(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＩｆＬ−II
［式中、Ｉはホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポリカルボン酸の常磁性金属キレートで構成される磁気応答配位子成分；
IIは体内の特異的部位、器官または組織に対して生物親和性を有する、組織および表面−特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれた生物特異的な標的因子成分；
Ｌは、プロピレンオキシ疎水性基Ｙおよび上記選ばれた標的因子成分IIとの連結をもたらす結合基Ｒを含有するエチレンオキシ親水性配列Ｗを有するポリオキシアルキレンブロックコポリマーの形状の両親媒性ブリッジリンカー成分であり；
並びにＬとIIの連結は、上記親水性配列Ｗの結合基Ｒを介する共有結合であり；および
ＬとＩのｆで示される連結は、非共有結合でかつ該両成分の疎水性基間の親和力を含む］
で示されることを特徴とする共役結合体化合物。
【請求項２】
Ｙが、１０〜６０個のプロピレンオキシ単位を有するポリオキシプロピレンから選ばれる請求の範囲１に記載の共役結合体化合物。
【請求項３】
Ｗが、５０〜１５０個のポリエチレンオキシ単位を有するポリオキシエチレンから選ばれる請求の範囲１に記載の共役結合体化合物。
【請求項４】
Ｙが４８個のプロピレンオキシ単位のポリオキシプロピレンおよびＷが１２７個のエチレンオキシ単位のポリエチレンオキシである請求の範囲１に記載の共役結合体化合物。
【請求項５】
Ｉがホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポリカルボン酸の常磁性金属キレートで構成され、IIが組織および細胞特異的または表面特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれ、およびＬがＦ１０８（ＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＯＣ−ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣ−ＮＨＮＨ2）2から選ばれ、ここで、Ｆ１０８が−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）ｂ−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−で示され、ａが１４７およびｂが４８である請求の範囲１に記載の共役結合体化合物。
【請求項６】
請求の範囲１に記載の共役結合体化合物を製造する方法であって、適当なプロピレンオキシ疎水性基Ｙおよびエチレンオキシ親水性配列Ｗを有する両親媒性リンカーを選択し、次いで（a）該両親媒性リンカーに変性によって結合基Ｒを付与して両親媒性ブリッジリンカー成分Ｌとし、（b）この両親媒性ブリッジリンカー成分Ｌを結合基Ｒを介して標的因子成分IIと共有結合せしめ式（Ｌ−II）の中間体を得ること、および（c）この両親媒性ブリッジリンカー成分Ｌを磁気応答配位子成分Ｉと両成分の疎水性基を介して非共有結合（f）せしめ式（ＩｆＬ）の中間体を得ることにより、式（ＩｆＬ−II）の共役結合体化合物を得ることを特徴とする共役結合体化合物の製造法。
【請求項７】
工程（b）の後に式（Ｌ−II）の中間体を得、該中間体（Ｌ−II）を用いて工程（c）を行なう請求の範囲６に記載の製造法。
【請求項８】
工程（c）を工程（b）の前に行なうことによって、工程（c）から中間体（ＩｆＬ）を得る請求の範囲６に記載の製造法。
【請求項９】
両親媒性リンカーに付与される結合基Ｒを、−ＮＨ2（またはＮＨＲ1、ここでＲ1は低級アルキル）、−ＣＨＯ（遊離またはジアルキルアセタールの形状）、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＣ１、−Ｏ−ＣＯＣ１等の中から選択する請求の範囲６に記載の製造法。
【請求項１０】
両親媒性ブリッジリンカー成分Ｌを、Ｆ１０８（ＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＯＣ−ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣ−ＮＨＮＨ2）2から選択し、ここで、Ｆ１０８が−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）ｂ−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−で示され、ａが１４７およびｂが４８であり；磁気応答配位子成分Ｉをホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト微粒子、および疎水化常磁性キレートから選択し、および標的因子成分IIをビオチン、ラクトース、ホレート、および
式：Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−ＯＨの“ＲＧＤ″ペプチドから選択する請求の範囲６に記載の製造法。
【請求項１１】
式：
（ＩｆＬ）または（Ｌ−II）
［式中、Ｉはホスファチジン酸で被覆された磁気粒子または疎水性長鎖脂肪族アルコールで部分エステル化されたポリアミノポルカルボン酸の常磁性金属キレートで構成される磁気応答配位子成分；
IIは体内の特異的部位、器官または組織に対して生物親和性を有する、組織および表面−特異的ホーミングプロテイン、グリコペプチドおよび炭水化物から選ばれた生物特異的な標的因子成分；
Ｌは、プロピレンオキシ疎水性基Ｙおよび上記選ばれた標的因子成分IIとの連結をもたらす結合基Ｒを含有するエチレンオキシ親水性配列Ｗをするポリオキシアルキレンブロックコポリマーの形状の両親媒性ブリッジリンカー成分であり；
並びにＬとIIの連結は、上記親水性配列Ｗの結合基Ｒを介する共有結合であり；および
ＬとＩのｆで示される連結は、非共有結合でかつ該両成分の疎水性基間の親和力を含む］
の中間体。
【請求項１２】
Ｌが、Ｆ１０８（ＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＯＣ−ＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ2）2、Ｆ１０８（ＯＣ−ＮＨＮＨ2）2から選ばれ、ここで、Ｆ１０８が−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）ｂ−（Ｏ（ＣＨ2）2）ａ−で示され、ａが１４７およびｂが４８であり；およびＩがホスファチジン酸で被覆されたマグネタイト微粒子、および疎水化常磁性キレートから選ばれる請求の範囲１１に記載の中間体。
【請求項１３】
ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のＭＲＩ画像形成に用いる請求の範囲１１または１２に記載の中間体。
【請求項１４】
ヒトおよび動物患者の体の特異的部位のＭＲＩ画像形成に用いるコントラスト剤の製造用の、請求の範囲１乃至５のいずれか１つに記載の共役結合体化合物の用途。
【発明の詳細な説明】
本発明は、磁気共鳴画像形成を目的とする、ヒトおよび動物患者の体の特異的部位に向けられる磁気標識ベクターからなる、投与しうる分子共役系（molecular conjugate system）または組成物に関する。
この種の分子共役系は、磁気応答信号発生剤成分（Ｉ）、および結合またはリンカー（Ｌ）によって該成分（Ｉ）に連結した物質（II）、たとえば生体の特異的部位（すなわち、映像化が必要な特異的器官または組織）に対して特異的親和性を有するプロテイン、ペプチドまたは生物活性物質から成る。実際に、成分（II）は、循環あるいはその他を介して体内の特異的標的に、信号を発生する成分（Ｉ）を輸送指示するアローヘッド（arrowhead）またはホーミング（homing）因子として作用する。必要に応じて、成分（II）は成分（Ｉ）のエンドサイトーシスを仲介しうることもある。
本発明は特に、新規中間体（Ｉ−ＬおよびＬ−II）および３成分構造（Ｉ−Ｌ−II）で示される分子共役系に関する。
背景技術
患者の生体の特異的部位またはレセプタへの標的となる生体分子（II）が、信号発生剤手段として作用する診断上活性な配位子（Ｉ）に連結して、診断上有用な情報を提供する、投与しうる共役系の使用は、最近数年間で広く知られるようになった。
診断上活性な作用物質としては、適当な受信機でとらえられ、電子工学的に処理され、次いでディスプレーに変換される応答信号を発生しうる物質が包含される。たとえば、電磁気信号を検出し、適当な機器で処理し、最後に適当な訓練者によって医療上解釈できるデータに変換することができる。診断上活性な作用物質の中で、カウントおよびシンチレーションで検出できる放射性核種（β−またはγ−エミッター）、放射線調査でコントラスト効果（contrast effect）を付与するヨウ素化Ｘ線不透明剤、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）でコントラスト効果を付与する磁気応答物質（鉄磁性、常磁性および超常磁性物質）、並びに超音波検査法でコントラスト効果を付与するマイクロバルブおよびマイクロバルーンが挙げられる。
上記共役系における連結は一般に、結合または成分（Ｉ）と（II）の共有結合をもたらすための化学的反応性基を有するリンカー（Ｌ）の助力に依存する。一般式（Ｉ−Ｌ−II）で示されうる多くの系、すなわち、成分（Ｉ）と（II）がリンカー（Ｌ）によって化学的に連結してなる系は、当該分野で公知である。
多くの異なる公知の提案としては、たとえば磁気活性Ｆｅ3Ｏ4粒子を含有するポリマー微小球が包含され、該ポリマー微小球において、反応性基含有の主としてアクリル系ポリマー、たとえばポリアクリルアミド、ポリアクリル酸等は、共有結合した蛍光染料、レクチン、抗原、抗体および他の生物学的活性物質で標識され、従って、特定の炭水化物残基、ホルモンレセプタおよび他の特異的細胞表面成分の検出および局在（localization）を可能にする。
また、細胞または組織の診断局在に対してインビボで使用できる超常磁性（superparamagnetic）酸化金属粒子も提案されており、ここで、細胞または組織は該粒子に連結する特定の生物親和性吸着剤によって見分けられ、また該粒子は、これに連結する治療上活性な作用物質を病的部位へ磁気指示するようにもなっている。必然的に式：Ｒ−Ｓi（ＯＸ）3（式中、Ｘは低級アルキル、およびＲは末端に−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、脂肪族疎水性基、もしくは両親媒性基（amphipatic function）を有する脂肪族または芳香族配列である）の反応性シランを伴うシラン化反応によって、シランリンカーに結合した磁気粒子は、生物親和性吸収剤に共有連結するのに好適であることが報告されている。
同じく、有機組織に対し結合親和性を有する物質に連結した、投与しうる磁気微粒子（たとえばマグネタイト）も知られている。このように、たとえば、組織−特異的物質（抗体、神経伝達物質、ホルモン、代謝産物、酵素、トキシン、および天然もしくは合成薬物など）は、磁気粒子に対し、該粒子に反応性官能基を有する生分解性ポリマーを被覆し、次いで上記反応性官能基を介して組織−特異的物質へ結合させることにより連結する。すなわち、血流に注射で投与される組織−特異的標的マグネタイト微粒子は、標的器官または組織へ輸送され、そこで、該器官のＭＲＩ調査において、コントラスト増強剤として機能する。
また、多形核白血球（ＰＭＮ）、たとえばリンパ球の、医療上有用な金属イオン（放射性同位元素および常磁性元素を含む）によるインビボ標識、およびその後のＰＭＮ往来（trafficking）および放射線検出あるいはＭＲＩによる生体内の集中白血球の部位の検出のための方法および試薬も提案されている。この提案方法において、白血球刺激性試薬（レクチン）が白血球に結合するのを可能にする条件下で、該白血球刺激性試薬が有用な金属種に結合してなる配合物の有効量が投与されることにより、その後に、通常の測定手段を用いる該金属の検出および定量によって、刺激された白血球の濃度が確かめられる。
ＥＰ−Ａ ０３９８ １４３（Ａ．Ｊ．フィッシュマンら）に、感染または炎症の病巣部位を画像形成する、標識化学走性ペプチドが開示されている。この特許文献に記載の標識ペプチドは、式：
Ｎ（Ｘ）−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−Ｚ−Ｗ
（式中、Ｎは窒素、Ｘは保護するホルミル、アセチルまたはt−Ｂoc基；Ｗは放射性または常磁性同位元素の標識、たとえばＥＤＴＡまたはＤＴＰＡキレートおよびＺは共有結合またはリンカー配列（sequence）である）
で示される。また、この特許文献には、放射性標識化学走性ペプチドの、予め大腿をＥ．coli．菌株で感染した実験ラットへの注射、次いで毎時継続γ−カメラ画像による感染部位の局在も記載されている。
さらに、基質を標的プロテインにブリッジする、変性（derivatized）親水性−疎水性ブロックコポリマーが開示されている。たとえば、ＷＯ−Ａ−９５／０６２５１（ユタ大学）に、ＰＥＧブロックの末端に反応性基を有する変性プルロニック（Ｐluronic、登録商標）およびテトロニック（Ｔetronic、登録商標）化合物が開示されている。疎水性表面（たとえばポリスチレンビーズおよび類似担体）を吸着により被覆するのに変性コポリマーを用い、ここで、被覆した表面は、プロテインや類似物質を固定する基質として機能する（用途：たとえばＥＬＩＳＡ試験）。
先行技術の遂行はメリットを有するが、冗漫かつ費用の高い通常の化学手段による一般式（Ｉ−Ｌ−II）の系の製造に関連して幾つかの避けられない欠点がある。
これまでに知られている系の他の不利な点は、いったんその目的、すなわち、標的組織の画像形成を果たすと、それ以上の目的を持たない、これらの複合分子の代謝または体からの排泄の問題に関連する。このような複合系を、治療剤の一定部位へのデリバリーに用いると、治療上活性な物質の減少は同時に、少なくとも一部の消化、次いで複合分子の除去をもたらす。しかしながら、かかる系を画像形成に用いるとき、使用した分子の除去が問題となる。
本発明は、変性疎水性−親水性ブロックコポリマーのリンカー性質を同様に使用するが、磁気応答成分（Ｉ）とホーミングプロテインまたはペプチド（II）の連結を簡易化するという重要な向上を構成する。
発明の概要
本発明の最初の目的は、式：
（Ｉ−Ｌ−II）
（式中、ＩはＭＲＩにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプレーのコントラストの因子として作用する磁気応答配位子成分Ｌは適当に官能化された疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、シンペロニック（Ｓynperonic、登録商標）等から誘導される両親媒性ブリッジリンカー成分およびIIは体の特異的部位、器官または組織に対し親和性を有するペプチド、プロテインまたは他の生物活性物質などの標的因子成分である）
の新規な投与しうる分子共役系、すなわち共役結合体化合物を提供することにある。
新規系の特徴は、以下の通りである。すなわち、ＬとIIの結合は共有結合であるが、ＩとＬの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度および循環の注射後オプソニン作用に対し共役系の優れた抵椛もたらす。この特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式：ＩfＬ−IIで表すことが好ましい。
明らかに、磁気応答配位子成分Ｉを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかる共役結合体化合物ＩfＬ−IIの注射も、本発明の目的の一つである。
リンカーＬは、式（ｉ）：
Ｙ（Ｗ−Ｚ−Ｒ）m                    （ｉ）
（式中、mは１、２または４；
ＹＷ部は、成分Ｉと非共有結合する疎水性−親油性基“Ｙ”と親水性−疎油性配列“Ｗ”が共に共有結合してなるセグメント；
Ｚは化学結合または中間連結配列［たとえばＣ1−Ｃ4脂肪族セグメント］；および
Ｒは選定した生物活性標的因子成分IIとの共有連結をもたらす反応性基（すなわち、結合基）である）の構造を有しうる。
本発明の他の目的は、前記構造に係るリンカーＬの製造方法にあり、該方法は、式：
ＹＷm
（式中、mは１または２、
Ｙは親油性および疎水性基および
Ｗは油／水型分散特性を持ち、末端に−ＯＨまたは−ＮＨ2を有する水相溶性配列である）の両親媒性の界面活性剤化合物を、−ＮＨＮＨ2、−ＣＨＯ（遊離またはジアルキルアセタールの形状）、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ2、−ＮＣＯ、ＮＣＳ、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣl、−Ｏ−ＣＯＣl等から選ばれる反応性基Ｒを付与するのに好適な反応物と反応させることにより、該界面融剤化合物を官能化することから成る。
さらに本発明の他の目的は、必然的に基Ｒを伴う反応を介して、リンカーＬを標的因子成分IIと共有結合させて、生体の特異的部位への輸送をもたらすよう適当に設計された中間体（Ｌ−II）を製造する方法にある。
本発明において、疎水性基Ｙは磁気応答配位子成分Ｉの類似の疎水性基に誘引結合（非共有結合）するように選ばれる。上述の如く、この説明で、この種の結合はｆで示される。このため、Ｙの性質に基づき、磁気応答配位子成分Ｉと連結する結合力は、調節可能であり、共役結合体化合物（ＩfＬ−II）の安定性並びに体へ投与した後代謝前の該共役結合体化合物の寿命を適切にコントロールすることができる。またこの構造は、より容易なおよび生体からの排泄後の分解（活性種の任意の放出を伴う）を可能ならしめる。
このため、本発明のさらに他の目的は、ＩおよびＬが前記と同意義である非共有結合中間体（ＩfＬ）、およびリンカーＬを磁気応答配位子成分Ｉと非共有結合させることによる上記中間体（ＩfＬ）の製造法の提供にあり、連結は、Ｌの疎水性基Ｙと上記配位子成分Ｉの類似疎水性基との相互の誘引力による。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係る共役結合体化合物ＩfＬ−IIの具体例を示す概要図である。この具体例において、ガドリニウムキレート（大きな円にＧdを記す）に疎水性セグメント（プレーン（plain）の線）が備わり、その疎水性セグメントは親和性により、両親媒性リンカーＬの対応セグメンＹと会合し、その親水性セグメントＷ（小さい円）は、変性され（−ＺＲ−）、アローヘッドIIと連結する。
図２は、本発明に係る他の共役結合体化合物を示す概要図である。この具体例において、マグネタイト微粒子（Ｆe3Ｏ4）は、ＭＲＩ信号発生剤として作用し、ホスファチジン酸（太いサイドアームを持つ円）が被覆され、その疎水性成分（ストレートアーム）は、両親媒性基（amphiphile）（ＹＷ）の疎水性セグメント（プレーンの丸くなった線）と会合する。後者（小さい円）の親水性部（Ｗ）は、変性され、先の具体例の図１と同様、ホーミング因子と連結する。
図３は、本発明に係るリンカーを介するビオチン標的の磁気粒子からなる分子共役系対未標的系のアビジンによる確認を示すグラフである。
図４は、本発明のリンカー（変性両親媒性基）を介する化学走性標的因子（ＲＧＤペプチド）を備えた磁気微粒子（ＳＢＰＡ）からなる系の細胞好中球の培養に対する活性を示すグラフである。
図５aおよび５bは、マグネタイト−標識ヘキサペプチドで刺激されたヒトＰＭＮによるＮＢＴの減少速度を示すグラフである。
発明の詳細な説明
添付の請求の範囲に記載の本発明の主たる観点は、以下に示す予想外の知見に基づく。すなわち、式：
（Ｉ−Ｌ−II）
（式中、ＩはＭＲＩにコントラストを付与しうる、すなわち、画像ディスプレーのコントラストの因子として作用する磁気応答配位子成分；Ｌは適当に官能化された疎水性−親水性ブロックコポリマー、たとえばプルロニック、テトロニック、シンペロニック等から誘導される両親媒性ブリッジリンカー成分；IIは体の特異的部位、器官または組織に対し親和性を有するペプチド、プロテインまたは他の生物活性物質などの標的因子成分、およびＬとIIの結合は共有結合、ＩとＬの結合は非共有結合である）
の投与しうる共役系は、両結合が共有結合であるが、それらの代謝、すなわち排泄が極めて速い系の全ての利点を持つことである。
新規系の特徴は、以下の事実による。すなわち、ＬとIIの結合は共有結合であるが、ＩとＬの結合は非共有結合、好ましくはファンデルワールス力で調節される親和力による結合であり、水性担体媒体で実質的な分子移動度および循環の注射後オプソニン作用に対し共役系の優れた抵抗をもたらすという事実である。この特徴あるパラメーターに鑑み、新規アダクトを式：ＩfＬ−IIで表すことが好ましい。
明らかに、磁気応答配位子成分Ｉを特異的標的部位へ輸送するため、循環へのかかる共役結合体化合物ＩfＬ−IIの注射も、本発明の目的の一つである。
Ｙは好ましくは、ステロール類（たとえばコレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、コプロスタノール、トコフェロール等）、長鎖アルコール類（たとえばＣ10〜Ｃ18アルコール類）のアルキル成分、長鎖酸類（たとえば脂肪酸）、長鎖ポリグリセリド類（たとえばモノ、ジおよびトリグリセリドのアルキル部）、アルキルフェノール類、アルキルアミン類およびアルキルアミド類、疎水性ポリオキシアルキレン類等から選ばれる配列を有する化合物の種類の中から選定される。他の具体例としては、疎水性の多価酸無水物、ポリオルトエステル類、ポリホスファゼン類、ポリヒドロキシ酸類、ポリカプロラクトン類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ−酪酸が挙げられる。“Ｙ”は有利には、酸素原子で分けられる短い脂肪族鎖、たとえばプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレン等を繰返して含有してもよい。実際、好ましいＹは約１０〜６０個の疎水性アルキレンオキシド単位、好ましくはプロピレンオキシを有する。一般に、Ｙの性質の最良選択の基準は、以下により詳しく記載するように、配位子成分Ｉに結合する類似基に対する親和性である。
本発明のセンス（sense）で有効に操作するためには、リンカーの配列Ｗの親水性特性は好ましくは、構造（ＩfＬ−II）の共役結合体化合物の水性液体への容易な分散を促進するようなものであるべきである。従って、正確な操作のため、Ｙの疎水性とＷの親水性の適切な調和が必要である。実際に、ＨＬＢバランスは好ましくは、約１０〜３５、好ましくは２５〜３０が必要であるが、この範囲は、特別な場合必要ならば逸脱してもよい。“Ｗ”はイオン、たとえばスルホネート、ポリホスフエート等も可能であるが、好ましくは、Ｗは非イオン、すなわち、親水性のポリオキシアルキレン類、糖類および糖誘導体、親水性のセルロース誘導体（たとえばヒドロキシメチルセルロースおよび類縁体）、第三級アミンオキシド類、クラウン（crown）エーテル類、ソルビタン環および類似の親水性環式化合物などの構造を含むべきである。Ｗの有利な構造は、ポリエチレンオキシおよびポリメチレンオキシ配列のものである。Ｗがポリエチレンオキシ鎖の場合、ポリエチレンオキシ単位の数は５〜３００であってよく、好ましくは約５０〜１５０である。
一般に、本発明を興味深く実施するのに、以下に示すラベルで同定される種類の市販の変性界面活性剤を使用しうる：プルロニック，シンペロニック，ポロキサマー（Ｐoloxamer、登録商標）のＬ３８、Ｆ３８、Ｌ４２、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６２ＬＦ、Ｌ６４、Ｆ６８、Ｐ７５、Ｌ８１、Ｐ８５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｆ１２７；シンペロニックＴ−シリーズ；シンペロニックＬ−シリーズ；ＢＲＩＪ（登録商標）；ＭＹＲＪ（登録商標）；ツイーン（Ｔween、登録商標）等。
反応性基（結合基）Ｒは非常に数多くあり、当該分野で周知である。かかる基およびその製造に関する完全な記述は、本明細書の前記、すなわち背景技術の項で引用した文献で見ることができる。かかる反応性基としては、たとえば−ＯＨ、−ＮＨ2（またはＮＲ1Ｒ2、ここでＲ1およびＲ2はＨまたは低級アルキル）、−ＣＨＯ（遊離またはジアルキルアセタールの形状、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＣl、−Ｏ−ＣＯＣl等が包含される。本発明において、後記実施例でより詳しく説明するように、セグメントＷの末端変性によってかかる基を導入することが好ましい。
この反応性基は、リンカーの官能化された−Ｗ−Ｒを標的物質と反応させることにより、構造（Ｌ−II）の中間体の製造を可能にする。標的物質の中で、それぞれの標的を含む以下に示すものを引用することができる。
0004018141.tif 000002
0004018141.tif 000003
中間体（Ｌ−II）を、水性担体液体中の手ごろな磁気応答配位子成分Ｉと接触状態にすると、必然的に共役結合体化合物（ＩfＬ−II）の直接結合および形成並びにその上記担体液体内の分散をもたらす。これは、配位子成分Ｉの適当な疎水性基、たとえば脂肪アルコール類または脂肪酸類のアルキル残基とまざり合いもしくはからみ合う（多分、吸着またはファンデルワールス力による）と思われる、本発明のリンカーの疎水性基Ｙの性質に基づくと考えられる。
本発明のリンカーの好ましい製造および使用態様において、反応的に変性したポリアルキレンオキシブロック−コポリマーＹ（ＷＲ）2（Ｙはプロピレンオキシ疎水性基、Ｗはエチレンオキシ親水性配列およびＲは−ＮＨ2）をプロテイン・ホーミング因子（たとえばビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・メチルエステル）と連結させることにより、構造Ｙ（Ｗ−ビオチン）2の中間体（Ｌ−II）を得る。この中間体を水性担体液体中、ＤＴＰＡ（常磁性金属とのキレートの形状）の脂肪アルコールモノまたはジエステルの存在下に置くと、連結反応が起こり、構造ＤＴＰＡfＹ（Ｗ−ビオチン）2の共役結合体化合物（ＩfＬ−II）の分散体が得られ、これは注射によって、ビオチン−アビジン活性化に付される細胞レセプタへ向けられる。これは図１の概要図で示される。ここで関係のある、必然的に未変性ポリオキシアルキレンブロック−コポリマー（たとえばポロキサマー、プルロニック、シンペロニック）と“疎水化した”ＤＴＰＡ常磁性キレートの親和力連結を伴う技法は、ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．９５８１０４０３．６に開示されている。事実、画像形成組成物が、親油性成分を有するポリアミノ−ポリカルボキシレートキレート化剤と複合した常磁性金属イオンに加えて、生理学的に許容しうる非イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤と好ましくは１種以上の両親媒性化合物（たとえばホスホリピド）の混合物を包含すると、並はずれて有効な常磁性ＮＭＲコントラスト組成物が得られる。
本発明の他の有利な製造および使用態様において（図２参照）、ラクトースイソシアネートとポリエチレンオキシ端に−ＮＨ2末端基を有する変性両親媒性基と共に連結させることにより、Ｌが変性プルロニックＦ−１０８およびIIがラクトースである、中間体Ｌ−IIを製造する。次いで、この中間体の親油性セグメントＹとホスホリピドの脂肪酸残基との即座の連結を利用して、肝細胞に対して、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）などのホスファチジン酸類で被覆したマグネタイト粒子を標的とすることができる。マグネタイト粒子のホスホリピドによる被覆は、国際出願公開ＷＯ−Ａ−９４／０４１９７（ひそかなマグネタイト粒子）に開示されている。
本発明のリンカーのＹセグメントとホスホリピドの脂肪残基の顕著な親和性を用いて、故意にリポソーム小胞を和らげる（tame）ことができる。この場合、たとえばリポソーム薬物−担体小胞の膜を作るホスホリピドへの、両親媒性物質の混和（ＥＰ−Ａ−０３５４８５５参照）を言及しうる。なお、該両親媒性物質は、本発明リンカーのＹＷ部を構成するものに類する性質を持つ。前記文献に開示の技法において、両親媒性基の疎水性部は膜形成リピドに埋もれるが、そこから親水性部が突出し、まわりの水性媒体に広がる。
もし、前記との類推によって、両親媒性基として、本明細書に記載の中間体（Ｌ−II）、すなわち親水性−親油性化合物ＷＹと標識する生物特異的物質の共役からなる標識構造を使用すれば、標的リポソーム小胞を包含する系が得られる。リポソームがその中に、たとえば治療上または診断上活性な作用物質を封入して含有するとき、該作用物質を生体の特異的部位に向けて投与することができる。この技法は簡単で、かつリポソーム形成リピドにおいて、グラフト化した官能基を有し、後に選択ホーミングプロテインと結合する成分を用いることに基づくリポソームを標的にする古い技法（たとえばＷＯ−Ａ−８６／０４２３２に開示の技法）に取って代わるものである。これらの公知技法は、リピドの小胞閉じ込め特性およびその封入安定性に悪影響を及ぼしうるが、明らかに本発明において、このような落し穴は存在しない。
次に実施例を挙げて、本発明を説明する。
実施例１
式：Ｈ−（Ｏ（ＣＨ2）2）a−（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）b−（Ｏ（ＣＨ2）2）a−ＯＨ（式中、a＝１４７およびb＝４８）のプルロニックＦ−１０８（１０g、１．４３ｍＥqＯＨ）を撹拌下、４０mlの乾燥酢酸エチル（ＡcＯＥt）に溶解し、２５５mg（１．４７mＥq）のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を加え、室温で撹拌を約１／２時間続ける。溶液を脱泡し、３９６mg（３mＥq）のt−ブチルカルバゼート（carbazate）（t−Ｂｕ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2）を加える。２４時間の静止後、４０mlのエーテルを加え、溶液を４℃で一夜結晶化せしめる。固体を濾取し、ＡcＯＥt（またはＣＨ2Ｃl2）およびエーテルより再結晶する。Ｆ−１０８−ジ［ヒドラジドウレタン−ＢＯＣ］の収量９７g。
かかる反応の概要は、以下の通りである。
0004018141.tif 000004
実施例２
式：Ｈ−（Ｏ（ＣＨ2）2）a−（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）b−（Ｏ（ＣＨ2）2）a−ＯＨ（式中、a＝１４７およびb＝４８）のプルロニックＦ−１０８（２０g、２．８６mＥqＯＨ）を撹拌下、８０mlの乾燥酢酸エチル（ＡcＯＥt）に溶解し、０．７２ml（３ミリモル）のトリ−n−ブチルアミンＮ（n−Ｂu）3および０．７g（７ミリモル）の無水コハク酸を加える。混合物を７０℃で１８時間加熱し、室温まで冷却し、濾過する。４０℃に加熱後、４０mlのエーテルおよび５ミリモルの酢酸（ＡcＯＨ）を加え、混合物を４℃で一夜結晶化せしめる。固体を集め、２００mlのエーテルに懸濁し、排液し、乾燥する。純度約９０％（０．０２Ｎ−ＮaＯＨ溶液による遊離カルボキシル基の滴定で確認）のＦ−１０８ジ酸コハク酸エステル１９．７４gを集めた。かかる反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000005
実施例３
２０mlのＣＣl4に、実施例２で製造したＦ−１０８ジ酸コハク酸エステル５g（０．６２mＥqＣＯＯＨ）を溶解し、０．３ml（４．２ミリモル、ＣＯＯＨに関して６．５eq）の塩化チオニルを加える。混合物を２時間還流し、回転エバポレータ（rotavapor）で溶媒を完全除去する。残渣に１０mlの乾燥ＡcＯＥtを加え、次いで８mlのＡcＯＥt中の１．３２g（１０ミリモル）のt−Ｂu−カルバゼートおよび２．３９ml（１０ミリモル）のＮ（n−Ｂu）3の溶液を加える。黄色溶液を５０℃で１時間加熱し、次いで４０mlのエーテルで希釈し、室温で一夜結晶化せしめる。固体（４．９７g）を１０mlの乾燥塩化メチレンに溶解し、５mlのテトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加える。室温で１．５時間後、回転エバボレータで溶媒を除去し、２０mlのＡcＯＥtを加え、溶液を４０℃に加熱し、この時点で４０mlのエーテルを加え、溶液をr．t．（室温）に戻すことにより、結晶が形成する。これらの結晶を集め、２０mlのＡcＯＥtに溶解し、０．５mlのＮ（n−Ｂu）3を加え、溶液を再度４０℃に加熱し、４０mlのエーテルで希釈し、室温まで冷却せしめる。次いで、さらに３０mlのエーテルを加え、一夜静止後、通常のヒドラジド分析（下記参照）で確認して、４．３３gのＦ１０８−ジヒドラジドコハク酸エステルを集めた。かかる反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000006
実施例４
１０mlのＣＣl4中の１０g（１．３mＥq）のＦ１０８の溶液に、０．８ml（３．６mＥq）のＮ（n−Ｂu）3を加え、次いで０℃にて、１４．３mＥqのスクシニルジクロリド（フルカ（Fluka）Ａ．Ｇ．より）を加える。黒色混合物を室温にもどした後、５０℃に２．５時間加熱し、次いで冷却せしめ、一夜放置する。混合物を回転エバポレータで約５０mlに濃縮し、２００mlのエーテルを加えて、くもらせる。次いで、ミルク状液体を６００mlのエーテルに注ぐことにより、緑色がかった固体が沈澱する。この固体を再溶解し、活性炭で処理し、濾過溶液からエーテルで再沈澱させて、８．８４gのジクロリドを得る。上記製造において、再蒸留したスクシニルジクロリド（４６〜４７℃／０．７〜０．９トル）を使用すれば、得られる生成物は、エーテルの添加後ゆっくりと晶出し、活性炭精製は不要であった。また収量は多くなる。かかる反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000007
ジクロリドを、実施例３の記載と同様にして、対応するジヒドラジドに変換する。
ジヒドラジド化合物（実施例１〜４の）を水溶液中、トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）および重硫酸カリウムの存在下、分光測定で（５０５nm、コントロン（Kontron）スペクトロメーター）分析する。測定は、t−Ｂu−カルバゼートの公知希釈溶液から作成した検量線に関して、１０-5〜１０-3Ｍ範囲の溶液で行った。測定されるサンプル（１ml）は、０．８mlのヒドラジド溶液（対照または試験）、０．１mlの１Ｍ−ＫＨＳＯ4および１mlのＴＮＢＳ（１g／Ｌ）を含有する。吸光度測定は、サンプル調製の１時間後に行い、この遅れは再現性を確実にするのに必要である。ブランク対照の場合、蒸留水を用いた。
これらの結果から、最適純度および収量のヒドラジドを得るのに、実施例１および４の技法が好ましいことが認められる。
実施例５
５g（０．６２mＥq−ＣＯＯＨ）のＦ１０８−ジ酸コハク酸エステル（実施例２で得たもの）を、２０mlのＡcＯＥtに溶解し（少し加熱が有用）、そして室温で１g（６ミリモル）のＣＤＩを加える。溶液を室温で３０分間放置し、次いで５０℃に３時間加熱する。室温で２時間静置後、５０℃に再加熱し、５０mlのエーテルを加えることにより、固体が晶出する（４．９１g）。これを集め、エーテルで洗い、乾燥する。
固体を２０mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、その１０mlに、１mlのＣＨ2Ｃl2中の４００mg（３ミリモル）のt−Ｂu−カルバゼートを加える。室温で２時間後、０．７２ml（３ミリモル）のＮ（n−Ｂu）3を加え、混合物を一夜放置する。晶出した生成物を集め、ＡcＯＥt／エーテルで再結晶する。収量２．３１g。この生成物を実施例３と同様に、４mlのＴＦＡ／４mlのＣＨ2Ｃl2と反応させて脱保護し、溶媒の除去後得られる固体を、ＡcＯＥt／エーテルより結晶化する。Ｆ１０８−ジスクシニル−ヒドラジドの収量２．１２ｇ。
上記と同様にヒドラジド分析を行ったところ、ほぼ理論量の２．９６mＥq／gを得た。
上記製造したジイミダゾリル−カルボニル誘導体の他の１０ml溶液を、２５３ml（３ミリモル）の１，３−ジアミノプロパンおよび０．７２ml（３ミリモル）のトリブチルアミン含有のＣＨ2Ｃl2溶液で処理する。室温で一夜後、溶液を濾過し、５０mlのエーテルで希釈して、固体を得る。固体を集め、ＡcＯＥt／エーテルおよびＣＣl4／エーテルより連続して再結晶する。Ｆ１０８のジ［アミノプロピルアミドスクシニル］−鶴体の収量２．２６g。かかる反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000008
実施例６
５gのＦ１０８（０．７mＥq）を１０mlの塩化メチレンに溶解し、０．５１ml（２．１５mＥq）のＮ（n−Ｂu）3を加える。溶液を０℃に冷却し、そして０．２３ml（２１mＥq）の塩化トレシルを加える。ゆっくりと室温まで戻した後（５時間）、１０mlのＡcＯＥtを加え、溶液を約５０℃に加熱し、５０mlのエーテルを加え、全体を結晶化のため放置する。２日後、固体を遠心分離し（８０００g）、エーテルで洗い、乾燥し、２０mlの塩化メチレンに溶解する。
この溶液の１０ml分を、１mlのＣＨ2Ｃl2中の４００mg（３ミリモル）のt−Ｂu−カルバゼートで処理する。室温で２時間後、０．７２ml（３ミリモル）のトリブチルアミンを加え、混合物を室温で一夜放置する。次いで、５０mlのエーテルを加えることにより、４℃で数時間後に、Ｆ１０８−ジ（ヒドラジノ−ＢＯＣ）の沈澱物が形成する。収量２．１１g。
上記固体を４mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、前記実施例の記載と同様に、４mlのＴＦＡで脱保護する。室温で１時間後、回転エバポレータで溶媒を除去し、残渣を８mlのＡcＯＥt中０．２４mlのトリブチルアミンで処理し、エーテルの添加で、所望のジヒドラジノ−Ｆ１０８（２g）の沈澱を起す。
かかる反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000009
上記反応工程に従って、塩化メチレン中のジトレシレート溶液の他の１０ml分から、室温で３ミリモルの１，３−ジアミノプロパンおよび３ミリモルのトリ−n−ブチルアミンによる処理、エーテルによる沈澱およびＣＣl4／エーテルからの結晶化によって、対応するジ（アミノプロピルアミノ）化合物を得る。
実施例７
８０mlのＣＣl4中の２１g（３mＥq）のＦ１０８の濾過溶液において、室温で１ml（４．２mＥq）のトリブチルアミンを加える。冷却後、２．２ml（３０ミリモル）の塩化チオニルを加え、混合物を４時間還流することにより、赤色に変化する。これを濾過し、溶媒よりストリッピングし、残渣を約６０℃で８０mlのＣＣl4に再溶解し、２００mlのエーテルを加えて、２０．３gの固体を沈澱せしめる。固体を、活性炭で漂白したＡcＯＥt（８０ml）に溶解し、濾過し、２００mlのエーテルの添加後、結晶化せしめる。所望のＦ１０８ジクロリドを１９．０６g集めた。反応の概要は、以下の通りである。
0004018141.tif 000010
実施例８
Ｆ１０８（２１g、３mＥq）を２００mlのトルエンに溶解し、溶媒をゆっくり留去し、水分を除去する。約１２０mlの溶媒の除去後、溶液を冷却し、０．５g（４ミリモル）のカリウム・t−ブトキシドを加える。２時間の還流後、オレンジ色溶液を冷却し、０．７ml（６ミリモル）のエチルブロモアセテートを加える。一夜静止後、溶液を２時間還流し、冷却し、セライト（celite）上で濾過する。２００mlのエーテルを加えて２０．７１gの固体を形成せしめ、該固体を集め、ＥtＯＨ（１００ml）／エーテル（４℃）、およびＡcＯＥt（８０ml）／エーテル（２００ml）より連続して結晶化する。収量１９．２５g。反応は、以下の通りである。
Ｆ１０８（Ｏ-）2＋２ＢｒＡｃＯＥｔ→ＥｔＯＯＣ−ＣＨ2−Ｏ−Ｆ１０８−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯＥｔ
実施例９
実施例８の５gのジエステル（０．７mＥq）を、約５０℃にて２５mlのＥtＯＨに溶解し、約１ml（２１ミリモル）のヒドラジン水和物を加えた後、混合物を３時間還流する。室温、次いで４℃に冷却後、ジヒドラジドの結晶が形成し、これを集め、アルコールおよびエーテルで洗う。収量４．８５ｇ。反応は、以下の通りである。
Ｆ１０８（ＯＣＨ2−ＣＯＯＥｔ）2＋Ｎ2Ｈ4・Ｈ2Ｏ→Ｆ１０８（ＯＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2）2
実施例１０
実施例８の１０gのエチルＦ１０８−ジアセテートを、５０mlのＥtＯＨおよび７０mlのＨ2Ｏの溶液に溶解し、３mlの３２％ＮaＯＨを加える。５０℃で２時間および室温で一夜後、１５gの塩を加え、濃ＨＣlでpＨ２に調整し、混合物を１００mlのＣＨ2Ｃl2で２回抽出する。コンバインした有機画分を飽和塩水で洗い、無水Ｎa−Ｍgスルフェート上で乾燥する。蒸発後、残渣を５０mlのアルコールに再溶解し、４℃で結晶化せしめる。
ジカルボン酸を過剰の０．２Ｎ−ＮaＯＨで滴定し（９mlのＨ2Ｏ中０．５２g）、０．２Ｎ−ＨＣlで逆滴定する。この結果、置換率７４％が認められる。
実施例１１
実施例７の２g（０．２８mＥq）のＦ１０８ジクロリドを、８mlの乾燥ＤＭＦに溶解し、０．５４g（２．９ミリモル）のカリウム・フタルイミドを加える。混合物を９０℃で一夜撹拌後、冷却し、セライト上で濾過する。溶液を５０℃に加熱し、３０mlのエーテルを加え、冷却すると固体が形成する。ＥtＯＨ（２０ml）／エーテル（５０ml）より結晶化後の収量１．４６g。なお、カリウム・フタルイミドをホルムアミド溶液の形状で加えると、より良好な収量および純度の生成物が得られる。反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000011
実施例１２
前記実施例の化合物（１．４６g、０．２mＥq）を９mlのＥtＯＨに溶解し、０．１ml（２ミリモル）のヒドラジン水和物を加える。室温で一夜後、溶液を１０mlのＥtＯＨで希釈し、３時間還流する。次いで溶媒を減圧下で除去し、残渣を８mlのＥtＯＨに溶解し、４０mlのエーテルを加えて、固体を沈澱させる。固体を集め、エーテルで洗い、８mlのエタノールに溶解し、０．１１ml（２ミリモル）のＡcＯＨを加える。混合物を５０℃に加熱し、これに５０mlのエーテルを加え、放置して結晶化する。ジアミノ−Ｆ１０８の白色結晶（１．２４g）を集め、分析する。−ＮＨ2基の滴定により、置換率が実質上１００％であることが認められる。反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000012
実施例１３
Ｆ１０８（２１g、３mＥqＯＨ）を、トルエン中の共沸蒸留で乾燥した後、実施例８の記載と同様に、対応するジカリウム・アルコキシドの溶液（１２０ml）に変換する。この溶液６０mlを撹拌下、１．８２ml（１５ミリモル）のブロモアセトアルデヒド・ジメチルアセタールと反応させる。黄色溶液を一夜還流することにより、濁ったオレンジ色となる。これをセライト上で濾過し、回転エバポレータで濃縮し、１２０mlのエーテルで希釈し、これによって静置で結晶化する。固体を集め、５０mlのＥtＯＨに溶解し、エタノール溶液を活性炭で処理し、濾過し、４０mlのエーテルで希釈する。４℃に冷却後、Ｆ１０８ジアセトアルデヒド・ジメチルアセタールの結晶（９．０５g）が形成し、これを集め、乾燥し、分析する。反応は、以下の通りである。
0004018141.tif 000013
実施例１４
Ｆ１０８（７．５g、１．０７mＥqＯＨ）を、５０℃にて３０mlのＣＣl4に溶解する。溶液を濾過し、室温で０．２７ml（１．１mＥq）のトリ−n−ブチルアミンを加えた後、１．０７g（３．６ミリモル）のビス（トリクロロメチル）カーボネート（トリホスゲン）（これは１０．８ミリモルのＣＯＣl2に相当）を加える。室温で１．５時間後、溶液を５０℃で２０時間加熱し、次いで減圧下で蒸発して、ＨＣlおよびホスゲン過剰分を完全に除去する。
残渣を３０mlのＣＣl4に溶解し、８０mlのエーテルで希釈する。形成した固体を４℃で集め、エーテルで洗い、３０mlのＣＣl4に再溶解する。
２mlのＣＣl4中に１．９g（１４．３ミリモル）のt−ブチルカルバゼートおよび０．２ml（０．８mＥq）のトリブチルアミンを含有する溶液を作る。これに上記Ｆ１０８ジクロロホルメート溶液２０ml（０．７１５mＥq）を加える。５０℃で１８時間後、溶液を濾過し、５０mlのエーテルの添加で沈澱せしめ、４℃に冷却する。固体をＡcＯＥt／エーテル（２０ml／５０ml）中で結晶化して４．２１gを得る。
ジ（ヒドラジド−ＣＯＯ−t−Ｂu）化合物を８mlのＣＨ2Ｃl2中、実施例４記載と同様な脱保護のため８mlのＴＦＡで処理する。室温で３時間後、混合物を減圧下で蒸発し、残渣を１５mlのＣＨ2Ｃl2に再溶解し、９０mlのエーテルを加えて、固体を沈澱せしめる。この固体を２０mlのＥtＯＨ＋０．５mlのトリブチルアミンより結晶化し、溶液を４℃で一夜放置する。Ｆ１０８−ジカルバゼート（ウレタンヒドラジド）の収量４．０４g。反応は以下の通りである。
0004018141.tif 000014
実施例１５
２mlのＣＣl4中の０．１ml（０．４ミリモル）のトリブチルアミンおよび０．５ml（７．２ミリモル）のエチレンジアミンの溶液に、実施例１４の１０ml（０．３６mＥq）のＦ１０８−ジクロロホルメート溶液を加える。溶液を５０℃で１８時間加熱し、１０mlのメタノールで希釈し、濾過し、５０mlのエーテルで固体を沈澱させる。固体を集め、ＡcＯＥt（１０ml）／エーテル（３０ml）中で再結晶する。Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｆ１０８−ＯＯＣ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2の収量２．２５g。通常の手段で−ＮＨ2基の滴定を行ったところ、置換率約６０％が認められる。
実施例１６
１００mlのエーテルに、１３．２２g（０．１モル）のt−ブチル・カルバゼートおよび１５．４ml（０．１１モル）のトリエチルアミンを溶解する。冷却下（０〜５℃）、８．９ml（０．１モル）のブロモアセチルブロミドをゆっくりと（約０．５時間で）加える。添加終了時に、温度を周囲温度に戻し、沈澱したトリエチルアンモニウムブロミドを濾去する（１９．８６g≒理論量）。赤色濾液をシリカ（２４cmカラム、２００ml）にて、溶離剤としてエーテル（１００＋２５０ml）を用いるクロマトグラフィーに付す。黄色溶出液を約８０mlに濃縮し、濁りが生じてくるまでヘキサンを加える。その後、振とうすると結晶がすぐに形成する。結晶を４℃で集める。収量２１．４６g（８５％）。
得られる生成物（t−ブチル・Ｎ−ブロモアセチルカルバゼート）を実施例８および１３と同様に、カリウム塩と反応させた後、t−Ｂu基をＴＦＡで除去する。このようにして、実施例９で得た生成物に対応するヒドラジドが得られる。反応は、以下の通りである。
Ｂｒ−ＣＨ2−ＣＯＢｒ＋Ｈ2ＮＮＨ−ＣＯＯ−ｔ．Ｂｕ→ＢｒＣＨ2−ＣＯＮＨＮＨ−ＣＯＯ−ｔ．Ｂｕ
0004018141.tif 000015
実施例１〜１６に従って製造したリンカーは、薬物または信号発生剤成分（Ｉ）と生物活性標的分子（II）を会合して、（II）に対してレセプタ親和性を有する生体の部位への（Ｉ）の輸送のため有効なベクターを付与するのに首尾よく用いた。
前記実施例において、プルロニックＦ１０８両親媒性化合物を、ＯＨまたはＮＨ2末端の親水性ポリアルキレンオキシセグメントを有する他のコポリマーで交換しても、同様な結果が得られ、生成する対応リンカー生成物は上記と同様に成分（Ｉ）と（II）のブリッジ連結に使用しうる。かかるコポリマーの中で、本発明の明細事項に属する各種の構造のプルロニックおよびシンペロニックを引用することができ、これらの構造は、長さが異なる種々の親水性および疎水性配列を含む。他のポロキサマーおよびポロキサミン並びにソルラン（Ｓolulan、登録商標）、ブリジ（Ｂrij、登録商標）、ミルジ（Ｍirj、登録商標）、ツイーン（Ｔween、登録商標）、スパン（Span、登録商標）等の一般登録名下で知られているブランドに属する他の手ごろな両親媒性基（amphiphile）も、特別な条件下で可能である。
実施例１７
（a）（ＩfＬ）リンカー−マグネタイト粒子の製造
４０mlの水に、８１．１mg（０．３ミリモル）のＦeＣl3・６Ｈ2Ｏおよび５６．９mg（０．３ミリモル）のＦeＣl2・４Ｈ2Ｏ（トータルＦe＝０．６ミリモルまたは３３．５mg）を溶解する。これに、０．１mＣiの59Ｆe（トレーサ量）をＦeＣl3形状で加える。
混合物を撹拌し、pＨが安定値８．６に到達するまで、７．５％アンモニア水溶液を滴下する。形成した黒色粒子の懸濁液を７５℃で５分間加熱し、室温で粒子を沈降せしめる。沈澱物を１００mlの水を分けたデカントで３回洗った後、再び撹拌下で６０mlの水に懸濁する。この懸濁液の鉄濃度は０．５mg／mlであった。
この懸濁液１０ml（５mgのＦe）に、成分（a）として１００mgのジパルミトイルホスファチジン酸のナトリウム塩（ＤＰＰＡ・Ｎa）を加え、音波破砕を２０分間行う（ＢＲＡＮＳＯＮ  ２５０音波発生器、１／８”ミクロプローブ、出力２０（１５−２０）Ｗ）。温度は音波破砕中に約６８℃まで上昇したが、これを室温まで下げ、成分（b）として実施例１２で製造した１００mgのプルロニック（ＮＨ2）2（または同一に変性した両親媒性基、たとえばＩＣＩのシンペロニック、またはポロキサマー３３８）を加える。次いで、上述の条件下で音波破砕を１５分間再開する。
従って、得られる被覆粒子（サンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2）の懸濁液は、１ml当り、０．５mgの鉄、１０mgのＤＰＰＡおよび１０mgの変性プルロニック（ＮＨ2）2界面活性剤を含有する（（a）と（b）の重量比＝１：１）。粒子計数装置（ＵＳＡカリフォルニア州のサンタ・バーバラ、Ｎicomp３７０ＨＤＬ−ＮＰＳＳオブ・パーティクル・サイジング・システムズ）による測定で、生産量に基づき、平均粒度は５０〜１００nm（±２０〜４０％）の範囲にあることがわかった。
前記実施例に記載の他の変性両親媒性基を用いて、他のサンプル（下記参照）を同様に製造した。
0004018141.tif 000016
（b）共役結合体化合物（ＩfＬ−II）の製造
１０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2（上記（a）参照）を、２７０００g下で１時間遠心分離する。下層残渣を２．５mlの１００mＭボレート緩衝剤（pＨ８．２）［またはホスフェートの無い等張溶液］で採取して、２mg鉄／ml含有の懸濁液を得る。
１mlの懸濁液に、スイスのＦluka  Ａ．Ｇから入手の５μモルのビオチン−ＮＨＳ（ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）連結を、正味のままあるいはＤＭＳＯ濃厚溶液で加える。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで蒸留水に４回連続して透析して、所望のマグネタイト−ビオチン共役結合体標識ＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｂioの精製サンプルを得る。
ＳＢＰＡ−ＮＨ2と他の標的因子（II）、すなわちラクトースイソチオシアネートおよびホレート（folate）−ＮＨＳ（「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」，２６９（１９９４年），３１９８〜３２０４頁の記載に従って製造）とに対し同様な反応を行って、それぞれＳＢＰＡ−ＮＨ−ＬacおよびＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｆolを得る。下記の反応式に従って“ＲＧＤ”ペプチド（Ｈ−Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsｐ−Ｓer−Ｃys−ＯＨ）と連結してＳＢＰＡ−ＮＨ−ＲＧＤを得るため、該連結を別途sＳＭＢＰ［Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−（４−マレインイミドフェニル）−ブチレート］の助けをかりて行なう。
0004018141.tif 000017
反応操作は以下の通りである。すなわち、ＳＢＰＡ−ＮＨ2サンプル［ビオチンとの連結に関して、上記（b）と同様にして得る］を、１００mＭヘペス（Hepes）緩衝剤（pＨ７）に懸濁して、２mgＦe／ml濃度とする。１mlの鉄懸濁液に、５μモルのsＳＭＢＰを加え、混合物を室温で２時間培養する。生成物懸濁液を過剰の試薬から、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ２５カラム）で精製する。精製したＳＢＰＡ−マレインイミドのＨepes懸濁液をＥＤＴＡ（１０mＭ）の存在下、１mgＦe当り２．５μモル量のチオール−変性ペプチドと一夜反応させ、次いで過剰の試薬を、Ｈepesに対する広範透析で除去する。
また、未変性Ｆ１０８を有するマグネタイト粒子を上記ホーミング因子と“偽連結”（上記の条件下で）を行って、対照も作成する。
上述の標的（および対照）試料（preparation）を０．２μm膜で濾過し、インビトロ（アビジンおよびＴＨＰＩレセプタ）および実験室ラットのインビボの両方で試験する。
インビトロ試験の場合、先ず、対照サンプルＳＢＰＡ−ctrl（上記参照）を、試料ＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｂioの作成に用いたのと同じ条件下、ビオチンで活性化することにより、対照試料を調製する。次いで、両試料をそれぞれ、６０，３０，１５，７．５および３．７５mg／鉄１mlに相当する一連の濃度に希釈する。次に各種の希釈液を、予めアビジンと共に培養したミクロ滴定プレートに接種することにより試験する。４時間後、プレートの非吸着物質を洗い流し、通常の分析（チオグリコール酸塩）で鉄の結合を確認する。結果を図３のグラフで示し、ここで、吸着鉄（“Ｙ”軸）を上記希釈液中の鉄（“Ｘ”軸）に対してプロットする。ＳＢＰＡ−ＮＨ−Ｂioの挙動を示すカーブに◆の印を付し、対照カーブに□の印を付した。このグラフから明らかに、標的磁性粒子はアビジンに対する親和性が非標的磁性粒子と比べてはるかに大きいことが証明される。
さらに、ＳＢＰＡ−ＲＧＤ（対照：ＳＢＰＡ−cys）の59Ｆe−標識試料の結合に関するインビトロ試験を、対応するレセプタを表わす細胞株を用いて行なう。この場合、試験すべき各種濃度の試料を含有するＵ９３７菌株サンプルを、５０nＭ−ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）で活性化した標準培地中で４８時間培養し、次いで３７℃で１時間培養する。細胞を冷ＰＢＳ中で洗い、分離し、放射線計量する。この測定から、対照に比す鉄−標識細胞の量を確認することができる。
結果を下記表１に示す。表１の結果から、ＳＢＰＡ−標的粒子によって放出される鉄量は対照のそれよりかなり多いことが認められる。
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同様な方法で、55Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレートシステム（上記参照）の結合について、ホレートレセプタを表わすヒトＫＢ細胞株に対する親和性を試験する。ＫＢ細胞をＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ，９２（１９９５年），３３１８〜３３２２頁の記載と同様に培養し、次いで各種濃度の55Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレートと共に３７℃で２時間培養する。対照として、ホレートと“偽連結”する55Ｆe−ＳＢＰＡ、Ｆ１０８（ＯＨ）を含有する試料を用いた。
結果を下記表２に示すが、これには、培地（別途ウシ胎児血清［ＦＣＳ］の存在および非存在）に保持される鉄濃度（平均値およびかっこ内は標準偏差）が記載されている。
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インビボ試験の場合、各試料（２０倍に希釈）を実験ラットの尾の静脈に注射し（開始時間to）、次いで時間の各種経過後（t10分〜t120分）、血液サンプルを採取し、鉄濃度を分析する。結果を下記表３に示す（注射用量の％で表示）。なお、Ａ＝ＳＢＰＡ−Ｃtrl、Ｂ＝ＳＢＰＡ−ＮＨ−、“＋”は“Ａ”と標的化合物に連結のないことを示す。
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表３の結果から、１つのケース（Ｂ−Ｆol）を除き、共役結合体はかなりの長時間にわたり、実際に未連結混合物よりも長く、循環中に残存したことが認められ、またこのことは、共役結合体が肝臓によって急速に除去されず、かつ選定部位へ有効に運ばれうることを示す。なお、Ｂ−Ｆolケースについては説明できないが、その結末はある未確認のアーチファクトによるものと思われる。
実施例１８
式：
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のＤＴＰＡモノ−およびジ−ステアリルエステル並びに対応するガドリニウム・キレート（Ｇd−ＤＴＰＡＳＥ）および（Ｇd−ＤＴＰＡ（ＳＥ）2）を、Ｇ．Ｗ．カバルカ（Ｋabalka）らの「Ｍagnetic Ｒesonance in Ｍedicine」（８（１９８８年）、８９〜９５頁）の記載に準じて製造する。合成に必要なＤＴＰＡ無水物は、エッケルマン（Ｅckelman）らの「Ｊ．Ｐharm．Ｓci．」（６４（１９７５年）、７０４〜７０６頁）に従って作る。通常の手段［２Ｎ塩酸中で分解（decomplexing）し、ＥＤＴＡ溶液で滴定；指示薬キシレノール−オレンジ］でガドリニウム分を測定して、画像化剤の純度をチェックする。この分析により、実質的に理論値に近い結果が得られる。
１００mgのＧd−ＤＴＰＡ−ＳＥ（０．１２７ミリモル）および２００mgのジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ−Ｎa）を、ＭeＯＨ／ＣＨＣl3（１／１）混合物２５mlに溶解する。溶液を減圧下で蒸発乾固した後（回転エバポレータ、７２℃／１５トル、１．５時間）、撹拌下で２０mlの蒸留水を加える。さらに混合物を、７０℃、約３０分間の音波破砕（ブランソン・ソニファイア（Ｂranso Ｓonifier）音波発生器、出力４０）により均質化する。この懸濁液に、実施例１２に開示の２００mgの変性シンペロニックＦ１０８（ＮＨ2）2を加え、音波破砕を数分間再開することにより、微粒子（標識“Ｍ１”）の安定で視覚上透明な懸濁液をミセル形状で得る。かかる調製を繰返すが、この場合、Ｇd−ＤＴＰＡ−ＳＥの代わりにＧd−ＤＴＰＡ−（ＳＥ）2（０．０９５ミリモル）を用いて、“Ｍ２”標識懸濁液を得る。
上記懸濁液のプロトン・スピン緩和度を、ミニスペック（Ｍinispec）ＰＣ−１２０（ブルカー）装置を用い、０．４７テスラ（２０ＭＨz）で運転して測定する。ＥＤＭ５１０Ａ（ＥＤＭ＝エクスペリメント・デフィニション・モジュール（Ｅxperiment Ｄefinition Ｍodule））を用いて、“反転回収（inversion recovery）”法でスピン−格子緩和時間Ｔ1を測定する。ＥＤＭ６１０Ａを用い、カール（Ｃarr）−パーセル（Ｐurcell）−メイブーム（Ｍeiboom）−ジル（Ｇill）（ＧＰＭＧ）技法で、スピン−スピン緩和時間Ｔ2を測定する。１mＭ濃度の場合のγ，単位［mＭs］-1＝１／Ｔで表わされる緩和度（γ１およびγ２）を下記表４に示す。
上記試料を、実施例１７に記載の選定ホーミング因子（II）と連結させると、対応する投与しうる共役結合体Ｇd−ＤＴＰＡ−ＳＥfＦ１０８−ＮＨ−（II）、およびＧd−ＤＴＰＡ−（ＳＥ）2fＦ１０８ＮＨ−（II）が得られる。実施例１７と同様に、ラットを用いてインビボ試験を行ったところ、血液循環に関してほぼ同等な結果が得られた。
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実施例１９
末端ＮＨ2基変性のシンペロニックＦ１０８で被覆したマグネタイト微粒子を、実施例１７（b）に記載の“ＲＧＤ”ペプチドと連結させて、試験サンプル標識ＳＢＰＡ−ＲＧＤを得る。末端連結反応において、ペプチドの代わりにメルカプトエタノールを用いる以外は、同様にして対照（ＳＢＰＡ−ＭＥ）を作成する、６６および３３μgの鉄／mlを含有する、それぞれ試験および対照の希釈液を調製する。これらは標識ＳＢＰＡ−ＲＧＤ（６６μgＦe／ml）およびＳＢＰＡ−ＲＧＤ（３３μgＦe／ml），それぞれＳＢＰＡ−ＭＥ（６６μgＦe／ml）およびＳＢＰＡ−ＭＥ（３３μgＦe／ml）である。
ＲＧＰ標的系の添加でひき起る好中球レスピラトリーバースト活性を、以下の手順で試験する。
すなわち、十分生育可能な顆粒球培養物を、カスヤらの「Ｊ．Ｂiomedical Ｍaterials Ｒesearch」（２８（１９９４年）、３９７〜４０４頁）の開示に準じて調製する。
次いで、以下に示す試薬を、適当なミクロプレート（microplate）溜めに投入する：（a）ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）の１５０μl溶液（ハンクスＢＳＳ中、２mg／ml）、（b）上記の値まで希釈した１００μlの試験または対照サンプル、（c）ＨＢＳＳ中、５×１０6細胞／mlを含有する５０μlの精製顆粒球試料。次いで、各種の時間長さで、３７℃の培養を行なう。
培養中に発生するＯ2による染料（黄色〜青色）の還元に基づく５４０nmでの吸収度の漸進的増加によって、生きている細胞の応答をチェックする。色対照として、１０μＭヨードアセトアミド中に同じ混合物を含有する別のプレートを用いる。その吸収度を、試験または対照の各時間測定から減算する。
上記実験の結果を図４のグラフに示すが、ここで、本発明に係る共役結合体化合物のかなりの活性が認められる。
実施例２０
ＳＢＰＡ−マレインイミドフェニル−ブチラミドの製造
１０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2（実施例１７参照）を、２７０００g下で１時間遠心分離する。下層残渣を１００mＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝剤（pＨ７．０）で採取し、２mgＦe／mlに希釈する。これに２．５μモルのスルホスクシンイミジル−４（p−マレインイミドフェニル］−ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）を加え、混合物を室温で２時間培養する。ＥＤＴＡ（１０mＭ）を加え、遠心分離して（２分、１００g）、過剰試薬を除去する。残渣をＨＥＰＥＳ（２．５mgＦe／ml）に再懸濁する。
実施例２１
ヘキサペプチドf−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−ＬysのＳ−アセチルチオアセテートの製造
６μモルのヘキサペプチド（ＥＰ−Ａ−０３９８１４３の記載に準じ製造）のＤＭＳＯに溶解して、濃度１０mg／mlとし、１当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−Ｓ−チオアセテート（ＳＡＴＡ）を１４mg／mlＤＭＳＯ溶液の形状で添加した後、Ｎ−メチルモルホリンを加えて、見掛pＨを８にする（湿ったpＨ試験片）。１時間後、混合物をＨ2Ｏで２０倍に希釈し、水中で平衡なＨＰＬＣクロマトグラフィー・カートリッジに装填する（Ｃ１８ボンド・エルト（Ｂond Ｅlut）カートリッジ、溶離剤８０％水性アセトニトリル）。チオアセチル化ペプチドが１８．７７分画分に生成し、これを乾燥して固体とし、該固体を少量ＤＭＳＯに再溶解する。
実施例２２
ＳＢＰＡマグネタイト粒子に連結したヘキサペプチドの製造
実施例２１の記載に従って製造したＳＢＰＡ−マレインイミド変性酸化鉄粒子のＨＥＰＥＳ溶液（２．５mgＦe）に、ヘキサペプチドＳ−アセチルチオアセテート（２mg）のＤＭＳＯ溶液を加える。使用するＨＥＰＥＳ緩衝剤もＥＤＴＡ（２．５mＭ）およびヒドロキシルアミン（５０mＭ）を含有し、ヒドロキシルアミンは脱アセチル化剤として作用する。混合物を室温で２時間保持し、次いで遠心分離で酸化鉄粒子を単離し、緩衝剤に再懸濁し、精製のため広範に透析する。
実施例２３
マグネタイト−化学誘引物質（Ｃhemoattractant）ペプチド共役結合体の顆粒球との親和性試験
細菌感染による組織損傷および炎症は、感染部位に生じる化学走性ペプチドに応答する顆粒球（ＰＭＮ）および単核食細胞形成を誘発する。実施例１９で認められるように、顆粒球はＯ2基を生成し、該Ｏ2基は、５４０nmで吸収する染料ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元によって分析することができる。
新しいバフィコートから好中球を単離し、「Ｍagn．Ｒes．Ｉmaging」（１３（１９９５年）、３９３〜４００頁）の記載に従って培養する。ＮＢＴ還元の速度を、ミクロプレートで培養した細胞において直接測定する。分析培地は、１５０μlのＮＢＴ溶液（２mg／ml）、１００μlの共役結合体溶液（これは各種濃度のサンプルを含む）からなり、これに５０μlのＰＭＮ（２．５×１０5細胞）を加える。光度計参照溜めの培地へ、ヨードアセトアミド（酸化バーストの抑制剤）を加える（最終濃度１０mＭに）。細胞は予め、１０mＭヨードアセトアミド中３７℃にて１０分間培養しておく。分析の完全詳細は、「Ｍethods in Ｅnzymology」（１３２、１４７頁、アカデミック・プレス、１９８７年）に開示されている。
図５のグラフ（a）において、ＳＢＰＡ−化学誘引物質合成ペプチドの各種希釈度（鉄濃度で同定）のそれぞれに応答する顆粒球によるＯ2生成の速度が示されている。ＳＢＰＡ−ヘキサペプチドによる用量依存法で刺激されるＰＭＮの容量について、化学誘引物質に連結するマグネタイト粒子の存在で示す。対照（b）において、ペプチドに連結しない、マグネタイト粒子単独の効果は、実質的に役に立たない。
さらに上述の結果を、放射能測定値（59Ｆe−標識共役結合体）およびＴ2プロトン緩和パラメータ（ＮＭＲ）で確認した。これらの実験の場合、新たに精製したヒトＰＭＮを、各種のＳＢＰＡ−ペプチド共役結合体と共に３７℃で１時間培養し、次いで冷ＰＢＳ中で洗う。Ｔ2測定値により、共役結合体からの鉄の取込み／会合は、未連結マグネタイト粒子の場合より６〜４３倍大きい効果を付与することが認められる。
実験室ラットにおいて、59Ｆe−ＳＢＰＡ−ヘキサペプチドサンプルの静脈注射後のトレーサ測定により、循環を経て損傷部位への鉄の優先的な輸送が認められる。
実施例２４
マグネタイト粒子と非特異的Ｆ（ab）2フラグメントの共役結合
１０mlのサンプルＳＢＰＡ−ＮＨ2（実施例１７参照）を、２７０００g下で１時間遠心分離する。下層残渣を１００mＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝剤（pＨ７．０）に採取し、２mgＦe／mlに希釈する。これに、２．５μモルのスルホスクシンイミジル−４［p−マレインイミドフェニル］−ブチレート（スルホーＳＭＰＢ）を加え、混合物を室温で２時間培養する。ＥＤＴＡ（１０mＭ）を加え、遠心分離して（２分、１００g）、過剰試薬を除去する。残渣をＨＥＰＥＳ（２．５mgＦe／ml）に再懸濁する。
抗体（Ａb＝非特異的ＩgＧ）のサンプルを、ペプシン（０．２Ｍ−ＮaＯＡc中、pＨ４．２）と共に３７℃で２０時間消化し、フラグメントを親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過で精製する。
遊離−ＳＨ基を暴露するため、Ｆ（ab）2フラグメントを、０．２Ｍ−ＮaＯＡc中１．５mg／mlの２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）溶液（pＨ５）と共に、３７℃で１時間培養して、約１０mＭ最終ペプチド濃度の溶液を得る。次いで、変性したＦabフラグメントを単離し、０．１５Ｍ−ＮＨ4ＯＡc（pＨ６．８）中ゲル濾過で精製する。
２mlの上記ＳＢＰＡ−ＮＨ−sＳＭＰＢ溶液（２mgＦe／mlに希釈）に、ＥＤＴＡ（１０mＭ）の存在下一定量（１mg）の還元したＡbフラグメントを加える。溶液を窒素下室温で一夜放置し、次いでＰＢＳ中平衡のセファロース（sepharose）４Ｂにてクロマトグラフィーに付することにより、未共役結合のＦabを除去する。残った所望化合物の同定は、通常の手段を用いる分析法（鉄およびペプチド測定）で行なった。
実施例２５
選定抗体（Ａb）の溶液（ＰＢＳ中２．５mg／ml、pＨ６）に、２２mＭ−ＮaＩＯ4溶液を得るため、０℃にて一定量の０．５Ｍ過ヨウ素酸塩溶液を加える。混合物を暗所で氷上にて７５分間放置、培養し、次いで１，３−ジアミノ−２−プロパノールを加え（３０mＭ調整）、反応を止める。ＡcＯＨでpＨを４まで下げ、酸化したグリコプロテイン（反応性−ＣＯ基の発生）を、パーマシア・スパロース（Ｐamacia Ｓuperose）１２カラムにてゲル濾過で脱塩する。
上記酸化したＡbの溶液（０．１Ｍ−ＮaＯＡc中、１．５g／ml、pＨ４．６〜５．３）２０mlを、４mgＦe／ml（コードＳＢＰＡ−ＣＯＨz、実施例１４および１７参照）を含有する１mlのＳＢＰＡ−ＯＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2溶液に加え、混合物を室温で２０時間培養することにより、ヒドラゾン結合を形成する。
標識磁気粒子の単離前に、pＨ４．６にて０．２Ｍシアノホウ水素化ナトリウムを用いてヒドラゾン基の還元を行なう。その後、Ａb−ＳＢＰＡ共役結合体を、セファロース４Ｂカラムにて、ゲル濾過で分離する。
実施例２６
実施例１７の操作の変形として、先ず変性両親媒性リンカー（シンペロニックＦ１０８−ＮＨ2）および標的ペプチド（ホレート−ＮＨＳ）を含むアダクト（Ｌ−II）を製造した後、信号発生磁気鉄粒子を共役させて、実例共役結合体化合物（ＩfＬ−II）を得る。出発成分として、変性シンペロニックＦ１０８−ＮＨ2（実施例１２参照）のＤＭＳＯ濃溶液（１００〜１８０mg／ml）を用いる。
一定量のこの溶液に、１モル当量の変性したホレート−ＮＨＳペプチド（実施例１７参照）およびpＨを８．２とするのに（湿った試験片）十分なＮ−エチルモルホリンを加える。室温で２４時間の静置後、未反応の配位子をゲル濾過クロマトグラフィーで除去し、さらに純水に対する透析を繰返して、Ｆｌ０８−ペプチド共役結合体を精製する。ホレート−連結Ｆ１０８の収量は、３６５nmの分光光度計で測定すると、０．６３モルのホレート／モル（Ｆ１０８）であった。
アダクト試料を用い、ＳＢＰＡ−ＮＨ2アダクト（ＩfＬ）を作成するための、実施例１７／（a）に開示の技法に係る音波破砕によって、対応するＳＢＰＡ−ホレート系を製造する。試料を遠心分離し、ペレットを等張緩衝剤に再懸濁する。対応する59Ｆe−ＳＢＰＡ−ホレート共役アダクトの場合の、実施例１７の記載と同様に、該共役系のＫＢ細胞への結合能力を正確にもたらした。同じ対象と比較した結果を、下記表６に示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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