【手続補正書】
【提出日】平成28年7月7日(2016.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを、膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
（ａ）ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが、共有結合的に付着されている、化学的に付着されている、もしくは遺伝子的に融合されている、および／または
（ｂ）ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが、１つもしくは複数のリンカーによって付着されている、もしくはアミノ酸配列である１つもしくは複数のリンカーによって付着されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチド結合成分が１つまたは複数のヘリカーゼを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）構築物中の２つ以上のヘリカーゼが互いに異なっている、および／または
（ｂ）２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似している、もしくは２つ以上のヘリカーゼが同じであるもしくは類似しており各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基を使用して付着されている、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）ポリヌクレオチド結合成分が、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを含む、もしくはポリヌクレオチド結合成分が表４に示されるものおよびその変種から選択される、ならびに／または
（ｂ）ポリヌクレオチド結合成分が（ｉ）エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼもしくはトポイソメラーゼ由来、もしくは（ｉｉ）Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号６２）もしくはその変種由来である、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）１つもしくは複数のヘリカーゼがスーパーファミリー１〜６から独立に選択される、ならびに／または
（ｂ）１つもしくは複数のヘリカーゼが単量体である、ならびに／または
（ｃ）１つもしくは複数のヘリカーゼが、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼおよびその変種から独立に選択される、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼがアミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（配列番号８）（式中、Ｘ１はＣ、ＭもしくはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基である）を含み；
（ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）（式中、Ｘ１はＧ、ＳもしくはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、ＳもしくはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳもしくはＣであり、Ｘ５はＧもしくはＡであり、Ｘ６はＫもしくはＲであり、Ｘ７はＴもしくはＳである）；および／または
−  アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＹ、ＷもしくはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣもしくはＶであり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴもしくはＮであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、ＶもしくはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧもしくはＳである）
を含み；
（ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼが、
−  アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配列番号３１〜３８）（式中、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）；または
−  アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（配列番号３９〜４５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である）
を含み；または
（ｄ）ＸＰＤヘリカーゼが、
− アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（配列番号８）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸残基であってよい）；および／または
− アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）３−Ｘｆ−（Ｘｇ）７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（配列番号９）（式中、Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であってよく、式中、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ中のＸ２がＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴもしくはＰである、ならびに／または
（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、もしくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ｉ）配列番号１０、１３、１６もしくは１９のいずれか１つに示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列と少なくとも４０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、または
（ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼが、（ｉ）配列番号４６、８７、９８もしくは１０２に示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列と少なくとも４０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、または
（ｄ）ＸＰＤヘリカーゼ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６ならびに／もしくはＸｂ、ＸｃおよびＸｄがＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される、もしくはＸＰＤヘリカーゼが、（ｉ）配列番号５２のいずれか１つに示す配列、もしくは（ｉｉ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列と少なくとも４０％相同性を有し、かつヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１つもしくは複数のヘリカーゼが付着を促進するために修飾されている、または
１つもしくは複数のヘリカーゼが、１つもしくは複数の非天然システイン残基および／もしくは１つもしくは複数の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）残基の導入によって付着を促進するために修飾されている、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドの１つもしくは複数の特性が、
（ａ）電気的測定および／もしくは光学的測定、または
（ｂ）電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定もしくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である電気的測定、
によって測定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、ヘリカーゼが互いに付着しており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項１２】
構築物が請求項４に定義されており、および／または２つ以上のヘリカーゼが請求項１６から９のいずれか一項に定義されている、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１３】
（ａ）ヘリカーゼと、配列番号９４もしくは配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４と少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列とを含む構築物であってヘリカーゼがアミノ酸配列に付着されている構築物、または
（ｂ）配列番号９０もしくは配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９０と少なくとも８０％相同性を有するその変種を含む構築物
であって、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の構築物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
【請求項１５】
ポアと、請求項１から９のいずれか一項に定義されている構築物または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
【請求項１６】
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、請求項１から９のいずれか一項に定義されている構築物または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の構築物の使用。
【請求項１７】
（ａ）ポアおよび（ｂ）請求項１から９のいずれか一項に定義されている構築物または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
【請求項１８】
複数のポア、および請求項１から９のいずれか一項に定義されている複数の構築物または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置。