【手続補正書】
【提出日】平成28年3月8日(2016.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン塩基またはピリミジン塩基と、３’−炭素原子に共有結合した構造−Ｏ−Ｃ（Ｒ）２Ｎ３を形成する除去可能な３’−ヒドロキシ保護基を有するリボースまたはデオキシリボースの糖部分とを含む修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子であって、ここで
Ｒは、水素、−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−Ｃ（Ｒ６）２Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ７Ｒ８および−Ｃ（Ｒ９）２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択され、
各Ｒ１およびＲ２は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから独立して選択され、
Ｒ３は、水素または必要に応じて置換されたアルキルから選択され、
各Ｒ４およびＲ５は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
各Ｒ６およびＲ９は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから選択され、
各Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
ｍは、０〜３の整数であり、
ｎは、０〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎの合計は３に等しく、かつ
ｐは、０〜６の整数であり、但し、
Ｒ１およびＲ２は両方ともハロゲンであることはできず、かつ
少なくとも１つのＲは水素ではない、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項２】
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎである、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項３】
−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎが、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＣｌ２または−ＣＨ２Ｃｌから選択される、請求項１または２に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項４】
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３であり、Ｒ３が水素である、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項５】
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、各Ｒ４およびＲ５は水素またはＣ１〜６アルキルから選択される、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項６】
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ６）２Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ７Ｒ８であり、各Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は水素である、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項７】
ｐが０または６である、請求項６に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項８】
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ９）２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１であり、Ｒ９およびＲ１０は水素であり、Ｒ１１は水素またはアミノ置換アルキルから選択される、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項９】
前記３’−ヒドロキシ保護基が、ホスフィンを用いた脱保護反応において除去される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項１０】
前記ホスフィンが、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、請求項９に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項１１】
前記塩基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項１２】
前記３’−ヒドロキシ保護基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項１３】
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
【請求項１４】
配列決定反応における標的一本鎖ポリヌクレオチドと相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子を該成長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込む工程を含み、ここで、該修飾されたヌクレオチドの取り込みは、該成長中の相補的なポリヌクレオチドへのいかなるその後のヌクレオチドの導入も防止する、方法。
【請求項１５】
前記修飾されたヌクレオチド分子の組み込みが、末端トランスフェラーゼ、末端ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
相補的なヌクレオチドの連続的な取り込みをモニターする工程であって、ここで、取り込まれる少なくとも１つの相補的なヌクレオチドが、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子である工程、および
該修飾されたヌクレオチド分子のアイデンティティーを検出する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
前記修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーが、前記塩基に結合した前記検出可能な標識を検出することによって判定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、次の相補的なヌクレオチドを導入する前に除去される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子と、そのための包装材料とを含む、キット。
【請求項２０】
酵素と、該酵素の作用に適した緩衝液とをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、本明細書に記載する複数の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子、およびそのための包装材料を含むキットに関する。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーは、塩基に結合した検出可能な標識を検出することによって決定される。いくつかのこのような実施形態において、３’−ヒドロキシ保護基および検出可能な標識は、次の相補的なヌクレオチドを導入する前に除去される。いくつかのこのような実施形態において、３’−ヒドロキシ保護基および検出可能な標識は、単一工程の化学反応において除去される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
プリン塩基またはピリミジン塩基と、３’−炭素原子に共有結合した構造−Ｏ−Ｃ（Ｒ）２Ｎ３を形成する除去可能な３’−ヒドロキシ保護基を有するリボースまたはデオキシリボースの糖部分とを含む修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子であって、ここで
Ｒは、水素、−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−Ｃ（Ｒ６）２Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ７Ｒ８および−Ｃ（Ｒ９）２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択され、
各Ｒ１およびＲ２は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから独立して選択され、
Ｒ３は、水素または必要に応じて置換されたアルキルから選択され、
各Ｒ４およびＲ５は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
各Ｒ６およびＲ９は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから選択され、
各Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
ｍは、０〜３の整数であり、
ｎは、０〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎの合計は３に等しく、かつ
ｐは、０〜６の整数であり、但し、
Ｒ１およびＲ２は両方ともハロゲンであることはできず、かつ
少なくとも１つのＲは水素ではない、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎである、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目３）
−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎが、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＣｌ２または−ＣＨ２Ｃｌから選択される、項目１または２に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目４）
−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎが−ＣＨＦ２である、項目１〜３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目５）
−Ｃ（Ｒ１）ｍ（Ｒ２）ｎが−ＣＨ２Ｆである、項目１〜３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目６）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目７）
Ｒ３が水素である、項目６に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目８）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４Ｒ５である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目９）
Ｒ４およびＲ５が両方とも水素である、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１０）
Ｒ４が水素であり、Ｒ５がＣ１−６アルキルである、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１１）
Ｒ４およびＲ５が両方ともＣ１−６アルキルである、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１２）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ６）２Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ７Ｒ８である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１３）
Ｒ６が両方とも水素である、項目１または１２に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１４）
Ｒ７およびＲ８が両方とも水素である、項目１、１２および１３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１５）
ｐが０である、項目１および１２〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１６）
ｐが６である、項目１および１２〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１７）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ９）２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１８）
Ｒ９が両方とも水素である、項目１または１７に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１９）
Ｒ１０およびＲ１１が両方とも水素である、項目１、１７および１８のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２０）
Ｒ１０が水素であり、Ｒ１１がアミノ置換アルキルである、項目１、１７および１８のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２１）
前記３’−ヒドロキシ保護基が、ホスフィンを用いた脱保護反応において除去される、項目１〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２２）
前記ホスフィンが、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、項目２１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２３）
前記塩基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２４）
前記３’−ヒドロキシ保護基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２５）
前記リンカーが切断可能である、項目２３または２４に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２６）
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２７）
前記リンカーは、酸に不安定であるか、光に不安定であるか、またはジスルフィド結合を含有する、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２８）
配列決定反応における標的一本鎖ポリヌクレオチドと相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法であって、項目１〜２７のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子を該成長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込む工程を含み、ここで、該修飾されたヌクレオチドの取り込みは、該成長中の相補的なポリヌクレオチドへのいかなるその後のヌクレオチドの導入も防止する、方法。
（項目２９）
前記修飾されたヌクレオチド分子の組み込みが、末端トランスフェラーゼ、末端ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって達成される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
相補的なヌクレオチドの連続的な取り込みをモニターする工程であって、ここで、取り込まれる少なくとも１つの相補的なヌクレオチドが、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子である工程、および
該修飾されたヌクレオチド分子のアイデンティティーを検出する工程
を含む、方法。
（項目３１）
前記修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーが、前記塩基に結合した前記検出可能な標識を検出することによって判定される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、次の相補的なヌクレオチドを導入する前に除去される、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、単一工程の化学反応において除去される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の複数の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子と、そのための包装材料とを含む、キット。
（項目３５）
酵素と、該酵素の作用に適した緩衝液とをさらに含む、項目３４に記載のキット。