【手続補正書】
【提出日】平成28年7月8日(2016.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016507727000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
例示のみを目的として、実施態様について図面を参照して説明する。
【図１】本発明の一つの実施態様におけるバーコード/携帯型無線通信デバイスシステムを示す概略図である。図１Ａに示す実施態様の場合、このシステムは（サンプルとのハイブリダイゼーション後の）異なる量子ドットバーコードを有するマイクロウェルチップ、異なる量子ドットバーコード（一次ラベル）および二次ラベルからの発光信号を可視化する光学手段、光学手段から信号を取り込み、信号を分析する携帯型無線通信デバイス、および携帯型無線通信デバイスから信号を無線受信し、これの保存および/または分析の続行を行う集中機構を有する。図１Ｂは、各ウェル内に異なるバーコードを有するマイクロウェルチップを示す写真である。図１Ｃは、携帯型無線通信デバイスカメラを使用して撮影した顕微鏡写真であり、チップの表面に組み付けた５種類の異なる量子ドットバーコード（実際の写真はカラー写真である）の画像を示す顕微鏡写真である。これらバーコードをＨｇランプ（λｅｘ＝３５０/５０）で励起し、光信号を倍率が２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．５０）で収集し、４３０ｎｍのロングパスフィルターでフィルター処理し、Ａｐｐｌｅ  ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォンを用いて０．０５秒の露光時間で撮像を行った。図１Ｄの写真は、（図１Ｄの左側にある）図１Ｃのスマートフォンによって撮像した光学像の他のデバイスへの無線送信を示すものである。
【図２】アッセイ画像および感度曲線を示す図である。図２Ａは、チップに付着処理した緑色、黄色および赤色（実際はカラー写真であり、矢印で強調して示す実施例、図８にＢ１、Ｂ４およびＢ６で示す）バーコードの顕微鏡写真であり、ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓスマートフォンカメラ（蛍光顕微鏡法パラメータ：ＮＡ＝０．５０における倍率が２０倍の対物レンズ、λｅｘ＝３５０/５０、λｅｍ＝４３０ＬＰ、露光時間＝０．０５秒）を使用して撮像したものである。マイクロウェルについては、明視野顕微鏡法を使用して視覚化している。蛍光像および明視野像が重なっている。図２Ｂは、アッセイ後を示すもので、マイクロビーズバーコードの無線通信デバイスカメラで取得した蛍光像にターゲット被検体および二次ラベル化プローブが結合している（蛍光顕微鏡法パラメータ：ＮＡ＝０．５０における倍率が２０倍の対物レンズ、λｅｘ＝６４０/４０、λｅｍ＝６９２/４０、露光時間＝１秒）。緑色ビーズおよび赤色ビーズの両ビーズ（実際はカラー写真）は存在するが、黄色ビーズ（矢印で強調した実施例）は存在しない。これは、サンプル中にはＴ１、Ｔ６ゲノムターゲットは存在するが、Ｔ４は存在していないことを説明するものである。なお、バーコード上の白色スポットは、Ａｌｅｘａ６４７蛍光体と、Ｂ６内に含侵した６４０ｎｍ量子ドットとの合成強度が高いために発生した過剰露光が理由である。図２Ｃは、感染症への適用例としてだけここで使用するインフルエンザＡウィルスＨ１Ｎ１（Ｔ１）、Ｈ３Ｎ５（Ｔ２）、Ｈ５Ｎ１（Ｔ３）、およびＢ４２０型肝炎（Ｔ４）、Ｃ型肝炎（Ｔ５）の遺伝子バイオマーカー感度曲線である。エラーバーはいずれも三回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図３】感染症への適用例としてだけ使用する５種類の感染症ターゲット分子鎖Ｔ１〜Ｔ５ならびにネガティブコントロールＴ６およびポジティブコントロールＴ７の多重化検出を示す図である。図３の場合、ＡＴ７のみがハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｂの場合、ターゲットＴ１、Ｔ３、Ｔ５、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｃの場合、ターゲットＴ２、Ｔ４、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｄの場合、ターゲットＴ１、Ｔ２、Ｔ３、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｅの場合、ターゲットＴ４、Ｔ５、およびＴ７がハイブリダイゼーション時に存在していた。図３Ｆの場合、Ｔ６を除くすべてのターゲットがハイブリダイゼーション時に存在していた。なお、Ｔ６を除いて、図３Ａ〜図３Ｆにおける他のいずれの値も図３Ｆにおけるそれぞれ正の値に対して標準化してある。
【図４】本発明の一つ実施態様における２．０μｍ（●）および２．９μｍ（■）についてのマイクロビーズの濃度およびサイズによって求めたマイクロウェルチップのマイクロビーズバーコード充填効率を示すグラフである。
【図５】量子ドットバーコードの強度を示すグラフである。７つのバーコードすべてについて既知のバーコード強度を示す。左から右にバーはフィルターλｅｍ＝５３０/１０（白色）、λｅｍ＝５８０/１０（斜線）、λｅｍ＝６４０/１０（格子縞）、およびλｅｍ＝６９２/４０（黒色）において観察した強度を示す。エラーバーはいずれも三回の複製からの標準偏差として算出したものである。
【図６】カスタム設計シーケンス（取り込みシーケンス：５´−ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；ターゲットシーケンス：５´−ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ａ  ＣＴＡ  ＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  Ｃ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；二次プローブシーケンス：５´−Ａｌｅｘａ６４７−ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  Ｇ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））について（Ａ）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｒｅｔｉｇａ  ＥＸｉ  Ｆａｓｔ１３９４、Ｑｉｍａｇｉｎｇ）および（Ｂ）ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラ（ｉＰｈｏｎｅＴＭ４Ｓ、Ａｐｐｌｅ  Ｉｎｃ．）を用いて撮像した画像から得た感度曲線の比較を示す。水平線が検出限界を示し、いずれも場合も〜１５ｆｍｏｌである。エラーバーについてはいずれも三回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図７】各バーコードについての取り込み鎖共役効率を示すグラフである。エラーバーについてはいずれも二回の複製からの標準偏差に基づいて算出したものである。
【図８】ＤＮＡシーケンス、これらの対応するバーコード画像および対応するバーコードスペクトルをリストアップした表である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
例えば、モデルゲノムシーケンスを使用して、ポジティブな検出を対象とする最終マイクロビーズコンプレックスのサンドウィッチ構造を説明する。シーケンス５´−ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と共役化した独立した一つの蛍光発光バーコードを有するチップを用意した。次に、ターゲットシーケンス５´−ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ａ  ＣＴＡ  ＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  Ｃ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）およびＡｌｅｘａ６４７染料ラベル化二次シーケンス５´−Ａｌｅｘａ６４７−ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  Ｇ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含有する溶液を加えた。ポジティブな検出の場合、マイクロビーズからの光信号は、バーコードおよびＡｌｅｘａ染料内の量子ドットから構成する。ターゲットシーケンスが、二次プローブおよびバーコードの両方にハイブリダイゼーションし、Ａｌｅｘａ染料の蛍光強度からターゲット被検体の濃度から確認できるものと考えられる。本明細書の説明から理解できるように、ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの場合、コストの高いＣＣＤカメラと比較して同程度の検出限界およびダイナミックレンジを実現できる（図６を参照）。以上の結果から、ｉＰｈｏｎｅＴＭカメラの場合、チップ面状のバーコードを撮像でき、生物学的アッセイの検出器として使用でき、また量子ドットバーコード検出システムのコストおよびサイズを抑制できることが確認できた。