(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウィルスＲＮＡゲノムから誘導された組換えＲＮＡ分子であって、そのＲＮＡ分子は動物宿主細胞に感染可能であり且つそこで複製することができ、そしてそのＲＮＡ分子は該アルファウィルスＲＮＡゲノムの複製に必須である完全なアルファウィルスＲＮＡ領域を含んでなり且つさらに該宿主細胞中でその機能を発現することができる外因性ＲＮＡ配列を含んでなり、該外因性ＲＮＡ配列が、組換えＲＮＡ分子の複製に必須でないアルファウィルスＲＮＡゲノムの領域内に且つ該組換えＲＮＡを動物宿主細胞に導入したとき外因性ＲＮＡ配列がサブゲノムプロモーターから発現されるような位置において操作可能に挿入されており、ここで該アルファウィルス由来ＲＮＡは、該ＲＮＡがアルファウィルス構造タンパク質をコードする領域の一部又は完全な領域を欠失するような欠失を含むアルファウィルスゲノムを含んでなり、そして該アルファウィルスがセムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）であることを特徴とする組換えＲＮＡ分子。
【請求項２】
外因性ＲＮＡ配列が外因性抗原性エピトープ又は抗原決定基を定めるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド配列をコードする請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
外因性ＲＮＡ配列がヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）型を含む免疫不全ウィルスの構造タンパク質のエピトープ配列をコードする請求項２に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
アルファウィルス由来ＲＮＡ分子領域がＲＮＡ複製に必要である該ウィルスＲＮＡの５′末端部分、ＲＮＡ複製に必要な非構造タンパク質のコード領域、サブゲノムプロモーター領域及びＲＮＡ複製に必要である該ウィルスＲＮＡの３′末端部分を含んでなる請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項５】
外因性ＲＮＡ配列が異種ポリペプチド又はタンパク質をコードし、サブゲノム２６Ｓ  ＲＮＡ中に組み込まれてその欠失部分を置換している請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１に記載の組換えＲＮＡと相補的な１本のストランドを有するｃＤＮＡを含んでなるＤＮＡベクター。
【請求項７】
請求項２〜５項のいずれかに記載のＲＮＡに相補的な１本のストランドを有するｃＤＮＡを含んでなる請求項６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項８】
該ｃＤＮＡの転写により請求項１に記載の組換えＲＮＡ分子を産生せしめる請求項６に記載のＤＮＡベクター。
【請求項９】
該ベクターがＡＴＧＧ又はＧＡＴＧＧの５′末端配列及びＴＴＴＣＣＡ69ＡＣＴＡＧＴの３′末端配列を有する請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含んでなり、そしてＤＮＡベクターで形質転換された動物宿主細胞中で外因性ポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡの発現を可能にするような位置に挿入された一体化ポリリンカー領域をさらに含んでなる請求項６〜９のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１】
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流に操作可能にリンクされ且つ位置する該ｃＤＮＡを含んでなる請求項６〜１０のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項１２】
ＳＦＶ−由来ｃＤＮＡを含んでなり、ベクターがそれぞれ配列番号４、５及び６に示すヌクレオチド配列を有するｐＳＦＶ１、ｐＳＦＶ２又はｐＳＦＶ３である請求項８に記載のベクター。
【請求項１３】
アルファウィルス構造タンパク質を発現するＳＦＶ  ＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含んでなり、さらに、そのＳＦＶ  ＲＮＡはアルファウィルスヌクレオキャプシド粒子へのＲＮＡのパッケージのためのＲＮＡシグナルをコードする配列を欠失しているが、宿主細胞内でのＳＦＶ  ＲＮＡの複製に必要な５′及び３′ポリヌクレオチド配列を含み且つまた該宿主細胞内で該アルファウィルス構造タンパク質をコードする該ＲＮＡの転写のためのアルファウィルス構造サブゲノムのためのプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列を含むヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項１４】
該ｃＤＮＡがＲＮＡ分子をコードし、ここで複製に必要な非構造ウィルスタンパク質をコードする領域が欠失している請求項１３に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項１５】
該ｃＤＮＡがすべてのアルファウィルス構造タンパク質をコードし、該タンパク質がヌクレオキャプシド、ｐ６２、６Ｋ及びＥ１タンパク質を含んでなる請求項１３に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項１６】
該構造タンパク質がｐ６２タンパク質である請求項１３又は１４に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項１７】
構造タンパク質をコードするＤＮＡが、アルファウィルスｐ６２タンパク質をコードする領域において、条件付致死突然変異を含み、その結果、ｐ６２タンパク質は宿主細胞プロテアーゼによって認識されず、宿主細胞内でウィルス細胞−侵入機能を活性化するアルファウィルス構造タンパク質Ｅ３及びＥ２へのタンパク質分解的切断を受けることができない欠失ｐ６２タンパク質を発現する請求項１３〜１６のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項１８】
該突然変異が温度感受性突然変異又は切断欠陥突然変異である請求項１７に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項１９】
該突然変異が該ｐ６２切断部位に位置する切断欠陥突然変異であり、外因的に添加されたプロテアーゼのための切断部位をもとの切断部位の前方のアミノ酸位置において保存しつつ該部位においてｐ６２切断をブロックするアミノ酸の変更を包含し、そしてアルファウィルスのｐ６２タンパク質の細胞内で切断できないが細胞外で切断できる突然変異形を発現し、かくして試験管内でのタンパク質分解処理による細胞−侵入機能の活性化を可能にする請求項１８に記載のＤＮＡベクター。
【請求項２０】
該切断欠陥突然変異がｐ６２タンパク質のＥ３部分のアミノ酸位置６６におけるアルギニンのロイシンへの置換を包含する請求項１９に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【請求項２１】
ウィルス粒子の表面上にタンパク質を発現する該突然変異ｐ６２タンパク質の細胞−侵入機能がトリプシンによる試験管内処理によって活性化され得る請求項１９又は２０に記載のＤＮＡベクター。
【請求項２２】
該ｃＤＮＡが、該ｃＤＮＡのＡｃｃＩ（３０８）からＡｃｃＩ（６３９９）までの制限エンドヌクレアーゼ部位に及ぶ欠失を含む配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する全長ＳＦＶ  ｃＤＮＡである請求項１３〜２１のいずれかに記載のヘルパーＤＮＡベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアルファウィルスに基づくＤＮＡ発現系に関し、その系はタンパク質及びワクチンなどの所望の生成物を高収率で製造するのに用いるための動物細胞の形質転換に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
バイオテクノロジーの急速な発展は、組み替えＤＮＡ法の導入に負う所が大きく、それは細胞の分子機構を明らかにする新しい道を開くことにより、細胞生物学的及び医学的研究に革命を起こした。ｃＤＮＡクローニングの方法を用いて毎年多数の興味深いタンパク質分子が特性化されている。従って今日多くの研究活動は、これらの分子の構造と機能の関係を明らかにすることに向けられている。結局この知識が人及び動物において健康を維持し病気を防除する我々の可能性を増すであろう。実際今日では、すでに薬剤又は診断薬として用いられている新規“クローニング”タンパク質生成物の数が増加しつつある。
【０００３】
生物学的問題を研究するための組み替えＤＮＡ法において、ＤＮＡ発現系は決定的な要素である。従って用いるのに簡単で安全で、所望の生成物を高収率で与え、多様な宿主細胞、特に哺乳類細胞でも用いることができる有効なＤＮＡ発現系が非常に求められている。
【０００４】
これらの要求を満たすＤＮＡ発現系の開発に、多くの試みが成されてきた。多くの場合ウィルスがそのような系の供給源として用いられてきた。しかし今日まで、存在するウィルス発現系のいずれもこれらの要求のすべてを満足に満たさなかった。例えばｃＤＮＡのためのバキュロウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現系は非常に有効であるが、昆虫細胞でしか用いることができない（引用文献のリストの参照文献１を参照；簡単のために以下においては引用文献を該リスト中の番号によってのみ示す）。哺乳類起源の細胞の場合は多くの重要な分子を製造し、プロセシングしてそれらを活性としなければならないので、この系はそのような場合に用いることはできない。さらに、タンパク質の構造と機能の関係の分析は一般に突然変異株の全系列の分析を含むので、バキュロウィルスｃＤＮＡ発現系はその実行が簡単ではない。表現型分析のための１個のバキュロ組み替えウィルスを構築するのに、現在約６−８週間を要する。この後者の問題は、さらに有効なワクシニア組み替えウィルス及び他の現代の組み替えウィルスｃＤＮＡ発現系の場合も真実である（２，３）。安定に形質転換された細胞系の確立法も非常に苦心のいる方法であり、さらにタンパク質発現のレベルが非常に低いことが多い。  これまでウィルスＤＮＡ発現系の開発のほとんどの試みは、ＤＮＡゲノムを有するウィルス又はレトロウィルスに基づいており、後者の複製可能中間体は二重鎖ＤＮＡである。
【０００５】
しかし近年、ＲＮＡゲノムを含むウィルスもＤＮＡ発現系の開発に用いられてきた。
【０００６】
ＥＰ  ０  １９４  ８０９において、（＋）鎖ＲＮＡウィルスから誘導されたＲＮＡ形質転換ベクターが開示され、それは該ウィルスＲＮＡゲノムの複製に非−必須な領域への外因性ＲＮＡの挿入により修正したキャップ構造のウィルスＲＮＡを含む。これらのベクターはそれを用いて形質転換された細胞における該外因性ＲＮＡの機能の発現のために用いられる。ＲＮＡは溶液で、又はキャプシド中にパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）して用いることができる。さらにこのＲＮＡは新しい機能、すなわちタンパク質発現を有する新規細胞の生成に用いることができる。該参照文献の発明は宿主細胞、（＋）鎖ＲＮＡウィルスなどに関して一般にクレイムされている。それにもかかわらず植物細胞のみが形質転換され、さらに植物ウィルスであるブロモモザイクウィルス（Ｂｒｏｍｏ  Ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）のみが形質転換ベクターとして用いられたことは、そこに示されている実験的支持から明らかである。
【０００７】
該参照文献中で、参照文献に記載されている原理を用い、いずれのＲＮＡウィルス−細胞系の、外因性ＤＮＡのための有用な発現系への変換も当該技術における熟練者には容易に明らかになると述べられているが、少なくとも動物細胞ＲＮＡウィルスの場合はそれが真実であることは証明されていない。この理由はいくつかあると思われる。それには：
１）試験管内転写されたＲＮＡを用いた動物細胞の形質転換の無効力；２）見掛け上複製可能な（コンピテント）（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＲＮＡ転写物が通常用いられるトランスフェクション法の後でＲＮＡ複製を開始することの無効力；
３）ヘルパーウィルスを含まない組み替えウィルスの高力価株（ｓｔｏｃｋ）の製造の不可能；
４）外因性ＲＮＡの機能を発現する形質転換細胞の安定な特性の確立の不可能
が含まれる。
【０００８】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ  ８４，１９８７，ｐｐ４８１１−４８１５において、アルファウィルス属の一員、すなわちシンドビスウィルスに基づく遺伝子発現系が開示されており、それがチキン胚繊維芽細胞などのトリの細胞中で細菌のＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を発現するのに用いられている。
【０００９】
Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２４３，１９８９，１１８８−１１９１もシンドビスウィルスに基づく遺伝子発現系を開示している。この系は広範囲の動物細胞で有効であると言われている。昆虫、トリ及びヒトを含む哺乳類細胞における細菌のＣＡＴの発現がそこに開示されている。
【００１０】
アルファウィルス属の一員、シンドビスウィルスが挿入に耐え、少なくとも１つの外部遺伝子、細菌のクロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ（ＶＡＴ）遺伝子の発現に向かうことができることが先行技術から知られているが、上記の両系共、外因性遺伝子発現に関して無効力であり、用いるのが非常にやっかいであることが記載の結果から証明されている。従って今日、動物細胞におけるＤＮＡ発現の分野で有用な系は見いだされていない。
【００１１】
シンドビスウィルスの欠陥干渉（ＤＩ）ウィルス変異体のｃＤＮＡコピーの最初の例は、ＣＡＴ遺伝子を運ぶのに用いられた。ＲＮＡは試験管内で転写され、トリ細胞のトランスフェクションに用いられ、細胞に野生型シンドビスウィルスを感染させた後、いくらかのＣＡＴタンパク質の製造が示された。後者のウィルスはＣＡＴ構築物の発現のためのウィルスレプリカーゼを備えていた。この系の無効力は、１）初期ＤＩ−ＣＡＴ  ＲＮＡトランスフェクションの低レベル（細胞の０．０５−０．５％）及び２）不自然で準最適タンパク質翻訳開始シグナルの故の、タンパク質翻訳へのＤＩ−ＣＡＴ  ＲＮＡの利用の無効力のためである。同系は組み替えＤＩ−ＣＡＴゲノムのいくらかの、ウィルス粒子内へのパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）という結果も与える。しかしこれは非常な大過剰の野生型シンドビスウィルスの製造と同時に起こる。従ってこの混合ウィルス株をＣＡＴ発現に用いることは、そのような株に感染した細胞のほとんどの複製及び翻訳活性が野生型にかかわり、組み替え遺伝子発現にかかわっていないという事実により非常に妨げられるであろう。
【００１２】
同様の問題の多くは、記載の他のシンドビス発現系に固有である。この場合、ＲＮＡ複製可能シンドビスＤＮＡベクターがＣＡＴ遺伝子を運ぶのに用いられる。試験管内で製造されたＲＮＡは動物細胞中で複製されることが示され、ＣＡＴ活性が見られる。しかし非常に少数の細胞がトランスフェクトされるのみなので、全体的ＣＡＴ製造はやはり低い。これに対する考えられる他の説明は、用いられたシンドビス構築物が複製に最適でないことである。野生型シンドビスウィルスを用いて組み替えゲノムを過剰の野生型ゲノムと共に粒子中に保護することができ、その後この混合株を感染を介してＣＡＴタンパク質の発現に用いることができる。しかしこの株は組み替えＤＩ系に関する上記と同様の問題を有する。後者の文献は、数過程を介してウィルスを増幅すると、力価の向上した組み替えウィルス粒子を得ることができることも示している。しかし野生型ウィルスの力価も対応して向上し、野生型ウィルスの主製造という最初の問題は残ることを記憶していなければならない。混合ウィルス株の製造に数過程を用いた時に起こり得る問題もいくつかある。組み替えゲノムに保存に対する選択的強制がないので、これらは容易に１）転移を起こし、２）効力の低い複製及び／又はパッケージング性の結果として野生型ゲノムにより数で圧倒される。
【００１３】
ウィルスＤＮＡ発現ベクターの他の重要な特徴は、非関連病原体の抗原の発現へのその利用であり、従ってそれらをそのような病原体に対するワクチンとして用いることができる。
【００１４】
ウィルス性の病気に対する安全で有効なワクチンの開発は、非常に困難な仕事であることが証明されてきた。多くの現存するワクチンは、多くの感染症の世界的流行との戦いを助けてきたが、有効なワクチンのない感染主がまだ多数ある。ワクチン製造の現在の方法はいくつかの問題を提供する：（１）十分な大量の抗原材料の製造が多くの場合困難である；（２）多くの場合、ワクチン調剤が殺されていない、又は十分に弱毒されていない危険が伴う；（３）免疫学的に活性な形態で抗原エピトープを与えるのが非常に困難なので、有効なワクチンの製造が多くの場合困難である：（４）多くのワクチンの場合、抗原成分の遺伝的変異により新しい血清学的特異性を有する新しい株が発生し、新しいワクチンの開発の必要が再び生まれる。
【００１５】
ワクチン製造におけるこれらの問題の多くの克服のために２種類のウィルスＤＮＡベクターが開発されてきた。これらは組み替えウィルス又はキメラウィルスのいずれかを与える。組み替えウィルスは組み替えゲノムの回りに野生型ウィルスパッケージを含む。これらの粒子を用いて細胞を感染させ、それがその後組み替えゲノムから抗原タンパク質を生産する。キメラウィルスも組み替えゲノムを含むが、通常これは正常なウィルス構造タンパク質の一部として抗原の生産を指定し、それが子孫粒子中に包まれ、例えばウィルススパイク（ｓｐｉｋｅ）タンパク質の表面上に露出される。ワクチンとして用いる目的のこれらの種類のウィルス調剤の主要な利点は、１）それらを大規模に生産することができ、２）それらが生物の免疫系に自然な形態で抗原を与えることである。組み替えウィルスに感染した細胞は、外因性抗原生成物を合成し、それをペプチドにプロセシングし、その後それが正常な方法でＴ細胞にそれを与える。キメラウィルスの場合、さらにウィルス粒子自身のサブユニットの意味において抗原が露出される。従ってキメラウィルスはエピトープキャリヤーとも呼ばれる。
【００１６】
これらの種類のワクチン調剤の場合の主要な困難は、宿主において安全で限度のある副作用のない粒子の複製をいかに保証するかということである。これまで組み替えウィルス法の例としてワクシニアウィルスを用いて（６９）、及びキメラ粒子の例としてポリオウィルスを用いて（７０−７２）いくつかの成功を得てきた。両ウィルス変異体共、通常用いられるワクチン株に基づいているので、これらはそれぞれ組み替え体及びキメラ粒子として有用なワクチン候補であると主張され得る。しかし両ウィルスワクチン共副作用の危険と組み合わされ、重度の副作用の危険さえあり、さらにこれらのウィルス株はすでに多くの国で人口の大部分にワクチンとして使用されている。
【００１７】
前記の議論から明らかな通り、種々の動物細胞において重要なタンパク質又はポリペプチドを高収率で容易に製造するために、及び種々の病原体に対する安全で有効なワクチンとして使用するための組み替えウィルス又はキメラウィルスの製造のために、改良ＤＮＡ発現系の開発が非常に必要とされている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、タンパク質及びポリペプチドの製造のために、及び組み替えウィルス又はキメラウィルスとして用いることができ、先行技術より多くの利点を与える、ウィルスベクターに基づいた改良ＤＮＡ発現系の提供である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明に従えば、アルファウィルスＲＮＡゲノムから誘導され、動物の宿主細胞に有効に感染させることができるＲＮＡ分子を提供し、そのＲＮＡ分子は該アルファウィルスＲＮＡの複製に必須である完全アルファウィルスＲＮＡゲノム領域を含み、さらに該宿主細胞中でその機能を発現できる外因性ＲＮＡ配列を含み、該外因性ＲＮＡ配列はＲＮＡ分子中のその複製に必須でない領域に挿入される。
【００２０】
アルファウィルスは、正の極性を有する一重鎖ＲＮＡゲノムがウィルススパイクタンパク質を含むエンベロープにより囲まれたヌクレオキャプシド中に封入されたトガウィルスの科に属する属である。
【００２１】
アルファウィルス属は中でもシンドビスウィルス、セムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）及びロスリバーウィルス（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）を含み、これらはすべて密接に関連している。本発明の好ましい具体化に従い、セムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）をＤＮＡ発現系の基礎として用いる。
【００２２】
外因性ＲＮＡ配列は、ウィルス又は宿主細胞に与えるべき所望の遺伝的特性をコードし、通常該配列は該遺伝的特性をコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列と相補的である。該ＤＮＡ配列は細菌又は哺乳類遺伝子などの単離された天然の遺伝子を含むことができ、又は所望の遺伝的特性、すなわち酵素、ホルモンなどの所望の生成物の発現、又は外因性抗原エピトープあるいは決定基を指定するペプチド配列の発現をコードする合成ＤＮＡ配列を構成していることもできる。
【００２３】
外因性ＲＮＡ配列がタンパク質又はポリペプチドなどの生成物をコードする場合、それをウィルスＲＮＡゲノムに挿入し、その欠失した構造タンパク質コード領域に置換されるが、ウィルスエピトープをコードするＲＮＡ配列は基本的に欠失を含まないか又はわずかなヌクレオシドしか欠失していないウィルスＲＮＡゲノムの構造タンパク質コード領域に挿入することができる。
【００２４】
ＲＮＡ分子はそれ自体溶液中で、例えばＤＥＡＥ−デキストラン法又はリン酸カルシウム沈澱法などの従来のトランスフェクションにより動物細胞の形質転換に用いることができる。しかし細胞を感染性ウィルス粒子に感染させることにより形質転換すると、細胞の形質転換の速度、従って発現の速度を実質的に増すことがてきると思われる。従って本発明の適した具体化は、感染性粒子中にパッケージされた発明のＲＮＡ分子を含むＲＮＡウィルス発現ベクターに関し、感染性粒子はアルファウィルススパイクタンパク質を含む膜により囲まれた該ＲＮＡをアルファウィルスヌクレオキャプシド中に含む。
【００２５】
本発明のＲＮＡ分子はそのような粒子中に自由にパッケージすることができ、但しその全体の寸法は野生型アルファウィルスＲＮＡゲノムに対応するか又は該感染性粒子中に該ＲＮＡをパッケージするのに適合する程度で変動する。
【００２６】
パッケージされた組み替えゲノムを含み、純粋で高力価の組み替えウィルス株を製造するこれらの感染性粒子は、正常なウィルス粒子の感染により外因性遺伝子又はＤＮＡ配列を発現する手段となり、形質転換の程度に関してＲＮＡトランスフェクションよりずっと有効である。
【００２７】
本発明の適した具体化に従い動物宿主細胞を、構造ウィルスタンパク質をコードする領域の一部又は全部の欠失した本発明のＲＮＡと、ＳＰ６プロモーター領域、ＲＮＡ複製に必要なシス作用シグナル（ｃｉｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）をコードするアルファウィルスｃＤＮＡの５’及び３’領域、及びウィルス構造タンパク質をコードする領域を含むが基本的にヌクレオキャプシド粒子内へのＲＮＡのパッケージングのためのＲＮＡシグナルをコードする配列を含む非構造ウィルスタンパク質コード領域をすべて欠失したヘルパーＤＮＡベクターから試験管内で転写されたヘルパーＲＮＡ分子と共にコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、宿主細胞を培養することによりそのような感染性粒子を製造する。
【００２８】
本発明の他の特徴に従い、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により動物宿主細胞への本発明のＲＮＡの有効な導入を行う。例えばベビーハムスター腎臓（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞の場合、本発明のＳＦＶ  ｃＤＮＡから誘導されたＲＮＡ転写物の導入に関してほとんど１００％という形質転換の程度が得られた。これにより、抗体沈降（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によりあらかじめ濃縮する必要なくタンパク質を全細胞ライセート中で追跡できる程の多量の外因性タンパク質製造を各細胞で達成することが可能になる。
【００２９】
エレクトロポレーションにより、本発明のパッケージされたＲＮＡを含む感染性粒子の製造のために、上記の方法で高度のコトランスフェクションを行うことも可能である。基本的にすべての動物細胞は本発明のＲＮＡ分子及びヘルパーＲＮＡ分子の両方を含み、非常に有効なトランス相補性及び感染性粒子の形成に導く。最高１０9−１０10個の感染粒子を含む純粋な組み替えウィルス株を、５ｘ１０6個のコトランスフェクションされた細胞からわずか２４時間の培養の後に得ることができる。さらにそのようにして得られたウィルス株は、所望の組み替えゲノムのみを含み、宿主細胞に感染することはできるが新しい子孫ウィルスを製造できないウィルスから成るので、非常に安全に用いることができる。
【００３０】
コトランスフェクションされた細胞中で組み替えウィルスを製造する時、野生型ウィルスゲノムの再生が理論的に起こり得る。しかし条件付致死突然変異をヘルパーゲノムの構造部分に挿入することにより、そのようなウィルスの拡散の可能性は除去することができる。そのような突然変異は本出願の実験部分で記載する。従ってそのようなヘルパーを用いて製造されたウィルスは試験管内で特殊な条件下で処理しないと非感染性である。
【００３１】
エレクトロポレーションの方法はバイオテクノロジーの分野で周知であり、当該技術における熟練者により最適条件を確立することができる。例えばそのような方法を行うのにＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。
【００３２】
本発明のＲＮＡ分子は、最初アルファウィルスＲＮＡから製造され、所望の遺伝的特性をコードする外因性ＤＮＡフラグメントを挿入されたｃＤＮＡクローンの生体内又は試験管内転写によって誘導する。
【００３３】
従って本発明は、アルファウィルスＲＮＡ又はその部分と相補的でＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流に位置する全長又は部分的ｃＤＮＡを含み、５’ＡＴＧＧ、５’ＧＡＴＧＧあるいは他の５’末端及びＴＴＴＣＣＡ69ＡＣＴＡＧＴあるいは他の３’末端を有するＤＮＡ発現ベクターにも関する。
【００３４】
本発明の１つの特徴に従うと、ウィルスｃＤＮＡの一部は欠失しており、欠失はウィルス構造タンパク質をコードする全又は部分的領域を含み、さらにベクターは組み込まれたポリリンカー領域を含み、それはＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＸｍａＩに対応し、異種ポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＤＮＡフラグメントがその後の動物宿主細胞における発現のためにベクターｃＤＮＡに挿入できるような位置に挿入されている。
【００３５】
本発明の他の特徴に従い、ベクターは全長ｃＤＮＡを含み、その場合異種エピトープペプチド配列をコードする外因性ＤＮＡフラグメントはウィルス構造タンパク質をコードする領域に挿入することができる。
【００３６】
その外因性ＤＮＡ挿入物を含むこのｃＤＮＡクローンは、トランスフェクションにより動物細胞に導入された後、非常に有効に複製されることが認められている。
【００３７】
本発明の非常に重要な特徴は、広範囲の動物起源の宿主細胞に適用できることである。これらの宿主細胞はトリ、哺乳類、爬虫類、両生類、昆虫及び魚類細胞から選ばれることができる。哺乳類細胞の例は、ヒト、サル、ハムスター、マウス及びブタ細胞である。適したトリ細胞はチキン細胞であり、爬虫類細胞としてはヘビ細胞を用いることができる。かえる及び蚊ならびにハエ（ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からの細胞はそれぞれ両生類及び昆虫細胞の例である。本発明の非常に有効なウィルスベクター／宿主細胞系は、ＳＦＶ／ＢＨＫ細胞に基づき、下記にてさらに詳細に議論する。
【００３８】
しかし、本発明のＤＮＡ発現ベクターの非常に重要な利点はそれが多様な動物細胞において有効なことであるが、それは他の真核細胞及び原核細胞でも用いることができる。
【００３９】
本発明は又、本発明のＲＮＡ分子を用いた、あるいはｃＤＮＡを含み、外因性ＤＮＡフラグメントを運ぶ本発明の転写ベクターを用いた細胞のトランスフェクションを含む、形質転換された動物宿主細胞の製造法に関する。本発明の適した具体化に従い、トランスフェクションは上記のエレクトロポレーション法により行われ、非常に高いトランスフェクション率が得られる。
【００４０】
さらに適した形質転換法は、本発明のＲＮＡ分子を含む上記の感染性ウィルス粒子による動物宿主細胞の感染に基づく。
【００４１】
本発明の形質転換細胞は種々の目的に用いることができる。
【００４２】
本発明の１つの重要な特徴は、形質転換細胞を培養して外因性ＲＮＡを発現させ、続いて該発現により形成された生成物を単離精製することにより、ポリペプチド又はタンパク質を生産するための本発明の形質転換細胞の利用に関する。形質転換細胞は、上記のポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＲＮＡを含む本発明のウィルス粒子による感染により、又はｃＤＮＡを含み、ポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＤＮＡフラグメントを運ぶ本発明のＤＮＡベクターの試験管内転写により得られるＲＮＡ転写物を用いたトランスフェクションにより製造することができる。
【００４３】
本発明の他の重要な特徴は、ワクチンにおける免疫化成分として用いるための、又は抗血清製造のための免疫化成分の生体内製造のための免疫化目的のキメラウィルス粒子を含む抗原の生産のための、本発明の形質転換細胞の利用に関する。
【００４４】
従って本発明は、その構造タンパク質内に挿入された外因性エピトープペプチド配列を有するキメラアルファウィルスを含む抗原にも関する。
【００４５】
キメラアルファウィルスはＳＦＶから誘導するのが好ましい。
【００４６】
適した具体化に従い、外因性エピトープペプチド配列はヒト免疫不全ウィルス型を含む免疫不全ウィルス種に属するウィルスの構造タンパク質から誘導されたエピトープペプチド配列を含む。
【００４７】
本発明の他の特徴は、該抗原を免疫化成分として含むワクチン調剤に関する。
【００４８】
該ワクチンの場合、前記の条件付致死ＳＦＶ−突然変異、アンバー（停止コドン）又は温度感受性突然変異などの突然変異をそのゲノム中に含むことによりキメラアルファウィルスが適当に弱毒される。
【００４９】
例えば前記の条件付致死突然変異（形態形成の間に宿主細胞においてある種のタンパク質分解的分裂を行うことが欠失している）をその構造タンパク質中に含むキメラウィルス粒子をワクチンとして用いる場合、これは生物に与えられる前に限定タンパク質分解的処理により最初に活性化され、受容細胞に感染できるようにする。新しいキメラ粒子が活性化ウィルスに感染した細胞中で形成されるが、これらは再び致死表現型であり、感染がさらに拡散することはできない。
【００５０】
本発明はまた、
ａ）異種エピトープペプチド配列をコードする外因性ＤＮＡフラグメントを運ぶ本発明のＤＮＡベクターのｃＤＮＡの試験管内転写、及び製造されたＲＮＡ転写物を用いた動物宿主細胞のトランスフェクション又はｂ）上記段階ａ）の該ｃＤＮＡを用いた動物宿主細胞のトランスフェクション、
トランスフェクションされた細胞の培養及びキメラアルファウィルス抗原の回収を含む、本発明の抗原の製造のための方法に関する。トランスフェクションはエレクトロポレーションにより行うのが好ましい。
【００５１】
本発明のさらに別の特徴は、ポリペプチド抗原をコードする外因性ＲＮＡを含む組み替えウィルスの、予防接種の目的又は抗血清の生産のための利用である。この場合組み替えウィルス又はその条件付致死突然変異体を用いて生体内で細胞を感染させ、感染細胞中で抗原の製造を起こし、免疫系への抗原の提示に用いる。
【００５２】
本発明の他の具体化に従い、
外因性エピトープペプチド配列をコードする外因性ＲＮＡを含む本発明の感染性粒子を生体内感染に用いることにより本発明の抗原を生物内で製造する。
【００５３】
以下において、代表的アルファウィルスであるセムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）と関連して本発明をより詳細に説明する。この説明は添付図面と関連させてより十分に理解することができる。図面中：
図１はセムリキ森林熱ウィルスの生活環に含まれる主要集合（ｍａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）及び解体（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）の略図であり、ｐ６２分裂及びｐＨによるＳＦＶ侵入機能（ｅｎｔｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の活性化の調節も示す。
【００５４】
図２はＳＦＶの構造タンパク質の合成の間の転移シグナルの利用を示し；上図は２６ＳサブゲノムＲＮＡの遺伝子地図であり；中図はＰ６２、６Ｋ及びＥ１タンパク質の膜転移の過程であり；内腔の側上の小さい矢印はシグナルペプチダーゼ分裂を示し；下図では３種類のシグナルペプチドの特性を挙げている。
【００５５】
図３は発現ベクターとしてＳＦＶが特に選ばれる特徴を示す。
【００５６】
図４Ａ−ＣはＳＦＶの全長感染性クローンの構築を示し；図４ＡはＳＦＶゲノムの図解制限地図を示し；ｃＤＮＡ合成の開始に用いられるプライマーを矢印で示し、最終クローンの組み立てに用いられるｃＤＮＡ挿入物を棒で示し；図４ＢはプラスミドｐＰＬＨ２１１、すなわちＳＦＶの全長感染性クローンのためのキャリヤーとして用いられるＳＰ６発現ベクター及び得られるプラスミドｐＳＰ６−ＳＦＶ４を示し；図４ＣはＳＦＶクローンのＳＰ６プロモーター領域の構造を示し；点描の棒はＳＰ６プロモーター配列を示し、転写される第１のヌクレオチドを星印により記し；下線の領域は真性ＳＦＶ配列を示す。
【００５７】
図５はＤＮＡ（Ｕ＝Ｔ）としてのｐＳＰ６−ＳＦＶ４  ＲＮＡ転写物の完全ヌクレオチド配列、及びＤＮＡ配列の下に非−構造ポリプロテイン及び構造ポリプロテインのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
図６は試験管内製造ＲＮＡの細胞中へのトランスフェクションの後のウィルス製造のためのＳＦＶ  ｃＤＮＡ発現系を示す。
【００５９】
図７はＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１−３及びヘルパー１の構築を示す。
【００６０】
図８はＳＦＶベクタープラスミドｐＳＦＶ１−３のポリリンカー領域を示し；サブゲノム２６Ｓ  ＲＮＡのためのプロモーターの位置は四角で囲んであり、転写するべき最初のヌクレオチドを星印で記す。
【００６１】
図９はヘルパートランス相補性を用いた感染性粒子中へのｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ  ＲＮＡの生体内パッケージングの略図である（ｄｈｆｒはジヒドロ葉酸レダクターゼを意味する）；
図１０はｐ６２からＥ２及びＥ３への分裂によるｐ６２−含有非感染性ウィルス粒子の感染性粒子への変換のためのトリプシンの利用を示す。
【００６２】
図１１はエレクトロポレーションによりＲＮＡトランスフェクションした場合のＢＨＫ細胞における異種タンパク質の発現を示す。
【００６３】
図１２は上図にてＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生ずるＳＦＶの主要抗原部位及び試験管内製造置換基を含む配列、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質の主要中和ドメインに及ぶ配列、及びＳＦＶキャリヤータンパク質Ｅ２にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドとして挿入されたＨＩＶドメインを示し；下図は野生型又はキメラ形態におけるドメイン２４６−２５１のブローアップ（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）を有するＳＦＶスパイク構造の略図である。
【００６４】
アルファウィルス  セムリキ森林熱ウィルス（下文でＳＦＶと省略する）は、ウィルス学及び生物学の両方において膜の生合成、膜の構造及び膜の機能、ならびにタンパク質−ＲＮＡ相互作用の研究のためのモデル系として約２０年間用いられてきた（４，５）。そのようなモデルとしてＳＦＶを用いる主な理由はその単純な構造及び有効な複製にある。
【００６５】
図１−３を参照し、以下においてＳＦＶ及びその複製をより詳細に説明する。基本的部分において本発明はシンドビスウィルスなどの他のアルファウィルスについても当て嵌まり、これに関連して引用されている多くの参照文献は実際にシンドビスウィルスに向けられている。ＳＦＶはＲＮＡ−含有ヌクレオキャプシド及び脂質二重層とタンパク質を含む回りの膜を含み、Ｃタンパク質と呼ばれるタンパク質の２０面体殻が規則的に配置されてキャプシドを形成し、その内側にゲノムＲＮＡが包まれている。キャプシドはＥ１、Ｅ２及びＥ３と呼ばれる３種類のタンパク質を含む脂質二重層により囲まれている。これらのいわゆるエンベロープタンパク質は糖タンパク質であり、そのグリコシル化部分が脂質二重層の外側にあり、これらのタンパク質の複合体が“スパイク”を形成し、それは電子顕微鏡によりウィルスの表面から外側に突き出ているのが見られる。
【００６６】
ＳＦＶゲノムは、１１４２２ヌクレオチドの一重鎖５’−キャップド及び３’−ポリアデニル化ＲＮＡ分子である（６，７）。それは正の極性を有し、すなわちｍＲＮＡとして機能し、むきだしのＲＮＡは細胞の細胞質中に導入されると感染を開始することができる。ウィルスが宿主細胞の形質膜上のタンパク質レセプターに結合すると感染が開始され、それによりウィルスが形質膜の表面上の“コーテッドピット（ｃｏａｔｅｄ  ｐｉｔｓ）”内に選択的に挿入され、それが陥入して被覆小胞を細胞中に形成し、その後該小胞を有するエンドサイトーシスされたビリオンが急速にエンドソームと呼ばれるオルガネラと融合する。ウィルスはエンドソームから細胞の細胞質ゾルにむきだしのヌクレオキャプシドとして逃げ、ウィルスのエンベロープがエンドソームに残る。その後ヌクレオキャプシドは“脱外被”され、従ってゲノムＲＮＡが放出される。ここで図１を参照すると、ゲノムの５’の３分の２のポリプロテインへの翻訳と共に感染が進行し、ポリプロテインが自己−分裂によるプロセシングにより４個の非構造タンパク質ｎｓＰ１−４となる（８）。タンパク質ｎｓＰ１はメチルトランスフェラーゼをコードし、それはウィルス−特異的キャッピング活性ならびに負ストランド合成を担い（９，１０）；ｎｓＰ２はプロテアーゼであり、これはポリプロテインをその４個の下部成分に切断し（１１，１２）；ｎｓＰ３はリンタンパク質であり、まだ機能は未知であり、ｎｓＰ４はＳＦＶ  ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む（１５，１６）。ｎｓＰタンパク質が合成されるとそれらは正ストランドゲノム（４２Ｓ）の全長負ストランドへの複製を担う。これらの分子はその後新しい４２ＳゲノムＲＮＡの製造の鋳型として働く。それらは又、サブゲノム（２６Ｓ）ＲＮＡの合成の鋳型としても働く。この４０７３ヌクレオチド長のＲＮＡはゲノムの最後の３分の１と共直線状であり、その合成は４２Ｓ負ストランド上の２６Ｓプロモーターにて内部的に開始される。
【００６７】
キャプシド及びエンベロープタンパク質は異なる区画で合成され、それらは細胞質を通る別々の経路に従い、すなわちエンベロープタンパク質は粗面小胞体に結合した膜−結合リボソームにより合成され、キャプシドタンパク質は細胞質ゾル中の遊離のリボソームにより合成される。しかし２６Ｓ  ＲＮＡはウィルスのすべての構造タンパク質をコードし、これらはポリプロテイン前駆体としてＣ−Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１の順で合成される（１９）。キャプシド（Ｃ）タンパク質が合成されるとそれは折り畳まれ、自己自身を新生鎖に切断するプロテアーゼとして働く（２０，２１）。合成されたＣタンパク質は前に複製されたゲノムＲＮＡに結合して細胞の細胞質中で新しいヌクレオキャプシド構造を形成する。
【００６８】
該切断により新生鎖中のＮ−末端シグナル配列が明らかになり、それはシグナル認識粒子により認識され、新生鎖−リボソーム複合体を小胞体膜に向け（２２，２３）、そこでそれは共翻訳的に転移し、シグナルペプチダーゼにより分裂して３個の膜構造タンパク質ｐ６２（Ｅ３／Ｅ２の前駆体の形態）、６Ｋ及びＥ１となる（２４，２５）。構造タンパク質の合成の間に用いられる転移シグナルを図２に示す。膜タンパク質は細胞の生合成輸送経路内で広範囲の転写後プロセシングを受ける。ｐ６２タンパク質は小胞体においてそのＥ３ドメインを介し、Ｅ１とヘテロダイマーを形成する（２６）。このダイマーは形質に輸送され、そこでスパイクヌクレオキャプシド相互作用を通してウィルス出芽が起こる。輸送の非常に後の段階（ゴルジ体−後）でｐ６２タンパク質は成熟ビリオンで見られる形態であるＥ３及びＥ２に分裂する（２７）。この分裂はビリオンの宿主細胞結合機能及びＥ１の膜融合能を活性化する。後者の活性は、ウィルスが新しい宿主細胞のエンドソームに入った後の第２の低−ｐＨ活性化段階に発現し、ウィルスヌクレオキャプシドの細胞の細胞質中への放出を担う（２８−３２）。成熟ウィルス粒子は、キャプシドタンパク質のＴ＝３対称の１８０個のコピー内に包まれた１個のＲＮＡゲノムのコピーを含み、Ｔ＝４対称の３個の群として配置されたＥ１＋Ｅ２＋Ｅ３を含むスパイクトリマータンパク質の２４０個のコピーを有する脂質二重層により囲まれている。
【００６９】
ＳＦＶ侵入機能はｐ６２分裂及びｐＨにより活性化され、調節される。さらに特定するとＥＲで形成されたｐ６２−Ｅ１ヘテロダイマーは耐酸性である。これらのヘテロダイマーがゴルジ複合体を介して形質膜に輸送されると、Ｅ１融合の活性化は複合体の解離を必要とするので、弱酸性環境にもかかわらずＥ１融合は活性化できない。図１に示す通り、放出されたウィルス粒子はＥ２Ｅ１複合体を含む。Ｅ２とＥ１の解離は酸性ｐＨに敏感なので、エンドサイトーシスを介した宿主細胞へのウィルスの侵入の間にエンドソームの酸性環境がスパイク複合体（Ｅ１  Ｅ２  Ｅ３）の解離を始めさせ、遊離のＥ１を生ずる。後者は上記の通り感染過程におけるウィルス及びエンドソーム膜の間の融合過程の触媒に関して活性化されることができる。
【００７０】
本発明の前部分で示した通りアルファウィルス系、特にＳＦＶ系はいくつかの独特の特徴を有し、それはＤＮＡ発現系において有利である。図３に関連して下記にまとめる。
【００７１】
１．正の極性のゲノム。ＳＦＶ  ＲＮＡゲノムは正の極性であり、すなわちそれは直接ｍＲＮＡとして機能し、従って感染性ＲＮＡ分子はゲノムの全長ｃＤＮＡコピーからの転写により得ることができる。
【００７２】
２．有効な複製。感染性ＲＮＡ分子はそれ自身のＲＮＡレプリカーゼをコードし、それが今度は有効なＲＮＡ複製を推進する。実際ＳＦＶは知られている最も有効な複製ウィルスの１つである。数時間内に正−ＲＮＡの最高２００．０００ものコピーが１個の細胞中で形成される。これらの分子が豊富なために、感染細胞の実際すべてのリボソームはウィルスにコードされたタンパク質の合成に巻き込まれ、宿主タンパク質の合成を圧倒し、感染細胞のパルス標識法はほとんどウィルスタンパク質のみを標識する結果となる。正常な感染の間に１０5個の新しいウィルス粒子が１個の細胞から製造され、これは少なくとも１０8個のタンパク質分子がウィルスゲノムによりコードされた計算になる（５）。
【００７３】
３．細胞質複製。ＳＦＶ複製は細胞の細胞質中で起こり、そこでウィルスレプリカーゼは構造タンパク質の製造のためのサブゲノムを転写し、キャップする（１９）。この特徴をｃＤＮＡ発現系に含むのは明らかに非常に有用であり、ｍＲＮＡのスプライシング、転写因子の限度、キャッピング効率及びｍＲＮＡ輸送に関する問題などの、従来の“核”ＤＮＡ発現系において遭遇する多くの問題が除去される。
【００７４】
４．細胞変性効果の遅い開始。感染細胞の細胞変性効果は、感染におけるいくらか遅い時期に現れる。従って感染後約４時間から最高感染後２４時間という広い時間枠があり、その間、構造タンパク質の非常に高い発現レベルと無視し得る程度の形態学的変化が組み合わされている。
【００７５】
５．広い宿主域。この現象はおそらく、自然界における節足動物ベクターから野生囓歯類（ｒｏｄｅｎｔ）及び鳥に至る伝達を含む正常な生活環の結果である。実験室条件下でＳＦＶは培養された哺乳類、トリ、爬虫類及び昆虫の細胞に感染する（３５）（Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ，ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【００７６】
６．自然には、ＳＦＶは人に対して病原性が非常に低い。さらに組織培養細胞中で製造されたウィルス株は明らかに非病原性である。特異的突然変異を用い、ウィルス株の大量生産が必要な場合に安全性を支えるのに非常に有用な特徴であるＳＦＶ条件付致死突然変異体の創造が可能である。
【００７７】
本明細書では、ヌクレオチド及びアミノ酸配列において以下の略字を用いた：Ａｌａ、アラニン；Ｉｌｅ、イソロイシン；ｌｅｕ、ロイシン；Ｍｅｔ、メチオニン；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｐｒｏ、プロリン；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｖａｌ、バリン；Ａｓｎ、アスパラギン；Ｃｙｓ、システイン；Ｇｌｎ、グルタミン；Ｇｌｙ、グリシン；Ｓｅｒ、セリン；Ｔｈｒ、トレオニン；Ｔｙｓ、チロシン；Ａｒｇ、アルギニン；Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｌｙｓ、リシン；Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ａ、アデニン；Ｃ、シトシン；Ｇ、グアニン；Ｔ、チミン；Ｕ、ウラシル。
【００７８】
以下の実施例において用いた材料及び一般的方法を下記に記載する。
【００７９】
１．材料。ほとんどの制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、ウシ腸ホスファターゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）から得た。ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ及びＫｐｎＩならびにＲＮアーゼインヒビター（ＲＮアシン）及びＳＰ６ポリメラーゼはＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。シークエナーゼ（修正Ｔ７ポリメラーゼ）はＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から得た。プロテイナーゼＫはＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）から得た。リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド及びキャップ類似体ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの合成機３８０Ｂを用いて製造し、その後ＨＰＬＣ及びＮＡＰ−５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）精製を行った。スペルミジン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、クレアチンホスフェート及びクレアチンホスホキナーゼはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｅｓ，Ｍｏ）から得た。パンソルビンはＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）かに得た。アガロースはＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）から、アクリルアミドはＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入した。Ｌ−［35Ｓ］−メチオニン及びα−［35Ｓ］−ｄＡＴＰ−α−ＳはＡｍｅｒｓｈａｍから得た。
【００８０】
２．ウィルスの成育及び精製：ＢＨＫ−２１細胞は、５％のウシ胎児血清、１０％のトリプトースホスフェートブロス、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）及び２ｍＭのグルタミンを補ったＢＨＫ培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で成育した。９０％の集密的細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのグルタミンを含むＭＥＭ中のＳＦＶに０．１の多重度で感染させた。感染後（ｐ．ｉ．）２４時間で培地を集め、４℃にて８，０００ｘｇの遠心を２０分間行うことにより細胞破片を除去した。４℃のＳＷ２８ローター中、２６，０００ｒｐｍで１．５時間遠心することによりウィルスを培地からペレット化した。ウィルスは０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＴＮ中に再懸濁した。
【００８１】
３．代謝標識（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）及び免疫沈降。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、０．２％のＢＳＡ、１００ＩＵ／モルのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補ったＭＥＭ中で成育したＢＨＫ細胞の集密的細胞単層に３７℃にて５０の多重度で感染させた。１時間ｐ．ｉ．後、培地を新しい培地と交換し、３．５時間成育を続けた。培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのグルタミンを含むメチオニン−非含有ＭＥＭを上に載せた。３７℃にて３０分後、培地を１００μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む同培地と交換し、プレートを３７℃にて１０分間培養した。１０倍過剰のメチオニンを含む標識培地で細胞を２回洗浄し、その後同培地中で種々の時間の間培養した。プレートを氷上に置き、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、最後に１０μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含むライシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（１％ＮＰ−４０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−２ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。細胞をプレートから砕き、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機にて４℃、６，０００ｒｐｍで５分間遠心することにより核を除去した。記載されている通りにタンパク質の免疫沈降を行った（３１）。簡単に記載すると、ライセートに抗体を加え、混合物を氷上に３０分間保った。氷上で３０分間パンソルビンに結合することにより複合体を回収した。複合体を低塩緩衝液（ｌｏｗ  ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ）で１回、高塩緩衝液で１回、及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌで１回洗浄してからゲル負荷緩衝液と共に加熱した。ｄｈｆｒを沈降させるために、ＳＤＳを０．１％まで加え、混合物を９５℃に２分間加熱し、その後１０体積のライシス緩衝液を加えた。抗−Ｅ１［８．１３９］、抗−Ｅ２［５．１］及び抗Ｃ［１２／２］（３７）単クローン性抗体は記載されている。腹水液中の単クローン性抗体ＯＫＴ−９を用いてヒトトランスフェリンレセプターを沈降させた。この調剤は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＴｙｐＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）Ｎｏ  ＣＲＬ  ８０２１から得た対応するハイブリドーマ細胞系を用いて我々の実験室においてＴｈｏｍａｓ  Ｅｂｅｌにより与えられた。多クローン性うさぎ抗マウスｄｈｆｒは、Ｅ．Ｈｕｒｔ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）からの親切な贈り物であり、うさぎ抗−リゾチームは記載されている（３８）。
【００８２】
４．蛍光抗体法。間接蛍光抗体法を行うために、ガラスのカバーグラス上の感染細胞単層を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回濯ぎ、−２０℃のメタノール中で６分間固定した。固定後、メタノールを除去し、カバーグラスをＰＢＳで３回洗浄した。０．５％のゼラチン及び０．２５％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で培養することにより、非特異的抗体結合を阻止した。阻止緩衝液を除去し、一次抗体を含む同緩衝液と交換した。室温で３０分後、ＰＢＳで３回洗浄することにより反応を止めた。一次抗体の場合と同様にして二次抗体（ＦＩＴＣ−複合羊抗−マウス［ＢｉｏＳｙｓ，Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ］）の結合を行った。ＰＢＳで３回洗浄し、水で１回濯いだ後、カバーガラスを乾燥させてから２．５％のＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ−［２．２．２］−オクタン）を含むＭｏｖｉｏｌ  ４−８８（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｄｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，ＦＲＧ）中に固定した。
【００８３】
５．ＤＮＡ法。プラスミドをエシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｏｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［ｒｅｃＡ  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉｌ  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  φ８０ｄｌａｃＺΔ（Ｍ１５）］中で成育した。すべての基礎的ＤＮＡ法は、基本的に記載の通りに行った（３９）。収率と純度を増すために凍結段階の間に３体積のフェノールを含んだ凍結−解凍法（４０）によりＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離した。フラグメントを、ベンゾイル−ナフトイル−ＤＥＡＥ（ＢＮＤ）セルロース（Ｓｅｒｖａ  Ｆｅｉｎ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）クロマトグラフィーにより精製した（４１）。感染ＲＮＡの製造に用いたプラスミドは、１ＭのＮａＣｌを通した沈降及びその後ＣｓＣｌ中でバンド形成することにより精製した（３９）。ある場合には、Ｑｕｉｇｅｎクロマトグラフィー（Ｄｉａｇｅｎ  Ｇｍｂｈ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，ＦＲＧ）によりプラスミドを精製した。
【００８４】
６．特定部位のオリゴヌクレオチド突然変異誘発。オリゴヌクレオチド突然変異誘発のために、ＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンの適したフラグメントをＭ１３ｍｐ１８又はｍｐ１９中にサブクローニングし（４２）、ＤＨ５αＦＩＱ［ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉｌ  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  φ８０ｄｌａｃΔ（Ｍ１５）  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９／Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃｌq  ｌａｃＺΔ（Ｍ１５）  Ｔｎ  ５］（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に形質転換した（４３）。これらの構築物からのＲＦ  ＤＮＡをＲＺ１０３２［Ｈｆｒ  ＫＬ１６  ｄｕｔ１  ｕｎｇ１  ｔｈｉ１  ｒｅｌＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｚｂｄ２７９：Ｔｎ１０．］中に形質転換し（４４）、ウリジンの存在下でウィルスを成育し、ウラシル残基をウィルスゲノム中に挿入した。一重鎖ＤＮＡをフェノール抽出によりＰＥＧ沈降ファージから単離した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ合成機上でオリゴヌクレオチドを合成し、ＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過により精製した。オリゴヌクレオチド  ５’−ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＣＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＧ、５’−ＧＣＧＣＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧ及び５’−ＧＣＧＣＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧを用いて新しいリンカー部位［ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＸｍａＩ］をＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンに挿入した。オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＣＧ及び５’−ＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧをシークエンシングプライマー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）（ＳＰ１及びＳＰ２）としてポリリンカー部位の上流及び下流で用いた。リン酸化オリゴヌクレオチドを前に述べられた通りシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）と共に突然変異誘発で用いた。試験管内製造ＲＦ形態をＤＨ５αＦ’ＩＱ中に形質転換し、得られたファージ単離物を、シークエナーゼの利用に関するＵＳＢの案に従ってジデオキシシークエンシング（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により正しい突然変異の存在に関して分析した。最後に突然変異フラグメントを全長ＳＦＶ  ｃＤＮＡクローン中に再挿入した。この場合も適した突然変異の存在をプラスミドＤＮＡからのシークエンシングにより確認した。６Ｋ領域の欠失は他に記載されている。
【００８５】
７．試験管内転写。ＳｐｅＩ直線化プラスミドＤＮＡを試験管内転写の鋳型として用いた。４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのスペルミジン−ＨＣｌ、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼ非含有ＢＳＡ、それぞれ１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、５００μＭのＧＴＰ、１単位／μｌのＲＮアシン及び１００−５００単位／ｍｌのＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含む１０−５０μｌの反応において３７℃にて１時間ＲＮＡを合成した。キャップド転写物（４６）の製造の場合、類似体ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ （５’）Ｇ又はｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａを１ｍＭにて反応中に含んだ。ＲＮＡ製造の定量のために微量の［α−32Ｓ］−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を反応中に含み、挿入を三塩化酢酸沈澱から測定した。必要な場合はＤＮアーゼ１又はＲＮアーゼＡをそれぞれ１０単位／μｇ鋳型あるいは２０μｇ／ｍｌで加えることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡを３７℃にて１０分間消化した。
【００８６】
８．ＲＮＡトランスフェクション。ＤＥＡＥ−デキストラン法によるＢＨＫ単層細胞のトランスフェクションを前に記載の通りに行った（４７）。エレクトロポレーションによるトランスフェクションの場合、ＲＮＡは試験管内転写反応から直接、又は５ｍＭのＤＴＴ及び１単位／μｌのＲＮアシンを含む緩衝液で転写物を希釈して加えた。細胞をトリプシン処理し、完全ＢＨＫ−細胞培地で１回、及び氷冷ＰＢＳ（ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を含まない）で１回洗浄し、最後にＰＢＳに再懸濁して１０7細胞／ｍｌとした。細胞は直接使用するか又は氷上で終夜保存（ＢＨＫ培地中）した。エレクトロポレーションの場合、０．５ｍｌの細胞を０．２ｃｍのキューベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）（ＢｉｏＲａｄ）に移し、１０−５０μｌのＲＮＡ溶液を加え、キューベットを逆さにすることにより溶液を混合した。パルス制御装置を最大抵抗に設定したＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置を用い、１．５ｋＶ／２５μＦの２回の連続パルスにより、室温でエレクトロポレーションを行った。１０分間培養した後、細胞を完全ＢＨＫ−細胞培地中に１：２０で希釈し、組織培養皿に移した。プラーク分析のために、エレクトロポレートした細胞を１ｍｌ当たり約３ｘ１０5個の新しい細胞と共にプレート化し、３７℃で２時間培養し、その後完全ＢＨＫ−細胞培地中の１．８％の低融点アガロースを上に載せた。３７℃で４８時間培養した後、ニュートラルレッドで染色することによりプラークを視覚化した。
【００８７】
９．ゲル電気泳動。ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミド  ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の試料を調製し、前に記載されている通りに（４８）５％の堆積ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）を含む１２％の分離ゲル（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｇｅｌ）上で実験した。６Ｋペプチドの分離の場合、アクリルアミドの１０％−２０％直線勾配ゲルを用いた。Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに露光する前に、ゲルを１０％酢酸−３０％メタノール中で３０分間固定した。ゲルをフルオログラフィー（４９）用に調製した場合、それを固定後に３０％メタノール中で３０分間洗浄し、その後１Ｍのサリチル酸ナトリウム−３０％のメタノール中に３０分間浸漬してから乾燥した。核酸は、５０ｍＭのトリス−ボレート−２．５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡを緩衝液として用いたアガロースゲル上で実験した。染色の場合、実験中に０．２μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを緩衝液及びゲルに含んだ。
【００８８】
【実施例】
実施例１
この実施例では全長ＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンを調製し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプラスミド中に置き、全長及び感染性転写物の試験管内転写をさせる。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４と称されるこのプラスミドを、１９９１年１１月２８日にＰＨＬＳ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ：に供託し、暫定受け入れ番号９１１１２８２６を与えられた。
【００８９】
図４Ａ−Ｃに示す通り、ＳＦＶクローン構築の戦略は、ＳＦＶ  ＲＮＡ分子の既知のヌクレオチド配列によって指定される適した制限エンドヌクレアーゼ部位の下流の、鋳型ＲＮＡに沿った数箇所でｃＤＮＡ合成を開始することである。ウィルスＲＮＡを精製ウィルス（中でもＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＵＳＡのＡｒｂｏｖｉｒｕｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能）からフェノール−クロロホルム抽出により単離し、前に記載されている通り（５０）ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。第１のストランド合成は、５’−ＴＴＴＣＴＣＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＧＴＣをプライマー−１として（ＳＦＶは２０４２−２０６２に相当する）及び５’−ＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＴＡＡＴＡをプライマー−２として（ＳＦＶは３３２３−３３４９に相当する）ならびにオリゴ−ｄＴ12-18をプライマー−３として（ＳＦＶの３’−末端）用いて３位置で開始した。
【００９０】
第２のストランド合成の前に、第１のストランドｃＤＮＡへのオリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＣ（ＳＦＶのゲノム配列の２８個の最初の塩基と同一）のハイブリッド化を行った。第２のストランド合成の完了後、ｃＤＮＡを裁断し（ｔｒｉｍｍｅｄ）、プライマー−１の反応の場合を除いたすべての場合に二重鎖アダプター５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴ／ＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＡ−３’（５’−付着−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＸｍａＩＩＩ−ＳｐｅＩ−ブラント−３’）を加え、記載されている通りに（５１）ｃＤＮａをＥｃｏＲＩ切断ｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中にクローニングした。５’末端領域のクローニングは、異なる方法で行った。ＳＦＶはＨｉｎｄＩＩＩ部位を１９４７位に含むので、プライマー−１を用いて開始したｃＤＮＡはこの領域を含まねばならず、従ってＨｉｎｄＩＩＩはそのｃＤＮＡの３’末端の指定に用いることができる。ＳＦＶの正に５’末端で制限部位を得るために、ｃＤＮＡをＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）中にクローニングした。ＳＦＶゲノムは配列５’−ＡＴＧＧで始まるので、ＳｍａＩ部位のブラントＣＣＣ−３’末端へのこの連結反応は、ＮｃｏＩ部位Ｃ’ＣＡＴＧＧを作る。ＳＦＶ配列は３個のＮｃｏＩ部位を含むが、これらのいずれもＨｉｎｄＩＩＩ部位の前の領域内になく、従ってこれらの５’末端クローンはさらにこの目的のために特に設計されたベクター中にＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングしなければならない(下記参照)。ｐＧＥＭ１中の最初のｃＤＮＡクローンを制限分析によりスクリーニングし、１５００ｂｐ以上の大きさの挿入物を含むものすべてを、挿入物の両端にＳＰ６又はＴ７シークエンシングプライマーを用いてプラスミドから直接シークエンシングすることによりさらに特性化するために選んだ。ｐＴＺ１８Ｒ中のＳＦＶ５’−末端クローンは、ｌａｃシークエンシングプライマーを用いてシークエンシングした。ＡＦＶ  ＲＮＡの試験管内合成を推進するためにＳＰ６プロモーターを用いた。あまり多くの異種ヌクレオチドを加えずにこのプロモーターの前のＳＦＶ５’末端をクローニングするために、ｐＧＥＭ１の誘導体を構築する必要があった。従ってｐＧＥＭ１をＥｃｏＲＩで開け、Ｂａｌ３１欠失を作り、ＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラント化し、Ｎｃｏｌオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＣＡＴＧＧＣ）を加えた。得られたクローンを、ＳＰ６プロモーターの転写開始部位（下線のＧ）に直接ＮｃｏＩ配列を有する変異体を拾い上げる（適した緊縮度で）ために設計されたオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣを用いたコロニーハイブリッド化（３９）によりスクリーニングした。Ｂａｌ３１欠失により最初のプラスミドの多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）のすべての制限部位が除去されたので、これらは新しい変異体からのＰｖｕＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ位で挿入されたＮｃｏ��部位を有する別のｐＧＥＭ１の変異体（ｐＤＨ１０１）にクローニングすることにより復活（ｒｅｓｔｏｒｅｄ）した。これによりプラスミドｐＤＨ２０１が作られた。最後にＳＦＶ  ｃＤＮＡのクローニングに用いられたアダプターをｐＤＨ２０１中のＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＰＬＨ２１１を作った（図４Ｂ）。このプラスミドを、全長クローンの組み立て物におけるＳＦＶ  ｃＤＮＡフラグメントの受容体として、これらの部位を用いて独立した重複サブクローンを結び付けることにより用いた。全長クローン、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４の組み立てに用いたフラグメント及び適した制限部位を図４Ａに示す。５’−末端の場合、選ばれたフラグメントは適したＳＦＶ配列５’−ＡＴＧＧを含み、前に追加のＧ−残基を１個有する。このＧ−残基を除去すると、ＳＰ６からの転写効率が低下するが試験管内製造ＲＮＡの感染性には影響しない。従ってこの後のすべての研究で用いるクローンは５’末端にＧ−残基を含む。クローンの３’−末端の場合、６９個のＡ−残基を含むｃＤＮＡフラグメントが選ばれた。ｃＤＮＡの３’−末端に独特のＳｐｅＩ部位を含むことにより、プラスミドは直線化することができ、試験管内でランオフ転写（ｒｕｎｏｆｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ができ、７０個のＡ−残基を有するＲＮＡを与える。図４ＣはＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンの５’及び３’境界配列を示す。全長ＳＦＶ  ＲＮＡの感染性をいかにして得、示すかの一般的な概略を図６に示す。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４  ＳＰ６転写物の完全ヌクレオチド配列を非構造及び構造タンパク質のアミノ酸配列と共に図５に示す。
【００９１】
典型的に１００ｎｇの鋳型当たり約５μｇのＲＮＡが１０単位のポリメラーゼを用いて得られたが、より多量の酵素を用いることによって収率の有意な向上は得られなかった。条件はアルファウィルスの感染性転写物の製造に関して以前に報告された（５２）（４７）条件と少し異なる。１ｍＭのｒＮＴＰ濃度でＲＮＡの最大の製造が得られた。しかし感染性は５’キャップ構造の存在にも依存するので、転写反応におけるＧＴＰ濃度を半分にした時に最適感染性が得られた。この低下は製造されるＲＮＡの量には限界的影響しか与えないが、特異的感染性を３倍に上げた（データは示していない）。
【００９２】
図５に示すｃＤＮＡ配列を以下の実施例で用いた。しかし図５中の最初の５’−Ｇヌクレオチドを欠いたＳＦＶ  ｃＤＮＡ配列の場合に上記で示した通り有効性は低いとしても、１個又は数個のヌクレオチドが図５に示した配列と異なっている配列もベクターとして有用である。
【００９３】
実施例２
この実施例ではＳＦＶ  ＤＮＡ発現ベクターの構築を開示する。
【００９４】
実施例１で得たＳＦＶの完全ゲノムをコードするｃＤＮＡクローンを用い、異種挿入物のための道を作るために２６Ｓ構造遺伝子のコード領域を欠失することによってＳＦＶ  ＤＮＡ発現ベクターを構築する。しかしｎｓＰ１−４レプリカーゼ複合体の製造に必要な非構造コード領域は保存する。ＲＮＡ複製は短い５’（ｎｔ  １−２４７）配列要素（５３，５４，５５）及び３’（ｎｔ  １１４２３−１１４４１）配列要素（５６，５７）に依存し、従ってこれらもＣ遺伝子のすぐ上流の２６Ｓプロモーター（１７，１８）と同様にベクター構築物中に含まれねばならない。
【００９５】
図７に示す通り、最初に実施例１のＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンからのＸｂａＩ（６６４０）−ＮｓｉＩ（８９２７）フラグメントをｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｌ，ＵＳＡ）中にクローニングした（段階Ａ）。得られたプラスミド、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）−ＳＦＶから、ＥｃｏＲＩフラグメント（ＳＦＶは７３９１及び８８７４６に相当する）をＭ１３ｍｐ１９中にクローニングし、特定部位の突然変異誘発を用いて２６Ｓプロモーター部位からすぐ下流にＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ−ＳｍａＩポリリンカー配列を挿入した（段階Ｂ）。Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ（一重鎖）からのシークエンシングにより正しい突然変異体が確認されたら、ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）−ＳＦＶ中に再挿入し（段階Ｃ）、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４中にＸｂａＩ−Ｎｓλフラグメントとして逆クローニングした（段階Ｄ）。ＳＦＶの構造タンパク質をコードするｃＤＮＡ領域の主要部分を欠失するために、これらのプラスミドをＡｓｕＩＩ（７７８３）及びＮｄｅＩ（１１０３３）を用いて切断し、４種類すべてのヌクレオチドの存在下でクレノウフラグメントを用いてブラント化し、連結し、それぞれｐＳＦＶ１、ｐＳＦＶ２及びｐＳＦＶ３と呼ばれる最終的ベクターを作った（段階Ｅ）。ベクターは２６ＳサブゲノムＲＮＡのプロモーター領域及びＥ１タンパク質の最後の４９アミノ酸、ならびにＳＦＶゲノムの完全非コード３’末端を保存している。
【００９６】
ベクターにおいてサブゲノム（２６Ｓ）部分をコードする部分をポリリンカー配列で置換し、２６Ｓプロモーター下で異種ｃＤＮＡ配列を挿入クローニングさせた。図８に示す通り、これらの３種類のベクターは同一の塩基カセットを２６Ｓプロモーターの下流に挿入して含み、すなわち３つのすべての読み枠においてポリリンカー（ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＸｍａＩ）に翻訳停止−コドンが続く。ベクターはポリリンカーカセットが挿入されている位置が異なる。ｐＳＦＶ１の場合、カセットは２６Ｓ翻訳開始部位の３１塩基下流に位置している。キャプシド遺伝子翻訳の開始作因（ｍｏｔｉｖｅ）は認められた配列（５８）と同一である。従ってこの作因はｐＳＦＶ２にも備わっており、その場合それはキャプシド遺伝子の作因のすぐ後に位置している。最後にｐＳＦＶ３ではカセットがキャプシド遺伝子の開始コドン（ＡＵＧ）のすぐ後に位置する。挿入の両端を調べるのに必要なシークエンシングプライマー（ＳＰ）は、２６Ｓプロモーター領域（ＳＰ１）又は停止コドンカセットの後の領域（ＳＰ２）のいずれかとハイブリッドするように設計されている。
【００９７】
２６ＳプロモーターはｎｓＰ４コード領域の３’−末端と重複することに注意する。ｐＳＦＶ２の場合、クローニング部位はＳＦＶキャプシド遺伝子の翻訳開始部位のすぐ後に位置する。ｐＳＦＶ３の場合、クローニング部位はさらに３ヌクレオチド下流に位置し、すなわちＳＦＶキャプシド遺伝子の開始ＡＵＧコドンに直接続いている。ポリリンカーに続く３個の翻訳停止コドンを四角で囲む。下流シークエンシングプライマー（ＳＰ１）は２６Ｓプロモーターと重複し、上流シークエンシングプライマー（Ｓｐ２）はＸｍａＩＩＩ部位と重複する。
【００９８】
実施例３
この実施例ではヘルパーウィルスベクター構築物を含む生体内パッケージング系を調製する。
【００９９】
系は、構造タクパク質機能の欠失したＳＦＶ変異体、又は実施例２で得た発現ベクター構築物から誘導された組み替えＲＮＡを感染性ウィルス粒子内にパッケージすることを可能にする。従ってこの系は正常な感染により組み替えＲＮＡを細胞中に導入できるようにする。実施例１で得たｐＳＰ６−ＳＦＶ４の制限エンドヌクレアーゼ部位ＡｃｃＩ（３０８）及びＡｃｃＩ（６３９９）の間の領域を、図７の段階Ｆで示す通りに切断及び連結することにより欠失させ、ｐＳＦＶ−Ｈｅｌｐｅｒ１と呼ばれるヘルパーベクターを構築する。ベクターはＲＮＡ複製に必要な５’及び３’シグナルを保存している。Ｈｅｌｐｅｒベクターのほとんど完全なｎｓｐ領域が欠失しているので、この構築物から製造されるＲＮＡは機能的レプリカーゼ複合体の欠乏のために細胞中で複製されない。図９に示す通り、ｐＳＦＶ１−組み替え及びヘルパーｃＤＮＡの試験管内転写の後、ヘルパーＲＮＡはｐＳＦＶ１−組み替え誘導体と共にコトランスフェクションされ、ヘルパー構築物が新しいウィルス粒子の組み立てに必要な構造タンパク質を与え、組み替え構築物はＲＮＡ複製に必要な非構造タンパク質を与え、組み替えゲノムを含むＳＦＶ粒子が製造される。コトランスフェクションは実施例６で開示した通りエレクトロポレーションにより行うのが好ましく、ＢＨＫ細胞を宿主細胞として用いるのが好ましい。
【０１００】
ＲＮＡのパッケージのために、キャプシドタンパク質を結合することが示されている（５７，５９）領域であるｎｓＰ１の末端の領域が必要である。ヘルパーはこの領域を欠いているので、このベクターから誘導されたＲＮＡはパッケージされず、従って組み替え及びヘルパーを用いたトランスフェクションは組み替え−誘導ＲＮＡを有するウィルス粒子のみを製造する。これは、これらのウィルスがさらに継代することはできず、従って１段階ウィルス株を与えることにつながる。利点は、これらの粒子による感染がウィルスタンパク質を製造しないことである。
【０１０１】
実施例４
この実施例は実施例１からの全長ＳＦＶ  ｃＤＮＡクローンの変異体の構築を説明し、それにより異種エピトープをコードする異種ＤＮＡ配列の挿入、及び該異種エピトープをＰ６２、Ｅ２又はＥ１スパイクタンパク質の不可欠の部分として有する組み替え（キメラ）ウィルスの製造が可能になる。
【０１０２】
この目的のために、Ｅ２及びＥ１エンベロープタンパク質の機能、形態学及び抗原構造に関するすべての知識が欠かせない。アルファウィルスの病原性に関する以前の研究は、Ｅ２に対する抗体が種類−特異的であり、優れた中和活性を有するが、Ｅ１に対する抗体は群−特異的であり、非中和性であることを示した（５）。しかし、密接に関連したアルファウィルスであるＳＦＶ、シンドビス及びロスリバーの抗原部位がマッピングされ、アミノ酸配列のレベル（６０，６１，６２，６３）と関連づけられたのは最近である。これらの研究は、問題の主要部位のほとんどがＳＦＶ  Ｅ２スパイクタンパク質のアミノ酸位置２１６、２３４及び２４６−２５１にあることを示した。興味深いことに、これらの３つの部位は、コンピューター分析により予測されたものと正確に同一の部位である。この実施例ではドメイン２４６−２５１がアルファウィルスの群内で高度に保存された構造、及びハイドロパシ−プロファイル（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）を有するのでこの領域を用いた。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４  Ｐ６２タンパク質の２４６−２５１領域に異種エピトープをコードする遺伝子を挿入すると、各ヘテロダイマー、すなわち２４０コピー上に１個の新しいエピトープを有する粒子を与える。
【０１０３】
ＳＦＶゲノムのＥ２部分内への異種エピトープの特異的挿入を可能にする独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を作るために、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＧＧＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＣを用いた特定部位の突然変異誘発によりＢａｍＨＩ部位を挿入した。
【０１０４】
実施例５
この実施例では、ＳＦＶの条件付致死変異体を、実施例１で得たＳＦＶ  ｃＤＮＡから構築し、その変異体はＰ６２タンパク質に突然変異を有し、該タンパク質の非分裂形態を生じ、その結果この変異体は外因的に加えられたプロテアーゼを用いて最初に切断しないとそのまま新しい宿主細胞に感染することはできない。
【０１０５】
図１０に示す通り、この形態のウィルスはトランスフェクトされた細胞における野生型の能力を用いて組み立てられるが新しい宿主細胞に侵入することはできないので、この構築物は異種エピトープのためのワクチンキャリヤーとして有利に用いることができる。阻止は、不活性ウィルス粒子のトリプシン処理により克服することができる。これは粒子を、このウィルス変異株の増幅に用いることができる十分に侵入−可能な形態に変換する。
【０１０６】
活性化されるとＳＦＶ変異体は、通常はエンドサイトーシス経路により細胞に侵入し、感染を開始する。形質膜でウィルスタンパク質が作られ、出芽が起こる。しかし製造されたウィルス粒子はすべて不活性な形態であり、従って複製が一巡した後感染は終わる。感染の徹底が阻止される理由は、ｐ６２の分裂部位に特定部位の突然変異誘発により導入された突然変異である。このアルギニンからロイシンへの置換（ｐ６２タンパク質のＥ３部分のアミノ酸位置６６における）は、分裂部位の認められた特徴を変化させ、細胞表面への輸送に間に通常ｐ６２タンパク質をＥ２及びＥ３ポリペプチドに切断する宿主細胞のプロテイナーゼによって認識されない。代わりに外因的に加えられたトリプシンがこの切断を行うことができ、この場合最初の分裂部位の直前のアルギニン残基６５で起こる。この切断が、侵入スパイクサブユニットの結合を制御することによりウィルスの侵入機能力の活性化を調節するので、非分裂ｐ６２のみを有するウィルス粒子が新しい宿主細胞に侵入することは完全に不可能である。
【０１０７】
分裂欠失変異Ｅ２の創造は以前に記載されている（２９）。この領域に及ぶＡｓｕｌｌ−Ｎｓλフラグメントをその後単離し、全長ｃＤＮＡクローンｐＳＰ６−ＳＦＶ４中にクローニングした。
【０１０８】
実施例６
この実施例では、外因性ＤＮＡを含む実施例１からの全長ｃＤＮＡから試験管内で転写されたＳＦＶ  ＲＮＡ分子又はその変異体、あるいは実施例２からのＳＦＶベクターを用いたＢＨＫ細胞のトランスフェクションを開示する。トランスフェクションは最適条件下で非常に有効であることが示されているエレクトロポレーションにより行う。
【０１０９】
ＢＨＫ細胞を上記のＳＦＶ  ＲＮＡ分子を用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、温度、電圧、キャパシタンス及びパルス数などのパラメーターを変化させることにより最適条件を決定した。２５μＦにおける１．５ｋＶの２回の連続パルスにより最適トランスフェクションが得られ、その条件下で死亡する細胞の数は無視し得るものであった。方法全体を通じて細胞を０℃より室温に保つのが良いことが見いだされた。エレクトロポレーションによるトランスフェクションを、投入ＲＮＡの関数としても測定した。予想通り、トランスフェクションの頻度の増加はＲＮＡ濃度に直線的に依存しておらず、１００％トランスフェクションを得るために約２μｇのｃＲＮＡが必要であった。
【０１１０】
従来のトランスフェクションと比較すると、これは大きな進歩である。例えばＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションの場合、最適で細胞のわずか０．２％がトランスフェクトされたのみであった。
【０１１１】
実施例７
この実施例は、２１ｋＤの細胞質マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）、９０ｋＤの膜タンパク質ヒトトランスフェリンレセプター（ＴＲ）、及び最後に１４ｋＤの分泌タンパク質チキンリゾチームをコードする遺伝子の場合の、ＳＦＶベクターである実施例２からのｐＳＦＶ１により推進される異種遺伝子発現を示す。ｄｈｆｒ遺伝子はｐＧＥＭ２−ｄｈｆｒから（６４）ＢａｍＨＩ−ＨｉｎＩＩＩフラグメントとして単離し、クレノウフラグメントを用いてブラント化し、ＳｍａＩ−切断ｐＳＦＶ１に挿入された。トランスフェリンレセプター遺伝子は、最初にｐＧＥＭ１−ＴＲからＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＧＥＭ７ＺＦ（＋）中にクローニングされ（６４，６５）、続いてそこからＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＳＦＶ１にクローニングされた。最後にリゾチーム遺伝子（２１）を有するｐＧＥＭ２からのＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＦＶ１にクローニングした。
【０１１２】
異種遺伝子の発現の研究のために、ｄｈｆｒの試験管内製造ＲＮＡ及びＴＲ構築物をＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートした。野生型ＳＦＶのＲＮＡを標準として用いた。エレクトロポレーション後（ｐ．ｅ．）の異なる時点で細胞を１０分間パルス−標識し、続いて１０分間追跡し、その後ライセートをゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより分析した。ＢＨＫ細胞は、野生型ＳＦＶのＲＮＡ、ｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ及びｐＳＦＶ１−ＴＲを用いてトランフェクトし、３、６、９、１２、１５及び２４時間ｐ．ｅ．でパルス−標識した。等量のライセートにつき１２％ゲル上で実験した。９時間の試料はＳＦＶ、ｄｈｆｒ及びトランスフェリンレセプタータンパク質の免疫沈降（ＩＰ）にも用いた。ｐＳＦＶ１−リゾチームを用いてトランスフェクトした細胞を９時間ｐ．ｅ．でパルス−標識し、その後示された時間（時間）追跡した。等しい割合のライセート又は培地を１３．５％ゲル上に負荷した。ＩＰは１時間追跡ライセート試料からの免疫沈降を示す。Ｕ−列は標識されたがトランスフェクトされていない細胞のライセートである。侵入ＲＮＡは負のストランド合成から出発し、これは約４−５時間ｐ．ｅ．までピークに達しないので（５）、３時間ｐ．ｅ．で外因性タンパク質はほとんど製造されなかった。この時点でほとんどすべての標識タンパク質は宿主起源であった。対照的に６時間ｐ．ｅ．にて、外因性タンパク質が高い効率で合成され、宿主タンパク質合成の重度の阻害が明らかであった。これは９時間ｐ．ｅ．でさらに衝撃的であり、最大停止（ｍａｘｉｍｕｍ  ｓｈｕｔ  ｄｏｗｎ）に達した。異種タンパク質の有効な製造は最高２４時間ｐ．ｅ．まで続き、その後製造は速度が落ち（データは示していない）、細胞が定常期に入ったことを示した。
【０１１３】
チキンリゾチームは分泌タンパク質なので、その発現は細胞ライセートと成育培地の両方から分析した。細胞を９時間ｐ．ｅ．でパルス−標識し、その後８時間追跡した。結果を図１１に示す。リゾチームはゆっくり分泌されるがほとんどすべての標識物質は追跡の間に培地に分泌された。
【０１１４】
実施例８
この実施例は本発明の生体内パッケージング系を示す。
【０１１５】
ｐＳＦＶ１−ＴＲの試験管内製造ＲＮＡを異なる比率でヘルパーＲＮＡと混合し、これらの混合物をＢＨＫ細胞中にトランスフェクトした。細胞を２４時間成育し、その後培地を集め、遠心によりウィルス粒子をペレット化した。蛍光抗体法により感染性単位（ｉ．ｕ．）の数を決定した。ヘルパーと組み替え体の１：１の比率が最も有効に感染性粒子を製造することが見いだされ、平均５ｘ１０6個の細胞が２．５ｘ１０9ｉ．ｕ．を与えた。異なる感染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＢＨＫ細胞に感染させることにより、このウィルス株の感染性を調べた。ｐＳＦＶ１−ＴＲ組み替えＲＮＡを有するそのような生体内パッケージ粒子に感染した後のＢＨＫ細胞におけるヒトトランスフェリンレセプターの発現に関する結果を図１１の右下に示す。ＭＥＭ（０．５％のＢＡＳ及び２ｍＭのグルタミンを含む）中に希釈した２００μｌのウィルスを細胞上に載せ、５−０．００５の範囲のｍ．ｏ．ｉ．値を与えた。３７℃にて１時間後、完全ＢＨＫ培地を加え、９時間成育を続け、その時点で１０分間のパルス（１００μＣｉ35Ｓ−メチオニン／ｍｌ）及び１０分間の追跡を行い、細胞をライシス緩衝液に溶解した。３００μｌ（３０，０００細胞に相当する）のライセートからの１０μｌにつき１０％ゲル上で実験し、乾燥ゲルを−７０℃にて２時間露光した。発現レベルが高いので、終夜露光を用いたオートラジオグラフィーで明白なバンドを得るためにわずか３，０００細胞しか必要でなかった。
【０１１６】
従って１細胞当たり約１ｉ．ｕ．にて有効なタンパク質製造及びそれに伴う宿主細胞停止が起こることが見いだされた。１個のＳＦＶ感染細胞が平均１０8個のキャプシドタンパク質分子を製造するので、１回のエレクトロポレーションから製造されたウィルス株を用いて約５０ｍｇのタンパク質に相当する１０17個のタンパク質分子を製造できることになる。
【０１１７】
前記の実験結果から本発明は、これまでに存在した発現系のいくつかの欠点を含まない非常に有用で有効な発現系に関することが明らかである。本発明の系の主な利点を簡単にまとめると以下のようになる：
（１）１回のトランスフェクション実験により１日で高力価の組み替えウィルス株を製造することができる。選択／スクリーニング、プラーク精製及び増幅段階の必要がない。組み替えウィルスの容易な製造は、多くの系列の突然変異体の表現型を特性化しなければならない実験において特に重要である。
（２）組み替えゲノムのみがパッケージングシグナルを含み、ヘルパーゲノムは含まないので、組み替えウィルス株はヘルパーウィルスを含まない。
（３）組み替えウィルスは、昆虫及びより高級な真核細胞型を含む多様な細胞中に“自然”で漏れのない方法で組み替えゲノムを感染させるのに用いることができる。そのような広い宿主域は、特に発現したタンパク質の活性のために細胞−型−特異的翻訳後修正反応が必要な場合、発現系にとって非常に有用である。
（４）得られるタンパク質発現のレベルが非常に高く、そのレベルは感染の間のウィルスタンパク質の量に相当する。宿主細胞タンパク質の停止も起こり、それにより抗体媒介による抗原濃縮を必要とせずに細胞ライセート中の異種タンパク質を明白に追跡することが可能になる。これは細胞生物学におけるＤＮＡ発現実験をかなり容易にするであろう。さらに内在する対になるものによる発現タンパク質に対する抵触の問題（すなわちホモ−オリゴマー化反応）を避けることができる。
【０１１８】
実施例９
この実施例はエピトープキャリヤーを示す。
【０１１９】
ワクチンの開発が最も重要とされている非常に重要な例は、ヒト免疫不全ウィルスＨＩＶ−１によって起こる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関する（６６，６７）。これまでＨＩＶ−１に対する有効なワクチンを製造する試みはすべて失敗してきたが、破裂ＳＩＶ−１（猿免疫不全ウィルス）を用いた予防接種がある程度ウィルスの感染に対する保護を与えるという極く最近の報告がある（６８）。しかしＨＩＶ−１に対する安全で有効なワクチンの開発は、ウィルスの生物学的性質の故に非常に困難であろう。この実施例ではＨＩＶ−１の１個のエピトープをＳＦＶのＥ２タンパク質の抗原性ドメイン中に挿入した。用いられたエピトープはＨＩＶ−１の糖タンパク質ｇｐ１２０に位置し、アミノ酸３０９−３２５に及ぶ。これはＨＩＶ−１の可変ループを形成し、Ｎ−グリコシル化部位の直後に位置する。
【０１２０】
ＨＩＶエピトープをコードする既製のオリゴヌクレオチドのカセット挿入を用い、ＨＩＶの３０９−３２５エピトープがＢａｍＨＩ部位に挿入されたキメラを構築した。ＢａｍＨＩ部位における必要な塩基置換によりベクター中のアミノ酸変化は起こらなかったが、２個のアミノ酸（Ａｓｐ及びＧｌｕが位置を変えた。試験管内製造ベクターＲＮＡは野生型の能力を用いて細胞感染を起こすので、この変化は悪影響を及ぼさない。図１２はエピトープキャリヤー中の問題の領域の配列を示す。予備実験でキメラタンパク質が製造されることが示された。タンパク質を抗−ＨＩＶ抗体を用いて免疫沈降させることができる。これらはＨＩＶに対するワクチン調剤に用いることができるキメラウィルス粒子の製造にも用いることができると思われる。そのような粒子を図１２の下部に示す。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
【表７】
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【０１２８】
【表８】
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【０１２９】
【表９】
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【０１３０】
【表１０】
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【０１３１】
【表１１】
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【０１３２】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はセムリキ森林熱ウィルスの生活環に含まれる主要集合（ｍａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）及び解体（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）の略図であり、ｐ６２分裂及びｐＨによるＳＦＶ侵入機能（ｅｎｔｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の活性化の調節も示す。
【図２】図２はＳＦＶの構造タンパク質の合成の間の転移シグナルの利用を示し；上図は２６ＳサブゲノムＲＮＡの遺伝子地図であり；中図はＰ６２、６Ｋ及びＥ１タンパク質の膜転移の過程であり；内腔の側上の小さい矢印はシグナルペプチダーゼ分裂を示し；下図では３種類のシグナルペプチドの特性を挙げている。
【図３】図３は発現ベクターとしてＳＦＶが特に選ばれる特徴を示す。
【図４】図４はＳＦＶの全長感染性クローンの構築を示し；図４ＡはＳＦＶゲノムの図解制限地図を示し；ｃＤＮＡ合成の開始に用いられるプライマーを矢印で示し、最終クローンの組み立てに用いられるｃＤＮＡ挿入物を棒で示し；図４ＢはプラスミドｐＰＬＨ２１１、すなわちＳＦＶの全長感染性クローンのためのキャリヤーとして用いられるＳＰ６発現ベクター及び得られるプラスミドｐＳＰ６−ＳＦＶ４を示し；図４ＣはＳＦＶクローンのＳＰ６プロモーター領域の構造を示し；点描の棒はＳＰ６プロモーター配列を示し、転写される第１のヌクレオチドを星印により記し；下線の領域は真性ＳＦＶ配列を示す。
【図５】図５はＤＮＡ（Ｕ＝Ｔ）としてのｐＳＰ６−ＳＦＶ４  ＲＮＡ転写物の完全ヌクレオチド配列、及びＤＮＡ配列の下に非−構造ポリプロテイン及び構造ポリプロテインのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は試験管内製造ＲＮＡの細胞中へのトランスフェクションの後のウィルス製造のためのＳＦＶ  ｃＤＮＡ発現系を示す。
【図７】図７はＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１−３及びヘルパー１の構築を示す。
【図８】図８はＳＦＶベクタープラスミドｐＳＦＶ１−３のポリリンカー領域を示し；サブゲノム２６Ｓ  ＲＮＡのためのプロモーターの位置は四角で囲んであり、転写するべき最初のヌクレオチドを星印で記す。
【図９】図９はヘルパートランス相補性を用いた感染性粒子中へのｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ  ＲＮＡの生体内パッケージングの略図である（ｄｈｆｒはジヒドロ葉酸レダクターゼを意味する）。
【図１０】図１０はｐ６２からＥ２及びＥ３への分裂によるｐ６２−含有非感染性ウィルス粒子の感染性粒子への変換のためのトリプシンの利用を示す。
【図１１】図１１はエレクトロポレーションによりＲＮＡトランスフェクションした場合のＢＨＫ細胞における異種タンパク質の発現を示す。
【図１２】図１２は上図にてＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生ずるＳＦＶの主要抗原部位及び試験管内製造置換基を含む配列、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質の主要中和ドメインに及ぶ配列、及びＳＦＶキャリヤータンパク質Ｅ２にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドとして挿入されたＨＩＶドメインを示し；下図は野生型又はキメラ形態におけるドメイン２４６−２５１のブローアップ（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）を有するＳＦＶスパイク構造の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図５（３）】
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【図５（４）】
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【図５（５）】
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【図５（６）】
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【図５（７）】
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【図５（８）】
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【図５（９）】
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【図５（１０）】
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【図５（１１）】
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【図５（１２）】
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【図５（１３）】
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【図５（１４）】
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【図５（１５）】
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【図５（１６）】
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【図５（１７）】
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【図５（１８）】
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【図６】
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【図７】
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【図７（１）】
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【図７（２）】
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【図７（３）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（１）】
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【図１２（２）】
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