【手続補正書】
【提出日】平成27年12月18日(2015.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素的な方式でオリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを作製し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むことと、
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びα−１，４ガラクトース転移酵素の存在下、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組は、ピロホスファターゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ３−合成反応混合物中に発生され、前記Ｇｂ３−合成反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｌａｃ−ＯＲ１Ａ、α−１，４−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
いかなる酵素反応発生前においても、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡとガラクトースのＧｂ３−合成反応混合物中のモル比が１：１であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記α−１，４ガラクトース転移酵素はナイセリア・メニンジティディスのＬｇｔＣから由来し、前記ガラクトースキナーゼは大腸桿菌から由来し、前記ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼはシロイヌナズナから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらにＧｂ３−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
さらに（ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の存在下、Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
さらに（ｉｖ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素組の存在下、ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを作製し、その中、前記ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素組は、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素及びピルビン酸キナーゼ、及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、Ｇｂ−４合成反応混合物中に行われ、前記Ｇｂ−４合成反応混合物は、ＧａｌＮＡｃ、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素組を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｇｂ−４合成反応混合物は、Ｇｂ３−合成反応混合物をＧａｌＮＡｃ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することで作製されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来し、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼはロンガム菌から由来し、または前記Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素は大腸桿菌から由来することを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
さらにＧｂ４−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
さらに（ｖ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ  １，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに（ｖｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組の存在下、ガラクトースをＵＤＰ−Ｇａに作製することを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｖ）及び（ｖｉ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記Ｇｂ５−合成反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記β１，３−ガラクトース転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来することを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
さらにＧｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに（ｖｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα１，２−フコース基転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
さらに（ｖｉｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素組の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素組は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）は、フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素組を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、または前記α１，２−フコース転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来することを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
さらにフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
さらに（ｉｘ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
さらに（ｘ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素組の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素組は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉｘ）及び（ｘ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素組を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記α−２，３−シアル酸転移酵素は海洋細菌（Ｍ．ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来し、前記シチジン一リン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼはパスツレラ・ムルトシダから由来することを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、β１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、さらにＧｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｄ）（ｃ）中に準備するＧｂ５−ＯＲ１Ａを含有する反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項３２】
さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、
（ｄ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、
（ｆ）Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｇ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、β１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、さらにＧｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｄ）（ｃ）中に準備するＧｂ５−ＯＲ１Ａを含有する反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ａ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｂ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素組と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、
（ｄ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをα−２，３シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素組と混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物に形成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素組は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｆ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１個の酵素は、支持体上に固定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｌａｃ−ＯＲ１Ａ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡまたはＧｂ５−ＯＲ１Ａは、支持体上に固定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。