(57)【要約】【課題】光透過性粒子の存否をより正確に判別する。【解決手段】拡大光学系２を用いて光透過性粒子を含む試料８から焦点Ｂが外れた状態で光透過性粒子を含む撮像領域Ａを拡大し、拡大光学系２によって拡大された撮像領域Ａの像をカメラ３を用いて撮像する際に、光透過性粒子の位置Ｗを基準として拡大光学系２と反対側の位置であって、拡大光学系２によって拡大される撮像領域Ａの外側の位置に配設された点光源４から光透過性粒子に照明光Ｃを照射する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
拡大光学系を用いて光透過性粒子から焦点が外れた状態で当該光透過性粒子を含む撮像領域を拡大し、当該拡大光学系によって拡大された前記撮像領域の像をカメラを用いて撮像する際に、
前記光透過性粒子の位置を基準として前記拡大光学系と反対側の位置であって、当該拡大光学系によって拡大される前記撮像領域の外側の位置に配設された点光源から前記光透過性粒子に照明光を照射する光透過性粒子の撮像方法。
【請求項２】
前記カメラから出力される前記撮像領域の二次元デジタル画像に対して、当該二次元デジタル画像を構成する各画素の輝度レベルを二値化する処理を実行する請求項１記載の光透過性粒子の撮像方法。
【請求項３】
光透過性粒子から焦点が外れた状態で当該光透過性粒子を含む撮像領域を拡大する拡大光学系と、
当該拡大光学系によって拡大された前記撮像領域の像を撮像するカメラと、
前記光透過性粒子の位置を基準として前記拡大光学系と反対側の位置であって、当該拡大光学系によって拡大される前記撮像領域の外側の位置に配設されて、前記光透過性粒子に照明光を照射する点光源とを備えている光透過性粒子の撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞などの光透過性粒子を顕微鏡などの拡大光学系を使用して撮像する光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞を顕微鏡を介して撮像する撮像方法として、下記特許文献に開示された細胞を計数する方法に使用されている撮像方法が知られている。この撮像方法は、ミルク内の細胞を計数する際に使用される撮像方法であって、測定チャンバを通って流れるミルクを照明するステップと、測定チャンバを流れる照明されたミルクを顕微鏡またはテレ／マクロ写真レンズシステムを備えたカメラシステムで拡大してその二次元デジタル画像を繰り返し記録するステップと、デジタル画像処理により、記録された多数の二次元デジタル画像から細胞のスコアを求めるステップとを実行する。
【０００３】
また、この撮像方法の実施に際しては、第１に、測定チャンバを挟んでカメラシステムと反対側に、カメラシステムの光軸上に位置する状態で、測定チャンバ側から透光性のロッド、光源の順に配置し、光源からの光をロッドを通して測定チャンバに照射してミルクを照明する。第２に、カメラシステムの被写界深度および焦点合わせを画像が鮮明になるように設定し、照明光の最終的な光源となるロッドの先端部をバックに含んだ状態でミルク内の細胞を撮像する。
【０００４】
この細胞を計数する方法によれば、１画像（１つの二次元デジタル画像）当たりに見られる細胞数は少ないが、多数の画像（例えば、数千枚の画像）を記録すると共に、これらの画像をデジタル画像処理することにより、正確な細胞数のスコアを得ることが可能となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５１８８５２号公報（第９−１１頁、第２−３図）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、上記した従来の撮像方法には、解決すべき以下の課題が存在している。すなわち、同じ細胞であっても光透過性のより高い細胞（光透過性粒子ともいう）の撮像に上記の撮像方法を使用した場合、光透過性粒子では明確な輪郭や陰影が伴わないため、撮像して得られた二次元デジタル画像を用いて上記したデジタル画像処理を行ったとしても、光透過性粒子の存否についての十分な情報が得られない（つまり、存否を正確に判別できない）という解決すべき課題が存在している。
【０００７】
本発明は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、光透過性粒子の存否をより正確に判別し得る光透過性粒子の撮像方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく請求項１記載の光透過性粒子の撮像方法は、拡大光学系を用いて光透過性粒子から焦点が外れた状態で当該光透過性粒子を含む撮像領域を拡大し、当該拡大光学系によって拡大された前記撮像領域の像をカメラを用いて撮像する際に、前記光透過性粒子の位置を基準として前記拡大光学系と反対側の位置であって、当該拡大光学系によって拡大される前記撮像領域の外側の位置に配設された点光源から前記光透過性粒子に照明光を照射する。
【０００９】
また、請求項２記載の光透過性粒子の撮像方法は、請求項１記載の光透過性粒子の撮像方法において、前記カメラから出力される前記撮像領域の二次元デジタル画像に対して、当該二次元デジタル画像を構成する各画素の輝度レベルを二値化する処理を実行する。
【００１０】
また、請求項３記載の光透過性粒子の撮像装置は、光透過性粒子から焦点が外れた状態で当該光透過性粒子を含む撮像領域を拡大する拡大光学系と、当該拡大光学系によって拡大された前記撮像領域の像を撮像するカメラと、前記光透過性粒子の位置を基準として前記拡大光学系と反対側の位置であって、当該拡大光学系によって拡大される前記撮像領域の外側の位置に配設されて、前記光透過性粒子に照明光を照射する点光源とを備えている。
【発明の効果】
【００１１】
請求項１記載の光透過性粒子の撮像方法および請求項３記載の光透過性粒子の撮像装置によれば、試料が透明な培養液とこの培養液中に含まれている光透過性粒子とで構成されていたとしても、試料における撮像領域内に含まれる部位内に存在している複数の光透過性粒子のうちの多くの光透過性粒子の存在位置に、輝度の高い画像が点状に位置している（現れる）二次元デジタル画像をカメラの撮像によって得ることができる。したがって、光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置によれば、この二次元デジタル画像に基づいて、他の部位よりも輝度の高い点状の画像の個数を計数することにより、撮像領域内に含まれる培養液中に存在している光透過性粒子の概数を確実かつ正確に計数することができる。
【００１２】
また、請求項２記載の光透過性粒子の撮像方法によれば、カメラから出力される撮像領域内の二次元デジタル画像に対して二値化する処理を実行するため、二次元デジタル画像に基づいて、輝度の高い点状の画像の個数を確実かつ正確に、しかも簡単に計数することができる結果、培養液中の光透過性粒子の概数の計数を確実かつ正確に、しかも容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】光透過性粒子の撮像方法の実施に際して使用する撮像装置１の構成を示す構成図である。
【図２】光透過性粒子の撮像方法によって撮像された実施例としての二次元デジタル画像（図面代用写真）である。
【図３】拡散光を使用する撮像方法によって撮像された比較例としての二次元デジタル画像（図面代用写真）である。
【図４】従来の光透過性粒子の撮像方法によって撮像された二次元デジタル画像（図面代用写真）である。
【図５】図２において輝度の高い点状の画像として撮像されているいくつかの細胞を識別するために付した数字を、当該細胞の位置に対応する位置に丸印で囲んだ状態で配置した図２についての対応図である。
【図６】図５において識別用の数字を付した細胞についての図４での位置を示すために、当該位置に対応する位置に当該数字を丸印で囲んだ状態で配置した図４についての対応図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置の実施の形態について、添付図面を参照して説明する。
【００１５】
まず、光透過性粒子の撮像装置１の構成について図面を参照して説明する。
【００１６】
撮像装置１は、図１に示すように、拡大光学系２、カメラ３、点光源４、処理部５および出力部６を備え、スライドガラスなどの透光性を有する試料台７の上に載置された試料８の像（拡大光学系２によって拡大された像）についての二次元デジタル画像を撮像すると共に出力可能に構成されている。本例では、試料８は、一例として、透明な培養液（不図示）と、この培養液中に含まれている光透過性粒子としての細胞（図２参照）で構成されて、撮像装置１は、その撮像領域Ａ（斜線を付した領域）に含まれる試料８の一部についての像の二次元デジタル画像を撮像して出力する。なお、本例では一例として、生きている細胞を試料８として撮像するものとする。
【００１７】
拡大光学系２は、一例として光学顕微鏡で構成されている。また、拡大光学系２は、試料台７の上に載置された試料８に、不図示の対物レンズが対向する状態で配設されて、焦点Ｂが試料８から外れた状態で撮像領域Ａを拡大して観察可能に構成されている。本例では一例として、拡大光学系２は、試料８の若干手前側に焦点Ｂが位置する状態（焦点Ｂが試料８から外れた状態）で撮像領域Ａを観察するように構成されているが、試料８の若干奥側に焦点Ｂが位置する状態（焦点Ｂが試料８から外れた他の状態）で撮像領域Ａを観察する構成を採用することもできる。
【００１８】
カメラ３は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device ）などの撮像素子を有して構成されて、拡大光学系２の不図示の接眼レンズ部分に装着されている。また、カメラ３は、拡大光学系２によって拡大された試料８の像（不図示）を撮像する。また、カメラ３は、撮像した撮像領域Ａ内に含まれる像についての二次元デジタル画像を示す画像データＤ１を出力する。
【００１９】
点光源４は、大きさが受照点（本例では、試料８）までの距離に比べて十分小さく、点とみなし得る光源であって、一例として、１つの発光ダイオードを用いて構成されている。また、点光源４は、試料８に対して試料台７側から照明光Ｃ（ドット部分）を照射する。具体的には、点光源４は、試料８の存在位置Ｗを基準として拡大光学系２と反対側の位置であって、拡大光学系２によって拡大される撮像領域Ａ（カメラ３の撮像領域でもある）の外側の位置に配設されて、試料８に対して斜め方向（拡大光学系２の光軸Ｌに対して斜め方向）から照明光Ｃを照射する。
【００２０】
この場合、試料８は、上記したように、透明な培養液および光透過性粒子としての細胞で構成されて、透光性を有する試料台７の上に載置されている。このため、図１に示すように、試料８の存在位置Ｗにおいて撮像領域Ａの全域が試料８の一部で覆われている場合であっても、点光源４が撮像領域Ａ内に位置しているときには、点光源４の像は試料台７および試料８を透過してカメラ３によって撮像される。本例の撮像装置１では、この状態を回避するため、上記したように、点光源４は撮像領域Ａの外側の位置に配設されている。
【００２１】
処理部５は、一例として、ＣＰＵおよびメモリ（いずれも図示せず）を備えて構成されて、カメラ３から出力された画像データＤ１に対する画像処理を実行する。また、処理部５は、画像データＤ１、および画像処理によって生成された新たな画像データＤ２の少なくとも一方のデータを出力部６に出力する出力処理を実行する。
【００２２】
出力部６は、一例として、液晶ディスプレイなどの表示装置で構成されて、処理部５から出力された画像データＤ１，Ｄ２のうちの少なくとも一方のデータに基づいて、このデータで示される二次元デジタル画像を画面上に表示させる。なお、出力部６をデータ伝送回路で構成して、撮像装置１とは別体に配設された表示装置などに画像データＤ１，Ｄ２のうちの少なくとも一方のデータを出力し、この表示装置にこの一方のデータで示される二次元デジタル画像を表示させる構成を採用することもできる。
【００２３】
次いで、この撮像装置１を用いた光透過性粒子の撮像方法について、添付図面を参照して説明する。
【００２４】
まず、光透過性粒子としての細胞を含む培養液を試料台７の表面に試料８として滴下する。続いて、図１に示すように、拡大光学系２の焦点Ｂから試料８（試料８中の細胞）が外れる状態となるように、拡大光学系２に対向して試料台７を配置する。次いで、拡大光学系２を用いて試料８を含む撮像領域Ａを拡大し、この拡大光学系２によって拡大された撮像領域Ａの像をカメラ３を用いて撮像する。
【００２５】
この撮像装置１では、点光源４が撮像領域Ａの外側に位置しているため、カメラ３から出力される画像データＤ１で示される二次元デジタル画像（撮像領域Ａ内に含まれる像についての二次元デジタル画像）には、輝度の高い点光源４の像は含まれていない。これにより、二次元デジタル画像内に含まれている複数の細胞のそれぞれの輪郭や陰影が、同じく二次元デジタル画像内に含まれている輝度の高い点光源４からの光によって判別できない状態となるといった事態の発生が回避されている。
【００２６】
また、試料８には、点光源４からの光が光軸Ｌを基準として斜め方向から試料８に照射され、かつ拡大光学系２の焦点Ｂが試料８から外れた状態となっている。これにより、試料８を構成する透明な培養液中に含まれている複数の細胞のうちの多くの細胞について、細胞が試料８の厚み方向に沿って重なり合いながら存在している状態であっても、各細胞において、その一部（具体的には中央部）の輝度が他の部位の輝度に対して高められた像（図２における白色の点状の像）として、拡大光学系２によって観察される。したがって、カメラ３から出力される画像データＤ１で示される二次元デジタル画像内には、この二次元デジタル画像内に含まれているすべての細胞のうちの多くの細胞の存在位置に、輝度の高い点状の画像が存在する状態となっている。
【００２７】
処理部５は、カメラ３から出力された画像データＤ１を入力してメモリに記憶する。この場合、画像データＤ１は、上記したように、試料８における撮像領域Ａ内に含まれる部位内に位置している複数の細胞のうちの多くの細胞の存在位置に、輝度の高い点状の画像が位置している二次元デジタル画像を示している。
【００２８】
次いで、処理部５は、この画像データＤ１に対する画像処理を実行する。本例では一例として、この画像処理では、処理部５は、画像データＤ１で示される二次元デジタル画像に対して、二次元デジタル画像を構成する各画素の輝度レベルを予め規定した基準輝度レベルを基準として（しきい値として）二値化する処理（例えば、基準輝度レベル以上の輝度レベルの画素を示すデータを「１」とし、基準輝度レベル未満の輝度レベルの画素を示すデータを「０」とする二値化処理）を実行する。また、処理部５は、このようにして二値化された二次元デジタル画像を示す画像データＤ２をメモリに記憶する。
【００２９】
最後に、処理部５は、出力処理を実行する。この出力処理では、処理部５は、メモリに記憶されている画像データＤ１および画像データＤ２のうちの少なくとも一方を表示装置で構成された出力部６に出力して、画像データＤ１および画像データＤ２で表される二次元デジタル画像のうちの少なくとも１つを画面上に表示させる。これにより、出力部６には、撮像領域Ａ内に位置する試料８に含まれている複数の細胞のうちの多くの細胞について、それらの存在位置に、他の部分よりも輝度の高い点状の画像が存在している二次元デジタル画像が表示される。
【００３０】
このように、この光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置１によれば、試料８が透明な培養液とこの培養液中に含まれている光透過性を有する細胞（光透過性粒子）とで構成されていたとしても、試料８における撮像領域Ａ内に含まれる部位内に存在している複数の細胞のうちの多くの細胞の存在位置に、輝度の高い画像が点状に位置している（現れる）二次元デジタル画像を示す画像データＤ１をカメラ３によって得ることができる。したがって、光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置１によれば、画像データＤ１で示される二次元デジタル画像に基づいて、他の部位よりも輝度の高い点状の画像の個数を計数することにより、撮像領域Ａ内に含まれる培養液中に存在している細胞の概数を確実かつ正確に計数することができる。
【００３１】
この光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置１を使用して、乳がんの細胞を含む試料８を撮像して得られた二次元デジタル画像（実施例）を図２に示す。また、この構成において、点光源４と試料台７との間に光を拡散させて透過させる拡散フィルムを配置することで、同じ試料８を拡散光を照射した状態で撮像して得られた二次元デジタル画像（比較例）を図３に示す。また、従来の撮像方法を採用して、つまり、点光源４に代えて、試料台７の背面側における拡大光学系２の光軸Ｌ上に面状の光源を配置して、試料台７側から試料８を照明し、かつ拡大光学系２の焦点を試料８に合わせた構成で、同じ試料８を撮像して得られた二次元デジタル画像（従来例）を図４に示す。
【００３２】
図２の二次元デジタル画像では、この画像中に含まれている複数の細胞のうちの多くの細胞（例えば、図２の対応図としての図５において数字１〜９を付した細胞）について、その一部（中央部）が輝度の高い点状の画像（同図中において白色の点状の画像）として撮像されている。このため、個々の細胞の輪郭の特定は困難であるものの、この輝度の高い点状の画像に基づいて個々の細胞の存在については明確に認識することが可能となっている。このため、この点状の画像の個数を計数することにより、培養液中の細胞の概数を計数することが可能である。一方、比較例としての図３の二次元デジタル画像は、ほぼ均一な輝度の画像として撮像されているため、細胞の特定は困難である。これにより、試料８に照射する光は、散乱光ではなく、点光源４からの光が好ましいことが確認される。また、従来例としての図４の二次元デジタル画像では、図４の対応図としての図６において数字１〜９を付した細胞（図２において輝度の高い点状の画像として撮像された細胞）については、細胞の輪郭であると思われる環状の模様が画像として撮像されているが、図２の二次元デジタル画像と比較して、個々の細胞を示す環状の模様がそれ以外のランダムな形状の模様と同じような輝度で混在した状態で撮像されることから、個々の細胞の存在位置が不明確となり、細胞の計数は困難である。
【００３３】
また、この光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置１によれば、カメラ３から出力される撮像領域Ａ内の二次元デジタル画像（例えば、図２の二次元デジタル画像）を示す画像データＤ１に対して、基準輝度レベルを基準（しきい値）とした二値化処理を実行するため、画像データＤ２で示される二次元デジタル画像に基づいて、輝度の高い点状の画像の個数を確実かつ正確に、しかも簡単に計数することができる結果、培養液中の細胞の概数の計数を確実かつ正確に、しかも容易に行うことができる。
【００３４】
なお、生きている細胞を試料８として撮像する例を挙げて説明したが、上記の光透過性粒子の撮像方法および光透過性粒子の撮像装置１は、死んでいる細胞を試料８として撮像することもできる。また、この場合には、試料８に含まれている細胞を染色した状態で撮像する方法を採用することもできる。
【符号の説明】
【００３５】
１  撮像装置
２  拡大光学系
３  カメラ
４  点光源
７  試料台
８  試料
Ａ  撮像領域
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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