【手続補正書】
【提出日】平成28年4月22日(2016.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)または細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)であって、そのゲノムのIg重鎖または軽鎖遺伝子座が(5'から3'の向きに)(i)第1の可変ドメインをコードするための再構成されていないヒト可変領域、(ii)任意選択のリンカーをコードする配列および(iii)エピトープ結合部分をコードする配列を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)または細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)。
【請求項２】
(i)の可変領域が再構成を受けることができ、再構成を受けることによって脊椎動物が標的エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドを発現することができ、結合部位が構造V1-L-E(式中、V1は抗体可変ドメインであり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカーである)を有する、ならびに/または
配列(i)が再構成を受けて、細胞が配列(i)および(iii)から誘導される第1および第2の可変ドメインを含むエピトープ結合部位をそれぞれ有する抗体鎖を生成することができ、第1および第2の可変ドメインの間にさらなる抗体ドメインが存在せず、
任意選択で、前記ポリペプチドが構造V1-L-E-X(式中、Xは定常領域(任意選択で、ガンマ定常領域)である)を有する、請求項1に記載の脊椎動物。
【請求項３】
標的エピトープに特異的な結合部位を含むポリペプチドであって、結合部位が構造V1-L-E(式中、V1は抗体可変ドメインであり、Eはエピトープ結合部分であり、Lは任意選択のペプチドリンカーである)を有し、V1は、Eをもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでのヒト可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導され、V1は、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含みかつ標的エピトープに特異的に結合し、
任意選択で、構造V1-L-E-X(式中、Xは定常領域(任意選択で、ガンマ定常領域)である)を有する、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項1または2に記載の非ヒト脊椎動物を、前記標的エピトープで免疫する工程、Ig遺伝子座の内因性AIDによる体細胞超変異を得て、V1-L-Eをコードする変異したIg遺伝子座を生成する工程、ならびにポリペプチド、および/またはポリペプチドをコードする核酸を単離する工程を含む、請求項3に記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項５】
(a)ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)であって、
非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーと、第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域とをコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含む、ポリペプチド鎖を発現し、第2のヌクレオチド配列が脊椎動物中で再構成された、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)、または
(b)細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)再構成された第2の可変ドメインヌクレオチド配列および第1の可変ドメインヌクレオチド配列からそれぞれ誘導される第2および第1の抗体可変ドメインを含むエピトープ結合部位を含むポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーと、第1の可変ドメインをコードする再構成された可変領域とをコードするヌクレオチド配列を含み、第2のヌクレオチド配列が細胞中で再構成された、脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマ。
【請求項６】
(a)リンパ球細胞を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)であって、
(i)それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー定常領域を含み、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチングを受けることができる、抗体重鎖遺伝子座を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、アイソタイプスイッチング後に、脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)であって
任意選択で、前記非ミュー定常領域がガンマ定常領域であり、前記重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数のIgG重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、IgG抗体を生成することができる、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)、または
(b)(i)細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたまたは再構成されていない可変領域、第1のスイッチ、ミュー定常領域、第2のスイッチおよび非ミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座であり、それぞれの細胞の重鎖遺伝子座がIgMから非ミューへのアイソタイプスイッチングを受けることができる抗体重鎖遺伝子座を含み、
(ii)非ミュー定常領域が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現させるための、(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、
非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)であって、
任意選択で、前記非ミュー定常領域がガンマ定常領域であり、前記重鎖遺伝子座が、アイソタイプスイッチングを受けて、軽鎖の非存在下で1つまたは複数のIgG重鎖を含みかつそれぞれの重鎖がCH1ドメインを欠く、IgG抗体を生成することができる、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【請求項７】
(a)ゲノムが(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含むリンパ球細胞を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)であって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物が(N末端からC末端の方向に)鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)、または
(b)細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成された可変領域および非ミュー定常領域を含む抗体重鎖または軽鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞もしくはラット細胞)またはハイブリドーマであって、
非ミュー定常領域が(5'から3'の方向に)任意選択のリンカーおよび所定のエピトープ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、細胞が(N末端からC末端の方向に)遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、脊椎動物細胞またはハイブリドーマ。
【請求項８】
(N末端からC末端の方向に)抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含み、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する多価ポリペプチド鎖を、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)中で生成する方法であって、
(a)脊椎動物を、第1のエピトープを担持する第1の所定の抗原で免疫し、脊椎動物の少なくともいくつかの重鎖遺伝子座中での非ミュー定常領域からの発現へのアイソタイプスイッチング、および体細胞超変異を受けた可変領域の発現を得る工程;ならびに
(b)前記第1のエピトープに結合する可変領域の選択により前記免疫した脊椎動物から1つまたは複数のポリペプチド鎖を選択し、それぞれの選択された鎖がエピトープに特異的に結合する体細胞超変異した可変領域を含む工程;ならびに
(d)脊椎動物のゲノム中の重鎖遺伝子座の非ミュー定常領域中にエピトープ結合部分のヌクレオチド配列を提供し、工程(b)で選択されたポリペプチド鎖が第1および第2のエピトープに結合する工程
を含み、
任意選択で、工程(a)におけるそれぞれの体細胞変異した可変領域が、CH1ドメインを欠く非ミュー型重鎖により提供され、
任意選択で、選択されたポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を単離または合成する工程;および任意選択で、その配列をヒト化する工程をさらに含む、方法。
【請求項９】
(a)請求項8に記載の方法により得られる多特異的ポリペプチド鎖、もしくは第1および第2のエピトープに特異的に結合するその誘導体、または
(b)(N末端からC末端の方向に)構造V-X-L-E-L-C
(式中、
(i)Vは第1のエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインであり、
(ii)Xは、存在しない、抗体ヒンジ領域、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり、
(iii)Lはそれぞれ、任意選択のリンカーであり、
(iv)Eは第2のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合部分であり、
(v)Cは存在しないか、または定常ドメインを含む抗体定常領域であり(例えば、CはヒトガンマFcである))
を有する多価ポリペプチド鎖であって、
Vは、エピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中(例えば、マウスまたはラット)中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり、
前記再構成された抗体可変ドメインは、内因性(例えば、マウスまたはラット)AIDパターンの体細胞超変異を含み、
任意選択で、前記エピトープ結合部分が、内因性AIDパターンの体細胞超変異を欠く、多価ポリペプチド鎖。
【請求項１０】
それぞれの重鎖が、請求項9の(b)に記載のポリペプチドであり、(N末端からC末端の方向に)構造
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E、
V-M-CH2-CH3-L-E、
V- L-E-L-CH1-M-CH2-CH3、
V- L-E-L-M-CH2-CH3、
V-CH1-N-E、
V- L-E-N-CH1、または
V- N-E-L-CH1
(式中、Nは任意選択の抗体ヒンジ領域を有するLであり;Mは任意選択の抗体ヒンジ領域である)
を有し、
任意選択で、定常ドメインはヒト定常ドメインである、重鎖の二量体を含む二価抗体。
【請求項１１】
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドであって、少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
第1の可変ドメインが、第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成から誘導される再構成された抗体可変ドメインであり;
再構成された第1の抗体可変ドメインが、内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む、抗原結合ポリペプチド。
【請求項１２】
1つまたは複数のエピトープ結合部分に連結されたタンパク質スキャホールドを含む抗原結合ポリペプチドの製造における第1および第2の再構成された抗体可変ドメインの使用であって、抗原結合ポリペプチドが少なくとも2つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの少なくとも一方がエピトープ結合部分により提供され、少なくとも一方が第2の抗体可変ドメインと対形成した第1の抗体可変ドメインにより提供され、
(i)第2の可変ドメインおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分をもコードするヌクレオチド配列における、得られる可変領域遺伝子の体細胞超変異と共に、非ヒト脊椎動物中でのin vivoでの可変領域遺伝子セグメントの再構成によって第1の可変ドメインの配列を取得し;再構成された第1の抗体可変ドメイン配列が内因性AIDパターンの体細胞超変異を含む可変ドメイン配列を、単離する工程;(ii)可変ドメインと、タンパク質スキャホールドおよび1つまたは複数のエピトープ結合部分とを発現させ組み合わせて、前記抗原結合ポリペプチドを生成する工程;ならびに(iii)前記ポリペプチドを単離する工程を含む、使用。
【請求項１３】
(a)リンパ球細胞を含み、それぞれの細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、および、任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)であって、
脊椎動物が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスもしくはラット)、または
(b)細胞ゲノムが、(5'から3'の方向に)再構成されたもしくは再構成されていない可変領域、および、任意選択のリンカーと所定のエピトープ結合部分とをコードするヌクレオチド配列を含むミュー定常領域を含む抗体重鎖遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)であって、
細胞が、(N末端からC末端の方向に)重鎖遺伝子座の前記可変領域から誘導される抗体可変ドメイン、任意選択のリンカーおよびエピトープ結合部分を含む多価ポリペプチド鎖を発現し、可変ドメインおよびエピトープ結合部分がそれぞれ第1および第2のエピトープに特異的に結合する、非ヒト脊椎動物細胞(例えば、マウス細胞またはラット細胞)。
【請求項１４】
N末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域またはそれぞれのN末端可変ドメインもしくは5'末端可変領域が、ヒト可変ドメインまたは領域である、請求項6から13のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞、ポリペプチド、方法または使用。
【請求項１５】
非ヒト種の脊椎動物を生成する方法であって、前記種の2つの脊椎動物を一緒に育種する工程を含み、脊椎動物が両方とも請求項1、2、5〜7、13および14のいずれか一項に規定の通りである、方法。