【手続補正書】
【提出日】平成28年3月8日(2016.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、炭素源の存在下で培養される、組換え微生物。
【請求項２】
前記ポリペプチドがパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記PPSポリペプチドが、
(a)SEQ ID NO: 1を含むアミノ酸配列を有する、または
(b)SEQ ID NO: 2を含む核酸配列によってコードされる、
請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記AhtSポリペプチドが、
(a)SEQ ID NO: 3を含むアミノ酸配列を有する、または
(b)SEQ ID NO: 22を含む核酸配列によってコードされる、
請求項5に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記炭素源が炭水化物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記一級アミンが、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、および1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記アシルチオエステルが脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記脂肪酸アシル-ACPまたは前記脂肪酸アシル-CoAが、前記微生物によって産生される、請求項10に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド（EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5）、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチド (EC 2.3.1.86) のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
チオエステラーゼポリペプチドおよびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項12に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列が、‘tesAの核酸配列を含む、請求項12または13に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記アシルCoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列がfadDである、請求項12〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記脂肪酸生合成ポリペプチドが、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、またはFadRをコードする核酸配列より選択される、請求項12〜15のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
細菌、ラン藻、藻類、または真菌である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記真菌が酵母または糸状菌である、請求項17に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌 (Escherichia coli)、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である、請求項19に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、
(a)前記微生物にとって内因性である、または
(b)前記微生物にとって外因性である、
請求項1〜20のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記脂肪酸アミドが脂肪酸アルカノールアミドまたは脂肪酸アミドアミンである、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
セリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
以下の段階を含む、脂肪酸アミドを生産する方法：
(a) 請求項1〜23のいずれか一項に記載の組換え微生物を提供する段階；および
(b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの該脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養する段階。
【請求項２５】
前記培地から前記脂肪酸アミドを単離する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂肪酸アミドが、
(a)C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アルカノールアミドである、または
(b)C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アミドアミンである、
請求項24または25に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本開示は、以下を含む、脂肪酸アミドを生産する方法をさらに包含する：(a) 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供すること；および (b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養すること。本方法は、培地から脂肪酸アミドを単離することをさらに含み得る。本方法を用いて脂肪酸アミドを生産することができる。1つの態様において、脂肪酸アミドは、脂肪酸アルカノールアミドおよび／または脂肪酸アミドアミンである。別の態様において、脂肪酸アミドはC8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アルカノールアミド、および／またはC8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アミドアミンである。
[本発明1001]
一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、炭素源の存在下で培養される、組換え微生物。
[本発明1002]
前記ポリペプチドがパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1004]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1を含むアミノ酸配列を有する、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1005]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 2を含む核酸配列によってコードされる、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1006]
前記ポリペプチドが、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1007]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1008]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3を含むアミノ酸配列を有する、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1009]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 22を含む核酸配列によってコードされる、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1010]
前記炭素源が炭水化物である、本発明1001〜1009のいずれかの組換え微生物。
[本発明1011]
前記一級アミンが、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、および1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの組換え微生物。
[本発明1012]
前記アシルチオエステルが脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAである、本発明1001〜1011のいずれかの組換え微生物。
[本発明1013]
前記脂肪酸アシル-ACPまたは前記脂肪酸アシル-CoAが、前記微生物によって産生される、本発明1012の組換え微生物。
[本発明1014]
脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド（EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5）、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチド (EC 2.3.1.86) のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、本発明1001〜1013のいずれかの組換え微生物。
[本発明1015]
チオエステラーゼポリペプチドおよびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、本発明1014の組換え微生物。
[本発明1016]
前記チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列が、‘tesAの核酸配列を含む、本発明1014または1015の組換え微生物。
[本発明1017]
前記アシルCoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列がfadDである、本発明1014〜1016のいずれかの組換え微生物。
[本発明1018]
前記脂肪酸生合成ポリペプチドが、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、またはFadRをコードする核酸配列より選択される、本発明1014〜1017のいずれかの組換え微生物。
[本発明1019]
細菌、ラン藻、藻類、または真菌である、本発明1001〜1018のいずれかの組換え微生物。
[本発明1020]
真菌である、本発明1019の組換え微生物。
[本発明1021]
前記真菌が酵母または糸状菌である、本発明1020の組換え微生物。
[本発明1022]
サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌 (Escherichia coli)、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞である、本発明1001〜1019のいずれかの組換え微生物。
[本発明1023]
アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である、本発明1022の組換え微生物。
[本発明1024]
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって内因性である、本発明1001〜1023のいずれかの組換え微生物。
[本発明1025]
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって外因性である、本発明1001〜1023のいずれかの組換え微生物。
[本発明1026]
前記脂肪酸アミドが脂肪酸アルカノールアミドまたは脂肪酸アミドアミンである、本発明1001〜1025のいずれかの組換え微生物。
[本発明1027]
セリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する、本発明1001〜1026のいずれかの組換え微生物。
[本発明1028]
以下の段階を含む、脂肪酸アミドを生産する方法：
(a) 本発明1001〜1027のいずれかの組換え微生物を提供する段階；および
(b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの該脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養する段階。
[本発明1029]
前記培地から前記脂肪酸アミドを単離する段階をさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アルカノールアミドである、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アミドアミンである、本発明1028または1029の方法。