【手続補正書】
【提出日】平成27年11月12日(2015.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが、グランザイムＢ認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、グランザイムＢによる切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記グランザイムＢ認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記グランザイムＢ認識部位が、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）、ＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）、またはＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）である、請求項１または２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクターを含む、キット。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。
【請求項８】
細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクター、または請求項７に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項９】
細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクター、または請求項７に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質、および
ｉｉｉ）細胞傷害性リンパ球と接触させることと、
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより細胞傷害性リンパ球から放出された前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞傷害性リンパ球が、患者もしくは患者由来の細胞傷害性Ｔリンパ球またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記グランザイムＢの検出が、前記細胞傷害性リンパ球の前記細胞傷害機能を決定する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記グランザイムＢ活性の検出が、細胞媒介性細胞傷害を示す、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
グランザイムＢ活性の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクター、または請求項７に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢの調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１４】
前記調節因子が、グランザイムＢの阻害剤またはグランザイムＢのエンハンサーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクター、または請求項７に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｃ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞から放出された前記グランザイムＢが、前記標的細胞内で前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１６】
細胞過程内のグランザイムＢ活性を検出する方法であって、
ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクター、または請求項７に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー中の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢ活性を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１７】
非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードする、ポリヌクレオチドであって、
前記ペプチドリンカーが、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７アイソフォームのうちの少なくとも１つにより認識および切断される、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較して、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７による切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｂ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞が、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７のうちの少なくとも１つを活性化することができ、前記少なくとも１つの活性化されたカスパーゼ−３またはカスパーゼ−７が、前記標的細胞集団内の前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断および活性化し、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
したがって、本発明は、特に、標的分子に対して強化された応答を有する、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを提供する。本発明の様々な特徴および利益は、以下の請求項に記載されている。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが、グランザイムＢ認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、グランザイムＢによる切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
〔２〕前記グランザイムＢ認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、前記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３〕前記グランザイムＢ認識部位が、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）、ＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）、またはＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）である、前記〔１〕または〔２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
〔５〕前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに操作可能に連結される、前記〔４〕に記載のベクター。
〔６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを含む、細胞。
〔７〕前記〔６〕に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
〔８〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。
〔９〕細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１０〕細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質、および
ｉｉｉ）細胞傷害性リンパ球と接触させることと、
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより細胞傷害性リンパ球から放出された前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１１〕前記細胞傷害性リンパ球が、患者もしくは患者由来の細胞傷害性Ｔリンパ球またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記グランザイムＢの検出が、前記細胞傷害性リンパ球の前記細胞傷害機能を決定する、前記〔１０〕または〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記グランザイムＢ活性の検出が、細胞媒介性細胞傷害を示す、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕グランザイムＢ活性の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、  ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢの調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１５〕前記調節因子が、グランザイムＢの阻害剤である、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記調節因子が、グランザイムＢのエンハンサーである、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１８〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔１５〕および〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕細胞の細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、  ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｃ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞から放出された前記グランザイムＢが、前記標的細胞内で前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔２０〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能の阻害剤である、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能のエンハンサーである、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２３〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔２０〕および〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記スクリーニングが、多重ウェル形式で行われる、前記〔１４〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２５〕細胞過程内のグランザイムＢ活性を検出する方法であって、
ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー中の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢ活性を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔２６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチド。
〔２７〕前記〔２６〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔２８〕前記〔２６〕に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
〔２９〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを含む、キット。
〔３０〕非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードする、ポリヌクレオチドであって、
前記ペプチドリンカーが、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７アイソフォームのうちの少なくとも１つにより認識および切断される、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較して、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７による切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
〔３１〕前記カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、前記〔３０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３２〕前記カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位が、ＤＥＶＤＧである、前記〔３０〕および〔３１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３３〕前記〔３０〕〜〔３２〕に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
〔３４〕前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに操作可能に連結される、前記〔３３〕に記載のベクター。
〔３５〕細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔３０〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔３３〕もしくは〔３４〕に記載のベクター、または前記〔３０〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または前記〔３３〕もしくは〔３４〕に記載のベクター、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｂ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞が、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７のうちの少なくとも１つを活性化することができ、前記少なくとも１つの活性化されたカスパーゼ−３またはカスパーゼ−７が、前記標的細胞集団内の前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断および活性化し、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔３６〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能の阻害剤である、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３８〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能のエンハンサーである、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３９〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔３６〕および〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕前記スクリーニングが、多重ウェル形式で行われる、前記〔３５〕〜〔３９〕のいずれか１項に記載の方法。