【手続補正書】
【提出日】平成28年9月26日(2016.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)フォワードプライマーおよびリバースプライマーであって、フォワードプライマーが、検出されるべきRNA分子に特異的であり、リバースプライマーが、ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列であって、場合によりオリゴ(dT)配列もしくはオリゴ(dA)配列、ならびに、場合により前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする前記配列の3'末端において、検出されるべきRNA分子に特異的なヌクレオチド配列を含み、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列、および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、フォワードプライマーおよびリバースプライマー;
を含み、かつ
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を含むか、前記1個または複数の特定のRNA分子に対応するcDNA分子を増幅および検出するための追加のプライマーまたはプローブを含まない、キット。
【請求項２】
（１）フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含み、リバースプライマーがヘアピンプライマーを含まない、あるいは
（２）リバースプライマーがヘアピンプライマーを含み、フォワードプライマーがヘアピンプライマーを含まない、
請求項1に記載のキット。
【請求項３】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素を含み、前記1個または複数の特定のRNA分子に対応するcDNA分子を増幅および検出するための追加のプライマーまたはプローブを含まない、請求項1に記載のキット。
【請求項４】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素が、ポリ(A)ポリメラーゼ、ウリジリルトランスフェラーゼまたはポリ(U)ポリメラーゼを含む、請求項1または請求項3に記載のキット。
【請求項５】
逆転写酵素を含み、場合により前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素、および逆転写酵素が1つの容器で提供される、請求項1から4のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
DNAポリメラーゼを含み、場合により逆転写酵素とDNAポリメラーゼを単一酵素の形として含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記ポリ(リボヌクレオチド)配列をRNA分子に付加する能力がある酵素が、単一酵素の形をとる逆転写酵素とDNAポリメラーゼと一緒に、1つの容器で提供される、請求項6に記載のキット。
【請求項８】
検出されるべき1個のRNA分子にいずれも特異的である少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の異なるプライマー対を含み、場合により少なくとも1つのプライマー対がヘアピンプライマーを含み、場合によりキットにおける各ヘアピンプライマーが異なる検出可能なシグナルを生じる、請求項1から6のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
特定のRNA分子が非コードRNAを含み、場合により非コードRNAが、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、一時的低分子RNA(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびPiwi相互作用RNA(piRNA)からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
非コードRNAがmiRNAを含み、場合により非コードRNAが、miR-31、CTL23、miR-126、miR-1、miR-335、miR-139-5p、miR-210、miR-143、miR-10b、miR-181a、miR-28-5p、miR-127-5p、miR-125b、miR-222、miR-29a*、miR-381、let7d、miR-93、miR-200-5p、miR-221、およびmiR-107のうちの1つまたは複数から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
多重反応において、非コードRNAと共に、1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対を追加として含み、場合により前記1個または複数のmRNA分子を増幅するための1つまたは複数のプライマー対がヘアピンプライマーを含まない、請求項9または10に記載のキット。
【請求項１２】
mRNA分子を検出するための1つまたは複数のプローブを追加として含み、場合によりプローブがmRNA分子に特異的である、請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
シグナル放出手段がエネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含み、それぞれがヘアピンプライマーに結合しており、かつデュプレックスの鎖が分離した時のみシグナルが検出可能であるように間隔を置いて配置されており、場合により（ａ）エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、約10〜40ヌクレオチドの範囲内での距離を置いて配置されており、（ｂ）受容体部分が、供与体部分によって放出された波長とは異なる波長で蛍光を放出するフルオロフォアであり、（ｃ）エネルギー供与体部分がフルオロフォアであり、エネルギー受容体部分がフルオロフォアクエンチャーであり、あるいは（ｄ）供与体部分が、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、およびReactive Red 4からなる群から選択され、受容体部分が、DABCYL、ローダミン、テトラメチルローダミン、酪酸ピレン、エオシンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、マラカイトグリーン、およびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて、5ヌクレオチドまたはそれ未満だけ離れている逆鎖ヌクレオチド上に位置しており、好ましくはエネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分が、デュプレックスにおいて互いに反対側にある相補ヌクレオチド上に位置している、請求項13に記載のキット。
【請求項１５】
試料における特定のRNA分子を増幅するための方法であって、前記方法が、
(a)試料におけるRNA分子にポリ(リボヌクレオチド)配列を付加する工程;
(b)前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列を含むリバースプライマーを用いて、ポリ(リボヌクレオチド)-RNA分子を逆転写する工程;ならびに
(c)同じリバースプライマー、および検出されるべきRNA分子に特異的なフォワードプライマーを用いて、cDNA分子を増幅および検出する工程
を含み、
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも1つが、
(i)検出されるべきRNA分子に特異的な第1のヌクレオチド配列および/または前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列;
(ii)第1の配列の5'末端における第2のヌクレオチド配列;
(iii)第2の配列の5'末端における第3のヌクレオチド配列またはスペーサー;
(iv)第3の配列の5'末端における第4のヌクレオチド配列であって、二本鎖のデュプレックスを形成するように第2の配列に相補的である第4の配列;ならびに
(v)デュプレックスの鎖が分離した時、検出可能なシグナルを放出するための手段
を含むヘアピンプライマーを含み、
リバースプライマーがヘアピンプライマーを含む場合、前記ポリ(リボヌクレオチド)配列にアニールする配列が、前記ヘアピンプライマーの第1のヌクレオチド配列内に存在する、方法。