【手続補正書】
【提出日】平成27年12月1日(2015.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ細孔センサーで使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
（ａ）材料層を有する電極を含むフローチャネルに緩衝溶液を方向付けることであって、前記緩衝溶液は、導電性であり、前記材料層は、１種または複数の脂質を含む、ことと、
（ｂ）前記緩衝溶液と、前記材料層とを接触させることと、
（ｃ）前記電極を通る電流を測定することにより、前記材料層の少なくとも一部が、前記電極に隣接して脂質二重層を形成しているか否かを決定することと、
（ｄ）（ｃ）の決定に基づいて、前記電極に刺激を加えることにより、前記材料層の前記少なくとも一部が前記電極に隣接して前記脂質二重層を形成するように誘導することとを含む、方法。
【請求項２】
（ｃ）において、１種または複数の電圧が前記電極に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記材料層が、１種または複数のポリンタンパク質と、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度の１種または複数の界面活性剤とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フローチャネルが、複数の電極を含み、前記複数の電極が、前記電極を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記材料層が、少なくとも２種の脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記電極が、フローチャネルの１つまたは複数の疎水性表面に隣接して堆積させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のフローチャネルが、複数のフローチャネルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のフローチャネルが、前記複数のフローチャネルに沿ったガイドレールを用いて流体的に互いに分離されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ナノ細孔感知装置において使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
（ａ）複数の電極と前記複数の電極に隣接する材料層とを含むチップを提供することであって、前記材料層の各々は、脂質を含む、ことと、
（ｂ）前記材料層と緩衝溶液とを接触させることであって、前記緩衝溶液は、導電性である、ことと、
（ｃ）前記複数の電極の少なくともサブセットに刺激を加えることにより、前記材料層が前記複数の電極に隣接して脂質二重層を形成するように誘導することと、
（ｄ）必要に応じて、前記複数の電極に加えられた約−１００ミリボルト（ｍＶ）〜−１０００ｍＶの電圧パルスで、前記複数の電極の少なくとも約２０％が非活性化するまでステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記材料層の各々が、ポアタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）が、
前記複数の電極と脂質溶液とを接触させることにより、前記材料層を形成すること
をさらに含み、前記脂質溶液が、前記脂質を含む、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
ナノ細孔センサーで使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
（ａ）材料層を有する電極を含むフローチャネルに緩衝溶液を方向付けることであって、前記緩衝溶液は、導電性であり、前記材料層は、１種または複数の脂質を含む、ことと、
（ｂ）前記緩衝溶液と、前記材料層とを接触させることと、
（ｃ）前記電極を通る電流を測定することにより、前記材料層の少なくとも一部が、前記電極に隣接して脂質二重層を形成しているか否かを決定することと、
（ｄ）（ｃ）の決定に基づいて、前記電極に刺激を加えることにより、前記材料層の前記少なくとも一部が前記電極に隣接して前記脂質二重層を形成するように誘導することとを含む、方法。
（項目２）
（ｃ）において、１種または複数の電圧が前記電極に加えられる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記電圧が、前記電極の上方の前記二重層を破壊または崩壊させるように選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記刺激が、前記電極の表面の上方の液体の流れ、前記電極の表面の上方の１種または複数の異なる液体の連続的な流れ、前記電極の表面の上方の１つまたは複数の気泡の流れ、電気パルス、ソニケーションパルス、圧力パルス、または音パルスのうち少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記材料層が、１種または複数のポリンタンパク質と、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度の１種または複数の界面活性剤とを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記フローチャネルが、複数の電極を含み、前記複数の電極が、前記電極を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記刺激が、前記複数の電極に同時に加えられる、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記材料層が、少なくとも２種の脂質を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記材料層が、ポアタンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ポアタンパク質が、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ（ＭｓｐＡ）、α溶血素、ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ（ＭｓｐＡ）もしくはα溶血素のうち少なくとも１つと少なくとも７０％の相同性を有する任意のタンパク質、またはそれらの任意の組合せである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｄ）の後に、前記電極を通して電気刺激を加えることにより、前記脂質二重層における前記ポアタンパク質の挿入を容易にすることをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記脂質二重層および前記ポアタンパク質が共に、約１ＧΩまたはそれよりも低い抵抗を示す、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ポアタンパク質のない前記脂質二重層が、約１ＧΩよりも大きい抵抗を示す、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記緩衝溶液の圧力は、前記材料層が、前記刺激なしで前記脂質二重層を形成するように選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
（ａ）の前に、前記材料層を前記電極に隣接して作り出すことをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記作り出すことが、
前記１種または複数の脂質を含む脂質溶液を、前記フローチャネルに方向付けることと、
前記電極上に前記材料層を堆積させることと
を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記脂質溶液が、有機溶媒を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記有機溶媒が、デカンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）の後に、
気泡を前記フローチャネルに方向付けることと、
前記気泡と前記材料層とを接触させることにより、前記材料層を滑らかにすることおよび／または薄くすることと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記気泡が、蒸気の気泡である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記材料層に隣接するポアタンパク質溶液を流動させることにより、前記材料層にポアタンパク質を堆積させることと、
前記フローチャネルにおけるイオン溶液および／または別の気泡を用いて前記材料層を薄くすることと
をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記１種または複数の脂質が、ジフタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記フローチャネルに曝露される前記電極の表面が、親水性である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記電極が、フローチャネルの１つまたは複数の疎水性表面に隣接して堆積させられる、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記１つまたは複数の疎水性表面が、シラン処理されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記フローチャネルが、チップに形成される、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記電極が、前記フローチャネル表面に形成される、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記フローチャネルが、密閉されている、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記１つまたは複数のフローチャネルが、複数のフローチャネルを含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記複数のフローチャネルが、前記複数のフローチャネルに沿ったガイドレールを用いて流体的に互いに分離されている、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記電極が、個々にアドレス可能な電極である、項目１に記載の方法。
（項目３５）
（ｃ）が、前記材料層の少なくとも一部が前記電極の全部または一部の上方に脂質二重層を形成しているか否かを決定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
ナノ細孔感知装置において使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
（ａ）複数の電極と前記複数の電極に隣接する材料層とを含むチップを提供することであって、前記材料層の各々は、脂質を含む、ことと、
（ｂ）前記材料層と緩衝溶液とを接触させることであって、前記緩衝溶液は、導電性である、ことと、
（ｃ）前記複数の電極の少なくともサブセットに刺激を加えることにより、前記材料層が前記複数の電極に隣接して脂質二重層を形成するように誘導することと、
（ｄ）必要に応じて、前記複数の電極に加えられた約−１００ミリボルト（ｍＶ）〜−１０００ｍＶの電圧パルスで、前記複数の電極の少なくとも約２０％が非活性化するまでステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことと
を含む、方法。
（項目３７）
前記複数の電極が、各々、個々にアドレス可能である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
工程（ｂ）および（ｃ）が、必要に応じて、前記加えられた電圧パルスで、前記複数の電極の少なくとも約６０％が非活性化するまで繰り返される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記加えられた電圧パルスが、約−４００ｍＶ〜−７００ｍＶである、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記刺激が、前記電極の表面の上方の液体の流れ、前記電極の表面の上方の１種または複数の異なる液体の連続的な流れ、前記電極の表面の上方の１つまたは複数の気泡の流れ、電気パルス、ソニケーションパルス、圧力パルス、または音パルスのうち少なくとも１つを含む、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記材料層の各々が、ポアタンパク質を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記ポアタンパク質が、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ（ＭｓｐＡ）、α溶血素、ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ（ＭｓｐＡ）もしくはα溶血素のうち少なくとも１つと少なくとも７０％の相同性を有する任意のタンパク質、またはそれらの任意の組合せである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
（ｃ）の後に、前記電極の少なくともサブセットを通して電気刺激を加えることにより、前記脂質二重層の各々における前記ポアタンパク質の挿入を容易にすることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
（ａ）が、
前記複数の電極と脂質溶液とを接触させることにより、前記材料層を形成すること
をさらに含み、前記脂質溶液が、前記脂質を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記脂質溶液が、有機溶媒を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記有機溶媒が、デカンを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４８）
前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、気泡を前記材料層の各々に隣接するように方向付けることをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目５１）
前記電極が、前記チップの１つまたは複数のフローチャネルにおいて密閉されている、項目３６に記載の方法。
（項目５２）
標的分子を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）感知電極に隣接して、またはその近傍に堆積させられた、膜中にナノ細孔を含むチップを提供することと、
（ｂ）核酸分子を前記ナノ細孔に方向付けることであって、前記核酸分子は、レポーター分子と会合しており、前記核酸分子は、アドレス領域とプローブ領域とを含み、前記レポーター分子は、前記プローブ領域で前記核酸分子と会合しており、前記レポーター分子は、標的分子にカップリングされている、ことと、
（ｃ）前記核酸分子が前記ナノ細孔に方向付けられている間、前記アドレス領域を配列決定することにより、前記アドレス領域の核酸配列を決定することと、
（ｄ）コンピュータプロセッサを用いて、（ｃ）で決定された前記アドレス領域の核酸配列に基づき前記標的分子を識別することと
を含む、方法。
（項目５３）
（ｂ）におけるプローブ分子が、前記核酸分子の前記プローブ領域へのレポーター分子の結合によって、細孔中に保持される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられるときに、前記核酸分子の最大３つの塩基が識別される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられるときに、前記核酸分子の最大５つの塩基が識別される、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記レポーター分子と前記ナノ細孔との相互作用のときに、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が、減少させられる、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
（ｂ）において、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度が、停止させられるか、または失速させられる、項目５２に記載の方法。
（項目５８）
（ｄ）の前に、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度が減少させられたか否かを決定することをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５９）
（ｄ）において、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられていると決定される場合、前記標的分子が識別される、項目５２に記載の方法。
（項目６０）
（ｄ）において、前記標的分子が、（ｉ）前記アドレス領域および会合部の核酸配列と、（ｉｉ）前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度との相関に基づき識別される、項目５２に記載の方法。
（項目６１）
前記ナノ細孔が、個々にアドレス可能である、項目５２に記載の方法。
（項目６２）
前記核酸分子が、一本鎖である、項目５２に記載の方法。
（項目６３）
前記ナノ細孔中に前記核酸分子を捕獲することをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目６４）
前記核酸分子が、前記核酸分子の末端部分の１つまたは複数に形成されているバルキーな構造を用いて、前記ナノ細孔中に捕獲される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記核酸分子が、前記核酸分子の末端部分の１つまたは複数に取り付けられているバルキーな構造を用いて前記ナノ細孔中に捕獲される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の流れの方向を逆転させることをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目６７）
前記核酸分子の流れの方向を逆転させると、前記アドレス領域の少なくとも一部を再度配列決定することをさらに含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記レポーター分子が、前記レポーター分子の末端部分に抗体またはアプタマーを含み、前記抗体またはアプタマーは、前記標的分子と会合している、項目５２に記載の方法。
（項目６９）
アドレス領域およびプローブ領域が、公知の核酸配列を有する、項目５２に記載の方法。
（項目７０）
前記レポーター分子が、前記プローブ領域の核酸配列に相補的な核酸配列を含む、項目５２に記載の方法。
（項目７１）
前記核酸分子が、前記のように方向付けられる前に前記レポーター分子と会合している、項目５２に記載の方法。
（項目７２）
（ｂ）の前に、前記核酸分子が、前記ナノ細孔を通って進み、（ｂ）において、前記レポーター分子が、前記ナノ細孔を通って進んだ前記核酸分子と会合している、項目５２に記載の方法。
概要
ナノ細孔は、核酸分子を包含するポリマーを配列決定して、および／または例えばタンパク質などの分子を検出するのに使用することができる。ポリマーの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。これを考慮して、核酸分子の識別、核酸の配列決定、および分子検出のための改良方法への必要性が認識されている。本明細書では、センサーの近傍で、脂質二重層（また本明細書では「二重層」ともいう）を形成して、二重層にナノ細孔を挿入する方法を説明する。