【手続補正書】
【提出日】平成28年11月4日(2016.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重バーコード化核酸分子を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドは分子内逆方向反復およびループを含み、そして前記逆方向反復は前記第１のバーコードを含む、ステップ；
（ｂ）前記第１のバーコードが連結した核酸分子から前記ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを前記第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、前記プライマーは、前記第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分、および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）アニールされた前記プライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、前記二重バーコード化核酸分子は、前記第２のバーコード、前記第１のバーコード、および前記核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ、
を包含する、方法。
【請求項２】
二重バーコード化核酸分子を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）アダプターの１つの鎖を標的核酸分子の少なくとも１つの末端に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、前記アダプターは前記第１のバーコードを含む、ステップ；
（ｂ）前記第１のバーコードが連結した核酸分子から前記アダプターの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを前記第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、前記プライマーは、前記第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分、および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）アニールされた前記プライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、前記二重バーコード化核酸分子は、前記第２のバーコード、前記第１のバーコード、および前記標的核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードにアニールする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードの一部にアニールする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコード内でアニールしない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、ステムループオリゴヌクレオチドまたはアダプターの１つの鎖を前記核酸分子の各末端に連結することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、核酸ライブラリー、またはそれらの断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステムループオリゴヌクレオチドまたはアダプターの５’末端がホスフェートを欠く、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステムループオリゴヌクレオチドまたは前記アダプターがステムループオリゴヌクレオチドまたはアダプターの集団である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステムループオリゴヌクレオチドのループ、または前記ステムループオリゴヌクレオチドのループに隣接した前記ステムの領域が、複製不可能な塩基または領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステムループオリゴヌクレオチドのループ、または前記ステムループオリゴヌクレオチドに隣接したステムの領域が、切断可能な複製停止点を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ニックトランスレーション重合の後かつステップ（ｃ）の前に、前記ニックが前記第１のバーコード化核酸分子から除去され、前記切断可能な複製停止点が切断される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ニックトランスレーション重合の後かつステップ（ｃ）の前に、前記ニックが前記第１のバーコード化核酸分子から除去される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループが切断可能な塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断可能な塩基がデオキシウリジンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記切断可能な塩基が、ステップ（ｂ）の前に切断されて、脱塩基部位を生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ステムループオリゴヌクレオチドまたはアダプターの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結することが、前記ステムループオリゴヌクレオチドまたは前記アダプターの３’末端を前記核酸分子の５’末端にライゲーションすることとさらに定義される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記プライマーがプライマーの集団である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
伸長することが、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記二重バーコード化核酸分子の少なくとも部分の増幅をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のバーコードが、ランダムなバーコードまたは部分的にランダムなバーコードを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のバーコードが、既知の配列または部分的に既知の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
二重バーコード化核酸分子を作製する方法であって、前記方法は：
（ａ）ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結して、第１のバーコードが連結した核酸分子を形成するステップであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドは分子内逆方向反復およびループを含み、そして前記逆方向反復は前記第１のバーコードを含む、ステップ；
（ｂ）前記第１のバーコードが連結した核酸分子から前記ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を鎖置換により、またはニックトランスレーション重合により置換して、第１のバーコード化核酸分子を形成するステップ；
（ｃ）プライマーを前記第１のバーコード化核酸分子にアニールするステップであって、前記プライマーは、前記第１のバーコード化核酸分子に相補的な第１の部分、および第２のバーコードを含む第２の部分を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）アニールされた前記プライマーを伸長させて、二重バーコード化核酸分子を形成するステップであって、前記二重バーコード化核酸分子は、前記第２のバーコード、前記第１のバーコード、および前記核酸分子の少なくとも一部を含む、ステップ、
を包含する、方法。
（項目２）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードにアニールする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコードの一部にアニールする、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記プライマーの前記第１部分が、前記第１のバーコード化核酸分子における前記第１のバーコード内でアニールしない、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）が、ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を前記核酸分子の各末端に連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記核酸分子の各末端に付着した前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記分子内逆方向反復が同一の配列を含まない、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、核酸ライブラリー、またはそれらの断片である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ステムループオリゴヌクレオチドがステムループオリゴヌクレオチドの集団である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループが切断可能な塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記切断可能な塩基がデオキシウリジンである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記切断可能な塩基が、ステップ（ｂ）の前に切断されて、脱塩基部位を生じる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
ステムループオリゴヌクレオチドの１つの鎖を核酸分子の少なくとも１つの末端に連結することが、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの３’末端を前記核酸分子の５’末端にライゲーションすることとさらに定義される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記プライマーがプライマーの集団である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
伸長することが、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記二重バーコード化核酸分子の少なくとも部分の増幅をさらに含む、項目１に記載の方法。
本発明の実施形態は、シーケンシングのための二重バーコード化核酸分子を作製する方法を提供する。核酸分子の同じ末端上に第１および第２のバーコードを有することは、シーケンシング読み取りが第２のバーコードから始まり、第１のバーコードを経て、その後、核酸分子へ続くことを可能にし得る。したがって、第２のバーコード、第１のバーコード、および核酸分子の配列の同定は、二重シーケンシングバーコードを用いる伝統的な方法における場合のような、核酸分子の遠位末端から戻って単一バーコードの配列を読み取るために核酸分子の各末端からのシーケンシング読み取りを提供しなければならないこととは対照的に、単一の読み取りで得られ得る。