【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年6月8日(2016.6.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本明細書では、標的抗原に対する１次抗体またはその一部の親和性成熟方法を提供する。この方法では、関連抗体またはその一部が、対応する型の１次抗体よりも標的抗原に対する活性の低下を示すことが特定され、この関連抗体またはその一部は、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、１）対応する関連抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対し少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または２）関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同等であり、および／または少なくとも１つの関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子のＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントに同等である抗体かのいずれかである。さらに、この方法では、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と比較される。比較後、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域が特定され、それにより、標的領域が、関連抗体の同じ領域に比べて、少なくとも１つのアミノ酸差異を示す１次抗体中の領域であることが特定される。標的領域の特定後、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖を含む複数の改変抗体またはその一部が産生され、単一アミノ酸残基の置換を、例えば、各複数抗体の標的領域が１次抗体と比較して別のアミノ酸への置換を含むように行い、標的領域中の少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が改変される。得られた複数の変異抗体は、標的抗原に対する活性により選別される。改変抗体は、１次抗体に比べ標的抗原に対する活性増加を示す。この方法の一例では、１次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を作ることにより複数の改変抗体が産生され、核酸分子が、標的領域中に未改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数のそれぞれの核酸分子が、標的領域中で単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
別の例では、関連抗体は、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１つの関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同等であり；および／または１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同等である関連可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。例えば、関連抗体は、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来であり；および／または少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来である関連可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。このような例では、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖は、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本明細書の方法では、１次抗体は、コンビナトリアル抗体ライブラリーの選別により特定され、コンビナトリアル抗体ライブラリーは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはそのインフレームの一部を組み合わせ、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し；さらにＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントまたはそのインフレームの一部、もしくはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせ、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成することにより作られる。組み合わせのステップでは、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、ＶλまたはＪλのそれぞれの部分は、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨもしくはＶＬまたはその一部を含む抗体またはその一部を作るのに充分である。組み合わせのステップは、複数の異なる核酸分子の配列を生成するために複数回繰り返される。核酸分子が合成され、２つのライブラリーが作られる。第一のライブラリーは、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；さらに第２のライブラリーは、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む。第１および第２ライブラリー由来の核酸分子が細胞に導入され、これを複数回繰り返し、細胞ライブラリーを産生し、この中の各細胞は、細胞ライブラリー由来の他のあらゆる細胞とのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む。最後に、コンビナトリアルライブラリーを生成する方法で、細胞が成長し、各細胞中で抗体またはその一部が発現し、それにより複数の抗体またはその一部を産生し、ライブラリー中の各抗体またはその一部が、ライブラリー中の全ての他の抗体またはその一部との種々の組み合わせの抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨもしくはＶＬ鎖またはその一部を含む。１次抗体を特定するために、ライブラリーは、選別されるライブラリー中の抗体またはその一部を標的タンパク質と接触させ、抗体またはその一部と標的タンパク質の結合、および／または抗体またはその一部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価することにより選別され；さらに標的タンパク質に対する活性を示す抗体またはその一部を特定する。ここで特定された抗体またはその一部が１次抗体である。同様に、関連抗体もまた、このようなコンビナトリアル抗体ライブラリーを標的抗原に対し選別し、１次抗体に比べて標的抗原に対し低い活性を示す関連抗体を特定する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
本明細書で使われる「関連可変重鎖」または「関連可変軽鎖」は、対応する参照抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖と配列同一性を示すが、対応する参照抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖と同じではない（例えば、１００％配列同一性を示さない）ものである。通常、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と少なくとも６０％配列同一性、通常、少なくとも７５％配列同一性を示すものである。例えば、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と６０％〜９９％配列同一性、例えば、正確にまたは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すものである。例えば、関連抗体には、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じであり、および／または可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶκおよびＪκまたは少なくとも１つのＶλおよびＪλ生殖系列セグメントが、１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶκおよびＪκまたはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントと同一である抗体が含まれる。通常、抗体の関連可変重鎖および／または可変軽鎖は、対応する参照抗体の可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を示す。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４０】
本明細書の目的に対しては、重鎖生殖系列セグメントは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨとして設計され、その編集により、ＶＨ鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖生殖系列セグメントは、カッパおよびラムダ軽鎖（ＶκおよびＪκ；ＶλおよびＪλ）を含むＶＬまたはＪＬとして設計され、その編集により、ＶＬ鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖であるが、ＶκおよびＪλの編集によるカッパ／ラムダの組み合わせは含まないことは理解されよう。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
本明細書で使われる、生殖系列セグメントに関連する「グループ」は、免疫グロブリン由来のコアコード領域、すなわち、重鎖または軽鎖をコードする可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、連結（Ｊ）遺伝子または定常（Ｃ）遺伝子、を指す。代表的な生殖系列セグメントグループには、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、ＶλおよびＪλが含まれる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４２】
完全長抗体は、４つのポリペプチド鎖、２つの等価な重（Ｈ）鎖（通常、それぞれ、約４４０アミノ酸を含む）および２つの等価な軽（Ｌ）鎖（それぞれ、約２２０アミノ酸を含む）を含む。軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なる形で存在する。各鎖は、可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域ドメイを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインとして組織化された一連のドメインにまとめられる。軽鎖は、Ｃ領域（ＣＬ）および可変領域（ＶＬ）に対応する２つのドメインを有する。重鎖は、４つのドメインの可変領域（ＶＨ）およびＣ領域中に３つまたは４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）、および一部のケースではヒンジ部を有する。４つの鎖（２つの重鎖と２つの軽鎖）は、共有結合（ジスルフィド）および非共有結合により一緒に保持されている。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４５】
ｂ．抗体配列および特異性
重鎖および軽鎖の可変領域は、非コード領域またはイントロンで分離された複数の生殖系列遺伝子セグメントによりコードされており、異なる染色体上に存在することが多い。Ｂ細胞分化の間に、生殖系列ＤＮＡは、再構成され、それにより、重鎖座位の１つのＤＨおよび１つのＪＨ遺伝子セグメントが組み換えられ、続いて、ＶＨ遺伝子セグメントの結合によりＶＨ鎖をコードする再構成ＶＤＪ遺伝子が形成される。再構成は、対立遺伝子排除のプロセスにより、単一重鎖対立遺伝子上でのみ起こる。対立遺伝子排除は、インフレームまたはＶＤＪセグメントの「増殖性」組換えにより調節されており、これは、ＶＤＪ組換え可変重鎖の約１／３で発生する。このような増殖性組換えイベントが細胞中で最初に起こる場合には、これにより、プレＢ細胞の表面上に発現したμ重鎖が産生され、さらなる重鎖組換えの停止シグナルを送り、それにより対立遺伝子重鎖座位の発現を防止する。表面に発現したμ重鎖は、また、再構成のためのカッパ（κ）座位を活性化する作用も行う。κ組換えが両座位で非生産的である場合、ラムダ（λ）座位は、再構成のための活性化のみが行われる。軽鎖再構成イベントは、ＶＬおよびＪＬセグメントのみ組み換えられることを除いて、重鎖に類似である。それぞれの１次転写の前に、対応する定常鎖遺伝子が追加される。その後の転写およびＲＮＡスプライシングによりｍＲＮＡが得られ、インタクト軽鎖または重鎖に翻訳される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２９８】
アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、組換えヒト生殖系列セグメントからなる可変重鎖および可変軽鎖を有する抗体を含む。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のＶ、ＤおよびＪセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別Ｖ（ＶκまたはＶλ）およびＪ（ＪκまたはＪλ）セグメントの組換えから生ずる。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３００
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３００】
米国仮出願特許第６１／１９８、７６４号、および６１／２１１、２０４号、ならびに国際公開第２０１００５４００７号（参照によって本明細書に組み込まれる）には、抗体メンバーの組み合わせ生成の理由により、各抗体の同一性が選別時点で既知であるコンビナトリアル抗体ライブラリーを生成する方法が提供されている。アドレス指定可能なコンビナトリアルライブラリーでは、ライブラリーの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）メンバーは、既知の生殖系列抗体配列またはその改変配列から、組換えでまたは合成的にＤＮＡ合成により生成される。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のＶ、ＤおよびＪセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別のＶ（ＶκまたはＶλ）およびＪ（ＪκまたはＪλ）セグメントから生成する。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３０１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３０１】
ライブラリー中の抗体の各ＶＬ鎖は、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドン、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントがインフレームで連結される。生殖系列セグメントは、ＶＬセグメントがＪＬセグメントの５’となるように連結される。ライブラリー中の抗体の各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントは、インフレームで連結される。生殖系列セグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントの５’であり、これがＪＨセグメントの５’となるように、連結される。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３０３】
可変重鎖または可変軽鎖をコードする核酸が、以下のように産生される。最初のステップで、それぞれの生殖系列セグメント（重鎖に対するＶＨ、ＤＨおよびＪＨまたは軽鎖に対するＶκおよびＪκ、またはＶλおよびＪλ）が組み換えのために選択される。生殖系列セグメントは、ヒト生殖系列セグメントもしくは、その縮重配列でも、あるいは、改変されていてもよい。例えば、可変重鎖のＤＨセグメントは、任意の読み枠に翻訳されてもよく、あるいは、ＤＨセグメントは、ＤＨ生殖系列セグメントの逆相補配列であってもよい。選択されるとすぐ、生殖系列セグメントは、組換え完全長核酸が５’開始コドン（ＡＴＧ）を有するインフレームとなるように連結され、それにより、完全長ポリペプチドの発現を可能とする。任意のＶ（Ｄ）Ｊの組み合わせが可能であり、従って、編集されたインフレームのＶ（Ｄ）Ｊ配列を生成するために接合部が改変され、一方、各セグメントの読み枠は保存される。Ｖセグメントは、常に読み枠１である。Ｊセグメントの読み枠は、適切なアミノ酸がコードされるように選択される。Ｄセグメントは、どのような読み枠でも可能だが、通常、読み枠は、生じたアミノ酸の疎水性が優るように選択される。必要に応じ、各セグメントが所望の読み枠に入るように、遺伝子セグメントの間の接合部で核酸の改変がなされる。例えば、Ｖ−Ｄ接合部では、１つまたは複数のヌクレオチドがＤの５’末端から欠失、１つまたは複数のヌクレオチドがＶの３’末端から欠失、または１つまたは複数のヌクレオチドがＶとＤに間に挿入されうる（例えば、ヌクレオチドは、Ｖの３’末端に追加できる）。接合部が形成されるとすぐに、配列は改変され、いずれの停止コドンもヌクレオチドに置換されることにより、例えば、停止コドンＴＡＡがコドンＴＡＴにより置換され；停止コドンＴＡＧがコドンＴＡＴにより置換され、さらに停止コドンＴＧＡがコドンＴＣＡにより置換されることにより除去される。最終的に、核酸は、さらに改変され、例えば、不必要な制限酵素部位、スプライシングドナーもしくは受容体部位、または効率的翻訳に潜在的に有害な他のヌクレオチド配列を除去できる。核酸配列の改変には、ヌクレオチドの交換もしくは置換、挿入、または欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３１４】
通常、１次抗体および関連抗体の可変重鎖および／または軽鎖は、同じまたは関連する抗体可変領域生殖系列セグメント、例えば、同じ遺伝子ファミリー、由来である。例えば、関連抗体は、１つまたは複数の可変重鎖ＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ生殖系列セグメントまたは可変軽鎖ＶκおよびＪκもしくはＶλおよびＪλ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。この生殖系列セグメントは、１次抗体をコードする核酸配列に含まれるセグメントと同じではなく、このセグメントと同じ遺伝子ファミリーに属する。通常、関連抗体は、生殖系列セグメントの１、２、３、４、または５つが異なるまたは関連していることを除いて、１次抗体をコードする核酸配列と同じ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。例えば、関連抗体は、同じ可変重鎖ＶＨおよびＤＨ生殖系列セグメントまたは同じ可変軽鎖ＶκもしくはＶλ生殖系列セグメントを含むが異なるまたは関連するＪＨおよびＪκもしくはＪλ生殖系列セグメントを含むＶＨまたはＶＬ鎖をコードする核酸配列によってコードされる。実施例に例示されるように、選択された「Ｈｉｔ」の可変重鎖配列をコードする核酸配列と比較して、同じ可変重鎖ＶＨおよびＪＨ生殖系列セグメント（すなわちＶＨ５−５１およびＩＧＨＪ４＊０１）を含むが、異なるＤＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＩＧＨＤ６−２５＊０１対ＩＧＨＤ５−５１＊０１＞３）を有する核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が、本明細書の方法の実施のために選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、１次抗体に対し９８％の配列類似性を示す。別の例では、選択された１次抗体の可変重鎖配列をコードする核酸配列に比べて、同じＶＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＶＨ１−４６）を含むが、異なるＪＨ生殖系列セグメント（すなわち、ＩＧＨＪ１＊０１対ＩＧＨＪ４＊０１）、および関連ＤＨ生殖系列セグメント（すなわち、同じ遺伝子ファミリーＩＧＨＤ６を共有するＩＧＨＤ６−６＊０１対ＩＧＨＤ６−１３＊０１）を含む核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が本明細書の方法の実施のために、選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、１次抗体に対し９５％配列の類似性を示す。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３５２】
ｃ．生殖系列スワッピング
一部の例では、さらなる変異誘発のために選択される領域は、生殖系列セグメント、すなわち、可変重鎖Ｖ、ＤもしくはＪセグメント、または可変カッパもしくはラムダ軽鎖ＶもしくはＪセグメント、例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｖλ、Ｊκ、およびＪλである。可変重鎖では、生殖系列セグメントＶＨはＣＤＲ１およびＣＤＲ２内のアミノ酸を含み、一方、生殖系列セグメントＤＨおよびＪＨはＣＤＲ３内のアミノ酸残基を含む。可変軽鎖では、Ｖ生殖系列セグメント（例えば、ＶκまたはＶλ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２内およびＣＤＲ３の５’末端のアミノ酸残基を含み、一方、Ｊ生殖系列セグメント（例えば、ＶλおよびＪκ）はＣＤＲ３の３’末端のアミノ酸残基を含む。生殖系列セグメントが変異誘発の標的とされる場合は、アミノ酸改変は、全体生殖系列セグメントを同じタイプの別の生殖系列セグメントでスワッピング、または置換することにより、可変重鎖または軽鎖中に導入される。例えば、ＪＨ生殖系列セグメント、例えば、ＩＧＨＪ１＊０１は、異なるＪＨ生殖系列セグメント、例えば、ＩＧＨＪ２＊０１で、または任意の他のＧＨＪ生殖系列セグメントで置換される。実施例１３Ａおよび図４Ａで例示されているように、ＩＧＨＪ１＊０１のスワッピングにより、重鎖ＣＤＲ３内の６アミノ酸残基およびフレームワーク領域４内の７番目の残基の同時変異が可能となる。１つの生殖系列セグメント、例えば、ＪＨがスワッピングされ、あるいは、２つの生殖系列セグメント、例えば、ＤＨとＪＨの両方が、１つの可変重鎖内でスワッピングされうる。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３５３】
生殖系列セグメントは、重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ３をコードするために、通常、ＤまたはＪ生殖系列セグメントが変異誘発のために選択される。さらに特異的となるように、生殖系列セグメントＤＨ、ＪＨ、Ｊκ、および／またはＪλが選択される。実施例１３Ｂに例示するように、ＤＨおよびＪＨセグメント両方のスワッピングは、重鎖ＣＤＲ３のほぼ完全なスキャンをもたらす。図４Ｂに示すように、生殖系列セグメントＪＨは、３つの異なるＪＨセグメントでスワッピングされてＣＤＲＨ３の３’末端の６アミノ酸を変異させ、また、図４Ｃに示すように、ＣＤＲＨ３の中央部の５アミノ酸が改変される。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５２３】
ＰＣＲ産物を単離し、その後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させて、同様に消化させたプラスミド中に連結した。大腸菌ＤＨ５α中で連結反応生成物の形質転換および平板培養後、個々のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．４％グルコースを補充した１．５ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＥＭＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む９６ウエルブロック中、３７℃で、一晩成長させた。ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＤＮＡを単離し、アラニン変異をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５２９】
引き続いて、各ＢｓａＩ含有プラスミドをＢｓａＩで消化し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮＡをゲル精製した。特異的プライマー（ＩＤＴ）を合成し、所望の変異体を生成した。簡単に述べれば、各１μｌの順方向および逆方向プライマーを９５℃の加熱下、ＴＥ中で２分間アニールし、続いて、室温までゆっくり冷却した。次に、１μｌのアニールしたプライマーを２ｎｇのＢｓａＩ消化ベクターに連結し、大腸菌ＤＨ５ａ細胞中で形質転換した。変異をＤＮＡシーケンシングにより確認した。連結反応を、９６ウエルプレート中で行い、高スループット変異誘発を可能とする。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５３４】
プラスミドＡおよびそれぞれ種々の組み合わせの可変重鎖および軽鎖を含むプラスミドＣまたはプラスミドＥの内の１つを大腸菌中で同時形質転換した。このプロセスを、全ての重鎖および軽鎖の組み合わせに対し繰り返した。簡単に述べれば、プラスミドＡ（Ｆａｂ重鎖をコード）およびプラスミドＣまたはプラスミドＥ（Ｆａｂ軽鎖をコード）をＴＥ緩衝液中で１ｎｇ／μＬの最終濃度で別々に再懸濁した。１μＬの重鎖プラスミドおよび１μＬの軽鎖プラスミドをＰＣＲチューブまたはＰＣＲプレート中で混ぜ合わせ、２０μＬの氷冷ＬＭＧ１９４コンピテント細胞と混合した。形質転換反応系を氷上で１０分間インキュベートし、続いて、予熱ＰＣＲブロック中、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた。次に、チューブをさらに２分間氷上に置き、その後、２００μＬのＳＯＣ培地を追加した。細胞を３７℃で１．５時間回収した。１００μＬの形質転換培養液を使って０．４％（ｗ／ｖ）グルコース、１７μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む０．９ｍＬＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｂｒｏｔｈ）培地に播種した。培養物を激しく振盪を加えながら３０℃で２０時間成長させた。下記に記載のように、Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）システムを使って、形質転換培養物を成長させ、精製した。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５３６】
タンパク質発現および精製を自動化するＰｉｃｃｏｌｏ（登録商標）（Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ（ＴＡＰ））を使ってＦａｂ抗体の高スループット、並列発現および精製を行った。Ｐｉｃｃｏｌｏ（登録商標）用の発現および精製パラメータをＲｕｎ  Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェア（ＴＡＰ）を使って作成した。種培養プレート中の各クローンの位置をマッピングした「株ファイル（Ｓｔｒａｉｎ  Ｆｉｌｅ）」を生成した。これはＲｕｎ  Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェアで処理され、基本的に装置設定を下記のように設定した：前誘発インキュベーターは３０℃に設定；発現インキュベーター１を１６℃に設定；遠心分離を６℃と５０００ｘｇに設定；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ；１Ｌ中に、１２ｇトリプトン、２４ｇ酵母抽出物、９．４ｇ二塩基性カリウムリン酸塩、および２．２ｇ一塩基性カリウムリン酸塩、を含有）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログＮｏ．７１７５４）を満たした培地ポンプ（Ｍｅｄｉａ  Ｐｕｍｐ）１、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０１５％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）；０．２％（ｗ／ｖ）アラビノース（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を満たしたインデューサーポンプ（Ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｐｕｍｐ）１；インキュベーターガス処理速度を５１％酸素で２秒に設定、０．１ｍＬ播種容量；帰納統計平均を外れ値除外に設定（すなわち、３つの最高値および３つの最低値を除いた後に求められるブロック平均ＯＤ６００）；ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｂｌｏｃｋ（ＣＶＢ）前誘発遅延を１時間２０分に設定、および発現インキュベーター順化（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ａｃｃｌｉｍａｔｉｚａｔｉｏｎ）を３０分に設定。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５４４】
Ａ．複数抗原に対する結合のためのマルチスポット（Ｍｕｌｔｉｓｐｏｔ）ＥＣＬアッセイ
上記に挙げた各抗原を、９６ウエルマルチスポット１０Ｈｉｇｈｂｉｎｄプレート（メソ・スケール・ディスカバリー；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）の表面上に５０ナノリッター（ｎｌ）の各タンパク質（６０μｇ抗原／ｍＬ）の量でスポット状に配置することにより１０プレートの各ウエル上に固定化した。スポット１０は、対照にするため、ブランクで残した。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５４５】
１５０μｌの分量の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中溶液を各ウエルに添加し、２０℃で３０分間、インキュベートし、続いて、洗浄およびタップ乾燥して残っている溶液を完全に除去した。その後、１２．５μｌの分量の１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴを各ウエルに添加し、続いて、１２．５μｌの分量の精製Ｆａｂを添加した。プレートをシールして、振盪を加えながら、２０℃で１時間インキュベートした。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５４６】
メーカーのインストラクションに従って、検出抗体を、それぞれヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｋ３５０２−１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｌ１６４５−１ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の両方をルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルフォ−タグＮＨＳ−エステル、メソ・スケール・ディスカバリー）に結合させることにより調製した。２５μｌのＴＡＧ検出抗体を各ウエルに添加し、振盪を加えながら、２０℃で１時間インキュベートした。最後に、１５μｌの読み取り緩衝液（Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ）Ｐを界面活性剤（Ｃａｔ＃Ｒ９２ＰＣ−１、メソ・スケール・ディスカバリー）と一緒に各ウエルに添加した。電気化学発光をＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００（メソ・スケール・ディスカバリー）を使って測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のＥＣＬシグナルを比較することによりデータを解析した。４以上のブランクに対するシグナルの比率の場合に、「Ｈｉｔ」Ｆａｂと見なした。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５４８】
最初のマルチスポットＥＣＬ選別から「Ｈｉｔ」を確認するために、Ｆａｂ濃度依存性滴定を行いＦａｂ−抗原結合親和性を測定した。下表に示すように、Ｆａｂ抗体の濃度が、各試験Ｆａｂに応じて、ウエル間で０．１ｎＭ〜２．４μＭ変動することを除いて、マルチスポットＥＣＬアッセイ法の結果は上記と同じであった。データを下表１１〜３３に示す。
【表１１】
2013510164.tif 000001
【表１２】
2013510164.tif 000002
2013510164.tif 000003
【表１３】
2013510164.tif 000004
【表１４】
2013510164.tif 000005
【表１５】
2013510164.tif 000006
【表１６】
2013510164.tif 000007
【表１７】
2013510164.tif 000008
【表１８】
2013510164.tif 000009
【表１９】
2013510164.tif 000010
【表２０】
2013510164.tif 000011
【表２１】
2013510164.tif 000012
【表２２】
2013510164.tif 000013
【表２３】
2013510164.tif 000014
【表２４】
2013510164.tif 000015
【表２５】
2013510164.tif 000016
【表２６】
2013510164.tif 000017
【表２７】
2013510164.tif 000018
【表２８】
2013510164.tif 000019
【表２９】
2013510164.tif 000020
【表３０】
2013510164.tif 000021
【表３１】
2013510164.tif 000022
【表３２】
2013510164.tif 000023
【表３３】
2013510164.tif 000024
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５４９】
Ｂ．ＤＬＬ４に対する結合に対する９６ウエルプレートＥＣＬアッセイ
試験ウエルプレート毎にただ１つの抗原を単一スポットに固定したこと以外は、同様にＥＣＬアッセイを行った。５μＬ（ＰＢＳ＋０．０３％トリトン−Ｘ−１００中の１０μｇ／ｍｌ  ＤＬＬ４溶液の）を各ウエルに添加し、２０℃で一晩インキュベートすることにより、組換え型ヒトＤＬＬ４（Ｃａｔ＃１５０６−Ｄ４／ＣＦ）を９６ウエルプレート上に固定した。１つのウエルは、対照としてブランクのまま残した。タンパク質を取りだし、１５０μ;ｌの分量のＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ溶液を各ウエルに添加し、２０℃で１時間インキュベートし、続いて、１５０μｌのＴＢＳＴで２回洗浄後、タップ乾燥して、完全に残っている溶液を除去した。その後、２５μｌの分量の各Ｆａｂ（ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡを含む）を各ウエルに添加した。プレートをシールし、振盪を加えながら２０℃で１時間インキュベートした。実施例７と１２で記載のように、２つの異なる抗原とＦａｂ濃度の組み合わせを使用した。１つの実験では、５μＬの３０μｇ／ｍＬ抗原を使って、プレートをコートし、各Ｆａｂを０．０２μＭの濃度で試験した。他の実験では、５μＬの１５μｇ／ｍＬ抗原を使って、プレートをコートし、各Ｆａｂを０．００４μＭの濃度で試験した。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５５０】
その後、Ｆａｂを取りだし、２５μｌの抗ヒトカッパルテニウム抗体または抗ヒトラムダルテニウム抗体（ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ溶液中の１μｇ／ｍｌ）を各ウエルに添加し、振盪を加えながら２０℃で１時間インキュベートした。最後に、１５μｌの読み取り緩衝液Ｐと界面活性剤（Ｃａｔ＃Ｒ９２ＰＣ−１、メソ・スケール・ディスカバリー）を各ウエルに添加した。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００（メソ・スケール・ディスカバリー）を使って電気化学発光を測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のＥＣＬシグナルを比較することによりデータを解析した。４以上のブランクに対するシグナルの比率を、「Ｈｉｔ」Ｆａｂと見なした。結果を下記の実施例７〜１５に示す。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５５２】
結果を下表３４に示す。表３４は、Ｆａｂ、ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、およびＫＤ（ｎＭ）ならびに標準偏差（括弧で）を示す。生殖系列Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、４．８μＭの平均ＫＤを有する。生殖系列Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＆Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１は、ＤＬＬ４に７３０ｎＭの平均ＫＤで結合する。生殖系列Ｆａｂ  ＶＨ６−１＿ＩＧＨＤ３−３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ４−３＿ＩＧＬＪ４＊０１は、３８μＭの平均結合親和性を有し、一方、生殖系列Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は、５００ｎＭの平均ＫＤを有する。
【表３４】
2013510164.tif 000025
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５５４】
Ａ．９６ウエルプレート
簡単に述べれば、０．５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４の１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中溶液（ｐＨ９）５０μｌを９６ウエルＣｏｓｔａｒプレート（Ｃａｔ＃３３７０、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）の各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中の１％ＢＳＡを添加してブロッキングして、室温で１時間インキュベートし、続いて、１５０μｌＴＢＳＴで２回洗浄した。ＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡを用い、Ｆａｂ抗体を１０００ｎＭの濃度から出発して系列希釈した。５０μｌの分量の各系列希釈物を３回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、２回ＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃ＡＢ１２３８−２００、Ａｂｃａｍ）で１：１０００に希釈した５０μｌのヤギ抗ＤＤＤＤＫタグＨＲＰ結合ポリクローナル抗体を各ウエルに添加し、プレートを室温で３０分インキュベート後、２００μｌ  ＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ一液型試薬（Ｃａｔ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦａｘ）を添加し、室温で２分間発色させた。１００μｌの０．５Ｍ  Ｈ２Ｓ０４を添加して反応を直ちに停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って、４５０ｎｍの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を実施例９と１０で示す。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５５５】
Ｂ．３８４ウエルプレート
簡単に述べれば、０．５μｇ／ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中ＤＬＬ４溶液（ｐＨ９）１０μｌを３８４ウエルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｃａｔ＃４６４７１８、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の各ウエルに添加し、室温で９０分間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン（ＴＢＳＴ）中１％ＢＳＡを添加してブロッキングを行い、室温で１時間インキュベートした後、１００μｌＴＢＳＴで２回洗浄した。ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて１０００ｎＭの濃度から出発して、Ｆａｂ抗体を系列希釈した。２０μｌの分量の各系列希釈液を３回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、１００μｌのＴＢＳＴで２回洗浄した。軽鎖に依存して、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃Ａ７１６４−１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１：１０００に希釈したヤギ抗カッパＨＲＰ結合ポリクローナル抗体の２０μｌ、または、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（Ｃａｔ＃Ｌ１６４５−１ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１：１０００に希釈したヤギ抗ラムダＨＲＰ結合ポリクローナル抗体の２０μｌを各ウエルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした後、１００μｌのＴＢＳＴで４回洗浄した。最後に、２５μｌのＴＭＢ一液型試薬（Ｃａｔ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦａｘ）を添加し、室温で１〜５分間発色させた。２５μｌの０．５Ｍ  Ｈ２Ｓ０４を添加して直ちに反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って４５０ｎｍでの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を、実施例９と１０で示す。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０５６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０５６０】
実施例４Ｂに記載のように、ＥＣＬ９６ウエルプレートアッセイを使って、精製Ｆａｂアラニン変異体をＤＬＬ４との結合に関し試験した。５μＬの１０μｇ／ｍＬ組換え型ヒトＤＬＬ４抗原を９６ウエルプレートにコートし、を０．０４μＭの濃度で添加した。対照として、９６ウエルプレートのブランクウエルへのＦａｂのバックグラウンド結合も測定した。データをＥＣＬシグナルのシグナル／ノイズ比率として示したが、これは、ＤＬＬ４との結合のＥＣＬシグナルを、プレートに対する残りの結合のＥＣＬシグナルで除算した比率である。表３５で、試験変異体ＦａｂおよびＤＬＬ４との結合に対し観察されたシグナル／ノイズ比率を示す。結果は、Ｅ１００、Ｙ１０１、Ｓ１０５、Ｅ１０７またはＱ１１０のアラニンによる変異が、ＥＣＬシグナルの減少を引き起こし、従って、ＤＬＬ４に対する結合親和性を低減させたことを示している。従って、これらの残基は、ＤＬＬ４結合に関与していると思われ、これ以上は変異誘発しなかった。対照的に、Ｓ１０２、Ｓ１０３、Ｓ１０４またはＨ１１１のアラニンによる変異により、親に比較してＥＣＬシグナルが増加したか、またはＥＣＬシグナルが変化せず、従って、ＤＬＬ４に対する結合親和性を改善したか、または結合親和性に影響を与えなかった。これにより、これらの残基は、さらなる変異誘発用の残基として特定された。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０６１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０６１０】
Ｃ．軽鎖
１．ＣＤＲ３のアラニンスキャンニング
親Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１Ｇ１００Ｋ／Ｇ１０４Ｔ（Ｈ：ＫＴ）＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ＊０１の軽鎖のＣＤＲ３中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、ＤＬＬ４結合に関与しないと思われるアミノ酸残基を特定した。ＣＤＲ３の全ての残基を変異させるアラニン置換変異導入を行った。精製Ｆａｂアラニン変異体に対し、ＥＣＬマルチスポットアッセイを使って、０．０４μＭの濃度でＤＬＬ４に対する結合の試験を行った。した。結果を下表９３〜９４に示す。結果は、アミノ酸残基Ｌ９２、Ｙ９３、Ｇ９５、Ｇ９７、Ｉ９８、またはＳ９９のアラニンへの変異により、ＤＬＬ４に対する結合が低減することを示したので、これらの残基に対しては、これ以上の変異誘発を行わなかった。Ｖ９１、Ｍ９４、またはＳ９６のアラニンによる置換は、ＤＬＬ４に対する結合を改善したか、またはＤＬＬ４に対する結合に影響を与えなかった。従って、これらの残基を、さらなる変異誘発のための残基として特定した。
【表９２】
2013510164.tif 000026
【表９３】
2013510164.tif 000027
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０６２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０６２７】
要約
親和性成熟の結果として、親Ｈｉｔ  Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１のＤＬＬ４に対する結合親和性が１３０倍増加した（下表１０８のＳＰＲデータ参照）。親Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＆Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、４．８μＭのＫＤでＤＬＬ４に結合する。重鎖変異体Ｆａｂ  Ｈ：ＫＴ＆Ｌ：ｗｔは、ＤＬＬ４に対する親和性が１３倍増加する（ＫＤ＝３５５ｎＭ）。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Ｆａｂ  Ｈ：ＫＴＴＲＶ＆Ｌ：ｗｔは、３６．２ｎＭのＫＤを有し、ＤＬＬ４に対する結合親和性の１３０倍の増加になる。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Ｆａｂ  Ｈ：ＫＴ  ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰおよびＨ：ＫＴ  ＴＲＶ＆Ｌ：ＬＰ  Ｓ５２Ｇは、それぞれ、３．３および５．０ｎＭのＫＤを有し、ＤＬＬ４に対する結合親和性の１０００倍の増加になる。
【表１０７】
2013510164.tif 000028
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０６４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０６４２】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのリポフェクタミン（登録商標）トランスフェクション試薬を使って、完全長ＤＬＬ４およびｐＯＧ４４リコンビナーゼベクター（配列番号２９３６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｋ６０１００１）を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭＳｙｓｔｅｍプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−ＩｎＴＭ−ＣＨＯ細胞株（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７５８０７）に形質移入した。細胞を１２ウエルプレート中で約９０％集密とした。２日後、形質移入した細胞を４００μｇ／ｍｌヒグロマイシンで選択した。５日後、コロニーを採取し、１０ｃｍ２組織培養皿に移した。これらの細胞株をヒグロマイシン選択により維持した。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０６４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０６４５】
簡単に述べれば、完全長ＤＬＬ４（ＣＨＯ−ＤＬＬ４）を発現しているＣＨＯ細胞を、実施例１６に記載のように、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ＃００−４５５５−５６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って組織培養プレートから採取した。Ｆａｂを５０ｎＭの出発濃度から開始する２％ＢＳＡ／ＰＢＳの５倍系列により希釈した。メーカーのインストラクションに従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（ｃａｔ＃２０２１７．Ｐｉｅｒｃｅ）を使って、Ｎｏｔｃｈ−ＦＣ（ｃａｔ＃３６４７−ＴＫ−０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をビオチン化した。採取した細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の２５０ｎＭビオチン化Ｎｏｔｃｈ−ＦＣおよび３０μＬ  Ｆａｂで３０分間、氷上で処理した。次に、ＰＥ−標識ストレプトアビジン（Ｃａｔ＃２１６２７、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して１：５の最終希釈度にし、続けて、室温で１０分間インキュベーションを行った。次に、細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａを使ってフローサイトメトリーにより分析した。