【手続補正書】
【提出日】平成28年2月23日(2016.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】血栓溶解、フリーラジカル捕捉および血栓へのターゲティング機能を兼ねる新規化合物およびその製造方法と用途
【技術分野】
【０００１】
本発明は血栓溶解、NOフリーラジカル捕捉および血栓へのターゲティング/抗血栓という三つの機能を兼ねる新規化合物およびその製造方法と用途に関する。さらに、本発明はカルボキシル基およびアミノ基を含むリンカーにより、PAK配列(配列番号1)を含む血栓溶解オリゴペプチド、1−(4−オキソアセチル−フェニル)−3,3,4,4−テトラメチル−イミダゾリン及びRGD配列(配列番号2)を含む血栓へのターゲティングペプチド/抗血栓オリゴペプチドを連結して形成する「PAK配列含有ペプチド/イミダゾリン/RGD配列含有ペプチド」という新規三元コンジュゲート（ternary  conjugate）に関する。さらに、本発明は前記化合物を含む、NOフリーラジカル捕捉、血栓溶解、血栓へのターゲティング/抗血栓および脳卒中/脳梗塞の治療のための医薬組成物に関する。本発明は前記化合物の製造方法も関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界範囲において、血栓性疾患は罹患率および死亡率がともに第一位にある。冠状動脈血栓は心筋梗塞を引き起こすものである。脳血管栓塞は脳梗塞を引き起し、すなわち臨床上の虚血性脳卒中である。心筋梗塞患者に対して、血栓溶解薬を静脈注射してよいし、バイパス手術を行ってもよい。指摘すべきこととして、心筋梗塞患者に血栓溶解薬を静脈注射することによって得られた肯定的な結果は虚血再灌流である。虚血再灌流過程において多量のNOフリーラジカルが生じるので、血栓溶解過程は心筋損傷及び患者死亡に関連する。これは現在血栓溶解により心筋梗塞を治療する場合の深刻な問題である。現在、脳梗塞治療においてはより複雑な問題に直面している。例えば、既存の血栓溶解薬はいずれも血液脳関門を有効的に通過することができないため、血栓溶解薬の静脈注射による脳梗塞患者の治療効果は非常に限りがある。別例として、現在、脳梗塞患者を救う適切な手術がない状況である。同様に、脳梗塞患者に血栓溶解薬を静脈注射することによって肯定的な結果が得られたとしても、虚血再灌流過程においても多量のNOフリーラジカルが生じるので、血栓溶解過程が脳組織損傷及び患者死亡に関与する。これは現在血栓溶解により脳梗塞を治療する場合の深刻な問題である。さらに、脳卒中患者の臨床治療は四つの難題に直面している。1)  tPA  (tissue−type  plasminogen  activator,  組織プラスミノーゲン活性化因子)以外、脳卒中患者に対して治療効果を示すほかの薬剤がないこと。2)  tPA治療はただ患者の脳卒中の3時間以内に治療効果を示し、すなわち、tPAに3時間の治療黄金期しかないこと。3)  tPA治療は、通常全身性出血を引き起こすこと。4)  tPA治療は、虚血再灌流過程で生じた多量のNOフリーラジカルによる患者の脳組織損傷及び患者死亡を回避できないこと。このような四つの難題を解決してこそ、脳卒中患者の臨床治療は実質的な成果が得られる。
【０００３】
中国特許出願公開番号CN102807604およびCN102807605において、Nα−(1,3−ジオキソ−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン−2−フェニル−4’−オキソアセチル)−nω−脂肪アシル−Lys−Arg−Gly−Asp−ValおよびNα−(1,3−ジオキソ−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン−2−フェニル−4’−オキソアセチル)−nω−脂肪アシル−Lys−Arg−Gly−Asp−Pheの二つの化合物が開示されている。これらの二つの化合物はNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリンとRGD配列(Arg−Gly−Asp)を含む抗血栓オリゴペプチドをリジンにより組み合わせてなるものである。本発明の化合物と異なり、これら二つの化合物に血栓溶解ペプチドが連結されていない。これらの二つの化合物は血栓溶解作用を有せず、血栓溶解薬の製造に適用しなく、そして虚血性脳卒中の患者の治療にも適用しない。
【０００４】
上述した問題を解決するために、血栓溶解、NOフリーラジカル捕捉および血栓へのターゲティング/抗血栓作用を兼ねる新規化合物が必要となる。また、このような新規化合物は、患者の脳卒中の3時間後に治療効果を示し、すなわち、tPAを使用する場合の3時間の治療黄金期のような制限がない必要がある。それに、虚血再灌流過程で生じた多量のNOフリーラジカルを捕捉できる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は血液脳関門通過、血栓溶解、抗血栓およびNOフリーラジカル捕捉活性の作用を兼ねる三元コンジュゲートを提供し、前記三元とはNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類、血栓溶解活性を有するペプチド及び血栓へのターゲティングペプチドであり、それらは適切なリンカーによって一体に連結されている。
【０００６】
具体的に、本発明の三元コンジュゲートは式I化合物で示される。
【０００７】
【化１】
2015529209.tif 000001
その中、NNはNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類を表し、AA1は少なくとも3つの連結用基を有するリンカーを表し、AA2は血栓溶解活性を有するペプチドを表し、AA3は血栓へのターゲティングペプチドを表す。
【０００８】
本発明に使用できるイミダゾリン類はニトロニル  ニトロキシド(Nitronyl  Nitroxides)(NN)類イミダゾール類ニトロキシドフリーラジカルを含み、それがNOを捕捉でき、酸素フリーラジカルを捕捉する機能もあり、酸素フリーラジカルに損傷される細胞にとって強い保護作用を奏する。本発明のNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類は、1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンが好ましく、それが優れた化学安定性および物理安定性を有し、血栓溶解活性ペプチド及び血栓へのターゲティングペプチドとコンジュゲートするいかなる化学反応にも使用できるし、貯蔵過程で分解しにくく、製剤要求に満足できる。
【０００９】
本発明に使用できるリンカーは少なくとも3つの連結用基を有し、例えば、カルボキシル基およびアミノ基により、イミダゾリン類、血栓溶解活性を有するペプチド、血栓へのターゲティングペプチドの3つをつなぐものである。本発明のリンカーは天然アミノ酸、例えばL−Lys、L−AspおよびL−Gluであってよい。本発明に使用されるリンカー(AA1)は3つ以上の連結用基を有する場合、１つ以上のNN、AA2、またはAA3をつなぐことができ、そのうち2つ以上のNN、AA2、またはAA3が同一でも相違してもよい。例えば、AA1は4つの連結用基を有する場合、１つのNN、2つのAA2、および１つのAA3をつなぐことができる。この際、2つのAA2は同一なまはは異なる血栓溶解活性ペプチドでもよい。
【００１０】
本発明に使用できる血栓溶解活性を有するペプチドはPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むオリゴペプチド、あるいはPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を構造単位として含む繰り返し配列ペプチドでもよい。オリゴペプチドとは分子量が1000ドルトン(D)以下の小分子ペプチドであり、一般的に3〜8のアミノ酸からなる。本発明の血栓溶解活性を有するオリゴペプチドはPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むトリペプチド〜オクタペプチドでもよく、好ましくはPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むトリペプチド〜ペンタペプチドである。例えば、本発明に使用できるPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むオリゴペプチドはPAK(配列番号1)、RPAK(配列番号5) 、ARPAK(配列番号6)、GRPAK(配列番号7)、QRPAK(配列番号8)、AKP(配列番号3)、KAP(配列番号4)、KPAK(配列番号9)、PAKP(配列番号10)、AKPAK(配列番号11)またはPAKPA(配列番号12)である。例えば、本発明に使用できるPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を構造単位とする繰り返し配列ペプチドは中国特許出願公開番号CN101190941に開示される一連の血栓溶解活性を有するペプチドであってよく、PAKを構造単位として合成した繰り返し配列ペプチド(PAK)2、(PAK)3、(PAK)4、(PAK)5および(PAK)6(配列番号13-17)；AKPを構造単位として合成した繰り返し配列ペプチド(AKP)2、(AKP)3、(AKP)4、(AKP)5および(AKP)6(配列番号18-22)；及びKPAを構造単位として合成した繰り返し配列ペプチド(KPA)2、(KPA)3、(KPA)4、(KPA)5および(KPA)6(配列番号23-27)が挙げられる。
【００１１】
本発明に使用できる血栓へのターゲティング/抗血栓ペプチドはRGD配列(配列番号2) を含むオリゴペプチドでもよい。RGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドはRGDS、RGDV  およびRGDF(配列番号28、29、30)などのRGDテトラペプチドでもよい。フィブリノゲン(Fibrinogen,Fg)および活性化血小板膜糖タンパク質(Glycoprotein、GP)IIb/IIIaレセプターの特異的結合は、各生理的誘導剤が血小板凝集を引き起こす最終的な共通経路であり、血栓形成において重要な役目を果たす。また、RGD配列(配列番号2)は配体Fgおよび活性化GPIIb/IIIaレセプターの結合の活性部位であり、血小板を活性化する標的性を有する。RGD配列(配列番号2)を含む構造物は競争的にFgおよびGPIIb/IIIaレセプターの結合を阻害および遮断できるので、血小板凝集および血栓の形成を遮断して、RGD(配列番号2)を含むオリゴペプチドを有効な血栓へのターゲティング分子および抗血栓剤とする。
【００１２】
また、本発明に使用できる血栓へのターゲティングペプチドは中国特許出願公開番号CN101190940に開示される一連の標的抗血栓活性を有するポリペプチドでもよく、RGDペプチド(配列番号2)とYIGSペプチド(配列番号31)をコンジュゲート式修飾して得られたポリペプチドが挙げられる。これらの修飾して得られたポリペプチドはYIGSRRGDS、YIGSRRGDV、YIGSRRGDF、YIGSRYIGSK、YIGSRYIGSR、YIGSKRGDS、YIGSKRGDF、YIGSKRGDV、YIGSKYIGSK、YIGSKYIGSR、RGDSRGDS、RGDVRGDV、RGDFRGDF、RGDSYIGSR、RGDSYIGSK、RGDVYIGSR、RGDVYIGSK、RGDFYIGSR、またはRGDFYIGSKでもよい(配列番号32-50)。
【００１３】
好適な実施態様においては、本発明化合物の中でNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである。これによって、本発明は血液脳関門通過、血栓溶解、抗血栓およびNOフリーラジカル捕捉活性の作用を兼ねる「PAK配列含有ペプチド/イミダゾリン/RGD配列含有ペプチド」という三元コンジュゲートを提供する。
【００１４】
１つの実施態様においては、本発明化合物の中でNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Lysであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである。そのうち、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドはARPAKペンタペプチド、GRPAKペンタペプチド、RPAKテトラペプチドまたはPAKトリペプチド(配列番号6、7、5、1)でもよく、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドはRGDテトラペプチド、例えばRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)でもよい。L−Lysをリンカーとする時、本発明化合物は以下の一般式I−1またはI−2でもよい。
【００１５】
【化２】
2015529209.tif 000002
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。同時に存在する時、aa1がR  (Arg)で、且つaa2がG  (Gly)、A  (Ala)またはQ  (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR  (Arg)であり、aa3がS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。
【００１６】
一般式I−1化合物を例とすれば，好適な実施態様においては、本発明化合物は以下の一般式I−1−1で示されるARPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲートでもよい。他の好適な実施態様においては、本発明化合物は以下の一般式I−1−2で示されるGRPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲートでもよい。他の好適な実施態様においては、本発明化合物は以下の一般式I−1−3で示されるRPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲートでもよい。他の好適な実施態様においては、本発明化合物は以下の一般式I−1−4で示されるPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲートでもよい。
【００１７】
【化３】
2015529209.tif 000003
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００１８】
一般式I−2化合物を例とすれば、本発明化合物は以下の一般式I−2−1、I−2−2、I−2−3またはI−2−4が好ましい。
【００１９】
【化４】
2015529209.tif 000004
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００２０】
他の実施態様においては、本発明化合物の中で、NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Aspであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ前記血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである。L−  Aspをリンカーとする時、本発明化合物は以下の一般式I−3またはI−4でもよい。
【００２１】
【化５】
2015529209.tif 000005
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。それらが同時に存在する時、aa1がR  (Arg)で、且つaa2がG  (Gly)、A  (Ala)またはQ  (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR  (Arg)であり、aa3がS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。aa1はR  (Arg)が好ましく、aa2はG  (Gly)が好ましく、且つaa3はV  (Val)が好ましい。
【００２２】
一般式I−3化合物を例とすれば、本発明化合物は以下の一般式I−3−1、I−3−2、I−3−3またはI−3−4が好ましい。
【００２３】
【化６】
2015529209.tif 000006
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００２４】
一般式I−4化合物を例とすれば、本発明化合物は以下の一般式I−4−1、I−4−2、I−4−3またはI−4−4が好ましい。
【００２５】
【化７】
2015529209.tif 000007
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００２６】
他の実施態様においては、本発明化合物の中でNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Gluであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである。L−Gluをリンカーとする時、本発明化合物は以下の一般式I−5またはI−6でもよい。
【００２７】
【化８】
2015529209.tif 000008
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。それらが同時に存在する時、aa1がR  (Arg)で、且つaa2がG  (Gly)、A  (Ala)またはQ  (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR  (Arg)であり、aa3がS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。aa1はR  (Arg)が好ましく、aa2はG  (Gly)が好ましく、且つaa3はV  (Val)が好ましい。
【００２８】
一般式I−5化合物を例とすれば、本発明化合物は以下の一般式I−5−1、I−5−2、I−5−3またはI−5−4が好ましい。
【００２９】
【化９】
2015529209.tif 000009
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００３０】
一般式I−6化合物を例とすれば、本発明化合物は以下の一般式I−6−1、I−6−2、I−6−3またはI−6−4が好ましい。
【００３１】
【化１０】
2015529209.tif 000010
aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよく、好ましくはV  (Val)である。
【００３２】
一方、本発明は前記本発明化合物および医薬上許容される担体を含む医薬組成物にも関する。本発明医薬組成物は前記一般式I−1、I−2、I−3、I−4、I−5、またはI−6の化合物を含むことが好ましい。本発明医薬組成物は一般式I−1−1、I−1−2、I−1−3またはI−1−4の化合物を含むことがより好ましい。本発明医薬組成物は一般式I−1−1、I−1−2、I−1−3またはI−1−4の化合物を含む時、これらの化合物が医薬組成物の中で2量体、3量体または4量体構造を形成してよく、且つ直径2  nm〜300  nmのナノスフィアも形成してよい。本発明医薬組成物の中で、前記ナノスフィア構造は2  nm〜100  nmの直径を有することがより好ましい。ナノ薬学における公知事実の一つとして、直径が100  nm未満のナノスフィアが血液輸送においてマクロファージに取り込まれにくく、毛細血管壁を通過しやすい。これらの性能により、本発明の化合物は血液脳関門を通過することが可能である。本発明医薬組成物は血栓溶解薬として、心筋梗塞(Mmyocardial  infarction)、脳卒中(Ischemic  stroke)、静脈血栓症(Deep  vein  thrombosis)、肺塞栓(Pulmonary  embolism)、末梢動脈閉塞症(Peripheral  arterial  occlusive  disease)、静脈カテーテル閉塞(occluded  central  vascular  access  devices)、動静脈瘻及びシャント閉塞(Clotted  arteriovenous  fistula  and  shunts)、および頸動脈狭窄症(Carotid  Stenosis)などの疾患の治療のために使用されることができる。また、本発明医薬組成物はNOフリーラジカル捕捉薬として、例えばアルツハイマー病(Alzheimer's  disease)、パーキンソン病(Parkinson's  disease)、運動ニューロン疾患(motor  neuron  diseases)、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic  lateral  sclerosis)、騒音性難聴(Noise−induced  hearing  loss)、ルー・ゲーリック病(Lou  Gehrig's  disease)、またはハンチントン病(Huntington's  disease  )のような神経変性疾患(Neurodegenerative  diseases)の治療のために；例えばアテローム性動脈硬化症(Atherosclerosis)、冠状動脈性心臓病(Coronary  heart  disease)、または心筋梗塞(Myocardial  infarction)のような心血管疾患(Cardiovascular  disease)の治療のために；例えば双極性障害(Bipolar  disorder)、統合失調症(Schizophrenia)、または自閉症(Autism)のような精神疾患の治療のために；並びに、高山病(Altitude  sickness  )、糖尿病、関節リウマチ、外傷性脳損傷(Traumatic  brain  injury)、癌、脆弱性X症候群(Fragile  X  syndrome)、鎌状赤血球症(Sickle  Cell  Disease)、扁平苔癬(Lichen  planus)、白斑(Vitiligo)、または慢性疲労症候群(Chronic  fatigue  syndrome)などの疾患の治療のために使用できる。また、本発明医薬組成物は血栓へのターゲティング/抗血栓薬として、血小板増加(Thrombocytosis)、骨髄増殖性疾患(myeloproliferative  disease)、真性多血症(Polycythemia  vera)、またはブルカ症候群(Budd−Chiari  syndrome)などの疾患の治療のために使用できる。また、本発明医薬組成物は脳卒中または脳梗塞を治療するための薬として、好ましくは、発症してから3時間、4時間、6時間および24時間を超える脳卒中または脳梗塞の治療に使用し、且つ連続投与の形で治療する。本発明医薬組成物/化合物はNOフリーラジカル捕捉、血栓溶解、および抗血栓/血栓へのターゲティングの機能を同時に有するので、患者が脳卒中にかかってから3時間後でも治療効果をもち、即ちtPAを使用するときの3時間の治療黄金期に制限されない。tPAのような全身性出血反応を引き起こさず、虚血再灌流過程で生じた多量のNOフリーラジカ���を捕捉できるため、治療の際、患者の脳神経組織が損傷を受けることが回避できる。本発明医薬組成物において、前記化合物のナノ構造によって、血液脳関門通過、血栓溶解、血栓へのターゲティング/抗血栓および虚血再灌流過程で生じたNOフリーラジカルの捕捉の作用を最大化にすることができる。
【００３３】
本発明医薬組成物は臨床的に許容されるいずれかの好適な製剤でもよい。例えば、注射用製剤（粉末注射剤、凍結乾燥粉末注射剤、液体注射剤、輸液など）、錠剤、経口液剤、顆粒剤、カプセル剤、軟カプセル剤またはドロッピングピルなどでもよい。そのうち、医薬上許容される担体は、キシリトール、マンニトール、ラクトース、フルクトース、グルカン、グルコース、ポリビニルピロリドン、低分子量デキストラン、塩化ナトリウム、グルコン酸カルシウムまたはリン酸カルシウムのうち一つまたは複数でもよい。また、本発明医薬組成物にはさらに添加剤が含まれ、前記添加剤が酸化防止錯化剤、充填剤、骨格材料などでもよい。
【００３４】
一方、本発明は前記式I化合物の製造方法も関し、前記製造方法が
（１）  NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)、少なくとも3つの連結用基を有するリンカー(AA1)、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)及び血栓へのターゲティングペプチド(AA3)を提供する工程（そのうち、リンカーが第一連結用基、第二連結用基及び第三連結用基をもつ）
（２）  適当な反応条件下において、NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)とリンカー(AA1)の第一連結用基をつなぎ、一般式IM−1の化合物を形成する工程
NN−AA1    (IM−1)
（３）  適当な反応条件下において、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)と一般式IM−1の化合物をつなぎ、一般式IM−2の化合物を形成する工程（そのうち、血栓溶解活性を有するペプチドの一端がリンカーの第二連結用基とつながる）
NN−AA1−AA2    (IM−2)
（４）  適当な反応条件下において、血栓へのターゲティングペプチド(AA3)と一般式IM−2の化合物をつなぎ、一般式Iの化合物を形成する工程（そのうち、血栓へのターゲティングペプチドの一端がリンカーの第三連結用基とつながる）を含み、そのうち、工程(3)と工程(4)の順序を交換してよい。
【００３５】
本発明の製造方法において、工程(1)が、さらに、リンカー(AA1)の第二および第三連結用基を保護基で保護し、且つ血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)および血栓へのターゲティングペプチド(AA3)上の、連結用末端を除く活性基を保護基で保護することを含み、工程(3)が、さらに、まず保護された第二連結用基を脱保護して、次に血栓溶解活性を有するペプチドと脱保護した第二連結用基をつなぐことを含み、工程(4)が、さらに、まず保護された第三連結用基を脱保護して、次に血栓へのターゲティングペプチドと脱保護した第三連結用基をつなぐことを含み、そして、工程(4)の後に、さらに、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)および血栓へのターゲティングペプチド(AA3)上の保護された活性基を脱保護することを含む。保護基を付加・除去する技術を利用することで、NN、AA2およびAA3とリンカーとつながる順序および位置を制御できる。組合せが完了した後、ほかの活性基上の保護基を脱保護させる。適当な反応条件とは、ポリペプチド合成における通常の条件である。本発明の製造方法に使用できるNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)、少なくとも3つの連結用基を有するリンカー(AA1)、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)及び血栓へのターゲティングペプチド(AA3)は、前記本発明式I化合物に使用される定義と同じである。
【００３６】
本発明の製造方法は以下のより詳細な説明から理解できる。
一つの実施態様として、本発明の製造方法におけるリンカーの第一連結用基がアミノ基であり、且つ前記第二および第三連結用基がカルボキシル基およびアミノ基から選ばれる。
【００３７】
本発明の製造方法の好適な実施態様において、NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Lysであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである。L−Lysをリンカーとする時、以下の二つのつながり方がある。
【００３８】
(1)  1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとL−Lysリンカーの一つのアミノ基がつながり、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチド上のカルボキシル基とL−Lysリンカーのもう一つのアミノ基がつながり、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Lysリンカーのカルボキシル基がつながる(前記一般式I−1の化合物が示す通り)。または、
(2)  1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとL−Lysリンカーの一つのアミノ基がつながり、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Lysリンカーのカルボキシル基がつながり、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチド上のカルボキシル基とL−Lysリンカーのもう一つのアミノ基がつながる(前記一般式I−2の化合物が示す通り)。
【００３９】
一般式I−1の化合物を例として、一般式I−1−1、I−1−2、I−1−3またはI−1−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図1−図4に示す合成経路でもよい。図1は一般式I−1−1の化合物を製造する合成経路図であり、図2は一般式I−1−2の化合物を製造する合成経路図であり、図3は一般式I−1−3の化合物を製造する合成経路図であり、図4は一般式I−1−4の化合物を製造する合成経路図である。図1〜図4において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−1−2の化合物を例として、本発明の製造方法を以下のように説明する。
（１）  1,3−ジオキソ−2−(4−オキシ酢酸基−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造する。
（２）  1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン(Lysリンカーのカルボキシル基を保護基で保護する)を製造する。
（３）  HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl、HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−ObzlまたはHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzlを製造する。
（４）  Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)を製造する。
（５）  Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)を1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンのリジンにつなぐことで1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンが得られる。
（６）  HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl、HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp  (OBzl)−Val−ObzlまたはHCl・Arg  (NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzlをそれぞれ1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−  Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとコンジュゲートすることで、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−  Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp−  (OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチル−イミダゾリンまたは1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg  (NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−  4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンがそれぞれ得られる。
（７）  工程(6)で製造された化合物の保護基を除去することで、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly−Arg−Pro−Ala−Lys]−  Lys−Arg−Gly−Asp−Ser}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly−Arg−Pro−  Ala−Lys]−Lys−Arg−Gly−Asp−Val}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンまたは1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly−  Arg−Pro−Ala−Lys]−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe}フェニル}−  4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンが得られる。
【００４０】
一般式I−1−1、I−1−3、およびI−1−4の化合物を製造する時、工程(4)における「Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)」を「Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)」、「Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)」、および「Boc−Pro−Ala−Lys(Z)」に変更して、前記製造工程を行う。
【００４１】
PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドとRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドは、組合せ設計の要求に応じて、適当な位置にある活性基において保護基で保護することによって、配列の一端(リンカーと接合できる活性基を含む)を選択してリンカーの活性基と結合する。PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドとRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドを組み合わせる工程は順序を交換し、例えば、まずRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドと組み合わせて、次にPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドと組み合わせてよい。
【００４２】
活性基には、アミノ基またはカルボキシル基などの縮合反応を行える基が含まれる。アミノ基の保護基は、カルボベンゾキシ基（CBz）、tert−ブトキシカルボニル基（Boc）、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ベンジル基（Bn）またはp−メトキシフェニル基（PMP）でもよい。カルボキシル基の保護基は、メチルエステル(OMe)、ベンジルエステル(OBn)、ベンジルメチルエステル（OBzl）、tert−ブチルエステル（OBUT）、またはシリルエステル（OSi(CH3)3）でもよい。
【００４３】
一般式I−2の化合物を例として、一般式I−2−1、I−2−2、I−2−3またはI−2−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図5−図8に示す合成経路でもよい。図5は一般式I−2−1の化合物を製造する合成経路図であり、図6は一般式I−2−2の化合物を製造する合成経路図であり、図7は一般式I−2−3の化合物を製造する合成経路図であり、図8は一般式I−2−4の化合物を製造する合成経路図である。図5〜図8において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−2−1、I−2−2、I−2−3またはI−2−4の化合物を合成する時、まず1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造して、その後RGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドのC端とLysリンカーのアミノ基を組み合わせて、最後にPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドのN端と脱保護されたリンカーのカルボキシル基を組み合わせる。
【００４４】
もう一つの実施態様において、本発明の製造方法のNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Aspであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドであり、そして、そのうち1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとL−Aspリンカーのアミノ基がつながり、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Aspリンカーの一カルボキシル基がつながり、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Aspリンカーのもう一つのカルボキシル基がつながる(前記一般式I−3またはI−4の化合物が示す通り)。
【００４５】
一般式I−3の化合物を例として、一般式I−3−1、I−3−2、I−3−3またはI−3−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図9−図12に示す合成経路でもよい。図9は一般式I−3−1の化合物を製造する合成経路図であり、図10は一般式I−3−2の化合物を製造する合成経路図であり、図11は一般式I−3−3の化合物を製造する合成経路図であり、図12は一般式I−3−4の化合物を製造する合成経路図である。図9〜図12において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−3−1、I−3−2、I−3−3またはI−3−4の化合物を合成する時、まず1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Asp−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造して、その後PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドのN端とAspリンカーの一つのカルボキシル基を組み合わせて、最後にRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドのN端と脱保護されたAspリンカーのもう一つのカルボキシル基を組み合わせる。
【００４６】
一般式I−4の化合物を例として、一般式I−4−1、I−4−2、I−4−3またはI−4−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図13−図16に示す合成経路でもよい。図13は一般式I−4−1の化合物を製造する合成経路図であり、図14は一般式I−4−2の化合物を製造する合成経路図であり、図15は一般式I−4−3の化合物を製造する合成経路図であり、図16は一般式I−4−4の化合物を製造する合成経路図である。図13〜図16において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−4−1、I−4−2、I−4−3またはI−4−4の化合物を合成する時、まず1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Asp−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造して、その後RGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドのN端とAspリンカーの一つのカルボキシル基を組み合わせて、最後にPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドのN端と脱保護されたAspリンカーのもう一つのカルボキシル基を組み合わせる。
【００４７】
もう一つの実施態様において、本発明の製造方法のNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、リンカーがL−Gluであり、血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドであり、そして、そのうち1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとL−Gluのアミノ基がつながり、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Gluリンカーの一つのカルボキシル基とつながり、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Gluリンカーのもう一つのカルボキシル基とつながる(前記一般式I−5またはI−6の化合物が示す通り)。
【００４８】
一般式I−5の化合物を例として、一般式I−5−1、I−5−2、I−5−3またはI−5−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図17−図20に示す合成経路でもよい。図17は一般式I−5−1の化合物を製造する合成経路図であり、図18は一般式I−5−2の化合物を製造する合成経路図であり、図19は一般式I−5−3の化合物を製造する合成経路図であり、図20は一般式I−5−4の化合物を製造する合成経路図である。図17〜図20において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−5−1、I−5−2、I−5−3またはI−5−4の化合物を合成する時、まず1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Glu−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造して、その後RGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドのN端とGluリンカーの一つのカルボキシル基を組み合わせて、最後にPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドのN端と脱保護されたGluリンカーのもう一つのカルボキシル基を組み合わせる。
【００４９】
一般式I−6の化合物を例として、一般式I−6−1、I−6−2、I−6−3またはI−6−4の化合物を製造する時、本発明の製造方法は図21−図24に示す合成経路でもよい。図21は一般式I−6−1の化合物を製造する合成経路図であり、図22は一般式I−6−2の化合物を製造する合成経路図であり、図23は一般式I−6−3の化合物を製造する合成経路図であり、図24は一般式I−6−4の化合物を製造する合成経路図である。図21〜図24において、上記のように、aa3はS  (Ser)、V  (Val)、またはF  (Phe)でもよい。一般式I−6−1、I−6−2、I−6−3またはI−6−4の化合物を合成する時、まず1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Glu−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造して、その後PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドのN端とGluリンカーの一つのカルボキシル基を組み合わせて、最後にRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドのN端と脱保護されたGluリンカーのもう一つのカルボキシル基を組み合わせる。
【００５０】
前記製造方法において、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドはARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、8、5、1)でもよく、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドがRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)でもよい。
【００５１】
本発明の化合物または医薬組成物はラット体内におけるNO捕捉活性試験において、比較的高いNOフリーラジカル捕捉活性を有することが示されている。体内外における血栓溶解および抗血栓活性試験において、優れた血栓溶解および抗血栓活性を有することが示されている。ラット体内における抗脳卒中活性試験において、有効に脳卒中ラットの神経機能を保護し、優れた抗脳卒中活性を有することが示されている。脳卒中ラット大脳梗塞体積試験において、有効に脳卒中ラット大脳梗塞体積を低減できることが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−1−1の化合物)の合成経路図である。
【図２】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−1−2の化合物)の合成経路図である。
【図３】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−1−3の化合物)の合成経路図である。
【図４】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−1−4の化合物)の合成経路図である。
【図５】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−2−1の化合物)の合成経路図である。
【図６】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−2−2の化合物)の合成経路図である。
【図７】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−2−3の化合物)の合成経路図である。
【図８】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−2−4の化合物)の合成経路図である。
【図９】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−3−1の化合物)の合成経路図である。
【図１０】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−3−2の化合物)の合成経路図である。
【図１１】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−3−3の化合物)の合成経路図である。
【図１２】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−3−4の化合物)の合成経路図である。
【図１３】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−4−1の化合物)の合成経路図である。
【図１４】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−4−2の化合物)の合成経路図である。
【図１５】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−4−3の化合物)の合成経路図である。
【図１６】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−4−4の化合物)の合成経路図である。
【図１７】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−5−1の化合物)の合成経路図である。
【図１８】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−5−2の化合物)の合成経路図である。
【図１９】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−5−3の化合物)の合成経路図である。
【図２０】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−5−4の化合物)の合成経路図である。
【図２１】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−6−1の化合物)の合成経路図である。
【図２２】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−6−2の化合物)の合成経路図である。
【図２３】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−6−3の化合物)の合成経路図である。
【図２４】本発明化合物の一つの実施態様(一般式I−6−4の化合物)の合成経路図である。
【図２５】本発明化合物Iaの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図２６】本発明化合物Ibの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図２７】本発明化合物Icの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図２８】本発明化合物Idの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図２９】本発明化合物Ieの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３０】本発明化合物Ifの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３１】本発明化合物Igの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３２】本発明化合物Ihの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３３】本発明化合物Iiの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３４】本発明化合物Ijの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３５】本発明化合物Ikの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３６】本発明化合物Ilの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造である。
【図３７】本発明化合物Ieの濃度0.01  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルである。
【図３８】本発明化合物Ieの濃度0.1  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルである。
【図３９】本発明化合物Ieの濃度1  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルである。
【図４０】本発明化合物Ieの濃度10  μMにおける高分解能FT−MS質量スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、具体的な実施例を参考しながら本発明をさらに説明する。本発明のメリットおよび特徴は説明によってより明瞭になる。しかしながら、これらの実施例はただ例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者が理解すべきこととして、本発明の精神と範囲に反しない条件下で本発明の技術内容の細部および形式を修正または変更してよく、これらの修正および変更はいずれも本発明の保護範囲に入っている。
【００５４】
NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類：1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
【００５５】
実施例１  2,3−ジメチル−2,3−ジニトロブタン
2−ニトロプロパン69  g  (0.78  mol)をNaOH  (6N)水溶液130  mlに入れ、氷塩浴で撹拌しながら1  h  以内でBr2  20  ml  (0.38  mol)を滴下し、その後エタノール240  mLを加え、90℃で3  h還流させ、反応液を熱いうちに氷水800  mlに入れて、表記化合物55  g  (81％)を濾過した。その化合物は無色のシート状結晶であり、Mpが110−112℃である。
【００５６】
実施例２  2,3−ジメチル−2,3−ジヒドロキシアミノブタンの製造
2,3−ジメチル−2,3−ジニトロブタン7  g  (40  mmol)およびNH4Cl  4  gをエタノール水溶液80  mL  (50％)に懸濁して、氷浴で撹拌しながら3  h以内で亜鉛粉16  gを加えた。亜鉛粉の添加が完了した後、氷浴を外し、引き続き室温で3  h攪拌反応した後、反応液を吸引ろ過した。エタノール水溶液(50％)でケーキを繰り返し洗浄して、ろ液と洗浄液を合わせて、濃塩酸でpH=2になるように調整して、スラリ状になるまで減圧蒸発した。適量な炭酸カリウムを加え、均一に攪拌した後、クロロホルムを抽出剤として、ソックスレー抽出器により6  h抽出した。抽出液を少量になるまで減圧濃縮し、石油エーテルを加えた後、表記化合物2.60  g  (44％)が析出した。その化合物は無色の結晶であり、Mpが157−159℃である。
【００５７】
実施例３  1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリジンの製造
p−ヒドロキシベンズアルデヒド1.22  g  (10  mmol)と2,3−ジメチル−2,3−ジヒドロキシアミノブタン1.48g  (10  mmol)をメタノール10  mLに溶かし、室温で8  h攪拌した後、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。吸引ろ過により表記化合物である無色の結晶1.29  g  (51％)が得られた。EI−MS  (m/z)  252  [M]+.  1H−NMR  (DMSO−d6)  δ(ppm)  =  1.03  (s,  6H),  1.05  (s,  6H),  4.39  (s,  1H),  6.70  (d,  J  =  6.9  Hz,  2H),  7.23  (d,  J  =  6.9  Hz,  2H),  7.63  (s,  1H),  7.85(s,  2H)。
【００５８】
実施例４  1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリジン504  mg  (2  mmol)をメタノール30  mLに溶かし、PbO2  3  gを加え、室温で40  min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。吸引ろ過により固体を除去し、室温でろ液を減圧蒸発乾燥して、カラムクロマトグラフィーにより残存物を精製する(クロロホルム溶出)ことで、表記化合物である青色の固体260  mg  (52％)が得られた。Mp  134−135℃,EI−MS  (m/z)  249  [M]+.  IR  (KBr)  3250,1610,1500,1490,  840。
【００５９】
実施例５  1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸エチル−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン250  mg(1  mmol)、ブロモ酢酸エチル0.32  mL及び水素化ナトリウム32  mgを無水THF  5  mLに溶かし、混合物を60℃で5時間攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。室温で減圧ろ過し、ろ液を乾燥になるまで減圧濃縮して、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:石油エーテル=1:5)により残存物を精製することで、目的化合物300  mg  (90％)が得られた。Mp  107−109℃。
【００６０】
実施例６  1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン(TMMZ)  の製造
1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸エチル−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン33  mg  (0.1  mmol)とメタノール3  mLの溶液にNaOH(2N)水溶液7滴を加え、室温で30  min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。反応液を減圧濃縮し、残存物をまず飽和食塩水2  mLで希釈して、さらに2N  HClでpH  6になるまで調整し、その後酢酸エチルで3回(3  ml  ×  3)抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで干燥しろ過して、室温でろ液を乾燥になるまで減圧濃縮することで、表記化合物である青色の結晶30  mg  (99％)が得られた。Mp  155−157℃.  EI−MS  (m/z)  307  [M]+。
NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類とリンカーとの組合せ：1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン
【００６１】
実施例７  1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Nω−Boc−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン307  mg(1  mmol)と無水THF  30  mlの溶液を氷浴で攪拌した。溶液にDCC  250  mg  (1.2  mmol)とHOBt  135  mg  (1  mmol)を加え、氷浴で10  min攪拌した。当該溶液にHCl・Lys(Boc)−Ome  300  mg  (1  mmol)、N−メチルモルホリン122  mg  (1  mmol)及び無水THF  6  mLで調製した溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で24時間反応させた。TLC(酢酸エチル:石油エーテル  =  2:1)でHCl・Lys(Boc)−Omeがなくなったことを確認した。反応混合物を乾燥になるまで減圧濃縮し、酢酸エチルにより残存物を溶解して、不溶物をろ過して取り除く。飽和重炭酸ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で順次にろ液を洗浄した。分離した酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで干燥し、ろ過して、ろ液を37℃で減圧濃縮(以下、これらの操作を通常の処理と総称する)した。カラムクロマトグラフィーにより残存物を精製する(酢酸エチル:石油エーテル  =  2:1)ことで、表記化合物である青色の固体433  mg(65％)が得られた。ESI−MS(m/z)  550  [M  +  H]+。
【００６２】
実施例８  1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Nω−Boc−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン625  mg  (1  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液15mL  (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法により反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られた。
【００６３】
血栓溶解活性を有するペプチド：適切に保護されたARPAKの製造
【００６４】
実施例９  Boc−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
Boc−Ala  473  mg  (2.5  mmol)を無水THF  10  mlに溶かす。氷浴において、HOBt  338  mg(2.5  mmol)、DCC  619  mg(3  mmol)及び無水THF  10  mLで調製した溶液を加えた。氷浴で反応混合物を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Lys(Z)−Obzl  936  mg  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)及び無水THF  6  mLで調製した溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で24時間反応し、TLC  (CHCl3:MeOH  ＝  30:1)でHCl・Lys(Z)−OBzlがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理で表記化合物である無色の固体1.204  g  (97％)が得られた。Mp  88−90℃.
（外１）
2015529209.tif 000011
＝−29.2  (c  =  0.1,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  565  [M  +  Na]+。
【００６５】
実施例１０    HCl・Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
Boc−Ala−Lys(Z)−OBzl  1.354  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル溶液約10  ml  (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH、30:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合液を室温で減圧濃縮し、残存物をさらに酢酸エチルで溶かし、室温で濃縮する。遊離した塩化水素(以下、これらの操作を通常の処理と総称する)が完全に除去されるまで、このように複数回繰り返した。残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００６６】
実施例１１    Boc−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
Boc−Pro  538  mg  (2.5  mmol)を適量の無水THFに溶かし、氷浴でHOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)の無水THF溶液を加え、20分間反応させた。当該溶液にHCl・Ala−Lys(Z)−Obzl  1.099  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)及び無水THF  10  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物2.847  g  (98％)が得られた。Mp  82−83℃.
（外２）
2015529209.tif 000012
＝−46.4  (c  =  0.11,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  661  [M  +  Na]+。
【００６７】
実施例１２  HCl・Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
Boc−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  1.596  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液15  mL  (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００６８】
実施例１３  Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Arg(NO2)  798  mg(2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Pro−Ala−Lys(Z)−Obzl  1.322  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)と無水THF  5  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)  で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物1.642  g  (85％)が得られた。Mp  84−85℃.
（外３）
2015529209.tif 000013
＝−65.0  (c  =  0.13,  MeOH).  ESI−MS  (m/z)  864  [M  +  Na]+。
【００６９】
実施例１４  HCl・  Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  2.099  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液20  mL  (4N)  に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)  で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００７０】
実施例１５  Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Ala  473  mg(2.5  mmol)、HOBt  338  mg(2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  1.785  g(2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)と無水THF  5  mLで調製した溶液を加え、24時間反応させることで、表記化合物1.802  g  (86％)が得られた。Mp  87  −  89℃.  
（外４）
2015529209.tif 000014
＝−63.9  (c  =  0.12,  MeOH).  ESI−MS(m/e)  934  [M  +  Na]+。
【００７１】
実施例１６  Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  の製造
Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  921  mg(1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加え、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出して(5  mL×  3)、合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、室温で減圧濃縮することで表記化合物である無色の固体767  mg  (80％)が得られた。EI−MS  (m/z)  830  [M  −  H]−。
【００７２】
血栓へのターゲティング/抗血栓ペプチド：適切に保護されたRGDS、RGDV、RGDFの製造
【００７３】
実施例１７  Boc−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Asp(OBzl)  808  mg(2.5  mmol)、HOBt  338  mg(2.5  mmol)、DCC  619  mg(3  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌反応した。当該溶液にHCl・Ser(Bzl)−Obzl  740  mg  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の油状物1.29  g  (95％)が得られた。ESI−MS(m/z)  591  [M  +  H]  +。
【００７４】
実施例１８  HCl・Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
Boc−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl  1.477  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)  15  mL  に溶かし、且つ室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００７５】
実施例１９  Boc−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Gly  438  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  1.212  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)と無水THF5  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)  で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.461  g  (98％)が得られた。Mp  53  −  55℃.
（外５）
2015529209.tif 000015
＝−23.7  (c  =  0.13,  MeOH).  ESI−MS  (m/z)  649  [M  +  H]+。
【００７６】
実施例２０  HCl・  Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl  1.619  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)  15  mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００７７】
実施例２１  Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Arg(NO2)  798  mg(2.5  mmol)、HOBt  338  mg(2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)及び無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  1.343  g(2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物である無色の固体1.66  g  (85％)が得られた。Mp  74  −  75℃.
（外６）
2015529209.tif 000016
＝  −26.2  (c  =  0.12,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  872  [M  +  Na]+。
【００７８】
実施例２２  HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzlの製造
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl  2.122  g  (2.5  mmol)と塩化水素−酢酸エチル液(4N)  20  mLの混合物を室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:  MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
【００７９】
実施例２３  Boc−Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
氷浴でBoc−Asp(OBzl)  808  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)及び無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・  Val−OBzl  558  mg  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の油状液体1.129  g  (96％)が得られた。ESI−MS(m/z)  512  [M  +  H]+。
【００８０】
実施例２４  HCl・Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
Boc−Asp(OBzl)−Val−OBzl  1.278  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)  15  mlに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００８１】
実施例２５  Boc−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
氷浴でBoc−Gly  438  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Val−Obzl  1.03  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の固体1.242  g  (95％)が得られた。Mp  66  −  68℃.
（外７）
2015529209.tif 000017
＝−43.8  (c=  0.11,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  592  [M  +  Na]+。
【００８２】
実施例２６  HCl・  Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl  1.421  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15  mL  に溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００８３】
実施例２７  Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
氷浴でBoc−Arg(NO2)  798  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl  1.162  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の固体1.523  g  (86％)が得られた。Mp  107  −  109℃.
（外８）
2015529209.tif 000018
＝−38.0  (c=  0.12,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  793  [M  +  Na]+。
【００８４】
実施例２８  HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzlの製造
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl  1.925  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)  20  mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
【００８５】
実施例２９  Boc−Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
氷浴でBoc−Asp(OBzl)  808  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Phe−Obzl  668  mg  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物である無色の固体1.222  g  (95％)が得られた。Mp  79  −  80℃.
（外９）
2015529209.tif 000019
＝−24.2  (c  =  0.13,  MeOH),  ESI−MS(m/z)  561  [M  +  H]+。
【００８６】
実施例３０  HCl・Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
Boc−Asp(OBzl)−Phe−OBzl  1.398  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル溶液(4N)15  mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００８７】
実施例３１  Boc−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
氷浴でBoc−Gly  438  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)の無水THF溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Phe−Obzl  1.141  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.29  g  (91％)が得られた。Mp  70  −  71℃.
（外１０）
2015529209.tif 000020
＝−22.5  (c  =  0.14,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  640  [M  +  Na]  +。
【００８８】
実施例３２  HCl・  Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl  1.541  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15  mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
【００８９】
実施例３３  Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
氷浴でBoc−Arg(NO2)  798  mg  (2.5  mmol)、HOBt  338  mg  (2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl  1.272  g  (2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg  (2.3  mmol)と無水THF  5  mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.637g  (87％)が得られた。Mp  77  −  79℃.
（外１１）
2015529209.tif 000021
＝−22.6  (c  =  0.09,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  841  [M  +  Na]+。
【００９０】
実施例３４  HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzlの製造
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl  2.045  g  (2.5  mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15  mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
【００９１】
ARPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲート(一般式I−1−1の化合物)：Ia、Ib、Icの製造
【００９２】
実施例３５  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴でBoc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  821  mg(1  mmol)、HOBt  135  mg(1  mmol)、DCC  250  mg(1  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480  mg(1  mmol)およびN−メチルモルホリン100  mg  (1  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である青色の固体925  mg  (83％)が得られた。Mp  179  −  182℃.
（外１２）
2015529209.tif 000022
＝−34.3  (c  =  0.14,  MeOH),  ESI−MS(m/z)  1275  [M  +  Na]+。IR  (KBr)  3319,  2935,  1658,  1531,  1448,  1363,  1254,  1168,  1053,  835,  749,  540  cm−1。
【００９３】
実施例３６  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1260  mg  (1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体945  mg  (82％)が得られた。EI−MS  (m/z)  1238  [M  −  H]−。
【００９４】
実施例３７  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  442  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体300  mg  (31％)が得られた。Mp  138  −  140℃.
（外１３）
2015529209.tif 000023
＝−39.4  (c  =  0.13,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1991  [M  +  H]+.  IR(KBr)  3309,  2936,  1656,  1531,  1449,  1363,  1256,  836,  743,  697,  601  cm−1。
【００９５】
実施例３８  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl  421  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体389  mg  (36％)が得られた。Mp  117  −  120℃.
（外１４）
2015529209.tif 000024
＝−14.8  (c  =  0.01,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1913  [M  +  H]+。IR(KBr)  3312,  2937,  1655,  1530,  1448,  1362,  1257,  835,  744,  697,  592  cm−1。
【００９６】
実施例３９  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−  Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl  445  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体320  mg  (36％)が得られた。Mp  115  −  118℃.
（外１５）
2015529209.tif 000025
＝−21.5  (c  =  0.16,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1961  [M  +  H]+。IR(KBr)  3316,  2936,  1654,  1529,  1448,  1362,  1256,  1169,  742,  698,  593  cm−1。
【００９７】
実施例４０  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Ala−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Ser]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ia)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−  4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン199  mg  (0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体109  mg  (85％)が得られた。Mp  134  −  135℃.
（外１６）
2015529209.tif 000026
＝−39.7  (c  =  0.12,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1374.7290  [M  +  H]+,  2748.4580  [2M  +  H]+,  4122.1870  [3M  +  H]+,  5495.9160  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3346,  3180,  2920,  1665,  1537,  1449,  1252,  1179,  1030,  837,  801,  720,  639,  518  cm−1。
【００９８】
実施例４１  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Ala−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Val]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ib)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−  Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン190  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10  で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96  mg  (82％)が得られた。Mp  143  −  144℃.
（外１７）
2015529209.tif 000027
＝−31.8  (c  =  0.01,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1386.7654  [M  +  H]+,  2772.5308,  [2M  +  H]+,  4158.2962  [3M  +  H]+,  5544.0616  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3349,  2942,  1659,  1539,  1394,  1250,  1030,  639  cm−1。
【００９９】
実施例４２  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Ala−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ic)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−  Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−  4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン194  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10  で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体106  mg  (81％)が得られた。Mp  96  −  97℃.
（外１８）
2015529209.tif 000028
＝−44.4  (c  =  0.15,  MeOH).  FT−MS  (m/z)  ESI−MS  (m/z)  1444.7654  [M  +  H]+,  ESI−MS(m/z)  2888.5308  [2M  +  H]+,  4332.2962  [3M  +  H]+,  5776.0616  [4M  +  H]+.    g  =  2.00789.  IR(KBr)  3363,  1665,  1538,  1448,  1256,  1173,  1031,  640,  577,  518  cm−1。
【０１００】
血栓溶解活性を有するペプチド：適切に保護されたGRPAKの製造
【０１０１】
実施例４３  Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzlの製造
氷浴でBoc−Gly  438  mg(2.5  mmol)、HOBt  338  mg(2.5  mmol)、DCC  619  mg  (3  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・  Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  1.785  g(2.3  mmol)、N−メチルモルホリン232  mg(2.3  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、24時間反応させることで、表記化合物1.857  g  (90％)が得られた。Mp  85  −  87℃.
（外１９）
2015529209.tif 000029
＝−38.5  (c  =  0.11,  MeOH).  ESI−MS  (m/e)  920  [M  +  Na]  +。
【０１０２】
実施例４４  Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  の製造
Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  907  mg(1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体785  mg  (82％)が得られた。EI−MS  (m/z)  816  [M  −  H]−。
【０１０３】
GRPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲート(一般式I−1−2の化合物)：Id、Ie、Ifの製造
【０１０４】
実施例４５  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴でBoc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  817  mg  (1  mmol)、HOBt  135  mg  (1  mmol)、DCC  250  mg  (1  mmol)および無水THF  10  mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480  mg(1  mmol)およびN−メチルモルホリン100  mg  (1  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体680mg  (52％)が得られた。Mp  79  −  82℃.
（外２０）
2015529209.tif 000030
＝−12.3  (c  =  0.14,  MeOH),  ESI−MS(m/z)  1261  [M  +  Na]+。IR  (KBr)  3319,  2935,  1658,  1531,  1448,  1363,  1254,  1168,  1053,  835,  749,  540  cm−1。
【０１０５】
実施例４６  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1260  mg  (1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体945  mg  (82％)が得られた。EI−MS  (m/z)  1223  [M  −  H]−。
【０１０６】
実施例４７  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−  (NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  442  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体500  mg  (48％)が得られた。Mp  127  −  129℃.
（外２１）
2015529209.tif 000031
＝−49.4  (c  =  0.13,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1956  [M  +  H]+.  IR(KBr)  3306,  2936,  1652,  1531,  1449,  1362,  1255,  1166,  742,  697,  592  cm−1。
【０１０７】
実施例４８  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−  (NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl  421  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体392  mg  (35％)が得られた。Mp  147  −  150℃.
（外２２）
2015529209.tif 000032
＝−34.6  (c  =  0.16,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1899  [M  +  Na]+。IR(KBr)  3311,  3068,  2937,  1661,  1531,  1451,  1395,  1254,  1163,  839,  743,  697,  596  cm−1。
【０１０８】
実施例４９  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−  (NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl  445  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC  (CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体336  mg  (31％)が得られた。Mp  125  −  128℃.
（外２３）
2015529209.tif 000033
＝−31.3  (c  =  0.18,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1925  [M  +  H]+。IR(KBr)  3315,  2935,  1657,  1529,  1448,  1361,  1257,  1173,  834,  742,  698,  541  cm−1。
【０１０９】
実施例５０  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Gly−Arg−Pro−Ala−Lys)−  Lys−Arg−Gly−Asp−Ser]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Id)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン195  mg  (0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸  6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体102  mg  (82％)が得られた。Mp  142  −  145℃.
（外２４）
2015529209.tif 000034
＝−29.7  (c  =  0.14,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1360.7133  [M  +  H]+,  2720.4266  [2M  +  H]+,  4080.1399  [3M  +  H]+,  5439.8532  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3348,  3180,  2940,  1670,  1539,  1447,  1199,  1134,  1034,  836,  801,  721,  638  cm−1。
【０１１０】
実施例５１  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Gly−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Val]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ie)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン190  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体99  mg  (84％)が得られた。Mp  147  −  149℃.
（外２５）
2015529209.tif 000035
＝−31.1  (c  =  0.17,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1372.7497  [M  +  H]+,  2744.4994  [2M  +  H]+,  4116.2491  [3M  +  H]+,  5487.9988  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3338,  2960,  1662,  1539,  1451,  1392,  1251,  1170,  1030,  639,  519  cm−1。
【０１１１】
実施例５２  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Gly−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (If)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−  Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン192  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体106  mg  (81％)が得られた。Mp  84  −  85℃.
（外２６）
2015529209.tif 000036
＝−54.1  (c  =  0.15,  MeOH).  FT−MS  (m/z)  1420.7497  [M  +  H]+,  2840.4994  [2M  +  H]+,  ESI−MS  FT−MS(m/z)  1420.7497  [M  +  H]+,  2840.4994  [2M  +  H]+,  4260.2491  [3M  +  H]+,  5679.9976  [4M  +  H]+.  g  =  2.00789.  IR(KBr)  3344,  3080,  2930,  1666,  1535,  1392,  1250,  1181,  1030,  835,  800,  719,  638  cm−1。
【０１１２】
血栓溶解活性を有するペプチド：適切に保護されたRPAKの製造
【０１１３】
実施例５３  Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  の製造
Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  850  mg(1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体742  mg  (92％)が得られた。EI−MS  (m/z)  849  [M  −  H]−。
【０１１４】
RPAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲート(一般式I−1−3化合物)：Ig、Ih、Iiの製造
【０１１５】
実施例５４  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴でBoc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)  760  mg  (1  mmol)、HOBt  135  mg  (1  mmol)、DCC  250  mg  (1  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480  mg(1  mmol)およびN−メチルモルホリン100  mg  (1  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体920  mg  (83％)が得られた。Mp  72  −  76℃.
（外２７）
2015529209.tif 000037
＝−32.7  (c  =  0.13,  MeOH),  ESI−MS(m/z)  1204  [M  +  Na]+。IR  (KBr)  3317,  2937,  1658,  1531,  1447,  1362,  1254,  1168,  1055,  835,  746,  697,  541,  460  cm−1。
【０１１６】
実施例５５  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−  Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1200  mg  (1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体899  mg  (80％)が得られた。EI−MS  (m/z)  1116  [M  −  H]−。
【０１１７】
実施例５６  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  442  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体421  mg  (40％)が得られた。Mp  77  −  79℃.
（外２８）
2015529209.tif 000038
＝−45.4  (c  =  0.15,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1897  [M  +  H]+.  IR(KBr)  3319,  2934,  1658,  1530,  1449,  1361,  1256,  834,  741,  698,  542  cm−1。
【０１１８】
実施例５７  実施例57  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−  Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583  mg  (0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl  421  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:  MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体472  mg  (42％)が得られた。Mp  107  −  109℃.
（外２９）
2015529209.tif 000039
＝−28.8  (c  =  0.11,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1820  [M  +  H]+。IR(KBr)  3314,  2938,  1658,  1531,  1448,  1362,  1258,  742,  698,  594  cm−1。
【０１１９】
実施例５８  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−  Arg(NO2)−  Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl  445  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体420  mg  (47％)が得られた。Mp  141  −  144℃.
（外３０）
2015529209.tif 000040
＝−35.7  (c  =  0.12,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1867  [M  +  H]+。IR(KBr)  3319,  2936,  1656,  1529,  1448,  1362,  1257,  1169,  834,  743,  698,  541  cm−1。
【０１２０】
実施例５９  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Ser]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ig)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−  Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン170  mg  (0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体102  mg  (82％)が得られた。Mp  148  −  150℃.
（外３１）
2015529209.tif 000041
＝−22.4  (c  =  0.14,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1303.6919  [M  +  H]+,  2606.3838,  [2M  +  H]+,  3909.0757  [3M  +  H]+,  5211.7676  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3344,  3080,  2930,  1666,  1535,  1392,  1250,  1181,  1030,  835,  800,  719,  638。
【０１２１】
実施例６０  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Val]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ih)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−  Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン182  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体99  mg  (84％)が得られた。Mp  137  −  139℃.
（外３２）
2015529209.tif 000042
＝−34.3  (c  =  0.18,  MeOH).  FT−MS(m/z)  ESI−MS(m/z)  1315.7282  [M  +  H]+,  2630.4564  [2M  +  H]+,  3945.1846  [3M  +  H]+,  5259.9128  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3329,  2953,  1665,  1533,  1391,  1198,  1134,  834,  801,  720,  599  cm−1。
【０１２２】
実施例６１  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ii)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−  Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン187  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96  mg  (81％)が得られた。Mp  99  −  100℃.
（外３３）
2015529209.tif 000043
＝−24.7  (c  =  0.14,  MeOH).  FT−MS  (m/z)  1363.7282  [M  +  H]+,  2726.4564  [2M  +  H]+,  4089.1846  [3M  +  H]+,  5451.9128  [4M  +  H]+.  g  =  2.00789.  IR(KBr)  3322,  3060,  2928,  1661,  1530,  1391,  1303,  1247,  641  cm−1。
【０１２３】
血栓溶解活性を有するペプチド：適切に保護されたPAKの製造
【０１２４】
実施例６２  Boc−Pro−Ala−Lys(Z)  の製造
Boc−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl  638  mg  (1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌した。TLCで原料スポットがなくなったことを確認し、2N  HClでpH  7に調整した。反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水溶液2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  ml  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体509  mg  (91.6％)が得られた。EI−MS  (m/z)  547  [M  −  H]−。
【０１２５】
PAK/イミダゾリン/RGD三元コンジュゲート(一般式I−1−4の化合物)：Ij、Ik、Ilの製造
【０１２６】
実施例６３  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴でBoc−Pro−Ala−Lys(Z)  548  mg  (1  mmol)、HOBt  135  mg  (1  mmol)、DCC  250  mg  (1  mmol)および無水THF  10  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480  mg(1  mmol)およびN−メチルモルホリン100  mg  (1  mmol)と無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体876  mg  (87％)が得られた。Mp  77  −  80℃.
（外３４）
2015529209.tif 000044
＝−12.6(c  =  0.16,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1003  [M  +  Na]+。IR  (KBr):  3315,  3069,  2937,  1671,  1531,  1449,  1394,  1364,  1302,  1167,  1132,  1054,  836,  743,  698,  596,  541,  458  cm−1。
【０１２７】
実施例６４  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン980  mg  (1  mmol)をメタノール3  mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30  min攪拌した。pH  12を保持し、氷浴で10  min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N  HClでpH  7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2  mLで希釈して、2N  HClでpH  2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5  mL  ×  3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体867  mg  (80％)が得られた。EI−MS  (m/z)  965  [M  −  H]−。
【０１２８】
実施例６５  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−  Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl  442  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体421  mg  (42％)が得られた。Mp  97  −  100℃.
（外３５）
2015529209.tif 000045
＝−42.5  (c  =  0.14,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1697  [M  +  H]+.  IR(KBr)  3298,  3070,  2935,  2869,  1642,  1534,  1450,  1369,  1253,  741,  697,  596  cm−1。
【０１２９】
実施例６６  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl  432  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体357  mg  (37％)が得られた。Mp  117  −  120℃.
（外３６）
2015529209.tif 000046
＝−22.3  (c  =  0.17,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1620  [M  +  H]+。IR(KBr)  3303,  3072,  2935,  1644,  1533,  1451,  1394,  1364，1255,  1167,  745,  697,  597  cm−1。
【０１３０】
実施例６７  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンの製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483  mg(0.5  mmol)、HOBt  69  mg  (0.5  mmol)、DCC  126  mg  (0.6  mmol)および無水THF  20  mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl  439  mg  (0.5  mmol)、N−メチルモルホリン50  mg  (0.5  mmol)及び無水THF  5  mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH,  20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体472  mg  (48％)が得られた。Mp  111  −  114℃.
（外３７）
2015529209.tif 000047
＝−15.3  (c  =  0.13,  MeOH).  ESI−MS(m/z)  1667  [M  +  H]+。IR(KBr)  3296,  3071,  2935,  1641,  1534,  1394,  1253,  1170,  834,  745,  697,  594  cm−1。
【０１３１】
実施例６８  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Ser]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ij)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン169  mg  (0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体98  mg  (80％)が得られた。Mp  127  −  128℃.
（外３８）
2015529209.tif 000048
＝−22.4  (c  =  0.13,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1147.5907  [M  +  H]+,  2294.1814  [2M  +  H]+,  3440.7721  [3M  +  H]+,  4587.3628  [4M  +  H]+.  g  =  2.00779.  IR(KBr)  3204,  1672,  1543,  1436,1199,  1133,  837,  801,  722,  598  cm−1。
【０１３２】
実施例６９  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Val]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Ik)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン162  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96  mg  (81％)が得られた。Mp  123  −  124℃.
（外３９）
2015529209.tif 000049
＝−24.6  (c  =  0.13,  MeOH).  FT−MS(m/z)  1159.6271  [M  +  H]+,  2318.2542  [2M  +  H]+,  3476.8813  [3M  +  H]+,  4635.5084  [4M  +  H]+.    g  =  2.00779.  IR(KBr)  3388,  2959,  1666,  1540,  1494,  1198,  1134,  835,  801,  720,  598  cm−1。
【０１３３】
実施例７０  1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[Nω−(Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン  (Il)  の製造
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−  Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−  Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン169  mg(0.1  mmol)とトリフルオロ酢酸6  mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5  mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH,  1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25％アンモニア水でpH  8に調整し、Sephadex  G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96  mg  (81％)が得られた。Mp  153  −  154℃.
（外４０）
2015529209.tif 000050
＝−12.6  (c  =  0.16,  MeOH).  FT−MS  (m/z)  1207.6271  [M  +  H]+,  2414.2542  [2M  +  H]+,  3620.8813  [3M  +  H]+,  4827.5084  [4M  +  H]+.  g  =  2.00789.  IR(KBr)  3385,  2938,  1659,  1541,  1450,  1391,  1251,  1126,  963,  841,  599,  456  cm−1。
【０１３４】
試験例1  本発明化合物Ia〜IlのNOフリーラジカル捕捉試験
体重が250−300gである雄Wistarラットを術前12時間断食させ、自由に水を飲ませ、頸椎脱臼によって死亡させた。迅速的に開胸して胸部大動脈を取り、付着した結合組織を剥離して、血管を長さ3−5  mmの動脈輪に切断してかん流バスに置いた。バス内にKrebs−Henseleit液15  mlを満たし、37℃で定温して、95％  O2−5％CO2ガスを導入した。動脈輪を固定するためのフックにテンショントランスデューサをつなぎ、2チャンネルレコーダーで血管運動曲線を描く。紙の速度が1  mm/minである。静止張力を1.0gに調整し、30  minバランスさせた後、終濃度が10−8  Mになるようにノルエピネフリンを投与することで、早期興奮作用を奏するように動脈収縮させた。ノルエピネフリンを洗い落として、30  minバランスさせ、終濃度が10−8  Mになるようにバスにノルエピネフリンを添加した。収縮張力がプラットフォームレベルで安定した後、バス内に生理食塩水(ブランク)  20  μlまたは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(終濃度が5×10−6  Mである)  20  μl、あるいはNOフリーラジカル捕捉剤(1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、TMMZ)の生理食塩水溶液(終濃度が5×10−6  Mである)20  μlを入れた。安定した後、アセチルコリンの生理食塩水溶液  (終濃度が10−6  Mである)  20  μlを加えた。薬剤のNO捕捉能力は、アセチルコリンによる血管条の拡張が阻害される百分率で表す。試験結果を表1に示す。
【０１３５】
試験結果から、NOを捕捉することによって、Ia−Ilはアセチルコリンの血管ストリップ拡張作用を阻害できることが分かる。ここから分かるように、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤(1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、TMMZ)につなぐことで、アセチルコリンの血管ストリップ拡張を阻害する活性がTMMZより明らかに強い化合物が9つあり、アセチルコリンの血管ストリップ拡張を阻害する活性がTMMZとほぼ同一である化合物が2つあり、アセチルコリンの血管ストリップ拡張を阻害する活性がTMMZより明らかに弱い化合物が1つある。評価された12の化合物のうち、阻害率が30％を超える化合物は4つある。これら4つの化合物はアセチルコリンの血管ストリップ拡張を阻害する活性の順番がIe  >  Ih  >  Ib  >  Ifである。これは、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、全体的にTMMZ基がNOフリーラジカルを捕捉する活性を改良したことを意味している。
【０１３６】
【表１】
2015529209.tif 000051
試験例2  本発明化合物Ia〜Ilのオイグロブリン溶解試験
豚の血と3.8％クエン酸ナトリウム溶液を体積比9:1で混合し、直ちに3000  r/minの速度で10  min遠心分離することで、乏血小板血漿を分離した。50  mLの遠心管に豚の乏血小板血漿2  mLおよび超純水36  mLを入れた。遠心管1本につき酢酸(1％)0.4  mLを加え、十分に混合した。4℃の冷蔵庫に入れ、10  min冷凍して、3000  r/minの速度で10  min遠心分離した。遠心管を反転させて、液体が流れなくなった後、ろ紙で管内壁の液体を吸収した。遠心分離で得られたオイグロブリンを沈殿させ、約40  min凍結乾燥し、こすり落とした。オイグロブリン約35  mgを硼砂バッファー液(pH  9.28)7  mLに溶かした。1時間後オイグロブリンがほとんど溶解して、CaCl2溶液(25  mM)  0.7  mLを添加し、直ちに10  cm×  10  cmのガラスプレート上に厚さ約1  mmで敷いた。凝固した後、ピペットで生理食塩水10  μLまたは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(1  mM)10  μL、あるいはウロキナーゼの生理食塩水溶液  (0.8  mg/mL)10  μLを凝固プレート上に滴下した。両点の間の間隔が1.5  cmより大きく、1サンプル当たり3回滴下した。4時間後溶解円の直径を量り，示度を表2に示した。
【０１３７】
試験結果から、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、全ての化合物が明らかなオイグロブリン溶解活性を示すことが分かる。
【０１３８】
【表２】
2015529209.tif 000052
試験例3    本発明化合物Ia〜Ilのin  vitro血栓溶解試験
SDラット(オス、350  −  400  g)に1200  mg/kgの用量でウレタン溶液を腹腔内注射することで麻酔をかけた。麻酔されたラットを仰臥位で固定させ、右総頸動脈を分離した。近位端で動脈鉗子を挟み、近位端および遠位端でそれぞれ縫合糸を通した。遠位端の縫合糸を毛皮用止血鉗子によって締め、遠位端で挿管した。動脈鉗子を緩めて、全ての動脈血を排出し、あらかじめシリコンオイル化された50  mlの容器に入れた。垂直に固定されたカラスチューブ(長さ20  mm、内径4  mm、外径5  mm、チューブの底がゴム栓で密封されている)にラット動脈血0.8  mlを注入し、速やかにチューブ内にステンレス製の血栓固定ボルトを一つ挿した。当該血栓固定スクリューは直径が0.2  mmのステンレス糸で巻きついてなるものであり、スクリュー部の長さが18  mmであり、15周の螺旋を含む。螺旋の直径が1.8  mmであり、螺旋とつながる柄は、長さが7.0  mmであり、疑問符状を呈する。血液が凝固した40  min後、ガラスチューブの底部のゴム栓を開栓して、ピンセットによって血栓固定スクリューの柄を保持し、ガラスチューブから血栓に包まれた血栓固定スクリューを入念に取り出した。それを三回蒸留した水に懸濁することで、表面に浮いている血を取り除いた。1  h後取り出して、精確に重量を量った。血栓を8  mLの生理食塩水、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(濃度が100  nMである)、あるいはARPAK、またはGRPAK、またはRPAK、またはPAK(配列番号6、7、5、1)の生理食塩水溶液(濃度は100  nM)、あるいはウロキナーゼの生理食塩水溶液(100  IU/mL)に懸濁浸漬して、37℃で恒温したシェーカーの中で振動させた(63  r/min)。2  h後取り出して、正確に重量を量った。投与前後の血栓の質量差を求め、結果を表3に示す。
【０１３９】
試験結果から、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、全ての化合物が明らかなin  vitro血栓溶解活性を示すことが分かった。Ia−Icの活性とARPAK(配列番号6)の活性がほぼ同じであり、Id−Ifの活性とGRPAK(配列番号7)の活性がほぼ同じであり、Ig−Iiの活性とRPAK(配列番号5)の活性がほぼ同じであり、Ij−Ilの活性とPAK(配列番号1)の活性がほぼ同じであるので、Ia−Ilのin  vitro血栓溶解活性は、一方では血栓溶解ペプチドの活性によるが、他方では、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、対応する血栓溶解ペプチドの活性を低減させることはないことが分かった。
【０１４０】
【表３】
2015529209.tif 000053
試験例4  本発明化合物Ia〜Ilのin  vivo血栓溶解試験
SDラット(オス、220−230  g)に1200  mg/kgの用量でウレタン溶液を腹腔内注射することで麻酔をかけた。麻酔されたラットを仰臥位で固定させ、右総頸動脈を分離した。近位端で動脈鉗子を挟み、近位端および遠位端でそれぞれ縫合糸を通した。遠位端の縫合糸を毛皮用止血鉗子によって締め、遠位端で挿管した。動脈鉗子を緩めて、約1mlの動脈血を排出し、1mlの弾丸の中に入れた。垂直に固定されたカラスチューブ(長さ15  mm、内径2.5  mm、外径5.0  mm、チューブの底がゴム栓で密封されている)  にラット動脈血0.1  mlを注入し、速やかにチューブ内にステンレス製の血栓固定ボルトを一つ挿した。当該血栓固定スクリューは直径が0.2  mmのステンレス糸で巻きついてなるものであり、スクリュー部の長さが12  mmであり、15周の螺旋を含む。螺旋の直径が1.0  mmであり、螺旋とつながる柄は、長さが7.0  mmであり、疑問符状を呈する。血液が凝固した15  min後、ガラスチューブの底部のゴム栓を開栓して、ピンセットによって血栓固定スクリューの柄を保持し、ガラスチューブから血栓に包まれた血栓固定スクリューを入念に取り出して、精確に重量を量った。
【０１４１】
バイパス挿管は3つの部分からなる。中部はポリエチレンチューブであり、長さが60.0  mmであり、内径が3.5  mmである。両端は同様なポリエチレンチューブであり、チューブの長さが100.0  mmであり、内径が1.0  mmであり、外径が2.0  mmである。ラットの頸動脈または静脈に挿入されるために、この管の一端が尖るように延伸されて、外径が1.0  mmである。他端の外部に長さ7.0  mm、外径3.5  mmのポリエチレンチューブ(中部のポリエチレンチューブ内に挿入するために、太くした)が嵌められた。3つの部分の内壁はいずれもシリル化された(1％のシリコンオイルエチルエーテル溶液)。血栓に包まれた血栓固定スクリューを中部のポリエチレンチューブの中に入れて、管の両端がそれぞれ二つの太くしたポリエチレン製末端を嵌めている。注射器を使って、尖った端から管にヘパリン生理食塩水溶液(50  IU/kg)をいっぱい入れて、必要に備えた。引き続き麻酔ラットの気管を分離し、気管の挿管を行った。ラットの左外頸静脈を分離し、近位端および遠位端でそれぞれ縫合糸を通し、露出した左外頸静脈に入念に切り目を斜めにつけ、斜めになった切り目から、前記製造されたバイパス管の尖った管を、バイパス管中部(精確に重量を量った血栓固定スクリューを含む)内の血栓固定スクリューの柄から遠ざけて、左外頸静脈開口の近位端に挿入した。注射器を使って、他端の尖った管から精確な量のヘパリン生理食塩水(50  IU/kg)を入れた。この時、注射器がポリエチレンチューブから離れない。止血鉗子により注射器とポリエチレンチューブの間のホースを挟んだ。右総頸動脈の近位端で動脈鉗子で止血し、動脈鉗子の付近で右総頸動脈に入念に切り目を斜めにつけた。ポリエチレンチューブの尖った部分から注射器を抜き出し、ポリエチレンチューブの尖った部分を、動脈の斜めになった切り目の近位端に挿入した。バイパス管の両端も#4の縫合糸により動静脈と固定されている。
【０１４２】
頭皮静脈針を使って、バイパス管の中部(精確に重量を量った血栓固定スクリューを含む)から、生理食塩水(3  mL/kg)、あるいはウロキナーゼの生理食塩水溶液(用量20000  IU/kg)、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(用量0.1  μmol/kg)、あるいはARPAK、またはGRPAK、またはRPAK、またはPAK(配列番号6、7、5、1)の生理食塩水溶液(用量1  μmol/kg)を、血栓固定スクリューから遠ざかる静脈付近に刺した。動脈鉗子を緩めて、血流をバイパス管により動脈から静脈に流せ、ラット動静脈バイパス血栓溶解モデルとなった。注射器中の液体を徐々に血液に注入し、血液循環を利用して静脈−心臓−動脈の順に生理食塩水(ブランク)、ウロキナーゼ(陽性対照)、あるいはARPAK、またはGRPAK、またはRPAK、またはPAK(配列番号6、7、5、1) (成分対照)、あるいはIa−Ilを血栓に作用させた。注射開始の時点から計時し、1  h後バイパス管から血栓固定スクリューを取り出し、精確に重量を量った。各ラットに対して、バイパス管における投与前後の血栓固定スクリューの質量差を求め、試験結果を表4に示す。
【０１４３】
試験結果から、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF (配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことで得られた化合物Ia−Icは、用量0.1μmol/kgでは、いずれも明らかな血栓溶解活性を有するとともに、活性強度が対応する血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)の用量1μmol/kgでの血栓溶解活性強度とほぼ同じであることが分かった。ここから分かるように、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF (配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、有効用量を10倍低減することができる。
【０１４４】
【表４】
2015529209.tif 000054
試験例5  本発明化合物Ia〜Ilのin  vivo抗血栓試験
SDラット(オス、220−230  g)をランダムにグループ分けして、1グループにつき11匹である。一日安静飼育し、飼育を中止して一晩過ごした。ラットに生理食塩水(用量3  mL/kg)、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(用量0.1μmol/kg)、あるいは標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)の生理食塩水溶液(用量10μmol/kg)、あるいはアスピリン(用量33  mg/kg)を胃内投与した。30分後、20％ウレタン溶液を利用してラットに麻酔をかけた後、右頸動脉と左頸静脈を分離した。挿管内にヘパリンナトリウムの生理食塩水溶液を満たした後、一端を左側の静脈に挿入し、他端では抗凝固のために注射器で規定量のヘパリンナトリウムを添加した後、右側の動脉に挿入した。血流は右側の動脉からポリエチレンチューブを通じて左側の静脈に流れ、15分後血栓がついた糸を取り出して重量を記録し、総重量から糸の重量を引いて血栓湿重量となる。試験結果を表5に示す。
【０１４５】
試験結果から、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより得られた化合物Ia−Icは、経口用量0.1μmol/kgでは、いずれも明らかな抗血栓活性を有するとともに、活性強度が対応する標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)の用量10μmol/kgでの抗血栓活性強度とほぼ同じであることが分かった。ここから分かるように、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことにより、有効用量を100倍低減することができる。
【０１４６】
【表５】
2015529209.tif 000055
脳卒中患者に対する本発明化合物の確実な治療効果を評価するための動物モデルの構築
（１）ここで記載されたラット実験プロトコールはジュネーブ動物実験ガイドに合致し、学校倫理委員会に認められている。体重280−305  gのクリーングレードの健康なオスSDラットはVital  River実験動物センターから購入した。これらのラットは血栓の製造または脳卒中モデルの製造にランダムに用いられた。
（２）SDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸動脈を分離し、新鮮な動脉血15  mLを取り、10μLごとに1.5  mLのEP管に入れて、形成された血栓をまず室温で2時間静置し、さらに−20℃の冷蔵庫内で22時間静置した。使用の際、生理食塩水0.5  mLを添加し、ガラス棒ですりつぶして、大きさが均一である血栓塊の生理食塩水懸濁液を調製し、血栓塊一つあたりの体積が約0.1  mm3である。
（３）SDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸動脈を分離し、新鮮な動脉血15  mLを取り、10μLごとに1.5  mLのEP管に入れて、形成された血栓をまず室温で24時間静置した。使用の際、生理食塩水0.5  mLを添加し、ガラス棒ですりつぶして、大きさが均一である血栓塊の生理食塩水懸濁液を調製し、血栓塊一つあたりの体積が約0.1  mm3である。
（４）オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させた。外頸静脈を分離し、外頸静脈から生理食塩水(ブランク)または本発明化合物の生理食塩水溶液を注入した。傷口を縫合し、感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。これは脳卒中直後の治療モデルである。
（５）オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために、2万IUのペニシリンを筋肉注射した。4時間、6時間または24時間後、尾静脈から生理食塩水(ブランク)または本発明化合物の生理食塩水溶液を注入した。これは脳卒中にかかった4時間、6時間および24時間後のラットの治療モデルである。
【０１４７】
脳卒中にかかった4時間、6時間および24時間後の本発明化合物の確実な治療効果を評価するための動物モデルの構築
（１）ラットが脳卒中にかかった直後に本発明化合物の治療を受けること、ラットが脳卒中にかかった4時間後本発明化合物の治療を受けること、ラットが脳卒中にかかった6時間後本発明化合物の治療を受けることによって得られた治療効果とは、ラットが蘇った24時間後観察された行為である。前記行為には、歩き方、右瞼の垂下程度、尾の硬直程度、筋肉張力、頭部が偏る程度、手足の支持力および死亡状況が含まれる。
（２）ラットが脳卒中にかかった24時間後本発明化合物の治療を受けることによって得られた治療効果とは、24時間治療した後観察された行為である。前記行為には、歩き方、右瞼の垂下程度、尾の硬直程度、筋肉張力、頭部が偏る程度、手足の支持力および死亡状況が含まれる。
（３）一度で本発明化合物の治療を受けた脳卒中ラットの治療効果と一度で生理食塩水の治療を受けた脳卒中ラットを比較した。
（４）連続的な治療を受けた脳卒中ラットに対して、24時間につき尾静脈から本発明化合物の生理食塩水を注入し、翌日録画して比較した。
本発明化合物Ia〜Ilの前記動物モデルにおける試験結果は以下のとおりである。
【０１４８】
試験例6  ラットが脳卒中にかかった直後に本発明化合物Ia〜Ilの治療を受けた試験
本発明化合物のin  vivo抗脳卒中活性は神経機能点数で表される。点数が低ければ、活性が強い。SDオスラット(250−300  g)に10％抱水クロラール(400  mg/kg)を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から少し右方へ離れた所で、縦に長さ約2  cmの切り目をつけて、胸鎖乳突筋の内側縁に沿って右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、外頸動脈に小さな切り目をつけて、外頸動脈の遠位端を結紮した。総頸動脈の近位端の動脈鉗子を緩め、血10μlを取り、その後、さらに非侵襲的動脈鉗子によって総頸動脈の近位端を締めた。得られた血10μlを1  mLのEP管内に入れて、まず常温で30分間静置することで、血液を凝固させた。その後、−20℃の冷蔵庫に移して1時間静置し、血液凝塊をしっかりとさせた。1時間後血液凝塊を取り出し、生理食塩水1  mLを添加した。シャベルを使って、血液凝塊を比較的均一で細かい血栓につぶした後、細かい血栓の懸濁液を1  mLの注射器に移し、必要に備えた。ラットの内頸動脈鉗子を緩めて、同時に1  mLの注射器内の血栓懸濁液をゆっくりとラット外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端のラット大脳に注入した。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈と総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させた。ラットの総頸静脈を分離し、または直ちに静脈を結紮して、傷口のところに3滴のペニシリンを滴下し、傷口を縫合した。動物が蘇った後、偽手術群として、ウロキナーゼの生理食塩水溶液(陽性対照群、用量20000  IU/kg)を注入するか、生理食塩水(ブランク群、用量3  ml/kg)を注入するか、TMMZの生理食塩水溶液(成分対照群、用量1μmol/kg)を注入するか、あるいは血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)の生理食塩水溶液(成分対照群、用量1μmol/kg)を注入し、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(用量0.1μmol/kg)を注入した。ラットが蘇った24時間後、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表6に示す。
【０１４９】
試験結果から分かるように、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことで得られた化合物Ia−Icは用量0.1μmol/kgでは、いずれも明らかな抗脳卒中活性を有する。一方、用量20000  IU/kgでは、ウロキナーゼは明らかな抗脳卒中活性を示していない。同様に、用量1μmol/kgでは、血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)も明らかな抗脳卒中活性を示していない。これにより、Lysで血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことで、化合物に抗脳卒中作用を持たせることが分かった。そのうち、用量1μmol/kgでは、抗脳卒中活性が用量20000  IU/kgでのウロキナーゼの抗脳卒中活性とほぼ同一である化合物は4つあり、抗脳卒中活性が用量20000  IU/kgでのウロキナーゼの抗脳卒中活性より明らかに強い化合物は8つあった。
【０１５０】
【表６】
2015529209.tif 000056
試験例7  ラットが脳卒中にかかった直後に本発明化合物Ia〜Ilでの治療を受けた場合の脳梗塞体積試験
試験例6のラットが蘇った24時間後、神経機能欠損程度を評価した。その後、ウレタンで麻酔をかけた後、速やかに断頭し脳を取った。脳組織を−20℃の冷蔵庫で2時間置いて後、前頭極から合計6枚の約2mmの冠状連続的な切片を行った。その後、2％TTC溶液の中に置いて、37℃で30  min遮光してインキュベートした。そして、脳切片の色変化を観察したところ、正常脳組織がTTCにより赤色に染められたが、虚血脳組織、即ち梗塞脳組織が白色を呈する。その後、デジタルカメラで撮影し、SPSS統計ソフトで処理することで、冠状切片における梗塞脳組織の体積および正常脳組織の体積を計算した。試験結果を表7に示す。
【０１５１】
試験結果から、Lysによって血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)および標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)をフリーラジカル捕捉剤TMMZにつなぐことで得られた化合物Ia−Icは、用量0.1μmol/kgでは、いずれも脳卒中ラットの脳梗塞体積を有効に低減でき、そしてこのような作用が用量20000  IU/kgでのウロキナーゼの作用より明らかに強いことが分かった。
【０１５２】
【表７】
2015529209.tif 000057
試験例8  ラットが脳卒中にかかった直後に異なる用量で本発明化合物Ieの治療を受けた試験
化合物Ia〜Ilが前記試験で示した治療作用は用量依存関係を有することを説明するために、本発明はあらゆる試験結果を分析、比較および総合したうえで、化合物Ieを代表として選び、用量−効果関係試験が行われた。強調すべきこととして、試験例1−7においてIa〜Ilのほかの化合物とIeが類似したNOフリーラジカル捕捉、オイグロブリン溶解、血栓溶解、抗血栓、並びに脳卒中ラット治療などの効果を奏したので、Ia〜Ilのほかの化合物はIeと同様に用量依存的治療作用が得られるはずである。
【０１５３】
SDオスラット(250−300  g)に10％抱水クロラール(400  mg/kg)を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から少し右方へ離れた所で、縦に長さ約2  cmの切り目をつけて、胸鎖乳突筋の内側縁に沿って右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、外頸動脈に小さな切り目をつけて、外頸動脈の遠位端を結紮した。総頸動脈の近位端の動脈鉗子を緩め、血10μlを取り、その後、さらに非侵襲的動脈鉗子によって総頸動脈の近位端を締めた。得られた血10μlを1  mLのEP管内に入れて、まず常温で30分間静置することで、血液を凝固させた。その後、−20℃の冷蔵庫に移して1時間静置し、血液凝塊をしっかりとさせた。1時間後血液凝塊を取り出し、生理食塩水1  mLを添加した。シャベルを使って、血液凝塊を比較的均一で細かい血栓につぶした後、細かい血栓の懸濁液を1  mLの注射器に移し、必要に備えた。ラットの内頸動脈鉗子を緩めて、同時に1  mLの注射器内の血栓懸濁液をゆっくりとラット外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端のラット大脳に注入した。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈と総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させた。ウロキナーゼの生理食塩水溶液(陽性対照群、用量20000  IU/kg)を注入するか、tPAの生理食塩水溶液(陽性対照群，用量3  mg/kg)を注入するか、生理食塩水(ブランク群、用量3  ml/kg)を注入するか、あるいは化合物Ieの生理食塩水溶液(用量1μmol/kg、0.1μmol/kg、0.1μmol/kg)を注入した。ラットが蘇った24時間後、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表8に示す。結果から分かるように、ラットが脳卒中にかかった直後に1μnmol/kg、0.1μnmol/kgおよび0.01μnmol/kgの化合物Ieでの治療を受けた場合、神経機能点数が0であるラットの百分率はそれぞれ60％、30％および0％であり、神経機能点数が1であるラットの百分率はそれぞれ20％、30％および10％であった。ここから、化合物Ieの抗脳卒中活性は用量依存性を示していることが分かった。さらに、20000  IU/kgウロキナーゼおよび3  mg/kg  tPAで治療した脳卒中ラットの神経機能点数が0であるラットの百分率はそれぞれ10％および40％であり、神経機能点数が1であるラットの百分率はそれぞれ50％および10％である。上述した結果と比べると、1μnmol/kgおよび0.1μnmol/kgの化合物Ieの治療効果は明らかに優れる。
【０１５４】
【表８】
2015529209.tif 000058
試験例9  ラットが脳卒中にかかった4時間後1μmol/kgの本発明化合物Ieでの連続的な治療を6回受けた試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、活性が強い。オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。4時間後尾静脈から化合物Ie(用量1μmol/kg，n  =  11)の生理食塩水溶液、またはウロキナーゼ(用量20000  IU/kg、n  =  6)の生理食塩水溶液、またはtPA(用量3  mg/kg、n  =  6)の生理食塩水溶液を注入した。一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からウロキナーゼの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からtPAの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表9−1、9−2および9−3に示す。
【０１５５】
表9−1のデータから、ラットが脳卒中にかかった4時間後、一日あたり用量1μmol/kgの化合物Ieでの治療を一回受け、6回治療し続いた場合、1匹が翌日突然死亡した以外、ほかの10匹のうち8匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、2匹がやや神経機能欠損兆候をもつ。ここから、用量1μmol/kgでは、化合物Ieは黄金期を超えた脳卒中に確実な治療作用を有することが分かった。
【０１５６】
【表９】
2015529209.tif 000059
表9−2のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった4時間後、一日あたり用量20000  IU/kgのウロキナーゼでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち2匹が48時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるまたはやや神経機能欠損兆候が残るように好転したラットがいなかった。
【０１５７】
【表１０】
2015529209.tif 000060
表9−3のデータから分かるように、ラット脳卒中にかかった4時間後、一日あたり用量3mg/kgのtPAでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち1匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるように好転したラットがいなかった。やや神経機能欠損兆候が残るように好転したラットがいた。
【０１５８】
【表１１】
2015529209.tif 000061
表9−1、9−2および9−3のデータをまとめて分かるように、脳卒中にかかった4時間後のラットに対して、二日連続して治療したとしても、用量1μmol/kgの化合物Ieが用量20000  IU/kgのウロキナーゼおよび用量3mg/kgのtPAより優れる。
【０１５９】
試験例10  ラットが脳卒中にかかった6時間後1μmol/kgの本発明化合物Ieでの連続的な治療を6回受けた試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie(用量1μmol/kg，n=11)の生理食塩水溶液、またはウロキナーゼ(用量20000  IU/kg，n  =  6)の生理食塩水溶液、またはtPA(用量3  mg/kg，n  =  6)の生理食塩水溶液を注入した。一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からウロキナーゼの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からtPAの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表10−1、10−2および10−3に示す。
【０１６０】
表10−1のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった6時間後、一日あたり用量1μmol/kgの化合物Ieでの治療を一回受け、6回治療し続いた場合、2匹が翌日突然死した以外、ほかの9匹のうち2匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、1匹がやや神経機能欠損兆候が残り、6匹が未損傷側へ回って尾行するように歩く兆候が残っている。ここから、用量1μmol/kgでは、化合物Ieは黄金期を超えた脳卒中に確実な治療作用を有することが分かった。
【０１６１】
【表１２】
2015529209.tif 000062
表10−2のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった6時間後、一日あたり用量20000  IU/kgのウロキナーゼでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち4匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、1匹のラットが好転し神経機能欠損兆候が全くなくなって、1匹のラットが意識障害が残り、自主的に歩く兆候がない。
【０１６２】
【表１３】
2015529209.tif 000063
表10−3のデータから分かるように、ラット脳卒中にかかった6時間後、一日あたり用量3mg/kgのtPAでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち2匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるように好転したラットがいなかった。2匹が神経機能欠損兆候がやや残り、1匹が未損傷側へ回って尾行するように歩く兆候が残り、1匹が意識障害が残り、自主的に歩く兆候がない。
【０１６３】
【表１４】
2015529209.tif 000064
表10−1、10−2および10−3のデータをまとめて分かるように、脳卒中にかかった6時間後のラットに対して、二日連続して治療したとしても、用量1μmol/kgの化合物Ieが用量20000  IU/kgのウロキナーゼおよび用量3mg/kgのtPAより優れる。
【０１６４】
試験例11  ラットが脳卒中にかかった6時間後一回目5μmol/kg、その後2μmol/kg  5回の本発明化合物Ieでの治療を受けた場合の試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie  (一回目の用量5  μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2  μmol/kg、n=12)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表11に示す。
【０１６５】
表11のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった6時間後、1日目用量5μmol/kgの化合物Ieでの治療を一回受けて、その後一日につき一回用量2μmol/kgの化合物Ieでの治療を5日受けることで、確実な治療効果が得られた。2匹が死亡した以外、治療を受けた12匹のラットのうち、残った10匹のラットの中6匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、2匹がやや神経機能欠損兆候が残り、1匹が未損傷側へ歩く兆候が残り、1匹が未損傷側へ回って尾行するように歩く兆候が残っていた。ここから、化合物Ieの連続的な治療は黄金期を超えた脳卒中に確実な効果を有することが分かった。
【０１６６】
【表１５】
2015529209.tif 000065
試験例12  ラットが脳卒中にかかった24時間後一回目5μmol/kgで、次に2μmol/kgで5回本発明化合物Ieでの治療を受けた場合の試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。24時間後尾静脈から化合物Ie  (一回目の用量5  μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2  μmol/kg、n=12)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表12に示す。
【０１６７】
表12のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった24時間後、1日目用量5μmol/kgの化合物Ieでの治療を一回受けて、その後一日につき一回用量2μmol/kgの化合物Ieでの治療を5日受けることで、確実な治療効果が得られた。3匹が死亡した以外、治療を受けた12匹のラットのうち、残った9匹のラットの中8匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、1匹がやや神経機能欠損兆候が残っていた。ここから、化合物Ieの連続的な治療は黄金期を超えた脳卒中に確実な効果を有することが分かった。
【０１６８】
【表１６】
2015529209.tif 000066
試験例13  ラットが脳卒中にかかった6時間後2μmol/kgの本発明化合物Ieでの治療を6回受けた場合の試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400  mg/kg体重で10％抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3  cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5  mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。上述した試験例と異なり、本試験例で使用される血栓塊は−24℃で保存した血栓により製造された血栓塊の生理食塩水懸濁液ではなく、室温で24時間静置したもっと陳旧性血栓により製造された、明らかに硬い血栓塊の生理食塩水懸濁液である。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie(一回目の用量5  μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2  μmol/kg)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表13に示す。
【０１６９】
【表１７】
2015529209.tif 000067
表13のデータから分かるように、陳旧性血栓により誘導されたラット脳卒中6時間後のモデルにおいて、一日につき一回用量2μmol/kgの化合物Ieでの治療を6回連続して受けることで、確実な治療効果が得られた。6匹が死亡した以外、治療を受けた12匹のラットのうち、残った6匹のラットの中1匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、5匹がやや神経機能欠損兆候が残っていた。ここから、化合物Ieの連続的な治療は陳旧性脳卒中に確実な効果を有することが分かった。
強調すべきこととして、試験例1−7においてIa〜Ilのほかの化合物とIeが類似したNOフリーラジカル捕捉、オイグロブリン溶解、血栓溶解、抗血栓、並びに脳卒中ラット治療などの効果を奏したので、Ia〜Ilのほかの化合物はIeと同様に用量依存的治療作用が得られるはずである。
試験例14  本発明化合物Ia〜Ilの濃度1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  Mにおけるナノ構造試験
三回蒸留した水を利用して、本発明化合物Ia〜Ilをそれぞれ1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  Mの溶液に調製した。10  μLの溶液を吸い取って、銅メッシュの表面に滴下した。銅メッシュの下にろ紙を当てて、自然乾燥させた。透過電子顕微鏡(JEOL、JEM−  1230)により観察し、形態と粒子径を写真の形で記録した。
１．被験化合物：本発明化合物Ia〜Il。
２．試験方法：三回蒸留した水を利用して、被験化合物（Ia−Il）を1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  Mの溶液に調製した。微量の溶液（10  μL）を吸い取って、銅メッシュの表面に滴下した。銅メッシュの下にろ紙を当てて、自然乾燥させた。透過電子顕微鏡(JEOL、JEM−  1230)により形態と粒子径を観察し写真の形で記録した。
３．試験結果を図25−図36に示す。図25は本発明化合物Iaの1×10−6  M、1  ×  10−9  Mおよび1  ×  10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIaのナノ構造が直径3.1  nm〜86.1  nmのナノスフィアである。図26は本発明化合物Ibの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIbのナノ構造が直径4.3  nm〜297.9  nmのナノスフィアである。図27は本発明化合物Icの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIcのナノ構造がそれぞれ直径2.2  nm〜165.7  nmのナノスフィアである。図28は本発明化合物Idの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIdのナノ構造が直径16.2  nm〜201.2  nmのナノスフィアである。図29は本発明化合物Ieの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIeのナノ構造が直径3.3  nm〜138.9  nmのナノスフィアである。図30は本発明化合物Ifの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIfのナノ構造が直径3.6  nm〜82.4  nmのナノスフィアである。図31は本発明化合物Igの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIgのナノ構造が直径6.3  nm〜264.5  nmのナノスフィアである。図32は本発明化合物Ihの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIhのナノ構造が直径5.1  nm〜149.8  nmのナノスフィアである。図33は本発明化合物Iiの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIiのナノ構造が直径4.7  nm〜107.7  nmのナノスフィアである。図34は本発明化合物Ijの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIjのナノ構造が直径9.1  nm〜73.7  nmのナノスフィアである。図35は本発明化合物Ikの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIkのナノ構造が直径10.1  nm〜66.7  nmのナノスフィアである。図36は本発明化合物Ilの1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIlのナノ構造が直径6.1  nm〜153.3  nmのナノスフィアである。
【０１７０】
試験例15  本発明化合物Ia〜Ilの濃度1×10−6  M、1×10−9  Mおよび1×10−12  Mにおける高分解能FT−  MS試験
三回蒸留した水を利用して、化合物Ia−Ilを2.5  μMの溶液に調製した。10  μLの溶液を吸い取ってアプライし、solariX  FT−ICR質量スペクトル(Bruker  Daltonik)により分子間会合状態を観察し、データを記録した。結果を表14−表16に示す。
【０１７１】
【表１８】
2015529209.tif 000068
【０１７２】
【表１９】
2015529209.tif 000069
【０１７３】
【表２０】
2015529209.tif 000070
表14−表16はFT高分解能質量スペクトルにより測定した精確な質量データである。これらの質量データによれば、本発明化合物Ia−Ilは1×10−6  M、1×10−9および1×10−12  Mという三つの濃度で同時に2量体、3量体および4量体を検出したことが分かった。ここから分かるように、本発明化合物は水溶液において同時に2量体、3量体および4量体を形成できる。
【０１７４】
試験例16  本発明化合物Ieの濃度10.0  μM、1.0  μM、0.1  μM、0.01  μMにおける高分解能FT−MS試験
質量スペクトルを視認化させるために、三回蒸留した水を利用して、化合物Ieをそれぞれ10.0  μM、1.0  μM、0.1  μM、0.01  μMの溶液に調製した。10  μLの溶液を吸い取ってアプライし、solariX  FT−ICR質量スペクトル(Bruker  Daltonik)により分子間会合状態を観察し、スペクトルを記録した。結果を図37−図40に示す。図37は本発明化合物Ieの濃度0.01  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルであり、915.84146が2量体の三価イオンであり、1030.32114が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。図38は本発明化合物Ieの濃度0.1  μMにおける高分解能FT−MS質量スペクトルであり、915.84124が2量体の三価イオンであり、1030.32208が3量体の四価イオンであり、1099.00829が4量体の五価イオンである。図39は本発明化合物Ieの濃度1  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルであり、915.84095が2量体の三価イオンであり、1030.32067が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。図40は本発明化合物Ieの濃度10  μMにおける高分解能FT−  MS質量スペクトルであり、915.84163が2量体の三価イオンであり、1030.32067が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。
【０１７５】
本発明化合物が水溶液において形成した2量体、3量体および4量体をさらに組み立て、直径2  nm〜300  nmのナノスフィアが形成された。これらのサイズのナノスフィアのうち、直径が100  nm未満のナノスフィアの数は99％を超えている。ナノ薬学における公知事実の一つとして、直径が100  nm未満のナノスフィアが血液輸送においてマクロファージに取り込まれにくく、毛細血管壁を通過しやすい。これらの性能により、本発明の化合物は血液脳関門を通過することが可能である。本発明化合物は、血液脳関門通過可能な性能があることから、治療を受けた脳卒中ラットの脳組織に本発明化合物の代謝物が検出された。
【０１７６】
試験例17  高分解能FT−  MSにより本発明化合物Ieで治療したラットの脳組織における代謝物を監視する試験
ラット大脳全体を取り、50  mLの遠心管に置き、0.9％  NaCl溶液10  mL添加し、ホモジネートして均一な懸濁物が得られた。その後、3000  rpmの条件で10  min遠心分離し、上澄み液5  mLを取り、さらにメタノール10  mLを添加して、均一に振盪した後、3000  rpmの条件で10  min遠心分離した。上澄み液を取り、減圧濃縮し蒸発乾燥させた。さらにメタノール1  mLを添加して、また12000  rpmの条件で10  min遠心分離することで上澄み液が得られた。当該上澄み液は化合物Ieで治療したラットの脳組織における代謝物の含有量の監視に用いられた。
高分解能FT−  MSの測定結果によれば、脳に二つの代謝物M1およびM2があることが示された。そのうち、M1の[M+1]+が291.06971であり、分子式がC15H19O5N2である。M2の[M+1]+が307.04350であり、分子式がC15H19O4N2である（質量スペクトルの条件：アプライ量10  μL、電離モデルES+、コーン電圧30  V、移動相流速0.2  mL/min）。これらのデータから、代謝物M1およびM2が以下の化合物であると推定できる。
【０１７７】
【化１１】
2015529209.tif 000071
【０１７８】
【表２１】
2015529209.tif 000072
これにより、本発明化合物Ieは確実に血液脳関門を通過し、脳内におけるNOフリーラジカル捕捉、血栓溶解および抗血栓の治療効果を達成できることが分かった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類と、血栓溶解活性を有するペプチドと血栓へのターゲティングペプチドとが適当なリンカーで連接されてなる三元コンジュゲート。
【請求項２】
式Iに示すものである請求項1に記載の三元コンジュゲート。
【化１２】
2015529209.tif 000073
（式中、NNはNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類を表し、AA1は少なくとも3つの連結用基を有するリンカーを表し、AA2は血栓溶解活性を有するペプチドを表し、AA3は血栓へのターゲティングペプチドを表す。）
【請求項３】
前記NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンである請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項４】
前記連結用基がカルボキシル基およびアミノ基からなる群より選ばれる請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項５】
前記リンカーが天然アミノ酸、とりわけL−Lys、L−AspまたはL−Gluである請求項4に記載の三元コンジュゲート。
【請求項６】
前記血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むオリゴペプチド、あるいはPAK配列、AKP配列またはKAP配列を構造単位として含む繰り返し配列ペプチドである請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項７】
前記血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項８】
前記血栓へのターゲティングペプチドがRGDペプチド(配列番号2)とYIGSペプチド(配列番号31)をコンジュゲートように修飾してなるポリペプチドである請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項９】
前記NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、前記リンカーがL−Lys、L−AspまたはL−Gluであり、前記血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ前記血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである請求項1又は2に記載の三元コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の三元コンジュゲート及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記化合物がナノスフィア構造を形成してよい請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血栓溶解薬、NOフリーラジカル捕捉薬または抗血栓薬である請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
脳卒中または脳梗塞を治療する医薬である請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
発症時間が3時間を超える脳卒中または脳梗塞の治療に用いられる請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（１）NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)、少なくとも3つの連結用基を有するリンカー(AA1)、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)及び血栓へのターゲティングペプチド(AA3)を提供する工程（前記リンカーが第一連結用基、第二連結用基及び第三連結用基をもつ）、
（２）適当な反応条件下において、前記NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)と前記リンカー(AA1)の第一連結用基をつなぎ、一般式IM−1の化合物を形成する工程、
NN−AA1    (IM−1)
（３）適当な反応条件下において、前記血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)と一般式IM−1の化合物をつなぎ、一般式IM−2の化合物を形成する工程（前記血栓溶解活性を有するペプチドの一端が前記リンカーの第二連結用基とつながる）、
NN−AA1−AA2    (IM−2)
（４）適当な反応条件下において、前記血栓へのターゲティングペプチド(AA3)と一般式IM−2の化合物をつなぎ、一般式Iの化合物を形成する工程（前記血栓へのターゲティングペプチドの一端が前記リンカーの第三連結用基とつながる）を含む製造方法であって、
但し工程(3)と工程(4)の順序を交換してよい式Iに示す請求項1に記載の三元コンジュゲートの製造方法。
【化１３】
2015529209.tif 000074
（式中、NNはNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類を表し、AA1は少なくとも3つの連結用基を有するリンカーを表し、AA2は血栓溶解活性を有するペプチドを表し、AA3は血栓へのターゲティングペプチドを表す。）
【請求項１６】
工程(1)が、さらに、前記リンカー(AA1)の第二および第三連結用基を保護基で保護し、且つ血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)および血栓へのターゲティングペプチド(AA3)における、連結用末端を除く活性基を保護基で保護することを含み、
工程(3)が、さらに、まず保護された第二連結用基を脱保護して、次に前記血栓溶解活性を有するペプチドと前記脱保護した第二連結用基をつなぐことを含み、
工程(4)が、さらに、まず保護された第三連結用基を脱保護して、次に前記血栓へのターゲティングペプチドと前記脱保護した第三連結用基をつなぐことを含み、
そして、工程(4)の後に、さらに、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)および血栓へのターゲティングペプチド(AA3)上の保護された活性基を脱保護することを含む請求項15に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記第一連結用基がアミノ基であり、且つ前記第二および第三連結用基がカルボキシル基およびアミノ基からなる群より選ばれる請求項15または16に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記リンカーが天然アミノ酸、とりわけL−Lys、L−AspまたはL−Gluである請求項17に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)、AKP配列(配列番号3)またはKAP配列(配列番号4)を含むオリゴペプチド、あるいはPAK配列、AKP配列またはKAP配列を構造単位として含む繰り返し配列ペプチドである請求項17に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである請求項17に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類が1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンであり、前記リンカーがL−Lys、L−AspまたはL−Gluであり、前記血栓溶解活性を有するペプチドがPAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチドであり、且つ前記血栓へのターゲティングペプチドがRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチドである請求項15または16に記載の製造方法。