【手続補正書】
【提出日】平成27年12月11日(2015.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠陥のある海馬を特徴とする哺乳動物の状態の治療用医薬の製造における、海馬を再生させる、Nrp2+神経堤幹細胞またはその突然変異体もしくはバリアントの使用。
【請求項２】
該Nrp2+神経堤幹細胞が、成体幹細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該成体Nrp2+神経堤幹細胞が、歯の象牙質および毛包から単離される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該状態が、脳の先天的な解剖学的異常または後天的脳傷害である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
該後天的脳傷害が、頭部外傷、窒息、萎縮または発育不全が原因である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該状態が、機能性ンパク質14-3-3ζまたはタンパク質14-3-3ζ/DISC1複合体形成のレベルの低下を特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
該状態が、神経精神疾患状態である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
該神経精神疾患状態が、統合失調症の一種以上の症状を特徴とする状態、統合失調症、統合失調症性人格障害、精神病、双極性障害、躁うつ病、感情障害、または統合失調症様障害または統合失調性感情障害、精神病性うつ病、自閉症、薬物誘発性精神病、せん妄、アルコール離脱症候群あるいは認知症性精神病を特徴とする状態である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
該哺乳動物が、ヒトである、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
欠陥のある海馬を特徴とする状態を有する哺乳動物の治療に用いるための、Nrp2+神経堤幹細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項１１】
該Nrp2+神経堤幹細胞が、成体幹細胞である、該請求項１０に記載の単離された細胞集団。
【請求項１２】
該Nrp2+神経堤幹細胞が、歯の象牙質または毛包から単離される、請求項１１に記載の単離された細胞集団。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１】14-3-3ζ欠損マウスは、異常な認知と行動特性を実証する。  (a)オープンフィールド試験にて、14-3-3ζ062-/-マウス(白抜きバー；n＝11)は、5〜30週齢において、14-3-3ζ062+/+同腹子(黒塗りバー；n＝11)よりも活発な探索行動をとった。(b)高架式迷路にて、14-3-3ζ062-/-マウス(白抜きバー；n＝12)は、オープンアームで、14-3-3ζ062+/+マウス(黒塗りバー；n＝12)よりも多い時間を費やした。(c)交差迷路逃避タスク試験にて、14-3-3ζ062-/-マウス(白丸；n＝12)は、空間学習(第1〜6日)および記憶(M1およびM2)の両方について、14-3-3ζ062+/+マウス(黒四角；n＝12)より低い能力を有する。(d)14-3-3ζ062+/+マウス(黒塗りバー；n＝11)と比較して、14-3-3ζ062-/-マウス(白抜きバー；n＝11)は、70dBのベースラインならびに100ミリ秒の刺激間隔におけるプレパルス(PP)2、4、8および16 dBにより、より低いプレパルス抑性を示した。すべてのPP強度の平均も示す。雄性および雌性マウスからのデータは、すべてのグラフにプールされる。誤差は、平均±SEMである。*）p＜0.05；**）p＜0.01；***）p＜0.001。
【図２】14-3-3ζは、アンモンの角の錐体細胞および歯状回の顆粒ニューロンにおいて発現される。  (a)(i)海馬の様々な領域を欠損している14.5 dpcのマウス胎児脳の冠状断面の略図。V、脳室；IZ、中間帯；VZ、脳室帯。(ii)P0マウス海馬のの冠状断面の略図。海馬原基からのニューロンは、脳室神経上皮(ライトブルー)および海馬采に隣接する脳室神経上皮(ダークブルー)に由来する。アンモンの角およびその層(so、上昇層；sp、錐体細胞層；sl、透明層；sr、放線層)を構成するアンモン角の錐体ニューロンを含んでいる３つの部分体(CA1〜3)を、歯状回(DG)中の顆粒状ニューロンの位置に関連して示す。(b)(i-ii)14.5 dpcの発生中の海馬の中間帯において、14-3-3ζ免疫活性を検出した。(iii-iv)P0にて、14-3-3ζ陽性ニューロンは、錐体細胞層に位置する。(v)錐体ニューロン(星印)のより拡大した図は、14-3-3ζが、細胞質内で点状に局在していることを示す。(c)P0、P7および成体14-3-3ζ062+/-海馬における14-3-3ζの内因性発現を示すX-gal染色である。高レベルの14-3-3ζ-lacZの発現は、錐体および顆粒ニューロンにおいて明らかである。(d)海馬ニューロンの培養。(i)EB1による14-3-3ζ染色(赤)。(ii)MAP2陽性海馬ニューロン(緑)。(iii)14-3-3ζとMAP2の重ね合わせは、MAP2陽性神経突起における共発現を強調表示する(矢印)。(e)14-3-3ζタンパク質(27 kDa)は、野生型マウスのアンモンの角および歯状回において発現される。成体WTおよび14-3-3ζ062-/-マウスからの溶解液のウエスタンブロットを免疫ブロットし、抗体で14-3-3ζを探査した(EB1)。抗β-アクチン(42 kDa)抗体をローディングコントロールとして用いた。スケールバー＝100 μm(bi-iv；c；di-iii)、25 μm(bv)。
【図３】14-3-3-ζ欠損マウスは、海馬の積層欠陥を示した。  ニッスル染色は、14.5 dpcから出生後第56日(P56)までのWTおよび14-3-3ζ062-/-マウスの海馬発生を示す。海馬細胞は、 14-3-3ζ062-/-マウスの錐体細胞層(sp)中に分散する(iv、vi、viii)。矢印は、放線層(sr)中の海馬錐体ニューロンの重複している層を強調表示する。星印は、上昇層(so)中に異所的に位置する錐体細胞を強調表示する。矢印は、歯状回中に漫然と配置された顆粒ニューロンを示す。(b)14-3-3ζ062バックグラウンドに導入されたThy1-YFP導入遺伝子の発現は、14-3-3ζ062-/-マウスにおいて海馬錐体ニューロンの激しい無秩序を示した。青、DAPI；緑、Thy1発現。(c)示した遺伝子型のP0(i-iv)およびP56(v-vi)マウスから得られた海馬の冠状切片である。WT海馬において、より深い錐体細胞層には、NeuN陽性錐体細胞が存在しており(黄、矢印)、 CA1からCA3への均一な成熟ゾーンを形成する。14-3-3ζ062-/-海馬において、成熟ゾーンの均一性はより低く、CA3における錐体細胞層のより深いゾーン(黄の矢印)およびより表面のゾーン(白の矢印)の両方において、異所的に存在するいくつかのNeuN陽性成熟錐体細胞を有する。P56 14-3-3ζ062-/-マウスにおいて、NeuNに対する免疫染色は、重複したCA3サブフィールド中の錐体細胞を強調表示し、異所性細胞が成熟に達したことを示す(vi)。スケールバー：100um。
【図４】BrdU-パルス-チェイス分析は、14-3-3ζ欠損マウスにおけるニューロン移動欠陥を示す。  14.5dpc：P7(i-v)および16.5dpc：P7(vi-x)におけるBrdU-パルス-チェイス分析は、BrdU陽性細胞(黒)が、WT海馬のCA3サブフィールドの錐体細胞層(sp)内に位置することを実証する(iiおよびvii)。(v)グラフは、14.5dpc：P7における異所性海馬ニューロンのパーセンテージをまとめたものである。14-3-3ζ062-/-マウスのBrdU-標識細胞は、異所的に配置された。ニューロンは、上昇層(so)にとどめられるか、または錐体細胞層を越えて、透明層(sl)に移動した(ivおよびix)。(x)グラフは、16.5dpc：P7における異所性海馬ニューロンのパーセンテージをまとめたものである。スケールバー：100 μm
【図５】14-3-3ζ欠損マウスにおける異常な苔状線維経路。  14-3-3ζ062+/+(i,iii,vおよびvii)および14-3-3ζ062-/-(ii、iv、viおよびviii)マウスにおける錐体下(IPMF、黄矢印)および錐体上(SPMF、白矢印)苔状線維の通り道の軌道のカルビンジン免疫染色。WTコントロールと同様に、14-3-3ζ062-/-欠損神経突起は、歯状回(DG)から離れて移動(navigate)した後、最初、SPMFブランチおよびIPMFブランチへと二股に分かれる。しかしながら、14-3-3ζ062-/-マウスのIPMFブランチは、錐体細胞の細胞体(sp、白矢印)の間で異常に移動した。さらに、14-3-3ζ062-/-マウスの拡散したSPMFブランチは、CA3にある重複した錐体細胞層に侵入した。スケールバー＝100 μm。
【図６】異所性CA3錐体細胞と経路を誤った苔状線維との間の機能的シナプス結合。  (i-iv)シナプトフィジン(Syp)に対する抗体で染色したP56 14-3-3ζ062+/+マウスからの海馬切片は、IPMF(白矢印)およびSPMF(黄矢印)の両方において免疫反応性を示す。Syp染色は、CA3の錐体細胞体を取り囲んでいる上昇層(so)および透明層(sl)の両方にある。(v-viii14-3-3ζ062-/-マウス)からの海馬切片のSyp染色は、CA3の錐体細胞層内で異常に移動する苔状線維(星印、v、vii)が機能的シナプスを形成することを示す。(ix-xii)異所性成熟CA3錐体細胞(NeuNで染色；星印で示す)は、経路を誤った苔状線維からのシナプスタンパク質(Syp、緑色)と連絡をとる。スケールバー＝100 μm。(b)ゴルジ染色は、WTまたは14-3-3ζ062-/-成体マウス(P35)の錐体細胞の樹状樹枝状構造(dendritic arborization)を示す。経路を誤った苔状線維シナプス神経繊維末端(MFB、斜角線(bevelled line))との接触点を示す、とげのある突出物の１つのセットは、WTニューロンにおけるCA3錐体細胞の頂端近位樹状突起(apical proximal dendrites)上にある。とげのある突出物の２つのセットが、14-3-3ζ062-/-マウスの頂端樹状ツリー上にあって、一方は近位頂端樹状突起にあり、他方は遠位樹状ブランチ(*)にある。(c)模式図は、WT海馬と比較して、経路を誤った苔状線維の通り道および14-3-3ζ062-/-マウスの異所性CA3錐体細胞に連絡している苔状線維神経繊維末端の異所性シナプス点を示す。
【図７】14-3-3ζは、DISC1と相互作用して、神経発達をコントロールする。  (a-b)P7マウス脳からの等量の溶解物を、抗DISC1抗体または抗14-3-3抗体で免疫沈降させ、DISC1(a)または14-3-3ζを認識するEB1精製抗血清(b)で免疫ブロットした。共免疫沈降に用いるための総細胞溶解物(インプット)の5%からのDISC1イソ型および14-3-3ζの相対的発現レベルも、直接免疫ブロット法によって決定した。矢印は、DISC1の主な100kDaおよび75kDaバンド(a)および14-3-3ζを表す27kDaバンド(b)を示す。星印は、免疫沈降からのバックグラウンドIgGバンドを表す。(c)ニューロン移動および軸索成長における14-3-3ζの役割を示す模式図である。(i)14-3-3ζは、CDK5リン酸化Ndel1を結合させて、LIS1との相互作用を促進し、それによってニューロン移動を促進する。(ii)14-3-3ζは、LIS1/ Ndel1/DISC1複合体にも存在して、軸索成長動力学をコントロールする。
【図８】14-3-3ζ遺伝子の遺伝子トラップ突然変異。  (a)14-3-3ζGt(OST062)Lexマウス株のためおよび(b)マウス株14-3-3ζGt(OST390)Lexのための挿入点を示す模式図である。遺伝子トラップベクターは、それによって内因性14-3-3ζプロモーター下で発現される選択可能なマーカー遺伝子(Oガラクトシダーゼ/ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子のためのBGEO)に融合したスプライスアクセプター配列(SA)を含む。14-3-3ζの上流エクソンに組み込まれた場合、BGEOは、mRNA転写を妨げる融合転写物を生成する。ベクターは、PGKプロモーターに続いて、スプライスドナー(SD)シグナルの上流にブルトン型チロシンキナーゼ遺伝子(BTK)の第一エクソンも含む。BTKは、融合転写物の下流の翻訳を妨げるために、すべての読み取り枠に終止コドンを含む。遺伝子トラップベクターは、レトロウイルス体において、２つの長い末端反復(LTR)の間に示される。両方の図において、矢印は、遺伝子型決定に用いたプライマーを示す。赤ボックスは、非コーティング非翻訳配列を示し、緑ボックスは、コーティング配列を示す。
【図９】ウエスタンブロット分析は、14-3-3ζ発現が、突然変異マウスの全ての組織において減少することを実証する：  (a)雄性および雌性の、14-3-3ζ062-/-および年齢をマッチさせた14-3-3ζ062+/+マウス、ならびに(b)雄性および雌性の、14-3-3ζ390-/-および年齢をマッチさせた14-3-3ζ390+/+マウスから組織を採集した。材料および方法において記載したように、プロテアーゼインヒビターを含むNP40溶解緩衝液中ですべてのサンプルをホモジナイズした。ピアスBCAプロテインアッセイキットを用いてタンパク質濃度を決定し、レーン毎に10μgのタンパク質をロードした。ブロットをEB-1抗体でプローブして、14-3-3ζを検出し、ローディングコントロールとして抗β-アクチン(1：5000)を用いた。結合した抗体を、HRP-複合二次抗体(1：20,000、Pierce-Thermo Scientific)で検出した。ECLによって免疫反応性タンパク質を視覚化した。EB1抗体が、14-3-3ζ以外の14-3-3イソ型を検出できることに留意。
【図１０】14-3-3イソ型のmRNAレベルは、14-3-3ζ欠損マウス脳において一定のままである：  すべてのイ14-3-3ソ型の転写物レベルは、14-3-3ζ062-/-マウス由来の脳組織において、14-3-3ζイソ型の欠失に応答して変化することはない。3匹の14-3-3ζ062-/-マウスおよび3匹の年齢をマッチさせた14-3-3ζ062+/+コントロールの全脳からRNAを単離した。Quantitect kit(Qiagen)を用いて、1 μgのRNAから相補的DNA(cDNA)を生成した。 Sybr Green(Qiagen)およびRotor Geneマシーン(Corbett)を用いるリアルタイムPCRを用いて、14-3-3のすべてのイソ型のサンプル中のGAPDHと比較して、mRNAのレベルを決定した。
【図１１】14-3-3ζ欠損マウスは、学習および記憶において認知機能障害を示す。  クロス迷路逃避タスク試験において、14-3-3ζ062-/-マウス(白丸；n＝12)は、空間学習(第1-6日)および記憶の両方について、14-3-3ζ062+/+マウス(黒四角；n＝12)よりも能力が低い。14-3-3ζ062-/-マウスは、トレーニング期間を通して、および記憶試験期間(M1およびM2)中に、逃避プラットフォームに到達するのにより長い時間がかかる。雄性および雌性マウスからのデータをプールする。誤差バーは、平均±SEMとして現す。*、p＜0.05；**、p ＜0.01；***、p ＜0.001。
【図１２】14-3-3ζ欠損マウスは、驚愕反射の低下を示す。  14-3-3ζ062-/-マウスの驚愕振幅(白抜きバー；n＝13)は、4つの115 dBのパルス単独ブロックを通して、14-3-3ζ062+/+マウス(黒塗りバー；n＝14)よりも低い。すべてのブロックからの平均驚愕(Avg)も示す。**、＜0.05。
【図１３】14-3-3ζ発現は、海馬ニューロンにおいて維持される。  X-gal染色は、P0およびP7の14-3-3ζ062+/-海馬および小脳における、14-3-3ζの内因性発現を示す。海馬における高レベルの14-3-3ζ-lacZ発現は、アンモンの角の錐体ニューロンおよび成熟歯状回ニューロンの両方において明らかであるが、誕生後の小脳においては明らかでない。スケールバー＝25 μm。
【図１４】、14-3-3ζ欠損マウスにおける海馬の層状構造の欠如。  ニッスル染色は、14.5 dpcから誕生(P0)までのWT(i、iii、v)および14-3-3ζ062-/-(ii、iv、vi)マウスの海馬発生を示す。海馬細胞は、14-3- 3ζ062-/-マウスの錐体細胞層(sp)において分散された。矢印は、放線層(sr)の海馬錐体ニューロン重複した層を強調表示する。星印は、上昇層(so)において異所的に配置された錐体細胞を強調表示する。スケールバー＝25 μm。
【図１５】14-3-3ζ欠損マウスの誤って配置されたニューロンは、成体期まで生存する。  海馬原基(a-f)および成熟海馬(g-h)におけるアポトーシス細胞。14-3-3ζ-/-海馬では、分裂したアポトーシス細胞核の増加は検出されなかった(aiiおよびbii中の緑のTUNEL陽性細胞において示される)。スケールバー＝100 μm。
【図１６】末梢神経系の発生中、Nrp1陽性神経堤幹細胞は、交感神経系および副腎のクロム親和細胞(c)、ニューロン(n)およびグリア(g)を形成する。対照的に、Nrp2陽性神経堤細胞は、感覚神経系のニューロンおよびグリアを形成する。我々は、Nrp1プロモーター(Nrp1：Cre/RFP)からCreおよび赤色蛍光タンパク質を発現しているトランスジェニックマウスモデル、またはNrp2プロモーター(Nrp2：Cre/GFP)からCreおよび緑色蛍光タンパク質を発現しているトランスジェニックマウスモデルを創り出した。これらのマウスは、各亜集団を精製するのに用いることができる、Nrp1およびNrp2陽性神経幹細胞のスペクトル分離を促進する。
【図１７】Nrp2：ベータガラクトシダーゼに対して染色したCre/GFPマウス由来のP0マウス脳の冠状切片。(A)中の枠囲み領域の拡大図である(B)は、海馬(h)のアンモン角(CA1-3)錐体ニューロンおよび歯状回(DG)顆粒ニューロンが、Nrp2発現神経幹細胞から誘導されることを実証する。Nrp2は、脳室帯(VZ)中の神経幹細胞においても発現される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
材料および方法
マウス：Geoレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築物を有する14-3-3ζGt(OST062)Lexおよび14-3-3ζGt(OST390)Lex突然変異マウスは、それぞれ、Lexicon Genetics ES細胞株であるOST062およびOST390に由来した。14-3-3ζGt(OST062)Lexマウス中の遺伝子トラップベクターは、14-3-3ζの第一イントロンに挿入されたが、14-3-3ζGt(OST390)Lexマウス中の遺伝子トラップベクターは、14-3-3ζの第二イントロンに挿入された。ES細胞株を増殖させ、SV129胚盤胞に注入した。得られる生殖細胞系伝達オスは、SV129バックグラウンドに維持するか、または６世代にわたってC57/Bl6およびBA1,BCバックグラウンドに戻し交配した。qRT-PCRおよび全組織サンプルからのウエスタンブロットを用いて、これらのマウス株における遺伝子の完全KOを確認した。ゲノムテールDNAのPCR増幅によって14-3-3C遺伝子型を決定した。WT対立遺伝子は、288 bp(14-3-3ζGt(OST062)Lex)または445 bp(14-3-3ζGt(OST390)Lex)のバンドを増幅させ、突然変異遺伝子トラップされた対立遺伝子は、165 bp(14-3-3ζGt(OST062)Lex)または203 bp(14-3-3ζGt(OST390)Lex)のバンドを増幅させた。マウスを、WT同腹子と表現型的に区別できないヘテロ接合つがいとして維持した。Institute of Medical and Veterinary Sciencesの動物倫理委員会およびアデレード大学のガイドラインにしたがって、動物実験を行った。