【手続補正書】
【提出日】平成28年10月11日(2016.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞のフォワードプログラミングにより肝細胞を産生する方法であって、前記方法は、（ａ）ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦＩＡおよびＴＢＸ３をコードする肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む少なくとも１つの外因性発現カセットで前記幹細胞をトランスフェクトする工程、および（ｂ）前記肝細胞またはその子孫細胞を懸濁培養物として培養する工程を含み、それにより前記幹細胞のフォワードプログラミングから肝細胞を産生する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの外因性発現カセットが、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞をＭＥＫ阻害剤および／またはＡＬＫ５阻害剤に接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＬＫ５阻害剤がＡ  ８３−０１である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞をサイクリックＡＭＰアナログに接触させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記サイクリックＡＭＰアナログが８−Ｂｒ−ｃＡＭＰである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞またはその子孫細胞が、レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的転写制御エレメントを含むレポーター発現カセットをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記肝細胞特異的転写制御エレメントが、アルブミン、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、シトクロムｐ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、アポリポタンパク質Ａ−ＩまたはＡＰＯＥのプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝細胞が、以下：
（ｉ）グルコース−６−ホスファターゼ、アルブミン、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＲ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、Ｉ型アルギナーゼ、シトクロムｐ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−１）またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の肝細胞マーカーの発現；
（ｉｉ）グルコース−６−ホスファターゼ、ＣＹＰ３Ａ４、胆汁の産生もしくは分泌、尿素の産生、または生体異物の解毒の活性；
（ｉｉｉ）肝細胞の形態学的特徴；または
（ｉｖ）免疫不全被験体におけるインビボでの肝臓の生着
を含む肝細胞の特性のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記肝細胞の特性がアルブミン発現である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
肝細胞について選択または濃縮する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞またはその子孫細胞が、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含む１つ以上の成長因子を含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記懸濁培養物がスピナーフラスコにおいて維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記スピナーフラスコが約４０〜７０ｒｐｍで作動される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記懸濁培養物が静置懸濁培養物として維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記条件における培養後に１５日未満または約１５日で前記肝細胞を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記条件における培養後に１０日未満または約１０日で前記肝細胞を得る工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
肝細胞に対する薬理学的または毒性学的効果について化合物を評価する方法であって、
前記方法は：
（ａ）請求項１による方法により提供された肝細胞を前記化合物に接触させる工程、および
（ｂ）前記肝細胞に対する前記化合物の薬理学的または毒性学的効果を評価する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
（ａ）ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３を含む１つ以上の外因性発現カセット、ならびに
（ｂ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的プロモーターを含むレポーター発現カセット
を含む、肝細胞または幹細胞。
【請求項２２】
１つ以上の外因性発現カセットを含む肝細胞または幹細胞であって、
１つ以上の前記外因性発現カセットは、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３を含み、前記外因性発現カセットのうちの少なくとも１つは、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている、肝細胞または幹細胞。
【請求項２３】
肝細胞を含む細胞集団であって、前記肝細胞の少なくとも８０％は、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３をコードする遺伝子を含む１つ以上の外因性発現カセットを含む、細胞集団。
【請求項２４】
幹細胞から肝細胞を産生する方法であって、前記方法は：
（ａ）ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３をコードする少なくとも肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む少なくとも１つの外因性誘導発現カセットで前記幹細胞をトランスフェクトする工程、
（ｂ）少なくとも１つの前記外因性誘導発現カセットの発現を誘導する工程、
（ｃ）前記幹細胞をＭＥＫ阻害剤および／またはＡＬＫ５阻害剤に接触させる工程、
（ｄ）前記幹細胞をサイクリックＡＭＰアナログに接触させ、それにより幹細胞から肝細胞を産生する工程、ならびに
（ｅ）前記幹細胞またはその子孫細胞を懸濁培養物として培養し、それにより幹細胞から肝細胞を産生する工程
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神内および範囲内の様々な変更および改変が当業者に明らかになるだろうという理由で、詳細な説明および特定の例が、本発明の好
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
幹細胞のフォワードプログラミングにより肝細胞を産生する方法であって、前記方法は、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦＩＡおよびＴＢＸ３をコードする肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む少なくとも１つの外因性発現カセットで前記幹細胞をトランスフェクトし、それにより前記幹細胞のフォワードプログラミングから肝細胞を産生する工程を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも１つの外因性発現カセットが、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記幹細胞をＭＥＫ阻害剤および／またはＡＬＫ５阻害剤に接触させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＡＬＫ５阻害剤がＡ  ８３−０１である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記幹細胞をサイクリックＡＭＰアナログに接触させる工程をさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記サイクリックＡＭＰアナログが８−Ｂｒ−ｃＡＭＰである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記幹細胞が間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞またはその子孫細胞が、レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的転写制御エレメントを含むレポーター発現カセットをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記肝細胞特異的転写制御エレメントが、アルブミン、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、シトクロムｐ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、アポリポタンパク質Ａ−ＩまたはＡＰＯＥのプロモーターである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記肝細胞が、以下：
（ｉ）グルコース−６−ホスファターゼ、アルブミン、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＲ）、アルコールデヒドロゲナーゼ１、Ｉ型アルギナーゼ、シトクロムｐ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−１）またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の肝細胞マーカーの発現；
（ｉｉ）グルコース−６−ホスファターゼ、ＣＹＰ３Ａ４、胆汁の産生もしくは分泌、尿素の産生、または生体異物の解毒の活性；
（ｉｉｉ）肝細胞の形態学的特徴；または
（ｉｖ）免疫不全被験体におけるインビボでの肝臓の生着
を含む肝細胞の特性のうちの１つ以上を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記肝細胞の特性がアルブミン発現である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
肝細胞について選択または濃縮する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記幹細胞またはその子孫細胞が、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含む１つ以上の成長因子を含む培地中で培養される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記肝細胞またはその子孫細胞を懸濁培養物として培養する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記懸濁培養物がスピナーフラスコにおいて維持される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記スピナーフラスコが約４０〜７０ｒｐｍで作動される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記懸濁培養物が静置懸濁培養物として維持される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記条件における培養後に１５日未満または約１５日で前記肝細胞を得る工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記条件における培養後に１０日未満または約１０日で前記肝細胞を得る工程を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
肝細胞に対する薬理学的または毒性学的効果について化合物を評価する方法であって、
前記方法は：
（ａ）項目１による方法により提供された肝細胞を前記化合物に接触させる工程、および
（ｂ）前記肝細胞に対する前記化合物の薬理学的または毒性学的効果を評価する工程
を含む、方法。
（項目２２）
（ａ）ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３を含む１つ以上の外因性発現カセット、ならびに
（ｂ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的プロモーターを含むレポーター発現カセット
を含む、肝細胞または幹細胞。
（項目２３）
１つ以上の外因性発現カセットを含む肝細胞または幹細胞であって、
１つ以上の前記外因性発現カセットは、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３を含み、前記外因性発現カセットのうちの少なくとも１つは、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている、肝細胞または幹細胞。
（項目２４）
肝細胞を含む細胞集団であって、前記肝細胞の少なくとも８０％は、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３をコードする遺伝子を含む１つ以上の外因性発現カセットを含む、細胞集団。
（項目２５）
幹細胞から肝細胞を産生する方法であって、前記方法は：
（ａ）ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ＡおよびＴＢＸ３をコードする少なくとも肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む少なくとも１つの外因性誘導発現カセットで前記幹細胞をトランスフェクトする工程、
（ｂ）少なくとも１つの前記外因性誘導発現カセットの発現を誘導する工程、
（ｃ）前記幹細胞をＭＥＫ阻害剤および／またはＡＬＫ５阻害剤に接触させる工程、ならびに
（ｄ）前記幹細胞をサイクリックＡＭＰアナログに接触させ、それにより幹細胞から肝細胞を産生する工程
を含む、方法。
（項目２６）
前記幹細胞またはその子孫細胞を懸濁培養物として培養する工程をさらに含む、項目２５に記載の方法。