(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、少なくとも前記水素供与体と、アルブミンとを同時に含む試薬組成物において、前記水素供与体が、下記一般式(I)で示される構造を有するアニリン誘導体であることを特徴とする試薬組成物。
【化１】
0004018401.tif 000007
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
（ただし、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に水素原子又は炭素数１〜２のアルキル基、Ｒ３は炭素数２〜４のスルホアルキル基又は炭素数２〜４のヒドロキシスルホアルキル基、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示す。）
【請求項２】
低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法に用いられることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物に関する。本発明の試薬組成物は、コレステロール、とりわけ、低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化性疾患の危険因子の1つであることが知られている。ＬＤＬ中のコレステロール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ということがある）を簡便に分別定量することは臨床上極めて有用である。
【０００３】
従来からのＬＤＬコレステロールの定量方法は、分画操作とコレステロール定量の2段階から求める方法と、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド値より求めるＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ式による演算方法がある。
【０００４】
分画操作としては超遠心法、沈殿法、免疫法等があるが、試料を遠心処理またはフィルター処理する操作が必要であり、簡便性や経済性に問題があった。またＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ式による演算方法もその使用に制限があり、個体差を加味していないため正確性に問題があった。
【０００５】
本出願人は、先に分画操作を要しないＬＤＬコレステロール定量方法（特開２００１−２２４３９７）を開発し、現在、この方法は、臨床検査の場にて適用されている。この方法は、第１工程で試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールをアブルミン存在下で選択的に消去し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定量するものである。本定量方法によれば、第一工程をアルブミンの存在下で行うことにより被検試料中にトリグリセリド（ＴＧ）が高濃度に含まれる場合であっても、その影響を回避して正確な定量を行うことができる。なお、コレステロールの定量は、コレステロールがコレステロールオキシダーゼの作用を受けて生成する過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量することにより行われる。そして、第１工程に用いられる試薬組成物には、水素供与体とアルブミンとが同時に含まれる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この定量方法において第１工程に用いられる、発色系の水素供与体とアルブミンとを同時に含む試薬組成物が、長期保存中に徐々に自然発色してくるという問題があった。この発色により、用いる測定波長によっては反応吸光度に影響を及ぼす。また、この発色により第１工程の一部の成分が消費され、被検試料と十分な反応が得られなくなることが分かった。それ故に、この問題点を回避することが測定試薬としての有用性を高めることとなり、その方法が望まれている状況にあった。なお、この問題は、水素供与体と、アルブミンとを別々の試薬組成物中に含めることでも解決可能であるが、そうすると、使用時に混合する試薬組成物が１つ増えてしまい、操作が煩雑となり、人為的なミスも起きやすくなるので好ましくない。従って、水素供与体とアルブミンとを同時に含む試薬組成物において上記問題点を解決することが望まれる。
【０００７】
従って、本発明の目的は、発色系の水素供与体とアルブミンとを同時に含む試薬組成物であって、長期保存中の自然発色を有意に抑制することができる試薬組成物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、試薬組成物の発色の原因において調査した結果、アルブミンおよび水素供与体であるアニリン誘導体の共存が、反応液中の溶存酸素によって発色を引き起こすことを突き止めた。具体的には、アニリン誘導体が反応液中に存在する溶存酸素により徐々に酸化され、4位に酸素が付加した酸化物へと変化する。この反応は３位及び／又は５位にアルコキシル基を有するアニリン誘導体に起こりやすく、この酸化により２または６位の反応性が増す。そして、この部分にアブルミンに由来する物質が結合し、発色を引き起こすというものである。
【０００９】
そこで、発色を抑える方法について検討した結果、３位及び５位のいずれにもアルコキシル基が結合していない特定のアニリン誘導体とアルブミンを組み合わせて用いることにより、反応液保存中の発色は抑えられ、その結果、ＬＤＬコレステロール測定値への影響は回避され、試薬組成物を長期安定化することができることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、少なくとも前記水素供与体と、アルブミンとを同時に含む試薬組成物において、前記水素供与体が、下記一般式(I)で示される構造を有するアニリン誘導体であることを特徴とする試薬組成物を提供する。
【化２】
0004018401.tif 000002
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
（ただし、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に水素原子又は炭素数１〜２のアルキル基、Ｒ３は炭素数２〜４のスルホアルキル基又は炭素数２〜４のヒドロキシスルホアルキル基、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示す。）
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の試薬組成物中に含まれる、発色系の水素供与体は、３位及び５位のいずれにもアルコキシル基が結合していないアニリン誘導体であり、水素受容体との反応（カップリング反応）により色素を形成するものである。本発明の組成物中に用いられるアニリン誘導体は、上記一般式(I)で示される構造を有するものである。
【００１３】
一般式(I)中、Ｒ３のスルホアルキル基又はヒドロキシスルホアルキル基におけるアルキル部分は、直鎖状でも分枝状でもよく、また、炭素数は、２〜４である。さらに、Ｒ４のアルキル基も、直鎖状でも分枝状でもよく、また、炭素数は、１〜３である。一般式(I)で表されるアニリン誘導体のうち、特に好ましいものとして、下記一般式(II)で示される構造を有するN-スルホプロピルアニリン誘導体及び下記一般式(III)で示される構造を有するN-ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体を挙げることができる。
【００１４】
【化３】
0004018401.tif 000003
【００１５】
【化４】
0004018401.tif 000004
（ただし、一般式(II)及び(III)中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は、前記一般式(I)中のＲ１、Ｒ２及びＲ４とそれぞれ同義）
【００１６】
試薬組成物中のアニリン誘導体の濃度は、特に限定されないが、通常、試薬組成物全体の重量を基準にして、０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度である。
【００１７】
本発明の試薬組成物に含まれるアルブミンは、アルブミンであれば何ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを用いることができる。アルブミンの起源は何ら限定されるものではなく、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。
【００１８】
試薬組成物中のアルブミンの濃度は、特に限定されないが、通常、試薬組成物全体の重量を基準にして、０．３〜３．０％程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．５％程度である。
【００１９】
被検試料中に含まれる測定すべき化合物に酸化酵素を作用させ、それによって生じる過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を比色定量する１試薬系又は２試薬系の試薬組成物自体は周知であり、また、ＬＤＬコレステロールの選択的定量方法に用いられる試薬組成物であって、被検試料中にＴＧが高濃度に含まれる場合に生じる測定誤差を回避するためにアブルミンをさらに配合した試薬組成物も公知である（特開２００１−２２４３９７）。本発明の試薬組成物は、アルブミンと発色系の水素供与体とを含む試薬組成物において、水素供与体として上記した特定のアニリン誘導体を用いることに特徴があり、他の成分は、公知の試薬組成物と同様でよい。
【００２０】
本発明の試薬組成物は、アルブミンと上記アニリン誘導体とを含有するものであれば、いずれの用途に適用されるものであってもよいが、特開２００１−２２４３９７に記載されている、ＬＤＬコレステロールの定量方法の第１工程に用いられる試薬組成物にとりわけ適している。以下、このＬＤＬコレステロールの定量方法についてさらに説明する。
【００２１】
リポ蛋白に含まれるコレステロールとしては，エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
【００２２】
本方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
本方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程では被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中のＬＤＬ中のコレステロールである。
【００２４】
第１工程における「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００２５】
すなわち、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
【００２６】
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜  ０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４００〜２０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は１．０〜６．０Ｕ／ｍＬが好ましく、水素供与体の濃度としては０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００２８】
第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。
【００２９】
ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／Ｌ程度である。
【００３１】
第１工程は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００３２】
第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００３３】
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。
【００３４】
第１工程の反応温度は３０〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また，反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００３５】
続く第２工程では，被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行うことができる。
【００３６】
ここで、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好ましくは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。
【００３７】
また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができる。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ましい。
【００３８】
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／Ｌ程度である。
【００３９】
また、第２工程における過酸化水素の定量は、水素供与体と、水素受容体とのカップリング反応により形成される色素を定量することにより行うことができる。水素供与体としては、上記したアニリン誘導体（第１工程に用いる試薬中に含まれる）が用いられ、水素受容体としては、従来と同様、4-アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。
【００４０】
第２工程のその他の好ましい条件は、第１工程における好ましい条件と同様である。
【００４１】
従って、本発明の試薬組成物を、上記したＬＤＬコレステロールの定量方法の第１工程を行うための試薬組成物として用いる場合には、上記したアルブミン及びアニリン誘導体の他に、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤が少なくとも含まれ、さらに、カタラーゼ、マグネシウム塩や緩衝剤が含まれていてもよい。組成物中のこれらの成分の濃度は、第１工程の反応液中の各成分の濃度が上記の範囲になるように設定することが好ましい。
【００４２】
なお、上記ＬＤＬの定量方法では、上記アニリン誘導体とカップリング反応して色素を形成する上記水素受容体は、第２工程において添加され、第１工程に用いられる試薬組成物中には含まれない。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１、比較例１
上記したＬＤＬコレステロールの定量方法の第１試薬として用いられる、下記の組成を有する試薬組成物を調製した。
【００４５】
試薬組成
ＰＩＰＥＳ緩衝液，pH７.０                   ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ                    ０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                    ０．５Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ                                  ６００U／ｍＬ
塩化マグネシウム                            １０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤  エマルゲンB-６６（花王社製）    ０．２％
ウシ血清アルブミン                          １．０％
水素供与体＊１                              ＊２
（＊１、＊２：実施例１ではN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)を2.00 mM、比較例１ではN-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)を0.56 mM）
【００４６】
各組成物の７００ｎｍにおける吸光度を測定した後、各組成物を８℃で１年間保存し、４００〜８００ｎｍにおける吸収スペクトル及び７００ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１及び表１に示す。
【００４７】
図１に示されるように、比較例１の試薬組成物では発色を示す吸収ピーク（725nmを最大吸収とするピーク）が大きく上昇しているのに対し、実施例１の試薬組成物では、この吸収ピークの上昇が全く認められず、安定であることがわかる。なお、比較例１で水素供与体として用いたHDAOSは、この種の試薬組成物において、発色系の水素供与体として従来から広く用いられている化合物である。また、表１に示されるように、比較例１の試薬組成物では、自動分析装置で使用する副波長７００ｎｍ吸光度が大幅に上昇しているのに対し、実施例１の試薬組成物では、波長７００ｎｍ吸光度の上昇が全く見られなかった。これらより、本発明の試薬組成物では、保存中の自然発色が従来の試薬組成物に比較して大幅に抑制されることが明らかになった。
【００４８】
【表１】
表１    試薬組成物保存後の測定波長吸光度（７００ｎｍ）への影響
0004018401.tif 000005
【００４９】
実施例２、比較例２
ＬＤＬコレステロールの定量試薬として用いられる、下記の組成を有する試薬組成物を調製した。
【００５０】
第１試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液，pH７.０                   ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ                    ０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                    ０．５Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ                                  ６００U／ｍＬ
塩化マグネシウム                            １０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤  エマルゲンB-６６                  ０．２％
ウシ血清アルブミン                            １．０％
水素供与体＊１                              ＊２
（＊１、＊２：実施例２ではN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)を2.00 mM、比較例２ではN-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)を0.56 mM）
【００５１】
第２試薬
４-アミノアンチピリン                       ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ４．０単位／ｍＬ
アジ化ナトリウム                            ０．０５％
非イオン界面活性剤                          １．０％
（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）
【００５２】
血清試料４μＬに，あらかじめ３７℃に加温した第１試薬３００μＬを混和し，３７℃で５分間反応させた後に，第２試薬１００μＬを加え５分間反応させ，６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度から事前に測定していた既知濃度試料の吸光度と比較を行い，ＬＤＬコレステロールを算出した。
【００５３】
各組成物を８℃，１年間保存した後，血清試料中のＬＤＬコレステロールを算出した。対照法として超遠心法による試料中のＬＤＬコレステロールを求めた。超遠心法は「新生化学実験講座第４巻  脂質I  中性脂質とリポ蛋白質」、１８１（１９９３）に記載された方法を用いた。
【００５４】
その結果を表２に示す。表に示されるように比較例２では超遠心法と５％以上乖離するものが数例見られる。これに対し，実施例２ではこのような乖離例は見られず，本発明の試薬組成物を用いたＬＤＬコレステロール測定試薬は正確にＬＤＬコレステロールを定量していることがわかる。
【００５５】
【表２】
表２    試薬生成物保存後のＬＤＬコレステロール測定値への影響
0004018401.tif 000006
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば，前記のアニリン誘導体を水素供与体として用いることにより、保存中の自然発色が抑えられ、自動分析装置での吸光度変化への影響が回避され、長期にわたり正確な測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の組成物(TOOS)及び比較例１の組成物(HDAOS)を８℃で１年間保存後の吸収スペクトルを示す。
【図１】
0004018401.tif 000008