【手続補正書】
【提出日】平成28年4月28日(2016.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｋｏｚａｋ配列を含む第１のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｂ）一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む第２のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｃ）６フレーム終止配列を含む第３のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｄ）直鎖状ベクター配列を含む第４のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のＤＮＡフラグメントを用いて生成物ベクターをアセンブルするステップとを含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
【請求項２】
ＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ増幅又は直接的ＤＮＡ合成を用いて得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第１のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第１のＤＮＡ分子の消化産物がＫｏｚａｋ配列を含む、ステップと；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第２のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第２のＤＮＡ分子の消化産物が一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第３のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第３のＤＮＡ分子の消化産物が６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第４のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第４のＤＮＡ分子の消化産物がベクター配列を含む、ステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
【請求項４】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を処理するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ増幅技術が使用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応が使用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
第４のＤＮＡ分子が致死遺伝子を含み、好ましくは、致死遺伝子がｃｃｄＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｋｏｚａｋ配列が、その５’末端に３フレーム終止配列を含み、
好ましくは、３フレーム終止配列が、配列番号４４〜６２及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１〜４３，６４〜７４及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
６フレーム終止配列が、配列番号７５〜８０及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第４のＤＮＡ分子の消化産物が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡフラグメントアセンブリのためのシステムであって、
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第１のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント１であって、Ｋｏｚａｋ配列を含む、ＤＮＡフラグメント１と；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第２のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント２であって、一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント２と；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第３のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント３であって、６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント３と；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第４のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント４であって、ベクター配列を含む、ＤＮＡフラグメント４と；
（ｅ）ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするための少なくとも１つのリコンビナーゼと
を含み、
好ましくは、前記システムが以下の少なくとも１つ
ｉ）前記システムが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む、
ｉｉ）ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、
ｉｉｉ）ＤＮＡフラグメント４が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる
を充足する、システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
プロモーター（ＺｍＵｂｉ１  ｖ８）も、３’結合部における３フレーム終止配列及びプラスミド結合部に一致する最小の１３ヌクレオチド配列（５’ベクターホモロジー）を含有する同様のＫｏｚａｋ配列を含む。同様に、６フレーム終止コドン配列を３’ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’ＵＴＲ）の５’末端に挿入する。３’ＵＴＲの３’末端は、プラスミドの別の末端と一致する１５ヌクレオチド配列（３’ベクターホモロジー）を含有する。フラグメントは、制限部位がフラグメント配列内に存在しないように、ＩＩ型制限部位と隣接する。ＩＩ型酵素は、例えば、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから選ばれることができる。これらのアセンブルしたベクターは、様々な制限酵素消化により確認可能であり、消化後のフラグメントパターンも当技術分野において周知のゲル電気泳動を用いて確認しうる。アセンブルしたベクターの配列も、当技術分野において公知のＤＮＡ配列決定によって確認しうる。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
（ａ）Ｋｏｚａｋ配列を含む第１のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｂ）一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む第２のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｃ）６フレーム終止配列を含む第３のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｄ）直鎖状ベクター配列を含む第４のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のＤＮＡフラグメントを用いて生成物ベクターをアセンブルするステップとを含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
［２］
ＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ増幅又は直接的ＤＮＡ合成を用いて得られる、［１］に記載の方法。
［３］
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第１のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第１のＤＮＡ分子の消化産物がＫｏｚａｋ配列を含む、ステップと；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第２のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第２のＤＮＡ分子の消化産物が一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第３のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第３のＤＮＡ分子の消化産物が６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第４のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第４のＤＮＡ分子の消化産物がベクター配列を含む、ステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
［４］
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を処理するステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［５］
ＤＮＡ増幅技術が使用されない、［１］に記載の方法。
［６］
ポリメラーゼ連鎖反応が使用されない、［１］に記載の方法。
［７］
ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、［１］に記載の方法。
［８］
第４のＤＮＡ分子が致死遺伝子を含む、［１］に記載の方法。
［９］
致死遺伝子が、ｃｃｄＢである、［８］に記載の方法。
［１０］
Ｋｏｚａｋ配列が、その５’末端に３フレーム終止配列を含む、［１］に記載の方法。
［１１］
Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１〜４３，６４〜７４及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、［１］に記載の方法。
［１２］
３フレーム終止配列が、配列番号４４〜６２及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、［１０］に記載の方法。
［１３］
６フレーム終止配列が、配列番号７５〜８０及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、［１］に記載の方法。
［１４］
リコンビナーゼが、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる、［１］に記載の方法。
［１５］
第４のＤＮＡ分子の消化産物が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる、［１］に記載の方法。
［１６］
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第１のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント１であって、Ｋｏｚａｋ配列を含む、ＤＮＡフラグメント１と；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第２のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント２であって、一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント２と；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第３のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント３であって、６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント３と；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第４のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント４であって、ベクター配列を含む、ＤＮＡフラグメント４と；
（ｅ）ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするための少なくとも１つのリコンビナーゼと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのためのシステム。
［１７］
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む、［１６］に記載のシステム。
［１８］
ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、［１６］に記載のシステム。
［１９］
リコンビナーゼが、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる、［１６］に記載のシステム。
［２０］
ＤＮＡフラグメント４が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる、［１６］に記載のシステム。