(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温殺菌すべき初期血漿１リットル当たり以下の濃度の添加剤：
− ８００〜１４００ｇのソルビトール、
− ４００〜６００ｇのサッカロース、
− ３〜５ｍＭのグルコン酸カルシウム、
− ８〜２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、
− １〜１０ｇのリジン、および
− １〜１０ｇのアルギニン
の混合物から構成されていることを特徴とする、低温殺菌中の血漿を安定化するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、低温殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｓａｔｉｏｎ）中の血液血漿を安定化するための組成物、上記組成物を用いた方法、並びに特に血漿充填処置（ｐｌａｓｍａ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）、または血液凝固因子置換処置（ｆｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｂｓｌｉｔｕｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）で用いることを意図した、上記で得られる血漿溶液に関する。
【０００２】
ヒト全血漿、またはクリオ蛋白質（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含まないヒト血漿が、未だ、ひどい火傷またはひどい損傷で苦しんでいる人、または主要な外科手術を受けた人を「充填処置（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）」するとき、即ち患者が重大な体液損失を経験した場合の全てで用いられている。
【０００３】
この種類の治療では、ウイルス病が移る危険性を排除するため先立って管理を受けさせた健康な被験者を用い、個々の供与者からの血漿が一般に用いられている。しかしながら、この処置では、前血清段階のウイルス、特に異なる肝炎およびエイズウイルスが混入する危険性の全てをなくさせることは不可能である。
【０００４】
従って、血漿が有する本質的な生物学的機能を維持させるウイルス不活性化方法および安定化組成物を継続して開発することは重要であると考えられる。
【０００５】
０．５Ｍのクエン酸ナトリウム存在下、６０℃で１０時間加熱することにより、Ｂ型肝炎ウイルス全体が不活性化される、ことが示された（Ｔａｂｏｒ他、ｔｈｒｏｍｏｂｏｓｉｓｉ  Ｒｅｓ．２２、１９８１、２３３−２３８頁）。しかしながら、この処理は、血漿中の特定蛋白質が有する生物学的活性の損失をもたらす（Ｔａｂｏｒ他およびＢａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ他、Ｆｒ．Ｊ．Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｙ  ５５、１９８３、３７−４６頁）。
【０００６】
血漿から精製した治療学的価値を有する異なる蛋白質に、種々の安定剤の存在下６０℃で１０時間、通常の低温殺菌を受けさせることが可能である、ことが確認された。しかしながら、１つの生物学的活性を安定化する組成物は、別の活性に対して全く効果を示さない可能性がある、ことを特記する。
【０００７】
このような異なる種類の実験データから、全血漿（新鮮な血漿または凍結した新鮮な血漿）、またはクリオ蛋白質が入っていない血漿の、ウイルス不活性化は、低温殺菌を用いたのでは達成できない、との印象が得られた。
【０００８】
しかしながら、全血漿に関する医学的必要条件が存在しているため、本出願者は、これと同時に、血漿の中に含まれている治療学的価値を有する因子全てに対して、低温殺菌過程中の変性から生物学的活性を保護することを保証する組成物を開発することを探求してきた。
【０００９】
従って、フランス特許出願第 ９０ ０８３７５号で、本出願人は、ソルビトール、ヘパリン、リジンおよびＣａＣｌ2の混合物が、低温殺菌過程中の血漿因子が有する生物学的活性を有効に安定化する、ことを示した。
【００１０】
しかしながら、このような安定化混合物の中に、従って最終調合物の中にヘパリンが存在しているため、ヘパリン治療を既に受けた患者にこのような血漿を注入することは不可能である。
【００１１】
このことが、同じ安定化機能を示す別の組成物を本出願人が探求した原因となっている。
【００１２】
ソルビトールは熱変性に対してある程度の保護を与えるが、この結果は、血漿サンプルの間で変化しそしてその効率も低いことを以前に観察したため、本出願人は、ソルビトールと一緒に混合することによりそれが有する安定化力を上昇させ得る異なる添加剤を探求し、そして特に、ソルビトール量の約５０％から成る量のサッカロースを加えることで良好な結果が得られた。
【００１３】
他方、加熱が長引いた場合ＣａＣｌ2が不安定になることが観察されたため、低温殺菌条件に良好な抵抗力を示すグルコン酸カルシウムをこれの代わりに用いた。
【００１４】
更に、クエン酸三ナトリウムを加えると、この濃度を注意深く調節することを条件として、上記混合物が示す保護効果が増強されたが、但し、用量が少なすぎると血漿の自然発生的凝固を生じさせる一方、用量が多すぎると、血漿をその後治療学的目的で用いるとき凝固因子の活性が低下する。
【００１５】
最後に、少なくとも２種のアミノ酸、好適にはリジンとアルギニンをこの混合物に添加する。
【００１６】
本発明に従う安定化組成物は、従って、ソルビトール、サッカロース、グルコン酸カルシウム、クエン酸三ナトリウム、リジンおよびアルギニンの混合物で構成される。低温殺菌すべき初期血漿１リットル当たり下記の濃度の異なる添加剤を用いる：
―  ８００から１，４００ｇ、好適には１，３００ｇのソルビトール
―  ４００から６００ｇ、好適には５１４ｇのサッカロース
―  ３から５ｍＭ、好適には４ｍＭのグルコン酸カルシウム
―  ８から２５ｍＭ、好適には１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム
―  １から１０ｇ、好適には５ｇのリジン
―  １から１０ｇ、好適には５ｇのアルギニン。
【００１７】
本発明に従う組成物を、新鮮な血漿、または凍結して解凍した新鮮な血漿、または寒冷沈降の蛋白質が入っていない血漿、に加えた後、上記血漿に、液状状態で１０時間６０℃±１℃に加熱することによる低温殺菌を受けさせる。
【００１８】
低温殺菌後、この温度を徐々に下げて２０℃にし、そしてこの溶液に対して透析を行うことで、該ソルビトールとサッカロースを除去する。この透析用緩衝液のｐＨは７．５であり、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、４ｍＭのグルコン酸カルシウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｇ／Ｌの濃度のリジン、および３ｇ／Ｌの濃度のアルギニンを含んでいる。異なる組成を有する透析用緩衝液もまた要求に従って使用され得る。次に、この溶液を濃縮して、血漿蛋白質の生理学的量を回復させる。この得られる溶液に対して、浄化濾過に続く滅菌濾過を行った後、分割して、深凍結するか或は凍結乾燥する。
【００１９】
本発明はまた、それを加熱するに先立って、本発明に従う組成物を血漿に添加した後、上で定義した緩衝液に対して低温殺菌血漿の透析を行うことを含む、血漿の低温殺菌方法にも関する。
【００２０】
この方法は、個々の収集物のいくつかから得られる大バッチの血漿に適用可能なため特に有利であり、そして１リットルから数百リットルの範囲で適用可能である。適当な管理を行った後の、６０リットルもしくはそれ以上の位のバッチを用いた低温殺菌で、一定の生化学品質を有する製品が保証され得る。
【００２１】
本発明はまた、本発明に従う方法で得られる低温殺菌血漿溶液に関するものであり、上記溶液には、全血漿、または特定の蛋白質（例えば寒冷沈降の蛋白質）が入っていない血漿が含まれ、そしてこれらは、全血漿を置き換えるためか、或は特定の血液因子の不足を補うための、治療学的用途を意図したものである。
【００２２】
本発明に従う組成物および方法はまた、動物を起源とする血漿にも適用され得る。これらは有意に、例えば、より詳細には治療用製品を製造することを意図した細胞培養物のための添加剤として用いられているウシ胎児血清に適用され得る。
【００２３】
以下に示す実施例は本発明の具体例の１つの形を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２４】
【実施例】
穏やかに撹拌しながら、解凍した血漿６０リットルに下記の混合物を加える：
【００２５】
【表１】
0004010573.tif 000002
【００２６】
６０℃で１０時間加熱することにより、熱調節されているタンクの中で低温殺菌を行う。
【００２７】
低温殺菌後、この温度を徐々に下げて２０℃にし、そして次に、この溶液に対して透析を行うことにより、該ソルビトールとサッカロースを除去する。
【００２８】
例えば、カセットを基とする限外濾過システム（Pellicon(R)）を用いた透析を行う．
この透析用緩衝液の組成は下記の通りである：
―  クエン酸三ナトリウム          １０ｍＭ
―  リジン                        １０ｇ／Ｌ
―  アルギニン                      ３ｇ／Ｌ
―  グルコン酸カルシウム            ４ｍＭ
―  塩化ナトリウム                  ０．１Ｍ。
【００２９】
最終生成物に対して、比色分析でソルビトールの除去を検査し、そして酵素分析でサッカロースの除去を検査する。
【００３０】
透析の後、適宜、同じ装置を用いた濃縮を行うことにより、凝固因子を回復させて、良好な品質の治療学的血漿中と同じ約１Ｕ／ｍＬにしてもよい。この生成物に対して、３７０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧および７から７．５のｐＨで透析を行う。
【００３１】
次に、例えば０．２２μｍの孔を有するＭｉｌｌｉｐａｃｋ(R)４０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ(R)）を用いた濾過により、この生成物を滅菌する。次に、この生成物を深凍結もしくは凍結乾燥する目的で、これを分割してプラスチック製バッグまたはボトルに入れる。
【００３２】
「生物学製品の消去およびウイルス不活性化の方法を批准するヨーロッパオーソリティーのバイオテクノロジー／ファーマコロジーにおける熟練者群」（ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｏｆ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が推奨するウイルス分類に関して、ウイルスの不活性化に関する低温殺菌の効果を評価した。その結果を以下の表に示す：
【００３３】
【表２】
0004010573.tif 000003
Ｅ＝エンベロープ有り
ＮＥ＝エンベロープ無し
６個の連続パイロットバッチに対して行った品質コントロールの結果を以下の表に示す。
【００３４】
【表３】
0004010573.tif 000004
【００３５】
【表４】
0004010573.tif 000005
【００３６】
【表５】
表ＩＶ．  動物に対するインビボ品質コントロール
ラットに対する試験
0004010573.tif 000006
上で定義した安定化組成物の存在下で低温殺菌した血漿は、治療学用途で決められている基準に従うものである。
【００３７】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００３８】
１．  ソルビトール、サッカロース、グルコン酸カルシウム、クエン酸三ナトリウム、リジンおよびアルギニンの混合物で構成されていることを特徴とする低温殺菌中の血漿を安定化するための組成物。
【００３９】
２．  該ソルビトール濃度が、初期血漿１リットル当たり８００〜１，４００ｇであることを特徴とする第１項記載の組成物。
【００４０】
３．  該ソルビトール濃度が１，３００ｇ／Ｌであることを特徴とする第２項記載の組成物。
【００４１】
４．  該サッカロース濃度が４００〜６００ｇ／Ｌであることを特徴とする第１〜３項いずれか１項記載の組成物。
【００４２】
５．  該サッカロース濃度が５１４ｇ／Ｌであることを特徴とする第４項記載の組成物。
【００４３】
６．  該グルコン酸カルシウム濃度が３〜５ｍＭであることを特徴とする第１〜５項いずれか１項記載の組成物。
【００４４】
７．  該グルコン酸カルシウム濃度が４ｍＭであることを特徴とする第６記載の組成物。
【００４５】
８．  該クエン酸三ナトリウム濃度が８〜２５ｍＭであることを特徴とする第１〜７項いずれか１項記載の組成物。
【００４６】
９．  該クエン酸三ナトリウム濃度が１５ｍＭであることを特徴とする第８項記載の組成物。
【００４７】
１０．  該リジンおよびアルギニン濃度が１〜１０ｇ／Ｌであることを特徴とする第１〜９項いずれか１項記載の組成物。
【００４８】
１１．  該リジンおよびアルギニン濃度が５ｇ／Ｌであることを特徴とする第１０項記載の組成物。
【００４９】
１２．  加熱段階に先立って第１〜１１項いずれか１項記載の組成物を血漿に添加し、そして次に、加熱段階の後、クエン酸三ナトリウム、グルコン酸カルシウム、塩化ナトリウム、リジンおよびアルギニンを含有する緩衝液に対して透析を行うことにより上記組成物から糖類を除去することを含むことを特徴とする血漿の低温殺菌方法。
【００５０】
１３．  該透析用緩衝液が、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、４ｍＭのグルコン酸カルシウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｇ／Ｌのリジンおよび３ｇ／Ｌのアルギニンを含むことを特徴とする第１２項記載の方法。
【００５１】
１４．  １リットル〜数百リットルの体積を有する血漿に適用可能であることを特徴とする第１２または１３項記載の方法。
【００５２】
１５．  第１２〜１４項いずれか１項記載の方法を用いて低温殺菌したものであることを特徴とする治療学的用途のための全血漿。
【００５３】
１６．  第１２〜１４項いずれか１項記載の方法を用いて低温殺菌したものであることを特徴とする治療学的用途のための寒冷沈降させた血漿上澄み液。
【００５４】
１７．  第１２〜１４項いずれか１項記載の方法を用いて低温殺菌したものであることを特徴とする動物由来の血漿もしくは血清。