(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミカン科（Rutaceae）に属する植物の花、葉、茎または木部からの抽出物を有効成分として含有する、ヒアルロン酸量増加促進剤。
【請求項２】
ミカン科（Rutaceae）に属する植物の花からの抽出物を有効成分として含有する、請求項１記載のヒアルロン酸量増加促進剤。
【請求項３】
ミカン科（Rutaceae）に属する植物が、ミカン科ミカン属（Citrus）に属する植物である、請求項１または２記載のヒアルロン酸量増加促進剤。
【請求項４】
ミカン科（Rutaceae）ミカン属（Citrus）に属する植物がウンシュウミカン（C. unshiu）、オレンジ（C. sinensis）、ダイダイ（C. aurantium）の中から選ばれる１種または２種以上である、請求項３記載のヒアルロン酸量増加促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸量増加促進剤を配合してなる、皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒアルロン酸量増加促進剤（以下、ヒアルロン酸産生促進剤とも記す）に関する。さらに詳しくは、ヒトにおけるヒアルロン酸産生能を促進させるヒアルロン酸産生促進剤に関する。該ヒアルロン酸産生促進剤は、ヒト皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力保持）、関節炎等の予防・治療、熱傷の初期の治療等に有効に適用され得る。特に、本発明ヒアルロン酸産生促進剤の配合により、皮膚のハリや弾力を保持してシワを防ぎ、うるおいのある若々しい肌の状態を維持することのできる皮膚外用剤が提供される。
【０００２】
【従来の技術】
近年、老化に関する研究が進められている。皮膚老化の原因は、マクロ的にみれば加齢が重要な因子であるが、それに加えて乾燥、酸化、太陽光（紫外線）等による影響も皮膚老化に関わる直接的な因子として挙げられる。皮膚老化の具体的な現象としては、ヒアルロン酸をはじめとするムコ多糖類の減少、コラーゲンの架橋反応、紫外線による細胞の損傷などが知られている。
【０００３】
なかでもヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗、および細菌感染の防止など、多くの機能を有している（"Bio Industry"、vol.8、p.346(1991)）。例えば、皮膚のヒアルロン酸量は加齢とともに減少し、それに伴い、小ジワやかさつき等の皮膚老化が現れるといわれている。そのため、このような老化した皮膚の改善剤として、ヒアルロン酸やコラーゲンを配合した化粧料が数多く提案されている。しかしながらこれら従来の化粧料は、皮膚表面における保湿効果を発揮するだけであり、本質的に老化肌を改善し得るものではない。また、皮膚細胞賦活剤として各種のビタミン類や生薬類を配合した化粧料が提案されているが、これらもやはり老化肌を改善、治療し得るまでには至っていないのが現状である。
【０００４】
さらに、関節液中に含まれるヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍｌであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（"Arthritis Rheumatism"、vol.10、p.357(1967)）。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎などでも慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（「結合組成」（金原出版）、４８１頁、１９８４年）。上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制および病的関節液の改善若しくは正常化のために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチ患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと上記の改善が認められることが報告されている（「炎症」（日本炎症学会）、１１巻、１６頁、１９９１年）。同様に、外傷性関節炎、骨関節炎や変形性関節炎においても、ヒアルロン酸の関節注入療法により上記の改善効果が報告されている。（「結合組織と疾患」（講談社）、２４６頁、１９８０年）。
【０００５】
しかしながら、上記疾患の治療は長期にわたり、しかも医師の処方を必要とする。従って、日常生活のなかで手軽に治療することができるヒアルロン酸産生促進剤を含有させた皮膚外用剤が望まれていた。
【０００６】
また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒアルロン酸が著しく増加することが知られており（「結合組織と疾患」（講談社）、１５３頁、１９８０年）、熱傷の初期の治療薬としても、ヒアルロン酸産生促進剤が期待されている。
【０００７】
一方、ヒト細胞のヒアルロン酸を産生する薬剤としては、インシュリン様成長因子−１や上皮成長因子（"Biochemica Biophysica Acta"、1014、p.305(1989)）およびインターロイキン−１（「日本産科婦人科学会」雑誌、４１巻、１９４３頁、１９８９年）などのサイトカイン、あるいはフォルボールエステル（"Experimental Cell Research"、vol.148、p.377(1983)）などが知られているが、いずれも化粧品、入浴剤や医薬品等として簡便にかつ安心して使用することができるものではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、安全で、かつ簡便に用いることができる、ヒトにおけるヒアルロン酸産生能を促進させるヒアルロン酸産生促進剤を提供することを目的とする。本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、ヒト皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力保持）、関節炎等の予防・治療、熱傷の初期の治療等に有効に適用され得る。特に、このヒアルロン酸産生促進剤の配合により、皮膚のハリや弾力を保持してシワを防ぎ、うるおいのある若々しい肌の状態を維持することのできる皮膚外用剤が提供される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題の解決に向けて広く種々の物質にヒアルロン酸産生促進能を調べた結果、ミカン科に属する植物の花等から得られる抽出物が優れたヒアルロン酸産生促進作用を有することを見出し、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ミカン科（Rutaceae）に属する植物の花、葉、茎または木部からの抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸量増加促進剤に関する。
【００１１】
ここで、ミカン科（Rutaceae）に属する植物の花からの抽出物が好ましく用いられる。
【００１２】
また、ミカン科（Rutaceae）の植物の中でも、特にミカン属（Citrus）に属する植物が好ましく用いられる。
【００１３】
さらに本発明は、上記のヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる皮膚外用剤に関する。
【００１４】
なお、ミカン科に属する植物抽出物の効果に関しては、ミカン科ミカン属に属する植物の種子の圧搾物および／または抽出物のシワ改善作用（特開平７−１２６１４２号公報）や、ポンカンエッセンスの活性酸素消去能（特開平９−３１５９９３号公報）等が既に知られている。しかしながら、ミカン科植物の抽出物にヒアルロン酸産生促進作用が認められたという報告はこれまでなく、本発明者らによって今回初めて見出されたものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
【００１６】
本発明に用いられるミカン科（Rutaceae）に属する植物としては、ミカン属（Citrus）、キンカン属（Fortunella）、カラタチ属（Poncirus）、ミヤマシキミ属（Skimmia）、ヘンルーダ属（Ruta）等に属する植物が挙げられるが、中でもミカン属（Citrus）に属する植物が好ましく用いられる。
【００１７】
ミカン属（Citrus）に属する植物としては、例えば、ウンシュウミカン（C. unshiu）、ナツミカン（C. natsudaidai）、オレンジ〔スイートオレンジ〕（C. cinensis）、ダイダイ〔サワーオレンジ、ビターオレンジ〕（C. aurantium）、マンダリンオレンジ（ポンカンを含む）（C. reticulata）、ハッサク（C. hassaku）、イヨカン（C. iyo）、グレープフルーツ（C. paradisi）、スダチ（C. sudachi）、カボス（C. sphaerocarpa）等が挙げられる。中でもウンシュウミカン（C. unshiu）、オレンジ（C. cinensis）、ダイダイ（C. aurantium）が好ましく用いられる。
【００１８】
本発明において、ミカン科に属する植物は、生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。ミカン科植物の使用部位は、植物体全体を用いることができるが、好ましくは花、葉、茎または木部等が用いられ、中でも花または葉がより好ましく用いられ、特に好ましくは花である。なお、この場合の「花」は、いわゆる花軸と花葉を含む、有性生殖に関与する諸器官を含んだものをいい、花弁、雄ずい、雌ずい、蕚片等を含む。
【００１９】
ミカン科植物の抽出物は、常法により得ることができ、例えばミカン科に属する植物を抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出した得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。
【００２０】
このようにして得たミカン科に属する植物またはその抽出物は、ヒアルロン酸産生促進作用を有する。このようなミカン科に属する植物またはその抽出物は、好ましくは外用剤に配合して用いられる。
【００２１】
上記ミカン科に属する植物またはその抽出物を皮膚外用剤に配合して用いる場合、外用剤全量中に乾燥重量として０．０００５〜２０．０重量％配合するのが好ましく、より好ましくは０．００１〜１０．０重量％である。０．０００５重量％未満では本発明のヒアルロン酸産生促進効果が十分に発揮され難く、一方、２０．０重量％超では製剤化が難しいので好ましくない。また、１０．０重量％を超えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められない。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤を皮膚外用剤に用いる場合、上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２３】
さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００２４】
また、本発明の皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００２５】
また、本発明の皮膚外用剤の使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができる。
【００２６】
なお、上記の剤型および使用形態に本発明の皮膚外用剤が採り得る形態が限定されるものではない。
【００２７】
また、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、優れたヒアルロン酸産生促進能を有することから、上記のように皮膚外用剤に用いる以外にも、関節炎の予防治療や熱傷の初期治療等としての適用が可能である。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものでない。なお、配合量はすべて重量％である。
【００２９】
実施例に先立ち、本発明のミカン科植物由来の溶媒抽出物のヒアルロン酸産生促進作用の試験方法について説明する。
【００３０】
１．  試料の調製
オレンジ（C. sinensis）、ウンシュウミカン（C. unshiu）、またはダイダイ（C. aurantium）の花５００ｇを、メタノールに室温で１週間浸漬し、抽出液を得た。この抽出液を濃縮し、ミカン科植物抽出物（以下、「本抽出物」と記す）９０ｇを得た。
【００３１】
本抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に濃度１０％となるよう溶解して、本抽出物含有溶液（以下、「元溶液」と記す）とした。
【００３２】
この元溶液を希釈して濃度を調整した溶液を、元溶液とともに被験溶液とし、以下の実験を行った。
【００３３】
２．  ヒアルロン酸産生促進作用の測定
２４穴シャーレにヒト皮膚由来不死化表皮細胞を１ウエルあたり２万播種し、増殖因子入りＫＧＢ培地（クラボウ（株）製）で４日間培養した。この後、培地を、上記被験溶液を含むＫＧＢ培地２ｍｌに交換し、さらに４日間培養した。なお、被験溶液の濃度は、ＤＭＳＯが培地に対して最終濃度０．１％になるように調整した。また、培地中での本抽出物濃度は１０-5〜１０-2重量％とした。
【００３４】
培養後、培地を採取し、ヒアルロン酸の測定を行った。ヒアルロン酸の測定は、市販のヒアルロン酸測定キット（中外製薬（株）製）を用いて行った。またシャーレ中のＤＮＡ量を測定し、細胞数の指標とした。ＤＮＡ量の測定は「ヘキスト３３２５８」（ヘキスト社製）を用いた蛍光測定法で行った。
【００３５】
なお、本抽出物については、上記実験濃度では細胞毒性は認められなかった。
【００３６】
ヒアルロン酸産生促進作用の評価はヒアルロン酸産生促進率により行った。ヒアルロン酸産生促進率（％）は、本抽出物を添加しない培地で培養したヒト皮膚由来不死化表皮細胞（コントロール）のＤＮＡあたりのヒアルロン酸量を１００とした時の、本抽出物含有培地で培養したヒト皮膚由来不死化表皮細胞のＤＮＡあたりのヒアルロン酸量と定義した。結果を表１に示す。
【００３７】
また、参考例として、既にヒアルロン酸産生促進作用を有することが知られている高麗人参の抽出物（メタノール抽出物）についても上記と同様の試験を行い、１０-3重量％濃度でのヒアルロン酸産生促進率を測定した。結果を表１に併せて示す。
【００３８】
【表１】
0003998085.tif 000002
【００３９】
表１から明らかなように、ミカン科植物の抽出物は、優れたヒアルロン酸産生促進効果を有することがわかる。
【００４０】
以下に、種々の剤型の本発明によるヒアルロン酸産生促進剤の配合例を挙げる。なお、各実施例で用いたミカン科植物の溶媒抽出物は常法により得た。なおこれら抽出物の配合量は乾燥重量で示す。
【００４１】
0003998085.tif 000003
（製法）
（１１）に（５）〜（７）を加え溶解し、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（４）、（８）〜（１０）を混合して加熱溶融し、７０℃に保った（油相）。次いで、水相に油相を攪拌しながら徐々に添加し、全部加え終わってからしばらくその温度に保ち反応を起こさせた。その後、ホモミキサーで均一に乳化し、よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００４２】
0003998085.tif 000004
（製法）
（１３）に（８）を加え溶解し、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合して加熱溶融し、７０℃に保った（油相）。次いで、水相に油相を加え予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００４３】
0003998085.tif 000005
（製法）
（１３）に（６）〜（７）を加え、加熱溶解して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（５）、（８）〜（１２）を混合し加熱溶融し、７０℃に保った（油相）。次いで、水相に油相を攪拌しながら徐々に加え反応を行った。反応終了後、ホモミキサーで均一に乳化した後、よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００４４】
0003998085.tif 000006
（製法）
少量の（１３）に（８）を溶解した（Ａ相）。残りの（１３）に（６）〜（７）を加え、加熱溶解して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（５）、（９）〜（１２）を混合し加熱溶融して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、さらにＡ相を加えホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００４５】
0003998085.tif 000007
（製法）
（１３）に（８）を加え、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合し、加熱溶融して７０℃に保った（油相）。油相を攪拌しながら水相を徐々に加え、ホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００４６】
0003998085.tif 000008
（製法）
（１２）に（４）を均一に溶解した（水相）。一方、（１）に（７）と（３）を溶解し、これを水相に添加した。次いでここに、（２）、（８）〜（１１）を加えた後、（５）、（６）で中和させ増粘した。
【００４７】
0003998085.tif 000009
（製法）
Ａ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ｃ相にＡ相を加えて可溶化した。次いでＢ相を加え充填を行った。
【００４８】
0003998085.tif 000010
（製法）
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化した。次いでＣ相を加え充填を行った。
【００４９】
0003998085.tif 000011
（製法）
（１）〜（７）の粉末成分をブレンダーで十分混合し、これに（８）〜（１１）の油性成分、（１２）、（１３）、（１４）を加え、よく混練した後、容器に充填、成型した。
【００５０】
0003998085.tif 000012
（製法）
水相を加熱攪拌後、十分に混合粉砕した粉体部を添加してホモミキサー処理した。さらに加熱混合した油相を加えてホモミキサー処理した後、攪拌しながら香料を添加して室温まで冷却した。
【００５１】
0003998085.tif 000013
（製法）
（１３）に（８）を加え溶解し、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合して加熱溶解し、７０℃に保った（油相）。次いで、水相に油相を加え予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よく攪拌しながら３０℃まで冷却した。
【００５２】
上記実施例１〜１１の各皮膚外用剤は、いずれもヒアルロン酸産生促進効果に優れるものであり、これを皮膚へ適用することにより、皮膚のハリや弾力を維持してシワを防ぎ、うるおいのある若々しい肌の状態を維持することができる。
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は優れたヒアルロン酸産生促進作用を有しており、ヒト皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力保持）、関節炎等の予防・治療、熱傷の初期の治療等に有効に適用され得る。特に、本発明のヒアルロン酸産生促進剤を皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品、化粧料を含む）等に配合することにより、細胞外マトリックス成分の一つであるヒアルロン酸の産生を促進し、皮膚のハリや弾力を維持してシワを防ぎ、うるおいのある若々しい肌の状態を維持することのできるという効果を有する。