【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年10月4日(2016.10.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓内の、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域に付着されている欠陥のある半月弁を交換するための半月弁の再生に使用するための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）弁導管を作製する方法であって、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料のシートを提供する工程と、
前記ＥＣＭ材料のシートを折り畳まれた状態にする工程と、ここで、前記シートは、前記シートの上縁を含む上端部分及び前記シートの下縁を含む下端部分を含み、折り畳まれた状態では、前記シートの前記下縁が前記シートの前記上縁から第一の距離、離れるように、前記シートの前記下縁が前記シートの前記上縁に向かって折り畳まれており、
前記ＥＣＭ材料のシートを前記折り畳まれた状態に固定することにより、上方部分、下方部分、第一の側縁、及び第二の側縁を有する折り畳まれたＥＣＭ弁構成物を作製する工程と、ここで、前記下方部分は第一の層及び第二の層を含み、前記下方部分の前記第一の層は、前記ＥＣＭ材料のシートの前記折り畳まれた下端部分に相当し、
前記第一の層を、第一の付着点及び第二の付着点で、前記第二の層に付着させる工程と、ここで、前記第一の付着点は前記第二の付着点から第二の距離、離れており、第一の複数の洞促進部分が前記ＥＣＭ弁構成物の前記上方部分に形成されており、第一の複数の交連促進部分が前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第一の層に形成されており、
前記ＥＣＭ弁構成物を整列状態にする工程と、ここで、前記ＥＣＭ弁構成物の前記第一の側縁は、前記ＥＣＭ弁構成物の前記第二の側縁と整列しており、
前記ＥＣＭ弁構成物を前記の整列状態にしたまま、前記ＥＣＭ弁構成物の前記第一の側縁を前記ＥＣＭ弁構成物の前記第二の側縁に固定することにより、内腔及び縦軸線を有するＥＣＭ弁導管を作製する工程と、ここで、前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分は、前記ＥＣＭ弁導管の入口部分に相当し、前記ＥＣＭ弁導管の前記入口部分は、前記ＥＣＭ弁導管の前記内腔と流体連通する入口を画定し、前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第一の層は、前記ＥＣＭ弁導管の前記内腔内に位置する内側層に相当し、前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第二の層は、前記ＥＣＭ弁構成物の前記上方部分と協働して前記ＥＣＭ弁導管の外壁を画定しており、
を含み、
前記再生が、
前記対象の前記心臓から前記欠陥のある半月弁を除去することと、
前記ＥＣＭ弁導管の前記入口部分が前記対象の前記心臓の前記環状領域の近傍に位置するように、前記ＥＣＭ弁導管を、前記対象の前記心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に付着させることと、
を含み、
前記ＥＣＭ弁導管が前記対象の前記心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に付着された後、
前記ＥＣＭ弁導管内側層の前記第一の複数の交連促進部分が、前記ＥＣＭ弁構成物の前記上方部分とリモデリング且つ融合して、前記ＥＣＭ弁導管内腔内に、交換半月弁の第一の複数の再生された弁葉が形成され、前記第一の複数の再生された弁葉は３つの弁葉を含み、
前記第一の複数の洞促進部分が、前記ＥＣＭ弁導管の前記内側層とリモデリング且つ融合して、前記交換半月弁の第一の複数の再生された洞部分が形成され、
前記ＥＣＭ弁導管の前記第一の複数の再生された弁葉及び前記第一の複数の再生された洞部分には、リモデリングされた心血管組織が含まれる、
前記方法。
【請求項２】
前記第一の付着点及び前記第二の付着点が第一の共通の平面に配置されており、前記第一の共通の平面が前記ＥＣＭ弁導管の前記縦軸線に対して垂直である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の付着点が、前記第一の側縁から第三の距離、離れており、前記第二の付着点が、前記第二の側縁から第四の距離、離れており、前記第三の距離及び前記第四の距離は、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記第二の距離に等しい、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第一の側縁と前記第一の付着点の中間の第三の付着点で、前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着されており、前記第一、前記第二および前記第三の付着点が第二の共通の平面内に配置されており、前記第二の共通の平面は前記ＥＣＭ弁導管の前記縦軸線に対して垂直であり、第二の複数の洞促進部分が前記ＥＣＭ弁構成物の前記上方部分に形成されており、第二の複数の交連促進部分が前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第一の層に形成されており、
前記再生において、前記ＥＣＭ弁導管が前記対象の前記心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に付着された後、前記第二の複数の洞促進部分が、前記ＥＣＭ弁導管の前記内側層とリモデリング且つ融合して、前記交換半月弁の第二の複数の再生された洞部分が形成され、前記第二の複数の交連促進部分が、前記ＥＣＭ弁構成物の前記上方部分とリモデリング且つ融合して、第二の複数の再生された弁葉が形成される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第三の付着点が、前記第一の付着点から第五の距離、離れており、前記第五の拒理が、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記第二の距離に等しい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第二の側縁と前記第二の付着点の中間の第四の付着点で、前記ＥＣＭ弁構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着されており、前記第一、前記第二、前記第三及び前記第四の付着点が前記第二の共通の平面内に配置されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第四の付着点が、前記第二の付着点から第六の距離、離れており、前記第六の拒理が、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記第二の距離に等しい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）弁導管であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って作製されたＥＣＭ弁導管。
【請求項９】
前記ＥＣＭ弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの組織の各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源が、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、請求項８に記載のＥＣＭ弁導管。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】細胞外マトリックス材料の弁導管及びその作製方法
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，６９３号、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，８７３号、２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，７２３号及び２０１２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，９１１号の出願日の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、細胞外マトリックス材料の弁導管及び弁導管を作製する方法に関する。特に、本発明は、細胞外マトリックス材料のシート又は導管から弁導管を作製する方法、並びにその方法から得られた細胞外マトリックス材料の弁導管に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓外科医は近年、患者の心臓内の弁の再建を達成するために様々な技術を用いる。例えば、凍結保存された同種移植片、ウシ頚静脈移植片、ブタの弁、および自己心膜がすべて、そのような弁の再建手術に使用されてきた。しかしながら、これらの公知の技術はすべて、いくつかの重大な制限を受ける。具体的には、凍結保存された同種移植片は、時間の経過とともに石灰化し、失敗しやすく、高コストと同種移植片の低可用性は、発展途上国における同種移植の有用性を制限する。これらの移植片はまた、患者の抗ヒト抗体による抗原汚染の前に、将来の心臓移植と反応し、著しく拒絶する可能性を高める。頚静脈移植片は、広く利用可能であるが、大きさが狭い範囲内で唯一提供することができるが、頚静脈移植片は、望ましくない石灰化および動脈瘤性拡張化する傾向がある。同様に、ブタの弁は時間の経過とともに石灰化し、弁、特に小児の弁の完全性の著しい減少につながる。自己心膜は使用されているが、短期的な成功にとどまり、自己心膜を用いた手術は、したがって、典型的に複雑で時間がかかり、ほとんどの国で使用することに適ない。自己心膜は時間とともに石灰化し、患者が以前に心臓手術を受けたとき、患者自身の心膜は、交換弁材料として使用することができない。
【０００４】
さらに、弁膜再建手術において使用される公知の弁導管は、典型的に、例えば、移植片や弁部分から形成される。これらの弁導管が使用される前に、弁部分が移植片部分内に適切に固定されなければならない。この制限は、手術全体にかなりの複雑さと時間を課し、得られた弁導管の二部構造はデバイスの故障の原因となり得る。
【０００５】
さらに、基本的なレベルで、既知の弁導管は、天然(native)の弁を再建するためではなく欠陥のある(defective)弁を交換するために、使用されている。したがって、移植後、これらの弁導管は、生理学的および解剖学的に正しい交換弁の形成を達成することができない。
【０００６】
発展途上国では、コストや供給制約が弁再建手術の普及を制限する。したがって、発展途上国において、外科手術の間に容易に使用することができる、入手が容易で、低コストの弁交換材料が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、対象の心臓への移植に際して、天然な弁の弁葉や洞部分と同一又は実質的に同一である弁葉や洞部を含む交換用心臓弁の再建を促進するように構成されている心臓弁導管の必要性がある。経時的に、心臓弁導管の合成材料が検出できないような、天然の動脈内に統合され、一体化する、移植可能な心臓弁導管の必要性がさらにある。容易に入手可能な材料を使用して、迅速かつ効率的に構成でき、又は迅速な移植のため事前に構成された無菌、無細胞、さらに低コストの心臓弁導管の必要性がさらにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
対象の心臓内にある欠陥のある半月弁を交換(置換)するために半月弁を再生するための方法が開示される。開示された一の方法では、欠陥のある半月弁を、対象の心臓から除去する。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料のシートを、折り畳まれた状態(folded position)にし、ここでシートの下縁(bottom edge)が、シートの上縁(top edge)から選択された距離、離れるように、シートの下縁がシートの上縁に向かって折り畳まれる。ＥＣＭ材料のシートを、第一の付着点及び第二の付着点で折り畳まれた状態に固定し、これにより折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物(construct)を作製する。折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物を、整列状態(aligned position)にし、ここで、折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の第一の側縁を折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の第二の側縁と実質的に整列させる。折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物を整列状態にしたままで、第一の側縁を第二の側縁に固定し、これによりＥＣＭ材料の弁導管(valve conduit)を作製する。
【０００９】
ＥＣＭ材料の弁導管は、内腔と、入口を画定し且つ内側層及び外側層を有する入口部分と、出口を画定する出口部分とを有する。入口部分の内側層は内腔内に配置される一方、入口部分の外側層は出口部分と協働して、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁を画定する。ＥＣＭ材料の弁導管は、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分が対象の心臓の環状領域の近傍に位置するように、対象の心臓の環状部分又は出口及び対象の動脈に付着される。ＥＣＭ材料の弁導管の内側層は、弁葉(leaflets)を再生するために弁葉促進部分(leaflet-promoting portions)を有し、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層は、交換(置換)半月弁の洞(sinus)部分を再生するための洞促進構成(sinus-promoting formations)を含む。記載される方法に従って作製され、使用されるＥＣＭ材料の弁導管もまた開示される。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態のそれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する発明の詳細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本明細書に記載の細胞外マトリックス材料の例示シートを示す。
【図２】図２Ａは、本明細書に記載の折り畳たまれた状態の図１のシートの平面図である。図２Ｂは折りたたまれた状態のシートの側面斜視図である。
【図３】図３Ａは、図１〜図２Ｂのシートから作製された細胞外マトリックス材料弁導管の側面斜視図である。図３Ｂは、その細胞外マトリックス材料弁導管の平面図である。
【図４】図４は、図３Ａおよび図３Ｂに図示された細胞外マトリックス材料の弁導管の弁葉促進部分および洞促進部分の略示図である。
【図５】図５は記述する細胞外マトリックス材料の導管の斜視図である。
【図６】図６Ａは、折り返した状態にある、図５の細胞外マトリックス材料の導管の側面斜視図であり、それによって細胞外マトリックス材料弁導管が作製される。図６Ｂはその細胞外マトリックス材料の弁導管の平面図である。
【図７】図７−図１１は、ヒツジの心臓の肺動脈弁を再生するための、細胞外マトリックス材料の弁導管の移植後三か月経過した再生肺動脈弁の写真であって、図７は再生肺動脈弁の右心室流出路の写真である。
【図８】図８は再生肺動脈弁の弁葉の写真である。
【図９】図９は、ヒツジの心臓の右心室から観察された再生肺動脈弁の写真である。
【図１０】図１０は再生肺動脈弁における弁葉形成の進展を示す写真である。
【図１１】図１１は再生肺動脈弁における洞形成の進展を示す写真である。
【図１２】図１２−図１４は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管を示す写真であって、図１２は水和前の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管を示す写真である。
【図１３】図１３は水和前の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管を示す写真である。
【図１４】図１４は水和後の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管を示す写真である。
【図１５】図１５−図２３は、本明細書に記載の概念を利用して実施された患者の調査研究に関連したスケッチおよび写真であって、図１５は患者の調査研究の間に患者に移植した弁導管を示す。
【図１６】図１６は患者の調査研究中に患者に移植した弁導管を示す。
【図１７】図１７は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図１８】図１８は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図１９】図１９は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２０】図２０は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２１】図２１は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２２】図２２は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２３】図２３は患者の調査研究中に患者に移植した弁導管を示す。
【図２４】図２４は、典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の構成の図で、縫い目許容範囲（sewing seam allowance; ｓ）、縫い目カフ（sewing cuff; ｓｃ）、弁葉の高さ（ｈｌ）、弁葉の幅（ｌｗ）およびＥＣＭシート幅（ｗ）を示す。
【図２５】図２５は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の術後に撮影されたドップラー・心エコー図の写真であり、図２５（ａ）は開放しているＥＣＭ材料の弁導管を示し、図２５（ｂ）は閉じているＥＣＭ材料の弁導管を示す。図２５（ｃ）は閉じたときのＥＣＭ材料の弁導管を放射方向に示す。
【図２６ａ】図２６は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の移植後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ａ）は三か月後の再生を示す。
【図２６ｂ】図２６は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の移植後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｂ）は五ヶ月後の再生を示す。
【図２６ｃ】図２６は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の移植後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｃ）は六ヶ月後の再生を示す。
【図２６ｄ】図２６は、本明細書に記載の典型的な細胞外マトリックス材料の弁導管の移植後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｄ）は十二ヶ月後の再生を示す。
【図２７】図２７−２８は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を行った後の小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物について、ＤＮＡ含有量を測定した実験の結果を示す。図２７は滅菌後の各ＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。
【図２８】図２８は、生の、未処理のＳＩＳ組成物と比較した、滅菌後の各ＳＩＳ組成物から除去されたＤＮＡの割合を示す。
【図２９】図２９−３０は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を行った後のＳＩＳ組成物について、天然の増殖因子の含有量を測定した実験の結果を示す。図２９は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３０】図３０は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物の活性ＴＧＦベータ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３１】図３１は、本明細書に記載のように、急速減圧中にｂＦＧＦをＳＩＳ組成物に組み込ませた実験の結果を示す。図３１は急速減圧後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦの含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３２】図３２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を行った後の、二プライ(二層)のＳＩＳ組成物の引張強度を測定した実験の結果を示す。図３２は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物について測定された引張強度を示す。
【図３３】図３３は、本明細書に記載の滅菌及び脱細胞化方法を含む様々な滅菌及び／又は脱細胞化方法を行った後のＳＩＳ組成物について、天然の増殖因子の含有量を測定した実験の結果を示す。図３３は、滅菌及び／又は脱細胞化後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３４】図３４は、様々な方法で処理された後のＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織を超臨界ＣＯ２にさらし、その後ＤＮＡ及び細胞片(cellular debris)のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらした。ＲＤＰ後、組織を滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）とともに超臨界ＣＯ２内に置いた。比較は、滅菌されていない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌された処理ＳＩＳに対して行われた。
【図３５】図３５は、様々な方法で処理された後のＳＩＳからのＤＮＡの除去率を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織を超臨界ＣＯ２にさらし、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらした。ＲＤＰ後、組織を滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）とともに超臨界ＣＯ２内に置いた。比較は、滅菌されていない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）で滅菌された処理ＳＩＳに対して行われた。
【図３６】図３６は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の活性形質転換増殖因子（ＴＧＦベータ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳをトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤(detergent)のみで処理したものである。次に組織を超臨界ＣＯ２にさらし、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらした。ＲＤＰ後、組織を滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）とともに超臨界ＣＯ２内に置いた。比較は、滅菌されていない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌された処理ＳＩＳに対して行われた。
【図３７】図３７は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳをトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤のみを用いて処理したものである。次に組織を、超臨界ＣＯ２にさらし、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらした。ＲＤＰ後、組織を滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）とともに超臨界ＣＯ２内に置いた。比較は、滅菌されていない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌された処理ＳＩＳに対して行われた。
【図３８】図３８は、急速減圧によるＳＩＳへの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量の追加を示す。ベースライン測定は生又は未処理のＳＩＳである。比較は、滅菌されていない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌された処理ＳＩＳに対して行われた。
【図３９】図３９は、人間の心臓を切開した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及びそれらの前後の記載を参照することによって、より速やかに理解されるであろう。しかしながら、本装置、システム及び／又は方法が開示され記載される前に、別に特定されない限り、本発明は開示された特定の装置、システム及び／又は方法に限定されるものではなく、従って当然に、様々であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書の用語は、具体的な態様を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形の「一つの（“a”）」、「一つの（“an”）」及び「その（“the”）」は、文脈が明確に別に指示しない限り、複数形の指示物を含む。従って、例えば、一つの「付着点」の参照は、文脈が別に示さない限り、二つ以上のそのような付着点を含む場合がある。
【００１４】
本明細書において、範囲は「約」一つの具体的な値から、及び／又は「約」もう一つの具体的な値までのように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、もう一つの態様では、一つの具体的な値から、及び／又は他の具体的な値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表現される場合、具体的な値がもう一つの態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各々の範囲の端点が、他の端点に関係して、及び他の端点に独立して意義を有することが理解されよう。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「任意」又は「任意で」は、続いて記載される事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載は、その事象又は状況が起こる事例と起こらない事例とを含む。
【００１６】
本明細書で使用される用語「又は」は、具体的な一覧の任意の一つの要素を意味し、また、その一覧の要素の任意の組み合わせを含む。
【００１７】
別に明確に記載されない限り、本明細書に説明される方法又は態様は、その工程を特定の順序で行うことを要するものと解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法に係る請求項が特許請求の範囲において、または発明の詳細な説明において、工程が特定の順序に限定されるべきであると特に記載しない場合、いかなる点においても、順序を暗示することを全く意図するものではない。このことは、本明細書に記載された、ステップの配列又は動作フローに関するロジックの事柄、文法的構成や句読点から派生する平易な意味、または、態様の数又はタイプを含む、解釈についての任意のあり得る非明示の原則に適用できる。
【００１８】
排他的な用語等を使用することなく、特許請求の範囲の「含む」という用語は、任意の付加的な要素を含むことを許容する。そのことは、所定の数の要素が特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関わらず、また、特徴の追加が特許請求の範囲に説明される要素の本質を変質させると見なされ得るかどうかに関わらない。本明細書において特に定義されるときを除いて、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的な用語は、特許請求の範囲の妥当性を維持しながら、可能な限り広範な一般に理解される意味を与えられるべきである。
【００１９】
本明細書で使用される、「対象」は個体であり、以下に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット又は齧歯類）、魚、鳥、爬虫類又は両生類を含む。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生児の対象、並びに胎児は、男性か女性かに関わらず、網羅されることが意図されている。「患者」は、疾患または疾病に苦しむ対象である。用語「患者」は、ヒトおよび家畜対象を含む。本明細書で使用される、用語「患者」と「対象」は、互換的に使用され得る。
【００２０】
本明細書で使用される、用語「周囲(周辺）(circumference)」は、閉じた平坦な形状により画成される境界の周囲又は周方向の長さを指す。任意であるが、本明細書で使用されているように、「周囲(周辺）」は閉じた平坦な円の周囲に対応することができる。しかし、「周囲(周辺)」は、限定でなく例示的な楕円形、四角形、矩形、台形又は非対称的な閉じた平坦形状といった閉じた平坦形状の周囲に対応することができることも意図する。例えば、本明細書で使用されているように、導管の外側「周囲(周辺）」は、導管の縦軸にそった特定の位置での導管の外側表面により画成される閉じた平坦形状の周囲に対応する。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物(cellular remnants)なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも８０％となるように少なくとも８０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を説明することを意図したものである。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９０％となるように少なくとも９０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９５％となるように少なくとも９５％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９６％となるように少なくとも９６％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらに他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９７％となるように少なくとも９７％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９８％となるように少なくとも９８％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたまたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９９％となるように少なくとも９９％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。このように、本明細書で使われる、用語「無細胞」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％及びそれらの値の間に入る任意の割合のレベルに脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「添加剤」は、本明細書に開示される滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物に所定の特質を与えるために、開示されるＥＣＭ材料に選択的に組み入れられ得る材料を指す。そのような添加剤は、限定でなく例示的に、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞及び例えば、スタチン系薬剤、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物を含む場合がある。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「同時に」は、事象が同時に及び／又は重複して起こることを指すとともに、事象が互いに前後約３０分以内に順次的に起こることを指す。従って、第１の事象が起こり、そして第２の事象が第１の事象と同時に起こった場合、または、第１の事象の前後３０分以内に起こった場合、第２の事象が第１の事象と同時に起こったという言う場合がある。例えば、第１の方法のステップが実施され場合、第１の方法のステップの五分後に実施される第２の方法のステップは、第１の方法ステップと「同時に」行われると言う場合がある。同様に、第２の方法ステップが第３の方法ステップを行う１０分前に行われた場合、第２の方法ステップが第３の方法ステップと「同時に」行われたと言う場合がある。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「超臨界」は、材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているときの材料の流体状態を指す。材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているとき、典型的に気体及び液体の両方の機能特性を有し、超臨界流体として機能すると言われる。従って、例えば、二酸化炭素がその臨界温度（３１．１℃）及びその臨界圧力（１，０７１ｐｓｉ）以上に保持される場合、それは超臨界二酸化炭素流体としてふるまい、例えば、液体の密度を有しながら気体の拡散特性を示し得る。
【００２５】
ここで開示されるのは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料から作製された弁導管である。一実施態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、対象の心臓内の肺動脈弁、大動脈弁のような半月（三葉(tri-leaflet)）弁を再生する。これらの態様で、ＥＣＭ材料の弁導管は、対象の心臓内の欠陥のある半月弁を置き換えるための半月弁を再生することができる。このような欠陥のある半月弁が、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域に付着されることが意図される。本明細書で使用される、用語「環状領域」は、対象の心臓内の心室と対象物の動脈との間にある環の本来の位置の近傍にある対象の心臓の一部を指す。環が対象の心臓内に位置するとき、環状領域は、その環と共にその環の近傍の心筋を含む。環が、対象の心臓から除去されるとき、環状領域は、対象の心臓内の環があった位置の近傍の心筋を含む。
【００２６】
実施態様において、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含む場合がある。開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心膜）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓の弁(heart valves with or without their attached vessels)、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材料の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ウマ、齧歯類等を含む一つ以上の哺乳動物のＥＣＭ構成要素又は材料由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。従って、開示のＥＣＭ材料の弁導管は、限定でなく例示的であるが、二つ以上のウシ、二つ以上のブタ、二つ以上のイヌ又は二つ以上のヒツジ等の二つ以上の同種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材料の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、又はウシとヒツジといった二つ以上の異なる哺乳動物種由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。またさらに、開示のＥＣＭ材料の弁導管は、限定でなく例示的であるが、第１の哺乳動物由来のＳＩＳ等の第１の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料、並びに、限定でなく例示的であるが、第２の哺乳動物由来のＳＳ等の第２の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。
【００２７】
一態様では図３Ａないし図４及び図６Ａないし６Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は、縦軸線４１、１４１を有し、内腔４２、１４２、入口部分４４、１４４及び出口部分５６、１５６を含むことができる。この態様では、内腔４２、１４２は内径を有し得ることが企図される。任意ではあるが、内腔４２、１４２の内径は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の縦軸線４１、１４１に沿って実質的に一定であり得る。例示的な態様において、内腔４２、１４２の内径は、約１５ｍｍから約３０ｍｍの範囲とすることができることが企図される。他の態様では、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は、約２０ｍｍから約４０ｍｍの範囲、好適には約２２ｍｍから約３４ｍｍの範囲の長手方向の長さ（縦軸線４１、１４１に沿って）を有することができることが企図される。
【００２８】
別の態様では、出口部分５６、１５６は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の内腔４２、１４２と連通する出口５８、１５８を画成することができる。他の態様では、入口部分４４、１４４は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の内腔４２、１４２と連通する入口４６、１４６を画成し、ＥＣＭ材料の弁導管の内腔内に位置する内側層４８、１４８と外側層とを含むことができる。この態様では、入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８及び外側層が単一の連続的な構造であって、内側層が、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の内腔４２、１４２内で内側に折り返されている(inwardly reflected)構造であり得ることが企図されている。従って、内側層４８、１４８及び外側層の単一でかつ連続的な構成のために、内側層および外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口４６、１４６の近傍で互いに固定される必要はないことが意図されている。
【００２９】
更に他の態様では、開示されたＥＣＭ材料の導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８は、複数の付着点３４、１３４、例えば二つ又は三つの付着点でＥＣＭ材料の導管の入口部分４４、１４４の外側層に付着され得る。この態様では、複数の付着点３４、１３４は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の外周囲(outer circumference)にそって実質的に等間隔で配置され得ることが企図される。さらに、 複数の付着点３４、１３４は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の縦軸線４１、１４１に実質的に垂直な共通平面内に実質的に配置され得ることが企図される。別の態様では、出口部分５６、１５６の内側層４８、１４８は、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を使用して、複数の付着点３４、１３４で、外側層に付着され得る。この態様において、非吸収性縫合糸を使用して内側層４８、１４８を外側層に固定する場合、各縫合糸の結び目(knots)は、外壁が内側層と結び目の間に位置するように、外壁に接触させて配置され、それによって、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の移植後に、結び目が内腔４２、１４２内に伸長しないことを確実にすることが企図される。例示的な態様において、内側層及び外側層４８、１４８は、十字縫合パターンを使用して互いに固定することができる。さらに別の態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分の外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管の出口部分と協働してＥＣＭ材料の弁導管の外壁５２、１５２を画成することができる。
【００３０】
他の態様において、図３Ｂ及び図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８は弁葉促進部分５０、１５０を含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０を、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分４４、１４４が対象の心臓の環状領域の近傍に配置されるように、対象の心臓の環状領域及び対象の動脈に付着した後、内側層４８、１４８の弁葉促進部分５０、１５０が、交換半月弁の三つの弁葉を再生するように構成することができることが企図される。例示的な態様において、内側層４８、１４８の各弁葉促進部分５０、１５０は長手方向の長さを有することができる。これらの態様において、弁葉促進部分５０、１５０の長手方向の長さは、任意ではあるが、弁導管の壁から伸長する再生された弁葉の伸びた長さで判断すると、交換半月弁の再生された弁葉の長さより長いか又はそれと等しくできることが企図される。例えば、弁葉促進部分５０、１５０の長手方向の長さと再生された弁葉の長さとの比は、１．０：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３．０：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４．０：１、及びこれらの値の間の値となることができることが企図される。他の任意の態様において、弁葉促進部分５０、１５０の長手方向の長さは、交換半月弁の再生された弁葉の長さよりも短くすることができることが企図される。
【００３１】
別の態様では、図３Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の外壁５２、１５２（すなわち、入口部分４４、１４４の外側層）の少なくとも一部が、洞促進部分５４、１５４を含むことができることが企図される。この態様では、環状領域及び動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の付着後、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁５２、１５２の洞促進部分５４、１５４がＥＣＭ材料の弁導管の内側層４８、１４８と融合して、交換半月弁の洞部を再生するように構成され得ることが企図される。
【００３２】
他の態様において、図３Ｂ及び図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８が、さらに交連促進部分(commissure-promoting portions)５１、１５１を含み得ることが企図される。この態様では、環状領域及び動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０付着の後、交連促進部分５１、１５１が外壁５２、１５２（例えば、入口部分４４、１４４の外側層）の少なくとも一部と融合するように構成され得ることが意図される。したがって、内側層４８、１４８及び外壁５２、１５２の連続性が、内側層と外壁とが交換半月弁の再生の促進に際して協働することを可能にするが企図される。
【００３３】
任意であるが、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は多積層構造をもつことができる。例示的な態様において、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は共に積層された２から１０層を含むことができる。例示的な態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、４プライ（４層）の多積層構造とすることができる。このような多積層構造がＥＣＭ材料の弁導管の構造的な完全性を高めることができることが企図される。
【００３４】
ＥＣＭ材料のシートからＥＣＭ材料の弁導管を形成する方法
例示的な態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管はＥＣＭ材料のシートから形成することができる。これらの態様において、ＥＣＭ材料のシートは、限定でなく例示的に、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び/又は基底膜層及び構成要素を含む公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含むことができる。任意に、ＥＣＭ材料のシートは、従来の方法により製造される多積層構造を有することができる。開示されたＥＣＭ材料の弁導管は、限定ではなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心膜）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着した血管をもつ又はもたない心臓の弁、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。一態様において、ＥＣＭ材料のシートは、約２０ｍｍから約１５０ｍｍの範囲の幅を有することができる。さらなる態様において、ＥＣＭ材料のシートは、約０．０２ｍｍから約３ｍｍの範囲の厚さを有することができる。ＥＣＭ材料のシートは、シートの所望の折り畳みと、対象の心臓内での開示されたＥＣＭ材料の弁導管の所望の付着とに適した長さを有することができることが企図される。
【００３５】
一態様では、図１−４に示されているように、ＥＣＭ材料のシート１０から、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０を形成する方法は、ＥＣＭ材料のシートを折り畳まれた状態にすることを含むことができる。この態様において、ＥＣＭ材料１０のシートは、そのシートの上縁１４を含む上端部分１２と、そのシートの下縁１８を含む下端部分１６を有することができることが企図される。さらに、折り畳まれた状態で、ＥＣＭ材料のシート１０の下縁１８が、シートの上縁14から、選択された距離２０だけ離れ、それによって縫合カフ(sewing cuff)が形成され得ることが意図されている。一態様では、折り畳まれた状態では、上縁１４と下縁１８との間の選択された距離２０は、約０ｍｍから約１５０ｍｍの範囲とすることができる。この態様では、選択された距離２０は、対象の動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０の所望の付着を可能にする距離とすることができることが企図される。例示的な態様において、選択された距離２０は、約１０ｍｍとすることができる。
【００３６】
図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、別の態様で、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、ＥＣＭ材料のシート１０を折り畳まれた状態に固定することを含み、これにより折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物を形成できることが企図される。この態様において、折り畳まれたEＥＣＭ材料構成物は、上方部分２２、下方部分２４、第一の側縁２６及び第二の側縁２８を有することができる。一態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４は、第一の層３０及び第二の層３２を含むことができる。この態様では、下方部分２４の第一の層３０は、ＥＣＭ材料のシート１０の折り畳まれた下端部分１６に相当し得る。さらなる態様において、図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第二の層３２に、第一の付着点３４ａ及び第二の付着点３４ｂで付着させることができる。この態様において、第一の付着点３４ａは、選択された距離３６、第二の付着点３４ｂから離し得ることが企図される。第一の付着点３４aと第二の付着点３４bとの間の選択された距離３６は、ＥＣＭ材料のシート１０の幅３７の約１／４から１／２の間とすることができることが企図される。したがって、第一の付着点３４aと第二の付着点３４bとの間の選択された距離３６は、約５ｍｍから約７５ｍｍの間とすることができることが企図される。例示的な態様において、第一の付着点３４aと第二の付着点３４bとの間の選択された距離３６は、ＥＣＭ材料のシート１０の幅３７の約１／３とすることができることが企図される。さらなる態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、限定ではなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて、下方部分の第二の層３２に付着され得ることが企図されている。この態様では、非吸収性縫合糸を使用して第一の層３０を第二の層３２に固定する場合、各縫合糸の結び目は、第二の層が第一の層と結び目との間に位置するように、第二の層と接触して配置し得ることが企図される。例示的な態様において、第一および第二の層３０、３２は、十字縫合パターンを使用して互いに固定することができる。
【００３７】
別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、任意であるが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第二の層３２に、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６と第一の付着点３４ａとの中間の第三の付着点３４ｃのでさらに付着されてよい。この態様では、第三の付着点３４ｃと第一の付着点３４ａとの間の距離３８ａは、第一の付着点と第二の付着点３４ｂとの間の距離３６と実質的に等しくできることが企図される。さらに、第三の付着点３４ｃは、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６から、約１ｍｍから２ｍｍの範囲、より好適には約１．５ｍｍの選択された距離、離され得ることが企図される。
【００３８】
さらに、別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の下方部分２４の第一の層３０は、任意であるが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第二の層３２に、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８と第二の付着点３４ｂとの中間の第四の付着点３４ｄでさらに付着されてよい。この態様では、第四の付着点３４ｄと第二の付着点３４ｂとの間の距離３８ｂは、第一の付着点３４ａと第二の付着点との間の選択された距離３６と実質的に等しくできることが企図される。さらに、第四の付着点３４ｄは、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８から、約１ｍｍから２ｍｍの範囲、より好適には約１．５ｍｍの選択された距離、離され得ることが企図される。
【００３９】
さらなる態様において、図３Ａに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を製作する方法は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を、整列状態(aligned position)にする工程を含む。この態様では、整列した位置では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６が、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８と実質的な整列状態にあり得ることが意図されている。例示的な態様では、この整列状態は、第一及び第二の側縁が互いに実質的に隣接するまで、第一の側縁部２６及び第二の側縁２８を巻いた状態、あるいは互いに向かって前進させた状態に相当し得ることが企図されている。これらの態様において、下方部分24の第二の層３２及び折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２が、協働して、実質的に円筒形のＥＣＭ材料の構成物を画成するように、第一の側縁２６及び第二の側縁２８を互いに向かって前進させ得るものであり、その際、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第一の層は、実質的に円筒状のＥＣＭ材料構成物内に配置され、且つ実質的に円筒状のＥＣＭ材料構成物の外面から延びている。任意であるが、整列状態は、第一及び第二の側縁２６、２８が重なり合う配置にある状態に相当し得ることが企図される。さらに、整列状態は、第一及び第二の側縁がＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２に対してめくり返されている(everted)状態に相当し得ることが企図される。
【００４０】
さらなる態様において、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を整列状態にしたまま、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６を、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８に固定し、これにより内腔４２を含み、縦軸線４１を有するＥＣＭ材料の弁導管４０を作製することができる。この態様において、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６及び第二の側縁２８を、第一の側縁26および第二の側縁28が得られるＥＣＭ材料の弁導管４０の内腔４２に対してめくり返されるように固定することができることが企図される。例示的な態様において、第一および第二の付着点３４a、３４ｂは、ＥＣＭ材料の弁導管４０の縦軸線４１に実質的に垂直な共通の平面内に実質的に位置することができる。これらの態様では、さらに、第三の付着点３４ｃ及び/又は第四の付着点３４ｄ（存在する場合）が、その共通平面内に位置し得ることが企図される。さらなる態様において、第1の側縁２６を、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科的接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて第二の側縁２８に固定し得ることが企図される。例示的な実施態様において、第二の側縁に第一の側縁を固定するために使用される手段は、ＥＣＭ材料の弁導管の長手方向の長さに沿って縫い目(seam)６０を形成し得ることが企図される。この態様において、二つの付着点３４を使用して、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の層３０をＥＣＭ材料構成物の第二の層３２に付着する場合、例示的な構成であるが、縫い目６０は、第一及び第二の付着点から実質的に半径方向に等しい間隔に位置し得る第三の付着点として機能し得ることが企図される。あるいは、三つ又は四つの付着点３４を使用して折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の層３０を折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の層３２に付着する場合、上記のように第一の側縁を第二の側縁に固定した後に、縫い目６０が第三及び/又は第四の付着点の近傍に位置し得るように、第三及び第四の付着点３４ｃ、３４ｄを、第一及び第二の側縁２６、２８の近傍に配置し得ることが企図される。例示的な態様において、図３Ａに示されているように、縫い目６０は、ＥＣＭ材料の弁導管４０の縦軸線４１に沿って間隔を置いて配置された複数の縫合糸６２から形成することができる。他の例示的な態様では、縫い目６０は、限定でなく例示的に、連続６−０ポリプロピレン縫合糸のような連続縫合糸を含むことができる。
【００４１】
一態様において、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４は、ＥＣＭ材料の弁導管４０の入口部分４４に相当することができる。この態様では、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の入口部分４４は、ＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２と流体連通する入口４６を画定することができる。別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の内腔４２内に位置した内側層４８に相当することができる。さらに別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第二の層３２は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２と協働して、ＥＣＭ材料の弁導管４０の外壁５２を画定することができる。さらに別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の出口部分５６に相当することができる。この態様では、ＥＣＭ材料弁導管40の出口部分５６はＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２と流体連通する出口５８を画定することができる。
【００４２】
ＥＣＭ材料導管からＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法
例示的な態様において、図５ないし図６Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料弁導管１４０はＥＣＭ材料導管１００から作製することができる。これらの態様において、 ＥＣＭ材料導管１００は、限定ではなく例示的に、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含むことができる。任意であるが、 ＥＣＭ材料の導管１００は、従来の方法により製造される多層積層構造を有することができる。開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０は、限定ではなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心膜）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着した血管をもつ場合又はもたない心臓の弁、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織源から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。一態様において、ＥＣＭ材料の弁導管１４０を作成するために使用されるＥＣＭ材料の導管１００は、限定ではなく例示的に、哺乳動物の小腸の無傷な内腔部分のような哺乳動物組織源の無傷な内腔部分を切除することによって得ることができる。この態様では、哺乳動物組織源の無傷な部分の選択された層が切除後に除去され得ることが企図される。
【００４３】
さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０は、公知のインビトロ法を使用して産生されるＥＣＭから作製され得ることが企図される。例えば、開示されたＥＣＭ材料の導管１００は、公知のインビトロ法を使用して円筒形の心棒(cylindrical mandrel)の外側表面上で細胞を成長させることによって形成することができる。心棒の外表面上の細胞の成長によって、1つ以上のＥＣＭ材料の製造がもたらされ得ることが企図される。
【００４４】
一態様では、および図５ないし図６Ｂに示されているように、ＥＣＭ材料の導管１００から開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０を作製する方法は、ＥＣＭ材料の導管１００を折り返した状態(reflected position)にすることを含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の導管１００が、内腔１０２を画定し、上端部分１０４及び下端部分１０８を有し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管１００の上端部分１０４がＥＣＭ材料の導管の頂端(top end)１０６を含み、ＥＣＭ材料の導管の下端部分１０８がＥＣＭ材料の導管の底端(bottom end)１１０を含み得ることが企図される。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１００を折り返した状態にする工程は、ＥＣＭ材料の導管の底端１１０を、ＥＣＭ材料の導管の内腔１０２内で、ＥＣＭ材料の導管の頂端１０６に向けて内側に折り返す工程を含み得ることが企図される。さらに、折り返した状態で、ＥＣＭ材料の導管100の底端１１０は、ＥＣＭ材料の導管の頂端１０６から選択された距離１１２だけ離され得ることが企図される。一態様では、折り畳まれた状態で、底端１１０と頂端１０６との間の選択された距離１１２は、約０ｍｍから約１５０ｍｍの範囲とし得ることが企図される。この態様では、選択された距離１１２は、対象の動脈へのＥＣＭ材料の弁導管１４０の所望の付着を可能にする距離とし得ることが企図される。
【００４５】
別の態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、ＥＣＭ材料の導管１００を折り返した状態に固定する工程を含み、これによりＥＣＭ材料の弁導管１４０が作製される。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１４０は、内腔１４２、入口部分１４４及び出口部分１５６を含み、縦軸線１４１及び外周囲を有することができる。一態様において、出口部分１５６は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０の内腔１４２と連通する出口１５８を画定することができる。さらなる態様において、入口部分１４４は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０の内腔１４２と連通する入口１４６を画定することができ、外側層と、ＥＣＭ材料の弁導管の内腔内に位置する内側層１４８を含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の入口部分１４４の内側層１４８は、ＥＣＭ材料の導管１００の折り返された底端１１０に相当し得ることが企図される。さらなる態様では、内側層1１４８は、三つの付着点１３４において外側層に付着することができる。この態様では、 三つの付着点１３４は、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の外周囲にそって、実質的に等しい間隔で配置され得ることが企図される。例えば、三つの付着点１３４は、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の外周囲に沿って、隣接する付着点から約５ｍｍから約７５ｍｍの範囲の距離、離されて配置され得ることが企図される。さらに、三つの付着点１３４は、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の縦軸線１４１に実質的に垂直な共通平面内に実質的に位置し得ることが企図される。さらに別の態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１００の入口部分１４４の外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管の出口部分１５６と協働して、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁１５２を画定することができる。
【００４６】
さらなる態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、公知の方法を用いてＥＣＭ材料の弁導管を凍結乾燥することを含むことができる。さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管が凍結乾燥された場合、ＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、さらに、公知の方法を用いてＥＣＭ材料の弁導管を水和させることを含むことができる。この態様では、凍結乾燥されたＥＣＭ材料の弁導管は、約５分ないし約３０分の範囲の期間、滅菌水、生理食塩水又は平衡塩類溶液中で水和され得ることが意図される。
【００４７】
例示的な態様において、本明細書に記載されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は、公知の方法を使用して又は本明細書の開示のとおりに、滅菌され及び/又は脱細胞化され得ることが企図される。これらの態様において、このような滅菌及び/又は脱細胞化工程は、対象内へのＥＣＭ材料の弁導管の移植前における、ＥＣＭ材料の弁導管を構成するどの段階でも行うことができる。一態様において、本明細書に記載のＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０はエチレンオキサイドガスを用いて滅菌し得ることが企図される。
【００４８】
一態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管は、無菌で無細胞のＥＣＭ組成物を含むことができる。例示的な態様において、このような無菌で、無細胞のＥＣＭ組成物は、単離されたＥＣＭ材料を同時に滅菌し及び脱細胞化することにより作製することができる。特に、以下の方法で開示されているように、単離されたＥＣＭ材料の所望の滅菌及び脱細胞化は、組織組成物の天然の特性が維持され、ＥＣＭ材料が無菌及び無細胞になされるように、同時に行われ得る。
【００４９】
ＥＣＭ弁導管で使用するためのＥＣＭ組成物の滅菌／脱細胞化
本明細書に記載されているように、開示された方法は、単離されたＥＣＭ材料の急速減圧を利用して、ＥＣＭ材料を無細胞にする。このＥＣＭ材料の急速減圧は、以前から公知の方法で適用される減圧速度よりも非常に高速の減圧速度で行われる。本明細書に記載されるように、ＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料への所望の滅菌剤および添加剤の組み込みを高めるために使用することができる。さらには、ＥＣＭ材料の急速減圧が、以前から公知の脱細胞化方法と比較して、天然の増殖因子の保持を向上させつつ、 ＥＣＭ材料を無細胞にし得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧が、以前から公知の脱細胞化法と比較して、 ＥＣＭ材料の引張強度の保持を改善するために使用され得ることが意図される。
【００５０】
開示された方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及びバイオプトリック特性(bioptric properties)をそれほど弱めないばかりでなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化する際、さらにＥＣＭ組成物への種々の添加剤の取り込みを高める際に、より効果的となる。したがって、開示された滅菌脱細胞化の方法は、より脱細胞化されたＥＣＭ組成物を提供し、当技術分野で知られたＥＣＭ組成物よりも多くの添加剤を組み込ませ、次いで送達するより優れた能力を有する。さらに、開示された滅菌及び脱細胞化方法は、保持された天然の増殖因子の量及び/又は濃度がより高いＥＣＭ組成物、そして当技術分野で公知の滅菌され、脱細胞化されたＥＣＭ組成物よりも強い引張強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【００５１】
任意に、開示のＥＣＭ材料の弁導管のＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、NovaSterilis社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（該特許は参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたシステム等の公知の滅菌システムを使用して滅菌することができることが企図される。従って、いくつかの態様では、開示の方法を実施するために使用されるシステムは、ブースター（例えば、ハスケルブースターＡＧＴ７／３０）と連動して使用される標準のエアコンプレッサ及び標準の圧縮保存シリンダを含む場合がある。他の態様では、エアコンプレッサ及びブースターは、単一のコンプレッサに置き替えることができる。実施態様において、圧縮保存シリンダは、二酸化炭素を受け入れるように構成され得、ブースターは、二酸化炭素ブースターであり得る。
【００５２】
システムはさらに入口ポートを含む場合があり、それによってリザーバに収容された一つ以上の添加剤を弁及び添加剤ラインを通じて反応容器に加えることができる。本明細書で使用される、用語「反応容器」は、本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料を受け入れ、ＥＣＭ材料を一つ以上の滅菌剤及び添加剤に曝露することができるように構成された内部空間を有する任意の容器を指す。実施態様において、反応容器は、限定されないが、バスケット、バケツ、たる、箱、パウチ及びその他の公知の容器とすることができる。一つの態様では、反応容器は、ＥＣＭ材料が充填されるシリンジであり得ることが企図される。
【００５３】
限定でなく例示的に、二酸化炭素等の選択された一次滅菌剤が、弁及び供給ラインを介してヘッダーラインから反応容器に導入され得ることが企図される。さらに、限定でなく例示的に、０．５μｍフィルタ等のフィルタが、容器から材料が漏れるのを防ぐために、供給ラインに設けられ得ることが企図される。実施態様では、圧力計が、圧力を視覚的に監視することができるように、ヘッダーラインの遮断弁の下流に設けられる場合がある。逆止弁が、ブースター内への逆方向の流体流れを防ぐために、弁の上流のヘッダーラインに設けられる場合がある。ヘッダーラインに存在する過圧状態を防止するために、圧力逃がし弁が任意で設けられ得る。
【００５４】
一つの態様では、反応容器の減圧は、出口ライン及び反応容器と連通する弁を用いて達成され得る。この態様において、減圧された流体は、供給ラインを介して容器から出て、フィルタユニットにより濾過され、その後セパレータに案内され、二酸化炭素等の濾過された流体が排出ラインを介して排出され得ることが企図される。さらに、上流の構成要素の流体を単離できるように、弁が装置の様々なラインに組み込まれ得ることが企図される。
【００５５】
一つの実施態様において、反応容器は、限定でなく例示的に、３１６ゲージステンレス鋼等のステンレス鋼を含む場合がある。もう一つの実施態様において、反応容器は、実験室規模又は工業規模のいずれかで、滅菌される材料を収容するのに十分な全内部体積を有する場合がある。例えば、反応容器は、約８インチの長さ、約２．５インチの内径及び約６００ｍＬの内部体積を有する場合があることが企図される。更に他の態様において、反応容器は、振動器、温度制御ユニット、インペラと磁気駆動部とを含む機械的攪拌システムを含む場合がある。一つの任意の態様では、反応容器は、３１６ゲージのステンレス鋼を含むバスケットを収容し得ることが企図される。この態様では、バスケットは滅菌される材料を保持し、さらにインペラを保護し、所定の方法で一次滅菌剤を案内するように構成される場合があることが企図される。
【００５６】
反応容器は、飛沫や乱流による材料の損失なしに、また、逆拡散を介して圧力ラインを汚染することなしに、一定圧力又は継続的な加圧及び減圧（圧力サイクル）条件下で動作させ得ることが企図される。さらに、システム内の弁は、反応容器をシステムの他の構成要素から容易に分離及び除去することを可能にし得る場合があることが企図される。一つの態様では、反応容器の内部空間へアクセスできるようにするために、減圧時に反応容器の頂部を除去することができる。
【００５７】
任意に、システムは、ユーザが反応容器内の温度を調整可能に制御できるようにする温度制御ユニットを含む場合がある。
【００５８】
使用時には、開示された装置を本明細書に開示されるように、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製する方法に採用する場合がある。しかしながら、開示の装置は単に例示であって、開示の方法のステップを実行することが可能な任意の装置が、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが理解される。従って特許請求の範囲に係る方法は、特定の装置に限定されるものでは全くない。
【００５９】
コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の有意な低減が、開示の方法に従い、一次滅菌剤を使用し滅菌温度及び圧力条件に単離されたＥＣＭ材料をさらすことにより、達成され得ることが企図される。任意に、一次滅菌剤は、所望の滅菌を達成するために、1つ以上の二次滅菌剤と組み合わせることができることが企図される。任意に、さらに、選択された添加剤が、得られるＥＣＭ組成物に所望の特性を与えるためにＥＣＭ材料に組み込まれ得ることが企図される。またさらに、開示の方法は、対象の体内に移植するための滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが企図される。
【００６０】
本明細書に記載のように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を無細胞にするために、単離されたＥＣＭ材料の急速な減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速な減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度よりも有意に高い減圧速度で行われる。本明細書に記載のようにＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料への所望の滅菌剤及び添加剤の組み込みを高めるために使用することができる。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、天然の増殖因子の保持率を向上させながら、ＥＣＭ材料を無細胞にすることができることが企図される。またさらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、ＥＣＭ材料の引張強度の保持を向上させるために使用することができることが企図される。
【００６１】
開示の方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及びバイオプトリック特性（bioptric properties）を著しく弱めることがないだけではなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化し、並びに、ＥＣＭ組成物への様々な添加剤の組み込みを高めることに、より有効である。従って、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べて、より脱細胞化された、並びに、より多くの添加剤を組み込み、その後送達するより高い性能を有するＥＣＭ組成物を提供する。さらに、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知である滅菌され脱細胞化されたＥＣＭ組成物に比べて、保持された天然の増殖因子の量及び/又は濃度が高く、引張り強度が高いＥＣＭ組成物を提供する。
【００６２】
実施態様において、一次滅菌剤は、その臨界圧力及び臨界温度条件にある、または、それに近い条件にある二酸化炭素とすることができる。しかしながら、例えば、ＥＣＭ材料の天然の特性を妨げない気体、液体又は粉末の滅菌剤を含む任意の従来の滅菌剤が一次滅菌剤として使用され得ることが企図される。
【００６３】
一つの実施態様において、開示される滅菌プロセスは、一次滅菌剤として二酸化炭素を用いて、約１，０００〜約３，５００ｐｓｉの範囲にある圧力及び約２５℃〜約６０℃の範囲にある温度で実施され得る。より好適に、超臨界二酸化炭素が使用される場合、滅菌プロセスは、１，０７１ｐｓｉ以上の圧力及び３１．１℃以上の温度で、一次滅菌剤として二酸化炭素を使用し得ることが企図される。この態様では、滅菌されるＥＣＭ材料は、そのような圧力および温度条件又はそれに近い条件にある二酸化炭素に、約１０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは、約１５分ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは、約２０分ないし約１２時間にかけてさらされる場合がある。好適に、開示のシステム及び方法に用いられる二酸化炭素は純粋であるか、あるいは、二酸化炭素の滅菌特性を損なわない他のガスをごく微量含むものであり得る。以下のさらなる検討を簡単にするために、用語「超臨界二酸化炭素」が使用されるが、そのような用語は、前述のような圧力及び温度範囲内にある二酸化炭素が開示の方法の実施に十分に採用され得るという点で、限定されないことが理解されよう。開示された圧力及び温度範囲内で、二酸化炭素は気体、液体、流体又はプラズマ形態でＥＣＭ材料に与えられ得ることが企図される。
【００６４】
いくつかの態様で、開示の方法で用いる二次滅菌剤は、限定でなく例示的に、過酸化物及び／又はカルボン酸等の化学滅菌剤を含み得る。好ましいカルボン酸は、アルカンカルボン酸及び／又はアルカン過カルボン酸を含み、それらは各々任意に、α位の炭素のところで、ハロゲン、酸素、窒素基等の1つ以上の電子求引性置換基で置換され得る。開示の方法の実施に使用される化学滅菌剤の典型的な種類は、限定でなく例示的に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酢酸（ＡｃＡ）、過酢酸（ＰＡＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びそれらの混合物を含む。一つの実施態様において、化学滅菌剤は、酢酸、過酸化水素及び過酢酸を含む混合物であるSporeclenz（商標）滅菌剤を含み得る。
【００６５】
二次滅菌剤は、一次滅菌剤の全体積を基準に、滅菌向上に有効な少なくとも約０．００１ｖｏｌ％以上の量で用いることができることが企図される。さらに、二次滅菌剤の量は、用いられる特定の二次滅菌剤に依存する場合があることが企図される。従って、例えば、過酢酸は約０．００５ｖｏｌ％以上の比較的少量であり、一方で酢酸は、約１．０ｖｏｌ％以上の量で用いられる場合があることが企図される。従って、二次滅菌剤の濃度は、約０．００１ｖｏｌ％ないし約２．０ｖｏｌ％の範囲にあり、典型的に、限定でなく例示的な超臨界二酸化炭素等の開示された一次滅菌剤と組み合わせて、滅菌向上作用を達成するために、本明細書に開示のように使用され得ることが企図される。
【００６６】
一つの態様では、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物の製造方法は、哺乳動物由来の選択された組織を採取する工程と、選択された組織を無菌生理食塩水又は当業者には知られている他の生体適合性の液体（限定でなく例示的に、リンガー液又は生体平衡塩類溶液）中ですすぐ工程を含む場合がある。この態様において、選択された組織は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心膜、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織であり得る。もう一つの態様において、本方法は、選択された組織を約１２〜約３６時間、より好ましくは、約１８〜約３０時間、最も好ましくは、約２２〜約２６時間の範囲にある期間、凍結する工程を含む場合がある。例えば、選択された組織が凍結される期間は、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間及び前述の値の間に入る時間の任意の他の期間であり得ることが企図される。追加の態様において、本方法は、冷低張トリス緩衝液中で選択された組織を解凍する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、本方法は、選択された組織を、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、氷上の冷低張トリス緩衝液中で解凍する工程を含む場合がある。実施態様では、選択された組織を凍結及び解凍する工程は、６回まで周期的に繰り返すことができることが企図される。
【００６７】
もう一つの態様において、本方法は、選択された組織由来のＥＣＭ材料を単離する工程を含む場合がある。この態様において、ＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心膜、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織等の公知の細胞外マトリックス構成要素を含む任意の材料とすることができる。一つの実施例の限定しない態様において、ＥＣＭ材料を単離する工程は、哺乳動物組織源からＳＩＳを単離する工程を含む場合がある。この態様では、本方法は、小腸の壁を該小腸の長手方向の軸に実質的に平行な経路に沿って切開する工程と、小腸を切開の経路に沿って小腸が表面上で平らなるように開く工程と、滅菌生理食塩水又は他の生体適合性の流体で小腸をすすぐ工程と、小腸のＳＩＳを周囲の平滑筋層及び漿膜層、並びに粘膜から、粘膜下層及び基底膜層を原則として残しながら機械的にはぎ取る工程とを含み得る。しかしながら、ＥＣＭ材料は、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号、米国特許第５，２８１，４２２号、米国特許第５，５５４，３８９号、米国特許第６，５７９，５３８号、米国特許第６，９３３，３２６号、米国特許第７，０３３，６１１号、Voytik-Harbin等 の“Identification of Extractable Growth Factors from Small Intestinal Submucosa” J. Cell. Biochem.  Vol. 67 pp. 478-491 (1997)、Hodde等の“Virus Safety of a Porcine-Derived Medical Device: Evaluation of a Viral Inactivation Method” Biotech. & Bioeng. Vol. 79 No. 2 pp. 21 1-216 (2001)、Badylak他 “The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction” Cell & Developmental Biology Vol. 13 pp. 377-383 (2002)、Robinson他 “Extracelular Matrix Scaffold for Cardiac Repair” Circulation Vol. 112 pp. I-135-I-143 (2005)、Hodde他 “Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part I. Composition and Matrix Architecture” J. Mater. Sci.: Mater. Med. Vol. 18 pp. 537-543 (2007)、並びに、Hodde他“Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part II. Bioactivity and Matrix Interaction” J. Mater. Sci. Mater. Med. Vol. 18 pp. 545-550 (2007)（各々が参照文献としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたものを含む任意の従来技術を使用して単離され得ることが企図される。
【００６８】
さらなる態様において、本方法は、単離されたＥＣＭ材料を、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Lonza Walkerville社）中で２４〜４８時間インキュベートする工程を含む場合がある。この態様では、胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦なＥＣＭ材料又はシート状のＥＣＭ材料は、延伸された形態でインキュベートされ得ることが企図される。さらに、無傷の尿管、動脈、静脈及び小腸などのＥＣＭ材料導管又はその他の管腔ＥＣＭ材料又は作製されたＥＣＭ導管は、浸漬を通じて、並びに蠕動ポンプを使用することにより、様々な開示された溶液で灌流され得る。
【００６９】
さらなる態様では、インキュベーション後に、本方法は、ＥＣＭ材料をＤＰＢＳですすぐ工程を含む場合がある。この態様で、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、１回、２回、３回、４回、５回又は６回を含む６回までＥＣＭ材料をすすぐこと（各々のすすぎは約３０分間持続する）を含み得ることが企図される。一つの実施態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎは約３０分持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００７０】
任意で、実施態様において、本方法はさらに、第２のインキュベーション手順を含む場合がある。これらの態様において、第２のインキュベーション手順は、ＥＣＭ材料を、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを５ｍＭのＥＤＴＡとともに含有する等張トリス緩衝液内でインキュベートする工程を含み得る。等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、人体の温度に実質的に対応する約３７℃の温度で行われ得ることが企図される。さらに、等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、約３０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは約1時間ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは約２時間ないし約１２時間にかけての期間、行われ得ることが企図される。さらなる態様において、第２のインキュベーション手順は、さらに、ＤＰＢＳでＥＣＭ材料をすすぐ工程を含む場合がある。この態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎが約３０分間持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００７１】
またもう一つの態様では、第２のインキュベーション手順が行われるか否かに関わらず、本方法はＥＣＭ材料を、約１℃〜約１０℃、より好適に約２℃〜約６℃、最も好適に約３℃〜約５℃の範囲にある温度で保存する工程を含む場合がある。実施態様において、ＥＣＭ材料は４℃で保存される場合がある。
【００７２】
さらなる態様において、本方法は、ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に導入する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤が、ＥＣＭ材料とともに反応容器の内部空間に加えられ得る。これらの態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤は、ＥＣＭ材料の導入の前、ＥＣＭ材料の導入の後、またはＥＣＭ材料の導入と同時に反応容器の内部空間に加えられ得る。さらに、温度制御ユニットが、反応容器の内部空間内に所望の温度を作り出すように選択的に調整され得ることが企図される。さらなる態様において、本方法は、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力を平衡にする工程を含む場合がある。例えば、この態様では、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力が大気圧と実質的に等しい場合があることが企図される。さらに別の態様では、装置内の圧力を平衡にした後に、本方法は、反応容器のインペラを作動させるために磁気駆動部を動作させる工程を含む場合がある。またさらなる態様では、本方法は、反応容器内が所望の圧力に達するまで、反応容器に保存シリンダから一次滅菌剤を選択的に導入する工程を含む場合がある。この態様では、反応容器に一次滅菌剤を選択的に導入する工程は、反応容器への一次滅菌剤の流れ込みを増大させるために、エアコンプレッサとブースターとを選択的に作動させることを含み得ることが企図される。実施態様において、エアコンプレッサ及びブースターは、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素を作製するのに必要な圧力及び温度等の超臨界圧力及び温度を、約２０分から約６０分の範囲にある時間間隔の間、ＥＣＭ材料に施すように作動させる場合がある。
【００７３】
さらに、他の態様において、本発明は、反応容器を急速に減圧させる工程を含む場合がある。この態様では、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素のような、所定の量の一次滅菌剤が、減圧ラインを通して反応容器から放出され得る。一次滅菌剤が反応容器に連結された弁の開放により反応容器から放出され、それによって反応容器内の圧力を減少させ得ることが企図される。本明細書で使用される、用語「急速減圧」は、４００ｐｓｉ／分以上の速度での反応容器の減圧を指す。例えば、反応容器は、約２．９ＭＰａ／分ないし約１８．０ＭＰａ／分（約４００ｐｓｉ／分ないし約２，６００ｐｓｉ／分）、より好適に、約５．０ＭＰａ／分ないし約１０．０ＭＰａ／分（約７００ｐｓｉ／分ないし約１，５００ｐｓｉ／分）、最も好適に、約７．０ＭＰａ／分ないし約８．０ＭＰａ／分（約１，０００ｐｓｉ／分ないし約１，２００ｐｓｉ／分）の範囲にある減圧速度で急速に減圧され得ることが企図される。従って、これらの急速な減圧は、米国特許第７，１０８，８３２号に開示された３００ｐｓｉ／分の減圧速度よりも著しく大きい。いかなる特定の理論に拘束されることなく、開示の急速な減圧速度は、ＥＣＭ材料で達成される脱細胞化のレベルを増加させると考えられる。例えば、開示のＥＣＭ材料の急速な減圧は、結果として約９６％を超える（９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００．０％等）ＥＣＭ材料の脱細胞化のレベルをもたらす場合がある。
【００７４】
実施態様において、本方法はさらに、ＥＣＭ材料に1つ以上の添加剤を組み込む工程を含む場合がある。これらの態様では、1つ以上の添加剤は、粉末又は液体の形態のいずれかで提供され得ることが企図される。一つの任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の間に、反応容器に1つ以上の添加剤を導入することを含む場合がある。この態様では、1つ以上の添加剤の導入は、従来の発泡プロセスとして特徴づけられる場合があることが企図される。別の任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程後、反応容器内に１つ以上の添加剤を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加剤は、反応容器の急速な減圧がＥＣＭ材料を膨張させ(swell)及び／又は発泡させた(expand)後にＥＣＭ材料に添加され、それによってＥＣＭ材料への添加剤の浸透を向上させることができることが企図される。さらに、実施態様において、１つ以上の添加剤は、反応容器の急速減圧の後、約３０分以内にＥＣＭ材料に添加され得ることが企図される。さらなる任意の態様において、１つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速減圧する工程の間にもその工程の後にも、反応容器中に１つ以上の添加剤を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加剤が迅速な方法及びゆっくりとした長時間にわたる方法の両方で反応容器内に放出され得ることが企図される。またさらなる任意の態様において、１つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の前に、反応容器中に１つ以上の添加剤を導入することを含む場合がある。
【００７５】
開示の添加剤は、結果として生成される滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物に選択された特性を付与するために、ＥＣＭ材料に組み込まれ得る。このように、１つ以上の添加剤は、本明細書に記載のように、ＥＣＭ材料の処理中に失われるＥＣＭ材料の構成要素を置換又は補完するように選択され得ることが企図される。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の添加剤は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物又は細胞を含む場合がある。さらに、１つ以上の添加剤が、ＥＣＭ材料に非天然の構成要素を組み込むように選択され得ることが企図される。例えば、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、幹細胞、血管新生サイトカイン及び抗炎症性サイトカインを動員するための増殖因子を含む場合がある。またさらに、１つ以上の添加剤は、スタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤等の薬剤であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、イリジウムナノ粒子、ロジウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、亜鉛ナノ粒子及びその他金属ナノ粒子等のナノ粒子であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加剤は、金属化合物であり得ることが企図される。１つの実施態様において、１つ以上の添加剤は、得られるＥＣＭ組成物を対象の体内に移植した後に、対象の免疫反応を薬学的に抑制するように選択することができる。
【００７６】
一つの態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、形質転換増殖因子ベータ−１、−２、−３（ＴＧＦ−β−１、−２、−３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られる）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む１つ以上の増殖因子を含む場合がある。
【００７７】
他の態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、幹細胞因子、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンフィレグリン、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、トロンボスポンジン３、トロンボスポンジン４、トロンボスポンジン５及びアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含む１つ以上のサイトカインを含む場合がある。
【００７８】
追加の態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ベータグリカン、シンデカン、デコリン、アグリカン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、ベルシカン、ニューロカン及びブレビカンを含む１つ以上のプロテオグリカンを含む場合がある。
【００７９】
さらなる態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）及びコンドロイチン硫酸Ａを含む1つ以上のグリコサミノグリカンを含む場合がある。
【００８０】
またさらなる態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、ベルシカン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、プラスミノーゲン、小ロイシンリッチタンパク質、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カドヘリン、免疫グロブリン、マルチプレキシン、細胞質領域―４４（ＣＤ−４４）、アミロイド前駆体タンパク質、テネシン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンI、フィビュリンII、インテグリン、膜通型分子及びオステオポンチンを含む１つ以上のタンパク質、ペプチド又は核酸を含む場合がある。
【００８１】
さらに別の態様において、１つ以上の添加剤は、限定でなく例示的に、セリバスタチン（cerevastatin）、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤、抗菌剤、抗生物質等のスタチン系薬剤を含む１つ以上の薬剤を含む場合がある。
【００８２】
実施態様において、反応容器中に１つ以上の添加剤を導入する工程は、１つ以上添加剤が、リザーバから入口ポートに流れることができるようにバルブを開けることを含む場合がある。加圧の前に、１つ以上の添加剤は、シールに先だって反応容器内に直接導入、及び／又は入口ポートを介して導入され得ることが企図される。
【００８３】
開示される反応容器の急速減圧及び再加圧は、１つ以上の添加剤の添加のあるなしに関わらず、任意の所望の数のサイクルで繰り返され得ることが企図される。さらに、減圧と再加圧のサイクル、ならびに一次滅菌剤及び／又は二次殺菌剤及び／又は添加剤の導入は、所望の圧力条件及びサイクルを達成するためにシステムの様々な弁を選択的に開く及び／又は閉じるように構成された制御器を介して自動的に制御され得ることが企図される。
【００８４】
いくつかの態様では、開示される方法は、さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程を含む場合がある。これらの態様では、反応容器の内容物を攪拌する工程は、振動器を用いて反応容器の内容物を周期的に攪拌することを含み得ることが企図される。さらに、反応容器の攪拌は、断続的、継続的又は連続的であり得ることが企図される。実施態様において、反応容器の内容物を攪拌する工程は、一次滅菌剤を反応容器内に導入する工程中に行われる場合がある。反応容器の内容物の撹拌は、反応容器内の流体中の空隙を排除してＥＣＭ材料と滅菌剤及び／又は添加剤とをより完全に接触させることにより、滅菌剤及び／又は添加剤の物質移動を向上させ得ることが企図される。さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程は、滅菌時間、温度、加圧／減圧サイクルを最適化するように攪拌の強度および持続時間を選択的に調整することを含み得ることが企図される。
【００８５】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の滅菌及び脱細胞化が完了した後、本方法はさらに、反応容器を減圧する工程及び攪拌翼（インペラ）の動作を停止するように磁気駆動部の動作を停止させる工程を含む場合がある。最後に本方法は、結果として得られる、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を反応容器の上部を通じて取り出すステップを含む場合がある。
【００８６】
ＥＣＭ材料の弁導管を使用した心臓弁の再生方法
また、心臓弁を再生する方法が本明細書に開示される。例示的な態様において、対象の心臓内の欠陥のある半月弁を交換するために半月弁を再生する方法が開示される。この態様において、図２４に示されているように、欠陥のある半月弁を、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域の環部に付着させることが企図される。本明細書で使用される、用語「半月弁」は、対象の心臓内の肺動脈弁又は大動脈弁のいずれかを指し得る。欠陥のある半月弁が肺動脈弁である場合に、欠陥のある半月弁は、対象の心臓の右心室と対象の肺動脈との間の環状領域の環部に付着されていることが企図される。さらに、欠陥のある半月弁が大動脈弁である場合に、欠陥のある半月弁は、対象の心臓の左心室と対象の大動脈との間の環状領域の環部に付着されていることが企図される。
【００８７】
一態様において、半月弁を再生する開示された方法は、対象の心臓から欠陥のある半月弁を除去し、環状領域を露出させることを含むことができる。この態様において、欠陥のある半月弁を除去する工程が、任意に、大動脈又は肺動脈のような、欠陥のある半月弁に結合された動脈の一部分を除去することを含み得ることが企図される。さらに、欠陥のある半月弁を除去する工程が、任意に、環状領域の環部を除去することを含み得ることが企図される。
【００８８】
欠陥のある半月弁を除去する工程がさらに心肺バイパス上に対象を配置することを含み得ることが企図される。さらに、欠陥のある半月弁を除去する工程が、さらに対象の心臓を停止させ及び／又はまたはフィブリル化し、対象の心臓切開を通じて欠陥のある弁を露出させることを含み得ることが企図される。代替的に、公知の方法を用いて経皮的に欠陥のある弁にアクセスすることができる。
【００８９】
さらなる態様において、半月弁を再生する開示の方法は、本明細書に開示されるもののようなＥＣＭ材料の弁導管を移植することを含み得る。この態様において、明細書にさらに開示されているように、ＥＣＭ材料の弁導管は、内腔を画定し、入口部分と出口部分を有することができる。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の弁導管を移植する工程は、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分を環状領域に固定し、入口部分が環状領域に近接して配置されるように、ＥＣＭ材料の弁導管の出口部分を対象の動脈に固定することを含み得る。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて環状領域及び／又は動脈に固定され得ることが企図される。任意選択的に、一態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、動脈に固定される前に、環状領域に固定することができる。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環部に固定された後、ＥＣＭ材料の弁導管の長さが、動脈へのＥＣＭ材料の弁導管の適切な付着を行うために十分な組織を保持しながら、余分な長さを除去するために、必要に応じてトリミングされ得ることが企図される。代替的に、ＥＣＭ材料の弁導管は、環状領域に固定される前に、動脈に固定され得る。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が適切に動脈に固定された後、ＥＣＭ材料の弁導管の長さが、環状領域へのＥＣＭ材料の弁導管の適切な付着を行うために十分な組織を保持しながら、余分な長さを除去するために、必要に応じてトリミングされ得ることが企図される。
【００９０】
例示的な態様において、一つ以上の綿撒糸が、環状領域及び／又は動脈へのＥＣＭ材料の弁導管の付着部分に近接した位置において、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁に加えられ得ることが企図される。これらの態様において、綿撒糸は、ＥＣＭ材料の弁導管と環状領域及び／又は動脈との間の縫合糸との直接接触からＥＣＭ材料の弁導管を遮蔽するように配置構成され、このことによりＥＣＭ材料の弁による縫合糸の切断のリスクが最小限に抑えられ、ＥＣＭ材料の弁導管の追加的な構造的完全性が提供され得ることが企図される。限定ではなく例示的に、Teflon（登録商標）製綿撒糸のような従来の綿撒糸がこれらの目的のために用いられ得ることが企図される。例示的な態様において、一つ以上の綿撒糸が少なくとも一つのＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。1つまたは複数の綿撒糸が、任意の適切な形状及び寸法を有し得ることが企図される。しかしながら、例示的な態様において、綿撒糸が、約２ｍｍから約４ｍｍの範囲の長さ、約２ｍｍから約４ｍｍの範囲の幅を有する実質的に矩形のシートを含み得ることが企図される。
【００９１】
ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環状領域及び動脈に固定された後、さらにＥＣＭ材料の弁導管の必要なトリミング(trimming)又は造形(sculpting)が完了した後、対象の心臓は必要に応じて閉じることができ、対象の心臓を再起動させることができる。
【００９２】
ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環状領域及び動脈に固定される前、固定の最中、及び/又は固定された後、抗凝固剤及び／又は抗血栓剤及び／又は治療剤が、対象に投与され得ることが企図される。これらの薬剤及び／又は治療剤が、対象における再生弁の弁葉において血栓形成を防止し得ることが企図される。
【００９３】
さらなる態様において、図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管の内側層は弁葉促進部分と交連促進部分を含むことができ、開示されたＥＣＭ材料の弁導管の外側層は洞促進部分を含むことができる。これらの態様において、弁葉促進部分が、環部の近傍の交換半月弁の複数の弁葉（すなわち、三つの弁葉）を再生し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層の洞促進部分がＥＣＭ材料の弁導管の内側層と融合して、交換半月弁の洞部を再生し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の弁導管の交連促進部分がＥＣＭ材料の弁導管の外側層と融合して、交換半月弁の交連を再生成し得ることが企図される。図７−１１は、本明細書に記載の方法による、例示的なＥＣＭ材料の弁導管の移植後の肺動脈弁の再生を示す。
【００９４】
本明細書に開示されているとおり、ＥＣＭ材料の弁導管の移植後、移植されたＥＣＭ材料の弁導管が、ＥＣＭ材料をリモデリングする対象の幹細胞を引き付け(attract)、交換半月弁を形成することが企図される。幹細胞は、ＥＣＭ材料の弁導管の内側層及び支持動脈壁を、交換半月弁の弁葉及び交連にリモデリングし、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層を、交換半月弁の洞部分にリモデリングすることができる。このリモデリングプロセスの間、移植されたＥＣＭ材料の弁導管が正常な弁機能を提供し得ることが企図される。さらに、移植されたＥＣＭ材料の弁導管は徐々に分解され、正常な天然の組織と区別できない（すなわち、同一もしくは実質的に同一の）宿主組織と置き換えられ得ることが企図される。
【実施例】
【００９５】
実験例
以下の実施例は、当業者に、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製され、評価されるかという完全な開示及び説明を提供するように述べられるものであり、本発明の単に実施例であることが意図され、発明者らが発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、多少の誤差や偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃又は雰囲気温度であり、圧力は大気圧又はその近傍である。
【００９６】
例１
本明細書に開示されているとおり、ＥＣＭ材料の弁導管を構築した。ヒツジを麻酔した。ヒツジの左胸を開胸した後、ヒツジの心臓を露出させた。羊を、肺動脈弁及び肺動脈の部分を切除する間、羊をサポートするために心肺バイパスの上に配置した。その切除の間、肺動脈弁（弁葉を含む）及び肺動脈弁が固定された環部を除去した。加えて、肺動脈弁複合体から遠位置の肺動脈を数センチメートル除去した。ＥＣＭ材料の弁導管を所定の位置に縫合し、入口部分は心臓に縫合し、出口部分は残りの肺動脈に縫合した。
【００９７】
図７−１４は、導管を、三ヶ月のリモデリングの間、動物内に入れた後の結果を示す。図７は、ＥＣＭ材料の弁導管が、どのように正常な肺動脈の外観をもつようになったかを示す。図８は、遠位の肺動脈から見たリモデリングされた弁葉を示す。図９は、心臓及び弁葉の心室側からみたＥＣＭ材料の弁導管の入口部分を示す。図１０は、縦方向に導管を開いた状態の三つの弁葉を示す。図１１は、ＥＣＭ材料の弁導管を開いた状態で肺動脈から見た三つの弁葉を示す。
【００９８】
図１２−１４は、移植前の例示的なＥＣＭ材料の弁導管を示す。図１２は、閉じた状態にある、作製されたＥＣＭ材料の弁導管を示すが、図１３は開いた状態のＥＣＭ材料の弁導管を示す。図１４は、移植前に滅菌水で水和された例示のＥＣＭ材料の弁導管を示す。
【００９９】
例２
図１５及び図１６に示されているように、心膜の大きな矩形パッチを使用して、折り畳み及び縫合の工程を経て三葉導管を構築した。パッチを、適切なサイズの拡張器に巻いた。パッチを、拡張器上に巻いた後、長い縫合糸を使用してＥＣＭ導管を作製した。図２３に示されているこのＥＣＭ材料の導管を使用して、患者に実施される先天的再建手順で右心室から肺への連続性を確立した。
【０１００】
移植材料は簡単に格納されたパケットになった乾燥シートであった。シートは７ｃｍＸ１０ｃｍの寸法をもっていた。シートは１０分間生理食塩水で調製された。
【０１０１】
患者は重度の大動脈弁狭窄症の原因となる二尖大動脈弁をもつ１２歳の女性だった。約１８カ月前に、逆行性バルーン弁形成術が実施されていた。その後、患者は、進行性の左心室拡大を伴う重症大動脈弁閉鎖不全症を発症した。左室拡張末期径は６．２ｃｍであり、患者は労作時呼吸困難の症状を示した。
【０１０２】
患者に手術のために麻酔をかけ、掛け布で覆い、ＥＣＭ材料導管を１０分間生理食塩水で水和した後、最終的な導管の寸法が２０ｍｍとなるように、トリミングした。導管の寸法は、術前の患者の肺動脈弁の大きさの心エコー測定と、その後の弁のＺscoreを２にするためのアップサイジングによって決定した。２０ｍｍの導管を、６５ｍｍＸ４５ｍｍの寸法をもつ長方形の心膜のパッチをトリミングすることによって作成した。図１５に関し、パッチの長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を、下記式によって決定した。
Ｌ＝Ｄ＊π：及び
Ｗ＝（２＊Ｄ）＋Ｃ
Ｄは導管の所望の直径であり、Ｃはカフの長さ（患者の肺動脈に付着されることになる導管の一部に対応する）である。
【０１０３】
導管の調製後、各吻合のために連続モノフィラメント縫合糸を使う完全基部の置換術を用いるロス手術を行った。手術は、二大静脈挿管(bi-caval cannulation)及び１５から２０分毎の間欠逆行血液心停止法(intermittent retrograde blood cardioplegia)を使用し、３２°Ｃで実施された。近位の大動脈基部再建の後及び遠位の大動脈縫合線完成の前に、連続モノフィラメント縫合糸を用いて、導管移植を実施した。遠位の導管の吻合は、近位の導管の吻合前に完了した。両方の吻合術は、大動脈クランピングを除去する前に、連続５−０プロレン縫合糸を用いて行った。分岐肺動脈(branch pulmonary arteries)を、張力のない近位吻合を可能にし、近位での追加のパッチ材料の使用を避けるために広く動員した。導管を、５ｍｍの遠位カフ延長部で作成した。クロスクランプ解除後、患者の心臓は、最小限の強心薬の助けをかりることで(inotropic support)活動的な収縮性を取り戻した。
【０１０４】
手術が完了し、患者はバイパスから容易に分離された。患者の心機能及び止血は良好であった。彼女は目覚め、手術室で抜管された。彼女の回復は順調で、集中治療室で1日を過ごした後病棟に移った。術後五日、彼女には退院前に、完全な心エコー検査が実施された。この結果は図１７−１９に示されている。術後六日、彼女は良好な状態で退院した。
【０１０５】
最初の追跡の心エコー検査が、退院後、一月で行われた。これらの心エコー検査は、導管の狭窄又は不全を全く示さず、自家移植不全が軽度であり、左心室が良好な保存状態をもつことを示した。患者の心室の寸法は正常に戻った。患者はなんら症状を示さず、アスピリンとＡＣＥ阻害薬を服用していた。心エコー検査は、患者がニューヨーク心臓協会（NYHA）心不全分類１にあることを示した。
【０１０６】
その後の追跡心エコー検査が、退院後、五ヶ月で行われた。これらの追跡心エコー検査の時点で、患者は、体重が増え、制限を受けない完全な身体活動に戻っていた。聴診において、収縮期も拡張期も心雑音が認められなかった。図２０−２２に示されている追跡心エコー図は、患者がＮＹＨＡ分類1に残っていることを示した。心エコー図はまた、患者が完全に正常な右及び左心室機能並びに正常導管機能を有していることが実証した。軽微な導管不全が観察され、弁葉の移動度(leaflet mobility)は術後五日に記録された心エコーと変わっていなかった。導管内のピークエコー速度は２ｍ／秒であり、色フローは乱流を示さなかった。左心室拡張末期径が４．０ｃｍと測定された。
【０１０７】
例３
図２４に示されたような例示的なＥＣＭ材料の弁導管の種々の測定値が以下の表1に示されている。
【表１】
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【０１０８】
例４
体外の機械的評価を、本明細書に記載の典型的なＥＣＭ材料の弁導管の縫い目(seam)上で行った。縫い目の最大引張破断力は、５２．１±１４．１Ｎ（１１．７±３．１６lbf）で、最小値及び最大値がそれぞれ３４．８Ｎ（７．８２lbf）及び７２．３Ｎ（１６．２４lbf）であることが分かった。本明細書に記載の典型的な4プライＥＣＭ材料の弁導管に対する引張力、ボールバースト及び縫合糸引き抜き力は、それぞれ１９．３５±５．５１Ｎ（４．３５±１．２４lbf）、１２６．６±３０．２Ｎ（６６９９±１５９８ｍｍＨｇ）、及び１１．１２±２．０８Ｎ（２．５±０．４７lbf）と測定された。これらの結果は、本明細書に記載のＥＣＭ材料の弁導管の構造的完全性が、右心の低圧環境下で肺動脈弁の力の要件を満たすのに十分以上であることを示している。
【０１０９】
例５
典型的なＥＣＭ材料の弁導管について動物実験モデルで評価した。ＥＣＭ材料の弁導管を、天然の肺動脈弁を除去した後、肺動脈弁の位置に移植した。結果は、組織のリモデリングの前の手術直後から十二ヶ月までにおいて、ＥＣＭ材料の弁導管に関して生理学的に正常な血行動態の結果を示している。十二月経過時に、ＥＣＭの大半は、動物の本来の組織にリモデリングされた。十二ヶ月までの心エコー検査は、再生された弁に対し良い血行動態を示し、弁葉が完全に接合され、弁葉の逸脱(leaflet prolapse)のないことを示している（図２５）。
【０１１０】
全体の剖検(gross necropsy)及び組織学上の結果は、続く各時点に宿主組織による交換増大を伴う弁の適切なリモデリングを示した。交換弁は、交換された天然弁と著しく類似しているように見えた。図２６は、非GLP研究の一部として、ＥＣＭ材料の肺動脈の弁導管を移植したヒツジからの三ヶ月、五ヶ月、六ヶ月及び十二ヶ月後の外植片を示す。これらの画像は、前記ヒツジにおいて経時的に生じている進行性のリモデリングを示す。図示のように、三ヶ月の時点（図２６（ａ）を参照）において、リモデリングは、既に弁輪で生じ、弁葉まで延びて、明らかに正常な弁組織を再生している。十二ヶ月の時点（図２６（ｄ））で、弁葉はリモデリングされ、天然の弁組織のように見える。
【０１１１】
三ヶ月、五ヶ月、六ヶ月および十二ヶ月後の外植されたＥＣＭ肺動脈の弁導管のＨ＆Ｅ組織が分析された。三ヶ月までに細胞が前記弁全体にわたって、さらには弁葉の先端にまで分布し、六ヶ月までにリモデリングされた組織は、海綿状で線維性の心室とともに天然の弁組織と似た三層構造を形成した。
【０１１２】
例６
開示された滅菌及び脱細胞化方法の典型的な適用において、選択された組織を採取し、無菌生理食塩水ですすいだ。その後選択された組織を、２４時間凍結させた。凍結した組織を５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、氷上の冷低張トリス緩衝液中で解凍した。本明細書に記載されたように、次いで、細胞外マトリックス材料を各々の選択された組織から単離した。
【０１１３】
単離された細胞外マトリックス材料を、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸と５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ロンザ・ウォーカーズビル社）中で、２４〜４８時間インキュベートした。胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、および膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦な細胞外マトリックス材料は、延伸された形態でインキュベートした。尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等の管状の細胞外マトリックス材料は、浸漬を通じ、また蠕動ポンプを用いて溶液で灌流させた。
【０１１４】
インキュベーション後、各々の細胞外マトリックス材料を、ＤＰＢＳで三回すすいだ。ＤＰＢＳを使用した各々のすすぎは、３０分間継続した。その後いくつかの細胞外マトリックス材料を、２〜１２時間に渡って３７℃で、５ｍＭのＥＤＴＡとともに１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを含有する等張トリス緩衝液中でインキュベートした。該インキュベーションステップの後、細胞外マトリックス材料を、再びＤＰＢＳで三回すすいだ。ＤＰＢＳを用いた各々のすすぎは３０分間継続した。細胞外マトリックス材料を４℃で保存した。
【０１１５】
保存の４８時間以内に細胞外マトリックス材料を、本明細書で開示のように、超臨界二酸化炭素で２０ないし６０分間、３１．１℃以上の温度及び１，０７１ｐｓｉ以上の圧力で処理した。この滅菌の工程の後、細胞外マトリックス材料を、２．７ＭＰａ／１０秒（３９１．６ｐｓｉ／１０秒）の速度で１分１９秒間、急速に減圧した。この間に、細胞外マトリックス材料に適用された圧力は９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａへ急速に減少した。
【０１１６】
細胞外マトリックス材料を、次いで、最終の滅菌を達成するために、３０分から６時間、本明細書に開示のように、超臨界二酸化炭素及び過酢酸（ＰＡＡ）内で処理した。この処理ステップでは、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａに増加した。得られた滅菌無細胞の細胞外マトリックス材料を、その後、流体の漏れを防止するためにプラスチック製のパウチ内にシールされたＴｙｖｅｋ（商標）（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）のパウチに詰めた。
【０１１７】
表２は、ブタ尿管、ウシ心膜及びブタ中皮の滅菌及び脱細胞化をまとめたものである。
【表２】
2014533119.tif 000002
【０１１８】
例７
ＥＣＭ材料サンプルのＤＮＡ含有量を、様々な滅菌及び脱細胞化技術を用いたそれぞれのＥＣＭ材料サンプルの脱細胞化の指標として測定した。測定されたＤＮＡ含有量を、ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）アッセイ（ＤＮＡを蛍光ラベルで標識して分光光度計で検出するアッセイ）で評価した。測定されたＤＮＡ含有量を、サンプルの乾燥重量で正規化した。ＤＮＡ含有量を、以下の処理群、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳ、について測定し、評価した。
【０１１９】
図２７は、乾燥重量で正規化されたそれぞれのサンプルの総ＤＮＡ含有量を示す。図２８は、生の、未処理のＳＩＳと比較した、各それぞれのサンプルから除去されたＤＮＡの割合を示す。これらの結果は、非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を使用して滅菌することにより、生のＳＩＳに見られるＤＮＡの９６％超が除去されているのに対し、ＳＩＳがＥｔＯによって滅菌された場合は９４％のみ、ＳＩＳがいずれの方法でも滅菌されなかった場合は９３％のみであることを示した。
【０１２０】
例８
尿管を、穏やかな界面活性剤（ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡ内の０．５％トリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）を用いて２４時間処理し、次いで、本明細書で開示されたように、ＤＰＢＳ内で三回すすいだ。この前処置の後に、尿管を、本明細書に開示されたように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理とを利用して脱細胞化し滅菌した。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を、以下の処理の段階、すなわち、（Ａ）天然尿管、（Ｂ）前処理された尿管、（Ｃ）前処理された尿管に、本明細書に開示のように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理を行ったもの、において、１つのサンプル尿管について調製した。これらの染色は、急速減圧によりＤＮＡ含有量が著しく低減されたことを示した。
【０１２１】
例９
ＥＣＭ材料サンプルの増殖因子の含有量を測定した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）をＥＣＭ材料サンプルに対して実施し、それぞれのサンプルの、ｂＦＧＦ及び活性型のＴＧＦベータの含有量が定量した。以下の処理群、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳ、について評価した。ｂＦＧＦ含有量及びＴＧＦベータ含有量の測定は、各それぞれのサンプルの乾燥重量で正規化された。それらの結果が図２９及び図３０に示されている。それらの結果は、ＥｔＯにさらしたことにより、両方の増殖因子の濃度が低下したことを示した。しかしながら、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた滅菌では、増殖因子の濃度に影響はなかった。
【０１２２】
例１０
本明細書に開示された方法により、超臨界ＣＯ２を、一次滅菌剤として及びＳＩＳシート内へｂＦＧＦを添加するための担体として使用した。まず、それぞれのＳＩＳシートを、様々な量のｂＦＧＦとともにＴｙｖｅｋ（商標）パウチに入れた。パウチを９．６ＭＰａで６０分間超臨界ＣＯ２に曝露した。パウチを、７．２０ＭＰａ／分の速度で急速に減圧した。サンプルを、２０分間、超臨界ＣＯ２において１６ｍＬのＰＡＡ中で直接処理した。以下の処理群、（１）ｂＦＧＦ無添加、（２）５μＬのｂＦＧＦ添加、（３）１５μＬのｂＦＧＦ添加、について評価した。各μＬのｂＦＧＦには０．１μｇのｂＦＧＦが含まれていた。従って、各ＳＩＳシートは約０．５ｇの重量であったため、５μＬ及び１５μＬの群について、ｂＦＧＦの最大濃度はそれぞれ、約４１７０ｐｇ／ｍｇ(乾燥重量)及び約１２，５００ｐｇ／ｍｇ(乾燥重量)だった。それぞれのサンプルの乾燥重量に関して測定されたこれらの群のｂＦＧＦの含有量が、図３１に示されている。これらの結果は、ｂＦＧＦの測定濃度が最大の濃度に達しなかったこと、及び１５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプルは、５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプル中のｂＦＧＦの測定濃度の３倍以上のｂＦＧＦの測定濃度にはならなかったことを示すものであった。
【０１２３】
例１１
二プライ(二層)のＳＩＳサンプルの引張強度を測定した。以下の処理群、（１）ＥｔＯ処理、（２）２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、（３）６０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、及び（４）１２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、について評価した。張強度試験の結果が図３２に示されている。これらの結果は、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ／超臨界ＣＯ２で２０分間又は１２０分間処理されたＳＩＳのサンプルは、ＥｔＯで処理されたＳＩＳのサンプルよりも著しく強度が高いことを示すものであった。
【０１２４】
例１２
表３（下記）に示されたＥＣＭ材料を記載の濃度及び記載の時間の間、穏やかな界面活性剤に浸漬又は灌流した後に、急速減圧を使用した。組織を採取し、生理食塩水ですすいだ。組織を少なくとも２４時間凍結させた。組織を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む、氷上の冷低張トリス緩衝液中で解凍した。目的のＥＣＭが単離された。平坦な組織（例えば、胃粘膜下層、小腸粘膜下層及び膀胱粘膜下層）については、組織を、組織延伸装置において延伸させ、延伸された形態で、溶液中でインキュベートした。管状の組織（例えば、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ）については、組織に蠕動ポンプを使用して溶液を灌流させ、インキュベーション中に浸漬した。組織を、５ｍＭのＥＤＴＡとともに０．５％のトリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸を含むＤＰＢＳ内で、２〜２４時間インキュベートした。組織をＤＰＢＳ内で、１回につき１５〜３０分間、３回すすいだ。組織を４℃で保存した。組織の保存の４８時間以内に、組織を超臨界ＣＯ２内で２０〜１２０分間処理し、続いて急速に減圧（ＲＤＰ）した（圧力は１分１９秒で９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａに減少、２．７ＭＰａ／１０秒の減圧に相当）。
【表３】
2014533119.tif 000003
【０１２５】
結果は、超臨界ＣＯ２曝露後の急速減圧（ＳＣＣＯ２＋ＲＤＰ）が、ＥＣＭ内の増殖因子を維持させつつ、細胞の残余物とＤＮＡの除去に役立ったことを示すものであった。
【０１２６】
例１３
様々なＥＣＭ組成物の増殖因子の含有量を、代表的な増殖因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて分析した。ｂＦＧＦは天然のＥＣＭ組織によく見られる増殖因子であるため、ｂＦＧＦを選択した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて、以下のサンプル、（１）未処理（生）のＳＩＳ、（２）界面活性剤浸漬（ＴＸ−デオキシ）のみの後のＳＩＳ、（３）ＴＸ−デオキシ及びＲＤＰ（ＳＣＣＯ２を含む）の後のＳＩＳ、（４）ＴＸ−デオキシ、ＲＤＰ及びＰＡＡ（滅菌のためにＰＡＡとともにＳＣＣＯ２）の後のＳＩＳ、（５）ＴＸ−デオキシ及びＰＡＡの後のＳＩＳ、（６）ＥｔＯで滅菌されたＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、及び（７）非滅菌ＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、についてｂＦＧＦ含有量を測定した。
【０１２７】
これらの検討において、ＳＩＳを使用して、ＲＤＰで処理された又は処理されていないＥＣＭ組成物と、クックバイオテック社提供のＳＩＳとを比較した。処理されたＳＩＳのいくつかはまた、脱細胞化の後、記載されたＳＣＣＯ２＋ＰＡＡ方法により滅菌した。それぞれのＥＣＭ組成物の測定された増殖因子の含有量が図３３に示されている。
【０１２８】
これらの結果は、ｂＦＧＦ含有量の維持において、急速減圧処理が他の脱細胞化処理よりも有効であること、残留ＤＮＡ及び細胞片を除去するための追加のＲＤＰ処理が、ｂＦＧＦの少量の損失しか生じさせないことを示すものであった。これに対して、ＰＡＡ滅菌プロセスは、ＲＤＰが行われないときでさえ、ほぼすべての残余のｂＦＧＦを除去するように思われた。さらに、急速減圧プロセスは、クックの脱細胞化方法に比べ、天然ＳＩＳ内のｂＦＧＦ含有量をより多く保存した。これらの結果から、ｂＦＧＦ含有量が減少した場合、増殖因子はすべて同じようにＥＣＭ組成物に結合しているので、すべての他の増殖因子の含有量も同様に減少したものと見なされる。
【０１２９】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の水準をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【０１３０】
当業者には、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく様々な修正及び変形が本発明においてなされ得ることは明らかであろう。本発明の他の実施形態が、本明細書に開示された本発明の詳細な説明及び実施例を考慮することにより、当業者には明らかであろう。発明の詳細な説明及び実施例は単に例示的なものと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および思想は以下の特許請求の範囲によって示される。
本願発明は、以下の態様を含む。
［１］
対象の心臓内の、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域に付着している欠陥のある(defective)半月弁を交換するために半月弁を再生する方法であって、
対象の心臓から欠陥のある半月弁を除去する工程と、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料のシートであって、前記シートの上縁(top edge)を含む上端部分(top portion)及び前記シートの下縁(bottom edge)を含む下端部分(bottom portion)を有するシートを折り畳まれた状態()にする工程と、ここで、折り畳まれた状態では、前記シートの前記下縁が前記シートの前記上縁から選択された距離、離れるように前記シートの前記下縁が前記シートの前記上縁に向かって折り畳まれており、
前記ＥＣＭ材料のシートを前記折り畳まれた状態に固定することにより、上方部分(upper portion)、下方部分(lower portion)、第一の側縁(first side edge)、及び第二の側縁(second side edge)を有する折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を作製する工程と、ここで、前記下方部分は第一の層及び第二の層を含み、前記下方部分の前記第一の層は、前記ＥＣＭ材料のシートの前記折り畳まれた下端部分に相当し、前記第一の層は、第一の付着点及び第二の付着点で前記第二の層に付着され、前記第一の付着点は、前記第二の付着点から、選択された距離、離れており、
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第一の側縁が、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第二の側縁と実質的に整列するように、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を整列状態にする工程と、
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を前記の整列状態にしたまま、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第二の側縁に固定することにより、内腔を含み、縦軸線を有するＥＣＭ材料弁導管を作製する工程と、ここで、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の入口部分に相当し、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔と流体連通する入口を画定し、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第一の層は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔内に位置する内側層に相当し、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第二の層は、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の前記上方部分と協働して前記ＥＣＭ材料弁導管の外壁を画定しており、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記入口部分が前記対象の心臓の前記環状領域の近傍に位置するように、前記ＥＣＭ材料弁導管を前記環状領域及び前記対象の前記動脈に付着する工程と、
を含み、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層は弁葉(leaflet)促進部分を含み、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記外側層は洞(sinus)促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の動脈への前記ＥＣＭ材料弁導管の付着の後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生し、前記外側層の洞促進部分は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層と融合して、前記交換半月弁の洞部分を再生する、
ことを特徴とする再生方法。
［２］
前記第一の付着点及び前記第二の付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、［１］に記載の再生方法。
［３］
前記第一の付着点が、前記第一の側縁から第一の距離、離れ、前記第二の付着点が、前記第二の側縁から第二の距離、離れ、前記第一の距離及び前記第二の距離は、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記選択された距離に実質的に等しい、［２］に記載の再生方法。
［４］
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第二の側縁に固定する工程が、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縦軸線にそって複数の縫合糸で縫い目(seam)を形成する工程である、［１］に記載の再生方法。
［５］
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第一の側縁と前記第一の付着点の中間の第三の付着点で、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着され、前記第一、前記第二および前記第三の付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、［４］に記載の再生方法。
［６］
前記第三の付着点と前記第一の付着点との間の距離が、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記選択された距離に実質的に等しい、［５］に記載の再生方法。
［７］
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第二の側縁に固定した後に、前記第三の付着点が前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縫い目の近傍に位置するように、前記第三の付着点が前記第一の側縁の近傍に配置される、［５］に記載の再生方法。
［８］
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第二の側縁と前記第二の付着点の中間の第四の付着点で、前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着され、前記第一、前記第二、前記第三及び前記第四の付着点が前記共通の平面内に実質的に配置される、［５］に記載の再生方法。
［９］
前記第四の付着点と前記第二の付着点との間の距離が、前記第一の付着点と前記第二の付着点との間の前記選択された距離に実質的に等しい、［８］に記載の再生方法。
［１０］
前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の前記第二の側縁に固定した後に、前記第四の付着点が前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縫い目の近傍に位置するように、前記第四の付着点が前記第二の側縁の近傍に配置される、［８］に記載の方法。
［１１］
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層がさらに交連促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に前記ＥＣＭ材料弁導管を付着した後に、前記内側層の前記交連促進部分が前記ＥＣＭ材料弁導管の前記外側層の少なくとも一部と融合する、［１］に記載の方法。
［１２］
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料弁導管であって、［１］に記載の方法に従って作製されたＥＣＭ材料弁導管。
［１３］
前記ＥＣＭ材料弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの組織の各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓弁、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、［１２］に記載のＥＣＭ材料弁導管。
［１４］
対象の心臓内の欠陥のある半月弁を交換するために半月弁を再生する方法であって、前記欠陥のある半月弁が前記対象の心臓の心室と前記対象の動脈との間の環状領域に付着しており、
対象の心臓から欠陥のある半月弁を除去する工程と、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料導管を折り返した状態(reflected position)にする工程と、ここで、前記ＥＣＭ材料導管は、内腔を画定し、前記ＥＣＭ材料導管の頂端(top end)を含む上端部分(top portion)および前記ＥＣＭ材料の底端(bottom end)を含む下端部分(bottom portion)を有し、前記折り返した状態では、前記ＥＣＭ材料導管の前記底端が前記ＥＣＭ材料導管の前記頂端から選択された距離、離れるように、前記底端が、前記頂端に向けて、前記ＥＣＭ材料導管の前記内腔内で内側に折り返されており、
前記ＥＣＭ材料導管を前記折り返した状態に固定することにより、縦軸線を有し、内腔、入口部分及び出口部分を含むＥＣＭ材料弁導管を作製する工程と、ここで、前記出口部分は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔と連通する出口を画定し、前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔と連通する入口を画定し且つ外側層および前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔内に位置する内側層を含み、前記入口部分の前記内側層は前記ＥＣＭ材料弁導管の折り返された底端に相当し、前記内側層は三つの付着点で前記外側層に付着されており、前記三つの付着点は前記ＥＣＭ材料弁導管の外周囲にそって、実質的に等しい間隔で配置され、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記入口部分の前記外側層は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記出口部分と協働して前記ＥＣＭ材料弁導管の外壁を画定しており、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記入口部分が前記対象の心臓の前記環状領域の近傍に位置するように、前記ＥＣＭ材料弁導管を前記環状領域および前記対象の前記動脈に付着する工程と、
を含み、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層は弁葉促進部分を含み、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記外側層は洞促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈への前記ＥＣＭ材料弁導管の付着の後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生し、前記外側層の前記洞促進部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層と融合して前記交換半月弁の洞部分を再生する、
ことを特徴とする再生方法。
［１５］
前記三つの付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、［１４］に記載の再生方法。
［１６］
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層がさらに交連促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に前記ＥＣＭ材料弁導管を付着した後に、前記内側層の前記交連促進部分が前記ＥＣＭ材料弁導管の前記外側層の少なくとも一部と融合する、［１４］に記載の方法。
［１７］
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料弁導管であって、［１４］に記載の方法に従って作製されたＥＣＭ材料弁導管。
［１８］
前記ＥＣＭ材料弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの組織の各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓の弁、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、［１７］に記載のＥＣＭ材料弁導管。
［１９］
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料弁導管であって、前記ＥＣＭ材料弁導管は縦軸線を有し、内腔、入口部分及び出口部分を含み、前記出口部分は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔と連通する出口を画定し、前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔と連通する入口を画定し且つ外側層および前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔内に位置する内側層を含み、前記入口部分の前記内側層は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内腔内で内側に折り返されており、前記内側層は、三つの付着で前記外側層に付着され、前記三つの付着点は前記ＥＣＭ材料弁導管の外周囲にそって、実質的に等しい間隔で配置されており、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記入口部分の前記外側層は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記出口部分と協働して、前記ＥＣＭ材料弁導管の外壁を画定しており、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層は弁葉促進部分を含み、
前記ＥＣＭ材料弁導管の前記外側層は洞促進部分を含み、
前記ＥＣＭ材料の前記入口部分が前記対象の心臓の前記環状領域の近傍に位置するように、前記ＥＣＭ材料弁導管を前記環状領域及び前記対象の動脈に付着した後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生するように構成されており、前記外側層の洞促進部分は、前記ＥＣＭ材料弁導管の前記内側層と融合して、前記交換半月弁の洞部分を再生するように構成されている、
ことを特徴とするＥＣＭ材料弁導管。
［２０］
前記三つの付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、［１９］に記載のＥＣＭ材料弁導管。
［２１］
前記ＥＣＭ材料弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの組織の各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、付着血管をもつ又はもたない心臓の弁、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、［１９］に記載のＥＣＭ材料弁導管。