(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−インターフェロンと、ポリソルベート８０と、浸透圧調節剤と、０．１〜０．３ｗ／ｖ％のフェノール、０．１〜０．２ｗ／ｖ％のｍ−クレゾールまたはそれらの混合物から成る群から選択される抗菌防腐剤と、緩衝系とからなり、キレート剤を含有しないα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項２】
添加されるα−インターフェロンの量が１×１０6ＩＵ／ｍｌ〜１×１０8ＩＵ／ｍｌの範囲である請求項１記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項３】
前記ポリソルベート８０の濃度は０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％の範囲である請求項１又は２記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項４】
前記浸透圧調節剤は塩化ナトリウムである請求項１〜３の何れか１項に記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項５】
前記緩衝系は酢酸アンモニウムおよび酢酸から成る緩衝系、またはリン酸一水素ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）および燐酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）から成る緩衝系である請求項１〜４の何れか１項に記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項６】
前記水溶液製剤中の前記緩衝系の濃度は５〜２０ｍＭの範囲である請求項１〜５の何れか１項に記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【請求項７】
前記製剤のｐＨは４．５〜６．０の範囲である請求項１〜６の何れか１項に記載のα−インターフェロンの水溶液製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト血清アルブミンを含有しないα−インターフェロン（α−ＩＦＮ）の安定水溶液製剤に関する。
【０００２】
（従来の技術の説明）
ほとんどのタンパク質は、水溶液中で容易に変性するかまたは生物学的活性を失う。このために、多くの製薬会社は、タンパク質薬剤製品の安定性を改良するために凍結乾燥製剤を開発してきた。しかしながらタンパク質薬剤の凍結乾燥製剤は、多数の欠点を有する。凍結乾燥法は高価であり、患者への薬剤投与の前にタンパク質薬剤の付加的再構成過程を要するため、経済的または利便性の点で液体製剤には望ましくない。これらの点は、α−ＩＦＮの製剤の開発に際しても考慮されてきた。
【０００３】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、正常または腫瘍細胞の増殖、分化および機能に一役を担い、種々のウイルスの増殖を抑制するタンパク質サイトカインの１つである。特にＩＦＮは天然キラー細胞（ＮＫ）の活性を制御し、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を強化し、マクロファージの貪食活性を増大する。それによりＩＦＮは最後にウイルス等に感染した細胞の免疫反応を媒介する。ＩＦＮは、分泌細胞または誘導物質の種類によって、α、βおよびγに分類される。それらの中で、αおよびβはｐＨ２でさえも安定であるが、しかしγ形態は酸性条件下では不安定である。
【０００４】
３つの形態の中で、α−インターフェロンは、ウイルス性疾患、例えばＣ型肝炎の治療に非常に有効であるため、長い間、抗ウイルス剤として用いられてきた。したがって多数の研究者が不断の努力を重ねて、長期間、α−インターフェロンの活性を保存し得る製剤を開発してきた。
【０００５】
米国特許第４４９６５３７号は、安定剤としてアラニン（またはグリシン）およびヒト血清アルブミン、ならびに６．５〜８．０という溶液中のｐＨを維持するための緩衝系を含有するα−インターフェロンの凍結乾燥製剤に言及する。さらに米国特許第４８４７０７９号は、ヒト血清アルブミン、グリシン、チメロサール、ならびに６．５〜８．０のｐＨを維持するための緩衝系を含有するα−インターフェロンの水性製剤に言及する。面白いことに、上記の特許はともに、製剤がα−インターフェロンの生物学的活性を保有するのに有効であるヒト血清アルブミンを含有することを特徴とする。しかしながら製剤がヒト血清アルブミンを含有する場合、製剤が感染性病原体、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により汚染され得る可能性が高い。したがって、近年、ヒト血清アルブミンを使用することは推奨されない。さらに上記のアルブミンはある人々に免疫反応を誘導し得ることが既知である。
【０００６】
欧州特許第０７３６３０３Ａ２号は、安定剤としてのポリソルベートおよび抗菌防腐剤としてのベンジルアルコールを含有し、そして４．５〜５．５の範囲にｐＨを維持するための緩衝系を有する水性α−インターフェロン製剤を開示する。上記の特許において、安全であるポリソルベートは、有害であるかもしれないヒト血清アルブミンの代わりに利用される。しかしながら、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０とともに用いられると、ベンジルアルコールの抗菌活性は低減することが知られている。実際、ベンジルアルコールとともにポリソルベート８０を用いることは許容可能でないことが発見されている（Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, 1986, p18）。したがって、抗菌活性を維持するためには、相対的に大量のベンジルアルコール（０．９、１．０％）が用いられる必要がある。しかしながらベンジルアルコールのこのような過剰使用は、ペプチドの凝集を引き起こし得る（Richard L. Remmele et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 2, 1998）。さらに本発明人等により観察された４０℃でのα−インターフェロンの製剤の加速試験によれば、１．０％ベンジルアルコールおよび０．０２％ポリソルベート８０を含有する液体製剤は、フェノール（またはｍ−クレゾール）および０．０２％ポリソルベート８０を含有する製剤よりかなり低い活性を有する。
【０００７】
ＷＯ  ９６／１１０１８は、ポリソルベート、およびキレート化剤、例えば二ナトリウムＥＤＴＡ、ならびに防腐剤を含有する水溶液製剤に言及する。しかしながら上記の液体製剤は、細胞傷害性であることが既知であるＥＤＴＡ二ナトリウムを含むため有害であるかもしれず（Paula Saarien-Savolainen et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No.2, 1998）、それはヒト身体内部のカルシウムイオンとキレート錯体を形成し得るため、別の問題を有する。さらに上記の特許におけるもうひとつのキレート化剤として記述されているクエン酸塩は、身体に投与された場合に重篤な疼痛を生じることが既知である。
【０００８】
（発明の概要）
上記の問題を解決するために、本発明人等は、長期間α−インターフェロンの生物学的活性を保有し且つ非常に安定であり、そして潜在的に有害なヒト血清アルブミンもキレート化剤も含有しないα−インターフェロンの水溶液製剤を開発するために研究してきた。本発明人等は、安定剤としてのポリソルベート、および抗菌防腐剤としてのフェノール、ｍ−クレゾールまたはそれらの混合物を用いることにより、長期間α−インターフェロンの生物学的活性を保有し且つ防腐剤の量を最小限にし得るα−インターフェロンの水溶液製剤を開発することによって、本発明を達成した。
【０００９】
長期間生物学的活性および物理化学的安定性を保有し、そしてそれが欧州薬局方により必要とされる抗菌防腐剤の抗菌効力試験において規定された容認判定基準を満たし得るとはいえ、極少量の防腐剤のみは含有するα−インターフェロンの安定水溶液製剤を提供することは、本発明の目的である。
【００１０】
さらにヒト血清アルブミンまたはキレート化剤のようなヒト身体に有害である恐れのある物質を伴わずに抗菌活性を保有するα−インターフェロンの安全水溶液製剤を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１１】
本発明は、α−インターフェロンと、安定剤と、浸透圧調節剤と、フェノール、ｍ−クレゾールまたはそれらの混合物から成る群から選択される抗菌防腐剤と、緩衝系とを含むα−インターフェロンの水溶液製剤を提供する。
【００１２】
本発明にしたがって、α−インターフェロンの安定水溶液製剤が提供される。さらにαインターフェロンのより安全な水溶液製剤が提供される。本発明のこれらのおよびその他の特徴、局面および利点は、以下の説明および併記の特許請求の範囲を参照することにより、さらに良好に理解されるようになる。
【００１３】
（詳細な説明）
上記の目的を達成するために、本発明は、α−インターフェロンと、安定剤と、浸透圧調節剤と、フェノール、ｍ−クレゾールまたはそれらの混合物から成る群から選択される抗菌防腐剤と、緩衝系とを含むα−インターフェロンの水溶液製剤を提供する。
【００１４】
本発明中の「α−インターフェロン」という用語は、組換え細菌、酵母および動物細胞中で発現され、精製される全種類のα−インターフェロンを含む。即ち「α−インターフェロン」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然および組換えα−インターフェロンを含む。さらに、天然ヒトα−インターフェロンのアミノ酸が天然ヒトα−インターフェロンの活性の５０％より多くを保持しながら、部分的に置換されるα−インターフェロン類似体または変異体は、本発明の水溶液製剤に含まれ得る。本発明の水溶液製剤中に添加されるα−インターフェロンの量は、好ましくは１×１０6ＩＵ／ｍｌ〜１×１０8ＩＵ／ｍｌの範囲である。
【００１５】
本発明の水溶液製剤中のα−インターフェロンの安定性を維持するのに役立つ安定剤は好ましくはポリソルベート８０であり、そしてポリソルベート８０の濃度は、好ましくは０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％の範囲である。
【００１６】
さらに本発明の水溶液製剤は、微生物の増殖を抑制するために抗菌防腐剤、例えばフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを含む。好ましいフェノール濃度は０．１〜０．３ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましいｍ−クレゾール濃度は０．１〜０．２ｗ／ｖ％の範囲であり、そしてフェノールおよびｍ−クレゾールの適切な混合物も本発明の水溶液製剤中に含まれ得る。
【００１７】
本発明の水溶液製剤中の緩衝系としては、酢酸塩緩衝溶液またはリン酸塩緩衝溶液が挙げられる。特に酢酸アンモニウムおよび酢酸からなる緩衝系、またはリン酸一水素ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）およびリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）から成る緩衝系が好ましい。さらに本発明の水溶液製剤中の上記の緩衝系の濃度は、好ましくは５〜２０ｍＭの範囲である。本発明の水溶液製剤のｐＨは、上記の緩衝系によっている。多くの場合、本発明の水溶液製剤のｐＨは４．０〜８．０の範囲であり、好ましくは４．５〜６．０の範囲である。
【００１８】
本発明の水溶液製剤は、浸透圧調節剤、例えば塩化ナトリウムも含み得る。浸透圧調節剤の量は、製剤中の他の構成成分によるものである。最後に、本発明の水溶液製剤は無菌条件下で調製される。
【００１９】
本発明においては、好ましい安定剤を探すために、種々の濃度の注射用製剤に有用ないくつかの賦形剤を含む水溶液製剤が調製され、α−インターフェロンの生物学的活性に及ぼす安定剤の作用が研究されてきた。４℃で４ヶ月間貯蔵後の結果は、安定剤としてそれぞれヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコールまたはゼラチンを含む水溶液製剤の活性が貯蔵前の初期充填生物学的活性の９０％より高く、一方、α−インターフェロンおよび緩衝系のみを含む水溶液製剤の活性は貯蔵前の初期充填生物学的活性の約８０％であった。それは恐らくは、上記の安定剤がバイアルの内表面上のα−インターフェロンの吸着を防止するためである。しかしながらヒト血清アルブミンおよびゼラチンの使用は、ＨＩＶ、ＨＢＶ等のような外因性のウイルスの潜在的な汚染に関しての増えつつある問題のために、近年は推奨されない。さらにそれはある種の人々には免疫原性であり得る。したがってポリソルベート８０が本発明における最も適切な安定剤として選択される。
【００２０】
さらに本発明人等は、水溶液製剤の外観に及ぼすポリソルベート８０および抗菌防腐剤の濃度の作用を研究してきた。その結果、０．０１〜０．０２％の範囲のポリソルベートが水溶液製剤のクリアランス(clearance)に影響を及ぼさなかった。しかしながら０．１５％より高濃度のｍ−クレゾールが用いられた場合には水溶液製剤は濁るようになり、濁度はｍ−クレゾールの濃度に比例した。フェノールが抗菌防腐剤として用いられた場合、０．１〜０．３％の範囲のフェノールは水溶液製剤のクリアランスに影響を及ぼさなかったが、しかし０．３％より高濃度のフェノールが用いられた場合には水溶液製剤は濁るようになった。
【００２１】
フェノールを含む水溶液製剤はｍ−クレゾールまたはベンジルアルコールを含む水溶液製剤より多少高い生物学的活性を保持する能力を有するが、しかし差は大きくない。しかしながら水溶液製剤が４０℃の高温で貯蔵された場合、ベンジルアルコールを含む水溶液製剤の生物学的活性は大きく低減した。
【００２２】
生物学的活性ならびにα−インターフェロンの二量体化は、ｐＨによって影響を受ける。α−インターフェロンの生物学的活性は、約ｐＨ５．８で相対的に安定であり、二量体化はｐＨが高いほど高頻度であった。したがって、α−インターフェロンの水溶液製剤の長期貯蔵期間中に高ｐＨを有するのは好ましくない。
【００２３】
さらに本発明人等は、欧州薬局方中の抗菌製剤の効力を試験するためのプロトコール（European Pharmacopoeia 1997, 5.1.3 Efficacy of Antimicrobial Preparation）にしたがって、種々の組成および濃度の防腐剤を含む水溶液製剤の抗菌防腐作用を調べた。欧州薬局方における抗菌製剤の効力を試験するための具体的プロトコールは、参考例３に記載されており、要約すると次の通りである。
【００２４】
この試験に用いるよう記載されている５種類の標準菌株（グラム陽性および陰性細菌および真菌属の標準菌株）を、水溶液製剤１ｍｌ当たり１０5〜１０6細胞の濃度で人工接種した。決められた時間間隔で、製剤の一部をサンプリングし、生育可能細胞の数の変化の程度を対数変換した。上記の対数変換値（Ｌｏｇ減少値）を欧州薬局方表５．１．３−１における値と比較して、抗菌活性のレベルを評価した。欧州薬局方に記載されているＡおよびＢカテゴリー間の分類は、時間の経過中に当該微生物の対数減少値の差異から成し遂げられ得る。細菌の場合、Ａカテゴリーは、６時間以内の２のlog値の減少および２４時間以内の接種に対して得られた値に対する生育可能微生物数の３のlog値の減少が起こるべきであると規定し、Ｂカテゴリーは接種から２４時間以内の１のlog値の減少および７日以内の３のlog値の減少が起こるべきであると規定する。同様に真菌の場合には、Ａカテゴリーは７日以内に２のlog値の減少が起こるべきであると規定し、そしてＢカテゴリーは１４日以内に１のlog値の減少が起こるべきであると規定する。さらに時間が上記のように規定された後、生育可能微生物の数の回復または増加は観察されるべきでない。各カテゴリーに関して上記された対数減少値は、注射用製剤および点眼薬に適用され、本発明のα−インターフェロンの水溶液製剤はこの規定下に入る。したがって異なる防腐剤を含むα−インターフェロンのいくつかの水溶液製剤を調製することにより、そして５種の標準菌株に対する抗菌効力試験を実施することによって相対的抗菌活性を評価することにより、本発明人等は最良の製剤を測定しようとしてきた。
【００２５】
その結果、０．２％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールを含む製剤ならびに０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールを含む製剤はともに、アスペルギルス属の黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、カンジダ属の鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、シュードモナス属の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ブドウ球菌属の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および大腸菌（Escherichia coli）に対する欧州薬局方におけるＡおよびＢカテゴリーを満たす。しかしながら０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールを含む製剤の場合、防腐剤の総量は製剤の０．２５％である。したがって０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールを含む製剤は、それが最少量の防腐剤を有するために、安全性の点でより好ましい製剤である。
【００２６】
本発明の上記のバージョンは、多数の利点を有し、それらの例としては、ウイルスの表面のα−インターフェロンの吸着を防止することにより長期間α−インターフェロンの生物学的活性を保有し得るα−インターフェロンの安定水溶液製剤を提供し、α−インターフェロンの生物学的活性ならびに抗菌活性が防腐剤の量を最小限にすることにより保有され得るα−インターフェロンの水溶液製剤を提供し、大量の防腐剤の使用はヒト身体に有害であることが既知であるため、最少量の防腐剤を有するα−インターフェロンのより安全な水溶液製剤を提供し、ヒト血清アルブミンまたはキレート化剤のようなヒト身体に有害であるかもしれない物質を含有しないα−インターフェロンの水溶液製剤を提供し、そして非常に安定であるα−インターフェロンの水溶液製剤を提供するといったことが挙げられる。
【００２７】
本発明はさらに、以下の実施例により例証される。これらの実施例は本発明をさらに詳しく説明するためのものであって、本発明が示された実施例に限定されないことは当業者には明らかである。
【００２８】
参照例１：精製組換えα−ＩＦＮの調製
インターマックス−α（登録商標）（インターフェロン−α２ａ、LG Chemical LTG）の活性物質製造方法により、製剤試験のための精製α−インターフェロンを調製した。
【００２９】
ヒトα−インターフェロン遺伝子挿入を含有する組換えビール酵母菌Saccharomyces cerevisiae（ビール酵母菌ｐＹＬＢＣ  Ａ／Ｇαｆα−ＩＦＮ；１９９２年７月２日に寄託されたKorean Collection for Type Culture of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnologyの寄託番号ＫＣＴＣ  ００５１ＢＰ）を発酵させた後、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含めたいくつかの精製過程により、９５％より高い逆相クロマトグラフィー純度のα−インターフェロンを得た。さらなる詳細に関しては、韓国特許出願第１９９２−２５９１２号（１９９２年１２月２８日提出、表題「Purification process of α-interferon expressed in recombinant yeast」）（現在、韓国特許第１１１２５１号）（この記載内容は、参照により本明細書中に開示される）を参照されたい。
【００３０】
参照例２：α−インターフェロンの水溶液製剤の調製およびその生物学的活性の評価
以下の組成物を有するα−インターフェロンの水溶液製剤を調製した：
α−インターフェロン：１×１０6ＩＵ／ｍｌ〜１００×１０6ＩＵ／ｍｌ
ポリソルベート８０：０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ
フェノール：１．５ｍｇ／ｍｌ
ｍ−クレゾール：１．０ｍｇ／ｍｌおよび
１０ｍＭの酢酸塩緩衝溶液または１０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液を含む緩衝系。
【００３１】
上記で調製したようなα−インターフェロンの水溶液製剤の生物学的活性を、monograph 1997:'1110 interferon alfa-2 concentrated solution' of the European Pharmacopoeiaに規定された手法にしたがって検討した。言い換えれば、国際標準組換えヒトインターフェロンα−２（ＩＦＮ  α−２）または企業内作業標準の細胞防御作用を比較することにより、ウイルスによる細胞感染に対するα−インターフェロンの水溶液製剤の細胞防御作用を測定して、国際単位（Ｉ．Ｕ．）を算定した。
【００３２】
３７℃および５％ＣＯ2の培養条件下で、ＭＤＢＫ細胞（Madin-Derbyウシ腎細胞：ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２２）をマイクロタイタープレート中で培養して、細胞単層を生成した。そして次に、３種類より多い異なる濃度のα−インターフェロン試験試料およびＮＩＨからの組換えヒトα−インターフェロン国際標準（カタログ番号：Ｇｘａ０１−９０１−５３５、米国）により較正されたα−インターフェロン作業標準をマイクロタイタープレートに添加して、培養した。一連のマイクロタイタープレートは、それぞれα−インターフェロンで処理されない細胞を含有したが、それらを陰性対照として用いた。３７℃および５％ＣＯ2の培養条件下で１８〜２４時間培養後、処理αインターフェロン溶液を棄て、細胞変性水疱性口内炎ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５８）を、対照以外の全てのプレートのウエル中に添加した。２４〜４８時間培養後、マイクロタイタープレートをクリスタルバイオレットで染色し、風乾した。エチレングリコールを各ウエルに添加して、染色染料を抽出した後、マイクロプレート分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定した。
【００３３】
α−インターフェロンの用量に関して標準および試験溶液の吸光度値をプロットし、線状関係を作成した。次に、平行線分析法を用いた比較により、試験溶液の力価を算定した。
【００３４】
参照例３：α−インターフェロンの水溶液製剤の抗菌効力試験
試験のために用いた５種の標準菌株は以下の通りであった。２種の真菌株アスペルギルス属の黒色アスペルギルスAspergillus niger（ＡＴＣＣ１６４０４）およびカンジダ属の鵞口瘡カンジダCandida albicans（ＡＴＣＣ１０２３１）、ならびに３種の細菌株シュードモナス属の緑膿菌Pseudomonas aeruginosa（ＡＴＣＣ９０２７）、ブドウ球菌属の黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（ＡＴＣＣ６５３８）および大腸菌Escherichia coli（ＡＴＣＣ８７３９）を用いた。
【００３５】
寒天Ｂ（１５ｇ／Ｌのカシトン、５ｇ／Ｌのソイトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１８ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ７．３±０．２）は細菌の固形培養用に、寒天Ｃ（１０ｇ／Ｌのペプトン、４０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ５．６±０．２）は真菌の固形培養用に用いた。細菌を３０〜３５℃で１８〜２４時間、そして真菌は、カンジダ属の鵞口瘡カンジダの場合には２０〜２５℃で２４〜４８時間、黒色アスペルギルスの場合には２〜７日間培養した。
【００３６】
アスペルギルス属の場合、約５日間の培養後に形成される黒色胞子を収集し、真菌の代わりに試験に用いた。
【００３７】
１０5〜１０6細胞（アスペルギルス属の場合は胞子）／ｍｌの濃度の標準菌株を用いてα−インターフェロンの試験水溶液製剤を含入する容器中で標準菌株を直接接種するために、希釈緩衝液で接種前の細胞濃度を１０7〜１０8細胞（または胞子）／ｍｌに希釈し、次に、添加された細胞懸濁液の量が水溶液製剤の１（ｖ／ｖ）％であるよう、希釈された細胞懸濁液を水溶液製剤に添加した。希釈緩衝液として、希釈緩衝液Ａ（９ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌのペプトン）は細菌類およびカンジダ属用に、そして希釈緩衝液Ｂ（９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌのポリソルベート８０）はアスペルギルス属用に用いた。
【００３８】
標準菌株懸濁液を試験水溶液製剤に接種した後、各０．１〜０．５ｍｌの試験製剤をそれぞれ０時間、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日目にサンプリングし、サンプリングされた溶液を希釈緩衝液を用いて１〜１０3倍に希釈した。次に希釈試料を寒天固形培地上に塗りつけて、上記の培養温度で培養した。固形培養から生成されたコロニー数を計数することにより、生育可能細胞数／試料１ｍｌを算定した。その間、サンプリング直後にインキュベーター中で２０〜２５℃で試験水溶液製剤を貯蔵した。生育可能細胞数および試験用培地を見積もるための方法として、欧州薬局方（Ｅ．Ｐ．１９９７，２．６．１２）に記載されたものを用いた。
【００３９】
実施例１：好ましい安定剤の探索
以下の実験を実施して、バイアルの表面のα−インターフェロンの吸着を防止することによりα−インターフェロンの生物学的活性を保有する好ましい安定剤を探した。
【００４０】
先ず、種々の濃度の注射用製剤に有用ないくつかの賦形剤を含む水溶液製剤を、表１に記載されているように調製し、塩化ナトリウムを添加して張度を調整した。各水溶液製剤を４℃で４ヶ月間貯蔵して、参照例２に記載した方法にしたがって各製剤中のα−インターフェロンの生物学的活性を評価した。結果を図１および以下の表１に示す。図１は、９×１０6ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロンを含有する水溶液製剤の充填生物学的活性に関するα−インターフェロンの相対生物学的活性（％）を示すグラフである。
【００４１】
【表１】
0003893286.tif 000002
【００４２】
α−インターフェロンおよび緩衝系のみを含む陰性対照製剤は、約８０％の初期充填生物学的活性を保有した。他方、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコールまたはゼラチンを含む水溶液製剤は、９０％より高い初期充填生物学的活性を保有した。それは恐らくは、ウイルス表面のα−インターフェロンの吸着が上記の添加剤により防止されるためである。
【００４３】
上記の添加剤はα−インターフェロンの生物学的活性を保有するのに寄与するが、しかしヒト血清アルブミンおよびゼラチンの使用は、外来性ウイルスによる潜在的な汚染問題のために、注射用製剤に関して制限される。したがってポリソルベート８０が最も適切な安定剤である。
【００４４】
実施例２：水溶液製剤の外観に及ぼすポリソルベート８０および抗菌防腐剤の濃度の影響
α−インターフェロンの水溶液製剤の初期選択のための予備実験として、水溶液製剤の外観に及ぼすポリソルベート８０および抗菌防腐剤の濃度の影響を調べた。ポリソルベート８０および抗菌防腐剤、例えばフェノール、ｍ−クレゾールまたはそれらの混合物を種々の濃度で含むα−インターフェロンの水溶液製剤１００ｍｌを調製した。次に、それぞれ０．８％塩化ナトリウムおよび１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を用いて、各製剤の張度およびｐＨを調整した。各製剤のｐＨは、５．３に調整した。
【００４５】
種々の濃度でポリソルベート８０および抗菌防腐剤を含む上記の水溶液製剤の色および濁度を、眼で観察した。結果を以下の表２に示す。
【００４６】
【表２】
0003893286.tif 000003
【００４７】
０．１５％より高い濃度のｍ−クレゾールを用いた場合、水溶液製剤は濁るようになり、濁度はｍ−クレゾールの濃度に比例した。フェノールの場合には、水溶液製剤を濁らせない濃度範囲は、０．１〜０．３％であって、０．３％より高い濃度のフェノールを添加した場合には水溶液製剤は濁るようになった。上記の試験結果は、ポリソルベート８０の０．０１％および０．０２％の濃度の両方で同様である。
【００４８】
実施例３：α−インターフェロンの生物学的活性に及ぼす抗菌防腐剤の影響
酢酸アンモニウム緩衝液を用いて水溶液製剤のｐＨを４．５〜５．５に制御し、塩化ナトリウムを添加して水溶液製剤の張度を調整した。α−インターフェロンの濃度は、全ての水溶液製剤に関して６×１０6ＩＵ／ｍｌに調整した。貯蔵温度は４℃または４０℃であった。貯蔵期間中、参照例２に記載した方法を用いて、α−インターフェロンの生物学的活性の変化を測定した。以下の表３および図２ａは４℃で貯蔵した水溶液製剤の生物学的活性試験の結果を示し、そして以下の表４および図２ｂは４０℃での結果を示す。
【００４９】
【表３】
0003893286.tif 000004
【００５０】
【表４】
0003893286.tif 000005
【００５１】
表３および図２ａに示すように、フェノールを含む水溶液製剤は生物学的活性を保有する能力が他の水溶液製剤よりわずかに高かったが、しかし差異は大きくなかった。しかしながら４０℃での貯蔵の場合、ベンジルアルコールを含む水溶液製剤の生物学的活性は、他の水溶液製剤と比較して大きく低減した（表４および図２ｂ参照）。
【００５２】
実施例４：α−インターフェロンの生物学的活性および二量体化に及ぼすｐＨの影響
６×１０6ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロン、０．１５％のｍ−クレゾールおよび１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を含む水溶液製剤を調製した。各水溶液製剤のｐＨは、それぞれ５．３、５．８および６．３に制御した。調製水溶液製剤を４０℃で１２週間貯蔵し、適切な時間間隔で各水溶液製剤の生物学的活性を測定した。結果を以下の表５および図３ａに示す。
【００５３】
【表５】
0003893286.tif 000006
【００５４】
１２週間後、非還元条件下で１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）（不連続緩衝系、分離ゲル：１４％、０．３７５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、堆積ゲル：５％，０．１２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）により、その後銀染色して、二量体の発生および程度を測定した。
【００５５】
先ず、１４％分離ゲルを２片のガラスプレート間に固化した後、５％堆積ゲル溶液を調製して、分離ゲル上に注ぎ、次にコームを挿入した。堆積ゲルを完全に固化させた後、コームを除去し、形成された各ウエルをランニングバッファー（トリス−グリシン、ｐＨ８．３）で洗浄した。上記の水溶液製剤１００μｌに、３倍濃縮試料緩衝液（０．１８６Ｍのトリス、３％ＳＤＳ、３０ｖ／ｖ％グリセロール、０．００９％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）５０μｌを添加し、十分に混合した。次に混合物を沸騰水浴中で２分間沸騰させ、冷浴中で冷却した。この試料５０μｌおよび分子量マーカー（Bio-Rad、低範囲ＭＷマーカー）１０μｌを異なるウエルに投入した。試料および分子量マーカー投入後、ゲルを電気泳動系（Hoeffer Scientific Instruments、ＳＥ６００）に入れて、次にランニングバッファーを系に注ぎ入れた。系を電力供給装置（Hoeffer Scientific Instruments、ＰＳ２５００）と接続してゲル１シート当たり１０ｍＡの電流を適用することにより、ブロモフェノールブルー帯域が分離ゲルト堆積ゲルの間の境界に達するまで、電気泳動を実行した。ブロモフェノールブルー帯域が境界に達したら、電流を２０ｍＡに上げて、次にブロモフェノールブルー帯域がガラスプレートの下端に達するまで、電気泳動を実行した。電気泳動完了後、電力を遮断し、ゲルを系から取り出して、メタノール：酢酸：水（５０：１０：４０）の混合物中で室温で１２〜１６時間、タンパク質を含有するゲルを固定した。次にゲルを１０％グルタルアルデヒド溶液に移して３０分間撹拌し、脱イオン水で各々２０分間、３回洗浄した。硝酸銀溶液（０．８％硝酸銀、０．０８％ＮａＯＨおよび４％アンモニア水）を調製後、ゲルをこの溶液に移して、暗所で５分間撹拌した。次にゲルを脱イオン水で各々１分間、３回洗浄した。使用直前に調製した現像液（０．００５％クエン酸，０．１４％ホルムアルデヒドおよび０．００５％メタノール）をゲルに添加し、ゲルを静かに振盪して、銀染色タンパク質帯域を現像した。結果を以下の表６および図３ｂに示す。
【００５６】
【表６】
0003893286.tif 000007
【００５７】
表５および図３ａに示したように、α−インターフェロンの生物学的活性は約ｐＨ５．８で相対的に安定していた。その間、α−インターフェロンの二量体化はｐＨが高いほど頻度が高かった（表６および図３ｂ参照）。その結果として、高ｐＨは、α−インターフェロンの水溶液製剤の長期間貯蔵のためには好ましくない。
【００５８】
実施例５：抗菌活性に及ぼす２つの防腐剤の影響
欧州薬局方（Ｅ．Ｐ  １９９７、５．１．３）に記載された手法にしたがって、防腐剤としてフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを含むα−インターフェロンの水溶液製剤に関して、抗菌効力試験を実行した。先ず、６×１０6ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロン、０．０２％のポリソルベート８０および１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を含む各水溶液製剤を調製した。製剤に、以下の表７に示すような種々の濃度で防腐剤を添加し、塩化ナトリウムを添加して各製剤の張度を調整した。水溶液製剤の抗菌効力試験の結果を、以下の表７に示す。参照例３に記載したような手法を用いて、水溶液製剤１ｍｌ当たりの生育可能細胞数を測定した。各サンプリング時に測定された生育可能細胞数を対数変換して、各時間間隔でのＬｏｇ減少値を算定した。得られたＬｏｇ減少値を欧州薬局方に規定された判定基準ＡまたはＢの値と比較して、それらが判定基準ＡまたはＢを満たすか否かを評価した。
【００５９】
【表７】
0003893286.tif 000008
【００６０】
表７の結果から判るように、０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの両方を含む水溶液製剤は、最少量の防腐剤(防腐剤の総量：０．２５％)を含有する場合でさえ、欧州薬局方における抗菌効力試験の判定基準ＡおよびＢを満たした。
【００６１】
実施例６：０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの混合物を含む水溶液製剤と０．３％フェノール単独を含む水溶液製剤との間の安定性の比較試験
６×１０6ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロン、０．０２％のポリソルベート８０、０．３％のフェノールおよび１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を含む水溶液製剤(試験水溶液製剤＃７−１)、ならびに０．１５％のフェノールおよび０．１％のｍ−クレゾールの混合物を０．３％フェノールの代わりに用いた以外は上記と同一の製剤(試験水溶液製剤＃７−２)を調製した。各水溶液製剤のｐＨを５．３に調整し、塩化ナトリウムを水溶液製剤に添加して張度を調整した。２種類の製剤を３群に分けて、それぞれ４℃、２５℃および４０℃の３群を１２週間貯蔵した。各群は３つのロットを有する。一定時間間隔で、α−インターフェロンの生物学的活性の変化を測定した。純度は、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ、Waters Alliance System、ＵＶ検出器、ジュピターＣ１８カラム)を用いて測定した。結果を以下の表８〜１３および図４ａ〜４ｆに示す。
【００６２】
（６−１）α−インターフェロンの生物学的活性の変化の評価
【００６３】
【表８】
0003893286.tif 000009
【００６４】
【表９】
0003893286.tif 000010
【００６５】
【表１０】
0003893286.tif 000011
【００６６】
（６−２）α−インターフェロンの純度
【表１１】
0003893286.tif 000012
【００６７】
【表１２】
0003893286.tif 000013
【００６８】
【表１３】
0003893286.tif 000014
【００６９】
図４ａ、４ｂおよび４ｃは、０時点でのα−インターフェロンの生物学的活性に関する相対的生物学的活性の変化を示すグラフである。表８〜１３および図４ａ〜４ｆに示したように、０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの混合物を含む水溶液製剤は、全試験期間中の活性ならびに純度に関して、０．３％フェノール単独を含むものと同様の傾向を示した。さらに２種類の製剤は、欧州薬局方における抗菌効力試験に規定された抗菌要件を満たした。しかしながら０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの混合物を含む水溶液製剤は、より少量の防腐剤を含有するために、０．３％フェノール単独を含むものよりヒト身体には安全である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の水溶液製剤を４℃で４ヶ月間貯蔵した場合のα−インターフェロン（α−ＩＦＮ）の生物学的活性に及ぼす安定剤の作用を示すグラフである。
【図２】  図２ａは、本発明の水溶液製剤を４℃で３６週間貯蔵した場合のα−ＩＦＮの生物学的活性を測定することによるα−ＩＦＮ（６×１０6ＩＵ／ｍｌ）の水溶液製剤の安定性に及ぼす抗菌防腐剤の作用を示すグラフである。
図２ｂは、本発明の水溶液製剤を４０℃で１６週間貯蔵した場合のα−ＩＦＮの生物学的活性を測定することによるα−ＩＦＮ（６×１０6ＩＵ／ｍｌ）の水溶液製剤の安定性に及ぼす抗菌防腐剤の作用を示すグラフである。
【図３】  図３ａは、本発明の水溶液製剤を４０℃で１２週間貯蔵した場合のα−ＩＦＮの生物学的活性を測定することによるα−ＩＦＮ（６×１０6ＩＵ／ｍｌ）の水溶液製剤の安定性に及ぼすｐＨの作用を示すグラフである。
図３ｂは、４０℃で１２週間貯蔵後のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動処理ゲルの銀染色により測定されるα−ＩＦＮの二量体化に及ぼすｐＨの作用を示す写真である。
【図４】  図４ａ、ｂおよびｃは、α−ＩＦＮ（６×１０6ＩＵ／ｍｌ）の水溶液製剤をそれぞれ４℃、２５℃および４０℃で１２週間貯蔵した場合の、抗菌防腐剤として０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの混合物を含む製剤と０．３％フェノール単独を含む製剤との間の生物学的活性の差を示すグラフである。
図４ｄ、ｅおよびｆは、α−ＩＦＮ（６×１０6ＩＵ／ｍｌ）の水溶液製剤をそれぞれ４℃、２５℃および４０℃で１２週間貯蔵した場合の、抗菌防腐剤として０．１５％フェノールおよび０．１％ｍ−クレゾールの混合物を含む製剤と０．３％フェノール単独を含む製剤との間の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定される純度の差を示すグラフである。
【図１】
0003893286.tif 000015
【図２】
0003893286.tif 000016
【図３】
0003893286.tif 000017
【図４】
0003893286.tif 000018
0003893286.tif 000019
0003893286.tif 000020