(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびサブグループＢの両方を中和するヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片であって、受託番号ＡＴＣＣ６９０７２を有するクローンによって産生される抗体のＦａｂ断片である、上記ヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片。
【請求項２】
Ｆａｂ断片のＨ鎖が以下の配列：
ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）
で示されるＣＤＲ３ポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片。
【請求項３】
呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むことが疑われる試料を診断的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体Ｆａｂ断片と接触させ、モノクローナル抗体Ｆａｂ断片が試料と結合するか否かを決定することを含む、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のインビトロ検出方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体Ｆａｂ断片が放射性同位体および常磁性標識からなる群から選択される標識で検出可能なように標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体Ｆａｂ断片が放射性同位体、蛍光物質、コロイド状金属、化学発光物質、生物発光物質および酵素からなる群から選択される標識で検出可能なように標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体Ｆａｂ断片が固相に結合されている、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
薬剤学的担体中に免疫治療的有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体Ｆａｂ断片を含む、ヒトの呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）疾患に受動免疫治療を提供するためのヒト投与用の医薬組成物。
【請求項８】
受動免疫治療が予防的に提供される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記疾患が肺炎および細気管支炎からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
投与が気道によりまたは非経口的に行われる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
気道投与が肺エアゾールによって行われる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
肺エアゾールが直径約５μｍより小さい粒子を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
液体として投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
液体が気管支鏡または人工通気管を用いて投与される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
非経口投与が皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮または静脈内注射により行われる、請球項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
非経口投与が漸次灌流により行われる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
漸次灌流が静脈内または蠕動手段により行われる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
免疫治療的有効量が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫治療的有効量が約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇである、請求項７に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫治療的有効量が約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである、請求項７に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒト気道の管腔表面で増殖することのできる呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と特異的に結合し、これを阻害するヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片であって、受託番号ＡＴＣＣ６９０７２を有するクローンによって産生される抗体のＦａｂ断片の肺エアゾールを免疫治療的有効量含む、宿主におけるＲＳＶ粘膜疾患に受動免疫治療を提供するための宿主投与用の医薬組成物。
【請求項２２】
前記宿主がヒトである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｆａｂ断片のＨ鎖が以下の配列：
ＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）
で示されるＣＤＲ３ポリペプチド配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むことが疑われる試料中のＲＳＶの検出に用いるキットであって、請求項１に記載のモノクローナル抗体Ｆａｂ断片を含む容器を含み、１以上の容器を厳重に拘束した状態で収納すべく区画化されたキャリア手段を含んでなるキット。
【請求項２５】
ＲＳＶに対する結合親和性が約４ｘ１０8Ｍ-1である、請求項１に記載のモノクローナル抗体Ｆａｂ断片。
【請求項２６】
１本鎖抗体のＦａｂ断片である、請求項１に記載のモノクローナル抗体Ｆａｂ断片。
【発明の詳細な説明】
本願は、１９９２年９月１６日出願の米国特許出願第０７／９４５，５１５号の一部継続出願である。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は一般には免疫学の分野に関し、特に呼吸合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）と結合してこれを中和するヒトモノクローナル抗体に関する。
２．関連技術の記載
ＲＳＶは小児気道の主要なウイルス病原体であり、肺炎および細気管支炎の主因であった。米国だけでも重症または致死的ＲＳＶ疾患を発症する危険性の高いかなり多数の幼児および子供（約１０万〜２０万人）がいる。危険性の高い者には気管支肺形成障害、先天性心臓疾患、嚢胞性繊維症、腫瘍または各種の免疫不全をもつ幼児や子供、ならびに骨髄移植前の免疫抑制された成人を含む（例えば、Mclntosh and Chanock(1990）Virology, 2nd edn.（Fields and Knipe編集）Raven Press, Ltd., New York, pp. 1045-1072）。
抗体がＲＳＶ感染と疾患に対する耐性を媒介することがいくつかの証拠により示されている。第１に、重症疾患の危険性が高い場合には、ＲＳＶに対する母親のＩｇＧ抗体濃度と、生後数カ月間の幼児の感染に対する耐性との間に相関がある（Ogilvie et al., J. Med. Virol., 7:263, 1981）。第２に、高濃度のＲＳＶ中和抗体を含む回収されたヒトＩｇＧまたはＲＳＶ中和性マウスモノクローナル抗体は、予防的に投与すると肺感染から小動物を保護し、また治療的に投与すると最高のＲＳＶ感染にある小動物や実験霊長類の肺の中のウイルス力価を低下させることができる（Walsh et al., Infectin and Immunity, 43:756, 1984; Prince et al., J. Virol., 55:517, 1985; Prince et al., Virus Research, 3:193, 1985; Prince et al., J. Virol., 63:1851, 1987;Hemming et al., J. Int. Dis., 152:1083, 1985）。第３に、高力価のＲＳＶ中和抗体を含む回収されたヒトＩｇＧの臨床研究により、これらの抗体が幼児および小さい子供の重症のＲＳＶ疾患に治療的効果を示すことができるという予備的示唆を提供した（Hemming et al., Antimicrob. Agnts. Chemotherap., 31:1882, 1987）。これが証明されれば、重症疾患の危険性の高い幼児を保護するための免疫予防と治療のために、また重症のＲＳＶ下部気道感染の場合の治療のために、ＲＳＶに対する中和抗体を開発することは極めて興味深い。
現在のところ、利用できるＲＳＶワクチンはまだない。現在予防的有効性が評価されている方法は、回収された血漿から調製されたヒトＩｇＧを定期的に静脈接種しなければならない。必要とするグロブリンが大量（１ｋｇ当たり１〜２ｇ）であること及び、この物質を秋、冬および初春の間、毎月２〜４時間にわたって診療所または病院で静脈内投与する必要性のために、この方法は極めて実用的でない。
ＲＳＶビリオンの表面上の主な中和抗原は主要糖タンパク質Ｆ（ウイルス融合）およびＧ（付着）である。免疫アフィニティー精製されたＦまたはＧ糖タンパク質に対して調製された単一特異性抗血清は、ＲＳＶを高い有効性で中和する（Walsh et al., J. Gen. Microbiol., 67:505, 1986）。Ｇではなく、Ｆに対する抗血清もまた、ＲＳＶ−感染細胞の、近隣非感染細胞への融合を阻害する。
回収されたヒト血漿調製物よりも大きな特異的活性をもつヒトＲＳＶ抗体調製物を開発する必要性がある。この問題を有効に解決する可能性としては、ＲＳＶに対するヒトモノクローナル抗体の利用があるであろう。ポリクローナル抗血清とは対照的に、ＲＳＶ−特異的モノクローナル抗体はその性質上、高濃度の特異的抗体を含む。したがって、モノクローナル抗体の使用は予防または治療に必要とするグロブリンの量を数桁の規模で減少するであろう。その結果、有効量のモノクローナル抗体を長期にわたって静脈内（ＩＶ）よりもむしろ筋肉内（ＩＭ）投与できる。危険性の高い幼児の予防には抗体を病院でＩＶ投与する必要がなく、家庭でＩＭ投与できる。治療に必要とするグロブリンの量の減少は、初期の軽症のＲＳＶ下部気道疾患をもつ患者に抗体をＩＭ投与して治療することにより入院を避けることもできる。さらに、モノクローナル抗体の特異的活性の増加と、それに伴う必要な治療濃度の減少、ならびにこのような抗体を肺に直接導入するときの治療有効性の増加により、エアゾール治療が可能となる。実際、エアゾール投与には、ＲＳＶモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）2断片で十分である。有用な抗体調製物は、これらの抗原サブグループＡおよびＢの両者を含む広範なＲＳＶ単離物を中和することもできる。これらＡおよびＢの２つのサブグループは、時期によってさまざまな比率で集団の間を同時に循環し、Ｆ糖タンパク質では５０％、Ｇ糖タンパク質では１−５％関連すると推定されている（Mclntosh and Chanock，上掲）。
過去数年間で、これまでの方法を２つの点で変更することによりＲＳＶ感染に対する局所的免疫療法の有効性が増加した。第１に、この糖タンパク質の主要保存中和エピトープに対するＲＳＶ  Ｆマウスモノクローナル抗体の混合物がコットン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットにおけるＲＳＶ感染の局所的免疫療法に有効であることが示された。第２に、ＲＳＶポリクローナル抗体を小顆粒エアゾール（２μｍ以下）で直接肺内に送達することも治療的に有効であった。モノクローナル抗体の使用は、治療に必要なＩｇＧの量を少なくとも２桁の規模で減少するはずである。コットンラットを用いる別の研究で、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）抗体も気道に直接投与すると治療的であることが示された。局所的免疫療法の有用性はＲＳＶに限定されない。このアプローチは、病原体の影響が下部気道の管腔に並ぶ細胞に限定されるその他の呼吸性ウイルス病原体にも有効であるだろう。
発明の概略
本発明は、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびＢと結合してこれを中和するヒトモノクローナル抗体、ならびにこれらモノクローナル抗体を産生する細胞系統を提供する。本発明はさらに、これらモノクローナル抗体のパラトープに中和機能を付与し、ＲＳＶと特異的に結合してこれを中和するその他の抗体を同定するために免疫原性的に使用しうるアミノ酸配列を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、ＲＳＶ疾患の診断および免疫療法用試薬として特に有用である。
本発明のモノクローナル抗体の主な利点は、これらがヒトポリヌクレオチド配列によってコードされるという事実による。したがって、本発明のモノクローナル抗体をＲＳＶ疾患の診断および免疫療法にインビボで使用すると、異種またはキメラ由来のモノクローナル抗体が使用されるときに通常遭遇する問題である、受動投与された抗体に対するかなりの宿主免疫応答の問題を大いに減少する。
本発明の抗体は、肺に直接投与するとＲＳＶ疾患の改善に特に有効である。驚くべきことに、Ｆａｂ断片でこのことが事実であることが見いだされた。ＲＳＶ抗体を直接肺に局所送達することは、ＲＳＶ疾患の治療に抗体を非経口投与するよりも大きな利点をもつ。前者の経路で送達される抗体は治療において８０−１６０倍有効であり、これによって治療に必要な抗体の量を８０−１６０の係数で減少する。治療に必要な抗体の量をさらに減少することは、ヒトモノクローナル抗体または“ヒト化”マウスモノクローナル抗体を用いることにより達成され、その結果、治療に必要な量をさらに２５−５０の係数で減少することができる。このことは、ＲＳＶ感染の処置にモノクローナル抗体を肺に直接投与すると、非経口処置で治療するために必要な抗体の全体量を２０００−８０００の係数で減少することができることを意味する。呼吸ウイルス感染に対してＦａｂ断片をインビボで使用できることは、抗体分子全体を用いるのに比べて以下の有意な利点を有する：（１）組織浸透性が大きい；（２）Ｆｃと関連する炎症などのエフェクター機能を回避する；及び（３）迅速なクリアランス。
呼吸ウイルス感染の治療におけるＦａｂ断片のインビボ治療の有効性は以下の事実からすると驚くべきことであり、予期せぬことである：（１）Ｆａｂは非共有結合性であり、単一の部位に結合することができるのみであり、したがってウイルス中和のために通常必要と考えられる別のウイルス粒子とのクロスリンクが排除されること；および（２）補体カスケード及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響するためにはウイルスクリアランスにＦｃ部分が必要であると考えられてきたこと。ＲＳＶと特異的に結合するＦａｂ断片の肺投与がＲＳＶ感染の改善に有効に使用しうるという予期せぬ知見に基づいて、インビボでのウイルス増殖が気道の管腔表面で起こるあらゆるウイルス感染にこの教示を広く適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラムダＨｃ２発現ベクターを示す。
図２は、Ｌｃ２発現ベクターを示す。
図３は、ｐＣｏｍｂ組み合わせファージミドベクターの模式構造を示す。
図４は、クローン１３、１９、１１、および無作為に選択されたその他の４つのクローンのＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインを示す。
図５ａは、ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサー要素（ｈＣＭＶ  Ｐ／Ｅ）の転写制御下にシグナルペプチド（ｓ．ｐ．）と融合させたカッパＬ鎖の発現に用いるベクターを示し、ポリアデニル化はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）によって提供される。このプラスミドはＣｏｌＥ１複製起点（ｏｒｉ）と大腸菌中での選択用のアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）とをもつ。シグナルペプチドをコードするＤＮＡリンカー配列および成熟タンパク質の最初の３つのＮ末端アミノ酸（１文字表記）を下に示す。矢印はシグナルペプチド切断部位を示す。３番目のアミノ酸は用いるリンカーによりＱまたはＥである。ＳａｃＩ部位はｐＥＬ  １０  ＣＱで破壊されるので、これをカッコに示す。
図５ｂは、ＩｇＧｌ  Ｈ鎖の発現に用いるベクターであるｐＥＨ．１０Ｃを示す。不変部へのクローン化Ｆｄの融合に用いたＣγ１ドメインのＢｓｔＥII部位を示す。Ｌ鎖構築物の特徴に加えて、このベクターは真核細胞での選択用ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）遺伝子をもつ。
発明の詳細な説明
本発明は、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抗原性サブグループＡおよびＢに特異的かつこれを中和するヒトモノクローナル抗体に関する。本体発明の好ましい態様では、ＲＳＶの糖タンパク質Ｆのエピトープポリペプチド配列と結合することのできるヒトモノクローナル抗体を開示する。また、これらの抗体によってウイルスが結合されたときにＲＳＶの中和を付与するアミノ酸配列を開示する。この特異性はヒトモノクローナル抗体および同様の特異性を有するヒトモノクローナル抗体をＲＳＶ疾患の診断および免疫療法に用いることを可能にする。
”ＲＳＶ疾患”の用語は、ＲＳＶによって直接または間接に引き起こされるすべての疾患、ならびにＲＳＶによる感染に患者をかかり易くする疾患を意味する。前者の範疇に入る疾患の例には、肺炎および細気管支炎を含む。後者の範疇に入る疾患（すなわち、患者を重症のＲＳＶ感染の危険にさらすような疾患）には、嚢胞性繊維症、先天性心臓疾患、癌、および一般に臓器移植を受ける患者や未熟児のような免疫抑制状態または免疫系の機能低下の段階を引き起こすすべての症状を含む。
ある面においては、本発明はＲＳＶ中和部位と反応性である組み合わせ由来のヒトモノクローナル抗体、およびこのような抗体を産生する細胞系統に関する。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系統の単離は、興味の対象であるモノクローナル抗体の一次反応パターンの決定ができる慣用のスクリーニング法を用いて実施できる。したがって、試験すべきヒトモノクローナル抗体がＲＳＶの抗原性サブグループＡおよびＢと結合してこれを中和するならば、試験すべきヒトモノクローナル抗体と本発明の細胞系統によって産生されるヒトモノクローナル抗体とは均等である。
また、過度の実験を行うことなく、あるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体のＲＳＶへの結合を妨げるか否かを確認することによって、前記のあるヒトモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性をもつかを決定することができる。もし、試験すべきヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合を減少させることによって示されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合するならば、これら２つのモノクローナル抗体は、同じかまたは密接に関連するエピトープと結合する可能性が高い。あるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性をもつか否かを決定する更に別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体とこれが通常反応性であるＲＳＶとを前培養し、次いで試験すべきヒトモノクローナル抗体を加えて、試験すべきヒトモノクローナル抗体がＲＳＶへの結合能力において阻害されるかを決定することである。もしも試験すべきヒトモノクローナル抗体が阻害されるならば、本発明のモノクローナル抗体と同じか、あるいは機能的に均等なエピトープ特異性をもつ可能性が高い。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングもＲＳＶを用い、モノクローナル抗体がＲＳＶを中和するか否かを決定することによって実施することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体を用いることによって、ヒトモノクローナル抗体をスクリーニングしてその抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ結合特異性をもつか否かを同定するために使用することができ、かつ、活発な免疫感作にも使用できる抗イディオタイプ抗体を作製することが今度は可能となる（Herlyn et al., Science, 232:100, 1986）。このような抗イディオタイプ抗体は、周知のハイブリドーマ手法を用いて作製できる（Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975）。抗イディオタイプ抗体は興味の対象である細胞系統によって産生されるヒトモノクローナル抗体上に存在する特有の抗原決定基を認識する抗体である。これらの抗原決定基は抗体の超可変領域に位置する。特定のエピトープと結合するのはこの領域であり、したがって抗体の特異性を担う部分である。抗イディオタイプ抗体は興味の対象であるモノクローナル抗体を動物に免疫感作することによって調製できる。免疫された動物は免疫抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識してこれに応答し、これらイディオタイプ抗原決定基に対する抗体を産生する。第２の動物を免疫感作するのに用いられた細胞系統によって産生される本発明のヒトモノクローナル抗体に特異的な、免疫された動物の抗イディオタイプ抗体を用いることにより、免疫感作に用いられたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプをもつ別のクローンを同定することが今度は可能となる。２つの細胞系統のヒトモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性は、２つのモノクローナル抗体が同じエピトープ抗原決定基の認識に関して同じであることを示すものである。したがって、抗イディオタイプ抗体を用いることにより、同じエピトープ特異性をもつモノクローナル抗体を発現するその他のハイブリドーマを同定することが可能である。
さらに、抗イディオタイプ手法を用いてエピトープを模倣するモノクローナル抗体を作製することも可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、この第１モノクローナル抗体によって結合されるエピトープの”イメージ”（image）である超可変領域中に結合ドメインをもつであろう。したがって、抗イディオタイプモノクローナル抗体結合ドメインは抗原として有効に作用するので、抗イディオタイプモノクローナル抗体を免疫感作に用いることができる。
本発明で使用する”抗体”という用語は、エピトープ抗原決定基と結合することのできる全体の分子、ならびにＦａｂやＦ（ａｂ’）2などのようなその断片を含む。本発明においては、Ｆａｂ断片が好ましい。Ｆａｂは治療様式としてＦ（ａｂ’）2や全免疫グロブリン分子に比べていくつかの利点を有している。第１に、Ｆａｂは同種抗原に対する結合部位を１つしかもたないので、免疫複合体の形成が排除されるが、二価のＦ（ａｂ’）2や全免疫グロブリン分子が標的抗原と遭遇するとこのような複合体が形成される。組織中に免疫複合体が蓄積すると好ましくない炎症反応をもたらすので、この点は重要である。第２に、ＦａｂはＦｃ領域をもたないので、補体カスケードの開始のようなＦｃによって活性化される好ましくない炎症反応を引き起こすことができない。第３に、小さいＦａｂ分子の組織浸透性は、大きい全体抗体よりもはるかに良好である。第４に、Ｆａｂは大腸菌などの細菌中で容易かつ安価に生産することができるが、全免疫グロブリン抗体分子を有用な量で生産するには哺乳動物細胞を必要とする。後者の場合には、免疫グロブリン配列を哺乳動物細胞にトランスフェクションして形質転換する必要がある。次いで、これらの配列の増幅を厳密な選択工程によって実施し、安定な形質転換体を同定して維持しなければならない。全免疫グロブリン分子は、血清含有培地の問題が付随する培養で安定に形質転換された高発現細胞によって生産されなければならない。これとは対照的に、大腸菌中でのＦａｂの生産はこれらの困難性を排除し、細胞培養由来の生成物よりも安価な抗体断片を大きな発酵器中で生産することができる。
Ｆａｂに加えて、ＲＳＶの少なくとも１つのエピトープ、好ましくはＲＳＶの糖タンパク質Ｆに結合特異性をもつ小さい抗体断片およびエピトープ結合ペプチドも本発明に含まれ、ウイルスを中和するために使用することもできる。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに付与された米国特許第４，９４６，７７８号（そのすべてを参照により本明細書に包含する）記載の方法によって１本鎖抗体を構築できる。１本鎖抗体は可動性リンカー部分で結合されたＬ鎖およびＨ鎖の可変領域を含む。更に小さいのは、単離されたＶＨ単一ドメインを含む単一ドメイン抗体として知られる抗体断片である。それが由来する全体の抗体の結合特異性の少なくともいくつかをもつ単一ドメイン抗体を得る方法は当業者に公知である。例えば、Ｗａｒｄらの“大腸菌から分泌される各種の単一免疫グロブリン可変ドメインの結合活性”（Nature 341:644-646）は、単離形でこれに結合する標的エピトープへの十分な親和性をもつ抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を得るためのスクリーニング法を開示する。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば液相または固相担体と結合して使用できる免疫アッセイに、インビトロで使用するのに適している。さらに、これらの免疫アッセイでのモノクローナル抗体は各種方法で検出しうるように標識できる。本発明のモノクローナル抗体を用いることのできる免疫アッセイの型の例としては、直接または間接法の競合または非競合免疫アッセイがある。このような免疫アッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫）アッセイがある。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的試料の免疫組織学的アッセイを含む、順、逆、または同時モードのいずれで行うこともできる免疫アッセイを用いて実施できる。当業者には過度の実験を行うことなくその他の免疫アッセイ法を知り、認識することができる。
本発明のモノクローナル抗体は多種類の担体に結合させてＲＳＶの存在の検出に用いることができる。公知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。本発明の目的にとっては、担体の性質は可溶性または不溶性いずれでもよい。当業者はモノクローナル抗体を結合するその他の適当な担体を知っており、または慣用の実験によってこれらを確認できるであろう。
多種類の標識および標識方法が当業者に公知である。本発明で使用できる標識の型の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、コロイド状金属、化学発光物質、および生物発光物質を含む。当業者であれば本発明のモノクローナル抗体に結合するためのその他の適当な標識を知っており、または慣用の実験によってこれらを確認できるであろう。さらに、本発明のモノクローナル抗体へのこれらの標識の結合は、当業者に公知の標準法を用いて行うことができる。
本発明の目的のためには、ＲＳＶが生物学的液体および組織中に存在するときは、これを本発明のモノクローナル抗体によって検出できる。検出しうる量のＲＳＶを含むいかなる試料でも用いうる。試料は尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清及びその類似物などの液体でも、また組織、糞及びそれらの類似物などの固体または半固体でも、あるいは組織学的診断で通常用いられる固体組織でありうる。
より感度のよい結果が得られる別の標識法は、抗体を低分子量のハプテンと結合することからなる。これらのハプテンは、次に第２の反応で検出できる。例えば、アビジンと反応するビオチン、あるいは特定の抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェノール、ピリドキサールまたはフルオレセインなどのハプテンが通常用いられる。
本発明で用いるように、“エピトープ”の用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上のあらゆる抗原決定基を意味する。エピトープ抗原決定基は、通常アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常特異的な三次元構造特性と特異的電荷特性とをもつ。
本発明のアッセイに用いる物質はキット調製に理想的に用いうる。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器手段を密に収納すべく区切られたキャリア手段からなり、各容器手段は、この方法で用いる分離された要素の１つを含む。例えば、容器手段の１つは検出しうるように標識されたか、または標識されうる本発明のヒトモノクローナル抗体を含みうる。キットはまた緩衝液を含む容器および／または酵素標識または蛍光標識などのレポーター分子と結合したアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質のようなレポーター手段からなる容器を含む。
抗原のインビボ検出に本発明のヒトモノクローナル抗体を用いるには、検出しうるように標識されたモノクローナル抗体を診断的有効量で投与する。”診断的有効量”という用語は、検出しうるように標識されたヒトモノクローナル抗体の量が、該モノクローナル抗体が特異的なＲＳＶ抗原をもつ部位の検出を可能にするのに十分な量で投与されることを意味する。
投与する、検出しうるように標識されたヒトモノクローナル抗体の濃度はＲＳＶへの結合がバックグランドと比較して検出するのに十分なように投与すべきである。さらに、最良の標的−バックグランドの信号比を得るために、検出しうるように標識されたモノクローナル抗体は循環系から迅速に除去されることが望ましい。
結果として、インビボ診断用の、検出しうるように標識されたヒトモノクローナル抗体の投与量は年齢、性別、個々人の疾患の程度により異なる。ヒトモノクローナル抗体の投与量は約０．０１ｍｇ／ｍ2〜約５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2、最も好ましくは約０．ｌｍｇ／ｍ2〜約１０ｍｇ／ｍ2で変更しうる。このような投与量は例えば、複数の注入をするのか、組織、およびその他の当業者に公知の要因により変更できる。
インビボでの診断用画像化では、利用できる検出装置の型が用いる放射性同位体を選択するうえでの主要な要因である。選択する放射性同位体は用いる装置で検出しうる崩壊形をもつものでなければならない。インビボ診断の放射性同位体を選択する際のさらに別の重要な要因は、放射性同位体の半減期が、標的による最大取り込み時間においても検出可能である程度に長く、しかし宿主への有害な放射線が最小になる程度に十分短いことである。理想的には、インビボ画像化に用いる放射性同位体は粒子放射がなく、しかし１４０−２５０ｋｅＶの範囲で慣用のガンマカメラで容易に検出しうる多数の光子を生成するものである。
インビボ診断では放射性同位体は中間体官能基（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を用いて直接または間接に免疫グロブリンと結合することができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンと結合するのによく用いられる中間体官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）や同様の分子などの二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体と結合できる金属イオンの典型例は、111Ｉｎ、97Ｒｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、89Ｚｒ、および201Ｔｌである。
インビボ診断の目的のために、本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の場合のように、常磁性同位体で標識することもできる。一般に、診断画像化を可視化するあらゆる慣用の方法を用いることができる。通常、カメラ画像化にはガンマおよび陽電子放射の放射性同位体が用いられ、ＭＲＩには常磁性同位体が用いられる。このような方法で特に有用な元素は157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒおよび56Ｆｅを含む。
本発明のヒトモノクローナル抗体はインビボおよびインビトロでＲＳＶ疾患の治療過程をモニターするのに用いることができる。したがって、例えばＲＳＶで感染された細胞数の増加または減少、あるいは体内または各種体液中にに存在するＲＳＶ濃度の変化を測定することにより、ＲＳＶ疾患の改善を目的とする治療法が有効であるか否かを決定することが可能となる。
ヒトモノクローナル抗体はＲＳＶ疾患に免疫治療的にも使用できる。本明細書でモノクローナル抗体について使用する“免疫治療的”または“免疫治療”という用語は、予防的および治療的投与の両方を意味する。したがって、モノクローナル抗体は、ＲＳＶ疾患の可能性および／または重症度を軽減するために危険性の高い患者に投与したり、あるいは既に活発なＲＳＶ感染を発症した患者に投与することができる。
本発明では、インビトロでＲＳＶを中和するＦａｂ断片がインビボでＲＳＶ感染を処置するのに治療的に使用できるという驚くべき発見によって、その他の肺性ウイルス感染にも同様のアプローチが使用できることを示唆する。したがって、広い意味においては、本発明はウイルスを中和するＦａｂ断片を、インビボで該ウイルスによって引き起こされ、該ウイルスの増殖が宿主の気道の管腔に限定されるような感染の治療に使用することを包含する。このようなウイルスは、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、およびコロナウイルス、ならびに本明細書の実施例に示すようにＲＳＶを含む。その他の肺性ウイルスに特異的なＦａｂ断片の同定は、過度の実験を行うことなく慣用の中和アッセイを用いて当業者により実施できる。
本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、ＲＳＶ疾患の症状が改善され、あるいは感染の可能性を減少するという所望の効果をもたらすのに十分な量である。投与量は高粘稠度（ｈｙｐｅｒｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）症候群、肺水腫、うっ血性心不全及びその類縁などの副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、および患者の重症度により変更し、当業者により決定される。あらゆる合併症があった場合には、投与量は個々の医師により調整される。投与量は、１日１回以上の投与回数で、１日又は数日にわたって、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変更しうる。好ましいのは、出現からウイルス複製の“後戻り”を避けるために、２−５日またはそれ以上続けて抗体を投与することである。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、注入による非経口投与または時間をかけた漸次注入によって投与できる。本発明のヒトモノクローナル抗体は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、または経皮投与できる。治療的に用いるときは、本発明のヒトモノクローナル抗体の好ましい投与経路は肺エアゾールである。本発明の抗体を含むエアゾール送達系を調製する方法は当業者に周知である。一般に、このような系はパラトープ結合能などの抗体の生物学的性質を有意に損なわないような成分を用いるべきである（例えば、Sciarra and Cutie, Aerosols, Remington Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp.1694-1712を参照：この文献は参照としてここに包含する）。当業者は過度の実験を行うことなく抗体エアゾールを製造する各種パラメーターおよび条件を容易に決定できる。
非経口投与用製剤は、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液および乳剤を含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体には水、食塩水および緩衝液を含むアルコール／水性溶液、乳剤または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発油を含む。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充物、電解質補充物（リンゲルデキストロースを基礎とするものなど）及びその類縁物などを含む。保存料およびその他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス及びその類縁物なども含めてよい。
本発明はまた、本発明のヒトモノクローナル抗体を含む、ＲＳＶ疾患の免疫治療用薬剤または医薬組成物を製造する方法にも関する。
本発明の好ましい態様は、そのＨ鎖がＣＤＲ３中でポリペプチドＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１）、ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号２）、およびこれらのペプチドの保存性変異体を含むヒトモノクローナル抗体に関する。ＲＳＶの糖タンパク質Ｆ中のエピトープ配列と結合し、かつこれと結合したときにＲＳＶの中和を行うある種のアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる、本明細書で用いる“保存性変異体”の用語は、アミノ酸残基を別の生物学的に類似のアミノ酸で置換することを意味する。保存性変異体の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどのごとき１つの疎水性残基を別のもので置換、又は極性残基を別のもので置換、例えばアルギニンをリシンで置換、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換、若しくはグルタミンをアスパラギンで置換する及びその類縁などを含む。“保存性変異体”の用語はまた、置換されたポリペプチドをもつ抗体もＲＳＶを中和するという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含む。同様に、本発明の別の好ましい態様は、上記のＨ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列に関する。相補的ポリヌクレオチド配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列を含む。
本発明の好ましいベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（１）原核細胞分泌シグナルドメイン、（２）異種ポリペプチド、および（３）繊維状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドをコードし、かつこれを発現できるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。ベクターは融合ポリペプチドを発現するＤＮＡ発現制御配列、好ましくは原核細胞制御配列を含む。
繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと会合して、これによって融合ポリペプチドをファージ表面に導入することのできるｃｐIIIまたはｃｐVIIIコートタンパク質のドメインが好ましい。
分泌シグナルは、グラム陰性菌のペリプラズム膜に対するタンパク質を標的とするタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはｐｅｌＢ分泌シグナルである。エルウィニア・カロトバ（Erwinia carotova）由来の２つのｐｅｌＢ遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列が、Ｌｅｉら（Lei et al., Nature, 331:543-546, 1988）により記載されている。ｐｅｌＢタンパク質のリーダー配列は融合タンパク質の分泌シグナルとして以前に使用されている（Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5728-5732, 1989; Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8095-8099,1990）。本発明で使用しうる大腸菌由来の他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列が、Ｏｌｉｖｅｒ（Neidhard, F.C.編集，Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69, 1987）に記載されている。
ベクター用の好ましい膜アンカーは繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄおよび均等な繊維状ファージから得られる。好ましい膜アンカードメインは遺伝子III及び遺伝子VIIIによってコードされるコートタンパク質中に見られる。繊維状ファージコートタンパク質の膜アンカードメインは、コートタンパク質のカルボキシ末端領域の部分であり、脂質二重層膜をスパニング（spanning）する疎水性アミノ酸残基の領域と、膜の細胞質表面に通常見られ、膜から伸長する荷電したアミノ酸残基の領域を含む。ファージｆ１においては、遺伝子VIIIコートタンパク質の膜スパニング領域は、Ｔｒｐ−２６からＬｙｓ−４０までの残基を含み、細胞質領域は４１から５２のカルボキシ末端１１残基からなる（Ohkawa et al., J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1981）。膜アンカーの例は、ｃｐVIIIの２６から４０残基からなる。したがって、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列はＭ１３繊維状ファージ遺伝子VIIIコートタンパク質（ｃｐVIIIまたはＣＰ８とも呼ぶ）に由来する。遺伝子VIIIコートタンパク質は、典型的にはコートタンパク質の約２５００から３０００コピーをもつファージ粒子の大部分以上の成熟繊維状ファージ上に存在する。
さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子IIIコートタンパク質（ｃｐIIIとも呼ぶ）に由来する。遺伝子IIIコートタンパク質は、典型的にはコートタンパク質の約４から６コピーをもつファージ粒子の一端にある成熟繊維状ファージ上に存在する。繊維状ファージ粒子の構造の詳細な説明、そのコートタンパク質および粒子構造については総説（Rached et al., Microbiol. Rev., 50:401-427, 1986; Model et al., “The Bacteriophages: Vol.2”, R. Calendar編集，Plenum Publishing Co., pp.375-456, 1988）を参照されたい。
ＤＮＡ発現制御配列は、構造遺伝子産物を発現するためのＤＮＡ発現シグナルのセットを含み、既に周知のように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できるようにシストロンに機能的に結合した５’および３’要素の両方を含む。５’制御配列は転写開始のためのプロモーター、および翻訳可能なＤＮＡ配列を上流の５’末端で機能的に結合したリボゾーム結合部位を規定する。
大腸菌で高レベルの発現を達成するには、大量のｍＲＮＡを生成するための強力なプロモーターのみならず、ｍＲＮＡが効率よく翻訳されることを確実にするためのリボゾーム結合部位を必要とする。大腸菌では、リボゾーム結合部位は開始コドン（ＡＵＧ）、および開始コドンから３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（Shine et al., Nature 254:34, 1975）。シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれる配列：ＡＧＧＡＧＧＵは大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端と相補的である。ｍＲＮＡへのリボゾームの結合およびｍＲＮＡの３’末端での配列はいくつかの要因に影響される：
（１）ＳＤ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の相補性の程度。
（２）ＳＤ配列とＡＵＧの間にある距離と、おそらくはＤＮＡ配列（Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:760, 1979a; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5596, 1979b; Guarente et al., Science 209:1428, 1980及びGuarente et al., Cell 20:543, 1980）。この距離が系統的に変化するプラスミド中における遺伝子の発現レベルを測定することにより、最適のものが得られる。種々のｍＲＮＡを比較すると、（ＡＵＧのＡの位置を０とした場合）−２０から＋３０の位置からの配列が統計的に好ましいことが示された（Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35:365, 1981）。リーダー配列が翻訳に劇的に影響することが示された（Roberts et al., 1979a,上掲）。
（３）リボゾーム結合に影響する、ＡＵＧに続くヌクレオチド配列（Taniguchi et al., J. Mol. Biol., 118:533, 1978）。
３’制御配列は、異種融合ポリペプチドとともに、及び、これと機能的に結合した、フレーム中の少なくとも１つの終止（ストップ）コドンを規定する。
好ましい態様においては、使用するベクターは原核細胞複製起点またはレプリコン、すなわち形質転換する細菌宿主細胞などの原核宿主細胞中で、組換えＤＮＡ分子の染色体外での自動的複製と維持を指示する能力をもつＤＮＡ配列を含む。このような複製起点は当業者に周知である。好ましい複製起点は宿主細胞中で効率よいものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸菌中でベクターを使用するための好ましい複製起点はｐＢＲ３２２で見られるＣｏｌＥ１およびその他の各種慣用のプラスミドである。ｐＡＣＹＣで見られるｐ１５Ａ複製起点やその誘導体も好ましい。ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは分子生物学でよく使用されており、各種プラスミドで使用でき、また少なくともＳａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning:a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）により記載されている。
ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは、別のレプリコンが同じ大腸菌細胞中の第２のプラスミドに存在しても、それぞれ大腸菌中でプラスミドの複製を指示する能力をもつので、本発明で使用するのに特に好ましい。言い換えると、ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａは、同一宿主中で２つのプラスミドの維持を可能にする非干渉性（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）レプリコンである（例えば、上掲Ｓａｍｂｒｏｏｋの１．３−１．４参照）。この特徴は本発明では特に重要である。なぜなら、ファージ複製を許す１つの宿主細胞が２つの別個のベクター（すなわち、異種融合ポリペプチドの発現のためのベクターと、ヘテロダイマー性レセプター、この場合ＲＳＶと結合してこれを中和するモノクローナル抗体の発現のためのベクター）の独立かつ同時の複製をサポートしなければならないからである。
さらに、原核細胞レプリコンを含むこれらの態様には、その発現によって形質転換する細菌宿主に薬剤耐性の如き選択的利点を付与する遺伝子をも含む。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子はアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するものである。ベクターは、典型的には翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入のための慣用の制限酵素部位も含む。ベクターの例には、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３がある。
繊維状ファージ粒子の表面上において、本発明のモノクローナル抗体の如きヘテロダイマー性レセプターを発現させるためのベクターは、第１および第２のレセプターポリペプチドの形で翻訳可能な第１および第２のＤＮＡ配列を受け取り発現するのに適した組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子であり、ここでレセプターポリペプチドのうちの１つは繊維状ファージコートタンパク質膜アンカーと融合している。すなわち、レセプターポリペプチドのうちの少なくとも１つは、繊維状ファージ膜アンカードメインと原核細胞分泌シグナルドメインとを含む融合ポリペプチドである。
ヘテロダイマー性レセプターを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ベクター中に存在する２つの別個のカセットに、２つの翻訳可能なＤＮＡ配列を独立にクローニング（挿入）して、ヘテロダイマー性レセプター、またはヘテロダイマー性レセプターを含むポリペプチドのリガンド結合部分の第１および第２ポリペプチドを発現するための２つの別個のシストロンを形成するための系を提供する。２つのシストロンを発現するためのＤＮＡ発現ベクターをジシストロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターと呼ぶ。
このベクターは、方向性連結に適したヌクレオチド配列を介して、挿入ＤＮＡと機能的に結合した上流および下流に翻訳可能なＤＮＡ配列を含む第１カセットを含む。上流の翻訳可能な配列は本明細書で規定する分泌シグナルをコードする。下流の翻訳可能な配列は本明細書で規定する繊維状ファージ膜アンカーをコードする。このカセットは、方向性連結に適したヌクレオチド配列を介して、翻訳可能な挿入ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）がカセット中に方向性をもって挿入されるときに産生されるレセプターポリペプチドを発現させるためのＤＮＡ発現制御配列を含むことが好ましい。好ましくは繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと結合して融合ポリペプチドをファージ表面上に取り込むことのできるｃｐIIIまたはｃｐIIIコートタンパク質のドメインである。
レセプター発現ベクターはまた、第２レセプターポリペプチドを発現するための第２カセットを含む。第２カセットは、方向性連結に適したヌクレオチド配列を介して、カセットの読み取り枠中で少なくとも１つの終止コドンを典型的に規定するベクターの下流ＤＮＡ配列と３’末端で機能的に結合した、本明細書で規定する分泌シグナルをコードする第２の翻訳可能なＤＮＡ配列を含む。第２の翻訳可能なＤＮＡ配列は、５’要素を形成するＤＮＡ発現制御配列と５’末端で機能的に結合する。第２カセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）を挿入すると、インサートＤＮＡによってコードされるポリペプチドをもつ分泌シグナルのレセプターを含む第２融合ポリペプチドを発現することができる。
上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は上述した原核細胞分泌シグナルをコードする。ｐｅｌＢ分泌シグナルをコードする上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、レセプター発現ベクター中に含まれる好ましいＤＮＡ配列である。下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は上述した繊維状ファージ膜アンカーをコードする。したがって、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、繊維状ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIコートポリペプチドのいずれかの膜アンカードメインに対応する、そして好ましくはこれと同一のアミノ酸残基配列をコードする。
本発明のＤＮＡ発現ベクター中のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）を挿入すると、適当な宿主中でレセプターポリペプチドを発現することができるヌクレオチド配列を形成するベクターの領域である。発現能を有するヌクレオチド配列をシストロンと呼ぶ。したがって、カセットは上流および下流に翻訳可能なＤＮＡ配列と機能的に結合したＤＮＡ発現制御要素を含む。シストロンは、翻訳可能なＤＮＡ配列がこのような目的に適したヌクレオチド配列を介して上流と下流配列の間に方向性をもって挿入する（方向性連結）ときに形成される。得られる３つの翻訳可能なＤＮＡ配列、すなわち上流配列、挿入配列および下流配列はいずれも同じ読み取り枠内で機能的に結合している。
したがって、ヘテロダイマー性レセプターを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、翻訳可能なＤＮＡ配列をベクターのカセット部分にクローニングして、モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖の如き、ヘテロダイマー性レセプターの第１および第２レセプターポリペプチドを発現することのできるシストロンを生成する系を提供する。異種融合ポリペプチドまたはヘテロダイマー性レセプターのいずれを発現するために用いるときでも、発現ベクターは、適合性宿主中で構造遺伝子産物を発現できるものとして特徴付けられる。
本明細書中では、“ベクター”の用語は、異なる遺伝子環境間で、それがあらかじめ機能的に結合していた別の核酸を運搬することのできる核酸分子をいう。好ましいベクターは、それが機能的に結合するＤＮＡ断片中に存在する構造遺伝子産物を自動的に複製および発現できるものである。したがって、ベクターは上述したレプリコンと選択マーカーを含むことが好ましい。
ＤＮＡ配列や断片に関してここに使用する“機能的に結合した”という用語は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ鎖の１本の鎖と、好ましくは慣用のホスホジエステル結合によって共有結合されている配列または断片を意味する。当業界で公知のように、本発明の転写単位またはカセットが機能的に結合するベクターの選択は、ベクター複製やタンパク質発現などの所望する機能性、ならびに形質転換する宿主細胞などの組換えＤＮＡ分子を構築する技術に固有の限定条件に直接依存する。
方向性連結、すなわちポリリンカーに適したヌクレオチド配列は、（１）上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を複製および運搬するように機能的に結合し、かつ（２）ＤＮＡ配列の方向性連結のための部位または手段をベクターに提供するようなＤＮＡ発現ベクターの領域である。典型的には、方向性ポリリンカーは２以上の制限酵素認識配列または制限部位を規定するヌクレオチド配列である。制限酵素の切断により、２つの部位が付着末端を生じ、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結しうる。好ましくは、制限酵素の切断により２つの制限部位が非相補的な付着末端を提供して、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列がカセットへの方向性挿入が可能になる。１つの態様においては、方向性連結手段は、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列、またはその両者に存在するヌクレオチドによって提供される。別の態様では、方向性連結に適したヌクレオチド配列は、多方向性クローニング手段を規定するヌクレオチド配列を含む。方向性連結に適したヌクレオチド配列が多数の制限部位を規定する場所を、多クローニング部位と呼ぶ。
好ましい態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の教示に従って、ゲノムを封入する繊維状ファージ粒子の形態でデザインすると操作が簡便である。この態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、繊維状ファージ複製起点を規定するヌクレオチド配列をさらに含み、その結果、適当な遺伝的相補性が提示されたときに、ベクターが１本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製でき、かつ繊維状ファージ粒子中にパッケージングされ得る。この特徴は、ＤＮＡ発現ベクターをファージ粒子中にパッケージングし、ファージ粒子集団を含む他の粒子から、粒子およびその中に含まれるベクターを続いて分離することを可能にする。
既に周知のように、繊維状ファージ複製起点は、複製開始部位、複製終止部位および複製によって産生される複製形態のパッケージング部位を規定するファージゲノムの領域である（例えば、Rasched et al., Microbiol. Rev. 50:401-427, 1986; Horiuchi, J. Mol. Biol. 188:215-223, 1986参照）。
本発明で使用するための好ましい繊維状ファージ複製起点は、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄファージ複製起点である（Short et al., Nucl. Acids Res. 16:7583-7600, 1988）。好ましいＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロン発現ベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３およびｐＣＯＭＢ２−３’である。
本発明を十分に開示したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、各種変更及び修飾がなしうることが当業者には自明であろう。
実施例１
ファージ粒子上にヘテロダイマー性レセプターを作製するためのジシストロン発現ベクターの構築
直接スクリーニングできる多数のＦａｂ抗体断片を作製するためのベクター系を得るために、Ｈｕｓｅら（Science 246:1275-1281, 1989）記載の通りに、バクテリオファージラムダ中に予め発現ライブラリーを構築した。しかしながら、これらの系は、Ｂａｒｂａｓら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:7978-7982, 1991）が記載するような、発現Ｆａｂに繊維状ファージ粒子の表面を標的とさせるようなデザイン特徴を含んでいない。
ベクター系選択に用いた主要な基準は、直接スクリーニングできる最も多くのＦａｂ断片作製の必要性であった。バクテリオファージラムダは、３つの理由により発現ベクター開発の出発点として選択された。第１に、ファージＤＮＡのインビトロパッケージングがＤＮＡを宿主細胞へ再導入する最も効率よい方法であった。第２に、単一ファージプラークのレベルでタンパク質発現を検出することが可能であった。最後に、ファージライブラリーのスクリーニングは、典型的には、非特異的結合を伴う困難性をほとんど含まなかった。別のプラスミドクローニングベクターは、同定後のクローン分析において有利なのみである。ｐＣｏｍｂVIIIなどのジシストロン発現ベクターを使用し、これによってＨ鎖、Ｌ鎖またはＦａｂ発現インサートを含むプラスミドを切り出すことが可能であるので、本発明の系でもこの利点は失われていない。
ａ．ジシストロン発現ベクターｐＣＯＭＢの構築
（ｉ）ラムダＺａｐTMII
の調製
ラムダＺａｐTMIIは、原ラムダＺａＰ（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）の誘導体であって、６つの特有のクローニング部位、融合タンパク質発現、およびファージミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−）の形でインサートを迅速に切り出す能力を含む元のラムダＺａｐの特質すべてを保持するが、ＸＬｌ−Ｂｌｕｅを含む多くのＮｏｎ−Ｓｕｐ  Ｆ株での増殖を可能にするＳＡＭ  １００突然変異を欠く。ラムダＺａｐTMIIはＳｈｏｒｔら（Nuc. Acid Res. 16:7583-7600, 1988）の記載するように、ラムダＺａＰを制限酵素ＮｃｏＩで消化して得られる４２５４塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片中に含まれるラムダＳ遺伝子を置き換えることによって構築した。この４２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、ラムダｇｔ１０（ＡＴＣＣ＃４０，１７９）を制限酵素ＮｃｏＩで消化した後にラムダｇｔ１０から単離したラムダＳ遺伝子を含む４２５４ｂｐのＤＮＡ断片で置換した。ラムダｇｔ１０から単離した４２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.,編集，John Willey and Sons, NY, 1987）を用いて、原ラムダＺａＰベクター中に連結し、ラムダＺａｐTMIIを得た。
（ii）ラムダＨｃ２の調製
大腸菌宿主細胞中で多数のＶH−コーディングＤＮＡ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）を発現させるために、ラムダＨｃ２と命名するベクターを構築した。このベクターは以下のものを提供した：正しい読み取り枠内にＶH−コーディングＤＮＡ相同体を入れる能力；Ｓｈｉｎｅら（Nature 254:34, 1975）が記載するリボゾーム結合部位；ｐｅｌＢ分泌シグナルと命名するペリプラズム空間に発現タンパク質を方向づけるリーダー配列；既知のエピトープ（エピトープタグ）をコードするポリヌクレオチド配列；およびＶH−コーディングＤＮＡ相同体と、エピトープタグをコードするためのポリヌクレオチドとの間のスペーサータンパクをコードするポリヌクレオチド。ラムダＨｃ２はＨｕｓｅら（Science 246:1274-1281, 1989）により既に記載されている。
ラムダＨｃ２を調製するために、互いにハイブリダイズして２本鎖の合成ＤＮＡ配列を形成する２０−４０塩基の１本鎖ポリヌクレオチド断片をデザインすることによって上記特徴をすべて含む合成ＤＮＡ配列を構築した。個々の１本鎖ポリヌクレオチド断片を表１に示す。
各ポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１μｌとＴ4ポリヌクレオチドキナーゼ２０単位を７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液に加えることによって、ポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ９−４、Ｎ１１、Ｎ１０−５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８（表１）をキナーゼ反応に付した。溶液を３７℃に３０分保持し、溶液を６５℃に１０分保持することにより反応を停止した。２０ｍｇのポリヌクレオチドＮ１およびポリヌクレオチドＮ１２の２つの末端ポリヌクレオチドを、２０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５０．０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液１／１０容量とともに上記キナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０℃、５分加熱し、水５００ｍｌのビーカー中、１．５時間かけて約２５℃の室温に冷却した。この期間に１０個のポリヌクレオチドすべてをアニールして２本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に、上記反応液４０μｌを加えることによって、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃に１０分保持することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。上記反応液５２μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含む溶液４μｌを混合することにより末端ポリヌクレオチドをキナーゼ反応に付した。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃に１０分保持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。
0003976333.tif 000002
完成した合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩであらかじめ消化しておいた実施例１ａ（ｉ）に記載のラムダＺａｐTMIIベクターに直接連結した。連結混合物をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊａｌｌａ，ＣＡ）から入手可能なＧｉｇａｐａｃｋ  II  Ｇｏｌｄパッキング抽出物を用いて製造者の説明書に従ってパッケージングした。パッケージングした連結混合物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に播いた。個々のラムダプラークを抜き取り、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供されたラムダＺａｐTMII用インビボ切り出しプロトコルに従ってインサートを切り出した。このインビボ切り出しプロトコルにより、ラムダＨｃ２ベクターからクローン化インサートをファージミドベクターに移動し、操作と配列決定が容易になった。Ｓａｎｇｅｒら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977）の記載するサンガージデオキシ法を用い、またＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ＡＴＰ配列決定キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、説明書に従ってインサートの配列決定を行うことにより上記クローニング工程の精度を確認した。得られたラムダＨｃ２発現ベクターを図１に示す。
（iii）ラムダＬｃ２の調製
大腸菌宿主細胞中で多数のＶL−コーディングＤＮＡ相同体を発現させるために、ＶL−コーディング相同体を正しい読み取り枠に入れる能力をもつラムダＬｃ２と命名するベクターを構築した。このベクターは、Ｓｈｉｎｅら（Nature 254:34, 1975）に記載されるように、リボゾーム結合部位をもち；Ｌｅｉら（J. Bac. 169:4379, 1987）およびＢｅｔｔｅｒら（Science 240:1041, 1988）が大腸菌でＦａｂ断片を分泌させるのに用いて成功した、ｐｅｌＢ遺伝子リーダー配列をもち；またクローニングのための制限酵素部位を含むポリヌクレオチドをもつ。ラムダＬｃ２はＨｕｓｅら（Science 246:1274-1281,1989）により既に記載されている。
互いにハイブリダイズして２本鎖の合成ＤＮＡを形成する２０−６０塩基の１本鎖ポリヌクレオチド断片をデザインすることによって、上記特徴をすべて含む合成ＤＮＡ配列を構築した。２本鎖合成ＤＮＡ配列中の個々の１本鎖ポリヌクレオチド断片（０１−０８）の配列を表２に示す。
各ポリヌクレオチド１μｌ（０．１μｇ／μｌ）とＴ4ポリヌクレオチドキナーゼ２０単位を、７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む溶液に加えることによって、表２に示すポリヌクレオチドをキナーゼ反応に付した。溶液を３７℃に３０分保持し、溶液を６５℃に１０分保持することにより反応を停止した。各２０ｎｇの２つの末端ポリヌクレオチドである０１と０８を、２０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１５．０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む溶液の１／１０容量とともに上記キナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０℃、５分加熱し、水５００ｍｌのビーカー中、１．５時間かけて約２５℃の室温に冷却した。この期間に８個のポリヌクレオチドすべてをアニールして図３に示す２本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に、上記反応液４０μｌを加えることによって、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃で１０分保持することにより、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。上記反応液５２μｌ、１０ｍＭのＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含む溶液４μｌを混合することにより、末端ポリヌクレオチドをキナーゼ反応に付した。この溶液を３７℃に３０分保持し、次いで溶液を６５℃に１０分保持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。
0003976333.tif 000003
完成した合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩであらかじめ消化しておいた実施例１ａ（ｉ）に記載のラムダＺａｐTMIIベクターに直接連結した。その連結混合物を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＧｉｇａｐａｃｋ  II  Ｇｏｌｄパッキング抽出物を用いて製造者の説明書に従ってパッケージングした。パッケージングした連結混合物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に播いた。個々のラムダプラークを抜き取り製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって提供されたラムダＺａｐTMIIのためのインビボ切り出しプロトコルに従ってインサートを切り出した。このインビボ切り出しプロトコルにより、操作と配列決定を容易にするため、ラムダＬｃ２ベクターからクローン化インサートをプラスミドファージミドベクターに移動した。ＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ｄＡＴＰ配列決定キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造者の説明書に従い、インサートの配列決定を行うことにより、上記クローニング工程の精度を確認した。得られたＬｃ２ベクターを図２に模式図として示す。
ラムダＬｃ３と命名する本発明で使用するための好ましいベクターは、上記調製したラムダＬｃ２の誘導体である。ラムダＬｃ２は、ＥｃｏＲＩ制限部位の３’側でシャイン−ダルガルノリボゾーム結合部位の５’側に位置するＳｐｅＩ制限部位（ＡＣＴＡＧＴ）を含む。ＳＰｅＩ制限部位は図１に示すように、ラムダＨｃ２にも存在する。ｐＣｏｍｂと命名する組み合わせベクターを、ラムダＨｃ２とＬｃ２の部分とを以下の実施例１ａ（iv）に記載するようにともに組み合わせることによって構築した。得られる組み合わせｐＣｏｍｂベクターは２つのＳｐｅＩ制限部位を含んでおり、このうち１つはラムダＨｃ２により、１つはラムダＬｃ２により提供されるものであり、その間にＥｃｏＲＩ部位を含む。２つのＳｐｅＩ制限部位が存在するにもかかわらず、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩ付着末端をもつＤＮＡ相同体は、あらかじめＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＣｏｍｂ発現ベクター中に方向性をもって連結することに成功した。ＥｃｏＲＩ制限部位が、Ｌｃ２によって提供される３’ＳｐｅＩ部位に近いことにより、３’ＳｐｅＩ部位の完全消化を阻害した。したがって、ｐＣｏｍｂをＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化しても２つのＳｐｅＩ部位の間にあるＥｃｏＲＩ部位を除去しなかった。
第２のＳｐｅＩ制限部位の存在は、２つの部位の間の領域が除去されるので、ＳｐｅＩのみによって消化されたｐＣｏｍｂベクターへの連結には好ましくない。したがって、ラムダＬｃ３と命名される、第２のまたは３’ＳｐｅＩ部位を欠くラムダＬｃ２の誘導体が、ラムダＬｃ２をまずＳｐｅＩで消化して直鎖状ベクターを形成することにより作製された。末端を埋めて平滑末端とし、これをとともに連結してＳｐｅＩ部位を欠くラムダＬｃ３を得た。ラムダＬｃ３は以下に記載する組み合わせベクターの構築に好ましいベクターである。
（iv）ｐＣｏｍｂの調製
上述したインビボ切り出しプロトコルを用いて、発現ベクターラムダＨｃ２またはラムダＬｃ２からファージミドを切り出した。Ｈｏｌｍｅｓら（Anal. Biochem., 114:193, 1981）によって記載される方法に従って、ファージミド含有細胞から２本鎖ＤＮＡを調製した。インビボ切り出しで得られるファージミドは、親ベクターと同じ抗体断片クローニングおよび発現のためのヌクレオチド配列を含み、それぞれラムダＨｃ２およびＬｃ２に対応するファージミドＨｃ２およびＬｃ２と命名された。
ファージミドＨｃ２とファージミドＬｃ２の部分を組み合わせることによって作製される組み合わせファージミドベクターｐＣｏｍｂの構築のために、ファージミドＨｃ２をまずＳａｃＩで消化してＬａｃＺプロモーターの５’側に位置する制限部位を除去した。直鎖状ファージミドを次にＴ４ポリメラーゼで平滑末端とし、連結によりＳａｃＩ部位を欠くＨｃ２ファージミドを得た。修飾Ｈｃ２ファージミドおよびＬｃ２ファージミドを、次に別々にＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、５’から３’にＳｃａＩ、ｎｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位をもつＨｃ２断片、ならびに：５’から３’にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位をもつＬｃ２断片を得た。直鎖状ファージミドを次にそれぞれの平滑末端で連結し、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＡｐａＩおよびＳｃａＩの制限部位を順にもつ環状ファージミドｐＣｏｍｂを形成した。連結したファージミドベクターを次いで適当な細菌宿主に挿入し、形質転換体を抗生物質アンピシリンで選択した。
選択したアンピシリン耐性の形質転換体を用いて２つのＮｏｔＩ部位の存在をスクリーニングした。得られたアンピシリン耐性の組み合わせファージミドベクターをｐＣｏｍｂと命名し、その模式的構造を図３に示す。得られた組み合わせベクターｐＣｏｍｂは、２つの融合タンパク質を発現するための２つのカセットをもち、かつ５’から３’方向に並ぶ以下の機能的に結合した要素のためのヌクレオチド残基配列をもつＤＮＡ分子からなる：ＬａｃＺ遺伝子から上流の誘導可能なＬａｃＺプロモーターからなる第１カセット；ＮｏｔＩ制限部位；リボゾーム結合部位；ｐｅｌＢリーダー；スペーサー；５’Ｘｈｏおよび３’ＳｐｅＩ制限部位によって区切られるクローニング領域；デカペプチドタグとそれに続く発現制御終止配列；発現制御リボゾーム結合部位からなる第２カセットの５’に位置するＥｃｏＲＩ制限部位；ｐｅｌＢリーダー；スペーサー領域；５’ＳａｃＩおよび３’ＸｂａＩ制限部位で区切られるクローニング領域とそれに続く発現制御終止配列および第２ＮｏｔＩ制限部位。
ｐＣｏｍｂ３と命名された好ましい組み合わせベクターは、ｐＣｏｍｂの調製について上述したように、ファージミドＨｃ２とファージミドＬｃ３の部分を組み合わせることによって構築される。得られる組み合わせベクターｐＣｏｍｂ３は、第２カセット中の第２ＳｐｅＩ制限部位が除去されている点以外は、ｐＣｏｍｂと同じ２つの融合タンパク質を発現するためのｐＣｏｍｂと同じ２つのカセットをもつＤＮＡ分子からなる。
ｂ．バクテリオファージコートタンパク質膜アンカーをもつ融合タンパク質を発現するためのベクターｐＣｏｍｂVIIIおよびｐＣｏｍｂIIIの構築
複数の制限酵素クローニング部位のために、上記で調製したｐＣｏｍｂファージミド発現ベクターは、本発明の発現ベクターの調製の修飾に用いうる有用なクローニングビヒクルである。この目的のために、ｐＣｏｍｂをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、次いでホスファターゼ処理をして直鎖状ｐＣｏｍｂを作製した。
（ｉ）ｐＣｏｍｂVIIIの調製
繊維状バクテリオファージコートタンパク質VIII（ｃｐVIII）膜アンカードメインと、付着ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ末端とを規定するヌクレオチド配列をもつＰＣＲ産物を、直鎖状ｐＣｏｍｂと混合して連結混合物を形成した。ｃｐVIII膜アンカーをコードするＰＣＲ断片を、対応する付着末端でｐＣｏｍｂファージミド発現ベクター中に方向性をもって連結し、ｐＣｏｍｂVIII（ｐＣｏｍｂ８とも呼ぶ）を作製した。ｐＣｏｍｂVIIIは、ｃｐVIII膜アンカーと機能的に結合したｐｅｌＢ分泌シグナルを含む。
ｐＣｏｍｂ２−VIIIまたはｐＣｏｍｂ２−８と命名する本発明で使用する好ましいファージミド発現ベクターは、上述したように、ｃｐVIII膜アンカーをコードするＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介してｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクター中に方向性をもって連結することにより調製した。ｐＣｏｍｂ２−８は、１つのＳｐｅＩ制限部位のみをもっていた。
（ii）ｐＣｏｍｂIIIの調製
バクテリオファージｃｐIII膜アンカードメインをコードする配列を用いて、別のファージミド発現ベクターを構築した。Ｌ鎖発現のための膜アンカーの３’にあるＬａｃＺプロモーター領域配列と、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端とを含むｃｐIII膜アンカーを規定するＰＣＲ産物を調製した。次いでｃｐIII由来のＰＣＲ産物を、ただ１つのＳｐｅＩ部位をもつ直鎖状ｐＣｏｍｂ２ベクター中に連結し、ベクターｐＣｏｍｂ２−３（ｐＣｏｍｂ２−IIIとも呼ぶ）を作製した。
制限酵素クローニング部位をさらに有する本発明で使用する、より好ましいファージミド発現ベクター（ｐＣｏｍｂ２−III’またはＰＣｏｍｂ２−３’と命名する）は、Ｓｈｏｒｔら（Nuc. Acid Res. 16:7583-7600, 1988）によって記載され、また、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来の５１塩基対断片をさらに付加して、ｐＣｏｍｂ２−３について上述したように調製した。ｐＣｏｍｂ２−３’を調製するためには、ｐＣｏｍｂ２−３をまずＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化して直鎖状ｐＣｏｍｂ２−３を作製した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを同じ酵素で消化して、ＳｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃII、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄIII，ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む５１塩基対の断片を取り出した。この５１塩基対断片をＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ付着末端を介して直鎖状ｐＣｏｍｂ２−３ベクター中に連結し、ｐＣｏｍｂ２−３’を作製した。
実施例２
ＲＳＶ特異的モノクローナル抗体の単離
リンパ球ＲＮＡの調製およびライブラリー構築
ＨＩＶ−１血清陽性の骨髄リンパ球からのＲＮＡの調製、ならびにｐＣｏｍｂ３系を用いるファージ表面上のＩｇＧｌκ  Ｆａｂライブラリーの構築は、文献記載の方法（Burton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134, 1991）により行った。
抗原結合性ファージ選択のためのライブラリーのパンニング、可溶性Ｆａｂの調製、ならびにＦａｂ上清のＥＬＩＳＡスクリーニング
上掲のＢｕｒｔｏｎらの記載するＨＩＶ−１血清陽性ドナーの血清のＥＬＩＳＡ分析により、ＲＳＶ  ＦＧ糖タンパク質に対して約１：３０００の力価を示したので、ＥＬＩＳＡウエルにコーティングした組換えＦＧ糖タンパク質（１μｇ／ウエルのバキュロウイルス発現ＦＧ融合糖タンパク質）に対して同じライブラリーをパンニングした。ライブラリーのパンニングは文献記載の方法（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:7978, 1991）により行った。パンニング４回により溶出ファージ中で約５００倍の増幅をもたらし、特異的抗原結合性クローンの豊富なことを示唆した。溶出ファージを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を感染した。細胞からのＤＮＡ調製およびファージコートタンパク質遺伝子III断片のＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ切り出しとそれに続く再連結により、可溶性Ｆａｂを作製した。再構築されたファージミドを用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換して、可溶性Ｆａｂ断片を分泌するクローンを作製した。上掲のＢｕｒｔｏｎらによって記載されるように、ペレット化細胞の音波処理によってＦａｂ上清を調製した。簡単に述べると、カルベニシリン５０μｌ／ｍｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含むＳＢ（スパーブロス：１リットル当たりトリプトン３０ｇ、酵母エキス２０ｇ、ＭＯＰＳ１０ｇ、ｐＨ７）１０ｍｌ中、３７℃でＯＤ600が０．２になるまでクローンを増殖した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを加えて、３７℃で一晩培養物を増殖した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ１０ローター中、４℃で４０００ｒｐｍ、１５分遠心することにより細胞をペレット化した。０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含むＰＢＳ３ｍｌ中に細胞を再懸濁し、氷上での音波処理により溶解した（２−４分）。ＪＡ−２０ローター中、１４，０００ｒｐｍ、４℃で数分遠心することにより破片をペレット化した。上清をＥＬＩＳＡ分析に直接用いた。音波処理の代わりに、凍結−解凍溶解プロトコルによりＦａｂ上清を調製した。増殖条件は、音波処理について上述したものと同じであるが、ＩＰＴＧ添加後に細胞を２５℃から３９℃で一晩増殖した。細胞をマイクロヒュージ管中のＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、ドライアイスで凍結し、３７℃の水浴で解凍した。凍結−解凍工程を３回繰り返し、マイクロヒュージ管中で１０分遠心した後、上清を回収した。上清をＥＬＩＳＡ分析に直接用い、−２０℃で貯蔵した。
Ｆａｂ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングは文献記載の方法（Barbas et al., Methods: A Comparison to Methods in Enzymol., Lerner,R. and Burton,D.編集, 2:119, 1991）で行った。ＥＬＩＳＡウエルを、ＦＧ−融合糖タンパク質または精製Ｆ糖タンパク質のいずれか０．１μｇでコーティングした。３０クローンが増殖し、Ｆａｂ断片を含む上清をＦＧとの反応性について、ＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングした。これらの陽性クローンのすべてがＦ糖タンパク質とも反応した。
ウイルス中和アッセイ
ＨＥｐ−２細胞培養物およびプロトタイプサブグループＡ（Ａ２株）ウイルスとサブグループＢ（１８５３７株）ウイルス、ならびに各種起源のサブグループＡおよびＢ単離物を用いて、補体−増強プラーク減少法（Coates et al., J. Epid., 83:299, 1966）により中和活性を測定した。中和抗体の力価はプラーク数を６０％減少したＦａｂの最高希釈度として計算した。
プラークアッセイにおいてサブグループＡ  ＲＳＶを中和する能力について２８個の陽性上清をスクリーニングした。クローン１３と１９のＦａｂ上清がこのウイルスを高効率で中和し、高濃度のＦａｂがウイルスを完全に中和した（表３）。各クローンの３つの別々の上清調製物が、０．９〜２．８ｎＭ、すなわち０．０４〜０．１４μｇ／ｍｌのＦａｂがＲＳＶプラーク力価を６０％減少する効率で、再現性よくＲＳＶを中和した。その他の上清はウイルスを中和するやや弱い能力をもっていたが、多少のバラツキがあった。これらのクローンの中で最も一貫した中和作用はクローン１１に観察された。このクローンはＲＳＶを完全には中和せず、中和効率はクローン１３および１９よりも約１０倍少なかった（表３）。
Ｆａｂの精製
カルベニシリン５０μｇ／ｍｌおよび２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含むスーパーブロスの１リットル培養物を適当なクローンに播種し、７時間後に２ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、３０℃で一晩増殖した。細胞ペレットを音波処理し、上清を５０ｍｌに濃縮した。濾過した上清を２５ｍｌのタンパク質Ｇ−抗−Ｆａｂカラムにのせ、緩衝液１２ｍｌで洗浄し（３ｍｌ／分）、クエン酸ｐＨ２．３で溶出した。次いで中和画分を濃縮し、５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０中に交換し、１ｍｌ／分で２ｍｌのＭｏｎｏ−Ｓカラムにかけた。１ｍｌ／分で０−５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配にかけ、２００−２５０ｍＭ  ＮａＣｌの領域にＦａｂが溶出した。濃縮後、そのＦａｂはＥＬＩＳＡによりＦＧに対して滴定すると陽性であり、１０−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより５０ｋＤに単一バンドを与えた。１．３５の吸光係数（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定することにより濃度を決定した。
大腸菌溶菌物からアフィニティクロマトグラフィーにより精製、濃縮したクローン１１、１３および１９のＦａｂも、粗溶解物で観察された効率と同等であるがそれよりもやや低い比較的高効率でＲＳＶを中和した。精製、濃縮したＦａｂがパラインフルエンザ型３ウイルスを中和しなかったという知見により、クローン１１及び１９によって示される中和活性の特異性が得られた（表３）。さらに、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する特異性をもつ精製、濃縮したＦａｂ調製物（ＥＬＩＳＡ力価１：１５００）はＲＳＶを中和しなかった（表３）。
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実施例３
各種ＲＳＶ単離物に対するＦａｂの中和活性
さらに別の９つのサブグループＡウイルス単離物および９つのサブグループＢウイルス単離物に対して試験することによりクローン１９の中和活性の幅を試験した。これらのウイルスは３１年にわたって各地から集めたものであった。実施例２に記載の方法でウイルス中和を行った。精製Ｆａｂ１９調製物は高効率でこれらの調製物のそれぞれを中和した（表４）。さらに研究を行ったところ、クローン１１はサブグループＡプロトタイプと同様の効率でサブグループＢのＲＳＶプロトタイプを中和し、またサブグループＡおよびＢウイルスに対する広範な中和活性をもつので、クローン１１も広範な反応性をもつことが示された。
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実施例４
RSV特異性モノクローナル抗体クローン間の核酸配列分析の比較
核酸配列決定を、シーケナーゼ1.0（USB）とＣγｌドメイン（SEQGb:5'GTCGTTGACCAGGCAGCCCAG-3'）またはＣκドメイン（SEQKb:5'ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3'）中の配列にハイブリッドを形成する適当なプライマーとを使用して二本鎖DNAにつき行った。また、配列決定は一本鎖DNAとT3プライマー（5'ATTAACCCTCACTAAAG-3',Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二編，Cold Spring Harbor Press,ニューヨーク，1989）またはＣκドメイン中の配列にハイブリッドを形成するプライマー（KEF : 5'-GAATTCTAAACTAGCTAGTTCG-3'）を使用した。
クローン間の関係を明らかにするために、クローン13及び19（有効に中和したクローン）、クローン11、及び４つのその他のクローン（ランダムに選択した）を配列決定した。図５に示されるように、クローン13および19はＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインの両方で同一であり、明らかにその他の５つのクローンと異なっていた。それにもかかわらず、クローン19およびクローン11は、これらの二つのFabをそれぞれの成分につき等しい中和活性を生じるように調節された混合物として試験した場合に相乗作用の証拠を示さなかった。クローン11およびランダムに選択されたクローンのＨ鎖は全て同一であり、またこの組のＬ鎖の４つが同一であり、一つが異なっていた。結合配列のこの非常に制限された多様性は、同じライブラリーから同定されたHIV-1 gp120結合クローンにつき観察されたかなりの多様性と対称的であるが、gp120およびFGに対するドナーの血清力価は類似していた。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖の体細胞変異体はgp120に結合するFabの中で同定されたが、一方、これはここでは真相ではなかった。これは、RSVの場合の時折の刺激と比較してHIV-1 gp120の場合の慢性抗原刺激を反映し得る。
競合ELISA  見掛結合親和性を記載されたようにして（Zebedeeら，Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:3175, 1992）Fab断片につきELISAウェルに被覆されたFGと遊離FG-糖タンパク質の競合により評価した。
被覆FGにつきFab断片とマウスモノクローナル抗Ｆ抗体の間の競合を実質的に記載されたようにして（Perssonら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88:2432, 1991）評価した。これらの試験を試みで行って、Fabが誘導されるRSV Fの抗原部位を同定した。RSV FG抗原を0.1μg/mlで４℃で一夜にわたってELISAウェルに被覆した。ウェルをブロックし、4x最高結合レベル（間接ELISAにより測定してOD490=2.5）でFab上澄みで37℃で１時間インキュベートし、次にRSV F特異性モノクローナル抗体（1142、1153、1112または1243; Beelerら，J.Virol., 63:2941, 1989）を産生する４つのハイブリドーマ細胞系の一つからのマウス腹水でOD490=2.5を生じる濃度で37℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、HRP接合抗マウスF（ab'）2で発色させた。抑制率を、100−（［実験OD／対称OD（初期競合体を含まない）］x 100］として計算した。相互アッセイにつき、４倍過剰のマウス抗体を４倍過剰のFG被覆プレートでインキュベートし、そして2.5のODを生じるヒトFabを添加し、ヤギ抗ヒトFabで検出した。
クローン11、13および19Fabを抑制ELISAにより更に試験し、これらは108M-1のオーダーの見掛結合親和性を生じた。また、FGの部位につき競合するFab11および13並びにマウスモノクローナル抗体の能力を競合ELISAにより研究した。この目的に使用したマウスモノクローナル抗体は、中和に重要であることが明らかであるＦ糖タンパク質の三つの部位を規定する。表５に示されるように、Ｂ部位の抗体はFab11と競合するが、Fab13とのマウス抗体による競合は殆どなく、または全くない。この最後の結果は親和性の相違を示し得るが、Fab13またはマウスmAbを過剰に使用した場合には、競合が殆どまたは全く観察されなかった。別の説明は、ヒトの抗体中和応答が、一部、マウスにより見られる抗原部位とは異なる抗原部位に対しつくられ得ること、または三つの部位が全抗体を使用して規定されたので、その結果がFab断片の更に小さいサイズを反映し得ることである。
0003976333.tif 000006
これらのFabの中和活性は、最近記載されたヒト化マウスRSVFモノクローナル抗体（Tempestら，Bio/Technology, 9:266, 1991）の中和活性に等しく、これは細胞培養中（0.4μg/mlがウイルスプラークを50％減少するのに充分であった）そしてマウス中（５mg/kgが感染の高さで肺ウイルス力価を105だけ減少するのに充分であった）の両方で非常に活性であった。完全長２価IgG分子のFcエフェクターセグメントを欠いた本発明のこれらの１価Fabは中和機能において均等であった。
実施例５
組換えヒト抗体の産生
免疫グロブリンレパートリークローニングに関する結合性ファージライブラリーアプローチが、最近、特異性抗原に対する高親和性によりヒト免疫グロブリンGl Fab結合をコードする遺伝子断片を単離することを可能にした（Barbasら，上記文献）。これらの遺伝子断片の一つに基く完全ヒト抗RSV抗体をコードする遺伝子の構築およびウイルストランスアクチベータータンパク質を構成的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系への別々のＨ鎖ベクターおよびＬ鎖ベクターの同時トランスフェクションによるこれらの構築物の有効な発現が、以下に記載されるように可能である。この系は一般にレパートリークローニングに由来する組換え抗体の迅速な分析に有益である。
株、プラスミドおよびDNA操作  E.coli株XL-1ブルー（F）proAB,lacl9ZDM15,Tn10（tet'）（ストラタゲン）を全てのクローニング実験に使用する。ベクターpEE6hCMVneo、pEE6hCMVBgIII、pEE6hCMVの誘導体、およびpE1001はセルテク社（Celltech Ltd, Slough UK）からのものである。
DNA操作を通常の技術（Sambrookら，上記文献）に従って行い、オリゴヌクレオチドをアプライド、バイオシステムズDNA合成装置380Aでb-シアノエチルホスホルアミジト化学により合成し、変性PAGEにより精製する。制限酵素はニュー・イングランド・バイオラブズからのものである。全ての構築物をSangerの上記文献に記載のDNA配列決定により確認する。
細胞培養およびDNAトランスフェクション  CHO L761h細胞をDMEM、10％のFCS、1x NEAA（非必須アミノ酸、GIBCO-BRL）および２mMのグルタミン中で増殖させる。DNAのトランスフェクションを、既に記載されたようにして行う（Stephensら, Nucl.Acids Res., 17:7110, 1989）。安定なトランスフェクタントの選択のために、G418（ゲネチシン、GIBCO-BRL）を１mg/ml添加する。細胞を96ウェルマイクロタイタプレート中で限界希釈によりクローン化する。
タンパク質の放射能標識および免疫沈殿  24ウェルマイクロタイタプレートの一つのウェル中のトランスフェクトされたCHO細胞の培地をトランスフェクションの24時間後に１mlのDMEM（メチオニンを含まない）、10％のFCS、1x NEAA、２mMのグルタミン、10mMのNaブチレートおよび4.62MBqトランスS35標識（ICNフロー）で置換する。37℃で３日間のインキュベーション後に、培養上澄みを14000gで５分間の遠心分離により回収し、その後の試験まで-20℃で貯蔵する。必要とされる場合、ツニカマイシンを10mg/mlの最終濃度で添加する。
IgG1の免疫沈殿のために、上澄み200mlを予備膨潤されたプロテインＡセファロース（ファーマシア）と２時間混合し、続いて7000gで15秒間遠心分離し、溶解緩衝液（10mMのトリス、pH7.4、１mMのEDTA、１％のノニデットP-40）/0.5MのNaCl中で洗浄する。溶解緩衝液/0.1％のSDSおよび10mMのトリス、pH7.4/0.1％のノニデットP-40中で更に２回洗浄した後、ビーズを還元性または非還元性SDS-PAGE試料緩衝液中で沸騰させることにより抽出し、そして14000gで５分間の遠心分離からの上澄みを10％のゲルでSDS-PAGEにより分析する。運転後に、ゲルを1MのNaサリチレート中に30分間浸漬し、真空乾燥器中で80℃で２時間乾燥させ、オートラジオグラフィーフィルムに-70℃で露出する。
ELISA  RSV抗体産生クローンを、PBS中のRSV-FG50μl（0.1mg）で被覆したELISA96マイクロタイタプレートを使用して検出した。結合された抗体を抗ヒトカッパーＬ鎖ペルオキシダーゼ接合体（シグマ、no.A7164）により検出した。抗体およびFabの結合親和性を競合ELISAにより評価する。
CHO細胞培養上澄み中の抗体量の評価をプロテインＡ被覆マイクロタイタプレートにつき競合ELISAにより行う。標準曲線を、アルカリ性ホスファターゼ標識ヒトIgG1カッパー（HarlowおよびLane, 抗体：実験マニュアル,CSH Laboratoy,CSH,NY,1988に従って調製した）の一定の飽和量を種々の量のヒトIgG1カッパー（シグマ、13889）と混合し、PBSで洗浄した後、プロテインＡ結合免疫グロブリンアルカリ性ホスファターゼ接合体を測定することにより作成する。
抗体精製およびＮ末端配列決定  抗体を、臭化シアン活性化セファロース（シグマ）を使用して調製したセファロースRSV-FGカラムでアフィニティー精製する。ビーズに吸着された抗体を、還元性試料緩衝液中で沸騰させることにより放出させ、そしてＨ鎖およびＬ鎖をSDS-PAGEにより分離する。配列決定のために、タンパク質をブロッティング緩衝液として10mMのCAPS/10％のMeOHを使用してイモビロン膜にブロットする。Ｈ鎖およびＬ鎖をポンソーＳ染色により検出し、エドマン分解により配列決定する。
発現構築物の設計  その概念は、CHO細胞中のＨ鎖およびＬ鎖の発現のための別個のベクターを生成することである。開始点として、pEE6（Whittleら, Protein Engineering, 1:499, 1987）の二つの誘導体（この場合、転写がヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーター／エンハンサー要素により誘導される）が選択される。全抗体として発現されるように選択されるFabは、例えば、高親和性RSVバインダー、クローン19である。CHO細胞中の二つの免疫グロブリンの分泌発現のために、Ｌ鎖（LC）およびＨ鎖（HC）のFd断片をコードするDNAは適当なシグナルペプチドと組み合わされるべきであり、これらは免疫グロブリン間で顕著な相違を示す。そのDNA配列から、どのサブグループにクローン19のFdおよびLCが属するのかが明らかであり、それ故、これらの遺伝子ファミリーからのシグナルペプチドが選択される。それ故、HCシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをクローンVH-26（Matthysensら，Steinberg,C.およびLefkovits,I.編集，免疫系，ニューヨーク：S.Karger, 132, 1981）中のそれぞれのDNA配列に従って合成し、LCシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをクローンEVJK11（Staveznerら，Nucl.AcidsRes., 13:3495, 1985）のリーダーペプチドに従って設計する。E.coli発現ベクターおよびPCRプライマーの設計のために、ヒト免疫グロブリンの最初の３つ（LC）、および５つ（Fd）のアミノ酸を最初にクローン化しなかった。それ故、それらを、VH-26およびEVJK11骨格1（FR1）配列に従って、シグナルペプチドをコードするリンカーにとり込んだ。Ｈ鎖ベクターにつき、Ｌ鎖構築のために5'Xholクローニング部位を維持することが可能である。しかしながら、Sacl部位の保存はグルタミン酸を天然に見られるグルタミンではなく成熟タンパク質の３位に導入する。更に、それは既に存在する+1のグルタミン酸と組み合わせてＮ末端の負の電荷の非常に異常なクラスター形成を生じる。それ故、二つの異なるＬ鎖構築物、グルタミン酸をコードする構築物と、クローニングに使用されるSacl部位を破壊する+3位の真正グルタミンをコードするその他の構築物がつくられる。失われたFc部分をFdに付加するために、相当するDNA断片を、ゲノムIgガンマ１クローン（Takahashiら，Cell, 29:671, 1982）のサブクローンを有するプラスミドpE1001から切除する。FdおよびFcの融合のために、γ１ドメインをコードするDNA中の特異なBstEII部位を使用した。有効な翻訳開始を可能にするために、使用した二つのシグナルペプチドの天然コザック配列をリンカーの5'末端の設計に入れた。完全HC構築物を哺乳類発現ベクターpEE6HCMVneo（Whittleら，上記文献）にクローン化して翻訳開始のためのhCMVプロモーター／エンハンサー要素、ポリアデニル化のためのSV40シグナルおよびネオマイシン耐性遺伝子を得、安定なトランスフェクタントの選択を可能にする（図５）。二つのLC構築物をベクターpEE6hCMVBgIII（Stephensら，上記文献）にそれぞれ別々にクローン化し、これは同じ転写調節シグナルを与えるが、真核細胞中の選択のための抗生物質耐性遺伝子を有しない（図５）。IgＨ鎖単独の高レベルの発現は哺乳類細胞につき致死性であり、それ故、Ｈ鎖ベクターの選択はＬ鎖の同時合成につき同時選択する。
CHO-L761h細胞中の一過性発現  hCMVプロモーターをトランスアクチベートする変異体アデノウイルスE1A遺伝子を構成的に発現するCHO細胞系CHO L761h（Cockettら，Nucl.Acids Res., 19:319, 1991）の開発は、一過性でトランスフェクトされた細胞を用いる研究に充分な発現レベルを可能にする。
LC発現ベクターおよびHC発現ベクターで一過性で同時トランスフェクトされたCHO L761h細胞の培養上澄みからの放射能標識タンパク質のプロテインＡ−セファロースによる免疫沈殿は、非還元性SDS PAGE条件下でヒトIgG1につき予測されるように、約150kDのバンドを明らかにすべきである。
還元性条件下で、これらのバンドは、IgＨ鎖およびＬ鎖につき予測された分子量である約50kDおよび25kDの二つのタンパク質に分解する。Ｎ末端で二つのグルタミン酸を有するカッパー鎖は、大半が天然グルタミンを含むＮ末端を有するカッパー鎖の後に遅れている広いバンドの形態で移動する。
IgG1エフェクター機能の表示につき、ＣH２ドメインは正確にＮ-グリコシル化されることが重要である。Ｈ鎖のグリコシル化を調べるために、ツニカマイシンを含み、またはそれを含まない培地中のその後の培養のための平行なトランスフェクションを行う。相当する免疫沈殿は、Ｈ鎖がCHO細胞によりN-グリコシル化されることを示すべきである。
安定なトランスフェクトされたCHO細胞によるIgG1/19の分泌
この系により産生し得る抗体の収率を調べるために、安定なトランスフェクタントをG418の添加そして続いて細胞の限界希釈により選択する。クローンを調べてどの細胞系が検出可能な量の抗RSV抗体を産生するのかを示す。これらのうちで、最高の産生クローンを生産性の更なる分析のために増殖する。抗体分泌のレベルは2-105の細胞から24時間で約200-300ng/mlであるべきである。
分泌抗体の分析  抗体を培養上澄みからRSVアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、最初の５つのＮ末端アミノ酸をエドマン分解により測定する。全ての抗体鎖につき、シグナルペプチダーゼによる正確かつ確実なプロセシングが示されるべきであり、得られた配列は正確に予測されたとおりである。二つの抗体のRSVに関する見掛結合親和性を競合ELISAにより評価し、最初のFabの見掛結合親和性との比較を可能にする。抗体は、高親和性抗体に典型的な約108M-1の見掛親和性でRSVを結合すべきである。
実施例６
ヒトFabモノクローナル抗体を使用するRSV感染の生体内の回復
３つのFabを、RSVで感染されたマウスの治療効力につき試験した。RSV Fabを上記のようにして産生した。RSV Fab 19はHEp-２細胞培養液中でプラーク減少中和技術により試験した場合ウイルスに対し高い中和活性（258μg/mlで力価1552）を示し、一方、別のRSV Fab 126は細胞培養液中で中和活性を有しないことが明らかであった。対称として研究された、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエンベロープ糖タンパク質に対し誘導された第三のヒトモノクローナルFabは、細胞培養液中でRSVに対し中和活性を示さなかった。アッセイの独立の組において、RSV Fab 19はまた非常に高い融合抑制（FI）活性を示すことが示された。RSV Fab 19のFI力価は、その中和抗体力価の約1/3であった。
生後15〜32週の雌の平均体重25gのBalb/cマウスを使用した。マウスに組織培地100μl中に含まれた106.3プラーク形成単位（pfu）のRSV株A2を鼻内接種した。マウスをメトキシフルランで麻酔した後に、接種を行った。これらの条件下で、鼻内接種された物質は肺に直接送出される。６匹のマウスを、研究したそれぞれのグループに入れた。ウイルス接種の３日後に、Fab懸濁液100μlをメトキシフルラン麻酔下で鼻内に点滴注入した。ウイルス接種の４日後に、マウスを犠牲にし、それらの肺を回収した（Murphyら，Vaccine, 8:497-502, 1990およびPrinceら，Am.J. Path., 93:771-792, 1978）。肺ホモジネートを５％のCO2インキュベーター中で37℃で半固体培地オーバーレイの下に維持されたHEp-2細胞に関してプラークアッセイによりRSVにつき滴定した（Princeら，1978）。プラークをイムノペルオキシダーゼ標識操作（Murphyら，1990）により検出した。
0003976333.tif 000007
表６に示されるように、細胞培養液中で高レベルの中和活性を既に示したRSV Fab 19はまたBalb/cマウスのRSV感染の高さでそれらの肺中のRSVのレベルを低下するのに有効であった。3.2μg程度の少量のFab 19がマウスの治療上活性であった。これは体重１kg当たり129μgのFab 19を投与したマウスの事例であった。Fab 12.9μg（または体重１kg当たり516μg）を投与したマウスは更に有効な治療結果を示し、この場合、肺中のRSVの力価は5000分の１に減少された。対照的に、細胞培養液中でRSVに対し中和活性を示さなかったRSV Fab 126またはHIV Fab DL 21はまた感染したマウスの肺中のRSVの力価を減少できなかった。加えて、RSV Fab 19はインフルエンザA/ウドルン/1972ウイルスで感染されたマウスで治療効果を示さず、インビボのRSV感染に対するこのFabの治療効果の特異性に関する付加的な証拠を与えた（表６）。次に、RSV感染に対するFab 19の治療効果の期間を、Fabの鼻内点滴注入後の種々の時間でマウスの肺中に存在するRSVの量を測定することにより調べた（表７）。
0003976333.tif 000008
治療の24時間後に肺中のウイルスの量のかなりの減少を生じるFab 19の能力を確認した。重要なことに、クローンFab 19の治療効果は、かなりの中和活性を有するJECヒトポリクローナル血清の治療効果よりも大きかった。しかしながら、２日後に、ウイルス力価の反動が観察された。こうして、治療３日後（これは感染の６日後であった）、治療マウス中の肺ウイルスの力価は対照グループ、即ち、HIV Fabを投与したマウスまたは治療を受けなかったマウスの力価と有意に異ならなかった。
これらの観察は、回復が起こるまでウイルス複製を含むためにFabによる成功した治療が反復投与を必要とし得ることを示唆した。このアプローチの実施可能性を、表８に要約した研究において調べた。
0003976333.tif 000009
マウスの一つのグループは感染の３日後にRSV Fab 19のみを受け、別のグループは感染の３日後および４日後に治療され、一方、マウスの残りのグループは感染の３日後、４日後および５日後にFabを受けた。先の実験のように、Fab 19の単一の点滴注入はマウス中の肺RSVを2500分の１に減少したが、高レベルへの反動が24時間後に起こった。それにもかかわらず、その時点のウイルスの力価は、対照マウスの力価と比較して、100分の１に減少された。次の２日中に、肺ウイルスの力価は、RSV複製の高さで存在する高レベル、即ち、感染４日後の106.5pfuに接近しなかった。感染６日後および７日後に、肺ウイルスのレベルは感染の切迫した消散の特徴的なレベル、即ち、104.2〜104.3Pfu（これは未治療グループの感染７日後の力価に類似する）に留まった（表８）。
連続２日または連続３日の治療は肺ウイルス力価の更に大きな減少を生じた（表８）。RSVは治療の停止の１日後に後者のグループのマウスの肺中で検出されず、一方、非常に適度の反動が１日後に観察された。この発生は重要ではないかもしれない。なぜならば、ウイルスは試験した４匹マウスのうちの２匹の肺のみで検出でき、そして回収したウイルスの量は対照グループよりも依然としてかなり少なかったからである（表８）。これらの観察は、Fab 19の如きRSV Fabが高リスクの乳児および幼児だけでなく、遺伝的疾患、臓器移植の抑制治療またはHIV感染にかかりやすいような免疫不全である全年齢の個人において重度の低RSVの呼吸道疾患の治療に有効であることを示唆する。加えて、これらの観察は、Fab 19の如きFabの直接の呼吸道投与がまた病院滞在中または外来診療所への訪問中に感染に晒される高リスクの個人の重度のRSV疾患の予防に有効であることを示唆する。
インビボの抗体Fab断片の治療活性を実証したこれらの観察は、全く予測されなかった。なぜならば、従来技術はこれらの結果を教示または示唆していなかったからである。実際に、本発明者らが最もよく知る限りでは、抗体Fabの生体内の治療効果は先に報告されていなかった。実際に、生体内の治療効果を全く見込みがないようにする幾つかの理論的な考察がある。Fabは1価であり、こうして一つの部位にのみ付着でき、それにより別個のウイルス粒子の抗原部位の架橋を排除する。この事実のために、２価の抗体分子またはF（ab'）2による架橋がウイルス中和の前提条件であると多くの研究者により考えられていた。また、Fabは有効ではないと考えられているようである。なぜならば、Fabは抗体のエフェクター機能、例えば、補体カスケードの活性化および抗体依存性細胞毒性（ADCC）の多くの原因である免疫グロブリン分子のFc部分を欠いているからである。それにもかかわらず、RSV Fab19はRSVで感染した肺中に存在するウイルスの量を減少するのに非常に活性であり、それ故、粘膜ウイルス感染、例えば、RSVだけでなく、その他の呼吸道ウイルス病原体、例えば、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、およびコロナウイルス（インビボ内のこれらの増殖は呼吸道の内腔表面に制限される）により引き起こされる粘膜ウイルス感染の免疫治療の新しい時期の開始のきっかけとなり得る。
試料の寄託
下記の細胞系統を1992年９月16日以前に米国、MD、ロックビル・パークローン・ドライブ1301にあるザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託した。
細胞系統 ATCC受託番号
クローン11            ATCC 69071
クローン19            ATCC 69072
この寄託を特許手続の目的のための微生物の寄託の国際認可に関するブタベスト条約の条項およびその規則（ブタベスト条約）のもとに行った。これは寄託の日から30年にわたる生存可能な培養物の維持を確保する。生物はブタベスト条約の条項のもとにATCCにより利用可能にされ、この条約は関連米国特許の発行後または米国特許出願もしくは外国特許出願の公開後（いずれか最初に公開されたもの）に公衆への培養物の子孫の永久かつ無制限の利用可能性を確保し、また35 USC§122およびそれに従う米国特許庁の規則（特に886 OG 638を参考とする37CFR §1.14を含む）に従って米国特許庁によりその権利が与えられると定められた者への子孫の利用可能性を確保する。
本件特許出願の譲受け人は、培養寄託物が適当な条件下で培養された場合に死滅し、または喪失もしくは分解される場合、それが同培養物の生存可能な標本で連絡後速やかに交換されることを同意した。寄託株の利用可能性はあらゆる政府の権威のもとにその特許法に従って付与された権利に反する発明の実施のライセンスと見なされるべきではない。
以上に記載された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに充分であると考えられる。本発明は寄託された細胞系統により範囲を限定されるべきではない。なぜならば、寄託実施態様は本発明の一局面の単なる例示として意図されており、機能上均等であるあらゆる細胞系統が本発明の範囲内にあるからである。試料の寄託は、本明細書に含まれる記載が本発明のあらゆる局面（その最良の様式を含む）の実施を可能にするのに不充分であるという承認を構成するものではなく、またそれは請求の範囲をそれが表す特定の例示に限定するものと見なされるべきではない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて本発明の種々の改良が以上の記載から当業者に明らかになるであろうし、これらは請求の範囲内に入る。
配列の要約
配列番号１は、RSVを中和するヒトモノクローナル抗体のＨ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は、RSVを中和するヒトモノクローナル抗体のＨ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号４は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号５は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号６は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号７は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号８は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号９は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号10は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号11は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号12は、抗体Ｈ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号13は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号14は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号15は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号16は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号17は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号18は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号19は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号20は、抗体Ｌ鎖分子の産生のためのポリヌクレオチド配列である。
配列番号21は、クローンrsv6H、11H、21H、22H、および23H（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号22は、クローンrsv13Hおよび19H（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号23は、クローンrsv6L、11L、21L、および22L（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号24は、クローンrsv23L（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号25は、クローンrsv13Lおよび19L（図４）のＨ鎖可変ドメインおよびＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号26は、Ｌ鎖リンカー（図５、上部）のヌクレオチド配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号27は、配列番号26のＬ鎖リンカー（図５）の推定アミノ酸配列である。
配列番号28は、Ｈ鎖リンカー（図５、下部）のヌクレオチド配列（および推定アミノ酸配列）であり、および
配列番号29は、配列番号28のＨ鎖リンカー（図５）の推定アミノ酸配列である。
配列表
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１０
（xi）配列の記載：配列番号１：
0003976333.tif 000010
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１９
（xi）配列の記載：配列番号２：
0003976333.tif 000011
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３２
（xi）配列の記載：配列番号３：
0003976333.tif 000012
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３６
（xi）配列の記載：配列番号４：
0003976333.tif 000013
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３２
（xi）配列の記載：配列番号５：
0003976333.tif 000014
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．２９
（xi）配列の記載：配列番号６：
0003976333.tif 000015
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．４０
（xi）配列の記載：配列番号７：
0003976333.tif 000016
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３８
（xi）配列の記載：配列番号８：
0003976333.tif 000017
（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．４０
（xi）配列の記載：配列番号９：
0003976333.tif 000018
（２）配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３８
（xi）配列の記載：配列番号１０：
0003976333.tif 000019
（２）配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３３
（xi）配列の記載：配列番号１１：
0003976333.tif 000020
（２）配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．２８
（xi）配列の記載：配列番号１２：
0003976333.tif 000021
（２）配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３４
（xi）配列の記載：配列番号１３：
0003976333.tif 000022
（２）配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３６
（xi）配列の記載：配列番号１４：
0003976333.tif 000023
（２）配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３１
（xi）配列の記載：配列番号１５：
0003976333.tif 000024
（２）配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．３０
（xi）配列の記載：配列番号１６：
0003976333.tif 000025
（２）配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．４８
（xi）配列の記載：配列番号１７：
0003976333.tif 000026
（２）配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．４０
（xi）配列の記載：配列番号１８：
0003976333.tif 000027
（２）配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．２７
（xi）配列の記載：配列番号１９：
0003976333.tif 000028
（２）配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１．．２４
（xi）配列の記載：配列番号２０：
0003976333.tif 000029
（２）配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１２９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：rsv 6H;11H;21H;22H; および23H
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１２９
（xi）配列の記載：配列番号２１：
0003976333.tif 000030
（２）配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：rsv 13Hおよび19H
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１２０
（xi）配列の記載：配列番号２２：
0003976333.tif 000031
（２）配列番号２３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：rsv 6L;11L:21L;および22L
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１０９
（xi）配列の記載：配列番号２３：
0003976333.tif 000032
（２）配列番号２４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：rsv 23L
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１０９
（xi）配列の記載：配列番号２４：
0003976333.tif 000033
（２）配列番号２５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：rsv 13Lおよび19L
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１０８
（xi）配列の記載：配列番号２５：
0003976333.tif 000034
（２）配列番号２６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１５．．８６
（Ｄ）他の情報：注−ヌクレオチド８１がＣである場合、アミノ酸２３はグルタミン（Gln）であり、ヌクレオチド８１がＧである場合、アミノ酸２３はグルタミン酸（Glu）である
（xi）配列の記載：配列番号２６：
0003976333.tif 000035
（２）配列番号２７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２７：
0003976333.tif 000036
（２）配列番号２８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：CDS
（Ｂ）存在位置：１５．．８９
（xi）配列の記載：配列番号２８：
0003976333.tif 000037
（２）配列番号２９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２９：
0003976333.tif 000038
【図１】
0003976333.tif 000039
【図２】
0003976333.tif 000040
【図３】
0003976333.tif 000041
【図４】
0003976333.tif 000042
【図５Ａ】
0003976333.tif 000043
【図５Ｂ】
0003976333.tif 000044