【手続補正書】
【提出日】平成28年4月28日(2016.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
抗体
本明細書中で用いる「凝固因子ＦＸＩおよび／またはその活性化形態である凝固因子ＸＩａを遮断する抗体」なる表現は、凝固因子ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ活性の完全または部分的な抑制を招く、本発明の抗体によるＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの遮断を示す意である。そのアミノ酸配列には、配列番号１９〜３６に記載されているアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
【図１】ヒトＦＸＩａを抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号１９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の用量反応曲線（ＥＣ５０はＩＣ５０と同一である）。この抗体はＣＤＲＨ１としての配列番号２１、ＣＤＲＨ２としての配列番号２２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号２３を含む。この抗体は更に、ＣＤＲＬ１としての配列番号２４、ＣＤＲＬ２としての配列番号２５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号２６を含む。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。関連ＤＮＡ配列を配列番号１〜配列番号８として示す。
【図２】ウサギＦＸＩａを抑制する抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ウサギＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図３】ヒトＦＸＩａを抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２７および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄの用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図４】抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄの用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ウサギＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図５】凝固因子ＸＩＩａを介したヒトＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号３０を含む抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。この抗体は、ＣＤＲＨ１としての配列番号３１、ＣＤＲＨ２としての配列番号３２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号３３を含む。この抗体は更に、ＣＤＲＬ１としての配列番号３４、ＣＤＲＬ２としての配列番号３５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号３６を含む。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。関連ＤＮＡ配列を配列番号１１〜配列番号１８として示す。
【図６】凝固因子ＩＩａによるヒトＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図７】凝固因子ＸＩＩａによるウサギＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図８】凝固因子ＩＩａによるウサギＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図９】ヒトＦＸＩａの触媒ドメインへの０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の結合および遮断活性。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４はヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するが、０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７はそのような活性を示さない。このことは、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４がＦＸＩａの触媒ドメインに結合することを示している。
【図１０】ラインウィーバー−バークプロットを用いる０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の結合様式の特徴づけは、この抗体が競合型阻害活性を示すことを示している。
【図１１】ＣＤ６２Ｐ発現および血小板微小凝集物形成に関するフローサイトメトリー分析。光散乱とＦＩＴＣ−ＣＤ４１／ＣＤ６１（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）蛍光との組合せにより、単一血小板が検出された。（Ａ）ＦＩＴＣ−ＣＤ４１およびＰＥ−ＣＤ６２Ｐ蛍光でのドットプロットによるＣＤ６２Ｐ発現の決定。潅流の前（左）および後（右）のゲートされた血小板を示す。（Ｂ）血小板微小凝集物形成が、円内に示されているサイズ増加（前方散乱）により特徴づけられた。潅流の前（左）および後（右）に集められたサンプルのドットプロットを示す。
【図１２】血小板ＣＤ６２Ｐ発現がＦＸＩ（ａ）抗体により減少した。全血を（Ａ）０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および（Ｂ）０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７で処理し、再石灰化の直後にコラーゲン被覆表面上で潅流した。並行して、全血サンプルをビヒクルまたはインヒビターで処理した後に集め、ＴＲＡＰ６（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で５分間インキュベートした。図１１に示されているとおり、血小板ＣＤ６２Ｐ発現をフローサイトメトリーにより分析した。データは、少なくとも５つの実験のゲートされた集団におけるＣＤ６２Ｐ陽性血小板の平均±ＳＥＭ％として示されている。各処理における５分間の潅流中の最大ＣＤ６２Ｐ発現レベルがグラフに示されている。
【図１３】血小板微小凝集物形成はＦＸＩ（ａ）抗体により抑制された。全血を（Ａ）  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および（Ｂ）０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７で処理し、再石灰化の直後にコラーゲン被覆表面上で潅流した。血小板微小凝集物を、図１３に示されているとおりにフローサイトメトリーにより分析し、表示した。データは、少なくとも５つの実験の１０４個のゲートされた単一血小板に対する平均±ＳＥＭ凝集物数として示されている。各処理における５分間の潅流中の最大凝集物数がグラフに示されている。
【図１４】塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４のインビボ効果。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４は、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１５】塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄのインビボ効果（実施例ｘｘｘに記載されている）。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄは、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１６】インビボ効果は、塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の効果（実施例ｘｘｘに記載されている）を示している。０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７は、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１７】この図は、ＦＸＩａ（上部）と複合体形成したＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（下部）のポンチ絵表示を示す。
【図１８ａ】この図はＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓに対するＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（ポンチ絵）の結合エピトープの詳細図を示す。ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓは表面表示として示されている。
【図１８ｂ】この図は、表面表示として示されたＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの重ね合せペプチドＸ線構造を伴うＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を示す。活性部位間隙が赤色楕円形で強調されている。
【図１９ａ】この図は、重ね合されたＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を伴うチモーゲンＦＸＩ（ｏｄｂエントリー２Ｆ８３）の結晶構造を示す。
【図１９ｂ】この図は同じ図を示すが、チモーゲンのＦＸＩの触媒ドメインがＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４：ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ複合体構造のＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの触媒ドメインにより置換されている。ＦＸＩおよびＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの触媒ドメインは表面表示として示されており、全ての他のドメインはポンチ絵として示されている。Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４との境界における適切に秩序だっていないループが図１９において強調されている。
【図２０】０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与の後にヒヒから集められた血漿サンプルにおいて決定されたインビトロａＰＴＴ血餅形成時間の増加。
【図２１】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の、投与後５分から投与後５０４時間までのＡＣＴ測定値。
【図２２】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の最初の２４時間のＡＣＴ測定値。
【図２３】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の、投与後５分から投与後５０４時間までのａＰＴＴ測定値。
【図２４】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の最初の２４時間のａＰＴＴ測定値。
【図２５】２ｍｍ  ｉ．ｄ．コラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ血管移植片における血小板沈着。
【図２６】実施例１２に記載されているコラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ血管移植片における血小板沈着。
【図２７】実施例１２に記載されている静脈成長チャンバー（およびコラーゲン被覆移植片とシリコンチャンバーとの間の連結部）における血小板沈着。
【図２８】０７６Ｄ−Ｍ００７−ＨＯ４の投与の後でヒヒ血漿において測定されたＴＡＴレベル。
【図２９】０．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および２ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（２４時間後）単独で、あるいはチュアブル・アスピリンを３２ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた後に処理されたヒヒにおける出血時間。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
実施例３：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを用いる抗凝固活性の決定
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを用いることにより、抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄおよび０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の抗凝固活性を試験した。ヒトおよびウサギ血漿におけるａＰＴＴの倍加に必要な濃度の値を表８に示す。
【表８】
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【表９】
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2015517305.tif 000029
2015517305.tif 000030
2015517305.tif 000031
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【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子ＸＩおよび／またはその活性化形態である因子ＸＩａに結合しうるヒトモノクローナル抗体であって、血小板凝集を抑制し、これにより、止血を妨げることなく血栓症を抑制することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＦＸＩａを抑制する、表９に示されている可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、請求項１記載のヒト抗ＦＸＩａ。
【請求項３】
ヒトＦＸＩａを抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号１９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む、請求項１および２のいずれか１項記載のヒト抗ＦＸＩａ。
【請求項４】
ヒトＦＸＩａを抑制する、表９に示されている少なくとも１つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１〜２のいずれか１項記載のヒト抗ＦＸＩａ。
【請求項５】
ＣＤＲＨ１としての配列番号２１、ＣＤＲＨ２としての配列番号２２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号２３、ならびにＣＤＲＬ１としての配列番号２４、ＣＤＲＬ２としての配列番号２５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号２６を含む、請求項４記載のヒト抗ＦＸＩａ。
【請求項６】
可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号３０を含む、請求項１〜２のいずれか１項記載のヒト抗ＦＸＩ抗体。
【請求項７】
ＣＤＲＨ１としての配列番号３１、ＣＤＲＨ２としての配列番号３２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号３３、ならびにＣＤＲＬ１としての配列番号３４、ＣＤＲＬ２としての配列番号３５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号３６を含む、請求項６記載のヒト抗ＦＸＩ抗体。
【請求項８】
可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２７および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む、請求項１および２のいずれか１項記載のヒト抗ＦＸＩ抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の抗体の１つと競合するヒト抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体を含む医薬。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体の１以上をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを含む宿主。