(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を結合した金ナノ粒子を応用したイムノクロマトグラフィによるセンサーのような、機能性に優れた、タンパク質が固定化された金担体を提供する。【解決手段】金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質を、金ナノ粒子等の金担体に固定化することにより製造される、機能性に優れた、タンパク質が固定化された金担体。また、該金担体を含む免疫センサー。【選択図】図１
2013151454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質が固定化された金担体であって、
前記タンパク質が、金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質である、金担体。
【請求項２】
前記ペプチドが、さらに金還元能を有する、請求項１に記載の金担体。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、さらに、前記ペプチドと前記タンパク質との間に挿入された保護タンパク質を有する、請求項１または２に記載の金担体。
【請求項４】
金ナノ粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の金担体。
【請求項５】
前記タンパク質が抗体結合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の金担体。
【請求項６】
さらに、前記抗体結合タンパク質に結合した抗体を含む、請求項５に記載の金担体。
【請求項７】
金担体にタンパク質を固定化することを含む、タンパク質が固定化された金担体の製造方法であって、
前記タンパク質が、金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質である、方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、さらに金還元能を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記金担体が金ナノ粒子である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
金イオンを還元して前記金ナノ粒子を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
金ナノ粒子の形成とタンパク質の固定化が同時に行われる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
被検試料中の測定対象物質を検出する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金担体と被検試料を反応させること、および
前記金担体と被検試料中の測定対象物質との特異的相互作用を検出することを含む、方法。
【請求項１３】
前記金担体が抗体結合金ナノ粒子であり、
前記測定対象物質が抗原であり、
前記特異的相互作用が抗原抗体反応である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
疾患の検査方法であって、
請求項１２または１３に記載の方法により測定対象物質を検出すること、および
検出結果に基づき疾患を検査することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金担体を含む、疾患の検査用キット。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金担体を含む、免疫センサー。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金担体を含む、免疫マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質が固定化された金ナノ粒子等の金担体およびその製造法に関する。また、本発明は、タンパク質が固定化された金担体の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
金ナノ粒子は表面プラズモン共鳴によって鮮やかな赤色を呈し、粒子の大きさに応じて色調が変化する分光学的性質を有している。この金ナノ粒子表面にタンパク質等の生体分子を結合させることで、金ナノ粒子特有の性質と生体分子の特異性を組み合わせたバイオマテリアルが開発されている。例えば、妊娠判定キットは抗体を結合した金ナノ粒子を応用したイムノクロマトグラフィによるセンサーである。生体分子を結合した金ナノ粒子を合成する場合、生体分子の機能を損なうことなく生体分子を金ナノ粒子に固定化させることが重要である。具体的には、例えば、抗体を結合した金ナノ粒子を合成する場合、抗体の配向性が機能や感度に大きく影響するため、抗体の抗原結合部位が露出するように配向性を調節しながら金ナノ粒子に固定化させることが非常に重要である。
【０００３】
現在、金ナノ粒子にタンパク質を固定する方法として、まずクエン酸やタンニン酸等の還元剤により金イオンを還元することで金ナノ粒子を合成し（非特許文献１）、これにタンパク質を加えることで金ナノ粒子に物理的に吸着させる方法が一般的に利用されている。しかし、この手法ではタンパク質が非特異的に金ナノ粒子に吸着するため、変性による失活やランダムな配向性によって、タンパク質の機能が低下する問題がある。
【０００４】
他に、タンパク質を化学修飾し、チオールなどによる共有結合を介して金ナノ粒子に固定する方法がある。しかし、化学修飾によりタンパク質の特定部位のみに特定の官能基を導入することは極めて難しいため、上記の場合と同様、変性による失活やランダムな配向性によって、タンパク質の機能が低下する問題がある。
【０００５】
また、抗体を効率良く金ナノ粒子に固定する方法として、抗体と特異的に結合するタンパク質（プロテイン A、プロテイン G、プロテイン A/G、またはプロテイン L）を用いた抗体固定化技術が開発されている。これらの抗体結合タンパク質は、抗原抗体反応に関与しない抗体の特定部位と強く結合することが可能で、金ナノ粒子に結合した抗体結合タンパク質を媒介にして、抗体を金ナノ粒子に固定できる。しかし、抗体結合タンパク質を金ナノ粒子に結合させる過程でタンパク質の配向性を制御することが難しく、抗体結合タンパク質の抗体認識部位が露出するとは限らない。そのため、例えば、十分に抗体を保持できないという問題が生じうる。
【０００６】
一方、近年、金還元能および金結合能を有するペプチドが発見され、HEPES 緩衝液中で金イオンと反応させることで金ナノ粒子が容易に合成できる技術が開発されている（非特許文献２）。その他、これまでに種々の金結合能を有するペプチドが報告されている（非特許文献３〜９）。
【０００７】
しかしながら、金結合能を有するペプチドをリンカーとしてタンパク質を金ナノ粒子に固定化することは知られていない。また、金還元能および金結合能を有するペプチドをリンカーとして利用して、金イオンの還元と金ナノ粒子へのタンパク質の固定化を同時に行うことも知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. W. Slot et al., Eur. J. Cell Biol., 1985, 38, 87-93
【非特許文献２】J. M. Slocik et al., Small, 2005, 1, 1048-1052
【非特許文献３】M. M. Tomczak et al., Bio-chem. Soc. Trans., 2007, 35, 512-515
【非特許文献４】C. Tamerler et al., Langmuir, 2006, 22, 7712-7718
【非特許文献５】M. Hnilova et al., Langmuir, 2008, 24, 12440-12445
【非特許文献６】K. T. Nam et al., Science, 2006, 312, 885-888
【非特許文献７】R. Djalali et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 13660-13661
【非特許文献８】J. Kim et al., Chem. Commun., 2010, 46, 4366-4368
【非特許文献９】J. Kim et al., Biomacromolecules, 2011, 12, 2518-2523
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、機能性に優れた、タンパク質が固定化された金担体およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは鋭意検討の末、金結合能を有するペプチドを融合させたタンパク質を金ナノ粒子に固定化することで、機能性に優れるように、タンパク質を金ナノ粒子に固定化できることを見出した。さらに、本願発明者らは、上記ペプチドとして金還元能を有するペプチドを利用することで、金ナノ粒子の形成およびタンパク質の固定化を１ステップで実施できることを見出した。以上に基づき、本発明は完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
[１]
タンパク質が固定化された金担体であって、
前記タンパク質が、金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質である、金担体。
[２]
前記ペプチドが、さらに金還元能を有する、前記金担体。
[３]
前記融合タンパク質が、さらに、前記ペプチドと前記タンパク質との間に挿入された保護タンパク質を有する、前記金担体。
[４]
金ナノ粒子である、前記金担体。
[５]
前記タンパク質が抗体結合タンパク質である、前記金担体。
[６]
さらに、前記抗体結合タンパク質に結合した抗体を含む、前記金担体。
[７]
金担体にタンパク質を固定化することを含む、タンパク質が固定化された金担体の製造方法であって、
前記タンパク質が、金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質である、方法。
[８]
前記ペプチドが、さらに金還元能を有する、前記製造方法。
[９]
前記金担体が金ナノ粒子である、前記製造方法。
[１０]
金イオンを還元して前記金ナノ粒子を形成することを含む、前記製造方法。
[１１]
金ナノ粒子の形成とタンパク質の固定化が同時に行われる、前記製造方法。
[１２]
被検試料中の測定対象物質を検出する方法であって、
前記金担体と被検試料を反応させること、および
前記金担体と被検試料中の測定対象物質との特異的相互作用を検出することを含む、方法。
[１３]
前記金担体が抗体結合金ナノ粒子であり、
前記測定対象物質が抗原であり、
前記特異的相互作用が抗原抗体反応である、前記検出方法。
[１４]
疾患の検査方法であって、
前記検出方法により測定対象物質を検出すること、および
検出結果に基づき疾患を検査することを含む、方法。
[１５]
前記金担体を含む、疾患の検査用キット。
[１６]
前記金担体を含む、免疫センサー。
[１７]
前記金担体を含む、免疫マーカー。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、機能性に優れた、タンパク質が固定化された金ナノ粒子等の金担体を提供できる。また、本発明の一態様においては、穏やかな反応条件の下、クエン酸等の還元剤を用いることなく、金ナノ粒子の形成とその表面へのタンパク質の固定化をワンステップで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】金還元・結合ペプチドを融合したタンパク質と金イオンを反応させることで、金ナノ粒子を形成し、同時に金ナノ粒子表面へタンパク質の固定を行う方法の原理を示す図である。さらに、抗体結合タンパク質を使用することで、配向性を調節して抗体を金ナノ粒子に固定し、抗原抗体反応に基づいた金ナノ粒子の凝集を利用する免疫センサーの原理を示す図である。
【図２】金還元・結合ペプチドを融合したタンパク質と金イオンを反応させることで金ナノ粒子を合成する際の反応水溶液の pH および緩衝剤の影響を示す図。a：サンプル i〜vi の外観（写真）、b：サンプル i〜vi の紫外可視吸収スペクトル、c：サンプル ii の TEM 画像（写真）、d：サンプル vi の TEM 画像（写真）、e：水およびトリス緩衝液を用いたときの外観（写真）
【図３】金還元・結合ペプチドを融合したタンパク質と金イオンを反応させることで金ナノ粒子を合成する際の経時変化を示す図。a：紫外可視吸収スペクトルの経時変化、b：525 nm における吸光度の経時変化
【図４】ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子を用いた ELISA による抗原検出の原理と結果を示す図。a：ELISAの原理、b：ELISA による抗原検出の結果（写真およびグラフ）
【図５】ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子と市販の抗体結合タンパク質固定化金ナノ粒子の性能を ELISA により比較した図。
【図６】pH 4で調製された金ナノ粒子を用い、抗原抗体反応により金ナノ粒子の凝集を誘発することで抗原を検出した結果を示す図。a：サンプル i〜iv の紫外可視吸収スペクトル、b：サンプル i〜iv の外観（写真）、c：サンプル i の TEM 画像（写真）、d：サンプル iii の TEM画像（写真）
【図７】pH 8で調製された金ナノ粒子を用い、抗原抗体反応により金ナノ粒子の凝集を誘発することで抗原を検出した結果を示す図。a：サンプル i〜iv の外観（写真）、b：サンプル iii の TEM 画像（写真）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞タンパク質が固定化された金担体
本発明は、タンパク質が固定化された金担体（以下、「本発明のタンパク質固定化金担体」または「タンパク質固定化金担体」ともいう）を提供する。
【００１６】
本発明において、金担体とは、全体または少なくとも表面の一部が金である構造体をいう。少なくとも表面の一部が金である構造体としては、例えば、少なくとも表面の一部が金でコーティングされた構造体が挙げられる。金担体として、具体的には、例えば、金ナノ粒子、金プレート、および金チップが挙げられる。これらの中では、金ナノ粒子が好ましい。金担体のサイズは特に制限されず、担体の種類や使用目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、金担体が金ナノ粒子である場合、その平均粒径は、好ましくは 1 nm から
200 nm であってよく、より好ましくは 2 nm から 100 nm であってよい。また、金チップとしては、例えば、表面プラズモン共鳴装置に利用されるセンサーチップ等の金薄膜チップが挙げられる。
【００１７】
本発明において、金担体に固定化されるタンパク質は、金結合能を有するペプチドとタンパク質との融合タンパク質である。言い換えると、金担体に固定化されるタンパク質は、あるタンパク質に、金結合能を有するペプチドが導入されてなるタンパク質である。
【００１８】
以下、金担体に固定化されるタンパク質を、「本発明のペプチド融合タンパク質」または「ペプチド融合タンパク質」ともいう。また、以下、金結合能を有するペプチドを「本発明のペプチド」ともいう。また、以下、本発明のペプチドと融合するタンパク質、すなわち、本発明のペプチドが導入される元のタンパク質を「本発明のタンパク質」ともいう。
【００１９】
本発明において、本発明のペプチドが導入されるタンパク質は、特に制限されず、当業者が所望する任意のタンパク質であってよい。本発明のタンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。本発明のタンパク質としては、例えば、医療用、研究用、または産業用に有用な生物学的活性を有するタンパク質を好適に利用できる。そのようなタンパク質としては、例えば、抗体結合タンパク質、抗体、抗原、受容体、DNA結合タンパク質、酵素、アルブミン、金属タンパク質が挙げられる。本発明のタンパク質は、何らかの物質と特異的に相互作用しうるタンパク質であるのが好ましい。相互作用としては、例えば結合が挙げられる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体（multimer）タンパク質であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。
【００２１】
抗体結合タンパク質としては、例えば、プロテイン A、プロテイン G、プロテイン A/G、およびプロテイン Lが挙げられる。
【００２２】
抗体は、完全抗体であってもよく、そうでなくてもよい。抗体としては、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、上記のようなタンパク質の全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生物学的活性を有する部位が挙げられる。生物学的活性を有する部位としては、例えば、抗体結合タンパク質中の抗体結合部位が挙げられる。また、タンパク質の一部としては、例えば、多量体タンパク質を構成するサブユニットから選択される一部のサブユニットが挙げられる。すなわち、本来のタンパク質が多量体タンパク質である場合、多量体タンパク質を構成する全てのサブユニットが金担体に固定化されてもよく、その一部のサブユニットのみが固定化されてもよい。
【００２４】
また、本発明のタンパク質は、天然のものと同一のタンパク質であってもよく、目的とする機能や発現時の宿主等の諸条件に応じて適宜改変されたものであってもよい。タンパク質の改変は、例えば公知の遺伝子工学的技術により行うことができる。
【００２５】
本発明のタンパク質は、単一のタンパク質であってもよく、２またはそれ以上のタンパク質の組み合わせであってもよい。２またはそれ以上のタンパク質の組み合わせとしては、例えば、２またはそれ以上のタンパク質が融合したものや、２またはそれ以上のタンパク質が相互作用により互いに結合したものが挙げられる。２またはそれ以上のタンパク質が融合したものとしては、例えば、上記のようなタンパク質から選択される２またはそれ以上のタンパク質が融合したものや、上記のようなタンパク質と後述する保護タンパク質とが融合したものが挙げられる。また、２またはそれ以上のタンパク質が相互作用により互いに結合したものとしては、例えば、抗体結合タンパク質と抗体の組み合わせが挙げられる。抗体結合タンパク質と抗体とを組み合わせて利用する場合、例えば、金結合能を有するペプチドが導入された抗体結合タンパク質を製造し、適宜選択された抗体と組み合わせることで、自由に特異性を調節できる。
【００２６】
本発明のペプチドは、金結合能を有するものであれば特に制限されない。本発明において、「金結合能を有する」とは、本発明のペプチドが導入されたタンパク質が金担体に結合できることをいう。なお、本発明のペプチドは、あらゆるタンパク質および金担体について金結合能を有する必要はなく、選択されたタンパク質および金担体について金結合能を有していればよい。
【００２７】
本発明のペプチドの長さは特に制限されないが、例えば、３〜１００アミノ酸残基の長さであってよく、５〜５０アミノ酸残基の長さであってもよい。本発明のペプチドのアミノ酸配列は特に制限されないが、本発明のペプチドは含硫アミノ酸残基および／または水酸基を有するアミノ酸残基を含むのが好ましい。含硫アミノ酸残基としては、システイン残基やメチオニン残基が挙げられ、システイン残基が好ましい。水酸基を有するアミノ酸残基としては、セリン、トレオニン、およびチロシンが挙げられる。本発明のペプチドに含まれる含硫アミノ酸残基および／または水酸基を有するアミノ酸残基の数は、１残基であってもよく、２またはそれ以上の残基であってもよい。
【００２８】
本発明のペプチドは、さらに金還元能を有するのが好ましい。本発明において、「金還元能」とは、金イオンを還元し、金担体を生成する能力をいう。なお、本発明のペプチドが金還元能を有する場合、本発明のペプチドはあらゆる金担体を生成する能力を有する必要はなく、少なくとも本発明において選択された金担体を生成する能力を有していればよい。具体的には、例えば、「金還元能」とは、金イオンを還元し、金ナノ粒子を生成する能力であってよい。
【００２９】
本発明のペプチドが金還元能を有する場合、本発明のペプチドはチロシン残基を含むのが好ましい。本発明のペプチドに含まれるチロシン残基の数は、１残基であってもよく、２またはそれ以上の残基であってもよい。
【００３０】
金結合能を有するペプチドとして、具体的には、例えば、非特許文献２に記載の A3 ペプチド（AYSSGAPPMPPF；配列番号１）、Flg ペプチド（DYKDDDDK；配列番号２）、それらの融合ペプチドである Flg-A3（DYKDDDDKPAYSSGAPPMPPF；配列番号３）および A3-Flg（AYSSGAPPMPPFPDYKDDDDK；配列番号４）、非特許文献３に記載の AYSSGAPPAPPF（配列番号５）、ASSSGAPPMPPF（配列番号６）、AMSSGAPPYPPF（配列番号７）、および PSPGSAYAPFPM（配列番号８）、非特許文献４に記載の GBP1（MHGKTQATSGTIQS；配列番号９）および 3R-GBP1（（MHGKTQATSGTIQS）3；配列番号１０）、非特許文献５に記載の AuBP1（WAGAKRLVLRRE；配列番号１１）および AuBP2（WALRRSIRRQSY；配列番号１２）、非特許文献６に記載の Au binding motif（LKAHLPPSRLPS；配列番号１３）、非特許文献７に記載の AHHAHHAAD（配列番号１４）、非特許文献８に記載の Midas-11（TGTSVLIATPGV；配列番号１５）、Midas-11c（TGTSVLIATPCV；配列番号１６）、および Midas-2（TGTSVLIATPYV；配列番号１７）、並びに非特許文献９に記載の AG4 ペプチド（NPSSLFRYLPSD；配列番号１８）が挙げられる。これらの内、例えば、A3 ペプチド、Flg ペプチド、Flg-A3、および A3-Flg、並びに AG4 ペプチドは、金還元能も有する（非特許文献２、９）。また、例えば、A3 ペプチドの誘導体である AYSSGAPPAPPF、ASSSGAPPMPPF、AMSSGAPPYPPF、および PSPGSAYAPFPM は、金還元能も有すると考えられる（非特許文献３）。また、例えば、Midas-11、Midas-11c、および Midas-2 は、金還元能も有すると考えられる（非特許文献８）。
【００３１】
本発明のペプチドが導入される位置は特に制限されないが、本発明のペプチドは、本発明のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に導入されるのが好ましい。また、多量体タンパク質を金担体に固定化する場合、本発明のペプチドは、多量体タンパク質を構成するサブユニットから選択される１つのサブユニットにのみ導入されてもよく、２またはそれ以上のサブユニットに導入されてもよく、全てのサブユニットに導入されてもよい。
【００３２】
本発明のペプチド融合タンパク質は、さらに修飾されていてもよいし、その他の要素を備えていてもよい。
【００３３】
例えば、本発明のペプチド融合タンパク質は、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との間に、さらに、保護タンパク質を有していてもよい。本発明において、保護タンパク質とは、本発明のペプチド融合タンパク質の構成要素である本発明のタンパク質が金担体に非特異的に結合するのを阻害できるタンパク質をいう。保護タンパク質は、例えば、立体障害により本発明のタンパク質が金担体に結合するのを阻害できればよい。保護タンパク質は適宜、利用しやすいものを選択すればよい。保護タンパク質として、具体的には、例えば、チオレドキシンやＢＳＡが挙げられる。保護タンパク質の立体構造において、本発明のペプチドと融合している末端と、本発明のタンパク質と融合している末端とは、離れているのが好ましい。
【００３４】
本発明のペプチド融合タンパク質は、例えば、本発明のペプチド融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡを用いたタンパク質発現や、タンパク質の翻訳後修飾によるペプチド修飾により製造することができる。
【００３５】
組み換えＤＮＡを用いたタンパク質発現は、例えば公知の手法により行うことができる。組み換えＤＮＡを用いたタンパク質発現は、具体的には、例えば、目的遺伝子を含むベクターを宿主となる生物に導入して発現させることにより達成できる。
【００３６】
宿主となる生物は、特に制限されず、本発明のタンパク質の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。宿主としては、例えば、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を用いることができる。宿主としては、微生物細胞を用いるのが好ましい。宿主‐ベクター系が開発されている微生物としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、アルスロバクター（Arthrobacter）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、およびアスペルギルス（Aspergillus）属真菌が挙げられる。中でも、エシェリヒア・コリ（E. coli）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）が好適に用いられる。
【００３７】
遺伝子を宿主に導入するために利用するベクターとしては、マルチコピーベクターが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターはカナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。例えば、エシェリヒア・コリに利用できる好適なベクターとしては、pTrc99A（ファルマシア社製）、pUC系ベクター（タカラバイオ社製）、pPROK系ベクター（クロンテック社製）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社製）、pQE系ベクター（キアゲン社製）等が挙げられる。また、その他のベクターとしては、例えば、pHY300PLK、pGK12、pLF14、および pLF22 等のエシェリヒア・コリ‐バチラス・サブチリス用シャトルベクター、l1059、lBF101、M13mp9、および Mu phage（特開平2‐109985）等のファージベクター、ならびに Mu、Tn10、Tn5 等のトランスポゾンが利用できる。
【００３８】
上記のようなベクターに宿主で機能するプロモーターおよび目的の遺伝子を順に連結したＤＮＡ断片が挿入された発現プラスミドで宿主を形質転換することにより、目的の遺伝子を発現できる形質転換体が得られる。なお、ベクターには遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含んでいるものがあり、そのようなベクターを用い、ベクターに含まれるプロモーターの下流に遺伝子を連結する場合には、別途プロモーターをベクターに挿入する必要はない。
【００３９】
また、組み換えＤＮＡを用いたタンパク質発現は、例えば、目的遺伝子を宿主となる生物の染色体上に導入して発現させることによっても達成できる。具体的には、例えば、宿主で機能するプロモーターおよび遺伝子を順に連結したＤＮＡ断片を宿主の染色体上に導入してもよい。また、宿主がもともと有するプロモーターを利用する場合は、同プロモーターの下流に目的遺伝子のみを導入してもよい。宿主の染色体上への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、遺伝子を宿主の染色体上へ転移させてもよい。
【００４０】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、ベクターをエシェリヒア・コリに導入するには、ヒートショック法やエレクトロポレーション法等、通常のエシェリヒア属細菌の形質転換に用いられる方法を利用することができる。具体的には、例えば、Morrison の方法（Morrison D.A., Methods in Enzymology 68, 326（1979））や受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159（1970））等を参考にしてよい。
【００４１】
上記のようにして得られる形質転換体を培養して本発明のペプチド融合タンパク質を発現させることで、本発明のペプチド融合タンパク質を製造することができる。培養および発現条件は、用いる宿主の種類、マーカーの種類、プロモーターの種類等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。例えば、エシェリヒア・コリ形質転換体を培養するのに用いる培地としては、２×ＹＴ培地、Ｍ９‐カザミノ酸培地、ＬＢ培地等の通常エシェリヒア・コ
リを培養するのに用いる培地を好適に用いることができる。
【００４２】
培養後、菌体を回収し、破砕または溶解することにより本発明のペプチド融合タンパク質を含む溶液が得られる。菌体の破砕には、例えば、超音波破砕、フレンチプレス破砕、またはガラスビーズ破砕を用いることができる。また、細胞の溶解には、例えば、卵白リゾチーム処理やペプチダーゼ処理を用いることができる。なお、破砕または溶解後に残渣が残る場合には、必要に応じて、遠心等により残渣を除去することができる。また、例えば、培養上清中に本発明のペプチド融合タンパク質が存在する場合には、培養上清を本発明のペプチド融合タンパク質を含む溶液として利用することができる。
【００４３】
本発明のペプチド融合タンパク質を含む溶液からの本発明のペプチド融合タンパク質の回収は、タンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４４】
＜２＞タンパク質が固定化された金担体の製造方法
本発明は、金担体に本発明のペプチド融合タンパク質を固定化することを含む、タンパク質固定化金担体の製造方法（以下、本発明の製造方法ともいう）を提供する。本発明においては、本発明のペプチドを介してタンパク質を金担体に固定化することで、機能性に優れた、タンパク質固定化金担体を製造することができる。
【００４５】
本発明において、「機能性に優れる」とは、例えば、従来のタンパク質固定化金担体と比較して、本発明のペプチド融合タンパク質を固定化した金担体においては、固定化されたタンパク質の機能がより効率的に発揮されることをいう。「機能性が優れる」とは、具体的には、例えば、本発明のタンパク質固定化金担体が抗体の結合した金担体である場合に、抗体の結合した従来のタンパク質固定化金担体と比較して、抗体の結合した本発明のタンパク質固定化金担体がより効率的に抗原と反応できることであってもよい。
【００４６】
本発明において、金担体に本発明のペプチド融合タンパク質を固定化することは、金担体と本発明のペプチド融合タンパク質を反応させることにより達成できる。金担体とタンパク質との反応条件は、例えば、公知の手法と同様に行ってもよく、後述する金イオンの還元条件に合わせて行ってもよい。
【００４７】
本発明において、金担体は、例えば公知の手法により製造することができる。また、金担体は、市販のものを用いてもよい。
【００４８】
例えば、金担体は、適宜選択した担体の表面を金でコーティングすることにより製造できる。金のコーティング方法としては、メッキ法や蒸着法等の公知の手法を用いることができる。
【００４９】
また、例えば、金担体が金ナノ粒子である場合、金イオンを還元することにより金ナノ粒子を形成できる。すなわち、本発明の方法は、さらに、金イオンを還元して金ナノ粒子を形成することを含んでいてもよい。例えば、金イオンを含む水溶液中で金イオンの還元反応を行うことができる。金イオンを含む水溶液は、例えば、金を含む水溶性化合物を水系溶媒に溶解することで調製できる。金を含む水溶性化合物としては、特に制限されないが、例えば、テトラクロロ金（III）酸（塩化金酸ともいう）やテトラクロロ金（III）酸ナトリウムが挙げられる。
【００５０】
金イオンの還元は、公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、クエン
酸やタンニン酸等の還元剤により金イオンを還元して金ナノ粒子を形成できる。
【００５１】
また、本発明のペプチドが金還元能を有する場合、金イオンの還元は、本発明のペプチドが有する金還元能により行われてもよい。本発明のペプチドが有する金還元能を利用して金イオンの還元を行う場合、Good's の緩衝剤を併用するのが好ましい。Good's の緩衝剤はそれ自体がある程度の金イオンの還元能を有することが知られており、Good's の緩衝剤が有する金還元能と本発明のペプチドが有する金還元能の相乗作用により、金ナノ粒子が効率的に形成されるものと考えられる。Good's の緩衝剤としては、特に制限されないが、例えば、HEPES、HEPPSO、PIPES、MOPS、MOPSO、MES が挙げられる。反応系の pH は、例えば、3 から 11 であってよく、好ましくは 4 から 8 であってよい。緩衝剤の濃度は、例えば、10 mM から 1 M であってよく、好ましくは 10 mM から 100 mM であってよい。反応温度は特に制限されないが、例えば、5 ℃〜70 ℃であってよく、10 ℃〜50 ℃であってもよく、室温であってもよい。反応時間は特に制限されないが、例えば、5 分〜10 時間であってよく、10 分〜1 時間であってもよく、10 分〜30 分であってもよい。
【００５２】
なお、本発明のペプチドが金還元能を有する場合に、還元剤により金イオンの還元を行ってもよい。その場合、Good's の緩衝剤を併用してもよいし、しなくともよい。
【００５３】
本発明において、金ナノ粒子の形成とタンパク質の固定化はそれぞれ別個に行われてもよく、一部同時に行われてもよく、全部同時に行われてもよい。
【００５４】
例えば、金イオン、還元剤、および本発明のペプチド融合タンパク質を共存させて反応させることで、金粒子の形成とタンパク質の固定化を同時に行うことができる。また、例えば、本発明のペプチドが金還元能を有する場合、本発明のペプチドが有する金還元能を利用して金イオンの還元を行うことで、金粒子の形成とタンパク質の固定化を同時に行うことができる（図１参照）。
【００５５】
本発明のタンパク質が抗体結合タンパク質等の抗体結合能を有するものである場合、さらに抗体を添加することで、金担体上の抗体結合タンパク質を足場として、抗体の配向性を調整しつつ金担体に結合できると考えられる（図１参照）。本発明において、本発明のタンパク質固定化金担体であって、このような抗体結合タンパク質を介して抗体を結合させた金担体や、抗体に直接本発明のペプチドを融合して固定化した金担体を総称して「抗体結合金担体」という場合がある。
【００５６】
本発明の製造方法は、さらに、製造されたタンパク質固定化金担体を回収することを含んでいてもよい。製造されたタンパク質固定化金担体は、例えば公知の手法により回収することができる。そのような手法としては、例えば、遠心分離やゲル濾過が挙げられる。
【００５７】
＜３＞タンパク質が固定化された金担体の利用
本発明のタンパク質固定化金担体は、例えば、金担体の性質および固定化されるタンパク質の性質に応じた用途に利用できる。そのような用途としては、例えば、化合物の検出、疾患の検査、免疫センサー、免疫マーカー、ドラッグデリバリーシステム、触媒、分子認識マテリアル、バイオセンサーが挙げられる。
【００５８】
なお、本発明のタンパク質固定化金担体は、本発明のタンパク質固定化金担体が用いられること以外は、従来のタンパク質固定化金担体を利用する場合と同様に利用されてもよい。また、従来のタンパク質固定化金担体に対する本発明のタンパク質固定化金担体の有意性等の諸条件に応じて、態様を適宜変更してもよい。例えば、本発明のタンパク質固定化金担体を利用する場合、機能性に優れることにより、従来のタンパク質固定化金担体を利用する場合と比較して、タンパク質固定化金担体の使用量の低減や、被検試料との反応
時間の低減等が期待される。
【００５９】
本発明のタンパク質固定化金担体は、例えば、金担体に固定化されているタンパク質と測定対象物質との特異的相互作用を利用して、測定対象物質を検出することができる。
【００６０】
すなわち、本発明は、被検試料中の測定対象物質を検出する方法であって、本発明のタンパク質固定化金担体と被検試料を反応させること、および前記タンパク質固定化金担体と被検試料中の測定対象物質との特異的相互作用を検出することを含む、方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう）を提供する。被検試料としては、特に制限されないが、生体試料や環境試料等が挙げられる。生体試料としては、例えば、血液、体液、および組織が挙げられる。生体試料は必要に応じて被験体から単離して用いればよい。
【００６１】
本発明の検出方法においては、特異的相互作用の有無および／または程度に基づき、測定対象物質を定性的または定量的に検出できる。すなわち、本発明において、「測定対象物質の検出」とは、測定対象物質の存在の有無の検出であってもよく、測定対象物質の存在の程度の検出であってもよい。
【００６２】
検出される測定対象物質が特定の疾患と相関するバイオマーカーである場合、測定対象物質の検出結果に基づき当該疾患を検査することができる。すなわち、本発明は、疾患の検査方法であって、本発明の検出方法により測定対象物質を検出すること、および検出結果に基づき疾患を検査することを含む、方法を提供する。例えば、癌が存在する場合に特異的に検出される癌抗原を測定対象物質として、癌の検査を行うことができる。本発明において、「疾患の検査」とは、疾患の発症リスクの検査であってもよく、疾患の発症の有無の検査であってもよく、疾患の重症度の検査であってもよい。なお、本発明において、「疾患」には、被験体の生理学的変化全般が含まれるものとする。具体的には、例えば、疾患の検査には妊娠の検査も含まれる。
【００６３】
特異的相互作用としては、例えば特異的結合が挙げられる。特異的結合としては、例えば、抗原抗体反応が挙げられる。
【００６４】
すなわち、上記検出方法の一態様としては、被検試料中の抗原を検出する方法であって、抗体結合金ナノ粒子と被検試料を反応させること、および前記抗体結合金ナノ粒子と抗原との間の抗原抗体反応を検出することを含む、方法が挙げられる。
【００６５】
特異的相互作用を検出する手法は、金担体の種類や特異的相互作用の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。例えば、金担体が金ナノ粒子である場合、金ナノ粒子の凝集や集積に基づく色調変化や発色を指標として、抗原抗体反応等の特異的相互作用を検出することができる。なお、色調変化、すなわち吸収スペクトルの変化は、金ナノ粒子の凝集や粒径の変化に限られず、金ナノ粒子や金薄膜の表面環境の変化によっても生ずる。よって、例えば、金ナノ粒子を分散させたコロイド膜や金薄膜を利用するにも、吸収スペクトルの変化を指標として、抗原抗体反応等の特異的相互作用を検出することができる。
【００６６】
また、本発明は、本発明のタンパク質固定化金担体を含む疾患の検査用キットを提供する。疾患の検査用キットとは、測定対象物質を検出し、疾患を検査するためのキットをいう。上述の通り、測定対象物質が特定の疾患と相関するバイオマーカーである場合、測定対象物質の検出結果に基づき当該疾患を検査することができる。疾患の検査用キットに含まれる本発明のタンパク質固定化金担体の量は、測定対象物質の種類やキットの態様等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。
【００６７】
疾患の検査用キットとしては、例えば、免疫クロマトグラフィーを利用するものが挙げられる。そのような疾患の検査用キットは、具体的には、例えば、被検試料と抗体結合金ナノ粒子との反応物を毛細管現象により移動させる部位（以下、移動部位ともいう）を備え、且つ前記移動部位にはさらに測定対象の抗原と抗体結合金ナノ粒子との結合体が集積される部位であって測定対象の抗原と結合していない抗体結合金ナノ粒子は集積されない部位（以下、集積部位ともいう）が備えられているキットであってよい。測定対象の抗原が被検試料中に存在する場合には、測定対象の抗原と抗体結合金ナノ粒子との結合体が集積部位に集積され発色する。集積部位には、例えば、測定対象の抗原とは反応するが抗体結合金ナノ粒子とは反応しない抗体であって、抗体結合金ナノ粒子と測定対象の抗原との結合部位とは異なる部位で測定対象の抗原と結合できるものが備えられていればよい。移動部位には、さらに、測定対象の抗原との結合によらず抗体結合金ナノ粒子が集積される部位（以下、対照集積部位）が備えられていてもよい。対照集積部位には、例えば、抗体結合金ナノ粒子に対する抗体が備えられていればよい。また、疾患の検査用キットは、さらに、被検試料を点着する部位や、抗体結合金ナノ粒子を含み被検試料と抗体結合金ナノ粒子を反応させる部位を備えていてもよい。
【００６８】
また、本発明は、本発明の抗体結合金担体を含む免疫センサーを提供する。免疫センサーとは、抗原抗体反応に基づき測定対象物質を検出できるセンサーをいう。免疫センサーは、測定対象の抗原が被検試料中に存在する場合に、抗体結合金担体と抗原との間の抗原抗体反応を検出することができるように構成されていればよい。具体的には、例えば、抗体結合金ナノ粒子、抗体結合金ナノ粒子を分散させたコロイド膜、抗体結合金薄膜等をセンサーとして利用することができる。免疫センサーに含まれる抗体結合金担体の量は、抗原の種類やセンサーの態様等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。
【００６９】
また、本発明は、本発明の抗体結合金ナノ粒子を含む免疫マーカーを提供する。免疫マーカーとは、抗原抗体反応に基づき測定対象物質が存在する部位を示すものである。免疫マーカーは、測定対象の抗原が被検試料中の特定部位に存在する場合に、当該特定部位において抗体結合金ナノ粒子と抗原との間の抗原抗体反応を検出することができるように構成されていればよい。例えば、癌に関連するバイオマーカーを測定対象とする抗体結合金ナノ粒子を用いることで、抗体結合金ナノ粒子が癌の部位に集積し発色する。免疫マーカーに含まれる抗体結合金ナノ粒子の量は、抗原の種類や集積部位の被験試料または被験体における位置等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。また、このような免疫マーカーの原理を利用して、本発明の抗体結合金ナノ粒子と特定の疾患に対する薬剤と組み合わせることで、当該疾患に対するドラッグデリバリーシステムを構築できる。例えば、癌に関連するバイオマーカーを測定対象とする抗体結合金ナノ粒子と抗癌剤を組み合わせることで、抗癌剤を癌の部位に集積させることができる。
【００７０】
本発明のタンパク質固定化金担体は、上記のような抗原抗体反応を利用する態様以外にも、固定化されるタンパク質の性質に応じて種々の用途に利用できる。例えば、酵素を固定化した金担体を触媒として利用することができる。また、例えば、特異的に結合する分子の組み合わせを利用して、種々のバイオセンサーや分子認識マテリアルを提供できる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７２】
＜実施例１＞ペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 の調製
黄色ブドウ球菌由来のプロテイン A は抗体である免疫グロブリン G（IgG）の Fc 領域に結合するタンパク質である。本実施例では抗体結合タンパク質としてプロテイン A の抗体認識部位である ZZ 領域（ZZ ドメイン）を選定し、保護タンパク質としてチオレド
キシン（Trx）、金還元能および金結合能を有するペプチドとして A3 ペプチド（AYSSGAPPMPPF；配列番号１）を融合したペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 を以下の手順で調製した。
【００７３】
まず、NcoIサイト−NdeIサイト−ZZ ドメインをコードする領域−BamHIサイト−チオレドキシンをコードする領域−トロンビン切断サイトをコードする領域−BamHIサイト−A3 ペプチドをコードする領域−終止コドン−XhoIサイトをこの順に含むＤＮＡ断片を pUC57
の EcoRV サイトに導入した人工合成プラスミドを、ＢＥＸ社に委託して合成した。pUC57 に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１９に示す。
【００７４】
次に、前記人工合成プラスミドを鋳型に、プライマー M13 M4（GTTTTCCCAGTCACGAC（17
mer）；配列番号２０）とプライマー M13 RV（CAGGAAACAGCTATGAC（17 mer）；配列番号２１）および KOD FX polymerase を用いたＰＣＲにより、ZZ ドメインをコードする領域等を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を NdeI および XhoI により消化し、アガロースゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction Kit で精製した。
【００７５】
同様に pET28a(+)ベクターを NdeI および XhoI で切断し、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化処理を行い、QIAquick PCR Purification Kit で精製した。
【００７６】
前述の制限酵素処理 PCR産物と脱リン酸化 pET28a(+)ベクターをリガーゼにより結合し、ペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 の発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターが正しい塩基配列を有することをシーケンス解析により確認した。前記発現ベクターを宿主である大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、カナマイシン硫酸塩（50 mg/L）を含んだ LB 寒天培地で培養した。得られた形質転換体を、カナマイシン硫酸塩（50 mg/L）を含んだ LB 液体培地 40 ml で 37 ℃、オーバーナイトで前培養した。得られた培養液を、カナマイシン硫酸塩（50 mg/L）を含んだ LB液体培地 1 L に植菌し、37 ℃、200 rpm で培養を行った。光学密度 OD600 = 0.4に達した時点で 25 ℃に冷却して培養を継続し、OD600 = 0.6 に達した時点で IPTG を最終濃度 0.5 mM になるように添加した。IPTG 添加後、25 ℃、200 rpm で 20 時間培養を行った。培養後、菌体を遠心分離（8,000 rpm, 10 min, 4 ℃）により集菌し、洗浄液（Tris 25 mM, KCl 2.68 mM, NaCl 137 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4）により 3 回洗浄を行った。さらに、保存液（Tris 20 mM, NaCl 500 mM, イミダゾール 40 mM, EDTA 0.1 mM, プロテアーゼ阻害剤, pH 7.4）に懸濁し、ディープフリーザーにより凍結保存した。凍結した菌体懸濁液を融解し、超音波処理により細胞破砕を行った。遠心分離（15,000 rpm, 10 min）により無細胞抽出液を回収し、80 ℃, 10 min 熱処理を行うことで大腸菌由来の夾雑タンパク質の変性を行った。遠心分離（15,000 rpm, 10 min）により熱処理後の無細胞抽出液を回収し、0.45 μm と 0.22 μm のフィルターで濾過を行った。濾液を Ni カラム（HisTrap HP column, GE Healthcare）にて精製し、溶出液を遠心限外濾過（Amicon Ultra-10 kDa, Millipore）により濃縮した。得られた濃縮液を、さらに脱塩カラム（PD-10 column, GE Healthcare）によりゲル濾過に供し、TBS（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）, 100 mM KCl）と buffer 交換し、目的のペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 を含む溶液を得た。このタンパク質溶液に等体積のグリセロールを加え、50 %グルセロールストックとして -20 ℃で保存した。得られたタンパク質が目的のペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 であること、および夾雑タンパク質が存在しないことは、SDS-PAGE により確認した。さらに、ELISA により ZZ-Trx-A3 の ZZ ドメインが抗体結合能を有することを確認した。
【００７７】
＜実施例２＞ペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 を用いた金ナノ粒子の合成とタンパク質の固定化
超純水 890 μL に 100 mM HEPES 緩衝液（pH 3, 4, 5, 6, 7, 8）100 μL を加え、実施例１で調製した ZZ-Trx-A3 の 50 %グリセロールストック水溶液を 5 μL 加えた。こ
れに 50 mM の塩化金酸水溶液（pH 1.3）を 5 μL 添加し、軽く混ぜた後、室温で 2 時間静置し、4 ℃で保存した。これにより、ZZ-Trx-A3 が固定化された金ナノ粒子（以下、「ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子」ともいう）の懸濁液を得た。生成した ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子の吸光スペクトルを紫外可視分光光度計にて測定し、TEM により形状を観察した。
【００７８】
HEPES 水溶液（pH 3〜8、終濃度 10 mM）に酸性の塩化金酸水溶液（pH 1.3）を添加すると、反応溶液の pH は低下する。酸性条件では赤紫色の水溶液が得られ、約 525〜530 nm に金ナノ粒子特有の表面プラズモン共鳴に起因する吸収が観測された（図２a, b のサンプル i 〜 iv）。酸性条件の中では、pH 4（サンプル ii）の場合に、最も短波長に吸収ピークが観測された。一方、中性条件では青色の水溶液が得られ、スペクトルは大きく長波長側にシフトした（図２a, b のサンプル v, vi）。この結果から中性条件では金ナノ粒子が凝集していることが示唆された。さらに pH 4（サンプル ii）および pH 8（サンプル vi）で合成した金ナノ粒子の TEM 観察を行ったところ、pH 4 では 2〜10 nm の粒度分布を示す金ナノ粒子が得られ、一方、pH 8では 10〜80 nm の粒度分布を示す金ナノ粒子が得られた（図２c, d）。
【００７９】
次に、金ナノ粒子形成における HEPES の影響を検討するため、HEPES の代わりに水または 100 mM トリス緩衝液（pH 7）を用いて同様に実験を行った。その結果、HEPES が存在しない条件では金ナノ粒子は形成されなかった（図２e）。すなわち、HEPES が金イオンの還元に関与していることが示唆された。
【００８０】
＜実施例３＞ペプチド融合タンパク質 ZZ-Trx-A3 を用いた金ナノ粒子の合成における経時変化
超純水 890μL に 100 mM HEPES 緩衝液（pH 4）100 μL を加え、実施例１で調製した
ZZ-Trx-A3 の 50 %グリセロールストック水溶液を 5 μL 加えた。これに 50 mM の塩化金酸水溶液（pH 1.3）を 5 μL 添加し、軽く混ぜた後、紫外可視分光光度計にて ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子の吸光スペクトルを経時的に測定した。その結果、時間とともに、吸光度の増大と短波長側へのシフトが観測され、20 分でスペクトルの変化がなくなった（図３a）。また、525 nm における吸光度の経時変化からも反応は約 20 分で終了することが明らかとなった（図３b）。このような穏やかな反応条件で速やかに金ナノ粒子が合成できることは大きな利点の１つである。
【００８１】
＜実施例４＞ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子を用いた ELISA による抗原検出
（１）試薬調製
以下の試薬を調整した。
TBS 緩衝液：50 mMトリス, 150 mM NaCl, pH 7.6
洗浄液：50 mMトリス, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween 20, pH 7.6
BSA 水溶液：BSA を 1 mg/mL になるように TBS 緩衝液に溶解した。
ブロッキング水溶液：カゼインを 10 mg/mL になるように TBS 緩衝液に溶解した。
抗体水溶液：抗-BSA ラビット由来抗体を TBS 緩衝液で 1 万倍に希釈した。
二次抗体水溶液：HRP ラベル化ラビット由来２次抗体を TBS 緩衝液で 500 倍に希釈した。
HRP 反応水溶液：オルトフェニレンジアミン 4 mg を 100 mM トリス緩衝液（pH 7.0）10
mL に溶解し、30 % 過酸化水素を 5 μL 加えた。
（２）ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子の合成
ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子：超純水 1780 μL に 100 mM HEPES 緩衝液（pH 4）200
μLを加え、実施例１で調製した ZZ-Trx-A3 の 50 %グリセロールストック水溶液を 10 μL 加えた。これに 50 mM の塩化金酸水溶液（pH 1.3）を 10 μL 添加し、軽く混ぜた後、室温で 2 時間静置した。最終濃度：HEPES 10 mM, ZZ-Trx-A3 1.4 μM、塩化金酸 0.
25 mM。生成した ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子水溶液 1.8 mL に 100 mM トリス緩衝液（pH 8.6）を 450 μL 加えることで pH 8 に中和し、4 ℃で保存した。これにより、ZZ-Trx-A3 が固定化された金ナノ粒子（以下、「ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子」ともいう）の懸濁液を得た。
【００８２】
（３）ELISA
本実験の原理を図４a に示す。まず、BSA を抗原としてウェルに物理吸着させ、カゼインによるブロッキング後、抗-BSA ラビット由来抗体を添加し、BSA を介してウェルに結合させる。次に、ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子を抗-BSA ラビット由来抗体に結合させ、さらに HRP ラベル化ラビット由来２次抗体を ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子に結合させる。最後に、基質と反応させることで抗原の検出を行う。
【００８３】
具体的には、以下の手順で ELISA を行った。
96 穴マイクロプレートに前記 BSA 水溶液を 100 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートした。
プレートウォッシャーを用いて前記洗浄液を 200 μL 加え、30 秒インキュベートを行い、洗浄を行った。この洗浄操作を 3 回行った。
前記ブロッキング水溶液を 300 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートした。
前記と同様に洗浄操作を 3 回行った。
前記抗体水溶液を 100 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートした。
前記と同様に洗浄操作を 3 回行った。
前記 ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子を 100 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートした。
前記と同様に洗浄操作を 3 回行った。
前記二次抗体水溶液を 100 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートした。
洗浄液の代わりに TBS 緩衝液を用いて前記と同様に洗浄操作を 3 回行った。
HRP 反応水溶液を 200 μL 加えて、マイクロプレートリーダーを用いて 415 nm の吸光度を90 分間測定した。
【００８４】
その結果、図４b に示すように BSA、抗-BSA ラビット由来抗体、ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子が全て揃った時のみ発色し、どれか１つでも欠けている場合はほとんど発色を示さなかった。このことから、ZZ ドメインを金ナノ粒子に固定しても ZZ ドメインは抗体に対する結合能力を損なうことがなく、また、ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子のカゼインへの非特異的吸着も非常に小さいことが明らかとなった。
【００８５】
＜実施例５＞ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子と市販の抗体結合タンパク質固定化金ナノ粒子の性能比較
市販品であるプロテイン A 固定化金ナノ粒子およびプロテイン G 固定化金ナノ粒子を用いて実施例４と同様の ELISA 実験を行い、本実施例で合成した ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子の性能と比較を行った。プロテイン A およびプロテイン G は ZZ ドメイン同様、抗体の Fc 部位に結合する能力がある。本実験ではそれぞれのタンパク質固定化金ナノ粒子が同じ吸光度を示すように調製した。その結果、図５に示すように、前記 ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子は、プロテイン A 固定化金ナノ粒子およびプロテイン G 固定化金ナノ粒子に比べて 2 倍以上の感度を示した。市販品では金ナノ粒子表面にプロテイン A およびプロテイン G が無作為に固定されているため、配向性が悪く、抗体認識機能が低下すると考えられる。一方、ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子では ZZ ドメインが秩序正しく配向しているため、抗体認識機能が保持されているものと考えられる。
【００８６】
＜実施例６＞抗体固定化金ナノ粒子の調製と免疫沈降法による抗原検出
超純水 4450 μL に 100 mM HEPES 緩衝液（pH 4）500 μL を加え、実施例１で調製し
た ZZ-Trx-A3 の 50 % グリセロールストック水溶液を 25 μL 加えた。これに 50 mM の塩化金酸水溶液（pH 1.3）を 25 μL 添加し、軽く混ぜた後、室温で 2 時間静置した。最終濃度：HEPES 10 mM, ZZ-Trx-A3 1.4 μM、塩化金酸 0.25 mM。生成した ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子水溶液 3.2 mL に 100 mM トリス緩衝液（pH 8.6）を 0.8 mL 加えることで pH 8 に中和し、4 ℃で保存した。中和した ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子水溶液 1
mL に抗-リゾチームラビット由来抗体 13 μL（ZZ ドメインと等量）を加え、室温で 2 時間インキュベートした。さらに、リゾチーム TBS 溶液（1.35 mg/mL）を 6 μL（抗-リゾチームラビット由来抗体の 0.5 等量）を加え、室温で 2 時間インキュベートした。反応後、紫外可視分光光度計により吸収スペクトルを測定し、金ナノ粒子の形状を TEM により観察した。コントロール実験としてリゾチームの代わりに BSA を用いて同様に実験を行った。
【００８７】
この結果、図６a に示すように ZZ ドメイン固定化金ナノ粒子水溶液に抗-リゾチームラビット由来抗体を加えてもスペクトルに大きな変化は見られなかった。しかし、抗原であるリゾチームをさらに加えると、溶液が濁り、吸収スペクトルのバックグランドが増加した。これは図１に示すように、金ナノ粒子に固定された抗-リゾチームラビット由来抗体とリゾチームの間で抗原抗体反応が起こり、金ナノ粒子の凝集が誘発されたためである。この水溶液を数時間放置すると、図６b のように、金ナノ粒子が沈降したため、抗原を目視で検出することも可能である。また、この時の金ナノ粒子を TEM により観察したところ、単分散であった金ナノ粒子が、抗原の添加によって凝集していることが明らかとなった（図６c, d）。一方、コントロール実験として、リゾチームの代わりに BSA を使用した場合、抗原抗体反応が起こらないため、何も変化が見られなかった。また、pH 8 の HEPES 緩衝液から調製した金ナノ粒子（青色）を用いて、同様の実験を行ったところ、リゾチームの添加によって溶液が濁り、数時間後、金ナノ粒子の沈降が確認された（図７a）。また、TEM 観察により金ナノ粒子が凝集していることが明らかとなった（図７b）。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、機能性に優れた、抗体等のタンパク質を固定化した金ナノ粒子等の金担体を提供できる。そのような金担体は、疾患の検査、免疫センサー、免疫マーカー等の種々の分野で利用できる。
【図３】
2013151454.tif 000003
【図５】
2013151454.tif 000004
【図１】
2013151454.tif 000005
【図２】
2013151454.tif 000006
【図４】
2013151454.tif 000007
【図６】
2013151454.tif 000008
【図７】
2013151454.tif 000009
【配列表】
2013151454000001.app