【手続補正書】
【提出日】平成28年2月10日(2016.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップであって、
パネル中のプローブは、孔にカップリングされておらず、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識されるステップと、
（ｂ）孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
（ａ）各プローブが、そのアプタマーが分析物メンバーと結合していない場合に孔を流れる電流に示差的な様式で影響する；および／または
（ｂ）パネル中の少なくとも１つのプローブが、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスを認識し、前記クラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む；および／または
（ｃ）パネル中の少なくとも１つのプローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネル中の各プローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
尾部が、
（ａ）孔を流れる電流に異なる方式で影響する少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある；および／または
（ｂ）重合体を含み、場合によって、重合体が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である；および／または
（ｃ）少なくとも１つの１本鎖ポリヌクレオチドを含み、場合によって、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なるヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にあり、および、場合によって、少なくとも２つの領域が、異なるヌクレオチドまたは異なるポリヌクレオチドバーコードの少なくとも２つのひと続きに相当する；および／または
（ｄ）孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる重合体の少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある；および／または
（ｅ）配列番号７から２３の残基１から３０を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
尾部が、少なくとも１つの２本鎖ポリヌクレオチドを含む、および／または、尾部が、約７から約７０までのヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む、請求項４（ｂ）〜（ｅ）のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）パネル中の２つ以上のプローブが、同じアプタマーと異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む；または
（ｂ）パネル中の各プローブが、異なるアプタマーを含む；および／または
（ｃ）パネル中の各プローブが、異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
パネル中の２つ以上のプローブが、異なるアプタマーと同じ１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、請求項１から５および６（ｂ）のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
パネル中のプローブの数が、２つ以上の分析物の群の分析物メンバーの数と同じである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
パネル中の２つ以上のプローブが、同じ分析物メンバーと特異的に結合する異なるアプタマーを含む、請求項１から５、６（ｂ）、６（ｃ）、および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）パネル中の各プローブが、場合によってコレステロールを用いて、膜にカップリングされている；および／または
（ｂ）群が、約４から約１００までの分析物メンバーを有する；および／または
（ｃ）分析物メンバーが、金属イオン、無機塩、重合体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物および環境汚染物質から独立して選択される；および／または
（ｄ）２つ以上の分析物の群が、疾患または状態を診断または予後予測するために用いることができる２つ以上のバイオマーカーの群であり、場合によって、疾患または状態が、がん、冠動脈心疾患、循環器疾患または敗血症である；および／または
（ｅ）アプタマーが、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
孔が、前庭またはバレルを含み、場合によって、
（ａ）バレルが、２本鎖ポリヌクレオチドが孔を通過できないように十分に狭い；および／または
（ｂ）前庭およびバレルが、それぞれ少なくとも２ヌクレオチドを含有するように十分に長い；および／または
（ｃ）孔が、膜貫通タンパク質孔または固体状態の孔であり、場合によって、膜貫通タンパク質孔が、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡに由来し、さらに場合によって、膜貫通タンパク質が、（ｉ）配列番号２に示す７つの同一のサブユニットで形成されている；（ｉｉ）そのバリアントであって、７つのサブユニットの１つまたは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有する前記バリアントであって、孔活性を維持する前記バリアントである；（ｉｉｉ）配列番号４に示す４つの同一のサブユニットと配列番号６に示す４つの同一のサブユニットとで形成されるγ−溶血素である；あるいは（ｉｖ）そのバリアントであって、サブユニットの１もしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ／またはサブユニットの１つもしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号６と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ孔が孔活性を維持する前記バリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、分析物メンバーの１つと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
試料中の２以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１または複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルであって、パネルが、２つ以上のプローブを含み、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
パネル中のプローブは、孔にカップリングされておらず、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される、プローブのパネル。
【請求項１５】
パネルが、請求項２から９のいずれか一項で定義するとおりである、および／または、各プローブが、プローブと膜とのカップリングを可能にする化学基をさらに含む、請求項１４に記載のプローブのパネル。
【請求項１６】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットであって、（ａ）請求項１４または請求項１５に記載のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含むキット。
【請求項１７】
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための分析装置であって、複数の膜貫通孔と、請求項１４または請求項１５に記載のプローブのパネルとを含む分析装置。
【請求項１８】
分析装置が、
複数の孔を支持でき、孔を用いて分析物メンバーの特徴決定を行うために作動可能なセンサデバイスと
特徴決定を行うための材料を保持するための少なくとも１の貯蔵器と、
少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器と
を含み、流体システムが、容器からセンサデバイスに選択的に試料を供給するように構成されている、請求項１７に記載の分析装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
考察
上記の方法を用いて、Ｋ２  ＥＤＴＡ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コード−Ｓ．Ｂ−０００９）８０％緩衝液中の２０％ウサギ全血中に存在する場合に、３つ全ての分析物についての特徴的なステップレベル変化を検出することが可能である。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を、膜貫通孔および２つ以上のプローブのパネルと接触させるステップであって、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識されるステップと、
（ｂ）孔を流れる電流を測定して、存在するならばパネル中のどのプローブが分析物メンバーと結合したかを決定し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
［２］
各プローブが、そのアプタマーが分析物メンバーと結合していない場合に孔を流れる電流に示差的な様式で影響する、上記［１］に記載の方法。
［３］
パネル中の少なくとも１つのプローブが、２つ以上の分析物の群内の分析物メンバーのあるクラスを認識し、前記クラス中の分析物メンバーと結合するアプタマーを含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
パネル中の少なくとも１つのプローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
パネル中の各プローブが、分析物メンバーの１つを特異的に認識し、前記分析物メンバーと特異的に結合するアプタマーを含む、上記［１］に記載の方法。
［６］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［７］
尾部が、重合体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［８］
重合体が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、上記［７］に記載の方法。
［９］
尾部が、少なくとも１つの１本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なるヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記［９］に記載の方法。
［１１］
少なくとも２つの領域が、異なるヌクレオチドまたは異なるポリヌクレオチドバーコードの少なくとも２つのひと続きに相当する、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
尾部が、孔を流れる電流に異なる方式で影響する異なる重合体の少なくとも２つの領域を含み、ある領域が、アプタマーが分析物メンバーの１つと結合していないときに孔の中にあり、異なる領域が、アプタマーが前記分析物メンバーと結合しているときに孔の中にある、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
尾部が、少なくとも１つの２本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記［８］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
尾部が、約７から約７０までのヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む、上記［８］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
尾部が、配列番号７から２３の残基１から３０を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
パネル中の各プローブが、異なるアプタマーを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
パネル中の各プローブが、異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
パネル中の２つ以上のプローブが、異なるアプタマーと同じ１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
パネル中のプローブの数が、２つ以上の分析物の群の分析物メンバーの数と同じである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
パネル中の２つ以上のプローブが、同じアプタマーと異なる１本鎖ポリヌクレオチド尾部とを含む、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
パネル中の２つ以上のプローブが、同じ分析物メンバーと特異的に結合する異なるアプタマーを含む、上記［１］から［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
パネル中の各プローブが、膜にカップリングされている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２３］
各プローブが、コレステロールを用いて膜にカップリングされている、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
群が、約４から約１００までの分析物メンバーを有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
分析物メンバーが、金属イオン、無機塩、重合体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物および環境汚染物質から独立して選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
２つ以上の分析物の群が、疾患または状態を診断または予後予測するために用いることができる２つ以上のバイオマーカーの群である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
疾患または状態が、がん、冠動脈心疾患、循環器疾患または敗血症である、上記［２６］に記載の方法。
［２８］
アプタマーが、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
孔が、前庭またはバレルを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
バレルが、２本鎖ポリヌクレオチドが孔を通過できないように十分に狭い、上記［２９］に記載の方法。
［３１］
前庭およびバレルが、それぞれ少なくとも２ヌクレオチドを含有するように十分に長い、上記［２９］または［３０］に記載の方法。
［３２］
孔が、膜貫通タンパク質孔または固体状態の孔である、上記［２９］から［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
膜貫通タンパク質孔が、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡに由来する、上記［３２］に記載の方法。
［３４］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す７つの同一のサブユニット、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、７つのサブユニットの１つまたは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも５０％の相同性を有する前記バリアントであって、孔活性を維持する前記バリアントで形成されている、上記［３３］に記載の方法。
［３５］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す４つの同一のサブユニットと配列番号６に示す４つの同一のサブユニットとで形成されるγ−溶血素、あるいは（ｂ）そのバリアントであって、サブユニットの１もしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有し、かつ／またはサブユニットの１つもしくは複数が、配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号６と少なくとも５０％の相同性を有し、かつ孔が孔活性を維持する前記バリアントである、上記［３３］に記載の方法。
［３６］
ステップ（ｂ）が、分析物メンバーの１つと結合するプローブについて、各プローブが結合しているときおよび未結合のときに孔を流れる異なる電流を比較することをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
試料中の２以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定する方法であって、
（ｉ）上記［１］から［３６］のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
（ｉｉ）試料中に存在することが示された１または複数の分析物メンバーについて、ステップ（ｂ）における孔を流れる電流を、各分析物メンバーについての対照または参照データと比較し、そのことにより試料中の１つまたは複数の分析物メンバーの濃度を決定するステップと
を含む方法。
［３８］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのプローブのパネルであって、パネルが、２つ以上のプローブを含み、
各プローブが、分析物メンバーの１つまたは複数を認識し、（ｉ）分析物メンバーの１つまたは複数と結合するアプタマーと、（ｉｉ）膜貫通孔に侵入でき、プローブ中のアプタマーが分析物メンバーの１つと結合しているか否かに応じて孔を流れる電流に異なる影響を与える尾部とを含み、
各プローブが、孔を流れる電流に示差的な様式で影響し、
２つ以上の分析物の群中の各分析物メンバーが、パネル中の少なくとも１つのプローブにより認識される、プローブのパネル。
［３９］
上記［２］から［２１］のいずれか一項で定義するとおりである、上記［３８］に記載のプローブのパネル。
［４０］
各プローブが、プローブと膜とのカップリングを可能にする化学基をさらに含む、上記［３８］または［３９］に記載のプローブのパネル。
［４１］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するためのキットであって、（ａ）上記［３８］から［４０］のいずれか一項に記載のプローブのパネルと、（ｂ）膜貫通孔とを含むキット。
［４２］
試料中の２つ以上の分析物の群の１つまたは複数の分析物メンバーの存在、濃度または非存在を決定するための分析装置であって、複数の膜貫通孔と、上記［３８］から［４０］のいずれか一項に記載のプローブのパネルとを含む分析装置。
［４３］
複数の孔を支持でき、孔を用いて分析物メンバーの特徴決定を行うために作動可能なセンサデバイスと
特徴決定を行うための材料を保持するための少なくとも１の貯蔵器と、
少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器と
を含み、流体システムが、容器からセンサデバイスに選択的に試料を供給するように構成されている、上記［４２］に記載の分析装置。