【手続補正書】
【提出日】平成28年3月9日(2016.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（ＶＩ）を有するニトロキシル化されたタンパク質：
【化１】
2015514718.tif 000001
[式中、
Ｚは、タンパク質を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素であり；
Ｙは、ＣＨ２であり；
ｍは、０または１であり；
ｎは、０または１であり；
ｐは、タンパク質に抱合されたニトロキシル基の平均数であり；および
Ｎは、タンパク質の窒素である]。
【請求項２】
ニトロキシル化されたタンパク質を製造するための方法であって、式（Ｉ）のニトロキシル化薬とタンパク質を反応することを含む方法：
【化２】
2015514718.tif 000002
[式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｘは、酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素であり；
Ｙは、ＣＨ２であり；
ｎは、０または１であり；および、
ｍは、０または１である]。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、−ＣＨ３であり；
ｎは、１であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；および／または
ｍは、１である、
請求項１または２に記載のニトロキシル化されたタンパク質または方法。
【請求項４】
前記タンパク質のＮ末端アミノ基はニトロキシル化されているか、または、少なくとも１つのリジン残基のイプシロン（ε）−アミノ基はニトロキシル化されており；および／または
ｐは、約１〜約２５である、
請求項１または３に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、ヘモグロビン（Ｈｂ）α−サブユニット、ヘモグロビンβ−サブユニット、ヘモグロビン四量体、ミオグロビンまたはアルブミンを含み、所望により：
前記アルブミンは血清アルブミン（所望によりヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））を含み；
前記ヘモグロビンα−サブユニットはヒトヘモグロビンα−サブユニットを含むか、前記ヘモグロビンβ−サブユニットはヒトヘモグロビンβ−サブユニットを含むか、または前記ヘモグロビン四量体はヒトヘモグロビンα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み；
前記ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含み；および／または
前記ヘモグロビン四量体は、約１７のニトロキシル化されたアミノ基を含む、
請求項１、３、および４のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項６】
前記ヘモグロビン四量体は、架橋されたαα二量体または架橋されたββ二量体を含み；
前記ヘモグロビン四量体はヒトヘモグロビンα−サブユニットを含み、前記ヒトヘモグロビンα−サブユニットは、Ｎ末端バリン残基のα−アミノ基にて、および／またはリジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるリジン残基のε−アミノ基にてニトロキシル化され；および
前記ヘモグロビン四量体は、所望により、ヒトヘモグロビンβ−サブユニットをさらに含み、前記ヒトヘモグロビンβ−サブユニットは、前記Ｎ末端バリン残基の前記α−アミノ基にて、および／またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるリジン残基の前記ε−アミノ基にてニトロキシル化される、
請求項５に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項７】
前記ニトロキシル化されたタンパク質は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）に抱合されており、前記ＰＡＯは、所望により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり：
前記ＰＥＧは、所望により、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有し；
前記ＰＥＧは、所望により、マレイミド−ＰＥＧであり、前記マレイミドは、所望により、アルキレンまたはフェニレンリンカーを介してＰＥＧに連結され、前記アルキレンリンカーは、所望により、エチレンリンカーであり；および／または
前記ＰＥＧは、所望により、スクシンイミジルバレラートＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）である、
請求項１、２、および４〜６のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のニトロキシル化されたタンパク質であって、前記マレイミド−ＰＥＧは、前記タンパク質のシステイン残基の固有のチオール部分、前記タンパク質のチオール化されたリジン残基のチオール部分およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のチオール部分に抱合されており、前記マレイミド−ＰＥＧは、所望により、構造（ＶＩＩＩ）を有する、ニトロキシル化されたタンパク質：
【化３】
2015514718.tif 000003
[式中、
Ｚは、前記タンパク質を表し、
Ｓは、前記タンパク質のチオールであり、
Ｒ３は、アルキレンまたはフェニレン基であり、
Ｘは、末端基であり、
ｍは、前記タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の平均数であり、および
ｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数を表す]。
【請求項９】
Ｒ３は、エチレンであり；
ｍは、約６〜約１０であり；
Ｘは、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはカルボキシレート（−ＣＯＯＨ）であり；
前記マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンβ−サブユニットのシステイン−９３残基のチオール部分に抱合されており；および／または
前記マレイミド−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基のチオール部分に抱合され、前記チオール化されたリジン残基は、所望により、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのチオール化されたリジン残基、またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのチオール化されたリジン残基である、
請求項８に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項１０】
前記ＰＥＧは、スクシンイミジルバレラートＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）であり、前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、前記タンパク質のリジン残基のε−アミノ部分、前記タンパク質の末端バリン残基のα−アミノ部分またはこれらの組み合わせから選択されるタンパク質のアミノ部分に抱合されており、前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、所望により、構造（ＩＸ）を有する、請求項７に記載のニトロキシル化されたタンパク質：
【化４】
2015514718.tif 000004
[式中、
Ｚは、前記タンパク質であり、
Ｎは、前記タンパク質のアミノ基であり、
Ｘは、末端基であり、
ｍは、タンパク質に抱合された活性化されたＰＥＧ重合体の数であり、および
ｎは、約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレンユニットの平均数である]。
【請求項１１】
Ｘは、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはカルボキシレート（−ＣＯＯＨ）であり；
ニトロキシル化されたタンパク質は、ヘモグロビン四量体を含み、ｍは、平均で四量体あたり約６〜約１０ＰＡＯ分子であり；
前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのリジン残基のε−アミノ部分に抱合され、前記リジン残基は、所望により、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのリジン残基、またはリジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのリジン残基であり；および／または
前記ＳＶＡ−ＰＥＧは、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットの末端バリン残基のα−アミノ部分に抱合されている、
請求項１０に記載のニトロキシル化されたタンパク質。
【請求項１２】
請求項５〜１１の少なくとも１つのα−サブユニットおよび／または請求項５〜１１の少なくとも１つのβ−サブユニットを含むヘモグロビン四量体であって、
前記ヘモグロビンは、所望により、平均で四量体あたり５〜１０ＰＡＯ分子に抱合されており；および／または
前記ヘモグロビンは、酸素化される、脱酸素化される、またはＣＯ、ＮＯまたはＣＯおよびＮＯの混合物とリガンド結合している、
ヘモグロビン四量体。
【請求項１３】
請求項１および３〜１１のいずれか１項に記載のニトロキシル化されたタンパク質または請求項１２に記載のヘモグロビン四量体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記組成物は、血液で正常腫脹性であるか、または血液と比較して過剰腫脹性であり；
前記薬学的に許容される担体は、水性希釈剤を含み；
前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水、生理食塩水−グルコース混合物、Ｒｉｎｇｅｒ液、乳酸Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｌｏｃｋｅ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｈａｒｔｍａｎｎの平衡生理食塩水、ヘパリン処置したクエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液、アセテート溶液、複数の電解質溶液、ラクトビオナート溶液および重合体の代用血漿またはこれらの組み合わせを含み；および／または
前記薬学的に許容される担体は、充填剤、塩、生理緩衝液、炭水化物、アルコール、ポリアルコール、抗酸化剤、抗バクテリア薬剤、コロイド浸透圧薬剤、還元薬剤またはこれらの組み合わせを含む、
医薬組成物。
【請求項１４】
前記水性希釈剤は、コロイドの水性溶液または非酸素運搬成分の水性溶液を含み；
前記水性希釈剤は、水性無細胞溶液（所望によりアルブミンの水性無細胞溶液）を含み；
前記水性希釈剤は、タンパク質の水性溶液、糖タンパク質の水性溶液、多糖の水性溶液またはこれらの組み合わせを含み；
前記重合体の代用血漿は、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、エチレンオキシド−プロピレングリコール凝縮物またはこれらの組み合わせを含み；および／または
前記還元剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステインまたはこれらの組み合わせを含む、
請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
急性肝不全、ベータ地中海貧血症、火傷、慢性重篤な肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、低酸素症、マラリア、器官虚血（所望により急性腸虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓症）、心臓性ショック、急性血管器官虚血、脳卒中、心筋梗塞または重篤な心虚血を含む）、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌状赤血球症、網膜疾患、内部眼球条件、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷脳損傷、潰瘍、血管攣縮またはこれらの組み合わせの治療における使用のための；
非外傷性出血ショック、入院前の環境の外傷、外傷性出血ショック、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官分解（エキソビボで）、器官分解（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症、敗血症性ショック、心筋梗塞、心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺動脈塞栓症またはこれらの組み合わせの治療における使用のための；
血管形成術に対する補助として、形成手術のための補助剤として、または補助人工心臓を植設する際の補助剤として；代用血液、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助剤、腫瘍学的薬剤、器官保存剤、性能増強剤、外科手術補助剤または創傷治癒薬剤として；イメージングにおいて；肺機能を改善するため；またはこれらの組み合わせとしての使用のための；または
傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、過剰脾臓化および巨脾、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫溶血性状態、鉄欠損症、イソ免疫性溶血性貧血、細血管障害性溶血性貧血、寄生または外科的麻酔で誘導される脳外傷による血液の喪失の獣医学的治療における使用のための、
請求項１３または１４に記載の医薬組成物。