(57)【要約】【課題】計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる定量方法を提供する。【解決手段】蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、少なくとも上面にフォーカス用マーカを有する既知の厚さの基準部材に対物レンズをフォーカスさせてレンズ位置情報を取得するレンズ位置情報取得ステップ（Ｓ１１，Ｓ１２）と、取得されたレンズ位置情報および基準部材の厚さ情報に基づいて、レンズ位置情報に対する対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する特性算出ステップ（Ｓ１３）と、算出されたフォーカス位置特性および蛍光画像を取得した際のレンズ位置情報に基づいて計測標本の表面からの距離を測定する距離測定ステップ（Ｓ１４）と、測定された距離に対応する検量線を選択して蛍光物質を定量する定量ステップ（Ｓ１５，１６）と、を含む蛍光物質の定量方法。【選択図】図７
2013019703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
標本ステージ上に載置され、少なくとも上面にフォーカス用マーカを有する既知の厚さの基準部材に対物レンズをフォーカスさせて、レンズ位置検出部からレンズ位置情報を取得するレンズ位置情報取得ステップと、
取得された前記レンズ位置情報および前記基準部材の厚さ情報に基づいて、距離測定部において前記レンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する特性算出ステップと、
算出された前記フォーカス位置特性および前記蛍光画像を取得した際の前記レンズ位置情報に基づいて、前記距離測定部において前記蛍光画像を取得した前記フォーカス位置の前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定ステップと、
測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線に基づいて、蛍光物質定量部において前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する定量ステップと、
を含むことを特徴とする蛍光物質の定量方法。
【請求項２】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのカバーグラスに載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項３】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージに直接載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項４】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのスライドグラスに載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項５】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージに前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項６】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのカバーグラスの上面に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項２に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項７】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのスライドグラスの上面に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項８】
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記基準部材に異なる既知の厚さで形成された複数の上面に前記対物レンズを順次フォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項９】
前記レンズ位置情報取得ステップは、厚さの異なる複数の前記基準部材の上面に前記対物レンズを順次フォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項１０】
前記基準部材は、金属、不透明樹脂、透明樹脂のいずれかを基材として、該基材の少なくとも上面の少なくとも一部に前記フォーカス用マーカを有する、ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項１１】
前記フォーカス用マーカは、蛍光色素からなる、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法。
【請求項１２】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法に使用する基準部材であって、
底面が平坦で、上面が段差状に形成された第１の上面および第２の上面を有する基材と、該基材の前記第１の上面および前記第２の上面に形成された前記フォーカス用マーカとを有する、ことを特徴とする基準部材。
【請求項１３】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光物質の定量方法に使用する基準部材であって、
厚さの異なる第１の基材および第２の基材と、前記第１の基材および前記第２の基材の上面にそれぞれ形成された前記フォーカス用マーカとを有する、ことを特徴とする基準部材。
【請求項１４】
前記基材は、金属、不透明樹脂、透明樹脂のいずれかから成る、ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の基準部材。
【請求項１５】
前記フォーカス用マーカは、蛍光色素からなる、ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の基準部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、計測標本の蛍光物質を定量する蛍光物質の定量方法、および該定量方法に使用する基準部材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織や細胞等の計測標本の蛍光物質の定量方法においては、蛍光顕微鏡を用いて計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から、蛍光強度と濃度との関係を示す検量線を用いて蛍光物質を定量するようにしている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１５５５４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、従来の定量方法にあっては、一つの検量線を用いて計測標本の蛍光物質を定量するようにしている。そのため、例えば、検量線用の標準標本の表面から短い距離（浅い位置）の蛍光物質により作成された検量線を用いて、計測標本の表面から長い距離（深い位置）の蛍光物質の定量を行うと、蛍光の散乱の影響が無視できなくなって、定量精度が低下することが懸念される。
【０００５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光物質の定量方法、および該定量方法に使用する基準部材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する第１の観点に係る蛍光物質の定量方法の発明は、
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
標本ステージ上に載置され、少なくとも上面にフォーカス用マーカを有する既知の厚さの基準部材に対物レンズをフォーカスさせて、レンズ位置検出部からレンズ位置情報を取得するレンズ位置情報取得ステップと、
取得された前記レンズ位置情報および前記基準部材の厚さ情報に基づいて、距離測定部において前記レンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する特性算出ステップと、
算出された前記フォーカス位置特性および前記蛍光画像を取得した際の前記レンズ位置情報に基づいて、前記距離測定部において前記蛍光画像を取得した前記フォーカス位置の前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定ステップと、
測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線に基づいて、蛍光物質定量部において前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する定量ステップと、
を含むことを特徴とするものである。
【０００７】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのカバーグラスに載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【０００８】
第３の観点に係る発明は、第１の観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージに直接載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【０００９】
第４の観点に係る発明は、第１の観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのスライドグラスに載置された前記基準部材に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１０】
第５の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージに前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１１】
第６の観点に係る発明は、第２の観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのカバーグラスの上面に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１２】
第７の観点に係る発明は、第４の観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記標本ステージにセットされたプレパラートのスライドグラスの上面に前記対物レンズをフォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１３】
第８の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、前記基準部材に異なる既知の厚さで形成された複数の上面に前記対物レンズを順次フォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１４】
第９の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記レンズ位置情報取得ステップは、厚さの異なる複数の前記基準部材の上面に前記対物レンズを順次フォーカスさせるステップを含む、ことを特徴とするものである。
【００１５】
第１０の観点に係る発明は、第１乃至９のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記基準部材は、金属、不透明樹脂、透明樹脂のいずれかを基材として、該基材の少なくとも上面の少なくとも一部に前記フォーカス用マーカを有する、ことを特徴とするものである。
【００１６】
第１１の観点に係る発明は、第１乃至１０のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法において、
前記フォーカス用マーカは、蛍光色素からなる、ことを特徴とするものである。
【００１７】
さらに、上記目的を達成する第１２の観点に係る蛍光物質の定量方法に使用する基準部材の発明は、
第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法に使用する基準部材であって、
底面が平坦で、上面が段差状に形成された第１の上面および第２の上面を有する基材と、該基材の前記第１の上面および前記第２の上面に形成された前記フォーカス用マーカとを有する、ことを特徴とするものである。
【００１８】
さらに、上記目的を達成する第１３の観点に係る蛍光物質の定量方法に使用する基準部材の発明は、
第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光物質の定量方法に使用する基準部材であって、
厚さの異なる第１の基材および第２の基材と、前記第１の基材および前記第２の基材の上面にそれぞれ形成された前記フォーカス用マーカとを有する、ことを特徴とするものである。
【００１９】
第１４の観点に係る発明は、第１２または１３の観点に係る基準部材において、
前記基材は、金属、不透明樹脂、透明樹脂のいずれかから成る、ことを特徴とするものである。
【００２０】
第１５の観点に係る発明は、第１２乃至１４のいずれかの観点に係る基準部材において、
前記フォーカス用マーカは、蛍光色素からなる、ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によると、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光物質の定量方法、および該定量方法に使用する基準部材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る蛍光物質の定量方法を実施する蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。
【図２】図１の標本ステージ部分を模式的に示す拡大図である。
【図３】図１の距離測定部のブロック図である。
【図４】図１の記憶部に記憶される検量線を示す図である。
【図５】図４の検量線と計測標本の表面からの距離との対応関係を示す図である。
【図６】図１の蛍光物質定量部のブロック図である。
【図７】第１実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【図８】第１実施の形態の変形例を説明するための図である。
【図９】基準部材の一変形例を説明するための図である。
【図１０】本発明の第２実施の形態に係る蛍光物質の定量方法を実施する蛍光顕微鏡システムの標本ステージ部分を模式的に示す拡大図である。
【図１１】第２実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【図１２】第２実施の形態の変形例を説明するための図である。
【図１３】本発明の第３実施の形態に係る蛍光物質の定量方法を実施する蛍光顕微鏡システムの標本ステージ部分を模式的に示す拡大図である。
【図１４】第３実施の形態の変形例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００２４】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光物質の定量方法を実施する蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。図１に示す蛍光顕微鏡システムは、蛍光顕微鏡１０と演算処理部１００とを有する。
【００２５】
蛍光顕微鏡１０は、公知の蛍光顕微鏡、例えば透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡等からなる。図１は、蛍光顕微鏡１０が落射型蛍光顕微鏡の場合を例示するもので、観察用光源１１、標本ステージ１２、蛍光励起用光源１３、対物レンズ１４、レンズ位置検出部１５、カメラ１６を有する。
【００２６】
標本ステージ１２には、蛍光物質で染色（標識）された組織等の計測標本３０を有するプレパラート３１が載置される。プレパラート３１は、図２に標本ステージ１２の部分を模式的に拡大して示すように、スライドグラス３２とカバーグラス３３との間に、計測標本３０を封入剤３４とともに保持して作製される。
【００２７】
本実施の形態では、計測標本３０の厚さｄ１を約４μｍ、スライドグラス３２の厚さｄ２を約１０００μｍ、カバーグラス３３の厚さｄ３を５０μｍとする。カバーグラス３３の上面には、計測標本３０が位置する領域から外れた領域に、後述する対物レンズのレンズ位置情報を取得するための既知の厚さｄ４（例えば、１００μｍ）の基準部材５０が載置される。本実施の形態において、基準部材５０は、アルミニウム等の金属からなる基材５１の上面の少なくとも一部（図２では全面）に、フォーカス用マーカとして、測定対象と同じ蛍光色素５２が塗布されて構成されている。また、標本ステージ１２には、例えばプレパラート３１が位置しない領域の一部に、同様にフォーカス用マーカとして蛍光色素５３が塗布されている。
【００２８】
蛍光励起用光源１３は、超高圧水銀灯、キセノンランプ、紫外線ＬＣＤ、レーザ光源等からなり、計測標本３０の蛍光物質を定量する場合に駆動される。この蛍光励起用光源１３から射出される励起光は、例えば励起フィルタ１７を経てダイクロイックミラー１８で反射されて、対物レンズ１４を経て計測標本３０に照射される。これにより計測標本３０の蛍光物質が励起されて、計測標本３０から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロイックミラー１８および吸収フィルタ１９を経てカメラ１６に入射されて、蛍光画像が形成される。
【００２９】
対物レンズ１４は、フォーカスハンドルやオートフォーカス機構のフォーカス調整機構により、手動的または自動的にフォーカス位置が調整される。なお、オートフォーカス機構は、パッシブ光路差法、コントラスト法、ナイフエッジを用いるアクティブ位相差法等の公知の方式が採用可能である。
【００３０】
レンズ位置検出部１５は、対物レンズ１４のレンズ位置を検出する。検出されたレンズ位置情報は、演算処理部１００に供給される。カメラ１６は、撮像する蛍光画像に応じて、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、フォトマルチプライヤ、マルチスペクトルカメラ等を用いて構成される。カメラ１６で撮像された計測標本３０の画像信号は、演算処理部１００に供給される。
【００３１】
なお、観察用光源１１は、計測標本３０の透過光学像を観察する場合に駆動される。この観察用光源１１から射出された照明光は、反射ミラー２０を含む照明光学系を経て計測標本３０に照射され、その透過光が対物レンズ１４を経て、図示しない接眼光学系や、カメラ１６に導かれる。これにより、蛍光画像と同様に、接眼光学系を経て計測標本３０の透過光学像が観察可能となっており、カメラ１６で撮像された透過光学像が、専用の表示部や後述する演算処理部１００の表示部に表示されるようになっている。
【００３２】
演算処理部１００は、距離測定部１１０、記憶部１２０、蛍光物質定量部１３０、制御部１４０、表示部１５０を有する。
【００３３】
距離測定部１１０は、計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を測定するもので、例えば図３に示すように、記憶部１１１および距離算出部１１２を有する。記憶部１１１には、プレパラート３１を構成する計測標本３０、スライドグラス３２、カバーグラス３３のそれぞれの厚さ情報および基準部材５０の厚さ情報が記憶されるとともに、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報およびカメラ１６からの画像信号が記憶される。また、記憶部１１１には、後述する対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性が記憶される。記憶部１１１に記憶された画像信号は、適宜、蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００３４】
距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶された厚さ情報およびレンズ位置情報に基づいて、フォーカス位置特性を算出して記憶部１１１に記憶する。また、距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶されたフォーカス位置特性と、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報とに基づいて、カバーグラス３３の下面からのフォーカス位置の距離、つまり計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を算出する。距離算出部１１２で算出された距離は、距離情報として蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００３５】
記憶部１２０は、例えば図４に示すような、計測標本３０の表面からの距離に応じた蛍光強度と濃度との関係を示す複数の検量線や、定量結果等の各種のデータを記憶する。なお、図４は、検量線１から検量線５までの５種類の検量線を示しており、各検量線と計測標本３０の表面からの距離との対応関係は、図５に示すようになっている。図４および図５から明らかなように、同じ濃度でも、計測標本３０の表面からの距離が長くなるに従って、蛍光強度は低くなる。
【００３６】
蛍光物質定量部１３０は、例えば図６に示すように、検量線選択部１３１および蛍光分子定量部１３２を有する。検量線選択部１３１は、距離算出部１１２からの距離情報に基づいて、対応する検量線を記憶部１２０から選択する。蛍光分子定量部１３２は、検量線選択部１３１で選択された検量線を用いて、距離算出部１１２からの画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する。その定量結果は、定量情報として制御部１４０に出力される。
【００３７】
制御部１４０は、蛍光顕微鏡１０および演算処理部１００の全体の動作を制御するもので、例えばパーソナルコンピュータで構成される。そして、制御部１４０は、蛍光物質定量部１３０からの定量情報を表示部１５０に表示する。また、制御部１４０は、必要に応じて、表示部１５０に、蛍光顕微鏡１０で取得した計測標本３０の蛍光画像や透過光学像を表示する。
【００３８】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００３９】
本実施の形態では、蛍光顕微鏡１０の標本ステージ１２に、図２に示したようなプレパラート３１をセットし、蛍光励起用光源１３を点灯させて蛍光物質を定量する。ここで、プレパラート３１は、例えば、計測標本３０が肺腺癌患者の病理組織標本の場合、採取されたヒト肺癌病理標本に、ヒト肺癌細胞の核に特異的に結合する蛍光標識抗ＴＦＦ１抗体を結合させて作製する。
【００４０】
先ず、標本ステージ１２にセットされたプレパラート３１のカバーグラス３３の上面に基準部材５０を載置し、その上面に対物レンズ１４をフォーカスさせて、その際にレンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０により取得する（ステップＳ１１）。ここで、基準部材５０の上面への対物レンズ１４のフォーカス動作は、基準部材５０の上面の蛍光色素５２の像を参照して、手動または自動で行われる。この基準部材５０の上面のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。
【００４１】
次に、対物レンズ１４を標本ステージ１２にフォーカスさせて、その際にレンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０により取得する（ステップＳ１２）。ここで、標本ステージ１２への対物レンズ１４のフォーカス動作は、標本ステージ１２に塗布された蛍光色素５３を用いてステップＳ１１の場合と同様に行われる。この標本ステージ１２のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。なお、ステップＳ１１とステップＳ１２とは、逆の順序で行ってもよい。
【００４２】
その後、距離測定部１１０は、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されているプレパラート３１を構成する計測標本３０、スライドグラス３２、カバーグラス３３のそれぞれの厚さ情報および基準部材５０の厚さ情報と、取得された基準部材５０の上面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報および標本ステージ１２のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ１３）。これにより、計測標本３０の表面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報を知ることができる。このフォーカス位置特性は、記憶部１１１に記憶される。
【００４３】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性を用いてレンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ１４）。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００４４】
蛍光物質定量部１３０は、距離測定部１１０から距離情報を受けると、検量線選択部１３１において、受信した距離情報に対応する検量線を記憶部１２０から選択する（ステップＳ１５）。この選択された検量線情報は、蛍光分子定量部１３２に供給される。
【００４５】
その後、蛍光分子定量部１３２は、選択された検量線情報を用いて、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する（ステップＳ１６）。その定量結果は、制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ１７）。
【００４６】
このように、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによると、上面に蛍光色素５２が塗布された厚さが既知の基準部材５０を用い、該基準部材５０の上面に対物レンズ１４をフォーカスさせた際のレンズ位置情報、基準部材５０の厚さ情報、プレパラート３１の厚さ情報等を用いて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する。そして、算出したフォーカス特性を用いて、対物レンズ１４がフォーカスされた計測標本３０の表面からの距離に応じた検量線を選択して、当該フォーカス位置で取得された蛍光画像から蛍光物質を定量する。
【００４７】
したがって、蛍光の散乱の影響を低減でき、蛍光物質を高精度で定量することができる。特に、蛍光物質の蛍光波長領域が近赤外領域の波長の場合は、標本表面からの距離に応じた適切な検量線を選択することにより、標本表面からの距離がより長い場合でも、組織の散乱に影響されずに、蛍光物質を正確に定量することが可能となる。
【００４８】
また、本実施の形態においては、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて、計測標本３０の表面からの距離を測定するので、迅速な距離の測定が可能となり、種々の距離での定量を行う場合の測定時間の短縮が図れる。
【００４９】
なお、基準部材５０は、図８（ａ）に示すように、標本ステージ１２上でプレパラート３１の載置領域から外れた領域に直接載置して、あるいは、図８（ｂ）に示すように、プレパラート３１のスライドグラス３２上で計測標本３０およびカバーグラス３３が位置する領域から外れた領域に載置して、同様にしてフォーカス位置特性を算出することも可能である。
【００５０】
また、基準部材５０の基材５１は、金属に限らず、透明または不透明の樹脂で構成することも可能である。この場合、上面の蛍光色素５２を含む基準部材５０の厚さを、例えば２０μｍ以下に薄くすることができる。また、特に、透明樹脂を基材５１とする場合は、図９に示すように、基材５１の上面の一部および下面の一部に蛍光色素５２，５４を塗布することもできる。そして、これらの蛍光色素５２，５４を利用して基準部材５０の上面および下面にそれぞれフォーカスした際のレンズ位置情報と、基準部材５０の厚さ情報ｄ４とに基づいてフォーカス位置特性を算出することも可能である。
【００５１】
これにより、例えば、基準部材５０を図９に示すようにカバーグラス３３の上面に載置した場合は、対物レンズ１４を基準部材５０の下面の発光色素５４にフォーカスすることで、カバーグラス３３の上面にフォーカスさせたレンズ位置情報を得ることができる。また、基準部材５０を標本ステージ１２上に直接載置した場合は、対物レンズ１４を基準部材５０の下面の発光色素５４にフォーカスすることで、標本ステージ１２にフォーカスさせたレンズ位置情報を得ることができる。同様に、基準部材５０をスライドグラス３２の上面に載置した場合は、対物レンズ１４を基準部材５０の下面の発光色素５４にフォーカスすることで、スライドグラス３２の上面にフォーカスさせたレンズ位置情報を得ることができる。したがって、これらの場合、標本ステージ１２の蛍光色素５３は不要となる。
【００５２】
また、計測標本３０が複数種類の蛍光物質で染色されている場合は、カメラ１６として公知のマルチスペクトルカメラを用いることにより、複数種類の蛍光分子を自動で正確に定量することが可能となる。
【００５３】
また、蛍光顕微鏡１０として、共焦点レーザ顕微鏡を用いた場合は、蛍光の励起範囲を正確に限定することができるので、蛍光物質をより高精度で定量することが可能となる。また、蛍光顕微鏡１０として、透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡、のいずれを用いる場合であっても、励起フィルタ１７、ダイクロイックミラー１８、吸収フィルタ１９の透過波長や反射波長を適切に組み合わせることにより、波長400nmから900nmに撮影感度を有するカメラ１６によって、蛍光を適切に撮影することが可能となり、正確な定量が可能となる。さらに、励起フィルタ１７、ダイクロイックミラー１８、吸収フィルタ１９を適切な波長ごとに組み合わせた蛍光キューブを複数種類搭載し、蛍光の特性にあった蛍光キューブを選択することにより、複数種類の蛍光分子を自動で正確に定量することも可能である。
【００５４】
（第２実施の形態）
本発明の第２実施の形態においては、第１実施の形態で説明した蛍光顕微鏡システムにおいて、標本ステージ１２の蛍光色素５３を省略し、基準部材５０に代えて、図１０に示すように、底面が平坦で、上面が段差状に形成された既知の厚さｄ５の第１の上面６２と、既知の厚さｄ６（＞ｄ５）の第２の上面６３とを有する基準部材６０を用いる。なお、図１０は、図２に対応している。第１の上面６２、第２の上面６３には、それぞれ少なくとも一部にフォーカス用マーカとしての蛍光色素６４，６５が塗布されている。ここで、厚さｄ５、ｄ６は、基準部材６０の基材６１がアルミニウム等の金属からなる場合は、例えばｄ５＝５０μｍ、ｄ６＝１００μｍとすることができ、基材６１が不透明樹脂や透明樹脂からなる場合は、例えばｄ５＝１０μｍ、ｄ６＝２０μｍとすることができる。
【００５５】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、第１実施の形態の構成および図１０を参照しながら、図１１に示すフローチャートに従って説明する。なお、本実施の形態では、基準部材６０をカバーグラス３３上に載置するので、少なくともカバーグラス３３の厚さｄ３が既知であるものとする。
【００５６】
先ず、標本ステージ１２にセットされたプレパラート３１のカバーグラス３３の上面に基準部材６０を載置し、基準部材６０の第１の上面６２に、蛍光色素６４を用いて第１実施の形態の場合と同様にして対物レンズ１４をフォーカスさせて、その際にレンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０により取得する（ステップＳ２１）。次に、同様にして、基準部材６０の第２の上面６３に、蛍光色素６５を用いて対物レンズ１４をフォーカスさせて、その際にレンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０により取得する（ステップＳ２２）。
【００５７】
その後、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されている基準部材６０のｄ５、ｄ６の厚さ情報と、取得された第１の上面６２、第２の上面６３のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ２３）。
【００５８】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性、厚さ情報ｄ５，ｄ３を用いて、レンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ２４）。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００５９】
以後は、図７のステップＳ１５〜Ｓ１７と同様にして、蛍光物質定量部１３０の検量線選択部１３１により、受信した距離情報に対応する検量線が記憶部１２０から選択され（ステップＳ２５）、その選択された検量線情報を用いて、蛍光分子定量部１３２により、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質が定量され（ステップＳ２６）、その定量結果が制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ２７）。
【００６０】
したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００６１】
なお、基準部材６０は、図１２（ａ）に示すように、標本ステージ１２上でプレパラート３１の載置領域から外れた領域に直接載置して、あるいは、図１２（ｂ）に示すように、プレパラート３１のスライドグラス３２上で計測標本３０およびカバーグラス３３が位置する領域から外れた領域に載置して、同様にしてフォーカス位置特性を算出することも可能である。
【００６２】
ここで、計測標本３０の表面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報を検知する場合、プレパラート３１については、図１２（ａ）の場合、少なくともスライドグラス３２の厚さｄ２および計測標本３０の厚さｄ１が既知であればよい。また、図１２（ｂ）の場合は、少なくとも計測標本３０の厚さｄ１が既知であればよい。
【００６３】
（第３実施の形態）
本発明の第３実施の形態においては、第２実施の形態で説明した蛍光顕微鏡システムにおいて、基準部材６０に代えて、図１３に示すように、既知の厚さｄ５の第１の基準部材７０と、既知の厚さｄ６（＞ｄ５）の第２の基準部材８０とを用いる。なお、図１３は、図２に対応している。第１の基準部材７０、第２の基準部材８０は、上記実施の形態と同様に、それぞれの第１の基材７１、第２の基材８１の上面の少なくとも一部（図１３では全面）に、フォーカス用マーカとして、測定対象と同じ蛍光色素７２，８２が塗布されて構成されている。
【００６４】
ここで、第１の基準部材７０、第２の基準部材８０の厚さｄ５，ｄ６は、第２実施の形態の場合と同様に、第１の基材７１、第２の基材８１がアルミニウム等の金属からなる場合は、例えばｄ５＝５０μｍ、ｄ６＝１００μｍとすることができ、不透明樹脂や透明樹脂からなる場合は、例えばｄ５＝１０μｍ、ｄ６＝２０μｍとすることができる。
【００６５】
本実施の形態においては、第２実施の形態における基準部材６０の第１の上面６２を第１の基準部材７０の上面とし、基準部材６０の第２の上面６３を第２の基準部材８０の上面とすることにより、第２実施の形態と同様にして、計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離に応じた検量線を選択して、計測標本３０の蛍光物質を定量することができる。したがって、本実施の形態においても、上記実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００６６】
なお、第１の基準部材７０、第２の基準部材８０は、図１４（ａ）に示すように、標本ステージ１２上でプレパラート３１の載置領域から外れた領域に直接載置して、あるいは、図１４（ｂ）に示すように、プレパラート３１のスライドグラス３２上で計測標本３０およびカバーグラス３３が位置する領域から外れた領域に載置して、図１２（ａ），（ｂ）の場合と同様にしてフォーカス位置特性を算出することも可能である。
【００６７】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、蛍光顕微鏡として透過型蛍光顕微鏡を用い、暗視野観察により蛍光画像を取得して蛍光物質を定量することも可能である。この場合、バックグランドが暗くなるので、微弱な蛍光から高いコントラストの画像を得ることができる。したがって、計測標本の表面からの距離（深さ）に応じた検量線を選択することと相俟って、蛍光物質を高精度かつ高感度で定量することが可能となる。
【００６８】
また、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性は、対物レンズを含む顕微鏡光学系によって決定される。したがって、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性を利用し、そのフォーカス位置特性に、厚さが既知の基準部材の上面のレンズ位置を予め対応付けることで、所望のレンズ位置情報に対する計測標本の表面からのフォーカス位置の距離を算出することも可能である。
【００６９】
また、上記実施の形態では、フォーカス用マーカとして、測定対象と同じ蛍光色素を塗布したが、使用する蛍光励起用光源によっては、蛍光色素以外の対物レンズをフォーカス可能な任意のマーカとすることが可能である。さらに、上記各実施の形態では、基準部材を、基材の少なくとも一部に蛍光物質を塗布して構成したが、基材自身が励起光により蛍光を発する材料からなる場合は、蛍光色素を塗布することなく、基材のみで基準部材を構成することもできる。この場合、基準部材の上面の全てにおいてフォーカス動作が可能となる。
【符号の説明】
【００７０】
１０  蛍光顕微鏡
１１  観察用光源
１２  標本ステージ
１３  蛍光励起用光源
１４  対物レンズ
１５  レンズ位置検出部
１６  カメラ
３０  計測標本
３１  プレパラート
３２  スライドグラス
３３  カバーグラス
３４  封入剤
５０，６０  基準部材
５１，６１  基材
５２，５３，５４，６４，６５，７２，８２  蛍光色素
６２  第１の上面
６３  第２の上面
７０  第１の基準部材
７１  第１の基材
８０  第２の基準部材
８１  第２の基材
１００  演算処理部
１１０  距離測定部
１１１  記憶部
１１２  距離算出部
１２０  記憶部
１３０  蛍光物質定量部
１３１  検量線選択部
１３２  蛍光分子定量部
１４０  制御部
１５０  表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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