【手続補正書】
【提出日】平成28年6月14日(2016.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ；
ｂ）細胞を溶解し、ｍＲＮＡ捕捉剤でｍＲＮＡ転写物を収集するステップ；
ｃ）ｍＲＮＡ捕捉剤を用いてｍＲＮＡをコンパートメントから単離するステップ；
ｄ）逆転写を行い、次いで捕捉されたｍＲＮＡにＰＣＲ増幅を行うステップ；そして、
ｅ）単一細胞から増幅された、少なくとも２つの異なったｃＤＮＡ産物を配列決定するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞がＢ細胞である、対象の抗原に結合する抗体について複数の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ捕捉剤がビーズであり、好ましくは前記ビーズが磁性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ビーズがｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが対象の抗原に結合する抗体の存在下でビーズに専ら複合化される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記個々のコンパートメントがゲル中のウェル、マイクロタイタープレート中のウェル又はエマルジョン中の微小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記個々のコンパートメントが５ｎＬ未満の体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）及び（ｂ）が
同時に行われるか、又は
単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１０，０００の各々の細胞から配列を取得すること、または少なくとも５，０００の各々の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）が、
少なくとも２の転写産物を単一のＤＮＡ分子に連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってｃＤＮＡを連結することを含むか、
重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まないか、
ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを単一分子中で連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを連結することを含むか、
重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡが別箇の分子であるか、
組み換えを行うことによってｃＤＮＡを連結することを含むか、又は
同一ビーズに共有結合的に連結された２又はそれ以上の転写産物の配列決定を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＶＨ及びＶＬ配列が異なった分子の配列決定によって得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及び癌細胞からなる群より選ばれ、好ましくは、前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、逆転写を刺激するための固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び個々の細胞を含み、個々の細胞からｍＲＮＡ転写産物を放出するために崩壊されている、組成物。
【請求項１５】
前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが前記抗原に結合する抗体の存在下で前記ビーズに専ら固定されている、請求項１４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
以下の図面は、本願の一部を形成し、本発明のある態様を更に証明するために含まれる。本発明は、本明細書に記載の具体的態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１又はそれ以上を参照することによってより理解されよう。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
以下：
ａ）単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ；
ｂ）細胞を溶解し、ｍＲＮＡ捕捉剤でｍＲＮＡ転写物を収集するステップ；
ｃ）ｍＲＮＡ捕捉剤を用いてｍＲＮＡをコンパートメントから単離するステップ；
ｄ）逆転写を行い、次いで捕捉されたｍＲＮＡにＰＣＲ増幅を行うステップ；そして、
ｅ）単一細胞から増幅された、少なくとも２つの異なったｃＤＮＡ産物を配列決定するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記細胞がＢ細胞である、複数の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍＲＮＡ捕捉剤がビーズである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ビーズが磁性である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ビーズがｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが対象の転写産物に特異的なポリ（Ｔ）及びプライマーの少なくとも１つを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
対象の抗原に結合する抗体について対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが対象の抗原に結合する抗体の存在下でビーズに専ら複合化される、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記個々のコンパートメントが５ｎＬ未満の体積を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｃ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記個々のコンパートメントがエマルジョン中の微小胞である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、単一細胞及びオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも１０，０００の各々の細胞から配列を取得することを含む、項目２に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも５，０００の各々の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得することを含む、項目２に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｅ）が、少なくとも２の転写産物を単一のＤＮＡ分子に連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってｃＤＮＡを連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ｅ）が重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まない、項目１に記載の方法。
（項目１９）
ステップ（ｅ）が、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを単一分子中で連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを連結することを含む、項目２に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ｅ）が、重複延長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡが別箇の分子である、項目２に記載の方法。
（項目２１）
前記ＶＨ及びＶＬ配列が異なった分子の配列決定によって得られる、項目２に記載の方法。
（項目２２）
前記対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定することが、配列の確率解析を行うことを更に含む、項目２に記載の方法。
（項目２３）
前記確率解析がＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲ−Ｌ３配列に基づく、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｅ）が組み換えを行うことによってｃＤＮＡを連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及び癌細胞からなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目２８）
単一細胞を隔離することが、細胞の大多数が単一細胞として捕捉されるように多数のマイクロウェルを含む装置に細胞を導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ｅ）が同一ビーズに共有結合的に連結された２又はそれ以上の転写産物の配列決定を含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
確率解析を用いて天然に対になった転写産物を決定することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記対転写産物を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
ａ）環状流動油相内に配置された水性流体相出口；及び
ｂ）水性流体相であって、水性相流体が細胞懸濁液を含み、油相内に分散され、細胞の水性懸濁液を含む低サイズ分散度を有する乳化液滴をもたらす、水性流体相
を含む、装置。
（項目３５）
前記水性流体相出口がニードルである、項目３４に記載の装置。
（項目３６）
前記水性流体相出口がガラス管である、項目３４に記載の装置。
（項目３７）
前記油相がガラス管を流れる、項目３４に記載の装置。
（項目３８）
前記油相がポリマーチューブを流れる、項目３４に記載の装置。
（項目３９）
前記水性相がポリマーチューブを流れる、項目３４に記載の装置。
（項目４０）
細胞濃度、水性流体相流速、及び油相流速が液滴形成を可能にし、各々の液滴が単一細胞を含む、項目３４に記載の装置。
（項目４１）
前記細胞がＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及び癌細胞からなる群より選ばれる、項目３４に記載の装置。
（項目４２）
前記水性流体相が核酸捕捉のためのビーズを含む、項目３４に記載の装置。
（項目４３）
前記水性流体相が、逆転写酵素試薬、ポリメラーゼ連鎖反応試薬、及びそれらの組み合わせを含む、項目３４に記載の装置。
（項目４４）
多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、逆転写を刺激するための固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び個々のＢ細胞を含み、個々のＢ細胞からｍＲＮＡ転写産物を放出するために崩壊されている、組成物。
（項目４５）
ａ）遺伝子標的のセットに特異的である２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの５’領域に共通配列を加えるステップ；
ｂ）共通配列を刺激することによって遺伝子標的のセットの核酸増幅を行うステップ；そして、
ｃ）固定されたオリゴヌクレオチドが核酸増幅を刺激するように、表面上に固定された共通配列を含むオリゴヌクレオチドを核酸増幅に含み、増幅された配列の表面捕捉をもたらすステップ、
を含む、方法。
（項目４６）
多数の対抗原受容体配列を取得する方法であって、以下：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一哺乳動物細胞を単離するステップ；
ｂ）細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、多数の単一細胞について、複数のｍＲＮＡ転写産物を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４７）
複数の、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得する方法として更に定義された、項目４６に記載の方法であって、以下：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｂ細胞を単離するステップ；
ｂ）Ｂ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一Ｂ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、複数の単一Ｂ細胞について、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４８）
複数の、対Ｔ細胞受容体配列を取得する方法として更に定義された、項目４６に記載の方法であって、以下のステップ：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｔ細胞を単離するステップ；
ｂ）Ｔ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、複数の単一Ｔ細胞について、対Ｔ細胞受容体配列を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４９）
対象の抗原に結合する抗体について、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得する方法として更に定義された、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記オリゴヌクレオチドが、対象の抗原に結合する抗体の存在下でのみ、固定されたオリゴヌクレオチドである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ｂ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われている、項目４６に記載の方法。
（項目５３）
前記ウェルがエマルジョン中の微小胞である、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記オリゴヌクレオチドがビーズ上に固定されている、項目４６に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に行われる、項目４６に記載の方法。
（項目５６）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、単一細胞及びビーズ上に固定されたオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ｃ）が、単一分子中で対抗原受容体ｃＤＮＡと連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって対抗原受容体ｃＤＮＡを連結することを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ｃ）が、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、対抗原受容体配列ｃＤＮＡが別個の分子である、項目４６に記載の方法。
（項目５９）
対抗原受容体配列を同定するステップ（ｅ）が、配列の確率解析を行うことを含む、項目４６に記載の方法。
（項目６０）
対抗原受容体配列が対ＶＨ配列及びＶＬ配列であり、確率解析がＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲ−Ｌ３配列に基づく、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記対抗原受容体配列を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
少なくとも１０，０００の個々の細胞から配列を取得することを含む、項目４６に記載の方法。
（項目６４）
ステップ（ｃ）の前に、固定されたｍＲＮＡ転写物を単離することを更に含む、項目４６に記載の方法。