【手続補正書】
【提出日】平成28年11月10日(2016.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
上記特定の実施形態は、例として示されており、これらの実施形態は、種々の改変及び代替的形態を受け入れる余地があり得ることを理解すべきである。特許請求の範囲は、開示された特定の形態に限定されることを意図しないが、本開示の精神及び範囲内に入る全ての改変、等価物及び代替物をカバーする意図であることを、さらに理解すべきである。
本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1)  全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(2)  抽出懸濁物が、緩衝用液体を実質的に含まない、(1)に記載の方法。
(3)  前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)  洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、(3)に記載の方法。
(5)  遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)  緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)  緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8)  緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(9)  緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(10)  血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ1.5mg/mlから80mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ0.5mg/mlから20mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)  血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ10mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ2.5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(12)  血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ0.05%から2.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(13)  血球溶解試薬のpHが、およそ5から11の間である、(12)に記載の方法。
(14)  血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、(12)に記載の方法。
(15)  Triton X-100が、およそ0.5%から1.5%の間の範囲の量で提供される、(12)〜(14)のいずれかに記載の方法。
(16)  血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(10)〜(15)のいずれかに記載の方法。
(17)  消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(16)に記載の方法。
(18)  抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(1)〜(17)のいずれかに記載の方法。
(19)  微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(18)に記載の方法。
(20)  電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(19)に記載の方法。
(21)  抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(20)に記載の方法。
(22)  電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(20)又は(21)に記載の方法。
(23)  適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(19)〜(22)のいずれかに記載の方法。
(24)  アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(18)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(25)  アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(18)〜(24)のいずれかに記載の方法。
(26)  分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(18)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(27)  微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(1)〜(26)のいずれかに記載の方法。
(28)  全血サンプルから微生物細胞を抽出するための前処理容器であって、前処理容器は:
内部体積を規定する容器本体及び容器本体を密封するための閉鎖機構であり、ここで容器本体は、遠心分離デバイス中で使用されるように設計されている、容器本体及び閉鎖機構
を含み、
ここで容器本体は:
血球溶解試薬を含む前処理混合物、及び
全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体であり、ここで緩衝用液体は、全血サンプル内の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集されるように、前記容器本体の遠心分離の際に上清の下に液体界面を形成する、疎水性緩衝用液体
を含み、
前記容器本体の遠位部分は、円錐形の形状である、前処理容器。
(29)  緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(28)に記載の前処理容器。
(30)  緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(28)に記載の前処理容器。
(31)  緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(28)に記載の前処理容器。
(32)  遠心分離下で、緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(28)に記載の前処理容器。
(33)  前記容器本体の内部表面が疎水性である、(28)〜(32)のいずれかに記載の前処理容器。
(34)  前記容器本体の内部表面がシリコン処理されている、(28)〜(32)のいずれかに記載の前処理容器。
(35)  前記容器本体の遠位部分が、底部が丸形末端になっている円錐形形状を有する、(28)〜(34)のいずれかに記載の前処理容器。
(36)  前記丸形末端が半球形末端である、(35)に記載の前処理容器。
(37)  予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ1.5mg/mlから80mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ0.5mg/mlから20mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれかに記載の前処理容器。
(38)  予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ10mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ2.5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれかに記載の前処理容器。
(39)  予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ0.05%から2.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれかに記載の方法。
(40)  血球溶解試薬のpHが、およそ5から11の間である、(39)に記載の前処理容器。
(41)  血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、(39)に記載の前処理容器。
(42)  Triton X-100が、およそ0.5%から1.5%の間の範囲の量で提供される、(39)〜(41)のいずれかに記載の前処理容器。
(43)  血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(37)〜(42)のいずれかに記載の前処理容器。
(44)  消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(43)に記載の前処理容器。
(45)  液体サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
液体サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、液体サンプルの密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで液体サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(46)  前処理容器が、液体サンプルが添加される緩衝液をさらに含む、(45)に記載の方法。
(47)  緩衝液が、液体サンプル内の1種以上の非微生物学細胞の溶解のために有効な試薬を含む、(46)に記載の方法。
(48)  液体サンプルが、痰サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル及び均質化された便サンプルからなる群より選択される、(45)〜(47)のいずれかに記載の方法。
(49)  液体サンプルが、食品サンプル及び均質化された食品サンプルのうち1種である、(45)〜(47)のいずれかに記載の方法。
(50)  液体サンプルが環境サンプルである、(45)〜(47)のいずれかに記載の方法。
(51)  緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(45)〜(50)のいずれかに記載の方法。
(52)  緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(45)〜(50)のいずれかに記載の方法。
(53)  緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(45)〜(50)のいずれかに記載の方法。
(54)  緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(45)〜(50)のいずれかに記載の方法。
(55)  前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、(45)〜(54)のいずれかに記載の方法。
(56)  洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、(55)に記載の方法。
(57)  遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、(45)〜(56)のいずれかに記載の方法。
(58)  抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(45)〜(57)のいずれかに記載の方法。
(59)  微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(58)に記載の方法。
(60)  電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(59)に記載の方法。
(61)  抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(60)に記載の方法。
(62)  電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(60)又は(61)に記載の方法。
(63)  適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(60)〜(62)のいずれかに記載の方法。
(64)  アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(58)〜(63)のいずれかに記載の方法。
(65)  アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(58)〜(64)のいずれかに記載の方法。
(66)  分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(58)〜(65)のいずれかに記載の方法。
(67)  微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(58)〜(66)のいずれかに記載の方法。
(68)  全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は血球溶解試薬を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
少なくとも1つの一連の洗浄ステップを実施するステップであり、ここで各一連の洗浄ステップは:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
を含む、ステップ、及び
前処理容器の内容物を撹拌して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、並びに
該懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(69)  血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物1ミリリットル当たりおよそ1.5ミリグラムから80ミリグラムの間の範囲の量のサポニンを含む水溶液である、(68)に記載の方法。
(70)  血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物1ミリリットル当たりおよそ0.5mgから20mgの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムをさらに含む、(69)に記載の方法。
(71)  血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(70)に記載の方法。
(72)  消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(71)に記載の方法。
(73)  抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(68)〜(72)のいずれかに記載の方法。
(74)  微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(73)に記載の方法。
(75)  電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(74)に記載の方法。
(76)  抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(75)に記載の方法。
(77)  電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(75)又は(76)に記載の方法。
(78)  適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(74)〜(77)のいずれかに記載の方法。
(79)  アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(73)〜(78)のいずれかに記載の方法。
(80)  アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(73)〜(79)のいずれかに記載の方法。
(81)  分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(73)〜(80)のいずれかに記載の方法。
(82)  微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(68)〜(81)のいずれかに記載の方法。
(83)  微生物細胞を含むサンプルを前処理して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、
該懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、並びに
溶解物に対して多重化された分子アッセイのセットを実施するステップであり、ここで多重化された分子アッセイのセットが:
サンプル中に存在する微生物細胞の界を同定するための少なくとも1つの一次rRNAベースの分子アッセイ、
サンプル中に存在する微生物細胞のグラム状況を同定するための少なくとも1つの二次rRNAベースの分子アッセイ、及び
真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての属、種レベルにおける少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイ
を含む、ステップ
を含む方法であって、
ここで真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイは、その結果に基づく抗微生物治療の段階的縮小に適切である、方法。
(84)  真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイが、耐性記録に基づいて選択される、(83)に記載の方法。
(85)  多重化された分子アッセイのセットが、追加で少なくとも1つの、株レベルにおけるgDNAベースの分子アッセイをさらに含む、(83)又は(84)に記載の方法。
(86)  多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のうち1つ以上についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、(83)〜(85)のいずれかに記載の方法。
(87)  多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、(83)〜(85)のいずれかに記載の方法。
(88)  サンプルが未培養のサンプルである、(83)〜(87)のいずれかに記載の方法。
(89)  サンプルが全血サンプルである、(88)に記載の方法。
(90)  サンプルが、陽性血液培養サンプルである、(83)〜(87)のいずれかに記載の方法。
(91)  多重化された分子アッセイのセットが、事前に核酸抽出ステップを行わずに実施される、(83)〜(90)のいずれかに記載の方法。
(92)  抗生物質と、多重化された分子アッセイのセットで得られた結果とを関連付けるステップをさらに含む、(83)〜(90)のいずれかに記載の方法。
(93)  グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、連鎖球菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(92)のいずれかに記載の方法。
(94)  グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、肺炎連鎖球菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(93)に記載の方法。
(95)  グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、ブドウ球菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(94)のいずれかに記載の方法。
(96)  グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、黄色ブドウ球菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(95)に記載の方法。
(97)  真菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、カンジダ属(Candida)及び/又はアスペルギルス属についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(96)のいずれかに記載の方法。
(98)  グラム陰性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、腸内細菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(97)のいずれかに記載の方法。
(99)  グラム陰性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、緑膿菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(98)に記載の方法。
(100)  サンプルから微生物細胞を抽出するための装置であって、該装置は:
モーター、
モーターによって駆動されるローターであり、ここでローターは、前記ローターの回転中に前処理容器の内容物に遠心力が適用されるように前処理容器を支持するように設計されており、モーターは、懸濁物から微生物細胞を取り出し、前処理容器の遠位表面近傍で微生物細胞を収集するのに十分な速度でローターを回転させるように設計されている、ローター、
回転部分及び非回転部分を含む回転ユニオンであり、ここで前記回転部分は、前記ローターと調和して回転する、回転ユニオン、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前処理容器上に提供されたキャップを介して前処理容器中に延びる吸引管であり、ここで前記吸引管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位吸引オリフィスを有する、吸引管、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前記キャップを介して前処理容器中に延びる分配管であり、ここで前記分配管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位分配オリフィスを有する、分配管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定入口管であり、ここで前記固定入口管は、前記ローターの回転中に前記分配管と流体連絡するようになっている、固定入口管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定出口管であり、ここで前記固定出口管は、前記ローターの回転中に前記吸引管と流体連絡するようになっている、固定出口管、並びに
流体を分配及び吸引するために、前記固定入口管及び前記固定出口管と流体連絡した、ポンプ機構
を含む、装置。
(101)  前処理容器内で沈降物を再懸濁し、流体を混合するのに十分な振動力が適用されるように設計された振動機構をさらに含む、(100)に記載の装置。
(102)  前記遠位吸引オリフィスが、前記遠位分配オリフィスよりも、前記前処理容器の遠位表面により接近して配置される、(100)に記載の装置。
(103)  前記遠位吸引オリフィスが、前処理容器の遠心分離中に上清と緩衝用液体との液体界面に収集される微生物細胞の撹乱を回避するように配置される、(100)〜(102)のいずれかに記載の装置。
(104)  処理ハードウェアをさらに含み、処理ハードウェアは:
前処理容器を撹拌するように設計されており、ここで前処理容器は、全血サンプル及び前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含み、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集され、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、及び
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、吸引管を介して懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物が取得されるように、前記ポンプ機構を制御するように設計されている、(100)〜(103)のいずれかに記載の装置。
(105)  前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させる前に、前記処理ハードウェアが、さらに、
前記分配管を介して、所定体積の洗浄緩衝液を前処理容器に添加するようにポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌するように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されている
ことによって一連の洗浄ステップが実施される、(104)に記載の装置。
(106)  前記処理ハードウェアが、洗浄ステップを追加で1回以上実施するようにさらに設計されている、(105)に記載の方法。
(107)  処理ハードウェアをさらに含み、処理ハードウェアは:
前処理容器を撹拌するように設計されており、ここで前処理容器は、全血サンプル及び前処理混合物を含み、前処理混合物は血球溶解試薬を含み、
前記全血サンプル由来の前記微生物細胞を懸濁物から取り出し、前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を再懸濁するようにモーター又は振動機構を制御するように設計されており、及び
前記吸引管を介して懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物が取得されるように、ポンプ機構を制御するように設計されている、(100)〜(103)のいずれかに記載の装置。
(108)  前処理容器の内容物を撹拌して微生物細胞を再懸濁する前に、前記処理ハードウェアがさらに、
前記分配管を介して、所定体積の洗浄緩衝液を前処理容器に添加するように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌するように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、
微生物細胞が前処理容器の遠位表面に輸送されその近傍で収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されている
ことによって一連の洗浄ステップが実施される、(107)に記載の装置。
(109)  前記処理ハードウェアが、洗浄ステップを追加で1回以上実施するようにさらに設計されている、(108)に記載の装置。
(110)  前記ローターが、1つ以上の追加の前処理容器を支持するように設計されており、前記装置は、追加の前処理容器ごとに:
前記回転ユニオンの前記回転部分から追加の前処理容器上に提供されるキャップを介して追加の前処理容器中に延びる追加の吸引管であり、ここで前記追加の吸引管は、追加の前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位吸引オリフィスを有する、追加の吸引管、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前記キャップを介して追加の前処理容器中に延びる追加の分配管であり、ここで前記追加の分配管は、追加の前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位分配オリフィスを有する、追加の分配管、
をさらに含み、
ここで前記回転ユニオンの回転部分は、前記ローターの回転中に、各吸引管を前記固定出口管と流体連絡させるように設計され、各分配管を前記固定入口管と流体連絡させるように設計されたマニホルドを含む、(100)〜(109)のいずれかに記載の装置。
(111)  全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、該前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、及び
懸濁物及び緩衝用液体を抽出するステップ、及び
懸濁物を緩衝用液体から外的に分離することによって、微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(112)  懸濁物及び緩衝用液体の抽出、並びに外的分離が:
吸引容器を使用して懸濁物及び緩衝用液体を吸引するステップ、
緩衝用液体を、吸引容器の下部オリフィスに隣接して沈降させるステップ、並びに
吸引容器から緩衝用液体を分配するステップ
によって実施される、(111)に記載の方法。
(113)  吸引容器がピペットチップである、(112)に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液含有サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
血液含有サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、血液含有サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで血液含有サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
抽出懸濁物が、緩衝用液体を実質的に含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
血球溶解試薬が、血液含有サンプル及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ1.5mg/mlから80mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ0.5mg/mlから20mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
血球溶解試薬が、血液含有サンプル及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ10mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ2.5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
血球溶解試薬が、血液含有サンプル及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ0.05%から2.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
Triton X-100が、およそ0.5%から1.5%の間の範囲の量で提供される、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
全血サンプルから微生物細胞を抽出するための前処理容器であって、前処理容器は:
内部体積を規定する容器本体及び容器本体を密封するための閉鎖機構であり、ここで容器本体は、遠心分離デバイス中で使用されるように設計されている、容器本体及び閉鎖機構
を含み、
ここで容器本体は:
およそ0.15%から7.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ15mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液を含む前処理混合物
を含む、前処理容器。
【請求項２１】
血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、請求項20に記載の前処理容器。
【請求項２２】
Triton X-100が、およそ1.5%から4.5%の間の範囲の量で提供される、請求項20又は21に記載の前処理容器。
【請求項２３】
液体サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
液体サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、液体サンプルの密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで液体サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
【請求項２４】
前処理容器が、液体サンプルが添加される緩衝液をさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
液体サンプルが、痰サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル及び均質化された便サンプルからなる群より選択される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、請求項23〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、請求項23〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、請求項23〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、請求項32〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
微生物細胞を含むサンプルに対して多重化されたアッセイを実施する方法であって、該方法は：
微生物細胞を含むサンプルを前処理して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、
該懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、並びに
溶解物に対して多重化された分子アッセイのセットを実施するステップであり、ここで多重化された分子アッセイのセットが:
サンプル中に存在する微生物細胞の界を同定するための少なくとも1つの一次rRNAベースの分子アッセイ、
サンプル中に存在する微生物細胞のグラム状況を同定するための少なくとも1つの二次rRNAベースの分子アッセイ、及び
真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての属、種レベルにおける少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイ
を含む、ステップ
を含み、
ここで真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイは、その結果に基づく抗微生物治療の段階的縮小に適切である、方法。
【請求項３９】
多重化された分子アッセイのセットが、追加で少なくとも1つの、株レベルにおけるgDNAベースの分子アッセイをさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のうち1つ以上についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、請求項38又は39に記載の方法。
【請求項４１】
多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、請求項38又は39に記載の方法。
【請求項４２】
多重化された分子アッセイのセットが、事前に核酸抽出ステップを行わずに実施される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
抗生物質と、多重化された分子アッセイのセットで得られた結果とを関連付けるステップをさらに含む、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、該前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、及び
懸濁物及び緩衝用液体を抽出するステップ、及び
懸濁物を緩衝用液体から外的に分離することによって、微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
【請求項４５】
懸濁物及び緩衝用液体の抽出、並びに外的分離が:
吸引容器を使用して懸濁物及び緩衝用液体を吸引するステップ、
緩衝用液体を、吸引容器の下部オリフィスに隣接して沈降させるステップ、並びに
吸引容器から緩衝用液体を分配するステップ
によって実施される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
吸引容器がピペットチップである、請求項45に記載の方法。