(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボン酸とハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて得られる混合酸無水物と、水酸基またはアミノ基を有するグリコサミノグリカンとを反応させ、該混合酸無水物のカルボニル基と該グリコサミノグリカンの水酸基もしくはアミノ基とをエステル結合またはアミド結合させることを特徴とする、カルボン酸と該グリコサミノグリカンとがエステル結合またはアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体の製造法。
【請求項２】
カルボン酸が、カルボキシル基以外の官能基が保護基で保護されたものであり、上記エステル結合反応またはアミド結合反応後、該保護基を除去する請求項１記載のグリコサミノグリカン誘導体の製造法。
【請求項３】
カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて、該グリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとからなるグリコサミノグリカン混合酸無水物を製造することを特徴とするグリコサミノグリカン誘導体の製造法。
【請求項４】
カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて得られるグリコサミノグリカン混合酸無水物と、１級アミンまたは２級アミンとを反応させ、該混合酸無水物のカルボニル基と該アミンのアミノ基とをアミド結合させることを特徴とする、該グリコサミノグリカンと１級アミンまたは２級アミンとがアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体の製造法。
【請求項５】
無水の有機溶媒中で中和剤の存在下で反応させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で反応させることを特徴とする請求項１または４記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカン誘導体およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリコサミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」ということがある）には抗血栓剤であるヘパリンや関節炎の治療剤であるヒアルロン酸のように、すでにその有用性が明らかなものと、コンドロイチン硫酸などのように用途開発が十分なされていないものがある。一方、ペプチドやタンパク質等は様々な優れた薬理作用を示すため有用な医薬品となる可能性を秘めた化合物群であるが、生体内での不安定さのため実用化が困難である場合が多い。そこでこれらの化合物を高分子化合物で修飾することで生体内での安定性を高めることが知られており、生体適合性に優れたＧＡＧとアミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、その他の低分子有機化合物等との複合体（多糖ハイブリット）はそのような目的に適したものであると考えられ、両者の有用性を増したり、新たな機能を持たせることが出来る。
【０００３】
例えば、ヒアルロン酸は動物組織中に天然に存在し生体再吸収性を有すると共に毒物学的および免疫学的作用が存在しないためそれ自体が薬剤、化粧品として利用されており、これに医薬品や生理活性ペプチドを結合させたものは優れたドラッグデリバリーシステムの薬剤となる。またヒアルロン酸を化学修飾により不溶化することで生体適合性にすぐれた医療用材料となる。
【０００４】
上記の多糖ハイブリットを得るためのＧＡＧの化学修飾法としては、ＧＡＧが有機溶媒に不溶であることからＧＡＧをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させピリジンを触媒とし酸塩化物と反応させる方法（Eur.J.Biochem.,1,46-50(1967)、Chem.Express,6(9),647-650(1991)）、およびＧＡＧがカルボキシル基を有し水溶性であるため、水溶液中、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）等の存在下で水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）のような活性化縮合剤と処理することでＧＡＧとアミン類とを結合させる方法が知られている。
【０００５】
また、ヘパリンのナトリウム塩をアンモニウム塩または３級アミン塩に置換し、ＤＭＦに可溶にした後、ジメチルアミノピリジンを触媒とし、カルボン酸の対称酸無水物と反応させる方法が知られている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２３６，１０７−１１９（１９９２））。
一方、ペプチドの化学合成法として、塩化ジメチルホスフィノチオイル（Ｍｐｔ−Ｃｌ）を用いる混合酸無水物法によってアミノ酸を縮合する反応が知られている（Chem.Lett.,1,p45-48(1982)）。この方法は、ペプチド合成においてアミノ酸の水酸基を無保護で反応でき、またアルコール系の溶媒中でも反応することができる方法である。また、酢酸、安息香酸、グリコール酸、グルクロン酸等のカルボン酸とＭｐｔ−Ｃｌとから誘導される混合酸無水物とグルコサミンまたはガラクトサミン等のアミノ糖とを反応させるＮ−アシルアミノ糖の製造方法が知られている（特開昭61-197589）。
【０００６】
しかしながら、グリコサミノグリカンを含む多糖の化学修飾にハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルを用いた混合酸無水物法は使用されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の、ＧＡＧの化学修飾法では、加熱や長時間の反応など過酷な反応条件が必要であり、しばしば低分子化や副反応を伴っていた。また、ＷＳＣのような活性化縮合剤を使用する方法は、活性化縮合剤や活性化されたカルボキシル基が水と反応して徐々に分解する上、反応が遅いため過剰の試薬を使用することからアミド化率をコントロールすることが困難であった。また過剰に使用した活性化縮合剤やその分解物、また特にアシル転移により副生するアシル尿素の除去が困難なため、しばしば問題となっていた。
【０００８】
さらに、ヘパリンのアンモニウム塩または３級アミン塩をカルボン酸の対称酸無水物と反応させる方法は、対称酸無水物が不安定であるので反応中に分解するためカルボン酸を所望量ヘパリンに導入することが困難であるという問題があった。
本発明の目的は、ＧＡＧを温和な条件下、短時間に化学修飾を施す方法および該方法で製造しうるＧＡＧ誘導体を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、上記課題を以下の構成によって解決する事に成功した。
すなわち本発明は、
１）カルボン酸とハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて得られる混合酸無水物と、水酸基またはアミノ基を有するグリコサミノグリカンとを反応させ、該混合酸無水物のカルボニル基と該グリコサミノグリカンの水酸基もしくはアミノ基とをエステル結合またはアミド結合させることを特徴とする、カルボン酸と該グリコサミノグリカンとがエステル結合またはアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体の製造法、
２）カルボン酸が、カルボキシル基以外の官能基が保護基で保護されたものであり、上記エステル結合反応またはアミド結合反応後、該保護基を除去する上記１）記載のグリコサミノグリカン誘導体の製造法、
３）カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて、該グリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとからなるグリコサミノグリカン混合酸無水物を製造することを特徴とするグリコサミノグリカン誘導体の製造法、
４）カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンとハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイルとを反応させて得られるグリコサミノグリカン混合酸無水物と、１級アミンまたは２級アミンとを反応させ、該混合酸無水物のカルボニル基と該アミンのアミノ基とをアミド結合させることを特徴とする、該グリコサミノグリカンと１級アミンまたは２級アミンとがアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体の製造法、
５）無水の有機溶媒中で中和剤の存在下で反応させることを特徴とする上記１）〜４）のいずれかに記載の製造法、
６）水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で反応させることを特徴とする上記１）または４）記載の製造法、
７−１）上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸またはこれらに水酸基もしくはアミノ基を有するスペーサー化合物が結合されたスペーサー化合物結合グリコサミノグリカンであり、カルボン酸が１または２以上のカルボキシル基を有する生理活性物質である、上記１）記載の方法で製造されたカルボン酸と水酸基またはアミノ基を有するグリコサミノグリカンとがエステル結合またはアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体、
７−２）上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸またはこれらのカルボキシル基にスペーサー化合物としてジアミンを共有結合させたアミノ基を有するスペーサー化合物結合グリコサミノグリカンであり、カルボン酸がインドメタシン、デオキシコール酸、アセチルサリチル酸、サラゾスルファピリジン、メトトレキサート、ロイシンエンケファリン、ロイシン、セリン、グリシンまたはグルタミンである１）の方法で製造されたカルボン酸と水酸基またはアミノ基を有するグリコサミノグリカンとがエステル結合またはアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体、
８−１）上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸またはこれらにカルボキシル基を有するスペーサー化合物が結合されたスペーサー化合物結合グリコサミノグリカンであり、１級アミンまたは２級アミンが１級アミノ基または２級アミノ基を有する生理活性物質である上記４）記載の方法で製造されたカルボキシル基を有するグリコサミノグリカンと１級アミンまたは２級アミンとがアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体、
８−２）上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸であり、１級アミンまたは２級アミンがベスタチン、トラネキサム酸、アドリアマイシン、メトトレキサート、フェニルアラニンまたはグルタミンである上記４）記載の方法で製造されたカルボキシル基を有するグリコサミノグリカンと１級アミンまたは２級アミンとがアミド結合してなるグリコサミノグリカン誘導体である。
【００１０】
以下、本発明につき、詳細に説明する。
本発明で使用する、カルボン酸とハロゲン化ジ低級アルキルホスフィノチオイル（以下、Ｒｐｔ−Ｘと記す。Ｘはハロゲン、Ｒｐｔはジ低級アルキルホスフィノチオイル基：一般式Ｒ2 Ｐ＝Ｓ（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基、好ましくはメチル基）を示す。）とを反応させて得られる混合酸無水物（以下、「混合酸無水物Ａ」ともいう）は、該カルボン酸とＲｐｔ−Ｘとを−２５℃から４０℃、好ましくは０℃から２５℃で１分間から１時間、好ましくは１分間から１０分間反応させることにより得られる。また、カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンとＲｐｔ−Ｘとを反応させて得られるグリコサミノグリカン混合酸無水物（以下、「混合酸無水物Ｂ」ともいう）は、カルボキシル基を有する該ＧＡＧとＲｐｔ−Ｘとを上記混合酸無水物Ａの調製条件と同じ条件下で反応させることにより得られる。
【００１１】
混合酸無水物Ａの生成反応は、以下の式（１）で表される。
Ｒ′−ＣＯＯＨ  ＋  Ｒｐｔ−Ｘ  →  Ｒ′−ＣＯＯＲｐｔ    （１）
（Ｒ′はカルボン酸のひとつのカルボキシル基を除く残基である。）
混合酸無水物Ｂの生成反応は、以下の式（２）で表される。
ｇａｇ−ＣＯＯＨ  ＋  Ｒｐｔ−Ｘ  →  ｇａｇ−ＣＯＯＲｐｔ    （２）
（ｇａｇはＧＡＧのひとつのカルボキシル基を除く残基である。）
本発明において、ＧＡＧとは、ＧＡＧ自体およびＧＡＧ自体にスペーサー化合物等を導入した誘導体を含む概念である。
【００１２】
上記（２）式の混合酸無水物Ｂ、即ち、ｇａｇ−ＣＯＯＲｐｔは、本発明の方法で生成されるＧＡＧ誘導体の一種であり、かつ更にこれと１級アミンまたは２級アミンと反応して得られる新規ＧＡＧ誘導体の原料でもある。
【００１３】
上記式（１）の反応に使用されるカルボン酸は、Ｒｐｔ−Ｘと反応しうるカルボキシル基を有する化合物を全て包含し、該化合物のカルボキシル基以外の官能基（例えば、アミノ基、水酸基等）が保護基で保護された化合物であってもよい。
カルボン酸としては、具体的にはアミノ基を保護したアミノ酸（Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH 、Z-Leu-OH、Boc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Gly-OH、Z-Gly-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、等、ここでFmoc- は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Z-はベンジルオキシカルボニル基、Boc-は第３ブトキシカルボニル基、tBuは第３ブチル基をそれぞれ示す。）、アミノ基を上記アミノ酸の場合と同様に保護したペプチド、分子内にカルボキシル基を持ち有用な薬理作用を有する生理活性物質（例えば、インドメタシン、デオキシコール酸、アセチルサリチル酸、サラゾスルファピリジン、ニコチン酸、チオクト酸、インドール−３酢酸、レチノイン酸、メトトレキサート等）、スペーサー化合物としてジカルボン酸を公知の方法でアミノ基あるいは水酸基を有する化合物に結合させカルボキシル基を持たせた該化合物、脂肪族カルボン酸（パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸等）、ケイ皮酸、サリチル酸、trans-エポキシコハク酸等が挙げられる。
【００１４】
また、上記式（２）の反応に使用されるカルボキシル基を有するＧＡＧとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸等が挙げられる。特にヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸は、生体適合性、ＧＡＧ誘導体の活性持続性等の点で優れるので好ましい。
上記のＧＡＧは、由来、分子量には限定されないが、一般的には分子量約１万〜５００万、好ましくは約２万〜２００万が挙げられる。また遊離型または塩型のＧＡＧのいずれも使用できるが、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン（例えば、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン等の３級アミン等）塩等のアルカリ塩が好ましく、特に一般的には入手し易いナトリウム塩またはカリウム塩が好ましい。
【００１５】
上記カルボキシル基を有するＧＡＧとしては、少なくともカルボキシル基を有するように、例えばカルボキシル基を有するスペーサー化合物等の公知化合物を公知の手法により結合することにより合成することもできる。
合成に使用するスペーサー化合物としては、ジカルボン酸、アミノ酸あるいはこれらのカルボキシル基に保護基を導入した誘導体等が挙げられる。
【００１６】
スペーサー化合物としては、例えば、Ｒ1 −（ＣＨ2 ）n −Ｒ2 （Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝カルボキシル基、またはＲ1 ＝保護されたカルボキシル基かつＲ2 ＝アミノ基、ｎが２〜１８）が挙げられるが、これに制限されるものではない。ここで、保護基は、スペーサー化合物を結合したＧＡＧ作成後にカルボキシル基の保護基を脱保護できるものであればよい。
【００１７】
尚、本発明においては、便宜上「カルボキシル基を有するＧＡＧ」は「カルボン酸」には包含されないものと定義する。
Ｒｐｔ−Ｘは、公知のものを使用できるが、好ましくは塩化物、臭化物等を用い、低級アルキル基としては炭素数１〜４のアルキル基、好ましくはメチル基のものを用いる。具体的には塩化ジメチルホスフィノチオイル（Ｍｐｔ−Ｃｌ）が例示される。
【００１８】
混合酸無水物ＡまたはＢの生成反応の際、カルボキシル基がフリーの酸である場合には混合酸無水物ＡまたはＢの形成（カルボキシル基の活性化）に伴い発生する塩酸を中和するための塩基、好ましくはトリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン等の３級アミンをＲｐｔ−Ｘと等モル量添加することが好ましい。またカルボキシル基が該塩基の塩である場合にはさらに塩基を添加する必要はない。
【００１９】
上記生成反応は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、ジクロロメタン等の単一または混合された有機溶媒中、好ましくは無水の有機溶媒中で行われる。
例えば、カルボン酸をＲｐｔ−Ｘと反応させて（活性化して）混合酸無水物Ａを製造する場合は、クロロホルムやＤＭＦ等の非プロトン性有機溶媒中で反応させる。またカルボキシル基を有するＧＡＧのカルボキシル基を同様に活性化して混合酸無水物Ｂを製造する場合には、公知の方法によりＧＡＧのカルボキシル基や硫酸基のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）またはアルカリ土類金属塩等をアンモニウム塩または３級アミン塩に置換することでＤＭＦ等の非プロトン性有機溶媒に可溶化したものを使用して反応させることができる。この場合、ＧＡＧを有機溶媒に溶解後モレキュラーシーブ等を用いて残留する水分を除去すると、混合酸無水物の分解が抑えられるので、この操作を行わない場合に比べて後述の１級アミンまたは２級アミンの導入率が向上する。
【００２０】
カルボン酸またはカルボキシル基を有するＧＡＧに対して、Ｒｐｔ−Ｘは過剰に用いることも可能であるが、通常１．０〜１．２当量、好ましくは等モル（１．０当量）を使用すれば、所望の混合酸無水物を得ることが出来る。酸無水物法には対称酸無水物法と混合酸無水物法が知られており、所望の酸無水物を得るために前記対称酸無水物法を用いると、２当量以上のカルボン酸が必要であるのに対し、本発明の混合酸無水物法においては等モル程度のカルボン酸、カルボキシル基を有するＧＡＧでよい。
【００２１】
このようにして得られる混合酸無水物は、単離することも可能であるが、そのまま混合酸無水物Ａは水酸基もしくはアミノ基を有するＧＡＧと、混合酸無水物Ｂは、１級アミンもしくは２級アミンと反応させることによりグリコサミノグリカン誘導体を生成することもできる。
混合酸無水物Ａと水酸基を含有するＧＡＧとの反応は、例えば以下の式（３）で表される。
【００２２】
Ｒ′−ＣＯＯＲｐｔ  ＋  ＨＯ−ｇａｇ  →  Ｒ′−ＣＯＯ−ｇａｇ  （３）
混合酸無水物Ａとアミノ基を有するＧＡＧとの反応は、例えば、以下の式（４）で表される。
Ｒ′−ＣＯＯＲｐｔ  ＋  Ｈ2 Ｎ−ｇａｇ→Ｒ′−ＣＯＮＨ−ｇａｇ  （４）
混合酸無水物Ｂと１級アミンもしくは２級アミンとの反応は、例えば１級アミンとの反応を例示すると、以下の式（５）で表される。
【００２３】
ｇａｇ−ＣＯＯＲｐｔ  ＋  Ｈ2 Ｎ−Ａ  →ｇａｇ−ＣＯＮＨ−Ａ  （５）
（Ａはアミンから１個のアミノ基を除いた残基を表す。）
前記式（３）の反応によって、カルボン酸を、水酸基を有するＧＡＧに導入する場合、該ＧＡＧの水酸基に混合酸無水物Ａを反応させ、エステル結合を形成させることにより導入することができる。この際、反応に使用される溶媒は水混和性有機溶媒を含んだ水溶液及び無水の有機溶媒が挙げられるが、反応効率の良さを考慮すると無水の有機溶媒であることが好ましい。
【００２４】
水混和性有機溶媒としては、具体的にはジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、アセトアミド、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等が挙げられる。
前記水溶液としては、前記例示した水混和性有機溶媒のいずれかから選択される１種以上の総計で約０〜５０％の範囲を含む水溶液が挙げられる。
【００２５】
無水の有機溶媒としては、具体的には前記例示した水混和性有機溶媒およびクロロホルム、ジクロロメタン等の単一または混合された溶媒が挙げられる。
水酸基を有するＧＡＧとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等のＧＡＧおよびその誘導体等が挙げられる。また、これらのＧＡＧに水酸基を有するスペーサー化合物を結合した化合物であってもよい。
【００２６】
具体的方法としては、混合酸無水物Ａを、ＧＡＧ（遊離型）、ＧＡＧのナトリウム塩もしくはカリウム塩等、またはＧＡＧのナトリウム塩もしくはカリウム塩等をアンモニウム塩もしくは３級アミン塩に置換したＧＡＧと−２５℃から６０℃、好ましくは０℃から２５℃で５分間から２４時間反応させる。この際、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系触媒、特に４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）あるいは４−ピロリジノピリジン等のエステル化反応の触媒を添加することが好ましく、この触媒添加によりさらに温和な条件での反応が可能となる。
【００２７】
また、反応によって生成する酸を中和する目的で酸の中和剤として、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の３級アミンまたは炭酸水素ナトリウムのような無機塩基を添加することが好ましい。
前記式（４）の反応によって混合酸無水物Ａとアミノ基を有するＧＡＧとを、または前記式（５）の反応によって混合酸無水物Ｂと１級アミンもしくは２級アミン（以下、「アミノ基を有するＧＡＧ、１級アミンもしくは２級アミン」をまとめてアミノ成分ということがある）とを反応させる場合は、−２５℃から６０℃、好ましくは０℃から２５℃で、５分間から２４時間、好ましくは３０分間から２時間、上記無水の有機溶媒中または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で反応させることができる。この際、反応の進行と共に生成する酸（ジ低級アルキルチオホスフィン酸）を中和する目的で、酸の中和剤として上記中和剤を添加することが好ましい。該水溶液の含水率としては、０〜８０容量％が挙げられる。
【００２８】
本発明に用いられるアミノ基を有するＧＡＧとしては、前記の水酸基を有するＧＡＧとして例示したＧＡＧのアミノ糖の置換アミノ基（アセチルアミノ基、スルホアミノ基等）をアミノ基に変換した化合物、例えば、脱アセチル誘導体等が挙げられる。また、ＧＡＧの水酸基あるいはカルボキシル基にアミノ基を有するスペーサー化合物、例えば、ジアミン、アミノ酸等を共有結合させて、アミノ基を有するスペーサー化合物結合ＧＡＧとすること、あるいはＧＡＧの還元末端にアミノ基を有するスペーサー化合物を導入してスペーサー化合物結合ＧＡＧとすることによってもアミノ基を有するＧＡＧとすることができる。ＧＡＧの還元末端にアミノ基を有するスペーサー化合物を結合したＧＡＧを使用すると、ＧＡＧの還元末端、すなわち特定の一カ所に、カルボン酸を結合させることが可能となる。
【００２９】
スペーサー化合物の導入法としては、例えばスペーサー化合物としてのアミノ基を保護したアミノ酸等のカルボキシル基とＧＡＧの水酸基とをエステル結合させた後、脱保護する方法、ジアミンの一方のアミノ基とＧＡＧのカルボキシル基とをアミド結合させる方法、およびＧＡＧの還元末端とジアミンとを適当な溶媒中で混合してシッフ塩基として結合させ、好ましくはさらに還元剤で処理することでＧＡＧとジアミンとを還元アミノ化により結合させる方法等が挙げられる。
【００３０】
スペーサー化合物としてのアミノ基を保護したアミノ酸としては、グリシンやロイシン等の任意の天然のアミノ酸を用いることが出来る。また、６−アミノカプロン酸のような任意の炭素数のω−アミノ酸等を用いることもでき、この場合スペーサーとしての自由度を増すことができる。アミノ基の保護基としては例えば、接触還元で除去可能なベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、塩基で除去可能な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、トリフルオロ酢酸水溶液で除去される第３ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基等が好ましい。
【００３１】
スペーサー化合物としてジアミンを用いる場合は、
Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ2 （ｎは好ましくは２〜１８）等で示されるジアミン（例えば、１，６−ヘキサンジアミン等）やアミノ酸でもあるリジン及びそのエステル体などが使用できる。
また、アミノ基を保護したアミノアルコールをスペーサー化合物として用いてＧＡＧのカルボキシル基とエステル結合させて次いで脱保護することによりアミノ基を有するスペーサー化合物結合ＧＡＧとしてもよい。
【００３２】
スペーサー化合物の導入法としてはカルボジイミド類を使用してＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合もしくはエステル結合する等の公知法が操作の簡便さやコスト的に優れている。また、上記のＧＡＧのカルボキシル基をＲｐｔ−Ｘで活性化させて混合酸無水物Ｂとし、これを前記式（５）の反応によってジアミンと反応させてもよい。
【００３３】
ＧＡＧのカルボキシル基を混合酸無水物Ｂとして活性化し、１級アミンまたは２級アミンと反応させる場合に使用する１級アミンまたは２級アミンとしては、例えばアミノ酸（グルタミン、フェニルアラニン等）、アミノ酸エステル（フェニルアラニンベンジルエステル等）、ペプチド、ペプチドエステル、ペプチドアミド、タンパク質、分子内にアミノ基を持ち有用な薬理作用を有する生理活性物質（トラネキサム酸、サイクロセリン、ベスタチン、アミノセファロスポリン酸、ピリドキサミン、アドリアマイシン、メトトレキサート等）、アミノ酸またはジアミンをスペーサー化合物として結合させアミノ基を持たせた化合物、アミノ糖（グルコサミン、ガラクトサミン等）、アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等）等が挙げられる。
【００３４】
上記混合酸無水物Ａと水酸基またはアミノ基を有するＧＡＧとの反応、または混合酸無水物Ｂと１級アミンもしくは２級アミンとの反応の後、エタノール沈澱や透析等などの公知の方法で精製することが可能である。また、反応後に生成物が析出する場合は、ガラスフィルター等により濾集し、重曹水、水、及びエタノール等の適当な溶媒で順次洗浄するといったより簡便な精製操作で目的物を得ることが出来る。
【００３５】
前記式（３）〜（５）の反応において、水酸基を有するＧＡＧまたはアミノ成分に対する混合酸無水物および触媒の量は、所望のＧＡＧ誘導体の種類、すなわち、ＧＡＧの種類、分子量あるいは混合酸無水物の種類ならびにＧＡＧに対するカルボン酸または１級アミンもしくは２級アミンの所望導入数等により適宜選定され得るが、一般的にアミノ成分とアミド結合を形成させる場合には所望導入数の１．０〜３．０倍モルの混合酸無水物を用いればよく、ＧＡＧの水酸基とエステル結合を形成させる場合には所望導入数の２．０〜１０倍モルの混合酸無水物を用いればよい。なお、ＧＡＧ誘導体へのカルボン酸または１級アミンもしくは２級アミンの導入率は、ＧＡＧ構成二糖単位当たりの導入モル数の百分率として定義できる。導入モル数は、プロトンＮＭＲの積分強度の測定により決定できる。
【００３６】
さらに、本発明の製造法によれば、カルボン酸としてアミノ基を保護したアミノ酸を選択し、混合酸無水物Ａとして前記式（４）の方法で反応させることで、アミノ基を有するＧＡＧのアミノ基に本発明の方法によってアミノ基を保護したアミノ酸のカルボキシル基を結合後、このアミノ保護基を除去し、再びＮ−保護アミノ酸を本発明の方法で結合する操作を繰り返すことにより、ＧＡＧ上で順次アミノ酸を伸長させるペプチド合成を行いＧＡＧ−ペプチド結合体を合成することも可能である。この場合、アミノ基の保護基としては例えば、１０％ジエチルアミン水溶液等で速やかに除去できる９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等が好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下実施例により本発明を詳細に説明する。
調製例１
コンドロイチン硫酸へのスペーサーとしての１，６−ヘキサンジアミンの導入平均分子量３万のコンドロイチン硫酸ナトリウム（１０ｇ）を水（１００ｍｌ）に溶解しＤＭＦ（１００ｍｌ）を加えた。Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４０ミリモル）のＤＭＦ溶液（３０ｍｌ）と１，６−ヘキサンジアミン・２塩酸塩（２０ミリモル）を加えた後、室温でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２０ミリモル）のＤＭＦ溶液（４０ｍｌ）を加えた。室温下にて１晩攪拌後、析出したジシクロヘキシル尿素をエタノールによりガラスフィルター上で洗浄除去した。エタノール洗浄後、ガラスフィルター上に得られた沈殿をさらに３回エタノール沈殿法により精製した後、減圧乾燥したところ１，６−ヘキサンジアミンが導入されたコンドロイチン硫酸を白色粉末として７．６７ｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とスペーサーの４つのメチレン基由来のシグナル（δ＝１．３−１．７ｐｐｍ）の強度比（３：２．６０）よりコンドロイチン硫酸の構成２糖単位あたりの上記ジアミンの導入率は３２％であった。
【００３８】
ここで、導入率は以下の式で表される。
導入率（％）＝２糖単位当たりのジアミンの導入モル数×１００
調製例２
コンドロイチン硫酸へのスペーサーとしてのリジンメチルエステルの導入
平均分子量３万のコンドロイチン硫酸ナトリウム（３ｇ）を水（３０ｍｌ）に溶解しＤＭＦ（３０ｍｌ）を加えた。リジン（Ｚ）メチルエステル塩酸塩（３ミリモル）とＨＯＢｔ（６ミリモル）を加えた後、氷冷下にてＤＣＣ（６ミリモル）のＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を加えた。室温で１晩攪拌後、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて３日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として３．０８ｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とＺ基のベンゼン環由来のシグナル（δ＝７．３−７．５ｐｐｍ）の強度比（３：１．２３）よりコンドロイチン硫酸の２糖単位あたりのリジン（Ｚ）メチルエステルの導入率は２５％であった。このものを水溶液中で蟻酸アンモニウムと１０％パラジウム炭素による接触還元に付してＺ基を除去したところリジンメチルエステル結合コンドロイチン硫酸を得た。
【００３９】
実施例１
デオキシコール酸修飾コンドロイチン硫酸の合成
デオキシコール酸（０．１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）にトリエチルアミン（０．２ミリモル）と塩化ジメチルホスフィノチオイル（Ｍｐｔ−Ｃｌ）（０．１ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．２ｍｌ）を室温下にて加えた。このものを５分後、調製例２で合成した修飾率２５％のリジンメチルエステル結合コンドロイチン硫酸（５０ｍｇ）の水−ＤＭＦ（１：１，ｖ／ｖ）溶液（２ｍｌ）に氷冷下にて加えた。室温下にて１晩攪拌後、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて２日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として５８ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とデオキシコール酸の１方のメチル基由来のシグナル（δ＝１．３−０．７ｐｐｍ）の強度比（３：０．８１）よりコンドロイチン硫酸の構成２糖単位あたりのデオキシコール酸の導入率は２７％であった。
【００４０】
ここで、導入率は以下の式で表される。
導入率（％）＝２糖単位当たりのデオキシコール酸の導入モル数×１００
実施例２
アセチルサリチル酸修飾コンドロイチン硫酸の合成
調製例２で合成した修飾率２５％のリジンメチルエステル結合コンドロイチン硫酸（５０ｍｇ）を用い、実施例１のデオキシコール酸に代えてアセチルサリチル酸（アスピリン）を使用し同様の操作を行った。ただし混合酸無水物を作る際、アセチルサリチル酸、トリエチルアミン、Ｍｐｔ−Ｃｌおよびそれらの溶媒は実施例１の５倍量を使用した。収量５６ｍｇ。アスピリン（アセチルサリチル酸）の導入率は２８％であった。
【００４１】
実施例３
Ｚ−アミノ酸を結合させたコンドロイチン硫酸の合成
Ｚ−ロイシン（０．５ミリモル）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）にトリエチルアミン（０．５ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（０．５ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．５ｍｌ）を室温下にて加えた。このものを５分後、コンドロイチン硫酸のトリエチルアミン塩（１００ｍｇ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．５ミリモル）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）に氷冷下にて加え、さらにトリエチルアミン（０．５ミリモル）を加えた。室温下にて１晩攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて３日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として１０７ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とＺ−ロイシンのベンゼン環由来のシグナルの強度比（３：１．９）よりコンドロイチン硫酸の構成２糖単位あたりのＺ−ロイシンの導入率は３８％であった。
【００４２】
実施例４
ヒアルロン酸の還元末端への保護アミノ酸の結合                          Ａ）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯtＢｕ）−ＯＨ（０．１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）にトリエチルアミン（０．１ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（０．１ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．１ｍｌ）を氷冷下にて加えた。このものを５分後、還元末端に、常法による水素化シアノホウ素ナトリウムを用いた還元アミノ化法で１，６−ヘキサンジアミンを結合させた平均分子量４万のヒアルロン酸（１００ｍｇ）の水−ＤＭＦ（１：１）溶液（８ｍｌ）に氷冷下にて加え、さらにトリエチルアミン（０．１ミリモル）を加えた。室温下にて１晩攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて７日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥して白色粉末として１０６ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）と第３ブチル（tＢｕ）基由来のシグナルの強度比（３：０．１６２）よりセリン１分子当たりのヒアルロン酸は２糖単位で５６ユニット結合していた。
【００４３】
Ｂ）コンドロイチン硫酸の還元末端への保護アミノ酸の結合
実施例４Ａ）のヒアルロン酸に代えて平均分子量３万のコンドロイチン硫酸を使用し同様の反応を実施したところ、１，６−ヘキサンジアミンが結合したコンドロイチン硫酸（１００ｍｇ）より目的物を９８ｍｇ得られた。ＮＭＲよりセリン１分子当たりのコンドロイチン硫酸は２糖単位で６０ユニット結合していた。
【００４４】
実施例５
サラゾスルファピリジン修飾ヒアルロン酸の合成
平均分子量４万のヒアルロン酸のナトリウム塩をイオン交換樹脂を用いた常法によりトリエチルアミン塩とした。このヒアルロン酸トリエチルアミン塩（２００ｍｇ）のＤＭＦ溶液（１５ｍｌ）にＤＭＡＰ（０．２ミリモル）を加えたものに、実施例１と同様の方法で調製したサラゾスルファピリジン（０．２ミリモル）の混合酸無水物を加え、室温下１晩攪拌した。実施例３と同様の後処理後、標記化合物を黄色粉末として１１７ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたサラゾスルファピリジンの導入率は５％であった。
【００４５】
実施例６
インドメタシン修飾コンドロイチン硫酸（アミド結合で導入）の合成
インドメタシン（１ミリモル）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に氷冷下にて、トリエチルアミン（１ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（１ミリモル）のＤＭＦ（２ｍｌ）を加えた。このものを５分後、１、６ーヘキサンジアミンがスペーサーとして結合した平均分子量３万のコンドロイチン硫酸（２００ｍｇ、調製例１と同様の方法で調製、導入率  ３２％）の水−ＤＭＦ（１：１）溶液（８ｍｌ）に加え、続いてトリエチルアミン（１ミリモル）を加えた。室温にて１晩攪拌後、実施例３と同様の処理したところ標記化合物を白色粉末として２４２ｍｇ得た。ＮＭＲより求めた導入率は２４％であった。
【００４６】
実施例７
インドメタシン修飾ヒアルロン酸（エステル結合で導入）の合成
インドメタシン（１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）にトリエチルアミン（１ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を氷冷下にて加えた。このものを５分後、平均分子量８０万のヒアルロン酸のトリエチルアミン塩（１００ｍｇ）／ＤＭＦ溶液５０ｍｌと４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．５ミリモル）／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）の混合溶液に氷冷下にて加え、さらにトリエチルアミン（１ミリモル）を加えた。室温下にて１晩攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに５回８０％エタノールにより洗浄、精製、減圧乾燥し標記化合物を白色粉末として１４０ｍｇ得た。
【００４７】
吸光光度法により予め算出した検量線より求めたインドメタシン含量とカルバゾール硫酸法より求めたヒアルロン酸含量との比較より算出したインドメタシン導入率は、２９．８％であった。
実施例８
インドメタシン仕込み量と導入率の関係
実施例７記載の方法に従いインドメタシンの仕込み量（反応当量）と導入率の関係を調べた。又、ヒアルロン酸も平均分子量を５万、３０万、８０万のものを用いた。
【００４８】
結果を図１に記載した。
図１を見ると仕込量と導入率の関係は、ほぼ一次の関係になっていることが分かる。又、ヒアルロン酸の平均分子量で見ると５万と３０万はほぼ同様の挙動を示したが、８０万のものについては全体的に反応性が低下していることが分かる。これは、高分子量による粘度の増加による影響であろうと考えられる。
【００４９】
実施例９
ｔ−ブトキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にカルボキシル基をＭｐｔ−Ｃｌで混合酸無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミド溶液３ｍｌを氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記ｔ−ブトキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸を白色粉末として７５ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）と第３ブチル基由来のシグナル（δ＝１．５ｐｐｍ）の強度比より求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入率は１１％であった。
【００５０】
実施例１０
ベンジルオキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸およびグリシン修飾ヒアルロン酸の製造
ｔ−ブトキシカルボニルグリシンに代えてベンジルオキシカルボニルグリシン（Ｚグリシンとも記す）２０９ｍｇ（１．０ミリモル）を用い実施例７と同様の方法に従った。
【００５１】
精製後、減圧乾燥することにより標記ベンジルオキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸を白色粉末として７４ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とベンジルオキシカルボニルグリシンのベンジル基由来のシグナル（δ＝７．５ｐｐｍ）の強度比より求めたベンジルオキシカルボニルグリシンのヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入率は１１％であった。
【００５２】
ベンジルオキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸６０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ／ｕｎｉｔ）を水５０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下で１０％パラジウム（Ｐｄ）活性炭１５ｍｇ、蟻酸アンモニウム１９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）加え、室温で６時間攪拌した後、再び同量のＰｄ活性炭、蟻酸アンモニウムを加え攪拌した。６時間後、再度同様の操作をした後、０．２２μｍのフィルターで活性炭を除去し、溶液を脱イオン水にて２日間透析した後、凍結乾燥により５１ｍｇの白色物を得た。ＮＭＲによりベンジル基由来のピーク（δ＝７．５ｐｐｍ）の消失を確認した。
【００５３】
実施例１１
ｔ−ブトキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸（分子量１５万）の製造
平均分子量１５万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にｔ−ブトキシカルボニルグリシンのカルボキシル基をＭｐｔ−Ｃｌで混合酸無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミド溶液を氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記ｔ−ブトキシカルボニルグリシン修飾ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入率は５％であった。
【００５４】
実施例１２
Ａ）コンドロイチン硫酸混合酸無水物及びベスタチン修飾コンドロイチン硫酸の合成
平均分子量３万のコンドロイチン硫酸のナトリウム塩をイオン交換樹脂を用いた常法によりトリエチルアミン塩とした。このコンドロイチン硫酸トリエチルアミン塩（５０ｍｇ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）に、氷冷下にてＭｐｔ−Ｃｌ（０．１ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．２ｍｌ）を加えコンドロイチン硫酸混合酸無水物を調製した。
【００５５】
５分後、ベスタチン（０．０５ミリモル）とトリエチルアミン（０．０５ミリモル）、さらに水（０．５ｍｌ）を加えて室温下１晩攪拌した。５％炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ）を加えた後、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて４日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として５７ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸アセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とベスタチンのベンゼン環由来のシグナルの強度比（３：０．４１）よりコンドロイチン硫酸の２糖単位あたりのベスタチンの導入率は８％であった。
【００５６】
Ｂ）トラネキサム酸修飾コンドロイチン硫酸の合成
実施例１０Ａ）のベスタチンに換えてトラネキサム酸を使用し同様の操作を行ったところ、標記化合物を導入率１５％で得た。
実施例１３
フェニルアラニンベンジルエステル修飾コンドロイチン硫酸の合成
平均分子量３万のコンドロイチン硫酸のナトリウム塩をイオン交換樹脂を用いた常法によりトリエチルアミン塩としてＤＭＦに溶解し、４Ａのモレキュラーシーブを加えてこの溶液を乾燥した。このコンドロイチン硫酸トリエチルアミン塩（１００ｍｇ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）に、氷冷下にてＭｐｔ−Ｃｌ（０．２ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．４ｍｌ）を加えた。５分後、フェニルアラニンベンジルエステルのトシル塩（０．２ミリモル）とトリエチルアミン（０．４ミリモル）を加えて室温下１晩攪拌した。５％炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ）を加えた後、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水（１０ｍｌ）に溶解し、脱イオン水にて３日間透析した。０．２２ミクロンのフィルターで濾過後、凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として１０３ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、コンドロイチン硫酸のアセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とのフェニルアラニンベンジルエステルのベンゼン環由来のシグナルの強度比（３：２．５）よりコンドロイチン硫酸の２糖単位あたりのフェニルアラニンベンジルエステルの導入率は２５％であった。
【００５７】
上記と同様の実験で、モレキュラーシーブによる該ＤＭＦ溶液の乾燥を行わなかった場合、導入率は１３％であった。
実施例１４
アドリアマイシン修飾コンドロイチン硫酸の合成
平均分子量３万のコンドロイチン硫酸のナトリウム塩をイオン交換樹脂を用いた常法に従いテトラブチルアンモニウム塩とした。このコンドロイチン硫酸テトラブチルアンモニウム塩（５０ｍｇ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に氷冷下にてＭｐｔ−Ｃｌ（０．０５ミリモル）のＤＭＦ（０．１ｍｌ）とトリエチルアミン（０．１ミリモル）を加えた。１０分後アドリアマイシン（１０ｍｇ）の水溶液（１ｍｌ）を加え、室温で１晩攪拌した。常法に従って処理したところ標記化合物を赤色粉末として５０ｍｇ得た。ＮＭＲより求めた導入率は９％であった。
【００５８】
なお、公知のカルボジイミド法によってはコンドロイチン硫酸にアドリアマイシンを導入できなかった。
実施例１５
メトトレキサート修飾ヒアルロン酸（エステル結合で導入）の合成
メトトレキサート（０．２５ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）にトリエチルアミン（０．２５ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（０．２５ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を氷冷下にて加えた。このものを５分後、平均分子量８０万のヒアルロン酸のトリエチルアミン塩（１００ｍｇ）／ＤＭＦ溶液５０ｍｌと４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１２５ミリモル）／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）の混合溶液に氷冷下にて加え、さらにトリエチルアミン（０．２５ミリモル）を加えた。室温下にて１晩攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回８０％エタノールにより洗浄した。得られた沈殿を水に溶解した後、脱イオン水にて１晩透析し、凍結乾燥し標記化合物を白色粉末として７７ｍｇ得た。
【００５９】
吸光光度法により予め算出した検量線より求めたメトトレキサート含量とカルバゾール硫酸法より求めたヒアルロン酸含量との比較より算出したメトトレキサート導入率は、２．７％であった。
実施例１６
ヒアルロン酸混合酸無水物及びメトトレキサート修飾ヒアルロン酸（アミド結合で導入）の合成
平均分子量８０万のヒアルロン酸のナトリウム塩をイオン交換樹脂を用いた常法によりトリエチルアミン塩とした。このヒアルロン酸トリエチルアミン塩（１００ｍｇ）のＤＭＦ溶液５０ｍｌに、氷冷下にてＭｐｔ−Ｃｌ（０．２５ミリモル）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍｌ）を加えヒアルロン酸混合酸無水物を調製した。
【００６０】
５分後、メトトレキサート（０．２５ミリモル）のＤＭＦ溶液１ｍｌとトリエチルアミン（０．２５ミリモル）を加えて室温下１晩攪拌した。５％炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ）を加えた後、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回８０％エタノールにより洗浄後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて３日間透析した。凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として８３ｍｇ得た。
【００６１】
吸光光度法により予め算出した検量線より求めたメトトレキサート含量とカルバゾール硫酸法より求めたヒアルロン酸含量との比較より算出したメトトレキサート導入率は、３．０％であった。
実施例１７
グルタミン修飾ヒアルロン酸（エステル結合で導入）の合成
Fmoc-Gln-OH（１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）にトリエチルアミン（１ミリモル）とＭｐｔ−Ｃｌ（１ミリモル）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を氷冷下にて加えた。このものを５分後、平均分子量８０万のヒアルロン酸のトリエチルアミン塩（１００ｍｇ）／ＤＭＦ溶液５０ｍｌと４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．５ミリモル）／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）の混合溶液に氷冷下にて加え、さらにトリエチルアミン（１ミリモル）を加えた。室温下にて５時間攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回８０％エタノールにより洗浄後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて１日透析した。凍結乾燥したところFmoc-Gln-ヒアルロン酸を白色粉末として１２７ｍｇ得た。
【００６２】
吸光光度法により予め算出した検量線より求めたFmoc-Gln-OH含量とカルバゾール硫酸法より求めたヒアルロン酸含量との比較より算出したグルタミン導入率は、３１．３％であった。
又、更にこのFmoc-Gln-ヒアルロン酸５７ｍｇに氷冷下、１５％ジエチルアミン水溶液（２０ｍｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。５％炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍｌ）を加え、酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱を８０％エタノールにより洗浄後、水（１０ｍｌ）に溶解し脱イオン水にて１日透析した。凍結乾燥したところ標記化合物を白色粉末として３９ｍｇ得た。
【００６３】
実施例１８
コンドロイチン硫酸上でのペプチドの伸長
Ｆｍｏｃ−ロイシン（０．５ミリモル）を実施例３と同様の方法でＭｐｔ−Ｃｌと反応させ混合酸無水物とした。このものに調製例１で合成したヘキサンジアミン結合コンドロイチン硫酸（平均分子量３万、スペーサー導入率３２％、１００ｍｇ）の水−ＤＭＦ（１：１）溶液（４ｍｌ）を滴下し、さらにトリエチルアミン（０．５ミリモル）を加えた。実施例３と同様に後処理したところＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ヘキサンジアミンーコンドロイチン硫酸を白色粉末として９９ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲより求めたロイシンの導入率はコンドロイチン硫酸のカルボキシル基に対して１８％（スペーサーに対して１００％）であった。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ヘキサンジアミン−コンドロイチン硫酸（９５ｍｇ）に氷冷下、１０％ジエチルアミン水溶液（５ｍｌ）を加え、１時間放置した。脱イオン水で２日間透析後、０．２２ミクロンのフィルターで濾過、凍結乾燥したところ、Ｌｅｕ−ヘキサンジアミン−コンドロイチン硫酸を白色粉末として８５ｍｇ得た。２７０ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、ロイシン由来のシグナルは残り、Ｆｍｏｃ基由来のシグナルは消失していた。
【００６４】
以下同様に、Ｆｍｏｃ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−グリシン、Ｆｍｏｃ−グリシン、Ｆｍｏｃ−チロシンの結合とＦｍｏｃ基の除去を繰り返し、最終的にロイシンエンケファリン修飾コンドロイチン硫酸を得た。
【００６５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明はＤＤＳや医療材料の素材として有望なＧＡＧ誘導体の新しい製造法として有用なものである。さらに本発明の製造法は、温和な条件のもとでの反応であるのでＧＡＧの低分子化等の副反応が少ないこと、反応時間が短く、混合酸無水物が比較的安定であるので修飾率のコントロールが比較的容易である点で優れた方法である。更に含水有機溶媒中で反応させる（アシル化する）ことも出来る。
【００６６】
また、本発明の方法により製造されたインドメタシン、アドリアマイシン、サラゾスルファピリジン等の生理活性物質が結合したＧＡＧ誘導体は、水溶性、活性の持続性等の面で生理活性物質単独の場合に比べ優れた効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例８におけるインドメタシンの仕込量と導入率の関係を示すグラフである。図中（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は、インドメタシンのモル数／ヒアルロン酸（２糖）モル数を示す。
【図１】
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