(57)【要約】      （修正有）【課題】新規オリゴマーの新規合成又は精製用試薬の提供。【解決手段】式の化合物。2013151468.tif 000025［式中、Ｘは、ホスホラミダイト基、Ｈ−ホスホネート基、アセタール基又はイソシアネートであり、Ｃは、直接結合、又は−Ｃａ−Ｃｂ−により表される切断可能アダプターであり、Ｌは、ヒドロカルビル鎖であり、そしてＨは、末端アルキル又は活性化されたシクロオクチンである］により表される構造式を有する、オリゴヌクレオチドの合成又は精製のための試薬。本試薬はオリゴヌクレオチドの合成及び精製に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ａ：
Ｘ−Ｃ−Ｌ−Ｈ    （式Ａ）
［式中、
Ｘは、ホスホラミダイト基、Ｈ−ホスホネート基、アセタール基又はイソシアネートであり、
Ｃは、直接結合又は切断可能アダプターであり、前記切断可能アダプターは、−Ｃａ−Ｃｂ−により表され、ここでＣａはＸに結合され、そして直接結合、ヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル又はヌクレオシドであり、それらの個々は、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ又はアルキルアミノから選択された１〜２個の置換基により任意に置換され、Ｃｂは直接結合、シラニル基、トリチル基又はビシニルアルコール基であり、
Ｌは、５〜９員のヘテロアリール、４〜９員のヘテロシクリル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、−Ｏ−Ｒ”、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ”、−ＮＲ’−Ｒ”、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ”、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ”、−ＣＯ−Ｒ”、−ＣＮ、ハロゲン又はそれらの組み合わせからなる群からそれぞれ選択された１〜４個の置換基により任意に置換され得るヒドロカルビル鎖であり、ここでＲ′及びＲ”はそれぞれ、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビルであるか、又は
Ｌは、−（ＣＨＲ’）ａ−Ｗｂ−（ＣＨＲ’）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨＲ’）ｅ−（ここで、Ｗ及びＶはそれぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ′−であり、Ｒ′はＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ、０〜１０整数である）により表されるように、他の原子により散在されるヒドロカルビル鎖であり、
Ｈは、末端アルキル又は活性化されたシクロオクチンである］
により表される構造式を有する、オリゴヌクレオチドの合成又は精製のための試薬。
【請求項２】
Ｈが、活性化されたシクロオクチン基である請求項１記載の試薬。
【請求項３】
Ｃが、−Ｃａ−Ｃｂ−により表され、ここでＣａはＸに結合され、そして直接結合、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、５〜１２員のヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、４〜１２員のヘテロシクリル又はヌクレオシドであり、それらの個々は、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ又はアルキルアミノから選択された１〜２個の置換基により任意に置換され、Ｃｂは直接結合、シラニル基、トリチル基又はビシニルアルコール基である請求項１記載の試薬。
【請求項４】
（１）Ｌが、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル又は（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択されたヒドロカルビル基であり、それらの個々は、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル又はハロゲンから選択された基により任意に置換され得、又は、
（２）Ｌは、−（ＣＨ２）ａ−Ｗｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨ２）ｅ−の一般式により表され、前記式中、Ｗ及びＶはそれぞれ−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ′−であり、Ｒ′は水素又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）であり、そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ及びｅはそれぞれ、０〜１０の整数である請求項１記載の試薬。
【請求項５】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2013151468.tif 000021
［式中、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−から選択された結合官能基であり、ここでＲ′は水素又は（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビルである］
で表される構造式を有する請求項２〜４のいずれか一項記載の試薬。
【請求項６】
Ａ）Ｘが、ホスホラミダイト基であり、そして前記試薬が、以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2013151468.tif 000022
［式中、Ｒは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又はシアノエチルである］
により表される構造式を有するか、
Ｂ）Ｘが、Ｈ−ホスホネート基であり、そして前記試薬が、以下の式（ＩＩＩ）：
【化３】
2013151468.tif 000023
［式中、Ｒは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又はシアノエチルである］
により表される構造式を有するか、又は
Ｃ）Ｘが、イソシアネート基であり、そして前記試薬が、以下の式（ＩＶ）：
【化４】
2013151468.tif 000024
により表される構造体を有する請求項２〜５のいずれか一項記載の試薬。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを合成する方法であって、
（ａ）固体支持体上のオリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシ保護基を脱保護し、固体支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離５′―ヒドロキシ基を生成するステップと、
（ｂ）前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離５′−ヒドロキシ基に、５′ヒドロキシ保護基を含むヌクレオチドモノマーを、前記ヌクレオチドモノマー上の３′−リン含有基を通してカップリングするステップと、
（ｃ）請求項１〜９のいずれか一項記載の試薬であるキャッピング剤を用いて、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの未反応５′−ヒドロキシ基をキャッピングするステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を、複数の回数で反復し、前記固体支持体上にポリヌクレオチドを生成するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記キャッピング剤が、式（Ｉ）により表される請求項７記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）のＸが、−Ｐ（ＯＲ１３）（ＮＲ１４Ｒ１５）（Ｒ１３がシアノエチルであり、そしてＲ１４及びＲ１５の個々がそれぞれ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）により表されるホスホラミダイト基である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ｅ）前記固体支持体からポリヌクレオチドを脱保護し、そして切断し、生成物の混合物を生成するステップと、
（ｆ）前記生成物の混合物の溶液と、アジド含有固体支持体又はニトロン含有固体支持体とを反応せしめるステップと、
（ｇ）前記固体支持体から、ポリヌクレオチドを含む溶液を分離するステップと
をさらに含む請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してオリゴヌクレオチドの試薬、合成及び精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーであり、通常、数個〜数百個のヌクレオチドを含む。それらは、ゲノム研究及びバイオテクノロジーのための重要な手段である。オリゴヌクレオチドは、より長い前駆体の切断により生成することができるが、現在では、それらは、一般的に、配列特異的な方法でモノマーから合成される。それらは、通常は、ホスホラミダイト化学又はホスホネート化学を用い、固相支持体上で合成される。
【０００３】
図１Ａは、ホスホラミダイトを用いた、固相オリゴヌクレオチド合成の典型的合成サイクルを示す。４つの主な工程：１）脱トリチル化、２）カップリング、３）キャッピング、及び４）酸化が含まれる。図１に示すように、第一のヌクレオチドは固相支持体（調整された細孔のガラスビーズ）に化学的に結合する。それらは、第一のヌクレオチドが固相支持体に予め結合された状態で商業源から購入することができる。
【０００４】
合成を開始するために、第一のヌクレオチド上の５’−ヒドロキシ保護基（通常に用いられる５’−ヒドロキシル保護基は、トリチル（すなわち、−Ｃ（Ｐｈ）３）又はＤＭＴ、ＤＭＴｒと省略される場合がある４，４’−ジメトキシトリチル基）は、緩酸（例えば、ジクロロメタン又はトルエンのような不活性溶媒中の２又は３％トリクロロ酢酸）を用いて除去される。次いで、３’−ホスホラミダイト基を有する５’−ＤＭＴｒで保護された第二のヌクレオチド（例えば、３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ−Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト）を、固相支持体上の遊離の第一のヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基とカップリングさせる。カップリングは、アセトニトリル中、酸性アゾール触媒（例えば、１Ｈ−テトラゾール）を用い、ホスホラミダイトを活性化して実施することができる。次いで、活性化されたホスホラミダイトを遊離の５’−ヒドロキシル基と反応させ、ホスファイトトリエステル結合を形成する。
【０００５】
カップリング反応は、決して１００％の効率でないので、いくらかの遊離５’−ヒドロキシル基が残る。任意の未反応の５’−ヒドロキシル基は無水酢酸及びアシル化触媒（例えば、Ｎ−メチルイミダゾール）とキャッピングし、次のサイクルにおける反応からの不良配列を防止する。キャッピング後、ホスファイトトリエステルを酸化し、それをホスフェート結合に変換する。酸化は、弱塩基（例えば、ピリジン）の存在下、ヨウ素を用いて実施することができる。これらの工程は、最初のカップリングサイクルを完了する。この工程を、所望のオリゴヌクレオチドが合成されるまで多くのサイクル繰り返すことができる。
【０００６】
同様の方法を図１Ｂに示し、これは、ホスホラミダイトの代わりにＨ−ホスホネートモノマーを用いている。１回のみの酸化工程を必要とし、これが合成の最後で実施されることを除き、ほとんどの工程は類似している。
【０００７】
鎖伸長の完了において、オリゴヌクレオチドは、固相支持体に結合したままであり、完全に保護されている。機能的オリゴヌクレオチドを提供するため、保護基を除去する必要があり、オリゴヌクレオチド生成物を固相支持体から遊離しなければならない。これらは、塩基溶液（例えば、水酸化アンモニウム又はメチルアミン水溶液）と、おそらくは他の前処理工程（例えば、２−シアノエチル保護基の脱保護）とを用いて実施することができる。
【０００８】
前記合成手順は、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーの合成に適用可能である。しかし、ＲＮＡ合成については、２’−ヒドロキシル基を、反応条件に耐え得る基で保護することが必要である。通常の２’−ヒドロキシ保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）及びトリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）が含まれる。
【０００９】
一般に、カップリング工程は１００％完全ではない。不完全な反応が短いオリゴマーの形成をもたらす。前述したように、短いオリゴマーは、通常、反復性の固相合成の際に、それらが成長することを防止するため、無水酢酸のような試薬でキャップオフされる。これは、通常、短いオリゴマー（ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３等のオリゴマー）及び所望の全長生成物からなるオリゴマーのプールをもたらす。図２Ａ及び２Ｂは、生成物がいくつかの不成功の配列を含む混合物であるという事実を示すため、それぞれＨＰＬＣクロマトグラム及びＰＡＧＥ分析を示す。
【００１０】
オリゴヌクレオチド合成からの生成物は、常に不成功の配列（短いオリゴヌクレオチド、大部分はｎ−１量体）を含んでいる。伝統的に、これらの粗生成物は、ＨＰＬＣ又はＰＡＧＥのようなゲル電気泳動を用いて精製される。これらの方法は、短いオリゴヌクレオチドの精製のためには受け入れられ、より長いオリゴヌクレオチド（例えば、５０〜３００量体）の精製のためには受け入れられない。さらに、これらの方法は高価であり時間がかかり、莫大な溶媒を消費し、熟練した専門家の使用には制限がある。
【００１１】
オリゴヌクレオチドの合成及び精製を促進するため、ＨＰＬＣ又はＰＡＧＥの使用を回避する合成精製ハンドルを用いるような、他のアプローチが研究されてきた。これらの他の方法の例には、フルオラス−親和性抽出（Ｂｅｌｌｅｒ，Ｃ．；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．，Ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｏｕｓ−Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｆａ  ２００５，８８，ｐｐ．１７１−１７９；ＷＯ  ２００６／０８１０３５  Ａ２）、ビオチン−アビジンの可能な親和性抽出（Ｆａｎｇ，Ｓ．；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００１；Ｆａｎｇ，Ｓ．；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ５’−ｅｎｄ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＮＡ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４，４５（４３），７９８７−７９９０）、ディールスアルダーによる反応をベースとする抽出法（ＷＯ  ２００３／０６２４５２  Ａ２）、及び重合（米国特許出願公開第２００８／００８１９０２  Ａ１号）が含まれる。
【００１２】
親和性をベースとする方法（すなわち、フルオラス親和性抽出及びビオチン−アビジン法）は、高価であり得る、タグをつけたオリゴヌクレオチドハンドルを生成するために、複合合成を必要とする。フルオラス親和性抽出の場合、フルオラス含有リン酸化試薬が非常にゆっくりとカップリングするので、長いオリゴヌクレオチド合成のためにキャッピング剤として用いることができない。最後のモノマーとして用いるために、５’−ＤＭＴｒフルオラス修飾ホスホラミダイトモノマーは、アセトニトリル中でわずかに溶解し、ゆっくりと非効率的にカップリングする。それらは、最終的な酸処理をも必要とし、それは、脱プリンを起こし、長いオリゴヌクレオチドの完全性に影響する。この戦略は、複雑さ及び費用を増大させるフルオラス相親和性カラムをも必要とし、これは、高い処理能力及び大規模精製できない。
【００１３】
ビオチン−アビジンの可能な親和性抽出は広範囲に用いられておらず、不成功の配列を捕捉するためのキャッピング試薬として用いられていなかった。ビオチンリン酸化試薬、又は５’−修飾ホスホラミダイトモノマーは、ビオチン自体の費用のため、製造するには高価である。さらに、ビオチンホスホラミダイト（リン酸化試薬及びモノマー）はアセトニトリルには溶性が低く、推奨されるカップリング時間は遅い（すなわち、約１５分）。従って、それらはキャッピング試薬として有用でない。さらに、この方法は、長いオリゴヌクレオチドのためには有用であることが確認されていない。また、この方法は、ストレプトアビジン−ビーズに対するビオチンの親和性に依存し、これは、高処理能力又は大規模プラットフォームにおいては高価である。
【００１４】
親和性をベースとするアプローチに対する費用及び他の問題のため、例えば、反応をベースとする代わりの方法が調査された。これらの方法には、ディールスアルダー及び重合を用いるものが含まれる。ディールスアルダーアプローチにおいては、ジエン−リン酸化試薬が、先端が切断された配列をキャッピングするために用いられ、マレイミド含有固相支持体との４＋２環化により、生成物混合物から引き出すことができる。実際には、この方法は、短いオリゴヌクレオチド（２０量体未満）の精製に制限され、非効率的反応のために最終収率及び純度は不十分である。
【００１５】
重合法は、先端が切断された（不成功の）配列をキャッピングオフするために、アクリルアミドリン酸化試薬を用いる。合成の完了により、ラジカル重合を開始してポリマーを形成し、次いで、これは、完全長生成物から分離することができる。アクリルアミドホスホラミダイトモノマーは、鎖内で最後のヌクレオチドとしても用いられ、全長生成物は、ラジカル重合によって捕捉され、その結果、アクリルアミド部分を含まない短いオリゴマーから分離される。また、この方法は、短いオリゴヌクレオチド、例えば２０量体未満に実用的であり、ラジカル重合が副反応のために所望のオリゴヌクレオチドの完全性を変化させる場合があることが懸念されている。さらに、所望の完全長生成物の純度及び回収率は最適のものに満たない。従って、この方法は、高処理能力精製又は大規模生産には適さない場合がある。
【００１６】
これらの先行技術の方法は、ある状況においては有用であるが、オリゴヌクレオチドの合成及び精製のための良好な方法が必要性である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの合成又は精製のための試薬であって、この試薬が、構造：
Ｘ−Ｃ−Ｌ−Ｈ  （式Ａ）
を有する試薬に関する。
式中、Ｘは、反復性のヌクレオチドカップリングサイクル、オリゴヌクレオチド合成の脱保護及び切断反応に耐える安定な結合を形成するための、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の５’−ヒドロキシル基と反応し得る官能基であり、適切なＸ官能基はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、アセタール、イソシアネート等を含み、
Ｃは、直接結合又は切断可能なアダプターであり、上記切断可能なアダプターは−Ｃａ−Ｃｂ−で表され、ＣａはＸに結合し、それぞれ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ又はアルキルアミノから選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい、直接結合、ヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、トリチル基又はビシニルアルコール基である。好ましくは、Ｃａは、直接結合、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、５〜１２員環のヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、４〜１２員環のヘテロシクリル、ヌクレオシドである。
Ｌは、独立して、５〜９員環のヘテロアリール、４〜９員環のヘテロシクリル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、−Ｏ−Ｒ’’，−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよいヒドロカルビル鎖であり、ここで、Ｒ’及びＲ’’は、独立してＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビルであり、好ましくは、Ｌは、それぞれ、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル又はハロゲンから選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル、又は（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルのようなヒドロカルビルであり、又は、Ｌは、−（ＣＨＲ’）ａ−Ｗｂ−（ＣＨＲ’）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨＲ’）ｅ−（ここで、Ｗ及びＶは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ’−であり、Ｒ’はＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜６であり、又は好ましくは０〜３であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの合計は好ましくは２〜６の整数である）により表される、他の原子が散在するヒドロカルビル鎖であり。
Ｈは、前記で定義される「クリックハンドル（ｃｌｉｃｋ  ｈａｎｄｌｅ）」であり、末端アルキン又は活性化シクロオクチンを含んでもよい。
【００１８】
本発明の一態様は、活性化シクロオクチン化合物に関する。本発明の一実施形態による活性化シクロオクチン化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
2013151468.tif 000002
（式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ここで、Ｒ’は水素又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシである）から選択される連結官能基であり、Ｘ、Ｃ及びＬは前記も定義した通りである。）により示される一般構造を有する。
【００１９】
本発明の一態様は、Ｘがホスホラミダイトを含む、式（Ｉ）の化合物に関する。これらの化合物は、式（ＩＩ）：
【化２】
2013151468.tif 000003
（式中、リンカーＬ、Ｃ及びＹは前記に定義した通りであり、Ｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又はシアノエチルである。）に示される一般構造を有する。ホスホラミダイト基は、ヒドロキシル基と反応し、オリゴヌクレオチドの合成及び脱保護のための条件下で安定なホスフェート結合を形成し得る。
【００２０】
本発明の一態様は、ＸがＨ−ホスホネートを含む式（Ｉ）の化合物に関する。これらの化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2013151468.tif 000004
（式中、リンカーＬ、Ｙ、Ｃ及びＲは前記に定義した通りである。）に示される一般構造を有する。Ｈ−ホスホネート基は、ヒドロキシル基と反応し、オリゴヌクレオチドの合成及び脱保護のための条件下で安定なホスフェート結合を形成し得る。
【００２１】
本発明の一態様は、Ｘがイソシアネート基を含む式（Ｉ）の化合物に関する。これらの化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化４】
2013151468.tif 000005
（式中、リンカーＬ、Ｙ及びＣは前記に定義した通りである。）に示される一般構造を有する。シアネート基は、ヒドロキシル基と反応し、オリゴヌクレオチドの合成及び脱保護のための条件下で安定なカルバメート結合を形成し得る。
【００２２】
本発明の一態様は、以下に示す構造を有する式（ＩＩ）の化合物に関する。
【化５】
2013151468.tif 000006
【００２３】
本発明の一態様はポリヌクレオチドの合成方法に関する。本発明の一態様における方法は、以下のステップを含む。
（ａ）固相支持体上のオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ保護基を脱保護して、固相支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離の５’−ヒドロキシ基を生成するステップ、
（ｂ）５’−ヒドロキシ保護基を含むヌクレオチドモノマーを、ヌクレオチドモノマー上の３’−リン（ｐｈｏｓｐｏｒｕｏｕｓ）含有基を通して固相支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離の５’−ヒドロキシ基とカップリングするステップ、
（ｃ）式（Ａ）の試薬を用いて、固相支持体上のオリゴヌクレオチドの未反応の５’−ヒドロキシ基をキャッピングするステップ、及び
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を選択された回数繰り返し、固体支持体上に中間体ポリヌクレオチドを生成するステップ。
【００２４】
本発明のある実施形態は、
（ｅ）中間体ポリヌクレオチド上の５’−ヒドロキシ保護基を脱保護するステップと、
（ｆ）最終的なヌクレオチドモノマーを、中間体ポリヌクレオチドとカップリングし、最終的なポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む。
【００２５】
本発明のある実施形態は、
（ｇ）固相支持体から最終的なポリヌクレオチドを脱保護及び切断して、生成物混合物を生成するステップと、
（ｈ）生成物混合物の溶液を、アジド含有固相支持体又はニトロン含有固相支持体と反応させるステップと、
（ｉ）アジド含有又はニトロン含有固相支持体から、ポリヌクレオチドを含有する溶液を分離するステップをさらに含む。
【００２６】
本発明の他の実施形態によるポリヌクレオチドの合成方法は、以下のステップを含む。
（ａ）固相支持体上のオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ保護基を脱保護して、固相支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離の５’−ヒドロキシ基を生成するステップ、
（ｂ）５’−ヒドロキシ保護基を含むヌクレオチドモノマーを、ヌクレオチドモノマー上の３’−リン（ｐｈｏｓｐｏｒｕｏｕｓ）含有基を通して固相支持体上のオリゴヌクレオチドの遊離の５’−ヒドロキシ基とカップリングするステップ、
（ｃ）キャッピング試薬を用いて、固相支持体上のオリゴヌクレオチドの未反応の５’−ヒドロキシ基をキャッピングするステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を選択された回数繰り返し、固体支持体上に中間体ポリヌクレオチドを生成するステップ、
（ｅ）中間体ポリヌクレオチド上の５’−ヒドロキシ保護基を脱保護するステップ、及び
（ｆ）最終的なヌクレオチドモノマー（最終的なヌクレオチドモノマーは式（Ａ）の試薬を含む）を、中間体ポリヌクレオチドとカップリングし、最終的なポリヌクレオチドを生成するステップ。
【００２７】
本発明のある実施形態は、
（ｇ）固相支持体から最終的なポリヌクレオチドを脱保護及び切断して、生成物混合物を生成するステップと、
（ｈ）生成物混合物の溶液を、アジド含有固相支持体又はニトロン含有固相支持体と反応させ、固相支持体に結合した完全長ポリヌクレオチドを生成するステップと、
（ｉ）アジド含有又はニトロン含有固相支持体に結合した、完全長ポリヌクレオチドを分離するステップをさらに含む。
【００２８】
前記方法は、アジド含有又はニトロン含有固相支持体から、完全長ポリヌクレオチドを遊離させるステップをさらに含んでいてもよい。本発明のある実施形態は、遊離した完全長ポリヌクレオチドを精製するステップをさらに含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の他の態様及び利点は、以下の説明及び添付した特許請求の範囲の記載から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】固相支持体上でのポリヌクレオチドの合成のための従来のホスホラミダイト法を示す。この方法は、４つの工程：脱保護、カップリング、キャッピング、及び酸化を含む。
【図１Ｂ】固相支持体上でのポリヌクレオチドの合成のための従来のＨ−ホスホネート法を示す。
【図２】図２Ａは、本発明の一実施形態による、活性化シクロオクチン試薬を示し、図２Ｂは、図２Ａの試薬を用いた、ポリヌクレオチドの合成及び精製のための本発明の方法を示す概略図を示す。
【図３】図３Ａは、本発明のある実施形態による、２種の活性化シクロオクチン試薬を示し、図３Ｂは、図３Ａの試薬を用いた、ポリヌクレオチドの合成及び精製のための本発明の方法を示す概略図を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による、キャッピング剤として末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬を用いた、オリゴヌクレオチド合成サイクルを示す概略図を示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態による、最後のヌクレオチド又は末端の５’−ヒドロキシル基保護剤として末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬を用いた、オリゴヌクレオチド合成サイクルを示す概略図を示す。  図５は、本発明の一実施形態による、最後のヌクレオチド又は末端の５’−ヒドロキシル基保護剤として末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬を用いた、オリゴヌクレオチド合成サイクルを示す概略図を示す。
【図６】図６は、３種のオリゴヌクレオチドについての捕捉時間に対する反応を示す３つのグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の実施形態は、新規な末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬、並びにオリゴヌクレオチドを合成及び精製する方法に関する。新規な末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬は、ヒドロキシル基と反応する官能基を含んでいてもよく、ポリヌクレオチドの合成及び脱保護のための条件下に安定な結合を形成する。官能基には、ホスホラミダイト基、Ｈ−ホスホネート基、アセタール基、又はイソシアネート基が含まれ得る。本発明の方法は、新規な末端アルキン又は活性化シクロオクチン試薬、並びに「クリック」ケミストリーを用い、オリゴヌクレオチド生成物の精製を容易にする。本発明の実施形態は相対的に長いオリゴヌクレオチド（例えば、５０量体以上）で最も有利であるが、当業者は、本発明の実施形態の利点が、短いオリゴヌクレオチドを含む、あらゆるオリゴヌクレオチドで実施し得ることを理解するであろう。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」は、ヌクレオチド内結合により結合する、複数のヌクレオシド部分サブユニット又はヌクレオシド残基を含む化合物を意味する。それ自体は、複数のヌクレオチド部分サブユニット又はヌクレオチド残基を含む化合物をも意味する。
【００３３】
「ヌクレオシドモノマー」は、ポリヌクレオチドの一部でないヌクレオシドである。ヌクレオシドモノマーは、ヌクレオシドモノマーの意図された用途に必要であるような基をも含んでいてもよい。ヌクレオシドモノマーは遊離していても、固相支持体と結合していてもよい。例えば、複素環塩基保護基及び１個以上のヒドロキシル保護基を有するヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドモノマーの合成における合成中間体である場合がある。例えば、ヌクレオシドモノマーは、ポリヌクレオチドの合成のために、固相支持体に結合していてもよい。
【００３４】
「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリン及びピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はウラシル（Ｕ）のみでなく、修飾されている、他の複素環塩基又はヌクレオ塩基を含む部分を含むことをも意図する。このような修飾には、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、アルキル化リボース又は他の複素環が含まれる。このような修飾には、例えば、ジアミノプリン及びその誘導体、イノシン及びその誘導体、アルキル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、チオレート化プリン又はピリミジン等、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメート、置換チオウレアのような保護基の付加したものが含まれる。プリン又はピリミジン塩基は、前述のものの類似体であってもよく、適切な類似体は当業者に公知であり、適切なテキスト及び文献に開示されている。通常の類似体には、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン及び２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
さらに、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語には、通常のリボース及びデオキシリボース糖、並びに通常の立体異性体だけでなく、他の糖類、Ｌエナンチオマー及びアルファアノマーを含む部分も含まれる。修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドには、例えば、１個以上のヒドロキシル基が、ハロゲン原子又は脂肪族基で置換されているか、又はエーテル、アミン等として官能性を持たせた、糖部分の修飾も含まれる。「類似体」は、文献において模倣体、誘導体であり、類似の構造を有し、又は他の類似の用語として認識されている構造的特徴を有する分子を意味し、例えば、非天然（天然には通常は存在しない）ヌクレオチドに組み入れられたポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾールを含むが、これらに限定されない２’−修飾ヌクレオシドのような非天然ヌクレオチド模倣体、並びに式（Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル、例えば、直鎖及び環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、及び（ＰＥＧ）−含有基、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴマーヌクレオシドホスホネート、及び保護基又は連結基のような置換基を付加したポリヌクレオチドが含まれる。
【００３６】
「ホスホラミダイト基」という用語は、構造−Ｐ（ＯＲ１３）（ＮＲ１４Ｒ１５）（Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、複素環、置換複素環、アリール又は置換アリールである）を含む基を意味する。ある実施形態においては、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、低級アルキル、低級アリール、置換低級アルキル及び低級アリール（好ましくは１８、１６、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個以下の炭素を含む構造で置換されている）から選択してもよい。ある実施形態においては、Ｒ１３は２−シアノエチル又はメチルであり、Ｒ１４及びＲ１５のいずれか又は両者はイソプロピルである。Ｒ１４及びＲ１５は環状で接続していてもよい。
【００３７】
「Ｈ−ホスホネート」という用語は、構造-Ｐ−（Ｏ）（Ｈ）（ＯＲ１６）（Ｒ１６はＨ、アシル、置換アシル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、複素環、置換複素環、アリール又は置換アリールである）を含む基を意味する。ある実施形態においては、Ｒ１６は、低級アルキル、低級アリール、置換低級アルキル及び低級アリール（好ましくは１８、１６、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個以下の炭素を含む構造で置換されている）から選択してもよい。ある実施形態においては、Ｒ１６はピバロイル又はアダマントイルである。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「アルキル」という用語は、特に示さない限り、１〜２４個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル）の、飽和の直鎖、分岐鎖又は環状炭化水素基、一般的に１〜１２個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル）、より一般的に１〜６個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルを意味する。「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルが含まれる。「シクロアルキル」という用語は、環状アルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルを意味する。
【００３９】
「アルキレン」及び「アルキレン鎖」は、分子の残りがラジカル基と結合し、単に炭素及び水素からなり、不飽和を含まず、１〜１２個の炭素原子を有し、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐の二価の炭化水素鎖、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン等を意味する。アルキレン鎖は、鎖内の１個の炭素を通し、又は鎖内の任意の２個の炭素を通し、分子の残りと結合し、ラジカル基と結合していてもよい。
【００４０】
さらに、「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子を有し、さらに追加の基、例えば、エーテル−、チオ−、アミノ−、ホスホ−、オキソ−、エステル−及びアミド−から選択される１個以上の結合を有し、及び／又は低級アルキル、アリール、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシ、アミノ、スルホニル、チオ、メルカプト、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、及びボロニルを含む１個以上の追加の基で置換されているアルキル基について言及する「修飾アルキル」を含む。
【００４１】
同様に、「低級アルキル」という用語は、１〜８個の炭素原子を有し、さらに追加の基、例えば、エーテル−、チオ−、アミノ−、ホスホ−、ケト−、エステル−及びアミド−から選択される１個以上の結合を有し、及び／又は低級アルキル、アリール、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、アミノ、スルホニル、チオ、メルカプト、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、及びボロニルを含む１個以上の追加の置換基で置換されている基について言及する「修飾低級アルキル」を含む。本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」という用語は、置換基−Ｏ−Ｒ（Ｒは前記で定義したアルキルである）を意味する。「低級アルコキシ」という用語は、Ｒが低級アルキルである、上記基を意味する。本明細書で用いられる場合、「チオアルキル」という用語は、置換基−Ｓ−Ｒ−（Ｒは前記で定義したアルキルである）を意味する。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」という用語は、特に示さない限り、少なくとも１個の二重結合を含む、分岐、非分岐又は環状（例えば、Ｃ５及びＣ６の場合）の２〜２４個の炭素原子（すなわち、（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル）、一般的には２〜１２個の炭素原子（すなわち、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル）、より一般的には２〜６個の炭素原子（すなわち、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル）の炭化水素基、例えば、エテニル、ビニル、アリル、オクテニル、デセニル等を意味する。「低級アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素原子のアルケニル基を意味し、具体的にはビニル及びアリルが含まれる。「シクロアルケニル」という用語は、環状アルケニル基を意味する。
【００４３】
「アルケニレン」及び「アルケニレン鎖」は、分子の残りがラジカル基と結合し、単に炭素及び水素からなり、少なくとも１個の二重結合を有し、２〜１２個の炭素原子を有する、直鎖又は分岐の二価の炭化水素鎖、例えば、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン等を意味する。アルケニレン鎖は、単結合を通して分子の残りの部分と、二重結合又は単結合を通してラジカル基と結合している。アルケニレン鎖の分子の残り、及びラジカル基との結合点は、鎖内の１個の炭素又は任意の２個の炭素を通してもよい。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」という用語は、特に示さない限り、２〜２４個、通常は２〜１２個の炭素原子を含有し、少なくとも１個の三重結合を有する、分岐又は非分岐の炭化水素基、例えば、アセチレニル、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニル等を意味する。「低級アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素原子のアルキニル基を意味し、例えば、アセチレニル及びプロピニルが含まれ、「シクロアルキニル」という用語は、環状アルキニル基を意味する。
【００４５】
「ヒドロカルビル」という用語は、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、又はアルキニルを意味する。ヒドロカルビル基中の炭素原子の数は、例えば、１〜１２個の炭素原子を含むヒドロカルビルを示す「（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル」として示してもよい。異なる炭素原子数を有するヒドロカルビル基は、類似の表記法において示すことができる。「置換ヒドロカルビル」という用語は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するヒドロカルビル部分を意味する。このような置換基には、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル又はアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、又はチオホルメート）、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、複素環、アラルキル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分が含まれる。適切であれば、炭化水素鎖上で置換された部分自体が置換されていてもよいことを当業者は理解するであろう。例えば、置換アルキルの置換基には、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイル及びスルホネートを含む）、及びシリル基、並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、及びエステルを含む）、−ＣＮ等の置換及び非置換形態が含まれる。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＮ等でさらに置換されていてもよい。
【００４６】
「アルコキシ」という用語は、酸素と結合したアルキル基を意味し、式Ｒ−Ｏ−（ここで、Ｒは前記で定義されたアルキル基を意味する）で表される。例は、メトキシ基ＣＨ３Ｏ−である。「（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ」という用語は、１〜６個の炭素原子を含む、前記で定義したアルコキシラジカルを意味する。異なる数の炭素を含むアルコキシは、類似の表記法、例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１２）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ１２）アルコキシ等で示されるであろう。
【００４７】
「アリール」は、水素及び炭素のみからなり、６〜１９個の炭素原子（（Ｃ６−Ｃ１９）アリールと表される）、好ましくは６〜１０個の炭素原子（（Ｃ６−Ｃ１０）アリールと表される）を含む芳香族単環、又はそれらのいくつかが一緒に縮合した多環の炭化水素環系を意味し、環系は部分的又は完全に飽和していてもよい。アリール基には、例えば、フルオレニル、フェニル及びナフチルのような基が含まれるが、これらに限定されない。明細書中で特に示さない限り、「アリール」という用語は、（Ｃ１−１２）ヒドロカルビル、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせ（ここで、Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルであり、Ｒは（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルである）から選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい、アリールラジカルを含むことが意図される。
【００４８】
「ヘテロアリール」は、炭素原子と、窒素、酸素及びイオウからなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子からなる、５〜１８員環の単環、二環又は縮合多環系を意味する。好ましくは、ヘテロアリールは、５〜１２、又は５〜９員環系である。本発明の目的のためには、ヘテロアリールラジカルは、縮合又は架橋環系を含んでいてもよい、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、ヘテロアリールラジカル中の窒素、炭素又はイオウ原子が酸化されていてもよく、窒素原子は四級化されていてもよい。例には、アゼピニル、アクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズインドリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、インドリジニル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、及びチオフェニルが含まれるが、これらに限定されない。明細書中で特に示さない限り、「ヘテロアリール」という用語は、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせから選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい、前記で定義したヘテロアリールラジカルを含むことを意図する（Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ、又は（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルであり、Ｒは（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルである）。
【００４９】
「ヘテロアリール」という用語は、芳香族複素環が、１個以上のアリール、脂環式又は複素環と縮合しており、ラジカル又は結合ポイントが芳香族複素環上である基をも意味する。非限定的例には、１−，２−，３−，５−，６−，７−，又は８−インドリジニル，１−，３−，４−，５−，６−，又は７−イソインドリル、２−，３−，４−，５−，６−，又は７−インドリル、２−，３−，４−，５−，６−，又は７−インダゾリル、２−，４−，５−，６−，７−，又は８−プリニル、１−，２−，３−，４−，６−，７−，８−，又は９−キノリジニル、２−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−キノリニル、１−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−イソキノリニル、１−，４−，５−，６−，７−，又は８−フタラジニル、２−，３−，４−，５−，又は６−ナフチリジニル、２−，３−，５−，６−，７−，又は８−キナゾリニル、３−，４−，５−，６−，７−，又は８−シンノリニル、２−，４−，６−，又は７−プテリジニル、１−，２−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−４ａＨカルバゾリル、１−，２−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−カルバゾリル、１−，３−，４−，５−，６−，７−，８−，又は９−カルボリニル、１−，２−，３−，４−，６−，７−，８−，９−，又は１０−フェナントリジニル、１−，２−，３−，４−，５−，６−，７−，８−，又は９−アクリジニル、１−，２−，４−，５−，６−，７−，８−，又は９−ペリミジニル、２−，３−，４−，５−，６−，８−，９−，又は１０−フェナトロリニル、１−，２−，３−，４−，６−，７−，８−，又は９−フェナジニル、１−，２−，３−，４−，６−，７−，８−，９−，又は１０−フェノチアジニル、１−，２−，３−，４−，６−，７−，８−，９−，又は１０−フェノキサジニル、２−，３−，４−，５−，６−，又はｌ−，３−，４−，５−，６−，７−，８−，９−，又は１０−ベンズイソキノリニル、２−，３−，４−，又はチエノ［２，３−ｂ］フラニル、２−，３−，５−，６−，７−，８−，９−，１０−，又は１１−７Ｈ−ピラジノ［２，３−ｃ］カルバゾリル、２−，３−，５−，６−，又は７−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］−ピラニル、２−，３−，４−，５−，７−，又は８−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］−ｏ−オキサジニル、１−，３−，又は５−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］−オキサゾリル、２−，４−，又は５４Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］チアゾリル、３−，５−，又は８−ピラジノ［２，３−ｄ］ピリダジニル、２−，３−，５−，又は６−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、１−，３−，６−，７−，８−，又は９−フロ［３，４−ｃ］シンノリニル、１−，２−，３−，４−，５−，６−，８−，９−，１０，又は１１−４Ｈ−ピリド［２，３−ｃ］カルバゾリル、２−，３−，６−，又は７−イミダゾ［１，２−ｂ］［１，２，４］トリアジニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−，４−，５−，６−，又は７−ベンゾキサゾリル、２−，４−，５−，６−，又は７−ベンズイミダゾリル、２−，４−，４−，５−，６−，又は７−ベンゾチアゾリル、１−，２−，４−，５−，６−，７−，８−，又は９−ベンゾキサピニル、２−，４−，５−，６−，７−，又は８−ベンゾキサジニル、１−，２−，３−，５−，６−，７−，８−，９−，１０−，又は１１−１Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］［２］ベンズアザピニルが含まれるが、これらに限定されない。通常の縮合ヘテロアリール基には、２−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−キノリニル、１−，３−，４−，５−，６−，７−，又は８−イソキノリニル、２−，３−，４−，５−，６−，又は７−インドリル、２−，３−，４−，５−，６−，又は７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−，４−，５−，６−，又は７−ベンゾキサゾリル、２−，４−，５−，６−，又は７−ベンズイミダゾリル、２−，４−，５−，６−，又は７−ベンゾチアゾリルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
「シクロアルキル」は、単に炭素及び水素原子からなり、３〜１５個の炭素原子を有し、好ましくは、３〜１２個の炭素原子を有し、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキルであり、飽和又は不飽和であり、単結合により分子の残りの部分に結合している安定した非芳香族単環又は二環式炭化水素ラジカルを意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル等である。明細書中で特に示さない限り、「シクロアルキル」という用語は、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよいシクロアルキルラジカルを含むことが意図される（Ｒ’及びＲ’’は、独立してＨ又は（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルである）。
【００５１】
「ヘテロシクリル」又は「複素環」は、例えば、４〜７員環の単環、７〜１２員環の二環又は１０〜１５員環の三環系である、少なくとも１個の炭素原子を含む環内に少なくとも１個のヘテロ原子を有している、置換されていてもよい、飽和又は部分的不飽和の非芳香族環状基を意味する。ヘテロ原子を含む複素環基の各環は、窒素原子、酸素原子及びイオウ原子から選択される、１、２、３又は４個のヘテロ原子を有していてもよく、窒素及びイオウヘテロ原子は酸化されていてもよい。複素環基は、ヘテロ原子又は炭素原子で連結されていてもよい。本明細書に開示される複素環は、得られる化合物が安定であれば、炭素又は窒素原子上で置換されていてもよい。特に示される場合、複素環内の窒素は四級化していてもよい。複素環内のＳ及びＯ原子の合計数が１を超える場合、これらのヘテロ原子は、お互いに隣接していないことが好ましい。二環又は三環複素環基は、スピロ環又はスピロ環基と縮合していてもよい。好ましくは、ヘテロシクリルは、４〜１２員環系である。また、好ましくは、ヘテロシクリルは４〜９員環系である。
【００５２】
代表的な単環複素環基には、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロロリジニル、ジヒドロピラゾリル、テトラヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｐｙｒａｎｙｌ）、ピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、チオピラニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル（ｐｔｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペラジニル、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｉｉｎｙｌ）、アゼピニル、ジヒドロアゼピニル、テトラヒドロアゼピニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキソアゼピニル、オキセパニル、チエパニル、ジヒドロチエピニル、テトラヒドロチエピニル、ジヒドロオキセピニル、テトラヒドロオキセピニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｉｉｎｙｌ）、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、プテペリドニル（Ａ−ｐｔｐｅｒｉｄｏｎｙ！）、イソキサゾリニル（ｉｓｏｘａｚｏｉｉｎｙｉ）、イソキサゾリル、１，４−アザチアニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チエキセパニル、１，４−ジアゼパニル、トロパニル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、チアゾリジニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン（ｔｈｉａｍｏｒｐｈｏｉｉｎｙｌ  ｓｕｉｆｏｎｅ）、１，３−ジオキソラン及びテトラヒドロ−１，１−ジオキソチエニル、１，１，４−トリオキソ−１，２，５−チアジアゾリジン−２−イル、ピラゾリニル等が含まれる。
【００５３】
代表的な二環式複素環基には、ジヒドロインドリル、キヌクチジニル、テトラヒドロキノリニル、デカヒドロキノリニル、２−オキサ−６−アザスピロ［３，３］ヘプタン−６−イル、テトラヒドロイソキノリニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｉｉｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル（ｄｅｃａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｉｉｎｙｌ）、ジヒドロイソインドリル、インドリニル（ｉｎｄｏｉｉｎｙｌ）、ノルボラニル、アダマンタニル等が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中、特に指定されない限り、「ヘテロシクリル」という用語は、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせから選択される１個以上の置換基で置換されていてよい、前記で定義されたヘテロシクリルラジカルが含まれる（Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビルである）。
【００５５】
「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素部分を意味する。
【００５６】
「アセタール」という用語は、化学において一般的な意味を有し、式：Ｒ−ＣＨ（ＯＲ’）２（Ｒ’はアルキルである）を有する。アセタールの例には、Ｒ−ＣＨ（ＯＣＨ３）２及びＲ−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２が含まれる。
【００５７】
「トリチル」という用語は、−Ｃ（Ｐｈ）３又はＤＭＴ又はＤＭＴｒと省略される場合がある、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は１個以上の芳香環に１個以上の置換基を有する、Ｃ（Ｐｈ）３又はＤＭＴの類似体を意味する。
【００５８】
「イソシアネート」という用語は、一般的な意味で用いられる。イソシアネートは、一般式：Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ（Ｒは、分子の残りについての残基である）を有する。イソシアネートは、アルコールと反応してカルバメートを生成することができ、これは、オリゴヌクレオチドの合成において反復性のカップリング及び脱保護のための条件に対して安定である。
【００５９】
「直接結合」という用語は、「直接結合」により連結した２個の実体がお互いに直接連結していることを意味する。
【００６０】
「ＲＮＡ」又は「リボ核酸」という用語は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「クリックケミストリー」又は「クリック反応」は、２００１年のＳｈａｒｐｌｅｓｓ及び共同研究者（以下の議論を参照されたい）により最初に開示された、非常に効率的かつ選択的であり、高収率で一緒に分子を製造することのできる反応のクラスを意味する。「クリック反応」は、通常、末端アルキン又は活性化アルキン類似体（例えば、活性化シクロオクチン）及びアジド又はニトロンを必要とする。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「クリックハンドル」は、「クリック反応」に関与し得る基を意味する。「クリックハンドル」は、分子の他の部分に連結する短い結合を含んでいてもよく、置換基で置換されていてもよい、末端アルキン（−Ｃ≡ＣＨ）、又は活性化シクロオクチンである。短い結合は、アルキレン（例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン）、アルケニレン（例えば、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、アルキニレン（例えば、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＮＲ’−ＣＯ−、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、又はそれらの組み合わせであってもよい（Ｒ’は、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）。任意の置換基は、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−、ＣＯ−Ｒ’’−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせであってもよい（Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）。
【００６３】
「活性化シクロオクチン」という用語は、１個以上の隣接する芳香環を有し、１個以上のフッ素置換基を有し（例えば、ジフルオロシクロオクチン）、又はシクロオクチン環上でひずみを起こす、１個以上の環縮合を有することにより活性化されたシクロオクチンを意味する。環縮合は、シクロオクチン環上にひずみを起こし、通常は、シクロプロピル又はシクロブチル環のような小さい環を必要とする。これらの種々の活性化シクロオクチンは、後述するように、当該技術分野において公知である。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「リンカー」は、分子内の２個の部分を架橋する。「リンカー」は、置換基によって置換されていてもよいヒドロカルビル鎖（例えば、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニレン）であってもよく、リンカーは、−（ＣＨＲ’）ａ−Ｗｂ−（ＣＨＲ’）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨＲ’）ｅ−によって表される（Ｗ及びＶは、独立して−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ’−であり、Ｒ’はＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立して０〜１０、好ましくは０〜６、又は好ましくは０〜３の整数であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの合計は好ましくは２〜６の整数である）、他の分子が散在するヒドロカルビル鎖であってもよい。任意の置換基は、−Ｏ−Ｒ’’，−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせであってもよい（Ｒ’及びＲ’’は、独立して、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビルである）。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「切断可能なアダプター」という用語は、式（Ａ）：Ｘ−Ｃ−Ｌ−Ｈにおける「Ｘ」及び「Ｈ」部分を分離するために用いることのできる官能基を含む部分である。「切断可能なアダプター」は、ヒドロカルビル基（例えば、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル）、アリール基（例えば、（Ｃ６−Ｃ１８）アリール）、ヘテロアリール基、シクロアルキル（例えば、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキルと連結した、シラニル基、トリチル基、若しくはビシニルアルコール、又はそれらの組み合わせから選択される切断可能な基を含む。
【００６６】
このような「切断可能なアダプター」の例には、化合物２における５’−シラニル−Ｏ−ヌクレオシド基、化合物４における５’−トリチル−Ｏ−ヌクレオシド基、及び化合物３におけるビシニルアルコール含有ノルボラニルイミド基が含まれ、以下に開示される。化合物２において示されるシラニル基は、当該技術分野において周知の緩酸又はフッ化物により切断することができる。トリチル基は、当該技術分野において周知の緩酸により切断することができる。化合物３（ＴＢＳ保護基の除去後）において示されるノルボラン構造内のビシニルアルコールは、分子内エステル交換／加水分解を起こし、隣接するリン酸基を加水分解するであろう。「切断可能なアダプター」は、切断後にオリゴヌクレオチド生成物に残るヌクレオシド部分又は類似の部分を含んでいてもよいことに注意されたい。これらの「切断可能なアダプター」の例を、化合物２及び化合物４内に示す。
【００６７】
「任意の」又は「任意に」は、状況が起こる場合と起こらない場合が含まれるように、続いて記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味する。例えば、「置換されていてもよい」という表現は、非水素置換基が存在していてもしていなくてもよいことを意味し、従って、記載は、非水素置換基が存在する構造、及び非水素置換基が存在しない構造を含む。
【００６８】
Ｋ．Ｂａｒｒｙ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及び共同研究者らは、２００１年に、高収率で一緒に分子を容易に製造することのできる、効率的かつ選択的なクラスの反応を意味する、「クリックケミストリー」という用語を造り出した（Ｋｏｌｂら、「Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，」Ａｎｇ．Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｅｄ．，４０，ｐｐ．２００４−２１）。「クリック」という用語は、２個のバックルを、一緒に「クリック」するような、分子の部分を連結する容易さを意味する。
【００６９】
２００２年に、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及びＭｅｌｄａｌのグループは、独立して、有機アジド及び末端アセチレンを用いた、銅触媒アジド−アルキレン環付加を証明した（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）「Ａ  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｈｕｉｓｇｅｎ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ’Ｌｉｇａｔｉｏｎ’ｏｆ  Ａｚｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｌｋｙｎｅｓ，」Ａｎｇ．Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｅｄ．，４１，ｐｐ．２５９６−９９；Ｔｏｒｎｏｅら（２００２），「Ｐｅｐｔｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ：［１，２，３］−Ｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ｂｙ  Ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｌｋｙｎｅｓ  ｔｏ  Ａｚｉｄｅｓ，」Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，６７，ｐｐ．３０５７−６４）。環状生成物は１，４−置換トリアゾールである。銅触媒は、室温において進行する反応を可能にし、位置選択性を与えた。しかし、銅は細胞毒性を有する。従って、この反応は多くの局面で用いることができない。これに応じ、触媒として銅を必要としない、他のタイプのアジド−アルキン環付加が開発された。このアプローチにより、環のひずみ、例えばシクロオクチンを導入することによってアルキンの反応性が増大する。
【００７０】
Ｂｅｒｔｏｚｚｉは、アジド−アルキン環付加におけるシクロオクチンの使用を最初に開示した（Ｊｅｗｅｔｔ及びＢｅｒｔｏｚｚｉ，「Ｃｕ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１０，３９，１２７２−１２７９、並びにこの文献で引用された文献）。しかし、有機アジドとシクロオクチンとの反応は、銅触媒反応に比べて遅い。この問題を回避するため、Ｂｅｒｔｏｚｚｉは、内部アセチレンに隣接する２個のフッ素を付加した。この新規な二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）は、標準の銅触媒環付加と匹敵する速度でアジドと反応する。
【００７１】
シクロオクチンの反応性を増大させるための他のアプローチは、シクロオクチン環にひずみを構築することによる。例えば、２個のベンゼン環に隣接するシクロオクチンが設計され、これはベンゼンの芳香属性が環のひずみを増大させた。他のアプローチにおいては、小さい環をシクロオクチン環と縮合することにより、シクロオクチン環が活性化され得る。これらすべてのシクロオクチンは、概して「活性化」シクロオクチンと呼ばれるが、それらは、芳香環、フッ素、又は環のひずみによって活性化されている。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、Ｃｕ（Ｉ）−触媒、及びＣｕ（Ｉ）を含まない「クリック」反応の両方を用いることができる。これらの反応の条件は当業者に周知であり、例えば、前記議論を参照されたい。
【００７３】
本発明の実施形態によれば、「クリック」反応に関与し得る試薬をオリゴヌクレオチドの合成に用いることができ、ポリヌクレオチド生成物の精製を容易にする。このような試薬には、末端アルキン又は活性化シクロオクチン部分が含まれる。活性化シクロオクチン部分には、芳香環に隣接し、三重結合の次にフッ素置換基を有し、又は環のひずみを有することにより活性化されるものが含まれる（例えば、シクロオクチン環と縮合したシクロプロパン環）。
【００７４】
本発明の実施形態によれば、末端アルキン及び活性化シクロオクチンの両方を用いることができる。本明細書において、末端アルキン及び活性化シクロオクチンは、一般に、「クリックハンドル」と呼ばれる。従って、本発明の試薬の一般式は：
Ｘ−Ｃ−Ｌ−Ｈ      式（Ａ）
として表すことができる。
式中、Ｘは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の５’−ヒドロキシル基と反応し得る官能基であり、適切なＸ官能基はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、アセタール、イソシアネート等を含み、
Ｃは、直接結合又は切断可能なアダプターであり、上記切断可能なアダプターは−Ｃａ−Ｃｂ−で表され、ＣａはＸに結合し、それぞれ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ又はアルキルアミノから選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい、直接結合、ヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、トリチル基又はビシニルアルコール基である。好ましくは、Ｃａは、直接結合、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、５〜１２員環のヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、４〜１２員環のヘテロシクリル、又はヌクレオシドである。
Ｌは、独立して、５〜９員環のヘテロアリール、４〜９員環のヘテロシクリル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、−Ｏ−Ｒ’’，−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよいヒドロカルビル鎖であり、ここで、Ｒ’及びＲ’’は、独立してＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビルであり、好ましくは、Ｌは、それぞれ、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル又はハロゲンから選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル、又は（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルのようなヒドロカルビルであり、又は、Ｌは、−（ＣＨＲ’）ａ−Ｗｂ−（ＣＨＲ’）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨＲ’）ｅ−（ここで、Ｗ及びＶは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ’−であり、Ｒ’はＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜６であり、又は好ましくは０〜３であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの合計は好ましくは２〜６の整数である）により表される、他の原子が散在するヒドロカルビル鎖であり。
Ｈは、前記で定義される「クリックハンドル（ｃｌｉｃｋ  ｈａｎｄｌｅ）」であり、末端アルキン又は活性化シクロオクチンを含んでいてもよい。
【００７５】
ホスホラミダイト、リンカー、及び「クリックハンドル」を有する化合物の特定の例を以下に示す。この例においては、式（Ａ）中の「Ｃ」は直接結合である。
【化６】
2013151468.tif 000007
【００７６】
上記式においては、「クリックハンドル」は、末端アルキン又は活性化シクロオクチンであってもよい。末端アルキン試薬の例、及び一般的な「活性化シクロオクチン」試薬の例を以下に示す。前記に言及したように、「活性化シクロオクチン」は、芳香環、フッ素、又は縮合環のひずみによって活性化することができる。
【化７】
2013151468.tif 000008
【化８】
2013151468.tif 000009
【００７７】
末端アルキン及び活性化シクロオクチンの両方を含む試薬を用いることができるが、明瞭化のために、以下の記載は、例として活性化シクロオクチンを用いる。特に、以下の記載は、例として、縮合環シクロオクチン（すなわち、ひずみのあるシクロオクチン）を用いる。これらの「ひずみのある」シクロオクチンは、以下の記述において、一般的に「活性化」シクロオクチンと呼ばれる。しかし、当業者は、この記載が、末端アルキン−含有試薬又は他のタイプの活性化シクロオクチン試薬にも適用されることを理解するであろう。
【００７８】
活性化シクロオクチンを有する、本発明の試薬は、式（Ｂ）：
【化９】
2013151468.tif 000010
（式中、ｍ、ｎは、それぞれ独立して０〜１０から選択される整数であり、Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ニトロ、エステル、カルボン酸、アルデヒド、エーテル、又はシアノエチル、電子求引基、電子供与基、Ｎ（Ｒ’）（Ｒ’’）、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ビシクリル、ＣＯ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｏ−ヒドロキシアルキル、Ｏ−ヒドロキシアルケニル、ＣＯ−アルコキシアルケニルから選択され（ここで、Ｒ’及びＲ’’は、それぞれＨ又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）である）、Ｘ、Ｃ及びＬは、式（Ａ）において定義された通りであり、Ｙは、
−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−から選択される連結官能基であり（ここで、Ｒ’は、水素又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）である））として示される一般構造として表される。
【００７９】
ひずみのあるシクロオクチンを有する、式（Ｂ）の化合物の代表的な試薬を、式（Ｉ）：
【化１０】
2013151468.tif 000011
（式中、点線入りの箱により囲まれた部分は、式（Ａ）のＨに相当し、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ’−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ここで、Ｒ’は水素又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）から選択される連結官能基であり、Ｘ、Ｃ及びＬは式（Ａ）において定義された通りである）に示す。
【００８０】
本発明のある実施形態によれば、Ｘには、ホスホラミダイト基、Ｈ−ホスホネート基、アセタール基、又はイソシアネート基が含まれる。Ｘの具体例には、アセタール（例えば、−ＣＨ（ＯＲ）２）、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、（２−シアノエチル）−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＮＣ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＯ−Ｎ（ｉＰｒ）２）、及びメチル−ジイソプロピルホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートアルキルエステル等が含まれる。
【００８１】
本発明のある実施形態によれば、Ｃは、−Ｃａ−Ｃｂ−で表される切断可能なアダプターであり、ここで、ＣａはＸに結合し、それぞれ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ又はアルキルアミノから選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい、直接結合、（Ｃ１−Ｃ１２）ヒドロカルビル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、５〜１２員環のヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、４〜１２員環のヘテロシクリル、ヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、トリチル基又はビシニルアルコール基である。好ましくは、Ｃａは、直接結合、（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビル、４〜１２員環のヘテロシクリル、又はヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、又はトリチル基である。
【００８２】
本発明のある実施形態によれば、Ｌは、一般式−（ＣＨ２）ａ−Ｗｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｖｄ−（ＣＨ２）ｅ−（ここで、Ｗ及びＶは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ’−であり、Ｒ’は水素又は低級アルキル（例えば、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、独立して０〜１０、好ましくは０〜６であり、又は好ましくは０〜３の整数であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの合計は好ましくは２〜６の整数である）により表される
【００８３】
本発明のある実施形態によれば、Ｌは、それぞれ、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルバモイル又はハロゲンから選択される基で置換されていてもよい、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルケニル、又は（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルのようなヒドロカルビル基である。本発明のある実施形態によれば、Ｌリンカーは、好ましくは（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルであり、さらに好ましくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【００８４】
本発明のある実施形態によれば、式（Ｉ）中のＸはホスホラミダイトである。このような化合物の例は、式（ＩＩ）：
【化１１】
2013151468.tif 000012
（式中、Ｃ、Ｌ及びＹは前記に定義した通りであり、Ｒは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又はシアノエチルである）において示される一般構造を有する。本発明の好ましい実施形態においては、Ｌは（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルであり、さらに好ましくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｙは−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−であり、Ｃは、−Ｃａ−Ｃｂ−で表される切断可能なアダプターであり、ＣａはＸに結合し、直接結合、（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビル、４〜１２員環のヘテロシクリル、又はヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、又はトリチル基であり、Ｒはシアノエチルである。
【００８５】
本発明のある実施形態によれば、式（Ｉ）中のＸはＨ−ホスホネートである。このような化合物の例は、式（ＩＩＩ）：
【化１２】
2013151468.tif 000013
（式中、Ｃ、Ｌ、Ｙ及びＲは前記に定義した通りである）において示される一般構造を有する。本発明の好ましい実施形態においては、Ｌは（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルであり、さらに好ましくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｙは−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−であり、Ｃは、−Ｃａ−Ｃｂ−で表される切断可能なアダプターであり、ＣａはＸに結合し、直接結合、（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビル、４〜１２員環のヘテロシクリル、又はヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、又はトリチル基であり、Ｒはシアノエチルである。
【００８６】
本発明のある実施形態によれば、式（Ｉ）中のＸはイソシアネートである。このような化合物の例は、式（ＩＶ）：
【化１３】
2013151468.tif 000014
（式中、Ｃ、Ｌ及びＹは前記に定義した通りである）において示される一般構造を有する。本発明の好ましい実施形態においては、Ｌは（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルであり、さらに好ましくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｙは−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−であり、Ｃは、−Ｃａ−Ｃｂ−で表される切断可能なアダプターであり、ＣａはＸに結合し、直接結合、（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロカルビル、４〜１２員環のヘテロシクリル、又はヌクレオシドであり、Ｃｂは、直接結合、シラニル基、又はトリチル基である。
【００８７】
式（ＩＩ）の化合物のいくつかの代表的例が下記に示されている。当業者は、それらの特定化合物が単なる例示のためであり、そしてそれらの化合物の他の修飾及び変動が本発明の範囲を逸脱することなしに可能であることを認識しているであろう。
【化１４】
2013151468.tif 000015
【００８８】
化合物１は、ヒドロキシル基と反応し、ホスフィト基を形成できるホスホラミダイトである。ホスフィト基は、例えば典型的なオリゴヌクレオチド合成における酸化工程の間、リン酸基に酸化され得る。リン酸基はオリゴヌクレオチドの合成に使用される反復カップリング及び脱保護に対して安定している。さらに、リン酸基は、最終脱保護及び固体支持体からのポリヌクレオチドの切断に対して安定している。従って、化合物１のような構造を有する活性化されたシクロオクチン試薬は、下記に記載されるように、合成の後、ポリヌクレオチドの精製を促進するために、不良配列の標識のためのキャッピング剤として使用され得る。
【００８９】
示されないが、Ｈ−ホスホネート（ホスホラミダイトの代わり）もまた使用され得る。Ｈ−ホスホネートはヒドロキシル基と反応し、ホスホネート基を形成することができる。ホスホネート基は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される反復カップリング及び脱保護に対して安定している。ホスホネート基は、例えば典型的なオリゴヌクレオチド合成における酸化工程の間、リン酸基に酸化され得る。リン酸基は、最終脱保護及び固体支持体からのポリヌクレオチドの切断に対して安定している。従って、化合物１のような構造体を有するが、しかしホスホミダイトの代わりにＨ−ホスホネートを有する活性化されたシクロオクチン試薬は、下記に記載されるように、合成の後、ポリヌクレオチドの精製を促進するために、不良配列の標識のためのキャッピング剤として使用され得る。
【００９０】
化合物２は、５′−ヒドロキシル基に結合される活性化されたシクロオクチン部分を有するヌクレオシド３′−ホスホラミダイトである。この試薬上の３′−ホスホラミダイト基は５′−ヒドロキシル基と反応し、ホスフィト基を形成することができる。このホスフィト基は、例えば典型的なオリゴヌクレオチド合成における酸化工程の間、リン酸基に酸化され得る。リン酸基は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される反復カップリング及び脱保護に対して安定している。さらに、リン酸基は、最終脱保護及び固体支持体からのポリヌクレオチドの切断に対して安定している。
【００９１】
化合物２中の活性化されたシクロオクチン部分は、シラニル基を通してヌクレオシドに結合され、これは、緩酸溶液又はフッ化物イオン（例えば、ＮａＦ、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフッ化物（（Ｂｕ）４ＮＦ）、ＨＦ−ピリジン又はＨＦ−ＮＥｔ３）による処理により切断され得る。従って、活性化されたシクロオクチン部分は、最終ポリヌクレオチドの精製を促進するそれらの機能を果たした後、ポリヌクレオチド生成物から解放され得る。従って、化合物２のような構造を有する試薬は、所望する配列の成長鎖にカップリングするための最後のヌクレオシドとして使用され得る。
【００９２】
合成の後、完全な長さの配列は、下記に記載されるように、アジド又はニトロン含有固体支持体上の完全な長さの配列を捕獲するために［クリック（ｃｌｉｃｋ）］反応を通して不良配列から分離され得る。完全な長さの配列の精製の後、活性化されたシクロオクチン部分は、緩酸溶液又はフッ化物イオン（例えば、ＮａＦ、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフッ化物（（Ｂｕ）４ＮＦ）、ＨＦ−ピリジン又はＨＦ−ＮＥｔ３）により生成物を処理することにより切断され得、そして所望する完全な長さの配列が単離され得る。
【００９３】
化合物３は、活性化されたシクロオクチンがホスホラミダイトに対して整列されることにおいて、化合物１に類似する。しかしながら、化合物３のリンカー部分は、隣接アルコールを有するノルボラニル基を含み、前記アルコールの１つはホスホラミダイトに結合され、そして他のアルコールはＴＢＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル）基により保護される。これは、普遍型［クリック］ハンドル（不良配列をキャッピングするためへの使用のための又は合成サイクルにおける最後のヌクレオチドへのカップリングのためへの使用のための）として作用することができる。ＴＢＳ保護基は、緩酸溶液又はフッ化物イオン（例えば、ＮａＦ、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフッ化物（（Ｂｕ）４ＮＦ）、ＨＦ−ピリジン又はＨＦ−ＮＥｔ３）による処理により除去され得る。ヒドロキシルが遊離されると、それは、加熱又は塩基処理、例えばアンモニア処理により隣接リン酸基を攻撃することができる。従って、化合物３における活性化されたシクロオクチン基は解放できる［クリック］ハンドルとして機能することができ、それは、所望する配列の精製を促進するようその機能を果たした場合、解放され得る。
【００９４】
化合物１におけるように、化合物３におけるホスホミダイト基はヒドロキシル基と反応し、ホスフィト基を形成できる。ホスフィト基は、例えば典型的なオリゴヌクレオチド合成における酸化工程の間、リン酸基に酸化され得る。リン酸基は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される反復カップリング及び脱保護に対して安定している。さらに、リン酸基は、最終脱保護及び固体支持体からのポリヌクレオチドの切断に対して安定している。従って、化合物１のような構造を有する活性化されたシクロオクチン試薬は、下記に記載されるように、合成の後、ポリヌクレオチドの精製の促進のために不良配列の標識のためのキャッピング剤としえ使用され得る。
【００９５】
さらに、「クリック」ハンドルが解放できるので、化合物３はまた、不良配列のためのキャッピング剤として化合物３を用いる代わりに、最後のヌクレオチドが付加された後、一時的キャッピング剤としても使用され得る。
【００９６】
切断できるシラニル基の代わりに、トリチル基もまた、切断できるコネクターとして使用され得る。トリチルコネクターは緩酸、例えばジクロロ酢酸又はトリフルオロ酢酸による処理により除去され得る。トリチルコネクターを使用する化合物の例は、化合物４として示される。シラニル及びトリチル基の両者は１つの例により示されるが、当業者は、種々の修飾及び変動が本発明の範囲を逸脱することなしに可能であることを理解しているであろう。
【００９７】
上記に示されるように、本発明の態様に従っての活性化されたシクロオクチン試薬は、オリゴヌクレオチドの合成及び精製において「クリック」化学ハンドルとして使用され得る。それらの試薬は次の２つのアプローチに使用され得る：（ｉ）続く反応におけるさらなる反応から不良配列を阻止するための「キャッピング」剤として、及び（ｉｉ）容易な精製のための最終生成物を標識するための最後のヌクレオチド類似体として。
【００９８】
本発明の態様に従っての第一アプローチによれば、反復オリゴヌクレオチド合成の間、不完全カップリングの結果として生成される短いマー（切断されたオリゴヌクレオチド）は、新規活性化されたシクロオクチンリン酸化試薬により「キャッピング−オフ（ｃａｐｐｅｄ−ｏｆｆ）される」。本発明の方法に従ってのオリゴヌクレオチドの合成及び精製にひずみのあるシクロオクチン試薬を用いるための典型的な方法が、図２及び４に示される。
【００９９】
図２及び４に関して、個々の合成サイクルにおいて、キャッピング工程は本発明のひずみのあるシクロオクチン試薬（例えば、上記に示される化合物１又は化合物３）を使用するために修飾され得る。すなわち、無水酢酸（例えば、Ａｃ２Ｏ）が、本発明の試薬、すなわち図４中の工程３におけるＸ−Ｃ−Ｌ−Ｈ（例えば、化合物１又は化合物３）により置換され得る。それらのキャッピング反応の結果として、固体支持体からの切断の後、最終生成物の混合物は、完全な配列の他に、５′−末端に結合される活性化されたシクロオクチン部分をそれぞれ有する種々の不良配列を含むであろう（図２を参照のこと）。
【０１００】
生成物の混合物は、アジド含有又はニトロン含有固体支持体（例えば、ビーズ）と反応され得る。ニトロンはイミンのＮ−酸化物である。アジド及びニトロンはアルキンと容易に反応し、安定した５員の環生成物を形成できる。環付加の後、不良配列は固体支持体に共有結合されるが、ところが完全な長さの配列は溶液に残存するであろう。従って、所望する完全な長さの配列は、例えば濾過により不良配列から容易に分離され得る。
【０１０１】
第二アプローチによれば、新規の切断できる活性化された−シクロオクチンリン酸化試薬は、最終の完全な長さの生成物自体の精製ハンドルとして、オリゴヌクレオチドの５′末端に付加され得る（反復合成の最終工程の間）。他方では、カップリングされる最終モノマーは、切断できる活性化されたシクロオクチン部分を含むことができる。切断できる活性化されたシクロオクチンリン酸化試薬の例は、化合物２、化合物３又は化合物４を包含することができる（上記に示される）。
【０１０２】
このアプローチに従っての方法は、図３及び５に示される。図３及び５に示されるように、最終生成物の混合物は、活性化されたシクロオクチン試薬により標識されない種々の不良配列を含むが、ところが完全な長さの生成物は活性化されたシクロオクチン基に対して共有結合される。
【０１０３】
生成物の混合物は、アジド含有又はニトロン含有固体支持体（例えば、ビーズ）と反応され、完全な長さのオリゴヌクレオチド生成物と共有結合を形成できる。溶液に残存する不良配列は、固体支持体から分離され得る。次に、固体支持体に結合される精製された十分な長さの生成物は、例えば緩酸溶液又はフッ化物イオン（例えば、ＮａＦ、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフッ素化物（（Ｂｕ）４ＮＦ）、ＨＦ−ピリジン又はＨＦ−ＮＥｔ３）を用いて、ビーズからオリゴヌクレオチドを切断することにより解放され得る。
【０１０４】
不良配列をキャッピングし、そしてトラッピングするためへの活性化されたシクロオクチンリン酸化試薬の使用、又はオリゴヌクレオチドサイクルの最後での活性化されたシクロオクチンホスホラミダイトモノマー又は類似試薬の使用は、合成及び精製の容易さを非常に改善するであろう。それらの方法は、高生産性及び大規模設定の両者においてオリゴヌクレオチドの急速精製を可能にするであろう。それらの簡単な方法はまた、オリゴヌクレオチド合成／精製の費用を削減するであろう。それはまた、所望する完全な長さの生成物の全体的収率及び回収率を高めるであろう。それはまた、すべての従来方法が失敗する長いオリゴヌクレオチド（すなわち、３００以上のマー）の精製において最も強力であろう。しかしながら、それらの方法はまた、より短いオリゴヌクレオチドについても従来の方法よりも好都合である。
【０１０５】
本発明の態様が下記に実施例によりさらに示される。それらの実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１０６】
本発明の態様が、次の実施例により示される。それらの実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものではない。さらに、当業者は、それらの実施例から種々の変動及び修飾が本発明の範囲を逸脱することなしに可能であることを理解すべきである。例えば、使用されるリンカーは、長いか又は短い結合を有する他のリンカー、又は異なったタイプのリンカーにより置換され得る。同様に、それらの実施例はホスホラミダイト官能基を用いるが、当業者は、類似する試薬が、周知の方法を用いて、Ｈ−ホスホネート部分により調製され得ることを理解するであろう。
【０１０７】
下記に示されるスキーム１は、上記に記載される化合物１の類似体の合成についての合成スキームを示す。手短に言及すると、１，５−シクロオクタジエンを、ジアゾアセテートと反応せしめ、縮合されたシクロプロピル−シクロオクテン構造体３４７６−３１を形成し、そのエステル官能基をその対応するアルコールに還元する。次に、シクロオクテン部分を臭素化し、そして脱臭化水素化し、その対応する縮合されたシクロプロピル−シクロオクチンアルコール３４７６−３９を生成する。
【０１０８】
縮合されたシクロプロピル−シクロオクチンアルコール３４７６−３９のアルコール官能基を、ｐ−ニトロフェノール基を含むカーボネートに転換する。カーボネート中のｐ−ニトロフェノール基を、求核体、例えばアミンにより置換する。従って、アミノ基を含む所望するリンカーをカーボネート化合物と反応せしめ、カルバメート官能基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）を通してリンカーにカップリングされる活性化されたシクロオクチン、例えば３４７６−１０５を生成できる。最終的に、リンカーの他端を、オリゴヌクレオチド合成方法に使用され得る、ホスホラミダイト又はＨ−ホスホネートに転換することができる。
【化１５】
2013151468.tif 000016
【０１０９】
スキーム１においては、化合物３４７６−３１の２種の立体異性体の１つのみが続く工程に示されている。これは明確に示すためである。１つはラセミ混合物を使用し、又は他の１つは代わりに異性体を用いることができる。
【０１１０】
さらに、スキーム１は、リンカーがカルバメート官能基、すなわち−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）６−Ｏ−を通して活性化されたシクロオクチン基にカップリングされることを示す。当業者は、他のタイプの結合官能基（例えば、エーテル、エステル、等）が本発明の範囲を逸脱することなしに使用され得ることを理解するであろう。そのような他の結合官能基の調製は通常の有機反応を包含し、そして当業者はそれらの化合物の調製においていずれの困難性も有さない。例としては、例えばエーテル結合は、次の反応スキームに従って調製され得る：
【化１６】
2013151468.tif 000017
【０１１１】
本発明の態様によれば、リンカーの長さは変更され得る。例えば、−（ＣＨ２）ｎ−においては、ｎは２〜１０の範囲の整数であり得る。さらに、化合物３４７６−３９中のアルコール基は、アミノ基又は脱離基（例えば、トシレート）に転換され、これは次に異なったタイプの結合官能基を得るために、さらに反応せしめられる。
【０１１２】
本発明の態様によれば、種々の結合官能基及び種々のリンカーが使用され得る。それらの例のいくつかは、上記式Ｉに関して、Ｙ及びＬ基として論じられている。
【０１１３】
以下の式（Ｖ）に示されるように、「リンカーボックス（ｌｉｎｋｅｒ  ｂｏｘ）」として分子の［−Ｙ−Ｌ−］部分を一般化できる。
【化１７】
2013151468.tif 000018
【０１１４】
そのような「リンカーボックス（式（Ｖ）を参照のこと）の一般的例は、次のものを包含する：−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−、−ＮＨ−（ＣＨ２）５−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−（ＣＨ２）４−、−Ｏ−（ＣＨ２）５−、−Ｏ−（ＣＨ２）６−、  −ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−、−ＮＨ−（ＣＨ２）５−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）６−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）４−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）５−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）６−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２、等。
【０１１５】
スキーム１に示されるように、関与する反応は一般的有機反応である。当業者は、独創的努力を伴わないで、それらの反応を実施することができる。例としては、典型的な活性化されたシクロオクチンホスホラミダイト部分３４７６−３１の合成のための詳細な合成方法及び条件が下記に記載される。
【０１１６】
［化合物３４７６−３１の合成］
ＤＣＭ（３０ｍｌ）中、１，５−シクロオクタジエン（５１．５７ｍｌ、０．４２０モル）及びＲｈ２（ＯＡｃ）４（１ｇ、０．００２６モル）の溶液に、エチルジアゾアセテートの８２％溶液（ＤＣＭ中、７．３２ｍｌ、０．０６０５モル）を、０℃で３時間にわたって滴下した。この溶液を４８時間、撹拌した。次に、それを蒸発乾燥した。過剰のシクロオクタジエンを、１：２００のＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１Ｌ）を用いて、シリカパッドを通して濾過することにより除去した。濾液を真空下で濃縮し、そして残渣を、シリカゲル（１：２０のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）上でのカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、透明無色の油状物を得た。エンド化合物はエキソ化合物よりも高いＲｆを有する。化合物は、Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｄｔ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１０，  ４９，  ９４２２により記載されるように、適合する。
【０１１７】
［化合物３４７６−３９の合成］
ジエチルエーテル（１００ｍｌ）中、ＬｉＡｌＨ４（３３４ｍｇ、８８ミリモル）の懸濁液を０℃に冷却した。これに続いて、エーテル（５０ｍｌ）中、３４７６−３１（１．７ｇ、８８ミリモル）を滴下した。次に、その混合物を室温で３０分間、撹拌し、次に０℃に冷却し、そして水を、灰色の固形物が白色に変わるまで、ゆっくり添加した。次に、硫酸ナトリウムを添加し、そして固形物を濾過し、そしてエーテルにより洗浄し、そして濾液を真空下で濃縮した。次に、それをＤＣＭ（２００ｍｌ）に溶解し、そして０℃に冷却した。次に、臭素溶液（０．５ｍｌ、９７ミリモル）を、黄色の色が持続するまで、ＤＣＭ（２０ｍｌ）に滴下した。次に、その反応混合物を、さらに３０分間、撹拌した。この点で、それを１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）により冷却し、そしてＤＣＭにより抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で濃縮し、二臭化物を黄色の油状物として得た。次に、この材料をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、続いて０℃で、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３ｇ、２６４ミリモル）の溶液を添加した。次に、前記溶液を３時間、還流した。室温への冷却の後、反応混合物をＤＣＭ（２００ｍｌ）により希釈し、そして飽和塩化アンモニウム溶液（５０ｍｌ）により冷却した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発し、そして真空下で濾過した。次に黄色の残渣を、７：３のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固形物を得た。化合物は、Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｄｔ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１０，  ４９，  ９４２２により記載されるように、適合する。
【０１１８】
［化合物３４７６−１０３の合成］
化合物３４７６−３９（１．８４ｇ、０．０１２２モル）を、窒素下でＤＣＭ（２５ｍｌ）に溶解した。これに続いて、ピリジン（５ｍｌ）及び３Ａ分子篩を添加した。次に、その溶液を室温で１５分間、撹拌した。これに続いて、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（３．２ｇ、０．０１５９モル）を添加した。反応を、ＴＬＣ（７：３のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いる）による判断により、完結するまで（２時間）、撹拌した。完結の後、反応をＤＣＭにより希釈し、そして５％塩化アンモニウム水溶液により徐々に処理した。有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発した。次に、得られる材料を、７：３のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色固形物を得た。化合物は、Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｄｔ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１０，  ４９，  ９４２２により記載されるように、適合する。
【０１１９】
［化合物３４７６−１０５の合成］
化合物３４７６−１０３（２．４７ｇ、０．００７８４モル）を、窒素下でＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解した。これに続いて、トリエチルアミン（３．３ｍｌ、０．０２３５モル）及びアミノヘキサノール（１．８４ｇ、０．１５７モル）を添加した。その反応混合物は１時間後、完結した。この点で、それを蒸発乾燥し、そしてＤＣＭ（２００ｍｌ）に再溶解した。次に、有機層を、１ＮのＮａＯＨ（２×５０ｍｌ）及び飽和塩化アンモニウムにより洗浄した。次に、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発した。次に得られる材料を、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨまでの勾配を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製し、９４％の収率で白色固形物を得た。１ＨＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ４．７２（１Ｈ），３．９４  （２Ｈ，  ｄ），３．６０  （２Ｈ，  ｔ），３．１４−３．１５  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３７  （２Ｈ，  ｄ），  ２．２３−２．２８（２Ｈ，  ｍ），  ２．１０−２．１４  （２Ｈ，  ｍ），  １．８０  （１Ｈ，  ｓ），  １．４５−１．５７  （４Ｈ，  ｍ），１．３３−１．３４  （６Ｈ，  ｍ），  ０．７１−０．７３（２Ｈ，  ｓ），０．６３−０．６６  （１Ｈ，  ｍ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １５６．８４，  ９８．７７，  ６８．９０，  ６２．６０，  ４０．７５，  ３３．２７，  ３２．５４，  ２９．９７，  ２６．３５，  ２５．２９，  ２３．７５，  ２２．７９，  ２１．３６；  ＥＳＩ−ＱＱＱ−Ｃ１７Ｈ２７ＮＯ３  についての計算値２９３．２  （＋Ｈ＋）；  実測値  ２９４．２。
【０１２０】
［化合物３４７６−１１１の合成］
化合物３４７６−１０５（５００ｍｇ、１７ミリモル）及びジイソプロピルテトラゾリド（５８６ｍｇ、０．００２４１ミリモル）を、３Å分子節を含む丸底フラスコに乾燥窒素下で添加した。これに続いて、ＤＣＭ（５ｍｌ）を添加した。次に、この材料を、室温で３０分間、撹拌し、この点で、ＤＣＭ（５ｍｌ）に溶解されたリン酸化試薬（３８８ｍｇ、１３ミリモル）を、前記丸底フラスコ中にカニューレ処理した。この反応を、ＴＬＣ（ＤＣＭ中、３％ＭｅＯＨ）による判断により完結まで、進行せしめ、次に、それを５％炭酸水素ナトリウムにより冷却し、そしてＤＣＭにより抽出した。有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発した。次に、残留材料を、１％ＴＥＡと共に、３：７のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、８５％の収率で透明無色の油状物を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （２０２  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １４６．８４；  ＥＳＩ−ＱＱＱ−Ｃ２６Ｈ４４Ｎ３Ｏ３Ｐ  についての計算値４９４．６  （＋Ｈ＋）；  実測値４９４．４。
【０１２１】
スキーム２は、完全な配列の精製を促進するためにクリック反応のためのハンドルを提供するために、オリゴヌクレオチド合成の間、最後のヌクレオシドとして使用され得る、切断できるリンカーを有する５′−活性化されたシクロオクチンヌクレオシドホスホラミダイトの調製のための合成スキームを示す。このスキームは例としてチミジン塩基を用いるが、他の塩基（適切な保護を有する）もまた、類似する態様で合成され得る。
【化１８】
2013151468.tif 000019
【０１２２】
スキーム２に示されるように、所望するホスホラミダイトの合成は、通常の有機反応を使用する。当業者は、困難性を伴わないで、それらの反応を実施することができるであろう。示されるように、化合物３４７６―１１７の合成のための詳細な方法及び反応条件は下記に記載される。
【０１２３】
［化合物３４７６−１１２の合成］
ジイソプロピルシリルジトリフラート（１．０４ｍｌ、０．００３５２モル）を、ＤＭＦ（１５ｍｌ）に窒素下で溶解し、そして−４２℃に冷却した。これに続いて、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中、３′−ＯＡｃ−ｄＴ（１ｇ、０．００３５２モル）を滴下した。これに続いて、ＤＭＦ（５ｍｌ）中、イミダゾール（０．４８０ｇ、０．００７０４モル）を添加した。この反応を、ＴＬＣにより判断される場合、ジイソプロピルシリルジトリフラート材料のすべてが消費されるまで（１時間）、続けた。次に、それを室温に暖め、ＤＭＦ（５ｍｌ）中、３４７６−１０５を滴下した。次に、反応を、ＴＬＣにより判断される場合、完結まで（３０分）、撹拌した。完結の後、溶媒を減圧下で除去し、そして残渣をＤＣＭに取り、そして飽和炭酸水素ナトリウムにより洗浄した。有機層を抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発した。次に、残渣を、ＤＣＭ中、３％ＭｅＯＨまでの勾配を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。最終化合物を、定量的収率で白色発泡体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ９．０３  （１Ｈ，  ｓ），  ７．５３  （１Ｈ，  ｓ），  ６．３６  （１Ｈ，  ｔ），  ５．３２  （１Ｈ，  ｄ），  ４．８０  （１Ｈ，  ｄ），  ３．９４−４．０５  （５Ｈ，  ｍ），  ３．７４  （２Ｈ，  ｔ），  ３．１２−３．１７  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３６−２．４２  （３Ｈ，  ｍ），  ２．１６−２．２９  （２Ｈ，  ｍ），  ２．０９−２．１４  （６Ｈ，  ｍ），  １．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４７−１．５７  （４Ｈ，  ｍ），  １．３２−１．３８  （６Ｈ，  ｍ），  １．０１−１．０５  （１４Ｈ，  ｍ），  ０．６５−０．７２  （３Ｈ，  ｍ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ２０９．１，  ２０７．９，  １６２．５，  １５６．８４，  １３５．１４，  １３０．４８，  １１０．００，  ９８．７７，  ６８．９０，  ６７．６３，  ６２．５９，  ４５．１３，  ４１．５６，  ４０．７５，  ３９．１６，  ３３．２６，  ３２．５４，  ３０．０４，  ２９．９７，  ２６．３５，  ２５．３８，  ２５．２８，  ２３．７４，  ２３．５０，  ２２．７８，  ２２．３９，  ２１．８０，  ２１．５７，  ２１．３６，  ２０．５６；  ＥＳＩ−ＱＱＱ−Ｃ３５Ｈ５５Ｎ３Ｏ９Ｓｉについての計算値  ６９０．４  （＋Ｈ＋）；実測値  ６９０．４。
【０１２４】
［化合物３４７６−１１５の合成］
化合物３４７６−１１２（１ｇ）をエタノール（１０ｍｌ）に溶解した。これに続いて、アンモニア：メチルアミンの１：１混合物（２ｍｌ）を添加した。次に、この溶液を５５℃に加熱し、そして３０分間、撹拌した。完結の後、揮発物を高真空下で除去し、そして残留材料をＤＣＭに取った。次に、これを水により洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発し、黄色の油状物を得た。次に、この材料を、５０：５０のＥｔＯＡｃ：ヘキサン→ＥｔＯＡｃの勾配を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製し、そして白色固形物として定量的収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ９．２０  （１Ｈ，  ｓ），  ７．５２  （１Ｈ，  ｓ），  ６．３５  （１Ｈ，  ｔ），  ４．８４  （１Ｈ，  ｓ），  ４．５０  （１Ｈ，  ｓ），  ３．９４−４．０４  （５Ｈ，  ｍ），  ３．７３−３．７５  （２Ｈ，  ｔ），  ３．４８  （１Ｈ，  ｓ），  ３．１２−３．１７  （１Ｈ，  ｍ），  ２．３６−２．４０  （２Ｈ，  ｍ），  ２．２３−２．２９  （２Ｈ，  ｍ），  ２．０９−２．１４  （２Ｈ，  ｍ），  １．９０  （３Ｈ，  ｓ），  １．４６−１．５６  （４Ｈ，  ｍ），  １．３２−１．３５  （４Ｈ，  ｍ），  １．０３−１．０５  （１４Ｈ，  ｍ），  ０．６５−０．７３  （３Ｈ，  ｍ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １６３．９２，  １５７．００，  １５０．４４，  １３５．５８，  １１０．８６，  ９８．７８，  ８７．１８，  ８４．９２，  ８７．１８，  ８４．９２，  ７１．８８，  ６９．０９，  ６３．０６，  ４０．９９，  ４０．７２，  ３３．２６，  ３２．４８，  ２９．９１，  ２６．２６，  ２５．２８，  ２３．６８，  ２２．８１，  ２１．３７，  １７．３９，  １７．３３，  １７．３０，  １７．２４，  １２．４７，  １２．００，  １１．８４；  Ｃ３３Ｈ５３Ｎ３Ｏ８Ｓｉについての計算値  ６４８．４  （＋Ｈ＋）；実測値  ６４８．４。
【０１２５】
［化合物３４７６−１１７の合成］
化合物３４７６−１１５（０．８ｇ、０．００１６モル）を、乾燥窒素下でＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解した。これに続いて、ＤＩＰＥＡ（０．８５ｍｌ、０．００４８７モル）を添加し、そしてジイソプロピルクロロリン酸試薬（０．３ｍｌ、０．００１２８モル）を滴下した。次に、この反応混合物を、完結まで２時間、撹拌した。次に、それを５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍｌ）により冷却し、そしてＤＣＭ（２００ｍｌ）により希釈した。次に、この混合物を分液漏斗に移し、そしてさらに、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を添加した。水性層をＤＣＭ（１００ｍｌ）により洗浄し、そして有機層をプールし、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発した。次に、残留材料を、２％ＴＥＡと共に３：２のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製し、９５％の収率で白色発泡体を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （２０２  ＭＨ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １４８．０３，  １４７．９８；  ＥＳＩ−ＱＱＱ−Ｃ４２Ｈ７０Ｎ５Ｏ９ＰＳｉについての計算値    ８４８．５  （＋Ｈ＋）；実測値    ８４８．５。
【０１２６】
上記に示されるように、本発明の態様によれば、アジド又はニトロン含有固体支持体（例えば、ビーズ又は基質）を用いて、活性化されたシクロオクチン含有オリゴヌクレオチドを「クリックするか」又はトラップし、それにより、所望する配列の精製を促進する。アジド又はニトロン含有固体支持体は、スキーム３に示されるように市販の固体支持体を用いて容易に調製され得る。
【化１９】
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【０１２７】
スキーム３は固体支持体として調節された細孔ガラスビーズを用いるが、いずれか他の適切な固体支持体、例えばポリマー若しくはプラスチックビース、ガラスプレート、又はポリマー若しくはプラスチックプレートが本発明の範囲から逸脱することなしに使用され得る。アジド化合物を有するリンカーを、アミノリンカーを含むＣＰＧにカップリングする。固体支持体上の他のタイプの反応性官能基、例えば−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、等がまた使用され得る。例として、試薬３４７６−９８の合成のための詳細な方法及び条件が下記に示される。
【０１２８】
［化合物３４７６−９８の合成］
１０００ÅのＣＰＧ（１９．２ｇ、負荷量＝１０３μモル／ｇ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡから購入されたロット番号ＰＳＩ００２１６２４）を、ＤＭＦ（５０ｍｌ）に懸濁した。これに続いて、トリエチルアミン（１．８ｍｌ、１２９モル）及びアジド−Ｐｅｇ−ＮＨＳ−エステルを添加した。次に、この反応を１６時間、振盪した。完結の後、それをガラスフリットを通して濾過し、そしてＤＣＭ、ＭｅＯＨ及び最終的にエーテルにより洗浄した。次に、前記材料を高真空下で乾燥した。次に、それをＣＡＰ  Ａ及びＣＡＰ  Ｂ（それぞれ２０ｍｌ）により１５分間、処理した。それを再び濾過し、そして上記のように洗浄した。次にその材料を高真空下で乾燥した。
【０１２９】
本発明の利点は、１又は２以上の以下のことを包含することができる。シクロオクチン部分自体が大規模（例えば、Ｋｇ）に調製され、そして合成するために安価である。さらに、それはより少ない消耗物、例えばＨＰＬＣ、重合、等の場合、溶媒を使用し、そして従って、よりグリーンなプロセスである。シクロオクチン部分は、有機溶媒（例えば、アセトニトリル）に自由に溶解でき、そしてキャッピング剤又はヌクレオチドモノマーとして急速なカップリング時間を可能にする。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断の後、シクロオクタン含有のキャッピングされた不良物又はシクロオクタン含有の完全な長さの生成物は、アジド又はニトロン含有固体支持体との急速な「クリック」反応を受け、混合物からそれらを共有分離するであろう。これは、存在する方法と比較しての主要改良点であり、この場合、精製工程が何時間という代わりに分といった程度であり、高生産性能力を高く増強する。さらに、クリック反応はほぼ定量的であることが知られているので、これは存在する方法よりも収率及び純度を非常に増強し、これは小又は大規模生産上重要でる。さらに、このプラットフォームは広範囲の溶媒及び反応条件に適用でき、そして親和性精製の場合におけるように一定条件に制限されないであろう。クリック反応はまた非常に特異的であることも知られており、その結果、オリゴヌクレオチドの修飾が存在しないであろう。最終的に、この方法は長いオリゴヌクレオチドの精製のために特に有用であり、そして他の従来技術におけるような短いオリゴヌクレオチドの精製に限定されないであろう。
【０１３０】
［アジド含有アガロースビースの合成］
アミノ−誘導体化されたアガロースビーズを濾過し、そして凍結乾燥した。次に、それらをＤＭＦに懸濁し、そして室温で１６時間、トリエチルアミンの存在下でアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓから購入される）と反応せしめた。完結の後、その材料を濾過し、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びエーテルにより洗浄した。次に、材料を高真空下で乾燥した。次に、それをＣＡＰ  Ａ及びＣＡＰ  Ｂ（それぞれ２０ｍｌ）により１５分間、処理した。それを再び濾過し、そして上記のようにして洗浄した。次に、材料を高真空下で乾燥した。
【０１３１】
［オリゴヌクレオチドの合成］
ｄＴ−２５−マーのオリゴヌクレオチド（１）を、標準のＤＮＡ合成条件を用いて、最終塩基として付加される３４７６−１１７により合成した（図６Ｂ）。３４７６−１１７を有さないｄＴ−２５−マーの対照（２）をまた、比較のために合成した（図６Ａ）。次にそれらのオリゴを５５℃で１６時間、水酸化アンモニウムにより処理し、続いて凍結乾燥した。化合物（１）をさらに、水中、アジド含有アガロースビーズにより一晩、処理した。次に、ビーズを濾過し、水により洗浄し、そして乾燥した。次に、それらを１ＭのＴＢＡＦにより８時間、処理した。ビーズを濾過し、そして濾液を水により希釈し、そしてＧ−２５セファデックスカラムに通した。次に、この材料をＨＬＰＣ−ＭＳにより分析した（図６Ｃ）。明らかに、３４７６−１１７により合成されたオリゴ（１）は、アジド含有ビーズによる処理、続くフッ化物イオンによる解放を伴わないオリゴに比較して、極端に純粋である。
【０１３２】
本発明は限定された数の態様に関して記載されてきたが、この開示の恩恵を有する当業者は、本明細書に開示されるような本発明の範囲を逸脱しない他の態様が考案され得ることを理解しているであろう。従って、本発明の範囲は付随する特許請求の範囲の記載によってのみ制限されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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