【手続補正書】
【提出日】平成28年6月9日(2016.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変動物を作製する方法であって、
胚または細胞の標的染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに前記胚または細胞を曝露する工程と、
代理母において前記細胞をクローニングする工程または代理母に前記胚を移植する工程であって、
前記代理母が、それによって、レポーター遺伝子を含むことなく、かつ前記ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位でのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する工程と
を含む方法。
【請求項２】
外来性配列を含有するＤＮＡに前記胚または細胞を曝露する工程であって、前記遺伝子改変が前記外来性配列を含む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来性配列が、前記ＴＡＬＥＮ標的化染色体部位の代替アレルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記代替アレルが、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシに存在するミオスタチンアレルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞または胚が第１の品種に属し、前記アレルが動物の第２の品種に属する、請求項３〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、外来性核酸配列への変化、逆位、転座、天然アレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、異種間のアレル移動、同一種のアレル移動、および新規アレルへの遺伝子変換からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡとしてまたは前記ｍＲＮＡをコードするプラスミドとして前記細胞に直接導入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記妊娠動物が、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、ゼブラフィッシュ、イヌ、マウス、ネコ、マウス、ラット、および実験動物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、家畜細胞、偶蹄目動物細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞、幹細胞、および接合体からなる群から選択されるか、または前記胚が胚盤胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、体細胞核移植またはクロマチン移植によりクローニングされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って調製された遺伝子改変動物。
【請求項１２】
遺伝子改変された非ヒト動物細胞または胚を作製する方法であって、
前記胚または細胞の標的化染色体部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡに前記動物の胚または細胞をインビトロで曝露する工程であって、前記細胞または胚が前記標的化染色体部位でのみ遺伝子改変される工程を含み、かつ前記方法がレポーター遺伝子を含むことなく実施される方法。
【請求項１３】
前記アレルが、挿入、欠失、多型、および一塩基多型からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
目的の部位に外来性核酸配列を含み、かつ他の遺伝子改変をまったく含まない、遺伝子改変動物。
【請求項１５】
前記外来性核酸配列がアレルであり、かつ前記目的の部位が前記アレルの相同体である、請求項１４に記載の動物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法で作製または使用される細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０、または１２〜１３のいずれか一項に従って調製された動物、細胞、または胚。
【請求項１８】
請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って作製された細胞または胚の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。
【図２】複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。
【図３】ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性を示す図である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮを、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞が形成されるまでインビトロで培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮにより媒介されたウシ胚のインデルを解析した図である。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆する、予想されるＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５  ＴＡＬＥＮにより媒介されたブタ接合体のインデルを解析した図である。
【図４】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示した野生型配列を示す。欠失および挿入の両方の現象が同定された。
【図５】家畜線維芽細胞において遺伝子編集するためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する図である。図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０，およびＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３、（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１に比較して））は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有し、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインがＣ末端に融合している。番号はＤＮＡ結合ドメインに対するものである。第１の反復可変２残基反復（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と標記し、最後のＲＶＤ反復の後のアミノ酸を「＋１」と標記する。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１  ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮペアのいずれかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝無処理。図ｃ）＋２３１またはＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドのいずれかを有する４つのさらなるＴＡＬＥＮペアの活性を示す図である。
【図６】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入を示す図である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図７】インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択を示す図である。実験スケジュールを図（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を分割前に３０℃または３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養してトランスポゾン組み込みを＋／−選択するために再播種する。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのために１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のために凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択、およびＴＡＬＥＮ  ｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。
【図８Ａ】インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングの図である。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２重の配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２重のピークにより各アレル間の相違が同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合型突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に２重ピークを示さない。
【図８Ｂ】野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合型インデルを有する両アレルクローンの配列比較を示す図である。
【図９Ａ】ＤＭＤの両アレル性改変アレルを示す図である。ホモ接合型改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を包含する）または各アレルに異なる突然変異を有する両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを有するコロニーでは、各アレルの配列決定の回数を右側に示す。一部の場合では、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定され、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示された。フレームシフトアレルを示し、またミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図９Ｂ】ＬＤＬＲの両アレル性改変アレルを示す図であり、図９Ａと同様の表記法を用いる。
【図１０】ＴＡＬＥＮにより誘導された欠失および逆位を示す図である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの配向を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想される産物の大きさと共に示す。エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方でＰＣＲ産物が観察された。
【図１１】ＤＭＤの欠失配列を示す図である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列に陰影を付け、ＴＡＬＥＮ認識部位に下線を付す。挿入されたヌクレオチドに陰影を付す。
【図１２】ＤＭＤの逆位配列を示す図である。ＤＭＤの逆位アレルの模式図を、シーケンシングにより解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想される配列を示し、対応する融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団に由来する、配列決定された逆位アレルを示す。各アレルの配列決定の回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。
【図１３】ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す図である。図ａ）二本鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対の欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が実証される。このアッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して生成させた（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の評価を混乱させると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対の欠失にまたがり、野生型アレル（ｗｔ）を増幅することができない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。
【図１４】シーケンシングによる、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ遺伝子移入の確認を示す図である。Ｗａｇｙｕ野生型ＧＤＦ８およびＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアームの外側に位置するプライマー（ｃおよびｄ）を使用してＰＣＲを行った後、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレル（ヘテロ接合型）に特徴的な予想された１１塩基対の欠失が明らかにされる。
【図１５】ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルを示す図である。ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。
【図１６】図５のＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドに関する詳細な配列情報およびＳａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより使用される別のスキャフォールドとの比較を示す図である。
【図１７】非翻訳部分を含む、図５のＣａｒｌｓｏｎ  ＋６３スキャフォールドを作製するために使用したベクターに関する詳細な核酸配列を示す図である。
【図１８】ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのためのＡＡＶ送達一本鎖ＤＮＡ鋳型の使用について示す図である。ａ）相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、青の矢印）およびｒＡＡＶ相同組換え鋳型（ＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ｂ）アレル特異的ＰＣＲから、ＨＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲ鋳型を含有する欠陥ＡＡＶによる感染に依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。
【図１９】ウシＧＤＦ８遺伝子座での相同組換えのための鋳型としての一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯｌｉｇｏ）の使用について示す図である。相同組換えにより、ウシＧＤＦ８遺伝子のエクソン３に１１ｂｐの欠失（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）および２つのｓｓＯＤＮを設計した。各ｓｓＯＤＮは、長さが７６塩基対であり、同じ標的部位のセンス鎖およびアンチセンス鎖であった。アレル特異的ＰＣＲから、ＨＤＲ誘導がトランスフェクションｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮ、およびその２４時間後のリポフェクタミンＬＴＸを使用するｓｓＯＤＮのトランスフェクションに依存することが実証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失にまたがり、野生型アレル「ＷＴ」を増幅することができない。１，０００細胞相当量を各ＰＣＲ反応に含み、表示コピー数の対照鋳型による陽性対照反応を、相同組換えの比較定量に使用した。ＢＢ−ＨＤＲセンス（Ｓ）は配列番号１３３を有し、ＢＢ−ＨＤＲアンチ（ＡＳ）は配列番号１３４を有する。
【図２０】家畜細胞にＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトすると、効率的な標的切断が生じることを示す図である。図ａ：表示量のｍＲＮＡをブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、３０℃または３７℃のいずれかで３日間、トランスフェクト細胞を培養した後、インデル解析を行った。図ｂ：ＮＨＥＪの割合を決定した。ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードする４マイクログラムのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる平均のＮＨＥＪの割合を、３０℃または３７℃で培養した細胞について点線で示した。
【図２１】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮのトランスフェクションは、ｓｓＯＤＮ  ＨＤＲを増強することを示す図である。ｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよびＢＢ−ＨＤＲセンスｓｓＯＤＮ（配列番号１３３）を、指定の機序によりＷａｇｙｕ細胞に導入し、上記のＰＣＲアッセイによりＨＤＲを測定した。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの両方がヌクレオフェクションにより同時に送達された細胞集団から、コロニーを単離した。
【図２２】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用する、種内天然アレルの移入を示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２１の方法によりＷａｙｇｕ線維芽細胞に移入した。「ｏｌｉｇｏ」と標記した配列は、配列番号１３５を有する。
【図２３】図２２のプロセスを、異なる温度（３７℃）で繰り返した。
【図２４】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、ある種に由来する天然アレルを他の種に移入することを示す図である。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅミオスタチンアレルＣ３１３Ｙを、図２５の方法によりＯｓｓａｂａｗ線維芽細胞に移入した。次のｓｓＯＤＮを使用した：ｇｇｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｔｃｔｇｇａｇａｇｔａｔｇａａｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔａｃａａａａａｔａｃｃｃｔｃａｃａｃｔｃａｔｃｔｔｇ（配列番号１４６）。
【図２５】ｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮおよびｓｓＯＤＮを使用して、特定のフレームシフトアレルをブタＬＤＬＲに導入することを示す図である。ブタＬＤＬＲ遺伝子のエクソン２に４塩基対の挿入を導入するために、９０ｂｐのｏｌｉｇｏを作製した。この挿入により、新規ＢａｍＨ１部位が生成し、フレームシフトアレルが誘発されることが予想される。ｓｓＬＤＬＲ２．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（マイクログラム単位の表示用量で）および０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮのコトランスフェクションの後、細胞を３０℃で３日間培養し、次いで３７℃でさらに１日培養した。４および２０日目に、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによりＮＨＥＪを測定した。ブタＬＤＬＲのエクソン２を含むＰＣＲ産物のＢａｍＨ１消化、ならびにデンシトメトリーによる、制限フラグメント（ＨＤＲを示す）の定量および野生型産物（上段産物、ＨＤＲなし）との比較により、ＨＤＲの割合を決定した。各処理からのコロニーを単離し、ＰＣＲおよびＢａｍＨ１消化により解析した。「Ｗｔ」と標記した配列は配列番号１３６を有し、「センス」と標記した配列は配列番号１３７を有する。
【図２６】ＤＮＡおよびｍＲＮＡにコードされたＴＡＬＥＮが、幹細胞で活性であることを示す図である。上段の図は、ブタ雄性生殖細胞系幹細胞（ＧＳＣ）にプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトしたＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮのＮＨＥＪの割合を示す。ヌクレオフェクション溶液Ｌ、Ｖ、またはＢを評価した。下段の図は、ＤＭＤ７．１  ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたブタＧＳＣのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。ｍＲＮＡの量（マイクログラム）を示す。
【図２７】ＴＡＬＥＮは、ニワトリ細胞においてＤＳＢを媒介し、ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）における相同組換えを促進することができる。図ａ）ＴＡＬＥＮ活性は、ＤＦ１不死化ニワトリ細胞株トランスフェクションおよびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイで最初に測定した。図ｂ）ニワトリｄｄｘ４遺伝子座のターゲティング戦略の模式図である。ＧＦＰ／ピューロマイシンレポーター遺伝子を、標的化細胞の第２エクソンにおける内因性コード配列と置き換える。図ｃ）相同組換えコンストラクト、ＴＡＬＥＮ（Ｔａｌ  １．１またはＴａｌ  ７．１のいずれか、空ベクター）、およびピューロマイシン選択トランスポゾンで、ＰＧＣにトランスフェクトした。ピューロマイシンで選択した後、Ｔａｌ  ７．１トランスフェクションでも空ベクタートランスフェクションでもなく、Ｔａｌ  １．１  ＴＡＬＥＮを使用した場合（右写真、左は明視野である）に、ＧＦＰ＋細胞を単離することができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
家畜の胚におけるＴＡＬＥＮの機能については、インビトロで調製した（ＩＶＰ）ウシおよびブタの胚を使用して検討した。実施例１および実施例２は、ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ）をウシ胚に直接インジェクトして、ＴＡＬＥＮが特異的に結合した部位に改変を含む遺伝子改変動物を作製したことについて記載する。改変には、ホモ接合型およびヘテロ接合型（両アレル）の改変が含まれた。ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを胚に直接インジェクトしたところ、遺伝子改変の成功が観察された。したがって、ＴＡＬＥＮを使用した直接的な胚改変は、家畜ゲノム改変の実行可能なアプローチであることが示された。このようにして、周知のプロセスを使用して、動物ファウンダー系統の妊娠および出産のための胚を調製し、代理雌に移植することができる。さらに、その後クローニングまたは他のプロセスに使用するために、レポーターを用いて細胞（たとえば、初代細胞、接合体、卵母細胞、胚盤胞）を選択することも可能である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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