【手続補正書】
【提出日】平成28年1月29日(2016.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された細胞であり：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２の非内因性ポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
【請求項２】
前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２に記載の単離された細胞。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫおよびＨＥＫ２９３から成る群から選択される細胞型である、請求項３に記載の単離された細胞。
【請求項５】
前記細胞型がＣＨＯである、請求項４に記載の単離された細胞。
【請求項６】
前記細胞がＫ、ＭおよびＤＧ４４から成る群から選択されるＣＨＯ細胞亜型である、請求項５に記載の単離された細胞。
【請求項７】
前記細胞が細菌細胞である、請求項２に記載の単離された細胞。
【請求項８】
前記細菌細胞が大腸菌である、請求項７に記載の単離された細胞。
【請求項９】
選択マーカーをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された細胞。
【請求項１０】
前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、請求項９に記載の単離された細胞。
【請求項１１】
前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、請求項１０に記載の単離された細胞。
【請求項１２】
前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、請求項１０に記載の単離された細胞。
【請求項１３】
前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、請求項１２に記載の単離された細胞。
【請求項１４】
第１または第２ポリヌクレオチドが染色体外のＤＮＡ構築物上にある、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１５】
第１または第２ポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ構築物上にある、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１６】
第１および第２ポリヌクレオチドが１つのＤＮＡプラスミド上にある、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１７】
第１および第２ポリヌクレオチドが異なるＤＮＡプラスミド上にある、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された細胞であり、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドまたは配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。
【請求項１９】
前記第２ポリペプチドと第１ポリペプチドの割合が少なくとも約８：２である、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
前記第２ポリペプチドと第１ポリペプチドの割合が少なくとも約９：１である、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の単離された細胞であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。
【請求項２２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも３倍である、請求項２１に記載の単離された細胞。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細胞および細胞培養培地を含む組成物。
【請求項２４】
配列番号３に示されるアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む切断された２鎖ポリペプチドを調製するための方法であり、前記方法が単離された細胞内に：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２の非内因性ポリヌクレオチドを発現させることを含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫおよびＨＥＫ２９３から成る群から選択される細胞型である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞型がＣＨＯである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞がＫ、ＭおよびＤＧ４４から成る群から選択されるＣＨＯ細胞亜型である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が細菌細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌細胞が大腸菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
選択マーカー遺伝子を細胞内に発現させることをさらに含む、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１または第２のポリヌクレオチドが染色体外ＤＮＡ構築物から発現される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１または第２のポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ構築物から発現される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
第１および第２ポリヌクレオチドが１つのＤＮＡプラスミド上にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
第１および第２ポリヌクレオチドが異なるＤＮＡプラスミド上にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡプラスミドがポリフェクションによって前記単離された細胞内にトランスフェクトされる、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１％〜約５０％である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１％〜約３０％である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約３％である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１０％である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約３０％である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質分画を前記細胞から単離することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質分画が配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
配列番号３に示される切断された２鎖ポリペプチドと配列番号１に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約８：２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
配列番号３に示される切断された２鎖ポリペプチドと配列番号１に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約９：１である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
第２ポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも３倍である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１に記載の単離された細胞または請求項２４に記載の方法で調製された２鎖ｆＸａ誘導体の調製物。
【請求項５３】
ポリヌクレオチド構築物であり、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド構築物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
単離された細胞は、必要な翻訳後修飾のプロセシングおよび切断を提供する任意の適切な宿主細胞であり得る。適切な細胞には、非制限的な例として、酵母細胞といった真菌細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞が含まれる。１つの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞である。関連する実施形態では、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫおよびＨＥＫ２９３から成る群から選択される細胞型である。さらなる実施形態では、前記細胞型はＣＨＯである。さらなる実施形態では、前記ＣＨＯ細胞型は、亜型Ｋ、ＭまたはＤＧ４４のものである。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
単離された細胞であり：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２の非内因性ポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
（項目２）
前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、項目１に記載の単離された細胞。
（項目３）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目２に記載の単離された細胞。
（項目４）
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫおよびＨＥＫ２９３から成る群から選択される細胞型である、項目３に記載の単離された細胞。
（項目５）
前記細胞型がＣＨＯである、項目４に記載の単離された細胞。
（項目６）
前記細胞がＫ、ＭおよびＤＧ４４から成る群から選択されるＣＨＯ細胞亜型である、項目５に記載の単離された細胞。
（項目７）
前記細胞が細菌細胞である、項目２に記載の単離された細胞。
（項目８）
前記細菌細胞が大腸菌である、項目７に記載の単離された細胞。
（項目９）
選択マーカーをさらに含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の単離された細胞。
（項目１０）
前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、項目９に記載の単離された細胞。
（項目１１）
前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、項目１０に記載の単離された細胞。
（項目１２）
前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、項目１０に記載の単離された細胞。
（項目１３）
前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、項目１２に記載の単離された細胞。
（項目１４）
第１または第２ポリヌクレオチドが染色体外のＤＮＡ構築物上にある、項目１に記載の単離された細胞。
（項目１５）
第１または第２ポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ構築物上にある、項目１に記載の単離された細胞。
（項目１６）
第１および第２ポリヌクレオチドが１つのＤＮＡプラスミド上にある、項目１に記載の単離された細胞。
（項目１７）
第１および第２ポリヌクレオチドが異なるＤＮＡプラスミド上にある、項目１に記載の単離された細胞。
（項目１８）
項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離された細胞であり、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドまたは配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。
（項目１９）
前記第２ポリペプチドと第１ポリペプチドの割合が少なくとも約８：２である、項目１８に記載の単離された細胞。
（項目２０）
前記第２ポリペプチドと第１ポリペプチドの割合が少なくとも約９：１である、項目１８に記載の単離された細胞。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれかに記載の単離された細胞であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、単離された細胞。
（項目２２）
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも３倍である、項目２１に記載の単離された細胞。
（項目２３）
項目１〜２２のいずれか１項に記載の単離された細胞および細胞培養培地を含む組成物。
（項目２４）
配列番号３に示されるアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む切断された２鎖ポリペプチドを調製するための方法であり、前記方法が単離された細胞内に：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２の非内因性ポリヌクレオチドを発現させることを含む、方法。
（項目２５）
前記細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞から成る群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫおよびＨＥＫ２９３から成る群から選択される細胞型である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞型がＣＨＯである、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞がＫ、ＭおよびＤＧ４４から成る群から選択されるＣＨＯ細胞亜型である、項目２４に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が細菌細胞である、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記細菌細胞が大腸菌である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
選択マーカー遺伝子を細胞内に発現させることをさらに含む、項目２４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記選択マーカーがピューロマイシン、メトトレキセート、ネオマイシンおよびハイグロマイシンから成る群から選択される化合物への耐性を与える、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記選択マーカーがメトトレキセートへの耐性を与える、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記選択マーカーがピューロマイシンへの耐性を与える、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記選択マーカー細胞が前記細胞への抗生物質耐性を与える、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１または第２のヌクレオチドが染色体外ＤＮＡ構築物から発現される、項目２４に記載の方法。
（項目３８）
前記第１または第２のポリヌクレオチドが前記単離された細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ構築物から発現される、項目２４に記載の方法。
（項目３９）
第１および第２ポリヌクレオチドが１つのＤＮＡプラスミド上にある、項目２４に記載の方法。
（項目４０）
第１および第２ポリヌクレオチドが異なるＤＮＡプラスミド上にある、項目２４に記載の方法。
（項目４１）
前記ＤＮＡプラスミドがポリフェクションによって前記単離された細胞内にトランスフェクトされる、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１％〜約５０％である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１％〜約３０％である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約３％である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約１０％である、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記第２のポリヌクレオチドを含む前記プラスミドがトランスフェクトされた全ＤＮＡの約３０％である、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
配列番号３と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質分画を前記細胞から単離することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目４８）
前記タンパク質分画が配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
配列番号３に示される切断された２鎖ポリペプチドと配列番号１に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約８：２である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
配列番号３に示される切断された２鎖ポリペプチドと配列番号１に示される切断されていないポリペプチドの割合が少なくとも約９：１である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
第２ポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドの発現量が内因性フーリン発現量の少なくとも３倍である、項目１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
項目１に記載の単離された細胞または項目２４に記載の方法で調製された２鎖ｆＸａ誘導体の調製物。
（項目５３）
ポリヌクレオチド構築物であり、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド構築物。