【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年1月29日(2016.1.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ基質の配列特異的な切断のための二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの使用であって、
前記エンドリボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ  ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；  Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ  ５’、
あるいは、
前記エンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ  ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ  ５’、
および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；  Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）であり、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ  ５’、
あるいは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ  ５’、
および、前記二本鎖ＲＮＡ基質は、認識配列を含み、前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識配列内で切断され、
前記二本鎖ＲＮＡ基質は、２２以上の長さの塩基対を含むことを特徴とする使用。
【請求項２】
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ  ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ  ５’、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列である、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ  ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ  ５’、
、ことを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによる、特異的に認識される共通配列内における二本鎖ＲＮＡ基質の配列特異的な切断方法であって、
前記方法は、
ａ）混合物中の二本鎖ＲＮＡ基質と、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを組み合わせる工程、及び
ｂ）二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって、特異的に認識される共通配列における前記二本鎖ＲＮＡ基質を切断する工程を含み、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ  ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；  Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ  ５’、
あるいは、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ  ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ  ５’、
および、二本鎖ＲＮＡ基質は特異的に認識される共通配列を含み、特異的に認識される共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；  Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）は以下の通りであり、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ  ５’、
あるいは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ  ５’、
二本鎖ＲＮＡ基質が２２以上の長さの塩基対を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ  ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ  ５’、
前記二本鎖ＲＮＡ基質は特異的に認識される共通配列を含み、特異的に認識される共通配列は以下の通りである、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ  ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ  ５’、
、ことを特徴とする、請求項３記載の二本鎖ＲＮＡ基質の配列特異的な切断方法。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡの切断は、３５°Ｃから４５°Ｃまでの温度で、および／または、５乃至６０ｍＭの塩化ナトリウム濃度で、１乃至２．５ｍＭのＭｇ２＋濃度で、行われる、ことを特徴とする、請求項３又は４に記載の二本鎖ＲＮＡ基質の配列特異的な切断方法。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼであって、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ  ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ  ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ  ５’
および、前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、前記共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示す、ことを特徴とする二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列が、以下の共通配列である、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ  ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ  ５’、
、ことを特徴とする請求項６記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを生成するための方法であって、
前記方法は、
請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを発現させる工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項９の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを含むキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
【表４】
2014518641.tif 000001
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
【表８】
2014518641.tif 000002
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
位置番号９４（Ｄ９４Ｒ）のアルギニンに対する置換変異体を作成した。タンパク質を工程３のように精製し、そのエンドリボヌクレアーゼ活性を２つの基質：バクテリオファージΦ６ゲノム、および、２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡで試験した。好ましい切断部位を有している２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡは、野生型酵素およびＤ９４Ｒ変異体によって同様に切断された。３８の共通な切断部位を有するΦ６二本鎖ＲＮＡは、両方の酵素によって同じ効率では切断されなかった。Ｄ９４Ｒ変異体による切断は、野生型の酵素と比較して、低下した。得られた結果を図５に示す。変異体Ｄ９４Ｒは二本鎖ＲＮＡの優先配列に対する選択性を増加させていることがわかる。酵素の選択性の増加は、二本鎖ＲＮＡの配列認識および切断を狭める結果を招くことになる。上記の結果によって、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループは、二本鎖ＲＮＡの配列によってのみ決定されるとともに不規則な螺旋構造および／または他のタンパク質との協働からは独立している、二本鎖ＲＮＡ切断時の配列特異性を決定することが明らかになった。該方法は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性の増加を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体につながる選択も実証しており、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断を含む誘導体および／または変異体を得る上記のような方法で、エンドリボヌクレアーゼ誘導体および／または変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断における特異的な配列に対する感受性の変化、増大を伴って生成される。