(57)【要約】【課題】  ＤＮＡの増幅等において、極めて高い感度で蛍光をリアルタイムで測定可能な蛍光測定装置等を提供する。【解決手段】  ウェル３は、内部に反応溶液１５を保持可能である。ウェル３は、反応溶液と接する側から、内部樹脂層１９および外部樹脂層２３の二層構造で構成される。ここで、内部樹脂層１９の屈折率は、外部樹脂層２３よりも高い。また、導波路９は、中央部にコア部２５が設けられ、コア部２５を覆うように外周部にクラッド部２７が設けられる。コア部２５を構成する樹脂の屈折率は、クラッド部２７を構成する樹脂の屈折率よりも高い。ウェル３と導波路９との接合部では、内部樹脂層１９とコア部２５とが接合される。また、外部樹脂層２３とクラッド部２７とが接合される。したがって、内部樹脂層１９内に封じ込められた光は、コア部２５に導出され、コア部２５内を伝播する。【選択図】図２
2013053911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定装置であって、
反応溶液を保持するウェルと、
前記ウェルの外周部に配置され、反応溶液の温度を調整可能な温度調整部と、
前記ウェルの下方に設けられる導波路と、
前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器と、を具備し、
前記ウェルは、少なくとも外部樹脂層と、内部樹脂層の二層構造であり、
前記内部樹脂層の屈折率は、前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、
前記導波路は、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有して、前記ウェルと一体で構成されるとともに、複数の前記ウェルが連結されてウェルプレートを形成し、
前記温度調整部によって前記反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中で生体材料の反応あるいは生成を行うことができ、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記内部樹脂層に封じ込めて前記コア部に導出して前記蛍光測定器によって測定可能であることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記温度調整部は、
均熱板と、
前記均熱板の下部に設けられる熱電素子と、
前記熱電素子の下部に配置される冷却部と、を具備し、
前記ウェルおよび前記導波路が前記温度調整部を貫通して設けられることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記ウェルの上端面又は外部樹脂層の外周面の少なくともいずれかには、反射膜が形成されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記導波路の端部には光源が設けられ、
前記光源は、前記導波路を介して前記ウェル内の前記反応溶液に光を照射し、
前記蛍光測定器は、前記導波路からの蛍光を光フィルタを介して測定可能であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記ウェルのコアを構成する樹脂は、ポリカーボネート、変性ポリカーボネート、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂のいずれかであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
蛍光測定用の反応溶液を保持する蛍光測定用ウェルであって、
前記反応溶液の保持部は、少なくとも外部樹脂層と内部樹脂層の二層構造であり、
前記内部樹脂層の屈折率は、前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、
前記保持部の下方に前記保持部と一体で形成される導波路は、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有し、
複数の前記保持部が連結されて構成されることを特徴とする蛍光測定用ウェル。
【請求項７】
請求項１に記載の蛍光測定装置の温度調整部を制御して、前記ウェル内に保持された反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中の蛍光色素で標識した生体材料の反応あるいは生成の進行を、前記反応溶液からの蛍光を連続して前記光測定器で測定することを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項８】
請求項１に記載の蛍光測定装置の温度調整部を制御して、前記ウェル内に保持された反応溶液を昇温して、鋳型ＤＮＡを一本鎖に分離する変性工程と、前記変性工程から降温し、プライマをＤＮＡにハイブリダイズするアニーリング工程と、前記アニーリング工程から昇温し、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応により、プライマに挟まれたＤＮＡ領域を増幅するポリメラーゼ伸長工程と、前記ポリメラーゼ伸長工程から降温し、ＤＮＡ領域の増幅の進行を前記光測定器で測定する蛍光測定工程と、を具備することを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項９】
前記反応溶液中の蛍光を前記光測定器により測定後、測定を終了した反応溶液を保持するウェルプレートを前記温度調整部より取り外し、新たな測定対象である反応溶液を保持するウェルプレートに交換した後、蛍光測定を繰り返すことを特徴とする請求項７または請求項８記載の蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料の反応あるいは生成あるいは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの蛍光測定装置およびこれらの装置を用いた蛍光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法は、ごく微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域を短時間で増殖する方法として知られている。その原理は、２本鎖ＤＮＡ上の２つの既知配列を利用して、相互いの合成方向が向かい合うような２つのプライマＤＮＡを設計する。これらのプライマに挟まれた領域のＤＮＡが合成されると、それが次のサイクルでは鋳型になる。このような反応を繰り返すことで、ＤＮＡ鎖を幾何級数的に増幅することができる。
【０００３】
ＤＮＡを増幅するＰＣＲ装置は、例えば、反応溶液の温度を５０℃台、７０℃台、９０℃台に３段階に変え、変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程を繰り返すことでＤＮＡを増幅する。なお、３段階の温度制御を一通り行うと理論上ＤＮＡ量は２倍となる。
【０００４】
このような、ＰＣＲ装置において、ＤＮＡの増幅の進行を把握する手段としては、ＤＮＡの増幅に応じて発生する、または消滅する蛍光を測定する方法がある。例えば、ヘアピンプライマＰＣＲ法では、ヘアピン領域に低分子が特異的に結合するシトシンバルジ領域が導入され、ＤＮＡ鎖の合成が進行し、ＰＣＲによりヘアピンプライマのヘアピン構造が開かれると、シトシンバルジ構造が消失する。このため蛍光色素が遊離して、蛍光強度が低下する。
【０００５】
また、例えばＴａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ法では、蛍光基と消光基で標識されたオリゴマーを用い、ＤＮＡの増幅に伴って消光基が消滅することで、ＤＮＡ鎖の合成が進行によって蛍光強度が増加するものである。すなわち、いずれの場合においても、反応系の蛍光を検出することで、ＰＣＲの進行を把握することができる。
【０００６】
このような、リアルタイムＰＣＲに関しては、例えば、伸長性の優れたＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲに用いることにより、より短時間で遺伝子を検出することが可能な遺伝子の増幅方法が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２３９８８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
図９は、このようなリアルタイムＰＣＲによって、蛍光を測定するためのウェル近傍を示す概略図である。まず、図９（ａ）に示すように、ウェル１０９内に各種の構成を含む反応溶液１１３が入れられる。この状態で、上方より照射・受光部１１１より光を照射する（図中矢印Ｉ方向）。照射・受光部１１１は、例えば光ファイバであり、図示を省略した光源および蛍光測定器に接続されている。
【０００９】
光が照射された反応溶液からは、ＰＣＲの進行に応じた蛍光が発生（消失）する。図９（ｂ）は、仮に蛍光発生中心１１５を蛍光の発生する中心であるとした場合に、蛍光の発生する状態を示す模式図である。蛍光発生中心１１５から発生する蛍光は、蛍光発生中心１１５を中心に全方向に（蛍光発生中心１１５を中心とする球体を仮定した場合の球面方向に対して）略均一に発生する（図中矢印Ｊ方向）。
【００１０】
この際、例えば照射・受光部１１１の受光面と蛍光発生中心１１５との距離をＬとすると、仮想受光面１１７（半径Ｌの球体の表面積）は、４πＬ２で表わされる。すなわち、ウェル１０９での反射等を無視すれば、反応溶液から発生した蛍光は、４πＬ２の表面積を有する仮想受光面１１７の表面全体に均一に到達する。
【００１１】
ここで、照射・受光部１１１の受光面の面積をａとすれば、実際に発生した蛍光の内、受光できる蛍光の量は、全体の４πＬ２の面積の内、面積ａの受光可能領域１１９（図中におけるハッチング部）のみとなる。すなわち、それ以外の方向に進んだ蛍光は、受光されることなく散逸する。
【００１２】
ここで、照射・受光部１１１の径を５ｍｍΦとし、距離Ｌを１０ｍｍとする。すると、仮想受光面１１７の全表面積（４×π×１０２）は、１２５７ｍｍ２程度となる。また、受光面の面積は（π×２．５２）は、約２０ｍｍ２程度となる。したがって、発生した蛍光に対して、２０／１２５７＝約１．６％程度となる。
【００１３】
このように、従来の蛍光測定装置においては、実際に生じた蛍光のほとんどが外部に漏れ出しており、発生した蛍光の内、わずかしか受光することができない。すなわち、蛍光を受光する効率が極めて悪い。したがって、例えば、医療分野において、被検査サンプル中の抗原（例えばウィルス）量が十分でないと検出精度を確保することが困難である。
【００１４】
特に、通常は多数のウェル内の蛍光を同時または順次に測定するため、複数のウェルプレート又は測定器が移動して測定を行う。この際、図９に示すように、測定距離が大きくなるほどに蛍光量は減衰するので、その感度は低下する。また隣のウェルの蛍光量の影響を受け易くなる。したがって、個々のウェル内の蛍光を高感度に測定することは困難である。また、特殊な試薬を用いて感度を得る方法もあるが、このような方法では反応溶液自体が高価であるため、より安価かつ高感度に測定可能な方法が望まれている。
【００１５】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、ＤＮＡの増幅等において、極めて高い感度で蛍光をリアルタイムで測定可能な蛍光測定装置等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前述した目的を達するために第１の発明は、蛍光測定装置であって、反応溶液を保持するウェルと前記ウェルの外周部に配置され、反応溶液の温度を調整可能な温度調整部と前記ウェルの下方に設けられる導波路と前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器とを具備し、前記ウェルは、少なくとも外部樹脂層と内部樹脂層の二層構造であり、前記内部樹脂層の屈折率は前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、前記導波路は内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有して、前記ウェルと一体で構成されるとともに、複数の前記ウェルが連結されてウェルプレートを形成し、前記温度調整部によって前記反応溶液の温度を調整することで反応溶液中で生体材料の反応あるいは生成を行うことができ、前記ウェル内で発生した蛍光を前記内部樹脂層に封じ込めて前記コア部に導出して前記蛍光測定器によって測定可能であることを特徴とする蛍光測定装置である。
【００１７】
前記温度調整部は、前記均熱板と前記均熱板の下部に設けられる熱電素子と前記熱電素子の下部に配置される冷却部とを具備し、前記ウェルおよび前記導波路が前記温度調整部を貫通して設けられることが望ましい。
【００１８】
前記ウェルの上端面には、反射膜が形成されてもよい。前記導波路の端部には光源が設けられ、前記光源は、前記導波路を介して前記ウェル内の前記反応溶液に光を照射し、前記蛍光測定器は、前記導波路からの蛍光を光フィルタを介して測定可能であってもよい。
【００１９】
前記ウェルを構成する樹脂は、内部樹脂層としては、たとえば、耐熱性を有するポリカーボネート樹脂、変性ポリカーボネート樹脂、ポリアミド、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂、架橋アクリル樹脂などを用いることができ、また、外部樹脂層には、一般的には耐熱性が高く、内部樹脂層よりも低屈折率のポリカーボネート樹脂、シリコーン樹脂、フッ素系樹脂やポリアミドを用いることができる。
【００２０】
第１の発明によれば、ウェルの周囲に温調可能な温度調整部が設けられるため、ＤＮＡの分離、抽出、増幅などの生体材料の反応あるいは生成および蛍光の測定を連続して行うことができる。
【００２１】
また、ウェルが二層構造で構成され、内部樹脂層の屈折率を外部樹脂層の屈折率よりも大きくすることで、ウェル内に入れられた反応溶液中からの蛍光をウェルの内部樹脂層に封じ込めることができる。また、内部樹脂層がウェルの下部で導波路に接続されるため、蛍光を導波路に導入することができる。したがって、導波路に接続された蛍光測定器で蛍光を効率良く測定することができる。
【００２２】
また、ウェル内で生じる蛍光を直接導波路に導出することで、従来の方法と比較して、外部に散逸する蛍光成分を抑えることができる。このため、極めて高い感度で蛍光を測定することができる。
【００２３】
また、ウェルの上端面に反射膜を形成することで、内部樹脂層内の蛍光がウェルの上端面から漏れてしまうことがない。
【００２４】
また、温度調整部が、均熱板、熱電素子および冷却部から構成され、ウェルおよび導波路が温度調整部を貫通して設けられれば、ウェル内の反応溶液の温度を迅速に調整することができる。また、温度調整部に設けられたウェルは、温度調整部に形成された貫通孔に配置されるため、測定後は容易に温度調整部から使用済みのウェルを取り外し、交換が可能である。このため、取り扱い性に優れる。
【００２５】
なお、熱電素子としては、例えばペルチェ素子を用いることが望ましい。ペルチェ素子への電圧負荷方向を制御することで、昇温および降温の制御を行うことができる。したがって、ウェル内の反応溶液を迅速に規定の温度に調整することができる。
【００２６】
また、ウェルを構成する樹脂として、内部樹脂層の樹脂としては、ポリカーボネート（耐熱温度１２５−１３５℃）、変性ポリカーボネート（耐熱温度１４５℃）、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂（耐熱温度１５０℃）、シリコーン樹脂（１５０−１７０℃）、架橋アクリル樹脂（耐熱温度１７５℃）から選択することで、ＰＣＲにおける熱でウェルが損傷することがない。また、内部樹脂層の樹脂にＰＭＭＡを用いても、外部樹脂層にα―フルオロアクリレート系樹脂を用いたプラスチック光ファイバを用いれば、耐熱性を向上させることができる。
【００２７】
尚、本装置を加熱の必要がない試験に用いる場合には、内部樹脂層の樹脂として、最も一般的に使用されているＰＭＭＡ、ポリスチレンなどを用いた汎用プラスチックファイバを用いることもできる。
【００２８】
上述の内部樹脂層の樹脂としては、外部樹脂層の樹脂より、屈折率が高く、導波路のコア材との相溶性あるいは親和性に優れ、さらに耐熱性に優れる樹脂ならば、いかなる樹脂をも用いることができる。
【００２９】
第２の発明は、蛍光測定用の反応溶液を保持する蛍光測定用ウェルであって、前記反応溶液の保持部は、少なくとも外部樹脂層と内部樹脂層の二層構造であり、前記内部樹脂層の屈折率は、前記外部樹脂層の屈折率よりも大きく、前記保持部の下方に前記保持部と一体で形成される導波路は、内部に前記内部樹脂層と同一の材質からなるコア部と、外部に前記外部樹脂層と同一の材質からなるクラッド部を有し、複数の前記保持部が連結されて構成されることを特徴とする蛍光測定用ウェルである。
【００３０】
第２の発明によれば、高感度な測定が可能なウェルを容易に得ることができる。
【００３１】
第３の発明は、蛍光測定方法であって、第１の発明にかかる蛍光測定装置の温度調整部を制御して、前記ウェル内に保持された反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中の蛍光色素で標識した生体材料の反応あるいは生成の進行を、前記反応溶液からの蛍光を連続して前記光測定器で測定することを特徴とする蛍光測定方法である。
【００３２】
また、第１の発明にかかる蛍光測定装置の温度調整部を制御して、前記ウェル内に保持された反応溶液を昇温して、鋳型ＤＮＡを一本鎖に分離する変性工程と、前記変性工程から降温し、プライマをＤＮＡにハイブリダイズするアニーリング工程と、前記アニーリング工程から昇温し、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応により、プライマに挟まれたＤＮＡ領域を増幅するポリメラーゼ伸長工程と、前記ポリメラーゼ伸長工程から降温し、ＤＮＡ領域の増幅の進行を前記光測定器で測定する蛍光測定工程と、を具備することを特徴とする蛍光測定方法である。
【００３３】
また、前記反応溶液中の蛍光を前記光測定器により測定後、測定を終了した反応溶液を保持するウェルプレートを前記温度調整部より取り外し、新たな測定対象である反応溶液を保持するウェルプレートに交換した後、蛍光測定を繰り返すこともできる。
【００３４】
第３の発明によれば、ウエル内に保持された反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中の蛍光色素で標識した生体材料の反応あるいは生成を、前記反応溶液からの蛍光を連続して前記光測定器で測定することができ、さらには、ＤＮＡの分離、抽出、増幅を同一ウェル内で行うことが可能であるとともに、ＤＮＡ増幅工程に対して連続してＤＮＡ増幅の進行を把握するための蛍光測定を行うことができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ＤＮＡの増幅等において、極めて高い感度で蛍光をリアルタイムで測定可能な蛍光測定装置等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】蛍光測定装置１を示す概略図。
【図２】ウェル３の拡大図。
【図３】ウェル３および導波路９の屈折率の分布図であり、（ａ）は図２のＣ−Ｃ線断面における分布図、（ｂ）は図２のＤ−Ｄ線断面における分布図。
【図４】ウェルの断面拡大図であり、（ａ）は図２のＡ部拡大図、（ｂ）は図２のＢ部拡大図。
【図５】ウェルで受光可能な領域を示す概念図。
【図６】ウェル３の全体斜視図。
【図７】ＰＣＲ測定の温度サイクルを示す概念図。
【図８】他の実施形態を示す図で、蛍光測定装置１ａを示す概略図。
【図９】従来の受光領域を示す概念図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は、蛍光測定装置１を示す概略図である。蛍光測定装置１は主に、複数のウェル３ａ、３ｂ、・・・、３ｎと、複数の光源５ａ、５ｂ、・・・、５ｎと、導波路９ａ、９ｂ、・・・、９ｎと、光学フィルタ１１ａ、１１ｂ、・・・、１１ｎと、蛍光測定器１３ａ、１３ｂ、・・・、１３ｎおよび各ウェルの温度調整を行う温度調整部１２等から構成される。なお、簡単のため、図ではウェルは３つのみ示すが、例えば、一つのプレート上には例えば４列×６段＝２４個のウェルが配置される。
【００３８】
ウェル３ａ、３ｂ、・・・、３ｎ（以下、総称してウェル３とする）は、内部に反応溶液１５を保持可能である。ウェル３は、反応溶液を保持する部位の高さが約１０ｍｍであり、外径が約８〜１０φ（内径約６〜８φ）程度である。また、ウェル３の下部にはそれぞれ導波路９ａ、９ｂ、・・・、９ｎ（以下、総称して導波路９とする）が一体で形成される。
【００３９】
各ウェル３は、上部において連結部４で連結される。すなわち、各ウェル３は所定の間隔で一体に形成される。なお、本発明では、個々のウェルを分離して構成してもよく、図示したように、複数のウェルを一体で形成してもよい。以下の説明においては、複数のウェルが連結されたものウェルプレートと称する。
【００４０】
図２（ａ）は、ウェル３の拡大図である。また、図３はウェルを含む屈折率の分布図であり、図３（ａ）は図２のＣ−Ｃ線断面における分布図、図３（ｂ）は図２のＤ−Ｄ線断面における分布図である。また、図４（ａ）は、図２のＡ部拡大図、図４（ｂ）は図２のＢ部拡大図である。ウェル３は、反応溶液と接する側から、内部樹脂層１９および外部樹脂層２３の二層構造で構成される。ここで、図３（ａ）、図３（ｂ）に示すように、内部樹脂層１９の屈折率は、外部樹脂層２３よりも高い。
【００４１】
図３（ａ）のＬは反応溶液１５の領域の屈折率である。また、図３（ａ）、図３（ｂ）のＭは内部樹脂層１９の屈折率であり、Ｎは外部樹脂層２３の屈折率である。なお、Ｎの両側は空気層であり、屈折率は１．０である。反応溶液１５の屈折率は、使用する溶液による。内部樹脂層１９の屈折率は、例えば１．５０〜１．７０程度であり、外部樹脂層２３の屈折率は、例えば、１．４８以下程度である。すなわち、内部樹脂層１９の内部に光を封じ込めることが可能である。
【００４２】
なお、ウェル３は、例えば、内部樹脂層は、耐熱性を有するポリカーボネート樹脂、変性ポリカーボネート樹脂、ポリアミド、高Ｔｇ成分モノマーとのアクリル系重合体、ノルボルネン系樹脂、シリコーン樹脂、架橋アクリル樹脂等の例えば１１０℃以上（さらに望ましくは１２０℃以上）の耐熱性を有する樹脂中から、反応溶液等に対する耐薬品性を考慮して選定した材質で構成する。外部樹脂層には、一般的にはフッ素系樹脂やポリアミドを用いる。また、屈折率の調整は、各層を構成する樹脂材質を変更することにより行ってもよく、または、同材質の母材に適宜添加剤を添加してもよい。
【００４３】
また、ウェル３を構成する材料としては、樹脂材料よりも耐熱性に優れるガラスを用いてもよい。このようなガラスとしては、例えば、３００から４００℃で成形可能な、ＳｉＯ２あるいはＮａ２Ｏを含有する多成分ガラスを用いることができる。
【００４４】
また、図４（ｂ）に示すように、導波路９は、中央部にコア部２５が設けられ、コア部２５を覆うように外周部にクラッド部２７が設けられる。コア部２５を構成する樹脂の屈折率は、クラッド部２７を構成する樹脂の屈折率よりも高い。例えば、コア部２５は内部樹脂層１９と同一の材質で構成されることが望ましいが、内部樹脂層の樹脂と、コア部を構成する樹脂は、互いに相溶性を有し、互いの屈折率が同一または近似するものを用いてもよい。同様に、クラッド部２７は外部樹脂層２３と同一の材質で構成されることが望ましいが、外部樹脂層の樹脂と、クラッド部を構成する樹脂は、互いに相溶性を有し、互いの屈折率が同一または近似するものを用いてもよい。ここで、コア部と内部樹脂層の屈折率は、同一または近時する必要があるが、両者を比べた場合に、コア部の屈折率が内部樹脂層の屈折率より大きければ良い。ここで、互いの屈折率が近似するとは、例えば、屈折率の違いが０．１程度以下であり、さらに好ましくは０．０５以下であることが望ましい。なお、導波路９としてはプラスチックファイバを用いてもよい。
【００４５】
ウェル３と導波路９との接合部では、内部樹脂層１９とコア部２５とが一体で形成される。また、外部樹脂層２３とクラッド部２７とが一体で形成される。したがって、内部樹脂層１９内に封じ込められた光は、コア部２５に導出され、コア部２５内を伝播する。
【００４６】
また、図１に示すように、ウェル３の上方には光源５ａ、５ｂ、・・・、５ｎ（以下、総称して光源５とする）がそれぞれ配置される。光源５は、それぞれのウェル３内の反応溶液に所定の波長の光を照射する。光源５としては、レーザやＬＥＤ等を用いることができる。
【００４７】
ウェル３の上端面には、反射膜１７が設けられる。反射膜１７は、ウェル３（内部樹脂層１９）内の光が、ウェル３の上端から漏れだすことを防止するものである。反射膜１７としては、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ニオブなどの物質を蒸着などによって形成すればよく、また、反射膜成分を塗布してもよい。反射膜１７の形成方法は問わない。
【００４８】
ウェル３の上面には、蓋２が設けられる。蓋２は、例えば透明なガラス板または樹脂板である。したがって、前述の光源５からの光を透過する。蓋２は、反応溶液の昇温時に、反応溶液の蒸発を防止し、隣接する各ウェルの反応溶液が蒸気によって混入しあうことを防止するものである。
【００４９】
ウェル３の外周部には、温度調整部１２が設けられる。温度調整部１２は、均熱板７、熱電素子８、冷却部１０から構成される。均熱板７、熱電素子、冷却部１０は例えば一体で構成される。温度調整部１２は、図示を省略した制御部に接続されており、ウェル３内部の反応溶液１５の温度調整が可能である。
【００５０】
均熱板７は例えばアルミニウム板や銅板等の金属板である。均熱板７は下部に設けられる熱電素子８の熱を均一に分散させるものである。均熱板７としては、６ｍｍ程度の厚みであり、例えば、ウェルの高さ程度に設定すればよい。
【００５１】
熱電素子８は、均熱板７の下部に接合される。熱電素子８は、例えばペルチェ素子である。熱電素子８に対して電圧を付与することで、熱電素子８を昇温または降温することができる。熱電素子８（層）の厚みは、例えば１．５〜２ｍｍ程度とすればよい。
【００５２】
熱電素子８の下部には冷却部１０が設けられる。冷却部１０は、熱電素子８自体を冷却するものである。冷却部１０としては、例えばアルミニウム製のフィン材等を用い、また、図示を省略したファンによって空冷することができる。冷却部１０としては、例えば１０〜２０ｍｍ程度とすればよい。
【００５３】
温度調整部１２は、熱電素子８、および冷却部１０の動作を制御することで、ウェル３内部の反応溶液１５の温度を迅速に制御することができる。なお、温度サイクルについては後述する。
【００５４】
均熱板７、熱電素子８、冷却部１０からなる温度調整部１２には、貫通孔が形成される。貫通孔には、ウェル３および導波路９が挿入される。なお、導波路９の挿入性を高めるために、貫通孔にあらかじめパイプを配置してもよい。貫通孔にウェル３および導波路９を挿入することで、温度調整部１２とウェル３を接触させることができる。
【００５５】
なお、本発明では、ウェル３および導波路９を温度調整部１２から取り外すことで、ウェルの交換を容易に行うことができる。すなわち、ウェル３自体を使い捨てとし、温度調整部１２を繰り返し使用することで、常に新たなウェルを使用することができ、交換作業性にも優れる。
【００５６】
また、貫通孔の加工性および反応溶液の温度を均一にするため、均熱板７の位置にウェル３の外径変化部を配置することが望ましい。均熱板７は金属板であり、比較的加工が容易であるため、ウェルの外径に応じた複雑な形状にも容易に対応が可能であるが、熱電素子８はその加工性や設計の自由度が低いため、熱電素子８における貫通孔は、導波路９のように径が変化しない部位とすることが望ましい。
【００５７】
導波路９には、それぞれ光学フィルタ１１ａ、１１ｂ、・・・、１１ｎ（以下、総称して光学フィルタ１１とする）が接続され、さらに光学フィルタ１１を介して蛍光測定器１３ａ、１３ｂ、・・・、１３ｎ（以下、総称して蛍光測定器１３とする）と接続される。光学フィルタ１１は、反応溶液１５内で発生する蛍光成分以外の光（例えば照射光成分）を除去するものである。光学フィルタ１１を通過した蛍光は、各蛍光測定器１３で測定される。
【００５８】
すなわち、ウェル３内部の反応溶液１５では、温度調整部１２による温度調整によって、ＤＮＡの増幅が行われる。この際観察される蛍光成分はウェル３内部の内部樹脂層１９内に封じ込められる。内部樹脂層１９内の蛍光は、導波路９に導出されて光学フィルタ１１を介して光測定器１３で測定される。以上により、蛍光の増減をリアルタイムで監視することができる。
【００５９】
なお、蛍光測定器は、各ウェル毎に配置してもよいが、ウェル３または蛍光測定器１３を相対的に移動させることで、一つの蛍光測定器によって複数のウェル内の蛍光を測定してもよい。
【００６０】
例えば、ウェルが複数列×複数段に配置されている場合に、ウェルの列の数だけ蛍光測定器１３を設けて、各列の蛍光を測定する。次に、当該列に垂直な方向に順次ウェル（または蛍光測定器）を相対的に移動させ、次の段における各列の蛍光を測定する。以上を繰り返すことで、各列のウェルを各段ごとに順次測定することができる。なお、光スイッチ等を用いて、ウェルと蛍光測定器とを光接続し、光スイッチを切り替えてもよい。
【００６１】
図５は、図９と同様に、ウェル３を用いた場合における反応溶液中から発生した蛍光の拡散状態を示す図である。ここで、光源５から蛍光発生中心２９までの距離をＬとする。光源５から光を反応溶液に照射すると、反応溶液から発生する蛍光は、蛍光発生中心２９から全方向に略均一に拡散する（図中矢印Ｅ）。
【００６２】
蛍光発生中心２９から発生した蛍光は、半径Ｌの球体表面である仮想受光面３１の表面全体に略均一に到達する。しかしながら、光源５が受光部を兼ねる場合（図９のように従来の測定の場合）には、受光可能な蛍光は、前述したように受光部の面積に対応する部位のみとなる。
【００６３】
一方、本発明では、ウェル３の内面から上方に向かって拡散する蛍光以外は、全てウェル３（内部樹脂層１９）に蛍光が封じ込められる。また、前述のように、ウェル３の上面方向には反射膜１７が形成されるため、ウェル３内部に封じ込められた光は全てウェル３の下部の導波路９へ出光される。
【００６４】
すなわち、本発明のウェル３を用いることで、仮想受光面３１において、ウェル３の開口から漏れだす光以外の光を全てウェル３内に封じ込めることができる。このため、仮想受光面３１において、受光可能領域３３は、ウェル３の開口部以外の全ての方向（図中ハッチングで示した領域）となる。したがって、従来と比較して、極めて効率良く発生した蛍光を測定することができる。
【００６５】
次に、ウェル３の製造方法の一例を説明する。図６は、ウェルプレート３５の全体（一部断面）を示す斜視図である。前述の通り、ウェルプレート３５（複数のウェルが連結されたもの）は、必要に応じて連結部４で連結されて一体で形成される。ウェルプレート３５としては、例えば射出成形で成形される。
【００６６】
この際、ウェル部および導波路９は一体で形成されることが望ましい。なお、本発明におけるウェルは、２層構造となっているが、これは同時に射出成型してもよく、別々に成形してもよい。例えば、内部樹脂層１９とコア部２５とを構成する樹脂によって全体を成形後、さらに外部樹脂層２３およびクラッド部２７を構成する樹脂で被覆してもよい。
【００６７】
また、ウェル部と導波路部を別々に成形してから接合して一体化してもよい。または、ウェル（ウェルプレート）と導波路とを別々で構成し、ウェルと導波路との間にマッチングオイルを塗り、マッチングオイルと介してウェルと導波路とを密着させてもよい。さらには、ウェルおよび導波路を縦割りして、複数に分割した状態で射出し、その後それらを接合して一体化してもよい。また、ウェル部と連結部とを別体で成形し、接着剤等で接着してウェルプレートを形成してもよい。なお、ウェルの配置数等は図示した例には限られない。
【００６８】
次に、温度調整部１２による反応溶液の温度調整のサイクルについて説明する。図７はＰＣＲ測定の温度サイクルを示す概念図である。前述したように、増幅サイクル３９は、変性工程４１、アニーリング工程４３、ポリメラーゼ伸長工程４５からなる。
【００６９】
変性工程４１は、約９５℃の温度で鋳型ＤＮＡを一本鎖に分離する工程である。アニーリング工程４３は、約５０℃に降温し、プライマをＤＮＡにハイブリダイズする工程である。ポリメラーゼ伸長工程４５は、約７０℃に昇温し、ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応により、プライマに挟まれたＤＮＡ領域を増幅する工程である。前述したウェル３等を用いたリアルタイム蛍光測定によって、ポリメラーゼ伸長工程の進行を把握することができる。蛍光測定によってプライマに挟まれたＤＮＡ領域が２倍に増幅されたと判断されると、増幅サイクル３９をさらに繰り返し、ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【００７０】
以上説明したように、本実施の形態によれば、ウェル３の周囲に温度調整部１２が配置されるため、反応溶液１５の温度を各工程に適した温度に調整することができる。このため、ウェル３の内部のみで増幅サイクルを連続して繰り返すことができる。また、熱電素子８を用いるため、昇温のみならず降温の制御も行うことができる。また、均熱板７を用いることで、ウェル３内の反応溶液１５を均一に温度制御することができる。
【００７１】
また、ウェル３が、屈折率の異なる二層構造で形成され、さらにウェル３の下部に導波路９が一体化されるため、ウェル３内部から浸入した光をウェル３に封じ込め、導波路９に導出することができる。このため、微量の蛍光であっても従来と比較して極めて感度良く検出することができる。
【００７２】
また、ウェル上端面に反射膜１７が設けられるため、光がウェル外に漏れ出すことを防止することができる。反射膜１７は、ウェルの形状によっては、ウェル底部の曲率の大きな部分において、ウェル外周部に蛍光が外部樹脂層の外周面から漏光した場合でも、外部樹脂層の外周面に反射膜を形成することにより、光がウェル外に漏れ出すことを防止できることから、ウェル底部の曲率の設計の自由度を広げることができる。
【００７３】
次に、第２の実施の形態について説明する。図８は、第２の実施の形態にかかる蛍光測定装置１ａを示す概略図である。なお、以下の説明において、蛍光測定装置１と同様の機能を奏する構成については、図１〜図３等と同様の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００７４】
蛍光測定装置１ａは、蛍光測定装置１と略同様の構成であるが、光源５の配置が異なる。蛍光測定装置１ａでは、光源５ａ、５ｂは、導波路９の下部に配置される。
【００７５】
光を発光する光源５ａ、５ｂは、アイソレータ４７およびハーフミラー４９を介してウェル３ａ、３ｂの下部に、光ファイバ５１等によって光接続される。アイソレータ４７は、光源５ａ、５ｂ側からの光のみを透過し、ウェル３ａ、３ｂ側から光源方向への光の通過を遮蔽するものである。
【００７６】
ハーフミラー４９は、光源５ａ、５ｂからの光の一部を透過して、ウェル３ａ、３ｂ方向に光を伝送する。ハーフミラー４９の先端部は、導波路９のコア部に光接続される。コア内部に導入された光は、導波路９ａ、９ｂおよびウェル３ａ、３ｂ内に閉じ込められ、その一部が反応溶液１５に照射される。すなわち、光源５ａ、５ｂからの照射光が反応溶液１５に照射される。尚、戻り光によるノイズが無視できるようであれば、アイソレータ４７を省略することも可能である。
【００７７】
反応溶液１５からの蛍光は、再びウェル３ａ、３ｂの内部樹脂層および導波路９ａ、９ｂのコア部内部に閉じ込められる。したがって、蛍光は、ハーフミラー４９によって一部が反射されてフィルタ１１ａ、１１ｂ方向へ分光される。フィルタ１１ａ、１１ｂでは、出射光成分が除去されて、光測定器１３ａ、１３ｂに蛍光のみが伝送され、光測定器１３ａ、１３ｂによって光が検出される。
【００７８】
なお、蛍光測定装置１ａでは、蓋２は透明であってもよく、または内面の全面に反射膜を形成してもよい。蓋２が透明であれば、内部の様子を外部から視認することが可能である。また、蓋２に反射膜を形成すれば、ウェルの開口部からの蛍光の散逸を防止することができる。
【００７９】
また、ハーフミラーに代えて光カプラを用いてもよい。また、ハーフミラーに代えて、ある特定の波長の光のみを反射して、その他の波長を透過する波長選択型のミラー型フィルタを配置してもよい。この場合、当該ミラー型フィルタは、照射光は透過させるが、検体から発生した蛍光のみを光測定器１３ａ、１３ｂ側に反射させることができる。なお、この場合には、光測定器１３ａ、１３ｂの前に別途光学フィルタを用いる必要はない。
【００８０】
また、光源および光測定器は、ウェル等の下部に配置した例を図示したが、光ファイバ５１等によって照射光および蛍光を導光すれば、ウェルから離れた位置で照射および蛍光測定を行うこともできる。
【００８１】
以上説明したように、第２の実施の形態によれば、蛍光測定装置１と同様の効果を得ることができる。また、蓋２の内面が蒸気に水滴が付着することで、光源からの光が遮断され、光量が不安定となることがない。
【００８２】
以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【００８３】
例えば、上述の実施形態では、熱サイクルによって反応溶液中でＤＮＡの分離、抽出および増幅と、ウェル内で発生した蛍光の測定を行う方法について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、熱原を用いずに、細胞等の蛍光測定やそれを用いた細胞のスクリーニングにも利用することもできる。
【符号の説明】
【００８４】
１、１ａ………蛍光測定装置
２………蓋
３、３ａ、３ｂ、３ｎ………ウェル
４………連結部
５、５ａ、５ｂ、５ｎ………光源
７………均熱板
８………熱電素子
９ａ、９ｂ、９ｎ………導波路
１０………冷却部
１１ａ、１１ｂ、１１ｎ………光学フィルタ
１２………温度調整部
１３、１３ａ、１３ｂ、１３ｎ………蛍光測定器
１５………反応溶液
１７………反射膜
１９………内部樹脂層
２３………外部樹脂層
２５………コア部
２７………クラッド部
２９………蛍光発生中心
３１………仮想受光面
３３………受光可能領域
３５………ウェルプレート
３９………増幅サイクル
４１………変性工程
４３………アニーリング工程
４５………ポリメラーゼ伸長工程
４７………アイソレータ
４９………ハーフミラー
５１………光ファイバ
１０９………ウェル
１１１………照射・受光部
１１３………反応溶液
１１５………蛍光発生中心
１１７………仮想受光面
１１９………受光可能領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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