【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年3月11日(2016.3.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
標的ＤＮＡの配列決定を行うための新規アプローチを以下に提示する。本方法は、標的ＤＮＡ捕捉デバイスとしての役割を果たすように、固相支持体上で汎用プライマー叢（lawn）（すなわち、ランダムに分布された少なくとも２つのプライマーを含有する叢）を修飾し、サンプルを大幅に操作することなく、捕捉されたＤＮＡの直接的な配列決定を可能にすることに基づく。本方法は、関連する流体プラットフォームを用いて、標的ＤＮＡの捕捉と配列決定実験のシームレスな統合を可能にする。このアプローチは、その配列決定の可能性を維持しながら、固相支持体上でＤＮＡ捕捉基質としての役割を果たす普遍的プライマー叢を使用する。本方法は、配列決定のための鋳型として未処理の天然ＤＮＡを使用することができる。この方法を使用した配列決定は、必ずしも研究施設に依存するわけではない。さらに、サンプル処理の間に導入されるあらゆるバイアスが回避され、他の方法と比較してより少ない時間および低コストで実質的により小さなサンプルを分析することができる。本方法は、一本鎖および二本鎖の鋳型を分析するために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ鋳型を分析する能力は、病理学アーカイブからのホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを使用するいくつかの配列決定用途にとって重要であり得る。同様に、一本鎖ＤＮＡ鋳型による配列決定を可能にすることにより、本方法は、複雑な核酸抽出ステップ、およびＤＮＡの二本鎖編成を保存するように設計された高価な断片化機器を必要としない。むしろ、廉価かつ効率的な溶解および加熱による断片化によってサンプルを調製することができる。単純な捕捉・配列決定アッセイは、ヒトゲノムＤＮＡに限定されず、細菌およびウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡ等の他の核酸基質も分析することができる。トランスクリプトーム、非翻訳領域、およびｍｉＲＮＡも、捕捉および配列決定することができる。また、ヌクレオチド配列の捕捉および配列決定、他の遺伝子特性およびエピジェネティックな特性（ＤＮＡメチル化、大きなゲノムの再編成、および遺伝子発現等）も調べることができる。本方法は、集団から合成ＤＮＡを選択するためにも用いることができる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
一般的に、配列決定は、ＤＮＡサンプルが、配列決定システム上での分析を促進するように構造的に修飾されるプロセスとして見なされてきた。以下に記載する方法は、配列決定システムを修飾するため、サンプルを修飾して大規模に調製する必要がない。合成ＤＮＡを使用して汎用プライマー叢を官能基化することにより、未処理サンプルの標的遺伝子のオリゴヌクレオチドライブラリーを直接的にアッセイすることができる。非特異的捕捉を減少させるために、ブリッジ構造の形成において用いられる配列を提供する特異的ＤＮＡ構成要素を経時的に導入すると、プライマー叢自体が修飾される。あらゆる種類のシーケンサーのための配列決定用ライブラリーの調製は、特異的二本鎖アダプター配列をＤＮＡ鋳型に付加することに依存する。捕捉オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化されたアダプターとしての役割を果たしたため、アッセイのためのライブラリーの調製は、単一アダプターの付加を必要とするだけであった。これによって、サンプル処理が実質的に短縮され、クローン増幅またはゲル電気泳動に基づくサイズ分別が不要となる。特定の場合において、固体支持体上で捕捉された鋳型に第２のアダプターが付加されてもよい。本方法の特定の実施形態は、配列決定用の鋳型としての粗ＤＮＡの使用を可能にする。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
追加の実施形態は、断片化ＤＮＡを鋳型として使用すること、および流体システムを使用して、捕捉されたＤＮＡ断片に配列決定アダプターを付加することにより、固体支持体上での配列決定のためにＤＮＡ断片の調製を可能にする方法を提供する。概念実証として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社の次世代ＤＮＡシーケンサーを使用してこれらのアプローチを開発した。プライマー叢の修飾およびヒトゲノム中の３６６ヶ所の標的部位を使用した、統合された捕捉および配列決定調製反応の結果を提示する。２５分間の加熱による断片化を除いて、全てのステップをＩｌｌｕｍｉｎａ社のフローセルの固相支持体上で行うことができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
以下に記載するデータは、アッセイのロバスト性、ならびに捕捉基質としての普遍的プライマー叢および流体システムの適用性を証明するものである。本方法がロバストに作用することを可能にする、プライマー叢の修飾の特有のパラメータを同定した。複雑な真核生物のゲノムに加えて、本方法は、真菌および他の微生物のゲノム、ウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡ、異なる源のトランスクリプトーム、ならびに合成ＤＮＡを捕捉するためにも適用できる。さらに、流体システムの固体支持体上に固定化された未変性のプライマー叢を「プログラミング」して、特異的な用途を実行するという概念を導入して立証した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
標的選択およびコンピュータによるＯＳ−Ｓｅｑオリゴヌクレオチドの設計    ＣＣＤＳ  Ｂｕｉｌｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００９０９０２、ＮＣＢＩのヒトゲノムＢｕｉｌｄ３７−ｈｇ１９、およびｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ  ＩＤ１３１を多型参照データセットとして使用した。遺伝子選択のために、ＧｅｎｅＲａｎｋｅｒアノテーションデータベースを使用して、重要性によって優先順位をつけた３４４個の癌遺伝子を選択した。オリゴヌクレオチドの標的特異的配列を検索するために、候補遺伝子のためのエクソンの定義をＣＣＤＳから採択した。標的エクソン（５００ｂｐ未満）のほとんどにおいて、４０−ｍｅｒ標的特異的配列が、エクソン境界の５’末端の１０塩基外側にあった（図３ａ）。個々のプライマー・プローブを使用してエクソンの両方の鎖を標的とした。ＯＳ−Ｓｅｑ−３６６は、エクソンの隣接領域のみを覆っていた。ＯＳ−Ｓｅｑ−１１ｋアッセイにおいて、エクソン領域全体が覆われるまで標的特異的配列をタイリングすることにより、５００ｂｐよりも大きいエクソンを処理した（図３ｂ）。ＯＳ−Ｓｅｑ−１１ｋのオンターゲット特異性を向上させるために、Ｒｅｐｂａｓｅを使用して反復性の高い配列を標的とするオリゴヌクレオチド配列を同定し、排除した。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
フローセルプライマー叢の修飾によるＯＳ−Ｓｅｑプライマー・プローブの合成    Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）システムにおいて、固相支持体（すなわち、フローセル）は、ポリアクリルアミド層上に極めて高密度でランダムに固定化された２つのプライマー（「Ｃ」および「Ｄ」）を有する。ＯＳ−Ｓｅｑ実験のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＣｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して「Ｄ」プライマーのサブセットを特異的に修飾した。ＮＧＳプライマー修飾の前に、１３３ｎＭオリゴヌクレオチドのプールを９５℃で５分間熱変性させた。熱ショック（９５℃で５分間）を用いてＯＳ−Ｓｅｑオリゴヌクレオチドのコード鎖を遊離させた。第２の鎖はフローセル上で不活性であり、ハイブリダイゼーション後に洗浄されたため、さらなる鎖の精製は必要なかった。変性オリゴヌクレオチドを４ｘハイブリダイゼーションバッファー（２０ｘＳＳＣ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈した。得られた１００ｎＭオリゴヌクレオチドをフローセル修飾実験に使用した。３０μｌのオリゴヌクレオチド混合物をフローセルの各レーンに分注した。温度勾配（１８分間で９６℃から４０℃）の間に、オリゴヌクレオチドは、固定化プライマー「Ｄ」に特異的にアニールした。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドを鋳型として「Ｄ」プライマーを伸長させるためにＤＮＡポリメラーゼを使用した。伸長後、元のオリゴヌクレオチド鋳型を伸長させた「Ｄ」プライマーから変性させ、固相支持体から洗浄した。伸長、洗浄、および変性ステップには標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ社のｖ４試薬を使用した。プライマー「Ｄ」の修飾によって、プライマー・プローブの固定化がもたらされた。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９２】
ＯＳ−Ｓｅｑの処理は３つのステップを伴う：Ｉｌｌｕｍｉｎａ社の配列決定システムを、標的特異的プライマー・プローブを含むように修飾し、単一アダプターライブラリーから標的を捕捉し、固定化された断片を配列決定のために完成させる（図１ｂ）。捕捉基質を調製するために、既存のプライマー叢のサブセットを標的特異的プライマー・プローブになるように修飾することにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のフローセルを分子的に再設計する。これらのプライマー・プローブを作製するために、オリゴヌクレオチドの複雑なプールの３’普遍的配列をフローセル上でその補体とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を使用して固定化プライマーを伸長させる。ランダムに配置された標的特異的プライマー・プローブのセットが得られ、フローセル表面上に固定される。６５℃の高温インキュベーションの間に、プライマー・プローブは、単一アダプターゲノムＤＮＡライブラリー内の標的相補的配列に特異的にハイブリダイズする：ハイブリダイゼーション後、次いで、プライマー・プローブは、別のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応のためのプライマーとして機能する。伸長ステップは、標的配列を効率的に捕捉する。伸長後、変性ステップを行い、次いで、４０℃の低温ハイブリダイゼーションにより配列決定用ライブラリーアダプターをフローセル上でその補体に安定化させ、ブリッジ構造を作製する。第３のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応により、３’末端に追加の配列を組み込み、固相増幅が可能な２つの分子を作製する。ＯＳ−Ｓｅｑに特異的な３つのステップの後、捕捉された分子をブリッジ増幅し、処理し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮＧＳシステムからの標準的な配列決定プロトコルを使用して配列決定する。ＯＳ−Ｓｅｑにおける分子生物学的ステップの詳細な説明は、上記に示され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＯＳ−Ｓｅｑ用Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎプログラムはそれに応じて変更される。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９３】
原理の実証の証拠として、２つの捕捉アッセイを開発した。最初に、１０個の癌遺伝子のエクソンに隣接する３６６個のＯＳ−Ｓｅｑプライマー・プローブ（ＯＳ−Ｓｅｑ−３６６）を設計した（図３）。このアッセイは、ＯＳ−Ｓｅｑの方法をテストすることを企図するものであって、決定的なエクソンカバレッジをテストすることを企図するものではなかった。カラムに基づく方法を使用してＯＳ−Ｓｅｑ−３６６オリゴヌクレオチドを合成した。次に、拡張性を証明するために、３４４個の癌遺伝子のエクソンを捕捉するための１１，７４２個のプライマー・プローブを設計および合成した（ＯＳ−Ｓｅｑ−１１ｋ）。これらのプライマー・プローブは、エクソンカバレッジの向上のために、反復を避けて大きなエクソンにわたってタイリングした。ＯＳ−Ｓｅｑ−１１ｋのハイスループットな産生のために、プログラム可能なマイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドを合成した。これらのアレイ合成オリゴヌクレオチドは、処理のためおよびＯＳ−Ｓｅｑに十分な材料を得るために増幅を必要とする（図４）。処理後、ＯＳ−Ｓｅｑオリゴヌクレオチドは、標的領域の５’末端に相補的な標的特異的４０−ｍｅｒを含有する（図５）。また、これらのオリゴヌクレオチドは、ペアエンド配列決定プライマーのアニーリングおよびフローセル上の固定化プライマー叢へのハイブリダイゼーションに必要な配列を含有する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された配列を捕捉および増幅する方法であって、
ａ）ｉ）表面結合オリゴヌクレオチドの第１の集団およびｉｉ）表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団を含む叢を含む基質を得ることであって、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１および第２の集団のメンバーは基質の表面全体にランダムに分布され、前記基質は空間的にまたは光学的にアドレス指定された単一ヌクレオチドの集団を含まないものであることと、
ｂ）前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１の集団の第１のメンバーを、前記第１のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム配列を含有する領域を含む合成選択オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、
ｃ）前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１の集団の前記第１のメンバーを伸長させて、前記ゲノム配列に相補的な配列を含む支持体結合選択プライマーを生成することと、
ｄ）前記支持体結合選択プライマーを、前記ゲノム配列を含む核酸断片を含む断片化されたゲノムとハイブリダイズさせることであって、前記核酸断片が５’末端にアダプターを含むものであることと、
ｅ）前記支持体結合選択プライマーを伸長させて、ゲノム内の前記ゲノム配列に隣接する隣接配列を含有する伸長産物を生成することであって、前記伸長産物が、ｄ）工程のアダプターに相補的な配列を３’末端に含むものであることと、
ｆ）前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１および第２の集団の伸長されていないメンバーを使用して、前記基質上で前記伸長産物をブリッジＰＣＲによって増幅して、前記隣接配列を含むＰＣＲ産物を生成することであって、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団のメンバーが、ｅ）工程の伸長産物の３’末端のアダプターに相補的な配列とハイブリダイズし、前記隣接配列を含むＰＣＲ産物を生成すること
を含む方法。
【請求項２】
ｄ）工程の前記５’末端アダプターは、前記断片化されたゲノムにライゲートされた末端に配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団は、
ｉ．表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第２の集団のメンバーを、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団の前記メンバーとハイブリダイズする領域および前記核酸断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、
ｉｉ．前記表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第２の集団の前記メンバーを伸長させて、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団を生成することと、によって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択オリゴヌクレオチドは、前記第１のメンバーとハイブリダイズする前記領域と前記ゲノム配列を含有する前記領域との間に配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｆ）工程の前記ＰＣＲ産物の第１の鎖を配列決定して、前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｆ）工程の前記ＰＣＲ産物の第２の鎖を配列決定して、前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
断片化されたゲノムを生成するために哺乳動物のゲノムを断片化することと、前記断片化されたゲノムにアダプターを付加することと、前記基質に前記断片化されたゲノムを適用することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記断片化は、物理的に、化学的に、または制限酵素を使用して行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記断片化は、超音波処理または剪断によって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリッド形成は、複数の異なる個体からの複数の断片化されたゲノムを調製することと、プールを生成するために前記複数の断片化されたゲノムをプールすることと、前記断片化されたゲノムのプールを前記基質に適用することと、前記異なる個体の前記ゲノム配列に隣接する配列を含むＰＣＲ産物を得ることと、によって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲ産物の少なくとも前記第１の鎖を配列決定して、前記異なる個体の前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プールすることの前に、異なるアダプターが、前記異なる個体からの前記断片化されたゲノムにライゲートされ、前記アダプターは、前記ＰＣＲ産物が配列決定された後に、前記アダプターをライゲートしたゲノム断片の源が同定されることを可能にするバーコード配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
第１のバーコード配列を含む第１のアダプターを使用して、第１の対象からの断片化されたゲノムＤＮＡにアダプターをライゲートして、第１の産物を生成することと、
第２のバーコード配列を含む第２のアダプターを使用して、第２の対象からの断片化されたゲノムＤＮＡにアダプターをライゲートして、第２の産物を生成することと、
前記第１および第２の産物を組み合わせて、混合鋳型を生成することと、
前記混合鋳型を使用して請求項１の方法を行って、各々が前記バーコード配列を含有する第１および第２のＰＣＲ産物を提供することと、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合された鋳型は、少なくとも１，０００の対象からの断片化されたゲノムＤＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｉ．前記核酸断片を、配列決定プライマーのための部位および前記第２の表面結合オリゴヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を含有するアダプターにライゲートすることと、
ｉｉ．前記アダプターをライゲートした断片を、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１の集団の第１のメンバーとハイブリダイズさせることと、
ｉｉｉ．前記アダプターをライゲートした断片がハイブリダイズされた前記表面結合オリゴヌクレオチドの第１の集団の前記第１のメンバーを伸長させることと、
ｉｖ．前記伸長産物の前記アダプターを含有する末端を、第２の支持体結合ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによってブリッジを生成し、ブリッジＰＣＲを促進することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団は、前記核酸断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第２の集団にライゲートして、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第２の集団を生成することによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸断片は、ゲノム断片またはｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。