【手続補正書】
【提出日】平成28年5月12日(2016.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏を診断またはスクリーニングするための組成物であって、
式（Ｉ）：
【化１３】
2015516578.tif 000001
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１４】
2015516578.tif 000002
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
の標識試薬またはその塩もしくは水和物
を含み、
１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を含有する分析物が、前記標識試薬を用いて誘導体化されることにより、標識された分析物を形成することと、
前記標識された分析物がイオン化されることと、
前記標識された分析物のシグネチャーイオンフラグメントが、質量分析によって検出されることと、
前記シグネチャーイオンフラグメントの強度が、標準のシグネチャーイオンフラグメントと比較されることと
を特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、
７α−コレステン−３−オン、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，１２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうちの１種または複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのうち少なくとも２種を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記誘導体化が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む分析物のパネルを誘導体化することを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記分析物のパネルが、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記標識試薬が、構造：
【化１５】
2015516578.tif 000003
またはその塩もしくは水和物を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記分析物が、生体マトリックスから得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体マトリックスが、新鮮血液、乾燥血液、血清、または血漿を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記生体マトリックスの体積が、１０μＬ以下である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記シグネチャーイオンフラグメントが、前記分析物の構造フラグメントおよび前記標識試薬またはその一部を含む中性損失フラグメントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
１種または複数の標準化合物が、式（Ｉ）の標識試薬を用いて誘導体化されることにより、同位体濃縮されている標識された標準を形成すること、ならびに前記標識された分析物および前記標識された標準の両方がイオン化されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記標準化合物が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記検出が、単回の質量分析の試行で実施される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
同位体標識された標準に対する前記標識された分析物の相対濃度が測定されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記標識された分析物のイオン化が、約１０〜約１３０ｅＶの範囲にある衝突エネルギーを使用して実施される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ケトステロール胆汁酸前駆体を分析するためのキットであって、
ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットと、
式（Ｉ）
【化１６】
2015516578.tif 000004
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１７】
2015516578.tif 000005
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
のうちの２種以上の化合物またはその塩もしくは水和物を含む質量標識のセットと、
アッセイを実施するためのバッファー、試薬、分離カラムおよび説明書のうちの１種または複数と
を含む、キット。
【請求項１９】
前記ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットが、
７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうち２種以上を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ケトステロール胆汁酸前駆体のセットが、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項１８に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏を診断またはスクリーニングする方法であって、
１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を含有する分析物を、式（Ｉ）：
【化１３】
2015516578.tif 000006
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１４】
2015516578.tif 000007
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
の標識試薬またはその塩もしくは水和物を用いて誘導体化することにより、標識された分析物を形成するステップと、
前記標識された分析物をイオン化するステップと、
前記標識された分析物のシグネチャーイオンフラグメントを、質量分析によって検出するステップと、
前記シグネチャーイオンフラグメントの強度を、標準のシグネチャーイオンフラグメントと比較するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）に起因する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏に起因する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、
７α−コレステン−３−オン、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，１２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうちの１種または複数を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのうち少なくとも２種を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記誘導体化が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む分析物のパネルを誘導体化することを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記分析物のパネルが、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標識試薬が、構造：
【化１５】
2015516578.tif 000008
またはその塩もしくは水和物を有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記分析物が、生体マトリックスから得られる、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記生体マトリックスが、新鮮血液、乾燥血液、血清、または血漿を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記生体マトリックスの体積が、１０μＬ以下である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記シグネチャーイオンフラグメントが、前記分析物の構造フラグメントおよび前記標識試薬またはその一部を含む中性損失フラグメントである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
１種または複数の標準化合物を、式（Ｉ）の標識試薬を用いて誘導体化することにより、同位体濃縮されている標識された標準を形成し、前記標識された分析物および前記標識された標準の両方をイオン化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記標準化合物が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記検出するステップが、単回の質量分析の試行で実施される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
同位体標識された標準に対する前記標識された分析物の相対濃度を測定することをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記標識された分析物をイオン化する前記ステップが、約１０〜約１３０ｅＶの範囲にある衝突エネルギーを使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ケトステロール胆汁酸前駆体を分析するためのキットであって、
ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットと、
式（Ｉ）
【化１６】
2015516578.tif 000009
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１７】
2015516578.tif 000010
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
のうちの２種以上の化合物またはその塩もしくは水和物を含む質量標識のセットと、
アッセイを実施するためのバッファー、試薬、分離カラムおよび説明書のうちの１種または複数と
を含む、キット。
（項目１９）
前記ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットが、
７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうち２種以上を含む、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
前記ケトステロール胆汁酸前駆体のセットが、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目１８に記載のキット。
本教示の一部の広い態様に従って、罹患したまたは正常なヒト試料などのヒト試料中のＣＴＸおよびＩＢＳ（過敏性腸症候群）バイオマーカーを検出および定量化する方法が開示されている。多数の実施形態では、このような方法は、少体積、例えば、１０μＬ未満、例えば、約３〜約５μＬの範囲にある試料体積などの約５マイクロリットル（μＬ）未満の試料体積を有する試料についてでさえ、必要とされるＬＬＯＱを達成するために、マススペクトロスコピーによるその検出のための、対象の分析物、例えば、ＣＴＸバイオマーカーのイオン化効率を改善するために、本明細書に開示される第四級アミノキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）（ＱＡＯ）試薬を使用する。ケトステロール胆汁酸前駆体は、ＣＴＸおよびＩＢＳバイオマーカーの例である。