【手続補正書】
【提出日】平成28年2月29日(2016.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の培養、維持及び増殖のための明確な細胞培養処方であって、前記明確な細胞培養処方は基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、細胞培養処方。
【請求項２】
前記細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項３】
前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、請求項１又は２に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項４】
前記細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項５】
前記細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、請求項４に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項６】
ＩＴＳ−Ｘが、インスリン、トランスフェリン、及びセレンを供給する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項７】
前記脂肪酸を含まないアルブミンが、試薬グレードである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項８】
前記ＴＧＦ−βリガンドが、ＴＧＦ−β１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項９】
ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１から本質的になる、明確な細胞培養処方。
【請求項１０】
ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸から本質的になる、明確な細胞培養処方。
【請求項１１】
ＭＣＤＢ−１３１、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドから本質的になる、明確な細胞培養処方。
【請求項１２】
ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法であって、明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程を含み、前記明確な細胞培養処方が、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、方法。
【請求項１３】
前記明確な細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記明確な細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記明確な細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＴＳ−Ｘ、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−Ｂ１、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した多能性細胞のインビトロ集団であって、前記集団中の細胞の少なくとも７０％が、Ｏｃｔ４＋、ＮＡＮＯＧ＋、ＳＯＸ２＋、ＫＩ６７＋、ＦＯＸＡ２＋及びＺＦＰ４２−である、多能性細胞のインビトロ集団。
【請求項１８】
前記明確な細胞培養処方が、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１ではない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の明確な細胞培養処方。
【請求項１９】
前記明確な細胞培養処方が、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１ではない、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
表ＸＩＩにて見られるように、表ＸＩ中で記載した培地処方中、１０継代培養したＨ１細胞は、ＦＩＳＨ解析によって測定されたように、１２番染色体及び１７番染色体に対して、正常なカウントを維持した。以上のデータは、ＩＴＳ−Ｘ、試薬グレード脂肪酸を含まないＢＳＡ、ＴＧＦ−Ｂ１、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸を補った、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地からなる明確な培地が、広範囲の濃度の脂肪酸を含まないＢＳＡとｂＦＧＦを使用した時に、細胞の多能性を維持する一方で、多能性細胞の増殖を許容することを示している。
本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］  多能性幹細胞の培養、維持及び増殖のための明確な細胞培養処方であって、前記明確な細胞培養処方は基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、細胞培養処方。
［２］  前記細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、上記［１］に記載の明確な細胞培養処方。
［３］  前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、上記［１］又は［２］に記載の明確な細胞培養処方。
［４］  前記細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、上記［１］に記載の明確な細胞培養処方。
［５］  前記細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、上記［４］に記載の明確な細胞培養処方。
［６］  ＩＴＳ−Ｘが、インスリン、トランスフェリン、及びセレンを供給する、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
［７］  前記脂肪酸を含まないアルブミンが、試薬グレードである、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
［８］  前記ＴＧＦ−βリガンドが、ＴＧＦ−β１である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
［９］  ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１から本質的になる、明確な細胞培養処方。
［１０］  ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸から本質的になる、明確な細胞培養処方。
［１１］  ＭＣＤＢ−１３１、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドから本質的になる、明確な細胞培養処方。
［１２］  ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法であって、明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程を含み、前記明確な細胞培養処方が、基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びアスコルビン酸を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、方法。
［１３］  前記明確な細胞培養処方が更に、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）を含む、上記［１２］に記載の方法。
［１４］  前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む、上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］  前記明確な細胞培養処方が更に、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、明確な脂質、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、上記［１２］に記載の方法。
［１６］  前記明確な細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１を含む、上記［１５］に記載の方法。
［１７］  ＩＴＳ−Ｘ、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−Ｂ１、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した多能性細胞のインビトロ集団であって、前記集団中の細胞の少なくとも７０％が、Ｏｃｔ４＋、ＮＡＮＯＧ＋、ＳＯＸ２＋、ＫＩ６７＋、ＦＯＸＡ２＋及びＺＦＰ４２−である、多能性細胞のインビトロ集団。