(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＤＳＭ６００９を有するトウモロコシ細胞系統にホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入して得られるトランスジェニックトウモロコシ細胞系統。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニックトウモロコシ細胞系統から再生されるトウモロコシ植物体、またはその部分もしくは子孫。
【請求項３】
ａ）寄託番号ＤＳＭ６００９を有するトウモロコシ細胞系統の細胞懸濁液から酵素によってプロトプラストを作成し、
ｂ）プロトプラストをホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡと共にインキュベートし、次いで
ｃ）該ＤＮＡ含有のプロトプラストからトランスジェニックトウモロコシ細胞系統を選択して増殖させる
ことからなる請求項１に記載のトランスジェニックトウモロコシ細胞系統の産生方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により得られたトランスジェニックトウモロコシ細胞系統から稔性植物体を再生させることを特徴とする、トランスジェニックトウモロコシ植物体の産生方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により得られたトランスジェニックトウモロコシ植物体を、他のトウモロコシを用いた交叉授粉により交配させることによって繁殖させることを特徴とする、トランスジェニックトウモロコシ植物体の産生方法。
【請求項６】
請求項２に記載のトウモロコシ植物体およびその子孫が栽培されている栽培中の区域に、ホスフィノスリシンまたはホスフィノスリシンアラニルアラニンを用いて雑草を選択的に駆除することによるトウモロコシ植物体の保護方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が解決しようとする課題】
双子葉植物は本質的には、Ｔｉプラスミドベクター系を介してアグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)により形質転換されうる。しかし、この系は単子葉植物には容易に適用され得ない。Potrykus氏等（Mol. Gen. Genet．１９９，１８３(１９８５)）およびLoerz氏等（Mol. Gen. Genet. １９９，１７８(１９８５））は、単子葉植物の植物プロトプラストがそれらのゲノム中に異質ＤＮＡを安定に組込むことができるということを示した。しかし、このプロトプラストが稔性植物に再生され得なかった事実によって、まず進展は阻止されてしまった。
【０００２】
【従来の技術】
従って、最近では植物再生の問題を解決できる遺伝子型および手法を見出すために広範な研究が行われている。ヨーロッパ特許第２９２,４３５号には、非粘質性で柔らかな（砕けやすい）顆粒状トウモロコシカルスから出発して稔性植物を得ることができる手法が記載されている。これに関連してShillito氏等（Bio／Technology ７，５８１(１９８９)）は、稔性植物への再生可能性には、植物再生可能性のある分裂性プロトプラスト培養物を調製しうるカルス懸濁培養から出発することがさらに必要であることを認めた。
【０００３】
７〜８ケ月のインビトロ培養期間の後に、Shillito氏等は生育能力のある子孫を有した植物を得ているが、しかしそれらは形態学および繁殖能力の面で異常を示す。
【０００４】
Prioli氏およびSoendahl氏（Bio／Technology ７，５８９(１９８９)）は、カテト（Cateto）トウモロコシ同系交配系統Ｃａｔ １００−１のトウモロコシプロトプラストからの稔性植物の再生および産生を記載している。これらの著者はプロトプラストの、稔性植物への再生は多数の種々の因子例えば遺伝子型、ドナー細胞の生理学的状態および培養条件の関数であると想定している。
【０００５】
ヨーロッパ特許出願第９０ １１１ ９４５.３号〔長期、高効率の植物再生が可能な改良されたZea mays（L.）遺伝子型；同時出願〕には新規なトウモロコシ遺伝子型が記載されている。該遺伝子型から出発するとプロトプラストを短期間で再生することができ次いで該プロトプラストは異常を伴なわないで稔性植物に再生され得る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
該新規トウモロコシ遺伝子型はホルモンを含まない培地上の未成熟胚から出発すると、オーキシン−独立栄養性で不定胚形成性（embryogenic）のカルスが、発育する苗木のシュートの基部に形成される点で前記の再生可能遺伝子型とは区別される。このカルスはホルモンを含まない培地上で長期間（＞１２ケ月）にわたり、その不定胚形成性の潜在力を保持しつつ二次培養され得る。これらの培養条件下では十分に発達した胚が形成され、そして該胚は時には自生的に分化して植物になる。さらに多数の不定胚が、特に培地中のスクロース含量が増加する（６〜９％）場合に形成される。不定胚形成性を有する細胞の凝集物からなる柔らかな顆粒状カルス（II型カルス）の形成は培地を変えることにより（スクロース含量を２〜３％に減少しそして２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）またはジカンバ１〜３mg／ｌを加える）再生的に誘導されうる。このII型カルスは液体培地中、細胞懸濁培養形態で二次培養する（subcultured）ことができそして全能性（totipotent）プロトプラストを単離するのに適している。該プロトプラストはとりわけ遺伝子的形質転換に用いられ、本発明に記載の条件下で再生されて稔性のトランスジェニックトウモロコシ植物とされる。
【０００７】
【発明の構成】
すなわち、本発明は
１．オーキシン−独立栄養性トウモロコシ遺伝子型から得られたプロトプラストから誘導されるトランスジェニックトウモロコシ細胞系統並びに該トウモロコシ細胞系統から再生されたトランスジェニック植物および植物部分、およびそれらの子孫；
２．−トウモロコシ遺伝子型の細胞懸濁液から酵素によってプロトプラストを作成し、
−プロトプラストをＤＮＡと共にインキュベートし次いで
−該ＤＮＡ含有のプロトプラストからトランスジェニックトウモロコシ細胞系統（cell line）を選択しそして再生する
ことからなるトランスジェニックトウモロコシ細胞系統の産生方法；
に関する。
【０００８】
ヨーロッパ特許出願第９０ １１１ ９４５.３号に述べられているように、好ましい態様で用いられた高度に不定胚形成性のトウモロコシ細胞系統ＤＳＭ６００９はこの登録番号でブタペスト条約規定に基づいて１９９０年７月１日付でドイツ国微生物および細胞培養収集機関〔Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH〕に寄託された。該特許出願明細書中に記載のように、該細胞系統は遺伝子型Ｈ２２９およびＯＫ２８１の交雑により得たトウモロコシ植物の胚から取得された。本発明によるトランスジェニックトウモロコシ植物を生産するには、プロトプラストを該細胞系統の懸濁培養から作成し次にそれらのプロトプラストを組込まれるべきＤＮＡと共にインキュベートする。
【０００９】
該プロトプラストはＤＳＭ６００９から溶解酵素例えばセルラーゼおよびペクチナーゼを用いて作成される。またこれらの酵素は混合物の形態で使用することも可能である。酵素の濃度は０.０５〜４％（酵素溶液容量当たりの重量）の広範囲内で変更することができる。この浸透性水溶液の最適組成並びに酵素濃度は各タイプの組織について簡単な試験により決定されなければならない。
【００１０】
プロトプラストを安定化させるには、該水溶液は浸透圧上活性な(osmotically active）物質例えばマンニトール、ソルビトール、グルコース、スクロース、フルクトース、ＫＮＯ3または植物培地において典型的なその他の塩を含有しなければならない。酵素溶液の容量オスモル濃度は有利には５００〜７５０mOsm好ましくは６００〜７００mOsmである。ｐＨは４.５〜６.０で変化することができる。酵素溶液のｐＨは５.５〜６に調整し、１〜５mMホスフェートおよび１〜１０mMモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）を用いて安定化させるのが好ましい。
【００１１】
溶解酵素の濃度によるが、プロトプラストは３〜２０時間経て出現する。酵素とのインキュベーション中は注意深く振とうするのが有利である。軌道振とう器での１０〜５０rpm振とうが有利であることが判明している。
【００１２】
どんなＤＮＡも該細胞中に導入することができる。選択可能な標識遺伝子、例えばホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アセトラクテートシンセターゼ、５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンセターゼ（ＥＰＳＰシンセターゼ）、グルタミンシンセターゼまたはトランスアミナーゼをコードする遺伝子を用いて行うのが有利である。勿論また、発現が植物の生長によって選択され得ない遺伝子を導入することも可能である。この型の遺伝子は例えばバチルススリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）のδ−エンドトキシンまたはウイルス耐性遺伝子例えばウイルス“コート”タンパク質遺伝子をコードするものとすることができる。さらに、キチナーゼ遺伝子または植物の光合成性能を改善する遺伝子、例えばホスホエノールピルベートカルボキシラーゼまたは細菌アスパラギンシンセターゼ遺伝子（Nakamura, M.M. et al. Nucleic Acids Research 9，4669 (1981）参照）を用いることができる。ストレプトミセスビリドクロモジェネス（Streptomyces viridochromogenes）由来のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ用の遺伝子（Wohlleben, W. et al., Gene 80, 25〜57 (1988））を使用するのが好ましく、該遺伝子は植物での発現において適当に修飾されうる。該遺伝子を組込ませることにより、トウモロコシ植物およびそれらの子孫はホスフィノスリシン（グルホシネート）およびホスフィノスリシンアラニルアラニン（ビアラホス）に対して耐性になる。
【００１３】
合成または単離後に、該遺伝子は慣用法例えば大腸菌の形質転換によりまたは“ポリメラーゼ連鎖反応”により増幅させることができる。次に単離した機能遺伝子は直接的にプロトプラスト中に導入するか、または植物において有効なプロモーターを有するまたは有さない、任意の所望のクローニングベクター、有利にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８またはｐＤＨ５１（Pietrzak, M. et al. Nucl. Acid Res. 5858（1986））によってプロトプラスト中に導入することができる。使用するのに好ましいプロモーターは３５Ｓプロモーターである。また、ＤＮＡは例えばドイツ国特許出願第４０ ０５ １５２.８号に記載されるように、ヒストンとの複合体の形態で用いることもできる。
【００１４】
プロトプラストのインキュベーションのためには、ＤＮＡをさらに緩衝液の塩をも含有しうる水溶液中に懸濁し次いでその懸濁液を、浸透剤として作用する形質転換用緩衝液中にあるプロトプラストに加える。
【００１５】
該形質転換用緩衝液は好ましくは二価陽イオンの塩例えばＭｇＣｌ2もしくはＣａＣｌ2またはこれらの混合物の水溶液、または別法として糖例えばスクロース、グルコースもしくはフルクトースの水溶液または糖アルコール例えばマンニトールもしくはソルビトールの水溶液からなる。この形質転換緩衝液において塩は３０〜３００mvalの量で存在し、糖または糖アルコールは５０〜５００mmolの濃度で存在する。
【００１６】
ＤＮＡ溶液をプロトプラストに加えた後、この混合物にポリエチレングリコール好ましくはＰＥＧ １５００〜８０００をその最終濃度が混合物のｌ当たり約１０〜２５重量％好ましくは６〜１０重量％になるようにして加える。次にインキュベーションはｐＨ６.０〜８.０好ましくは６.５〜７および温度１５〜４０℃好ましくは２０〜２５℃で５分〜１時間好ましくは２０〜３０分かけて実施されうる。インキュベーションが終了したら、あらかじめＰＥＧを１回またはそれ以上の洗浄操作によって除去してから細胞を、無機塩例えばアンモニウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩およびまた硝酸塩、りん酸塩、硫酸塩、りん酸二水素塩、クエン酸塩、ビタミン、アミノ酸、合成オーキシン例えば２,４−Ｄもしくはジカンバ並びにまた糖好ましくはフルクトース、グルコースおよびスクロースの混合物を含有する生長培地に有利には移される。
【００１７】
１０〜２５日後に生き残っている分裂細胞を選択培地上で培養する。プロトプラストカルスの浸透性安定化のために、培地は有利には６〜１０％糖特にスクロースを含有すべきである。プロトプラスト培養が古ければ古い程、糖含量は少ないこともある。例えば約９％の糖を含有する培地は１５〜２０日令のプロトプラスト培養に対して適している。該選択培地は本質的には前記生長培地と同一の組成を有しかつ選択剤例えばホスフィノスリシンを含有する。選択は例えばヨーロッパ特許第０,２９０,９８７号に記載のようにして実施される。
【００１８】
前記培地上で、形質転換されたプロトプラストは発育して該遺伝子を発現する細胞群になり次いで肉眼で見ることのできるカルスに生長する。
選択開始後の１４〜２８日目には、胚発生を可能ならしめるためにカルスを新鮮な好ましくはホルモンを含まない選択培地に移す。引続きの培養中には培地中に選択剤を用いてもまたは用いなくてさえも、形成されたトランスジェニック胚が葉および根を分化しうる。
【００１９】
インビトロ植物が４〜８cmの高さに達したと同時にそれらを土壌中に植え、調整された環境の室中でまたは温室中で生長させて顕花植物にする。稔性のトランスジェニックトウモロコシ植物は、自己受粉によるかまたは交雑受粉すなわち精鋭の同系交配系統との交雑によるかのいずれかによって繁殖されうる。
【００２０】
本発明はまた本発明方法で得ることができかつホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する植物およびその子孫を、耕作中の地面に植えることにより、ホスフィノスリシンまたはホスフィノスリシンアラニルアラニンを用いて雑草を選択的に駆除して単子葉植物を保護する方法に関する。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例でより詳細に説明する。
実施例
プロトプラスト単離培地（１００m1）
セルラーゼ オノズカ ＲＳ（明治製菓製、日本）         ８００ mg
ペクトリアーゼ Ｙ２３                                  ４０ mg
ＫＮＯ3                                              ２００ mg
ＫＨ2ＰＯ4                                           １３６ mg
Ｋ2ＨＰＯ4                                             ４７ mg
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                                   １４７ mg
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                   ２５０ mg
牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）                           ２０ mg
グルコース                                         ４０００ mg
フルクトース                                       ４０００ mg
スクロース                                         １０００ mg
ｐＨ                                                  ５.８
浸透圧モル濃度                                       ６６０mOsm
プロトプラスト洗浄溶液１：セルラーゼ、ペクトリアーゼおよびＢＳＡを含有しない上記溶液
【００２２】
形質転換用緩衝液
ａ）  グルコース                                             ０.５Ｍ
ＭＥＳ                                                 ０.１％
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                                   ２５   mM
ｐＨ                                                   ５.８
６００mOsmに調整
ｂ）  ＰＥＧ６０００溶液
グルコース                                             ０.５Ｍ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                                 １００   mM
Hepes                                              ２００   mM
ｐＨ                                                   ６.５
ＰＥＧ６０００は溶液使用の直前に上記ｂ）緩衝液に加える（ＰＥＧ ４０重量％）。このＰＥＧ溶液は０.４５μｍ滅菌濾過器で濾過する。
【００２３】
Ｗ５溶液
ＣａＣｌ2                                        １２５ mM
ＮａＣｌ                                         １５０ mM
ＫＣｌ                                               ５ mM
グルコース                                         ５０ mM
プロトプラスト培地（量、mg／ｌ）
ＫＮＯ3                                          ３０００
(ＮＨ4)2ＳＯ4                                      ５００
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                 ３５０
ＫＨ2ＰＯ4                                         ４００
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                                 ３００
Fe ＥＤＴＡおよび微量元素〔ムラシゲ−スクーグ（Murashige-Skoog）培地（Physiol. Plant, １５, ４７３（１９６２））の場合と同様〕
ｍ−イノシトール                                   １００
チアミン ＨＣｌ                                        １.０
ニコチンアミド                                         ０.５
ピリドキシン ＨＣｌ                                     ０.５
グリシン                                               ２.０
グルクロン酸                                       ７５０
ガラクツロン酸                                     ７５０
ガラクトース                                       ５００
マルトース                                         ５００
グルコース                                    ３６,０００
フルクトース                                  ３６,０００
スクロース                                    ３０,０００
アスパラギン                                       ５００
グルタミン                                         １００
プロリン                                           ３００
カゼイン水解物                                     ５００
２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）             ０.５
ｐＨ                                                   ５.８
浸透圧モル濃度                                     ６００mOsm
【００２４】
１．細胞系統ＤＳＭ６００９のプロトプラストの産生
プロトプラストの単離
懸濁培養の最終培地変更後２〜４日目好ましくは３日目に、その液体培地を吸引し次いで残留細胞を５０m1のプロトプラスト洗浄溶液１ですすぎそして再び吸引して乾燥する。この収穫したバイオマス２ｇ当たりにつき１０m1の前記プロトプラスト単離培地を加える。再懸濁した細胞および細胞凝集物を穏和な振とう（３０〜４０rpm）下で暗中２７±２℃において４〜６時間培養する。
【００２５】
プロトプラストの精製
１m1当たり少なくとも１００万個のプロトプラストが出現（顕微鏡で観察）したら直ちに、懸濁液を２００μｍメッシュサイズのステンレス−スチール製篩および４５μｍメッシュサイズのナイロン製篩に通す。１００μｍ篩分け１回と６０μｍ篩分け１回の組合せで細胞凝集物を同様に十分分離させる。プロトプラスト含有濾液を顕微鏡で評価する。慣例上、それは９８〜９９％のプロトプラストを含有する。残留物は消化されなかった単細胞である。上記程度の純度を有するプロトプラスト調製物を、さらに匂配遠心分離せずに形質転換実験用に用いる。プロトプラストをスウィング−アウトローター（１００×ｇ、３分）による１０００rpmでの遠心分離で沈降させる。上澄みを除去し、プロトプラストを洗浄溶液１中に再懸濁する。該遠心分離工程を繰り返し次いでプロトプラストを前記の形質転換用緩衝溶液中に再懸濁する。
【００２６】
２．ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
形質転換工程においては後記の合成ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ写しからのプロモーターを制御しつつ使用される（次の〔化１〕に記載するｐＤＨ５１のＳａｌＩ開裂サイト中に次の〔化２〕に示されるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ構造遺伝子はクローン化される）かまたはヨーロッパ特許出願第０,２７５,９５７号に記載の合成遺伝子が使用される。３５Ｓプロモーター構造遺伝子および３５Ｓターミネーターからなるキメラ遺伝子はｐＵＣ１８ポリリンカーのＥｃｏＲＩサイト中に組込まれる。
【００２７】
大部分の実験では、切断されていないｐＵＣ１８−３５Ｓ−アセチルトランスフェラーゼプラスミドが使用される。いくつかの個々の実験では該プラスミドはＥｃｏＲＩで開裂され、線状になったｐＵＣ１８プラスミドおよび１.３ｋｂの３５Ｓ−アセチルトランスフェラーゼ挿入物の混合物が形質転換用に使用される。
【００２８】
【化１】
0003878678.tif 000002
【００２９】
【化２】
0003878678.tif 000003
【００３０】
３．プロトプラスト形質転換
前記の形質転換用緩衝液中に再懸濁されているプロトプラストの各１０m1ずつを、０.５〜１.１０6個のプロトプラスト／m1の力価で５０m1ポリアロマー管中に導入する。形質転換用に使用するＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中に溶解する。プロトプラスト懸濁液１m1当たりにつきプラスミドＤＮＡ ２０μｇを加える。該ＤＮＡを加えた後にプロトプラスト懸濁液を慎重に振とうしてＤＮＡを溶液中に均一に分配する。その後直ちにＰＥＧ溶液５m1を滴加する。
【００３１】
ＰＥＧ溶液は管を慎重に傾けることによって均一に分配される。その後さらにＰＥＧ溶液５m1を加え、均質混合を反復する。プロトプラストは２５±２℃で２０分間ＰＥＧ溶液中に残存する。次にこれらのプロトプラストを３分間の遠心分離（１００ｇ≒１０００rpm）により沈降させる。上澄みを除去する。プロトプラストをＷ2溶液２０m1中において慎重に振とうすることにより洗浄し次いで再び遠心分離する。その後それらを前記のプロトプラスト培地２０m1中に再懸濁し、再び遠心分離しそしてまた該培地中に再懸濁する。力価を１m1当たり６〜８.１０5個のプロトプラストに調整し、プロトプラストを３m1ずつに分けてペトリ皿（直径６０mm、高さ１５mm）中で培養する。パラフィルム（Parafilm）で密封した各ペトリ皿を２５±２℃で暗中に置く。
【００３２】
４．プロトプラストの培養
プロトプラストの単離およびプロトプラストの形質転換の後の最初の２〜３週間中、新しい培地を加えずにプロトプラストを培養する。プロトプラストから再生した細胞が発育して、２０〜５０個より多い細胞を有する細胞凝集物になると同時に、浸透剤としてスクロース（９０ｇ／ｌ）を含有する新しいプロトプラスト培地１m1を加える。
【００３３】
５．形質転換されたトウモロコシ細胞の選択および植物再生
新培地の添加後３〜１０日目に、プロトプラストから誘導される細胞凝集物をＬ−ホスフィノスリシン１００mg／ｌ含有の寒天培地上に載置することができる。適当な培地は前記のプロトプラスト培地のビタミン類、スクロース９０ｇ／ｌおよび２,４−Ｄ １.０mg／ｌを有するＮ６培地であるかまたは例えば前記ＭＳ培地（ムラシゲ＋スクーグ１９６２）の多量−および微量栄養素塩類含有の類似培地である。
【００３４】
安定に形質転換されたプロトプラストから由来したカルスは選択培地上で妨害されずに生長し続けることができる。３〜５週間好ましくは４週間後にこのトランスジェニックカルスを、これもまたＬ−ホスフィノスリシン１００mg／ｌを含有するがもはやオーキシンを含有しない新選択培地に移すことができる。３〜５週間経過後にＬ−ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をゲノム中に組込んだトランスジェニックトウモロコシカルス約５０％が、Ｌ−ホスフィノスリシン存在下の該培地上でゲノムが分化した最初の植物になる。
【００３５】
６．トランスジェニック再生植物の栽培
不定胚形成性の形質転換されたトウモロコシ組織を、ホルモンを含まないＮ６培地（Chu C.C. et al., Sci. Sin. １６，６５９,(１９７５)）上で５.１０-4Ｍ Ｌ−ホスフィノスリシンの存在下において培養する。この培地上において、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェナーゼ遺伝子（ＰＡＴ遺伝子）を十分量で発現するトウモロコシ胚が発生して植物になる。形質転換されていない胚またはＰＡＴ活性が非常に弱い胚は死滅する。インビトロ植物の葉が４〜６mmの長さになったら、それらを土壌中に移すことができる。根に付着した寒天の残留物を完全に洗浄し、次に植物をローム層、砂、バーミキュライトおよび標準土壌が３：１：１：１の割合である混合物中に植え、移植後９０〜１００％相対大気湿度で最初の３日間土壌培養に付す。これらの植物を植物平面で約２５,０００ルックスの受光時間１４時間を有する調整された環境室中で、昼間／夜間温度２３±１７±１℃において栽培する。適応した植物を大気湿度６５±５％で培養する。
【００３６】
７．転移されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現の証明
ａ）  土壌中に移した後３〜４週間目に、トランスジェニック再生植物並びに対照としての、ＤＮＡ処理なしのカルスからの再生植物に、商業的に入手しうる製剤バスタ（BastaR，登録商標）でホスフィノスリシンを噴霧する。ホスフィノスリシンの量は、１ha当たり２.０kgの活性成分で処理するような量で使用する。この除草剤は５０m1／m2（＝５００ｌ／ha）の水量で適用される。７〜１０日経過後におけるＰＡＴ活性のない植物の、上記量のホスフィノスリシンによる損傷は、遺伝子が発現される程度によるが、存在しないかまたはＰＡＴ活性が低い場合には局部的な葉斑点が出現するかのいずれかである。しかし該斑点は処理した植物の生長を無視できない程まで冒すことはない。
【００３７】
ｂ）  トウモロコシカルスおよび葉組織１００mg試料の各バッチを液体窒素下、１.５m1反応容器中で凍らせ次いで容器の形に合うように適合されるステンレススチール製ミクロペストル（micropestle）を用いて均質化する。トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（５０mMトリス／２mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５）１００μｌを加える。ホモジネートをエッペンドルフ（Eppendorf）遠心機で１２,０００rpmにおいて１分間遠心分離する。透明な上澄みをピペットで採取し、ペレットを除去する。粗抽出物のタンパク質含量はバイオ−ラッド（Bio-Rad）タンパク質検定を用いて測定する。ＰＡＴ検定のために、粗抽出物のアリコートをとり出すが、その各々はタンパク質２０μｇを含有する。これらの抽出物にアセチル−ＣｏＡおよび１４Ｃ Ｌ−ホスフィノスリシンを加える。培養混合物中の最終濃度はアセチル−ＣｏＡの場合には１mMでありそして１４Ｃ Ｌ−ホスフィノスリシンの場合には０.１mMである。各試料を暫時混合し次いで３７℃で１時間培養する。その後1/2容量の１２％トリクロロ酢酸を加えることにより該酵素反応を止め、各試料を完全に混合し次いで氷上に１０分間置く。その後それらを１２,０００rpmで１０分間遠心分離し、上澄みをＴＬＣ用に使用する。薄層プレート（セルロースＦ２５４、Merck社製）に培養混合物６μｌの各部分並びにまた標準物質１４Ｃ ホスフィノスリシンおよび１４Ｃ アセチルホスフィノスリシンを塗布する。薄層クロマトグラフィー用に使用する移動相はｎ−プロパノール：２５％ＮＨ3（３：２）またはピリジン：ｎ−ブタノール：氷酢酸：水（３：５：１：４）のいずれかである。
【００３８】
乾燥した薄層プレートをプラスチック製フィルムに包み、Ｘ線フィルムカセット中で感光させる。現像したＸ線フィルム上では、ＰＡＴ活性がアセチルホスフィノスリシンバンド（これはトランスジェニック組織にだけ生ずる）により認識されうる。前記移動相中、ホスフィノスリシンおよびアセチルホスフィノスリシンは薄層クロマトグラフィーにより適切に分離されうる。
【００３９】
８．再生植物子孫への転移遺伝子の伝達
グルホシネート投与割合２kg a.i.／haの適用を損傷なしに許容しかつＰＡＴ酵素検定でＰＡＴ活性を明確に示す形質転換体の花粉を、種々の同系交配系統とりわけＢ７３、ＬＨ１１９、ＬＨ８２、ＬＨ５１またはＭｏ１７の柱頭に受粉するのに使用する。核コード化遺伝子のみが花粉を介して伝達されうるので、転移遺伝子が核ゲノム中に組込まれたかどうかを確認することは可能である。この場合のみに子孫での遺伝子発現およびメンデル性遺伝が期待されうる。
【００４０】
ａ）  未成熟胚の試験
受粉後１２〜１６日目に、滅菌条件下で穀果から未成熟胚を摘出する。単離した胚を、スクロース９％およびＬ−ホスフィノスリシンのアンモニウム塩（グルホシネートアンモニウム）を含有するホルモン不含ＭＳまたはＮ6寒天培地上で培養する。それらの胚は、胚盤が寒天に接触するようにして該培地上で培養する。引続きそれらを２０００〜５０００ルックス（１２時間／日）で７５±２℃において培養する。この培地上で、発現可能なＰＡＴ遺伝子のない胚はあらかじめ発芽を開始することもなく１４日以内に死滅する。３種の相異なる形質転換体の雑種第一代（ｔ1雑種）の行動は下記表１に示すとおりである。
【００４１】
【表１】
0003878678.tif 000004
【００４２】
発生しそして５.１０-4Ｍ Ｌ−ホスフィノスリシンの存在下で発芽する胚は、上記培地上で通常の根並びに緑葉を発育させる。これらの植物は、体細胞胚から発生させたインビトロ植物と同様に土壌中に移すことができる。これらの植物は、ｔ1植物の花粉が非トランスジェニック母親植物の柱頭上に置かれる場合にはＰＡＴ遺伝子をｔ2世代に伝達する。
【００４３】
ｂ）  苗木試験
前記交雑から得た成熟種子を乾燥し（水含量 ＜１５％）次いで播く（２０,０００ルックス、１２時間、昼間２２℃／夜間１６℃）。苗木が２〜３枚の葉段階に達すると同時に、再生植物の場合と類似の方法で（前記実施例６参照）商業的に入手しうる製品BastaRの１％溶液を噴霧する。結果は表２に示すとおりである。
【００４４】
【表２】
0003878678.tif 000005
【００４５】
分離比は、いくつかの形質転換体がそれらのゲノム中に１個の機能性ＰＡＴ遺伝子を有するだけであるという仮定と一致する。
【００４６】
１９９０年６月１２日付で形質転換体Ｎｏ.１４の種子はブタペスト条約規定の下、英国アバディーンにある国立工業用および海洋細菌収集会社〔National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB）〕に登録番号ＮＣＩＭＢ ４０２９１として寄託された。