【手続補正書】
【提出日】平成28年3月14日(2016.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリーから非所望の核酸配列を排除するまたは低下させるための方法であって：
ａ．核酸ライブラリー中のＤＮＡ断片における非所望の核酸配列に対して配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブをアニールするステップであって、アダプターが前記ＤＮＡ断片の各末端に付加され、それによって、部分的な二重鎖ＤＮＡ断片を産生するステップ；
ｂ．前記部分的な二重鎖を有する前記ＤＮＡ断片をヌクレアーゼで処理して、それによって、前記ＤＮＡ断片を切断するステップ；および
ｃ．前記核酸ライブラリー中に所望の核酸配列を含むＤＮＡ断片に付加された前記アダプター配列にアニールするプライマーのセットによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行し、それによって、前記核酸ライブラリー中に所望の核酸配列を含む増幅されたＤＮＡ断片を生成するステップ；
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、前記二本鎖ＤＮＡの破壊を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前記核酸ライブラリーを構築するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）の前記核酸ライブラリーが、偏りがない核酸鋳型集団を保持しながら、対象のサンプルから構築される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の前記ＤＮＡ断片が、ｃＤＮＡ断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の前記核酸ライブラリーを構築するステップが、ＲＮＡサンプル中のＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡ断片の第一のｃＤＮＡ鎖を形成するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡサンプルが、生物学的な供給源からの全ＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的な供給源がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡサンプルを精製するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡサンプルが、２０ｎｇ未満の核酸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡを逆転写するステップが、ランダムプライマーを前記ＲＮＡに対してアニールするステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ランダムプライマーが、ランダムヘキサマーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のｃＤＮＡ鎖の３’末端を末端トランスフェラーゼにより伸長させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
第二の鎖のｃＤＮＡ合成を行って、前記ｃＤＮＡ断片の第二の鎖を形成するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記非所望の配列が、ｒＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記非所望の配列が、ミトコンドリア配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ミトコンドリア配列が、ミトコンドリアＲＮＡ配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミトコンドリアＲＮＡ配列が、ミトコンドリアｒＲＮＡ配列である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列特異的なオリゴヌクレオチドが、前記非所望の核酸配列に相補的であるように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ断片に付加された前記アダプター配列が、バーコードを含む所望の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸ライブラリー中に所望の核酸配列を含む増幅されたＤＮＡ断片をシークエンシングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記シークエンシングが、超並列シークエンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記超並列シークエンシングが、ペアエンドシークエンシングを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーのセットが、バーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）において生成された前記核酸ライブラリーが、方向性をもつｃＤＮＡライブラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前に、ステップ（ａ）における前記核酸ライブラリー中の前記ＤＮＡ断片を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）の前記増幅された産物を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の新規な特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特色および利点についてのよりよい理解は、本発明の本質が利用されている、例証となる実施形態について記載する以下の説明および添付の図面に対する参照によって得られるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸ライブラリーから特異的な非所望の核酸配列を排除するまたは低下させるための方法であって、
ａ．それぞれのＤＮＡ断片のそれぞれの末端に対して付加された方向が固定されたアダプターを有する一本鎖ＤＮＡ断片を含む核酸ライブラリーを生成するステップ、
ｂ．それぞれの末端に付加された方向が固定されたアダプターを有する前記一本鎖ＤＮＡ断片に対して配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブをアニールするステップであって、前記配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、前記非所望の核酸配列に対して相補的となるように設計され、２つの前記アダプターの少なくとも１つが、二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む、ステップ、
ｃ．ＤＮＡポリメラーゼにより前記配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブを伸長させ、それによって、前記非所望の核酸配列の少なくとも１つの一部分を含む二本鎖ＤＮＡ断片を作るステップ、
ｄ．二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼにより、二本鎖および一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ断片の集団を処理し、それによって、制限エンドヌクレアーゼ部位で二本鎖ＤＮＡ断片を切断するステップ、ならびに
ｅ．前記アダプターの配列に対して特異的なプライマーのセットによりＰＣＲを実行し、それによって、所望の核酸配列を含む前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ
を含む、方法。
（項目２）
増幅された産物をシークエンシングする追加のステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸ライブラリーが、ソートされた細胞の集団に由来する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記核酸ライブラリーが、単一細胞に由来する、項目３に記載の方法。
（項目５）
マルチウェルプレート、マイクロアレイ、マイクロ流体デバイス、またはスライドの中に細胞をソートし、それによって、ソートされた細胞の前記集団を生成するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記ソートするステップが、細胞表面マーカーに従って実行される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ソートするステップが、前記細胞の光学的特性に従って実行される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ソートするステップが、細胞サイズに従って実行される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記非所望の核酸配列が、細菌リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ヒトグロビンｍＲＮＡ、ヒト細胞質内ｒＲＮＡ、ヒトミトコンドリアｒＲＮＡ、ブドウ細胞質内ｒＲＮＡ、ブドウミトコンドリアｒＲＮＡ、またはブドウ葉緑体ｒＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ステップｄ．の制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｐＱＩである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＭｙＴａｑポリメラーゼである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ステップａ．が、以下のステップ：
ｉ．ＲＮＡサンプルを逆転写するステップ、
ｉｉ．逆転写された前記ＲＮＡサンプルから二本鎖ｃＤＮＡを生成するステップであって、４つのｄＮＴＰ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰのうちの少なくとも１つが、第２の鎖の合成の間に非標準ｄＮＴＰと交換され、そして前記第２の鎖の中に組み込まれる、ステップ、
ｉｉｉ．前記二本鎖ｃＤＮＡ上で末端修復を実行するステップ、
ｉｖ．前記二本鎖ｃＤＮＡの５’末端に対してアダプターをライゲーションするステップであって、前記アダプター鎖のうちの１つが、前記アダプターのライゲーション鎖の中に組み込まれる前記非標準ヌクレオチドを有する、ステップ、
ｖ．ギャップ修復を実行するステップ、および
ｖｉ．切断剤によって前記第２の鎖を選択的に除去するステップ
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記非標準ヌクレオチドが、ウリジンまたはイノシンを含む、項目５に記載の方法。
（項目１５）
ステップｖｉが、１つ以上の前記非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２３）
核酸のプールに対するアダプターライゲーションの方法であって、
ａ．５’リン酸を含む第１の核酸鎖、５’リン酸および１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む第２の核酸鎖を含む核酸を、５’リン酸を欠く第１のアダプター鎖ならびに５’リン酸および１つ以上の非標準ヌクレオチドを欠く第２のアダプター鎖を含む、少なくとも１つの第１のアダプターとライゲーションするステップ、
ｂ．３’伸長反応を実行するステップ、ならびに
ｃ．１つ以上の切断試薬を含む作用物質により切断反応を実行し、それによって、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む少なくとも１つの核酸鎖を切断するステップであって、前記１つ以上の切断剤のうちの１つが、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む核酸鎖に対して特異的である、ステップ
を含む方法。
（項目２４）
前記核酸を、５’リン酸を欠く第３のアダプター鎖ならびに５’リン酸および１つ以上の非標準ヌクレオチドを欠く第４のアダプター鎖を含む第２のアダプターとライゲーションするステップをさらに含み、前記第１のアダプターおよび前記第２のアダプターが、異なる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記核酸が、それぞれの末端で第１のアダプターまたは第２のアダプターとライゲーションされる、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記非標準ヌクレオチドが、ウラシルおよびイノシンから選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
ステップｃが、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成することを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記１つ以上の切断試薬が、グリコシラーゼを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記１つ以上の切断試薬が、第一級アミンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記１つ以上の切断試薬が、ポリアミンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目３２）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記１つ以上の切断試薬が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
前記１つ以上の切断試薬が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目２３に記載の方法。
（項目３５）
第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む増幅反応を実行するステップをさらに含み、前記第１のプライマーが、前記第１のアダプター鎖に対してハイブリダイズすることができ、そして前記第２のプライマーが、前記第４のアダプター鎖に対してハイブリダイズすることができ、それによって増幅産物を生成する、項目２４に記載の方法。
（項目３６）
前記第１のアダプターは、二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む、項目２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ｄ．前記第１の核酸鎖上の配列に対してプローブをハイブリダイズするステップ、
ｅ．ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブを伸長させ、それによって、部分的な二重鎖核酸を産生するステップ、および
ｆ．二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼにより前記部分的な二重鎖核酸を処理し、それによって、前記認識配列で二本鎖ＤＮＡ断片を切断するステップ
をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記アダプターの配列に対して特異的なプライマーのセットによりＰＣＲを実行し、それによって、核酸の前記プールにおいて少なくとも１つの第２の核酸を増幅するステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記第２の核酸が、ステップｄにおける配列を欠く、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記第２の核酸の一部分をシークエンシングするステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記核酸が、以下：
ｉ．ＲＮＡ上で第１の鎖の合成を実行し、それによって、第１の鎖の合成産物を形成し、そして
ｉｉ．非標準ヌクレオチドの存在下において前記第１の鎖上で第２の鎖の合成を実行し、それによって、第２の鎖の合成産物を形成すること
によって生成される、項目２３に記載の方法。
（項目４２）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップが、ＲＮアーゼＨによる処理を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ｉｉｉ．前記第１の鎖の合成産物および前記第２の鎖の合成産物を断片化し、それによって、断片化された第１の鎖の合成産物および第２の鎖の合成産物を生成するステップ、
ｉｖ．末端修復を実行するステップ、ならびに
ｖ．５’リン酸化を実行するステップ
をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
核酸の前記プールが、ソートされた細胞の集団に由来する、項目２３に記載の方法。
（項目４６）
核酸の前記プールが、単一細胞に由来する、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
マルチウェルプレート、マイクロアレイ、マイクロ流体デバイス、またはスライドの中に細胞をソートし、それによって、ソートされた細胞の前記集団を生成するステップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ソートするステップが、細胞表面マーカーに従って実行される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ソートするステップが、前記細胞の光学的特性に従って実行される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ソートするステップが、細胞サイズに従って実行される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
核酸の前記プールが、細菌リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ヒトグロビンｍＲＮＡ、ヒト細胞質内ｒＲＮＡ、ヒトミトコンドリアｒＲＮＡ、ブドウ細胞質内ｒＲＮＡ、ブドウミトコンドリアｒＲＮＡ、またはブドウ葉緑体ｒＲＮＡを含む、項目２３に記載の方法。
（項目５２）
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｐＱＩである、項目３６に記載の方法。
（項目５３）
前記３’伸長反応が、ホットスタートポリメラーゼを使用して実行される、項目２３に記載の方法。
（項目５４）
前記３’伸長反応が、ＭｙＴａｑポリメラーゼを使用して実行される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
所望の核酸および望まれない核酸を含む核酸の鎖保持ライブラリーを作るためのアダプターライゲーションの方法であって、
ａ．１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む望まれない核酸および１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む所望の核酸を含む鋳型のプールを、それぞれ３’オーバーハングを含む複数の部分的二重鎖プライマーと混合するステップ、
ｂ．前記複数の部分的二重鎖プライマーを前記鋳型に対してアニールするステップ、
ｃ．前記鋳型に沿ってプライマー伸長反応を実行し、それによって、それぞれプライマー伸長産物を含む二本鎖核酸を形成するステップ、
ｄ．前記プライマー伸長産物の少なくとも１つの５’末端に対してアダプターをライゲーションするステップ、ならびに
ｅ．前記１つ以上のヌクレオチドを含む核酸に対して特異的な切断剤により前記二本鎖核酸から前記鋳型を切断するステップ
を含む、方法。
（項目５６）
前記複数の部分的二重鎖プライマーが、相違する３’オーバーハング配列を有する少なくとも２つの部分的二重鎖プライマーを含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記複数の部分的二重鎖プライマーが、二本鎖部分内に共有配列を含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記アダプターに沿ってプライマー伸長反応を実行することを含むステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
ステップｅが、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成することを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６１）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６３）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６４）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６６）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６７）
前記１つ以上の非標準ヌクレオチドが、ウラシルまたはイノシンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６８）
前記１つ以上の非標準ヌクレオチドが、ウラシルおよびイノシンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目６９）
鋳型の前記プールが、
ｉ．前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの存在下においてＲＮＡ上で第１の鎖合成を実行し、それによって、第１の鎖の合成産物を形成し、そして
ｉｉ．断片化反応を実行すること
によって生成される、項目５５に記載の方法。
（項目７０）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップをさらに含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップが、ＲＮアーゼＨによる処理を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記断片化反応が、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドを標的にする切断剤を利用することを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
断片化反応が、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成するステップを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目７２に記載の方法。
（項目８０）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目７２に記載の方法。
（項目８１）
前記アダプターが、二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む、項目５５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
ｆ．前記プライマー伸長産物の配列に対してプローブをハイブリダイズするステップ、
ｇ．ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブを伸長させ、それによって、部分的な二重鎖核酸を産生するステップ、
ｈ．二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼにより前記部分的な二重鎖核酸を処理し、それによって、前記認識配列で二本鎖ＤＮＡ断片を切断するステップ
をさらに含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記アダプターに対して逆相補的な配列に対してハイブリダイズすることができるプライマーによりＰＣＲを実行し、それによって、鋳型の前記プールにおいて所望の核酸を増幅するステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記所望の核酸の一部分をシークエンシングするステップをさらに含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
鋳型の前記プールが、ソートされた細胞の集団に由来する、項目５５に記載の方法。
（項目８６）
鋳型の前記プールが、単一細胞に由来する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
マルチウェルプレート、マイクロアレイ、マイクロ流体デバイス、またはスライドの中に細胞をソートし、それによって、ソートされた細胞の前記集団を生成するステップをさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記ソートするステップが、細胞表面マーカーに従って実行される、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記ソートするステップが、前記細胞の光学的特性に従って実行される、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
前記ソートするステップが、細胞サイズに従って実行される、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
鋳型の前記プールが、細菌リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ヒトグロビンｍＲＮＡ、ヒト細胞質内ｒＲＮＡ、ヒトミトコンドリアｒＲＮＡ、ブドウ細胞質内ｒＲＮＡ、ブドウミトコンドリアｒＲＮＡ、またはブドウ葉緑体ｒＲＮＡを含む、項目５５に記載の方法。
（項目９２）
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｐＱＩである、項目８１に記載の方法。
（項目９３）
前記プライマー伸長反応が、ホットスタートポリメラーゼを使用して実行される、項目５５に記載の方法。
（項目９４）
前記プライマー伸長反応が、ＭｙＴａｑポリメラーゼを使用して実行される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
所望の核酸および望まれない核酸を有する核酸の鎖保持ライブラリーを作るためのアダプターライゲーションの方法であって、
ａ．望まれない核酸および所望の核酸を含む鋳型のプールを、それぞれ３’オーバーハングを含む複数の部分的二重鎖プライマーと混合するステップ、
ｂ．前記複数の部分的二重鎖プライマーを前記鋳型に対してアニールするステップ、
ｃ．前記鋳型に沿ってプライマー伸長反応を実行し、それによって、それぞれプライマー伸長産物を含む二本鎖核酸を形成するステップ、
ｄ．前記プライマー伸長産物の少なくとも１つの５’末端に対してアダプターをライゲーションするステップ、ならびに
ｅ．前記１つ以上のヌクレオチドを含む核酸に対して特異的な切断剤により前記二本鎖核酸から前記プライマー伸長産物を切断するステップ
を含む、方法。
（項目９６）
前記複数の部分的二重鎖プライマーが、相違する３’オーバーハング配列を有する少なくとも２つの部分的二重鎖プライマーを含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記複数の部分的二重鎖プライマーが、二本鎖部分内に共有配列を含む、項目９５または９６に記載の方法。
（項目９８）
前記３’オーバーハングを有する前記複数の部分的二重鎖プライマーの鎖が、前記二本鎖部分内の前記共有配列においてアデニンを欠く、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記アダプターに沿ってプライマー伸長反応を実行することを含むステップをさらに含む、項目９５に記載の方法。
（項目１００）
前記プライマー伸長反応が、１つ以上の非標準ヌクレオチドの存在下において実行される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
ステップｅが、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成することを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０２）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０３）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０５）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０６）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０８）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１０９）
前記１つ以上の非標準ヌクレオチドが、ウラシルまたはイノシンを含む、項目９５または１００に記載の方法。
（項目１１０）
鋳型の前記プールが、以下：
ｉ．前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの存在下においてＲＮＡ上で第１の鎖合成を実行し、それによって、第１の鎖の合成産物を形成し、そして
ｉｉ．断片化反応を実行すること
によって生成される、項目９５に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップをさらに含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記ＲＮＡを選択的に切断するステップが、ＲＮアーゼＨによる処理を含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記断片化反応が、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドを標的にする切断剤を利用することを含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１４）
前記断片化反応が、前記１つ以上の非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断し、それによって、塩基脱落部位を形成するステップを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１８）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１９）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１２１）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１２２）
前記アダプターが、二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む、項目９５〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
ｆ．前記望まれない核酸の配列に対してプローブをハイブリダイズするステップ、
ｇ．ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブを伸長させ、それによって、部分的な二重鎖核酸を産生するステップ、
ｈ．二本鎖ＤＮＡに対して特異的な制限エンドヌクレアーゼにより前記部分的な二重鎖核酸を処理し、それによって、前記認識配列で二本鎖ＤＮＡ断片を切断するステップ
をさらに含む、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記アダプターに対して逆相補的な配列および前記３’オーバーハングと対向する前記部分的二重鎖プライマーの前記共有配列に対してハイブリダイズすることができるプライマーのセットによりＰＣＲを実行し、それによって、鋳型の前記プールにおいて所望の核酸を増幅するステップをさらに含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記所望の核酸の一部分をシークエンシングするステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
鋳型の前記プールが、ソートされた細胞の集団に由来する、項目９５に記載の方法。
（項目１２７）
鋳型の前記プールが、単一細胞に由来する、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
マルチウェルプレート、マイクロアレイ、マイクロ流体デバイス、またはスライドの中に細胞をソートし、それによって、ソートされた細胞の前記集団を生成するステップをさらに含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２９）
前記ソートするステップが、細胞表面マーカーに従って実行される、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記ソートするステップが、前記細胞の光学的特性に従って実行される、項目１２８に記載の方法。
（項目１３１）
前記ソートするステップが、細胞サイズに従って実行される、項目１２８に記載の方法。
（項目１３２）
鋳型の前記プールが、細菌リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ヒトグロビンｍＲＮＡ、ヒト細胞質内ｒＲＮＡ、ヒトミトコンドリアｒＲＮＡ、ブドウ細胞質内ｒＲＮＡ、ブドウミトコンドリアｒＲＮＡ、またはブドウ葉緑体ｒＲＮＡを含む、項目９５に記載の方法。
（項目１３３）
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｐＱＩである、項目１２２に記載の方法。
（項目１３４）
前記プライマー伸長反応が、ホットスタートポリメラーゼを使用して実行される、項目９５に記載の方法。
（項目１３５）
前記プライマー伸長反応が、ＭｙＴａｑポリメラーゼを使用して実行される、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
ａ．制限エンドヌクレアーゼ、
ｂ．一方の鎖上に１つ以上の非標準ヌクレオチドを含み、５’リン酸を欠く第１のアダプター、
ｃ．前記１つ以上の非標準ヌクレオチドを欠き、５’リン酸を欠く第２のアダプター、
ｄ．リガーゼ、
ｅ．ポリメラーゼ、
ｆ．切断剤、
ｇ．プローブのライブラリー、および
ｈ．前記アダプターの配列に対して特異的なプライマーのセット
を含むキットであって、前記第２のアダプターが、前記制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む、キット。
（項目１３７）
ａ．制限エンドヌクレアーゼ、
ｂ．５’リン酸を欠く第１のアダプター、
ｃ．それぞれ３’オーバーハングを含み、かつ二本鎖部分内に共有配列を含む、複数の部分的二重鎖プライマー、
ｄ．リガーゼ、
ｅ．ポリメラーゼ、
ｆ．切断剤、
ｇ．プライマー伸長反応のためにプライマーとして作用することができるプローブのライブラリー、および
ｈ．前記アダプターに対して逆相補的な配列にハイブリダイズすることができるプライマー
を含むキットであって、前記第１のアダプターが、前記制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含み、前記複数の部分的二重鎖プライマーが、相違する３’オーバーハング配列を有する少なくとも２つの部分的二重鎖プライマーを含む、キット。
（項目１３８）
ａ．制限エンドヌクレアーゼ、
ｂ．５’リン酸を欠く第１のアダプター、
ｃ．複数の部分的二重鎖プライマーであって、それぞれ３’オーバーハングを含み、二本鎖部分内に共有配列を含み、かつ前記３’オーバーハングを有する前記複数の部分的二重鎖プライマーの鎖が前記二本鎖部分内の前記共有配列においてアデニンを欠く、複数の部分的二重鎖プライマー、
ｄ．リガーゼ、
ｅ．ポリメラーゼ、
ｆ．切断剤、
ｇ．プライマー伸長反応のためにプライマーとして作用することができるプローブのライブラリー、および
ｈ．前記アダプターに対して逆相補的な配列および前記３’オーバーハングと対向する前記部分的二重鎖プライマーの前記共有配列に対してハイブリダイズすることができるプライマーのセット
を含むキットであって、前記第１のアダプターが、前記制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含み、前記複数の部分的二重鎖プライマーが、相違する３’オーバーハング配列を有する少なくとも２つの部分的二重鎖プライマーを含む、キット。
（項目１３９）
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｐＱＩである、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４０）
前記ポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼである、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４１）
前記ポリメラーゼが、ＭｙＴａｑである、項目１４０に記載のキット。
（項目１４２）
１つ以上の非標準ヌクレオチドをさらに含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４３）
前記１つ以上の非標準ヌクレオチドが、ウラシルまたはイノシンを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４４）
前記切断剤が、グリコシラーゼを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４５）
前記グリコシラーゼが、ＵＮＧまたはＵＤＧである、項目１４４に記載のキット。
（項目１４６）
前記切断剤が、第一級アミンを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４７）
前記切断剤が、ポリアミンを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１４８）
前記ポリアミンが、ＤＭＥＤである、項目１４７に記載のキット。
（項目１４９）
前記切断剤が、グリコシラーゼおよびポリアミンを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１５０）
前記切断剤が、エンドヌクレアーゼＶを含む、項目１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【図１】図１は、ｉｎｓｅｒｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄａｐｔｏｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ（ＩｎＤＡ−Ｃ）を使用する、一本鎖ＤＮＡ断片の核酸ライブラリーからの非所望の核酸配列の排除を示す図である。遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）は、その相補的配列のみに対してアニールし、ポリメラーゼベースの伸長の後に二本鎖または部分的二本鎖分子の集団を作る。アダプター特異的制限エンドヌクレアーゼによる続く処理は、ＧＳＰ伸長反応によって活性化された断片のみを切断し、それによって、非所望の断片からＰＣＲプライミング部位のうちの１つを除去する。ＰＣＲ増幅は、関心のある核酸配列について濃縮されるライブラリーを生成する。
【図２】図２は、実施例１において概説されるように、鎖特異的全トランスクリプトームｃＤＮＡライブラリーから細菌ｒＲＮＡ断片を排除する実験からの結果の概要を示す図である。
【図３】図３は、実施例１において記載される４つの試験ライブラリーからの発現プロファイルの比較を示す図である。
【図４】図４は、実施例１における汎用原核生物ＩｎＤＡ−Ｃプローブによる１６Ｓ  ｒＲＮＡ部位の標的排除を示す図である。
【図５Ａ】図５は、方向性をもつライブラリー構築の方法を示す図である。
【図５Ｂ】図５は、方向性をもつライブラリー構築の方法を示す図である。
【図６】図６は、二重ｃＤＮＡ加水分解を含む、ＩｎＤＡ−Ｃプローブを使用する、核酸排除の方法を示す図である。
【図７Ａ】図７は、ＩｎＤＡ−Ｃプローブを使用する、核酸排除の他の方法を示す図である。
【図７Ｂ】図７は、ＩｎＤＡ−Ｃプローブを使用する、核酸排除の他の方法を示す図である。
【図８】図８は、２つの部分的二重鎖プライマーについての設計を示す図である。
【図９】図９は、汎用原核生物ＩｎＤＡ−Ｃプローブによる望まれない核酸についての方法を示す図である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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