【手続補正書】
【提出日】平成28年5月30日(2016.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞を構築する方法であって、
ａ）組込みポリヌクレオチドコンストラクトにより形質転換された真菌宿主細胞を供給し、ここで該コンストラクトは、選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで該第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；
ｂ）前記形質転換された真菌宿主細胞を、前記選択マーカーの発現を促進する条件下で培養し；そして
ｃ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピー；好ましくは２以上のコピー；さらにより好ましくは３以上のコピー、最も好ましくは４以上のコピーを、ゲノム内に組み込まれた状態で含む、組換え真菌宿主細胞を単離すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞；好ましくはアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）における真菌宿主細胞が成長不全を有し、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが前記宿主細胞のゲノム中に組込まれると、前記成長不全を補完し、好ましくは、前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的硝酸レダクターゼ又は亜硝酸レダクターゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが、それぞれ機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、又は機能的亜硝酸レダクターゼ、例えばｎｉｉＺをコードする遺伝子を含み；又は前記段階（ａ）における真菌宿主細胞が、機能的エノラーゼを欠き、前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトが機能的エノラーゼ、例えばacuNをコードする遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、 配列番号２５、 配列番号２６、 配列番号２７、 配列番号２８、 配列番号２９、 配列番号３０、 配列番号３１、 配列番号３２、 配列番号３３、 配列番号３４、 配列番号３５、 配列番号３６、 配列番号３７、 配列番号３８、 配列番号３９ 及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する、請求項１〜５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項１〜６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
真菌宿主細胞の形質転換及び前記細胞のゲノム中への組込みに適したポリヌクレオチドコンストラクトであって、
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチは、その分枝部位とそのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロン；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項９】
機能的硝酸レダクターゼ、例えばｎｉａＤをコードする遺伝子、機能的亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は機能的エノラーゼ、例えばａｃｕＮをコードする遺伝子を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１０】
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１１】
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、 配列番号２５、 配列番号２６、 配列番号２７、 配列番号２８、 配列番号２９、 配列番号３０、 配列番号３１、 配列番号３２、 配列番号３３、 配列番号３４、 配列番号３５、 配列番号３６、 配列番号３７、 配列番号３８、 配列番号３９ 及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１２】
前記第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来する、請求項８〜１１の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１３】
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項８〜１２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドコンストラクトの１又は２以上のコピーをゲノム内に組込まれた状態で含む組換え真菌宿主細胞であって、該コンストラクトが、
ａ）選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ここで前記第１ポリヌクレオチド、その５′未翻訳領域及び／又はそれらと作動式に連結されるリボスイッチが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に５個又はそれ以下のヌクレオチドを有するスプライセオソームイントロンを含み；及び
ｂ）目的のポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド、
を含む、組換え真菌宿主細胞。
【請求項１５】
糸状菌宿主細胞；好ましくはアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である、請求項１４に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１６】
前記スピライセオソームイントロンが、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に４個又はそれ以下のヌクレオチド；好ましくは３個又はそれ以下のヌクレオチド；より好ましくは２個又はそれ以下のヌクレオチド；さらにより好ましくは、１個のヌクレオチドを有し；さらにより好ましくは、スピライセオソームイントロンは、その分枝部位と、そのアクセプター部位との間に、及び最も好ましくは、分枝部位と、少なくとも１つのヌクレオチドによるスピライセオソームイントロンオーバーラップのアクセプター部位との間に、０個のヌクレオチドを有する、請求項１４又は１５に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１７】
前記スピライセオソームイントロンが、配列番号２４、 配列番号２５、 配列番号２６、 配列番号２７、 配列番号２８、 配列番号２９、 配列番号３０、 配列番号３１、 配列番号３２、 配列番号３３、 配列番号３４、 配列番号３５、 配列番号３６、 配列番号３７、 配列番号３８、 配列番号３９ 及び配列番号４０から成るイントロンヌクレオチド配列群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４又は１５に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１８】
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第１ポリヌクレオチドが、それと作動式に連結されるリボスイッチを有し；好ましくは前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）におけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子に由来し；さらにより好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチを含み；最も好ましくは、前記リボスイッチは、アスペルギルス・オリザエにおけるｔｈｉＡ又はｎｍｔＡ遺伝子のリボスイッチから成る、請求項１４〜１７の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項１９】
前記組込みポリヌクレオチドコンストラクトの第２ポリヌクレオチドによりコードされる目的のポリペプチドが、酵素；好ましくはヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ - キシロシダーゼを含む、請求項１４〜１８の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞。
【請求項２０】
目的のポリペプチドの生成方法であって、
ａ）請求項１４〜１９の何れか１項に記載の組換え真菌宿主細胞を培養し；そして
ｂ）ポリペプチドを回収する、方法。