【手続補正書】
【提出日】平成27年12月4日(2015.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質を製造する光合成微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
【請求項２】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え光合成微生物に対して内因性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
組換え光合成微生物が、微細藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
組換え光合成微生物が、、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）またはボルボックス属（Volvox）の種である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
組換え光合成微生物が、ラン藻である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
組換え光合成微生物が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）の種である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物であって、チオエステラーゼをコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え光合成微生物。
【請求項２３】
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２４】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２５】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項２４に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２６】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２７】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２８】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の組換え光合成微生物。
【請求項２９】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３０】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３１】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３２】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３３】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３４】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３５】
組換え光合成微生物が、微細藻類である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３６】
組換え光合成微生物が、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される属の種である、請求項３５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３７】
組換え光合成微生物が、ラン藻である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３８】
組換え光合成微生物が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）およびゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される属の種である、請求項３７に記載の組換え光合成微生物。
【請求項３９】
配列番号２９に対して、少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列およびチオエステラーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む発現カセット。
【請求項４０】
配列番号２９に対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列およびチオエステラーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む発現カセット。
【請求項４１】
チオエステラーゼが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
チオエステラーゼが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
非天然遺伝子または組換え核酸分子によってコードされる脱水素酵素は、酸化反応においてＮＡＤＰを使用し得る脱水素酵素であり得る。さらに、またはあるいは、非天然遺伝子は、宿主微生物に対して異種（異なる種から誘導される）または同種（同じ種から誘導される）である脱水素酵素をコードし得、特定の態様では、非天然遺伝子は、宿主微生物における過剰発現のために操作された内因性遺伝子であり得る。種々の例では、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素（例えば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素または非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）を含む）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素であり得る。例えば、組換え微生物は、いくつかの例では、配列番号４、配列番号４６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、脱水素酵素は、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、いくつかの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
方法は、培養物から少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含み得る。脂質は、細胞、培地または全培養物から単離され得る。また、本明細書において提供される方法または組換え微生物のいずれかによって製造される脂質も本明細書において提供される。脂質は、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケン、リン脂質、ガラクト脂質もしくはトリグリセリドのいずれかまたはいずれかの組合せであり得る。脂質は、１２から２４個の間の炭素原子、例えば、１２から１８個の炭素原子などの８から２４個の炭素原子を含有する少なくとも１種のアシル鎖を含み得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
特定の実施形態の前記の説明は、他者が、当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を容易に修飾および／または種々の適用のために適応させることができる本発明の一般的な性質を示す。したがって、このような適応および修飾は、本明細書において示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内にあるものとし、本発明の広がりおよび範囲は、上記の例示的実施形態のいずれかによって制限されてはならない。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
脂質を製造する微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のための少なくとも１種の遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組換え微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
［２］
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
［３］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
［４］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［５］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
［６］
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［７］
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９またはその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
［８］
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［９］
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
［１０］
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［１１］
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
［１２］
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え微生物に対して内因性である、請求項１０に記載の方法。
［１３］
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の方法。
［１６］
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え微生物であって、脂質の製造に関与している酵素をコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、酵素が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え微生物。
［１７］
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項１６に記載の組換え微生物。
［１８］
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１６または請求項１７のいずれかに記載の組換え微生物。
［１９］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１８に記載の組換え微生物。
［２０］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２１］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組換え微生物。
［２２］
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２３］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組換え微生物。
［２４］
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２５］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
［２６］
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
［２７］
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
［２８］
配列番号２９に対して、少なくとも６５％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子。