(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｊｉ細胞を板状体に塗抹して、この細胞を板状体上に固定するＥＢＮＡ抗原スライドの製造方法において、スライドとして用いる板状体におけるＲａｊｉ細胞の塗抹後、この板状体を室温に晒し、次いで、水性溶媒と接触させた後に、塗抹したＲａｊｉ細胞の固定化処理を行う、ウイルス抗原スライドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルスの測定手段に関する技術分野の発明であり、より具体的には、検体中の特定のウイルス抗体を測定し得る、ウイルス抗原スライドに関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
特定のウイルスの抗原をスライド上に固定した「ウイルス抗原スライド」は、このスライド上に固定したウイルス抗原と検体とを接触させて、その検体中の特定のウイルスに対する抗体を、このウイルス抗体と前記のスライド上に固定したウイルス抗原との抗原抗体反応により検出し、これにより検体中のウイルス抗体を測定し得る手段として用いられる、ウイルス抗体測定用品である。
【０００３】
このウイルス抗原スライドは、すでに実用化されており、ウイルス抗体検出試験の際に個別的に製造される他、市販もなされている。
このスライド上に固定するウイルス抗原の代表的なものとして、そのウイルス抗原を生産し得る特定の細胞が用いられている。この態様のウイルス抗原スライドにおいては、特定の細胞に発現するウイルス抗原と検体中のウイルス抗体との間の抗原抗体反応を検出することにより、検体中のウイルス抗体が測定され得るのである。
【０００４】
ウイルス抗原を発現し得る特定の細胞を固定したウイルス抗原スライドにより測定されるウイルスの代表的なものの一つとして、ＥＢ（Epstein-Barr）ウイルスを挙げることができる。このＥＢウイルスは、伝染性単核症の原因ウイルスであるが、このＥＢウイルスの核抗原であるＥＢＮＡ（EB virus-associated Nuclear Antigen)抗体は、伝染性単核症の急性期においては陰性で、回復期に入ってからは陽転するという特徴が知られている。そして、これが伝染性単核症の診断上の重要な指標となっている。
【０００５】
上記のＥＢＮＡを生産する細胞としては、例えば、Ｒａｊｉ細胞が知られており、このＲａｊｉ細胞を固定した、ＥＢＮＡ測定用のウイルス抗原スライドは、既に市販されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現在提供されているＲａｊｉ細胞等のＥＮＢＡ発現細胞を固定した、ＥＢＮＡ測定用のウイルス抗原スライドにおいても課題が存在しないわけではない。
【０００７】
すなわち、従来から用いられている、このＥＢＮＡ抗体測定用のウイルス抗原スライドは、製造方法における難点故に、ロット間差を解消することが困難であり、ＥＢＮＡ抗体を正確に測定することに対する障害になっている点は否めない。
【０００８】
そこで、本発明が解決すべき課題は、このような課題を克服した、ＥＢＮＡ測定用のウイルス抗原スライドを提供する手段を確立することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題の解決のために、上記のＲａｊｉ細胞のスライドへの固定方法について鋭意検討した。その結果、従来行われていない特定の条件を、Ｒａｊｉ細胞のスライドへの固定に際して施すことにより、この課題を解決し得ることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、Ｒａｊｉ細胞を板状体に塗抹して、この細胞を板状体上に固定するＥＢＮＡ抗原スライドの製造方法において、スライドとして用いる板状体におけるＲａｊｉ細胞の塗抹後、この板状体を室温に晒し、次いで、水性溶媒と接触させた後に、塗抹したＲａｊｉ細胞の固定化処理を行う、ウイルス抗原スライドの製造方法（以下、本発明製造方法という）を提供する発明である。
【００１１】
なお、本発明において、「スライドとして用いる板状体」とは、Ｒａｊｉ細胞を固定化する前提として塗抹する対象となる板状体であり、通常は、透明度の高いガラス板やプラスチック板等が用いられる。この板状体の典型的な態様は、いわゆるスライドグラスである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明製造方法において、スライドとして用いられる板状体上（以下、特に断わらない限り、板状体と記載する）に塗抹する、ＥＢＮＡ発現細胞であるＲａｊｉ細胞は、バーキットリンパ腫患者から培養樹立されたリンパ芽球様細胞株で、ＥＢＶ遺伝子を保有し、その細胞核内にＥＢＮＡを発現している細胞株である。このＲａｊｉ細胞は、また、ＥＢウイルス感染診断検査において、ＥＢＮＡ抗体測定に繁用されている。かかるＲａｊｉ細胞は、世界中の研究機関において継代維持されているが、市販もされており、容易に入手することができる細胞である。
【００１３】
Ｒａｊｉ細胞の板状体の塗抹は、通常公知の方法に従って行うことができる。
すなわち、継代培養を行って得た、継代Ｒａｊｉ細胞を洗浄後、Ｒａｊｉ細胞の細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液を板状体上に塗抹することにより、目的の塗抹を行うことができる。
【００１４】
次いで、板状体上に塗抹した細胞懸濁液を、室温に晒して、完全に乾燥させることが必要である。本発明製造方法において、この室温に晒す時間は、１時間以内であることが好ましい。
このようにして、室温に細胞懸濁液を塗抹した板状体を晒した後、この板状体に塗抹されたＲａｊｉ細胞と水性溶媒とを接触させる。ここで用いられる水性溶媒は、水を基礎とした溶媒であれば特に限定されるものではなく、ＰＢＳ（水で希釈率を調整することも可能）、ＢＳＳ（Balanced salt-solution：水で希釈率を調整することも可能）等が挙げられる。本発明においては、一定のｐＨ及びイオン強度を保つことが好ましいという理由から、特に水で希釈したＰＢＳを用いることが好適である。かかる場合のＰＢＳの希釈率は、概ね４倍〜５倍程度が好ましい。
【００１５】
このＲａｊｉ細胞と水性溶媒との接触時間は、３０秒程度であることが必要である。かかる接触時間が３０秒程度よりも長くても、短くても、後述する蛍光抗体補体法によるＥＮＢＡ抗体の測定において、蛍光染色性が低下し、例えば、蛍光顕微鏡像がリング状に光る等の不都合が生じる傾向が強くなり、好ましくない。
【００１６】
上記の処理を行った、Ｒａｊｉ細胞を塗抹した板状体に固定化処理を施して、所望するウイルス抗原スライドを製造することができる。
この固定化処理は、公知の固定化処理方法に従って行うことができる。すなわち、上記のＲａｊｉ細胞を塗抹した板状体をアセトン等の固定化溶媒に接触させ、これを乾燥させることにより、所望するＲａｊｉ細胞を固定化した、ウイルス抗原スライドを製造することができる。
【００１７】
上記のような工程を経て製造した、ウイルス抗原スライドは、驚くべきことに、従来のものに比べて、製品のロット間の格差は格段に解消され、ＥＢＮＡ抗原と検体中の抗ＥＢＮＡ抗体との抗原抗体反応をさらに的確に検出して、検体中のＥＢウイルスの測定効率及び測定確度を向上させることが可能である。
【００１８】
この本発明製造方法に係わるウイルス抗原スライド（以下、本発明ウイルス抗原スライドともいう）を用いた、検体中のＥＢウイルスの測定手法は、現在、既存のウイルス抗原スライドを用いたウイルスの測定手法と同様の方法で行うことが可能である。
【００１９】
本発明おいて、ＥＮＢＡ抗体の測定は、間接蛍光抗体補体法により行われる。すなわち、板状体に固定化したＲａｊｉ細胞のＥＢＮＡ抗原を抗原とし、検体中の抗ＥＢＮＡ抗体を反応させ（一次反応）、これにより生じた抗原抗体複合物に補体成分を反応させる（二次反応）。次いで、この補体成分に対する蛍光標識抗補体抗体を反応後（三次反応）、蛍光顕微鏡下で陽性像の有無を観察する方法である。
【００２０】
なお、伝染性単核症の診断のために、本発明ウイルス抗原スライドを抗ＥＢＮＡ抗体を検出するべき検体は、特に限定されないが、例えば、血清等の血液検体や髄液検体等を用いることができる。
本発明ウイルス抗原スライドは、かかる測定手法において、好適に用いられる。
【００２１】
伝染性単核症は、主にＥＢウイルス感染によって惹き起こされる。抗体検査による感染診断においては、ＥＢＶ−ＶＣＡ／ＩｇＭ抗体が陽性となった際に、最近にＥＢＶ感染が起こったことが証明され、患者の疾患が、ＥＢＶによる伝染性単核症と診断されるが、患者によっては、ＶＣＡ−ＩｇＭの抗体上昇が不十分な場合があり得る。ＥＮＢＡ抗体は、本疾患の回復期においてはじめてできる抗体であるので、ＥＢＶ既感染のマーカーであるＶＣＡ−ＩｇＧ抗体が陽性で、かつ、ＥＢＮＡ抗体が陰性の結果が得られた場合に、ＥＢＶの感染は、過去数カ月以内に起こったと判断される。さらに、ＥＡ−ＩｇＧが陽性であれば、ほぼＥＢＶによる感染であると判断される。また、逆に、ＥＮＢＡ抗体が陽性であれば、患者の症状がＥＢＶによる伝染性単核症であることを否定し得る。
【００２２】
なお、本発明ウイルス抗原スライドは、上記のような伝染性単核症の診断に用いる診断用キットとしての形態もとり得る。
この診断用キットには、本発明ウイルス抗原スライドの他に、検体中の抗ＥＢＮＡ抗体を検出するために必要な公知の要素を加えることができる。具体的には、例えば、蛍光抗体、蛍光抗体用希釈液、対照陽性検体、対照陰性検体、希釈用緩衝液、封入液等を、診断用キットの要素として含ませることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、これらの実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００２４】
本発明ウイルス抗原スライドの製造
市販されているＲａｊｉ細胞を、培地としてＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ培地を用い、ＣＯ2 インキュベーター中（３７℃，５％ＣＯ2 ，湿度９５％以上）で継代培養を行い、この培養３日目で、細胞の生存率が９５％以上であることを確認して回収した。
【００２５】
回収したＲａｊｉ細胞を、無血清のRPMI1640培地に懸濁して、１５００rpm の遠心処理を５分間、３回行うことにより、洗浄した。次いで、この洗浄したＲａｊｉ細胞の３倍容の無血清のRPMI1640培地に懸濁して、この細胞懸濁液を、５０μL のマイクロピペットで、スライドグラスのウエルに塗抹した（塗抹時の湿度は２０〜８０％、気温は２０〜２８℃であった）。この細胞懸濁液の塗抹終了後、塗抹済みのスライドグラスを３０分間〜１時間、同様の環境下で放置して、スライドグラスの全ウエルが乾燥したことを確認した。次いで、このスライドグラスを染色カゴに移し、蒸留水で５倍容に薄めた、室温ＰＢＳ又は氷冷ＰＢＳ中に染色カゴごと静かに浸漬し、３０秒間、室温下又は氷冷下で、Ｒａｊｉ細胞と上記の希釈したＰＢＳを接触させた。
【００２６】
この希釈したＰＢＳとスライドグラスの接触後、スライドグラスをアセトンと３０秒間、室温で接触させ、さらに、別のアセトン中に、１０分間、室温で接触させた後、スライドグラスを３０分程室温で乾燥させて、Ｒａｊｉ細胞をスライドグラスに固定した。
このようにして製造した本発明ウイルス抗原スライドは、保存容器に乾燥剤と共に入れ、−３５℃で凍結保存を行った。
【００２７】
対照として、従来の方法でウイルス抗原スライドを製造した。
すなわち、上記と同じく、市販のＲａｊｉ細胞から調製した洗浄済みの継代Ｒａｊｉ細胞を、スライドグラスに塗抹した後、２時間室温で放置した。次いで、アセトン：メタノール＝１：１（容量比）の混液（−２０℃）に１〜２分間、この細胞塗抹スライドを接触させ、Ｒａｊｉ細胞の固定を行った。これを１時間風乾し、比較用の対照となるウイルス抗原スライドを製造し、これを、上記と同一の条件で凍結保存を行った。
【００２８】
試験例１
上記の保存容器から、本発明ウイルス抗原スライドと比較用のウイルス抗原スライドを、各３枚（本発明ウイルス抗原スライドを、各本発明品Ａ，Ｂ，Ｃで表し、比較用のウイルス抗原スライドを、各比較品ａ，ｂ，ｃで表す）を取り出して、扇風機で送風しつつ、室温に戻した。
【００２９】
被験血清は、３名の健常人の血清を用い（各血清１，２，３で表す）、各々の被験血清をＰＢＳで５倍希釈し、３０分間、５６℃下に晒すことにより、患者自身の血清補体を不活化した。
マイクロプレート上で、１０〜３２０倍の被験血清の二段階希釈列をつくり、湿潤箱中に置いた、ウイルス抗原スライドの各ウエルに、各々の希釈度の被験血清を接触させて、バイブレータ（ＶＦ−５：サクラ精機製）で、３０秒間、微振盪を行った後、３７℃のインキュベーター内で、３０分間反応を行った。
【００３０】
次いで、ＰＢＳで被験血清を洗い流した後、１０分間、ＥＮＢＡ抗原スライドをＰＢＳ中に浸漬した（ＰＢＳの交換を１回行った）。
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているＰＢＳを拭き取り、スライドグラス上の各Ｒａｊｉ細胞が濡れている状態のうちに、冷ＢＳＳで至適希釈を行った補体〔ヒト：２０倍（自家製）、モルモット：１２０倍（デンカ生研製）〕を、直ちに各スライドグラス上のＲａｊｉ細胞に接触させて、補体反応を開始した。
【００３１】
かかる補体反応は、補体を接触させた上記スライドグラスを、上記のバイブレーターで、６０秒間微振盪後、３７℃のインキュベーター内で、４５分間放置することにより行った。
補体反応終了後、スライドグラス上の補体をＰＢＳで洗い流し、１０分間、各マイクロプレートをＰＢＳ中に浸漬した（ＰＢＳの交換を１回行った）。
【００３２】
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているＰＢＳを拭き取り、スライドグラス上の各Ｒａｊｉ細胞が濡れている状態のうちに、ＰＢＳで至適希釈した蛍光抗体（ＦＩＴＣ標識した抗ヒト抗体と抗モルモットＣ３抗体：抗ヒト抗体は２０倍希釈、抗モルモット抗体は８０倍希釈）を接触させて、抗原抗体反応を行った。
【００３３】
かかる抗原抗体反応は、蛍光抗体を接触させた上記スライドグラスを、上記のバイブレーターで、３０秒間微振盪後、３７℃のインキュベーター内で、３０分間放置することにより行った。
抗原抗体反応終了後、スライドグラス上の蛍光抗体をＰＢＳで洗い流し、１０分間、各スライドグラスをＰＢＳ中に浸漬した（ＰＢＳの交換を１回行った）。
【００３４】
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているＰＢＳを拭き取り、封入剤（グリセリン：ＰＢＳ＝１：１）を、各ウエルに滴下した。
次いで、各スライドグラスのウエルをカバーグラスで封入し、各々の蛍光を励起させて（Ｕ励起又はＢ励起による）、蛍光顕微鏡による観察を行った。
結果を第１表に表す。
【００３５】
0004018826.tif 000002
【００３６】
表中における被験血清の希釈率は、蛍光顕微鏡下で、固定化したＲａｊｉ細胞の蛍光染色像が鮮明に認められた希釈率である。例えば、表中で、「８０」とあるのは、８０倍に被験血清を希釈しても、蛍光顕微鏡における固定化したＲａｊｉ細胞の染色像が鮮明であるが、１６０倍では鮮明ではなかったことを示している。
【００３７】
この第１表により、同一の被験血清において、本発明品においては、比較品の少なくとも２倍高い希釈率が認められることが明らかになった。すなわち、本発明ウイルス抗原スライドにおいては、ＥＢＮＡ抗体の蛍光染色法による検出感度が飛躍的に向上することが明らかになった。
また、本発明品は、比較品に比べて、同一の被験血清に対して、ロット間における結果のズレが小さいことが明らかになった。
【００３８】
なお、比較品３ロット（比較品ａ，ｂ，ｃ）は、９ロットの比較品を製造してはじめて得ることができた。すなわち、比較品９ロット中、６ロットは２０倍に被験血清を希釈しても、固定化したＲａｊｉ細胞の染色像が十分に認められなかった。これに対して、本発明品においては、製造した３ロット全て（本発明品Ａ，Ｂ，Ｃ）が、２０倍に希釈した被験血清に対して、固定化したＲａｊｉ細胞の鮮明な染色像を与えた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、製品ロット間差が少なく、蛍光抗体補体法における染色性に優れる、検体中のＥＢウイルスを測定し得る、ウイルス抗原スライドの製造方法が提供される。