(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性の流路の内側に設定された複数の部位に対して、異なる所望の塩基配列を有する複数種類のＤＮＡフ゜ローフ゛を配置したことを特徴とするDNAキャピラリィ。
【請求項２】
前記流路の末端部が、開放された中空状のキャピラリィであることを特徴とする請求項１記載のDNAキャピラリィ。
【請求項３】
前記流路が、円形、多角形、楕円形のいずれかの断面形状であることを特徴とする請求項２記載のDNAキャピラリィ。
【請求項４】
前記流路が、複数個で且つ一体に配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。
【請求項５】
前記流路が、複数本並列させるか束状であることを特徴とする請求項４記載のDNAキャピラリィ。
【請求項６】
前記複数個の流路の全てが、少なくとも一つの末端部付近で合流路と連通していることを特徴とする請求項４または５に記載のDNAキャピラリィ。
【請求項７】
複数のDNAフ゜ローフ゛が、前記流路に沿って直列した配置であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。
【請求項８】
前記流路が、ガラスまたはシリコン基板上にエッチング加工されて形成されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数のＤＮＡプロ−ブを用いてそのＤＮＡプロ−ブと相補的に反応するタ−ゲットＤＮＡやｍＲＮＡを検出するためのデバイスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノム計画と言われるようなプロジェクトが世界的規模で進められており、人間の全遺伝子の塩基配列の解析が試みられている。この作業は非常に多くの人手を要し、かつ煩雑な作業にもかかわらず、２１世紀の初頭には解明が終了すると言われている。この塩基配列の解析（シ−ケンシング）は先に述べたように非常に煩雑なため、解析機器の改良、自動化やＤＮＡチップと呼ばれる新規な解析方法の提案がなされている。ＤＮＡチップとはシリコン等の基板に半導体のリソグラフィ技術を用いて多数の種類のＤＮＡプロ−ブが決められた位置に配置されたものである。また、ＤＮＡプロ−ブとはＤＮＡを構成する４種の塩基アデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），チミン（Ｔ）が相補的に結合する性質を利用したもので、例えば塩基Ａと塩基Ｔ、塩基Ｇと塩基Ｃがそれぞれ相補的に結合する。従って、ＡＧＣＴＴ（５’→３’）という塩基配列のプロ−ブを用いるとＡＡＧＣＴという塩基配列のＤＮＡを選択的に捕らえることができる。
【０００３】
例えばＤＮＡプロ−ブの固相化方法としては、Ｓｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７３（１９９１年２月発行）に示されているように、光反応を用いて実質的に平坦な基板上にＤＮＡプロ−ブを構成する方法がある。この方法を図１に示す。シラン処理によりアミノ基を基板表面に形成し、光保護分子Ｘを結合させた表面の一部に紫外線を照射し、目的の位置の保護基をはずしてアミノ基を露出させる（図１ａ）。次いで露出したアミノ基と光保護基の付いた４種のＤＮＡ塩基のうちの１種の塩基Ａを選択し、反応させる（図１ｂ）。その結果、光保護基Ｘの付いたＤＮＡ塩基Ａと光保護基のみが付いた表面が形成される（図１ｃ）。さらに、保護基のみが付いた表面の一部を選択し、その部分に光を照射して光保護基の付いたＤＮＡ塩基Ｂと反応させる（図１ｄ）。その結果、光保護基の付いたＤＮＡ塩基Ａと光保護基の付いたＤＮＡ塩基Ｂを含む表面が形成される（図１ｅ）。これらの反応を２次元的な位置決めでＤＮＡ塩基Ｃと塩基Ｄについても同様に行うと４種の塩基全てを基板表面に固定することが出来る。さらに、任意の塩基と光保護基とが付いた部分に対して上述したプロセスを繰り返すことにより、３次元的に塩基の積み重ねが行われて（図１ｆ）に示すように異なった塩基配列を有するＤＮＡプロ−ブを特定の場所に特定の配列で形成することが出来る。従って、本技術を用いることにより例えば８種類の塩基から成るあらゆる塩基配列の組み合わせのＤＮＡプロ−ブを基板上に構成する場合、３２枚のマスクを用意してリソグラフィと光反応技術を３２回繰り返せば全ての組み合わせのＤＮＡプロ−ブを基板上に構成することが出来る。このように形成された基板はＤＮＡチップと呼ばれ主に未知の塩基配列のＤＮＡのシ−ケンシングに用いる事が出来、従来の電気泳動を利用したシ−ケンシング技術に比べ、高速で簡便にシ−ケンシングできるという利点がある。
【０００４】
また、国際出願特許公開ＷＯ９３／０９６６８号（特表平７−５０６５６１号）は、上記国際出願に記載されたシ−ケンシング技術の応用に関するものであり、複数のフロ−式チャネルに適用する方法が述べられている。予めシラン処理によりアミノ基を基板表面に形成した実質的に平坦な基板に対して複数のフロ−式チャネルを取り付けた後に、それぞれのチャネルの全長に亙って一種類の、しかしチャネル毎には異種の塩基配列からなるＤＮＡプロ−ブが固定化される。また、本技術の好ましい態様では、即ち、アミノ基を有する基板を複数の平行に並んだチャネルブロックと合接させた後に、選択されたＤＮＡプロ−ブを含む処理液を特定のチャネルに流すことにより、目的のＤＮＡプロ−ブの１つ目の塩基を固相化し、次に、基板とチャネルブロックとを互いに所定角度（例えば９０度）相対的に回転させてから再び基板とチャネルブロックとを合接させた後に、２つ目の塩基に相当する塩基を固相化する工程を順次繰り返すことにより、所望の塩基配列からなるＤＮＡプロ−ブを構成する方法が述べられている。この方法は光反応による方法と組み合わせることもでき、先に述べたＤＮＡチップを一度に大量に製作することが出来るという利点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術は、ＤＮＡ配列のシ−ケンシングを行うという目的では有力な方法と考えられるが、最近ではポストゲノムの観点から、得られたＤＮＡ情報を如何に利用するかということが今後の課題である。例えば、ＤＮＡがどのように発現するかを研究するために細胞内で発現するｍＲＮＡのパタ−ンを解析することが行われるようになってきている。同じ遺伝子を持ちながら臓器の違いによるｍＲＮＡ発現の違いや同一の細胞でも時間的な発現の変化を研究することは遺伝子治療、医薬品開発、農業・畜産など多くの分野に応用する事が出来、今後の発展が期待されている。そのような発現パタ−ンを調べるにはｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡに対応する複数のＤＮＡプロ−ブを準備し、目的の細胞に含まれるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡとＤＮＡプロ−ブを反応させる方法が考えられる。このような測定においては測定対象のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの塩基配列はある程度既知のものであり、また測定の正確さ、効率性を考慮すると２０〜６０塩基程度、好ましくは４０塩基付近の長さのＤＮＡプロ−ブが用いられる。先に述べたＤＮＡチップでこのようなプロ−ブを構成するには８０〜２４０枚のマスクを準備してリソグラフィと光反応による塩基の合成を８０〜２４０回繰り返す必要がある。従って、ＤＮＡプロ−ブの長さが長くなるにつれ多大な労力が必要になるという問題がある。さらに、合成の収率を考慮すると、長さが４０塩基に揃ったＤＮＡプロ−ブを基板上に直接合成することは実用上不可能といえるが、長さが揃っていないと測定が不正確になってしまうので好ましくない。
【０００６】
また、一つの細胞では約１０万個の遺伝子のうち２〜３万種のｍＲＮＡが発現していると考えられるが、それらのうち細胞特異的なものの割合は、数％（１〜３％程）程度であると推測されている。従って、測定対象のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの種類は数百〜千程度と考えられる。先に述べたＤＮＡチップで８塩基の長さのプロ−ブは４8  すなわち６５，５３６種類形成できるが、測定対象のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの種類は最大で２〜３万程度、実際にはその１／１０以下と想定されるのでこのように大量種類のプロ−ブを形成する必要はない。ＤＮＡプロ−ブと測定対象のｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡの断片とのハイブリダイゼ−ションの熱安定性は一様ではない。また、測定装置のダイナミックレンジを考慮すると、処理濃度が大きく異なるｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡ断片を同時に処理することは不可能である。したがって、同一測定条件の下にある大量種類のＤＮＡプロ−ブの中で、有効な結果を与えるものは限られる。このことからも、大量種類のＤＮＡプロ−ブを基板上に形成する必要が無いことが分かる。
【０００７】
さらに、先に述べたＤＮＡチップでは光反応による合成を繰り返すため、光照射時のＤＮＡプロ−ブの紫外線による劣化が問題となる可能性もあり２０塩基以上の長さのプロ−ブを形成する方法としては適切ではない。また、ＤＮＡチップは実質的に平坦な基板上に形成されるが、固相化時には多数の試薬を交互に反応させたり、また測定時には試料との反応や洗浄を行うために液体を何度も作用させる必要がある。平坦な基板のＤＮＡチップを用いて上記の処理を行うには反応液の入った容器にＤＮＡチップを浸漬するか、ＤＮＡチップ表面を有して流路を形成するような治具を製作して液体処理をする必要がある。従って、これらの処理を円滑に行うためにはＤＮＡチップ以外に液体処理をするための治具を必要とする。しかし、浸漬する方法では、固相化および試料の測定に当って余剰量の各種処理液を必要とする。また、流路を適用する方法では、ＤＮＡプロ−ブが固相化された面積が制限されてしまう。
【０００８】
以上のように、本発明はこの点に着目し、複数種類のDNAフ゜ローフ゛に対する処理用液体を簡単に取り扱うことができるデバイス提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び作用】
上記課題を解決するために、本発明のDNAキャピラリィは、光透過性の流路の内側に設定された複数の部位に対して、異なる所望の塩基配列を有する複数種類のＤＮＡフ゜ローフ゛を配置したことにより、複数種類のDNAフ゜ローフ゛に対する試料、試薬、洗浄液等の処理用液体の取り扱いを簡単に実行できる。ここで、前記流路の末端部が、開放された中空状のキャピラリィであることが好ましい。また、前記流路は、円形、多角形、楕円形のいずれかの断面形状のキャピラリィであることが一層好ましい。また、前記流路が、複数個で且つ一体に配置されていれば、処理能力が向上する。ここで、前記流路が、複数本並列させるか束状であることが好ましい。特に、複数個の流路の全てが、少なくとも一つの末端部付近で合流路と連通していれば、DNAフ゜ローフ゛による試料の測定等に際して、合流路を通じて各種処理用液体が一括して導入されるか或いは回収される。
【００１０】
また、複数のＤＮＡプロ−ブが、前記流路に沿って直列した配置である場合には、流路に沿って処理用の液体（場合によっては、乾燥その他の目的のための気体）を流路に沿って流すことにより、それぞれのＤＮＡプロ−ブが次々に処理される。
【００１１】
また、前記流路が、ガラスまたはシリコン基板上にエッチング加工されて形成されていれば、ＤＮＡプロ−ブの固定が容易になる。しかも、好ましい態様においては、ＤＮＡプロ−ブが光反応を用いて固定されることで、本発明のＤＮＡキャピラリィを好適に製造することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
図２に本発明のＤＮＡキャピラリィの第一の実施の形態を示す。この発明の実施の形態は次のように構成されている。図２は、種々のＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…が、注入用開口部２ａおよび排出用開口部２ｂを両端に有する光透過性の円筒状キャピラリィ４の内壁５に縞状に固定されている状態を示している。キャピラリィのサイズは内径が０．１ｍｍから数ｍｍまで種々のサイズが用いられるが、取り扱いの容易さから０．５ｍｍから１ｍｍ程度のものが好適である。キャピラリィ４の内径や流路長は、測定する試料の容量や液体の流動し易さに応じて決定される。
【００１３】
キャピラリィ４の内部に固定するＤＮＡプロ−ブは、予め所望の塩基配列からなる２０塩基以上、好ましくは２０〜６０塩基、特に４０塩基付近（例えば、３５〜４５塩基）のものであって、その種類は目的によって異なり、測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの数に依存するが、１種類から数千種類までを対象とする。本発明の第一の目的であるｍＲＮＡの発現パタ−ンを解析するためには数千種類のＤＮＡプロ−ブを固定する必要があるが、例えば感染症などの検査を目的とする場合には１から数種類のＤＮＡプロ−ブで十分である。各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…の間隔は、測定対象の数が多い場合には密にすればよい。測定対象の数が少ない場合にはその間隔を広く取ることができ、そうすることにより測定し易さが増す。実際には、２０〜６０塩基程度のＤＮＡプロ−ブを複数種類直列的に配置するために、１μｍから数ｍｍ程度まで種々の間隔で各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…を配置することができる。必要ならば、同種のＤＮＡプロ−ブを複数固定化したり、対照用のタンパクを固定化することにより、測定の多様性を加えてもよい。
【００１４】
通常、ＤＮＡキャピラリィを用いた測定は、測定対象が微量である場合を考慮して、蛍光や化学発光を利用した光増感方式を採用するのが好ましい。キャピラリィ４に固定化された各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…の間隔が密であるとき、蛍光顕微鏡等のように高い分解能を有する測定手段を用いて複数の反応パタ−ンを個別に読み取る必要があるが、数ｍｍの粗い間隔であればトランスイルミネ−タを用いることにより、肉眼でも観察が可能である。このような光測定をし易くするためには、光透過性のよい任意の部材（プラスチック類、シリカ、ガラス、ポリマ−等）からなるＤＮＡキャピラリィを使用するべきであり、特に後述するシラン処理による製造方法を行うにはガラス或いはシリコンが好適である。必要ならば、部分的に光反射性または遮光性であってもよい。市販のガラスキャピラリィを利用すると安価にＤＮＡキャピラリィを製作することができる。
【００１５】
次にＤＮＡキャピラリィの製作方法について説明する。図３は、種々のＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…をガラスキャピラリィの内壁５に固定化する方法を示している。以下に示す各製造プロセスにおける各種処理用液体の導入は、キャピラリィ４の注入用開口部２ａから適宜の分注手段によって行なわれ、処理後の液体の排出は、排出用開口部２ｂから適宜の吸引手段によって行なわれる。まず、内壁５をシランカップリング剤を含む溶液をキャピラリィ４中に導入して、アミノ基（ＮＨ２）７をその表面に形成する（Ｓ１）。次に、特定の波長の光、好ましくは紫外線で光分解を起こすキャッピング剤７を含む溶液をキャピラリィ４中に導入して、内壁５全体をアミノ基で覆う（Ｓ２）。次に、内壁５の固定化したい領域に紫外線照射して、その領域のみのアミノ基６を露出させる（Ｓ３）。ここで、特定の場所のみに紫外線８を照射するためには、半導体のリソグラフィ技術で用いられているマスク部材で特定の場所以外に光が当たらないようにするか、光をレンズ等で照射範囲を絞り込めばよい。また、キャピラリィ４が円筒形状であるから、キャピラリィ側面をほぼ直角に入射する角度であれば、任意の方向から光照射して構わない。また、キャピラリィ４全体が光透過性であるために、キャピラリィ４の内壁５は、紫外線照射された領域のみがリング状に脱保護された状態になる。
【００１６】
次に、アミノ基と反応して結合する結合性部分を分子の一端に、アミノ基もしくはチオ−ル基と反応して結合する結合性部分を分子の他端に有するリンカ−分子９を含む液体をキャピラリィ４中に導入する（Ｓ４）。このとき、リンカ−分子９の一端の結合性部分のみが内壁５上のアミノ基６と結合し、他端の結合性部分はフリ−の状態となる。次に、末端部にアミノ基或いはチオ−ル基を形成させたＤＮＡプロ−ブ１０を含む液体をキャピラリィ４中に導入して、リンカ−分子９にＤＮＡプロ−ブ１０を結合させる（Ｓ５）。なお、適宜の洗浄液を適量導入してキャピラリィ４内を洗浄するプロセスを介して、上記（Ｓ３）、（Ｓ４）、（Ｓ５）の固定化プロセスを所要の間隔だけ離間させた別の場所に変えて繰り返すことにより、図２に示すような目的の場所に目的のＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…を各々リング状に独立して固相化したＤＮＡキャピラリィを製作することができる。ここで、本発明においてリング状または環状とは、中空状流路の断面形状に応じて円形、多角形、楕円形等の種々の形を含んでいる。また、流路とは、少なくとも所要量の処理用液体が流れることのできる幅と高さを有している。この流路は、好ましくは毛管力による流動促進作用を有するように選ばれる。したがって、単に、凹凸の隆起が形成された表面は、流路とは呼ばない。
【００１７】
なお、（Ｓ１）で用いられるシランカップリング剤としては、例えばアミノエチルアミノピロピルトリメトキシシラン等が用いられるが、これに限定されるものではなくアミノ基を表面に形成できるようなものであれば、アミノエチルアミノピロピルメチルジメトキシシシラン等のアミノシラン類が利用可能である。（Ｓ２）で用いられるキャッピング剤としては、４，５−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、６−Ｎｉｔｒｏｖｅｒａｔｒｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、4−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、ｏ−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｙｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ等が用いられるが、この限りでなく紫外線または可視光によりアミノ基との結合が外れるような分子内開裂を示す物質が用いられる。
【００１８】
（Ｓ３）で用いられる光は通常３５０ｎｍ前後の光が用いられるが、キャッピング剤や用いる溶媒の種類に依存して最適な光分解性が得られるような波長帯の光が選択される。また、紫外線のような特定光の照射のための光学装置は、市販のものでよい。
【００１９】
（Ｓ４）リンカ−分子としては、Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ等のｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（ＮＨＳ）ｅｓｔｅｒｓグル−プ分子やＤｉｍｅｔｈｙｌａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ−２−ＨＣＬ等のｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓグル−プ分子が用いられる。また、本実施の形態で用いたリンカ−分子は分子の両末端にアミノ基と反応するスクシイミド基を有しているが、片方は例えばチオ−ル基やカルボキシル基と反応するようなヘテロな反応基を有するリンカ−分子を用いることも可能である。
【００２０】
（Ｓ５）で用いられるＤＮＡプロ−ブ１０は、ＤＮＡプロ−ブ合成時にＤＮＡの５’末端にアミノ基或いはチオ−ル基を付与したものが用いられる。アミノ基或いはチオ−ル基の付与は、市販のＤＮＡシンセサイザ−の専用キットを用いて容易に得られる。ＤＮＡプロ−ブに用いる塩基配列は、遺伝学的、生化学的または免疫学的、病理学的に有意義な任意の生物学的材料に関するものが選択される。
【００２１】
キャピラリィ４の内壁５に対する（Ｓ１）、（Ｓ２）、（Ｓ３）、（Ｓ４）および（Ｓ５）の各プロセスでの処理条件は、キャピラリィの材質、形状、サイズやＤＮＡプロ−ブの種類に応じて適宜設定すればよい。
【００２２】
製作したＤＮＡキャピラリィを用いて測定を行うには、注入用開口部２ａおよび排出用開口部２ｂを通じて、試料や試薬等の処理用液体の注入および排出を行えばよい。ここで、排出用開口部２ｂからの排出時機を種々変更することによって、所望の反応時間を得ることが可能となる。例えば、試料をキャピラリィ４の一端の開口から導入し、ＴＭ値から１０〜１５度低い温度で反応させ、キャピラリィ洗浄のため洗浄液による洗浄操作を行った後、蛍光測定等に用いられる。ここで使用する洗浄液は、使用温度や組成を適宜変えることにより、ストリンジェンシ−を調節したものが望ましい。試料の測定に関与するプロセスが、固定化したＤＮＡに対するハイブリダイゼ−ション反応を含む場合には、試料中のＤＮＡはハイブリダイゼ−ション可能な状態に調製された上で、ＤＮＡキャピラリィに適用される。試料は、生物学的材料がそれ自体液状であるか適宜の溶液に溶解または懸濁された液状のものをいう。従って、試料の種類は、任意である。
【００２３】
また、本実施の形態では１本のキャピラリィを用いて行った例を示したが、複数本並列させるか束状にして同時に処理することも可能である。複数のキャピラリィの配置は任意であるが、測定に関与する一部または全部のプロセスにとって都合の良い配置とするのが好ましい。
【００２４】
図４に本発明のＤＮＡキャピラリィの第二の実施の形態を示す。これは複数のＤＮＡキャピラリィを効率よく製作するに適した形態を示している。図４（ａ）は全体像、図４（ｂ）は上面から見た図を示している。ガラス又はシリコン等の材料からなる下側基板１６ａおよび上側基板１６ｂとを接着させた基板１６には、下側基板１６ａ上に図示するようなパタ−ンの溝が設けられており、これによって複数のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…が形成されている。図４（ｂ）に示すように各々のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の一端は個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…の真下まで延在して、各個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…を通じて外気に開放されており、他端は合流路としての連結流路１７で一本に連結され、共通出入口１５の真下まで延在して、この共通出入口１５を通じて外気に開放されている。個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…および共通出入口１５は、例えばスクリ−ン印刷技術を利用して接着剤を所定の位置に薄膜状に形成して接着することにより取り付けることが出来る。ＤＮＡプローブ１２ａ，１２ｂ，１２ｃ…は、図示するように各々のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の流路に沿って流体の流れる方向とは直角な方向に直線上に配置されている。
【００２５】
ＤＮＡプローブの固相化プロセスは、第一の実施の形態で述べた光反応を利用した方法が適用できる。第二の実施の形態においてはＤＮＡプローブの固相化に用いる固相化用処理液は共通出入口15から連結流路１７を介し、各々のＤＮＡキャピラリィに同時に供給できるとともに、それら処理液の排出もまた共通出入口１５を通じて一括して吸引排液が行なわれる。また、紫外線による露光プロセスは、適宜の紫外線照射手段を上方でＸＹ方向に移動可能にし、ＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…に対して直交するライン状にスキャニングしながら照射することにより、一度に全てのＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の特定の場所にＤＮＡプロ−ブ１２ａを形成することが出来る。本実施形態では、下側基板１６ａが光透過性を有していなくとも、上側基板１６ｂが光透過性であれば、下側基板１６ａおよび上側基板１６ｂの両壁面が露光されて、環状の固相化が達成される。
【００２６】
次に、ライン状に照射する位置をＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…平行に所定間隔分だけ移動し、同様のスキャニング照射を行った後にＤＮＡプロ−ブ１２ｂによる固相化を行う。このような操作を繰り返すことにより、図４に示すように独立して配置したＤＮＡプロ−ブ１２ａ，１２ｂ，１２ｃ…を形成することが出来る。なお、上述した露光プロセスにおいて、スキャニングの軌跡上で露光したくないＤＮＡキャピラリィが有る場合には、例えば紫外線照射手段による照射の有無を適当なスイッチ回路により選択的に切り替えるようにして、スキャニングの際に紫外線が照射されないようにすることにより、各ＤＮＡキャピラリィ毎に多様なＤＮＡプロ−ブの組合せで固相化することができる。このことは、多項目の測定対象を測定する上で、必要最小限の項目での測定を可能とするとともに、余分なＤＮＡの固相化を省くのに有効である。各ＤＮＡキャピラリィに同種のＤＮＡプロ−ブの組合せを固相化すれば、最大キャピラリィと同数の試料に関する測定を同時に実施できる。
【００２７】
上記の固相化プロセスにおいて、共通出入口１５を通じてＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…に導入された固相化用処理液のうち、特に、ＤＮＡプロ−ブを含む液体（図３のＳ５参照）及びそれに続く洗浄のための洗浄液については個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…から排出するようにすれば、異なった液を複数用いる際に起きるコンタミネーションの影響も極力避けることが出来る。また、測定の際には個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…から試料等を注入して測定を行うことにより、異なった試料間で各液とが完全に分離された状態で流動させることが出来るので、測定精度が向上する。
【００２８】
ＤＮＡキャピラリィのサイズは用途に合わせ種々の大きさに加工することが出来るが、実用的には幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さが数ｍｍ〜１００ｍｍ、ＤＮＡキャピラリィ間隔１０μｍ〜数ｍｍ程度で十分である。但し、反応の効率性を考えると測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの拡散速度は毎秒で数μと遅いのでＤＮＡキャピラリィ断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００２９】
ＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の溝部分の物理的な加工方法としては、エキシマレ−ザエッチング、フォトリソグラフィによるエッチング等様々な方法が考えられ、本発明においてはその加工方法を限定するものではないが、以下に、半導体加工技術を用いて溝加工する方法を例にして図５に従って説明する。また、説明の都合上、図４ａにおける下側基板１６ａと上側基板１６ｂとを別々にしてシラン処理したときの場合を例にして説明する。まず、図５ａのように、シリコンウエハ−基板２０に酸化膜１９を５０００Å程度形成し、さらにレジスト膜１８を形成する。次に、図５ｂのように、シリコンウエハ−基板２０上の溝パタ−ンに応じたマスクを製作し、アライナ−を用いてレジスト露光を行って現像する。次に、図５ｃのように、パタ−ニングされたレジスト膜18を用いて、酸化膜１９のエッチングを行う。エッチングにはフッ酸とフッ化アンモニウムを１：９程度に混合した溶液を用いる。次に、図５ｄのように、レジスト膜１８を除去する。除去には硫酸と過酸化水素溶液の混合液や酸素プラズマによる方法が用いられる。次に、図５ｅのように、パタ−ニングされた酸化膜19を用いてシリコンウエハ−基板２０のエッチングを行う。エッチング方法としては等方性、異方性のウエットエッチングやプラズマを用いたドライエッチングなど既存の様々の方法が適用可能である。次に、図５ｆのように、酸化膜１９を除去する。この場合は単に除去するだけであるので、例えばフッ酸溶液を純水で５０％に希釈した溶液に浸すことにより行えばよい。次に、図５ｇのように、エッチングされた溝部分も含めシリコンウエハ−基板20の周囲をシリコン酸化膜21で覆う。
【００３０】
以上で溝の物理的な加工は終了するが、さらに、図５ｈに示すように、光透過性の蓋２３を接合すれば、図４で示したような個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…および共通出入口１５を設けたＤＮＡキャピラリィのアレイを形成することが出来る。図４ａで示された基板１６は図５ｈでは酸化膜２１で覆われたシリコンウエハ−基板２０に相当する。なお、蓋２３の接合は陽極接合法を用いることが出来る。陽極接合法とは５００℃程度に加熱しながらシリコンウエハ−基板２０と蓋２３に１０００Vの電圧を印加して基板同士を接合する方法で、このために蓋２３にはシリコンと熱膨張率のほぼ等しいパイレックスガラス等を用いる必要がある。また、この方法では、必ずしも、蓋２３を同様のシラン処理する必要はなく、この場合には、シリコンウエハ−基板２０の溝部分のみに光反応によるＤＮＡプロ−ブの固相化が行われて、Ｕ字状の固相領域が得られる。しかし、蓋２３も同様のシラン処理を行うようにすれば、図４で示したのと同様に環状にＤＮＡプロ−ブを固相化されるので、固相効率および反応感度上有利である。
【００３１】
前記溝加工においてはシリコンウエハー基板２０を用いたが、石英やパイレックスガラスなどのガラス基板を用いることもできる。その場合には基板のエッチングマスクを酸化膜１９の代わりに金などの金属マスクを用いる。また、接合もそのまま陽極接合法を用いることは出来ないが、間にシリコン薄膜を形成することにより可能となる。シリコンウエハ−基板２０のエッチングマスクに用いた酸化膜１９もこれに限定されることなく、窒化シリコン膜やアルミナ等の膜が利用できる。
【００３２】
このように形成されたＤＮＡキャピラリィアレイには次のような作用効果がある。一度に大量のＤＮＡキャピラリィが形成できるため、コストを低価格にすることが出来る。また、キャピラリィが形成する流路に対して紫外線照射による脱保護を行うので、ＤＮＡプロ−ブをキャピラリィの内壁に効率良く固定化でき、試料の測定感度が向上する。また、多くの試料を測定する際にもＤＮＡキャピラリィが集積化されているため、例えば、個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…からそれぞれ異なる試料を導入して、所要時間インキュ−ベションして生物学的反応をさせた後に、共通出入口１５から一括して試料を回収除去し、以後、適宜、洗浄液や測定用試薬を同様の流れで処理できるから、自動化し易くひいては測定処理能力の高い装置を構成することが出来る。
【００３３】
なお、本発明のＤＮＡキャピラリィは、上述した実施の形態にとらわれることなく様々な変形が可能である。例えば、上述した各実施の形態では、その製造および試料測定に当って、いずれも互いに異なる開口部を用いて注入と排出とを行っているので、各々の液体については必ず一方向の流れが存在するが、場合によっては注入時の開口部と同じ開口部から排液するようにて、注入時の流れとは反対方向に戻すようにしてもよい。また、第一の実施形態では、キャピラリィ４への固相化処理用液体および試料測定用液体の注入を、ピペッタ−のような吐出手段を利用するように説明したが、所要量の固相化処理用液体または試料測定用液体を各々収容している容器に直接キャピラリィ４の先端（注入用開口部２ａ）を漬けるだけで毛管力で自然注入できるし、排液についても、特別な吸引装置を利用しなくとも高吸水性材料（スポンジ、高吸水性ポリマ−等）に先端（排出用開口部２ｂ）を接触させるだけで自然排液できるので、用手法・自動化ともに扱い易い。また、第一の実施形態のキャピラリィ４は、横に寝せた状態でも縦向きに立てて使用しても同様の作用効果が得られる。縦向きにする場合には、注入用開口部２ａ側を上側にした姿勢のまま、上方からの注入を行うとともに排出用開口部２ｂを通じて下方からの排液を行うようにすることもできる。
【００３４】
また、第二の実施形態では、各々のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の一端を連結流路１７で連結しているが、各ＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…を放射状に配置して一端部をいずれも中心付近で連結することで、各流路が合流する部分のみからなる合流路とし、他端部を同心円上に配置することも可能である。また、複数のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…を連結流路１７で連結せずに、各々独立した流路で構成するようにすれば、複数の試料を効率良く処理する集積化アレイを提供できる。
【００３５】
また、本発明のＤＮＡキャピラリィは、試料測定以外にも、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの分離・精製にも利用可能である。また、本発明のＤＮＡキャピラリィに固相化する対象は、抗原抗体反応に関与するタンパクを構成するものであっても構わない。また、試料測定に当っては、本件出願前に公知であるＤＮＡプロ−ブを用いた任意の反応原理から適宜選択すればよい。このとき、測定に必要な種々の試薬、例えば蛍光、化学発光物質、発色物質等の標識試薬は公知の化学分析技術にしたがって利用してよい。必要ならば、選択した反応原理に適した市販の分析装置によって、自動測定することも可能である。
【００３６】
上述した実施形態に述べたように、本発明のＤＮＡキャピラリィは、それ自体が液体を流す流路を形成しているため、上述した固相化、測定、分離等の各種反応や洗浄操作も容易に行え、液体処理装置のような種々の液体を連続的に処理するような装置に接続するだけで容易に一連の操作を行わせることが出来る。また、予め所望の塩基配列からなるＤＮＡプロ−ブを用いることにより、１回の光照射でＤＮＡプロ−ブを固相化できるため、ＤＮＡプロ−ブへのダメ−ジをきわめて少なくすることが出来、良好な固相化状態を保てるという利点がある。また、光反応を利用することで、複数のＤＮＡプロ−ブが流路に沿って直列して環状に且つ縞状に配置されているので、試料を流路中に導入するだけで複数のＤＮＡプロ−ブと同時に且つ効率良く結合反応させることができる。さらに、ＤＮＡプロ−ブを固相化した表面はキャピラリィの内面に保護されるため、汚染の影響も少なくより一層のハンドリングの容易さが期待できる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、複数種類のDNAフ゜ローフ゛に対する処理用液体による取り扱いを簡単に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＤＮＡプローブの固相化方法を説明するための図。
【図２】本発明のＤＮＡキャピラリィの第一の実施の形態を示す図。
【図３】ＤＮＡプロ−ブをキャピラリィの内壁に固定化する方法を説明するための図。
【図４】本発明のＤＮＡキャピラリィの第二の実施の形態を示す図。
【図５】本発明のＤＮＡキャピラリィにおいて半導体加工技術を用いて溝加工する方法を説明するための断面図。
【符号の説明】
１    ＤＮＡプロ−ブ
２ａ  注入用開口部
２ｂ  排出用開口部
４    キャピラリィ
５    内壁
１３  ＤＮＡキャピラリィ
１４  個別出入口
１５  共通出入口
１６  基板
１７  連結流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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