【手続補正書】
【提出日】平成28年4月7日(2016.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】図1A〜1Eは、ソルチリン1がヒト石灰化組織中およびヒト血管SMCの骨形成移行の間に誘導されることを示す。図1A、ソルチリン1（左）は、ヒトアテローム動脈硬化性頸動脈の石灰化領域中に発現される。ヘマトキシリンによる紫色染色で、石灰化領域を示した。SMCをα平滑筋細胞アクチン（αSMA、中央）で、マクロファージをCD68（右）で染色する。患者試料20個のうち1個を示す。バー；100μm。図1B、免疫蛍光顕微鏡法で、ヒト石灰化病変においてソルチリン1（左）およびRUNX2（中央）が同時発現することを示す。核をDAPIで染色した（右）。バー；50μm。図1C〜1E、対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中でSMCを最大21日間培養した。図1C、1日目に対するソルチリン1 mRNAの発現、n＝4人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。図1D、ソルチリン1タンパク質の発現。上：代表的なウエスタンブロット、下：統計解析。1日目に対する、n＝4人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。図1E、免疫蛍光顕微鏡法で、石灰化SMCにおけるソルチリン1およびオステオポンチン（OPN）の発現を示す（21日目）。バー；100μm。エラーバーはSDを示す。
【図２】図2A〜2Gは、ソルチリン1の改変が石灰化SMCにおけるアルカリホスファターゼ活性およびマトリックスミネラル化を変化させることを示す。対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中でSMCを14日間（アルカリホスファターゼ活性）または21日間（マトリックスミネラル化）培養した。ソルチリン1をsiRNA（A、B、D；siSORTもしくはスクランブル対照、Scr）によってサイレンシングするか、または細胞を組み換えソルチリン1（B、E；rSORT1、200ng/ml）で1週間に2回、細胞培養期間全体にわたり刺激した。図2Aおよび2B、組織非特異的アルカリホスファターゼ活性（TNAP）。図2C、結節形成を示している明視野SMCの代表的画像。図2Dおよび2E、マトリックスミネラル化。上：アリザリンレッドSで染色されたミネラル化マトリックスの代表的画像。n＝4人の独立した細胞ドナー。図2Fおよび2G、SMCを骨形成培地中で培養した。ソルチリン1をアデノウイルス（AdSORT1）によって過剰発現させた。LacZを対照として役立てた（AdLacZ）。図2F、TNAPおよび図2G、マトリックスミネラル化。n＝3人の独立した細胞ドナー。エラーバーはSDを示す。
【図３】図3A〜3Eは、ソルチリン1がPHEXの発現を調節することを示す。SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で21日間培養した。ソルチリン1をsiRNA（siSORT1またはスクランブル対照、Scr）によってサイレンシングするか、アデノウイルス（AdSORT1もしくはAdLacZ）によって過剰発現させるか、または細胞を組み換えソルチリン1（rSORT1、200ng/ml）で1週間に2回、細胞培養期間全体にわたり刺激した。図3A、骨形成培地中で3日目の細胞生存率。n＝3人の独立した細胞ドナー。図3B、PCRアレイを使用して決定された石灰化SMCにおけるPHEX mRNAの発現。n＝4人の独立した細胞ドナー。図3Cおよび3D、PHEXの発現。上：代表的なウエスタンブロット。b-アクチンを、ローディング対照として役立てた。下：mRNA発現の定量。n＝4人の独立した細胞ドナー；*p＜0.05。図3E、PHEXとソルチリン1 mRNAの発現との相関。r＝-0.865；R2＝0.748；p＝0.0001。エラーバーはSDを示す。
【図４】図4A 〜4E は、miR125bが直接結合によってソルチリン1を調節することを示す。図4A、SORT1 3'UTR内でmiR-125bに対する結合部位は、異なる種の間で高度に保存されている。www.targetscan.comを利用して2012年4月30日時点で分析を行った。示される配列はAAAUGCUCAGGGUCCCC（記載順に、SEQ ID NO：1および11〜17）である。図4B〜4D、SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で培養し、それにmiR-125bインヒビター（抗125b）および対応する対照（Scr）を72時間トランスフェクトした。図4B、miR-125bの発現。図4C、ソルチリン1の発現。上：代表的なウエスタンブロット。b-アクチンをローディング対照として役立てた。下：mRNAの発現。n＝4人の独立した細胞ドナー；*p＜0.05。図4D、miR-125bの発現とソルチリン1 mRNAの発現の相関。r＝-0.825；R2＝0.681；p＝0.043。図4E、SORT1 3'UTRレポーター活性は、miR125b模倣物（プレ-miR-125b）によって抑制され、miR125bインヒビター（抗miR125b）によって誘導される。データを、対応する対照からの増加倍率として示す。n＝3人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。エラーバーはSDを示す。
【図５】図5A〜5Gは、ソルチリン1が、Apoe-/-マウスにおける5/6腎切除によって誘導された慢性腎疾患で増加することを示す。図5A、（CDR）5/6腎切除が行われていない、および行われた、野生型（WT）マウスおよびApoe-/-マウスにおけるソルチリン1の免疫蛍光染色。ソルチリン1；赤。DAPI；青、自己蛍光；緑。1群あたり4匹の動物の1匹を示す。バー；50μm。図5B、慢性腎疾患（CRD）5/6腎切除を行われていない、および行われたWTマウス、Apoe-/-マウスの大動脈におけるソルチリン1の免疫組織化学染色。1群あたり4匹の動物の1匹を示す。倍率：40×。図5Cおよび5D、アテローム動脈硬化性病変中のソルチリン1陽性細胞の定量。血管中膜（C）および内膜（D）の別々の分析。n＝4。*p＜0.05。図5E ソルチリン1の血清レベル。n＝3〜5。図5F、FGF23の血清レベル。n＝3〜5。図5G、WT、Apoe-/-およびCRDマウスにおける血清ソルチリン1および血清リン酸の相関。n＝12；r＝0.831；R2＝0.691；p＝0.0008。点は個々の濃度を示す。エラーバーはSDを示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、ソルチリン1の免疫共沈研究の結果を示す。図6A、21日間培養された対照（CM）または石灰化（OM）SMCからIgGを予備除去後に低塩／ストリンジェンシー条件下でソルチリン1を免疫沈降（IP）させた。IgG-IPを対照として役立てた。2人の細胞ドナーからの1人を示す。ゲルのクマシーブルー染色（上）およびソルチリン1のウエスタンブロット（下）を示す。ドットの枠は、全部で4個のIPレーンにわたり各ゲルレーンの切り出された領域を示す。M；サイズマーカー（kDa）。緑の矢尻は、OM条件で消失するバンド（ミオシン）を示し、赤の矢尻は、ソルチリン1に対応する分子量領域を示し、黒の矢尻はビメンチンを示す。図6B、OM条件とCM条件との間の相対ペプチドスペクトルマッチ（peptide-spectrum match）（PSM）の比の対数プロット。
【図７】図7Aおよび7Bは、ソルチリン1のサイレンシングの確立を示す。SMCを対照培地（CM）中で21日間培養し、21日の全細胞培養期間中、1週間に2回siRNA（siSORT1またはスクランブル対照、Scr）をトランスフェクトした。図7A、4、14、および21日目のソルチリン1 mRNA。n＝2〜4。エラーバーはSDを示す。図7B、ソルチリン1タンパク質。b-アクチンをローディング対照として役立てた。4回のウエスタンブロットのうち1回を示す。
【図８】図8A〜8E。SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で21日間培養し、21日の全細胞培養期間中、1週間に2回siRNA（siSORT1またはスクランブル対照、Scr）をトランスフェクトするか、または細胞を組み換えソルチリン1（rSORT1、200ng/ml）で刺激した。図8Aおよび8B、細胞外マトリックスのコラーゲン含量。図8C、RUNX2 mRNAの発現。n＝4人の独立した細胞ドナー；*p＜0.05。図8Dおよび8E、SMCをリン酸（2mM、3mM）で刺激した。48時間後にソルチリン1のmRNA（D）およびタンパク質（E）の発現を決定した。3つの独立したウエスタンブロット画像のうち1つを示す。n＝3。*p＜0.05。エラーバーはSDを示す。
【図９】リン酸調節エンドペプチダーゼ（PHEX）がソルチリン-1依存性SMC石灰化に直接的には関与しないことを示す。SMCを骨形成培地中で培養した。ソルチリン1（siSORT1）およびPHEX（siPHEX）をsiRNA（50nM）またはスクランブル対照（scr）によって全細胞培養期間中、1週間に2回サイレンシングした。マトリックスミネラル化を21日目に測定した。n＝3人の独立した細胞ドナー。エラーバーはSDを示す。*scrに比べてp＜0.05。
【図１０】図10A〜10Cは、骨芽細胞形成中にソルチリン1が増加しないことを示す。図10A、ヒト間葉系間質細胞（hMSC）を骨形成培地中で最大21日間培養した。タンパク質の発現を表示の時点でウエスタンブロットによって評価した。図10B、hMSCを骨形成培地中で培養して骨芽細胞を得た。ソルチリン1（siSORT1）をsiRNA（50nM）またはスクランブル対照（scr）によって全細胞培養期間中、1週間に2回サイレンシングした。図10C、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）活性を14日目に測定した。（C）マトリックスミネラル化を21日目に測定した。代表的な画像を上に示す。n＝3。
【図１１】図11Aおよび11Bは、ソルチリン1が石灰化SMCから細胞外小胞内に放出されることを示す。図11A、対照SMC（CM、21日目）；石灰化SMC（OM、21日目）またはアデノウイルスソルチリン1（AdSORT1）もしくは対照としてのAdLacZを7日間形質導入されたSMCからの細胞培養上清からタンパク質を沈殿させた。対照SMC（CM、21日目）、石灰化SMC（OM、21日目）からの全細胞溶解物を対照として役立てた。図11B、対照SMC（CM、21日目）または石灰化SMC（OM、21日目）からの細胞培養上清から超遠心分離法を用いて細胞外小胞を単離した。タンパク質20μgをゲルにロードした。対照SMC（CM、21日目）、石灰化SMC（OM、21日目）からの全細胞溶解物を対照として役立てた。
【図１２】図12は、石灰化SMCでミオシン-9およびb-アクチンとのソルチリン1の結合が消失することを示す。SMCを対照培地（NM）または骨形成培地（OM）中で21日間培養した。IgGの予備除去後にソルチリン1を免疫沈降させた。IgG-IPを対照として役立てた。ソルチリン1、ミオシン-9（MYH9）およびb-アクチンに対するウエスタンブロット。2人の独立した細胞ドナーを示す。
【図１３】図13Aおよび13Bは、石灰化SMCでカベオリン-1および組織非特異的アルカリホスファターゼとのソルチリン1の結合が増加することを示す。SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で21日間培養した。IgGの予備除去後にソルチリン1を免疫沈降させた。IgG-IPを対照として役立てた。ソルチリン1、カベオリン-1（Cav-1）および組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）に対するウエスタンブロット。図13A、インプット、ソルチリン1のIPおよびIgG  IPのウエスタンブロット。図13B、4人の独立した細胞ドナーを示す。
【図１４】カベオリン-1がヒト血管SMCの骨形成移行中に誘導されることを示す。対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中でSMCを21日間培養した。1日目、7日目、および21日目のウエスタンブロット。b-アクチンをローディング対照として役立てた。
【図１５】ソルチリン1に対するブロッキング抗体がアルカリホスファターゼ（ALP）活性を低減したことを示す。石灰化平滑筋細胞（SMC）をソルチリン1抗体（10ug/ml、R&D systems）または対応するIgG対照（10ug/ml、R&D System）の存在下で14日間培養した。細胞外ドメインに対する抗体を使用するソルチリン1のブロッキングは、IgG対照に比べてALP活性を有意に低減した（p＝0.02、n＝3）。
【図１６】ソルチリン1プロペプチドがALP活性を低減したことを示す。石灰化SMCをソルチリン1プロペプチド（200ng/ml）の存在下で14日間培養した。ソルチリン1プロペプチドは、未処理対照に比べてALP活性を有意に低減した（p＝0.03、n＝3〜4）。
【図１７】図17A〜17Eは、ソルチリン1がマトリックス小胞（MV）中にロードされることを示す。図17Aは、慢性腎疾患を有するApoe-/-マウスの大動脈切片上でのソルチリン1の透過電子顕微鏡法ベースの免疫金染色を示す。3匹の動物のうち1匹を示す。Bar＝200nm。図17Bは、対照（CM）または骨形成（OM）培地中で21日間培養されたSMCから単離されたMVにおけるソルチリン1、カベオリン-1（Cav-1）、および組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）の発現を示す。3回の実験からの1回を示す。図17Cは、質量分析を用いたMV中のソルチリン1ペプチドの同定を示す。ペプチド配列は、上から下に：AAAAGGAFPR（SEQ ID NO：2）；TEFGMAIGPENSGK（SEQ ID NO：3）；SAPGEDEECG（SEQ ID NO：4）；およびCTSNFLSPEK（SEQ ID NO：5）である。図17E、対照（CM）または骨形成培地（OM）中で、アデノウイルス性過剰発現のソルチリン1（Ad-SORT1）または対照ベクター（Ad-LacZ）のもとでSMCを14および21日間培養した。MVはSMC上清から単離した。上：ウエスタンブロット。数字は配列決定されたペプチドの数および対応するペプチドスペクトルマッチ（PSM）を表す。図17Eは、MVの放出を示す。n＝4人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。エラーバーはSDを示す。
【図１８】図18A〜18Hは、ソルチリン1が石灰化SMCにおいて脂質ラフト／カベオラ富化膜に再分布することを示す。図18A、SMCを対照（CM）または骨形成（OM）培地中で21日間培養した。水力学的方法によって脂質ラフト／カベオラ富化膜（CEM）を他の細胞構成要素から分離した（n CEM）。カベオリン-1（Cav-1）およびソルチリン1タンパク質の発現をウエスタンブロットによって評価した。3人の独立した細胞ドナーのうち1人を示す。図18Bおよび18C、SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で21日間培養した。ソルチリン1およびカベオリン-1をsiRNA（siSORT、siCav-1またはスクランブル対照、Scr）によって全細胞培養期間中、1週間に2回サイレンシングした。全細胞溶解物（図18Bおよび18C）ならびにCEM/nCEM（図18C）のウエスタンブロット。3人の独立した細胞ドナーのうち1人を示す。図18Dおよび18E、SMCを対照培地（CM）または骨形成培地（OM）中で14日間（図18D、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）活性）または21日間（図18E、マトリックスミネラル化）培養した。カベオリン-1を、siRNA（siCav-1またはスクランブル対照、Scr）によって全細胞培養期間中、1週間に2回サイレンシングした。n＝4人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。図18Fおよび18G、SMCをカベオリン-1欠損マウス（Cav-1-/-）または野生型マウス（WT）から単離し、マウス組み換えソルチリン1（rSORT1、200ng/ml）を有するおよび有さない骨形成培地培地中で、SMCを14日間（図18F、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNAP）活性）または21日間（図18G、マトリックスミネラル化）培養した。n＝4。*p＜0.05。図18Hに、対照（CM）または骨形成（OM）培地中で14日間培養されたSMCから単離されたMVにおけるTNAP活性を示す。ソルチリン1をsiRNA（siSORT、またはスクランブル対照、Scr）によって全細胞培養期間中、1週間に2回サイレンシングした。n＝4人の独立した細胞ドナー。*p＜0.05。エラーバーはSDを示す。
【図１９】S825およびS819でのリン酸化が細胞性ALP活性およびマトリックスミネラル化に影響することを示す。