【手続補正書】
【提出日】平成28年4月22日(2016.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、
遠心凝集により、前記無血清培地の中で前記未分化幹細胞を凝集させ、且つ遠心胚様体を形成すること、
前記遠心胚様体からの前駆細胞の産生を誘導するために前記無血清培地の中で前記遠心胚様体を培養すること、
第２無血清培地の中で、かつ外来性間質細胞が存在しない状態で、前記前駆細胞を培養して前記前駆細胞より前記ナチュラルキラー細胞を作製すること、および
前記ナチュラルキラー細胞を不活化人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養すること
を含む前記方法。
【請求項２】
（ｉ）前記未分化幹細胞が未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含むか；
（ｉｉ）前記未分化幹細胞が未分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むか；
（ｉｉｉ）前記第１無血清培地が前駆細胞の産生を誘導するための増殖因子を含むか；または
（ｉｖ）前記第１無血清培地がＳＣＦ複合体、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）マウス間質が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施するか；
（ｉｉ）マウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施するか；
（ｉｉｉ）前記第２無血清培地がナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を含むか；または
（ｉｖ）前記第２無血清培地がインターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ＳＣＦ複合体、およびＦｍｓ関連チロシ
ンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記前駆細胞がＣＤ３４を発現する細胞を含むか；
（ｉｉ）前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現する細胞を含むか；または
（ｉｉｉ）前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現する細胞を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記方法が、前記前駆細胞が発現するタンパク質に基づいて前記前駆細胞を選別する細胞選別ステップを前記遠心胚様体培養ステップと前記前駆細胞の培養の間に含まないか；または
（ｉｉ）作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記方法が、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を不活性化して不活化ａＡＰＣを作製することをさらに含むか；
（ｉｉ）前記共培養ステップが１：１の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有するか；または
（ｉｉｉ）前記方法が、インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化ａＡＰＣと共培養することをさらに含み、特に、前記共培養ステップが約５：１から１：５の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
（ａ）第１無血清培地の中で前記多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること；
（ｂ）第２無血清培地の中で前記胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞を作製すること；
（ｃ）インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、ＳＣＦ、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む第３無血清培地の中で、かつ外来性の間質または間質細胞が存在しない状態で、前記造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製すること；および
（ｄ）前記ナチュラルキラー細胞を不活化ａＡＰＣと共培養すること、
を含む前記方法。
【請求項８】
（ｉ）前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるか；
（ｉｉ）遠心凝集によって前記凝集を実施するか；または
（ｉｉｉ）前記第２無血清培地がＳＣＦ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記造血前駆細胞がＣＤ３４を発現するか；
（ｉｉ）前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現するか；または
（ｉｉｉ）前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が細胞選別ステップをステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に含まないか；または、作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
約５：１から１：５の不活化ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率で前記共培養を実施するか；
前記方法が、インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を不活化ａＡＰＣと共培養することをさらに含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の培養を６〜２０日間実行するか：または
ステップ（ｃ）の培養を２０〜６０日間実行する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
必要とする患者にナチュラルキラー細胞の有効量が投与されることを特徴とする、免疫療法において使用するための、請求項７に記載の方法によって作製されたナチュラルキラー細胞を含む組成物。
【請求項１４】
（ｉ）前記患者が癌患者であるか；
（ｉｉ）前記患者が感染症を有し、特に前記患者がウイルス感染症を有し、特に前記患者がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しているか；あるいは
（ｉｉｉ）前記多能性細胞が前記患者に由来する、
請求項１３に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、
遠心凝集により、前記無血清培地の中で前記未分化幹細胞を凝集させ、且つ遠心胚様体を形成すること、
前記遠心胚様体からの前駆細胞の産生を誘導するために前記無血清培地の中で前記遠心胚様体を培養すること、および
第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養して前記前駆細胞より前記ナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。
（項目２）
前記未分化幹細胞が未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。（項目３）
前記未分化幹細胞が未分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１無血清培地が前駆細胞の産生を誘導するための増殖因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１無血清培地がＳＣＦ複合体、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
マウス間質が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目１に記載の方法。
（項目７）
マウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２無血清培地がナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第２無血清培地がインターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ＳＣＦ複合体、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記前駆細胞がＣＤ３４を発現するＣＤ３４＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記方法が、前記前駆細胞が発現するタンパク質に基づいて前記前駆細胞を選別する細胞選別ステップを前記遠心胚様体培養ステップと前記前駆細胞の培養の間に含まない、項目１に記載の方法。
（項目１６）
作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を不活性化して不活化ａＡＰＣを作製すること、および
前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化ａＡＰＣと共培養すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記共培養ステップが１：１の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
不活化ａＡＰＣを作製するための薬剤で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を処理すること、および
インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化ａＡＰＣと共培養すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記共培養ステップが約５：１から１：５の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
多能性幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
（ａ）第１無血清培地の中で前記多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること、
（ｂ）第２無血清培地の中で前記胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞を作製すること、および
（ｃ）インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、ＳＣＦ、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む第３無血清培地の中で前記造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。
（項目２２）
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
遠心凝集によって前記の凝集を実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記第２無血清培地がＳＣＦ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
マウス間質またはマウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
外来性の間質または間質細胞が存在しない状態で前記造血前駆細胞を培養する前記ステップを実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４を発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現する、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記方法が細胞選別ステップをステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に含まない、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、項目２１に記載の方法。
（項目３２）
前記ナチュラルキラー細胞を不活化人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養することをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目３３）
約５：１から１：５の不活化ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率で前記共培養を実施する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を不活化ａＡＰＣと共培養することをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目３６）
ステップ（ｂ）の培養を６〜２０日間実行する、項目２１に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｃ）の培養を２０〜６０日間実行する、項目２１に記載の方法。
（項目３８）
必要とする患者に項目２１に記載の方法によって作製されたナチュラルキラー細胞の有効量を投与することを含む、患者を治療する免疫療法。
（項目３８）
（ａ）項目２１に記載の方法によってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を作製すること、および
（ｂ）必要とする患者に前記ＮＫ細胞の有効量を投与すること
を含む、患者を治療する免疫療法。
（項目３９）
前記患者が癌患者である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記患者が感染症を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記患者がウイルス感染症を有する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記患者がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記多能性細胞が前記患者に由来する、項目３８に記載の方法。
第１の実施形態では、未分化多能性幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法は、第１無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、遠心凝集（ｓｐｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）により、第１無血清培地の中で未分化細胞を凝集させ、且つ、胚様体（ＥＢ）を形成すること（遠心胚様体（ｓｐｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）（遠心ＥＢ（ｓｐｉｎ  ＥＢｓ））を形成することになる）、遠心ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中で遠心ＥＢを培養すること、および前駆細胞からＮＫ細胞を作製するための第２無血清培地の中でそれらの前駆細胞を培養することを含む。その方法は未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または未分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である未分化幹細胞を使用する。