(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有する請求の範囲１項に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有する請求の範囲１項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
未分化細胞の分化抑制作用を有する請求の範囲１項〜３項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
未分化細胞が脳神経系または筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞である請求の範囲４項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
未分化細胞が血液未分化細胞である請求の範囲４項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有する請求の範囲１項〜３項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求の範囲１項〜２項のいずれかに記載のポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求の範囲１項〜２項のいずれかに記載のポリペプチドを含有する細胞培養培地。
【請求項１０】
細胞が、血液未分化細胞である請求の範囲９項に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列の９０番から７３１番にあたる配列を有する請求の範囲１１項に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列の９０番から３２５４番にあたる配列を有する請求の範囲１３項に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列の９０番から３７２５番にあたる配列を有する請求の範囲１５項に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組換えＤＮＡ体。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組換えＤＮＡ体。
【請求項１９】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組換えＤＮＡ体。
【請求項２０】
請求の範囲１７項に記載した組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞。
【請求項２１】
請求の範囲１８項に記載した組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞。
【請求項２２】
請求の範囲１９項に記載した組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞。
【請求項２３】
請求の範囲２０項〜２２項のいずれかに記載の細胞を培地に培養し、培養物中より産生された化合物を採取することを特徴とする請求の範囲１項〜３項のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２４】
配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、未分化細胞の分化を抑制するための新規生理活性物質に関するものである。
従来の技術
ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球やリンパ球は感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々のサイトカインや環境要因によって刺激されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。このサイトカインとして、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血小板産生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子（ｍｐｌリガンド）が発見されて、前者２つは現在すでに臨床応用がなされている。
血液未分化細胞に関して、特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞とすべての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概念的に分類されている。血液前駆細胞に関してコロニーアッセイによって同定が可能であるが、造血幹細胞の同定方法は確立されていない。これらの細胞に関して、ステムセルファクター（ＳＣＦ）やインターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インター口イキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭなどが細胞の分化増殖を促すことが報告されている。
骨髄移植療法に代替される造血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、造血幹細胞を体外で増幅することが検討されている。しかし、この細胞を上記のようなサイトカインを用いて体外で増殖培養させると、造血幹細胞が本来有している多分化能および自己複製能が徐々に失われ、５週間培養後には特定の系列にのみ分化する血液前駆細胞へと変化し、造血幹細胞の特徴の一つである多分化能が失われることが報告されている（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８６，５１２−５２３，１９９５）。
血液前駆細胞の増殖には単独のサイトカインのみでは効果が十分でなく、複数のサイトカインの共同作用（シナジー）が重要であることが明らかになっている。このことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増殖させるためには、血液未分化細胞を増殖、分化させるサイトカインと共に分化を抑制するサイトカインが必要であると考えられている。しかし、一般に細胞の増殖や分化を促進するサイトカインが多数見いだされているのに対して、細胞の分化を抑制するサイトカインは少数しか見いだされていない。例えば、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）はマウス胚幹細胞を分化させずに増殖させる作用が報告されているが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対し、そのような作用は有していない。また、腫瘍細胞増殖因子（ＴＧＦ−β）は多様な細胞に対して増殖抑制の作用をするが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対する作用は一定の見解が得られていない。
血液細胞のみならず、未分化細胞、特に幹細胞に関しては組織再生に強く関与すると考えられている。これらの組織再生、並びに各組織の未分化細胞を増幅させることは成書（吉里勝利著  再生−甦るしくみ、１９９６、羊土社）を参考にすることからその幅広い用途を知ることができる。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）はショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。
一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
特にヒトに関して、ヒトノッチホモログであるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅｌｌｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６，６４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に２つのノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液細胞においてはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３，２０５７−２０６２，１９９４）。しかしながら、ヒトに関して、ノッチのリガンドと考えられるヒトデルタ、ヒトセレイトの遺伝子のクローニングの報告はない。
ショウジョウバエノッチについて、そのリガンドとの結合性が詳細に調べられ、ノッチの細胞外部分に３６あるＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様繰り返しアミノ酸配列のうち１１番目と１２番目の繰り返し配列を結合領域として、リガンドとＣａ++を介して結合し得ることが示された（文献のＦｅｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１，５２３−５３４，１９９０およびＲｅｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６７，６８７−６９９，１９９１および特表平７−５０３１２３号公報）。他種のノッチホモログについてもＥＧＦ繰り返し配列は保存されており、リガンドとの結合に関して同様の機構が類推されている。
リガンドにおいても、アミノ酸末端の近くにＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ−２）と呼ばれるアミノ酸配列とリセプターと同様にＥＧＦ様繰り返し配列が保存されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，２２５−２３２，１９９５）。ＥＧＦ様配列はトロンボモジュリン（Ｊａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８８３４−８８３８，１９８６）や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）リセプター（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７，５７７−５８５，１９８４）および血液凝固因子（Ｆｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５３，５０５−５１８，１９８９）で見いだされ、細胞外での凝集や接着に重要な役割を果たすと考えられている。
ショウジョウバエデルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだされており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生にＸｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，７６１−７６６，１９９５）。
一方、ショウジョウバエセレイトの脊椎動物のホモログはラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８０，９０９−９１７，１９９５）。この報告によれば、ラットジャグドのｍＲＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。またラットノッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャグド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチを強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジャグドが作用しないことが見いだされている。
これらの報告から、ノッチおよびそれに対するリガンドは神経細胞の分化制御に関係していると考えられているが、一部筋芽細胞を除き、血液細胞を含む他の細胞、特にプライマリーな細胞への作用に関しては全く不明であった。
発明が解決しようとする課題
上記のように未分化細胞に関して、それらの特徴を保ったまま増殖させる方法は完成されていない。この最大の原因は未分化細胞の分化を抑制する因子が十分に見いだされていないことにある。本発明の課題は、未分化細胞の分化を抑制する新規な因子に由来する化合物を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らはノッチおよびそのリガンドが神経細胞の分化制御のみならず、広く未分化な細胞の分化制御を行なうとの仮説を立てた。しかしヒトへ臨床応用する際、既知のニワトリ型、アフリカツメガエル型などの異種の生物種のノッチリガンドでは種特異性、抗原性の問題がある。このため未だ報告のないヒト型のノッチリガンドを取得することは不可欠である。ヒト型ノッチ（ＴＡＮ−１）の推定上のリガンドであるヒトデルタホモログ（以下ヒトデルタと呼称する）及びヒトセレイトホモログ（以下ヒトセレイトと呼称する）が存在し、これらの発見は未分化細胞の分化制御に有効な医薬品の候補となると本発明者らは考えその発見に努めた。
本発明者らはヒトノッチリガンドの探索のため、ヒト以外の動物で発見されているこれらのホモログの保存されたアミノ酸配列を解析し、対応するＤＮＡ配列の混合プライマーによるＰＣＲによってこの遺伝子を発見すべく進めた。そして、鋭意研究の結果、新規ヒトデルタ、ヒトセレイトのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの単離に成功し、このｃＤＮＡを用いて蛋白質の発現系を作製し、タンパクを精製し、生理活性を見いだし、既に特許出願を行った（国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２）。
更に、本発明者らは脊椎動物においては前記の特許出願のヒトデルタ、ヒトセレイト（以下各々ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１と呼称する）以外にショウジョウバエデルタ、セレイト類似分子があると考え、その発見に努めた。
その方法として、本発明者らは遺伝子配列のデーターベース上を検索する手法を用いた。すなわち、本発明者らが初めて見いだしたヒトセレイト−１の遺伝子配列（配列表の配列番号５にアミノ酸配列と共に示す）を基に、遺伝子配列データーベースＧｅｎｂａｎｋのランダムなヒトｃＤＮＡ配列の遺伝子断片のデーターべースであるＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）を遺伝子配列検索ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ／ＣＤ（ソフトウエア開発社製）を用いてホモロジーの高い遺伝子断片（２００から３５０ｂ程度の長さ）を複数個見いだした。
これらの短い遺伝子断片をＰＣＲにてクローニングし、これらの遺伝子断片をプローブとして、ヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーなどからよりこれらより長い遺伝子断片のクローニングを試みた。その結果、この様にして分離され、遺伝子配列を決定したより長い遺伝子断片の遺伝子配列を再度ヒトセレイト−１の遺伝子配列と比較を行なったところ、その中からヒトセレイト−１と比較的高いホモロジーを有する遺伝子が単離されていることが明らかとなり、この分子をヒトセレイト−２と命名し、全長の遺伝子クローニングを行い、成功した。
更に、この全長遺伝子クローニングを行ったセレイト−２の発現ベクターを各種構築し、ついでこれらの蛋白質の精製法を確立し、精製を行い単離した。また、該ヒトセレイト−２を免疫原として抗体を作製し、精製法を確立し、血液未分化細胞に対する作用を確認し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関し、これらポリペプチドが未分化細胞の分化抑制作用を有するポリペプチドに関する。さらに、これらのポリペプチドに関し、未分化細胞が脳神経系または筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞であるポリペプチド、また、未分化細胞が血液未分化細胞であるポリペプチド、更にポリペプチドが血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチドに関し、該ポリペプチドを含有する医薬組成物、該ポリペプチドを含有する細胞培養培地に関し、該細胞が血液未分化細胞である培地に関する。
さらに本発明は、配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関し、これらＤＮＡが配列番号４に記載のＤＮＡ配列の９０番から７３１番、９０番から３２５４番もしくは９０番から３７２５番にあたる配列を有するＤＮＡに関する。更に配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組換えＤＮＡ体に関し、さらにこれらＤＮＡ体により形質転換された細胞に関する。
また本発明は、さらにこれら該ポリペプチドを生産し得る細胞を培地にて培養し、産生された化合物を採取する化合物の製造方法に関し、さらに配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
本発明の新規化合物は少なくとも配列表の配列番号１〜３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変体も、配列表の配列番号１、２または３のポリペプチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規化合物に含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｅｔｔらの出願（国際公開番号ＷＯ９６／２６４５）などに詳しく記載されており、これらを参考にして作製することができる。本発明での改変体とはこのようなアミノ酸置換に伴う改変体に関し、その改変体がアミノ酸配列において９０％以上の類似性を有するアミノ酸配列と規定できる。
また、配列表の配列番号１〜３のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号４にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明で記載する未分化細胞とは、特定の刺激によって増殖可能な細胞であり、かつ特定の刺激によって特定の機能を有する細胞に分化可能な細胞と規定され、これらの中には皮膚組織系の未分化細胞、脳神経系の未分化細胞、筋肉系の未分化細胞、血液系の未分化細胞などが含まれ、各々幹細胞といわれる自己複製能力を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞を含む。また、分化抑制作用とは、これらの未分化細胞が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制する作用であり、具体的には未分化な状態を維持する作用である。また、脳神経系未分化細胞とは、特定の刺激に伴い、特定の機能を有する脳、神経の細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定できる。また、筋肉系未分化細胞とは特定の刺激に伴い、特定の機能を有する筋肉細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定される。また、本発明で記載する血液未分化細胞とは、血液コロニーアッセイで同定が可能な特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞および全ての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細胞群と規定される。
配列表において、配列番号１のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−２のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列であり、配列番号３に示した本発明のヒトセレイト−２の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から２１７番に相当している。配列番号２のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−２のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号３に示した本発明のヒトセレイト−２成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１０５８番に相当している。配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−２の成熟型全長アミノ酸配列である。配列番号４の配列は本発明のヒトセレイト−２の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。また、配列表の配列番号５の配列は本発明で使用したヒトセレイト−１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末と呼称する）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末と呼称する）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
ヒトノッチリガンドの遺伝子をクローニングするために次の方法が考え得る。ヒトノッチリガンドは生物の進化の過程で一部のアミノ酸配列が保存されていることから、保存されたアミノ酸配列に対応したＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして利用し、ヒト由来のＰＣＲテンプレートをＰＣＲ反応によって増幅することにより、ヒトノッチリガンド遺伝子の断片が得られる可能性がある。またヒト以外の生物のノッチリガンドホモログの既知ＤＮＡ配列情報からＲＴ−ＰＣＲプライマーを作製し、その生物のＰＣＲテンプレートから既知遺伝子断片を取得することは原理的に可能である。
ヒトノッチリガンド断片取得を目的としてＰＣＲを行うに当たって、ＤＳＬ配列に対するＰＣＲがまず考えられたが、この領域に保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列の組み合わせは膨大であり、ＰＣＲプライマー設計が無理であったため、ＥＧＦ様配列をＰＣＲの対象としなければならなかった。先述のように多数の分子にＥＧＦ様配列は保存されているため、断片取得及び同定は極めて困難であった。本発明者らは参考例１に示した配列を例とする５０組のＰＣＲプライマーを設計、作製し、ヒト由来の様々な組織のｐｏｌｙＡ+ＲＮＡから作製したｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして各々ＰＣＲを行い、各１０種類以上のＰＣＲ産物をサブクローニングし、合計５００種以上のシークエンスを行い、鋭意努力の結果、ヒトセレイト−１の目的とする配列を有するクローンを１種類同定できた。
すなわち参考例１のごとく、得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターにクローニングし、このＰＣＲ産物を含む組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質変換し、組換えプラスミドを含む宿主細胞を大量培養し、組換えプラスミドを精製・単離し、クローニングベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を調べ、各々について既知の他種セレイトホモログのアミノ酸配列と比較し、ヒトセレイト−１の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。その結果、配列表の配列番号５に記載のＤＮＡ配列の１２７２番から１７３７番と同一の配列、すなわちヒトセレイト−１のｃＤＮＡの一部を含む遺伝子断片を見いだした。次に、参考例２に示したごとく、こうして得られたヒトセレイト−１遺伝子断片を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーから各々の全長ｃＤＮＡを得た。本発明者らはこれらの内容について既に特許出願を行った（国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２）。
本発明においてはこのヒトセレイト−１分子以外に、他のリガンドが存在していると考え、そのリガンドの存在に関して、ヒトセレイト−１分子のアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号５の塩基配列の４０９番から４０６２番の遺伝子配列に対して、これとホモロジーの高い遺伝子断片の探索を遺伝子配列のデーターベース上を検索する手法にて行った。具体的には遺伝子配列データーベースとしてはＧｅｎｂａｎｋ（リリース９１、１９９５）のランダムなヒトｃＤＮＡ配列の遺伝子断片のデーターベースであるＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）を解析ソフトウエアとして遺伝子配列検索ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ／ＣＤ（ソフトウエア開発社製）を用いて行った。
すなわち、近年、ＤＮＡシーケンス技術が向上し、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーをランダムにシーケンスし、ヒト、線虫、シロイヌナズナなどの種の全ゲノムＤＮＡおよび全ｃＤＮＡ配列の解明が試みられている（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３７７，３Ｓ，１９９５）。ヒトのｃＤＮＡに関して、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によるＥＳＴプロジェクト、ワシントン大学−メルクによるＥＳＴプロジェクト、コロラド大学によるＳＴＳプロジェクトなどがこの事業に参入している。これらの機関から提出されたｃＤＮＡの部分塩基配列はＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬの遺伝子データベースに登録されており、開示されている。１９９５年１０月発行のＧｅｎｂａｎｋリリース９１によれば、ＥＳＴクローンの累積登録数は約３３万クローンで、平均長は３４６塩基対（ｂｐ）であることがわかる。
これらのデータベースのデータを、既知もしくは新たにクローニングした新規分子などの遺伝子配列、アミノ酸配列をもとにしてホモロジー検索を行い、その類似分子ファミリー分子の存在の可能性を知ることができ、部分遺伝子を配列情報を得ることができる。
その解析ソフトウエアとしては市販の解析ソフトでも構わないし、各々のデーターベースに付属している解析ソフトウエア、例えばＧｅｎｂａｎｋに付属しているＢＬＡＳＴを用いて解析する、すなわち米国ナショナル・センター・オブ・バイオテクノロジー・インフォメーション、日本国京都大学化学研究所などにＷＷＷ（ワールド・ワイド・ウェブ）、電子メールなどでアクセスして計算することができる。
このような、操作を通して、目的の遺伝子に対して類似性の高い遺伝子断片（２００から３５０ｂ程度の長さ）の遺伝子配列情報を入手することができる。このように入手した遺伝子断片配列情報には一般に遺伝子配列情報とともに、その遺伝子のクローン名、存在した臓器、組織の情報が記載されている。遺伝子配列情報に関しては、ＤＮＡシークエンサーの生データ情報に近いため、遺伝子配列が未決定でＮと記載されていたり、遺伝子配列情報が間違っているケースが多いため、これらの遺伝子配列情報は必ずしも確かではない。
これらの遺伝子情報から、遺伝子配列でＮのデータが出てこない領域を最も確からしい遺伝子配列情報の部分と考えて、これら遺伝子配列の最も確からしい遺伝子配列をさらに比較して、この領域で有意なホモロジーのある（２００ｂ程度の遺伝子ならば、遺伝子配列の類似性として４０％前後の値以上であることが望ましい）遺伝子断片の同定を行う。このように同定された遺伝子断片に関して、一部の遺伝子については、そのクローン名が明らかになれば米国ゲノムシステム社などから購入可能であるが、発現臓器が明示されているので、市販の発現臓器のｃＤＮＡからＰＣＲによって分離することが出来る。
ただし、このようにして見出された遺伝子情報は部分的な情報であり、全体の情報が得られない限り、その部分遺伝子がコードしているであろう全長のアミノ酸がもともとホモロジーサーチに用いた分子の類似分子とは限らない。この情報だけからその分子に関して確実なことを示すことはできない。下記に示すように本発明者らは実際にホモロジーを有するプローブを多数調製して、プラークハイブリダイゼーションにてクローニングを行ったが、多くの遺伝子断片は目的の分子をコードしてはいなかった。したがって、この手法は技術的に可能ではあるが、容易な手法ではないと結論づけられる。
具体的には、ヒトセレイト−１ｃＤＮＡと類似性を示す遺伝子断片をおよそ５０種以上にわたってＰＣＲにてプローブを作製した。最終的には下記に示すように、ライブラリースクリーニングにてクローニングを行い、遺伝子配列を決定した結果、実施例１に記載した３種のＧｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子配列クローン（登録番号Ｔ０８８５３、Ｒ５００２６、Ｒ４６７５１）を基に作製した３種のＤＮＡプローブ、すなわち配列表の配列番号８、９及び１０に記載した配列を有するＤＮＡプローブを用いて分離された遺伝子がヒトセレイト−２分子をコードしている遺伝子断片であった。
次に、このように分離されたｃＤＮＡ遺伝子断片をプローブとして用い、その発現臓器などのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、さらに長い遺伝子配列遺伝子、もしくは全長ｃＤＮＡ遺伝子をクローニングすることが出来る。その方法としては、前記の方法にて部分クローニングした遺伝子をアイソトープ標識、及び各種非アイソトープ標識し、ライブラリーをハイブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングすることによって得ることができる。アイソトープの標識法としては、たとえば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。
さらに、ライブラリーを用いない方法として５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法等で遺伝子を伸張する方法でも全長遺伝子をクローニングしたり、より長い遺伝子断片をクローニングすることが出来る。また今までに示したＰＣＲを用いた方法、データーベースを検索する方法によらない別の方法として、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、ＣＯＳ−７細胞などで発現させ、リセプターノッチ蛋白質を用いて、その結合分子を検索することにより、目的の遺伝子をスクリーニングする発現クローニングなどの手法でリガンドのｃＤＮＡを分離することもできる。発現クローニングには、ＴＡＮ−１など今まで見出されている４種類のヒトノッチのアミノ酸配列を含有するポリペプチドの結合を利用したセルソーターによる分画法、ラジオアイソトープを用いたフィルムエマルジョンによる検出法、等の方法が挙げられる。
ここではヒトセレイト−２遺伝子取得の方法として述べたが、ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１のクローニングで行ったＰＣＲ法を含め本発明に明示した各種の手法は、いずれもまだクローニングされていない新しいノッチリガンドファミリー分子の取得に応用できる。たとえば、ヒトセレイト−１とヒトセレイト−２のアミノ酸配列、遺伝子配列を比較して保存されている領域をいくらか見いだしてＰＣＲでクローニングしたり、ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−２を基にＥＳＴをサーチして同様にクローニングしたりする事ができる。このようにクローニングした新しいノッチリガンドファミリー分子は、本発明で示したヒトセレイト−２同様に全長クローニング、発現ベクター作製、形質転換細胞作製、タンパク生産、抗体作製、生理活性探索を行うことができ、いずれも細胞の分化抑制作用を期待できる。
本発明者らは実施例２に示したごとく、これらの３種の遺伝子断片をラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクローンのＤＮＡ配列を決定し、この結果、全体の遺伝子配列にわたってヒトセレイト−１と類似性が高いことが判明した。しかしながらこれらのクローンでは、全長のアミノ酸をコードしている全長ｃＤＮＡ遺伝子はクローニングできていなかったため、さらにこのクローニングされた遺伝子配列を基にＤＮＡプローブを作製し、再度スクリーニングを行い、これでも全長遺伝子が同定できなかったため、最終的に５’−ＲＡＣＥ法にてアミノ酸の翻訳開始メチオニンコドンを含む遺伝子をクローニングし、遺伝子配列を決定し、全長のヒトセレイト−２の遺伝子クローニングに成功した。このようにクローニングされたｃＤＮＡを実施例２に示したようにつなぎ合わせて、該ヒトセレイト−２の全長をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いることができる。このようにして、得られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法等を用いて導入する。
上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア  コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２、ＪＭ１０９などが挙げられる。上記バチルス属菌の例としてはバチルス、サチリスＭＩ１１４等が挙げられる。また、ファージベクターは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１：２４４２−、１９７８）を用いて導入することができる。
このクローニングされた全長の遺伝子配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、リリース９３、１９９６）で比較したところ、部分的に先に挙げた３種のＥＳＴクローンとこれら以外にほぼ一致する部分配列としていくらかのＥＳＴクローンデータが存在したが、全体を通した配列に関しては新規な配列である。
さらに、該ヒトセレイト−２のアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列についても同様に、既知のアミノ酸配列のデーターベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、リリース３２、１９９５、及びＧｅｎｂａｎｋＣＤＳ、リリース９３、１９９６）で比較したところ、一致するアミノ酸配列はなく新規なアミノ酸配列であった。前述のヒトセレイト−１及び他生物のセレイトホモログとのアミノ酸配列の比較では、ヒトセレイト−１、ショウジョウバエセレイト、ラットジャグドとの相同性はそれぞれ５３．１％、３４．３％、５２．３％であり、これらの物質とは異なる新規なアミノ酸配列を有する新規物質であり、本発明者らにより初めて明らかにされた物質である。
また、このヒトセレイト−２のアミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５、１９８２）にしたがって、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、配列表の配列番号４に記載したアミノ酸配列において、遺伝子に全長の前駆体アミノ酸配列は該アミノ酸配列の−２６番から１２１２番からなる１２３８アミノ酸から構成されるポリペプチドであり、シグナルペプチド領域は、−２６番のメチオニンから−１番のプロリンにあたる２６アミノ酸から構成され、細胞外部分は１番のメチオニンから１０５５番のグリシンにあたる１０５５アミノ酸から構成され、細胞膜通過領域は１０５６番のロイシンから１０７９番のトリプトファンにあたる２４アミノ酸から構成され、細胞内部分は１０８０番のスレオニンから１２１２番のグルタミン酸から構成されると各々推定される。ただし、これらの各部分はあくまでもアミノ酸配列から予想された各ドメイン構造であり、実際に細胞上並びに溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が５から１０アミノ酸前後することも考えられる。
特にアミノ末端（Ｎ末端）に関しては、実施例６に記載したように精製された本発明リガンドポリペプチドＥＸＳ２Ｆｃ及びＥＸＳ２ＦＬＡＧのＮ末端のアミノ酸配列を同定したところ配列表の配列番号１〜３の１番目のアミノ酸であるメチオニンである。したがって、少なくともシグナルペプチドは配列表の配列番号４の−２６番のメチオニンから−１番のプロリンである。
特に細胞外領域に関して、ノッチのリガンドファミリー分子は進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトセレイト−２とヒトセレイト−１との比較により、ヒトセレイト−２のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１７２番のシステインから２１４番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。
ＥＧＦ様配列は１６回繰り返して存在し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２１７番システインから２４７番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２５０番システインから２７８番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２８５番システインから３１８番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３２５番システインから３５６番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３６３番システインから３９４番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は４０１番システインから４３２番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４３９番システインから４６９番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４７６番システインから５０７番システインまで、第９ＥＧＦ様配列は５１４番システインから５４５番システインまで、第１０ＥＧＦ様配列は５６３番システインから６０７番システインまで、第１１ＥＧＦ様配列は６１４番システインから６４５番システインまで、第１２ＥＧＦ様配列は６５２番システインから６８３番システインまで、第１３ＥＧＦ様配列は６９０番システインから７２１番システインまで、第１４ＥＧＦ様配列は７２９番システインから７６０番システインまで、第１５ＥＧＦ様配列は７６７番システインから７９８番システインまで、第１６ＥＧＦ様配列は８０５番システインから８３６番システインに該当した。
またシステイン残基に関して、第９ＥＧＦ様配列と第１０ＥＧＦ様配列の間に２つのシステイン残基があり、ＤＳＬ配列のＮ末端方向に６つのシステイン残基があり、第１６ＥＧＦ様配列のＣ末端方向に１６個のシステイン残基が存在し、ＥＧＦ様配列を含みいずれのシステイン残基もヒトセレイト−１とほぼ同様な位置に保存されていた。
アミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１２７番、５４４番、５９３番、７２６番及び１０３２番のアスパラギン残基が挙がられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号１、２または３の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
ショウジョウバエノッチおよびそのリガンドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチのリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている（特表平７−５０３１２１号公報）。また、同様に線虫を用いたＦｉｔｚｇｅｒａｌｄとＧｒｅｅｎｗａｌｄ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２１、４２７５−４２８２、１９９５）の研究からノッチリガンド様分子ＡＰＸ−１はノッチ様リセプターの活性化にとって全長のアミノ末端からＤＳＬドメインまでで十分であることが明らかにされている。このことから、ヒトセレイト−２のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号１に示した新規アミノ酸配列であることがわかる。
また、配列表の配列番号の４の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ノーザンブロットが可能である。従って、本遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の配列番号４の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが出来る。同様な方法でマウス等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができる。
さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本ヒトセレイト−２の更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。
実施例３に記載したようにヒト正常組織における発現は、各組織にわたっており、発現されているｍＲＮＡの長さは約５ｋｂの一種類であった。この様にして本分子のｍＲＮＡの発現を検出することは、正常臓器でこれらの発現が認められない部位における悪性腫瘍の検出などの診断に応用可能である。また、この発現臓器のパターンを参考にすれば本発明では具体的に指摘していないヒトセレイト−２の用途を見出すことができる。
尚、本発明のヒトセレイト−２の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＳＲ−２を大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＳＲ−２として日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２７である。
上記の方法にて分離したヒトセレイト−２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトセレイト−２の発現、精製には多数の方法が成書によって知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓ，１９９０および横田ら、バイオマニュアルシリーズ４，遺伝子導入と発現・解析法，羊土社、１９９４）。すなわち、分離した該ヒトセレイト−２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることができる。
本発明分子を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
本発明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。
ポリペプチドを発現させるとき配列表の配列番号１、２または３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコードするｃＤＮＡを付加したり、該ヒトセレイト−２の多量体構造を形成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもできる。
本発明者らは実施例４に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から１０５５番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から１０５５番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すなわちＡｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓのアミノ酸配列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号２２）を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の１番から１０５５番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号ＷＯ９４／０２０３５に記載されている）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、東京医科歯科大学丸山より入手可能）に各々別々につなぎ、ヒトセレイト−２の細胞外部分発現ベクターを作製した。
また、全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、４）配列表の配列番号２の１番から１２１２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および５）配列表の配列番号２の１番から１２１２番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質コードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトセレイト−２の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトセレイト−２をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
実施例５に示したごとく、上記の５種類の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導入し、ヒトセレイト−２をＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒトセレイト−２タンパクを製造することができる。
上記の培養物からヒトセレイト−２タンパクを分離精製するには、例えば下記の方法により行うことができる。
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や濾過によりヒトセレイト−２タンパクの粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合には、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒトセレイト−２タンパクは公知のタンパク質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合には、それら既知抗原エピトープに対する抗体を用いたイムノアッセイで検出して精製を進めることができる。また、このような融合タンパク質として発現させない場合には、実施例７に記載したヒトセレイト−２に対する抗体を用いて検出することができる。
精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。この際に用いる抗体としては実施例７に記載した各種ヒトセレイト−２に対する抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合には、実施例６に示したように、ヒトセレイト−２以外の部分に対する抗体、例えばＦＬＡＧであればＦＬＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いることができる。
このようにして精製されたヒトセレイト−２タンパク、またはヒトセレイト−２の生理機能を、各種細胞株、マウス、ラットなどの生物個体を用いた各種生理活性アッセイ法、分子生物学的手法に基づく細胞内シグナル伝達の各種アッセイ法、ノッチリセプターとの結合などの色々なアッセイ法にて知ることができる。
その作用としては細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、また組織再生を促す作用等が期待できる。
すなわち、実施例８に示したようにＣＤ３４陽性細胞画分を濃縮した臍帯血由来血液未分化細胞において、各種サイトカイン存在下でコロニー形成する血液未分化細胞に対してコロニー形成作用の抑制活性を有することを見いだした。
さらに、実施例９に示したように、サイトカイン存在下での液体培養へのヒトセレイト−２のＩｇＧ１キメラ蛋白質の添加により、ヒト血液未分化細胞の中で最も未分化な血液幹細胞と位置付けられているＬＴＣ−ＩＣ（Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ）の数を有意に低下させる活性を有していることを見いだした。
これらの結果から、ヒトセレイト−２は血液未分化細胞の分化を抑制し、それらの作用は血液幹細胞からコロニー形成細胞にわたって作用することが明らかである。医薬品として用いた場合には、抗癌剤などの副作用で見られる骨髄抑制作用を保護し、軽減する作用がある。
またさらに、実施例１０に示したように本発明分子は血液細胞以外で未だ生理活性の知られていない血管細胞に対する作用を調べたところ、ヒト血管内皮細胞の増殖を抑制する作用を見いだした。したがって、本発明には配列表の配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する血管細胞の増殖抑制剤、並びに各種血管新生を抑制することにより効果が期待される疾患（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５、４４２−４４７、１９８７などを参照）を対象とした治療剤も本発明に含まれ、これらの治療薬として使用できる。
医薬品として用いるならば、上記に示した形態を有する本発明のポリペプチドを適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと共に凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供することができる。本発明者らは本発明の化合物１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン５ｍｇ／ｍｌとなるようにバイアルに小分けし、長期にわたって該化合物の活性は保持された。さらに、細胞を体外にて培養、活性化させる場合には医薬品同様に、凍結乾燥品、もしくは溶液剤を作製して、培地に加える、もしくは培養に使用する容器に固定化することができる。また、該化合物の毒性については、マウスに対して１０ｍｇ／Ｋｇを腹腔内投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。
また、本発明のインビトロの生理活性は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデルとして投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、異常を調べることにより可能となる。例えば、造血細胞に関する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌剤を投与して、骨髄抑制モデルマウスを作製し、このマウスに本発明の化合物を投与した群としなかった群の骨髄細胞、末梢血細胞の数、生理的な機能を調べることで明らかになる。また更に、体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培養、増殖を調べる場合には、マウス骨髄細胞を培養器などを利用して、培養を行い、その際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射線照射マウスに細胞移植を行い、その結果の回復の度合いを、生存率、血球数の変動などを指標にすることで調べることが出来る。勿論、これらの結果が人にも外挿できるため、本化合物の薬効としての評価として有効なデータを得ることが出来る。
本発明の化合物を医薬品として利用する場合、その適応として、細胞の分化異常に伴う疾患、例えば白血病、悪性腫瘍の治療があげられ、体外でヒト由来細胞を培養して、その本来の機能を保ったまま増殖させる、もしくは新たな機能を持たせる等を行う細胞治療、組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組織が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法などの応用が可能である。その際の投与量としてはその形態などにもよるが、具体的には１０μｇ／Ｋｇから１０ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。
また、さらに強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。実施例に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させた該ヒトセレイトの細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。
さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他の該ヒトセレイト−２の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型該ヒトセレイト−２を得ることもできる。また、さらに配列表の配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを遺伝子工学的に２つ以上直列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている２量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により作製される２量体もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
また、その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リシン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、アミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、２量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される２量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有する形の配列表の配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
体外において細胞を増殖、活性化し、体内に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のような形態を有したヒトセレイト−２を直接培地中に加えることも可能だが、固定化する事も同様に可能である。固定化の方法としてはヒトセレイト−２のアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器にリガンドを共有結合させることができる。したがって、固体表面に存在する形態を有する配列表の配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関しても本発明に含まれる。
また、ヒトセレイト−２分子はそのリセプターであるノッチリセプター分子と特異的な結合をするため、例えば上記のヒトセレイト−２の細胞外部分とヒトＩｇＧＦｃの融合タンパクを用いれば、ノッチリセプターの発現を検出できる。ノッチは、ある種の白血病に関連していることが知られており（Ｅｌｌｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６，６４９−６６１，１９９１）、したがって、配列表の配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは体外もしくは体内の診断薬として使用が可能である。
該ヒトセレイト−２を特異的に認識する抗体は実施例７に示したように作製することができる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することができる。このように作製された抗体はヒトセレイト−２の精製に利用できる。すなわち、実施例７に示したこれらのヒトセレイト−２を特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のヒトセレイト−２の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性腫瘍など疾患の診断薬として使用でき得る。
発明の実施の形態
以下に本発明を実施する形態について参考例及び実施例として示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
参考例１
ヒトセレイト−１遺伝子プローブの作製
ショウジョウバエセレイトおよびラットジャグドに保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわち配列表の配列番号６に記載のセンスプライマーおよび配列番号７に記載のアンチセンスプライマーを用いた。但しこれらの配列で使用した記号ＳはＣおよびＧ、記号ＹはＴおよびＣ、記号ＷはＴおよびＡ、記号ＫはＧおよびＴ、記号ＲはＡおよびＧ、記号ＮはＣ、Ｇ、ＴおよびＡ、の各々等量混合物を示す。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としてはアプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。次に核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。以下、オリゴヌクレオチドの合成は同様に行った。
ＰＣＲによる増幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌ、前述のセレイトホモログに特異的なセンスプライマーＤＬＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い、最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約５００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
このようにして得られたＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて作製した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて約５００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとしてｐＣＲＩＩ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩＩと呼称する）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲＩＩを大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約５００ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列をアプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ｓ）にて決定した。このようにして遺伝子クローニングされた遺伝子断片を既知のノッチリガンド分子であるショウジョウバエセレイト、ラットジャグドのアミノ酸配列と比較し、有意な類似性を見出すことにより、ヒトセレイト−１をコードしているｃＤＮＡ断片であることを確認した。
参考例２
ヒトセレイト−１遺伝子の全長クローニング
ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１にｃＤＮＡが挿入されたもの、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。出現したプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで、中和処理（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次に、ＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し風乾した。その後、０．４Ｍ  ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトセレイト−１プローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識された先のＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、ヒトセレイトプライマーによる精製ＰＣＲ産物（約５００ｂｐ）が組み込まれたｐＣＲＩＩより、ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０：べーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうした後、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
単離されたファージクローンは２２クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｓ１６およびＳ２０の２クローンは共に配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から１８７３番の配列を含むクローンであり、Ｓ５およびＳ１４の２クローンは配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９９０番から４００５番を含むクローンであった。これらのクローンはキロシークエンス用デリションキット（宝酒造社製）を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明のポリペプチドをコードする全長のｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
この結果、Ｃ末端のアミノ酸配列をコードしている領域が１００程度クローニングできていないことが判明したため、全長遺伝子のクローニングをＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製３’ＲＡＣＥシステムキットを用いて、添付のマニュアルに従って、ヒト胎盤由来ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）から３’方向の遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行い、遺伝子配列を決定した。
このように遺伝子クローニングした３つの遺伝子断片を配列表の配列番号５のＤＮＡ配列の１２９３番にある制限酵素Ｂｇｌ  ２サイトと３９４３番にあるＡｃｃ１サイトを利用し、配列表の配列番号５のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドをｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩとＸｂａ１の間につなぎ込み、ｐＵＣＳＲ−１を作製した。この遺伝子の配列を配列表の配列番号５にアミノ酸配列とともに示す。
実施例１
ＰＣＲによるプローブの作製
スクリーニング用いる遺伝子プローブすなわち、配列表の配列番号８、９及び１０に記載の遺伝子は次のようにして取得した。これらの配列は各々Ｇｅｎｂａｎｋの登録番号Ｔ０８８５３、Ｒ５００２６及びＲ４５７５１に記載の遺伝子配列の一部に当たる。以下、配列番号８の遺伝子配列を有するプローブを￥１、配列番号９の遺伝子配列を有するプローブを￥２、配列番号１０の遺伝子配列を有するプローブを￥４とする。
すなわち、配列表の配列番号１１及び１２の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーを用いたＰＣＲにて配列番号８の遺伝子を、配列表の配列番号１３及び１４の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーを用いたＰＣＲにて配列番号９の遺伝子を、配列表の配列番号１５及び１６の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーを用いたＰＣＲにて配列番号１０の遺伝子を各々分離した。
ＰＣＲによる増幅は、以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌ、前述の組合せのプライマー２０ｐｍｏｌ／μｌを１μｌづっ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９４℃で１分間、５５℃で５分間、７２℃を３分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を４０サイクル行い、最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、各々のＰＣＲ産物が目的のサイズの遺伝子が増幅されていることを確認した。
次に、これらのＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて作製した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて各々のバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとしてｐＣＲＩＩ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩＩと呼称する）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲＩＩを大腸菌〇ｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、各々の目的のザイズのＤＮＡが切り出されてくることで各々該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列をアプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ｓ）にて決定し、前述のＧｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子配列と比較して、目的の遺伝子、すなわち配列表の配列番号８、９及び１０の遺伝子配列を有する遺伝子が分離されていることを確認した。
実施例２
ヒトセレイト−２遺伝子の全長クローニング
ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１０にｃＤＮＡが挿入されたもの、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。出現したプラークを参考例２に記載の方法と同様にアルカリ固定した。これらのフィルターを用いて参考例２に記載した方法で放射性同位元素32Ｐにて標識された実施例１にて分離された３種のプローブを用いて、各々別々にスクリーニングを行い、複数のクローンを分離した。
単離されたファージクローンは￥１をプローブとして用いた場合から２クローン、￥２をプローブとして用いた場合から６クローン、￥４をプローブとして用いた場合から４クローンであった。但し、￥４から分離されたクローンは全て￥２から分離されたクローンに含まれていた。これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ウィザードラムダプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）もしくはｐＵＣ１８（ファルマシア社製）に組み込んだ。
これらのクローンの全ＤＮＡ配列を参考例２と同様にＤＮＡシークエンサーにより決定し、同一配列部分を比較した結果、＃５クローンは配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の４８４番から２０２５番の配列を含むクローンであり、＃２１クローンは配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１８８２番から３５３７番の配列を含むクローンであり、＃８６クローンは配列表の配列番号４の２４５５番から３９５５番の配列を含むクローンであった。残りのクローンは、これらのクローンと配列が一致する部分のみからなる短いインサートしか有さないクローンであった。この結果、ヒトセレイト−１等のアミノ酸配列との比較からＮ末端のアミノ酸配列をコードしている領域がクローニングできていない事が判明した。そこで更に、配列表の配列番号１７のＤＮＡ配列を有するプローブを作成し、５’領域のｃＤＮＡのクローニングをするために２回目のスクリーニングを行った。プローブの作成は実施例１に記載の方法と同様に配列表の配列番号１８及び１９のＤＮＡ配列を有するＰＣＲプライマーで上記の＃５クローンを鋳型にしてＰＣＲを行い作成した。ライブラリーは１回目のスクリーニングと同様に調製したものを使用し、条件などは全く同じ方法で行った。
この様にして、２回目のスクリーニングにおいて単離されたクローンは６クローンであった。これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ウィザードラムダプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１８に組み込んだ。これらのクローンの全ＤＮＡ配列を参考例２と同様にＤＮＡシークエンサーにより決定し、同一配列部分を比較した結果、最も５’方向を含むと考えられたクローンとしてＳ４３−１クローンが分離された。ただし、このクローンは配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の３８番から１５３８番の配列を含むクローンであった。残りのクローンは、１回目で分離されたクローン及び既に他のクローンで決定された配列と一致する部分のみからなる短いインサートしか有さないクローンであった。
この様に２回目のスクリーニングでも翻訳開始のメチオニンをコードするＡＴＧの配列が認められなかったので、さらに５’ＲＡＣＥ法にて５’方向のｃＤＮＡ配列のクローニングを行った。５’ＲＡＣＥはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製５’ＲＡＣＥシステムキットを用いて、添付のマニュアルにしたがって、ヒト心臓由来ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）から５’方向の遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行い、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から３７番の遺伝子配列を決定した。
以上の結果、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列、すなわちヒトセレイト−２の全長をコードするｃＤＮＡ配列を決定した。
全長遺伝子をコードするｃＤＮＡを作成するために、他のクローンとライゲーションできる５’端のｃＤＮＡを得るために次のようなＰＣＲを行い、クローニングした。すなわち、配列表の配列番号２０のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２１のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、Ｓ４３−１クローンを鋳型にして実施例１に記載の方法でＰＣＲを行い、同様にｐＣＲ−ＩＩにサブクローニングして、遺伝子配列を決定して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から５０３番のＤＮＡ配列を有するクローンを作製した。このクローンをＳ２−５とする。
以上のクローン、すなわちＳ２−５、Ｓ４３−１、＃５、＃２１、＃８６のクローンの遺伝子をＳ２−５とＳ４３−１は配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の２１７番目の制限酵素ＳｐｌＩサイトで、Ｓ４３−１と＃５は同様に１４５３番目のＫｐｎＩサイトで、＃５と＃２１は同様に２０１６番目のＳａｃＩサイト、＃２１と＃８６は同様に２９９１番目のＢａｍＨＩサイトを各々利用し、最終的に配列表の配列番号４のＤＮＡ配列を有するＤＮＡをｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIIIサイトの間につなぎ込み、ｐＵＣＳＲ−２を作製した。
実施例３
ヒトセレイト−２の発現臓器
ヒトセレイト−２のｍＲＮＡの発現を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターである、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＢｌｏｔII、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＢｌｏｔIII、Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＢｌｏｔII（すべてＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、実施例２に記載の配列表の配列番号１７の配列を有するＤＮＡをプローブとして前掲のＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にて前述の方法で32Ｐ標識し、上記のフィルターの添付の取扱説明書にしたがってハイブリダイゼーションを行い発現を調べた。
その結果、発現されているｍＲＮＡの長さは約５ｋｂの一種類であった。発現部位としてヒト成人組織のうち強い発現を認めたのは、心臓、骨格筋、甲状腺、脊髄、気管であり、明かな発現を認めたのは膵臓、前立腺、精巣、小腸、副腎であり、極めて弱くしか発現が認められなかったのは脳、胎盤、腎臓、胸腺、卵巣、胃、リンパ節であり、全く発現が認められなかったのは肺、肝臓、脾臓、結腸、末梢血リンパ球、骨髄であった。ヒト胎児組織においては胎児肺に発現が高く、胎児脳、胎児腎臓に明かな発現が認められ、胎児肝臓には発現は認められなかった。
実施例４
ヒトセレイト−２発現ベクターの作製
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトセレイト−２およびそのキメラタンパク質の発現ベクターを作製した。
１）分泌型細胞外ヒトセレイト−２の発現ベクター
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から１０５５番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、東京医科歯科大学丸山より入手可能）につなぎ、発現ベクターを作製した。
すなわち、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列を有するベクターｐＵＣＳＲ−２を鋳型として配列表の配列番号２３の配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２４の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記の方法に従いＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲＩＩにつなぎ、ＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の２９８６番から３２５４番まで遺伝子配列でその３’端に終止コドンと制限酵素ＳａｌＩサイトが付加されているＤＮＡを作製した。
ｐＵＣＳＲ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して得られるおよそ３ｋｂｐの遺伝子断片、上記のＰＣＲ産物をインサートとして含むｐＣＲＩＩベクターを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られるおよそ２５０ｂｐの遺伝子断片、ｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化して得られるおよそ４．３ｋｂの遺伝子断片、これら３つの遺伝子断片を同時にライゲーションして、配列表の配列番号４にＤＮＡ配列の１番から３２５４番の遺伝子断片を含む発現ベクター、すなわち分泌型細胞外ヒトセレイト−２タンパク質（以下このタンパク質をＥＸＳ２と呼称する）発現ベクターｐＭＥＸＳ２を作製した。
２）分泌型細胞外ヒトセレイト−２のＦＬＡＧキメラタンパク質の発現ベクター
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から１０５５番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列（配列表の配列番号２２）をコードするｃＤＮＡを付加したキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
すなわち、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列を有するベクターｐＵＣＳＲ−２を鋳型として配列表の配列番号２３の配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２５の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記の方法に従いＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲＩＩにつなぎ、ＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の２９８６番から３２５４番まで遺伝子配列で、その３’端にＦＬＡＧ配列をコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号２２のＤＮＡ配列）と終止コドンと制限酵素ＳａｌＩサイトが付加されているＤＮＡを作製した。
ｐＵＣＳＲ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して得られるおよそ３ｋｂｐの遺伝子断片、上記のＰＣＲ産物をインサートとして含むｐＣＲＩＩベクターを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌ１で消化して得られるおよそ３００ｂｐの遺伝子断片、ｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化して得られるおよそ４．３ｋｂの遺伝子断片、これら３つの遺伝子断片を同時にライゲーションして（制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩは認識配列は異なるが消化された末端遺伝子配列が相補的なためつなぐ事ができる）、配列表の配列番号４にＤＮＡ配列の１番から３２５４番の遺伝子断片とＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子断片を含む発現ベクター、すなわち分泌型細胞外ヒトセレイト−２のＦＬＡＧキメラ蛋白質（以下このタンパク質をＥＸＳ２ＦＬＡＧと呼称する）発現ベクターｐＭＥＸＳ２ＦＬＡＧを作製した。
３）分泌型細胞外ヒトセレイト−２のＩｇＧ１Ｆｃキメラタンパク質発現ベクター
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から１０５５番のポリペプチドのＣ末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タンパクの作製は、Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。
すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号２８の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素ＸｂａＩサイトのついた配列表の配列番号２９の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、およそ１．４Ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）で処理をして、同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ４ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。その後、このプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列が確かにひとＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ９１−３２４２，１９９１参照のこと）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。
配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列を有するベクターｐＵＣＳＲ−２を鋳型として配列表の配列番号２３の配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２６の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記の方法に従いＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲＩＩにつなぎ、ＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の２９８６番から３２５４番まで遺伝子配列で、その３’端に制限酵素Ｂｇｌ２サイトが付加されているＤＮＡを作製した。
このＰＣＲ産物をインサートとして含むｐＣＲＩＩベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌ２消化し得られるおよそ２５０ｂｐの遺伝子断片を、上記のヒトＩｇＧ１ＦＣをコードする遺伝子をインサートとして含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したベクター（およそ４．３ｋｂｐ）にライゲーションしてつなぐ。この際には制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌ２は消化された末端遺伝子配列が相補的なためつなぐ事ができる。また、その後この部分はこれらの制限酵素によって消化されない。
次いで、このベクターを制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔ１で消化して得られるおよそ１．５ｋｂｐの遺伝子断片、ｐＵＣＳＲ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して得られるおよそ３ｋｂｐの遺伝子断片、ｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔ１で消化して得られるおよそ４．３ｋｂの遺伝子断片、これら３つの遺伝子断片を同時にライゲーションして（制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩは認識配列は異なるが消化された末端遺伝子配列が相補的なためつなぐ事ができる）、配列表の配列番号４にＤＮＡ配列の１番から３２５４番の遺伝子断片とヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする遺伝子断片を含む発現ベクター、すなわち分泌型細胞外ヒトセレイト−２のＩｇキメラタンパク質（以下このタンパク質をＥＸＳ２Ｆｃと呼称する）発現ベクターｐＭＥＸＳ２Ｆｃを作製した。
４）全長ヒトセレイト−２タンパク質の発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から１２１２番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
すなわち、ｐＵＣＳＲ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで消化して切り出されてくるおよそ４ｋｂｐの遺伝子断片を同様の制限酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲーションし、次いでこのベクターをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し切り出されてくるおよそ４ｋｂｐの遺伝子断片を、発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔ１で消化し得られるおよそ４．３ｋｂの遺伝子断片にライゲーションして、配列表の配列番号４にＤＮＡ配列の１番から３９５５番の遺伝子断片を含む発現ベクター、すなわち全長ヒトセレイト−２タンパク質（以下このタンパク質をＦＳ２と呼称する）発現ベクターｐＭＦＳ２を作製した。
５）全長ヒトセレイト−２ＦＬＡＧキメラタンパク質の発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から１２１２番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列（配列表の配列番号２２）をコードするｃＤＮＡを付加したキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
すなわち、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列を有するベクターｐＵＣＳＲ−２を鋳型として配列表の配列番号２３の配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２７の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記の方法に従いＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲＩＩにつなぎ、ＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定して、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の２９８６番から３７２５番まで遺伝子配列で、その３’端にＦＬＡＧ配列をコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号２２のＤＮＡ配列）と終止コドンと制限酵素ＳａｌＩサイトが付加されているＤＮＡを作製した。
ｐＵＣＳＲ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して得られるおよそ３ｋｂｐの遺伝子断片、上記のＰＣＲ産物をインサートとして含むｐＣＲＩＩベクターを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られるおよそ７００ｂｐの遺伝子断片、ｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化して得られるおよそ４．３ｋｂの遺伝子断片、これら３つの遺伝子断片を同時にライゲーションして（制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩは認識配列は異なるが消化された末端遺伝子配列が相補的なためつなぐ事ができる）配列表の配列番号４にＤＮＡ配列の１番から３７２５番の遺伝子断片とＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子断片を含む発現ベクター、すなわち全長型ヒトセレイト−２のＦＬＡＧキメラタンパク質（以下このタンパク質をＦＳ２ＦＬＡＧと呼称する）発現ベクターｐＭＦＳ２ＦＬＡＧを作製した。
実施例５
ヒトセレイト−２発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
実施例４で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ＰＢＳ（−）に１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレーション専用セル（０．４ｍｍ）に取り、発現ベクターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
その翌日、培養上清を除去し、ディッシュに付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍｌを加えてさらに４日間培養し、発現ベクターｐＭＥＸＳ２、ｐＭＥＸＳ２ＦＬＡＧ及びｐＭＥＸＳ２Ｆｃを遺伝子導入した場合に関しては培養上清を回収し、セントリコン３０（アミコン社製）にてバッファーをＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行った。
また、ｐＭＦＳ２及びｐＭＦＳ２ＦＬＡＧを遺伝子導入した場合に関しては、同様に４日間の培養後、細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで洗浄し、セルスクレイパー（コースター社製）にて細胞を剥がし、再度ＰＢＳ（−）を１０ｍｌ加えて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し洗浄した。
この細胞沈殿物をセルリシスバッファー［５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％  グリセロール、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ  ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ］５００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放置し、その後１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を取り細胞抽出液を得た。
こうして得られたサンプルを用いてウェスタンブロッティング法にてＦＬＡＧキメラ蛋白とイムノグロブリンキメラ蛋白の発現を確認した。すなわち、上記の得られた細胞上清濃縮液もしくは細胞抽出液をＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったもの、もしくはこの処理を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（ＢｉｏＲａｄ社製）にＢｉｏＲａｄ社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
このように作製されたフィルターをブロックエース、ＴＢＳ−Ｔ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０］に４℃一晩振盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に添付の説明書に従い、目的のタンパク質がＦＬＡＧキメラの場合は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２（コダック社製）、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ヒトＩｇＧ１Ｆｃキメラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間は、ＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に１分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。
その結果、発現ベクターｐＭＥＸＳ２ＦＬＡＧを遺伝子導入したＣＯＳ上清からＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体によりおよそ１３５Ｋダルトンの分子量を有するバンドが検出され、目的のタンパクＥＸＳ２ＦＬＡＧを産生していることが確認され、発現ベクターｐＭＥＸＳ２ＦＬＡＧにより形質転換された細胞を得た。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際の還元処理の有無による分子量にほとんど変化は無かった。また、アミノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ２０Ｋダルトン程度大きく糖鎖が付加されていると考えられた。
また、発現ベクターｐＭＥＸＳ２Ｆｃを遺伝子導入したＣＯＳ上清から抗ヒトＩｇヒツジ抗体により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元条件下の場合にはおよそ１６５Ｋダルトンの分子量を有するバンドが検出され、非還元条件下ではおよそ３３０Ｋダルトンの分子量を有するバンドが目的のタンパクＥＸＳ２Ｆｃを産生していることが確認され、発現ベクターｐＭＥＸＳ２Ｆｃにより形質転換された細胞を得た。還元条件下のＥＸＳ２Ｆｃの分子量が非還元条件下のそれのおよそ半分であることから、このＥＸＳ２Ｆｃはジスルフィド結合を介した２量体を形成している。また、同様にアミノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ４０Ｋダルトン程度大きく糖鎖が付加されていると考えられた。
さらに、発現ベクターｐＭＦＳ２ＦＬＡＧを遺伝子導入したＣＯＳ細胞抽出液からＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体により、還元条件下でおよそ１５０Ｋダルトンの分子量を有するバンドが検出され、目的のタンパクＦＳ２ＦＬＡＧを産生していることが確認され、発現ベクターｐＭＦＳ２ＦＬＡＧにより形質転換された細胞を得た。また、同様にアミノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ２０Ｋダルトン程度大きく、細胞外部分に糖鎖が付加されていると考えられた。
また、キメラタンパク以外に関しては、ウエスタンブロットの際の１次抗体として、実施例７に記載の抗ヒトセレイト−２マウスモノクローナル抗体及び抗ヒトセレイト−２ウサギポリクローナル抗体を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）もしくはペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い同様に行った。
その結果、発現ベクターｐＭＥＸＳ２を遺伝子導入したＣＯＳ上清中に、およそ１３５Ｋダルトンの分子量を有するバンドが検出され、目的のタンパクＥＸＳ２を産生していることが確認され、発現ベクターｐＭＥＸＳ２により形質転換された細胞を得た。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際の還元処理の有無による分子量にほとんど変化は無かった。また、発現ベクターｐＭＦＳ２を遺伝子導入したＣＯＳ細胞抽出液から還元条件下でおよそ１５０Ｋダルトンの分子量を有するバンドが検出され、目的のタンパクＦＳ２を産生していることが確認され、発現ベクターｐＭＦＳ２により形質転換された細胞を得た。いずれの場合もアミノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ２０Ｋダルトン程度大きく、細胞外部分に糖鎖が付加されていると考えられた。
これらの実験では、コントロールとしてｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体、抗ヒトセレイト−２抗体に反応するバンドは検出されなかった。
実施例６
遺伝子導入細胞による分泌型細胞外ヒトセレイト−２キメラタンパク質の精製
実施例５の方法で発現ベクターｐＭＥＸＳ２ＦＬＡＧもしくはｐＭＥＸＳ２Ｆｃにより形質転換されたＣＯＳ−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラムによってキメラタンパク質、すなわちＥＸＳ２ＦＬＡＧもしくはＥＸＳ２Ｆｃを精製した。
ＥＸＳ２ＦＬＡＧに関しては、実施例５に記載した方法によって取得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（コダック社製）を充填したカラムに通して、キメラタンパク質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカラム（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チューブ（ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、各々の画分を中和した。
上記の方法で精製されたＥＸＳ２ＦＬＡＧの溶出画分の各１０μｌは実施例５に記載の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳動終了後、和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果として、ＥＸＳ２ＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバンドが検出され、この分子量は実施例５で得られた抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果と一致した。この結果からＥＸＳ２ＦＬＡＧの純品が精製された。
ＥＸＳ２Ｆｃに関しては、同様の操作で培養上清の２リットルをファルマシア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースカラムに吸着させ、溶出画分を分取した。
ＥＸＳ２ＦＬＡＧと同様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第４番から第１５番にバンドが検出され、それらの分子量は実施例５の結果と一致した。この結果からＥＸＳ２Ｆｃの純品が精製された。
実施例７
ヒトセレイト−２を認識する抗体作成
実施例６に記載の方法で精製されたＥＸＳ２ＦＬＡＧを免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の採血を行い、血清を採取して、ＢｉｏＲａｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトセレイト−２ウサギポリクローナル抗体を精製して作製した。
また、実施例６に記載した方法で精製されたＥＸＳ２ＦＬＡＧを免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上記のように精製されたＨＳＦＬＡＧをＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトセレイトの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトセレイトを特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をファルマシア社製Ｍａｂ  ＴｒａｐＧ  ＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトセレイト−２マウスモノクローナル抗体を精製し作製した。
このモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。カップリング効率は９９．６％であった。このゲルの２ｍｌを２ｃｍ×１ｃｍのサイズのカラムを作製した。
このカラムに対しＥＸＳ２を含む細胞培養上清を実施例５に記載の方法で作成し、その濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。
さらに実施例５に記載の方法に従って、精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結果、約１４０ｋダルトンのバンドが検出された。したがって、このモノクローナル抗体でウエスタンブロットが可能であり、またこのアフィニティーカラムでヒトセレイト−２が精製可能である。
実施例８
ヒトセレイト−２タンパクの血液未分化細胞のコロニー形成に対する作用
ヒトセレイト−２の血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、ＣＤ３４陽性細胞をＥＸＳ２Ｆｃおよび既存のサイトカイン存在下で無血清半固形培地で培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
ヒト臍帯血もしくはヒト正常骨髄血のＣＤ３４陽性細胞は臍帯血もしくは成人正常骨髄血をシリカ液（日本国免疫生物研究所製）により添付の説明書にしたがって処理し、その後フィコールパック（スエーデン国ファルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞画分（＜１．０７７ｇ／ｍｌ）を分画した単核球より分離した。
ＣＤ３４陽性細胞の分離は、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０  ＣＤ３４とＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤＳ  ＣＤ３４を用い、添付の取扱説明書に従って分離した。分離後、その純度はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体ＨＰＣＡ２（米国ベクトンデッキンソン社製）で染色し、同社のフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）にて検定し、８５％以上の純度を有していることを確認して用いた。
このようにして分離したＣＤ３４陽性細胞４００個が下記の培地１ｍｌ中に存在するように均一に懸濁し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社製）にまき、３７℃、５％炭酸ガス、５％酸素ガス、９０％窒素ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで２週間の培養後、形成された血球コロニーを倒立顕微鏡下で計測した。
培養に用いた培地は、α−ｍｅｄｉｕｍ（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に２％Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌ  ヒトインスリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、２００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール（日本国ナカライテスク社製）、１６０μｇ／ｍｌソイビーンレクチン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、９６μｇ／ｍｌコレステロール（米国Ｓｉｇｍａ社製）、０．９％メチルセルロース（日本国和光純薬社製）で行った。
上記の培地に下記条件のサイトカイン存在下に対し、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトセレイト−２細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＥＸＳ２Ｆｃ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。サイトカイン条件は、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ  Ｅｐｏ（日本国中外製薬社製）、１０ｎｇ／ｍｌヒトＧ−ＣＳＦ（日本国中外製薬社製）で行った。その結果を第１表に示す。ＣＤ３４+細胞４００個当たりのコロニー数をｎ＝３の平均値として示し、４種の異なったさい帯血由来細胞で行った。
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第１表の結果から、４種の異なった臍帯血由来血液未分化細胞に対していずれも作用し、本発明のヒトセレイト−２は血液幹細胞を含む血液未分化細胞の分化を抑制する活性を有していることが明らかとなった。
実施例９
ヒトセレイト−２の血液未分化細胞ＬＴＣ−ＩＣの液体培養に対する作用
ヒトセレイト−２の血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をＥＸＳ２Ｆｃおよび既存のサイトカイン存在下で無血清培地で２週間液体培養し、現在最も未分化な血液細胞群と考えられるＬＴＣ−ＩＣの増減を観察した。
実施例８に記載した方法で分離した臍帯血単核球ＣＤ３４陽性細胞を１０００００から２００００個を下記の培地で２週間培養し、培養前区、ＥＸＳ２Ｆｃ存在区、比較区の３つの実験区に存在するＬＴＣ−ＩＣ数の違いを調べた。
液体培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍに２％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン、１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを加え、更に１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６加えた培地を用い、これにＥＸＳ２Ｆｃを１μｇ／ｍｌ加え、比較区には前述のヒトＩｇＧ１を同濃度加えた。
ＬＴＣ−ＩＣに使用するヒト骨髄ストローマ細胞層の作製、限界希釈法によるＬＴＣ−ＩＣの頻度の定量はＳｕｔｈｅｒｌａｎｄらの方法（Ｂｌｏｏｄ、７４、１５６３−、１９８９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、３５８４−、１９９０）に従って行った。
すなわち、実施例８で得られた分離前のシリカ液処理しない骨髄単核球を１〜２×１０7細胞を１μＭハイドロコルチゾン（日本国日本アップジョン社製）添加したＬＴＣ培地（ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ、カナダ国Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）５ｍｌでＴ−２５フラスコ（米国ファルコン社製）にて、３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で培養し、付着細胞層であるストローマ細胞形成が底面積の８０％以上の状態になるまで培養し、その後トリプシンＥＤＴＡ液（日本国コスモバイオ社製）で処理して剥がした。９６穴プレート（米国ベクトンデッキンソン社製）に１ウェルあたり約２×１０4個蒔き、再度培養を同培地にて培養を続け、ストローマ細胞の再構成を行った後、２５０Ｋｉｌｏｖｏｌｔ  ＰｅａｋのＸ線を１５Ｇｙ照射して、ストローマ細胞の増殖とストローマ細胞中の血液細胞を除去した物をストローマ細胞層として実験に用いた。
上記の方法で培養した各実験区の細胞をＬＴＣ−ＩＣアッセイに共するにあたって、１ウェルあたり培養前のＣＤ３４陽性細胞細胞は２５〜４００個、培養後の各実験区の細胞は６２５〜２００００個の範囲で６段階希釈し、上記のストローマ細胞形成した９６穴プレートにて、１希釈段階について１６ウェルで共培養行った。培養の培地はストローマ形成で用いた培地、条件は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で５週間にわたって培養を行った。培養後の細胞は１ウェルづつ浮遊細胞、付着細胞とも回収し、α−ｍｅｄｉｕｍに０．９％メチルセルロース、３０％牛胎児血清（ＦＣＳ、日本国ＩＣＮバイオメディカルジャパン社製）、１％ＢＳＡ、１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ  Ｅｐｏ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＧ−ＣＳＦ添加した半固形培地に移し、２週間の培養後、実施例８同様のコロニー形成細胞の検出を行い、コロニー形成細胞が存在したウェル数を検出した。このデータをもとにＴａｓｗｅｌｌらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６、１６１４−、１９８１）に従ってＬＴＣ−ＩＣの頻度の算出を行った。結果を第２表に示す。
0003922726.tif 000003
第２表の結果からヒトセレイト−２はＬＴＣ−ＩＣに作用し、その数を減少させる作用を有していることが明らかとなった。
実施例１０
ヒトセレイト−２の血管内皮細胞増殖に及ぼす変化
血管内皮細胞は、日本国クラボウ社製の正常ヒト大動脈血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養の継代時に組織培養用９６ウエルプレート（米国フアルコン社製）に５００細胞数／ウエルズずつ蒔き、日本国クラボウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１００ｎｇ／ｍｌ、ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各々含有する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その際、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトセレイト−２細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＥＸＳ２Ｆｃ）を加え、比例区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。尚、対照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加蛋白質無しの条件で培養を行った。培養は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下で３日間行った後に、細胞を計数した。
血管内皮細胞の計数は、ＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ（３−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セットを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定した。
その結果、大動脈血管内皮細胞の場合は、対照区では吸光度の値がＯｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）として０．２１±０．０２であり、ヒトＩｇＧ１添加区ではほぼ同様な０．２０±０．０１であったが、ＥＸＳ２Ｆｃ添加区では０．１０±０．０２でありと著名に少なかった。また、肺動脈血管内皮細胞の場合は対照区では０．１５±０．０１であり、ヒトＩｇＧ１添加区ではほぼ同様な０．１６±０．０２であったが、ＥＸＳ２Ｆｃ添加区では０．０７±０．０２でありと著名に少なかった。これらの結果から、ＥＸＳ２Ｆｃは血管内皮細胞の増殖を抑制することがわかった。
発明の効果
本発明のヒトセレイト−２は、未分化細胞の分化を制御する作用を有し、新しい細胞の分化制御剤として使用できる。
配列表
配列番号  ：１
配列の長さ：２１４
配列の型  ：アミノ酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：アミノ酸
起源
生物名  ：ヒト
配列
0003922726.tif 000004
配列番号  ：２
配列の長さ：１０５５
配列の型  ：アミノ酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：アミノ酸
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：３
配列の長さ：１２１５
配列の型  ：アミノ酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：アミノ酸
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：４
配列の長さ：３９５５及び１２３８
配列の型  ：核酸及びアミノ酸
鎖の数    ：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：５
配列の長さ：４００５及び１１９９
配列の型  ：核酸及びアミノ酸
鎖の数    ：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状及び不明
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：６
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：７
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：８
配列の長さ：１８０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：９
配列の長さ：２５２
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：１０
配列の長さ：１８４
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
起源
生物名  ：ヒト
配列
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配列番号  ：１１
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１２
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１３
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１４
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１５
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１６
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１７
配列の長さ：３９７
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
起源
生物名  ：ヒト
配列
0003922726.tif 000047
配列番号  ：１８
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：１９
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003922726.tif 000049
配列番号  ：２０
配列の長さ：６０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２１
配列の長さ：２２
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２２
配列の長さ：２７及び８
配列の型  ：核酸及びアミノ酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ及びアミノ酸
配列
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配列番号  ：２３
配列の長さ：２０
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２４
配列の長さ：３３
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２５
配列の長さ：５８
配列の型  ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２６
配列の長さ：３１
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２７
配列の長さ：５８
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２８
配列の長さ：３６
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号  ：２９
配列の長さ：３３
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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