(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールのエステルを、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属もしくはリゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属由来のリパーゼまたはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物菌体または微生物の菌体処理物の存在下に加水分解反応させ、光学活性なＲ体またはＳ体の３−ペンチン−２−オールおよびそのエステルを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、不斉合成の不斉源や光学活性な生理活性物質の合成原料として重要な化合物である光学活性アルコールおよび光学活性エステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般式（II）
【化１】
0003893721.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数１〜５の低級アルキル基、Ｒ３は水素または炭素数１〜５の低級アルキル基。）
で示されるような内部アセチレン結合を有する光学活性第２級アルキンアルコールを得る方法として、炭酸エステル体をキャンディダ属由来の酵母リパーゼ、シュードモナス属、リゾプス属、アスペルギルス属、ムコール属由来の菌体リパーゼ、豚膵臓リパーゼ、緑膿菌由来のリポプロテインリパーゼなどのリパーゼで加水分解する方法（特開平５−３１７０９０）が知られているが、炭酸エステル体の合成が煩雑であるという欠点を有していた。
【０００３】
また、脂肪酸エステル体で末端アセチレン結合を有する化合物を酵素で不斉加水分解反応を行い光学活性第２級アルキンアルコールを得る方法（特開平３−２４７２９９）も知られているが、内部アセチレン結合を有する光学活性第２級または第３級アルキンアルコールの製造方法は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の欠点を克服し、光学活性な３−ペンチン−２−オールで代表されるアルキンアルコールあるいは該アルコールのエステルを製造する工業的に有利な方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため種々の検討を行った結果、内部アセチレン結合を有する光学活性第２級または第３級アルキンアルコールの製造方法として、下記一般式（Ｉ）
【化２】
0003893721.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数１〜５の低級アルキル基、Ｒ３は水素または炭素数１〜５の低級アルキル基、Ｒ４は炭素数１〜５の低級アルキル基またはフェニル基。）
で示される（Ｒ，Ｓ）−エステルを用い、該エステルをシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、もしくはリゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属由来のリパーゼまたはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物菌体を用いて不斉加水分解を行うことにより、効率的に前記光学活性なアルコールおよび該アルコールのエステルが得られることを見いだし、本発明に至ったものである。
前式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ４が低級アルキル基を意味する場合には、該アルキル基は不斉加水分解反応に影響を及ぼさないような置換基を有していてもよい。
すなわち、本発明は、（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールのエステルを、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属もしくはリゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属由来のリパーゼまたはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物の菌体または微生物の菌体処理物の存在下に加水分解反応させ、光学活性なＲ体またはＳ体の３−ペンチン−２−オールおよびそのエステルを製造する方法に関する。
【０００６】
本発明において、原料として用いられる前記一般式（Ｉ）で示される化合物の具体例としては、３−ペンチン−２−オール、３−ヘキシン−２−オール、３−ヘプチン−２−オール、３−オクチン−２−オール、４−ヘキシン−３−オール、２−メチル−３−ペンチン−２−オール等の酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、安息香酸のエステル体が挙げられる。
【０００７】
前記エステル体は、前記アルコールと前記酸類を通常のエステル化手段でエステル化して得られる。
【０００８】
本発明で用いられる酵素はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属由来のリパーゼであり、前式（II）の（Ｒ，Ｓ）−エステルに作用して、Ｒ体またはＳ体のどちらか一方のエステルを選択的に不斉加水分解を行う能力を有するものであれば、その種類は問わない。例えば、入手の容易な市販の酵素として、リパーゼＰＳ“Ａｍａｎｏ”、リパーゼＡＫ“Ａｍａｎｏ”、リパーゼＤ“Ａｍａｎｏ”１００、リパーゼＦ−ＡＰ１５〔いずれも天野製薬（株）製〕などが挙げられる。また、これらのリパーゼは精製品でも粗製品でも良く、また、リパーゼを含有する微生物菌体（処理菌体、休止あるいは静止菌体）そのものでも良い。その形態としては粉末状又は顆粒状であり、更に、ポリスチレンや、デンプン等の高分子化合物やゼオライトやシリカゲル等の多孔質物質に担持、固定した固定化酵素や固定化菌体としても利用できる。
【０００９】
本発明で用いられる微生物は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属し、前式（II）の（Ｒ，Ｓ）−エステルに作用してＲ体あるいＳ体のいずれか一方のエステルを選択的に不斉加水分解を行う能力を有するものであればいずれでも良い。その具体例としては、ロドコッカス・ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＡＴＣＣ  １４３５２、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ  １３８６９、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  ３０６４、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ  １２１３８、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ  １３２５７、ノカルディア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）ＩＦＯ  １３５１０、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  ０３８９、ハンゼヌラ・ノンファーメンタンス（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＦＯ  １４７３、サッカロマイセス・ロウキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）ＩＦＯ  ０４８７などが挙げられる。
【００１０】
微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩、有機微量栄養源などを含有する通常の培地でよく、微生物の種類に応じて適宜選択して使用すればよい。また、培養方法は通常液体培地で行われるが、固体培養によっても行うことができる。培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択すればよく、培養温度は１０〜７０℃、ｐＨ３〜１２の範囲が用いられるが、一般的には温度２０〜４５℃、ｐＨ４〜９の範囲で１０〜１２０時間培養すればよい。培養中には通気撹拌を行って微生物の培養を促進させることもできる。このようにして培養した微生物は、生菌体や乾燥菌体または菌体破砕物や菌体抽出物のような菌体処理物の形態で使用できる。さらに菌体または菌体処理物を常法に従って固定化して使用することもできる。
【００１１】
本発明における不斉加水分解反応は、（Ｒ，Ｓ）−エステルと酵素または微生物の菌体または菌体処理物を水性媒体中で接触させることによって行われる。反応の条件は適宜選択すればよく、基質濃度として（Ｒ，Ｓ）−エステルを０．１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍｌとすればよい。反応における系のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９に保てばよく、ｐＨの調整は通常の方法、たとえばリン酸カリウムバッファー、トリスバッファー、塩化アンモニウムバッファーなどによって調整すればよい。水性媒体としては、水、水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。使用し得る有機溶媒には特に限定はないが、メタノールやエタノール等の低級アルコール；アセトン等のケトン；テトラヒドロフラン等の親水性溶媒が好ましい。これらの溶媒を併用することによって、反応系中の基質の溶解度を上げることができる。また、同様の目的で、各種の界面活性剤を添加することも可能である。反応温度は不斉加水分解反応が最大になるように設定すればよく、通常１５〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃である。反応時間は通常１〜１２０時間である。
【００１２】
かくして不斉加水分解反応を行った後、酵素、微生物の菌体または菌体処理物は通常の濾過操作または遠心分離などで分離することができるが、分離せずそのまま再使用することもできる。得られた反応液からは抽出操作、蒸留操作またはカラムクロマトグラフィーなどによりエステルとアルコールをそれぞれ分離することができ、前記分離したエステルはそのまま利用しても良いし、必要に応じて、例えばアルカリ分解でアルコールに変換することができる。かくして目的とする光学活性なＲ体またはＳ体のアルコールおよび該アルコールのエステルを得ることができる。
【００１３】
本発明で得られた光学活性アセチレンアルコールは分子内に三重結合とヒドロキシル基を持つ反応性の高い化合物であり、光学活性なβ−ヒドロキシアルデヒド、β−ヒドロキシ酸、ブテノライド、ラクトン化合物、エポキシ化合物の合成原料として有用である。
【００１４】
【実施例】
次に本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
リン酸カリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）９００ｍｌ、リパーゼＰＳ“Ａｍａｎｏ”（天野製薬製）１００ｇおよび（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールの酢酸エステル５０ｇを２ｌ容の三角フラスコにいれ、３０℃で３時間、マグネチックスターラーで撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターで酢酸エチルを留去し、次いでスルーザー型精密蒸留装置で減圧蒸留（７０ｍｍＨｇ）し、沸点６２℃の３−ペンチン−２−オールを１６．７ｇと、沸点７３℃の３−ペンチン−２−オールの酢酸エステルを２０．５ｇ得た。３−ペンチン−２−オ−ルの比旋光度〔α〕20Dは＋４８．７（ｎｅａｔ）であり、キャピラリーカラム（Ｃｈｉｒａｌｓｅｌ−ＤＥＸ  ＣＢ，０．２５ｍｍ×２５ｍ；Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、カラム温度１１０℃、注入口温度２３０℃、キャリアーガス（ヘリウム：２ｍｌ／ｍｉｎ，窒素；６０ｍｌ／ｍｉｎ）の条件下、ガスクロマトグラフィーで分析した結果、光学純度は９９％以上の（Ｒ）−３−ペンチン−２−オール（リテンションタイム２．７分）であった。また、３−ペンチン−２−オールの酢酸エステルは光学純度９９％の（Ｓ）−３−ペンチン−２−オールの酢酸エステルであった。
【００１６】
実施例２
リン酸カリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）９０ｍｌ、リパーゼＡＫ“Ａｍａｎｏ”（天野製薬製）１０ｇおよび（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールのプロピオン酸エステル５ｇを２００ｍｌ容の三角フラスコにいれ、３０℃で３時間、マグネチックスターラーで撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、実施例１と同様な減圧蒸留法により３−ペンチン−２−オールを得た。実施例１と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果、収率７５％で、光学純度は９８％の（Ｒ）−３−ペンチン−２−オールであった。
【００１７】
実施例３
リパーゼＤ“Ａｍａｎｏ”１００（天野製薬製）と（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールの酢酸エステルを用いる以外は実施例２と同様に反応と分析を行った結果、収率５１％で、光学純度９８．２％の（Ｓ）−３−ペンチン−２−オール（ガスクロマトグラフィーのリテンションタイム３．２分）を得た。
【００１８】
実施例４
リパーゼＦ−ＡＰ１５（天野製薬製）を用いる以外は実施例３と同様に反応と分析を行った結果、収率３５％で、光学純度９８．１％の（Ｓ）−３−ペンチン−２−オールを得た。
【００１９】
前記各実施例で使用したリパーゼＰＳ“Ａｍａｎｏ”、リパーゼＡＫ“Ａｍａｎｏ”、リパーゼＤ“Ａｍａｎｏ”１００およびリパーゼＦ−ＡＰ１５は下表１に示した起源のものである。
【００２０】
【表１】
0003893721.tif 000004
【００２１】
実施例５
グルコース１ｇ／ｄｌ、ペプトン１．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ2ＨＰＯ4０．３ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ０．２ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０２ｇ／ｄｌ、寒天２ｇ／ｄｌからなる寒天斜面培地（ｐＨ７．０）で２８℃、２４時間培養したロドコッカス・ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＡＴＣＣ  １４３５２の１白金耳を、グルコース１ｇ／ｄｌ、ペプトン１．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス３ｇ／ｄｌ、Ｋ2ＨＰＯ4０．３ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ０．２ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．２ｇ／ｄｌからなり、ｐＨ７．０に調整、加熱滅菌した液体培地５００ｍｌを入れた２１容量の振盪フラスコに植菌し、２８℃で４８時間振盪培養した。遠心分離で集菌し、０．０１Ｍリン酸カリウムバッファーで洗浄した後、室温で風乾し、乾燥菌体を得た。次いでこの乾燥菌体１ｇ、リン酸カリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）９ｍｌ、および（Ｒ，Ｓ）−３−ペンチン−２−オールの酢酸エステル０．５ｇを三角フラスコに入れ、３０℃で３時間、マグネチックスターラーで撹拌した。その後、実施例１と同様に抽出、分析を行った結果、収率９５％で、光学純度９９％の（Ｒ）−３−ペンチン−２−オールを得た。
【００２２】
実施例６〜１０
表２に示す微生物を使う以外は実施例５と同様に反応と分析を行った。結果を表３に示した。
【００２３】
【表２】
0003893721.tif 000005
【００２４】
【表３】
0003893721.tif 000006
【００２５】
実施例１１〜１３
酵母エキス３ｇ／ｄｌ、麦芽エキス５０ｇ／ｄｌ、寒天２ｇ／ｄｌからなる寒天斜面培地（ｐＨ６．０）で２８℃、４８時間培養した表２に示す微生物の１白金耳を、酵母エキス３ｇ／ｄｌ、麦芽エキス５０ｇ／ｄｌからなり、ｐＨ６．０に調整、加熱滅菌した液体培地５００ｍｌを入れた２１容量の振盪フラスコに植菌し、２８℃で４８時間振盪培養した。遠心分離で集菌し、０．０１Ｍリン酸カリウムバッファーで洗浄した後、室温で風乾し、乾燥菌体を得た。次いで実施例５と同様に反応、分析を行なった。結果を表４に示した。
【００２６】
【表４】
0003893721.tif 000007
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、特定の酵素、微生物菌体または微生物の菌体の処理物を用いることにより、簡便でしかも高不斉選択的に光学活性アルコールおよび光学活性エステルを得ることができる。