【手続補正書】
【提出日】平成28年3月14日(2016.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡを修飾する方法であって、
該標的ＤＮＡを、
（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチド並びに
（ｂ）単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであって、
（ｉ）該標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する、２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、該タンパク質結合セグメント
を含む前記単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
を含む複合体と接触させることを含み
該接触はインビトロまたはエクスビボの細胞内で行われ、
該修飾は標的ＤＮＡの切断である、上記方法。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡ二本鎖が８塩基対（ｂｐ）から３０ｂｐの長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ハイブリダイズして該タンパク質結合セグメントのｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド間の相補性が７０％よりも大きい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該標的ＤＮＡが細菌細胞、古細菌細胞、真核単細胞生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞、または脊椎動物細胞からの細胞に存在する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
該ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、１またはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸もしくはペプチド核酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該接触が、
（ａ）前記Ｃａｓ９ポリペプチド又は前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド
を細胞に導入することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドが、組み換え発現ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
該Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端に、タンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
該Ｃａｓ９ポリペプチドのカルボキシル末端に、タンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの、細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチド、または前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに
（ｂ）単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化セグメント、および
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、該タンパク質結合セグメント
を含む該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、
を含む組成物。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡ二本鎖が８塩基対（ｂｐ）から３０ｂｐの長さを有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該ハイブリダイズして該タンパク質結合セグメントのｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド間の相補性が７０％よりも大きい、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該標的ＤＮＡが細菌細胞、古細菌細胞、真核単細胞生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞、または脊椎動物細胞からの細胞に存在する、請求項１３、１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１３、１４または１５に記載の組成物。
【請求項１８】
該Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端に、タンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの、細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
該Ｃａｓ９ポリペプチドのカルボキシル末端に、タンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
該Ｃａｓ９ポリペプチドと該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、インビトロまたはエクスビボの細胞中に存在する、請求項１３〜９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
該ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、１またはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸もしくはペプチド核酸を含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドが、組み換え発現ベクターである、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組み換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが
（ａ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化セグメント、および
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、該ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、タンパク質結合セグメント
を含む、該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ｄｓＲＮＡ二本鎖が８塩基対（ｂｐ）から３０ｂｐの長さを有する、請求項２４に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
【請求項２６】
該ハイブリダイズして該タンパク質結合セグメントのｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド間の相補性が７０％よりも大きい、請求項２４または２５に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
【請求項２７】
該標的ＤＮＡが細菌細胞、古細菌細胞、真核単細胞生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞、または脊椎動物細胞からの細胞に存在する、請求項２４、２５または２６に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
【請求項２８】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項２４、２５または２６に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
【請求項２９】
該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、１またはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸もしくはペプチド核酸を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
【請求項３０】
（ａ）単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする、第１のヌクレオチド配列であって、
（ｉ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化セグメント、および
（ｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、該タンパク質結合セグメント
を含む、第１のヌクレオチド配列を含み、
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする第１のヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結しており、並びに、
（ｂ）Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列であって、前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結している、第２のヌクレオチド配列を含んでもよい、
一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３１】
前記核酸は一つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターである、請求項３０に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３２】
前記一つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、一つまたはそれ以上のウイルスベクターである、請求項３１に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３３】
該第２のヌクレオチド配列が、該Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合的に連結された、タンパク質形質導入ドメインをコードし、ここで、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項３０、３１または３２に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３４】
前記ｄｓＲＮＡ二本鎖が８塩基対（ｂｐ）から３０ｂｐの長さを有する、請求項３０または３１に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３５】
該ハイブリダイズして該タンパク質結合セグメントのｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド間の相補性が７０％よりも大きい、請求項３０、３１または３４に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３６】
該標的ＤＮＡが細菌細胞、古細菌細胞、真核単細胞生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞、または脊椎動物細胞からの細胞に存在する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３７】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項３８】
（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたは前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに
（ｂ）単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化セグメント、および
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、該ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、該タンパク質結合セグメント
を含む該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、
を含むキットであって、
（ａ）および（ｂ）は単一のまたは別々の容器中に存在する、前記キット。
【請求項３９】
該標的ＤＮＡが細菌細胞、古細菌細胞、真核単細胞生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞、または脊椎動物細胞からの細胞に存在する、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸、および／または前記単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸が、組み換え発現ベクターである、請求項３９または４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記組み換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
タンパク質形質導入ドメインが、該Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合的に連結されており、ここで、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項３８〜４２の何れか一項に記載のキット。
【請求項４４】
該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、１またはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸もしくはペプチド核酸を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
患者の治療的な処置方法において用いるための、療請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の一つまたはそれ以上の核酸。
【請求項４６】
１つまたはそれ以上の
（ａ）単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであって、
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化セグメント、および
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用するタンパク質結合セグメントであって、該タンパク質結合セグメントは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する２つの相補的な一続きのヌクレオチドを含み、該ｄｓＲＮＡ二本鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含み、前記２つの相補的な一続きのヌクレオチドは、介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結されている、前記タンパク質結合セグメント
を含む単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、並びに、
（ｂ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を含む遺伝子改変された真核生物細胞であって、
前記遺伝子改変された真核生物細胞は、インビトロまたはエクスビボに存在する、該真核生物細胞。
【請求項４７】
前記ｄｓＲＮＡ二本鎖が８塩基対（ｂｐ）から３０ｂｐの長さを有する、請求項４６に記載の遺伝子改変された真核生物細胞。
【請求項４８】
該ハイブリダイズして該タンパク質結合セグメントのｄｓＤＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド間の相補性が７０％よりも大きい、請求項４６に記載の遺伝子改変された真核生物細胞。
【請求項４９】
該標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核生物細胞。
【請求項５０】
タンパク質形質導入ドメインが、該Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合的に連結されており、ここで、前記タンパク質形質導入ドメインは、該Ｃａｓ９ポリペプチドの細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項４６〜４８の何れか一項に記載の遺伝子改変された真核生物細胞。
【請求項５１】
該単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、１またはそれ以上の修飾ヌクレオチド塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸もしくはペプチド核酸を含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核生物細胞。