(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする線虫由来のＤＮＡ。
【請求項４】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするラット由来のＤＮＡ。
【請求項７】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子。
(ａ)配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項８】
配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするヒト由来のＤＮＡ。
【請求項１０】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子。
(ａ)配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１１】
配列番号７に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項１２】
配列番号７に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするマウス由来のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線虫高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１６】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラット高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１８】
配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマウス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１３〜２０のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２４】
請求項１３〜２０のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現することができる発現系を導入してなる宿主細胞。
【請求項２５】
高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項７〜９のいずれか記載の遺伝子又はＤＮＡを導入することを特徴とする高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法。
【請求項２６】
高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞が、請求項７〜９のいずれか記載の遺伝子又はＤＮＡが染色体にインテグレイトされ、ステイブルに高親和性コリントランスポーター活性を示す細胞であることを特徴とする請求項２５記載の高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全身の臓器に分布し、内分泌系と並んでエネルギー代謝、循環、呼吸及び生殖など生体にとって最も基本的な機能を調節する神経系である自律神経は、アドレナリン作動性とコリン作動性に分類される。交感神経の節後繊維以外のすべての自律神経繊維、運動神経繊維、交感神経のうち汗腺・血管拡張繊維はコリン作動性神経であり、運動・自律神経機能に重要である。脳にも存在するコリン作動性神経は、脳の認知機能に重要であり、アルツハイマー病では変性することが知られている。また、コリン作動性神経では、コリン生合成能を欠いているため、アセチルコリン分解産物のコリンはシナプス前部に存在する高親和性コリントランスポーターによって細胞内に取り込まれ、アセチルコリン合成に再利用される。この高親和性コリンの取り込みはアセチルコリン合成の律速段階であり、シナプス伝達の効率を調節すると考えられている（J. Neurochem. 18, 781-798, 1971、Science 178, 626-628, 1972、Biochem. Biophys. Acta 291, 564-575, 1973、Mol. Pharmacol. 9, 630-639, 1973、J. Pharmacol. Exp. Ther. 192, 86-94,1975、J. Neurochem. 30, 15-21, 1978、J. Neurochem. 44, 11-24, 1985、J.Neurochem. 60, 1191-1201, 1993、J. Neurochem. 20, 581-593, 1973、Eur. J.Pharmacol. 102, 369-370, 1984）。従来、主要な神経伝達物質トランスポーターのほとんどのｃＤＮＡは単離されているが、生理的に重要である高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは同定されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
コリン作動性神経に局在し、アセチルコリンの前駆体であるコリンを細胞内に取り込む作用をするタンパク質の存在がこれまでに予想されており、このタンパク質である高親和性コリントランスポーターの分子的性質は不明であった。本発明の課題は、生理的に重要である高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらを利用した高親和性コリントランスポーター活性促進物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ゲノム・プロジェクトの情報（Science 282, 2012-2018, 1998）を利用して、線虫（C. elegans）のゲノム配列から予測されるＮａ+依存性トランスポーターｃＤＮＡを１つひとつクローニングし、そのそれぞれについてアフリカツメガエルの卵母細胞発現系で高親和性コリン取り込み活性を調べることにより、線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ（ｃｈｏ−１）を同定し、このｃＤＮＡとの塩基配列の相同性を指標にラット脊髄から相同分子（ＣＨＴ１）をクローニングした。このＣＨＴ１は神経伝達物質トランスポーター（J. Neurochem. 71, 1785-1803, 1998）との相同性をもたないが、Ｎａ+依存性グルコーストランスポーターファミリーに属する分子（Nature 330, 379-381, 1987）に対して２０−２５％の相同性を有していた。
【０００５】
ノザン解析の結果、脊髄、前脳基底部、線条体、脳幹に限局してＣＨＴ１の転写産物が確認され、ＣＨＴ１はコリン作動性神経で発現していると考えられたので、ＣＨＴ１をアフリカツメガエルの卵母細胞で発現させると、Ｎａ+依存的で、ヘミコリニウム−３で完全に阻害されるコリン取り込み活性が観察された。これらの結果から、ＣＨＴ１が高親和性コリントランスポーター活性を有することを見い出した。また、本発明者らは、ヒト及びマウス由来のコリントランスポーターｃＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定し、その発現産物が高親和性コリン取り込み活性を有することを確認した。本発明は以上のようにして完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち本発明は、［１］以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子；
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
や、［２］配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、［３］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする線虫由来のＤＮＡや、［４］以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子；
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
や、［５］配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、［６］配列番号３に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするラット由来のＤＮＡに関する。
【０００７】
また本発明は、［７］以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子；
(ａ)配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
や、［８］配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、［９］配列番号５に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするヒト由来のＤＮＡや、［１０］以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子；
(ａ)配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
や、［１１］配列番号７に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、［１２］配列番号７に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするマウス由来のＤＮＡに関する。
【０００９】
また本発明は、［１３］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、［１４］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線虫高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質や、［１５］配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、［１６］配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラット高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質や、［１７］配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、［１８］配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質や、［１９］配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、［２０］配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマウス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に関する。
【００１０】
また本発明は、［２１］上記［１３］〜［２０］のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質に関する。
【００１１】
また本発明は、［２２］上記［１３］〜［２０］のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
【００１２】
また本発明は、［２３］抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［２２］記載の抗体に関する。
【００１３】
また本発明は、［２４］上記［１３］〜［２０］のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現することができる発現系を導入してなる宿主細胞に関する。
【００１４】
また本発明は、［２５］高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、上記［７］〜［９］のいずれか記載の遺伝子又はＤＮＡを導入することを特徴とする高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法に関する。
【００１５】
また本発明は、［２６］高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞が、上記［７］〜［９］のいずれか記載の遺伝子又はＤＮＡが染色体にインテグレイトされ、ステイブルに高親和性コリントランスポーター活性を示す細胞であることを特徴とする上記［２５］記載の高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の配列番号１に記載される線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、C. elegansゲノム・プロジェクトからＮａ+依存性トランスポーターファミリーのメンバーと予測される完全長の候補ｃＤＮＡから調製したそれぞれのｃＲＮＡを、アフリカツメガエル卵母細胞に注入し高親和性コリン取り込みを調べることにより得ることができる。その際、哺乳類の脳シナプトソームでは高親和性コリン取り込みは１μＭのＨＣ３で完全に阻害される（Ｋｉ＝１０−１００ｎＭ）のに対し、あらゆる細胞に分布している低親和性コリン取り込みはより高濃度のＨＣ３でのみ阻害される（Ｋｉ＝５０μＭ）ことから、１μＭのヘミコリニウム−３（hemicholinium-3；ＨＣ３）に対する感受性を高親和性コリン取り込みの判断基準とすることができる。例えば、以下のようにして線虫（C.elegans）の候補ｃＤＮＡから目的とする遺伝子の同定、発現、局在を確かめることができる。
【００１７】
高親和性コリン取り込みにおいて、Ｃ４８Ｄ１．３と予測された遺伝子に相当するｃＤＮＡは１μＭのＨＣ３で阻害される有意なコリン取り込みを促すことが分かった。図１には、Ｃ４８Ｄ１．３ｃＲＮＡまたは水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り込み結果が示されている。図１中、黒と白のカラムは１μＭのＨＣ３の非存在下、存在下でのコリン取り込みをそれぞれ示し、それぞれのカラムは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜８卵母細胞） で表示されている。また図２には、Ｎａ+のコリン取り込みに対する効果が示され、黒カラムは標準溶液中で測定したコリン取り込みを示し ([Ｎａ+]＝１００ｍＭ)、白カラムはＮａ+非存在下でのコリン取り込みを示している（Ｎａ+はＬｉ+に置き換えられた）。さらに図３にはＨＣ３によるコリン取り込みの阻害が示されている。かかる図２，３から、この取り込みはＮａ+ 依存性であり、ＨＣ３のＫｉは５０ｎＭと推定された。このｃＤＮＡクローンはｃｈｏ−１（high-affinity cholinetransporter-1）と名付けられた。
【００１８】
ｃＤＮＡとゲノムの塩基配列の比較により、ｃｈｏ−１遺伝子は９つのエクソンからなることが分かった。ｃｈｏ−１のｃＤＮＡの塩基配列から予想されるタンパク質は５７６アミノ酸残基であり（図４参照）、この配列番号２に示されるタンパク質は常法により作製することができる。また、入手できるデータベースを検索したところｃｈｏ−１のアミノ酸配列はＮａ+依存性グルコーストランスポーターファミリーのメンバーに対して弱いながら有意な相同性を示した。疎水性分析と他のトランスポーターとの比較から１２回膜貫通領域をもつことが示唆される（図７参照）。
【００１９】
次に、線虫（C.elegans）の神経系でｃｈｏ−１を発現している細胞を同定するために、ｃｈｏ−１遺伝子上流５．１ｋｂの領域を融合させたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を線虫に導入し、cho-1::gfpを発現している神経細胞の分布を調べた。cho-1::gfpレポーターＤＮＡを染色体外に保持しているＬ１幼虫の写真を図５として示す（スケールバー；５０μｍ）。図５中、矢頭は神経環を示す。腹部神経索ではＧＦＰはコリン作動性運動神経においてのみ発現しているが、おそらく染色体外のレポーターＤＮＡが欠失したためにいくつかのＤＡ、ＤＢ神経細胞はＧＦＰを発現していない。これはｃｈｏ−１がコリン作動性神経の高親和性コリントランスポーターであることを裏付けている。
【００２０】
本発明の配列番号３に記載されるラット高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次のようにして調製することができる。脊椎動物のｃｈｏ−１相同分子に注目し、ｃｈｏ−１から予想されるアミノ酸配列でデータベースを検索し、ヒトのgenomic survey sequence（ＧＳＳ）で一つの候補（GenBank accession number：AQ316435）を同定した。このヒトのゲノムＤＮＡとｃｈｏ−１の塩基配列の相同性に基づき、縮重プライマーを用いたＰＣＲでラット脊髄ｃＤＮＡからｃＤＮＡ断片を増幅した。この断片を使ってラット脊髄ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし陽性のｃＤＮＡクローンを得た。最長の読み枠の塩基配列からｃｈｏ−１と５１％の同一性および７０％の類似性を示す５８０アミノ酸残基のタンパク質が予想された（図４参照）。このラットｃＤＮＡクローンはＣＨＴ１と名付けられた。図４には、ラットＣＨＴ１と線虫ＣＨＯ−１のそれぞれのアミノ酸配列が、同一残基は黒囲みで、類似残基はグレー囲みで表示されている。予想される膜貫通領域Ｉ−ＸIIは下線が引かれている。この配列番号４で示されるタンパク質は常法により作製することができる。
【００２１】
上記ＣＨＴ１のアミノ酸配列はＮａ+依存性グルコーストランスポーターファミリーのメンバーと有意な相同性を有する（２０−２５％）。遺伝研究所（三島、日本）のプログラムCLUSTALWを用いてneighbor-joining法で作製したＮａ+依存性グルコーストランスポーターファミリーの系統樹を図６に示す。図６には、ラットＣＨＴ１に対してそれぞれのタンパク質が含む同一のアミノ酸の割合％が右側に示されている。一方、酵母のコリントランスポーター（J. Biol. Chem. 265, 15996-16003, 1990）、当初は高親和性コリントランスポーターと報告されていたクレアチントランスポーター（Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 637-645, 1994）、及び他の神経伝達物質トランスポーターとは相同性をもたない。
【００２２】
ＣＨＴ１の予想されるトポロジーは線虫ＣＨＯ−１と本質的に同じであると考えられ、ラットＣＨＴ１の予想されるトポロジーを図７に示す。図７中、黒の円は同一残基、グレーの円はよく保存された残基、白の円は類似していない残基を示す。枝線は予想される糖鎖付加部位を示す。円中のＰはタンパク質キナーゼＣによるリン酸化予想部位を示す。
【００２３】
次に、ノザン解析やin situ ハイブリダイゼーションでＣＨＴ１のｍＲＮＡの発現分布を調べた。ラットのさまざまな組織のノザン解析からおよそ５ｋｂの長さの転写産物の発現を確認した。図８には、ラット組織でのＣＨＴ１のｍＲＮＡ転写産物のノザン解析の結果が示されている。また、ＲＮＡの標準（０．２４−９．５ｋｂ；GIBCO BRL）の長さが左に示されている。図８からわかるように、前脳基底部や脳幹、脊髄で多く、線条体では少なかった。これらの組織はいずれもコリン作動性神経を含むことが知られている。一方、脳の他の領域や非神経系の組織では転写産物は確認されなかった。
【００２４】
これらの結果と一致して、in situ ハイブリダイゼーションでは線条体、前脳基底部の細胞群、脊髄前角を含む主要なコリン作動性神経の細胞集団でＣＨＴ１のｍＲＮＡの発現が確認された。図９及び図１０（スケールバー；１mm）には、ラット脳及び脊髄におけるＣＨＴ１転写産物のin situ ハイブリダイゼーション解析に関する、ジゴキシゲニンでラベルされたアンチセンスのｃＲＮＡプローブにハイブリダイズされた明視野での切片の顕微鏡写真が図示されている。図９から、ＣＨＴ１のｍＲＮＡ転写産物はvertical及びhorizontal limbs of the diagonal band (VDB, HDB), medial septal nucleus (MS), caudate and putamen (CPu), olfactory tubercle (Tu)で検出されていることが、図１０から脊髄では前角 (VH)で発現が観察されることがわかる。また、小胞アセチルコリントランスポーターのプローブでハイブリダイズされた隣の切片も本質的に同様な分布を示した。この発現分布はすでに報告されているコリンアセチル基転移酵素や小胞アセチルコリントランスポーターの分布と本質的に同じである。これらの結果はＣＨＴ１のｍＲＮＡがコリン作動性神経に限局して発現していることを示している。
【００２５】
次にＣＨＴ１によるコリン取り込みをアフリカツメガエル卵母細胞で調べた。ＣＨＴ１のｃＲＮＡを注入した卵母細胞のコリン取り込みは水を注入したコントロールよりも２−４倍高かった。図１１には、ＣＨＴ１のｃＲＮＡまたは水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り込み結果が示されている。図１１中、黒と白のカラムは１００ｍＭのＮａＣｌあるいはＬｉＣｌを含む標準溶液でのコリン取り込みをそれぞれ示し、それぞれのカラムは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜８卵母細胞）で表示されている。またコリン濃度のコリン取り込みに対する効果が図１２に示されている。図１２においては、水を注入した卵母細胞の取り込みをｃＲＮＡのそれから差し引いて、ＣＨＴ１によるコリン取り込みを算出し、取り込みはミカエリス・メンテンの曲線に近似させている。図１２に示されるように、ＣＨＴ１のコリン取り込みはコリン濃度を増加させると飽和した（Ｋｍ＝２．２±０．２μＭ，ｎ＝３）。
【００２６】
次に、ＨＣ３によるコリン取り込みの阻害の結果を図１３に示す。図１３から、コントロールの内因性のコリン取り込みのＫｍは１０μＭより高く、ＣＨＴ１のコリン取り込みは０．１μＭのＨＣ３で完全に阻害される（Ｋｉ＝２−３ｎＭ）のに対して、コントロールでは１０μＭのＨＣ３でわずかしか阻害されないことがわかる。図１４に示されるように、ＣＨＴ１のコリン取り込みのイオン依存性を調べるとＮａ+だけでなくＣｌ-依存的であることがわかった。黒と白のカラムは水を注入した卵母細胞のコリン取り込み、ｃＲＮＡを注入した卵母細胞のコリン取り込みをそれぞれ示す（標準溶液中の１００ｍＭのＮａＣｌは図で示されているそれぞれの１００ｍＭの塩で置換）。これらの結果は脳シナプトソームの高親和性コリン取り込みから期待される特性（コリンに対する高い親和性、ＨＣ３に対する高い感受性、Ｎａ+−Ｃｌ-依存性）をＣＨＴ１がもつことを示している（J. Neurochem. 27, 93-99, 1976）。
【００２７】
また、ＣＨＴ１のｃＤＮＡとベクター（コントロール）をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から調製した膜の［3Ｈ］ＨＣ３結合活性を調べた。結果を図１５に示す。図１５からわかるように、ＣＨＴ１を発現させた細胞の膜ではＮａ+依存的な［3Ｈ］ＨＣ３結合が観察されたが、コントロールの膜では観察されなかった。次に、特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の飽和解析を行った。図１６に示されるように、平衡解離定数（Ｋｄ）は１．６±０．２μＭ（ｎ＝３）であると推定された。この値は脳シナプトソームで報告されている数値と類似していた（J. Neurochem. 60, 1191-1201, 1993、Life Sci. 35, 2335-2343, 1984、Brain Res. 348, 321-330, 1985）。さらに、ＨＣ３、コリン(Cho)、アセチルコリン(Ach)による特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の置換について検討した。アセチルコリンは１μＭフィゾスチグミン存在下で測定した。結果を図１７に示す。図１７から、［3Ｈ］ＨＣ３の特異的結合はアセチルコリンよりも約１０倍以上低い濃度で置換されることがわかる。これらの結果はＣＨＴ１が高親和性コリントランスポーターであるだけでなくＨＣ３結合部位でもあることを示している。
【００２８】
本発明の配列番号５に記載されるヒト高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次のようにして調製することができる。線虫（C. elegans）ＣＨＯ−１のアミノ酸配列でデーターベース検索を行い、有意な相同性がある特定のヒトゲノムＤＮＡ断片の配列（human genomic survey sequenceの１クローンであるＲ−１０７Ｐ１２；GenBank accession number：AQ316435）を見い出し、かかるＤＮＡ断片の塩基配列を基にＰＣＲの遺伝子特異的プライマーを設計した。ヒト全脳のMarathon-ReadyTM cDNA（クローンテック社製）と付属のアダプタープライマーを用いて５′−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）及び３′−ＲＡＣＥを行った。この得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ用クローニングベクターにクローン化し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。また、このＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は配列番号６で示されている。かかる配列番号６で示されるヒト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて常法により作製することができる。
【００２９】
本発明の配列番号７に記載されるマウス高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次のようにして調製することができる。線虫（C. elegans）ＣＨＯ−１のアミノ酸配列でデーターベース検索を行い、有意な相同性がある特定のヒトゲノムＤＮＡ断片の配列（human genomic survey sequenceの１クローンであるＲ−１０７Ｐ１２；GenBank accession number：AQ316435）を見い出し、かかるＤＮＡ断片の塩基配列を基にＰＣＲの遺伝子特異的プライマーを設計した。マウス全脳のMarathon-ReadyTM cDNA（クローンテック社製）と付属のアダプタープライマーを用いて５′−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）及び３′−ＲＡＣＥを行った。この得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ用クローニングベクターにクローン化し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。また、このＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は配列番号８で示されている。かかる配列番号８で示されるマウス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質は、配列番号７に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて常法により作製することができる。
【００３０】
本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質としては、天然由来のタンパク質であっても組換えタンパク質であってもよく、上記具体的に開示した配列番号２、４、６及び８で示されるものの他に、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質も包含され、これらは公知の方法で調製することができる。また、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡとしては、上記具体的に開示された配列番号１、３、５及び７で示されるものの他に、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡや、これら遺伝子又はＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含され、これらは公知の方法で調製することができる。
【００３１】
ところで、コリン作動性神経は学習・記憶に非常に重要な役割を果たしている。この神経の障害と痴呆の重篤さは相関する。アセチルコリン合成の律速段階は高親和性コリン取り込みであり、その活性は神経活動や種々の刺激で制御されている。さらにアルツハイマー病患者の脳では高親和性コリン取り込みやＨＣ３結合活性が亢進している（Trends Neurosci. 15, 117-122, 1992、Ann. NY Acad.Sci. 777, 197-204, 1996、J. Neurochem. 69, 2441-2451, 1997）。上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡや、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質のクローニングはこれらの制御の分子機構を明らかにしたり、アルツハイマー病の新しい療法を開発したりするために重要である。
【００３２】
本発明の融合タンパク質とは、線虫、ラット、ヒト、マウス等の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させたものをいい、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の精製や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の検出や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に対する抗体の定量、アルツハイマー症の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３３】
本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、アルツハイマー症の診断や高親和性コリントランスポーターの制御の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３４】
高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００３５】
本発明の上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に対する抗体は、とりわけ、アルツハイマー症等の診断や治療に使用できる可能性がある。
【００３６】
本発明はまた、上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００３７】
また、発現系としては、上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００３８】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、抗高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質抗体を結合させたカラムや、上記高親和性コリントランスポーターに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を得ることができる。
【００３９】
本発明において、上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００４１】
例えば、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００４２】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウスを作製することができる。また、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００４３】
高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質のトランスジェニックマウスは、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００４４】
また、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡの全部あるいは一部を用いると、アルツハイマー症等の遺伝子治療に有効な細胞を調製することができる。本発明におけるこれら細胞の調製方法としては、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、上記本発明の遺伝子又はＤＮＡの全部あるいは一部をトランスフェクション等により導入し、高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞を得る方法を挙げることができ、特に、かかる高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞としては、上記遺伝子又はＤＮＡ等が染色体にインテグレイトされ、ステイブルに高親和性コリントランスポーター活性を示す細胞を用いることが好ましい。
【００４５】
また、上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に対する抗体、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞、高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞等を用いると、アルツハイマー症等のような症状の治療に有用な薬剤、すなわち高親和性コリントランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００４６】
本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の高親和性コリントランスポーター活性を測定・評価する方法や、被検物質の存在下、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞をインビトロで培養し、該細胞における高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性及び／又は発現量を測定・評価する方法や、前記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物及び／又は野生型非ヒト動物に被検物質を投与し、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性及び／又は発現量を測定・評価する方法等を挙げることができる。上記細胞膜又は細胞としては、前記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物又は野生型非ヒト動物などから得られる初代培養した細胞などの細胞や、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞や、これら細胞の細胞膜などを具体的に例示することができる。
【００４７】
上記被検物質と高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質とを用いたスクリーニング方法について、以下に具体的に例を挙げて説明するが、本発明のスクリーニング方法はこれらに限定されるものではない。高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質発現細胞を被検物質の存在下で培養し、一定時間培養後細胞膜表面に発現された高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質が減少又は増加したことを、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ等による免疫化学的に検出して、あるいはｍＲＮＡの発現が抑制又は促進したことを指標として評価することができる。また、かかるｍＲＮＡの検出法は、ＤＮＡチップ、ノーザンハイブリダイゼーション等の方法で行なうことができる他、高親和性コリントランスポーターをコードする遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をつないだ遺伝子を導入した細胞を用いると、被検物質による高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現抑制又は促進は、前記レポーター遺伝子の活性を指標に検出することが可能である。
【００４８】
また本発明は、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性又は発現の促進を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性又は発現の抑制を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物であって、有効成分として高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現を促進する物質又は高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現を抑制する物質を含んでなる医薬組成物に関する。高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質は、多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与していることから、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を刺激し得る化合物や、その機能を阻害し得る化合物は医薬としての用途が期待できる。
【００４９】
上記高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現を促進又は抑制する物質としては、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に結合して、あるいは上流のシグナル伝達分子に作用して、単独で高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現を促進する物質又はその活性若しくは発現を阻害・拮抗する物質であればどのようなものでもよく、例えば、抗体、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質のリガンド、このタンパク質の断片及び断片をコードするオリゴヌクレオチド等を具体的に挙げることができ、またこれらはアルツハイマー疾等のような症状の治療及び予防目的等の医薬として使用することができるが、これらの用途に限定されるものではない。
【００５０】
本発明はまた、検体中の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することからなる、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断方法に関する。高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検出は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出すことにより行うことができ、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。そして、塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また点突然変異は増幅ＤＮＡを標識高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズさせることで同定することができる。このように、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することで、アルツハイマー疾等のような症状の診断又は判定をすることができる。
【００５１】
本発明はまた、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるアルツハイマー症等のような症状の疾患の診断用プローブ、及び当該プローブ及び／又は本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体を含有してなるアルツハイマー疾等のような症状の疾患の診断薬に関する。前記診断用プローブとしては、高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。かかるプローブ及び／又は本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体をアルツハイマー症等のような症状の診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。また、これらの診断薬を用いた、免疫染色法（Dev. Biol. 170, 207-222, 1995、J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、In situ ハイブリダイゼーション法（J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、in situ PCR法等の方法によりアルツハイマー症等のような症状の疾患を診断することもできる。
【００５２】
以下上記の各種実験における実験方法等をさらに詳細に説明する。
（高親和性コリントランスポーターｃＤＮＡのクローニング）
線虫高親和性コリントランスポーターの候補のｃＤＮＡは、種々の発生段階の線虫混合物のpoly(A)+RNAから逆転写ＰＣＲ及び３′ＲＡＣＥで単離した。プロトコールに従ってMarathonTM cDNA Amplification Kit (クローンテック社製)を用いた。ＰＣＲの順方向のプライマーはＣ．ｅｌｅｇａｎｓゲノム・プロジェクトから入手したＤＮＡ塩基配列に基いて、予測遺伝子の暫定的な翻訳開始点で設計した。増幅されたＰＣＲ産物を改変pSPUTKベクター（ストラタジーン社製）のＮｃｏＩ（平滑化）部位とＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。ラットのＣＨＴ１ｃＤＮＡはGeneTrapper cDNA PositiveSelection System (ギブコバイオラッドラボレトリー：GIBCO BRL)をプロトコール通りに使用してラット脊髄ｃＤＮＡライブラリーから単離した。用いたプライマーは縮重ＰＣＲで得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列から設計した。得られたｃＤＮＡクローンを解析した結果陽性だったクローンをpSPUTKベクター及びpcDNA3.1+ ベクター (インビトロジェン社製) にサブクローニングした。
【００５３】
（アフリカツメガエル卵母細胞での発現）
ｃＲＮＡはキャップアナログ存在下でＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで合成した。キャップ化ＲＮＡ２０−３０ｎｇをアフリカツメガエル卵母細胞（ステージＶ−VI）に微量注入した。取り込み測定は文献（Nature 360, 467-471, 1992）に述べられている方法と本質的に同様に行った。コリン取り込みはＲＮＡ注入の２−３日後に０．７５ｍｌの標準液中（０．０１−１μＭの［3Ｈ］−コリン、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣａＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＴｒｉｓ：ｐＨ７．４） の卵母細胞（６−８個）を用いて３０−６０分間行った。取り込み後の卵母細胞は１０％のＳＤＳで可溶化して、液体シンチレーションカウンターで［3Ｈ］量を測定した。
【００５４】
（ＧＦＣ発現コンストラクト）
cho-1::gfpの転写融合コンストラクトは文献（Gene 212, 127-135, 1998）で述べられている方法と同様にＰＣＲで作製した。核移行シグナル配列（ＮＬＳ）の下流にあるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子をｃｈｏ−１翻訳開始点からアミノ酸３残基分下流の位置に読み枠が合うように挿入した。ＮＬＳとｇｆｐ遺伝子はpPD104.53ベクターから増幅した。ｃｈｏ−１翻訳開始点から５．１ｋｂ上流領域を調製するためにｃｈｏ−１の最初のアミノ酸３残基分を含むように設計したＰＣＲプライマーを用いた。文献（EMBO J. 10, 3959-3970, 1991）で述べられている方法と同様にｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）マーカーと作製したＤＮＡを線虫の生殖器官に同時注入した。
【００５５】
（ノザン解析）
ラットのさまざまな組織から調製した６μｇのpoly(A)+RNAをホルムアルデヒド−アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜に転写した。次にハイブリダイゼーション溶液（最終濃度で５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt's solution、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのsalmon sperm DNAを含む溶液）中で、ランダム・プライム法で［32Ｐ］ラベルしたＣＨＴ１のｃＤＮＡ断片に対して４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ナイロン膜は最終条件（０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ：６５℃）で洗浄後、エンハンシングスクリーン（enhancing screen）と共に７日間オートラジオグラフィーを行った。
【００５６】
（in situ ハイブリダイゼーション）
ジゴキシゲニンでラベルしたアンチセンスの転写産物はin vitroで合成した。転写産物は平均長２００〜４００塩基対になるまでアルカリ分解を行った。新鮮凍結組織のクリオスタット切片（１０〜２０μｍ）を用いた。ハイブリダイゼーションは1×Denhardt's 溶液［最終濃度で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ、５０％のホルムアミド、１０％のデキストランサルフェート、１ｍｇ／ｍｌの大腸菌（E. coli）のｔＲＮＡを含む溶液］に溶解させたラベル化ｃＲＮＡプローブ（およそ１μｇ／ｍｌ）で４５℃で２０時間行った。次に切片を２×ＳＳＣ／５０％のホルムアミド中で２回、１×ＳＳＣ／５０％のホルムアミド中で１回、いずれも４５℃で洗浄した。ハイブリダイズしたプローブを抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片（Boehringer-Mannheim）とＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を用いて可視化した。切片は基質溶液中で２４−４８時間反応させた。
【００５７】
（結合実験）
［3Ｈ］ヘミコリニウム−３（ＨＣ３；１２８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はNEN Life Science Products から入手した。pcDNA3.1-CHT1あるいはpcDNA3.1をそれぞれＣＯＳ７細胞に一過性に発現させた。プロトコールに従ってTransFast Reagent（プロメガ社製）を導入し用いた。膜調製は、細胞を０．３２Ｍスクロース中でホモジュナイズし、２００，０００ｇで１時間遠心後、沈澱物を懸濁させた。結合実験は他で述べられている方法と本質的に同様に行った。特異的結合量は１０μＭのＨＣ３存在下で決定した非特異的結合量を全体の結合量から差し引いて計算した。飽和結合実験のデータから特異的な［3Ｈ］ＨＣ３結合量を非線形近似で解析してＫｄ値を算出した。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によると、生理的に重要である高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子ＤＮＡを提供することができる。また、それらタンパク質や遺伝子ＤＮＡを用いることにより、アルツハイマー症の予防や治療に有用な物質をスクリーニングすることや、遺伝子治療に有用な細胞を調製することができる。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）または水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り込み結果を示す図である。
【図２】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）または水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞のＮａ+の依存性によるコリン取り込みに対する効果の結果を示す図である。
【図３】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）または水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞のＨＣ３によるコリン取り込みの阻害の結果を示す図である。
【図４】本発明のラットＣＨＴ１及び線虫ＣＨＯ−１のそれぞれのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】線虫の神経系で本発明のcho-1::gfpを発現している神経細胞の分布を示す図である。
【図６】Ｎａ+依存性グルコーストランスポーターファミリーの系統樹を示す図である。
【図７】本発明のラットＣＨＴ１の予想されるトポロジーを示す図である。
【図８】本発明のラット組織でのＣＨＴ１ｍＲＮＡ転写産物のノザン解析の結果を示す図である。
【図９】本発明のラット脳におけるＣＨＴ１転写産物のin situ ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図１０】本発明の脊髄におけるＣＨＴ１転写産物のin situ ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図１１】本発明のＣＨＴ１ｃＲＮＡまたは水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り込みの結果を示す図である。
【図１２】本発明のＣＨＴ１のコリン濃度によるコリン取り込みに対する効果を示す図である。
【図１３】本発明のＣＨＴ１のＨＣ３によるコリン取り込みの阻害の結果を示す図である。
【図１４】本発明のＣＨＴ１のＮａ+及びＣｌ-依存性によるコリン取り込みの結果を示す図である。
【図１５】本発明のＣＨＴ１ｃＤＮＡあるいはベクターｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から調製した膜への［3Ｈ］ＨＣ３結合結果を示す図である。
【図１６】本発明のＣＨＴ１ｃＤＮＡあるいはベクターｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から調製した膜への特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の飽和解析の結果を示す図である。
【図１７】本発明のＨＣ３、コリン（Ｃｈｏ）、アセチルコリン（Ａｃｈ）による特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の置換の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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