【手続補正書】
【提出日】平成28年11月1日(2016.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび／またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法であって、
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸および／またはフェルラ酸グルコシドを生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
培養培地が、最大で１ｍＭの、例えば最大で０．５ｍＭの、例えば最大で０．０１ｍＭの、例えば検出不可能な、クマル酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物であって、
ｉ．フェルラ酸を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素である、
前記微生物。
【請求項４】
微生物が、細菌および真菌からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または微生物。
【請求項５】
微生物が酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法または微生物。
【請求項６】
微生物が、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または微生物。
【請求項７】
フェルラ酸の合成に関与する酵素が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、およびフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法または微生物。
【請求項８】
フェルラ酸の合成に関与する酵素が、バニリルアルコールオキシダーゼである、請求項６に記載の方法または微生物。
【請求項９】
微生物を、オイゲノールを含む培養培地中で培養することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バニリンを製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物がバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること；および
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ステップｂ）が、微生物を、フェルラ酸の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培養培地が、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭのフェルラ酸を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
培地が、糖蜜を含むかこれからなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
バニリンおよび／またはバニリン誘導体の製造方法であって、
ａ）フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を提供すること、
ｂ）フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体をバニリンシンターゼと接触させること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができ、これによりバニリンおよび／またはバニリン誘導体を生成する酵素である、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
in vitroで実施される、請求項１〜２および４〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
フェルラ酸誘導体がフェルラ酸グルコシドであり、バニリン誘導体がバニリングルコシドである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを製造する方法であって、
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリンを植物から単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
バニリンシンターゼをコードする異種核酸およびグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む植物であって、前記バニリンシンターゼが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素である、前記植物。
【請求項１９】
植物が双子葉植物である、請求項１７に記載の方法または請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
植物がNicotiana tabacumである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法または植物。
【請求項２１】
植物が、ツユクサ類（commelinoids）およびアカザ科からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法または植物。
【請求項２２】
動物飼料を製造する方法であって、
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）植物を動物飼料に加工すること、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
植物が、イネ科（Poaceae）またはイネ科（Gramineae family）のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
食品を製造する方法であって、
ａ）可食部を含む植物を提供すること、ここで前記植物が、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）前記可食部を収穫すること、
を含み、これによりバニリンの味覚を有する食品を得る、前記方法。
【請求項２５】
植物がトマトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
バニリンシンターゼが、配列番号１のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、微生物または植物。
【請求項２７】
バニリンシンターゼが、配列番号２１のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項２８】
バニリンシンターゼが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
ａ．最Ｎ末端の１〜１５０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｂ．最Ｎ末端の２１〜１３７個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｃ．最Ｎ末端の１２０〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｄ．最Ｎ末端の１３０〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｅ．最Ｎ末端の２１〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｆ．最Ｎ末端の２１個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｇ．最Ｎ末端の６１個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｈ．最Ｎ末端の１３７個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｉ．最Ｎ末端の２１個のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｊ．最Ｎ末端の１４０個のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｋ．ａ）からｊ）までのいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体、
である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項２９】
バニリンシンターゼが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
ａ）配列番号１のａａ２２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｂ）配列番号１のａａ１３８〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｃ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｄ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｅ）ａ）からｄ）までのいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体、
である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３０】
バニリンシンターゼが、次の式：
［シグナルペプチド］−Ｘ−[切断部位]−[切断型バニリンシンターゼ]
式中、Ｘはリンカー配列である、
で表されるポリペプチドである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３１】
切断型バニリンシンターゼが、請求項２７または２８に定義されたものである、請求項３０に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３２】
シグナルペプチドが、宿主生物に内因性のタンパク質のシグナルペプチドである、請求項３０または３１に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３３】
切断部位が、宿主生物に内因性のタンパク質の切断部位である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３４】
微生物または植物が、グルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸も含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３５】
グルコシルトランスフェラーゼが、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼである、請求項３４に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３６】
グルコシルトランスフェラーゼが、グルコースのバニリンへの転移を触媒することができ、これによりバニリングルコシドを形成するグルコシルトランスフェラーゼである、請求項３４または３５に記載の方法、植物または微生物。
【請求項３７】
グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のUGT72E2またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項３４に記載の方法または微生物。
【請求項３８】
バニリンを製造する方法である、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
方法が、バニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から、および／または植物から単離するステップを含み、および方法が、前記バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップをさらに含む、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップが、バニリングルコシドをグルコシダーゼに接触させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
グルコシダーゼが、β−グルコシダーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
バニリングルコシドを製造する方法である、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。