【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年1月5日(2016.1.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
概要
本開示は、一酸化炭素(CO)を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に発酵させる工程を含んでなる、ガス状基質から1種以上のアルコールを生産する方法であって、前記水性培地内で特定CO取込みを調整することによって細胞密度を高める工程を含み、ここで特定CO取込みの変化速度はCOの流入（インプット）速度を制御する工程を含み、ここで特定CO取込みの変化速度はCO流入（インプット）速度を測定する工程；CO流出（アウトプット）速度を測定する工程；及び細胞質量を測定する工程を含み；さらに所定量で特定CO取込みを変える工程を含み；場合により、前記所定量は約0.001〜約10.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；前記所定量は約0.01〜約5.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；前記所定量は約0.1〜約1.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含む；さらに水性培地の流れをバイオリアクターに加える工程；バイオリアクターから発酵ブロスの流れを除去する工程を含み；さらに水性培地の連続流れをバイオリアクターに加える工程；バイオリアクターから発酵ブロスの連続流れを除去する工程を含み（場合により、前記水性培地は、生物学的に純粋な微生物、天然微生物、非天然微生物、遺伝子修飾により生成された非天然微生物、天然微生物のミュータント、非天然微生物のミュータント、組換え微生物、遺伝子操作された微生物、人工的に合成された微生物を含めた1種以上の微生物を含み；前記バイオリアクターは1つ以上のバイオリアクターを含み；前記バイオリアクターは細胞再循環装置を含み；前記CO含有基質は水素を含む）；さらに前記バイオリアクターに栄養培地を加える工程を含む方法を提供する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
本開示は、一酸化炭素(CO)を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、前記水性培地内で1種以上の前記微生物の特定CO取込みを調整することによって細胞密度を高める工程を含み（一実施形態では、特定CO取込みの変化速度は1以上の工程を調整する工程を含み；一実施形態では、特定CO取込みの変化速度はCOの流入速度を制御する工程を含み；一実施形態では、特定CO取込みの変化速度はCO流入速度を測定する工程；CO流出速度を測定する工程；及び細胞質量を測定する工程を含む）；さらに、所定量内で特定CO取込みを変える工程を含み（一実施形態では、前記所定量は約0.001〜約10.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；一実施形態では、前記所定量は約0.01〜約5.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；一実施形態では、前記所定量は約0.1〜約1.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含む）、一実施形態では、バイオリアクターに水性培地の連続流れを加える工程を含み；前記バイオリアクターから発酵ブロスの連続流れを除去する工程を含み；ここで、約1〜約50g/Lの範囲の所望エタノール生産性を得るまで前記工程を繰り返す（一実施形態では、バイオリアクターに水性培地の連続流れを加え；前記バイオリアクターから発酵ブロスの連続流れを除去し；ここで、発酵ブロス内で約1〜約50g/Lの範囲の所望エタノール濃度を得るまで前記工程を繰り返す）方法を提供する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、目標とする特定CO取込みを選択する工程；特定CO取込みが、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程を含む方法を開示する。
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の、目標とする特定CO取込みを選択する工程、特定CO取込みが前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程；約0.1〜約15g/Lの範囲の所望細胞密度を達成するまで前記工程を繰り返す工程；前記所望細胞密度を達成したらすぐに連続操作モードに変換する工程を含む方法を開示する。
本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、細胞密度を測定する工程；ガス状基質の流入を調整して細胞密度を高める工程；特定CO取込みを約0.001〜約10.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の所定量で変える工程を含む方法を提供する。
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、目標とする特定CO取込みを選択する工程；特定CO取込みが、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の、前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程を含む方法を開示する。
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の、目標とする特定CO取込みを選択する工程、特定CO取込みが前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程；約0.1〜約15g/Lの範囲の所望細胞密度を達成するまで前記工程を繰り返す工程；前記所望細胞密度を達成したらすぐに連続操作モードに変換する工程を含む方法を開示する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
定義
特に定義しない限り、本開示のこの明細書全体を通じて使用する下記用語は、以下のように定義され、下記定義の単数形又は複数形のどちらも包含し得る。
いずれの量をも修飾する用語「約」は、微生物培養を維持する実世界条件、例えば、研究室、パイロットプラント、又は生産施設で遭遇する当該量の変動を表す。例えば、「約」で修飾されている場合、混合物又は含量で用いられる成分量又は測定量は、生産プラント又は研究室の実験条件で測定する際に典型的に採用される管理の変動及び程度を包含する。例えば、産物の成分の「約」で修飾された量は、プラント又は研究室における複数の実験のバッチ間の変動及び分析方法に固有の変動を包含する。「約」による修飾の有無にかかわらず、量は、当該量に等価な量を包含する。本明細書に記載の「約」で修飾されたいずれの含量も、本明細書では「約」で修飾されない量として採用することもできる。
用語「アセトゲン(acetogen)」又は「酢酸生成(acetogenic)」は、嫌気性呼吸の産物としてアセタートを生成する細菌を指す。これらの微生物は、既知のアセトゲンが全て細菌であることから、酢酸生成菌とも呼ばれる。アセトゲンは、一般的に嫌気性(酸素を欠く)様々な生息地で見られる。アセトゲンはエネルギー源及び炭素源として種々の化合物を使用することができ；酢酸生成代謝物の最良の研究形態は、炭素源として二酸化炭素の使用及びエネルギー源として水素の使用を含む。
用語「バイオリアクター」、「リアクター」、又は「発酵バイオリアクター」には、1つ以上の容器及び／又は塔又は配管から成る発酵装置が含まれ、連続撹拌槽型反応器(Continuous Stirred Tank Reactor)(CSTR)、気泡塔(Bubble Column)、ガスリフト発酵槽(Gas lift Fermenter)、静的ミキサー(Static Mixer)、又は気液接触に適した他の装置が挙げられる。この開示の方法では、発酵バイオリアクターは、発酵ブロスを第2の発酵バイオリアクターに供給する成長リアクターを含み、この中で産物エタノールのほとんどが生成される。
用語「細胞密度」は、発酵ブロスの単位体積当たりの微生物の質量、例えば、g/リットルを意味する。
用語「細胞再循環」は、発酵ブロス内の固体微生物細胞から液体(パーミエート(permeate))を分離し、前記分離された固体微生物細胞の全て又は一部を、前記微生物を用いて前記発酵ブロスを生成した発酵槽に戻す配置を意味する。一般的にろ過装置を用いて前記分離を達成する。パーミエートストリームのない固体微生物のストリーム及び濃縮した固体微生物のストリームがろ過装置から生成される。パーミエートストリームのない固体は、規定粒径未満の固体粒子を含有し得る。
用語「転化率」は、産物に変換される流入量の割合を意味し；これは下記方程式で表される：(流入量−流出量)／(流入量)。
用語「エタノール生産性」は、1日当たりの発酵槽の単位体積毎に生産されるエタノールの量を意味する。発酵槽体積は、発酵槽内の有効容積又は液体体積である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
詳細な説明
本開示は、一酸化炭素(CO)を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、前記水性培地内の1種以上の前記微生物の特定CO取込みを調整することによって細胞密度を高める工程を含み（場合により、特定CO取込みの変化速度は、下記工程：COの流入速度を制御する工程；CO流入速度を測定する工程；CO流出速度を測定する工程；細胞質量を測定する工程；の1以上を調整及び／又は制御する工程を含み）；さらに、所定量内で特定CO取込みを変える工程（場合により、前記所定量は約0.001〜約10.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；必要に応じて一実施形態では、前記所定量は約0.01〜約5.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲及び／又は約0.1〜約1.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲を含み；一実施形態は必要に応じてバイオリアクターに水性培地の連続流れを加える工程；前記バイオリアクターから発酵ブロスの連続流れを除去する工程を含み；ここで、約1〜約50g/Lの範囲の所望エタノール生産性を得るまで前記工程を繰り返す（一実施形態では、必要に応じてバイオリアクターに水性培地の連続流れを加え；前記バイオリアクターから発酵ブロスの連続流れを除去し；ここで、発酵ブロス内で約1〜約50g/Lの範囲の所望エタノール濃度を得るまで前記工程を繰り返す）方法を提供する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、細胞密度を測定する工程；ガス状基質の流入を調整して細胞密度を高める工程；約0.001〜約10.0ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の所定量で特定CO取込みを変える工程を含む方法を開示する。
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、目標とする特定CO取込みを選択する工程；特定CO取込みが、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の、前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程を含む方法を開示する。
実施形態として、本開示は、一酸化炭素を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、約0.01〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)の範囲の、目標とする特定CO取込みを選択する工程、特定CO取込みが前記目標とする特定CO取込みに等しくなるようにガス状基質の流れを調整する工程；約0.1〜約15g/Lの範囲の所望細胞密度を達成するまで前記工程を繰り返す工程；前記所望細胞密度を達成したらすぐに連続操作モードに変換する工程を含む方法を開示する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
図1は、細菌による発酵によって、シンガス等の一酸化炭素(CO)を含むガス状基質から、アルコール産物混合物等の化学薬品を生産する方法を示し、この方法は、前記細菌細胞及び発酵培地を含む発酵ブロスを含有するバイオリアクター(100)を含む。COを含むガス状基質を含んでなるガスストリーム(101)を、発酵培地のストリーム(102)と共にバイオリアクターに供給することができる。前記細菌細胞及び前記産物化学薬品を含む発酵ブロスのストリーム(110)を前記バイオリアクターから除去することができる。ガス状基質を含む前記ガスストリームの未使用部分を含んでなる発酵槽オフガスのストリーム(120)はバイオリアクターから放出される。一実施形態では、発酵槽ブロスのストリーム(110)は細胞再循環装置(200)に流れ、そこで細胞が濃縮され、バイオリアクターに戻される(220)。
パーミエートストリーム(210)は、前記細胞再循環装置から前記化学薬品の回収プロセスに向けられる。一実施形態では、発酵槽ブロスのストリーム(110)の少なくとも一部が前記アルコール産物混合物の回収プロセスに向けられる。一実施形態では、発酵ブロスのストリーム(210)の少なくとも一部が前記アルコール産物混合物の回収プロセスに向けられる。
一実施形態では、バイオリアクター(100)は、ガス状基質を含むガスストリームの液体発酵培地との接触を容易にし、かつ液体発酵培地とのガス状基質の質量移動を促進するために撹拌を与えるための撹拌器(105)を備えている。発酵プロセスの間ずっとバイオリアクター内で良い質量移動、ひいては十分な撹拌があることが望ましい。
バイオリアクターに導入されたガス状基質を含むガスストリーム(101)及びバイオリアクターを去るオフガス(120)のサンプルを収集するための配置がある(図1には示さず)。バイオリアクターの発酵ブロスのサンプルを収集するための配置がある(図1には示さず)。
前記ガスサンプル及び液体サンプルを間隔をあけて収集し、種々のガス成分消費又は生成、種々の産物の生成及び発酵ブロスの光学密度について分析する。
これらの測定値を用いて、下記方程式を利用してバイオリアクター内の発酵ブロス中の特定一酸化炭素(CO)取込み(SCU)及び細胞密度を計算することができる。
CO取込み(ミリモル/分)＝(CO流入(ミリモル/分))−(CO流出(ミリモル/分))          (1)
細胞密度(g/L)＝(光学密度)・(希釈係数)・(細胞質量定数)                        (2)
細胞質量(g)＝(細胞密度)・(バイオリアクターの容積)                            (3)
特定CO取込み(ミリモル/分/g)＝(CO取込み)／(細胞質量)                          (4)
細胞密度は、発酵ブロスの単位体積当たりの細胞の質量である。バイオリアクターの容積は、撹拌を止めたときのバイオリアクター内の液体の体積である。細胞質量定数は、光学密度が1の発酵ブロス1リットル当たりの乾燥細菌細胞の質量(g)である。光学密度は、生理食塩水等の適切な溶媒で発酵ブロスを希釈した後に得たサンプルの光学密度である。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
本開示の方法の一実施形態では、細胞密度を測定する工程及びガス状基質の流入を調整することによって、特定CO取込みを増やすことで細胞密度を高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程及びガス状基質の流入を調整することによって、特定CO取込みを減らすことで細胞密度を高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程及びガス状基質の流入を調整することによって、特定CO取込みを増やすことで細胞密度を徐々に高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程及びガス状基質の流入を調整することによって、特定CO取込みを減らすことで細胞密度を徐々に高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程及び特定CO取込みを所望特定CO取込みまで徐々に増やすことによって細胞密度を高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程及び特定CO取込みを所望特定CO取込みまで徐々に減らすことによって細胞密度を高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程、特定CO取込みを増やすことによって細胞密度を高め、かつアルコール生産性を所望アルコール生産性まで徐々に高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、細胞密度を測定する工程、特定CO取込みを増やすことによって細胞密度を高め、かつアルコール生産性を所望アルコール生産性まで徐々に高める工程を含む。一実施形態では、本開示の方法は、特定CO取込みの変化が工程の所定規模の増大を含む。一実施形態では、本開示の方法は、特定CO取込みの変化が工程の所定規模の減小を含む。一実施形態では、所定規模の工程が等しい規模の工程を含む。一実施形態では、所定規模の工程が等しくない規模の工程を含む。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
本開示の方法は、回分プロセス、半回分プロセス、流加プロセス、移行プロセスから連続プロセス、連続プロセスを具体化することを想定する。
本開示は、一酸化炭素(CO)を含むガス状基質をバイオリアクター内の水性培地中に加える工程を含み；前記水性培地が1種以上の微生物を含んでなる、ガス状基質の発酵方法であって、細胞密度を測定する工程；COの流入速度及びCOの流出速度を測定する工程；特定CO取込みを決定する工程；特定CO取込みが所定量で変化するように、COの流入速度を調整して細胞密度を高める工程；必要に応じてこれらの行為を繰り返す工程を含む方法を提供する。
栄養培地は、選択微生物の成長を可能にする1種以上のビタミン及びミネラルを含有し得る微生物成長培地を含む。表1は、本開示が企図する栄養培地の実施形態を提供する。
本開示に適した他の栄養培地は技術上周知である。
さらに、当技術分野では開示されていないが、表1に記載の種々の成分から導かれる栄養培地を本発明で利用することができる。本開示は、栄養培地の改良された組成を提供する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
実施例2：クロストリジウム・リュングダーリイC-01
0.3g/Lの活発に増殖するクロストリジウム・リュングダーリイC-01株を用いて、約1.5リットル(例えば1.45〜1.65リットルの範囲)の発酵培地を含むNew Brunswick Bioflow Iバイオリアクターを始動した。実験の開始時にリアクターの撹拌速度を600rpmに設定した。この撹拌速度を実験の間ずっと維持した。バイオリアクター内の温度は実験の間ずっと約36〜約37.9℃の範囲に維持した。下記サンプルを異なる間隔で取って分析した(例えば1〜4時間間隔)：バイオリアクターへのシンガス供給原料；バイオリアクターからのオフガス；バイオリアクター内の発酵ブロス。サンプル分析は下記を与えた：種々のガス成分の消費、種々のガス成分の生成、発酵ブロスの酢酸濃度、エタノール濃度及び光学密度。
このようにして上記方程式(1)〜(4)を用いて特定CO取込み(SCU)を決定した。
最初に、上記方程式を用いて約1.4ミリモル/分/gのSCUに対応するシンガス流入値を計算し、この計算値でシンガスの流れを、細胞密度が上昇して約1.5g/Lの値に到達するまに維持した。
リアクターの細胞密度が約1.5g/Lに到達したらすぐに、ガスを予測するための設定SCU値を約1.2ミリモル/分/gに下げた。その後、リアクターの細胞質量が約2.5g/Lに到達したらすぐに、ガスを予測するための設定SCU値を約1.0ミリモル/分/gに下げた。時間とともに細胞質量が増加し、リアクターの接種後約79時間以内で2.8g/Lの期待細胞質量に到達した。この時点で培養は約20g/Lを超えるエタノールを生成した。
接種の約13.97時間後にリアクターへの培地流れを約0.2ml/分(細胞保持時間：約125時間を近似する)で開始した。接種の約28.08時間後にリアクターへの培地流れを約0.5ml/分(細胞保持時間：約52時間を近似する)に増やした。実験中、pHは約4.5周辺で維持した。
スタートアップ手順の間ずっと設定SCUを徐々に下げるのは、培養が徐々に低SCU(約0.7〜約0.9ミリモル/分/g)に変化するのを促してリアクターの生産モード(定常状態)の間維持するためである。
上記プロセスは、リアクターの細胞質量の設定目標(約2.8g/L)に到達するのに約80時間未満しかかからない。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
実施例3：クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)
約0.47g/Lの活発に増殖するクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いて、約1.5リットル(例えば約1.45〜約1.65リットルの範囲)の発酵培地を含むNew Brunswick Bioflow Iバイオリアクターを始動した。実験の開始時点で、バイオリアクターの撹拌速度を約600rpmに設定した。この撹拌速度を実験の間ずっと維持した。バイオリアクター内の温度は実験の間ずっと約36〜約37.5℃の範囲に維持した。下記サンプルを異なる間隔で取って分析した(例えば1〜4時間間隔)：バイオリアクターへのシンガス供給原料；バイオリアクターからのオフガス；バイオリアクター内の発酵ブロス。サンプル分析は下記を与えた：種々のガス成分の消費、種々のガス成分の生成、発酵ブロスの酢酸濃度、エタノール濃度及び光学密度。
このようにして上記方程式(1)〜(4)を用いて特定CO取込み(SCU)を決定した。
最初に、上記方程式を用いて約0.4ミリモル/分/gのSCU値に対応するシンガス流入値を計算し、細胞密度が上昇するまでこの計算値でシンガスの流れを維持した。約0.4ミリモル/分/gの目標SCU値に対応するガス流れを約19時間維持した。接種後19〜21時間の間、目標SCU値は約0.5ミリモル/分/gであった。接種後約21時間に目標SCU値を約0.6に設定した。時間とともに細胞密度が上昇し、リアクターの接種後約79時間以内で約3g/Lに達した。この時点で培養は約15g/Lを超えるエタノールを生産していた。接種後約26時間にリアクターへの培地流れを約0.1ml/分(細胞保持時間：約240時間を近似する)で開始した。接種後約50時間にリアクターへの培地流れを約0.2ml/分(細胞保持時間：約119時間を近似する)に増やした。接種後約71時間にリアクターへの培地流れを約0.5ml/分(細胞保持時間：約50時間を近似する)に増やした。実験中、pHは約4.5周辺で維持した。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
実施例4：クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)
約0.47g/Lの活発に増殖するクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いて、約1.5リットル(例えば約1.45〜約1.65リットルの範囲)の発酵培地を含むNew Brunswick Bioflow Iバイオリアクターを始動した。実験の開始時点で、バイオリアクターの撹拌速度を約600rpmに設定した。この撹拌速度を実験の間ずっと維持した。バイオリアクター内の温度は実験の間ずっと約36〜約37.5℃の範囲に維持した。下記サンプルを異なる間隔で取って分析した(例えば1〜4時間間隔)：バイオリアクターへのシンガス供給原料；バイオリアクターからのオフガス；バイオリアクター内の発酵ブロス。サンプル分析は下記を与えた：種々のガス成分の消費、種々のガス成分の生成、発酵ブロスの酢酸濃度、エタノール濃度及び光学密度。
このようにして上記方程式(1)〜(4)を用いて特定CO取込み(SCU)を決定した。
最初に、上記方程式を用いて約0.6ミリモル/分/gのSCU値に対応するシンガス流入値を計算し、細胞密度が上昇するまでこの計算値でシンガスの流れを維持した。接種後約26時間に目標SCU値を約0.7に設定した。時間とともに細胞密度が上昇し、リアクターの接種後約79時間以内で約2.97g/Lに達した。この時点で培養は約18g/Lを超えるエタノールを生産した。接種後約18.3時間にリアクターへの培地流れを約0.1ml/分(細胞保持時間：約242時間を近似する)で開始した。接種後約41.6時間にリアクターへの培地流れを約0.2ml/分(細胞保持時間：約121時間を近似する)に増やした。実験中、pHは約4.5周辺で維持した。