(57)【要約】【課題】本発明は、オウゴン抽出物に由来する成分を含有するＭＭＰ−１阻害剤を提供する。【解決手段】オウゴン抽出物、特に、一般式（１）：2013203679.tif 000008で表される化合物又はその塩を５重量％以上含有する抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１阻害剤、及びそれを含むがんの予防又は治療剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オウゴン抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１阻害剤。
【請求項２】
オウゴン抽出物が、一般式（１）：
【化１】
2013203679.tif 000006
で表される化合物又はその塩を５重量％以上含有する抽出物である請求項１に記載のＭＭＰ−１阻害剤。
【請求項３】
一般式（１）で表される化合物がバイカリンである請求項２に記載のＭＭＰ−１阻害剤。
【請求項４】
一般式（１）：
【化２】
2013203679.tif 000007
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するＭＭＰ−１阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＭＭＰ−１阻害剤を含むがんの予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オウゴン抽出物を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）は、がん細胞の浸潤・転移において重要な役割を果たしている。がん細胞の浸潤・転移には、細胞外基質を分解して組織に侵襲していくことが重要な過程となる。がん細胞はＭＭＰを過剰発現し分泌するので、がん細胞の浸潤・転移に深く関与している（非特許文献１等）。特に、基底膜を通り抜けたがん細胞は、ＭＭＰ−１を分泌して、主としてタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩコラーゲンで構成されている細胞外基質を破壊し、血管あるいはリンパ管に到達すると血管の基底膜を破壊して血管内に侵入し、他の臓器などに転移することが知られている。
【０００３】
そのため、ＭＭＰ−１を阻害することにより、新規ながん治療薬を創出できると考えられる。そのような治療薬として低分子のＭＭＰ−１阻害薬が大いに期待されているが、いまだ開発されていない。
【０００４】
シソ科（Labiatae）のコガネバナ（Scutellaria baicalensis Georgi）の周皮を除いた根であるオウゴンに含まれるウォゴニン（wogonin）が、ＭＭＰ−１の転写因子であるアクチベーター プロテイン−１（ＡＰ−１）の活性化を阻害すること（非特許文献２）や、オウゴンに含まれるバイカリン（Baicalin）が炎症性サイトカインであるインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）によるＭＭＰ−１発現誘導を阻害すること（非特許文献３）が報告されている。しかし、オウゴンについてＭＭＰ−１自体に対する阻害作用を研究した報告例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】がん研究のいま〜(2)がん細胞の生物学、高井義美・秋山徹 編集／東京大学出版会／2006
【非特許文献２】Mol Pharmacol. 2001, Sep. 60(3):507-13.
【非特許文献３】Eur. J. Pharmacol. 2010, Sep. 1; 641(1): 1-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、オウゴン抽出物に由来する成分を含有するＭＭＰ−１阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、オウゴン抽出物に含まれるバイカリン（Baicalin）が優れたＭＭＰ−１阻害活性を有することを見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記のＭＭＰ−１阻害剤を提供する。
【０００９】
項１  オウゴン抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１阻害剤。
【００１０】
項２  オウゴン抽出物が、一般式（１）：
【００１１】
【化１】
2013203679.tif 000002
【００１２】
で表される化合物又はその塩を５重量％以上含有する抽出物である項１に記載のＭＭＰ−１阻害剤。
【００１３】
項３  一般式（１）で表される化合物がバイカリンである項１に記載のＭＭＰ−１阻害剤。
【００１４】
項４  一般式（１）：
【００１５】
【化２】
2013203679.tif 000003
【００１６】
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するＭＭＰ−１阻害剤。
【００１７】
項５  項１〜４のいずれかに記載のＭＭＰ−１阻害剤を含むがんの予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＭＭＰ−１阻害剤は、オウゴン抽出物（さらに一般式（１）で表される化合物、特にバイカリン）を有効成分として含有することを特徴とし、これらは、ＭＭＰ−１に対し優れた阻害活性を示すため、がんの予防又は治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】オウゴンの抽出及び分画工程を示すグラフである。
【図２】オウゴニン、バイカリン、バイカレイン、ロズマリン酸及びフェルラ酸のＭＭＰ−１阻害活性（ＩＣ５０値）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明のＭＭＰ−１阻害剤は、オウゴンの抽出物を有効成分として含有する。
【００２２】
オウゴンは、シソ科（Labiatae）のコガネバナ（Scutellaria baicalensis Georgi）を起源植物とし、その周皮を除いた根を乾燥したものである（第１５改正日本薬局方）。オウゴンの抽出物とは、オウゴンを例えば熱水抽出法、水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法、油脂吸収法、揮発性溶剤抽出法、超臨界流体抽出法等の公知の方法を用いて抽出した成分である。抽出液としては、例えば、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；酢酸エチル等のエステル；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサン等のエーテル等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を用いることができる。上記のうち、熱水抽出法が好ましく採用され、さらに必要に応じエタノールやエステルを用いた溶剤抽出法等を採用することもできる。
【００２３】
上記方法によってオウゴン抽出物を得た後、本発明では得られた抽出液をそのままＭＭＰ−１阻害剤として用いることが可能である。或いは、必要に応じて、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって抽出物を得ることができる。
【００２４】
更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、ＭＭＰ−１阻害活性のある画分又は化合物を取り出して、ＭＭＰ−１阻害剤とすることができる。溶出溶媒は、公知のものを用いればよい。
【００２５】
オウゴン抽出物は、それ自身で強いＭＭＰ−１阻害活性を有しているが、抽出物を活性のある分画部に分離し、さらに精製することにより、ＭＭＰ−１阻害活性の高い抽出物の分画部を調製することができる。
【００２６】
本発明において、オウゴン抽出物中のＭＭＰ−１阻害活性を発揮する成分がバイカリンであることを確認し（実施例３及び図２を参照）、この知見に基づき、下記一般式（１）：
【００２７】
【化３】
2013203679.tif 000004
【００２８】
で表される化合物又はその塩が特に高いＭＭＰ−１阻害活性を有していることを見出した。一般式（１）で表される化合物又はその塩のうち、好ましくは、一般式（１ａ）：
【００２９】
【化４】
2013203679.tif 000005
【００３０】
で表される化合物（即ち、バイカリン）又はその塩である。
【００３１】
オウゴン抽出物又はその分画部には、乾燥重量にて、一般式（１）で表される化合物（特に、バイカリン）を５重量％以上、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは５０〜１００重量％、特に好ましくは８０〜１００重量％含んでいる。
【００３２】
一般式（１）で表される化合物（特に、バイカリン）は、オウゴンの抽出物から単離精製して得ることができ、或いはバイカレインと対応するウロン酸（特に、グルクロン酸）から公知の方法に従い合成することもできる。
【００３３】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、その塩、その溶媒和物、結晶多形、光学異性体等のいずれをも包含する。
【００３４】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、酸性基であるカルボキシル基を有するため、薬学的に許容可能な塩基性化合物と塩を形成することができる。当該塩基性化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
【００３５】
本発明のＭＭＰ−１阻害剤は、オウゴン抽出物又はその分画部を含み、或いは、単離精製した一般式（１）で表される化合物（特に、バイカリン）を含む。
【００３６】
本発明のＭＭＰ−１阻害剤を医薬品として用いる場合、哺乳動物（特に、ヒト）におけるがんの予防又は治療薬として用いられる。具体的には、がん細胞がＭＭＰ−１を分泌して細胞外基質を破壊し、血管あるいはリンパ管に到達すると血管の基底膜を破壊して血管内に侵入し他の臓器などに転移する。この際に、本発明のＭＭＰ−１阻害剤は、このＭＭＰ−１を阻害することでがん細胞の浸潤・転移を予防することができる。
【００３７】
本発明のＭＭＰ−１阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。
【００３８】
製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。
【００３９】
本発明の医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選ぶことができる。
【実施例】
【００４０】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１（MMP-1阻害活性試験）
MMP-1阻害活性の測定は、下記に示すSDS-PAGEによる電気泳動を利用した阻害活性の測定法を採用した。MMP-1阻害活性測定法の試薬および試料において、typeIIcollagen（Lot.No.10917，MCK社製）は250μg/mlで用いた。MMP-1（Collagenase Type Ｉ，Lot.No.D00102633，CALBIOCHEM社製）は25U /mlで用いた。
【００４２】
MMP-1阻害活性測定法は、typeIIcollagen（250μg/ml）50μl、試料サンプル100μl、MMP-1（25U/ml）50μlを1000μlマイクロチューブに入れ混合し、加温機（DRYING OVEN PO-300A ，AS ONE社製）を用いて38℃で120分間加熱した。次に、反応停止液として、5-メルカプトエタノール（Lot.No.M9G6347，ナカライテスク社製）5μl、SDS還元バッファー95μlを入れた。混合後、定温乾燥機（DO-300A、AS ONE社製）を用いて95℃で5分間加熱し、酵素を失活させた。その液の5μlを泳動用サンプルとした。
【００４３】
SDS-PAGEによる電気泳動は、BIO-RAD社製のPOWER/PAC 300を用いた。条件として、濃縮ゲルをポリアクリルアミド4%ゲル、分離ゲルをポリアクリルアミド10%ゲル、20mA/ゲル1枚と設定し100分間泳動した。そして、ゲルを約100ml精製水に浸し、マルチシェーカー（MS-300，AS ONE社製）を用いて5分間振とうさせ、精製水を交換し、これを計3回繰り返し洗浄した。次に、約50mlのCBB Stain One（ナカライテスク社製）でゲルを浸し、マルチシェーカーを用いて60分間振とうさせ、染色した。最後に、ゲルを約100mlの精製水で浸し、マルチシェーカーを用いて10分間振とうさせ、精製水を交換し、これを計3回繰り返し脱色した。
【００４４】
そのゲルを用いて、電気泳動ゲル解析ソフトウェアであるNHI Image J（Version 1.41）を使って解析した。各試料のバンド強度から、下記の式（Ｉ）で阻害率を求めた。
【００４５】
阻害率（％）＝100×（サンプル）/｛（コントロール）−（ブランク）｝  （Ｉ）
実施例２（オウゴンの抽出物及びその分画部のMMP-1阻害活性評価）
オウゴン（Scutellariae Radix）をウィレー粉砕機（池本理化工業社製）で粉末にした。生薬（オウゴン粉末）1.5gと水道水15mlを秤量した。それらをパーソナル有機合成装置（ゾディアックCCX-1000，東京理化器械社製）の試験管に入れ、110℃で60分間加熱した。その抽出液を、減圧下で吸引ろ過し、300mlナスフラスコにとり、凍結させ、減圧乾燥した。それによりできた粉末を抽出エキスとした。オウゴンの抽出エキスを、メタノールエキス、酢酸エチルエキスに分画し（図１）、これらについてMMP-1阻害活性を検討した。
【００４６】
文火楽楽（栃本天海堂社製）を用い、オウゴン200ｇを秤量し、水道水810ml計量し、それらを専用の容器に入れて沸騰させた。その後30分間中火で煮沸抽出した。生薬残渣を取り除くために、ヌッチェにガーゼを敷いて抽出液を吸引ビンにてろ過した。抽出液は300mlナスフラスコ2本に取り分け、凍結させ、減圧下で凍結乾燥し、水抽出エキス（収率17.48%）を得た。
【００４７】
次に、１Lマイヤーに、水抽出物10ｇ秤量し、１Lのメタノールを用いて30分間超音波で抽出を行った。続いて、生薬残渣を再度１Lのメタノールを用いて30分間超音波抽出を行った。この作業を、計3L分のメタノールを用い繰り返した。メタノール可溶部は、300mlナスフラスコに取り分け、順次エバポレーターを用いメタノールを取り除いた。乾固物に精製水を加えて凍結させた後，凍結乾燥機（太陽科学工業社製、VA-300 FREEZE TRAP）を用いて凍結乾燥し、メタノール可溶部エキス（収率13.54%）を得た。また、生薬残渣においても凍結乾燥を行った。これにより、メタノール不溶部エキスを（収率2.53%）得た。
【００４８】
メタノール可溶部、不溶部エキスを精製水で濃度10mg/mlにし、MMP-1阻害活性測定法（実施例１）により阻害率がそれぞれ，89.4％，29.9％となった。メタノール可溶部エキスのMMP-1阻害活性が強かったので、続いてメタノール可溶部の分画をおこなった。
【００４９】
次に、１Lマイヤーにメタノール可溶部エキス5ｇ秤量し、１Lの酢酸エチルを用いて30分間超音波で抽出を行った。続いて、生薬残渣を再度１Lの酢酸エチルを用いて30分間超音波抽出を行った。この作業を、計3L分の酢酸エチルを用い繰り返した。酢酸エチル可溶部は300mlナスフラスコに取り分け、順次エバポレーターを用い酢酸エチルを取り除いた。乾固物に精製水を加えて凍結させた後、凍結乾燥機（太陽科学工業社製、VA-300 FREEZE TRAP）を用いて凍結乾燥をし、酢酸エチル可溶部エキス（収率0.083%）を得た。また、生薬残渣においても凍結乾燥を行った。これにより酢酸エチル不溶部エキス（収率3.46%）を得た。
【００５０】
酢酸エチル可溶部エキス及び不溶部エキスをMMP-1阻害活性測定法（実施例１）により測定したところ、10mg/mlではそれぞれ48.1％，97.1％の阻害率を示し、1mg/mlではそれぞれ18.8％，43.7％の阻害率を示した。酢酸エチル不溶部のMMP-1阻害活性が強かったので、続いて酢酸エチル不溶部の分画を行った。
【００５１】
次に、酢酸エチル不溶部を高速液体クロマトグラフ法で精製を繰り返し行い、活性成分としてバイカリン（baicalin）を得た。
【００５２】
実施例３（バイカリン等のMMP-1阻害活性測定）
実施例２で単離精製したバイカリン、並びにバイカリンのアグリコンであるバイカレイン（Baicalein）、オウゴンに特有の成分であるオウゴニン（Wogonin）、既知の植物由来のMMP阻害成分であるロズマリン酸（Rosmarinic acid）及びフェルラ酸（Ferulic acid）について、実施例１に記載のMMP-1阻害活性測定法を用いてMMP-1阻害活性を測定し、それぞれIC50(μM)を求めた。
【００５３】
その結果を、図２に示す。これより、フラボノイドにウロン酸を有するバイカリンは、高いMMP-1阻害活性を有するのに対し、同じフラボノイドでもウロン酸を有しないバイカレインやオウゴニンはMMP-1阻害活性が認められない又は非常に弱いことが確認された。また、バイカリンは、ロズマリン酸及びフェルラ酸と同程度の高いMMP-1阻害活性を有することが確認された。
【００５４】
なお、実施例２で得られたオウゴンの水抽出物のIC50(mg/ml)は、5.6であった。
【図１】
2013203679.tif 000009
【図２】
2013203679.tif 000010