(57)【要約】【課題】光学顕微鏡により撮影される画像の輝度のリニアリティを良好に検証することのできる撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置を提供すること。【解決手段】撮影画像のリニアリティ評価方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。【選択図】図７
2013120239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
【請求項３】
請求項２に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ１とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から９０度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の２点それぞれの輝度をＡ１、Ｂ１として、前記撮影画像の評価値Ｖ１（Ｖａｌｕｅ１）をＶ１＝（Ａ１＋Ｂ１）／２Ｃ１から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ２とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から９０度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の２点それぞれの輝度をＡ２、Ｂ２として、前記理論輝点画像の評価値Ｖ２（Ｖａｌｕｅ２）を、ガンマを変数としてＶ２＝（Ａ２＋Ｂ２）／２Ｃ２から求め、
前記撮影画像の評価値Ｖ１と前記理論輝点画像の評価値Ｖ２を比較し、前記Ｖ１と近似する前記Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
【請求項４】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、
前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する
画像取得方法。
【請求項５】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、
前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値を基に、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部と
を具備する画像取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物組織などの、微細な粒子を分析、分取する手法としてフローサイトメトリーがある。フローサイトメトリー装置（フローサイトメータ）は、細胞などの粒子１個ずつから、大きさなどの形態の情報、ＤＮＡ／ＲＮＡ蛍光染色や、タンパクなどを蛍光抗体で染色した蛍光の情報を高速に取得し、それらの相関を解析し、目的の細胞集団などを分取することが可能な装置である。また、細胞の蛍光画像からサイトメトリーを行う手法としてはイメージングサイトメトリーが知られる。イメージングサイトメトリーでは、スライドガラスやシャーレ上の生体サンプルの蛍光像を拡大して撮影し、当該蛍光像中の一つ一つの細胞の情報、例えば細胞を蛍光標識する輝点の強度（輝度）やサイズなどの定量・数値化、細胞周期の解析などが行われる。（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１０７６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
蛍光顕微鏡により撮影された画像中で蛍光標識された輝点の強度（輝度）を測定するためには、撮影された画像の輝度のリニアリティが重要である。光学系と撮像素子を用いて撮影された画像の輝度のリニアリティは撮像素子の変換特性などに依存しており、測定系の特性と整合しているとは限らない。そこで光学系と撮像素子を用いて撮影された画像の輝度のリニアリティを評価する方法が求められるが、これまでこれといった方法は知られていない。
【０００５】
ところで、蛍光の輝点の強度が段階的に設定された蛍光ビーズを用いて画像のリニアリティを評価する方法などが存在する。しかし、この蛍光ビーズは焦点深度が比較的深い（焦点をあわせることが比較的やさしい）光学系を用いることが一般的であるフローサイトメトリー装置用に開発されたものである。焦点深度が浅い（焦点を合わせることが比較的難しい）光学系が用いられる光学顕微鏡においては、焦点が合っていない場合にも輝度が低下するので、上記の蛍光ビーズを用いて輝度のリニアリティを検証することは困難であった。
【０００６】
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、光学顕微鏡により撮影される画像の輝度のリニアリティを良好に検証することのできる撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の課題を解決するため、本技術の一形態に係る撮影画像のリニアリティ評価方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
本技術では、焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて撮影画像を得るので、略楕円状の輝点像を得ることができ、この輝点像の輝度分布より撮影環境のガンマ値を評価することができ、実撮影画像のリニアリティを良好に検証することができる。
【０００８】
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価してもよい。
【０００９】
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ１とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から９０度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の２点それぞれの輝度をＡ１、Ｂ１として、前記撮影画像の評価値Ｖ１（Ｖａｌｕｅ１）をＶ１＝（Ａ１＋Ｂ１）／２Ｃ１から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ２とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から９０度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の２点それぞれの輝度をＡ２、Ｂ２として、前記理論輝点画像の評価値Ｖ２（Ｖａｌｕｅ２）を、ガンマを変数としてＶ２＝（Ａ２＋Ｂ２）／２Ｃ２から求め、
前記撮影画像の評価値Ｖ１と前記理論輝点画像の評価値Ｖ２を比較し、前記Ｖ１と近似する前記Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価してもよい。
【００１０】
本技術の他の形態に係る画像取得方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する。
【００１１】
本技術の更に他の形態に係る画像取得装置は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部とを具備する。
【発明の効果】
【００１２】
以上のように、本技術によれば、撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本技術の第１の実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。
【図２】図１の画像取得装置の画像取得対象である生体サンプルを示す図である。
【図３】図１の画像取得装置におけるデータ処理部のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図４】図１の画像取得装置による生態サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
【図５】図１の画像取得装置による撮像対象の領域を示す図である。
【図６】図１の画像取得装置による露光時の焦点位置変化による撮像素子に撮像される像の形状と位置の経時変化を示す図である。
【図７】実撮影画像の一輝点画像及び理論輝点画像を示す図であり、画像の輝度分布から画像評価値を求める計算式にあてはめる輝度値Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれに対応する位置を示す。
【図８】（ａ）は実撮影画像の一輝点画像を示し、（ｂ）〜（ｉ）はそれぞれガンマ値を０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２、２．５として計算して求めた理論輝点画像を示す。
【図９】図８（ｂ）〜（ｉ）の理論輝点画像におけるガンマ値と輝度評価値Ｖ２との関係をテーブル化した理論輝点画像の評価値テーブルを示す図である。
【図１０】図９に示す理論輝点画像の評価値テーブルをグラフ化したものを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
［本実施形態の概要］
本実施形態は、光学顕微鏡により撮影される実撮影画像のリニアリティを評価し、この評価結果に基づいて実撮影画像を補正する画像取得方法に関する。
蛍光顕微鏡により撮影された画像中で蛍光標識された輝点の強度（輝度）を測定するためには、撮影された画像の輝度のリニアリティが重要となる。例えば、撮影画像の輝度のリニアリティ評価方法として、ガンマ値を変えて複数枚の実撮影画像を取得し、評価者が、これら複数枚の実撮影画像と、光学系を通した生体サンプルの目視による観察結果とを比較して、撮影画像の輝度のリニアリティを評価することが考えられる。しかしながら、この評価方法では、複数枚の撮影画像が必要なため評価に時間がかかるうえ、目視では微妙な違いを評価することが困難である。
【００１５】
このような点を改善するために、本実施形態の画像取得方法では、光学系と撮像素子を用いて撮影された１枚の実撮影画像の一輝点像の輝度分布から、撮像素子の特性や撮影時の周辺温度等の撮影環境のガンマ値を求める。
具体的には、光学系と撮像素子を用いて、光学系の焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて実撮影画像を得、この実撮影画像の輝度分布から輝度評価値を求める。また、この実撮影画像の輝度評価値とは別に、ガンマを変数として撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求め、この理論輝点画像の輝度分布から輝度評価値を予め求めておく。そして、１つの実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と、予め求めていたガンマ値が異なる複数の理論輝点画像の輝度評価値とを比較することにより、実撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
【００１６】
更に、実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と近似する輝度評価値を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値から、撮影環境のガンマ値を求め、この求めた撮影環境のガンマ値をもとに、光学系と撮像素子を用いて撮影された実撮影画像を補正する。この補正により得られる撮影画像は、撮影対象となる生体サンプルの蛍光標識された輝点の強度をより正確に再現したものとなっている。従って、補正された撮影画像は、リニアリティをもっているので、撮影画像の輝点像の輝度を定量化して評価することが可能となる。
【００１７】
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
［画像取得装置の構成］
図１は、一実施形態に係る画像取得装置１００を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置１００は、顕微鏡１０と、データ処理部２０とを有する。
【００１８】
［顕微鏡１０の構成］
顕微鏡１０は、ステージ１１、光学系１２、光源１３及び撮像素子１４を有する。
ステージ１１は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルＳＰＬを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向（ｘ−ｙ平面方向）及び垂直方向（ｚ軸方向）へ移動可能とされている。
【００１９】
図２は、上記ステージ１１に載置される生体サンプルＳＰＬをステージ１１の側面方向から示した図である。同図に示すように、生体サンプルＳＰＬは、Ｚ方向に例えば数μｍから数十μｍの厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれて所定の固定手法により固定されている。生体サンプルＳＰＬは蛍光染色剤によって染色されている。蛍光染色剤は同一の光源から照射される励起光によって蛍光を発する染色剤である。蛍光染色剤としては、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ＳｐＡｑｕａ、ＳｐＧｒｅｅｎなどを挙げることができる。
【００２０】
図１に戻り、ステージ１１の上方には光学系１２が配置される。光学系１２は、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂ、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄ及び励起フィルタ１２Ｅを有する。光源１３は、例えば水銀ランプ等の電球やＬＥＤ（Light Emitting Diode）など、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射するものである。
【００２１】
励起フィルタ１２Ｅは、生体サンプルＳＰＬの蛍光像を得る場合に、光源１３から出射された光のうち蛍光色素を励起する励起波長の光のみを透過させることで励起光を生成する。ダイクロイックミラー１２Ｃは、当該励起フィルタで透過されて入射する励起光を反射させて対物レンズ１２Ａへ導く。対物レンズ１２Ａは、当該励起光を生体サンプルＳＰＬへ集光する。そして対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂは、生体サンプルＳＰＬの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像を撮像素子１４の撮像面に結像させる。
【００２２】
生体サンプルＳＰＬに励起光が照射されると、生体サンプルＳＰＬの各組織に結合している染色剤が蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過し、エミッションフィルタ１２Ｄを介して結像レンズ１２Ｂへ到達する。エミッションフィルタ１２Ｄは、上記対物レンズ１２Ａによって拡大された、発色光以外の光（外光）を吸収する。当該外光が喪失された発色光の像は、上述のとおり、結像レンズ１２Ｂにより拡大され、撮像素子１４上に結像される。
【００２３】
撮像素子１４としては、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等が用いられる。撮像素子１４は、ＲＧＢ(Red、Green、Blue)の色別に光を受けて電気信号に変換する光電変換素子を有し、入射光からカラー画像を得るカラーイメージャである。
【００２４】
光源駆動部１６は、後述するデータ処理部２０の光源制御部３６からの指令に従って、光源１３を駆動する。ステージ駆動部１５は、後述するデータ処理部２０のステージ制御部３１からの指令に従って、ステージ１１を駆動する。撮像制御部１７は、後述するデータ処理部２０の画像取得部３２からの指令に従って、撮像素子１４の露光を制御し、また、撮像素子１４から取得した像を画像取得部３２に提供する。
【００２５】
［データ処理部２０の構成］
図３は、データ処理部２０のハードウェア構成を示すブロック図である。
データ処理部２０は、例えばＰＣ（Personal Computer）により構成され、撮像素子１４より取得した生体サンプルＳＰＬの蛍光像（実撮影画像）を、例えばＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）等の任意形式のデジタル画像データとして保存する。
【００２６】
同図に示すようにデータ処理部２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、操作入力部２４、インターフェイス部２５、表示部２６及び記憶部２７を有し、これら各ブロックがバス２８を介して接続されている。
【００２７】
ＲＯＭ２２は、各種の処理を実行するためのファームウェア等の複数のプログラムやデータを固定的に記憶する。ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１の作業用領域として用いられ、ＯＳ（Operating System）、実行中の各種アプリケーション、処理中の各種データを一時的に保持する。
【００２８】
記憶部２７は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や、フラッシュメモリ、その他の固体メモリ等の不揮発性メモリである。当該記憶部２７には、ＯＳや各種アプリケーション、各種データが記憶される。特に本実施形態では、記憶部２７には、撮像素子１４から取り込まれた蛍光像（実撮影画像）データ、蛍光像（実撮影画像）データを画像処理する画像補正アプリケーション、後述する理論輝点画像の評価値テーブル２９、後述する補正撮影画像データも記憶される。
【００２９】
図１０は、理論輝点画像の評価値テーブル２９を示す図である。
図１０に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル２９には、ガンマ（γ）毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。ここで、理論輝点画像とは、撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる像である。輝度評価値の求め方については、後述する。
【００３０】
図３に戻って、インターフェイス部２５は、顕微鏡１０のステージ１１、光源１３及び撮像素子１４をそれぞれ駆動するコントロール基板（ステージ駆動部１５、光源駆動部１６、撮像制御部１７）とそれぞれ接続され、所定の通信規格により当該コントロール基板とデータ処理部２０との間で信号のやり取りを行う。
【００３１】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、当該展開されたプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。ＣＰＵ２１は、ＲＡＭ２３に展開されたプログラム（画像取得プログラム）に基づいて生体サンプル像取得処理を実行する。
【００３２】
操作入力部２４は、例えばマウス等のポインティングデバイス、キーボード、タッチパネル、その他の操作装置である。
【００３３】
表示部２６は、例えば液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro-Luminescence）ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイ等である。当該表示部２６は、データ処理部２０に内蔵されていてもよいし、データ処理部２０に外部接続されていてもよい。
【００３４】
［データ処理部２０の機能的な構成］
図４は画像取得装置１００の生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
図４に示すように、データ処理部２０は、記憶部２７と、画像取得部３２と、輝点検出部３３と、算出・評価部３７と、補正部３８と、データ記録部３４と、データ記憶部３５と、ステージ制御部３１と、光源制御部３６とを有する。
【００３５】
同図において、ステージ制御部３１（移動制御部）は、ステージ駆動部１５に指令を出して、生体サンプルＳＰＬの対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲に位置するようステージ１１を順次移動させて、例えば図５に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。
【００３６】
また、ステージ制御部３１は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、ステージ１１をｚ軸方向（対物レンズ１２Ａの光軸方向）に移動させてサンプル部位に対する焦点を厚み方向に移動させると同時に、ｘｙ平面（対物レンズ１２Ａの光軸方向と直交する平面）上で移動させるように制御を行う。ステージ制御部３１は、露光の間、ステージ１１を移動させる。
【００３７】
図６は、露光時のステージ１１移動による焦点位置変化による撮像素子１４に撮像される像の形状と位置の経時変化を示す図である。像の位置変化は軌跡４１として示す。
図６に示すように、ステージ制御部３１は、ステージ１１をｚ軸方向に図上、上から下へ等速で移動させ、これと同時にｘｙ平面を等速で円移動させる。露光開始から露光終了の間、特定の遺伝子に結合した蛍光マーカに対して対物レンズの焦点が合っていない状態から、焦点があった状態となり、再び焦点が合っていない状態へと変化していく。
詳細には、露光開始位置では、撮像素子１４には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像（Defocused image）４０が撮像される。
そして、露光時間が経過していくにつれ徐々に焦点があっていき、露光開始位置における像のｚ軸座標をｚstart、露光終了位置における像のｚ軸座標をｚendとし、露光時間をｔexとしたとき、像のｚ軸座標が（ｚend+ｚstart）／２、露光時間がｔex／２となるときに、焦点があった像（Focused image）４１が撮像素子１４に撮像される。
更に露光時間が経過すると再び焦点がぼやけた像となり、露光終了位置では、撮像素子１４には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像（Defocused image）４３が撮像される。
【００３８】
図４に戻って、データ記憶部３５は、撮像素子１４から取り込まれた蛍光画像データ、蛍光画像データを画像処理する画像補正アプリケーション、理論輝点画像の評価値テーブル２９を記憶する。理論輝点画像の評価値テーブル２９は、後述する算出・評価部３７で予め作成される。
【００３９】
図９は、理論輝点画像の評価値テーブル２９を示す。
図９に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル２９には、ガンマ（γ）毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。
【００４０】
図４に戻って、画像取得部３２（露光制御部）は、対象とすべきサンプル部位をステージ制御部３１が撮像範囲ＡＲに移動するごとに、ｚ軸方向及びｘｙ平面上のステージ１１の移動が開始された時点から終了する時点まで撮像素子１４を露光させるように撮像制御部１７に指令を送る。画像取得部３２は、ステージ１１におけるｚ軸方向及びｘｙ平面上の移動が終了する時点で、当該移動終了時点と移動開始時点との間の露光により得られるサンプル部位の像を撮像制御部１７を介して撮像素子１４から取得する。そして画像取得部３２は、各撮像範囲ＡＲに割り当てられるサンプル部位の像を、所定の連結アルゴリズムを用いて連結することによって全体の生体サンプル像（実撮影画像）を生成する。
【００４１】
輝点検出部３３は、画像取得部３２により生成された生体サンプル像（実撮影画像）から、蛍光を発する輝点を検出する。
【００４２】
ここで、生体サンプル像は、焦点位置を生体サンプルＳＰＬの厚さの方向に移動させつつ該生体サンプルＳＰＬの厚さ方向と直交する方向に移動させる間に、撮像素子１４を露光させることによって得られたものであることから、生体サンプル像において蛍光マーカはそれぞれ円形状や図７に示すような円弧状のぼけた輝点像として標識される。
【００４３】
算出・評価部３７は、理論輝点画像の評価値テーブル２９を作成し、データ記憶部３５に記憶させる。更に、算出・評価部３７は実撮影画像の輝度評価値を算出し、実撮影画像の輝度評価値と理論輝点画像の輝度評価値を比較、評価する。
【００４４】
まず、理論輝点画像の評価値テーブル２９の作成について説明する。
算出・評価部３７は、予め撮像素子１４を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求める。更に、算出・評価部３７は、計算によって求められた理論輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値Ｖ２を算出し、ガンマ値と輝度評価値とからなる理論輝点画像の評価値テーブル２９（図９参照）を作成する。
【００４５】
図８（ｂ）〜（ｉ）はそれぞれガンマ値を０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２、２．５として計算して求めた理論輝点画像を示す。各図において、画像上部に示される数値は後述する計算方法によって求めた輝度評価値である。図８（ｂ）〜（ｉ）に示すように、ガンマ値を変化させることにより、理論輝点画像の円弧形状が変化する。
【００４６】
図９は、図８（ｂ）〜（ｉ）の理論輝点画像におけるガンマ値と輝度評価値Ｖ２との関係をテーブル化した理論輝点画像の評価値テーブル２９を示す図である。図１０は、図９に示す理論輝点画像の評価値テーブル２９をグラフ化したものであり、横軸にガンマ値、縦軸に輝度評価値をとっている。図１０に示すように、ガンマ値と輝度評価値とはほぼ一次関数の関係となっている。
【００４７】
次に、実撮影画像の輝度評価値の求め方について説明する。
算出・評価部３７は、実撮影画像の１つ或いは複数の輝点画像のうちの一輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値Ｖ１を求める。図８（ａ）は実撮影画像の一輝点画像の形状の一例を示し、画像上部に示される数値は後述する計算方法によって求めた輝度評価値Ｖ１である。
【００４８】
実撮影画像の輝点画像の輝度評価値Ｖ１及び理論輝点画像の輝度評価値Ｖ２は例えば次のように求められる。
図７は実撮影画像の一輝点画像（理論輝点画像）の一例である。
図７に示すように、実撮影画像の輝点画像５０（理論輝点画像６０）は円弧状を有する。以下、実撮影画像の輝点画像５０は、単に輝点画像５０と称す。
【００４９】
輝点画像５０（理論輝点画像６０）のうち輝度が最大となる位置５４（６４）の輝度をＣ１（Ｃ２）とする。輝点画像５０（理論輝点画像６０）の中心５３（６３）を基点にして輝点画像５０（理論輝点画像６０）の輝度が最大となる位置５４（６４）から９０度回転した輝点画像５０（理論輝点画像６０）の中心５３（６３）を介して対向する輝点画像５０（理論輝点画像６０）上の２点５１（６１）、５２（６２）それぞれの輝度をＡ１（Ａ２）、Ｂ１（Ｂ２）とする。輝点画像５０（理論輝点画像６０）の輝度評価値Ｖ１（Ｖａｌｕｅ１）（Ｖ２（Ｖａｌｕｅ２））は、
式  Ｖ１＝（Ａ１＋Ｂ１）／２Ｃ１（Ｖ２＝（Ａ２＋Ｂ２）／２Ｃ２）
から求める。
【００５０】
次に、実撮影画像の輝度評価値Ｖ１と理論輝点画像の輝度評価値Ｖ２の比較、評価について説明する。
算出・評価部３７は、輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１と理論輝点画像６０の輝度評価値Ｖ２とを比較し、輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１と近似する理論輝点画像６０の輝度評価値Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
例えば、実撮影画像の輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１が０．３７６７であった場合、図８及び図９に示すように、この輝度評価値Ｖ１の値は、理論輝点画像６０のガンマ値が１．７５のときの輝度評価値Ｖ２である０．３４８６と、ガンマ値が２．０のときの輝度評価値場Ｖ２である０．３９７６との間にあり、算出・評価部３７は、撮影環境のガンマ値が２．０に近似すると判断し、更に１．７５〜２．０の間にあると判断する。
上述したように、ガンマ値と輝度評価値とは、ほぼ一次関数の関係にあるので、算出・評価部３７は、ガンマ値が１．７５のときの輝度評価値Ｖ２と、ガンマ値が２．０のときの輝度評価値Ｖ２とから、ガンマ値と輝度評価値との関係を表す
一次関数の式  ｙ＝０．１９６ｘ＋０．００５６（式中、ｘはガンマ値、ｙは輝度評価値）を求める。そして、この一次関数式と、実撮影画像の輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１である０．３７６７とから、撮影環境のガンマ値を約１．８９と算出する。
【００５１】
補正部３８は、算出・評価部３７により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、撮像素子から出力される電気信号を補正することによって、画像取得部３２によって取得されたサンプル部位毎の生体サンプル像をそれぞれサンプル部位毎に補正し、補正撮影画像を生成する。
【００５２】
データ記録部３４は、補正部３８により補正されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して１つの生体サンプル画像を生成し、ＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部３５に記憶させる。
【００５３】
光源制御部３６は、光源１３の照射のタイミングを制御し、光源駆動部１６に対して光源１３の照射の有無の指令を出す。
【００５４】
［生体サンプル像取得方法（画像取得方法）］
次に、上述の画像処理装置１００を用いた生体サンプル像取得方法について説明する。
まず、算出・評価部３７は、撮像素子１４を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像６０を求め、この理論輝点画像６０の輝度分布から上述した計算方法で輝度評価値Ｖ２を算出し、理論輝点画像の評価値テーブル２９（図９参照）を予め作成する。算出・評価部３７は、作成した理論輝点画像の評価値テーブル２９をデータ記憶部３５に記憶させる。
【００５５】
画像取得部３２は、ステージ上に載置される蛍光標識された生体サンプルＳＰＬに励起光を照射し、蛍光マーカから発光される発色光の像を撮像素子１４に露光させ、露光により得られるサンプル部位の実撮影画像を撮像制御部１７を介して撮像素子１４から取得する。露光中、ステージ制御部３１は、ステージ１１をｚ軸方向（対物レンズ１２Ａの光軸方向）に移動させ、これと同時にｘｙ平面上で移動させる。
【００５６】
次に、輝点検出部３３は、画像取得部３２により生成された生体サンプル像（実撮影画像）から、蛍光を発する輝点を検出する。算出・評価部３７は、検出した一輝点画像５０の輝度分布から上述した計算方法で輝度評価値Ｖ１を算出する。
【００５７】
次に、算出・評価部３７は、輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１と、データ記憶部３５に記憶されている理論輝点画像６０の輝度評価値Ｖ２とを比較し、輝点画像５０の輝度評価値Ｖ１と近似する理論輝点画像６０の輝度評価値Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに撮影環境のガンマ値を算出する。撮影環境のガンマ値の算出は上述のとおりである。
【００５８】
次に、補正部３８は、算出・評価部３７により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、画像取得部３２によって取得されたサンプル部位毎の生体サンプル像を補正し、補正撮影画像を生成する。
【００５９】
データ記録部３４は、補正部３８により補正されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して１つの生体サンプル画像を生成し、ＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部３５に記憶させる。
【００６０】
以上のように、本実施形態の構成によれば、１つの実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と、予め求めていたガンマ値が異なる複数の理論輝点画像の輝度評価値とを比較することにより、実撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
【００６１】
更に、本実施形態においては、実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と近似する輝度評価値を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値から、撮影環境のガンマ値を求め、この求めた撮影環境のガンマ値をもとに、光学系と撮像素子を用いて撮影された実撮影画像を補正する。この補正により得られる撮影画像は、撮影対象となる生体サンプルの蛍光標識された輝点の強度をより正確に再現したものとなっている。従って、補正された撮影画像は、リニアリティをもっているので、撮影画像の輝点像の輝度を定量化して評価することが可能となる。
【００６２】
また、上述の実施形態では、焦点位置を移動させるためにステージ１１を移動させることとしたが、光学系１２の対物レンズ１２Ａを移動させるようにしてもよい。
【００６３】
なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。
（１）蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
（２）前記（１）に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
（３）前記（２）に記載の画像取得装置であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ１とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から９０度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の２点それぞれの輝度をＡ１、Ｂ１として、前記撮影画像の評価値Ｖ１（Ｖａｌｕｅ１）をＶ１＝（Ａ１＋Ｂ１）／２Ｃ１から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ２とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から９０度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の２点それぞれの輝度をＡ２、Ｂ２として、前記理論輝点画像の評価値Ｖ２（Ｖａｌｕｅ２）を、ガンマを変数としてＶ２＝（Ａ２＋Ｂ２）／２Ｃ２から求め、
前記撮影画像の評価値Ｖ１と前記理論輝点画像の評価値Ｖ２を比較し、前記Ｖ１と近似する前記Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
（４）蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、
前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する
画像取得方法。
（５）前記（４）に記載の画像取得方法であって、
前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
（６）前記（５）に記載の画像取得方法であって、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ１とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から９０度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の２点それぞれの輝度をＡ１、Ｂ１として、前記撮影画像の評価値Ｖ１（Ｖａｌｕｅ１）を
式  Ｖ１＝（Ａ１＋Ｂ１）／２Ｃ１から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をＣ２とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から９０度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の２点それぞれの輝度をＡ２、Ｂ２として、前記理論輝点画像の評価値Ｖ２（Ｖａｌｕｅ２）を、ガンマを変数として
式  Ｖ２＝（Ａ２＋Ｂ２）／２Ｃ２
から求め、前記撮影画像の評価値Ｖ１と前記理論輝点画像の評価値Ｖ２を比較し、前記Ｖ１と近似する前記Ｖ２を求めたときの計算上のガンマ値をもとに、前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
（７）蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、
前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部と
を具備する画像取得装置。
【００６４】
本発明はこの実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において変更され得る。
【符号の説明】
【００６５】
ＳＰＬ…生体サンプル
１０…顕微鏡
１１…ステージ
１２…光学系
１２Ａ…対物レンズ
１３…光源
１４…撮像素子
３１…ステージ制御部
３２…画像取得部
３７…算出・評価部
３８…補正部
５０…実撮影画像の輝点像
６０…理論輝点画像
１００…画像取得装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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