【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）炭水化物抗原又はその免疫原性断片と、
（ｂ）トキソイドタンパク質と、
を含み、
前記炭水化物抗原と前記トキソイドタンパク質との比率が、５：１〜３９：１の範囲内である、ワクチン。
【請求項２】
前記トキソイドタンパク質が、ジフテリア毒素（ＤＴ）である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記炭水化物抗原と前記ジフテリア毒素との比率が、８：１〜２４：１の範囲内である、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記トキソイドタンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記炭水化物抗原と前記破傷風トキソイドとの比率が、７：１〜１２：１の範囲内である、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記炭水化物抗原が、Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４又はＧｂ−４から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記炭水化物抗原が、Ｇｌｏｂｏ−Ｈである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ジフテリア毒素が、ジフテリア毒素交差反応物質又はジフテリアトキソイドである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ジフテリア毒素交差反応物質が、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ１９７又はＣＲＭ２２８から選択される、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
サポニンアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記サポニンアジュバントが、ＯＢＩ−８２１サポニンである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）アジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記α−ガラクトシルセラミドアジュバントは、下記構造式で表される、請求項１２に記載のワクチン。
【化１】
2016504385.tif 000001
【請求項１４】
医薬組成物であって、
（ａ）炭水化物抗原又はその免疫原性断片と、
（ｂ）ジフテリア毒素（ＤＴ）と、
（ｃ）薬学的に許容される担体と、
を含み、
前記炭水化物抗原とジフテリア毒素との比率が、５：１〜３９：１の範囲内である、医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）請求項１に記載のワクチンと、
（ｂ）薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
がん細胞を抑制する方法であって、
請求項１に記載のワクチンの有効量を、それを必要とする個体に投与する工程を含み、
前記がん細胞が抑制される、方法。
【請求項１７】
前記がんが、Ｇｌｏｂｏ−Ｈを発現するがんである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｇｌｏｂｏ−Ｈを発現するがんが、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌である、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
現在では免疫応答、特にＩｇＧの免疫応答を向上させるためのがんワクチン及び有効なアジュバントを開発するという満たされていない需要が存在する。よって、本発明は、上記及び他の需要を満たすように炭水化物抗原に対するワクチン及びアジュバントを提供する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許第８５４０９６４号明細書
（特許文献２）  国際公開第２０１３／１４２２４５号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２０１２／０３２８６４６号明細書
（特許文献４）  国際公開第２０１１／１５６７７４号明細書
（特許文献５）  国際公開第１９９６／０４０２４２号明細書
（特許文献６）  国際公開第２００９／１２６７３７号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）  Ｙｅｎ−Ｌｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ＰＮＡＳ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１３  ｖｏｌ．１１０  ｎｏ．７  ２５１７-２５２２
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の第３実施例では、１８５７化合物Ｖ１Ａ、１８５７化合物Ｖ１Ｂ、１８５７化合物Ｖ２Ａ及び１８５７化合物Ｖ２Ｂを含むＯＢＩ−８２１の新規サポニンアジュバントを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の第４実施例では、炭水化物抗原又はその免疫原性断片と、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントとを含むワクチンを提供する。一つの実施例において、ワクチンはさらに担体タンパク質を含む。ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを含むワクチンのＩｇＧの産生、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性は、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを含まないワクチンと比較してより高いことが発見された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の例示的な実施例は、以下添付の図面を参照して、詳細に説明する。
【図１Ａ】図１Ａは、２４日目にＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／ＯＢＩ−８２１サポニン、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ／ＯＢＩ−８２１サポニン、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ／Ｃ３４及びＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／Ｃ３４の組成物の抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＩｇＧ力価の棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２４日間にわたる図１Ａに記載された組成物の抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＩｇＧ力価の折れ線グラフである。
【図２】図２は、２４日間にわたるマウスにおけるＧ２ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１））、Ｇ３ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１）／ＯＢＩ−８２１）及びＧ４ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（２４：１）／ＯＢＩ−８２１）のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を示す棒グラフの集合である。図２Ａは、ＡＤＣＤの生データであり、図２Ｂは、ＡＤＣＤの正規化データであり、図２Ｃは、ＣＤＣの生データであり、図２Ｄは、ＣＤＣの正規化データである。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、２４日間にわたる下記組成物の総合的なＩｇＭ及びＩｇＧ力価の折れ線グラフである：Ｇ１（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／ＯＢＩ−８２１）、Ｇ２（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（３：１）／ＯＢＩ−８２１）、Ｇ３及びＧ４（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１）／ＯＢＩ−８２１）、Ｇ５（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１）／Ｃ３４）、Ｇ６（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／Ｃ３４）、Ｇ７（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（１６：１）／ＯＢＩ−８２１）及びＧ８（ＰＢＳ）である。
【図４】図４は、１０日目、１７日目、２４日目に図３における組成物のＩｇＭ及びＩｇＧ応答を示す棒グラフの集合である：図（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ１０日目、１７日目、２４日目の図３に記載された組成物のＩｇＭ応答であり、図（Ｄ）〜（Ｆ）は、それぞれ１０日目、１７日目、２４日目の図３に記載された組成物のＩｇＧ応答である。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＯＢＩ−８２１（１９８９及び１８５７化合物を含む）の質量スペクトル画像である。
【図６】図６は、ＯＢＩ−８２１のＬＣ−ＵＶクロマトグラム画像である。
【図７】図７は、ＯＢＩ−８２１のＬＣ／ＭＳクロマトグラム画像の集合である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
当該ワクチンは、アジュバントをさらに含むことができ、そのアジュバントはサポニン、例えば、本明細書に記載されたＯＢＩ−８２１、又はαーガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−ｃｅｒａｍｉｄｅ）の合成アナログ（α−ＧａｌＣｅｒ又はＣ１）である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
「αーガラクトシルセラミド」及び「α−ＧａｌＣｅｒ」という用語は、ナチュラルキラーＴ細胞を刺激してヘルパーＴ（ＴＨ）１およびＴＨ２サイトカインの両者を産生する糖脂質を指し、例えば、米国特許第８，２６８，９６９号に開示され、その全開示を参照により本明細書に組み入れることとする。一実施例において、α−ＧａｌＣｅｒのアジュバントは、下記の構造を有する。
【化２】
2016504385.tif 000002
なお、Ｒは、（ＣＨ２）２４ＣＨ３、（ＣＨ２）７ＰｈＦ、（ＣＨ２）１０ＰｈＯＰｈＦ又は（ＣＨ２）１０ＰｈＦである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
新規サポニンアジュバント
本発明は、実質的に純粋なＯＢＩ−８２１サポニンを提供することができる。本発明は、実質的に純粋なＯＢＩ−８２１サポニンと、生物活性断片とを含むものである。本発明もまた、不純なＯＢＩ−８２１サポニンを含むことができる。精製したＯＢＩ−８２１サポニンは、本明細書に記載されたワクチンと共に投与する、或いはそれを他の実質的に純粋なサポニン又は非サポニンのジュバントと混合する場合、アジュバントの効果を高めることを示した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
ＯＢＩ−８２１サポニンは、天然に存在するグリコシドであり、例えば、米国特許第５，０５７，５４０号、及び米国特許第６，５２４，５８４号（その内容が本明細書にその全体を参照により援用される）に開示された高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、低圧液体シリカクロマトグラフィー及び親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によってキラジャサポナリアモリナコルテックス樹（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅ）の皮から高純度で抽出される。高圧液体クロマトグラフィー分析では、ＯＢＩ−８２１は構造に関連する異性化合物の混合物であることを示した。ＯＢＩ−８２１サポニンの異なる精製異性化合物は確認されて本明細書に記載されている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ＯＢＩ−８２１サポニンは、少なくとも一つの下記単離された式（Ｉ）の化合物を含む。
2016504385.tif 000003
なお、Ｒ１は、β―Ｄ―アピオース又はβ−Ｄ−キシロースであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれＨ基、アルキル基、
2016504385.tif 000004
（１９８９化合物の脂肪アシル基部分（Ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｍｏｉｅｔｙ））、又は
2016504385.tif 000005
（１８５７化合物の脂肪アシル基部分）である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＯＢＩ−８２１サポニンは、下記単離された式（Ｉ）の化合物をさらに含んでもよい：（ｉ）Ｒ１はβ―Ｄ―アピオースであり、Ｒ２は上記の１９８９化合物の脂肪アシル基部分であり、Ｒ３はＨ基であり（１９８９化合物Ｖ１Ａ）、（ｉｉ）Ｒ１はβ―Ｄ―アピオースであり、Ｒ２はＨ基であり、Ｒ３は上記の１９８９化合物の脂肪アシル基部分であり（１９８９化合物Ｖ１Ｂ）、（ｉｉｉ）Ｒ１はβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２は上記の１９８９化合物の脂肪アシル基部分であり、Ｒ３はＨ基であり（１９８９化合物Ｖ２Ａ）、又は（ｉｖ）Ｒ１はβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２はＨ基であり、Ｒ３は上記の１９８９化合物の脂肪アシル基部分であり（１９８９化合物Ｖ２Ｂ）である。総称として、１９８９化合物Ｖ１Ａ、１９８９化合物Ｖ１Ｂ、１９８９化合物Ｖ２Ａ及び１９８９化合物Ｖ２Ｂは、「１９８９化合物の混合物」と呼ばれる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
ＯＢＩ−８２１サポニンは、下記単離された式（Ｉ）の化合物を含んでもよい：（ｉ）Ｒ１はβ―Ｄ―アピオースであり、Ｒ２は上記の１８５７化合物の脂肪アシル基部分であり、Ｒ３はＨ基であり（１８５７化合物Ｖ１Ａ）、（ｉｉ）Ｒ１はβ―Ｄ―アピオースであり、Ｒ２はＨ基であり、Ｒ３は上記の１８５７化合物の脂肪アシル基部分であり（１８５７化合物Ｖ１Ｂ）、（ｉｉｉ）Ｒ１はβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２は上記の１８５７化合物の脂肪アシル基部分であり、Ｒ３はＨ基であり（１８５７化合物Ｖ２Ａ）、又は（ｉｖ）Ｒ１はβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２はＨ基であり、Ｒ３は上記の１８５７化合物の脂肪アシル基部分であり（１８５７化合物Ｖ２Ｂ）である。総称として、１８５７化合物Ｖ１Ａ、１８５７化合物Ｖ１Ｂ、１８５７化合物Ｖ２Ａ及び１８５７化合物Ｖ２Ｂは、「１８５７化合物の混合物」と呼ばれる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ＯＢＩ−８２１サポニンは、一つ又は複数の下記化合物を含む：（ｉ）１８５７化合物Ｖ１Ａ、（ｉｉ）１８５７化合物Ｖ１Ｂ、（ｉｉｉ）１８５７化合物Ｖ２Ａ、（ｉｉｉ）１８５７化合物Ｖ２Ｂ、（ｉｖ）１９８９化合物Ｖ１Ａ、（ｖ）１９８９化合物Ｖ１Ｂ、（ｖｉ）１９８９化合物Ｖ２Ａ、又は（ｖｉｉ）１９８９化合物Ｖ２Ｂである。ＯＢＩ−８２１サポニンにおける１８５７化合物の混合物と１９８９化合物の混合物との百分率が下記範囲内にある：
（ｉ）約１モル％〜約１５モル％の１８５７化合物の混合物、及び
（ｉｉ）約８５モル％〜約９９モル％の１９８９化合物の混合物。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
もう一つの実施例において、実質的に純粋なＯＢＩ−８２１は、粗キラジャサポナリアモリナコルテックス樹抽出物から精製され、そのＯＢＩ−８２１は、逆相ＨＰＬＣによって５μｍの粒度、１００オングストロームの孔サイズ、４．６ｍｍ  ＩＤ  ×  ２５ｃｍＬを有する対称Ｃ１８カラムに、流速１ｍｌ／ｍｉｎで移動相Ａが０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を含有する蒸留水であり、移動相Ｂが０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）であり、且つＡ：Ｂが９５％：５％〜７５％：２５％の移動相を含む溶出プログラムを用いて１１分に分析する場合、溶媒ピークを除いて、クロマトグラムのすべてのピーク総面積の９０％又は以上を占める単一主要なピークであることを特徴とする。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
当該ワクチンは、炭水化物抗原又はその免疫原性断片と、ＯＢＩ−８２１サポニンとを含んでもよい。もう一つの実施例において、ワクチンは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ−４又はその混合物から選択される炭水化物抗原と、ＤＴと、ＯＢＩ−８２１サポニンとを含む。また一つの実施例において、ワクチンは、炭水化物抗原又はその免疫原性断片と、担体タンパク質と、ＯＢＩ−８２１サポニンとを含む。担体タンパク質の非限定的な例は、トキソイドタンパク質と、非トキソイドタンパク質（例えば、ＫＬＨ）とを含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
実施例１：炭水化物／トキソイドタンパク質の比率の高いワクチンの調製及びＯＢＩ−８２１の抽出
Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、当該技術分野において公知の方法を通してＫＬＨ又はＤＴと結合され、例えば、米国特許第６，５４４，９５２号又は第８，２６８，９６９号に記載の方法に従って、その全開示を参照により本明細書に組み入れることとする。得られたワクチンは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ：ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率＝２〜４：１）を含む。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ＯＢＩ−８２１サポニンの調製
ＯＢＩ−８２１サポニンの調製は、下記ステップに従ってキラジャサポナリアモリナコルテックス樹抽出物から抽出する。
（ａ）大きい粒子径のＣ１８の逆相クロマトグラフィーによってキラジャサポナリアモリナコルテックス樹抽出物を予め濾過し、そしてシリカ系の順相分取クロマトグラフィーによって精製する。上記によって、粗ＯＢＩ−８２１を得る。
（ｂ）続いて、大きい粒子径のＣ１８の逆相クロマトグラフィーによってステップ（ａ）の粗ＯＢＩ−８２１を予め濾過し、そして分取逆相ＨＰＬＣを行う。ＯＢＩ−８２１物質は脱塩及び凍結乾燥処理で順次に生成する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
キラジャサポナリアモリナコルテックス樹の皮から抽出された精製ＯＢＩ−８２１サポニンは、質量スペクトルによって分析する。図５Ａにおける１９８９．０１にある質量ピーク、図５Ｂにおける１９８９．１２にある質量ピーク及び１９８９．１３にある質量ピークは、約１９８９の分子量を有する化合物が存在することを示した。約１９８９の分子量を有する化合物のモル比は、図５Ａにおける８９．８％、図５Ｂにおける９６．８％及び図５Ｃにおける８７．０％である。同様に、図５Ａにおける１８５６．９７にある質量ピーク、図５Ｂにおける１８５６．０２にある質量ピーク及び１８５７．０９にある質量ピークは、約１８５７の分子量を有する化合物が存在することを示した。約１８５７の分子量を有する化合物のモル比は、図５Ａにおける１０．２％、図５Ｂにおける３．２％及び図５Ｃにおける１３％である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
精製ＯＢＩ−８２１サポニンは、更にクロマトグラフィーによって分析する。図６は、ＬＣ−ＵＶクロマトグラムの画像（カラム：ＰｏｌｙＬＣＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ  Ａ  ２００  ＊  ４．６  ｍｍ  ５μｍ，  ３００  Ａ）である。第１ピークは、１９８９化合物Ｖ１（Ａ及びＢ）及び１８５７化合物Ｖ１（Ａ及びＢ）（約６５．９４％）が存在することを示し、第２ピークは、１９８９化合物Ｖ２（Ａ及びＢ）及び１８５７  化合物Ｖ２（Ａ及びＢ）（約３４．０６％）が存在することを示した。図７はＬＣ／ＭＳクロマトグラムの画像（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ＯＤＳ  １５０＊２．１  ｍｍ）である。上部の図における第１ピークは、１９８９化合物Ｖ１Ｂ及びＶ２Ｂ（約２．２％）が存在することを示し、第４ピークは、１９８９化合物Ｖ１Ａ及びＶ２Ａ（約９７．８％）が存在することを示した。下部の図における第２ピークは、１８５７化合物Ｖ１Ｂ及び１８５７化合物Ｖ２Ｂ（約１．９％）が存在することを示し、第３ピークは、１８５７化合物Ｖ１Ａ及び１８５７化合物Ｖ２Ａが存在することを示した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例２：炭水化物／トキソイドタンパク質の比率の高いワクチンの免疫原性及びＯＢＩ−８２１サポニンアジュバント効果
ＣＬ５７Ｂ／６マウスを用いて例１におけるＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１）のワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性及びＯＢＩ−８２１サポニンアジュバント効果の評価を行う。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
約８週齢のＣＬ５７Ｂ／６マウスを下記試験群の４群に無作為に群分した。
2016504385.tif 000006
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
結果：Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（比率８：１）免疫マウスからＩｇＧ力価は、Ｃ３４アジュバントを含有するＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨのＩｇＧ力価より有意に高い（Ｐ<０．０１）である。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（比率８：１）免疫マウスからＩｇＧ力価は、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを含有するＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨのＩｇＧ力価より有意に高い（図１（Ａ）を参照）である。使用された担体タンパク質の種類に問わず、ＯＢＩ−８２１サポニンは、Ｃ３４アジュバントと比較して統計的に有意に高いＩｇＧ力価を誘導する（Ｐ<０．０１、図１（Ａ）及び図１（Ｂ）を参照）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
実施例３：ＡＤＣＣ及びＣＤＣのアッセイで炭水化物／トキソイドタンパク質の比率の高いワクチンの免疫原性及びＯＢＩ−８２１サポニンアジュバント効果の評価を行う
ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ  ｒａｔｓ）の４群が表３におけるワクチンで免疫される。
【表３】
2016504385.tif 000007
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
結果：図２Ｂ及び図２Ｄに示すように、２４日目にＧ３ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを有する）のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性は、Ｇ２ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを有しない）のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性と比較してより高いである。図２Ｂ及び図２Ｄに示すように、２４日目にＧ４ワクチン（Ｇｏｌｂｏ  Ｈ／ＤＴ  比が２４：１）のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性は、Ｇ３ワクチン（Ｇｏｌｂｏ  Ｈ／ＤＴ  比が８：１）のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性と比較してより高いである。この結果によって、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントと、炭水化物抗原／トキソイドタンパク質の比率が５：１以上のワクチンとがより長く持続するＡＤＣＣ及びＣＤＣ応答を誘導且つ強化することを示した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
実施例４：炭水化物／トキソイドタンパク質の比率の高いワクチンの免疫原性及びＯＢＩ−８２１サポニンアジュバント効果の評価
ＣＬ５７Ｂ／６マウス又はＢａｌｂ／ｃマウスを用いて例１におけるＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（８：１）のワクチン及びＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（１６：１）のワクチンと、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントとのｉｎ  ｖｉｖｏ評価を行う。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
約８週齢のＣＬ５７Ｂ／６マウスを下記試験群の８群に無作為に群分した。
2016504385.tif 000008
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
結果：ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントを有するワクチンは、Ｃ３４アジュバントを有するワクチンより統計的に有意に高い抗ＧｌｏｂｏＨ  ＩｇＭ及び抗ＧｌｏｂｏＨ  ＩｇＧを誘導することを示した（図３Ａ、図３Ｂ及び図４を参照）。なお、下記統計的に有意な差が確認された。
●１７日目にＧ３ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＭ力価は、Ｇ５ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．０２）、
●１７日目にＧ１ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＭ力価は、Ｇ６ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．０３）、
●２４日目にＧ３ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＭ力価は、Ｇ５ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．０３）、
●１７日目にＧ３ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＧ力価は、Ｇ５ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．００１）、
●１７日目にＧ１ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＧ力価は、Ｇ６ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．００３）、
●２４日目にＧ３ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＧ力価は、Ｇ５ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．００３）、及び
●２４日目にＧ１ワクチン（ＯＢＩ−８２１サポニン）のＩｇＧ力価は、Ｇ６ワクチン（Ｃ３４）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．００４）。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
この結果によって、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントは、Ｃ３４アジュバントと比較してＩｇＭ及びＩｇＧ応答を有意に強化することを示した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
１７日目及び２４日目にＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ１）は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（３：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ２）と比較して有意に高いＩｇＭ及びＩｇＧ力価を誘導する。特定の理論に縛られるものではないが、Ｇ１は高い炭水化物の密度（ＫＬＨ担体タンパク質当たり約７００のＧｌｏｂ  Ｈユニット）を有し、且つ強力な免疫応答を誘導するのに対し、Ｇ２は低い炭水化物の密度（ＤＴ担体タンパク質当たり３のＧｌｏｂｏ  Ｈユニット）を有し、且つ弱い免疫応答を誘導すると考えられる。なお、下記統計的に有意な差が確認された。
●１７日目にＧ１ワクチン（ＫＬＨ）のＩｇＭ力価は、Ｇ２ワクチン（ＤＴ）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．００３）、
●２４日目にＧ１ワクチン（ＫＬＨ）のＩｇＭ力価は、Ｇ２ワクチン（ＤＴ）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．０３）、
●２４日目にＧ１ワクチン（ＫＬＨ）のＩｇＧ力価は、Ｇ２ワクチン（ＤＴ）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．００４）。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
１７日目及び２４日目にＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ３及びＧ４）と、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が１６：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ７）とのＩｇＭ及びＩｇＧ力価は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＫＬＨ／ＯＢＩ−８２１サポニン（ＧＩ）のＩｇＭ及びＩｇＧ力価に相当する（図４を参照）。ＧＨ−ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）は、ＧＨ−ＫＬＭ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が７００：１）と比較して低い炭水化物の密度を有するが、ＧＨ−ＫＬＭの免疫原性に相当することを示した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴの比率（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１又は１６：１）の高いワクチンは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴの比率（３：１）の低いワクチンと比較してより高い及び長く持続するＩｇＭ及びＩｇＧ力価を誘導する。なお、下記統計的に有意な差が確認された。
●１７日目にＧ３ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）のＩｇＭ力価は、Ｇ２ワクチン（３：１の比率）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．０２）、
●１７日目にＧ７ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が１６：１）のＩｇＭ力価は、Ｇ２ワクチン（３：１の比率）のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ＝０．００６）、
●１７日目にＧ３ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）のＩｇＧ力価は、Ｇ２ワクチン（３：１の比率）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．０１）、
●１７日目にＧ７ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が１６：１）のＩｇＧ力価は、Ｇ２ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が３：１）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．０３）、
●２４日目にＧ３ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）のＩｇＧ力価は、Ｇ２ワクチン（３：１の比率）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．０１）、
●２４日目にＧ７ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が１６：１）のＩｇＧ力価は、Ｇ２ワクチン（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が３：１）のＩｇＧ力価より有意に高い（ｐ＝０．０１）、
１７日目及び２５日目にＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が８：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ３）及びＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（１６：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ７）のＩｇＭ力価は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＤＴ（Ｇｌｏｂｏ  ＨとＤＴとの分子の比率が３：１）／ＯＢＩ−８２１サポニン（Ｇ２））のＩｇＭ力価より有意に高い（ｐ<０．０５）。