(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの基質であるプロコラーゲンを構成するアミノ酸であるプロリンをトリチュウムまたはジュウテリウムで標識して、そのプロコラーゲンおよび酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼを含む反応液をインキュベーションして、生ずるトリチュウム水またはジュウテリウム水を分子篩を通過させて、標識物質の量を測定することで、酵素活性を測定することを特徴とする酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの活性測定法。
【請求項２】
組織又は組織液又は体液である検体中の酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼと、構成アミノ酸をトリチュウムまたはジュウテリウムで標識したプロコラーゲンとを、遠心チューブまたは加圧チューブに装着され、底に分子篩を張った酵素反応用チューブに少なくとも緩衝液を入れた後に、添加して、一定温度で一定時間インキュベーションした後、遠心チューブ又は加圧チューブに装着したまま遠心又は加圧して、チューブ内に移行した液の一定量中の標識物質を計測して酵素活性を測定することを特徴とするペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの活性の微量測定法。
【請求項３】
前記標識物質が、前記構成アミノ酸に標識されたトリチュウム又はジュウテリウムが反応液中に遊離して生成したトリチウム水又はジュウテリウム水であって、これらの標識物質を各々シンチレーションカウンター又は質量分析器で計測する請求項２記載のペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの活性の微量測定法。
【請求項４】
前記分子篩は、分子量２０００から１００００までをカットするフィルター付きチューブである請求項２記載の酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの活性の微量測定法。
【請求項５】
遠心又は加圧による濾過を遠心では５０００Ｇから７０００Ｇで、加圧では１から１００気圧で行う請求項２記載の酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼの活性の微量測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性測定法に関し、特に、本酵素の活性が低値の検体でも迅速に測定できる酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性測定法に関するものである。
【０００２】
【従来技術および解決しようとする課題】
動物蛋白の1/6 を占めるコラーゲンは、２０種近いサブタイプをそれぞれ組織に特有の分布と代謝回転をしているので夫々のサブタイプ毎にコラーゲンの合成酵素と分解酵素がバランス良く活性を維持している。しかし、一旦バランスを失うとコラーゲンの沈着過剰や壊死と言う病的状態を呈する事になる。
コラーゲンの一連の合成酵素のうち律速段階は、ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類とされている。しかし、その活性測定方法は前述の通りどの方法も、型別に対応するコラーゲン分解酵素測定法の処理検体数と精度とで遅れを取っている。従来の合成酵素活性測定法は、分解酵素活性測定法に較べ検体量で約１００倍以上、１日の処理検体数で約１００分の１なので比較ができなかった。
【０００３】
ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性測定法は、現在まで３種類ある。
第一は、直接法と称される方法であり、該方法では、KivirikoーProkop らは14Ｃー標識プロリンを含むプロコラーゲンを基質とし、酵素反応後、生成物を加水分解し、酸化して14Ｃーピロールとして、これのβ線量から活性を算出した。第二は、間接法と称される方法であり、該方法では、コファクターの14Ｃーαーケトグルタール酸を基質とし反応で生じる14ＣＯ2 のβー線量を測定する。第三はトリチューム遊離法と称される方法である。該方法では、Huttonn らは、3Ｈープロリンを取り込ませたプロコラーゲンを基質として酵素反応させ、反応液中に遊離してくるトリチュウム水を減圧蒸留してトリチュウム水を捕捉し遊離してきたトリチュウム水のβ線量を測定した。何れも一長一短で実用的ではない。
【０００４】
しかし、ハットン法は、組織または体液などを検体（酵素源）とするにはグラム単位を必要とし、またトリチュウム水を減圧下で捕捉する装置が大掛かりであり、また減圧の保持に困難を伴うため一日の検体処理数は約２０検体と少ないしまた測定誤差が大きい。その為に個人の手技や施設の違いで極端に異なった測定値を出す結果となる。しかしながら、上記３法の中では原理的に簡便で改良の余地がある。
以上の様に、動物やヒトの病態解析または診断など実用的に使用できるペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性測定法が求められている。
【０００５】
従って本発明の目的は、コラーゲンの型別に分解酵素活性を測定し、さらに感度と迅速性、そして信頼性が夫々高いペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の型別活性測定法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、一日の処理検体数を６００検体以上とし、検体としての組織や体液量を数ミリグラム程度、そして安価なペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の型別活性測定法を提供することにある。
【０００６】
【問題点を解決する為の手段】
上記の目的を達成するために、本発明は、トリチュウム水又はジュウテリウム水の捕捉を分子篩を通過せして分離して、ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性を測定する新規方法を発明した。
【０００７】
また本発明は、動物の組織、組織液または体液中に含むペプチジールプロリンヒドロキシダーゼの酵素活性類の微量測定法であって、分子篩を底部に装着した酵素反応チューブ中で一定時間インキュベートした後、外套の遠心又は加圧チューブに装着したまま遠心又は加圧して、分子篩で濾過されてチューブ内へ移行した液中の標識物質を計器計測することを特徴とする酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性測定法である。
この場合、前記篩は分子量２０００から１００００までをカットするフィルター付きチューブとした。また遠心又は加圧による濾過は５００Ｇから７０００Ｇで、加圧は１から１００気圧で行った。
また計測機器はシンチレーションカウンターまたは質量分析装置を用いた。
【０００８】
【作用】
本発明によれば、上記手段を採用した事により、酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類により基質のプロコラーゲンペピチド中の構成アミノ酸に標識したトリチュウムまたはジュウテリウムが酵素酸化により反応液中に遊離してトリチュウム水またはジュウテリウム水としての存在量を効率良く分子篩で遠心又は加圧濾過して、濾過液中に移行したこれら標識物質を上記計測機器で測定し、酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性を測定することができる。
【０００９】
【実施例】
以下、図面に示す本発明の実施例について説明する。
図１は、本発明によるペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性を測定をする為の反応と濾過装置が示されている。
図１の左側にチューブの構造が図示されていて、右側に酵素反応時と遠心又は加圧後の濾液の位置が示されている。
【００１０】
図１に示すように、内側の反応チューブの底部には分子篩（フィルター）が装着してあり、遠心又は加圧の際も破壊されない強度を保たせた。内側のチューブには、緩衝液、基質、補酵素、補因子などを入れた後、冷却下に酵素含有液（組織、組織液そして体液などの）を加えて、この反応チューブを遠心又は加圧チューブ内に装着して蓋を閉めて、一定温度で加温して酵素反応を一定時間インキュベーションする。反応後、一定の回転数で遠心又は加圧して、反応液中に遊離したトリチューム水またはジューテリウム水を含む反応液を遠心又は加圧チューブ内に濾過せしめる様にした。
【００１１】
さらに、遠心又は加圧チューブ内に濾過した標識水は、適当なシンチレーションカウンター液を用いたβ線量測定か質量分析装置で標識物質量を測定する。
酵素反応に用いる緩衝液は、例えば０．２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を０．８ｍｌに０．２５ｍＭのアスコルビン酸、０．５ｍＭ硫酸第一鉄、０．２ｍＭαーケトグルタール酸で行った。
酵素反応に用いる基質は、例えば９週の雄性ラットからの尾腱を用いて3 Ｈープロリンをジピリジンの存在下インキュベーション後、抽出および精製したＩ型プロコラーゲン含有液を用いた。
【００１２】
酵素反応に用いた他の基質は、１３日目の鶏胚から得たアキレス腱からラットの場合と同様条件でインキュベートした後、抽出および精製したＩ型プロコラーゲン含有液を用いた。
酵素反応に用いた標準酵素液としては、例えば９日目の鶏胚のホモジネートをそのままー８０℃に凍結して用いたが、経時変化は殆どなかった。
これらの酵素反応を確かめる病態動物の実験系としてＳＤラットの四塩化炭素肝繊維化現象の経時変化実験から肝臓組織液（ホモジネート）用いた。
【００１３】
参考例１
従来用いていたトリチューム蒸留法と本発明の分子篩濾過法を上記病態ラット肝臓組織液で比較した（図２）。
参考例２
上記蒸留法と分子篩法の比較をその相関性で示した（図３）。
参考例３
組織液使用量とトリチューム遊離量との相関性を示した（図４）。
【００１４】
【発明の効果】
本発明は、前記の様なので検体であるヒトを含む動物組織、組織液そして体液などに含有する酵素ペプチジールプロリンヒドロキシラーゼ類の活性を微量測定法で精度良く測定でき、しかも従来の蒸留法と比較して検出限界をより微量化させることができると共に従来法との相関性も良く、以前のデーターとの換算もできる。更に、測定時間の大幅な短縮に成功し、測定コストも削減できた。将来膜技術の進歩と共に更に測定の精度とコストの削減が期待できる。
【００１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を説明する図。
【図２】従来用いていたトリチューム蒸留法と本発明の分子篩濾過法を上記正常と病態ラット肝臓組織液で比較した有意の差を示す結果を示す図。
【図３】従来の蒸留法と分子篩法の比較をその良好な相関性で示した図。
【図４】組織液使用量とトリチューム遊離量との良好な相関性を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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