【手続補正書】
【提出日】平成28年3月9日(2016.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．病原体に対する抗原をコードする少なくとも１つの核酸の制御された発現、および
ｂ．前記抗原がサイトゾルに運搬され、かつ前記病原体に対する宿主細胞性免疫を誘導するように、エンドソーム脱出を可能にする、少なくとも１つの変異
が可能である、組換え細菌。
【請求項２】
病原体がインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項３】
抗原がインフルエンザウイルスのＮＰである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項４】
抗原がインフルエンザウイルスの１以上の保存されたＴ細胞エピトープに融合したＮＰである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項５】
抗原がインフルエンザウイルスのＮＰ１４７−１５５エピトープである、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項６】
病原体が結核菌である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項７】
抗原が、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、Ｍｔｂ３９Ａ、ＦＡＰ、Ｔｂ１５．３、ＲｆｐＡおよびＲｆｐＢからなる群から選択される結核菌の抗原である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項８】
細胞性免疫がエンドソーム脱出により誘導される、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項９】
細胞性免疫がＣＤ８媒介性免疫である、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１０】
細胞性免疫が病原体の保存されたエピトープに対する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１１】
抗原がＴ細胞エピトープを含有すると知られている、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１２】
請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含む、ワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含む、病原体に対する細胞性免疫応答を誘導するための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１、２または５に記載の組換え細菌を含む、細胞性免疫応答を誘発するための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１５】対象のインフルエンザ株の提案されているＨＡ  Ｔ細胞エピトープのアラインメント。上図：ＴＹＶＳＶＧＴＳＴＬ（配列番号：７２）；Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６０；Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６１；Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１６／２００７（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６２；Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／３０４６／２００４（Ｈ５Ｎ１）−配列番号：６３；Ａ／Ｈａｎｏｉ／０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ＰＡＲＴＩＡＬ−配列番号：６４；Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８２／９７（Ｈ５Ｎ１）−配列番号：６５。下図：ＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫ（配列番号：７４）；Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６６；Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６７；Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１６／２００７（Ｈ１Ｎ１）−配列番号：６８；Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／３０４６／２００４（Ｈ５Ｎ１）−配列番号：６９；Ａ／Ｈａｎｏｉ／０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）ＰＡＲＴＩＡＬ−配列番号：７０；Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８２／９７（Ｈ５Ｎ１）−配列番号：７１。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１６】提案されているＨＡ  Ｔ細胞エピトープタグ（Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）のヌクレオチド（ｎｔ）配列および構造。ＴＹＶＳＶＧＴＳＴＬ（配列番号：７２）；ａｃａｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｇｇｔａｃａｔｃｔａｃａｃｔｇ（配列番号：７３）；ＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫ（配列番号：７４）；ｃｇｔａｃａｃｔｇｇａｔｔｔｃｃａｔｇａｔｔｃｔａａｃｇｔｔａａａ（配列番号：７５）；ＡＡＹ（配列番号：７６）；ｇｃｇｇｃｇｔａｔ（配列番号：７７）；ａｃａｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｇｇｔａｃｃｔｃｔａｃａｃｔｇｇｃｇｇｃｇｔａｔｃｇｔａｃａｃｔｇｇａｔｔｔｃｃａｔｇａｔｔｃｔａａｃｇｔｔａａａｔａａ（配列番号：７８）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、ＤＮＡ核標的配列（ＤＴＳ）を含んでもよい。ＤＴＳの非限定的な例には、ＳＶ４０  ＤＮＡ核標的配列が挙げられ得る。他の実施形態では、ベクターはまた、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−２（配列番号１：ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）などの、転写因子のための人工的な結合部位を含んでもよい。転写因子ＮＦ−κＢは、ほとんど全ての動物細胞種において見られる。サルモネラ感染は、ＮＦ−κＢの発現を速やかに刺激し、かつ、ＮＦ−κＢメンバーのそれらのＤＮＡ結合部位（κＢ部位）への結合アフィニティーは高く、かつＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体の核への移行は急速（分）である。κＢ部位を備えるプラスミドＤＮＡは、新たに合成されたＮＦ−κＢが細胞質においてプラスミドＤＮＡに結合し、タンパク質核輸入機構（ｉｍｐｏｒｔ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって核にそれを輸送できるようする。導入遺伝子に対するそれらの位置によって、結合部位はまた、遺伝子発現レベルをさらに増大させる転写エンハンサーとして機能することができた。ＳＶ４０  ＤＴＳ、ＮＦ−κＢ、およびＡＰ−２結合配列は、プラスミドＤＮＡの核輸入を促進し、かつ、これはベクター上の遺伝子配列の転写を促進する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２２】
ＮＰ遺伝子のコドン最適化。
インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３の核タンパク質（ＮＰ）遺伝子の配列（ＮＣＢＩ，登録番号ＥＵ３３０２０３）が、サルモネラにおける最大発現のためにコドン最適化された。遺伝子配列を商業的にコドン最適化し、かつｐＵＣ−５７にクローニングして、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりｐＵＣ−５７−ＮＰ−ＷＳＮを得た。交換されたコドンが表２に表される。平均Ｇ＋Ｃ含量は、コドン最適化後に、非最適化遺伝子に対する４６．６６から５４．５９へ変化した。リボソームの結合およびｍＲＮＡの安定性に影響を与えるステムループ構造は破壊された。大腸菌に関するコドン使用バイアス（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂｉａｓ）は、０．５７のコドン適応指数（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）から０．９８に増加された。
表２．  Ａ／ＷＳＮ／３３  ＮＰ遺伝子に関する、コドン最適化対オリジナルのヌクレオチド配列およびアミノ酸。Ｏｐｔ＝コドン最適化配列（配列番号２）；Ｏｒｉ＝非コドン最適化オリジナル配列（配列番号３）。
【表２−１】
2015513915.tif 000001
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
2015513915.tif 000006
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
ベクター構築。
本研究で用いられたプライマー対が表３に示される。ｄＮＴＰｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＰＣＲ反応のためにＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【表３】
2015513915.tif 000007
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
免疫実験
ワクチン株χ１１２４６（ｐＹＡ５１２１）、χ１１２４６（ｐＹＡ５１２２）、χ１１２４６（ｐＹＡ５１２６）、χ１１２４６（ｐＹＡ３６８１）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２１）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２２）、χ１１５０９（ｐＹＡ５１２６）、χ１１５０９（ｐＹＡ３６８１）、χ１１２４６（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ）、χ１１２４６（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）、χ１１５０９（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ）、およびχ１１５０９（ｐＹＡ  ＳｏｐＥ２１−８０＋ｕＯｐｔ−ＮＰ＋Ｏｐｔ−ＨＡａ−ＡＡＹ−Ｏｐｔ−ＨＡｂ）が、実施例１から５のための材料および方法において記載されたように生育され、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを経口免疫するために用いられ得る。インフルエンザウイルスでの負荷への免疫保護は、エンドソームへ脱出できない組換えワクチン株と比べて、エンドソームへ脱出できる制御された遅延細胞溶解を示す株において、優れているだろう。実施例１から５における教示に基づくと、エンドソームからのワクチン脱出による、続いてサイトゾルにおける溶解による、サイトゾルへの、ＮＰに加えてＨＡエピトープ（ｅｐｔｔｏｐｅ）の運搬は、インフルエンザ負荷に対する防御免疫の誘導をさらに増大し得る。ＳｏｐＥ２断片の融合体が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答および防御免疫のレベルをさらに拡大するため、クラスＩ提示のためのプロテオソームへの輸送（ｔｒａｆｆｉｃｉｎｇ）を促進するために、速やかにユビキネート化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）されるべきであることもまた、予測される。全体として、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体に対する防御Ｔ細胞免疫応答を誘導することへのこれらのアプローチは、宿主細胞サイトゾルへのＴ３ＳＳによるように、分泌を低減あるいは起こらないようにしさえする、抗原構造的拘束（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｔｒａｉｔ）によって多くの場合制限される、抗原運搬の他の方法よりも優れている。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
2015513915.tif 000023
【表７−５】
2015513915.tif 000024
【表７−６】
2015513915.tif 000025
【表７−７】
2015513915.tif 000026
実施例６のための参考文献
【化７】
2015513915.tif 000027
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
ベクター構築
本研究で用いられたプラスミドを構築するために用いられたプライマー対が表９に示される。ｄＮＴＰｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＰＣＲ反応のためにＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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