(57)【要約】【課題】  グリオーマ、特にグリオーマ幹細胞に特異的に発現する分子を見出し、当該分子を標的とした、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物、並びにグリオーマ細胞を殺傷するための方法を提供すること。【解決手段】  光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体、該抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物、並びに該抗体を利用する、グリオーマ細胞を殺傷するための方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体。
【請求項２】
光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物。
【請求項３】
グリオーマ細胞を殺傷するための方法であって、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を対象に投与し、前記対象に光照射を行って、前記対象内のグリオーマ細胞を殺傷する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体に関する。また、本発明は、該抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物、並びに該抗体を対象に投与する、グリオーマ細胞を殺傷するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の治療は手術による脳摘出を基本とし、術後の放射線・化学療法を組み合わせた集学的治療が一般的である。手術においては取り残しを防ぐために腫瘍及び周辺の正常脳組織を含めて切除することが適すると考えられるものの、脳の機能部位（言語野、運動野等）の温存という観点から、腫瘍周囲の正常組織を拡大して切除することは困難であることが多い。しかしながら、悪性度の高い脳腫瘍（膠芽腫：グリオーマ）では腫瘍細胞が腫瘍の周囲の正常組織内に広く浸潤していることが多く、再発の原因と考えられている。
【０００３】
この問題を解決するために光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）の脳腫瘍への応用が試みられている。これは、レーザー光照射により細胞傷害性のある一重項酸素を発生する光感受性物質が腫瘍細胞に集積しやすいこと等から検討されている治療法である。すなわち、特定波長のレーザー光を照射することにより活性化された光感受性物質は、基底状態から励起状態へと変化した後、蛍光を発することで基底状態へと遷移する。その過程において発生した一重項酸素等が細胞膜などに反応し細胞傷害性をもたらす。これが光線力学的療法の原理である。現在、光感受性物質としてポルフィマーナトリウム（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ、商品名：フォトフィリン）、タラポルフィンナトリウム（Ｔａｌａｐｏｒｆｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、商品名：レザフィリン）、ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ、商品名：ビスダイン）、５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（５−ＡＬＡ）、商品名：５−ＡＬＡ軟膏）が開発され早期の肺癌・胃癌・子宮頸癌、表在性食道癌、滲出型加齢性黄斑変性症、日光角化症に適用されている。安全性が高く侵襲性も低く、また他の治療法との併用も容易なことから期待される治療法となっている。特に、手術不能な高齢者に対しては第一選択となり得る。
【０００４】
しかしながら、これらの光感受性物質は分子構造の改良によりある程度は腫瘍特異性を高めているものの正常細胞への取込みは少なくはない。すなわち、レーザー光照射時に正常細胞への傷害性が問題となっている。さらには、皮膚に取り込まれる太陽光を浴びることで光線過敏症の発症が指摘されている。これらの問題を解決するには腫瘍細胞特異的な集積能を持つ光感受性物質の開発が期待されており、例えば、腫瘍細胞に特異的な抗体等と結合させることにより、光感受性物質に極めて高い腫瘍細胞特異的な集積能を持たせることが試みられている（特許文献１〜３、非特許文献１〜１０）。
【０００５】
また、近年の研究により、癌には造腫瘍能、治療抵抗性という性質を備えた、癌の根源細胞である癌幹細胞というものが存在することが判明している。癌幹細胞は、抗癌剤、放射線に対して耐性を有するため、従来型の癌治療方法では普通の癌細胞を死滅させることは可能であっても、癌幹細胞は残存してしまうことから、治療後のこの細胞の有無が再発及び生存率を大きく左右する因子であると考えられている。そのため、癌幹細胞を根絶する治療法の開発が試みられているものの、癌幹細胞を死滅させる薬剤はいまだ開発されていない。
【０００６】
一方、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であるＥｖａ１（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＭＰＺＬ２とも称される）は、細胞骨格系に関わる分子であり、胸腺等で発現していることが知られている。また、このタンパク質と、肺小細胞癌（ＳＣＣ）、転移性肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）、膵がん、乳頭状甲状腺癌等との関連性について報告されている（非特許文献１１〜１４）。しかしながら、Ｅｖａ１とグリオーマとの関係、特にＥｖａ１とグリオーマ幹細胞との関係については、これまで何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００１０５５８号明細書
【特許文献２】米国特許第７４９８０２９号明細書
【特許文献３】特開２００９−２８０６０７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕｎａｇａ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２０１１年１１月６日、１７巻、１２号、１６８５〜１６９１ページ
【非特許文献２】Ａｎａｔｅｌｌｉ  Ｆ，ら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ、２００６年１１−１２月、３巻、６号、６５４〜６６４ページ
【非特許文献３】Ｓｏｕｋｏｓ  ＮＳ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年６月１日、６１巻、１１号、４４９０〜４４９６ページ
【非特許文献４】Ｈａｍｂｌｉｎ  ＭＲ，ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．、２０００年１２月、８３巻、１１号、１５４４〜１５５１ページ
【非特許文献５】Ｄｅｌ  Ｇｏｖｅｒｎａｔｏｒｅ  Ｍ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００年８月１日、６０巻、１５号、４２００〜４２０５ページ
【非特許文献６】Ｍｏｌｐｕｓ  ＫＬ，ら、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．、２０００年３月、７６巻、３号、３９７〜４０４ページ
【非特許文献７】Ｄｅｌ  Ｇｏｖｅｒｎａｔｏｒｅ  Ｍ，ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．、２０００年１月、８２巻、１号、５６〜６４ページ
【非特許文献８】Ｄｕｓｋａ  ＬＲ.ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．、１９９７年、７５巻、６号、８３７〜８４４ページ
【非特許文献９】Ｈａｍｂｌｉｎ  ＭＲ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６年１１月１５日、５６巻、２２号、５２０５〜５２１０ページ
【非特許文献１０】Ｓｔｒｏｎｇ  Ｌ.ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、１９９４年１１月３０日、７４５巻、２９７〜３２０ページ
【非特許文献１１】Ａｒｕｍｕｇａｍ  Ｔ.ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９年７月１５日、６９巻、１４号、５８２０〜５８２８ページ
【非特許文献１２】Ｊａｒｚａｂ  Ｂ.ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５年２月１５日、６５巻、４号、１５８７〜１５９７ページ
【非特許文献１３】Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏ  Ｓ.ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．、２００３年９月、３９巻、１３号、１９３６〜１９４７ページ
【非特許文献１４】Ｐｉｙｕｓｈら、Ｃｅｌｌ、２００９年、１３８巻、６４５〜６５９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、グリオーマ細胞、特にグリオーマ幹細胞に特異的に発現する分子を見出し、当該分子を標的としたグリオーマ細胞を殺傷するための組成物、並びにグリオーマ細胞を殺傷するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｅｖａ１タンパク質がグリオーマ細胞、特にグリオーマ幹細胞に特異的に発現していることを見出した。さらに、本発明者らは、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体に光感受性物質  クロリン  ｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ６）を結合させ、培養グリオーマ幹細胞の培地に添加した後、レーザー光照射を行うことによって、該光感受性物質を単独で添加した場合と比較し、グリオーマ幹細胞への取込み量が増加していること、さらには細胞傷害性の向上がもたらされていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体。
（２）  光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物。
（３）  グリオーマ細胞を殺傷するための方法であって、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を対象に投与し、前記対象に光照射を行い、前記対象内のグリオーマ細胞を殺傷する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｅｖａ１タンパク質を標的として、特異性高く、グリオーマ細胞、特にグリオーマ幹細胞を殺傷することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトＥｖａ１（ｈＥｖａ１）アミノ酸配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列）及びマウスＥｖａ１（ｍＥｖａ１）アミノ酸配列（配列番号４に記載のアミノ酸配列）のアライメントを示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、抗Ｅｖａ１抗体の抗原として用いた合成ペプチドの配列（８６〜１０２アミノ酸）であることを示す。また、太字はシグナル配列（１〜２０アミノ酸）であることを示し、四角で囲んだ箇所は膜貫通ドメイン（１５２〜１７５アミノ酸）であることを示し、矢印はシステイン残基を指し示す。
【図２】ＦＬＡＧタグを融合させたｈＥｖａ１タンパク質を用いたウェスタンブロッティングにより、抗Ｅｖａ１抗体を評価した結果を示す写真である。なお、抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いた分析の結果は抗Ｅｖａ１抗体を用いた分析の結果の陽性対照であり、抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた分析の結果を内部標準（ローディングコントロール）とした。
【図３】マウスグリオーマ幹細胞及びヒトグリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。
【図４】ＮＳＣＬ６１及びｈＧＩＣにおけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。
【図５】ＮＳＣＬ６１由来の腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中赤色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し（真ん中の２パネル  参照）、図中緑色に発光している部分はＧＦＰの発現を示し（左側の２パネル  参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは２００μｍを示す。なお、ＧＦＰはＮＳＣＬ６１を樹立するために導入したベクター内に組み込まれているものであるため、その発現はＮＳＣＬ６１又はＮＳＣＬ６１由来の細胞であることを示している。
【図６】ｈＧＩＣ由来の異種移植腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。
【図７】グリオーマ組織原発性ＧＢＭ（ｐｒｉｍａｒｙ  ＧＢＭ、ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、原発性多形性神経膠芽腫）におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。
【図８】マウス脳の矢状断面（胎生１８日（Ｅ１８）、生後１日（Ｐ１）、生後１００日（Ｐ１００））におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中緑色に発光している部分はＥｖａ１の発現を示し（上から２段目の３パネル  参照）、図中赤色に発光している部分はＮｅｓｔｉｎの発現を示し（一番上の３パネル  参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また、図中「Ｖ」は脳室を示し、スケールバーは５０μｍを示す。
【図９】ヒト原発性グリオーマ組織及びヒトグリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。
【図１０】グリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。
【図１１】ｈＧＩＣ及びグリオーマ細胞株のＥｖａ１を免疫染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。図中左側は二次抗体（Ａｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体）のみを各細胞と反応させたものの結果を示し、図中真ん中はコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）のみを各細胞と反応させたものの結果を示し、図中右側は、抗Ｅｖａ１抗体と二次抗体とを各細胞に反応させたものの結果を示す。
【図１２】光感受性物質を備えた抗ＥＶＡ１タンパク質抗体（Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体）を培地に添加してレーザーを照射した後の、グリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１）の形態学的変化を示す、顕微鏡写真である。
【図１３】Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体を培地に添加してレーザーを照射した後の、グリオーマ幹細胞（ＥＶＡ１陽性細胞、ＮＳＣＬ６１）の生細胞数の相対値を示す、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜グリオーマ細胞を殺傷するための組成物＞
本発明は、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を提供する。また、本発明は、該抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物も提供する。
【００１５】
本発明において「グリオーマ」とは、神経幹細胞、神経系前駆細胞及び神経膠細胞から発生した腫瘍の総称であり、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、星細胞腫（アストロサイトーマ）、随芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、特に退形成アストロサイトーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成オリゴデンドログリオーマが挙げられるが、これらの疾病に限定されない。
【００１６】
本発明において「グリオーマ細胞」とは、これらグリオーマを構成する細胞又はこれらグリオーマに由来する細胞（例えば、これらグリオーマから単離され、継代培養を経て樹立された細胞）のことをいう。さらに、前記グリオーマにおいては、多分化能及び自己増殖能を備えた細胞、すなわちグリオーマ幹細胞が存在していることが知られているため、グリオーマ幹細胞も、本発明における「グリオーマ細胞」に含まれるものである。
【００１７】
本発明において、「Ｅｖａ１タンパク質」は、ヒト由来のものであれば典型的には配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子がコードするタンパク質）であり、マウス由来のものであれば典型的には配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号３に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子がコードするタンパク質）である。しかしながら、タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、「Ｅｖａ１タンパク質」に含まれる。
【００１８】
本発明における「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、Ｅｖａ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体などが挙げられる。
【００１９】
また、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を治療薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が望ましい。
【００２０】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２５５−２５８、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１３，６５−９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９９１，２２２，５８１−５９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１５，１４６−１５６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：７２２−７２７、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００２１】
また、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体には、望ましい活性（Ｅｖａ１タンパク質への結合活性、及び／又はその他の生物学的特性等）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、さらに、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００２２】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体（例えば、本実施例に記載の抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、フローサイトメーター、ＥＬＩＳＡ，ウェスタンブロッティング、免疫沈降法等を用いて解析することにより評価することができる。
【００２３】
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００２４】
抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。
【００２５】
本発明において「光感受性物質」とは、光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性（細胞毒性）を示す形態に変化する物質、又は細胞傷害性物質（細胞毒性物質）を生じさせる物質のことを意味する。「光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性を示す形態に変化する物質」としては特に制限はないが、例えば、紫外線の感受性を高める物質であるソラレン類が挙げられる。また、「細胞傷害性物質（細胞毒性物質）」としては特に制限はないが、例えば、一重項酸素及び他の酸素由来のフリーラジカルといった酸化剤が挙げられ、さらに「光照射により活性化されることにより、細胞傷害性物質を生じさせる物質」としては特に制限はないが、例えば、ポルフィマーナトリウム（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ、登録商標：フォトフリン）、タラポルフィンナトリウム（Ｔａｌａｐｏｒｆｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、商品名：レザフィリン）、ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ、商品名：ビスダイン）、合成ジポルフィリン、合成ジクロリン、フタロシアニン及びその金属置換体、クロロアルミニウムフタロシアニン、Ｏ−置換テトラフェニルポルフィリン（ピケットフェンスポルフィリン）、３,１-メソテトラキス（ｏ-プロピナミドフェニル）ポルフィリン、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎｓ）、プルプリン（ｐｕｒｐｕｒｉｎｓ）、スズオクタエチルプルプリン、亜鉛オクタエチルプルプリン、エチオプルプリン、ヒドロポルフィリン（ｈｙｄｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ）、テトラ（ヒドロキシフェニル）ポルフィリンシリーズのバクテリオクロリン、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、クロリンｅ６、クロリンｅ６のモノ-ｌ-アスパチル誘導体、クロリンｅ６のジ−ｌ−アスパチル誘導体、スズ（ＩＶ）クロリンｅ６、メタ-テトラヒドロキシフェニルクロリン、ベンゾポルフィリン、ベンゾポルフィリン一酸誘導体（ＢＰＤ-ＭＡ）、ベンゾポルフィリンのテトラシアノエチレン付加体、ベンゾポルフィリンのジメチルアセチレンジカルボキシレート付加体、ベンゾポルフィリンの一酸環“ａ”誘導体、スルホン化アルミニウムＰＣ、スルホン化ＡＩＰｃ、二スルホン化誘導体、三スルホン化誘導体、四スルホン化誘導体、スルホン化アルミニウムナフタロシアニン、ナフタロシアニン、アントラセンジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅｓ）、アントラピラゾール（ａｎｔｈｒａｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、アミノアントラキノン（ａｍｉｎｏａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）、フェノキサジン染料（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ  ｄｙｅｓ）、フェノキサジン誘導体、ピリリウムカルコゲン染料（ｃｈａｌｃｏｇｅｎａｐｙｒｙｌｉｕｍ  ｄｙｅｓ）、陽イオン性のピリリウムセレン及びピリリウムテルルの誘導体、環置換陽イオン性ＰＣ（ｒｉｎｇ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＰＣ）、フェオホルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）誘導体、天然生成ポルフィリン、へマトポルフィリン、ＡＬＡ−誘導プロトポルフィリンＩＸ、５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（５−ＡＬＡ、商品名：５−ＡＬＡ軟膏）、ベンゾナフトポルフィラジン、陽イオン性イミン塩、テトラサイクリン、ルテチウムテクサフィリン（ｌｕｔｅｔｉｕｍ  ｔｅｘａ���ｈｙｒｉｎ）、スズ−エチオプルプリン、ポルフィセン（ｐｏｒｐｈｙｃｅｎｅｓ）、ベンゾフェノチアジニウム化合物（ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍ）、及びこれらの前駆体及び誘導体が挙げられる。そして、当業者であれば、このような化合物の中から、種々の観点、例えば、一重項酸素等への高い光反応収率を有すること、組織透過性の高い長波長側（特に波長６００ｎｍ以上）のスペクトルにおいて高い吸収を示すこと、光感受性物質自体の体内動態、光感受性物質自体の副作用が低いこと等の観点に基づき、適宜選択し、前記「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」に備えさせ、利用することができるが、他の光感受性物質よりも排泄されにくいため、グリオーマ細胞への到達率がより高いという観点から、クロリンｅ６であることが好ましい。
【００２６】
本発明の「光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」において、光感受性物質と抗Ｅｖａ１タンパク質抗体との結合様式は特に制限はなく、間接的な結合であってもよく、直接的な結合であってもよい。「間接的な結合」としては、例えば、光感受性物質に直接結合した二次抗体を介した、光感受性物質と抗Ｅｖａ１タンパク質抗体（一次抗体）との結合が挙げられる。また、光感受性物質と抗Ｅｖａ１タンパク質抗体との結合様式は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよいが、グリオーマ幹細胞により特異的に集積し、より効率良く細胞傷害をもたらすために、生理条件下にて安定した結合であることが望ましいという観点から、「共有結合」であることが好ましい。
【００２７】
このような「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオ―ルどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエステル結合が挙げられ、当業者であれば、利用する光感受性化合物の性質（構造）に合わせて適宜選択することができる。さらに、後述の実施例において示す通り、かかる共有結合に必要な反応基は、種々のカップリング剤を適宜利用することにより、光感受性化合物又は抗体に導入することができる。かかる「カップリング剤」としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、オルト−フェニレン−ジマレイミド（ｏ−ＰＤＭ）、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。
【００２８】
「非共有結合」としては、例えば、アビジンを直接結合した光感受性物質とビオチンを直接結合した抗Ｅｖａ１タンパク質抗体とを利用した際の、ビオチン−アビジン間結合を介した光感受性物質と抗Ｅｖａ１タンパク質抗体との結合が挙げられる。
【００２９】
また、本発明の「光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」において、備える光感受性物質は１種に限らず、複数種の光感受性物質を１の抗Ｅｖａ１タンパク質抗体が備えていてもよい。
【００３０】
後述の実施例において示す通り、光感受性物質に抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を結合させることにより、該光感受性物質のグリオーマ幹細胞への取込み量を増加させ、さらには細胞傷害性の向上がもたらされる。従って、本発明の「光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物」は、グリオーマの治療のために投与される医薬組成物又は研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
【００３１】
また、本発明の「光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を有効成分とする、グリオーマ細胞を殺傷するための組成物」は、当該抗体と任意の成分、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、リン酸緩衝液を含有する組成物の形態で使用することができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００３２】
また、本発明の「光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」には、後述の脳関門透過物質が結合されていても良い。さらに、当該抗体は、グリオーマ特異的なＥＶＡ１タンパク質を標的としているため、グリオーマの治療のみならず、グリオーマの診断への応用も考えられる。前記抗体をグリオーマの診断に用いる場合又はグリオーマの治療における腫瘍部位の検出に用いる場合、前記抗体は、前記光感受性物質以外の化合物にて標識したものであってもよい。このような標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジンが挙げられる。
【００３３】
＜グリオーマ細胞を殺傷するための方法＞
本発明は、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を対象に投与し、前記対象に光照射を行って、前記対象内のグリオーマ細胞を殺傷するための方法を提供する。
【００３４】
本発明の治療方法における「対象」は、グリオーマを治療するために本発明の方法を用いる際には、グリオーマ患者である。ヒト以外の動物におけるグリオーマの治療を目的とする場合には、対象は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、鳥等が挙げられる。また、インビトロやインビボの実験に本発明の方法を用いる際には、グリオーマ細胞を含む培地等である。
【００３５】
光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を対象に投与する方法としては、グリオーマの治療を目的とする場合には、例えば、脳内への直接投与や静脈注射等により行うことができる。また、当業者であれば、適宜選択した前記任意の成分と当該抗体とを組み合わせることにより、各投与形態に適した本発明の組成物を調製することができ、該組成物を利用することによって、前記抗体を対象に効率よく投与することが可能となる。前記抗体を脳内に直接投与する方法としては、例えば、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じてグリオーマに投与する方法が挙げられる。前記抗体を脳内に直接投与しない場合には、前記抗体に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用することができるが、これに制限されない。対象がＧＢＭを羅患している生体である場合は、血管新生が生じた脳腫瘍内血管に正常な脳にある脳関門（ＢＢＢ）が形成されていないことから、脳関門透過物質を結合させなくとも、前記抗体を静脈注射等によってＧＢＭに送達することができる。脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３ページ  参照）が挙げられるが、これに制限されない。
【００３６】
本発明の光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体の投与量は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態（グリオーマの進行の程度）、投与経路、備えている光感受性物質の種類・量、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体の力価等により変動しうるが、一般的に、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇであり、投与の回数は通常1日1回である。
【００３７】
そして、このようにして対象に投与された光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体は、後述の実施例において示す通り、グリオーマ、特にグリオーマ幹細胞に対して極めて高い細胞傷害性を示すため、グリオーマに対する光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）に好適に利用することができる。
【００３８】
本発明の方法をグリオーマを治療するために用いる際には、他のグリオーマの治療法（例えば、抗腫瘍剤を用いた化学的療法、放射線療法）と併用してもよい。
【００３９】
また、インビトロやインビボの実験に本発明の方法を用いる際に、光感受性物質を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を対象に投与する方法としては、例えば、グリオーマ細胞を含む培地に当該抗体を添加する方法が挙げられる。
【００４０】
本発明の方法において、光感受性物質を活性化させるために対象に照射される光は、非コヒーレント（非レーザー）光であってもよく、コヒーレント（レーザー）光であってもよいが、光の収束性、指向性に優れているという観点から、コヒーレント（レーザー）光であることが好ましい。また、非コヒーレント光の光源としては特に制限はなく、例えば、光フィルターを備えた、水銀及びキセノンアークランプ、タングステンランプ、冷陰極蛍光ランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、白熱光源が挙げられる。レーザー光の光源としては、半導体レーザー（レーザーダイオード）、アルゴンイオンレーザー、波長可変レーザー、Ｔｉ−サファイアレーザー、ルビーレーザー、アレキサンドライトレーザー、ヘリウム−ネオンレーザー、ＧａＡｌＡｓ及びＩｎＧａＡｓダイオードレーザー、Ｎｄ−ＹＬＦレーザー、Ｎｄ−ガラスレーザー、Ｎｄ−ＹＡＧレーザー、ファイバーレーザーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
照射される光の波長としては特に制限はなく、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体が備えた光感受性物質の種類に応じて適宜選択して利用することができるが、グリオーマの治療を目的とする場合には、組織透過性が高いという観点から、長波長側（特に波長６００ｎｍ以上）であることが好ましい。
【００４２】
照射の領域及びタイミングは、グリオーマの治療を目的とする場合には、治療される病理学的症状（グリオーマの浸潤の程度等）、位置、領域によって適宜決定され、例えば、グリオーマ摘出後の摘出腔に対する照射が挙げられる。
【００４３】
また、照射時間は、備えている光感受性物質の種類・量、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体の力価等により変動し得、さらにグリオーマの治療を目的とする場合には、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態（グリオーマの進行の程度）等を考慮して設定されるが、総照射時間として、通常１〜２０分、好ましくは５〜１０分である。
【００４４】
照射のために使用される光の全体の流量及びエネルギーも、備えている光感受性物質の種類・量、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体の力価等により変動し得、さらにグリオーマの治療を目的とする場合には、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態（グリオーマの進行の程度）等を考慮して設定されるが、総エネルギーとしては、通常１０〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは１００〜５００Ｊ／ｃｍ２である。さらに、照射のために使用される光の照射強度は、通常７５〜５００ｍＷ／ｃｍ２、好ましくは１００〜３００ｍＷ／ｃｍ２である。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例は、以下に記載した実験方法に基づいて行った。
【００４６】
（実施例１）
＜抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体の作製＞
先ずヒト由来のＥｖａ１タンパク質（ｈＥｖａ１、配列番号２の細胞外領域（１〜１５０アミノ酸）から、抗原として８６〜１０２アミノ酸（ＰＭＳＧＲＦＫＤＲＶＳＷＤＧＮＰＥ、配列番号１１、図１参照）を抗原として選択した。次に選択したアミノ酸配列からなる合成ペプチドを作製し、これを用いてウサギに免疫付与した。そして、かかるウサギから血清を採取し、ペプチドアフィ二ティーカラムを用いて精製して、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体を調製した。
【００４７】
また、得られた抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体の特異性はウェスタンブロッテングにより評価した。ウェスタンブロッティングは、「Ｔａｋａｎａｇａ  Ｈ，ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００９年、２７巻、１６５〜７４ページ」の記載の通りに行った。ウェスタンブロッティングの分析には、ｐｃＤＮＡ３−ｅｖａ１−２ｘＦＬＡＧ−ｃ等をＣｏｓ７細胞にトランスフェクションすることにより導入し、そのトランスフェクションの２日後に細胞から抽出したタンパク質を供した。さらに、ｈＥｖａ１  ｓｈＲＮＡ（ヒトｅｖａ１をノックダウンするためのヘアピン配列）によってｈＥｖａ１−２ｘＦＬＡＧの発現が抑制されている細胞由来のタンパク質も供した。なお、かかるトランスフェクション並びにｈＥｖａ１  ｓｈＲＮＡについては、後述の＜ベクターの構築＞にて示す。また、ブロットしたメンブレンを、前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体（１／５００に希釈して使用）、マウス由来の抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、１／１０００に希釈して使用）、又はマウス由来の抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、１／１０００に希釈して使用）を用いてプローブした。さらに、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を検出のために用いた。得られた結果を図２に示す。
【００４８】
図２に示した結果から明らかなように、ｐｃＤＮＡ３−ｅｖａ１−２ｘＦＬＡＧ−ｃが導入されたＣｏｓ７細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、前記抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体は抗ＦＬＡＧタグ抗体同様に、２ｘＦＬＡＧタグが結合されたＥｖａ１タンパク質（ｈＥｖａ１−２ｘＦＬＡＧ）を検出できることが確認された。また、コントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３）のみを発現させた細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、前記抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体は、Ｅｖａ１以外のタンパク質を非特異的に検出しないことも確認された。さらに、ｈＥｖａ１  ｓｈＲＮＡによってｈＥｖａ１−２ｘＦＬＡＧの発現が抑制されている細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、前記抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体は抗ＦＬＡＧタグ抗体同様に、細胞内に発現した少量のＥｖａ１タンパク質を特異的に検出できることが確認された。
【００４９】
＜動物及び試薬類＞
マウスは、理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）の動物資源開発室及び日本チャールズリバー株式会社から入手した。また、マウスに関する全ての実験プロトコールは理研ＣＤＢ動物実験委員会の承認を受けたものである。試薬及び成長因子は、特に記載される場合を除き、シグマアルドリッチジャパン及びぺプロテック社から各々購入した。
【００５０】
＜細胞培養＞
マウス神経幹細胞（ＮＳＣ）、マウスＮＳＣＬ６１、及び、ヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ）は、下記文献に記載している通りに調製を行い、ＮＳＣ培地（試薬、ｂＦＧＦ  （１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ社製））中で培養した（Ｋｏｎｄｏ  Ｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００４年、１８巻、２９６３〜２９７２ページ、及び、Ｈｉｄｅ  Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３〜７９５９ページ  参照）。
【００５１】
また、ＯＰＣＬ６１の樹立は下記の通りに行った。すなわち、先ず、オリゴデンドロ前駆細胞（ＯＰＣ）への分化誘導を、マウス由来のｐ５３欠損神経幹細胞（ｐ５３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＮＳＣ）をＯＰＣ培地（試薬、ＰＤＧＦＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、及び０．２５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））を用いて培養することによって行った後、イムノパニング（ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ、Ｋｏｎｄｏ  Ｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００４年、１８巻、２９６３〜２９７２ページ  参照）を逐次行うことによって精製した。そして、得られたＯＰＣ  ２×１０６個を、ＨＲａｓの恒常的活性型（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）及びＧＦＰをコードしているｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＬ６１  １０μｇを含有するマウスＮＳＣ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（ＬＯＮＺＡ社製）１００μｌ中に懸濁した。そして、このプラスミドベクターを遺伝子導入装置（製品名：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ＬＯＮＺＡ社製）を用いてＯＰＣに導入した。遺伝子導入されたＯＰＣを、最適化した培地中で培養し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリー（製品名：ＪＳＡＮセルソーター、ベイバイオサイエンス株式会社製）を用いて単離した。
【００５２】
グリオーマ（神経膠芽腫）細胞株（Ｃ６、Ｔ９８Ｇ、Ｔｐ４８３、ＳＦ１２６、Ｕ８７、及び、Ｕ２５１）は１０％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリンＧ、及び、１００ｕｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。Ｅｖａ１染色に関しては、細胞をＮＳＣ培地中で７日間培養し、フローサイトメトリーを用いて解析した。ＳＦ１２６はＨＳ研究資源バンクより購入した。
【００５３】
＜蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）＞
ｈＧＩＣ及びグリオーマ細胞株は、前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）、及びＡｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）によって免疫標識した。そして免疫標識した細胞は、ＪＳＡＮセルソーター（ベイバイオサイエンス株式会社製）を通し、二波長の励起光（４８８ｎｍ固体レーザー及び６３８ｎｍ半導体レーザー）を用いて分析した。なお、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性細胞（例えば、死細胞）は、この分析から除外した。
【００５４】
＜免疫染色＞
解剖したマウスの脳を、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。固定後、１２〜１８％スクロース含有ＰＢＳを用いて脳を凍結保護し、ＯＣＴコンパウンド中に包埋した。そして、大脳皮質から冠状切片（厚さ１０μｍ）を調製した。なお、Ｅｖａ１は、ＨｉｓｔｏＶＴ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を、その使用説明書に従って用いて賦活化した。次に、抗体を浸透させるために、切片は０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳをもって前処理し、次いでブロッキング溶液（２％  スキムミルク、，０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＢＳ）中で１時間処理した。そして、一次抗体とともに４℃で１６時間インキュベーションした。固定した細胞の免疫染色は下記文献に記載の通りに行った（Ｋｏｎｄｏ  Ｔ，ら、ＥＭＢＯ  Ｊ、２０００年、１９巻、１９９８〜２００７ページ  参照）。また、以下の抗体は細胞内抗原を検出するのに用いた。
前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）
マウス由来の抗ラットＮｅｓｔｉｎモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、１／４００に希釈して使用）
ラット由来の抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ナカライテスク社製、１／５００に希釈して使用）
マウス由来の抗ＣＤ３１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製、１／２００に希釈して使用）
マウス由来の抗Ｃｅａｃａｍ１モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、１／５０に希釈して使用）
これらの抗体は、Ａｌｅｘａ５６８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ若しくは抗ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）、又はＣｙ３標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製、１／４００に希釈して使用）を用いて検出した。また、核を可視化するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍｌ）により、細胞を対比染色した。
【００５５】
＜ヒト脳腫瘍＞
ヒト由来のグリオーマ幹細胞であるｈＧＩＣ（ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２）は、「Ｈｉｄｅ  Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３〜７９５９ページ」に記載のものを用いた。また、ヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ  ＧＢＭ（ｐｒｉｍａｒｙ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、原発性多形神経膠芽腫）組織、ヒト原発性グリオーマ組織は、熊本大学医学部脳外科教室より提供を受けた。そして、これらのヒト由来の試料は、理研ＣＤＢ及び熊本大学大学院医学教育部の倫理委員会での承認を得て、それぞれの研究ガイドラインに従って使用した。なお、ｈＧＩＣ、ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２は各々ｈＧＳＣ、ｈＧＳＣ１及びｈＧＳＣ２とも称する。
【００５６】
また、これらの試料から、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて調製し、ｃＤＮＡはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて合成した。
【００５７】
また、パラフィン包埋したヒト脳腫瘍は厚さ６μｍの切片に調製した。そして、Ｅｖａ１染色に関しては、ＨｉｓｔｏＶＴ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を、その使用説明書に従って用いて、抗原を賦活化した。次に、切片は５％スキムミルク含有ＴＰＢＳ中にて室温下で３０分間前処理し、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体（１／５０に希釈して使用）と共に室温下で２時間インキュベーションし、次いで、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）を用いて免疫染色を行った。また、全ての核を可視化するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍｌ）により、細胞を対比染色した。
【００５８】
＜ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植＞
ＮＳＣＬ６１及びｈＧＩＣは５μｌの培地中に懸濁し、そして前もって１０％ペントバルビタールで麻酔をかけておいた５〜８週齢の雌ヌードマウスの脳内に注入した。注入部位の定位座標は、ラムダから２ｍｍ前方、矢状縫合から２ｍｍ後方、５ｍｍの深部とした。
【００５９】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
ＲＴ−ＰＣＲは下記文献に記載の通りに行った（Ｋｏｎｄｏ  Ｔ，ら、ＥＭＢＯ  Ｊ、２０００年、１９巻、１９９８〜２００７ページ  参照）。サイクルパラメーターは、９４℃で２０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３５秒の３５サイクルとした。なお、ｇａｐｄｈの増幅に関しては、９４℃で１５秒、５３℃で３０秒、７２℃で９０秒の２２サイクルとした。また、ｅｖａ１の増幅には、以下のオリゴブクレオチドＤＮＡプライマーを合成し用いた。
センスプライマー：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＴＧＴ−３’（配列番号：５）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＧＣＣＣＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧ−３’
（配列番号：６）。
【００６０】
＜ベクターの構築＞
全長マウスｅｖａ１は、マウスＮＳＣ  ｃＤＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ及びＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、使用説明書に従って増幅し、そしてｐＭＯＳＢｌｕｅベクター（ロシュ社製）にクローニングした。なお、ヌクレオチド配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＡＢＩシークエンサーモデル３１３０ｘｌ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて確認した。そして、マウスｅｖａ１ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３−２ｘＦＬＡＧ−ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、ｐｃＤＮＡ３−ｅｖａ１−２ｘＦＬＡＧ−ｃを得た。
【００６１】
なお、全長マウスｅｖａ１ｃＤＮＡを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した。
５’プライマー：５’−ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣ−３’（配列番号：７）
３’プライマー：５’−ＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号：８）。
る。
【００６２】
また、ヒトｅｖａ１をノックダウンするために、ヘアピン配列をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｓｉＲＮＡ  Ｗｉｚａｒｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／）を用いて作製し、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ  Ｇ１発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）に挿入し、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ−ｈｅｖａ１ｓｈを得た。
【００６３】
なお、ヒトｅｖａ１の標的配列は、５’−ＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号：９）であり、本実施例において、これらのベクターから発現されたＥｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡを「ｈＥｖａ１ｓｈＲＮＡ」とも称する。
【００６４】
コントロールｓｈＲＮＡ（ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ）の標的配列は、５’−ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：１０）である。
【００６５】
また、トランスフェクションは、Ｈｉｄｅ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３〜７９５９ページ、Ｈｉｄｅ，Ｔ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１１年、２９巻、４号、５９０〜５９９ページに記載した通り、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、その製造会社の説明書に従って行った。
【００６６】
（実施例２）
＜グリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現＞
グリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１、ＯＰＣＬ６１、ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）及び正常細胞（ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＢ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔ、神経幹細胞））におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた結果を図３に示す。
【００６７】
また、これらの細胞におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図４に示す。さらに、ＮＳＣ６１又はｈＧＩＣをヌードマウスの脳に移植することによって形成されたグリオーマにおけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図５〜６に示す。また、ヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ  ＧＢＭ組織におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図７に示す。
【００６８】
さらに、マウスの脳の発生過程におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、マウス脳の矢状断面（胎生１８日（Ｅ１８）、生後１日（Ｐ１）、生後１００日（Ｐ１００））を、抗Ｅｖａ１抗体及び抗Ｎｅｓｔｉｎ（神経幹細胞のマーカータンパク質）抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図８に示す。
【００６９】
図３に示した結果から明らかなように、マウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１、ＯＰＣＬ６１）及びヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）ではｅｖａ１は発現しているものの、ＯＰＣ及びＮＢにおいては発現しておらず、ＮＳＣにおいてもごくわずかな発現しか認められなかった。また、図４に示した結果からも明らかなように、マウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１）及びヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）ではＥｖａ１は発現しているものの、正常な細胞（ＮＳＣ）においてはごくわずかな発現しか認められなかった。
【００７０】
さらに、図５〜７に示した結果から明らかなように、ヌードマウス脳内に形成されたグリオーマ幹細胞由来の腫瘍組織、及びヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ  ＧＢＭ組織においても、Ｅｖａ１の発現が確認された。特に、ＮＳＣＬ６１由来の腫瘍組織においては、腫瘍組織全体よりも腫瘍辺縁部において、Ｅｖａ１を高発現している細胞が存在していることが確認された。
【００７１】
また、図８に示した結果から、Ｅｖａ１の発現は発生段階（Ｅ１８、Ｐ１）の脳の神経幹細胞に限局して検出され、成体（Ｐ１００）の脳においてはその発現は消失していることが明らかになった。これは、図３及び図４に示した結果と一見矛盾しているようにも思われるが、図３及び図４で使用したＮＳＣは長期間（３カ月以上）試験管内で培養しているため、図８に示した成体（Ｐ１００）の脳における神経幹細胞と同様に、Ｅｖａ１の発現は、図３及び図４で使用したＮＳＣにおいて低下したことが考えられる。
【００７２】
（実施例３）
＜グリオーマ組織及びグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現＞
次に、実施例２において明らかになったグリオーマ組織におけるＥｖａ１の発現を詳細に調べるために、外科手術で取り除かれたグリオーマ組織におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲを行った。調べたグリオーマ組織は下記の通りである
ＧＢＭ：ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、多形神経膠芽腫（ＷＨＯ診断基準のグレード４）
ＡＯ：Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ診断基準のグレード３）
ＡＯＡ：Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏ−ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ、退形成性乏突起星細胞腫（ＷＨＯ診断基準のグレード３）
ＯＬＩ：Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、乏突起膠細胞腫（ＷＨＯ診断基準のグレード２）。
【００７３】
また、前記グリオーマ組織と併せて、正常脳組織（ＮＢ：Ｎｏｒｍａｌ  ｂｒａｉｎ又はＣＢ：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ）、及び、実施例２において用いたｈＧＩＣについても、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた結果を図９に示す。
【００７４】
さらに、ヒトＧＢＭ由来のグリオーマ細胞株及びラットグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲを行った。調べたグリオーマ細胞株は下記の通りである
Ｔ９８Ｇ：ヒトグリオーマ細胞（Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７９年、９９巻、４３〜５４ページ  参照）
Ｔｐ４８３：ヒトグリオーマ細胞（Ｌａｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．、２００５年、１６０巻、１〜１４ページ  参照）
ＳＦ１２６：ヒトグリオーマ細胞（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８１年、６巻、２２７〜２３５ページ  参照）
Ｕ８７：ヒトグリオーマ細胞（Ｃｌａｒｋら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０年、６巻、１号、ｅ１０００８３２  参照）
Ｕ２５１：ヒトグリオーマ細胞（Ｂｉｇｎｅｒら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９８１年、４０巻、２０１〜２２９ページ  参照）
Ｃ６：ラットグリオーマ細胞（Ｂｅｎｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６８年、１６１巻、３７０〜３７１ページ  参照）。
【００７５】
また、前記グリオーマ細胞株と併せて、実施例２において用いたＮＳＣ、ＮＳＣＬ６１、及びｈＧＩＣ２、並びにＮＳＣＬ６１の基となったｐ５３−／−ＮＳＣ（ｐ５３欠損神経幹細胞）についても、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた結果を図１０に示す。
【００７６】
図９及び図１０に示した結果から明らかなように、ｅｖａ１は調べた殆どのＧＢＭ組織において発現しており、また、いくつかのＧＢＭ由来のグリオーマ細胞株においてもｅｖａ１の発現は確認された。
【００７７】
（実施例４）
＜グリオーマ幹細胞及びグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現＞
次に、ヒトグリオーマ幹細胞及びヒトグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いたＦＡＣＳによる分析を行った。なお陰性対照として、二次抗体（Ａｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体）のみを各細胞と反応させたもの、コントロール抗体（ウサギＩｇＧ）のみを各細胞と反応させたものを用意し、ＦＡＣＳにて分析を行った。得られた結果を図１１に示す。
【００７８】
図１１に示した結果から明らかなように、Ｅｖａ１はヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２）において強く発現していることが確認された。しかしながら、グリオーマ細胞株においては、Ｅｖａ１の発現をＦＡＣＳにて検出することはできなかった。
【００７９】
なお、一般的にグリオーマ細胞株を脳内に移植しても実際の脳腫瘍と同じ病理的所見を見つけることは出来ず、一方、グリオーマ幹細胞においては、実際の脳腫瘍と同様の病理的所見を容易に見つけられることが知られている。
【００８０】
従って、実施例２〜４の記載の通り、成体の脳の正常組織では発現せず、グリオーマ幹細胞及びグリオーマ組織（特にＧＢＭ）において高発現しているＥｖａ１は、グリオーマ細胞を殺傷するための方法に利用できることが考えられる。
【００８１】
（実施例５）
＜グリオーマに対する光線力学的療法＞
前述の通り、Ｅｖａ１は、グリオーマ細胞を殺傷するための方法に利用できることが想定されるため、以下に示す通り、光感受性物質としてクロリンｅ６を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を調製し、該抗体によるグリオーマ細胞を殺傷するための方法における有効性を評価した。
【００８２】
＜クロリンｅ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｅ６−ＮＨＳエステル）の合成＞
クロリンｅ６と抗体のアミノ基とのアミド結合を形成させるため、クロリンｅ６のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にてエステル化し、活性化エステル基とした。具体的には、クロリンｅ６（Ｃｅ６）（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬社製）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬）とを、１：１．５：１．５（モル比）にてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍＬに溶解し、遮光条件にて室温下で２４時間反応させ、Ｃｅ６−ＮＨＳエステルを調製した。反応液は分注し、抗体との結合反応に用いるまで−８０℃にて保存した。
【００８３】
＜Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体複合体の合成＞
Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体複合体を合成するため、前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体のアミノ基とＣｅ６−ＮＨＳエステルとをアミド結合により結合させた。具体的には、０．１ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）に０．１ｍｇの前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体を溶解し、抗体とＣｅ６−ＮＨＳエステルとを１：２５（モル比）で混合、遮光条件で室温２４時間反応させた。未反応のＣｅ６−ＮＨＳエステルを除去するために遠心濃縮フィルターアミコンウルトラ０．５（分画分子量５０ｋＤａ）（日本ミリポア社製）にサンプルを添加、１２０００回転  １０分間遠心、途中、溶媒を置換するために１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）を３００ｕＬづつ添加し合計５回遠心分離を行った。精製したＣｅ６を備えた抗Ｅｖａ１タンパク質抗体（「Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体」「Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体複合体」とも称する）は実験に用いるまで４℃で保存した。
【００８４】
＜Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体複合体におけるＣｅ６結合数の計測＞
前記ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体へのＣｅ６結合数を解析するためにマトリックス支援レーザー脱離イオン化  飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて質量分析を行った。具体的にはＣｅ６−Ｅｖａ１抗体をゲル濾過脱塩用スピンカラムＰＤ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐ  Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社製）に添加、８００回転１分間遠心し塩類を除去した濾液を凍結乾燥させ質量分析用サンプルとした。なお、サンプルは蒸留水５ｕＬで溶解し、うち１ｕＬでタンパク濃度を測定した。また、質量分析用のマトリックスとしてはシナピン酸（和光純薬）を２０ｍｇ／ｍｌになるように６６％アセトニトリル（和光純薬）／０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬）水溶液で調整したものを用いた。Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体溶液とシナピン酸溶液とを１：４（容量比）で混合したもの１ｕＬを質量分析用金属プレートに点置し室温で自然乾燥後、質量分析を行った。マトリックス支援レーザー脱離イオン化  飛行時間型質量分析計Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）を用いてレーザーパワー６０％でイオン化し質量数を測定し、Ｃｅ６未結合のＥｖａ１抗体との質量数の差を求めることでＣｅ６結合数を算出した。その結果、前記抗Ｅｖａ１タンパク質抗体へのＣｅ６結合数は１抗体分子当たり平均１．１個であった。
【００８５】
＜Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体複合体によるＥｖａ１陽性癌幹細胞を標的とした、グリオーマ細胞を殺傷するための方法＞
９６穴マイクロプレート（ファルコン社製）に１×１０４個／穴の濃度でグリオーマ幹細胞ＮＳＣＬ６１を播種、ＣＯ２インキュベーター（アステック社製）で４８時間培養後に実験に用いた。培地１００μＬあたりＣｅ６−Ｅｖａ１抗体（５μｇ）を添加し、ＣＯ２インキュベーターで３時間培養後、上清を除去し、２００μＬの培地で３回洗浄して、結合していないＣｅ６−Ｅｖａ１抗体を除去した。その後、暗所にて半導体レーザー発振装置（Ｐｏｗｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて６８８ｎｍのレーザー光を１５分間照射後、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。レーザーの照射は、レーザー強度１２０ｍＷ／ｃｍ２、照射部位１ｃｍ２（総エネルギー：１０８Ｊ）にて行った。
【００８６】
そして、レーザーを照射してから２４時間後に、細胞数を測定するため、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を１０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターでさらに２時間培養後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定、対照群（培地のみ添加）と比較検討を行った。なお、Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体の対照実験として５μｇのＣｅ６−Ｅｖａ１抗体溶液のみ又は同等量の２３ｎｇのＣｅ６のみを添加した実験も行った。さらに、細胞の形態学的変化についてはレーザーを照射してから０時間後、１２時間後及び２４時間後に倒立顕微鏡にて観察を行いＣＣＤカメラで記録した。得られた結果を図１２に示す。また、２４時間後の生細胞数を定量した結果を図１３に示す。
【００８７】
図１２に示した結果から明らかな通り、レーザー照射１２時間後には、対照群（未添加群）と比較し、Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体添加群でのみ顕著な細胞変性及び細胞死が観察された。また、Ｃｅ６添加群においては若干の細胞増殖の減少傾向が認められた。さらに、２４時間後のＣｅ６−Ｅｖａ１抗体添加群において、殆どの細胞における細胞死をが観察された。
【００８８】
また、図１３に示した結果から明らかな通り、レーザー照射２４時間後において、対照群と比較しＣｅ６添加群では約４０％の生細胞数の減少が認められたのに対し、Ｃｅ６−Ｅｖａ１抗体投与群では約９０％もの顕著な生細胞数の減少が認められた。
【００８９】
従って、光感受性物質に抗ＥＶＡ１タンパク質抗体を備えさせることにより、光感受性物質のグリオーマ幹細胞への取込み量を増加させ、さらには細胞傷害性の向上がもたらされることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上説明したように、本発明によれば、グリオーマ、特にグリオーマ幹細胞に対して、高い特異性並びに細胞傷害性を示す組成物、並びにグリオーマ細胞を殺傷するための方法を提供することができる。
【００９１】
したがって、本発明の抗体及び該抗体を有効成分とする組成物は、正常細胞への光感受性物質の取り込まれを極めて低く抑えることができ、また、抗癌剤や放射線照射に耐性を有するため、従前のがん治療技術では死滅させることが困難であったグリオーマ幹細胞をも死滅させることができるため、グリオーマの治療において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１
＜２２３＞  ヒトＥＶＡ１
配列番号３
＜２２３＞  マウスＥＶＡ１
配列番号５〜８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号９〜１０
＜２２３＞  ｓｈＲＮＡ標的配列
【図１】
2013203709.tif 000002
【図２】
2013203709.tif 000003
【図３】
2013203709.tif 000004
【図４】
2013203709.tif 000005
【図５】
2013203709.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
2013203709.tif 000009
【図９】
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【図１０】
2013203709.tif 000011
【図１１】
2013203709.tif 000012
【図１２】
2013203709.tif 000013
【図１３】
2013203709.tif 000014
【配列表】
2013203709000001.app