【手続補正書】
【提出日】平成28年2月10日(2016.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドが、該重複する同一のヌクレオチドを含む該接合部においてフラップを形成する、工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸を遊離する、工程;
連結産物配列を形成するために、該接合部において該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結する工程;
該試料中の該連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
【請求項２】
前記接触させる工程の前に前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列を増幅する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
プローブセット中の前記オリゴヌクレオチドプローブの1つがジップコード部分をさらに含み、該ジップコード部分が、その相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドと、均一なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、前記方法が、
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程;および
最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの連結産物配列の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該連結産物配列を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程
をさらに含み、該連結産物配列とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に前記検出する工程が行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、それぞれの連結産物配列が該5'プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、および該3'プライマー特異的部分を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれ第1のタグ部分および第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、かつ、それぞれの異なるオリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が、異なるヌクレオチド配列を有し、前記方法が、
前記連結する工程の後に、前記試料を、ある特定の連結産物配列の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分がハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化連結産物配列を形成する、工程;ならびに
該供する工程の後に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを該試料から除去する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記供する工程の前に、連結産物配列を含む前記試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除して(occlude)、非連結オリゴヌクレオチドプローブの伸長または増幅を阻止する工程
をさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接合部において前記重複する同一のヌクレオチドの5'側にあるヌクレオチドフラップをさらに含み、該ヌクレオチドフラップの少なくとも一部が、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの該ヌクレオチドフラップおよび該3'プライマー特異的部分の相補領域が互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記供する工程の間に、前記ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分を伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることができない伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的標的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第3のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接触させる工程の間に前記標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第3のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、プローブセット中の該第2のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有し、該重複する同一のヌクレオチドが前記切断する工程の間に除去されて、該接合部における該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間の連結が、プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、該第2のオリゴヌクレオチドプローブ、および該第3のオリゴヌクレオチドプローブを含む連結産物配列を形成することを可能にする、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記特定する工程に基づいて疾患状態を診断または予後予測する(prognose)工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'非標的特異的フラップ部分を切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドの該標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸を遊離する、工程;
該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、該1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を有する該標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する工程;
該試料中の連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)該連結産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該第1のジップコード部分の一部および該第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該一次伸長産物および該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を、(i)ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)該集団の該捕捉用オリゴヌクレオチドが、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(i)(a)該第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、(ii)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該一次伸長産物を、ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化一次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)ある特定のヘアピン化一次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
該ヘアピン化一次伸長産物の捕捉用オリゴヌクレオチド部分から該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
【請求項２２】
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および、(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有する、キット。
【請求項２３】
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
多重増幅反応においてプライマー標的の入り交じった状態とプライマーペア間で増幅のバランスをとる上での困難さとを解決する方法が本明細書において説明される。本方法は、(a)基本的に、単一試料中で同時に調べることができる標的の数を増加し、(b)必要とされる試料の量を減少させ、(c)まれな核酸試料、または少量で/低品質で/分解された(例えば、単一細胞/ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)/母方循環胎児の核酸試料、または腫瘍に由来する核酸試料を調べるための方法を提供する。
[本発明1001]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドが、該重複する同一のヌクレオチドを含む該接合部においてフラップを形成する、工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸を遊離する、工程;
連結産物配列を形成するために、該接合部において該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結する工程;
該試料中の該連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1002]
前記接触させる工程の前に前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列を増幅する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
プローブセット中の前記オリゴヌクレオチドプローブの1つがジップコード部分をさらに含み、該ジップコード部分が、その相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドと、均一なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、前記方法が、
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程;および
最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの連結産物配列の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該連結産物配列を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程
をさらに含み、該連結産物配列とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に前記検出する工程が行われる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、16ヌクレオチド超であり、かつ、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が固体支持体上に固定化されている、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記固体支持体が、ビーズ、スライド、ディスク、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、およびそれらの複合物からなる群より選択される形態をとる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記固体支持体が、位置のアレイを備え、前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が、該位置のアレイにおいて固定化されている、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、それぞれの連結産物配列が該5'プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、および該3'プライマー特異的部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
プライマーセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方が、検出可能な標識を含み、前記検出する工程が、標識された一次伸長産物の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記検出する工程が、
前記供する工程の後に前記伸長産物を配列決定する工程
を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
プローブセット中の前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの一方または両方が、ジップコードまたはその一部をさらに含み、該ジップコードが、均一なハイブリダイゼーション条件下で、相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、本発明1011の方法。
[本発明1016]
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、それぞれの捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する工程;ならびに
前記供する工程の間に、該集団の捕捉用オリゴヌクレオチドを、前記連結産物配列またはその相補鎖の該捕捉用オリゴヌクレオチドに相補的なジップコード部分にハイブリダイズさせる工程
をさらに含み、ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識が前記伸長処理中に切断され、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、それぞれの捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
前記一次伸長産物にハイブリダイズすることができる1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程;
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、該一次伸長産物、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成し、該集団の捕捉用オリゴヌクレオチドが、該一次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチドに相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、二次オリゴヌクレオチドプライマーが該一次伸長産物にハイブリダイズし、ハイブリダイズされた該プライマーが伸長される、工程;ならびに
該伸長処理中に、ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズする、工程;および
前記供する工程の後に、最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの一次伸長産物の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該一次伸長産物を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程
をさらに含み、該一次伸長産物とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に、前記検出する工程が行われる、本発明1015の方法。
[本発明1020]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、16ヌクレオチド超であり、かつ、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つが、検出可能な標識をさらに含み、それによって、標識された一次伸長産物を形成する、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が固体支持体上に固定化されている、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記固体支持体が、ビーズ、スライド、ディスク、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、およびそれらの複合物からなる群より選択される形態をとる、本発明1023の方法。
[本発明1024]
前記固体支持体が、位置のアレイを備え、前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が該位置のアレイにおいて固定化されている、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記ジップコードの第1の部分、および、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分をさらに含み、かつ、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該ジップコードの第2の部分、および、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、前記方法が、
該第1のジップコード部分の一部および該第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
前記一次伸長産物および該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を、(i)ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)該集団の該捕捉用オリゴヌクレオチドが、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;ならびに
ハイブリダイズされた捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1026]
(i)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットごとに異なる第2のプライマー特異的部分、前記ジップコードの第1の部分、および、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分をさらに含み、かつ、(ii)前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該ジップコードの第2の部分、および、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、前記方法が、
(i)(a)該第1のオリゴヌクレオチドプローブの該第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1の二次オリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じヌクレオチド配列を有する、第2の二次オリゴヌクレオチドプライマーとを含む、1つまたは複数の二次プライマーセットを供給する工程;
該一次伸長産物、1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成する、工程;
該二次伸長産物を、ある特定の二次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化二次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)ある特定のヘアピン化二次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;ならびに
該ヘアピン化二次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分から該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1027]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分をさらに含み、それによって、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、該unitaq検出部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む連結産物配列を形成し、前記方法が、
1つまたは複数のunitaq検出プローブを供給する工程であって、それぞれのunitaq検出プローブが、相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該1つまたは複数のunitaq検出プローブを前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する工程;ならびに
前記供する工程の間に、該1つまたは複数のunitaq検出プローブを、該連結産物配列上またはその相補鎖上にある相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズさせる工程
をさらに含み、該1つまたは複数のunitaq検出プローブから該クエンチャー分子および該検出可能な標識が前記伸長処理中に切断され、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1028]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがunitaq検出部分をさらに含み、それによって、形成された前記一次伸長産物配列が、前記5'プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、該unitaq検出部分、および前記3'プライマー特異的部分を含み、前記方法が、
1つまたは複数のunitaq検出プローブを供給する工程であって、それぞれのunitaq検出プローブが、相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該一次伸長産物にハイブリダイズすることができる1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程;
該1つまたは複数のunitaq検出プローブ、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、該一次伸長産物、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成し、該1つまたは複数のunitaq検出プローブが、該伸長産物の該unitaq検出プローブに相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、該二次オリゴヌクレオチドプライマーが該一次伸長産物にハイブリダイズし、ハイブリダイズされた該プライマーが伸長される、工程;
該伸長処理中に、1つまたは複数のハイブリダイズされた該unitaq検出プローブから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1029]
前記unitaq検出プローブが、さらなる部分を介して前記二次オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端と結合されている、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
(i)前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分をさらに含み、それによって、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、該unitaq検出部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む連結産物配列を形成し、(ii)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、該連結産物配列の該unitaq検出部分に相補的なunitaq検出プローブと、該unitaq検出プローブによって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識とをさらに含み、かつ、(iii)前記供する工程の間に形成された前記一次伸長産物が、該検出可能な標識、該unitaq検出プローブ、該クエンチャー分子、該5'プライマー特異的部分、該標的特異的部分、該unitaq検出部分、および該3'プライマー特異的部分を含み、前記方法が、
一次伸長産物を、ある特定の伸長産物の該unitaq検出プローブがその相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化伸長産物を形成する、工程;および
該ヘアピン化伸長産物の該unitaq検出プローブから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、標識された該ヘアピン化伸長産物または切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1031]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれ第1のタグ部分および第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、かつ、それぞれの異なるオリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が、異なるヌクレオチド配列を有し、前記方法が、
前記連結する工程の後に、前記試料を、ある特定の連結産物配列の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分がハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化連結産物配列を形成する、工程;ならびに
該供する工程の後に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを該試料から除去する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1032]
前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、前記方法が、
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
前記消化する工程の後に該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プライマーセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方が、検出可能な標識を含み、前記検出する工程が、標識された一次伸長産物の検出を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記供する工程の前に、連結産物配列を含む前記試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除して(occlude)、非連結オリゴヌクレオチドプローブの伸長または増幅を阻止する工程
をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1035]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接合部において前記重複する同一のヌクレオチドの5'側にあるヌクレオチドフラップをさらに含み、該ヌクレオチドフラップの少なくとも一部が、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの該ヌクレオチドフラップおよび該3'プライマー特異的部分の相補領域が互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記供する工程の間に、前記ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分を伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることができない伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端に結合されており、それによって、結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成し、該結合されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む環状連結産物配列を形成する、本発明1011の方法。
[本発明1038]
前記結合されたプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が結合されている部分内に、ポリメラーゼブロッカーをさらに含み、かつ、前記供する工程の間に非環状伸長産物が形成される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記結合されたプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が結合されている部分内に、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含み、かつ、前記供する工程の間に非環状伸長産物が形成される、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記結合されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記3'標的特異的部分に相補的なセグメントをさらに含み、連結の非存在下では、該結合されたプローブの該3'標的特異的部分が該相補的なセグメントとハイブリダイズして、ヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1037の方法。
[本発明1041]
前記供する工程の間に、結合されヘアピン化した前記オリゴヌクレオチドプローブの前記3'標的特異的部分を伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長され結合されヘアピン化したオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的標的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第3のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接触させる工程の間に前記標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第3のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、プローブセット中の該第2のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有し、該重複する同一のヌクレオチドが前記切断する工程の間に除去されて、該接合部における該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間の連結が、プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、該第2のオリゴヌクレオチドプローブ、および該第3のオリゴヌクレオチドプローブを含む連結産物配列を形成することを可能にする、本発明1001の方法。
[本発明1043]
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1044]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1045]
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部から2塩基または3塩基である塩基位置においてミスマッチヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部における前記重複する同一のヌクレオチドの3'側にある1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含む、本発明1045の方法。
[本発明1048]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部における前記重複するヌクレオチドの5'側にある1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含む、本発明1045の方法。
[本発明1049]
前記試料中の過剰量の核酸分子に由来するコピー数と比較して1つまたは複数の低含量標的ヌクレオチド配列のコピー数が定量され、該過剰量の核酸分子が、前記低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有する、本発明1045の方法。
[本発明1050]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1001の方法。
[本発明1051]
前記試料中の他のヌクレオチド配列と比較して前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数が定量される、本発明1050の方法。
[本発明1053]
前記特定する工程に基づいて疾患状態を診断または予後予測する(prognose)工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1055]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'非標的特異的フラップ部分を切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドの該標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸を遊離する、工程;
該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、該1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を有する該標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する工程;
該試料中の連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1056]
ポリメラーゼを用いて前記第1のオリゴヌクレオチドプローブを前記切断する工程の前に伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブとの接合部を形成する工程であって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的部分が、伸長された該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つが、検出可能な標識をさらに含み、前記検出する工程が、標識された前記連結産物配列の検出を含む、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、本発明1055の方法。
[本発明1059]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズで分離する工程
を含む、本発明1055の方法。
[本発明1060]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも1つが、標的特異的な前記最初のヌクレオチド塩基の3'側にある、本発明1055の方法。
[本発明1061]
プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、それぞれの連結産物配列が、該5'プライマー特異的部分、1つまたは複数のチオリン酸を有する前記標的特異的部分、および該3'プライマー特異的部分を含む、本発明1055の方法。
[本発明1062]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該伸長産物の検出を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
前記供する工程の前に、連結産物配列を含む前記試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除して、非連結プローブの伸長または増幅を阻止する工程
をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記5'ヌクレオチドフラップの少なくとも一部が、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'ヌクレオチドフラップおよび該3'プライマー特異的部分の相補領域が互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1062の方法。
[本発明1065]
前記ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分を前記供する工程の間に伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記検出する工程が、
前記供する工程の後に前記伸長産物を配列決定する工程
を含む、本発明1062の方法。
[本発明1067]
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1068]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、本発明1055の方法。
[本発明1069]
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1055の方法。
[本発明1071]
前記試料中の他のヌクレオチド配列と比較して前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1070の方法。
[本発明1072]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数が定量される、本発明1070の方法。
[本発明1073]
前記試料中の過剰量の核酸分子に由来するコピー数と比較して1つまたは複数の低含量標的ヌクレオチド配列のコピー数が定量され、該過剰量の核酸分子が、前記低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有する、本発明1069の方法。
[本発明1074]
前記特定する工程に基づいて疾患状態を診断または予後予測する工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1075]
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1076]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)該連結産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該第1のジップコード部分の一部および該第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該一次伸長産物および該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を、(i)ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)該集団の該捕捉用オリゴヌクレオチドが、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1077]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(i)(a)該第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、(ii)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該一次伸長産物を、ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化一次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)ある特定のヘアピン化一次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
該ヘアピン化一次伸長産物の捕捉用オリゴヌクレオチド部分から該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1078]
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および、(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有する、キット。
[本発明1079]
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、キット。