(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0003976610.tif 000025
〔式中、Ｒ１およびＲ３はアリルであり、Ｒ７は水素であり、Ｒ８はシクロヘキシルである〕
を有する化合物。
【請求項２】
医薬上許容され得る担体および請求項１記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項３】
哺乳動物の嚢胞性線維症治療剤である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該哺乳動物がヒトである請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
該哺乳動物の肺に投与される請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
該化合物を０．００１〜０．０１％ｗ／ｗ含有する水性医薬組成物として投与される請求項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、嚢胞性線維症細胞のような頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞を治療するためのＣＦＴＲ結合性化合物の同定方法に関する。さらに、本発明は、そのような細胞を治療するのに有用な化合物およびその医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
健康な動物細胞は、種々の無機イオンの適正なバランスが、細胞膜を渡る不可欠な電気的ポテンシャルおよび生命を促進する内部イオン強度をもたらすように、数ある条件や材料の中でも、該イオンの細胞膜を渡る動きを維持することを必要とする。例えば、Ｎａ+，Ｃｌ-，Ｋ+およびＣａ++が動物において細胞膜を通過することが知られているが、Ｋ+およびＣａ++は種々の細胞で発達の種々の時点で様々な程度で細胞内に蓄積され、他方、Ｎａ+は大部分が細胞内部から排除されてしまう。これらのイオンの細胞を横切る移動は、適当なイオンチャンネルの部位で膜に結合したＮａ+／Ｋ+依存型およびＣａ++依存型ＡＴＰアーゼによって仲介される。塩素イオンは受動的手段により動物細胞を透過して外部体液と内部体液の濃度を平衡化し、全体としての負への細胞内変化の結果、細胞内部的にはＣｌ-は過小発現ということになると信じられていた。しかし、塩素イオンのコンダクタンスは、Ｃｌ-チャンネルによって能動的にも仲介されるということが示された（Edwards, Neuroscience, 7, 1335-1366(1982)を参照）。
【０００３】
嚢胞性線維症（“ＣＦ”）の病理に関する研究の成果により、細胞レベルでイオンコンダクタンスが損なわれることが多くのレベルでヒトの健康に及ぼし得る悪影響に関する情報が得られている。ＣＦは、アフリカ系米国人（約１７０００生産児に１人）に比べて白色米国人（１６００生産児から２０００生産児に１人）の間で特異的に発病率が高いことから、遺伝的根拠を有することが知られていた。実際、過去１０年間にわたる研究の結果、遺伝性の別個の遺伝子変異が異常な外分泌腺および肺の異常機能を含むＣＦの臨床的症状を伴うことが明らかとなっている。
【０００４】
より明確にいえば、ＣＦは嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異により引き起こされ、そのうち最も一般的なのが５０８位におけるフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ508；図１のＣＦＴＲタンパク質の物理的地図を参照）の欠失である。該変異ＣＦＴＲタンパク質はΔＦ５０８と称され、該変異部位は第一のヌクレオチド結合フォールド（ＮＢＦ−１）内部にある（Schoumacher etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 4012-4016(1990); Riodan et al., Science, 245, 1066-1073(1979) ）。より明確にいえば、この変異はＮＢＦ−１の長い内部部分に位置し、Ｎ末端側でWalker A  配列（アミノ酸位置458-471；“ＣＦＴＲ[458-471] ”とも称する）に、またＣ末端側で次のＣドメイン（アミノ酸位置548-560 ；“ＣＦＴＲ[548-560] ”とも称する）およびWalker B  ドメイン（アミノ酸位置561-573；“ＣＦＴＲ[561-573] ”とも称する）に隣接する。Ｉα、ＩβおよびＩｏ（図１を参照）のポリペプチド配列を含む、ＣＦＴＲ[471] とＣＦＴＲ[561] の間に位置する介在配列の生理学的役割は不明である。
【０００５】
結果としてΔＦ５０８を生じるようなある特定のＣＦＴＲ遺伝子の変異は、ＣＦ上皮を挟んで異常なポテンシャル差を引き起こす。かかる異常は、細胞頂端の塩素イオン（Ｃｌ-）コンダクタンスの低下に起因する。その結果、例えば、ＣＦに苦しむ人の上皮膜を通過する塩素イオンおよびナトリウムイオンの輸送に異常をきたす。ΔＦ５０８変異を有する細胞はまた、小胞体（以下、“ＥＲ”という）に結合したＣＦＴＲタンパク質を通常よりも多く有することが知られている。もっとも、野生型の細胞も相当量のＣＦＴＲタンパク質をＥＲ中に保持し分解する。とはいえΔＦ５０８変異体よりはずっと少ない（Ward et al., J. Gen. Physiol., 104, 33a (1994) ）。
【０００６】
このＣＦＴＲ変異が、数ある中でも呼吸系における病態生理学的変化の原因であることは明らかである。該疾患に苦しむほとんどすべての患者が呼吸系の慢性の進行性疾患を発症させる。大多数の場合、膵機能不全が起こり、また肝胆汁性および尿生殖器疾患も頻繁である。
【０００７】
嚢胞性線維症患者の生存は近年向上してはいるが、集中的な支持的および予防的治療の発達や実施にもかかわらず、今なお半数生存年数はわずか２８年に過ぎない。該疾患と闘うための現在の努力は、変異ＣＦＴＲ遺伝子産物を活性化し得るかあるいは冒された細胞からのＣｌ-の付加的な分泌を引き起こし得る薬剤に焦点が絞られている。遺伝子治療はまた別の活発な研究分野であり、これによれば、陰イオンコンダクタンス欠損が組換え野生型ＣＦＴＲ遺伝子、すなわち、結果として異常を生じる変異を欠くＣＦＴＲ遺伝子を導入することによって修復されるかもしれない。
【０００８】
アミロリド（Knowles et al., N. Engl. J. Med., 322, 1189-1194(1990) ）かあるいはＡＴＰおよびＵＴＰの混合物（Knowles et al., N. Engl. J. Med., 325, 533-538(1991) ）のどちらかを含み、気管上皮中のＣｌ-の蓄積を遅延させるエアロゾルの使用に関して、有望な臨床上の成果が最近報告されている。
【０００９】
ＣＦの治療に有用であると称する他の薬剤も記述されている。例えば、米国特許第4,866,072号には、９−エチル−６，９−ジヒドロ−４，６−ジオキソ−１０−プロピル−４Ｈ−ピラノ（３，２−ｇ）キノリン−２，８−ジカルボキシル酸またはその医薬上許容され得る誘導体をＣＦの治療に使用することが記載されている。米国特許第4,548,818号には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療のための３−アルキルキサンチンの使用が記載されている。米国特許第5,032,593号には、気管支収縮の治療における１，３−アルキル置換８−フェニルキサンチンまたはその医薬上許容され得る塩の使用を記載している。米国特許第5,096,916号には、トラゾリンのような、イミダゾリンα−アドレナリン遮断薬および血管拡張剤を嚢胞性線維症、慢性気管支炎および肺気腫を含むＣＯＰＤ、もしくは喘息を伴うＣＯＰＤの治療に使用することが記載されている。
【００１０】
喘息患者およびＣＦ患者には、歴史上、肺機能増進のためにセオフィリンが投与されてきた。かかる肺機能の増進は、原則的には、平滑筋および炎症へのセオフィリンの作用による気管支拡張によって引き起こされる。セオフィリンはホスホジエステラーゼを阻害するだけでなく、アデノシン受容体と拮抗することがわかっている。したがって、セオフィリンは２以上の部位で作用するため、明らかに特異性に欠け、そのため、ＣＦを治療するための有用性が少ない。ホスホジエステラーゼの阻害ではなく、Ａ1アデノシン受容体との拮抗作用が、結果としてＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を促進させることがわかっているという事実を考慮すれば、かかる特異性の欠如は、結果的に心組織、腎組織および／または中枢神経系組織に対する有害な効果のような、望ましくない副作用を生じる可能性があろう。さらに、セオフィリンは有益な効果を達成するには大量に投与しなければならず、そのため、該化合物の高い毒性による副作用の危険性が増す。
【００１１】
基本構造においてセオフィリンと類似する他の化合物が試験されたが、ＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を喚起するのに有用であるとは証明されておらず、それ故、嚢胞性線維症の治療能力は全くもしくはほとんどない。例えば、構造的にセオフィリンと類似する３−イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は活性が非特異的であり且つ毒性が高く、それ故、ＣＦの治療における実用性を欠く。また、化合物２−チオ−８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（２−チオ−ＣＰＸ）、１，３−ジプロピル−８−ノルアダマンチルキサンチン（ＫＷ−３９０２）および１，３−ジメチル−８−シクロペンチルキサンチン（ＣＰＴ）は、塩素イオン流出の活性化において効果がない（米国特許第5,366,977号を参照）。同様に、ＣＰＸ（１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン）の１または３位のプロピル基を一炭素基で置換すると、ＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を活性化する効果のない化合物を生じる。明らかに些細な構造的差異が、ＣＦの治療における特定の化合物の有効性に、決定的でないにしても重要な影響力を持つのである。したがって、もしある方法が、冒された細胞における塩素イオンコンダクタンスを増進させる能力に関して化合物をスクリーニングするのに利用できるならば、特に有用となるであろうし、該化合物はまた、嚢胞性線維症患者を処置するための治療薬の候補となるであろう。
【００１２】
上に引用した第'977号特許およびEidelman et al. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5562-5566(1992) ）には、ＣＰＸがヒト上皮細胞株（ＣＦＰＡＣ−１）からの塩素イオンの流出を増進させる強力なＡ1アデノシンアンタゴニストであることが開示されていた。さらに実施例６に記載されているが、このＣＦＰＡＣ−１株は前記のＣＦＴＲΔＦ５０８変異を発現しており、ＣＦ−活性化合物の第一世代スクリーニング材料とみなされ得る。第'977号特許に開示されるＣＰＸおよびその関連キサンチンアミノコンジナーは比較的毒性がなく、そのためＣＦの治療に有用である可能性があることが示されているが、このような化合物がＡ1アデノシン受容体に対して拮抗作用を有するという事実は、このような治療がおそらくＣＦの病気とは無縁の動物に対して付加的な影響を有するであろうことを暗に示すものである。したがって、このような化合物、つまり複数の活性ターゲットが知られている化合物は実際どれでも使用を避けるのが好ましい。なぜなら、このような化合物の使用は少なくとも有害である可能性があるからである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、高い効力、低い毒性およびアデノシン受容体に対してほとんどもしくは全く特異性がない薬剤が、嚢胞性線維症細胞のような、頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞を処置するための非常に望ましい有望な治療薬となるであろう。このような薬剤は嚢胞性線維症自体の治療に有用性を備えるだけでなく、一般にＣＯＰＤの治療において治療上有用であろう。
【００１４】
本発明の目的は、損なわれた塩素イオンコンダクタンスチャンネルを活性化し得る化合物を同定する方法を提供することである。かかるコンダクタンスが損なわれた細胞の、低下したＣｌ-コンダクタンスを修正する方法を提供することもまた本発明の目的である。本発明の別の目的は、嚢胞性線維症細胞の治療方法を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、嚢胞性線維症膜貫通調節因子のアミノ酸位置５０８のフェニルアラニンを含む欠失を有する嚢胞性線維症細胞の治療方法を提供することである。本発明の目的はまた、かかる方法において有用な化合物、特にアデノシン受容体に対してはほとんどもしくは全くアフィニティーを有しないが、にもかかわらずＣｌ-の流出を促進することによりＣＦ細胞のＣｌ-インバランスを改善する能力を有する新規キサンチン誘導体を提供することである。
【００１５】
本発明のこれらのおよび他の目的と利点、並びに付加的な発明的特徴は、ここに提供される発明の記載から明らかとなるであろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｉα［配列番号：１］のように、ΔＦ５０８変異細胞におけるＣＦＴＲと関連した塩素イオンの流出を活性化することが知られている化合物に特異的に結合する能力を示し、ＣＦＴＲと関連した塩素イオンの流出を活性化するこのような能力を有しないことが知られている化合物には結合能を示さないある特定のＣＦＴＲポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、ＣＦＴＲと関連した塩素イオンの流出を活性化し得るさらなる化合物の同定法を提供する。かかる方法は、イオン流出活性化化合物の選択的結合剤としての、前記ＣＦＴＲポリペプチドの適用を含む。また、該同定法のさらなる改良として、Ｉβ［配列番号：３］またはＩｏ［配列番号：４］のように、Ｉαの位置に隣接もしくはオーバーラップする領域のアミノ酸配列を有し、Ｉαに極めて近接もしくは重複しているにもかかわらずイオンの流出を活性化することが知られている化合物に対してアフィニティーを持たないか負のアフィニティーを有する他のＣＦＴＲポリペプチドも開示する。
【００１７】
前記同定法を応用して、ＣＦ細胞、特にΔＦ５０８変異を有するＣＦ細胞のようなイオン流出欠損細胞において、イオンの流出を活性化する能力を有する化合物が同定され得る。さらに、本発明によれば、このような化合物は、Ａ1−アデノシン細胞受容体またはＡ2−アデノシン細胞受容体のどちらにもほとんどあるいは全くアフィニティーを有しないようにさらにスクリーニングされ得る。したがって、このような化合物は嚢胞性線維症細胞のような頂端のＣｌ-のコンダクタンスが低下した細胞の治療法に使用され得る。より明確にいえば、本発明の方法は、頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞を、Ａ1−，Ａ2−およびＡ3−アデノシン細胞受容体に対してほとんどまたは全くアフィニティーを有しない化合物の治療上有効な量に接触させることを含む。しかしながら、本発明の化合物とＣＦ細胞との間の接触は、結果としてかかる細胞からのＣｌ-イオンの流出を生じる。
【００１８】
特に、当該方法はかかる細胞を式：
【００１９】
【化３】
0003976610.tif 000002
【００２０】
【００２１】
（式中、Ｒ1およびＲ3は同一で、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであり、Ｒ7はＣ1−Ｃ6アルキルまたは水素、Ｒ8はＣ4−Ｃ8シクロアルキルである。）を有する化合物に接触させることを含む。このような化合物は、さらに、１，３−ジプロピル−７−メチル−８−シクロペンチルキサンチン、１，３−ジプロピル−７−メチル−８−シクロヘキシルキサンチン、シクロヘキシルカフェイン、１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチンおよび治療上有効なそれらの誘導体からなる群より選択され得る。
【００２２】
本発明の方法で使用される化合物は基本構造においてセオフィリンと類似するが、両者はＲ1,Ｒ3およびＲ8位の置換基において著しく異なる。セオフィリンに類似する化合物におけるわずかな構造の相違が、該化合物のＣＦの治療における効果をなくするかさもなくば有用でなくすることがわかっていたので、前記化合物がＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を活性化するのに有効であることを発見するのは驚きであった。本発明の化合物の活性は明らかにその機作にいかなるアデノシン受容体の関与も含まないので、この発見はとりわけ予測し得ないものであった。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明はＣＦＴＲ変異細胞における塩素イオンの流出を活性化する化合物に対して正のアフィニティーを有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、本明細書においては、ＣＦＴＲタンパク質の一部、すなわち図１にＩαとして識別されるている部分か、機能において有意な相違のないその変形のどちらかである。Ｉαはアミノ酸位置４７７からアミノ酸位置５０８にまたがるポリペプチドとして定義され、下記の配列を有する：
【００２４】
0003976610.tif 000003
【００２５】
配列中、ＮＨ2とＣＯＯＨ基の間の大文字は種々のアミノ酸に対する慣用の一文字記号であり、以下、このタンパク質関連命名法が配列番号：３および配列番号：４についても同様に使用される。
【００２６】
ポリペプチドＩα［配列番号：１］は、(1) 当該技術分野で周知の方法を用いた分析的または予備的なポリペプチド合成によっても（例えば、Atherton et al.,Solid Phase Polypeptide Synthesis, A Practical Approach (Oxford Univ.Press, 1989)を参照）、(2) 当該技術分野で周知の遺伝子工学の手法を用いてポリペプチドＩαを発現させるに好適なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む微生物を適当にインキュベートすることによっても（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed. 1989) を参照）、あるいは(3) 他のいかなる好適な手法によっても調製することができる。本発明によれば、当該技術の範囲内で理解されるような、ポリペプチドに電荷やコンフォメーションの変更をもたらさない保存的なアミノ酸変化は本発明のさらなる態様を構成する。例えば、イソロイシンをロイシン残基と交換してもポリペプチドＩαの機能性にほとんどもしくは何も影響がないと信じられている。また、Ｉαの断片も同様に機能的であろうと予測される。したがって、このような断片は本発明のさらなる態様を示すものである。
【００２７】
Ｉα合成のためのクローニング手法を構築するのに好適なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列は、遺伝子コードを用いてＩαのアミノ酸配列［配列番号：１］を逆翻訳および逆転写することによって決定することができる。ＤＮＡ鎖、すなわち“センス”鎖および“アンチセンス”鎖のどちらか一方または両方が、Ｉα合成のためのクローンを遺伝子操作するのに有用に用いられ得る。同様に、ＲＮＡ配列もまた“センス”鎖および“アンチセンス”鎖を構成し得る。したがって、本発明はここに列挙および／または言及されるＲＮＡまたはＤＮＡ配列中に具現化されているものと考えられよう。
【００２８】
下記配列のいずれかを有するＲＮＡ分子を生成するためにはいかなる好適な手法を適用してもよい：
【００２９】
0003976610.tif 000004
【００３０】
配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシル、Ｃはシトシン、ＷはＡまたはＵ、ＹはＣまたはＵ、ＲはＡまたはＧ、ＨはＡ，ＣまたはＵ、ＮはＧ，Ａ，ＣまたはＵであり、記号は生物中で翻訳されるようにコドンを反映するトリプレットでまとめてある。以下、このＲＮＡ関連命名法は配列番号：５および配列番号：６についても同様に用いられる。
【００３１】
翻訳によって同じポリペプチド配列、あるいはその機能的な均等物を与える他のＲＮＡ配列もここは意図されている。例えば、トリプレットＵＣＮはトリプレットＡＧＹで置換することができるし、トリプレットＣＧＮはトリプレットＡＧＲで置換することができるが、それでも結果として得られるポリペプチド配列に変化は生じない。ここにおいては、ＲＮＡレベルで識別される、何の変化ももたらさない配列相違に加えて、上述のように、得られるアミノ酸配列に保存的な変化を与えるヌクレオチドの変化も意図されている。つまり、例えば、アミノ酸イソロイシンをコードするトリプレットＡＵＨは、クレームされたポリペプチドの機能性に大した影響を与えることなく、その異性体アミノ酸であるロイシンをコードするトリプレットＣＵＮで置換することができる。このような配列はどれでも、当該技術分野で周知の手法を用いて、好適な核酸ベクター中に連結して好適な細胞またはウイルス宿主中で増殖および発現させることができる。
【００３２】
前述のＲＮＡ分子の遺伝的相補物、すなわち、アンチセンスＲＮＡ、並びにセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子に対応するＤＮＡは、本発明の態様として意図されている。前記配列、その相補物またはそれらに対応するＤＮＡ、さらに以下に開示されるものを生成するための好適な手段としては、手動または自動のインビトロポリヌクレオチド合成が挙げられる。一旦構築されれば、このような配列は転写または翻訳のシグナルを特定する他の核酸配列、並びに細菌、ウイルスもしくは動物細胞中で増殖および／または発現させるためのベクターとして有用なさらに別の核酸配列に連結することができる。このような核酸構築物を調製する方法は当該技術分野でよく知られている（Sambrook et al.,上述を参照）。
【００３３】
当該ポリペプチドまたはその好適な断片は、それ自体で使用してもよいし、第二のポリペプチドとして一緒に共有結合し得る１以上のアミノ酸、プロテオグリカン、プロテオリピッド、炭水化物もしくは何か他の好ましい巨大分子のような別の化合物と結びつけてもよい。本発明のポリペプチドと別の巨大分子とのこのような連結は、共有結合、水素結合、吸着、吸収、金属結合、ファン・デル・ワールス力、イオン結合または他の好適な分子間もしくは分子内の結合もしくは力、あるいはそれらのいずれかの組合せによって安定化され得る。例えば、ポリペプチドＩαは、ＣＦＴＲ変異細胞における塩素イオンの流出を活性化する分子への結合という本質的特徴が保持される限り、１以上のアミノ酸をカルボキシもしくはアミノ末端、あるいは両末端に共有結合的に付加することによって効果的に拡大することができる。本発明のポリペプチドの好ましい形態は、該ポリペプチドの好適なアフィニティークロマトグラフィーマトリックス、例えば、セルロース（ｍ−アミノベンジルオキシメチルセルロース、ブロモアセチルセルロース、カルボキシメチルセルロースヒドラジド、セルロースサイクリックカーボネート等);６−アミノヘキサノン酸；セファロース（セファロース４Ｂ、セファロース６ＭＢ、セファロース６Ｂ、チオールセファロース４Ｂ等）；親水性アクリル樹脂、ポリアクリルアミドおよびアガロースからなるビーズ；および線状ポリアクリルアミドへの共有結合を含む。
【００３４】
ヒドラジド、カーボネート等のような好適な反応性部位、並びにブロモシアン、カルボニルジイミダゾール、クロロホルム酸塩等のような好適な活性化剤を、例えば、１９９３シグマケミカル社カタログの１６１２〜１６１８頁および他のソースより提供されるような、当該技術分野で周知の方法および材料を用いて、前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックスに適用することができる。
【００３５】
Ｉαポリペプチドの特性としては、(1) 約１ｍＭのＣａＣｌ2存在下、ウシクロマフィン顆粒の凝集を開始または惹起し、２２．２μｇ／ｍｌまたは６．３μＭの見かけ上のｋ1/2を有する（図３Ａおよび３Ｂを参照）；(2) 約５．５〜約７．５のｐＨ範囲で活性を有し、約６．７５で５０％の活性が測定された（図４Ａを参照）；(3) ΔＦ５０８変異を有する細胞における塩素イオン流出を活性化する化合物と組み合わせた際に、リポソームの凝集の開始または惹起に対する相助効果を有する。かかる化合物としては、ＣＰＸ、カフェインおよびＮ，Ｎ−ジアリルシクロヘキシルキサンチン（ＤＡＸ）が含まれる（それぞれ、図５、６、および７を参照）；(4) ΔＦ５０８変異を有する細胞における塩素イオン流出を活性化しないことが知られている化合物と組み合わせた際に、リポソームの凝集の開始または惹起に対する増大効果を有しない。かかる化合物としては、数ある中で２−チオ−ＣＰＸおよびイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）が挙げられる；(5) アデノシンと二相性の相互作用を有する。すなわち、７０および１００ｎＭという低アデノシン濃度では、ポリペプチドＩαにより駆動される前記リポソーム凝集反応はおだやかに増大し、高アデノシン濃度では活性のこのような増加はみられず、１μＭ以上では凝集活性は抑制された；および(6) ΔＦ５０８細胞からの塩素イオン流出を活性化することが知られているキサンチン誘導体であるＣＰＸに関して６９±２７ｎＭの見かけ上のＫDを有することが挙げられる。
【００３６】
本発明はまたポリペプチドＩαに近接するが、にもかかわらず、著しく異なる特性を有する他のあるポリペプチドを提供する。ポリペプチドＩβは、ＣＦＴＲタンパク質中５０９位〜５３９位に含まれるアミノ酸配列であり、下記配列を有する：
【００３７】
0003976610.tif 000005
【００３８】
ポリペプチドＩｏは、ＣＦＴＲタンパク質中５００位〜５３１位に含まれる別のアミノ酸配列であり、下記配列を有する：
【００３９】
0003976610.tif 000006
【００４０】
これらのポリペプチドはポリペプチドＩαと隣接するか部分的に重複しているが、これらのポリペプチドはクロマフィン顆粒や合成リポソームの凝集を駆動させないし、ここに開示されるようなポリペプチドＩαの活性および塩素イオン流出を活性化するキサンチン誘導体の活性にも何ら効果を有しない。Ｉαの保存的なアミノ酸変化に関する上記の議論と同様に、このような保存的な変化を有するポリペプチドは本発明のさらなる実施態様である。
【００４１】
ＩβおよびＩｏポリペプチドは、Ｉαポリペプチドについて上述したように、遊離のポリペプチドとして、その断片として、あるいは別の巨大分子と結合させて調製し使用することができる。ＩβおよびＩｏポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーに使用することができ、Ｉαポリペプチドに対するネガティブコントロールとして使用することができる。
【００４２】
Ｉαポリペプチドについて上述したように、ＩβおよびＩｏに対応する好適なＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列は、遺伝子コードを用いて各ポリペプチドのアミノ酸配列の逆翻訳／逆転写によって決定することができる。よって、下記配列のいずれかを有するＲＮＡ分子を生成するためにいかなる好適な手法を適用してもよい：
【００４３】
0003976610.tif 000007
【００４４】
0003976610.tif 000008
【００４５】
Ｉα配列と同様に、配列番号：５および配列番号：６と比較して同一のまたは機能的に均等な配列をコードする他の配列もまた意図されている。例えば、トリプレットＵＣＮ、ＧＣＮおよびＵＵＲはＡＧＹ、ＡＧＲおよびＣＵＮで、それぞれ、アミノ酸電荷の相違なしに置換され得る。さらに、Ｉα配列に関して上述したように、結果として何の変化ももたらさないアミノ酸変化を生じるヌクレオチド配列も本発明のさらなる態様として意図されている。さらにまた、Ｉα配列と同様に、配列番号：５および配列番号：６のＲＮＡ相補物、並びにそれから予見される対応するＤＮＡも本発明の態様として含まれ、それらは当業者に常用の遺伝子コードを用いることにより決定することができる。
【００４６】
前記Ｉα、ＩβおよびＩｏ、あるいはそれらの機能的均等物は、ＣＦＴＲ結合性化合物の同定法に使用することができる。かかる方法は、ＣＦＴＲ結合性と推定される化合物のポリペプチドＩα［配列番号：１］への結合を見越した十分な条件下で、該推定ＣＦＴＲ結合性化合物を該ポリペプチドＩαに接触させ、該推定ＣＦＴＲ結合性化合物が、実際にＣＦＴＲ結合性化合物であることを示すであろうような結合が起こったかどうかを、いずれかの好適な手段により測定することを含む。ＣＦＴＲ結合性化合物によって、本法によって同定される化合物は、細胞のＣＦＴＲ、好ましくはΔＦ５０８のような変異ＣＦＴＲと相互作用し、ＣＦＴＲが仲介する塩素イオン流出を増大させ、おそらくは元通りにするであろうことを意図している。ＣＦＴＲ結合性化合物とＣＦＴＲタンパク質との間のかかる相互作用は、ＣＦＴＲのアミノ酸配列の機能およびＣＦＴＲ結合性化合物の理化学的性質としての、イオン性、疎水性およびファン・デル・ワールス結合または力のいずれかの好適な組合せによって提供され得る。このようなＣＦＴＲ結合性化合物、好ましくはＣＦ用の治療剤として試験する候補化合物の同定には、ポリペプチドＩαに対してアフィニティーがあるという正の効果を試験するのが有用であり、さらにポリペプチドＩβおよび／またはＩｏに対するアフィニティーがないという中性または負の効果をも試験することが好ましい。このようなＣＦＴＲ結合性化合物を同定するためのアフィニティーアッセイに使用される条件は、当該技術分野で周知の慣用的技術を用いて最適化することができる。本法は、例えばＩαに選択的に結合するが、例えばＩβには結合しないすべての好適な化合物を同定することができる。該化合物としては、タンパク質、脂肪、核酸またはそれらのすべての組合せを含む炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
目的のＣＦＴＲ結合性化合物の効果の中で興味深いものは以下の通りである：(1) 合成多糖リポソーム調製物（すなわち、かかるリポソームを含む組成物）に加えると、該リポソームの凝集を開始または惹起する（実施例１に記載される）；(2) クロマフィン顆粒調製物（すなわち、かかるクロマフィン顆粒を含む組成物）に加えると、クロマフィン顆粒の凝集を開始または惹起する（実施例１に記載される）；および(3) 前記リポソームにΔＦ５０８細胞の塩素イオン流出活性化剤を加えると、該リポソームの凝集を速度を増して開始または惹起する（図５〜７を参照）。本発明において有用な塩素イオン流出活性化剤としては、ＣＰＸ、カフェイン、Ｎ，Ｎ−ジアリルシクロヘキシルキサンチンおよび他の好適な化合物が挙げられる。Ｉαと共に試験した塩素イオン流出活性化剤は、すべてＩα単独の効果に対してリポソーム凝集の速度が増加する現象を示した。
【００４８】
さらに本発明は、嚢胞性線維症細胞のような頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞の治療方法を提供し、本発明の方法に関連して有用な新規化合物およびその医薬組成物を提供する。より明確にいえば、該治療方法は、頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞を、アデノシン細胞受容体、特にＡ1アデノシン細胞受容体かＡ2アデノシン細胞受容体のどちらかに対してほとんどもしくは全くアフィニティーを有しないが、それでもＣｌ-流出を促進する化合物の治療上有効な量に接触させることを含む。特に、本法はかかる細胞を式
【００４９】
【化４】
0003976610.tif 000009
【００５０】
（式中、Ｒ1およびＲ3は同一で、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであり、Ｒ7はＣ1−Ｃ6アルキルまたは水素、Ｒ8はＣ4−Ｃ8シクロアルキルである。）で表される化合物もしくは治療上有効なその誘導体に接触させることを含む。かかる化合物はＡ1またはＡ2アデノシン受容体のようなアデノシン受容体に対するそれぞれのアフィニティーで特徴づけられる。特に、かかる化合物のアフィニティーは、０．０１以上のＫi値を有するというように、Ｋi値で表現することができる。好適な化合物は少なくとも０．０５のＫiを有する。このような好適な化合物には、Ｒ1およびＲ3がメチル、プロピルまたはアリルでＲ7がメチルまたは水素、並びにＲ8がシクロペンチルまたはシクロヘキシルであるものが含まれ、特に好ましくは１，３−ジプロピル−７−メチル−８−シクロヘキシルキサンチン、１，３−ジプロピル−７−メチル−８−シクロペンチルキサンチン、１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチンおよび８−シクロヘキシルカフェインからなる群である。
【００５１】
本発明の方法は、嚢胞性線維症細胞の治療に特に有用である。該方法は、特に嚢胞性線維症膜貫通調節因子のアミノ酸位置５０８のフェニルアラニンを含む欠失を有する嚢胞性線維症細胞の治療、就中、ヒト患者のような哺乳動物に見出される該嚢胞性線維症細胞の治療に好適である。
【００５２】
本発明の方法において使用される化合物は、好ましくはホスホジエステラーゼ活性を有しないものである。治療上有効な量の該化合物が毒性を有しないことがまた好ましい。最も好ましくは、該化合物自体が毒性を有しないか、有するとしてもかかる毒性に勝る長所を提供することである。本発明の化合物は、上に列挙した、および以下にＡ1またはＡ2アデノシン受容体について例示するように、いずれのアデノシン受容体に対しても低レベルのアフィニティーを有する（例えば、約０．０１ｍＭ以上のＫiを有する）ことがさらに好ましい。Ａ3アデノシン受容体については、ほとんどのキサンチン類がＡ3アデノシン受容体結合部位に収容され得ないことから、本発明の化合物が、それに対して実質的なアフィニティーを有することはありそうにない（van Galen et al., Medicinal Res. Rev.,12, 423-471(1992)）。本発明の方法に使用するのに特に好ましい化合物は、１，３−ジプロピル−７ーメチルシクロペンチルキサンチン（ＤＰ−ＣＰＸ）、１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチン（ＤＣＨＸ）およびシクロヘキシルカフェイン（ＣＨＣ）であり、最も好ましい化合物はＤＣＨＸである。
【００５３】
かかる化合物およびそれを含む医薬組成物はこれまで開示されていないが、それら自身が本発明の実施態様である。特に、ここで初めて開示される本発明の化合物は、式
【００５４】
【化５】
0003976610.tif 000010
（式中、(a) Ｒ1およびＲ3は同一で、メチルまたはアリルであり、Ｒ7はエチル、シクロプロピルメチルまたは水素であり、Ｒ8はシクロヘキシルである；但し、Ｒ7が水素の時はＲ1はアリルであり、Ｒ7がエチルまたはシクロプロピルメチルの時はＲ1はエチルである；または(b) Ｒ1およびＲ3はともにメチルであり、Ｒ7は水素またはメチルであり、Ｒ8はシクロヘキシルメチルまたはシクロヘプチルである）で表される。前記構造によれば、好ましい化合物は化合物１７、すなわち１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチン（ＤＣＨＸ）である。
【００５５】
その代わりに、あるいはそれに加えて、例えば、ＤＰ−ＣＰＸ、ＣＨＣもしくはＤＣＨＸの医薬上許容され得る誘導体、あるいは、さらに追加例としてそれらの組合せが本発明の方法において使用され、それらは本発明のさらに別の態様を提供する。かかる誘導体は、本発明の治療方法において等価な治療効果を有することが望ましい。
【００５６】
本発明の方法に有用な化合物は、いかなる好適な手段によって投与してもよい。当業者は、本発明によれば、動物、特にヒトに対して該化合物を投与する多くの好適な方法が利用可能であり、ある特定の化合物を投与するのに１以上の経路を使用できるが、ある特定の投与経路が他の経路よりも、より直接的且つより効果的な反応を提供し得ることを理解するであろう。
【００５７】
該化合物は患者の肺に直接投与することが好ましい。好ましくは、該化合物は医薬上許容され得る水溶液として投与される。さらに好ましくは、該化合物は、該化合物を約０．００１〜約０．０１ｗ／ｗ％含有する医薬水溶液として投与される。別の好ましい投与手段として医薬上許容され得るエアロゾルがある。該エアロゾルは、該化合物を約０．００１〜約０．０１ｗ／ｗ％含有することが好ましい。
【００５８】
該化合物はまた経口投与してもよい。このような場合、該化合物は、一般に約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で投与される。経口投与のための本発明の化合物の好適な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日である。静脈内および腹膜内投与のような他の投与経路もまた可能である。
【００５９】
該化合物は、治療上有効な濃度の該化合物が体中の冒された細胞に接触するように投与すべきである。動物、特にヒトへの投与量は、本発明の文脈によれば、適当な期間にわたって該動物内で治療応答効果を示すに十分である必要がある。投与量は使用される特定の化合物の強さおよび動物の状態、並びに治療される動物の体重によって決定される。また、投与量の幅はまた、特定の化合物の投与に伴うかもしれないあらゆる不利な副作用の存在、性質および程度、並びに特定の患者について使用される特定の投与経路によって決定される。一般に、本発明の化合物は少ない投与量で治療効果を示す。有効な投与量の範囲は血液中約３０ｎＭ〜約１００ｎＭである。したがって、該化合物は一般に比較的少ない量で投与されよう。
【００６０】
該化合物は医薬上許容され得る担体とともに投与することができる。本発明は、本発明の化合物および医薬上許容され得る担体を含む医薬組成物を包含する。医薬上許容され得る担体は当業者によく知られている。担体の選択は、幾分は特定の化合物によって、また幾分は該組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物には、非常に多様な好適な処方がある。
【００６１】
経口投与に好適な製剤には（ａ）水あるいは生理食塩水のような希釈液に有効量の化合物を溶解させたような液状溶液剤、（ｂ）各々、特定量の活性成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤あるいは錠剤、（ｃ）適当な液体での懸濁液剤および（ｄ）好適な乳剤が含まれる。錠剤にはラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド性二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびその他の賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝剤、給湿剤、保存剤、芳香剤および医薬上適合し得る担体を１つあるいはそれ以上含めることができる。ロゼンジ剤は、活性成分を通常シュクロースやアラビアゴムあるいはトラガカントといった香味料に含めることができ、また、香錠剤は、ゼラチンやグリセリン、あるいはシュクロースやアラビアゴム乳剤、ゲル剤などのような不活性な基剤に活性成分を含み、活性成分に加え、この分野で公知の担体が含められる。
【００６２】
吸入による投与に好適な製剤には、ジクロロジフロロメタン、プロパン、窒素等のような加圧された許容しうる噴射剤内に入れられるエアロゾル製剤が含められる。活性薬は好適な賦形剤とともにエアロゾル化してもよい。
【００６３】
静脈内あるいは腹腔内投与に投与に好適な製剤としては、例えば水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤および予定された被投与者の血液と製剤を等張にするための溶質が含まれていても良く、また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤があり、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および保存剤が含まれていてもよい。製剤はアンプルやバイアルのように単位投与量あるいは多投与量で容器に封入され、フリーズドライ（凍結乾燥）され、注射するためには使用直前に例えば水のような注射用の無菌の液体の担体を添加するだけでよい状態で保存され得る。前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤の即席の注射液剤や懸濁液剤が調製され得る。
【００６４】
細胞からのＣｌ-流出の誘導の望ましい程度は、治療すべき特定の状態または疾患、さらには患者の安定度と考えられる副作用にもよるであろう。ある化合物を適当な量で適当に投与すると、本発明は、例えば、ほとんど活性化しない場合から実質的に完全に活性化する場合まで、広い範囲の塩素イオン流出速度の活性化を提供する。
【００６５】
本発明は、疾患を含めて、低下した頂端のＣｌ-コンダクタンスによって特徴づけられ得るすべての状態を治療するのに有効であると期待される。特に、本発明は慢性閉塞性肺疾患、就中、嚢胞性線維症の治療に有用であると期待される。
【００６６】
以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６７】
【実施例】
実施例１
本実施例に、ある種のＣＦＴＲポリペプチドの膜指向性活性を測定するための方法およびその結果を説明する。
【００６８】
リポソーム凝集アッセイ：ホスファチジルセリン（“ＰＳ”, Avantiから入手）をクロロホルムに溶解し、当分野では公知の押出し工程によって小さな単層のリポソームを調製した。リペックス機を用いて、１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中に該ＰＳを押し出した。当該リポソームを５４０ｎｍでの最終吸光度が０．０１になるように希釈し、種々の濃度の、種々のポリペプチドおよび／または塩素イオン流出活性化化合物とインキュベートした。
【００６９】
クロマフィン顆粒凝集アッセイ：副腎は地方の屠殺場から入手し、畜殺後２時間以内に氷上にて研究室まで輸送した。組織はBrocklehurst et al. が「Polyp-eptide Hormones: A Practical Approach （Oxford Univ. Press, K. Siddle and J. Hutton eds., 1990）」の237-25５頁に記載したようにして処理した。クロマフィン顆粒は、常法を用いたメトリザマイドのステップグラジエントで精製した。再懸濁した後、顆粒の凝集アッセイを、記載された（Brocklehurst et al.,上述）ようにして行い、５４０ｎｍでの吸光度の増加の初期速度からシネキシン（synexin）の活性を測定した。簡単に言えば、当該アッセイは、クロマフィン顆粒懸濁液（０．３ｍｏｌ／ｌシュクロース、４０ｍｍｏｌ／ｌヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０、シネキシンおよび種々の量の塩化カルシウム）の入った、１ｍｌ石英キュベット中、室温で行った。
【００７０】
ＣＦＴＲポリペプチドの調製：ポリペプチドはエール大学の分子生物学・生物物理学部門で、通常の固相法を用いて合成された。該ポリペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製され、その配列は、当分野ではよく知られている通常の方法を用いて、直接化学的な配列決定、アミノ酸分析、および質量分光学によって確かめられた。特異的なポリペプチドはＩα［配列番号：１］、Ｉβ［配列番号：３］、およびＩｏ［配列番号：４］であった。
【００７１】
Ｉα［配列番号：１］によるクロマフィン顆粒およびリポソームの凝集：図２に示すように、ポリペプチドＩαは１ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下でウシのクロマフィン顆粒の凝集を引き起こすことがわかった。対照的に、隣接しているポリペプチドＩβ［配列番号：３］はクロマフィン顆粒の凝集アッセイにおいては本質的に不活性であった。同様に、オーバーラップしているポリペプチドＩｏ［配列番号：４］もまた不活性であった。つまり、これらのデータはＩαの作用はＩα配列に特異的であると示唆しているようである。
【００７２】
図３Ａに図示されているＩα活性の滴定はｋ1/2,app が２２．２μｇ／ｍｌあるいは６．３μＭであったことを示している。これらのデータのＨｉｌｌプロット（図３Ｂ参照）はＨｉｌｌ係数（ｎH ）が２．６であることを示した。同様のデータが凝集の標的としてホスファチジルセリンリポソームを用いた場合にも観察され、ｐＨ５．５から７．５にわたるｐＨ領域での詳細な滴定では５０％活性を示すためのｐＨはおよそ６．７５（図４Ａ参照）であることを示した。
【００７３】
低濃度のＩαによるＰＳリポソームの凝集：図２に示すように、高ポリペプチド濃度で凝集反応は迅速に開始し、続いて明らかな１次反応が起こり、実際上５−１０分以内にプラトーに達した。Ｉαによって引き起こされる凝集反応の協同性は、Ｈｉｌｌ係数（図３Ａ参照）によって定量的にも明らかで、該協同性は、より低ポリペプチド濃度では凝集の初期速度が幾分唐突に小さくなったことを図示している。しかしながら、より長い期間では、たとえ複雑なカイネティックスを伴うにしろ、顕著な凝集反応がまだ生じたことが明白となった。図４Ｂに示すように、該カイネティックスは、初期の約８−１０分の遅滞期、それに続く上昇期そしてプラトーを包含していた。明白な一次反応からより複雑な反応への転換はＩαポリペプチドが２μＭ以下で起こり、複雑な反応が０．４から２μＭの間で濃度依存的に明白であった。約０．４μＭ以下では実質的に全ての活性が停止した。
【００７４】
したがって、Ｉαが上述の膜凝集現象を引き起こす一方で、隣接の（Ｉβ）あるいは部分的に重複している（Ｉｏ）ポリペプチド配列は、ＣＦＴＲに関しては、そのような凝集は引き起こさない。効果的な内部の負の制御は、ＣＦＴＲ上の、Ｉαの部位に位置している特別の機能特性の存在を明瞭に示しており、この特性は明らかに膜の関与を示すものである。
【００７５】
実施例２
本実施例に、ある種の塩素イオン流出活性化化合物のＩαへの特異的な結合、および塩素イオンの流出を活性化しないある種の化合物のＩαへの結合不能性を説明する。
【００７６】
ＣＰＸをΔＦ５０８変異細胞からの塩素イオンの流出を活性化することが知られている代表的な化合物として使用した。ＣＰＸのストック溶液は、ミリモル濃度の範囲でＤＭＳＯで調製した。Ｉαポリペプチド（１００ｎＭ最終ポリペプチド濃度）を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ＝７．０）、３００ｍＭシュクロース、および１０ｍＭグルタチオンを含有する緩衝液１００μｌに溶解した。３７℃、１時間インキュベートした後、１−１００ｎＭの3Ｈ−ＣＰＸ（ＩＣＮ、比活性＝１０９Ｃi／モル）を添加し、さらに１５分間インキュベートした。置換実験の為に、放射活性プローブの前に、未標識ＣＰＸあるいは他のキサンチン拮抗剤類およびヌクレオチド類をインキュベーション混液に添加した。当該混液は、通常のドットブロット装置を用いて、ニトロセルロース（ＮＣ）膜（Schleicher &  Schuell）でろ過した。3［Ｈ］−ＣＰＸのＮＣフィルターへの非特異的な結合は０．３％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でフィルターをブロッキングすることにより減じた。ドットブロットは、２００μｌのＴＲＩＳ緩衝液−ＮａＣｌ溶液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ，ｐＨ＝７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で５回洗浄し、放射活性のあるスポットを切り出し、全部を、液体シンチレーション計数によって放射活性測定した。Ｉαへの特異的な3Ｈ−ＣＰＸ結合は、全結合から、１０μＭの非標識のＣＰＸでプレインキュベーションすることによって明らかになる非特異的な結合を差し引くことにより測定した。
【００７７】
3Ｈ−ＣＰＸのＩαへの結合は、ＣＰＸの濃度によって飽和に達し得る機能であった。データをＳｃａｔｃｈａｒｄプロットにあてはめると、ＫD,app は６９±２７ｎＭ（ｎ＝４）を示した。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロットの切片から推定されたＢmax'は結合Ｉαポリペプチドのモル分率が１／２０００未満であることを示した。結合の置換は、既知の塩素イオン流出活性化剤であるＣＰＸ、カフェイン、およびＤＡＸによって行われたが、塩素イオン流出を活性化しないことが知られているＩＢＭＸあるいは２−チオ−ＣＰＸによっては行われなかった。
【００７８】
これらのデータは、塩素イオン流出活性化剤が特異的にＩαに結合できることを示し、それによって、ＣＦＴＲ（ΔＦ５０８）変異を有する細胞のＣＰＸ活性化の機構がＣＦＴＲ分子それ自体との相互作用によるものであるかもしれないことを示唆している。さらに、Ｉαに塩素イオン流出活性化剤が結合し、塩化物イオン流出活性化剤でないものは結合しないという特異性によって、ＣＦ細胞に治療効果を有するかもしれないＣＦＴＲ結合タンパク質をさらに同定するためにこの方法が利用できることをこれらのデータは示している。
【００７９】
実施例３
本実施例に、Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソームの凝集におけるＣＰＸの影響について説明する。
【００８０】
Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソームの凝集におけるＣＰＸの影響力について調べた。該実験は１〜３０ｎＭ（ΔＦ５０８含有細胞において活性化が示される）、３０〜１００ｎＭ（前述の細胞において最大の活性化が示される）、１０００ｎＭまで（前述の細胞において活性化の阻害が示される）の濃度のＣＰＸを用いて行った。
【００８１】
図５に示すように、０．５μｇ／ｍｌ（０．１８μＭ）のＩα単独で引き起こされるリポソームの凝集は非常に緩和であった。しかしながら、ＣＰＸ濃度の上昇に伴って、およそ５分の遅滞の後に凝集反応は漸次活性化された。凝集の最大速度および程度は、１００ｎＭ  ＣＰＸの時に観察され、その後、３００ｎＭにまでＣＰＸ濃度を上げると、減少した。図５の挿入図は、２０分の時点での反応の程度を示したものである。
【００８２】
従って、これらのデータは（１）ΔＦ５０８含有細胞についてのＣＰＸの濃度依存的な挙動と、（２）Ｉα凝集についてのＣＰＸの濃度依存的な挙動との間にパラレルな関係があることを示している。
【００８３】
実施例４
本実施例に、Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソームの凝集における他のキサンチン類の影響を説明する。該研究には、ΔＦ５０８において塩素イオンの流出を活性化することが知られているある種のキサンチン誘導体類（例えば、カフェインおよびＮ，Ｎ−ジアリルシクロヘキシルキサンチン（ＤＡＸ））あるいはそのような塩素イオンの流出を活性化しないことが知られているある種のキサンチン誘導体類（例えば、２−チオ−ＣＰＸおよびイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ））が用いられた。
【００８４】
ＰＳリポソーム凝集アッセイの結果を図６に示す。該グラフから明らかなように、カフェインはＩα凝集の活性化効果は低いが、最も高い濃度でもＩα凝集の不活性化は示さないようである。図６の挿入図は、２０分の時点での反応の程度を示したもので、調べたカフェイン濃度にわたり、凝集は全く横ばいにはならないことを示している。
【００８５】
ＤＡＸの場合は、その効果はＣＰＸの範囲内であるが、３００ｎＭという高い濃度でも不活性化は認められない（図７参照）。図７の挿入図は２０分の時点での反応の程度を示している。この図より、同様のタイプのプロット（図８）でＣＰＸおよびＤＡＸの両方を比較することができ、それによるとＤＡＸは少なくとも１／２ログはＣＰＸよりも効果が低いことがわかる。しかしながら、ＤＡＸおよびＣＰＸの塩素イオン流出に関する有効性は実質的に同じである。より高い濃度のＤＡＸが得られなかったのはその溶解性に限界があるためであった。
【００８６】
リポソーム凝集アッセイに、ΔＦ５０８変異を有する細胞からの塩素イオン流出活性化剤としては不活性であることが知られている化合物である、２−チオ−ＣＰＸおよびＩＢＭＸを含めることにより、これらの化合物がＩαによって引き起こされるリポソーム凝集を高めることにおいては、それぞれ１および１５μＭまでの濃度では、全く不活性であることが示された。
【００８７】
従って、Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソーム凝集アッセイは、塩素イオン流出の活性化において活性あるいは不活性であることが知られているキサンチン誘導体類の結果とまさにパラレルな結果を与える。
【００８８】
実施例５
本実施例に、Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソーム凝集におけるアデノシンの影響を説明する。
【００８９】
アデノシンをＰＳリポソーム凝集アッセイに用いた。アデノシンは、Ｉαによって引き起こされるＰＳリポソーム凝集反応に極めて緩和ではあるが明らかに二相性の影響を及ぼした。７０および１００ｎＭというより低い濃度で、アデノシンは凝集反応を緩やかに活性化した。しかしながら、より高濃度ではその活性化効果は消失した。１μＭおよびそれ以上のアデノシン濃度では、凝集反応はすでに低いコントロールレベルより下にまで実際に抑制された。つまり、これらのデータはキサンチン類、ＣＰＸおよびＤＰＸは、アデノシンとアフィニティーのある、Ｉαポリペプチド上の一部分と明らかに相互作用することを示している。
【００９０】
実施例６
本実施例に、本発明の新規のキサンチン誘導体類、および以前に開示されたキサンチン誘導体類の合成および化学分析について説明する。
【００９１】
化合物１５、１６、２２、および２４を得るためのキサンチン誘導体類のＮ−７の位置でのアルキル化はJacobson et al., J. Med. Chem., 36, 2639-2644(1993)およびDaly et al., J. Med. Chem., 29, 1305-1308(1986)に記載されたようにして行った。化合物８−１２、１４、１８、１９、２０、および２５は、Jacobson et al., Biochem. Pharmacol., 37, 3653-3661(1988)；Shimada et al.,J.Med. Chem., 35, 924-930(1992) ；およびShamim et al., J. Med. Chem.,32, 1231-1237(1989)に記載されたようにして合成され、化合物７、１４、１８および１９は、Mullet et al., J. Med. Chem., 36, 3341-3349(1993)、およびShamin et al., J. Med. Chem., 35, 924-930(1989)に開示されている。化合物１−５および２６および２−クロロアデノシンはリサーチ・バイオケミカルズ・インターナショナル（ナティック，マサチューセッツ州）から入手した。化合物２７は、Thompson et al., J. Med. Chem., 34, 2877-2882(1991)に開示された。
【００９２】
【表１】
0003976610.tif 000011
0003976610.tif 000012
【００９３】
以下の方法を用いて、アルキルあるいはシクロアルキルカルボン酸を５，６−ジアミノ−１，３−ジメチルウラシルと反応させて、５−（シクロヘプタノイルアミノ）−６−アミノ−１，３−ジメチルウラシルおよび５−（シクロヘキシルメチルカルボニルアミノ）−６−アミノ−１，３−ジメチルウラシル等の対応するアミドを得た：
【００９４】
酸（１当量）を、最小容量の１，３−ジアルキル−５，６−ジアミノウラシル（１．５当量）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル  カルボジイミド：ＨＣｌ（１当量）を添加し、続いて触媒量（０．０５当量）の４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジンおよび０．０５当量のイミダゾールを添加した。該混合物を室温で３時間攪拌し、飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し（１，３−ジプロピル誘導体類を使用する場合はここで水を用いた）、沈澱あるいは無定形の不溶性画分を得た。不溶性の残渣をろ過し、十分にメタノールを含有している４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に溶解して澄明な溶液を得た。混合物を２時間、ＴＬＣ（シリカプレート、ＣＨＣｌ3；ＣＨ3ＯＨ；ＨＯＡｃ；８５：１０：５ｖ／ｖ）を用いた判定で、完全に出発物質が消失するまで６０℃で加熱した。混合物を冷却し、６Ｎの塩酸水溶液でｐＨを１に酸性化した。該沈澱を水で洗浄し、乾燥し、さらに分取シリカプレート（８５−９５％ＣＨＣｌ3；５−１５％メタノール；１−５％ＨＯＡｃ）を用いて精製した。
【００９５】
該新規化合物類をＶａｒｉａｎ  ＧＥＭＩＮＩ−３００  ＦＴ−ＮＭＲ分光計を用いて３００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴質量分析法によって同定した（および共鳴を帰属した）。特に記さない限り、化学シフトは、テトラメチルシランからの低場への移動をｐｐｍで表している。新規化合物類は、質量分光計で、あるいはＶＧ７０７０Ｆ質量分光計を用いてＥ１モードで、化学イオン化質量分析法（ＮＨ3）によって同定された。化合物１５、１６、２２および２４の典型的なスペクトルデータ：1Ｈ ＮＭＲ ＣＤＣｌ3δ ３．４２（Ｓ，３Ｈ Ｎ3ＣＨ3）; ３．６３（Ｓ，３Ｈ  Ｎ5ＣＨ3）；３．８９（Ｓ，６Ｈ  ＯＣＨ3）；５．０６（Ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ2）；６．８（Ｓ，２Ｈ）；６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ）；７．３−７．５（ｍ，５Ｈ）；７．７（Ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ）；ＭＳ（Ｃｌ）  ｍ／ｅ  ４６３（ＭＨ+ｂａｓｅ），３７５，３５７。
【００９６】
炭素、水素、および窒素分析はアトランティック  マイクロラブズ（ノルクロス，ジョージア州）によって行い、±０．４％を認容した。前述の技術を適用して行った同定実験の概要は、表２に示した。表２には、化合物１５−１７および２１−２４の化学式および元素分析を示した。
【００９７】
【表２】
0003976610.tif 000013
【００９８】
全てのキサンチン誘導体類は、生物学的な試験の前に薄層クロマトグラフィーを用いて同質であるということを判定した。
【００９９】
実施例７
本実施例に、ＣＦＰＡＣ細胞と本発明のキサンチン誘導体類との接触に反応した、当該細胞からの塩素イオン流出の測定を、該細胞の培養および該細胞に対する実験の実施に必要とされる方法を含めて述べる。
【０１００】
ＣＦＰＡＣ細胞は、非常に一般的なＣＦＴＲ変異、すなわちＰｈｅ508の欠失についてホモである膵臓腺癌細胞である（Schoumacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 4012-4016(1990)）。ＣＦＰＡＣ細胞およびＣＦＴＲをトランスフェクトしたＣＦＰＡＣ細胞（ＣＦＰＡＣ−４．７ＣＦＴＲ）をアラバマ大学のR.Frizzellから得た。該細胞を分け、２４ウエルのＣＯＳＴＡＲプレートに、Ｉｓｃｏｖｅ培地ででできた培地〔１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の熱非働化ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌフンギゾン、および１％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルタミンを添加し、浸透圧を３１０ｍＯｓｍに調整してある〕中、低密度で撒いた。全ての培養材料はBiofluids （ロックビル、メリーランド州）から入手した。５時間後、培地を置換し、４８〜７２時間、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気中で、接着した細胞をコンフルエントな状態にまで増殖させた。
【０１０１】
各実験の前に、細胞に以下のようにして［36Ｃｌ-］を与えた。コンフルエントな状態の細胞を、実施例６で開示した培地で４回洗浄した。そして、最後の洗浄液を吸引したのち、１．４×１０8カウント／分（ｃｐｍ）の［36Ｃｌ］-（アマシャム）を含有する培地を５００μｌ、各ウエルに添加した。この細胞プレートを３７℃で一晩、５％ＣＯ2／９５％空気中でインキュベートすることにより、［36Ｃｌ］-同位体平衡を得た。流出実験を開始するために、ＣＰＸおよび／または他のキサンチン誘導体類の濃縮液を該細胞に添加し、１９℃で１５分間インキュベートした。インキュベートのあと、該細胞を連続４回、氷冷洗浄用培地〔１５０ｍＭグルコン酸ナトリウム、１．５ｍＭグルコン酸カリウム、および１０ｍＭ  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）で構成〕のアリコートで洗浄した。
洗浄工程の最後に、重炭酸塩の入っていない流動培地５００μｌを１９℃で添加し、０、１、２、３、５、７、および１０分の時点で各ウエルから５０μｌアリコートを回収することによりサンプリングを開始した。必要に応じて、また、後の実施例で述べられているように、該流動培地は１５０ｍＭグルコン酸ナトリウム、１．５ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ  ナトリウムＮａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、共輸送体による流出を阻害するための１００μＭブメタニド、および種々の濃度のＣＰＸあるいは、例えばＡ1アデノシン拮抗剤類やｃＡＭＰ合成の活性化剤といった他の薬剤を含んでいた。浸透圧は３１０ｍＯｓｍであった。各流出実験の最後に、残存している放射活性を測定するために、５０％トリクロロ酢酸２０μｌを最終濃度５％になるように添加した。サンプルを１．５ｍｌのサイトシント（Cytoscint）液と混合し、２分間、最大幅のウインドーで、ベックマンＬＳ９０００シンチレーションカウンターで測定した。浸透圧強度は、浸透圧浸透圧計において凝固点降下によって測定した（Eidelman et al.,上述, 1992参照）。
【０１０２】
表１に、本発明のキサンチン誘導体類を用いた塩素イオン流出実験を少なくとも４回反復して得られたデータをまとめた。さらに、繰り返した実験内の各データ点は４つの別個の細胞で行った流出実験の平均から算定した。“最大  濃度（ｎＭ）”と標した欄は、塩素イオン流出に最大の影響を及ぼす時のキサンチン誘導体の濃度を表し、そして次の右の欄はコントロールに対する最大影響時の塩素イオン流出の百分率を表している。“閾値（ｎＭ）”と標した欄は、塩素イオン流出に対する影響を検出するのに要されるキサンチン誘導体の最小濃度を表し、次の右の欄は、コントロールに対する最小検出時の塩素イオン流出の百分率を表している。表１に見られるように、最大促進の範囲は、約３ｎＭ（例えば化合物１４の時）から１０4ｎＭを越える（例えば化合物３の時）範囲である。最大促進濃度での、コントロールを越える百分率上昇は、約１０％（すなわち、化合物２や１２のような効果的でない化合物）から約２６０％±７０％（化合物１７）にわたった。塩素イオン流出の閾促進でのキサンチン誘導体の濃度は、０．１ｎＭ（例えば化合物１３の時）から約１０4ｎＭ（例えば化合物２０の時）にわたった。閾促進濃度での、コントロールを越える百分率の上昇は、１２０％（例えば化合物１２）から約１７０％（例えば化合物１７）にわたった。
【０１０３】
これらのデータから、また望ましくない副作用の発生率を最小限にするために、所望の結果をもたらすいかなる特定の薬物もより低い濃度で使用したいという観点から、化合物６、７、１３、１４、１７、１９および２５が、μＭあるいはそれ以下の濃度で塩素イオンの流出を促進するこれらの化合物の顕著な能力に鑑みて、より好ましい化合物であることは明らかである。
【０１０４】
図９−１２は流出実験のデータを表し、化合物１、即ちセオフィリン（図９）; 化合物５、即ちＣＰＸ（図１０）；化合物２２、即ち８−シクロヘキシルメチルカフェイン（図１１）；および化合物１７、即ち１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチン（図１２）をグラフで表した。図９−１２の各々のグラフの垂直軸は、放射標識された塩素イオンの［36Ｃｌ］-流出（ＦＡ）の速度を、テストした化合物の濃度（水平軸）の関数として表している。これらは、通常の技法を用いて対数の線形回帰分析によって時間の関数として算出し（ＦＡ）、同じプレート上のコントロールウエルの速度定数に対する百分率として表した。データはＱｕａｔｒｏ−Ｐｒｏ  ４．０プログラムで処理した。誤差バーは４つの実験（即ちｎ＝４）のＳ．Ｅ．Ｍ．値を表す。
【０１０５】
図９−１２を簡単に観察してわかるように、化合物１、５、および２２の各々は、コントロールに比して、２００％の流出速度をもたらす特性を有している。化合物１７もまたコントロールの流出能力の１００％以上を示すが、他の３つの化合物に比べるとその程度はより低い。ここで結果を図で示した４つの化合物の中で、化合物１および２２は試験したどちらのアデノシンレセプターへのアフィニティーもほとんどなく、化合物１７はＡ1レセプターに中程度のアフィニティーを有し（Ｋi＝約０．０７）、および化合物５はＡ1レセプターに極端なアフィニティーを有している（Ｋi＝約０．０００５）。化合物１７は化合物５に比べると、Ａ1レセプターに対して顕著に低いアフィニティーを持つのにもかかわらず、例えば、化合物１７は表１に示すように、その絶対的な塩素イオンの流出能力においてより顕著な効能を示す（化合物５はコントロールの２００％であるのに対し、化合物１７は最大限コントロールの２６０％）。
【０１０６】
実施例８
本実施例にアデノシンレセプター結合の検出のためのアッセイ、ならびに本発明の新規キサンチン誘導体類の部分的な同定において行われる該アッセイの結果について説明する。
【０１０７】
ラットの大脳皮質膜および線条体膜をHide et al., Mol. Pharamcol., 41, 352-359(1992)に従って調製し、−７０℃で貯蔵する前に、アデノシンデアミナーゼ（２Ｕ／ｍｌ）で３０分間３７℃で処理した。アデノシン誘導体類の固体サンプルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、常法で−２０℃で保存した。ストック溶液を、水性の培地に添加する前に≦０．１ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯで希釈した。アッセイ培地におけるＤＭＳＯの最終濃度は一般に２％とした。
【０１０８】
ラットの大脳皮質膜での、１ｎＭ［3Ｈ］Ｎ6フェニルイソプロピルアデノシン（デュポン  ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州）のＡ1レセプターへの結合の阻害をSchwabe et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 313,179-187(1980)およびJacobson et al., J. Med. Chem., 36, 1333-1342(1993a)に記載されているようにして測定した。膜（チューブあたり〜１００μｇタンパク質）を１．５時間、３７℃で、５０ｍＭトリス塩酸で全量０．５ｍｌとなるように、ｐＨ７．４でインキュベートした。被検薬物はＤＭＳＯに溶解して、１０μｌアリコートで添加し、最終ＤＭＳＯ濃度を２％とした。結合した、および遊離の放射リガンドを３ｍｌの、５０ｍＭトリス塩酸を含有する緩衝液をｐＨ７．４、５℃で添加し、つづいてＢｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ブランデル、ゲイダーズバーグ、メリーランド州）およびワットマンＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターを用い、さらに計９ｍｌの緩衝液を用いた洗浄を伴う減圧濾過を行うことにより分離した。非特異的結合は、１０μＭ  ２−クロロアデノシンを用いて測定した。
【０１０９】
５ｎＭ［3Ｈ］ＣＧＳ２１６８０（２−［４−［（２−カルボキシエチル）−フェニル］エチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキシアミドアデノシン）（デュポンＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州）のＡ2aレセプターへの結合の阻害を、Jarvis et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 251, 888-893(1989)で報告されたようにして行った。膜（チューブあたり〜８０μｇタンパク質）を１時間、２５℃で、５０ｍＭトリス塩酸および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2からなる緩衝溶液で全量０．５ｍｌとなるようにして、ｐＨ７．４でインキュベートした。被検薬物はＤＭＳＯに溶解して、１０μｌアリコートで添加し、最終ＤＭＳＯ濃度を２％とした。非特異的な結合は２０μＭの２−クロロアデノシンを用いて測定した。濾過は、洗浄緩衝液として上記したトリスＨＣｌ／ＭｇＣｌ2緩衝液を用い、上述のＢｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて行った。
【０１１０】
各化合物のＩＣ50にあわせて適当に調整した、３オーダーの幅にわたる、少なくとも６つの種々の濃度を用いた。ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰＡＤプログラム（Institute for Scientific Information）上の非線形回帰式を用いてコンピューターで算出し、［3Ｈ］ＰＩＡおよび［3Ｈ］ＣＧＳ２１６８０結合について、それぞれ１．０および１４ｎＭであるＫD値（Jacobson et al.,  上述, 1993a; Ukena et al., FEBS Letters, 209, 122-128(1986) ）を用いて、またCheng et al.,（Biochem. Pharmacol., 22, 3099-3108(1973) ）の方法を用いて、見かけのＫi値に変換した。
【０１１１】
全てのキサンチン誘導体類について、アデノシンレセプター結合実験の結果を表１に“Ｋi，μＭ（Ａ1）”および“Ｋi，μＭ（Ａ2）”の欄に示す。特定のレセプターに高いアフィニティーを有しているレセプター拮抗剤は、Ａ1およびＡ2レセプターについて上に記載したアッセイを用いて測定すると、その低いＫi値に特徴付けられる。従って、化合物５はＡ1レセプターに対して高いアフィニティーを有するが、化合物６は調べたレセプターのどちらにも低いアフィニティーを有するということがわかる。
【０１１２】
図１３−１４はまた、上述のレセプター実験、特にアデノシンレセプターでの結合における、８−シクロアルキル置換基の環の大きさを変更することによる影響の確認に関してのデータを表している。ラット皮質Ａ1レセプターの値（閉じた円、●）およびラット線条体Ａ2aレセプターの値（開いた三角、△）をグラフに組み入れた。Ａ1−Ａ2レセプタ−についての８−シクロアルキルセオフィリン誘導体類（図１３）のアフィニティーおよび８−シクロアルキルカフェイン誘導体類（図１４）のアフィニティーを示した。値は３回行った内の２つあるいは３つの測定の平均（＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）が示されている。８−シクロブチル誘導体類についてのデータはJacobson et al., J. Med. Chem., 36, 2639-2644(1993b) からのものである。
【０１１３】
図１３および１４はセオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン）の誘導体類の中では、シクロペンチル  アナログである化合物４が最も高いＡ1アフィニティーを有していることを示している。カフェイン（１，３，７−トリメチルキサンチン）の誘導体類の中ではシクロヘプチルアナログである化合物２４がいくらかＡ2aアフィニティー（６倍）を示し、より小さい環のサイズ（４−６）のものではアフィニティーはほとんどないか全くなかった（Jacobson et al.,  上述， 1993b ）。これらの構造活性相関は、Ｃｌ-流出促進において、同じ化合物で観察されるものとは非常に異なっている。
【０１１４】
全体として考えたときに、上述の結果は、化合物６、１４、１７および１９はアデノシンレセプターについての活性の欠落に結びつく、低い濃度範囲での実質的な流出活性の特性を提供するということを示唆している。
【０１１５】
これらの実施例の結果は、（１）インビトロのリポソーム−および／またはＣＦＴＲ−結合アッセイを用いて、細胞の塩素イオン流出を活性化する化合物を同定すること；および（２）化合物６、１４、１７あるいは１９のようなＡ1−あるいはＡ2アデノシンレセプタ−へのアフィニティーがほとんどないか、あるいは全くない化合物を用いることによってＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を活性化することができることを示している。最も効果のある被検化合物は化合物１７であった。アデノシンレセプターへの影響、あるいは実質的な影響がなく、ＣＦ細胞からの塩素イオンの流出を特別に活性化することのできる薬物の治療上の利点は、そのような薬物の作用が、他の組織への望ましくない副作用によって妨げられることが少ないことから明白である。
【０１１６】
ここで述べられた特許、特許出願および刊行物を含めた全ての引例は、ここに引用することで、その全体がここに組み込まれるものである。
【０１１７】
本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適な方法、化合物および組成物は変更させて用いてもよく、また、ここで詳細に記載された以外の方法で該発明を実行してもよい良いことは当業者には明白である。従って、本発明は添付の請求項によって明確になる、本発明の精神および範囲内に包含される全ての変更を含むものである。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明によって、嚢胞性線維症細胞のような頂端のＣｌ-コンダクタンスが低下した細胞を治療するためのＣＦＴＲ結合性化合物の同定方法が提供される。さらに、本発明は、そのような細胞を治療するのに有用な化合物およびその医薬組成物を提供する。
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、下記配列の位置を示すＣＦＴＲタンパク質の一部の物理的地図である：
Walker A（アミノ酸 458-471）；Ｉα（アミノ酸 477-508）；Ｉβ（アミノ酸 509-539）；Ｉｏ（アミノ酸 500-531）；Ｃ（アミノ酸 548-560）およびWalker B（アミノ酸 561-573）。
【図２】図２は、ｐＨ６．０、１ｍＭ  Ｃａ++で、濃度２０μｇ／ｍｌ（５．２μＭ）のあるＣＦＴＲポリペプチドによるクロマフィン顆粒の凝集を示すグラフである。ｘ軸の単位は時間［分］を表し、ｙ軸の単位は濁度の変化（Δ５４０ｎｍ）を表している。
【図３】図３Ａは、種々の濃度のＩαポリペプチドの存在下でのクロマフィン顆粒の凝集を示すグラフである。ｘ軸の単位はＩαポリペプチドの濃度（μｇ／ｍｌ）を表し、ｙ軸の単位は濁度の変化（Δ５４０ｎｍ）を表している。反応は図２のデータを生成したのと同様に行った。各Ｉα濃度について初速度を算出した。
図３Ｂは、図３Ａに示されるデータについてのHillプロットである。Ｖmax app は該データのLineweaver-Burk プロット（ｌｏｇ（Ｖi／Ｖm −Ｖi）対ｌｏｇ［Ｉα］）の直線の外挿から見積もり、各条件についての速度比を計算した。傾き（２．６）がHill係数（ｎH ）である。
【図４】図４Ａは、様々なｐＨ値（ｘ軸）におけるＩαによるホスファチジルセリンリポソームの凝集（ｙ軸はΔＡ350／分）を示すグラフである。Ｉαの濃度は２μｇ／ｍｌ（０．６μＭ）である。
図４Ｂは、経時的（ｘ軸は分）に測定された、比較的低濃度のＩαポリペプチドによるホスファチジルセリンリポソームの凝集（ｙ軸はΔＡ350／分）を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｉαポリペプチドによって駆動されるホスファチジルセリンリポソームの凝集（ｙ軸はΔＡ350）に及ぼすＣＰＸの効果（ｘ軸は分）を示すグラフである。差し込まれたグラフは、２０分の時点でのＣＰＸ活性化に関する濃度依存性を示しており、図中ｙ軸はΔＡ350／２０分、ｘ軸はＣＰＸのｎＭ濃度である。
【図６】図６は、Ｉαポリペプチドによって駆動されるホスファチジルセリンリポソームの凝集（ｙ軸をΔＡ350として測定された）に及ぼすカフェインの効果（ｘ軸は分である）を示すグラフである。差し込まれたグラフは、２０分の時点でのＣＰＸ活性化に関する濃度依存性を示しており、図中ｙ軸はΔＡ350／２０分、ｘ軸はｎＭ濃度のカフェインの単位である。
【図７】図７は、Ｉαポリペプチドによって引き起こされるホスファチジルセリンリポソームの凝集（ｙ軸、△Ａ350）におけるＤＡＸ濃度（ｘ軸は分である）の影響を描写するグラフである。差し込まれたグラフは２０分の時点でのＤＡＸ活性化に関する濃度依存性を示しており、図中ｘ軸はＤＡＸ濃度（ｎＭ）単位、ｙ軸は△Ａ350／２０分単位である。
【図８】図８は、Ｉαポリペプチドによって引き起こされるホスファチジルセリンリポソームの凝集のＣＰＸおよびＤＡＸによる活性化の比較を描写するグラフである。ｘ軸はＣＰＸあるいはＤＡＸのｎＭ濃度単位、ｙ軸は△Ａ350／２０分である。
【図９】図９は、化合物１（セオフィリン）と接触させた場合の、ＣＦＰＡＣ細胞の［36Ｃｌ］-流出実験の結果のグラフを描写するものである。ｘ軸は化合物１のｎＭ濃度を表し、ｙ軸は塩素イオン流出の速度を、コントロールに対する百分率として表している。
【図１０】図１０は、化合物５（ＣＰＸ）と接触させた場合のＣＦＰＡＣ細胞の［36Ｃｌ］-流出実験の結果のグラフを描写するものである。ｘ軸は化合物５のｎＭ濃度を表し、ｙ軸は塩素イオン流出の速度を、コントロールに対する百分率として表している。
【図１１】図１１は、化合物２２（８−シクロヘキシルメチル  カフェイン）と接触させた場合のＣＦＰＡＣ細胞の［36Ｃｌ］-流出実験の結果のグラフを描写するものである。ｘ軸は化合物２２のｎＭ濃度を表し、ｙ軸は塩素イオン流出の速度を、コントロールに対する百分率として表している。
【図１２】図１２は、化合物１７（１，３−ジアリル−８−シクロヘキシルキサンチン）と接触させた場合のＣＦＰＡＣ細胞の［36Ｃｌ］-流出の実験の結果のグラフを描写するものである。ｘ軸は化合物１７のｎＭ濃度を表し、ｙ軸は塩素イオン流出の速度を、コントロールに対する百分率として表している。
【図１３】図１３は、セオフィリン誘導体の８−シクロアルキル置換基の大きさ（ｘ軸）を変化させた場合のＫi値（μＭ、ｙ軸）に対する影響について調べたもので、塩素イオン流出実験の結果のグラフを描写している。ラット皮質Ａ1−アデノシンレセプター（●）およびラット線条体Ａ2a−アデノシンレセプター（△）に対する８−シクロアルキルテオフィリン誘導体類のアフィニティーのデータを示す。
【図１４】図１４は、カフェイン誘導体の８−シクロアルキル置換基の大きさ（ｘ軸）を変化させた場合のＫi値（μＭ、ｙ軸）に対する影響について調べたもので、塩素イオン流出実験の結果のグラフを描写している。ラット皮質Ａ1−アデノシンレセプター（●）およびラット線条体Ａ2a−アデノシンレセプター（△）に対する８−シクロアルキルカフェイン誘導体類のアフィニティーのデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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