【手続補正書】
【提出日】平成27年11月25日(2015.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であるマウス細胞又は繁殖可能マウスの作製方法であって、
マウスが
(a)染色体12のそれぞれのコピー上に各遺伝子導入重鎖遺伝子座を含み、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている
ゲノムを有し、
方法が、
(c)1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを染色体12のDNAに、ヒト遺伝子セグメントがマウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように挿入するステップによって、遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む遺伝子導入マウス胚性幹細胞を構築するステップ、
(d)ステップ(c)と同時に又は別々に、内在性抗体重鎖発現を不活性化するために前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分を除去するステップであって、除去がマウスADAM6遺伝子を含むステップ、
(e)ステップ(c)又は(d)と同時に又は別々に、受精能を回復させるために、1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子を胚性幹細胞ゲノムに挿入するステップ、並びに場合により
(f)繁殖可能マウス又はその後代に胚性幹細胞を成育させるステップであって、前記マウス又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であり、且つ、ADAM6をコードしており、更には、内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分がゲノム中の両方の染色体12から除去されており、場合により前記繁殖可能マウス又は後代がオスであるステップ
のステップを含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウス若しくはマウス細胞が、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
方法。
【請求項２】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であるマウス細胞又は繁殖可能マウスの作製方法であって、
マウスが
(a)染色体12のそれぞれのコピー上に各遺伝子導入重鎖遺伝子座を含み、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている
ゲノムを有し、
方法が、
(c)1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを染色体12のDNAに、ヒト遺伝子セグメントがマウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように挿入するステップによって、遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む遺伝子導入マウス胚性幹細胞を構築するステップ、
(d)ステップ(c)と同時に又は別々に、内在性抗体重鎖発現を不活性化するために前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分を除去するステップであって、除去がマウスADAM6遺伝子を含むステップ、
(e)子マウス又はその後代に胚性幹細胞を成育させるステップであって、前記子マウス又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座を含むステップ
(f)前記マウス由来の第二の胚性幹細胞を派生させるステップ、及び、受精能を回復させるために、前記第二の胚性幹細胞のゲノムに1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子を挿入するステップ、並びに場合により
(g)繁殖可能マウス又はその後代に第二の胚性幹細胞を成育させるステップであって、前記マウス又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であり、且つ、ADAM6をコードしており、更には、内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分がゲノム中の両方の染色体12から除去されており、場合により前記繁殖可能マウス又は後代がオスであるステップ
のステップを含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウス若しくはマウス細胞が、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
方法。
【請求項３】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である繁殖可能マウスの作製方法であって、
マウスが
(a)染色体12のそれぞれのコピー上に各遺伝子導入重鎖遺伝子座を含み、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている
ゲノムを有し、
方法が、
(c)1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを染色体12のDNAに、ヒト遺伝子セグメントがマウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように挿入するステップによって、遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む遺伝子導入マウス胚性幹細胞を構築するステップ、
(d)ステップ(c)と同時に又は別々に、内在性抗体重鎖発現を不活性化するために前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分を除去するステップであって、除去がマウスADAM6遺伝子を含むステップ、
(e)子マウス又はその後代に胚性幹細胞を成育させるステップであって、前記子マウス又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座を含むステップ、並びに
(f)前記子マウス又は後代と、そのゲノムが1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子を含むさらなるマウスとを繁殖させるステップによって、繁殖可能マウス又はその後代を成育させるステップであって、前記繁殖可能なマウス又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であり、且つ、発現可能なADAM6をコードしており、更には、内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分がゲノム中の両方の染色体12から除去されており、場合により前記繁殖可能マウス又は後代がオスであるステップ
のステップを含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウスが、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
方法。
【請求項４】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である繁殖可能げっ歯類の作製方法であって、
げっ歯類が
(a)マウス染色体12又は前記げっ歯類についての同等な染色体のそれぞれのコピー上に各遺伝子導入重鎖遺伝子座を含み、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている
ゲノムを有し、
方法が、
(c)1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを前記染色体のDNAに、ヒト遺伝子セグメントがげっ歯類重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように挿入するステップによって、遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む遺伝子導入胚性幹細胞を構築するステップ、
(d)ステップ(c)と同時に又は別々に、内在性抗体重鎖発現を不活性化するために前記染色体のげっ歯類内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分を除去するステップであって、除去がADAM6遺伝子を含むステップ、
(e)ステップ(c)又は(d)と同時に又は別々に、受精能を回復させるために、1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子を胚性幹細胞ゲノムに挿入するステップ、並びに
(f)繁殖可能げっ歯類又はその後代に胚性幹細胞を成育させるステップであって、前記げっ歯類又はその後代のゲノムが前記遺伝子導入重鎖遺伝子座に関してホモ接合性であり、且つ、ADAM6をコードしており、更には、内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分がゲノム中の両方の前記染色体から除去されており、場合により前記繁殖可能げっ歯類又は後代がオスであるステップ
のステップを含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記げっ歯類が、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記げっ歯類が、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有するマウスである
方法。
【請求項５】
繁殖可能なオスのマウスを産生するためのマウスの製造におけるADAM6遺伝子の使用であって、
マウスが
(a)ヒト遺伝子セグメントがマウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように、染色体12のDNAに挿入された1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む遺伝子導入重鎖遺伝子座、並びに
(b)内在性抗体重鎖発現を不活性化するための前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分の除去であって、前記除去がマウスADAM6遺伝子を含む、除去
を含むゲノムを有し、
1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子がゲノムに挿入されており、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウスが、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
使用。
【請求項６】
繁殖可能なオスのマウスに成育できる細胞を産生するためのマウス細胞の製造におけるADAM6遺伝子の使用であって、
マウス細胞が
(a)ヒト遺伝子セグメントがマウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されるように、染色体12のDNAに挿入された1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む遺伝子導入重鎖遺伝子座、並びに
(b)内在性抗体重鎖発現を不活性化するための前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分の除去であって、前記除去がマウスADAM6遺伝子を含む、除去
を含むゲノムを有し、
1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子がゲノムに挿入されており、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウス若しくはマウス細胞が、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
使用。
【請求項７】
発現可能なADAM6遺伝子が一方又は両方のマウスの染色体12に挿入されている、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項８】
前記ヒト遺伝子セグメントの挿入及び内在性VDJ DNAの除去が同時に行われるように、前記ヒト遺伝子セグメントを、内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分を置き換えるようにマウス染色体12に挿入し、場合により内在性VDJ領域全体が置き換えられる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項９】
最終的な繁殖可能マウスがADAM6a及びADAM6bタンパク質の両方又はラットADAM6タンパク質を発現できるようにマウスADAM6a及びADAM6b遺伝子又はラットADAM6遺伝子を挿入する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
最終的な繁殖可能マウス又は後代のゲノムが、挿入された各ADAM6遺伝子に関してホモ接合性であり、場合によりゲノムが2コピーを超えるマウスADAM6a及び/又はADAM6b遺伝子を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
各生物がマウスの代わりにラットであり、各前記染色体が染色体12の代わりに染色体6である代替を有する、又は各細胞がマウス細胞の代わりにラット細胞であり、各前記染色体が染色体12の代わりに染色体6である代替を有し、請求項1から6に記載の選択肢(iii)が適用されない、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である、場合によるオスの繁殖可能マウスであって、
(a)染色体12上に前記遺伝子導入重鎖遺伝子座を含む、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている、
ゲノムを有し、
ゲノムの前記染色体12が
(c)マウス又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されている1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座、
(d)内在性抗体重鎖発現を不活性化するための前記染色体12のマウス内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分の除去であって、前記除去がマウスADAM6遺伝子を含む、除去、
を含み、
ゲノムが
(e)1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子の挿入
を含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記マウスが、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記マウスが、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有する
マウス。
【請求項１３】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である、場合によりオスの繁殖可能ラットであって、
(a)前記遺伝子導入重鎖遺伝子座を染色体6上に含み、並びに
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている
ゲノムを有し、
ゲノムの前記染色体6が
(c)ラット又はヒト重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されている1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座、
(d)内在性抗体重鎖発現を不活性化するための前記染色体6のラット内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分の除去であって、前記除去がラットADAM6を含む、除去
を含み、並びに
ゲノムが
(e)1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子の挿入
を含み、
場合により、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記ラットが、ヒト標的抗原を含む
ラット。
【請求項１４】
ゲノムが染色体12のそれぞれのコピー上に遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む、請求項12に記載のマウス、又は、ゲノムが染色体6のそれぞれのコピー上に遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座を含む、請求項13に記載のラット。
【請求項１５】
遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座に関してホモ接合性である、場合によるオスの繁殖可能げっ歯類であって、
(a)第一の染色体のそれぞれのコピー上に各重鎖遺伝子座を含む、及び
(b)内在性抗体重鎖発現について不活性化されている、
ゲノムを有し、
ゲノムの各第一の染色体が
(c)げっ歯類重鎖定常領域、場合によりCmu及び/又はCgammaの上流に作動可能に連結されている1つ又は複数のヒトVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒトD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトJH遺伝子セグメントを含む遺伝子導入抗体重鎖遺伝子座、
(d)内在性抗体重鎖発現を不活性化するための前記染色体の内在性重鎖VDJ領域の全体又は部分の除去であって、前記除去がADAM6を含む、除去、
を含み、
ゲノムが
(e)1つ又は複数の発現可能なADAM6遺伝子の挿入
を含み、
(i)前記ゲノムが、ヒトEλエンハンサーを含むラムダ導入遺伝子及び/若しくはヒトEκエンハンサーを含むカッパ導入遺伝子を含み、又は
(ii)前記げっ歯類が、ヒト標的抗原を含み、又は
(iii)前記げっ歯類が、129、BALB/c、C57BL/6N、C57/BL/6J、JM8、AB2.1、AB2.2、129S5若しくは129Svから選択される遺伝的背景を有するマウスである
げっ歯類。
【請求項１６】
挿入される各ADAM6遺伝子が(i)動物がマウスである場合は染色体12上にあり、又は(ii)動物がラットである場合は染色体6上にある、請求項12に記載のマウス又は請求項13に記載のラット。
【請求項１７】
ADAM6遺伝子が、(i)一方又は両方の遺伝子導入重鎖遺伝子座内に、又は(ii)一方又は両方の遺伝子導入重鎖遺伝子座の20Mb以内に挿入される、請求項7に記載の方法若しくは使用、又は請求項12から16のいずれか一項に記載のマウス、ラット若しくはげっ歯類。
【請求項１８】
ヒト遺伝子セグメントが各重鎖遺伝子座中の内在性VDJ領域の全体又は部分を置き換える、請求項12から17のいずれか一項に記載のマウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項１９】
ゲノムが、挿入された発現可能なマウスADAM6a及びADAM6b遺伝子を含むか、又は、ゲノムが、挿入された発現可能なラットADAM6遺伝子を含む、請求項12から18のいずれか一項に記載のマウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項２０】
ゲノムが挿入された各ADAM6遺伝子に関してホモ接合性であり、場合によりゲノムがラットADAM6、マウスADAM6a及びマウスADAM6b遺伝子から選択される2コピーを超えるADAM6遺伝子を含む、請求項12から19のいずれか一項に記載のマウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項２１】
ゲノムが標的化ベクター、例えば、BACベクターから挿入される発現可能なADAM6を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法、使用、マウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項２２】
ゲノムが標的化又は無作為挿入によって胚性幹細胞又は接合体に挿入されるADAM6エクソンを含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法、使用、マウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項２３】
発現可能なADAM6遺伝子が、内因性マウスADAM6プロモーターに作動可能に連結されたラットADAM6ヌクレオチド配列又は内因性ラットADAM6プロモーターに作動可能に連結されたマウスADAM6ヌクレオチド配列である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法、使用、マウス、ラット又はげっ歯類。
【請求項２４】
ゲノムがヒト染色体14由来の塩基105,400,051から106,368,585を含む挿入されたヒトVDJ領域を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項２５】
ゲノムが、Ig重鎖、Igλ及びIgκ遺伝子座でホモ接合性である、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項２６】
ゲノムが
(a)それぞれが内在性げっ歯類定常領域又はヒト定常領域、例えば、Cmu及び/又はCgammaの上流に、1つ又は複数のヒト重鎖V遺伝子セグメント、1つ又は複数のヒト重鎖D遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒト重鎖JH遺伝子セグメントを含む、重鎖遺伝子座、
(b)内在性げっ歯類、例えば、内在性マウス若しくはラットのカッパ定常領域の上流に、1つ又は複数のヒトカッパ鎖V遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトカッパ鎖Jκ遺伝子セグメントを含む、場合によりホモ接合性状態のカッパ軽鎖遺伝子座、並びに場合により
(c)ラムダ定常領域の上流に、1つ又は複数のヒトラムダ鎖V遺伝子セグメント及び1つ又は複数のヒトラムダ鎖Jλ遺伝子セグメントを含む、場合によりホモ接合性状態のラムダ軽鎖遺伝子座、
を含み、並びに
(d)げっ歯類、マウス又はラットが前記遺伝子座の再構成及び抗原での免疫化後にキメラ抗体を産生できる、
請求項1から25のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項２７】
げっ歯類がマウスであり、ゲノムがマウス染色体6の座標70,673,899と70,675,515との間、好適には位置70,674,734に、又は染色体16上のラムダマウス遺伝子座中の対応する位置に標的化されたヒト軽鎖カッパVJの挿入を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項２８】
ゲノムが、ヒトRPCI-11ライブラリー、RPCI-13ライブラリー、CalTech Aライブラリー、CalTech Bライブラリー、CalTech Cライブラリー又はCalTech Dライブラリーから選択されるライブラリー由来のヒトDNAを、重鎖及び/又は軽鎖遺伝子セグメントの供給源として含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項２９】
げっ歯類がマウス又はラットである、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法、使用又はげっ歯類。
【請求項３０】
天然で反転されているヒトVH又は偽遺伝子VHがゲノムから取り除かれている、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法、使用、げっ歯類、マウス又はラット。
【請求項３１】
(a)請求項1から30のいずれか一項に記載のげっ歯類、例えば、マウス又はラットをヒト標的抗原でげっ歯類が抗体を産生するように免疫化するステップ、並びに
(b)げっ歯類から前記抗原に特異的に結合する抗体を単離するステップ及び/又はそのような抗体の少なくとも重鎖及び/又は軽鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を単離するステップ、並びに
場合により次に前記抗体の可変領域をヒト定常領域に繋ぐステップ
を含む、抗体又は抗体をコードしているヌクレオチド配列を単離する方法。
【請求項３２】
免疫化のために初期及び追加免疫プロトコルが用いられる、又は、RIMMSプロトコルが免疫化のために用いられる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
抗体が、希釈剤、賦形剤又は担体とともに医薬組成物として調合されるものであり、組成物が、IV容器、又はIVシリンジに連結されている容器に含まれるものである、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
請求項1から30のいずれか一項に記載のげっ歯類、マウス又はラット由来の細胞系統、例えば、不死化細胞系統、胚性幹細胞若しくはiPS細胞系統、B細胞、融合細胞又は幹細胞であって、幹細胞が、BALB/c、JM8、AB2.1又はAB2.2胚性幹細胞である、細胞系統、細胞又は融合細胞。
【請求項３５】
げっ歯類がマウスBALB/c、C57BL/6N、C57BL/6J、129S5又は129Sv株である、請求項35に記載の細胞系統、細胞又は融合細胞。