【手続補正書】
【提出日】平成28年9月6日(2016.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-10を産生することができるB10細胞をex vivoで増加させる方法であって、対象動物から採集したB細胞をIL-21と接触させる工程及び該B10細胞を単離する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
さらに細胞をCD40アゴニストと接触させる工程或いはB細胞をCD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに最初にB細胞をCD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞とIL-4の存在下で接触させる工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
B細胞生存促進因子がBAFF（BLyS）である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、B細胞をex vivoで増加させる方法：
a）対象動物から採集したB細胞をCD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞とIL-4の存在下で接触させる工程；
b）工程（a）のB細胞をCD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞とIL-21の存在下で接触させる工程；
c）工程（b）のB細胞を単離する工程；及び
d）工程（c）のB細胞からB10細胞を単離する工程。
【請求項６】
B10細胞が、CD1d、CD5、CD24又はCD27の細胞表面発現について選別することによって単離される、請求項１−５に記載の方法。
【請求項７】
フィーダー細胞がさらにVCAM-1及びCD44、或いは、CD24、IL-7、MST1又はTs1pから選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項２−６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
フィーダー細胞が、コントロールフィーダー細胞よりも少なくとも2倍少ないCD99、CXCR7、Dlk1、Jag1、Notch1又はTGFBIを発現する、請求項２−７のいずれか1項に方法。
【請求項９】
B細胞が、対象動物の血液、脾臓、腹腔、リンパ節、骨髄、自己免疫疾患部位、炎症部位、又は移植物拒絶を示す組織から採集される、請求項１−８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１−９のいずれか1項に記載の方法であって、B細胞が、該方法で使用する前に、非B細胞の除去、又は細胞表面IgM、IgD、IgG、IgA、IgE、CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD40、CD72、CD79a、CD79b、CD1d、CD5、CD9、CD10、CD23、CD27、CD38、CD48、CD80、CD86、CD138、CD148、若しくはそれらの組み合わせについての選別によって単離される、前記方法。
【請求項１１】
CD40アゴニストが、CD154、CD154のフラグメント、又はCD40と反応する抗体、アプタマー又はポリペプチド、又はそれらのフラグメントである、請求項２−１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
B細胞生存促進因子が、フィーダー細胞、BAFF（BLyS）、BAFFフラグメント、APRIL、CD22リガンド、CD22モノクローナル抗体、又はそれらのフラグメントの少なくとも1つから選択される、請求項２−１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
フィーダー細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、又は他の間葉系若しくは間質細胞である、請求項２−１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
B細胞を3から10日間IL-4と接触させる、請求項３−１３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
B細胞を4から8日間IL-21と接触させる、請求項１−１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
B10細胞がIL-10を産生しているか、又はIgM、IgD、IgG、IgA、IgE、CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD40、CD72、CD79a、CD79b、CD1d、CD5、CD9、CD10、CD1d、CD23、CD27、CD38、CD48、CD80、CD86、CD138、CD148、若しくはそれらの組み合わせを含む細胞表面分子の弁別的発現を基準に単離される、請求項１−１５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか1項に記載の方法によって製造される細胞を含む組成物であって、単離B10細胞の50％超がIL-10産生能をもつB10細胞である、前記組成物。
【請求項１８】
前記細胞の90％超がB10細胞である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
自己免疫異常を有する対象動物を治療するため、器官、組織若しくは細胞の移植拒絶又は関連する慢性移植片対宿主病を予防若しくは治療するため、アレルギー性異常又は炎症性異常を治療するため、或いは、組換えタンパク質、治療薬タンパク質又は異種タンパク質を受容する対象動物を処置するための、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
疾患が、多発性硬化症、狼瘡、関節炎、炎症性腸疾患、強皮症、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性異常、敗血症ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス性若しくは細菌性感染症に起因する慢性炎症から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
自己B細胞を含む、請求項１９−２０のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２２】
106から1010の間でB細胞が対象動物に投与される、請求項１９−２１のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２３】
対象動物で諸症候開始前、その最中、又はその開始後に投与される、請求項１９−２２のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２４】
以下の工程を含む、B10細胞機能を対象動物で評価する方法：
a）対象動物由来のサンプルから採集したB細胞をIL-21及びCD40アゴニストと接触させる工程；及び
b）B細胞がIL-10を産生できるか否かを決定する工程。
【請求項２５】
IL-21とともに培養する前に、さらにB細胞をCD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞とIL-4の存在下で接触させる工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を、CD40アゴニスト及びB細胞生存促進因子を発現するフィーダー細胞とIL-21の存在下で接触させる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、産生されたIL-10の量又はIL-10を産生できる細胞のパーセンテージを正常なB細胞機能を有するコントロールと比較する工程、及び対象動物でB10細胞機能が正常であるか又は異常であるかを決定する工程を含む、請求項２４−２６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、B10細胞が正常B10細胞、不全B10細胞又は活性過剰B10細胞であると決定する工程を含む、請求項２４−２７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
対象動物由来のサンプルが、血液、脾臓、腹腔、リンパ節、骨髄、自己免疫疾患部位、炎症部位、又は移植拒絶を示す組織である、請求項２４−２８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
フィーダー細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、又は他の間葉系若しくは間質細胞である、請求項２４−２９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
B細胞を3から10日間IL-4と接触させる、請求項２４−３０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
B細胞を4から8日間IL-21と接触させる、請求項２４−３１のいずれか1項に記載の方法。