(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＬＡ分解能を有する新規酵素及び新規微生物、それらを用いた効率的なＰＬＡ分解方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質。（ａ）ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来の特定のアミノ酸配列からなるポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド。（ｂ）ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来の特定のアミノ酸配列に対して１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド。（ｃ）ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来の特定のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の第３４〜４４番目のアミノ酸からなるペプチド、第６５〜７５番目のアミノ酸からなるペプチド及び第２１７〜２２７番目のアミノ酸からなるペプチドを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸。
【請求項４】
下記（１）〜（４）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する核酸；
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して１個〜数個の塩基が欠失、置換、付加、または挿入された塩基配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（４）（１）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列の第３４〜４４番目のアミノ酸からなるペプチド、第６５〜７５番目のアミノ酸からなるペプチド及び第２１７〜２２７番目のアミノ酸からなるペプチドをコードするヌクレオチドを含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属し、配列表の配列番号２で示される塩基配列の核酸を有する、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０５として寄託されている放線菌Ｂ１２−１株。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸を含有する組換えベクターを含む組換え微生物。
【請求項８】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０６として寄託されている、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
請求項６に記載の放線菌Ｂ１２−１株又は請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養し、得られる培養物からポリ乳酸分解酵素を回収する、ポリ乳酸分解酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１若しくは２に記載のタンパク質、請求項６に記載の放線菌Ｂ１２−１株及び請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換え微生物からなる群から選択される少なくとも１種とポリ乳酸を含む物質とを接触させる、ポリ乳酸の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のポリ乳酸分解酵素、前記酵素をコードする核酸、前記酵素を産生する新規微生物、及び、前記核酸が組み込まれた組換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）は、乳酸を化学合成によって重合させた物質である。ＰＬＡは融点やガラス転移点が高いため耐熱性に優れる。さらに透明度が高く従来のプラスチックと同等の物理的性質を備えているため、日用品から農業用品、医療機器や自動車部品などさまざまな分野で利用することが可能である。
【０００３】
ＰＬＡは生分解性プラスチックであり、現在までに、ＰＬＡを分解する酵素や該酵素を産生する微生物についての研究がおこなわれてきた。例えば、特許文献１〜５は、ＰＬＡ分解能を有する酵素や微生物を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３７６２９９０号公報
【特許文献２】特許第４４４１６３９号公報
【特許文献３】特開２００７−３１９０７７号公報
【特許文献４】特開２００７−３１９０７８号公報
【特許文献５】特開２００８−１６７７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＬＡ分解能は酵素や微生物の種類によって異なり、ＰＬＡの利用拡大のためには、より高いＰＬＡ分解能を有する酵素や微生物が必要である。したがって、本発明は、ＰＬＡ分解能を有する新規酵素及び新規微生物を提供し、さらに、それらを用いた効率的なＰＬＡ分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるポリペプチドを含有するタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチド、を提供する。
本発明のタンパク質は、新規ＰＬＡ分解酵素である。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、高いＰＬＡ分解活性を有する。
【０００７】
上記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列の第３４〜４４番目のアミノ酸からなるペプチド、第６５〜７５番目のアミノ酸からなるペプチド及び第２１７〜２２７番目のアミノ酸からなるペプチドを含むことが好ましい。これらのペプチドは、ＰＬＡ分解酵素の活性中心を含む。
【０００８】
また、本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を提供する。
さらに、本発明は、下記（１）〜（４）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する核酸；
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して１個〜数個の塩基が欠失、置換、付加、または挿入された塩基配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（４）（１）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ポリ乳酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を提供する。
配列番号２に記載の塩基配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列である。すなわち、本発明の核酸は、ＰＬＡ分解酵素をコードする。したがって、上記核酸を微生物に組み込んで、本発明のＰＬＡ分解酵素を微生物に産生させることができる。
【０００９】
上記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列の第３４〜４４番目のアミノ酸からなるペプチド、第６５〜７５番目のアミノ酸からなるペプチド及び第２１７〜２２７番目のアミノ酸からなるペプチドを含むヌクレオチドを含むことが好ましい。上記ヌクレオチドは酵素の活性中心を含むペプチドをコードする。
【００１０】
また、本発明は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属し、配列表の配列番号２で示される塩基配列の核酸を有する、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０５として寄託されている放線菌Ｂ１２−１株を提供する。この放線菌Ｂ１２−１株は、本発明のＰＬＡ分解酵素を産生する微生物である。
【００１１】
また、本発明は、上記核酸を含有する組換えベクターを含む組換え微生物を提供する。組換え微生物により、本発明のＰＬＡ分解酵素が産生される。上記組換え微生物は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することが好ましく、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０６として寄託されている微生物であることがさらに好ましい。この組換え微生物は、極めて高いＰＬＡ分解活性を有する。
【００１２】
また、本発明は、放線菌Ｂ１２−１株又は上記組換え微生物を培養し、得られる培養物からＰＬＡ分解酵素を回収する、ＰＬＡ分解酵素の製造方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、上記本発明のタンパク質、放線菌Ｂ１２−１株及び上記組換え微生物からなる群から選択される少なくとも１種とＰＬＡを含む物質とを接触させる、ＰＬＡの分解方法を提供する。本発明の分解方法は、ＰＬＡ分解活性の高い酵素や微生物を用いているため、効率的にＰＬＡが分解される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＰＬＡ分解能を有する新規酵素及び新規微生物、さらに、それらを用いた効率的なＰＬＡ分解方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ｂ１２−１株を寒天培地に３７℃、５日間培養した際にＢ１２−１株が形成したクリアゾーンを示す図である。
【図２】図２は、組換えプラスミドｐＧ１２を用いて作製した制限酵素地図を表す図である。
【図３】図３は、Ｂ１２−１株の分解活性と組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１の分解活性とを比較した図である。
【図４】図４は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１を寒天培地に３０℃、５日間培養した際にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１が形成したクリアゾーンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（タンパク質）
本発明が提供するタンパク質は、新規ＰＬＡ分解酵素（以下、場合により単に「ＰＬＡ分解酵素」と称する。）である。本発明のタンパク質は、ＰＬＡを分解することが知られている既知の酵素よりも高いＰＬＡ分解活性を有する。したがって、本発明のタンパク質を用いることで、従来よりも早く、またはより多くのＰＬＡを分解することができる。本発明のタンパク質は、（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する。（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（全長２７６アミノ酸残基）は、それ自身がＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドである。
【００１７】
本発明が提供するタンパク質が含有するポリペプチドは、（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドであってもよい。「１個または数個」とは１個から３０個、好ましくは１個から１０個、より好ましくは１個から５個、さらに好ましくは１個から３個である。さらに、本発明が提供するタンパク質が含有するポリペプチドは、（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドであってもよい。該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。
【００１８】
本明細書における「ＰＬＡ分解活性」は、例えば、実施例２に記載の酵素活性測定法により測定することができる。また、本明細書において「ＰＬＡ分解活性を有する」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上のＰＬＡ分解活性を有することと定義することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列から、セリンプロテアーゼの一種であると推定され、ＰＬＡ分解活性の活性中心は、アスパラギン酸（配列番号１の第３９番目）、ヒスチジン（配列番号１の第７０番目）及びセリン（配列番号１の第２２２番目）であると推定される。したがって、本発明のタンパク質はこの活性中心を含むことが好ましい。具体的には、本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列の第３４〜４４番目のアミノ酸からなるペプチド、第６５〜７５番目のアミノ酸からなるペプチド及び第２１７〜２２７番目のアミノ酸からなるペプチドを含むことが好ましい。
【００２０】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、シグナルペプチド（配列番号３の第１〜３５番目、３５アミノ酸残基）、及びプロペプチド（配列番号３の第３６〜１３０番目、９５アミノ酸残基）が付加されたポリペプチド（全長４０６アミノ酸残基）である。配列番号１に記載のポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＰｒｅ−Ｐｒｏ−Ｅｎｚｙｍｅとして生産され、シグナルペプチドにより細胞外に輸送された後、プロペプチドが切断され、活性化酵素として働くことができる。
【００２１】
本発明のタンパク質は、（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドに、別種のタンパク質または物質が結合されたものでもよい。例えば、上記ポリペプチドの検出または精製を容易にするために、あるいは別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別種のタンパク質またはペプチド、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、Ｈｉｓ−ｔａｇ等が、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加されたものであってもよい。
【００２２】
（核酸）
本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、すなわちＰＬＡ分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を提供する。具体的には、（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する核酸が挙げられる。（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（全長８３１残基）は、（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明が提供する核酸が含有するポリヌクレオチドは、（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して１個〜数個の塩基が欠失、置換、付加、または挿入された塩基配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。「１個または数個」とは１個から３０個、好ましくは１個から１０個、より好ましくは１個から５個、さらに好ましくは１個から３個である。また、本発明が提供する核酸が含有するポリヌクレオチドは、（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。該ポリヌクレオチドの塩基配列と配列番号２に記載の塩基配列との同一性は、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。さらに、本発明が提供する核酸が含有するポリヌクレオチドは、（４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の同一性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２６】
（ミクロモノスポラ属に属する新規微生物Ｂ１２−１株）
本発明のタンパク質が含有する（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に属する新規微生物Ｂ１２−１株（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０５、２０１１年６月１３日付受領にて寄託、以下、場合により「Ｂ１２−１株」と称する。）から単離精製することができる。Ｂ１２−１株は、ＰＬＡ分解能を有する新菌種である。Ｂ１２−１株は、ＰＬＡを分解可能な微生物として土壌から分離されたグラム陽性を示す放線菌であり、胞子を形成する。Ｂ１２−１株は、ＰＬＡの分解について優れた能力を有する。
【００２７】
Ｂ１２−１株は、微生物の培養に用いられる通常の条件下で培養して、維持・増殖させることができる。例えば、ｐＨ６．０〜８．０、温度２０〜５０℃の培養条件で培養することができる。生育速度の点から、ｐＨ６．８〜７．３、温度３７〜４０℃で培養することが好ましい。
【００２８】
Ｂ１２−１株を維持可能な培地として、微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含む各種の培地を使用できる。例えばグルコース、フラクトース、マンノース、シュクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの炭素源；例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、ペプトン、酵母抽出物などの窒素源；例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガンなどの無機塩類；を、それぞれ含むものであって、通常利用される固体又は液体培地であればいずれも好ましく使用できる。なお、培地には、上記成分の他、微生物の成育を促進させるための各種ビタミン、ミネラル、その他の栄養成分を含ませてもよい。
【００２９】
（ＰＬＡ分解酵素の製造方法）
本発明のＰＬＡ分解酵素は、Ｂ１２−１株を培養し、得られる培養物からＰＬＡ分解酵素を回収することによって得ることができる。
【００３０】
ＰＬＡ分解酵素を得るための、Ｂ１２−１株の培養に適した培地としては、具体的には、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、酵母エキス、オリーブ油等を含む液体培地を用いることができる。培地中の成分の濃度は限定されるものではなく、炭素源や窒素源などの種類や濃度によって適宜調整できる。
【００３１】
ＰＬＡ分解酵素は、Ｂ１２−１株の菌体、菌体破砕物及び菌体の培養上清などの各形態から得ることができる。菌体の場合、その培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる生菌体、菌体を凍結乾燥した乾燥粉末、菌体を含む培養液のいずれであってもよい。破砕物としては、物理的手段又は化学的手段によって破砕されたものであればよく、物理的手段としては、超音波粉砕機、グラスビーズを用いた細胞破砕機などを挙げることができ、化学的手段としては、リゾチームなどの溶菌酵素を挙げることができる。物理的手段又は化学的手段を用いて菌体を破砕する場合には、それぞれ酵素が失活しない穏和な条件下で行うことが好ましい。培養上清としては、前述した液体培地中でＢ１２−１株を培養したものであればよく、酵素産生量から、好ましくは培養２〜６日目、より好ましくは培養３〜４日目の培養上清を使用することができる。
【００３２】
ＰＬＡ分解酵素の回収法は、一般の酵素の回収の手段に準じて行うことができる。以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば上記手段によって得られた菌体破砕物、あるいは培養上清を、粗酵素液として用いることができる。粗酵素液は、そのままで使用することもできるが、必要に応じて、例えば塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製することができる。
【００３３】
ＰＬＡ分解酵素を得るための別の方法としては、ＰＬＡ分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含む組換え微生物を培養し、得られる培養物からＰＬＡ分解酵素を回収する方法が挙げられる。
【００３４】
（組換え微生物）
本発明の組換え微生物は、ＰＬＡ分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する組換えベクターを含む。このような組換え微生物は、ＰＬＡ分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸をＢ１２−１株より取得し、次いでこの核酸を適当なベクターに組込んで組換えベクターを作製し、この組換えベクターを用いて宿主を形質転換することにより作製することができる。
【００３５】
本発明の組換え微生物を作製するために用いるベクターは、宿主の種類により適宜選択される。ベクターとして、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから構築されたベクターが適している。ファージベクターとしては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主微生物とする場合にはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、酵母を宿主とする場合にはＹｒｐ７、ｐＹＣ１、Ｙｅｐ１３などが使用でき、これらを組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等とを構成要素とし、これらを公知の方法により組み合わせて作製される。ベクターに核酸を組み込む方法は、公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理して核酸を特定部位で切断し、次いで同様に特定部位で切断したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的の核酸に適当なリンカーを結合し、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００３７】
（宿主）
本発明の組換え微生物を作製するための宿主として、原核微生物又は真核微生物を用いることができる。原核微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の菌を挙げることが出来、この中でもストレプトマイセス属が好ましい。具体的には、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）を挙げることができる。真核微生物の好適例としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属及びピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属等の酵母、並びに、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等の真菌を挙げることができる。
【００３８】
（形質転換法）
核酸が組み込まれた組換えベクターを、宿主細胞に公知の方法で導入することにより組換え微生物が得られる。組換えベクターの宿主細胞への導入は、公知の方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入及び感染等が挙げられる。
【００３９】
（組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１）
上述のようにして、本発明の核酸を含有する組換えベクターを含む組換え微生物が得られる。本発明は、実施例５に記載の方法により得られた組換え微生物として、ストレプトマイセス・リビダンスを宿主とし、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する組換えベクターを含む組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０６、２０１１年６月１３日付受領にて寄託）を提供する。組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１は、ＰＬＡの分解について優れた能力を有する。
【００４０】
組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１は、微生物の培養に用いられる通常の条件下で培養して、維持・増殖させることができる。例えば、ｐＨ６．０〜８．０、温度２０〜３７℃の培養条件で培養することができ、生育速度の観点から、ｐＨ６．８〜７．３、温度３０〜３５℃で培養することが好ましい。
【００４１】
組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１を維持可能な培地として、微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含む各種の培地を使用できる。例えばグルコース、フラクトース、マンノース、シュクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの炭素源；例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの窒素源；例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガンなどの無機塩類；を、それぞれ含むものであって、通常利用される固体又は液体培地であればいずれも好ましく使用できる。なお、培地には、上記成分の他、微生物の成育を促進させるための各種ビタミン、ミネラル、その他の栄養成分を含ませてもよい。
【００４２】
（組換え微生物によるＰＬＡ分解酵素の製造方法）
本発明の核酸を含有する組換えベクターを含む組換え微生物によっても、ＰＬＡ分解酵素を得ることができる。本発明のＰＬＡ分解酵素は、該組換え微生物を培養し、得られる培養物からＰＬＡ分解酵素を回収することによって得ることができる。ＰＬＡ分解酵素の産生のための培地は特に限定されないが、例えば、組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１を培養する場合、ＰＬＡ分解酵素の産生に適した培地として、具体的には、ポリペプトン、ソイペプトン、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、グルコース等を含む液体培地を用いることができる。ＰＬＡ分解酵素は、組換え微生物の菌体、菌体破砕物及び培養上清などの各形態から得ることができ、それぞれＢ１２−１株を用いた場合と同様の方法により調製できる。培養上清としては、酵素産生量から、好ましくは培養１〜３日目、より好ましくは２日目の培養上清を使用することができる。酵素の回収方法は、Ｂ１２−１株を用いた場合と同様の方法を採用することができる。
【００４３】
（ＰＬＡの分解方法）
本発明の、ＰＬＡ分解酵素、Ｂ１２−１株及び組換え微生物からなる群から選択される少なくとも１種とＰＬＡを含む物質とを接触させることにより、ＰＬＡを分解することができる。本発明のＰＬＡ分解酵素は高いＰＬＡ分解活性を有するので、物質中に含まれるＰＬＡを少ない時間で大量に分解することができ、効率的である。
【００４４】
（ＰＬＡ）
本発明の方法により分解されるＰＬＡとしては、乳酸を主成分とする重合体であればよく、ポリＬ−乳酸及びポリＤ−乳酸のようなホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸、これらと他の成分から構成される共重合体を挙げることができる。共重合体である場合には、乳酸成分は重量比率が１０％以上のものであることが好ましい。また共重合体を構成する他の成分としては、ε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等を挙げることができる。これらの他の成分は１種であっても、２種以上であってもよい。本発明によって分解可能なＰＬＡの分子量に特に制限はないが、分解速度の点から、数平均分子量５０００〜５０００００であることが好ましく、１００００〜２０００００であることがより好ましい。また、ＰＬＡを含む物質の形態としては、例えば、フィルム（シート）、成型体、破砕物、粉末、懸濁液などを挙げることができる。また、分解時のＰＬＡは、ＰＬＡ単独であってもよいし、他のプラスチックとの混合物であってもよい。
【００４５】
分解に用いるＰＬＡ分解酵素、Ｂ１２−１株及び組換え微生物は、乾燥形態又は適当な液体担体に混合された液体形態であってもよい。液体形態を構成するために用いられる液体担体としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限されず、水、緩衝液等を挙げることができる。
【００４６】
ＰＬＡ分解酵素をＰＬＡの分解に用いる場合、ＰＬＡ分解酵素として、上述の方法により精製した酵素又は粗酵素を用いることができる。ＰＬＡを含む物質と、ＰＬＡ分解酵素とを接触させる接触方法としては、特に限定されないが、ＰＬＡ分解酵素を含む酵素液にＰＬＡを含む物質を投入する、ＰＬＡを含む物質が入った容器にＰＬＡ分解酵素を添加する、等の方法が挙げられる。分解時のｐＨは、分解速度の点から、ｐＨ６．０〜１２．０とすることが好ましく、ｐＨ９．０〜１０．０とすることがより好ましい。分解時の温度は、分解速度の点から、３０℃〜６０℃とすることが好ましく、４５〜５５℃とすることがより好ましい。分解時間は、処理効率の点から、１日間〜５日間とすることが好ましく、２日間〜３日間とすることがより好ましい。使用するＰＬＡ分解酵素の量は、基質となるＰＬＡの種類及びＰＬＡを含む物質の形態によって異なるが、例えば、分子量４×１０４のＰＬＡを含む乳化液中のＰＬＡを分解する場合、乳化液中に含まれるＰＬＡ１ｇに対して、０．０１〜０．２ｇのＰＬＡ分解酵素を使用することが好ましく、０．０５〜０．１ｇを使用することがより好ましい。
【００４７】
Ｂ１２−１株又は組換え微生物をＰＬＡの分解に用いる場合、種々の形態で使用することができる。このような形態としては、微生物菌体、菌体破砕物及び微生物の培養上清などの各形態から適宜選択することができる。菌体の場合には、その培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる生菌体、菌体を凍結乾燥した乾燥粉末、微生物を含む培養液のいずれであってもよい。破砕物としては、物理的手段又は化学的手段によって破砕されたものであればよく、物理的手段としては、超音波粉砕機、グラスビーズを用いた細胞破砕機などを挙げることができ、化学的手段としては、リゾチームなどの溶菌酵素を挙げることができる。物理的手段又は化学的手段を用いて菌体を破砕する場合には、それぞれ破砕物が分解活性を損なわない穏和な条件下で行うことが好ましい。培養上清としては、前述した液体培地中で微生物を培養したものであればよく、培養上清における分解活性の強さから、Ｂ１２−１株では好ましくは培養２〜６日目、より好ましくは３〜４日目の培養上清を使用することができ、組み換え微生物では好ましくは１〜３日目、より好ましくは２日目の培養上清を使用することができる。
【００４８】
ＰＬＡを含む物質と、Ｂ１２−１株又は組換え微生物とを接触させる接触方法としては、特に限定されないが、例えば、培養槽に、基本培地及び分解対象のＰＬＡを添加し、さらに、種々の形態のＢ１２−１株もしくは組換え微生物を添加することによって接触させることができる。分解時のｐＨは、分解速度の点から、ｐＨ６．０〜９．０とすることが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０とすることがより好ましい。分解時の温度は、Ｂ１２−１株では、分解速度の点から２５〜５０℃とすることが好ましく、３０〜４０℃とすることがより好ましい。また、組み換え微生物では、分解速度の点から２０〜４０℃とすることが好ましく、２５〜３５℃とすることがより好ましい。分解時間は、Ｂ１２−１株では処理効率の点から２〜６日間とすることが好ましく、３〜４日間とすることがより好ましい。また組み換え微生物では処理効率の点から、１〜３日間とすることが好ましく、１〜２日間とすることがより好ましい。使用するＢ１２−１株又は組換え微生物の量は、対象となるＰＬＡの種類及びＰＬＡを含む物質の形態によって異なるが、例えば、分子量４×１０４のＰＬＡを含む乳化液中のＰＬＡを分解する場合、乳化液中に含まれるＰＬＡ１ｇに対して、１．０×１０８〜２．０×１０９ｃｆｕの菌体を用いることが好ましく、５．０×１０８〜１．０×１０９ｃｆｕの菌体を用いることがより好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下、例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜実施例１．ミクロモノスポラ属のＢ１２−１株によるＰＬＡの分解＞
（菌株の培養とクリアゾーンの測定）
菌株としてミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属のＢ１２−１株（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０５）を用いた。試験管に分注したＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（５ｍＬ）に一白金耳量の菌体を植菌後、振とう培養（４０℃、１２０ｒｐｍ）し、これを前培養液とした。本培養として、ＢＭ培地に前培養液を１％植菌し、振とう培養（４０℃、１２０ｒｐｍ）した。続いて固体培養をおこなった。固体培養にはＰＬＡ基本培地またはＴＳＢ培地にアガロース（ＢＯＬ：清水食品）を１．５％添加した寒天培地を用いた。滅菌したつまようじでスラントから菌体を取りＰＬＡ基本培地の寒天培地に３点植菌した。３７℃で５日間培養し、培養終了時にクリアゾーンの直径を測定した。その結果、Ｂ１２−１株は直径１９ｍｍのクリアゾーンを形成した（図１）。
【００５１】
（培地の組成）
各培地の組成を以下に示す。
【表１】
2013000099.tif 000003
【表２】
2013000099.tif 000004
【表３】
2013000099.tif 000005
なお、乳化ＰＬＡ（０．２％）は以下の方法で調製した。０．４ｇのポリ乳酸樹脂（Ｖｙｌｏｅｃｏｌ  ＢＥ−４００、東洋紡）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を２００ｍＬ加え、超音波処理（Ｕｌｔｒｔａｓｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＵＳ−３００Ｔ：日本精機製作所、チップサイズ２６、４００Ｗ、５分間×３回）し、乳化した。
【００５２】
＜実施例２．ＰＬＡ分解酵素の精製＞
（酵素活性測定法）
本発明において、酵素活性を以下の方法により測定した。０．４ｇのポリ乳酸樹脂（Ｖｙｌｏｅｃｏｌ  ＢＥ−４００、東洋紡）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。これにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）を２００ｍＬ加え、超音波処理（Ｕｌｔｒｔａｓｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＵＳ−３００Ｔ：日本精機製作所、チップサイズ２６、４００Ｗ、５分間×３回）して乳化し、この乳化ＰＬＡ（０．２％）を基質とした。乳化ＰＬＡ６５０μＬに酵素液５０μＬを添加し反応させた（５０℃、１０分間）。反応後、３分間煮沸し反応を停止させた。反応液の濁度（６３０ｎｍ）の減少量からＰＬＡ分解活性を求めた。なお、本明細書では、ＰＬＡ分解活性１Ｕを、１分間に６３０ｎｍにおける乳化ＰＬＡの濁度を１．０減少させる酵素量と定義した。
【００５３】
（菌体の培養）
以下のように、前培養にはＴＳＢ培地を用い、本培養にはＢＭＢ１２培地を用いた。試験管にＴＳＢ培地５ｍＬを分注し、コロニーを一白金耳量植菌後、振とう培養し（３７℃、１８０ｒｐｍ、３日間）、これを前々培養液とした。５００ｍＬ容三角フラスコにＴＳＢ培地１００ｍＬを分注し、前々培養液を１％植菌後、振とう培養し（３７℃、１８０ｒｐｍ、２日間）、これを前培養液とした。５００ｍＬ容三角フラスコにＢＭＢ１２培地を２００ｍＬ分注し、前培養液を１％植菌後、振とう培養し（３７℃、１８０ｒｐｍ、４日間）、これを培養液とした。培養液を遠心分離（５００ｍＬボトル、５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間、ｈｉｍａｃ  ＳＣＲ−２０Ｂ：ＨＩＴＡＣＨＩ）し、上清を回収した。
【００５４】
培地の組成を以下に示す。
【表４】
2013000099.tif 000006
【００５５】
（酵素精製）
酵素精製は特に断らない限り低温室（７℃）で行った。
（１）硫安沈殿
培養液上清を限外濾過膜（ｍｉｃｒｏｚａ  ＳＬＰ−００５３：旭化成）で２〜３倍に濃縮後、その濃縮液を硫安沈殿に用いた。培養液上清に粉末状にした硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう徐々に添加した。その後、１時間以上氷冷した。氷冷後、遠心分離（５００ｍｌボトル、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分、ｈｉｍａｃ  ＣＲ２２ＧＩＩ：ＨＩＴＡＣＨＩ）し、沈殿をリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解した。同緩衝液で一晩透析し、活性画分を得た。活性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【００５６】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
緩衝液はリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）を用いた。充填剤としてＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社）を用い、カラムに充填した。カラム（カラム容量：４００ｍＬ）を５倍量の緩衝液で予め平衡化した。カラムにサンプルを通液しＰＬＡ分解酵素を吸着後、カラム容量の３倍量の同緩衝液で洗浄した。ＰＬＡ分解酵素をＮａＣｌの濃度勾配（０〜０．５Ｍ）で溶出させた。活性画分を同緩衝液で透析後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社）を充填したカラム容量１００ｍＬのカラムに換え、ＮａＣｌの濃度勾配を０〜０．３Ｍとし、再度陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、活性画分を得た。
【００５７】
（３）疎水クロマトグラフィー
緩衝液はリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）を用いた。充填剤としてＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ（東ソー株式会社）を用い、カラム（カラム容量：３０ｍＬ）に充填した。カラムを、硫酸アンモニウム（３０％飽和）を含むリン酸カリウム緩衝液で予め平衡化した。陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和となるように添加し、１時間氷冷後、遠心分離（５００ｍＬボトル、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分）した。これをカラムに通液し、ＰＬＡ分解酵素を吸着させた。カラムを、硫酸アンモニウム（３０％飽和）を含むリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＬＡ分解酵素を硫酸アンモニウムの濃度勾配（３０〜０％飽和）を用いて溶出させ、活性画分を得た。
【００５８】
（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
疎水クロマトグラフィーで得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、単一なバンドを示したため、これを精製酵素とした。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＰＬＡ分解酵素の分子量は３１ｋＤａと推定した。
【００５９】
＜実施例３．ＰＬＡ分解酵素の性質＞
（基質特異性）
ＰＬＡ分解酵素の生分解性プラスチックに対する基質特異性を調べた。生分解性プラスチックの基質には、ＰＬＡ（「Ｖｙｌｏｅｃｏｌ  ＢＥ−４００」東洋紡、分子量４×１０４）、ＰＬＡ（「ＬＡＣＥＡ  ＃４００」三井化学、分子量１．５×１０５）、ＰＬＡ（「Ｌａｃｔｙ」島津、分子量２．２×１０５）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ、「ＣＥＬＧＲＥＥＮ」ダイセル化学工業株式会社）、ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ「ビオノーレ３００１」昭和高分子株式会社）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ「ビオノーレ１００１」昭和高分子株式会社）を用いた。基質特異性はＰＬＡ（Ｖｙｌｏｅｃｏｌ  ＢＥ−４００）に対する分解活性を１００とし、相対活性で示した。結果を表５に示す。表５に示す通り、本発明のＰＬＡ分解酵素は、ＰＬＡを分解したが、ＰＣＬ、ＰＢＳＡにはほとんど作用せず、ＰＢＳには全く作用しなかった。ＰＬＡでは分子量の小さい方がよく分解された。
【００６０】
【表５】
2013000099.tif 000007
【００６１】
（至適温度および熱安定性）
ＰＬＡ分解酵素の作用至適温度を以下のようにして求めた。酵素活性測定法における反応温度を３０〜９０℃まで１０℃ずつ変化させて酵素反応を行い、各温度における活性を測定した。その結果、ＰＬＡ分解酵素は７０℃で最も活性が高く、７０℃を至適温度とした。また、ＰＬＡ分解酵素の熱安定性を調べるために、酵素溶液を所定の温度で３０分間加熱処理した後、直ちに冷却し、残存活性を上述した酵素活性測定法に従って測定した。その結果、本発明のＰＬＡ分解酵素は、７０℃の活性を１００％として、５０℃、３０分間保温後も１００％の活性を維持し、６０℃、３０分間保温後でも約５０％の残存活性を有していた。
【００６２】
（至適ｐＨおよびｐＨ安定性）
ＰＬＡ分解酵素の作用至適ｐＨを以下のようにして求めた。酵素活性測定における反応液中の緩衝液として、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）、ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液（１１．０〜１２．０）を用いて反応を行い、活性を測定した。その結果、ＰＬＡ分解酵素はｐＨ９．０で最も活性が高く、ｐＨ９．０を至適ｐＨとした。また、ＰＬＡ分解酵素のｐＨ安定性を調べるために、酵素溶液をｐＨの異なる緩衝液で透析し、４℃で２０時間放置後、残存活性を酵素活性測定法に従って測定した。その結果、ｐＨ７．５の緩衝液を用いた場合の活性を１００％として、本発明のＰＬＡ分解酵素はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の範囲では９０％以上の残存活性を示した。また、ｐＨ１０．０〜ｐＨ１２．０の範囲では約８０％の残存活性を示した。
【００６３】
＜実施例４．ＰＬＡ分解酵素遺伝子のクローニング＞
（ＰＬＡ分解酵素のＮ末端および内部アミノ酸配列の決定）
ＰＬＡ分解酵素のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−２１Ａ、島津製作所）を用いて分析した。Ｎ末端アミノ酸配列の分析には実施例２で得られた精製酵素をサンプルとした。その結果、Ｎ末端配列として、ＧＴＱＴＧＡＴＷＧＬＤＲＩＤＱＲＮＬＰＬ（配列番号１の第１〜２０番目）の配列を有していた。内部アミノ酸配列の分析には精製酵素を臭化シアンで断片化したものをサンプルとした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ３種類の酵素断片（Ｃ１：１４ｋＤａ、Ｃ２：１１ｋＤａ、Ｃ３：０．６ｋＤａ）が確認できた。このうちＣ１、Ｃ２断片をＰＶＤＦ膜に転写し、アミノ酸配列の決定に用いた。その結果、Ｃ１断片のアミノ酸配列は、Ｎ末端アミノ酸配列と等しかった。Ｃ２断片は、ＳＬＧＧＧＡＳＴＴＬＤＮＡＶＡＮＳＩＡＳ（配列番号１の第１２８〜１４７番目）の配列を有していた。
【００６４】
（ＰＬＡ分解酵素遺伝子の部分増幅）
ハイブリダイゼーションのプローブに用いるＰＬＡ分解酵素遺伝子断片を取得するために、ＰＬＡ分解酵素遺伝子の部分増幅を、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、ＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  ＴＰ６００：Ｔａｋａｒａ）で行った。ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｈｏｔ  ｓｔａｒ  Ｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。まず、ＰＬＡ分解酵素のＮ末端およびＣ２断片の内部アミノ酸配列を基に、縮重プライマーを設計した。設計した縮重プライマーを以下に示す。
５’−ＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＣＴＧ−３’（Ｆ−ａｕｒ４２７、配列番号５）
５’−ＧＴＴＳＧＣＳＡＣＳＧＣＧＴＴＧＴＣ−３’（ＳはＧ又はＣ）（Ｒ−ＤＮＡＶＡＮ、配列番号６）
設計した縮重プライマーを用い、Ｂ１２−１株の総ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約３９０ｂｐの増幅断片を得た。この増幅断片をシークエンスしたところ、内部アミノ酸配列（ＳＬＧＧＧＡＳＴＴＬ）（配列番号１の第１２８〜１３７番目）をコードする塩基配列が認められたため、この増幅断片をハイブリダイゼーションに用いるプローブとした。
【００６５】
（サザンハイブリダイゼーション）
サザンハイブリダイゼーションと、後述するコロニーハイブリダイゼーションを、非放射性システムであるＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ロシュダイアグノスティック社）を用いて行った。上記で得られた増幅断片をラベル化プローブ調製の鋳型とした。鋳型ＤＮＡ（１μｇ）に滅菌蒸留水を加えて１６μＬにした。沸騰水中で１０分間インキュベートして鋳型ＤＮＡを熱変性させた後、氷水で急速に冷却した。その後、ＤＩＧ−ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅを４μＬ加え、３７℃で２０時間反応させた。反応後、２μＬのＥＤＴＡ（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、反応を停止させた。これをラベル化プローブとした。一方、Ｂ１２−１株の総ＤＮＡを制限酵素であるＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断した（３７℃、３時間）。切断後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＳｐｈＩ断片の中で約９ｋｂｐのＤＮＡ断片がプローブとハイブリダイズした。そこで、この約９ｋｂｐのＳｐｈＩ断片をｐＵＣ１９に連結し、コロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００６６】
（コロニーハイブリダイゼーション）
ＳｐｈＩ断片（９ｋｂｐ）をｐＵＣ１９に連結した組換えプラスミドを大腸菌に形質転換した。コロニー５００個に対しコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、陽性クローンが１個得られた。陽性クローンから得た組換えプラスミドのＳｐｈＩ断片に対しサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、プローブがハイブリダイズした。よってこの９ｋｂｐのＳｐｈＩ断片にＰＬＡ分解酵素遺伝子が含まれると考えられた。このＳｐｈＩ断片（９ｋｂｐ）を含む組換えプラスミドをｐＧ１２として以降の実験に用いた。
【００６７】
（ＰＬＡ分解酵素遺伝子の位置の推定）
組換えプラスミドｐＧ１２を各種の制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーションを行った。この結果より、９ｋｂｐのＳｐｈＩ断片中にＥｃｏＲＩ認識部位が１ヶ所、ＢａｍＨＩ認識部位が２ヶ所、ＢｇｌＩＩ認識部位が２ヶ所存在することが確認できた。次にＳｐｈＩ断片（９ｋｂｐ）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩを組み合わせて切断し、断片長をアガロースゲル電気泳動から推定した。これらの断片に対しサザンハイブリダイゼーションを行い、制限酵素地図を作製し、遺伝子の位置を推定した（図２）。
【００６８】
（ＰＬＡ分解酵素遺伝子の塩基配列決定）
制限酵素地図から、ＰＬＡ分解酵素遺伝子を含むと推定されるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（２．２ｋｂｐ）をｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、シークエンスを行った。シークエンスはベックス社に依頼した。シークエンス試薬は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ．１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）を用い、シーケンサーは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）を使用した。決定した塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ．８．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）で解析した。シークエンスの結果、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＧＡ）および開始コドンの上流にＳＤ配列と推定される配列（ＡＧＧＧＡＧ）が認められた。配列は、配列番号４に示す１２２１ｂｐからなり、配列番号３に示す４０６アミノ酸をコードしていた。シグナルペプチドをＳｉｇｎａｌ  ｉＰ  ３．０を用いて推定した。また、シグナルペプチドの次のアミノ酸から、プロテインシーケンサーで明らかにしたＰＬＡ分解酵素のＮ末端アミノ酸の１つ前のアミノ酸までの配列をプロペプチドの配列とした。活性化酵素になる前の未成熟酵素は、シグナルペプチド（配列番号３の第１〜３５番目、３５アミノ酸残基）、プロペプチド（配列番号３の第３６〜１３０番目、９５アミノ酸残基）、成熟酵素（配列番号３の第１３１〜４０６番目、すなわち、配列番号１、２７６アミノ酸残基）から構成されると推定された。ＰＬＡ分解酵素は、プロテアーゼで良く知られるＰｒｅ−Ｐｒｏ−Ｅｎｚｙｍｅとして生産され、シグナルペプチドにより細胞外に輸送された後、プロペプチドが切断され、活性化酵素として働くと推定された。
【００６９】
本発明のＰＬＡ分解酵素のアミノ酸配列と類似性の高い酵素を検索したところ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕ  由来Ａｑｕａｌｙｓｉｎ１（類似性５３％）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．  Ｒｔ４１Ａ由来  Ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（５３％）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＧＦ９６由来Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（５２％）が見出された。これらは、Ｐｒｅ−Ｐｒｏ−Ｅｎｚｙｍｅとして生産され、かつ、セリンプロテアーゼに属する。よって遺伝子情報からは、本発明のＰＬＡ分解酵素はセリンプロテアーゼの一種であると推定された。本発明のＰＬＡ分解酵素では、活性中心と予測されるアスパラギン酸（配列番号２の第３９番目）、ヒスチジン（配列番号２の第７０番目）、セリン（配列番号２の第２２２番目）が保存されていた。
【００７０】
＜実施例５．ＰＬＡ分解酵素遺伝子の組換え微生物への組み込みおよび遺伝子発現＞
（プラスミドｐＢＰａ１の構築）
以下のようにして、組換えベクターとして、プラスミドｐＢＰａ１を構築した。遺伝子を組み込むプラスミドとして、放線菌大腸菌シャトルベクターである、ｐＵＣ７０２を用いた。ｐＵＣ７０２は、ｐＵＣ１９とｐＩＪ７０２をＫｐｎＩ、ＳａｃＩサイトで連結したプラスミドである。ＰＣＲによりＰＬＡ分解酵素遺伝子増幅を行った。ＰＣＲ用の鋳型として、ＰＬＡ分解酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＧＢＥを用い、プライマーとして、Ｆ−Ｂ１２ｐ７０２およびＲ−Ｂ１２ｐ７０２を用いた。これらのプライマーは、遺伝子断片がプロモーター領域またはターミネーター領域を含んで増幅されるように設計したものである。
Ｆ−Ｂ１２ｐ７０２およびＲ−Ｂ１２ｐ７０２プライマーの配列を以下に示す。
５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＣ−３’（Ｆ−Ｂ１２ｐ７０２、配列番号７）
５’−ＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＴＣ−３’（Ｒ−Ｂ１２ｐ７０２、配列番号８）
増幅された遺伝子断片を、ｐＵＣ７０２のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、発現用プラスミドｐＢＰａ１を構築した。
【００７１】
（放線菌プロトプラストの調製）
ＰＬＡ分解酵素遺伝子を発現させる放線菌として、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２１を用いた。滅菌した試験管にＴＳＢ培地を５ｍｌ分注し、一白金耳量の菌体を植菌して振とう培養し（１８０ｒｐｍ、３０℃、４８時間）、これを前培養液とした。次にＹＥＭＥ培地を１００ｍＬ分注した５００ｍＬ容三角フラスコに前培養液を２％植菌し、振とう培養し（１８０ｒｐｍ、３０℃、３６時間）、これを培養液とした。培養液を集菌し、１０．３％スクロース溶液で２回洗浄した。リゾチーム溶液（１ｍｇ／ｍＬとなるようリン酸緩衝液に溶解）８ｍＬを加え、よく懸濁し、３０℃で１５分間インキュベートした。さらに５ｍＬのリン酸緩衝液を加え１５分間インキュベートした。その後、反応液を滅菌したコットンでろ過し、ろ液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、室温、７分間）した。上清を除き、沈殿したプロトプラストにリン酸緩衝液を３ｍＬ加え、穏やかに懸濁し、プロトプラスト溶液を調製した。トーマ血球計算版を用い、プロトプラストの濃度を計測した。マイクロチューブに分注し、−８０℃で保存した。
【００７２】
培地の組成を以下に示す。
【表６】
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【００７３】
（放線菌の形質転換）
プロトプラスト溶液を３０℃のウォーターバスで素早く溶解した。プロトプラスト溶液１５０μＬに適量のプラスミドｐＢＰａ１溶液を加え、穏やかに攪拌した。その後すぐにリン酸緩衝液（２５％ＰＥＧ含有）を加えゆっくりと３回ピペッティングした。この溶液をＲ５プレートに丁寧に塗布し、３０℃で培養した。培養１６〜２０時間後にチオストレプトン含有軟寒天培地を重層し、さらに３０℃で３日間培養し、プラスミドｐＢＰａ１を形質転換した組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１を作製した。
【００７４】
（組換え微生物の培養）
組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１の培養は、終濃度５μｇ／ｍｌとなるようチオストレプトンを加えたＴＳＢ培地で行った。まず、滅菌した試験管に上記ＴＳＢ培地を５ｍＬ分注し、一白金耳量の菌体を植菌して振とう培養し（１８０ｒｐｍ、３０℃、２日間）、これを前培養液とした。次に１００ｍＬの上記ＴＳＢ培地を分注した５００ｍＬ容三角フラスコに前培養液を１％となるよう植菌し、振とう培養した（１８０ｒｐｍ、３０℃、２日間）。
【００７５】
（組換え微生物のＰＬＡ分解能）
組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１は１４．０Ｕ／ｍｌのＰＬＡ分解活性を示し、Ｂ１２−１株の２８倍の酵素生産性を示した（図３）。また、組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１の、ＰＬＡ基本培地の寒天培地でのクリアゾーンを測定した。Ｂ１２−１株は３７℃、５日間の培養で直径１９ｍｍのクリアゾーンを示したのに対し、組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１は３０℃、５日間の培養で直径４５ｍｍのクリアゾーンを示した（図４）。このことから組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１は高いＰＬＡ分解活性を有することが示された。
【受託番号】
【００７６】
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属のＢ１２−１株（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０５、２０１１年６月１３日付受領にて寄託）
組換え微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＢＰ１（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１１０６、２０１１年６月１３日付受領にて寄託）
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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