(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化式１又は化式２で表される基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド。
【化１】
0003893057.tif 000021
【化２】
0003893057.tif 000022
【請求項２】
請求項１に記載のヌクレオチドを含む核酸。
【請求項３】
請求項１に記載のヌクレオシド及び／又はヌクレオチドを含む、２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基と前記化式１又は化式２で表される基との間で塩基対を形成させるための塩基対形成剤。
【請求項４】
２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基が２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−３−イル基である、請求項３に記載の塩基対形成剤。
【請求項５】
２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基を有するヌクレオチドを含む核酸と、下記式１及び／又は式２で表される基を有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせて、２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基と式１及び／又は式２で表される基との間に塩基対を形成させる方法。
【化３】
0003893057.tif 000023
【化４】
0003893057.tif 000024
【請求項６】
２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基が２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−３−イル基である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−［［（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシ］ホスフィノ］−２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］プリンまたはその２位のアミノ基が保護基により修飾された化合物。
【請求項８】
保護基がベンゾイル基である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
２−アミノ−６−（２−チエニル）−９−［２−デオキシ−３−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）］ホスフィノ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル］プリンまたはその２位のアミノ基が保護基により修飾された化合物。
【請求項１０】
保護基がイソブチリル基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
下記式１及び／又は式２で表される基を有するヌクレオチドを含む核酸の遺伝情報を、ＲＮＡポリメラーゼを用いて２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基を有するヌクレオチドを含むＲＮＡに転写する方法。
【化５】
0003893057.tif 000025
【化６】
0003893057.tif 000026
【請求項１２】
２位にヒドロキシ基又はケト基を有するピリジンからなる基が２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−３−イル基である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、立体障害を利用した選択的な新規人工核酸塩基対の形成に関する。
また、本発明は、本発明の新規人工核酸塩基対を使用した核酸の複製、転写、および、これを用いタンパク質合成システムあるいは機能性核酸に関する。より詳細には、本発明は、立体障害を利用した選択的な塩基対を形成させることができる、好ましくは立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を利用した選択的な塩基対を形成させることができる新規な人工核酸、その製造方法、それを含有してなるコドン、それを含有してなる核酸分子、それを用いた非天然型の遺伝子の製造方法、前記核酸分子又は非天然型の遺伝子を用いた新規な蛋白質の製造方法などに関する。
背景技術
地球上の生物は、すべて遺伝子としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類の塩基からなる核酸を用い、ＡとＴ、ＧとＣの特異的な塩基対形成によってその遺伝情報を伝えている。また、遺伝子ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ中の遺伝情報に従ってタンパク質が合成される。その際、３塩基からなる６４種類（４３＝６４）のコドンがそれぞれ２０種類のアミノ酸に対応している。
もし、４種類（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）の既存の塩基に加えて新規な核酸塩基（Ｘ，Ｙ）（ここでは、ＸとＹが特異的に塩基対を形成する）を創製することができればコドンの種類が飛躍的に増大し（６３＝２１６）、新たにできたコドンを非天然型アミノ酸に対応させることにより、非天然型アミノ酸を含むタンパク質の合成が可能となる（Ｊ．Ｄ．Ｂａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５６，５３７−５３９（１９９２））。
これまで、Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ以外の人工塩基対として、イソシトシンとイソグアニンが報告されているが、イソグアニンの互変異性のためにイソシトシンよりもチミンと塩基対を形成し易い事が問題となっている（Ｃ．Ｓｗｉｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１，８３２２−８３２３（１９８９）；Ｃ．Ｙ．Ｓｗｉｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１０４８９−１０４９６（１９９３）．）。また、その他にもいくつかの新規塩基対の報告があるが、いずれもまだ、ポリメラーゼによる認識に問題があり実用化されていない（Ｊ．Ａ．Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３３−３７（１９９０）；Ｊ．Ｈｏｒｌａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６３２９−６３３３（１９９５）；Ｊ．Ｃ．Ｍｏｒａｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔ．ｂｉｏｌ．，５，９５４−９５９（１９９８））。
ところで、様々な機能をもつ核酸分子がインビトロセレクション法によって見いだされているが（Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２（１９９０）；Ｃ．Ｔｕｅｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，５０５−５１０（１９９０））、前記したＸ−Ｙのような新規な塩基対がＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及び逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の各種ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）に認識されれば、現在、４種類の塩基で行われているインビトロセレクション法を６種類の塩基で行うことができ、４種類の塩基では実現できない新しい機能をもつ核酸分子の創製の可能性が期待できる。
また、遺伝子の１個又は２個以上の塩基が他の塩基になっているために発現する遺伝病の治療に、新しい塩基対の創製が期待されている。
本発明者らは、天然の核酸とは塩基対を形成せず、それら自体で選択的に塩基対を形成し、かつ各種のポリメラーゼに認識され得る新規な人工の核酸塩基対を創製すべく鋭意研究してきたところ、立体障害を利用することにより天然の核酸との塩基対の形成を阻害することができ、新たにデザインされた核酸同士で選択的に塩基対を形成させ得ることを見出した。さらに、このようにデザインされた核酸が天然の各種ポリメラーゼに十分認識されることも見出した。
例えば、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）と塩基対を形成しないようにチミンの６位のケト基と立体障害によってぶつかりあうように、２，６−ジアミノプリン（２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）の６位のアミノ基に嵩高いメチル基を２つ導入した２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン（２−ａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅ）（この塩基をＸという。）をデザインする。こうしてこのＸは、チミンとは塩基対を形成しなくなるが、チミンの６位のケト基を水素に変えた同族体ピリジン−２−オン（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ）（この塩基をＹという。）などの塩基は、このＸと塩基対を形成することができることを見出した（第１図参照）。
さらに、プリン環の６位に立体障害を起こし得るジメチルアミノ基を導入した２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２−ａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−９−（２’−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ）（このものを、ｄＸという。）を含むＤＮＡオリゴマーと、３−（２’−デオキシ−５’−トリホスホロ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（３−（２’−ｄｅｏｘｙ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ）（このものを、ｄＹＴＰという。）を化学合成し、ｄＹＴＰあるいはそのリボヌクレオチド体（ｒＹＴＰ）が、前記のｄＸの相補鎖としてＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼによって選択的にＤＮＡやＲＮＡ中に取り込まれることを見い出した。
しかし、このものは、第２図のａ及びｂに示されるように、この塩基（第２図ａのｄｘ）中の６−ジメチルアミノ基はその立体的なかさ高さによって、天然型塩基のチミン（あるいはウリジン）（第２図ｂ参照）やシトシンとの塩基対をある程度排除することが出来たが、この立体障害が前後に存在する塩基にも影響を与えることから、同時に塩基間のスタッキング等にも不利な影響を及ぼし、ＫｌｅｎｏｗフラグメントによるｄＹＴＰの取り込み効率は低く、ｄｘに対するチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の取り込みを抑えるには充分ではなかった。
そこで、本発明者らは、立体障害だけでなく、塩基相互間の静電的な反発や、前後の塩基とのスタッキング作用を考慮した新たな人工の塩基対を検討しところ、選択性の優れた人工の塩基対を得ることができることを見出した。
発明の開示
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼによって塩基対が認識される際に、塩基対間の立体障害を利用して、より好ましくはさらに塩基間のスタッキングには悪影響を及ぼさず、塩基対平面にのみその立体障害を引き起こさせ、さらに好ましくは天然型の塩基との静電的な反発が利用でき得る塩基を選択することにより選択的に新規人工核酸塩基対が形成されうるという概念を提供するものである。
即ち、本発明は天然の核酸とは塩基対を形成せず、それら自体で選択的に塩基対を形成し、かつ各種のポリメラーゼに認識され得る新規な人工の核酸塩基対を提供するものである。さらに、本発明は、これらの人工の核酸、それを含むコドン、核酸分子、非天然型の遺伝子、及びそれらの応用方法を提供するものである。
本発明は、核酸の塩基部分に立体障害を起こさせ得る基、好ましくは核酸の塩基部分に立体障害及び静電的な反発並びスタッキング作用を有する基を導入することにより選択的な塩基対を形成させる方法に関し、より詳細には、当該立体障害を起こさせ得る基が、天然の核酸の塩基部分との塩基対を形成することを阻害するためのものであり、また当該立体障害及び静電的な反発により、天然の核酸の塩基部分との塩基対を形成することを阻害し、スタッキング作用により前後の塩基と安定に存在し、かつこのような塩基対がポリメラーゼに認識され得る塩基対であることを特徴とする選択的な塩基対を形成させる方法に関する。
また、本発明は、核酸の塩基部分における立体障害を利用して選択的な塩基対を形成させる、好ましくは核酸の塩基部分における立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を利用して選択的な塩基対を形成させるように核酸をデザインする方法に関し、より詳細には、当該立体障害の利用、好ましくは当該立体障害及び静電的な反発の利用により天然の核酸の塩基部分との塩基対を形成することを阻害し、さらに好ましくはスタッキング作用により前後の塩基と安定に存在し、かつこのような塩基対がポリメラーゼに認識され得る塩基対であることを特徴とする選択的な塩基対を形成させ得る核酸をデザインする方法に関する。
さらに、本発明は、核酸の塩基部分に立体障害を起こさせ得る基、好ましくは核酸の塩基部分に立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を有する基を導入することにより選択的な塩基対を形成させ得る核酸に関し、より詳細には、当該立体障害を起こさせ得る基、好ましくは当該立体障害及び静電的な反発を起こさせ得る基が、天然の核酸の塩基部分との塩基対を形成することを阻害し、さらに好ましくはスタッキング作用を有する基により前後の塩基と安定に存在するためのものであり、かつこのような塩基対がポリメラーゼに認識され得る塩基対であることを特徴とする選択的な塩基対を形成させ得る核酸、及びその製造方法に関する。
即ち、本発明は、天然の塩基を含有する核酸類と同様な挙動をすることができる新規な人工の核酸、及びこのような核酸をデザインする方法を開示するものであり、本発明の核酸は天然の核酸と同様な応用をすることができる。
したがって、本発明は、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸を用いた各種の応用に関する。
より詳細には、本発明は、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸を１個以上含有してなるコドンに関し、当該コドンは天然の核酸と同様にアミノ酸をコードすることができ、当該アミノ酸としては非天然型のアミノ酸であることもできる。また、本発明は、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸、及び天然に存在する核酸を含有してなる核酸分子に関し、当該核酸分子は天然の核酸と同様に蛋白質をコードすることができ、また、当該核酸分子は天然の遺伝子の遺伝情報の全部又は一部を保持することもできる。このような核酸分子に各種のポリメラーゼ作用させて、その相補鎖を有する核酸分子を製造することもでき、本発明はこのような相補鎖の製造方法にも関する。
また、天然の遺伝子の一部に、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸を導入又は置換することができ、したがって、本発明は天然の遺伝子に、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸を１個又は２個以上導入又は置換させて非天然型の遺伝子を製造する方法に関し、これらの導入又は置換を前記した本発明のコドン単位にて行うこともできる。
さらに、本発明は、前記した方法により得ることができる非天然型の遺伝子又は前記した本発明の核酸分子に基づいて、それが含有しているコドンに基づいたアミノ酸の配列を有する蛋白質を製造する方法に関し、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸を含有するコドンが非天然型のアミノ酸をコードするようにした場合には、天然の蛋白質の一部に非天然型のアミノ酸が導入又は置換された蛋白質を製造することができる。
したがって、本発明の方法により天然の蛋白質の一部が、他の天然型又は非天然型のアミノ酸、好ましくは非天然型のアミノ酸に置換又はそれらが導入された新たな蛋白質を製造する方法を提供するものであり、それにより天然の遺伝子がコードしている蛋白質の各アミノ酸の機能をスクリーニングすることができ、本発明は天然の遺伝子がコードしている蛋白質の各アミノ酸の機能をスクリーニングする方法にも関する。
また、本発明は、本発明の核酸又は本発明の方法によりデザインされた核酸（以下、単に本発明の核酸という。）を含有する非天然型の遺伝子で形質転換された微生物にも関する。
さらに、本発明の新規な塩基対は、天然の塩基と対を形成しないので、遺伝子の１個又は２個以上の塩基が他の塩基になっているために発現する遺伝病等の治療に有用であり、本発明は新規な塩基対又はその一方の塩基からなる医薬組成物を提供するものである。
本発明は、天然の核酸の塩基とは塩基対を形成せず、かつポリメラーゼに認識され得る人工の核酸を提供することであるが、従来の人工の核酸は水素結合の位置のみを変更しようとしたために天然の核酸の塩基との塩基対の形成を実質的に阻害することはできず、塩基対の選択性が十分ではなかった。本発明は、係る選択性を立体障害を起こす基、好ましくは立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を有する基を導入するという手法で解決したものであり、人工の核酸同士が選択的に塩基対を形成することができる最初の人工核酸を提供するものである。
したがって、以下で本発明を具体例に基づいてより具体的に説明してゆくが、これらの具体例は本発明をよりよく理解させるためのものであり、本発明がこれらの具体例に限定されるものでないことは前述した本発明の技術的思想から明らかである。
本発明の核酸における塩基部分に立体障害を起こさせ得る基としては、好ましくない塩基との水素結合を阻害することができる程度のもので、核酸の塩基としての性質に悪影響を及ぼさないものであれば、特に制限はない。さらに好ましくは、核酸の配列における、他の核酸の塩基対の形成を阻害しない程度の大きさのものがよい。また、水素結合が可能となる極性部分や活性水素原子を有していない基が好ましいが、これらの極性部分や活性水素が距離的に水素結合が可能でない箇所に位置する場合には特に留意する必要はない。
本発明の核酸の塩基部分に立体障害を起こさせ得る基としては、例えば、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基などの低級アルキル基、好ましくは分枝した低級アルキル基、メチル基あるいはこれらの低級アルキル基からなる低級アルコキシ基、メチル基あるいはこれらの低級アルキル基で置換されたジ低級アルキルアミノ基、メチル基あるいはこれらの低級アルキル基で置換されたシリル基などが挙げられる。
このような立体障害を起こさせ得る基を塩基中に導入する方法としては、通常の化学合成法を利用することができる。
また、本発明の核酸の塩基部分に立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を有する基としては、塩基相互間の好ましくない水素結合を阻害することができる程度の立体障害を有する基で、静電的な反発を有する基で、かつスタッキング作用を有するための環状のπ電子系を有する基であって、核酸の塩基としての性質に悪影響を及ぼさないものであれば、特に制限はない。さらに好ましくは、核酸の配列における、他の核酸の塩基対の形成を阻害しない程度の大きさのものがよい。また、水素結合が可能となる極性部分や活性水素原子を有していない基が好ましいが、これらの極性部分や活性水素が距離的に水素結合が可能でない箇所に位置する場合には特に留意する必要はない。
本発明の核酸の塩基部分に立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を有する基としては、平面構造を有する芳香複素環式基が好ましい。このような芳香複素環式基は、分子の平面方向において充分な立体障害を起こさせるだけの大きさを有し、異種原子による静電的な反発を起こさせることができ、そして芳香複素環式基のπ電子系によるスタッキング作用も期待することができる。
このような芳香複素環式基としては、より具体的には、異種原子として１又は２個の硫黄原子、酸素原子又は窒素原子を有する５又は６員環の芳香複素環式基が挙げられる。これらの芳香複素環式基は、縮合環式、多環式、又は単環式のいずれのものであってもよいが、立体的な大きさからは単環式のものが好ましい。また、これらの芳香複素環式基は必要により各種の置換基を有するものであってもよいが、立体的な制限や好ましくない水素結合が生起することから通常は大きな置換基を持たないものが好ましい。このような置換基としては、水酸基、アミノ基、カルボニル基、炭素数１〜５程度の低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルアミノ基、ニトロ基などが挙げられる。
このような立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を有する基を塩基中に導入する方法としては、通常の化学合成法を利用することができる。
また、本発明の核酸はポリメラーゼに認識され得る人工の核酸であり、ポリメラーゼとしては、いずれのポリメラーゼであってもよいが、好ましくはＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、最近のポリメラーゼの構造解析の結果は、全てのポリメラーゼと核酸の相互作用が本質的に同じであることを示しており、本発明の塩基対の形成はポリメラーゼ反応の本質に関わるものであり、以下で具体的な説明で用いたＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、逆転写酵素などを含め全てのポリメラーゼにおいても利用することができる。
さらに、最近の分子の立体配置の解析方法や原子間距離の精密な測定方法などにより、核酸の立体配置が計算されるので、これらの結果に基づいて立体障害を起こし、かつ他の位置で相互の核酸の塩基が１個又は２個以上、好ましくは２個の水素結合をし得る塩基の化学構造をデザインすることができる。したがって、本発明は核酸の立体障害、好ましくは核酸の塩基部分における立体障害、好ましくはさらにこれに加えて静電的な反発並びにスタッキング作用に基づいて人工の核酸をデザインする方法を包含するものである。本発明の塩基対のデザインに当たっては、ワトソン・クリック型塩基対によるデザインが通常であるが、フーグスティーン型塩基対によりデザインしてもよい。
本発明の核酸は、核酸の立体障害、好ましくは核酸の塩基部分における立体障害に基づいてその化学構造がデザインされた人工の核酸であればよく、人工の核酸同士が選択的に塩基対を形成するものであればよい。好ましくは、これらの人工の核酸の塩基対がポリメラーゼに認識され得るものであり、ポリメラーゼの作用により天然の核酸と同様にその相補鎖が合成されるものが好ましい。
本発明の核酸は、通常の化学合成法によっても合成することができるが、この方法に限定されるものではない。化学的な合成法の例を第３図、第４図及び第５図に例示する。
本発明の核酸を、核酸の配列の中に組み込む方法としては、天然の核酸を組み込む通常の方法を又はこれに準じた方法により行うことができる。例えば、ＤＮＡ合成装置による方法や、ポリメラーゼによる方法や、ポイントミューテーション技術などに準じて行うことができる。また、従来の天然の核酸と同様な標識化を行うこともできる。
したがって、本発明は遺伝子断片やプローブなどとして使用される核酸分子であって、前記した本発明の核酸を含有する核酸分子を包含する。本発明の核酸分子は１個又は２個以上の本発明の核酸を含有するものであり、１本鎖のものであっても２本鎖のものであってもよい。また、本発明の非天然型の遺伝子は、天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換したもの、天然の遺伝子に本発明の核酸を１個又は２個以上を付加したもの、又はこれらを組み合わせたものが包含される。このような本発明の非天然型の遺伝子は、従来の天然型の遺伝子の改変と同様な方法又は従来の方法に準じた方法により行うことができる。
したがって、本発明の核酸分子や非天然型の遺伝子は、従来の天然型のものと同様にこれを適当なベクターに挿入して又はファージなどを用いて、適当な微生物を本発明の核酸を含有する遺伝子により形質転換することができる。
また、本発明の核酸を含む新たなコドンを設計することができる。例えば、本発明の新規な人工の核酸の塩基をＸ及びＹとすると、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＸなどのこれらの塩基の組み合わせや、ＡＸＡ、ＴＹＴ、ＣＧＸ、ＡＴＸ、などの天然の核酸の塩基との組み合わせによるコドンを設計することができる。新たなコドンは、天然型のアミノ酸をコードさせることもできるし、また、非天然型のアミノ酸をコードさせることもできる。さらに、転写や輸送などの機能をコードさせることもできる。このように本発明は新規な人工の核酸を提供するのみならず、本発明の核酸を含む新たなコドンの設計による、全く新しい遺伝暗号の設計を可能とするものであり、新たな遺伝暗号の世界を提供するものである。
本発明の新たなコドンに応じたｔＲＮＡ系を設計することにより、非常に多くのアミノ酸を利用可能とする新たな蛋白質合成システムを設計することができる。利用可能なアミノ酸はリポソームにおける蛋白質合成酵素系で利用できるものであればよい。したがって、本発明は前記した本発明のコドンをもちいた新たな蛋白質合成システムを提供するものでもある。
従来、天然の蛋白質中の一部のアミノ酸を非天然型のアミノ酸に置換したり、非天然型のアミノ酸を挿入することは極めて困難であったが、本発明の蛋白質合成システムによれば希望する位置のコドンの核酸を本発明の核酸に置換又は導入することにより、所望の非天然型のアミノ酸を含有する蛋白質を製造することが可能となる。そして、このようなアミノ酸の変更を行うことにより、蛋白質中の各アミノ酸の機能をスクリーニングすることが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
次の本発明を具体例により詳細に説明する。
人工の塩基のひとつである２，６−ジアミノプリンはチミンの６位のケト基と水素結合をし、チミンと塩基対を形成することがある。このものがチミンと塩基対を形成しないようにチミンの６位のケト基と立体障害によってぶつかりあうように、２，６−ジアミノプリンの６位のアミノ基に嵩高いメチル基を２つ導入した次式で示される、
0003893057.tif 000002
２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン（以下、この塩基をＸという。）をデザインした。
こうしてこのＸは、チミンとは塩基対を形成しなくなるが、チミンの６位のケト基を水素に変えた同族体ピリジン−２−オン（以下、この塩基をＹという。）などの塩基は、このＸと塩基対を形成することができた（第１図参照）。第１図の下段は、これらの塩基Ｘ及びＹが他の塩基と対を形成できない様子を示している。
次に、塩基対Ｘ−Ｙの立体障害を利用した選択的な新規核酸塩基対形成を検証するために、ＤＮＡのプライマー伸長反応（Ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法とＤＮＡからＲＮＡを合成する転写反応を用いた。プライマー伸長反応法とは、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）となるＤＮＡオリゴマーにプライマーとなるオリゴマーをアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼと２’−デオキシヌクレオシド−５’三リン酸（ｄＮＴＰ）を加えることにより、プライマーの３’末端にテンプレートの相補的な配列を伸長させるものである。転写反応は、ＤＮＡを鋳型としてその相補鎖ＲＮＡを合成するものである。ここでは、ＤＮＡポリメラーゼの一つである大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩからその５’−エクソヌクレアーゼを取り除いたクレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を、また、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７ファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。どちらの酵素も現在最も良く用いられているものの一つである。
まず、鋳型となるＤＮＡにＸを組み込むため、ｄＸのアミダイト試薬を化学合成し（第３図参照）、次に示す塩基配列を有するｄＸを含む鋳型ＤＮＡ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ３、５、６、７、８、９）、また対照実験に用いる鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ１、２、４）及び、それらのプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ  １、２、３）を合成した。
ｄＸを含む鋳型ＤＮＡ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ３、５、６、７、８、９）
0003893057.tif 000003
対照実験に用いる鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ１、２、４）
0003893057.tif 000004
0003893057.tif 000005
プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ  １、２、３）
0003893057.tif 000006
また、基質となるｄＹＴＰやｒＹＴＰの合成も行った（第４図参照）。
ついで、プライマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ）と［α−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて３２Ｐラベルした。３２Ｐラベルされたプライマー１（０．５μＭ）及びテンプレート１、３（１μＭ）と種々のｄＮＴＰ（１５０μＭ）（Ｎは種々の塩基を示す。）を用いて、クレノウフラグメント（０．２ユニット／μｌ）によるプライマー伸長反応を、１７℃で３０分間行った。
この実験に用いたプライマーとテンプレートの組み合わせを次に示す。
テンプレート１を用いた場合：
0003893057.tif 000007
テンプレート３を用いた場合：
0003893057.tif 000008
結果を２０％ポリアクリルアミド  ７Ｍ尿素ゲルに電気泳動をし、それをイメージングプレート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて分析した結果を第６図に示す。第６図の左側５個のＡＧ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＡＧＹ及びＡＧＣＴはテンプレート１を用いた場合を、右側の５個はテンプレート３を用いた場合を示す。この結果、塩基ＹはＡ、Ｇ及びＸの相補鎖に取り込まれ、Ｘの相補鎖にはＹの他にＣ、Ｔが取り込まれることがわかった（第６図参照）。
さらに、これらの取り込みを定量するため、５’末端を３２Ｐラベルしたプライマー２（１μＭ）とテンプレート１、２及び３（２μＭ）を用い、ｄＮＴＰ（１５０μＭ）を１種類だけ加えて同様の実験を行った。
この実験に用いたプライマーとテンプレートの組み合わせを次に示す。
テンプレート１を用いた場合：
0003893057.tif 000009
テンプレート２を用いた場合：
0003893057.tif 000010
テンプレート３を用いた場合：
0003893057.tif 000011
この結果を第７図のＡ及びＢに示す。この結果、ＹはＡ、Ｇ及びＸの相補鎖にそれぞれ７８％、４８％及び４１％取り込まれることがわかった。また、Ｘの相補鎖には、Ｙ、Ｃ及びＴがそれぞれ４１％、９．５％  及び１３％取り込まれることがわかった（第７図参照）。
Ｙは単独ではＸだけでなくＡやＧにも取り込まれることがわかったので、次に、ＹがＴやＣと共存するとき、それぞれの相補鎖に対してどちらが取り込まれやすいかを調べるために、以下のような競争実験を行った。
ラベルされていないプライマー２とテンプレート３をアニールさせ、これに［α−３２Ｐ］ＴＴＰと種々の量のｄＹＴＰを加え、［α−３２Ｐ］ＴＴＰのＸの相補鎖への取り込みがｄＹＴＰによって阻害されるかを調べた。また、同時にｄＡＴＰも加えることにより、この阻害がＸのつぎのＴの相補鎖に対するＡの取り込みにも影響するかを調べた（第８図のＡ参照）。その結果、ｄＹＴＰを［α−３２Ｐ］ＴＴＰとほぼ等量加えると［α−３２Ｐ］ＴＴＰのＸの相補鎖への取り込みが５０％阻害されることがわかった。同様の実験をテンプレート１及び２を用いて、ＡやＧに対して行った結果、ｄＹＴＰは［α−３２Ｐ］ＴＴＰのＡの相補鎖への取り込み及び［α−３２Ｐ］ＣＴＰのＧの相補鎖への取り込みに対しては全く阻害しないことがわかった（第８図のＢ（テンプレート１）、Ｃ（テンプレート２）参照）。したがって、ｄＹＴＰのＡやＧへの取り込みは、ＴＴＰやｄＣＴＰ共存させることによって抑えられることがわかった。
また、鋳型上にＸが２個あった場合にＹ及びＣやＴのＸの相補鎖への取り込みがどうなるかを調べるために、５’末端を３２Ｐラベルしたプライマー３とテンプレート４、５、６、７、８及び９を用いてプライマー伸長反応法を行った。その結果、テンプレート上にＸが連続して２つあるといずれの塩基を用いてもポリメラーゼ反応が２つのＸの場所で停止してしまうことがわかった。２個のＸの間に３つの別の塩基が挿入された場合のみ、Ｙだけが２個目のＸの相補鎖にも取り込まれ、相補鎖合成が進むことがわかった（第９図参照）。
同様にＸを含むＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによる転写反応が進行するかも調べた。鋳型にテンプレート１−３を用い、この配列上のプロモータ領域を２本鎖化して、［α−３２Ｐ］ＡＴＰを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行った。
この実験に用いたプライマー領域ーとテンプレートの組み合わせを次に示す。
テンプレート１−３を用いた場合：
0003893057.tif 000012
（テンプレート１：Ｎ＝Ａ、
テンプレート２：Ｎ＝Ｇ、
テンプレート３：Ｎ＝Ｘ）
この結果を第１０図に示す。テンプレート３（Ｎ＝Ｘ）の場合には、Ｘに対してＹが選択的に取り込まれた生成物に相当するバンドが電気泳動上で認められた。ただし、Ｕも僅かながら取り込まれている。テンプレート１（Ｎ＝Ａ）の場合には、Ａの相補鎖にＵだけでなく、Ｙも取り込まれてしまうことが分かった。テンプレート２（Ｎ＝Ｇ）では、Ｃのみが取り込まれ、Ｙの取り込みよる生成物はほとんど認められなかった。
次に全てのｒＮＴＰが共存する際の転写反応を行った。先の実験と同様にテンプレート１（Ｎ＝Ａ）及び３（Ｎ＝Ｘ）を用い［α−３２Ｐ］ＡＴＰを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を、ｒＡＴＰ２ｍＭ、ｒＧＴＰ２ｍＭ、ｒＣＴＰ２ｍＭ、ＵＴＰ２ｍＭ、及びｒＹＴＰ１ｍＭの条件で行い、次いでＲＮａｓｅＴ２により生成した全長のＲＮＡを完全分解し、３’端が標識されたヌクレオチドを２次元ＴＬＣで分析した。この実験の概要を次の式で示す。
0003893057.tif 000013
この結果を第１１図に示す。第１１図中の丸で囲んだスポットはＵＶで観測されたスポットであることを示す。第１１図のＡはテンプレート３（Ｎ＝Ｘ）の場合の結果を示し、第１１図のＢはテンプレート１（Ｎ＝Ａ）の場合の結果を示す。それぞれの場合の各塩基の理論値と実測値を次の表１に示す。
0003893057.tif 000014
この結果、テンプレート３（Ｎ＝Ｘ）の転写反応では、Ｘに対してＹがほぼ選択的に取り込まれていて、Ｕは微量ながらわずかに検出された。また、テンプレート１（Ｎ＝Ａ）の場合には、Ｙは全く取り込まれていなかった。
以上のように、このようにデザインされた塩基Ｘは、チミンとは塩基対を形成しなくなるが、チミンの６位のケト基を水素に変えた同族体ピリジン−２−オン（塩基Ｙ）などの塩基は、このＸと塩基対を形成することができ（第２図ａ及びｂ参照）、塩基対Ｘ−Ｙの選択的な核酸塩基対の形成が検証された。
しかし、このｄｘ中の６−ジメチルアミノ基はその立体的なかさ高さによって、天然型塩基のチミン（あるいはウリジン）（第２図ｂ参照）やシトシンとの塩基対をある程度排除することが出来たが、同時に塩基間のスタッキング等にも不利な影響を及ぼし、ＫｌｅｎｏｗフラグメントによるｄＹＴＰの取り込み効率は低く、ｄｘに対するチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の取り込みを充分に抑えることが出来なかった。
そこでこのジメチルアミノ基の代わりに塩基間のスタッキングには悪影響を及ぼさず、塩基対平面にのみその立体障害を引き起こさせるために平面構造を有する芳香族系の置換基をｄｘの６位に導入することを行った。
この実験に当たって、その一例として６位にチオフェンを導入した次式で示される、
0003893057.tif 000015
２−アミノ−６−（２−チエニル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ｄｘ２：この新しい塩基をＸ２とし、先の２−アミノ−６−（Ｎ．Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンをｄｘとする）の合成を行い、この塩基を含む鋳型に対するｄＹＴＰやｒＹＴＰの取り込みを調べた。
鋳型ＤＮＡ合成用のｄｘ２のアミダイト試薬の調製法の概要を第５図に示した、詳細は実施例２を参照されたい。このアミダイト試薬は、ＤＮＡ合成において通常の市販のアミダイト試薬と同様のカップリング収率を示した。
まず、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）を用いて、鋳型中のｄｘ２に対するｄＹＴＰの取り込みを調べた（実施例１０参照）。
テンプレート及びプライマーとして次の塩基配列のものを使用した。
0003893057.tif 000016
テンプレートのＮの箇所に本発明の塩基Ｘ、塩基Ｘ２及び対照としてＡの塩基を結合させて各種の塩基の取り込み実験を行った。結果を第１２図に示す。第１２図にレーン１及び２は対照として使用したアデニン（Ａ）におけるシトシン（Ｃ）とチミン（Ｔ）の取り込みを示している。
この結果、先のｄｘに対するｄＹＴＰの取り込み効率は２１％（レーン３）であったが、ｄｘ２を用いることにより４０％（レーン８）まで取り込み効率が上昇した。同条件での天然型のｄＡに対するｄＴＴＰの取り込み効率が５７％（レーン２）であることと比較すると、ｄｘ２によりかなりの改善が見られたことになる。ｄｘに比べてｄｘ２は、ｄＣＴＰの取り込みが大きくなっている（２２％）（レーン１１）が、それでもｄＹＴＰの取り込み（４０％）に比べるとそれほど大きな値であるということはできない。
このＫｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）による実験の結果から、先のｄｘからｄｘ２を用いることにより、ｄｘ２に対するｄＣＴＰの取り込み効率が上昇したが、これは、シトシンの４−アミノ基とｄｘ２中のチオフェンの硫黄原子との相互作用によるものと思われる（第２図ｆ参照）。また、このようにｄｘ２中のチオフェンの硫黄原子が塩基対面に向いたときは、チミン（Ｔ）の４−ケト基と静電的な反発が予想され、これは、塩基対の形成を阻害する要因として、立体的な障害に加えて、静電的な反発（第２図ｅ参照）を用いることができることを示している。これらのことから、ｄｘ２中のチオフェンは、硫黄原子の側が塩基対面に向いていると考えられる。
次に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型中のｄｘ２に対するｒＹＴＰのＲＮＡ中への取り込みを、次に示す反応、
0003893057.tif 000017
によって調べた（実施例１１）。
この方法で製造された次の
ＧＧＧ＊ＡＧＧ＊Ａ＊ＡＧＡｎ＊ＡＧ＊ＡＧＣ＊Ａ
（ｎはテンプレートの塩基Ｎに対応する塩基を示し、右肩のアスタリスクは標識化されていることを示す。）
塩基配列を有するＲＮＡを、ＲＮａｓｅ  Ｔ２で分解して、次いで２次元ＴＬＣ（セルロース樹脂）により、それぞれのヌクレオチドの比を求めた。
第１３図にそのＴＬＣの展開図を示す。また、次の表２にそれぞれのヌクレオチドの組成比を示す。
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表２中のカッコ内は、理論値を示す。
この結果、ｄｘ２を用いても高い選択性でｒＹＴＰがｄｘ２に対してのみ取り込まれることがわかった。先のｄｘを鋳型に用いた場合にも良い結果が既に得られていたが、同様の条件でｄｘ２を鋳型に用いて転写反応を行い、ｄｘ２に対してＲＮＡ中に取り込まれたヌクレオチドの組成分析を行っても、同様に高い選択性でｒＹＴＰがｄｘ２に対してのみ取り込まれたことになる。
以上のように、本発明は、これまで報告された人工塩基対ではまだ達成されていない選択的な塩基対の形成を提供するものである。そして、本発明は、このような選択的な塩基対の形成を、塩基の立体障害、好ましくは立体障害及び静電的な反発並びにスタッキング作用を利用することによって実現できることを明らかにするものである。前記の各種の実験に使用した塩基は、本発明を例示するものであり、そして選択的な人工の塩基対を形成させるために必要な前記した本発明の考え方が正しいことを実証するものである。したがって、本発明は前記で例示した具体的な塩基に限定されるものではなく、本発明の考え方に基づいて生成される塩基対を全て包含できるものである。
さらに本発明の塩基対は天然の合成酵素類に認識され得るものであることも前記で示したように実証され、天然のＤＮＡやＲＮＡなどの合成、転写などの系において天然のものと同様に核酸の複製、転写などがおこなわれ得るものであるものである。したがって、本発明は、天然の遺伝子の機能発現のシステムにおいて、そのまま適用可能な新規な人工塩基対を形成させるためのコンセプトを提供するものであり、本発明の塩基を用いタンパク質合成システムあるいは機能性核酸にこのような人工核酸塩基対を適用できることが示され、天然の遺伝子のシステムに応用できるだけでなく、天然の遺伝子のシステムの機能や作用の解明のために応用することも可能である。
実施例
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例１：２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−［［（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシ］ホスフィノ］−２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシノル］プリン（２−Ｂｅｎｚａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−９−［５’−Ｏ−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−３’−Ｏ−［［（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｏ］−２’−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ｐｕｒｉｎｅ）（１０）の合成（第３図参照）
（Ａ）２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２）の合成
２−アミノ−６−クロロ−９−（２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１）（Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｕｚｎａｎｓｋｉ，Ｃａｎ．Ｊ．ｃｈｅｍ．，５９，２６０１−２６０７（１９８１）．）（１８．６ｍｍｏｌ，７．９６ｇ）を、無水ピリジンで３回共沸脱水後、無水ピリジン（１８０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌したところへ、ジメチルアミン塩酸塩（５５．８ｍｍｏｌ，４．５５ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（７４．４ｍｍｏｌ，１２．９ｍｌ）を加え、室温で１５時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に水を加え、減圧濃縮する。残査にクロロホルムを加え、有機層を水で３回、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、水で１回、１０％クエン酸水溶液で２回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮した。残査がピリジン臭がしなくなるまでトルエンで共沸した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（２）を５．４２ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）（６７％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．５６（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），６．０２（ｄ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝５．０Ｈｚ），５．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２’．Ｊ＝５．０Ｈｚ），５．７９（ｔ，１Ｈ，Ｈ３’，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．６９（ｓ，２Ｈ，２−ＮＨ２），４．４２−４．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．３４−４．４０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．４３（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．１３，２．１０，２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）．
（Ｂ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（３）の合成
前記（Ａ）で得た化合物（２）（１０ｍｍｏｌ，４．３６ｇ）を無水ピリジンで３回共沸脱水後、無水ピリジン（１８０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌したところへ、塩化ベンゾイル（１５ｍｍｏｌ，１．７４ｍｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に水を加え、減圧濃縮する。残査にクロロホルムを加え、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、水で１回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮した。残査がピリジン臭がしなくなるまでトルエンで共沸した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−ジクロロメタン）で精製し、目的物（３）を３．５３ｇ（６．５３ｍｍｏｌ）（６５％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．４６（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．９６（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝１０．０  Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４８（ｔ，２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５），６．０８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝３．０Ｈｚ），５．９６−６．０１（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’．Ｈ３’），４．３９−４．５０（ｍ，３Ｈ，Ｈ４’，Ｈ５’，Ｈ５”），３．４８（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．１５（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１０（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）．
（Ｃ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（４）の合成
前記（Ｂ）で得た化合物（３）（６．５３ｍｍｏｌ，３．５３ｇ）にピリジン−メタノール−水（６５：３０：５）５０ｍｌを加え、氷浴中で撹拌したところへ、２Ｍ水酸化ナトリウム−ピリジン−メタノール−水（６５：３０：５）溶液５０ｍｌを加え、氷浴中で１５分間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に塩化アンモニウム（５．２１ｇ）を加え４０ｍｌになるまで減圧濃縮した。その溶液にクロロホルムを加え、有機層を抽出し、水層をクロロホルム−ピリジンで２回抽出した後、有機層を集め硫酸マグネシウムで乾燥した。濾液を１０ｍｌになるまで減圧濃縮し、そこにトルエンを加え減圧濃縮すると結晶が析出した。結晶を濾取し、減圧下９０℃で乾燥し、目的物（４）を２．８７ｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．２８（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．９２（ｄｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４９（ｔ，２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５），５．９１（ｄ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．４８（ｄ，１Ｈ，ＯＨ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．１５（ｄ，１Ｈ，ＯＨ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．０４（ｔ，１Ｈ，ＯＨ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），４．５６（ｔ，１Ｈ，Ｈ２’，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｈ３’，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．９３（ｄ，３Ｈ，Ｈ４’，Ｊ＝３．５Ｈｚ），３．６３−３．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’），３．５２−３．５６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５”），３．４８（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３）．
（Ｄ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５）の合成
前記（Ｃ）で得た化合物（４）（５．０ｍｍｏｌ，２．０７ｇ）を無水ピリジンで３回共沸脱水した後、無水ピリジン（５０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（５．５ｍｍｏｌ，１．７６ｍｌ）を加え室温で１４時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に水を加え、減圧濃縮する。残査にクロロホルムを加え、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮した。残査がピリジン臭がしなくなるまでトルエンで共沸した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（５）を２．６３ｇ（４．０ｍｍｏｌ）（８０％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．２２（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．８０（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４８（ｔ，２Ｈ，Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．９１（ｓ，１Ｈ，Ｈ１’），４．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ３’，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｈ２’，Ｊ＝５．５Ｈｚ），４．０７−４．２０（ｍ，２Ｈ，Ｈ４’，Ｈ５’），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｈ５”，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），３．４８（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），０．９５−１．０８（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｅ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（６）の合成
前記（Ｄ）で得た化合物（５）（３．９８ｍｍｏｌ，２．６１ｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水した後、無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら１−メチルイミダゾール（７．９６ｍｍｏｌ，０．６４ｍｌ）とクロロチオ炭酸フェニル（５．５７ｍｍｏｌ，０．７７ｍｌ）を加え室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。有機層を抽出後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、水で１回、１０％クエン酸水溶液で２回、水で１回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（６）を２．９６ｇ（３．７３ｍｍｏｌ）（９４％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．１７（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．８７（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝３．０  Ｈｚ），７．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．５５（ｔ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４７（ｔ，２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４１（ｄ，２Ｈ，ＰｈＯ−ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２９（ｔ，２Ｈ，ＰｈＯ−ｍ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，ＰｈＯ−ｐ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），６．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ２’，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．１１（ｓ，１Ｈ，Ｈ１’），５．１４−５．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．２３−４．２６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’），４．０７−４．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’，Ｈ５”），３．４８（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），０．９９−１．１５（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｆ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’−デオキシ−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（７）の合成
前記（Ｅ）で得た化合物（６）（３．７３ｍｍｏｌ，２．９６ｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水した後、無水トルエン（８８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（０．７４６ｍｍｏｌ，１２２ｍｇ）を加え、室温下アルゴンガスを１時間バブリングさせる。そこに、水素化トリブチルスズ（５．６０ｍｍｏｌ，１．５１ｍｌ）を加え７５℃で３．５時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液を減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（７）を２．２７ｇ（３．５５ｍｍｏｌ）（９５％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．８３（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．５４（ｔ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４８（ｔ，２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝７．５Ｈｚ），４．８０−４．８３（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），３．９７−４．０７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．８６−３．８８（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．５０（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．６８−２．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），２．５９−２．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ２”），１．０３−１．０９（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｇ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（８）の合成
前記（Ｆ）で得た化合物（７）（３．５５ｍｍｏｌ，２．２７ｇ）を１Ｍテトラブチルアンモニウムフロライド−テトラヒドロフラン溶液（１４ｍｌ）に加え、室温で１５分間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液を減圧濃縮した。残査をクロロホルムに溶解し、少量の水で洗った後、水層をクロロホルムで４回抽出し、有機層を集めて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾液を減圧濃縮し、トルエンでピリジン臭のしなくなるまで共沸を繰り返し、残査をメタノールに溶解した。そこに少しずつジクロロメタンを加え結晶化させた。結晶を濾取し、減圧下乾燥し、目的物（８）を０．９６４ｇ（２．４２ｍｍｏｌ）（６８％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．２３（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．８４（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．５０（ｔ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４２（ｔ，２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．２５（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．２１（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．８９（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．３３（ｓ，１Ｈ，Ｈ３’），３．７７（ｓ，１Ｈ，Ｈ４’），３．５０−３．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’），３．４３−３．４６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５”），３．４８（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．５６−２．６１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），２．１６−２．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２”）．
（Ｈ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（９）の合成
前記の（Ｇ）で得た化合物（８）（１．４７ｍｍｏｌ，０．５８５ｇ）を無水ピリジンで３回共沸脱水した後、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（１．６１ｍｍｏｌ，５４７ｍｇ）を加え室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に水を加え、減圧濃縮する。残査にクロロホルムを加え、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、水で１回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮する。残査がピリジン臭がしなくなるまでトルエンで共沸した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール  ０．５％トリエチルアミン）で精製し、目的物（９）を０．９９ｇ（１．４１ｍｍｏｌ）（９６％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．１６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．２０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．７７（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ，Ｊ＝１．４Ｈｚ），７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｂｚ−ｐ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），７．１４−７．５１（ｍ，１１Ｈ，ＨＢｚ−ｏ，ＤＭＴｒ），６．７２（ｄｄ，４Ｈ，ＤＭＴｒ），６．４５（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．７８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．７４（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．５０（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），３．３９−３．４７（ｍ，１Ｈ，−Ｈ５’），３．３０−３．３３（ｍ，１Ｈ，Ｈ５”），２．８０−２．８５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’，Ｈ２”）．
（Ｉ）２−ベンズアミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−９−［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−［［（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシ］ホスフィノ］−２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（１０）の合成
前記（Ｈ）で得た化合物（９）（０．８６４ｍｍｏｌ，０．６０５ｇ）を無水ピリジンで３回、無水テトラヒドロフランで２回共沸脱水した後、無水テトラヒドロフラン（６ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながらＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５９ｍｍｏｌ，０．４５２ｍｌ）とクロロ−２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスフィン（１．７３ｍｍｏｌ，０．３８５ｍｌ）を加え室温で２時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に無水メタノールを加え、反応を停止した。反応液にに酢酸エチルを加え、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で１回飽和食塩水で３回洗った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール  ２％トリエチルアミン）で精製した後、少量のクロロホルムに溶解し、ヘキサンで再沈殿を行い、目的物（１０）を０．５７４ｇ（０．６３８ｍｍｏｌ）（７４％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．１６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．１４（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．１３（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），７．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨＢｚ），７．６５−７．７０（ｍ，２Ｈ，Ｂｚ−ｍ），７．１６−７．４７（ｍ，１２Ｈ，Ｈ  Ｂｚ−ｐ，ｏ，ＤＭＴｒ），６．７０−６．７５（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴｒ），６．２７−６．４１（ｍ，１Ｈ，Ｈ１’），４．６３−４．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．２０−４．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．７４（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．２４−３．７２（ｍ，１０Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”，ＮＣＨ（ＣＨ３）２，Ｎ−ＣＨ３），２．８３−３．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），２．４０−２．６４（ｍ，５Ｈ，Ｈ２”，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ），１．０６−１．１９（ｍ，１２Ｈ，ＮＣＨ（ＣＨ３）２．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０９．３６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１４９．２５．
実施例２：２−イソブチリルアミノ−６−（２−チエニル）−９−［２−デオキシ−３−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）］ホスフィノ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（２２）の合成法（合成経路を第５図に示す。）
（Ａ）  ２−イソブチリルアミノ−６−ヨード−９−（２−デオキシ−３，５−      ジ−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１８）の合成  ２−イソブチリルアミノ−６−アミノ−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１７）（Ｂａｂａｒａ  Ｌ．Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｌｕｉｓ  Ａ．Ｍａｒｋｙ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒ  Ａ．Ｊｏｎｅｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４０，３−１３（１９８４））２．３８ｇ（５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で６０℃に加熱し、ｎ−ｐｅｎｔｙｌｎｉｔｒｉｔｅ  １３．５ｍｌ（０．１０ｍｏｌ）とジョードメタン２５ｍｌ（０．３１ｍｏｌ）を素早く加え懸濁した。この混合物を６０℃でよく攪拌しながら２００Ｗハロゲンタングステンランプにより光源距離２ｃｍで可視光を３時間外部照射した。反応溶液に３０ｍｌの飽和亜硫酸ナトリウム水溶液を加え室温で３時間攪拌した。その後１２０ｍｌの飽和亜硫酸ナトリウム水溶液と１５０ｍｌのクロロホルムを加え分液した。水相をクロロホルムでさらに２回抽出した。得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。残査をショートカラム（展開溶媒  酢酸エチル：ジクロロメタン＝１：４）で精製し目的物（１８）を１．０１ｇ（１．７２ｍｍｏｌ）（３４．４％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０  Ｍ  Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．１９（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｂｓ，１Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．４，６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｍ，２Ｈ），４．３４（ｍ，１Ｈ），３．００（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｍ，３Ｈ），１．１７（ｍ，１８Ｈ）．
（Ｂ）  ２−イソブチリルアミノ−６−（２−チエニル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１９）の合成
前記（Ａ）で得た（１８）２９４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で８０ｍｌのチオフェンに溶解し、ファイレックス製光反応容器に移した。アルゴン気流下、４００Ｗ水銀ランプ紫外線を２４時間照射した。照射後の反応溶液を濃縮し、残査をショートカラム（展開溶媒  イソプロパノール：ジクロロメタン＝３：１９７）で精製し目的物（１９）を２１２ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）（７８．０％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０Ｍ  Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６３（ｄｄ，Ｊ＝３．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｂｓ，１Ｈ），７．６４（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．４７（ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．８Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｍ，１Ｈ），３．００（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｍ，３Ｈ），１．２４（ｍ，１８Ｈ）．
（Ｃ）  ２−イソブチリルアミノ−６−（２−チエニル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２０）の合成
前記（Ｂ）で得た（１９）２１２ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）を氷冷下１Ｍ水酸化ナトリウム（ピリジン：メタノール：水＝１３：６：１）１．９５ｍｌに溶解し、１５分間攪拌した。反応溶液に５％塩化アンモニウム水溶液を加え中和した。１．２ｇのセライトを加え減圧下完全に溶媒を除いた。残査をショートカラム（展開溶媒  ５〜７％エタノール−ジクロロメタン）で精製し目的物（２０）を１４７ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）（９３．６％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０Ｍ  Ｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．４５（ｂｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝４．６，３．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９１（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．３３（ｍ，１Ｈ），１．１１（ｍ  ６Ｈ）．
（Ｄ）  ２−イソブチリルアミノ−６−（２−チエニル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（２１）の合成
前記（Ｃ）で得た（２０）９８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を１ｍｌの無水ピリジンで３回共沸した。残査を２ｍｌの無水ピリジンに溶解し、トリエチルアミン３５ｍｌ、ジメチルアミノピリジン１．４ｍｇそして塩化ジメトキシトリチル８５ｍｇを加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液に２５ｍｌの酢酸エチルを加え２５ｍｌの水で３回分液し、有機相を得た。各々の水相を酢酸エチルで洗った。有機相を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。残査をショートカラム（展開溶媒  ２５〜５０％酢酸エチル−ジクロロメタン）で  精製し目的物（２１）１３２ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）（７６．７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０Ｍ  Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６４（ｄｄ，Ｊ＝３．６，０．９Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｂｓ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝４．３，０．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，８Ｈ），６．７７（ｍ，４Ｈ），６．４７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｄｄ，Ｊ＝１０．２３，５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｄｄ，Ｊ＝１０．２３，４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｍ，１Ｈ），１．２７（ｍ，６Ｈ）．
（Ｅ）  ２−イソブチリルアミノ−６−（２−チエニル）−９−［２−デオキシ−３−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）］ホスフィノ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（２２）の合成
前記（Ｄ）で得た（２１）１２５ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌの無水ピリジンで３回共沸し、０．５ｍｌの無水テトラヒドロフランで３回共沸した。残査をアルゴン雰囲気下１．２ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４６ｍｌ、そして塩化（２−シアノエトキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン５９ｍｌを加え、室温で１時間攪拌したのち５０ｍｌのメタノールで未反応の塩化物を分解した。反応溶液に２５ｍｌの３％トリエチルアミン含有酢酸エチルを加え２５ｍｌの水で３回分液し、有機相を得た。各々の水相を３％トリエチルアミン含有酢酸エチルで洗った。有機相を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。残査をショートカラム（展開溶媒  ３％トリエチルアミン−３２％酢酸エチル−６５％ヘキサン）で精製し、目的物（２２）１３９ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）（９２．２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０Ｍ  Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６４（ｍ，１Ｈ），８．１６（ｍ，１Ｈ），７．８６（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，８Ｈ），６．７８（ｍ，４Ｈ），６．４５（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．２３（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，６Ｈ），３．７０（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｍ，１Ｈ），２．４８（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｍ，１８Ｈ）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（２７０Ｍ  Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）：１４９．５１，１４８．４３ｐｐｍ．
実施例３：３−（２’−デオキシ−５’−Ｏ−トリホスホリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（ｄＹＴＰ）（１６）の合成（第４図参照）
（Ａ）３−（３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（１２）の合成
３−（β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（１１）（Ｊ．Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ａｎｄ  Ｌ．Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３８，２０３−２０６（１９９７）．）（２．２９ｍｍｏｌ，５２０ｍｇ）を、無水ピリジンで３回共沸脱水後、無水ピリジン（２３ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（２．５２ｍｍｏｌ，０．８１ｍｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に水を加えて反応を止めた後、減圧濃縮した。残査をクロロホルムに溶解し、有機層を５％炭酸水索ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾液を減圧下濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（１２）を４４２ｍｇ（０．９４ｍｍｏｌ）（４１％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．０６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１３．０７（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｈ４，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３７（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，Ｊ＝４．６Ｈｚ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｈ５，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．０７（ｓ，１Ｈ，Ｈ１’），４．０１−４．３０（ｍ，５Ｈ，Ｈ２’，Ｈ３’，Ｈ４’，Ｈ５’，Ｈ５”），０．８３−１．１０（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｂ）３−（２’−Ｏ−イミダゾチオカルボニル−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン  （１３）の合成
前記（Ａ）で得た化合物（１２）（０．９４ｍｍｏｌ，４４２ｍｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水後、無水ＤＭＦ（９ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら、チオカルボニルイミダゾライド（２．２４ｍｍｏｌ，４０１ｍｇ）を加え、室温で７時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に酢酸エチルを加え、有機層を水で２回洗った後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾液を減圧下濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（１３）を４３４ｍｇ（０．７４９ｍｍｏｌ）（８０％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．０６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１３．４０（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），８．４４（ｓ，１Ｈ，ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ），７．８４（ｄ，１Ｈ，Ｈ４，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．７３（ｓ，１Ｈ，ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ），７．３３（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，Ｊ＝６．５Ｈｚ），７．０７（ｓ，１Ｈ，ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ），６．３４（ｔ，１Ｈ，Ｈ５，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｈ２’，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．２５（ｓ，１Ｈ，Ｈ１’），４．４６−４．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．２５−４．２９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’），４．０３−４．０９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４’，Ｈ５”），０．８７−１．０９（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｃ）３−（２’−デオキシ−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピルジシロキサニル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（１４）の合成
前記（Ｂ）で得た化合物（１３）（０．７４９ｍｍｏｌ，４３４ｍｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水後、硫酸アンモニウム（８．４ｍｇ）を加え、ヘキサメチルジシラザン（１２．６ｍｌ）に溶解し、１時間還流した。反応液を減圧濃縮後、無水トルエンで３回共沸脱水し、アゾビスイソブチロニトリル（８３．５ｍｇ）を加え、無水トルエン（１６．８ｍｌ）に溶解した。そこに、水素化トリブチルスズ（０．８２１ｍｌ）を加え１時間還流した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液を減圧下濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）で精製し、目的物（１４）を０．２６８ｇ（０．５９１ｍｍｏｌ）（７９％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．０６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１３．０７（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），７．７２（ｄ，１Ｈ，Ｈ４，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，Ｊ＝６．５  Ｈｚ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｈ５，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．２０−５，２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ１’），４．３７−４．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），３．９７−４．１２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．８０−３．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），２．２６−２．３６（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），１．７７−１．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ２”），０．９０−１．０９（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）．
（Ｄ）３−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（１５）の合成
前記（Ｃ）で得た化合物（１４）（０．０８９ｍｍｏｌ，４２ｍｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水後、１Ｍテトラメチルアンモニウムフルオライド／ＴＨＦ溶液（０．５ｍｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応液に酢酸（０．０８ｍｌ）を加え、減圧濃縮した。残査を水に溶解し、酢酸エチルで３回洗った後、水層を減圧濃縮した。残査を逆相シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的物（１５）を１０．４ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）（５２％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．０６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：７．７７（ｄ，１Ｈ，Ｈ４，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，Ｊ＝３．５Ｈｚ），６．４１（ｔ，１Ｈ，Ｈ５，Ｊ＝３．６Ｈｚ），５．０１−５，１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ１’），４．２９−４．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），３．９３−３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．６２−３．７０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”），２．３１−２．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），１．８９−１．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２”）．
（Ｅ）３−（２’−デオキシ−５’−Ｏ−トリホスホリル−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン−２−オン（１６）の合成
前記（Ｄ）で得た化合物（１５）（０．０５９ｍｍｏｌ，１３．４ｍｇ）を無水トルエンで３回共沸脱水後、リン酸トリメチル（０．２ｍｌ）に溶解し、氷冷下オキシ塩化リン（０．０６５ｍｍｏｌ，７．１μｌ）を加え、氷冷下７時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完結を確認した後、反応溶液に０．５Ｍ  ビストリブチルアンモニウムピロホスフェイト（ｂｉｓｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−ＤＭＦ溶液とトリブチルアミン（７０．２μｌ）をよく撹拌した混合溶液を素早く加え、氷冷下３０分間よく撹拌した。反応溶液に１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）（０．３５ｍｌ）を加えて反応を停止し、減圧濃縮した。残差を水に溶かし、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５  カラムクロマトグラフィー（１５×３００ｍｍ）にのせ、５０ｍＭ−１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムのグラジエントで溶出し、０．５３−０．５９Ｍで溶出された画分を分取し、凍結乾燥した。
ＭＳ（ＥＳＩ−）、１Ｈ−ＮＭＲおよび３１Ｐ−ＮＭＲにより構造を確認した後、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗｘ８カラムクロマトグラフィーによりナトリウム塩にした。
ＭＳ（ＥＳＩ−）：（Ｍ−Ｈ−）４４９．９．
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０．０６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｈ４，Ｊ＝４．９Ｈｚ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，Ｊ＝４．９Ｈｚ），６．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ５，Ｊ＝４．９Ｈｚ），５．１７（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．５６（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ３’），４．０６（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４’），３．９９（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ５’，Ｈ５”），２．１９−２．３３（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），１．８１−１．９８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２”）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（１０９．３６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：−１０．３（ｍ，２Ｐ，Ｐ１，Ｐ３），−２２．７（ｍ，１Ｐ，Ｐ２）．
ＵＶ（１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０）：λｍａｘ＝２９８ｎｍ（ε＝７．６ｘ１０３），２２６ｎｍ（ε＝７．０ｘ１０３），λｍｉｎ＝２４７ｎｍ，２１１ｎｍ．
実施例４：プライマー及びテンプレートの合成
パーキンエルマー社アップライドバイオシステムズ事業部のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機３９２型により、同事業部より販売されている、ｄＡ，  ｄＣ，  ｄＧ，Ｔの各シアノエチルアミダイト試薬と上記の方法で合成したｄＸのシアノエチルアミダイト試薬を用いて、常法に従って、以下に示すプライマーおよびテンプレートを合成した。
ただし、ｄＸを含むオリゴマーの合成においては、ｄＸのアミノ基の保護基であるベンゾイル基の除去が常法の濃アンモニア中５５℃、一夜の条件では、完全に除去できなかったので、濃アンモニア中８０℃、１０時間処理することにより、完全に除去した。
0003893057.tif 000019
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実施例５：プライマーの５’−３２Ｐ標識
０．５ｍｌのチューブにプライマー１−４（ｃａ．１ｎｍｏｌ）、１０ｘポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ）バッファー（ＴＡＫＡＲＡ）２μｌ、［γ−３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（ｃａ．１．１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）２μｌ、およびポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕｎｉｔ／μｌ，ＴＡＫＡＲＡ）２μｌを加え、全量２０μｌで、３７℃、４０分間インキュベートした。そこに、１０Ｍ尿素ＢＰＢダイ（ｄｙｅ）１０μｌを加えて反応を停止し、７５℃、５分間加熱した後、２０％ポリアクリルアミド  ７Ｍ尿素ゲル電気泳動（１０×１０ｃｍ）をした。ＵＶ（２５４ｎｍ）でメインバンドを切り出し、１．５ｍｌチューブに移し滅菌水を４５０μｌを加えて、３７℃、１２時間撹拌した。軽く遠心した上清を別のチューブに移し、グリコーゲン１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム４０μｌおよびエタノール１ｍｌを加え、よく撹拌した後、−３０℃で１時間放置した。−５℃、１３，０００ｒｐｍで１時間遠心した後、沈殿を７０％エタノールでリンスし、遠心エバポレーターで３０分間乾燥した。そこに、滅菌水４０μｌを加え、７５℃で５分間加熱した後、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量した。
実施例６：クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いたシングルヌクレオチド挿入反応とプライマー伸長反応
０．５ｍｌのチューブに５’−３２Ｐラベルしたプライマー、テンプレートおよび１０ｘクレノウフラグメントバッファー（ＴＡＫＡＲＡ）１μｌを加え全量を７μｌにして、９５℃で３分間、４０℃で３分間、４℃で７分間アニーリングした後、ｄＮＴＰ１μｌ、クレノウフラグメント（１ｕｎｉｔ／ｍｌ，Ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＴＡＫＡＲＡ）２μｌを加え、全量を１０μｌにして、１７℃で所定の時間インキュベートした。そこに、１０Ｍ尿素ＢＰＢダイ（ｄｙｅ）５μｌを加えて反応を停止し、７５℃、５分間加熱した後、２０％ポリアクリルアミド  ７Ｍ尿素ゲル電気泳動をした。それを、イメージングプレート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて分析した。
結果を第６図、第７図、第９図に示す。シングルヌクレオチド挿入反応を第７図に、プライマー伸長反応を第６図、第９図にそれぞれ示す。
実施例７：クレノウフラグメントを用いたプライマー伸長反応の阻害実験
０．５ｍｌのチューブにプライマー、テンプレートおよび１０ｘクレノウフラグメントバッファー（ＴＡＫＡＲＡ）１μｌを加え全量を７μｌにして、９５℃で３分間、４０℃で３分間、４℃で７分間アニーリングした後、［α−３２Ｐ］ＴＴＰあるいは［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびｄＹＴＰをそれぞれの終濃度になるように加え、クレノウフラグメント（１ｕｎｉｔ／ｍｌ，Ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＴＡＫＡＲＡ）２μｌを加え、全量１０μｌにして、１７℃で所定の時間インキュベートした。そこに、１０Ｍ尿素ＢＰＢダイ（ｄｙｅ）５μｌを加えて反応を停止し、７５℃、５分間加熱した後、２０％ポリアクリルアミド  ７Ｍ尿素ゲル電気泳動をした。それを、イメージングプレート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて分析した。
結果を第８図に示す。
実施例８：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応
プロモーター領域を二本鎖化した１μＭの鋳型ＤＮＡと２．５ｕｎｉｔｓのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、２ｍＭｒＮＴＰ−０．１μＣｉ／μｌの［α−３２Ｐ］ｒＡＴＰを含む溶液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．０），８ｍＭ  ＭｇＣｌ２．２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，５ｍＭ  ＤＴＴ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍＭ  ｒＧＭＰ，）に加え、３時間インキュベートした。反応後、これに１０Ｍ尿素を含む色素を加え、７５℃で３分間加熱し、２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、生成物を分析した。
結果を第１０図に示す。
実施例９：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応
実施例８と同様の反応を行い、生成したＲＮＡをゲル電気泳動で単離し、０．７５ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｅ  Ｔ２でＲＮＡを分解し、それぞれのヌクレオチドを二次元ＴＬＣで分離し、それぞれの比を求めた。
結果を第１１図に示す。また、先の表１にそれぞれのヌクレオチドの組成比を示す。
実施例１０：Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）を用いた１ヌクレオチド挿入反応
［５’−３２Ｐ］ラベルしたプライマーＤＮＡ（２０−ｍｅｒ，４ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ，４ｍＭ）および２ｘ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント用緩衝液（ＴＡＫＡＲＡ）を含む溶液を、９５℃３分間、４０℃３分間、４℃７分間アニーリングした後、これに等量の４０ｍＭ  ｄＮＴＰとＫｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ＋）（２ｕｎｉｔｓ，Ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＴＡＫＡＲＡ）の溶液を加え、３７℃で３０分インキュベートした。これに等量の１０Ｍ  ｕｒｅａ−ＢＰＢ  ｄｙｅ溶液を加えて、７５℃で５分間加熱した後、２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動を行った。Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｅｒプレートを用いて生成物の分析を行った。結果を第１２図に示す。
実施例１１：Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応
プロモーター領域を二本鎖化した１ｍＭの鋳型ＤＮＡ、２．５ｕｎｉｔｓのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２ｍＭ  ｒＮＴＰ、０．１ｍＣｉ／ｍｌの［α−３２Ｐ］ｒＡＴＰを含む溶液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ｒＧＭＰ）を調製し、３時間インキュベートした。これに１０Ｍ尿素を含む色素溶液を加え、７５℃で３分間加熱し反応を停止した。この溶液中の生成物のＲＮＡ（１６−ｍｅｒ）を２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。このＲＮＡを０．７５ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｅ  Ｔ２で分解し、２次元ＴＬＣ（セルロース樹脂）により、それぞれのヌクレオチドの比を求めた。第１３図にそのＴＬＣの展開図を示す。また、先の表２にそれぞれのヌクレオチドの組成比を示す。
実施例１２：塩基Ｘ２を含有するプライマー及びテンプレートの合成
パーキンエルマー社アップライドバイオシステムズ事業部のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機３９２型により、同事業部より販売されている、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、Ｔの各シアノエチルアミダイト試薬と実施例１の方法に準じて合成した  ｄｘ２のシアノエチルアミダイト試薬を用いて、常法に従って、プライマー及びテンプレートを合成した。
ただし、ここで用いたｄｘ２の２−アミノ基の保護基のイソブチリル基は、オリゴマー合成後の通常の塩基性条件下（５５℃、１０時間の濃アンモニア水処理）での脱保護法では完全に除去できなかったので、８０℃、１０時間の濃アンモニア水処理を行った。
産業上の利用可能性
本発明は、これまで報告された人工塩基対ではまだ達成されていない選択的な塩基対形成が立体障害、及び静電的な反発並びにスタッキング作用を利用することによって実現可能であることを示したものである。本発明の方法により、核酸の複製、転写、および、これを用いてタンパク質合成システムあるいは機能性核酸にこのような人工核酸塩基対を適用できる。例えば、本発明の人工塩基対を用いることにより、天然の４種類の塩基で行われているインビトロセレクション法を６種類の塩基で行うことができ、４種類の塩基では実現できない新しい機能をもつ核酸分子の創製や、さらに遺伝子の１個又は２個以上の塩基が他の塩基になっているために発現する遺伝病の治療に、本発明の新しい塩基対を利用することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の立体障害を利用新規人工核酸塩基対（Ｘ−Ｙ）を示すものである。第１図中のＲは、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル基を示す。
第２図は、立体障害による塩基対（第２図ａ及びｂ）と、立体障害、静電的な反発及びスタッキング作用を利用した新規人工核酸塩基対（Ｘ２−Ｙ）を示すものである。
第３図は、本発明の塩基Ｘを有する核酸のｄＸのアミダイト試薬の合成スキームを示すものである。
第４図は、本発明の塩基Ｙを有する核酸のｄＹＴＰの合成スキームを示すものである。
第５図は、本発明の塩基Ｘ２を有する核酸のｄｘ２のアミダイト試薬の合成スキームを示すものである。
第６図は、５’末端を３２Ｐラベルしたプライマー１（０．５μＭ）及びテンプレート１、３（１μＭ）と種々のｄＮＴＰ（１５０μＭ）を用いたクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応を２０％ポリアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル電気泳動によって示すものである。反応は１７℃で３０分間行った。
第７図は、５’末端を３２Ｐラベルしたプライマー２（１μＭ）及びテンプレート１、２、３（２μＭ）とｄＮＴＰ（１５０μＭ）を用いたクレノウフラグメントによるシングルヌクレオチド挿入反応を示すものである。反応は１７℃で３０分間行った。Ａは２０％ポリアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル電気泳動の図であり、Ｂはその結果をグラフにしたものである。
第８図は、プライマー２及びテンプレート１、２、３と［α−３２Ｐ］ＴＴＰあるいは［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いたクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応のｄＹＴＰによる阻害実験を示すものである。
Ａは、プライマー２（１μＭ）及びテンプレート３（２μＭ）と［α−３２Ｐ］ＴＴＰ（１５０μＭ）を用い、ｄＹＴＰをそれぞれ、０、５０、１５０、３００及び５００μＭ加えてクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応を１７℃で３０分間行った。右の５レーンは、そこに、ｄＡＴＰ（３００μＭ）を加えて同様の反応を行ったものである。
Ｂは、プライマー２（１μＭ）及びテンプレート１（２μＭ）と［α−３２Ｐ］ＴＴＰ（５０μＭ）を用い、ｄＹＴＰをそれぞれ、０、２０、１００、５００及び１０００μＭ加えてクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応を１７℃で１０分間行った。右の５レーンは、そこに、ｄＡＴＰ（３００μＭ）を加えて同様の反応を行ったものである。
Ｃは、プライマー２（１μＭ）及びテンプレート２（２μＭ）と［α−３２Ｐ］ＣＴＰ（５０μＭ）を用い、ｄＹＴＰをそれぞれ、０、２０、１００、５００及び１０００μＭ加えてクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応を１７℃で３０分間行った。右の５レーンは、そこに、ｄＡＴＰ（３００μＭ）を加えて同様の反応を行ったものである。
第９図は、５’末端を３２Ｐラベルしたプライマー３（０．３３μＭ）及びテンプレート４、５、６、７、８、９（１μＭ）と種々のｄＮＴＰ（１５０μＭ）を用いたクレノウフラグメントによるプライマー伸長反応を示すものである。反応は１７℃で６０分間行った。
第１０図は、テンプレート１−３と［α−３２Ｐ］ｒＡＴＰならびに種々のｒＮＴＰｓを用いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によって生成したＲＮＡを電気泳動で調べた結果である。
第１１図は、すべてのｒＮＴＰを共存させて第１０図と同様の転写を行い、生成したＲＮＡを電気泳動で精製し、これをＲＮａｓｅＴ２によりヌクレオチドに完全分解し、その産物を二次元ＴＬＣで解析した結果である。
第１２図は、本発明のＸ２塩基に対する各種の塩基の取り込み結果を示す、図面に代わる写真である。
第１３図は、Ｘ２塩基を含有するテンプレートを用いて、すべてのｒＮＴＰを共存させたときに生成したＲＮＡを電気泳動で精製し、これをＲＮａｓｅＴ２によりヌクレオチドに完全分解し、その産物を二次元ＴＬＣで解析した結果を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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