【手続補正書】
【提出日】平成28年7月8日(2016.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セグメント化部位において０〜３個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する第一アルブミンポリペプチドの第一セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉ）第一輸送体ポリペプチド、および少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドとを含む第一ポリペプチド構築物;および
セグメント化部位において０〜３個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する第二アルブミンポリペプチドの第二セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含み、
前記第一アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記第二アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、相補的界面を有し、ならびに
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記第一または第二アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する、
ヘテロ多量体。
【請求項２】
第一ポリペプチド構築物が、２つの第一カーゴポリペプチドを含む、請求項１記載のヘテロ多量体。
【請求項３】
少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項１または２記載のヘテロ多量体。
【請求項４】
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される、請求項３記載のヘテロ多量体。
【請求項５】
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドをさらに含むか、または第二ポリペプチド構築物が、２つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６】
少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項５記載のヘテロ多量体。
【請求項７】
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される、請求項６記載のヘテロ多量体。
【請求項８】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合され、および／または前記少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される、請求項５〜９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１】
ａ）前記第一アルブミンポリペプチドまたは前記第二アルブミンポリペプチドの前記セグメント化部位が、高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有しかつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているループ上に存在し、および／またはｂ）前記第一および第二セグメント間の相補的界面は、無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２】
前記第一アルブミンポリペプチドおよび／または前記第二アルブミンポリペプチドが、セグメント化部位において０〜２個のアミノ酸残基が欠失しているか、またはセグメント化部位において０または１個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３】
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、リンカーを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４】
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである、請求項１３記載のヘテロ多量体。
【請求項１５】
セグメント化部位において０〜３個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する第一アルブミンポリペプチドの第一セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
セグメント化部位において０〜３個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する第二アルブミンポリペプチドの第二セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含み、
前記第一アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記第二アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、相補的界面を有し、ならびに
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記第一または第二アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する、
ヘテロ多量体。
【請求項１６】
ａ）前記第一アルブミンポリペプチドおよび前記第二アルブミンポリペプチドの前記セグメント化部位が、高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有しかつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているループ上に存在し、および／またはｂ）前記第一および第二セグメント間の相補的界面は、無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う、請求項１５記載のヘテロ多量体。
【請求項１７】
前記第一および／または前記第二アルブミンポリペプチドが、セグメント化部位において０〜２個のアミノ酸残基が欠失しているか、またはセグメント化部位において０または１個のアミノ酸残基が欠失しているセグメント化部位を有する、請求項１５または１６記載のヘテロ多量体。
【請求項１８】
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、リンカーを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９】
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである、請求項１８記載のヘテロ多量体。
【請求項２０】
前記第一または第二アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、６５℃より高い融解温度を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２１】
少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一および第二輸送体ポリペプチドからの残基間に形成され、かつジスルフィド結合が前記第一または第二アルブミンポリペプチドにおいても観察される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２２】
前記第一および／または第二アルブミンポリペプチドが、配列番号１の配列（1乃至29位のシグナル配列を除く）を有するヒト血清アルブミンもしくはその類似体またはその変異体である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２３】
（ａ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号３９を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４０を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｂ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４１を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４２を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｃ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４３を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４４を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｄ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４５を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４６を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｅ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４７を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４８を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｆ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４９を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５０を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；
（ｇ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号５１を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５２を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有するか；または
（ｈ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号５３を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５４を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）もしくはその類似体または変異体を有する、
請求項１または１５記載のヘテロ多量体。
【請求項２４】
セグメント化部位を有する第一アルブミンポリペプチドの第一セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
セグメント化部位を有する第二アルブミンポリペプチドの第二セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含み、かつ
前記第一輸送体ポリペプチドは、前記第二輸送体ポリペプチドと異なり、かつ
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの少なくとも１つがアミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも１つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチドとジスルフィド結合を形成し、かつ
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記第一または第二アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する、
ヘテロ多量体。
【請求項２５】
ａ）前記第一アルブミンポリペプチドおよび前記第二アルブミンポリペプチドのセグメント化部位が、高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有しかつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているループ上に存在し、および／またはｂ）前記第一輸送体ポリペプチドおよび前記第二輸送体ポリペプチドが、相補的界面を有し、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う、請求項２４記載のヘテロ多量体。
【請求項２６】
前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ１９４Ｃ、Ｌ１９８Ｃ、Ｗ２１４Ｃ、Ａ２１７Ｃ、Ｌ３３１ＣおよびＡ３３５Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含み、および／または前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ３３１Ｃ、Ａ３３５Ｃ、Ｖ３４３Ｃ、Ｌ３４６Ｃ、Ａ３５０Ｃ、Ｖ４５５Ｃ、およびＮ４５８Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項２４または２５記載のヘテロ多量体。
【請求項２７】
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、リンカーをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２８】
リンカーが、ＧＧＧＧｓリンカーである、請求項２７記載のヘテロ多量体。
【請求項２９】
前記第一および／または第二アルブミンポリペプチドが、配列番号１の配列（1乃至29位のシグナル配列を除く）を有するヒト血清アルブミンもしくはその類似体またはその変異体である請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３０】
前記第一ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドをさらに含むか、または第一ポリペプチド構築物が、２つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３１】
少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項３０記載のヘテロ多量体。
【請求項３２】
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される、請求項３１記載のヘテロ多量体。
【請求項３３】
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドをさらに含むかまたは２つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３４】
少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項３３記載のヘテロ多量体。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される、請求項３４記載のヘテロ多量体。
【請求項３６】
前記第一ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３７】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項３６記載のヘテロ多量体。
【請求項３８】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ３に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項３６記載のヘテロ多量体。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合され、および／または前記少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４０】
前記ヘテロ多量体がＦｃＲｎに結合する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４１】
第一または第二アルブミンポリペプチドが、アロ−アルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４２】
第一アルブミンポリペプチドおよび第二アルブミンポリペプチドが、同一型のアルブミンポリペプチドであるか、または異なる型のアルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４３】
前記第一アルブミンポリペプチドおよび第二アルブミンポリペプチドが、哺乳動物アルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４４】
前記第一アルブミンポリペプチドおよび第二アルブミンポリペプチドが、非哺乳動物アルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４５】
前記第一アルブミンポリペプチドおよび第二アルブミンポリペプチドが、アロアルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４６】
前記第一アルブミンポリペプチドおよび第二アルブミンポリペプチドの一方が、ヒト血清アルブミンポリペプチドであり、および他方がアロアルブミンポリペプチドである、請求項１〜２１ならびに２４〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４７】
第一ポリペプチド構築物が、標的抗原に結合する少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記標的抗原が、ＩＬ−２Ｒのα−鎖（ＣＤ２５）、アミロイドベータ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦプロテイン、Ｇ２５０、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ９０、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ，ＶＥＧＦ−Ａ、グルカゴン受容体、ＧＬＰ受容体、およびＬＤＬ受容体のうちの少なくとも１つである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４８】
第一輸送体ポリペプチドが、酵素、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカインもしくはその変異体またはその断片である少なくとも１つのカーゴポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４９】
前記第一または第二アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、アルブミンに匹敵する熱安定性を有するか、またはアルブミンの熱安定性の約２０℃以内である熱安定性を有する、請求項２４〜４８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５０】
第一輸送体ポリペプチドが少なくとも１つのカーゴポリペプチドをさらに含み、カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に変更される、請求項１〜４９のいずれか一項記載のヘテロ多量体。
【請求項５１】
セグメント化部位で導入されるＣおよび／またはＮ末端が、ＧＧＧＧＳペプチド配列に融合される、請求項１、１５、および２４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、癌の治療のための治療薬。
【請求項５３】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、腫瘍の増殖の抑制のための治療薬。
【請求項５４】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、腫瘍の萎縮のための治療薬。
【請求項５５】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体をコードする、核酸または核酸のセット。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸または核酸のセットを含む、ベクターまたはベクターのセット。
【請求項５７】
請求項５６に記載のベクターまたはベクターのセットを含む、宿主細胞。
【請求項５８】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体およびアジュバントを含む薬学的組成物。
【請求項５９】
目的のタンパク質から自己会合ポリペプチドを設計する方法であって、少なくとも１つのセグメント化部位で前記タンパク質をセグメント化して少なくとも２つのポリペプチドセグメントを獲得し、これにより前記ポリペプチドセグメントが自己集合してヘテロ多量体を形成することを包含し、ここで前記ヘテロ多量体は前記タンパク質の擬似ネイティブ単量体構造を形成し、
ａ．  高度の溶媒接触表面積を有しかつ前記タンパク質の残りの構造との接触が限定されている目的のタンパク質の少なくとも１つのループを選択するステップ、および
ｂ．  選択したループ当たり１つのセグメント化部位を導入し、少なくとも２つのポリペプチドセグメント間に相補的界面を生じるステップであり、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合うステップ、
を包含する方法。
【請求項６０】
ポリペプチドセグメント間に少なくとも１つのジスルフィド結合を導入することを包含する、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
単量体タンパク質がアルブミンである、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
ヘテロ多量体がポリペプチド間に共有結合を含まないようセグメント化が実施されるか、またはヘテロ多量体がポリペプチド間に少なくとも１つの共有結合を含むようセグメント化が実施される、請求項５９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
[本発明1001]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって；
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
セグメント化がセグメント化部位での0〜3個のアミノ酸残基の欠失を生じるように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1002]
ａ）前記セグメント化部位が、高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有し、かつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているアルブミンポリペプチドのループ上に存在し、ｂ）前記セグメント化が輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じ、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1003]
セグメント化が、セグメント化部位での0〜2個のアミノ酸残基の欠失を生じる本発明1001または1002のヘテロ多量体。
[本発明1004]
セグメント化が、セグメント化部位での0または1個のアミノ酸残基の欠失を生じる本発明1001または1002のヘテロ多量体。
[本発明1005]
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、リンカーをさらに含む本発明1001〜1004のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1006]
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである本発明1005のヘテロ多量体。
[本発明1007]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、65℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1008]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、70℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1009]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、75℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1010]
少なくとも1つのジスルフィド結合が、第一および第二輸送体ポリペプチドからの残基全体を通して形成され、かつジスルフィド結合が前記アルブミンポリペプチドにおいても観察される本発明1001〜1009のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1011]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1001〜1010のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1012]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号39を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号40を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1013]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号41を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号42を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1014]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号43を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号44を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1015]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号45を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号46を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1016]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号47を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号48を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1017]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号49を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号50を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1018]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号51を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号52を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1019]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号53を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号54を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1020]
前記第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、アミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチド上の対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1021]
前記第一および第二輸送体ポリペプチドが、アミノ酸残基のシステインへの少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが別の輸送体ポリペプチド上のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する本発明1020のヘテロ多量体。
[本発明1022]
前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ194Ｃ、Ｌ198Ｃ、Ｗ214Ｃ、Ａ217Ｃ、Ｌ331ＣおよびＡ335Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1021のヘテロ多量体。
[本発明1023]
前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ331Ｃ、Ａ335Ｃ、Ｖ343Ｃ、Ｌ346Ｃ、Ａ350Ｃ、Ｖ455Ｃ、およびＮ458Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1021のヘテロ多量体。
[本発明1024]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって；
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、かつ
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドの少なくとも1つがアミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチドとジスルフィド結合を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1025]
セグメント化部位が、ａ）高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有し、かつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているアルブミンポリペプチドのループ上に存在し、ｂ）輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じ、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1026]
前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ194Ｃ、Ｌ198Ｃ、Ｗ214Ｃ、Ａ217Ｃ、Ｌ331ＣおよびＡ335Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1024または1025の単離ヘテロ多量体。
[本発明1027]
前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ331Ｃ、Ａ335Ｃ、Ｖ343Ｃ、Ｌ346Ｃ、Ａ350Ｃ、Ｖ455Ｃ、およびＮ458Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1024または1025の単離ヘテロ多量体。
[本発明1028]
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、リンカーをさらに含む本発明1024〜1027のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1029]
リンカーが、ＧＧＧＧｓリンカーである本発明1028のヘテロ多量体。
[本発明1030]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1024〜1029のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1031]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号19を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号20を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1032]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号21を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号22を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1033]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号23を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号22を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1034]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号25を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号26を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1035]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号27を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号28を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1036]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号29を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号30を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1037]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号31を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号32を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1038]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号33を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号34を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1039]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号35を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号36を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1040]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号37を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号38を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1041]
前記第一ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1042]
第一ポリペプチド構築物が、2つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1041のヘテロ多量体。
[本発明1043]
少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1041または1042のヘテロ多量体。
[本発明1044]
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2、またはＨＥＲ3に結合する本発明1043のヘテロ多量体。
[本発明1045]
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1041〜1044のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1046]
第二ポリペプチド構築物が、2つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1045のヘテロ多量体。
[本発明1047]
少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1045または1046のヘテロ多量体。
[本発明1048]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2、またはＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される本発明1047のヘテロ多量体。
[本発明1049]
前記第一ポリペプチド構築物が少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記第二ポリペプチド構築物が少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1048のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1050]
前記第一カーゴポリペプチドがＣＤ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドがＣＤ19またはＣＤ20に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1049のヘテロ多量体。
[本発明1051]
前記第一カーゴポリペプチドがＨＥＲ2に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドがＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1050のヘテロ多量体。
[本発明1052]
前記少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1041〜1051のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1053]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1041〜1051のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1054]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチド;および（ｉｉ）ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2またはＨＥＲ3と結合する抗原結合ポリペプチド構築物である少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物、ならびに
（ｉｉｉ）第二輸送体ポリペプチド;および（ｉｖ）少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって、
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1055]
前記第一ポリペプチド構築物が、2つの第一カーゴポリペプチドを含む本発明1054のヘテロ多量体。
[本発明1056]
2つの第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3、またはＣＤ19に結合する本発明1055のヘテロ多量体。
[本発明1057]
2つの第一カーゴポリペプチドが、互いに異なる本発明1055または1056のヘテロ多量体。
[本発明1058]
前記2つの第一カーゴポリペプチドのうちの一方がＣＤ3に結合し他方がＣＤ19に結合する本発明1057のヘテロ多量体。
[本発明1059]
前記2つの第一カーゴポリペプチドのうちの一方がＨＥＲ2に結合し他方がＨＥＲ3に結合する本発明1058のヘテロ多量体。
[本発明1060]
前記第二ポリペプチド構築物が、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2またはＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドを含む本発明1054〜1059のヘテロ多量体。
[本発明1061]
前記第二ポリペプチド構築物が、2つの第二カーゴポリペプチドを含む本発明1060のヘテロ多量体。
[本発明1062]
2つの第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3またはＣＤ19に結合する本発明1061のヘテロ多量体。
[本発明1063]
2つの第二カーゴポリペプチドが、互いに異なる本発明1061のヘテロ多量体。
[本発明1064]
前記2つの第二カーゴポリペプチドのうちの一方がＣＤ3に結合し他方がＣＤ19に結合する本発明1063のヘテロ多量体。
[本発明1065]
前記2つの第二カーゴポリペプチドのうちの一方がＨＥＲ2に結合し他方がＨＥＲ3に結合する本発明1063のヘテロ多量体。
[本発明1066]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1067]
前記少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1068]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1069]
リンカーが、ＧＧＧＧｓリンカーである本発明1068のヘテロ多量体。
[本発明1070]
前記ヘテロ多量体がＦｃＲｎに結合する本発明1001〜1069のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1071]
少なくとも1つの輸送体ポリペプチドが、アロ−アルブミン誘導体である本発明1001〜1069のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1072]
輸送体ポリペプチドが、同一型のアルブミンポリペプチドに由来する本発明1001、1024または1025のヘテロ多量体。
[本発明1073]
輸送体ポリペプチドが、異なる型のアルブミンポリペプチドに由来する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1074]
第一ポリペプチド構築物が標的抗原に結合する少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ第二ポリペプチド構築物が毒素部分である少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1075]
第一ポリペプチド構築物が標的抗原に結合する少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記標的抗原がＩＬ−2Ｒのａ−鎖（ＣＤ25）、アミロイドベータ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ3、ＣＤ16、ＣＤ20、ＣＤ22、ＣＤ23、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ52、ＣＤ80、ＣＴＬＡ−4、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦプロテイン、Ｇ250、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3、ＩＧＦ1Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ90、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−12、ＩＬ−23、ＩＬ−1ｂ、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ，ＶＥＧＦ−Ａ、グルカゴン受容体、ＧＬＰ受容体、およびＬＤＬ受容体のうちの少なくとも1つである本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1076]
少なくとも1つのカーゴポリペプチドが、酵素、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカインまたはその変異体もしくは断片である本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1077]
前記輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む本発明1001〜1076のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1078]
前記輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む本発明1001〜1076のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1079]
本発明1001〜1075のいずれかのヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞。
[本発明1080]
第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸が、単一ベクター中に存在する本発明1079の宿主細胞。
[本発明1081]
第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸が、別々のベクター中に存在する本発明1079の宿主細胞。
[本発明1082]
本発明1041〜1078のヘテロ多量体およびアジュバントを含む薬学的組成物。
[本発明1083]
それを必要とする患者に本発明1082の薬学的組成物の有効量を提供することを包含する癌の処置方法。
[本発明1084]
本発明1041〜1078のいずれかのヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する腫瘍の増殖の抑制方法。
[本発明1085]
本発明1041〜1078のいずれかのヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する腫瘍の萎縮方法。
[本発明1086]
目的のタンパク質から自己会合ポリペプチドを設計する方法であって、少なくとも1つのセグメント化部位で前記タンパク質をセグメント化して少なくとも2つのポリペプチドセグメントを獲得し、これにより前記ポリペプチドセグメントが自己集合してヘテロ多量体を形成することを包含し、ここで前記ヘテロ多量体は前記タンパク質の擬似ネイティブ単量体構造を形成し、
ａ．  高度の溶媒接触表面積を有しかつ前記タンパク質の残りの構造との接触が限定されている目的のタンパク質の少なくとも1つのループを選択するステップ、および
ｂ．  選択したループ当たり1つのセグメント化部位を導入し、少なくとも2つのポリペプチドセグメント間に相補的界面を生じるステップであり、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合うステップ
を包含する方法。
[本発明1087]
ポリペプチドセグメント間に少なくとも1つのジスルフィド結合を導入することを包含する本発明1086の方法。
[本発明1088]
単量体タンパク質がアルブミンである本発明1086の方法。
[本発明1089]
ヘテロ多量体がポリペプチド間に共有結合を含まないようセグメント化が実施される本発明1086の方法。
[本発明1090]
ヘテロ多量体がポリペプチド間に少なくとも1つの共有結合を含むようセグメント化が実施される本発明1086の方法。
[本発明1091]
本発明1086の方法により設計されるヘテロ多量体。
[本発明1092]
本発明1086の方法により設計されるヘテロ多量体を含む治療用足場。
[本発明1093]
擬似ネイティブ単量体構造が、アルブミンに匹敵する熱安定性を有する本発明1024〜1078のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1094]
熱安定性が、擬似ネイティブ単量体構造の融解温度（Ｔｍ）を測定することにより測定される本発明1093のヘテロ多量体。
[本発明1095]
擬似ネイティブ単量体の熱安定性が、アルブミンの熱安定性の約20℃以内である本発明1094のヘテロ多量体。
[本発明1096]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に変更される本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1097]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に弱められる本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1098]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に2〜100倍弱められる本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1099]
セグメント化部位で導入されるＣおよびＮ末端が、ＧＧＧＧＳペプチド配列に融合される本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1100]
ＧＧＧＧＳペプチド配列をセグメント化部位で導入されるＣおよびＮ末端に融合するステップをさらに包含する本発明1086の方法。
本発明の他の態様および特徴は、本発明の具体的実施形態についての以下の説明を添付の図面とともに検討すれば、当業者には明らかになる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明の実施形態を例証する図面において、
【図１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）分子の構造を示す。二次構造のαヘリックス部分を、棒として表された結合と一緒に模式的に示す。
【図２】２つのアルブミンベースのポリペプチドの界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットである。ＡＢＨ１は左の構造により表され、一方、ＡＢＨ２は右の構造により表される。
【図３】別々に発現される２つのアルブミンベースのポリペプチドを示す。２つのポリペプチドは、それぞれ明灰色および暗灰色で示されている。各ポリペプチドは、機能性カーゴタンパク質のための２つの融合部位を含み、これらの部位は球として表されている。構造中のジスルフィド残基は棒として示されている。
【図４】本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体に基づく二重特異性およびその他の多機能性治療薬の模式図である。アルブミンベースの、またはアロアルブミンベースのポリペプチドを、Ａ１およびＡ２で示す。多機能性ヘテロ多量体は、抗原結合モチーフ、サイトカインおよびその他の型のシグナル伝達分子、化学毒素、放射性毒素またはその他の機能的に関連する免疫複合体をＡ１およびＡ２上のＮおよび／またはＣ末端と結合することにより得られ、これを記号□で表す。
【図５】ヘテロ二量体Ｆｃドメイン由来の二重特異性抗体の模式図である。アルブミンまたはアロアルブミンベースのポリペプチドはＦｃのＣ末端と連結されてヘテロ二量体の形成を選択的に駆動する。
【図６】図６Ｂは、ＨＳＡベースの輸送体ポリペプチドの同時発現により形成される、全長ＨＳＡならびにヘテロ二量体足場であるアルブミンベースのヘテロ多量体−１（ＡＢＨ１）およびアルブミンベースのヘテロ多量体−２（ＡＢＨ２）の、ネイティブゲル電気泳動プロフィールを示す。図６Ａは、ＡＢＨ２、ＡＢＨ１およびＷＴ  ＨＳＡの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールを示す。ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の２つの断片ポリペプチドを、図の上部の比により示されるような異なるＤＮＡ比で同時発現させた。対照として、およびホモ二量体化を観察するために、断片ＡおよびＢを独立して発現させた。図６Ｃは、ＷＴ−ＨＳＡ（ｖ２２５）およびＡＢＨ２（ｖ２２１）のＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後の、初期、フロースルー、洗浄および最終溶出のネイティブゲルである。
【図７】示差走査熱量測定を用いて試験した野生型ＨＳＡならびにヘテロ二量体足場ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の安定性を示す。
【図８】３０００ＲＵを超える平衡結合等温線３０００ｎＭ  ＦｃＲＮ  ３倍希釈シリーズを示す。図８Ｂはアルブミンを示し、図８Ａはヘテロ多量体足場ＡＢＨ１を示す。
【図９】抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよび抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ生物活性融合体を含む、多価アルブミンベースのヘテロ多量体の模式図である。
【図１０】表８に記載したヘテロ多量体ＡＢＨ２融合体の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を含有する。ゲルは、すべての構築物が予測分子量を有する妥当な複合体を形成することを示している。
【図１１】ＰＤＢ構造  １ＭＣＸに基づくアネキシン分子の構造を示す。アネキシン分子を分割することにより得られる２つの単量体は、明灰色および暗灰色単位として色分けされている。カーゴタンパク質のための融合の部位は球として表されている。
【図１２】アネキシンベースの輸送体ポリペプチド−１、およびアネキシンベースの輸送体ポリペプチド−２の界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットを示す。
【図１３】ＰＤＢ構造  １Ｈ７６に基づくトランスフェリン分子の構造を示す。トランスフェリン分子を分割することにより得られる２つの単量体は、明灰色および暗灰色単位として色分けされている。カーゴタンパク質のための融合の部位は球として表されている。
【図１４】本明細書中に記載される２つのトランスフェリンベースの輸送体ポリペプチドの界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットを示す。本明細書中で設計されるような残基位置３３０近くのスプリットトランスフェリンは、約１８００Å２の埋没表面積を有するヘテロ二量体を形成する。
【図１５−１】（図１５Ａ〜Ｄ）自己会合して擬似ネイティブ単量体アルブミンを形成するアルブミンベースの輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体を示す。輸送体ポリペプチドの各対は、他とは異なる独自の部位でのアルブミンのセグメント化により得られる。
【図１５−２】（図１５Ｅ〜Ｈ）同上
【図１５−３】（図１５Ｉ〜Ｌ）同上
【図１５−４】（図１５Ｍ〜Ｐ）同上
【図１６】それぞれ、ＡＢＨ２およびＡＢＨ１の構造を提供する。両図は、ａ）アルブミンベースのタンパク質を作成するためのＷＴ−ＨＳＡにおける切断部位の位置、ｂ）新規のＣ'およびＮ'切断部位の位置ならびにｃ）多数の後述の実施例で利用される、ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の両方を示す簡略化した円を包含する。
【図１７】ＡＢＨ２に結合され得る抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖの種々の１、２、３および４価立体配置を示す。対照は、ＡＢＨ２足場、抗ＨＥＲ  ｓｃＦｖ、単腕Ｆｃおよび２価Ｆｃを包含した。さらに、Ｈｅｒ２を発現するＳＫＯＶ細胞に結合する種々のＡＢＨ２構築物の能力が表内にＫＤ値で示されている。
【図１８Ａ】図１８Ａは、４つの抗Ｈｅｒ３×Ｈｅｒ２負荷構築物（ｖ１０８７、ｖ１０８８、ｖ１０８９およびｖ１０９０）の、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合曲線を示す。ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とともにＦＡＣＳを用いて、細胞に対する親和性を評価した。下左のグラフは線形スケールでの濃度を示し、一方、下右は対数スケールである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、前記４つの構築物の、ＳＫＯＶ−３細胞への結合曲線を示す。下左のグラフは線形スケールでの濃度を示し、一方、下右は対数スケールである。
【図１９−１】（図１９Ａ〜Ｂ）ヒト血清における４つの抗Ｈｅｒ２（ｖ５１９、ｖ５２０、ｖ５１８およびｖ５１７）装填ＡＢＨ２の安定性を実証する。ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とともにＦＡＣＳを用いて、ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合親和性を評価した。
【図１９−２】（図１９Ｃ〜Ｄ）同上
【図２０Ａ】ｖ１０８７（ＭＭ−１１１）対照と比較した場合の、二重特異性抗Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３  ＡＢＨ２（ｖ１３７８）のＦｃＲｎに対する結合親和性を示す。グラフは、経時的にＲｅｓｐ．  Ｄｉｆｆ．として表される２つの化合物の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線を表す。
【図２０Ｂ】同上
【図２１】３つの温度（３７℃、室温および４℃）で５日間インキュベートされたＡＢＨ２足場（ｖ２２１）および一価抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２（ｖ５１７）の両方のネイティブゲルプロフィールを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後の、トータル、フロースルー、洗浄および溶出画分のネイティブゲルプロフィールを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ゲル濾過カラムに適用されたＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡのクロマトグラムである。異なるピークは異なるタンパク質産物を表す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ゲル濾過カラムへの適用により分画された、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡのクロマトグラムである。
【図２３Ａ】ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製およびゲル濾過後のＷＴ−ＨＳＡ（ｖ２２５）の液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラムである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ〜２３Ｅは、画分に分離されゲル濾過ＬＣにより分析された、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後の、それぞれＡｌｂｕＣＯＲＥ足場  １（ｖ２２５）、３（ｖ１６３６）、６（ｖ１６３８）および９（ｖ１６４０）のクロマトグラムである。
【図２３Ｃ】同上
【図２３Ｄ】同上
【図２３Ｅ】同上
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のアルブミン足場（ｖ２２１）のゲル濾過ＬＣ分析を表す。ＣＨＯ細胞における一過性同時発現により発現産物をスケールアップした。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、同じ変異体の非還元型（−ＤＴＴで示される）および還元型（＋ＤＴＴで示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡおよびＡｌｂｕＣＯＲＥ−Ａタンパク質のトータル、フロースルー、洗浄および最終溶出画分のネイティブゲルプロフィールを表す。
【図２５Ｂ−１】図２５Ｂは、同じ２つのタンパク質のＬＣ／ＭＳ分析を表す。
【図２５Ｂ−２】同上
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＡＢＨ２における４つの末端間の空間的分離の程度を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、正常抗体分子の可変領域間の空間的分離の程度を実証する比較図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、他の抗原結合のための異なる且つ可変的な末端間距離を有する４つのＡｌｂｕＣＯＲＥ足場を示す。
【図２７】ＡｌｂｕＣＯＲＥ足場１、３、６および９のＤＳＣ融解曲線を示す。各グラフにおいて、各アルブミンベースの足場の曲線および融点を、ＷＴ  ＨＳＡの曲線および７５℃の融点と比較する。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＷＴ−ＨＳＡまたは継ぎ合わせたアルブミン足場上の抗ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性二価ヘテロ多量体を模式的に示したものである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、追加の一価抗ＣＤ３ヘテロ多量体構築物ならびに一価および多価の両方の抗ＣＤ１９ヘテロ多量体構築物を模式的に表す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、各々が懸濁増殖ヒトＣＨＯ系で発現された後の、前記構築物の非還元型ＰＡＧＥゲルを表す。
【図２９】ＷＴ−ＨＳＡまたは継ぎ合わせたアルブミン足場における４つの抗ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性二価ヘテロ多量体のＫａおよびヒル勾配測定値を提供する。結合試験は、ＦＡＣＳを用いて分析した場合のＪｕｒｋａｔまたはＲａｊｉ細胞に結合する変異体の能力を評価した。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＢｉＴＥ様対照（ｖ８９１）、抗ＣＤ３×ＣＤ１９アルブミンベースのヘテロ多量体（ｖ１０９２）および抗ＣＤ３×ＣＤ１９  Ｈｅｔ−Ｆｃ−ベースのヘテロ多量体（ｖ８７３）のＦＡＣＳ細胞集団グラフを示す。ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞への結合を評価した。
【図３０Ｂ−１】図３０Ｂは、アルブミン対照（ｖ２２１）と比較した場合の、３つの前記構築物の追加のＦＡＣＳグラフを示す。
【図３０Ｂ−２】同上
【図３１】図３１Ａは、Ｃｏ２＋アフィニティーを用いた精製の前、最中および後のｖ２１８発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図３１Ｂは、ゲル濾過による追加の精製後の同じ構築物のクロマトグラムである。
【図３２】その三次元構造から導かれるヒト血清アルブミンにおける残基のサブセットによりなされる残基接触のプロット。
【図３３】ヒト血清アルブミンにおける選択ホットスポット残基により達成される接触および相互作用の性質のプロット。
【図３４】ヒト血清アルブミンにおけるホットスポット残基またはホットスポット残基のクラスター（パッチ）の構造表示。
【図３５】導入システイン残基を含むいくつかのアルブミンベースのヘテロ多量体の発現を実証するゲルを示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ヘテロ多量体変異体  １６３５、１６３８、１６３９および１６４１の発現を示す非還元型ゲルを提供する；図３６Ｂは、ヘテロ多量体変異体  １６３４、１６３６、１６３７、１６４０、および２２１の発現を示す非還元型ゲルを提供する。ＣＨＯ細胞を以下のＤＮＡ比でトランスフェクトした：比Ａ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  １００％：０％；比Ｄ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ６６％：３４％；比Ｂ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ５０％：５０％；比Ｈ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ３４％：６６％；および比Ｆ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ０％／１００％。
【図３６Ｂ】同上
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
図２は、セグメント化点がタンパク質配列に沿って移動される際、ＨＳＡの擬似ネイティブ構造へと理想的にフォールドする２つのアルブミンベースのポリペプチドの界面で埋没される溶媒接触表面積を示す。分析は、スプリットセグメント化が２〜３の例外を伴って残基３０〜５２０間のどこかに導入されると、疎水性界面を保持しつつ、２０００Å２以上のオーダーの大きな表面積が埋没されことを示す。いくつかの実施形態では、コンピューターで計算された分子表面積が、溶媒接触表面積の代わりに用いられる。いくつかの実施形態では、埋没表面積は、２０００Å２〜６０００Å２の範囲である。より大きい埋没表面積が非共有結合ＡＢＨ１に関して観察された。さらに、分析はまた、いくつかのループ領域が相対的曝露された表面であることも明らかにした。アルブミンは、ネイティブタンパク質構造の安定性に寄与する例外的に多数のジスルフィド架橋を有する。残基１１０、１９０、３００、３９０および５００付近のタンパク質の区分は、２つの輸送体ポリペプチドを横断するジスルフィド結合に関与する残基を分割しないセグメント化の部位を提供する。他の領域におけるセグメント化は、２つの輸送体ポリペプチド対間に架橋ジスルフィド結合を有するヘテロ二量体を生じるであろう。図３は、ＨＳＡ配列中の残基２９４〜３０３からのループの除去により得られる、１つのこのような擬似ネイティブアルブミン構造のモデルを表示する。本明細書中で示される配列番号２および配列番号３の２つのアルブミンベースのポリペプチドに関する総埋没表面積は、約２５００Å２である。これは、多数のタンパク質−タンパク質ヘテロ二量体およびホモ二量体共複合体構造で観察される平均範囲である１９１０〜３８８０Å２以内である［Ｂａｈａｄｈｕｒ  Ｒ．Ｐ．＆Ｚａｃｈａｒｉａｓ  Ｍ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１０５９−１０７２］。このことは、２つのポリペプチドのフォールディング経路が互いに十分に独立しているならば、この２つのポリペプチドが互いと選択的に会合する可能性が高いことを示唆する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
図３０Ａは、ｖ１０９２、二重特異性ＣＤ３／ＣＤ１９抗体（ｖ８７３）およびＢｉＴＥ様対照ｖ８９１がＪｕｒｋａｔ  ＣＤ３  Ｔ細胞（下右）とＲａｊｉ  ＣＤ１９  Ｂ細胞（上左）を架橋する能力をＦＡＣＳにより比較する。架橋されたＴ−Ｂ細胞は上右に出現する。この結果は、ｖ１０９２は０．３ｎＭという低い濃度でＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ  Ｂ細胞を特異的に架橋でき、架橋の程度はＢｉＴＥ（総細胞の２１％）およびヘテロ二量体Ｆｃを有する二重特異性ＣＤ３／ＣＤ１９抗体（２５％）と同程度（総細胞の３１％）であることを実証している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2015524799.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３０Ａ】
2015524799.tif 000002