【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ナノ粒子を中和する方法であって、前記脂質ナノ粒子が放出可能な極性ヘッド基を有する少なくとも１つの脂質を含み、前記方法が、前記極性ヘッド基が前記脂質から放出され、前記脂質ナノ粒子がそれによって中和されるように、前記脂質ナノ粒子を１つ以上の薬剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記脂質が、構造
【化３３】
2015518472.tif 000001
を有し、式中、Ｒ１が、前記放出可能な極性ヘッド基であり、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、および任意に置換されたピリジルからなる群から選択され、
Ｒ２が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアシル、任意に置換されたピリジル、
【化３４】
2015518472.tif 000002
からなる群から選択され、
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の薬剤が、前記脂質のジスルフィド結合を還元的に切断することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質の前記ジスルフィド結合を還元的に切断するとき、構造
【化３５】
2015518472.tif 000003
が前記脂質から遊離し、前記脂質がそれによって中和される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質の前記ジスルフィド結合を還元的に切断するとき、残りの中性脂質は、構造
【化３６】
2015518472.tif 000004
を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
修飾された脂質が形成されるように、前記残りの中性脂質を修飾するステップをさらに含み、
前記修飾された脂質が、次の構造
【化３７】
2015518472.tif 000005
を有し、式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロまたは任意の正の整数である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記中性脂質を修飾する前記ステップが、ジスルフィド結合が形成され、前記中性脂質がそれによって修飾されるような酸化条件下で、前記中性脂質を、次の構造
【化３８】
2015518472.tif 000006
を有する二次化合物と接触させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記中性脂質を修飾する前記ステップが、前記中性脂質を、次の構造
【化３９】
2015518472.tif 000007
を有する二次化合物と接触させることを含み、
式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記中性脂質を修飾する前記ステップが、前記中性脂質を、次の構造
【化４０】
2015518472.tif 000008
を有する二次化合物と接触させることを含み、
式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ５が、ペプチド、アプタマー、ビタミン、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される標的リガンドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ５が、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ、グルコース、ガラクトース、およびマンノースからなる群から選択される標的リガンドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ５が、ポリエチレングリコールである、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ５が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の薬剤が、還元剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記還元剤が、溶液の形態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、前記還元剤と接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、前記還元剤と接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、前記還元剤と接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、前記還元剤と接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂質ナノ粒子が、１つ以上の治療薬を被包する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂質ナノ粒子が、前記脂質ナノ粒子を中和する前に１つ以上の治療薬で充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療薬が、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記中和された脂質ナノ粒子が、少なくとも０．１μｇの被包されたポリヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記中和された脂質ナノ粒子が、少なくとも０．５μｇの被包されたポリヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡが、タンパク質または酵素をコードする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質または酵素が、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、アルファガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法に従い調製された、中性脂質ナノ粒子。
【請求項４０】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項３９に記載の中性脂質ナノ粒子。
【請求項４１】
請求項９に記載の方法に従い調製された、修飾された脂質ナノ粒子。
【請求項４２】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項４１に記載の修飾された脂質ナノ粒子。
【請求項４３】
請求項４０または４２に記載の脂質ナノ粒子を含む、治療のための組成物。
【請求項４４】
中性脂質ナノ粒子に１つ以上の治療薬を被包する方法であって、（ａ）少なくとも１つの還元可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を１つ以上の治療薬で充填するステップと、（ｂ）前記脂質ナノ粒子が中和されるように、前記脂質ナノ粒子を１つ以上の還元剤と接触させるステップと、を含む、方法。
【請求項４５】
前記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも５０％の被包効率を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも７５％の被包効率を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも９０％の被包効率を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４１】
2015518472.tif 000009
を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４２】
2015518472.tif 000010
を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４３】
2015518472.tif 000011
を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記１つ以上の還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、前記還元剤と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、前記還元剤と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、前記還元剤と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、前記還元剤と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させた後は約−１０．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記治療薬が、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡであり、前記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＲＮＡが、タンパク質または酵素をコードする、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
請求項４４に記載の方法に従い調製された中性脂質ナノ粒子。
【請求項６９】
請求項６８に記載の中性脂質ナノ粒子を含む、治療のための組成物。
【請求項７０】
脂質ナノ粒子を中和する方法であって、前記脂質ナノ粒子が放出可能な極性ヘッド基を有する少なくとも１つの脂質を含み、前記方法が、前記極性ヘッド基が前記脂質から放出され、それによって前記脂質ナノ粒子を中和するように、前記脂質ナノ粒子を１つ以上の薬剤と接触させるステップを含み、前記脂質が、構造
【化４４】
2015518472.tif 000012
を有し、式中、Ｒ１が、放出可能な極性ヘッド基であり、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、および任意に置換されたピリジルからなる群から選択され、
Ｒ２が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアシル、任意に置換されたピリジル、
【化４５】
2015518472.tif 000013
からなる群から選択され、
式中、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
ｘが、ジスルフィド、エステル、ヒドラゾン、イミン、アセタール、ケタール、シス−アコニチル、オルト−エステル、無水物、ベータ−チオプロピオン酸塩、ビニルエーテル、ホスホロアミド酸、ＧＬＦＧ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、ＧＧ、ＡＡ、ＧＧＧＦ、およびＰＶＧＬＩＧからなる群から選択される切断可能なリンカー基であり、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、方法。
【請求項７１】
前記切断可能なリンカー基が、ジスルフィドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ以上の薬剤が、還元剤である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、前記還元剤と接触させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、前記還元剤と接触させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、前記還元剤と接触させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、前記還元剤と接触させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記脂質ナノ粒子の前記ゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、前記脂質ナノ粒子を前記１つ以上の還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記脂質ナノ粒子の前記ゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記脂質ナノ粒子の前記ゼータ電位が、前記脂質ナノ粒子を前記還元剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記１つ以上の薬剤が、酵素である、請求項７１に記載の方法。
【請求項８２】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトシンデアミナーゼ、ニトロ還元酵素、β−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシターゼ、チオレドキシン、およびガンマ−インターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記脂質が、構造
【化４６】
2015518472.tif 000014
を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
前記脂質が、構造
【化４７】
2015518472.tif 000015
を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８５】
前記脂質が、構造
【化４８】
2015518472.tif 000016
を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８６】
前記切断可能なリンカー基が、エステルである、請求項７０に記載の方法。
【請求項８７】
前記１つ以上の薬剤が、前記脂質ナノ粒子を接触させたとき、前記エステルを加水分解する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
請求項７０に記載の方法に従い調製された脂質ナノ粒子。
【請求項８９】
前記脂質ナノ粒子が、少なくとも５０％の被包効率を有する、請求項８８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９０】
前記脂質ナノ粒子が、少なくとも７５％の被包効率を有する、請求項８８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９１】
前記脂質ナノ粒子が、少なくとも９０％の被包効率を有する、請求項８８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９２】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項８８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９３】
前記治療薬が、ｍＲＮＡである、請求項９２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９４】
前記脂質ナノ粒子が、少なくとも０．１μｇの被包された治療薬を含む、請求項９２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９５】
前記脂質ナノ粒子が、少なくとも０．５μｇの被包された治療薬を含む、請求項９２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９６】
前記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項９３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９７】
前記ｍＲＮＡが、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結基を含む、請求項９３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９８】
前記ｍＲＮＡが、全てのホスホロチオエートヌクレオチド間連結基を含む、請求項９３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９９】
前記ｍＲＮＡが、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、プソイドウリジン、２−チオウリジン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンシトシンからなる群から独立して選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項９３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１００】
リポソームビヒクルの表面電荷を調節する方法であって、前記リポソームビヒクルが、放出可能な極性ヘッド基を含む少なくとも１つの脂質を含み、前記方法が、前記リポソームビヒクルを少なくとも１つの薬剤と接触させるステップを含み、前記リポソームビヒクルを少なくとも１つの薬剤と接触させるとき、前記極性ヘッド基が、前記脂質から放出され、前記リポソームビヒクルの前記表面電荷がそれによって調節される、方法。
【請求項１０１】
前記リポソームビヒクルが、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記リポソームビヒクルの正味表面電荷が、前記リポソームビヒクルを前記少なくとも１つの薬剤と接触させる前は少なくとも約＋２５ｍＶであり、前記リポソームビヒクルを前記少なくとも１つの薬剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ未満である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記リポソームビヒクルが、脂質ナノ粒子である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記調節されたリポソームビヒクルの前記正味表面電荷が、約−２５ｍＶ未満である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記調節されたリポソームビヒクルの前記正味表面電荷が、約−５０ｍＶ未満〜約−１０ｍＶである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
前記調節されたリポソームビヒクルの前記正味表面電荷が、約−５．０ｍＶ未満〜約＋５．０ｍＶである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記薬剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０８】
前記脂質が、構造
【化４９】
2015518472.tif 000017
を有する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０９】
前記脂質が、構造
【化５０】
2015518472.tif 000018
を有する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１０】
前記脂質が、構造
【化５１】
2015518472.tif 000019
を有する、請求項１００に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本発明の上述および多くの他の特徴および付随する利点は、付随する実施例と合わされるとき、以下の本発明の詳細な説明を参照することによりさらに理解されるだろう。本明細書に記載される様々な実施形態は補足であり、本明細書に含まれる教示を考慮して当業者により理解される様式で組み合わされる、または一緒に使用され得る。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
脂質ナノ粒子を中和する方法であって、上記脂質ナノ粒子が放出可能な極性ヘッド基を有する少なくとも１つの脂質を含み、上記方法が、上記極性ヘッド基が上記脂質から放出され、上記脂質ナノ粒子がそれによって中和されるように、上記脂質ナノ粒子を１つ以上の薬剤と接触させるステップを含む、方法。
（項目２）
上記脂質が、構造
【化３３】
2015518472.tif 000020
を有し、式中、Ｒ１が、上記放出可能な極性ヘッド基であり、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、および任意に置換されたピリジルからなる群から選択され、
Ｒ２が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアシル、任意に置換されたピリジル、
【化３４】
2015518472.tif 000021
からなる群から選択され、
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記１つ以上の薬剤が、上記脂質のジスルフィド結合を還元的に切断することができる、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記脂質の上記ジスルフィド結合を還元的に切断するとき、構造
【化３５】
2015518472.tif 000022
が上記脂質から遊離し、上記脂質がそれによって中和される、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記脂質の上記ジスルフィド結合を還元的に切断するとき、残りの中性脂質は、構造
【化３６】
2015518472.tif 000023
を有する、項目３に記載の方法。
（項目６）
修飾された脂質が形成されるように、上記残りの中性脂質を修飾するステップをさらに含み、
上記修飾された脂質が、次の構造
【化３７】
2015518472.tif 000024
を有し、式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロまたは任意の正の整数である、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記中性脂質を修飾する上記ステップが、ジスルフィド結合が形成され、上記中性脂質がそれによって修飾されるような酸化条件下で、上記中性脂質を、次の構造
【化３８】
2015518472.tif 000025
を有する二次化合物と接触させることを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記中性脂質を修飾する上記ステップが、上記中性脂質を、次の構造
【化３９】
2015518472.tif 000026
を有する二次化合物と接触させることを含み、
式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記中性脂質を修飾する上記ステップが、上記中性脂質を、次の構造
【化４０】
2015518472.tif 000027
を有する二次化合物と接触させることを含み、
式中、Ｒ５が、ポリマー、ペプチド、標的リガンド、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、およびキャップ構造からなる群から選択され、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
Ｒ５が、ペプチド、アプタマー、ビタミン、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される標的リガンドである、項目６に記載の方法。
（項目１１）
Ｒ５が、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ、グルコース、ガラクトース、およびマンノースからなる群から選択される標的リガンドである、項目６に記載の方法。
（項目１２）
Ｒ５が、ポリエチレングリコールである、項目６に記載の方法。
（項目１３）
Ｒ５が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルである、項目６に記載の方法。
（項目１４）
上記１つ以上の薬剤が、還元剤である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記還元剤が、溶液の形態である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、上記還元剤と接触させる、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、上記還元剤と接触させる、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、上記還元剤と接触させる、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、上記還元剤と接触させる、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
上記脂質ナノ粒子が、１つ以上の治療薬を被包する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
上記脂質ナノ粒子が、上記脂質ナノ粒子を中和する前に１つ以上の治療薬で充填される、項目１に記載の方法。
（項目２７）
上記治療薬が、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記中和された脂質ナノ粒子が、少なくとも０．１μｇの被包されたポリヌクレオチドを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
上記中和された脂質ナノ粒子が、少なくとも０．５μｇの被包されたポリヌクレオチドを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３４）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３６）
上記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記ＲＮＡが、タンパク質または酵素をコードする、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
上記タンパク質または酵素が、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、アルファガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
項目１に記載の方法に従い調製された、中性脂質ナノ粒子。
（項目４０）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目３９に記載の中性脂質ナノ粒子。
（項目４１）
項目９に記載の方法に従い調製された、修飾された脂質ナノ粒子。
（項目４２）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目４１に記載の修飾された脂質ナノ粒子。
（項目４３）
項目４０または４２に記載の脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、治療方法。
（項目４４）
中性脂質ナノ粒子に１つ以上の治療薬を被包する方法であって、（ａ）少なくとも１つの還元可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を１つ以上の治療薬で充填するステップと、（ｂ）上記脂質ナノ粒子が中和されるように、上記脂質ナノ粒子を１つ以上の還元剤と接触させるステップと、を含む、方法。
（項目４５）
上記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも５０％の被包効率を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも７５％の被包効率を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
上記中性脂質ナノ粒子が、少なくとも９０％の被包効率を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
上記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４１】
2015518472.tif 000028
を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
上記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４２】
2015518472.tif 000029
を有する、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
上記還元可能なカチオン性脂質が、構造
【化４３】
2015518472.tif 000030
を有する、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
上記１つ以上の還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、上記還元剤と接触させる、項目４４に記載の方法。
（項目５３）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、上記還元剤と接触させる、項目４４に記載の方法。
（項目５４）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、上記還元剤と接触させる、項目４４に記載の方法。
（項目５５）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、上記還元剤と接触させる、項目４４に記載の方法。
（項目５６）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、項目４４に記載の方法。
（項目５７）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記脂質ナノ粒子のゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させた後は約−１０．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
上記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目６０）
上記治療薬が、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目４４に記載の方法。
（項目６１）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
上記ＲＮＡが、ｍＲＮＡであり、上記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
上記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
上記ＲＮＡが、タンパク質または酵素をコードする、項目６４に記載の方法。
（項目６８）
項目４４に記載の方法に従い調製された中性脂質ナノ粒子。
（項目６９）
項目６８に記載の中性脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、治療方法。
（項目７０）
脂質ナノ粒子を中和する方法であって、上記脂質ナノ粒子が放出可能な極性ヘッド基を有する少なくとも１つの脂質を含み、上記方法が、上記極性ヘッド基が上記脂質から放出され、それによって上記脂質ナノ粒子を中和するように、上記脂質ナノ粒子を１つ以上の薬剤と接触させるステップを含み、上記脂質が、構造
【化４４】
2015518472.tif 000031
を有し、式中、Ｒ１が、放出可能な極性ヘッド基であり、イミダゾール、グアニジウム、イミン、エナミン、アミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、および任意に置換されたピリジルからなる群から選択され、
Ｒ２が、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアルキル、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のアシル、任意に置換されたピリジル、
【化４５】
2015518472.tif 000032
からなる群から選択され、
式中、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
ｘが、ジスルフィド、エステル、ヒドラゾン、イミン、アセタール、ケタール、シス−アコニチル、オルト−エステル、無水物、ベータ−チオプロピオン酸塩、ビニルエーテル、ホスホロアミド酸、ＧＬＦＧ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、ＧＧ、ＡＡ、ＧＧＧＦ、およびＰＶＧＬＩＧからなる群から選択される切断可能なリンカー基であり、
ｎが、ゼロ、または任意の正の整数である、方法。
（項目７１）
上記切断可能なリンカー基が、ジスルフィドである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記１つ以上の薬剤が、還元剤である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
上記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約５分間、上記還元剤と接触させる、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約１時間、上記還元剤と接触させる、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約３時間、上記還元剤と接触させる、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
上記脂質ナノ粒子を、少なくとも約２４時間、上記還元剤と接触させる、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
上記脂質ナノ粒子の上記ゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させる前は少なくとも約２５ｍＶであり、上記脂質ナノ粒子を上記１つ以上の還元剤と接触させた後は約５ｍＶ未満である、項目７２に記載の方法。
（項目７９）
上記脂質ナノ粒子の上記ゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させた後は約−２５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
上記脂質ナノ粒子の上記ゼータ電位が、上記脂質ナノ粒子を上記還元剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ〜約５．０ｍＶである、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
上記１つ以上の薬剤が、酵素である、項目７１に記載の方法。
（項目８２）
上記酵素が、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトシンデアミナーゼ、ニトロ還元酵素、β−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシターゼ、チオレドキシン、およびガンマ−インターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）からなる群から選択される、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記脂質が、構造
【化４６】
2015518472.tif 000033
を有する、項目７１に記載の方法。
（項目８４）
上記脂質が、構造
【化４７】
2015518472.tif 000034
を有する、項目７１に記載の方法。
（項目８５）
上記脂質が、構造
【化４８】
2015518472.tif 000035
を有する、項目７１に記載の方法。
（項目８６）
上記切断可能なリンカー基が、エステルである、項目７０に記載の方法。
（項目８７）
上記１つ以上の薬剤が、上記脂質ナノ粒子を接触させたとき、上記エステルを加水分解する、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
項目７０に記載の方法に従い調製された脂質ナノ粒子。
（項目８９）
上記脂質ナノ粒子が、少なくとも５０％の被包効率を有する、項目８８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９０）
上記脂質ナノ粒子が、少なくとも７５％の被包効率を有する、項目８８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９１）
上記脂質ナノ粒子が、少なくとも９０％の被包効率を有する、項目８８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９２）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目８８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９３）
上記治療薬が、ｍＲＮＡである、項目９２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９４）
上記脂質ナノ粒子が、少なくとも０．１μｇの被包された治療薬を含む、項目９２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９５）
上記脂質ナノ粒子が、少なくとも０．５μｇの被包された治療薬を含む、項目９２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９６）
上記ｍＲＮＡが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、項目９３に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９７）
上記ｍＲＮＡが、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結基を含む、項目９３に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９８）
上記ｍＲＮＡが、全てのホスホロチオエートヌクレオチド間連結基を含む、項目９３に記載の脂質ナノ粒子。
（項目９９）
上記ｍＲＮＡが、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、プソイドウリジン、２−チオウリジン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンシトシンからなる群から独立して選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、項目９３に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１００）
リポソームビヒクルの表面電荷を調節する方法であって、上記リポソームビヒクルが、放出可能な極性ヘッド基を含む少なくとも１つの脂質を含み、上記方法が、上記リポソームビヒクルを少なくとも１つの薬剤と接触させるステップを含み、上記リポソームビヒクルを少なくとも１つの薬剤と接触させるとき、上記極性ヘッド基が、上記脂質から放出され、上記リポソームビヒクルの上記表面電荷がそれによって調節される、方法。
（項目１０１）
上記リポソームビヒクルが、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
上記リポソームビヒクルの正味表面電荷が、上記リポソームビヒクルを上記少なくとも１つの薬剤と接触させる前は少なくとも約＋２５ｍＶであり、上記リポソームビヒクルを上記少なくとも１つの薬剤と接触させた後は約−５．０ｍＶ未満である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
上記リポソームビヒクルが、脂質ナノ粒子である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
上記調節されたリポソームビヒクルの上記正味表面電荷が、約−２５ｍＶ未満である、項目１００に記載の方法。
（項目１０５）
上記調節されたリポソームビヒクルの上記正味表面電荷が、約−５０ｍＶ未満〜約−１０ｍＶである、項目１００に記載の方法。
（項目１０６）
上記調節されたリポソームビヒクルの上記正味表面電荷が、約−５．０ｍＶ未満〜約＋５．０ｍＶである、項目１００に記載の方法。
（項目１０７）
上記薬剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、ジチオエリスリトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤である、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
上記脂質が、構造
【化４９】
2015518472.tif 000036
を有する、項目１００に記載の方法。
（項目１０９）
上記脂質が、構造
【化５０】
2015518472.tif 000037
を有する、項目１００に記載の方法。
（項目１１０）
上記脂質が、構造
【化５１】
2015518472.tif 000038
を有する、項目１００に記載の方法。