(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｉｂと呼称される精製タンパク質であって；
（ａ）Ｂ群れんさ球菌菌株から得ることができ；
（ｂ）９０ＫＤ〜９５ＫＤの見掛けの分子量を有し；
（ｃ）トリプシンおよびペプシンによる分解に対して耐性であり；
（ｄ）配列番号：１又は２のＮ末端アミノ酸配列を有し；かつ
（ｅ）該タンパク質を発現するＢ群れんさ球菌菌株に対する防御免疫を与える；
ことを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
Ｂ群れんさ球菌菌株が血清型ＩＩＩの菌株である請求の範囲１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記菌株が菌株ＢＳ３０またはＢＭ１１０であり、前記タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約９５ＫＤの見掛けの分子量を有する請求の範囲１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
請求の範囲１に定義されているタンパク質Ｒｉｂを発現するＢ群れんさ球菌菌株を培養し、その培地および／または微生物を単離し、その細菌を酵素で消化し、消化した細菌を上澄み液から分離し、次いでタンパク質Ｒｉｂを上澄み液から抽出することを特徴とする請求の範囲１に定義されているタンパク質Ｒｉｂの単離方法。
【請求項５】
前記酵素はムタノリシンである請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質を、透析、イオン交換クロマトグラフィーによる分画、およびゲル濾過によって、前記上澄み液から抽出する請求の範囲４又は５記載の方法。
【請求項７】
請求の範囲１に定義されているタンパク質Ｒｉｂに対して高度に特異的な抗体。
【請求項８】
請求の範囲１に定義されているタンパク質Ｒｉｂが入っていることを特徴とする、タンパク質Ｒｉｂに対する抗体を検出するのに用いる薬剤キット。
【請求項９】
請求の範囲１に定義されているタンパク質に特異的な抗体が標準として入っていることを特徴とする、タンパク質Ｒｉｂを検出するのに用いる薬剤キット。
【請求項１０】
請求の範囲１に定義されているタンパク質Ｒｉｂが入っていることを特徴とする請求の範囲９記載の薬剤キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｂ群れんさ球菌（group  B  streptococcus）の大部分の侵入性菌株に対する免疫を与える、Ribと呼称される新規なタンパク質〔ならびにそのサブフラグメント、変異体および多重体（multiple）〕、そのタンパク質の精製方法、そのタンパク質に特異的な抗体、薬剤キット、ならびに該タンパク質またはそのフラグメントを含有する医薬組成物に関する。
最近の３０年間に、西欧世界に、新生児の疾患の主原因としてＢ群れんさ球菌が出現した。米国だけで、この細菌で起こる侵入性疾患は一年間当り約１００００の症例がある。これらの感染症は、全死亡率が約２０％であり、そして生残る小児の多くには永久的な神経後遺症がみられる。これらの知見から、予防法と治療法を見つけかつＢ群れんさ球菌が感染症を起こす機構を分析するため大きな努力がなされている。
全女性の約２０％はＢ群れんさ球菌の腟内保菌者であり、母体生殖器官からの垂直伝播が恐らく、この細菌によって起こる新生児の疾患の最も普通の感染源であろう。しかし、出産時、Ｂ群れんさ球菌が定着している小児の１〜２％しか重篤な感染症にかからない。それ故、出産中この細菌に暴露されること以外の要因が新生児疾患の発生に関与しているに違いない。感染した小児の母はIII型きよう膜に対する抗体のレベルが大幅に低いが、このことはこれらの抗体が新生児疾患に対して防御するのに重要であることを意味している（Baker，C．J．およびD．L．Kasper，N．Engl．J．Med．，２９４巻、７５３頁、１９７６年）。
Ｂ群れんさ球菌の菌株は、その多糖類のきよう膜の構造に基づいて４種の主要血清型（Ｉａ、Ｉｂ、IIおよびIII）に区分されている（Baker，J  Inf  Dis，１６１巻、９１７頁、１９９０年）。血清型Ｉ、IIおよびIIIは、通常のフローラ中の細菌内でほぼ等しい比率で発生するが、III型は侵入性感染症由来のすべての分離菌の約２／３を占めている。そのきよう膜は公知の毒性因子であるからかなり詳細に研究されており、特にIII型菌株のきよう膜が詳細に研究されている。III型の多糖類きよう膜が必須成分であるワクチンを開発する努力がなされている。しかし多糖類のきよう膜をワクチンとして使用すると、ヒトの組織と交差反応を起こすので問題がある（Pritchardら、Infect  Immun，６０巻、１５９８頁、１９９２年）。したがって、多糖類以外のタンパク質に基づいたワクチンを開発できれば非常に有益である。
またＢ群れんさ球菌は雌ウシの乳腺炎も起こす、これは、経済的に非常に重大なウシの疾患である。したがってＢ群れんさ球菌感染症に対するワクチンを開発することは獣医学の面でも大切である。
２種のＢ群れんさ球菌細胞表面タンパク質すなわちαタンパク質とβタンパク質がすでに詳細に研究されている。これらのタンパク質は、これらタンパク質を発現する菌株に対する防御免疫を与えるが、III型の菌株（大部分の重篤な感染症を起こす）は通常これらのタンパク質を発現しないので、Ｂ群れんさ球菌の疾患に対する重要性は限られたものになっている。
本発明は一つのれんさ球菌の細胞表面タンパク質、およびその変異体とサブフラグメントに関する。このタンパク質は、タンパク質Ribと呼称されているが、別個の９５KDのタンパク質として血清型IIIのＢ群れんさ球菌から単離した。タンパク質Ribは、血清型IIIのＢ群れんさ球菌菌株のほとんどすべてと、II型のような他の血清型の少数の菌株とによって発現される。タンパク質Ribを精製する方法を考案し、そしてタンパク質Ribを発現する菌株による致死感染症に対して、このタンパク質の抗体が防御することを立証した。
また本発明は、タンパク質Ribを発現する細菌すなわち特に血清型IIIのＢ群れんさ球菌の菌株で起こる感染症に対して防御する性能を有する、該タンパク質の天然産のおよび人工的に修飾した変異体、サブフラグメントおよび多重体に関する。
また本発明は、非ヒトの宿主生物中に挿入して前記宿主から発現させるのに適切な、タンパク質Ribならびにその変異体、サブフラグメントおよびフラグメントの遺伝コードを含有しているプラスミド、コスミドまたはファージのようなベクターに関する。本発明は特に、寄託番号がそれぞれDSM９０３９，９０４０および９０４１である３種のファージクローンすなわちλRib１−３、λRib１−５およびλRib１−７に関する。
また本発明は、タンパク質Ribならびにその変異体、サブフラグメント、フラグメントおよび多重体をコードするDNA配列であって、プラスミド、コスミドまたはファージのような適切なベクター中に挿入できるDNA配列に関する。このDNA配列は、寄託されているファージ類であるλRib１−３、λRib１−５またはλRib１−７から得ることができる。
Ribタンパク質は各種のIII型菌株によって発現される。いくつもの異なる菌株から調製した抽出液を、ウエスタンブロッティング法で分析用抗Rib血清を用いて分析したところ、ほとんどすべての抽出液はタンパク質Ribを含有していたが、そのタンパク質の分子量は、６５KD〜１２５KD（データは記載していない）の間を変動していることが分かった。大きさの変動は他のＢ群れんさ球菌タンパク質であるαタンパク質とβタンパク質についてもすでに報告されているので上記の結果は予想外のことではなかった。
入手可能なデータは、このタンパク質は単位体（unit）の多重体で構成され、各単位体は約９KDの分子量に相当している。したがって本発明には、９５KDのタンパク質のサブフラグメントと多重体または同じ特性を有する基本単位体のサブフラグメントおよび多重体が含まれる。変異体には、該タンパク質を発現する細菌によって起こる感染症に対して防御する性能を変えることなくアミノ酸を置換もしくは挿入したものが含まれる。
Ｂ群れんさ球菌の菌株は公知であり、感染したヒトの血液から単離することができる。本発明の発明者らが使用したBM１１０菌株は、S．Mattingly博士（テキサス州、サンアントニオ所在のテキサス大学）から入手した。本願で引用する菌株はすべて、ルンド大学およびルンド大学付属病院の本発明の発明者らから入手できる（Gunnar  Lindahl博士、スエーデン、Ｓ２２３６２ルンド、Soelvegatan  ２−３、医学微生物学部）。
タンパク質Ribは、血清型IIIのＢ群れんさ球菌の菌株、好ましくは菌株BS３０またはBM１１０から単離することができる。また本発明はタンパク質Ribの精製方法に関する。
該タンパク質は以下の手順で単離することができる。すなわち該タンパク質を発現するＢ群れんさ球菌菌株を培養し、培地および／または該微生物を単離し、該細菌を酵素好ましくはムタノリシンで消化し、プロテアーゼインヒビターを任意に添加し、消化された細菌を上澄み液から分離し、次いでその上澄み液からタンパク質Ribを抽出する。培地は、例えばトッド・ヒューイットブロス（Oxoid）のごときれんさ球菌を培養するのに適したいずれの培地でもよく、そして細胞は１〜３０時間とくに１２〜２０時間培養することが好ましい。酵素好ましくはムタノリシンによる消化は、１〜３０時間、特に１０〜２０時間、好ましくは１５〜１８時間、２０〜４０℃好ましくは３７℃で、振盪せずに実施する。該タンパク質は培地から単離することができ、このような場合、細胞壁を破るのに使用される酵素で消化する必要はない。塩化ベンズアミジン、ヨード酢酸またはフェニルメチルスルホニルフルオリドのようなプロテアーゼインヒビターを添加して、ムタノリシンを汚染しているかまたは微生物中に存在していることがあるプロテアーゼからの作用を防止する。
該タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過法によって精製することができ、該タンパク質を含有する画分を当該技術分野で確立された方法にしたがって収集する。
本発明は特に、実質的に純品のタンパク質Ribまたはそのサブフラグメントに関する。“実質的に純品の”という用語を、本発明の発明者らは、医薬として有害な物質を含有していない物質と理解している。
また本発明は、タンパク質Ribならびにそのサブフラグメント、変異体または多重体に対応する抗体に関する。抗原で、本発明の場合タンパク質Ribで動物を免疫化し、その血液を収集し、その血清を単離し、次いで該タンパク質と反応する抗体を使用する方法は公知である。この抗体を含有する血清またはIgG画分は該タンパク質を分析するのに使用できる。
タンパク質Ribに対する抗体はＢ群れんさ球菌菌株による致死感染症に対して防御することができるので、このような抗体のレベルを測定する方法は、例えば妊婦が乳児をかような感染症から防御するのに充分な抗体をもっているか否かを推定するのに有益である。タンパク質Ribまたはそのサブフラグメントは該タンパク質に対するかような抗体を検出するのに用いることができる。したがって本発明は、タンパク質Ribまたはそのサブフラグメントが入っている薬剤キットに関する。
タンパク質Ribの存在について各種の試料を分析することも重要である。該タンパク質に対する抗体はこの目的のために使用できる。それ故、本発明はタンパク質Ribまたはそのサブフラグメントに対する抗体が入っている、該タンパク質を検出するのに用いる薬剤キットに関する。薬剤キットには、該抗体を含有する上記血液の画分のいずれかが入っている。またその薬剤キットには、標準として用いる該タンパク質、そのサブフラグメントまたは多重体も入っている。
タンパク質Ribの特性は、このタンパク質がＢ群れんさ球菌に対するワクチンを開発するのに用いることができることを示している。したがって本発明は、該タンパク質またはそのフラグメントを活性成分として含有しならびに医薬として許容される佐剤と賦形剤を含有していてもよい医薬組成物に関する。医薬として許容される適切な佐剤はこの技術分野で通常用いられる佐剤である。適切な賦形剤の例をいくつか挙げるとマンニトール、ラクトース、デンプン、グルコースなどがある。佐剤と賦形剤として挙げる例によって本発明は限定されない。
本発明は下記の添付図面によってさらに詳細に説明する。
図１は、４種の主要血清型を示すＢ群れんさ球菌菌株（Ｉａ型：菌株Ａ９０９；Ｉｂ型：SB３５；II型：Ｂ１２８−４；III型：BS３０）から調製した抽出物のウエスタンブロット法による分析結果を示す。その免疫ブロットに示すように、Ｉａ型とＩｂ型の菌株はαとβのタンパク質を発現し、これらのタンパク質の染色ゲル中の位置を矢印で示す（下側矢印：α抗原；上側矢印：β抗原）。III型菌株BS３０の９５KDのタンパク質Ribの染色ゲル中の位置は星印で示す。分子量マーカーはKDの単位で左側に示す。
図２Ａと２ＢはIII型菌株BS３０由来のタンパク質Ribの精製を示す。（図２Ａ）予め行ったDEAEイオン交換クロマトグラフィーで部分的に精製したムタノリシン抽出物を、DEAE  Bio−Ge1Aの３０ｍｌカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーに付した。すなわち１０mMトリス、ｐＨ８．０中のNaClの直線勾配液（８００ｍｌ）次いで１Ｍ  NaCl（６０ｍｌ）で溶出した。斜線領域がタンパク質Ribを含有する画分を示す。挿入図はSDS-PAGEで分析したタンパク質Rib含有画分のプールを示し、分子量マーカーをKD単位で左側に示し、そしてタンパク質Rib（９５KD）の位置を矢印で示してある。（図２Ｂ）上記イオン交換クロマトグラフィー由来のタンパク質Rib含有画分のプールを、セファロースCL６Ｂのカラム（４．２×９０cm）を用いるゲル濾過に付した。斜線領域はタンパク質Ribを含有する画分を示し、挿入図はSDS−PAGEによって分析したこれら画分のプールを示す（Ｖoはボイドの容積；Ｖtは全容積）。
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、α、βおよびRibのタンパク質を細胞表面が発現する、４種の主要血清型のＢ群れんさ球菌菌株の分析結果を示す。５種の菌株：Ａ９０９（Ｉａ型）；SB３５（Ｉｂ型）；Ｂ１２８４（II型）；BS３０（III型）；およびBM１１０（III型）を試験した。これら５種の菌株に用いた記号をパネルＣに示す。細菌の懸濁液を、図に示すように、異なる希釈度の、α、βまたはRibのタンパク質に対するウサギ抗血清とともにインキュベートした。Ｘ軸の数字は細菌混合物中の最終抗体希釈度を示す。捕捉された抗体は、放射能標識を付けたプロテインＧとともにインキュベートすることによって検出した。免疫前ウサギ血清を含有する対照をすべての試験に含めたが、すべての場合、完全に陰性であった。
図４は、精製タンパク質に対して生成したウサギ抗血清で、α、βおよびRibの精製タンパク質のウエスタンブロット分析を行った結果を示す。抗血清は１：１０００の希釈度で使用し、そして捕捉された抗体は放射能標識を付けたプロテインＧで検出した。分子量のマーカーをKD単位で左側に示してある。
図５は、トリプシンまたはペプシンで処理したα、βおよびRibの精製タンパク質のSDS−PAGE分析結果を示す。トリプシンによる処理はｐＨ７．５で行い、ペプシンによる処理はｐＨ４．０で行った。試料を中和してからSDS−PAGE分析に付した。対照はトリプシンまたはペプシンを含有する試料と同じ方式で処理したが酵素は全く添加しなかった。このような処理ではタンパク質の分解は全く起こらなかった。Ｐ＝ペプシン；Ｔ＝トリプシン。分子量マーカーをKDの単位で左側に示す。
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、菌株BM１１０由来のrib遺伝子のクローン化と、エシェリキア・コリ（Escherichiacoli）内でのタンパク質Ribの発現の結果を示す。（図６Ａ）７種のλクローンのウエスタンブロット分析の結果。抗Ribとともにインキュベートした。（図６Ｂ）菌株BM１１０由来の染色体DNAの制限消化。（図６Ｃ）Ribを発現するλ−クローンλrib３の制限消化。
異なる血清型のいくつもの菌株のムタノリシン抽出物を、SDS−PAGEに付し次いでαとβのタンパク質に対する抗血清を用いて免疫ブロッティングを行うことによって、分析した（実施例１参照）。４種の主要血清型を示す４種の菌株で得た試験結果を図１に示す。αタンパク質とβタンパク質は、Ｉａ型菌株とＩｂ型菌株の両者によって発現されるが、染色ゲルの高分子量領域に別個のバンドを生成した。これらのタンパク質は２種の菌株間で大きさが異なり、これは先の観察結果と一致している。高分子量領域における主要タンパク質種はIII型菌株から調製した抽出物中に存在していたが、この菌株はαタンパク質またはβタンパク質を発現しない。高分子量のかような別個のタンパク質種は他のIII型菌株の抽出物中にもみとめられ、そしてそのタンパク質は異なる菌株間では大きさが変化して出現した。αタンパク質とβタンパク質はこのように類似しているので、III型菌株の高分子量タンパク質を一層詳細に研究することが重要になった。菌株BS３０をこの研究用に選択した。というのはこの菌株はマウス毒性であることが知られていたからである。この菌株が発現した９５KDのタンパク質（図１）を、イオン交換クロマトグラフィーの二つの連続ステップ次いでゲル濾過法を用いて（図２）、ムタノリシン抽出物から精製した（実施例２）。９５KDのタンパク質の存在について、画分をSDS−PAGEで分析した。ゲル濾過で得た妥当な画分をプールし分析したところ、二つのタンパク質種だけが見出された。すなわち大きい９５KDのタンパク質と小さい９０KDのタンパク質である（図２Ｂ中の挿入図参照）。この９０KDのタンパク質は恐らく９５KDのタンパク質の分解生成物であろう。というのはこれらの二つのタンパク質は同じＮＨ2末端配列を有していることがその後に分かったからである。この精製されたタンパク質はタンパク質Ribと呼称される（resistance  to  prot  eases，immunity，group  B）。９５KD型のタンパク質Ribに対する抗血清は、SDS−PAGEのゲルから切り取ったスライスでウサギを免疫化することによって調製した。
タンパク質Ribが細胞表面タンパク質であるか否かを分析するため、４種の主要血清型を示す菌株について、抗Rib血清を捕捉する性能を試験した（図３）。試験した５種の菌株は上記の４種の菌株と追加のIII型菌株BM１１０であり、BM１１０は高毒性のIII型クローンのメンバーである。比較のため、これら５種の菌株も、これらタンパク質の高度に精製した製剤に対する抗血清を用いて、αタンパク質とβタンパク質の発現について試験した。
抗α血清は予想どおりＩａとＩｂの菌株と強く反応し、またIII型の二つの菌株とは弱く反応した（図３Ｃ）。しかし、III型菌株のムタノリシン抽出物は、ウエスタンブロット法で分析したところ検出可能なαタンパク質を含有していなかった。したがって、抗α血清のIII型の全細菌との弱い反応性は、ある種の他の細胞壁成分との交差反応性を示すようである。これらのデータは、抗α血清との反応性は、菌株が細胞表面にα抗原を発現するか否かを明確に分析するのに使用できることを示している。類似のデータを抗β血清によって得た（図３Ｂ）。
タンパク質Ribに対する抗血清は上記２種のIII型菌株と反応したがＩａとＩｂ型の菌株とは反応しなかった（図３Ａ）。中間レベルの結合性がII型菌株にみとめられた。分析用抗Rib血清を用いて、５種の菌株のムタノリシン抽出物をウエスタンブロット法で分析したところ、III型菌株の抽出物は強く反応して９５KDの位置に大きなブロッティングバンドを示したが、他の３種の菌株の抽出物は反応性が完全に欠除していた（データは示していない）。この結果は、抗Rib血清のII型菌株との中位の反応性は交差反応性が原因でありこの反応性はウエスタンブロットの条件下では消失したことを示している。本発明の発明者らは、タンパク質Ribは上記２種のIII型菌株の細胞表面に発現されるが残りの３種の菌株の細胞表面には発現されないと結論するものである。
公知の血清型の合計５８個の菌株（これらはすべて侵入性感染症から単離した）を、タンパク質Ribに対する抗体を捕捉する性能について試験した（表１、実施例６参照）。また各菌株はαとβのタンパク質に対する抗体を捕捉する性能について試験した。多数の菌株の試験を簡素化するため、各抗血清は、図３に示すデータに基づいて選択した１０００倍希釈度一つだけで試験した。この種の分析によって、実施例６の表１に要約した明確な結果が得られた。タンパク質Ribは、３３個のIII型菌株のうち３１個の細胞表面および１３個のII型菌株のうち１個の細胞表面に見出されたが、１２個のＩａ型とＩｂ型の菌株のいずれからも発見されなかった。
細胞表面上にタンパク質Ribを欠除している菌株が、該タンパク質を倍地中に放出することがありうると思われた。したがって、表１に列挙した５８個の菌株の培養物の上澄み液を、分析用抗Rib血清を用いてドットブロット法で分析した。タンパク質Ribは、細胞表面に該タンパク質を発現しない２６個のすべての菌株の上澄み液中に検出されなかったが、細胞表面に該タンパク質を発現する３２個の菌株のうち２６個の上澄み液中に見出された（データは記載していない）。
タンパク質Ribに対するウサギ抗体がＢ群れんさ球菌による致死感染症に対して防御できるか否かを試験するため、マウスの防御モデルを使用した（表２、実施例７）。対照の動物は、提示しているように、αタンパク質に対する抗血清または免疫前の血清を投与された。得られたデータは、タンパク質Ribに対する抗血清が、タンパク質Ribを発現する菌株による致死感染症に対してマウスを防御することを示している。
タンパク質Ribはαタンパク質およびβタンパク質と同様に防御免疫を与えるため、これら３種のタンパク質を比較することは重要であった。分析用の精製タンパク質に対する抗血清を用いてウエスタンブロット試験を実施した（図４）。染色ゲルは、これら３種のタンパク質が高度に精製されて各製剤中に一つの主要種として含有されていることを示したが、ウエスタンブロットに示すように、これら３種のタンパク質間に血清学的交差反応は全くなかった。
αタンパク質とβタンパク質は、本来、プロテアーゼ感受性の差によって識別された。αタンパク質はトリプシンに対して耐性であるがペプシンに対して感受性であり、一方βタンパク質はこれら両者のプロテアーゼに対して感受性である（BevangerおよびMaeland，Acta  Path  Microbiol  Scand  Sect  B、８７巻、５１頁、１９７９年）。精製したαタンパク質とβタンパク質による試験で、上記の差を確認しまたタンパク質Ribがトリプシンとペプシンの両者に対して耐性であることを立証した（図５）。予想どおりに、これら３種のタンパク質はすべてプロテイナーゼＫによる分解に対して感受性であった（データは示していない）。タンパク質Ribのプロテアーゼ耐性はインヒビターが存在するためではない。というのは、βタンパク質は、タンパク質Ribの存在下でもトリプシンとペプシンの両者によって完全に分解されたからである（データは提示していない）。
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
実施例  １ タンパク質の同定
４種の主要血清型を示す４種のＢ群れんさ球菌菌株を参考菌株として使用した。すなわちＡ９０９、Ｉａ／ｃ型；SB３５、Ｉｂ型；Ｂ１２８４、II型；BS３０、III型である。BS３０菌株は、ルンド大学の大学病院で、新生児疾患がみられる男児から単離した。細菌菌株はすべて、振盪することなく、トッド・ヒューイットブロス（Oxoid）中３７℃で増殖させた。これら菌株のムタノリシン抽出物は、SDS−PAGEを行い次にαとβのタンパク質に対する抗血清を用いて免疫ブロティングを行うことによって分析した。れんさ球菌菌株の小規模ムタノリシン抽出物を、タンパク質の精製に用いた大規模抽出物について記載したのと同様にして製造したが、わずか５０ｍｌの培養物を用いて２０％の細菌懸濁液を調製し、その１ｍｌの試料を酵素で消化した。
SDS−PAGEは、架橋度が３．３％のポリアクリルアミドを全濃度１０％で用いて標準の方法で実施した。試料を、２％のSDSと５％の２−メルカプトエタノールを含有する溶液中で３分間煮沸してから電気泳動にかけた。分離したタンパク質はクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０で染色するか、またはSemi−Dry  Electroblotter（デンマーク、Vig所在のAncos社）を用い、電気ブロッティングによって、メタノールで活性化させたポリジフッ化ビニリデンの膜（Immobilon−P；フランス、Molsheim所在のMillipore  Corp．社）に転移させた。このImmobilon膜を、標準法を用いてゼラチンでブロックし、次いで１０００倍に希釈した指定した型のウサギ抗血清とともにインキュベートし（実施例７参照）次に放射能標識をつけたプロテインＧを用いてオートラジオグラフィーに付した。
タンパク質の放射能標識付けは、クロラミンＴ法を用いて担体なしの125Ｉ（英国、Amersham  International社）で行った。全タンパク質の濃度はMicroBCAタンパク質検定試薬（Pierce）で測定した。SDS−PAGEゲルからのタンパク質の電気溶出を、Bio−Rad社から入手したmodel４２２  Electro−Eluterで実施した。
試験結果を図１に示す。
実施例  ２ タンパク質Ribの精製
菌株BS３０の一夜培養物１０ｌ中の細菌を遠心分離し（spin  down）、５０mMトリスｐＨ７．３で２回洗浄し次に同じ緩衝液に再懸濁させて２０％（ｖ／ｖ）にした。この細菌懸濁液（１２５ｍｌ）に、１０mMリン酸カリウムｐＨ６．２に溶解して５０００単位／ｍｌにしたムタノリシン（米国、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma  Chemical  Co．社）を添加し、最終濃度を３５０単位／ｍｌにした。消化を、緩やかに振盪しながら３７℃で１７時間行い、次にプロテアーゼインヒビター類を次の最終濃度まで添加した。すなわち塩化ベンズアミジン、５mM；ヨード酢酸、５mM；フッ化フェニルメチルスルホニル、２mMである。得られた懸濁液を遠心分離し、その上澄み液を直ちに１０mMトリスｐＨ８．０に対して透析した（透析管：Spectrapor  No.４）。この透析された製剤をイオン交換クロマトグラフィーの二つの連続ステップに付した。予備試験で分かっていたように、この方法によって純粋なタンパク質Ribを最高に回収することができた。タンパク質Ribが存在していることは、SDS−PAGEを行い次に９５KDのバンドの存在についてゲルを視覚検査することによって分析した。第一のクロマトグラフィーのステップでは、透析された製剤（１１０ｍｌ）を、１０mMトリスｐＨ８．０中０．４Ｍ  NaClおよび１０mMトリスｐＨ８．０で平衡化したDEAE  Bio−Gel  Ａ（３０ｍｌ）（米国、カリフォルニア州、リッチモンド所在のBioRad  Laboratories社）と混合した。この混合物を４℃で１時間ゆるやかに攪拌し、次いで未吸収物質（タンパク質Ribを含有している）をガラスフィルターによる濾過を行ってゲルから分離した。第二のクロマトグラフィーのステップ（図２Ａ）では、タンパク質Ribを含有する濾液を蒸留水で２０倍に希釈してイオン強度を低下させ、次に先に述べたようにして平衡化させたDEAE  Bio−Gel  Ａ（３０ｍｌ）と混合した。４℃で１６時間ゆるやかに攪拌した後、ゲルを濾過によって回収し１０mMトリスｐＨ８．０で洗浄した。吸収されたタンパク質（タンパク質Ribを含有している）を、塩の直線勾配液（１０mMトリスｐＨ８．０中の０〜０．２Ｍ  NaCl）８００ｍｌで続いて１Ｍ  NaCl  ６０ｍｌで溶離した。１０ｍｌずつの画分を収集し、タンパク質Ribを含有する画分をプールし、濃縮し、次にPBSA（０．１２Ｍ  NaCl、０．０３Ｍリン酸塩、０．０２％NaN3、ｐＨ７．２）中のセファロース CL ６Ｂのカラム（４．２cm×９０cm）でゲル濾過に付した（図２Ｂ）。上記の各画分は９５KDのバンドの存在についてSDS−PAGE電気泳動によって分析した。タンパク質Ribを含有する画分（１０ｍｌずつ）をプールし凍結した。タンパク質Ribの収量は細菌２５ｇ当り約６mgであった。免疫化学分析に用いるタンパク質Ribの製剤の純度を保証するため、この試験に使用する該タンパク質はさらにSDS−PAGEで精製し生成した９５KDのバンドを電気溶出させた。しかし、SDS−PAGE分析した結果、この電気溶出がなされた物質と上記ゲル濾過ステップで回収された物質との間に純度の差は全くみとめられなかった。
上記のように、タンパク質Ribは該タンパク質を発現する菌株の培地中にもみとめられる。該タンパク質は、上記の方法に類似の方法を用いて、かような培地から精製することができる。
Immobilonに転移させたタンパク質バンドの自動アミノ酸配列の分析を、Applied  Biosystems  ４７０Ａガス−液体固相シークエネータを用いて、上記膜上で直接実施した。これらの膜をクーマシー・ブリリアント・ブルーで軽く染色してタンパク質のバンドの位置を突き止め、そのバンドを配列決定のために切り取った。タンパク質の配列の分析についてはSwissProt  Data  Bankを利用した。
菌株BS３０由来のタンパク質RibのNH2末端の配列を配列番号：１に示す。精製されたタンパク質Rib中の推定分子量が９５KDと９０KDの二つのタンパク質（図２Ｂ）は同じNH2末端配列を有することが見出されたが、このことは、小さい方の分子が大きい方の分子の分解生成物であることを示唆している。データサーチを行ったところ、タンパク質RibのNH2末端の配列は独特のものであることが分かった。
菌株BM１１０からのタンパク質Ribの単離も同じ精製手順にしたがって行った。菌株BM１１０から単離されたタンパク質RibのNH2末端配列（配列番号：２）は、BS３０由来の対応するタンパク質のNH2末端配列と７位で異なっている。すなわちBM１１０の該タンパク質は７位にAspの代わりにSerを有している。
実施例  ３ αタンパク質の精製
αタンパク質は、αタンパク質とβタンパク質の両方を発現するＩｂ型菌株である菌株SB３５から精製した。使用した方法は、菌株BS３０からタンパク質Ribを精製するのに使用したのと類似の方法である。各画分は、ウサギ抗α血清（ノルエーのトロンヘイム大学のL．Bevanger博士から提供された）および125Ｉで放射能標識をつけたプロテインＧ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴのCalbio  chem  Co．社）を用いて、ドットブロット分析法によって、αタンパク質の存在について分析した。イオン交換ステップとゲル濾過ステップにおいて、αタンパク質の挙動はタンパク質Ribの挙動と類似していた（図２参照）。ゲル濾過ステップで回収されたαタンパク質はシャープなピークで存在していた。異なる抗血清でこの物質を分析したところ、この物質が痕跡量の汚染βタンパク質を含有していることを示したが、この汚染βタンパク質は該製剤をIgA−セファロースの小カラムを通過させることによって除去した。精製されたαタンパク質は、SDS−PAGE分析の結果、分子量が約１１００００であった（図４参照）。αタンパク質の収量は、細菌３９ｇ当り１２ｍｇであった。免疫化学試験に用いるαタンパク質は、タンパク質Ribについて先に述べたようにしてSDS−PAGEゲルから電気溶出法でさらに精製した。しかしSDS−PAGEで分析したところ、この電気溶出された物質とゲル濾過ステップから回収した物質との間に純度の差はみとめられなかった。
実施例  ４ βタンパク質の精製
IgA結合βタンパク質（Russell−Jonesら、J  Exp  Med、１６０巻、１４６７頁、１９８４年）を、Ribタンパク質およびαタンパク質に使用したのと類似の方法で精製した。出発物質は、洗浄したSB３５細菌を、５０mMグリシン−NaOH緩衝液ｐＨ１１．０中でインキュベートすることによって得た（懸濁液の最終ｐＨ９．７）。本発明の発明者らの実験室での以前の研究によって、このような抽出物中の主要タンパク質の種はβタンパク質であることが分かっていた。その抽出物（２２２ｍｌ）を直ちに１０mMトリスｐＨ８．０に対して透析し、蒸留水で２０倍に希釈し、次いで４０ｍｌのDEAE  Bio−Gel  Ａ（１０mMトリスｐＨ８．０で平衡化した）と混合した。４℃で２時間ゆるやかに攪拌した後、ゲルをカラムに移し、８００ｍｌの塩の直線勾配液（１０mMトリスｐＨ８．０中０〜０．２ＭのNaCl）で溶離した。βタンパク質の存在について画分（１０ｍｌずつ）を試験するため、分析用の、放射能標識を付けたIgAまたは抗β血清および放射能標識を付けたプロテインＧを用いて、ドットブロット法を利用した。βタンパク質は該勾配液の最初の部分で溶出した。適正な画分をプールし、濃縮し、次いでPBSA中のAcA ３４のカラム（４．２×１００cm）（スエーデン、アプサラ所在のPharmacia−LKB社）でゲル濾過に付した。βタンパク質は明確なピークで溶出した。適正な画分をプールし、濃縮し次いで凍結した。その収量は、細菌２３ｇ当り純粋なタンパク質９mgであった。このような製剤の主要タンパク質の種は、SDS−PAGEによる分子量が約１３００００であったが、そのタンパク質をウエスタンブロット分析に付したところ、分子量が小さい少量の分解生成物もみとめられた。
実施例  ５ プロテアーゼ感受性の分析
プロテアーゼ感受性を分析するため（図５）、精製したα、βまたはRibのタンパク質（０．５mg／ｍｌ）の試料２００μｌずつを、トリプシン、ペプシンまたはプロテイナーゼＫ（０．２mg／ｍｌ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。トリプシンによる消化は、０．２５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．５中で実施し、ペプシンによる消化は、０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中で行い、そしてプロテイナーゼＫによる消化は０．２５ＭトリスｐＨ７．４中で行った。試料はSDS−PAGEで分析する前に中和した。
実施例  ６ α、βおよびRibのタンパク質の細胞表面での発現に関するれんさ球菌菌株の分析
本発明の発明者らの実験室で入手できる５種の参考菌株を、第一に、α、βおよびRibのタンパク質の表面発現について分析した。その後、５８個のＢ群れんさ球菌菌株のコレクション（すべて侵入性感染症の症例から単離した）もこれら細胞表面タンパク質の発現を試験するのに用いた（表１参照）。Ｂ群れんさ球菌菌株の型の判定は、標準の方法を用いてルンド大学大学病院の臨床微生物学研究所で実施した。
１０ｍｌの一夜培養物中の細菌をPBSAT（０．０５％  Tween２０で補充したPBSA）で２回洗浄し次いでPBSATによる１％懸濁液を調製した。この細菌懸濁液の試料（１８０μｌ）を、PBSATで希釈したウサギ抗血清（２０μｌ）と混合し、次にその混合物を２３℃で１時間インキュベートした。２ｍｌのPBSATを添加し、細菌を遠心分離し、２ｍｌのPBSATで一回洗浄し、２００μｌのPBSATに再懸濁させた。捕捉されたIgGを検出するため、２５μｌの放射能の標識をつけたプロテインＧ（PBSAT中約１０4cpm）を添加し、インキュベーションを２３℃で１時間続けた。２ｍｌのPBSATを添加してから、細菌を遠心分離し、得られたペレットを、２ｍｌのPBSATを添加することによって洗浄した。最終の遠心分離を行った後、上澄み液を排棄してペレットの放射能を測定した。多くの菌株をα、βおよびRibのタンパク質の発現について試験したとき（表１）、１：１０００という単一の最終抗血清希釈度を使用した。免疫前のウサギ抗血清による対照を常に含めたがすべての場合、完全に陰性であった。タンパク質Ribは、３３個のIII型菌株のうち３１個の細胞表面に見出されたが１２個のＩａ型とＩｂ型の菌株のいずれからも見出されなかった。
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α、βおよびRibのタンパク質の細胞表面発現は特異的抗血清で分析し、そして捕捉された抗体は、図３に示すように放射能標識をつけたプロテインＧで検出した。
ここで試験した５８個の菌株はすべて侵入性感染症の症例から単離したが、これら菌株の無作為のコレクションではない。というのはII型の菌株の大部分は最初に試験したコレクションにその後つけ加えたものであり、最初のコレクションにはII型菌株は２個しか含まれていなかったからである。
実施例  ７ 抗血清の製造とマウス防御試験
抗血清はすべてウサギに産生させた。そのウサギは背中への皮下注射で免疫化した。菌株BS３０によって発現されるタンパク質Ribに対する抗血清を調製するため、SDS−PAGEゲル中のいくつもの９５KDバンドに相当するスライスを切り取り、小片に分割し、次に完全フロイントアジュバントと混合した。最初の免疫化を行うため、１ｍｌのPBS中６個のスライス（約６０μｇのタンパク質）を１ｍｌのアジュバントと混合した。追加注射（booster  injection）用に３個のバンド（３０μｇのタンパク質）を使った。第一の追加注射は４週間後に行い、次いで３回の追加注射を２週間の間隔をおいて行った。次にそのウサギから３週間の間隔をおいて３回採血し、これら３回の採血で得た血清をプールし、ここで報告する実験に使用した。αタンパク質に対する抗血清は同様の方法で製造した。抗α血清の第一の試料は、精製中の画分を分析するのに使用したが、これはトロンヘイム在住のLars  Bevanger博士から入手した。精製されたβタンパク質に対する抗血清は本発明の発明者らの実験室で入手できた。
本発明の発明者らの部署で飼育したＣ３Ｈ／HeNマウスを１０〜２０週齢で使用した。これらのマウスに、PBSで５倍に希釈したウサギ血清０．５ｍｌを腹腔内注射し、次に４時間後、トッド・ヒューイットブロスで希釈した対数期の細菌０．５ｍｌを腹腔内注射することによって感染させた。使用した細菌の数は、９０％致死量（LD90）と推定された数であり、BM１１０、BE２１０およびSB３５sedlについては２×１０6c.f.u.であり、BS３０とL２５については２×１０7c.f.u.であった。死亡動物は４日間毎日計数した。対照の動物は通常２４時間以内に死亡した。
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Ｃ３Ｈ／HeNマウスに０．１ｍｌのウサギ抗血清（PBSで０．５ｍｌまで希釈）を腹腔内注射し、次にトッド・ヒューイットブロス０．５ｍｌで希釈した対数期細菌のLD90量を４時間後に注射して免疫性を試験した。生存データをカイ二乗検定法で解析した。
−  タンパク質Ribまたはαタンパク質の発現、この実験に関連する二つの抗原。
＋  ４日間生残するマウスの数／感染マウスの合計数。
§P＜0.001  抗α血清または通常血清を受けている対照と比較した場合。
"n.d.  ＝未測定。
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抗α血清を受けている対照と比較した場合。
--P＜0.01  抗Rib血清を受けている対照と比較した場合。
表２のデータは、タンパク質Ribに対する抗血清が、該タンパク質が精製されたIII型菌株であるBS３０による致死感染症に対して防御することを示している。この防御は、対照の血清による試験で分かるように非特異的ではない。また抗Rib血清は、Ｂ群れんさ球菌菌株の高毒性クローンのメンバーである他のIII型菌株のBM１１０（Musserら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８６巻、４７３１頁、１９８９年）による致死感染症に対して防御した。これに対して抗Rib血清は、タンパク質Ribを発現しないIII型菌株の一つであるＬ２５による感染症に対して防御をしなかった（表２）。抗Rib血清の防御作用は、タンパク質Ribを発現するII型菌株による試験で示されているように、III型菌株に限定されなかった。予想どおりに、抗Rib血清はα抗原を発現するＩｂ型菌株に対して防御しなかった。これらのデータを総合してみると、タンパク質Ribは、ほとんどすべてのIII型菌株といくつかのII型菌株、すなわち侵入性感染症を起こす大部分のＢ群れんさ球菌菌株に毒性因子として作用することを強く示唆している。
実施例  ８ rib遺伝子のクローン化およびエシェリキア・コリ（Escherichia  coli）でのタンパク質Ribの発現
タンパク質Ribに対する構造遺伝子を、高毒性クローンのメンバーの血清型IIIの菌株である菌株BM１１０からクローン化した。この菌株が発現するタンパク質Rib（配列番号：２）と菌株BS３０が発現するタンパク質Rib（配列番号：１）は、類似した大きさとNH2末端配列を有している。バクテリオファージλ中に菌株BM１１０DNAのライブラリーを構築した。菌株BM１１０の対数期のトッド・ヒューイット培養物５００ｍｌ中の細菌を遠心分離した。ペレットの凍結と融解を３回行い、２０ｍｌのTE緩衝液（１０mMトリス、１mM  EDTA、ｐＨ８．０）中に懸濁させ、遠心分離し、洗浄し次いで４ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁させた。１０mMリン酸カリウムｐＨ６．２に５０００単位／ｍｌまで溶解したムタノリシン（米国、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma  Chemical  Co．）を、上記細菌懸濁液に添加して、最終濃度５００単位／ｍｌにした。リゾチーム（Sigma社）を最終濃度８mg／ｍｌまで添加し、次に消化を３７℃で３時間行った。最近の細胞を、２００μｌの１０％SDSおよび５００μｌのTween溶解ミックス（２％Tween−２０、５０mMトリスｐＨ８．０および６０mM  EDTA）を添加し、次いで別の２００μｌの１０％SDSを添加することによって溶解した。得られた溶菌液をプロテイナーゼＫ（Sigma社、１００μｇ／ｍｌ）で５０℃にて１９時間処理し次いでフエノールとクロロホルムによる抽出を繰返した。得られたDNAをエタノールで沈澱させ、SpeedVac  concentrator（SAVAC）で乾燥し、次いで４．５ｍｌのTE緩衝液に溶解した。得られたDNAをさらにCsCl密度勾配超遠心分離法で精製し、次にTE緩衝液に対して透析した。そのDNAの濃度は約２．５μｇ／μｌであった。このDNAをSau ３ＡＩ（Promega社）で部分的に消化し、λEMBL３（Statagene社）のBam  HIで開裂されたアームに連結した。その組換えファージDNAを、Gigapack  II  Gold  Packaging  Extract（Stratagene社）を用いて、生体外でパッケージした。そのライブラリーをイー・コリ（E．Coli）菌株LE３９２上にプレートし、タンパク質Ribの産生について免疫ブロッティング法で選別した。すなわち、約１０００個のプラークを有するプレートをニトロセルロースの膜で覆って４℃で１時間放置した。膜を取り外し、ブロックし、５０倍に希釈されたウサギ抗Rib血清を含有する緩衝液中でインキュベートした。陽性のプラークすなわちウサギIgGを捕捉するプラークは、ペルオキシダーゼで標識を付けたプロテインＡ（Sigma社）（２０μｇ／ｍｌ）を添加することによって検出され、そしてペルオキシダーゼの存在は標準の方法を用いて可視化した。７個の独立したRib発現λクローンが単離された。これらのクローンのなかの３個すなわち、λRib  １−３、λRib  １−５およびλRib  １−７はそれぞれ寄託番号DSM９０３９，９０４０及び９０４１でDeutsche  Sammlung  von  Microorganismenに寄託されている。またDNA濃度が約０．５μｇ／μｌである、λRib  １−３クローン由来のDNA製剤を製造した。これら７種のクローンの溶菌液を、抗Rib血清を用いてウエスタン免疫ブロット分析に付した（図６参照）。これらクローンのいくつかは菌株BM１１０から直接単離したタンパク質Ribと同じ大きさのタンパク質Ribを発現する。
配列表
一般情報
出願人
姓  名：グンナル・リンダール
住  所：マグヌス  ステンボックスガタン  ５
都市名：ルンド
国  名：スウェーデン
郵便番号（ZIP）：２２２  ２４
発明の名称：Ｂ群れんさ球菌の多くの菌株に対する免疫を与える細胞表面タンパク質であるタンパク質Rib、そのタンパク質の精製方法、薬剤キットおよび医薬組成物
配列の数：２
コンピュータが読出し可能なフォーム
媒体の種類：フロッピー・ディスク
コンピュータ：IBM  PCコンパチブル
オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS
ソフトウェア：Patentln  Release  ＃１．０、
Version＃１．２５（EPO）
本件出願のデータ
出願番号：
配列番号：１
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
起源
生物名：Ｂ群れんさ球菌
株  名：BS３０
配列
0003976334.tif 000005
配列番号：２
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル：ＮＯ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
起源
生物名：Ｂ群れんさ球菌
株  名：BM１１０
配列
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【図１】
0003976334.tif 000007
【図２Ａ】
0003976334.tif 000008
【図２Ｂ】
0003976334.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0003976334.tif 000012
【図４】
0003976334.tif 000013
【図５】
0003976334.tif 000014
【図６Ａ】
0003976334.tif 000015
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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