【手続補正書】
【提出日】平成28年4月6日(2016.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
げっ歯類細胞において標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）該げっ歯類細胞中に、以下：
（ｉ）標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および
（ｉｉ）上流相同性アームおよび下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、該インサート核酸が、約５ｋｂから約３０ｋｂまでの長さ範囲であり、該上流相同性アームおよび該下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、ＬＴＶＥＣ、
を導入するステップ；ならびに
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座中に該インサート核酸を含む標的化されたげっ歯類細胞を選択するステップであって、該標的ゲノム遺伝子座中への該インサート核酸の組込みが、該標的ゲノム遺伝子座における、該インサート核酸による内因性核酸配列の置換を生じさせる、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
原核細胞において細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介してげっ歯類の標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）該げっ歯類の該標的ゲノム遺伝子座を含む該原核細胞中に、以下：
（ｉ）第１の上流相同性アームおよび第１の下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む第１の大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、該インサート核酸が、約５ｋｂから約３０ｋｂまでの長さの範囲であり、該第１の上流相同性アームおよび第１の下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、第１のＬＴＶＥＣ、および
（ｉｉ）該標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
を導入するステップ、ならびに
（ｂ）該インサート核酸を含む標的化された原核細胞を選択するステップであって、該標的ゲノム遺伝子座中への該インサート核酸の組込みが、該標的ゲノム遺伝子座における、該インサート核酸による内因性核酸配列の置換を生じさせる、ステップ、
を含み、
ここで、該標的ゲノム遺伝子座は、第２の上流相同性アームおよび第２の下流相同性アームを含む第２のＬＴＶＥＣ中に存在し、
該第２の上流相同性アームおよび該第２の下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂであり、
該原核細胞が、該ＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することが可能である、方法。
【請求項３】
前記げっ歯類が、マウス、ラットまたはハムスターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記げっ歯類細胞が多能性細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記げっ歯類細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、造血幹細胞、または神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＴＶＥＣと前記ＺＦＮとの併用が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせ、必要に応じて、前記標的化効率が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のＬＴＶＥＣと前記ＺＦＮとの併用が、前記第１のＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせ、必要に応じて、該標的化効率が、前記第１のＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記原核細胞が、組換えコンピテント株のＥ．ｃｏｌｉである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
（Ｉ）前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含むか、または
（ＩＩ）前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含まず、前記リコンビナーゼをコードする該核酸が、前記原核細胞中に導入される、
請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｉ）前記ＺＦＮが、ＺＦＮタンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物であり、前記核酸が、前記細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結しているか、または
（ＩＩ）前記ＺＦＮが、ＺＦＮタンパク質をコードするｍＲＮＡである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＺＦＮの標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座中のイントロン、エクソン、プロモーター、プロモーター調節領域またはエンハンサー領域中に位置付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記インサート核酸が選択カセット、レポーター遺伝子、ヒト核酸配列、または条件的対立遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記インサート核酸が、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含み、
必要に応じて、該免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列またはそれらの組合せであり、
必要に応じて、該免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびそれらの組合せから選択される、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
（Ｉ）前記インサート核酸が、前記げっ歯類細胞の前記標的ゲノム遺伝子座における置換された核酸配列に対して相同な核酸配列を含むか；
（ＩＩ）前記インサート核酸が、前記げっ歯類細胞の前記標的ゲノム遺伝子座における置換された核酸配列に対してオルソロガスな核酸配列を含むか；または
（ＩＩＩ）前記インサート核酸が、異なる種由来の核酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（Ｉ）前記インサート核酸が、前記げっ歯類の前記標的ゲノム遺伝子座における置換された核酸配列に対して相同な核酸配列を含むか；または
（ＩＩ）前記インサート核酸が、前記げっ歯類の前記標的ゲノム遺伝子座における置換された核酸配列に対してオルソロガスな核酸配列を含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せを生じさせる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
選択するステップ（ｂ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
（Ｉ）前記ＬＴＶＥＣが、約５０ｋｂから約７５ｋｂ、約７５ｋｂから約１００ｋｂ、約１００ｋｂから約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂから約２００ｋｂ、約２００ｋｂから約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂ、または約２７５ｋｂから約３００ｋｂであるか、あるいは
（ＩＩ）前記上流相同性アームおよび前記下流相同性アームの総計が、約１０ｋｂから約２０ｋｂ、約２０ｋｂから約３０ｋｂ、約３０ｋｂから約４０ｋｂ、約４０ｋｂから約５０ｋｂ、約５０ｋｂから約６０ｋｂ、約６０ｋｂから約７０ｋｂ、約７０ｋｂから約８０ｋｂ、約８０ｋｂから約９０ｋｂ、約９０ｋｂから約１００ｋｂ、約１００ｋｂから約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂから約２００ｋｂである、
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣが、約５０ｋｂから約７５ｋｂ、約７５ｋｂから約１００ｋｂ、約１００ｋｂから約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂから約２００ｋｂ、約２００ｋｂから約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂ、または約２７５ｋｂから約３００ｋｂであるか、あるいは
（ＩＩ）前記第１の上流相同性アームおよび前記第１の下流相同性アームの総計が、約１０ｋｂから約２０ｋｂ、約２０ｋｂから約３０ｋｂ、約３０ｋｂから約４０ｋｂ、約４０ｋｂから約５０ｋｂ、約５０ｋｂから約６０ｋｂ、約６０ｋｂから約７０ｋｂ、約７０ｋｂから約８０ｋｂ、約８０ｋｂから約９０ｋｂ、約９０ｋｂから約１００ｋｂ、約１００ｋｂから約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂから約２００ｋｂである、
請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記げっ歯類細胞が多能性細胞であって、
（ｃ）改変されたげっ歯類多能性細胞をプレ桑実胚期の胚に導入するステップ；
（ｄ）胚盤胞期まで該胚をインキュベートし、代理母に該胚を移植してＦ０げっ歯類を生成するステップ；および
（ｅ）前記遺伝子改変されたゲノム遺伝子座を保有するげっ歯類を同定するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｃ）遺伝子改変された第２のＬＴＶＥＣを単離するステップ；
（ｄ）該遺伝子改変された第２のＬＴＶＥＣを前記げっ歯類の多能性細胞に導入して、目的のゲノム遺伝子座において前記インサート核酸を含む遺伝子改変された多能性細胞を生成するステップ；
（ｅ）該遺伝子改変された多能性細胞を選択するステップ；
（ｆ）該遺伝子改変された多能性細胞をプレ桑実胚期における前記げっ歯類の宿主胚に導入するステップ；および
（ｇ）該遺伝子改変された多能性細胞を含む該宿主胚を代理母に移植して、該改変された多能性細胞に由来するＦ０世代を生成するステップ、
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
（Ｉ）前記げっ歯類がマウスであるか；
（ＩＩ）単離するステップ（ｃ）が、前記遺伝子改変された第２のＬＴＶＥＣを線状化することをさらに含むか；
（ＩＩＩ）導入するステップ（ｄ）が、ＺＦＮを前記多能性細胞に導入することをさらに含むか；または
（ＩＶ）選択するステップ（ｅ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、
請求項２３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
一実施形態では、選択するステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、本明細書に記載される対立遺伝子の改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｅ）（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
哺乳動物細胞において標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞中に、以下：
（ｉ）標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、および
（ｉｉ）上流相同性アームおよび下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、
を導入するステップ；ならびに
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座中に前記インサート核酸を含む標的化された哺乳動物細胞を選択するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記哺乳動物細胞が多能性細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記哺乳動物細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記多能性細胞がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記多能性細胞が造血幹細胞である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記多能性細胞が神経幹細胞である、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記哺乳動物細胞がヒト線維芽細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記哺乳動物細胞が、疾患を有する患者から単離されたヒト細胞であり、該ヒト細胞が、そのゲノム中に少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記ゲノム中の前記少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を置換する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＬＴＶＥＣと前記ヌクレアーゼ剤との併用が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＬＴＶＥＣの前記標的化効率が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、前記核酸が、前記哺乳動物細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結している、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ヌクレアーゼが転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記ヌクレアーゼ剤の標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座中のイントロン、エクソン、プロモーター、プロモーター調節領域またはエンハンサー領域中に位置付けられる、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記上流相同性アームおよび前記下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記インサート核酸が、約５ｋｂから３００ｋｂまでの範囲の長さである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記インサート核酸が選択カセットを含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記インサート核酸がレポーター遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における内因性遺伝子の欠失を生じさせる、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加を生じさせる、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せを生じさせる、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記インサート核酸が、ヒト核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記インサート核酸が、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列またはそれらの組合せである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびそれらの組合せから選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
選択するステップ（ｂ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記インサート核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中の核酸配列に対して相同な核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記インサート核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中の核酸配列に対してオルソロガスな核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記インサート核酸が、異なる種由来の核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記標的化された哺乳動物細胞が、そのゲノム中に、約５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲の前記インサート核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
原核細胞において細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介して哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を含む原核細胞中に、以下：
（ｉ）第１の上流相同性アームおよび第１の下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む標的化ベクター、および
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、
を導入するステップ、ならびに
（ｂ）前記インサート核酸を含む標的化された原核細胞を選択するステップ、
を含み、
ここで、前記標的ゲノム遺伝子座は、第２の上流相同性アームおよび第２の下流相同性アームを含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）中に存在し、
前記原核細胞が、前記ＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することが可能である、方法。
（項目３７）
前記哺乳動物がヒトである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物がげっ歯類である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記げっ歯類が、マウス、ラットまたはハムスターである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記標的化ベクターと前記ヌクレアーゼ剤との併用が、前記標的化ベクター単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記標的化効率が、前記標的化ベクター単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記原核細胞が、組換えコンピテント株のＥ．ｃｏｌｉである、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含まず、前記リコンビナーゼをコードする該核酸が、前記原核細胞中に導入される、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、該核酸が、前記原核細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結している、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ヌクレアーゼが転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記ヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
前記ヌクレアーゼ剤の標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座中のイントロン、エクソン、プロモーター、プロモーター調節領域またはエンハンサー領域中に位置付けられる、項目３６に記載の方法。
（項目５１）
前記第２の上流相同性アームおよび前記第２の下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、項目３６に記載の方法。
（項目５２）
前記インサート核酸が、約５ｋｂから３００ｋｂまでの範囲の長さである、項目３６に記載の方法。
（項目５３）
前記インサート核酸が選択カセットを含む、項目３６に記載の方法。
（項目５４）
前記インサート核酸がレポーター遺伝子を含む、項目３６に記載の方法。
（項目５５）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における内因性遺伝子の欠失を生じさせる、項目３６に記載の方法。
（項目５６）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加を生じさせる、項目３６に記載の方法。
（項目５７）
前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せを生じさせる、項目３６に記載の方法。
（項目５８）
前記インサート核酸が、ヒト核酸配列である、項目３６に記載の方法。
（項目５９）
前記インサート核酸が、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列またはそれらの組合せである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびそれらの組合せから選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目６３）
前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目６４）
選択するステップ（ｂ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、項目３６に記載の方法。