(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物に由来するアニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる、体液中のインターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンを吸着除去するための吸着剤。
【請求項２】
水不溶性担体が親水性であることを特徴とする請求項１記載の吸着剤。
【請求項３】
水不溶性担体に−ＯＨで表される末端官能基が存在することを特徴とする請求項１記載の吸着剤。
【請求項４】
水不溶性担体が多孔性であることを特徴とする請求項１記載の吸着剤。
【請求項５】
体液中のインターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンを吸着除去するための吸着器を製造するための請求項１記載の吸着剤の使用。
【請求項６】
アニオン性官能基を有する水不溶性担体を、インターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンを含有しうる体液と接触させることにより該インターロイキンを吸着する工程および該吸着したインターロイキンを溶出する工程からなる、インターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの回収方法。
【請求項７】
体液の入口および出口を有し、かつ吸着剤の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項１記載の吸着剤を充填してなるインターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの吸着器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン類の吸着剤、吸着除去方法および吸着器に関する。とくに詳しくは、インターロイキン−８（以下、ＩＬ−８という）、インターロイキン−１β（以下、ＩＬ−１βという）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６という）およびインターロイキン−２（以下、ＩＬ−２という）よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンを吸着する吸着剤、ならびに前記吸着剤を用いた吸着除去方法および吸着器に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは種々の抗原特異的、非特異的免疫炎症反応に深く関わる生体防御因子として、非常に重要なタンパク性物質である。その存在は生体の恒常性の維持に必要不可欠な物質であるが、炎症をともなう疾患では過剰に産生され、その疾患の病態の形成、遷延に関与している。
【０００３】
「ＩＬ−８」は、サイトカインの一種であり、１９８７年に松島らによって単球由来の好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）として精製され、その遺伝子もクローニングされている。ＩＬ−８は、種々の細胞によって産生される好中球活性化遊走制御因子である。
【０００４】
ＩＬ−８は、好中球に作用して、好中球が有するカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖抑制作用を増強することが知られており、免疫賦活剤としての効果が期待されている（日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、１９９１年、６５〜７２頁）。それゆえ、ＩＬ−８を体液または培養液から大量かつ効率的に精製する方法が望まれている。
【０００５】
他方、ＩＬ−８の持続大量投与は組織にとって非常に有害であり、肺胞では成人呼吸窮迫症候群様の組織破壊、関節では大量のリンパ球浸潤をともなう組織破壊を生じる。実験的にもリポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘導性皮膚炎、虚血後再灌流時の好中球浸潤にＩＬ−８が本質的に関与していることが示される。これは、前記リンパ球浸潤あるいは好中球浸潤にともなう組織破壊が、ＩＬ−８に対する中和抗体を投与することでほぼ完全に抑止されることで、証明されている。さらには、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬、接触性皮膚炎、敗血症、突発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、免疫性血管炎、糸球体性腎炎、尿路感染症、心筋梗塞、喘息、気道感染症、周産期感染、移植臓器拒絶症などの疾患においては、炎症局所あるいは全身血中から正常人に比して異常に高濃度のＩＬ−８が検出されており（免疫薬理、１２巻１号、１５〜２１頁、１９９４年）、これらの疾患にＩＬ−８が関与していることが考えられている。しかしながら、現在のところ、これらの疾患において、ＩＬ−８の作用を抑止する有効な方法は確立されていない。
【０００６】
つぎに、「ＩＬ−１β」は細菌など異物による刺激で、主に単球・マクロファージから産生される炎症性サイトカインであり、１９８４年にアウロン（Ａｕｒｏｎ）らによってヒトの遺伝子がクローニングされている。
【０００７】
１９７９年の第２回国際リンフォカインワークショップにおいて同一物質としてインターロイキン１（ＩＬ−１）との統一的呼称が決定されるまで、内因性発熱物質（ｅｎｄｏｇｅｎｉｏｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎ）（ＥＰ）、白血球内因性メディエーター（ｌｅｕｋｏｃｙｔｉｃ  ｅｎｄｏｇｅｎｉｏｕｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＬＥＭ）、リンパ球活性化因子（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）（ＬＡＦ）、Ｂ細胞活性化因子（Ｂ  ｃｅｌｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＢＡＦ）などとして見い出されていたことからもわかるように、その生物活性は多岐にわたっている。
【０００８】
炎症の主要なメディエーターであるＩＬ−１βは、通常の状態では生体の恒常性を含む種々の反応において重要な役割を果たしているが、何らかの機構で過剰、または長期にわたって持続的に産生されると、逆に組織の破壊や炎症性疾患の病態の形成・悪化を誘導することが明らかになってきた（バイオメディカ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）、９巻、１９９３年、７０３〜７０７頁）。とくに敗血症をはじめとするトキシック症候群（ｔｏｘｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性関節リウマチ、ライム病、骨粗鬆症、川崎病、痛風、糸球体腎炎、拡張性心筋症、子宮内膜炎、早産、肉芽腫、急性骨髄性白血病、アルツハイマー病、ダウン症候群、肝線維化、肝硬変、さらにはアルコール性肝炎などの各病態へのＩＬ−１βの関与が強く示唆されており（日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、１９９１年、１３〜２０頁および１７７〜１８７頁）、ＩＬ−１βの特異的抑制方法が望まれ、盛んに研究されている。
【０００９】
代表的なものとして、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１βレセプター抗体、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）などが開発され（医学のあゆみ、１６７巻、１９９３年、４３２〜４３５頁）、一部は敗血症を対象疾患として臨床試験に供されたが、いずれも期待された効果はえられず、実用化にはいたっていない。
【００１０】
また「ＩＬ−６」は、元来Ｂ細胞の分化因子として単離され、１９８６年に平野、岸本らによってその遺伝子構造が決定されたが、骨髄腫細胞の増殖因子として働いたり、肝臓において急性期タンパク質を誘導するなど炎症の主要メディエーターとしての作用が認められている。
【００１１】
ＩＬ−６の異常産生がＢ細胞のポリクローナルな活性化を招き、形質細胞腫を引きおこすことが、トランスジェニックマウスの作製により、示されている。また一般に、ＩＬ−６は多くの急性炎症疾患や細菌感染、ウイルス感染、火傷、心筋梗塞などにおいて血中のＩＬ−６が高値を示すことが観察されている。実際火傷や外科手術などの侵襲時にＩＬ−６レベルが亢進し、急性の細菌性髄膜炎患者（肺炎菌、ブドウ球菌、リステリア菌による）の脳脊髄液中では、５００ｎｇ／ｍｌにおよぶＩＬ−６が検出された例が報告されている。一方、慢性肝炎において局所の炎症組織または全身においてＩＬ−６が検出されている。慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患やキャストルマン（Ｃｓｔｌｅｍａｎ）症、心房粘液腫などにおいては、ＩＬ−６の異常産生があり、これがγグロブリン血症タンパク産生の引き金になっていると考えられている。そのほかにも子宮頸癌、ＡＩＤＳ、アルコール性肝炎、多発性骨髄腫、レンネルトＴリンパ腫、メサンジウム増殖性腎炎、腎細胞腫、乾癬、敗血症などの疾患へのＩＬ−６の関与が指摘されている（日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、１９９１年、１７７〜１８７頁）。しかしながら現在のところ、これら疾患において、ＩＬ−６の作用を特異的に抑止する有効な方法は確立されていない。
【００１２】
さらに、「ＩＬ−２」は従来Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と呼称されていた分子量約１５ｋＤａの糖タンパク質であり、１９８３年に谷口らによって遺伝子がクローニングされたサイトカインである。ＩＬ−２はそのＴ細胞に対する増殖促進活性から単独療法あるいは局所養子免疫療法による癌の治療薬としての応用が図られている。
【００１３】
一方、トランスジェニックマウスを用いた実験から局所（このばあいは膵臓）で持続的に産生されるＩＬ−２が自己免疫性糖尿病の有力な病因の１つであることを示唆する知見がえられている（ヘス  ダブリュー  アール（Ｈｅａｔｈ  Ｗ．Ｒ．）アリソン  ジェー（Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｊ．）ら：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３５９巻、５４７頁、１９９２年）。またＩＬ−２投与において全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）を併発したとの報告もある（キャゼライン（Ｃｈａｚｅｒａｉｎ  Ｐ．）、メイヤー  オー（Ｍｅｙｅｒ  Ｏ）、カーン  エム−エフ（Ｋａｈｎ  Ｍ−Ｆ）ら：アン・インターン・メッド（Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．）、１１６巻、４２７頁、１９９２年およびバンドル  ユー  ビィー（Ｗａｎｄｌ  Ｕ．Ｂ．）、ナゲル−イムケ  エム（Ｎａｇｅｌ−Ｈｉｅｍｋｅ  Ｍ．）、メイ  ディー（Ｍａｙ  Ｄ．）ら：クリン・イミューノル・イムノパソル（Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．）、６５巻、７０頁、１９９２年）。さらには、敗血症性ショックにおいてＴＮＦ−αとともにＩＬ−２がその病態に深く関与している可能性が示唆されている（エンドー  エス（Ｅｎｄｏ  Ｓ．）、イナダ  ケー（Ｉｎａｄａ  Ｋ．）、イノウエ  ワイ（Ｉｎｏｕｅ  Ｙ．）ら：サーキュレイトリー  ショック（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｈｏｃｋ）、３８巻、２６４頁、１９９２年）。しかしながら現在のところ、これらの疾患において、ＩＬ−２の作用を抑止する有効な方法は確立されていない。
【００１４】
かかる現状を鑑み、本発明者らは病因物質としてのＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を患者体液から吸着除去する、要すれば回収する方法について研究した。本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、アニオン性官能基を有する水不溶性担体が体液と接触した際に、体液中のＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２を強く吸着することを見い出し、さらに検討を進め、本発明を完成するにいたった。
【００１５】
本発明の課題は体液、とくに血液、血漿および血清からＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を選択的に吸着除去する、要すれば回収することにある。
【発明の開示】
【００１６】
すなわち本発明は、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなるＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの吸着剤、前記吸着剤を体液と接触させることを特徴とするＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの吸着除去方法、アニオン性官能基を有する水不溶性担体を、インターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンを含有しうる液と接触させることにより該インターロイキンを吸着する工程および該吸着したインターロイキンを溶出する工程からなる、インターロイキン−８、インターロイキン−１β、インターロイキン−６およびインターロイキン−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの回収方法ならびに液の入口、出口を有し、かつ吸着剤の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、前記吸着剤を充填してなるＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの吸着器に関する。
【００１７】
前記吸着剤において、好ましくはアニオン性官能基は硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステル基よりなる群から選択される少なくとも１種類よりなり、硫酸、デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物に由来し、かつ／または前記官能基内に複数のアニオン性官能基を有するポリアニオン性官能基である。
【００１８】
また、前記吸着剤において、好ましくは水不溶性担体が親水性であり、多孔性であり、かつ／または水不溶性担体に−ＯＨで表わされる末端官能基が存在する。
【００１９】
本発明において体液とは血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた画分成分、ならびにその他の生体由来の液性成分をいう。
【００２０】
「ＩＬ−８」は分子量約８０００のタンパク質であり、１〜２量体で存在することが報告されている（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２６４巻、９０〜９２頁）。
【００２１】
「ＩＬ−１β」は１５３アミノ酸からなる分子量約１７，５００のタンパク質であり、等電点は７〜８である。マクロファージや単球から産生され、免疫担当細胞の増殖や分化の誘導、内因性発熱物質活性、肝臓における急性期炎症タンパク質の合成などの炎症反応の誘導といった様々な生物活性を有している。また「ＩＬ−６」は、リンパ系の細胞のみならず非リンパ系の細胞からも産生される分子量約２１，０００〜２８，０００の糖タンパク質である。
【００２２】
「ＩＬ−２」はＴ細胞から産生される分子量約１５，０００の糖タンパク質である。ＩＬ−２はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球やマクロファージなどに対して増殖や分化あるいは機能活性化を促すことが知られている。
【００２３】
本発明に用いる水不溶性担体とは常温常圧で固体であり、固体表面が水不溶性物質で覆われていてもよい。
【００２４】
本願における水不溶性担体の形状は、とくに限定されない。たとえば、粒状、板状、膜状、繊維状などがある。繊維状であるばあい、中空であってもよい。本発明においては、水不溶性担体をカラムに充填して使用しうる。
【００２５】
吸着剤をカラムに充填して使用するばあいは、血液を通液できることが好ましい。すなわち血液に含まれる細胞が充分に通過しうる間隙を作れるものであることが好ましい。たとえば吸着剤が粒状あって、ＩＬ−８を吸着させるばあい、平均粒径が５μｍ〜１０００μｍであることが望ましい。好ましくは、平均粒径が２５〜１０００μｍ、最も好ましくは、平均粒径が５０〜３００μｍである。平均粒径が５μｍ以下であれば、体液を高流速で長時間、安定して通液できなくなる。１０００μｍ以上であれば、吸着効率が低下する。粒子であるばあい、粒径分布が狭い方がより好ましい。
【００２６】
また、吸着剤が繊維状でかつ中空であるばあい、内径は５μｍ以上が好ましく、ＩＬ−８を吸着させるならば、好ましくは、２０〜１０００μｍ、最も好ましくは、３０〜３００μｍである。
【００２７】
中が密な繊維状であるばあいは径が１μｍ以上であることが好ましく、ＩＬ−８を吸着させるならば、好ましくは、２〜５００μｍ、最も好ましくは、５〜２００μｍである。水不溶性担体の表面は滑らかな方がよく、表面が粗であると非特異吸着が増加し選択性が低下するため好ましくない。
【００２８】
本発明におけるアニオン性官能基とは、ｐＨが中性付近で負に帯電するような官能基を含んでいればいかなるものでもよい。このような官能基の代表例としては、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、シラノール基、リン酸エステル基、フェノール性水酸基などがあげられ、これらの中では、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を吸着させるばあい、スルホン酸基、硫酸エステル基が好ましいが、これらに限定されるものではない。また、これらの官能基は、単独でも、また２種以上組み合わせても使用しうる。ＩＬ−８を吸着させるばあいは、好ましいアニオン性官能基としては、硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステル基があげられる。
【００２９】
また、本発明におけるアニオン性官能基とは、１分子あたりひとつのアニオン性官能基を有するモノアニオン性官能基であっても、または複数のモノアニオン性官能基を有するポリアニオン性官能基であってもよい。ポリアニオン性官能基はＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２に対する親和性が大きく、また単位量の水不溶性担体に多くのモノアニオン性官能基を導入しやすいので好ましい。なかでも分子量が１０００以上のポリアニオン性官能基はＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２に対する親和性、多くのモノアニオン性官能基を導入できる点でより好ましい。ポリアニオン性官能基が有するモノアニオン性官能基は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００３０】
ＩＬ−８を吸着させるばあい、本発明におけるアニオン性官能基は、水不溶性担体の単位体積（１ｍｌ）当たり、１００ｎｍｏｌから１０ｍｍｏｌ含まれていることが望ましい。好ましくは、１μｍｏｌから２００μｍｏｌ、最も好ましくは、５μｍｏｌから１００μｍｏｌである。１００ｎｍｏｌより少ないとアニオン性官能基の効果が小さく、１０ｍｍｏｌより多すぎると前記インターロイキン類以外の非特異吸着が起こる。
【００３１】
本発明におけるポリアニオン性官能基を導入するための化合物の代表例としては、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリスチレンリン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン化合物、およびヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ホスホマンナンなどのアニオン性官能基を有する多糖類があげられるがこれらに限定されるわけではない。また、モノアニオン性官能基を導入するための化合物の代表例としては硫酸などの化合物があげられるが、これらに限定されるわけではない。好ましくはアニオン性官能基は、硫酸、デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物に由来する。
【００３２】
さらに、本発明におけるアニオン性官能基は前記モノアニオン性官能基および／またはポリアニオン性官能基の群より選択された少なくとも１種類よりなるものであり、２種類以上であってもよい。また、モノアニオン性官能基およびポリアニオン性官能基を同時に有してもよい。
【００３３】
本発明の吸着剤であるアニオン性官能基を有する水不溶性担体としては、アニオン性官能基を有する化合物自体が使用されうる。また、アニオン性官能基を有するモノマーを重合してえられる重合体、またはアニオン性官能基を導入することによりえられる水不溶性担体が使用されうる。
【００３４】
また、血液を通過させる際に血球成分の非特異吸着を避けるために、たとえばヒドロキシエチルメタクリレートの重合体といった適当な高分子で吸着剤をコーティングしてもよい。また、このコーティングは吸着剤からの微粒子の発生を防ぐために行なってもよい。
【００３５】
本発明に用いる水不溶性担体としては、たとえば、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などがあげられるが、なかでも親水性担体は非特異的吸着が比較的少なくＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２の吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が６０度以下の担体を指す。このような担体としては、セルロース、キトサン、セファロース、デキストランなどの多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
【００３６】
これらのなかでも−ＯＨ基が存在する担体は吸着性能、選択性の点ですぐれており、なかでも多孔性セルロースゲルは、
（a）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填したばあい体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まりしたりせず、さらに細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、
（b）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない、
（c）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルにおとらない吸着容量がえられる、
（d）安全性が合成高分子ゲルなどに比べて高いなどの優れた点を有しており、
本発明に用いるのに最も適した担体の１つである。本発明においてはこれらの担体のみに限定されるものではない。なお、前記担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
【００３７】
本発明における吸着剤はその外表面だけでもＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を吸着することができるが、より多くのＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を吸着するために水不溶性担体に要求される性質は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔性であることである。本発明の吸着体の吸着対象であるＩＬ−８は分子量が約８０００、ＩＬ−１βは分子量が約１７，５００、ＩＬ−６は分子量が約２１，０００〜２８，０００、そしてＩＬ−２は分子量が約１５，０００であることから、これらのタンパク質を効率よく吸着するためにはＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが他のタンパク質の侵入はできる限りおこらないことが好ましい。
【００３８】
細孔の孔径の測定には水銀圧入法が最もよく用いられているが、本発明で用いる多孔性水不溶性担体のばあいには適用できないことが多いので、細孔の孔径の目安として排除限界分子量を用いるのが適当である。排除限界分子量とは、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量を有するものの分子量をいう（波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）。排除限界分子量は一般に球状タンパク質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体のばあい、球状タンパク質を用いてえられた値を用いるのが適当である。
【００３９】
ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６の吸着には、ＩＬ−１βの分子量が約１７，５００であり、ＩＬ−６の分子量が約２１，０００〜２８，０００であることから、３万未満の排除限界分子量をもつ担体を用いたばあいには、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６の吸着除去量は小さくその実用性が低下してしまう。したがって、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６に対して用いる担体の好ましい排除限界分子量は３万以上であり、さらには５万以上であることが好ましい。
【００４０】
また、ＩＬ−２の吸着には、ＩＬ−２の分子量が約１５，０００であることから、１万未満の排除限界分子量を持つ担体を用いたばあいには、ＩＬ−２の吸着除去量は小さくその実用性が低下してしまう。したがって、ＩＬ−２に対して用いる単体の好ましい排除限界分子量は１万以上であり、さらには２万以上であることが好ましい。体液として血漿または血清を用いる限り、排除限界分子量に上限はない。
【００４１】
さらに、体液として血液を用いたばあい、排除限界分子量が５００万をこえると血小板の付着の割合が増加する傾向がみられ、本発明の吸着体を直接血液灌流（ＤＨＰ）型の血液浄化システムで用いたばあい、必ずしも充分な性能を発揮できない。したがって排除限界分子量が５００万以下であることが望ましい。すなわち、体液として血液を用いたばあいの排除限界分子量は好ましくは３〜５００万、さらに好ましくは５〜５００万である。
【００４２】
一方、ＩＬ−８の吸着には、排除限界分子量が１〜１００万、好ましくは３〜５０万、さらに好ましくは５〜２０万である。この値は水不溶性担体が粒状、板状、繊維状であっても基本的には同じである。
【００４３】
つぎに担体の多孔構造について述べる。吸着体の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく空孔容積が２０％以上であり、比表面積が３ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。また担体の形状は粒状、繊維状、中空形状など任意に形状を選ぶことができる。
【００４４】
さらに、担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられる。
【００４５】つぎに本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着体として使用するためには、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要である。そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって、本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルのばあい、参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2まで直線関係にあるものをいう。
【００４６】
本発明の吸着剤は、アニオン性官能基を有する水不溶性担体であることを特徴とするものをいう。そのようなアニオン性官能基を有する水不溶性担体をうるためにアニオン性官能基を水不溶性担体へ導入する方法は種々あり、いかなる方法で導入してもよいが、代表的な導入方法としては、
（１）アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有する化合物をモノマーあるいは架橋剤として用いる重合によって吸着剤を形成させる方法、
（２）アニオン性官能基を有する化合物を水不溶性担体に固定させる方法、
（３）アニオン性官能基を有する化合物と水不溶性担体とを直接反応させることによって、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を固定させる方法
などがあげられる。
【００４７】
（１）の方法において用いるアニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有するモノマーあるいは架橋剤の代表例としては、アクリル酸およびそのエステル、メタクリル酸およびそのエステル、スチレンスルホン酸などがあげられるがこれらに限定されるわけではない。
【００４８】
（２）の方法、すなわち、アニオン性官能基を有する化合物を水不溶性担体に固定させる方法としては、物理的吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合により固定化する方法などがあり、いかなる方法を用いてもよいが、吸着剤の保存性ならびに安定性のためにはアニオン性官能基を有する化合物が脱離しないことが重要であるので、強固な固定が可能な共有結合法が望ましい。
【００４９】
共有結合によりアニオン性官能基を有する化合物を固定化するばあい、アニオン性官能基を有する化合物がアニオン性官能基以外に固定化に利用できる官能基を有する多官能性化合物であることが好ましいが、ポリアニオン性官能基を有する化合物を固定化するばあい、一部のアニオン性官能基を用いて固定化してもよい。
【００５０】
固定化に利用できる官能基の代表例としては、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシニルイミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン基、エポキシ基、シラノール基などがあげられるがこれらに限定されるわけではない。
【００５１】
たとえば、硫酸エステル基を有する化合物を水不溶性担体に共有結合で固定化するばあい、硫酸エステル基を有する化合物の代表例としてはアルコール、糖類、グリコールなどの水酸基を有する化合物の硫酸エステル化物があげられるが、これらの中でも多価アルコールの部分硫酸エステル化物、とりわけ多糖類の硫酸エステル化物が硫酸エステル基、固定化に必要な官能基の双方を含んでいるうえに、容易に水不溶性担体に固定化できるところからとくに好ましい。
【００５２】
つぎに、（３）の方法すなわちアニオン性官能基を有する化合物と水不溶性担体とを直接反応させることによって水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を固定化してアニオン性官能基を導入する方法の代表例として水酸基を有する水不溶性担体に硫酸エステル基を導入する方法があげられる。このばあい、水酸基を有する水不溶性担体とクロルスルホン酸、濃硫酸などの試薬を反応させることによって直接硫酸エステル基を導入することができる。
【００５３】
これら３種類の方法のほかにも
（４）アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有する化合物をモノマーとして用いて水不溶性担体上にグラフト重合することにより、ポリアニオン性官能基を有する水不溶性担体をうる方法がある。
【００５４】
つぎに、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる吸着剤を体液と接触させ体液中のＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択されるインターロイキンを吸着除去する方法には種々の方法がある。代表的な方法としては、体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着剤を混合してＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択されるインターロイキンを吸着除去したのち、前記吸着剤を濾別してＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２よりなる群から選択されるインターロイキンの除去された体液をうるバッチ式の方法、体液の入口および出口を有し、出口に体液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着した容器に吸着剤を充填し、これに常圧または加圧下で体液を流す連続式の方法などがある。いずれの方法を用いてもよいが、後者の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインで、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２を除去することが可能であり、本発明の吸着剤はこの方法に適している。両方の方法を組み合わせて用いてもかまわない。
【００５５】
吸着剤に吸着したＩＬ−８の回収は、たとえばＩＬ−８の吸着した吸着剤を高塩濃度の水溶液、たとえば０．５Ｍの濃度の食塩を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で処理し、吸着したＩＬ−８を溶出させることにより行なわれる。塩濃度の勾配をつけた緩衝液も用いられうる。なお、ＩＬ−１β、ＩＬ−２および／またはＩＬ−６についても同様の方法で回収できる。
【００５６】
前記の除去および回収は前記のようにバッチ式、連続式あるいはこれらを組み合わせて行ないうる。連続式のばあいは簡単な操作で吸着剤からＩＬ−８を回収することも容易である。たとえば、ＩＬ−８の遺伝子を組み込んだ微生物を培養してＩＬ−８を含む培養液からＩＬ−８を回収するばあい、あるいは血液からＩＬ−８を回収するばあいに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
つぎにＩＬ−１βの吸着剤を用いた本発明のＩＬ−１βの吸着器を、その一実施例の概略断面図である図１にもとづき説明する。なお、前記以外のＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２の吸着器のばあいも同様である。
【００５８】
図中、１は体液の流入口、２は体液の流出口、３は本発明のＩＬ−１β（ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−２）吸着剤、４および５は体液および体液に含まれる成分は通過できるがＩＬ−１β（ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−２）吸着剤は通過できない吸着剤流出防止手段、６はカラム、７は吸着器である。前記吸着器の容器の形状、材質にとくに限定はないが、好ましい具体例としては、たとえば容量１５０〜４００ｍｌ程度、直径４〜１０ｃｍ程度の筒状容器があげられる。
【００５９】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００６０】
参考例
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロースゲル（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製のバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロースゲル（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ７００−ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタリックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。
【００６１】
図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、バイオゲルＡ−５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2まで直線関係にあるものを硬質ゲルという。
【００６２】
実施例１
吸着剤の作製：多孔質セルロースゲルとしてセルロファインＧＣ２００−ｍ（球状タンパク質の排除限界分子量１２０，０００、粒径４４〜１０５μｍ、チッソ（株）製）（以下、ＧＣ２００−ｍという。）１０ｍｌに２０％ＮａＯＨ  ４ｇ、ヘプタン１２ｇおよびノニオン系界面活性剤トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を１滴加えた。４０℃で２時間撹拌後、エピクロルヒドリン５ｇを加えて４０℃で２時間撹拌し、ゲルを水洗濾過してエポキシ化セルロースゲルをえた。導入されたエポキシ基の量はカラム体積１ｍｌあたり３０μｍｏｌであった。えられたゲル２ｍｌに極限粘度数０．０２７ｄｌ／ｇ、硫黄含量１７．７％のデキストラン硫酸ナトリウム０．１２ｇおよび水２ｍｌを加え（デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約２．５％）、ｐＨ１１に調整して４５℃で１６時間振とうした。そのあとゲルを濾別して、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩溶液および水を用いて、この順に水洗し、デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル（以下、Ｇ−１という）をえた。
【００６３】
ヒトＩＬ−８の調製：大腸菌組換えヒトＩＬ−８（アールアンドディー  システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）０．１％ＢＳＡにて所定の濃度に調製した。
【００６４】
吸着操作：ＧＣ２００−ｍまたは前記のＧ−１を乾燥重量として１０ｍｇおよびヒトＩＬ−８が５ｎｇ／ｍｌになるように調製したＰＢＳ溶液を、ポリプロピレンチューブ（エッペンドルフ社製）に加えて、３７℃にて２時間振とうした。
【００６５】
分析方法：各サンプルの上清を一部抜き取り、アールアンドディー  システムズ社製ヒトＩＬ−８測定キットを用いてＩＬ−８の濃度を測定し、ＩＬ−８の吸着率を算出した。
分析結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
0003901214.tif 000002
【００６７】
実施例２
吸着剤Ｇ−１の作製は実施例１と同様に行った。
ヒトＩＬ−８の調製は実施例１と同様に行った。
【００６８】
吸着操作：ＧＣ２００−ｍまたは実施例１と同様にしてえられたＧ−１を乾燥重量として１０ｍｇ、最終容量に対してヒト血清５０％およびヒトＩＬ−８が５ｎｇ／ｍｌになるように調製したＰＢＳ溶液を、ポリプロピレンチューブ（エッペンドルフ社製）に加えて、３７℃にて２時間振とうした。
【００６９】
分析方法：各サンプルを実施例１と同様に測定した。
分析結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0003901214.tif 000003
【００７１】
実施例３
吸着剤Ｇ−１の作製は実施例１と同様に行った。
ヒトＩＬ−８の調製は実施例１と同様に行った。
【００７２】
吸着操作：ＧＣ２００−ｍまたはＧ−１を乾燥重量として１０ｍｇ、最終容量に対してヒト血清７０％、ヒトＩＬ−８が５ｎｇ／ｍｌになるように調製したＰＢＳ溶液を、ポリプロピレンチューブ（エッペンドルフ社製）に加えて、３７℃にて２時間振とうした。
【００７３】
分析方法：各サンプルを実施例１と同様に測定した。
分析結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
0003901214.tif 000004
【００７５】
実施例４
吸着剤Ｇ−１の作製は実施例１と同様に行った。
ヒトＩＬ−８の調製は実施例１と同様に行った。
【００７６】
吸着および回収操作：Ｇ−１ゲルＰＢＳ懸濁液５００μ１（乾燥重量として３０ｍｇ）を、ポリプロピレン性小型カラムであるセバコールミニＰＰ（生化学工業（株）製）に充填し、ここへ９０％健常人血清を含むヒトＩＬ−８の５ｎｇ／ｍｌ溶液３ｍｌを流した。流速はペリスタリックポンプで約０．１ｍｌ／ｍｉｎに調整した。この流出液のヒトＩＬ−８を実施例１と同様に測定した。さらに続いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ溶液にてヒトＩＬ−８を脱離、回収した。
【００７７】
分析方法：各サンプルを実施例１と同様に測定した。
吸着率の分析結果を表４に示す。また、ヒトＩＬ−８回収率は９８％であった（吸着量を１００％とする）。
【００７８】
【表４】
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【００７９】
実施例５
吸着剤の作製：ＧＣ２００−ｍ  １０ｍｌを取り、エタノール中で臨界点乾燥により乾燥させた。乾燥ゲルを１０ｍｌのよく脱水したピリジン中に懸濁させ氷冷した。これにクロルスルホン酸２ｍｌを撹拌下に滴下し、滴下終了後１０分間撹拌を続けた。反応終了後ゲルを濾過し、ピリジンついで水で洗浄して、単位体積（１ｍｌ）あたり硫酸エステル基が０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌ量導入されたセルロースゲル（以下、Ｇ−２という）をえた。
【００８０】
ヒトＩＬ−８の調製は実施例１と同様に行った。
吸着および回収操作は実施例４と同様に行った。
【００８１】
分析方法：各サンプルを実施例１と同様に測定した。
吸着率の分析結果を表５に示す。また、ヒトＩＬ−８回収率は９８％であった（吸着量を１００％とする）。
【００８２】
【表５】
0003901214.tif 000006
【００８３】
実施例６
吸着剤の作製：セルロースビーズＣＫ−Ａ３（チッソ（株）製、球状タンパク質の排除限界分子量５００万、粒径４５〜１０５）１００ｍｌ、水１００ｍｌ、２Ｍ水酸化ナトリウム５０ｍｌおよびエピクロルヒドリン２０ｍｌを反応容器中で混合し４０℃で２時間反応させることにより、エポキシ化セルロースビーズＣＫ−Ａ３をえた。えられたエポキシ化セルロースビーズＣＫ−Ａ３を１００ｍｌ、水１００ｍｌおよび２８％アンモニア水１０ｍｌを反応容器中で混合し、室温で一晩反応させることによりアミノ化セルロースビーズＣＫ−Ａ３をえた。一方、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム１０ｇ、塩化チオニル１ｍｌおよびトルエン２５０ｍｌを反応容器中で混合し、室温で８時間反応させることにより、一部をクロロ化したポリスチレンスルホン酸ナトリウムをえた。このクロロ化ポリスチレンスルホン酸ナトリウム１０ｇ、アミノ化セルロースビーズＣＫ−Ａ３を１００ｍｌおよび水１００ｍｌを反応容器中で混合し室温で一晩反応させることにより、ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３をえた。
【００８４】
吸着剤の評価：ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３を生理食塩水で平衡化した。このビーズ０．５ｍｌを試験管にとり、余分な生理食塩水を除いた。ここに、ＩＬ−１βを約１．３ｎｇ／ｍｌまたはＩＬ−２を約７５０ｐｇ／ｍｌ含んだヒト血清３ｍｌ加え、３７℃で２時間振とうした。上清のＩＬ−１βまたはＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
分析結果を表６に示す。
【００８５】
実施例７
吸着剤の作製：実施例６と同様にしてえられたエポキシ化セルロースビーズＣＫ−Ａ３  １００ｍｌに極限粘度数０．２７ｄｌ／ｇ、硫黄含量１７．７％のデキストラン硫酸ナトリウム６ｇおよび水１００ｍｌを加え（デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約２．５％）、ｐＨ１１に調整して４５℃で１６時間振とうした。そののちゲルをろ別して水洗し、デキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３をえた。
【００８６】
吸着剤の評価はデキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３について実施例６と同様に行った。
分析結果を表６に示す。
【００８７】
比較例１
実施例６で用いたセルロースビーズＣＫ−Ａ３について、実施例６と同様に前記ビーズの評価を行った。
分析結果を表６に示す。
【００８８】
【表６】
0003901214.tif 000007
【００８９】
比較例１に対して実施例６および７の上清ＩＬ−１βおよびＩＬ−２の濃度が低下しており、本発明の吸着剤を用いることにより効率よく体液中のＩＬ−１βおよびＩＬ−２を吸着除去できることがわかる。
【００９０】
実施例８
吸着剤の作製：実施例６と同様の方法で、ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースＣＫ−Ａ３をえた。
【００９１】
吸着剤の評価：ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３を生理食塩水で平衡化した。このビーズ０．５ｍｌを試験管にとり、余分な生理食塩水を除いた。ここにＩＬ−６を約４２０ｐｇ／ｍｌ含んだヒト血清３ｍｌ加え、３７℃で２時間振とうした。上清のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
分析結果を表７に示す。
【００９２】
実施例９
吸着剤の作製：実施例７と同様の方法で、デキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３をえた。
【００９３】
吸着剤の評価はデキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズＣＫ−Ａ３について実施例８と同様に行った。
分析結果を表７に示す。
【００９４】
比較例２
実施例６で用いたセルロースビーズＣＫ−Ａ３について、実施例８と同様に前記ビーズの評価を行った。
分析結果を表７に示す。
【００９５】
【表７】
0003901214.tif 000008
【００９６】
比較例２に対して実施例８および９の上清１Ｌ−６濃度が低下しており、本発明の吸着剤を用いることにより効率よく体液中のＩＬ−６を吸着除去できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明の、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる吸着剤および吸着器を用いることにより、病因、物質たりうるＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２を、患者の血液、血漿および血清などの体液から効率よく吸着除去、要すれば回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明のＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−２の吸着器の一実施例の概略断面図である。
【図２】３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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