【手続補正書】
【提出日】平成28年5月20日(2016.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに存在すると疑われる腸出血性大腸菌(EHEC)の血清型を同定する方法であって、前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAにおいて、以下の大腸菌CRISPR配列：
ａ)− 配列番号１、配列番号２及び配列番号３のCRISPR配列であり、その１以上の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列；及び/又は
− 配列番号４のCRISPR配列であり、その存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す配列
から選択される、EHEC O157:[H7]同定用CRISPR配列；
ｂ) 配列番号５の配列であり、その存在がEHEC O145:[H28]の存在を示すEHEC O145:[H28]同定用CRISPR配列；及び
ｃ) 配列番号６の配列であり、その存在がEHEC O111:[H8]の存在を示すEHEC O111:[H8]同定用CRISPR配列；及び
ｄ) 配列番号７の配列であり、その存在がEHEC O121:[H19]の存在を示すEHEC O121:[H19]同定用CRISPR配列；及び
ｅ) 配列番号８の配列であり、その存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示すEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]同定用CRISPR配列；及び
ｆ) 配列番号９の配列であり、その存在がEHEC O104:[H4]の存在を示すEHEC O104:[H4]同定用CRISPR配列；及び
ｇ) 配列番号10の配列であり、その存在がEHEC O26:[H11]の存在を示すEHEC O26:[H11]同定用CRISPR配列
の存否を検出することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、前記CRISPR配列を標的するプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行うことを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーの組合せが
ａ)− 以下の配列：
GGGAACACAAACCGAAACACA(配列番号11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号12)
で規定される、配列番号１及び配列番号２の両方のCRISPR配列を標的するプライマーセット、及び
− 以下の配列：
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(配列番号13)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(配列番号14)
で規定される、配列番号３のCRISPR配列を標的するプライマーセット；及び/又は
− 以下の配列：
GAACACAAACCGAAACACACG(配列番号15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(配列番号16)
で規定される、配列番号４のCRISPR配列を標的するプライマーセット
からなり、前二者のプライマーセットの少なくとも一方の増幅産物の存在及び/又は後者のプライマーセットの増幅産物の存在がEHEC O157:[H7]の存在を示す、EHEC O157:[H7]検出用プライマー；及び
ｂ) 以下の配列：
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(配列番号17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(配列番号18)
で規定される、配列番号５のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O145:[H28]の存在を示す、EHEC O145:[H28]検出用プライマー；及び
ｃ) 以下の配列：
GTGACCGCCTGTACACGC(配列番号19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC(配列番号20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(配列番号21)
で規定される、配列番号６のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、配列番号19及び配列番号20又は配列番号19及び配列番号21の少なくとも一方のプライマー対の増幅産物の存在がEHEC O111:[H8]の存在を示す、EHEC O111:[H8]検出用プライマー；
ｄ) 以下の配列：
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(配列番号22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG(配列番号23)
で規定される、配列番号７のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O121:[H19]の存在を示す、EHEC O121:[H19]検出用プライマー；
ｅ) 以下の配列：
GAGTCTATCAGCGACACTACC(配列番号24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC(配列番号25)
で規定される、配列番号８のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]の存在を示す、EHEC O103:[H2]及び/又はEHEC O45:[H2]検出用プライマー；及び
ｆ) 以下の配列：
GGAACTCACCGAGCGCCG(配列番号26)
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(配列番号27)
で規定される、配列番号９のCRISPR配列を標的するプライマーセットからなり、その増幅産物の存在がEHEC O104:[H4]の存在を示す、EHEC O104:[H4]検出用プライマー；及び
ｇ) 以下の配列：
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(配列番号28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA(配列番号29)
で規定される第１のプライマーセットと、以下の配列：
TGAAACCACTCGCGGCAGAT(配列番号30)
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(配列番号31)
で規定される第２のプライマーセットとの、配列番号10のCRISPR配列を標的する２つのプライマーセットからなり、それらの少なくとも一方の増幅産物の存在がEHEC O26:[H11]の存在を示す、EHEC O26:[H11]検出用プライマー
を含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
espK遺伝子の検出と、以下の標的遺伝子：espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の１以上の検出とを含んでなる、サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]及びO104:[H4]血清型の少なくとも１つのEHECを含有するかどうかを予測する方法。
【請求項５】
espK遺伝子の検出と、espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156から選択される少なくとも１つの遺伝子の検出と、Z6065遺伝子の検出とを含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、espKに由来するプライマーセットとespV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156及びZ6065の少なくとも１つに由来するプライマーセットとを含んでなるプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行い、各プライマーセットの増幅産物の存否を検出することを含んでなる請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル又は該サンプルから単離したDNAについて、stx1に由来するプライマーセット及びstx2に由来するプライマーセットを含んでなるプライマーの組合せを用いてPCRアッセイを行い、各プライマーセットの増幅産物の存否を検出することを更に含んでなる請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルがEHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]及びO104:[H4]の少なくとも１つの血清型の腸出血性大腸菌(EHEC)を含有するかどうかを予測する前工程を含んでなり、該前工程が請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法により行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項３に規定するプライマーセットを含み、任意に該プライマーセットの各々の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい、腸出血性大腸菌(EHEC)の血清型の同定キット。
【請求項１０】
espKに由来するプライマーセットと、以下：espVに由来するプライマーセット、ureDに由来するプライマーセット、Z2098に由来するプライマーセット、Z1151に由来するプライマーセット、Z1153に由来するプライマーセット、Z1154に由来するプライマーセット、Z1155に由来するプライマーセット、Z1156に由来するプライマーセット、Z6065に由来するプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットとを更に含んでなり、任意に該プライマーセットの各々の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
stx1及びstx2を標的するプライマーセットを更に含んでなり、任意にstx1の増幅産物を検出するプローブとstx2の増幅産物を検出するプローブを含んでもよい請求項９又は１０に記載のキット。