【手続補正書】
【提出日】平成28年4月4日(2016.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【図１】ファージに提示されるＮ末端アミノ酸の酸化中の、ファージ上の化学反応を最適化および定量化する例を示す図である。
【図２】反応効率に対する酸化−クエンチャーの影響のプロファイルを示す図である。
【図３】ファージ上のＮ末端Ｓｅｒの酸化の反応速度の評価を示すグラフである。
【図４】アルデヒドおよびオキシムの形成に対する酸化の代表的な収率を示すグラフである。
【図５】酸化およびカップリング中に反応性のあるライブラリーのサブセットを選択するための概略図である。
【図６】グリコペプチド（Ａ）または大環状ペプチド（Ｂ）の遺伝的にコードされた化学ライブラリーの合成を示す図である。
【図７】酸化オキシムライゲーションを介して合成されたペプチド誘導体のパニングおよび増幅の反応速度を示すグラフである。
【図８】ジスルフィドの還元およびシステインのアルキル化によるペプチド誘導体の合成の最適化を示す反応の図である。
【図９】還元およびアルキル化の反応速度の概略図および解析結果を示すグラフである。
【図１０】リンカーカップリングの最適化およびクローンファージ上の環化反応の概略図ならびにその結果を示すグラフである。
【図１１】ライブラリーファージ上の環化反応の最適化のための概略図およびファージのクローン集団とファージライブラリーの間の反応性の差異を示すグラフである。
【図１２】光応答性リンカーでの環化を用いた光応答性ライブラリーを生成するための概略図である。
【図１３】非天然の光感受性リンカーで環化したライブラリーのパニングの結果を示すグラフである。
【図１４】他の生化学的方法を用いた、図１〜図７に記載の反応の定量化を示す写真である。
【図１５】ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動を用いた、リンカーによるマーカーの検出を示すグラフである。
【図１６】ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によるペプチド誘導体の捕捉の最適化を示すグラフである。
【図１７】ファージ上の様々なアルデヒド反応の最適化を示す図である。
【図１８】段階的な環化反応の例（Ａ）を示す図及び対ｐＨの補足％を示すグラフ（Ｂ）である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
図１は、ファージに提示されるＮ末端アミノ酸の酸化中の、ファージにおける化学反応の最適化および定量化を示す。図１Ａでは、Ｒｘｎ１は、アルデヒド部分を生成するＲｅａｇ１．１＝ＮａＩＯ４によるＮ末端セリン残基の酸化を含む。捕捉剤ＣＡ１は、アルデヒド反応性ビオチンヒドロキシルアミンである。Ｎ末端ＳｅｒまたはＴｈｒを有するペプチドを提示するファージまたはファージライブラリーは、アルデヒドに酸化することができる。アルデヒドの量および酸化の特異性は、アルデヒド反応性捕捉剤（２）を用いて評価することができる。その後、ファージを、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを用いて捕捉する。捕捉前後のファージの数の定量化を用いて、反応の収率を計算することができる。試薬の濃度および反応のタイミングを用いて、収率を最大限にした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
図３Ａにおいて、ファージに提示されるＮ末端のＳｅｒの酸化を、捕捉されるファージの最適な収率が得られるように「微調整」した。全ての反応は、１０１１ｐｆｕ／ｍＬのファージを用いて行った。各酸化後に、反応を４−メトキシベンゼンチオールで停止した。ファージを１時間、１ｍＭのビオチン−ヒドロキシルアミンに曝露し、１,０００,０００倍に希釈し、Ｓｔｒｅｐ−ＭＢ上に捕捉した。得られた反応速度曲線（図３Ｂ）は、これらの条件での反応収率が酸化剤濃度または反応時間に関わらず９０％を超えて増加することができないことを示す（上の２つのパネル）。延長された反応時間または高い酸化剤濃度では、生存率の減少が生じる（下のパネル）。ＷＴファージの修飾を含む副反応は、これらの反応レジームで最小である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
図４は、未反応のアルデヒドをキャラクタライゼーションすることによって、アルデヒドへの酸化およびオキシム形成の２段階の反応の収率プロファイルを示す。パネルＡにおいて、ファージを最適な酸化条件（５分間、０.０６ｍＭのＮａＩＯ４）に曝露し、グルタチオンでクエンチした。その後、ファージを、マンノース−ヒドロキシルアミンに曝露した。未反応のアルデヒドの量を、捕捉剤ビオチン−ヒドロキシルアミンへの暴露によって定量化した（パネルＢ）。その中のグラフに示すように、ファージの約９０％がビオチンヒドロキシルアミンに対して反応性を示すが、ファージのわずか１０％が、１ｍＭのマンノースヒドロキシルアミンへの１時間の暴露後にビオチン−ヒドロキシルアミンによって修飾可能である。マンノース−ヒドロキシルアミンとの反応の収率は、９０〜１０＝８０％（パネルＣ）である。パネルＤは、ランダムライブラリー中のファージの２０％が、酸化後にビオチン−ヒドロキシルアミンに対して反応性があることを示し、ライブラリーの２０％がＮ末端ＳｅｒまたはＴｈｒ残基を含むことを裏付ける。パネルＥは、ファージ上の化学結合が、複数日間安定であることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
図５（パネルＡからＣ）は、末端にＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を含むディスプレイされたペプチド（「Ｓ／Ｔ末端サブライブラリー」）対Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基を含まないライブラリーメンバー（「非Ｓ／Ｔ末端ライブラリーメンバー」）の収率を決定するために、酸化またはカップリングで反応するライブラリーのサブセットを選択する方法を示す。この実施例において、ファージのランダムライブラリー（パネルＡ）を最適な酸化条件（５分間、０.０６ｍＭのＮａＩＯ４）に暴露し、グルタチオンおよびオキシム形成条件（１ｍＭのビオチン−ＴＥＶ−ヒドロキシルアミン）でクエンチした。ランダムライブラリーのわずか２０％がＮ末端Ｓｅｒを含むので、未処理のランダムライブラリーにおける反応の収率は約２０％である。捕捉されたファージの放出および再増幅後（パネルＣ）に、同一条件下での同一反応の収率は典型的には高く、数ラウンドのこの選択後に、ほぼ１００％の収率に近づく。したがって、このプロセスは、これらの反応条件下で最適に反応するライブラリーのサブセットを選択する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
図７は、酸化オキシムライゲーションを介して合成されたペプチド誘導体のライブラリーが、パニングおよび増幅に使用することができることを示す。モデルマンノース結合標的であるコンカナバリンＡに対するペプチド−マンノースコンジュゲートのパニング、ならびに修飾されていないペプチドライブラリーのパニングの例を示す。パニングの効率を評価するために、各ステップで洗浄したファージの量を測定した。これらの値およびビーズから溶出したファージの量から、各洗浄工程におけるビーズ上のファージの量の逆算によりファージの量を決定した。これらの値は、標準的な一次オフ速度式に従う。各ライブラリーにはインサートを含まない野生型ファージを意図的に混ぜており、それらは白色のプラークを形成するので、混合物で定量化することができる。これに反して、このライブラリーは青色のプラークを形成する。インサートを含まないファージは、非特異的結合のための内部コントロールとして機能する。パニングの効率を評価するために、各ステップで洗浄される「青」および「白」のファージの量を測定した。最後の洗浄工程（洗浄１０）と比較して、溶出工程（ＥＬ）におけるファージの数の増加は、ファージが非特異的な相互作用により回収されたことを示した。ファージディスプレイパニングにおける青白スクリーニングについてのさらに詳しい方法については、ＲＤｅｒｄａ,Ｓ Ｍｕｓａｈ,ＢＰ Ｏｒｎｅｒ,ＪＲ Ｋｌｉｍ,Ｌ Ｌｉ,ＬＬ Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ”Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.２０１０,１３２,１２８９を参照されたい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
図１０は、クローンファージおよびライブラリーファージ上でのリンカーカップリングならびに環化の最適化の一例を示す。パネルＡにおいて、ファージに提示されるジスルフィドペプチドの還元およびアルキル化ならびに副産物が生じる可能性を示す。（Ｂ）ＢＩＡへの曝露を用いて、還元ジスルフィドまたは（Ｃ）未反応チオールを定量化する。パネルＤは、ビオチン−チオール（ＢＳＨ）への曝露が、非環化ペプチドを定量化することを示す。パネルＥでは、ビオチン化ファージの画分が、ＢＳＢＣＡを有するファージの培養後に減少する。ＢＳＨへの暴露後にビオチン化が起こらないことは、ＢＳＢＣＡカップリングが主産物として環状ペプチドを生成したことを示した。パネルＦにおいて、ＢＳＢＣＡによるアルキル化の速度定数（ｋ）を算出するために、ビオチン化ファージの消失を擬一次速度式に適合させた。パネルＧにおいて、２種類のファージディスプレイペプチド（Ｆ１、Ｆ２）について測定した２つの速度定数は、ＨＰＬＣならびに同じアミノ酸配列（Ｐ１、Ｐ２）の合成ペプチドを用いて測定したものと同様であった。パネルＨに示すとおり、質量分析により、環状生成物がＢＳＢＣＡとペプチドＡＣＰＡＲＳＰＬＥＣＧＧＧＳＡＥＴＶＥＳＣ（Ｃａｍ）ＬＡＫＳ（下線の配列は、ｐＩＩＩの合成断片である）の反応の主産物であることが確認された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
図１１は、ファージライブラリーの最適化のための一つの例示的なスキームを示す。個々の配列を提示するファージに最適な条件は、複数の反応性ペプチドを含むライブラリーにおいて同じ収率が得られるとは限らない。パネルＡは、還元およびアルキル化反応の１つのスキームを示す。パネルＢでは、ライブラリーのアルキル化の観察された収率が約３５％であり、ファージのクローン集団に対する同じ条件では、アルキル化ファージは８０％を超える（図１０）。パネルＣでは、ファージのクローン集団に対して最適化された条件（図２および図３）に基づいて、オキシム修飾で予想されるカップリングは約８０％である。ライブラリーの観察された収率は５０％（パネルＤ）である。したがって、意外なことに、ペプチドの一種類を提示するクローンに対して最適化された条件は、多様なペプチドを提示するクローンの大規模ライブラリーにおいてはるかに低い収率が得られることが見出された。差異は、特定の反応に依存し、ライブラリーの６０％における微妙な差異の８０％（クローン）から、５０％（ライブラリー）における９９％を超える（クローン）著しい変化まで変動する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
図１５（ＡからＣ）は、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動を用いてリンカーによるマーカーの検出を示す。ファージを、リンカーとの反応前後にヨードアセトアミドフルオレセイン（ＦＩＡ）と反応させた。リンカーとの反応後の蛍光は残っている未反応基を示す（すなわち、リンカーカップリングの効率の指標）。ゲルは、ＢＳＢＣＡリンカーの低濃度でのカップリングが、より高い反応温度でも動作しないことを示す。高濃度のリンカー（１ｍＭ）での反応は、５５℃および室温で同様に良好に進行する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
図１８は、段階的な環化反応の例（Ａ）を示す図及び対ｐＨの補足％を示すグラフ（Ｂ）である。第１ステップにおいて、ファージは、検出マーカー、ここではビオチンを含むリンカーにより修飾される。第２ステップにおいて、検出マーカーが除去される。ステップ１およびステップ２を定量化し、独立して選択することができる。ステップ１の後に、未反応の分子を廃棄することができる。ｐＨを上げると、第２の反応（環化）が促進され、同時にビーズからのファージの溶出が促進される。ステップ２で反応した分子だけが、次のラウンドへ運ばれ得る。提供した例は、反応条件１でアルデヒドと反応する基（「基１」）および反応条件２（ｐＨ＞８）で反応するエステルなどの脱離基を含む分子（オキシム、ｐＨ＝４.７で反応する）とファージディスプレイアルデヒドとの反応である。基１には、ヒドロキシルアミン（またはアミノオキシ基）が含まれる。ｐＨ＜８でアルデヒドと反応する他の基が適切である。このような基の例としては、安定化された蛍光体イリド（Ｗｉｔｔｉｇ反応）、アミノベンズアミドオキシムおよびアミノベンジルアミンが挙げられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
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【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2015508638.tif 000004
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
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