【手続補正書】
【提出日】平成28年8月2日(2016.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の標的部位を切断して、それによって前記ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こす工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、前記ＦＡＤ２遺伝子が切断後に修飾される方法。
【請求項２】
対象となる核酸配列を前記破壊に組み込む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＡＤ２遺伝子がＦＡＤ２  ２．３、ＦＡＤ２  ２．６遺伝子、または両方である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
部位特異的様式での前記切断が、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質或いは前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含み、前記融合タンパク質が特異的に前記標的部位に結合し、前記標的部位またはその近くを切断して、それによって前記破壊を引き起こす、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、および前記のいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
部位特異的様式での前記切断がＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対象となる前記核酸配列が標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞または大豆植物。
【請求項１３】
大豆細胞または植物が、ＦＡＤ２  ２．３および／またはＦＡＤ２  ２．６遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞または植物である、請求項１２に記載の細胞または植物。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が前記細胞と異種性または相同性である、請求項１３に記載の細胞または植物。
【請求項１５】
前記相同性配列が少なくとも１つの一塩基多型を含む、請求項１４に記載の細胞または植物。
【請求項１６】
前記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれる、請求項１３から１５のいずれかに記載の細胞または植物。
【請求項１７】
配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する、ＦＡＤ２遺伝子を修飾するために使用するための部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項１７に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は以下を提供する。
［１］部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の標的部位を切断して、それによって上記ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こす工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、上記ＦＡＤ２遺伝子が切断後に修飾される方法。
［２］対象となる核酸配列を上記破壊に組み込む工程をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記ＦＡＤ２遺伝子がＦＡＤ２  ２．３、ＦＡＤ２  ２．６遺伝子、または両方である、上記［１］または上記［２］に記載の方法。
［４］部位特異的様式での上記切断が、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質或いは上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを上記細胞に導入する工程を含み、上記融合タンパク質が特異的に上記標的部位に結合し、上記標的部位またはその近くを切断して、それによって上記破壊を引き起こす、上記［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、および上記のいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、上記［４］に記載の方法。
［６］上記切断ドメインまたは切断ハーフドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記［４］または上記［５］に記載の方法。
［７］上記融合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［４］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、上記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される上記認識ヘリックス領域を含む、上記［７］に記載の方法。
［９］部位特異的様式での上記切断がＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、上記［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］上記標的部位が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される、上記［１］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］対象となる上記核酸配列が標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］上記［１］から［１１］のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞または大豆植物。
［１３］大豆細胞または植物が、ＦＡＤ２  ２．３および／またはＦＡＤ２  ２．６遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞または植物である、上記［１２］に記載の細胞または植物。
［１４］上記ヌクレオチド配列が上記細胞と異種性または相同性である、上記［１３］に記載の細胞または植物。
［１５］上記相同性配列が少なくとも１つの一塩基多型を含む、上記［１４］に記載の細胞または植物。
［１６］上記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれる、上記［１３］から［１５］のいずれかに記載の細胞または植物。
［１７］配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
［１８］上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、上記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される上記認識ヘリックス領域を含む、上記［１７］に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
本開示は、（例えば、植物、藻類および真菌類において）ＦＡＤ２遺伝子の発現を調節するための組成物および方法、ならびに対象となる核酸配列（例えば、外因性核酸配列）の宿主細胞への標的化組込みのための部位としてのこれらの座の使用を記載する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、そのいずれかまたは全てが選択的に修飾および／または破壊され得る１つまたはそれ以上のＦＡＤ２配列（例えば、ホモログまたはパラログ）を含む１つまたはそれ以上のゲノムを含み得る。具体的な例では、本開示が、ダイズ（Glycine max）（例えば、ダイズ栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２、Ｘ５、ＷｅｓｔａｇおよびＭａｖｅｒｉｃｋ）のＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６遺伝子、ならびに対応するホモログまたはパラログ、ならびに対象となる核酸配列の標的化組込みのための座としてのその使用を記載する。本明細書に記載されるように、ＦＡＤ２遺伝子は宿主の脂肪酸生合成に関与しているが、（例えば、ＦＡＤ２コード配列への外因性核酸の組込みによる）修飾または破壊は、結果として生じる宿主生物に予想外に全く有害効果をもたらさないまたは最小の有害効果しかもたらし得ない。