(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）第１残基；該第１残基は、三量体プロコラーゲンＣ−プロペプチドに集合する活性を有し、第１の型のプロα鎖に由来し、鎖選択のための認識配列を含む、および
（ii）第２残基；該第２残基は、該第１の型とは異なるプロα鎖からの三重螺旋形成ドメインを含む、
を含むポリペプチドであって、その際、該第１残基は該第２残基に結合しており、該認識配列が、該ポリペプチドと該活性および三重螺旋形成ドメインを含む他のポリペプチドとの同時集合を可能とすることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
該認識配列がプロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロα１（II）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα３（Ｖ）、プロα１（ＸI）、プロα２（ＸI）およびプロα３（ＸI）鎖認識配列よりなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
該認識配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３の配列よりなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
該認識配列が細繊維プロα鎖の認識配列である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
該第２残基が少なくともコラーゲンα−鎖を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
該コラーゲンα鎖がプロα１（Ｉ）鎖、プロα２（Ｉ）鎖、プロα１（II）鎖、プロα１（III）鎖、プロα１（Ｖ）鎖、プロα２（Ｖ）鎖、プロα３（Ｖ）鎖、プロα１（ＸI）鎖、プロα２（ＸI）およびプロα３（ＸI）鎖コラーゲンα−鎖よりなる群から選択される請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
該第２残基がプロα鎖Ｎ−プロペプチドをも含む請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
該Ｎ−プロペプチドがプロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロα１（II）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα３（Ｖ）、プロα１（ＸI）、プロα２（ＸI）およびプロα３（ＸI）α鎖Ｎ−プロペプチドよりなる群から選択される請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
該第１残基がプロα１（III）Ｃ−プロペプチド認識配列を含み、該第２残基がプロα２（Ｉ）鎖からの三重螺旋形成ドメインおよびＮ−プロペプチドを含む請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号：４の配列を有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸残基が介在することによって該第１残基および該第２残基が分離されている請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の第１のポリペプチドを、それぞれプロコラーゲンＣ−プロペプチドに集合する活性および三重螺旋形成ドメインを有するさらに２つのポリペプチドと同時集合させ、それによって該第１のポリペプチドおよび該さらなる２つのポリペプチドが同時集合して三重螺旋ドメインを有する分子を形成させることを含む、プロコラーゲン分子の製造法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によってプロコラーゲン分子を調製し、ついで該プロコラーゲン分子をコラーゲン分子に変えることを含むコラーゲン分子の製造法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により製造されたコラーゲン分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載のコラーゲン分子を含むコラーゲン細繊維。
【請求項１６】
請求項１５に記載のコラーゲン細繊維を含むコラーゲン繊維。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１８】
発現を指令する調節配列に作動可能に結合した請求項１７に記載のＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションした発現宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現宿主細胞をコラーゲンの産生を可能とする条件下で培養し、該発現宿主細胞から該コラーゲンを回収し、ついで任意に該コラーゲンを精製することを含む、コラーゲンの製造法。
【請求項２０】
発現を指令するのに十分である調節配列に作動可能に結合した請求項１７に記載のＤＮＡ分子をゲノムが含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２１】
非ヒト動物が非ヒト胎性哺乳動物であり、調節配列が成体雌の乳中の発現を指令する請求項２０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のトランスンジェニック非ヒト動物からコラーゲンを回収し、ついで任意に該コラーゲンを精製することを含むコラーゲンの製造法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、特に、コラーゲン分子とともにコラーゲンα−鎖の天然に不在の組み合わせを含む新規のプロコラーゲン分子、細繊維および繊維、同物をコードするＤＮＡ、同物で形質転換またはトランスフェクションした発現宿主、トランスジェニック動物および天然に不在のコラーゲンを産生する方法に関する。
コラーゲン（プロセシングされたプロコラーゲン分子または三重螺旋のプロセシングしたプロコラーゲン単量体分子としても知られる）（概説には、カドラー（Ｋadler, Ｋ.）、１９９５、Ｐrotein  Ｐrofile、"Ｅxtracellular Ｍatrix １：fibril-forming collagens"、２：４９１−６１９；アヤド（Ａyad, Ｓ.）ら１９９４、ザ・エクストラセルラー・マトリックス・ファクツ・ブック（Ｔhe Ｅxtracellurar Ｍatrix Ｆacts Ｂook）、アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐress）、ロンドン、ＩＳＢＮ ０−１２−０６８９１０−３および参考文献として本明細書に引用するものを参照）は殆ど細繊維の形態で結合組織の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に存在する動物中の主要構造タンパク質である。該コラーゲン細繊維（多量体コラーゲン）は結合組織の機械的な強度の主要起原であり、細胞接着のための土台および動的分子相互作用の足場を提供する。コラーゲンファミリーは三重螺旋に巻き込んだ３本のコラーゲンα−鎖を含む複雑なマルチドメインタンパク質を含む。少なくとも２０の遺伝的に特徴的であるコラーゲンのタイプが明らかにされるべく記載され、該コラーゲンは、コードされるタンパク質の遺伝子ホモロジーおよび機能に基づいてサブグループに分類されることができる。細繊維形成コラーゲン（Ｉ、II、III、ＶおよびＸＩ型：表１参照）を可溶性プロコラーゲン（プロα鎖、プロコラーゲンα−鎖および単量体鎖としても知られる）として合成され、Ｃ−プロペプチド、Ｇly−Ｘ−Ｙ繰り返し含有領域（細繊維形成コラーゲン単量体鎖の場合には阻止されていない（uninterrupted）コラーゲンα−鎖を含む）およびＮ−プロペプチドを含む。該プロα鎖は三量体化して非プロセシングプロコラーゲン分子（単量体プロコラーゲン分子および三量体化したプロα鎖としても知られる）を形成し、Ｎ−末端プロペプチドドメインおよびＣ−末端プロペプチドドメイン（Ｎ−プロペプチドおよびＣ−プロペプチド）の酵素的開裂により細繊維構造へ集合する（図１参照）。
該プロα鎖をコードする遺伝子は非常に似通っているが、該プロα鎖の折り畳みおよび三量体化をコントロールするプロセスについては比較的殆ど知られておらず（ディオン（Ｄion, Ａ.Ｓ.）およびマイヤーズ（Ｍyers, Ｊ.Ｃ.）、１９８７、Ｊ. Ｍolec. Ｂiol.、１９３：１２７−１４３）およびコラーゲンの僅かに限られた範囲が形成される。例えば、皮膚繊維芽細胞は同時に６つの非常に類似のプロα鎖を合成する（プロα１（Ｉ）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｉ）、プロα２（Ｖ）およびプロα３（Ｖ））。該６つのプロα鎖の組合せの可能性が非常に多数であるにもかかわらず、コラーゲン鎖の特別な組合せのみが存在する−これらはＩ、IIIおよびＶ型コラーゲンを産み出すものである。Ｉ型コラーゲンはヘテロダイマーとして存在し、２つのプロα１（Ｉ）鎖および１つのプロα２（Ｉ）鎖の化学量論（［プロα１（Ｉ）］2プロα２（Ｉ））と共に集める。プロα２（Ｉ）のホモ三量体は検出されず、従って、三量体におけるこの鎖の含有はプロα１（Ｉ）鎖との関連に依存する。III型コラーゲンはホモ三量体（［プロα１（III）］3）を含み、組成の鎖はＩ型コラーゲンプロα鎖のいずれかを集めない。Ｖ型コラーゲンは鎖の組成に関する不均一性（heterogeneity）を示し、ホモ−（［プロα３（Ｖ）］3）およびヘテロ三量体（［プロα１（Ｖ）］2プロα２（Ｖ）および［プロα１（Ｖ）プロα２（Ｖ）プロα３（Ｖ）］）の両方を形成する。
Ｃ−プロペプチドはＮ−およびＣ−プロペプチドの開裂および細繊維形成プロα鎖におけるコラーゲンの形成の前に三量体化したプロα鎖（プロセシングしていないプロコラーゲン）へのモノマー鎖の集合に関係すると知られている。三量体化したプロα鎖になる３つのモノマー鎖の集合は、Ｃ−プロペプチドの会合によって開始する。この会合は２段階に分けられる：最初に鎖の選択を決定するプロα鎖間の認識事象が起こり、ついで正しい三重螺旋のアラインメントおよび折り畳みへと導く登録（registration）事象が起こる。プロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）およびプロα１（III）プロα鎖（集合してコラーゲンＩ型およびIII型を形成する）のＣ−プロペプチドのアミノ酸配列の比較（図２）は、これらのプロα鎖間の配列の顕著なレベルの類似性を示すが、そのホモロジーにもかかわらず、常にコラーゲンの型特異的様式で集合し折り畳まれる。
Ｃ−プロペプチド、および特にそれらのある配列は必要であるだけでなく、結合する残基の型特異的集合を決定するのに十分であることが現在わかっている。これらのある配列の存在のため、該Ｃ−プロペプチドは結合残基（特に外在性のコラーゲンα−鎖であるかもしれない）の集合を自律的に指示することができる。本発明者らは、鎖の選択事象を定義するが、後の折り畳みに影響を及ぼさないＣ−プロペプチドの領域を単離し特徴付けた。これにより新規三量体化した新規三量体プロα鎖およびコラーゲンを形成する新規のプロα鎖の合成ができる。いまやプロα鎖間の鎖選択相互作用を制御できるので、既存のおよび新規なプロα鎖およびＣ−プロペプチドを用い、多大な範囲の新規な三量体分子、特にコラーゲンを合成できる。これらの新規の分子は選択された生物学的および物理的特性を有することができ、広範囲の用途を有する。例えば、新規のコラーゲンはコラーゲンが製造物または製造工程の一部として使用される産業において使用できる。そのようなコラーゲンおよび使用は例えば：食品、食品加工および写真術において使用するための新規のゼラチン；醸造工程の間の酵母を除去するための新規な清澄剤；食品梱包産業のための新規ゼラチン；テキスタイルの製造のための新規なポリマー；建造、建設および製造において使用する新規の接着剤；錠剤のための新規のコーティング；ヒトまたは動物の体に使用する新規接着剤；生体移植として使用するための新規コラーゲン；アジュバントとしての新規コラーゲンおよびプロコラーゲン；医薬および製薬剤のための分子担体としてのプロコラーゲン；および例えば傷の治癒および線維症における使用のためのコラーゲン細繊維形成のモジュレーターとしての例が含まれる。
本発明により、少なくとも第１残基がプロコラーゲンＣ−プロペプチドの活性を有し、第２残基が外在性（alien）コラーゲンα−鎖および非コラーゲン物質の群の任意の１つから選択され、第１残基が第２残基に結合したものを含む分子を提供する。
該分子は他の類似の分子に結合することができる。該分子は、他の類似の分子と三量体化することができる。
第１残基は一般に第２残基のＣ−末端に結合するが、間に遮るアミノ酸残基が存在してもよい。
第１残基はプロα鎖Ｃ−プロペプチドまたはその部分的に修飾した形態またはそのアナログ（analogue）を含み、プロα鎖のＣ−末端領域を形成する際には該分子が類似の他の分子に結合することを可能にする。プロα鎖のＣ−プロペプチド領域は、プロα鎖のＣ−プロテイナーゼ切断から生み出されるＣ−末端断片であってもよい。
Ｃ−プロテイナーゼは、配列ＦＡＰＹＹＧＤ（配列番号２の残基３７６−３８２）、ＹＹＲＡＤ（配列番号：１４の残基１−５）またはＦＹＲＡＤ（配列番号：１の２８４−２８８残基）（図２）またはそのアナログにおいて、残基ＧとＤの間またはＡとＤの間およびそのアナログで開裂することができる。
分子に対する修飾には残基の付加、欠失、置換を含む。置換は保存的置換であってよい。修飾された分子は実質的に、該分子が由来する分子と同様の特性および特徴を有することができる。それらは例えば、少なくとも４０％のホモロジーを、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のホモロジーを有することができる。
本発明者らは結合する残基の型特異的集合を決定するのに必要でありかつ十分である配列を含むプロコラーゲンＣ−プロペプチド中の部位（認識部位）を単離および同定した（実験セクション参照）。認識部位は、他のＣ−プロペプチドに対するＣ−プロペプチドのアラインメントプロット（alignment plot）中で、接続点ＢおよびＧ（図２）間の領域中の配列に対応する配列（認識配列）を含むＣ−プロペプチドの一部であると定義される。アラインメントプロットは英国、ダレスベリー・ラボラトリーズ（Daresbury Laboratories）にてＳＥＱＮＥＴ上のＰＩＬＥ−ＵＰプログラムを用いて行う。認識配列で置換されており、その結果、異なる特性または特徴を有する既存のプロα鎖は、プロα−鎖Ｃ−プロペプチドおよび外在性コラーゲンを含む分子であると考えられ、Ｃ−プロペプチドは新規であるので、すべてのコラーゲンα−鎖はそれゆえ該Ｃ−プロペプチドに対し外在性である。
図２に見られるように、認識配列は類似のアミノ酸の領域を含む。保存された残基に対する置換は（「実験」セクション、以下、参照）鎖の選択を崩壊させないし、また正確に並んだ螺旋の形成を妨げるものではないので、鎖の選択に保存された残基は関係ないと思われる。従って、該認識配列は約２３アミノ酸の連続した配列を含むが、不連続な可変配列内に含まれる鎖の選択特性を有すると考えられる。例えば、α１（III）（配列番号：６）の認識配列において、不連続な可変配列は１−１２および２１−２３の残基を含むと考えられる。
Ｃ−プロペプチドおよび／または認識配列は細繊維プロα鎖の配列であってよい。より一般的には、Ｃ−プロペプチドは現存するＣ−プロペプチド、例えば、天然に見いだされるＣ−プロペプチドまたは、現存するプロα鎖Ｃ−プロペプチドアナログ（すなわち実質的に同一の特性および特徴を持つが、しかし異なる配列を持つ）の部分的に修飾した形態であってよいか、または新規のＣ−プロペプチド（すなわち、他のＣ−プロペプチドに対して優位に異なる特性または特徴を有するＣ−プロペプチド）を含んでよい。
現存するＣ−プロペプチドはプロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロ１（II）、プロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロ１（II）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα３（Ｖ）、プロα１（ＸI）、プロα２（ＸII）およびプロα３（ＸＩ）プロα鎖Ｃ−プロペプチド、またはその部分的に修飾した形態またはそのアナログの群のいずれか１つから選択されることができる。プロコラーゲンＣ−プロペプチドの部分的に修飾した形態にはＣ−プロペプチドの認識配列、例えばそれらが由来するＣ−プロペプチドに関連する付随の図面の図面３に同定されるものが含まれる。
該Ｃ−プロペプチドは現存するＣ−プロペプチドまたはその部分的に修飾した形態または認識部位で置換したそのアナログを含むかもしれない。該Ｃ−プロペプチドは例えば異なるＣ−プロペプチドの認識配列などの現存するＣ−プロペプチドの認識配列で認識部位を置換することができる。例えば、プロα１（III）、プロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロα１（II）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα１（ＸI）、プロα２（ＸI）およびプロα３（ＸＩ）プロα鎖の群のいずれか１つのＣ−プロペプチドの認識配列で認識部位を置換することができる。配列番号：６−１３の群のいずれか１つの配列を有する認識配列で認識部位を置換する。アミノ酸残基の付加、欠失または置換による例を修飾したＣ−プロペプチドの認識配列は実質的に同一の特性および／または特徴を有するものであるが、現存するＣ−プロペプチドのものと本質的にみなされる。一般に認識配列は該配列が由来する配列に少なくとも４０％類似であり、または少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％類似であり得る。
そのような該認識部位での置換は該Ｃ−プロペプチドの特性または特徴に有意に影響を及ぼす。
代わりに、該認識配列は新規であってよい。そのような新規の認識配列は、例えば第１残基に新規の動力学または第１残基に対する特異性、または第１残基の新規の組合せを与えることができる。
第２残基は第１残基に結合した任意の分子要素である。例えばこれには外在性コラーゲンα−鎖分子または他のタンパク質またはタンパク質の断片、抗体またはその抗原結合断片またはその組合せなどを含む。第２残基を構成するまたは貢献するタンパク質はグリコシル化されてよく、またさもなければ翻訳後に修飾する。「外在性コラーゲンα−鎖」とは天然のＣ−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成しないコラーゲンα鎖を意味する；コラーゲンα鎖は三重螺旋形成ドメインを含み、Ｎ−プロペプチド配列もまた存在することができる。同種由来の他のコラーゲンα−鎖ならびに他の種からのそれが使用されるかもしれない。天然に存在するＣ−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成しないコラーゲンα鎖として含まれるので部分的に修飾した形態であり、天然に存在するＣ−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成する現存するコラーゲンα−鎖のアナログおよび結合特異性などのプロコラーゲン分子の適切な特性または特徴またはコラーゲンα−鎖に有意には影響を及ぼさないものである。コラーゲンα鎖の部分的に修飾した形態およびアナログは、Ｃ−プロペプチドまたはコラーゲンα鎖の適切な特性または特徴に有意には影響を及ぼさない例えば、付加、欠失または置換を有することができる。
従って、本発明により、新規コラーゲンが製造されることができる。そのような新規コラーゲンは天然のＣ−プロペプチドの集合指示効果（assembly-directing effect）のために天然には見られないα−鎖の組合せを有する。本発明はタンパク質技術によって天然に存在しないα−鎖の組合せを有する新規のコラーゲンを構築することができる。従って、本発明は天然に存在しないα−鎖の組合せを含むプロコラーゲン分子に拡張する。天然に不在のプロコラーゲンホモ三量体およびヘテロ三量体には表１には記載されていないすべての可能性のある三量体を含み、これらは本発明の範囲に含まれる。
第２残基は少なくともコラーゲンα−鎖を含むことができる。コラーゲンα鎖はプロα１（Ｉ）鎖、プロα２（Ｉ）鎖、プロα１（II）鎖、プロα１（III）鎖、プロα１（Ｖ）鎖、プロα２（Ｖ）鎖、プロα３（Ｖ）鎖、プロα１（ＸI）鎖、プロα２（ＸI）鎖およびプロα３（ＸＩ）鎖コラーゲンα鎖のうちのいずれか１つから選択することができる。
第２残基はまたプロα鎖Ｎ−プロペプチドをも含むことができる。Ｎ−プロペプチドはプロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロα１（II）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα３（Ｖ）、プロα１（ＸI）、プロα２（ＸI）およびプロα３（ＸＩ）プロα鎖Ｎ−プロペプチドの群のいずれか１つから選択することができる。
第２残基は天然に結合する（例えばプロα２（Ｉ）鎖の）コラーゲンα−鎖およびＮ−プロペプチドを含むことができるかまたはコラーゲンα鎖およびＮ−プロペプチドの天然に不在の組合せを含むことができるかもしれない。本発明の分子を発現させたい宿主の器官に依存して、該Ｎ−末端プロペプチドは発現系において分泌を促進するかまたは他の操作またはプロセシングに置換または適応させることができる。
該分子はコラーゲンα−鎖およびプロα２（Ｉ）鎖のＮ−プロペプチドの活性を含む第２残基に結合するプロα１（III）Ｃ−プロペプチドを有する第１残基を含むことができる。該分子は配列番号：４の配列を有することができる。
イン・ビボでのコラーゲン分子の天然の形成において、Ｎ−およびＣ−プロペプチドはポリマーコラーゲンの形成の間にコラーゲン分子を産生するためプロコラーゲン分子で開裂される。結果的に、本発明はその範囲内にα−鎖の天然に不在の組合せを含むコレーゲン分子を含む。天然に不在のコラーゲンホモ三量体およびヘテロ三量体（表１に挙げていない可能性のあるすべてのコラーゲン三量体を含む）は、本発明の範囲内である。（何らかの理由のため、Ｃ−プロペプチドを持つがＮ−プロペプチドを持たない天然に不在のコラーゲン分子またはその逆を所望する場合、選択した発現系においてプロセシングを担う酵素は、操作されるかまたは適宜に選択されるか、または適当に酵素的なプロセシングを受け易くするよう修飾された分子の配列であってよい。）
コラーゲン分子は本来、自己集合（self-assemble）してコラーゲン細繊維となり、次々と集合してコラーゲン繊維を形成する。コラーゲン細繊維およびコラーゲン繊維は上記のコラーゲン分子を含み、ゆえに本発明によりまた、考慮される。
本発明の第１の側面の分子はペプチドライゲーションおよび完全な合成を含む任意の便利な方法によって調製されることができる。しかしながら、該分子は組換えＤＮＡ系からの発現によって調製されるのが好ましい。この目的および本発明の第２側面により、上記の分子およびコードする組換えまたは単離された形態であるＤＮＡ分子を提供する（特に天然に不在のプロコラーゲンα−鎖）。
本発明の組換えＤＮＡはベクターの形態であってよい。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージであってよい。ベクターはしばしば１またはそれ以上の選択可能なマーカーを含み、それらでトランスフェクション（または形質転換：該語は本明細書中では交換可能に使用される）した細胞を選択可能にし、好ましくは異種ＤＮＡを含むベクターを有する細胞の選択を可能にする。適当な開始および終結シグナルが存在するであろう。該ベクターは発現させる調節配列を有する発現ベクターであってよい。調節配列を含まないベクターは、クローニングベクターとして有用である；および勿論、発現ベクターもまた、クローニングベクターとしても有用である。
クローニングベクターは、その操作を容易にする大腸菌または適切な宿主に導入することができる。本発明の他の態様により、従って上記のＤＮＡでトランスフェクションまたは形質転換する宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は原核生物または真核生物細胞であってよい。真核宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物細胞株を含む。発現宿主は安定して形質転換することができる。不安定および無細胞発現系は適当な環境において使用することができるが、それらは現在の技術状態では大きな産物には都合よくないようである。
本発明のＤＮＡはトランスジェニック植物または好ましくは動物における発現のために設計されたトランスジーン構築物の形態、または好ましくは動物であってもよい。原則として、本発明は家禽などの鳥類、爬虫類種および魚類など含むすべての動物に適応可能である。該タンパク質は体液または他の生体産物（適当なところでは卵）から回収することができる。実際には哺乳動物（非ヒト動物）、特に胎性哺乳動物には、多大な市販されていて有用な適用性は現在予見されており、乳腺における発現として、ミルクからの発現産物の連続した、ときおりの回収が証明され、好ましい技術である。本発明が最も有用なのは、有蹄類、特に経済的に重要であるウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダおよびブタなどの有蹄類であう。そのような哺乳動物トランスジェニック乳発現系の産生および有用性が両者とも一般的に、ある例においては特異的にＷＯ−Ａ−８８００２３９およびＷＯ−９００５１８８に開示されている。β−ラクトグロブリンプロモーターは特に、トランスジェニック乳発現系における使用に好ましい。ＷＯ−Ａ−９４１６５７０はトランスジェニック動物の乳におけるヒト組換えコラーゲンの産物を開示すると主張しているが、そのように行われた産物の実験的詳細発現は含まれていない。
発現宿主、特にトランスジェニック動物は本発明の分子の生合成の発現、集合、分泌および他の側面を容易にする外在性ＤＮＡを含むかもしれない。例えば、発現宿主はプロリル４−ヒドロキシラーゼ、ＷＯ−９３０７８８９号に開示されるようにプロコラーゲンの天然での生合成において重要である翻訳後酵素（post-translational enzyme）である、共発現するかもしれない。
天然のプロコラーゲン鎖をコードするＤＮＡ、特にｃＤＮＡは公知であり、かつ当該技術分野においては使用可能である。例えば、ＷＯ−Ａ−９３０７８８９、ＷＯ−Ａ−９４１６５７０および両方に引用される参考文献は詳細を与える。そのようなＤＮＡは、本発明のＤＮＡの便利な開始点を形成し、それから組換え技術によって調製することができる。Ｃ−プロペプチド（またはそれからの最小必須領域）をコードするＤＮＡの一般的観点が外在性コラーゲン三重螺旋ドメイン（通常Ｎ−プロペプチドに一致するものをコードするＤＮＡに結合する）をコードするＤＮＡに単にライゲーションするかもしれないが、実際、正確なライゲーションに影響を及ぼすためのＰＣＲに基づいた技術を利用するのは有用である。例えば、Ｃ−プロペプチドと三重螺旋ドメインの間の接合領域をブランキングするＰＣＲ産物を調製することができ、ついで組み合わせることができる；ついで重複拡張反応（overlap extension reaction）が行われ、１つのプロコラーゲン鎖のＣ−プロペプチドをコードするＤＮＡと他のプロコラーゲン鎖の三重螺旋ドメインをコードするＤＮＡ（およびＮ−プロペプチド、通常）間のハイブリッドであるＰＣＲ産物を産生する。
原則として、本発明は合成ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡｓ、全長ゲノム配列および「微小遺伝子（minigenes）」（全長遺伝子に存在する介在配列の全てではないにせよいくつかを含む部分的なゲノム配列をいう）の使用を適応させることができる。一般的に、コラーゲン遺伝子中に介在配列が多数存在するので、しかし実験的な実用性は通常ｃＤＮＡまたは幾つかの状況においては微小遺伝子の使用が都合よい。
本発明のＤＮＡは原則として、引き続きのヌクレオチドとともに結合する任意の便利な方法、および／まだはイン・ビトロ工程を含み、オリゴ−および／またはポリヌクレオチドをライゲーションすることに関するが、選択の方法を形成する組換えＤＮＡ技術が形成する。
本発明の分子はヒトまたは動物体の治療または診断の方法において有用であるかもしれない。該分子は接着剤または移植物としての使用であってよい。本発明は、それゆえ、恐怖が低減した傷または繊維障害の治癒を促進するのに使用できる。慢性傷の治癒を促進することにおいての使用であってよい。「傷または線維障害」なる語は、瘢（scar）組織の形成が可能な任意の状態を意味する。特に、これは皮膚の傷の治癒、腱の傷害の修復、圧潰（crush）傷の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）傷害の治癒、ＣＮＳ中の瘢組織の形成を起こす状態、発作由来の瘢組織形成および組織接着、例えば、傷または外科手術などの結果であるが、これらを含む（これは例えば、腱の治癒および腹部構造および接着に応用できる）。繊維の障害の例には肺線維症、糸球体腎炎、肝硬変および増殖性硝子体網膜症を含む。
例えば、線維症の抑制において、新規のコラーゲン分子またはプロα鎖は傷または線維症、コラーゲン細繊維形成を抑制する新規のコラーゲン（またはプロα鎖）およびよって線維症の部位に応用することができる。新規のコラーゲン、またはプロα鎖は例えば短くしたα−鎖を有することができる。
本発明のＤＮＡは適当な構築物において、遺伝子療法において有用であり得る。骨形成不全（ＯＩ）、エーレルス・ダンロー症候群（ＥＤＳ）、スティックラー症候群（Ｓtickler Ｓyndrome）、脊椎骨形成異常、低軟骨形成または大動脈瘤の治療における使用のためであってよい。コラーゲン遺伝子内の変異はＯＩのたいていの形態の、ＥＤＳおよびいくつかの軟骨形成不全の形態の原因である。たいていの場合、該疾患の破壊的効果は一層大きな側鎖を有するアミノ酸のGly−Ｘ−Ｙ繰り返し含有領域−の三重螺旋内のグリシンの置換による。これは、トリマー化したプロα鎖の分泌において劇的な減少がみられる結果で三重螺旋の折り畳みが妨害または遅延される。誤って折り畳まれたタンパク質は、使い切られた後、分解され、細胞内に、恐らくＥＲ（小胞体）内に保有されるであろう。Ｃ−プロペプチドの折り畳みが、三重螺旋ドメイン内の変異によって影響されず、野生型ならびに変異鎖由来のＣ−プロペプチドは結合し、かつ細胞内に保有されることができる。野生型鎖の保有および分解は変異の効果を増幅する変異鎖との相互作用により、「プロコラーゲン自殺」と称す。この現象によるタンパク質の多量の損失は、そのような変異の最も有力な致死的効果を説明することができる。変化した鎖の選択性を有するプロα鎖を操作することによって、プロα鎖はおそらく変異鎖と結合させないで処理し、従って、折り畳まれ、通常で選択するであろう。そのように操作されたプロα鎖は野生型のコラーゲンα鎖を含むことができ、それによって変異コラーゲンα−鎖によって引き起こされる欠点を埋め合わせる。発現したタンパク質は、いくつかの状況において、疾患の治療および遺伝子療法による一層基本的なレベルで明確にする状態においても有用である。
本発明はまた、写真術、醸造、食料品、テキスタイルまたは接着剤においても有用である。
本発明により、本発明の分子の使用を含むヒトまたは動物体の治療または診断の方法をもまた提供する。
本発明はさらに以下の図面および実験の記載を含む実施例から明らかである：
図１は、プロコラーゲンの細胞内折り畳み、集合（assembly）の修飾の最初の段階を示す。段階１で同時翻訳転座（co-translational translocation）およびシグナルペプチド開裂が起こることが見られる。ついで、分子内ジスルフィド結合形成外在ならびにＮ−結合グリコシル化、プロリン異性化およびプロリンヒドロキシル化が第２段階で起こる。ついでトリマー化および分子内ジスルフィド結合形成によるプロα鎖の３型特異的な集合が続く。最終的に第４段階にて、三重螺旋の形成がカルボキシからアミノ酸方向へと続いてトリマー化したプロα鎖を得る；
図２は、デフォルト設定を用いて、英国、ダレスベリー・ラボラトリーズにてＳＥＱＮＥＴ上のＰＩＬＥ−ＵＰプログラムを用いて行ったＩ型およびIII型プロコラーゲンのプロα鎖のＣ−プロペプチドのアラインメントプロットを示す。α１（Ｉ）は配列番号：１４；α２（Ｉ）は配列番号：１の残基番号２８４−５３４である；およびα１（III）は配列番号：２の残基番号３７９−６２６である。Ｃ−プロテイナーゼ開裂部位（ＣＰと記す）はＡとＤ（α１（Ｉ））、ＡとＤ（α２（Ｉ））およびＧとＤ（α１（III））間である。結合点Ａ、Ｆ、Ｂ、ＣおよびＧは以下に示す。数字は保存されたシステイン残基をも示す。＃は同一のアミノ酸を示し、および〜は保存された側鎖を有するアミノ酸を示す；
図３は、それぞれ配列番号：７、８、９、６、１０、１１、１２および１３を有するプロα１（Ｉ）、プロα２（Ｉ）、プロα１（II）、プロα１（III）、プロα１（Ｖ）、プロα２（Ｖ）、プロα１（ＸI）およびプロα２（ＸI）プロα鎖の認識配列を示し、図２の結合点ＢとＧの間の配列に対応するような他のＣ−プロペプチド（特に図２のＣ−ペプチド）に対するＣ−プロペプチドのアラインメントプロットによって同定される。
図４は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは以下の通りである：１−分子量マーカー；２および６−プロα１（III）Δ１；３および７−プロα２（Ｉ）Δ１；４および８−プロα２（Ｉ）：（III）ＣＰ；５および９−プロα１（III）：（Ｉ）ＣＰ；
図５は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは以下の通りである：１−分子量マーカー；２および７−Ａ−結合；３および８−Ｆ−結合；４および９−Ｂ−結合；５および１０−Ｃ−結合；６および１１−recip−Ｃ−結合；
図６は、α，α'−ジピリジルの存在下（レーン３、５および７）および不在下（レーン２、４および６）の翻訳されたプロコラーゲンを示す。レーンは以下の通りである：２および３−プロα２（Ｉ）：（III）ＣＰ；４および５−ＢＧＲ；６および７−プロα１（III）：（Ｉ）ＣＰ；
図７は、還元条件（レーン１−３）および非還元条件（レーン４−６）下での翻訳されたプロコラーゲン構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは以下の通りである：１および４−ＢＧＲS-C；２および５−ＢＧＲ；３および６−ＢＧＲL-M；および
図８は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは以下の通りである：１−分子量マーカー；２−ＢＧＲS-C；３−ＢＧＲ；４−ＢＧＲL-M。
実  験
切断された形態の（truncated）プロα２（Ｉ）鎖（プロα２（Ｉ）Δ１；配列番号：１；核酸コード配列−配列番号：１９）をコードするｃＤＮＡクローンは、ｐＢluescriptＳＫ+のＥcoＲＩ部位にサブクローニングした２つの部分的なｃＤＮＡクローンｐＨｆ１１３１およびｐＨｐ２０１０（クイバニエミ（Ｋuivaniemi, Ｈ.）ら、１９８８、Ｂiochem. Ｊ.、２５２：６３３−６４０）から構築された。ベクターと該遺伝子の５'−末端の０．５ｋｂを含む３．４ｋｂのＰstＩ断片を、ｐＨｐ２０１０から単離し、３'末端をコードするｐＨｆ１１３１由来の１．４ｋｂＰstＩ断片にライゲーションする。得られた組換えプロα２（Ｉ）Δ１はコーディング配列において２．２kbの欠失を有する（リーズ（Ｌees）およびブレイド（Ｂulleid）、１９９４、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.、２６９：２４３５４−２４３６０）。
この構築物はウィルソン（Ｗilson）らによって記載されたような（１９９５、Ｂiochem Ｊ. ３０７：６７９−６８７）半透過化された（semi-permeabilised）（ＳＰ）ＨＴ１０８０細胞系を用いて分析した。半透過化細胞をＨＴｌ０８０細胞調製した。７５ｃｍ2フラスコからの一定の密度に達したＨＴ１０８０細胞を１回ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で濯ぎ、ついで室温で３分間２．５mg／mlのトリプシンを含むＰＢＳ、２mlでインキュベートした。そのフラスコを氷に移し、そこに氷冷したＫＨＭ（１１０mＭＫＯＡc、２０ｍＭ Ｈepes、ｐＨ７．２、２mＭ ＭgＯＡc）８ｍｌ（１００μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビターを含む）を加え、ついで細胞をプレートに撒く。細胞を１２，０００rpmで３分間ペレット化し、再度４０μｇ／ｍｌのジギトニン（ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中の４０ｍｇ／ｍｌストックから希釈）を含む６ｍｌのＫＨＭに再懸濁し、ついで氷上で５分間インキュベートする。透過を終結させるため、８ｍｌのＫＨＭを加え、細胞をペレット化して再度５０mＭＨepes、pＨ７．２、９０mＭ ＫＯＡｃに再懸濁する。１０分後、細胞をペレット化し、１００μｌのＫＨＭ（約２×１０6細胞）に再懸濁する。ＣaＣｌ2を１mＭ加え、スタフィロコッカススクレアーゼを１０μｇ／ｍｌに加えることによって内在性ｍＲＮＡを除去し、室温で１２分間インキュベートする。その反応を４ｍＭまでＥＧＴＡを加えて終結させ、ついで細胞をペレッティングする。半透過化細胞を１００μｌのＫＨＭ再懸濁した。ＲＮＡを３０℃で１時間ウサギ網膜細胞溶解物（フレキシリゼイト（Ｆlexi Ｌysate）、プロメガ（Ｐromega）、サザンプトン、英国）を用いて翻訳する。その翻訳反応液（２５μｌ）は１６μｌの網膜細胞溶解物、１μｌの１mＭアミノ酸（メチオニンは除く）、１５μＣiＬ−［35Ｓ］メチオニン、１μｌ転写ＲＮＡおよび半透過化した細胞（約１×１０5）を含む。翻訳後、Ｎ−エチルマレイミドを最終濃度２０mＭにまで加える。ジスルフィド結合の形成を還元条件および非還元条件下で翻訳産物を７．５％ポリアクリルアミドゲル上で相対的にゲル電気泳動することによって確認する。この無細胞系を用いて分析する場合、プロα２（Ｉ）Δ１ｍＲＮＡからの翻訳産物はホモ三量体を形成するように自己結合しないことは最初の認識事象に必要な情報を含まないことを示す（図４、レーン３および７）。
切断された形態のプロα１（III）鎖（プロα１（III）Δ１；配列番号：２；核酸コーディング配列−配列番号：２０と称す）ｃＤＮＡクローンは２つの部分的なｃＤＮＡであるｐＳ４１３およびｐＳ３１（アラ−コッコ（Ａla-Ｋokko）ら、１９８９、Ｂiochem. Ｊ. ２６０：５０９−５１６）から構築された全長型IIIプロコラーゲンｃＤＮＡから構築する。各ｃＤＮＡをｐＢluescript ＳＫ-のＥcoＲ Ｉ部位にサブクローニングする。ベクターおよび５'末端１．８ｋｂを含む４．７ｋｂのＳal Ｉ（制限酵素）断片をｐＳ４１３から単離し、ついでｐＳ３１からの３．６kbのＳal １断片にライゲーションしてプロα１（III）を製造する。内部の２．５ｋｂＸho Ｉ断片をプロα１（III）から切り出し、ついで親のプラスミドを再度ライゲーションしてプロα１（III）Δ１（リーおよびブレイド、１９９４、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.、２６９：２４３５４−２４３６０）。
プロα１（III）Δ１ｍＲＮＡは、集合して、半透過化した無細胞翻訳系において翻訳した分子内のジスルフィド結合したダイマーおよび三量体を形成することができる能力によって判断されたホモ三量体を形成することができる。このことはそれが自己集合に必要な情報を含むことを示していた（図４、レーン２および６）。
ハイブリッドｃＤＮＡクローンはプロα１（III）Δ１およびプロα２（Ｉ）Δ１由来の配列を含み、調製される。プロα１（III）Δ１のＣ−プロテイナーゼ開裂部位はこれらの実験のため、配列番号：２のＡla３７７とＰro３７８の間で図２に示すように配列番号：２のＧly３８１とＡsp３８２の間のかわりにとられる。これらの構築物の最初に、プロα１（III）Δ１鎖からのＣ−プロペプチドのためのコーディング配列をプロα２（Ｉ）鎖からのＣ−プロペプチドの配列で置換し、その結果得たキメラをプロα１（III）：（Ｉ）ＣＰ（配列番号：３）と称す。この構築物は、無細胞系で翻訳されると自己結合に失敗する（図４、レーン５および９）。相互構築物をプロα２（Ｉ）Δ１からのＣ−プロペプチドをプロα２（Ｉ）：（III）ＣＰ（配列番号：４）と称されたキメラのプロα１（III）からのＣ−プロペプチドと置換した。
この構築物は自己結合することができ、ダイマーおよびホモ三量体（図４、レーン４および８）を形成し、そのことは、Ｃ−プロペプチド内の選択結合残基に必要であるすべての情報を初めて証明した。プロα１（III）：（Ｉ）ＣＰ構築物は以下に記載するように調製した。他の構築物は同様の方法および公開された配列を用いて製造した。
ハイブリッドｃＤＮＡクローンをＰＣＲに基づいた方法を用いて調製した。プロα１（III）：（Ｉ）ＣＰの構築のため、ＰＣＲ産物はプライマーを有してプロα１（III）Δ１から調製され、そのプライマーの１つ（配列番号：１５；ＪＬ−３５）は三重螺旋ドメイン内でハイブリダイズし、もう一方はＣ−プロペプチドで結合点から２１ヌクレオチド上流のものとハイブリダイズする。このプライマーはまたプロα２（Ｉ）Δ１のＣ−プロペプチドの最初の２１ヌクレオチドに相補的な２１ヌクレオチドの重複を含む。これにより０．２５kbのＰＣＲ産物を得た。
第２ＰＣＲ産物をプライマー（そのうちの１つは（配列番号：１７；ＪＬ−３１Ｋpn）３'−未翻訳領域内の翻訳停止コドンの下流ではハイブリダイズした）を用いてプロα２（Ｉ）Δ１から調製した。このプライマーはまた、Ｋpn Ｉ部位を含む。他のプライマー（配列番号：１８；ＪＬ−３６）はプロα２（Ｉ）Δ１のＣ−プロペプチドの最初の１８ヌクレオチドとハイブリダイズする。
２つのＰＣＲ産物を組み合わせて第３のＰＣＲ（重複拡張（overlap extension））をプライマー−ＪＬ３５（配列番号：１５）およびＪＬ−３１Ｋpn（配列番号：１７）を用いて行い、１．１kbの産物を産生する。これをＸho ＩおよびＫpn Ｉで開裂し、ついでＸho ＩおよびＫpn Ｉ開裂したプロα１（III）Δ１にサブクローニングしてプロα１（III）：（Ｉ）ＣＰを産生する。
プロα２（Ｉ）Δ１ Ｃ−プロペプチド配列の一部がプロα１（III）Ｃ−プロペプチドの対応領域で置換されたもので、多様なハイブリッド構築物を調製した。多様な領域をＡ、Ｆ、Ｂ、ＣおよびＧと称された結合点で図２において略述した。例えば、Ａ結合分子はプロ１α（III）鎖のＣ−プロペプチドからの対応領域由来であるもの部分（すなわちＥＩ…）のカルボキシ側のすべての配列を有して、Ａ部分まで、Ａ部分は含まないプロ２α（Ｉ）Δ１配列のすべてを含む。プロα１（III）およびプロα２（Ｉ）Ｃ−プロペプチドはシステイン残基の相補物（およびゆえにジスルフィド結合することができる能力）において、Ｃys２残基（図２）を欠如するプロα２（Ｉ）の代わりにセリン残基を有する点で異なっている。非還元条件下（以下参照）での分析を容易にするために、該Ｆ、ＢおよびＣ構築物はプロα２（Ｉ）鎖のＣys２部位にてシステイン変異の代わりにセリンを含む。この変異が鎖の選択に全く役割を果たさないことを確認するために、同様の変異構築物（プロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲS-C−はＢＧＲS-Cという；以下参照）を逆突然変異（back-mutated）した。逆突然変異した構築物（すなわちプロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲ−はまたＢＧＲという）はその親分子（プロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲS-C）として同様の鎖の選択性を有する（以下参照）。
Ａ結合、Ｆ結合およびＢ結合キメラは、無細胞系（図５、レーン７、８および９）において翻訳する場合、すべて集合してホモ三量体を形成する。しかしながら、Ｃ結合分子は集合せず（図５レーン１０）、そのことは集合のための認識部位はＢ部位のカルボキシ末端およびＣ部位のアミノ末端配列内にて含まれることを示唆している。Ｃ結合分子の集合の欠如は集合のための認識配列内にあるためであるという可能性は排除されなかった。認識部位が分裂させられた証拠は相互構築物が作成された場合に得られる。本構築物は、プロα２（Ｉ）Ｃ−プロペプチド由来であるＣ−プロペプチドの残りを有するＣ−部位までのプロα１（III）Δ１鎖を含む。この構築物（recip−Ｃ−結合）から全く集合が見られなかったことは認識部位が分解された（図５、レーン１１）ことを示す。
次の構築物はプロα１（III）のＣ−プロペプチドからの対応領域で置換されたＢ部位およびＧ部位（配列番号：６）間の短い２３アミノ酸は別として、すべてのプロα２（Ｉ）Δ１配列を含む。この構築物は（ＢＧＲ；配列番号：５と称す）該分子（すなわちシステインが配列番号：５の３３５番目の残基のセリンで置換されている）のプロα２（Ｉ）のＣys ２部位でのセリンの代わりのシステインを構築物の変異発生を指示した部位によって変化させられた。その結果得られた分子（プロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲS-Gと称す）無細胞系（図７、レーン４）において翻訳される場合には集合して分子内ジスルフィド結合したホモ三量体を形成し、そのことは短い一連の２３アミノ酸はホモ三量体を形成させることを示している。
セリンからシステインへの変異が鎖の選択に影響を及ぼさないことを確認するため、逆突然変異が行われ（すなわちプロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲを得る）、予期されたように、分子内ジスルフィド結合三量体は、本分子が分子内ジスルフィド結合形成に必要であるシステイン残基を含まないので検出されなかった。
キメラプロコラーゲンの翻訳後、安定した三重螺旋が形成されるか否かを決定するため、簡単なプロテアーゼ保護アッセイを行った。これにはタンパク質加水分解酵素（トリプシン、キモトリプシンおよびペプシン）の組合せで翻訳産物を処理することを含む。翻訳後に単離されたＳＰ−細胞を１％（v/v）Ｔriton Ｘ−１００中の０．５Ｍ酢酸に再懸濁し、２０℃で２時間ペプシン（１００mg／ml）とインキュベートする。１Ｍ Ｔris塩基で中和することによって消化を停止し、タンパク質を最終濃度２７％（v/v）でエタノール沈澱する。ペプシン消化物から沈澱したタンパク質を０．１５Ｍ ＮaＣl、１０mＭ ＥＤＴＡ（エチルジアミンテトラ酢酸および１％Ｔriton Ｘ−１００を含む５０mＭ Ｔris−ＨＣl（ｐＨ７．４）に再懸濁した。キモトリプシンおよびトリプシンをそれぞれ最終濃度２５０μg／mlおよび１００μg／mlにて添加し、ついでサンプルを室温で２分間インキュベートした。その消化を最終濃度５００μg／mlの濃度のダイズトリプシンインヒビターを、５倍量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ズデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）の沸騰したサンプルバッファーに添加し、該サンプルを３分間煮沸することによって停止する。その結果を図６および８に示す。
安定な三重螺旋の形成は、消化後のプロテアーゼ耐性断片（三重螺旋ドメインに対応する）の出現によって特徴付けられる。プロα２（Ｉ）：（III）ＣＰ（図６、レーン２）の翻訳産物およびＢＧＲ構築物（図６、レーン４；図８、レーン２および３）のみが翻訳の間（図６）、α，α'−ジピリジル（プロリル４−ヒドロキシラーゼ）のインヒビター）が存在しない場合にのみ形成されるプロテアーゼ耐性断片を製造する。プロリンヒドロキシル化は熱に安定である三重螺旋の形成に必要であるので、このことは正確に折り畳まれた三重螺旋がこれらの構築物で形成されることを示す。
このことはまた、ＢＧＲは分子内ジスルフィド結合によって安定化された三量体を形成することができなかったが、正確に並んだ三重螺旋を形成するため三量体化することができることを示している。
プロα１（III）およびプロα２（Ｉ）鎖（図３）からのＢ−Ｇモチーフの分析は、認識配列（図３；それぞれ配列番号：６および８）における残基のモチーフ、残基１３−２０はプロα１（III）中の残基１７−Ｌeu（Ｌ）およびプロα２（Ｉ）中のＭet（Ｍ）と同一であることを示した。鎖選択プロセスにおけるこれらの残基によって演じられた役割を決定するため、変異発生を指示した部位をプロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲS-G構築物（プロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲL-Mと称するかまたはＢＧＲL-Mともいう）中のプロα１（III）認識配列中の、ＬeuのかわりにＭetで置換して使用する、すなわち、配列番号：５のＬeu４２５残基でＭetを置換し、Ｓer ３３５でＣysを置換するために使用する。
プロα２（Ｉ）：（III）ＢＧＲL-Mの鎖の集合は上記のように行われ、鎖の電気泳動移動度を分析した。非還元条件下、この構築物は分子内ジスルフィド結合（図７、レーン６）を形成し、ついでプロテアーゼ耐性三重螺旋ドメイン（図８、レーン４）を形成した。ＭetのかわりのＬeuは見られず、それゆえ、鎖の選択を崩壊するか、または正確に並んだ螺旋の形成を妨害するわけではない。
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配  列  表
配列番号１
（i）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５３５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号１：
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配列番号２
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６２６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：２
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配列番号３
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６２３塩基対
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：３
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配列番号４
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５３７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：４
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配列番号５
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５３４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：５
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配列番号６
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述、配列番号：６
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配列番号７
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：７
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配列番号８
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：８
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配列番号９
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：９
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配列番号１０
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述、配列番号：１０
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配列番号１１
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：１１
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配列番号１２
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：１２
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配列番号１３
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：１３
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配列番号１４
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：未知
（xi）配列の記述：配列番号：１４
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配列番号１５
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記述：／desc＝”ＰＣＲプライマー配列”
（xi）配列の記述：配列番号：１５
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配列番号１６
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記述：／desc＝”ＰＣＲプライマー配列”
（xi）配列の記述：配列番号：１６
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配列番号１７
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記述：／desc＝”ＰＣＲプライマー配列”
（xi）配列の記述：配列番号：１７
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配列番号１８
（i）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記述：／desc＝”ＰＣＲプライマー配列”
（xi）配列の記述：配列番号１８：
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配列番号１９
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６０８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー；直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記述：配列番号：１９
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配列番号２０
（i）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１８８１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：未知
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記述：配列番号２０：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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