(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板減少症及び自己免疫病を自然発症することを特性として劣性に遺伝する系統に属し、腎炎の発症が抑制されたＳＡＴ／ＨｉＮｋマウス。
【請求項２】
腎炎及び自己免疫病を発症し、血小板減少も特性として有すマウスから、腎炎を発症するという特性を抑制することにより、血小板減少症及び自己免疫病を自然発症することを特性として劣性に遺伝する系統に属する請求項１記載のマウス。
【請求項３】
腎炎及び自己免疫病を発症し血小板減少も特性として有すＥＯＤ／ｋｊマウスから腎炎を発症する特性を抑制することにより、劣性に遺伝する特性として更にベージュ色の毛色を有す請求項１記載の血小板減少症及び自己免疫病マウス。
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【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、突然変異によっで生じた病態発現マウスに関する。
本発明の病態発現マウスは血小板減少症及び自己免疫病マウスに係り、特に血小板減少症治療薬及び自己免疫病治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として有用な血小板減少症及び自己免疫病マウスに関する。なお、この明細書中のＭＲＬ／ｌｐｒやｉｎ  ｖｉｖｏなどのアンダーラインを引いた英文字は、イタリックの字体を表わすものとする。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの疾患治療薬を研究開発するためには、各種の研究用の疾患モデルを必要とする。ヒトの特発性血小板減少症治療薬及び自己免疫病治療薬の疾患モデルとしては、例えば、ＮＺＷマウスの雌とＢＸＳＢ系マウスの雄とのＦ１世代（以下「（Ｗ／Ｂ）Ｆ１」と記す）の雄が用いられている。このマウスは、ヒトの特発性血小板減少性紫斑病及び自己免疫病の治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために供されている。（ブリティシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー、９１巻、６９１〜６９６頁、１９９５年及びブラッド，７９巻，９４２〜９４７頁，１９９２年）
また、これまでに知られている自己免疫病のモデルとしては、疾患モデル動物ハンドブックＮｏ．２、２９６〜３００頁、昭和５７年、医歯薬出版（株）記載にあるＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／１ｐｒ（以下、ＭＲＬ／１ｐｒと記す）、ＢＸＳＢ／Ｍｐ（以下、ＢＸＳＢと記す）、及び特開平５−１０３５６２号記載のＥＯＤ／Ｋｊマウス等が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトの疾患治療薬を疾患モデルを用いて開発する場合は、薬剤による寿命効果や血液学的、血清学的及び病理組織学的な改善効果を判定する必要があるが、病態を複数発症するモデルは薬剤の効果判定を複雑にする。
従来の（Ｗ／Ｂ）Ｆ１マウスはヒトの自己免疫性血小板減少症モデルであるが、本来は、腎炎を遺伝的に発症するマウスとして報告されている。そのため、多くの（Ｗ／Ｂ）Ｆ１マウスは重症の血小板減少症を呈する前に腎炎のために死亡してしまう。つまり、血小板減少症治療薬の開発研究に大きな制約を与えている。従って、自己免疫性血小板減少症をより特異的に遺伝的に発症するモデルの出現が待たれている。
また、自己免疫病を発症するモデルであるＭＲＬ／１ｐｒ、ＢＸＳＢ、ＥＯＤ／Ｋｊマウスも特徴として腎炎を発症し腎炎の悪化のために死亡してしまう。そのため、ある特定の症状が有意に発症進行するモデルが望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、鋭意検討の結果、上述の不都合を除去するために、血小板減少症及び自己免疫病を特性として劣性遺伝し、腎炎の発症を抑制したマウスの樹立、より具体的にはＥＯＤ／Ｋｊマウスから腎炎の発症を抑制した突然変異系を樹立したことに基づき成し遂げられた。
すなわち、本発明は、血小板減少症及び自己免疫病を自然発症することを特性として劣性に遺伝する系統に属し、腎炎の発症が抑制されたマウスに関する。
更には本発明は腎炎及び自己免疫病を発症し血小板減少も特性として有すマウスから、腎炎を発症するという特性を抑制することにより、血小板減少症及び自己免疫病を自然発症することを特性として劣性に遺伝する系統に属するマウスに関する。
更には、本発明は腎炎及び自己免疫病を発症し、血小板減少も特性として有すＥＯＤ／Ｋｊマウスから腎炎を発症する特性を抑制することにより、劣性に遺伝する特性として更にベージュ色の毛色を有す血小板減少症及び自己免疫病マウスに関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明においてＥＯＤ／Ｋｊマウスとは特開平５−１０３５６２号記載のＭＲＬ／１ｐｒ系の雌とＢＸＳＢ系の雄とを掛け合わせて選択した腎炎及び自己免疫病を早期に発症して死亡する特性を遺伝する近交系化を図ったマウスであり、また、ＥＯＤ／Ｋｊマウスは血小板の著名な減少を病気の発症に伴い起こることが知られている。ＥＯＤ／Ｋｊマウスは特開平５−１０３５６２号記載の生産方法により作成、供給される。
本発明の血小板減少症及び自己免疫病マウス（以下「本発明マウス」と記す）は、（ＭＲＬ／１ｐｒｘＢＸＳＢ）リコンビナント近交系であるＥＯＤ／Ｋｊ
マウスの突然変異系として確立された近交系であり、ＳＡＴ／ＨｉＮｋ（以下「ＳＡＴ」と記す）と命名する。ＳＡＴの名は、その大きな特徴である自然発症性自己免疫性血小板減少症（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）に由来するものである。
【０００６】
このマウスの雄は、ｌｐｒ及びＹａａ、また、雌はｌｐｒという強力な自己免疫現象促進遺伝子を有し、且つ、これらの遺伝子の特徴を十分引き出す背景遺伝子群との関係で、極めて特徴的な重度の血小板減少症を発症する。これまでに知られている自己免疫病のモデルであるＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（以下「ＭＲＬ／ｌｐｒ」と記す）、ＢＸＳＢ／Ｍｐ（以下「ＢＸＳＢ」と記す）、（Ｗ／Ｂ）Ｆ１の雄やＥＯＤ／Ｋｊマウスの特徴は腎炎の発症と腎炎の悪化による死亡である。一方、本発明でのマウスは重度の血小板減少症を呈し、あるいは赤血球減少症を併発する。また、このマウスでの腎炎の程度は軽微であり、腎不全による死亡はまれであるので、血小板減少症治療薬及び自己免疫病治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として極めて有望なものと思われる。
【０００７】
本発明マウスの特徴としては、以下の３つが主に挙げられる。
（１）血小板減少症及び自己免疫病を発症すること。
（２）血小板に対する自己抗体が出現し、ヒトの特発性血小板減少性紫斑病や全身性エリテマトーデスなどの自己免疫病で観察される血小板減少症に類似したものである。
（３）高率にクリオグロブリンを血症を認め、抗ＤＮＡ抗体が上昇し、かつ、全身リンパ節の腫脹や軽微な腎炎を伴う自己免疫病を発症する。
【０００８】
本発明マウスＳＡＴマウスの同定
表１に示したように、解析範囲ではＳＡＴマウスは遺伝的にＥＯＤ／Ｋｊマウスと均一であり、ＥＯＤ／Ｋｊマウスの突然変異系として矛盾のない所見をしめしている。従って、ＳＡＴマウスはＭＲＬ／ｌｐｒ系とＢＸＳＢ系を起源とするリコンビナント近交系であるＥＯＤ／Ｋｊマウスと近似した遺伝的背景を持つと考えられる。つまり、ＭＲＬ／ｌｐｒ系を起源とし、そして、著明なリンパ節の腫脹を伴うことから、ｌｐｒ遺伝子をホモの状態で有することが、また、ＢＸＳＢ系の雄を起源とすることから、Ｙ遺伝子上にあるとされるＹａａ遺伝子を有することも確実である。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
また、ＳＡＴマウスの毛色はベージュ色であり、野性色のＥＯＤ／Ｋｊマウスとは外観からも容易に区別される。
ＳＡＴマウスの毛色は劣性遺伝することもわかった。即ち、ＳＡＴマウスとＥＯＤ／Ｋｊマウスの第一世代はＥＯＤマウスと同様に、野性色であった。この野性色の第一世代の交配によって得られた第二世代にはメンデルス遺伝の法則に従って、野性色の他に、ベージュ色のＳＡＴマウスが得られる。
なお、本出願人は、本発明マウスの受精卵を特許法施行規則第２７条の３第１項の規定に準じて分譲する用意がある。
【００１１】
以下に、本発明マウスの生産維持方法について述べる。
本発明ＳＡＴマウスは、他の近交系と同様に、原則として、兄妹交配によって維持する。但し、兄妹交配により産児数の著しい減少、発育不全あるいは奇形を認めた場合には、親子交配も選択可能とする。
また、実験などで大量に同一条件のこのマウスを必要とするときには、ＥＯＤ／ＫｊマウスとＳＡＴマウスとのＦ１世代に、ＳＡＴマウスを交配することによっても可能である。
【００１２】
本発明マウスにおける病態特性は、以下のように特徴づけられる。
（１）血小板減少症
一般的に、正常マウスの血小板数はおよそ７０〜１００万／μｌ程度である（実験動物学の生物学的特性データ、田嶋嘉雄監修、ソフトサイエンス社  １９８９年）。本発明マウスの末梢血中の血小板数の推移を図１および図２に示した。加齢と共に、雌雄ともに血小板数の減少を認めた。
次に、抗血小板抗体の測定について示す。
自己免疫性血小板減少症は血小板に対する自己抗体の産生が引き金となる。即ち、抗体の結合した血小板は全身の網内系組織で速やかに破壊されるため、血小板の寿命が著しく短くなる。このマウスの血漿中の抗血小板抗体価の推移を図３および図４に示した。抗血小板抗体価はＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ９１，６９１〜６９６，１９９５）を用いて測定した。大部分のＳＡＴマウスは加齢と共に、正常なＢＡＬＢ／ｃマウス血漿の平均５６単位より高い値を示した。
【００１３】
また、特発性血小板減少性紫斑病の診断基準としては、血中の血小板表面免疫グロブリンＧの増量を測定する方法が用いられている（厚生省特定疾患特発性造血障害調査研究班、昭和６３年研究業績報告書、ｐ３８−６０、１９８８）。
本発明の血小板減少症（３０万／ｍｍ3 以下）を呈したＳＡＴマウスについて、血中血小板表面免疫グロブリンＧの増量を測定したところ、正常マウスに比較して高値を示す事が判った。これらの結果を図５に示した。
これらにより、本発明マウスの血小板減少症を発症することが判り、血小板に対する自己抗体が出現し、ヒトの特発性血小板減少性紫斑病や全身エリテマトーデスなどの自己免疫病で観察される血小板減少症に類似したものである。
なお、本発明マウスが血小板減少症の病態モデルとして可能であるのは、ＥＯＤ／Ｋｊマウス等からの腎炎の発症及びこれによる死亡率を抑制したためによる長期生存に因ることが大きい。
【００１４】
（２）自己免疫病
（ｉ）クリオグロブリン血症について
クリオグロブリンは免疫グロブリンと補体成分などの非免疫グロブリンから構成され、血液温度が３０°Ｃ前後でも析出することがある。クリオグロブリンは血管内で他の免疫グロブリン、補体、フィブロネクチンなどと凝集物を形成することにより血栓形成、あるいは免疫複合体の形成による血管炎や腎炎発症の原因とも考えられている。このマウスの血清クリオグロブリン率を測定した（リウマチ、２９巻、ｐ２２０−２２７，１９８９年）。表２に示した如く、加齢につれてクリオグロブリンの出現を認めた。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
（ｉｉ）腎炎について
腎機能の指標として血中尿素窒素（Ｂｌｏｏｄ  Ｕｒｅａ  Ｎｉｔｏｒｇｅｎ，ＢＵＮ）値を測定した。一般に正常マウスのＢＵＮ値は２５ｍｇ／ｄｌ以下（実験動物学の生物学的特性データ、田嶋嘉雄監修、ソフトサイエンス社）である。図６および図７に示したように、このマウスの腎機能は軽度に低下していることが認められたが、死因と考えられる重度の高尿素血症を呈するマウスは稀であった。
また、本発明マウスは全身リンパ節の腫脹、皮膚潰瘍も観察された。
以上のように、本発明マウスは、クリオグロブリン血症を認め、腎炎や全身リンパ節の腫脹、及び皮膚潰瘍を伴う自己免疫病を発症した。
【００１７】
（３）本発明マウスの生存率
本発明マウス（ＳＡＴ）マウスの生存率を観察したところ、雄が１９６日（ｎ＝１２、中間値）、雌が２３８日（ｎ＝１６、中間値）であった。
一方、比較対象となるＥＯＤ／Ｋｊマウスの生存率は雄が８２日（５０％生存率）雌が１０８日（５０％生存率）であり（特開平５−１０３５６２号）、更には（Ｗ／Ｂ）Ｆ１の雄は１３７日（中間値）であった（ブリティシュ・ジャーナル・オブ・エマトロジー、９１巻、６９１−６９６頁、１９９５年）。これら、対象マウスは、いずれも腎炎、発症を原因として死亡したものであるが、本発明マウス（ＳＡＴ）はこれらに比較して腎炎の発症が抑制され長期に生存することが確認され、病態モデルとして有用である。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明マウスの生産に関する実施例を示す。
５〜７週令の本発明マウス（ＳＡＴマウス）の雌雄を各々ホモ接合体（病態発現マウス、ベージュ色の毛色）、ヘテロ接合体（外見上は正常、野性色）に分け、これらを交配することにより仔を生産した。交配組合せは（１）ホモ：ホモ（雌：雄）が１０組、（２）ホモ：ヘテロ（雌：雄）が１４組、（３）ヘテロ：ホモ（雌：雄）が２８組、（４）ヘテロ：ヘテロ（雌：雄）１５組であった。出産仔総数は３８６匹でありホモ仔（病態発現マウス）は１５３匹（３９．６％）、一方ヘテロ仔は２３３匹（６０．４％）であった。詳細な繁殖成績を表３に示す。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
【発明の効果】
以上詳細に説明した如く、この発明によれば、ヒト血小板減少症治療薬及び自己免疫病治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として極めて価値のある特性の血小板減少症及び自己免疫病マウスが得られ、また、自己免疫性血小板減少症をより選択的に遺伝的に発症することにより、この種の疾患の特効薬の研究開発及び疾患原因の解明に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明マウス雄の血小板数の経日的推移を示す。
【図２】本発明マウス雌の血小板数の経日的推移を示す。
【図３】本発明マウス雄の抗血小板抗体価の経日的推移を示す。
【図４】本発明マウス雌の抗血小板抗体価の経日的推移を示す。
【図５】本発明マウスの血小板表面免疫グロブリンＧの測定結果を示す。
【図６】本発明マウス雄の血中尿素窒素の経日的推移を示す。
【図７】本発明マウス雌の血中尿素窒素の経日的推移を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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