【手続補正書】
【提出日】平成28年5月2日(2016.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）グリコシル化されている配列番号２をもつ修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素であるが、成熟型アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２（野生型）におけるＮ２；Ｎ１６８およびＮ３４６からなる群より選択される少なくとも一つのアスパラギン残基が、グリコシル化に適していない一または二以上のアミノ酸によって置換されており、そしてこれによってこの位置における潜在的なグリコシル部位がそれぞれ排除、または不活性化されているグリコシル化されている修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素、および
（ｂ）（ａ）記載の、配列番号２をもつ前記修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素に対して８０％またはそれ以上のアミノ酸配列相同性を示す、グリコシル化されている修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素であって、成熟型アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２におけるＮ２；Ｎ１６８およびＮ３４６からなる群より選択される少なくとも一つのアスパラギン残基が、グリコシル化に適していない一または二以上のアミノ酸によって置換されており、そしてこれによってこの位置における潜在的なグリコシル部位がそれぞれ排除、または不活性化されており、類似性が決定される領域が（ａ）記載の修飾ＦＡＤ−ＧＤＨの全配列であり、および、（ａ）記載のＦＡＤ−ＧＤＨの前記配列が参照配列であるグリコシル化されている修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素の活性フラグメント
からなる群より選択される、グリコシル化されている修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素であって、
（ｂ）記載のＦＡＤ−ＧＤＨまたは（ｃ）記載のフラグメントにおいて、前記潜在的なグリコシル化部位を排除するまたは不活性化する前記置換が、（ａ）記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素と比較した場合に保存されており、および
（ｂ）記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素または（ｃ）記載のフラグメントが、（ａ）記載のＦＡＤ−ＧＤＨの酵素活性の少なくとも８０％の酵素活性を示しており、かつ、（ａ）記載のＦＡＤ−ＧＤＨの乾燥条件下での温度安定性の少なくとも８０％の温度安定性を示しており、
ここで、「乾燥条件下での温度安定性を示す」との表現が、
１）凍結乾燥、および、凍結乾燥された酵素の８０℃で８日間、モレキュラーシーブ（３Ａ、ＭＳ５５１、Ｇｒａｃｅ）上でのインキュベーション
の後に算出され、およびストレス無負荷の凍結乾燥物と比較された、凍結乾燥された修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）自身の、および、凍結乾燥された組成物中に含まれる場合凍結乾燥された組成物中の残存活性を意味している、グリコシル化されている修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項２】
前記修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素が、グリコシル化されている配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、乾燥条件下での改良された温度安定性を示し、前記配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨがアスペルギルス  オリゼでの発現によって得られ得る、請求項１記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項３】
５０％未満であるグリコシル化の程度、および／または、１．０２未満であるＭｗ／Ｍｎの比を示す請求項１または２記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項４】
Ｎ２；Ｎ１６８およびＮ３４６からなる群より選択されるただ一つのアスパラギン残基のみが、グリコシル化に適していない一または二以上のアミノ酸によって置換されており、そしてこれによってこの位置における潜在的なグリコシル部位がそれぞれ排除、または不活性化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項５】
アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２（野生型）由来の前記修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントが、一または二以上の以下の置換：Ｎ２Ｓ、Ｎ１６８Ｐ、Ｎ１６８ＳＰおよびＮ３４６Ｄを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項６】
アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２（野生型）由来の前記修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントが、以下の置換Ｎ２Ｓ（配列番号３）を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項７】
５０％未満であるグリコシル化の程度、および／または、１．０２未満であるＭｗ／Ｍｎの比を示す請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントを含む組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチドであって、Ｎ１６８Ｋ、Ｎ１６８Ｐ、Ｎ１６８ＹまたはＮ１６８Ｗからなる群より選択される単一の置換を有する、アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２（野生型）由来の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントをエンコードしない単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントをエンコードしている単離ポリヌクレオチドを含む請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記単離ポリヌクレオチドがＮ１６８Ｋ、Ｎ１６８Ｐ、Ｎ１６８ＹまたはＮ１６８Ｗからなる群より選択される単一の置換を有する、アスペルギルス  オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの野生型配列、配列番号２（野生型）由来の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントをエンコードせず、前記宿主細胞が、内因性のグリコシル化酵素を有することによってグリコシル化、特にはＮ−結合型グリコシル化を行うことができ、かつ、大腸菌株ではない宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体を培養する工程を含む、修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントを産生するための方法。
【請求項１２】
グリコシル化を行うことのできる宿主細胞中で、請求項１１記載の方法によって得られる請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項もしくは請求項１２記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント、または、請求項７記載の組成物を用いた、エクスビボサンプル中のグルコースを検出、決定または測定する方法であって、前記検出、決定または測定が、エクスビボサンプルを前記修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメントとそれぞれ接触させることを含む方法。
【請求項１４】
前記グルコースの検出、決定または測定がセンサーまたはテストストリップ素子を用いて行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項もしくは請求項１２記載の修飾フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素またはその活性フラグメント、または、請求項７記載の組成物を含むエクスビボサンプル中のグルコースの検出、決定または測定のための装置。