(57)【要約】【課題】本発明は、椿花またはそれらの抽出物を含有する、皮膚外用剤を提供する。また、抽出物から単離された新規なカメリオサイド式（1）、式（4）を含むカメリオサイド類を提供する。さらに、その皮膚外用剤の製造方法、およびその非臨床的使用を提供する。【解決手段】椿花またはそれらの抽出物および／またはこれらの新規カメリオサイドとその類縁体は、肌にある有害な酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、およびチロシナーゼ等）の阻害剤として働き、美白剤、老化防止剤などの皮膚外用剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）又は（４）で示される化合物。
【化１】
2013053108.tif 000022
【請求項２】
請求項１記載の式（１）又は（４）で示される化合物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項３】
化粧品である請求項２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
美白剤である請求項２記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
肌の老化防止剤である請求項２記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
椿花抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項７】
椿花抽出物が式（１）又は（４）で示される化合物を含有することを特徴とする請求項６記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
式（１）又は（４）で示される化合物が配合されている請求項６記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
式（１）又は（４）で示される化合物を配合する工程を含んでなる皮膚外用剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項２から請求項８のいずれか一項に記載の皮膚外用剤の非臨床的使用。
【請求項１１】
以下の式（１）〜（５）で表される化合物のいずれかを含有する皮膚外用剤。
【化２】
2013053108.tif 000023
【化３】
2013053108.tif 000024
【化４】
2013053108.tif 000025
【化５】
2013053108.tif 000026
【化６】
2013053108.tif 000027
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物、およびそれを含有する椿花抽出物、ならびに、それらの用途、製造方法、および使用に関する。より具体的には、椿花またはそれらの抽出物を含有する皮膚外用剤に関する。また、抽出物から単離された新規物質を含むカメリオサイド（Camellioside）類に関する。椿花抽出物および／またはこれらの新規物質は、肌にある有害な酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、およびチロシナーゼ等）の阻害剤として働き、美白剤、老化防止剤などの皮膚外用剤として有用である。さらにその皮膚外用剤の製造方法、およびその非臨床的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は各種の人の器官にあって、唯一、外界と接する器官である。このため、外界の影響を直接受けることになる。その原因となるものは、光、温度、湿気、異物などの影響を受けることになるが、傷や一部の炎症などは時間とともに解消していくが、なかなか影響が解消せず、あるいは蓄積されていくものもある。
【０００３】
例えば、日焼けなどによる、炎症や肌の黒化、皺などが例示される。その中で、肌の黒化、しみ、そばかすは、メラニンの生成と排泄のバランスが崩れ、表皮細胞内にメラニンが過剰に蓄積したものである。これらの原因には遺伝的要素もあるが、紫外線すなわち、日光によって助長される。そしてこの作用を抑えるために各種の美白剤がすでに知られている。例示すれば、アスコルビン酸、またはその誘導体、プラセンタエキス、ハイドロキノン、またはハイドロキノン誘導体（アルブチン）、コウジ酸、システイン、コロイド硫黄、各種の植物エキス等が知られており、これらを配合した美白化粧料が提案されている。また、サンゴの粉末は特許文献１（特許第２８９００２７号公報）や特許文献２（特開２０００−３５５５１５号公報）によって化粧品に応用することが示されているが、保湿作用または抗炎症作用、皮膚のかさつき感の抑制等の用途に用いられている。
【０００４】
皮膚の組成は大きく三つに分類され、外層から表皮、真皮、皮下組織から形成されており、それぞれは身体の恒常維持、外界からの防御など、種々役割を担っている。表皮は主に外界からの菌の進入や悪環境（紫外線、乾燥など）から保護し、皮下組織は体温の維持等が主だった機能である。
【０００５】
一方、皮膚真皮の機能は、外界からの衝撃を吸収するいわばクッションのような役割を果たしている。この効果は、真皮の厚さ、柔軟性などによるものであるが、老化とともに失われていく傾向にあり、皮膚科学的にも皮膚のはりの消失にともない、しわ、たるみの発生が起こる。
【０００６】
真皮の構成成分は主に、コラーゲン、エラスチン、線維芽細胞でそのほとんどを占めている。しわ、くすみ、きめの消失、または弾力性の低下など皮膚の老化に伴う変化には、コラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの線維の劣化、減少あるいは変性が起こっていることが知られている。その原因は、従来、肌にある有害な酵素の働きが関与することが指摘されている。これらの酵素としては、例えば、エラスターゼやコラゲナーゼに代表されるマトリックスメタロプロテアーゼと呼ばれる酵素の他、トリプシン、キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、およびチロシナーゼ等が挙げられる。
【０００７】
例えば、エラスターゼやコラゲナーゼの老化への関与は以下のようである。
【０００８】
健常な真皮中ではコラーゲンおよびエラスチンは古くなったものは吸収・排出される一方、新たにコラーゲンおよびエラスチンが線維芽細胞から生産され、一定した質および量を恒常的に保っている。しかし、年齢を重ねると、外的および内的な要因において、その恒常性は崩れ、線維芽細胞由来のエラスターゼが必要以上にエラスチンを分解することにより、老化症状が促進する。
【０００９】
また、間質型コラゲナーゼＩ型の発現量は紫外線の照射量に依存して大きく増加することから、その活性が紫外線によるコラーゲン減少性変性の原因の一つとなっており、皮膚のシワの形成等の大きな要因の一つとなっている。
【００１０】
近年の社会生活の複雑化によってもたらされる精神的、肉体的ストレスが皮膚などへも蓄積されており、従来の化粧品料では、十分な原状、健康回復を行うことができない問題を有している。このため、それらに薬効のある化学物質を配合することも行われているが、化学合成によって製造された化学物質は、その使用者によっては肌に合わないこともあり、かぶれや痒みの原因となる新たな問題が発生している。特に、近年女性の肌が敏感になってきており、これらの不具合が顕著となってきている。このため、天然物質由来成分を有効に利用することにより、その良好な効用を有し、しかも、かぶれや痒みの発生がなく、肌などに優しくあらゆる使用者に使用することができる手法がとられることも多い。
【００１１】
本発明で使用した椿（Camellia japonica）の花は、民間薬として、吐血や腸風下血（腸出血）の治療に用いられており、滋養強壮効果を有することも知られている。また、近年においては、椿花に含有される成分による化粧品としての研究も進められているが、不明の部分が多いのが現状である。椿花の含有成分としては，ロイコアントシアニン、アントシアニン、トリテルペン配糖体等が知られている。椿花の他の含有成分やそれらの薬効等については不明の部分も多く、さらなる研究が求められている。特に、カメリオサイドと呼ばれるトリテルペン配糖体は、ＳＯＤ様活性に由来する抗酸化作用があることが知られており（特許文献３、特開２００２−３７１０９２号公報）、化粧品として特に有用な美白効果および抗老化作用成分に関しては、本発明者らが自ら学会発表した技術がある（非特許文献１、日本薬学会１３１年会要旨集）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第２８９００２７号公報
【特許文献２】特開２０００−３５５５１５号公報
【特許文献３】特開２００２−３７１０９２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日本薬学会１３１年会要旨集 「メディシナルフラワー研究:椿花の美白及び抗老化作用成分−Ｃａｍｅｌｌｉｏｓｉｄｅ Ｅ，Ｆの化学構造−」３１Ｐ−０５２５，ｐ．２２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
近年の社会生活の複雑化によってもたらされる精神的、肉体的ストレスが皮膚などへも蓄積されており、従来技術では、十分な原状、健康回復を行うことができない問題を有している。すなわち、従来の製剤中の安定性が不十分であったり、アレルギー、皮膚刺激性等、皮膚の安全性の面で問題があったり、効果が不十分であったりして、必ずしも、満足する美白剤はなく、より有効な美白剤が求められている。さらには、美白以外の効果（例えば肌の老化防止効果）も有している原料が期待されている。
【００１５】
本発明の目的は、前述した不利益を回避した、目的の効果を有する新規物質並びにその類縁体、および当該新規物質並びにその類縁体を含有する抽出物、ならびに、それらの皮膚外用剤としての用途、その製造方法、およびその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記のような事情に鑑み、肌の美白作用が強くさらに、その他の効果を持ち、安全性や安定性に優れた皮膚外用剤の成分を鋭意検討した結果、驚くべきことに、椿花の抽出物が、肌の美白作用および肌の老化防止効果を有することを見出した。また、その成分を単離したところ、新規なカメリオサイド（式（1）、式（4））を含むカメリオサイド類を見出した。以下に詳述する。
【００１７】
椿花の抽出物の培養メラノーマ細胞におけるメラニン生成抑制作用、線維芽細胞の増殖作用および肌の老化に関連する酵素活性に及ぼす影響を検討した。肌の老化に関連する酵素活性としては、マッシュルーム由来チロシナ-ゼ、 ヒストリチクス菌 （Clostridium histolyticum）由来コラゲナーゼＩ型、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ、ブタ膵臓由来エラスターゼを用いた。その結果、椿花抽出物はいずれの実験系においても有効性を示した。したがって、メラニンの生成を抑える作用は、肌の美白作用効果があり、線維芽細胞の増殖作用および肌の老化に関連する酵素活性を抑えることは、肌の老化防止に効果がある。さらに産地（京都産、五島産、韓国・済州島）による効果の違いも検討したが、大きな差は見られず、椿花エキスに普遍的な効果であることが明らかとなった。本発明者らは、ここに、椿花抽出物およびその成分が肌の美白作用および肌の老化防止効果を有するという技術思想を確立し、本発明を完成した。
【００１８】
本発明は、
［１］以下の式（１）又は（４）で示される化合物；
【化１】
2013053108.tif 000002
［２］［１］記載の式（１）又は（４）で示される化合物を含有することを特徴とする皮膚外用剤；
［３］化粧品である［２］記載の皮膚外用剤；
［４］美白剤である［２］記載の皮膚外用剤；
［５］肌の老化防止剤である［２］記載の皮膚外用剤；
［６］椿花抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤；
［７］椿花抽出物が式（１）又は（４）で示される化合物を含有することを特徴とする［６］記載の皮膚外用剤；
［８］式（１）又は（４）で示される化合物が配合されている［６］記載の皮膚外用剤；
［９］式（１）又は（４）で示される化合物を配合する工程を含んでなる皮膚外用剤の製造方法；
［１０］［２］〜［８］のいずれか一項に記載の皮膚外用剤の非臨床的使用；および
［１１］以下の式（１）〜（５）で表される化合物のいずれかを含有する皮膚外用剤；
を開示するものである。
【化２】
2013053108.tif 000003
【化３】
2013053108.tif 000004
【化４】
2013053108.tif 000005
【化５】
2013053108.tif 000006
【化６】
2013053108.tif 000007
【００１９】
カメリオサイド類は、塩が形成できる場合は薬学上許容されるその塩を含む。また、光学異性体およびそれらの異性体の混合物、溶媒和物、結晶多型などを含む。さらに、１個以上の原子が、自然界にて通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子と置き換えられたこと以外は本明細書に記載されたものと同一である同位体標識化合物を含む。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、ヨウ素および塩素の同位体が挙げられ、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１２３Ｉおよび１２５Ｉが挙げられる。上記同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する本発明の化合物も、本発明の範囲内である。
【００２０】
本発明の椿花抽出物を得るために用いることができる植物の花は、ツバキ科（Theaceae）に属する植物の花であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヤブツバキ、ユキツバキ、ホンコンツバキ、サルウィンツバキ、ヤクシマツバキ、トウツバキ、ウラクツバキ、ワビスケ、カンツバキ、ナツツバキ、岩根絞、春曙光、太郎冠者等の種々の品種の花が挙げられる。なかでも、ヤブツバキ（Camellia Japonica L.）の花が好ましい。これらの植物は、日本、アジア等に広く生育しているものであり、どこに生育しているものでも使用することができる。なお、ツバキ科植物の花としては、単種または複数種のツバキ科植物の花のいずれを使用してもよい。ツバキ科植物の花は、通常、ガク片、花弁、心皮、雄ずい、雌ずい等を含むもので、かつ新鮮なものであることが好ましい。
【００２１】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコールおよび液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３−ブチレングリコールおよびプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
【００２２】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈および濾過処理、活性炭等による脱色、脱臭処理等をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００２３】
本発明の皮膚外用剤には、上記抽出物をそのまま使用しても良く、また、別途に単離または合成した１つまたはそれ以上のカメリオサイド類を加えて使用してもよい。また、抽出物の効果を損なわない範囲内で、外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することができる。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリ−ム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデ−ション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤等の頭皮を含む皮膚に適用されるものが挙げられる。
【００２５】
本発明に用いる上記抽出物の配合量は、本発明の皮膚外用剤全量に対し、固形物に換算して０．０００１重量％以上、好ましくは０．００１〜１０重量％の配合が良い。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００２６】
本発明で使用される水性アルコールとしては、炭素数１〜３の脂肪族アルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。なかでも、メタノールや水性アルコール水溶液として、１〜５０重量％程度の水性アルコールを含有する水溶液が好ましい。
【００２７】
本発明によれば、ツバキ科植物の花を水性アルコールまたは水性アルコール水溶液により抽出し、椿花抽出物を得る。この際、水性アルコール等は、ツバキ科植物の花の１〜１０倍（重量）程度、好ましくは１〜５倍程度使用することが適当である。
【００２８】
また、抽出は、冷浸または温浸のいずれで行ってもよいが、５０〜８５℃程度の温度で、振盪下または非振盪下に、上述したツバキ科植物の花を上述した溶剤に浸漬することによって行うことが適当である。振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜５時間程度行うことが適当であり、非振盪下に浸漬する場合は、１時間〜１０日間程度行うことが適当である。なお、抽出処理は、同一椿花材料について１回のみ行ってもよいが、２回以上繰り返して行うことが好ましい。
【００２９】
得られた抽出物は、精製処理に付してもよい。精製処理は、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法等を単独または組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のいずれかまたはそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。例えば、薄層クロマトグラフィーの場合には、水―メタノール系の溶媒、高速液体クロマトグラフィーの場合にはメタノール−酢酸系の溶媒等を使用することができる。
【００３０】
上記で得られた水性アルコール（特に、メタノール）抽出物またはｎ−ブタノール抽出物を順相および逆相薄層クロマトグラフィーに付し、さらに高速液体クロマトグラフィーに付した場合、実施例に示す式（１）〜式（４）の化合物に対応するスポットおよびピークを得ることができる。このように、本発明の椿花抽出物は、最終的に得られたピークを示す成分を精製することにより、式（１）〜式（４）の化合物を単離することができる。
【発明の効果】
【００３１】
椿花の抽出物、および、それから単離された新規なカメリオサイド（式（1）、式（4））を含むカメリオサイド類は、肌にある有害な酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、リパーゼ、およびチロシナーゼ等）の阻害作用を有し、美白効果および肌の老化防止効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】椿花の抽出方法の概要を示す。
【図２】図１におけるＯＤＳカラムによるフラクション４のＨＰＬＣチャートを示す。
【図３】図１におけるＯＤＳカラムによるフラクション５のＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】図１におけるＯＤＳカラムによるフラクション６のＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の椿花抽出物、そこに含有される新規化合物およびその類縁体の作用についての実施例を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
成分の単離方法
椿花の抽出方法の概要を図１に示す。韓国済州島で採取し、乾燥した椿花（Camellia Japonica L.）１００２．７ｇをメタノール（９９．９％）１０リットルに浸漬し、８０℃の加温下、２時間抽出した。これを２回繰り返し、得られたメタノールを合液し、メタノールを蒸発させることにより、メタノール抽出物を得た（４４４ｇ）。同様に京都産、五島産椿花についてもメタール抽出物を得た（収率４６．２％、４６．０％）。また、済州島産椿花については５０％エタノール抽出物を上記の方法に準じて作成した（収率３０．０％）。
【００３５】
次いで、得られたメタノール抽出物４４４ｇに、室温下、酢酸エチルおよび水（１：１）を８リットルずつ加えて振り混ぜ、得られた酢酸エチル層および水層をそれぞれ分液採取した。この操作を６回繰り返した。さらに、得られた水層に、室温下、含水ｎ−ブタノールを８リットル加えて振り混ぜ、得られた含水ｎ−ブタノール層および水層をそれぞれ分液採取した。この操作を６回繰り返した。酢酸エチル層、含水ｎ−ブタノール層および水層から溶媒を蒸発させることにより、酢酸エチル分画、含水ｎ−ブタノール分画および水分画を、それぞれ得た（２１ｇ、１３８ｇおよび２７８ｇ）。
【００３６】
続いて、得られたｎ−ブタノール抽出物を、ＳｉＯ２カラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてＣＨＣｌ３−メタノール−７：３でフラクション１から４を、ＣＨＣｌ３−メタノール−水７：３：０．５でフラクション５、ＣＨＣｌ３−メタノール−水６：４：１でフラクション８から１１、メタノールで１２のフラクションを得た。
【００３７】
得られた１２のフラクションのうち、フラクション６として得られた分画を、さらにＯＤＳカラムを用いた薄層クロマトグラフィーにより、分離状態を確認しながら、移動相としてメタノール３０、４０−５０、５０、６０、６５、７０、８０、９０、１００％と組成比を順次切り替えて分離し、９のフラクションを得た。得られた９のフラクションのうち、フラクション４として得られた分画を、液体クロマトグラフ装置（島津製作所製：ＨＰＬＣ装置、送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＳ、示差屈折計：ＲＩＤ−６Ａ、ＹＭＣ−ＰＡＣ ＯＤＳカラム、流速：２ｍＬ／分）と、移動相として７０％メタノール１％水溶液−酢酸とを用いて、４つのフラクションに分離し、式（１）（７６２ｍｇ）および式（２）（５８９ｍｇ）、式（３）（９４ｍｇ）の化合物をそれぞれ得た。
【００３８】
また、フラクション５として得られた分画を、液体クロマトグラフ装置（島津製作所製：ＨＰＬＣ装置、送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＳ、示差屈折計：ＲＩＤ−６Ａ、ＹＭＣ−ＰＡＣ ＯＤＳカラム、流速：２ｍｌ／分）と、移動相として７０％メタノール１％水溶液−酢酸とを用いて、４つのフラクションに分離し、上記式（２）（１４８９ｍｇ）及び式（３）（１５００ｍｇ）の化合物をそれぞれ得た。
さらに、フラクション６として得られた分画を、液体クロマトグラフ装置（島津製作所製：ＨＰＬＣ装置、送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＳ、示差屈折計：ＲＩＤ−６Ａ、ＹＭＣ−ＰＡＣ ＯＤＳカラム、流速：２ｍｌ／分）と、移動相として８０％メタノール１％水溶液−酢酸とを用いて、６につのフラクションに分離し、上記式（４）（１２０ｍｇ）を得た。なお、式（１）、（２）、（３）、および（４）の各化合物の構造は、ＮＭＲ法により、それぞれ決定した。また、大島産椿花から分取されている式（５）についても検討した。構造式を以下に示す。また、各化合物のＨＰＬＣのチャートをそれぞれ図２〜図４に示す。
【００３９】
【化７】
2013053108.tif 000008
【００４０】
【化８】
2013053108.tif 000009
【００４１】
【化９】
2013053108.tif 000010
【００４２】
【化１０】
2013053108.tif 000011
【化１１】
2013053108.tif 000012
【００４３】
培養メラノサイト細胞におけるメラニン生成に及ぼす作用
［方法］
マウス由来メラノサイト細胞（Ｂ１６−４Ａ５）５×１０４個／ｍＬをＤ−ＭＥＭ （４５００ｍｇグルコース、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μＬ／ｍＬ）、アンホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）に懸濁し、２４穴プレートに４００μＬずつ播種した。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養後、培地を吸引除去し、被検体をＤＭＳＯに溶解後、Ｄ−ＭＥＭで希釈（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％）した培地４００  ｍＬ  添加、さらに、１ｍＭ  ｔｈｅｏｐｈｉｌｉｎｅ  １００  ｍＬを加え、ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。
７２時間後、ＰＢＳで２回洗浄後、トリプシンを１００μＬ 加え、細胞を剥離し、Ｄ−ＭＥＭで回収した。回収した細胞を２０００Ｇ、５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄後、１．０Ｍ ＮａＯＨ１２０μＬを加え、８０℃、５０分間加熱して細胞を溶解し、４０５ｎｍ、参考波長６５５ｎｍにおける２点吸光度を測定した。
また、Ｄ−ＭＥＭ中、メラノサイト細胞（Ｂ１６−４Ａ５） ５×１０４個／ｍＬを９６穴プレートに１００μＬずつ播種し、２４時間培養後、被検体を含む培地１００ｍＬに交換し、さらに７２時間培養後、ｋｉｔ−８を用いて細胞数を検討した。
【００４４】
［結果］
表１に示すように、椿花の抽出物は、いずれの産地においても強いメラニン生成抑制作用を示した。この作用は、美白化粧品に有効成分として配合されているアルブチンよりも強く有用性の高いことが明らかになった。
また、この活性は脂溶性分画に強く、単離された化合物の中では式（２）、（４）、（５）に抑制作用が認められ、その作用はアルブチンの１００倍以上であった。
（※アルブチン800μg/mLは、約2400μMに相当する。）
また、これらの化合物はメラノサイト細胞の増殖を抑制しており、これがメラニン生成抑制の作用機序の一つであると考えられた。
【００４５】
【表１】
2013053108.tif 000013
【００４６】
チロシナーゼ酵素活性に及ぼす作用
［方法］
チロシナーゼ酵素抑制効果は、ドーパからドーパキノンへの変換について行った。即ち、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した被検体０．５ｍＬにＬ−ＤＯＰＡ（３００μｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え２５℃、１０分間プレインキュベートの後、４５μｇ／ｍＬ（２４１．７Ｕ／ｍＬ）のチロシナーゼ０．５ｍＬを添加して、２５℃、５分間インキュベートの後、４７５ nmの吸光度を測定した。
被検体はＤＭＳＯに溶解後、リン酸緩衝液で希釈した（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％）。
【００４７】
［結果］
表２に示すように、メラニン生成抑制の作用機序の一つであるチロシナーゼ酵素を各産地の椿花抽出物に抑制する作用のあることが明らかになった。この作用は、既に美白成分として用いられるアルブチンに比して２倍から４倍の作用があり、有効性の高いことが示された。また、酢酸エチル分画に強い抑制作用が認められた。
【００４８】
【表２】
2013053108.tif 000014
【００４９】
線維芽細胞増殖に及ぼす作用
［方法］
ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ、ＴＯＹＯＢＯ）５×１０５個／ｍＬをＤ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ μＬ／ｍＬ）、アンホテリシンＢ（０．２５ ｍｇ／ｍＬ））に懸濁し、９６穴プレートに１００μＬずつ播種した。被検体はＤＭＳＯに溶解後（ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％）、Ｄ−ＭＥＭで希釈し、１００μＬ添加した。
被検体を添加後、ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞数の測定を下記の方法で行った。
Ｋｉｔ−８法（同仁化学研究所）：ＰＢＳで洗浄後、Ｄ−ＭＥＭ １００μＬおよびＫｉｔ−８試薬を１０μＬ加え、１時間培養後４５０ｎｍと６５５ｎｍにおける２点吸光度を測定した。
蛋白質定量法：ＰＢＳで洗浄後、蒸留水５０μＬ 加え、凍結と溶解を３回繰り返して細胞を割り、蛋白定量キット（タカラバイオ）の試薬を１５０ μＬ加え３０分後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５０】
［結果］
表３に示すように、線維芽細胞増殖に対して各産地の椿花抽出物はいずれも増殖を促進する作用を示した。細胞数の検討方法としてKit-8を用いる方法と蛋白質を定量する二つの方法で行ったが、いずれの方法においても同様の結果が得られた。
椿花から単離された化合物でも同様に線維芽細胞の増殖を促進する作用を示した。式（２）、（４）、（５）ではメラノサイト細胞の増殖を抑制する作用が認められたが、肌の構成に強い影響のある線維芽細胞に対しては増加させる効果を示しており、化粧品原料としての有用性を示した。
【００５１】
【表３】
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VCPMg：アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩
【００５２】
コラゲナーゼ酵素活性に及ぼす作用
［方法］
各濃度の試料溶液５０μＬ（最終濃度０．１％のＤＭＳＯを含む）に酵素液として０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩ型（ＳＩＧＭＡ）溶液を５０μＬ加えた。基質溶液として０．３９ｍｇ／ｍＬの４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ 二水和物、ＳＩＧＭＡ）５０μＬを加えて混合し、３７℃、３０分間反応させた後、１ｍＬの２５ｍＭクエン酸を加えて反応を停止させた。２ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出して、酢酸エチル層の吸光度を３２０ｎｍで測定した。なお、試料、コラゲナーゼ、基質は２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。なお、対照には試料の代わりに精製水を用い、ブランクとしてコラゲナーゼの代わりに２０ｍＭ塩化カルシウム入りトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を用いた。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の３２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ３２０）
Ｂ：対照ブランクのＯＤ３２０
Ｃ：試料のＯＤ３２０
Ｄ：試料ブランクのＯＤ３２０
【００５３】
［結果］
表４に示すように、各産地の椿花抽出物は、コラゲナーゼ酵素の活性を抑制した。その作用は、水分画の活性が比較的低く、脂溶性分画に強い活性が認められた。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
エラスターゼ酵素活性に及ぼす影響
［方法］
基質溶液として２ｍｍｏｌ／ｍＬのＮ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド１００μＬに各濃度の試料溶液５０μＬ（最終濃度０．１％のＤＭＳＯを含む）を加え、０．０５単位／ｍＬの豚膵臓由来のエアラスターゼ酵素液５０μＬを加え、３７℃、３０分反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、生成したニトロアニリン量を求め、エラスターゼ活性抑制率を算出した。
なお、基質、試料、エラスターゼは０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）緩衝液で溶解した。
エラスターゼ活性抑制率は以下の式により算出した。
エラスターゼ活性抑制率＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
Ａ：基質液と試料溶液とを混合した後、酵素液を添加した時の混合液の波長４０５ｎｍの吸光度
Ｂ：基質液と試料溶液とを混合した時の混合液の波長４０５ｎｍの吸光度
Ｃ：試料溶液の代わりに、該溶液の溶媒を基質液と上記割合で混合した後、酵素液を添加した時の混合液の波長４０５ｎｍの吸光度
Ｄ：試料溶液も酵素液も添加していない、基質液の波長４０５ｎｍの吸光度
【００５６】
［結果］
表５に示すように、各産地の椿花抽出物には、エラスターゼ酵素の活性を抑制する作用が認められた。溶媒分画では、ブタノール分画の抑制活性がやや弱かったものの、活性は各分画に分散していた。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
ヒアルロニダーゼ酵素活性に及ぼす影響
［方法］
ヒアルロニダーゼ阻害活性試験は、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法に準じて実施した。
１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解した試料溶液１００μＬにヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）３４ユニットを添加し、３７℃で２０分間予備加温した。同緩衝液に溶解した０．０５％（ｗ/ｖ）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（ナカライテスク社製）および２５ｍＭ塩化カルシウム溶液を１００μＬ加えて、３７℃で２０分間インキュベートしてヒアルロニダーゼを活性化させた。この溶液に２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸カリウム溶液１００μＬを加え、３７℃で４０分反応させた後、０．４ＮＮａＯＨ を１００μＬ加え、０．５Ｎ ＫＯＨに溶解した０．８Ｍホウ酸溶液を１００μＬ反応液に加え、１００℃で３分間加温した後、氷冷した。この溶液にｐ-ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を３ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた後、５８５ｎｍの吸光度を測定した。ヒアルロニダーゼ阻害活性は次式により求めた。
ヒアルロニダーゼ阻害活性（％）＝｛［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）］／（Ａ−Ｂ）｝×１００
Ａ：試料を添加していない反応液の吸光度（コントロール）
Ｂ：酵素を添加していない反応液の吸光度（ブランク）
Ｃ：試料を添加した反応液の吸光度
Ｄ：試料、酵素を添加していない反応液の吸光度（試料ブランク）
【００５９】
［結果］
表６に示すように、各産地の椿花抽出物にヒアルロニダーゼ酵素を抑制する作用が認められた。また、水分画にこの活性は全く認めらえず、脂溶性の分画に活性が集中し、そこから単離された化合物（４）、（５）に強い抑制作用が認められた。特に化合物（４）の活性は５μMの用量で８９％の抑制率を示した。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
キモトリプシン酵素活性に及ぼす影響
［方法］
Ｎ−サクシニル−１−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド１００μＬ（最終濃度０．１ｍＭ）を加え、各濃度の試料溶液５０μＬ、キモトリプシン〔和光純薬工業（株）〕１ｍｇ／ｍＬ を５０μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を測定して、酵素活性を測定した。
なお、試料、キモトリプシン、基質は０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に溶解した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の吸光度
Ｂ：対照ブランクの吸光度
Ｃ：試料の吸光度
Ｄ：試料ブランクの吸光度
【００６２】
［結果］
表７に示すように、キモトリプシン酵素に対して、各産地の椿花抽出物は抑制効果を示した。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
トリプシン酵素活性に及ぼす影響
［方法］
Ｎ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド１００μＬ（最終濃度０．１ｍＭ）を加え、各濃度の試料溶液５０μＬ、トリプシン〔和光純薬工業（株）〕１ｍｇ／ｍＬ を５０μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を測定して、酵素活性を測定した。
なお、試料、コラゲナーゼ、基質は０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に溶解した。また、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の吸光度
Ｂ：対照ブランクの吸光度
Ｃ：試料の吸光度
Ｄ：試料ブランクの吸光度
【００６５】
［結果］
表８に示すように、トリプシン酵素に対して、各産地の椿花抽出物は抑制効果を示した。
【００６６】
【表８】
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【００６７】
リパーゼ酵素活性に及ぼす影響
［方法］
トリオレイン８０ｍｇ、ホスファチジルコリン１０ｍｇ、タウロコール酸ナトリウム５ｍｇを０．１ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）９ｍＬ に懸濁した基質溶液０．１ｍＬ に各濃度の試料溶液を０．１ｍＬ加えて、３７℃で３分間インキュベートし、２５０μｇ／ｍＬの牛膵臓由来リパーゼ（ＳＩＧＭＡ）０．０５ｍＬを加えて、３７℃、３０分間インキュベートした。その後、１００℃で２分間加熱した後、氷冷し、遊離した脂肪酸量を遊離脂肪酸測定キット（ＮＥＦＡＣ−ｔｅｓｔ、Ｗａｋｏ）を使って測定し、リパーゼの活性を算出した。
なお、各試料の阻害作用は、次の式から求められる阻害率で算出した。
阻害率（％）＝〔１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）〕×１００
Ａ：対照の吸光度
Ｂ：対照ブランクの吸光度
Ｃ：試料の吸光度
Ｄ：試料ブランクの吸光度
【００６８】
［結果］
表９に示すように、リパーゼ酵素に対して、各産地の椿花抽出物は抑制効果を示した。
【００６９】
【表９】
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各産地の椿花抽出物はいずれも、肌の老化を進める酵素の活性を抑制し、肌老化を防止する作用が椿花に共通する作用として認められた。
また、数種の酵素活性を椿花抽出物が抑制することは、それぞれの酵素を抑制するために、個々の酵素を抑制する化合物や植物抽出物などをそれぞれ配合する必要がなく、椿花抽出物のみの配合で効果が期待出来、皮膚外用剤を製造する上で非常に有利である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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