【手続補正書】
【提出日】平成28年7月6日(2016.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエの変異株を調製するための方法であって、
Ｍ．ハイオニューモニエのプロモーター領域と少なくとも８０％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある配列である、少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むキャリアベクターを用いることによってＭ．ハイオニューモニエの菌株を形質転換する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
外来性ＤＮＡ配列は、抗生物質に対する耐性遺伝子、リコンビナーゼをコードする遺伝子、トランスポザーゼをコードする遺伝子、トランスポザーゼ標的配列、ＭｈｙｏからのＤＮＡ断片、好ましくは、一又は幾つかのＤＮＡ断片と並べ替えられ或いは再結合された断片、ブタ疾患を引き起こす微生物の抗原成分をコードする遺伝子、及びそれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外来性ＤＮＡ配列は、ブタ疾患を引き起こす微生物の抗原成分をコードする遺伝子と組み合わせた、及び任意でＭｈｙｏ膜タンパク質をコードする遺伝子と組み合わせた、抗生物質に対する耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
キャリアベクターは、
１）マイコプラズマ属の種の菌株のｏｒｉＣ領域を含むＤＮＡ配列、及び
２）Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある、マーカー遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列、及び任意で付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む複製プラスミドベクターであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
キャリアベクターは、
１）トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
２）マーカー遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列、及び
３）任意で、付加的な外来性ＤＮＡ配列
を含むトランスポゾンベクターであって、
トランスポザーゼ及び外来性ＤＮＡ配列の少なくとも一をコードするＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にあることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ベクターはプラスミドであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ベクターが、アクチノバチルス属の種(Actinobacillus sp.)、ブラキスピラ属の種(Brachyspira sp.)、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ属の種（Salmonella sp.）、連鎖球菌属の種（Streptococcus sp.）、イソスポラ属の種（Isospora sp.）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属の種（Leptospira sp.）、ブドウ球菌属の種（Staphylococcus sp.）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム属の種（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属の種（Mycoplasma sp.）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、大腸菌、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後成長不全症候群薬剤、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）及びブタサーコウイルスによって形成された群からの微生物によって引き起こされるブタに影響を及ぼす疾患又は病理学的状態に対する防御応答を誘導する組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項４から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
付加的な外来性ＤＮＡ配列は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドのタンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び前記タンパク質のＮ末端にＭｅｔＳｅｒＧｌｙＳｅｒアミノ酸を付加的に有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドのタンパク質を含むタンパク質をコードするＤＮＡ配列から形成される群から選択され、
ＰＣＶ２カプシドのタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５により形成される群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
付加的な外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域に対して逆向きであるＭｈｙｏ遺伝子であることを特徴とする、請求項４から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、Ｐ３６、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ７６、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ１４６、及びＰ２１６タンパク質により形成される群から選択されるＭｈｙｏタンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含むことを特徴とする、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターは、
トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
マーカー遺伝子をコードし、任意でｌｏｘＰ配列に隣接されたＤＮＡ配列、
（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）ＭｈｙｏＰ４６膜タンパク質の遺伝子をコードする最後の塩基に融合される配列番号４、及び（ｉｉｉ）Ｍｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のアミノ酸９２と９３の間に挿入される配列番号３から選択される配列によって定義されるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を含み、
ここでＤＮＡ配列の各々は、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質又はＰ４６タンパク質のプロモーター領域から選択され、好ましくは、配列番号３及び配列番号４のＰ４６タンパク質のプロモーター領域であるか、好ましくは、配列番号５のＰ９７タンパク質のプロモーター領域である、Ｍｈｙｏのプロモーター領域の制御下にあることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１２】
細菌を形質転換する工程は、二価イオンを含む塩の存在下での細菌のインキュベーション、ポリエチレングリコールの混合物への曝露、又は電気穿孔により実施されることを特徴とする、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細菌を形質転換する工程は、電気穿孔により実施されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電気穿孔を行う前に、Ｍｈｙｏ細菌の懸濁液は、二価イオンキレート剤を含む電気穿孔緩衝液中でのインキュベーションに供されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１）マイコプラズマ属の種の菌株のｏｒｉＣ領域を含むＤＮＡ配列、及び
２）Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある、マーカー遺伝子、及び任意で付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む外来性ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、複製プラスミドベクター。
【請求項１６】
１）トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
２）マーカー遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列及び、
３）任意で、付加的な外来性ＤＮＡ配列
を含み、
トランスポザーゼ及び外来性ＤＮＡ配列の少なくとも一をコードするＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にあることを特徴とする、トランスポゾンベクター。
【請求項１７】
ベクターが、アクチノバチルス属の種(Actinobacillus sp.)、ブラキスピラ属の種(Brachyspira sp.)、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ属の種（Salmonella sp.）、連鎖球菌属の種（Streptococcus sp.）、イソスポラ属の種（Isospora sp.）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属の種（Leptospira sp.）、ブドウ球菌属の種（Staphylococcus sp.）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム属の種（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属の種（Mycoplasma sp.）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、大腸菌、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後成長不全症候群薬剤、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）及びブタサーコウイルスによって形成された群からの微生物によって引き起こされるブタに影響を及ぼす疾患又は病理学的状態に対する防御応答を誘導する組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のベクター。
【請求項１８】
付加的な外来性ＤＮＡ配列は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質をコードする配列、及び前記タンパク質のＮ末端にＭｅｔＳｅｒＧｌｙＳｅｒアミノ酸を付加的に有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質を含むタンパク質をコードする配列により形成される群から選択され、ＰＣＶ２カプシドのタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５により形成される群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、Ｐ３６、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ７６、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ１４６、及びＰ２１６タンパク質により形成される群から選択されるＭｈｙｏタンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含むことを特徴とする、請求項１５から１８の何れか一項に記載のベクター。
【請求項２０】
ベクターは、
トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
マーカー遺伝子をコードし、任意でｌｏｘＰ配列に隣接されたＤＮＡ配列、
（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）ＭｈｙｏＰ４６膜タンパク質の遺伝子をコードする最後の塩基に融合される配列番号４、及び（ｉｉｉ）Ｍｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のアミノ酸９２と９３の間に挿入される配列番号３から選択される配列によって定義されるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を含み、
ここでＤＮＡ配列の各々は、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質又はＰ４６タンパク質のプロモーター領域から選択され、好ましくは、配列番号３及び配列番号４のＰ４６タンパク質のプロモーター領域であるか、好ましくは、配列番号５のＰ９７タンパク質のプロモーター領域である、Ｍｈｙｏのプロモーター領域の制御下にあることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１４の何れか一項に記載の方法により得ることができるＭｈｙｏの変異株。
【請求項２２】
ゲノム又はそれらの細胞質ゾル中に安定的に組み込まれる少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＭｈｙｏの変異株。
【請求項２３】
ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺに寄託されたＭｈｙｏの変異株であり、
受託番号ＤＳＭ２６０２０を有するＭｈｙｏの変異株、
受託番号ＤＳＭ２６０２７を有するＭｈｙｏの変異株、
受託番号ＤＳＭ２６０３３を有するＭｈｙｏの変異株、
受託番号ＤＳＭ２６０３４を有するＭｈｙｏの変異株、及び
受託番号ＤＳＭ２６０４９を有するＭｈｙｏの変異株から選択される、請求項２１に記載の変異株。
【請求項２４】
請求項２１に記載される、Ｍｈｙｏの変異株の免疫学的に有効な量を含む、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ流行性肺炎に対して、及び任意でブタに影響を及ぼす別の疾患又は付加的病理学的状態に対して、ブタを保護するためのワクチン。
【請求項２５】
付加的ワクチン又は抗原性組成物と組み合わされることを特徴とする、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
請求項２１に記載される、変異株の免疫学的に有効な量を含む容器を含む、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ流行性肺炎に対して、及び任意でブタに影響を与える微生物によって引き起こされる別の疾患又は病理学的状態に対して、ブタにワクチン接種するためのワクチン接種キット。