【手続補正書】
【提出日】平成28年6月6日(2016.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成モノヌクレオソームであって、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンを各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）であって、１つ以上の前記ヒストンと結合して安定な蛋白質を形成する塩基配列と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内での１つ以上のＤＮＡ延長部とを含み、
前記ＤＮＡ延長部が修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ延長部中の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されてＤＮＡ修飾のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質と
の複合体を含み、
さらに（ｉ）ヒストン修飾のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾のパターンを有し、それによってヌクレオソーム修飾のパターンを形成し、（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置が前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記パターンを示す１つ以上の固有のバーコードを含む、合成モノヌクレオソーム。
【請求項２】
定義されたＤＮＡ分子によって互いに結合している２つ以上の合成モノヌクレオソームを含む合成ポリヌクレオソームであって、前記モノヌクレオソームが定義された接続性を有し、前記２つ以上の合成モノヌクレオソームの各々が、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンを各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と；
（ｂ）モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、
前記ＤＮＡ延長部が修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ延長部中の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されてモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾のパターンを形成している、モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質と
の複合体を含み、
モノヌクレオソーム性ヒストン修飾の前記パターンおよび／または前記ポリヌクレオソーム中のモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の前記パターンが、均一であってもよく、または異なっていて、ポリヌクレオソーム性修飾のパターンを得られてもよく；
前記ポリヌクレオソームが、前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置がポリヌクレオソーム性修飾の前記のパターンを示す前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のバーコードを含む、合成ポリヌクレオソーム。
【請求項３】
請求項２に記載の合成ポリヌクレオソームを２つ以上含む合成ポリヌクレオソームのライブラリーであって、
前記ライブラリーの各メンバーが、ポリヌクレオソーム性修飾のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
【請求項４】
前記ヒストンの前記修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然のアミノ酸を含む、請求項１に記載の合成モノヌクレオソーム。
【請求項５】
（ａ）前記ヒストンアイソフォームが、タンパク質配列内の１つ以上のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入またはタンパク質配列の末端の延長部および／またはタンパク質配列内の短縮を含み；および／または
（ｂ）前記ＰＴＭが、ヌクレオソーム当たり１つの部位の修飾または２つ以上の部位の修飾を有する、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、プロリルシス／トランス異性化、ニトロシル化、および酸化を含めた、任意の天然に存在するヒストン修飾から選択され、および／または
（ｃ）前記非天然のアミノ酸が、化学的および生化学的に不活性な、光架橋剤、蛍光標識または同位体標識であり得る翻訳後修飾（ＰＴＭ）の合成類似体から選択される、請求項４に記載の合成モノヌクレオソーム。
【請求項６】
前記ＤＮＡの修飾が、天然に存在する修飾を有するＤＮＡ塩基もしくは人工的な修飾を有する塩基を１つ以上含む、請求項１に記載の合成モノヌクレオソーム。
【請求項７】
１つ以上の請求項１に記載の合成モノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２に記載の合成ポリヌクレオソームを含むキットであって、モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームが、１つ以上の容器に含まれている、キット。
【請求項８】
各固有のバーコードとモノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソーム修飾のパターンの間の相関を示す一覧をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記容器が、試験管、マルチウエルプレートのウェルまたは微小流体装置の反応チャンバーである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
組換えに由来する、および／もしくは有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチンリーダーの認識パターンならびに親和性の特異性を決定する、または組換えに由来する、および／もしくは１つ以上の細胞系の有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチン修飾物質の特異性ならびにクロマチン修飾クロストークを決定する方法であって、  
（ｉ）１つ以上の請求項１に記載の合成モノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２に記載の合成ポリヌクレオソームを、１つ以上の前記クロマチンリーダーまたは１つ以上の前記クロマチン修飾物質と接触させることと、
（ｉｉ）結合したおよび／または修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームを単離することと、
（ｉｉｉ）前記結合したまたは修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームおよび任意の付加されたマークまたは除去されたマークを同定および／または定量化することと
を含む方法。
【請求項１１】
２つ以上の請求項１に記載の合成モノヌクレオソームを含むライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、モノヌクレオソーム修飾のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
【請求項１２】
１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質に関連する１つ以上の修飾を同定する方法であって、
請求項１１に記載のライブラリーを１つ以上のサブライブラリに分けることと；
前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質および／または修飾物質を前記の１つ以上のサブライブラリと共にインキュベートすることと；
１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質と結合している１つ以上の修飾モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームから１つ以上のＤＮＡバーコードを単離することと；
前記の単離されたＤＮＡバーコードを、各単離されたＤＮＡ配列に、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質に対応する追加のバーコード配列を備えることにより多重化すること；および
前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質の各々に関連する前記の１つ以上の修飾をポリメラーゼ連鎖反応またはＤＮＡ配列決定を介したバーコード検出により同定すること
とを含む方法。
【請求項１３】
エピジェネティック薬物の特異性を同定し、プロファイリングする方法であって、
候補分子を１つ以上の請求項１に記載のモノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２に記載のポリヌクレオソームと組み合わせることと、
ヌクレオソーム修飾のモジュレーションおよび／またはその結合を検出することとを含み、
それによって、ヌクレオソーム修飾をモジュレートするおよび／またはそれに結合する候補エピジェネティック薬物を同定する、方法。
【請求項１４】
ＤＮＡバーコードおよび関連するヌクレオソーム修飾ならびにバーコード化した各ヌクレオソームの組成の一覧と組み合わせたヌクレオソームのライブラリー。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ分子の前記５’および／もしくは３’末端にまたはその中にＤＮＡバーコードを含む、合成モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム。
【請求項１６】
１つ以上の修飾されたヒストンタンパク質、補完的な非修飾ヒストン、および１つ以上のバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡと親和性タグ付けした緩衝ＤＮＡとを既定の比で組み合わせることを含む、請求項１に記載のモノヌクレオソームを会合させる方法。
【請求項１７】
前記ライブラリーが安定するように前記ＮＰＳが十分に強力であり、４℃で少なくとも１カ月間貯蔵した後でも、モノヌクレオソームライブラリーメンバーの間で有意なＤＮＡスクランブリングが発生しない、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記ヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾が、生物学的に重要なクロマチン状態の代表的なセットを含む、請求項１に記載の合成モノヌクレオソーム。
【請求項１９】
前記モノヌクレオソームライブラリーメンバーの比が、等モル（各ライブラリーメンバーについて１：１）であるかまたは等モルでなく、固定された既定の比でライブラリーメンバーの１つまたはサブセットに対して１〜１０００の範囲である、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ヒストンの修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然アミノ酸である；ならびに／または、前記ＤＮＡ分子の前記修飾が、１つ以上のＤＮＡ塩基の天然に存在する修飾もしくは人工的な修飾を含む、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記リンカーヒストンがＨ１である請求項１に記載の合成モノヌクレオソーム。
【請求項２２】
前記リンカーヒストンがＨ１である請求項２に記載の合成ポリヌクレオソーム。
【請求項２３】
前記の結合したまたは修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームの同定および／または定量が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または次世代配列決定の使用を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝ＤＮＡがＭＭＴＶである請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
前述の説明から、当業者はこの発明の重要な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、本発明の変更および修正を作製して、様々な使用法および条件にそれを適合させることならびに本発明をその最も完全な範囲に利用することができる。前述の好ましい特定の態様は、単なる例示であり、どんな任意の方法も本発明の範囲を制限するものではないと解釈されるべきである。２０１２年６月６日出願の米国特許仮出願第６１／６５６，２３３号、および２０１２年１０月１０日に出願の米国特許仮出願第６１／７１２，１４８号を含めた、前述した全ての出願、特許および刊行物の開示全体を、特に本出願において引用される開示に関して、参照によりその全体をここで組み込む。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  ２種類以上のモノヌクレオソームを含む合成モノヌクレオソームのライブラリーであって、各モノヌクレオソームが、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、任意に
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
前記ライブラリー中の各モノヌクレオソームが、（ｉ）ヒストン修飾の固有のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾の固有のパターンを有し、それによって、ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを形成し、（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置が前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記固有のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
［２］  定義されたＤＮＡ分子によって互いに結合している２つ以上の合成モノヌクレオソームを含む合成ポリヌクレオソームであって、前記モノヌクレオソームが定義された接続性を有し、各モノヌクレオソームが、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と；
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、任意に
（ｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
モノヌクレオソーム性ヒストン修飾の前記パターンおよび／または前記ポリヌクレオソーム中のモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の前記パターンが、均一であってもよく、または異なっていて、ポリヌクレオソーム性修飾の固有のパターンを得られてもよく；
前記ポリヌクレオソームが、前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置がポリヌクレオソーム性修飾の前記固有のパターンを示す前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のバーコードを含む、合成ポリヌクレオソーム。
［３］  ［２］に記載の合成ポリヌクレオソームを２つ以上含む合成ポリヌクレオソームのライブラリーであって、
前記ライブラリーの各メンバーが、ポリヌクレオソーム性修飾の固有のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
［４］  前記ヒストンの前記修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然のアミノ酸を含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［５］  （ａ）前記ヒストンアイソフォームが、タンパク質配列内の１つ以上のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入またはタンパク質配列の末端の延長部を含み；および／または
（ｂ）前記ＰＴＭが、ヌクレオソーム当たり１つの部位の修飾または２つ以上の部位の修飾を有する、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、プロリルシス／トランス異性化、ニトロシル化、および酸化を含めた、任意の天然に存在するヒストン修飾から選択され、および／または
（ｃ）前記非天然のアミノ酸が、化学的および生化学的に不活性な、光架橋剤、蛍光標識または同位体標識であり得るＰＴＭの合成類似体から選択される、［４］に記載のライブラリー。
［６］  前記ＤＮＡ分子の前記修飾が、天然に存在する修飾を有するＤＮＡ塩基もしくは人工的な修飾を有する塩基を１つ以上含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［７］  ［１］または［３］に記載のライブラリーを含むキットであって、モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームが、任意に１つ以上の容器の中にある、キット。
［８］  ヒストン修飾の各固有のバーコードと固有のパターンの間の相関を示す一覧をさらに含む、［７］に記載のキット。
［９］  前記容器が、試験管、マルチウエルプレートのウェルまたは微小流体装置の反応チャンバーである、［７］に記載のキット。
［１０］  組換えに由来する、および／もしくは有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチンリーダーの認識パターンならびに親和性の特異性を決定する、または組換えに由来する、および／もしくは１つ以上の細胞系の有核細胞抽出物から抽出されたクロマチン修飾物質の特異性ならびにクロマチン修飾クロストークを決定する方法であって、
（ｉ）［１］または［３］に記載のライブラリーを前記クロマチンリーダーまたは前記クロマチン修飾物質と接触させる（たとえば、インキュベートする）ことと、
（ｉｉ）結合したおよび／または修飾されたライブラリーメンバーを単離することと、
（ｉｉｉ）前記結合したまたは修飾されたライブラリーメンバーおよび任意の付加されたマークまたは除去されたマークを同定および／または定量化することとを含む方法。
［１１］  相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を同定する方法であって、
［１］または［３］に記載のモノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームのライブラリーを用いて１を超える数のクロマチン相互作用物質および／または修飾物質を多重化することと、前記修飾に従って前記ライブラリーを同数のサブライブラリーに分けることと、各相互作用物質または修飾物質に関連する前記修飾を同定することとを含む方法。
［１２］  エピジェネティック薬物の特異性を同定し、プロファイリングする方法であって、
候補分子を［１］または［３］に記載のライブラリーと組み合わせることと、
ヌクレオソーム修飾のモジュレーションを検出することとを含み、それによって、ヌクレオソーム修飾をモジュレートする候補エピジェネティック薬物を同定する、方法。
［１３］  ＤＮＡバーコードおよび関連するヌクレオソーム修飾ならびにバーコード化した各ヌクレオソームの組成の一覧と組み合わせたヌクレオソームのライブラリー。
［１４］  前記ＤＮＡ分子の前記５’および／もしくは３’末端にまたはその中にＤＮＡバーコードを含む、合成モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム。
［１５］  （ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、任意に
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの前記５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
前記モノヌクレオソームが、ヒストン修飾の固有のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾の固有のパターンを有し、それによって、ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを形成し、
前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の前記バーコードの前記配列および位置が、前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記固有のパターンを示す、合成モノヌクレオソーム。
［１６］  ヒストンタンパク質およびバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡとビオチンタグ付けしたＭＭＴＶ緩衝ＤＮＡとを既定の比で組み合わせることを含む、［１５］に記載のモノヌクレオソームを会合させる方法。
［１７］  前記ライブラリーが安定するように前記ＮＰＳが十分に強力であり、４℃で少なくとも１カ月間貯蔵した後でも、モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの間で有意なＤＮＡスクランブリングが発生しない、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［１８］  前記ヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾が、生物学的に重要なクロマチン状態の代表的なセットを含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［１９］  前記モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの比が、等モル（各ライブラリーメンバーについて１：１）であるかまたは等モルでなく、固定された既定の比でライブラリーメンバーの１つまたはサブセットに対して１〜１０００の範囲である、［１］または［３］に記載のライブラリー。