【手続補正書】
【提出日】平成28年4月26日(2016.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプル中の生存細胞を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記細胞サンプル中の細胞を（ｉ）膜透過性核酸結合蛍光染料が生存細胞および非生存細胞の両方に浸透できる条件下で前記蛍光染料に、ならびに（ｉｉ）膜不透過性核酸結合蛍光消光剤が非生存細胞には選択的に浸透できるが、生存細胞には浸透できない条件下で、前記蛍光染料によって生じる蛍光を消光できる前記消光剤に曝露するステップ、ここで、前記蛍光染料および蛍光消光剤は、非生存細胞内で核酸に結合し実質的に非蛍光性の複合体を形成する、
（ｂ）ステップ（ａ）の後に、前記蛍光染料を励起して蛍光発光を生じさせることができる波長を有する光に前記細胞を曝露するステップ、および
（ｃ）前記細胞からの蛍光発光が存在する場合に、前記蛍光発光を検出器で検出するステップ、ここで、前記非生存細胞内の前記蛍光染料が、前記生存細胞内の前記蛍光染料よりも実質的に弱い蛍光を発光し、これにより、前記細胞サンプル中の前記生存細胞を検出する、
を含み、前記生存細胞が微生物である、方法。
【請求項２】
細胞サンプル中の生存細胞を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記細胞サンプル中の細胞を（ｉ）膜透過性核酸結合蛍光染料が生存細胞および非生存細胞の両方に浸透できる条件下で前記蛍光染料に、ならびに（ｉｉ）膜不透過性核酸結合蛍光消光剤が非生存細胞には選択的に浸透できるが、生存細胞には浸透できない条件下で、前記蛍光染料によって生じる蛍光を消光できる前記消光剤に曝露するステップ、ここで、前記蛍光染料は、前記蛍光消光剤の吸光度スペクトルと重なる発光スペクトルを有し、その結果、前記蛍光染料と前記蛍光消光剤の両方が、非生存細胞内で核酸に結合して複合体を形成した場合、前記複合体は、前記蛍光染料を励起して蛍光発光を生じることができる波長を有する光に曝露されたときに、実質的に非蛍光性である、
（ｂ）ステップ（ａ）の後に、前記蛍光染料を励起して蛍光発光を生じさせることができる波長を有する光に前記細胞を曝露するステップ、および
（ｃ）前記細胞からの蛍光発光が存在する場合に、前記蛍光発光を検出器で検出するステップ、ここで、前記検出器が、前記消光剤からの検出可能な発光が生じる場合、前記検出可能な発光が、前記蛍光染料からの検出可能な発光の５０％以下であるように、前記消光剤からの検出可能な発光よりも前記蛍光染料からの検出可能な発光を優先的に検出するよう構成されており、前記非生存細胞が、前記生存細胞よりも実質的に弱い、前記検出器によって検出される蛍光を発光し、これにより、前記細胞サンプル中の前記生存細胞を検出する、
を含み、前記生存細胞が微生物である、方法。
【請求項３】
前記消光剤からの検出可能な発光が生じる場合、前記発光が、前記蛍光染料からの検出可能な発光の３０％以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記消光剤が、ステップ（ｂ）で前記光に曝露されたときに前記検出器によって検出可能な蛍光事象を生成しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）で、前記細胞が前記蛍光染料に曝露され、次いで蛍光消光剤に曝露される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）で、前記細胞が、前記蛍光染料および前記蛍光消光剤に同時に曝露される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光染料および前記蛍光消光剤が、前記細胞内で互いに結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の最中に、複数の異なる蛍光染料が前記細胞に曝露される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の最中に、複数の異なる蛍光消光剤が前記細胞に曝露される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非生存細胞が、前記光に曝露されたときに前記検出器によって検出可能な蛍光を実質的に発光しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記非生存細胞が、前記光に曝露されたときに蛍光を実質的に発光しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の最中に、前記蛍光染料を励起できる前記光が、約３５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の波長を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記波長が、約３５０ｎｍ〜約６００ｎｍの範囲および約６００ｎｍ〜約７５０ｎｍの範囲の少なくとも１つの範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）で、前記蛍光発光が、約３５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長範囲内で検出される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光発光が、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、および約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの範囲内で検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、多孔質膜上に収集される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記多孔質膜が、約３５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の波長を有する光に曝露されたときに実質的に非自家蛍光性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が固体支持体上に載せられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体支持体が顕微鏡スライドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が液体に入れられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が光学セル内に配置される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生存細胞、非生存細胞、または生存細胞と非生存細胞の組み合わせを標識する第２の異なる膜透過性蛍光染料に前記細胞を曝露するステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル中の前記細胞を、約３５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の波長を有する光によって活性化されたときに蛍光信号を発する複数の蛍光粒子と合わせるステップをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
１つ以上の前記蛍光粒子によって生成される蛍光信号を検出するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞サンプルの少なくとも一部における生存細胞の数を決定するステップをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞サンプルが液体サンプルである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）の後、前記生存細胞が成長および／または増殖できる条件下で前記細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生存細胞の属および／または種を特定するステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の最中、またはステップ（ａ）の前および最中に、細胞増殖できる条件下で前記細胞が培養される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）の後であるが、ステップ（ｂ）の前に、細胞増殖ができる条件下で前記細胞を培養する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。