(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に、生体分子プローブ固定化用スポットを複数個有する生体分子マイクロアレイ用基板であって、前記生体分子プローブ固定化用スポットは、前記基板表面との間に光反射層スポットを有する前記基板。
【請求項２】
前記光反射層スポットは、前記生体分子プローブ固定化用スポットと、実質的に同一の平面形状を有する請求項１に記載の基板。
【請求項３】
前記生体分子プローブ固定化用スポットが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びポリ−Ｌ−リジン、並びにアミノ基、アルデヒド基、チオール基、カルボキシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシド基及びイソチオシアネート基を有する化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の生体分子プローブ固定化用化合物からなる請求項１または２に記載の基板。
【請求項４】
前記生体分子プローブ固定化用スポットは円形であり、直径が１０〜５００μｍの範囲であるか、または矩形若しくは多角形であり、一辺の長さが１０〜５００μｍの範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。
【請求項５】
前記光反射層が金属層である請求項１〜４のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６】
前記基板がガラス基板、シリコン基板または石英ガラス基板である請求項１〜５のいずれか１項に記載の基板。
【請求項７】
前記生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない前記基板表面に撥水層を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の基板。
【請求項８】
基板表面に光反射層を設ける工程、光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程、生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程、フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程、フォトレジスト層を現像する工程、フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングして生体分子プローブ固定化層及び光反射層のスポットを形成する工程、フォトレジスト層を除去する工程を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子マイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項９】
エッチング工程とフォトレジスト層除去工程との間に基板表面を撥水処理する工程を含む請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記生体分子プローブ固定化層が、光反射層表面をアミノシラン処理した後に、生体分子プローブ固定化用化合物を固定化することで形成される請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１１】
光反射層がアルミニウム層であり、このアルミニウム層表面をエタノールで酸化処理することにより、アミノシラン処理された光反射層を形成する請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記光反射層が、金属の蒸着により形成される請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体分子マイクロアレイ用基板が有する生体分子プローブ固定化用スポットに生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定スポットを複数個有する生体分子マイクロアレイ。
【請求項１４】
前記固定化された生体分子プローブがオリゴＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡである請求項１３に記載の生体分子マイクロアレイ。
【請求項１５】
前記固定化された生体分子プローブが各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる塩基配列を有する請求項１４に記載の生体分子マイクロアレイ。
【請求項１６】
前記固定化された生体分子プローブがタンパク質またはペプチドである請求項１３に記載の生体分子マイクロアレイ。
【請求項１７】
前記固定化された生体分子プローブが各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる残基配列を有する請求項１６に記載の生体分子マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高感度化及びデジタル解析が可能な生体分子マイクロアレイ用基板及びその製造方法、さらには生体分子マイクロアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析できるＤＮＡマイクロアレイは、1枚につき数千〜数万の遺伝子を解析する。従来のＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡをスタンピングする装置(ＤＮＡアレイヤー)を用い、先が割れたクイルピンでＤＮＡを吸い取り、スライドガラスに４〜４８本程度のクイルピンを同時に打ち付けることによりＤＮＡスポットを作製する。このようにして作製されたＤＮＡスポットは、形状や面積が一定していないため、再現性や定量性に悪影響を与える。また、ＤＮＡスポットの位置は、クイルピンごとに曲がっている向きが異なっていたり、クイルピンがスタンピング時にそれぞれ回転することで、それぞれのＤＮＡスポットが正確に整列することなくＤＮＡスポットはゆがみが生じる結果となる。このようにして作製されたＤＮＡマイクロアレイは、蛍光標識した核酸試料をハイブリダイゼーション反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡をベースにした蛍光スキャナーによりＤＮＡマイクロアレイ全体の蛍光像を取得する。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光像は、そのままではスポットごとの蛍光強度を測定することができないため、解析用ソフトウエアにより、グリッディングという操作を行う。グリッディングは、アレイ上のスポットの縦横の数やスポットの間隔、スポットの直径の大きさを入力し、スポットを円で囲む操作をいう。このグリッディングは、スポットの位置がずれていると正確に囲むことができないため、ソフトウエアにより、自動で位置を補正する機能がついている。しかるに、すべての操作が自動になっているわけではなく、手動でスポットの開始点の設定や目視によりすべてのスポットのグリッドを確認し補正する必要がある。そのため、この操作は、非常に煩雑であり、ＤＮＡスポットの数が数千以上になると非常に時間がかかる作業となり、解析スピードを遅らせる要因となっている。
【０００４】
そこで本発明は、グリッディングを自動で行うことを可能にし、生体分子マイクロアレイ、例えば、ＤＮＡマイクロアレイからの蛍光データの収集を、人手を煩わすことなく自動で行うことができ、デジタル解析を可能にする基板を提供することを目的とする。
【０００５】
上記目的を達成する本発明は以下の通りである。
［請求項１］基板表面に、生体分子プローブ固定化用スポットを複数個有する生体分子マイクロアレイ用基板であって、前記生体分子プローブ固定化用スポットは、前記基板表面との間に光反射層スポットを有する前記基板。
［請求項２］前記光反射層スポットは、前記生体分子プローブ固定化用スポットと、実質的に同一の平面形状を有する請求項１に記載の基板。
［請求項３］前記生体分子プローブ固定化用スポットが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びポリ−Ｌ−リジン、並びにアミノ基、アルデヒド基、チオール基、カルボキシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシド基及びイソチオシアネート基を有する化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の生体分子プローブ固定化用化合物からなる請求項１または２に記載の基板。
［請求項４］前記生体分子プローブ固定化用スポットは円形であり、直径が１０〜５００μｍの範囲であるか、または矩形であり、一辺の長さが１０〜５００μｍの範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。
［請求項５］前記光反射層が金属層である請求項１〜４のいずれか１項に記載の基板。
［請求項６］前記基板がガラス基板、シリコン基板または石英ガラス基板である請求項１〜５のいずれか１項に記載の基板。
［請求項７］前記生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない前記基板表面に撥水層を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の基板。
［請求項８］基板表面に光反射層を設ける工程、光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程、生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程、フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程、フォトレジスト層を現像する工程、フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングして生体分子プローブ固定化層及び光反射層のスポットを形成する工程、フォトレジスト層を除去する工程を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子マイクロアレイ用基板の製造方法。
［請求項９］エッチング工程とフォトレジスト層除去工程との間に基板表面を撥水処理する工程を含む請求項８に記載の製造方法。
［請求項１０］前記生体分子プローブ固定化層が、光反射層表面をアミノシラン処理した後に、生体分子プローブ固定化用化合物を固定化することで形成される請求項８または９に記載の製造方法。
［請求項１１］光反射層がアルミニウム層であり、このアルミニウム層表面をエタノールで酸化処理することにより、アミノシラン処理された光反射層を形成する請求項１０に記載の製造方法。
［請求項１２］前記光反射層が、金属の蒸着により形成される請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
［請求項１３］請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体分子マイクロアレイ用基板が有する生体分子プローブ固定化用スポットに生体分子プローブが固定化された生体分子プローブ固定スポットを複数個有する生体分子マイクロアレイ。
［請求項１４］前記固定化された生体分子プローブがオリゴＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡである請求項１３に記載の生体分子マイクロアレイ。
［請求項１５］前記固定化された生体分子プローブが各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる塩基配列を有する請求項１４に記載の生体分子マイクロアレイ。
［請求項１６］前記固定化された生体分子プローブがタンパク質またはペプチドである請求項１３に記載の生体分子マイクロアレイ。
［請求項１７］前記固定化された生体分子プローブが各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる残基配列を有する請求項１６に記載の生体分子マイクロアレイ。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の態様は、生体分子プローブ固定化用スポットを複数個有する生体分子マイクロアレイ用基板である。
上記生体分子マイクロアレイ用基板の基板は、例えば、ガラス基板、シリコン基板または石英ガラス基板であることができる。
上記生体分子プローブ固定化用スポットは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びポリ−Ｌ−リジン、並びにアミノ基、アルデヒド基、チオール基、カルボキシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシド基及びイソチオシアネート基を有する化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の生体分子プローブ固定化用化合物を所定量固定化することにより形成される。
生体分子プローブ固定化用化合物の例としては、以下の化合物を挙げることができる。但し、これらの化合物は例示にすぎず、これらに限定される意図ではない。
【０００７】
＜アミノ基を有する化合物＞
３−アミノプロピルトリメトキシシラン
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＥＤＡ）
トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン
＜アルデヒド基を有する化合物＞
グルタルアルデヒド
＜チオール基を有する化合物＞
４−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）
＜エポキシド基を有する化合物＞
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
＜イソチオシアネート基を有する化合物＞
４−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＩＴＣ）
＜スクシンイミド及びマレイミド基有する化合物＞
ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）
スクシンイミジル４−（マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）
ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）
【０００８】
生体分子プローブ固定化用スポットに固定化される生体分子プローブ固定化用化合物の量は、化合物の種類に応じて適宜決定できる。
生体分子プローブ固定化用スポットの形状には特に制限は無いが、例えば、円形であることができ、その直径は、例えば、１０〜５００μｍの範囲であることができる。また、生体分子プローブ固定化用スポットの形状は、矩形若しくは多角形であることもでき、矩形または多角形の一辺の長さは、例えば、１０〜５００μｍの範囲であることができる。
【０００９】
本発明の基板は、生体分子プローブ固定化用スポットと基板表面との間に光反射層を有する。さらに、この光反射層は、その上に設けられた生体分子プローブ固定化用スポットと、実質的に同一の形状を有することが好ましい。それにより、光反射層のスポットを検出することにより、生体分子スポットの位置及び面積を自動に認識することができるという利点がある。
【００１０】
光反射層を構成する物質は、光反射性を有する物質であれば特に制限はない。光反射層は、例えば、金属層であることかでき、金属層としては、例えば、アルミニウム、金、銀、プラチナ、ニッケル等を挙げることができる。あるいは、光反射層は、酸化物等からなる単層または多層の反射層であることもできる。
【００１１】
本発明の生体分子マイクロアレイ用基板は、生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面に撥水層を有することができる。生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面が撥水処理されていることで、生体分子プローブ固定化用スポットへの生体分子プローブの固定化をより正確に行うことができる。撥水層は、既存の撥水剤を用いて形成することができる。撥水剤としては、例えば、シリコンコート剤、フッ素コート剤、ナイロンコート剤、テフロンコート剤（テフロンは登録商標）等を用いることができる。
【００１２】
本発明の生体分子マイクロアレイ用基板に固定化される生体分子プローブは、例えば、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができ、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板には、ＤＮＡマイクロアレイ用基板が包含される。
【００１３】
上記本発明の生体分子マイクロアレイ用基板は、以下の工程を含む本発明の製造方法により製造できる。
基板表面に光反射層を設ける工程、
光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程、
生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程、
フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程、
フォトレジスト層を現像する工程、
フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングする工程、
フォトレジスト層を除去する工程
を含む本発明の製造方法により製造できる。
【００１４】
基板表面に光反射層を設ける工程は、例えば、金属を基板表面に蒸着することにより行うことができる。金属の蒸着方法及び条件は、公知の方法及び条件をそのまま用いることができる。尚、金属を基板表面に蒸着する前に、基板表面を洗浄しておくことが好ましい。
次いで、光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を形成するが、光反射層がアルミニウム層の場合、生体分子プローブ固定化層形成の前に、アルミニウム層表面をエタノールで酸化処理し、さらにアミノシラン化合物を用いてアミノシラン処理することができる。光反射層をアミノシラン処理することで、ＤＮＡ等の生体分子を物理吸着ではなく化学的固定が可能となるため、その後の操作におけるＤＮＡ等の生体分子の損失を少なくすることができるという利点がある。
【００１５】
光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程は、光反射層上に生体分子プローブ固定化用化合物を固定化することにより行うことができる。生体分子プローブ固定化用化合物は上記本発明の基板において挙げた物質から適宜選択できる。生体分子プローブ固定化用化合物がビオチンの場合、その固定化は、例えば、ビオチンスクシンイミドエステルをアミノシラン処理した光反射層表面に反応させることで実施できる。生体分子プローブ固定化用化合物がアルデヒド基を有する化合物であるグルタルアルデヒドの場合、その固定化は、グルタルアルデヒドをアミノシラン処理した光反射層表面に反応させることで実施できる。
【００１６】
生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程は、例えば、既存のレジスト材を常法、例えば、スピンコート法によりコーティングし、次いでレジスト材を熱硬化させることで行うことができる。レジスト材の種類、コーティング方法、硬化条件には特に制限はないが、例えば、ポジ型レジスト材をスビンコーターで約１μｍの厚みにコートし、オーブンで加熱することで、レジストの熱硬化を行うことができる。
【００１７】
フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程は、レジスト材がポジ型又はネガ型かに応じて、所望の寸法、形状及び間隔で生体分子プローブ固定化用スポットが形成されるようなマスクを用意し、このマスクを介して行われる。露光条件は、フォトレジスト材の種類に応じて適宜決定される。
【００１８】
フォトレジスト層を現像する工程は、露光したフォトレジスト層を、現像液で処理し、必要により洗浄することで行われる。現像液は、使用するレジスト材に応じて適宜選択できる。
【００１９】
現像後、フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングする。この工程は、光反射層をエッチングできるエッチング液を適宜選択して行われる。例えば、光反射層が金属層の場合、エッチング液は酸水溶液であることができ、酸水溶液に含まれる酸の種類や濃度等は、エッチングすべき金属の種類や層の厚みを考慮して適宜決定できる。
【００２０】
エッチング後、フォトレジスト層を除去する。この工程は、フォトレジストを溶解できる有機溶媒、例えば、アセトンを用いて行うことができる。フォトレジスト層除去後、必要により洗浄し、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板が得られる。
【００２１】
本発明の製造方法においては、エッチング工程とフォトレジスト層除去工程との間に基板表面を撥水処理する工程を含むことができる。この段階で撥水処理することで、生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面に撥水層を形成することができる。撥水処理は、撥水剤の種類に応じて適宜行うことができ、例えば、撥水剤に基板を浸漬することで行うことができる。
【００２２】
本発明は、生体分子マイクロアレイを包含し、本発明の生体分子マイクロアレイは、上記本発明の生体分子マイクロアレイ用基板の生体分子プローブ固定化用スポットに生体分子プローブが固定化されたものである。
生体分子プローブ固定スポットは、基板上に複数個設けられる。生体分子プローブ固定スポットの個数には特に制限はなく、基板の大きさ、スポットの大きさ及びスポットの間隔等を勘案して適宜決定される。
【００２３】
固定化された生体分子プローブは、例えば、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。即ち、本発明の生体分子マイクロアレイには、ＤＮＡマイクロアレイが包含される。この場合、固定化された生体分子プローブは、各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる塩基配列を有することができる。さらに固定化された生体分子プローブは、例えば、タンパク質またはペプチドであることもできる。この場合、固定化された生体分子プローブは各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる残基配列を有することができる。
【００２４】
生体分子プローブ固定化用スポットへの生体分子プローブの固定化は、生体分子プローブ固定化用スポットを形成する生体分子プローブ固定化用化合物と結合性を有する物質または官能基を生体分子プローブに予め固定化しておき、例えば、この生体分子プローブを含む溶液を、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板の生体分子プローブ固定化用スポットに滴下することで、行うことができる。
上記結合性を有する物質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンを挙げることができ、上記結合性を有する官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、スクシンイミド基、及びマレイミド基を挙げることができる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、生体分子マイクロアレイの生体分子スポットの形状、面積、位置を一定にし、生体分子スポットの下層に光反射層を設けることにより高感度化でき、かつ生体分子スポットと実質的に同一の平面形状を有する光反射層を検出することにより、生体分子スポットの位置及び面積を自動に認識することができる。それにより生体分子スポットの蛍光強度をデジタルに解析することができ、大幅な解析人工の縮小と解析時間の短縮が可能となる。生体分子スポットの位置及び面積を認識することから、生体分子スポットの蛍光強度のみを測定し、不必要な部分(マイクロアレイ上の生体分子スポット以外の領域)の蛍光強度を測定せず、検出時間をより短縮することができる。
【００２６】
実施例
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
基板作成法
1．スライドガラスの洗浄
傷のないスライドガラス20枚を選出し、スライドラックに入れ、200mlのアセトン中30分間超音波洗浄した後、超純水(500ml×2,200ml×1)ですすいだ。過酸化水素と硫酸(1:1、200ml)を氷浴中混合し、スライドガラスを浸し30分間超音波洗浄を行い、超純水(500ml×3)ですすいだ後、更に超純水200ml中30分間超音波洗浄を行った。スライドラックごと超純水(流水)にて十分すすいだ後、500mlの超純水に浸して洗浄した。洗浄したスライドガラスをラックごとアルミ箔をかぶせ200℃のオーブンで15分間乾燥し、アルミ箔で包みデシケーター中で室温まで冷却し、使用時までそのまま保存した。
【００２７】
2．アルミニウムの蒸着
アセトンで拭いたタングステンボードを真空蒸着装置にセットし、その上にアセトンで拭き1cm長さのアルミニウム線(Φ1.Omm、99.999%)をのせ、洗浄したスライドガラスをセットし、4.0×10-3Paまで減圧し10nm/secのスピードで300〜500nmの膜厚になるようにアルミニウムの蒸着を行った。
【００２８】
3．アルミニウム表面のエタノール処理
超純水とエタノールを5分間超音波にかけよく混合し調製した70%エタノールを、アルミニウム蒸着スライドガラスを5枚入れたコプリンジャーに約70ml加え、30分間超音波処理を行った。エタノール処理したスライドガラスを一枚ずつ超純水(500ml×3)ですすぎ、更にスライドラックに入れ、ラックごと超純水(500ml)ですすいだ。
【００２９】
4．アミノシラン処理
196mlの超純水に3-(2-アミノエチルアミノプロピル)トリメトキシシラン4mlを加えて暗室下30分間撹絆し、そこにエタノール処理したスライドガラスをスライドラックごと浸し、暗室下10分間反応させた。超純水(200ml×2)で緩やかにすすいだ後、110℃のオーブンにスライドラックごといれアルミ箔をかぶせ45分間加熱し、アルミ箔で包みデシケー夕ー中で室温まで冷却した。
【００３０】
5．ビオチン化
Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble (Vector Laboratories)を50mM Na2C03-NaHCO3(pH8.7)バッファーに1mg/mlの濃度になるように溶解しビオチン化バッファーを調製した。アミノシラン処理した前記スライドガラスを角型シャーレに5枚並べ、そこにビオチン化バッファー25mlを加えて蓋をし、マイルドミキサーで緩やかに一晩攪拌した。超純水(500ml×3)で洗浄し、60℃のオーブンで45分間乾燥した。
【００３１】
6．パターニング
ビオチン化したスライドに、スピンコーターでポジ型レジスト(シプレイ・ファーイースト株式会社、MP S1813)を１μmの厚みになるようコートし(300rpm、3秒;slope、5秒;3000rmp、l0秒)、60℃のオーブンで45分間加熱した。次に、レジストコートした前記スライドガラスに、ＤＮＡプローブ固定化用スポットのパターンが形成してあるマスクを通して、紫外線を露光した。露光操作には、YAGレーザーの第3高調波(波長:355nm、レーザーパワー:80mW)を走査露光できる試作装置を用いた。走査時間は、実験的に適切な時間を求め、120秒(30×80mmのエリア)とした。現像液(シプレイ・ファーイースト株式会社、MF CD-26)で激しく振とうしながら45秒間現像し、超純水(500ml×2)ですすいだ後、エッチング溶液(リン酸:酢酸:硝酸:超純水=16:2:1:1、200ml)に浸して3分間超音波処理を行った。エッチングしたスライドガラスを超純水(500ml×5)で十分すすいだ。この操作によって、レジストの下層になったアルミニウム層及びＤＮＡプローブ固定化用スポットのみがスライドガラス上に残った。
【００３２】
7．シリコンコーティング（撥水処理）
70℃に温めた超純水195mlにシリコンコーティング試薬(岩城硝子株式会社、SIL-COAT 5)を5ml加えて10分間攪拌した。エッチングしたスライドガラスを10秒間浸した後、超純水(500ml×3)でよく洗浄し、スライドガラスをラックごとアルミ箔をかぶせて110℃で30分間焼き、アルミ箔に包みデシケータ一中で室温まで冷却し、使用時までそのまま保存した。
【００３３】
8．レジストの溶解
エッチング、シリコンコーティングしたスライドガラスを1枚ずつアセトン(70ml×3)で洗浄し、スポット上に残っていたレジストを溶解した。超純水(500ml×2)で十分すすいだ後、70mlの超純水中で30分間超音波処理しながら洗浄し、更に70ml超純水ですすいだ。
【００３４】
実施例２
生体分子マイクロアレイの作製
実施例１で作製した基板全面に0.05mg/mlストレプトアビジン溶液(Vector社、溶解バッファー：1XPBS；137mM NaCl、8.10mM Na2HPO4、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4、pH 7.4)をのせ、室温で30分間静置した。その後、1XPBSで10分間3回洗浄し、未反応のストレプトアビジンを除去した。超純水でストレプトアビジンが結合した基板をすすいだ後、遠心分離機で水をとばし、乾燥した。この基板のDNA固定化用スポットにはストレプトアビジンが結合している。
次に、この基板にビオチン化オリゴヌクレオチドＤＮＡを固定化するために、スポット装置により、この基板のDNAプローブ固定化用スポットに正確にビオチン化オリゴヌクレオチドDNA溶液をスタンピングした。スタンピング後、未反応のDNAを除去するために1XSSPEバッファー(150mM NaCl、8.65mM NaH2PO4、1.25mM
EDTA; pH7.4)で洗浄し、DNAマイクロアレイを作製した。
【００３５】
実施例３
検出感度比較
実施例１で得られた生体分子マイクロアレイ用基板（DNAマイクロアレイ用基板）と市販されているDNAマイクロアレイ用のポリ−L−リジンがコートされたガラス基板（PLLスライドガラス）に、実施例2と同様にしてCy3-オリゴＤＮＡの希釈系列(0、0.06、0.13、0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0pmol/μl)をスポッティングし、洗浄せず各スポットの蛍光強度を以下の方法で測定した。得られた結果を図1に示す。図1に示す結果から、実施例1で得られたＤＮＡマイクロアレイ用基板では、0.13pmol/μlのスポットから、明確な蛍光シグナルが計測されたのに対し、光反射層を有さない市販のＤＮＡマイクロアレイ用基板では、明確な蛍光シグナルが計測されたのは0.50pmol/μlからであった。即ち、本発明のＤＮＡマイクロアレイ用基板は、光反射層を有さないＤＮＡマイクロアレイ用基板と比較して、約4倍の高感度化が可能であることが分かる。
【００３６】
なお、上記蛍光スポットの計測は、以下の方法によって行った。
蛍光マイクロアレイスキャナー（日本レーザー電子社）を用いて両基板の蛍光像を取得した。その際、スキャナーの検出器（光電子増倍管）の印加電圧を両基板の測定において同一条件で行った。蛍光スポットの強度のグラフ化は画像解析ソフト（NIHイメージ）を用いて行った。
【００３７】
実施例４
生体分子プローブ固定化用スポットの特定
上記実施例1で得られたDNAマイクロアレイの生体分子プローブ固定化用スポットの特定を次の方法で行った。
蛍光マイクロアレイスキャナ−（日本レーザー電子社）の検出器（光電子増倍管）の入射光側に設置してある光学カットフィルターを外し、DNAマイクロアレイの表面で反射されたレーザー光が直接光電子増倍管に入射するようにした。その際、光電子増倍管の印加電圧は、通常、蛍光を測定する場合よりも低く設定した。この方法により、実施例1で得られたDNAマイクロアレイ表面からの反射光を計測したものが、図2である。検出器に入射した光の強度が高いほど、白く表示される。この結果によると、光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定化用スポットは、それが被覆されていない基板表面よりもレーザー光の反射光の強度が高くなっていることがわかる。この特性を利用することで、生体分子プローブ固定化用スポットの特定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３で得られた結果を示す。試験例１で得られた結果を示す。
【図２】実施例４で得られた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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