(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明支持体上に少なくとも発色試薬層と展開層を有する乾式分析要素の製造方法において、該展開層に少なくとも酵素及び二糖類を含有する水溶液を供給し、約３０〜７０℃の温風を当てて乾燥することを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、該酵素がペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼであり、かつ、該二糖類がトレハロース、シュクロース及びマルトースから選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
【請求項３】
該温風が約４０〜７０℃であることを特徴とする請求項１もしくは請求項２記載の乾式分析要素の製造方法。
【請求項４】
該温風が約５５〜７０℃であることを特徴とする請求項１もしくは請求項２記載の乾式分析要素の製造方法。
【請求項５】
請求項１において、該酵素がヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼであり、かつ、該二糖類がシュクロースであることを特徴とする乾式分析要素の製造方法。
【請求項６】
該温風が約３０〜４５℃であることを特徴とする請求項１もしくは請求項５記載の乾式分析要素の製造方法。
【請求項７】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５もしくは請求項６に記載の方法で製造されたことを特徴とする乾式分析要素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれる成分を定量するための乾式分析要素、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の成分を定量するための乾式分析要素は広く知られており、例えば富士ドライケム（富士写真フイルム株式会社）、ビィトロス（ジョンソン・アンド・ジョンソン）等の名称で市販されている。富士ドライケムの場合、血液中の総コレステロ−ル、中性脂肪、グルコ−ス、総ビリルビン、総蛋白、尿酸、カルシウム、無機リンといった一般化学物質を定量する乾式分析要素、血液中のクレアチンキナ−ゼ、アミラ−ゼ、トランスアミナ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、乳酸脱水素酵素、トランスペプチタ−ゼといった酵素の活性を測定する乾式分析要素等がある。
【０００３】
血液中の成分の一つであるコレステロールを定量分析する有用な方法として、例えばコレステロールオキシダーゼの存在下にコレステロールを酸化し生ずる過酸化水素又はコレステノンを定量する方法が特公昭５４−８３１８号（出願人：ナショナル  リサーチ  アンド  ディベロプメント  コーポレイション）で知られている。
【０００４】
また結合コレステロールを含めた総コレステロールの定量に適用するために、この方法をコレステロールエステラーゼによるコレステロールの遊離と組みあわせることも、米国特許３，９２５，１６４号（ベーリンガー・マンハイム社）によって知られている。上記方法はコレステロールから生じるコレステノンとＨ２０２のいずれかを公知の方法で定量するものである。Ｈ２０２を定量するにはトラインダー試薬が有用であるが、共存するビリルビンが分析結果に誤差を与える。このビリルビンの干渉を防ぐ方法として、フェロシアン塩を共存させることが、米国特許４，２９１，１２１号（マイルズ・ラバラトリーズ社）で知られているが、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトラインダー試薬（または類似の過酸化水素検出試薬系）を含む乾式分析要素にフェロシアン塩を含有させると、分析要素の保存安定性が著しく損なわれることが判明した。
【０００５】
血液中の成分の他の１つであるＣＰＫ（クレアチンキナーゼ)を定量分析する有用な方法としてクレアチンリン酸（以下ＣＰと略す）とＡＤＰを基質とし、生成するＡＴＰをグルコースとヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと略す）によりグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）へ、さらにＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ６ＰＤＨと略す）によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換し、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの増加を波長３４０ｎｍで測定することによりＣＰＫ酵素活性を測定する方法が特公昭４６−９９８８号により知られ、ＳＳＣＣ法等として広く用いられている。
【０００６】
しかしこの方法は、紫外線領域の測光を必要とするので機器が高価なものになり、また紫外線域に吸収を有する多くの化合物の干渉を受ける欠点があった。
【０００７】
酵素反応で生成したＮＡＤＨを、電子受容性の色素前駆体と電子伝達剤から、可視域に吸収スペクトルを有するフォルマザン染料を形成させる比色分析法を用いれば可視域の分光測光によりＮＡＤＨの定量ができる。溶液法と比較して煩雑な調液作業を必要とせず迅速簡便な分析ができる乾式分析要素に、前記のＣＰＫ活性測定に用いられる反応系を導入する試みがなされており、特開昭５９−８８０９７号、特開昭６１−２５４１９９号に開示されている。
【０００８】
これら公知のＣＰＫ活性測定要素は、多孔性担体を有し、該多孔性担体またはこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ＡＤＰ、ＣＰＫ活性化剤であるチオール化合物、グルコース、ＨＫ、ＮＡＤ＋、Ｇ６ＰＤＨ、電子伝達剤、及びフォルマザン染料形成テトラゾリウム塩とゼラチンを含有する。さらに好ましくは、多孔性層、該多孔性層と液体接触関係にある水浸透性層及び水不浸透性・光透過性支持体がこの順に一体に積層され、該多孔性層またはこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ＡＤＰ、ＣＰＫ活性化剤であるチオール化合物、グルコース、ＨＫ、ＮＡＤ＋、Ｇ６ＰＤＨ、及び電子伝達剤を含み前記  水浸透性層（多孔性層と液体接触関係にある）の少なくとも１つがゼラチンから成り、かつフォルマザン染料形成テトラゾリウム塩を含む、ＣＰＫ酵素活性測定用乾式多層分析要素である。しかし、これらの分析要素においても、保存性能が十分とは言い難かった。
【０００９】
糖類を用いて酵素や蛋白質等の巨大分子を安定化する技術はいくつか知られている。例えば、特開平８−１８７０９５号（東洋紡）には、糖類を用いた凍結乾燥によるコレステロ−ルオキシダ−ゼの安定化法およびコレステロ−ル測定試薬キットが開示されている。また、特公平７−７９６９４号（カドラント）は、トレハロ−スの存在のもとで氷点を超える温度で乾燥することによって行われることからなる蛋白質の保護法、およびそれに用いられるトレハロ−スで含浸されている多孔質基質が開示されている。しかし、これらの公報に開示されているのは乾燥時における巨大分子活性の失活を防止する技術であり、マトリクス構造体の中に室温付近から７０度程度の熱風で乾燥して固定化された酵素を有する乾式分析要素において、二糖類の添加により分析要素の保存安定性が向上するという技術は示唆されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれる成分を定量する、酵素を含有する乾式分析要素の製造方法及び当該方法によって製造された、保存性が改良された乾式分析要素を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、透明支持体上に少なくとも発色試薬層と展開層を有する乾式分析要素の製造方法において、該展開層に少なくとも酵素及び二糖類を含有する水溶液を供給し、約３０〜７０℃の温風を当てて乾燥することを特徴とする乾式分析要素の製造方法及び当該製造方法によって製造された乾式分析要素によって達成された。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、酵素を含有する公知の多種の乾式分析要素に適用することが出来る。特に検出試薬系と被検液がいずれも透過し得る固体担体を含む要素に適用することが出来る。要素は光透過性・液不透過性の支持体上に、多孔性液体展開層のほかに下塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、光遮蔽層、濾過層、および公知のその他の層を有する多層構造であってもよい。このような分析要素は例えば、特開昭６３−１１９６９７号、同６３−１５８０００号、特開昭６３−３２４９９号、同６３−２８３６００号等に記載されている。
【００１３】
本発明において使用できる二糖類としては、トレハロース、シュクロース、マルトース、ラクトース等が挙げられるが、これらの中でトレハロース、シュクロースが好ましい。これらの二糖類は、０．５〜４０ｇ／ｍ2、好ましくは４〜２０ｇ／ｍ2の量で存在させる。
【００１４】
以下に、本発明を適用することができる例の一つとして、血液中のコレステロールを定量する乾式分析要素について説明する。このような乾式分析要素は、例えば特開昭６３−１１９６９７号に記載されているが、支持体を用いる場合、当該乾式分析要素の実用的に採りうる構成は、
【００１５】
（１）支持体上に液体展開層を有するもの。支持体と液体展開層の間に吸水層を有してもよい。
【００１６】
（２）支持体上に試薬層、液体展開層をこの順に有するもの。支持体と試薬層の間に吸水層を有してもよい。この場合、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、二糖類が液体展開層に含まれるのが好ましい。
【００１７】
コレステロールエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１３）は試料中に含まれているコレステロールエステルをコレステロールに変える酵素であり、コレステロールオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）はコレステロールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素である。ペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．７）はこの過酸化水素を利用して発色試薬組成物を酸化発色させる反応に関与する酵素である。コレステロールエステラーゼとしてはＥ．Ｃ．３．１．１．１３に分類される酵素を用いることができるだけでなく、コレステロールエステラーゼ活性を有する他の単独の酵素（例、特公昭５６−４５５９９号に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパーゼＭＲ、リパーゼ３０００Ｒ）、およぴ２種以上の酵素の組合せ（例、特公昭５６−４５５９９号に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパーゼ（例、リパーゼＭＲ、リパーゼ３０００Ｒ）、とプロテアーゼ（例、キモトリプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．１）、パパイン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．２）、プロメライン（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．４）、プロナーゼＲ）との組合せを用いることができる。
【００１８】
コレステロールオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）はコレステロールを酸化して過酸化水素を発生させる酵素である。コレステロールオキシダーゼとしては、市販の酵素から適宜に選択して用いることができる。必要に応じて補酵素ＦＤＡ（フラビンアデニン  ジヌクレオチド）とともに用いることができる。
【００１９】
ペルオキシダーゼとしては特公昭５６−４５５９９号、特公昭５７−５５２０号等に記載の植物起源およぴ動物起源のペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．７）、特公昭５８−５０３４号等に記載の微生物起源のペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．７）を用いることができる。これらのうちでは植物起源または微生物起源の非特異性ペルオキシダーゼが好ましい．好ましいペルオキシダーゼの例として西洋わさび、大根から抽出したペルオキシダーゼ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属の微生物から抽出したペルオキシダーゼ等がある。
【００２０】
発包試薬層は発色試薬組成物の全部または一部を含み、親水性ポリマーで形成される層である。試薬層に用いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１．５から約２０、好ましくは約２．５から１５の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。例として、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。試薬層の乾燥時の厚さは通常約１μｍから約１００μｍの範囲、好ましくは約３μｍから３０μｍの範囲である。試薬層には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性）や緩衝剤を含有させることもできる。
【００２１】
発色試薬層に含有させる発色試薬組成物は▲１▼色原体とカプラーを含み、ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカプラーが酸化カプリングしてキノンイミン染料を形成して発色する組成物、または▲２▼ロイコ色素でペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色する化合物である。
【００２２】
色原体としては、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４−２７（１９６９）に記載の４−アミノアンチピリン（別名４−アミノフエナゾン、すなわち１−フェニルー２，３−ジメチルー４−アミノー３ーピラゾリン−５一オン）、特開昭５９−５４９６２号等に記載の１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−5 −オン、１−（３，５−ジクロロフエニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等のトリ置換−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、特公昭５５−２５８４０号等に記載の１−フエニル−２，３−ジメチル−４−ジメチルアミノ−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノアンチピリン類似体を用いることができる。これらの化合物のうちでは、４−アミノアンチピリン、１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３−ジメチルー４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、１−（３，５−ジクロロフエニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等が好ましい。
【００２３】
カプラーとしては、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，２４−２７（１９６９）、特公昭５５−２５８４０号、特公昭５８−４５５９９号、特公昭５８−１８６２８号、特開昭５５−１６４３５６号、特開昭５６−１２４３９８号、特開昭５６−１５５８５２号等に記載のフエノール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン酸等のフエノールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を含む）；１−ナフトール、２−ナフトール；１，７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキシナフタレン；１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホン酸、１−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホン酸等のナフトールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を含む）；その他のフエノールまたはナフトール誘導体がある。これらの化合物のうちでは、１，７−ジヒドロキシナフタレン、１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、３，５−ジクロロー２−ヒドロキシー１−ベンゼンスルホン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。
【００２４】
ロイコ色素としては、特公昭５７−５５１９号に記載の２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエニル）−４，5 −ビス〔４−（ジメチルアミノ）フエニル〕イミダゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭５９−１９３３５２号に記載の２−（３，５−ジメトキシー４−ヒドロキシフエニル）−４−〔４−（ジメチルアミノ）フエニルト５−フエネチルイミダゾール等のジアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭６１−４９６０号に記載の２−（２−フエニルー３−インドリル）−４，５−ジ「４−（ジメチルアミノ）フエニルイミダゾール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素；特開昭６１−２２９８６８号に記載の２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエニル）−３−アセチル−４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フエニル〕イミダゾール等のトリアリールモノアシルイミダゾールロイコ色素；２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエニル）−３−メチル−４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フエニル〕イミダゾール等のトリアリールモノアルキルイミダゾールロイコ色素等がある。
【００２５】
当該乾式分析要素に用いることができる光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる検出層あるいはその他の層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面に物理的（たとえばグロー放電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。
【００２６】
当該分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）吸水層を設けることができる。吸水層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しない層で、水を吸収して膨潤する親水性ポリマーから成る。吸水層に用いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１．５から約２０、好ましくは約２．５から１５の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。例として、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。吸水層の乾燥時の厚さは通常約１μｍから約１００μｍの範囲、好ましくは約３μｍから３０μｍの範囲である。吸水層には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性）や緩衝剤を含有させることもできる。
【００２７】
当該分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）検出層を設けることができる。検出層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層である。検出層は、吸水層と同種の親水性ポリマーにより構成することができる。検出層には、硬膜剤、界面活性剤（カチオン性、アニオン性、両性、又は非イオン性）、緩衝剤、光遮蔽性（反射性または吸収性）微粒子を必要に応じて含有させることができる。
【００２８】
吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の上には、展開層を接着し積層するための接着層を設けてもよい。接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤したときに展開層を接着することができるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層に用いることができる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いられると同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１０μｍの範囲である。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層等の上に塗布する方法により設けることができる。
【００２９】
当該分析要素の試薬層その他の層に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌  第５巻（第２号）、４６７ページより４７７ページ（１９６６年）に記載されているグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤などがある。これらの緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎実験法』（堀尾武一、他著、南江堂、１９８１年）等の公知文献を参考にして選択し、使用することができる。
【００３０】
光遮蔽層は、親水性ポリマーをバインダーとして、光反射性微粒子が分散されている水浸透性の層であることが好ましい。光反射性微粒子は、試薬層（または吸水層）に生じた検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。光反射性を有する微粒子の例としては、顔料微粒子たとえば二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブルッカイト型の、粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子等を挙げることができる。好ましいのはルチル型二酸化チタン微粒子である。親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の吸水層に用いられる種類の親水性ポリのほか、弱親水性の再生セルロース等を挙げることができる。これらのうちゼラチン、ポリアクリルアミド等が好ましい。なおゼラチン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加することができる。光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により吸水層、試薬層等の上に塗布し乾燥することにり設けることができる。
【００３１】
当該分析要素には、必要に応じ展開層中にも上記のごとき光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。展開層は、液体計量作用を有する展開層であるとが好ましい。液体計量作用を有するとは、その表面に点着供給された液体試料を、その中に含有している部分を実質的に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用を有することである。
【００３２】
展開層のマトリックスを構成する材料としては、紙、不織布、織物生地（例えばブロード等の平織等）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編等）、ブラッシュポリマーより形成されるメンブランフイルター、あるいはポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用いることができる。これらのうちでは、織物生地および編物生地に代表される繊維質層が好ましい。これらの詳細については特開昭５５−１６４３５６号、同５７−６６３５９号および同６０−２２２７６９号を参照すればよい。これらの織物生地や編物生地は水洗等の脱脂処理により糸、織物あるいは編物の製造時等に付着した油脂類が実質的に除去されていることが好ましい。
【００３３】
これらの層は、水溶性高分子例えばゼラチンを含む水溶液を塗布することにより、あるいは不織布等をラミネートすることにより、積層することができる。
【００３４】
酵素及び二糖類は、同じ層に含有させることが好ましい。総コレステロール用スライド、ＣＰＫ用スライドにおいては、特に展開層に含有させることが好ましい。この場合には、酵素及び二糖類を含有する溶液を展開層の上に塗布、乾燥することで製造できる。
【００３５】
酵素及び二糖類を含有する溶液を塗布後乾燥する場合には、乾燥条件は重要であり、一般的には室温付近〜７０℃の温風を当てて乾燥する。例えば、温度３０〜７０℃、露点０〜１０℃に調整された温風を用いることができる。
【００３６】
この乾燥温度は製造する乾式分析要素によっても異なる。例えば、総コレステロールの定量に用いる分析要素においては約３０〜７０℃、好ましくは約４０〜７０℃、更に好ましくは約５５〜７０℃である。一方、ＣＰＫの定量に用いる分析要素においては約３０〜７０℃、好ましくは約３０〜４５℃の範囲である。
【００３７】
本発明で製造される一体型多層分析要素は、一辺約１５mmから約３０mmの正方形またはほぼ同サイズ円形等の小片に裁断し、特開昭５７−６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭５６−１２５４２４号、実開昭５５−３２３５０号および特表昭５８−５０１１４４号公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スライドとして用いることができる。
【００３８】
また、特開平６−５０９５９号、同６−２７３４２４号公報等に開示された、スライド枠を有しない分析要素にも適用することができる。
【００３９】
本発明で製造される乾式分析要素は、約５μｌから約３０μｌ、好ましくは約８μｌから約１５μｌの水性液体試料を展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５℃、好ましくは３５℃から４０℃の範囲の実質的に一定の温度でインキュベーションする。その後、一方の側から（一体型多層分析要素においては光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測定対象成分を分析する。
【００４０】
以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
実施例１
〔総コレステロール測定用分析要素の作成〕
ゼラチン下塗りを施されている厚さ１８０μｍの無色透明のＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）平滑フィルムの上に、下記組成のロイコ色素溶液を塗布（１９０ｃｃ／ｍ2）、乾燥し、乾燥厚さ約２０μｍの発色試薬層を形成した。
【００４２】
ゼラチン                              ２５ｇ／ｍ2
下記に示したロイコ色素            ４７４ｍｇ／ｍ2
【００４３】
【化１】
0004003993.tif 000002
【００４４】
上記発色試薬層の上に下記組成の水溶液を塗布（５０ｃｃ／ｍ2）、乾燥し、乾燥厚さ約３μｍの反射層を形成した。
【００４５】
ゼラチン                                ３ｇ／ｍ2
酸化チタン                        ９３０ｍｇ／ｍ2
フェロシアン化カリウム            ７１２ｍｇ／ｍ2
【００４６】
上記反射層に約３０ｍｇ／ｍ2の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（厚さ約２５０μｍ）を軽く圧力をかけて重ね合わせ、乾燥させて編物布地展開層を形成した。
【００４７】
こうして形成した展開層に、下記組成になるように試薬を水溶液とした酵素含有水溶液、及び当該水溶液にｍ2あたりの含量が各０．７５、１．５、４．５、９．０もしくは１５．０ｇとなるようにトレハロースを添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ（１５０ｃｃ／ｍ２）、温度６０℃、露点１０℃に調整した温風を当てて乾燥して、総コレステロール測定用分析要素を作成した。
【００４８】
ペルオキシダーゼ                  ４３５００Ｕ／ｍ2
コレステロールエステラーゼ          ２３００Ｕ／ｍ2
コレステロールオキシダーゼ          ４６００Ｕ／ｍ2
アスコルビン酸オキシダーセ        １３０００Ｕ／ｍ2
リン酸カリウム                            ５ｇ／ｍ2
【００４９】
〔スライド保存性能の評価〕
上記の分析要素を湿度１０％の環境下でアルミニウムラミネート袋内に密封包装し、４５℃で７日保管した後、総コレステロール量２００ｍｇ／ｄｌの液を１０μｌ点着し、密閉容器内で３７℃に保った際の６分後の反射光学濃度（ＯＤｒ（６））を、波長５０５ｎｍで測定した。図１に、４５℃で７日間保管前のスライドでのＯＤｒ（６）に対する４５℃で７日間保管後のスライドでのＯＤｒ（６）の比とトレハロース含量との関係を示す。
【００５０】
図１から、本発明になる総コレステロール分析要素は、従来の分析要素と比べて経時保存性能が優れていることが明らかである。
【００５１】
また、図２に４５℃７日間保管する前の分析要素について、トレハロース含量とＯＤｒ（６）との関係を示す。これから、保管前の分析要素においては、トレハロースを添加しなくても十分な性能を示していることが判る。
【００５２】
実施例２
実施例１と同様にして、ＰＥＴフィルムの上に発色試薬層、反射層を形成し、その上に、実施例１と同様にして編物布展開層を形成した。次いで実施例１で調製したと同じ組成の酵素含有水溶液を調製し、当該液及び当該液にグルコース、マンニトール、シュクロース、マルトース、トレハロースを、ｍ2当たりの含量が各４．５ｇとなるように添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ（１５０ｃｃ／ｍ2）、実施例１と同様の条件で乾燥して、各種の総コレステロール測定用分析要素を作成した。
【００５３】
上記のようにして作成した各分析要素を４５℃で７日間保管した後、実施例１と同様の方法で保存性能を評価した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３より、総コレステロール分析要素に二糖類を添加すると保存性能が良化し、中でもトレスロースの効果が大きいことが判る。
【００５５】
実施例３
〔クレアチンキナーゼ測定用分析要素の作成〕
ゼラチン下塗りを施されている厚さ１８０μｍの無色透明のＰＥＴ平滑フィルムの上に、下記組成のフォルマザン染料前駆体溶液を塗布（１６３ｃｃ／ｍ2）、乾燥し、乾燥厚さ約２０μｍの発色試薬層を形成した。
【００５６】
ゼラチン                                  ２０ｇ／ｍ2
下記に示したフォルマザン染料前駆体    ８００ｍｇ／ｍ2
【００５７】
【化２】
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【００５８】
上記発色試薬層に約３０ｍｇ／ｍ2の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（厚さ約２５０μｍ）を軽く圧力をかけて重ね合わせ、乾燥させて編物布地展開層を形成した。
【００５９】
こうして形成した展開層に、下記組成になるように試薬を水溶液とした酵素含有水溶液、及び当該水溶液にｍ２あたりの含量が各１．３、６．３ｇとなるように二糖類を添加した水溶液をほぼ均一に浸透させ（１２６ｃｃ／ｍ2）、温度３５℃、露点０℃に調整した温風を当てて乾燥して、クレアチンキナーゼ測定用分析要素を作成した。
【００６０】
ヘキソキナーゼ                              ９７６２Ｕ／ｍ2
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ    １３９３８Ｕ／ｍ2
ジアホラーゼ                                １１３２Ｕ／ｍ2
アスコルビン酸オキシダーゼ                  ４９９３Ｕ／ｍ2
クレアチンリン酸                            １．８５ｇ／ｍ2
【００６１】
上記の様にして作成した各分析要素を４５℃で７４日間保管したものに、クレアチンキナーゼを７０Ｕ／ｌ含有する液を各１０μｌ点着し、引き続き密閉容器中で３７℃に保った際の５４０ｎｍにおける吸光度を、２．５分及び４．０分において測定し、その変動を算出した。結果を図４に示す。
【００６２】
また、二糖類としてシュクロースを用いた分析要素に含まれる酵素Ｇ６ＰＤＨの残存活性の変化を図５に示す。
【００６３】
上記結果から、本発明になるクレアチンキナーゼ分析要素は、従来のクレアチンキナーゼ分析要素に比べて保存性能が優れていることが明らかである。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、保存性能の優れた酵素含有乾式分析要素が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  総コレステロール分析要素に含有されるトレハロースの量と分析要素の保存前後の発色濃度（ＯＤｒ（６））比の関係を示す。
【図２】  経時保存をする前の分析要素について、トレハロースの量と発色濃度（ＯＤｒ（６））との関係を示す。
【図３】  各種二糖類を含有する総コレステロール分析要素の保存性能を示す。
【図４】  クレアチンキナーゼ分析要素の保存性に対する二糖類添加の効果を示す。
【図５】  クレアチンキナーゼ分析要素における保存中の酵素活性の低下に対するシュクロース添加の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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