(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のNAIPポリペプチドをコードする、実質的に純粋な核酸。
（ａ）配列番号：２２または２４に記載のNAIPポリペプチド
（ｂ）配列番号：２２または２４に記載のポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を有し、神経アポトーシス抑制活性を有するNAIPポリペプチド
【請求項２】
核酸が哺乳動物由来である、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項2記載の核酸。
【請求項４】
核酸がゲノムDNAまたはcDNAである、請求項1記載の核酸。
【請求項５】
配列番号：２１に記載の配列を含む実質的に純粋なDNA、または配列番号：２２に記載の神経アポトーシス抑制活性を有するNAIPポリペプチドをコードする、その縮重変異体。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の実質的に純粋なDNA。
（ａ）配列番号：２１に記載のDNA
（ｂ）配列番号：２１に記載のDNAと少なくとも90％の配列同一性を有し、神経アポトーシス抑制活性を有するNAIPポリペプチドをコードするDNA
（ｃ）配列番号：２１に記載のDNAに厳密度の高い条件下でハイブリダイズするDNAであって、神経アポトーシス抑制活性を有するNAIPポリペプチドをコードするDNA
【請求項７】
DNAがポリペプチドの発現のための調節配列と機能的に結合しており、該調節配列にプロモーターが含まれる、請求項1記載のDNA。
【請求項８】
プロモーターが構成的プロモーターであるか、一つもしくはそれ以上の外来因子によって誘導可能であるか、または細胞型特異的である、請求項7記載のDNA。
【請求項９】
配列番号：２２に記載のポリペプチドの１２８４位から１４０３位のアミノ酸をコードする核酸の欠失を含む、請求項1記載の核酸。
【請求項１０】
ベクター含有細胞において核酸にコードされたペプチドの発現を指向する能力を有する、請求項1記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項1記載のDNAを含む細胞。
【請求項１２】
細胞が、細胞死の過剰または不足に起因する疾患を有する患者の体内に存在している、請求項11記載の細胞。
【請求項１３】
細胞が、線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、昆虫細胞、胚幹細胞、心筋細胞、およびリンパ球からなる群より選択される、請求項11記載の細胞。
【請求項１４】
細胞内部で発現する請求項1記載のDNAを含む遺伝子導入細胞。
【請求項１５】
その内部でDNAが発現する、請求項11記載の細胞から作製されたトランスジェニック動物。
【請求項１６】
神経アポトーシス抑制活性を有する、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の実質的に純粋な哺乳動物NAIPポリペプチド。
（ａ）配列番号：２２または２４に記載のポリペプチド
（ｂ）配列番号：２２または２４に記載のポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号：２１または２３に記載のDNAによりコードされるポリペプチド
（ｄ）配列番号：２１または２３に記載のDNAと少なくとも90％の配列同一性を有するDNAによりコードされるポリペプチド
（ｅ）配列番号：２１または２３に記載のDNAに厳密度の高い条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド
【請求項１７】
NAIPポリペプチドの3つのBIRドメインを含み、配列番号：２２に記載のポリペプチドの１２８４位から１４０３位のアミノ酸を欠失している、請求項16記載のNAIPポリペプチドの断片。
【請求項１８】
請求項1記載の核酸にコードされる、請求項16記載のポリペプチド。
【請求項１９】
哺乳動物のポリペプチドである、請求項16記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ヒトのポリペプチドである、請求項16記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項16記載のNAIPポリペプチドを活性成分として含み、該活性成分が生理学的に許容される担体中に製剤化された治療的組成物。
【請求項２２】
活性成分が請求項1記載の核酸にコードされたNAIPポリペプチドである、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
請求項1記載の核酸または18ヌクレオチド長以上のその一部と動物細胞からのゲノムDNA調製物との接触を含み、配列番号：２１に記載の配列とのヌクレオチド配列の同一性が90％またはそれ以上であるDNA配列の検出を提供する、動物細胞におけるNAIP遺伝子の検出方法。
【請求項２４】
検出の目的が、アポトーシスのレベルの変調が関与する疾患の診断である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
請求項16記載のNAIPポリペプチドを得るための、以下を含む方法：
（a）細胞内の発現する位置に置かれた請求項16記載のNAIPポリペプチドをコードするDNAを有する細胞の提供、
（b）該DNAが発現するための条件下における該細胞の培養、および
（c）該NAIPポリペプチドの単離。
【請求項２７】
DNAが、一つまたはそれ以上の外来因子によって誘導可能なプロモーターをさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子または請求項3に記載の核酸と同一な配列を有するその一部を単離するための方法であって、オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRによる該NAIP遺伝子またはその一部の増幅を含み、該プライマーが、
（a）それぞれ13ヌクレオチドを超える長さであり、
（b）それぞれ配列番号：２１に記載のヌクレオチド配列のある領域の逆DNA鎖と相補的な領域を有し、および
（c）増幅産物中に制限酵素切断部位を作成する能力、および該NAIP遺伝子またはその一部を単離する能力を有する配列を任意に含む、方法。
【請求項２９】
以下を含む、細胞から請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子またはその断片を単離する方法：
（a）細胞DNAの試料の提供、
（b）請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子の保存領域と相同な配列を有する一対のオリゴヌクレオチドの提供、
（c）ポリメラーゼ連鎖反応を介するDNA増幅に適した条件下における、一対の該オリゴヌクレオチドと該細胞DNA試料との混合、および
（d）NAIP増幅遺伝子またはその断片の単離。
【請求項３０】
増幅が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応がRACEである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
以下を含む、哺乳動物細胞におけるNAIP遺伝子を同定する方法：
（a）哺乳動物細胞DNAの調製物の提供、
（b）請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能に標識されたDNA配列の提供、
（c）ヌクレオチド配列の同一性が90％またはそれ以上である遺伝子の検出を提供するハイブリダイゼーション条件下における、該細胞DNA調製物と、検出可能に標識された該DNA配列との接触。
【請求項３３】
DNA配列が、NAIPのエクソン14aまたはエクソン17の少なくとも一部を含む、請求項28、29または32記載の方法。
【請求項３４】
以下を含む、NAIP遺伝子を同定する方法：
（a）哺乳動物細胞試料の提供、
（b）形質転換による、NAIP候補遺伝子の該細胞試料への導入、
（c）該細胞試料における該NAIP候補遺伝子の発現、および
（d）アポトーシスレベルの変化により請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子が同定される状況における、該試料が変化したレベルのアポトーシスを示すか否かについての判定。
【請求項３５】
細胞試料が、リンパ球、線維芽細胞、昆虫細胞、グリア細胞、心筋細胞、胚幹細胞、およびニューロンからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項16記載のNAIPポリペプチドと特異的に結合する精製された抗体。
【請求項３７】
以下を含む、アポトーシスを調節する化合物を同定する方法：
（a）請求項16記載のNAIPポリペプチドを発現している細胞の提供、ならびに
（b）該ポリペプチドをコードするNAIP遺伝子の発現レベルの変化からアポトーシスを調節する化合物の存在が示されるような、該細胞と候補化合物との接触およびNAIP遺伝子の発現のモニター。
【請求項３８】
NAIP遺伝子がヒトNAIP遺伝子である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
細胞が心筋細胞として現れる、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物について、アポトーシスの変調が関与する疾患を有するか否かまたはアポトーシスの変調が関与する疾患を発症する可能性が高いか否かを検出する方法であって、該方法が、該哺乳動物からの核酸試料の単離および該核酸が請求項1記載の核酸の変異を含むか否かの判定を含み、該変異の存在から、該哺乳動物がアポトーシス性疾患に罹患していることまたはアポトーシスが関与する疾患を発症する可能性が高いことが示される方法。
【請求項４１】
哺乳動物について、アポトーシスの変調が関与する疾患を有するか否かまたはアポトーシスの変調が関与する疾患を発症する可能性が高いか否かを検出する方法であって、哺乳動物由来の試料中の請求項1記載の核酸を含むNAIP遺伝子発現を測定することを含み、罹患していない哺乳動物由来の試料との比較による該発現の変化から、該哺乳動物がアポトーシス性疾患に罹患していることまたはアポトーシス性疾患を発症する可能性が高いことが示される方法。
【請求項４２】
NAIP遺伝子がヒトNAIP遺伝子である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子発現が、試料中の請求項16記載のNAIPポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
NAIPポリペプチドが、免疫学的方法または試料中の請求項1記載のNAIP RNAの量を解析することによって測定される、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
請求項16記載のNAIPポリペプチドと特異的に結合する実質的に純粋な抗体を含む、哺乳動物について、アポトーシスの変調が関与する疾患を有するか否かまたはアポトーシスの変調が関与する疾患を発症する可能性が高いか否かを診断するためのキット。
【請求項４６】
抗体のNAIPポリペプチドとの結合を検出するための手段をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
アポトーシスの調節に用いるための請求項1記載の核酸。
【請求項４８】
アポトーシスの調節に用いるための請求項16記載のNAIPポリペプチド。
【請求項４９】
アポトーシスを調節するための医薬品の製造を目的とする請求項16記載のNAIPポリペプチドの使用。
【請求項５０】
アポトーシスを調節するための医薬品の製造を目的とする請求項1記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般的に、アポトーシスにおけるNAIP抑制性蛋白質の機能に関し、特に、NAIPの特徴づけ、NAIPを調節する化合物の同定、ならびにNAIPレベルの変化によって影響を受ける疾患の診断および治療のためのNAIPの抗体、蛋白質、および核酸に関する。
発明の背景
アポトーシスは、プログラム細胞死の形態学的に明確な形の一つであり、多細胞生物の正常発生および維持に重要な役割を果たしている。アポトーシスの調節不全は、癌の発生時、または脊髄筋萎縮症（spinal muscular atrophy：SMA）などの後天性免疫不全および一部の神経変性疾患において起こると考えられている細胞死の程度の制御に障害が生じた時に起こるように、細胞死が不適切に抑制された形をとることがある。
小児期の脊髄性筋萎縮症は、脊髄運動ニューロンの進行性減耗を特徴とする神経変性疾患であり、常染色体劣性疾患の中で最も多いものの一つである（ダボウィッツ（Dubowitz）, V. 1978, Brooke, M.A. 1986）。Ｉ型SMAは幼児期の遺伝的死因の中で最も頻度が高い。SMAにおける運動ニューロンの損失から、この疾患の根底には、運動ニューロンで通常発生するアポトーシスに不適切な持続または再活性化が生じていることが示唆される（サルナット（Sarnat）, H.B. 1992）。SMA関連遺伝子であるNAIPは、ヒト染色体5q13.1に遺伝子座があることが判明している。
バキュロウイルスの中には、ウイルスが昆虫細胞に感染した時に通常なら起こるアポトーシスを抑制するために、アポトーシス蛋白質抑制因子（IAP）と呼ばれる蛋白質をコードしているものがある。これらの蛋白質は、ウイルスのその他の蛋白質とは独立した様式で作用すると考えられている。バキュロウイルスのIAP遺伝子は、DNA結合に関与するリングジンクフィンガー様部分（RZF）およびBIRドメイン（バキュロウイルス反復）と呼ばれる70アミノ酸反復モチーフを含む2つのN末端ドメインをコードする配列を含む。
発明の概要
本発明者らは、アポトーシスが関与する疾患の検出および治療のための、NAIPの蛋白質、核酸、および抗体の使用法を見いだした。さらに、本発明者らは、増強された抗アポトーシス活性を有する新規なNAIP配列およびNAIP断片をも発見した。
本発明は一般的に、哺乳動物のNAIPポリペプチドをコードするか、またはそれに対応する、ゲノム、cDNA、アンチセンスDNA、RNA、もしくは合成核酸分子などの実質的に純粋な核酸分子を特徴とする。この核酸はベクターに組み込まれたものでもよい。このようなベクターは、哺乳動物、酵母、線虫、または細菌細胞などの細胞内にあってもよい。また、この核酸はトランスジェニック動物またはその胚に組み込まれたものでもよい。好ましい態様において、この核酸分子はヒトNAIP核酸である。最も好ましい態様において、このNAIP遺伝子はヒトNAIP遺伝子である。その他の種々の好ましい態様において、この細胞は形質転換細胞である。
一つの好ましい態様において、核酸配列にはエクソン14aおよび17をコードするcDNA配列が含まれる。さらに好ましい態様において、この配列にはNAIP遺伝子の完全な5'および3'非翻訳領域も含まれ、それを配列番号：2、21、または23として示しているが、最も好ましくは配列番号：21に示したものである。その他の好ましい態様において、核酸は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、アンチセンスDNA、または本発明のcDNA配列に対応する配列番号：2、21もしくは23のcDNA配列と実質的に同一なその他のDNAを含む、精製されたヌクレオチド配列である。最も好ましくは、エクソン1〜14および14a〜17は、配列番号：21に記載したものである。
特殊な態様において、本発明は、図21に示した配列またはその断片と実質的に同一な核酸配列を特徴とする。もう一つの面において、本発明は、本明細書に記載したDNAによってコードされるRNAも特徴とする。好ましくは、このRNAはmRNAである。もう一つの態様において、このRNAは、NAIPのコード鎖と相補的なアンチセンスRNAである。
本発明の第2の面において、NAIPをコードする核酸は、本明細書に提供するNAIP配列の少なくとも3つのBIRドメイン（例えば、図6に提供したNAIP配列の第1〜1360位のヌクレオチド）を含むが、NAIPポリペプチドのカルボキシ末端領域をコードする配列の少なくとも一部を欠失している。好ましくは、NAIP遺伝子のうち、図6に示した配列番号：21のNAIP配列の第1360位（すなわち、BIRドメインの終端）から第4607位（すなわち、コード配列の終端）の核酸の間の領域から少なくとも30ヌクレオチドが欠失している。さらに好ましくは、少なくとも100ヌクレオチドが欠失し、より好ましくは、少なくとも1000ヌクレオチドが欠失している。最も好ましい態様において、最大3247個までのヌクレオチドが欠失している。好ましくは、この欠失により、本明細書に提供する解析法の一つに関して、コードされた蛋白質の抗アポトーシス活性に統計的に有意な増加が引き起こされる。
第3の面において、本発明は、アポトーシスを起こすことが可能な細胞において、NAIP遺伝子もしくはその断片の発現または発現の活性化が可能なプロモーターを含む、実質的に純粋なDNAを特徴とする。この面の好ましい態様において、上記の通り、NAIP遺伝子はヒトNAIPまたはその断片である。本発明のこの面のさらに好ましい態様において、このプロモーターはNAIP遺伝子に対する本来のプロモーターである。さらに、好ましくは、転写および翻訳調節領域は、NAIP遺伝子に対する本来の領域である。
もう一つの面において、本発明により、本発明のNAIP核酸を含む遺伝子導入細胞系が提供される。本発明のトランスジェニック細胞は、好ましくは、アポトーシス性反応において変化を生じる細胞である。好ましい態様において、この遺伝子導入哺乳動物細胞は、線維芽細胞、神経細胞、肺細胞、腎細胞、リンパ球、グリア細胞、心筋細胞、胚幹細胞、または昆虫細胞である。最も好ましくは、神経細胞は運動ニューロンであり、リンパ球はCD4+T細胞である。
関連するもう一つの面において、本発明は、NAIPポリペプチドまたはアンチセンス核酸をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入細胞の作製を含む、アポトーシスのレベルを変化させる方法を特徴とする。この導入遺伝子は、発現が可能な方法で細胞のゲノムに組み込まれる。さらに、細胞における発現のレベルは、アポトーシスのレベルを変化させるのに十分なレベルである。好ましい態様において、この導入遺伝子は運動ニューロンまたは心筋細胞内にある。
関連するさらにもう一つの面において、本発明は、上記の通りにゲノムに挿入されたNAIP遺伝子（変異型または野生型）もしくはゲノム内のノックアウトされたNAIP遺伝子またはその両方を有するトランスジェニック動物を特徴とし、これは好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは齧歯類、最も好ましくはマウスである。NAIPアンチセンス核酸を発現するトランスジェニック動物もこれに含まれる。このトランスジェニック動物が発現するNAIPポリペプチドの量は、用いる構築物またはゲノム変化の性質に応じて、増加しても減少してもよい。例えば、NAIP遺伝子内にノックアウト変異を作成するために、NAIPの全体または一部をコードする核酸分子を使用することにより、対応するNAIPポリペプチドの全体または一部のいずれかの発現が低下した動物を作製することができる。これに対して、好ましくは活性調節要素およびプロモーター要素の制御下において、NAIP遺伝子の全体または一部の外来コピーをゲノムに挿入することにより、対応するNAIPポリペプチドの発現が増強される。
もう一つの面において、本発明は、細胞からのゲノムDNA試料を用いて、NAIP遺伝子またはその一部（これは9ヌクレオチドより長く、好ましくは18ヌクレオチドより長い）を検出することによって、細胞内のNAIP遺伝子を検出する方法を特徴とする。NAIP遺伝子およびゲノムDNAを、NAIPポリペプチドをコードするDNAとの同一性が少なくとも50％である細胞内の核酸配列とのハイブリダイゼーションが（従って検出が）可能な条件下において、互いに接触させる。好ましくは、使用する核酸には、少なくとも、図6および7に提供したエクソン14aまたはエクソン17の一部が含まれる。
もう一つの面において、本発明は、NAIPポリペプチドをインビトロおよびインビボで産生する方法を特徴とする。一つの態様において、この方法は、NAIPポリペプチド（これは細胞内において発現する位置に置かれている）の全体または一部をコードする核酸を有する細胞の提供、核酸の発現が可能な条件下における細胞の培養、およびNAIPポリペプチドの単離を含む。好ましい態様において、NAIPポリペプチドは、構成的または誘導的なプロモーターの制御下にあるDNAによって発現される。本明細書で説明する通り、プロモーターは本来のプロモーターでも異種のプロモーターでもよい。好ましい態様において、この核酸にはエクソン14aまたはエクソン17が含まれる。最も好ましくは、この核酸は図6または図7に示した核酸のいずれかである。最も好ましくは、これは図6の配列である。
もう一つの面において、本発明は、実質的に純粋な哺乳動物NAIPポリペプチドを特徴とする。好ましくは、このポリペプチドは、図6または7に示したアミノ酸配列のいずれか一方と実質的に同一なアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、このポリペプチドは図6のヒトNAIPポリペプチドである。また、本明細書に提供する、少なくとも2つのBIRドメインを含む断片も本発明の一部である。好ましくは、この断片は、少なくとも3つのBIRドメインを含む。例えば、1360位の核酸と遺伝子の終端との間に欠失がある上記の核酸によってコードされるポリペプチドも、本発明の一部である。一つの態様において、このNAIP断片は、配列番号：22または24のうち少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むNAIP断片を含む。最も好ましくは、この断片は、少なくとも、エクソン14aまたはエクソン17の一部を含む。
別の面において、本発明は、アポトーシスを調節する能力を有するNAIPに由来する、組換え哺乳動物ポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、本明細書で定義する通り、少なくとも2つのBIRドメインを含むことができ、好ましくは3つのBIRドメインを含む。好ましい態様において、このNAIPアミノ酸配列は、保存的置換がある点のみが図6または7のNAIP配列と異なるか、BIRドメインのカルボキシ末端領域のアミノ酸に欠失がある点のみが配列番号：1、2、21または23の核酸によってコードされる配列と異なる。その他の好ましい態様において、この組換え蛋白質は、対照との比較により、アポトーシスを少なくとも5％、好ましくは25％低下させる。
もう一つの面において、本発明は、哺乳動物のアポトーシスを抑制する方法を特徴とし、この方法には以下が含まれる：アポトーシスを起こすことが可能な細胞へのNAIPポリペプチドをコードする核酸の提供、ここで核酸は細胞内で発現する位置に置かれ、NAIP遺伝子はその遺伝子の発現の調節に適した調節配列の制御下にあり、NAIP導入遺伝子の発現のレベルは、NAIP導入遺伝子を持たない細胞と比べてアポトーシスを抑制するために十分である。この核酸は、NAIPの全体または一部をコードしてもよい。これは、例えば、2つまたは3つのBIRドメインをコードしてもよいが、カルボキシ末端のアミノ酸に欠失を有する。好ましくは、この核酸は、エクソン14a、エクソン17、またはその両方をコードする配列を含む。
関連する面において、本発明は、NAIP遺伝子またはその一部を含む導入遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞を作製することによってアポトーシスを抑制する方法を特徴とする。このNAIP遺伝子は、NAIP遺伝子の構成的発現を起こすプロモーターの制御下に置かれていてもよい。また、NAIP導入遺伝子は、その遺伝子の発現が環境刺激によって調節されるようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、NAIP遺伝子は、組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーター、または化学的信号もしくは薬物などの外来性の信号もしくは薬物の導入によって活性化されるプロモーターを用いて発現させてもよい。好ましい態様において、哺乳動物細胞はリンパ球、神経細胞、グリア細胞、または線維芽細胞である。その他の態様において、この細胞は、HIVが感染したヒト、または神経変性疾患、虚血性障害、毒素性肝疾患、もしくは脊髄形成異常症候群に罹患した動物の細胞である。
関連する面において、本発明は、アポトーシス抑制量のNAIPポリペプチドを提供することによって哺乳動物のアポトーシスを抑制する方法を提供する。このNAIPポリペプチドは、全長のポリペプチドでも、本明細書に説明したその断片の一つでもよい。
もう一つの面において、本発明は、NAIP蛋白質と特異的に結合する精製された抗体を特徴とする。このような抗体は、NAIPポリペプチドの検出、定量化、および精製のためのあらゆる標準的な免疫検出法に用いることができる。好ましくは、この抗体はNAIPと特異的に結合する。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、診断または治療の目的のために改変されたものでもよい。最も好ましい抗体は、配列番号：22および／または24のNAIPポリペプチド配列と結合するが、PCT/CA95/00581に開示したNAIPポリペプチド配列とは結合しない。
本発明の抗体は種々の方法によって作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体を誘導するために、動物にNAIPポリペプチド、またはその抗原性断片を投与することもできる。また、本明細書の記載に従って用いる抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて作製したモノクローナル抗体でもよい（例えば、コーラー（Kohler）ら、Nature 256:495, 1975;コーラー（Kohler）ら、Eur. J. Immunol. 6:511, 1976;コーラー（Kohler）ら、Eur. J. Immunol. 6:292, 1976;ハンマーリング（Hammerling）ら、「モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas）」, Elsevier, NY, 1981を参照）。本発明は、ヒトまたはネズミのNAIPポリペプチド、またはその断片と特異的に結合する抗体を特徴とする。特に、本発明は「中和」抗体を特徴とする。「中和」抗体とは、NAIPポリペプチドのあらゆる生物活性、特にNAIPがアポトーシスを抑制する能力を妨げる抗体を意味する。この中和抗体は、NAIPポリペプチドのアポトーシス抑制能を、好ましくは50％、さらに好ましくは70％、最も好ましくは90％またはそれ以上低下させることができる。中和抗体の可能性があるものを評価するには、本明細書に記載したものを含め、アポトーシスに関するあらゆる標準的アッセイ法を用いることができる。
本発明は、操作を加えていないモノクローナルまたはポリクローナルの抗NAIP抗体のほかに、種々の遺伝的操作を加えた抗体、ヒト化抗体、ならびにF（ab'）2、Fab'、Fab、FvおよびsFv断片を含む抗体断片を特徴とする。抗体は、当業者に周知の方法によってヒト化することができ、例えば、望ましい結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化することもできる（スコットジーン（Scotgene）, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, CA）。トランスジェニック動物が発現するような、完全なヒト抗体も本発明の特徴である（グリーン（Gleen）ら、Nature Genetics 7:13〜21, 1994）。
ラドナー（Ladner）により、単一ポリペプチド鎖抗体を作製する方法が記載されている（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）。ワード（Ward）らは、高い抗原結合親和性を持ち、自ら「単一領域抗体」と命名した、重鎖可変領域の作製について記載している（Nature 341:544〜546, 1989）。マッカファーティ（McCafferty）らは、fdバクテリオファージの表面に完全な抗体V領域を提示することができ、このファージが抗原と特異的に結合し、ファージのごく一部（100万個中の1個）をアフィニティクロマトグラフィーによって単離することができることを示した（Nature 348:552〜554, 1990）。ボス（Boss）らは、単一の宿主細胞において、免疫グロブリン、ならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含んでおり免疫的な機能を有するその断片を産生させるための種々の方法について記載している（米国特許第4,816,397号）。カビリー（Cabilly）らは、キメラ型抗体を作製するための方法を記載している（米国特許第4,816,567号）。
もう一つの面において、本発明は、アポトーシスを調節する化合物を同定する方法を特徴とする。この方法は、NAIPポリペプチドを発現する能力を有する細胞の提供、その細胞と候補化合物との接触、およびNAIP遺伝子またはNAIP遺伝子調節配列と結合したレポーター遺伝子の発現のモニター、またはNAIPの生物活性のモニターを含む。NAIP遺伝子の発現レベルに変化が生じていれば、アポトーシスを調節する化合物が存在することを意味する。種々の好ましい態様において、この哺乳動物細胞は、心筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、リンパ球（T細胞またはB細胞）、または昆虫細胞である。
関連する面において、本発明は、相互作用トラップ（interaction trap）技術およびおとり（bait）としてNAIPポリペプチドまたはその断片を用いて、アポトーシスを調節する化合物を検出する方法を特徴とする。好ましい態様において、アポトーシスの調節因子として検討される化合物はポリペプチドである。
関連する面において、本発明は、i)候補となるNAIPが発現するための発現ベクターの提供、ii)前記の発現ベクターによる哺乳動物細胞へのトランスフェクション、iii)形質転換細胞にアポトーシスを起こさせるための誘導、およびiv)この細胞と適当な対照哺乳動物細胞との生存率の比較を含む、候補NAIPの抗アポトーシス作用を分析するための方法を特徴とする。
さらにもう一つの面において、本発明は、i)組織または細胞試料の提供、ii)抗NAIPポリクローナルまたはモノクローナル抗体と前記の試料とのインキュベーション、およびiii)NAIPの分布の画像化を含む、組織中におけるNAIPの発現を検出するための方法を特徴とする。
もう一つの面において、本発明は、NAIP核酸プローブまたはNAIP抗体を用いて、細胞増殖性疾患の有無、またはそのような疾患の易発症性を診断するための方法を特徴とする。好ましくは、この疾患は中枢神経系の癌である。最も好ましくは、この疾患は、神経芽細胞腫、髄膜腫、神経膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、神経星状膠細胞腫、前骨髄球性白血病、Hela型癌、慢性骨髄性白血病（好ましくはxiapまたはhiap-2関連プローブを用いる）、リンパ芽球性白血病（好ましくはxiap関連プローブを用いる）、バーキットリンパ腫、結腸直腸腺癌、肺癌、および悪性黒色腫からなる群より選択される。診断は、好ましくは発現または活性が2倍に増強することによってなされ、さらに好ましくは、発現または活性が少なくとも10倍に増強することによってなされる。
もう一つの面において、本発明は、有害レベルのアポトーシスを有する患者を治療する方法を含む。患者が望ましい程度よりも高度のアポトーシスを有するか、そのままでは正常NAIPが欠損している場合、この方法は、治療的に望ましい程度よりもアポトーシスが進行している細胞に到達させることができる形態による、前記の患者に対する治療的有効量のNAIP蛋白質、NAIP核酸、またはNAIP活性レベルを高める化合物の投与の段階を含む。一つの好ましい態様において、有害レベルのアポトーシスを有する細胞は、心疾患と診断された患者の心筋細胞である。
不十分なレベルのアポトーシスが起こる可能性が高い場合は、通常ならばNAIP活性レベルを低下させるアンチセンス核酸、NAIP抗体、または化合物を投与してもよい。SMAの治療は本発明から特に除外される。したがって、NAIP依存的抗アポトーシス経路の負の調節因子を細胞に投与することによって、細胞にアポトーシスを誘導させてもよい。この負の調節因子は、NAIPポリペプチド断片または精製されたNAIP特異的抗体であってもよいが、それに限定されない。例えば、この抗体は、3つのBIRドメインのいずれか一つのエピトープと結合してもよい。また、この負の調節因子は、NAIPのアンチセンスRNA分子であってもよい。
当業者には、哺乳動物NAIP、またはその断片（本明細書に記載したようなもの）が、治療的組成物の有効成分として有用であることは周知であると思われる。この組成物は、含まれるNAIPまたは断片に応じて、アポトーシスを調節し、それによってアポトーシスの障害に起因する任意の疾患を治療するために用いることができる。したがって、本明細書に記載する本発明のもう一つの面において、薬学的に許容される担体中に存在する本発明の化合物が含まれることは理解されると思われる。
上記の概要の通り、アポトーシスを調節するために、NAIPの核酸、ポリペプチドまたは抗体を用いることができる。さらに、NAIPの核酸、ポリペプチドまたは抗体を、アポトーシスを調節するための医薬品の発見および／または製造に用いることもできる。
「NAIP遺伝子」とは、少なくとも図6もしくは7のエクソン14aもしくはエクソン17、または図5の配列番号：1の配列を有し、上記の通り、活性を高めるために少なくともカルボキシ末端の核酸10個が欠失したポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。好ましい態様において、NAIP遺伝子は、アポトーシスを抑制する能力、またはNAIPと特異的に結合する抗体を誘導する能力を有するポリペプチドをコードする。好ましい態様において、NAIP遺伝子は、図6または7のNAIPアミノ酸コード配列のヌクレオチド配列との同一性が約50％またはそれ以上である遺伝子である。もう一つの好ましい態様において、NAIP遺伝子は、アポトーシスを抑制するために十分な断片ををコードする。好ましくは、同一性を評価する配列領域は、エクソン14aまたはエクソン17をコードする領域である。哺乳動物NAIP遺伝子には、あらゆる哺乳動物の供給源から単離したヌクレオチド配列が含まれる。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。
「NAIP遺伝子」という用語は、アポトーシスを調節する能力によって特徴づけられ、図6および7に示したNAIPポリペプチドのアミノ酸配列との同一性が少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも50％であるポリペプチドをコードする、あらゆるNAIP遺伝子を包含することを意味する。PCT/CAT95/00581に開示されており配列番号：1に示した全長配列は特に除外される。
「NAIP蛋白質」または「NAIPポリペプチド」とは、上記のNAIP遺伝子によってコードされるポリペプチド、またはその断片を意味する。
「アポトーシスを調節する」または「アポトーシスを変調させる」とは、該操作を行わなかった場合に一定の細胞集団においてアポトーシスを呈する細胞数が増加または減少することを意味する。好ましくは、この細胞集団は、T細胞、神経細胞、線維芽細胞、心筋細胞、またはある実験条件においてアポトーシスを呈することが知られているその他のあらゆる細胞系（例えば、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞）を含む。一定の解析において、NAIPまたは調節性化合物によって引き起こされる調節の程度はさまざまに異なると考えられるが、当業者であれば、NAIPを調節する化合物またはNAIPが同定されるアポトーシスのレベルにおける統計的に有意な変化を判断することができる。
「アポトーシスを抑制する」とは、非処理の対照と比べてアポトーシスを呈する細胞数が減少することを意味する。好ましくは、この減少は少なくとも25％で、さらに好ましくはこの減少は50％であり、最も好ましくはこの減少は100％である。
「実質的に同一」とは、参照となるアミノ酸または核酸配列との同一性が少なくとも50％、好ましくは85％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％であるポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較する配列の長さは一般的に少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸であり、さらに好ましくは少なくとも25アミノ酸であり、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸については、比較する配列の長さは一般的に少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチドであり、さらに好ましくは少なくとも75ヌクレオチドであり、最も好ましくは110ヌクレオチドである。
配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用い、デフォルト設定のパラメータにした条件で評価することが一般的である（例えば、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705の配列解析ソフトウェアパッケージ（Sequence Analysis Software Package））。このソフトウェア・プログラムは、種々の置換、欠失、およびその他の修飾に関する相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列を比較する。保存的置換には一般的に以下の各群内における置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自然の状態で付随している成分から分離されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、自然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が重量にして少なくとも60％であれば実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは、重量にして少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％純粋なNAIPポリペプチドである。実質的に純粋なNAIPポリペプチドは、例えば、自然の供給源（例えば、線維芽細胞、神経細胞、またはリンパ球）からの抽出、NAIPポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または蛋白質の化学合成によって得ることができる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などのあらゆる適した方法を用いて測定することができる。
蛋白質は、自然の状態で付随している汚染物質から分離されている場合に、自然の状態で伴う成分を実質的に含まない。このため、化学的に合成された蛋白質または天然の細胞とは異なる細胞系によって産生された蛋白質は、自然の状態で伴う成分を実質的に含まないと考えられる。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するポリペプチドが含まれるだけでなく、大腸菌またはその他の原核生物において合成されたものも含まれる。「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する天然の生物体のゲノムにおいて、その遺伝子の近傍に位置する遺伝子を含まないDNAを意味する。このため、この用語は、例えば、ベクター、自律複製性のプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、またはその他の配列から独立した分離分子（例えば、PCRまたは制限酵素消化によって産生されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAを含む。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもこれに含まれる。
「形質転換された細胞」とは、その内部（またはその前駆細胞の内部）に、組換えDNA技術を用いて（本明細書で用いるように）NAIPポリペプチドをコードするDNA分子が導入された細胞を意味する。
「導入遺伝子」とは、操作によって細胞内に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となる、DNAのあらゆる断片を意味する。このような導入遺伝子には、トランスジェニック生物体に対して部分的または完全に異種由来（すなわち、外来）である遺伝子、または生物体の内生遺伝子と相同な遺伝子が含まれうる。
「トランスジェニック」とは、操作によって細胞に組み込まれ、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となったDNA配列を含むあらゆる細胞を意味する。本明細書で用いているように、トランスジェニック生物体は一般にトランスジェニック哺乳動物（例えば、ラットまたはマウスなどの齧歯類）であり、DNA（導入遺伝子）は操作によって核ゲノム内に組み込まれる。
「形質転換」とは、外来分子を細胞に導入するためのあらゆる方法を意味する。リポフェクション、リン酸カルシウム法、レトロウイルス投与、電気穿孔、および遺伝子銃による形質転換は、使用することができる例のごく一部である。例えば、遺伝子銃による形質転換は、高速で射出されたタングステンまたは金の粒子などの弾丸を用いて、細胞に外来分子を導入する方法である。このよな高速射出法は、本来はヘリウム、圧縮空気、および火薬を原動力とする技術を含む圧力性射出に由来するが、これらに限定されない。遺伝子銃による形質転換は、細胞小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）、細菌、酵母、真菌、藻類、動物組織、および培養細胞を無制限に含む広範な種類の細胞および完全な組織に対する形質転換またはトランスフェクションに適用することができる。
「発現する位置に置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写および翻訳を指向する（すなわち、例えばNAIPポリペプチド、組換え蛋白質またはRNA分子の産生を促進するような）DNA配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。
「レポーター遺伝子」とは、その発現を解析することができる遺伝子を意味する。このような遺伝子には、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ、およびグリーン蛍光蛋白質（GFP）が、無制限に含まれる。
「プロモーター」とは、転写を促すために必要な最小の配列を意味する。また、本発明では、細胞型特異的、組織特異的な制御を受ける、または外来性のシグナルまたは因子によって誘導されるプロモーター依存的遺伝子発現を引き起こすために十分なそれらのプロモーター要素も含む。このような要素は、本来の遺伝子の5'または3'領域のいずれに位置してもよい。
「機能的に結合した」とは、ある遺伝子と一つまたはそれ以上の調節配列とが、適した分子（例えば、転写活性化蛋白質）が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連結していることを意味する。
「保存領域」とは、NAIPファミリーのメンバーの2つまたはそれ以上の間（例えば、ヒトNAIPとマウスNAIPとの間）でアミノ酸の配列の同一性が少なくとも30％、好ましくは50％、最も好ましくは70％であるような、6個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含むすべての連続部分を意味する。
「NAIPのカルボキシ末端アミノ酸」とは、NAIP遺伝子の3つのBIRドメインのカルボキシ末端側に位置するアミノ酸を意味する。例えば、配列番号：21の第1360位以降の核酸によってコードされるアミノ酸は、カルボキシ末端にある。
「検出可能に標識した」とは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、その遺伝子もしくは断片、またはcDNA分子などの、ある分子の存在を示したり同定するためのあらゆる手段を意味する。分子に検出可能に標識する方法は、当業者には十分に周知であり、放射性標識（例えば、32Pまたは35Sなどの放射性同位元素を用いる）および非放射性標識（例えば、フルオレセイン標識などの化学発光標識）を無制限に含む。
「アンチセンス」とは、本明細書で核酸に関して用いているように、その長さに関わらず、遺伝子のコード鎖に対して相補的な核酸配列を意味する。
「精製抗体」とは、自然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が、重量にして少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは、この調製物は、重量にして少なくとも75％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは少なくとも99％の抗体、例えばNAIP特異的抗体である。精製抗体は、例えば、組換えによって産生された蛋白質または保存部分のペプチドおよび標準的手法を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって得ることができる。
「特異的に結合する」とは、蛋白質を認識して結合するが、自然の状態では蛋白質を含む生物試料などの試料中のその他の分子は実質的に認識せず結合もしない抗体を意味する。好ましい抗体は配列番号：２のNAIPペプチド配列と結合するが、PCT/CA95/00581に開示されているNAIP配列には結合しない。
本発明のその他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の詳細な説明、および請求の範囲から明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
添付した図面に関して、本発明の種々の局面を説明する。
図1は、ウェスタンブロット法（A〜D）および免疫蛍光法によって分析した、ヒーラ（HeLa）、CHOおよびRat-1の保存されている安定的な細胞系、ならびにアデノウイルス感染細胞におけるNAIPの発現を示したものである。A-Bは、NAIP-mycをコードするアデノウイルスを感染させた細胞に対し、マウス抗mycモノクローナル抗体またはウサギ抗ヒトNAIPポリクローナル抗体によって検出したものである。Cはアデノウイルスを感染させた細胞をNAIPポリクローナル抗体によって検出したものである。Dは代表的な保存細胞系におけるmyc-NAIPの発現を、mycに対する抗体を用いて免疫蛍光的に検出したものである。E-Fは、rat-1のNAIP遺伝子導入株を、Eでは抗myc抗体、Fでは抗NAIP抗体によって検出したものである。
図2は、血清除去、メナジオン、およびTNF-αによって誘導される細胞死に対するNAIPの効果を示したものである。血清を除去したCHO細胞の生存率を、Aではアデノウイルス感染細胞について、Bでは保存された形質転換株について示した。C-Hはそれぞれ、アデノウイルス感染CHO細胞（C、D）およびRat-1細胞（E、FおよびG、H）のアデノウイルス感染細胞および保存された形質転換株における、メナジオンによって誘導された細胞死を示す。Iは、TNF-α/シクロヘキサミドを投与したHela細胞のアデノウイルス感染体、Jはその保存された形質転換株である。
図3は、ヒト脊髄組織の免疫蛍光分析を示す。Aは前角細胞、Bは中間外側ニューロン、Cは後根、Dは前根である。
図4は、ヒト染色体5q13.1のPAC 125D9のゲノム構造を図示したものである。図示した131,708bpの領域の2本鎖の塩基配列を決定したが、これはGenBank寄託番号#U80017に見い出せる。NotＩ（N）、EcoRＩ（E）、HindIII（H）およびBamHＩ（B）部位を示した。BTF2p44（緑）、NAIP（赤）およびSMN（グレー）のエクソンは、番号を付した色付き枠として示した。転写された（しかし翻訳されていない）CCA配列は、ライトグリーン色の枠で示した。特異的領域が占めるヌクレオチドの数は図示した通りであり、例えばNAIPとSMNとの間隔は15471bpである。PACをカバーするプラスミドクローンの最小のタイリングパターン（tiling pattern）を図の下に示した。それぞれのクローンの開始部の文字は、プラスミドライブラリーの作製に用いた制限酵素を示すが、例外として1C6、2A8、および2E2は、部分的Sau3AＩライブラリー（SstＩ-S）からのクローンである。NIH-セクイン（Sequin）プログラムを用いて発見された8つのクラスの反復配列の位置および方向を、色付き三角印によって示した。異なる色で示した反復部の名称を図の上右部に示した。GRAIL（赤矢印）またはPrestridge（プレスティッジ（Prestidge）, D.S. J. Mol. Biol. 249, 923〜932（1995））（緑矢印）のプログラムによって検出されるプロモーター配列、およびCpG島を、バーの上にそれぞれ矢印または青色の四角印として示した。
図5は、NAIP遺伝子に関する2つの別々の塩基配列分析によって得られた配列を示す。
図6は、好ましいNAIP cDNA配列、および予想されるNAIPポリペプチド配列を示す。
図7は、イントロン-エクソン境界部を含むNAIP配列を示す（配列番号：23）。
好ましい態様の詳細な説明
NAIPの抗アポトーシス作用に関する正確な部位および機序は不明であるが、現在では、NAIPが哺乳動物細胞のアポトーシス経路に明らかに関与していることが示されている。さらに、免疫蛍光的な局在部位の評価により、NAIPが運動ニューロンでは発現しているが、感覚神経では発現していないことが示されている。これらの所見は、この蛋白質がアポトーシス、特に神経細胞アポトーシスの負の調節因子として作用し、それが不足したり欠失した場合には、SMAおよびALSなどの神経変性性の表現型をもたらすとの考え方と一致する。
I．NAIP遺伝子
5q13.1上には、2つのほぼ同一なNAIPのコピーが存在する。図6に示した完全なNAIP遺伝子は、18のエクソン（1〜14、および14a〜17）を含み、推定90kbのゲノムDNAにまたがって存在する（得られたその他の中間配列は図5および7に示した）。NAIPのコード領域は4212ヌクレオチドに及び、1404アミノ酸長と予想される遺伝子産物を生じる（配列番号：22）。NAIP遺伝子の全長は6228ヌクレオチドに及び（配列番号：21）、5'UTRに395ヌクレオチド、3'UTRに1621ヌクレオチドが付随する。配列番号：2の完全配列によって、当業者は、相同配列の同定、およびDNA内部の変異の同定のためのプローブおよびプライマーを開発することができる。また、遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする因子に対するコード結合部位により、NAIPの経路および機能がさらに示されるため、5'および3'領域も有用であると思われる。配列番号：2および23として同定された配列は、抗体の開発のほか、NAIPの産生、およびその機能の検討のための適切なベクターおよび宿主における蛋白質の発現のためにも有用である。SMA遺伝子の存在部位である可能性が高いと同定された154kbのPAC 125D9の塩基配列分析により、図5の配列番号：1に示したNAIP配列が同定された。付加的なコード配列であるエクソン14aもそれ以後同定され、ともに本明細書に提供される。エクソン14aを含むNAIPのDNA配列は、SMA患者において欠失または変異を生じていない優性遺伝子アイソフォームであると思われる。ヒト胎児脊髄cDNAライブラリーから得たエクソン14aの単離および適用のために用いた技術およびプライマーは、その他のエクソンの同定に関して説明し、実施例4に詳しく説明したものと同じである。
cDNAライブラリーの付加的スクリーニング、およびPAC 125D9のゲノムDNA配列の分析を組み合わせることにより、付加的にエクソン17の配列を含む、NAIPの新規な3'端が同定された。
II．NAIPの合成
クローニングされたたNAIP遺伝子配列の特徴は、その配列をさまざまな種類の細胞に導入すること、またはインビトロの細胞外システムを用いることによって解析することができる。続いて、さまざまな生理的条件の下でNAIPの機能を検討することができる。遺伝子および遺伝子産物の発現を理解するための研究では、NAIP DNA配列を操作する。また、遺伝子産物を過剰発現する細胞系を作製することにより、生化学的特徴分析、大量産生、抗体産生、および患者の治療に用いるためのNAIPを精製することもできる。
蛋白質の発現のためには、真核生物および原核生物の発現系を作製し、そこでプラスミドまたはその他のベクター内にNAIP遺伝子配列を導入した後、生きた細胞に導入する。オープンリーディングフレーム全体を含むNAIP cDNA配列を含んだ構築物を発現プラスミド内に正しい方向で挿入することも、蛋白質発現のために用いられる。また、野生型または変異型のNAIP配列を含む配列の一部を挿入してもよい。原核生物および真核生物の発現系により、重要な機能を有する蛋白質のさまざまなドメインを融合蛋白質として回収することができ、続いてそれを結合性、構造および機能の試験ならびに適した抗体の作製のために用いることもできる。NAIPによりアポトーシスが増強される場合、この蛋白質は誘導性プロモーターの制御下で発現させることが望ましいと考えられる。
典型的な発現ベクターは、該遺伝子に対応するmRNAの大量な合成を促すプロモーターを含む。また、それらは、宿主生物体内部におけるそれらの自律的複製を可能にする真核生物または原核生物由来の複製配列、ベクターを含む細胞の選択を可能とする遺伝的特徴をコードする配列、および合成されたmRNAが翻訳される効率を高める配列をも含む。あるベクターには、選択条件下で細胞を増殖させることにより該細胞の単離を可能にするネオマイシン耐性などの選択マーカーが含まれる。安定な長期的ベクターは、ウイルスの調節要素を用いることにより、自由複製物として維持することができる。ゲノムDNA内にベクターが組み込まれた細胞系を作製することもでき、この方法を用いて連続的に遺伝子産物を産生することができる。
大腸菌などの細菌内で外来配列を発現させるには、NAIP配列を発現ベクター、通常は細菌のプラスミドに挿入する必要がある。このプラスミドベクターには、細胞内のベクターの維持を確実にする選択マーカーをコードする配列、導入することによりクローン化遺伝子から大量のmRNAが産生されるような調節可能な転写プロモーター（すなわち、lac）、転写調節配列、およびベクター内への適切な方向での遺伝子の挿入を容易にするポリリンカーなどのいくつかの要素が含まれる。lacプロモーターを用いる単純な大腸菌発現ベクターでは、発現ベクタープラスミドは、lacプロモーターおよび隣接するlacZ遺伝子を含む大腸菌染色体の断片を含む。ラクトース類似体であるIPTGの存在下において、RNAポリメラーゼは通常、lacZ mRNAを産生するlacZ遺伝子を転写し、このmRNAからコードされた蛋白質であるβ-ガラクトシダーゼが翻訳される。制限酵素を用いて発現ベクターからlacZ遺伝子を切り出し、NAIP遺伝子配列を置換することもできる。この結果生じるプラスミドを大腸菌にトランスフェクションすると、IPTGの付加およびそれに続くlacプロモーターからの転写が起こってNAIP mRNAが産生され、それがNAIPポリペプチドに翻訳される。
いったんNAIP遺伝子を含む適切な発現ベクターが構築されれば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラントランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、およびリポソームを介するトランスフェクションなどの形質導入技術によって、それを適切な大腸菌株に導入する。
本発明のベクターを用いてトランスフェクションされた宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス、枯草菌もしくはその他のバチルス属細菌、その他の細菌、酵母、真菌、昆虫（発現には例えばバキュロウイルスを用いる）、マウスもしくはその他の動物またはヒトの組織細胞からなる群より選択することができる。また、哺乳動物細胞は、ワクシニアウイルス発現系を用いて、NAIP蛋白質の発現に用いることもできる。
クローニングされたDNAによってコードされた蛋白質のインビトロ発現は、T7後期プロモーター発現系を用いても可能である。この系は、バクテリオファージT7のDNAにコードされた酵素であるT7 RNAポリメラーゼの調節された発現に依存している。このT7 RNAポリメラーゼは、T7後期プロモーターと呼ばれる特異的な23bpのプロモーター配列から始まるDNAを転写する。T7後期プロモーターのコピーはT7ゲノムの7つの部位に位置するが、大腸菌染色体DNAにはいずれも存在しない。その結果として、T7感染細胞ではT7 RNAポリメラーゼがウイルス遺伝子の転写を触媒するが、大腸菌遺伝子の転写は触媒されない。この発現系で、lacプロモーターに続いてT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を載せるように操作されたのは、組換え大腸菌細胞が最初である。IPTGの存在下において、これらの細胞はT7ポリメラーゼ遺伝子を高速で転写し、豊富な量のT7 RNAポリメラーゼを合成する。続いて、T7後期プロモーター蛋白質のコピーを載せたプラスミドベクターを用いてこれらの細胞を形質転換する。これらの形質転換された大腸菌細胞を含む培養液にIPTGを添加すると、多量のT7 RNAポリメラーゼが産生される。続いてこのポリメラーゼは、挿入されたcDNAの転写を高速で触媒しながら、プラスミド発現ベクター上のT7lateプロモーターと結合する。それぞれの大腸菌は発現ベクターの多数のコピーを含むため、この系ではクローニングされたcDNAに対応するmRNAが大量に産生され、その結果生じる蛋白質に放射性標識を施すことができる。また、lateプロモーターならびにT3、T5およびSP6などの関連したバクテリオファージから得た対応するRNAポリメラーゼを含むプラスミドベクターを、クローニングしたDNAからの蛋白質のインビトロ産生に用いることもできる。大腸菌を、M13ファージmGPI-2の感染による発現のために用いることもできる。また、大腸菌ベクターを、融合蛋白質ベクター、マルトース結合蛋白質融合体、またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合蛋白質により、ファージラムダ調節配列とともに用いることもできる。
好ましい発現系は、クロンテック社（Clontech）（Palo Alto, CA）から入手することができるベクターpBacPAK9などを用いるバキュロウイルス系である。必要に応じて、この系は、例えばエヴァン（Evan）ら（Mol. Cell Biol. 5: 3610〜3616, 1985）に記載されたmycタッグ法などのその他の蛋白質発現法と組み合わせて用いてもよい。
真核生物発現系では、発現した蛋白質に対する適切な翻訳後修飾を行うことができる。これによって、生物活性のために適した発現および翻訳後修飾の決定、NAIP遺伝子の5'領域に位置する調節要素およびNAIP蛋白質発現の組織での調節におけるその役割の同定を含む、NAIP遺伝子および遺伝子産物に関する種々の研究が可能となる。また、正常型および変異型の蛋白質を単離および精製するために大量に産生すること、NAIP蛋白質を発現している細胞をその蛋白質に対して作製された抗体の機能的アッセイ系として用いること、薬学的因子の有効性を検討すること、シグナル伝達系の成分として検討すること、または正常な完全蛋白質、蛋白質の特殊な部分、もしくは天然の多形および人工的に作製された変異型蛋白質の機能を研究することも可能となる。制限酵素による消化、DNAポリメラーゼによる挿入（fill-in）、エキソヌクレアーゼによる除去、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、合成またはクローニングされたDNA配列の連結、および特異的オリゴヌクレオチドとともにPCRを用いる部位指定配列改変などの当業者に周知の手法を用いて、NAIPのDNA配列を改変することもできる。
NAIPはまた、安定的にトランスフェクションされた哺乳動物細胞系によって産生することもできる。哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションのために適した多くのベクターは、このような細胞系を構築する方法と同じく（例えば、アウスーベル（Ausubel）ら、前記を参照）、一般に入手することができる（例えば、パウエル（Pouwels）ら、前記）。一つの例においては、NAIPをコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターにクローニングする。細胞培養液に0.01〜300μMのメトトレキセートを添加することにより、宿主細胞染色体へのプラスミドが組み込まれ、したがってNAIPをコードする遺伝子が組み込まれたものが選択される（アウスーベル（Ausubel）ら、前記に記載された方法により）。この優性選択法は、ほとんどの種類の細胞に対して実施することができる。組換え蛋白質の発現は、トランスフェクションした遺伝子にDHFRを介する増幅を施すことによって増強させることができる。
遺伝子増幅を有する細胞系を選択する方法は、アウスーベルら（前記）に記載されている。これらの方法は一般に、培地に含まれるメトトレキセートの濃度を徐々に高めていきながら継続培養することを含む。最も多く用いられるDHFRを含む発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)である（アウスーベル（Ausubel）ら、前記に記載）。上記の宿主細胞または、好ましくはDHFR欠損CHO細胞系（例えば、CHO DHFR-細胞、ATCC寄託番号CRL 9096）は、安定的にトランスフェクションされた細胞系またはDHFRを介した遺伝子増幅のDHFRによる選択のために最適な細胞の一部である。
いったん組換え蛋白質が発現すれば、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより、単離することができる。一つの例において、本明細書に記載した方法によって産生することができる抗NAIP抗体をカラムに結合し、NAIP蛋白質を単離するために用いることができる。アフィニティクロマトグラフィーの前に実施するNAIPを有する細胞の溶解および分画化は、標準的手法によって行うことができる（例えばアウスーベル（Ausubel）ら、前記を参照）。いったん単離されれば、この組換え蛋白質は、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、例えばフィッシャー（Fisher）、生化学および分子生物学における実験技術（Laboratory Technique in Biochemistry And Molecular Biology）,ワーク（Work）およびバードン（Burdon）編、Elsevier, 1980を参照）などによってさらに精製することができる。
本発明のポリペプチド、特に短いNAIP断片を、化学合成によって産生することもできる（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）、第２版、1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL）に記載された方法による）。ポリペプチドの発現および精製に関するこれらの一般的手法は、本明細書に記載した通り、有用なNAIP断片または類似体の産生および単離に用いることもできる。
分子生物学に関する当業者には、組換え蛋白質を産生するために極めて多岐にわたる発現系を用られることが理解されると考えられる。使用する宿主細胞の正確な種類は、本発明に関して決定的に重要ではない。NAIP蛋白質の産生には、原核生物宿主（例えば大腸菌）または真核生物宿主（例えば、酵母、Sf21細胞などの昆虫細胞、またはCOS-1、NIH 3T3もしくはHela細胞などの哺乳動物細胞）のいずれを用いてもよい。これらの細胞は、市販されており、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockville, MD（アウスーベル（Ausubel）ら、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、John Wiley & Sons, New York, NY, 1994も参照）から入手することができる。形質転換の方法および発現媒介物の選択は、選択した宿主細胞によって異なる。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えばアウスーベルら（前記）に記載されており、発現媒介物は、例えば「クローニングベクター:研究室マニュアル（Cloning Vectors：A Laboratory Mannual）」（P.H.Pouwelsら、1985, Supp. 1987）に提示されているものから選択してもよい。
III NAIP生物活性の有無についての試験
第1の手法においてNAIPの効果を分析するために、発現プラスミド単独、またはほぼ全長のNAIPまたはBcl-2（通常条件下において細胞をアポトーシスから保護する機能を有する蛋白質）をコードするものを、CHO、Rat-1およびHela細胞にトランスフェクトした後、G418によって選別した。最初に、構築されたコスミドライブラリーからのコスミドのゲノムDNA挿入体を用いてヒト胎児脳cDNAライブラリーを探索することによってNAIPのcDNAを単離し、NAIP遺伝子配列に対応する、3つのBIRドメインの大部分をコードするcDNA断片を単離した。
IV.NAIPの細胞分布
本発明者らは、標識された抗体の免疫蛍光を用いてNAIPの分布を観察し、NAIPが少なくとも以下の組織で発現していることを見いだした：運動ニューロン、心筋細胞、肝臓、胎盤、およびCNS。
V.NAIP断片
NAIPのBIRドメインは、NAIPの生物活性のために必要かつ十分であるように思われる。驚くべきことであるが、本発明者らは、NAIPアミノ酸のカルボキシ末端の欠失によって、NAIPによるアポトーシス抑制が実際に増強されると考えるだけの根拠を有する。欠失はNAIPの最後の（すなわち第3の）BIRドメインの終端の直前まで及んでもよいが、第3のBIRドメインに対してカルボキシ末端側にある全領域が欠失する必要はない。
VI．XAF抗体
ポリクローナル抗体を調製するために、NAIP、NAIPの断片、またはNAIP蛋白質の規定の部分もしくは全部を含む融合蛋白質を、適当なクローニング媒体に載せた対応するDNA配列を発現させることにより、細菌内で合成することができる。抗体を産生するための抗原の供給源には、融合蛋白質が一般に用いられる。大腸菌に関して広く使用される2つの発現系は、pUR系列のベクターを用いるlacZ融合体、およびpATHベクターを用いるtrpE融合体である。続いてこの蛋白質を精製し、キャリア蛋白質と連結して（ウサギによる抗原応答の誘発を補助するために）フロイントアジュバントと混合し、ウサギまたはその他の実験動物に注入することができる。また、NAIPを発現している培養細胞から蛋白質を単離することもできる。2週間間隔でブースター注入を行った後、ウサギまたはその他の実験動物に瀉血を施し、血清を単離する。血清は直接使用してもよく、プロテインA-セファロース、抗原セファロース、および抗マウスIg-セファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーを含むさまざまな手法により、使用前に精製してもよい。続いて、NAIP蛋白質を同定するために、ポリアクリルアミドゲルにかけた組織から蛋白質抽出物を検出するために血清を用いることもできる。また、蛋白質の抗原性部分に対して合成ペプチドを作製し、動物に接種することもできる。
NAIP特異的抗体の作製に使用するためのペプチドを作製するために、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；スミス（Smith）ら、Gene 67: 31〜40, 1988）とのC末端融合体として、NAIPコード配列（すなわち、配列番号:22および24に示すアミノ酸断片）を発現させることができる。この融合蛋白質は、グルタチオン-セファロースビーズ上で精製し、グルタチオンを溶出し、トロンビンを用いて切断し（操作によって作成した切断部分において）、ウサギを十分に免疫化するために必要な程度まで精製することができる。一次免疫化はフロイント完全アジュバントによって行うことができ、その後の免疫化はフロイント不完全アジュバントを用いて実施される。抗体価の測定は、GST-NAIP融合蛋白質のトロンビン切断NAIP断片を用いるウェスタンブロットおよび免疫沈降分析によって行われる。CNBr-セファロースを連結したNAIP蛋白質を用いて、免疫血清のアフィニティ精製を行う。抗血清の特異性は、一連の非関連GST蛋白質（GSTp53、Rb、HPV-16 E6、およびE6-APを含む）およびGST-トリプシン（既知の配列を用いるPCRによって作成されたもの）を用いて決定される。
また、当業者には、蛋白質を活発に発現している細胞または組織から単離された細胞を培養することによって、モノクローナルNAIP抗体を産生することもできることが理解されている。NAIP蛋白質を含む細胞抽出物または組換え蛋白質抽出物を、例えばフロイントアジュバントとともにマウスに注入してもよい。注入の後、マウスの脾臓を摘出してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再懸濁することもできる。この脾細胞はリンパ球の供給源として役立てることができ、その一部は適した特異性を有する抗体を産生する。続いて、これらを永久増殖性の骨髄腫パートナー細胞と融合させ、HATなどの選択性薬物の存在下において、融合産物を多数の組織培養皿に平板培養する。続いて、ELISAによって、結合抗体を産生している細胞を含む培養皿をスクリーニングする。続いて、それらを再び平板培養して一定期間増殖させた後、抗体産生細胞を同定するためにそれらの培養皿を再びスクリーニングする。90％を超える培養皿が、抗体産生に関して陽性である単一クローンを含むようになるまで、何回かのクローニング手順を実施する。この手順によって、抗体を産生するクローンの安定系列が確立される。続いて、プロテインAセファロース、イオン交換クロマトグラフィーに加えてこれらの手法の変法および組み合わせを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体を精製することができる。また、適当な宿主において望ましいモノクローナル抗体断片を発現するプラスミドを作製する組換え法によって、切断型のモノクローナル抗体を産生することもできる。
GST融合蛋白質に対する代替的または付属的な免疫原として、NAIPの比較的特定の親和性領域に対応するペプチドを作製し、導入したC末端リジンを介してキーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）と連結させてもよい。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清を、BSAと共役させたペプチド上で同様にアフィニティ精製し、ペプチド共役体を用いるELISAおよびウェスタンブロット、およびGST融合蛋白質として発現したXAF-1を用いるウェスタンブロットおよび免疫沈降法によって特異性を検討する。
また、上記のNAIP蛋白質および標準的なハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる（例えば、ケラー（Kohler）ら、Nature 256: 495, 1975、ケラーら、Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976、ケラーら、Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976、ハンマーリング（Hammerling）ら、モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas）, Elsevier, New York, NY, 1981、アウスーベル（Ausubel）ら、前記を参照）。いったん産生されたモノクローナル抗体には、ウェスタンブロットまたは免疫沈降分析によって（アウスーベル（Ausubel）ら、前記に記載された方法により）、NAIPの特異的認識に関する検査を行うこともできる。
本明細書に記載されたような、一つ以上のBIRドメインを含むNAIP（またはNAIPの断片）を特異的に認識する抗体は、本発明に有用であると考えられる。例えばそれらを、NAIP発現レベルをモニターするためにまたは哺乳動物で産生されるNAIPもしくはNAIP断片の細胞内の位置を判定するためにイムノアッセイに用いることができる。本明細書に記載したNAIPを抑制する抗体は、望ましくない増殖を起こしている細胞においてアポトーシスを誘導するために特に有用であると考えられる。
好ましくは本発明の抗体は、高度に保存された領域内に位置していないNAIP配列を用いて産生させ、ジェームソン（Jameson）およびウルフ（Wolf）のアルゴリズム（CABIOS 4: 181, 1988）を用いてペプチド構造プログラム（Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Program Manual for the GCG Package, Version 7, 1991）によって示される基準などによる解析では、抗原性があると考えられる。これらの断片は、PCRなどの標準的手法によって作製し、pGEX発現ベクターにクローニングすることができる（アウスーベル（Ausubel）ら、前記）。融合蛋白質は大腸菌内で発現し、アウスーベル（Ausubel）ら（前記）に記載された通り、グルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを用いて精製される。NAIPに対して非特異的または低親和性の結合を示す抗血清が得られる可能性を極めて少なくするためには、それぞれの蛋白質について2種類または3種類の融合体を作製し、それぞれの融合体を少なくとも2匹のウサギに注入する。何回かの連続注入、好ましくは少なくとも3回のブースター注入によって抗血清が得られる。
VII. NAIPの利用
NAIPに対する抗体は、上記の通り、NAIPを検出するためまたは蛋白質を抑制するために用いることができる。さらにこの抗体を、画像化および治療のための放射性ヌクレオチドならびに化合物を特異的な組織部位に到達させるためのリポソームなどの、診断的および／または治療的利用のための化合物と結合させることもできる。
VIII．NAIP遺伝子の発現の検出
記載した通り、上記の抗体を、NAIP蛋白質の発現をモニターするために用いることができる。さらにインサイチューハイブリダイゼーションも、NAIP遺伝子の発現を検出するために用いることができる。インサイチューハイブリダイゼーション法は、特異的に標識化された核酸プローブと、個々の細胞または組織中の細胞RNAとのハイブリダイゼーションに基づく。したがって、これにより、心臓などの完全な組織の内部のmRNAの同定が可能となる。この方法では、NAIP遺伝子の特定の部分に対応するオリゴヌクレオチドまたはクローニングしたヌクレオチド（RNAまたはDNA）の断片を、例えば脳内の特異的mRNA種を検出するために用いる。この方法では、ラットに麻酔を施し、低温PBSによる経心臓的潅流を行った後、ホルムアルデヒド溶液を用いて潅流する。続いて、脳またはその他の組織を摘出し、液体窒素中にて凍結させ、その微小薄層切片を作成する。切片をスライドグラス上に置き、プロテイナーゼK中にてインキュベートする。DEP、水、およびエタノールで洗浄した後、スライドグラスをプレハイブリダイゼーション緩衝液中にてインキュベートする。プライマーに対応した放射性プローブをニックトランスレーション（nick translation）によって作製し、切片化した脳組織とともにインキュベートする。インキュベートおよび自然乾燥の後、標識された領域をオートラジオグラフィーによって可視化した。組織試料中の暗点は、プローブが蛋白が発現したことを示すNAIP mRNAとハイブリッドを形成したことを意味する。
IX．NAIP蛋白質の発現を調節する化合物の同定
NAIP cDNAは、NAIPの発現を増強または減弱させる分子の同定を容易にするために用いることができる。一つの手法では、NAIP mRNAを発現している細胞の培養液に種々の濃度の候補化合物を添加する。続いて、例えば、NAIP cDNA、またはcDNAもしくはRNA断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いるノーザンブロット分析（アウスーベル（Ausubel）ら、前記）により、NAIP mRNAの発現を測定する。その他のすべての因子（例えば、細胞の種類および培養条件）を同一にして、候補分子の存在下におけるNAIPの発現レベルを、候補分子の非存在下におけるNAIPの発現レベルと比較する。
代わりに、NAIPを介したアポトーシスに対する候補分子の作用を、NAIP特異的抗体（例えば、本明細書に記載したNAIP抗体）を用いるウェスタンブロットまたは免疫沈降などの標準的蛋白質検出法とともに、上記の一般的な手法を用いることによって翻訳のレベルで測定することもできる。
NAIPのレベルを調節する化合物は、精製しても、実質的に精製してもよく、または細胞から採取した抽出物もしくは上清などの化合物の混合体の一つの要素であってもよい（アウスーベル（Ausubel）ら、前記）。化合物の混合体の一つの解析では、化合物プール（例えば、HPLCまたはFPLCなどの標準的精製手法によって作製したもの）のサブセットの大きさを段階的に小さくしていきながら、NAIPの発現を調節する単一の化合物または効力のある最小数の化合物が示されるまで、NAIPの発現の検討を続ける。
化合物を、NAIPアポトーシス誘導活性を調節する能力に基づいてスクリーニングすることもできる。この手法では、候補化合物の存在下におけるアポトーシスの程度と、非存在下におけるアポトーシスの程度とを同一条件下で比較する。また、候補化合物プールを用いてスクリーニングを開始し、そこから一つまたはそれ以上の有用な調節性化合物を段階的に単離してもよい。アポトーシス活性は、例えば本明細書に記載したものなどのあらゆる標準的な解析によって測定することができる。
NAIPの活性を調節する化合物を検出するためのもう一つの方法は、あるNAIPポリペプチドと物理的に相互作用する化合物のスクリーニングのための方法である。これらの化合物は、当業者に既知の相互作用トラップ（interaction trap）発現系を適合させることによって検出される。これらの系は、転写活性化解析を用いて蛋白質相互作用を検出することができ、ギュリス（Gyuris）ら（Cel1 75: 791〜803, 1993）およびフィールド（Field）ら（Nature 340: 245〜246, 1989）に一般的に記載されており、クローンテック（Clontech）社（Palo Alto, CA）から購入することができる。さらに、PCT出願公告（Publication）国際公開公報第95/28497号には相互作用トラップ解析が記載されており、そこではアポトーシスに関与する蛋白質が、BCL-2との相互作用を利用して検出されている。同様の方法は、NAIPと相互作用する蛋白質およびその他の化合物を同定するために用いられている。
NAIPを介した細胞死の調節因子として機能する化合物または分子は、細胞抽出物、哺乳動物血清、または哺乳動物細胞が培養されていた増殖培地中に存在するような、ペプチドおよび非ペプチド分子を含む。
NAIP発現またはNAIP活性の増強を促進する分子は、本発明において特に有用と考えられる。このような分子は、例えば、NAIPの細胞レベルを高め、それによってアポトーシスを抑制するNAIPポリペプチドの能力を引き出す治療薬として用いることができる。
また、NAIP活性を低下させる分子（例えばNAIP遺伝子の発現またはポリペプチド活性の減弱による）は、細胞増殖を減衰させるために用いることもできる。これは、腫瘍または他の増殖性疾患の治療に有用と考えられる。
上記の方法によって、NAIP遺伝子の発現またはポリペプチド活性を効果的に調節することが分かった分子を、動物モデルでさらに試験することになる。これらの分子が、インビボの状態でもうまく機能すれば、アポトーシスを阻害するか促進するための、いずれか適当な治療薬として用いることができると考えられる。
X．治療法
治療法は、NAIP遺伝子の欠損またはNAIP遺伝子発現の不十分さを回避または克服し、それによって、アポトーシスを調節しできるだけ阻害するように設計されうる。NAIP遺伝子は、肝臓、心筋、および胎盤ならびに中枢神経系（CNS）中で発現される。したがって、さまざまな治療法を考えると、この治療法は、肝臓、心筋などの脳以外のすべての組織およびNAIPを発現することが示されたその他のあらゆる組織を標的とすることができることが分かる。
ａ）蛋白質治療
変異蛋白質または不適当なNAIP蛋白質を正常な蛋白質で置き換えたり、変異蛋白質の機能を変化させたり、正常なNAIP蛋白質を適当な細胞に輸送することによって、アポトーシスを治療または予防することができる。また、一旦NAIP蛋白質の生物学的経路が完全に理解されれば、生理学的欠陥を修正するために蛋白質が関与する病態生理学的経路（例えば、シグナル伝達経路）を改変することも可能である。
変異蛋白質を正常な蛋白質で置き換えたり、充分な量のNAIPを発現しなくなった細胞に蛋白質を加えたりするためには、この蛋白質を発現することができる培養細胞系から、大量の精製NAIPを得る必要がある。そして、適当なパッケージング・システムまたは投与システムを用いて、変質した組織に蛋白質を輸送することができる。または、NAIP作用薬として作用させ、また、このようにして所期の生理学的効果を発生させるために、小さな分子類似体を用いて投与してもよい。
ｂ）遺伝子治療
遺伝子治療はもう一つの見込みのある治療法で、選択した組織に正常なNAIP遺伝子のコピーを導入して、変質したタイプの細胞において正常で豊富な蛋白質を首尾よくコードするようにさせる治療法である。遺伝子は、これらの細胞に取り込まれるような形で輸送され、また、有効な機能を提供するのに十分な蛋白質をコードしていなければならない。または、いくつかの変異体においては、該遺伝子に第二の変異を有するか、変異を変更するような相同遺伝子のコピーをもう一つ導入してアポトーシスを阻止したり、負の効果を遮断するために別の遺伝子を用いることもできる。
体細胞の遺伝子治療には、レトロウイルス・ベクターの導入を利用することができる。これは、特に、感染効率が高く、安定した取り込みと発現が行われるからである。しかし、標的となる細胞は、分裂できるものでなければならず、正常な蛋白質の発現レベルが高くなければならない。全長NAIP遺伝子、または、その一部をレトロウイルス・ベクターにクローニングして、この遺伝子が本来有するプロモーターか、レトロウイルスの長い末端反復配列、または、目的とする標的細胞型（例えば、ニューロン）に特異的なプロモーターを作用させることができる。その他利用することができるウイルスベクターには、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、エプスタイン-バーウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる。
インビトロでの遺伝子導入が必要な非ウイルス法を用いて、遺伝子導入を行なってもよい。これには、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、および、プロトプラスト融合法が含まれうる。リポソーム法も、細胞にDNAを輸送する上で利点があるかもしれない。これらの方法を利用することができるが、これらの多くは効率が悪い。
アンチセンスに基づく方法が、NAIP遺伝子の機能を調べるためおよび治療薬設計の基礎として用いられる。この原理は、細胞の中でmRNAとそれに相補的なアンチセンス分子種との間にハイブリッドが形成されることによって、遺伝子発現を配列特異的に抑制することができるという仮説に基づいている。そして、ハイブリッド形成したRNA二本鎖は、プロセッシング／輸送／翻訳、および/または、標的となったNAIP mRNAの安定化を妨げる。アンチセンス法は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いたり、アンチセンスRNAを注入したり、アンチセンスRNA発現ベクターをトランスフェクションさせるなど、さまざまな方法を用いることができる。アンチセンス効果は、制御（センス鎖）配列によって誘導することができるが、表現形質上の変化は非常にさまざまであった。アンチセンス効果によって誘導される表現形質的な効果は、蛋白質レベル、蛋白質活性測定、および標的mRNAのレベルなどの変化に基づいて判断される。
患者の罹患細胞に対する正常遺伝子の移植は、有用な治療ともなりうる。この手法では、患者にとって外因性または内因性のいずれかである培養可能な細胞型に対して正常NAIPをトランスフェクションする。続いて、これらの細胞を血清学的に標的組織に対して注入する。
治療的なNAIP遺伝子構築物のための遺伝子移入到達系としては、アポトーシスに関与すると考えられる細胞（例えば上皮細胞）に対する親和性を有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターを用いてもよい。この目的に使用することができる多数のベクターは公知である（ミラー（Miller）, Human Gene Therapy 15〜14, 1990;フリードマン（Friedman）, Science 244:1275〜1281, 1989;エグリティス（Eglitis）およびアンダーソン（Anderson）, BioTechniques 6:608〜614, 1988;トルストシェフ（Tolstoshev）およびアンダーソン（Anderson）,current opinion in Biotechnology 1;55〜61, 1990;シャープ（Sharp）, The Lancet 337:1277〜1278, 1991;コルネッタ（Cornetta）ら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311〜322, 1987;アンダーソン（Anderson）, Science 22-:401〜409, 1984;モーン（Moen）, Blood Cells 17:407〜416, 1991;ミラー（Miller）ら、Biotechniques 7:980〜990, 1989;Le Gai La Salleら、Science 259:988〜990, 1993;およびジョンソン（Johnson）, Chest 107:77S〜83S, 1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でも使用されてきた（ローゼンバーグ（Rosenberg）ら、N. Engl. J. Med 323:370, 1990;アンダーソン（Anderson）ら、米国特許第5,399,346号）。そのままではアポトーシスが起こると予想される細胞内に治療的なDNAを導入するために、非ウイルス的手法を用いることもできる。例えば、リポフェクション（フェルグナー（Felgner）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987;オノ（Ono）ら、Neurosci. Lett. 117:259, 1990;ブライアム（Brigham）ら、Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989;シュタウビンガー（Staubinger）ら、Meth. Enz. 101:512, 1983）、アシアロソヌコイド・ポリリジン抱合（ウー（Wu）ら、J. Biol. Chem. 263:14621, 1988;ウー（Wu）ら、J. Biol. Chem. 264:16985, 1989）、または、あまり好ましくはないが、外科的状況下におけるマイクロインジェクション（ウォルフ（Wolff）ら、Science 247:1465, 1990）によって、神経細胞またはT細胞にNAIPを導入することもできる。
上記の適用方法のいずれについても、治療的なNAIP DNA構築物は、好ましくはアポトーシス現象が予想される部位に対して適用される（例えば注入によって）。しかし、アポトーシス現象が予想される部位の近傍の組織、またはアポトーシスが起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。
上記の構築物において、NAIP cDNAの発現は、任意の適したプロモーターによって指向させることができ（例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインのプロモーター）、任意の適切な哺乳動物調節要素によって調節することができる。例えば、必要に応じて、NAIPを発現させるために、神経細胞、T細胞、またはB細胞における遺伝子発現を優先的に指向することが知られているエンハンサーを用いてもよい。使用するエンハンサーは、その発現が組織または細胞に特異的であると特徴づけられたものを無制限に含む。また、NAIPゲノムのクローンを治療的構築物として用いる場合（例えば、上記のNAIP cDNAとのハイブリダイゼーションによって単離した後）には、コグネイト調節配列、または、必要に応じて、上記の任意のプロモーターもしくは調節要素を含む異種供給源に由来する調節配列を介して調節することもできる。
あまり好ましくはないが、NAIPの遺伝子治療は、NAIP mRNAまたはアンチセンスNAIP mRNAの直接投与によって実施される。このmRNAはいかなる標準的手法によって作製および単離を行ってもよいが、高効率プロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるNAIP cDNAを用いるインビボ転写によって最も容易に産生される。NAIPのアンチセンス体またはmRNAの細胞mRNAへの投与は、上記の直接的な核酸投与の方法のいずれによっても実施することができる。
理想的には、あらゆる遺伝子治療手法によるNAIP蛋白質の産生は、少なくとも非罹患細胞における正常なNAIPの細胞内レベルと等しい、NAIPの細胞内レベルをもたらすと思われる。NAIPを介したいかなる遺伝子治療の手法による治療も、そのほかの慣習的な治療法と併用することができる。
本発明に含まれる別の治療法は、アポトーシスが起こると予測される部位に（例えば、注射によって）直接、または、（例えば、従来からの組み換え蛋白質投与法によって）全身に、組み換えNAIP蛋白質を投与することを含む。NAIPの用量は、各患者の体格および健康状態など、多くの要因に依存するが、通常、一日当たり[0.1mgから100mg]を、薬学的に許容される処方剤にして投与する。
XI．NAIPポリペプチド、NAIP遺伝子、またはNAIP合成もしくは機能の調節因子の投与
薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤の中に入れ、一用量単位の形にして、NAIP蛋白質、遺伝子または調節因子を投与することができる。過剰なアポトーシスによって起こる病気を患う患者に、NAIPを投与するのに適した処方剤または組成物を提供するために、従来からある医薬診療法を用いることもできる。患者に病徴が現れる前に投与を開始する。適当な投与経路を用いればよいが、例えば、投与は、非経口で、静脈内に、動脈内に、皮下に、筋肉内に、頭蓋内に、眼窩内に、眼から、心室内に、包内に、脊椎内に、槽内に、腹腔内に、鼻腔内に、エアゾールで、座剤によって、または、経口投与で行われうる。治療用処方剤は、溶液状または懸濁液状でよいが、経口投与のためには、処方剤は錠剤またはカプセル剤の形でもよい、また、鼻腔用処方剤としては、粉末状、鼻腔ドロップまたはエアゾールの形状でもよい。
処方剤を作成するための、当業においてよく知られた方法が、例えば、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）に記載されている。例えば、非経口投与のための処方剤は、賦形剤、滅菌水または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキリングリコール、植物性油脂、または、水素添加したナフタレンを含んでいるかもしれない。生物親和性で生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、または、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを化合物の放出を制御するために用いることができる。NAIP調節化合物の非経口的輸送システムとして有用である可能性のあるものには、エチレン-ビニル酢酸コポリマー粒子、浸透ポンプ、包埋可能な注入システム、リポソームが含まれる。吸入用処方剤は、例えば、ラクトースなどの賦形剤を含むか、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸などを含む水溶液でもよく、鼻腔用ドロップの形で投与するための油性溶液またはゲルでもよい。
必要に応じて、NAIP蛋白質、遺伝子、または調節化合物を用いる治療を、病気に対するより慣習的な治療法、例えば、手術、ステロイド治療、自己免疫疾患に対する化学療法（例えば、エイズに対する抗ウイルス療法、および虚血性傷害に対する組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA））などと組み合わせてもよい。
XII．アポトーシス異常に関連する病状の検出
アポトーシス異常に関連する病状を検出したり観察したりするときに、NAIPのアミノ酸配列と塩基配列を診断に使用できることがわかった。例えば、ヒトにおいて、NAIPの発現低下は、アポトーシスの増加と相関するかもしれない（下記XII参照）。従って、NAIP産生レベルの減少または増加は、有害な状態の徴候を示すものとなるかもしれない。標準的な技術によって、NAIPの発現レベルを測定することができる。例えば、標準的なノザンブロット解析によって、生物試料（例えば、生検試料）におけるNAIP発現をモニターしてもよく、PCRを利用してもよい（例えば、アウスーベル（Ausubel）ら、前記;PCR技術:DNA増幅のための原理と応用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification）、H. A. Ehrlich, Ed. Stockton Press, NY;ヤップ（Yap）ら、Nucl. Acid Res. 19: 4294, 1991）。
または、不適合検出法を用いて、NAIP配列における１個以上の突然変異について、患者から得た生物試料を解析してもよい。一般的に、これらの技術には、患者の試料から塩基配列をPCR増幅し、その後、ハイブリッド形成の変化、電気泳動ゲルの移動の異常さ、不適合蛋白質が媒介する結合もしくは切断、または、直接の塩基配列決定のいずれかによって、変異（すなわち、不適合）を同定することが含まれる。NAIP変異の検出を容易にするために、これらの技術の何れを用いることもでき、また、これらのいずれも当業においてよく知られている。特定の技術の例が、オリタ（Orita）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766〜2770, 1989）およびシェフィールド（Sheffield）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232〜236, 1989）において説明されているが、これらだけには制限されない。
さらに別の方法では、生物試料において、NAIP蛋白質を検出またはモニターするために免疫測定法が用いられる。NAIPポリペプチドのレベルを測定するための、どの標準的な免疫測定方式（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA）においても、NAIP特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（上記のようにして産生されたもの）が用いられうる。これらのレベルを、アポトーシスの増加に関連した状態を示すNAIP産生の減少により、野生型のNAIPレベルと比較する。免疫測定法の実施例は、例えば、「アウスウーベル（Ausubel）ら、前記」で説明されている。NAIP検出のために、免疫組織化学的手法を利用することもできる。例えば、患者から組織試料を採取して、切片にし、抗NAIP抗体と標準的な検出システム（例えば、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼを結合した二次抗体を含むシステム）のいずれかとを用いて、NAIPが存在するかを見るために染色してもよい。このような技術に関する一般的な手引きは、例えば、バンクロフト（Bancroft）およびスティーブンス（Stevens）（組織学的技術の理論と実際（Theory and Practice of Histological Techuniques）、Churchill Livingstone,1982）、および「アウスウーベル（Ausubel）ら、前記」の中にある。
好ましい実施例の一つにおいて、NAIP蛋白質の産生を評価すること（例えば、免疫学的手法、または、蛋白質短縮試験（protein truncation test）（ホルゲロースト（Horgerrorst）ら、Nature Genetics 10: 208〜212, 1995））で始まり、より微細なNAIPの変異（例えば、点突然変異）を同定するために設計された、核酸に依拠する検出技術も含む組み合わせ診断法が用いられるかもしれない。上記のように、当業者は、数多くの不適合検出法を利用することができ、どれでも好ましい技術を用いればよい。NAIPの発現がなくなるか、NAIPの生物活性を失わせるような、NAIPにおける突然変異が検出されるかもしれない。この組み合わせ診断法を変化させた方法において、適当なアポトーシス測定システム（例えば、本明細書で説明されているシステム）を用いて、抗アポトーシス活性としてのNAIPの生物活性を測定する。
不適合検出法は、また、不適切なアポトーシスが原因で起き、NAIPが介在する疾病素質を診断する機会を提供する。例えば、NAIP変異に関してヘテロ接合の患者は、臨床上の病徴は示さないかもしれないが、それでもなお、神経変性、脊髄形成異常、または虚血症の重篤な後遺症などのいくつかのタイプを発症させる可能性は正常な場合よりも高い。この診断が与えられていれば、患者は、有害な環境因子（例えば、紫外線被曝または化学的な変異原）に曝される機会を最少にするよう注意したり、自分の医学的状態を注意深くモニターする（例えば、頻繁に健康診断を受ける）よう注意するかもしれない。また、このようなタイプのNAIP診断法は、出生前のスクリーニングで、NAIP変異を検出するために用いられるかもしれない。上記のNAIP診断測定法は、NAIPが正常に発現する生物学的試料（例えば、何らかの生検試料、または、他の組織）を用いて行われるかもしれない。被験試料にした、これらの試料を用いて、変異NAIP遺伝子の同定を行うこともできる。
または、特に、NAIPに関連した変性病の素質に関する診断の一部として、何らかの細胞からのDNA試料を用いて、例えば、不適合検出技術によって、NAIP変異について試験してもよい。好ましくは、解析の前に、DNA試料をPCR増幅しておく。
XIII．予防的抗アポトーシス治療
XAF-1変異に関してヘテロ接合であるか、NAIP変異に感受性であると（これらの変異により、まだNAIP生物活性における変化または欠失が起きていなくとも）診断された患者、変性病（例えば、SMAまたはALS病のような運動ニューロン変性病）を有すると診断された患者、またはHIV陽性であると診断された患者においては、病気の表出が起こる前に、上記の治療法が施されることになる。例えば、この治療法は、HIV陽性であるが、まだＴ細胞数の減少またはその他AIDS明白な徴候を示していない患者に対して提供される。特に、標準的な投与用量および投与経路によって、NAIP発現またはNAIP生物活性を増加させることが分かっている化合物が投与されることになると考えられる（上述したところを参照のこと）。または、変性病が発症する前に細胞の欠損を元に戻すか予防するために、NAIP発現構築物を用いた遺伝子治療が行われるかもしれない。
哺乳動物、例えば、ヒト、ペット、または家畜において、本明細書に説明されている疾患を緩和したり、診断したりするために本発明の方法が用いられるかもしれない。ヒトでない哺乳動物を治療したり、診断したりするときには、NAIPポリペプチド、核酸または抗体は、その生物種に特異的なものであることが好ましい。
XV．別のNAIP遺伝子の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーションなど、標準的な技術を用いて、他の生物種における、さらに別のNAIP相同遺伝子をクローニングしてもよい。ヒトNAIPに特異的なプローブを用いて、低い厳密度で、マウスのゲノムDNAのサザンブロットによって、NAIPおよび/または、それに関連したファミリーの蛋白質に一致するバンドが現れる。このように、低い厳密度のハイブリダイゼーションを用いて、さらに別のNAIP配列が容易に同定されうる。RT-PCRによって、さらに別の遺伝子をクローニングするために、マウスおよびヒトのNAIP特異的なプライマーを用いてもよい。
XVI．NAIP活性の特徴と細胞内での局在調査
NAIPがアポトーシスを変えられることを、アポトーシスの変化を検出できるインビトロ・システムで明らかにすることができる。哺乳動物での発現する構築物で、全長または欠失したNAIP cDNAを有するものを、CHO、NIH 3T3、HL60、Rat-1、またはジャーカット細胞などの細胞系に導入することができる。さらに、SF21昆虫細胞を用いてもよいが、その場合には、昆虫ヒートショックプロモーターを用いてXAFを発現させるのが好ましい。形質転換した後、標準的な方法によってアポトーシスを誘導することができるが、これには、血清停止（serum withdrawal）またはスタウロスポリン、メナジオン（遊離基形成を通してアポトーシスを誘導する）、または抗Fasを注入することが含まれる。対照として、アポトーシスが起こるように誘導する条件と同じ条件の下で細胞を培養するが、細胞は形質転換されていないか、NAIP挿入配列を持たないベクターで形質転換されている。各NAIP構築物がその発現によってアポトーシスを阻害できる能力を、生き残った対照細胞に対する、生き残った形質転換細胞の比率を示す、細胞の生残指数を計算することによって定量することができる。これらの実験によって、アポトーシスを抑制する活性があることを確認することができ、下記で検討されるように、NAIPの機能的領域を決定することができる。また、NAIP発現によってアポトーシスを変える化合物を同定するために、さらに別の化合物の注入を組み合わせて、これらの解析を行なってもよい。
XVII．さらに別のアポトーシスの測定法の実施例
アポトーシスの測定法の特異的な実施例が、以下の参考文献において提供されている。リンパ球におけるアポトーシスの測定法が、リー（Li）ら「HIV-1 Tat蛋白質による、非感染リンパ球におけるアポトーシスの誘導（Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein）」、Science 268: 429〜431, 1995; ジベリーニ（Gibellini）ら、「Tatを発現するジャーカット細胞は、１型急性ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）感染などの異なるアポトーシス刺激に対する抵抗性の増加を示す（Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to deffferent apoptotic stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1（HIV-1）infection）」、Br. J. Haematol. 89: 24〜33, 1995; マーチン（Martin）ら、「インビトロでのヒトCD4+Ｔ細胞のHIV-1感染。これらの細胞における特異的なアポトーシス誘導（HIV-1 infection of human CD4+T cells in vitro. Differential inducrion of apoptosis in these cells.）」、J. Immunol. 152: 330〜342, 1994; テライ（Terai）ら、「HIV-1に急性感染した培養Ｔリンパ芽球における細胞死のメカニズムとしてのアポトーシス（Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1）」、J. Clin. Invest. 87: 1710〜1715, 1991; ドハイン（Dhein）ら、「APO-1/（Fas/CD95）によって媒介される自己分泌Ｔ細胞の自殺（Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/（Fas/CD95））」、Nature 373: 438〜441, 1995; カツィキス（Katsikis）ら、「ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体では、Fas抗原刺激によってＴリンパ球の顕著なアポトーシスが誘導される（Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals）」、J. Exp. Med. 1815: 2029〜2036, 1995; ウェステンドープ（Westendorp）ら、「CD95が媒介する、HIV-1 Tatとgp120によるアポトーシスに対するＴ細胞の感作（Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120）」、Nature 375: 497, 1995; デロッシ（DeRossi）ら、Virology 198: 234〜244, 1994によって開示されている。
繊維芽細胞におけるアポトーシスを測定する方法が、ボスベックら（Vossbeckら）、「ラット繊維芽細胞に対するTGF-βの直接的な形質転換活性（Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts）」、Int. J. Cancer 61: 92〜97, 1995; ゴルッピ（Goruppi）ら、「NIH 3T3繊維芽細胞のＳ期誘導に関係するc-mycドメインの解剖（Dissection of c-myc domains involved in S phaseinduction of NIH3T3 fibroblasts）」、Oncogene 9: 1537〜44, 1994; フェルナンデス（Fernandez）ら、「腫瘍壊死因子に対する、正常なC3Hマウス胚繊維芽細胞とHa-rasで形質転換したC3Hマウス胚繊維芽細胞の特異的な感受性：抵抗性細胞における、bcl-2とc-myc、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼの誘導（Differential sensitivity of normal and Ha-ras transfomed C3H mouse embryofibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells）」、Oncogene 9: 2009〜2017, 1994; ハリントン（Harrington）ら、「繊維芽細胞におけるc-Myc誘導のアポトーシスは、特異的なサイトカインによって阻害される（c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines）」、EMBOJ. 13: 3286〜3295, 1994; イトウ（Ito）ら、「アポトーシスに必要な新しい蛋白質ドメイン。ヒトFas抗原の突然変異解析（A novel protein domain required for aoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen）」、J. Biol. Chem. 268: 10932〜10937, 1993によって開示されている。
ニューロン細胞におけるアポトーシスの測定法が、メリノ（Melino）ら、「組織トランスグルタミナーゼとアポトーシス：ヒト神経芽腫細胞を用いた、センス鎖とアンチセンス鎖による形質転換実験（Tissue transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells）」、Mol. Cell Biol. 14: 6584〜6596, 1994;ローゼンバウム（Rosenbaum）ら、「培養したニューロンの、低酸素に誘導されるプログラムされた細胞死に関する証拠（Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons）」、Ann. Neurol. 36: 864〜870, 1994; サトウ（Sato）ら、「bcl-2による細胞死を予防した結果起きるPC12細胞の神経分化（Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2）」、J. Neurobiol. 25: 1227〜1234, 1994; フェラーリ（Ferrari）ら、「N-アセチルシステインのD型とL型立体異性体は、神経細胞のアポトーシス死を防止する（N-acetylcysteine D- and L-stereoisomers prevents apoptotic death of neuronal cells）」、J. Neurosci. 1516: 2857〜2866, 1995; タリー（Talley）ら、「ヒトのニューロン細胞における、腫瘍壊死因子αに誘導されたアポトーシス：酸化防止剤N-アセチルシステイン、bcl-2遺伝子およびcrmA遺伝子による予防（Tumor necrosis facvtor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crmA）」、Mol. Cell Biol. 1585：2359〜2366, 1995; ウォーキンショー（Walkinshaw）ら、「カテコールアミンが関与するPC12細胞における、L-DOPAによるアポトーシスの誘導（Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease.）」、J. Clin. Invest. 95: 2458〜2464, 1995によって開示されている。
昆虫細胞におけるアポトーシスの測定法が、クレム（Clem）ら、「昆虫細胞を感染したときの、バキュロウイルスの遺伝子によるアポトーシスの防止（Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells）」、Science 254: 1388〜1390, 1991; クルック（Crook）ら、「ジンクフィンガー様モチーフを有する、アポトーシスを阻害するバキュロウイルスの遺伝子（Anapoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif）」、J. Virol. 67: 2168〜2174, 1993; ラビザデー（Rabizadeh）ら、「バキュロウイルスのp35遺伝子の発現は、哺乳動物の神経細胞の死を阻害する（Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death）」、J. Neurochem. 61: 2318〜2321, 1993; ビルンバウム（Birnbaum）ら、「Cys/His配列モチーフを有するポリペプチドをコードする核多角体病ウイルスに由来するアポトーシス阻害遺伝子（An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs）」、J. virol. 68: 2521〜2528, 1994; クレム（Clem）ら、Mol. Cell Biol. 14:5212〜5222, 1994によって開示されている。
XVIII．遺伝子導入動物の構築
NAIP遺伝子の特徴を調べることによって、相同的組み換えによる、NAIPノックアウト動物モデルの作出に必要な情報が提供される。このモデルは、哺乳動物であるのが好ましく、マウスが最も好ましい。同様に、標準的な遺伝子導入技術によって、１個以上のNAIP配列をゲノムに組み込んで、NAIPを過剰産生する動物モデルを作成してもよい。
例えば、129/Sv系統（ストラタジーン社（Stratagene Inc.）、カリフォルニア州ラホヤ）のマウスなどに由来する同質遺伝子系のゲノミッククローンを用いて、ノックアウトモデルを作出するために用いることができる置換型のターゲティング・ベクターを構築することができる。このターゲティング・ベクターをエレクトロポレーションによって適当な細胞株に由来する胚幹（ES）細胞に導入し、NAIPを広範に削った形で有するES細胞系を作成する。キメラの始祖マウスを作成するために、標的となった細胞系をマウス胞胚期胚に注入する。ヘテロ接合の子孫マウスを交配してホモ接合体を得る。ノックアウトマウスにより、NAIP依存的な経路でアポトーシスを変える治療薬となる化合物をインビボでスクリーニングするための方法が提供されると考えられる。染色体上にNAIPのコピーが複数存在することにより、このようなマウスを作出するには、loxP部位を利用する必要がある（サワー（Sauer）およびヘンダーソン（Henderson）, Nucleic Acids Res. 17: 147〜61, 1989を参照のこと）。
実施例
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、いかなる意味でも、本発明を制約するものではない。
実施例
以下の実施例は、例示による説明をを目的とするもので、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1  ウェスタンブロット法および免疫蛍光法によって分析した、Rat-1、CHOおよびHela保存安定細胞系、ならびにアデノウイルス感染細胞におけるNAIPの発現
mycエピトープがタグ（tag）付加されたほぼ3.7kbのNAIP構築物を作製するために、(I)NAIPの2.5kbのBsu36Ｉ/SalＩ断片をブルースクリプト（Bluescript）にクローニングしたMTG-SP3.7、(ii)300bpのmycエピトープおよびNAIPの1.7kb断片を含む発現ベクターpcDNA3であるBsu36Ｉ/XhoＩ切断MTG-SE1.7、を結合させた。DNA 8μgを用いるリポフェクション（Gibco BRL）によってHeLa、CHOおよびRat-1にトランスフェクトし、細胞をそれぞれ250μg/ml、400μg/ml、および800μg/mlのG418中に維持することにより、G418耐性形質転換株を選別した。すべての細胞は、10％牛胎児血清を含むイーグル培地中にて維持した。アデノウイルスを構築するため、NAIPの3.7kbのBamHＩ断片を、アデノウイルス発現コスミドpAdex1CAwtのSwaＩ部位中にクローニングした。ベクターの産生、塩化セシウム二重勾配法による精製、および抗体価の測定は、ローゼンフェルト（Rosenfeld, M.A.）ら、1992、ならびにグラハム（Graham, F.L.）およびファン・デル・エプ（Van Der Eb, A.）ら、1973に記載された通りに実施した。
ウェスタンブロット分析は、マウス抗ヒトmycモノクローナル抗体（エリソン（Ellison）, M.J.およびホフストラッサー（Hochstrasser）, M.J. 1991）、またはウサギ抗ヒトNAIP（E1.0）ポリクローナル抗体を用いて実施した。NAIP抗体を産生するには、精製された細菌産生融合蛋白質を完全フロイントアジュバントとともに投与して、ウサギに免疫化を施した。GST蛋白質、および固定GST-NAIP融合蛋白質によって精製した抗NAIP免疫グロブリンを用いて、血清を前処理（pre-clear）した。
免疫蛍光法のためには、細胞をスライドグラス上で増殖させ、ホルムアルデヒド固定を10分間行い、0.3％Triton X-100（登録商標）を含むPBS中にて抗NAIP（1:200）または抗myc（1:20）抗体とともに1時間インキュベートした後、二次抗血清、FITC標識ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（アマーシャム社（Amersham））、ビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（アマーシャム社）およびストレプトアビジンテキサスレッド（登録商標）（アマーシャム社）とともにインキュベートした。
実施例2  血清除去、メナジオン、およびTNF-αによって誘導される細胞死に対するNAIPの効果
いずれのアッセイについても、細胞は5×104mlで各々3個ずつ平板培養した。CHOまたはRat-1細胞にはメナジオンを1.5時間投与し、PBSで5回洗浄した後、通常の培地中にて維持した。血清除去アッセイのためには、細胞をPBSで5回洗浄した後、牛胎児血清を含まない培地中にて維持した。HeLa細胞はTNF-α 20単位/mlおよびシクロヘキサミド30g/mlによる処置を17時間実施した。それぞれの刺激に関するアポトーシスを、ヨウ化プロピジウム染色により解析した。アデノウイルス感染細胞には、感染の36時間後に刺激を与えた。エリソン（Ellison, M.J.）およびホッホシュトラッサー（Hochstrasser, M.J.）、1991に記載された方法に従い、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドール-β-D-ガラクトシダーゼ（X-gal）によって、LacZの発現を組織化学的に確認した。PIANの転写は、製造者のプロトコール（ベーリンガーマンハイム（Boeringer Mannheim））に従い、DIG標識化センスオリゴヌクレオチドを用いるインサイチューハイブリダイゼーションによって判定した。ヒトBcl-2クローンpB4（ATCC）は、EcoRＩによって消化し、pcDNA3のEcoRＩ部位と結合させた。
アデノウイルスアッセイのため、LacZをコードするアデノウイルス、アンチセンスNAIP（NAIP）、または無挿入の単独のベクターを対照として用いた。細胞系アッセイでは、Bcl-2を陽性対照として、pcDNA単独を陰性対照として用いた。細胞の生存度は、トリパンブルー排出によって判定した。データは3つの個々の起源の遺伝子導入プールまたは感染株の平均として示した。
実施例3  ヒト脊髄組織の免疫蛍光分析
ヒト組織は、非神経性の原因によって死亡した2カ月齢の乳児の剖検時に入手し、-80℃で保存した。14μmのクリオスタット切片をホルムアルデヒド中で20分間固定し、PBSで洗浄した後にブロッキング溶液（PBS中に2％馬血清、2％カゼイン、2％BSAを含む）中にて15分間インキュベートした後、このブロッキング溶液で希釈した抗NAIP抗血清とともに一晩インキュベートした。二次抗血清として、CY-3標識ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（シグマ社（Sigma））を用いた。
実施例4  NAIP遺伝子の単離およびクローニング
PACコンティグアレイ
40G1 CATTサブローカス（subloci）が連鎖不平衡を示すことから、CATT領域を含むPACコンティグアレイが構築された。このPACコンティグアレイは9つのクローンを含み、長さは約400kbに及ぶ。遺伝子分析と物理的マッピングデータとを組み合わせることにより、SMAと最大の連鎖不平衡を示した40G1 CATTサブローカスマーカーが複製されており、重要なSMA区間（interval）の最も動原体側に位置することが示された。その結果、動原体終末部から10kb以内にCMS対立遺伝子を定義するSMA区間を含み、遠隔的に40G1 CATTを組み込むように伸長した154kbのPACクローン125D9を以降の検討のために選択した。
PAC 125D9上においてSau3AＩによる完全および一部消化（平均挿入サイズ5kb）を実施し、BamHＩによって消化したBluescriptプラスミド中に制限産物をクローニングすることにより、2つのゲノムライブラリーを構築した。ゲノムの塩基配列は、5kb挿入体の部分的Sau3AＩライブラリーからの200個のクローンの両端に関して、PACの大部分をカバーする連続して部分的に重複したゲノムクローンが構築されるように、（シェン（Chen）ら、1993）の様式によって決定した。これは、神経アポトーシス抑制性蛋白質の遺伝子構造を解明するための手段となることが明らかになった。
PAC 125D9を、NotＩ部位（これは後にアポトーシス抑制ドメインの起始部でPAC 125D9のエクソン7を二分することが示される）で30kbの動原体側断片と125kbのテロメア側断片とに切断する。NotＩによるPAC断片をPFGE調製物によって単離し、胎児脳cDNAライブラリーを探索するために別々に用いた。CpG島の存在をアッセイするために、コード配列を迅速に検出する手法である、NotＩ部位領域の物理的マッピングおよび塩基配列決定も実施した。また、PAC 125D9も、エクソントラップ系のテンプレートとして用い、これによって神経アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子に含まれるエクソンの同定がなされた。
コスミドアレイ（GA1およびL7などの）により、すでにハイブリダイゼーションによって同定された転写物の存在に加えて、多面的アプローチにより、神経アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子に含まれる6つのcDNAクローンが迅速に同定された。可能な場合には、これらのクローンを一部が重複したアレイとして配列させた。PAC 125D9の部分的Sau3AＩゲノムライブラリーに由来するクローンの配列によって、cDNAクローン末端が同一線上に存在することを検出することにより、多くの場合、キメラ性は除外された。
神経アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子のクローニング
5つのCATTサブローカスのいずれか一つを含むコスミド250B6の全ゲノムDNA挿入体を用いて、ヒト胎児脊髄cDNAライブラリーを探索した。これにより、2.2kbの転写物が検出され、GA1と命名された。連続したコスミド挿入体（コスミド40G1）のほか、このようなコスミドから単離した単一コピーのサブクローンを用いて、胎児脳ライブラリーをさらに探索した。L7と命名されたものを含む、多数の転写物が得られた。L7からはコード領域はまったく検出されず、これはおそらく、クローンの重要な部位が処理を受けていない異核RNAを含むとの事実によると考えられた。しかし、後になって、L7は神経アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子と考えられる部分を含むことが判明した。同じく、GA1転写物も最終的には神経アポトーシス抑制性蛋白質のエクソン13であることが判明した。GA1はエクソンを含み、それが発現する遺伝子であることがわかっているため、これは特に興味が持たれる。PACクローン125D9に含まれていたGA1転写物は、cDNAライブラリーのさらなる探索により、実質的に伸長された。
トラップされた2つのエクソンを用いて胎児脳ライブラリーを探索することにより、cDNAの残った間隙部も完全に埋められ、最終的な3'伸長が達成された。一部重複するクローンによるcDNAの物理的地図が作製された。全cDNA配列を表1に示したが、これは18個のエクソンを含む（1〜14aおよび14〜17）。アミノ酸配列は、ヌクレオチドトリプレットATGに対応するメチオニンから始まっている。
DNAの操作および分析
PACゲノムDNA挿入体のBamHＩ、BamHＩ/NotＩ、完全および部分的Sau3aＩ（5kb挿入サイズのために選択された）消化により、PAC 125D9挿入体を含む4つのゲノムライブラリーを構築し、Bluescriptベクターにサブクローニングした。チェン（Chen）ら（1993）の様式により、部分的Sau3AＩ消化ライブラリーからの205kbクローンの両端の約400bpの塩基配列を決定した。
チャーチ（Church）ら（1994）が記載したエクソン増幅手法により、PACからのコード配列を単離した。BamHＩまたはBamHIIIおよびBglIIによってPACを消化し、pSPL3にサブクローンした。それぞれのPACの保存したクローンをCOS-1細胞に形質移入した。24時間の形質移入の後に全RNAを抽出した。エクソンはpAMP10（Gibco, BRL）にクローニングし、プライマーSD2（GTG AAC TGC GTG ACA AGC TGC）を用いて塩基配列を決定した。
DNA塩基配列の決定は、ABI 373A自動DNAシークエンサーを用いて実施した。候補転写物の単離には、ラムダgt（ストラタジーン社（Stratagene））およびラムダZAP（クロンテック社（Clontech））で構築された2種類の市販のヒト胎児脳cDNAライブラリーを用いた。ノーザンブロットは商業的に実施し（クロンテック社（Clontech））、探索は標準的手法を用いて実施した。
一般的に、PCRに関する論文に用いられているプライマーは60℃のTmのために選択されており、以下の条件で用いることができる：94℃60秒、60℃60秒、72℃90秒を30サイクル。PCRプライマーのマッピングは図面の凡例および説明文に記した通りである。プライマー配列は以下の通りである：
0004005135.tif 000002
SMAに関する本発明者らの遺伝的およびマッピングによる分析により、154kbの挿入体であるPAC 125D9がSMA遺伝子の可能性が高い部位として同定された。本発明者らは、本明細書において、NAIPおよびSMNtelの両方のほかに、基本転写因子遺伝子BTF2p44のコピーの3'端も含む、PAC 125D9挿入体の131kb部分の完全DNA塩基配列を報告する9。種々の制限酵素で消化したPAC 125D9挿入体を用いて、9つのライブラリーを作製した。Sau3AＩライブラリーから得たクローンのショットガン配列決定は、その領域がAluに富むことが妨害因子となるため、トランスポゾンに基づく改変手法10によって塩基配列を決定し、図示した配置を得た。NAIPおよびSMNtelの遺伝子は、15.5kbずつに分けられ、テイル・ツー・テイル（tail to tail）（5'→3'：3'←5'）配向を有し、ゲノムDNAではそれぞれ56kbおよび28kbの長さを有する。5q13.1上には遺伝子BTF2p44の多数のコピーが存在する10。BTF2p44の一つのコピーのエクソン11〜16は、PAC挿入体の5'側の11kbの大部分を占め、続いてNAIPエクソン2の前に11kbの区間がある。本来報告された第1のNAIPエクソン3は、このPACには存在せず、異核性のアーチファクトである可能性もある。NAIPとSMNとの間にある15.5kbの区間内の約3kbの区域（CCA、図）は、転写はされるが蛋白質コード配列は含まない。事実、すべての区間を通じて、BTF2p44、NAIPおよびSMN以外のコード配列は同定されなかった。
CpG島は、SMNおよびNAIPの遺伝子の両方の5'領域中に同定された。131kb配列中に145個のAlu配列が同定され、高密度の5つのクラスターが認められた（図面の説明を参照）。L1の不足（5コピー）を伴うこのようなAluの密度は、ライトギムザ染色（または逆の）染色体バンドに関する以前の所見と一致する11。Sequinプログラムによって検出されるような、その他の反復部（例えば、MIR2、MSTおよびMER）のコピーも図示した12。異常な1および2ヌクレオチド反復のほか、SMA領域にあることが以前マッピングされた多型ミクロサテライト座（CMS113、CATT14またはC16115、C17115、C27215またはAG-116,17）も示した。
全長のNAIP cDNA（6228bpで、4212bpのORFを伴う）も、cDNAシークエンシングおよびPAC配列との比較によって解明され、1403アミノ酸を含む予想された156kDaの蛋白質をコードする17のエクソンを備えていた（データは示していない）。本来のエクソン14と15との間に存在する新規なNAIPエクソン14が同定された。本来のエクソン17は、停止コドン、1.6kbの3'UTR領域、および3'RACEによって同定される、ポリアデニル化コンセンサス部位（AATAAA）を含む新規なエクソンによって置換されていた。NAIP遺伝子には新たな蛋白質ドメインは見いだされなかった。
1型SMAの染色体上にどれだけの長さの欠失があるかを厳密に定義することが、疾患の原因を理解するためには最も重要である。1型SMAの染色体上に最も高い頻度で観察される遺伝型（すなわち、NAIPエクソン4および5のほか、SMNtelエクソン7および8の欠失）が単一の事象の結果であれば、本発明者らの塩基配列決定から、最小欠失サイズが60kbであることが示唆される。CATT-40G1の1型SMAの染色体上で欠失の頻度が高いこと14は（これはNAIPエクソン7と8との間にマップされる）、このような欠失の存在と一致する。
NAIP cDNAによって探索したゲノムDNAのサザンブロットにより、5q13.1のこの遺伝子座に種々の形態の多型が存在する結果として、各バンドの多様性が示された3,18。これに対して、SMN cDNAで探索した同じブロットでは、完全なSMN座と関連したバンドのみが、SMAの個体でも非SMAの個体でも同様に認められた。従って、NAIP遺伝子に関してみられたような、切断または部分的欠失のあるSMA遺伝子に関する証拠は得られなかった。SMA患者において検出しうるSMA接合部断片が存在しなかったことは、SMA症例の著しく多数に検出されたSMNtelエクソン7および8の欠失には全SMNte1遺伝子が組み込まれ、このため推定上の最小の1型SMA欠失は約100kbに及ぶことを強く示唆する（図）。これは1型SMAの染色体上でC272（またはAG-116,17）のミクロサテライト（SMNエクソン1にマップされている、図）が高い頻度で欠失していることと一致する15。臨床的重症度を考慮しない全SMA症例で観察された、BTF2p44の1つのコピーの欠失頻度は15％であり9、この変異は推定上のSMA-NAIP欠失の伸長ではないことが示唆された。この問題の解決には、p44のどのコピーが欠失しているかに関する詳細を待つ必要がある。
本発明者によるPAC 125D9のシークエンシングにより、本来のNAIPの遺伝子座、および臨床的に関連したSMNtelが1型SMAの染色体（すなわち、CATT-40G114、C27215またはAG-116,17）の著しく多数で優先的に欠失しているミクロサテライト多型を含む100kb領域にあることがマップされた。この区間にNAIPおよびSMN以外のいかなる蛋白質コード配列も存在しなかったことは、1型SMAの重要な調節因子としてのこれらの2つの遺伝子に注意を喚起するものである。考えられる一つの病因モデルは、SMNtelの不在が主要な神経毒性障害として作用し19、NAIPの枯渇／不在が共存することによって、アポトーシス抵抗性の減弱5,6を招き、運動ニューロンの減少を悪化させるというものである。また、付加的なSMNcenの存在が、この疾患の経過を変調させるように作用する可能性もある20。本明細書に提示した配列は、急性SMAの原因に対する理解を助けることに加え、両方の遺伝子に関する転写制御要素の研究にも有用と考えられ、この破壊的な神経筋疾患に対する遺伝的治療法の処方もおそらく促進させると思われる。
DNAシークエンシング
PAC 125D9挿入体から、部分的なSau3AＩ（3〜5kbの範囲に選択された）、BamHＩ、EboRＩ、HindIII、PstＩ、SstＩ、XbaＩ、およびEcoRＶによるライブラリーを作製し、トランスポゾンに基づく方法を用いて（TN1000Gold Biotechnology10）塩基配列を決定した。市販されているpMOBプラスミドへの多数の挿入物のサブローニングには問題があることが判明し、このためpUC18およびpBluescript SKを用いた。一般的に、クローンの10％未満がベクター内にトランスポゾンを保有していた。本発明者らが改変した熱浸漬プロトコール21により、配列決定用テンプレートとして大腸菌溶解物を用いた。シークエンシングは、標的DNAに無作為に挿入したTN1000トランスポゾンから、反対方向のプライマー（5'-ATA TAA ACA ACG AAT TAT CTC C-3'5'-GTA TTA TAA TCA ATA AGT TAT ACC-3'）を用いて、Alu反復部の300bpを容易に上回る、5bpの重複部を有する約1kbの配列を作製して行った。本発明者らの手法では、14kbの大きさの挿入部の配列決定が可能である。
SMA領域は不安定であることが知られているため、完全で変化のないPAC挿入物を確実に得るために、主にサザンブロット上でのPAC 125D9挿入物とゲノムDNAとのハイブリダイゼーションパターンの対比により、特別な注意を払った。
本発明者らの自動シーケンサー（ABI 373およびABI 373A）によって得られたDNA配列の生データを処理し、Sequencher 3.0プログラム（ジーンコード社（Gene Codes Inc.））、およびStadenパッケージ27からのGAP4プログラムによって平行に配置した。編集結果は自動的にGCGフォーマットに変換され22、外部の利用者が本発明者の電子メールサーバーである「smafasta@mgcheo.med.uottawa.ca」を用いて検索を行えるように別々のデータベースに収めた。蛋白質コード配列のスクリーニングのためにはGRAIL28およびBlast20による検索を採用し、蛋白質ドメインを検索するためにはPROSITEデータベース24を用いた。
実施例5  NAIP発現ベクター
同定されたNAIP配列情報を用いて、mycエピトープによるタグ付加を施した全長の3.7kbのNAIP構築物を作製するために、(I)NAIPの2.5kbのBsu36Ｉ/SalＩ断片をBluescriptにクローニングしたMTG-SP3.7、(ii)300bpのmycエピトープおよびNAIPの1.7kb断片を含む発現ベクターpcDNA3であるBsu36Ｉ/XhoＩ切断MTG-SE1.7、を結合させた。DNA 8μgを用いるリポフェクション（ギブコ（Gibco）BRL）によってHeLa、CHOおよびRat-1にトランスフェクトし、細胞をそれぞれ250μg/ml、400μg/ml、および800μg/mlのG418中に維持することにより、G418耐性の形質転換株を選択した。
第2の手法では、細胞にアデノウイルス単独、またはNAIP、アンチセンスNAIP、もしくはLacZを発現しているアデノウイルスを感染させた。アデノウイルスの構築のために、NAIPの3.7kbのBamHＩ断片を、アデノウイルス発現コスミドpAdex1CAwtのSwaＩ部位にクローニングした。アンチセンスNAIP RNAは、開始コドンを含むmRNAの領域と相補的な配列を含む。NAIPの発現は、ウェスタンブロット分析および蛍光抗体法の両方の手法によって確認した。組換えアデノウイルスを感染させた後、血清除去によってCHO細胞にアポトーシスを誘導させたところ、48時間後の生存率は、48％（挿入せず）、51％（LacZ）および45％（アンチセンスNAIP）であった（図1a）。これに対して、NAIPを発現しているアデノウイルスを感染させたCHO細胞は78〜83％の生存率であった。また、NAIPは、安定的にトランスフェクションを受けたCHO保存系でも、アデノウイルス感染細胞の場合よりは幾分低いが、やはり高い生存率をもたらした。すなわち、48時間後の生存率は、ベクター形質移入体では44％、NAIP遺伝子導入株では65％であった（図1b）。次に、20μMメナジオン（フリーラジカルの強力な誘導因子）を投与したCHO細胞ではNAIPの過剰発現が起こり、その結果、24時間後の生存率は対照と比べて20〜30％増加した（図1c、1d）。また、NAIPの過剰発現には、メナジオンを投与されたRat-1線維芽細胞を細胞死から保護する効果もあった（図1e、1f、1g）。LacZを発現しているアデノウイルスに感染した細胞では12時間後の生存率はわずかに15％であり、これに対してNAIP感染細胞は80％であったが、この効果は保存Rat-1 NAIP遺伝子導入株でも検出された。より低いメナジオン濃度（5μM）ではNAIP過剰発現によってさらに高い生存率が得られ、24時間後には保存NAIP遺伝子導入株の98％および対照群の遺伝子導入株の33％が生存していた（図1g、1h）。また、サイトカインTNF-αに曝露した細胞に対するNAIPの保護作用も評価した。TNF-αおよびシクロヘキサミドを投与したHeLa細胞は、高いレベルのNAIPを発現しているアデノウイルスを感染させた場合には、48時間後にもアポトーシスに対する防御を示したが（139％）、この効果はアンチセンスNAIPでは認められなかった（52％）。同様の効果は保存Hela形質変換細胞でも認められなかった。
アポトーシス誘導因子を与えた後も生存した細胞がNAIPを発現したことを確かめるため、多数の細胞死アッセイ系に対して抗NAIP抗血清を用いる免疫蛍光法を実施した。免疫蛍光法は、求める蛋白質に対して特異的な抗体、および蛍光顕微鏡を用いることによって、光顕下に細胞内の蛋白質の位置を調べる技術である。色素を、求める蛋白質に対して特異的な精製抗体に対する抗体と化学的に結合させることもできる。この蛍光色素・抗体複合体を透過化処理細胞または組織切片に添加すると、求める抗原抗体と結合し、励起波長の照射によって発光する。また、蛍光抗体を可視化のために培養細胞内に注入してもよい。免疫蛍光法を用いうる場合には、赤色光を発する色素であるCY-3を、結合した抗NAIP抗体を検出するための二次抗体と結合させる。NAIP発現細胞が極めて多数観察され、NAIPの細胞質分布には変化は認められなかった。これらのデータは、NAIPのアポトーシス抑制活性を強く指示する。
実施例6  NAIP抗体を用いたNAIPの細胞分布
NAIP転写物がヒト脊髄に存在することは、逆転写PCR分析によって以前に示されている（ロイ（Roy）ら、The gene for NAIP, a novel protein with homology to baculoviral inhibitor of apoptosis, is partially deleted in individual with spinal muscule atrophy. Cell 80:167〜178（1995））。NAIPの細胞分布をさらに正確に規定するために、NAIPに対するポリクローナル抗体を作製した。続いて、この蛋白質の細胞内分布および組織特異性を確立するために、細胞および組織中の蛋白質を直接可視化することを目的に、NAIP抗体を免疫組織化学法および免疫蛍光法の両方に用いた。
NAIPの検出に関するポリクローナル抗体の能力は、myc標識NAIPを形質移入した細胞への、抗NAIPおよび抗Myc抗体の両方を用いる免疫蛍光法のほか、これらの細胞の蛋白質抽出物に対するウェスタンブロット分析によって確認した（図1）。ウェスタンブロット法では、蛋白質をポリアクリルアミドゲル中で泳動させた後、ニトロセルロース膜に移行させた。続いて、（一次）抗体の存在下でこれらの膜をインキュベートし、洗浄した後、蛋白質・一次抗体複合体を検出するための二次抗体とともにインキュベートした。繰り返し洗浄した後、比色法または化学発光法を用いて、すべての複合体を可視化した。両方の抗体を用いるウェスタンブロット法で期待される分子量の蛋白質を検出し、その細胞内共存を蛍光抗体法によって示した。抗NAIPで染色したヒト脊髄切片では、前角細胞および中間外側ニューロンの細胞質に強い免疫反応がみられた（図3aおよび3b）。運動ニューロン染色の場合と同じく、NAIP反応性は、運動ニューロン軸索を含む後根には認められたが、知覚神経軸索を含む後根では認められなかった（図3cおよび3d）。運動ニューロン染色による観察結果は、SMAの原因におけるこの蛋白質の役割と相関している。しかし、SMAにおいて障害を来すとの報告のない中間外側ニューロンにNAIPが存在したことは、神経細胞の2つのクラスの間でアポトーシス経路が異なることを意味する。
その他の態様
別の態様において、本発明は、図6および7（配列番号:22および24）で提供されている、哺乳動物のNAIPポリペプチドと実質的に同じ蛋白質を含む。この相同蛋白質には、他の実質的に純粋な天然の哺乳動物NAIP蛋白質ならびに対立遺伝子変異体；自然突然変異体；誘発突然変異体；蛋白質をコードするDNA配列が含まれ、また、高厳密度条件下でまたはあまり好ましくはないが低厳密度条件下（例えば、少なくとも40ヌクレオチドの長さのプローブを用いて2×SSC中400Cで洗浄する）で、図6および7（配列番号:21および23）のNAIP DNA配列にハイブリダイズするDNA配列；NAIPポリペプチドに対する抗血清が特異的に結合する蛋白質も含む。この語はまた、NAIP部分を含むキメラポリペプチドも含む。配列番号:1の配列およびIAP蛋白質は、特異的に排除される。
本発明は、さらに、天然のNAIPポリペプチドの類似体を含む。アミノ酸配列の違いか、翻訳後修飾、または、その両方によって、類似体は、天然のNAIPと異なっている。本発明に係る類似体は、天然のNAIPアミノ酸配列のすべてまたはその一部と、一般的には85％以上、より好ましくは90％、最も好ましくは95％か、さらに99％の一致を示す。配列を比較する長さは、少なくともアミノ酸残基15個、好ましくは少なくとも25アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも35アミノ酸残基の長さである。修飾には、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、または、グリコシル化などの、インビボまたはインビトロでのポリペプチドの化学誘導が含まれ；このような修飾は、ポリペプチド合成の間、または単離した修飾酵素で処理する過程もしくは処理した後に起こる。また、類似体は、初期の配列が変更されることによって、天然のNAIPポリペプチドと異なることがある。これらには、天然の、または、誘導された遺伝的変異体（例えば、放射線照射または硫酸エタンメチル（ethanemethylsulfate）に曝したり、「サンブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第二版、CSH出版、1989、または、「アウスーベル（Ausubel）ら、前掲」で説明されている部位特異的な突然変異誘発によって、ランダムに突然変異が誘発された結果できたもの）が含まれる。環状化されたペプチド、分子、L型アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ型アミノ酸、またはＢもしくはＹアミノ酸などの天然には存在しないかまたは合成したアミノ酸を含む類似体も含まれる。全長ポリペプチドに加えて、本発明には、また、NAIPポリペプチド断片も含まれる。本明細書で用いられるとき、「断片」という語は、20個以上の連続したアミノ酸、好ましくは、30個以上の連続したアミノ酸、より好ましくは、50個以上の連続したアミノ酸、最も好ましくは、60個から80個またはそれ以上の連続したアミノ酸を意味する。NAIPポリペプチドの断片を、当業者に知られている方法によって作成することができ、または、蛋白質の通常のプロセッシングによってできるかもしれない（例えば、生成したポリペプチドから生物活性に必要でないアミノ酸を取り除くこと、選択的スプライシング、選択的な蛋白質プロセッシング過程）。
本発明に係る好ましい断片または類似体とは、診断すべき試料の中から、NAIPの核酸配列またはアミノ酸配列の特異的な検出を容易にするものである。この目的のために、特に有用なNAIP断片には、制約はないが、表2に示されているアミノ酸断片が含まれる。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：UNIVERSITY OF OTTAWA
（B）街路名：650 CUMBERLAND
（C）市名：OTTAWA
（D）州名：ONTARIO
（E）国名：CANADA
（F）郵便番号：K1N 6N5
（G）電話：（613）562-5841
（H）ファックス：（613）562-5730
（I）テレックス：0533338
（ii）発明の名称：神経アポトーシス抑制性蛋白質（NAIP）の使用
（iii）配列数：27
（iv）コンピューター読み取りフォーム：
（A）メディア形式：Floppy disk
（B）コンピューター：IBM PC compatible
（C）運転システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPO）
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：5502塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：１：
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（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：6133塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：２：
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（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：３：
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（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：４：
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（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：５：
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（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：６：
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（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：７：
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（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：８：
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（2）配列番号：９：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：９：
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（2）配列番号：１０：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
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（2）配列番号：１１：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
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（2）配列番号：１２：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：27塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
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（2）配列番号：１３：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
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（2）配列番号：１４：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１４：
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（2）配列番号：１５：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
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（2）配列番号：１６：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
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（2）配列番号：１７：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
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（xi）配列の記載：配列番号：１７：
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（2）配列番号：１８：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
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（2）配列番号：１９：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
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（2）配列番号：２０：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
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（2）配列番号：２１：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：6124塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
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（2）配列番号：２２：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1403アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
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（2）配列番号：２３：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：6228塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
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（2）配列番号：２４：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1403アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
0004005135.tif 000043
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（2）配列番号：２５：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
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（2）配列番号：２６：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
0004005135.tif 000051
（2）配列番号：２７：の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）他の核酸の説明：/desc=”PRIMER”
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
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【図１Ａ】
0004005135.tif 000053
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0004005135.tif 000075
【図５Ｃ】
0004005135.tif 000076
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0004005135.tif 000087
【図６Ｃ】
0004005135.tif 000088
【図６Ｄ】
0004005135.tif 000089
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
0004005135.tif 000093
【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0004005135.tif 000096
【図７Ｃ】
0004005135.tif 000097
【図７Ｄ】
0004005135.tif 000098
【図７Ｅ】
0004005135.tif 000099
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
0004005135.tif 000102
【図７Ｉ】
0004005135.tif 000103
【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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