【手続補正書】
【提出日】平成28年7月19日(2016.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が、開口部の部分を形成するまたは開口部に隣接している２つ以上のアミノ酸を連結することによって繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼ。
【請求項２】
２つ以上の部分が、単量体中で空間的に近接しており、単量体の表面上にあるおよび／または単量体のループ領域であり、かつ、開口部を閉じるように繋がれている、請求項１に記載のヘリカーゼ。
【請求項３】
ポリヌクレオチド周囲の共有結合的に閉じた構造を形成できるように修飾されている、または２つ以上の部分が一過的に繋がれている、請求項１または２に記載のヘリカーゼ。
【請求項４】
ポリヌクレオチド結合ドメインが、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項５】
２つ以上の部分が親和性分子によって繋がれており、親和性分子が、（ａ）相補的ポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ、（ｃ）ペプチドジッパー、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質または（ｈ）ハーフキレーターである、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項６】
２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれており、前記リンカーが、アミノ酸配列、ポリヌクレオチド結合成分を含むアミノ酸配列、および／または１つもしくは複数の化学的架橋剤である、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項７】
２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するために修飾されている、または２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインもしくは非天然アミノ酸で置換されている、請求項６に記載のヘリカーゼ。
【請求項８】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはその変種である、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、およびＴｒａＩヘリカーゼが表３に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、前記ヘリカーゼ。
【請求項９】
前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、ヘリカーゼが、１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入され、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼであり、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさらに修飾されている、または修飾されていない、前記ヘリカーゼ。
【請求項１０】
１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つもしくは複数に、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つもしくは複数にまたは（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に導入されている、請求項９に記載のヘリカーゼ。
【請求項１１】
（ａ）位置Ｌ２６５、Ｅ２７５、Ｌ２７６、Ｓ２７９、Ｐ５８５、Ｋ６９０およびＥ６９３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１３（Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕ）に示す配列の変種；
（ｂ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｖ２９７、Ｄ６７１、Ｋ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１６（Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ）に示す配列の変種；
（ｃ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｇ２９７、Ｄ６６８、Ｒ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１９（Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ）に示す配列の変種；
（ｄ）位置Ｄ２８０、Ｋ２９０、Ｉ２９１、Ｓ２９４、Ｐ５８９、Ｔ６９４およびＮ６９７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２２（Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ）に示す配列の変種；
（ｅ）位置Ｌ２８１、Ｋ２９１、Ｑ２９２、Ｄ２９５、Ｄ５９６、Ｋ７０２およびＱ７０５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２５（Ｈｅｌ３０８Ｓｓｏ）に示す配列の変種；
（ｆ）位置Ｈ２６４、Ｅ２７２、Ｋ２７３、Ａ２７６、Ｇ５７６、Ｋ６７８およびＥ６８１の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｒ）に示す配列の変種；
（ｇ）位置Ｓ２７９、Ｌ２８９、Ｓ２９０、Ｄ２９３、Ｐ６４９、Ｋ７５３およびＲ７５６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２９（Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ）に示す配列の変種；
（ｈ）位置Ｙ２７６、Ｌ２８６、Ｓ２８７、Ｄ２９０、Ｐ５７９、Ｋ６７９およびＫ６８２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３２（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ）に示す配列の変種；
（ｉ）位置Ｌ２６６、Ｓ２７６、Ｌ２７７、Ｑ２８０、Ｐ５８３、Ｋ６８９およびＤ６９２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３３（Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ）に示す配列の変種；
（ｊ）位置Ｌ２８７、Ｅ２９７、Ｌ２９８、Ｓ３０１、Ｓ６０４、Ｋ７１０およびＥ７１３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３４（Ｈｅｌ３０８Ｔｂａ）に示す配列の変種；
（ｋ）位置Ｌ２８９、Ｑ２９９、Ｌ３００、Ｇ３０３、Ｎ６０６、Ｇ７１２およびＥ７１５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３７（Ｈｅｌ３０８Ｔｓｉ）に示す配列の変種；
（ｌ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｓ５８９、Ｋ６９１およびＤ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂａ）に示す配列の変種；
（ｍ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３９（Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ）に示す配列の変種；
（ｎ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４０（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｈ）に示す配列の変種；
（ｏ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４１（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ）に示す配列の変種；
（ｐ）位置Ａ２６９、Ｌ２７９、Ａ２８０、Ｌ２８３、Ｈ５７５、Ｋ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４２（Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ）に示す配列の変種；
（ｑ）位置Ｈ２７４、Ｑ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９６、Ｋ６９９およびＱ７０２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４３（Ｈｅｌ３０８Ｍｚｈ）に示す配列の変種；
（ｒ）位置Ｇ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｔ５９０、Ｋ６９１およびＹ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４４（Ｈｅｌ３０８Ｍｅｖ）に示す配列の変種；
（ｓ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号４５（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ）に示す配列の変種；
（ｔ）位置Ｇ２７７、Ｔ２８７、Ｅ２８８、Ｅ２９１、Ｄ６３４、Ｋ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４６（Ｈｅｌ３０８Ｎｍａ）に示す配列の変種；
（ｕ）位置Ａ２７０、Ｅ２７７、Ｒ２７８、Ｅ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＥ６８８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４７（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｏ）に示す配列の変種；
（ｖ）位置Ｑ２６４、Ｆ２６７、Ｅ２６８、Ｅ２７１、Ｐ５５９、Ｋ６６３およびＫ６６６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４８（Ｈｅｌ３０８Ｆａｃ）に示す配列の変種；
（ｗ）位置Ｒ２７５、Ｌ２８５、Ｓ２８６、Ｅ２８９、Ｐ５７６、Ｋ６７６およびＫ６７９の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４９（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｅ）に示す配列の変種；
（ｘ）位置Ｉ２７３、Ｌ２８３、Ｓ２８４、Ｅ２８７、Ｐ５７４、Ｋ６７４およびＫ６７７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５０（Ｈｅｌ３０８Ｍｊａ）に示す配列の変種；
（ｙ）位置Ｒ２５７、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｄ２７１、Ｐ５５４、Ｋ６５１およびＫ６５４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５１（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ）に示す配列の変種；
（ｚ）位置Ｓ２６９、Ｑ２７７、Ｅ２７８、Ｒ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＲ６８８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号５２（Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ）に示す配列の変種；
（ａａ）位置Ｋ２６８、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ｅ２８１、Ｄ５７５、Ｒ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５３（Ｈｅｌ３０８Ａｆｕ）に示す配列の変種；
（ａｂ）位置Ｄ２７７、Ｄ２８７、Ｄ２８８、Ｄ２９１、Ｄ６２６、Ｋ７２９およびＥ７３２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５４（Ｈｅｌ３０８Ｈｔｕ）に示す配列の変種；
（ａｃ）位置Ｄ２７６、Ｄ２８６、Ｑ２８７、Ｄ２９０、Ｄ５９５、Ｋ７０７およびＥ７１０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５５（Ｈｅｌ３０８Ｈｐａ）に示す配列の変種；
（ａｄ）位置Ｅ２８６、Ｅ２９６、Ｉ２９７、Ｖ３００、Ｄ６３３、Ａ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５８（Ｈｅｌ３０８Ｈｓｐ（ｓｋｉ２様ヘリカーゼ））に示す配列の変種；または
（ａｅ）Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１０に示す配列の変種
を含む、請求項１０に記載のヘリカーゼ。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項１３】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項１２に記載の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
（ａ）ポアと、（ｂ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項１２に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
【請求項１５】
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項１２に記載の構築物の使用。