(57)【要約】【課題】  本発明、土壌や汚泥など多種類の微生物が生息する環境で採取される試料から、目的とする微生物を選択的に分離する方法として、何等特殊な設備等を用いることなく極めて簡単な技術を提供する。【解決手段】  目的とする微生物が必須とする少なくとも１種の栄養を欠いた固体培地に、採取した試料を播き、前記栄養成分を担持した多孔膜を前記微生物が付着した固体培地に被い静置培養した後、該膜上に形成された微生物をそれぞれ採取する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする微生物のみが必須とする少なくとも１種の必須栄養成分を欠いた固体培地に採取した試料を播き、前記必須栄養成分を担持した多孔質膜を前記固体培地上に被い静置培養した後、該膜上に形成された微生物のコロニーを採取することを特徴とする微生物の分離方法
【請求項２】
前記多孔質膜が実質的に前記必須栄養成分よりなることを特徴とする請求項１記載の微生物の分離方法
【請求項３】
前記多孔質膜が多数の細孔よりなる高分子フィルムであり、該細孔中に、前記必須栄養成分の溶液が充填されていることを特徴とする請求項１記載の微生物の分離方法
【請求項４】
固体培地が微生物成育時の炭素源となる有機栄養成分を含まない培地であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の微生物の分離方法
【請求項５】
多孔質膜が実質的にセルロース繊維からなる紙でありセルロース分解微生物を含む試料をグルコース単位を持った有機栄養成分を含まない固体培地に播き、セルロース分解能を有する微生物を分離することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のセルロース分解能を有する微生物の分離方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌等の微生物を多数種類含む試料から特定の能力を持つ微生物を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上には、殆ど無数種類の微生物が存在している。それらのあるものは、有機物を分解するものや、金属等の無機物を分解するものなど多種多様であるが、これまでに分離され或いは研究対象とされてきた微生物の種は、極めて僅かであり、全微生物の１％未満であると考えられる。
【０００３】
しかるに微生物の持つ能力は、驚くべきものがあり、古くから発酵工業や医薬品の製造などに応用されてきた。今後益々の産業上有益な微生物の利用可能性が考えられる。
【０００４】
なかでも、有機物を分解する能力のある微生物の新規な発見は、新たな医薬品の開発や汚水や廃棄物の処理、バイオ燃料の生産等多くの産業上の利用が期待される。
【０００５】
従来、ある特定の有機物を分解する微生物を分離する際の方法として、特定の有機物を含む培養液で集積培養を行い、増殖してきた微生物を適当な寒天培地で分離する方法がある（非特許文献１）。この方法では、その時に用いた培養条件（培養液組成、温度、酸素の有無）を好む種が優占的に増殖するため、それ以外の種が淘汰され、純粋分離が困難であった（非特許文献２、３）。
【０００６】
また、別の方法として、セルロース等のような培地に溶けにくい有機物の場合、水溶性の誘導体へ変換し、その水溶性誘導体を溶解した寒天培地上に試料を接種し、増殖してきた微生物のコロニーを純粋分離する方法がある（非特許文献４）。この方法では、増殖の速い種や抗菌物質を分泌する種のコロニーが寒天培地一面で広がり、多種微生物のコロニーをマスクして純粋分離が困難となる。さらに、寒天は多くの低分子有機物が夾雑成分としても含むことから、これを栄養とする微生物も生育し、目的とする有機物を分解する能力がない“擬陽性”コロニーも出現するという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fujii, K., Shintoh, Y.(2006) Degradation of mikan (Japanese mandarin orange) peel by a novelPenicillium species with cellulolytic and pectinolytic activity. Journal ofApplied Microbiology 101 (5), 1169-1176
【非特許文献２】Da Rocha UN, VanOverbeek L, Van Elsas JD(2009) Exploration of hitherto-uncultured bacteria fromthe rhizosphere. FEMS Microbiol Ecol 69(3):313-328
【非特許文献３】Joint I, Muhling M, QuerellowJ(2010) Culturing marine bacteria-an essential prerequisite for biodiscovery.Microbial Biotechnol 3(5):564-575
【非特許文献４】Prasertsan,P.,H-kittikul, A.,Chitmanee, B.(1992) Isolation and selection of cellulolyticfungi from palm oil mill effluent  World Journal of Microbiology &Biotechnology 8 (6), 614-617.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、上記の事情に鑑み、特定の物質を分解する能力を有する微生物を自然環境等から効率よく簡易に分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多孔質膜を用いることで上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、（１）目的とする微生物のみが必須とする少なくとも１種の必須栄養成分を欠いた固体培地に採取した試料を播き、前記必須栄養成分を担持した多孔質膜を前記固体培地上に被い静置培養した後、該膜上に形成された微生物のコロニーを採取することを特徴とする微生物の分離方法である。
【００１０】
本発明の第２の態様は、（２）前記多孔質膜が実質的に前記必須栄養成分よりなることを特徴とする（１）記載の微生物の分離方法である。
【００１１】
本発明の第３の態様は、（３）前記多孔質膜が多数の細孔よりなる高分子フィルムであり、該細孔中に、前記必須栄養成分の溶液が充填されていることを特徴とする（１）記載の微生物の分離方法である。
【００１２】
本発明の第４の態様は、（４）固体培地が微生物生育時の炭素源となる有機栄養成分を含まない培地であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の微生物の分離方法である。
【００１３】
本発明の第５の態様は、（５）多孔質膜が実質的にセルロース繊維からなる紙でありセルロース分解微生物を含む試料をグルコース単位を持った有機栄養成分を含まない固体培地に播き、セルロース分解能を有する微生物を分離することを特徴とする（１）乃至（４）のいずれか１項に記載のセルロース分解能を有する微生物の分離方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来法では得られなかったか、または極めて手数を要する方法でしか微生物を分離することができなかった微生物の分離が、たった１種類の土壌試料等からでも多種類の微生物が得られる点は、新奇微生物の探索に非常に有用である。
【００１５】
また、請求項２の方法によれば多孔質膜は栄養基質の役割も兼ねており、特定の有機物分解微生物を選択的に分離することが可能である。
【００１６】
さらに、本発明では、特別な施設や熟練操作を必要とせず、一般的な微生物学実験の知識を習得したものであれば、比較的容易に行える。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】は、本発明の手順を示す例の模式図である。
【図２】は、本発明における２週間培養後の固形培地上のろ紙に形成されたコロニーの様相を示す写真である。
【図３】は、本発明よりセルロース分解微生物を分離した系統図である。
【図４】は、本発明よりセルロース分解微生物を分離した系統図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の最大の特徴は、目的とする微生物の必須とする栄養成分を存在させない固体培地上に微生物を含む溶液を播き、当該微生物溶液に前記目的とする微生物のみが必須とする栄養成分を膜状（フィルムともいう）に固定し、実質的に拡散しない状態で、前記微生物に接触させることにより、固体培地から膜側に移行した栄養成分と膜内の必須成分とにより、膜中に散在する微生物は、膜内でこれを栄養として分解・摂取することで成育し、膜上面にコロニーとして出現する。しかし、膜内に存在する栄養成分を摂取できない微生物は、膜内で生育できず、従ってコロニーとして出現することはできない。また例え膜内の栄養成分を必須とする微生物同士であっても、膜内の微生物細胞は膜内支持体によって固定化され、胞子等の拡散も阻まれることから、個々の細胞が固定化されている各所で、それぞれ独立したコロニーを形成する。
【００１９】
かくして、膜上に現れる微生物のコロニーは、完全に独立して別々の微生物群となるのである。
【００２０】
これらの微生物を、それぞれ白金耳等の針を用いて採取分離し、常法により、液体又は、固体培地を用いて増殖するか、或いは必要により、本発明の方法を繰り返し行う継代培養により微生物の精製を行うこともできるのである。
【００２１】
本発明の特徴の一つは、前記膜自体を、目的とする微生物の必須栄養成分で構成することも可能である。例えば、セルロース（これは、ポリグルコピラノースよりなる高分子である）よりなる所謂紙を用いればよいし、同様に、たん白質を分解する微生物を分取する場合は、絹織物や動物の毛の不織布或いはカゼイン、ゼラチン等のフィルム（これらは、微生物の分解により細孔を生じるので本明細書では多孔膜とする）も用いることもできる。
【００２２】
更に、特殊糖類等では、オブラード等も多孔膜として使用し得る。また、グリセリン、グリコール、ウレタン等の薬品類を分解する微生物に対しては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン類、多孔膜、或いは発泡スチレン、塩化ビニル、ポリウレタン等の発泡多孔膜などの合成高分子プラスチックスの微多孔中に、それらの栄養成分の溶液を含浸等により充填して用いることもできる。
【００２３】
なお、特殊な薬剤に対して耐性を有する菌などの微生物を分取する場合には、それらの抗菌剤をアンチ栄養剤として含む膜を用いることもできる。この場合も、本願発明では必須栄養成分と表現するものとする。
【００２４】
また、培地としては一般に寒天培地が用いられるが、これに限定されるものではない。更に培地には、窒素源（例えばアミノ酸）、ビタミン類（例えばチアミン等）及び無機塩類（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛その他の塩類）またはペプトン（例えば、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、ゼラチンペプトン、大豆ペプトン等）が必要により取捨選択して用いることができる。勿論本発明の培地には、分離の目的物である微生物のみが必須とする栄養成分の少なくとも１種は含ませてはならない。本発明の試料は複数種の微生物が混在するものであればよく、例えば土壌や汚泥或いは、生物の一部等、特に限定されないが、土壌など微生物が多く含まれる試料が好適である。
【００２５】
以下に、本発明の分離方法を、セルロース分解微生物を分離する場合を例として、その手順を説明する。
【００２６】
まず、腐葉土等、セルロース分解微生物が多く存在すると思われる土壌（一般にこれらの土壌には１ｇ中１０５〜１０９個の微生物が含まれると言われる）の約１ｇを採取し水を加えて懸濁液とし、これを多段階に希釈を行う。その後、目的とする微生物（セルロース分解微生物）に必須の成分であるグルコース或いは、ダルコピラノース核等のグルコース単位を持った糖類の基本骨格の化合物を含まない寒天培地上に１滴若しくは数滴塗布し、その上からろ紙を被う。この手順を図１を用いて更に説明する。
【００２７】
図１の（１）に示すように、無機塩を加えた寒天培地をシャーレに入れ、約１gの土壌を５ｍｌの水中に懸濁させた試料を、（２）１滴（約１ｍｌ）、培地上に滴下し、（３）培地上に拡げ、（４）その上をろ紙で被い静置培養する。これを３０℃の温度下に２週間培養した場合のろ紙上に形成されたコロニーの模様を示す写真が図２である。
【００２８】
これらのコロニー数の計算から、１ｇ土壌あたり約２０００個のセルロース分解微生物の存在が示唆された。形態的差違に基づき、６２株の純粋分離株であることが分かった。
【００２９】
分離株のＤＮＡ（糸状菌はＩＴＳ領域、細菌は１６ＳｒＤＮＡ）を基に系統解析を行った結果、糸状菌分離株５３株または１０属に分類されたが、そのうち１０株は既知近縁種とのＤＮＡ相同性が９７％以下であり、未報告種の可能性がある。
【００３０】
以上のように、本発明の分離方法を利用すれば、１種類の土壌試料から、多種類の微生物を分離回収することが容易に行えるうえ、特別な施設やスキルを用いる必要もなく、まさに一般的な微生物学実験の知識を習得した者であれば容易に実施することができるのである。
【００３１】
勿論、本発明の分離方法は、セルロース分解性微生物に限らず、被覆する膜としては、ろ紙に限らず、わら半紙を使えば、セルロースに加えてリグニンを分解する微生物が、また竹皮を使えばセルロース、リグニンに加えてキシラン分解微生物が、またオブラート膜を使えば、澱粉糖化微生物が、また絹布を使えばたん白質分解微生物が、更にポリエステル繊維の不織布等の多孔膜を使えば芳香族環分解微生物の探索や分離も可能となる。
【００３２】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
＜培養液の調製＞
微生物の分離には、ろ紙を炭素源として加えた無機塩固形培地（pH5.3）を用いた。無機塩固形培地の組成は20g/l寒天、5.0g/l硫酸アンモニウム、1.0g/lリン酸二水素カリウム、500mg/l硫酸マグネシウム・７水塩、100mg/l塩化ナトリウム、100mg/l塩化カルシウム・２水塩、0.5mg/lホウ酸、0.4mg/l硫酸マンガン・５水塩、0.4mg/l硫酸亜鉛・７水塩、0.2mg/l塩化鉄、0.2mg/lモリブデン酸ナトリウム・２水塩、0.1mg/lヨウ化カリウム、0.04mg/l硫酸銅・５水塩、2.0mg/lイノシトール、0.4mg/lパントテン酸カルシウム、0.4mg/lナイアシン、0.4mg/lチアミン塩酸塩、0.4mg/l塩酸ピリドキシン、0.2mg/lリボフラビン、0.2mg/lアミノ安息香酸、2mg/l葉酸、2mg/lビオチンである。
【００３４】
＜土壌試料の採集＞
実験に供した土壌は山口大学演習林（ブナを主とする雑木林）から採集した。森林土壌の表面〜深度3cmまでの土壌を採集し、2mmのステンレスふるいを通した。水分、pH(H2O)、pH(KCl)は各々22.0(wt%)、5.3、及び3.2であった。土壌中の有機炭素および窒素量は11.7及び0.064(重量%)であった。
【００３５】
＜微生物の培養と分離＞
土壌試料(1.0g)を5mlの滅菌水に懸濁した。これを固形培地上に1ml加え、さらにその上にWhatman no.5ろ紙（ワットマン社製）を被せ、土壌微生物をろ紙と固形培地で挟み込む様にし、30℃で2週間静置培養した。培養後にろ紙上に出現したコロニーをセルロース分解微生物として純粋分離した。
【００３６】
＜分離株の系統分類＞
分離株をYM培地(10g/lグルコース、3g/l酵母エキス、3g/l麦芽エキス、5g/lペプトン)でフラスコ培養し、菌体を得た。Master Pure Yeast DNA精製キット(Epicentre社製)を用いて各菌体からDNAを抽出し、PCRの鋳型とした。糸状菌ではITS1(配列番号１  5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)とITS4(配列番号２  5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)プライマーを用いてITS領域DNAをPCR増幅し、細菌では27F(配列番号３  5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)と380R(配列番号４  5’-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3’)プライマーを用いて16SリボソームDNA部分配列を増幅した。PCRの反応温度は94℃ for
1min、55℃ for 1min、72℃ for 2minの30サイクル、最後に7min at 72℃であった。増幅したPCR産物はダイターミネータ法で塩基配列を決定し、既知微生物DNAとデータベース比較することで系統分類を行った。
【００３７】
＜酵素活性の測定＞
分離株の酵素活性を分析するために、セルロース粉末およびキシランを含む培養液で分離株を1週間液体培養した。培養後、菌体を遠心分離（3000rpm,10min）で除去し、残った培養上清をVivaspin-20(GE ヘルスケア社製)で遠心濃縮、さらに50mMクエン酸緩衝液(pH4.8)で置換したものを酵素液とした。この酵素液を用いて各種酵素活性を測定した。
【００３８】
エキソセルラーゼ活性、エンドセルラーゼ活性およびキシラナーゼ活性は、各々セルロース粉末、カルボキシメチルセルロース、キシランを10mg/ml濃度で含むクエン酸緩衝液に酵素液を添加し、50℃で1時間加温後に生じた還元糖量を定量し、酵素活性を算出した。ラッカーゼ活性は、シリングアルダジンを基質として含むクエン酸緩衝液に酵素液を加えて30℃で30分反応させ、525nm吸光度の増加を基に、活性を算出した。
【００３９】
＜実験に供した土壌の微生物数＞
実験に供した土壌中の微生物数は3.3X106CFUs/g-dry
soilであった。
【００４０】
本法を用いて微生物を含む土壌懸濁液を培養したところ、培養2週間後に様々な形態学的特徴を持つ微生物コロニーがろ紙上に出現した（図２)。唯一の有機炭素源であるろ紙上に出現したコロニーはセルロース分解能を有していると考えられ、その微生物数は2,150CFUs/g-dry soilであった。出現コロニーの80%が糸状菌、20%が細菌であった。
【００４１】
形態学的特徴に基づき、67個のコロニーを分離し、62株が継代培養可能であった。この62株の内訳は53株が糸状菌、9株が細菌であった。
【００４２】
＜分離株の系統分類＞
図３は各々糸状菌分離株と細菌分離株の系統樹を示している。得られた分離株は図中“Ｓｔｒａｉｎ”と記載し、“Ｓｔｒａｉｎ”の後ろの数字は株番号を示す。糸状菌株は10種類の属に渡る多様な種が確認された。これらの分離株のうち10株（Strain-9,Strain-11,Strain-18,Strain-19,Strain-33,Strain-34,Strain-44,Strain-50,Strain-55,Strain-63）は既知種とのITS領域のDNA相同性が97%以下であり、未報告種である可能性が示唆された。対比実験として、土壌試料を液体培地（固形培地から寒天を除いたもの）で集積培養したところ、微生物種の多様性は完全に失われ、Penicillium属の株のみしか得られなかった（図３）。
【００４３】
細菌分離株は2種類の属に分類されたが、内2株Strain-25,Strain-47は既知種との16S-リボソームDNA相同性が97%以下であり、未報告種である可能性が示唆された（図４）。
【００４４】
＜分離株の酵素活性＞
分離株62株の中には系統学的に同種と考えられる株もあったことから、これらの中から代表株を28株選出し、これらの株の酵素活性を測定した。表１には酵素活性の測定結果を示している。全ての被検株でエキソセルラーゼ活性が認められ、他に比して強い酵素活性を持つ株も見られた。また、分離株の多くがエンドセルラーゼ活性とキシラナーゼ活性も併せ持ち、さらにラッカーゼ活性を有するものもいた。
【００４５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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