(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域相補性決定領域（CDR）及びヒト抗体Ｖ領域フレームワーク領域（FR）を含んで成るヒト型化Ｖ領域において、前記CDRが、次のアミノ酸配列：
Ｈ鎖CDR
H-CDR1：Asp Tyr Tyr Met His （配列番号：133）
H-CDR2：Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe
Gln Gly （配列番号：134）
H-CDR3：Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr （配列番号：135）
Ｌ鎖CDR
L-CDR1：Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe Leu Ser（配列番号：136）
L-CDR2：Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp （配列番号：137）
L-CDR3：Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr Thr （配列番号：138）
を有し、非変性TF、非還元下変性TF及び還元下変性TFと反応するヒト型化抗体を形成する、ヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項２】
前記FRにおいて、Ｈ鎖のFRが次のアミノ酸配列：
H-FR1：Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys （配列
番号：110)
H-FR2：次の配列（1)〜(3）のいずれか：
（1）Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly （配列番
号：111）
（2）Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly （配列番
号：112）
（3）Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly （配列番
号：113）
H-FR3：次の配列（1)〜(10）のいずれか：
（1）Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Ile Ala Tyr Leu Glu
Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：114）
（2）Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：115）
（3）Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：116）
（4）Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
（配列番号：117）
（5）Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys Ile Ala Tyr Met Glu
Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
（配列番号：118）
（6）Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：119）
（7）Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys Ala Arg
（配列番号：120）
（8）Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Leu Gln
Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg
（配列番号：121）
（9）Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe Met Glu
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：122）
（10）Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
（配列番号：123）
FR4：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser （配列番号：
124）
を有する、請求項１に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項３】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＨ鎖Ｖ領域が、配列番号：30（バージョンａ）、配列番号：40（バージョンｂ）、配列番号：42（バージョンｃ）、配列番号：50（バージョンｄ）、配列番号：52（バージョンｅ）、配列番号：58（バージョンｆ）、配列番号：60（バージョンｇ）、配列番号：64（バージョンｈ）、配列番号：70（バージョンｉ）、配列番号：72（バージョンｊ）、配列番号：76（バージョンb1）、配列番号：78（バージョンd1）、配列番号：82（バージョンb3）又は配列番号：84（バージョンd3）に示すアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項４】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＨ鎖Ｖ領域が、配列番号：40（バージョンｂ）のアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項５】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＨ鎖Ｖ領域が、配列番号：70（バージョンｉ）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項６】
前記FRにおいて、Ｌ鎖のFRが次のアミノ酸配列：
L-FR1：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys （配列番号：125）
L-FR2：次の配列（1)〜(3）のいずれか：
（1）Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu LeuIle Tyr （配列
番号：126）
（2）Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr LeuIle Tyr （配列
番号：127）
（3）Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser LeuIle Tyr （配列
番号：128）
L-FR3：次の配列（1)〜(3）のいずれか：
（1）Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
（配列番号：129）
（2）Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
（配列番号：130）
（3）Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
（配列番号：131）
L-FR4：Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys （配列番号：132）
を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項７】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＬ鎖Ｖ領域が、配列番号：93（バージョンａ）、配列番号：99（バージョンｂ）、配列番号：101（バージョンｃ）、配列番号：107（バージョンb1）又は配列番号：109（バージョンb2）に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項８】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＬ鎖Ｖ領域が、配列番号：99（バージョンｂ）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項９】
前記ヒト型化抗体Ｖ領域のＬ鎖Ｖ領域が、配列番号：109（バージョンb2）に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒト型化Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域を含んで成る、ヒトTFに対するヒト型化抗体。
【請求項１１】
前記ヒト抗体Ｃ領域のＨ鎖Ｃ領域が、Cγ1，Cγ2，Cγ3又はCγ4である、請求項10に記載のヒト型化抗体。
【請求項１２】
前記ヒト抗体Ｃ領域のＬ鎖Ｃ領域が、Cλ又はCκである、請求項10又は11記載のヒト型化抗体。
【請求項１３】
配列番号：40（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖及び配列番号：99（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んで成るヒト型化Ｌ鎖からなる、ヒトTFに対するヒト型化抗体。
【請求項１４】
配列番号：70（バージョンｉ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖及び配列番号：99（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んで成るヒト型化Ｌ鎖からなる、ヒトTFに対するヒト型化抗体。
【請求項１５】
配列番号：70（バージョンｉ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖及び配列番号109（バージョンb2）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｌ鎖からなる、ヒトTFに対するヒト型化抗体。
【請求項１６】
非変性TF、非還元下変性TF及び還元下変性TFと結合する、請求項10〜15のいずれか１項に記載のヒト組織因子に対する抗体。
【請求項１７】
解離定数（KD）が1.09×10-9〜2.30×10-8[1/M]である、請求項１〜15のいずれか1項に記載の抗体Ｖ領域又は抗体。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒト型化抗体Ｖ領域のＨ鎖又端Ｌ鎖をコードするDNA。
【請求項１９】
請求項10〜15のいずれか１項に記載のヒト型化抗体のＨ領域又はＬ領域をコードするDNA。
【請求項２０】
請求項18又は19に記載のヒト型化Ｈ鎖をコードするDNA及びＬ鎖をコードするDNAを、同一又は別々のベクターに含んで成る発現ベクター。
【請求項２１】
前記ヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAとＬ鎖をコードするDNAが、配列番号：40（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAと配列番号：99（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型Ｌ鎖をコードするDNAとである、請求項20に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAとＬ鎖をコードするDNAが、配列番号：70（バージョンｉ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAと配列番号99（バージョンｂ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｌ鎖をコードするDNAとである、請求項20に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記ヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAとＬ鎖をコードするDNAが、配列番号：70（バージョンｉ）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｈ鎖をコードするDNAと配列番号：109（バージョンb2）のアミノ酸配列を含んでなるヒト型化Ｌ鎖をコードするDNAとである、請求項20に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
請求項20〜23のいずれか１項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
【請求項２５】
請求項24に記載の宿主を培養し、該培養物からヒト型化抗体を採取することを特徴とする、ヒトTFに対するヒト型化抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ヒト組織因子（ＴＦ）に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体に移植されているヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ鎖又はＨ鎖を構成するＶ領域の断片に関する。本発明はさらに、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体の作製方法に関する。
本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ領域の断片をコードするＤＮＡ、及びＶ領域を含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡに関する。本発明はさらに、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はさらに、ヒトＴＦに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）治療薬に関する。
背景技術
組織因子（ＴＦ）は、細胞表面に発現される凝固第ＶＩＩ因子受容体であり、凝固第ＶＩＩ因子との複合体形成を通じて、凝固第ＩＸ因子およびＸ因子の活性化に不可欠な役割を担っており、血液凝固反応の実質的な開始因子と位置づけられている。
ＴＦは血管を構成する線維芽細胞や平滑筋細胞などに発現されており、血管損傷の際に凝固系を活性化して止血機能を果たすことが知られている。
ＤＩＣは、血管内での凝固系の活性化によって全身の主として細小血管内に血栓が多発する疾患である。血小板や凝固因子が消費されて低下することにより、血栓とは逆の現象である出血を生じることも少なくない。また多発した微小血栓により重要臓器の微小循環不全をきたし、一旦発症すると不可逆的な機能障害を残すことも多く、ＤＩＣの予後が不良となるため、重要な疾患と認識されている。
厚生省特定疾患血液凝固異常症調査研究班平成２年度および４年度の研究報告書から推定される基礎疾患の割合は、造血器悪性腫瘍が約３０％、固形癌約２０％、感染症約１５％、産科的疾患約１０％、肝疾患６％、ショック５％、心血管系疾患３％である。またＤＩＣの発症頻度は白血病が約１５％、悪性リンパ種が６〜７％と高く、固形癌では３％程度である。
これら種々の疾患に合併してＤＩＣは発症するが、その原因物質は共通であり、それがＴＦである。すなわち、急性白血病や悪性リンパ腫、固形癌においては腫瘍細胞のＴＦの生成・発現の異常亢進、感染症（特にグラム陰性菌性敗血症）においては単球・血管内皮細胞におけるＴＦ産生・発現の亢進、劇症肝炎では壊死した肝組織からのＴＦの血中への流入、大動脈瘤・心臓瘤・巨大血管腫では血管内面でのＴＦ形成、また産科的疾患（羊水栓塞・常位胎盤早期剥離）や手術・外傷・火傷においてもＴＦの血中への流入がＤＩＣの発症機序と考えられている。
原疾患（基礎疾患）の治療が第一であるが、実際にはこれが容易ではない。
現状のＤＩＣ治療法としては、抗凝固療法と補充療法が行われている。抗凝固療法の中心となっているのはヘパリン製剤（未分画ヘパリン、低分子ヘパリン）であり、合成蛋白分解酵素阻害剤（メシル酸ガベキサート、メシル酸ナファモスタット）や濃縮血漿製剤（アンチトロンビンＩＩＩ、活性化プロテインＣ製剤）も用いられている。補充療法としては濃縮血小板血漿や新鮮凍結血漿（フィブリンの補給）、洗浄赤血球等がある。
しかし現状の治療薬では、有効性や副作用の面で十分に満足できるものはなく、ＤＩＣからの完全離脱が出来ない場合がほとんどであることより、治療効果が高く副作用の少ない薬剤の使用が期待されている。
一方、新しいＤＩＣ治療の試みとしては、トロンボモジュリン製剤やヒルジン、抗ＰＡＦ剤がある。ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）や、ＦＸａ選択的阻害剤が経口投与可能な抗凝固・抗血栓剤として注目を集めている。また、ＴＦの活性を中和するものとして、ＷＯ８８／０７５４３には、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体が、ＷＯ９６／４０９２１には、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体として開示されている。
マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体は、ＤＩＣに於いて主薬効に伴う出血傾向などを示さない安全で有効な治療薬となることが期待できる。しかしながら、マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）を有し、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス抗体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、血清病又は他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウスモノクローナル抗体をヒトに頻回投与することはできない。
これらの問題を解決するため、非ヒト由来の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫原性を低減させる方法が開発された。その一つが、抗体の可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。
得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全な形で含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来するアミノ酸配列の比率が実質的に滅少しでおり、それ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想されるが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．，Ｆ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，１９８９）。
マウス抗体の免疫原性を低減させるための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させることが期待される。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を作製する。ただし、必要によっては、再構成ヒト可変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分は、ＣＤＲ及び極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。
ヒト型化抗体については、さらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．らＮａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅ，Ｍ．らＳｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９９８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．らＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，１９９１；Ｃａｔｅｒ，Ｐ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１１４９−１１５４，１９９２；及びＳａｔｏ，Ｋ．，らＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５１−８５６，１９９３を参照のこと。
従来のヒト型化技術では、フレームワーク領域（ＦＲ）の一部にマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植されたアミノ酸配列を含む。そのため、ヒトにおいて治療薬として投与した場合に、可変領域の−ないし数アミノ酸ではあるが、ヒトに存在しないアミノ酸配列を有する部位に対する抗体ができる危険性が存在する。この危険性を回避するために、第三のヒト型化技術を考案した。すなわち、三個のＣＤＲの立体構造を保持するために必要な四個のＦＲ（ＦＲ１〜４）について、一つのＦＲを単位として、データベース上に存在するマウス抗体のＦＲと相同性の高いヒト抗体のＦＲを置換する方法である。この際、データベース上に存在するヒト抗体から数種類のＦＲを選択し、順次置換（ｓｈｕｆｆｌｅ）することにより活性の高いヒト型化抗体の作製を行う。
こうすることにより、可変領域の中でＣＤＲを除くＦＲは、全てヒト抗体由来のアミノ酸配列を有するヒト型化抗体を作製することが出来る。このため、マウスＣＤＲを担持するヒト型化抗体は、もはやヒトＣＤＲを含有するヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
前記のごとく、ヒト型化抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒト型化抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在せず、特定の抗原に対して十分な結合活性、中和活性を示すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５１−８５６，１９９３を参照のこと）。
発明の開示
本発明は、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ鎖又はＨ鎖を構成するＶ領域の断片を提供することを目的とする。本発明はさらに、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体の作製方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ領域の断片をコードするＤＮＡ、及びＶ領域の断片を含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡを提供することを目的とする。本発明はさらに、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及ぶ該ベクターにより形質転換された宿主を提供することを目的とする。本発明はさらに、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）治療薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のヒトにおける免疫原性が低減されている抗体を得ることに成功し、また、新しいヒト型化抗体の作製方法を開発し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片を含むキメラＨ鎖に関する。Ｈ鎖Ｖ領域としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、Ｃ領域としてはＣγ４領域のものが挙げられる。
さらに、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の断片を含むキメラＬ鎖に関する。Ｌ鎖Ｖ領域としては、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、Ｌ鏑Ｃ領域としてはＣκ領域のものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記キメラＨ鎖及びキメラＬ鎖を含む、ヒトＴＦに対するヒトマウスキメラモノクローナル抗体に関する。
さらに、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）１〜４、及びヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片に関する。ＣＤＲ１〜３としては、それぞれ配列番号１３３〜１３５で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ１との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ１が挙げられ、ＦＲ２としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ２との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ２が挙げられ、ＦＲ３としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ３との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ３が挙げられ、ＦＲ４としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ４との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ４が挙げられる。
好ましくは、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ１との相同性が５０％以上のヒト抗体ＦＲ１が挙げられ、ＦＲ２としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ２との相同性が７０％以上のヒト抗体ＦＲ２が挙げられ、ＦＲ３としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ３との相同性が６５％以上のヒト抗体ＦＲ３が挙げられ、ＦＲ４としては、マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域ＦＲ４との相同性が８０％以上のヒト抗体ＦＲ４が挙げられる。具体的な例としては、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられ、ＦＲ２としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０、ヒト抗体Ｐ０１７４２およびヒト抗体の７８０８４４が挙げられ、ＦＲ３としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０、ヒト抗体Ｚ３４９６３、ヒト抗体Ｐ０１８２５、ヒト抗体Ｍ６２７２３、ヒト抗体Ｚ８０８４４、ヒト抗体Ｌ０４３４５、ヒト抗体Ｓ７８３２２、ヒト抗体Ｚ２６８２７、ヒト抗体Ｕ９５２３９およびヒト抗体Ｌ０３１４７が挙げられ、ＦＲ４としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられる。
好ましい例としては、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられ、ＦＲ２としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０、およびヒト抗体のＺ８０８４４が挙げられ、ＦＲ３としては、ヒト抗体Ｚ３４９６３、ヒト抗体Ｍ６２７２３およびヒト抗体Ｕ９５２３９が挙げられ、ＦＲ４としてヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられる。さらに好ましい例としては、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられ、ＦＲ２としては、ヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられ、ＦＲ３としては、ヒト抗体Ｚ３４９６３およびヒト抗体Ｕ９５２３９が挙げられ、ＦＲ４としてヒト抗体Ｌ３９１３０が挙げられる。
さらに、本発明は、フレームワーク領域中の番号としてＫａｂａｔの規定（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）による。
さらに、本発明は、配列番号３０、４０、４２、５０、５２、５８、６０、６４、７０、７２、７６、７８、８２、８４で表されるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片に関する。
さらに、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１〜４、及びヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域の断片に関する。ＣＤＲ１〜３としては、それぞれ配列番号１３６〜１３８で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ１との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ１が挙げられ、ＦＲ２としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ２との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ２が挙げられ、ＦＲ３としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ３との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ３が挙げられ、ＦＲ４としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ４との相同性が４０％以上のヒト抗体ＦＲ４が挙げられる。
好ましくは、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ１との相同性が７５％以上のヒト抗体ＦＲ１が挙げられ、ＦＲ２としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ２との相同性が８０％以上のヒト抗体ＦＲ２が挙げられ、ＦＲ３としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ３との相同性が７０％以上のヒト抗体ＦＲ３が挙げられ、ＦＲ４としては、マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域ＦＲ４との相同性が８０％以上のヒト抗体ＦＲ４が挙げられる。具体的な例としては、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、ヒト抗体Ｚ３７３３２が挙げられ、ＦＲ２としては、ヒト抗体Ｚ３７３３２およびヒト抗体Ｘ９３６２５が挙げられ、ＦＲ３としては、ヒト抗体Ｚ３７３３２、ヒト抗体Ｓ６８６９９およびＰ０１６０７が挙げられ、ＦＲ４としてヒト抗体Ｚ３７３３２が挙げられる。さらに好ましい例としては、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ１としては、ヒト抗体Ｚ３７３３２が挙げられ、ＦＲ２としては、ヒト抗体Ｘ９３６２５が挙げられ、ＦＲ３としては、ヒト抗体Ｓ６８６９９が挙げられ、ＦＲ４としてヒト抗体Ｚ３７３３２が挙げられる。
さらに、本発明は、フレームワーク領域中の番号としてＫａｂａｔの規定（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ，Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）による。
さらに、本発明は、配列番号９３、９９、１０１、１０７又は１０９で表されるアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域の断片に関する。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片及びヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域の断片を含む、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体のＨ鎖に関する。ここで、Ｃ領域としてはＣγ４領域、ヒト抗体由来のＦＲ１〜４としては、それぞれヒト抗体Ｌ３９１３０（ＦＲ１）、ヒト抗体Ｌ３９１３０（ＦＲ２）、ヒト抗体Ｚ３４９６３（ＦＲ３）またはヒト抗体Ｕ９５２３９（ＦＲ３）、ヒト抗体Ｌ３９１３０（ＦＲ４）由来のもの、そしてＣＤＲ１〜３としてはそれぞれ配列番号１３３〜１３５で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域の断片及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域の断片を含む、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体のＬ鎖に関する。ここで、Ｃ領域としてはＣκ領域、ヒト抗体由来のＦＲ１〜４としては、それぞれヒト抗体Ｚ３７３３２（ＦＲ１）、ヒト抗体Ｘ９３６２５（ＦＲ２）、ヒト抗体Ｓ６８６９９（ＦＲ３）、ヒト抗体Ｚ３７３３２（ＦＲ４）由来のもの、そしてＣＤＲ１〜３としてはそれぞれ配列番号１３６〜１３８で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ鎖及びＨ鎖を含む、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体に関する。
さらに、本発明は、ヒトＴＦに対するヒト型化抗体の作製方法に関する。ヒト型化の作製方法とは、Ｈ鎖またはＬ鎖の抗原認識部位であるＣＤＲ１〜３の構造を支えるＦＲ１〜４の選択方法に関する。すなわち、各ＦＲを一つの単位として、マウス抗体由来のＦＲと相同性の高いヒト抗体のＦＲを複数選択し、そのＦＲを順次置換（ｓｈｕｆｆｌｅ）して所望の活性を有するヒト型化抗体の作製方法に関する。
さらに詳しくは、本発明のヒト型化抗体の製造方法の一例においては、非ヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び天然ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）を有する免疫原性を低減させた天然ヒト型化抗体の製造方法において、
（１）目的とする抗原に対して反応性の非ヒトモノクローナル抗体を用意し、
（２）前記（１）のモノクローナル抗体中のＦＲのアミノ酸配列に対して高い相同性を有するヒト抗体を複数用意し、
（３）前記（２）における１種類のヒト抗体の４個のＦＲを前記（１）の非ヒトモノクローナル抗体の対応するＦＲにより置換して第一のヒト型化抗体を作製し、
（４）前記（３）において作製したヒト型化抗体の抗原への結合性又は抗原の生物活性を中和する能力を測定し、
（５）前記（３）において作製したヒト型化抗体中の１〜３個のＦＲを、（２）で用意したヒト抗体の内、（３）で使用したものとは異なるヒト抗体の対応するＦＲにより置換して第二のヒト型化抗体を作製し、
（６）前記（５）で作製した第二のヒト型化抗体と前記（３）で得た第一のヒト型化抗体とを、抗原に対する結合性、又は抗原の生物活性を中和する能力について比較し、好都合な活性を示すヒト型化抗体を選択し、
（７）前記（６）で選択されたヒト型化抗体について、前記（３）〜（６）の段階を実施し、そして
（８）前記（１）における非ヒトモノクローナル抗体と同等の活性を有するヒト型化抗体が得られるまで前記（３）〜（６）の段階を反復する、
ことを特徴とする。
ヒトＴＦに対する中和活性をある程度有するヒト型化抗体が得られれば、そのＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の特定のＦＲに対してさらに相同性の検索を行い、さらに相同性の高いヒト抗体を選択することが出来る。ここで得られたヒト抗体を上記の工程（２）の複数のヒト抗体群に加えて、さらに工程（３）〜（６）を反復し、所望の活性を有するヒト型化抗体を得ることが出来る。
さらに、本発明は、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片又はＬ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡに関する。Ｈ鎖Ｖ領域の断片及びＬ鎖Ｖ領域の断片のアミノ酸配列及びＤＮＡとしては、それぞれ配列番号９又は１５で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記キメラＨ鎖又はキメラＬ鎖をコードするＤＮＡに関する。該Ｈ鎖をコードするＤＮＡとしては例えば配列番号９で表される塩基配列を含むものが挙げられ、該Ｌ鎖をコードするＤＮＡとしては配列番号１５で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域の断片又はＬ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡに関する。Ｈ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡとしては配列番号２９、３９、４１、４９、５１、５７、５９、６３、６９、７１、７５、７７、８１又は８３で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられ、Ｌ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡとしては配列番号９２、９８、１００、１０６又は１０８で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、ヒト型化抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡに関する。
さらに、本発明は、配列番号３０、４０、４２、５０、５２、５８、６０、６４、７０、７２、７６、７８、８２又は８４で表されるいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む、ヒト型化抗体のＨ鎖ＤＮＡに関する。該ＤＮＡとしては、配列番号２９、３９、４１、４９、５１、５７、５９、６３、６９、７１、７５、７７、８１又は８３で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡに関する。
さらに、本発明は、配列番号９３、９９、１０１、１０７又は１０９で表されるアミノ酸配列をコードする、ヒト型化抗体のＬ鎖ＤＮＡである。該ＤＮＡとしては配列番号９２、９８、１００、１０６又は１０８で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記いずれかのＤＮＡを含む組換えベクターに関する。
さらに、本発明は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体に関する。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヒトＴＦに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体を採取することを特徴とするヒトＴＦに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物又はＤＩＣ治療剤に関する。
発明の実施の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の作製
ＴＦに対するマウスモノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからＴＦ活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製される。
すなわち、ヒト胎盤より精製したＴＦを抗原として免疫したマウスの脾細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのスクリーニングは、抗体のＴＦとの結合能はＴＦ高発現細胞株Ｊ８２を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで、ＴＦに対する中和能は凝固第Ｘ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ：ＦＸ）の活性化に対する阻害活性を指標にした測定系で行った。その結果、ＴＦ／ＶＩＩａ複合体のＦＸ活性化を強く阻害する抗体６種を産生するハイブリドーマの樹立に成功した。
（１）抗原の調製
動物の免疫に用いるＴＦとしては、組換えＤＮＡ法又は化学合成により調製したＴＦのアミノ酸配列の一部のペプチド、又はヒト胎盤由来のＴＦなどが挙げられる。例えば、Ｉｔｏらの方法（Ｉｔｏ  Ｔ．らＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，６９１−６９６，１９９３）に準じて行い精製したヒト胎盤由来のＴＦを抗原として用いることができる。
得られたヒトＴＦは、アジュバントと混合し抗原として用いる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
（２）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた抗原を非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間間隔で免疫する。
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、０．１〜１００μｇが用いられる。
（３）抗体価の測定
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、又は抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。
抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
（４）細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８−１５５０，１９７９），Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７，１９７８），ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１−５１９，１９７６），ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５，１９７６），ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．らＮａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８），Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１−２１，１９８０），Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｅ，Ｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３，１９７８），Ｒ２１０（ＧＧａｌｆｒｅ，Ｇ．らＮａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３，１９７９）等が好適に使用される。
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。
細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（５）ハイブリドーマの選択及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、種々の測定系を組み合わせて行うことが出来る。例えば、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡのごとき抗原認識測定系やＦａｃｔｏｒ  Ｘａ活性を指標としたＴＦ中和活性測定系、血漿凝固阻害活性測定系のごとき中和活性測定系を組み合わせて所望の活性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。このようにして、例えば、ＡＴＲ−２、ＡＴＲ−３、ＡＴＲ−４、ＡＴＲ−５、ＡＴＲ−７およびＡＴＲ−８のごときモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得することが出来る。
（６）モノクローナル抗体の採取
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水又は血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製する。
２．ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
（ｉ）ｍＲＮＡの調製
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングを行うため、回収されたハイブリドーマから公知の方法、例えばグアニジン−超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９７９），１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐら（１９８７），１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添付されたオリゴ（ｄＴ）−セルロース  スパンカラム等によりｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いることにより、全ＲＮＡの抽出操作を経ずに、ｍＲＮＡの調製を行うこともできる。
（ｉｉ）ｃＤＮＡの調製及び増幅
上記（ｉ）で得たｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域におけるｃＤＮＡをそれぞれ合成する。ｃＤＮＡの合成は、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー又はＬ鎖Ｃ領域若しくはＨ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする適当なプライマー（例えばキット添付のｃＤＮＡ合成プライマー）を用いることが出来る。
ｃＤＮＡ合成反応は、前記ｍＲＮＡとプライマーとを混合し、逆転写酵素の存在下で例えば５２℃で３０分の反応を行う。
ｃＤＮＡの増幅は、Ｌ鎖及びＨ鎖ともに５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２，１９８８，Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．らＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）に基づくＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来る。すなわち、上記で合成した２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ  ａｄａｐｔｅｒを連結し、Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡ（以下、Ｌ鎖Ｖ領域の断片をコードするＤＮＡを「Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡ」又は「Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ」と略記することもある（Ｈ鎖Ｖ領域等についても同様））についてＰＣＲを行う。
Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、例えば５′−側プライマーにはキット添付のＡｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ１と３′−側プライマーにはマウス抗体のＨ鎖定常領域ＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号１）（ＡＴＲ−２、ＡＴＲ−３、ＡＴＲ−４およびＡＴＲ−５）（Ｃγ１領域）あるいはＭＨＣ−Ｇ２ａプライマー（配列番号２）（ＡＴＲ−７およびＡＴＲ−８）（Ｃγ２ａ領域）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を用いることが出来る。また、Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、例えば５′−側プライマーにはキット添付のＡｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ１と３′−側プライマーにはマウス抗体のＬ鎖κ鎖定常領域（Ｃκ領域）プライマー（例えば配列番号３で表される塩基配列を有するＭＫＣプライマー）を用いることが出来る。
（ｉｉｉ）ＤＮＡの精製及び塩基配列の決定
ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した後、ＤＮＡの回収及び精製を行い、ベクターＤＮＡに連結する。
ＤＮＡの精製は、フェノール及びクロロホルムで抽出するか（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、市販のキット（例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ；ＢＩ０１０１）を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることができる。
前記ＤＮＡと上記ベクターＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン）等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを調製する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。本発明では、自動塩基配列決定装置（ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いることができる。
（ｉｖ）相補性決定領域（ＣＤＲ）
Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、抗原結合部位を形成し、その全般の構造は互いに類似性を有している。すなわち、それぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）部分が、３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。ＦＲのアミノ酸配列は比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
前記４個のＦＲの多くの部分は、β−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲは、ある場合にはβ−シート構造の一部を形成することもある。従って、３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そしてＦＲは対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
このような事実に基づき、ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見いだすことが出来る。
ＣＤＲ領域の配列は、ヒト型化抗体を作製した際にヒトＴＦに対する結合活性及び中和活性が保持される範囲内であれば、挿入、置換又は欠失による改変体も本発明に含まれる。例えば、配列番号１３３−１３８の各ＣＤＲ又は配列番号１３９−１４１，１４３−１４４，１４５−１４７及び１４９−１５０のＶ領域中の各ＣＤＲ領域との相同性が９０〜１００％の配列であるものが挙げられる。好ましくは、相同性が９５〜１００％の配列であるものが挙げられる。さらに好ましくは、相同性が９８〜１００％の配列であるものが挙げられる。
３．キメラ抗体の発現ベクターの作製
マウスモノクローナル抗体のマウスＬ鎖（以下、抗体のＬ鎖又はＨ鎖を表す場合は、マウスについては「マウスＬ鎖」、ヒト抗体のＨ鎖については「ヒトＨ鎖」のように略記することもある。）及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒトＴＦ抗体が得られる。
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んでなる。あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを含んでなる。
ヒト抗体Ｃ領域の断片は、任意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域のものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについてはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４、及びＬ鎖のものについてはＣλ又はＣκを各々挙げることができる。
キメラ抗体の製造のためには、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとてマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとてマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）を作製する。次に、この発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。単一の発現ベクターには、ＩｇＧｌκ型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＩｇＧ４κ型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いることができる。
（ｉ）キメラ抗体Ｈ鎖の構築
キメラ抗体のＨ鎖発現ベクターは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｈ鎖Ｃ領域としては、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４領域が挙げられる。
ここで、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを発現ベクターに挿入するにあたり、ＰＣＲ法により該ｃＤＮＡに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするため該ｃＤＮＡの開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、該ｃＤＮＡの３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を発現ベクターに導入することができる。
こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、上記発現ベクターに挿入して、Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１あるいはＣγ４）をコードするＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。
（ｉｉ）キメラ抗体Ｌ鎖κ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
キメラ抗体のＬ鎖発現ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｌ鎖Ｃ領域としては、例えばＣκ、Ｃλ領域が挙げられる。
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築するにあたり、ＰＣＲ法により、該ｃＤＮＡに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡに導入する。
こうして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、上記発現ベクターに挿入して、Ｌ鎖Ｃ領域（Ｃκ領域）をコードするＤＮＡを含むキメラＬ鎖発現ベクターを構築する。
４．ヒト型化抗体の作製
（１）ヒト抗体との相同性検索
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト型化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域を、Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。また、同時にＫａｂａｔらにより、抗体のＦＲの長さ、アミノ酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグループ（ＨＳＧ：Ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ）（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）との比較を行う。
ヒトＨ鎖Ｖ領域の場合は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜ＩＩＩに分類することが出来、例えば、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＨ鎖Ｖ領域は、ＨＳＧＩのコンセンサス配列と６７．８％のホモロジーを有する。一方、ヒトＬ鎖κ鎖Ｖ領域は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜ＩＶに分類することが出来、例えば、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＬ鎖κ鎖Ｖ領域は、ＨＳＧＩのコンセンサス配列と７２．３％のホモロジーを有する。
従来の技術によりマウス抗体をヒト型化する場合には、必要によっては、ヒト型化Ｖ領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているマウス抗体のＶ領域のＦＲの一部のアミノ酸配列をヒトＶ領域のＦＲに移植する場合がある。しかしながら、マウス抗体のＶ領域ＦＲのどのアミノ酸をヒト抗体Ｖ領域のＦＲに移植すべきかについては、一定の法則がない。従って、ＣＤＲの構造を保持するために必須のアミノ酸を特定することは、多くの努力を必要とする。
また、ＦＲの一部にマウス抗体のＶ領域からヒトＶ領域に移植されたアミノ酸配列に対するヒト抗体ができる危険性が存在する。本発明では、ヒト型化した抗体に於いてＣＤＲを除く全てのアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列とするために、ＣＤＲの立体構造を保持するために必要な四個のＦＲ（ＦＲ１〜４）について、一つのＦＲを単位として、データベース上に存在するマウス抗体のＦＲと相同性の高いヒト抗体のＦＲを検索した。以下に、モノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の各ＦＲについて、データーベースと相同性検索した結果を示す。
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（２）ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの設計
ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの設計における第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域の各ＦＲを選択することである。また、ＦＲ  ｓｈｕｆｆｌｅにおいては、それぞれのＦＲにおいて、バラエティーの高いヒト抗体Ｖ領域ＦＲを選択する必要がある。
本発明においては、モノクローナル抗体ＡＴＲ−５に関しては、Ｈ鎖については、マウス抗体Ｈ鎖Ｖ領域全体と各ＦＲとのホモロジー検索の結果から、ＦＲ２については３種類、ＦＲ３については１０種類のヒト抗体Ｖ領域ＦＲを選択した。Ｌ鎖については、マウス抗体Ｌ鎖Ｖ領域全体と各ＦＲとのホモロジー検索の結果から、ＦＲ２については３種類、ＦＲ３については３種類のヒト抗体Ｖ領域ＦＲを選択する事が出来る。
ヒト型化Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域ともに、第一のバージョン（バージョンａ：ｖｅｒ．ａ）として、マウスモノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域とそれぞれホモロジーの高いヒト抗体Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域Ｌ３９１３０とＺ３７３３２を選択する事が出来る。これらのヒト型化抗体を作製するに当たり、ＦＲ  ｓｈｕｆｆｌｅを容易に行えるように各ＣＤＲ内部及びＦＲの適当な部位に、適当な制限酵素認識部位を設計する事が出来る。こうすることにより、いずれかのＦＲのみを容易に入れ替えることが可能になる。
例えばヒト型化Ｈ鎖ＣＤＲ１の制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ認識部位、ＣＤＲ２の制限酵素ＢａｌＩ認識部位、ＣＤＲ３の制限酵素ＮｃｏＩ認識部位およびＦＲ３の制限酵素ＸｈｏＩ認識部位、例えばヒト型化Ｌ鎖ＣＤＲ１の制限酵素ＡｆｌＩＩ認識部位、ＣＤＲ２の制限酵素ＳｐｅＩ認識部位、ＣＤＲ３の制限酵素ＰｓｔＩ認識部位およびＦＲ３の制限酵素ＡｃｃＩＩＩ認識部位である。
このように設計したバージョンａを基にして、それぞれのＦＲについてＦＲ  ｓｈｕｆｆｌｅを行い、所望の活性を有するヒト型化抗体を作製する事が出来る。
（３）ヒト型化抗体Ｖ領域の断片の作製
本発明のヒト型化抗体は、該抗体のＣ領域、及びＶ領域のＦＲがヒト抗体由来のものであり、Ｖ領域のＣＤＲがマウス抗体由来のものである。本発明のヒト型化抗体のＶ領域の断片は、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が入手可能ならば、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングと呼ばれる手法により作製することができる。「ＣＤＲ−グラフティング」とは、マウス由来のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を作製し、これを鋳型となるヒト抗体のＣＤＲと入れ換える手法をいう。
また、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が入手できない場合は、データベースに登録されている塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒト型化抗体Ｖ領域を作製することができる。さらに、アミノ酸配列のみデータベースに登録されている場合は、そのアミノ酸配列を基に、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らの報告（ＵＳ  Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）している抗体のコドン使用頻度に基づいて、全塩基配列を類推することができる。この塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒト型化抗体Ｖ領域の断片を作製することができる。
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び発現ベクターの構築
本発明では、ヒト型化抗体の鋳型とするヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子をデータベースから入手し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法により構築することが出来る。例えば、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＨ鎖Ｖ領域と高い相同性（ホモロジー）を有するＬ３９１３０をヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域バージョン“ａ”として作製することが出来る。ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域バージョン“ａ”を作製するためには、例えば配列番号２２〜２６に示す５本のプライマー及び配列番号２７、２８に示す２本の外部プライマーに分けて使用する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ（配列番号２２）、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ（配列番号２３）及びｈＲ５Ｈｖ４Ｓ（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、モしてＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ３Ａ（配列番号２５）及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１８−３５ｂｐの相補的配列を有する。ｈＲ５Ｈｖ１ＳはＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）およびＳａｌＩ認識部位を有するように、またｈＲ５Ｈｖ５ＡはＮｈｅＩ認識部位を有するように設計する。また外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ（配列番号２７）及びｈＲ５ＨｖＰｒＡ（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａとホモロジーを有する。
ＰＣＲ法を用いて、５本のプライマーをアセンブリさせ完全長のｃＤＮＡ合成し、さらに外部プライマーを加えＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法によるアセンブリとは、ｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａとがその相補的配列によりアニーリングし、完全長のヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡが合成されることを指す。
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＨ鎖Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を挙げることができる。
前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、例えばヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１またはＣγ４のＤＮＡと連結することができる。キメラ抗体Ｈ鎖の構築で述べたように、適当な制限酵素にて処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び発現ベクターの構築
本発明では、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの場合と同様、鋳型となるヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域の遺伝子をデータベースから入手し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法により構築することが出来る。例えば、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体ＡＴＲ−５のＬ鎖Ｖ領域と高い相同性（ホモロジー）を有するＺ３７３３２をヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域バージョン“ａ”として作製することが出来る。
ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域バージョン“ａ”を作製するためには、ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ（配列番号８５）及びｈ５Ｌｖ４Ｓ（配列番号８６）はセンスＤＮＡ配列を、ＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ２Ａ（配列番号８７）、ｈ５Ｌｖ３Ａ（配列番号８８）及びｈ５Ｌｖ５Ａ（配列番号８９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、各プライマーの両端に２０ｂｐの相補的配列を有する。プライマーｈ５Ｌｖ１Ｓは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）および制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位を有するように、またｈ５Ｌｖ５Ａは制限酵素ＳｐｌＩ認識部位を有するように設計する。また、外部プライマーｈ５ＬｖＳ（配列番号９０）及びｈｓＬｖＡ（配列番号９１）はＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ及びｈ５Ｌｖ５Ａとホモロジーを有する。
ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域と同様に、ＰＣＲ法を用いて、５本のプライマーをアセンブリさせ完全長のｃＤＮＡ合成し、さらに外部プライマーを加えＤＮＡの増幅を行うことが出来る。
ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＬ鎖ＣλやＣκを挙げることができる。
前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖ＣκやＣλ領域のものと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
前記のようにして、ヒト型化抗体のＶ領域断片が作製されても、該Ｖ領域断片が抗体としての活性（抗原に対する結合活性、中和活性等）を有するか否かは必ずしも明らかではない。そのため、ヒト型化Ｈ鎖との組み合わせによりＣＯＳ−７のごとき動物細胞で発現させ、活性の有無を検討する必要がある。
（ｉｉｉ）ヒト型化抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲ  ｓｈｕｆｆｌｅ
本発明者は、作製したヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を含むヒト型化抗体をＣＯＳ−７のごとき動物細胞で一過性に発現させ、抗原結合活性及び中和活性について検討した結果、抗原結合活性及び中和活性を有するものの、キメラ抗体と比較して十分でないことがことが判明した。
本発明者は、ヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＦＲを順次ｓｈｕｆｆｌｅすることにより、この問題を解決する事が出来る。ＦＲのｓｈｕｆｆｌｅに用いるヒト抗体は、既存のデータベースより選択する事が出来る。選択したヒト抗体のＦＲは、データベースで明らかになっている塩基配列を基に、ＤＮＡ合成機により合成することが出来る。この際、前記のように、ＣＤＲもしくはＦＲに設計した制限酵素認識配列を付加することにより、上記で作製したヒト型化抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲと、容易にｓｈｕｆｆｌｅすることが出来る。このようにして作製したヒト型化抗体の活性を調べることにより、所望する抗原結合活性並びに中和活性を有するヒト型化抗体を得ることが出来る。
例えば、ヒト型化抗体Ｖ領域Ｈ鎖ＦＲ３をヒト抗体Ｚ３４９６３（ＧｅｎＢａｎｋ，Ｂｏｒｒｅｔｚｅｎ  Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，１２９１７−１２９２１，１９９４）由来のＦＲ３にｓｈｕｆｆｌｅする事が出来る。
ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＲＦＦＳ（配列番号３５）およびＦ３ＲＦＢＳ（配列番号３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＲＦＦＡ（配列番号３７）およびＦ３ＲＦＢＡ（配列番号３８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＲＦＦＳ、Ｆ３ＲＦＢＳ、Ｆ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＡはＤＮＡ合成機で合成することが出来る。
Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩおよびＸｈｏＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩおよびＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を確認することにより正しい配列を有するプラスミドを得ることが出来る。このようにして得られたヒト型化抗体Ｈ鎖を含むプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣと命名し、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖をバージョン“ｂ”とする。その塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号３９に示し、バージョン“ｂ”のアミノ酸配列を配列番号４０に示す。
同様にして、データベースから選択した他のヒト抗体Ｖ領域Ｈ鎖およびＬ鎖由来のＦＲについても、ヒト型化抗体Ｖ領域Ｈ鎖及びＬ鎖のＦＲとｓｈｕｆｆｌｅすることが出来る。
ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲをｓｈｕｆｆｌｅするためのさらに好ましいヒト抗体を選択するためには、以下のようにして行うことが出来る。すなわち、ヒト型化抗体Ｈ鎖バージョン“ｂ”とキメラ抗体Ｌ鎖の組み合わせでは、キメラ抗体あるいはマウス抗体と同等の中和活性を有する。しかしながら、ヒト型化抗体Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”との組み合わせでは、キメラ抗体あるいはマウス抗体より中和活性が低下している。
このような場合に、ＦＲをｓｈｕｆｆｌｅするため候補とするヒト抗体を選択するためには、例えば、ヒト型化抗体Ｈ鎖バージョン“ｂ”のＦＲ３（アクセッションＮｏ．７３４９６３：配列番号１１５）に対する相同性検索を行い、この配列と相同性の高いヒト抗体を選択することが出来る。例えば、このようにして選択したヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域ＦＲ３では、Ｕ９５２３９（配列番号１２２）やＬ０３１４７（配列番号１２３）が挙げられる。
このようにして作製したヒト型化抗体Ｖ領域Ｈ鎖のアミノ酸配列を表３及び表４に示し、そしてヒト型化抗体Ｖ領域Ｌ鎖のアミノ酸配列を表５に示す。
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前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域各バージョンは、任意のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域、例えばそれぞれヒトＨ鎖Ｃγ４およびヒトＬ鎖Ｃκ領域のＤＮＡと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＨ鎖Ｃγ４およびヒトＬ鎖Ｃκ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域各バージョンをコードするＤＮＡと、それぞれヒトＨ鎖Ｃγ４及びヒトＬ鎖Ｃκ領域をコードするＤＮＡとを含む発現ベクターを作製する。
また、前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするヒト型化抗体を生産させることができる。
５．キメラ抗体及びヒト型化抗体の製造
キメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するためには、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ、並びにＬ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一ベクターに連結し、適当な宿主細胞を形質転換し、抗体を産生させることができる。すなわち、キメラ抗体の発現には、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリーダー配列並びにマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。
ヒト型化抗体の発現には、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。そして、これらのベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体を生産させる。
また、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含むそれぞれ２種類の発現ベクターを作製することが出来る。すなわち、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとてマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとてマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとてヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとてヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
あるいはまた、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、マウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ、並びにマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ、並びにヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。
次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。
以上のようにして目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体又はヒト型化抗体は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。
本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体又はヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡアガロースカラムを用いて行うことができる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体又はヒト型化抗体は分離・精製することができる。
ヒトＴＦに対する本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するために、任意の発現系を使用することができる。例えば、真核細胞を用いる場合は動物細胞（例えば樹立された哺乳類細胞系）、真糸状菌細胞又は酵母細胞などが挙げられ、原核細胞を用いる場合は細菌細胞（例えば大腸菌細胞等）などを使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（ＷＯ９２−１９７５９）が含まれる。
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１０８，１９７９）、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，１９９０）に従えば容易に実施することができる。
複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）ＩＩ又はＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
６．キメラ抗体及びヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性の評価
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体の濃度測定
得られた精製抗体の濃度の測定は、ＥＬＩＳＡにより行うことができる。
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（例えばＭａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を例えば１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを固相化する。
２００μｌの希釈バッファー（以下、ＤＢと称する。例えば５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、キメラ抗体、若しくはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞若しくはＣＨＯ細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加える。次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定する。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いることができる。
（２）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製する。ヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１）を、細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０６個の細胞数で播き込む。これをＣＯ２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させる。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄する。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化する。
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングする。キメラ抗体またはヒト型化抗体を含む培養上清、あるいは精製したキメラ抗体またはヒト型化抗体をＤＢにて段階希釈して１００μｌを各穴に加え、室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（Ｂｉｏ  Ｓｏｕｒｃｅ）１００μｌを加える。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定する。
（３）中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ）によるファクターＸａ産生阻害活性を指標に測定する事が出来る。すなわち、１．２５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ  １０μｌと適当な濃度に希釈した抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させる。
これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）および８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で１時間反応させる。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させ、発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定する。室温で１時間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定する。抗体無添加の１時間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出することにより、中和活性を測定する。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、精製水で２倍希釈した後、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製する。
７．ヒト型化抗体と可溶性ＴＦとの相互作用による反応速度論的解析
ＢＩＡＣＯＲＥによって本発明の抗ＴＦ抗体のｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ、すなわち解離定数（ＫＤ）、解離速度定数（ｋｄｉｓｓ）及び結合速度定数（ｋａｓｓ）を測定することができる。
組換型ＰｒｏｔｅｉｎＧをセンサーチップに固相化し、これに抗体を結合させ、抗原として精製した組換型ＴＦ（１−２１９にＦＬＡＧペプチドタグを付した可溶型ＴＦ）（以下、可溶型ＴＦと称す）を用い、種々の濃度に調製した可溶型ＴＦをアナライトとする。得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーター（解離速度定数ｋｄｉｓｓ及び結合速度定数ｋａｓｓ）を算出することによって解離定数を求めることができる。速度論的解析に関しては、「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ」（ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０．）などを参考にすることができる。
本発明の抗ＴＦ抗体は、解離定数（ＫＤ）が小さい値であるほど中和活性を有する点で好ましい。本発明の抗ＴＦ抗体において、ＫＤ値は２．３０×１０−８［１／Ｍ］以下であることが好ましく、２．３０×１０−９［１／Ｍ］以下であることがより好ましく、１．１７×１０−９［１／Ｍ］以下のものが最も好ましい。
また、ＫＤ値は解離速度定数（ｋｄｉｓｓ）及び結合速度定数（ｋａｓｓ）の２つのパラメーターから決定される（ＫＤ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓ）。したがって、ｋｄｉｓｓの値が小さく、ｋａｓｓの値が大きければ、ＫＤ値が小さくなることは明らかである。
具体的には、本発明の抗ＴＦ抗体の場合、ｋｄｉｓｓの値が９．５２×１０−３［１／ｓｅｃ］以下であればよい。好ましくは、ｋｄｉｓｓの値が９．５２×１０−４［１／ｓｅｃ］以下であり、最も好ましくは６．３５×１０−４［１／ｓｅｃ］以下である。
一方、ｋａｓｓの値は４．１５×１０４［１／Ｍ・ｓｅｃ］以上であればよい。好ましくは、ｋａｓｓの値が４．１５×１０５［１／Ｍ・ｓｅｃ］以上であり、最も好ましくは４．６５×１０５［１／Ｍ・ｓｅｃ］以上である。
さらに、ｋｄｉｓｓの値が９．５２×１０−３［１／ｓｅｃ］以下であり、かつ、ｋａｓｓの値が４．１５×１０４［１／Ｍ・ｓｅｃ］以上の抗ＴＦ抗体も好ましい。
さらに具体的には、本発明の抗ＴＦ抗体は、ＫＤ値が１．０９×１０−１０〜２．３０×１０−８［１／Ｍ］の範囲であり、１．０９×１０−９〜２．３０×１０−９［１／Ｍ］のものが好ましく、１．０９×１０−９〜１．３９×１０−９［１／Ｍ］のものが最も好ましい。
また、ｋｄｉｓｓ値が５．０６×１０−４〜９．５２×１０−３［１／ｓｅｃ］の範囲であり、５．０６×１０−４〜９．５２×１０−４［１／ｓｅｃ］のものが好ましく、５．０６×１０−４〜６．４９×１０−４［１／ｓｅｃ］のものが最も好ましい。
そしてｋａｓｓ値は、４．１５×１０４〜５．４４×１０５［１／Ｍ・ｓｅｃ］の範囲であり、４．１５×１０５〜５．４４×１０５［１／Ｍ・ｓｅｃ］のものが好ましく、４．６５×１０５〜５．４４×１０５［１／Ｍ・ｓｅｃ］のものが最も好ましい。
これらのＫＤ値、ｋｄｉｓｓ値及びｋａｓｓ値は、ＢＩＡＣＯＲＥ以外にもスキャッチャード解析、あるいはＢＩＡＣＯＲＥなどの表面プラズモン共鳴センサー等により得ることができるが、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて得ることが好ましい。
８．ヒト型化抗体のヒトＴＦへの反応性の測定
ドットブロットハイプリダイゼーション法によって、本発明のヒト型化抗体の非変性ＴＦ、非還元下変性ＴＦ、還元下変性ＴＦへの反応性を検討することができる。
ＴＦはヒト組織より精製したもの、もしくはＣＨＯ細胞の哺乳動物細胞で発現させ精製したもの等を用い、検討できる。また、変性剤には尿素の代わりにグアニジン塩酸塩やＳＤＳ等を用いることができ、還元剤にはＤＴＴの代わりに２−メルカプトエタノールなどのＳＨ還元試薬を用いることもできる。ヒト型化抗体の検出には様々な物質で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。ここでいう標識物質は例えば、放射性物質、ビオチン、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素などである。本発明の抗ＴＦ抗体は、非変性ＴＦ、非還元下変性ＴＦならびに還元下変性ＴＦのいずれにも反応する。
９．ヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びＤＩＣ治療剤
ヒトＴＦに対するヒト型化抗体の治療効果を確認するには、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体を高ＤＩＣ症状を呈した動物に投与し、ＤＩＣの指標を測定することによりその治療効果を確認することができる。
本発明で使用される抗体は、ヒトＴＦに対するヒト型化された抗体である。この抗体は、ヒトＴＦに結合することにより、ヒトＴＦの活性を中和する抗体であり、特に、好ましくはヒト型化されたＡＴＲ５抗体が挙げられる。ヒト型化ＡＴＲ５抗体の作製方法は、実施例に記載されている。
本発明で使用される抗体は、塩析法、ＨＰＬＣ等を用いたゲル濾過法、プロテインＡカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を組み合わせて高純度に精製することができる。このように精製された抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、あるいは蛍光抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により、高精度にヒトＴＦを認識することを確認できる。
本発明のＴＦに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びＤＩＣ治療剤は、非経口的に全身又は局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１０ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。
本発明のＴＦに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びＤＩＣ治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、フルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択されるが、これらに限定されるものではない。
発明の効果
本発明により、ヒトＴＦに対するキメラ抗体およびヒト型化抗体ならびにヒト型化抗体の作製方法が提供される。これらの抗体は、ヒトにおける抗原性が低いことから、治療薬として有用である。
実施例
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１． ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域
をコードするＤＮＡのクローニング
（１）ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマＡＴＲ−２、ＡＴＲ−３、ＡＴＲ−４、ＡＴＲ−５（ＩｇＧ１κ）、ＡＴＲ−７、及びＡＴＲ−８（ＩｇＧ２ａκ）からｍＲＮＡをＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて調製した。キット添付の処方に従い、それぞれのハイブリドーマ細胞を抽出緩衝液で完全にホモジナイズし、オリゴ（ｄＴ）−セルローススパンカラムにてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿を行った。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出緩衝液に溶解した。
（２）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製及び増幅
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。
前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型として、キット添付のｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｉｍｅｒを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ  アダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはキット添付のアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号１）（ＡＴＲ−２、ＡＴＲ−３、ＡＴＲ−４及びＡＴＲ−５）あるいはＭＨＣ−Ｇ２ａプライマー（配列番号２）（ＡＴＲ−７及びＡＴＲ−８）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
ＡＴＲ−２、３、４及び５抗体Ｈ鎖Ｖ領域に対するＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー、及びｃＤＮＡアダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１〜５μｌを含有する。
ＰＣＲはいずれもＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型としてｃＤＮＡ合成プライマーを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ  アダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＫＣプライマー（配列番号３）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＫＣプライマー、及びｃＤＮＡ  アダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。
ＰＣＲはＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
（３）ＰＣＲ生成物の精製及び断片化
前記のＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃で１時間消化した。ＸｍａＩ消化混合物を２％から３％のＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｈ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長、Ｌ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（以下、ＴＥと称す）１０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＸｍａＩ消化ＤＮＡ断片と、ＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９プラスミドベクターとをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。
次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）（以下、ＬＢＡ寒天培地と称す）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と称す）３ｍｌあるいは４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
（４）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）（配列番号４）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）（配列番号５）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
こうして得られたハイブリドーマＡＴＲ−２、ＡＴＲ−３、ＡＴＲ−４、ＡＴＲ−５、ＡＴＲ−７及びＡＴＲ−８に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれＡＴＲ−ｘＨｖ／ｐＵＣ１９（ｘ＝２、３、４、５、７又は８）と命名し、そしてＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれＡＴＲ−ｘＬｖ／ｐＵＣ１９（ｘ＝２、３、４、５、７又は８）と命名した。プラスミドＡＴＲ−ｘＨｖ／ｐＵＣ１９（ｘ＝２、３、４、５、７又は８）に含まれる各マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号６から１１に、プラスミドＡＴＲ−ｘＬｖ／ｐＵＣ１９（ｘ＝２、３、４、５、７又は８）に含まれる各マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号１２から１７に示す。
実施例２． キメラ抗体の構築
マウスＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をヒト抗体Ｃ領域に連結したキメラＡＴＲ−５抗体を作製した。ＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をコードする遺伝子をヒト抗体Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結することにより、キメラ抗体発現ベクターを構築した。
（１）キメラ抗体Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＨＳ（配列番号１８）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素ＳａｌＩの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＨＡ（配列番号１９）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＨＳプライマー並びにｃｈ５ＨＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｈｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
クローニングベクターには制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩ及びＳｐｌＩ、ＢｇｌＩＩの認識配列を導入した改変ｐＵＣ１９ベクター（以下、ＣＶＩＤＥＣと称す）を用いた。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＳａｌＩ認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＮｈｅＩ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
（２）キメラ抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＬＳ（配列番号２０）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＬＡ（配列番号２１）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＳｐｌＩの認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＬＳプライマー並びにｃｈ５ＬＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｌｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＳｐＩｌ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
ＩＤＥＣ社より導入した抗体発現ベクターを用いてキメラ抗体発現ベクターを構築した。ベクターにはＩｇＧ１型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＩｇＧ４型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いた。発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４Ｐのヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域の直前にあるＳａｌＩ−ＮｈｅＩ部位にＡＴＲ−５のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を、ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域の直前にあるＢｇｌＩＩ−ＳｐｌＩ部位にＡＴＲ−５のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、キメラＡＴＲ−５抗体発現ベクターを作製した。
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＮ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ６０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｈｅＩ  ＤＮＡ断片とＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化したＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌＩＩ  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１ｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、キメラ抗体を一過性に発現させた。
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ダルベッコＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳと称す）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からキメラ抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて以下のように精製した。
１ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。
次に、１３．５ｍｌの２．５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出し、直ちに１．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ１００（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２回行うことにより、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以下、ＴＢＳと称す）に溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
（６）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ無血清培地（ＧＩＢＣＯ）に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に前記発現プラスミドを導入した。
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状ＤＮＡにし、フェノール及びクロロホルムで抽出の後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。直鎖状にしたプラスミドをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＤＧ４４細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＤＧ４４細胞０．７８ｍｌに、プラスミド１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞をヒポキサンチン・チミジン（ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、２枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、ヒポキサンチン・チミジン（ＧＩＢＣＯ）及び５００μｇ／ｍｌ  ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、後述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
実施例３． ヒト型化抗体の構築
（１）  ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の構築
ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｌ３９１３０（ＤＤＢＪ，Ｇａｏ  Ｌ．ら、未発表、１９９５）由来のＦＲを有するヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖バージョン“ａ”の作製のために７個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ（配列番号２２）、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ（配列番号２３）及びｈＲ５Ｈｖ４Ｓ（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ３Ａ（配列番号２５）及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１８−３５ｂｐの相補的配列を有する。
ｈＲ５Ｈｖ１ＳはＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＳａｌＩ認識部位を有するように、またｈＲ５Ｈｖ５ＡはＮｈｅＩ認識部位を有するように設計した。また外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ（配列番号２７）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓと、ｈＲ５ＨｖＰｒＡ（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ５Ａとホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ、ならびに外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、９８μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａをそれぞれ５ｐｍｏｌｅを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡを加え、１００μｌの系で同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
約４３０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１７μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したプラスミドベクターＣＶＩＤＥＣに、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い添付の処方に従って反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
ＥｃｏＴ２２Ｉ認識部位の前もしくは後に変異、欠失が認められたため、それぞれ正しい配列を有する断片を連結して再度ＣＶＩＤＥＣにサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２９に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
（ｉｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”の構築バージョン“ｂ”及び“ｃ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｂ”ではＦＲ３をヒト抗体２３４９６３（ＤＤＢＪ、Ｂｏｒｒｅｔｚｅｎ  Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，１２９１７−１２９２１，１９９４）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＲＦＦＳ（配列番号３１）及びＦ３ＲＦＢＳ（配列番号３２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＲＦＦＡ（配列番号３３）及びＦ３ＲＦＢＡ（配列番号３４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。
Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＢａｌＩ及びＸｈｏＩの認識配列を有する。バージョン”ｃ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｐ０１８２５（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｐｏｌｊａｋ  ＲＪ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，３４１２−３４２０，１９７７）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ３ＮＭＦＳ（配列番号３５）及びＦ３ＮＭＢＳ（配列番号３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＮＭＦＡ（配列番号３７）及びＦ３ＮＭＢＡ（配列番号３８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩの認識配列を有する。
Ｆ３ＲＦＦＳ、Ｆ３ＲＦＢＳ、Ｆ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＡ、Ｆ３ＮＭＦＳ、Ｆ３ＮＭＢＳ、Ｆ３ＮＭＦＡ及びＦ３ＮＭＢＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３９に示す。また、バージョン“ｂ”のアミノ酸配列を配列番号４０に示す。
Ｆ３ＮＭＦＳとＦ３ＮＭＦＡ、Ｆ３ＮＭＢＳとＦ３ＮＭＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４１に示す。また、バージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号４２に示す。
（ｉｉｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”及び“ｅ”の構築
バージョン“ｄ”及び“ｅ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｄ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｍ６２７２３（ＤＤＢＪ、Ｐａｓｃｕａｌ  Ｖ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，１３２０−１３２８，１９９０）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ（配列番号４３）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＥＰＡ（配列番号４４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
また外部プライマーＦ３ＰｒＳ（配列番号４５）及びＦ３ＰｒＡ（配列番号４６）はＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ及びＦ３ＥＰＡとホモロジーを有し、他のＦＲ３のシャッフリングにも用いることができる。バージョン“ｅ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｚ８０８４４（ＤＤＢＪ、Ｔｈｏｍｓｅｔｔ  ＡＲ．ら，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＶＨＳ（配列番号４７）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＶＨＡ（配列番号４８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＥＰＳ、Ｆ３ＥＰＡ、Ｆ３ＰｒＳ、Ｆ３ＰｒＡ、Ｆ３ＶＨＳ及びＦ３ＶＨＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳとＦ３ＥＰＡ、又はＦ３ＶＨＳとＦ３ＶＨＡをそれぞれ５μｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４９に、バージョン“ｄ”のアミノ酸配列を配列番号５０に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号５１に、バージョン“ｅ”のアミノ酸配列を配列番号５２に示す。
（ｉｖ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”及び“ｇ”の構築
バージョン“ｆ”及び“ｇ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｆ”はヒト抗体Ｌ０４３４５（ＤＤＢＪ、Ｈｉｌｌｓｏｎ  ＪＬ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８，３３１−３３６，１９９３）由来のＦＲ３に、バージョン“ｇ”はＳ７８３２２（ＤＤＢＪ、Ｂｅｊｃｅｋ  ＢＥ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，２３４６−２３５１，１９９５）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｆ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ（配列番号５３）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＳＳＡ（配列番号５４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
バージョン“ｇ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＣＤＳ（配列番号５５）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＣＤＡ（配列番号５６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＳＳＳ、Ｆ３ＳＳＡ、Ｆ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ及びＦ３ＳＳＡもしくはＦ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｆ”アミノ酸配列を配列番号５７及び５８に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｇ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｇ”のアミノ酸配列を配列番号５９、６０に示す。
（Ｖ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の構築
バージョン“ｈ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｈ”はヒト抗体Ｚ２６８２７（ＤＤＢＪ、Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｓｔｏｅｐら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，９９−１０７，１９９３）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｈ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ（配列番号６１）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＡＤＡ（配列番号６２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
Ｆ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡをそれぞれ５μｌずっ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号６３に示す。また、バージョン“ｈ”のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
（ｖｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”の構築
バージョン“ｉ”及び“ｊ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｉ”はヒト抗体Ｕ９５２３９（ＤＤＢＪ、Ｍａｎｈｅｉｍｅｒ−Ｌｏｒｙ  ＡＪ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のＦＲ３に、バージョン“ｊ”はＬ０３１４７（ＤＤＢＪ、Ｃｏｌｌｅｔ  ＴＡ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１００２６−１００３０，１９９２）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｉ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳ（配列番号６５）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＭＭＡ（配列番号６６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
バージョン“ｊ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＢＭＳ（配列番号６７）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＢＭＡ（配列番号６８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＭＭＳ、Ｆ３ＭＭＡ、Ｆ３ＢＭＳ及びＦ３ＢＭＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳとＦ３ＭＭＡ、又はＦ３ＢＭＳとＦＳＢＭＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｉ”アミノ酸配列を配列番号６９及び７０に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｊ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｊ”のアミノ酸配列を配列番号７１及び７２に示す。
（ｖｉｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”の構築
バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体Ｐ０１７４２（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＢＡ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３１６１−３１７０，１９７０）由来のものに置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＭＰＳ（配列番号７３）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＭＰＡ（配列番号７４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。
Ｆ２ＭＰＳ、Ｆ２ＭＰＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。Ｆ２ＭＰＳとＦ２ＭＰＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号７５及び７６に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ１”のアミノ酸配列を配列番号７７及び７８に示す。
（ｖｉｉｉ）  ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”の構築
バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体Ｚ８０８４４（ＤＤＢＪ、Ｔｈｏｍｓｅｔｔ  ＡＲ．ら，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のＦＲ２に置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＶＨＳ（配列番号７９）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＶＨＡ（配列番号８０）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相捕的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。Ｆ２ＶＨＳ、Ｆ２ＶＨＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。
Ｆ２ＶＨＳとＦ２ＶＨＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ３”アミノ酸配列を配列番号８１及び８２に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ３”のアミノ酸配列を配列番号８３及び８４に示す。
（２）ヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
（ｉ）バージョン”ａ”
ヒト型化ＡＴＲ５抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｚ３７３３２（ＤＤＢＪ、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  Ｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７９，２０３−２１４，１９９５）由来のフレームワーク領域を有するヒト型化抗体Ｌ鎖（バージョン“ａ”）の作製のために７本のＰＣＲプライマーを使用した。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ（配列番号８５）及びｈ５Ｌｖ４Ｓ（配列番号８６）はセンスＤＮＡ配列を、ＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ２Ａ（配列番号８７）、ｈ５Ｌｖ３Ａ（配列番号８８）及びｈ５Ｌｖ５Ａ（配列番号８９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、各プライマーの両端に２０ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーｈ５ＬｖＳ（配列番号９０）及びｈ５ＬｖＡ（配列番号９１）はＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ及びｈ５Ｌｖ５Ａとホモロジーを有する。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ５Ａ、ｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５ｐｍｏｌｅのＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、及びｈ５Ｌｖ５Ａを含有する。
ＰＣＲはＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを５回行うことにより、５本のＣＤＲグラフティングプライマーをアセンブルした。この反応混合液に１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡを加え、９４℃にて３０秒間、５２℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを３０回行うことにより、アセンブルしたＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲ反応混合液を３％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）及びＢｇｌＩＩ（宝酒造）により３７℃で４時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ１０μｌに溶解した。上記のようにして調製したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌＩＩ  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３′−側にＳｐｌＩ認識配列を持つプラスミドをｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン”ａ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号９２に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号９３に示す。
（ｉｉ）バージョン“ｂ”及び“ｃ”
バージョン“ｂ”及び“ｃ”を、バージョン“ａ”のＦＲ３を置換（ＦＲ−シャッフリング）することにより作製した。バージョン“ｂ”にはヒト抗体Ｓ６８６９９（ＤＤＢＪ、Ｈｏｕｇｓ  Ｌら，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ｅｔ．，１０，１４１−１５１，１９９３）由来のＦＲ３を、バージョン“ｃ”にはヒト抗体Ｐ０１６０７（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｅｐｐ  Ｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，４９４３−４９５２，１９７５）由来のＦＲ３をそれぞれ使用した。
バージョン“ｂ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＳＳ（配列番号９４）とＦ３ＳＡ（配列番号９５）、あるいはバージョン“ｃ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＲＳ（配列番号９６）とＦ３ＲＡ（配列番号９７）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩの認識配列を有する。Ｆ３ＳＳ、Ｆ３ＳＡ、Ｆ３ＲＳ、Ｆ３ＲＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。各１００ｐｍｏｌｅのＦ３ＳＳとＦ３ＳＡ、あるいはＦ３ＲＳとＦ３ＲＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したバージョン“ｂ”あるいは“ｃ”のＦＲ３をコードするＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片とＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化することによりＦＲ３を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”のＦＲ３を置換したバージョン“ｂ”あるいはバージョン“ｃ”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ”アミノ酸配列を配列番号９８、９９に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列およびバージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号１００および１０１に示す。
（ｉｉｉ）バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”
バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”を、バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換することにより作製した。バージョン“ｂ１”にはヒト抗体Ｓ６５９２１（ＤＤＢＪ、Ｔｏｎｇｅ  ＤＷら，Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，５６−６２，１９９３）由来のＦＲ２を、バージョン“ｂ２”にはヒト抗体Ｘ９３６２５（ＤＤＢＪ、ＣｏｘＪＰら，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４，８２７−８３６，１９９４）由来のＦＲ２をそれぞれ使用した。
バージョン“ｂ１”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＳＳ（配列番号１０２）とＦ２ＳＡ（配列番号１０３）、あるいはバージョン“ｂ２”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＸＳ（配列番号１０４）とＦ２ＸＡ（配列番号１０５）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩの認識配列を有する。Ｆ２ＳＳ、Ｆ２ＳＡ、Ｆ２ＸＳ及びＦ２ＸＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。各１００ｐｍｏｌｅのＦ２ＳＳとＦ２ＳＡ、あるいはＦ２ＸＳとＦ２ＸＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＡｆｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したバージョン“ｂ１”あるいは“ｂ２”のＦＲ２をコードするＡｆｌＩＩ−ＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片とＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩで消化することによりＦＲ２を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭＩ０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換したバージョン“ｂ１”あるいはバージョン“ｂ２”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号１０６及び１０７に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ２”のアミノ酸配列を配列番号１０８及び１０９に示す。
（３）ヒト型化抗体の発現ベクターの構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖との組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドを，ｈＨｖａ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｃ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨＶｄ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉ）ヒト型化し鎖とキメラＨ鎖との組み合わせ
抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いて、キメラＨ鎖との組み合わせでヒト型化抗体を発現させることにより、ヒト型化Ｌ鎖の評価を行った。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で２〜３時間消化した。消化混合物を１．５％または２％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
これら各バージョンのヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳＰｌＩ−ＢｇｌＩＩ  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体をＬＢＡ培地２５０ｍｌまたは５００ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＨ鎖とヒト型化Ｌ鎖をコードする遺伝子を導入したプラスミドをそれぞれｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｃ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖の組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖａ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｃ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｇ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
構築した発現プラスミドベクターをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇあるいは２０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿あるいは１５ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間もしくは９６時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からの抗体の精製をＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、あるいはｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキットを用いた精製はキット添付の処方に従って行った。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いた精製は以下のように行った。
１ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。次に１３．５ｍｌの２．５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出した。１．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ３０もしくは１００（ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２〜３回行うことにより、ＴＢＳに溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
実施例４． 抗体の定量及び活性評価
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ９．６）（以下、ＣＢと称す）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．１）（以下ＤＢと称す）でブロッキングの後、抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
１時間室温にてインキュベートし０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むダルベッコＰＢＳ（以下ＲＢと称す）で洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳｉｇｍａ１０４（ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を基質バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）に溶解したもの（以下、基質溶液と称す）を加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（２）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０６個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
（３）中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ）によるＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、１．２５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ  １０μｌと適当な濃度に希釈した抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で１時間反応させた。
０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で１時間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の１時間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、精製水で２倍希釈した後、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（４）活性の評価
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（ａ−ｃｈ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた（図１）。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体（ｃｈ−ｃｈ）に比べて弱い活性であった（図２）。よってヒト型化Ｈ鎖はＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖を組み合わせた抗体（ｃｈ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、キメラ抗体と同等以上の抗原結合活性が認められた（図１）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて弱い活性であった（図２）。よってヒト型化Ｌ鎖もＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ａ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた（図３）。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体に比べてかなり弱い活性であった（図４）。よってヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖のＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｉｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”及び“ｄ”とキメラＬ鎖との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｃｈ”、“ｃ−ｃｈ”、及び“ｄ−ｃｈ”）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｃｈ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｃｈ”及び“ｃ−ｃｈ”はわずかに劣る抗原結合活性を示した（図５，６）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｃｈ”はほぼ同等、“ｄ−ｃｈ”はわずかに弱い活性であった。またバージョン“ｃ−ｃｈ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図７）。よってヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”がヒト型化Ｈ鎖で高い活性を示すと考えられるバージョンであった。
（ｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ｂ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度で抗原に対する結合量が低下していた（図５）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、かなり弱い活性であった（図８）。よって“ｂ−ａ”が“ａ−ａ”より高い活性を示すバージョンであった。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｖｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ”、“ｃｈ−ｃ”）を作製したところ、いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体と同等の活性を示した（図９及び１０）。よってバージョン“ｂ”及び“ｃ”をヒト型化抗体Ｌ鎖の候補とした。マウス抗体由来のアミノ酸残基数が１つ少ないバージョン“ｂ”の方がバージョン“ｃ”より抗原性の点で優れていると考えられる。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＨＯ細胞ＤＧ４４で発現させ精製した抗体を用い評価したもので、これ以降の評価でもこの抗体を陽性対照に用いた。
（ｖｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｂ−ｃ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体よりわずかに劣る活性を示した（図１１及び１２）。
（Ｖｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｄ−ｂ”）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｂ”は高濃度でわずかに劣る抗原結合活性を示した（図１３）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｂ”はわずかに弱い活性で、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図１４）。よって“ｂ−ｂ”は抗原活性中和能の高いバージョン、“ｄ−ｂ”は抗原結合能の高いバージョンであることが示された。
（ｉｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｅ”をキメラＬ鎖及びヒト型化バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｅ−ｃｈ”及び“ｅ−ｂ”）を作製したところ、“ｅ−ｃｈ”の抗原結合能はキメラ抗体と同等の活性を示したが、“ｅ−ｂ”は抗体の発現量が非常に低く、且つ抗原結合能も殆ど喪失していた（図１５）。また“ｅ−ｃｈ”の抗原活性中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図１６）。よってＨ鎖バージョン“ｅ”はＬ鎖バージョン“ｂ”との組合せが悪いと考えられた。
（ｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｆ−ｂ”、“ｇ−ｂ”及び“ｈ−ｂ”）作製したところ、“ｆ−ｂ”及び“ｈ−ｂ”の抗体は抗体の発現量が非常に低くかった。なお、バージョン“ｆ”、“ｈ”についてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。“ｇ−ｂ”は低い濃度から飽和状態に達し、キメラ抗体より弱い抗原結合能を示した（図１７）。“ｇ−ｂ”の抗原中和能は、キメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図１８）。
（ｘｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ１−ｂ”及び“ｄ１−ｂ”）作製したところ、ともに抗体は殆ど発現されなかった。なお、これらについてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。
（Ｘｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ３−ｂ”及び“ｄ３−ｂ”）作製したところ、“ｄ３−ｂ”の抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っており、“ｂ３−ｂ”の抗原結合能はさらに劣っていた（図１９）。“ｂ３−ｂ”の抗原中和能は“ｂ−ｂ”より上回る活性を示したものの、キメラ抗体の活性には及ばず、“ｄ３−ｂ”は“ｂ−ｂ”と同程度の活性にとどまった（図２０）。
（ｘｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”をキメラＬ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｃｈ”及び“ｊ−ｃｈ”）とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ”及び“ｊ−ｂ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はいずれの抗体もキメラ抗体とほぼ同等の活性を示した（図２１、２２）。“ｉ−ｃｈ”にはキメラ抗体の活性を上回る抗原中和能が認められ、“ｊ−ｃｈ”の抗原中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図２３）。“ｉ−ｂ”はキメラ抗体と同等の活性が認められ、“ｊ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図２４）。
（ｘｉｖ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ１”及び“ｃｈ−ｂ２”）を作製したところ、いずれの抗体もキメラ抗体と同等の抗原結合能を示した（図２５）。抗原中和能については、“ｃｈ−ｂ１”ではキメラ抗体と同等の活性を示し、“ｃｈ−ｂ２”では高濃度側でキメラ抗体を若干上回る活性が認められた（図２６）。バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ともにヒト型化抗体Ｌ鎖の候補になり得るが、より強い活性を有するという点でバージョン“ｂ２”の方が優れている。
（ｘｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”と組み合わせた抗体（“ｂ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っていた（図２７）。抗原中和能は“ｂ−ｂ”の活性を上回ったものの、“ｉ−ｂ”の活性には及ばなかった（図２８）。（ｘｖｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”又は“ｂ２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”又は“ｂ２”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ１”及び“ｉ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。“ｉ−ｂ２”の抗原結合能はキメラ抗体とほぼ同等で、“ｉ−ｂ１”はわずかに劣る程度であった（図２９）。また、“ｉ−ｂ１”及び“ｉ−ｂ２”の抗原中和能はキメラ抗体や“ｉ−ｂ”を上回る活性を示し、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ１”の順に強かった（図３０）。
実施例５． ＣＨＯ細胞産生ヒト型化抗体の作製及び活性評価
（１）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体（ｂ−ｂ、ｉ−ｂ及びｉ−ｂ２）の安定産生細胞株を樹立するため、無血清培地に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に抗体発現遺伝子ベクターを導入した。
プラスミドＤＮＡ、ｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状にし、フェノール及びクロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿により精製した。エレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏ  Ｒａｄ）により、直鎖状にした発現遺伝子ベクターをＤＧ４４細胞に導入した。ＤＧ４４細胞をＰＢＳに１×１０７／ｍｌの細胞密度で懸濁し、この懸濁液約０．８ｍｌに前記のＤＮＡを１０もしくは５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、ヒポキサンチン−チミジン（ＧＩＢＣＯ）（以下、ＨＴ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に処理された細胞を懸濁し、２枚の９６穴平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に１００μｌ／穴となるように播種し、ＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始８〜９時間後にＨＴ及び１ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を１００μｌ／穴加え、５００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ選択培地に変換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。３〜４日に一度１／２量の培地を新鮮な培地と交換し、選択培地への変換から約２週間経過した時点で、その４〜５日後に細胞の順調な増殖が観察された穴の培養上清の一部を回収した。この培養上清中に発現された抗体濃度を前述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにより測定し、抗体産生量の高い細胞を選出した。
（２）ヒト型化抗体の大量精製
前記のように選出したヒト型化抗体（“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”）発現ＤＧ４４細胞株を２Ｌローラーボトル（ＣＯＮＩＮＧ）を用い、５００ｍｌ／ボトルのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中で数日培養後、培養液を回収して新鮮なＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加え、再び培養した。培養液は遠心分離により細胞破片を除去し、０．２２μｍもしくは０．４５μｍのフィルターで濾過した。これを繰り返し、それぞれ全量約２Ｌの培養上清を得た。得られた培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティーカラム（Ｐｏｒｏｓ）を接続したＣｏｎＳｅｐＬＣ１００システム（ミリポア）にて抗体を精製した。
（３）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９Ｇ穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴をＣＢで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌで固相化し、２００μｌのＤＢでブロッキングの後、抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、基質溶液を１００μｌ加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（４）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートに１×１０６個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、ＰＢＳで各穴を２回洗浄した。ＰＦＡ／ＰＢＳを各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。精製抗体を上測定結果をもとに、ＤＢにて１０μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を１００μｌ加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
（５）ＴＦ中和活性（ファクターＸａ産生阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸａ産生阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ）によるＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ  １０μｌと抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比５で段階希釈した。
これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（６）ＴＦ中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸ結合阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ）を用い、予めＴＦとＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩａの複合体を形成させ、その複合体のＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性を指標にファクターＸ結合阻害活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ  １０μｌと８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で予め１時間反応させた。
これに抗体溶液を１０μｌ加え、室温で５分間反応させた後、３．２４５μｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ  Ｘ（セルサス・ラボラトリーズ）を１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。なお抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈した。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（７）ＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）はヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ）を用いたプロトロンビン時間を指標に測定した。すなわち、サンプルカップにヒト血漿（コスモ・バイオ）１００μｌを入れ、これに様々な濃度に希釈した抗体を５０μｌ加え、３７℃で３分間加温した。予め３７℃に加温しておいた１．２５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓを５０μｌ加え、血漿凝固を開始させた。この凝固時間はＡｍｅｌｕｎｇ  ＣＲ−Ａを接続したＡｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ−１０Ａ（ともにエム・シー・メディカル）にて測定した。
抗体は８０μｇ／ｍｌより公比２で０．１％のＢＳＡを含有するＴＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＴＢＳ）にて段階希釈した。測定した抗体無添加の凝固時間を１００％のＴＦ血漿凝固活性とし、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓの濃度と凝固時間をプロットした検量線により抗体を添加した際のそれぞれの凝固時間からＴＦ残存活性を算出した。
検量線は様々なＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓの濃度とその凝固時間を測定することにより作成した。適当に希釈したＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ、５０μｌに５０μｌのＢＳＡ−ＴＢＳを加え、３７℃で３分間加温し、予め３７℃に加温しておいたヒト血漿を１００μｌ加えて凝固を開始させ凝固時間を測定した。Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓは６．２５ｍｇ／ｍｌより公比２で２５ｍＭのＣａＣｌ２を含むハンクス緩衝液（ＧＩＢＣＯ）にて段階希釈した。横軸にＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ濃度、縦軸に凝固時間を両対数グラフにプロットし、これを検量線とした。
（８）活性の評価
“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”のヒト型化抗体すべてはキメラ抗体と同等以上の活性を有していた（図３１）。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ結合阻害活性及び血漿凝固阻害活性においても、ヒト型化抗体“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”はキメラ抗体と同等以上の活性を有しており、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ”＞“ｂ−ｂ”の順に活性が強かった（図３２、３３及び３４）。
実施例６． ＢＩＡＣＯＲＥを用いたＴＦと抗ＴＦ抗体の相互作用
における反応速度論的解析
ＢＩＡＣＯＲＥを用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。組換型ＰｒｏｔｅｉｎＧをセンサーチップに固相化し、これに抗体を結合させた。抗原として精製した組換型ＴＦ（１−２１９にＦＬＡＧペプチドタグを付した可溶型ＴＦ）（以下、可溶型ＴＦと称す）を用い、種々の濃度に調製した可溶型ＴＦをアナライトとした。得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーター（解離速度定数ｋｄｉｓｓ及び結合速度定数ｋａｓｓ）を算出した。速度論的解析に関して、「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ」（ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０．）を参考にした。
（１）センサーチップへのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇの固相化
センサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ）へＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＺＹＭＥＤ）を固相化する。
ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ  緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ３ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  ポリソルベート  ２０（ｖ／ｖ））（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、流速は５μＬ／分とした。センサーチップＣＭ５上のカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を１００μＬの０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）／０．２Ｍ  塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）のインジェクトにより活性化した。引き続き、１０μＬの５０μｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇをインジェクトし、これを３回行って固相化した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇは１０ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）にて５０μｇ／ｍＬに希釈し調製した。さらに１００μＬの１．０Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．５）をインジェクトし、過剰の活性基をブロックした。これに１０μＬの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）および１０μＬの１０ｍＭ塩酸をインジェクトし、非共有結合している物質を洗浄した。これを各フローセルについて行い、７２ｎＭのヒト型化抗ＴＦ抗体バージョン“ｉｂ２”を１０μＬインジェクトし、約１０００ＲＵ結合することを確認した。
（２）固相化抗ＴＦ抗体とヒトＴＦとの相互作用
ヒトＴＦは、アミノ酸配列１−２１９のＣ末端にＦＬＡＧペプチドを連結させたものをＣＨＯ細胞にて発現させて精製した。これを可溶型ヒトＴＦとして用いた。
ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ  緩衝液を用い、流速２０μＬ／分で７２ｎＭの抗体溶液を１０μＬインジェクトし、抗体を固相化した。抗体の希釈はＨＢＳ−ＥＰ  緩衝液を用いて行った。これに各種濃度の可溶型ヒトＴＦ溶液４０μＬを流速３０μＬ／分でインジェクトし、分析はインジェクトする８０秒を結合相とし、その後ＨＢＳ−ＥＰ  緩衝液に切り替え、１２０秒の解離相とした。解離相終了後、１０μＬの２０ｍＭ塩酸をインジェクトすることにより、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体についてセンサーグラムを得た。なお、可溶型ヒトＴＦ溶液はＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用い、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．３ｎＭ、１５．６ｎＭ、７．８１ｎＭ、３．９１ｎＭの濃度に調製した。また、ブランクには希釈に用いたＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をインジェクトして得られたセンサーグラムを用いた。
以上のことをフローセルの１〜３それぞれで行った。
（３）相互作用の速度論的解析
目的のデータファイルを読み込み、目的の反応領域について、ＨＢＳ−ＥＰ  緩衝液のセンサーグラムをベースラインとして、重ね書きによる反応パターンの比較を行った。さらにカーブフィッティングによるカイネティクスパラメーター（結合速度定数ｋａｓｓ及び解離速度定数ｋｄｉｓｓ）の算定を行うＢＩＡＣＯＲＥ専用の解析アプリケーションソフトウェアである「ＢＩＡｅｖａＩｕａｔｉｏｎ  ２．１」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、相互作用の速度論的解析を行った。なお、結合速度定数ｋａｓｓを求める際には、解析モデルタイプ４を用いた（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈａｎｄ  ｂｏｏｋ，Ａ１〜Ａ５）。それぞれのフローセルから算出した値から、各種抗体のカイネティクスパラメーターを得た。結果（各フローセルから算出した値の平均値±標準偏差）を表６に示す。
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実施例７． ヒト型化抗ＴＦ抗体のヒトＴＦへの反応性の測定
ドットブロットハイブリダイゼーション法（「改訂版分子生物学研究のためのタンパク実験法」（羊土社）竹縄忠臣／編  ｐ．１０１）によって、非変性ＴＦ、非還元下変性ＴＦ、還元下変性ＴＦへの反応性を検討した。ＴＦは細胞外領域にＦＬＡＧタグを付したものをＣＨＯ細胞にて発現させ、精製したもの（ｓｈＴＦ）を用いた。ｓｈＴＦをそれぞれ次の３種の緩衝液（緩衝液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０；  緩衝液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  ８Ｍ  尿素；  緩衝液Ｃ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  ８Ｍ  尿素，  ５ｍＭ  ＤＴＴ）にて希釈した。緩衝液Ａで処理したものは非変性ＴＦであり、一方、非還元下変性ＴＦは緩衝液Ｂで処理し、還元下変性ＴＦは緩衝液Ｃで処理して調製した。それぞれのサンプルは室温で２４時間処理した。処理後、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にサンプルをブロッティングした。サンプルを０．５μｌ、１μｌ及び２μｌ（３μｇ／ｍｌ）膜にブロットし、膜を風乾した。ＤＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．１，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３，  １％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ）でブロッキングした。膜をヒト型化抗ＴＦ抗体を含むＤＢもしくはＤＢ（コントロール）で反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）を含むＤＢで反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、Ｘ線フィルムに３０秒間暴露させた。
図３５に示したようにキメラ型抗ＴＦ抗体及びヒト型化抗ＴＦ抗体（バージョン“ｂｂ”“ｉｂ”及び“ｉｂ２”）は非変性ＴＦ、非還元下変性ＴＦ、還元下変性ＴＦ全てに反応した。
実施例８． ラット急性ＤＩＣモデルにおける抗血栓作用の確認
抗ＴＦ抗体の抗血栓作用について、ラットを用いたトロンボプラステン誘発ＤＩＣモデルで確認した。すなわち、ＳＤ系雄性ラットにヒトトロンボプラステン溶液を４０ｍｇ／ｋｇの用量で３時間かけて静脈内に持続注入することでＤＩＣモデルを作製した。抗ＴＦ抗体（キメラおよびヒト型化抗ＴＦ抗体ｉ−ｂ２）は各々０．２ｍｇ／ｋｇの用量でトロンボプラステン溶液の注入開始５分前に静脈内投与した。トロンボプラステン溶液の持続注入終了１５分後に腹部大動脈からクエン酸加血液を採取し、血小板数、活性化部分トロンボプラステン時間（ａＰＴＴ）、フィブリノーゲン濃度（Ｆｉｂ）、可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）濃度、トロンビン／アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）濃度を測定した。
その結果、表７に示すように、トロンボプラスチンの持続注入により血小板数の減少、ａＰＴＴの延長、フィブリノーゲン濃度の減少、ｓＦＭＣおよびＴＡＴ濃度の上昇が認められ、明らかな凝固亢進状態を呈した。これに対し、キメラおよびヒト型化抗ＴＦ抗体はともにこれらの変化をほぼ同様に強く抑制した。
この結果から、ヒト型化抗ＴＦ抗体は抗血栓薬として有用なことが示された。
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（平均値±標準偏差）
溶媒投与対照群に対する差の有意性：ａ）：ｐ＜０．０１，ｂ）：ｐ＜０．０５
参考例１． 抗ＴＦモノクローナル抗体の作製
１．ヒトＴＦの精製
ヒト胎盤からのＴＦの精製は、Ｉｔｏらの方法（Ｉｔｏ，Ｔ．らＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，６９１−６９６，１９９３）に準じて行った。すなわち、ヒト胎盤を１０ｍＭ塩化ベンザミジン、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェートおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ，ｐＨ７．５）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱脂し、得られた脱脂粉末を２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む上記緩衝液に懸濁してＴＦを可溶化した。
この上清からＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および抗ＴＦ抗体を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、精製ＴＦを得た。これを限外濾過膜（ＰＭ−１０，Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、精製標品として４℃で保存した。
精製標品中のＴＦ含量は、市販の抗ＴＦモノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）とポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を組合せたＳａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡで、組換え型ＴＦを標準にして定量した。
また精製標品の純度は、４−２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものを銀染色することで確認した。
２．免疫とハイブリドーマの作製
精製ヒトＴＦ（約７０μｇ／ｍｌ）を等容量のＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と混合後、５週齢のＢａｌｂ／ｃ系雄性マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、ＴＦとして１０μｇ／マウスとなるように免疫した。１２，１８及び２５日にはＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントと混合したＴＦを５μｇ／マウスとなるように皮下に追加免疫し、最終免疫として３２日にＰＢＳで希釈したＴＦ溶液を５μｇ／マウスで腹腔内投与した。
最終免疫の３日後に４匹のマウスから脾細胞を調製し、細胞数で１／５のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。融合細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＲＰＭＩ−培地とする）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ  ｏｒ  ｉｅｎｔａｌ）に懸濁し、９６穴プレートに１匹のマウスにつき４００穴（約４００個／穴）播種した。融合後、１，２，３，５日目に培地の半量をＨＡＴ（大日本製薬）およびｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）を含むＲＰＭＩ−培地（以下ＨＡＴ−培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのＨＡＴ選択を行った。
下記のスクリーニング法で選択したハイブリドーマは２回の限界希釈を行うことでクローン化した。
限界希釈は、９６穴プレート２枚に一穴あたり０．８個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーであることが確認できた穴について、下記に示したＴＦ結合活性とＴＦ中和活性の測定を行いクローンを選択した。得られたクローンはＨＡＴ−培地からＲＰＭＩ−培地に馴化し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認したうえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行った。以上の操作により、ＴＦ／ファクターＶＩＩａ複合体とファクターＸとの結合を強く阻害する抗体６種（ＡＴＲ−２，３，４，５，７及び８）を産生するハイブリドーマが樹立できた。
３．腹水の作製および抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代したハイブリドーマ１０６個を、あらかじめ鉱物油を２回腹腔内に投与しておいたＢａｌｂ／ｃ系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後１〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（日本ガイシ）を装着したＣｏｎＳｅｐＬＣ１００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。
４．Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
ＴＦを高発現することで知られているヒト膀胱癌由来細胞株Ｊ８２（Ｆａｉｒ  Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１１６９２−１１６９８，１９８７）をＡＴＣＣより導入し、ＲＰＭＩ−培地中、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度の条件で継代・維持した。
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用プレートは、９６穴プレートにＪ８２細胞を１０５個／穴の濃度で播種し、上記条件で１日培養後、培地を除いてリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）を加えて氷冷下で１０分静置することで固定化することによって作製した。ＰＦＡを除去し、ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液）を加えて、使用時まで４℃で保存した。
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡは以下のように行った。すなわち、上記のように作製したプレートからＢｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液を除去し、抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清を加えて室温で１．５時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ）を１時間反応させ、洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加して１時間後に４０５ｎｍにおける吸光度を測定することで、Ｊ８２細胞に結合した抗ＴＦ抗体量を定量した。
５．ファクターＸａ活性を指標としたＴＦ中和活性測定系
５０μｌの５ｍＭＣａＣｌ２および０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ：ｐＨ７．６）に１０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラステン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ）と１０μｌのファクターＶＩＩａ溶液（８２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を添加し、室温で１時間反応させることでＴＦ／Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ複合体を形成させた後、１０μｌの所定濃度に希釈した抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清および１０μｌのＦａｃｔｏｒ  Ｘ溶液（３．２４５μｇ／ｍｌ）（Ｃｅｌｓｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｅ）を添加して４５分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ添加することで反応を止めた。ここに２ｍＭ  Ｓ−２２２２溶液（第一化学薬品）を５０μｌ添加し、３０分間の４０５ｎｍにおける吸光度変化をもってＴＦのＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生活性とした。この方法では、ＴＦ／Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ複合体とＦａｃｔｏｒ  Ｘとの結合を阻害する抗体の活性は測定できる。
６．血漿凝固阻害活性測定系
市販の正常ヒト血漿（コージンバイオ）を用い、この１００μｌに適当に希釈した抗ＴＦ抗体溶液５０μｌを混和して３７℃で３分間反応させた後、５０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（１．２５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、血漿が凝固するまでの時間を血漿凝固時間測定装置（ＣＲ−Ａ：Ａｍｅｌｕｎｇ）で測定した。
７．抗体のアイソタイプの決定
ハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体について、マウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて抗体のアイソタイプを確認し、結果を下に示した。
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参考例２． 可溶型ヒトＴＦの作製法
可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）は以下のように作製した。
ヒトＴＦの貫通領域（２２０番目のアミノ酸）以下をＦＬＡＧペプチドＭ２に置換したものをコードする遺伝子を、哺乳動物細胞用の発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子を含む）に挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。ヒトＴＦのｃＤＮＡ配列はＪａｍｅｓ  Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙらの報告（Ｃｅｌｌ（１９８７）５０，１２９−１３５）を参考にした。この可溶型ヒトＴＦの遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号１５１に示した。Ｇ４１８により薬剤セレクションし、発現細胞を選抜し、さらにメトトレキサートで発現増幅をかけ、ｓｈＴＦ発現細胞を樹立した。
この細胞を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）で培養し、ｓｈＴＦを含む培養上清を得た。同容量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（１００ｍＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．３Ｍとし、ｓｈＴＦをカラムから溶出した。得られたｓｈＴＦ画分に終濃度２．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作（１０，０００ｒｐｍ、２０分）により夾雑蛋白質を沈殿させた。上清をＢｕｔｙｌ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（３０ｍＬ，ＴＯＳＯＨ）に添加し、２．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）中、硫酸アンモニウム濃度を２．５Ｍから０Ｍまで直線的に下げ、ｓｈＴＦを溶出させた。ｓｈＴＦを含むピーク画分をＣｅｎｔｒｉ−Ｐｒｅｐ  １０（アミコン）で濃縮した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＧカラム（２１．５×６００ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）に濃縮液を添加し、ｓｈＴＦのピーク画分を回収した。これを０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌し、可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）とした。試料の吸光度２８０ｎｍのモル吸光係数をε＝４０，１３０、分子量を４３，２１０として、試料の濃度を算出した。
配列表フリーテキスト
配列表の＜２２３＞に記載した内容は次の通りである。
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化ａバージョン／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化ａバージョン抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化ａバージョン／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化ａバージョン抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化ａバージョン／Ｌ鎖ヒト型化ａバージョン抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図４は、抗−ＴＦ−マウスモノクローナル抗体ＡＴＲ−５、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンａ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンａ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図５は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンａ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図６は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｃ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｄ／Ｌ鎖キメラ抗体の抗原結合活性を測定したグラフである。
図７は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｃ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｄ／Ｌ鎖キメラ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図８は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンａ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図９は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｃ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図１０は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｃ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性の比較を示すグラフである。
図１１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｃ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図１２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｃ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図１３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｄ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図１４は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｄ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図１５は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｅ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｅ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図１６は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｅ／Ｌ鎖キメラ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図１７は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｇ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図１８は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｇ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図１９は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ３／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｄ３／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２０は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ３／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｄ３／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図２１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｊ／Ｌ鎖キメラ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｊ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖キメラ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｊ／Ｌ鎖キメラ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図２４は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｊ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図２５は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ１抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２６は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ１抗体、及びＨ鎖キメラ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図２７は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２８は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図２９は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ１抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図３０は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ１抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性を比較したグラフである。
図３１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図３２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦのファクターＸａ産生阻害活性）を比較したグラフである。
図３３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）を比較したグラフである。
図３４は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦの血漿凝固阻害活性）を比較したグラフである。
図３５は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の各種条件で処理したヒトＴＦへの反応性を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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