(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の工程を含んでなることを特徴とするホモシステインの測定方法。
（１）  ホモシステインを含有する被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させて該被検体中のホモシステインを２−ケト酪酸に転化させる工程
（２）  アンモニア又はアンモニウム塩、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の存在下に、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸に２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素を作用させて酵素反応を行い、任意の特定の時間内に該酵素反応により消費される前記ニコチンアミド補酵素或いは前記チオニコチンアミド補酵素の消費量、又は任意の特定の時間内に該酵素反応により生成する、それぞれ使用した補酵素の型と異なる型のニコチンアミド補酵素或いはチオニコチンアミド補酵素の生成量を測定する工程
（３）  前記工程（２）で測定されたこれら補酵素の量から選ばれる少なくとも１つの量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定する工程
【請求項２】
請求項１の工程（２）における酵素反応を、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質の存在下に行い、任意の特定の時間内に該酵素反応により生成する、それぞれ使用した補酵素の型と異なる型のニコチンアミド補酵素或いはチオニコチンアミド補酵素、或いは前記脱水素酵素の基質の脱水素体の生成量、又は任意の特定の時間内に該酵素反応により伴い消費される前記脱水素酵素の基質の消費量を測定し、測定されたこれら化合物の量から選ばれる少なくとも１つの量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定することを特徴とするホモシステインの測定方法。
【請求項３】
ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素、及びアンモニア又はアンモニウム塩を含んでなることを特徴とするホモシステイン定量試薬。
【請求項４】
さらに、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質を含んでなる請求項３記載のホモシステイン定量試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中のホモシステインを極めて高感度に定量する新規な方法に関するものである。特に、生体内の各臓器及び体液中のホモシステイン定量に対して有効であり、例えば臨床検査などの診断用試薬分野において広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来のホモシステインの定量方法としては、下記(i)〜(iv)に示すような方法が知られている。
【０００３】
(i)  被検体中のホモシステインをＳＨ基と反応する蛍光標識試薬を使用して標識した後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離して定量するプレラベルＨＰＬＣ法｛例えば、Methods in Enzymology、143巻、67頁（1987年）｝。
【０００４】
(ii)  被検体からホモシステインをＨＰＬＣにより分離した後にＳＨ基と反応する蛍光標識試薬と反応させて検出定量するポストラベルＨＰＬＣ法｛例えば Analytical  Biochemistry、227巻、14頁（1995年）｝。
【０００５】
(iii)  被検体中のホモシステインと特異的に作用する酵素等（例えばアデノシン及びS-アデノシルホモシステイン合成酵素）を作用させて、その酵素反応生成物（例えばS-アデノシルホモシステイン）を抗体法によって検出定量する酵素免疫法｛例えば、特表平8-50648号公報、及びClinical Chemistry、44巻、311頁（1998年）｝。
【０００６】
(iv)  被検体中のホモシステインに特異的に作用する酵素を作用させた後に、その生成物を酵素法で検出定量する酵素法。該方法の例としては、被検体中のホモシステインをホモシステイナーゼなる酵素と作用せしめ、生成した硫化水素を色素に導いた後に比色分析することによってホモシステインを定量する方法（国際特許WO-9905311号公報）、及び被検体中のホモシステインをホモシステインデスルフラーゼなる酵素と作用せしめ、生成した２−ケト酪酸を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略記することもある。）の存在下で乳酸脱水素酵素あるいはピルビン酸脱水素酵素と作用せしめ、生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略記することもある。）を定量することによってホモシステインを定量する方法（国際特許WO-9807872号公報）が挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、かかる従来の定量方法には測定精度あるいは操作性に問題があり、これら方法により多検体について簡便かつ精度良くホモシステインを定量する事はできないのが実状であった。
【０００８】
即ち、前記(i)のプレラベルＨＰＬＣ法は、高感度化は図られてはいるが、被検体中のチオール化合物を高感度蛍光ラベル試薬でラベルするプレラベル化反応の操作が煩雑であり、被検体の処理能力が低い等の難点を有している。
【０００９】
また、前記(ii)のポストラベルＨＰＬＣ法は、上記プレラベル化反応の煩雑さを解決する方法として開発されたものであるが、検体処理能力が低いという問題は依然解決されていない上に、ポストラベル化において高価な蛍光試薬をに多量に使用するという問題がある。
【００１０】
また、前記(iii)の酵素免疫法は、上記のようなＨＰＬＣ法と比較すれば多検体の処理能力の点では有利になってはいるが、酵素反応と酵素免疫法を組み合わせた煩雑さや高価な抗体を使用する欠点を有している。
【００１１】
さらに、前記(iv)の酵素法の内、比色分析することによってホモシステインを定量する方法は、色素法であるため感度が低い難点を有している。また、酵素反応により生成するＮＡＤを定量することによってホモシステインを定量する方法は、高感度である有利さはある一方、定量工程の途中でＮＡＤＨを分解させる煩雑な工程を経た後に酵素サイクリングを行わしめる方法であり、更に臨床検査の分野で広く用いられている吸光光度計を検出器とする自動分析機で定量することが困難であるという難点を有している。
【００１２】
この様に、多検体について簡便かつ精度良くホモシステインを定量する方法はこれまで知られておらず、この様な方法、特に上記のような一般的に使用されている自動分析機に適用可能なホモシステインの定量方法が望まれている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる従来の技術の課題を解決するために、高感度化が実現されている酵素サイクリングを利用した酵素法に着目し、その操作性を向上させるべく鋭意検討を行った。その結果、被検体中のホモシステインにホモシステインデスルフラーゼを作用させて得られる生成した２−ケト酪酸をＮＡＤＨの存在下、特定の条件で酵素サイクリング反応を行った場合には、ＮＡＤＨの分解操作という煩雑な操作を行うことなくホモシステインが定量出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、第一の本発明は、下記（１）〜（３）の工程を含んでなることを特徴とするホモシステインの測定方法である。
【００１５】
（１）  ホモシステインを含有する被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させて該被検体中のホモシステインを２−ケト酪酸に転化させる工程。
【００１６】
（２）  アンモニア又はアンモニウム塩、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の存在下に、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸に２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素を作用させて酵素反応を行い、任意の特定の時間内に該酵素反応により消費される前記ニコチンアミド補酵素或いは前記チオニコチンアミド補酵素の消費量、又は任意の特定の時間内に該酵素反応により生成する、それぞれ使用した補酵素の型と異なる型のニコチンアミド補酵素或いはチオニコチンアミド補酵素の生成量を測定する工程。
【００１７】
（３）  前記工程（２）で測定されたこれら補酵素の量から選ばれる少なくとも１つの量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定する工程。
【００１８】
上記本発明の測定方法では、例えば、アミノ酸脱水素酵素と還元型ニコチンアミド補酵素との組み合わせにより２−ケト酪酸とアンモニア又はアンモニウム塩からＬ−２−アミノ酪酸と酸化型ニコチンアミド補酵素生成する反応と、アミノ酸脱水素酵素と酸化型チオニコチンアミド補酵素との組み合わせにより前記反応で生成したＬ−２−アミノ酪酸と還元型チオニコチンアミド補酵素とアンモニア又はアンモニウム塩を生成する反応がサイクリックに進行し、反応サイクル数に応じて２−ケト酪酸が酸化型ニコチンアミド補酵素、又は還元型チオニコチンアミド補酵素の形で増幅される。したがって、これら化合物の量を測定し、これを指標とすることにより、２−ケト酪酸ひいてはホモシステインの量を高感度に測定することが可能となる。また、その際に煩雑な操作を要することもない。
【００１９】
また、第二の本発明は、前記第一の本発明の測定方法の工程（２）における酵素反応を、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質の存在下に行い、任意の特定の時間内に該酵素反応により生成する、それぞれ使用した補酵素の型と異なる型のニコチンアミド補酵素或いはチオニコチンアミド補酵素、或いは前記脱水素酵素の基質の脱水素体の生成量、又は任意の特定の時間内に該酵素反応により伴い消費される前記脱水素酵素の基質の消費量を測定し、測定されたこれら化合物の量から選ばれる少なくとも１つの量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定することを特徴とするホモシステインの測定方法である。
【００２０】
該測定方法によれば、酵素反応により生成する特定の補酵素の量を吸光度測定により行う場合に於いて、共存物の影響を受けることが少なく、より高感度な測定を行うことが可能となる。
【００２１】
前記第一の本発明の測定方法、及び第二の本発明の測定方法は、それぞれ、第三の本発明である「ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素、及びアンモニア又はアンモニウム塩を含んでなることを特徴とするホモシステイン定量試薬」、および第四の本発明である「さらに、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質を含んでなる前記第三の本発明のホモシステイン定量試薬」を用いて好適に行うことが出来る。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法では、先ず、工程（１）として被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させて該被検体中のホモシステインを２−ケト酪酸に転化させる。
【００２３】
本発明の測定方法で使用する被検体は、ホモシステインを含有する溶液又は懸濁液であれば特に限定されず、例えば、医学や臨床検査分野等におけるホモシステインの測定対象となる被検体である血清、血漿、細胞液、臓器抽出液、及びこれらを緩衝溶液等で希釈したり、濃縮あるいはイオン交換等のカラム処理をした溶液又は懸濁液等が制限なく使用できる。
【００２４】
また、該工程（１）で時使用するホモシステインデスルフラーゼ（ＥＣ 4.4.1.2）は、ホモシステインを基質として２−ケト酪酸を生成する反応を触媒する酵素であれば如何なるものでも良く、かかる特性を有する公知の酵素が特に制限なく使用される。このような特性を有する酵素を例示すれば、メソッズ  イン  エンザイモロジー｛Methods in Enzymology、第２巻、318頁（1955年）｝及びジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー｛Journal of Biological Chemistry、192巻、371頁（1951年）｝に記載のプロテウス・モルガニ由来のホモシステインデスルフラーゼ、ジャーナル  オブ  バイオケミストリー｛Journal of Biochemistry、79巻、1263頁（1976年）｝、バイオケミストリー｛Biochemistry、16巻、100頁（1977年）｝、及びメソズ  イン  エンザイモロジー｛Methods in Enzymology、143巻、459頁（1987年）｝に記載のシュードモナス属由来のホモシステイナーゼ、メディカル  サイエンス｛Medical Science、第13巻、493頁（1985年）｝及び国際特許WO 9807872号公報に記載の線虫トリコモナス属由来のホモシステインデスルフラーゼ等が挙げられる。なお、ホモシステインデスルフラーゼを選択する際には、測定対象となる被検体の種類や測定条件を考慮して好適なものを適宜選択して使用するのが好ましい。
【００２５】
被検体にホモシステインデスルフラーゼを作用させる方法は、被検体とホモシステインデスルフラーゼとを接触させる方法であれば特に限定されないが、操作の簡便性から、被検体にホモシステインデスルフラーゼを添加して攪拌するのが好適である。
【００２６】
この時の作用（反応）条件は、被検体の種類や測定条件に応じて適宜決定すればよい。例えば、被検体に作用させるホモシステインデスルフラーゼの量は、被検体中に含まれるホモシステインを全て２−ケト酪酸に転化し得る量であれば特に限定されず、被検体の種類や酵素の種類（活性）によって適宜決定すればよい。一般的には、被検体１ｍｌ当たりの酵素活性（μmoles／min.）で表して、０．１〜１０００μmoles／min.／mlの濃度範囲、好適には０．２〜５００μmoles／min.／mlの濃度範囲で使用される。
【００２７】
また、ホモシステインデスルフラーゼを作用させる際のｐＨは、酵素の由来によって適宜選ばれるが、一般的にはｐＨ３．５〜１０．５の範囲、特にｐＨ４．０〜１０．０の範囲が好適に選ばれる。また、ホモシステインデスルフラーゼを作用させる際の反応温度は、一般的には２０〜４５℃の温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲が選ばれる。
【００２８】
なお、工程（１）において、後で詳述する工程（２）を行う前に被検体に含まれるホモシステインの全てを２−ケト酪酸に転化させる必要は必ずしもなく、転化して得られた２−ケト酪酸が逐次前記工程（２）の酵素反応に供されるような態様、すなわち被検体中のホモシステインを２−ケト酪酸に変換せしめつつ、Ｌ−２−アミノ酪酸との可逆反応あるいは該可逆反応と補酵素の再生反応を同時進行させてもよい。測定時間短縮の観点からは、むしろ後者の態様が好適である。
【００２９】
本発明の測定方法は、特定の酵素及び補酵素を用いた酵素サイクリング法により、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸を別な化合物の形で増幅し、増幅された該化合物を定量する工程（２）を含む。
【００３０】
該工程（２）で採用できる酵素サイクリング法としては、アンモニア又はアンモニウム塩、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の存在下に、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸に“２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素（以下、本アミノ酸脱水素酵素ともいう。）”を作用させて酵素反応を行う酵素サイクリング法が挙げられる。
【００３１】
工程（２）において、上記酵素サイクリング法を採用した場合には、該酵素サイクリング反応の進行に伴い、本アミノ酸脱水素酵素と共存させる酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素が消費され、それと同時に、これら共存補酵素の組み合わせに応じて、それぞれ使用した各補酵素と異なる型（ここで、異なる型とは、酸化型に対する還元型のように、対応する反対の型を意味する。）のニコチンアミド補酵素およびチオニコチンアミド補酵素が生成する。
【００３２】
例えば、還元型のニコチンアミド補酵素及び酸化型のチオニコチンアミド補酵素を共存させた場合に、酵素反応の進行に伴いこれらが消費され、酸化型のニコチンアミド補酵素及び還元型のチオニコチンアミド補酵素が生成する。また、酸化型のニコチンアミド補酵素及び還元型のチオニコチンアミド補酵素を共存させた場合に、酵素反応の進行に伴いこれらが消費され、還元型のニコチンアミド補酵素及び酸化型のチオニコチンアミド補酵素が生成する。
【００３３】
参考のため、共存させる還元型ニコチンアミド補酵素及び酸化型のチオニコチンアミド補酵素として、それぞれＮＤＡＨ及び酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）を用いたときの酵素サイクリングを下記式（Ａ）に示す。
【００３４】
【化１】
0003869601.tif 000002
【００３５】
工程（２）における前記酵素サイクリング反応は、工程（１）を経た後の被検体、或いは工程（１）を行っている最中の被検体に、アンモニア又はアンモニウム塩、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、及び本アミノ酸脱水素酵素を添加混合することにより好適に行うことが出来る。
【００３６】
このとき使用されるアンモニア又はアンモニウム塩は、特に限定されないが、アンモニア水溶液；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、あるいは塩化アンモニウム等に代表される無機アンモニウム塩類；及び酢酸アンモニウム、蓚酸アンモニウム、あるいは酒石酸アンモニウム等に代表される有機アンモニウム塩類が好適に使用出来る。また、使用されるアンモニア又はアンモニウム塩の濃度は、被検体の種類や使用される本アミノ酸脱水素酵素の種類によって適宜決定されるが、一般的には０．０１〜１００ｍＭの濃度範囲、特に０．０５〜５０ｍＭの濃度範囲が好適に使用される。
【００３７】
また、工程（２）で使用される酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素とは、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）；酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰＨ）；酸化型又は還元型アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド；酸化型又は還元型アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェイト；酸化型又は還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド；又は酸化型又は還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト等である。
【００３８】
また、工程（２）で使用できる酸化型又は還元型のチオニコチンアミド補酵素とは、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤＨ）；酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（チオＮＡＤＰ）、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（チオＮＡＤＰＨ）；酸化型又は還元型チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド；又は酸化型又は還元型チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイトである。
【００３９】
なお、工程（２）で使用する上記チオニコチンアミド補酵素は、併用するニコチンアミド補酵素と異なる型のものを用いる必要がある。すなわち、酸化型のニコチンアミド補酵素を用いる場合には還元型のチオニコチンアミド補酵素を用い、逆に還元型のニコチンアミド補酵素を用いる場合には酸化型のチオニコチンアミド補酵素を用いる必要がある。この様な条件を満足すれば、ニコチンアミド補酵素とチオニコチンアミド補酵素の組み合わせは、特に限定されないが、後述する補酵素ように、酵素サイクリングで生成する補酵素量又は消費される補酵素量を測定するときに吸光度法を用いた場合にその検出が容易であるという観点から、ＮＤＡＨ及びチオＮＡＤ、又はＮＤＡ及びチオＮＡＤＨの組み合わせを選択するのが好適である。
【００４０】
前記工程（２）で使用される酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素及びそれとは異なる型のチオニコチンアミド補酵素の濃度は特に限定されないが、通常は、それぞれ共に通常１μM〜２００ｍＭの範囲であるが、５μM〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。
【００４１】
前記工程（２）で使用する本アミノ酸脱水素酵素としては、アンモニア又はアンモニウム塩、酸化型又は還元型ニコチンアミド補酵素、及び該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素存在下で２−ケト酪酸からＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素であれば、公知の酵素が特に制限なく使用される。このような特性を有する酵素を例示すれば、バイオヒミカ  バイオフィジカ  アクタ｛Biochimica Biophisica Acta、96巻、248頁（1965年）｝に記載のバチルス・ズブチルス由来のＬ−アラニン脱水素酵素（ＥＣ 1.4.1.1）、アーカイブ  マイクロバイオロジー｛Arch. Microbiology、125巻、137頁（1980年）｝に記載のストレプトミセス属由来のＬ−アラニン脱水素酵素（ＥＣ 1.4.1.1）、特開昭５８−２１２７８２号公報に記載のサーマス・フラバス由来のＬ−アラニン脱水素酵素（ＥＣ 1.4.1.1）、特開平１−１６８２８０号公報に記載のストレプトミセス属由来のＬ−アラニン脱水素酵素（ＥＣ 1.4.1.1）、あるいはジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー｛Journal of Biological Chemistry、253巻、5719頁（1978年）｝に記載のＬ−ロイシン脱水素酵素（ＥＣ 1.4.1.9）等のＬ−アミノ酸脱水素酵素が挙げられるが、特にバチルス・ズブチルス由来のＬ−アラニン脱水素酵素、ストレプトミセス属由来のＬ−アラニン脱水素酵素、あるいはＬ−ロイシン脱水素酵素が入手の容易さで好適に使用出来る。
【００４２】
本アミノ酸脱水素酵素の使用量は、使用する被検体の種類や測定条件あるいは酵素の由来によって適宜決定されるが、一般的には、被検体１ｍｌ当たりの酵素活性で表して、０．１〜１０００μmoles/min/mlの濃度範囲、特に０．５〜５００μmoles/min/mlの濃度範囲が好適に使用される。
【００４３】
工程（２）の前記酵素サイクリング反応を行うときの反応ｐＨは、使用する酵素によって適宜決定されるが、一般的にはｐＨ４．０〜１０．５の範囲、特にｐＨ４．５〜１０．０の範囲が好適である。また、反応温度は、一般的には２０〜４５℃の温度範囲、特に２５〜４０℃の温度範囲が好適に選ばれる。
【００４４】
工程（２）の前記酵素サイクリングで使用する各補酵素の消費量、及び該酵素サイクリングで生成する各補酵素の量は前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸の量（初期濃度）および酵素サイクリングの反応サイクル数に依存し、反応時間の経過（すなわち、反応サイクル数の増大）に伴って増大する。したがって、予め定めておいた任意の特定の時間反応を行えば、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸が、反応条件に応じた特定の倍率をもって前記補酵素量の生成量又は消費量として増幅されることになる。このように、反応時間は、本アミノ酸脱水素酵素の活性や反応条件に応じて適宜任意に定めることができるが、全測定時間の短縮及び高感度化の点から、通常１分〜１２０分、特に２〜３０分とするのが好適である。
【００４５】
なお、前記酵素サイクリング反応の停止は、加熱処理や酸性あるいはアルカリ処理することにより行うことができるが、測定方法によっては必ずしも反応を停止する必要はない。例えば吸光度法により測定を行う場合には、セル内で反応を行えば反応を継続しながら任意の反応時間経過後における補酵素量を測定することが可能である。
【００４６】
工程（２）では、前記酵素サイクリングにより生成する補酵素の量、又は該酵素サイクリングにより消費される補酵素の量を測定する。これら量の測定方法は特に限定されないが、操作の簡便性や汎用の自動分析機を用いた測定が可能であるという点から各補酵素の極大分子吸光係数を示す波長における吸光度分析により行うのが好適である。例えば、酵素サイクリング開始時に共存させる、酸化型又は還元型ニコチンアミド補酵素と該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素の組み合わせとして、ＮＤＡＨ及びチオＮＡＤ、又はＮＤＡ及びチオＮＡＤＨの組み合わせを採用した場合には、ＮＡＤＨについては３４０ｎｍ付近、チオＮＤＡＨについては４００ｎｍ付近における吸光度を測定すればよいので、両者が共存していても精度の高い測定が可能である。
【００４７】
吸光度測定により各補酵素量を測定する場合に於いて、各補酵素の量は、予め各補酵素の濃度が既知の標準試料を用いて濃度と吸光度の関係を調べた検量線を作成しておき、この検量線に基づいて測定試料について実測された吸光度から各補酵素の濃度を知ることが出来る。しかしながら、吸光度と各補酵素量に明瞭な相関関係があることが明らかな場合は、後述する工程（３）に於いては各補酵素量の代わりに吸光度の変化量を用いてもよい。この時、吸光度の変化量は、反応開始時の吸光度を基準とする必要は必ずしもなく、反応初期の任意の時点における吸光度を基準とすることが出来る。
【００４８】
なお、工程（２）において、最終的に酵素サイクリング反応の経過に伴って増減するニコチンアミド補酵素またはチオニコチンアミド補酵素を定量する際、条件によっては各々の補酵素がそれぞれ補酵素の定量を妨害することがあるが、このような問題は、該酵素サイクリング開始時に共存させる酸化型或いは還元型ニコチンアミド補酵素、又は該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素のうち実際に定量する特定の補酵素（以下、測定補酵素ともいう。）と別の種類の補酵素（以下、非測定補酵素とも言う。）を再生する酵素サイクリング反応を組み合わせることで解決することが出来る。すなわち、この様な非測定補酵素酵素サイクリングを組み合わせることによりニコチンアミド補酵素濃度とチオニコチンアミド補酵素濃度の差が大きくなり妨害を少なくすることが可能となる。しかも、この場合には、単なる非測定補酵素補酵素の再生反応を組み合わせた場合と異なり、該補酵素の濃度が安定しているので２−ケト酪酸／Ｌ−２−アミノ酪酸酵素サイクリング反応に悪影響を与えることもない。
【００４９】
上記非測定補酵素再生酵素サイクリングは、２−ケト酪酸／Ｌ−２−アミノ酪酸酵素サイクリング反応を行う際に、該反応に悪影響を与えず、且つ非測定補酵素となるニコチンアミド補酵素あるいはチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素およびその基質を共存させることにより好適に行うことが出来る。
【００５０】
この時、好適に使用できる脱水素酵素及びその基質の組み合わせを例示すると、アルコール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.1、またはＥＣ 1.1.1.2）とエタノールあるいはアセトアルデヒドの組み合わせ；グリセロール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.6）とグリセロールあるいはジヒドロキシアセトンとの組み合わせ；アラビニトール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.12、あるいはＥＣ 1.1.1.14）とアラビニトール、キシルロースあるいはリブロースとの組み合わせ；グリセリン酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.29）とグリセリン酸あるいはヒドロキシピルビン酸との組み合わせ；リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.37、あるいはＥＣ 1.1.1.82）とリンゴ酸あるいはオギザロ酢酸との組み合わせ；アリールアルコール脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.90）とベンジルアルコールあるいはベンズアルデヒドとの組み合わせ；酒石酸脱水素酵素（ＥＣ 1.1.1.93）と酒石酸あるいはオギザログリコール酸との組み合わせ；等が挙げられる。
【００５１】
上記のような脱水素酵素の濃度は、使用される補酵素の種類や濃度によって異なるが、一般的には０．１〜１０００μmoles/min/mlの濃度範囲、特に０．５〜５００μmoles/min/mlの範囲が好適に使用される。また、該脱水素酵素の基質の濃度は、０．１〜５０００ｍＭの範囲が好適である。
【００５２】
なお、非測定補酵素再生酵素サイクリングを組み合わせた場合には、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸の量およびサイクル数に応じて前記脱水素酵素の基質の脱水素体が生成するので、測定補酵素の代わりに該脱水素体の量を測定してもよい。
【００５３】
非測定補酵素再生酵素サイクリングを組み合わせたケースについて、下記式（Ｂ）に示すような、工程（２）の前記式（Ａ）で示される２−ケト酪酸／Ｌ−２−アミノ酪酸酵素サイクリング反応において、測定補酵素としてチオＮＡＤＨを選択し（チオＮＡＤの減少量を測定してもよいことは勿論である。）、非測定補酵素であるＮＡＤＨを再生する酵素サイクリング反応を組み込むためにアルコール脱水素酵素及びエタノールを添加した場合を例に、更に詳しく説明する。
【００５４】
【化２】
0003869601.tif 000003
【００５５】
上記式に示される酵素サイクリング反応では、前記工程（１）で得られた２−ケト酪酸に、アンモニア又はアンモニウム塩、高濃度のチオＮＡＤ、及び低濃度のＮＡＤＨ素の存在下で本アミノ酸脱水素酵素を作用させると、可逆反応の進行に伴ってチオＮＡＤＨが生成すると共に、ＮＡＤＨが消費されて行く。ＮＡＤＨが消費されて行くと、通常は該可逆反応は速度が低下するか或るいは停止する。しかし、アルコール脱水素酵素及びエタノールが共存する場合には、エタノールの脱水素化物であるアセトアルデヒドを生成しながら消費されたＮＡＤＨがＮＡＤから再生され、前記可逆反応が継続すると共にＮＡＤとＮＡＤＨの濃度の割合が比較的一定になる。このため、２−ケト酪酸／Ｌ−２−アミノ酪酸酵素サイクリング反応の反応速度が減少することなく継続し、しかも反応停止後は、チオＮＡＤＨ濃度に比べＮＡＤ（及びＮＡＤＨ）濃度は相対的に低くなるので、これらの影響をほとんど受けることなく吸光度法等によりチオＮＡＤＨ量を測定することが可能となる。
【００５６】
上記のようなケースでは、工程（２）で生成する補酵素量、又は前脱水素酵素の基質の脱水素体（添加基質脱水素体ともいう。）の生成量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定することができる。
【００５７】
したがって、本発明の測定方法で被検体中のホモシステイン量の指標となる量（以下、指標量ともいう。）を整理すると、２−ケト酪酸／Ｌ−２−アミノ酪酸酵素サイクリング反応のみを行う場合には、▲１▼該反応の開始時に添加した酸化型（或いは還元型）のニコチンアミド補酵素の消費量、▲２▼該反応の開始時に添加した還元型（或いは酸化型）のチオニコチンアミド補酵素の消費量、▲３▼該反応で生成した還元型（或いは酸化型）のニコチンアミド補酵素の生成量、又は▲４▼該反応で生成した酸化型（或いは還元型）のチオニコチンアミド補酵素の生成量の少なくとも１つである。また、非測定補酵素再生酵素サイクリング反応を組み合わせたときは、非測定補酵素の選択に応じて、前記▲１▼、▲３▼、或いは▲５▼添加基質脱水素体量の少なくとも１つ（非測定補酵素としてチオニコチンアミド補酵素を選択した場合）、又は前記▲２▼、▲４▼、或いは▲５▼添加基質脱水素体量の少なくとも１つ（非測定補酵素としてニコチンアミド補酵素を選択した場合）である。
【００５８】
これら指標量を指標として被検体中に含まれるホモシステインの量を決定する方法は特に限定されないが、工程（２）において、工程（１）で得られた２−ケト酪酸の代わりに既知量の２−ケト酪酸を用いる他は実際の測定と同様にして調製した標準試料を２−ケト酪酸量を変えて複数調整し、これら標準試料について実際の反応と同一条件で反応を行い。指標となる各物質毎にその量を測定して、２−ケト酪酸量と各指標量との検量線を作成し、この検量線に基づいて実際の測定値から２−ケト酪酸量を求める方法により好適に行うことが出来る。前記工程（１）では、最終的に被検体中のホモシステインは全て２−ケト酪酸に転化するので、得られた２−ケト酪酸量が被検体中のホモシステイン量となる。
【００５９】
本発明の測定方法における前記工程（１）及び工程（２）は、ホモシステインデスルフラーゼ、酸化型又は還元型のニコチンアミド補酵素、該ニコチンアミド補酵素と異なる型のチオニコチンアミド補酵素、２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素、及びアンモニア又はアンモニウム塩を含んでなるホモシステイン定量試薬（以下、ＨＣＹ定量試薬１ともいう。）、又は該ＨＣＹ定量試薬１にさらに、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質を加えたホモシステイン定量試薬（以下、ＨＣＹ定量試薬２ともいう。）を用いることによりより簡便に行うことが出来る。
【００６０】
即ち、上記ＨＣＹ定量試薬１或いはＨＣＹ定量試薬２、又はこれら試薬の構成成分を２若しくはそれ以上に分けた試薬を予め調製しておくことにより、それらを所定量採り被検体に加えることにより直ちに前記工程（１）及び／又は前記工程（２）を開始することが出来る。
【００６１】
上記ＨＣＹ定量試薬１は、前記の各必須成分を含むものであれば特に限定されないが、試薬自身で酵素反応の進行せず、かつ組成が経時変化を起こさないことが必要である。測定の簡便さから判断すれば、臨床化学自動分析機を使用する場合は試薬を２つに分けて使用することが一般的な方法として採用されている。さらに本発明の測定法を実施する際、工程（１）と工程（２）から成る工程を、分離させて実施する測定法と、同時に行わしめて実施する測定法の２通りの測定方法が可能である。このようなことからＨＣＹ定量試薬１は、これら２通りの測定法に対応できる２つの測定試薬にして使用することが一般的であり、特に工程（１）の反応を進行させるホモシステインデスルフラーゼと緩衝液とからなる第１の測定試薬液と、工程（２）の酵素サイクリングを進行させるチオニコチンアミド補酵素、ニコチンアミド補酵素、２−ケト酪酸を基質としてＬ−２−アミノ酪酸を可逆的に生成させる反応を触媒するアミノ酸脱水素酵素、および緩衝液から成る第２の測定試薬液の組み合わせが好適である。
【００６２】
酵素や補酵素から成る該定量試薬に含まれる各必須成分は、最も安定に保存できる溶液状態のものでも、使用直前に測定試薬液に使用する緩衝液で溶解させる凍結乾燥状態のものでも任意に使用できる。なお、該定量試薬に含まれる各必須成分は、本発明の測定方法の説明で挙げたものが制限なく使用できる。また、緩衝液としては、ｐＨを調整できるものであれば特に限定されないが、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、あるいはグッド緩衝液等が使用できる。また、その他添加する任意成分としては、該定量試薬を安定化させるためのシュークロースなどの糖類や防腐のためのアジ化ナトリウムや抗菌剤等の防腐剤が使用できる。なお、これら各成分の含有量もほぼ本発明の測定方法の説明で示した反応条件に応じて適宜決定すればよい。
【００６３】
また、前記ＨＣＹ定量試薬２についても、工程（１）用試薬及び工程（２）用試薬に分けるのが好適であるが、ニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質とニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を共存させた場合に酵素反応が進行するため、該酵素反応を進行させない組成を選択する必要がある。このため、工程（１）用試薬としてはＨＣＹ定量試薬１におけるものと同じものにニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素あるいは該脱水素酵素の基質を添加した組成物が使用でき、工程（２）用試薬としてはＨＣＹ定量試薬１における工程（２）用試薬に、工程（１）用試薬に添加しなかったニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、あるいは該脱水素酵素の基質を添加した組成物が使用できる。
【００６４】
これら工程（１）用あるいは工程（２）用試薬に添加するニコチンアミド補酵素又はチオニコチンアミド補酵素を可逆的に酸化還元する脱水素酵素、及び該脱水素酵素の基質の濃度はそれぞれ、０．０５〜５００Ｕ／ｍｌ及び０．１ｍＭ〜１Ｍ、特に０．１〜２００Ｕ／ｍｌ及び０．５〜５００ｍＭの濃度となるよう添加したものが使用できる。
【００６５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、酵素量は３７℃下で１．０μmole/minの反応を触媒する酵素量を１．０Ｕとして示す。
【００６６】
実施例１｛工程（１）と工程（２）を段階的に行った例｝
先ず、以下に示す組成の測定用試液Ａ、測定試液Ｂ、及びホモシステイン希釈溶液を調製した。
［測定用試液Ａ］
５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１０Ｕ／ｍｌ  ホモシステインデスルフラーゼ（Proteus morganii ＩＦＯ−３１６８由来）
［測定用試液Ｂ］
５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐH ８．５）
５ｍＭ  チオＮＡＤ（シグマ社製）
１ｍＭ  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
５ｍＭ  塩化アンモニウム
２００Ｕ／ｍｌ  L-ロイシン脱水素酵素 （東洋紡社製、Bacillus sp.由来）
［ホモシステイン溶液］
５０μM  ホモシステイン標準水溶液（シグマ社製）を精製水にて希釈して、１０μM、２０μM、３０μM、及び４０μM濃度の希釈系列のホモシステイン希釈溶液を調製した。
【００６７】
次に、上記ホモシステイン標準水溶液及び上記１０μM〜４０μM濃度のホモシステイン希釈溶液（標準試料）をそれぞれ２０μlキュベットに分注し、各キュベットに３７℃に加温した測定用試液Ａ０．５ｍｌを分注し混和後、３７℃下で１０分間反応させた。反応後、各々のキュベットにあらかじめ３７℃に加温した測定試液Ｂを０．５ｍｌずつ分注して混和し、測定試薬Ｂを加えてから3分間後と13分間後の２回、４００ｎｍの吸光度を測定し、それぞれの吸光度の差をΔAbsとした。ΔAbsと標準試料のホモシステイン濃度との関係を図１に示す。
【００６８】
図１は、ホモシステイン濃度が未知の水溶液系被検体について上記と同様な条件で反応を及び吸光度測定を行い、得られたΔAbs値からホモシステイン濃度を求めるための検量線となるものであるが、図１に示されるように、１０μM以下のホモシステイン濃度領域に於いてもΔAbsとホモシステイン濃度との間には良好な直線関係が認められることから、微量のホモシステインを含む被検体についても正確なホモシステイン量の測定ができることが判る。
【００６９】
実施例２｛工程（１）と工程（２）を逐次的に行った例｝
実施例１で用いたのと同じ測定用試液Ａ、測定試液Ｂ、ホモシステイン標準溶液、及びホモシステイン希釈溶液を用い、実施例１と同様にしてキュベット内で反応用試料を調製した。その後、各反応用資料に予め３７℃に加温した０．５ｍｌの測定用試液Ａおよび予め３７℃に加温した０．５ｍｌ測定用試液Ｂをほぼ同時に添加し、混和した。両測定用試液添加後3分間後と13分間後の２回につて４００ｎｍの吸光度を測定し、実施例１と同様にしてΔAbsを求めた。この時得られたΔAbsと標準試料のホモシステイン濃度との関係を図２に示す。
【００７０】
図２においても図１と同様に良好な直線関係が認められることから、ホモシステインデスルフラーゼ反応を完結することなく酵素サイクリング反応を同時進行させることによってもホモシステンの高感度測定が可能であることが判る。
【００７１】
実施例３｛工程（２）に補酵素再生酵素サイクリング反応を組み込んだ例｝
まず、以下に示す組成の測定用試液Ｃ、及び測定試液Ｄを調製した。
［測定用試液Ｃ］
５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐH ８．０）
１０Ｕ／ｍｌ ホモシステインデスルフラーゼ（Proteus morganii ＩＦＯ−３１６８由来）
２００ｍＭ  エタノール
［測定用試液Ｄ］
５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐH８．０）
５ｍＭ  チオＮＡＤ（シグマ社製）
０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ（シグマ社製）
５ｍＭ  塩化アンモニウム
３００Ｕ／ｍｌ  L-ロイシン脱水素酵素（東洋紡社製、Bacillus sp.由来）
５０Ｕ／ｍｌ  アルコール脱水素酵素（オリエンタル酵母社製、酵母由来）
次いで、実施例１と同様にしてキュベット内で調製した各反応用試料に予め３７℃に加温した０．５ｍｌ測定用試液Ｃと０．５ｍｌの測定用試液Ｄをほぼ同時に添加し、混和した。両測定用試液添加後3分間後と13分間後の２回につて４００ｎｍの吸光度を測定し、実施例１と同様にしてΔAbsを求めた。この時得られたΔAbsと標準試料のホモシステイン濃度との関係を図３に示す。
【００７２】
図３と図２を比較すると、図３の方がホモシステイン濃度変化に対するΔAbs変化が大きいことから、操作は煩雑になるが更に高感度に被検体中のホモシステイン量を測定できることが判る。
【００７３】
実施例４（血清サンプル中のホモシステイン量の測定）
Ｉ．検量線の作製
測定用試液Ａに変えて下記組成の測定用試液Ｅを用いる他は実施例１と同様にして反応及び吸光度測定を行いΔAbs求めた。
［測定用試液Ｅ］
５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）
１０ｍＭ  ジチオスレイトール（DTT）
１０Ｕ／ｍｌ  ホモシステインデスルフラーゼ（Proteus morganii ＩＦＯ−３１６８由来）
得られたΔAbsとホモシステイン濃度との関係から検量線を作製した。なお、該検量線は、図１とほぼ一致していた。
【００７４】
II．  血清サンプル中のホモシステイン量の測定
先ず、健常者の血液から常法に従って血清分離を行って５種類の血清サンプル（血清サンプル１〜５）を調製した。
【００７５】
次いで、検量作製時に使用した標準試料に代えて上記血清サンプルを用いる以外は検量線作成時と同様にして反応および吸光度測定を行いΔAbsを測定し、該ΔAbsから検量線を用いてホモシステイン濃度を求めた。測定されたΔAbs値及び検量線から求められたホモシステイン濃度を併せて表１に示す。
【００７６】
【表１】
0003869601.tif 000004
【００７７】
【発明の効果】
本発明のホモシステインの測定法法によれば、簡便な操作で被検体中の極微量のホモシステインを正確に定量することができる。しかも、実質的に吸光度法に検出が可能であるので、この様な検出器を有する従来の自動分析装置に適用することも可能である。このため、多検体測定も容易となり、血清や血漿等の被検体中のホモシステインを定量するような臨床検査等の医療分野に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図２】  実施例２の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図３】  実施例３の測定法でホモシステイン標準希釈水溶液を測定した場合のホモシステイン濃度と吸光度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
0003869601.tif 000006
【図３】
0003869601.tif 000007