(57)【要約】【課題】液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。また、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供する。【解決手段】炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】
炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタ、或いは、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定は、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で高精度に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、再現性試験におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１％以下程度の精度が要求される。
【０００３】
液体クロマトグラフィーにより安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定するための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくして均一にすることである。しかしながら、カラム充填剤粒子の粒径を小さくすると、測定系に生じる圧力値が高くなる。例えば、特許文献１には、平均粒径値が３〜４μｍのカラム充填剤粒子を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法が開示されているが、特許文献１の技術を用いた測定系の圧力値は５ＭＰａ以上と高くなるため、耐圧性の高い液体クロマトグラフが必要となる。また、このような高圧状態で長期間使用した場合、配管の詰まりや、配管の接続部分の劣化による液漏れや、カラム寿命の短縮等を引き起こしやすい。
【０００４】
更に、測定系の圧力値は、液体クロマトグラフに用いられるフィルタの詰まりによっても変動する。フィルタは、通常、液体クロマトグラフの流路に設置され、測定試料や試薬類等から流路に混入する夾雑物を取り除く。例えば、特許文献２には、カラムのエンドフィッティング内に、ステンレス鋼繊維を積層して焼結した繊維焼結フィルタをフリットとして設置した液体クロマトグラフィー用カラムが開示されている。ステンレス焼結フィルタは最も一般的な液体クロマトグラフ用のフィルタであるが、血液等の生体試料を測定する場合には、血液中のタンパク質等がフィルタの表面に吸着するため測定系の圧力値が上昇しやすい。フィルタの詰まりによる測定系の圧力上昇は、上記に示した小さな粒径の充填剤を用いた高圧での測定と同様の問題を引き起こしやすい。また、フィルタへの非特異吸着により測定系の圧力値が変動して、クロマトグラムの変形を引き起こすため測定再現性が低下しやすい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−００５７３０号公報
【特許文献２】特開平０７−２６０７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。また、本発明は、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定において、炭素数３以下のアルケンの重合体又は炭素数３以下のアルキル基を有するアクリル化合物の重合体を素材とするフィルタを用いること、及び一定の圧力範囲で測定を行うことにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できることを見出した。
【０００８】
本発明の第１の発明は、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第２の発明は、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第３の発明は、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタ、或いは、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
以下、第１の発明から詳述する。
【０００９】
本発明の第１の発明は、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
【００１０】
第１の発明に用いるフィルタは、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体を素材とする。
炭素数２〜３のアルケンの重合体とは、エチレン又はプロピレンをモノマーとする重合体及び共重合体である。炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体とは、エチレン又はポリプロピレンをモノマーとする重合体の一部にハロゲン基を導入した重合体及び共重合体である。
【００１１】
炭素数２のアルケンの重合体としては、ポリエチレン、炭素数３のアルケンの重合体としてはポリプロピレン等が挙げられる。
炭素数２のハロゲン化アルケンの重合体としては、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフルオロエチレン、ポリジフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。
炭素数３のハロゲン化アルケンの重合体としては、ポリトリフルオロプロピレン等が挙げられる。
第１の発明に用いるフィルタは、これらの重合体の共重合体や混合物からなるものでもよい。
【００１２】
炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体は、炭素数２〜３のアルケンを重合してアルケンの重合体を得た後、該アルケンの重合体にハロゲン基を導入して得られるものでもよいし、ハロゲン基を導入した炭素数２〜３のアルケンを重合して得られるものでもよい。
【００１３】
第１の発明に用いるフィルタは、公知の方法により加工したフィルタを用いることができる。例えば、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体を繊維状、膜状、シート状、ろ紙状等の薄膜状に加工したフィルタ、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体の繊維を不織布、織布、編み物状に加工したフィルタ、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体の繊維又は粉体を積層し圧縮等の方法により加工したフィルタ、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体の繊維又は粉体を積層して焼結したフィルタ等が挙げられる。
【００１４】
フィルタの形状は、溶離液等の液状試薬が流入する方向に面するろ過面が円状の円盤体、円柱体、円錐体等が好ましい。
フィルタの表面には凸部や凹部が設けられていてもよい。
【００１５】
フィルタのろ過面が円形の場合、直径の好ましい下限は０．５ｍｍ、好ましい上限は２０ｍｍである。フィルタの直径が０．５ｍｍ未満であると、フィルタが目詰まりを起こすことがある。フィルタの直径が２０ｍｍを超えると、フィルタ内で測定試料や移動相が拡散して分離性能が低下することがある。フィルタの直径のより好ましい下限は１ｍｍ、より好ましい上限は１０ｍｍである。
【００１６】
フィルタの厚さの好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は１０ｍｍである。厚さが０．１ｍｍ未満の場合、通液する液体中の夾雑物を充分に捕捉できないことがある。厚さが１０ｍｍを超える場合、測定試料や溶離液がフィルタ内で拡散して分離性能が低下し、測定再現性が低下する。より好ましい下限は０．２ｍｍ、より好ましい上限は５ｍｍである。
【００１７】
フィルタの孔径の好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。フィルタの孔径が０．１μｍ未満であると、フィルタが目詰まりを起こしやすくなったり、測定系の圧力上昇により測定再現性が低下したりすることがある。フィルタの孔径が２０μｍを超えると、通液する液体中の夾雑物を充分に捕捉できないことがある。フィルタの孔径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は１５μｍである。
また、特開平２−２６２０５４号公報に開示されているように、孔径の異なる部分を内部に有するフィルタを用いてもよい。
【００１８】
フィルタは、表面を処理した表面処理フィルタであってもよい。上記「表面」とは、測定試料が接触するフィルタの外表面及び内表面を含む。
表面処理フィルタは、ブロッキング処理フィルタ、シリコーン処理フィルタ等公知の処理方法によるフィルタが好ましい。これらの表面処理フィルタは、異なる複数種の表面処理を行った表面処理フィルタでもよい。
【００１９】
第１の発明は、上記のフィルタを用いた液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
第１の発明に用いるフィルタは、液体クロマトグラフの流路上に設置する。特に、測定試料が通過する流路上に設置することが好ましい。第１の発明に用いるフィルタは、例えば、流路配管の途中に設置するラインフィルタ、分離用カラムの直前に設置するプレフィルタ、カラムのエンドフィッティング内で充填剤に接して設置されるフリット等、公知のフィルタの使用方法として用いることが好ましい。なかでも、プレフィルタ又はフリットとしての使用が好適である。
【００２０】
第１の発明では、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する。本明細書において、「測定系に生じる圧力値（以下、単に圧力値ともいう）」とは、液体クロマトグラフの流路において、カラムを含む送液ポンプ以降の流路全体により発生する圧力値を意味する。例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定できる値である。また、上述した「９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下」の圧力範囲を本発明の「圧力規定値」という。
【００２１】
圧力値を９．８×１０３Ｐａ未満に設定した場合は、ヘモグロビン類の測定値の再現性が低下し測定時間が長くなる。また設定圧力値が非常に小さいため圧力値を安定させることが困難となる。圧力値を１９．６×１０５Ｐａを超える値に設定した場合は測定値の再現性が低下する。
【００２２】
第１の発明の液体クロマトグラフィーは、送液用ポンプ、分離用カラム、検出器、試料導入機構等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上述したシリコーン処理フィルタを設置して行う。本発明に用いる液体クロマトグラフの例を示す構成図を図１に示す。
【００２３】
液体クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸は、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピック化合物等を適宜添加してもよい。
【００２４】
安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、充分なイオン交換反応が行なわれずヘモグロビン類を分離することが困難となることがある。緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、緩衝液中の塩が析出して液体クロマトグラフに悪影響を及ぼすことがある。
【００２５】
第１の発明により、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる。また、健常人血に含まれるその他のヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等を測定できる。また、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等を測定できる。
【００２６】
本発明の第２の発明は、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体からなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
【００２７】
アクリル重合体はアクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル等のアクリル構造又はメタクリル構造を有する化合物（以下、アクリル化合物ともいう）の重合体又は共重合体である。
炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基が挙げられる。
置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基の一部に置換基を導入したものである。置換基としては、アクリル重合体が有する炭素数１〜３のアルキル基に適度な親水性又は疎水性を付与できることから、ハロゲン基、アミノ基、水酸基、エーテル基、エポキシ基、グリシジル基、エステル基、カルボキシル基、スルホン酸基等が好ましい。なかでも、水酸基、エーテル基、ハロゲン基がより好ましい。
【００２８】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体としては、ポリメチル（メタ）アクリレート、ポリエチル（メタ）アクリレート、ポリプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体としては、ポリ２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリ２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリ２、２−ジヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリ２、３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリ２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリグリシジル（メタ）アクリレート、ポリトリフルオロエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
第２の発明に用いるフィルタは、これらの重合体の共重合体や混合物からなるものでもよい。
【００２９】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体は、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル化合物を重合して得られるものでもよいし、炭素数１〜３のアルキル基を有しないアクリル化合物を重合した後、アルキル基を導入して得られるものでもよい。
また、置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体は、置換基を含むアクリル化合物を重合して得られるものでもよいし、置換基を有しないアクリル化合物を重合した後、置換基を導入して得られるものでもよい。
【００３０】
第２の発明に用いるフィルタを得る方法及びフィルタの仕様は、上記第１の発明に用いるフィルタと同様である。
【００３１】
第２の発明では、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する。圧力値を９．８×１０３Ｐａ未満に設定した場合は、設定圧力値が非常に小さいために圧力値を安定させることが困難となる。また、測定時間が長くなる場合がある。圧力値を１９．６×１０５Ｐａを超える値に設定した場合は再現性が低下する。
【００３２】
第２の発明に用いられる液体クロマトグラフは、第１の発明と同様である。また、第２発明に用いられる溶離液は、第１の発明と同様である。第２の発明により、第１の発明と同様に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類、及び、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類を測定できる。
【００３３】
第３の発明は、炭素数２〜３のアルケンの重合体及び／又は炭素数２〜３のハロゲン化アルケンの重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタ、或いは、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体とポリエーテルエーテルケトンとからなるフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
以下、第１の発明の、炭素数２〜３のアルケンの重合体又は炭素数２〜３ハロゲン化アルケンの重合体をまとめて、単に「アルケン重合体」ともいう。また、第２の発明の、炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体及び／又は置換基を含む炭素数１〜３のアルキル基を有するアクリル重合体をまとめて、単に「アクリル重合体」ともいう。
【００３４】
第３の発明に用いるフィルタにおいて、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体との混合比率は、好ましくは１：９〜９：１である。より好ましくは２：８〜８：２であり、更に好ましくは３：７〜７：３である。
【００３５】
第３の発明に用いるフィルタとしては、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体を混合して公知の方法により加工したフィルタを用いることができる。例えば、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体の混合物、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体の混合物を繊維状、膜状、シート状、ろ紙状等の薄膜状に加工したフィルタ、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体の繊維の混合物を不織布、織布、編み物状に加工したフィルタ、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体の繊維又は粉体の混合物を積層し圧縮等の方法により加工したフィルタ、ポリエーテルエーテルケトンとアルケン重合体、又は、ポリエーテルエーテルケトンとアクリル重合体の繊維又は粉体の混合物を積層して焼結したフィルタ等が挙げられる。
【００３６】
第３の発明のフィルタの仕様は、上記第１の発明のフィルタと同様である。
【００３７】
第３の発明に用いられる液体クロマトグラフは、第１の発明と同様である。また、第３発明に用いられる溶離液は、第１の発明と同様である。第３の発明により、第１の発明と同様に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、健常人血に含まれるヘモグロビン類、及び、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類を測定できる。
【００３８】
上述したように、本発明の第１の発明、第２の発明、第３の発明によれば、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビンを測定できる。本発明の第１の発明、第２の発明、又は、第３の発明を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明では、炭素数３以下のアルケンの重合体、炭素数３以下のハロゲン化アルケンの重合体、炭素数３以下のアルキル基を有するアクリル化合物の重合体、又は、置換基を含む炭素数３以下のアルキル基を有するアクリル化合物の重合体を素材とするフィルタを用いる。更に、測定系の圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定することにより、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる液体クロマトグラフィーを提供できる。また、本発明によれば、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明に用いる液体クロマトグラフの例を示す構成図である。
【図２】実施例１のフィルタを用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図３】比較例１のフィルタを用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のフィルタを用いて異常ヘモグロビン類を含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図５】比較例１のフィルタを用いて異常ヘモグロビン類を含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図６】実施例１のフィルタを用いてヘモグロビンＡ２を含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図７】比較例１のフィルタを用いてヘモグロビンＡ２を含む試料を測定した場合に得られたクロマトグラムである。
【図８】測定例１、２及び３の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図９】測定例４、５及び６の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１０】測定例７、８及び９の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１１】測定例１０、１１及び１２の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１２】測定例１３、１４及び１５の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１３】測定例１６、１７及び１８の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１４】測定例１９、２０及び２１の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１５】測定例２２、２３及び２４の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１６】測定例１、４、７及び１０の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図１７】測定例１３、１６、１９及び２２の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（製造例１）
製造例１〜３では、平均粒径の異なるヘモグロビン類測定用のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１３０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１、３−ジメタクリロキシプロパン（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。
反応系を３５０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（親水性単量体、東亞合成社製）１８０ｇ、及び、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（親水性単量体、日油社製）６０ｇ、メタノール１００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、平均粒径を測定した結果、４．１μｍであった。
【００４２】
（製造例２）
反応系の撹拌条件を３００ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、６．９μｍであった。
【００４３】
（製造例３）
反応系の撹拌条件を２５０ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、１１．２μｍであった。
【００４４】
（実施例１）
実施例１では、炭素数２のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエチレン粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００４５】
（実施例２）
実施例２では、炭素数３のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリプロピレン粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００４６】
（実施例３）
実施例３では、炭素数２のハロゲン化アルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリトリフルオロエチレンの粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００４７】
（実施例４）
実施例４では、炭素数２のアルケン重合体と炭素数３のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
エチレン−プロピレン共重合体の粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００４８】
（実施例５）
実施例５では、炭素数２のアルケン重合体と炭素数２のハロゲン化アルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエチレンとポリテトラフルオロエチレンの粉末を１：１の比率で混合した混合物を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００４９】
（実施例６）
実施例６では、炭素数１のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリメチルメタクリレートの粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５０】
（実施例７）
実施例７では、置換基を含む炭素数２のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートの粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５１】
（実施例８）
実施例８では、炭素数１のアルキル基を有するアクリル重合体と、置換基を含む炭素数３のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
メチルメタクリレート−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート共重合体の粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５２】
（実施例９）
実施例９では、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）と炭素数２のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエーテルエーテルケトンとポリエチレンの粉末を１：１の比率で混合した混合物を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５３】
（実施例１０）
実施例１０では、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）と炭素数１のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエーテルエーテルケトンとポリメチルメタクリレートの粉末を１：１の比率で混合した混合物を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５４】
（比較例１）
比較例１では、金属を素材とするフィルタを調製した。
ステンレス鋼（ＳＵＳ３１６）金属短繊維及びステンレス鋼（ＳＵＳ３１６）金属微粉末を混合して得た焼結体を圧縮成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５５】
（比較例２）
比較例２では、炭素数４のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリブチレン粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５６】
（比較例３）
比較例３では、炭素数６の芳香族重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリスチレン粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５７】
（比較例４）
比較例４では、炭素数４のアルキル基を有するアクリル重合体素材とするフィルタを調製した。
ポリブチルメタクリレート粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５８】
（比較例５）
比較例５では、置換基を含む炭素数４のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリ２−ヒドロキシブチルメタクリレート粉末を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００５９】
（比較例６）
比較例６では、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）と炭素数４のアルケン重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエーテルエーテルケトンとポリブチレンの粉末を１：１の比率で混合した混合物を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
【００６０】
（比較例７）
比較例７では、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）と炭素数４のアルキル基を有するアクリル重合体を素材とするフィルタを調製した。
ポリエーテルエーテルケトンとポリブチルメタクリレートの粉末を１：１の比率で混合した混合物を焼結成型して連続多孔質体を作製し、直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを調製した。
以上の実施例及び比較例のフィルタの素材と炭素数（アルキルを有するアクリル重合体及び置換基を含むアルキル基を有するアクリル重合体については、アルキル基の炭素数）を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2013120163.tif 000002
【００６２】
（評価）
実施例及び比較例で得られたフィルタを用いて評価を行った。
【００６３】
（１）ヘモグロビン類測定用カラムの調製
製造例１〜３で得られたカラム充填剤をカラムに充填して、ヘモグロビン類測定用カラムを調製した。
製造例１〜３で得られた各カラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに添加して撹拌した後、５分間超音波処理して充填剤スラリーを調製した。長さ３０ｍｍ、内径４．６ｍｍのエンプティカラム（巴製作所社製）を接続した容量３０ｍＬのカラム充填用パッカー（アズワン社製）にスラリー全量を注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、２０ＭＰａの圧力で充填してヘモグロビン類測定用カラムを得た。
【００６４】
（２）測定条件
図１の液体クロマトグラフ１に、上記「（１）ヘモグロビン類測定用カラムの調製」で得られたヘモグロビン類測定用カラムを接続した（図１の７）。また、実施例及び比較例のフィルタを、インジェクションバルブ５と分離用カラム７の間に接続した（図１の６）。圧力値は、送液ポンプ３とインジェクションバルブ５の間に圧力計４（長野計器社製、「デジタル圧力計ＧＣ６１」）を接続して測定した。測定条件を表２に示す。
【００６５】
【表２】
2013120163.tif 000003
【００６６】
（３）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定
製造例１の充填剤を用いたカラム、及び実施例と比較例のフィルタを用いて健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定した。
測定試料は、フッ化ナトリウム入り採血管で採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１２０倍に溶血希釈したものを用いた。
表２の測定条件における測定系の圧力値を表１に示す。いずれの実施例及び比較例のフィルタを用いた場合も、圧力値は本発明の圧力規定値内であった。
実施例１のフィルタを用いた場合に得られたクロマトグラムを図２に示す。実施例１のフィルタを用いた場合、１分以内で安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ピーク２１）が他のヘモグロビン類から良好に分離できた。実施例２〜１０のフィルタを用いた場合のクロマトグラムも実施例１と同様に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃが良好に分離できた。
比較例１のステンレス製フィルタを用いた場合に得られたクロマトグラムを図３に示す。比較例１のステンレス製フィルタを用いた場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類との分離は、実施例１のフィルタを用いた場合のクロマトグラムに比較して不良であった。比較例２〜７のフィルタを用いた場合のクロマトグラムも比較例１と同様に、実施例１のフィルタを用いた場合のクロマトグラムと比較して不良であった。
上記の健常人血試料を連続して２０回測定して同時再現性試験を実施した。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値を表１に示す。実施例ではＣＶ値が１％以下と良好であった。比較例はＣＶ値が不良であった。
【００６７】
（４）修飾ヘモグロビン類の測定
製造例１の充填剤を用いたカラム、及び、実施例と比較例のフィルタを用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を上記の測定条件で測定した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）のヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表１に示す。
実施例のフィルタを用いた場合のΔ値は０．２％未満であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定できた。比較例のフィルタを用いた場合はΔ値が０．３％以上であり、修飾ヘモグロビン類の影響を受けて正確なヘモグロビンＡ１ｃの測定ができなかった。
【００６８】
（５）異常ヘモグロビン類の測定
製造例１の充填剤を用いたカラム、及び、実施例と比較例のフィルタを用いて、異常ヘモグロビンのヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を測定した。
実施例１のフィルタを用いた場合（図４）はヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離できた。実施例２〜１０のフィルタを用いた場合も実施例１と同様に良好な分離が得られた。比較例１のフィルタを用いた場合（図５）はヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離できなかった。比較例２〜７のフィルタを用いた場合も比較例１と同様、良好な分離は得られなかった。
【００６９】
（６）ヘモグロビンＡ２の測定
製造例１の充填剤を用いたカラム、及び、実施例と比較例のフィルタを用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料（バイオラッド社製「Ａ２コントロールレベル２」）を測定した。
実施例１のフィルタを用いた場合（図６）はヘモグロビンＡ２を良好に分離できた。実施例２〜１０のフィルタを用いた場合も実施例１と同様に良好な分離が得られた。
比較例１のフィルタを用いた場合（図７）はヘモグロビンＡ２を分離できなかった。比較例２〜７のフィルタを用いた場合も比較例１と同様、良好な分離は得られなかった。
【００７０】
（７）圧力値の同時再現性への影響評価
充填剤の粒径及び測定時の流速を変えて、測定系の圧力値を変化させて同時再現性試験を行った。これらの評価に用いた測定例１〜２４を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2013120163.tif 000004
【００７２】
測定例１〜３は、粒径の異なる製造例１〜３の充填剤を用いたカラム、及び、実施例１のフィルタを用いて同時再現性試験を行った例である。平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図８に示す。
本発明の圧力規定値の範囲内においてＣＶ値が良好であった。実施例１のフィルタを用いた場合でも、圧力規定値外ではＣＶ値が悪化した。
同様に、測定例４〜６では実施例３のフィルタ、測定例７〜９では実施例６のフィルタ、測定例１０〜１２では実施例９のフィルタを用いて同時再現性を行った。平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を、それぞれ図９〜１１に示す。実施例３、実施例６、実施例９のフィルタを用いた場合も実施例１のフィルタを用いた場合と同様の挙動を示した。
【００７３】
測定例１３〜１５は、粒径の異なる製造例１〜３の充填剤を用いたカラム、及び、比較例１のフィルタを用いて同時再現性試験を行った例である。平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図１２に示す。比較例１のフィルタを用いた場合、ＣＶ値は悪く、圧力規定値内で再現性が向上する挙動は認められなかった。
同様に、測定例１６〜１８は比較例２のフィルタ、測定例１９〜２１は比較例４のフィルタ、測定例２２〜２４は比較例６のフィルタを用いて同時再現性を行った。平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を、それぞれ図１２〜１５に示す。比較例２、比較例４、比較例６のフィルタを用いた場合も比較例１のフィルタを用いた場合と同様の挙動を示した。
以上から、本発明に用いるフィルタを用い、かつ、圧力値を本発明の規定圧力範囲内とした場合に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が向上することが確認できた。
【００７４】
（８）繰り返し測定の影響評価
上記「（７）圧力値の同時再現性への影響評価」で用いた測定例の内、製造例１の充填剤を用いた例（測定例１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２）を用いて、健常人血液試料を合計３０００回測定した際の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性の推移を確認した。２００回の測定毎に同時再現性試験を実施した時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を図１６及び図１７に示す。
実施例のフィルタを用いた場合を示した図１６では３０００回の測定期間中に良好なＣＶ値を維持した。比較例のフィルタを用いた場合を示した図１７では、初期よりＣＶ値が悪く、約１５００回の測定でＣＶ値が更に悪化した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で再現性良く測定できる液体クロマトグラフィーを提供できる。また、本発明によれば、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供できる。
【符号の説明】
【００７６】
１  液体クロマトグラフ
２  溶離液切替バルブ
３  送液ポンプ
４  圧力計
５  インジェクションバルブ
６  プレフィルタ
７  分離用カラム
８  検出器
９  溶離液
１０  オートサンプラ
１１  廃液容器
２１  安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
２２  ヘモグロビンＡ０
２３  ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
２４  ヘモグロビンＳ
２５  ヘモグロビンＣ
２６  ヘモグロビンＡ２
【図１】
2013120163.tif 000005
【図２】
2013120163.tif 000006
【図３】
2013120163.tif 000007
【図４】
2013120163.tif 000008
【図５】
2013120163.tif 000009
【図６】
2013120163.tif 000010
【図７】
2013120163.tif 000011
【図８】
2013120163.tif 000012
【図９】
2013120163.tif 000013
【図１０】
2013120163.tif 000014
【図１１】
2013120163.tif 000015
【図１２】
2013120163.tif 000016
【図１３】
2013120163.tif 000017
【図１４】
2013120163.tif 000018
【図１５】
2013120163.tif 000019
【図１６】
2013120163.tif 000020
【図１７】
2013120163.tif 000021