【手続補正書】
【提出日】平成28年3月11日(2016.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート非依存核酸ポリメラーゼと、アテニュエーター−アダプター分子と、アテニュエーター配列に相補的であるヌクレオチドと、リガーゼと、を含む、組成物。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびポリ（Ｕ）ポリメラーゼからなる群から選択されるＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アテニュエーター分子が、２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、塩基類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記アテニュエーター分子が、１０個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチドまたは１００個のヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記アテニュエーター分子が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸塩、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆位デオキシチミジンからなる群から選択される３’保護基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記アテニュエーター分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、環状分子、ペプチド核酸、シゾフィラン多糖、ロックド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アテニュエーター分子が、分解性であるかまたは置換可能である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記アテニュエーター−アダプター分子が、１本鎖アテニュエーター配列を含み、前記アテニュエーター配列の５’に位置する部分的に２本鎖のアダプター配列Ｗをさらに含み、かつ配列Ｘに相補的であり、任意に、前記アダプターは５’リン酸塩を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リガーゼが、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
プライマーと、ポリメラーゼと、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子とをさらに含む、請求項１０に記載の組成物であって、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である、組成物。
【請求項１２】
前記アテニュエーター−アダプター分子が、固定化される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アテニュエーター−アダプター分子のアテニュエーター部分が、（１）ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｒＡ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）からなる群から選択されるホモポリマー配列、あるいは（２）
（ｉ）ｄＡおよびｒＡ塩基、
（ｉｉ）ｄＴ、ｄＵ、およびＵ塩基、
（ｉｉｉ）ｄＣおよびｒＣ塩基、または
（ｉｖ）ｄＧおよびｒＧ塩基
の組み合わせを含むヘテロポリマー配列を含むか、または前記アテニュエーター分子が、以下のジヌクレオチドの組み合わせ（ｉ）ｄＧおよびｄＣ；（ｉｉ）ｄＡおよびｄＴ；（ｉｉｉ）ｄＧおよびｄＴ；（ｉｖ）ｄＧおよびｄＡ；（ｖ）ｄＡおよびｄＣ；または（ｖｉ）ｄＣおよびｄＴから構成される複数のランダム配列を含むジヌクレオチド配列を含むか、または前記アテニュエーター分子が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含むジヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
（ｉ）前記アテニュエーター分子が、ｄＵ塩基を含み、ｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を不安定化するか、またはｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーション、および後続の８０℃を上回る温度でのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を分解するか、あるいは前記アテニュエーター分子がｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物とインキュベートされる、
（ｉｉ）前記アテニュエーター分子が、リボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下でリボヌクレアーゼにより分解性であり、前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される、かつ／または
（ｉｉｉ）前記アテニュエーター分子が、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性であり、任意に、前記ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼが、ＤＮａｓｅ  Ｉである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
基質ポリヌクレオチドの減弱されたテーリングおよび同時アダプター連結の方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物を、前記基質ポリヌクレオチド、および前記アテニュエーター分子に相補的であるヌクレオチドと混合すること、ならびに
前記基質ポリヌクレオチドの３’端への、尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートすることを含み、前記尾配列の付加が前記尾配列と前記アテニュエーター分子との間の会合およびアダプター配列の前記基質ポリヌクレオチドへの連結を可能にし、複合体を形成する、方法。
【請求項１６】
前記基質ポリヌクレオチドが、
（ｉ）１本鎖基質ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）２本鎖基質ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）部分的に２本鎖であり、部分的に１本鎖の基質ポリヌクレオチドであって、前記２本鎖の基質ポリヌクレオチドが３’突出端を有する基質ポリヌクレオチド、
（ｉｖ）亜硫酸水素塩処理された基質ポリヌクレオチド、または
（ｖ）プライマー伸長反応の生成物
である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質ポリヌクレオチドが、遊離３’ヒドロキシル基を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アテニュエーター−アダプター分子のアテニュエーター部分が、前記尾配列を付加する過程中に前記尾配列と会合し、前記アテニュエーター分子の前記尾配列への会合が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、温度感受性であり、前記温度が、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃または約５０℃である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質ポリヌクレオチドが、ＤＮＡであるか、または前記基質ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも３０個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌクレオチドまたは少なくとも１００個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドが、前記減弱されたテーリングおよび同時連結反応の後に固定化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２４】
基質ポリヌクレオチドの減弱されたテーリングおよび同時アダプター連結の方法であって、
（１）前記基質ポリヌクレオチドを含む混合物を、前記基質ポリヌクレオチドの伸長が前記基質に尾を付けることを可能にする条件下で、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）アテニュエーター配列を含み、かつ前記アテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、アダプター配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター分子を含む組成物であって、前記組成物が、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である組成物、および（ｉｉｉ）前記アテニュエーター分子のアテニュエーター配列に相補的であるデオキシヌクレオチドとインキュベートすることと、
（２）前記アダプター配列Ｘを前記基質ポリヌクレオチドに連結し、前記アテニュエーター分子を別のポリヌクレオチドから解離することと、
（３）前記基質ポリヌクレオチドの配列に相補的なプライマーを、前記プライマーが前記基質ポリヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で添加することと、
（４）前記プライマーからポリメラーゼ伸長を実施するために、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドを添加して、前記基質ポリヌクレオチドに相補的な第２鎖ポリヌクレオチドを生成し、２本鎖基質分子を作製することと、
（５）前記アダプター分子を前記２本鎖基質分子に連結することと、
（６）任意に、前記第２鎖ポリヌクレオチドを分解することと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘとハイブリダイズするのに前記基質ポリヌクレオチドの配列に十分に相補的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘ以外の前記基質分子の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である標的特異的プライマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質ポリヌクレオチドが、１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドまたはリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
配列Ｘが別のポリヌクレオチド上にある、請求項９に記載の組成物。
【請求項２９】
配列Ｘが別のポリヌクレオチド上にある、請求項２４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本明細書に開示される組成物のいずれかを含むキットも提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸ポリメラーゼと、アテニュエーター分子と、を含む、組成物。
（項目２）
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記核酸ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼである、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびポリ（Ｕ）ポリメラーゼからなる群から選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記アテニュエーター分子が、２’−デオキシチミジン５’−１リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−１リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−１リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−１リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン１リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン１リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、塩基類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、項目１〜６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
前記アテニュエーター分子が、１０個のヌクレオチドを含む、項目１〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
前記アテニュエーター分子が、２０個のヌクレオチドを含む、項目１〜８のいずれかに記載の組成物。
（項目１０）
前記アテニュエーター分子が、３０個のヌクレオチドを含む、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記アテニュエーター分子が、５０個のヌクレオチドを含む、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記アテニュエーター分子が、１００個のヌクレオチドを含む、項目１〜１１のいずれかに記載の組成物。
（項目１３）
前記アテニュエーター分子が、３’保護基を含む、項目１〜１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）
前記保護基が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸塩、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆位デオキシチミジンからなる群から選択される、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記アテニュエーター分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、環状分子、ペプチド核酸、シゾフィラン多糖、ロックド核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１６）
前記アテニュエーター分子が、分解性である、項目１〜１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
前記アテニュエーター分子が、ホモポリマー配列の５’に位置するアダプター配列、識別タグ配列、またはそれらの両方をさらに含む、項目１〜１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
リガーゼが、存在する、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物。
（項目１９）
前記アテニュエーター分子が、アテニュエーター配列を含み、かつ前記アテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上の配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター−アダプター分子であり、
前記組成物が、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記アテニュエーター分子が、固定化される、項目１７に記載の組成物。
（項目２１）
前記アテニュエーター分子が、１本鎖である、項目１〜２０のいずれかに記載の組成物。
（項目２２）
前記アテニュエーター分子が、少なくとも部分的に２本鎖である、項目１７〜２１のいずれかに記載の組成物。
（項目２３）
前記少なくとも部分的に２本鎖のアテニュエーター分子が、前記アダプター配列を含むアダプター分子に前記アテニュエーター分子をアニールすることにより生成される、項目２１または２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）
前記アテニュエーター分子が、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（ｒＡ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、ならびに
（ｉ）ｄＡおよびｒＡ塩基、
（ｉｉ）ｄＴ、ｄＵ、およびＵ塩基、
（ｉｉｉ）ｄＣおよびｒＣ塩基、または
（ｉｖ）ｄＧおよびｒＧ塩基の組み合わせを含むヘテロポリマー配列からなる群から選択されるホモポリマー配列を含む、項目１〜２３のいずれかに記載の組成物。
（項目２５）
前記アテニュエーター分子が、ｄＵ塩基を含み、ｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を不安定化するか、またはｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーション、および後続の８０℃を上回る温度でのインキュベーションが前記アテニュエーター分子を分解するか、あるいは前記アテニュエーター分子がｄＵ−グリコシラーゼと脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼの混合物とインキュベートされる、項目１６に記載の組成物。
（項目２６）
前記アテニュエーター分子が、リボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下でリボヌクレアーゼにより分解性である、項目１６に記載の組成物。
（項目２７）
前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群から選択される、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記アテニュエーター分子が、デオキシリボヌクレオチドを含み、ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼにより分解性である、項目１６に記載の組成物。
（項目２９）
前記ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼが、ＤＮａｓｅ  Ｉである、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記基質ポリヌクレオチドの３’端への、尾配列の付加を可能にするのに十分な条件下で、前記基質ポリヌクレオチドを項目１〜２９のいずれかに記載の組成物とインキュベートすることを含み、前記尾配列の付加が前記尾配列と前記アテニュエーター分子との間の会合を可能にし、複合体を形成する、方法。
（項目３１）
前記基質ポリヌクレオチドの伸長後、前記アテニュエーター分子を分解することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記基質ポリヌクレオチドの伸長後、前記アテニュエーター分子を不安定化することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することをさらに含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
項目１〜２７のいずれか１項に記載の組成物を、前記基質ポリヌクレオチド、および前記アテニュエーター分子の前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することをさらに含む、項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
基質ポリヌクレオチドが、１本鎖基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記基質ポリヌクレオチドが、２本鎖基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記基質ポリヌクレオチドが、部分的に２本鎖であり、部分的に１本鎖の基質ポリヌクレオチドである、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記２本鎖基質ポリヌクレオチドが、３’突出端を有する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記基質ポリヌクレオチドが、遊離３’ヒドロキシル基を含む、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
多数のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記アテニュエーター分子が、前記アテニュエーター分子の長さ全てまたは一部にわたって前記尾配列と会合する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記アテニュエーター分子が、前記尾配列を付加する過程中に前記尾配列と会合する、項目４０または項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記アテニュエーター分子の前記尾配列への会合が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する、項目４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記条件が、前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加を調節する、項目３０〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、温度感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
約４℃〜約５０℃の温度範囲で実施される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記温度が、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、時間感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記インキュベーションステップが、約０．５分〜約１２０分の範囲の時間の長さにわたって進行する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記インキュベーションステップが進行する前記時間の長さが、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約３１分、約３２分、約３３分、約３４分、約３５分、約３６分、約３７分、約３８分、約３９分、約４０分、約４１分、約４２分、約４３分、約４４分、約４５分、約４６分、約４７分、約４８分、約４９分、約５０分、約５１分、約５２分、約５３分、約５４分、約５５分、約５６分、約５７分、約５８分、約５９分、約６０分、約６１分、約６２分、約６３分、約６４分、約６５分、約６６分、約６７分、約６８分、約６９分、約７０分、約７１分、約７２分、約７３分、約７４分、約７５分、約７６分、約７７分、約７８分、約７９分、約８０分、約８１分、約８２分、約８３分、約８４分、約８５分、約８６分、約８７分、約８８分、約８９分、約９０分、約９１分、約９２分、約９３分、約９４分、約９５分、約９６分、約９７分、約９８分、約９９分、約１００分、約１０１分、約１０２分、約１０３分、約１０４分、約１０５分、約１０６分、約１０７分、約１０８分、約１０９分、約１１０分、約１１１分、約１１２分、約１１３分、約１１４分、約１１５分、約１１６分、約１１７分、約１１８分、約１１９分、または約１２０分である、項目４８または項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨ感受性である、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０の範囲である条件下で実施される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加が、ｐＨが約ｐＨ５．１、約ｐＨ５．２、約ｐＨ５．３、約ｐＨ５．４、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．６、約ｐＨ５．７、約ｐＨ５．８、約ｐＨ５．９、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．１、約ｐＨ６．２、約ｐＨ６．３、約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．６、約ｐＨ６．７、約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、または約ｐＨ９．０である条件下で実施される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記基質ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、項目３０に記載の方法。
（項目５５）
前記基質ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、項目３０に記載の方法。
（項目５６）
少なくとも３個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
少なくとも１０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
少なくとも２０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
少なくとも３０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
少なくとも５０個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
少なくとも１００個のヌクレオチドが、前記基質ポリヌクレオチドに付加される、項目３０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記アダプター分子が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加中に、リガーゼ酵素によって前記基質ポリヌクレオチドに連結され、前記基質ポリヌクレオチドの固定化をもたらす、項目３０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記リガーゼが、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記アダプター分子が、ヌクレオチドの前記基質ポリヌクレオチドへの付加後に、リガーゼ酵素によって前記基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記固定化されたアテニュエーター−アダプター分子が、尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加中に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによって基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記固定化されたアテニュエーター−アダプター分子が、尾配列の前記基質ポリヌクレオチドへの付加後に、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼによって基質ポリヌクレオチドに連結される、項目３０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
反応物に添加される前記リガーゼ酵素の量が、約０．１〜約１０００単位（Ｕ）である、項目６２〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、３’リン酸塩を含む分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いて７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
ＤＮＡグリコシラーゼを添加することにより、前記アテニュエーター分子を不安定化することと、
前記混合物を、３７℃で約５分間インキュベートするか、または前記混合物を、８０℃を上回る温度でインキュベートすることにより、前記アテニュエーター分子を分解することと、
任意に、前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目６９）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、少なくとも２つのリボヌクレオチドを任意に含む保護基を含むアテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるデオキシヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いてＴｄＴ酵素を不活性化するために、７０℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
任意に、前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７０）
基質ＲＮＡポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
基質ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、分解性アテニュエーターポリヌクレオチド、および前記アテニュエーターポリヌクレオチドの前記ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、
前記混合物を、約３０℃〜約３７℃で約３０分間インキュベートし、続いて９５℃で約１０分間さらにインキュベートすることと、
ＤＮＡグリコシラーゼを添加することによって前記アテニュエーター分子を不安定化し、前記混合物を３７℃で約１０分間インキュベートするか、またはＤＮＡグリコシラーゼを添加し、前記化合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、続いて８０℃を上回る温度でインキュベートすることにより、前記アテニュエーター分子を分解することと、
任意に、前記伸長した基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７１）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とアダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、前記アテニュエーター分子および相互に少なくとも部分的に相補的である前記アダプター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記アテニュエーター−アダプター分子の前記ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドと混合することと、
約３０℃〜約３７℃で約１５分〜約３０分間インキュベートすることと、
任意に、前記アテニュエーター−アダプター分子に連結された前記伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７４）
ＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とビオチン化アダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、相互に少なくとも部分的に相補的である前記前記ビオチン化アダプター分子にアテニュエーター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約２５℃で約２時間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子の前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、
前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された前記固定化された部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約３０℃〜約３７℃で約１５分〜３０分間、前記ＤＮＡ基質ポリヌクレオチド、ＴｄＴ酵素、リガーゼ酵素、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるヌクレオチドとインキュベートすることと、
前記溶液をＮａＯＨで洗浄し、前記ビーズから前記非ビオチン化１本鎖ＤＮＡを除去することと、
任意に、前記２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長したＤＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７５）
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
アテニュエーター分子とアダプター分子の混合物を、適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、前記アテニュエーター分子および相互に少なくとも部分的に相補的である前記アダプター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の前記１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドと混合することと、
前記ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを、約３０℃〜約３７℃で約１５〜約３０分間、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）酵素、リガーゼ酵素、前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター−アダプター分子の前記１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドとインキュベートすることと、
任意に、前記アテニュエーター−アダプター分子に連結された前記伸長したＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７６）
ＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを伸長し、固定する方法であって、
２つの分子の混合物を、適切な緩衝液中で、約１００℃に加熱し、その後約２５℃に冷却することによって、相互に少なくとも部分的に相補的である前記ビオチン化アダプター分子に前記アテニュエーター分子をアニールすることであって、前記アニーリングが、部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子をもたらすことと、
前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を、約２５℃で約２時間、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを含む溶液と混合することにより、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子を固定化し、前記部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子の前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの固定化をもたらすことと、
前記ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズに結合された前記固定化された部分的に２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプターｖを、約３０℃〜約３７℃で約１５〜３０分、前記ＲＮＡ基質ポリヌクレオチド、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、リガーゼ酵素、および前記部分的に２本鎖のアテニュエーター分子の１本鎖ホモポリマー部分に相補的であるリボヌクレオチドとインキュベートすることと、
前記溶液をＮａＯＨで洗浄し、前記ビーズから前記非ビオチン化１本鎖ポリヌクレオチドを除去することと、
任意に、前記２本鎖のビオチン化アテニュエーター−アダプター分子に連結された伸長し、かつ固定化されたＲＮＡ基質ポリヌクレオチドを単離することと、を含む、方法。
（項目７７）
項目１〜２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
（項目７８）
基質ポリヌクレオチドを伸長する方法であって、
（１）前記基質ポリヌクレオチドを含む混合物を、前記基質ポリヌクレオチドの伸長が前記基質に尾を付けることを可能にする条件下で、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）アテニュエーター配列を含み、かつ前記アテニュエーター配列に隣接して位置付けられ、別のポリヌクレオチド上のアダプター配列Ｘに相補的である配列Ｗをさらに含むアテニュエーター分子を含み、前記組成物が、配列Ｖに相補的である配列Ｙを含むアダプター分子をさらに含み、配列Ｖが、Ｙと同じ長さであるか、または配列Ｙと同じ長さ未満であり、前記アダプター分子が、前記アテニュエーター−アダプター分子とは別の分子である組成物、および（ｉｉｉ）前記アテニュエーター分子のアテニュエーター配列に相補的であるデオキシヌクレオチドとインキュベートすることと、
（２）前記アダプター配列Ｘを前記基質ポリヌクレオチドに連結し、前記アテニュエーター分子を前記別のポリヌクレオチドから解離することと、
（３）前記基質ポリヌクレオチドの配列に相補的なプライマーを、前記プライマーを前記基質ポリヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で添加することと、
（４）前記プライマーからポリメラーゼ伸長を実施するために、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドを添加して、前記基質ポリヌクレオチドに相補的な２本鎖ポリヌクレオチドを生成し、２本鎖基質分子を作製することと、
（５）前記アダプター分子を前記２本鎖基質分子に連結することと、
（６）任意に、前記２本鎖ポリヌクレオチドを分解することと、を含む、方法。
（項目７９）
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘとハイブリダイズするのに前記基質ポリヌクレオチドの配列に十分に相補的である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記プライマーが、適切な条件下で配列Ｘ以外の前記基質分子の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である標的特異的プライマーである、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記基質ポリヌクレオチドが、１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記基質ポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）である、項目７８に記載の方法。