(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階からなる、ＩＧＦ−Ｉペプチドを含む培地からの正しく折りたたまれた単量体インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の精製方法：
（ａ）培地を、少なくとも約０．０３１から１．０リットル／ｇ真正ＩＧＦ−Ｉの第一のカチオン交換マトリックスと約２〜３０℃の温度で、約０．０１〜１時間またはそれ以上の時間、接触させて、培地から全ＩＧＦ−Ｉの少なくとも約９５％を吸着させる；
（ｂ）ＩＧＦ−Ｉがのせられた第一のカチオン交換マトリックスを第一のカチオン交換洗浄バッファーで洗浄して、実質的な量の真正または非真正ＩＧＦ−Ｉを除かずに実質的な量の吸着したＩＧＦ−Ｉ以外の物質を除去する；
（ｃ）段階（ａ）のカチオン交換マトリックスを十分な量の第一のカチオン交換溶出バッファーと接触させることにより該カチオン交換マトリックスからすべての形態の吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出させ、この際、該第一のカチオン交換溶出バッファーは、カチオン交換マトリックスから実質的にすべての真正及び非真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いｐＨまたはイオン強度を有するように、５．０〜７．０のｐＨ及び０．２〜１．０Ｍの塩濃度を有する；
（ｄ）段階（ｃ）のＩＧＦ−Ｉ含有溶出物を変性／再生バッファー中に移し、これにより：（ｉ）ＩＧＦ−Ｉタンパク質の鎖内のジスルフィド結合が還元され、永久変性を伴わずに変性が促進され；さらに（ｉｉ）ＩＧＦ−Ｉの再生及び再酸化により適当な対を形成する鎖内のジスルフィド結合が形成できる；
（ｅ）段階（ｄ）の再生されたＩＧＦ−Ｉを、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種の塩を０．４Ｍ〜２．０Ｍの濃度で含むｐＨ４．０〜５．０の溶媒システムに移した後、約０．０５〜１リットルのマトリックス／ｇ真正ＩＧＦ−Ｉの疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスと約１５〜３０℃の温度で、少なくとも約０．１〜３０分間、接触させて、溶出物から少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着させる；
（ｆ）ほとんどの非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分低いが、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスからかなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには低くないイオン強度を有する疎水性相互作用洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを洗浄し、この際、該洗浄工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸で洗浄した後、０．１５〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸で洗浄する工程を有する；
（ｇ）疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを疎水性相互作用溶出バッファーと接触させることにより該マトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出し、この際、該疎水性相互作用溶出バッファーは該マトリックスから実質的にすべての吸着した真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いｐＨ、または十分低いイオン強度を有し、かつ該溶出は、該疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに約４カラム容積の０〜０．０２Ｍ塩化ナトリウムを含み、約３．０のｐＨを有する０．２Ｍ酢酸をのせることから本質的に構成される；
（ｈ）段階（ｇ）の溶出物を、少なくとも約０．０３１から１．０リットル／ｇ真正ＩＧＦ−Ｉの第二のカチオン交換マトリックスと約２〜３０℃の温度で、約０．０１〜１時間またはそれ以上の時間、接触させて、溶出物から少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着させる；
（ｉ）ほとんどの割合の非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分高いが、かなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには高くないイオン強度またはｐＨを有するカチオン交換洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた第二のカチオン交換マトリックスを洗浄し、この際、該カチオン交換洗浄バッファーは、０．０５Ｍ酢酸塩を含む；
（ｊ）第二のカチオン交換マトリックスを第二のカチオン交換溶出バッファーと接触させることにより該マトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出し、この際、該第二のカチオン交換溶出バッファーは、５．０〜７．０のｐＨ及び０．２〜１．０Ｍの塩濃度を有し、かつ該マトリックスから実質的にすべての吸着した真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いイオン強度、または十分高いｐＨを有する；
（ｋ）段階（ｊ）の溶出物を適当量の予め０．２Ｍ酢酸で平衡化した逆相クロマトグラフィーマトリックスと接触させる；
（ｌ）ほとんどの割合の非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分高いが、かなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには高くないように、０〜２０％の有機溶媒濃度を有する水性／有機溶媒逆相洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた逆相クロマトグラフィーマトリックスを洗浄し、この際、有機溶媒は、メタノール、エタノール、２−プロパノール、及びアセトニトリルから選択される；
（ｍ）かなりの割合の多量体形態のＩＧＦ−Ｉは除去せずに実質的にすべての真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのに十分高いように、２０〜４０％の有機溶媒濃度を有する水性／有機溶媒バッファーで逆相クロマトグラフィーマトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出し、この際、有機溶媒は、メタノール、エタノール、２−プロパノール、及びアセトニトリルから選択される。
【請求項２】
段階（ｆ）の洗浄により除去される非真正ＩＧＦ−Ｉが、段階（ｈ）の開始前にのみ、段階（ｄ）から（ｇ）を少なくとも１回再度行う、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
該ＩＧＦ−Ｉがヒトの組換ＩＧＦ−Ｉである、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
【請求項４】
該ヒトの組換ＩＧＦ−Ｉが形質転換された酵母細胞中で産生される、請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
該形質転換された酵母細胞がピチア  パストリス(Pichia pastoris)種に属する、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
該ピチア  パストリス(Pichia pastoris)種が株ＧＳ１１５に属する、請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
該ＩＧＦ−Ｉが酵母の増殖培地中に分泌される、請求の範囲第４項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ａ）において、該第一のカチオン交換マトリックスがスルフィルプロピル化され、クロマトグラフィーカラム内にある、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）において、該洗浄が、該第一のカチオン交換マトリックスに約３．０カラム容積の０．０２Ｍ酢酸、さらには、約３．０カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）をのせることから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｃ）において、該溶出が、該第一のカチオン交換マトリックスに３〜１０カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び０．４Ｍ塩化ナトリウムをのせることから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｄ）において、該変性／再生バッファーが、本質的に、約１．５〜３．０Ｍの尿素；約１．０〜３．０Ｍの塩化ナトリウム；約５％〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール；約１ｍＭ〜１５ｍＭのホウ酸ナトリウム；および約０．００５ｍＭ〜１０ｍＭのジチオトレイトールから構成され、かつ約８．５〜１０．０のｐＨを有する、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｄ）において、該変性／再生バッファーが、本質的に、２Ｍ尿素、１．５ｍＭ塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタノール、５ｍＭホウ酸ナトリウム及び０．２ｍＭ  ＤＴＴから構成され、かつ約９．０〜９．５のｐＨを有する、請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｅ）において、該疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチルで置換されたポリメタクリレートマトリックスである、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｆ）において、該洗浄が、該疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに約３カラム容積の０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸；さらには約１０カラム容積の０．１５〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸をのせることから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｈ）において、該第二のカチオン交換マトリックスがスルフィルプロピル化され、クロマトグラフィーカラム内にある、請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｉ）において、該洗浄が、該第二のカチオン交換マトリックスに約７〜１０カラム容積の０．１Ｍ塩化ナトリウムを含み約５．５のｐＨを有する０．０５Ｍ酢酸ナトリウムをのせることから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｊ）において、該第二のカチオン交換溶出バッファーが、約７カラム容積の、約５．５のｐＨを有する、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．４Ｍ塩化ナトリウムから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ｋ）において、該逆相クロマトグラフィーマトリックスがポリマー樹脂媒体である、請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｌ）において、該洗浄が約１カラム容積の０％エタノールを含む０．２Ｍ酢酸；さらには約４カラム容積の１９％エタノールを含む０．２Ｍ酢酸をのせることから本質的に構成される、請求の範囲第１項〜第１８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｍ）において、該溶出が、該逆相クロマトグラフィーマトリックスに約４カラム容積の１９％エタノールを含む０．２Ｍ酢酸をのせ、さらには０．２Ｍ酢酸における１９％〜２５％（ｖ／ｖ）エタノールの勾配をかけることから本質的に構成され、該勾配が直線的勾配及び段階勾配からなる群より選ばれる、請求の範囲第１項〜第１９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ｇ）において、該疎水性相互作用溶出バッファーは、約４カラム容積の０．２Ｍ酢酸及び０．０２Ｍ塩化ナトリウムを含む、請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｊ）において、該第二のカチオン交換溶出バッファーは、約５．５のｐＨを有する０．０５Ｍ酢酸ナトリウム及び０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む、請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該培地は、酵母細胞が予め除去されたＩＧＦ−Ｉ含有培地である、請求の範囲第１項〜第２２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ｄ）において、段階（ｃ）のＩＧＦ−Ｉ含有溶出物を変性／再生バッファーと室温で１５〜２０時間接触させる、請求の範囲第１項〜第２３項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、タンパク質の精製に関するものである。
発明の背景
インスリン様成長因子−Ｉ（「ＩＧＦ−Ｉ」と称する；「ソマトメジンＣ」としても知られている）は正常な成長及び発達に必須な哺乳動物の成長因子である。ＩＧＦ−Ｉは、筋肉及び脂肪組織に対してインスリン様の作用を有し、また、様々な細胞のタイプに分裂促進効果を有する。ＩＧＦ−Ｉは臨床上様々に用途を有する。例えば、非有糸分裂性のコリン作動性ニューロン等のニューロンの生存を促進するのに使用される（ルイス(Lewis）ら、米国特許番号５，０９３，３１７号）。
ヒトのＩＧＦ−Ｉタンパク質の完全なアミノ酸配列は既知であり、ヒトのＩＧＦ−Ｉをコード化するＤＮＡはクローニングされ、また大腸菌(E. coli）及び酵母において発現された（例えば、ブリアーレイ(Brierley)ら、米国特許番号５，３２４，６３９号を参照）。ヒトのＩＧＦ−Ｉタンパク質は６個のシステイン残基を含む単一の(single)７０アミノ酸ポリペプチドから構成され、これらのシステイン残基はすべて３個の鎖内(intrachain)ジスルフィド結合の形成に関与している（アクセルソン(Axelsson)ら、ユーロ  ジェー  バイオケム(Eur. J. Biochem.)、２０６：９８７（１９９２年））。これらの３個のジスルフィド結合は、６個のシステイン残基すべてが適切に対になっているが、ＩＧＦ−Ｉが正しい（即ち、天然の）３次構造を有するのに必要である。これらのジスルフィド結合が還元及び再酸化されると、ＩＧＦ−Ｉは様々な様式で再生されて(refold)、１５個という数多い単量体構造(monomeric configuration）が形成できる（メング(Meng)ら、ジェー  クロム(J. Chrom.)、４３３：１８３（１９８８年））。加えて、ＩＧＦ−Ｉのポリペプチドは互いに相互作用して多量体を形成できる。正しく折りたたまれた精製ＩＧＦ−Ｉを得る方法は既に公表された（例えば、ホルツ(Holtz）ら、米国特許番号５，２３１，１７８号（以下、「ホルツ(Holtz)」と称する）；チャング(Chang）ら、米国特許番号５，２８８，９３１号；およびハート(Hart)ら、バイオテック  アプル  バイオケム(Biotech. Appl. Biochem.)、２０：２１７（１９９４年）を参照のこと）。
発明の要約
我々は、精製された、単量体の、完全な、正しく折りたたまれた（即ち、「真正(atuhentic)」）ＩＧＦ−Ｉを得る改良された方法を発見した。より詳しくは、我々は、ホルツ(Holtz)（上記）に記載されるＩＧＦ−Ｉの精製方法で得られた真正(atuhentic）ＩＧＦ−Ｉの最終的な収率を、少なくとも３倍、向上させる方法を発見した。このような収率の向上は、主として、下記により得られる：（１）第一のカチオンクロマトグラフィー(cation chromatography）段階後に、ＩＧＦ−Ｉタンパク質の変性／再生(unfolding/refolding）段階を行われることを含み；および（２）ホルツ(Holtz）に記載されるゲル瀘過段階の代わりに逆相クロマトグラフィー段階を使用する。
したがって、本発明は、以下の段階からなる、ＩＧＦ−Ｉポリペプチドを含む培地からの単量体の、完全な、正しく折りたたまれたＩＧＦ−Ｉポリペプチドの精製方法を提供するものである：
（ａ）培地から全ＩＧＦ−Ｉの少なくとも約９５％を吸着できる条件下で十分な量の第一のカチオン交換マトリックスと培地を接触させる；
（ｂ）ＩＧＦ−Ｉがのせられた第一のカチオン交換マトリックスを第一のカチオン交換洗浄バッファーで洗浄して、実質的な量の真正または非真正ＩＧＦ−Ｉを除かずに実質的な量の吸着したＩＧＦ−Ｉ以外の物質を除去する；
（ｃ）段階（ａ）のカチオン交換マトリックスを十分な量の第一のカチオン交換溶出バッファーと接触させることにより該カチオン交換マトリックスからすべての形態の吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出させ、この際、該第一のカチオン交換溶出バッファーはカチオン交換マトリックスから実質的にすべての真正及び非真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いｐＨまたはイオン強度を有する；
（ｄ）段階（ｃ）のＩＧＦ−Ｉ含有溶出物を変性／再生(unfolding/refolding）バッファー中に移し、これにより：（ｉ）ＩＧＦ−Ｉタンパク質の鎖内のジスルフィド結合が抑制され、永久変性を伴わずに変性(unfolding）が促進され；さらに（ｉｉ）ＩＧＦ−Ｉの再生(refolding）及び再酸化により適当な対を形成する鎖内のジスルフィド結合が形成できる；
（ｅ）段階（ｄ）の再生されたＩＧＦ−Ｉを、適当な溶媒システムに移した後、溶出物から少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着できる条件下で十分な量の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスと接触させる；
（ｆ）ほとんどの非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分低いが、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスからかなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには低くないイオン強度を有する疎水性相互作用洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを洗浄する；
（ｇ）疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを疎水性相互作用溶出バッファーと接触させることにより該マトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出し、この際、該疎水性相互作用溶出バッファーは該マトリックスから実質的にすべての吸着した真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いｐＨ、または十分低いイオン強度を有する；
（ｈ）溶出物から少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着できる条件下で段階（ｇ）の溶出物を十分な量の第二のカチオン交換マトリックスと接触させる；
（ｉ）ほとんどの割合の非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分高いが、かなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには高くないイオン強度またはｐＨを有するカチオン交換洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた第二のカチオン交換マトリックスを洗浄する；
（ｊ）第二のカチオン交換マトリックスを第二のカチオン交換溶出バッファーと接触させることにより該マトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出し、この際、該第二のカチオン交換溶出バッファーは該マトリックスから実質的にすべての吸着した真正ＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いイオン強度、または十分高いｐＨを有する；
（ｋ）溶出物から少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着できる条件下で、水性バッファーにおいて、段階（ｊ）の溶出物を適当に十分な量の逆相クロマトグラフィーマトリックスと接触させる；
（ｌ）ほとんどの割合の非真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのには十分高いが、かなりの割合の真正ＩＧＦ−Ｉを除去するほどには高くない有機溶媒濃度を有する水性／有機溶媒逆相洗浄バッファーでＩＧＦ−Ｉがのせられた逆相クロマトグラフィーマトリックスを洗浄する；
（ｍ）かなりの割合の多量体形態のＩＧＦ−Ｉは除去せずに実質的にすべての真正ＩＧＦ−Ｉを除去するのに十分高い有機溶媒濃度を有する水性／有機溶媒バッファーで逆相クロマトグラフィーマトリックスから吸着したＩＧＦ−Ｉを溶出する。
必要であれば、段階（ｆ）から回収された非真正ＩＧＦ−Ｉに、段階（ｈ）の開始前でのみ、段階（ｄ）から（ｇ）を少なくとも１回再度行ってもよい。
本明細書中で使用される、「真正(authentic)」ＩＧＦ−Ｉということばは、適当に対を形成する、即ち、天然で生じるＩＧＦ−Ｉにおけるのと同様にして対を形成する、システイン残基を含む３個の鎖内ジスルフィド結合を有する単量体の、完全な、正しく折りたたまれたＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「カラム容積(column volume)」ということばは、間隙液体などの、クロマトグラフィーマトリックスによって占められる容積を意味する。
本明細書中で使用される、「分解された(degraded)」ＩＧＦ−Ｉということばは、真正ＩＧＦ−Ｉのポリペプチド主鎖またはアミノ酸側鎖中に存在する一以上の共有結合が切断されたＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「ｄｅｓ−２」ＩＧＦ−Ｉということばは、真正ＩＧＦ−Ｉの始めの２個のアミノ酸残基が欠失するＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「グリコシル化」ＩＧＦ−Ｉということばは、一以上の共有結合する炭水化物部分を有するＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「完全な(intact)」ＩＧＦ−Ｉということばは、分解していないＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「誤って折りたたまれた(misfolded)」ＩＧＦ−Ｉということばは、真正ＩＧＦ−Ｉ以外の２次構造を有するＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「多量体(multimeric)」ＩＧＦ−Ｉということばは、共有または非共有化学結合により連結された２以上のＩＧＦ−Ｉポリペプチド鎖を意味する。
本明細書中で使用される、「酸化された」ＩＧＦ−Ｉということばは、少なくとも一の酸化されたアミノ酸残基を含むＩＧＦ−Ｉを意味する。本明細書中で使用される、「再酸化された(reoxidized)」ＩＧＦ−Ｉということばは、一以上の鎖内ジスルフィド結合が切断後に再形成されたＩＧＦ−Ｉを意味する。
本明細書中で使用される、「約」ということばは、ある数値の平均＋／−その値の１０％を意味し、例えば、「約５０％」とは４５％〜５５％を意味する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ホルツ法の段階を本発明の一実施態様の段階と比較するフローチャートである。
図２は、ホルツ法の第一のカチオン交換段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図３は、本発明の第一のカチオン交換段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図４Ａは、本発明による変性／再生段階前に回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図４Ｂは、本発明の方法による変性／再生段階後に回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図５Ａは、ホルツ法によるＨＩＣ段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図５Ｂは、本発明の方法によるＨＩＣ段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図６Ａは、ホルツ法による第二のカチオン交換クロマトグラフィー段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図６Ｂは、本発明による第二のカチオン交換クロマトグラフィー段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図７Ａは、ホルツ法によるゲル瀘過クロマトグラフィー段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図７Ｂは、本発明による逆相クロマトグラフィー段階から回収される材料の典型的な分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図８Ａは、ホルツ法によって製造される材料の分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図８Ｂは、本発明の方法によって精製される材料の分析スケールのシアノ逆相クロマトグラムである。
図９Ａは、ホルツ法によって精製される材料の分析スケールのＣ８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図９Ｂは、本発明の方法によって精製される材料の分析スケールのＣ８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１０Ａは、ホルツ法によって精製される還元材料から得られるペプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
図１０Ｂは、本発明の方法によって精製される還元材料から得られるペプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
図１１Ａは、ホルツ法によって精製される非還元材料から得られるペプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
図１１Ｂは、本発明の方法によって精製される非還元材料から得られるペプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
図１２Ａは、正しく折りたたまれる非還元ＩＧＦ−Ｉから得られるぺプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
図１２Ｂは、誤って折りたたまれる非還元ＩＧＦ−Ｉから得られるペプチドマッピング産物の分析スケールの逆相クロマトグラムである。
発明の詳細な説明
本発明は、単量体の、完全な、正しく折りたたまれたＩＧＦ−Ｉの改良された精製方法を提供するものである。
ＩＧＦ−Ｉの出発材料および細胞除去
本発明を実施する際のＩＧＦ−Ｉの出発材料は、様々な塩、酸、塩基、有機小分子、非タンパク性高分子、ＩＧＦ−Ｉ以外のタンパク質(non-IGF-I protein)、ＩＧＦ−Ｉフラグメント、多量体ＩＧＦ−Ｉ、不正確に折りたたまれたＩＧＦ−Ｉ、またはこれらの組み合わせが混入した培地中にあってもよい。ＩＧＦ−Ｉは、天然源由来であってもまたは遺伝子操作により形質転換された真核細胞によって産生される組換ＩＧＦ−Ｉであってもよい。好ましい実施態様によると、ＩＧＦ−Ｉは遺伝子操作により形質転換された酵母によって産生される組換ＩＧＦ−Ｉである。
特に好ましい実施態様によると、組換ＩＧＦ−Ｉは、発現ベクターｐＩＧＦ２０１、ｐＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ０２４またはｐＩＧＦ２０６で安定して形質転換されたピチア  パストリス(Pichia pastoris）株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）中で産生される。発現ベクターｐＩＧＦ２０１、ｐＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ０２４及びｐＩＧＦ２０６を用いた、ピチア  パストリス(P. pastoris）株ＧＳ１１５におけるＩＧＦ−Ｉの産生は、ブリアーレイ(Brierley)ら、米国特許番号５，３２４，６３９号に記載され、この公報は参考のために引用される。
好ましくは、本発明は形質転換された酵母細胞から分泌される組換ＩＧＦ−Ｉを用いて実施される。酵母細胞がＮ−末端シグナルペプチドを有するＩＧＦ−Ｉ前駆体タンパク質をコード化するＩＧＦ−Ｉ発現ベクターで形質転換されると、酵母細胞による分泌がなされる。このシグナルペプチドは、ＩＧＦ−Ｉ前駆体タンパク質を酵母細胞の細胞質膜を介して増殖培地中に分泌させる。分泌工程中に、このシグナルペプチドは切断されて成熟ＩＧＦ−Ｉポリペプチドが得られる。
本発明を組換酵母細胞を用いて実施する際には、ＩＧＦ−Ｉは発酵工程中に培地中に分泌される。特に好ましい発酵段階／工程は米国特許番号５，４２３，６３９号に記載される。米国特許番号５，４２３，６３９号に記載される特に好ましい発酵を用いることにより、発酵中に添加される「ＰＴＭ１」の極微量塩(trace salt)の量は、１リットル出発培地当たり２ｍｌの１回の添加に対して、約１０倍減少でき、好ましい。好ましくは、「ＰＴＭ１」における硫酸、銅、亜鉛及び鉄のレベルは、米国特許番号５，４２３，６３９号に記載される方法と比較すると、３倍少ない。
本発明を組換分泌ＩＧＦ−Ｉを用いて実施する際には、宿主細胞はＩＧＦ−Ｉ含有培地から除去されなければならない。細胞の除去は、例えば、遠心または精密瀘過または双方など、いずれかの適当な手段によってなされる。
第一のカチオン交換段階
宿主細胞を除去した後、本発明の方法における第一の段階は、溶液から全ＩＧＦ−Ｉの少なくとも約９５％を吸着できる条件下でＩＧＦ−Ｉ含有サンプル溶液を適当量の第一のカチオン交換マトリックスと接触させることである。
ＩＧＦ−Ｉ含有溶液は、様々な方法で第一のカチオン交換マトリックスと接触される。例えば、第一のカチオン交換マトリックスをＩＧＦ−Ｉ含有培地が導入される容器内に仕込んだ後、第一のカチオン交換マトリックスからＩＧＦ−Ｉが消耗された(IGF-I-depleted)培地を傾瀉してもよい。または、第一のカチオン交換マトリックスをＩＧＦ−Ｉ含有培地の入った容器に添加した後、第一のカチオン交換マトリックスからＩＧＦ−Ｉが消耗された(IGF-I-depleted)溶液を除去してもよい。第一のカチオン交換マトリックスは、ＩＧＦ−Ｉ含有培地が流れるカラムに入れられることが好ましい。
第一のカチオン交換段階に使用されるマトリックスは当該分野において既知である。カチオン交換マトリックスは、高い流速が可能である、即ち、高圧に耐えられ、マクロ孔質構造を有し、さらに、広範なｐＨ範囲にわたってＩＧＦ−Ｉを結合できるものが好ましい。セルロース、ポリスチレン、デキストラン、アガロース、架橋アガロースなどの、マトリックス支持体がカチオン交換マトリックスに使用される。本段階に好ましく使用されるカチオン交換マトリックスはスルフィルプロピル化(sulfylpropylated)（「ＳＰ」）マトリックスである。特に好ましい第一のカチオン交換マトリックスはトヨパール(Toyopearl）ＳＰ５５０Ｃ（商標）（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）である。
当業者であれば、ＩＧＦ−Ｉ含有サンプル溶液を第一のカチオン交換マトリックスと接触させる前に、マトリックスを再生するおよび／または活性化する必要があることは認識できると解される。再生および／または活性化はマトリックスの販売者の推奨や既知の方法に従って行われなければならない。
第一のカチオン交換マトリックスの使用量は、１ｇ真正ＩＧＦ−Ｉ当たり、少なくとも約０．０３１から１．０リットルのマトリックスである。具体的には、ＩＧＦ−Ｉ含有溶液を、約２〜３０℃の温度で、約０．０１〜１時間またはそれ以上の時間、第一のカチオン交換マトリックスと接触させる。約２０〜２５℃の温度が好ましい。
ＩＧＦ−Ｉ含有溶液を第一のカチオン交換マトリックスと接触させてＩＧＦ−Ｉを吸着させた後は、ＩＧＦ−Ｉが消耗された(IGF-I-depleted)溶液を除去する。これは、例えば、瀘過、傾瀉、遠心など、様々な方法でなされる。好ましい実施態様によると、ＩＧＦ−Ｉ含有溶液の接触およびＩＧＦ−Ｉが消耗された(IGF-I-depleted)培地の除去は、ＩＧＦ−Ｉ含有培地を第一のカチオン交換マトリックスからなるクロマトグラフィーカラムに通すことによって一段階でなされる。
ＩＧＦ−Ｉを第一のカチオン交換マトリックス上に吸着させた後であって、ＩＧＦ−Ｉを溶出させる前に、ＩＧＦ−Ｉをのせたマトリックスを約１〜１０カラム容積の弱酸希釈液で洗浄することが好ましい。弱酸希釈液の例としては、約０．０２Ｍの濃度の、酢酸またはリン酸溶液が挙げられる。
従来方法によっては、ＩＧＦ−Ｉをのせた第一のカチオン交換カラムを、塩、例えば、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む弱酸希釈液（または緩衝液）でさらに洗浄して、ＩＧＦ−Ｉよりも弱い力で第一のカチオン交換マトリックスに結合する、多量体および／または誤って折りたたまれた単量体の形態を有するＩＧＦ−Ｉなどの、不純物を除去する。本発明においては、このような高イオン強度による洗浄段階は、次の変性／再生段階で真正ＩＧＦ−Ｉに変換して真正ＩＧＦ−Ｉの全体としての収率を向上できる、多量体または誤って折りたたまれた単量体の形態を有するＩＧＦ−Ｉを回収することが望ましいため、第一のカチオン交換段階では排除される。
第一のカチオン交換段階での特に好ましい洗浄工程は以下の手順である：約３．０カラム容積の０．０２Ｍ酢酸；さらに、約３．０カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）。
ＩＧＦ−Ｉをのせた第一のカチオン交換マトリックスを（上記したようにして）洗浄した後、マトリックスから実質的にすべてのＩＧＦ−Ｉを脱離させるのに十分高いｐＨまたはイオン強度を有する十分量の溶媒システム（「溶出バッファー」と称する）とマトリックスを接触させることにより、ＩＧＦ−Ｉを溶出させる。
この溶出バッファーは、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に、及び塩濃度を約０．２〜１．０Ｍの維持するのに適した緩衝剤からならなければならない。好ましい溶出バッファーは０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び０．４Ｍ塩化ナトリウムから構成される。
溶出バッファーの使用量は様々であるが、好ましくは、３〜１０カラム容積の範囲である。溶出バッファーが０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び０．４Ｍ塩化ナトリウムから構成される際には、好ましい溶出バッファー量は４カラム容積である。
カチオン交換マトリックスからのＩＧＦ−Ｉの溶出は、様々な条件下で行うことができる。好ましくは、約２〜３０℃の温度が使用される。好ましくは、溶出時間は、比較的短く、例えば、より長いまたは短い時間を使用してもよいが、約０．０１〜１．０時間である。
ＩＧＦ−Ｉの変性／再生段階
第一のカチオン交換段階後にＩＧＦ−Ｉの変性／再生段階を行うことは本発明の必須の態様である。変性／再生段階では、カチオン交換溶出物をジスルフィド結合交換を促進する緩衝液（「変性／再生バッファー」と称する）に移す。このような移動は、希釈、ゲル瀘過、透析、またはダイアフィルトレーションなど、様々な手段によりなされる。
変性／再生バッファーは、通常、アルカリ性、弱還元性、弱変性および可溶化の特性を有する。また、このバッファーは下記が可能でなければならない：（１）ＩＧＦ−Ｉの鎖内ジスルフィド結合を還元し、かつ永久変性を伴わずにＩＧＦ−Ｉタンパク質の変性を促進する；および（２）再酸化によるＩＧＦ−Ｉの再生により適当な対を形成するＩＧＦ−Ｉの鎖内のジスルフィド結合が形成される。
好ましくは、変性／再生バッファーは、ｐＨを８．０〜１０．５に維持するのに適する緩衝剤、例えば、ホウ酸塩、酢酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（「トリス」と称する）；カオトロピック剤、例えば、尿素またはグラニジン；塩、例えば、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール；および還元剤、例えば、ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」と称する）、システイン、β−メルカプトエタノール（「ＢＭＥ」と称する）を含む。好ましくは、変性／再生バッファーは、８．５〜１０．０のｐＨを有し、１．５〜３．０Ｍの濃度の尿素、１．０〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウム、５〜２０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノール、１ｍＭ〜１５ｍＭの濃度のホウ酸ナトリウム、および０．００５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトールからなる。最も好ましくは、変性／再生バッファーのｐＨは約９．０〜９．５であり、バッファーは２Ｍ尿素、１．５ｍＭ塩化ナトリウム、１５％エタノール、５ｍＭホウ酸ナトリウム及び０．２ｍＭ  ＤＴＴから構成される。
好ましくは、全ＩＧＦ−Ｉ濃度は約０．１〜５ｍｇ／ｍｌであり；より好ましくは、上記濃度は０．２〜２ｍｇ／ｍｌである。
好ましくは、変性／再生バッファーの組成及び各成分の濃度は、再生及び再酸化が変性及び還元から１時間以内に開始し、４〜４０時間以内に実質的に終了するようなものである。より好ましくは、再生及び再酸化は実質的に１５〜２０時間以内に終了する。
最も好ましい変性／再生バッファー（上記）を使用する際には、ジスルフィドの還元は数秒で生じる。空気の存在下で室温で緩やかに撹拌すると、再酸化が約１時間以下に開始する。再生及び再酸化は実質的に約１５〜２０時間以内に終了する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）段階
変性／再生段階後、部分的に精製され再生されたＩＧＦ−Ｉを十分量のＨＩＣマトリックスと接触させて、少なくとも約９５％のＩＧＦ−Ｉを吸着させる。好ましくは、ＨＩＣマトリックスはＩＧＦ−Ｉ含有バッファーが通過するカラムに入れられる。
再生ＩＧＦ−Ｉ溶液をＨＩＣマトリックスと接触させる前に、ＩＧＦ−Ｉ含有サンプルのｐＨ及び塩濃度を調節する。好ましくは、ｐＨは４．０〜５．０に調節され、塩濃度は０．４Ｍ〜２．０Ｍに調節される。より好ましくは、ｐＨは４．０〜４．５に調節され、塩濃度は１．０〜１．５Ｍに調節される。
ＩＧＦ−Ｉ含有培地の塩濃度を上げることにより、ＩＧＦ−ＩのＨＩＣマトリックスへの結合が促進される。このような用途に適した塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明に好ましく使用されるＨＩＣマトリックスは、アルキル−またはアリール−置換ＨＩＣマトリックスである。ＨＩＣマトリックスの例としては、ブチル−、オクチル−、またはフェニル−置換マトリックスが挙げられる。本発明を実施するにあたって有用なＨＩＣマトリックス支持体としては、合成ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）など；セルロース、デキストラン、アガロース、架橋アガロースなどが挙げられる。特に好ましいＨＩＣマトリックスはブチル−置換、ポリメタクリレート疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス（例えば、トヨパールブチル(Toyopearl Butyl）６５０Ｍ（商標）またはトヨパールブチル(Toyopearl Butyl）６５０Ｃ、トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）である。
必要な再生(regeneration)後、カラムを５〜１０カラム容積の塩含有酢酸塩／リン酸緩衝液（約２．５〜４．５、好ましくは約３．０のｐＨ）で平衡化する。
本発明を実施するにあたって使用されるＨＩＣマトリックスの量は様々である。具体的には、約０．０５〜１リットルのマトリックス／ｇ真正ＩＧＦ−Ｉが使用される。
例えば、ＩＧＦ−ＩをＨＩＣマトリックスと約１５〜３０℃の温度で、少なくとも約０．１〜３０分間、接触させる。２０〜２５℃の温度が好ましい。
実質的にすべてのＩＧＦ−Ｉを第一のＨＩＣマトリックスに吸着させた後、マトリックスをバッファーと接触（即ち、「洗浄」）して、かなりの量の完全な、単量体の、正しく折りたたまれた形態の吸着したＩＧＦ−Ｉは除去せずに、かなりの量の混入物質（即ち、単量体の、完全な、正しく折りたたまれたＩＧＦ−Ｉ以外の物質）をマトリックスから除去する。特に好ましいカラム洗浄工程では、ＨＩＣカラムを、約３カラム容積の、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む、０．２Ｍ酢酸で洗浄する。次に、ＨＩＣカラムを、約１０カラム容積の、０．１５〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む、０．２Ｍ酢酸で洗浄する。
カラムによる洗浄工程が終了したら、ＨＩＣマトリックスをＨＩＣ溶出バッファー、即ち、実質的にすべての残りの吸着した真正ＩＧＦ−Ｉをマトリックスから除去するのに適したバッファーと接触させる。
吸着したＩＧＦ−Ｉは様々な条件下でＨＩＣマトリックスから溶出される。好ましくは、溶出バッファー温度は１５〜３０℃である。より好ましくは、上記温度は２０〜２５℃である。溶出時間は、カラム寸法やマトリックス材料などの機能として変化する。カラムを通る溶出液の流速は約１０〜３００ｃｍ／時間であることが好ましい。
特に好ましいＨＩＣ溶出工程は、約４カラム容積の、０〜０．０２Ｍ塩化ナトリウムを含む、０．２Ｍ酢酸を流すことから構成される。
上記したような特に好ましい材料及び工程からなるＨＩＣ段階は、従来技術工程に比べて以下のような様々な利点がある：（１）潜在的なＩＧＦ−Ｉが硫酸アンモニウムにおいて不純物と結合して沈殿するのを防止する；（２）塩勾配を排除することにより、より簡便である；および（３）ｐＨの変化が防止される。
必要であれば、一部の、またはすべてのＨＩＣマトリックスからの溶出物をＨＩＣ精製に再度かけてもよい。必要であれば、一部の、またはすべてのＨＩＣマトリックスからの洗浄液を変性／再生をした後にＨＩＣ精製に再度かけてもよい。
第二のカチオン交換段階
ＨＩＣ段階から得られた部分精製されたＩＧＦ−Ｉを第二のカチオン交換精製段階にかける。第二のカチオン交換段階における材料や工程の選択に関わる原理は、本質的には、第一のカチオン交換段階のものと同様である。したがって、同様の型のカチオン交換マトリックスが具体的には第一及び第二のカチオン交換段階で使用される。本発明の最も好ましい実施態様によると、第二のカチオン交換段階は下記工程からなる。
カチオン交換カラム、好ましくはＳＰカラム(Sp column)、最も好ましくはトヨパール(Toyopearl）ＳＰ５５０ＣTM、ＳＰ６５０ＳTM、またはＣＭ−６５０ＭTM（トーソーハース(TosoHaas)）カラム（予め再生済み）を、本質的に０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）から構成されるバッファーで平衡化する。ＨＩＣ段階から得られた部分精製されたＩＧＦ−Ｉをこのカチオン交換カラムにのせた後、カラムを７〜１０カラム容積の０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で洗浄することが好ましい。次に、ＩＧＦ−Ｉは、約７カラム容積の０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で溶出されることが好ましい。
第二のカチオン交換マトリックスの使用量、即ち、第二のカチオン交換カラムの大きさは、マトリックスに吸着されるＩＧＦ−Ｉの全量に依存する。様々な市販のカチオン交換マトリックスの能力が売り主により提供されており、ＩＧＦ−Ｉに対するマトリックスの適当な割合の算出法は当該分野における通常の知識を有するものには既知である。
逆相クロマトグラフィー段階
第二のカチオン交換段階から得られた部分的に精製され、再生されたＩＧＦ−Ｉは逆相クロマトグラフィー段階に供される。従来のＩＧＦ−Ｉの精製方法の相当する箇所では、ゲル瀘過クロマトグラフィーが使用されていた。ゲル瀘過は高分子量の混入物を除去する。本発明による逆相クロマトグラフィーもまた高分子量の混入物を除去する。しかしながら、逆相クロマトグラフィー段階は、酸化、グリコシル化、及び一部が分解した形態などの、様々な非真正の形態のＩＧＦ−Ｉをもさらに除去する。
市販される、様々な逆相クロマトグラフィー媒体が使用される。ポリマー樹脂媒体が好ましい。ポリマー樹脂媒体の利点としては、水酸化ナトリウムによりデピロゲネーション(depyrogenation)及び衛生を可能にする化学的な安定性がある。特に好ましい逆相クロマトグラフィー媒体は、アンバークロム(Amberchrom)ＣＧ１０００ｓｄTM（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）である。逆相クロマトグラフィー段階に使用される有機溶媒例としては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、及びアセトニトリルが挙げられる。エタノールが特に好ましい。
第二のカチオン交換段階から得られた部分的に精製ＩＧＦ−Ｉサンプルを、逆相カラムを０．２Ｍ酢酸で平衡化した後のカラムにのせる。
次に、ＩＧＦ−Ｉが吸着した逆相カラムを、０％〜２０％エタノールを含む一以上の水性／有機溶媒バッファーで洗浄して、混入物、即ち、真正ＩＧＦ−Ｉ以外の物質を除去する。本発明の特に好ましい実施態様によると、ＩＧＦ−Ｉが供せられた逆相クロマトグラフィーカラムに、約１カラム容積の０．２Ｍ酢酸による１回目の無勾配洗浄を行う。次に、このカラムに、０．２Ｍ酢酸における１９％エタノールによる２回目の無勾配洗浄を行い、真正ＩＧＦ−Ｉより疎水性の低い混入物（例えば、酸化、グリコシル化及びｄｅｓ−２  ＩＧＦ−Ｉ等の、一部分解した形態のＩＧＦ−Ｉ）を除去する。
真正ＩＧＦ−Ｉは、水性／有機溶媒バッファーによる無勾配溶離により回収された後、勾配溶離にかけられる。無勾配溶離は、数カラム容積の、有機溶媒濃度が約２０％〜４０％である水性／有機溶媒バッファーを用いて行われる。さらに、有機溶媒の勾配により、ＩＧＦ−Ｉが溶出される。好ましくは、無勾配溶離は、４カラム容積の１９％エタノールを含む０．２Ｍ酢酸を用い、勾配（段階または直線的）は、０．２Ｍ酢酸において、１９％〜２５％（ｖ／ｖ）エタノールを用いる。真正ＩＧＦ−Ｉより疎水性の高い混入物質はカラムに吸着されたままであるため、真正ＩＧＦ−Ｉから分離される。エタノール勾配は段階勾配であってもまたは直線勾配であってもよい。
真正ＩＧＦ−Ｉを溶出した後の、残った吸着化合物、即ち、真正ＩＧＦ−Ｉより疎水性の高いものは、逆相カラムから「ストリップされる(stripped)」（除去される）。好ましくは、カラムは、例えば、約７０％〜１００％濃度の、高濃度のエタノールでストリップされる(stripped)。
濃縮／ダイアフィルトレーション
逆相クロマトグラフィー段階後は、精製した真正ＩＧＦ−Ｉを、限外瀘過などの濃縮工程にかける。この段階の意図は、精製したＩＧＦ−Ｉを約１２〜１６ｍｇ／ｍｌの最終濃度にまで濃縮し、逆相クロマトグラフィー溶出バッファーを最終産物を配合する次の段階に適したバッファーに置換することである。
様々な材料からなり、様々な孔径（分子量のカットオフを決定する）を有する、限外瀘過膜は、市販されている。本発明の好ましい実施態様によると、１，０００の分子量のカットオフを有するポリスルホン製平膜（フィルトロン(Filtron)、ノースボラウ、マサチューセッツ州(Northborough, MA)）が使用される。より好ましい実施態様によると、３，０００または５，０００の分子量のカットオフを有するポリスルホン製中空糸膜（エージー  テクノロジー(AG Technology)、ニードハム、マサチューセッツ州(Needham, MA)）が使用される。中空糸膜は、分子量のカットオフの規格が異なるものの、平膜に比べて、フラックス比が高くかつＩＧＦ−Ｉの保持能が良好である。
濃縮／ダイアフィルトレーションは本方法の前記段階のいずれかまたはすべての終了時に行ってもよい。例えば、材料の精製が異なる位置で終了しようとする場合には、濃縮／ダイアフィルトレーションをＨＩＣ段階の後に行ってもよい。技術者は、濃縮／ダイアフィルトレーションを行う際に必要であると指令できる。
分析方法
ＩＧＦ−Ｉの精製工程の各段階で、ＩＧＦ−Ｉ含有サンプル、ＩＧＦ−Ｉが消耗された(IGF-I-depleted)溶液、カラム洗浄液、収集画分などのアリコートは、一以上の分析法によりアッセイされることが好ましい。このようなアッセイにより、精製工程の目的とする概念をモニターすることができる。目的とするサンプルに関する適当なアッセイ法はサンプルの型や検索しようとする情報に依存する。例えば、ＩＧＦ−Ｉ、または、混入物、またはその双方をアッセイすることが望ましい。
様々なＩＧＦ−Ｉの分析方法が既知であり、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、ウェスタンブロッティング、ペプチドマッピング、Ｎ−末端アミノ酸配列決定、及びＨＰＬＣなどが挙げられる。本発明に関して好ましく使用されるＩＧＦ−Ｉの分析方法は、ＨＰＬＣ法、例えば、Ｃ４  ＲＰ  ＨＰＬＣ、Ｃ８  ＲＰ  ＨＰＬＣ、カチオン交換ＨＰＬＣまたはＳＥＣ  ＨＰＬＣである。具体的には、一以上のこれらのＨＰＬＣ法を用いて、ＩＧＦ−Ｉ法を通してのクロマトグラフィーカラム画分をアッセイする。
他の好ましいＩＧＦ−Ｉの分析方法は、「シアノ逆相クロマトグラフィー(cyano reverse phase chromatography)」（ワイエムシー（ＹＭＣ）、ウィルミントン、ノースカロライナ州(Wilmington, NC)）である。シアノ逆相逆相クロマトグラフィー(cyano reverse phase chromatography)を本発明に係る分析方法として使用する際には、０．１％トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」と称する）によるアセトニトリルのシャロウグラジエント(shallow gradient)を用いて、真正ＩＧＦ−Ｉ及び主要な混入する、非真正の形態のＩＧＦ−Ｉを分離及び定量する。
実施例の情報
従来方法、特にホルツ（上記）で記載された方法、および本発明の好ましい方法を、１０リットルの発酵発育スケール(fermentation development scale)で行われた実験試験で比較した。ＩＧＦ−Ｉ含有出発材料は、ピチア  パストリス(P. pastoris)株ＧＳ１１５の１０リットル発酵ブロスから構成された。上記株は、Ｎ−末端にシグナルペプチドを有する組換ヒトＩＧＦ−Ｉをコード化するプラスミドｐＩＧＦ２０６で安定して形質転換される。シグナルペプチドの存在により、組換ヒトＩＧＦ−Ｉは、ピチア  パストリス(P. pastoris）の増殖培地中に分泌される。増殖培地及び発酵条件はホルツ（上記）に記載されるのと同様である。ＰＴＭ１の極微量塩の添加量(trace salt addition）は１０倍減少した；さらに、ＰＴＭ１における硫酸、銅、亜鉛及び鉄レベルは約３倍減少した。
発酵中、様々な形態のＩＧＦ−Ｉが増殖培地中に分泌された。図２は、第一のカチオン交換段階から回収されたＩＧＦ−Ｉの典型的なシアノ逆相クロマトグラムを示すものである。これらのＩＧＦ−Ｉの形態としては、７．３分に溶出する真正ＩＧＦ−Ｉ（全ＩＧＦ−Ｉの約１８％）；５．０８分に溶出する誤って折りたたまれた単量体ＩＧＦ−Ｉ（約１５％）；６．０分に溶出する分解されたまたはアミノ−末端がクリップされた(clipped)（ｄｅｓ−２）単量体形態（全体の約１％）；６．７分に溶出する酸化されたまたはグリコシル化された単量体形態（全体の約７％）；８〜１１分に溶出する様々な分解されたまたはニック(nicked)単量体形態（全体の約７％）；および１１〜２２分に溶出する多くの多量体形態（全体の約５０％）が挙げられる。
表１は、ホルツ法における基礎的な段階を本発明の方法における好ましい段階と比較するものである。ホルツ法における段階に対する最適な変更を表２に要約する。工程の各段階での真正ＩＧＦ−Ｉの収率（シアノ逆相クロマトグラフィー分析法によって測定）を表３に示す。本発明の好ましい方法に関する表３のデータは、６回の１０リットルの製造操作に関する平均値である。従来の方法に関する表３のデータは、１回の１０リットルの製造操作から得たものである。
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細胞を除去した後、細胞を含まない発酵ブロスを、２０〜２５℃で、１３０ｍｌ／分の流速で、２７０ｍｌのトヨパール(Toyopearl）ＳＰ５５０Ｃ（商標）（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）カラム（５ｃｍ×１４ｃｍ）にのせた。ローディングされたカラムを、２０〜２５℃で、１３０ｍｌ／分の流速で、約３カラム容積の０．０２Ｍ酢酸でまず洗浄した後、約３カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウムでさらに洗浄した。ＩＧＦ−Ｉを４カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、０．４Ｍ塩化ナトリウムでカラムから溶出させた。第一のカチオン交換段階から回収された材料を表４に要約する。
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本発明の方法における第一のカチオン交換段階は、ホルツ法における第一のカチオン交換段階とは、第二の洗浄バッファーで塩化ナトリウムを使用しなかった点で異なる。これにより、（次の変性／再生段階において単量体の形態に変換される）多量体の形態のＩＧＦ−Ｉが回収でき好ましい。多量体ＩＧＦ−Ｉの回収量の増加は、ホルツ法による第一のカチオン交換（「ＳＰ１」と称する）産物および本発明の方法を用いて得られたＳＰ１産物の分析クロマトグラムを比較することによって観察される。多量体ＩＧＦ−Ｉレベルを除くと、上記２つのクロマトグラフィーによるプロフィール（図２及び３）には有意な差はない。
ＳＰ１回収プールを、以下の最終濃度を得られるように、変性／再生バッファーの濃縮（２×濃度）ストックと合わせた：２Ｍ尿素、１．５Ｍ塩化ナトリウム、１５％エタノール；５ｍＭホウ酸ナトリウム；及び０．２ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ９〜９．５）。変性／再生を、室温で、１５〜２０時間、緩やかに混合しながら、行った。変性／再生段階前後になされた分析からの具体的なシアノ逆相クロマトグラムを図４Ａ及び４Ｂに示す。変性／再生段階前後の様々な形態のＩＧＦ−Ｉの相対量（全ＩＧＦ−Ｉの割合（％）として）を表５に示す。多量体ＩＧＦ−Ｉピークの減少および真正ＩＧＦ−Ｉピークの増加が図４Ａ及び４Ｂでは明らかに認められる。多量体ＩＧＦ−Ｉピークが減少する結果、真正ＩＧＦ−Ｉが存在する全ＩＧＦ−Ｉの１４％から４４％にまで増加した。高い割合の多量体ＩＧＦ−Ｉが単量体に変換される（６４％多量体から２１％多量体に減少）ため、非真正単量体形態によっては量が増加するものもある。例えば、酸化された及びグリコシル化された形態（７．２５分）は全体の５％から１２％に増加した；ｄｅｓ−２と称される分解された形態（６．８６分）は１．５％から３．４％に増加した（表５）。
しかしながら、真正ＩＧＦ−Ｉに対する非真正単量体形態の割合は、真正ＩＧＦ−Ｉの量もまた増加したので、増加していないことに留意すべきである。新たな混入物は変性／再生段階の結果としては同定されなかった。変性／再生工程は、１００リットル及び１５００リットルの発酵スケールに相当するような実験において行われたところ、匹敵するデータが得られた（データは示さず）。
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ＨＩＣカラムへのローディングを目的とした調製において、再生プールのｐＨは酢酸で４．２に調節され、さらに等容の１Ｍ塩化ナトリウムで希釈された。１．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨが調節された再生プールを、２０〜２５℃で、４０ｍｌ／分の流速で、トヨパールブチル(Toyopearl Butyl）６５０Ｍ（商標）（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア・ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）ＨＩＣカラム（３．２ｃｍ×４７ｃｍ）にのせた。
ＩＧＦ−Ｉが吸着した、ＨＩＣカラムを、約３カラム容積の０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸で洗浄した。次に、ＨＩＣカラムを約１０カラム容積の０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸で洗浄した。さらに、吸着したＩＧＦ−Ｉを、４カラム容積の０．０２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ酢酸でＨＩＣカラムから溶出させた。
ＨＩＣ段階後に回収された産物の分析による具体的なシアノ逆相クロマトグラムを図５Ａ及び５Ｂに示す。クロマトグラフィーによるプロフィールにおいて本質的な相違は認められない。ホルツ法における及び本発明の方法におけるＨＩＣ段階後の様々な形態のＩＧＦ−Ｉの相対量（全ＩＧＦ−Ｉの割合（％）として）を表６に示す。
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第二のカチオン交換段階を、１０ｍｌ／分の流速で、トヨパール(Toyopearl）ＳＰ５５０Ｃ（商標）（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア・ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）カラム（１．６ｃｍ×３５ｃｍ）で行った。
ローディング後、第二のカチオン交換カラムを約１カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で洗浄した。次に、このカラムを約７カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）で洗浄した。ＩＧＦ−Ｉを約７カラム容積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．４Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）で溶出させた。ホルツ法及び本発明の方法における第二のカチオン交換段階後の様々な形態のＩＧＦ−Ｉの相対量（全ＩＧＦ−Ｉの割合（％）として）を表７に示す。
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第二のカチオン交換段階から回収された材料を、約３カラム容積の０．２Ｍ酢酸バッファーで平衡化された、アンバークロム(Amberchrom)ＣＧ１０００ｓｄTM（トーソーハース(TosoHaas)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(Philadelphia, PA)）逆相クロマトグラフィーカラム（２．６ｃｍ×２１ｃｍ）にのせた（流速：２０ｍｌ／分）。ローディング後、この逆相カラムを１カラム容積の０．２Ｍ酢酸で洗浄した。次に、このカラムを４カラム溶液の１９％エタノールを含む０．２Ｍ酢酸で洗浄した（流速を１５ｍｌ／分に減少させた）。ＩＧＦ−Ｉを１９％〜２５％エタノール勾配を用いて逆相カラムから溶出させた。ＩＧＦ−Ｉ回収後、カラムを高濃度のエタノール（即ち、７０〜１００％）でストリップした。図７は、ホルツ法によるゲル瀘過産物および本発明の方法による逆相産物の分析からの典型的なシアノ逆相クロマトグラムを示すものである。ホルツ法におけるゲル瀘過段階および本発明の方法における逆相クロマトグラフィー段階後の様々な形態のＩＧＦ−Ｉの相対量（全ＩＧＦ−Ｉの割合（％）として）を表８に示す。
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最終産物の分析および特徴付け
本発明を実施することによって得られた最終産物の純度、同一性及び効力を調べるために、様々な試験を使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
産物の純度及び同一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。本発明の方法による産物を、ホルツ法による参考標準物質とコミグレートした(co-migrate)ところ、検出可能な量のより高い分子量のタンパク質を含んでいない（データ示さず）。
ウェスタンブロット／ＥＬＩＳＡ
非ＩＧＦ−Ｉタンパク質をウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。上記試験では、１次抗体がネガティブコントロールであるピチア  パストリス(Pichia pastoris）発酵液の第一カチオン交換段階から回収されたタンパク質に対して生じた。この抗体は、混入した宿主細胞タンパク質の存在をプローブするのに使用された。混入した宿主細胞タンパク質の量は、本発明の方法による産物では、ホルツ法による産物と比較して、約１０倍少ない。スロットブロットＥＬＩＳＡ(slot blot ELISA）アッセイを用いて定量した。表９はＥＬＩＳＡによる測定結果を要約するものである。
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シアノ逆相ＨＰＬＣ
最終産物の純度をまた、シアノ逆相カラム（シアノ  ゾルバックス(Cyano Zorbax)、マックモッド  アナリティカル(MacMod Analytical)、チャッズ  フォード、ペンシルバニア州(Chadds Ford, PA)）を用いて評価した。ｐＨ６．８における２５ｍＭリン酸バッファーとのアセトニトリルのシャローグラジエント(shallow gradient)を用いて、主要なＩＧＦ−Ｉ類似体を分離し、真正ＩＧＦ−Ｉの濃度及び純度を測定した。このシアノ逆相アッセイは、真正ＩＧＦ−Ｉから様々なＩＧＦ−Ｉ類似体（酸化及びグリコシル化）を良好に分解する。表１０は、本発明の方法によって製造される３ロットの物質の純度をホルツ法によって製造される数個のロットと比較した際の結果を要約するものである。図８の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムは、ホルツ法と本発明の方法を比較するものである。
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サイズ排除ＨＰＬＣ
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて、産物中の高分子量の凝集物の存在を検出した。表１１は、各ロットの試験結果を要約するものである。本発明の方法は、効率よく、産物から高分子量物質を除去する。
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等電点電気泳動
等電点電気泳動ゲルにより、ホルツ法によって製造された産物と比較した際の、本発明の方法による産物の同一性をまた確認する（データ示さず）。
タンパク質の配列決定
産物のＮ−末端の配列決定により、ホルツ法によって製造された産物及び組換ヒトＩＧＦ−Ｉの公知の配列に関して、タンパク質の配列が正しいことが確認された。
ペプチドマッピング
本発明による産物のペプチドマッピングによる結果は、ホルツ法による物質で得られた結果と同一である。還元及び非還元マップが双方とも一致する。図１０は、マッピング研究の結果を示すものである。本発明の方法によって製造される産物は再生されるため、ＲＰ−ＨＰＬＣによる未消化のＩＧＦ−Ｉの及び非還元ペプチドマップのピークの保持時間により、本発明の方法によって製造されるＩＧＦ−Ｉの折りたたみが正しいことを確認する。さらに、図１１は、精製工程から得られる誤って折りたたまれたＩＧＦ−Ｉのペプチドマップを示すものである。予想される通り、非還元マップは、正しく折りたたまれた真正ＩＧＦ−Ｉのマップとは異なる。
質量分光法(mass spectroscopy）
さらに同一性を質量分析によって調べた。７６４９±５ＡＭＵの分子量を有する、主要な成分が本発明の方法による物質の各ロットで観察された。ホルツ法の産物と同等の強さを有する微量成分もまた存在する。
生物学的な活性
本発明の方法によって製造される物質に関するラジオレセプターアッセイ(radio receptor assay)結果は、ＨＰＬＣアッセイ及び紫外線分光法による全タンパク質に基づいて、産物の予想される効力と一致する。
本発明の方法による様々なロットの物質の生物学的な効力もまた分裂促進バイオアッセイ(mitogenic bioassay)において試験した。ＩＧＦ−Ｉは強力な分裂促進因子である。その効果は、ジメチルチアゾル−２−イルジフェニルテトラゾリウム(dimethylthiazol-2-yl diphenyltetrazolium)（ＭＴ）をヒトの骨肉腫細胞系ＭＧ−６３のＤＮＡ中に導入することにより測定される。双方の方法によって製造される様々なロットのＩＧＦ−Ｉの効力は同等である（データは示さず）。
本発明の方法によって製造される産物は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉの予想される特性を有する。この産物の純度はホルツ法による産物に比べて約１〜４％上昇していた。
本発明の他の実施態様は、下記請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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