【手続補正書】
【提出日】平成28年5月13日(2016.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法であって、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で１以上のＬ−ヌクレオチドを第一のＬ−核酸と反応させる段階を含み、前記酵素活性が前記第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる、方法。
【請求項２】
前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくは、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項３から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記反応が、第二のＬ−核酸をさらに含み、前記第一のＬ−核酸の１つの分子が、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成を通じて前記第二のＬ−核酸の１つの分子とハイブリッド形成する、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｌ−ヌクレオチドおよび酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法であって、前記酵素活性が前記標的Ｌ−核酸を増幅させることができる、方法。
【請求項１０】
前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項１１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのプライマー、好ましくは２つのプライマーを利用し、前記少なくとも１つのプライマーが、Ｌ−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる、請求項９から１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、前記酵素活性が第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる、タンパク質。
【請求項１８】
前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくは、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、
請求項１８から２０の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
【請求項２４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
【請求項２５】
野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体が、ポリメラーゼ活性、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性を有する、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
【請求項２６】
前記ポリメラーゼ変異体が、少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項２５または２６に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２８】
野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体がポリメラーゼ活性を有する、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
【請求項２９】
少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項２８または２９に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項３１】
Ｌ−核酸の３’末端に対して１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法における、酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用。
【請求項３２】
Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法における、酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用。
【請求項３３】
標的Ｌ−核酸を増幅するための方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記タンパク質が、請求項１７から３０の何れか１項に記載のタンパク質であり、前記タンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項３１から３３の何れか１項に記載の使用。
【請求項３５】
標的分子結合Ｌ−核酸分子の同定のための方法であって、次の段階：
（ａ）Ｌ−核酸分子の不均一集団を作製すること；
（ｂ）段階（ａ）の前記Ｌ−核酸分子の不均一集団を前記標的分子と接触させること；
（ｃ）前記標的分子が結合しないＬ−核酸分子を分離すること；
（ｄ）前記標的分子が結合するＬ−核酸分子を増幅させること
を含み、前記増幅段階が請求項１７から３０の何れか１項に記載のタンパク質を使用し、
前記タンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項３６】
請求項１７から３０の何れかに記載のタンパク質を作製するための方法であって、
ａ）請求項１７から３０の何れかに記載のタンパク質の２以上の断片が化学的に合成され、それによって、前記断片が全体として前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくは前記断片が固相ペプチド合成により合成され、
ｂ）段階ａ）の断片が、セグメント縮合、ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせにより互いに対して連結され、
前記タンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項３７】
酵素性ライゲーションによって第一のＤ−ペプチドまたは第一のＤ−タンパク質および第二のＤ−ペプチドまたは第二のＤ−タンパク質を互いに対して連結させるための方法であって、
前記第一のＤ−ペプチドまたは前記第一のＤ−タンパク質が保護基によってそのＮ−末端で保護され、そのＣ−末端で４−グアニジノフェニルエステル基により保護され、
前記第二のＤ−ペプチドまたは前記第二のＤ−タンパク質が、自由Ｎ−末端および、そのＣ−末端でチオアルキルエステルまたはチオアリールエステル基を含む、方法。