(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、３、５、７又は１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及びそれらのアミノ酸配列の一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されてなるアミノ酸配列からなり、ニコチアナミン合成酵素活性を有する蛋白質よりなる群から選ばれる蛋白質。
【請求項２】
配列表の配列番号１７、１９又は２１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及びそれらのアミノ酸配列の一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されてなるアミノ酸配列からなり、ニコチアナミン合成酵素活性を有する蛋白質よりなる群から選ばれる蛋白質。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
塩基配列が配列表の配列番号２、４、６、８又は１２に示される塩基配列からなる、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
塩基配列が配列表の配列番号１８、２０又は２２に示される塩基配列からなる、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡを含有してなるベクター。
【請求項７】
ベクターが発現ベクターである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載されたベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
形質転換体が細菌類である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
形質転換体が高等植物細胞である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載された形質転換体を用いてニコチアナミンを製造する方法。
【請求項１２】
請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡが導入された植物。
【請求項１３】
種子である請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の植物を生育して得られる果実。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項１６】
ポリクローナル抗体である請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である請求項１５に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ムギネ酸の生合成経路におけるニコチアナミン合成酵素、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターで形質転換された細胞、それを用いたニコチアナミンの製造方法、ニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物、及び、ニコチアナミン合成酵素に対する抗体に関する。
背景技術
ムギネ酸（ｍｕｇｉｎｅｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて土中の不溶態Ｆｅ（ＩＩＩ）をキレート化して吸収するいわゆるストラテジーＩＩ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−ＩＩ）によって鉄を吸収するイネ科植物は、鉄のキレーター（ファイトシデロフォア）を根から分泌し、根圏の鉄を可溶化して吸収する（Ｒｏｅｍｈｅｌｄ，１９８７）。その分泌量は鉄欠乏ストレスにより顕著に増加する。ムギネ酸類は現在までに知られている唯一のファイトシデロフォアである（Ｔａｋａｇｉ  １９７６）。したがって、イネ科植物の鉄欠乏耐性能はムギネ酸類の分泌量に依存すると考えられている（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｒｏｅｍｈｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ  １９８６，Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｍｉｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ  １９８９，Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
植物中でのムギネ酸類の生合成経路を第１図に示す。まず、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素によりメチオニンからＳ−アデノシルメチオニンが作られる。次いで、ニコチアナミン合成酵素により３分子のＳ−アデノシルメチオニンが結合して１分子のニコチアナミンが生成される。生成したニコチアナミンは、ニコチアナミンアミノ基転移酵素により３”−ケト体になり、続いて何らかの還元酵素により２’−デオキシムギネ酸になる。これがさらに水酸化されてムギネ酸をはじめとする他のムギネ酸誘導体になる（Ｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  １９８７，Ｓｈｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，ｓｈｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｍａ  ａｎｄ  Ｎｏｍｏｔｏ  １９９３）。
第１図における右下の化合物のＲ１及びＲ２が水素原子でＲ３が水酸基である化合物がムギネ酸である。Ｒ１が水素原子で、Ｒ２及びＲ３が水酸基である化合物が、３−ヒドロキシムギネ酸である。また、Ｒ２が水素原子でＲ１及びＲ３が水酸基である化合物が３−エピヒドロキシムギネ酸である。
オオムギの根から３種のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子が単離されたが、この発現は鉄欠乏で誘導されなかった（Ｔａｋｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。また、オオムギからディファレンシャルスクリーニング法により得られた遺伝子Ｉｄｓ３はデオキシムギネ酸を水酸化してムギネ酸にする酵素の遺伝子であると推定されるが、この発現は鉄欠乏により強く誘導される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。さらに、ニコチアナミンアミノ基転移酵素が鉄欠乏オオムギの根から精製・単離され、その２つの遺伝子Ｎａａｔ−ＡとＮａａｔ−Ｂが単離された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。このＮａａｔ−Ａの発現も、鉄欠乏で誘導された。
Ｓ−アデノシルメチオニンからニコチアナミンを合成する反応は、脱炭酸Ｓ−アデノシルメチオニンからポリアミンを合成する反応と似ている。しかし、ポリアミン合成酵素と違い、ニコチアナミン合成酵素は３分子のＳ−アデノシルメチオニンの結合とアゼチジン環の形成を同時に触媒するものである（第１図）。このようなニコチアナミン合成酵素は新しい型の酵素である。以前、本発明者らは鉄欠乏オオムギ根からのニコチアナミン合成酵素の部分精製と活性の発現パターンについて報告した（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｋａｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６ａ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６ｂ）。しかし、ニコチアナミン合成酵素は抽出、精製の途中で非常に分解され易く、分離精製することは困難であり、部分アミノ酸配列を決定するのに十分な量を得ることも困難であった。
本発明は、ニコチアナミン合成酵素を精製単離し、この遺伝子をクローニングし、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定し、この遺伝子を用いて鉄欠乏に対する耐性の強い植物、特にイネ科植物を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素、又は、その一部のアミノ酸が欠失、他のアミノ酸で置換、若しくはさらに他のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素に関する。
本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。
また、本発明は、前記の遺伝子を含有してなるベクター、及び、当該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明は、前記形質転換体を用いてニコチアナミンを製造する方法に関する。
また、本発明は、前記の遺伝子が導入された植物、特にイネ科植物、及び、これらの植物を生育させて得られる果実に関する。
本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素をチオールプロテアーゼ阻害剤、好ましくはＥ−６４の存在下に抽出する方法に関する。
さらに、本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素に対する抗体に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、以前からニコチアナミン合成酵素の単離を試みてきたが（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ＆Ｓｏｉｌ  １６５巻  Ｐ．１７３〜１７９  １９９４）、本酵素は非常に分解され易く、単離精製が非常に困難であり、部分アミノ酸配列を決定するのに十分な量すら得ることが困難であった。その後、チオールプロテアーゼの阻害剤であるトランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン（ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ（以下、Ｅ−６４と略す））Ｅ−６４によって本酵素の分解が強く抑制されることがわかってきた（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ＆Ｓｏｉｌ  １７８巻  Ｐ．１７１〜１７７  １９９６  ａ）。
今回、液体窒素中で細かい粉状になるまで粉砕した根を、０．１ｍＭのチオールプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４を含む抽出バッファーと速やかに混合するようにしたところ、ニコチアナミン合成酵素タンパク質を単離することができ、その遺伝子も単離することができた。
さらに、本発明の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＳＤＳを除くと活性が回復するが、その回復の程度はかなり低く（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ＆Ｓｏｉｌ  １６５巻  Ｐ．１７３〜１７９  １９９４）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う前にさらに精製度を上げておく必要があった。そこでカラムクロマトグラフィーの方法についても改善が行なわれた。
また、本発明者らは、本発明の酵素は疎水性が比較的高いため、温和な界面活性剤であるＣＨＡＰＳをバッファーに加えることにより、分離能が上昇することを見出した。陰イオン交換クロマトグラフィー担体を何種類か試したところ、ＤＥＡＥセファロースＦＦとＤＥＡＥセファセルがもっとも効果的であった。
ＴＳＫゲル・ブチルトヨパール  ６５０Ｍに加えて、同じく疎水クロマトグラフィー担体であるＴＳＫゲル・エーテルトヨパール  ６５０Ｍが３０〜３５ｋＤａの不純物を取り除くために効果的であった。
本発明の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＳＤＳを除くと活性が回復する３０〜３５ｋＤａのペプチドであることが報告されているが、活性は３０〜３５ｋＤａの間の広い分子量の範囲で検出されていた（第３図参照）。第３図は、酵素活性を有する分画における分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１１％アクリルアミドスラブゲルで行った。ゲルの一部をクマシーブリリアントブルーで染色し、残りを銅染色し３０〜３５ｋＤａを７つに切り分けた（短い線で切った場所を表示）。第３図の横棒は、各ゲル片から検出された酵素活性を相対表示したものである。
そこで、これらの分子量を有する蛋白質の中から、ニコチアナミン合成酵素ペプチドを同定するために、鉄欠乏、及び、対照となるオオムギのそれぞれの根から精製したニコチアナミン合成酵素画分に含まれるペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて比較した。それぞれのオオムギの根２００ｇから、後述する実施例３に記載の方法に従い本酵素を精製した。
対照の酵素活性は鉄欠乏の１／４であった。
本発明の酵素を精製する各段階の活性画分のペプチド組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較したものを、第２図、第１３図、及び、第１４図に示す。第２図、第１３図、及び、第１４図は、鉄欠乏のオオムギの根２００ｇからの精製過程（図中（−）で示す）と、対照のオオムギの根２００ｇからの精製過程（図中（＋）で示す）との比較を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２．５％アクリルアミドスラブゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７巻  Ｐ．６８０〜６８５  １９７０）で行った。ゲルは、クマシーブリリアントブルーで染色した。第２図は、ＤＥＡＥセファロースの前の段階のもので、上段は鉄欠乏のオオムギの根からのものを示し、下段は対照の根からのものを示す。各レーンの、レーン１は粗抽出物２００μｇのものを、レーン２はブチルトヨパール６５０Ｍ後のもの１００μｇのものを、レーン３はヒドロキシルアパタイト後のもの２０μｇのものを、レーン４はブチルトヨパール６５０Ｍ後のもの１５μｇのものを示している。第１３図は、ＤＥＡＥセファロースＦＦ後のもので、各レーン２５μｇのものである。第１４図は、エーテルトヨパール６５０Ｍ後のもので、左側は不活性分画を、右側は活性分画を示し、各画分の１／２５を泳動させたものである。
この結果から、ＤＥＡＥセファロースの前の段階までは鉄欠乏、および対照とでほとんど違いは見られなかった（第２図参照）。ＤＥＡＥセファロース後、３０および３１ｋＤａのペプチドが鉄欠乏で誘導されていることがわかった（第１３図参照）。エーテルトヨパール後、３１ｋＤａペプチドは活性画分から除かれた。新たに３２および３３ｋＤａのペプチドが鉄欠乏で誘導されていることがわかる（第１４図参照）。３２および３３ｋＤａペプチドからは活性が検出されたが、３０ｋＤａペプチドからは検出されなかった（第３図参照）。
次に、本発明の酵素の分子量をゲルろ過により決定した。
ニコチアナミン合成酵素のゲルろ過により推定された分子量は、４０，０００〜５０，０００であると報告されている（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ＆Ｓｏｉｌ  １６５巻Ｐ．１７３〜１７９  １９９４）。しかし、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる値と一致していなかった。
今回、本発明者らは、バッファーにＣＨＡＰＳを加えてゲルろ過を行ったところ分離能が上昇し、本酵素の分子量は３５，０００と推定された（第４図参照）。これは、以前にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定された値とよく一致した。
第４図は、ゲルろ過カラムからのニコチアナミン合成酵素活性の溶出パターンを示す。黒丸印（●）は酵素活性を示し、実線は２８０ｎｍの吸光度を示す。ヒドロキシルアパタイト後の活性画分を、展開バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、０．０５％  ＣＨＡＰＳ、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、３ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で平衡化したセファクリルＳ３００ＨＲ（ファルマシア社）カラム（１．５ｃｍ×７１ｃｍ、１２５ｍｌ）に通した。分子量マーカーは、チログロブリン（Ｍｒ  ６７０，０００）、γ−グロブリン（Ｍｒ  １５８，０００）、オブアルブミン（Ｍｒ  ４４，０００）、ミオグロビン（Ｍｒ  １７，０００）を用いた。線流速１０ｃｍ／時で展開した。
精製したニコチアナミン合成酵素から部分アミノ酸配列を決定した。
１ｋｇの鉄欠乏オオムギの根より、後述する実施例３の方法を用いて、前述した３０ｋＤａ、３２ｋＤａ、および３３ｋＤａのペプチドを精製した。これらを後述する実施例４の方法を用い部分分解した。３２と３３ｋＤａのペプチドは完全には分離できなかったが、配列は互いによく似ているかあるいは  ３２ｋＤａは３３ｋＤａの分解物であると仮定して一緒に分解した。
決定した部分配列からこれらのペプチドは互いによく似ていることがわかった（第５図）。また、３３ｋＤａ、３２ｋＤａ（１）断片は分解前の分子量とほとんど変わらない分子量であったのでこの配列が本酵素のＮ末端領域であると思われた。コンピューター検索によりこれらの配列とよく似た配列を持つ機能未知の遺伝子が、イネおよびシロイヌナズナにあることがわかった。特にイネのＥＳＴ−ｃＤＮＡクローンＤ２３７９２とＤ２４７９０は、前者については３３アミノ酸残基の重なりのうち８０．０％が同一のアミノ酸、後者については１９アミノ酸残基の重なりのうち６８．４％が同一のアミノ酸で非常によく似ていた（第５図）。
第５図は、オオムギ由来のニコチアナミン合成酵素から決定した６つの部分アミノ酸配列と、コンピューター検索により得られたイネの類似の配列とを比較したものである。一致するアミノ酸残基を「：」で示した。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は矢印で示した部分の塩基配列を利用した。
次いで、ニコチアナミン合成酵素ｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列を決定した。
前述した方法で得られた部分アミノ酸配列からデジェネレイトプライマーを合成し、鉄欠乏オオムギ根由来のｃＤＮＡに対してＰＣＲを行ったが、目的のＤＮＡは増幅されてこなかった。そこでイネのＤ２３７９２とＤ２４７９０の配列から、単一の塩基配列を持つプライマー（第５図中に矢印で表示）を合成してＰＣＲを行った。ＮＦおよびＮＲプライマーを用いたＰＣＲで２０５ｂｐの断片が、ＩＦおよびＩＲプライマーを用いたＰＣＲで２７４ｂｐの断片が増幅され、これらは目的の配列を含んでいた。２０５ｂｐの断片をプローブとして、鉄欠乏オオムギ根ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ１９個のクローンが、２７４ｂｐの断片をプローブとしてスクリーニングしたところ８８個のクローンが得られた。
得られたクローンのうちＨｖＮＡＳ１と名付けたものは、９８５ｂｐの翻訳領域を含みそこから推定されるアミノ酸配列は３２８アミノ酸残基で、推定分子量３５，１４４であった。この値はＳＤＳ−ＰＡＧＥやゲルろ過から推定された値とよく一致した。３２ｋＤａおよび３３ｋＤａペプチドから決定された部分アミノ酸配列は全てＨｖＮＡＳ１中に含まれていた（第６図）。
第６図は、ＨｖＮＡＳ１のｃＤＮＡの全長とそこから予想されるアミノ酸配列を示したものである。下線で示した部分は、前記第５図の部分配列と一致している部分を示している。その右側に塩基の数を示した。左側にアミノ酸残基の数を示した。
予想されるｐＩは、５．２で未変性等電点電気泳動による値と一致した。ＨｖＮＡＳ１の他に極めてよく似た配列を持つ６個のクローンＨｖＮＡＳ２、ＨｖＮＡＳ３、ＨｖＮＡＳ４、ＨｖＮＡＳ５、ＨｖＮＡＳ６、ＨｖＮＡＳ７が得られた（表１、第７図）。
第７図は、オオムギから得られた前記の７つのｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列の比較を示したものである。全てのクローンで一致するアミノ酸残基を「＊」で示した。
これらのクローンの塩基配列を配列番号２（ＨｖＮＡＳ１）、配列番号４（ＨｖＮＡＳ２）、配列番号６（ＨｖＮＡＳ３）、配列番号８（ＨｖＮＡＳ４）、配列番号１０（ＨｖＮＡＳ５）、配列番号１２（ＨｖＮＡＳ６）、配列番号１４（ＨｖＮＡＳ７）にそれぞれ示す。また、これらのアミノ酸配列を配列番号１（ＨｖＮＡＳ１）、配列番号３（ＨｖＮＡＳ２）、配列番号５（ＨｖＮＡＳ３）、配列番号７（ＨｖＮＡＳ４）、配列番号９（ＨｖＮＡＳ５）、配列番号１１（ＨｖＮＡＳ６）、配列番号１３（ＨｖＮＡＳ７）にそれぞれ示す。
0003893024.tif 000002
３０ｋＤａペプチドから決定された部分アミノ酸配列は全てＨｖＮＡＳ５に含まれていた。これらのクローンの５’および３’非翻訳領域は互いに似ていなかった。
イネのニコチアナミン合成酵素類似物Ｄ２３７９２とＤ２４７９０は、ＨｖＮＡＳ１と約８０％の相同性を示した。シロイヌナズナのＡＣ００３１１４とＡＢ００５２４５はＨｖＮＡＳ１と約４５％の相同性を示した。
得られたＨｖＮＡＳ１のタンパク質を大腸菌で発現させた。
ＨｖＮＡＳ１のＯＲＦをＰＣＲで増幅してベクターｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、ＨｖＮＡＳ１がマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質はＩＰＴＧにより発現が強く誘導される。
これを用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から粗抽出物を得、融合タンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、ベクターのみでは全く活性は検出されなかったが、ＨｖＮＡＳ１のＯＲＦを導入した場合には活性が検出された。結果を第８図に示す。
第８図は、マルトースバインディングプロテイン−ＨｖＮＡＳ１融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で検出した結果を示すものである。第８図のレーン１は、標準ニコチアナミド（ＮＡ）であり、レーン２はマルトースバインディングプロテイン（ＳＡＭ）のみを発現している大腸菌のものであり、レーン３はマルトースバインディングプロテイン−ＨｖＮＡＳ１融合蛋白質を発現している大腸菌のものである。
後述の実施例７で述べる方法によりノーザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、この遺伝子は鉄欠乏の根で強く誘導されていた（第９図）。これは本酵素活性の発現パターンと一致していた（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。第９図は、ＨｖＮＡＳ１をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す。全ＲＮＡを、鉄欠乏処理開始後１週間のものと、対照のオオムギの葉と根から抽出し、各レーンに５μｇのＲＮＡを泳動した。
また、後述の実施例８で述べる方法によりサザンハイブリダイゼーション解析を行った。ＢａｍＨＩあるいはＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄ  ＩＩＩでＤＮＡを断片化したところ複数の断片が検出されたが、現在得られているどのクローンもＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでは切断されないので、ニコチアナミン合成酵素遺伝子はオオムギおよびイネのゲノム中で複数コピー存在するものと思われた（第１０図）。
第１０図は、ＨｖＮＡＳ１をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す。オオムギとイネの葉から抽出したゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ（レーンＢ）、ＥｃｏＲＩ（レーンＲ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーンＨ）で断片化し、各レーンに１０μｇを泳動した。
さらに、後述する実施例９に述べた方法により調製した抗体を用い、実施例１０で述べる方法によりウエスタンブロット解析を行った。本酵素活性を検出するために調製した粗抽出物中では、本酵素タンパク質は操作中に速やかに分解されることがわかった（第１１図）。この染色パターンは本酵素活性がＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に３０〜３５ｋＤａの間に広がって検出されること（第３図参照）と一致した。
第１１図は、活性検出に用いた粗酵素試料のウエスタンブロット解析の結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２．５％アクリルアミドスラブゲルで行った。１００μｇのタンパク質を泳動した。
後述する実施例１０に述べる方法によりタンパク質を変性させて得られた粗抽出物中では、３５〜３６ｋＤａのほぼ単一のバンドとして検出された（第１２図）。この値はアミノ酸配列から予想された値とよく一致した。
第１２図は、トリクロロ酢酸／アセトンで抽出した全タンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％アクリルアミドスラブゲルで行った。１００μｇのタンパク質を泳動した。根については２００μｇ、葉については５００μｇのタンパク質を泳動した。
２次元電気泳動を行った後ウエスタンブロット解析を行ったところ数個のスポットが検出された。このことは複数のニコチアナミン合成酵素遺伝子が得られたことと一致していた。どのスポットも鉄欠乏の根で誘導されていた。
また、ＨｖＮＡＳ１を制限酵素ＡｐａＬＩとＸｈｏＩで切り出した断片をプローブとして、鉄欠乏イネ根ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、２０個のクローンが得られた。これらのクローンは配列から３種類に分けられ、そのうち１種類だけがＯＲＦ全長を含んでおり、これをＯｓＮＡＳ１と名付けた。ＯｓＮＡＳ１の塩基配列を配列番号１６に、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
ＯｓＮＡＳ１のＯＲＦをＰＣＲで増幅してベクターｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、ＯｓＮＡＳ１がマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質はＩＰＴＧにより発現が強く誘導される。
これを用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から粗抽出物を得、融合タンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、ＨｖＮＡＳ１と同様に活性が検出された。結果を第１５図に示す。第１５図はマルトースバインディングプロテイン−ＯｓＮＡＳ１融合タンパク質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、ＴＬＣで検出した結果を示すものである。第１５図のレーン１は標準ニコチアナミン（ＮＡ）であり、レーン２はマルトースバインディングプロテイン−ＯｓＮＡＳ１融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン３はマルトースバインディングプロテイン−ＨｖＮＡＳ１融合タンパク質を発現している大腸菌のものである。
後述の実施例７で述べる方法によりノーザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、オオムギとは違い、イネでは鉄欠乏処理により根だけでなく葉でも発現が誘導されていた（第１６図）。第１６図はＯｓＮＡＳ１のＯＲＦをプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す。全ＲＮＡを、鉄欠乏処理開始後２週間のものと、対照のイネの葉と根から抽出し、各レーンに５μｇのＲＮＡを泳動した。
コンピューター検索によって得られたＨｖＮＡＳ１に似たアラビドプシス（シロイヌナズナ）の塩基配列をプライマーとして、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子を３つ得た。これをＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３とした。
これらの遺伝子の塩基配列を配列番号１８（ＡｔＮＡＳ１）、配列番号２０（ＡｔＮＡＳ２）、配列番号２２（ＡｔＮＡＳ３）にそれぞれ示す。またこれらのアミノ酸配列を配列番号１７（ＡｔＮＡＳ１）、配列番号１９（ＡｔＮＡＳ２）、配列番号２１（ＡｔＮＡＳ３）にそれぞれ示す。
ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３のＯＲＦをＰＣＲで増幅してベクターｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、それぞれがマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質はＩＰＴＧにより発現が強く誘導される。
これを用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から粗抽出物を得、融合タンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、活性が検出された。結果を第１７図に示す。第１７図はマルトースバインディングプロテイン−ＡｔＮＡＳ融合タンパク質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、ＴＬＣで検出した結果を示すものである。第１７図のレーン１は標準ニコチアナミド（ＮＡ）とＳ−アデノシルメチオニンであり、レーン２はマルトースバインディングプロテインのみを発現している大腸菌のものであり、レーン３はマルトースバインディングプロテイン−ＡｔＮＡＳ１融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン４はマルトースバインディングプロテイン−ＡｔＮＡＳ２融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン５はマルトースバインディングプロテイン−ＡｔＮＡＳ３融合タンパク質を発現している大腸菌のものである。
後述の実施例１１で述べる方法によりＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＡｔＮＡＳ１はシロイヌナズナの根と地上部で発現しており、ＡｔＮＡＳ２は根でも地上部でも発現しておらず、ＡｔＮＡＳ３は根のみで発現していた（第１８図）。第１８図のレーンＭは分子量マーカーであり、地上部、根及び陽性コントロールについて行った。各部について、レーンＣはＡｔＮＡＳ１およびＡｔＮＡＳ２のＯＲＦ全長を増幅したものであり、レーン１はＡｔＮＡＳ１特異的な増幅断片であり、レーン２はＡｔＮＡＳ２特異的な増幅断片であり、レーン３はＡｔＮＡＳ３特異的な増幅断片である。
ムギネ酸類の分泌量は根乾燥重量１ｇあたり１日に２０ｍｇに達する（Ｔａｋａｇｉ  １９９３）。本発明者らが検出した粗精製ニコチアナミン合成酵素活性はこれをまかなうのに足りるものであった。本酵素タンパク質が数種類以上存在していること、および活性のない３０ｋＤａペプチドが存在していることから、これらのペプチドが会合することにより、３分子のＳ−アデノシルメチオニンを結合するのに適した構造となり最大の活性を示す、ということも考えられる。しかしゲルろ過により推定された分子量は３５，０００であった（第４図）。
また、サブユニットが再会合したことによる活性の上昇は現在までのところ観察されていない。さらにマルトースバインディングプロテインとの融合タンパク質の状態でも活性を示したことから、本発明者らは、今のところ本酵素は単量体であると考えている。しかしならが、多量体を形成してより大きな活性を示すという可能性が完全に否定されているわけではない。
Ｓ−アデノシルメチオニンからニコチアナミンを合成する反応機構は、Ｓ−アデノシルメチオニンをメチル基供与体とするメチル基転移反応や、脱炭酸Ｓ−アデノシルメチオニンからスペルミジンやスペルミンを合成する反応と似ていると思われる。これらの酵素に共通の触媒部位についてはタンパク質の高次構造中での等価なアミノ酸残基の配置の類似性が論じられている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｈｌｕｃｋｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
将来、他の植物種のニコチアナミン合成酵素とのアミノ酸配列の比較やＸ線結晶構造解析から触媒部位が明らかになるであろう。
鉄欠乏によるニコチアナミン合成酵素活性の誘導はイネ科植物に特有の現象であり、ムギネ酸類の大量生合成のために必須である。イネは主要なイネ科作物の中でムギネ酸類の分泌量がもっとも少なく、石灰質土壌での鉄欠乏に非常に弱い。
したがって、本発明のニコチアナミン合成酵素の遺伝子をイネ科植物、特にイネに導入し、鉄欠乏時に大量に発現させるようにして鉄欠乏耐性のある形質転換イネを作出することにより、石灰質土壌でのイネの栽培が可能となる。
イネ科植物においてはこれまで、ニコチアナミンはムギネ酸類を合成する前駆体としての役割しか考えられていなかったが、本発明によりニコチアナミン合成酵素の遺伝子は多重遺伝子族を形成していることが明らかになったことから、イネ科植物においても他に重要な役割をはたしていることが考えられる。
イネ科以外のムギネ酸類を分泌しない植物では、ニコチアナミンは体内で、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋といった２価金属陽イオンのキレーターとして働き、これらの金属の恒常性の維持に貢献するのではないかといわれており（ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、イネ科植物でも同様の役割をはたしていることが考えられる。
また、ニコチアナミン合成酵素活性は双子葉植物では、鉄欠乏により誘導されず、本発明の遺伝子の発現も鉄欠乏で誘導されないものと思われる。本発明者らは、シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子をクローン化している。これらの遺伝子のプロモーター領域を比較することにより鉄欠乏による遺伝子発現の機構が明らかにされることにより、本発明の遺伝子がイネ科植物のみならず、双子葉植物においても重要な機能を果たすことになるであろう。
配列表の配列番号１に本発明のニコチアナミン合成酵素のアミノ酸配列を示す。
本発明のニコチアナミン合成酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもののみならず、ニコチアナミン合成酵素の活性を失わない限り、これらのアミノ酸配列の一部、好ましくは全アミノ酸の５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下のアミノ酸が欠失してもよいし、他のアミノ酸で置換されていてもよいし、若しくは、他のアミノ酸が更に付加してしいてもよいし、又は、これらの欠失、置換、付加が組み合わされていてもよい。
また、配列表の配列番号２に本発明のニコチアナミン合成酵素をコードする塩基配列を示す。
本発明のニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列を有するもののみならず、前記したニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子を包含するものである。
本発明の前記遺伝子を導入するベクターとしては、特に制限はないが、種々のベクターに導入することが可能である。好ましいベクターとしては発現ベクターが挙げられる。
本発明の組換えベクターを用いて種々の細胞を常法に従って形質転換することができる。得られた形質転換体を用いてニコチアナミドを大量に製造することができる。これらの方法は当業者によく知られている方法により行うことができる。
本発明の前記遺伝子を導入する宿主としては、各種の細菌類、酵母、細胞類などが挙げられる。好ましくは、植物が挙げられ、特にイネ科植物が好ましい。
遺伝子を導入する方法としては、特に制限はなく、ベクターを使用してもよいし、ゲノムに直接導入してもよい。
本発明のニコチアナミン合成酵素に対する抗体は、常法により本発明のニコチアナミン合成酵素を用いて製造することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもよく、必要ならば、モノクローナル抗体とすることもできる。
さらに、本発明の遺伝子を用いて、植物、好ましくはイネ科植物の品種の改良を行うこともできる。特に、鉄分が欠乏している土壌においても生育できる品種に改良するために、本発明の遺伝子を利用することができる。
実施例
以下に本発明をより具体的に説明するたに実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（植物材料の調製）
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．ｃｖ  エヒメハダカ１号）を湿らせた濾紙の上で発芽させてから標準的な水耕液（Ｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  １９８７）を用いて、自然光のもと、空調設備のない温室で成育させた。水耕液のｐＨ値は、０．５Ｎ  ＨＣｌを用いて毎日５．５に合わせた。第３葉が展開したとき鉄を除いた水耕液に移した。水耕液のｐＨ値は、０．５Ｎ  ＮａＯＨを用いて毎日７．０に合わせた。対照区は引き続き標準的な水耕液で成育させた。水耕液は１週間に１回更新した。鉄欠乏処理開始後２週間以降に第４、５葉に顕著に鉄欠乏クロロシス症状が現れたところで根を採取し、液体窒素で瞬間的に凍結させ、−８０℃で使用時まで保管した。
実施例２（ニコチアナミン合成酵素活性の測定）
すでに本発明者らが発表した測定方法（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６ａ）を改善した方法を用いた。酵素液を反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（以下、ＤＴＴと略す）、１０μＭ（Ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライド（（ｐ−ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（以下、ｐ−ＡＰＭＳＦと略す）、１０μＭ  トランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン（ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ）（以下、Ｅ−６４と略す）、ｐＨ８．７）でバッファー交換した。バッファー交換には限外ろ過フィルターユニット、ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ  ＮＭＷＬ１００００（ミリポア社）を用いた。カルボキシル基が１４Ｃで放射能標識されたＳ−アデノシルメチオニン（アマシャム社）を、終濃度２０μＭとなるように添加し、１５分間２５℃に保った。反応生成物をシリカゲルＬＫ６（ワットマン社）を用い展開溶媒（フェノール：ｎ−ブタノール：ギ酸：水＝１２：３：２：３）で薄層クロマトグラフィーにて分離した。反応生成物の放射活性はイメージアナライザーＢＡＳ−２０００（フジフィルム社）で検出した。タンパク質量はブラッドフォード法によるプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用いて測定した。
実施例３（ニコチアナミン合成酵素の精製）
以下の操作はすべて４℃で行い、ニコチアナミン合成酵素を含む画分には終濃度１０μＭとなるようにＥ−６４を添加した。
凍結した根を液体窒素中で粉状になるまで粉砕し、根１００ｇあたり２００ｍｌの抽出バッファー（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  Ｅ−６４、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、５％（ｗ／ｖ）不溶性ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）（ＰＶＰ）、ｐＨ８．０）を加えて家庭用ジューサーミキサーを用いて混合した。これを、２２，５００ｘｇ３０分間で遠心分離し上清を得た。これに硫酸アンモニウムを終濃度０．４Ｍとなるように加え、１時間静置した。再度２２，５００ｘｇ３０分間で遠心分離し上清を得た。
ＴＳＫゲル・ブチルトヨパール  ６５０Ｍカラム（東ソー社、根１００ｇあたりカラム体積１０ｍｌ）を吸着バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）で平衡化したものに遠心分離上清を通しニコチアナミン合成酵素を吸着させ、溶出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、５％グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、０．０５％３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］プロパンスルホン酸（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、ＣＨＡＰＳと略す）、ｐＨ８．０）で溶出した。
このニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分に、塩化カリウムを終濃度１０ｍＭとなるように、１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）を終濃度１ｍＭとなるように加えた。吸着バッファー（１ｍＭ  Ｋ−Ｐ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）で平衡化したヒドロキシルアパタイト１００〜３５０メッシュ（ナカライ社）をタンパク質１００ｍｇあたり１０ｍｌ用意し、これにニコチアナミン合成酵素を含む画分を通した。ニコチアナミン合成酵素は吸着されずにそのまま出てきた。
この素通り画分をすでに述べたようにＴＳＫゲル・ブチルトヨパール６５０Ｍカラム（タンパク質１０ｍｇあたりカラム体積１ｍｌ）に吸着させ、ニコチアナミン合成酵素を溶出した。
吸着バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、０．０５％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦカラム（ファルマシア社、タンパク質２５ｍｇあたりカラム体積５ｍｌ）にこのニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分を通し、塩化カリウム濃度０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍで段階溶出した。ニコチアナミン合成酵素は０．１５Ｍで溶出された。
ＴＳＫ  ゲル・エーテルトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社、根１００ｇあたりカラム体積１０ｍｌ）を吸着バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、１．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）で平衡化したものにこのニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分を通した。ニコチアナミン合成酵素は吸着されずにそのまま出てきた。これをそのまますでに述べたようにＴＳＫゲル・ブチルトヨパール６５０Ｍカラムに吸着させ、ニコチアナミン合成酵素を溶出した。
以上のカラムクロマトグラフィーにより精製されたニコチアナミン合成酵素を含む画分中のペプチドをさらに、１１％アクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）により分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルを０．３Ｍ  塩化銅で染色し（Ｄｚａｎｄｕ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）分離したペプチドのバンドを切りだした。このゲル片を０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ／０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ９．０）で脱色し、抽出バッファー（１％  ＳＤＳ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）と共にすりつぶした。これをＳＤＳを含まないバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ））を用いて電気抽出し、ペプチドを回収した。
実施例４（部分アミノ酸配列の決定）
単離したニコチアナミン合成酵素を、臭化シアンを用いて化学分解した（Ｇｒｏｓｓ  １９６７）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ニコチアナミン合成酵素を含むゲル片に１０倍体積の７０％（ｖ／ｖ）ギ酸、１％（ｗ／ｖ）臭化シアンを加え４℃で１晩かけて分解した。分解終了後、液体部分を回収し、減圧乾固した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料バッファーに溶かし、１晩室温においた後、トリシンを含む１６．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｃｈａｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｇｏｗ，１９８７）で、分解産物を分離した。泳動終了後ＰＶＤＦ膜にペプチドを転写し（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７９）アミドブラックで染色した。染色されたバンドを切り分け、エドマン分解気相シーケンサー（モデル４９２Ａプロテインシーケンサー、アプライドバイオシステムズ社）により、各ペプチドのＮ末端側からアミノ酸配列を決定した。
実施例５（ニコチアナミン合成酵素遺伝子のクローニング）
得られた部分アミノ酸配列に基づいて合成したプライマーを用い、鉄欠乏オオムギ根由来のｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をランダムプライマーキット（宝酒造）により［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで放射能標識したものをプローブとして、鉄欠乏オオムギ根ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調整したｐＹＨ２３ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。単離したｃＤＮＡクローンについてサイクルシークエンシングキット（島津分光）および島津ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ−１０００Ｌを用いて塩基配列を決定した。
ＨｖＮＡＳ１を制限酵素ＡｐａＬＩとＸｈｏＩで切り出した断片をプローブとして、鉄欠乏イネ根ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。単離したｃＤＮＡクローンについてサイクルシークエンシングキット（島津分光）及び島津ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ−２０００Ｌを用いて塩基配列を決定した。
シロイヌナズナのＡＣ００３１１４とＡＢ００５２４５の塩基配列に基づいて合成したプライマーを用い、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片についてサイクルシークエンシングキット（島津分光）および島津ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ−１０００Ｌを用いて塩基配列を決定した。
決定された塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
実施例６（ＮＡＳ１タンパク質の大腸菌での発現）
ＰＣＲにより、ＨｖＮＡＳ１  ｃＤＮＡの最初のＡＴＧの上流にＥｃｏＲＩサイトを、終止コドンの下流にＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩサイトを導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物をＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−にサブクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次にＥｃｏＲＩサイトとＰｓｔＩサイトを用いてｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、ＨｖＮＡＳ１がマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。
ＰＣＲにより、ＯｓＮＡＳ１の最初のＡＴＧの上流にＥｃｏＲＩサイトを、終止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−にサブクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次にＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いてｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、ＯｓＮＡＳ１がマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。
ＰＣＲにより、ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３の最初のＡＴＧの上流にＥｃｏＲＩサイトを、終止コドンの下流にＸｂａＩサイトを導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物をＥｃｏＲＩサイトとＸｂａＩサイトを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−にサブクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次にＥｃｏＲＩサイトとｘｂａＩサイトを用いてｐＭＡＬ−ｃ２にクローニングし、ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３がそれぞれマルトースバインディングプロテインのＣ末端に融合した形で発現するようにした。
この融合タンパク質を発現させる宿主として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を用いた。ｐＭＡＬ−ｃ２−ＨｖＮＡＳ１とｐＭＡＬ−ｃ２をそれぞれＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入し、アンピシリンとテトラサイクリンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度０．３ｍＭとなるように添加し、引き続き３７℃で培養し３時間後に集菌した。菌体を０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  Ｅ−６４を含む１０ｍＭトリスバッファー  ｐＨ７．４に懸濁し液体窒素で凍結した。これを氷水中で融解し１５秒間の超音波処理を１０回行った。得られた粗抽出物のニコチアナミン合成酵素活性を実施例２で述べた方法で測定した結果、酵素活性が確認された。
実施例７（ノーザンハイブリダイゼーション）
ＨｖＮＡＳ１  ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断したＤＮＡ断片を［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで放射能標識したものをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った。オオムギから全ＲＮＡを抽出し（Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）、１．４％  アガロースゲル電気泳動により分離した後、ハイボンド−Ｎ＋膜（アマシャム社）に転写した。ＯｓＮＡＳ１のＯＲＦ部分を［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで放射能標識したものをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った。イネから全ＲＮＡを抽出し１．４％アガロースゲル電気泳動により分離した後、ハイボンド−Ｎ＋膜（アマシャム社）に転写した。膜を０．５Ｍ  チャーチリン酸（Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ  １９８４）１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含むバッファーを用いて６５℃１晩でプローブとハイブリダイズした。これを４０ｍＭチャーチリン酸、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むバッファーを用いて６５℃１０分間洗浄した。この洗浄をもう１回行った後、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むバッファーを用いて６５℃１０分間洗浄した。放射活性はイメージアナライザーＢＡＳ−２０００で検出した。
結果を第９図及び第１６図に示す。
実施例８（サザンハイブリダイゼーション）
オオムギとイネの葉からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出した。これをＢａｍＨＩ、あるいはＥｃｏＲＩ、あるいはＨｉｎｄＩＩＩで断片化し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で分離した後、ハイボンド−Ｎ＋膜（アマシャム社）に転写した。実施例７で述べた方法でハイブリダイズし、放射活性を検出した。
結果を第１０図に示す。
実施例９（ポリクローナル抗体の調製）
ネズミ２匹を約１００μｇの単離したニコチアナミン合成酵素を抗原として免疫した。抗原としては部分アミノ酸配列を決定したものと同じ試料を用いた。１回目の免疫時には完全フロイントアジュバント、２回目以降は不完全フロイントアジュバントを用いた。４回免疫した後、全採血を行い、血清を−８０℃で保存した。
実施例１０（ウエスタンブロット解析）
トリクロロ酢酸とアセトンを用いて全タンパク質を抽出した（Ｄａｍｅｒｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）。植物体を液体窒素中で粉状になるまで粉砕し、１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を含むアセトンと混合した。−２０℃で１時間静置してタンパク質を沈殿させた後、１６，０００ｘｇ  ３０分遠心して沈殿を回収した。沈殿を０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を含むアセトンに懸濁し、−２０℃で１時間静置してタンパク質を沈殿させた後、１６，０００ｘｇで３０分遠心して沈殿を回収した。沈殿を減圧乾燥した後、試料バッファー（９．５Ｍ尿素（ｕｒｅａ），２％（ｗ／ｖ）トリトン−Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００），５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）に溶かし、１６，０００ｘｇ１０分遠心して上清を得た。これに含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、あるいは変性２次元電気泳動（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ  １９７５）で分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜に対して、実施例９で調製した抗ニコチアナミン合成酵素抗体を１次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体（和光純薬）を２次抗体として、ジアミノベンジジンで発色しウエスタンブロット解析を行った。
結果を第１２図に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％アクリルアミドスラブゲルで行った。１００μｇのタンパク質を泳動した。根については２００μｇ、葉については５００μｇのタンパク質を泳動した。
実施例１１（ＲＴ−ＰＣＲ）
シロイヌナズナから全ＲＮＡを抽出し、その１μｇを鋳型としてＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（パーキンエルマー社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーはＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２、ＡｔＮＡＳ３それぞれに特異的なものを用いた。結果を第１８図に示す。
産業上の利用可能性
本発明の組換えベクターを用いて種々の細胞を常法に従って形質転換することができ、得られた形質転換体を用いてニコチアナミドを大量に製造することができる。これらの方法は当業者に知られている方法により行うことができる。
また、本発明の遺伝子を用いて、植物、好ましくはイネ科植物の品種の改良を行うこともできる。特に、鉄分が欠乏している土壌においても生育できる品種に改良するために、本発明の遺伝子を利用することができる。
【配列表】
0003893024.tif 000003
0003893024.tif 000004
0003893024.tif 000005
0003893024.tif 000006
0003893024.tif 000007
0003893024.tif 000008
0003893024.tif 000009
0003893024.tif 000010
0003893024.tif 000011
0003893024.tif 000012
0003893024.tif 000013
0003893024.tif 000014
0003893024.tif 000015
0003893024.tif 000016
0003893024.tif 000017
0003893024.tif 000018
0003893024.tif 000019
0003893024.tif 000020
0003893024.tif 000021
0003893024.tif 000022
0003893024.tif 000023
0003893024.tif 000024
0003893024.tif 000025
0003893024.tif 000026
0003893024.tif 000027
0003893024.tif 000028
0003893024.tif 000029
0003893024.tif 000030
0003893024.tif 000031
0003893024.tif 000032
0003893024.tif 000033
0003893024.tif 000034
0003893024.tif 000035
0003893024.tif 000036
【図面の簡単な説明】
第１図は、ムギネ酸類の生合成経路を示すものである。
第２図は、鉄欠乏オオムギ及び対照のオオムギの根からの精製過程での両者の比較を示すものである。
第３図は、３０〜３５ｋＤａ付近の分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）を示す。横棒は各ゲル片から検出された酵素活性を相対表示したもの。
第４図は、ゲルろ過カラムからのニコチアナミン合成酵素活性の溶出パターンを示す。黒丸印（●）は酵素活性を示す。
第５図は、オオムギ由来のニコチアナミン合成酵素から決定した６つの部分アミノ酸配列と、コンピューター検索により得られたイネの類似の配列とを比較したものである。一致するアミノ酸残基を「：」で示した。
第６図は、ＨｖＮＡＳ１のｃＤＮＡの全長とそこから予想されるアミノ酸配列を示したものである。下線で示した部分は、前記第５図の部分配列と一致している部分を示している。その右側に塩基の数を示した。左側にアミノ酸残基の数を示した。
第７図は、オオムギから得られた前記の７つのｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列の比較を示したものである。全てのクローンで一致するアミノ酸残基を「＊」で示した。
第８図は、マルトースバインディングプロテイン−ＨｖＮＡＳ１融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で検出した結果を示すものである
第９図は、ＨｖＮＡＳ１をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション解析を示す。
第１０図は、ＨｖＮＡＳ１をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析を示す。
第１１図は、活性検出に用いた粗酵素試料のウエスタンブロット解析を示す。
第１２図は、トリクロロ酢酸／アセトンで抽出した全タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。
第１３図は、鉄欠乏オオムギ及び対照のオオムギの根からの精製過程におけるＤＥＡＥセファロースＦＦ後での両者の比較を示すものである。
第１４図は、鉄欠乏オオムギ及び対照のオオムギの根からの精製過程におけるエーテルトヨパール６５０Ｍ後での両者の比較を示すものである。
第１５図は、マルトースバインディングプロテイン−ＯｓＮＡＳ１融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で検出した結果を示すものである
第１６図は、ＯｓＮＡＳ１をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション解析を示す。
第１７図は、マルトースバインディングプロテイン−ＡｔＮＡＳ１、ＡｔＮＡＳ２又はＡｔＮＡＳ３融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で検出した結果を示すものである
第１８図はシロイヌナズナの地上部及び根から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。右端は陽性コントロールを示す。
【図１】
0003893024.tif 000037
【図２】
0003893024.tif 000038
【図３】
0003893024.tif 000039
【図４】
0003893024.tif 000040
【図５】
0003893024.tif 000041
【図６】
0003893024.tif 000042
【図７】
0003893024.tif 000043
【図８】
0003893024.tif 000044
【図９】
0003893024.tif 000045
【図１０】
0003893024.tif 000046
【図１１】
0003893024.tif 000047
【図１２】
0003893024.tif 000048
【図１３】
0003893024.tif 000049
【図１４】
0003893024.tif 000050
【図１５】
0003893024.tif 000051
【図１６】
0003893024.tif 000052
【図１７】
0003893024.tif 000053
【図１８】
0003893024.tif 000054