【手続補正書】
【提出日】平成28年4月26日(2016.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養された２９３細胞または２９３細胞の派生物において組換えタンパク質を産生する方法であって、
高密度培養培地において２９３細胞または２９３細胞の派生物を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約２×１０６から約２×１０７細胞／ｍｌの間の細胞密度を有する、工程；
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記２９３細胞または２９３細胞の派生物にトランスフェクトする工程；
前記トランスフェクトされた２９３細胞または２９３細胞の派生物を第１の期間にわたってインキュベートする工程；
前記トランスフェクトされた２９３細胞または２９３細胞の派生物を、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）を含む少なくとも１つの発現増強物質組成物と接触させる工程；
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた２９３細胞または２９３細胞の派生物を、前記発現増強物質組成物の存在下で第２の期間にわたってインキュベートする工程；および
前記第２の期間の後に、前記トランスフェクトされた２９３細胞または２９３細胞の派生物を収集する工程
を含み、前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、方法。
【請求項２】
前記培養された２９３細胞または２９３細胞の派生物が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記浮遊培養物が、２９３細胞、２９３細胞の派生物、２９３Ｆ細胞、または２９３Ｆ細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応しており；
任意で、前記浮遊培養物が２９３Ｆ細胞の派生物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸ナトリウム、または酢酸リチウムをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
バルプロ酸（ＶＰＡ）の濃度が、約０．２０ｍＭから約２５ｍＭの範囲であり；任意で、バルプロ酸の濃度が、約０．２５ｍＭから約２４ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２３ｍＭ、０．２７ｍＭから約２３ｍＭ、０．２８ｍＭから約２３ｍＭ、０．２９ｍＭから約２２ｍＭ、約０．３０ｍＭから約２１ｍＭ、約０．３１ｍＭから約２０ｍＭ、約０．３２ｍＭから約１９ｍＭ、約０．３３ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３４ｍＭから約１８ｍＭ、約０．３５ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３６ｍＭから約１６ｍＭ、約０．３７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１４ｍＭ、約０．４１ｍＭから約１３ｍＭ、約０．４２ｍＭから約１２ｍＭ、約０．４３ｍＭから約１１ｍＭ、約０．４４ｍＭから約１０ｍＭ、約０．４５ｍＭから約９ｍＭ、約０．４６ｍＭから約８ｍＭ、約０．４７ｍＭから約７ｍＭ、約０．４８ｍＭから約６ｍＭ、約０．４９ｍＭから約５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５５ｍＭから約３ｍＭ、０．６ｍＭから約２ｍＭまたは０．７５から約１．５ｍＭ、約０．１５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１６ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１７ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１８ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１９ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．３０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．６０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．７０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．８０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．９０ｍＭから約１．５ｍＭ、または約０．１０ｍＭから約１．５ｍＭの範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下のいずれかである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法：
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．２ｍＭから約１００ｍＭの範囲であり；
さらに任意で、前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約０．５から約８０ｍＭ、約０．４ｍＭから約７０ｍＭ、約０．５ｍＭから約６０ｍＭ、約０．６ｍＭから約５０ｍＭ、約０．７ｍＭから約４０ｍＭ、約０．８ｍＭから約３０ｍＭ、約０．９ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約２ｍＭから約１０ｍＭ、約３ｍＭから約９ｍＭ、約４ｍＭから約８ｍＭ、または約５ｍＭから約７ｍＭの範囲であり；またさらに任意で、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約２ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、約３ｍＭから約４ｍＭ、約４ｍＭから約５ｍＭ、約５ｍＭから約６ｍＭ、約６ｍＭから約７ｍＭ、約７ｍＭから約８ｍＭ、約８ｍＭから約９ｍＭ、または約９ｍＭから約１０ｍＭの範囲であり；なおまたさらに任意で、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、または約１０ｍＭであるか；あるいは、
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含み、かつ任意で、前記培養物におけるＬｉＡｃの最終濃度が、約０．２５から約２５ｍＭの範囲であり；
さらに任意で、前記培養物におけるＬｉＡｃの前記最終濃度が、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲である。
【請求項７】
前記浮遊培養物の量が、約２００μＬから約５Ｌの範囲であるか；前記浮遊培養物の量が、約２５ｍＬから約５０Ｌの範囲であるか；前記浮遊培養物の量が、約１００ｍＬから約１Ｌの範囲であるか；または、前記浮遊培養物の量が、約２００ｍＬから約５００ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約１×１０６から約２０×１０６細胞／ｍｌの間であるか；または、前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約２×１０６から約６×１０６の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターがＷＰＲＥエレメントを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、８０％を上回ったままの細胞生存率で、２．５×１０６細胞／ｍｌを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清／無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含み；任意で、前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２９３細胞または２９３細胞の派生物が、１種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、前記方法であって、任意で以下のうち少なくとも１つをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法：
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＰＫＢａからなるリストから選択される；
前記２９３細胞または２９３細胞の派生物が、１種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する；
前記２９３細胞または２９３細胞の派生物が、１種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する。
【請求項１４】
前記第１の期間が、約２時間から約４日、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり、任意で、前記第１の期間が、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の期間が、約１０時間から約１０日、約２時間から５日、約２．５時間から４日、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり、任意で、前記第２の期間が、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の他の実施形態は、本発明の図面および明細書、並びに特許請求の範囲の記載に照らせば、当業者にとって明らかであろう。
[本発明1001]
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法：
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×106から約2×107細胞／ｍｌの間の細胞密度を有する、工程；
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を第1の期間にわたってインキュベートする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程；
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程；および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
[本発明1002]
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293Ｆ細胞、293Ｆ細胞の派生物、ＰＥＲ−Ｃ6細胞、ＰＥＲ−Ｃ6細胞の派生物、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞の派生物、ＣａｐＴ細胞、ＣａｐＴ細胞の派生物、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ細胞の派生物、ＣＯＳ−7細胞、ＣＯＳ−7の派生物、Ｓｐ2／0細胞、またはＳｐ2／0細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記浮遊培養物が293Ｆ細胞の派生物を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記浮遊培養物の量が、約200μＬから約5Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記発現増強物質組成物が、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも1つ、または前述の任意の組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
バルプロ酸（ＶＰＡ）の濃度が、約0．20ｍＭから約25ｍＭの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バルプロ酸の前記濃度が、約0．25ｍＭから約24ｍＭ、約0．26ｍＭから約23ｍＭ、0．27ｍＭから約23ｍＭ、0．28ｍＭから約23ｍＭ、0．29ｍＭから約22ｍＭ、約0．30ｍＭから約21ｍＭ、約0．31ｍＭから約20ｍＭ、約0．32ｍＭから約19ｍＭ、約0．33ｍＭから約17ｍＭ、約0．34ｍＭから約18ｍＭ、約0．35ｍＭから約17ｍＭ、約0．36ｍＭから約16ｍＭ、約0．37ｍＭから約15ｍＭ、約0．40ｍＭから約14ｍＭ、約0．41ｍＭから約13ｍＭ、約0．42ｍＭから約12ｍＭ、約0．43ｍＭから約11ｍＭ、約0．44ｍＭから約10ｍＭ、約0．45ｍＭから約9ｍＭ、約0．46ｍＭから約8ｍＭ、約0．47ｍＭから約7ｍＭ、約0．48ｍＭから約6ｍＭ、約0．49ｍＭから約5ｍＭ、約0．50ｍＭから約4ｍＭ、約0．50ｍＭから約4ｍＭ、約0．55ｍＭから約3ｍＭ、0．6ｍＭから約2ｍＭまたは0．75から約1．5ｍＭ、約0．15ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．16ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．17ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．18ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．19ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．20ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．25ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．30ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．40ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．50ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．60ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．70ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．80ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．90ｍＭから約1．5ｍＭ、または約0．10ｍＭから約1．5ｍＭの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0．2ｍＭから約100ｍＭの範囲である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0．5から約80ｍＭ、約0．4ｍＭから約70ｍＭ、約0．5ｍＭから約60ｍＭ、約0．6ｍＭから約50ｍＭ、約0．7ｍＭから約40ｍＭ、約0．8ｍＭから約30ｍＭ、約0．9ｍＭから約20ｍＭ、約1ｍＭから約15ｍＭ、約2ｍＭから約10ｍＭ、約3ｍＭから約9ｍＭ、約4ｍＭから約8ｍＭ、または約5ｍＭから約7ｍＭの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約1ｍＭから約10ｍＭ、約1ｍＭから約2ｍＭ、約2ｍＭから約3ｍＭ、約3ｍＭから約4ｍＭ、約4ｍＭから約5ｍＭ、約5ｍＭから約6ｍＭ、約6ｍＭから約7ｍＭ、約7ｍＭから約8ｍＭ、約8ｍＭから約9ｍＭ、または約9ｍＭから約10ｍＭの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約1ｍＭ、約1．5ｍＭ、約2ｍＭ、約2．5ｍＭ、約3ｍＭ、約3．5ｍＭ、約4ｍＭ、約4．5ｍＭ、約5ｍＭ、約5．5ｍＭ、約6ｍＭ、約6．5ｍＭ、約7ｍＭ、約7．5ｍＭ、約8ｍＭ、約8．5ｍＭ、約9ｍＭ、約9．5ｍＭ、または約10ｍＭであってもよい、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記培養物におけるＬｉＡｃの最終濃度が、約0．25から約25ｍＭの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培養物におけるＬｉＡｃの前記最終濃度が、約0．26ｍＭから約20ｍＭ、約0．27ｍＭから約15ｍＭ、約0．28ｍＭから約10ｍＭ、約0．29ｍＭから約5ｍＭ、約0．3ｍＭから約4．5ｍＭ、約0．31ｍＭから約4ｍＭ、約0．35ｍＭから約3ｍＭ、約0．5ｍＭから約2．5ｍＭ、約1ｍＭから約3ｍＭ、約1．5ｍＭから約2．5ｍＭ、または約2ｍＭから約3ｍＭの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記発現増強物質組成物が酪酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約0．25から約25ｍＭ、約0．26ｍＭから約20ｍＭ、約0．27ｍＭから約15ｍＭ、約0．28ｍＭから約10ｍＭ、約0．29ｍＭから約5ｍＭ、約0．3ｍＭから約4．5ｍＭ、約0．31ｍＭから約4ｍＭ、約0．35ｍＭから約3ｍＭ、約0．5ｍＭから約2．5ｍＭ、約1ｍＭから約3ｍＭ、約1．5ｍＭから約2．5ｍＭ、または約2ｍＭから約3ｍＭの範囲である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記浮遊培養物の量が、約25ｍＬμｌから約50Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記浮遊培養物の量が、約100ｍＬμｌから約1Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記浮遊培養物の量が、約200ｍＬμｌから約500ｍＬの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×106から約20×106細胞／ｍｌの間である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×106から約6×106の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記発現ベクターがｐＣＤＮＡ3．3の派生物である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
ｐＣＤＮＡ3．3の前記派生物がＷＰＲＥエレメントを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記発現ベクターがＷＰＲＥエレメントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80％を上回ったままの細胞生存率で、2．5×106細胞／ｍｌを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清／無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ18、Ｐ21、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＰＫＢａからなるリストから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2．5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。