【手続補正書】
【提出日】平成28年8月22日(2016.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一の特定細胞型の細胞、並びに少なくとも一の混同される細胞型の細胞を含む微視的な多細胞組織試料において複数の細胞型を可視化する方法であって、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞及び前記少なくとも一の混同される細胞型の細胞の両方が第２の細胞マーカーを含み、少なくとも一の混同される細胞型の細胞は少なくとも一の特定細胞型には存在しない第１の細胞マーカーも含み、
ａ）少なくとも一の混同される細胞型の細胞、並びに少なくとも一の特定細胞型の細胞を含むことが判明している微視的な多細胞組織試料を提供する工程；
ｂ）工程ａ）の微視的な多細胞組織試料を、混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができるが、前記少なくとも一の特定細胞型の細胞上の細胞マーカーには結合できない少なくとも一の抗体様リガンドの第１のカクテルを用いてインキュベートする工程であって、試料は、混同される細胞上の前記細胞マーカーと前記リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下で第１のカクテルを用いてインキュベートされ、その結果前記細胞の前記細胞マーカーと前記リガンドとの複合体が形成される工程；
ｃ）工程ｂ）で形成された複合体を、第１の検出酵素にコンジュゲートしている第１の検出抗体様リガンドの調製物を用いてインキュベートする工程であって、前記第１の検出抗体様リガンドは、前記第１のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、インキュベーションは、前記第１の検出抗体様リガンドと前記第１のカクテルの抗体様リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下で実行され、その結果前記第１の検出抗体様リガンドと工程ｂ）で形成された複合体との複合体が形成される工程；
ｄ）前記第１の検出酵素のための基質を含む第１の基質調製物を、工程ｃ）で形成された複合体に添加し、結果として得られる混合物を、検出可能なポリマーの形成に有利な条件下でインキュベートすることにより、前記微視的な多細胞組織試料の混同される細胞の内部又は近傍に検出可能な蓄積ポリマーを得る工程；
ｅ）前記特定細胞型上の細胞マーカーに特異的に結合することができる第１の一次抗体様リガンドの調整物を添加し、結果として得られる混合物を、前記細胞マーカーと前記一次抗体様リガンドとの複合体の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｆ）工程ｅ）の結果得られる混合物に、蛍光色素にコンジュゲートしている第１の二次抗体様リガンドであって、前記第１の一次抗体様リガンドに特異的に結合することができる第１の二次抗体様リガンドの調整物を添加し、結果として得られる混合物を、前記第１の一次抗体様リガンドと前記第１の二次抗体様リガンドとの特異結合の形成に有利な条件下でインキュベートする工程；
ｇ）未結合の二次抗体様リガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程；
ｈ）結合した一次及び二次抗体様リガンドの複合体を化学的に固定化する工程；
ｉ）結果として得られた試料の細胞を、少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループに曝す工程であって、前記少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物の前記グループの各調製物は、対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合することができ、且つ固有の蛍光シグナルを送出することができる固有の蛍光色素を有する工程；
ｊ）未結合の蛍光色素で標識されたリガンドを、例えば洗浄工程により除去する工程；並びに
ｋ）方法が進行する間に、前記少なくとも一の特定細胞型及び前記少なくとも一の混同される細胞型を、一又は複数の蛍光色素から得られる蛍光シグナルを検出することにより、及び前記少なくとも一の混同される細胞型の周囲に形成されたブロッキングポリマーを検出することにより、可視化する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルが第１のカクテルと一緒に使用され、第２のカクテルの抗体様リガンドは、前記第１のカクテルのリガンドよりも混同される細胞型の他の細胞マーカーに特定的に結合することができ、工程ｃ）において、第２の検出抗体様リガンドの調整物が使用され、第２の検出抗体様リガンドは第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、第２の検出酵素を有し、工程ｄ）において、前記第２の検出酵素のための基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍にさらなるポリマーが蓄積され、工程ｋ）において、前記さらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項１に記載の可視化する方法。
【請求項３】
工程ｃ）の後、且つ工程ｄ）の前に以下の工程：
１）工程ｃ）の結果得られる混合物を、前記第１のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができる抗体様リガンドの第２のカクテルを用いて、第２のカクテルのリガンドの前記他の細胞マーカーへの結合を可能にする条件下でインキュベートする工程；並びに
２）工程１）の結果得られる混合物を、第２のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合できる第２の検出抗体様リガンドであって、第２の検出酵素を有する第２の検出抗体様リガンドを用いてインキュベートする工程；
が実行され、
工程ｄ）において、前記第２の検出酵素のための基質を含む第２の基質調製物が添加され、その結果第２のカクテルに結合する混同される細胞の近傍にさらなるポリマーが蓄積され、工程ｋ）において、前記さらなるポリマーの蓄積が検出される、
請求項１に記載の可視化する方法。
【請求項４】
工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第３のカクテル、第３の検出抗体様リガンド、及び第３の検出酵素のための基質を含む第３の基質調製物を用いて反復され、第３のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１及び第２のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第３の検出抗体様リガンドは、第３のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第３の検出酵素を有し、前記第３の基質調製物は前記第３の検出酵素のための基質を含み、工程ｋ）においてさらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項３に記載の可視化する方法。
【請求項５】
工程１）及び２）が、抗体様リガンドの第４のカクテル、第４の検出抗体様リガンド、及び第４の検出酵素のための基質を含む第４の基質調製物を用いて反復され、第４のカクテルの前記抗体様リガンドは、前記第１、第２及び第３のカクテルより他の混同される細胞型の他の細胞マーカーに特異的に結合することができ、前記第４の検出抗体様リガンドは、第４のカクテルの抗体様リガンドに特異的に結合することができ、且つ第４の検出酵素を有し、前記第４の基質調製物は前記第４の検出酵素のための基質を含み、工程ｋ）においてさらなるポリマーの蓄積が検出される、請求項４に記載の可視化する方法。
【請求項６】
第１の基質調製物から形成される蓄積ポリマーの色は暗色及び／又は不透明であり、その後に形成される蓄積ポリマーの色は徐々に明度及び／又は透明度を上げる、請求項３から５のいずれか一項に記載の可視化する方法。
【請求項７】
工程ｅ）〜ｋ）に使用される抗体様リガンド調製物の複数の対は、各々が、複数の特定細胞型の中から対象となる一の特定細胞型を検出するために使用され、且つ
対象となる特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できるリガンドを含む特定の一次抗体様リガンド調製物と；
前記特定の一次抗体様リガンドに特異的に結合できるリガンドを含む特定の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンドが、固有の蛍光シグナルを送出することができる蛍光色素に共有結合している二次抗体様リガンド調製物と
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の可視化する方法。
【請求項８】
検出酵素が、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼといったペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）において添加される基質が、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ベタゾイドＤＡＢ、Ｄｅｅｐ  Ｓｐａｃｅ  Ｂｌａｃｋ、Ｂａｊｏｒａｎ  Ｐｕｒｐｌｅ、Ｗａｒｐ  Ｒｅｄ、Ｆｅｒａｎｇｉ  Ｂｌｕｅ、バルカンファーストレッド、及びＶｉｎａ  ｇｒｅｅｎからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光色素が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５といったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ蛍光色素の群；Ｃｙ２、Ｃｙ７、及びＣｙ７といったＣｙ蛍光色素；ＤｙＬｉｇｈｔ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ５５５、Ｄｙｌｉｇｈｔ７５０といったＤｙＬｉｇｈｔ蛍光色素；ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
可視化工程ｋ）は、試料の一又は複数の画像を取得することにより実行される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
取得された画像は既知の原理によりデジタル化され、複合画像に合成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
混同される細胞及び特定細胞型を表すマーカーを含む少なくとも４つの異なる細胞マーカー又は非細胞構造が検出され、好ましくは少なくとも５つの異なる細胞マーカーが検出される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための部品の入ったキットであって：
ａ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合することができる少なくとも一の抗体様リガンドのカクテル；
ｂ）前記カクテルの抗体様リガンドに結合できる検出抗体様リガンド調製物であって、調製物の抗体様リガンドが検出酵素に共有結合している検出抗体様リガンド調製物；
ｃ）検出抗体様リガンドの検出酵素により触媒される反応に参画させるのに適した基質調製物；
ｄ）特定細胞型の細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一の一次抗体様リガンド調製物；
ｅ）共有結合した蛍光色素を含む少なくとも一の二次抗体様リガンド調製物であって、二次抗体様リガンド調製物の抗体様リガンドは一次抗体様調製物の抗体様リガンドに特異的に結合する、二次抗体様リガンド調製物；
ｆ）ｄ）及びｅ）の調整物を試料に化学的に固定化するための調製物；並びに
ｇ）少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループであって、前記少なくとも一の蛍光色素で標識された抗体様リガンド調製物のグループの各調製物が、特定細胞型に関連付けられた固有の細胞マーカーに特異的に結合できる、抗体様リガンド調製物のグループ
を含むキット。
【請求項１５】
ｈ）混同される細胞上の細胞マーカーに特異的に結合できる少なくとも一の抗体様リガンドの第２のカクテルであって、少なくとも一のリガンドが、ａ）のカクテルが結合するものより他の細胞マーカーに結合する、第２のカクテル；並びに
ｉ）第２のカクテルの抗体様リガンドに結合できる第２の検出抗体様リガンド調製物であって、検出酵素がｂ）の調製物の酵素とは異なる、第２の検出抗体様リガンド調製物
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。