【手続補正書】
【提出日】平成28年9月9日(2016.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の神経突起を含む以前に単離されたニューロンを供する段階；
不均一な交流電場を供する段階；及び、
前記不均一な交流電場を前記神経突起の伸張領域に位置させて、前記交流電場の領域において神経突起の成長を抑えることによって１つ以上の神経突起の伸張を指向的に誘導する段階、
を有する、試験管内の方法。
【請求項２】
可逆的に前記神経突起の成長を阻止し得る物理的ガイダンスキューを供する段階；及び、
前記物理的ガイダンスキューを用いて前記神経突起の成長を制御する段階、
をさらに有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
軸索突起ダイオードを形成する段階を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電場の大きさは１００V/m未満である、請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記電場が、２００μｍ以下の中心間の距離を有する２つ以上の電極によって生成される、請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記伸張を指向的に誘導する段階が、基板上でまたは３次元スキャフォールド内部で軸索突起の伸張を指向的に誘導する段階を含む、請求項１乃至５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スキャフォールドがコラーゲンを含むゲルマトリックスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記神経突起の伸張を指向的に誘導する段階が、本質的に同一の条件下で前記電場が存在しない状態での神経突起の伸張に比して神経突起の伸張を加速させる、請求項１乃至７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記神経突起の伸張を指向的に誘導する段階が、第１方位での神経突起の伸張を阻止し、第２方位での神経突起の伸張を可能にすることを含む、請求項１乃至８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２方位が、生成された電場に対して垂直な電極の軸に対して９０°以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
神経突起の伸張を指向的に誘導する段階が、該神経突起が第２神経突起に重なるようなものである、請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経突起の伸張を指向的に誘導することが、第１神経突起の個体群と第２神経突起の個体群との間でニューラルネットワークを構成するように、３次元スキャフォールド内で前記第１神経突起と前記第２神経突起の伸張を指向的に誘導する段階、を有する、請求項１乃至１１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電場の周波数が１００Ｈｚ以上である、請求項１乃至１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１神経突起が、前記第２神経突起とは異なるニューロンを起源とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生きている細胞を収容し、かつ、細胞の成長を促進することが可能なチャンバ；
前記チャンバに接続され、かつ、２０μｍ以下の高さ及び／又は幅を有する、チャネル；並びに、
一の電極対は中心間の間隔が２００μｍ以下の２つの電極を含む、複数の電極対、を有するシステムであって、
前記複数の電極対は前記チャネルと交差し、前記チャネルでの神経突起の成長を抑えるための交流電場を前記チャネル上に供するよう適応されている、
システム。
【請求項１６】
第１チャネルに接続された第１チャンバ；
前記第１チャネルの少なくとも一部と位置合わせされた第１電極対であって、前記第１電極対の一部は前記第１チャンバの少なくとも一部と重なる、第１電極対；
第２チャネルに接続された第２チャンバ；及び、
前記第２チャネルの少なくとも一部と位置合わせされた第２電極対、を有するシステムであって、
前記第２電極対の一部は前記第２チャンバの少なくとも一部と重なり、
前記第１チャネルと前記第２チャネルは、１０μｍよりも高い高さを有する重なり領域で交差し、前記第１及び第２電極対は、神経突起の成長を抑えるための交流電場をそれぞれ前記第１及び第２チャネル上に供するよう適応されている、
システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明は概して、１つ以上のニューロンの神経伸張に関する。神経突起の成長を変化させるシステム及び方法が概ね記載されている。一部の実施例では、システム（たとえばマイクロ流体システム）は、神経突起（たとえば軸索（軸索突起ともいう））を含むニューロン、及び、物理的ガイダンスキュー（たとえば電場駆動力）を生成することが可能な構成要素を有して良い。物理的ガイダンスキューは、神経突起の成長を変化させるのに用いられて良く、かつ、神経突起の成長が空間的及び／又は時間的に変化し得るように時間的及び空間的に変化可能であって良い。一部の場合では、構成要素は電極であって良く、かつ、物理的ガイダンスキューは、電場（たとえば交流電場）によって生成される電場駆動力であって良い。一部の場合では、システムは、各々が神経突起を含む２つ以上のニューロンを有して良い。そのような場合の一部では、１つ以上の物理的ガイダンスキューは、神経突起間での一方向性接続を形成するのに用いられて良い。これらのシステムは、神経突起の成長、神経細胞の信号方式、及び、制御されてある方位をとるニューラルネットワークの形成の定量的研究の用途にとって特に適し得る。とはいえこれらのシステムは他の用途にも用いられ得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
培養チャンバにニューロンを加えると、拡張的な神経突起の伸張が、試験管内（in  vitro）にて４日（ＤＩＶ）で起こった。このとき多くの神経突起がマイクロチャネルに入り込んだ（図５Ａ）。図１Ａは、マイクロ流体神経電場駆動プラットフォーム（the  Microfluidic  neuronal  electrokinetic  platform）のデバイスの断面を示している図５Ａは、試験管内において４日でのデバイス内で成長したニューロンの画像である。図のスケールバーは５０μｍである。図５Ｂは、４つのウエルを有する流体インターフェースと電気インターフェースを示す写真である。スケールバーは１ｃｍである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
次にＡＣ信号が電極に印加され、かつ、軸索突起（axon）の成長がモニタリングされた。電極と交差しないマイクロチャネル内では、軸索突起は、マイクロチャネルの長さを貫通するように成長した（図１Ｃ−図１Ｄ）。しかし電極を備えるマイクロチャネル内での軸索突起は、電場が印加されたときには、電極で成長を止めた（図１Ｃ）。一旦電場がオフにされると、軸索突起は、マイクロチャネルを貫通する成長を再開した。このことは、軸索突起が生存可能のままだったことを示唆している。ＡＣ電場が軸索突起の成長に及ぼす影響を定量化するため、試験管内で７日間印加した後、ＡＣ信号の周波数と電圧振幅を変化させた。顕著な温度上昇（ΔＴ〜σＶ２／ｋ。ここで、σは媒質の電気伝導度で、ｋは熱伝導率で、ここで最大電圧での細胞の培養媒質ではΔＴ〜７℃であった）又は（σｍ＝０．９８±０．０８Ｓ／ｍで測定される）高伝導度の海馬培養媒質中での電気分解を回避するため、周波数は１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚ及び電圧は０〜３Ｖｐ−ｐの範囲にそれぞれ制限された。ＡＣ信号の周波数と電圧のいずれも、軸索突起の長さに顕著な影響を有した。このとき、より低周波数は、所与の電圧での軸索突起の伸張をより顕著に抑制した（図６）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
図１Ｃは、試験管内において４日での、組み合わせたれた垂直な電極を備えるマイクロチャネル内での軸索突起の成長の蛍光偽色画像である。ニューロンは、生きている細胞を視覚化する目的で、チューブリン−ＧＦＰバキュロウイルスによって感染させた。太い矢印は、マイクロチャネルを貫通するように成長する、電極のない制御チャネル内での軸索突起を表す。細い矢印は、電極端部で止まる、電極を備えるマイクロチャネル内での軸索突起を表している。周波数は１００ｋＨｚで、かつ、電圧は２Ｖだった。スケールバーは１５０μｍである。図１Ｄは、試験管内で４日間電場を印加した後に試験管内で６日経った時点での軸索突起の成長の蛍光偽色画像である。太い矢印は軸索突起の終端部を表している。図６は、電圧をオンにした状態でチップ内にて７日間培養した後での電圧に対する規格化された軸索突起の長さのグラフである。(***:  p<0.001)。図中、ｎは２つの独立した複製実験にわたって測定された軸索突起の数を表す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
図７は、制御実験（電場は印加されない）及びＡＣ界面動電効果によって阻止される軸索突起のための、プラットフォーム内で長時間にわたる軸索突起の長さを示している。第１電極への距離及びチャネル端部への距離がハイライトされている。主要な本体の区画からの軸索突起は約３日で第１電極に到達する一方で、ＡＣによる阻止から軸索突起を解放した後の軸索突起の伸張は１日かからない。結果は、試験管内での４日と試験管内での６日の間での観測された軸索突起の伸張は、阻止された軸索突起の伸張によるものであり、細胞本体の区画から成長する新しい樹状突起ではないことを強く示唆している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
軸索突起を阻止するデータ（図１Ｄ）を検討すると、周波数が低い（ｆ＜２５０ｋＨｚ）と、軸索突起の長さが最小となり、周波数が低い領域では、ＤＥＰ／ＥＨＤの比が最大になる（図３ｂ）ことがわかった。同様に、モデルは、高い周波数（ｆ＞２５０ｋＨｚ）でＤＥＰ力の大きさが減少することを示している。他方、周波数が増大するときには、実験的に軸索突起の長さが増大した−つまりは界面動電効果が小さくなった−ことが観測された。しかもモデルは、所与の周波数では、ＤＥＰ／ＥＨＤ力が電圧の増大と共に増大することを示している一方で、実験は、１００ｋＨｚを除くすべての周波数で電圧の増大と共に軸索突起の長さが増大することを示している。興味深いことに、この最低周波数は、周波数に対するＤＥＰ／ＥＨＤのプロットにおけるピークに対応し得る（図９Ｂ）。よって軸索突起の長さの定量的データにおける傾向（図１Ｄ）が、発達する軸索突起がＤＥＰ力によって作用する機構と最も良く整合する。モデル及びパラメータの値によって、成長に作用する最大のＤＥＰ力が〜６６ｐＮであることがわかった（図１１）。これは、試験管内での脊柱交連神経細胞の軸索突起の成長円錐によって生じる引っ張り力と同じオーダーであり、かつ、成長円錐の引きつけを生じさせるネトリン１によって生じる力である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
２つの異なるマイクロ流体チップはこのようにして構築された。第１チップ（図１）は、マイクロ溝（長さ４５０μｍ、幅５μｍ、高さ３μｍ）のアレイによって分離された長方形のマイクロチャネル（長さ４０００μｍ、幅５００μｍ、高さ１００μｍ）で作られた２つの区画を有するチップだった。第２チップ（図４）は、正三角形内に設けられた３つのマイクロチャンバ（直径５００μｍ、高さ１００μｍ）に接続される５ｍｍの穴があけられた流入容器と流出容器で作られた３区画チップだった。各容器は、マイクロチャネル（長さ４５０μｍ、幅５０μｍ、高さ３μｍ）を介して他の容器に接続された。マイクロチャネルは、培養器中で２４時間、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ−ｌ−リジン（シグマ  アルドリッチ社）によってコーティングされた。続いてチャネルは、蒸留水（ＤＩ）で３回洗浄され、かつ、２時間、２０μｇ／ｍＬのラミニン（シグマ  アルドリッチ社）によってコーティングされた。チャネルは、ＤＩ水によって再度３回洗浄され、かつ、２ｍＭのグルタミンと１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（海馬培養媒質）を含むNeurobasal−B27（登録商標）によって３回洗浄及び充填された。マイクロ流体チップは、使用されるまで培養器内に設けられた。
「分離及び細胞の培養」
すべての動物の仕事は、ＭＩＴの動物の保護に関する委員会（MIT  Committee  of  Animal  Care）及び比較医学部（Division  of  Comparative  Medicine）によって承認され、かつ、動物福祉に関する研究所、州、及び連邦政府のガイドラインを遵守している。海馬は、E18  Sprague  Dawleyラット（チャールズリバー研究所）から採取され、かつ、１０ｍMのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３で緩衝された、よく冷えたＨａｎｋの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）によって消化（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）された。細胞組織は、２０Ｕ／ｍｌのパパイン（ワージントンバイオケミカル）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＬ−システインを含む、ＨＥＰＥＳで緩衝された２ｍｌのＨＢＳＳ中で３０分間培養されたことで消化された。続いて細胞組織は、８ｍｌの海馬培養媒質によって３回洗浄された。細胞は、１ｍｌの海馬培養媒質中で穏やかに粉砕され、血球計算盤によって計数され、かつ、デバイス内へ流し込まれた。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２で維持された。
「デバイス中でのニューロンの種付け」
種付け前、マイクロ流体チップの容器は、マイクロチャネルから媒質を除去することなく空であった。各流入容器では、４μＬの高密度（＞８×１０６の細胞／ｍＬ）で溶解したニューロン溶液が、マイクロチャネルの入口付近に設けられた。チップは、ニューロンをコーティングされたガラスに接合させるため、５分間培養器に戻された。種付けプロセスは、高い細胞濃度を達成するように３回繰り返された。最後に、流入容器と流出容器は海馬培養媒質によって迅速に充填され、かつ、チップは培養器に戻された。
「ニューロンのトランスフェクション」
プレーティング後２４時間のニューロンが、販売業者によって示唆されているように、１０４の細胞に対して２μLの比で、チューブリン−ＧＦＰバキュロウイルス（ライフテクノロジー社、チューブリン−ＧＦＰバキュマム２．０ウイルス）によってトランスフェクションされた。続いて細胞は、１６時間の培養後に蛍光中で撮像された。
「画像の取得」
画像は、冷却されたＣＣＤカメラであるＬａＶｉｓｉｏｎ  ＩｍａｇｅｒＱＥ（ＬａＶｉｓｉｏｎ）と自動ステージであるＬｕｄＩ  ＭＡＣ５０００（ＬｕｄＩ）に適合したAxiovert  200M（ザイス社）によって取得された。顕微鏡は、Metamorphソフトウエア（モレキュラーデバイス社）によって制御された。画像は、ImageJ及びMatlabソフトウエア（マスワーク社）を用いて解析された。
「培養器内部でＡＣ電気信号を印加する試験管内プラットフォーム」
ＡＣ信号が、培養器内部に設けられた特注のプラットフォームによってマイクロ電極に印加された。マイクロ流体チップは、アルドゥイーノの自作プリント回路基板積層体に接続されたＺＩＦコネクタに対して位置合わせされ、かつ、ＺＩＦコネクタへ挿入された。ＺＩＦコネクタは、チップの機械的及び電気的ホルダとして機能する。積層体は、３つのボード、マスターであるアルドゥイーノのボード、デジタル直接合成発振器によって発振されたＡＣ信号のボード、及びルーティングボードで構成された。（ミッドナイトデザインソリューション社、ＤＤＳ−６０ドーターカードに基づく）ＤＤＳボードは、０〜６０ＭＨｚ及び０〜１０Ｖｐ−ｐの範囲内でＡＣ信号を発生させることが可能だった。（テキサスインスツルメント社、ADG333ABRスイッチ、アナログボード、及び74HC595シフトレジスタを用いた）ルーティングボードは、１つ以上の電極へのＡＣ信号の再ルーティング及び維持が可能だった。ＵＳＢによってアルドゥイーノに接続されたラズベリー・パイ  ミニコンピュータは、積層体全体を操作した。各電極の周波数と電圧が、リアルタイムでウエブブラウザ経由で遠隔的に変化できるように、ウエブサーバが、ラズベリー・パイにインストールされた。電気信号は、電気スイッチとシフトレジスタで構成される自作のアルドゥイーノボードを介して各電極へ選択的に送られる。スイッチを閉じる命令は、ウエブサーバが常時動いているラズベリー・パイによってアルドゥイーノへ送られる。アルドゥイーノとＺＩＦコネクタのいずれも、最終的には培養器中に設けられる。
「軸索突起の長さの測定」
全ての溝は落射蛍光下で撮像された。軸索突起の長さはＭａｔｌａｂによって測定された。撮像アルゴリズムは、最初にコントラストと輝度を改善する段階、続いて画像を（各画像にとって手動で最適化された閾値で）二値化する段階、続いてハフ変換を適用する段階、及び、最後にチャネルエッジと軸索突起の端部との間のギャップを測定する段階で構成される。各電圧と周波数について、規格化軸索突起長さが、観測された軸索突起の長さ（図６のＡＬ）と、チャネル端部と第１電極との間の距離（図６のＤＣＥ）との比として定義された。軸索突起ロックシステムでは、軸索突起の長さは、これまでのものと同一のアルゴリズムによって測定された。成長円錐が電極によって隠されたとき、位置は、電極の幅程度の誤差で電極自体の中央にあると推定された。
「ニューラルネットワークの刺激」
ニューロンは、１時間Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）  ＢＡＰＴＡ１（ライフテクノロジー社）によって染色され、かつ、媒質によって洗浄された。一の個体群の一部だけを刺激するため、９０ｍＭのＫＣｌ溶液２０μＬが、一のマイクロチャンバの流入口内にのみ注入された。他の個体群のニューロンの容器は、５０μＬの各媒質で充填された。それにより、ＫＣｌが注入されたマイクロチャンバから流出するのを防止するように、チャンバ間に圧力差が生成された。この流体流のコンパートメント化の詳細は補足情報において与えられる。
「活動電位の記録」
活動電位は、軸索突起をロックする三角チップ内においてマイクロ電極自体を介して記録された。同一のマイクロチャネルからのマイクロ電極は、ＺＩＦモジュールを介して刺激用電極及び記録用電極として接続された。パルス発生装置（ＴＴｉ）は、電流変換器（アイソレータ−１０、Axon  Instruments社）に接続され、続いて刺激用電極に接続された。記録用電極は、ロックインアンプ（利得×１０４、ＩＳＯ−８０、World  Precision  Instruments社）とＰＣオシロスコープ（PicoScope、ＰＣオシロスコープソフトウエア）に接続された。続いて信号は、Ｍａｔｌａｂに送られ、時間的に合成された。
「統計解析」
軸索突起の停止解析では、差異は、各実験条件が複製されて実行された２つの独立する実験からスチューデントのｔ検定によって解決された。すべての解析について、＊ｐ値は０．０５未満で、＊＊ｐ値は０．０５未満で、＊＊＊ｐ値は０．００１未満だった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
最初に、結合されたチップは、細胞容器内で神経細胞たいが結合可能となるように、ポリ−ｄ−リシンとラミニンによって官能化された。続いて、マイクロ流体チャネル全体が、スキャフォールド流入口を介してＩ型コラーゲン溶液で充填され、かつ、完全なゲル化まで３７℃で培養された。酢酸（０．２Ｍ、ｐＨ３．５）が、コラーゲンを不安定化させるために細胞容器内に滴下された。酸がマイクロ流体チャネルをエッチングするのを防止するため、静水圧が、細胞媒質を流入口へ滴下することによって印加された。３７℃で３０分エッチングした後、不安定化したスキャフォールドは、細胞流出口を介して慎重に吸引された。酸と残留物を取り除くため、チャネルは、緩衝細胞媒質によって３回フラッシングされた。図22は、毛管の充填２２−１とマイクロ流体パターニング２２−２に用いられる手順を表している。図22Aは、媒質容器（破線）、細胞とスキャフォールド容器（100μm）、およびマイクロチャネル（50μm）を備える電気マイクロ流体チップを示している。図22Bは、コラーゲンによる構造物の充填及び完全なゲル化の後の電気マイクロ流体チップを表している。図22Cは、酸が細胞容器をエッチングした後でも、マイクロチャネルは、スキャフォールドが充填された容器からの静水圧の印加によって保護されている電気マイクロ流体チップを表している。図22Dは、不安定化したスキャフォールドが吸引され、かつ、過剰な酸と残留物が緩衝溶液によって取り除かれた後の電気マイクロ流体チップを表している。図22Eは、プロセスの経時変化画像である。500μm/分のエッチング速度を得ることができた。その結果、スキャフォールドは、電極チャネル内及び媒質容器内にのみ残る一方で、細胞容器は空でかつ細胞の種付けの準備ができている。
「分離及び細胞の培養」
すべての動物の仕事は、動物福祉に関する研究所、州、及び連邦政府のガイドラインを遵守している。海馬は、E18  Sprague  Dawleyラット（チャールズリバー研究所）から採取され、かつ、１０ｍMのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３で緩衝された、よく冷えたＨａｎｋの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）によって消化（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）された。細胞組織は、２０Ｕ／ｍｌのパパイン（ワージントンバイオケミカル）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＬ−システインを含む、ＨＥＰＥＳで緩衝された２ｍｌのＨＢＳＳ中で３０分間培養されたことで消化された。続いて細胞組織は、８ｍｌの海馬培養媒質によって３回洗浄された。細胞は、１ｍｌの海馬培養媒質中で穏やかに粉砕され、血球計算盤によって計数され、かつ、35,000細胞／mm2の密度でプレーティングされた。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２で維持された。細胞媒質は３日毎に５０％について更新された。静水圧を維持するために、ニューロンの区画の容器が毎日媒質を系統的に満たされ、他は容器表面を乾かすことなく空にされた。
「デバイス中でのニューロンの種付け」
種付け前、マイクロ流体チップの容器は、マイクロチャネルから媒質を除去することなく空であった。各流入／流出容器では、６μＬのプレーティング媒質が流出口に設けられ、直後に、４μＬの高密度（＞８×１０６の細胞／ｍＬ）溶解ニューロン溶液が、マイクロチャネルの入口付近に設けられた。チップは、ニューロンをコーティングされたガラスに接合させるため、５分間培養器に戻された。種付けプロセスは３回繰り返された。最後に、流入容器と流出容器は海馬培養媒質によって迅速に充填され、かつ、チップは培養器に戻され、かつ、実施例５で説明したAC電場を印加するため、試験管内プラットフォームに装着された。
「ニューロンのトランスフェクション」
各蛍光レンチウイルスについて、tdTomato又はEGFPのクローンが、CMVプロモーター後であって、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント(WPRE)前に、レンチウイルスの転写プラスミド内で作製され、かつ、Stbl3細胞内で増幅された。ウイルスを作製するため、少ない通路（10未満）で3百万のHEK293FT細胞（ライフテクノロジー社）が、10%のFBS（ハイクローン社）が補充されたDMEM内でのT−225フラスコ内でのトランスフェクション前の日に種付された。細胞は、100μmのリポフェクタミン2000（登録商標）と、20μgの転写プラスミド（tdTomato又はEGFPのいずれか）、15μgのpsPAX2、10μgのVSVg  (アドジーン社)を有する200μlのプラス試薬（ライフテクノロジー社）を用いてOptiMEM内でトランスフェクトされた。６時間後、媒質は除去され、かつ、１０％ＦＢＳと１％ＢＳＡが補充されたＤＭＥＭに置換された。６０時間後、補充物が除去され、かつ、回転速度３０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離された。この補充物は、０．４５μｍの低タンパク質結合フィルタ（ミリポア社）によって濾過された。３００×の濃度のウイルス粒子を実現するため、濾過されたレンチウイルスは、回転速度２４０００ｒｐｍ及び４℃で２時間超遠心分離され（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ）（Ｓｏｒｖａｌｌ（商標））、その後、１％ＢＳＡが補充されたＤ１０内において４℃で再懸濁された。アリコートが、ニューロンの形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）まで−８０℃で貯蔵された。
「画像の取得」
画像は、冷却されたＣＣＤカメラであるＬａＶｉｓｉｏｎ  ＩｍａｇｅｒＱＥ（ＬａＶｉｓｉｏｎ）と自動ステージであるＬｕｄＩ  ＭＡＣ５０００（ＬｕｄＩ）に適合したAxiovert  200M（ザイス社）によって取得された。顕微鏡は、Metamorphソフトウエア（モレキュラーデバイス社）によって制御された。画像は、ImageJ及びMatlabソフトウエア（マスワーク社）を用いて解析された。画像の組は、フジのImageJプラグインによってまとめられた。
「ニューロンの数を定量化する画像解析」
細胞体が、ImageJプラグインMOSAICによって縫合された画像上で計数された。
「神経突起の偏差角、成長速度、及び軸索突起の高さを定量化する画像解析」
神経突起の位置合わせ及び長さの定量化が以下のようにして実行された。コラーゲンスキャフォールドを有する一のチャネルを含む３つの試料の画像が、各条件について解析され、かつ、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ社）を用いて定量化された。一の試料は最小で５０の樹状突起を含んでいた。反射強度の閾値は、神経突起をバックグラウンドから分離するように定義された。楕円を各樹状突起の主軸に合わせることによって、主チャネルの方向に対する神経突起の角度が決定された。位置合わせ方向に対して平行な樹状突起の方位は０°の角度に相当する。神経突起の角度分布は、（１８０の角度に分類された）方位角の相対周波数に基づき、かつ、ガウス分布の半値全幅（ＦＷＨＭ）へのフィッティングによって決定された。たとえば神経突起に沿った評価点での角度が、５０μｍ（成長円錐の直径の５倍）前での評価点での角度と比較して１０％よりも大きな変化を有する、といったように初期の軌跡のずれが定義された。続いてずれは、角度に対する評価点間の相対的な差異であるように記録された。各神経突起の長さは、コラーゲンが充填されたマイクロチャネルの開始点での原点から終端部まで測定された。そのコースに沿った方向の変化は、各伸張の全長に沿った追跡によって考慮された。単一で、かつ、明らかに孤立した伸張は、他の伸張との混合の可能性を排除するように測定された。その後成長速度は、測定された相対長さを、それらの測定間での時間経過で除することによって評価された。３Ｄにおける軸索突起の高さは、Ｍａｔｌａｂ内での蛍光共焦点画像の積層体を後処理することによって決定された。スクリプトは、ノイズを減少させ、かつ、軸索突起の中心を決定するガウシアンフィルタを含んで良い。プロットは、チャネルの各独立するスライス内で検出された中心を含む。
「統計解析」
軸索突起の停止解析では、差異は、各実験条件が複製されて実行された２つの独立する実験からスチューデントのｔ検定によって解決された。すべての解析について、＊ｐ値は０．０５未満で、＊＊ｐ値は０．０５未満で、＊＊＊ｐ値は０．００１未満だった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
上述の明細書中のみならず請求項中でも、すべてのつなぎ言葉−たとえば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ、ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等−は、限定がない−つまり含むがそれに限定されない−と解される。「・・・からなる」及び「基本的に・・・からなる」というつなぎ言葉は、審査手順の米国特許庁マニュアルの２０１１年３月版で説明されているように限定的（closed）又は半限定的（semi-closed）である。
いくつかの態様を記載しておく。
〔態様１〕
１つ以上の神経突起を含むニューロンを供する段階；
交流電場を供する段階；及び、
前記交流電場を用いて１つ以上の神経突起の伸張を指向的に誘導する段階、
を有する方法。
〔態様２〕
交流電場を用いることによって神経突起の伸張を指向的に誘導する段階、を有する方法。
〔態様３〕
２つ以上の電極によって生成される電場によって神経突起の成長に影響を与える段階であって、前記電極間の中心間の間隔は約２００μｍ以下である、段階、を有する方法。
〔態様４〕
多方向での神経突起の成長に影響を、前記神経突起の周辺で約１００Ｖ／ｍ以上の大きさを有する電場によって与える段階、を有する方法。
〔態様５〕
神経突起を含むニューロンを供する段階；
可逆的に前記神経突起の成長を阻止し得る物理的ガイダンスキューを供する段階；及び、
前記物理的ガイダンスキューを用いて前記神経突起の成長を制御する段階、
を有する方法。
〔態様６〕
第１方位での神経突起の成長を可能にする段階；及び、
機械的に作用しない物理的ガイダンスキューを前記神経突起に印加することで、前記神経突起の成長が第２方位で起こるように前記神経突起に影響を与える段階、
を有する方法。
〔態様７〕
各々が１つ以上の神経突起を含む２つ以上のニューロンを供する段階；
電場を供する段階；
一の神経突起を他の神経突起とは独立に制御する段階；及び、
前記２つ以上のニューロンからニューラルネットワークを構成する段階、
を有する方法。
〔態様８〕
生きている細胞を収容し、かつ、細胞の成長を促進することが可能なチャンバ；
前記チャンバに接続され、かつ、約２０μｍ以下の高さ及び／又は幅を有する、チャネル；並びに、
一の電極対は中心間の間隔が約２００μｍ以下の２つの電極を含む、複数の電極対、を有する製品であって、
前記複数の電極対は前記チャネルと交差する、
製品。
〔態様９〕
一方向性神経連絡を形成する段階を有する、態様１乃至の７うちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１０〕
軸索突起ダイオードを形成する段階を有する、態様１乃至７及び９のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１１〕
前記電場が再構成可能である、態様１乃至７、９、及び１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１２〕
軸索突起の伸張を２次元に誘導する段階を有する、態様１乃至７及び９乃至１１のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１３〕
軸索突起の伸張を３次元に誘導する段階を有する、態様１乃至７及び９乃至１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１４〕
チャネルへの成長を抑制する段階であって、前記チャネル内での電場の大きさは１００V/m未満である段階を有する、態様１乃至７及び９乃至１３のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１５〕
前記電場を変化させることによって前記神経突起の成長を誘導する段階を有する、態様１乃至７及び９乃至１４のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１６〕
前記電場が交流電場である、態様１乃至７及び９乃至１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１７〕
前記電場の大きさが約１００V/m以上である、態様１乃至７及び９乃至１６のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１８〕
前記電場の周波数が約１００Ｈｚ以上である、態様１乃至７及び９乃至１７のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様１９〕
前記神経突起の成長に影響を与える段階が神経突起の成長を阻止する段階を含む、態様１乃至７及び９乃至１８のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２０〕
前記電場が、約２００μｍ以下の中心間の距離を有する２つ以上の電極によって生成される、態様１乃至７及び９乃至１９のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２１〕
前記伸張を指向的に誘導する段階が、３次元スキャフォールド内部で軸索突起の伸張を指向的に誘導する段階を含む、態様１乃至７及び９乃至２０のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２２〕
前記スキャフォールドがゲルマトリックスである、態様１乃至７及び９乃至２１のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２３〕
前記スキャフォールドがコラーゲンを含む、態様１乃至７及び９乃至２２のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２４〕
前記神経突起の成長に影響を与える段階が、本質的に同一の条件下で前記電場が存在しない状態での神経突起の伸張に対する神経突起の伸張を加速させる段階を含む、態様１乃至７及び９乃至２３のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２５〕
前記神経突起の成長に影響を与える段階が、第１方位での神経突起の伸張を阻止する段階、及び、第２方位での神経突起の伸張を可能にする段階を含む、態様１乃至７及び９乃至２４のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２６〕
前記第２方位が、生成された電場に対して垂直な電極の軸に対して９０°以上である、態様１乃至７及び９乃至２５のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２７〕
前記第１方位がｘｙ平面で、かつ、前記第１方位がｙｚ平面又はｘｚ平面である、態様１乃至７及び９乃至２６のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２８〕
前記物理的ガイダンスキューが、機械的に作用しない物理的ガイダンスキューである、態様１乃至７及び９乃至２７のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様２９〕
前記ニューロンが、海馬ニューロン、後根神経節ニューロン、及び、網膜神経節細胞からなる群から選ばれる、態様１乃至７及び９乃至２８のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様３０〕
前記電場が不均一である、態様１乃至７及び９乃至２９のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様３１〕
第１チャネルが３次元スキャフォールドを含む、態様８に記載の製品。
〔態様３２〕
前記スキャフォールドがゲルマトリックスである、態様８又は３１に記載の製品。
〔態様３３〕
前記スキャフォールドがコラーゲンを含む、態様８、３１、又は３２に記載の製品。
〔態様３４〕
前記チャネルの高さが約２０μｍ以下である、態様８及び３１乃至３３のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様３５〕
前記チャネルの高さが約１０μｍ以下である、態様８及び３１乃至３４のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様３６〕
前記電極対が２つの平行な電極を有する、態様８及び３１乃至３５のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様３７〕
前記中心間の距離が約１００μｍ以下である、態様８及び３１乃至３６のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様３８〕
前記中心間の距離が約５０μｍ以下である、態様８及び３１乃至３７のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様３９〕
前記生きている細胞がニューロンである、態様８及び３１乃至３８のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様４０〕
前記ニューロンが、海馬ニューロン、後根神経節ニューロン、及び、網膜神経節細胞からなる群から選ばれる、態様８及び３１乃至３９のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様４１〕
複数の電極対が前記３次元スキャフォールド内に含まれない、態様８及び３１乃至４０のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様４２〕
ガイダンスキューを用いることによって、第１神経突起を第２神経突起に重ねる段階、を有する方法。
〔態様４３〕
第１神経突起が第２神経突起に重なるように前記第１神経突起の成長を誘導する段階、を有する方法。
〔態様４４〕
電場を用いることによって、第１個体群の神経突起と第２個体群の神経突起との間でニューラルネットワークを構成するように、３次元スキャフォールド内で第１神経突起と第２神経突起の伸張を指向的に誘導する段階、を有する方法。
〔態様４５〕
電場を用いることによって、３次元スキャフォールド内で神経突起の伸張を加速させる段階、を有する方法。
〔態様４６〕
第１チャネルに接続される第１チャンバ；
前記第１チャネルの少なくとも一部と位置合わせされる第１電極対であって、前記第１電極対の一部は前記第１チャンバの少なくとも一部と重なる、第１電極対；
第２チャネルに接続される第２チャンバ；及び、
前記第２チャネルの少なくとも一部と位置合わせされる第２電極対、を有する製品であって、
前記第２電極対の一部は前記第２チャンバの少なくとも一部と重なり、
前記第１チャネルと前記第２チャネルは、約１０μｍよりも高い高さを有する重なり領域で交差する、
製品。
〔態様４７〕
第１チャンバ及び第２チャンバに接続される第１チャネル；及び、
前記第１チャネルの少なくとも一部と位置合わせされる第１電極対、を有する製品であって、
前記第１電極対の一部は前記第１チャンバの少なくとも一部と重なり、かつ、
前記第１電極対間の中心間距離は約２００μｍ以下である、
製品。
〔態様４８〕
前記第１チャネルと位置合わせされた第２電極対を有する、態様８、３１乃至４０、並びに態様４６及び４７のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様４９〕
前記第１電極対が前記第１チャネルに対して実質的に平行である、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至４８のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５０〕
前記第２電極対が前記第２チャネルに対して実質的に平行である、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至４９のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５１〕
前記第２電極対が前記第１電極対に対して実質的に垂直である、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５０のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５２〕
前記第１チャネル及び／又は前記第２チャネルが、約１０μｍ以下の高さを有する、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５１のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５３〕
前記重なり領域の高さが約５００μｍ以下である、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５２のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５４〕
前記第１電極対の一部が、前記第２チャンバの少なくとも一部と重なる、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５３のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５５〕
前記第２電極対の一部が、前記第２チャンバの少なくとも一部と重なる、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５４のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５６〕
前記第２電極対間の中心間の距離が約２００μｍ以下である、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５５のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５７〕
電場を印加する段階を有する、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５６のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５８〕
生きている細胞を有する、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５７のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様５９〕
前記ニューロンが、海馬ニューロン、後根神経節ニューロン、及び、網膜神経節細胞からなる群から選ばれる、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５８のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様６０〕
前記第１チャネル及び／又は前記第２チャネルが３次元スキャフォールドを有する、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至５９のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様６１〕
前記スキャフォールドがゲルマトリックスである、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至６０のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様６２〕
前記スキャフォールドがコラーゲンを含む、態様８、３１乃至４０、及び態様４６乃至６１のうちのいずれか一項に記載の製品。
〔態様６３〕
前記第１電極と前記第２電極との間の中心間の距離が約２００μｍ以下である、態様１乃至７及び９乃至３０のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６４〕
前記電場が交流電場である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６５〕
前記電場の大きさが約１００V/m以上である、態様１乃至７、９乃至３０、並びに６３及び６４のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６６〕
前記電場の周波数が約１００Ｈｚ以上である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至６５のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６７〕
前記第１チャンバ及び前記第２チャンバが、生きている細胞を収容し、かつ、細胞の成長を促進するように、適合及び配置される、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至６６のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６８〕
前記重なりが３次元スキャフォールド内で起こる、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至６７のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様６９〕
前記第１神経突起が、前記第２神経突起とは異なるニューロンを起源とする、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至６８のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７０〕
前記第２神経突起が、前記神経突起とは異なるニューロンを起源とする、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至６９のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７１〕
前記成長を誘導する段階がガイダンスキューを印加する段階を含む、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７０のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７２〕
前記ガイダンスキューが物理的ガイダンスキューである、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７１のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７３〕
前記ガイダンスキューが電場である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７２のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７４〕
前記電場が交流電場である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７３のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７５〕
前記第１神経突起と前記第２神経突起とが重なる場所で、前記第１神経突起の１０％未満は、前記第２神経突起との神経連絡を形成する、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７４のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７６〕
神経突起が、神経連絡を形成することなく前記第２神経突起と重なる、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７５のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７７〕
前記神経突起が、海馬ニューロン、後根神経節ニューロン、及び、網膜神経節細胞からなる群から選ばれるニューロンを起源とする、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７６のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７８〕
前記スキャフォールドがゲルマトリックスである、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７７のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様７９〕
前記スキャフォールドがコラーゲンを含む、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７８のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様８０〕
前記電場が不均一である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至７９のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔態様８１〕
前記神経突起が軸索突起である、態様１乃至７、９乃至３０、及び６３乃至８０のうちのいずれか一項に記載の方法。