(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0004018768.tif 000005
〔Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はアシル基を示す〕で表される化合物を有効成分として含有する、動脈硬化の予防・治療剤。
【請求項２】
アシル基がアセチル基である請求項１記載の予防・治療剤。
【請求項３】
単離した一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する、抗アレルギー剤。
【請求項４】
アシル基がアセチル基である請求項３記載の抗アレルギー剤。
【請求項５】
単離した一般式（Ｉ）で表される化合物が配合された、機能性食品。
【請求項６】
単離した一般式（Ｉ）で表される化合物が配合された、食品添加物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を示し、動脈硬化や心臓病などの成人病やアレルギー症の予防に有効である、１２−リポキシゲナーゼ阻害剤、機能性食品および食品添加物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポキシゲナーゼは、アラキドン酸カスケードと呼ばれるヒトの恒常性維持に必要な代謝経路のひとつを構成する一群の酸化酵素である。これらはヒトの血小板や白血球、リンパ球に存在し、アラキドン酸からモノヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（ＨＰＥＴＥ）と呼ばれる過酸化脂肪酸を生ずる反応を触媒する。ついでＨＰＥＴＥはフリーラジカルを放出してモノヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）へ酵素的、非酵素的に変換される。
【０００３】
１２−リポキシゲナーゼは、アラキドン酸の１２位の炭素に酸素分子を導入することができる上記リポキシゲナーゼの一種であり、体内で重要な役割を演じていると考えられている。組織が何らかの刺激を受けると、ホスホリパーゼにより細胞膜脂質からアラキドン酸が遊離され、１２−リポキシゲナーゼによって１２−ＨＥＴＥが産生される。１２−ＨＥＴＥは白血球の走化性や血小板の凝集、平滑筋細胞の遊走性を増大させ、動脈硬化、心臓病等の成人病やアレルギー症等、多くの病態に関与しているといわれており、その過剰生産などが問題視されている。現代人の食生活は肉食中心となりがちで、摂取される脂肪酸の組成から見るとアラキドン酸過剰の状態である。これは、すなわち１２−ＨＥＴＥの過剰生産につながるものであり、これをコントロールするために食事の改善が重要であるとされている。
また、アラキドン酸から１２−ＨＰＥＴＥを生ずる反応を触媒する１２−リポキシゲナーゼの活性を阻害すれば、１２−ＨＥＴＥの過剰生産を抑制することができると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、優れた１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を示し、動脈硬化や心臓病などの成人病やアレルギー症の予防に有効である、薬剤、機能性食品および食品添加物を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するものとして、下記一般式（Ｉ）で示される化合物〔以下、化合物（Ｉ）とも称する〕が、強い１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を示すことを見い出して本発明を完成した。
【０００６】
本発明の要旨は次の通りである。
（１）一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
0004018768.tif 000002
【０００８】
〔Ｒ1 、Ｒ2 、およびＲ3 はアシル基を示す〕で表される化合物を含有する１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（２）アシル基がアセチル基である上記（１）に記載の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（３）海藻の溶媒抽出エキスの態様で一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する、上記（１）または（２）に記載の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（４）海藻が緑藻イワヅタ（Caulerpaceae) 科イワヅタ (Caulerpa) 属である上記（３）に記載の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（５）緑藻イワヅタ科イワヅタ属に属する海藻がイチイヅタ (Caulerpa taxifolia)あるいはCaulerpa prolifera である上記（４）に記載の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（６）溶媒抽出に用いる抽出溶媒が親油性溶媒及び／または親水性溶媒であることを特徴とする上記（３）に記載の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤。
（７）一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する機能性食品。
（８）一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する食品添加物。
【０００９】
【発明の実施の形態】
一般式（Ｉ）中のＲ1 、Ｒ2 、およびＲ3 で示されるアシル基としては、例えばアセチル基、アクリロイル基、シクロヘキサンカルボニル基、シクロヘキセンカルボニル基等の脂肪族アシル基や、例えばベンゾイル基、ベンジルカルボニル基、ナフタレンカルボニル基等の芳香族アシル基、例えばフランカルボニル基、ピロールカルボニル基、ピリジンカルボニル基、キノリンカルボニル基等の複素環アシル基が挙げられる。当該アシル基は、飽和、不飽和のいずれでもよい。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、そのＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 がアセチル基である式（ＩＩ）：
【００１０】
【化３】
0004018768.tif 000003
【００１１】
〔Ａｃはアセチル基を示す〕で表される化合物〔以下、化合物（ＩＩ）とも称する〕である。
【００１２】
化合物（Ｉ）は公知化合物であり、通常、当該化合物を含有する海藻、例えば、緑藻イワヅタ科イワヅタ属に属する海藻の溶媒抽出エキスを分離、精製することにより得られるが、化学的に合成したものであってもよい。
本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤は、精製された化合物（Ｉ）を含有していても良いし、また、例えば緑藻イワヅタ科イワヅタ属に属する海藻等の、化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスの態様で化合物（Ｉ）を含有していてもよい。特に、精製された化合物（ＩＩ）、または、例えば緑藻イワヅタ科イワヅタ属に属する海藻等の、化合物（ＩＩ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスの態様で化合物（ＩＩ）を含有していることが好ましい。
本発明における緑藻イワヅタ科イワヅタ属の海藻としては、イチイヅタ (Caulerpa taxifolia)あるいは日本未記載種の一種 (Caulerpa prolifera)が好ましい。
【００１３】
化合物（Ｉ）を含有する、緑藻イワヅタ科イワヅタ属の海藻等の海藻から上記の化合物（Ｉ）を抽出するには、常法に従い適当な有機溶媒で抽出することができる。
海藻は、乾燥粉末状でも生の海藻体の状態でも用いることができ、攪拌後一定時間室温に放置し、濾過ないし遠心分離によって得られた粗抽出液を減圧濃縮、乾固することにより、溶媒抽出物を得ることができる。
抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の親水性溶媒、及びクロロホルム、酢酸エチル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、エーテル等の親油性溶媒が好ましい。これらの中で特に好ましい抽出溶媒としては、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、イソプロパノール、エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン等が挙げられる。
上記の溶媒は、各々単独で用いてもよいし、複数で用いてもよい。
溶媒抽出エキスからの化合物（Ｉ）の単離精製と同定は、常法にて行われる。例えば、抽出液あるいはその濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどで分離・精製できる。
【００１４】
各画分について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法および質量分析（ＭＳ）法等により同定を行う。ＮＭＲに関しては、２００ＭＨｚ以上の超伝導フーリエ変換（ＦＴ）ＮＭＲ装置を用い、水素（ 1Ｈ）と炭素（13Ｃ）のＮＭＲスペクトルを、さらにはシフト相関二次元ＮＭＲスペクトル等を取るのが同定には有効である。また、ＭＳに関しては、ガスクロマトグラフィー電子衝撃法質量分析（ＧＣＥＩ−ＭＳ）が同定には有効である。
【００１５】
以上のようにして得られた化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスは、必要に応じて、凍結乾燥法等の公知の手法を用いて乾燥し、粉末状の固体物質とすることもできる。
【００１６】
得られた化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスを、本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤として用いる場合には、通常、公知の医薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、可溶化剤、増量剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤等の添加剤と適宜混合して、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、粉末、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等の投与に適した態様で製剤化し、経口的または非経口的に投与することができる。
【００１７】
上記製剤中には、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスの有効量が配合される。投与量は、投与ルート、症状、患者の体重、年齢等によって異なるが、例えば成人に投与する場合には、１日当たり、化合物（Ｉ）として１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｋｇを、１日１〜数回に分けて投与するのが望ましい。
【００１８】
また、上記のようにして得られた化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスは、単独で、又は適当な配合物と混合して機能性食品や食品添加物として用いることができる。
適当な配合物としては、例えば、ビタミン類、ミネラル、甘味料、着色料、香料、安定化剤、保存剤等の食品衛生上許容されうる配合物を使用すればよく、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスにこれらの配合物を適宜添加して混合し、常法により錠剤（タブレット）状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、液状、クリーム状、清涼飲料等の、食品または食品添加物に適した態様にすることができる。
上記の機能性食品または食品添加物中には、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスが０．１〜１００重量％程度、好ましくは１〜５０重量％程度の濃度で含有される。
【００１９】
上記食品添加物は、例えば、ソーセージ、ハム等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、バター、チーズ等の乳製品、ケーキ、ビスケット等の菓子、味噌等の米加工品、パン等の小麦二次製品、麺類、大豆加工品、飲料、調味料などの種々の食品に添加することができる。
【００２０】
化合物（Ｉ）は優れた１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を有する。従って、化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤、化合物（Ｉ）を含有する本発明の機能性食品または食品添加物を摂取すると、これらに含有される化合物（Ｉ）の１２−リポキシゲナーゼ阻害活性により、アラキドン酸から１２−ＨＰＥＴＥを生ずる反応が阻害され、それに伴い１２−ＨＥＴＥの生成が阻害されて、白血球の走化性、血小板の凝集および平滑筋細胞の遊走性の亢進が抑制されるため、動脈硬化や心臓病などの成人病やアレルギー症等の予防に有用である。
【００２１】
本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤は、上述したように優れた１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を示し、１２−ＨＥＴＥの生成を阻害する。この１２−リポキシゲナーゼ阻害活性の測定は、１２−ＨＥＴＥの生成量を調べることで行う。ＩＣ50は、アラキドン酸および１２−リポキシゲナーゼを含有する反応液に、１２−リポキシゲナーゼ阻害剤試料を０．５〜１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、１２−ＨＥＴＥ生成の阻害率が５０％の時の濃度とした。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例および試験例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるわけではない。
【００２３】
実施例１
▲１▼溶媒抽出エキスの調製
緑藻イワヅタ科イワヅタ属イチイヅタ (Caulerpa taxifolia)を水で洗浄、凍結乾燥して粉砕した。この凍結粉砕物１１０ｇに、メタノール１，１００ｍｌを加え、一昼夜よく攪拌して抽出した。抽出液を濾過し、不溶分を除去するとともに濾液を集め溶媒を減圧除去した。緑褐色の溶媒抽出エキス１２．０ｇを取得した。この抽出エキスの一部をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液を調製した。
【００２４】
▲２▼１２−リポキシゲナーゼ阻害活性の測定
酵素液９０μｌ（ラット血小板ホモジネート；２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．６、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に、先に調製したイチイヅタの溶媒抽出エキスのＤＭＳＯ溶液を５μｌ加え５分間３７℃に放置後、基質として１０ｍＭアラキドン酸エタノール溶液を５μｌ加え、３７℃で１時間反応後生成した１２−ＨＥＴＥを高速液体クロマトグラフィーで分析した。コントロールとして、ＤＭＳＯを５μｌ加えて同様に測定した。溶媒抽出エキスは、この濃度で１２−リポキシゲナーゼ活性を完全に阻害した。
【００２５】
実施例２
▲１▼抽出エキスの分離・精製
実施例１において、メタノールにて抽出した溶媒抽出エキス１２ｇを用いて有効成分の分離・精製を行った。すなわち、この抽出物をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８プレップ；カラムサイズ＝３０ｍｍ×５００ｍｍ、展開溶媒＝アセトニトリル）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ社  シリカゲル６０；カラムサイズ＝２０ｍｍ×３００ｍｍ、展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で粗精製した結果、１２−リポキシゲナーゼ阻害活性のある粗精製物（粗精製物Ａとする）が得られた。
【００２６】
▲２▼精製物質Ａの単離
粗精製物Ａを、更にセミ分取高速液体クロマトグラフィー（カラム；ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＳＩＬ−０６、カラムサイズ＝２０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶離剤；ヘキサン：酢酸エチル＝３：１、検出器；ＵＶ２５４ｎｍ；流速＝５．０ｍｌ／ｍｉｎ）で分画して精製物質（精製物質Ａとする）を０．８ｍｇ単離した。
【００２７】
▲３▼精製物質の１２−リポキシゲナーゼ阻害活性の測定
上記精製物質Ａの一部をＤＭＳＯに溶解し、５ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液を調製した。このＤＭＳＯ溶液を用いて実施例１と全く同様にして１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を測定した。コントロールも実施例１と同様に測定した。精製物質Ａは、この濃度で１２−リポキシゲナーゼ活性を完全に阻害した。
【００２８】
▲４▼精製物質のＩＣ50
酵素液９０μｌ（ラット血小板ホモジネート；２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．６、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に、精製物質Ａを０．５〜１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、各濃度において実施例１と同様の方法で１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を測定した。１２−ＨＥＴＥ生成の阻害率が５０％の時の濃度を求めた結果、本条件ではＩＣ50＝３０μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
▲５▼精製物質の構造の解析
上記精製物質を２７０ＭＨｚのＮＭＲ、及びＧＣＥＩ−ＭＳを駆使して同定を行った。主なシグナルを下記に示した。
【００３０】
1Ｈ−ＮＭＲ（δｐｐｍ）：
7.89(1H,d), 1.61(3H,s), 5.72(1H,d), 7.32(1H,s), 1.56(3H,s),
6.18(1H,t), 1.70(3H,s), 2.47(1H,s), 2.58, 2.48(2H,m), 7.03(1H,t),
1.70(3H,s)
13Ｃ−ＮＭＲ（δｐｐｍ）：
137.52(d), 167.33(s), 19.93(q), 109.38(d), 68.14(d), 118.49(s),
135.11(d), 166.34(s), 19.80(q), 169.11(s), 20.32(q), 32.90(t),
143.52(d), 140.73(s), 10.60(q), 178.56(s), 79.89(s), 79.10(d)
ＧＣＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
348 (M+ ), 288, 246, 186
【００３１】
上記のＧＣＥＩ−ＭＳの結果から、上記の方法により得られた精製物質は分子量３４８の物質であることが確認できる。さらに、 1Ｈ−ＮＭＲと13Ｃ−ＮＭＲのデータ、及び文献〔Antonio Guerriero ら、J. Chem. Soc., Chem. Commun., 2083-2084 頁、1994年〕 等と併せて検討すると、この精製物質はカウレルペニンの誘導体であり、その構造は次式（ＩＩ）に示すものであった。
【００３２】
【化４】
0004018768.tif 000004
【００３３】
【発明の効果】
化合物（Ｉ）は優れた１２−リポキシゲナーゼ阻害活性を有する。このため、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスを有効成分として含有する１２−リポキシゲナーゼ阻害剤、機能性食品または食品添加物を摂取すると、アラキドン酸から１２−ＨＰＥＴＥが生成される反応が阻害され、１２−ＨＥＴＥの生成も阻害されるため、動脈硬化や心臓病などの成人病やアレルギー症等の予防に有用である。
また、本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤の有効成分は、精製された化合物（Ｉ）でも、化合物（Ｉ）を含有する海藻の溶媒抽出エキスでもよく、また、化合物（Ｉ）は緑藻イワヅタ科イワヅタ属に属する海藻等の海藻から抽出することにより簡便に得ることができるため、本発明の１２−リポキシゲナーゼ阻害剤、機能性食品または食品添加物は簡便かつ大量に提供することができる。