【手続補正書】
【提出日】平成28年7月22日(2016.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在的薬物候補のスクリーニング及び選択のための方法、又はミトコンドリアに作用する物質に対するヒトの感受性を試験するための方法であって、
i）ミトコンドリアを含むヒト血液構成要素のサンプルを、高解像度呼吸計測にかけること、
ii）ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質に該細胞サンプルを接触させること、
iii）ビヒクル中に試験物質を含む試験サンプルを加えること、
iv）該試験サンプルを加える前と後の酸素消費量の比較、及び該ビヒクル中の対照サンプルの酸素消費量と該試験サンプルの酸素消費量の比較を行うこと、ここで酸素消費量の減少はミトコンドリアに対する負の効果を示し、
v）iii）から得られたサンプルをミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤と接触させること、及び
vi）v）から得られたサンプルをミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤と接触させること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
臨床試験又は治療投薬における薬物候補のミトコンドリアへの影響を調べるための方法であって、
i）ミトコンドリアを含むヒト血液構成要素のサンプルを、高解像度呼吸計測にかけること、ここで、該細胞のサンプルは臨床研究下または治療投薬下にあるヒトから採取したものであり、かつ該臨床研究又は治療投薬の期間中、試験物質が該ヒトに投与されており、
ii）ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質に該細胞サンプルを接触させること
iii）臨床研究下又は治療投薬下にあるヒトから採取した該サンプルの酸素消費量を対照サンプルの酸素消費量と比較すること、ここで酸素消費量の減少はミトコンドリアに対する負の効果を示し、
iv）iii）で得られたサンプルをミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤に接触させること、及び
v）iv）で得られたサンプルをミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤に接触させること、
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記高解像度呼吸計測を37℃の恒温下、400−25 μM O2の範囲の酸素濃度において行う、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質を加え、前記サンプル中のミトコンドリア電子伝達系の最大容量を得る、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質が、カルボニルシアニドｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、2,4-ジニトロフェノール（DNP）、及びその他のプロトンチャネル開口剤並びにそれらの混合物から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質が、0.1から10 μM、例えば0.5 μMから5 μM、1 μMから3 μM、約2 μMの範囲の濃度で加えられる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記ミトコンドリア内膜のプロトンへの漏洩を増加させる物質がＦＣＣＰである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記ビヒクルが、有機溶媒、例えば、エタノール、イソプロパノール、メタノール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、又はＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）である、請求項1及び3〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記試験サンプルが液体状であり、かつ濃度既知の前記試験物質を含む、請求項1及び3〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記試験サンプルを段階的に濃度を上げて加える、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記試験サンプルを段階的に加えることにより、該試験サンプルの最終濃度を1 μMから10 mMとする、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
iii）の対照サンプルが、前記試験サンプルと同一であるが試験物質を含まないものである、請求項1及び3〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記ミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤を加えて、複合体II-基質の酸化に依存的な細胞呼吸を明らかにする、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤が、0.1から10 μM、例えば0.5から5 μM、1から3 μM、又は約2 μMの範囲の濃度で加えられる、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記ミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤がロテノンである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記ミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤を加えて、ミトコンドリア非依存的な酸素消費活性、例えば前記サンプルの自動酸化を決定する、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記ミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤を加えて、その最終濃度を、約0.1から10 μg/ml、例えば約0.5から5 μg/ml、約0.75から2 μg/ml、又は1 μg/mlの範囲とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記ミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤がアンチマイシン-Aである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記対照サンプルが対照群から採取されたものである、請求項2〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記対照サンプルが任意の治療開始前に採取されたものである、請求項2〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
薬物候補物質のスクリーニングのための、請求項1及び3〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
薬物物質又は薬物候補に対する被験者の感受性を検査するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
臨床試験における試験物質のミトコンドリア毒性を評価するための、請求項2〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ミトコンドリア機能に対する物質の効果を分析するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞サンプルが前記被験者から単離したものである、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
ミトコンドリア呼吸とATP産生とを刺激できる化合物を評価するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
潜在的薬物候補をスクリーニング及び選択するための方法、又はミトコンドリアに作用する物質に対するヒトの感受性を試験するための方法であって、
i）ヒト血液サンプルから単離したミトコンドリアを含むヒト血液構成要素のサンプルを、高解像度呼吸計測にかけること、
ii）該細胞サンプルを複合体I呼吸を阻害する物質に接触させること、
iii）ビヒクル中に試験物質を含む試験サンプルを加えること、
iv）細胞膜を透過する物質を加えること、
v）iv）で得たサンプルに参照物質を加えること、ここで、該参照物質が複合体II結合性基質であり、及び
vi)複合体III呼吸を阻害する物質を加え、かつ得られた酸素消費量を、工程iii）において参照物質を用いて試験サンプルを加えることを省いて該方法を実施した場合に得られる酸素消費量と比較すること
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記細胞膜を透過する物質が、ジギトニンである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
ジギトニンを5 μg/mlから約250 μg/mlの濃度で加える、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記参照物質がコハク酸である、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記参照物質の最終濃度が約0.1から約20 mMである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
i）からvi）の各工程の詳細が請求項3、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、21、24、及び/又は26のいずれか一項に定義されたものである、請求項27〜31のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
潜在的薬物候補をスクリーニングし、かつ選択する、又はミトコンドリアに影響する物質へのヒトの感受性を試験する（上記の項目1、及び2）ための代替のプロトコルは、複合体IIスクリーニングアッセイにおいて、そのような試験物質の効果を調べることである。そのような方法は図11に図示され、かつ
i)ヒト血液サンプルから単離された活性ミトコンドリアを含む細胞サンプルを高解像度の呼吸計測にかけること、
ii)該細胞サンプルを複合体I呼吸を阻害する物質と接触させること、
iii)ビヒクル中に試験物質を含む試験サンプルを加えること、
iv)細胞膜を透過する物質を加えること、
v) 参照物質をiv)で得られたサンプルに加えること、及び
vi)複合体III呼吸を阻害する物質を加えること、を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前記試験結果を、用いた試験物質が参照物質と同じものである、前記方法で得られた結果と比較する。典型的な結果を図11に示す。ここでは、候補薬物がある一定の度合いで細胞膜を透過できることが示されている（すなわち、呼吸の増加が達成されている）。細胞膜を透過性にするジギトニンを添加しても、さらなる呼吸の増加に至らない。すなわち、試験物質にはそれ以上の効果はない。参照物質（コハク酸のような複合体II結合性基質）を加えた場合（これは典型的にはコハク酸のような内在的基質である）、呼吸の増加が観察され、かつ最大容量が達成される。次いでアンチマイシン-Aのような複合体III阻害剤を加え、該サンプルの自動酸化のようなミトコンドリア非依存的な酸素消費活性が決定される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
コハク酸のような内在基質である、参照物質を用いた結果と比較すると、該参照物質は細胞膜を透過しないように見える。該膜を透過性にしたとき（例えばジギトニンを用いて）のみ、該呼吸は増加する。内在基質をさらに加えても呼吸は変化しないが、一方で、複合体IIIの阻害剤を加えるとミトコンドリアの呼吸は停止する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
上記方法に関して以下の詳細が与えられている。
（1.健常者から採取した血液、又はいわゆるバフィーコートと呼ばれる血小板と白血球の濃縮された溶液由来の細胞における、初期又は後期の段階にある薬物候補のスクリーニング及び選択）
そのような方法は、下記を含む方法である：
i)ヒト静脈血サンプルから単離した活性ミトコンドリアを含む細胞サンプルを、37℃の恒温下400-25 μM O2の範囲の酸素濃度で高解像度呼吸計測にかけること、
ii) 該細胞サンプルをカルボニルシアニドp-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、2,4-ジニトロフェノール（DNP）、又はその他のプロトンチャネル開口剤のような、ミトコンドリア内膜のプロトン透過性を増加させる物質と接触させることで、血小板中に存在するミトコンドリアの電子伝達系の最大容量を得ること、
iii)ビヒクル中に試験物質を含む試験サンプルを加えること、ここで、ビヒクルの追加と比較して、追加は標準的には段階的に投与量を上げながら加える；
iv)試験サンプルを加える前と後の酸素消費量を比較し、試験物質及びビヒクルの間の酸素消費量を比較すること、ここで、酸素消費量の減少がミトコンドリアに対する負の効果を示す；
v) 複合体II基質の酸化に依存的な細胞呼吸を明らかにするために、iii)で得られた前記サンプルをロテノンのようなミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤と接触させること、
及び、
vi) v)で得られる該サンプルをアンチマイシン-Aのようなミトコンドリア複合体IIIの機能阻害剤と接触させ、該サンプルの自動酸化のようなミトコンドリア非依存的な酸素消費活性を決定すること。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（3.臨床試験におけるミトコンドリアに対する薬物毒性の分析）
臨床試験はどのような試験でもよく、例えば、投与量を決定する試験、ヒトを用いた安全性試験等があり、該方法は単純な血液サンプルに基づいている。短期、急性、長期、及び慢性の効果の全てを評価できる。特徴的な例はHIVの治療薬であり、これは長期の使用後に、ミトコンドリアの異常を示す症状を与え得る（ミトコンドリアDNAの喪失に起因する）。この目的で、薬物物質の複合的な毒性並びに対象の血漿中の循環代謝物を決定することを可能とする、本願方法は大きな利点がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
そのため、そのような方法は、下記を含む：
i) 37℃の恒温下、400−25 μM O2の範囲の酸素濃度で、ヒト静脈血サンプルから単離された活性ミトコンドリアを含む細胞を、高解像度の呼吸計測にかけること、ここで、血液サンプルを採取する前に該ヒトに試験物質が投与される；
ii)該細胞サンプルを、カルボニルシアニドp-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）、又はミトコンドリア内膜のプロトン透過性を増加させる他の物質と接触させ、血小板中に存在する該ミトコンドリアの、該電子伝達系の最大容量を取得すること、
iii)第一のヒト血液サンプルの酸素消費量を、第二の血液サンプルの酸素消費量と比較すること、ここで、酸素消費量の減少は、ミトコンドリアに対する負の効果を示し、かつ酸素消費量の上昇は、ミトコンドリアへの正の効果を示す；
iv)複合体II-基質の酸化に依存的な、細胞呼吸を明らかにするために、ii)で得られたサンプルを、ロテノンのような、ミトコンドリア複合体Iの機能阻害剤と接触させること、
及び、
v) iv)で得たサンプルを、アンチマイシン-Aのような複合体IIIの機能阻害剤と接触させ、該サンプルの自動酸化のような、ミトコンドリア非依存的な酸素消費活性を決定すること。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図４】血小板のミトコンドリア呼吸についての、年齢と性別の相関。A：常態呼吸と年齢の相関。個々の点は、2回繰り返しにより得た値の平均である。B：ETSCII呼吸およびC：OXPHOSCI+II呼吸と年齢の相関。D：ETSCI+II呼吸の性別間の比較。呼吸状態の定義については図3参照。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
基質、脱共役剤、阻害剤滴定（SUIT）プロトコルを使用して、複合体I（CI）及び複合体II（CII）の両方に分かれる電子の流れの呼吸容量並びにQ-ジャンクション（CI+II）を介して入力される合流電子を確立した（Gnaigerの文献、2009）。常態呼吸が確立した後、ジギトニンにより細胞膜を透過処理することから滴定を開始し、リンゴ酸（5 mM）とピルビン酸（5 mM）を同時に加えた。NADH関連基質により駆動される、複合体IのOXPHOS容量は、ADP（1 mM）を加え、さらにグルタミン酸（5 mM）（OXPHOSCI、または状態3CI）を追加することで評価した。続いて、10 mMコハク酸を加えることで、複合体Iと複合体IIの両方を介した合流入力（OXPHOSCI+IIまたは状態3CI+II）を伴う、最大OXPHOS容量を誘導した。オリゴマイシン（1 μg/ml）はATPシンターゼを阻害し、LEAK呼吸を誘導するために使用した。続いて、FCCP(ETSCI+II、平均濃度6 μM)を滴定することで、ETSの最大合流呼吸容量を得た。複合体Iをロテノン（2 μM）で阻害し、複合体IIのみを通じコハク酸により支持されるETS容量（ETSCII）を評価した。最後に、ETSを通じた電子の流れを、アンチマイシン-A（1 μg/ml）を加えることにより阻害し、ETSと関係しない残存酸素消費量を提供した。対照比は、最大酸化呼吸又はFCCP刺激時の最大呼吸を、LEAK呼吸で除することにより、算出した（それぞれOXPHOSCI+II/LEAK及びETSCI+II/LEAK）。分析したサンプルは、-80℃で保存した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
（2.2未処置の血小板のミトコンドリア呼吸）
未処置の細胞を用いた実験の、代表的なグラフを図2に示す。未処置の細胞では、呼吸は内在基質によってのみ駆動される。常態呼吸はPBS-グルコースにインキュベートした細胞も、血漿にインキュベートした細胞も、同様であった。LEAK呼吸は非常に低く、1 pmol O2/s/108血小板であった。結果的に対照比ETS/LEAKが高くなることから、非常に強く共役した呼吸をしていることを示唆している。FCCPによるETSの最大刺激は、オリゴマイシンを用いない実験で有意に高く、対照比ETS/常態により示される余剰の呼吸容量は、血漿に懸濁した、オリゴマイシン処理をしていない血小板の方が、PBSグルコースに懸濁したものより、有意に高かった。ロテノンによる複合体Iの阻害は、〜99％の呼吸を抑制し、アンチマイシン-Aを加えた後には、さらなる阻害は見られなかった。異なる集団間では、日本人の対照群と対する臍帯血のFCCP刺激後の最大呼吸（ETS）の間で有意差があった（15 ± 1.3 vs 23 ±2.3 pmol O2/s/1×106血小板）。その他では差は見られなかった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
（2.2.1透過処理をした血小板のミトコンドリア呼吸）
SUITプロトコルを開発し、1回の実験で、異なる呼吸複合体の容量について、可能な限り多くの情報を得た。基質と阻害剤を加えたときの、代表的な軌跡と異なる状態の定義を、図3に描いた。MiR05中の細胞の常態呼吸は、PBS-グルコース又は血漿中にインキュベートした未処置の血小板と、同じ範囲であった。ジギトニンを加えた後は、細胞質中の基質とアデニンヌクレオチドが周囲の培地へと拡散したため、安定した呼吸の減少がみられた。複合体Iの基質としてのリンゴ酸とピルビン酸の存在下、ADP刺激を行うと、常態呼吸と比較して、〜80％呼吸が増加した。さらに、NADHを生成させ、複合体Iの電子入力を行うために、グルタミン酸を加えると、呼吸はさらに〜10％増加した。コハク酸を加えた後、複合体Iと複合体IIの両方からETSへの入力を受け合流した電子の流れが得られ、常態呼吸の3倍の呼吸速度と、複合体Iの基質のみ受けたときの呼吸より〜50％増加した呼吸が引き起こされた。LEAK呼吸は、最大共役呼吸OXPHOSCI+IIの〜15％であった。〜7.0のOXPHOSCI+II/LEAK比は、効率よいATP合成と電子伝達との共役を示しており、ほかの組織と同程度である（Kuznetsovらの文献、2002）。最大呼吸容量ETSCI+IIは、プロトンチャネル開口剤FCCPに誘導され、OXPHOSCI+IIと比較して〜5％高かった。OXPHOS/ETS比は1に近く、外因基質が飽和している状態では、リン酸化システムによる流れの制限がほとんどないことが示唆している。ロテノンによる複合体Iの阻害の後、測定したETSCII活性は、複合体Iと複合体IIの活性が組み合わされたETSCI+IIの、〜35％であった。日本の参照材料では、統合された入力同様に、複合体Iの基質の最大呼吸は、スウェーデンの参照材料を用いたときと、同程度であった。しかしながら、LEAK呼吸と複合体IIに刺激された呼吸は、ともにETSCI+II/LEAK比が低下したスウェーデン及び小児集団からの値と比較して、〜25％高かった。臍帯血の値は、OXPHOSとETSの両方で、最大呼吸が高い値を示す点で、相違した。結果として得た比が低かったことから、LEAK呼吸は絶対値並びに比の双方において、有意に高かった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（2.4異なる血小板濃度における呼吸の線形性）
異なる血小板濃度における呼吸を評価した。100-400×106 plt/mlの範囲において呼吸は、全ての状態で線形性を残した。50×106 plt/mlの濃度では、最大のFCCP刺激は20-25％減少した（図5）。その後の実験の多くは、血小板濃度200×106/mlで行った。該方法は同じ個人に対し異なる日に行う実験によって評価すると、よい再現性を示した。異なる呼吸パラメーターにおいて、その分散係数は6-13％であった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
SUIT-3においては、最大OXPHOSCI+II容量に続き、主にミトコンドリア内膜を挟んだプロトンのすり抜け又は漏洩により引き起こされる、LEAKCI+II（状態4）の呼吸を評価するために、オリゴマイシン（1 μg/ml）により、ATPシンターゼを阻害した。酸化的リン酸化を伴わない呼吸を通じた最大の電子伝達、ETSCI+IIを、段階的に（2-4 μM）FCCPで滴定することにより、評価した。酸化的リン酸化と共役しない複合体II結合呼吸、ETSCIIを、ロテノンを加えることに続き、ETSをアンチマイシン-Aにより阻害することで評価した。この時点で再酸素化を行い、SUIT-2及びSUIT-3プロトコルにおいて160-180 μM O2のレベルにおいた。複合体IVの活性は、複合体IVの電子供与体である、N,N,N',N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン（TMPD 0.5 mM）を加えることにより、評価した。TMPDアジ化ナトリウム（10 mM）は自動酸化するため、複合体IV阻害剤を加え、得られる2つのレベルの差を、複合体IVの活性として計算した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
2つのスクリーニングプロトコルが利用される。
（1）複合体II効果について、110 mM スクロース、HEPES 20 mM、タウリン 20 mM、K-ラクトビオン酸 60 mM、MgCl2 3 mM、KH2PO4 10 mM、EGTA 0.5 mM、BSA 1 g/l、pH 7.1を含む緩衝液中の単離した血小板又は白血球細胞を用いて、第一のスクリーニングを行った。内在の基質による、ベースライン呼吸を確立した後、複合体Iをロテノン2 mMで阻害した。DMSOに溶解した薬物候補を、最終濃度100 μM、500 μM、及び5 mMとなるように段階的に滴定した。
続いて、ジギトニン（1 mg/1×106 plt）により、細胞膜透過処理を行った。呼吸が安定した後、コハク酸10 mMを加え、呼吸が安定した後、アンチマイシン-Aを最終濃度1 μg/mlで加えることにより実験を終了し、残存呼吸を測定した。図11は、新規細胞透過性ミトコンドリア基質を評価するプロトコルを示す。該アッセイにおいて、未処置の細胞におけるミトコンドリア機能は、呼吸複合体Iの阻害剤であるロテノンにより抑制される。細胞膜透過処理の前と後に薬物候補を内在の基質と比較し、生物エネルギーの促進又は阻害を評価する。