【手続補正書】
【提出日】平成27年11月30日(2015.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する抗脂肪生成/抗肥満組成物であって、前記酢酸エチル画分が、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含むことを特徴とする抗脂肪生成/抗肥満組成物：
【化１】
2015527324.tif 000001
。
【請求項２】
脂肪生成性非ヒト哺乳類細胞を、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含むハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する組成物と接触させる処置を含むことを特徴とする、非ヒト哺乳類細胞内の脂肪生成の抑制方法：
【化２】
2015527324.tif 000002
。
【請求項３】
非ヒト哺乳類の脂肪生成に起因する肥満の治療的抑制方法であって、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含むハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する組成物を、前記治療的抑制を必要とする非ヒト哺乳類に食事補給する処置を含むことを特徴とする前記治療的抑制方法：
【化３】
2015527324.tif 000003
。
【請求項４】
哺乳類細胞内での脂肪生成の抑制のための薬剤を調製するための、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含むハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する組成物の使用：
【化４】
2015527324.tif 000004
。
【請求項５】
下記の工程を含むことを特徴とする、ハマスゲの根茎を生物活性指針分別して、(A) それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBと、(B) ピセアタンノール並びにそのダイマーのそれぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBとを含む抗脂肪生成/抗肥満組成物を取得する方法：
１. ハマスゲの根茎を乾燥させ、該根茎を粉砕して粗粉末を調製する工程；
２. 工程１の粉末を3容量のヘキサンで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してヘキサン可溶性画分および廃物質を得る工程；
３. 工程２の廃物質を3容量のメタノールで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してメタノール可溶性活性画分および廃物質を得る工程；
４. 工程３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノール中で可溶化し、クロロホルム(CHCl3)、酢酸エチル(EtOAc)およびメタノールで連続分別して、それぞれ、クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層を得る工程；
５. 前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層をさらなる生物活性指針分別に供する工程であって、生物活性パラメーターが、前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層の、3T3-L1マウス脂肪細胞(哺乳類脂肪細胞)内での脂肪生成を抑制する能力である工程；
６. クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層が示す脂肪生成抑制におけるIC50 (μg/ml)値(それぞれ、0、9.39および66.42)を算出する工程；
７. カラム分画を使用して、前記酢酸エチル層を分別して前記生物活性(脂肪生成抑制)バイオマーカーを同定する工程；該分別工程は、各画分をメタノール：クロロホルムの極性の上昇によって溶出させて前記酢酸エチル層(画分)のサブ画分を得る工程を含む；
８. 工程７のサブ画分を生物活性(抗脂肪生成)分析に供する工程；
９. 工程８の最も生物活性のサブ画分を同定し、これらの画分をLC-MS分析に供して前記生物活性成分スシルプシンAおよびスシルプシンBを同定する工程；
１０. 工程７のサブ画分を分取HPLCに供して精製ダイマーを得、この精製ダイマーを高分解能質量分析(HRMS)、液体クロマトグラフィー・質量分析(LC-MS/MS)および核磁気共鳴分析(NMR)に供してスシルプシン生物活性成分の質量および構造を確認する工程：
【化５】
2015527324.tif 000005
。
【請求項６】
ハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する、哺乳類細胞中の脂肪生成の抑制に使用するための医薬組成物。
【請求項７】
ハマスゲの根茎の酢酸エチル画分を含有する、哺乳類の脂肪生成に起因する肥満の治療的抑制に使用するための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
また、別の実施態様においては、本発明は、ハマスゲの根茎を生物活性指針分別して、(A) それぞれSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBと、(B) ピセアタンノール並びにそのダイマーのそれぞれSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBとを含む抗脂肪生成/抗肥満組成物を取得する方法に関し、該方法は、下記の工程を含む：
１. ハマスゲの根茎を乾燥させ、該根茎を粉砕して粗粉末を調製する工程；
２. 工程１の粉末を3容量のヘキサンで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してヘキサン可溶性画分および廃物質を得る工程；
３. 工程２の廃物質を3容量のメタノールで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してメタノール可溶性活性画分および廃物質を得る工程；
４. 工程３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノール中で可溶化し、クロロホルム(CHCl3)、酢酸エチル(EtOAc)およびメタノールで連続分別して、それぞれ、クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層を得る工程；
５. 前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層をさらなる生物活性指針分別に供する工程であって、ここで、生物活性パラメーターは前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層の3T3-L1マウス脂肪細胞(哺乳類脂肪細胞)内での脂肪生成を抑制する能力である；
６. クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層が示す脂肪生成抑制におけるIC50 (μg/ml)値(それぞれ、0、9.39および66.42)を算出する工程；
７. カラム分画を使用して、前記酢酸エチル層を分別して前記生物活性(脂肪生成抑制)バイオマーカーを同定する工程；該分別工程は、各画分をメタノール：クロロホルムの極性の上昇によって溶出させて前記酢酸エチル層(画分)のサブ画分を得る工程を含む；
８. 工程７のサブ画分を生物活性(抗脂肪生成)分析に供する工程；
９. 工程８の最も生物活性のサブ画分を同定し、これらの画分をLC-MS分析に供して前記生物活性成分スシルプシンAおよびスシルプシンBを同定する工程；
１０. 工程７のサブ画分を分取HPLCに供して精製ダイマーを得、この精製ダイマーを高分解能質量分析(HRMS)、液体クロマトグラフィー・質量分析(LC-MS/MS)および核磁気共鳴分析(NMR)に供してスシルプシン生物活性成分の質量および構造を確認する工程：
【化１】
2015527324.tif 000006
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本発明を好ましい実施態様に関連して説明してきたけれども、当業者であれば、明らかに、本発明はそのような実施態様に限定されないことを理解すべきである。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲に関連してのみ解釈すべきである。
本発明は、さらに、以下の態様であり得る。
〔１〕それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含むことを特徴とする抗脂肪生成/抗肥満組成物：
2015527324.tif 000007
〔２〕脂肪生成性哺乳類細胞を、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含む組成物と接触させる処置を含むことを特徴とする、哺乳類細胞内の脂肪生成の抑制方法：
2015527324.tif 000008
〔３〕哺乳類の脂肪生成に起因する肥満の治療的抑制方法であって、それぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含む組成物を、前記治療的抑制を必要とする哺乳類に食事補給する処置を含むことを特徴とする前記治療的抑制方法：
2015527324.tif 000009
〔４〕下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBを含む組成物の、哺乳類細胞内での脂肪生成の抑制のための使用：
2015527324.tif 000010
〔５〕下記の工程を含むことを特徴とする、ハマスゲの根茎を生物活性指針分別して、A) 下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBと、B) ピセアタンノール並びにそのダイマーのそれぞれ下記のSTR#１およびSTR#2によって示されるスシルプシンAおよびスシルプシンBとを含む抗脂肪生成/抗肥満組成物を取得する方法：
１. ハマスゲの根茎を乾燥させ、該根茎を粉砕して粗粉末を調製する工程；
２. 工程１の粉末を3容量のヘキサンで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してヘキサン可溶性画分および廃物質を得る工程；
３. 工程２の廃物質を3容量のメタノールで抽出し、次いで、加熱して3時間還流処理し、濾過してメタノール可溶性活性画分および廃物質を得る工程；
４. 工程３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノール中で可溶化し、クロロホルム(CHCl3)、酢酸エチル(EtOAc)およびメタノールで連続分別して、それぞれ、クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層を得る工程；
５. 前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層をさらなる生物活性指針分別に供する工程であって、生物活性パラメーターが前記クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層の3T3-L1マウス脂肪細胞(哺乳類脂肪細胞)内での脂肪生成を抑制する能力である工程；
６. クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層が示す脂肪生成抑制におけるIC50 (μg/ml)値(それぞれ、0、9.39および66.42)を算出する工程；
７. カラム分画を使用して、前記酢酸エチル層を分別して前記生物活性(脂肪生成抑制)バイオマーカーを同定する工程；該分別工程は、各画分をメタノール：クロロホルムの極性の上昇によって溶出させて前記酢酸エチル層(画分)のサブ画分を得る工程を含む；
８. 工程７の各サブ画分を生物活性(抗脂肪生成)分析に供する工程；
９. 工程８の最も生物活性のサブ画分を同定し、これらの画分をLC-MS分析に供して前記生物活性成分スシルプシンAおよびスシルプシンBを同定する工程；
１０. 工程７の各サブ画分を分取HPLCに供して精製ダイマーを得、この精製ダイマーを高分解能質量分析(HRMS)、液体クロマトグラフィー・質量分析(LC-MS/MS)および核磁気共鳴分析(NMR)に供して各スシルプシン生物活性成分の分子量および構造を確認する工程：
2015527324.tif 000011