【手続補正書】
【提出日】平成27年12月24日(2015.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドが細孔を介して移動し、ＲｅｃＤヘリカーゼが細孔を介する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを、膜貫通細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項２】
１または複数の特徴が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択され、場合によって、前記標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、１もしくは複数のタンパク質で、または１もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測定により測定され、ここで前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細孔を隔てて電圧を印加して、細孔とヘリカーゼとの間の複合体を形成するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細孔が、膜貫通タンパク質細孔または固体状態細孔であり、場合によって、前記膜貫通タンパク質細孔が、ヘモリシン、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）のポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）属オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）、およびＷＺＡから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示される８つの同一のサブユニット、もしくは７つのサブユニットのうちの１もしくは複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号２と少なくとも５０％の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体から形成されるものであり、または、（ｂ）配列番号４に示される７つの同一のサブユニットから形成されるα−ヘモリシン、もしくは７つのサブユニットのうちの１もしくは複数が、配列の全体にわたりアミノ酸同一性に基づいて配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有し、細孔活性を保持するその変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）［式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｐ、Ａ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＡであり、Ｘ６は、ＫまたはＲであり、Ｘ７は、ＴまたはＳである］；および／または
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号９、１０、および１１）［式中、Ｘ１は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、Ｘ２は、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｃ、またはＶであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、ＴまたはＮであり、Ｘ５は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ７は、ＧまたはＳである］
を含み、場合によって、前記ＲｅｃＤヘリカーゼが、以下のモチーフ：
（ａ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＷＡＶＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号２０）；
（ｂ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＬＴＶＨＲＡＱＧ（配列番号２３）；
（ｃ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＩＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号２７）；
（ｄ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＹＣＩＳＶＨＫＳＱＧ配列番号（２９）；
（ｅ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＡＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号３１）；
（ｆ）  ＧＧＰＧＣＧＫＳ（配列番号３３）および／またはＹＡＭＴＩＨＲＳＱＧ（配列番号３４）；
（ｇ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＶＳＩＨＫＳＱＧ（配列番号３６）；
（ｈ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＴＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号３８）；
（ｉ）  ＧＧＰＧＴＧＫＴ（配列番号１９）および／またはＹＡＶＳＶＨＫＳＱＧ（配列番号４０）；
（ｊ）  ＧＧＰＧＶＧＫＴ（配列番号２６）および／またはＹＡＴＳＩＨＫＳＱＧ（配列番号４３）；または
（ｋ）  ＧＧＰＧＴＧＫＳ（配列番号２２）および／またはＹＡＬＴＶＨＲＧＱＧ（配列番号４５）
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、表４もしくは５に示されるヘリカーゼのうちの１つ、またはその変異体であり、場合によって、前記ＲｅｃＤヘリカーゼが、
（ａ）配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２、および４４のうちのいずれか１つに示される配列；または
（ｂ）配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも２５％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＲｅｃＤヘリカーゼが、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼであり、場合によって、前記ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配列番号４６〜５３）［式中、Ｘ１およびＸ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される］；または
・アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（配列番号５４〜６０）［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ９は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４は、ＤまたはＥであり、Ｘ８は、任意のアミノ酸である］
をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、以下のモチーフ：
（ａ）  ＧＹＡＧＶＧＫＴ（配列番号６２）、ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ（配列番号６３）およびＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ（配列番号６４）；
（ｂ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＶＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＬＨＦＨ（配列番号６８）；
（ｃ）  ＧＡＡＧＡＧＫＴ（配列番号７０）、ＹＣＩＴＩＨＲＳＱＧ（配列番号７１）およびＨＥＤＡＲＴＶＤＤＩＡＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号７２）；
（ｄ）  ＧＦＡＧＴＧＫＳ（配列番号７５）、ＹＡＴＴＶＨＳＳＱＧ（配列番号７６）およびＨＥＴＳＲＥＲＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号７７）；
（ｅ）  ＧＲＡＧＡＧＫＴ（配列番号７９）、ＹＡＴＴＩＨＫＳＱＧ（配列番号８０）およびＧＭＶＡＤＷＶＹＨＤＮＰＧＮＰＨＩＨ（配列番号８１）；
（ｆ）  ＧＡＡＧＴＧＫＴ（配列番号８３）、ＹＡＳＴＡＨＫＳＱＧ（配列番号８４）およびＨＳＴＳＲＡＱＤＰＨＬＨＳＨ（配列番号８５）；
（ｇ）  ＧＨＡＧＡＧＫＴ（配列番号８７）、ＹＡＧＴＴＨＲＮＱＧ（配列番号８８）およびＨＡＳＳＲＥＱＤＰＱＩＨＳＨ（配列番号８９）；
（ｈ）  ＧＬＡＧＴＧＫＴ（配列番号９１）、ＹＡＶＴＳＨＳＳＱＧ（配列番号９２）およびＨＤＴＡＲＰＶＮＧＹＡＡＰＱＬＨＴＨ（配列番号９３）；
（ｉ）  ＧＰＡＧＡＧＫＴ（配列番号９５）、ＹＡＩＴＡＨＲＡＱＧ（配列番号９６）およびＨＹＤＳＲＡＧＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号９７）；
（ｊ）  ＧＷＡＧＶＧＫＴ（配列番号９９）、ＹＡＶＴＡＤＨＭＱＧ（配列番号１００）およびＨＬＣＧＲＬＤＰＱＩＨＮＨ（配列番号１０１）；
（ｋ）  ＧＶＡＧＡＧＫＴ（配列番号１０３）、ＹＡＬＴＩＤＳＡＱＧ（配列番号１０４）およびＨＭＴＳＧＤＧＳＰＨＬＨＶＨ（配列番号１０５）；
（ｌ）  ＧＹＡＧＴＧＫＳ（配列番号１０７）、ＹＡＡＴＩＨＫＡＱＧ（配列番号１０８）およびＧＭＩＡＤＬＶＮＶＨＷＤＩＧＥＤＧＫＡＫＰＨＡＨ（配列番号１０９）；
（ｍ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＬＨＦＨ（配列番号１１１）；
（ｎ）  ＧＶＡＧＡＧＫＳ（配列番号１１５）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＮＲＮＱＥＰＮＡＨＦＨ（配列番号１１６）；
（ｏ）  ＧＧＡＧＶＧＫＳ（配列番号１１８）、ＹＡＩＮＶＨＩＡＱＧ（配列番号１１９）およびＨＤＶＳＲＮＮＤＰＱＬＨＶＨ（配列番号１２０）；
（ｐ）  ＧＩＡＧＡＧＫＳ（配列番号６６）、ＹＡＬＮＭＨＭＡＱＧ（配列番号１２２）およびＨＤＴＳＲＡＬＤＰＱＧＨＩＨ（配列番号１２３）；
（ｑ）  ＧＶＡＧＡＧＫＳ（配列番号１１５）、ＹＡＬＮＡＨＭＡＱＧ（配列番号６７）およびＨＤＴＳＲＡＬＤＰＱＧＨＩＨ（配列番号１２３）；
（ｒ）  ＧＲＡＧＴＧＫＴ（配列番号１２６）、ＦＡＳＴＡＨＧＡＱＧ（配列番号１２７）およびＨＥＡＳＲＮＬＤＰＱＬＨＳＨ（配列番号１２８）；
（ｓ）  ＧＹＡＧＴＧＫＴ（配列番号１３０）、ＹＡＭＴＳＨＡＡＱＧ（配列番号１３１）およびＨＤＩＳＲＤＫＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１３２）；
（ｔ）  ＧＬＡＧＴＧＫＴ（配列番号９１）、ＹＡＱＴＶＨＡＳＱＧ（配列番号１３４）およびＨＮＴＳＲＤＬＤＰＱＴＨＴＨ（配列番号１３５）；
（ｕ）  ＧＦＡＧＴＡＫＴ（配列番号１３７）、ＹＶＱＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１３８）およびＨＥＴＳＲＡＱＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１３９）；
（ｖ）  ＧＹＡＧＴＡＫＴ（配列番号１４１）、ＹＶＤＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１４２）およびＨＧＴＳＲＡＱＤＰＱＬＨＴＨ（配列番号１４３）；
（ｗ）  ＧＹＡＧＴＡＫＴ（配列番号１４１）、ＹＡＳＴＡＦＡＡＱＧ（配列番号１４５）およびＨＧＴＳＲＡＬＤＰＱＬＨＳＨ（配列番号１４６）；
（ｘ）  ＧＳＡＧＳＧＫＴ（配列番号１４８）、ＹＡＶＴＳＹＳＡＱＧ（配列番号１４９）およびＨＤＴＡＲＰＶＧＧＹＡＡＰＱＬＨＴＨ（配列番号１５０）；
（ｙ）  ＧＥＡＧＴＧＫＴ（配列番号１５３）、ＹＡＨＴＳＹＫＥＱＧ（配列番号１５４）およびＨＥＴＮＲＥＮＥＰＱＬＨＮＨ（配列番号１５５）；
（ｚ）  ＧＹＡＧＶＡＫＴ（配列番号１５７）、ＹＶＬＴＮＹＫＶＱＧ（配列番号１５８）およびＱＰＳＳＲＡＮＤＰＡＬＨＴＨ（配列番号１５９）；
（ａａ）  ＧＳＡＧＴＧＫＴ（配列番号１６１）、ＹＳＬＴＡＮＲＡＱＧ（配列番号１６２）およびＨＳＭＳＲＡＧＤＰＥＭＨＮＨ（配列番号１６３）；
（ｂｂ）  ＡＧＡＧＴＧＫＴ（配列番号１６５）、ＹＡＧＴＶＹＡＡＱＧ（配列番号１６６）およびＨＹＴＴＲＥＧＤＰＮＩＨＴＨ（配列番号１６７）；または
（ｃｃ）  ＡＰＡＧＡＧＫＴ（配列番号１６９）、ＹＡＶＴＶＨＡＡＱＧ（配列番号１７０）およびＨＥＴＳＲＡＧＤＰＨＬＨＴＨ（配列番号１７１）
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、表６もしくは７に示されるヘリカーゼのうちの１つ、またはその変異体であり、場合によって、前記ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼが、（ａ）配列番号６１、６５、６９、７３、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８のうちのいずれか１つに示される配列、または（ｂ）配列の全体にわたりアミノ酸の同一性に基づいて当該配列と少なくとも１０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持するその変異体を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも０．３Ｍまたは少なくとも１．０Ｍの塩濃度を用いて実行され、塩が、場合によって、ＫＣｌである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、細孔とＲｅｃＤヘリカーゼとの間で複合体を形成し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーを形成するステップを含む方法。
【請求項１５】
複合体が、（ａ）細孔とヘリカーゼとを、標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、細孔を隔てて電圧ポテンシャルもしくは化学ポテンシャルポテンシャルを印加することにより形成され、または（ｂ）細孔をヘリカーゼへと共有結合的に連結することにより形成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置およびＲｅｃＤヘリカーゼと、（ｂ）細孔およびＲｅｃＤヘリカーゼとを含み、場合によって、前記キットが、両親媒性層を含むチップをさらに含む、前記キット。
【請求項１７】
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための解析装置であって、（ａ）ＲｅｃＤヘリカーゼまたは（ｂ）複数の細孔および複数のＲｅｃＤヘリカーゼを含む、前記解析装置。
【請求項１８】
複数の細孔を支持することが可能であり、細孔およびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチドの特徴付けを実施するのに作動可能なセンサーデバイスと、
特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと、
材料を、少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスへと、制御可能な形で供給するように構成された流体力学系と、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体力学系が、試料を、容器からセンサーデバイスへと、選択的に供給するように構成された容器と
を含む、請求項１７に記載の解析装置。
【請求項１９】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドをＲｅｃＤヘリカーゼと接触させるステップと、
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御するときに、１または複数の測定を行うステップであって、測定値が、標的ポリヌクレオチドの１または複数の特徴を示し、これにより、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項２０】
（ａ）１または複数の特徴が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択され、
（ｂ）標的ポリヌクレオチドが、メチル化により、酸化により、損傷により、１もしくは複数のタンパク質で、または１もしくは複数の標識、タグ、もしくはスペーサーで修飾され、および／または標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖であり、
（ｃ）１または複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測定により測定され、
（ｄ）ＲｅｃＤが、表４もしくは５に示されるヘリカーゼのうちの１つ、またはその変異体であり、および／またはＲｅｃＤヘリカーゼが、ＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒａＩ亜群ヘリカーゼであり、ならびに／またはＲｅｃＤヘリカーゼが、
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）［式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ｐ、Ａ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＡであり、Ｘ６は、ＫまたはＲであり、Ｘ７は、ＴまたはＳである］；および／または
・アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号９、１０、および１１）［式中、Ｘ１は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、Ｘ２は、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｃ、またはＶであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、ＴまたはＮであり、Ｘ５は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ７は、ＧまたはＳである］
を含み、または
（ｅ）方法が、少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて実行され、塩が、場合によって、ＫＣｌである、
請求項１９に記載の方法。