【手続補正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ある態様によれば、相同組換え（ＨＲ）の方法が提供される。その間に位置する（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）ＡＡＶＳ１断片を標的とする２つのｇＲＮＡであるＴ１およびＴ２を構築する（図１ｂ）。それらの活性を、以前に報告されている同じ領域を標的とするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼヘテロダイマー（ＴＡＬＥＮ）（参照文献（１１）参照）の活性と比較した。３種の標的化試薬を用いた場合の全てにおいてＨＲ現象の成功が観察され、Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡを用いた遺伝子補正率はそれぞれ３％ および ８％ に近かった（図１Ｃ）。ＲＮＡを介したこの編集プロセスは顕著に速く、最初の検出可能なＧＦＰ＋細胞が出現したのは、ＡＡＶＳ１  ＴＡＬＥＮではトランスフェクションの約４０時間後であったのに比べて、約２０時間後であった。ＨＲは、修復ドナー、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡを同時に導入した場合にのみ観察されたことから、ゲノム編集には全てのコンポーネントが必要であることが確認された（図４）。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡの発現と関連する明らかな毒性は認められなかったが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを用いた研究では、一方の鎖にのみニックを入れることでさらに毒性が低くなることが示されている。そこで、インビトロでニッカーゼとして機能することが知られているＣａｓ９Ｄ１０Ａ変異体を試験した結果、ＨＲは同様であったが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の比率はより低かった（図５）（参照文献（４、５）参照）。関連するＣａｓ９タンパク質がＰＡＭの６ｂｐ上流で両鎖を切断することを示す場合（参照文献４）と一致して、ＮＨＥＪデータから、ほとんどの欠失または挿入が標的配列の３′末端で起こったことが確認された（図５Ｂ）。さらに、標的ゲノム部位の変異が、この部位におけるｇＲＮＡによるＨＲを妨げることが確認され、ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集が配列特異的であることが実証された（図６）。ＧＦＰ遺伝子における２種のｇＲＮＡ標的部位、ならびにＤＮＡメチルトランスフェラー ゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）遺伝子およびＤＮＭＴ３ｂ遺伝子の相同領域に由来するさらに３種のｇＲＮＡ標的断片が、改変レポーター細胞株において有意なＨＲを配列特異的に誘導可能であることが示された（図７、図８）。全体として、これらの結果は、ヒト細胞におけるＲＮＡ誘導性のゲノム標的化により、複数の標的部位で強固（ｒｏｂｕｓｔ）なＨＲが誘導されることを裏付けている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ＧＦＰレポーターアッセイの結果と一致し、３種の細胞型の全てについて、内在性の遺伝子座において多くのＮＨＥＪ現象が観察された。２種のｇＲＮＡであるＴ１およびＴ２はそれぞれ、２９３Ｔ細胞で１０％および２５％、Ｋ５６２細胞で１３％および３８％、ＰＧＰ１−ｉＰＳ細胞で２％および４％のＮＨＥＪ比率を達成した（図２Ｂ）。これらの細胞型のいずれにおいても、ＮＨＥＪの誘導に必要なＣａｓ９およびｃｒＲＮＡの発現に由来する明白な毒性は観察されなかった（図９）。予想された通り、Ｔ１およびＴ２に対するＮＨＥＪによる欠失は、標的部位の位置を中心としており、この標的化プロセスの配列特異性がさらに検証された（図９、１０、１１）。Ｔ１ｇＲＮＡおよびＴ２ｇＲＮＡの両方を同時に導入することにより、その間に位置する１９ｂｐの断片が高効率で欠失し（図１０）、このアプローチを用いてゲノム座位の多重編集（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ）が実現可能であることが実証された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
実施例１３
Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪ
図１０の左パネルに示すコンストラクトをＫ５６２細胞に核化（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）した。ヌクレオフェクションの４日後、ＤＳＢでのゲノムの欠失率および挿入率をディープシークエンシングにより評価することによってＮＨＥＪ比率を測定した。パネル１：標的領域で検出された欠失率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。各ヌクレオチド位置での欠失の発生率を黒線にプロットし、欠失を有するリードの割合として欠失率を計算した。パネル２：標的領域で検出された挿入率。赤色の破線：Ｔ１ＲＮＡ標的部位の境界；緑色の破線：Ｔ２ＲＮＡ標的部位の境界。最初の挿入接合部が検出されたゲノム位置での挿入の発生率を黒線にプロットし、挿入を有するリードの割合として挿入率を計算した。パネル３：欠失サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの欠失の頻度をプロットした。パネル４：挿入サイズの分布。全ＮＨＥＪ集団間の異なるサイズの挿入の頻度をプロットした。両方のｇＲＮＡによるＫ５６２標的化は効率的であり（１３〜３８％）、配列特異的である（ＮＨＥＪ欠失分布の位置のシフトにより示される）。重要なことに、観察された欠失サイズ頻度のヒストグラムにおけるピークからも明らかなように、Ｔ１ガイドＲＮＡおよびＴ２ガイドＲＮＡの同時導入により、その間に位置する１９ｂｐ断片の高効率な欠失が生じており、このことは、このアプローチを用いてゲノム座位の多重編集も実現可能であることを示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を真核細胞に付与すること、および
前記ガイドＲＮＡ配列と相互作用するＣａｓ９タンパク質を前記真核細胞に付与すること
を含み、
前記ガイドＲＮＡ配列が前記標的核酸配列に結合する、真核細胞を改変する方法。
【請求項２】
前記Ｃａｓ９タンパク質がＣａｓ９酵素であり、前記標的核酸配列が切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガイドＲＮＡ配列が、前記ガイドＲＮＡ配列をコードする第一の核酸を前記真核細胞に導入することにより前記真核細胞に付与され、
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第二の核酸を前記真核細胞に導入することにより前記真核細胞に付与され、
前記真核細胞が、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９タンパク質を生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の核酸が、ウイルス的送達法を用いて前記真核細胞に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の核酸及び／又は前記第二の核酸が、トランスフェクションにより前記真核細胞に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の核酸が、アデノ随伴ウイルスを用いて前記真核細胞に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９酵素、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９、改変Ｃａｓ９、またはＣａｓ９のホモログである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞が、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ガイドＲＮＡが、１０ヌクレオチド〜２５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡが、２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
異なる標的核酸配列に相補的な複数のガイドＲＮＡ配列が、前記真核細胞に付与され、
前記複数のガイドＲＮＡ配列が、前記異なる標的核酸配列に結合し、
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記複数のガイドＲＮＡ配列と相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ヒトコドン最適化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、核局在化シグナルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子座中の複数の標的核酸配列に相補的な複数のガイドＲＮＡ配列が、前記真核細胞に付与され、
前記複数のガイドＲＮＡ配列が、前記複数の標的核酸配列に結合し、
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記複数の標的核酸配列を切断するＣａｓ９酵素であり、
その間に位置する核酸配列が前記遺伝子座から欠失される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記標的核酸配列を切断するＣａｓ９酵素であり、
前記真核細胞に付与されたドナー核酸配列が前記標的核酸配列に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損であり、前記ガイドＲＮＡ配列と相互作用し、前記標的核酸配列と結合し、
前記Ｃａｓ９タンパク質にはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが結合しており、
隣接するガイドＲＮＡ配列−Ｃａｓ９タンパク質複合体のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの二量体化により標的核酸配列が切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ガイドＲＮＡが、前記標的核酸配列と相補的なガイド配列及び前記ガイド配列と連結した足場配列を含み、
前記足場配列が以下の核酸配列
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号：４５）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損であり、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインを含み、
標的遺伝子の発現が調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損であり、蛍光タンパク質を含み、
前記蛍光タンパク質が可視化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損であり、タンパク質結合有機フルオロフォア、核酸結合有機フルオロフォア、量子ドット、分子ビーコン、エコープローブ、または多価リガンド結合タンパク質ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸配列に相補的であって前記標的核酸配列に結合可能なガイドＲＮＡ配列、又は前記ガイドＲＮＡ配列をコードする第一の核酸配列、及び
前記ガイドＲＮＡ配列と相互作用するＣａｓ９タンパク質、又は前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第二の核酸
を含む、ＲＮＡ誘導性ゲノム編集システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の前記ＲＮＡ誘導性ゲノム編集システムを含む真核細胞。