【手続補正書】
【提出日】平成28年9月16日(2016.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または微生物を含む生体試料からの標的核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記生体試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、前記細胞または微生物を溶解させるために十分な量で前記生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで酸性緩衝液を前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して前記標的核酸を前記生体試料から抽出する工程とを含む、方法。
【請求項２】
工程（ｄ）に続いてＰＣＲを使用して核酸増幅を実施する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が、全血、血清、血漿、痰、唾液、便、または組織である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記遷移金属塩がマンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ土類金属塩がマグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸がウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性緩衝液がクエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）を実行した後の前記溶解物のｐＨが、ｐＨ  １〜ｐＨ  ５の間の酸性範囲内である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗剤が陽イオン性または非イオン性洗剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記陽イオン性洗剤が、セトリモニウムブロミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非イオン性洗剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）が、磁性粒子を工程（ｃ）の前記溶解物に添加すること；磁気微粒子分離を用いて前記磁性微粒子を前記溶解物から分離すること；洗浄液を前記磁性微粒子に添加すること、および溶出緩衝液を前記磁性微粒子に添加して前記核酸を溶出することによって実行される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸およびヌクレアーゼを含む試料中の増幅核酸産物を検出するための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、試料中の前記ヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）酸性緩衝液を、前記試料のｐＨを約ｐＨ  ５未満まで低下させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｃ）核酸増幅反応を実施して、前記標的核酸から前記増幅核酸産物を生成する工程と
（ｄ）前記増幅核酸産物を検出する工程とを含む、方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅反応がＰＣＲ法であり、かつ／または前記標的核酸がＤＮＡ、所望によりウイルスＤＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施され；かつ／または
（ｂ）前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択され；かつ／または
（ｃ）前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択され；かつ／または
（ｄ）前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液であり；かつ／または
（ｅ）前記標的核酸がＲＮＡ、所望によりウイルスＲＮＡである
方法。
【請求項１８】
核酸、ヌクレアーゼおよび阻害剤を含む生体試料から核酸を抽出するためのキットであって、
（ａ）抽出溶液；
（ｂ）遷移金属塩溶液、アルカリ土類金属塩溶液、またはその組合せ；
（ｃ）酸性緩衝液、および
（ｄ）洗浄液を含む、キット。
【請求項１９】
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記洗浄液がトリフルオロ酢酸溶液または塩酸溶液である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
Ｂ型肝炎ウイルスを含む生体試料からの標的Ｂ型肝炎ウイルス核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、前記試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記生体試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、前記細胞または微生物を溶解させるために十分な量で前記生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）酸性緩衝液を、前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記試料を加熱する工程と；
（ｅ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して、前記生体試料から前記標的核酸を抽出する工程とを含む、方法。
【請求項２５】
前記生体試料が、約６５℃〜約７５℃の間の温度まで加熱される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記加熱工程が、約５０秒〜約７０秒間実行される、請求項２４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図から当業者に明らかとなるであろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
細胞または微生物を含む生体試料からの標的核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、前記生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、前記細胞または微生物を溶解させるために十分な量で生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで酸性緩衝液を前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して前記標的核酸を前記生体試料から抽出する工程とを含む、方法。
（項目２）
工程（ｄ）に続いて核酸増幅を実施する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
核酸増幅がＰＣＲである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記核酸増幅から生じた増幅核酸産物を検出する工程をさらに含む、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記生体試料が、全血、血清、血漿、痰、唾液、便、または組織である、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記遷移金属塩がマンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記アルカリ土類金属塩がマグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記標的核酸がＲＮＡである、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記標的核酸がウイルスＲＮＡである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記標的核酸がＤＮＡである、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記酸性緩衝液がクエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
工程（ｃ）を実行した後の前記溶解物のｐＨが、ｐＨ  １〜ｐＨ  ５の間の酸性範囲内である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記洗剤が陽イオン性または非イオン性洗剤である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記陽イオン性洗剤が、セトリモニウムブロミドである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記非イオン性洗剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
工程（ｄ）が、磁性粒子を工程（ｃ）の前記溶解物に添加すること；磁気微粒子分離を用いて前記磁性微粒子を前記溶解物から分離すること；洗浄液を前記磁性微粒子に添加すること、および溶出緩衝液を前記磁性微粒子に添加して前記核酸を溶出することによって実行される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
標的核酸およびヌクレアーゼを含む試料中の増幅核酸産物を検出するための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）酸性緩衝液を、前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｃ）核酸増幅反応を実施して、前記標的核酸から増幅核酸産物を生成する工程と
（ｄ）前記増幅核酸産物を検出する工程とを含む、方法。
（項目２０）
工程（ａ）および工程（ｂ）が、同時に実施される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、項目１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、項目１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸増幅反応がＰＣＲ法である、項目１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記標的核酸がＲＮＡである、項目１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記標的核酸がウイルスＲＮＡである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記標的核酸がＤＮＡ、所望によりウイルスＤＮＡである、項目１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
核酸、ヌクレアーゼおよび阻害剤を含む生体試料から核酸を抽出するためのキットであって、
（ａ）抽出溶液；
（ｂ）遷移金属塩溶液、アルカリ土類金属塩溶液、またはその組合せ；
（ｃ）酸性緩衝液、および
（ｄ）洗浄液を含む、キット。
（項目２９）
前記抽出溶液が、プロテイナーゼＫ、洗剤、またはそれらの組合せを含む、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
前記遷移金属塩が、マンガン塩または亜鉛塩からなる群から選択される、項目２８または２９に記載のキット。
（項目３１）
前記アルカリ土類金属塩が、マグネシウム塩またはカルシウム塩からなる群から選択される、項目２８から３０のいずれか一項に記載のキット。
（項目３２）
前記酸性緩衝液が、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、項目２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目３３）
前記洗浄液がトリフルオロ酢酸溶液または塩酸溶液である、項目２８から３２のいずれか一項に記載のキット。
（項目３４）
Ｂ型肝炎ウイルスを含む生体試料からの標的Ｂ型肝炎ウイルス核酸の抽出のための方法であって、前記方法が：
（ａ）遷移金属塩、アルカリ土類金属塩、またはその組合せを、前記生体試料中のヌクレアーゼを不活性化させるために十分な量で前記試料に添加する工程と；
（ｂ）抽出溶液を、細胞または微生物を溶解させるために十分な量で前記生体試料に添加し、それにより溶解物を形成する工程と；
（ｃ）酸性緩衝液を、前記溶解物のｐＨを低下させるために十分な量まで前記溶解物に添加する工程と；
（ｄ）前記試料を加熱する工程と；
（ｅ）前記標的核酸を前記溶解物から分離して、前記生体試料から前記標的核酸を抽出する工程とを含む、方法。
（項目３５）
前記生体試料が、約５０℃〜約８０℃の間の温度まで加熱される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生体試料が、約６５℃〜約７５℃の間の温度まで加熱される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記加熱工程が、約３０秒〜約９０秒間実行される、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記加熱工程が、約５０秒〜約７０秒間実行される、項目３７に記載の方法。