【手続補正書】
【提出日】平成27年12月18日(2015.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、該細胞は低減された機能活性を有するｉｓｐＡ遺伝子と、
（ａ）異種核酸によりコードされるイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１種以上の核酸；及び
（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを含み、
前記組み換え細胞を適切な培地で培養することで、前記ポリペプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え細胞。
【請求項２】
前記ｉｓｐＡ遺伝子の機能活性が、
ａ．ｉｓｐＡ遺伝子を欠失させること；
ｂ．ｉｓｐＡ遺伝子の発現を低減させること；
ｃ．ｉｓｐＡタンパク質の活性を低減させること；
ｄ．ｉｓｐＡタンパク質の発現を低減させること；又は
ｅ．ｉｓｐＡの発現を一時的に調節すること、により低減される、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項３】
ｉｓｐＡ遺伝子の発現が、（ａ）弱いプロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置すること、（ｂ）自己調節型プロモーターの調節下にｉｓｐＡ遺伝子を配置すること、又は（ｃ）転写抑制因子ＨｒｃＡ、により低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項４】
ｉｓｐＡタンパク質活性が、（ａ）翻訳によりｉｓｐＡタンパク質をタンパク質分解性のタグと融合させること、（ｂ）アンチセンスＲＮＡを使用すること、（ｃ）ｉｓｐＡのｍＲＮＡ分子中に存在するリボソーム結合部位に１つ以上の変異を導入すること、（ｄ）内在性ｉｓｐＡ遺伝子が、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドのＫｍと比較してＤＭＡＰＰに関しＫｍが増加しているポリペプチドをコードしている遺伝子により置き換えられること、または（ｅ）内在性ｉｓｐＡ遺伝子が、異なる最適温度を含む別の遺伝子により置き換えられること、により低減される、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項５】
イソプレン合成酵素ポリペプチドが、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項６】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、クズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項８】
前記植物のイソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ（kudzu）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体、又はユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項９】
（ｂ）の、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている前記１種以上の核酸が、異種核酸である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１０】
前記細胞が含むＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、（ａ）上流ＭＶＡ経路に由来するものであり、上流ＭＶＡ経路の核酸が、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸からなる群から選択される、（ｂ）前記下流ＭＶＡ経路に由来するものであり、前記下流ＭＶＡ経路の核酸が、ＭＶＫ、ＰＭＫ及びＭＶＤ核酸からなる群から選択される、または（ｃ）完全なＭＶＡ経路の、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む、請求項９に記載の組み換え細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート合成酵素（ＤＸＳ）ポリペプチドを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１３】
前記ＤＸＳポリペプチドをコードしている１種以上の核酸が、（ａ）ＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸である、または（ｂ）ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸のコピーである、請求項１２に記載の組み換え細胞。
【請求項１４】
前記１種以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーター下に配置される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
前記１種以上の異種核酸が、マルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１６】
前記１種以上の異種核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１７】
前記細胞が細菌、藻類、真菌又は酵母細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項１８】
前記組み換え細胞が、細菌細胞であり、前記細菌細胞がグラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞である、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項１９】
前記細菌細胞が、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス（Pseudomonas sp.）、及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の細菌細胞。
【請求項２０】
前記細胞が藻類細胞である、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２１】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項２０に記載の藻類細胞。
【請求項２２】
前記細胞が真菌細胞であり、任意で前記真菌細胞が糸状菌である請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２４】
前記酵母細胞が、酵母菌（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項２３に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項２４に記載の酵母細胞。
【請求項２６】
更にケトフォスフォラーゼ活性を有するポリポリペプチドを含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項２８】
（ａ）請求項１〜２６のいずれか一項の組み換え細胞を、イソプレン合成をもたらすのに好適な条件下で培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程、を含む、イソプレン産生方法。
【請求項２９】
前記組み換え細胞により産生された前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項２８に記載の方法。