【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年8月19日(2016.8.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i. 配列番号１または２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し；および
ii. 癌細胞浸潤の阻止および癌増殖阻止からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有する単離ポリペプチドであって、
単離ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する場合、配列番号１の２１６位から２１８位に相当するアミノ酸残基がアルギニン−グリシン−アスパラギン酸である、または
単離ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する場合、配列番号２の２０８位から２１０位に相当するアミノ酸残基がアルギニン−グリシン−アスパラギン酸である、単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１または２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１または２に示すアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
癌が低悪性度神経膠腫、中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
癌が神経膠腫である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
癌が多形神経膠芽腫である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
活性が癌細胞浸潤の阻止であり、癌細胞が癌幹細胞および非幹様癌細胞からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする配列を含む、単離核酸分子。
【請求項９】
核酸がデオキシリボース核酸である、請求項８に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
癌細胞増殖、癌細胞浸潤および／または癌の再発を阻止することによる癌治療における使用を目的とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
癌が、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)のような中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌および鼻咽頭癌から選択される、請求項１０に記載の使用のための単離ポリペプチド。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
発明の分野
本発明の態様は、癌増殖阻止、癌細胞浸潤阻止および癌再発阻止の活性の一つ以上を有することにより特徴付けられる、フィビュリン３(ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１(ＥＦＥＭＰ１)とも称される)ポリペプチド変異体およびそれをコードするヌクレオチド配列に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
まだ有効な処置が何もない致命的形態の脳腫瘍である多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)は、異なる増殖および浸潤特性を有することで特徴付けられる、多様な亜集団の細胞からなる。手術、放射線および化学療法のような処置後のＧＢＭ再発の根底にある機序は決定的には解明されていない。再発は、 神経幹細胞特性を有し、放射線および化学療法に耐性であって、神経幹細胞特性を有するＧＢＭ細胞の浸潤性亜集団(いわゆる腫瘍幹細胞)が原因であろうと推定されている。ＧＢＭ増殖は、血管新生腫瘍微小環境に大きく依存するように見え、抗血管形成治療剤がＧＢＭ腫瘍増殖を一時的に抑制することが示されている。しかし、抗血管形成治療剤はＧＢＭ患者の全体的生存を改善せず、浸潤パターンが増加した腫瘍再発に終わる。これまでは、神経膠腫細胞浸潤を標的とした治療は存在しない。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
発明の概要
過去３０年間、手術後の放射線療法にテモゾロミド処置の併用が追加されたにもかかわらず、ＧＢＭ癌患者について生存期間中央値の２.５ヶ月のわずかな延長しか達成されていない。本発明の目的は、ＧＢＭのような癌における癌細胞増殖、浸潤および／または再発の阻止を提供できる、癌治療剤を提供することである。従って、本発明の態様は、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、タンパク質チロシンキナーゼ２(ＰＴＫ２)およびＮＯＴＣＨを含むタンパク質の活性および／または発現レベルを、癌細胞において調節することにより特徴付けられる、野生型ＥＦＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列変異体を提供する。癌は、ＧＢＭのような低〜中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌または鼻咽頭癌であり得る。そして、癌細胞は癌幹細胞および非幹様癌細胞であり得る。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本発明のある態様は、(ｉ)配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む；および(ii)癌細胞浸潤の阻止、腫瘍増殖の阻止および癌再発の阻止からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有する、ポリペプチドを提供する。本発明のある態様は、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
【図４Ａ】図２および実施例１に記載するＥ１〜Ｅ３、Ｅ５、Ｅ６〜Ｅ７、Ｅ９〜Ｅ１０、Ｅ１１およびＥ１３〜Ｅ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物でおよびベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株ならびにＵ２５１親対照細胞(Ｐ)で開始した、実施例５に記載するマトリゲル細胞浸潤アッセイからのtranswellインサートの底面の写真である。
【図４Ｂ】図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１神経球細胞培養から開始する、実施例５に記載するマトリゲル浸潤アッセイからの細胞浸潤のプロットである。
【図４Ｃ】図４Ｂに示すマトリゲル浸潤アッセイの細胞で行った、実施例６に記載する酵素電気泳動のゲルの写真である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明により達成される目的は、神経膠腫(例えば、多形神経膠芽腫)のような癌について、癌増殖阻止、癌細胞浸潤阻止および癌再発阻止の活性の少なくとも一つを有する、ＥＦＥＭＰ１ポリペプチド変異体のアミノ酸配列を提供することである。ある態様において、野生型ＥＦＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列変異体(ＥＦＥＭＰ１由来腫瘍抑制タンパク質(ＥＴＳＰ)と称することもある)は、高速増殖性および浸潤性神経膠腫腫瘍細胞亜集団の増殖および浸潤活性を、同所性腫瘍フォーマティングで個々に、また同時に抑制する。このようなＥＴＳＰは、少なくとも一部、野生型ＥＦＥＭＰ１のアミノ酸配列相同性試験および変異体ＥＦＥＭＰ１ポリペプチドの実験により発見された。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
染色体７の２個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１細胞は、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイで速い増殖を示す。これらはまた実施例８に記載するＩ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて、浸潤性を欠くが、腫瘍塊の大部分を形成する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
染色体７の１個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１−ＮＳ細胞は、実施例５および６に記載するマトリゲル浸潤および酵素電気泳動アッセイにおいて、高レベルの浸潤性を示す。これらはまた、腫瘍幹様細胞特性を有し、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて腫瘍形成能を欠く。血管内皮細胞増殖因子を過発現するようにトランスフェクトされたＵ２５１−ＮＳ細胞は、実施例４に記載する皮下(Ｓ.Ｃ.)異種移植片アッセイにおいて、腫瘍を形成する。Ｕ２５１−ＮＳ細胞は、実施例８に記載する頭蓋内(Ｉ.Ｃ.)異種移植片アッセイにおいて、浸潤性の腫瘍を形成する。そして、これらは、実施例８に記載するＩ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて、染色体７の２個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１細胞よりも浸潤性である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
図４Ａは、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４およびＥ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物およびプラスミドベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株ならびにＵ２５１親対照細胞(Ｐ)で開始する、実施例５に記載するマトリゲル細胞浸潤アッセイからの細胞プレートの写真である。この結果は、構築物Ｅ３、Ｅ１１およびＥ１５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、マトリゲルアッセイにおけるＵ２５１細胞の浸潤性を抑制することを示す。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
図４Ｂは、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物をおよびプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１神経球細胞(Ｕ２５１−ＮＳ)培養で開始する、実施例５に記載するマトリゲル浸潤アッセイにおける細胞浸潤のプロットである。レンチウイルスインフェクタントを、導入遺伝子を発現させるためにドキシサイクリン含有培地で培養し、蛍光顕微鏡でＲＦＰ発現をアッセイすることにより発現を確認した。この結果は、構築物Ｅ５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体はＵ２５１−ＮＳ細胞浸潤を有意に抑制し、一方、野生型ＥＦＥＭＰ１ならびに構築物Ｅ１、Ｅ１５およびＥ１８から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体はＵ２５１−ＮＳ細胞浸潤を有意に促進することを示す。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
図４Ｃは、図４Ｂに示すマトリゲル浸潤アッセイの細胞で行った、実施例６に記載する酵素電気泳動の２個のゲルの写真である。この結果は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞が、酵素電気泳動アッセイで検出して、活性ＭＭＰ２(〜６７kD)を分泌することを示す。ＭＭＰ２は神経膠腫細胞で高度に発現されるプロテアーゼであり、細胞浸潤を担う。また、構築物Ｅ５から発現されるＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞の活性化ＭＭＰ２産生を有意に阻害し、一方、野生型ＥＦＥＭＰ１ならびに構築物Ｅ１、Ｅ１５およびＥ１８から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞の活性化ＭＭＰ２産生を有意に促進することも示される。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
まとめると、上記データおよび結果は、Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体が強力なＥＴＳＰであることを示す。ＦＬＡＧ標識Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体のアミノ酸配列を配列番号１に示す。非ＦＬＡＧ標識Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
実施例５
マトリゲル浸潤アッセイ。９〜１２mg／mlマトリゲルを氷上または４℃で融解した。１０ml氷冷無血清培地を融解マトリゲルに添加した。融解マトリゲルを氷冷ＳＦ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２で希釈し、transwell(１２ウェル；８μm)に２００μl添加し、室温で＞１時間インキュベートすることにより、プレートを調節した。細胞播種前に、非結合物質を穏やかに吸引して除いた。マトリゲルコーティングは無色であり、不可視である。１００mm皿で８０〜９０％コンフルエンシーまで増殖させた細胞を、１０ml  ＰＢＳで洗浄することにより剥離し、２ml  ０.０５％トリプシン−ＥＤＴＡで３０秒消化させ、トリプシンを除去し、ボトルを軽打することにより細胞を剥離し、１０ml培養培地を添加し、ピペット中を上下させ、細胞を１５mlチューブに移すことにより、細胞を調製した。次いで細胞を遠沈させ、１０〜１５ml  ＳＦ培地に再懸濁し、１０μlを取って、血球計数器で細胞を計数した。次いで、５×１０６細胞を遠沈し、５ml  ＳＦ培地に１×１０６／mlで再懸濁した。５×１０５細胞を被覆transwellに添加し、１ml  ０.０５％ＣＳ培地を底ウェルに添加した。ＣＯ２インキュベーター中で播種し、そこでプレートを２４時間培養した。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２】
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