【手続補正書】
【提出日】平成28年7月27日(2016.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は：
（ａ）前記標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第１の部分に特異的な前記第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において前記標的核酸配列の前記第１の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
（ｃ）第１相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第１相増幅反応混合物が、第２の増幅オリゴヌクレオチドを含み、前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的であり、かつ
前記第１の増幅産物が、前記第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
（ｄ）前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物を、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物から欠如している少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第２相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
（ｅ）前記第２相増幅反応混合物において、第２相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップと、
（ｆ）前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第２相増幅反応混合物における前記第２の増幅産物の合成を検出するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の増幅オリゴヌクレオチドが、３’標的特異的配列と、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１相の等温性の転写関連増幅反応および前記第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種の構成成分が、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）の前記第１の増幅産物が、前記試料中の前記標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、そして
ステップ（ｅ）の前記第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｇ）が、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）が、前記第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
第５の態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列を定量化する方法を提供する。本方法によれば、先ず、（ａ）標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料を、標的核酸配列の第１の部分に特異的な第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップが存在する。次に、（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしなかった第１の増幅オリゴヌクレオチドを全て除去することにより、増幅前ハイブリッドを単離するステップが存在する。これに続き、（ｃ）第１相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された増幅前ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップが行われる。一般的に言えば、第１相増幅反応混合物は、第２の増幅オリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的である。同様に、第１の増幅産物は、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない。次に、（ｄ）第１の増幅産物を含む反応混合物を、第１の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、第１の増幅産物を含む反応混合物から欠如している少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップが存在する。一般に、第２相増幅反応混合物は、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。次に、（ｅ）第２相増幅反応混合物において、第２相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップが存在する。これに続き、（ｆ）配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、第２相増幅反応混合物における第２の増幅産物の合成を検出するステップ、次に、（ｇ）検出ステップ（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化するステップを行う。一般に好ましい一方法において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、３’標的特異的配列およびＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列を含む。好ましい事例において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。別の一般に好ましい一方法において、第２の増幅オリゴヌクレオチドは、第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される。別の一般に好ましい一方法において、固体支持体は、固定化された捕捉プローブを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ａ）は、試料を、標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、増幅前ハイブリッドは、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした標的核酸配列を含む。別の一般に好ましい一方法において、固体支持体は、磁気的に誘引できる粒子を含む���別の一般に好ましい一方法において、第１および第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれは、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、逆転写酵素は、内在性ＲＮａｓｅＨ活性を含む。別の一般に好ましい一方法において、少なくとも１種の構成成分は、第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｃ）の第１の増幅産物は、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、ステップ（ｅ）の第２の増幅産物は、ＲＮＡ分子である。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｄ）における配列特異的ハイブリダイゼーションプローブは、第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｄ）における配列特異的ハイブリダイゼーションプローブは、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｇ）は、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化するステップを含む。別の一般に好ましい一方法において、ステップ（ｃ）は、第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は：
（ａ）前記標的核酸配列の第１の部分への第１の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第１の部分に特異的な前記第１の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ（ａ）において前記標的核酸配列の前記第１の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
（ｃ）第１相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ（ｂ）において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第１相増幅反応混合物が、第２の増幅オリゴヌクレオチドを含み、前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的であり、かつ
前記第１の増幅産物が、前記第１相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
（ｄ）前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物を、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物から欠如している少なくとも１種の構成成分と組み合わせて、第２相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第２相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
（ｅ）前記第２相増幅反応混合物において、第２相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第２の増幅産物を合成するステップと、
（ｆ）前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第２相増幅反応混合物における前記第２の増幅産物の合成を検出するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記第１の増幅オリゴヌクレオチドが、３’標的特異的配列と、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列とを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第２の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第１相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第１の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記第１相の等温性の転写関連増幅反応および前記第２相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、そして
前記逆転写酵素が、内在性ＲＮａｓｅＨ活性を含む、
項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１種の構成成分が、前記第１の増幅オリゴヌクレオチドを含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｃ）の前記第１の増幅産物が、前記試料中の前記標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、そして
ステップ（ｅ）の前記第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、
項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第２の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｄ）における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｇ）が、線形較正曲線およびステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｃ）が、前記第１相増幅反応混合物において１０倍〜１０，０００倍増幅するステップを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。