【手続補正書】
【提出日】平成28年6月22日(2016.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を維持する、増幅する、および／または培養するステップを含む、心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を誘導するための方法であって、Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる作用物質が、多能性幹細胞分化の中期で該多能性幹細胞の培養培地に添加され、該中期は、中胚葉細胞または心臓前駆細胞が心筋細胞に分化するときであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、ヒトまたは哺乳動物の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる前記作用物質が、最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２またはＢＭＰ４であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
心筋細胞の分化を促進する１種または複数の因子が、多能性幹細胞分化の初期の間に前記培養培地に添加され、該初期が、多能性幹細胞が中胚葉細胞に分化するときであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
心筋細胞の分化を促進する前記１種または複数の因子が、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ノギン、ドルソモルフィン、およびＢＩＯのうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞分化の前記中期で、前記培養培地にＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答（Ｗｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅ）の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加されるＤＫＫ１の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、ＤＫＫ１以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１種または複数の制御分子が、多能性幹細胞分化の前記中期の間に前記培養培地に添加され、前記１種または複数の制御分子が、ｉ）前記培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有しないとき、レチノイン酸受容体（ＲＡＲγ）の活性化剤を含み、ならびに／またはｉｉ）該培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有するとき、ＲＡＲαおよび／もしくはＲＡＲβのアンタゴニストを含み、
ｉ）の活性化剤、およびｉｉ）のアンタゴニストが０．００１〜１００μＭの最終濃度を有する
ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
心臓の疾患または状態に対する薬物スクリーニングのための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞を含む、組成物。
【請求項１０】
薬物開発における心毒性試験のための、請求項１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
【請求項１１】
損傷した心臓組織を修復するための幹細胞療法のための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞を含む、組成物。
【請求項１２】
心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を促進するためのインビトロの方法であって、幹細胞から分化した中胚葉細胞においてＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、寡能性幹細胞、または単能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎児幹細胞、または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が哺乳動物幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物幹細胞がヒト幹細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、未分化幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成因子２（ＢＭＰ２）、骨形成因子４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰ経路阻害剤、およびＷｎｔ３ａ経路活性化剤のうちの１種または複数と接触させることによって、分化して中胚葉を形成していることを特徴とする、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰ４アンタゴニストであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＭＰアンタゴニストがノギンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が小分子ＢＭＰ経路阻害剤であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記小分子ＢＭＰ経路阻害剤がドルソモルフィンであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が、ＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＳＫ−３α／βの前記ＡＴＰ競合阻害剤が、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化されることを特徴とする、請求項１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、請求項１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記レチノイン酸前駆体がビタミンＡであることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＡＲγアゴニストが、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のＢＭＳ９６１、パロバロテン、またはＣＤ４３７であることを特徴とする、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＡＲγアゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）および／またはレチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ）のアンタゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、請求項１２から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ＲＡＲαの前記アンタゴニストが、Ｒｏ４１−５２５３、ＢＭＳ１９５６１４、またはＥＲ５０８９１であり、ＲＡＲβの前記アンタゴニストがＬＥ１３５であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβの前記アンタゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、請求項３３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞をＷｎｔ阻害剤と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１２から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、他の物質が、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１２から３９のいずれかに記載の方法によって生成された心室心筋細胞。
【請求項４１】
心室特異的遺伝子の上昇した発現レベル、胚性心室様活動電位（ＡＰ）および／または心室心筋細胞に一般的なＣａ２＋スパークパターンを有する、請求項４０に記載の心室心筋細胞。
【請求項４２】
前記心室特異的遺伝子がＩＲＸ−４および／またはＭＬＣ−２ｖである、請求項４１に記載の心室心筋細胞。
【請求項４３】
幹細胞を含む組成物であって、該幹細胞が、分化して中胚葉を形成しており、該幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する外因性作用物質で処理された、幹細胞を含む組成物。
【請求項４４】
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲγアゴニストである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
幹細胞から心室心筋細胞を生成するためのインビトロの方法であって、
１）幹細胞をｂＦＧＦおよびＢＭＰ４と接触させて幹細胞分化を開始するステップと、
２）ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４によって処理された該幹細胞をアクチビンＡと接触させて中胚葉を形成するステップと、
３）分化して中胚葉を形成した前記幹細胞をノギンと接触させて該幹細胞の心臓分化効率を増強するステップと、
４）ノギンによって処理された前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化して心室心筋細胞形成を促進するステップと、
５）ノギンによって処理された前記幹細胞をＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの１種または複数と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップと
を含む、方法。
【請求項４８】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をＲＡＲγのアゴニストと接触させることによって活性化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストと接触させることによって活性化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４７から５０のいずれかに記載の方法によって生成された心室心筋細胞。
【請求項５２】
心外傷または心障害を処置するための医薬組成物であって、有効量の請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項５３】
被験体における心外傷または心障害を処置するための請求項５２に記載の医薬組成物であって、有効量の該医薬組成物が、そのような処置を必要とする、またはそのような処置が望ましい被験体に投与されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項５４】
前記被験体がヒトである、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
幹細胞に基づく心臓修復療法に使用されるものである、請求項５３または５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の医薬を製造するための、請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
【請求項５７】
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防のための組成物であって、請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞を含む、組成物。
【請求項５８】
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の薬物をスクリーニングおよび／または開発するための組成物であって、請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞を含む、組成物。
【請求項５９】
薬物開発における心毒性試験のための、請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
【請求項６０】
心室心筋細胞のモジュレーターを同定するための方法であって、
１）請求項４０または５１に記載の心室心筋細胞をモジュレーター候補と接触させ、該心室心筋細胞の性質に対する該モジュレーター候補の効果を測定するステップと、
２）該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞の該性質を測定するステップと
を含み、該モジュレーター候補と接触させた該心室心筋細胞の該性質が、該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞のものと異なる場合、該心室心筋細胞の該性質のモジュレーターとして該モジュレーター候補を同定する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
いくつかの態様では、一利点として、本発明は、いずれの精製ステップも必要としない。いくつかの他の態様では、本発明は、心臓前駆細胞のＶＭへの分化の基礎をなす制御機構を明らかにするプラットフォームを提供する。さらに他の態様では、本発明は、ヒト幹細胞由来ＣＭを使用する心筋梗塞の細胞移植療法ならびに薬物の研究および開発に対する重要な意義を有する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
インビトロで多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を維持する、増幅する、および／または培養するステップを含む、心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を誘導するための方法であって、Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる作用物質が、多能性幹細胞分化の中期で該多能性幹細胞の培養培地に添加され、該中期は、中胚葉細胞または心臓前駆細胞が心筋細胞に分化するときであることを特徴とする、方法。
（項目２）
前記多能性幹細胞が、ヒトまたは哺乳動物の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｓｍａｄ１／５／８経路を直接または間接的に活性化することができる前記作用物質が、最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２またはＢＭＰ４であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目４）
心筋細胞の分化を促進する１種または複数の因子が、多能性幹細胞分化の初期の間に前記培養培地に添加され、該初期が、多能性幹細胞が中胚葉細胞に分化するときであることを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
心筋細胞の分化を促進する前記１種または複数の因子が、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ノギン、ドルソモルフィン、およびＢＩＯのうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目６）
多能性幹細胞分化の前記中期で、前記培養培地にＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
Ｗｎｔシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答（Ｗｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅ）の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含み、前記培養培地に添加されるＤＫＫ１の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、ＤＫＫ１以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目６に記載の方法。
（項目８）
１種または複数の制御分子が、多能性幹細胞分化の前記中期の間に前記培養培地に添加され、前記１種または複数の制御分子が、ｉ）前記培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有しないとき、レチノイン酸受容体（ＲＡＲγ）の活性化剤を含み、ならびに／またはｉｉ）該培養培地がレチノイン酸もしくはその前駆体を含有するとき、ＲＡＲαおよび／もしくはＲＡＲβのアンタゴニストを含み、
ｉ）の活性化剤、およびｉｉ）のアンタゴニストが０．００１〜１００μＭの最終濃度を有する
ことを特徴とする、項目６に記載の方法。
（項目９）
心臓の疾患または状態に対する薬物スクリーニングのための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１０）
薬物開発における心毒性試験のための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１１）
損傷した心臓組織を修復するための幹細胞療法のための、項目１から８のいずれかに記載の方法によって得られる心室心筋細胞の使用。
（項目１２）
心室心筋細胞（複数可）への多能性幹細胞分化を促進するための方法であって、幹細胞から分化した中胚葉細胞においてＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路を活性化するステップを含む、方法。
（項目１３）
前記幹細胞が、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、寡能性幹細胞、または単能性幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎児幹細胞、または成体幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記幹細胞が哺乳動物幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記哺乳動物幹細胞がヒト幹細胞であることを特徴とする、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記幹細胞が、未分化幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成因子２（ＢＭＰ２）、骨形成因子４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、ＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰ経路阻害剤、およびＷｎｔ３ａ経路活性化剤のうちの１種または複数と接触させることによって、分化して中胚葉を形成していることを特徴とする、項目１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰ４アンタゴニストであることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＢＭＰアンタゴニストがノギンであることを特徴とする、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＢＭＰ経路阻害剤が小分子ＢＭＰ経路阻害剤であることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記小分子ＢＭＰ経路阻害剤がドルソモルフィンであることを特徴とする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤であることを特徴とする、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記小分子Ｗｎｔ３ａ経路活性化剤が、ＧＳＫ−３α／βのＡＴＰ競合阻害剤であることを特徴とする、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ＧＳＫ−３α／βの前記ＡＴＰ競合阻害剤が、細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物であることを特徴とする、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞透過性ビス−インドロ（インジルビン）化合物が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）であることを特徴とする、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記培養培地に添加される増殖因子の最終濃度が０．０１〜１２００ｎｇ／ｍＬであり、増殖因子以外の別の物質の最終濃度が０．００１〜１００μＭであることを特徴とする、項目１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）のアゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記レチノイン酸前駆体がビタミンＡであることを特徴とする、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＲＡＲγアゴニストが、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のＢＭＳ９６１、パロバロテン、またはＣＤ４３７であることを特徴とする、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＲＡＲγアゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目３０から３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）および／またはレチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ）のアンタゴニストと接触させることによって活性化されることを特徴とする、項目１２から２７のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
ＲＡＲαの前記アンタゴニストが、Ｒｏ４１−５２５３、ＢＭＳ１９５６１４、またはＥＲ５０８９１であり、ＲＡＲβの前記アンタゴニストがＬＥ１３５であることを特徴とする、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβの前記アンタゴニストが、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用されることを特徴とする、項目３３から３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記幹細胞をＷｎｔ阻害剤と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップをさらに含むことを特徴とする、項目１２から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記Ｗｎｔ阻害剤が、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｗｎｔ阻害剤が、０．０１〜１２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、他の物質が、０．００１〜１００μＭの最終濃度で使用される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
項目１２から３９のいずれかに記載の方法によって生成する心室心筋細胞。
（項目４１）
心室特異的遺伝子の上昇した発現レベル、胚性心室様活動電位（ＡＰ）および／または心室心筋細胞に一般的なＣａ２＋スパークパターンを有する、項目４０に記載の心室心筋細胞。
（項目４２）
前記心室特異的遺伝子がＩＲＸ−４および／またはＭＬＣ−２ｖである、項目４１に記載の心室心筋細胞。
（項目４３）
幹細胞を含む組成物であって、該幹細胞が、分化して中胚葉を形成しており、該幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する外因性作用物質で処理された、幹細胞を含む組成物。
（項目４４）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４である、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲγアゴニストである、項目４３に記載の組成物。
（項目４６）
前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化する前記外因性作用物質が、ＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストである、項目４３に記載の組成物。
（項目４７）
幹細胞から心室心筋細胞を生成するための方法であって、
１）幹細胞をｂＦＧＦおよびＢＭＰ４と接触させて幹細胞分化を開始するステップと、
２）ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４によって処理された該幹細胞をアクチビンＡと接触させて中胚葉を形成するステップと、
３）分化して中胚葉を形成した前記幹細胞をノギンと接触させて該幹細胞の心臓分化効率を増強するステップと、
４）ノギンによって処理された前記幹細胞におけるＳｍａｄ１／５／８経路を活性化して心室心筋細胞形成を促進するステップと、
５）ノギンによって処理された前記幹細胞をＤＫＫ１、ＩＷＰ、およびＷｎｔ応答の阻害剤（ＩＷＲ）のうちの１種または複数と接触させて該幹細胞を心室心筋細胞に分化させるステップと
を含む、方法。
（項目４８）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４と接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、レチノイン酸またはその前駆体を含まない培地中で前記幹細胞を培養し、該幹細胞をＲＡＲγのアゴニストと接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｓｍａｄ１／５／８経路が、前記幹細胞をＲＡＲαおよび／またはＲＡＲβのアンタゴニストと接触させることによって活性化される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
項目４７から５０のいずれかに記載の方法によって生成される心室心筋細胞。
（項目５２）
心外傷または心障害を処置するための医薬組成物であって、有効量の項目４０または５１に記載の心室心筋細胞、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目５３）
被験体における心外傷または心障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする、またはそのような処置が望ましい被験体に有効量の項目５２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目５４）
前記被験体がヒトである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
幹細胞に基づく心臓修復療法に使用される、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の医薬を製造するための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５７）
被験体における心外傷または心障害の処置および／または予防用の薬物をスクリーニングおよび／または開発するための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５８）
薬物開発における心毒性試験のための、項目４０または５１に記載の心室心筋細胞の使用。
（項目５９）
心室心筋細胞のモジュレーターを同定するための方法であって、
１）項目４０または５１に記載の心室心筋細胞をモジュレーター候補と接触させ、該心室心筋細胞の性質に対する該モジュレーター候補の効果を測定するステップと、
２）該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞の該性質を測定するステップと
を含み、該モジュレーター候補と接触させた該心室心筋細胞の該性質が、該モジュレーター候補と接触させていない該心室心筋細胞のものと異なる場合、該心室心筋細胞の該性質のモジュレーターとして該モジュレーター候補を同定する、方法。