(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量のホウ素源としての下記式（Ｉ）：
【化１】
0003878534.tif 000005
ただし、Ｐｈは、フェニル基を表わす、
を有するトリフェニルボロキシン及び製薬上許容できるキャリアーを含むホウ素中性子捕捉療法用の薬剤組成物。
【請求項２】
癌のホウ素中性子捕捉療法を目的とする、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
該癌は、肝癌、乳癌または悪性黒色腫である、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
該癌は、肝癌である、請求項３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
該製薬上許容できるキャリアーは、リピオドール（登録商標）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
癌細胞による製薬上許容できるキャリアーの取り込みを促進するためのプロモーターとしてレシチンをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
該製薬上許容できるキャリアーにおけるレシチンの溶解性を向上するための溶解剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
該溶解剤は、炭素原子数１０〜２０の脂肪酸である、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
ホウ素の含有量が、薬剤組成物に対して、０．１〜３質量％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
１ｍｌのリピオドール（登録商標）当たり１５〜２５ｍｇのレシチン及び０．０５〜０．０９ｍｌの炭素原子数１０〜２０の脂肪酸；ならびに薬剤組成物に対して０．１〜３質量％のホウ素を含む、請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
該炭素原子数１０〜２０の脂肪酸は、リノール酸である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法(boron neutron capture therapy)（本明細書中では「ＢＮＣＴ」とも略す）に用いられる薬剤組成物に関するものである。特に、本発明は、トリフェニルボロキシンをホウ素源として含むＢＮＣＴに用いられる薬剤組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１には、リピオドール（登録商標；以下、省略）、サブミクロンのホウ素粉末、レシチン及び炭素原子数１２〜２２の脂肪酸からなり、サブミクロンのホウ素粉末がレシチン及びリノール酸等の脂肪酸の存在下でリピオドール中に懸濁されているホウ素含有リピオドール薬剤組成物が開示される。このホウ素含有リピオドール薬剤組成物は少なくとも肝癌のホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に有用であり、これらの成分のうち、リピオドールは肝癌での高い保持特性を有し、レシチンはホウ素運搬能(boron carrying capacity)を有し、さらに炭素原子数１２〜２２の脂肪酸はリピオドール中にレシチンを可溶化する作用を有する。このホウ素含有リピオドール薬剤組成物には、サブミクロンのホウ素粉末が、均一に分散するように適当な粒度分布を有する必要がある。
【０００３】
悪性黒色腫及び脳腫瘍の処置を目的とした臨床試験へのborocaptate sodium（ＢＳＨ）及びboronophenylalanine（ＢＰＡ）が報告されている（例えば、非特許文献１〜３を参照。）。さらに、非特許文献４には、マウスの肝腫瘍及び正常な肝細胞へのホウ素中性子捕捉療法の効果が研究されている。
【０００４】
また、非特許文献５には、トリフェニルボロキシンの構造及び熱運動性が研究されている。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第６，１１７，８５２号明細書
【非特許文献１】
Mishima, Y., et al.  Lancet, 12, 388-389 (1989)
【非特許文献２】
Hatanaka, H. and Nakagawa, Y.  Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 28, 1061-1066 (1994)
【非特許文献３】
Barth, R. F., et al.  Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. Vol. 47, No. 1, 209-218 (2000)
【非特許文献４】
Minoru Suzuki, et al., Jpn. J. Cancer Res. 91. 1058-1064, October 2000
【非特許文献５】
Carolyn Pratt Brock, Robin P. Minton and Kurt Niedenzu, Acta Cryst. (1987). C43, 1775-1779
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）でホウ素源として使用される癌細胞での選択的で高い保持能を有するホウ素含有薬剤組成物を提供することを目的とするものである。
【０００７】
本発明の他の目的は、ホウ素源としての化合物が薬剤組成物中に均一にかつ安定して分散でき、薬剤組成物が血清中で安定であり、かつ癌細胞中に高濃度で選択的に蓄積できる、ホウ素中性子捕捉療法に使用される薬剤組成物、さらにはホウ素源化合物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、特定の式のトリフェニルボロキシンを合成し、これをＢＮＣＴのホウ素源として使用したところ、肝癌、乳癌及び悪性腫瘍等の癌細胞、特に肝癌細胞中に効率的に取り込まれ、蓄積され、これにより、これらに対するＢＮＣＴに好適に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、上記諸目的は、下記（１）〜（１１）によって達成される。
【００１０】
（１）  治療上有効な量のホウ素源としての下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化２】
0003878534.tif 000002
【００１２】
ただし、Ｐｈは、フェニル基を表わす、
を有するトリフェニルボロキシン及び製薬上許容できるキャリアーを含むホウ素中性子捕捉療法用の薬剤組成物。
【００１３】
（２）  癌のホウ素中性子捕捉療法を目的とする、前記（１）に記載の薬剤組成物。
【００１４】
（３）  上記癌は、肝癌、乳癌または悪性黒色腫である、前記（２）に記載の薬剤組成物。
【００１５】
（４）  上記癌は、肝癌である、前記（３）に記載の薬剤組成物。
【００１６】
（５）  上記製薬上許容できるキャリアーは、リピオドールを含む、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の薬剤組成物。
【００１７】
（６）  癌細胞による製薬上許容できるキャリアーの取り込みを促進するためのプロモーターをさらに含む、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の薬剤組成物。
【００１８】
（７）  上記製薬上許容できるキャリアーにおけるプロモーターの溶解性を向上するための溶解剤をさらに含む、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の薬剤組成物。
【００１９】
（８）  上記プロモーターは、レシチンであり、上記溶解剤は、炭素原子数１０〜２０の脂肪酸である、前記（７）に記載の薬剤組成物。
【００２０】
（９）  ホウ素の含有量が、薬剤組成物に対して、０．１〜３質量％である、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の薬剤組成物。
【００２１】
（１０）  １ｍｌのリピオドール当たり１５〜２５ｍｇのレシチン及び０．０５〜０．０９ｍｌの炭素原子数１０〜２０の脂肪酸；ならびに薬剤組成物に対して０．１〜３質量％のホウ素を含む、前記（８）に記載の薬剤組成物。
【００２２】
（１１）  上記炭素原子数１０〜２０の脂肪酸は、リノール酸である、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の薬剤組成物。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ホウ素源としての疎水性化合物である下記式（Ｉ）：
【００２４】
【化３】
0003878534.tif 000003
【００２５】
ただし、Ｐｈは、フェニル基を表わす、
を有するトリフェニルボロキシン（フェニルボロン酸無水物(phenylboronic anhydride)）［（Ｃ6Ｈ5ＢＯ）3］を治療上有効な量及び製薬上許容できるキャリアーを含むホウ素中性子捕捉療法用の薬剤組成物に関するものである。本発明の薬剤組成物は、癌のホウ素中性子捕捉療法に好適に使用でき、この際、適用できる癌としては、特に制限されないが、例えば、肝癌、乳癌及び悪性黒色腫が挙げられ、これらのうち、特に肝癌のホウ素中性子捕捉療法に好適に使用できる。
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明の薬剤組成物は、上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンを必須成分として含むものである。この際、上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンは疎水性化合物である。薬剤組成物中の上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンの存在量は、所望のホウ素中性子捕捉療法に効果的に使用できるものであれば、特に制限されず、処置されようとする疾患（例えば、癌や腫瘍）の種類や併用されるキャリアーの種類などによって適宜選択できる。具体的には、ホウ素の含有量が、薬剤組成物に対して、０．１〜３質量％となるような量である。
【００２８】
本発明の薬剤組成物を構成する製薬上許容できるキャリアーは、特に制限されず、公知のキャリアーが使用できる。例えば、リピオドールなどが好ましく挙げられる。このリピオドールは、Ｘ線の造影剤及びリンパ管撮影の造影剤として使用されている。本発明者は、その研究により、培養中の肝癌細胞が、細胞の寿命の限り細胞内にリピオドールを長期間保持して、多量のリピオドールをエンドサイトーシスによって迅速に活性をもって取り込むことができることを知得した[Chou FI, Fang KC, Chung C, Lui WY, Chi CW, Liu RS, and Chan WK. Lipiodol uptake and retention by human hepatoma cells. Nucl Med Biol (1995) 22(3): 379-386]。本発明において、リピオドールは、特に肝癌細胞中に選択的でかつ高濃度の保持ができる点で、ホウ素含有薬剤のキャリアーとして好適に使用できるものである。加えて、本発明の薬剤組成物のホウ素含有薬剤（ホウ素源）である上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンは、リピオドール中で均一に分散し、また、リピオドール中で安定であるため、この点を考慮しても、リピオドールは製薬上許容できるキャリアーとして好ましく使用できる。キャリアーの使用量は、特に制限されないが、好ましくは、癌細胞中にトリフェニルボロキシンを選択的かつ高濃度で保持でき、また、上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンを均一に分散できる量である。例えば、キャリアーとしてリピオドールを使用する場合のリピオドールにおけるトリフェニルボロキシンの濃度は、薬剤組成物の重量に基づくホウ素濃度が１×１０3ｐｐｍ〜３×１０4ｐｐｍとなるような量であることが好ましく、これは、１ｍｌのリピオドール当たり０．０２５〜０．９ｍｌのトリフェニルボロキシンに相当する。
【００２９】
本発明の薬剤組成物は、プロモーターをさらに含んでもよく、この際、プロモーターは、癌細胞による製薬上許容できるキャリアーの取り込みを促進することを目的とするものであることが好ましい。プロモーターとしては、特に制限されず、公知のプロモーターが使用できるが、例えば、レシチンなどが挙げられる。このレシチンは、肝癌細胞によるリピオドールの取り込みを促進するため、本発明においてプロモーターとして好ましく使用される。
【００３０】
また、本発明の薬剤組成物がプロモーターを含む場合には、薬剤組成物は、製薬上許容できるキャリアーにおけるプロモーターの溶解性を向上するための溶解剤をさらに含むことが好ましい。この際、溶解剤としては、特に制限されず、公知のキャリアーが使用できるが、例えば、炭素原子数１０〜２０の脂肪酸、より具体的には、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、ノナデカン酸及びアラキン酸等の飽和脂肪酸；ならびにオレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸及びステアロール酸等の不飽和脂肪酸などが挙げられる。これらのうち、特にプロモーターとしてレシチンを使用する際には、リピオドールにおけるレシチンの溶解性を向上するため、リノール酸が好ましく使用される。
【００３１】
本発明は、上述したように、式（Ｉ）のトリフェニルボロキシン、製薬上許容できるキャリアー、ならびに必要であればプロモーター及びその溶解剤を含むものであるが、これら成分の組成は、ホウ素中性子捕捉療法に効果的に使用できるものであれば、特に制限されず、処置されようとする疾患、例えば、癌や腫瘍の種類や使用されるキャリアー、プロモーターや溶解剤の種類などによって適宜選択できる。例えば、本発明の薬剤組成物が式（Ｉ）のトリフェニルボロキシン、製薬上許容できるキャリアーとしてのリピオドール、プロモーターとしてのレシチン及びその溶解剤としてのリノール酸からなる場合の各成分の組成は、好ましくは下記のとおりである：１ｍｌのリピオドール当たり１５〜２５ｍｇのレシチン及び０．０５〜０．０９ｍｌの炭素原子数１０〜２０の脂肪酸（好ましくは、リノール酸）；ならびに薬剤組成物に対して０．１〜３質量％のホウ素含量となるような量の上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシン。
【００３２】
本発明に使用される上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンの製造は、特に制限されず、公知の方法を単独であるいは組み合わせて使用することによって達成できるが、一般的にはフェニルボロン酸［式：Ｐｈ−Ｂ（ＯＨ）2；但し、Ｐｈはフェニル基を表わす］から製造される。または、本発明においては、市販のトリフェニルボロキシンを利用してもよい。この際、本発明による上記式（Ｉ）のトリフェニルボロキシンの製造に関する特に好ましい一実施態様を下記実施例における調製例１に記載する。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
調製例１：トリフェニルボロキシンの合成
丸底フラスコに、３ｇのフェニルボロン酸及び１ｍｌのエタノールアミン触媒を添加し、この混合物を、マグネチックスターラーで攪拌しながら、油浴で１３０℃で２４時間、加熱した。これにより、赤褐色の溶液が得られた。この赤褐色の溶液の一部を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析用に採取した。この際、ＴＬＣ分析の移動相として、ヘキサン及び酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝５：２（体積比））の混合溶媒を用いて、溶液の液滴を展開した。次に、シリカゲルＴＬＣフィルム(silica gel TLC film)をＩ2蒸気によって着色した後、暗い点が０．５のＲｆで検出された。
【００３５】
残ったエタノールアミンを除去するために、上記で得られた赤褐色の溶液を、酸化アルミニウムが充填されたカラムに導入して、酢酸エチル（溶離剤）で溶出した。溶剤を蒸発させた後、最初のセクションで集められた溶出液を、ヘキサン及び酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１（体積比））の混合溶媒を溶離剤として用いることによってシリカゲルが充填されたカラムで別途溶出させた。ここで、溶出液を連続した別の画分として集めて、これらの画分をそれぞれシリカゲルＴＬＣフィルムに滴下して、ヘキサン及び酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝５：２（体積比））の混合溶媒で展開して、ＴＬＣ分析を行なった。このシリカゲルＴＬＣフィルムをＩ2蒸気によって着色したところ、０．５のＲｆを有するものが目的とするものであった。このようにして集められたＲｆが０．５である溶出液部分を真空中で蒸発して、含まれている溶剤を除去し、疎水性のトリフェニルボロキシンを主要な部分として含む液状産物を得た。
【００３６】
トリフェニルボロキシンの構造おび分子量の同定：
上記液体クロマトグラフィーによって精製された液状産物を、厚いシリカゲルフィルム（２ｍｍ）に滴下し、ヘキサン及び酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝５：２（体積比））の混合溶媒で展開した。Ｒｆが０．５である産物を掻き取った。得られた粉末を管に入れ、酢酸エチルで溶解した。この溶液をガスクロマトグラフィー−質量分析(gas chromatography-mass spectrum)（ＧＣ−ＭＳ）分析にかけたところ、分子量３１２を有する主要な産物が観察された。
【００３７】
中性子照射後のトリフェニルボロキシンのαトラック：
上記で調製されたトリフェニルボロキシン液状産物５μｌを、αトラック検出フィルム(α track detectable film)(Koda, LR-115 film)に滴下した。一晩乾燥した後、このフィルムをTsing Hua Open-pool Reactor（ＴＨＯＲ）に入れ、所定時間、熱中性子線を照射した。次に、この照射フィルムをＴＨＯＲから取り除いて、５０分間、超音波処理しながら６０℃で１０％  ＮａＯＨ水溶液でエッチングすることによって現像した。このエッチングフィルムを蒸留水で洗浄して、残存するＮａＯＨを除去し、乾燥し、位相差顕微鏡で観察した。αトラックが現像フィルムのトリフェニルボロキシン液状産物の液滴の領域で見出された。
【００３８】
実施例１：トリフェニルボロキシンを取り込んだリピオドール(triphenylboroxin entrapped lipiodol)（本明細書中では、単に「ＴＥＬ」とも略す）の調製
丸底フラスコ内に下記組成で仕込まれたリピオドール、リノール酸及びレシチンに、無水エタノールを添加した後、攪拌しながら７０℃で２０分間、加熱した。溶液が完全に透明になるまで、上記調製例１で調製されたトリフェニルボロキシン液状産物を添加し、さらに１０分間、同様に攪拌、加熱を行なった。得られた混合物を５０℃でロータリーエバポレーターに入れて、エタノールを完全に除去することによって、トリフェニルボロキシンを取り込んだリピオドール（ＴＥＬ）を油状の明るい黄色−茶色の透明な液体の形態で得た。本実施例において、ＴＥＬを調製するのに使用された各成分の組成比は以下のとおりであった。
【００３９】
【表１】
0003878534.tif 000004
【００４０】
中性子照射後のＴＥＬのαトラック：
トリフェニルボロキシン液状産物の代わりに、上記で調製されたＴＥＬを使用する以外は、上記調製例１に記載の方法と同様の中性子照射におけるトリフェニルボロキシンのαトラックの観察に関する方法を繰り返した。現像フィルムを観察した結果、現像フィルムのＴＥＬの液滴の領域にαトラックが均一に分布し、液滴以外のところにはαトラックが存在しなかったことが示された。
【００４１】
ＴＥＬのホウ素濃度：
テフロン（登録商標）製の高圧消化容器に、０．５ｍｌのＴＥＬ、３ｍｌの硝酸溶液（１４Ｎ、６５％）及び０．５ｍｌの過酸化水素水（３０〜３５％）を添加した。この容器をキャップで密閉し、以下の消化条件でマイクロ波消化オーブン(microwave digestion oven)(MLS 1200 Miesfone, Italia)に入れた：３００Ｗで１５分間及び６００Ｗで１０分間。６０分間冷却して容器内の圧力を下げた後、キャップをひねった(turn off)ところ、容器内の混合物が透明な溶液になっていたことから、完全に消化が行なわれたことが示された。さらに、この消化溶液を注ぎ出し、蒸留水で希釈し、誘導結合プラズマ−原子分光(inductively coupled plasma-atomic spectroscopy)（ＩＣＰ−ＡＥＳ）(OPTIMA 2000 DV, Perkin Elmer Instruments)によってアッセイした。この結果、ＴＥＬのホウ素含量は１２０００ｐｐｍであった。このＴＥＬのホウ素含量は、ＴＥＬの調製時の配合によって異なる。ＴＥＬの重量に基づくホウ素濃度の適当な範囲は、１×１０3ｐｐｍ〜３×１０4ｐｐｍである。
【００４２】
ＴＥＬの安定性：
ヒト血清におけるＴＥＬの安定性を試験するために、１２０００ｐｐｍのホウ素を有する０．１ｍｌのＴＥＬ（Ｂ−リピオドール）を、５ｍｌのヒト血清と混合した後、７５ｒｐｍで３７℃でインキュベートすることによって、血清におけるＴＥＬベヒクルの懸濁液を形成した。水性血清への油状調製物からのホウ素の放出を定量的に試験するために、２ｍｌの血清を、３７℃に維持し、７５ｒｐｍで回転した各試験管から一様にサンプリングした。これらのサンプルのホウ素含量をＩＣＰ−ＡＥＳによって測定したところ、ＴＥＬベヒクルのホウ素含量は、初めの１時間で８８％にまで減少し、その後は安定になり、８５％のホウ素含量が９６時間後のＴＥＬベヒクルで保持されたことが示された。これから、トリフェニルボロキシンはリピオドール中で安定して保持されたことが示唆された。
【００４３】
肝癌細胞、ＨｅｐＧ２細胞によるＴＥＬの相互作用および保持：
０．１５ｍｌのＴＥＬを１００ｍｌの完全ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)（ＣＤＭＥＭ）に添加した後、滅菌条件下で７５Ｗの電力での超音波処理によって均質化して、ＴＥＬ−ＣＤＭＥＭ液体を形成した。７ｍｌのＴＥＬ−ＣＤＭＥＭを、ＣＤＭＥＭ中で７０％コンフルエント(confluence)にまで培養したＨｅｐＧ２細胞に添加したところ、添加後の培養液中の絶対ホウ素含量は１６μｇであった。ＨｅｐＧ２細胞をＴＥＬ−ＣＤＭＥＭでインキュベートしたところ、ＴＥＬ小球が倒立光学顕微鏡による試験によって細胞膜上に検出された。１時間後、細胞膜上のＴＥＬは乳化して、より小さな小球を形成することが分かった。ＴＥＬ−ＣＤＭＥＭと共に８時間インキュベートした後は、ほとんどのＨｅｐＧ２細胞が細胞質中で細胞内ＴＥＬ小球を有していたことが、倒立光学顕微鏡によって確認された。細胞内ＴＥＬ（Ｂ−リピオドール）小球は、時間がたつにつれて、大きさ及び量がより増えるように見えた。４８時間では、多数のＴＥＬ小球が細胞質内に蓄積されて、これにより細胞の大きさが大きくなり、原形質膜が膨らんだ(bulge)。
【００４４】
ＣＤＭＥＭ中で７０％コンフルエント(confluence)にまで培養したＨｅｐＧ２細胞に７ｍｌのＴＥＬ−ＣＤＭＥＭを添加したところ、添加後の培養液中の絶対ホウ素含量は１６μｇであった。このＨｅｐＧ２細胞を所定時間ＴＥＬ−ＣＤＭＥＭに暴露した後、細胞を５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄することにより、ゆるく結合したＴＥＬを除去した。細胞を遠心によって集めて、消化した。このようにして集められ、消化された細胞のホウ素含量を、ＩＣＰ−ＡＥＳによってアッセイした。その結果、集められ、消化された細胞のホウ素含量はＴＥＬ−ＣＤＭＥＭでの培養時間が増加するにつれて増加し、１２時間及び２４時間の培養時間でのホウ素含量は、それぞれ、５８ｐｐｍ及び１１８ｐｐｍであり、４８時間では、ホウ素含量は２１４ｐｐｍに達し、この含量はＢＣＮＴに関して十分高い値であることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の薬剤組成物は、ホウ素源としての上記式（Ｉ）を有するトリフェニルボロキシンを治療上有効な量及び製薬上許容できるキャリアーを含むことを特徴とするものである。本発明の薬剤組成物は、肝癌、乳癌及び悪性黒色腫等の癌、特に肝癌に関するホウ素中性子捕捉療法に好適に使用できる。
【００４６】
また、本発明の薬剤組成物におけるホウ素源としてのトリフェニルボロキシンは、薬剤組成物中に均一にかつ安定して分散できる。さらに、本発明の薬剤組成物は、血清中で安定であり、癌細胞中に高濃度で選択的に蓄積できるという利点をも有する。