【手続補正書】
【提出日】平成28年6月30日(2016.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１Ａの単一行に示される順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質と、切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、野生型ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、操作されたドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載の１つ以上のタンパク質を含む、単離細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
【請求項８】
前記細胞が、赤血球前駆細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）である、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
前記前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のタンパク質を含む、キット。
【請求項１２】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１３】
細胞におけるグロビン遺伝子発現を改変するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
前記細胞に、請求項５に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上のタンパク質が発現され、前記グロビン遺伝子発現が改変されるような条件下で導入することを含む、方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、グロビン遺伝子の発現を増加させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記グロビン遺伝子が、ガンマグロビンまたはベータグロビン遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ドナー配列を前記細胞のゲノムに組み込むことを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ドナー配列が、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド、またはプラスミドを用いて前記細胞に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞および造血幹細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドナー配列が、内因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ドナー配列が、外因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレアーゼによってなされるゲノム修飾を含む遺伝子修飾された細胞であって、前記ゲノム修飾が、ＢＣＬ１１ａエクソンの標的部位内にあり、さらに、前記ゲノム修飾が、挿入、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、遺伝子修飾された細胞。
【請求項２３】
前記ゲノム修飾が、ＢＣＬ１１ａのエクソン２またはエクソン４内にある、請求項２２に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２４】
前記ゲノム修飾が、配列番号５６、６３、６６、７１、１６０、１７０、１７９、１８３、１８９、１９３、１９７、２００、２０３、２０７、２１１、および２１３からなる群から選択される内因性配列にあるか、またはこの付近にある、請求項２３に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞または造血幹細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）に分化する、請求項２５に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項２５に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２８】
前記ヌクレアーゼが、少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項２２に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが、ポリヌクレオチドとして前記細胞に導入される、請求項２２に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項３０】
前記挿入が、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組み込みを含む、請求項２２に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項３１】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、認識ヘリックスを含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含み、さらに、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１Ａの単一行に示される順序で前記認識ヘリックス領域を含む、請求項２８に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項３２】
細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾するための、請求項２に記載の１つ以上の融合タンパク質を含む組成物であって、前記融合タンパク質が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を切断する、組成物。
【請求項３３】
前記修飾が、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に導入される外因性配列をさらに含む、請求項３２または請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、被験体の１つ以上の細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾することを特徴とする、請求項３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾され、前記細胞が被験体に投与されることを特徴とする、請求項３２〜３５のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
修飾されたＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む細胞を含む組成物であって、前記修飾されたＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む細胞が、被験体における異常ヘモグロビン症の治療に使用されることを特徴とする、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を含むキットもまた、提供される。キットは、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含有される遺伝子をコードするＲＮＡ分子またはＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ９遺伝子）、および必要な場合操作されたｓｇＲＮＡ、またはヌクレアーゼタンパク質の一定分量、ドナー分子、好適な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための指示等を含んでもよい。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１の単一行に示される順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
（項目２）
項目１に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型もしくは操作された切断ドメインまたは野生型もしくは操作された切断ハーフドメインとを含む、融合タンパク質。
（項目３）
項目１または項目２に記載の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目４）
項目２に記載の１つ以上の融合タンパク質または項目３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
（項目５）
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）または前駆細胞からなる群から選択される、項目４に記載の細胞。
（項目６）
前記前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、項目５に記載の細胞。
（項目７）
項目１もしくは項目２に記載のタンパク質または項目３に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
（項目８）
細胞におけるグロビン遺伝子発現を改変する方法であって、
前記細胞に、項目１もしくは項目２に記載の１つ以上のタンパク質または項目３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上のタンパク質が発現され、前記グロビン遺伝子発現が改変されるような条件下で導入することを含む、方法。
（項目９）
前記タンパク質が、グロビン遺伝子の発現を増加させる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記グロビン遺伝子が、ガンマグロビンまたはベータグロビン遺伝子である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ドナー配列を前記細胞のゲノムに組み込むことを更に含む、項目８〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ドナー配列が、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド、またはプラスミドを用いて前記細胞に導入される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞である、項目８〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ＲＢＣ前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
前記ドナー配列が、内因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、項目８〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記ドナー配列が、外因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、項目８〜１４のいずれかに記載の方法。