例として、同量のシクロスポリンＡ（２５％グリセリン／５０％エタノール水溶液）を塗布し、投与後１、３、２４時間後に全採血を行い、ＦＰＩＡ法により血漿中に含まれるシクロスポリンＡを定量した。結果を表１０に示した。【００７０】マウス皮膚へのシクロスポリンＡ（ＣＹＡ）封入粒子を塗布した後の血中ＣＹＡ濃度の推移【００７１】
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【００７２】  表１０に示した結果から判るように、本発明のナノ粒子を塗布した場合は、シクロスポリンＡのみを塗布した場合に比べ、高い血中濃度を示すと同時に徐放性を示し、粒子化することでシクロスポリンＡが経皮吸収されやすくなっている。また、本発明のナノ粒子を皮下注射投与した場合でも、２４時間後でも高い血中濃度が維持されており、吸収性、徐放性に優れていた。【００７３】［実施例９］三次ナノ粒子の作製−界面活性剤、脂肪酸、溶媒の使用量の影響
所定量のアセトン中に、エナント酸テストステロン１０ｍｇ、所定量のミリスチン酸およびＴｗｅｅｎ８０を溶解し、その溶液を水中に添加、攪拌することによりエナント酸テストステロン含有の一次粒子を得た。この粒子懸濁液中に１Ｍ塩化カルシウム水溶液（ミリスチン酸に対し等モル量）を添加し３０分攪拌して二次粒子を作製した。次いで、この溶液中へ１Ｍ炭酸水素ナトリウム（カルシウムに対し０．２倍モル量）を添加し１〜１２時間攪拌した。Ｔｗｅｅｎ８０量、ミリスチン酸量、アセトン量を適宜変えながら調製して得た三次ナノ粒子含有溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清中に含まれる粒子の粒径、エナント酸テストステロンの量を測定した。結果を表１１〜１３に示した。【００７４】Ｔｗｅｅｎ量が粒子形成に及ぼす影響【００７５】
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エナント酸テストステロン（ＴＥ）：１０ｍｇ、ミリスチン酸：０．５ｍｇ、アセトン：３６０μＬ【００７６】ミリスチン酸量が粒子形成に及ぼす影響【００７７】
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エナント酸テストステロン（ＴＥ）：１０ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：０．５ｍｇ、アセトン：３２７０μＬ【００７８】アセトン量が粒子形成に及ぼす影響【００７９】
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エナント酸テストステロン（ＴＥ）：５ｍｇ、ミリスチン酸：０．５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：２ｍｇ【００８０】  表１１〜１３に示した結果より、Ｔｗｅｅｎ８０と薬物との混合比、ミリスチン酸と薬物との混合比およびアセトンの使用量が、粒子の形成（粒径、エナント酸テストステロンの含有量）に大きく影響を及ぼすことが判明した。また、Ｔｗｅｅｎ８０の量が多いほどエナント酸テストステロンの含有量が増加し、ミリスチン酸の量が多いほどエナント酸テストステロンの含有量が減少し、アセトンの使用量が多いほど粒径が小さくなることが判明した。【００８１】［実施例１０］水溶性薬物（リン酸ベタメサゾン）の三次ナノ粒子の作製
リン酸ベタメサゾン１０ｍｇを溶解した５００μＬの水中に、０．５Ｍ酢酸亜鉛水溶液１０００μＬを添加した。１２，０００ｒｐｍ／５分間遠心し、上清を除去後、沈殿に水を添加し遠心することで沈殿を洗浄した。この沈殿と１ｍｇのミリスチン酸及びＴｗｅｅｎ８０をアセトン１０００μＬ中に溶解（または懸濁）し、水中に添加攪拌することで、一次ナノ粒子を得た。この粒子懸濁液中に１Ｍ塩化カルシウム水溶液（ミリスチン酸に対し等モル量）を添加し３０分攪拌後、１Ｍ炭酸水素ナトリウム（カルシウムに対し０．２倍モル量）を添加し１時間〜１２時間攪拌し、リン酸ベタメサゾンを含有する三次ナノ粒子を作製した。Ｔｗｅｅｎ８０の量を変え調製し、５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清の粒子の粒径、およびリン酸ベタメサゾン（ＢＰ）残量をＨＰＬＣにより測定した。その結果を表１４に示した。【００８２】Ｔｗｅｅｎ量が粒子形成に及ぼす影響【００８３】
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【００８４】  表１４に示した結果から、Ｔｗｅｅｎ８０を混合しないで調製した場合には、凝集塊が形成され上清中にＢＰはほとんど検出されなかった。Ｔｗｅｅｎ８０量を混合させることで分散安定性の高い粒子が調製され、その量を多くするほど小さな粒子が調製できることがわかった。【００８５】［実施例１１］レチノール（ビタミンＡ）粒子の作製
レチノール（ビタミンＡ）６ｍｇを溶解したエタノールまたはアセトン溶液１０μＬと大豆油１００ｍｇを混合し、グリセリン２２ｍｇ、レシチン１０ｍｇ、オレイン酸ナトリウム１０ｍｇおよびオレイン酸−ポリエチレングリコール共重合体１２ｍｇの水懸濁液中に添加し、総量で１０ｍＬとなるようにした。この混合液を超音波発生器またはフレンチプレッシャーを用いて均一化して、レチノール含有の一次ナノ粒子を作製した。次いで、オレイン酸ナトリウムに対し等モル量の塩化カルシウム水溶液を添加し、室温で１時間攪拌することにより二次ナノ粒子を作製した。次いで、塩化カルシウムに対し０．２〜１倍モル量の炭酸水素ナトリウムを添加し、３時間から一晩攪拌し、三次ナノ粒子を得た。最終的にレチノールの濃度は、０．３〜０．５％程度であった。【００８６】［実施例１２］レチノール（ビタミンＡ）粒子の作製
水１００重量部にオレイン酸ナトリウム０．５重量部を加え、オレイン酸ナトリウムが完全に溶解するまでスタラーにて攪拌した。一方、別にエタノール５．０重量部とレチノール５０Ｃ（ＢＡＳＦ社製：４９％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）；４７％レチノール；３％ブチルヒドロキシトルエン；１％ブチルヒドロキシアニソールの混合原料）５．０重量部とを混合・溶解させておき、先の溶液に添加し、混合液を１０分間スタラーで攪拌し、一時ナノ粒子を作成した。次いで、１Ｍ塩化カルシウム水溶液を０．２５重量部加え、室温にて１０分間スタラーで攪拌することにより二次ナノ粒子を作製した。次いで、１Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を０．０５重量部添加し、一晩攪拌し、三次ナノ粒子を得た。上記で得たナノ粒子の粒径は約１００ｎｍであった。【００８７】［実施例１３］ユビデカレノン粒子の作製
大豆油１ｇに、５０ｍｇ／ｍＬのユビデカレノン−アセトン溶液２００μＬを加えて攪拌、溶解させた。この溶液に２５ｍｇ／ｍＬのレシチン水溶液４ｍＬを加え攪拌した。さらに１００ｍｇ／ｍＬのオレイン酸ナトリウム１ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬのＯｌｅｙｌ−Ｏ−ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＯＥ−０２０；日本油脂社製）２ｍＬ、５０％グリセリン水溶液４４０μＬ、精製水を加えて全量を１０ｍＬとした。攪拌後、超音波発生器（ＵＤ−２０１；トミー精工社製）を用いて乳化処理して粒子液を作製した。その後、１Ｍ塩化カルシウム水溶液３３０μＬを加えて４５分間回転混和し、さらに１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３３０μＬを加えて４５分間回転混和した。その後、遠心分離により過剰な金属塩および分離油脂層を除き、ユビデカレノンの三次ナノ粒子を得た。
この粒子の粒子径を粒径アナライザーＦＲＡＲ−１０００（大塚電子社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は２７６．６ｎｍであった。
また、乳化処理をフレンチプレス細胞破砕機（ＯＭＦＡ０７８Ａ；Ｔｈｅｒｍｏ  ＩＥＣ）で行っても同様にナノ粒子を作製することができた。
こうして得られたユビデカレノンの三次ナノ粒子を５０℃、５日間、非遮光で放置したところ、粒子の外観、粒径とも変化を示さなかった。【００８８】［実施例１４］軟膏剤／ハイドロゲル剤の製造
実施例５で得られた三次ナノ粒子（エナント酸テストステロン封入）、白色ワセリン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびパラオキシ安息香酸メチルを適宜使用して、全量が均質になるまで混和し、軟膏剤およびハイドロゲル剤とした。【００８９】［実施例１５］ゲル剤
処方：ハイドロゲル剤として１００重量部中
ポリビニルピロリドン（コリドン９０Ｆ）          ０．２重量部
エデト酸二ナトリウム                            ０．１重量部
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）                  １．５重量部
ベンザルコニウムクロリド                        ０．０１重量部
実施例１２で得られた三次ナノ粒子                ０．１重量部
脱イオン水                                      残部
上記配合成分によりゲル剤を得た。【００９０】［実施例１６］外用貼付剤（水性パップ剤）
処方：
実施例５で得られた三次ナノ粒子                  ０．１重量部
（エナント酸テストステロン封入）
ポリアクリル酸                                  ２．０重量部
ポリアクリル酸ナトリウム                        ５．０重量部
カルボキシメチルセルロースナトリウム            ２．０重量部
ゼラチン                                        ２．０重量部
ポリビニルアルコール                            ０．５重量部
グリセリン                                    ２５．０重量部
カオリン                                        １．０重量部
水酸化アルミニウム                              ０．６重量部
酒石酸                                          ０．４重量部
ＥＤＴＡ−２−ナトリウム                        ０．１重量部
精製水                                                  残部
上記配合成分をベースとし、常法により外用剤（水性パップ剤）を得た。【００９１】［実施例１７］注射剤
実施例５で得られた三次ナノ粒子（シクロスポリンＡ封入）を注射用蒸留水に溶解し、等張化剤を含有させ、さらにｐＨを６．９に調整した後、バイアル充填し、高温高圧滅菌を行い、注射剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９２】  以上のように、本発明は、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有する一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩を作用させることから成る薬物含有ナノ粒子（二次ナノ粒子）、および脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物を含有する一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩と作用させることにより二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を作用させることから成る薬物含有ナノ粒子（三次ナノ粒子）、ならびにそれらのナノ粒子の製造方法、さらにそれらのナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤および注射用剤である。本発明のナノ粒子は、これまで十分に達成されていなかった脂溶性薬物、水溶性薬物の経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする画期的な効果を有し、高吸収性、徐放性、安定性のある脂溶性・水溶性薬物を含有する外用剤、注射剤である。