【手続補正書】
【提出日】平成28年7月11日(2016.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞微粒子の製造方法であって、
（i）幹細胞の分化が可能な環境下で幹細胞を培養すること、及び
（ii）上記細胞により産生される微粒子を回収すること
を含む方法。
【請求項２】
幹細胞の分化が可能な環境が、多区画のバイオリアクタ中の培養であり、例えば、バイオリアクタが細胞を含有する区画をガス及び／又は培養培地を含有する1つ以上の区画から分離する1つ以上の膜又は障壁で分離されている少なくとも2つの区画を含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
培養が7日を超えるものである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞の条件培地が、幹細胞による培地中への微粒子の放出を刺激する1種以上の添加成分又は薬剤を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
1種以上の成分が、形質転換増殖因子-ベータ（TGF-β）、インターフェロン-ガンマ（INF-γ）及び／又は腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞が低酸素条件下で培養されたものである、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
幹細胞が別の細胞型と共培養されたものである、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
別の細胞型が内皮細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞が神経幹細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞が神経幹細胞株である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
神経幹細胞株が条件的不死化されている、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
神経幹細胞株が、ECACC受託番号04091601を有するCTX0E03、ECACC受託番号04110301を有するSTR0C05、又はECACC受託番号04092302を有するHPC0A07である、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
神経幹細胞株が無血清培地で生育されている、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
神経幹細胞が、Nestin、Sox2、GFAP、βIIIチューブリン、DCX、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上のマーカーを発現する、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
微粒子がエキソソームであり、該エキソソームがDCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現する、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも2種の、3種の、4種の、5種の、6種の又は7種のmiRNAが、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞における場合と比較して微粒子において上方制御又は下方制御される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
微粒子がエキソソームであり、該エキソソームが、以下のmiRNA：hsa-miR-146b-5p; hsa-let-7c; hsa-miR-99a; hsa-miR-132; hsa-miR-378; hsa-miR-181a; hsa-let-7b; hsa-miR-100; hsa-let-7e; hsa-miR-23b; hsa-miR-185; hsa-let-7i; hsa-let-7a; hsa-let-7d; hsa-let-7g; hsa-miR-222; hsa-let-7f; hsa-miR-218; hsa-miR-24; hsa-miR-9; hsa-miR-126; hsa-miR-134; hsa-miR-128; 及びhsa-miR-155の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも高いレベルで発現する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
微粒子がエキソソームであり、該エキソソームが、以下のmiRNA：hsa-miR-22; hsa-miR-26a; hsa-miR-210; hsa-miR-92a; hsa-miR-93; hsa-miR-424; hsa-miR-195; hsa-miR-127-5p; hsa-miR-21; hsa-miR-103a; hsa-miR-16; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-10a; hsa-miR-10b; hsa-miR-345; hsa-miR-130a; hsa-miR-15b; hsa-miR-20b; hsa-miR-20a; hsa-miR-17; hsa-miR-7; hsa-miR-106b; hsa-miR-101; hsa-miR-302a; hsa-miR-301a; hsa-miR-183; hsa-miR-219-5p; hsa-miR-18a; hsa-miR-15a; hsa-miR-182; hsa-miR-33a; hsa-miR-96; 及びhsa-miR-18bの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも低いレベルで発現する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
微粒子が、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
単離された又は精製された微粒子に、1種以上の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物又はプロドラッグを負荷することをさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
外因性の核酸が、1種以上の病態遺伝子をサイレンシングすることができるsiRNAである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により得ることができる微粒子。
【請求項２４】
DCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現するエキソソームである微粒子。
【請求項２５】
エキソソームが、以下のmiRNA：hsa-miR-146b-5p; hsa-let-7c; hsa-miR-99a; hsa-miR-132; hsa-miR-378; hsa-miR-181a; hsa-let-7b; hsa-miR-100; hsa-let-7e; hsa-miR-23b; hsa-miR-185; hsa-let-7i; hsa-let-7a; hsa-let-7d; hsa-let-7g; hsa-miR-222; hsa-let-7f; hsa-miR-218; hsa-miR-24; hsa-miR-9; hsa-miR-126; hsa-miR-134; hsa-miR-128; 及びhsa-miR-155の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも高いレベルで発現する、請求項23又は24に記載の微粒子。
【請求項２６】
エキソソームが、以下のmiRNA：hsa-miR-22; hsa-miR-26a; hsa-miR-210; hsa-miR-92a; hsa-miR-93; hsa-miR-424; hsa-miR-195; hsa-miR-127-5p; hsa-miR-21; hsa-miR-103a; hsa-miR-16; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-10a; hsa-miR-10b; hsa-miR-345; hsa-miR-130a; hsa-miR-15b; hsa-miR-20b; hsa-miR-20a; hsa-miR-17; hsa-miR-7; hsa-miR-106b; hsa-miR-101; hsa-miR-302a; hsa-miR-301a; hsa-miR-183; hsa-miR-219-5p; hsa-miR-18a; hsa-miR-15a; hsa-miR-182; hsa-miR-33a; hsa-miR-96; 及びhsa-miR-18bの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも低いレベルで発現する、請求項23〜25のいずれか1項に記載の微粒子。
【請求項２７】
hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、請求項23〜26のいずれか1項に記載の微粒子。
【請求項２８】
治療に使用するための、請求項23〜27のいずれか1項に記載の微粒子。 
【請求項２９】
治療が、
（i）神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン、アルツハイマー、卒中若しくはALS、
（ii）リソソーム蓄積症、
（iii）心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
（iv）特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
（v）代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病（I型若しくはII型）、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
（vi）精神障害、例えば鬱病、双極性、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
（vii）失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症又は網膜色素変性症、あるいは
（viii）脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性まひ、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
に対するものである、請求項28に記載の微粒子。
【請求項３０】
請求項23〜27のいずれか1項に記載の微粒子及び幹細胞を含む組成物であって、場合により該幹細胞が、該微粒子が由来する幹細胞であり、例えば幹細胞がECACC受託番号04091601を有するCTX0E03である、上記組成物。
【請求項３１】
治療に使用するための、請求項30に記載の組成物。 
【請求項３２】
幹細胞及び微粒子が、
（i）単一の医薬組成物で共に投与される、
（ii）同時期に又は同時に投与されるが別々に投与される、あるいは
（iii）別々に及び連続して投与される、例えば細胞の投与と微粒子の投与との間の期間が1時間、1日、1週間、2週間又はそれ以上である、
請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
治療が、微粒子が由来する幹細胞を受ける宿主において寛容、典型的には免疫寛容を誘導する、あるいは幹細胞を微粒子と共に投与することにより幹細胞に対する寛容が増強する、請求項31又は32に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】微粒子を産生するCTX0E03条件的不死化神経幹細胞を示す電子顕微鏡写真である。パネルA〜Eは、直径30nm〜50nmのエキソソームを含有する細胞内多小胞体（MVB）を示し、パネルFは、細胞膜での出芽プロセスを経て神経幹細胞から放出された直径100nm超の微小胞を示す。
【図２】幹細胞からの微粒子の同定、特性決定及び製造に関するプロトコルの概要を示す図である。
【図３】CTX0E03の条件培地及び非条件培地に対して実施したヒト血管新生ELISAストリップの光学密度の読み取りを示す。
【図４】図4Aは、通常の培養条件（3日T175）と比較した、Integraシステムから精製した微粒子を含有する15mlの培地から抽出したタンパク質の量（BCAアッセイで測定した）を示す。図4Bは、（i）Integra培養CTX0E03エキソソーム（左上のパネル）及び微小胞（右上のパネル）におけるCD63と、（ii）Integra培養CTX0E03エキソソーム（左下のパネル）及び微小胞（右下のパネル）におけるCD81とに関する（2ug/ml、1：250での）FACS検出を示す。
【図５】通常の培養条件（3日T175）と比較した、Integraシステムからのろ過により精製した微粒子を含有する15mlの培地から抽出して260/280nmで測定した単離全RNAの量を示す。
【図６Ａ】図6Aは、CTX0E03条件培地中で培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の又は精製したCTX0E03エキソソームの添加時の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性を表す創閉鎖/掻創アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、基礎の条件（エキソソームなし）に対する10μgのCTX0E03エキソソームの効果を比較する、72時間後の掻創アッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】図6Cは、基礎の条件、2μg/mlのエキソソーム、6μg/mlのエキソソーム、20μg/mlのエキソソーム及びLSGS（低血清増殖サプリメント）陽性対照に関する治癒面積の％を示す。図6Cの上のパネルは、Integra Cellineシステム中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示し、図6Cの下のパネルは、Integra Cellineシステム中で6週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示す。
【図６Ｄ】図6Dは、インビボの注射創傷治癒アッセイ（injection wound healing assay）においてCTX0E03細胞と陰性対照（生理食塩水）とを比較する。
【図７】標準的なCTX0E03（T175）培養からの培養培地毎に得た精製エキソソームの量 対 3週目の時点でのIntegra CELLineシステムからの培養培地毎に得た精製エキソソームの量を示す。
【図８】図8Aは、CTX0E03 Integra CELLine培養システムの1週後、2週後及び3週後の2種の異なるフラスコから回収したエキソソームの濃度を示す。図8Bは、CTX0E03細胞の6週連続培養中において単一のIntegra CELLineフラスコから回収したエキソソームの濃度を示す。
【図９】標準的な（「対照」）CTX0E03（T175）培養と比較して、Integra CELLineシステム中において3週にわたって培養したCTX0E03細胞中で測定した様々なmRNAマーカーの発現レベルの変化倍率（fold change）を示す。
【図１０】標準的なCTX0E03（T175）培養でのCTX0E03細胞における基準発現レベルに対して評価した、Integraバイオリアクタ培養で3週にわたって培養したCTX0E03細胞から得たエキソソーム中の及び標準的なCTX0E03（T175）培養から得た微粒子中の様々なmiRNAの上方制御倍率及び下方制御倍率を示す。
【図１１ａ】標準的な（T175）条件下で培養したCTX0E03細胞（「CTX」）、微小胞（「MV」）及びエキソソーム（「EXO」）からのmiRNAの大規模シーケンシングから得たmiRNAのプロファイルを示す。図11a及び図11bは2種の培養物からの結果を示す。
【図１１ｂ】標準的な（T175）条件下で培養したCTX0E03細胞（「CTX」）、微小胞（「MV」）及びエキソソーム（「EXO」）からのmiRNAの大規模シーケンシングから得たmiRNAのプロファイルを示す。図11a及び図11bは2種の培養物からの結果を示す。
【図１２Ａ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12Aは、基礎のHUVECと比較して、微小胞を添加した場合（右側のパネル）に観測した管形成の明確な増加を示す写真である。
【図１２Ｂ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12B及び図12Cは、様々な濃度（0.05μg、0.1μg、0.3μg-図12B及び0.6μg/ml-図12C）でhNSC微小胞によりもたらされる管全長の増加を示す。
【図１２Ｃ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12B及び図12Cは、様々な濃度（0.05μg、0.1μg、0.3μg-図12B及び0.6μg/ml-図12C）でhNSC微小胞によりもたらされる管全長の増加を示す。
【図１３】PC-12細胞における神経突起伸長に対するhNSC微小胞の影響を示す写真である。
【図１４】Agilent RNAバイオアナライザで決定したCTX0E03細胞、エキソソーム及び微小胞における全RNA含有量プロファイルを示す電気泳動図である。
【図１５】エクソンに完全に重複する遺伝子をコードする割合（％）及びイントロン又は遺伝子間配列内に位置する非コード転写産物の割合（％）を模式的に示す（GENCODE配列データセットに対してNGS BAMファイルを実行することにより作成した）。
【図１６】CTX0E03プロデューサー細胞と比較してエキソソーム及びMVに選択的にシャトルされる（shuttled）、上位にランクする新規miRNAを示す。
【図１７Ａ】1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03エキソソーム（図17A）及び微小胞（図17B）の粒子サイズ及び濃度を決定するために行ったNanoSight分析の結果を示す。
【図１７Ｂ】1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03エキソソーム（図17A）及び微小胞（図17B）の粒子サイズ及び濃度を決定するために行ったNanoSight分析の結果を示す。
【図１８】CTX0E03エキソソームからのプロテオームデータと微小胞からのプロテオームデータとを比較し（18A及び18B）、並びに神経幹細胞エキソソームと間葉系幹細胞エキソソームとを比較する（18C及び18D）ベン図を示す。図18Aは、2週のIntegra培養システムから単離したCTX0E03エキソソーム及び微小胞内に特有のタンパク質の数を示す。図18Bは、CTX0E03エキソソーム内において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスと微小胞内において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスとを比較する。図18Cは、CTX0E03神経幹細胞エキソソームのプロテオームと間葉系幹細胞エキソソームのプロテオームとを比較し、図18Dは、MSC由来のエキソソームにおいて同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスと神経幹細胞由来のエキソソームと関連する生物学的プロセスとを比較する。
【図１９】NSC由来のエキソソームと関連するが間葉系幹細胞エキソソームとは関連しないことが分かった30種の生物学的プロセスを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
C）標準的な（T175）培養からのCTX0E03細胞、微小胞及びエキソソームmiRNA発現の大規模シーケンシング
大規模シーケンシングはcDNAライブラリの調製及びその後のシーケンシングに基づいており、微小胞及びエキソソームにおける様々なmiRNAの全配列の読み取りに関する情報を提供する。これらの大規模配列データにより、上記に示すqRT-PCRアレイデータが補完され、細胞及び微粒子のmiRNAプロファイルが包括的に分析される。qRT-PCRアレイ分析とは異なり、大規模シーケンシングはプローブアレイ中に存在する配列の同定に限定されず、そのため、同定される配列は前もって既知である必要はない。大規模シーケンシングはまた、直接読み取ることもでき、非常に短い配列を配列決定する能力も有する。しかしながら、大規模シーケンシングは、発現が低い転写産物の検出に適していない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９９】
GTPアーゼ、クラスリン、シャペロン、熱ショックタンパク質（例えばHsp90、Hsp70）、スプライシング因子、翻訳因子、アネキシン及び増殖因子（例えばTGF-ベータ）をエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2015529450.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2015529450.tif 000002