【手続補正書】
【提出日】平成28年3月14日(2016.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された又は精製された、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸であり、該CARは、抗原認識部分とT細胞活性化部分を含み、該抗原認識部分は、B細胞成熟化抗原（BCMA）に対して指向されている、核酸。
【請求項２】
該抗原認識部分は、BCMAに対して指向されているモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項１記載の単離された又は精製された核酸。
【請求項３】
該抗原認識部分は、BCMAに対して指向されているモノクローナル抗体の可変領域を含む、請求項２記載の単離された又は精製された核酸。
【請求項４】
該T細胞活性化部分は、以下のタンパク質いずれかのT細胞シグナリングドメインを含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の単離された又は精製された核酸：ヒト CD8-アルファタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3ゼータータンパク質、ヒトFcRγタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-1BBタンパク質、前記の何れかの改変版又は前記のいずれかの組み合わせ。
【請求項５】
該核酸配列は、SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 3の核酸配列を含む、請求項１−４のいずれか１項に記載の単離された又は精製された核酸。
【請求項６】
請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸によりコードされた、単離された又は精製されたCAR。
【請求項７】
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11又はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む請求項６記載の単離された又は精製されたCAR。
【請求項８】
請求項１−５のいずれか１項に記載の、単離された又は精製された核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸を発現する単離された宿主細胞。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11又はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含むCARを発現する請求項９記載の単離された宿主細胞。
【請求項１１】
T細胞である、請求項９又は請求項１０記載の単離された宿主細胞。
【請求項１２】
ナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項９又は請求項１０記載の単離された宿主細胞。
【請求項１３】
BCMAを発現する癌細胞を、請求項１−５のいずれか１項に記載の単離された又は精製された核酸、請求項８に記載のベクター、請求項１１に記載の単離された１個以上のT細胞、又は請求項１２に記載の単離された１個以上のNK細胞と接触させることを含み、それによってCARが産生されて、癌細胞上のBCMAに結合し、癌細胞が破壊される、癌細胞の破壊方法であって、該癌細胞が生体外に存在する、方法。
【請求項１４】
請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸、請求項６又は７に記載のCAR、請求項８に記載のベクター又は請求項９−１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を含有してなる、癌細胞破壊剤。
【請求項１５】
癌細胞が多発性骨髄腫またはホジキンリンパ腫細胞である、請求項１４に記載の剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
“抗体のフラグメント”、“抗体フラグメント”、“抗体の機能的フラグメント”及び“抗原結合部分”の用語は、本願中では、相互に変更して用いられ、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメント乃至は部分を意味する（例えば、一般的には、Holligerら, Nat. Biotech, 23(9): 1126-1129 (2005)参照）。本発明の核酸配列がコードするCARの抗原認識部分は、BCMA結合抗体フラグメントいずれも包含する。該抗体フラグメントは、望ましくは、例えば、1以上のCDRs、可変領域（若しくはそれらの一部分）、定常領域（若しくはそれらの一部分）又はそれらの組み合わせを含む。抗体フラグメントの例としては、例えば、(i) VL、VH、CL 及び CH1ドメインからなる単価フラグメントである Fab フラグメント; (ii) ヒンジ領域でジスルフイド架橋により繋がれた２つのFab フラグメントを含む２価フラグメントである F(ab')2 フラグメント; (iii)抗体の単一アームのVL及びVHドメインから成る Fvフラグメント; (iv)２つのドメインが単一のポリペプチド鎖として合成されるのを可能にする合成リンカーによって合体されたFvフラグメント (すなわち、VL 及び VH)の２つのドメインから成る単価分子である単鎖Fv (scFv) (例えば、Birdら, Science, 242: 423-426 (1988); Hustonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) 及び Osbournら, Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)参照)及び(v) ポリペプチド鎖のダイマーである二重特異性抗体（該抗体においては、各ポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上でVHとVLの間でペアリングするには短すぎるペプチドリンカーにより、VLに結合されたVHを含み、それにより、色々なVH‐VLポリペプチド鎖上で、相補性ドメイン間のペアリングをひきおこし、２つの機能的抗原結合部位を持つダイマー分子を生成する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体フラグメントは、本技術分野で既知であり、例えば、米国特許公開公報2009/0093024 A1に、より詳細に記載されている。好ましい態様において、本発明の核酸配列がコードするCARの抗原認識部分は、抗BCMA単鎖Fv (scFv)を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
膜貫通ドメインに加え、T細胞活性化部分は、更に、細胞内の（すなわち、細胞質の）T細胞シグナリングドメインを含んでいる。細胞内T細胞シグナリングドメインは、CD28 分子、CD3ゼータ（ζ）分子若しくはそれらの改変版、ヒトFc受容体ガンマー（FcRγ）鎖、CD27分子、OX40分子、4-1BB分子又は本技術分野で公知の他の細胞内シグナリング分子から得ること又は誘導することができる。上述のように、CD28分子は、T細胞同時刺激における重要なT細胞マーカーである。CD3ζは、TCRsと連携してシグナルを生じ、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ITAMs）を含む。4-1BBは、CD137とも称され、強力な同時刺激シグナルをT細胞に伝達し、分化を促進し、更にTリンパ球の長命生存性を高める。好ましい実施態様では、CD28、CD3ゼータ、4-1BB、OX40及びCD27はヒトのものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の核酸配列がコードするT細胞活性化ドメインは、上記した膜貫通性ドメインの何れか一つ及び上記した細胞内T細胞シグナリングドメインいずれか１以上を組み合わせて含んでいてもよい。例えば、本発明の核酸配列は、CD28 膜貫通ドメインとCD28及びCD3ゼータの細胞内T細胞シグナリングドメインを含むCARをコードすることができる。或いはその代わりに、本発明の核酸配列は、CD8α膜貫通ドメインとCD28、CD3 ゼータ、Fc 受容体ガンマー(FcRγ)鎖及び／又は4-1BBの細胞内T細胞シグナリングドメインを含むCARをコードすることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
一つの実施態様では、本発明の核酸配列は、5’から3’に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF受容体）シグナル配列、抗BCMA scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒトCD28分子の細胞質T細胞シグナリングドメイン及びCD3ζ分子のT細胞シグナリングドメインを含むCARsをコードする。別の実施態様では、本発明の核酸配列は、5’から3’に、ヒト CD8αシグナル配列、抗-BCMA scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒトCD28分子の細胞質T細胞シグナリングドメイン及びヒトCD3ζ分子の細胞質T細胞シグナリングドメインを含むCARsをコードする。別の実施態様では、本発明の核酸配列は、5’から3’に、ヒトCD8αシグナル配列、抗-BCMA scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒト4-1BB分子の細胞質T細胞シグナリングドメイン及び／又はヒトOX40 分子の細胞質T細胞シグナリングドメイン及びヒトCD3ζ分子のT細胞シグナリングドメインを含むCARをコードする。例えば、本発明の核酸配列は、SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 3の核酸配列を含む又はそれらから成る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明の核酸配列は、SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11又はSEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を含む又はそれらから成るCARをコードする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
それぞれ異なるシグナル配列とT細胞活性化ドメインを有する、上記した抗-bcma2 CARに基づく5つの追加的キメラ抗原受容体をコードするDNA 配列を設計した。これに関し、8ss-抗-bcma2 CAR は、以下の要素を5'から3'に含んでいた:
CD8αシグナル配列、scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、CD28分子の細胞質部分及びCD3ζ分子の細胞質部分。
G-抗-bcma2 CAR は、以下の要素を5'から3'に含んでいた:
ヒトGM-CSF 受容体シグナル配列、scFv、 ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、CD28分子の細胞質部分及びCD3ζ分子の細胞質部分。
抗-bcma2-BB CAR は、5'から3'に以下の要素を含んでいた:
CD8αシグナル配列、scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB 分子の細胞質部分及びCD3ζ分子の細胞質部分。
抗-bcma2-OX40 CARは、5'から3'に以下の要素を含んでいた:
CD8αシグナル配列、scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、OX40 分子の細胞質部分（例えば、Latzaら, European Journal of Immunology, 24: 677-683 (1994)参照）及び、CD3ζ分子の細胞質部分。
抗-bcma2-BBOX40は、5'から3'に以下の要素を含んでいた:
CD8αシグナル配列、scFv、ヒトCD8α分子のヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB 分子の細胞質部分、OX40 分子の細胞質部分及びCD3ζ分子の細胞質部分。
7つのCAR配列のそれぞれに存在する要素を表1に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
【表１】
2015513920.tif 000001
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
抗-bcma1及び抗-bcma2 CARsをコードする配列を連結し、pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPREと名付けられたレンチウイルスベクタープラスミドにした(例えば、Yangら, J. Immunotherapy, 33(6): 648-658 (2010)参照)。このベクターのcoDMF5部分を、標準的な方法を用いて、CARをコードする核酸配列と置き換えた。得られた抗-BCMA CARベクターは、pRRLSIN.cPPT.MSCV.抗-bcma1.oPRE及びpRRLSIN.cPPT.MSCV.抗-bcma2.oPREと名付けた。ハプテン2,4,6-トリニトロフェニールを認識するSP6 scFv を含むネガティブコントロールCARも構築した(例えば、Grossら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(24): 10024-10028 (1989)参照)。このCARを、SP6と称した。SP6 CAR をクローン化し、抗-BCMA CARs と同じレンチウイルスベクターにした。これは抗-bcma1及び抗-bcma2と同じシグナリングドメインを含んでいた。各CARをコードするレンチウイルスを含む上清を、前出のYangらに記載のプロトコールにより製造した。具体的には、293T-17細胞 (ATCC CRL-11268)に、以下のプラスミドを形質移入した：pMDG (水疱性口内炎ウイルス エンベロープタンパク質をコードする), pMDLg/pRRE (HIV Gag及びPolタンパク質をコードする), pRSV-Rev (RSV Rev タンパク質をコードする)及び抗-bcma CARsをコードするプラスミド(例えば、前出Yangらを参照)。