【手続補正書】
【提出日】平成28年5月20日(2016.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の粒子中の単粒子をアッセイする方法において、
前記複数の粒子を個別の反応容積に捕捉して、それぞれが１つの粒子のみを含有する複数の個別の反応容積を生成するステップと、
それぞれ個別の反応容積内にある各粒子に対して複数の反応を行って、各粒子ごとに複数の反応生成物を生成し、少なくとも１種の反応生成物が、標的核酸に添加されかつ前記反応生成物の供給源であった前記反応容積の同一性をコード化するヌクレオチド配列を含んでいるサブステップ、および
前記反応生成物を解析して、結果を得るサブステップ
を含む、各粒子ごとに複数のパラメーターをアッセイするステップと、
前記アッセイの結果を各粒子に関連付けて、個別の反応容積内にある前記複数の粒子中の各粒子ごとに複数のパラメーターを含むデータ集合を生成するステップと
を含む、複数の粒子中の単粒子をアッセイする方法。
【請求項２】
前記パラメーターの少なくとも１つが、それぞれ個別の反応容積内でアッセイされる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個別の反応容積の内容物が回収される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
それぞれ１つの粒子のみを有する個別の反応容積の予測される割合が、個別の反応容積の総数の少なくとも３５％であるように、前記捕捉するステップを最適化するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記個別の反応容積が、マイクロ流体デバイスの個々のコンパートメント内に存在する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記粒子が、前記複数の反応を行うための１種または複数種の試薬を添加する前に、個別の反応容積に捕捉される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が細胞である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
４０，０００個よりも少ない粒子が前記方法で用いられる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
個別の反応容積内に分布した粒子の数が１０個よりも多く、１００個よりも多く、または１０００個よりも多い、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉するステップが、限界希釈により行われる、請求項１から３または５から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
限界希釈が、
粒子懸濁液の連続希釈物を調製するステップと、
各希釈物から、マイクロ流体デバイスの個別のコンパートメント内に粒子を分布させるステップと、
各コンパートメント内の粒子の数を決定するステップと、
個別の反応容積に単粒子を捕捉する際に使用される、単粒子のみ含む最も多い数のコンパートメントを生成する希釈物を選択するステップと
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
各コンパートメント内の粒子の数が、明視野顕微鏡法または蛍光顕微鏡法により決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉するステップが、マイクロ流体デバイス内の複数の捕捉部位での機械的捕捉を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
各捕捉部位が、
１つの粒子のみを含有するようにサイズ決めされた捕捉形体と、
前記捕捉形体が粒子によって占有されていない場合に、前記捕捉部位内に前記流体を流すことが可能なドレイン形体と
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロ流体デバイスが、粒子の流れを各捕捉部位に集束させる集束形体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
親和性に基づく捕捉を含み、かつ粒子成分に結合する結合パートナーを用いる、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記結合パートナーが、前記マイクロ流体デバイスの別々の領域に添着され、それぞれ別々の領域は１つの粒子のみを結合可能にする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記親和性に基づく捕捉が、
マイクロ流体デバイス内の複数の捕捉部位に前記結合パートナーを含む支持体を捕捉して、各捕捉部位に固定化された支持体を生成するステップであり、それぞれ固定化された支持体が、１つの粒子のみをそれぞれ固定化された支持体に結合可能とするように結合パートナーを呈示するステップと、
粒子を、前記固定化された支持体上の前記結合パートナーに結合するステップと
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記支持体が、機械的捕捉によって捕捉される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
各捕捉部位が、
１つの支持体のみを含有するようにサイズ決めされた捕捉形体と、
捕捉形体が支持体によって占有されていない場合に、前記捕捉部位内に前記流体を流すことが可能なドレイン形体と
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイクロ流体デバイスが、支持体および／または粒子の流れを各捕捉部位に集束させる集束形体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
各捕捉部位が、マイクロ流体デバイスの個別のコンパートメント内に位置付けられる、請求項１３から１５および１７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記個別の反応容積がマイクロ流体デバイスの個々のコンパートメント内に存在し、
それぞれ個別の反応容積内の粒子の数を決定するステップと、
粒子を含有しないまたは単粒子より多い粒子を含有する任意の反応容積からの結果を無視するステップと
を含む、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記回収するステップが、個別の反応容積から反応生成物を個別に回収するサブステップを含む、請求項３から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記回収するステップが、複数の個別の反応容積から反応生成物をプールするサブステップを含む、請求項３から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種の反応生成物が、少なくとも２つの増幅プライマーを使用する核酸増幅を含む反応によって生成され、各増幅プライマーは、前記反応生成物の供給源であった前記反応容積の同一性をコード化するバーコード配列とバーコード配列の組合せを含む、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸増幅が、１対のインナープライマーおよび１対のアウタープライマーを使用し、
前記インナープライマーは、
第１のヌクレオチドタグ、第１のバーコードヌクレオチド配列および標的特異的部分を含む順方向インナープライマーと、
標的特異的部分、第１のバーコードヌクレオチド配列および第２のヌクレオチドタグを含む逆方向インナープライマーと
を含み、
前記アウタープライマーは、
第２のバーコードヌクレオチド配列および第１のヌレオチドタグ特異的部分を含む順方向アウタープライマーと、
第２のヌクレオチドタグ特異的部分および第２のバーコードヌクレオチド配列を含む逆方向アウタープライマーと
を含み、
前記アウタープライマーは前記インナープライマーよりも過剰であり、
核酸増幅は、５’−第２のバーコードヌクレオチド配列−第１のヌクレオチドタグ配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−標的ヌクレオチド配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−第２のヌクレオチドタグ配列−第２のバーコードヌクレオチド配列−３’を含むアンプリコンを生成する、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸増幅が、１対のインナープライマーと、１対のスタッファープライマーと、１対のアウタープライマーとを使用し、
前記インナープライマーは、
第１のヌクレオチドタグおよび標的特異的部分を含む順方向インナープライマーと、
標的特異的部分および第２のヌクレオチドタグを含む逆方向インナープライマーとを含み、
前記スタッファープライマーは、
第３のヌクレオチドタグ、第１のバーコードヌクレオチド配列および第１のヌクレオチドタグ特異的部分を含む順方向スタッファープライマーと、
第２のヌクレオチドタグ特異的部分、第１のバーコードヌクレオチド配列、第４のヌクレオチドタグを含む逆方向スタッファープライマーとを含み、
前記アウタープライマーは、
第２のバーコードヌクレオチド配列および第３のヌクレオチドタグ特異的部分を含む順方向アウタープライマーと、
第４のヌクレオチドタグ特異的部分および第２のバーコードヌクレオチド配列を含む逆方向アウタープライマーと
を含み、
前記アウタープライマーは、前記インナープライマーよりも過剰な前記スタッファープライマーよりも過剰であり、
前記核酸増幅は、５’−第２のバーコードヌクレオチド配列−第３のヌクレオチドタグ配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−第１のヌクレオチドタグ配列−標的ヌクレオチド配列−第２のヌクレオチドタグ配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−第４のヌクレオチドタグ配列−第２のバーコードヌクレオチド配列−３’を含むアンプリコンを生成する、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記個別の反応容積が、マイクロ流体デバイスの個別のコンパートメントであり、前記個別のコンパートメントが、行および列によって画定されたアレイとして並べられており、各アンプリコンにおける前記第１および前記第２のバーコードの組合せが、前記アンプリコンの供給源であった前記コンパートメントの前記行および前記列を特定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記回収するステップが、行におけるまたは列におけるコンパートメントからアンプリコンをプールするサブステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アウタープライマーが、ＤＮＡ配列決定プライマーにより結合することが可能な第１および第２のプライマー結合部位をさらに含み、前記核酸増幅が、５’−第１のプライマー結合部位−第２のバーコードヌクレオチド配列−第１のヌクレオチドタグ配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−標的ヌクレオチド配列−第１のバーコードヌクレオチド配列−第２のヌクレオチドタグ配列−第２のバーコードヌクレオチド配列−第２のプライマー結合部位−３’を含むアンプリコンを生成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記解析するステップが、前記増幅生成物を配列決定するサブステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の反応が無傷の粒子上で行われる、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の反応が、崩壊した粒子上で行われる、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の反応が、溶解した細胞上で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記粒子が、前記複数の反応を行う前に、生体応答を誘発する薬剤で処理される、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
各粒子の内部にあるまたは各粒子に関連付けられた１つまたは複数のＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定するステップを含む、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記解析の結果が、
表現型に相関する２つ以上のコピー数多型、
表現型に相関する２つ以上の突然変異、または
一緒になって表現型に相関する、少なくとも１つのコピー数多型および少なくとも１つの突然変異
の存在を示す、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記解析の結果が、ゲノム組換えの出現を示す、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記解析の結果が、特定のスプライスバリアントの共発現を示す、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記解析の結果が、Ｂ細胞内での特定の軽鎖および重鎖の共発現を示す、請求項１から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記解析の結果が、特定の宿主細胞における特定の病原体の存在を示す、請求項１から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
基質上の捕捉部位に結合パートナーを含む支持体を捕捉して、前記捕捉部位に固定化された支持体を生成するステップであり、前記結合パートナーが粒子成分に結合し、前記固定化された支持体が、それぞれ固定化された支持体に１個の粒子のみを結合可能にするように前記結合パートナーを呈示するステップと、
前記固定化された支持体上で前記結合パートナーに粒子を結合するステップと
を含む、単粒子を単離する方法。
【請求項４４】
前記捕捉するステップが、支持体の機械的捕捉を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記捕捉部位が、
１つの支持体のみを含有するようにサイズ決めされた捕捉形体と、
前記捕捉形体が支持体によって占有されない場合に、前記捕捉部位内に流体を流すことが可能なドレイン形体と
を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記基質が、流れを各捕捉部位に集束させる集束形体を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記基質が複数の捕捉部位を含む、請求項４３から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
各捕捉部位が、マイクロ流体デバイスの個別のコンパートメント内に位置付けられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記粒子を含む溶液を、前記マイクロ流体デバイスの前記コンパートメント内に通すステップを含み、それによって前記コンパートメントの３５％以上が単粒子のみを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
複数の粒子中の単粒子をアッセイする方法において、
前記複数の粒子を個別の反応容積に捕捉して、それぞれが１つの粒子のみを含有する複数の個別の反応容積を生成し、それぞれ１つの粒子のみを有する個別の反応容積の予測される割合が、個別の反応容積の総数の少なくとも３５％であるようにするステップと、
それぞれ個別の反応容積内の粒子の数を決定するステップと、
それぞれ個別の反応容積内にある各粒子ごとに複数のパラメーターをアッセイするステップであって、前記パラメーターの少なくとも１つが、それぞれ個別の反応容積内でアッセイされ、前記アッセイするステップが、
それぞれ個別の反応容積内にある各粒子に対して複数の反応を行って、それぞれ個別の反応容積内にある各粒子ごとに複数の反応生成物を生成するサブステップであって、
少なくとも１種の反応生成物が、少なくとも２つの増幅プライマーを使用する核酸増幅を含む反応によって生成されるアンプリコンであり、各増幅プライマーはバーコード配列を含み、
前記個別の反応容積はマイクロ流体デバイスの個別のコンパートメントであり、前記個別のコンパートメントは行および列によって画定されたアレイとして並べられており、各アンプリコンにおける前記第１および前記第２のバーコードの組合せが、前記アンプリコンの供給源であった前記コンパートメントの前記行および前記列を特定する、
サブステップと、
行におけるまたは列におけるコンパートメントから反応生成物をプールすることによって前記個別の反応容積の内容物を回収するサブステップと、
前記反応生成物を解析して結果を得るサブステップと、
粒子を含有しないまたは単粒子より多い粒子を含有する任意の反応容積からの結果を無視するサブステップと、
を含み、
前記方法は更に、
前記アッセイの残りの結果を、１つの粒子のみを有する各個別の反応容積に関連付けて、個別の反応容積内にある前記複数の粒子中の各粒子ごとに複数のパラメーターを含むデータ集合を生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項５１】
それぞれ１つの粒子のみを有する個別の反応容積の予測される割合が、個別の反応容積の総数の少なくとも５０％であるように、前記捕捉するステップを最適化するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
それぞれ１つの粒子のみを有する個別の反応容積の予測される割合が、個別の反応容積の総数の少なくとも６５％であるように、前記捕捉するステップを最適化するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
それぞれ１つの粒子のみを有する個別の反応容積の予測される割合が、個別の反応容積の総数の少なくとも８５％であるように、前記捕捉するステップを最適化するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記粒子が、前記複数の反応を行うための１種または複数種の試薬を添加する前に、個別の反応容積に捕捉される、請求項５０から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記粒子が細胞である、請求項５０から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記粒子が、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、およびこれらの組合せから選択される、請求項５０から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
４０，０００個よりも少ない粒子が前記方法で用いられる、請求項５０から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
１０，０００個よりも少ない粒子が前記方法で用いられる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
個別の反応容積内に分布した粒子の数が１０個よりも多く、１００個よりも多く、または１０００個よりも多い、請求項５０から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記捕捉するステップが、限界希釈を含む方法により行われる、請求項５０から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
限界希釈が、
粒子懸濁液の連続希釈物を調製するステップと、
各希釈物から、マイクロ流体デバイスの個別のコンパートメント内に粒子を分布させるステップと、
各コンパートメント内の粒子の数を決定するステップと、
個別の反応容積に単粒子を捕捉する際に使用される、単粒子のみ含む最も多い数のコンパートメントを生成する希釈物を選択するステップと
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
各コンパートメント内の粒子の数が、明視野顕微鏡法または蛍光顕微鏡法により決定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
染色剤、色素または標識を用いて、それぞれ個別の反応容積内の粒子の数を検出する、請求項６１に記載の方法。