【手続補正書】
【提出日】平成28年8月31日(2016.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の遺伝子試料における遺伝的変異の検出方法であり、
第１標識プローブおよび第１タグプローブを含む第１プローブセットと、第２標識プローブおよび第２タグプローブを含む第２プローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第１および第２プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における第１および第２対象核酸領域に、それぞれハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも前記第１標識プローブと前記第１タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第１プローブセットをライゲーションする工程、
少なくとも前記第２標識プローブと前記第２タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第２プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされた第１および第２プローブセットを増幅する任意の工程、
前記タグプローブを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第１および第２標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、第１および第２標識をそれぞれ含み、
前記第１標識と前記第２標識とが、異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第１および第２タグプローブおよび／またはこれらを増幅した増幅タグプローブが、第１および第２タグをそれぞれ含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
（ｉ）前記基板に固定化された前記第１標識の個数である第１の個数および（ｉｉ）前記基板に固定化された前記第２標識の個数である第２の個数を計数する工程、ならびに
前記第１および第２の個数を比較し、前記遺伝子試料における遺伝的変異を判定する工程、
を含む、遺伝的変異の検出方法。
【請求項２】
前記接触工程の前に、前記第１および第２標識プローブを、前記第１および第２標識でそれぞれ標識する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記接触工程の前に、前記第１および第２タグプローブに、前記第１および第２タグをそれぞれ付加する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する工程を含み、前記増幅は、前記プローブの標識化を伴って、または伴わずに行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２標識プローブのそれぞれが、フォワードまたはリバースプライミング配列を含み、前記第１および第２タグプローブのそれぞれが、対応するリバースまたはフォワードプライミング配列と、タグであるタグヌクレオチド配列とを含み、
前記方法が、前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する工程を含み、
前記増幅工程が、下記（ｉ）および（ii）を増幅することを含み、
（ｉ）前記ライゲーションされた第１標識プローブおよび第１タグプローブ
前記フォワードおよびリバースプライミング配列に第１フォワードおよびリバースプライマーがそれぞれハイブリダイズしており、前記第１標識プローブにハイブリダイズした前記第１フォワードまたはリバースプライマーが、前記第１標識を含む
（ii）前記ライゲーションされた第２標識プローブおよび第２タグプローブ
前記フォワードおよびリバースプライミング配列に第２フォワードおよびリバースプライマーがそれぞれハイブリダイズしており、前記第２標識プローブにハイブリダイズした前記第２フォワードまたはリバースプライマーが、前記第２標識を含む
前記タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、基板上の所定位置に固定化され、前記第１および第２タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、前記第１および第２タグであり、
前記第１の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第１プローブセットにおける前記第１標識の個数であり、前記第２の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第２プローブセットにおける前記第２標識の個数である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２標識プローブのそれぞれが、リバースプライミング配列を含み、前記第１および第２タグプローブのそれぞれが、タグであるタグヌクレオチド配列を含み、
前記方法が、前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する工程を含み、
前記増幅工程が、下記（ｉ）および（ii）を増幅することを含み、
（ｉ）前記ライゲーションされた第１標識プローブおよび第１タグプローブ
前記第１標識プローブの第１リバースプライミング配列に第１リバースプライマーがハイブリダイズしており、前記第１リバースプライマーが、前記第１標識を含む
（ii）前記ライゲーションされた第２標識プローブおよび第２タグプローブ
前記第２標識プローブ第２リバースプライミング配列に第２リバースプライマーがハイブリダイズしており、前記第２リバースプライマーが、前記第２標識を含む
前記タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、基板上の所定位置に固定化され、前記第１および第２タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、前記第１および第２タグであり、
前記第１の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第１プローブセットにおける前記第１標識の個数であり、前記第２の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第２プローブセットにおける前記第２標識の個数である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第３標識プローブおよび第３タグプローブを含む第３プローブセットと、第４標識プローブおよび第４タグプローブを含む第４プローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第１および第２プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料の二本鎖ヌクレオチド分子を構成する一本鎖ヌクレオチド分子における第１および第２対象核酸センス鎖に、それぞれハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
前記第３および第４プローブセットの少なくとも一部を、前記第１および第２対象核酸センス鎖の核酸アンチセンス鎖に、それぞれハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも（ｉ）前記第１標識プローブと前記第１タグプローブ、（ii）前記第２標識プローブと前記第２タグプローブ、（iii）前記第３標識プローブと前記第３タグプローブ、（iv）前記第４標識プローブと前記第４タグプローブをライゲーションすることにより、ライゲーションされた第１、第２、第３、および第４プローブセットを作製する工程、
リガーゼ連鎖反応を行う工程であり、
前記リガーゼ連鎖反応は、
ライゲーションされていない第１、第２、第３、および第４プローブセットの少なくとも一部を、前記ライゲーションされた第３、第４、第１、および第２プローブセットに、それぞれハイブリダイズさせることと、
前記ライゲーションされていないプローブセットにおける、少なくとも（ｉ）前記第１標識プローブと前記第１タグプローブ、（ii）前記第２標識プローブと前記第２タグプローブ、（iii）前記第３標識プローブと前記第３タグプローブ、（iｖ）前記第４標識プローブと前記第４タグプローブとをライゲーションすることを含む反応である工程、
前記タグプローブを基板上の前記所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第１、第２、第３、および第４標識プローブが、第１、第２、第３、および第４標識をそれぞれ含み、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第１、第２、第３、第４タグプローブが、第１、第２、第３、第４タグをそれぞれ含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
（ｉ）前記基板に固定化された前記第１および第３標識の合計である第１の合計および（ii）前記基板に固定化された前記第２および第４標識の合計である第２の合計を計数する工程、ならびに
前記第１の合計と前記第２の合計を比較し、前記遺伝子試料における遺伝的変異を判定する工程、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記接触工程の前に、前記第１、第２、第３、第４標識プローブを、前記第１、第２、第３、第４標識でそれぞれ標識する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第３標識が同一であり、前記第２および第４標識が同一である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
第３標識プローブおよび第３タグプローブを含む第３プローブセットと、第４標識プローブおよび第４タグプローブを含む第４プローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程であり、
前記第１および第３標識プローブが、第１リバースプライミング配列を含み、
前記第２および第４標識プローブが、第２リバースプライミング配列を含み、
前記タグプローブのそれぞれが、タグであるタグヌクレオチド配列を含む工程、
前記第１および第２プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料の二本鎖ヌクレオチド分子を構成する一本鎖ヌクレオチド分子における第１および第２対象核酸センス鎖に、それぞれハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
前記第３および第４プローブセットの少なくとも一部を、前記第１および第２対象核酸センス鎖の核酸アンチセンス鎖に、それぞれハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
（ｉ）前記第１標識プローブと前記第１タグプローブ、（ii）前記第２標識プローブと前記第２タグプローブ、（iii）前記第３標識プローブと前記第３タグプローブ、（iv）前記第４標識プローブと前記第４タグプローブをライゲーションすることにより、ライゲーションされた第１、第２、第３、および第４プローブセットを作製する工程、
リガーゼ連鎖反応を行う工程であり、
前記リガーゼ連鎖反応は、
前記ライゲーションされていない第１、第２、第３、および第４プローブセットの少なくとも一部を、前記ライゲーションされた第３、第４、第１、および第２プローブセットに、それぞれハイブリダイズさせることと、
前記ライゲーションされていないプローブセットにおける（i）前記第１標識プローブと前記第１タグプローブ、（ii）前記第２標識プローブと前記第２タグプローブ、（iii）前記第３標識プローブと前記第３タグプローブ、（iv）前記第４標識プローブと前記第４タグプローブとをライゲーションすることを含む反応である工程、ならびに
下記（ｉ）および（ii）を増幅する工程を含み、
（ｉ）前記ライゲーションされた第１および第３プローブセット
前記第１リバースプライミング配列に第１リバースプライマーがハイブリダイズしており、前記第１リバースプライマーが、前記第１標識を含む
（ii）前記ライゲーションされた第２および第４プローブセット
前記第２リバースプライミング配列に第２リバースプライマーがハイブリダイズしており、前記第２リバースプライマーが、前記第２標識を含む
前記タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、基板上の所定位置に固定化され、前記第１、第２、第３、および第４タグプローブの増幅されたタグヌクレオチド配列が、第１、第２、第３、および第４タグであり、
前記第１の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第１および第３プローブセットにおける前記第１標識の個数であり、前記第２の個数が、前記基板に固定化された前記増幅された第２および第４プローブセットにおける前記第２標識の個数である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ライゲーションされた第１および第２標識プローブが、前記ライゲーションされた第１および第２プローブセットの３’末端に位置し、前記第１および第２リバースプライマーにハイブリダイズした第１および第２リバースプライミング配列をそれぞれ含み、
前記第１および第２リバースプライマーが、前記第１および第２標識を含み、
前記ライゲーションされた第１および第２タグプローブが、前記第１および第２プローブセットの５’末端に位置する、請求項５から６および１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライゲーションされた第１および第２標識プローブが、前記ライゲーションされた第１および第２プローブセットの３’末端に位置し、前記第１および第２リバースプライマーにハイブリダイズした第１および第２リバースプライミング配列をそれぞれ含み、
前記第１および第２リバースプライマーが、前記第１および第２標識を含み、
前記ライゲーションされた第１および第２タグプローブが、前記ライゲーションされた第１および第２プローブセットの５’末端に位置し、前記第１および第２フォワードプライマーにハイブリダイズした対応する第１および第２フォワードプライミング配列をそれぞれ含む、請求項５記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅工程が、前記増幅されたプローブにエキソヌクレアーゼを接触させること、ならびに、５’末端に標識を有さない増幅されたプローブセットの５’末端を分解することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
５’末端に標識を有する増幅されたプローブセットの５’末端が、エキソヌクレアーゼ分解から保護される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記判定された遺伝的変異が、前記被検体における癌の転移、有無および／またはリスク、薬物動態変動、薬物毒性、移植拒絶反応、または異数性を示す、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝的変異が異数性である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における遺伝的変異である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミー、Ｘの異数性、およびＹの異数性からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、前記遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における２１トリソミーである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が、２２ｑ１１．２、１ｑ２１．１、９ｑ３４、１ｐ３６、および２２ｑ１３からなる群から選択される、前記妊娠中の被検体の胎児における変異である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記異なる標識が、異なる光学特性を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第１および第２の遺伝的変異を検出する方法であり、
第５標識プローブおよび第５タグプローブを含む第５プローブセットを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第５プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、前記第１および第２対象核酸領域とは異なる第３対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも前記第５標識プローブと前記第５タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第５プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記タグプローブのそれぞれを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第５標識プローブおよび／またはこれを増幅した増幅標識プローブが、第５標識を含み、
前記第５標識が、前記第１および第２標識とは異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第５タグプローブおよび／またはこれを増幅した増幅タグプローブが、第５タグを含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
前記基板に固定化された前記第５標識の個数である第３の個数を計数する工程、ならびに
前記第３の個数を、前記第１および／または第２の個数と比較し、前記遺伝子試料における前記第２の遺伝的変異を判定する工程、をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記第１遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における２１トリソミーであり、
前記第２遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における１３トリソミー、１８トリソミー、Ｘの異数性、およびＹの異数性からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
第６標識プローブおよび第６タグプローブを含む第６プローブセットを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第６プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、前記第１、第２、および第３対象核酸領域とは異なる第４対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも前記第６標識プローブと前記第６タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第６プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記タグプローブのそれぞれを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第６標識プローブおよび／またはこれを増幅した増幅標識プローブが、第６標識を含み、
前記第６標識が、前記第１および第２標識とは異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第６タグプローブおよび／またはこれを増幅した増幅タグプローブが、第６タグを含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
前記基板に固定化された前記第６標識の個数である第４の個数を計数する工程、ならびに
前記第４の個数を、前記第１、第２および／または第３の個数と比較し、前記遺伝子試料における第３の遺伝的変異を判定する工程、をさらに含む、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記第１、第２、および第３の遺伝的変異が、それぞれ、前記妊娠中の被検体の胎児における、１８トリソミー、２１トリソミー、および１３トリソミーである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
第７標識プローブおよび第７タグプローブを含む第７プローブセットを、前記遺伝子試料と接触させる工程、
前記第７プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、前記第１、第２、第３、および第４対象核酸領域とは異なる第５対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも前記第７標識プローブと前記第７タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第７プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記タグプローブのそれぞれを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第７標識プローブおよび／またはこれを増幅した増幅標識プローブが、第７標識を含み、
前記第７標識が、前記第１および第２標識とは異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第７タグプローブおよび／またはこれを増幅した増幅タグプローブが、第７タグを含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
前記基板に固定化された前記第７標識の個数である第５の個数を計数する工程、ならびに
前記第５の個数を、前記第１、第２、第３および／または第４の個数と比較し、前記遺伝子試料における第４の遺伝的変異を判定する工程、をさらに含む、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
第８標識プローブおよび第８タグプローブを含む第８のプローブセットを、前記遺伝子試料と接触させる工程、
前記第８のプローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、前記第１、第２、第３、第４、および第５対象核酸領域とは異なる第６対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化させる工程、
少なくとも前記第８標識プローブと前記第８タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第８プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記タグプローブのそれぞれを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第８標識プローブおよび／またはこれを増幅した増幅標識プローブが、第８標識を含み、
前記第８標識が、前記第１および第２標識とは異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第８タグプローブおよび／またはこれを増幅した増幅タグプローブが、第８タグを含み、
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
前記基板に固定化された前記第８標識の個数である第６の個数を計数する工程、ならびに
前記第６の個数を、前記第１、第２、第３、第４および／または第５の個数と比較し、前記遺伝子試料における前記第５の遺伝的変異を判定する工程、をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記第１、第２、第３、第４、および第５遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミー、異数性Ｘ、および異数性Ｙである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における２１トリソミーであり、
前記第１対象核酸領域が第２１染色体上にあり、
前記第２対象核酸領域が前記第２１染色体上にない、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が、前記妊娠中の被検体の胎児における２１トリソミーであり、
前記第１対象核酸領域が第２１染色体上にあり、
前記第２対象核酸領域が第１８染色体上にある、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記被検体がヒトである、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子試料が、全血、血清、血漿、尿、唾液、汗、糞便、および涙からなる群から選択される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子試料が血漿であり、
前記方法が、前記被検体の血液試料から血漿を単離する工程をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子試料が血清であり、
前記方法が、前記被検体の血液試料から血清を単離する工程をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子試料がセルフリーＤＮＡ試料であり、
前記方法が、前記被検体の血液試料から前記セルフリーＤＮＡ試料を単離する工程をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ハイブリダイゼーション、コンジュゲート、結合または固定化工程の前に、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子を増幅する工程をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１標識プローブおよび前記第１タグプローブが、前記第１対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化し、
前記第２標識プローブおよび前記第２タグプローブが、前記第２対象核酸領域にハイブリダイズ、コンジュゲート、結合または固定化する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記計数工程が、光学的分析を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記計数工程が、前記第１および第２標識にそれぞれ対応する第１および第２撮像チャネルでの前記基板の読み込み、ならびに前記基板の画像を１以上生成することを含み、
前記１以上の画像において、前記第１および第２標識プローブが分解可能である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記計数工程が、空間フィルタリングを含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記計数工程が、ウォーターシェディング解析（ｗａｔｅｒｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記比較工程が、前記第１および第２対象核酸領域を有する前記ヌクレオチド分子の相対数の推定値を得ることを含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記固定化された同じ種類の標識が、両次元において、少なくとも２５０ｎｍ離間している、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１および第２プローブセットが、それぞれ第３および第４標識プローブをさらに含み、
前記固定化された第１プローブセットおよび／または増幅された第１プローブセットが、第９標識を、前記第３標識プローブおよび／またはその増幅産物中にさらに含み、
前記固定化された第２プローブセットおよび／または増幅された第２プローブセットが、第１０標識を、前記第４標識プローブおよび／またはその増幅産物中にさらに含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記各標識が蛍光色素である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記各タグが同一であり、前記基板上の同一の位置に、直接または間接的に固定化されるよう構成されている、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１および第２タグが同一であり、これら以外の各タグが、前記第１または第２タグとは異なる、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記基板が、前記各タグに接触して前記各タグを固定化する結合パートナーを含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記固定化工程が、前記タグまたはタグヌクレオチド配列の少なくとも一部を、前記基板上に固定化された対応するヌクレオチド分子にハイブリダイズさせることを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記各タグプローブが、基板上の複数の所定位置のアレイに固定化されている、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）前記固定化された第１プローブセットおよび／または増幅された第１プローブセットが、前記標識プローブ内に第１１標識をさらに含み、
（ii）前記固定化された第２プローブセットおよび／または増幅された第２プローブセットが、前記標識プローブ内に、前記第１１標識とは異なる第１２標識をさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１、第２、第１１、および第１２標識が互いに異なり、
前記計数工程が、前記基板上に固定化された前記第１１および第１２標識の個数を計数することをさらに含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および第２標識プローブを、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域にそれぞれハイブリダイズさせ、
前記第１および第２タグプローブを、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域にそれぞれハイブリダイズさせ、
前記第１標識プローブを、前記第１タグプローブをハイブリダイズさせた領域と隣接する領域にハイブリダイズさせ、
前記第２標識プローブを、前記第２タグプローブをハイブリダイズさせた領域と隣接する領域にハイブリダイズさせる、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記被検体由来の前記遺伝子試料とは異なるコントロール試料について、前記各工程を繰り返す工程、
前記基板に固定化された前記各標識のコントロール数を計数する工程、ならびに
前記第１、第２、第３、第４、第５および／または第６の個数を前記コントロール数と比較し、前記遺伝子試料における前記遺伝的変異を確認する工程をさらに含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、
前記遺伝的変異が前記妊娠中の被検体の胎児における遺伝的変異であり、
母系標識プローブおよび母系タグプローブを含む母系プローブセットと、父系標識プローブおよび父系タグプローブを含む父系プローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記母系および父系プローブセットのそれぞれの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、所定の一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む対象核酸領域にハイブリダイズさせる工程であり、
前記母系プローブセットの少なくとも一部が前記ＳＮＰ部位における第１アリルにハイブリダイズし、前記父系プローブセットの少なくとも一部が前記ＳＮＰ部位における第２アリルにハイブリダイズし、前記第１および第２アリルが互いに異なる工程、
少なくとも（ｉ）前記母系標識プローブと前記母系タグプローブ、（ii）前記父系標識プローブと前記父系タグプローブをライゲーションすることにより、前記母系および父系プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされた母系および父系プローブセットを増幅する任意の工程、
前記母系および父系タグプローブを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化された母系および父系タグプローブにライゲーションされた、前記母系および父系標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、母系および父系標識をそれぞれ含み、
前記母系標識と前記父系標識とが、異なる標識であり、
前記固定化された母系および父系標識が、光学的に分解可能である工程、
前記母系および父系標識の個数を計数する工程、ならびに
前記遺伝子試料における胎児由来物質の割合が、前記母系および父系標識の個数に基づく前記胎児における遺伝的変異の検出に十分かどうかを判定する工程、をさらに含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、前記遺伝的変異が前記妊娠中の被検体の胎児における遺伝的変異であり、
アリルＡ標識プローブおよびアリルＡタグプローブを含む、アリル特異的なアリルＡプローブセットと、アリルＢ標識プローブおよびアリルＢタグプローブを含む、アリル特異的なアリルＢプローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記アリルＡおよびアリルＢプローブセットのそれぞれの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における、所定の一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む対象核酸領域にハイブリダイズさせる工程であり、
前記ＳＮＰ部位においては、母系アリルプロファイルが、胎児アリルプロファイルとは異なり、
前記アリルＡプローブセットの少なくとも一部が前記ＳＮＰ部位における第１アリルにハイブリダイズし、前記アリルＢプローブセットの少なくとも一部が前記ＳＮＰ部位における第２アリルにハイブリダイズし、前記第１および第２アリルが互いに異なる工程、
少なくとも（i）前記アリルＡ標識プローブと前記アリルＡタグプローブ、（ii）前記アリルＢ標識プローブと前記アリルＢタグプローブをライゲーションすることにより、前記アリルＡおよびアリルＢプローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記アリルＡおよびアリルＢタグプローブを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたアリルＡおよびアリルＢタグプローブにライゲーションされた、前記アリルＡおよびアリルＢ標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、アリルＡおよびアリルＢ標識をそれぞれ含み、
前記アリルＡ標識とアリルＢ標識とが、異なる標識であり、
前記固定化されたアリルＡ標識とアリルＢ標識が、光学的に分解可能である工程、
前記アリルＡおよびアリルＢ標識の個数を計数する工程、ならびに
前記遺伝子試料における胎児由来物質の割合が、前記アリルＡおよびアリルＢ標識の個数に基づく前記胎児における遺伝的変異の検出に十分かどうかを判定する工程、をさらに含む、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記被検体が妊娠中の被検体であり、前記遺伝的変異が前記妊娠中の被検体の胎児における遺伝的変異であり、前記遺伝子試料がＹ染色体を含み、
母系標識プローブおよび母系タグプローブを含む母系プローブセットと、父系標識プローブおよび父系タグプローブを含む父系プローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記母系および父系プローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における母系および父系の対象核酸領域に、それぞれハイブリダイズさせる工程であり、
前記父系の対象核酸領域が、Ｙ染色体上にあり、
前記母系の対象核酸領域が、Ｙ染色体上にない工程、
少なくとも（ｉ）前記母系標識プローブと前記母系タグプローブ、（ii）前記父系標識プローブと前記父系タグプローブをライゲーションすることにより、前記母系および父系プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされた母系および父系プローブセットを増幅する任意の工程、
前記母系および父系タグプローブを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化された母系および父系タグプローブにライゲーションされた、前記母系および父系標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、母系および父系標識をそれぞれ含み、
前記母系標識と前記父系標識とが、異なる標識であり、
前記固定化された母系および父系標識が、光学的に分解可能である工程、
前記母系および父系標識の個数を計数する工程、ならびに
前記遺伝子試料における胎児由来物質の割合が、前記母系および父系標識の個数に基づく前記胎児における遺伝的変異の検出に十分かどうかを判定する工程、をさらに含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１プローブセットが、第１ギャッププローブをさらに含み、
前記第２プローブセットが、第２ギャッププローブをさらに含み、
前記第１および第２プローブセットを、前記第１および第２対象核酸領域に、それぞれハイブリダイズさせ、
前記第１ギャッププローブは、前記第１標識プローブがハイブリダイズする領域と前記第１タグプローブがハイブリダイズする領域の間に位置する領域にハイブリダイズし、前記第２ギャッププローブは、前記第２標識プローブがハイブリダイズする領域と前記第２タグプローブがハイブリダイズする領域の間に位置する領域にハイブリダイズし、
前記ライゲーション工程が、（i）前記第１標識プローブと、前記第１タグプローブと、前記第１ギャッププローブ、（ii）前記第２標識プローブと、前記第２タグプローブと、前記第２ギャッププローブをライゲーションすることを含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１および第２ギャッププローブおよび／またはそれらの増幅産物が、第１３および第１４標識でそれぞれ標識されており、前記第１３および第１４標識のそれぞれが、前記第１および第２標識とは異なる標識である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記第１および第２ギャッププローブおよび／またはそれらの増幅産物が、第１３および第１４標識でそれぞれ標識されており、前記第１３および第１４標識が同一である、請求項５８から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１および第２標識プローブを、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域にそれぞれハイブリダイズさせ、
前記第１および第２タグプローブを、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域にそれぞれハイブリダイズさせ、
前記第１および第２ギャッププローブを、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域にそれぞれハイブリダイズさせ、
前記第１標識プローブおよびタグプローブをハイブリダイズさせた領域の間には、１〜１００個のヌクレオチドが存在し、
前記第２標識プローブおよびタグプローブをハイブリダイズさせた領域の間には、１〜１００個のヌクレオチドが存在する、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１標識プローブおよび第１タグプローブに、第１スペーサをコンジュゲートし、
前記第２標識プローブおよび第２タグプローブに、第２スペーサをコンジュゲートし、
前記第１および第２スペーサを、前記遺伝子試料の前記ヌクレオチド分子にハイブリダイズさせない、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ハイブリダイズさせた遺伝子試料を酵素で分解する工程、ならびに
前記分解後に、前記第１および第２スペーサにおける結合を解除する工程をさらに含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記遺伝子試料の前記ヌクレオチド分子の配列を識別することを含まない、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象核酸領域および／または前記プローブの配列決定を含まない、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ハイブリダイゼーション工程または前記ライゲーション工程の後に、前記遺伝子試料の前記ヌクレオチド分子を増幅することを含まない、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ハイブリダイゼーション工程および前記ライゲーション工程の後に、前記遺伝子試料の前記ヌクレオチド分子を増幅することを含まない、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
バルクアレイの読み出し、またはアナログ式の定量化を含まない、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記遺伝的変異が、前記各標識から、一回の測定により検出される、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記各プローブセットがバインダーを含み、
前記方法が、
前記ライゲーション工程後に、前記バインダーを固相に固定化する工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを、ライゲーションされていないプローブから単離する工程をさらに含む、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記バインダーがビオチンを含み、前記固相が磁気ビーズを含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記計数工程が、
前記固定化された各標識からの光学シグナルを測定することと、
単一標識からの光学シグナルを、バックグラウンドおよび／または複数の標識から生じる残りの光学シグナルと区別することにより、前記計数した個数を補正することを含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記区別が、単一標識からの光学シグナルの強度に対する、前記光学シグナルの相対的シグナル強度および／またはシングル対ノイズ強度を算出すること、ならびに、前記光学シグナルが単一標識から生じたものかどうかを判定することを含み、
前記光学シグナルの前記相対的シグナル強度および／またはシングル対ノイズ強度と単一標識からの光学シグナルの強度との差が所定量以下である場合、前記光学シグナルは、単一標識から生じたものである、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記所定量が、単一標識からの光学シグナル強度の０％〜１００％である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記計数工程が、
（ｉ）前記各標識を励起するための光源の電力、（ii）前記光源の種類、（ii）前記各標識の露光時間、および／または（iv）前記各標識から生じる対応する光学シグナルと一致させるための前記各標識用のフィルターセットを最適化することと、
前記標識からの光学シグナルを測定することを含む、請求項７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記各標識からの光学シグナルを、２以上の時点について測定し、
光学シグナルの強度が一段階関数（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）的に低減する場合は、前記光学シグナルは、単一標識から生じたものである、請求項７２から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
単一標識からの光学シグナルの強度が、時間と共に一段階の低減を示し、２以上の標識からの光学シグナルの強度が、時間と共に複数段階の低減を示す、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記各標識からの光学シグナルを２以上の時点で測定し、前記各標識の退色プロファイルを正規化する、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
２以上の時点におけるコントロール標識からの光学シグナルを測定する工程、ならびに
前記コントロール標識からの光学シグナルを、前記各標識からの光学シグナルと比較し、前記各標識からの光学シグナルの増加または減少を判定する工程をさらに含む、請求項７２から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記計数工程が、前記計数を確認する工程をさらに含む請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法であり、
前記確認工程が、
第１コントロール標識プローブおよび前記第１タグプローブを含む第１コントロールプローブセットと、第２コントロール標識プローブおよび前記第２タグプローブを含む第２コントロールプローブセットを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第１および第２コントロールプローブセットの少なくとも一部を、前記遺伝子試料のヌクレオチド分子における前記第１および第２対象核酸領域に、それぞれハイブリダイズさせる工程、
少なくとも前記第１コントロール標識プローブと前記第１タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第１コントロールプローブセットをライゲーションする工程、
少なくとも前記第２コントロール標識プローブと前記第２タグプローブとをライゲーションすることにより、前記第２コントロールプローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
前記各タグプローブを基板上の所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第１および第２コントロール標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、第１および第２コントロール標識をそれぞれ含み、
前記第１および第２コントロール標識が、異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能である工程、
前記基板に固定化された前記コントロール標識からの光学シグナルを測定する工程、ならびに
前記固定化された第１および第２コントロール標識からの光学シグナルを、前記固定化された第１および第２標識からの光学シグナルと比較し、前記標識に基づく誤差が存在するかどうかを判定する工程を含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１標識と前記第２コントロール標識が同一であり、前記第２標識と前記第１コントロール標識が同一である、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記第１対象核酸領域が、第１染色体上にあり、
前記第２対象核酸領域が、前記第１染色体とは異なる第２染色体上にあり、
前記計数工程が、前記計数を確認する工程をさらに含み、
前記確認工程が、
第１コントロール標識プローブおよび第１コントロールタグプローブを含む第１コントロールプローブセットと、第２コントロール標識プローブおよび前記第２コントロールタグプローブを含む第２コントロールプローブセットとを、前記遺伝子試料に接触させる工程、
前記第１および第２コントロールプローブセットの少なくとも一部を、前記第１および第２染色体上における、前記第１および第２対象核酸領域とは異なる第１および第２コントロール領域にそれぞれハイブリダイズさせる工程、
少なくとも（ｉ）前記第１コントロール標識プローブと第１コントロールタグプローブ、（ii）前記第２コントロール標識プローブと第２コントロールタグプローブとをライゲーションすることにより、前記第１および第２プローブセットをライゲーションする工程、
前記ライゲーションされたプローブセットを増幅する任意の工程、
（ｉ）前記第１プローブセットおよび前記第２コントロールプローブセットを第１所定位置に、（ii）前記第２プローブセットおよび前記第１コントロールプローブセットを第２所定位置に固定化する工程であり、
前記固定化されたタグプローブにライゲーションされた、前記第１および第２コントロール標識プローブおよび／またはこれらを増幅した増幅標識プローブが、第１および第２コントロール標識をそれぞれ含み、
前記第１標識と前記第２コントロール標識とが、異なる標識であり、
前記第２標識と前記第１コントロール標識とが、異なる標識であり、
前記固定化された標識が、光学的に分解可能であり、
前記固定化された第１および第２コントロールタグプローブおよび／またはこれらを増幅した増幅タグプローブが、第１および第２コントロールタグをそれぞれ含み、および
前記固定化工程が、前記タグを前記所定位置に固定化することによって実施される工程、
前記基板に固定化された前記コントロール標識からの光学シグナルを測定する工程、ならびに
前記固定化されたコントロール標識からの光学シグナルを、前記固定化された第１および第２標識からの光学シグナルと比較し、前記対象核酸領域に基づく誤差が存在するかどうかを判定する工程を含む、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１タグと前記第２コントロールタグが同一であり、前記第２タグと前記第１コントロールタグが同一である、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
各ライゲーションされたプローブセットが、独立して、天然のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記比較において、前記第１の個数および前記第２の個数の比率を取得する、請求項１から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記基板が、ガラス基板である、請求項１から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記基板が、ウェルまたは隆起領域を含む、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記バインダーが、ビオチンを含む、請求項７０記載の方法。
【請求項８９】
前記第１および第２タグが、前記基板上の異なる位置に直接または間接的に固定化されるよう構成されている、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１および第２標識が、独立して、それぞれ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、ＢＯＤＹＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、およびＦＡＭからなる群から選択された色素を含む、請求項１から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１および第２プローブセットが、２個以上の標識を含む、請求項１から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１および第２のプローブセットが、繰り返し行うライゲーション反応によりライゲーションされる、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記判定された遺伝的変異が、癌治療に対する反応を示す、請求項１から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記被検体が、癌患者であり、前記遺伝的変異が、前記被検者の癌における遺伝的変異である、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記遺伝的変異が、腫瘍の大きさ、増殖速度、悪性度、ステージ、予後、および／または診断を示す、請求項１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記判定された遺伝的変異が、移植拒絶反応の有無を示す、請求項１５記載の方法。
【請求項９７】
前記ライゲーションされた第１および第２プローブセットが、環状分子を生成する、請求項１から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
さらに、前記環状分子の生成後、エキソヌクレアーゼを用いて直鎖状核酸分子を分解する、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
さらに、標識付けされたプライマーを用い、前記ライゲーションされたプローブセットを、直線的に増幅させる、請求項１から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１および第２プローブセット、および／またはこれらを増幅した増幅プローブセットが、２個以上の標識を含む、請求項１から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１および第２プローブセットの少なくとも一部が、前記第１および第２対象核酸領域に、それぞれハイブリダイズする、請求項１から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１および第２標識プローブが、独立して、ゲノム配列を有する、請求項１から１０１のいずれか一項に記載の方法。