【手続補正書】
【提出日】平成28年10月3日(2016.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む改変機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含む、改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項２】
前記２つの隣接する塩基性アミノ酸が、アルギニンおよびリジンを含む群から独立して選択される、請求項１に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項３】
前記スイッチループ領域が、３つの隣接する塩基性アミノ酸を含む、請求項１に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項４】
前記スイッチループ領域が、少なくとも２つのさらなる隣接する塩基性アミノ酸を含む、請求項１に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項５】
位置２９６のネイティブアスパラギンが、前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる、請求項３に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項６】
前記改変タンパク質および野生型タンパク質がＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による切断活性が、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい、請求項１に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項７】
前記スイッチループ領域が、
【化９】
2015531407.tif 000001
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項８】
改変機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域が、
【化１０】
2015531407.tif 000002
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項９】
前記スイッチループ領域が、
【化１１】
2015531407.tif 000003
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項１０】
前記スイッチループ領域が、
【化１２】
2015531407.tif 000004
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質。
【請求項１１】
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細
菌細胞。
【請求項１２】
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
【請求項１３】
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
【請求項１４】
前記必須標的タンパク質が、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＮＡｓｅ、プロテアーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、グルタレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、アミノ酸分解酵素、ポリリン酸キナーゼ、および低温ショックタンパク質から成る群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１６】
無細胞合成抽出物の調製方法であって、
ｉ）切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むステップ；および
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ
を含む方法。
【請求項１７】
前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、約２５Å２と約２２５Å２との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中
に活性のままである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質をコードする核酸。
【請求項２４】
無細胞合成抽出物を調製する方法であって、
ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ
を含む、方法。
【請求項２５】
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
無細胞合成システムであって、単一反応混合物中に、
ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
ｉｖ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質と
を含む、無細胞合成システム。
【請求項２９】
前記反応混合物が、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチ
ャージすることができる、請求項２８に記載の無細胞合成システム。
【請求項３０】
前記システムが活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する、請求項２８に記載の無細胞合成システム。
【請求項３１】
無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法であって、
ｉ．核酸テンプレートと細菌抽出物を、タンパク質合成を可能にする条件下であわせるステップであって、前記細菌抽出物が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０３に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む改変ＲＦ１タンパク質を含み、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むステップ；および
ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
を含む方法。
【請求項３２】
細菌細胞であって、前記細菌細胞のゲノムに組み込まれた請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質を含む細菌細胞。
【請求項３３】
改変必須標的タンパク質を含む細菌抽出物であって、前記タンパク質が、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含み、前記タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含む、細菌抽出物。
【請求項３４】
前記改変必須標的タンパク質が、ＯｍｐＴ１によって切断可能である機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質である、請求項３３に記載の細菌抽出物。
【請求項３５】
被定義アミノ酸残基において組み込まれた非ネイティブアミノ酸を有するポリペプチドの無細胞合成システムにおける収率を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質の使用。
【請求項３６】
被定義アミノ酸残基において組み込まれた非ネイティブアミノ酸を有するポリペプチドの無細胞合成システムにおける収率を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変機能性ＲＦ１タンパク質を含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
別の態様において、本発明は、細菌細胞であって、ＯｍｐＴ１によって切断され得る機能性ＲＦ１をコードするゲノムに組み込まれた配列を含む細菌細胞を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質。
（項目２）
前記３つの隣接する塩基性アミノ酸が、アルギニンおよびリジンを含む群から独立して選択される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目３）
前記スイッチループ領域が、少なくとも２つのさらなる隣接する塩基性アミノ酸を有するように改変される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目４）
位置２９６のネイティブアスパラギンが、前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目５）
前記改変タンパク質および野生型タンパク質がＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による切断活性が、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目６）
前記スイッチループ領域が、
【化９】
2015531407.tif 000005
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目７）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域が、
【化１０】
2015531407.tif 000006
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＲＦ１タンパク質。
（項目８）
前記スイッチループ領域が、
【化１１】
2015531407.tif 000007
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目７に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目９）
前記スイッチループ領域が、
【化１２】
2015531407.tif 000008
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目７に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目１０）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細
菌細胞。
（項目１１）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１２）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１３）
前記必須標的タンパク質が、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＮＡｓｅ、プロテアーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、グルタレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、アミノ酸分解酵素、ポリリン酸キナーゼ、および低温ショックタンパク質から成る群より選択される、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１４）
前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１５）
インビトロ無細胞合成システムにおける改変必須標的タンパク質の有害な活性を低減させるための方法であって、
ｉ）前記改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記タンパク質が、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合を含むように改変され、該タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されるものであるステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記必須標的タンパク質を、インタクトタンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートを前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含む方法。
（項目１６）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、約２５Å２と約２２５Å２との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌である、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中
に活性のままである、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）をコードする核酸であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、核酸。
（項目２３）
インビトロ無細胞合成システムにおいてアンバーコドンでのＲＦ１競合を低減させるための方法であって、
ｉ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記抽出物中の前記ＲＦ１タンパク質を、インタクトＲＦ１タンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードし、かつアンバーコドンを含む核酸テンプレートを、前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含み、
前記ＲＦ１タンパク質が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を有し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、方法。
（項目２４）
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
無細胞合成システムであって、単一反応混合物中に、
ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
ｉｖ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能な機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質と
を含む、無細胞合成システム。
（項目２８）
前記反応混合物が、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチ
ャージすることができる、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目２９）
前記システムが活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目３０）
無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法であって、
ｉ．核酸テンプレートと細菌抽出物を、タンパク質合成を可能にする条件下であわせるステップであって、前記細菌抽出物が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０３に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合においてＯｍｐＴ１によって切断されたＲＦ１タンパク質を含み、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されたものであるステップ；および
ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
を含む方法。
（項目３１）
細菌細胞であって、前記細菌細胞のゲノムに組み込まれた項目１または項目７に記載の機能性ＲＦ１を含む細菌細胞。