(57)【要約】【課題】ウイルスの感染予防、ウイルス感染細胞の除去に寄与し、高い効果を発揮するウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を提供すること。【解決手段】ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤。該ウイルス性疾患は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、エプステインバールウイルス、ＲＳウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、コロナウイルス、アフトウイルス、水胞性口炎ウイルスなどである。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス感染の予防剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス感染細胞の除去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌株を有効成分として含有するウイルス疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸菌は、免疫賦活力などの生理学的機能の観点からプロバイオティックスとして注目されている。乳酸菌を利用した食品素材などがこれまでに数多く提案されており、また、乳酸菌をウイルス感染の予防または治療に用いる検討も行なわれている。これらにおいて検討されている乳酸菌の属は多岐に渡っている。
【０００３】
特許文献１には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株が腸管のＩｇＡ産生を増加させ、免疫賦活に機能することが記載されている。しかし、特許文献１においては、ウイルス疾患に対する作用は確認されていない。
特許文献２には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株がインフルエンザワクチンの効果を増強することが記載されている。しかし、特許文献２においては、ＡＹＡ株単独でのウイルス疾患に対する作用は確認されていない。
【０００４】
特許文献３には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムをウイルス感染の予防／治療に用い得ることが記載されており、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化、大腸菌の食作用は確認されている。しかし、特許文献３においては、実際のウイルス疾患に対する作用は確認されていない。
特許文献４には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株がＩＬ−１２産生を増加させ、免疫賦活に機能することが記載されている。しかし、特許文献４においては、ウイルス疾患に対する作用は確認されていない。
非特許文献１には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株がマウスのインフルエンザ感染試験で、生存率の向上、インターフェロン産生の増加を示すことが記載されている。しかし、さらに高い効果が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２０１７０８号公報
【特許文献２】特開２０１０−４７４８５号公報
【特許文献３】特表２００９−５１１４７０号公報
【特許文献４】特開平１０−１６７９７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ハウスウェルネスフーズ株式会社、ニュースリリース、２００９年１２月９日、インターネット〈URL:http://www.house-wf.co.jp/release/weblog/2009/12/hk_l-137.html〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ウイルスの感染予防、ウイルス感染細胞の除去に寄与し、高い効果を発揮するウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意検討した結果、様々な種類の乳酸菌の中でも、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株が、ウイルス疾患に対して特に高い効果を発揮することを知見し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス感染の予防剤を提供するものである。
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６）を有効成分として含有する、ウイルス感染細胞の除去剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤は、マウス脾臓細胞のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性を増加させ、細胞障害率を向上させた。このことから、本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を用いれば、ウイルスやウイルス感染細胞の除去を有効に行えることが期待できる。また、本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤は、実際に、致死率１００％のマウスのインフルエンザ感染試験で生存率を向上させ、生存動物の体重を感染前の９０％にまで回復させた。
以上から明らかな通り、本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤は、ウイルスの感染予防、ウイルス感染細胞の除去に寄与し、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療に高い効果を発揮するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例中のＮＫ活性試験における細胞傷害率を示すグラフである。
【図２−１】実施例中のインフルエンザ感染試験におけるコントロール群のマウスの体重測定結果を示すグラフである。
【図２−２】実施例中のインフルエンザ感染試験におけるテスト群のマウスの体重測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例中のインフルエンザ感染試験におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤が含有する乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２１１０６である。
【００１３】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株の菌学的性質を下記に示す。
ＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）を用いて、３０℃、１８時間培養したときの菌の形態（１）菌の形態  桿菌
（２）グラム染色  陽性
（３）運動性  なし
（４）胞子  なし
（５）カタラーゼ  なし
（６）通性嫌気性
（７）ブドウ糖の代謝  ５０％以上乳酸に転換する
（８）生育温度範囲  １５℃、３０℃および３５℃では生育を認めるが、４５℃では生育を認めない
（９）乳酸発酵  ホモ型
（１０）乳酸の旋光性  ＤＬ
（１１）炭水化物の発酵性  グリセロールは陽性、Ｄ-アラビノースは陰性、Ｌ-アラビノースは陽性、リボースは陽性、Ｄ-キシロースは陰性、ガラクトースは陽性、グルコースは陽性、フルクトースは陽性、マンノースは陽性、ラムノースは陽性、マンニトールは陽性、ソルビトールは陽性、αメチルＤグルコシドは陰性、アミグダリンは陽性、エスクリンは陽性、サリシンは陽性、セロビオースは陽性、マルトースは陽性、ラクトースは陽性、メリビオースは陽性、シュクロースは陽性、トレハロースは陽性、イヌリンは陰性、メレジトースは陽性、ラフィノースは陽性、スターチは陰性、グルコン酸は陽性。
【００１４】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、そのままあるいは必要に応じて薬学的に許容される種々の担体、賦形剤、その他の添加剤、その他の成分を配合して製剤化することによって、本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤とすることができる。また、本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤は、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を用いて発酵させた種々の動植物性物質をベースとしてもよい。
【００１５】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、食経験が豊富な素材（パン酵母）から分離したものであるため、安全に利用することができる。したがって、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株をそのまま、食品や飼料の形態の本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤として利用することができ、或いは、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を有効成分として含有する本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を通常の飲食品や飼料に含有させて利用することもできる。
【００１６】
本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤において、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株の含有量は、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療に有効な量であればいかなる量であってもよく、使用形態、剤形、投与又は摂取する者の症状や年齢性別などによって適宜変化させることができる。本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤を経口投与又は摂取させる場合には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株としての１人１日当たりの投与量又は摂取量が１ｍｇ〜２０ｇとなるように含有させることが好ましい。また、食品として摂取する場合には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株としての１人１日当たりの摂取量は５ｍｇ〜５ｇであることが好ましく、飼料として動物に投与する場合には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株として体重ｇ当たり１日０．１ｍｇ〜５００ｍｇの摂取量となるように含有させることが好ましい。
【００１７】
本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、エプステインバールウイルス、ＲＳウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、コロナウイルス、アフトウイルス、水胞性口炎ウイルスなどの空気感染性又は飛沫感染性のウイルス性疾患に対して効果を発揮し、特にインフルエンザに対して高い効果が認められる。
【００１８】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、ウイルス感染の予防機能及び／又はウイルス感染細胞の除去機能を発揮する。ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株を有効成分として含有する本発明のウイルス感染の予防剤及び本発明のウイルス感染細胞の除去剤について、特に説明しなかった点については、上述の本発明のウイルス性疾患の予防及び／又は治療剤についての説明を適宜適用することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００２０】
〔実施例１〕
（１）ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株粉末の製造方法
ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０６）を、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含むＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ）培地を用いて３７℃で４８時間培養した。その後、遠心分離によって集菌し、滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水に懸濁し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、これを乾燥してラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株粉末試料を得た。
【００２１】
（２）ＮＫ活性試験
マウスＢＡＬＢ／ｃ（雌、６週齢、ＳＬＣ社）６匹を購入し、１週間の馴化後に解剖し、脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ含有）に懸濁することにより脾臓細胞懸濁液（２×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１５ｍｌ調製した。そこに、マウスインターロイキン２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を２ｎＭになるように添加して３７℃にて５％ＣＯ2条件下で５日間培養し、脾臓細胞中のＮＫ細胞を活性化させた。これをエフェクター細胞とした。また、ターゲット細胞としては、マウス由来Ｙａｃ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＮＯ：ＴＩＢ１６０（登録商標））を使用した。
細胞障害性を評価するために、細胞から放出されたラクトースデヒドロゲナーゼ（以下ＬＤＨ）を定量するキットであるＣｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。
【００２２】
エフェクター細胞としての脾臓細胞と、ターゲット細胞としてのＹａｃ−１細胞を、９６穴マイクロプレート（丸底）を用いて３７℃、５％ＣＯ2条件下で４時間培養した。その際、コントロールでは、脾臓細胞とＹａｃ−１細胞とを培養し、テストでは、脾臓細胞とＹａｃ−１細胞に、上記（１）で調製したラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株粉末試料を加えて共培養した。
尚、細胞数は、脾臓細胞は５×１０6個／ｗｅｌｌとし、Ｙａｃ−１細胞は５×１０3個／ｗｅｌｌとした。ＡＹＡ株粉末試料は５０μｇ／ｗｅｌｌとした。また、１ウェルあたり１００マイクロリットルの系として培養を実施した。
【００２３】
培養後に遠心（２５０ｇで４分間）してから上清を実験試料として５０μｌ採取し、それにＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｍｉｘ（上記キットの付属品）を５０μｌ加え、遮光し室温で３０分間インキュベートした。そして、５０μｌのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上記キットの付属品）を加え、４９０ｎｍの吸光度を測定し、実験試料のＬＤＨ量を求めた。実験試料のＬＤＨ量の結果を下記の式に入力して、細胞障害率を算出した。
【００２４】
【数１】
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【００２５】
尚、上記の式における各項目は、以下の通りである。
実験試料：コントロールの場合は脾臓細胞とＹａｃ−１細胞を培養した後の上清中のＬＤＨ量、テストの場合は脾臓細胞とＹａｃ−１細胞をラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株粉末試料と共培養した後の上清中のＬＤＨ量
Effector Spontaneous：脾臓細胞を単独で培養した際の上清中のＬＤＨ量
Target Spontaneous：Ｙａｃ−１細胞を単独で培養した際の上清中のＬＤＨ量
Target Maximum：Ｙａｃ−１細胞を融解処理し上清中に放出させたときに存在するＬＤＨ量
【００２６】
細胞障害率を示すグラフを図１に示す。図１から明らかなように、ターゲット細胞と脾臓細胞の共培養下における、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株によるＮＫ活性上昇による細胞障害効果が１％の有意水準で確認された。
【００２７】
（３）インフルエンザ感染試験
マウスＢＡＬＢ／ｃ（雌、６週齢、ＳＬＣ社）２０匹を購入し、１群１０匹の２群（コントロール群及びテスト群）に分けた。１週間の馴化後に餌を各群４週間自由摂取させた。コントロール群の餌は、市販の飼料（商品名ＡＩＮ９３Ｇ、オリエンタル酵母工業）とし、テスト群の餌は、コントロール群と同じ市販の飼料に、上記（１）で製造したラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株粉末試料を５質量％添加したものとした。
４週間の摂取終了後、ＰＢＳで８．３％に希釈したソムノペンチルを２００μｌ／匹注射し、麻酔が効いてからインフルエンザウイルスＸ−３１株を２．５×１０5×ＴＣＩＤ50／匹になるように経鼻投与した。感染当日から感染１０日後まで１日１回全マウスの体重を測定し、生存率を求めた。尚、本試験においては、インフルエンザウイルス感染による急激な体重減少を伴うため、人道的エンドポイントとして「Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook 2nd Edition 2002」を参考に２０％の体重減少を設定した。
【００２８】
コントロール群およびテスト群の体重の測定結果（単位：ｇ）を表１−１及び１−２にそれぞれ示す。表１−１及び１−２に示した結果を、感染時体重に対する比（感染時体重を１００とした相対値）に換算した結果を表２−１及び２−２にそれぞれ示す。また、表２−１及び２−２に示した結果を図２−１及び２−２にグラフとしてそれぞれ示す。さらに、表２−１及び２−２に示した結果から求めた生存率を図３に示す。
【００２９】
【表１−１】
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【００３０】
【表１−２】
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【００３１】
【表２−１】
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【００３２】
【表２−２】
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【００３３】
図３から明らかな通り、ＡＹＡ株摂取により、生存率が１％水準で有意に上昇することが確認された。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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