(57)【要約】【課題】BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞においてBRCA1非依存性相同組換え修復能のみを抑制し、BRCA1が正常に機能している体細胞のBRCA1依存性相同組換え修復は抑制しない薬剤を開発し、前記癌細胞のみをPRAP1阻害剤等の単鎖切断誘導剤に対して感受性とすることを目的とする。【解決手段】クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質として、該標的タンパク質を抑制する標的タンパク質抑制剤を有効成分とする前記癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤であって、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質として、該標的タンパク質を抑制する標的タンパク質抑制剤を有効成分とする前記増感剤。
【請求項２】
前記タンパク質群がATM、MDC1、RNF8、RNF168、HERC2及びUBC13からなる、請求項１に記載の増感剤。
【請求項３】
前記単鎖切断誘導剤がポリADPリボースポリメラーゼ１阻害剤又はDNA架橋剤である、請求項１又は２に記載の増感剤。
【請求項４】
癌細胞が乳癌細胞又は卵巣癌細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項５】
前記標的タンパク質抑制剤が前記標的タンパク質の遺伝子発現を抑制する発現抑制剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項６】
前記発現抑制剤が前記標的タンパク質のRNA干渉剤、アンチセンス核酸、U1アダプター、リボスイッチ又はそれらをコードする核酸である、請求項５に記載の増感剤。
【請求項７】
前記標的タンパク質抑制剤が前記標的タンパク質の機能を抑制する機能抑制剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項８】
前記機能抑制剤がアプタマー又は抗体である、請求項７に記載の増感剤。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の少なくとも1つの増感剤を包含する医薬組成物。
【請求項１０】
BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤の製造方法であって、
クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質として、該標的タンパク質を抑制する抑制剤を癌細胞に投与する標的タンパク質抑制剤投与工程、
前記癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞を測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定値が前記標的タンパク質抑制剤投与工程を経ていない前記癌細胞の測定値と比較したときに両測定値間に統計学的に有意な差がある場合に、前記標的タンパク質抑制剤を前記増感剤として判定する判定工程
を含む前記製造方法。
【請求項１１】
前記測定工程に先立ち、前記単鎖切断誘導剤を前記癌細胞に投与する単鎖切断誘導剤投与工程をさらに含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記測定が生細胞又は死細胞の測定である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記単鎖切断誘導剤がポリADPリボースポリメラーゼ１阻害剤又はDNA架橋剤である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記タンパク質群がATM、MDC1、RNF8、RNF168、HERC2及びUBC13からなる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
癌細胞が乳癌細胞又は卵巣癌細胞である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記標的タンパク質抑制剤が、前記タンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質とする、RNA干渉剤、アンチセンス核酸、U1アダプター、リボスイッチ、アプタマー又は抗体である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤、それを包含する医薬組成物、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、相同組換え（HR: homologous recombination）、塩基除去修復（base excision repair）、非相同末端再結合（non-homologous end joining）、ミスマッチ修復（mismatch repair）、損傷乗り越え修復（transleisio synthesis）、複製後修復（post replication repair）、FANCONI経路等の多くのDNA修復機構を有する。これらの修復機構は、そのいずれかが無効化した場合、しばしば互いに重複して働くことが知られている。例えば、PARP-1は、単鎖切断修復に必要なタンパク質であり、複製フォーク進行阻害（stalled replication forks）において機能する。また、BRCA1は、相同組換えに必要なタンパク質であり、DNAの二本鎖損傷（DSB: DNA double-strand break）修復時において機能する。ここで、正常細胞にPARP-1阻害剤を適用して単鎖切断修復を阻害した場合、DNA損傷は、相同組換えによって修復される（非特許文献１）。一方、相同組換えに欠陥のある細胞にPARP-1阻害剤を適用した場合には、両DNA修復機構の破綻によってアポトーシスが誘導される（非特許文献２）。また、DNA二本鎖間に架橋が生じた場合には、塩基除去修復、損傷乗り越え修復、複製後修復、及び相同組換え修復が協調して架橋された二本鎖を修復する。それ故、そのいずれかの修復機構（例えば、相同組換え修復）に欠陥のある細胞は、DNA二本鎖間を架橋する薬剤に対して感受性となる。
【０００３】
上記のいわゆる合成致死による効果は、医療分野でも応用されている。例えば、DNA損傷応答に関与する遺伝子変異を原因とする疾患として、家族性乳癌や家族性卵巣癌が知られている。その癌の原因遺伝子はBRCA1遺伝子であり、当該癌細胞ではDNA相同組換え修復を行うことができない。一方、癌細胞以外の体細胞では、BRCA1が正常に機能していることから相同組換え修復を行うことができる。したがって、家族性乳癌患者や家族性卵巣癌患者にPARP-1阻害剤を適用した場合、合成致死によって癌細胞のみを効率的に死滅させることができる（非特許文献１）。
【０００４】
ところが、近年の研究で、BRCA1が正常に機能していない場合であっても、非相同末端再結合に機能する53BP1の発現が低下すれば、BRCA1に依存しない相同組換え修復が作動することが明らかとなった（非特許文献３及び４）。BRCA1が変異し、かつ53BP1の発現が低い癌細胞では、PARP1阻害剤の適用による前記合成致死が無効化されることが示された(非特許文献５及び６）。臨床サンプルを用いた解析でもBRCA1変異を有し、かつ53BP1の発現が低下している家族性乳癌で、PARP1阻害剤による治療成績が悪いことも示されている(非特許文献６)。このような癌細胞を再びPARP1阻害剤に対して感受性にし、合成致死による治療効果を回復させる手段としては、当該癌細胞におけるBRCA1に依存しない相同組換え修復能を抑制する方法が考えられる。しかし、この方法を採用した場合、癌細胞以外の正常な体細胞の相同組換え修復も抑制されるため、PARP1阻害剤による合成致死効果が体細胞にも及び、個体に激烈な副作用を及ぼす問題を伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Helleday, T., 2011, Mol. Oncol., 5: 387-393
【非特許文献２】2005,Nature, 14;434:913-7
【非特許文献３】Bunting S.F., 2010, Cell. 141: 243-54
【非特許文献４】Bouwman P., et al., 2010, Nat Struct Mol Biol., 17: 688-95
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において、BRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制し、BRCA1が正常に機能している体細胞におけるBRCA1依存性相同組換え修復は抑制しない薬剤を開発することによって、前記癌細胞のみをPRAP1阻害剤等の単鎖切断誘導剤に対して感受性とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において、クロマチンのポリユビキチン化を制御する少なくとも一のタンパク質を抑制すれば、その癌細胞のBRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制できることを見出した。つまり、前記タンパク質を抑制した状態の前記癌細胞は、BRCA1変異型癌細胞と同様にPARP1等の単鎖切断誘導剤に対して感受性となった。それ故、前記BRCA1非依存性相同組換え修復能が抑制された癌細胞を単鎖切断誘導剤で処理することで、当該癌細胞を効率的にアポトーシスに誘導することができるようになる。一方、BRCA1が正常な体細胞では、BRCA1依存性相同組換え修復能が機能しているため、前記タンパク質を抑制しても単鎖切断誘導剤に対して耐性を有しており、それ故、アポトーシスは誘導されなかった。本発明は、これらの知見に基づくものであって、以下を提供する。
【０００８】
（１）BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤であって、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質として、該標的タンパク質を抑制する標的タンパク質抑制剤を有効成分とする前記増感剤。
（２）前記タンパク質群がATM、MDC1、RNF8、RNF168、HERC2及びUBC13からなる、（１）に記載の増感剤。
（３）前記単鎖切断誘導剤がポリADPリボースポリメラーゼ１阻害剤又はDNA架橋剤である、（１）又は（２）に記載の増感剤。
（４）癌細胞が乳癌細胞又は卵巣癌細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の増感剤。
（５）前記標的タンパク質抑制剤が前記標的タンパク質の遺伝子発現を抑制する発現抑制剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の増感剤。
（６）前記発現抑制剤が前記標的タンパク質のRNA干渉剤、アンチセンス核酸又はU1アダプターである、（５）に記載の増感剤。
（７）前記標的タンパク質抑制剤が前記標的タンパク質の機能を抑制する機能抑制剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の増感剤。
（８）前記機能抑制剤がアプタマー又は抗体である、（７）に記載の増感剤。
（９）（１）〜（８）に記載の少なくとも1つの増感剤を包含する医薬組成物。
（１０）BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤の製造方法であって、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質として、該標的タンパク質を抑制する抑制剤を癌細胞に投与する標的タンパク質抑制剤投与工程、前記癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞を測定する測定工程、及び前記測定工程で得られた測定値が前記標的タンパク質抑制剤投与工程を経ていない前記癌細胞の測定値と比較したときに両測定値間に統計学的に有意な差がある場合に前記標的タンパク質抑制剤を前記増感剤として判定する判定工程を含む前記製造方法。
（１１）前記測定工程に先立ち、前記単鎖切断誘導剤を前記癌細胞に投与する単鎖切断誘導剤投与工程をさらに含む、（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記測定が生細胞又は死細胞の測定である、（１１）に記載の製造方法。
（１３）前記単鎖切断誘導剤がポリADPリボースポリメラーゼ1阻害剤又はDNA架橋剤である、（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）前記タンパク質群がATM、MDC1、RNF8、RNF168、HERC2及びUBC13からなる、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１５）癌細胞が乳癌細胞又は卵巣癌細胞である、（１０）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）前記標的タンパク質抑制剤が、前記タンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質を標的タンパク質とする、RNA干渉剤、アンチセンス核酸、U1アダプター、アプタマー又は抗体である、（１０）〜（１５）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の単鎖切断誘導剤増感剤によれば、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下することで単鎖切断誘導剤に対する耐性を獲得した癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にすることができる。したがって、単鎖切断誘導剤と併用することで合成致死効果により前記癌細胞を効率的に死滅させることができる。一方、BRCA1が正常に機能している細胞では、単鎖切断誘導剤と併用してもDNA相同組換え修復能により合成致死を生じないことから、副作用が極めて小さいという利点を有する。
【００１０】
本発明の医薬組成物によれば、有効成分である本発明の単鎖切断誘導剤増感剤により、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にすることができる。
【００１１】
本発明の単鎖切断誘導剤増感剤の製造方法によれば、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にすることのできる単鎖切断誘導剤増感剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の単鎖切断誘導剤増感剤の製造方法のフロー図である。実線で囲んだ工程は必須工程を示し、破線で囲んだ工程は選択工程を示す。
【図２】各siRNAをトランスフェクションした細胞における各siRNAの標的タンパク質の発現を示すウェスタンブロット図である。図中、星印の位置のバンドは、非特異的バンドを示す。
【図３−１】標的タンパク質阻害剤をsiRNF8としたときの免疫蛍光顕微鏡による共焦点画像を示す。2Gyは、2グレイで放射線照射した細胞であり、No IRは、放射線照射していない細胞である。左カラムは抗RAD51抗体で染色したときのRAD51の局在（foci）を、また右カラムは抗γ-H2AX抗体で染色したときのγ-H2AXの局在（foci）をそれぞれ示す。スケールバーは、25μmである。
【図３−２】図３−１の結果（N=3）に基づいて、5個以上のRAD51のfociが確認された細胞を定量化したグラフである。
【図４】標的タンパク質阻害剤をsiRNF168としたとき、図３−１と同様の免疫蛍光顕微鏡解析法（N=3）に基づいて、5個以上のRAD51のfociが確認された細胞を定量化したグラフである。
【図５−１】免疫蛍光顕微鏡による共焦点画像である。2Gyは、2グレイで放射線照射した細胞であり、No IRは、放射線照射していない細胞である。左カラムは抗RAD51抗体で染色したときのRAD51の局在（foci）を、また右カラムは抗53BP1抗体で染色したときの53BP1の局在（foci）をそれぞれ示す。スケールバーは、25μmである。
【図５−２】図５−１の結果（N=3）に基づいて、5個以上のRAD51のfociが確認された細胞を定量化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．単鎖切断誘導剤増感剤
１−１．概要と定義
本発明の第１の態様は、BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤である。当該増感剤は、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質のいずれか一以上を抑制する標的タンパク質抑制剤を有効成分とすることを特徴とする。
【００１４】
本明細書において遺伝子の「変異」とは、機能欠損型変異であって、それ故、その遺伝子より発現するタンパク質は不活性型である。また、ここでいう遺伝子の「発現量が低下した」とは、遺伝子の発現量がその遺伝子のコードするタンパク質が本来の機能を発揮する上で必要な量に達していない状態をいう。
【００１５】
「BRCA1遺伝子」は、家族性乳癌や家族性卵巣癌の発症に関連する遺伝子として単離された癌抑制遺伝子であり、そのタンパク質（BRCA1）は、環境因子や放射線等により損傷を受けたDNAを相同組換え機構によって修復する機能（DNA相同組換え修復能）を有することが知られている（Moynahan M.E., et al., 1999, Mol. Cell., 4(4):511-8）。したがって、通常、BRCA1遺伝子が変異した又はその発現量が低下することによりBRCA1が機能障害を起こした場合には、その細胞のDNA相同組換え修復能は失われ、BRCA1変異型癌細胞を生じ得る。
【００１６】
本明細書において「BRCA1変異型癌細胞」とは、前記BRCA1の機能障害によるDNA相同組換え修復能の喪失に起因して生じる癌細胞であって、後述するBRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子の両方が変異した又はその発現量が低下した癌細胞を除いたものをいう。BRCA1変異型癌には、例えば、大部分の家族性乳癌、家族性卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膵臓癌、大腸癌、精巣癌及び前立腺癌が挙げられる。BRCA1変異型癌細胞は、DNA相同組換え修復能が喪失しているため単鎖切断誘導剤に対する感受性が高く、通常、後述する単鎖切断誘導剤の適用により直ちにアポトーシスが誘導され死滅する。
【００１７】
「53BP1遺伝子」は、DNA損傷の修復に関与するタンパク質因子である53BP1をコードする。53BP1は、DNAの二本鎖切断損傷に応答して、ヒストンH4における20位のリジンのジメチル化を認識して、前記BRCA1等の各種DNA損傷修復因子と共に損傷部位にリクルートされる（Sanders S.L., et al., 2004, Cell,119(5):603-14）。53BP1遺伝子の変異や発現量の低下により、53BP1のみが機能障害を起こした場合には、放射線高感受性となる。
【００１８】
本明細書において「BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞」とは、細胞内においてBRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異又はその発現量が低下することによって、BRCA1及び53BP1の両者が機能障害を起こした状態の癌細胞をいう。当該癌細胞では、BRCA1が機能障害を起こしているにもかかわらず、DNA相同組換え修復能が作動する。その機序はまだ明らかにされていないが、このような癌細胞では、BRCA1変異に依存しないDNA相同組換え修復能（BRCA1非依存性相同組換え修復能）を有するため、単鎖切断誘導剤に対する耐性が高い。本明細書では、このような癌細胞をしばしば「BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞」と称する。BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌には、一部の、家族性乳癌、家族性卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膵臓癌、大腸癌、精巣癌、前立腺癌が挙げられる。すなわち、DNA相同組換え修復能の喪失に起因する癌には、大多数のBRCA1変異型癌と、一部にBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌が含まれる場合が多い。前述のように、単鎖切断誘導剤は、BRCA1変異型癌には有効であるが、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌には効果がない。これが、同様の病状を呈する家族性乳癌等であっても一部患者には単鎖切断誘導剤による治療効果がない原因である。
【００１９】
本明細書において「単鎖切断誘導剤」とは、DNAの単鎖切断を誘導する薬剤である。例えば、単鎖切断修復系に関与するいずれかの因子の機能を抑制する薬剤、又はDNA二本鎖間を架橋する薬剤が挙げられる。
【００２０】
本明細書において「単鎖切断修復系」とは、塩基除去修復やミスマッチ修復等を含むDNAの一本鎖切断修復系をいう。単鎖切断修復系とDNA相同組換え修復系は、DNA損傷が生じたときに、いずれか一方が機能する限り、細胞は正常細胞、癌細胞に関わらず維持される。一方、両修復系が機能しなくなった細胞では、DNA修復機能が破綻し、アポトーシスが誘導される。単鎖切断修復系に関与する因子としては、例えば、ポリADPリボースポリメラーゼ１（poly(ADP-ribose)polymerase 1：以下、しばしば「PARP1」とする）のような塩基除去修復に関与する遺伝子群、ミスマッチ修復に関与する遺伝子群、損傷乗り越え修復に関与する遺伝子群、複製後修復に関与する遺伝子群、Fanconi経路に関与する遺伝子群等が挙げられる。
【００２１】
「単鎖切断修復系に関与する因子の機能を抑制する薬剤」の例としては、PARP1阻害剤が挙げられる。PARP1阻害剤には、例えば、BSI-201（商品名：iniparib；BiPar Sciences）、ADZ2281（商品名：Olaparib；Astra Zeneca)、ABT-888（商品名：Veniparib； Abbott）が含まれる。
【００２２】
また、「DNA二本鎖間を架橋する薬剤」の例としては、DNA架橋剤が挙げられる。DNA架橋剤には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンCが含まれる。
【００２３】
１−２．構成 
「BRCA1遺伝子及び53BP1遺伝子が変異した又はその発現量が低下した癌細胞において単鎖切断誘導剤に対する感受性を増感させる増感剤」（以下、本明細書ではしばしば「単鎖切断誘導剤（の）増感剤」又は単に「増感剤」と略称する）とは、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞の単鎖切断誘導剤に対する感受性をBRCA1変異型癌細胞と同程度にまで回復させる薬剤をいう。本態様の増感剤は、標的タンパク質抑制剤を有効成分とする。
【００２４】
本明細書において「標的タンパク質抑制剤」は、特定の標的タンパク質を特異的に抑制する薬理効果を有する薬剤である。本明細書において、「標的タンパク質」とは、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質である。したがって、本明細書において「標的タンパク質抑制剤」とは、細胞内におけるクロマチンのポリユビキチン化の抑制剤を意味する。クロマチンのポリユビキチン化は、DNAの二本鎖損傷に応答して作動するシグナル伝達系によって制御されている。このシグナル伝達系は、複数のタンパク質群によって構成されているが、本明細書の標的タンパク質は、そのタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質であればよい。具体的には、例えば、ATM（Ataxia-Telangiectasia Mutated:末梢血管拡張性運動失調症変異遺伝子）（McKinnon P.J., 2004, EMBO Rep., 5(8):772-6）、MDC1（mediator of DNA-damage checkpoint 1:DNA損傷チェックポイント仲介因子１）（Stucki M. and Jackson S.P., 2006, DNA Repair (Amst), 5(5):534-43）、RNF8（Ring Finger Protein 8：リングフィンガータンパク質8）（Kolas N.K., et al., 2007, Science. 318(5856):1637-40）、RNF168（Ring Finger Protein 168：リングフィンガータンパク質168）（Stewart G.S., et al., 2009, Cell, 136(3):420-34）、HERC2（hect domain and RLD 2：ヘクトドメインとRLD2）（Bekker-Jensen S.,et al., 2010, Nat Cell Biol. 12(1):80-6）及びUBC13（UBiquitin−Conjugating enzyme 13：ユビキチン結合酵素13）（Zhao G.Y., et al., 2007, Mol. Cell, 25(5):663-75）が挙げられる。
【００２５】
前記標的タンパク質抑制剤には、発現抑制剤及び機能抑制剤が含まれる。本態様の増感剤は、異なる標的タンパク質を抑制する一又は二以上の発現抑制剤を標的タンパク質抑制剤として包含でき、また異なる標的タンパク質を抑制する一又は二以上の機能抑制剤を標的タンパク質抑制剤として包含できる。さらに、同一の又は異なる標的タンパク質を抑制する一又は二以上の発現抑制剤と機能抑制剤の組合せを標的タンパク質抑制剤として包含することもできる。以下、発現抑制剤及び機能抑制剤について具体的に説明をする。
【００２６】
Ａ．発現抑制剤
本明細書において「発現抑制剤」とは、前記標的タンパク質の遺伝子発現を抑制する機能を有する薬剤である。すなわち、発現抑制剤は、標的タンパク質が転写された後、翻訳されるまでの間に当該タンパク質の発現を阻害又は抑制する物質である。例えば、核内において標的タンパク質の転写後、標的タンパク質のmRNAスプライシングを特異的に阻害又は抑制する物質、標的タンパク質の成熟mRNAの核外輸送を特異的に阻害又は抑制する物質、核外において標的タンパク質のmRNAを分解する（サイレンシングを含む）物質又は標的タンパク質のmRNAの翻訳を阻害する物質が挙げられる。本明細書において、標的タンパク質のmRNAを分解する物質及び／又は標的タンパク質のmRNAの翻訳を阻害する物質としては、例えば、標的タンパク質のRNA干渉剤、アンチセンス核酸、又はU1アダプターが挙げられる。以下、それらについて具体的に説明をする。
【００２７】
Ａ−１．RNA干渉剤
「RNA干渉剤」とは、生体内においてRNA干渉（RNA inteference：RNAi）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）する核酸分子をいう。例えば、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA)（pri-miRNA、pre-miRNAを含む）が挙げられる (Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162）を参照)。
【００２８】
（１）siRNA
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤の一の実施形態は、前記標的タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を標的とするsiRNAである。「siRNA」（短分子干渉RNA:small interference RNA）は、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。siRNAは、細胞（真核細胞）へ導入することによって配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができる（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。
【００２９】
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのsiRNAは、例えばsiRNAセンス鎖の塩基配列として、標的タンパク質が、ヒトATM遺伝子であればアクセッションNo. NM_000051.3で示される塩基配列、ヒトMDC1遺伝子であればアクセッションNo. NM_014641.2で示される塩基配列、ヒトRNF8遺伝子であればアクセッションNo. NM_003958.3で示される塩基配列、ヒトRNF168遺伝子であればアクセッションNo. NM_152617.3で示される塩基配列、ヒトHERC2遺伝子であればアクセッションNo. NM_004667.4で示される塩基配列、そしてヒトUBC13遺伝子であればアクセッションNo. NM_003348.3で示される塩基配列のうち15塩基以上35塩基以下、好ましくは15塩基以上30塩基以下、より好ましくは18塩基以上25塩基以下の連続した塩基配列を含む。好適には、開始コドンから少なくとも50塩基、より好ましくは70塩基〜100塩基よりも下流の塩基配列である。
【００３０】
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのsiRNAは、標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 32:936-948, 2004）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 1050-1058, 2004）らの方法にに基づいて、その配列を設計することができる。また、種々の研究機関や企業によって、siRNA設計が可能なウェブサイトが公開されており、有効なsiRNAをウェブ上で設計することが可能である。代表的なsiRNA設計ウェブサイトとしては、siDirect（http://design.RNAi.jp/）、siSearch（http://www.epigeneticstation.com/epigenetic-links/detail/link-203.html）、siDESIGN Center（http://www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx）、siRNA Selection Server （http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）、Gene Specific siRNA Selector（http://bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm）などが挙げられる。
siRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。
【００３１】
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのsiRNAは、化学的合成法又は当該分野で公知のインビトロRNA転写法によって調製したものを使用することができる。好ましくは、化学的合成法によって調製したものである。siRNAの調製は、現在、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらのメーカーに委託し、調製されたものを使用してもよい。
【００３２】
前記siRNAの一方の末端又は両末端には、付加的なヌクレオチドを連結することもできる。付加するヌクレオチドの数は、特に限定はしないが、通常は1〜20個の範囲内が好ましい。例えば、siRNAのセンス鎖側及びRNAアンチセンス鎖側の3’末端側にTT（チミン−チミン）又はUU（ウラシル−ウラシル）等を付加することができる。
【００３３】
（２）shRNA
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤の一の実施形態は、標的タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を標的とするshRNAである。「shRNA」とは、前記siRNA又は後述する成熟型二本鎖miRNAが適当な短いスペーサで連結された一本鎖RNAをいう。したがって、shRNAは、一分子内でセンス鎖領域とアンチセンス鎖領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサがループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を有する。スペーサは、通常3〜24ヌクレオチド、好ましくは、4〜15ヌクレオチドあればよい。したがって、shRNAは、全体として41〜80ヌクレオチド、好ましくは45〜70ヌクレオチド、より好ましくは48〜65ヌクレオチドで構成される。スペーサの塩基配列は、自己アニーリングやセンス鎖領域間とのアニーリング等の分子内フォールディングによる高次構造を形成しない配列であれば、特に制限しない。
【００３４】
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのshRNAも、化学的合成法又は当該分野で公知のインビトロRNA転写法によって調製したものを使用することができる。またライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらのメーカーに委託し、調製されたものを使用してもよい。
【００３５】
（３）miRNA（pri-miRNA、pre-miRNAを含む）
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤の一の実施形態は、標的タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を標的とするmiRNAである。「miRNA」とは、生体内に存在し、特定の遺伝子の発現を調節する長さ18〜25塩基長の一本鎖ノンコーディングRNAである。このRNAは、標的遺伝子のmRNA及びタンパク質因子と結合して複合体を形成し、標的遺伝子の翻訳を阻害することが知られている。miRNAは、pri-miRNAと呼ばれる一本鎖の前駆体状態でゲノムから転写された後、核内でDroshaと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりpre-miRNAと呼ばれるさらなる一本鎖前駆体状態にプロセシングされ、核外でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによってmiRNA鎖とmiRNAスター鎖からなる成熟型二本鎖miRNAとなり、そのうちmiRNA鎖がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取り込まれて、成熟型一本鎖miRNAとなり標的遺伝子発現を抑制する（David P. Bartel, Cell, Vol. 116, 281-297, January 23, 2004,）。本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのmiRNAは、標的タンパク質をコードする遺伝子のmiRNAが存在する限りにおいて、pri-miRNA、pre-miRNA及び成熟型二本鎖miRNAのいずれのmiRNAを包含する。
【００３６】
Ａ−２．アンチセンス核酸
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤の一の実施形態は、前記標的タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸である。ここで言う核酸は、DNA又はRNAのみならず、例えば、PNAやLNAのような核酸類似体も含む。本発明で使用する「アンチセンス核酸」は、標的タンパク質をコードする遺伝子のmRNA全体若しくはその一部に相補的な配列を有する核酸分子であり、細胞内においてその標的タンパク質をコードする遺伝子のmRNAに結合して、遺伝子発現を抑制することができる。
【００３７】
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野における公知の合成又は転写技術を用いて作製することができる。例えば、Sambrook, J. et. al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。
【００３８】
Ａ−３．U1アダプター
本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤の一の実施形態は、前記標的タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を標的とするU1アダプターである。「U1アダプター」とは、約25塩基からなる二機能性のオリゴヌクレオチドであって、標的遺伝子のmRNA前駆体における3'末エクソンに相補的な5'側の「標的ドメイン」とU1 snRNAの5’領域に相補的な配列を有する3'側の「U1ドメイン」を含む（Goraczniak R., et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263,）。生体内にU1アダプターを導入するとU1 snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質(U1 snRNP)が標的遺伝子のmRNA前駆体のポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のmRNA前駆体は不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。したがって、例えば、アクセッションNo. NM_000051.3で示される塩基配列を有するヒトATM遺伝子、アクセッションNo. NM_014641.2で示される塩基配列を有するヒトMDC1遺伝子、アクセッションNo. NM_003958.3で示される塩基配列を有するヒトRNF8遺伝子、アクセッションNo. NM_152617.3で示される塩基配列を有するヒトRNF168遺伝子、アクセッションNo. NM_004667.4で示される塩基配列を有するヒトHERC2遺伝子、又はアクセッションNo. NM_003348.3で示される塩基配列を有するヒトUBC13遺伝子を標的遺伝子とする場合、本態様の増感剤における標的タンパク質抑制剤としてのU1アダプターは、前記標的遺伝子の3'末エクソンに相補的な標的ドメインを有するU1アダプターが該当する。
【００３９】
Ｂ．機能抑制剤
本明細書において「機能抑制剤」とは、前記標的タンパク質の活性部位等に直接的に又は間接的に作用して、標的タンパク質が有する特有の機能を分解、競合、結合、立体的阻害等により失活又は抑制する薬剤である。機能抑制剤は、核酸分子、ペプチド分子、低分子化合物又はそれらの組合せのいずれで構成されていてもよい。核酸分子で構成される機能抑制剤としては、例えば、核酸アプタマーが挙げられる。また、ペプチド分子で構成される機能抑制剤としては、例えば、抗体やペプチドアプタマーが挙げられる。以下、機能抑制剤の具体例として、アプタマー、抗体、及び低分子化合物について説明をする。
【００４０】
Ｂ−１．アプタマー
「アプタマー」とは、それ自身の立体構造によって標的分子（ここでは標的タンパク質）に特異的に結合して、その機能を阻害又は抑制することのできる核酸分子やペプチドをいう。本明細書におけるアプタマーは、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。
【００４１】
（１）核酸アプタマー
「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーで、RNAで構成されるRNAアプタマーと、DNAで構成されるDNAアプタマーが知られるが、本発明の核酸に含まれる核酸アプタマーは、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれで構成されていてもよい。RNAアプタマーは、RNAの性質に基づいて、一般に、DNAと比較して、より多くの立体構造を形成できる柔軟性を有する点で優れており、DNAアプタマーは、生体内でRNAよりも安定性が高い点において優れている。必要に応じて適切な核酸アプタマーを適宜使用すればよい。
【００４２】
核酸アプタマーは、標的分子に対する特異性及び親和性が、通常、抗体よりも高く、それ故、標的分子と特異的に直接かつ強固に結合できる。また、結合に必要な標的のアミノ酸残基数が抗体のそれと比較して少なくてもよいことから、例えば、互いに相同性の高いタンパク質群の中で特定のタンパク質の機能のみを抑制させたい場合には抗体よりも優れている。アプタマーに関しては、例えば、Jaynasena S.D., (1999) Clin. Chem. 45:1628-1650を参照されたい。
【００４３】
本明細書における核酸アプタマーは、例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有するDNA又はRNAで構成されたプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後にその核酸分子を核酸増幅法で増幅した後、DNA分子の場合はそのまま、RNA分子の場合はRT-PCR等で得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、次のラウンドのプールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い分子を選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。通常、ランダム配列領域は20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲である。最終的に得られた核酸分子を核酸アプタマーとして利用する。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1995) 92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
【００４４】
（２）ペプチドアプタマー
「ペプチドアプタマー」は、アミノ酸で構成されるアプタマーで、抗体と同様に、特定の標的分子の表面構造を認識して、特異的に結合する1〜6kDのペプチド分子である。ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法を用いて製造することができる。ペプチドアプタマーの製造法は、当該分野で公知の方法に基づいて作製すればよい。例えば、Whaley,S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668を参照することができる。
【００４５】
Ｂ−２．抗体
本明細書における抗体は、標的タンパク質に結合してその機能を抑制する中和抗体として機能し得る。本明細書の抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体、及び抗体フラグメントを含む。
【００４６】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）であってもよい。機能抑制剤としてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる場合、抗体は、本態様の増感剤を投与する生物種と同種由来の抗体であることが好ましい。例えば、増感剤をヒトに投与する場合、機能抑制剤としてのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。
【００４７】
「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は多重特異性抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。これによりヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、適当なヒト抗体の可変領域（V領域）における相補性決定領域（CDR）をマウスモノクローナル抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
【００４８】
「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
【００４９】
「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab’2）、Fv等が該当する。
抗体は、修飾されていてもよい。抗体の修飾には、機能上の修飾又は標識上の修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素（フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP、）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
【００５０】
（ｃ）低分子化合物
本明細書において「低分子化合物」とは、分子量5000以下、好ましくは2000以下、より好ましくは1000以下の化合物が該当する。例えば、ホルモン（例えば、ステロイドホルモン等）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び免疫抑制剤等の様々な医薬化合物が挙げられる。本明細書の低分子化合物は、前記低分子化合物と同等の薬理活性を有する低分子化合物の誘導体、又はその塩も含む。
【００５１】
１−３．効果
本態様の増感剤によれば、BRCA1非依存性相同組換え修復が作動することにより単鎖切断誘導剤によるアポトーシスの誘導に対して耐性を獲得したBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞をBRCA1変異型癌細胞と同程度にまで単鎖切断誘導剤に対する感受性を回復させることができる。したがって、単鎖切断誘導剤と併用することにより、これまで治療の困難であったBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌を治療することが可能となる。
【００５２】
２．医薬組成物
２−１．概要
本発明の第２の態様は、医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、前記第１態様に記載の増感剤を包含することを特徴とする。
【００５３】
本態様の医薬組成物は、有効成分である第１態様に記載の増感剤の作用によって、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞に作用し、当該癌細胞をBRCA1変異型癌細胞と同程度にまで単鎖切断誘導剤感受性にする薬理効果を有する。
【００５４】
２−２．構成
２−２−１．成分
本態様の医薬組成物は、増感剤を包含し、必要に応じて、液性媒体、担体、及び／又は他の有効成分を含むことができる。以下、本態様の医薬組成物における各成分について具体的に説明をする。
【００５５】
（１）増感剤
本態様の医薬組成物に包含される増感剤は、前記第１態様に記載の増感剤である。当該増感剤は、本発明の医薬組成物における必須の構成成分であり、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞の単鎖切断誘導剤に対する耐性能を喪失させ、BRCA1変異型癌細胞と同程度にまで単鎖切断誘導剤感受性にする、本医薬組成物の有効成分として機能する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、単一の標的タンパク質を抑制する二以上の異なる増感剤を含むことができる。また、異なる二以上の標的タンパク質を抑制する一又は二以上の異なる増感剤を含むこともできる。
【００５７】
本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分である増感剤の含有量は、製薬上有効な量であればよい。本明細書において「製薬上有効な量」とは、増感剤がその機能を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。具体的な用量は、使用する増感剤の種類、標的タンパク質の種類、増感剤の作用効果及び安定性、後述する担体の種類、剤形、被検体の情報、投与方法、及び投与経路等によって異なる。ヒトに投与する場合、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、通常、細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被検者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被検者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
【００５８】
一投与単位あたりにおける増感剤の含有量の具体例として、他の医薬の服用を必要としないヒト成人男子（体重60kg）に対して、本発明の医薬組成物を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)〜約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)の増感剤を含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で増感剤の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【００５９】
（２）液性媒体
本態様の医薬組成物は、剤形が液剤等の場合には、液性媒体を構成成分として含むことができる。液性媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような液性媒体は、使用時に殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００６０】
（３）担体
本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を構成成分として含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００６１】
賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
【００６２】
結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
【００６３】
崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
【００６４】
充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
【００６５】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【００６６】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【００６７】
本実施形態の医薬組成物は、必要に応じて、上記担体を二以上包含することもできる。
このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形状態及び薬剤効果を維持する他、有効成分である増感剤が生体内の酵素による分解を受け難くするために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
【００６８】
（４）他の有効成分
本明細書において「他の有効成分」とは、本態様の医薬組成物における第１態様の増感剤以外の有効成分をいう。他の有効成分は、例えば、第１態様の増感剤と同じ薬理効果を有するものであってもよいし、異なる薬理効果を有するものであってもよい。第１態様の増感剤は、薬理効果としてBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にするものの、癌細胞の増殖を抑制する作用はない。それ故、単鎖切断誘導剤と併用することが望ましいことから、本態様の医薬組成物は、当該単鎖切断誘導剤を他の有効成分として含んでもよい。
【００６９】
２−２−２．剤形
本実施形態の医薬組成物の剤形は、第１態様の増感剤を不活化させない又はさせにくく、かつ投与後に生体内でその薬理効果を十分に発揮し得る形態であれば特に限定しない。一般に、増感剤が核酸分子やペプチドの場合には、生体内でヌクレアーゼやプロテアーゼ等の分解酵素による影響を受けやすいため、本発明の医薬組成物を投与する場合には生体内で増感剤が分解され難い剤形が好ましい。
【００７０】
一般的な剤形としては、液体又は固体（ゲルのような半固体を含む）が挙げられるが、本発明のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。
【００７１】
また、本態様の医薬組成物をナノ粒子(例えば、Davis ME， et al.，Nature， 2010, 464:1067-1070に記載の標的ナノ粒子伝達システムを含む)、リポソーム（例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、SNALPsを含む）、コレステロール結合体の形態に調製してもよい。
【００７２】
２−３．医薬組成物の製造
本発明の医薬組成物の製造方法については、当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
【００７３】
２−４．投与方法
本態様の医薬組成物の投与方法は、有効成分である増感剤が標的癌細胞に到達し得る方法であれば、当該分野で公知の形態で適用することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００７４】
本態様の医薬組成物の具体的な投与単位形態は、経口投与法及び非経口投与法に大別できる。経口投与法は、一般に全身投与でもあるが、非経口投与法は、さらに全身投与と局所投与（例えば、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与、又は経直腸的投与等）に細分できる。
【００７５】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができ、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。本態様の医薬組成物の有効成分である増感剤は、BRCA1が正常に機能している細胞、すなわちBRCA1依存性のDNA相同組換え修復能が作動している細胞に対しては作用しない。したがって、副作用による影響がないか又は極めて小さいことから全身投与が可能である。全身投与には、例えば、血管内注射又は経口投与が挙げられる。静脈注射等による血管内投与は、好適である。血流を介して増感剤を全身に行き渡らせることが可能なため、迅速に、かつ診断で発見できない病変部にも増感剤を適用でき、また侵襲性が比較的低く、被検体に与える負担が小さいからである。もちろん、発症箇所が局部的な疾患であれば、局所注射や経皮投与等により発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与も採用できる。注射による医薬組成物の注入部位は特に限定しない。例えば、血管内若しくは心室内のような循環系内や、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内、舌下等の器官若しくは組織内が挙げられる。好ましくは、静脈内注射、動脈内注射等の血管内への注射である。
【００７６】
２−５．効果
本態様の医薬組成物によれば、有効成分である第１態様に記載の増感剤の作用によって、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞に作用し、当該癌細胞をBRCA1変異型癌細胞と同程度にまで単鎖切断誘導剤に対する感受性を回復させる薬理効果を有する。したがって、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌に罹患した患者に、本態様の医薬組成物を単鎖切断誘導剤と共に投与することで、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞を効率的にアポトーシスへと誘導し、当該癌を治療することが可能となる。
【００７７】
３．単鎖切断誘導剤増感剤の製造方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、第１態様に記載した増感剤の製造方法である。本態様の製造方法によれば、増感剤を効率的に製造することができる。
【００７８】
３−２．構成
本態様の製造方法は、図１に示すように、標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）、測定工程（S103）、判定工程（S104）を必須工程として、また単鎖切断誘導剤投与工程（S102）を選択工程として含む。単鎖切断誘導剤投与工程（S102）は、標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）後、測定工程（S103）前に行ってもよいし、標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）と同時に行うこともできる。以下、各工程について、具体的に説明をする。
【００７９】
（１）標的タンパク質抑制剤投与工程
「標的タンパク質抑制剤投与工程」（S101）とは、標的タンパク質を抑制する抑制剤を癌細胞に投与する工程である。本工程は、製造すべき増感剤の候補剤である標的タンパク質抑制剤をBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞に投与して、当該癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にすることを特徴とする。
【００８０】
本工程で使用する癌細胞は、前述のBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞である。すなわち、BRCA1及び53BP1の両方が機能障害を起こしてBRCA1変異に依存しないDNA相同組換え修復能が作動する結果、単鎖切断誘導剤に対して耐性を有している癌細胞である。当該癌細胞は、培養細胞又はBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌モデル動物の生体内細胞のいずれを用いてもよい。操作の容易性から、好ましくは培養細胞である。
【００８１】
本態様の標的タンパク質は、細胞内に存在する第１態様に記載のクロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質群から選択される少なくとも1のタンパク質である。例えば、ATM、MDC1、RNF8、RNF168、HERC2及びUBC13が挙げられる。
【００８２】
本態様において「標的タンパク質を抑制する抑制剤（標的タンパク質抑制剤）」とは、本態様の製造方法で製造すべき増感剤の候補剤であり、第１態様に記載の標的タンパク質抑制剤が該当する。すなわち、発現抑制剤としてのRNA干渉剤、アンチセンス核酸及びU1アダプター、及び／又は機能抑制剤としてのアプタマー（核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）及び抗体が挙げられる。本工程で使用する標的タンパク質抑制剤は、標的タンパク質に応じて適宜決定する。例えば、標的タンパク質がRNF8であれば、RNF8を特異的に抑制するRNF8抑制剤を用いる。発現抑制剤、機能抑制剤のいずれを使用してもよい。製造すべき増感剤の製造効率を高めるため、候補剤として使用する標的タンパク質抑制剤は、少なくとも標的タンパク質の発現抑制効果又は機能抑制効果がインビトロやインビボによる他の実験によって予め確認されているものを使用することが望ましい。標的タンパク質抑制剤は、1種又は2種以上の組合せで投与してもよい。2種以上を投与する場合には、それぞれを同時に又は別個に癌細胞に投与することができる。
【００８３】
前記癌細胞に投与する標的タンパク質抑制剤の分量は、使用する標的タンパク質抑制剤の種類に応じて適宜定める。なお、標的タンパク質抑制剤の分量は、癌細胞における標的タンパク質の発現又は機能を抑制することによって、細胞内のクロマチンのポリユビキチン化を一過的に抑制するだけで足り、完全に除去する必要はない。BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞においてクロマチンのポリユビキチン化を一過的に抑制することができれば、当該癌細胞の単鎖切断誘導剤に対する感受性が回復するため、続く単鎖切断誘導剤投与工程で前記感受性が回復した癌細胞は、アポトーシスによって分解、除去されるからである。
【００８４】
薬剤候補物質を細胞内に投与する方法は、当該分野で公知の方法を用いればよい。例えば、RNAi干渉剤、アンチセンス核酸、U1アダプター及び核酸アプタマーのような核酸分子、及び抗体やペプチドアプタマーのようなペプチドを細胞内に導入する場合には、培養細胞であれば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染法、リポフェクション法、細胞膜透過性ペプチド法等の周知の方法を用いることができる。これらの方法は、いずれも公知の方法に準じて行えばよい。例えば、Current protocols in Protein Sciences, 1995, John Wiley＆ Sons Inc.に記載の方法を参照すればよい。また、Lipofectamin2000（Invitrogen社）等の市販の核酸・ペプチド導入剤を使用してもよい。低分子化合物を細胞内に導入する場合、培養細胞であれば、通常は、培地に添加すればよい。また生体内細胞であれば、注射等によって癌細胞部位又はその周辺に直接投与するか、血管内に投与すればよい。
【００８５】
（２）単鎖切断誘導剤投与工程
「単鎖切断誘導剤投与工程」（S102）とは、単鎖切断誘導剤を前記癌細胞に投与する工程である。前述のように、本工程は、選択工程であり、必要に応じて、前記標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）後、測定工程（S103）前に行うか、又は標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）と同時に行うことができる。
【００８６】
本工程は、標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）によってBRCA1非依存性相同組換え修復能を喪失した、すなわち単鎖切断誘導剤感受性となったBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞に単鎖切断誘導剤を投与することによって、アポトーシスを誘導し、その細胞を合成致死に至らしめることを特徴とする。
【００８７】
本工程で使用する単鎖切断誘導剤は、第１態様に記載の単鎖切断修復系に関与するいずれかの因子の機能を抑制する薬剤、又はDNA二本鎖間を架橋する薬剤である。本工程では、1又は2以上の単鎖切断誘導剤を使用することができる。
【００８８】
前記癌細胞に投与する単鎖切断誘導剤の分量は、使用する単鎖切断誘導剤に応じて適宜定めればよい。例えば、単鎖切断誘導剤がPARP-1阻害剤の場合には、Olaparibであれば、例えば1nM〜10nMを、シスプラチンのようなDNA架橋剤の場合には、10nM〜500nMを投与すればよい。
【００８９】
単鎖切断誘導剤を細胞内に投与する方法は、培養細胞であれば、通常は、培地に添加すれば足りる。生体内細胞であれば、注射等によって癌細胞部位又はその周辺に直接投与するか、血管内に投与すればよい。
【００９０】
（３）測定工程
「測定工程」（S103）とは、前記BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞を測定する工程である。
【００９１】
「BRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞を測定する」とは、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞の絶対量又は相対量を測定することをいう。ここでいう「絶対量」とは、細胞数である。例えば、後述する実施例１等に記載のように、蛍光顕微鏡解析法等によってγ-H2AXのようにDNA損傷が生じている部位を示すタンパク質の細胞内局在（foci）とRAD51のようにDNA相同組換え修復に寄与するタンパク質の細胞内局在（foci）の一致する数に基づいてBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する細胞数を測定することができる。また、「相対量」とは、吸光度、蛍光強度のような測定値の他、適当な基準量に対する割合をいう。例えば、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞は、相同組換え修復能が維持されていることから、DR‐GFPアッセイ法（Pierce et J., et al, 1999, Genes Dev., 13, 2633-8）等を用いて、相同組換え修復によって発現するGFPを前記フローサイトメトリーシステムを用いて検出する方法で測定することもできる。
【００９２】
また、前記単鎖切断誘導剤投与工程（S102）を含む場合であれば、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞の生細胞又は死細胞を測定してもよい。本態様において「生細胞」とは、分裂能を維持したBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞の生存細胞をいう。また本工程において「死細胞」とは、アポトーシスを起こしたBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞をいう。BRCA1非依存性相同組換え修復能を喪失した癌細胞に単鎖切断誘導剤を適用すると、その細胞はアポトーシスを起こす。そこで、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞において、生存する細胞又はアポトーシスを起こした細胞のいずれかを測定することによってBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞を測定することができる。
【００９３】
生細胞又は死細胞を測定する方法は、特に限定はしない。当該分野で公知の方法によって測定すればよい。例えば、死細胞を測定する場合であれば、単鎖切断誘導剤投与工程（S102）後の細胞をヨウ化プロピジウム、7アミノアムチノマイシD、アネキシンV等の色素で処理して、死細胞を染色した後、FACSCalibur フローサイトメーター（BD）やCell Lab Quanta(Beckman Coulter)等のフローサイトメトリーシステムを用いて死細胞を検出する方法が挙げられる。また、生細胞を測定する場合には、前述し、DR‐GFPアッセイ法や蛍光顕微鏡解析法を利用することができる。
【００９４】
（４）判定工程
「判定工程」（S104）とは、前記測定工程（S103）で得られた測定値が前記標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）を経ていないBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞の対応する測定値と比較したときに両測定値間に統計学的に有意な差がある場合に、前記標的タンパク質抑制剤を前記増感剤として判定する工程である。本工程は、前記測定工程（S103）の結果に基づいて、標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）で投与した標的タンパク質抑制剤の中から、第１態様に記載した増感剤としての効果を有するもの、すなわちBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にする増感剤として判定することを特徴とする。
【００９５】
本態様において「測定工程で得られた測定値」（以下「被検測定値」と表記する）とは、前記測定工程で測定したBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する又は喪失した細胞の測定値である。
【００９６】
本態様において「前記標的タンパク質抑制剤投与工程を経ていない前記癌細胞の対応する測定値」（以下「対照測定値」と表記する）とは、本態様の製造方法に供したBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞に対して、前記標的タンパク質抑制剤投与工程（S101）のみを行わず、他の工程を全て同一条件で行ったときに得られる測定結果である。したがって、被検測定値と対照測定値との差異は、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞が標的タンパク質抑制剤で処理されたか否かの差異となる。
【００９７】
本態様において「統計学的に有意な差」とは、前記被検測定値と対照測定値の差異を統計学的に処理したときに、両測定値間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【００９８】
統計学的な有意差に基づいて標的タンパク質抑制剤投与工程で使用した標的タンパク質抑制剤を増感剤として判定する方法としては、例えば、前記測定値がBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を喪失した細胞を測定した値、又は単鎖切断誘導剤投与工程（S102）を含む場合には死細胞を測定した値であれば、被検測定値が対照測定値よりも統計学的に有意に高いときに、その標的タンパク質抑制剤を増感剤として判定すればよい。逆に、前記測定値がBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を有する細胞を測定した値、又は単鎖切断誘導剤投与工程（S102）を含む場合には生細胞を測定した値であれば、被検測定値が対照測定値よりも統計学的に有意に低いときに、その標的タンパク質抑制剤を増感剤として判定すればよい。
【００９９】
本工程によって増感剤として判定された標的タンパク質抑制剤は、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞を単鎖切断誘導剤感受性にする有効成分となり得る。
【実施例】
【０１００】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の一具体例に過ぎず、本発明は、以下の実施態様に限定されるものではない。
【０１０１】
＜実施例１：本発明の増感剤によるBRCA1非依存性相同組換え修復能の抑制効果（１）＞
（目的）
本発明の増感剤がBRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞のBRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制できることを検証する。
【０１０２】
（方法及び結果）
１．培養細胞と培養条件
大腸癌由来のHCT116細胞株及び子宮頸癌由来のHeLa細胞株を用いた。HECT116細胞は、Drs. N. Shiomi及びH.Shiomiから分与いただいた（Shiomi, N. et al., 2007, Nucleic acids Res. 35:e9）。また、HeLa細胞は、HSRR(Health Services and Sciences Research Resources)より入手した。HCT116細胞は、10％FBS（Bovogen）を含むDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）（SiGMA）を用いて5％CO2下で37℃にて培養した。
【０１０３】
２．増感剤有効成分
本実施例では、標的タンパク質をRNF8とし、また本発明の増感剤の有効成分である標的タンパク質抑制剤をRNF8の発現を特異的に抑制するRNF8 siRNA（以下「siRNF8」と表記する）として使用した。siRNF8には、siRNF8 #DとsiRNF8 #2の2つを用いた。siRNF8 #Dは、Dharmacon siGENOME SMARTpool (Thermo scientific)由来のsiRNF8であり、配列番号１及び２、３及び４、５及び６、並びに７及び８で示される4種類の二本鎖オリゴヌクレオチドからなるsiRNF8の混合物である。また、siRNF8 #2は、配列番号９及び１０で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。非標的対照用siRNA(以下「siCTRL」と表記する)には、SIC-002（Sigma-Aldrich）を用いた。
【０１０４】
３．RNAi発現抑制
総siRNA量は、siCTRLを添加することによってサンプル間で同一となるように調整した。全てのsiRNAiは、18μMをLipofectamine RNAi Max（Invitrogen）を用いてHCT116細胞又はHeLa細胞にトランスフェクションした。
【０１０５】
なお、BRCA1遺伝子及び／又は53BP1遺伝子の発現量が低下した癌細胞に模倣した培養細胞を構築するため、前記培養細胞にBRCA1を特異的に抑制するBRCA1 siRNA（以下「siBRCA1」と表記する）及び53BP1を特異的に抑制する53BP1 siRNA（以下「si53BP1」と表記する）をトランスフェクトした。siBRCA1には、配列番号１１及び１２で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなるsiBRCA1#1と配列番号１３及び１４で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなるsiBRCA1#2の2種類を用いた。また、53BP1 siRNAは、配列番号１５及び１６で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。
【０１０６】
４．ウェスタンブロット
siRNAをトランスフェクションした細胞における各siRNAの標的タンパク質の発現をウェスタンブロットで確認した。細胞は、SDSサンプルバッファ（10%グリセロール,1%SDS，0.003%ブロモフェノールブルー，80mM Tris-HCl）で溶解した後、全細胞溶解物を5〜20%のSDS-PAGE (e-PAGEL, ATTO)で分離し、iBlot Gel Transfer System (Invitrogen)を用いて、ニトロセルロースメンブレンに転写した。その後メンブレンをTBSTに溶解した5％Difco skim milk (BD)でブロッキングし、一次抗体と反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識された二次抗体（抗マウスHRP W4021； 抗ウサギHRP W4011; Promega）でブロッティングした。一次抗体には、抗BRCA1抗体(D-9, Santa Cruz, 1:200)、抗53BP1抗体(clone 19, BD Biosciences, 1:2,000)、抗RNF8抗体(H00009025-B01P, Abnova, 1:250)、抗RAD51抗体(70-001 lot 1, Bio Academia, 1:2,000)、及び抗α-チューブリン抗体(T6074,Sigma-Aldrich, 1:1,000)を用いた。化学発光によるHRP標識抗体の検出には、Western Lightning ECL Pro Reagent Kit (Perkin Elmer)を用いた。化学発光シグナルは、LAS4000 (Fuji Film)で検出した。
【０１０７】
結果を図２に示す。この図では、HCT116細胞を用いたときの結果を示している。各タンパク質のsiRNAをトランスフェクションした細胞では、そのタンパク質の発現が抑制されていた。α-チューブリンは各レーンにアプライしたタンパク質量を示す対照であり、またRAD51は、DNA相同組換え修復に必須のタンパク質であって、DNAの二本鎖損傷部位にリクルートされ、集合することが知られている（Ohta, T., et al., 2011, FEBS lett., 585:2836-2844）。
【０１０８】
５．免疫蛍光顕微鏡解析
BRCA1、53BP1及び／又はsiRNF8の発現をsiRNAで抑制したHCT116細胞にsiRNAトランスフェクションして48時間後に2グレイ(Gy)で放射線照射したときの細胞内におけるRAD51の局在について調べた。
【０１０９】
HCT116細胞をMASコートしたNo.1ガラスカバースリップ（Matsunami）上で生育させた後、3％パラホルムアルデヒド及び2％スクロース/PBSを用いて15分間室温で固定した。続いて、0.5％ Triton X-100/PBSで15分間室温にて透過処理を行った。その後、細胞を2％BSA/PBSで希釈した抗RAD51抗体(70-001 lot 1, Bio Academia, 1:20,000)及び抗γ-H2AX抗体(cloneJBW301, Upstate, 1:5,000)を用いて染色した。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG抗体（Invitrogen）又はAlexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)で染色した。細胞を2％BSA/PBS及びPBSを用いて、それぞれ2回洗浄した。試料にはProlong Gold mounting agent (Invitrogen)をマウントした。共焦点画像は、63倍の油浸レンズを備えた倒立顕微鏡（TCS SP5, Leica）を用いて撮影した。画像は、LAS AF (Leica) フォーマットで取り込んだ。免疫染色データの定量化のために少なくとも300個の細胞を解析した。
【０１１０】
結果を図３−１及び図３−２に示す。図３−１は、免疫蛍光顕微鏡による共焦点画像である。図３−２は、図３−１の結果に基づいて、5個以上のRAD51の局在（foci）が確認された細胞を定量化したグラフである。図３−１においてγ-H2AXの局在（foci）が観察される部位は、放射線照射によりDNA損傷が生じている部位を示している。図３−１から、BRCA1及び53BP1の発現を各siRNAで抑制した細胞（siBRCA1#1/si53BP1）では、RAD51の局在がγ-H2AXの局在と一致している。RAD51は、DNAの二本鎖損傷部位にリクルートされ、DNA相同組換え修復に寄与することから、この結果は、siBRCA1#1/si53BP1のHCT116細胞は、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞と同様に、BRCA1非依存性相同組換え修復が作動していることを示しており、当該癌細胞の性質を模倣できることを示している。一方、siBRCA1#1/si53BP1の細胞に、標的タンパク質阻害剤であるsiRNF8を加えて、RNF8の発現を抑制した細胞（siRNF8#D/siBRCA1#1/si53BP1及びsiRNF8#2/siBRCA1#1/si53BP1）では、二本鎖損傷部位におけるRAD51の局在が消失した。図３−２からもRNF8の発現を抑制することでsiBRCA1#1/si53BP1の細胞におけるRAD51のDNA損傷部位への局在が強く抑制されることがわかる。以上の結果から、本発明の増感剤の有効成分としてのRNF8阻害剤は、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞におけるBRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制できることが立証された。
【０１１１】
６．DR-GFPアッセイ
相同組換え修復によって発現するGFP蛍光強度により相同組換え修復能を測定するDR‐GFPアッセイ法（Pierce et J., et al, 1999, Genes Dev., 13, 2633-8）を用いて、siRNF8によるsiBRCA1#1/si53BP1細胞のBRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制について確認した。
【０１１２】
DR-GFP相同組換えレポーターを含むHeLaクローンをDR-GFPアッセイに用いた。このHeLaクローンは、GFP配列の途中に制限酵素I-sceIの認識配列が組み込まれており、野生型GFPが発現しないGDP配列の下流にN末及びC末を欠くGFP配列が配置された組換え遺伝子を染色体中に有している（Pierce, A.J., et al., 1999, Genes Dev., 13:2633-8）。siRNAには、siBRCA#1、si53BP1及びsiRNF8#2を単独で又は組み合わせて用いた。siRNAをトランスフェクトしたHeLa細胞を6ウェルディッシュ内で5％CO2下37℃にて48時間培養した。その後、細胞にFuGene HD (Roche)を用いて2μgのI-SceI 発現ベクターpCBASceをトランスフェクトした。トランスフェクトの48時間後に、トリプシン処理を行い、細胞を回収した。細胞をPBSで2度洗浄した後、0.1% FBS/PBSに再懸濁し、濾過した。GFP陽性細胞、すなわち相同組換え修復能を有する細胞の割合（％）は、フローサイトメトリー（BD）を用いてFACSCalibur フローサイトメーターで決定した。
【０１１３】
結果を図４に示す。DR-GFPアッセイによる相同組換え修復率においても、前記免疫蛍光顕微鏡解析結果と同様に、siBRCA1#1/si53BP1細胞にsiRNF8#2をトランスフェクトし、RNF8の発現を抑制した細胞（レーン４）では、siBRCA1#1/si53BP1細胞（レーン３）における相同組換え修復率が、siBRCA1#1のみをトランスフェクトすることによってBRCA1変異型癌細胞を模倣したHeLa細胞（レーン２）と同程度にまで著しく抑制された。
【０１１４】
＜実施例２：本発明の増感剤によるBRCA1非依存性相同組換え修復能の抑制効果（２）＞
（目的）
本発明の増感剤において実施例１で示したRNF8以外のクロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質を標的タンパク質阻害剤としたときにも、RNF8阻害剤と同様に、BRCA1非依存性相同組換え修復作動型癌細胞のBRCA1非依存性相同組換え修復能を抑制できることを検証する。
【０１１５】
（方法）
１．培養細胞と培養条件
HCT116細胞株を用いた。培養条件については、実施例１の記載条件と同じである。
【０１１６】
２．増感剤有効成分
本実施例では、標的タンパク質をRNF8と同様にクロマチンのポリユビキチン化を制御するRNF168とし、また本発明の増感剤の有効成分である標的タンパク質抑制剤をRNF168の発現を特異的に抑制するRNF168 siRNA（以下「siRNF168」と表記する）として使用した。siRNF168には、siRNF168 #5とsiRNF168 #Cの2種を用いた。siRNF168 #5は、配列番号１７及び１８で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなり、siRNF168 #Cは、配列番号９及び２０で示される二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。また、siCTRLには、実施例１と同様にSIC-002（Sigma-Aldrich）を用いた。
【０１１７】
３．RNAi発現抑制
総siRNA量は、siCTRLを添加することによってサンプル間で同一となるように調整した。siRNAiは、siBRCA1を36μMで、siRNF8を18μMで、si53BP1を4μMで、Lipofectamine RNAi Max（Invitrogen）を用いてHCT116細胞にトランスフェクションした。
なお、BRCA1遺伝子及び／又は53BP1遺伝子の発現量が低下した癌細胞に模倣した培養細胞は、実施例１と同様にsiBRCA1#1とsi53BP1を用いて構築した。
【０１１８】
４．免疫蛍光顕微鏡解析
実施例１と同様の手順及び条件により、各細胞に対して免疫蛍光顕微鏡解析を行い、その後RAD51の局在（foci）とγ-H2AXの局在（foci）の結果（データ示さず）に基づいて、5個以上のRAD51の局在（foci）が確認された細胞を定量化した。
【０１１９】
（結果）
結果を図４に示す。標的タンパク質阻害剤としてsiRNF168を用いた場合、siRNF168 #5及びsiRNF168 #C2のどちらもsiBRCA1#1/si53BP1の細胞におけるRAD51のDNA損傷部位への局在が強く抑制された（レーン２及び３）。
【０１２０】
この結果から、本発明の増感剤の有効成分である標的タンパク質阻害剤は、RNF8に限られず、クロマチンのポリユビキチン化を制御するタンパク質の阻害剤が広く有効であることが立証された。
【０１２１】
＜実施例３：正常細胞における増感剤の影響＞
（目的）
本発明の増感剤の有効成分である標的タンパク質抑制剤を、BRCA1が正常に機能している細胞に適用した場合の当該細胞におけるDNA修復機構への影響について検証する。
【０１２２】
（方法）
１．培養細胞と培養条件
HCT116細胞株を用いた。培養条件については、実施例１の記載条件と同じである。
【０１２３】
２．増感剤有効成分
本実施例では、実施例１と同様に標的タンパク質をRNF8とし、標的タンパク質抑制剤はsiRNF8を使用した。siRNF8には、siRNF8 #D及びsiRNF8 #2を用いた。また、siCTRLには、実施例１と同様にSIC-002（Sigma-Aldrich）を用いた。
【０１２４】
３．RNAi発現抑制
総siRNA量は、siCTRLを添加することによってサンプル間で同一となるように調整した。全てのsiRNAiは、Lipofectamine RNAi Max（Invitrogen）を用いてHCT116細胞に実施例１と同様の方法でトランスフェクションした。
BRCA1遺伝子の発現量が低下したBRCA1変異型癌細胞に模倣した培養細胞を構築するため、前記培養細胞にsiBRCA1#1をトランスフェクトした。
【０１２５】
４．免疫蛍光顕微鏡解析
BRCA1及び／又はsiRNF8の発現を各siRNAで抑制したHCT116細胞に実施例１と同一条件で放射線照射したときの細胞内におけるRAD51及び53BP1の局在について調べた。
【０１２６】
免疫蛍光顕微鏡解析の方法は、実施例１の免疫蛍光顕微鏡解析に記載方法に準じた。ただし、本実施例では、細胞を2％BSA/PBSで希釈した抗RAD51抗体(70-001 lot 1, Bio Academia, 1:20,000)及び抗53BP1抗体(clone 19, BD Biosciences, 1:5,000)を用いて染色した。
【０１２７】
（結果）
結果を図５−１及び図５−２に示す。図５−１は、免疫蛍光顕微鏡による共焦点画像である（siRNF8 #2の結果はsiRNF8 #Dと同じであることから示さず）。図５−２は、図５−１の結果に基づいて、5個以上のRAD51の局在（foci）が確認された細胞を定量化したグラフである。図５−１において53BP1の局在（foci）が観察される部位は、放射線照射によりDNA損傷が生じている部位を示している。siRNF8が正常に機能している細胞では53BP1のfociが見えなくなる。図５−１から、BRCA1が正常に機能しているHEC116細胞（-siBRCA1#1細胞）においてsiRNF8によりRNF8の発現を抑制した場合、53BP1の局在（foci）と一致するRAD51の局在（foci）が見られ、BRCA1依存性相同組換え修復能が作動していることが明らかとなった。図５−２もRNF8の発現を抑制しても、BRCA1が抑制されず、正常に機能していればHEC116細胞におけるRAD51の局在(foci)の形成に大きな影響は及ぼさないことを示している。以上の結果から、本発明の増感剤の有効成分としての標的タンパク質阻害剤は、BRCA1が機能する正常細胞に対しては、副作用の影響が非常に小さいことが立証された。
【図１】
2013203673.tif 000002
【図２】
2013203673.tif 000003
【図３−１】
2013203673.tif 000004
【図３−２】
2013203673.tif 000005
【図４】
2013203673.tif 000006
【図５−１】
2013203673.tif 000007
【図５−２】
2013203673.tif 000008
【配列表】
2013203673000001.app