【手続補正書】
【提出日】平成28年5月27日(2016.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン細胞含有試料を特徴付ける方法であって、
被験体から得られたメラニン細胞含有試料中の、
（ｉ）ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つ、ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの正規化バイオマーカー
についての発現レベルを決定し、これにより、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々および該少なくとも１つの正規化バイオマーカーについての生の発現値をもたらすステップと、
該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての該生の発現値を、該少なくとも１つの正規化バイオマーカーについての該生の発現値に対して正規化して、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての正規化された発現値をもたらすステップと、
該正規化された発現値を、回帰アルゴリズムまたは機械学習アルゴリズムにおいて使用して、出力値をもたらすステップと、
該出力値を、良性であるのか悪性であるのかがあらかじめ既知である複数のメラニン細胞含有試料中の、該少なくとも２つのバイオマーカーについての正規化された発現値から導出されたカットオフ値と比較するステップと、
該出力値が、該複数の既知の良性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を良性として特徴付けるか、または該出力値が、該複数の既知の悪性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を悪性として特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの正規化バイオマーカーが、母斑試料と原発性黒色腫試料との間で発現の統計学的有意差を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの正規化バイオマーカーが、表３のバイオマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ全てを含む、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記メラニン細胞含有試料中の複数のバイオマーカーについての遺伝子発現値を測定するステップであって、該複数のバイオマーカーについての発現の範囲が、該試料のトランスクリプトームにおけるバイオマーカー発現の全範囲を表すステップと、
このような複数のバイオマーカーについての中心傾向発現値を計算するステップと、
必要に応じて、外れ値を棄却し、該外れ値発現値を伴わずに再計算された複数の中心傾向発現値を計算するステップと
該中心傾向発現値、または、必要に応じて、該再計算された複数の中心傾向発現値を使用して、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての前記生の発現値を正規化するステップと
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
被験体からのメラニン細胞含有試料中の遺伝子発現を決定する方法であって、
該試料中の、ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含む複数の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
該試料中の該複数の遺伝子の発現レベルの報告、または該試料の、該複数の遺伝子の該発現レベルに基づく、母斑または黒色腫としての特徴付けを提供するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、
Ｎ４ＲＡ１およびＢ４ＧＡＬＴ１、または
ＮＲ４Ａ１およびＳＯＣＳ３、または
ＮＲ４Ａ１、ＳＯＣＳ３、およびＢ４ＧＡＬＴ１、または
ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、およびＳＯＣＳ３
を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表４のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含み、前記出力値が、ロジスティック回帰アルゴリズムによりもたらされた、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アルゴリズムが、
出力値＝β０＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋・・・βｎＸｎ
［式中、Ｘｎは、前記少なくとも２つの（最大でｎの）表４のバイオマーカーについての発現値の対数であり、β０は、−２００を超え、かつ、２００未満であり、ｎ＞０に対する全てのβは、−１，０００を超え、かつ、１，０００未満である］
である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表１１および１３のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含み、前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表１１のバイオマーカーのうちの少なくとも２つまたは表１３のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、
Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＡＸ、ＭＡＧＥＡ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＩＡ４、ＰＲＡＭＥ、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、ＳＡＴ１、ＰＤＬＩＭ７、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＭＡＧＥＣ２、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＺＦＹＶＥ１６、およびＢＥＳＴ１のうちの少なくとも２つ、または
ＮＲ４Ａ１、ＳＯＣＳ３、ＰＲＡＭＥ、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＢＥＳＴ１、ＲＵＮＸ１、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＰＤＬＩＭ７、ＺＦＹＶＥ１６、ＨＩＦ１Ａ、およびＰＩＣＡＬＭのうちの少なくとも２つ
を含み、
前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、
請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表４、表１１、表１３、または表４および表１１の両方の遺伝子のうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＡＸ、ＭＡＧＥＡ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＩＡ４、ＰＲＡＭＥ、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、ＳＡＴ１、ＰＤＬＩＭ７、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＭＡＧＥＣ２、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＺＦＹＶＥ１６、およびＢＥＳＴ１から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを、被験体から得られたメラニン細胞含有試料における悪性度の指標とする方法であって、該方法は、
該少なくとも２つのバイオマーカーの該発現レベルを入力として使用するアルゴリズムからの出力を計算するステップ
を含み、
該アルゴリズムの出力の、既知の悪性メラニン細胞含有試料に由来する参照標準との比較が、該試料が悪性であるのか悪性でないのかの指標となる、方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの選択されたバイオマーカーの前記発現レベルを、
（ａ）ＭＦＩ２、ＲＡＰ２Ｂ、ＢＭＰ１、および／もしくはＮＣＯＲ２のうちの少なくとも１つ、
（ｂ）ＭＦＩ２、ＮＣＯＲ２、ＲＡＰ２ｂ、およびＢＭＰ−１、
（ｃ）ＲＰＳ６ＫＢ２および／もしくはＳＤＨＡ、または
（ｄ）前記メラニン細胞含有試料中で発現した少なくとも１つの遺伝子であって、該少なくとも２つのバイオマーカーではなく、その発現が、代表的な複数のメラニン細胞含有試料において有意に異ならない遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１つの正規化バイオマーカーの該発現レベルに対して正規化するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
発現レベルを決定するステップが、核酸の発現を決定することを含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
核酸の発現を決定することが、前記試料を、複数の核酸プローブまたは対合増幅プライマー対と接触させることを含み、各プローブまたは対合プライマーは、該複数の核酸プローブまたは対合プライマーがその／それらの相補的な少なくとも２つのバイオマーカーとハイブリダイズすることを可能とする条件下で、前記少なくとも２つのバイオマーカーのうちの１つに対して特異的、かつ、相補的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料を前記複数の核酸プローブと接触させた後で、該試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも３つのアドレス可能な位置であって、各位置が、同じ特異性を有する固定化された捕捉プローブを含み、各位置が、各他の位置における捕捉プローブとは異なる特異性を有する捕捉プローブを含む位置
を含むアレイであって、
該少なくとも３つの位置のうちの２つにおける該捕捉プローブが、ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーのうちの２つ以上を含むバイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、該少なくとも３つの位置のうちの１つにおける該捕捉プローブが、表３に列挙される正規化バイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、
各捕捉プローブの該特異性が、該アレイの該アドレス可能な位置により同定可能であるアレイ。
【請求項１９】
前記少なくとも３つのアドレス可能な位置の各々が、個別に同定可能なビーズまたはフローセル内のチャネルである、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のアレイ、ならびに
溶解緩衝液を含有する容器；
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含有する容器；
複数の核酸プログラミングリンカーを含有する容器；
複数のＮＰＰを含有する容器；
複数の二官能性検出リンカーを含有する容器；
該二官能性検出リンカーに特異的に結合する検出プローブを含有する容器；および
検出試薬を含有する容器
のうちの１または複数
を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、生物学的試料（メラニン細胞含有試料など）を、良性の母斑または原発性黒色腫として診断するためのアレイおよびキットも開示される。例えば、アレイは、少なくとも３つのアドレス可能な位置であって、各位置が、同じ特異性を伴う固定化された捕捉プローブを有し、各位置が、各他の位置における捕捉プローブとは異なる特異性を伴う捕捉プローブを有する位置を含むことが可能であり、ここで、少なくとも３つの位置のうちの２つにおける捕捉プローブは、ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーのうちの２つ以上を含むバイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、少なくとも３つの位置のうちの１つにおける捕捉プローブは、表３に列挙される正規化バイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、各捕捉プローブの特異性は、アレイのアドレス可能な位置により同定可能である。本明細書で提示される１または複数のアレイのほか、溶解緩衝液を含有する容器；一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含有する容器；複数の核酸プログラミングリンカーを含有する容器；複数のＮＰＰを含有する容器；複数の二官能性検出リンカーを含有する容器；二官能性検出リンカーに特異的に結合する検出プローブを含有する容器；および検出試薬を含有する容器のうちの１または複数も含むキットが提示される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
メラニン細胞含有試料を特徴付ける方法であって、
被験体から得られるメラニン細胞含有試料中の、
（ｉ）ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つ、ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの正規化バイオマーカー
についての発現レベルを決定し、これにより、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々および該少なくとも１つの正規化バイオマーカーについての生の発現値をもたらすステップと、
該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての該生の発現値を、該少なくとも１つの正規化バイオマーカーについての該生の発現値に対して正規化して、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての正規化された発現値をもたらすステップと、
該正規化された発現値を、回帰アルゴリズムまたは機械学習アルゴリズムにおいて使用して、出力値をもたらすステップと、
該出力値を、良性であるのか悪性であるのかがあらかじめ既知である複数のメラニン細胞含有試料中の、該少なくとも２つのバイオマーカーについての正規化された発現値から導出されたカットオフ値と比較するステップと、
該出力値が、該複数の既知の良性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を良性として特徴付けるか、または該出力値が、該複数の既知の悪性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を悪性として特徴付けるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記少なくとも１つの正規化バイオマーカーが、母斑試料と原発性黒色腫試料との間で発現の統計学的有意差を有さない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つの正規化バイオマーカーが、表３のバイオマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つ全てを含む、項目１から２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記メラニン細胞含有試料中の複数のバイオマーカーについての遺伝子発現値を測定するステップであって、該複数のバイオマーカーについての発現の範囲が、該試料のトランスクリプトームにおけるバイオマーカー発現の全範囲を表すステップと、
このような複数のバイオマーカーについての中心傾向発現値を計算するステップと、
必要に応じて、外れ値を棄却し、該外れ値発現値を伴わずに再計算された複数の中心傾向発現値を計算するステップと
該中心傾向発現値、または、必要に応じて、該再計算された複数の中心傾向発現値を使用して、該少なくとも２つのバイオマーカーの各々についての前記生の発現値を正規化するステップと
をさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
試料中の遺伝子発現を決定する方法であって、
被験体からメラニン細胞含有試料を得るステップと、
該試料中の、ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含む複数の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
該試料中の該複数の遺伝子の発現レベルの報告、または該試料の、該複数の遺伝子の該発現レベルに基づく、母斑または黒色腫としての特徴付けを提供するステップと
を含む方法。
（項目６）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、
Ｎ４ＲＡ１およびＢ４ＧＡＬＴ１、または
ＮＲ４Ａ１およびＳＯＣＳ３、または
ＮＲ４Ａ１、ＳＯＣＳ３、およびＢ４ＧＡＬＴ１、または
ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、およびＳＯＣＳ３
を含む、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表４のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含み、前記出力値が、ロジスティック回帰アルゴリズムによりもたらされた、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記アルゴリズムが、
出力値＝β０＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋・・・βｎＸｎ
［式中、Ｘｎは、前記少なくとも２つの（最大でｎの）表４のバイオマーカーについての発現値の対数であり、β０は、−２００を超え、かつ、２００未満であり、ｎ＞０に対する全てのβは、−１，０００を超え、かつ、１，０００未満である］
である、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表１１および１３のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含み、前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表１１のバイオマーカーのうちの少なくとも２つまたは表１３のバイオマーカーのうちの少なくとも２つを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、
Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＡＸ、ＭＡＧＥＡ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＩＡ４、ＰＲＡＭＥ、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、ＳＡＴ１、ＰＤＬＩＭ７、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＭＡＧＥＣ２、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＺＦＹＶＥ１６、およびＢＥＳＴ１のうちの少なくとも２つ、または
ＮＲ４Ａ１、ＳＯＣＳ３、ＰＲＡＭＥ、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＢＥＳＴ１、ＲＵＮＸ１、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＰＤＬＩＭ７、ＺＦＹＶＥ１６、ＨＩＦ１Ａ、およびＰＩＣＡＬＭのうちの少なくとも２つ
を含み、
前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、
項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも２つのバイオマーカーが、表４、表１１、表１３、または表４および表１１の両方の遺伝子のうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１３）
メラニン細胞含有試料における悪性度を決定する方法であって、
被験体から得られるメラニン細胞含有試料中の、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＡＸ、ＭＡＧＥＡ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＩＡ４、ＰＲＡＭＥ、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、ＳＡＴ１、ＰＤＬＩＭ７、ＢＩＲＣ５、ＭＥＴ、ＭＡＧＥＣ２、ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＺＦＹＶＥ１６、およびＢＥＳＴ１から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、
該少なくとも２つのバイオマーカーの該発現レベルを入力として使用するアルゴリズムからの出力を計算するステップと、
該アルゴリズムの出力から、該出力を既知の悪性メラニン細胞含有試料に由来する参照標準と比較することにより、該試料が悪性であるのか悪性でないのかを決定するステップと
を含む方法。
（項目１４）
前記少なくとも２つの選択されたバイオマーカーの前記発現レベルを、
（ａ）ＭＦＩ２、ＲＡＰ２Ｂ、ＢＭＰ１、および／もしくはＮＣＯＲ２のうちの少なくとも１つ、
（ｂ）ＭＦＩ２、ＮＣＯＲ２、ＲＡＰ２ｂ、およびＢＭＰ−１、
（ｃ）ＲＰＳ６ＫＢ２および／もしくはＳＤＨＡ、または
（ｄ）前記メラニン細胞含有試料中で発現した少なくとも１つの遺伝子であって、該少なくとも２つのバイオマーカーではなく、その発現が、代表的な複数のメラニン細胞含有試料において有意に異ならない遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１つの正規化バイオマーカーの該発現レベルに対して正規化するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
発現レベルを決定するステップが、核酸の発現を決定することを含む、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
核酸の発現を決定することが、前記試料を、複数の核酸プローブまたは対合増幅プライマー対と接触させることを含み、各プローブまたは対合プライマーは、該複数の核酸プローブまたは対合プライマーがその／それらの相補的な少なくとも２つのバイオマーカーとハイブリダイズすることを可能とする条件下で、前記少なくとも２つのバイオマーカーのうちの１つに対して特異的、かつ、相補的である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記試料を前記複数の核酸プローブと接触させた後で、該試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
少なくとも３つのアドレス可能な位置であって、各位置が、同じ特異性を有する固定化された捕捉プローブを含み、各位置が、各他の位置における捕捉プローブとは異なる特異性を有する捕捉プローブを含む位置
を含むアレイであって、
該少なくとも３つの位置のうちの２つにおける該捕捉プローブが、ＭＡＧＥＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＤＩＡ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＬＩＭ７、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＡＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＣＳ３、および表１３のバイオマーカーのうちの２つ以上を含むバイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、該少なくとも３つの位置のうちの１つにおける該捕捉プローブが、表３に列挙される正規化バイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、
各捕捉プローブの該特異性が、該アレイの該アドレス可能な位置により同定可能であるアレイ。
（項目１９）
前記少なくとも３つのアドレス可能な位置の各々が、個別に同定可能なビーズまたはフローセル内のチャネルである、項目１８に記載のアレイ。
（項目２０）
項目１８または１９に記載のアレイ、ならびに
溶解緩衝液を含有する容器；
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含有する容器；
複数の核酸プログラミングリンカーを含有する容器；
複数のＮＰＰを含有する容器；
複数の二官能性検出リンカーを含有する容器；
該二官能性検出リンカーに特異的に結合する検出プローブを含有する容器；および
検出試薬を含有する容器
のうちの１または複数
を含むキット。