【手続補正書】
【提出日】平成28年2月23日(2016.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、化合物の催奇形リスクを評価する方法：
（1）中内胚葉へ分化中の多能性幹細胞と化合物を接触させる工程；
（2）Sox17、EOMES、およびT-ブラキュリからなる群より選択される1種以上の中内胚葉マーカーのタンパク質発現を測定する工程；
（3）該1種以上のマーカーのタンパク質発現の50％の阻害をもたらす該化合物のIC50濃度を決定する工程；ならびに
（4）評価している該化合物の催奇形リスクを確立するため、工程（3）において決定されたIC50濃度を、（a）公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度および（b）公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度と比較する工程。
【請求項２】
多能性幹細胞が霊長類起源のものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞がH9ヒト胚性幹細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がSOX17である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がEOMESである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がT-ブラキュリである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17のタンパク質発現のみである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17およびEOMESのタンパク質発現のみである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17およびT-ブラキュリのタンパク質発現のみである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質発現が免疫組織化学によって測定される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質発現がフローサイトメトリーによって測定される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質発現が蛍光顕微鏡検査によって測定される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞の40〜60％が中内胚葉へ分化した後、工程（1）が実施される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、アクチノマイシンD、トレチノイン、シタラビン、ノコダゾール、ロテノン、トレチノイン、イソトレチノイン、ブロモデオキシウリジン、ドキソルビシン、ドルソモルフィン、サリドマイド、5-フルオロウラシル、ダサチニブ、ソラフェニブ、バルプロ酸、スニチニブ、ジプラシドン、ミアンセリン、バンデタニブ、ジエチルスチルベストロール、6-アミノニコチンアミド、リタンセリン、およびゲフィチニブからなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、サリドマイド、ミアンセリン、およびリタンセリンからなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（4）における公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、エソメプラゾール、葉酸塩、カテキン、リスリド、ナイアシン、アスピリン、イブプロフェン、アシクロビル、ケタンセリン、ストレプトマイシン、メチルドパ、サッカリン、カフェイン、ペニシリン、およびテガセロッドからなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（4）における公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、葉酸塩およびメチルドパからなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、サリドマイド、ミアンセリン、およびリタンセリンからなる群より選択され、かつ公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、葉酸塩およびメチルドパからなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、化合物の催奇形リスクを評価する方法を提供する：
（1）中内胚葉へ分化中の多能性幹細胞と化合物を接触させる工程；
（2）Sox17、EOMES、およびT-ブラキュリなどの1種以上の発生的に制御されるマーカーのタンパク質発現を測定することによって、胚発生の進行を検出する工程；
（3）該1種以上のマーカーのタンパク質発現の50％の阻害をもたらす該化合物のIC50濃度を決定する工程；ならびに
（4）評価している該化合物の催奇形リスクを確立するため、工程（3）において決定されたIC50濃度を、（a）公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度および（b）公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度と比較する工程。
[本発明1001]
以下の工程を含む、化合物の催奇形リスクを評価する方法：
（1）中内胚葉へ分化中の多能性幹細胞と化合物を接触させる工程；
（2）Sox17、EOMES、およびT-ブラキュリからなる群より選択される1種以上の中内胚葉マーカーのタンパク質発現を測定する工程；
（3）該1種以上のマーカーのタンパク質発現の50％の阻害をもたらす該化合物のIC50濃度を決定する工程；ならびに
（4）評価している該化合物の催奇形リスクを確立するため、工程（3）において決定されたIC50濃度を、（a）公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度および（b）公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物のIC50濃度と比較する工程。
[本発明1002]
多能性幹細胞が霊長類起源のものである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
多能性幹細胞がH9ヒト胚性幹細胞である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がSOX17である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がEOMESである、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記中内胚葉マーカーの少なくとも1種がT-ブラキュリである、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17のタンパク質発現のみである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1010]
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17およびEOMESのタンパク質発現のみである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1011]
測定される中内胚葉マーカーが、SOX17およびT-ブラキュリのタンパク質発現のみである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1012]
タンパク質発現が免疫組織化学によって測定される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
タンパク質発現がフローサイトメトリーによって測定される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
タンパク質発現が蛍光顕微鏡検査によって測定される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1015]
多能性幹細胞の40〜60％が中内胚葉へ分化した後、工程（1）が実施される、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、アクチノマイシンD、トレチノイン、シタラビン、ノコダゾール、ロテノン、トレチノイン、イソトレチノイン、ブロモデオキシウリジン、ドキソルビシン、ドルソモルフィン、サリドマイド、5-フルオロウラシル、ダサチニブ、ソラフェニブ、バルプロ酸、スニチニブ、ジプラシドン、ミアンセリン、バンデタニブ、ジエチルスチルベストロール、6-アミノニコチンアミド、リタンセリン、およびゲフィチニブからなる群より選択される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、サリドマイド、ミアンセリン、およびリタンセリンからなる群より選択される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
工程（4）における公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、エソメプラゾール、葉酸塩、カテキン、リスリド、ナイアシン、アスピリン、イブプロフェン、アシクロビル、ケタンセリン、ストレプトマイシン、メチルドパ、サッカリン、カフェイン、ペニシリン、およびテガセロッドからなる群より選択される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
工程（4）における公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、葉酸塩およびメチルドパからなる群より選択される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1020]
工程（4）における公知の催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、サリドマイド、ミアンセリン、およびリタンセリンからなる群より選択され、かつ公知の非催奇形リスクを有する1種以上の化合物が、葉酸塩およびメチルドパからなる群より選択される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1021]
上記の発明。